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特表2022-546431抗体及びその使用

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-11-04

(54)【発明の名称】抗体及びその使用

(51)【国際特許分類】

C12N 15/13 20060101AFI20221027BHJP

C07K 16/10 20060101ALI20221027BHJP

A61K 39/395 20060101ALI20221027BHJP

A61K 45/00 20060101ALI20221027BHJP

A61P 43/00 20060101ALI20221027BHJP

A61P 31/12 20060101ALI20221027BHJP

A61P 31/18 20060101ALI20221027BHJP

G01N 33/577 20060101ALI20221027BHJP

G01N 33/543 20060101ALI20221027BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13

C07K16/10 ZNA

A61K39/395 N

A61K39/395 S

A61K45/00

A61P43/00 121

A61P31/12

A61P31/18

G01N33/577 B

G01N33/543 545A

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022513241

(86)(22)【出願日】2020-08-26

(85)【翻訳文提出日】2022-04-19

(86)【国際出願番号】 EP2020073805

(87)【国際公開番号】W WO2021037883

(87)【国際公開日】2021-03-04

(31)【優先権主張番号】19306033.2

(32)【優先日】2019-08-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】518068833

【氏名又は名称】ディアキュレート

【氏名又は名称原語表記】ＤＩＡＣＣＵＲＡＴＥ

(74)【代理人】

【識別番号】100121728

【弁理士】

【氏名又は名称】井関勝守

(74)【代理人】

【識別番号】100165803

【弁理士】

【氏名又は名称】金子修平

(74)【代理人】

【識別番号】100170900

【弁理士】

【氏名又は名称】大西渉

(72)【発明者】

【氏名】ポトリヒト，ジュリアン

(72)【発明者】

【氏名】テゼ，ジャック

【テーマコード（参考）】

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C084AA19

4C084MA17

4C084MA66

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZB33

4C084ZC55

4C084ZC75

4C085AA14

4C085AA16

4C085BB41

4C085BB42

4C085BB43

4C085BB44

4C085CC23

4C085DD62

4C085EE01

4C085EE03

4C085GG01

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA20

4H045EA50

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

本発明は、抗体及びその使用に関する。特に、本発明は、ｇｐ４１の特定のドメインに対する抗体、それを含む医薬組成物、キット又は装置、及びそれらの使用に関する。本発明は、特に、単独又は他の処置／薬剤と組み合わせて、対象におけるＡＩＤＳを処置（例えば治療若しくは予防）、検出又はモニタリングするのに有益である。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＨＩＶｇｐ４１タンパク質のエピトープに結合する単離されたモノクローナル抗体又はその変異体若しくは断片であって、
前記エピトープは、ｇｐ４１タンパク質のＰＥＰ３ドメインの少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、
前記モノクローナル抗体又はその変異体若しくは断片は、ｇｐ４１がＣ１ｑＲに結合するのを阻害する、単離されたモノクローナル抗体又はその変異体若しくは断片。

【請求項2】

ＨＩＶｇｐ４１タンパク質のＰＥＰ３の１つ以上のアミノ酸残基において該ＨＩＶｇｐ４１タンパク質に結合する単離されたモノクローナル抗体又はその変異体若しくは断片であって、
ｇｐ４１がＣ１ｑＲに結合するのを阻害する、単離されたモノクローナル抗体又はその変異体若しくは断片。

【請求項3】

軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体であって、
前記軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号１５、２１、２７、３３、３９若しくは４５から選択される配列からなる若しくは実質的に該配列からなるＣＤＲ－Ｌ１、及び／又は（ｉｉ）配列番号１６、２２、２８、３４、４０若しくは４６から選択される配列からなる若しくは実質的に該配列からなるＣＤＲ－Ｌ２、及び／又は（ｉｉｉ）配列番号１７、２３、２９、３５、４１若しくは４７から選択される配列からなる若しくは実質的に該配列からなるＣＤＲ－Ｌ３を含む、モノクローナル抗体。

【請求項4】

前記軽鎖可変領域は、
配列番号１５、１６及び１７、
配列番号２１、２２及び２３、
配列番号２７、２８及び２９、
配列番号３３、３４及び３５、
配列番号３９、４０及び４１、又は、
配列番号４５、４６及び４７、で示されるＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３を含む、請求項３に記載のモノクローナル抗体。

【請求項5】

重鎖可変領域を含み、
前記重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号１８、２４、３０、３６、４２若しくは４８から選択される配列からなる若しくは実質的に該配列からなるＣＤＲ－Ｈ１、及び／又は（ｉｉ）配列番号１９、２５、３１、３７、４３若しくは４９から選択される配列からなる若しくは実質的に該配列からなるＣＤＲ－Ｈ２、及び／又は（ｉｉｉ）配列番号２０、２６、３２、３８、４４若しくは５０から選択される配列からなる若しくは実質的に該配列からなるＣＤＲ－Ｈ３を含む、請求項３又は４に記載のモノクローナル抗体。

【請求項6】

前記重鎖可変領域は、
配列番号１８、１９及び２０、
配列番号２４、２５及び２６、
配列番号３０、３１及び３２、
配列番号３６、３７及び３８、
配列番号４２、４３及び４４、又は、
配列番号４８、４９及び５０、で示されるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３を含む、請求項５に記載のモノクローナル抗体。

【請求項7】

配列番号３、５、７、９、１１及び１３から選択される配列からなる若しくは実質的に該配列からなる軽鎖可変領域、並びに／又は配列番号４、６、８、１０、１２及び１４から選択される配列からなる若しくは実質的に該配列からなる重鎖可変領域を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。

【請求項8】

配列番号３及び４、
配列番号５及び６、
配列番号７及び８、
配列番号９及び１０、
配列番号１１及び１２、又は、
配列番号１３及び１４、で示される軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む、請求項７に記載のモノクローナル抗体。

【請求項9】

ＨＩＶｇｐ１２０タンパク質に実質的に結合しない、請求項１に記載のモノクローナル抗体。

【請求項10】

４Ｇ１、８Ｄ５、３Ａ２、１５Ｂ４、５Ｅ１２及び９Ｂ１２から選択され、好ましくは４Ｇ１、８Ｄ５、３Ａ２及び１５Ｂ４から選択される、請求項８に記載のモノクローナル抗体。

【請求項11】

ヒト化された、請求項１～１０のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。

【請求項12】

Ｆａｂ、Ｆａｂ’２、ＳｃＦｖ、ナノボディ又はＣＤＲである、請求項１～１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体の断片。

【請求項13】

請求項１～１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体、その軽鎖若しくは重鎖、又はその可変領域をコードするヌクレオチド。

【請求項14】

請求項１～１２のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体、その変異体若しくは断片、又は請求項１３に記載のヌクレオチドを含む組成物。

【請求項15】

医薬的に許容可能な賦形剤をさらに含む、請求項１４に記載の組成物。

【請求項16】

（ｉ）抗ウイルス剤又は（ｉｉ）抗ＰＬＡ２－ＧＩＢ抗体をさらに含む、請求項１４又は１５に記載の組成物。

【請求項17】

容器中に請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗体又はその変異体若しくは断片を含むキット。

【請求項18】

免疫反応を行うための１つ以上の試薬、好ましくは基質若しくはラベル及び／又はマーカー抗体をさらに含む、請求項１７に記載のキット。

【請求項19】

ＥＬＩＳＡ反応のための試薬を含む、請求項１７又は１８に記載のキット。

【請求項20】

処置を必要とする対象に対してＨＩＶの処置をするために用いるための請求項１４～１６のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項21】

サンプル中のＨＩＶｇｐ４１タンパク質を検出する方法であって、
（ｉ）前記サンプルを請求項１～１２のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体、その変異体又は断片に接触するステップと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）において形成された抗体と抗原との複合体の存在を検出するステップとを含む、方法。

【請求項22】

モニタリングを必要とする対象におけるＨＩＶ疾患の進行をモニタリングする方法であって、
請求項１～１２のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体、その変異体又は断片を用いて異なる時間間隔で前記対象から得た血漿サンプル中のｇｐ４１をインビトロで定量することを含む、方法。

【請求項23】

抗ＨＩＶ処置の有効性をモニタリングするための、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

ＨＩＶに感染された対象が抗ＰＬＡ２－ＧＩＢ免疫療法、好ましくは抗ＰＬＡ２－ＧＩＢ抗体療法又はトランスＣＤ４免疫療法の効果を得ているかどうかを決定するための、請求項２２に記載の方法。

【請求項25】

前記サンプル中の請求項１～１２のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体、その変異体若しくは断片の参照値と比較して増大された結合レベルを重症度の指標とする、前記対象におけるＨＩＶ疾患の重症度を決定するための請求項２２に記載の方法。

【請求項26】

前記参照値は、同一の対象から得た初期段階のサンプルで測定された値又は平均値である、請求項２５に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

【背景技術】

【0002】

ｓＰＬＡ２－ＧＩＢがＨＩＶに感染された患者におけるＣＤ４Ｔ細胞の不活性化に関わることが、本発明者らにより文書化されている（ＷＯ２０１５／０９７１４０号を参照）。ｓＰＬＡ２－ＧＩＢモジュレータが、例えば免疫不全に関連する障害等の哺乳動物における疾病を処置するのに有効であることが、本発明者らにより提示及び文書化されている。彼らの研究を継続して、出願人はｓＰＬＡ２－ＧＩＢの効果は、疾病に罹った対象に存在するコファクターにより媒介され及び／又は増幅され、そのようなコファクターはＴ細胞の表面におけるｇＣｉｑ受容体を通って作用することを発見した（ＰＣＴ／ＥＰ２０１９／０５４６８６を参照）。そのようなコファクターのモジュレータが、例えば免疫不全に関連する障害といった哺乳動物における疾病の処置に有効であることが本発明者らにより提示及び文書化されている。ＨＩＶウイルス血症の患者に関して、ｇｐ４１がヒトＣＤ４Ｔ細胞におけるｓＰＬＡ２－ＧＩＢの阻害効果を増大するコファクターとして作用することがより具体的に開示されている。また、ｇｐ４１由来ＰＥＰ３ペプチド単独でもｓＰＬＡ２－ＧＩＢ活性を増大することも示されており、ＰＥＰ３ｇｐ４１配列がｇｐ４１コファクター活性のための重要なドメインであることが提示されている。

【発明の概要】

【0003】

本発明は、ＰＥＰ３配列に特異的な新規の抗ｇｐ４１抗体を開示する。本発明は、そのような抗体、その変異体、その製造、それを含む組成物又は装置、及び例えば検出、モニタリング又はＨＩＶ障害を処置するためのその使用に関する。

【0004】

より具体的に、本発明は、ｇｐ４１タンパク質、特にｇｐ４１のＰＥＰ３ドメインに結合するために選択された抗体及びその変異体を提供する。本発明は、上記抗体の配列、並びに例えばそのｇｐ１２０に対する相対的な特異性、ＣＤ４Ｔ細胞におけるＨＩＶウイルス血症患者の血漿の阻害活性の抑制能、及び／又はＨＩＶウイルス血症患者の血漿におけるｇｐ４１産物の定量能といった機能的特徴を開示する。

【0005】

全体的に、これらの抗体は、ＨＩＶ患者の血漿又は他のサンプル中のｇｐ４１濃度を追うために、及びＨＩＶ疾患の重症度又はＨＩＶウイルス血症患者の予後を予測するために用いられ得る。

【図面の簡単な説明】

【0006】

【図1】図１はＣＤ４Ｔ細胞におけるｓＰＬＡ２－ＧＩＢ活性のｇｐ４１による制御のモデル図である。このモデル図は、ＣＤ４Ｔ細胞におけるＰＬＡ２－ＧＩＢの作用機構を要約する。ヒトにおけるインビボで、小サイズ（平均直径１００ｎｍ）の生理学的細胞膜マイクロドメイン（ｐＭＭＤｓ）は、ガンマｃサイトカイン（例えばＩＬ－７、ＩＬ－２及びＩＬ－４）及びＣＤ４Ｔ細胞におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の活性化により誘導され、それらのシグナル経路のために必要である。ＨＩＶウイルス血症患者の血漿において、ＰＬＡ２－ＧＩＢは、生理学的受容体を捕捉及び不活性化する大サイズ（直径が２００ｎｍより大きい）の異常細胞膜マイクロドメイン（ａＭＭＤｓ）を誘導するようにｇｐ４１と協力する。マウスにおけるインビボ、又はマウス及びヒト精製ＣＤ４Ｔ細胞におけるインビトロにおいて、高濃度のＰＬＡ２－ＧＩＢは単独で、ガンマｃサイトカイン及びＴＣＲ刺激に対するＣＤ４Ｔ細胞応答を阻害できる。ウイルス血症の血漿に存在するような、ＨＩＶウイルス血症の血漿単独、並びに低濃度ＰＬＡ２－ＧＩＢ及びｇｐ４１は、ガンマｃサイトカインシグナリング経路の効率を低減する。このモデル図は、どのようにＰＬＡ２－ＧＩＢがＨＩＶに感染された患者において観察されるアネルギー及びリンパ球減少に関係するかを説明する。

【図2】図２はＰＬＡ２－ＧＩＢ活性とｇｐ４１との間の相乗効果を示す。（Ａ）組換型ｇｐ４１タンパク質は、ＩＬ－７に応答したリン酸化ＳＴＡＴ５の核移行（ｐＳＴＡＴ５ＮＴ）におけるＰＬＡ２－ＧＩＢの阻害活性に対するＣＤ４Ｔ細胞の感受性を引き起こす。ＩＬ－７に応答したｐＳＴＡＴ５ＮＴにおけるＰＬＡ２－ＧＩＢ活性の組換型ｇｐ４１タンパク質の用量効果が示されている。健康なドナーからの精製ＣＤ４Ｔ細胞を種々の量のｇｐ４１又はバッファー（ＰＢＳ／１％ＢＳＡ）で前処理を１５分間行い、５ｎＭのＰＬＡ２－ＧＩＢの存在下又は非存在下（ｗ／ｏ）で３０分間インキュベートし、ＩＬ－７で１５分間刺激した。ｐＳＴＡＴ５ＮＴを共焦点顕微鏡により分析した。３つの試験のうちの１つの代表的試験を示す。（Ｂ）３人の独立した健康なドナーのＣＤ４Ｔ細胞を３４ｎＭのｇｐ４１で１５分間処理し、５ｎＭのＰＬＡ２－ＧＩＢで３０分間処理し又は処理せず（ｗ／ｏ）、ＩＬ－７で１５分間処理した試験の要約を示す。Ａ及びＢにおいて、ＩＬ－７を含むバッファーに応答したｐＳＴＡＴ５ＮＴで正規化されたｐＳＴＡＴ５ＮＴの阻害の割合を示す結果である。（Ｂ）３人のドナーからのＣＤ４Ｔ細胞におけるｐＳＴＡＴ５ＮＴ細胞阻害の割合の平均±ＳＤとしての結果を示す。ＰＬＡ２－ＧＩＢで処理せずｇｐ４１単独の場合と比較したｇｐ４１及び５ｎＭのＰＬＡ２－ＧＩＢの阻害の差異の統計分析は、ｔｗｏｔａｉｌｅｄｕｎｐａｉｒｅｄｔ検定により行われ、＊はｐ＜０．０５を意味する。（Ｃ）ＩＬ－７に応答したｐＳＴＡＴ５ＮＴの阻害割合において、ＰＬＡ２－ＧＩＢ活性におけるＰＥＰ３及びＣＴＬペプチドの用量効果を示す。健康なドナーからの精製ＣＤ４Ｔ細胞に対して、種々の用量のＰＥＰ３若しくはＣＴＬペプチド又はバッファー（ＰＢＳ／１％ＢＳＡ）で前処理を１５分間行い、５ｎＭのＰＬＡ２－ＧＩＢで３０分間処理し又は処理せず（ｗ／ｏ）、ＩＬ－７で１５分間処理した。ｐＳＴＡＴ５ＮＴを共焦点顕微鏡により分析した。２つの試験のうちの１つの代表的試験を示す。（Ｄ）４人の独立した健康なドナーのＣＤ４Ｔ細胞に対して、２７５ｎＭのＰＥＰ３を５ｎＭのＰＬＡ２－ＧＩＢ４５を含む又は含まず（ｗ／ｏ）に４５分間処理し、ＩＬ－７で１５分間刺激した試験の要約を示す。Ｃ及びＤは、ＩＬ－７を含むバッファーに応答したｐＳＴＡＴ５ＮＴで正規化されたｐＳＴＡＴ５ＮＴの阻害割合として結果を示す。（Ｄ）４人の健康なドナーからのＣＤ４Ｔ細胞におけるｐＳＴＡＴ５ＮＴ細胞阻害の割合の平均±ＳＤとして結果を示す。ＰＬＡ２－ＧＩＢで処理せずＰＥＰ３単独の場合と比較したＰＥＰ３及び５ｎＭのＰＬＡ２－ＧＩＢの阻害の差異の統計分析は、ｔｗｏｔａｉｌｅｄｕｎｐａｉｒｅｄｔ検定により行われ、＊＊はｐ＜０．０１を意味する。

