特表2022-546422 | 知財ポータル「IP Force」

知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」

▶ ナショナルインスティテュートフォーバイオテクノロジーインザネゲヴリミテッドの特許一覧

特表2022-546422前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的化するための単一ドメイン抗体

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

目に優しい文字サイズ小中大 PDF Top

< >

1A
1B
1C
1D
1E
1F
2A
2B
2C
2D
2E
2F
2G
2H
3A-C
3D
3E
3F
3G
4A-I
5A-H
6A
6B
6C
6D
7A
7B
7C
8
9A
9B
10A
10B
10C
10D
11
12A
12B
12C
12D
12E
13
14A
14B
14C
14D
15
16A
16B
16C
16D
17
18A
18B
18C
19A
19B
20
21
22A
22B
22C
22D
22E
22F

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-11-04

(54)【発明の名称】前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的化するための単一ドメイン抗体

(51)【国際特許分類】

C07K 16/30 20060101AFI20221027BHJP

A61P 35/00 20060101ALI20221027BHJP

A61P 13/08 20060101ALI20221027BHJP

A61P 21/00 20060101ALI20221027BHJP

A61P 25/16 20060101ALI20221027BHJP

A61P 25/18 20060101ALI20221027BHJP

A61P 25/28 20060101ALI20221027BHJP

A61P 25/14 20060101ALI20221027BHJP

A61K 39/395 20060101ALI20221027BHJP

A61K 45/00 20060101ALI20221027BHJP

G01N 33/483 20060101ALI20221027BHJP

G01N 33/574 20060101ALI20221027BHJP

C12N 15/13 20060101ALN20221027BHJP

【ＦＩ】

C07K16/30 ZNA

A61P35/00

A61P13/08

A61P21/00

A61P25/16

A61P25/18

A61P25/28

A61P25/14

A61K39/395 N

A61K45/00

G01N33/483 C

G01N33/574 A

C12N15/13

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022513205

(86)(22)【出願日】2020-08-30

(85)【翻訳文提出日】2022-03-28

(86)【国際出願番号】 IL2020050940

(87)【国際公開番号】W WO2021038571

(87)【国際公開日】2021-03-04

(31)【優先権主張番号】62/893,264

(32)【優先日】2019-08-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

２．ＰＬＵＲＯＮＩＣ

(71)【出願人】

【識別番号】522072932

【氏名又は名称】ナショナルインスティテュートフォーバイオテクノロジーインザネゲヴリミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀明代

(74)【代理人】

【識別番号】100208580

【弁理士】

【氏名又は名称】三好玲奈

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋香元

(72)【発明者】

【氏名】パポ，ニヴ

(72)【発明者】

【氏名】ローセンフェルド，リオール

【テーマコード（参考）】

2G045

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

2G045AA26

2G045CB02

2G045DA36

2G045FB03

4C084AA17

4C084NA05

4C084ZA021

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZC751

4C085AA14

4C085BB11

4C085GG02

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA75

4H045DA76

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

本発明は、そのいくつかの実施形態において、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に対する結合親和性が増加した抗原結合ポリペプチドを対象とする。いくつかの実施形態において、本発明はさらに、前立腺がんなどのＰＳＭＡの発現上昇に関連する疾患の診断および治療における抗原結合ポリペプチドの使用を対象とする。
【選択図】図６Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ｉ）ＧＹＴＤＳＮＹＹＭＳ（ＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１）、ＧＶＮＴＧＲＧＳＴＳＹＡＤＳＶＫＧ（ＣＤＲ－Ｈ２、配列番号２）、およびＡＡＣＨＦＣＤＳＬＰＫＴＱＤＥＹＩＬ（ＣＤＲ－Ｈ３、配列番号３）、
（ｉｉ）ＧＷＰＹＳＴＹＳＭＮ（ＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４）、ＧＩＳＳＴＭＳＧＩＩＦＡＥＳ（ＣＤＲ－Ｈ２、配列番号５）、およびＲＲＤＹＳＬＳＳＳＳＤＤＦＤＹ（ＣＤＲ－Ｈ３、配列番号６）、ならびに
（ｉｉｉ）ＧＹＴＡＳＦＳ（ＣＤＲ－Ｈ１、配列番号７）、ＧＶＡＶＩＮＶＧＶＧＳＴＹＹＡＤＳＶ（ＣＤＲ－Ｈ２、配列番号８）、およびＳＬＲＷＳＲＰＰＮＰＩＳＥＤＡＹＮＹ（ＣＤＲ－Ｈ３、配列番号９）からなる群から選択される３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、抗原結合ポリペプチド。

【請求項2】

ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号１０（ＧＩＳＳＴＭＳＧＩＩＦＡＥＳＫＡＧＱＦＴＩＳＱＤＮＡ）に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗原結合ポリペプチド。

【請求項3】

単一ドメイン抗体である、請求項１または２に記載の抗原結合ポリペプチド。

【請求項4】

アミノ酸配列：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＴＡＰＧＹＴＤＳＮＹＹＭＳＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＷＶＡＧＶＮＴＧＲＧＳＴＳＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＱＤＮＡＫＮＴＭＦＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＩＹＹＣＡＶＡＡＣＨＦＣＤＳＬＰＫＴＱＤＥＹＩＬＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳ（配列番号１１）を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗原結合ポリペプチド。

【請求項5】

アミノ酸配列：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＲＳＧＷＰＹＳＴＹＳＭＮＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＡＶＡＧＩＳＳＴＭＳＧＩＩＦＡＥＳＫＡＧＱＦＴＩＳＱＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＮＬＫＰＥＤＴＡＩＹＹＣＡＡＲＲＤＹＳＬＳＳＳＳＤＤＦＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳ（配列番号１２）を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗原結合ポリペプチド。

【請求項6】

アミノ酸配列：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＳＶＱＴＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＴＡＳＦＳＷＩＧＹＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＡＶＩＮＶＧＶＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＴＥＮＴＩＳＬＥＭＮＳＬＫＰＥＤＴＧＬＹＹＣＡＧＳＬＲＷＳＲＰＰＮＰＩＳＥＤＡＹＮＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳ（配列番号１３）を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗原結合ポリペプチド。

【請求項7】

アミノ酸配列：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＳＶＥＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＲＳＧＷＰＹＳＴＹＳＭＮＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＡＶＡＧＩＳＳＴＭＳＧＩＩＦＡＥＳＫＡＧＱＦＴＩＳＱＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＮＬＫＰＥＤＴＡＩＹＹＣＡＡＲＲＤＹＳＬＳＳＳＳＤＤＦＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳ（配列番号１４）を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗原結合ポリペプチド。

【請求項8】

前記抗原結合ポリペプチドが、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に対して特異的結合親和性を有する、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗原結合ポリペプチド。

【請求項9】

前記抗原結合ポリペプチドが、前記ＰＳＭＡに対する少なくとも１０^４モル^－１秒^－１の結合定数（Ｋ_ａ）を特徴とする、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗原結合ポリペプチド。

【請求項10】

前記抗原結合ポリペプチドが、前記ＰＳＭＡに対する７．１×１０^５モル^－１秒^－１の結合定数（Ｋ_ａ）を特徴とする、請求項４に記載の抗原結合ポリペプチド。

【請求項11】

前記抗原結合ポリペプチドが、前記ＰＳＭＡに対する２×１０^４モル^－１秒^－１の結合定数（Ｋ_ａ）を特徴とする、請求項５に記載の抗原結合ポリペプチド。

【請求項12】

前記抗原結合ポリペプチドが、前記ＰＳＭＡに対する３．６×１０^４モル^－１秒^－１の結合定数（Ｋ_ａ）を特徴とする、請求項６に記載の抗原結合ポリペプチド。

【請求項13】

前記抗原結合ポリペプチドが、前記ＰＳＭＡに対する２．２×１０^４モル^－１秒^－１の結合定数（Ｋ_ａ）を特徴とする、請求項７に記載の抗原結合ポリペプチド。

【請求項14】

前記抗原結合ポリペプチドが、前記ＰＳＭＡに対する１５ｎＭ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）を特徴とする、請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗原結合ポリペプチド。

【請求項15】

前記抗原結合ポリペプチドが、前記ＰＳＭＡに対する５５ｐＭの解離定数（Ｋ_Ｄ）を特徴とする、請求項４に記載の抗原結合ポリペプチド。

【請求項16】

前記抗原結合ポリペプチドが、前記ＰＳＭＡに対する６ｎＭの解離定数（Ｋ_Ｄ）を特徴とする、請求項５に記載の抗原結合ポリペプチド。

【請求項17】

前記抗原結合ポリペプチドが、前記ＰＳＭＡに対する０．６ｎＭの解離定数（Ｋ_Ｄ）を特徴とする、請求項６に記載の抗原結合ポリペプチド。

【請求項18】

前記抗原結合ポリペプチドが、前記ＰＳＭＡに対する３．４ｎＭの解離定数（Ｋ_Ｄ）を特徴とする、請求項７に記載の抗原結合ポリペプチド。

【請求項19】

前記抗原結合ポリペプチドが、２５ｋＤａ未満の分子量を特徴とする、請求項１～１８のいずれか一項に記載の抗原結合ポリペプチド。

【請求項20】

前記抗原結合ポリペプチドが、前記ＰＳＭＡ酵素の非触媒部位に対して特異的結合親和性を有する、請求項１～１９のいずれか一項に記載の抗原結合ポリペプチド。

【請求項21】

少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸をさらに含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の抗原結合ポリペプチド。

【請求項22】

治療または診断有効量の先行請求項のいずれか一項に記載の前記抗原結合ポリペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。

【請求項23】

治療または診断有効量の、治療剤、診断剤、およびセラノスティック剤から選択される少なくとも１つの薬剤をさらに含む、請求項２２に記載の医薬組成物。

【請求項24】

ＰＳＭＡを標的化する方法であって、前記ＰＳＭＡを含む試料を、請求項１～２１のいずれか一項に記載の前記抗原結合ポリペプチドと接触させ、それによってＰＳＭＡを標的化することを含む、方法。

【請求項25】

前記方法が、ＰＳＭＡ関連障害に罹患している、または罹患している疑いのある対象において前記ＰＳＭＡを画像化するために使用され、前記方法が、
ａ．有効量の請求項１～２１のいずれか一項に記載の抗原結合ポリペプチドと、造影剤とを、前記対象に投与することと、
ｂ．前記対象において前記ＰＳＭＡを検出することと、を含み、
それによってＰＳＭＡを含む細胞を画像化する、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記方法が、ＰＳＭＡ関連障害の治療を必要とする対象においてＰＳＭＡ関連障害を治療するために使用され、前記方法が、有効量の請求項１～２１のいずれか一項に記載の前記抗原結合ポリペプチドと、細胞傷害剤またはセラノスティック剤と、許容される担体とを含む医薬組成物を前記対象に投与し、それによって前記ＰＳＭＡ関連障害の治療を必要とする対象において前記ＰＳＭＡ関連障害を治療することを含む、請求項２４に記載の方法。

【請求項27】

前記ＰＳＭＡ関連障害が、前立腺がんである、請求項２５または２６に記載の方法。

【請求項28】

前記ＰＳＭＡ関連障害が、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、統合失調症、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される神経学的障害である、請求項２５または２６に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、「ＳＩＮＧＬＥ－ＤＯＭＡＩＮＡＮＴＩＢＯＤＹＦＯＲＴＡＲＧＥＴＩＮＧＰＲＯＳＴＡＴＥＳＰＥＣＩＦＩＣＭＥＭＢＲＡＮＥＡＮＴＩＧＥＮ（ＰＳＭＡ）」と題された、２０１９年８月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／８９３，２６４号の優先権の利益を主張し、その内容は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

本発明は、単一ドメイン抗体の分野である。

【背景技術】

【0003】

前立腺がん（ＰＣａ）は、通常、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）の血清濃度を測定する抗体ベースのアッセイによって検出されるが、これらのアッセイはエラー率が高くなる傾向がある。さらに、化学療法は、多くの場合、去勢抵抗性ＰＣａを治療するために使用されるが、ドキソルビシン（ＤＯＸ）などのＰＣａに対するいくつかの潜在的に有効な化学療法は、腫瘍内に十分に蓄積せず、分布容積が大きく、結果として、治療効果が低く、非特異的毒性が高くなる。したがって、ＰＣａの検出および細胞傷害剤の標的化送達の両方のための新しい手段が、緊急に必要とされている。これらの両方の問題に対処するために利用され得る１つの有望な標的は、おそらく細胞増殖を誘発する葉酸加水分解酵素活性のために、ＰＣａにおいて過剰発現される膜貫通タンパク質である、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）である。ＰＳＭＡは、主に、ＰＣａ細胞の膜上で発現されるが、ＰＣａを含む多くのがん腫の血管新生でも発現される。重要なことに、ＰＳＭＡの過剰発現は、悪性の去勢抵抗性ＰＣａ、アンドロゲン受容体発現の低下、およびＰＣａの予後不良と関連しており、したがって、これは、ＰＣａを検出し、疾患の病期を特定し、個別化された腫瘍特異的医療を促進するために使用され得る。特に、ＰＳＭＡの標的化は、その発現は増加するが、ＰＳＡの発現が減少し、化学療法薬を必要とする一次治療が失敗することが多い、侵襲性のアンドロゲン非依存性ＰＣａ腫瘍の治療において特に重要であり得る。

【0004】

ＰＳＭＡは、主に核医学の分野において、ＰＳＭＡを標的とした診断および阻害のための有望な化合物を提示した、複数の研究グループによって標的として広く利用されてきた。しかし、今日まで、十分に高い親和性（ナノモル範囲）でＰＳＭＡの細胞外領域に結合することが見出されたほとんどのタンパク質は、モノクローナル抗体または抗体断片であり、分子画像化およびがん治療の両方の目的に関していくつかの注意点がある。例えば、抗体の長い血清半減期および広範な生体内分布は、多くの場合、信号対雑音比を低下させ、それらを長期間循環中に維持する。これらの効果は、抗体が細胞傷害性放射性同位体にコンジュゲートすると、毒性副作用を増加させるか、または抗体－薬物コンジュゲートが非腫瘍細胞に内在化する可能性があるため、抗体が薬物にコンジュゲートすると、特異性を低下させる。さらに、大きなサイズの抗体は、異常な腫瘍組織のコアに浸透する能力を妨げることが多く、したがって、それらの薬物送達効率を劇的に低下させる。抗体断片はこれらの注意点のいくつかを解決するかもしれないが、それらは、多くの場合、弱い結合および低い安定性を示し、以前にマスクされた免疫原性エピトープを露出させる可能性がある。いくつかの非抗体ＰＳＭＡ結合剤および阻害剤が記載されており、有望な結果を示しているが、他の操作されたＰＳＭＡ結合ペプチドは、低い親和性、すなわち、高ナノモルからマイクロモルの範囲での低い親和性を示す。

【0005】

ＶＨＨとしても知られているＮＢは、重鎖抗体（ＨＣＡｂ）の一本鎖可変ドメインである。ＮＢは抗原結合を媒介するＨＣＡｂの唯一の断片であるため、親和性を低下させることなく、ＨＣＡｂの残りとは別に発現され得、すぐに（約１５ｋＤａ）、非免疫原性で標的特異性の高いタンパク質が生じ、これは、インビボ画像化および標的療法適用のための足場として使用するための優れた候補である。

【0006】

ＰＳＭＡを特異的に標的化することができる臨床的に適用可能なＮＢ－薬物コンジュゲートに対する大きなニーズが依然として存在している。そのような化合物の構造、ＰＳＭＡ活性および細胞生存率に対するそれらの効果、ならびに薬物担体としてのそれらの可能性は、まだ決定されていない。

【発明の概要】

【0007】

本発明は、そのいくつかの実施形態において、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に対する結合親和性が増加した抗原結合ポリペプチドを対象とする。いくつかの実施形態において、抗原結合ポリペプチドは、単一ドメイン抗体である。いくつかの実施形態において、本発明の単一ドメイン抗体は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。

【0008】

第１の態様によれば、（ｉ）ＧＹＴＤＳＮＹＹＭＳ（ＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１）、ＧＶＮＴＧＲＧＳＴＳＹＡＤＳＶＫＧ（ＣＤＲ－Ｈ２、配列番号２）、およびＡＡＣＨＦＣＤＳＬＰＫＴＱＤＥＹＩＬ（ＣＤＲ－Ｈ３、配列番号３）、（ｉｉ）ＧＷＰＹＳＴＹＳＭＮ（ＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４）、ＧＩＳＳＴＭＳＧＩＩＦＡＥＳ（ＣＤＲ－Ｈ２、配列番号５）、およびＲＲＤＹＳＬＳＳＳＳＤＤＦＤＹ（ＣＤＲ－Ｈ３、配列番号６）、ならびに（ｉｉｉ）ＧＹＴＡＳＦＳ（ＣＤＲ－Ｈ１、配列番号７）、ＧＶＡＶＩＮＶＧＶＧＳＴＹＹＡＤＳＶ（ＣＤＲ－Ｈ２、配列番号８）、およびＳＬＲＷＳＲＰＰＮＰＩＳＥＤＡＹＮＹ（ＣＤＲ－Ｈ３、配列番号９）からなる群から選択される３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗原結合ポリペプチドが提供される。

【0009】

別の態様によれば、治療的または診断的有効量の本発明の抗原結合ポリペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物が提供される。

【0010】

別の態様によれば、ＰＳＭＡを標的化する方法であって、方法は、ＰＳＭＡを含む試料を本発明の抗原結合ポリペプチドと接触させ、それによってＰＳＭＡを標的化することを含む、方法が提供される。

【0011】

いくつかの実施形態において、ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号１０（ＧＩＳＳＴＭＳＧＩＩＦＡＥＳＫＡＧＱＦＴＩＳＱＤＮＡ）に記載のアミノ酸配列を含む。

【0012】

いくつかの実施形態において、抗原結合ポリペプチドは、単一ドメイン抗体である。

【0013】

いくつかの実施形態において、抗原結合ポリペプチドは、アミノ酸配列：ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＴＡＰＧＹＴＤＳＮＹＹＭＳＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＷＶＡＧＶＮＴＧＲＧＳＴＳＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＱＤＮＡＫＮＴＭＦＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＩＹＹＣＡＶＡＡＣＨＦＣＤＳＬＰＫＴＱＤＥＹＩＬＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳ（配列番号１１）を含む。

【0014】

いくつかの実施形態において、抗原結合ポリペプチドは、アミノ酸配列：ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＲＳＧＷＰＹＳＴＹＳＭＮＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＡＶＡＧＩＳＳＴＭＳＧＩＩＦＡＥＳＫＡＧＱＦＴＩＳＱＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＮＬＫＰＥＤＴＡＩＹＹＣＡＡＲＲＤＹＳＬＳＳＳＳＤＤＦＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳ（配列番号１２）を含む。

【0015】

いくつかの実施形態において、抗原結合ポリペプチドは、アミノ酸配列：ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＳＶＱＴＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＴＡＳＦＳＷＩＧＹＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＡＶＩＮＶＧＶＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＴＥＮＴＩＳＬＥＭＮＳＬＫＰＥＤＴＧＬＹＹＣＡＧＳＬＲＷＳＲＰＰＮＰＩＳＥＤＡＹＮＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳ（配列番号１３）を含む。

【0016】

いくつかの実施形態において、抗原結合ポリペプチドは、アミノ酸配列：ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＳＶＥＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＲＳＧＷＰＹＳＴＹＳＭＮＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＡＶＡＧＩＳＳＴＭＳＧＩＩＦＡＥＳＫＡＧＱＦＴＩＳＱＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＮＬＫＰＥＤＴＡＩＹＹＣＡＡＲＲＤＹＳＬＳＳＳＳＤＤＦＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳ（配列番号１４）を含む。

【0017】

いくつかの実施形態において、抗原結合ポリペプチドは、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に対して特異的結合親和性を有する。

【0018】

いくつかの実施形態において、抗原結合ポリペプチドは、このＰＳＭＡに対する少なくとも１０^４モル^－１秒^－１の結合定数（Ｋ_ａ）を特徴とする。

【0019】

いくつかの実施形態において、抗原結合ポリペプチドは、ＰＳＭＡに対する７．１×１０^５モル^－１秒^－１の結合定数（Ｋ_ａ）を特徴とする。

【0020】

いくつかの実施形態において、抗原結合ポリペプチドは、ＰＳＭＡに対する２×１０^４モル^－１秒^－１の結合定数（Ｋ_ａ）を特徴とする。

【0021】

いくつかの実施形態において、抗原結合ポリペプチドは、ＰＳＭＡに対する３．６×１０^４モル^－１秒^－１の結合定数（Ｋ_ａ）を特徴とする。

【0022】

いくつかの実施形態において、抗原結合ポリペプチドは、ＰＳＭＡに対する２．２×１０^４モル^－１秒^－１の結合定数（Ｋ_ａ）を特徴とする。

【0023】

いくつかの実施形態において、抗原結合ポリペプチドは、ＰＳＭＡに対する１５ｎＭ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）を特徴とする。

【0024】

いくつかの実施形態において、抗原結合ポリペプチドは、ＰＳＭＡに対する５５ｐＭの解離定数（Ｋ_Ｄ）を特徴とする。

【0025】

いくつかの実施形態において、抗原結合ポリペプチドは、ＰＳＭＡに対する６ｎＭの解離定数（Ｋ_Ｄ）を特徴とする。

【0026】

いくつかの実施形態において、抗原結合ポリペプチドは、ＰＳＭＡに対する０．６ｎＭの解離定数（Ｋ_Ｄ）を特徴とする。

【0027】

いくつかの実施形態において、抗原結合ポリペプチドは、ＰＳＭＡに対する３．４ｎＭの解離定数（Ｋ_Ｄ）を特徴とする。

【0028】

いくつかの実施形態において、抗原結合ポリペプチドは、２５ｋＤａ未満の分子量を特徴とする。

【0029】

いくつかの実施形態において、抗原結合ポリペプチドは、このＰＳＭＡ酵素の非触媒部位に対して特異的結合親和性を有する。

【0030】

いくつかの実施形態において、抗原結合ポリペプチドは、少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸をさらに含む。

【0031】

いくつかの実施形態において、医薬組成物は、治療的または診断的有効量の、治療剤、診断剤、およびセラノスティック剤から選択される少なくとも１つの薬剤をさらに含む。

【0032】

いくつかの実施形態において、方法は、ＰＳＭＡ関連障害に罹患している、または罹患している疑いのある対象においてＰＳＭＡを画像化するために使用され、この方法は、（ａ）有効量の本発明の抗原結合ポリペプチドと、造影剤とを対象に投与することと、（ｂ）対象においてＰＳＭＡを検出し、それによってＰＳＭＡを含む細胞を画像化することと、を含む。

【0033】

いくつかの実施形態において、方法は、ＰＳＭＡ関連障害の治療を必要とする対象においてＰＳＭＡ関連障害を治療するために使用され、この方法は、有効量の本発明の抗原結合ポリペプチドと、細胞傷害剤またはセラノスティック剤と、許容される担体とを含む医薬組成物を対象に投与し、それによってＰＳＭＡ関連障害の治療を必要とする対象においてＰＳＭＡ関連障害を治療することを含む。

【0034】

いくつかの実施形態において、ＰＳＭＡ関連障害は、前立腺がんである。

【0035】

いくつかの実施形態において、ＰＳＭＡ関連障害は、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、統合失調症、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される神経学的障害である。

【0036】

他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および／または科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または同等の方法および材料を本発明の実施形態の実施または試験に使用することができるが、例示的な方法および／または材料を以下に説明する。矛盾する場合は、定義を含む特許明細書が優先される。さらに、材料、方法、および例は、単なる例示であり、必ずしも限定するように意図されるものではない。

【0037】

本発明のさらなる実施形態および適用可能性の全範囲は、以下に与えられる詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、本発明の趣旨および範囲内の種々の変更および修正がこの詳細な説明から当業者に明らかになるため、例示としてのみ与えられることが理解されるべきである。

【図面の簡単な説明】

【0038】

本発明のいくつかの実施形態は、添付の図面を参照して、単なる例として本明細書で説明される。次に、図面を詳細に具体的に参照することで、示されている詳細は、例としてであって、本発明の実施形態の例示的な考察の目的のためのものであることが強調される。この点において、図面と併せた説明は、本発明の実施形態がどのように実施されることができるかを当業者に明らかにする。

【0039】

【図1A-1F】ナノボディ（ＮＢ）がインビトロで前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）およびＰＳＭＡ発現前立腺がん細胞に結合することを示すグラフを含む。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および１：１のＬａｎｇｍｕｉｒ動力学モデルを使用して測定した応答単位（ＲＵ）を使用して、ＰＳＭＡに対する固定化されたＮＢ７（１Ａ）、ＮＢ８（１Ｂ）、ＮＢ１３（１Ｃ）、およびＮＢ３７（１Ｄ）の親和性（Ｋ_Ｄ）を計算した。ＰＳＭＡ濃度は、ＮＢ７センソグラムでは２５、５０、１００、１，６００、または３，２００ｐＭであり、ＮＢ８、ＮＢ１３、およびＮＢ３７センソグラムでは２．９４、５．８８、１１．７５、２３．５０、または４７．００ｎＭであった。各センソグラムの一番下の曲線は最低濃度を表し、一方、一番上の曲線は最高濃度を表す。ＦＡＣＳ分析（ｎ＝３）を使用して、ＰＣ３－ＰＩＰ（ＰＳＭＡ^＋）細胞（１Ｅ）およびＰＣ３－ｆｌｕ（ＰＳＭＡ^－）細胞（１Ｆ）に対するこれらのＮＢ（０．１～１，０００ｎＭ）の結合を決定した。便宜上、各蛍光値は、最高および最低濃度のＰＣ３－ＰＩＰ細胞での蛍光値に正規化した。

【図2A-2H】ＮＢおよびそれらのＰＳＭＡ結合エピトープの構造分析を示す図を含む。（２Ａ～２Ｃ）ＮＢ７（２Ａ、２．６５Å、ＰＤＢ６ＸＸＮ）、ＮＢ８（２Ｂ、１．５Å、ＰＤＢ６ＸＸＯ）、およびＮＢ３７（２Ｃ、１．５Å、ＰＤＢ６ＸＸＰ）の解明された結晶構造。ＣＤＲ１、２、および３には、それぞれ、アスタリスク（＊）、矢じり（▲）、および矢印（↑）の標識が付けられている。（２Ｄ～２Ｆ）単独（２Ｄ；ＰＤＢ１Ｚ８Ｌ）、または０．２ｍｇ／ｍｌのＮＢ７（２Ｅ、矢印で示されている；ＰＤＢ６ＸＸＮ）もしくはＮＢ３７（２Ｆ、矢印で示されている；ＰＤＢ６ＸＸＰ）との、ＰＳＭＡ（０．５ｍｇ／ｍｌ）の結晶構造に適合した、ＳＡＸＳ分解低解像度構造（灰色のメッシュ）に基づくタンパク質複合体の構造再構築。ＰＳＭＡ単量体には、ローマ数字で個々に標識が付けられており、生物学的二量体は、Ｉ＋ＩＩおよびＩＩＩ＋ＩＶによって形成され、一方、非生物学的二量体は、Ｉ＋ＩＩＩおよびＩＩ＋ＩＶによって形成される。（２Ｇ～２Ｈ）ＰＳＭＡおよびＮＢ７（２Ｇ）ならびにＰＳＭＡおよびＮＢ３７（２Ｈ）のコンピューターによるドッキング分析。（２Ｇ）ＮＢ７は、完全な黒色の線で囲まれている。主要な相互作用（図２０による）は、黒色の破線で示される。（２Ｈ）ＮＢ３７は、完全な黒色の線で囲まれている。主要な相互作用（図２１）は黒色の破線で示される。

【図3A-3G】標識されたＮＢのインビボ全身ＮＩＲ画像化を示す顕微鏡写真およびグラフを含む。ＰＣ３－ｆｌｕ（ＰＳＭＡ^－）およびＰＣ３－ＰＩＰ（ＰＳＭＡ^＋）ＰＣａ細胞を、無胸腺ヌードマウスの左および右上腹部にそれぞれ異種移植片として同時注入した。９日後、マウスに蛍光標識されたＮＢ（左から右へ：ＮＢ７、ＮＢ１３、ＮＢ８、およびＮＢ３７；各ＮＢのＫ_Ｄは便宜上括弧内に示される）を静脈内注射し、全身画像を、注射後３時間（３Ａ）および６時間（３Ｂ）、ならびにシグナルがもはや検出されなくなったとき（３Ｃ）に再び捕捉し、ＮＢ８およびＮＢ１３については３２時間、ならびにＮＢ３７については２４時間で捕捉し、ＮＢ７を注射したマウスは、注射後５６時間でも蛍光シグナルが示され、この時点でマウスを画像化し、次いで安楽死させた。）各個々の画像において、左側のマウスには腫瘍細胞を注射したが、ＮＢは注射せず、中央のマウスにはＮＢを注射したが、腫瘍細胞は注射せず、右側のマウスには腫瘍細胞およびＮＢの両方を注射した。（３Ｄ～３Ｇ）ＮＢ７（３Ｄ）、ＮＢ８（３Ｅ）、ＮＢ１３（３Ｆ）、およびＮＢ３７（３Ｇ）についての各時点での解剖された器官からのＡＦ_６８０蛍光シグナルの定量化。ＰＣ３－ＰＩＰ腫瘍はＰＳＭＡを発現するが、ＰＣ３－ｆｌｕ腫瘍は発現しない。

【図4A-4I】ＮＢの前立腺がん細胞への内在化の共焦点画像化を示す蛍光顕微鏡写真を含む。ＰＣ３－ＰＩＰ（ＰＳＭＡ^＋）細胞（４Ａ～４Ｄ）およびＰＣ３－ｆｌｕ（ＰＳＭＡ^－）細胞（４Ｅ～４Ｈ）を、Ｈｏｅｃｈｓｔ試薬（核染色）、ＰＥ抗ＰＳＭＡ抗体、および１００ｎＭのＮＢ７（４Ａ、４Ｅ）、ＮＢ８（４Ｂ、４Ｆ）、ＮＢ１３（４Ｃ、４Ｇ）、またはＮＢ３７（４Ｄ、４Ｈ）のいずれかと１０分間インキュベートし、それぞれＤｙｌｉｇｈｔ４８８で標識した。あるいは、ＰＣ３－ＰＩＰ細胞を、いずれのＮＢも用いずにＰＥ抗ＰＳＭＡ抗体と１０分間インキュベートした（４Ｉ）。スケールバー＝１０μｍ。

【図5A-5H】ＮＢ７ｃｙｓ、ＤＯＸ、およびＮＢ７ｃｙｓＤＯＸコンジュゲートのＰＣａ細胞への内在化の共焦点画像化を示す蛍光顕微鏡写真を含む。ＰＣ３－ＰＩＰ（ＰＳＭＡ^＋；５Ａ～５Ｄ）およびＰＣ３－ｆｌｕ（ＰＳＭＡ^－；５Ｅ～５Ｈ）細胞を、ＤＯＸ（自己蛍光；５Ｂ、５Ｆ）、Ｄｙｌｉｇｈｔ６５０で標識したＮＢ７ｃｙｓ（５Ｃ、５Ｇ）、またはＤｙｌｉｇｈｔ６５０で標識したＮＢ７ｃｙｓＤＯＸ（５Ｄ、５Ｈ）のいずれかとインキュベートした。未処理の対照細胞（５Ａ、５Ｅ）。１５分のインキュベーション後に画像を撮影した。ＮＢ７およびＤＯＸの重複していない共局在化は、ＮＢ７ｃｙｓＤＯＸコンジュゲートからのＤＯＸの切断を示す。ＤＯＸ分子の一部は、ＮＢ７ｃｙｓとは別に見出されたが（矢印）、その他はＮＢ７ｃｙｓと共局在化した（矢じり）。スケールバー＝１０μｍ。

【図6A-6D】ＰＣ３－ＰＩＰ（ＰＳＭＡ^＋）腫瘍に対するＮＢ７ｃｙｓＤＯＸのインビボおよびインサイチュ効果を示すグラフおよび顕微鏡写真を含む。無胸腺ヌードマウスのＰＣ３－ＰＩＰ異種移植片を、生理食塩水（対照）、２ｍｇ／ｋｇの市販のＤＯＸ、または１．４ｍｇ／ｋｇのＮＢ７ｃｙｓＤＯＸのいずれかで処置した。（６Ａ）処置から８日後の平均腫瘍体積（倫理規定のために数匹のマウスを実験から除外する前）。＊対照に対してｐ＜０．０５（スチューデントのｔ検定、対象についてはｎ＝７ならびにＤＯＸおよびＮＢ７ｃｙｓＤＯＸについてはｎ＝８）。（６Ｂ）処置対対照（Ｔ／Ｃ）群における計算された対数腫瘍増殖の勾配。＊対照に対してｐ＜０．０５（スチューデントのｔ検定、対照についてはｎ＝７、ＤＯＸについてはｎ＝４、およびＮＢ７ｃｙｓＤＯＸについてはｎ＝８；（６Ｃ）ＮＢ７ｃｙｓＤＯＸで処置し、ＰＳＭＡおよびＮＢ７を特定するために、それぞれ、ＰＥ抗ＰＳＭＡおよびＦＩＴＣ抗Ｈｉｓで標識し、核も染色した（Ｈｏｅｃｈｓｔ）、１匹のマウスからの処置終了から４日後に得た腫瘍からの代表的な組織切片。白い矢印は、ＰＳＭＡおよびＮＢ７の共局在化を指す。（６Ｄ）処置終了から４日後に得た腫瘍からの組織切片のヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色（上段）ならびに末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニックエンド標識（ＴＵＮＥＬ）およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色（下段）。白い矢印は、ＴＵＮＥＬおよびＰＩの共局在化を示す。スケールバーは、同じ段の３つの画像すべてに適用される。

【図7A-7C】ＮＢの選択および精製を示すグラフおよび顕微鏡写真を含む。（７Ａ）異なるＮＢ配列を発現する個々の細菌コロニーによるＰＳＭＡの結合を示す酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）の結果。精製のために選択した配列：ＮＢ７（クローン７、９、２２、２８、３１～３３、および４６）、ＮＢ８（クローン８および２１）、ＮＢ１３（クローン１３および１８）、およびＮＢ３７（クローン３７）。（７Ｂ）ＮＢ７についての代表的なサイズ排除クロマトグラフィー（ＮＢ８、ＮＢ１３、およびＮＢ３７についてのクロマトグラムはここに示したものと同様であった）。（７Ｃ）４つの精製したＮＢを示すＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの結果。すべてのタンパク質は、予想されるサイズが約１６ｋＤａであった。

【図8】ＰＳＭＡ活性アッセイを示す縦棒グラフを含む。ＰＳＭＡをＮＢの存在下または非存在下で基質とインキュベートして、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ活性を測定した。不活性（変性）ＰＳＭＡおよび市販のＰＳＭＡ阻害剤（ＰＭＰＡ）が対照として機能した。結果を比較し、未処理のＰＳＭＡの蛍光に対して正規化した。実験は３連で実施し、結果は平均±ＳＥＭとして示す。＊＊＊ｐ＜０．００５（スチューデントのｔ検定、ｎ＝３）。

【図9A-9B】単量体ＰＳＭＡの小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）分析およびＲ_ｇを含む。（９Ａ）ＰＢＳ（０．５～３ｍｇ／ｍｌ）中のＰＳＭＡのＳＡＸＳ分析。（９Ｂ）遊離ＰＳＭＡについての回転半径（Ｒ_ｇ）値は、溶液中の種間の相互作用により、濃度が高くなるとわずかに増加する。ギニエ（Ｇｕｉｎｉｅｒ）プロットを使用することによって決定したＲ_ｇ値は、０．５ｍｇ／ｍｌで４３Åおよび３ｍｇ／ｍｌで４６Åである。両方のパネルの色はＰＳＭＡ濃度を反映する（より暗い＝より高い）。

【図10A-10D】ＮＢの濃度を増加させたＰＳＭＡのＳＡＸＳ曲線および対応するギニエプロットを示すグラフを含む。ＰＳＭＡ（０．５ｍｇ／ｍｌ）を、１：０．５～１：５のＰＳＭＡ：ＮＢモル比を表す、０．１ｍｇ／ｍｌ～０．５ｍｇ／ｍｌの範囲にＮＢ（１０Ａ：ＮＢ７、１０Ｂ：ＮＢ８、１０Ｃ：ＮＢ１３、および１０Ｄ：ＮＢ３７）の濃度を増加させて予混合した。色はＮＢ濃度を反映する（より暗い＝より高い）。