【図3】図３は抗ｇｐ４１抗体によるウイルス血症患者の血漿の免疫除去がＣＤ４Ｔ細胞においてｐＳＴＡＴ５ＮＴにおけるＰＬＡ２－ＧＩＢの阻害活性を抑制すること（すなわち、ＰＬＡ２－ＧＩＢによる不活性化に対するＣＤ４Ｔ細胞の耐性の回復）を示す。（Ａ）ヤギ抗ｇｐ４１ｐＡｂは、ｇｐ１２０ではなくｇｐ４１に結合する。抗ｇｐ４１ｐＡｂを用いたイムノブロット：１００ｎｇ及び２００ｎｇのＤ１１７ＩＩＩｇｐ１２０又は１００ｎｇのＭＮｇｐ４１組換型タンパク質を、還元条件における４％～２０％のＴｒｉｓ－ＢｉｓＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ膜に転写した。抗ｇｐ４１ｐＡｂ（５μｇ／ｍｌ）の結合を、ロバ抗ヤギＩｇＧ－ＨＲＰ（１：１００００）で検出した。（Ｂ）３人の独立した健康なドナーのからの精製ＣＤ４Ｔ細胞を、３つの独立した試験において、ＰＬＡ２－ＧＩＢに対する感受性の陽性対照としてＰＬＡ２－ＧＩＢ単独、健康なドナー（ＨＤ）の血漿又はウイルス血症患者（ＶＰ）の血漿で３０分間処理し、事前に、抗ｇｐ４１ポリクローナルを用いた枯渇（ｐＡｂａｎｔｉ－ｇｐ４１）、対照ポリクローナル抗体（ｐＡｂｃｔｒｌ）での処理又は抗体（単独）の処理をせず、またＩＬ－７で１５分間刺激した。ＩＬ－７を含むバッファーに応答したｐＳＴＡＴ５ＮＴで正規化されたｐＳＴＡＴ５ＮＴの阻害割合を結果として示す。ｐＡｂａｎｔｉ－ｇｐ４１で処理されたウイルス血症の血漿と比較したｐＡｂｃｔｒｌでのｐＳＴＡＴ５ＮＴ阻害の差異の統計分析は、ｔｗｏｔａｉｌｅｄｕｎｐａｉｒｅｄｔ検定により行われ、＊＊はｐ＜０．０１を意味し、＊＊＊はｐ＜０．００１を意味する。

【図4】図４は、クマシーブルーにより染色されたＳＤＳ－ＰＡＧＥポリアクリルアミドゲルにおける抗ＰＥＰ３ｍＡｂの特徴付けを示す。６つの抗ＰＥＰ３ｍＡｂである、３Ａ２（レーン３）、４Ｇ１（レーン４）、８Ｄ５（レーン５）、９Ｂ１２（レーン６）、５Ｅ１２（レーン７）及び１５Ｂ４（レーン８）は、クマシーブルー染色後にＳＤＳ－ＰＡＧＥポリアクリルアミドゲルにおいて予測されるパターンを示す。分子量タンパク質ラダー（レーン１）、対照マウスＩｇＧ（レーン２）及び選択された６つの精製抗ＰＥＰ３ｍＡｂを（Ａ）還元条件（１３．５％ポリアクリルアミド）及び（Ｂ）非還元条件（７．５％ポリアクリルアミド）においてＳＤＳ－ＰＡＧＥポリアクリルアミドゲルで分離した。

【図5A-F】図５Ａ－Ｆは、ＰＥＰ３ペプチド及びｇｐ４１組換型タンパク質のＥＬＩＳＡによる抗ＰＥＰ３ｇｐ４１ｍＡｂの特徴付けを示す。ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートを、１μｇ／ｍｌの（Ａ）ＨＩＶＭＮｇｐ４１又は（Ｂ）ＢＳＡ－ＰＥＰ３ペプチドの溶液５０μｌでコーティングした。ＰＥＰ３配列は下記パネルＡで詳しく示す。１００～０．０００１μｇ／ｍｌである６つのｍＡｂの種々の希釈液５０μｌの結合を、ヤギ抗マウスＩｇＧのＨＲＰコンジュゲートＦ（ａｂ）’２断片を用いて試験して示した。（Ｃ）ＭＮｇｐ４１（Ｅ．Ｃｏｌｉで生成）及びＢＳＡ－ＰＥＰ３に対する６つの抗ＰＥＰ３ｍＡｂ結合のＥＣ５０を抗体のμｇ／ｍｌで示す。ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートを、１μｇ／ｍｌの（Ｄ）ＨＩＶＭＮｇｐ４１（Ｓ２細胞で生成）又は（Ｅ）ＨＸＢ２ｇｐ４１（２９３細胞で生成）の１００μｌ溶液でコーティングした。（Ｄ）１００～０．０００１μｇ／ｍｌ及び（Ｅ）１００～１０^－１０μｇ／ｍｌの６つのｍＡｂの種々の希釈液１００μｌの結合を、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧを用いて試験して示す。（Ｆ）ＭＮｇｐ４１（Ｓ２細胞で生成）及びＨＸＢ２に対する６つの抗ＰＥＰ３ｍＡｂの結合のＥＣ５０を、抗体のμｇ／ｍｌで示す。

【図6A-F】図６Ａ－Ｆは、４Ｇ１軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）可変領域の配列を示す。（Ａ～Ｃ）４Ｇ１ＶＬは再配列され、生産的ＩＧＫ配列であり、データベース（Ｕｎｉｐｒｏｔデータバンク－ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ）に同等物が無いカッパアイソタイプである。（Ａ）４Ｇ１ＶＬ領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。４Ｇ１ＶＬ可変領域の配列は黒字であり、定常領域Ｃｋの部分配列、マウスＩＧＫＣ^＊０１アレルは、赤字及びイタリックである。（Ｂ）マウス初期配列（http://www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/）に対する４Ｇ１ＶＬの比較を示す。（Ｃ）４Ｇ１ＶＬの代表的な機能的構造及びモデルを示す（IMGT Colliers de Perles）。（Ｄ～Ｆ）４Ｇ１ＶＨは再配列され、生産的ＩＧＨ配列であり、データベース（Ｕｎｉｐｒｏｔデータバンク－ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ）に同等物が無いＩｇＧ２ｂアイソタイプである。（Ｄ）４Ｇ１ＶＨ領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。ＶＨ可変領域の配列は黒字であり、定常領域ＣＨ１の部分配列、マウスＩＧＨＧ２ｂ^＊０２アレルは赤字及びイタリックである。（Ｅ）マウス初期配列（http://www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/）に対する４Ｇ１ＶＨの比較を示す。（Ｆ）４Ｇ１ＶＨの代表的な機能的構造及びモデルを示す（IMGT Colliers de Perles）。

【図7A-F】図７Ａ－Ｆは、３Ａ２軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）可変領域の配列を示す。（Ａ～Ｃ）３Ａ２ＶＬは再配列され、生産的ＩＧＫ配列であり、データベース（Ｕｎｉｐｒｏｔデータバンク－ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ）に同等物が無いカッパアイソタイプである。（Ａ）３Ａ２ＶＬ領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。３Ａ２ＶＬ可変領域の配列は黒字であり、定常領域Ｃｋの部分配列、マウスＩＧＫＣ^＊０１アレルは赤字及びイタリックである。（Ｂ）マウス初期配列（http://www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/）に対する３Ａ２ＶＬの比較を示す。（Ｃ）３Ａ２ＶＬの代表的な機能的構造及びモデルを示す（IMGT Colliers de Perles）。（Ｄ～Ｆ）３Ａ２ＶＨは再配列され、生産的ＩＧＨ配列であり、データベース（Ｕｎｉｐｒｏｔデータバンク－ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ）に同等物が無いＩｇＧ２ｃアイソタイプである。（Ｄ）３Ａ２ＶＨ領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。ＶＨ可変領域の配列は黒字であり、定常領域ＣＨ１の部分配列、マウスＩＧＨＧ２ｃ^＊０２アレルは赤字及びイタリックである。（Ｅ）マウス初期配列（http://www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/）に対する３Ａ２ＶＨの比較を示す。（Ｆ）３Ａ２ＶＨの代表的な機能的構造及びモデルを示す（IMGT Colliers de Perles）。

【図8A-F】図８Ａ－Ｆは、８Ｄ５軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）可変領域の配列を示す。（Ａ～Ｃ）８Ｄ５ＶＬは再配列され、生産的ＩＧＫ配列であり、データベース（Ｕｎｉｐｒｏｔデータバンク－ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ）に同等物が無いカッパアイソタイプである。（Ａ）８Ｄ５ＶＬ領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。８Ｄ５ＶＬ可変領域の配列は黒字であり、定常領域Ｃｋの部分配列、マウスＩＧＫＣ^＊０１アレルは赤字及びイタリックである。（Ｂ）マウス初期配列（http://www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/）に対する８Ｄ５ＶＬの比較を示す。（Ｃ）８Ｄ５ＶＬの代表的な機能的構造及びモデルを示す（IMGT Colliers de Perles）。（Ｄ～Ｆ）８Ｄ５ＶＨは再配列され、生産的ＩＧＨ配列であり、データベース（Ｕｎｉｐｒｏｔデータバンク－ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ）に同等物が無いＩｇＧ２ｂアイソタイプである。（Ｄ）８Ｄ５ＶＨ領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。ＶＨ可変領域の配列は黒字であり、定常領域ＣＨ１の部分配列、マウスＩＧＨＧ２ｂ^＊０１アレルは赤字及びイタリックである。（Ｅ）マウス初期配列（http://www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/）に対する８Ｄ５ＶＨの比較を示す。（Ｆ）８Ｄ５ＶＨの代表的な機能的構造及びモデルを示す（IMGT Colliers de Perles）。

【図9A-F】図９Ａ－Ｆは、１５Ｂ４軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）可変領域の配列を示す。（Ａ～Ｃ）１５Ｂ４ＶＬは再配列され、生産的ＩＧＫ配列であり、データベース（Ｕｎｉｐｒｏｔデータバンク－ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ）に同等物が無いカッパアイソタイプである。（Ａ）１５Ｂ４ＶＬ領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。１５Ｂ４ＶＬ可変領域の配列は黒字であり、定常領域Ｃｋの部分配列、マウスＩＧＫＣ^＊０１アレルは赤字及びイタリックである。（Ｂ）マウス初期配列（http://www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/）に対する１５Ｂ４ＶＬの比較を示す。（Ｃ）１５Ｂ４ＶＬの代表的な機能的構造及びモデルを示す（IMGT Colliers de Perles）。（Ｄ～Ｆ）１５Ｂ４ＶＨは再配列され、生産的ＩＧＨ配列であり、データベース（Ｕｎｉｐｒｏｔデータバンク－ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ）に同等物が無いＩｇＧ２ｂアイソタイプである。（Ｄ）１５Ｂ４ＶＨ領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。ＶＨ可変領域の配列は黒字であり、定常領域ＣＨ１の部分配列、マウスＩＧＨＧ２ｂ^＊０１アレルは赤字及びイタリックである。（Ｅ）マウス初期配列（http://www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/）に対する１５Ｂ４ＶＨの比較を示す。（Ｆ）１５Ｂ４ＶＨの代表的な機能的構造及びモデルを示す（IMGT Colliers de Perles）。

【図10A-F】図１０Ａ－Ｆは、５Ｅ１２軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）可変領域の配列を示す。（Ａ～Ｃ）５Ｅ１２ＶＬは再配列され、生産的ＩＧＫ配列であり、データベース（Ｕｎｉｐｒｏｔデータバンク－ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ）に同等物が無いカッパアイソタイプである。（Ａ）５Ｅ１２ＶＬ領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。５Ｅ１２ＶＬ可変領域の配列は黒字であり、定常領域Ｃｋの部分配列、マウスＩＧＫＣ^＊０１アレルは赤字及びイタリックである。（Ｂ）マウス初期配列（http://www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/）に対する５Ｅ１２ＶＬの比較を示す。（Ｃ）５Ｅ１２ＶＬの代表的な機能的構造及びモデルを示す（IMGT Colliers de Perles）。（Ｄ～Ｆ）５Ｅ１２ＶＨは再配列され、生産的ＩＧＨ配列であり、データベース（Ｕｎｉｐｒｏｔデータバンク－ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ）に同等物が無いＩｇＧ１アイソタイプである。（Ｄ）５Ｅ１２ＶＨ領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。ＶＨ可変領域の配列は黒字であり、定常領域ＣＨ１の部分配列、マウスＩＧＨＧ１^＊０１アレルは赤字及びイタリックである。（Ｅ）マウス初期配列（http://www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/）に対する５Ｅ１２ＶＨの比較を示す。（Ｆ）５Ｅ１２ＶＨの代表的な機能的構造及びモデルを示す（IMGT Colliers de Perles）。

【図11A-F】図１１Ａ－Ｆは、９Ｂ１２軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）可変領域の配列を示す。（Ａ～Ｃ）９Ｂ１２ＶＬは再配列され、生産的ＩＧＫ配列であり、データベース（Ｕｎｉｐｒｏｔデータバンク－ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ）に同等物が無いカッパアイソタイプである。（Ａ）９Ｂ１２ＶＬ領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。９Ｂ１２ＶＬ可変領域の配列は黒字であり、定常領域Ｃｋの部分配列、マウスＩＧＫＣ^＊０１アレルは赤字及びイタリックである。（Ｂ）マウス初期配列（http://www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/）に対する９Ｂ１２ＶＬの比較を示す。（Ｃ）９Ｂ１２ＶＬの代表的な機能的構造及びモデルを示す（IMGT Colliers de Perles）。（Ｄ～Ｆ）９Ｂ１２ＶＨは再配列され、生産的ＩＧＨ配列であり、データベース（Ｕｎｉｐｒｏｔデータバンク－ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ）に同等物が無いＩｇＧ２ｃアイソタイプである。（Ｄ）９Ｂ１２ＶＨ領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。ＶＨ可変領域の配列は黒字であり、定常領域ＣＨ１の部分配列、マウスＩＧＨＧ２ｃ^＊０１アレルは赤字及びイタリックである。（Ｅ）マウス初期配列（http://www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/）に対する９Ｂ１２ＶＨの比較を示す。（Ｆ）９Ｂ１２ＶＨの代表的な機能的構造及びモデルを示す（IMGT Colliers de Perles）。

【図12】図１２は、４Ｇ１への抗ＰＥＰ３ｍＡｂ親和性及び特異性の要約を示す。（Ａ）ＢＳＡ－ＰＥＰ３、ＭＮｇｐ４１（Ｅ．Ｃｏｌｉで生成）、ＭＮｇｐ４１（Ｓ２で生成）及びＨＸＢ２ｇｐ４１、並びに抗体アイソタイプでのコーティングに対する結合の６つのｍＡｂのＥＣ５０の要約を示す。４Ｇ１、８Ｄ５、３Ａ２及び１５Ｂ４の４つのｍＡｂは、ｇｐ４１組換型タンパク質及びＰＥＰ３ペプチドの両方に結合する。最初に行われたＥＬＩＳＡでｇｐ４１タンパク質及びＰＥＰ３ペプチドに対して最も高い結合効率を有するため、４Ｇ１が選択された（Ｅ．Ｃｏｌｉで生成されたＭＮｇｐ４１）。５Ｅ１２及び９Ｂ１２の２つのｍＡｂは、ＰＥＰ３ペプチドに結合するがｇｐ４１タンパク質には結合しない又は非常に低い効率で結合する。（Ｂ、Ｃ）抗ＰＥＰ３ｇｐ４１ｍＡｂ４Ｇ１は、ｇｐ４１に結合するがｇｐ１２０には結合しない。（Ｂ）ＥＬＩＳＡ：マイクロタイタープレートのウェルを１０μｇのＤ１１７ＩＩＩｇｐ４１又はＤ１１７ＩＩＩｇｐ１２０組換型タンパク質で一晩中コーティングし、タンパク質に対する４Ｇ１（１μｇ／ｗｅｌｌ）の結合をヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰを用いて明示化した。トリプリケートの平均±ＳＤで結果を示す。（Ｃ）４Ｇ１ｍＡｂを用いたイムノブロット：５００ｎｇ又は１μｇのＤ１１７ＩＩＩｇｐ１２０又はＭＮｇｐ４１組換型タンパク質を、還元条件において４％～２０％のＴｒｉｓ－ＢｉｓＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ膜に転写した。抗体の結合を１μｇ／ｍｌで試験し、ヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（１：１００００）で明示化した。