【図11】ＰＳＭＡのＲ_ｇに対するＮＢの効果を示すグラフを含む。ＮＢの濃度を増加させた（０．０５～０．５８ｍｇ／ｍｌ）、ＰＳＭＡ（０．５ｍｇ／ｍｌ）のＲ_ｇ値を示すＳＡＸＳの結果。破線は、ＮＢを有しないＰＳＭＡのＲ_ｇを示す。

【図12A-12E】ＳＡＸＳデータのオーダーメードのスクリプト分析の結果を示すグラフを含む。分析は、スクリプトおよびコンピュータープログラムＧＮＯＭに基づく自動化された手順を使用して行った。「合計推定」スコアを使用して、最適な結果を選択した。ＰＳＭＡ（１２Ａ）、ＰＳＭＡ＋ＮＢ７（１２Ｂ）、ＰＳＭＡ＋ＮＢ８（１２Ｃ）、ＰＳＭＡ＋ＮＢ１３（１２Ｄ）、およびＰＳＭＡ＋ＮＢ３７（１２Ｅ）。

【図13】１：２のモル比でのＰＳＭＡおよびＮＢの距離分布関数Ｐ（ｒ）を示すグラフを含む。Ｐ（ｒ）は、プログラムＧＮＯＭを使用して決定した。

【図14A-14D】前立腺がん異種移植片のエクスビボ光学画像化を示す顕微鏡写真を含む。エクスビボシグナルは、ＮＢ７（１４Ａ）、ＮＢ１３（１４Ｂ）、ＮＢ８（１４Ｃ）、またはＮＢ３７（１４Ｄ）のいずれかを注射したマウスの様々な解剖した器官の３つの時点で示される（データは図３に示される）。強度バーはＮＢ１３の画像の下に示され、すべての画像に適用される。

【図15】ＰＣ３－ＰＩＰ細胞へのＮＢの内在化を示すグラフを含む。ＰＣ３－ＰＩＰ細胞を、ＮＢ７、ＮＢ８、ＮＢ１３、またはＮＢ３７のいずれかと、９６ウェルプレート中で１時間インキュベートした。次に、Ｏｐｅｒｅｔｔａを使用してウェルを画像化し、それらの膜上またはそれらの細胞質内にＮＢを有する細胞の数を４０分ごとにカウントし、それによって最初の画像化ラウンドをインキュベーションの１時間４０分後に完了した。内在化プロセスは、それらの膜内にＮＢを有する細胞の数に対するそれらの細胞質内にＮＢを有する細胞の数（「細胞質／膜比」）に反映されるため、比が高いほど、細胞質内に内在化されたＮＢが多いことを示す。

【図16A-16D】ＮＢ７ｃｙｓのＤＯＸへのコンジュゲーションを示すプロセスの図およびグラフを含む。（１６Ａ）コンジュゲーションプロセス。（１６Ｂ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５１０／３００を使用して分析した、ＮＢ７ｃｙｓＤＯＸについてのサイズ排除クロマトグラフィー。「１」および「２」は、それぞれ、２８０ｎｍおよび４８８ｎｍの吸光度を示す。（１６Ｃ）マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）を使用して分析した、ＮＢ７ｃｙｓ（１）およびＮＢ７ｃｙｓＤＯＸ（２）の質量分析。（１６Ｄ）示した濃度でのＰＣ３－ＰＩＰ細胞に対するＮＢ７ｃｙｓおよびＮＢ７ｃｙｓＤＯＸのフローサイトメトリー結合。実験は３連で実施し、結果は平均±ＳＥＭを示す。スチューデントのｔ検定により、調べた濃度のいずれにおいてもＮＢ７とＮＢ７ｃｙｓＤＯＸとの間に有意差がないことが示された。

【図17】ＤＯＸ－ＢＭＰＨリンカーの^１Ｈ核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルを示すグラフを含む。

【図18A-18C】細胞生存率に対するＮＢ７ｃｙｓＤＯＸの効果を示すグラフを含む。（１８Ａ）ＰＣ３－ＰＩＰ細胞の数を、ＮＢ７ｃｙｓ、ＤＯＸ、またはＮＢ７ｃｙｓＤＯＸのいずれかでの２４時間の処理後にカウントした。実験は３連で実施し、結果は平均±ＳＥＭとして示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（未処理の細胞と比較したスチューデントのｔ検定）。（１８Ｂ）ＮＢ７（１）、ＤＯＸ（２）、もしくはＮＢ７ｃｙｓＤＯＸ（３）のいずれかで処理したか、または未処理のまま（４、「１」のヒストグラムで部分的に隠れた）で、次いでＰＩとインキュベートしたＰＣ３－ＰＩＰ細胞のＦＡＣＳ分析。（１８Ｃ）ＰＣ３－ＰＩＰ細胞を、ＮＢ７、ＤＯＸ、ＮＢ７ｃｙｓＤＯＸ、もしくはＦＣＣＰで処理したか、または未処理のままで、次いで陰性対照として使用したＴＭＲＥ（「ＴＭＲＥなし」）とインキュベートし、ＴＭＲＥの蛍光シグナルを、プレートリーダーを使用することによって測定した。未処理の試料の蛍光を１として設定し、他のすべての試料を正規化して、それと比較した。実験は３連で実施し、結果は平均±ＳＥＭとして示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５（スチューデントのｔ検定）。

【図19A-19B】ＮＢ７ｃｙｓＤＯＸによるインビボ腫瘍増殖阻害を示すグラフを含む。無胸腺ヌードマウスのＰＣ３－ＰＩＰ異種移植片を、生理食塩水（対照）、ＤＯＸ（２ｍｇ／ｋｇ）、またはＮＢ７ｃｙｓＤＯＸ（１．４ｍｇ／ｋｇ）のいずれかで処置した。（１９Ａ）腫瘍体積を、処置期間中に１週間に２回測定した。一部のマウスを、倫理規定のために試験期間中に安楽死させ、それらの腫瘍サイズは、対数腫瘍増殖に基づく方程式を使用することによって推定した（材料および方法のセクションを参照のこと）。曲線の実線部分は、すべての動物が分析に含まれた時点を示し、一方、破線部分は、対数的に外挿されたデータを示す。（１９Ｂ）各時点で実験に含まれたマウスのパーセンテージ。「１」：対照（ｎ＝７のマウス）、「２」：ＤＯＸ（ｎ＝８のマウス）、「３」：ＮＢ７ｃｙｓＤＯＸ（ｎ＝８のマウス）。

【図20】ＮＢ７とＰＳＭＡとの間の予測される相互作用を示す表を含む（Ａ：ＰＳＭＡの単量体Ａ、Ｂ：ＰＳＭＡの単量体Ｂ）。ＣＤＲ１は、ＮＢのアスパラギン酸２９と、ＰＳＭＡのリジン２２３との間の、単量体Ｂとの静電相互作用を示す。ＣＤＲ２は、ＮＢのアスパラギン酸６２と、ＰＳＭＡのリジン７１８との間の、単量体Ａとの静電相互作用を示す。ＣＤＲ３は、単量体Ｂに対する２つの静電相互作用を示し、一方は、ＮＢのグルタミン酸１１３と、ＰＳＭＡのアルギニン２８１との間であり、他方は、ＮＢのリジン１０９と、ＰＳＭＡのグルタミン酸２８５との間である。

【図21】ＮＢ３７とＰＳＭＡとの間の予測される相互作用を示す表を含む。ＣＤＲは、グルタミン酸６２と、ＰＳＭＡの２つのアルギニン残基（アルギニン３６３およびアルギニン４１１）との間の静電相互作用を示す。別の静電相互作用は、アルギニン１９（非ＣＤＲ残基）と、ＰＭＳＡのアスパラギン酸６５４との間である。

【図22A-22F】ＮＢ７への非天然アミノ酸の組み込みを示す、顕微鏡写真、図、およびグラフを含む。（２２Ａ）ＮＢ７の異なる位置（Ａ１４、Ａ４０、Ｇ４２、Ｋ４３、およびＡ７５）に非天然アミノ酸ＢＯＣリジンが組み込まれていることを示すウエスタンブロット分析。（２２Ｂ）ＮＢ７－Ｃｙｓの異なる位置（Ｋ４３、およびＡ７５）に非天然アミノ酸ＢＯＣリジンが組み込まれていることを示すウエスタンブロット分析。（２２Ｃ）ＰＳＭＡと、ＮＢ７ｃｙｓ（＋ドキソルビシン）、ＮＢ７Ｋ４３ｐｒｏｐ（＋Ｃｙ５．５）、またはＮＢ７ｃｙｓＫ４３ｐｒｏｐ（＋ドキソルビシンおよびＣｙ５．５）との間の結合相互作用を示す非限定的なスキームの図。（２２Ｄ）はサイズ排除クロマトグラフィーを示すグラフである。ＮＢ７（１）、ＮＢ７ｃｙｓ（２）、およびＮＢ７Ｋ４３ｐｒｏｐ（３）についての２８０ｎｍの吸光度を示す。（２２Ｅ）ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦを使用して分析した、ＮＢ７（１）、ＮＢ７ｃｙｓ（２）、およびＮＢ７Ｋ４３ｐｒｏｐ（３）の質量分析。（２２Ｆ）ＦＡＣＳ分析を使用して決定した、ＰＣ３－ＰＩＰ細胞に対するＮＢ７およびＮＢ７Ｋ４３ＰｒＫの結合を示す縦棒グラフ。結果は、Ｋ４３ＰｒＫ変異後に結合の有意な変化がないことを示す。

【発明を実施するための形態】

【0040】

いくつかの実施形態において、本発明は、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に対する結合親和性が増加した抗原結合ポリペプチドを対象とする。いくつかの実施形態において、抗原結合ポリペプチドは、単一ドメイン抗体である。

【0041】

本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明が、以下の説明に記載されるかまたは実施例によって例示される詳細へのその適用に必ずしも限定されないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態が可能であり、または種々の方法で実施もしくは実行することができる。

【0042】

本明細書で使用される場合、「前立腺特異的膜抗原」またはＰＳＭＡという用語は、Ｎ－アセチル－Ｌ－アスパルチル－Ｌ－グルタミン酸ペプチダーゼＩ（ＮＡＡＬＡＤａｓｅＩまたはＮＡＡＧペプチダーゼ）としても知られているグルタミン酸カルボキシペプチダーゼＩＩを指す。非限定的な例として、ヒトＰＳＭＡには、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ０４６０９がある。

【0043】

「抗体」および「抗原結合ポリペプチド」（「免疫グロブリン」または「Ｉｇ」とも呼ばれる）という用語は、１つの抗原に特異的な少なくとも１つの結合ドメインを含むポリペプチドまたはポリペプチドの群を指す。特定の実施形態において、キメラ抗体またはヒト化抗体の使用もまた、本発明に含まれる。

【0044】

いくつかの実施形態において、「抗体断片」という用語は、インタクトな抗体の一部を指し、好ましくはその抗原結合領域を含む。

【0045】

「単一ドメイン抗体」という用語は、単一可変ドメイン（Ｖ_ＨＨ）からなる抗体断片を指す。単一ドメイン抗体は、特定の抗原に結合することもできる抗体のより小さな機能的断片である。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、従来の抗体よりも良好な組織透過性を有し、したがって、それらは、臨床的／診断的使用に有益である。

【0046】

いくつかの実施形態において、本発明の単一ドメイン抗体は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。

【0047】

いくつかの実施形態において、「相補性決定領域」という用語は、可変重鎖を指す。いくつかの実施形態において、可変重鎖は、特定のＰＳＭＡに結合することができるアミノ酸配列を含む。

【0048】

Ｋａｂａｔらは、任意の抗体に適用可能な可変ドメイン配列の番号付けシステムを定義した。当業者は、配列自体以外の任意の実験データに依存することなく、この「Ｋａｂａｔ番号付け」のシステムを任意の可変ドメイン配列に明確に割り当てることができる。本明細書で使用される場合、「Ｋａｂａｔ番号付け」は、Ｋａｂａｔｅｔａｌ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆＨｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ，“ＳｅｑｕｅｎｃｅｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）によって示された番号付けシステムを指す。

【0049】

いくつかの実施形態において、抗原結合ポリペプチドは、ＧＹＴＤＳＮＹＹＭＳ（ＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１）、ＧＶＮＴＧＲＧＳＴＳＹＡＤＳＶＫＧ（ＣＤＲ－Ｈ２、配列番号２）、およびＡＡＣＨＦＣＤＳＬＰＫＴＱＤＥＹＩＬ（ＣＤＲ－Ｈ３、配列番号３）を含む３つのＣＤＲを含む。

【0050】

いくつかの実施形態において、抗原結合ポリペプチドは、ＧＷＰＹＳＴＹＳＭＮ（ＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４）、ＧＩＳＳＴＭＳＧＩＩＦＡＥＳ（ＣＤＲ－Ｈ２、配列番号５）、およびＲＲＤＹＳＬＳＳＳＳＤＤＦＤＹ（ＣＤＲ－Ｈ３、配列番号６）を含む３つのＣＤＲを含む。

【0051】

いくつかの実施形態において、抗原結合ポリペプチドは、ＧＹＴＡＳＦＳ（ＣＤＲ－Ｈ１、配列番号７）、ＧＶＡＶＩＮＶＧＶＧＳＴＹＹＡＤＳＶ（ＣＤＲ－Ｈ２、配列番号８）およびＳＬＲＷＳＲＰＰＮＰＩＳＥＤＡＹＮＹ（ＣＤＲ－Ｈ３、配列番号９）を含む３つのＣＤＲを含む。

【0052】

いくつかの実施形態において、抗原結合ポリペプチドは、ＧＷＰＹＳＴＹＳＭＮ（ＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４）、ＧＩＳＳＴＭＳＧＩＩＦＡＥＳＫＡＧＱＦＴＩＳＱＤＮＡ（ＣＤＲ－Ｈ２、配列番号１０）、およびＲＲＤＹＳＬＳＳＳＳＤＤＦＤＹ（ＣＤＲ－Ｈ３、配列番号６）を含む３つのＣＤＲを含む。

【0053】

いくつかの実施形態において、抗原結合ポリペプチドは、アミノ酸配：ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＳＶＱＸ_１ＧＧＳＬＲＬＳＣＴＡＰＧＹＴＤＳＮＹＹＭＳＷＦＲＱＸ_２ＰＸ_３Ｘ_４ＥＲＥＷＶＡＧＶＮＴＧＲＧＳＴＳＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＱＤＮＸ_５ＫＮＴＭＦＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＩＹＹＣＡＶＡＡＣＨＦＣＤＳＬＰＫＴＱＤＥＹＩＬＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳ（配列番号１５）を含み、Ｘ_１は、アラニンまたは人工もしくは天然に存在しないアミノ酸から選択され、Ｘ_２は、アラニンまたは人工もしくは天然に存在しないアミノ酸から選択され、Ｘ_３は、グリシンまたは人工もしくは天然に存在しないアミノ酸から選択され、Ｘ_４は、リジンまたは人工もしくは天然に存在しないアミノ酸から選択され、Ｘ_５は、アラニンまたは人工もしくは天然に存在しないアミノ酸から選択される。いくつかの実施形態において、人工または天然に存在しないアミノ酸は、アミノ酸ＢＯＣ－リジンを含むか、またはそれからなる。

【0054】

【0055】

いくつかの実施形態において、抗原結合ポリペプチドは、アミノ酸配列：ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＳＶＱＸ_１ＧＧＳＬＲＬＳＣＡＲＳＧＷＰＹＳＴＹＳＭＮＷＦＲＱＸ_２ＰＸ_３Ｘ_４ＥＲＥＡＶＡＧＩＳＳＴＭＳＧＩＩＦＡＥＳＫＡＧＱＦＴＩＳＱＤＮＸ_５ＫＮＴＶＹＬＱＭＮＮＬＫＰＥＤＴＡＩＹＹＣＡＡＲＲＤＹＳＬＳＳＳＳＤＤＦＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳ（配列番号１６）を含み、Ｘ_１は、アラニンまたは人工もしくは天然に存在しないアミノ酸から選択され、Ｘ_２は、アラニンまたは人工もしくは天然に存在しないアミノ酸から選択され、Ｘ_３は、グリシンまたは人工もしくは天然に存在しないアミノ酸から選択され、Ｘ_４は、リジンまたは人工もしくは天然に存在しないアミノ酸から選択され、Ｘ_５は、アラニンまたは人工もしくは天然に存在しないアミノ酸から選択される。いくつかの実施形態において、人工または天然に存在しないアミノ酸は、アミノ酸ＢＯＣ－リジンを含むか、またはそれからなる。

【0056】

【0057】

いくつかの実施形態において、抗原結合ポリペプチドは、アミノ酸配列：ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＳＶＱＴＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＴＡＳＦＳＷＩＧＹＦＲＱＸ_１ＰＸ_２Ｘ_３ＥＲＥＧＶＡＶＩＮＶＧＶＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＴＥＮＴＩＳＬＥＭＮＳＬＫＰＥＤＴＧＬＹＹＣＡＧＳＬＲＷＳＲＰＰＮＰＩＳＥＤＡＹＮＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳ（配列番号１７）を含み、Ｘ_１は、アラニンまたは人工もしくは天然に存在しないアミノ酸から選択され、Ｘ_２は、グリシンまたは人工もしくは天然に存在しないアミノ酸から選択され、Ｘ_３は、リジンまたは人工もしくは天然に存在しないアミノ酸から選択される。いくつかの実施形態において、人工または天然に存在しないアミノ酸は、アミノ酸ＢＯＣ－リジンを含むか、またはそれからなる。