【図13】図１３は、４Ｇ１抗ＰＥＰ３によるウイルス血症の血漿の免疫除去がＣＤ４Ｔ細胞におけるｐＳＴＡＴ５ＮＴに対するＰＬＡ２－ＧＩＢの阻害活性を抑制することを示す。３人の独立した健康なドナーからの精製ＣＤ４Ｔ細胞を、３つの独立した試験において、ＰＬＡ２－ＧＩＢに対する感受性の陽性対照としてＰＬＡ２－ＧＩＢ単独、健康なドナー（ＨＤ）の血漿若しくはウイルス血症患者（ＶＰ）の血漿単独（ｗ／ｏＡｂ）、又は１０～３０ｋＤａのＨＤ若しくはＶＰ断片で３０分間処理し、事前に４Ｇ１抗ＰＥＰ３ｍＡｂ又は対照ｍＡｂ（ｍＡｂｃｔｒｌ）で処理し、ＩＬ－７で１５分間刺激した。ＩＬ－７を含むバッファーに応答したｐＳＴＡＴ５ＮＴで正規化されたｐＳＴＡＴ５ＮＴの阻害割合の平均±ＳＤで結果を示す。４Ｇ１で処理された１０～３０ｋＤａのＶＰ血漿と比較したｍＡｂｃｔｒｌ処理でのｐＳＴＡＴ５ＮＴ阻害の差異の統計分析は、ｔｗｏｔａｉｌｅｄｕｎｐａｉｒｅｄｔ検定により行われ、＊＊はｐ＜０．０１を意味し、＊＊＊はｐ＜０．００１を意味する。

【図14】図１４は、ヤギ抗ｇｐ４１抗体又は４Ｇ１抗ＰＥＰ３によるウイルス血症の血漿の免疫除去が、ＣＤ４Ｔ細胞におけるｐＳＴＡＴ５ＮＴに対するＰＬＡ２－ＧＩＢの阻害活性を同様に抑制することを示す。４Ｇ１及びヤギ抗ｇｐ４１抗体の効果と比較するため、図３及び図１３で示された結果の要約を示す。（Ａ、Ｂ）ＣＤ４Ｔ細胞において抗ｇｐ４１（ｇｐ４１）ポリクローナル抗体（ｐＡｂ）（Ａ）若しくは４Ｇ１抗ＰＥＰ３ｍＡｂ（抗ＰＥＰ３）（Ｂ）を用いて除去された、又は対照（ｃｔｒｌ）若しくは除去しない（ｗ／ｏＡｂ）場合の１％又は３％の血漿の阻害活性を示す。（Ａ、Ｂ）３人のドナーにおけるｐＳＴＡＴ５ＮＴ細胞阻害の割合の平均±ＳＤとして結果を示す。ｔｗｏｔａｉｌｅｄｕｎｐａｉｒｅｄｔ検定により、＊＊はｐ＜０．０１を意味し、＊＊＊はｐ＜０．００１を意味する。

【図15】図１５は、４Ｇ１抗ＰＥＰ３ｍＡｂ及びヤギ抗ｇｐ４１ｐＡｂを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡを示す。（Ａ）ＥＬＩＳＡの概略図を示す。（Ｂ）４Ｇ１は、ＥＬＩＳＡによりＭＮｇｐ４１を定量するためにヤギ抗ｇｐ４１ｐＡｂと共に用いられ得る。ＭＮｇｐ４１抗原を用いるヤギ抗ｇｐ４１ｐＡｂと４Ｇ１との結合の試験である。マイクロタイタープレートを、１０μｇ／ｍｌの４Ｇ１を用いて１００μｌ／ｗｅｌｌでコーティングし、ブロッキング後、種々の量のＭＮｇｐ４１組換体（Ｓ２細胞で生成）を加えた。コーティングされた４Ｇ１に対して結合されたｇｐ４１の検出を、５μｇ／ｍｌのビオチン化ヤギ抗ｇｐ４１ｐＡｂを用いて１００μｌ／ｗｅｌｌで行い、１：２００００のＨＲＰストレプトアビジンで明示化した。（Ｃ、Ｄ）４Ｇ１、８Ｄ５、３Ａ２及び１５Ｂ４は、ＨＸＢ２ｇｐ４１抗原を定量するためにヤギ抗ｇｐ４１ｐＡｂと共に用いられ得る。（Ｃ）ＨＸＢ２ｇｐ４１抗原を用いるヤギ抗ｇｐ４１ｐＡｂと４Ｇ１、３Ａ２、８Ｄ５及び１５Ｂ４の結合の試験である。マイクロタイタープレートを、１０μｇ／ｍｌの４Ｇ１、３Ａ２、８Ｄ５及び１５Ｂ４ｍＡｂを用いて１００μｌ／ｗｅｌｌでコーティングし、ブロッキング後、種々の量のＨＸＢ２ｇｐ４１組換体を加えた。コーティングされた抗ＰＥＰ３ｍＡｂに対して結合されたｇｐ４１の検出を、５μｇ／ｍｌのビオチン化ヤギ抗ｇｐ４１ｐＡｂを用いて１００μｌ／ｗｅｌｌで行い、１：２００００のＨＲＰストレプトアビジンで明示化した。（Ｄ）Ｃで示されたｇｐ４１のμｇ／ｍｌにおけるＨＢＸ２ｇｐ４１検出のＥＣ５０を示す。（Ｅ）４Ｇ１は、ＨＢＸ２ｇｐ４１を定量するために他の抗ＰＥＰ３ｍＡｂと共に用いられ得る。ＨＸＢ２ｇｐ４１抗原を用いる３Ａ２、８Ｄ５及び１５Ｂ４と４Ｇ１との結合の試験を示す。マイクロタイタープレートを、（Ｅ）１０μｇ／ｍｌの３Ａ２、８Ｄ５及び１５Ｂ４ｍＡｂを用いて１００μｌ／ｗｅｌｌでコーティングし、ブロッキング後、種々の量のＨＸＢ２ｇｐ４１組換体を加えた。コーティングされた抗ＰＥＰ３ｍＡｂに対して結合されたｇｐ４１の検出を、２０μｇ／ｍｌのビオチン化４Ｇ１を用いて１００μｌ／ｗｅｌｌで行い、１：２００００のＨＲＰストレプトアビジンで明示化した。

【図16A-B】図１６Ａ－Ｂは、ＥＬＩＳＡによるＨＩＶウイルス血症患者の血漿におけるｇｐ４１を検出するための追加の抗ｇｐ４１ｍＡｂの開発を示す。（Ａ）ｇｐ４１配列におけるＰＥＰ３及び５１８４－３ペプチドの位置を示す。両方のペプチドは、ＭＮｇｐ４１の外部ドメインに位置する。（Ｂ）ＰＥＰ３及び５１８４－３ペプチドの分子局在を示す。ＰＥＰ３は、ＨＲ２のＣ末部（＝Ｃ末端ヘプタッドリピート）におけるｇｐ４１ループ及び５１８４－３ペプチドのＣ末部に位置する。

【図17】図１７は、抗ＨＲ２ｇｐ４１ハイブリドーマの特徴付けを示す。（Ａ）マウスの免疫付与のために用いられた５１８４－３ペプチドの配列及びＨＸＢ２組換型タンパク質における対応配列を示す。ＨＸＢ２におけるアミノ酸置換を赤字で示す。（Ｂ）ＭＮ及びＨＸＢ２ｇｐ４１組換型タンパク質におけるハイブリドーマ上清を用いたＥＬＩＳＡを示す。マイクロタイタープレートを１μｇ／ｍｌのＢＳＡ－５１８４－３ペプチド、ＭＮ及びＨＸＢ２ｇｐ４１組換型タンパク質の５０μｌ溶液でコーティングした。ハイブリドーマ上清を、そのまま又は１：１０で試験した。抗体の結合は、ＨＲＰ－抗マウスＩｇＧを用いて明示化した。ハイブリドーマ上清で生成された抗体のアイソタイプが示されている。６３Ｇ４ハイブリドーマは、主にＩｇＧ１および多少のＩｇＭ抗体を含むポリクローナルである。６３Ｇ４、６７Ｄ７及び６９Ｄ９は、全てマウスＳ１２由来である。７２Ｄ７はマウスＳ１３由来である。

【図18A-C】図１８Ａ－Ｃは、腹水からのマウスにおけるインビボで生成された精製抗ＨＲ２ハイブリドーマＡｂ及び４Ｇ１は、ビオチン化され又はされず、ＥＬＩＳＡによってｇｐ４１ペプチド及びＨＸＢ２ｇｐ４１で検証された。（Ａ）４つの抗ＨＲ２抗体における精製抗体の純度及び量を示す。６７Ｄ７及び７２Ｄ７における良好な収率及び９５％を超える純度は、これらの抗体のビオチン化を可能とする。（Ｂ、Ｃ）ｇｐ４１ペプチド及びＨＸＢ２ｇｐ４１タンパク質に対する抗体の結合の試験を示す。（Ｂ）マイクロタイタープレートを５０μｌのＰＥＰ３（２μｇ／ｍｌ）又はＢＳＡ－５１８４－３（１μｇ／ｍｌ）でコーティングした。４Ｇ１及びビオチン化４Ｇ１（４Ｇ１－ｂｉｏｔ）をＰＥＰ３でコーティングされたウェルで試験した。７２Ｄ７及び６７Ｄ７ビオチン化（７２Ｄ７－ｂｉｏｔ、６７Ｄ７－ｂｉｏｔ）又は非ビオチン化を、ＢＳＡ－５１８４－３ペプチドでコーティングされたウェルで試験した。（Ｃ）マイクロタイタープレートを５０μｌのＨＸＢ２ｇｐ４１（１μｇ／ｍｌ）でコーティングした。（Ｂ、Ｃ）１μｇ／ｍｌ抗体における１００～０．０００１の種々の希釈液５０μｌの結合をビオチン化抗体のためのＨＲＰ－ストレプトアビジン（１：１０００）又は非ビオチン化抗体のためのＨＲＰ－抗マウスＩｇＧ（１：５０００）で明示化した。

【図19A-E】図１９Ａ－Ｅは、サンドイッチＥＬＩＳＡによる抗ＨＲ２及び４Ｇ１抗体の結合の試験を示す。捕捉抗体としての７２Ｄ７及び検出抗体としてのビオチン化４Ｇ１は、ＨＸＢ２ｇｐ４１の定量を可能とする。捕捉抗体（Ａ）抗ＰＥＰ３４Ｇ１（１０μｇ／ｍｌ）、（Ｂ）抗ＨＲ２６３Ｇ４（１０μｇ／ｍｌ）、（Ｃ）抗ＨＲ２６７Ｄ７（２０μｇ／ｍｌ）、（Ｄ）抗ＨＲ２６９Ｄ６（１０μｇ／ｍｌ）、又は（Ｅ）抗ＨＲ２７２Ｄ７（１０μｇ／ｍｌ）におけるビオチン化４Ｇ１（０．１μｇ／ｍｌ）、７２Ｄ７（５０μｇ／ｍｌ）及び６７Ｄ７（１００μｇ／ｍｌ）の結合の試験を示す。（Ａ～Ｅ）マイクロタイタープレートを５０μｌの捕捉Ａｂ溶液でコーティングした。ＨＸＢ２ｇｐ４１の種々の希釈液（０、０．１、１及び１０μｇ／ｍｌ）５０μｌを加えた。その結合を、ビオチン化検出Ａｂを加えることによるサンドイッチＥＬＩＳＡにより試験し、ＨＲＰ－ストレプトアビジン（１：１０００）で明示化した。

【図20】図２０は、抗ＨＲ２７２Ｄ７及び４Ｇ１ｍＡｂ又はヤギ抗ｇｐ４１ｐＡｂを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡを示す。７２Ｄ７は、ＨＸＢ２ｇｐ４１を定量するために４Ｇ１ｍＡｂ又はヤギ抗ｇｐ４１ｐＡｂと共に用いられ得る。ＨＸＢ２ｇｐ４１抗原を用いた４Ｇ１ｍＡｂ又はヤギ抗ｇｐ４１ｐＡｂと抗ＨＲ２７２Ｄ７ｍＡｂの結合の試験を示す。マイクロタイタープレートを１０μｇ／ｍｌの７２Ｄ７を用いて１００μｌ／ｗｅｌｌでコーティングし、ブロッキング後に、種々の量のＨＸＢ２ｇｐ４１組換体を加えた。コーティングされた７２Ｄ７に結合されたｇｐ４１の検出を、２０μｇ／ｍｌのビオチン化４Ｇ１ｍＡｂ又は５μｇ／ｍｌのビオチン化ヤギ抗ｇｐ４１ｐＡｂの１００μｌ／ｗｅｌｌを用いて行い、１：２００００のＨＲＰ－ストレプトアビジンで明示化した。

【発明を実施するための形態】

【0007】

本発明は、概して新規抗体及びその使用に関する。本発明は特に、ＨＩＶウイルス血症患者におけるｇｐ４１コファクター活性を阻害するために用いられ得る抗ＰＥＰ３抗体を開示する。さらに、これらの抗体は、ＨＩＶウイルス血症患者の血漿におけるｇｐ４１の定量、及び抗レトロウイルス処置の際のｇｐ４１濃度の結果を追求するのに用いられ得る。

【0008】

定義
本明細書で用いられる「ｇｐ４１」の用語は、ＨＩＶウイルスによりコードされる実質的に４１ｋＤａの糖タンパク質を示す。ｇｐ４１の配列は、Ｇｅｎｂａｎｋの例えばＮｏ．ＡＡＣ３１８１７．１で得られる。代表的なｇｐ４１タンパク質のアミン酸配列は配列番号１として示される。配列番号１（配列番号２）のアミノ酸９７～１１１番目は、ＰＥＰ３配列又はドメイン又はペプチドを指すｇｐ４１のドメインを示す。

【0009】

ｇｐ４１の用語は、多型又はスプライシングから生じる変異体等の、その自然変異体を含むタンパク質の形態を示す。「ｇｐ４１」の用語は、配列番号１の配列を含むタンパク質、又は多型若しくはスプライシングから生じる変異体等のその自然変異体を典型的に示す。

【0010】

一般に、「抗体」の用語は、重鎖及び軽鎖を含むイムノグロブリン型分子を示す。典型的な抗体は、２つの重鎖及び２つの軽鎖からなる基本的な単量体の「Ｈ２Ｌ２」構造を有する。重鎖のそれぞれは軽鎖と結合する。重鎖及び軽鎖は、「可変領域」又は「可変ドメイン」を含む。重鎖の可変ドメインは、「ＶＨ」と呼ばれ得る。軽鎖の可変ドメインは、「ＶＬ」と呼ばれ得る。これらのドメインは、一般に抗体の最も変化可能な領域であり、抗原結合サイトを含む。軽鎖又は重鎖可変領域（ＶＬ又はＶＨ）は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」と呼ばれる３つの超可変領域によって分断されたフレームワーク領域からなる。

【0011】

抗体の「断片」は、抗原結合を与える抗体の部分を示す。断片は典型的に、Ｆａｂ、Ｆａｂ’２、ＳｃＦｖ、ナノボディ又はＣＤＲを示す。

【0012】

本明細書で用いられる抗体の「変異体」は、参照抗体の抗原特異性を維持するが、典型的にはその特性が改善するように１つ以上のアミノ酸残基が（例えば化学的に又は生物学的に）修飾された抗体を意味する。そのような化学的修飾の例は、例えばアルキル化、ＰＥＧ化、アシル化、エステル又はアミド形態等を含む。特に変異体は、水溶性ポリマー等の１つ以上の追加の非タンパク質性成分を含むように修飾された本明細書で開示されるような抗体である。水溶性ポリマーの例は、以下に限られないが、ＰＥＧ、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン及びポリビニルアルコールを含む。

【0013】

また、変異体は、抗体がグリコシル化される程度を増大又は減少するように生成され得る。抗体に対するグリコシル化サイトの追加又は除去は、１つ以上のグリコシル化サイトを生成又は除去するようにアミノ酸配列を変更することにより便利に達成され得る。抗体がＦｃ領域を含む場合、それに付加された糖質は変更され得る。哺乳動物細胞により生成されたネイティブの抗体は、典型的に、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ－結合により結合された分枝型の二分枝オリゴ糖を含む（例えばWright et al. TIBTECH, 1997, 15:26-32を参照）。オリゴ糖は、例えばマンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース及びシアル酸、並びに二分枝オリゴ糖構造の「幹」におけるＧｌｃＮＡｃに結合されたフコースといった種々の糖質を含み得る。いくつかの実施形態において、本発明の抗体におけるオリゴ糖の修飾は、特定の改善された特性を有する抗体変異体を生成するために行われ得る。

【0014】

一実施形態において、変異体は、（ＦｃガンマＲＩＩＩ結合の変更を介して）ＡＤＣＣを変更するために修飾されたＦｃ領域を有する。

【0015】

一実施形態において、抗体変異体は、Ｆｃ領域に（直接又は間接に）結合されたフコースを欠損する糖質構造を有するように提供される。例えば、そのような抗体におけるフコースの量は、１％～８０％、１％～６５％、５％～６５％又は２０％～４０％であり得る。フコースの量は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法により測定されるようなＡｓｎ２９７に結合された全ての糖構造（例えば複合体、ハイブリッド及び高マンノース構造）の合計と比較した、Ａｓｎ２９７における糖鎖内のフコースの平均量を算出することにより決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域における概ね位置２９７番目に配置されたアスパラギン残基を意味するが（Ｆｃ領域残基のＥｕナンバリング）、抗体における小さい配列変異に起因してＡｓｎ２９７は２９７番目の位置の約±３アミノ酸分の上流又は下流に配置されてもよく、すなわち、２９４～３００番目の位置に配置されていてもよい。「脱フコシル化」又は「フコース欠損」抗体変異体に関する公開の例は、以下に限らないが、Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336: 1239-1249 (2004)及びYamane-Ohnuki N, Satoh M. mAbs. 2009;1:230-236を含む。脱フコシル化抗体を生成できる細胞株の例は、タンパク質フコシル化が欠損したＬｅｄ３ＣＨＯ細胞（Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)）、及びα－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子であるＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ細胞等のノックアウト細胞株（例えばYamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)を参照）を含む。

【0016】

特定の実施形態において、それは、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基に置換された、例えば「ｔｈｉｏＭＡＢｓ」といったシステイン改変抗体を生成するのに望ましい場合がある。特定の実施形態において、置換される残基は、抗体のアクセス可能サイトで生じる。システインでそれらの残基を置換することによって、反応的チオール基は、抗体のアクセス可能サイトに配置され、さらに本明細書で記載されるようにイムノコンジュゲートを生成するために、薬物成分又はリンカー－薬物成分等の他の成分に抗体をコンジュゲートするのに用いられ得る。特定の実施形態において、１つ以上の下記残基がシステインに置換され得る：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔナンバリング）、重鎖のＡ１１８（ＥＵナンバリング）及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵナンバリング）。システイン改変抗体は、例えば米国特許第７５２１５４１号明細書に記載されるように生成され得る。

【0017】

また、「変異体」の用語は、以下に限定されないが細胞毒性剤、蛍光成分、診断用放射性同位体若しくはイメージング剤等の検出可能成分、又はアガロースビーズ等の固体担体を含む１つ以上の異種分子にコンジュゲートされた上記のような抗体を含むイムノコンジュゲートを含む。細胞毒性剤の例は、以下に限定されないが、化学療法剤若しくは薬物、増殖阻害剤、毒物（例えばタンパク質毒物、細菌、真菌、植物若しくは動物起源の酵素活性毒物、又はそれらの断片）、又は放射性同位体を含む。抗体及び細胞毒性剤のコンジュゲートは、当業者に周知の種々の二官能性タンパク質カップリング剤を用いて作製され得る。リンカーは、細胞内において細胞毒性剤の放出を促進する「切断可能リンカー」であってもよい。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、感光性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Chari et al., Cancer Res. 52: 127-131 (1992)）が用いられ得る。誘導体は、二重特異性抗体であってもよい。特定の誘導体は、抗体の検出又は捕捉を可能とするラベル（マーカー、トレーサー、タグ）をもつ標識化抗体である。そのような誘導体の例は、融合分子の検出又は定量を可能とするレポーターペプチド等の１つ以上のタンパク質又はペプチドと抗体との共有又は非共有結合により形成された融合分子を含む。いくつかの実施形態において、本発明の抗体誘導体は、検出可能及び／又は定量可能にするために、ビオチン化等の操作がなされ得る。

【0018】

好ましい実施形態において、本発明の抗体、断片及び誘導体は単離されている。「単離された」抗体は、その自然環境の成分から分離されたものである。特に、抗体は、例えば電気泳動（例えばＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えばイオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）により決定されるような９５％以上又は９９％以上の純度に精製され得る。抗体の純度の評価の方法のレビューのために、例えばFlatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)を参照できる。

【0019】

そのような抗体が他の分子と比較して抗原に対して優先的な結合を示す場合、抗体は高原に対して「選択的」である又は抗原に「選択的に結合する」。選択性は、競合的ＥＬＩＳＡ又はＢｉａｃｏｒｅアッセイにより決定され得る。選択性を表す親和性／結合性の差異は、例えば１：１．１以上の比、又は約１：５、１：１０、１：１００、１：１０００以上の比等の検出可能な優先度であり得る。

【0020】

「ｇＣ１ｑＲ」又は「ｇＣ１ｑ受容体」は、特にＣＤ４Ｔ細胞といった細胞の表面における補体Ｃ１ｑに対する受容体、特にヒト形態の受容体を示す。また、ｇＣ１ｑＲは、Ｃ１ｑ結合タンパク質（Ｃ１ＱＢＰ）、ＡＳＦ／ＳＦ２結合タンパク質ｐ３２（ＳＦ２Ｐ３２）、糖タンパク質ｇＣ１ｑＢＰ、ヒアルロン酸結合タンパク質１（ＨＡＢＰ１）、ミトコンドリアマトリクスタンパク質ｐ３２、ｇＣ１ｑ－Ｒタンパク質、ｐ３３、Ｃ１ｑＢＰ及びＧＣ１ＱＢＰとしても知られている。受容体のアミノ酸配列は本分野において開示されている。ヒトｇＣ１ｑＲの代表的なアミノ酸配列は、配列番号６５に示されている。

【0021】

ｇＣ１ｑＲの用語は、上記配列番号６５（受入番号ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｑ０７０２１．１）の受容体、並びにその切断形態及び変異体を示す。変異体は、例えば配列番号６５と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する自然起源の変異体を含む。

【0022】

出願人は、以前にｇｐ４１がＧｃ１ｑＲに結合することを書面化し、それは、細胞内小胞のエキソサイトーシスを起こすシグナル経路を発動する。Ｇｃ１ｑＲに対するｇｐ４１の結合の阻害は、そのような結合の好ましくは少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％又は少なくとも５０％の抑制といった阻害レベルを示す。そのような活性は、本技術分野において周知の方法を用いてインビトロで確かめられ得る。

【0023】

抗ＰＥＰ３抗体
特定の態様において、本発明は、抗ｇｐ４１抗体、その変異体又は断片に関する。そのような抗体は、ＰＥＰ３ペプチドを用いた免疫化により生成され、その後、ｇｐ４１及び／又はＰＥＰ３ドメインを結合する能力に基づいて選択された。抗体は、Ｃ１ｑＲに対するｇｐ４１の結合を阻害する能力及び／又は生物学的サンプルにおける反応的ｇｐ４１を効率的に定量する能力でさらに選択された。本発明の抗体の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列が決定され、その組換え生成物及びその変異体の生成を可能とした。試験に基づいて、これらの抗体がｇｐ４１及び／又はＰＥＰ３に結合できることを確認した。また、本発明の抗体がＣＤ４Ｔ細胞におけるＨＩＶウイルス血症の血漿の抑制的影響を有効に阻害することも見られた。従って、これらの抗体は、治療的及び診断的使用において優れた特性を示す。

【0024】

これらの抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号３～１４に提供される（図面も参照）。また、各可変領域のＣＤＲドメインも同定され、配列番号１５～５０に提供される。

【0025】

特定の態様において、本発明は、配列番号１５～５０のいずれかから選択された配列からなる又は実質的に該配列からなるＣＤＲを含むｇｐ４１結合抗体に関する。

【0026】

さらに特定の実施形態において、本発明は、軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体に関し、該軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号１５、２１、２７、３３、３９若しくは４５から選択される配列からなる又は実質的に該配列からなるＣＤＲ－Ｌ１、及び／又は（ｉｉ）配列番号１６、２２、２８、３４、４０若しくは４６から選択される配列からなる又は実質的に該配列からなるＣＤＲ－Ｌ２、及び／又は（ｉｉｉ）配列番号１７、２３、２９、３５、４１若しくは４７から選択される配列からなる又は実質的に該配列からなるＣＤＲ－Ｌ３を含む。

【0027】

さらに特定の実施形態において、軽鎖可変領域は、以下のＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３を含む：
配列番号１５、１６及び１７、
配列番号２１、２２及び２３、
配列番号２７、２８及び２９、
配列番号３３、３４及び３５、
配列番号３９、４０及び４１、又は、
配列番号４５、４６及び４７。

【0028】

さらに特定の実施形態において、本発明は、重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体に関し、該重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号１８、２４、３０、３６、４２若しくは４８から選択される配列からなる又は実質的に該配列からなるＣＤＲ－Ｈ１、及び／又は（ｉｉ）配列番号１９、２５、３１、３７、４３若しくは４９から選択される配列からなる又は実質的に該配列からなるＣＤＲ－Ｈ２、及び／又は（ｉｉｉ）配列番号２０、２６、３２、３８、４４若しくは５０から選択される配列からなる又は実質的に該配列からなるＣＤＲ－Ｈ３を含む。

【0029】

さらに特定の実施形態において、軽鎖可変領域は、以下のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３を含む：
配列番号１８、１９及び２０、
配列番号２４、２５及び２６、
配列番号３０、３１及び３２、
配列番号３６、３７及び３８、
配列番号４２、４３及び４４、又は、
配列番号４８、４９及び５０。

【0030】

さらに特定の実施形態において、本発明は、上記のような軽鎖及び重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体に関する。より具体的に、本発明の特定のモノクローナル抗体は、
（ｉ）配列番号１５、２１、２７、３３、３９若しくは４５から選択されるＣＤＲ－Ｌ１、及び／又は（ｉｉ）配列番号１６、２２、２８、３４、４０若しくは４６から選択されるＣＤＲ－Ｌ２、及び／又は（ｉｉｉ）配列番号１７、２３、２９、３５、４１若しくは４７から選択されるＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、
（ｉ）配列番号１８、２４、３０、３６、４２若しくは４８から選択されるＣＤＲ－Ｈ１、及び／又は（ｉｉ）配列番号１９、２５、３１、３７、４３若しくは４９から選択されるＣＤＲ－Ｈ２、及び／又は（ｉｉｉ）配列番号２０、２６、３２、３８、４４若しくは５０から選択されるＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域と、を含む。

【0031】

さらに特定の実施形態において、本発明は、配列番号３、５、７、９、１１及び１３から選択される配列からなる若しくは実質的に該配列からなる軽鎖可変領域、並びに／又は配列番号４、６、８、１０、１２及び１４から選択される配列からなる若しくは実質的に該配列からなる重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体に関する。

【0032】

さらに特定の実施形態において、本発明は、以下のような軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体に関する：
配列番号３及び４、
配列番号５及び６、
配列番号７及び８、
配列番号９及び１０、
配列番号１１及び１２、又は、
配列番号１３及び１４。

【0033】

本発明の抗体の特定の例は、４Ｇ１、８Ｄ５、３Ａ２、１５Ｂ４、５Ｅ１２及び９Ｂ１２抗体である。

【0034】

上述のように、また、実施例で示すように、本発明の抗体は、ｇｐ４１及び／若しくはＰＥＰ３に結合し、並びに／又はＧｃ１ｑＲに対するｇｐ４１の結合を阻害し、並びに／又はＣＤ４Ｔ細胞におけるＨＩＶウイルス血症の血漿の抑制的影響を阻害する。

【0035】

他の実施形態において、本発明は、配列番号６３又は６４の１つ以上のアミノ酸残基を含むｇｐ４１のエピトープを結合する抗ｇｐ４１抗体に関する。

【0036】

核酸、ベクター及び宿主細胞
また、本発明は、上記のような抗体又は断片をコードする核酸、核酸等を含むクローニング又は発現ベクター、及び組換え宿主細胞に関する。

【0037】

他の態様において、本発明は、本発明の抗体をコードする核酸分子、又は該コード配列に相補的な核酸に関する。好ましくは、核酸は単離されている又は精製された核酸である。

【0038】

核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡ若しくはｇＲＮＡ）、ＲＮＡ又はそれらの混合物であってもよい。それは、１本鎖形態若しくは２本鎖形態又はそれら２つの混合物であってもよい。それは、例えば修飾結合、修飾プリン若しくはピリミジン塩基、又は修飾糖を含む修飾ヌクレオチドを含んでもよい。それは、化学合成、組換え及び突然変異誘発を含む本技術分野において当業者に周知の方法により準備され得る。本発明に係る核酸は、本発明に係る抗体の配列から推定されてもよく、コドン使用頻度は、その核酸の転写がなされるであろう宿主細胞に従って適合され得る。これらのステップは、本技術分野において当業者に周知の方法に従って行われてもよく、それらのうちのいくつかは参照マニュアルSambrook et al. (Sambrook J, Russell D (2001) Molecular cloning: a laboratory manual, Third Edition Cold Spring Harbor)に記載されている。

【0039】

本発明の核酸は、抗体の軽鎖を含むアミノ酸配列及び／若しくは抗体の重鎖を含むアミノ酸配列をコードしてもよく、又はそのようなコード配列と相補的であってもよい。

【0040】

そのような核酸配列の特定の例は、配列番号５１～６２のいずれかを含む配列、及びそれらに相補的な配列を含む。さらに、本発明は、本発明の核酸を含むベクターを提供する。任意に、ベクターは、本発明のいくつかの核酸を含んでもよい。特に、ベクターは、制御領域、すなわち１つ以上の制御配列を含む領域に操作可能に結合された本発明の核酸を含み得る。任意に、ベクターは、いくつかの制御領域に操作可能に結合された本発明のいくつかの核酸を含み得る。

【0041】

「制御配列」の用語は、コード領域の発現に必要な核酸配列を意味する。制御配列は、内因性又は異種性であってもよい。周知の制御配列及び本技術分野において当業者により一般に用いられている制御配列が好ましいであろう。そのような制御配列は、以下に限定されないが、プロモーター、シグナルペプチド配列及び転写ターミネーターを含む。

【0042】

「操作可能に結合」の用語は、制御配列がコード領域の発現を指示するように、制御配列がコード配列に対して適切な位置に配置されている構成を意味する。

【0043】

さらに、本発明は、宿主細胞の形質転換、トランスフェクト又は形質導入のための本発明に係る核酸又はベクターの使用に関する。

【0044】

また、本発明は、本発明の１つ若しくはいくつかの核酸及び／又は本発明の１つ若しくはいくつかのベクターを含む宿主細胞を提供する。

【0045】

また、「宿主細胞」の用語は、複製の際に起こる変異による親宿主細胞と同一ではない親宿主細胞の子孫を含む。抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に適切な宿主細胞は、本明細書に記載された原核細胞又は真核細胞を含む。