【0058】

【0059】

いくつかの実施形態において、抗原結合ポリペプチドは、アミノ酸配列：ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＳＶＥＸ_１ＧＧＳＬＲＬＳＣＡＲＳＧＷＰＹＳＴＹＳＭＮＷＦＲＱＸ_２ＰＸ_３Ｘ_４ＥＲＥＡＶＡＧＩＳＳＴＭＳＧＩＩＦＡＥＳＫＡＧＱＦＴＩＳＱＤＮＸ_５ＫＮＴＶＹＬＱＭＮＮＬＫＰＥＤＴＡＩＹＹＣＡＡＲＲＤＹＳＬＳＳＳＳＤＤＦＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳ（配列番号１８）を含み、Ｘ_１は、アラニンまたは人工もしくは天然に存在しないアミノ酸から選択され、Ｘ_２は、アラニンまたは人工もしくは天然に存在しないアミノ酸から選択され、Ｘ_３は、グリシンまたは人工もしくは天然に存在しないアミノ酸から選択され、Ｘ_４は、リジンまたは人工もしくは天然に存在しないアミノ酸から選択され、Ｘ_５は、アラニンまたは人工もしくは天然に存在しないアミノ酸から選択される。いくつかの実施形態において、人工または天然に存在しないアミノ酸は、アミノ酸ＢＯＣ－リジンを含むか、またはそれからなる。

【0060】

【0061】

いくつかの実施形態において、抗原結合ポリペプチドは、ＰＳＭＡに対して特異的結合親和性を有する。

【0062】

本明細書で使用される場合、「特異的結合」という用語は、２つの実体の第１および第２の部分の非共有物理的会合を指す。いくつかの実施形態において、第１の部分と第２の部分との間の会合は、結合が起こる環境に存在する他の部分の会合の少なくとも１０倍強く、少なくとも５０倍強く、または少なくとも１００倍強い。

【0063】

いくつかの実施形態において、平衡「解離定数」Ｋ_Ｄが、１０^－３Ｍ未満、１０^－４Ｍ未満、１０^－５Ｍ未満、１０^－６Ｍ未満、１０^－７Ｍ未満、１０^－８Ｍ未満、１０^－９Ｍ未満、１０^－１０Ｍ未満、１０^－１１Ｍ未満、もしくは１０^－１２Ｍ未満、またはそれらの間の任意の値および範囲である場合、２つ以上の実体の結合は、特異的であるとみなされ得る。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、平衡「解離定数」Ｋ_Ｄが、１０^－１０Ｍ～１０^－３Ｍ、１０^－１２Ｍ～１０^－４Ｍである場合、２つ以上の実体の結合は、特異的であるとみなされ得る。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、特異的結合は、複数のより弱い相互作用によって達成され得る。ペプチドの解離定数（Ｋ_Ｄ）の計算は、当業者に知られており、本明細書の以下の実施例のセクションにも示される。

【0064】

いくつかの実施形態において、「結合定数」、または「会合定数」という用語は、解離定数の逆数である、平衡定数Ｋ_ａの特殊な場合を指す。

【0065】

いくつかの実施形態において、抗原結合ポリペプチドは、ＰＳＭＡに対する少なくとも１０^３、少なくとも１０×１０^３、少なくとも１０^４、少なくとも２×１０^４、少なくとも１０^５、もしくは少なくとも５×１０^５モル^－１秒^－１（Ｍ^－１ｓ^－１）、またはそれらの間の任意の値および範囲の結合定数（Ｋ_ａ）を特徴とする。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。

【0066】

非限定的な例示的な実施形態において、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含む抗原結合ポリペプチドは、ＰＳＭＡに対する約７．１×１０^５Ｍ^－１ｓ^－１の結合定数（Ｋ_ａ）を特徴とする。

【0067】

非限定的な例示的な実施形態において、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含む抗原結合ポリペプチドは、ＰＳＭＡに対する約２×１０^４Ｍ^－１ｓ^－１の結合定数（Ｋ_ａ）を特徴とする。

【0068】

非限定的な例示的な実施形態において、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含む抗原結合ポリペプチドは、ＰＳＭＡに対する約３．６×１０^４Ｍ^－１ｓ^－１の結合定数（Ｋ_ａ）を特徴とする。

【0069】

非限定的な例示的な実施形態において、配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含む抗原結合ポリペプチドは、ＰＳＭＡに対する約２．２×１０^４Ｍ^－１ｓ^－１の結合定数（Ｋ_ａ）を特徴とする。

【0070】

いくつかの実施形態において、抗原結合ポリペプチドは、ＰＳＭＡに対する１０ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、５００ｐＭ未満、１５ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、もしくは５００ｎＭ未満、またはそれらの間の任意の値および範囲の解離定数（Ｋ_Ｄ）を特徴とする。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。

【0071】

非限定的な例示的な実施形態において、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含む抗原結合ポリペプチドは、ＰＳＭＡに対する約５５ｐＭの解離定数（Ｋ_Ｄ）を特徴とする。

【0072】

非限定的な例示的な実施形態において、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含む抗原結合ポリペプチドは、ＰＳＭＡに対する約６ｎＭの解離定数（Ｋ_Ｄ）を特徴とする（本明細書以下の実施例のセクションで計算される）。

【0073】

非限定的な例示的な実施形態において、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含む抗原結合ポリペプチドは、ＰＳＭＡに対する約０．６ｎＭの解離定数（Ｋ_Ｄ）を特徴とする。

【0074】

非限定的な例示的な実施形態において、配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含む抗原結合ポリペプチドは、ＰＳＭＡに対する約３．４ｎＭの解離定数（Ｋ_Ｄ）を特徴とする。

【0075】

いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ＰＳＭＡの非触媒部位に結合する。一実施形態において、ポリペプチドは、ＰＳＭＡの細胞外ドメインに結合する。

【0076】

本明細書で使用される場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために交換可能に使用される。別の実施形態において、本明細書で使用される場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、天然ペプチド、ペプチド模倣物（典型的には非ペプチド結合または他の合成修飾を含む）、ならびにペプチド類似体ペプトイドおよびセミペプトイドまたはそれらの任意の組み合わせを包含する。

【0077】

いくつかの実施形態において、ＰＳＭＡに結合するポリペプチドは、ＰＳＭＡとのさらなる相互作用を可能にすることを特徴とする。いくつかの実施形態において、ＰＳＭＡに結合するポリペプチドは、ＰＳＭＡ酵素活性を保持することを特徴とする。ＰＳＭＡ活性を決定する方法は、当該技術分野で知られており、非限定的な例として本明細書以下にも例示される。

【0078】

いくつかの実施形態において、抗原結合ポリペプチドは、１５ｋＤａ未満、２０ｋＤａ未満、２５ｋＤａ未満、３５ｋＤａ未満、もしくは５０ｋＤａ未満、またはそれらの間の任意の値および範囲の分子量を特徴とする。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。

【0079】

いくつかの実施形態において、抗原結合ポリペプチドは、少なくとも６０℃、少なくとも７０℃、少なくとも９０℃、もしくは少なくとも９５℃、またはそれらの間の任意の値および範囲の熱安定性（Ｔ_ｍ）を特徴とする。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。

【0080】

本明細書で使用される場合、「熱安定性」という用語は、高温でのその化学的または物理的構造の不可逆的変化に対する物質の耐性を指す。いくつかの実施形態において、Ｔ_ｍは、タンパク質またはペプチドの変性／アンフォールディングを引き起こした熱エネルギーを示す。

【0081】

いくつかの実施形態において、抗原結合ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端は、タグモチーフを含む。いくつかの実施形態において、タグモチーフは、少なくとも６つのアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、抗原結合ポリペプチドは、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグを含む。いくつかの実施形態において、抗原結合ポリペプチドは、ヒトインフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）タグを含む。

【0082】

別の実施形態によれば、本発明のポリペプチドは、それらがＰＳＭＡに結合することができる限り、配列番号１～１４のいずれか１つの短縮型および／または断片を包含する。

【0083】

当業者に知られているアミノ酸の保存的置換は、本発明の範囲内である。保存的アミノ酸置換には、あるアミノ酸を、同じ種類の官能基または側鎖を有する別のアミノ酸、例えば、脂肪族、芳香族、正電荷、負電荷アミノ酸で置き換えることが含まれる。当業者は、コードされた配列中の単一のアミノ酸またはわずかな割合のアミノ酸を改変、追加、または欠失するペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失、または追加が、改変によってアミノ酸が化学的に類似したアミノ酸に置換されている「保存的に修飾されたバリアント」であることを認識するであろう。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は、当該技術分野で周知である。

【0084】

以下の６つの群のそれぞれには、相互に対して保存的置換であるアミノ酸が含まれる：１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，１９８４を参照のこと）。

【0085】

「保存的置換」という用語はまた、このようなペプチドが本明細書で指定される免疫系の先天性応答を調節する必要な機能を示すという条件で、非誘導体化残基の代わりに化学的に誘導体化された残基の使用を含む。

【0086】

いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、天然に存在しないアミノ酸を含む。

【0087】

天然に存在しないアミノ酸をポリペプチドに組み込むための方法は一般的であり、当業者には明らかであろう。

【0088】

いくつかの実施形態において、天然に存在しないアミノ酸を含む、結果として生じるポリペプチドが、その活性、例えば、ＰＳＭＡに対する高親和性結合、または本明細書に開示されるような任意の他の活性を維持する限り、任意の天然に存在しないアミノ酸が本発明によって想定される。

【0089】

いくつかの実施形態において、天然に存在しないアミノ酸は、３－ヨード－Ｌ－チロシン、Ｎ^ε－ベンジルオキシカルボニルリジン（ＺＬｙｓ）、Ｎ^ε－アセチルリジン（ＡｃＬｙｓ）、Ｎ^ε－シクロペンチルオキシカルボニル－Ｌ－リジン（Ｃｙｃ）、Ｎ^ε－（（（１Ｒ，２Ｒ）－２－アジドシクロペンチルオキシ）カルボニル）－Ｌ－リジン（ＡＣＰＫ）、ｏ－ニトロベンジル－オチロシン、ｏ－ニトロベンジルオキシカルボニル－Ｎ^ε－Ｌリジン、Ｎ^ε－［（１－（６－ニトロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５イル）エトキシ）カルボニル］－Ｌ－リジン、Ｎ^ε－［（２－（３－メチル－３Ｈジアジリン－３－イル）エトキシ）カルボニル］－リジン、（３－（３－メチル－３Ｈジアジリン－３－イル）－プロパミノカルボニルＮ^ε－Ｌ－リジン（ＤｉＺＰＫ）、ＢＣＮ（エキソ異性体）、ＢＣＮ（エンド異性体）、ＴＣＯ、Ｎ^ε－（１－メチルシクロプロパ－２－エンカルボキサミド）リジン（ＣｐＫ）、Ｎ^ε－アクリロイル－Ｌ－リジン、ｐＮＯ_２ＺＬｙｓ、ＴｍｄＺＬｙｓ、Ｎ^ε－クロトニル－Ｌ－リジン（Ｋｃｒ）、２－クロロ－Ｌ－フェニルアラニン、２－ブロモ－Ｌ－フェニルアラニン、２－ヨード－Ｌ－フェニルアラニン、２－メチル－Ｌ－フェニルアラニン、２－メトキシ－Ｌ－フェニルアラニン、２－ニトロ－Ｌ－フェニルアラニン、２－シアノ－Ｌ－フェニルアラニン、およびＮ^ε－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｌ－リジン（ＢＯＣ－リジン）から選択される。

【0090】

いくつかの実施形態において、天然に存在しないアミノ酸は、ＢＯＣ－リジンを含むか、またはそれからなる。

【0091】

治療および診断のための方法
別の実施形態において、本発明は、ＰＳＭＡを含む試料を本発明の抗原結合ポリペプチドと接触させ、それによってＰＳＭＡを標的化することによってＰＳＭＡを標的化するための方法を提供する。

【0092】

一実施形態において、本発明は、ＰＳＭＡ関連障害に罹患している対象の治療に対する適合性を処理、診断、予知、または決定するための方法であって、この方法は、有効量の本発明の抗原結合ポリペプチドと、細胞傷害剤またはセラノスティック剤と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を対象に投与することを含み、それによって対象においてＰＳＭＡ関連障害に罹患している対象の治療に対する適合性を処理、診断、予知、または決定する、方法を提供する。

【0093】

一実施形態において、ＰＳＭＡ関連障害に罹患している、または罹患している疑いのある対象などの、対象においてＰＳＭＡを画像化するための方法であって、この方法は、有効量の本発明の抗原結合ポリペプチドと、造影剤とを含む組成物を対象に投与することと、対象においてＰＳＭＡを検出することとを含み、それによって対象においてＰＳＭＡを画像化する、方法が提供される。

【0094】

いくつかの実施形態において、造影剤は、蛍光標識（例えば、フルオレセインイソチオシアネート）、発色団、放射性標識、常磁性イオン（例えば、Ｇｄ^＋３）、およびそれらの任意の組み合わせから選択されるが、これらに限定されない。

【0095】

いくつかの実施形態において、「発色団」という用語は、ＵＶから近赤外領域までの特定の波長の光を吸収し、発光する場合も、しない場合もある材料を指す。

【0096】

一実施形態において、造影剤は、放射性標識（例えば、同位体）である。別の実施形態において、治療剤は、放射性標識（例えば、同位体）である。いくつかの実施形態において、同位体は、^１８Ｆ、^４７Ｓｃ、^５１Ｃｒ、^５２Ｆｅ、^５２ｍＭｎ、^５６Ｎｉ、^５７Ｎｉ、^６２Ｃｕ、^６４Ｃｕ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^７２Ａｓ、^７５Ｂｒ、^７６Ｂｒ、^７７Ｂｒ、^８２Ｂｒ、^８９Ｚｒ、^９４ｍＴｃ、^９７Ｒｕ、^９９ｍＴｃ、^１１１Ｉｎ、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１３１Ｉ、^１９１Ｐｔ、^１９７Ｈｇ、^２０１Ｔｌ、^２０３Ｐｂ、^１１０ｍＩｎ、^１２０Ｉ、^１１Ｃ、^１８Ｆ、および^１３Ｎから選択されるが、これらに限定されない。

【0097】

いくつかの実施形態において、画像化技術は、コンピューターＸ線断層撮影法（ＣＴ）、超音波（ＵＳ）、および磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、ポジトロン放射断層撮影法（ＰＥＴ）、単一光子放射コンピューター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、蛍光および放射アッセイ、細胞蛍光測定、および蛍光活性化セルソーティングから選択されるが、これらに限定されない。このような技術の原理は、免疫化学ハンドブック、例えば、ＡＪｏｈｎｓｔｏｎｅａｎｄＲ．Ｔｈｏｒｐｅ，Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｉｎｐｒａｃｔｉｃｅ，２^ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ（１９８７），ｂｌａｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＯｘｆｏｒｄＬｏｎｄｏｎＥｄｉｎｂｕｒｇｈＢｏｓｔｏｎＰａｌｏＡｌｔｏＭｅｌｂｏｕｒｎｅに見出され得る。

【0098】

非限定的な例示的な実施形態は、蛍光標識にコンジュゲートした抗原結合ポリペプチドの投与から２４時間後の近赤外線（ＮＩＲ）画像化によるインビボでの前立腺腫瘍の診断を実証する。

【0099】

一実施形態において、この方法は、抗原結合ポリペプチドの投与によってＰＳＭＡ亜集団の相対的パーセンテージを決定することをさらに含む。

【0100】

いくつかの実施形態において、本発明の抗原結合ポリペプチドは、外科手術、凍結外科手術、放射線、温熱療法、ホルモン治療、化学療法、免疫療法、ワクチン、およびそれらの任意の組み合わせを含む、他の治療的治療法と組み合わせて使用することができる。

【0101】

いくつかの実施形態において、治療剤は、疾患の症状および／または進行を予防、阻害、または阻止することができる任意の薬剤（例えば、分子、薬物、医薬組成物など）を含むことができる。

【0102】

いくつかの実施形態において、治療剤は、化学療法剤（例えば、メトトレキサート、シスプラチンおよびパクリタキセル）、抗発がん剤、抗血管新生剤、腫瘍抑制剤、抗菌剤、または治療用タンパク質をコードする核酸を含む発現構築物から選択されるが、これらに限定されない。

【0103】

いくつかの実施形態において、ＰＳＭＡ関連障害は、前立腺がんである。

【0104】

いくつかの実施形態において、ＰＳＭＡ関連障害は、神経学的障害である。いくつかの実施形態において、神経学的障害は、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、および統合失調症から選択されるが、これらに限定されない。

【0105】

医薬組成物
本発明はまた、ヒトの医療用途のための医薬組成物であって、本明細書に記載される少なくとも１つの抗原結合ポリペプチドを含む、組成物も企図する。

【0106】

本発明はまた、がんまたは神経学的障害の治療、診断、セラノスティック、または予防のための医薬組成物を製造するための、本明細書に記載される抗原結合ポリペプチドの使用も企図する。

【0107】

いくつかの実施形態において、医薬組成物は、任意選択により、さらなる治療成分、造影剤、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つと、１つ以上の薬学的に許容される担体とともに、治療的または診断的有効量の本明細書に記載される抗原結合ポリペプチドを含む。

【0108】

本発明の医薬組成物は、本発明のポリペプチドまたはそれらの類似体の薬学的に許容される塩の形態で製剤化することができる。薬学的に許容される塩には、塩酸、リン、酢酸、シュウ酸、酒石酸などの非毒性の無機または有機酸に由来する塩などの遊離アミノ基で形成される塩、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの非毒性の無機または有機塩基に由来する塩などの遊離カルボキシル基で形成される塩が含まれる。一実施形態において、本発明の医薬組成物は、当該技術分野で周知のプロセスによって、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠製造、摩砕、乳化、カプセル化、取込みまたは凍結乾燥プロセスによって製造される。

【0109】

「類似体」という用語は、１つ以上の残基が機能的に類似の残基で保存的に置換されており、本明細書に記載される能力を示す、本明細書に具体的に示される配列の１つと実質的に同一のアミノ酸配列を有する任意のペプチドを含む。保存的置換の例には、別の残基へのイソロイシン、バリン、ロイシン、もしくはメチオニンなどの１つの非極性（疎水性）残基の置換、アルギニンとリジンとの間、グルタミンとアスパラギンとの間、グリシンとセリンとの間などの別の残基への１つの極性（親水性）残基の置換、別の残基へのリジン、アルギニン、もしくはヒスチジンなどの１つの塩基性残基の置換、または別の残基へのアスパラギン酸もしくはグルタミン酸などの１つの酸性残基の置換が含まれる。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。