【0046】

例えば、抗体は、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要ない場合、細菌において生成され得る。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現については、米国特許第５６４８２３７号明細書、米国特許第５７８９１９９号明細書及び５８４０５２３号明細書を参照できる（Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254, describing expression of antibody fragments in E. coli.も参照）。発現後、抗体は、可溶性画分において細菌細胞溶解物から単離されてもよく、さらに精製され得る。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母等の真核微生物は、抗体をコードするベクターの適切なクローニング又は発現のための宿主であり、グリコシル化経路が「ヒト化」されて部分的に又は完全にヒトグリコシル化パターンを含む抗体を生成する真菌及び酵母株を含む。Gerngross, Nat. Biotech. 22: 1409-1414 (2004), and Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)を参照できる。また、グリコシル化抗体の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）由来である。無脊椎動物細胞の例は、植物及び昆虫細胞を含む。多くのバキュロウイルス株は、昆虫細胞にコンジュゲートするのに、特にツマジロクサヨトウ細胞のトランスフェクションのため用いられることができるとして同定された。植物細胞培養物も、宿主細胞として用いられ得る。例えば、米国特許第５９５９１７７号明細書、米国特許第６０４０４９８号明細書、米国特許第６４２０５４８号明細書、米国特許第７１２５９７８号明細書及び米国特許第６４１７４２９号明細書を参照できる。また、脊椎動物細胞も宿主として用いられ得る。例えば、懸濁液において増殖するのに適合する哺乳動物細胞株は有益となり得る。有益な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７）、ヒト胚性腎臓株（例えばGraham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)に記載されている２９３又は２９３細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えばMather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)に記載されているＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト頚部カルシノーマ細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）、例えばMather et al., Annals N. Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)に記載されているようなＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞及びＦＳ４細胞である。他の有益な哺乳動物宿主細胞は、ＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、及びＹ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０等のミエローマ細胞株を含む。抗体の生成に適切な特定の哺乳動物宿主細胞のレビューのために、例えばYazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255- 268 (2003)を参照できる。また、本発明は、抗体の発現に適切な条件下で上記のような本発明の核酸又は本発明のベクターを含む宿主細胞を培養すること、及び任意に宿主細胞又は宿主細胞の培養培地から抗体を回収することを含む本発明の抗体を生成するための方法に関する。任意に、回収された抗体は、さらに精製又は単離され得る。適切な培地、培養条件及び生成方法は、当業者に周知であり、宿主細胞及び生成されるための抗体に従って容易に選択され得る。

【0047】

医薬及び診断組成物
さらに、本発明は、本発明の抗体、核酸、ベクター又は宿主細胞を含む医薬又は診断組成物に関する。組成物は、本発明の１つ又はいくつかの抗体、本発明の１つ又はいくつかの核酸、本発明の１つ又はいくつかのベクター及び／又は本発明の１つ又はいくつかの宿主細胞を含み得る。好ましくは、組成物は、本発明の１つ又はいくつかの抗体を含む。

【0048】

医薬組成物は、本発明の抗体及び適切な賦形剤を含む。通常、抗体は、所望の純度を有し、任意に例えば水溶液、凍結乾燥又は他の乾燥剤形の形態で生理学的に許容可能な担体、ビヒクル又は安定剤と混合される(Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th edition (2000))。

【0049】

許容可能な担体、賦形剤又は安定剤は、採用される用量及び濃度でレシピエントに対して無毒であり、以下に限定されないが、緩衝剤、安定化剤、防腐剤、等張剤、非イオン性界面活性剤、酸化防止剤及び他の添加剤を含む。

【0050】

緩衝剤は、生理条件に近似する範囲内にｐＨを維持することを助ける。それらは、約１ｍＭ～約５０ｍＭの範囲の濃度で存在することが好ましい。本発明で用いるのに適切な緩衝剤は、以下に限定されないが、クエン酸、コハク酸、酒石酸、フマル酸、グルコン酸、シュウ酸、乳酸及び酢酸緩衝剤、並びにリン酸緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤及びＴｒｉｓ等のトリメチルアミン塩等の有機酸及び無機酸の両方及びそれらの塩を含む。防腐剤は、微生物の増殖を阻害するために添加されてもよく、０．２％～１％（ｗ／ｖ）の範囲の量で添加され得る。本発明で用いるのに適切な防腐剤は、以下に限定されないが、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール、メタクレゾール、メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム塩化物、ベンズアルコニウムハロゲン化物（例えば塩化物、臭化物、ヨウ化物）、ヘキサメトニウム又はベンゼトニウム塩化物、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール及び３－ペンタノールを含む。

【0051】

等張剤は、本発明の液体組成物の等張性を保証するために添加されてもよく、グリセリン、エリトリトール、キシリトール及びマンニトール等の多価糖アルコール、好ましくは３価又はそれ以上の糖アルコールを含む。

【0052】

安定剤は、充填剤から治療剤を可溶化する又は変性若しくは容器の壁への付着の防止を助ける添加剤までの機能の範囲に及ぶ賦形剤の広いカテゴリーを意味する。代表的な安定剤は、多価糖アルコール（上記のもの）；アルギニン、リシン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ－ロイシン、２－フェニルアラニン、グルタミン酸、トレオニン等のアミノ酸；イノシトール等のシクリトールを含むラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、キシリトール、リビトール、ミオイノシトール、ガラクチトール、グリセロール等の有機糖又は糖アルコール；ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー；尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α－モノチオグリセロール及びチオ硫酸ナトリウム等の還元剤含有硫黄；低分子量のポリペプチド（すなわち１０残基未満）；ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン又はイムノグロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；キシロース、マンノース、フルクトース、グルコース等の単糖類；ラクトース、マルトース、スクロース等の二糖類；ラフィノース等の三糖類；並びにデキストラン等の多糖類であり得る。安定剤は、治療剤の１重量部毎に０．１～１００００重量部の範囲で存在し得る。

【0053】

非イオン性界面活性剤（「湿潤剤」としても知られる）は、治療剤の可溶化を助けるために、及び撹拌誘導性の凝集に対して治療タンパク質を保護するために添加され得る。適切な非イオン性界面活性剤は、以下に限定されないが、ポリソルベート（２０、８０等）、ポロキサマー（１８４、１８８等）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）、ポリオール、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（ＴＷＥＥＮ（登録商標）－２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）－８０等）を含む。非イオン性界面活性剤は、約０．０５ｍｇ／ｍｌ～約１．０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．０７ｍｇ／ｍｌ～約０．２ｍｇ／ｍｌの範囲で存在し得る。

【0054】

追加の種々の賦形剤は、以下に限定されないが、充填剤（例えばデンプン）、キレート剤（例えばＥＤＴＡ）、酸化防止剤（例えばアスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ）及び共溶媒を含む。

【0055】

また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセルとポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルとのそれぞれ、コロイドドラッグデリバリーシステム（例えばリポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルジョンに封入され得る。そのような技術は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th edition (2000)に開示されている。本発明の医薬組成物は、局所、経口、非経口、経鼻、静脈内、筋肉内、皮下又は眼球内等の投与用に製剤化され得る。

【0056】

好ましくは、医薬製剤は、注射可能な製剤である。これらは、特に等張で無菌の生理食塩水（リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム等、又はそのような塩の混合物）、又は場合によって滅菌水又は生理食塩水の添加で注射溶液の構成を可能とする乾燥、特に凍結乾燥組成物であってもよい。

【0057】

無菌注射溶液は、上述の種々の他の成分を含む適切な溶媒内で必要とされる量で活性化合物を組み込み、必要に応じてろ過滅菌をすることにより調製され得る。無菌注射溶液の調製のための無菌粉末の場合において、調製の好ましい方法は、先のろ過滅菌溶液から追加の所望成分を含む活性成分の粉末を生じる真空乾燥及び凍結乾燥技術である。

【0058】

静脈内又は筋肉内投与等の非経口投与のために製剤化された組成物に加え、他の医薬的に許容可能な形態は、例えば、経口投与のための錠剤又は他の固体、徐放性カプセル及び現在用いられている他の形態を含む。

【0059】

本発明の医薬組成物は、本発明の１つ又はいくつかの抗体を含み得る。

【0060】

さらに、医薬組成物は、１つ又はいくつかの追加の活性化合物を含み得る。追加の活性化合物の例は、以下に限定されないが、化学療法薬、抗体、抗寄生虫剤、抗真菌剤又は抗ウイルス剤を含む。

【0061】

特定の障害又は状態の処置に有効となるであろう本発明の抗体の量は、その障害又は状態の特性に依存し、標準の臨床技術により決定され得る。好ましい実施形態において、各用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ（体重）～約２５ｍｇ／ｋｇ（体重）の抗体の範囲であってもよく、より好ましくは、約１ｍｇ／ｋｇ（体重）～約１０ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲であってもよい。投与計画は、疾病の型、疾病の重症度及び治療剤に対する対象の感受性を含む多くの臨床因子に依存して１月に１回から毎日まで異なり得る。

【0062】

検出、投薬、診断の方法
更なる態様において、本発明は、上記のような抗体、その断片又は変異体を用いてｇｐ４１を検出又は定量する方法に関する。その方法は、対象におけるＨＩＶ感染の重症度又は進行度をモニターするために、及びそのような感染の予後を予測する又は最適な処置を決定するために用いられ得る又は実施され得る。

【0063】

特定の実施形態において、その方法は、ａ）サンプルを準備すること、及びｂ）上記のような抗体又はその断片を用いてサンプル内におけるｇｐ４１タンパク質の存在又は量を検出することを含む。

【0064】

一般に、検出ステップｂ）は、（ｉ）サンプル又はサンプルの生物的複製物を本明細書で記載されたモノクローナル抗体又はその断片若しくは変異体のいずれかに接触させること、及び（ｉｉ）ステップ（ｉ）において形成された抗体：抗原複合体の存在を検出することを含む。

【0065】

抗体：抗原複合体の存在を検出することは、当業者により周知の技術、及び本明細書に広く記載された技術により行われ得る。一般に、検出は、ｇｐ４１に対する２次抗体、好ましくは１次捕捉抗体のエピトープとは別の（且つ離れた）エピトープに結合する２次抗体を用いて行われ得る。代替的に、捕捉抗体は標識されてもよく、検出ステップは、典型的には非結合抗体を除去した後の反応における標識の量を測定することを含んでもよい。

【0066】

抗体は、表面若しくはは粒子に固定されていてもよく、又はされていなくてもよい。反応は、マイクロプレート、チップ、ボトル等の適切な担体又は容器において行われ得る。また、特定の実施形態において、検出ステップ（ｉｉ）は、レポーティング基にコンジュゲートされた又は検出可能に操作された抗体等の標識化抗体を用い、より好ましくはその抗体はビオチン化されている。

【0067】

その方法では、血清サンプル、血漿サンプル、全血、生物学的流体等の生物学的サンプル等のサンプルが用いられ得る。特定の実施形態において、用いられるサンプルは、対象から得られる。サンプルは、希釈、濃縮等により検出前に処理され得る。それは、本発明の方法に用いる前に凍結乾燥、滅菌、凍結等がなされ得る。

【0068】

特定の実施形態において、本発明は、
（ｉ）本発明のモノクローナル抗体、変異体又は断片にサンプルを接触させることと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）において形成された抗体：抗原複合体の存在を検出することと、を含むＨＩＶの検出のための方法に関する。

【0069】

本発明は、本発明の抗体がｇｐ４１の適切な（又は反応性の）形態を検出できる又は定量できるため特に適切である。実際に、ＰＥＰ３ドメインを標的化することにより、本質的に反応性のｇｐ４１タンパク質が測定され、従って、それは疾病／患者の状態についての関連情報を提供する。

【0070】

従って、本発明は、それを必要とする対象におけるＨＩＶ疾患の進行をモニタリングする方法に関し、それは、本発明のモノクローナル抗体、変異体又は断片を用いて対象からの血漿サンプルにおいて異なる時間間隔でｇｐ４１をインビトロで定量することを含む。

【0071】

本発明の方法は、例えば抗ＨＩＶ処置の有効性をモニタリングするために用いられ得る。

【0072】

また、本発明の方法は、ＨＩＶに感染された対象が抗ＰＬＡＧ１Ｂ免疫療法、好ましくは抗ＰＬＡ２Ｇ１Ｂ抗体療法又はトランスＣＤ４免疫療法から利益を受けることができるかどうかを決定するために用いられ得る。

【0073】

また、本発明の方法は、対象におけるＨＩＶ疾患の重症度を決定するために用いられてもよく、サンプル内における本発明のモノクローナル抗体、変異体又は断片の参照値と比較して増大した結合レベルは、重症度の指標である。本発明における使用において、参照値は、同一の対象からのサンプルにおけるより早い段階で決定された値又は平均値であってもよい。

【0074】

また、本発明は、抗レトロウイルス分子で処置されたＨＩＶに感染された患者の血漿におけるｇｐ４１（断片）の量をモニタリング／追跡するために、並びにｇｐ４１レベルをＰＬＡ２ＧＩＢ活性及び疾病の予後と関連付けるために用いられ得る。

【0075】

さらなる態様において、本発明は、容器（プレート、マイクロプレート、チューブ、ボトル、フラスコ等）中に少なくとも１つの本明細書に記載されるような抗体又はその変異体若しくは断片を含むキットに関する。本発明のキットは、免疫反応物又は抗体－抗原複合体を実施、検出又は定量するための１つ以上の試薬をさらに含むことが好ましい。１つ以上の試薬は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ等の免疫反応に適合する例えば希釈液、基質、ラベル、マーカー抗体等から選択され得る。

【0076】

ＨＩＶを処置する方法
本発明の抗体及び組成物は、それを必要とする対象におけるＨＩＶを処置するためにさらに用いられ得る。

【0077】

さらなる態様において、本発明は、上記のような組成物、又は抗体又はその断片若しくは変異体を、それを必要とする対象に投与することを含むＨＩＶを処置するための方法に関する。さらなる態様において、本発明は、ＨＩＶ疾患を処置するために使用するための上記のような組成物、又は抗体又はその断片若しくは変異体に関する。

【0078】

本明細書において用いられる「処置」又は「処置する」は、処置される個体の自然経過を変更するための試みにおける臨床的介入を意味し、予防又は治療目的のために行われ得る。処置の所望の効果は、以下に限定されないが、疾病の発生又は再発の予防、症状の緩和、疾病の直接的又は間接的な病理学的結果の減少、ウイルスの量、複製又は毒性の抑制、疾病進行速度の低減、疾病状態の改善又は緩和、及び寛解又は改善された予後を含む。いくつかの実施形態において、本発明の組成物及び方法は、疾病若しくは障害の発生を遅らせるために、又は疾病若しくは障害の進行を遅らせるために用いられる。

【0079】

本発明の化合物又は組成物の投与期間、容量及び頻度は、対象及び疾病に従って適合され得る。処置は、単独で、又は他の活性成分と組み合わせて同時に若しくは別々に若しくは順次用いられ得る。

【0080】

本発明のさらなる態様及び利点は、以下の実施例の項で開示される。

【実施例】

【0081】

材料及び方法
組換えタンパク質及びペプチド－ヒトＰＬＡ２－ＧＩＢをＥ．ｃｏｌｉ（ＧｅｒａｒｄＬａｍｂｅａｕから贈られた、純度＞９８％）又はＣＨＯ－Ｓ（純度＞９８％）で産生した。ＨＩＶ－１ＭＮｇｐ４１（Ｇｅｎｂａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃ＡＡＣ３１８１７．１）組換えタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで産生し、抗体オンラインから得た（ＭＮｇｐ４１（５６５－７７１デルタ６４２－７２５），ＡＢＩＮ２１２９７０３，ｌｏｔ９３－４８２，純度＞９５％）。ＨＸＢ２ｇｐ４１組換えタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃ＡＡＢ５０２６２．１，ａ．ａ．５３４－６８１，純度＞９５％）を２９３細胞培養物から精製し、抗体オンラインから購入した（ＡＢＩＮ１６０５８６５）。ＨＩＶ－１ＭＮｇｐ４１（Ｇｅｎｂａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃ＡＡＣ３１８１７．１，ａ．ａ．５４２－６６６）、Ｄ１１７ＩＩＩｇｐ４１（ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃ＡＡＭ０８３６４．１，ａ．ａ．５３２－６５６）（用いられる組換えタンパク質のアライメントを参照、方法をスライドする）、及びＤ１１７ＩＩＩｇｐ１２０（Ｇｅｎｂａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃ＡＡＭ０８３６４．１，ａ．ａ．３１－４８２）をＳ２細胞で産生し、ＤＩＡＣＣＵＲＡＴＥで精製した（純度＞９８％）。ＰＥＰ３ペプチドのＮＨ２－ＰＷＮＡＳＷＳＮＫＳＬＤＤＩＷ－ＣＯＯＨ及び対照ペプチド（ＣＴＬ）のＮＨ２－ＰＷＮＡＴＷＴＱＲＴＬＤＤＩＷ－ＣＯＯＨをＣｏｖａｌａｂから注文した（純度９８％）。