【0110】

「薬学的に許容される」という用語は、対象、例えば、ヒトへの投与に好適であることを意味する。例えば、「薬学的に許容される」という用語は、連邦もしくは州政府の規制機関によって承認されたか、または動物、より具体的にはヒトで使用するために米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に列挙されていることを意味することができる。「担体」という用語は、治療化合物が一緒に投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。そのような医薬的担体は、無菌液体、例えば、水、および、石油、動物、植物もしくは合成起源の油（例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などを含む）、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などでよい。医薬組成物を静脈内投与する場合、水が好ましい担体である。生理食塩水およびデキストロースおよびグリセロール水溶液も、特に注射可能な溶液の場合、液体担体として用いることができる。好適な賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが含まれる。組成物は、必要に応じて、少量の湿潤剤または乳化剤、あるいは酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などのｐＨ緩衝剤を含むこともできる。ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張性を調整するための薬剤も想定される。担体は、合計で、本明細書に提示される医薬組成物の約０．１重量％～約９９．９９９９９重量％を構成し得る。

【0111】

組成物は、溶液、懸濁液、エマルション、錠剤、丸薬、カプセル、粉末、ゲル、クリーム、軟膏、フォーム、ペースト、徐放性製剤などの形態をとることができる。組成物は、トリグリセリド、微結晶性セルロース、トラガカントガム、またはゼラチンなどの従来の結合剤および担体とともに、坐剤として製剤化することができる。経口製剤には、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体が含まれ得る。好適な医薬担体の例は、Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ”に記載されており、それらの内容は、参照により本明細書に組み込まれる。そのような組成物は、対象への適切な投与のための形態を提供するように、好適な量の担体と一緒に、好ましくは実質的に精製された形態で、治療有効量の活性剤および本発明の抗原結合ポリペプチドを含む。

【0112】

本発明の実施形態は、単位剤形で提示され、薬学の分野において周知の方法のいずれかによって調製される、抗原結合ポリペプチドに関する。本発明の実施形態において、単位剤形は、錠剤、カプセル、トローチ、ウエハ、パッチ、アンプル、バイアル、または事前に充填された注射器の形態である。さらに、最適な投与量範囲を特定するのを助けるために、インビトロアッセイを任意選択的に用いることができる。製剤に用いられる正確な用量は、投与経路、および疾患または障害の性質にも依存し、開業医の判断および各患者の状況に応じて判定されるべきである。実効線量は、インビトロまたはインビボの動物モデル試験バイオアッセイまたはシステムから得られた用量反応曲線から推定することができる。

【0113】

目的の組織の位置に応じて、本発明の抗原結合ポリペプチドは、目的の組織内の細胞へ抗原結合ポリペプチドの提供に好適な任意の方法で供給することができる。したがって、例えば、抗原結合ポリペプチドを含む組成物は、例えば、全身循環に導入することができ、これにより、抗原結合ポリペプチドが目的の組織に分配されるであろう。あるいは、組成物は、目的の組織に局所的に適用することができる（例えば、持続注入として注射、もしくはポンプ注入される、または組織内のボーラスとして、皮膚の表面の全部または一部に適用されるなど）。

【0114】

本発明の実施形態において、抗原結合ポリペプチドは、経口、直腸、膣、局所、経鼻、眼、経皮、皮下、筋肉内、腹腔内または静脈内の投与経路を介して投与される。医薬組成物の投与経路は、治療される疾患または状態に依存するであろう。好適な投与経路には、非経口注射、例えば、皮内、静脈内、筋肉内、病変内、皮下、髄腔内、および当該技術分野で知られている他の任意の注射様式が含まれるが、これらに限定されない。他の経路で投与される抗原結合ポリペプチドの生物学的利用能は、非経口注射により投与する場合よりも低くなる可能性があるが、適切な製剤を使用することにより、経皮、経口、直腸、膣、局所、経鼻、吸入および眼の治療様式で本発明の組成物を投与することが可能であると考えられる。さらに、本発明の医薬組成物は、脳室内および髄腔内注入を含む、任意の好適な経路によって導入することが望ましいものであり得、脳室内注入は、例えば、リザーバーに取り付けられた脳室内カテーテルによって容易化され得る。

【0115】

局所適用の場合、本発明の抗原結合ポリペプチド、またはその類似体は、薬学的に許容される担体、造影剤、および１つ以上の治療剤と組み合わせることができ、その結果、所望の活性に基づいて有効な投与量が送達される。担体は、例えば、限定するものではなく、軟膏、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム、エアロゾル、坐剤、パッドまたはゲル化スティックの形態でよい。

【0116】

経口適用のため、医薬組成物は錠剤またはカプセルの形態にあり得、以下の原料、または同様な性質の化合物のいずれかを含むことができ、微結晶性セルロース、トラガカントガム、もしくはゼラチンなどの結合剤、デンプンもしくはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、プリモゲル、もしくはコーンスターチなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムなどの滑剤、またはコロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤が挙げられる。投与単位形態がカプセルである場合、それは、上記の種類の材料に加えて、脂肪油などの液体担体を含むことができる。さらに、投与単位形態は、投薬単位の物理的形態を修正する様々な他の材料、例えば、砂糖、シェラック、または他の腸溶性剤のコーティングを含むことができる。本発明の錠剤は、さらにフィルムコーティングすることができる。

【0117】

非経口投与の目的のために、ゴマ油もしくはピーナッツ油または水性プロピレングリコールにおける溶液、ならびに対応する水溶性塩の滅菌水溶液を使用することができる。そのような水溶液は、必要に応じて適切に緩衝化され得、液体希釈剤は、最初に十分な生理食塩水またはグルコースを用いて等張にされる。これらの水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、および腹腔内注入目的に特に適している。

【0118】

本発明の組成物は、概して、本発明の抗原結合ポリペプチドを、薬学的に許容される担体または希釈剤と一緒に含む医薬組成物の形態で投与される。したがって、本発明の組成物は、任意の従来の経口、非経口、または経皮剤形で、個別または一緒に投与することができる。

【0119】

本発明の実施形態による医薬組成物は、０．１％～９５％の本発明の抗原結合ポリペプチドと、好ましくは１％～７０％の活性／造影剤とを含むことができる。任意の事象において、投与される組成物または製剤は、投与される対象の状態または疾患を治療または診断するのに有効な量の本発明の実施形態による量の抗原結合ポリペプチドならびに活性および／または造影剤を含むことができる。

【0120】

組成物はまた、塩化ベンザルコニウムおよびチメロサールなどの防腐剤；ＥＤＴＡナトリウムおよびその他などのキレート剤；リン酸塩、クエン酸塩および酢酸塩などの緩衝液；塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトールおよびその他などの等張化剤；アスコルビン酸、アセチルシステイン、メタ重亜硫酸ナトリウムおよびその他などの抗酸化剤；芳香剤；セルロースおよびその誘導体を含む、ポリマーなどの粘度調整剤；ならびにポリビニルアルコールおよび必要に応じてこれらの水性組成物のｐＨを調整するための酸および塩基を含む。組成物はまた、局所麻酔薬または他の活性物質を含むことができる。

【0121】

さらに、組成物は、結合剤（例えば、アカシア、コーンスターチ、ゼラチン、カルボマー、エチルセルロース、グアーガム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポビドン）、崩壊剤（例えば、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸、二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、グアーガム、デンプングリコール酸ナトリウム）、様々なｐＨおよびイオン強度の緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ－ＨＣＩ、酢酸塩、リン酸塩）、表面への吸収を防ぐためのアルブミンまたはゼラチンなどの添加剤、洗浄剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８、胆汁酸塩）、プロテアーゼ阻害剤、界面活性剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）、浸透促進剤、可溶化剤（例えば、グリセロール、ポリエチレングリセロール）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、ブチル化ヒドロキシアニソール）、安定剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、増粘剤（例えば、カルボマー、コロイド状二酸化ケイ素、エチルセルロース、グアーガム）、甘味料（例えば、アスパルテーム、クエン酸）、防腐剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム）、流動助剤（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）、可塑剤（例えば、フタル酸ジエチル、クエン酸トリエチル）、乳化剤（例えば、カルボマー、ヒドロキシプロピルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム）、ポリマーコーティング（例えば、ポロキサマーまたはポロキサミン）、コーティングおよび膜形成剤（例えば、エチルセルロース、アクリル酸塩、ポリメタクリル酸塩）ならびに／またはアジュバントをさらに含むことができる。

【0122】

本発明の抗原結合ポリペプチドまたはその類似体は、制御放出システムで送達することができる。したがって、注入ポンプを使用して、例えば、特定の臓器または腫瘍にインスリンまたは化学療法を送達するために使用されるものなどの抗原結合ポリペプチドを投与することができる。一実施形態において、本発明の抗原結合ポリペプチドは、選択された部位で制御された期間にわたって抗原結合ポリペプチドを放出する、生分解性、生体適合性ポリマーインプラントと組み合わせて投与される。好ましいポリマー材料の例には、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリエチレン酢酸ビニル、コポリマーおよびそれらのブレンドが含まれるが、これらに限定されない（Ｍｅｄｉｃａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｒｅｌｅａｓｅ，ＬａｎｇｅｒａｎｄＷｉｓｅ（ｅｄｓ．），１９７４，ＣＲＣＰｒｅｓ．，ＢｏｃａＲａｔｏｎ，Ｆｌａを参照のこと。その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。さらに別の実施形態において、制御放出システムは、治療標的の近くに配置することができ、したがって、全身用量のほんの一部しか必要としない。

【0123】

一実施形態において、本発明の組成物は、ＦＤＡ承認キットなどの、パックまたはディスペンサーデバイスで提供され、それは、活性成分を含む１つ以上の単位剤形を含む。一実施形態において、パックまたはディスペンサーデバイスは、投与のための説明書を伴う。

【0124】

一実施形態において、本発明の抗原結合ポリペプチドは、標的化剤を用いない治療と比較して改善された治療効果を達成するために、活性剤とともに個体に提供され得ることが理解されるであろう。別の実施形態において、測定（例えば、補足薬剤の投薬および選択）は、併用療法に関連する有害な副作用に対して行われる。

【0125】

活性剤および抗原結合ポリペプチドの「治療有効量」は、組成物が投与される対象に有益な効果を提供するのに十分な量である。より具体的には、治療有効量とは、治療される対象の疾患の組織損傷または症状を予防、軽減または改善するのに有効な活性剤および抗原結合ポリペプチドの量を意味する。

【0126】

いくつかの実施形態において、有効量または用量の調製は、最初にインビトロアッセイから推定することができる。一実施形態において、用量は動物モデルで定式化することができ、そのような情報を使用して、ヒトでの有用な用量をより正確に判定することができる。

【0127】

一実施形態において、本明細書に記載される活性／標的化剤の毒性および治療効果は、インビトロでの細胞培養または実験動物において、標準的な薬学的手順によって決定することができる。一実施形態において、これらのインビトロおよび細胞培養アッセイならびに動物試験から得られたデータは、ヒトで使用するための範囲の投薬量を製剤化する際に使用することができる。一実施形態において、投薬量は、用いられる剤形および利用される投与経路に応じて変化する。一実施形態において、正確な処方、投与経路、および投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師が選択することができる。［例えば、Ｆｉｎｇｌ，ｅｔａｌ．，（１９７５）“ＴｈｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢａｓｉｓｏｆＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”，Ｃｈ．１ｐ．１を参照のこと］。

【0128】

一実施形態において、治療される状態の重症度および応答性に応じて、投薬は、単回または複数回の投与であってもよく、治療の過程は、数日から数週間、または治癒が効果を奏するか、もしくは疾患状態の減少が達成されるまで続く。一実施形態において、投与される組成物の量は、もちろん、治療される対象、苦痛の重症度、投与方法、処方する医師の判断などに依存するであろう。一実施形態において、適合性のある医薬担体中に製剤化された本発明の調製物を含む組成物も調製され、適切な容器に入れられ、示された状態の治療のために標識される。

【0129】

一般的用語
本明細書で使用する場合、「約」という用語は、±１０％を指す。

【0130】

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語およびこれらの同根語は、「含むが、限定されない」ことを意味する。「からなる」という用語は、「含みかつこれ（ら）に限定されること」を意味する。「から本質的になる」という用語は、組成、方法、または構造が追加の成分、ステップ、および／またはパーツを含むことができるが、追加の成分、ステップ、および／またはパーツが請求した組成、方法または構造の基本的かつ新規の特徴を実質的に変えない場合にのみであることを意味する。

【0131】

「例示的」という用語は、本明細書では、「例、事例、または例示として役立つ」ことを意味するために使用される。「例示的」として説明されるいかなる実施形態も、他の実施形態よりも好ましいかもしくは有利であると必ずしも解釈されるべきではなく、および／または他の実施形態からの特色の組み込みを必ずしも除外するものではない。

【0132】

「任意選択的に」という単語は、本明細書では、「いくつかの実施形態では提供され、かつ他の実施形態では提供されない」ことを意味するために使用される。本発明のいかなる特定の実施形態も、このような特色が矛盾しない限り、複数の「任意選択の」特色を含み得る。

【0133】

本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に他のことを指示しない限り、複数の指示対象を含む。例えば、「１つの化合物」または「少なくとも１つの化合物」という用語は、これらの混合物を含む、複数の化合物を含み得る。

【0134】

本出願全体を通して、本発明の様々な実施形態は、範囲形式で提示されている場合がある。範囲形式での説明は、単に便宜性および簡潔性のためであり、本発明の範囲への確固たる限定として解釈するべきではないことを理解すべきである。したがって、範囲の説明は、すべての可能な部分範囲ならびにその範囲内の個々の数値を具体的に開示しているとみなされるべきである。例えば、１～６などの範囲の説明は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの部分範囲、ならびに、その範囲内の個々の数、例えば、１、２、３、４、５、および６を具体的に開示しているとみなされるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。

【0135】

本明細書で数値範囲が示される場合は常に、指示範囲内の任意の引用数字（分数または整数）を含むことを意味している。第１の指示数～第２の指示数「の範囲にある／との間の範囲」および第１の指示数「～」第２の指示数の「範囲にある／範囲」という表現は、本明細書では互換的に使用され、第１および第２の指示数ならびにそれらの間のすべての分数と整数の数字を含むことを意味する。

【0136】

本明細書で使用する場合、「方法」という用語は、化学分野、薬理学分野、生物学分野、生化学分野および医学分野の実務者に既知であるかまたは実務者によって既知の様式、手段、技術および手順から容易に開発されるかのいずれかである様式、手段、技術および手順を含むがこれらに限定されない、所与の課題を達成するための様式、手段、技術および手順を指す。

【0137】

本明細書で使用される場合、「治療する」という用語は、状態の進行を抑制する、実質的に阻害する、遅くする、もしくは後退させる、状態の臨床的もしくは審美的症状を実質的に寛解させる、または状態の臨床的もしくは審美的症状の出現を実質的に防止することを含む。

【0138】

「Ａ、Ｂ、およびＣ等のうちの少なくとも１つ」に類似する慣例が使用される場合、概して、そのような構成は、当業者がその慣例を理解する意味で意図されている（例えば、「Ａ、Ｂ、およびＣのうちの少なくとも１つを有するシステム」は、Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、ＡおよびＢともに、ＡおよびＣともに、ＢおよびＣともに、ならびに／またはＡ、Ｂ、およびＣともになどを有するシステムを含むが、これらに限定されない）。説明、特許請求の範囲、または図面に関わらず、２つ以上の代替用語を提示する実質的に任意の離接語および／または語句が、用語のうちの１つ、用語のいずれか、または両方の用語を含む可能性を企図すると理解されるべきであることが、当業者によってさらに理解されるであろう。例えば、「ＡまたはＢ」という語句は、「Ａ」または「Ｂ」または「ＡおよびＢ」の可能性を含むことが理解されるであろう。

【0139】

明確にするために、別個の実施形態の文脈において説明される本発明の特定の特徴がまた、単一の実施形態で組み合わせて提供され得ることが理解される。逆に、簡潔にするために単一の実施形態の文脈で説明されている本発明の種々の特色はまた、別々に、または何らかの好適な部分組み合わせで、または本発明の何らかの他の説明された実施形態において好適なものとして提供され得る。様々な実施形態の文脈で説明されている特定の特徴は、実施形態がそれらの要素なしでは機能しない場合を除いて、それらの実施形態の本質的な特徴とみなされるべきではない。

【0140】

上記に記述され、かつ以下の特許請求の範囲のセクションで特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様は、以下の実施例において実験的証拠を見出す。

【実施例】

【0141】

一般に、本明細書で使用される命名法、および本発明で利用される実験手順には、分子、生化学、微生物、および組換えＤＮＡの技術が含まれる。そのような技術は、文献中で十分に説明されている。例えば、”ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡｌａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，（１９８９）、”ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ”ＶｏｌｕｍｅｓＩ－ＩＩＩＡｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）、Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，”ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ”，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）、Ｐｅｒｂａｌ，”ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅｔｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ”，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８８）、Ｗａｔｓｏｎｅｔａｌ．，”ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＤＮＡ”，ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＡｍｅｒｉｃａｎＢｏｏｋｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎｅｔａｌ．（ｅｄｓ）”ＧｅｎｏｍｅＡｎａｌｙｓｉｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌＳｅｒｉｅｓ”，Ｖｏｌｓ．１－４，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９８）、米国特許第４，６６６，８２８号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８０１，５３１号、同第５，１９２，６５９号、および同第５，２７２，０５７号に記載された方法論、”ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＨａｎｄｂｏｏｋ”，ＶｏｌｕｍｅｓＩ－ＩＩＩＣｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）、”ＣｕｌｔｕｒｅｏｆＡｎｉｍａｌＣｅｌｌｓ－ＡＭａｎｕａｌｏｆＢａｓｉｃＴｅｃｈｎｉｑｕｅ”ｂｙＦｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９４）、ＴｈｉｒｄＥｄｉｔｉｏｎ、”ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”ＶｏｌｕｍｅｓＩ－ＩＩＩＣｏｌｉｇａｎＪ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）、Ｓｔｉｔｅｓｅｔａｌ．（ｅｄｓ），“ＢａｓｉｃａｎｄＣｌｉｎｉｃａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（８ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）、ＭｉｓｈｅｌｌａｎｄＳｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ），“ＳｔｒａｔｅｇｉｅｓｆｏｒＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ－ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＣｏｕｒｓｅＭａｎｕａｌ”ＣＳＨＬＰｒｅｓｓ（１９９６）を参照のこと。