【0082】

抗ｇｐ４１抗体の開発－ＨＩＶ－１ＭＮ株ｇｐ４１におけるＰＥＰ３配列（ＰＷＮＡＳＷＳＮＫＳＬＤＤＩＷ）に特異的な抗体をＫＬＨにコンジュゲートされたＮＨ２－Ｃ－ＰＷＮＡＳＷＳＮＫＳＬＤＤＩＷ－ＣＯＯＨのペプチド（ＫＬＨ－ＰＥＰ３）を用いたＯＦ１マウスの免疫化によってＢＩＯＴＥＭ（フランス）で生成した。マウスを３週間ごとに５回免疫化した。最初の免疫化は、５０μｇのペプチド及び完全フロイントアジュバントを皮下及び腹腔内投与した。その後、マウスに対して５０μｇのペプチド及び不完全フロイントアジュバントを腹腔内に３回注射した。血清中の抗体力価は、ＰＥＰ３及びＭＮｇｐ４１タンパク質（ＡＢＩＮ２１２９７０３）におけるＥＬＩＳＡにより評価した。タンパク質及びペプチドにおける最も良い力価を有するマウスを選択し、５μｇのＫＬＨ－ＰＥＰ３のみを静脈内注射した。３日後、脾臓を回収し、細胞をミエローマ細胞（Ｓｐ２／０－Ａｇ１４）と融合してハイブリドーマを生成した。１０７２の融合からの１０９３の上清がＢＳＡ－ＰＥＰ３ペプチドに陽性であった。最も良い１２３個を選択し、ＢＳＡ－ＰＥＰ３ペプチド及びＭＮｇｐ４１において再度試験した。２７個のクローンのアイソタイプを決定し、細胞培養液で維持された６つのクローンを含むそれらを凍結して、安定クローンを得た（表１）。これら６つのクローンである４Ｇ１、８Ｄ５、３Ａ２、１５Ｂ４、５Ｅ１２及び９Ｂ１２を細胞培養のためにＨｉｇｈＹｉｅｌｄｉｎｇＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＦｌａｓｋ（ｈｙｐｅｒｆｌａｓｋ）に播種して、１０％の低ＩｇＧウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＤＭＥＭ培地を含む５６０ｍｌの上清を生成した。低エンドトキシン条件（＜１０ＥＵ／ｍｇ、ＬＡＬテスト）においてタンパク質Ａでのアフィニティークロマトグラフィーにより上清からＩｇＧを精製した。ＢＳＡ－ＰＥＰ３、ＭＮｇｐ４１及びＨＸＢｇｐ４１に結合する抗体を本特許で示すように試験し、これらの抗体の可変領域をコードするｃＤＮＡ配列を決定した（以下参照）。

【0083】

ＨＩＶ－１ＭＮ株ｇｐ４１における配列５１８４－３（ＨＲ２領域におけるＥＫＳＱＴＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬＥＬＤＫ，ａ．ａ．６４８－６６６）抗ＨＲ２抗体は、ＫＬＨにコンジュゲートされたＮＨ２－Ｃ－ＥＫＳＱＴＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬＥＬＤＫ－ＣＯＯＨのペプチド（ＫＬＨ－５１８４－３）を用いたＯＦ１マウスの免疫化によってＢＩＯＴＥＭ（フランス）で生成した。３匹のマウスを５回免疫化し、そのうち最初の３回の間隔及び４回目と５回目との間を３週間空けて、３回目と４回目の間を４か月空けた。最初の免疫化では、２０μｇ（Ｓ１１及びＳ１２マウス）又は５０μｇ（Ｓ１３マウス）のペプチド並びに完全フロイントアジュバントを皮下及び腹腔内投与した。２回目の免疫化では、２０μｇ（Ｓ１１及びＳ１２マウス）又は５０μｇ（Ｓ１３マウス）のペプチド並びに不完全フロイントアジュバントを皮下及び腹腔内投与した。３回目及び４回目の注射は、１０μｇのペプチド及び不完全フロイントアジュバントを腹腔内投与した。血清中の抗体力価を、５１８４－３ペプチド、ＭＮＧｐ４１及びＨＸＢ２ｇｐ４１でのＥＬＩＳＡにより評価した。マウスＳ１２及びＳ１３は最も良好な力価を有した。従って、それら療法に、２．５μｇのＭＮｇｐ４１及びＨＸＢ２ｇｐ４１の両方を静脈内注射した。３日後に脾臓を回収し、細胞にミエローマ（Ｓｐ２／０－Ａｇ１４）細胞を融合し、ハイブリドーマを生成した。Ｓ１２マウス細胞の融合からの５１５個の上清のうち、ＥＬＩＳＡによるＢＳＡ－５１８４－３ペプチドで３つが陽性であり、ＢＳＡ－５１８４－３、ＭＮｇｐ４１（Ｓ２細胞で生成）及びＨＸＢ２ｇｐ４１タンパク質（６３Ｇ４、６９Ｄ６及び６７Ｄ７）でのＥＬＩＳＡにより確認した。Ｓ１３マウス細胞の融合からの３０１個の上清のうち、ＥＬＩＳＡによるＢＳＡ－５１８４－３ペプチドで１つが陽性であり、ＢＳＡ－５１８４－３、ＭＮｇｐ４１及びＨＸＢ２ｇｐ４１タンパク質（７２Ｄ７）でのＥＬＩＳＡにより確認した。我々は、抗ＨＲ２Ａｂ（抗５１８４－３）を生成する４つのクローンを得た。それらを凍結し、アイソタイプを決定した。

【0084】

ＥＬＩＳＡ－ペプチド又はタンパク質に対するＥＬＩＳＡを、ＢＳＡ－ＰＥＰ３及びＭＮｇｐ４１タンパク質（抗ＰＥＰ３Ａｂのスクリーニング、図５Ａ～Ｃ）、又はＢＳＡ－５１８４－３、ＭＮｇｐ４１及びＨＸＢ２ｇｐ４１タンパク質（抗ＨＲ２Ａｂのスクリーニング、図１７、１８Ｂ、１８Ｃ）のＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液５０μｌを用いて室温（ＲＴ）で一晩中コーティングされたマイクロタイタープレートで行った。洗浄後、ウェルを１５０μｌのＰＢＳ／２．５％スキムミルク（抗ＰＥＰ３Ａｂのスクリーニング）、又はＰＢＳ／１％ＢＳＡ（抗ＨＲ２Ａｂのスクリーニング）を用いてＲＴで１時間ブロッキングした。洗浄後、１００～０．０００１μｇ／ｍｌの抗体のＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／０．５％ＢＳＡによる種々の希釈液５０μｌをＲＴで２時間インキュベートした。ウェルを洗浄し、抗体の結合を、非ビオチン化ＡｂにおいてはＨＲＰコンジュゲートａｆｆｉｎｉＰｕｒｅＦ（ａｂ）’２断片ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：５０００，Ｊａｃｋｓｏｎ１１５－０３６－００８）、又はビオチン化ＡｂにおいてはＨＲＰ－ストレプトアビジンＨＲＰ（１：１０００）を含む５０μｌのＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／０．５％ＢＳＡを用いて１時間インキュベートし、ＴＭＢを添加して（室温で１０分、ＳｕｒｅＢｌｕｅＴＭＢＭｉｃｒｏｗｅｌｌＰｅｒｏｘｉｄａｓｅＳｕｂｓｔｒａｔｅＫｉｔ，ＫＰＬ５２－００－０１，ＶＷＲ）、発現させた。

【0085】

ＭＮｇｐ４１（Ｓ２細胞で生成）又はＨＸＢ２ｇｐ４１（図５Ｄ～Ｆ）のコーティング上での抗ＰＥＰ３ｍＡｂを用いたＥＬＩＳＡを、１μｇ／ｍｌのタンパク質組換体を含むカルボネートバッファーｐＨ９．６溶液１００μｌを用いて４℃で一晩中コーティングされたマイクロタイタープレートで行った。非特異的結合サイトを３００μｌのＰｉｅｒｃｅブロッキングバッファー（３７５７２、Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてブロッキングした。洗浄後、Ａｂを含むＰｉｅｒｃｅブロッキングバッファーの種々の希釈液（ＭＮｇｐ４１で１００～０．０００１μｇ／ｍｌ；ＨＸＢ２ｇｐ４１で１００～１０^－１０μｇ／ｍｌ）１００μｌをＲＴで２時間、４通りでインキュベートした。結合した抗体を、ヤギ抗マウスＨＲＰコンジュゲート抗体と相互作用させた後、１００μｌ／ｗｅｌｌのＴＭＢ基質（ＵＰ６６４７８１，Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）を添加して検出した。

【0086】

抗ＰＥＰ３ｍＡｂのさらなる研究のために、それらのビオチン化４Ｇ１又はビオチン化ヤギ抗ｇｐ４１ｐＡｂ（ＰＡ１－７３１００，ＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）との結合をサンドイッチＥＬＩＳＡにより試験した（図１５Ａ～Ｅ）。１０μｇ／ｍｌで捕捉抗体（４Ｇ１、３Ａ２、８Ｄ５又は１５Ｂ４）を含む１００μｌのカルボネートバッファーｐＨ９．６でマイクロタイタープレートをコーティングした。非特異的結合サイトを３００μｌのＰｉｅｒｃｅブロッキングバッファー（３７５７２、Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてブロッキングした。洗浄後、Ａｂを含むＰｉｅｒｃｅブロッキングバッファーによる非タグ化ＭＮｇｐ４１（０．５～０．００３９１μｇ／ｍｌ、Ｓ２細胞で生成）又はＨＸＢ２ｇｐ４１（１０～１０^－６μｇ／ｍｌ）の種々の希釈液１００μｌを、ＲＴで２時間、４通りでインキュベートした。非タグ化ＭＮｇｐ４１タンパク質をエンテロキナーゼ（Ｐ８０７０、ＮＥＢ）による切断下で得た。２μＭのＣａＣｌ２を含むＰＢＳに含まれる１００μｇ／ｍｌのＭＮｇｐ４１を、１：３００でのエンテロキナーゼの添加により３７℃で１６時間切断した。検出Ａｂを１００μｌのＰｉｅｒｃｅブロッキングバッファーに、ビオチン化ヤギ抗ｇｐ４１ｐＡｂの場合は５μｇ／ｍｌ、又はビオチン化４Ｇ１Ａｂの場合は２０μｇ／ｍｌとなるように加えた。結合した抗体を、ＨＲＰストレプトアビジン（１：２００００、ＵＰ３９５８８８，ＩｎｔｅｒｃｈｉｍＵｐｔｉｍａ）と相互作用させた後、１００μｌ／ｗｅｌｌのＴＭＢ基質（ＵＰ６６４７８１，Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）を添加して検出した。

【0087】

４Ｇ１と抗ＨＲ２Ａｂ（抗５１８４－３Ａｂ）との間のサンドイッチＥＬＩＳＡの実行可能性を試験するために、４つの抗ＨＲ２ハイブリドーマをヌードマウスに注射して腹水中にＡｂを生成した。２ｍｌの腹水を回収し、抗体をタンパク質Ａでのアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。抗体量が十分な場合、それらをビオチン化した（６７Ｄ７及び７２Ｄ７）。また、４Ｇ１もビオチン化した。ビオチン化された又はされていない抗体を、１μｇ／ｍｌのＢＳＡ－５１８４－３ペプチド（全ての抗ＨＲ２Ａｂ）、２μｇ／ｍｌのＰＥＰ３（４Ｇ１及び４Ｇ１－ｂｉｏｔ）又は１μｇ／ｍｌのＨＸＢ２（全ての抗体）を含む５０μｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）でコーティングされたマイクロタイタープレートでまず試験し、ＨＸＢ２及び５１８４－３ペプチドでそれらの反応性を検証した。捕捉抗体としての種々の抗ＨＲ２又は４Ｇ１と検出Ａｂとしてのビオチン化Ａｂ（６７Ｄ７－ｂｉｏｔ、７２Ｄ７－ｂｉｏｔ及び４Ｇ１－ｂｉｏｔ）との間の結合を、１０μｇ／ｍｌの４Ｇ１、６３Ｇ４、６９Ｄ６及び７２Ｄ７又は２０μｇ／ｍｌの６７Ｄ７捕捉抗体のＰＢＳ希釈液５０μｌをコーティングすることにより試験した（図１９Ａ～Ｅ）。ＰＢＳ／１％ＢＳＡを用いてＲＴで１時間ブロッキングした後、種々の濃度のＨＸＢ２ｇｐ４１（５０μｌのＰＢＳ中で０、０．１及び１０μｇ／ｍｌ）をＲＴで２時間インキュベートした。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／０．５％ＢＳＡで希釈された５０μｌの検出ＡｂをＲＴで１時間インキュベートし、サンドイッチをＨＲＰストレプトアビジン（１：１０００、ＲＴで１時間）及びＴＭＢ（ＲＴで１０分、ＳｕｒｅＢｌｕｅＴＭＢＭｉｃｒｏｗｅｌｌＰｅｒｏｘｉｄａｓｅＳｕｂｓｔｒａｔｅＫｉｔ，ＫＰＬ５２－００－０１，ＶＷＲ）を用いて、発現させた。

【0088】

４Ｇ１又はヤギ抗ｇｐ４１ｐＡｂと７２Ｄ７との結合をさらに試験するために、７２Ｄ７を捕捉Ａｂとして試験し、ビオチン化４Ｇ１又は抗ｇｐ４１ｐＡｂを検出Ａｂとして試験した（図２０）。マイクロタイタープレートを、１０μｇ／ｍｌの７２Ｄ７を含むカルボネートバッファーｐＨ９．６希釈液１００μｌを用いてコーティングした。非特異的結合サイトを３００μｌのＰｉｅｒｃｅブロッキングバッファー（３７５７２、Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてブロッキングした。洗浄後、Ａｂを含むＰｉｅｒｃｅブロッキングバッファーによるＨＸＢ２ｇｐ４１の種々の希釈液（１０～１０^－６μｇ／ｍｌ）１００μｌを室温で２時間、４通りでインキュベートした。検出Ａｂを、ビオチン化ヤギ抗ｇｐ４１ｐＡｂの場合は５μｇ／ｍｌとなるように、ビオチン化４Ｇ１Ａｂの場合は２０μｇ／ｍｌとなるように１００μｌのＰｉｅｒｃｅブロッキングバッファーに加えた。結合した抗体を、ＨＲＰストレプトアビジン（１：２００００、ＵＰ３９５８８８，ＩｎｔｅｒｃｈｉｍＵｐｔｉｍａ）と相互作用させた後、１００μｌ／ｗｅｌｌのＴＭＢ基質（ＵＰ６６４７８１，Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）を添加して検出した。

【0089】

６つの抗ＰＥＰ３ｍＡｂの可変領域をコードするｃＤＮＡのシークエンシング及び分析－ＲＮＡをクローン化ハイブリドーマから抽出し、ハイフィデリティ逆転写酵素を用いてＢＩＯＴＥＭ（フランス）でｃＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡをハイフィデリティＴａｑポリメラーゼ、並びに軽鎖及び重鎖可変領域の近傍の縮重プライマーを用いたＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物のバルクの両方の鎖を、直接に配列決定した。配列を、定常領域の一部の配列を含む軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）の可変領域をコードする配列を得るためにアライメントした。これらのヌクレオチド配列に基づいて、タンパク質配列を推測し、軽鎖及び重鎖のアイソタイプを確認した。ＩＭＧＴウェブサイト（国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報システムhttp://www.imgt.org）を用いて、抗ＰＥＰ３ｍＡｂのＶＬ及びＶＨ配列とマウス初期配列との間の同一性割合を決定し、機能構造サブドメインＦＲ１～ＦＲ４及びＣＤＲ１～３並びにｃｏｌｌｉｅｒｓｄｅＰｅｒｌｅｓ（ＩＭＧＴＣｏｌｌｉｅｒｓｄｅＰｅｒｌｅｓ）における３Ｄ構造の代表的モデルを予測した。

【0090】

ｇｐ４１及びｇｐ１２０組換えタンパク質に対するモノクローナル４Ｇ１の抗ｇｐ４１特異性の特徴付け－組換体ＭＮｇｐ４１、Ｄ１１７ＩＩＩｇｐ４１及びＤ１１７ＩＩＩｇｐ１２０をＳ２細胞で生成した。マイクロタイタープレートをカルボネートバッファーｐＨ９．６に含まれる組換体Ｄ１１７ＩＩＩｇｐ１２０又は組換体Ｄ１１７ＩＩＩｇｐ４１を１０μｇ／ｗｅｌｌで３通りでコーティングした。４℃で一晩中コーティングした後、非特異的結合サイトをＰｉｅｒｃｅブロッキングバッファー（３７５７２、Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてブロッキングした。抗ＰＥＰ３ｍＡｂ４Ｇ１を含むブロッキングバッファー最終希釈液を１μｇ／ｗｅｌｌで添加した。結合した抗体を、ヤギ抗マウスＨＲＰコンジュゲート抗体と相互作用させ、ＴＭＢ基質（ＵＰ６６４７８１，Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）を１００μｌ／ｗｅｌｌ添加することにより検出した。反応を０．１ＭのＨ_２ＳＯ_４を５０μｌ添加することにより停止し、Ｏ．Ｄ．_{４５０ｎｍ}をＴｅｃａｎＩｎｆｉｎｉｔｅＭ１０００Ｐｒｏを用いて測定した。ウエスタンブロット分析を、５００ｎｇ又は１μｇの組換体ＭＮｇｐ４１又はＤ１１７ＩＩＩｇｐ１２０タンパク質を還元条件下で４％～２０％のＴｒｉｓ－ＢｉｓＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）ゲルで行った。抗原をＴｒａｎｓ－ＢｌｏｔＴｕｒｂｏ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を用いてＰＶＤＦ膜（ＢＩＯ－ＲＡＤ）に転写した。５％スキムミルク／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳを用いて非特異的結合サイトをブロッキングした後、抗体の結合を、４Ｇ１の場合は１μｇ／ｍｌ及びポリクローナル抗ｇｐ４１（ＰＡ１－７２１９，Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）の場合は５μｇ／ｍｌで試験した。ヤギ抗マウス（３１４３０、Ｐｉｅｒｃｅ）及びロバ抗ヤギ（７０５－０３５－００３、ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）ＨＲＰコンジュゲート抗体を１：１００００希釈で用いた。検出をＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌＷｅｓｔＰｉｃｏＰｌｕｓＳｕｂｓｔｒａｔｅ（３４５８０，ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて膜で直接に行った。

【0091】

ヒトＣＤ４Ｔリンパ球の精製－ＥＦＳ（ＥｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔＦｒａｎｃａｉｓｄｕＳａｎｇ，ＣｅｎｔｒｅＮｅｃｋｅｒ－Ｃａｂａｎｅｌ，Ｐａｒｉｓ）を通じて健康なボランティアから静脈血を得た。ＣＤ４Ｔ細胞をＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐＨｕｍａｎＣＤ４＋ＴｃｅｌｌＥｎｒｉｃｈｍｅｎｔＣｏｃｋｔａｉｌ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ，１５０６２）を用いて全血から精製した。このカクテルは、マウスの腹水又はハイブリドーマの培養上清から、タンパク質Ａ又はタンパク質Ｇセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製されたマウス及びラットのモノクローナル抗体を含む。これらの抗体は、ヒト造血細胞における細胞表面抗原（ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｂ、ＴＣＲγ／δ）及び赤血球におけるグリコホリンＡを標的とする二重特異的四量体抗体複合体に結合される。ｒｏｓｅｔｔｅＳｅｐ抗体カクテルは、ヒト全血における望まない細胞を多数の赤血球にクロスリンクしてイムノロゼットを形成する。これは、望まない細胞の密度を増大し、それらはリンパ球分離培地（Ｅｕｒｏｂｉｏ，ＣＭＳＭＳＬ０１－０１）等の浮遊密度培地で遠心分離処理をすると、遊離する赤血球と共にペレットを形成する。

【0092】

全血を、５０μｌ／ｍｌの濃度でＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐＨｕｍａｎＣＤ４＋ＴｃｅｌｌＥｎｒｉｃｈｍｅｎｔＣｏｃｋｔａｉｌを用いて緩やかな撹拌条件下（１００ｒｐｍ）で室温で２０分間インキュベートし、同体積のＰＢＳ／２％ＦＢＳで希釈し緩やかに混合した。その希釈サンプルに対して、リンパ球分離培地の上面において１２００×ｇで２０分間の遠心分離処理をした。濃縮細胞を血漿界面で密度培地から回収し、ＰＢＳ／２％ＦＢＳで２回洗浄した。その後、細胞を、５％ＦＢＳ、５０ｍＭのＨＥＰＥＳｐＨ７．４、グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン及びファンギゾンを含む（完全培地）ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｏｎｚａ）に再懸濁し、ＭｏｘｉＺｍｉｎｉａｕｔｏｍａｔｅｄｃｅｌｌｃｏｕｎｔｅｒ（ＯＲＦＬＯ，ＭＸＺ０００）を用いてカウントした。細胞懸濁液を、７×１０^６ｃｅｌｌ／ｍｌに調節し、５％ＣＯ２の湿気のある雰囲気下で３７℃で少なくとも２時間の平衡化を行った。

【0093】

濃縮ＣＤ４Ｔ細胞群をｃｙｔｏｆｌｅｘ（Ｂｅｃｋｍａｎｃｏｕｌｔｅｒ）においてフローサイトメトリーにより回収した。回収されたＣＤ４Ｔ細胞の静止状態を低レベルのＩＬ－２Ｒα（ＣＤ２５）により制御した。ＣＤ４Ｔ細胞を、抗ヒトＣＤ３ｅＦｌｕｏｒ７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ｃｌｏｎｅＵＣＨＴ１，４７－００３８－４２）、抗ヒトＣＤ２５－ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，ｃｌｏｎｅＢＣ９６，３０２６０５）、及び抗ヒトＣＤ４－ＰｅｒＣＰ（ＢＤ，ｃｌｏｎｅＳＫ３，３４５７７０）を用いて標識した。濃縮ＣＤ４Ｔ細胞群は、９５％を超えるＣＤ３＋ＣＤ４＋及び８％未満のＣＤ２５＋を含む。

【0094】

ＣＤ４Ｔ細胞におけるＰＬＡ２－ＧＩＢバイオアッセイ及び光学顕微鏡のための特異的タンパク質の標識－平衡化された精製ＣＤ４Ｔ細胞を、温度調節水において３７℃条件下で、２４ウェルポリスチレンプレートにおけるポリＬリシンコーティング（Ｓｉｇｍａ，Ｐ８９２０）された円形カバーガラス（直径１４ｍｍ、Ｍａｒｉｅｎｆｅｌｄ）上にロードし、ペプチド、組換えタンパク質と共に組換体ＰＬＡ２－ＧＩＢを含む若しくは含まない、又はウイルス血症患者の血漿（１又は３％）若しくは健康なドナーの血漿を含むＰＢＳ／１％ＢＳＡの５０μｌ懸濁液と混合した。細胞懸濁液を、４０μｌのペプチド、組換えタンパク質若しくはＨＩＶ－１ＮＤＫ粒子を含むＰＢＳ／１％ＢＳＡ、又はＰＢＳ／１％ＢＳＡ擬似希釈液で１５分間の前処理を行い、その後、１０μｌのＰＬＡ２－ＧＩＢ（最終５ｎＭ）で３０分間処理する又はペプチド若しくは組換えタンパク質をＰＬＡ２－ＧＩＢ（最終５ｎＭ）と共に含むＰＢＳＢＳＡ１％希釈液５０μｌで直接に４５分間処理した。細胞を、２ｎＭ組換えグリコシル化ヒトＩＬ－７（ＡｃｃｒｏｂｉｏＳｙｓｔｅｍ）を用いて１５分間活性化した。細胞上清を除去し、細胞を、４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ溶液（Ｆｉｓｈｅｒ，ＰＦＡ３２％ＥｌｅｃｔｒｏｎＭｉｃｒｏｓｃｏｐｙＳｃｉｅｎｃｅ，１５７１４）５００μｌの添加により３７℃で１５分間の固定をし、その後、５００μｌの氷冷９０％メタノール／水溶液で一晩中の透過処理を行った。

【0095】

その後、細胞を、５％ＦＢＳを含むＰＢＳで１５分間の再水和をした後に標識化した。そして、スライドを、ＰＢＳ中のメタノール処理後に２度洗浄し、５％ＦＢＳを含むＰＢＳを用いて室温で１５分間の再水和を行った。スライドに対し、５％ＦＢＳを含む６０μｌのＰＢＳで希釈された１次抗体（１／１２０）で１時間の標識化を行い、ＰＢＳバッファーで１５回洗浄し、ＰＢＳ／ＦＢＳバッファーで５回洗浄し、その後、２次抗体（１／３００）で１時間の染色を行った。スライドをＰＢＳ５％ＦＢＳバッファーで５回洗浄し、ＰＢＳで１５回リンスし、その後、共焦点顕微鏡観察のために新鮮なＰｒｏｌｏｎｇＧｏｌｄＡｎｔｉｆａｄｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐ３６９３０）マウンティング培地にマウントした。用いた１次抗体は、ウサギ抗ｐＳＴＡＴ５（ｐＹ６９４，９３５９，ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｌｉｎｇ）、マウス抗ＣＤ４（ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ，５５５３４４）からなり、２次抗体は、ロバ抗マウスＩｇＧ－ＡＦ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ａ２１２０２）及びロバ抗ラビットＩｇＧ－ＡＦ５５５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ａ３１５７２）であった。

【0096】

共焦点顕微鏡－ＰＦＡ固定細胞のための、油浸プランアポクロマート６３ｘ／１．４ＮＡ対物レンズ（Ｚｅｉｓｓ）を含む倒立型共焦点レーザ走査顕微鏡（ＬＳＭ７００、Ｚｅｉｓｓ）において回折限界を超えて画像を得た。画像を、ＺＥＮソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ）を用いて獲得及び分析した。

【0097】

健康なドナーＣＤ４Ｔ細胞におけるｇｐ４１及びＰＥＰ３血漿コファクターペプチド活性の測定－ＰＬＡ２－ＧＩＢ活性の制御因子としての血漿ｇｐ４１の役割は、特異的抗体を用いた内因性ｇｐ４１の免疫除去により評価した。簡単に言うと、１ｍｌのＶＰ又はＨＤ血漿を、１００μｇのヤギ抗ｇｐ４１ポリクローナル抗体（ＰＡ１－７２１９，Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）又は対照ヤギポリクローナル抗体（ｐｒｅｉｍｍｕｎｅ，ＡＢ１０８－Ｃ，Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）を用いてインキュベートして、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ内で４℃で一晩中のｇｐ４１の免疫除去を行った（Ｔｅｓｔｔｕｂｅ－ｒｏｔｏｒ，３４５２８，Ｓｎｉｊｄｅｒｓ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄ）。０．１％アジ化ナトリウムを最初に含むヤギ抗ｇｐ４１ｐＡｂにおいて、それを１６１００×ｇ、２分４℃の遠心分離によって１０ｋＤａのＡｍｉｃｏｎ（０５１８２８，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）スピンフィルタを用いてＰＢＳで５回洗浄し、免疫除去の進行前にアジ化ナトリウムを除去した。正常ヤギＩｇＧ対照を、抗ｇｐ４１ｐＡｂと同様に処理した。その後、ＰＢＳ／１％ＢＳＡで３回洗浄された２００μｌのタンパク質Ｇセファロース４ＦａｓｔＦｌｏｗｂｅａｄｓ（１７－０６１８－０１，ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を各サンプルに加え、サンプルを４℃で３時間インキュベートした。サンプルを４００×ｇ、４℃で２分の遠心分離処理によりビーズを除去し、その後、１６１００×ｇ、４℃で１５分の遠心分離処理で上清を回収した。ヤギ抗ｇｐ４１ｐＡｂは、組換えｇｐ４１に特異的に結合するが、ｇｐ１２０には結合しない（図３Ａ）。３つのＶＰ及び３つのＨＤからのＶＰ又はＨＤ血漿（５００μｌ）を、３０ｋＤａカットオフのＡｍｉｃｏｎスピンフィルタ（０５１８５０，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、その後１０ｋＤａカットオフのＡｍｉｃｏｎスピンフィルタ（０５１８２８，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で分画した。１０～３０ｋＤａ画分を回収し、対照アイソタイプ（マウスＩｇＧ２ｂ／ｋ、１６－４７３２－８５，Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）で処理、又はｇｐ４１を上記のように１００μｇの４Ｇ１で免疫除去した。４Ｇ１ｍＡｂは、組換えｇｐ４１に特異的に結合するが、ｇｐ１２０には結合しない（図１２Ｂ及び１２Ｃ）。

【0098】

ペプチド、組換えタンパク質と共に組換えＰＬＡ２－ＧＩＢ、ＶＰ又はＨＤ血漿を含む若しくは含まないＰＢＳ／１％ＢＳＡ、又はｇｐ４１を予め除去した若しくはしていない１０～３０ｋＤａの画分で精製ＣＤ４Ｔ細胞をインキュベートすることにより、ＣＤ４Ｔ細胞のＰＬＡ２－ＧＩＢ活性におけるｇｐ４１の効果を評価した。ＰＬＡ２－ＧＩＢ活性における組換えｇｐ４１及びＰＥＰ３ｇｐ４１ペプチドの効果を、４０μｌの組換えｇｐ４１タンパク質又はペプチドを用いて細胞懸濁液を１５分間処理し、その後、１０μｌのＰＬＡ２ＧＩＢを添加して３０分処理することにより試験した（図２Ａ～Ｄ）。内因性ｇｐ４１によるＰＬＡ２－ＧＩＢの制御を、予めｇｐ４１を除去した又は除去していない５０μｌの血漿希釈液又は１０～３０ｋＤａの血漿画分で細胞懸濁液を３０分間処理することにより試験した（図３Ｂ、１３及び１４）。ｐＳＴＡＴ５ＮＴ阻害を、上記のように顕微鏡により試験した。

【0099】

結果及び検討
１．ＨＩＶ－１ｇｐ４１はＩＬ－７で刺激されたＣＤ４Ｔ細胞におけるｐＳＴＡＴ５ＮＴに対するＰＬＡ２－ＧＩＢの阻害活性を増大する
我々は、コファクターの非存在下でｐＳＴＡＴ５を阻害できない一用量のＰＬＡ２－ＧＩＢ（５ｎＭ）を組換えｇｐ４１タンパク質と共に前処理若しく組換えｇｐ４１タンパク質無しで前処理をし、又はｇｐ４１タンパク質のみでＰＬＡ２－ＧＩＢ無しで前処理をした（ｗ／ｏＧＩＢ）細胞におけるＩＬ－７に対するｐＳＴＡＴ５ＮＴ反応を分析した。図２に示すように、ｇｐ４１タンパク質単独では、ＩＬ－７に応答したｐＳＴＡＴ５ＮＴに対して僅かな阻害効果を示し、３４ｎＭのｇｐ４１では１０％のみの阻害、１７～３．４ｎＭのｇｐ４１では８％未満の阻害であった（図２Ａ及び２Ｂ）。対照的に、５ｎＭのＰＬＡ２－ＧＩＢの存在下で、０．３４ｎＭのｇｐ４１では１８％の阻害を示し（図２Ａ）、３４ｎＭのｇｐ４１タンパク質は、ｐＳＴＡＴ５ＮＴの６０％以上の阻害を示し（ｐ＜０．０５、ｎ＝３ドナー、図２Ｂ）、用量依存的阻害を示す。