【0142】

さて、次の実施例を参照することにし、該実施例は、先の説明と一緒に、本発明を非限定的な形で例示している。

【0143】

材料および方法
動物の手順
すべての動物実験は、イスラエルの動物実験倫理委員会によって承認された（ラクダおよびマウスの手順については、それぞれ承認番号１１－２２０－６および４８－０７－２０１２）。この研究で使用した動物の数および苦痛を最小限に抑えるために、十分な努力を払った。

【0144】

抗ＰＳＭＡＮＢの生成および精製
ＮＢ生成のプロトコルは、Ｐａｒｄｏｎｅｔａｌ．およびＶｉｎｃｋｅｅｔａｌから適合した。簡単に説明すると、ラクダ（Ｃａｍｅｌｕｓｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）を、ＰＳＭＡ［残基４４～７５０；ＣａｌｔｅｃｈＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＣｅｎｔｅｒ、ＣＡから購入した］の精製した細胞外ドメイン１ｍｇを用いて連続注射の間隔を２週間にして７回免疫化した。次に、ラクダのリンパ球からのＲＮＡを単離し、ＤＮＡに変換し、可変重鎖ホモ二量体（ＶＨＨ）をコードするＤＮＡを増幅し、ｐＭＥＣＳベクターにライゲーションした。このＤＮＡライブラリーを、ＴＧ１Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉコンピテントセルに形質転換し、得られたライブラリー（１０^７クローン）を、Ｍ１３ヘルパーファージの感染によるファージディスプレイを使用した選択に供した。ＰＳＭＡに対する２ラウンドのパニングの後、４７個の細菌コロニーを、ＥＬＩＳＡを使用してＰＳＭＡ結合について個別に評価し、次に配列決定した（ＮＩＢＮｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂｅｎ－ＧｕｒｉｏｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆｔｈｅＮｅｇｅｖ、Ｉｓｒａｅｌ）。４つの選択したＮＢ（ＮＢ７、ＮＢ８、ＮＢ１３、およびＮＢ３７）、およびＣ末端にシステインが付加されたＮＢ７（ＮＢ７ｃｙｓ）をコードするＤＮＡを、ＷＫ６Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換した。細菌を、ＯＤ_６００＝０．５に達するまで、３７℃および２５０ｒｐｍでＴＢ培地（１７ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４、９４ｍＭのＫ_２ＨＰＯ_４、１２ｇ／ｌのペプトン、２４ｇ／ｌの酵母エキス、０．４％のグリセロール）で増殖させた。次に、１ｍＭのＩＰＴＧを培地に添加し、温度を２８℃に一晩調整した後、１２ｍｌのＴＥＳ緩衝液（５００ｍＭのスクロース、２００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８）を使用して３時間、次に２４ｍｌのＴＥＳ緩衝液（希釈１：４）を使用して一晩、ペリプラズム抽出を行った。ＮＢを、Ｎｉ－ＮＴＡ重力ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）でのアフィニティークロマトグラフィーを使用してさらに精製した。溶出画分を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５１６／６００カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＭＡ）を使用してＦＰＬＣ精製に供した。タンパク質のサイズおよび純度を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動および質量分析を使用することによって評価し、予想されるサイズが約１６ｋＤａおよび純度が９５％を超えることを確認した。

【0145】

表面プラズモン共鳴結合アッセイ
ＰＳＭＡに対する各ＮＢの親和性をＰｒｏｔｅＯｎＸＰＲ３６チップ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、ＣＡ）で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分光法を使用することによって決定した。チップは、スルホ－ＮＨＳ（０．１ＭのＮ－ヒドロキシスクシンイミド）およびＥＤＣ［０．４Ｍの１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド］を使用することによって活性化した。各ＮＢ（０．２μｇ）を１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．０に、３０μｌ／分の流速で固定化した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（３μｇ）を陰性対照としてチップに固定化した。未結合のエステルを、ｐＨ８．５で１ＭのエタノールアミンＨＣｌにより不活性化させた。次に、可溶性ＰＳＭＡを、２５μｌ／分の流速で、２．９４、５．８８、１１．７５、２３．５０、または４７．００ｎＭ（ＮＢ８、１３、および３７の場合）、または２５、５０、１００、１，６００、もしくは３，２００ｐＭ（ＮＢ７の場合）の濃度でチップ上に適用した。この時間の間に、ＮＢとＰＳＭＡとの間の会合を測定した。５０μｌ／分のＰＢＳＴ（すなわち、０．００５％のＴｗｅｅｎを含むリン酸緩衝生理食塩水）を流しながら、解離を測定した。各タンパク質複合体について、ＮＢに対するＰＳＭＡ応答の値からＢＳＡに対するＰＳＭＡ応答の値を差し引くことにより、結合センソグラムを生成した。解離定数（Ｋ_Ｄ）を、Ｌａｎｇｍｕｉｒ１：１動力学モデルから決定した。結合測定の間の温度は２５℃に設定した。

【0146】

ＰＳＭＡ活性アッセイ
ＰＳＭＡの酵素的Ｎ－アセチル化－アルファ－結合－酸性ジペプチダーゼ（ＮＡＡＬＡＤａｓｅ）活性を、組換えＰＳＭＡについてＲ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓによって提案されたアッセイプロトコルを使用することによって決定した。簡単に説明すると、ＰＳＭＡを０．４μｇ／ｍｌに希釈し、Ａｃ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ基質（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）を、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５で４０μＭに希釈した。作業溶液は、１２５μｌのＰＳＭＡおよび基質溶液を組み合わせることによって生成した。陰性対照に関して、熱変性によってＰＳＭＡを不活性化させた。阻害のための対照として、０．５ｎＭの市販のＰＳＭＡ阻害剤（ＰＭＰＡ、Ｔｏｃｒｉｓ、Ｉｓｒａｅｌ）を、ＰＳＭＡおよび基質を含む溶液に添加した。ＮＢ７、ＮＢ８、ＮＢ１３、およびＮＢ３７（それぞれ１００ｎＭ）をこの溶液に添加し、３７℃で１時間、次に９５℃で５分間インキュベートした。次に、０．２ＭのＮａＯＨおよび０．１％のベータ－メルカプトエタノール中の１５ｍＭのフタルジアルデヒド（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）２５０μｌを、各試料に添加した。試料を室温で１０分間インキュベートし、それらの蛍光を測定した（励起：３３０ｎｍ、発光：４５０ｎｍ）。未処理のＰＳＭＡ試料の蛍光値を１として設定し、他のすべての試料を、それに応じて正規化した。

【0147】

細胞結合アッセイ
ＰＣ３－ＰＩＰ（ＰＳＭＡ陽性、ＰＳＭＡ^＋）細胞およびＰＣ３－ｆｌｕ（ＰＳＭＡ陰性、ＰＳＭＡ^－）細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、Ｌ－グルタミン、ペニシリン、およびストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ１６４０培地（ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｉｓｒａｅｌ）中で増殖させた。細胞が７０％のコンフルエンスに達したら、１０^５個の細胞を、９６ウェルＵ字型底プレート（ＧｒｅｉｎｅｒＢｉｏ－Ｏｎｅ、Ａｕｓｔｒｉａ）の各ウェルに添加し、１５０ｇで５分間遠心分離し、ＰＢＳＡ（すなわち、ＰＢＳ＋１ｇ／ｌのＢＳＡ）で洗浄した。ＮＢを、０．１、０．５、２、５、１０、２０、５０、１００、５００、または１０００ｎＭの濃度で細胞に添加した。細胞をＮＢと２時間インキュベートした後、３回のＰＢＳＡ洗浄ステップを行った。次に、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にコンジュゲートした抗Ｈｉｓ抗体を１：１００の希釈で添加し、細胞と１時間インキュベートし、ＰＢＳＡで３回洗浄した。実験の間、細胞を氷上に保った。各試料の蛍光を、ＡｃｃｕｒｉＣ６フローサイトメトリーアナライザー（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ）を使用して測定した。各実験条件を３回繰り返した。滴定曲線を作成するために、各試料の値を、次の式を使用して決定した。

【数1】

式中、Ｆ_試料は、平均蛍光値であり、Ｆ_低は、ＰＣ３－ＰＩＰ細胞の最低濃度での蛍光であり、Ｆ_高は、ＰＣ３－ＰＩＰ細胞の最高濃度での蛍光である。結合曲線は、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５．０を使用して作成した。

【0148】

タンパク質の結晶化、データ収集、構造決定、および改良
ＮＢ７、ＮＢ８、およびＮＢ３７（５ｍｇ／ｍｌ）を、１：１（ｖ／ｖ）の比でリザーバー溶液と混合し、１．７Ｍの硫酸アンモニウムおよび６．５７％の２－プロパノール（ＮＢ７の場合）；０．１Ｍのクエン酸三ナトリウム、ｐＨ３．５、および３ＭのＮａＣｌ（ＮＢ８の場合）；または０．１Ｍのクエン酸三ナトリウム、ｐＨ３．５、および２５％のポリエチレングリコール３３５０（ＮＢ３７の場合）のいずれかを含むリザーバーに対してシッティングドロップ蒸気拡散法によって室温で結晶化した。次に、結晶を回収し、凍結保護し、液体窒素で急速冷却した。Ｘ線回折（ＸＲＤ）データを、ＥｕｒｏｐｅａｎＳｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎＲａｄｉａｔｉｏｎＦａｃｉｌｉｔｙ（ＥＳＲＦ、Ｇｒｅｎｏｂｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）のビームラインＩＤ３０Ｂで収集した。データを、ＮＢ８およびＮＢ３７では１．５Å、ＮＢ７では２．６５Åの最大分解能まで回折した各ＮＢの１つの結晶から１００Ｋで収集した。ＮＢ７結晶は、ａ５３．５６３、ｂ１７１．７１６、およびｃ８３．４７９の単位セル寸法を有する、空間群Ｐ２１に属しており、それは、非対称単位にタンパク質の８つのコピーを含む。ＮＢ８結晶は、ａ５５．９４５、ｂ６８．８５７、およびｃ７５．６４７の単位セル寸法を有する、空間群Ｉ２２２に属しており、それは、非対称単位にタンパク質の１つのコピーを含む。ＮＢ３７結晶は、ａ５５．９４９、ｂ６９．０８７、およびｃ７５．８６９の単位セル寸法を有する、空間群Ｉ２２２に属しており、それは、非対称単位にタンパク質の１つのコピーを含む。Ｘ線データを、ＸＤＳを使用してマージし、スケーリングし、ＣＣＰ４でＰｈａｓｅｒを使用した分子置換によって解明した。検索モデルとして、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）ＩＤ：５Ｍ７Ｑを使用した。改良には、ＣＯＯＴでの手動再構築およびＰｈｅｎｉｘを使用した自動改良の交互のサイクルが含まれた。座標および構造因子は、アクセッションコード６ＸＸＮ（ＮＢ７）、６ＸＸＯ（ＮＢ８）、および６ＸＸＰ（ＮＢ３７）としてＰＤＢに提出した。

【0149】

小角Ｘ線散乱、分析、および３次元構造の再構築
単量体ＰＳＭＡの小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）を、ＰＢＳ中で最終濃度０．５～３ｍｇ／ｍｌにて測定した。ＰＳＭＡ－ＮＢ複合体試料について、ＰＳＭＡの濃度は０．５ｍｇ／ｍｌであり、ＮＢの濃度は０．１～０．５ｍｇ／ｍｌであった。ＥＳＲＦでビームラインＢＭ２９において測定を実施した。Ｘ線の波長は１．５Åであり、温度は４℃であった。検出器はＰｉｌａｔｕｓ１Ｍであり、試料から検出器までの距離は２．８６ｍに設定し、散乱ベクトル（ｑ）の範囲は、０．００２５～０．５Å^－１であった。２θの散乱角で、散乱ベクトル（ｑ）の大きさは以下のように定義される。

【数2】

【0150】

すべての試料についての実験的なＳＡＸＳデータは、低いｑのギニエ領域において線形であった。回転半径（Ｒ_ｇ）は、ギニエ近似を使用して、ｑＲ_ｇ＜１の領域のデータから導出した。

【数3】

【0151】

本発明者らは、ＧＮＯＭ法に埋め込まれたギニエ近似を使用して、散乱プロファイルの小角領域（０．０１２＜ｑ＜０．０８Å^－１）を分析した。

【0152】

散乱曲線は、逆格子空間の構造特性を反映する。散乱プロファイルを、フーリエ変換によって実空間に変換し、ペアワイズ距離分布関数Ｐ（ｒ）を得た。この関数は、巨大分子内の散乱点のペア間の距離を反映し、粒子の最大寸法（Ｄ_ｍａｘ）の決定を可能にする。Ｄ_ｍａｘの信頼できる定量化を得るために、本発明者らは、ＧＮＯＭを社内スクリプトに組み込んだ。ＳＡＸＳデータから抽出した単量体ＰＳＭＡのＲ_ｇを、ＣＲＹＳＯＬを使用して単量体ＰＳＭＡ（ＰＤＢ３Ｄ７Ｄ）の結晶構造から計算したＲ_ｇと比較した。ＰＳＭＡおよびＰＳＭＡ－ＮＢ複合体の全体的な３次元アブイニシオモデルを、Ｄａｍｍｉｎを使用することによって実験的な散乱データから復元した。形状の再構築を実施して、すべてのモデルについてχ^２＜１．３で選択した、Ｄ_ｍａｘによって定義された検索ボリューム内の密集した球体アセンブリとして分子形状を表した。すべての試料について、プログラムＤＡＭＡＶＥＲを使用して２０の低解像度モデルを平均して、各再構成の一般的な構造的特徴を表す平均モデルを作成した。

【0153】

結合エピトープのコンピューター分析
ＰＳＭＡのタンパク質結晶構造を、ドッキング手順（ＰＤＢ１Ｚ８Ｌ）のために選択した。ＮＢ３７（ＰＤＢ６ＸＸＰ）およびＮＢ７（ＰＤＢ６ＸＸＮ）を、ＺＤＯＣＫとともにＤｉｓｃｏｖｅｒｙＳｔｕｄｉｏ４．５（Ｂｉｏｖｉａ，ＤａｓｓａｕｌｔＳｙｓｔｅｍｓ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用することによって、ＰＳＭＡ結晶構造の単量体型およびホモ二量体型にドッキングした。次に、ＺＲＡＮＫ法を使用して、ＺＤＯＣＫによって予測されたドッキングしたタンパク質複合体を迅速かつ正確に再ランク付けした。ドッキングシミュレーションごとに、ドッキングソリューションの方向性の最終的な上位２０００個の複合体を、群にクラスター化した。分類は、ソリューションの空間的近接に基づいており、クラスター中心から６Åの最大リガンド界面ＲＭＳＤカットオフおよび９Åの界面カットオフを使用して、ＰＳＭＡとＮＢとの間の界面領域を定義し、より明確に定義されたクラスターを取得した。このプロセスにより、本発明者らは、さらに分析するための最も有望なドッキングソリューションを選択することができた。選択したドッキングソリューションの形状を、エネルギー最小化プロトコルおよびＢｉｏｖｉａＳｍａｒｔＭｉｎｉｍｉｚｅｒアルゴリズムを使用することによって最適化した。選択した最小化されたソリューションについて、２つのタンパク質ドメイン間の結合界面を特定し、ドメイン間の相互作用を計算した。界面残基、すなわち、タンパク質が複合体にある場合と、分離されている場合で、溶媒に接近できる表面積が異なる残基を特定し、相互作用の種類（水素結合、静電相互作用、および疎水性相互作用など）を決定した。すべてのタンパク質をドッキングする前に、ＰＳＭＡおよびＮＢを、タンパク質の調製プロトコルに供し、このプロトコルは、滴定可能な各鎖のＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、ならびにＮ末端およびＣ末端についての標準的なまたは予測されたｐＫａ値を使用することによって水素の列挙を修正する。このプロトコルを使用した結果は、鎖末端および側鎖の好ましい水素表現およびプロトン化状態である。

【0154】

インビボ光学画像化
腫瘍異種移植片を、ＰＣ３－ＰＩＰおよびＰＣ３－ｆｌｕ細胞を使用することによって、６週齢の雄性無胸腺ヌードマウスで生成した。各マウスに、マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＵＳＡ）で１：１に希釈した、各系統の２×１０^６個の細胞を同時に皮下注射した。ＰＣ３－ＰＩＰ細胞は右上脇腹の上に注射し、一方、ＰＣ３－ｆｌｕ細胞は左上脇腹の上に注射した。接種から９日後、腫瘍のサイズが約２００ｍｍ^３に達したため、これらのマウスに、ＮＨＳ－エステルＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識した、１．５ナノモルのＮＢ７、ＮＢ８、ＮＢ１３、またはＮＢ３７（群当たり４匹のマウス）のいずれかを静脈内注射した。これらの１６匹のマウスに加えて、４匹の腫瘍担持マウスには、いずれのＮＢも注射しなかったが、他の４匹のマウスには、標識されたＮＢ（マウスごとに異なるＮＢ）を注射したが、異種移植片は移植しなかった。マウスを異なる時点でイソフルランで麻酔し（以下を参照）、ＩＶＩＳＬｕｍｉｎａシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＵＳＡ）を使用して、近赤外（ＮＩＲ）光学画像化において蛍光標識タンパク質の分布を測定した。露光時間は１秒に設定した。蛍光シグナルを、注射時、および注射後０．５、１、２、３、６、１０、１８、２４、２８、３２、３６、４８、および５６時間で測定した。マウスの画像を、注射の３時間および６時間後、ならびにシグナルがもはや検出されなくなったとき（注射の２４～５６時間後）に再び取得した。各時点で、ＮＢを注射された腫瘍担持マウスの各群からの１匹のマウスを、ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅソフトウェアを使用してその臓器の蛍光シグナルのｅｘｖｉｖｏでの定量化のために安楽死させた。

【0155】

ＮＢ７ｃｙｓへのＤＯＸコンジュゲーション
ドキソルビシンコンジュゲート（図１６に示される）（１）を、標準的な手順に従って合成した（図１６Ａ）。Ｎ－（β－マレイミドプロピオン酸）ヒドラジドトリフルオロ酢酸塩（２、３９ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を、１０ｍｌの無水メタノール中のドキソルビシン塩酸塩（ＤＯＸ、３、２９ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。トリフルオロ酢酸（３μｌ）を反応混合物に加え、次にそれを暗所で１８時間室温で撹拌した。反応混合物を１ｍｌの体積に濃縮し、撹拌しながらアセトニトリル（２０ｍｌ）に滴下して加えた。得られた溶液を４℃で少なくとも２４時間静置した。最終生成物（１）を遠心分離によって単離し、新鮮な１：１０のメタノール／アセトニトリル溶液で洗浄し、真空下で乾燥させて、１、２５ｍｇ、７１％の収率を得た。^１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ＝１０．４６（ｓ，１Ｈ），７．９４－７．９２（ｍ，２Ｈ），７．６７（ｄｄ，Ｊ＝７．４および３．４Ｈｚ，１Ｈ），６．８７（ｓ，２Ｈ），５．７８（ｔ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，１Ｈ），５．５１（ｓ，１Ｈ），５．４０（ｄ，Ｊ＝３．９Ｈｚ，１Ｈ），５．２６（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），４．９１（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），４．４０（ｔ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，２Ｈ），３．９９（ｓ，４Ｈ），２．７３（ｄ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，１Ｈ），２．３４－２．２４（ｍ，２Ｈ），２．１５－２．１０（ｍ，２Ｈ），１．８８－１．８１（ｍ，２Ｈ），１．７１－１．６６（ｍ，２Ｈ），１．１４（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）ｐｐｍ（図Ｓ１１）。Ｃ_３４Ｈ_３７Ｎ_４Ｏ_１３［Ｍ＋Ｈ］^＋についてのＭＳ（ＥＳＩ）計算値：７０９．２３、観測値：７０９．１４。次に、マレイミドベースの化学を使用して、ＮＢ７ｃｙｓを１：２０のモル比で１にコンジュゲートさせた（４℃で２４時間）。ＮＢ７ｃｙｓＤＯＸを、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５１０／３００（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＭＡ）を使用したＦＰＬＣによって、非コンジュゲートＮＢ７ｃｙｓから分離した。タンパク質へのＤＯＸのコンジュゲーションを、ＦＰＬＣ実行中の４８８ｎｍでの吸光度に基づいて、および質量分析によって検証した。

【0156】

共焦点画像化
ＮＢを、Ｄｙｌｉｇｈｔ４８８ＮＨＳ－エステル（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＩＬ）を用いて１：３のモル比で標識した。フィコエリトリン（ＰＥ）－抗ＰＳＭＡ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＣＡ）およびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、３×１０^４個のＰＣ３－ＰＩＰまたはＰＣ３－ｆｌｕ細胞と１５分間インキュベートし、これを、１００ｎＭの標識したＮＢの存在下または非存在下で、８ウェルμスライド（ｉｂｉｄｉＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中で一晩増殖させた。ＮＢ７ｃｙｓおよびＮＢ７ｃｙｓＤＯＸを、Ｄｙｌｉｇｈｔ６５０ＮＨＳ－エステルを用いて１：３のモル比で標識した。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２および１．５μｇ／ｍｌのＤＯＸ（Ｔｅｖａ、Ｉｓｒａｅｌ）または同等のモル量の標識されたＮＢ７ｃｙｓもしくは標識されたＮＢ７ｃｙｓＤＯＸを、上記のように増殖させた、ＰＣ３－ＰＩＰおよびＰＣ３－ｆｌｕ細胞とインキュベートした。細胞を、長作動距離×６０／１．３５開口数、油浸対物レンズで、ＯｌｙｍｐｕｓＦＶ１０００共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｊａｐａｎ）を用いて画像化した。

【0157】

ＮＢ内在化の時間依存性定量化
それぞれＤｙｌｉｇｈｔ４８８で標識したＮＢ７、ＮＢ８、ＮＢ１３、およびＮＢ３７を、９６ウェルプレート中で１時間（１００ｎＭで）、個々にインキュベートした。各ウェルに１．５×１０^４個のＰＣ３－ＰＩＰ細胞を播種し、一晩増殖させ、次にＯｐｅｒｅｔｔａＣＬＳハイコンテント分析システム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して、ウェルを４０分ごとに合計１６時間画像化した。各ウェルを、２４の視野として画像化し、後でそれらを組み合わせてウェル全体の画像を作成した。Ｏｐｅｒｅｔｔａ分析ソフトウェアを使用して、細胞を、ＮＢの分布に従って２つの群に定性的に分類した：（ｉ）主に細胞膜上、および（ｉｉ）主に細胞質内。各群の細胞数を各時点で定量化し、各群の細胞数間の比率を計算した。

【0158】

細胞定量化アッセイ
ＰＣ３－ＰＩＰ細胞（５×１０^４）を、２４ウェルプレートに播種した。細胞をプレートに付着させた後、それらを未処理のままにしたか、またはＤＯＸ（１．５μｇ／ｍｌ）もしくは同等のモル量のＮＢ７ｃｙｓもしくはＮＢ７ｃｙｓＤＯＸで処理した。処理の２４時間後、ＣｏｕｎｔｅｓｓＩＩ自動セルカウンター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、各ウェルの細胞数をカウントした。

【0159】

細胞生存率アッセイ
ＰＣ３－ＰＩＰ細胞を、上記の細胞定量化アッセイのセクションで説明したように増殖させ、処理した。細胞を回収し、０．５μｇのヨウ化プロピジウム（ＰＩ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）とインキュベートし、ＢＤＣ６フローサイトメーターにおいて、それらの蛍光強度を測定した。

【0160】

ミトコンドリア電位アッセイ
ＰＣ３－ＰＩＰ細胞（２×１０^４）を、９６ウェルプレートに播種した。細胞をプレートに付着させた後、それらを、１．５μｇ／ｍｌのＤＯＸもしくは同等のモル量のＮＢ７ｃｙｓもしくはＮＢ７ｃｙｓＤＯＸで処理したか、または対照としてそれらを未処理のままにした。２４時間後、テトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ、Ａｂｃａｍ、ＵＫ）を、製造業者が提供するプロトコルに従って添加した。蛍光強度を、５４９ｎｍの励起波長および５７５ｎｍの発光波長で測定した。カルボニルシアニド４－（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）は、製造業者のプロトコルに従って使用される陰性対照として機能した。

【0161】

インビボ腫瘍増殖阻害
ＰＣ３－ＰＩＰ異種移植片を、上記のインビボ光学画像化のセクションで説明したように、無胸腺ヌードマウスで増殖させた。平均腫瘍サイズが、２００ｍｍ^３に達したら、マウスを３つの群に分け（平均腫瘍サイズを制御した）、それぞれ異なる処置に供した：１５０μｌの生理食塩水（ｎ＝７）、２ｍｇ／ｋｇのＤＯＸ（ｎ＝８）、または１．４ｍｇ／ｋｇ（約４０μｇ）のＮＢ７ｃｙｓＤＯＸ（ｎ＝８）。処置は、３週間連続して週２回尾静脈に投与した。以前に説明されたように（ＴｏｍａｙｋｏａｎｄＲｅｙｎｏｌｄｓ、１９８９）、各サンプリング点で腫瘍体積を計算した（Ｖ＝０．５×Ｌ×Ｗ×Ｈ）。ＢＧＵでの研究における動物の倫理的ケアおよび使用に関する委員会のガイドラインに従って、腫瘍体積が１，５００ｍｍ^３に達したとき、またはその体調が悪化したときに、マウスを安楽死させた。安楽死前の推定腫瘍体積および速度に基づいたＴ／Ｃを、以前に説明されているように決定した（Ａｓｔｏｎｅｔａｌ．，２０１７）。

【0162】

組織学
インビボ腫瘍増殖阻害アッセイにおける各処置の最終投与の４日後、マウスを安楽死させ、それらの異種移植片を４％ホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋した。腫瘍切片（厚さ５μｍ）を、以前に説明されているように（Ｐｉｔｔａｌａｅｔａｌ．，２０１８、Ｆｉｓｃｈｅｒｅｔａｌ．，２００８）、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色、ＴＵＮＥＬアッセイ、ならびに免疫蛍光（ＩＦ）に供した。ＩＦについては、ＰＥにコンジュゲートした抗ＰＳＭＡおよびＦＩＴＣにコンジュゲートした抗ＨＩＳを使用して、それぞれＰＳＭＡおよびＮＢ７ｃｙｓＤＯＸを検出した。核染色には４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を使用した。Ｈ＆Ｅ染色した切片を、パノラマＭＩＤＩＩＩスキャナー（３ＤＨＩＳＴＥＣＨＫｆｔ．、Ｈｕｎｇａｒｙ）を使用して可視化した。ＴＵＮＥＬ、ＰＩ、およびＩＦは、共焦点顕微鏡で可視化した。

【0163】

非天然アミノ酸の組み込み
まず、本発明者らは、ｐＭＥＣＳ上のＮＢ７遺伝子の３’のＴＡＧ終止コドンをＴＡＡに変更した。次に、本発明者らは、５つの異なるＡＡ位置をＴＡＧに変異させた：Ａ１４、Ａ４０、Ｇ４２、Ｋ４３、およびＡ７５。その結果、各ＮＢ７遺伝子は、これらの終止コドン選択肢のうちの１つを含む。本発明者らは、変異したＮＢ７遺伝子を含むｐＭＥＣＳ、およびｐＥＶＯＬを、ＷＫ６細菌に同時形質転換した。５つの変異体はすべて、ＯＤ０．５に達するまで３７℃で小規模精製のために増殖させ、ＩＰＴＧで誘導し、Ｏ．Ｎについて温度を２８℃に設定した。細菌には、それらの培地中にＢＯＣ－リジンが提供された。次に、各培養物からの１ｍｌの細菌、およびＧＦＰ陽性対照を収集し、遠心分離し、１００μｌのＰＢＳで再懸濁した。細菌を９５℃で５分間煮沸し、ペレット化し、ＮＢを含む上清を回収した。マウス抗Ｈｉｓ、続いてＨＲＰ－抗マウスＡｂを使用して、２５μｌの上清をＷＢのために回収し、ＥＺ－ＥＣＬキットを使用して開発した。Ｋ４３変異体は、良好な発現を示したため、大規模精製のために選択し、本発明者らは、リジン（Ｋ）をＰｒＫに変更しても、タンパク質の安定性および活性が損なわれる可能性は低いと仮定した。ＳＥＣおよびＭＳクロマトグラムにより、ＰｒＫの添加後のＮＢ７のＭｗへの添加が、理論上のＭｗと相関していることが確認された。ＮＢ７およびＮＢ７Ｋ４３ＰｒＫのＰＣ３－ＰＩＰ細胞への結合を、ＦＡＣＳを使用して決定し、Ｋ４３ＰｒＫ変異後の結合に有意な変化は見られなかった。

【0164】

同様の手順をＮＢ７ｃｙｓで実施した。２つの位置は、ＷＢにおいて検出可能なレベルのＮＢ７ｃｙｓＢＯＣ－リジンを示したが、ＮＢ７ｃｙｓＫ４３ＰｒＫの大規模精製ではタンパク質は検出されなかった。

【0165】

統計的分析
特に明記しない限り、各実験は３連で実施し、結果は平均±ＳＥＭを示す。統計的有意性は、スチューデントのｔ検定を使用して決定した。

【0166】

実施例１
抗ＰＳＭＡＮＢの分離
ＰＳＭＡを注入したラクダのリンパ球から抽出したＲＮＡは、１０７個のバリアントのサイズのＮＢファージディスプレイライブラリーの基礎として機能した。ＰＳＭＡに対するファージディスプレイのパニングプロセスにより、ＮＢバリアントを発現する４７個の細菌コロニーが得られ、３２個の固有のＮＢ配列を特定した。これらのうち、配列が数回繰り返され、ＥＬＩＳＡでＰＳＭＡへの最も強い結合を示した４つのＮＢを、精製のために選択した（図７Ａ～７Ｂ）。ＮＢ７、ＮＢ８、ＮＢ１３、およびＮＢ３７と呼ばれる、精製したＮＢは、予想されるサイズが約１６ｋＤａであり（図７Ｃ）、収量は４～１８ｍｇ／ｌ培養物であった。

【0167】

実施例２
ＮＢはピコモルからナノモルの親和性でＰＳＭＡに結合する
ＳＰＲは、ＰＳＭＡに対する４つの精製したＮＢのインビトロ結合親和性がピコモルからナノモルの範囲であったが、ＮＢ間でかなり異なることが明らかになった（表１、および図１Ａ～１Ｄ）。

【表1】

【0168】

ＦＡＣＳベースの滴定曲線は、４つのＮＢすべてが、ＰＣ３－ＰＩＰ（ＰＳＭＡ＋）前立腺がん細胞に用量依存的に結合したが（図１Ｅ）、それらは、ＰＣ３－ｆｌｕ（ＰＳＭＡ－）細胞には結合しないことを示した（図１Ｆ）。特に、おそらくＮＢが細胞内に内在化されたため、ＦＡＣＳ結合曲線はプラトーに達しなかった（下記を参照のこと）。したがって、このデータセットはＫＤ値の計算には使用しなかった。酵素活性アッセイは、ＮＢがＰＳＭＡの酵素ＮＡＡＬＡＤａｓｅ活性を損なわないことを明らかにし（図８）、それらが、タンパク質の非機能的エピトープに結合することを示唆している。

【0169】

実施例３
ＮＢ構造およびそれらのＰＳＭＡ結合エピトープ
４つのＮＢのＫ_Ｄ値のかなりの変動（最大１００倍）は、それらの潜在的に異なるＰＳＭＡ結合エピトープに起因する可能性がある。この可能性を試験するために、ＮＢ７、ＮＢ８、およびＮＢ３７の結晶構造を、１．５Å（ＮＢ８、ＮＢ３７）または２．６５Å（ＮＢ７）の分解能で解明した（図２Ａ～２Ｃ、および表２～４）。ＮＢ１３結晶は、試みた成長条件下のいずれでも得ることができなかった。単一のアミノ酸残基が異なる、それらの配列の高い相同性と一致して、ＮＢ８およびＮＢ３７の構造は非常に類似していたが、ＮＢ７の構造は著しく異なり、より多くのβシートおよびより少ないランダム領域を含んでいた。ＳＡＸＳ分析（図９）により、単量体ＰＳＭＡがＰＢＳ中で安定であり、濃度依存性の分子間相互作用を示すことが示され、これは、ＰＳＭＡ単量体が溶液中で互いに相互作用することを示唆しており、ＰＳＭＡが二量体を形成する能力を裏付けている。増加するＮＢ濃度の存在下での単量体ＰＳＭＡの散乱曲線は、ギニエ領域（Ｓ^２≦０．００６Å^－２）が線形であることを示しており、どの試料でも凝集がほとんどまたは全くないことを示している（図１０）。しかしながら、ＰＳＭＡに低濃度のＮＢ１３を、すなわち、１：０．５～１：３のＰＳＭＡ：ＮＢ１３比で加えると、ＰＳＭＡの回転半径（Ｒ_ｇ）が増加した（図１１）。ＰＳＭＡ－ＮＢ複合体のＲ_ｇは、ＰＳＭＡのもとのＲ_ｇ（４３Å、図１１）からＮＢ７ではより高いＲ_ｇに、ＮＢ８、ＮＢ１３、およびＮＢ３７ではより低いＲ_ｇにシフトした。ＰＳＭＡ単独のＲ_ｇは、ＰＳＭＡ単量体の結晶構造に基づいて計算されたＲ_ｇ値と同等であった。粒子内のペアワイズ距離の分布（図１２）は、Ｐ（ｒ）で表されている（方法を参照のこと）。ＰＳＭＡＰ（ｒ）のＤ_ｍａｘは１１５Åであり（図１３）、Ｐ（ｒ）分布の形状は細長い構造を示している。ＰＳＭＡのＮＢ７およびＮＢ１３への結合はＤ_ｍａｘを増加させたが、ＮＢ８およびＮＢ３７へのその結合は、それを減少させた（表５）。

【0170】

次に、本発明者らは、ＤＡＭＭＩＮおよびＤＡＭＡＶＥＲを使用して平均化したデータから２０個の再構成したアブイニシオモデルを計算した。本発明者らは、ＰＳＭＡ、ＮＢ７、およびＮＢ３７の結晶構造を使用し、それらを、ＰＳＭＡのみ（０．５ｍｇ／ｍｌ）、またはＮＢ７もしくはＮＢ３７（各場合０．２ｍｇ／ｍｌ）を有するＰＳＭＡ（０．５ｍｇ／ｍｌ）のいずれかを含む試料の再構成した構造に適合させた（図２Ｄ～２Ｆ）。本発明者らは、ＮＢ８の結合機構は、それらの高い配列および構造相同性のためにＮＢ３７のものと類似していると仮定し、本発明者らは、ＮＢ１３のモデルを、その結晶構造を有しなかったので生成しなかった。

【0171】

モデルは、ＰＳＭＡが、ＰＳＭＡの四量体結晶構造（ＰＤＢ１Ｚ８Ｌ）で観察されたものと同様に、両方の単量体のＮ末端間の相互作用を伴う非生物学的二量体を形成することを示唆した（図２Ｄ）。低解像度の構造は非対称であるため、一方の単量体が他方の単量体よりも小さく見えるが、特に、この見かけの非対称性は、溶液中に単量体および二量体の両方が存在することに起因している可能性があり、それによって平均サイズは両方の種の組み合わせたサイズを反映している可能性がある。モデルは、ＮＢ７の存在下で、ＰＳＭＡ単量体の１つと生物学的二量体を形成することによって、別のＰＳＭＡ単量体が二量体複合体に加えられることを示唆した。このモデルによれば、ＮＢ７は、異なる相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する生物学的二量体の各単量体に結合し（図２Ｅ）、複合体のサイズおよびＲ_ｇの増加をもたらす。ＰＳＭＡ－ＮＢ３７複合体の場合、ＮＢ３７は、Ｎ末端においてＰＳＭＡに結合するように見え（図２Ｆ）、したがって非生物学的二量体を破壊し、Ｒ_ｇの減少をもたらす。

【0172】

実施例４
ドッキング分析
ＳＡＸＳの結果およびＰＳＭＡ（ＰＤＢ１Ｚ８Ｌ）を用いたＮＢ７（ＰＤＢ６ＸＸＮ）の分子ドッキングシミュレーションにより、ＮＢ７が二量体化界面の近くでＰＳＭＡに結合し、両方の単量体と同時に相互作用することが明らかになった（図２Ｇ、および図２０）。ＮＢ７は、主にＣＤＲ３およびＣＤＲ１を介して１つのＰＳＭＡ単量体と相互作用するが、ＣＤＲ２およびいくつかの非ＣＤＲ残基は、ホモ二量体の２番目の単量体と相互作用する（主な寄与相互作用は図２Ｇに示され、図２０にさらに詳述される）。ドッキングシミュレーションによると、ＮＢ３７（ＰＤＢ６ＸＸＰ）は、ＰＳＭＡのＮ末端に近いエピトープに結合する（図２Ｈ、図２１）。ＮＢ３７とＰＳＭＡとの間の予測される相互作用は、主にＣＤＲ２を介して発生し、一部はＣＤＲ３を介して発生する。主な寄与相互作用は図２Ｈに示され、図２１にさらに詳述される。ＮＢ３７の４４３．７２Å^２と比較して、ＮＢ７のリガンド接触表面積は９６９．３４Å^２であるため、全体として、ＮＢ７はＮＢ３７よりも多く相互作用する（表８）。

【0173】

実施例５
ＮＢはインビボでＰＳＭＡ発現腫瘍に蓄積する
次に、本発明者らは、ＮＢが、インビボでＰＳＭＡを発現するＰＣａ腫瘍に特異的に結合するかどうか、およびそれらの親和性間の差が、腫瘍におけるそれらのインビボでの蓄積と相関するかどうかを決定することを目的とした。この目的のために、本発明者らは、ＰＣ３－ＰＩＰおよびＰＣ３－ｆｌｕ異種移植片を接種したヌードマウスの全身近赤外（ＮＩＲ）光学画像を取得した。本発明者らは、標識したＮＢを注射してから３時間および６時間後（それぞれ、初期および中期の時点）、ならびに蛍光シグナルがインビボでもはや検出できなくなったとき（後期の時点）に再び画像を捕捉した。一部のマウスでは、注射から５６時間後でもシグナルは依然として検出可能であった。本発明者らは、倫理規定のためにこれらのマウスを安楽死させ、本発明者らは、これらの場合の後期の時点を５６時間超として示す。

【0174】

初期の画像化時点では、ＮＢは、腎臓およびＰＣ３－ＰＩＰ腫瘍の両方で検出されたが、ＰＣ３－ｆｌｕ腫瘍では検出されなかった。しかしながら、中期の画像化時点では、それらは腎臓から完全に除去され、ＰＣ３－ＰＩＰ腫瘍にのみ残っていた（図３）。蛍光シグナルがもはや検出されなくなるまでの期間（後期の時点）は、ＰＳＭＡに対するＮＢの親和性に依存していたため、親和性が高い（Ｋ_Ｄが低い）ＮＢは、シグナル除去に長い期間を必要とした（ＮＢ３７では２４時間、ＮＢ８およびＮＢ１３では３２時間、ならびにＮＢ７では５６時間超）。これらの低い除去速度は、４つのＮＢすべてが、臨床的画像化および腫瘍特異的薬物送達などの、インビボでの適用のために使用することができる可能性があることを示唆している。実際に、全身画像化によって蛍光シグナルが検出されなかった後でも、それは、エキソビボで腫瘍内で依然として観察され（図１４）、腎臓と比較して時間とともにＰＣ３－ＰＩＰ腫瘍内で増加した（図３Ｄ）。他の臓器およびＰＣ３－ｆｌｕ腫瘍内のシグナルは、実験全体を通してかなり弱かった。例えば、３時間後のＮＢ８では、シグナル強度は、ＰＣ３－ｆｌｕ腫瘍内の２１，３００カウント／ｃｍ^２／秒と比較して、ＰＣ３－ＰＩＰ腫瘍内で１７１，０００カウント／ｃｍ^２／秒および腎臓内で９４，７００カウント／ｃｍ^２／秒であった。この結果は、ＮＢが、ＰＳＭＡ^＋腫瘍内に特異的に蓄積し、その後、ＮＢのサイズが小さいこと［１６ｋＤａ、一方、腎臓のカットオフは約６０ｋＤａである］から予想され得るように、主に腎臓によって除去されたことを示唆している。

【0175】

実施例６
ＮＢはＰＳＭＡ発現細胞に内在化される
ＮＢが、化学療法剤をＰＳＭＡ^＋前立腺腫瘍細胞に送達できるようにするには（多くの既存の薬物の有効性の必須条件）、それらは、ＰＳＭＡ^＋細胞に特異的に内在化されなければならない。４つのＮＢの内在化能力を試験するために、本発明者らは、それらを蛍光標識し、それらを、ＰＥ抗ＰＳＭＡ抗体およびＨｏｅｃｈｓｔ核染色溶液と一緒に、生ＰＣ３－ＰＩＰ（ＰＳＭＡ^＋）または生ＰＣ３－ｆｌｕ（ＰＳＭＡ^－）細胞のいずれかとインキュベートした。ＰＣ３－ＰＩＰ細胞の共焦点画像化により、ＮＢがＰＳＭＡと共局在化し、細胞膜および細胞内のクラスターの両方に現れることが明らかになった（図４Ａ～４Ｄ）。特に、抗ＰＳＭＡ抗体は、ＮＢの非存在下では細胞内に見られず（図４Ｉ）、ＮＢが、抗ＰＳＭＡ抗体に依然として結合している間にＰＳＭＡの内在化を促す可能性があることを示唆している。ＰＣ３－ｆｌｕ細胞の画像化により、ＮＢも抗ＰＳＭＡ抗体も細胞に結合しないか、または細胞に内在化しないことが示された（図４Ｅ～４Ｈ）。長期の内在化アッセイにより、ＰＳＭＡに対する親和性が高いＮＢ（すなわち、ＮＢ７およびＮＢ１３）は、親和性が低いものよりもはるかに速くＰＳＭＡ発現細胞に内在化されることが明らかになった（図１５）。ＰＳＭＡに対するインビトロおよびインビボの親和性、ならびに各ＮＢの精製収率に基づいて、本発明者らは、ＮＢ７を使用してＮＢ－薬物コンジュゲートを生成することを選択した。

【0176】

実施例７
ＮＢ７ｃｙｓのＤＯＸへのコンジュゲーション
標的細胞内のＮＢおよびＰＳＭＡのクラスター化されたパターンは、他のＰＳＭＡ結合剤で以前に示されているように、それらの内在化が細胞内小胞によって媒介されることを示唆している。両方の細胞内小胞は、典型的には酸性であるため、本発明者らは、ｐＨ＜６．０で加水分解される、ｐＨ感受性リンカーＮ－（β－マレイミドプロピオン酸）ヒドラジド（ＢＭＰＨ）（図１６Ａおよび１７）を介してＮＢ７をＤＯＸにコンジュゲートした。本発明者らは、小胞内の酸性条件が、リンカーとＤＯＸとの間の共有結合を加水分解し、それによってＤＯＸをコンジュゲートから放出し、それが小胞の外側および細胞質ゾル内に拡散することを可能にし、そこで核に浸透することができ、おそらくＤＮＡ転写を阻害すると仮定した。

【0177】

ＮＢ７ｃｙｓＤＯＸと呼ばれる、コンジュゲートしたタンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製した（図１６Ｂ）。ＮＢ７にＤＯＸを付加すると、そのサイズがわずかに増加したが（すなわち、約７００Ｄａまで）、ＤＯＸの疎水性により溶出速度が低下し、本発明者らは、コンジュゲートタンパク質と、非コンジュゲートタンパク質とを分離することができた。ＤＯＸの蛍光（ｅｘ．４９５およびｅｍ．５６０）により、４８８ｎｍでコンジュゲートタンパク質のみの吸光度が得られ、これは４９５に十分に近く、コンジュゲートタンパク質画分と、非コンジュゲートタンパク質画分とをさらに区別した。酸性ｐＨ（ｐＨ＝４）で質量分析を使用して、ＮＢ７ｃｙｓＤＯＸ画分をさらに評価し、この場合、ＤＯＸはリンカーから切断され、それによってＮＢから切断されている。この分析により、コンジュゲートタンパク質の質量が、ＮＢ７ｃｙｓ単独の質量よりも１８５Ｄａ高いことが明らかになった（すなわち、それぞれ、１６，３２６Ｄａと比較して１６，１４１Ｄａ、図１６Ｃ）。この違いは、ＮＢ７ｃｙｓおよびＢＭＰＨリンカーの組み合わせたサイズを反映しており、すべてのＮＢ分子がＤＯＸにコンジュゲートし、ＤＯＸが酸性条件下で放出されることを示している。ＮＢ７ｃｙｓおよびＮＢ７ｃｙｓＤＯＸのＰＳＭＡ発現ＰＣ３－ＰＩＰ細胞への結合のＦＡＣＳ分析（図１６Ｄ）により、ＤＯＸのコンジュゲーションが、これらの細胞へのＮＢ７ｃｙｓの結合を損なわないことが明らかになった。

【0178】

実施例８
ＮＢ７ｃｙｓＤＯＸはＰＳＭＡ発現細胞に対して細胞傷害性である
ＮＢ７ｃｙｓＤＯＸコンジュゲートが、ＰＳＭＡ発現細胞に特異的に内在化する能力、およびコンジュゲートからのＤＯＸの連続的な分離を評価するために、本発明者らは、ＰＣ３－ＰＩＰおよびＰＣ３－ｆｌｕ細胞を、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（核染色）および１．５μｇ／ｍｌのＤＯＸ（蛍光性）またはモル当量のＤｙｌｉｇｈｔ６５０で標識したＮＢ７ｃｙｓもしくはＮＢ７ｃｙｓＤＯＸのいずれかと１５分間インキュベートした（図５）。ＰＣａ細胞と単独でインキュベートすると、小さく疎水性の分子であるＤＯＸが、ＰＣ３－ＰＩＰ細胞およびＰＣ３－ｆｌｕ細胞の両方に自然に拡散し、細胞質ゾル全体に均一に散在していることを見出した。逆に、ＰＳＭＡ依存性の内在化機構から予想されるように（図４Ａを参照）、ＮＢ７ｃｙｓはＰＣ３－ＰＩＰ細胞にのみ蓄積し、主に細胞膜に見出され、細胞質ゾルへの内在化を開始した。ＮＢ７ｃｙｓＤＯＸの分布は、ＮＢ７ｃｙｓの分布と非常に類似していたが（すなわち、ＰＣ３－ｆｌｕ細胞ではなく、ＰＣ３－ＰＩＰ細胞の膜および細胞質ゾル上の定義された領域において）、ＤＯＸは、細胞内の複数の領域に散在しており、ほとんどがＮＢ７ｃｙｓから分離していた（ただし、少量のＮＢ７ｃｙｓがＤＯＸクラスター内で見出された）。内在化されたコンジュゲートから放出されたＤＯＸが、その細胞傷害活性を保持するかどうかを試験するために、本発明者らは、ＰＣ３－ＰＩＰ細胞を、１．５μｇ／ｍｌのＤＯＸまたは同等のモル量のＮＢ７ｃｙｓＤＯＸもしくはＮＢ７ｃｙｓと２４時間インキュベートし、各ウェル内の細胞の数をカウントし、それを未処理の細胞のものと比較した（図１８Ａ）。このアッセイにより、ＤＯＸとのインキュベーション、またはより大きな程度でのＮＢ７ｃｙｓＤＯＸとのインキュベーションにより、ウェル内の細胞数が大幅に減少することが明らかになった。次に、異なるセットの実験において、本発明者らは、ＰＣ３－ＰＩＰ細胞を、ＤＯＸ、ＮＢ７ｃｙｓ、またはＮＢ７ｃｙｓＤＯＸ（上記のとおり）のいずれかと２４時間インキュベートし、その後、後期アポトーシスおよび壊死の蛍光マーカーであるヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で細胞を標識した。ＦＡＣＳ分析（図１８Ｂ）により、細胞をＮＢ７ｃｙｓで処理してもＰＩシグナルを変化させなかったが、それらをＤＯＸ、またはより大きな程度でのＮＢ７ｃｙｓＤＯＸで処理すると、シグナルがかなり増加したことが明らかになった。ＰＣ３－ＰＩＰ細胞を、活性ミトコンドリアを標識する試薬であるＴＭＲＥで処理すると、ＤＯＸおよびＮＢ７ｃｙｓＤＯＸが、同様にミトコンドリア膜電位を低下させることが明らかになった（図１８Ｃ）。ミトコンドリア膜電位を遮断し、陽性対照として機能するＦＣＣＰで細胞を処理すると、ＰＣ３－ＰＩＰ細胞のミトコンドリア膜電位も大幅に低下した。対照的に、未処理の細胞と比較して、ＮＢ７ｃｙｓだけではＴＭＲＥシグナルは変化しなかった。まとめると、これらの結果は、ＮＢ７ｃｙｓＤＯＸが、少なくともＤＯＸ単独と同じくらいＰＳＭＡ^＋細胞に対して細胞傷害性であることを示している。

【0179】

実施例９
ＮＢ７ｃｙｓＤＯＸはマウスにおいて腫瘍増殖を阻害する
インビボでのＮＢ７ｃｙｓＤＯＸの活性を試験するために、本発明者らは、無胸腺ヌードマウスにおいてＰＣ３－ＰＩＰ腫瘍異種移植片を作製し、腫瘍が約２００ｍｍ^３に達したら、本発明者らは、それらを、生理食塩水（対照）、２ｍｇ／ｋｇ（２．８６μｍｏｌ／ｋｇ）の市販のＤＯＸ（これは、マウスにおいて有効であり、ヒトでの使用と同様であることが以前に示されている）、または１．４ｍｇ／ｋｇ（０．０８７μｍｏｌ／ｋｇ）のＮＢ７ｃｙｓＤＯＸ（これは、ＤＯＸ単独で使用されるよりも４２分の１のＤＯＸのモル用量を表す）のいずれかで、３週間の間、週に２回静脈内処置した。本発明者らは、各注射の前に腫瘍のサイズを測定したが、倫理規定（すなわち、大きな腫瘍負荷または身体的悪化）のために、治療開始から８日後までに一部のマウスを安楽死させなければならなかった。これらのマウスでは、本発明者らは、外挿によって連続する時点での腫瘍サイズを推定した。

【0180】

すべての生きているマウスからの腫瘍が分析に含まれた最後の時点は、処置開始から８日後であった。その時点で、平均腫瘍サイズは、生理食塩水で処置されたマウスよりもＮＢ７ｃｙｓＤＯＸで処置されたマウスで有意に小さかった（図６Ａ）。経時的分析（図１９Ａ）および処置／対照（Ｔ／Ｃ；図６Ｂ）の速度に基づいた増殖勾配により、腫瘍増殖速度が、実際に、生理食塩水で処置されたマウスよりもＮＢ７ｃｙｓＤＯＸで処置されたマウスの方が低いことが明らかになった。さらに、ＮＢ７ｃｙｓＤＯＸ処置マウスに投与されたＤＯＸの量は、ＤＯＸ処置マウス（２ｍｇ／ｋｇ用量のＤＯＸを受けた）に投与された量よりも有意に少なかったが、腫瘍増殖速度は、両方の群で類似しており、ＤＯＸ投与単独と比較してＮＢ７ｃｙｓＤＯＸコンジュゲートの有効性が示される。特に、速度に基づいた分析のために、３匹のマウスをＤＯＸ処置群から除外した。これらの結果と一致して、ＤＯＸ処置またはＮＢ７ｃｙｓＤＯＸ処置群（これらは互いに有意に異ならなかった）のいずれかよりも生理食塩水処置群において、多くのマウスが最大腫瘍サイズ（すなわち、倫理規定のためにマウスを安楽死させたサイズ）に達した（図１９Ｂ）。

【0181】

次に、本発明者らは、ＮＢ７ｃｙｓＤＯＸの最終投与の４日後に処置したマウスから腫瘍を抽出し、それらをＰＥ－抗ＰＳＭＡおよびＦＩＴＣ－抗Ｈｉｓで標識した。組織学的分析により、ＰＳＭＡは主に腫瘍細胞の膜に局在化しているが、ＮＢ７ｃｙｓＤＯＸはＰＳＭＡと共局在化しているか、または細胞質内に局在化しているように見えることが明らかになり（図６Ｃ）、ＮＢ７ｃｙｓＤＯＸが、実際に腫瘍内に到達し、少なくとも４日間留まっていることが示された。腫瘍をＨ＆Ｅで染色すると、生理食塩水で処理したマウスから得られた腫瘍は、群がっており、Ｈ＆Ｅによって強く標識されたが、ＤＯＸまたはＮＢ７ｃｙｓＤＯＸで処置したマウスからの腫瘍は壊死性であり、細胞間に大きな空孔があったことが明らかになった（図６Ｄ、上）。ＴＵＮＥＬアッセイにより、ＤＯＸまたはＮＢ７ｃｙｓＤＯＸ処置マウスから得られた腫瘍の有意なアポトーシスと比較して、生理食塩水処置マウスから得られた腫瘍のアポトーシス細胞はごくわずかだけだったことが明らかになった（図６Ｄ、下）。これらの結果は、ＮＢ７ｃｙｓＤＯＸ処置マウスに投与されたＤＯＸ分子の数が、ＤＯＸ処置マウスに投与されたものの３％未満であるが、薬物の細胞傷害性効果は両方の群で類似していることを示している。

【0182】

【表2】

【0183】

【表3】

【0184】

【表4】

【0185】

【表5】

【0186】

【表6】

【0187】

さらに、本発明者らは、天然に存在しないアミノ酸を本発明のポリペプチドに組み込むことが実現可能であることを示した（図２２）。具体的には、本発明者らは、Ｋ４３のＫ４３ＰｒＫ変異による置換が、ＰＳＭＡのＮＢ７結合に有意に影響を及ぼさないことを示した（図２２Ｅ）。

【0188】

本発明は、その特定の実施形態と併せて説明されてきたが、多くの代替、修正、および変更が当業者に明らかであることは明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の精神および広範な範囲内に入るそのようなすべての代替、修正、および変更を包含することが意図されている。

【0189】

本明細書で言及するすべての公開物、特許、および特許出願は、各個々の公開物、特許、または特許出願が、参照により本明細書に組み込まれることが具体的かつ個々に示されているのと同程度に、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。さらに、本出願における参考文献の引用または確認は、かかる参考文献が本発明の先行技術として利用可能であることの承認として解釈されてはならない。節の見出しが使用されている限りにおいて、それらは必ずしも制限しているものとして解釈されるべきではない。

【図1A】