【0100】

２．ｇｐ４１におけるＰＥＰ３モチーフは、ＩＬ－７により刺激されたＣＤ４Ｔ細胞におけるｐＳＴＡＴ５ＮＴを阻害する
ｇＣ１ｑＲ結合エレメント及び高度に保存されたＳＷＳＮＫＳモチーフを含むｇｐ４１の１５アミノ酸ペプチドドメインにＣＤ４Ｔ細胞を曝露した。また、５ｎＭのＰＬＡ２－ＧＩＢ有り（５ｎＭ）又は無し（ｗ／ｏ）と共に対照ペプチド（ＣＴＬ）を細胞に曝露した（図２Ｃ）。ＣＴＬペプチドのみ若しくはそれとＰＬＡ２－ＧＩＢ、又はＰＥＰ３のみではｐＳＴＡＴ５ＮＴに対して効果を示さなかったが、ＰＥＰ３及び５ｎＭのＰＬＡ２－ＧＩＢによる処理では、１３７５～１３．７５ｎＭのＰＥＰ３それぞれでｐＳＴＡＴ５ＮＴに対して５１％～１８％のＰＥＰ３用量依存的阻害を示した（図２Ｃ）。図２Ｄに要約するように、２７５ｎＭのＰＥＰ３のみの処理では、ＣＤ４Ｔ細胞におけるｐＳＴＡＴ５の４％の阻害を示し、５ｎＭのＰＬＡ２－ＧＩＢと共に２７５ｎＭのＰＥＰ３を処理すると５１％の阻害を示した（Ｐ＜０．０１、ｎ＝４ドナー）。

【0101】

３．ＨＩＶ－１ｇｐ４１タンパク質はＩＬ－７で刺激したＣＤ４Ｔ細胞におけるｐＳＴＡＴ５ＮＴに対するウイルス血症患者の血漿の阻害活性において重要な役割を果たす
まず、我々は、イムノブロットにおいて、ＨＩＶエンベロープの別のサブユニットであるｇｐ１２０と比較してｇｐ４１に特異的であるポリクローナル抗体を同定した（図３Ａ）。その後、ｇｐ４１タンパク質がウイルス血症患者の血漿においてＰＬＡ２－ＧＩＢのコファクターとなり得ることを実証するために、我々は、ｇｐ４１に対するポリクローナル抗体（ｐＡｂ抗ｇｐ４１）又は対照ポリクローナル抗体（ｐＡｂｃｔｒｌ）を用いてウイルス血症患者の血漿を枯渇した。健康なドナー血漿を、陰性対照として同様に処理した。図３Ｂに示すように、ｐＳＴＡＴ５ＮＴの阻害は、予想通り７５ｎＭのＰＬＡ２－ＧＩＢで４９％示し、２５０ｎＭのＰＬＡ２－ＧＩＢで８０％示し、また、抗体無しで１％のウイルス血症患者の血漿で４７％示し、３％のウイルス血症患者の血漿で６０％示した。健康なドナーの血漿は、抗体無し、対照ポリクローナル抗体と共に、又は抗ｇｐ４１ポリクローナル抗体と共に処理でＩＬ－７に対するｐＳＴＡＴ５ＮＴ応答の阻害効果は見られず、それは、抗体がＣＤ４Ｔ細胞に対する毒性を有しないことを証明する（図３Ｂ）。対照ポリクローナル抗体と共にするウイルス血症患者の血漿による処理は、１％及び３％の血漿でそれぞれ４９％及び６０％の阻害であり阻害活性を変更しなかった（図３Ｂ）。特に、抗ｇｐ４１ポリクローナル抗体を用いた免疫除去は、１％及び３％の免疫除去血漿による１２％及び１４％の残余の阻害活性によりウイルス血症患者の血漿の阻害活性をほぼ抑制した（ｐ＜０．０１及びｐ＜０．００１、ｐＡｂ抗ｇｐ４１対ｐＡｂｃｔｒｌ処理血漿のそれぞれ、図３Ｂ）。全体として、これらの結果は、ｇｐ４１がウイルス血症患者の血漿におけるＰＬＡ２－ＧＩＢのコファクターであることを証明する。

【0102】

４．抗ＰＥＰ３モノクローナル抗体の開発
単独のＰＥＰ３ペプチドがＰＬＡ２－ＧＩＢの阻害活性を増大できる（図２Ｃ及びＤ）という上記証明は、この配列がＨＩＶウイルス血症の血漿ｇｐ４１タンパク質に存在すること、及び血漿ＰＬＡ２－ＧＩＢに対するコファクター効果に関連する可能性があることを提示する。我々は、ＰＥＰ３配列に特異的な新規の抗ｇｐ４１抗体を開発した。ＫＬＨにコンジュゲートしたＰＥＰ３配列のみを含むペプチドを用いてＯＦ１マウスを免疫化した。１０９３個のハイブリドーマのうち１０７２個がＥＬＩＳＡでＢＳＡ－ＰＥＰ３に陽性であった。最も良好な１２３個を、ＥＬＩＳＡによりＢＳＡ－ＰＥＰ３ペプチド及びＭＮｇｐ４１タンパク質に対してさらに確認した。我々は、２７クローンを選択し（表１）、凍結し、それらのアイソタイプを決定した。それらのうち６クローンを細胞培養液で維持し、安定クローンを得た：４Ｇ１、８Ｄ５、３Ａ２、１５Ｂ４、５Ｅ１２及び９Ｂ１２。これら６クローンから多量の抗体を精製した。それらについて、ＢＳＡ－ＰＥＰ３ペプチド、ＭＮ及びＨＸＢ２ｇｐ４１組換えタンパク質に対するＥＬＩＳＡによって、抗体結合のＥＣ５０を算出して十分に特徴付けした（図５）。それらの可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）領域の配列決定を行った（図６～図１１）。これは、軽鎖アイソタイプ（図６～図１１Ａ及びＢ）及び重鎖アイソタイプ（図６～図１１Ｄ及びＥ）を確認し、それらの機能的サブドメインＦＲ１～ＦＲ４及びＣＤＲ１～３の予測を可能とし、ＶＬ（図６～図１１Ｃ）及びＶＨ（図６～図１１Ｆ）の３Ｄ構造（ＩＭＧＴｃｏｌｌｉｅｒｓｄｅＰｅｒｌｅｓ）の再現モデルの構築を可能とする。マウス初期配列に対するＶＬ配列（図６～図１１Ｂ）及びＶＨ配列（図６～図１１Ｅ）の同一性の分析は、データベース（Ｕｎｉｐｒｏｔｄａｔａｂａｎｋ－ＵｎｉｐｏｒｔｋＢ）に予め記載されている同等配列が無いことを証明する。いくつかのＭＮ及びＨＸＢｇｐ４１組換えタンパク質及びＢＳＡ－ＰＥＰ３と６つの抗ＰＥＰ３ｍＡｂの軽鎖及び重鎖のアイソタイプとのＥＣ５０結合の結果は、図１２Ａに要約する。まず、我々は、我々が試験した（図１２Ａ）ＢＳＡ－ＰＥＰ３及び第１のＭＮｇｐ４１（Ｅ．ｃｏｌｉで生成）に対して最も高いＥＣ５０を有するため、４Ｇ１ｍＡｂに対する我々の関心を集中し、次に、それが追加分析でＥＬＩＳＡにより試験された全てのｇｐ４１組換えタンパク質に対して最も高いＥＣ５０のうちの１つを有することを確認した（図１２Ａ）。我々は、この抗体がＨＩＶエンベロープｇｐ４１タンパク質に特異的であることを、組換体ｇｐ４１及びｇｐ１２０タンパク質に対するＥＬＩＳＡ及びイムノブロットにより確認した（図１２Ｂ及びＣ）。全体として、これらの結果は、ＰＥＰ３ｇｐ４１配列に対する４Ｇ１ｍＡｂの特異性及び高い親和性を示す。

【0103】

５．４Ｇ１抗ＰＥＰ３ｍＡｂはＩＬ－７で刺激されたＣＤ４Ｔ細胞におけるｐＳＴＡＴ５に対するウイルス血症患者の血漿の阻害活性をほぼ抑制する
我々は、４Ｇ１抗ＰＥＰ３ｍＡｂ（抗ＰＥＰ３ｍＡｂ）又は対照アイソタイプ（ｍＡｂｃｔｒｌ）を用いて、ウイルス血症患者（ＶＰ）の血漿を枯渇した。健康なドナー（ＨＤ）の血漿を陰性対照として同様に処理した。ｐＳＴＡＴ５ＮＴの阻害は、７５ｎＭのＰＬＡ２－ＧＩＢで４７％であり、２５０ｎＭのＰＬＡ２－ＧＩＢで６７％であり、抗体無しの１％のＶＰ血漿で４９％であり、３％のＶＰ血漿で５８％であった（図１３）。健康なドナー（ＨＤ）の血漿では、抗体無しでＩＬ－７に応答したｐＳＴＡＴ５ＮＴに対する僅かな阻害効果を示しただけであった。同様に、両方の抗体で処理されたＨＤ血漿の画分は、ｐＳＴＡＴ５ＮＴに対して阻害活性を示さず、これは抗体がＣＤ４Ｔ細胞に対して毒性が無いことを証明する（図１３）。興味深いことに、ＶＰ血漿の画分の対照アイソタイプによる処理は、１％のＶＰ血漿の画分で４８％、３％のＶＰ血漿の画分で６１％の阻害活性であり、阻害活性を変更しなかった。このレベルの阻害は、ＶＰ血漿全体のみの場合と非常に類似しており、それはＶＰ血漿活性が１０～３０ｋＤａの画分によるといった我々の先の発見をさらに支持する（図１３）。特に、４Ｇ１免疫除去は、１％及び３％の免疫除去血漿により９％及び１９％の残余阻害活性を示し、ＶＰ血漿の阻害活性を非常に低減させた（ｐ＜０．００１及びｐ＜０．０１、４Ｇ１抗ＰＥＰ３対ｃｔｒｌｍＡｂ処理血漿のそれぞれ、図１３）。ＶＰ阻害活性における４Ｇ１及びヤギ抗ｇｐ４１ｐＡｂの効果を比較するために、我々は、図３Ｂ及び１３に示すデータを図１４に結合した。全体として、これらのデータは、ヤギ抗ｇｐ４１（図１４Ａ）及び４Ｇ１抗ＰＥＰ３ｍＡｂ（図１４Ｂ）の両方がＶＰ阻害活性を非常に抑制することを示す。これは、ＰＥＰ３配列を含むｇｐ４１断片によるウイルス血症の血漿におけるＰＬＡ２－ＧＩＢ活性の我々の制御モデルを確認する。

【0104】

６．ＨＩＶウイルス血症の血漿の検出：抗ｇｐ４１Ａｂの開発及びＥＬＩＳＡ
他の試みは、ＨＩＶウイルス血症患者の血漿におけるｇｐ４１産物の定量である。ＨＩＶウイルス血症患者の血漿における抗ｇｐ４１抗体の存在は、よく説明されている(Boyd and James, 1992; Butler et al., 2019; Mikell et al., 2011; Trama et al., 2014; Vaidya et al., 2018; Williams et al., 2015)。急性ＨＩＶ－１感染者の血漿細胞から観察された最初の抗ＨＩＶタンパク質モノクローナル抗体は、ｇｐ４１を主に標的とするものであった(Butler et al., 2019; Trama et al., 2014)。しかしながら、我々の知る限り、ｇｐ４１タンパク質は、ＨＩＶに感染された患者の血漿で検出されたことは無く、それはｇｐ４１の濃度が極めて小さい、並びに／又は開発された抗ｇｐ４１抗体が血漿中のｇｐ４１を検出できないくらい低い親和性を有することを提示する。我々が開発した６つの抗ＰＥＰ３ｍＡｂのうち、ｇｐ４１タンパク質に対して最も高い親和性で結合する４つのｍＡｂは、４Ｇ１、８Ｄ５、３Ａ２及び１５Ｂ４である（図１２Ａ）。ＥＬＩＳＡに用いられる抗体の可能性を評価するために、我々は、これらの抗ＰＥＰ３ｍＡｂ及びヤギ抗ｇｐ４１ｐＡｂを組換えＭＮｇｐ４１又はＨＸＢ２ｇｐ４１に対するサンドイッチＥＬＩＳＡで試験した（図１５Ａ～Ｄ）。全ての抗体は、ｇｐ４１の捕捉及びビオチン化ヤギｐＡｂによる検出が可能である（図１５Ａ～Ｄ）。４Ｇ１、３Ａ２及び８Ｄ５は、１５Ｂ４よりもＨＸＢｇｐ４１に対する算出されたＥＣ５０が低い（図１５Ｃ及びＤ）。しかしながら、検出されたｇｐ４１の最低量は高いままであり、捕捉Ａｂとして４Ｇ１、８Ｄ５及び３Ａ２を用いた場合は１ｎｇ／ｍｌであり、１５Ｂ４を用いた場合は１０ｎｇ／ｍｌ以上である（図１５Ｂ及びＣ）。また、我々は、捕捉Ａｂとして１５Ｂ４、８Ｄ５及び３Ａ２、並びに検出Ａｂとしてビオチン化４Ｇ１を試験した。検出されたｇｐ４１の最低量は、捕捉Ａｂとして８Ｄ５を用いた場合は３７．５ｎｇ／ｍｌであり、捕捉Ａｂとして３Ａ２を用いた場合は１５０ｎｇ／ｍｌであった（図１５Ｅ）。１５Ｂ４は、試験条件下で４Ｇ１とサンドイッチを形成しなかった。

【0105】

ＥＬＩＳＡでｇｐ４１を検出するための抗体の効率をさらに増大するために、我々は、ｇｐ４１に対する追加の抗体を生成した。我々の試験は、ＶＰ血漿におけるｇｐ４１断片がＰＥＰ３配列を含み、ＶＰ血漿の１０～３０ｋＤａ画分に含まれることを示した。このため、我々は、それがｇｐ４１タンパク質の一部又はエクトドメインであり得るとの仮説を立てた。従って、我々は、ｇｐ４１の第２の７回繰り返し配列領域（ＨＲ２）のＣ末部分に存在する我々が５１８４－３と命名したペプチドに対してＯＦ１マウスを免疫化することを決めた（図１６Ａ及びＢ）。我々は、５１８４－３ペプチド及びＨＸＢ２ｇｐ４１タンパク質に対するそれらの血清の力価に基づいて２匹のマウス（Ｓ１２及びＳ１３）を選択した。８１６個の上清のうち、抗ＨＲ２Ａｂ（抗５１８４－３）を生成した４つのクローンは、ＥＬＩＳＡでＢＳＡ－５１８４－３ペプチドに対して陽性であり、ＢＳＡ－５１８４－３、ＭＮｇｐ４１（Ｓ２細胞で生成）及びＨＸＢ２ｇｐ４１タンパク質（マウスＳ１２からの６３Ｇ４、６９Ｄ６及び６７Ｄ７並びにマウスＳ１３からの７２Ｄ７、図１７）に対するＥＬＩＳＡで確認した。それらのアイソタイプを決定し、それらを凍結した。その後、我々は、４Ｇ１ｍＡｂを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡで用いるための４つの抗ＨＲ２Ａｂの能力を試験した。これらの抗ＨＲ２抗体の小産物は、ヌードマウスへのハイブリドーマの注射後にインビボで実施された。得られた純度及び量は、６７Ｄ７及び７２Ｄ７では高く、６３Ｇ４及び６９Ｄ６では低かった（図１８Ａ）。従って、６７Ｄ７及び７２Ｄ７のみをビオチン化した（６７Ｄ７－ｂｉｏｔ及び７２Ｄ７－ｂｉｏｔ）。ビオチン化された又はされていない精製抗体の結合を、５１８４－３（図１８Ｂ）又はＨＸＢ２ｇｐ４１タンパク質（図１８Ｃ）で確認した。４Ｇ１及びビオチン化４Ｇ１（４Ｇ１－ｂｉｏｔ）群のＰＥＰ３ペプチド及びＨＸＢ２ｇｐ４１タンパク質に対する結合も確認した（図１８Ｂ及び図１８Ｃ）。その後、捕捉Ａｂとしての４Ｇ１、６３Ｇ４、６９Ｄ６、６７Ｄ７及び７２Ｄ７と検出Ａｂとしての７２Ｄ７－ｂｉｏｔ及び６７Ｄ７－ｂｉｏｔとの結合を、ＨＸＢ２－ｇｐ４１抗原を用いて試験した（図１９Ａ～Ｅ）。唯一観察された結合は、捕捉Ａｂとしての７２Ｄ７と検出Ａｂとしての４Ｇ１－ｂｉｏｔであった。７２Ｄ７と４Ｇ１－ｂｉｏｔとの結合は、ＨＸＢ２ｇｐ４１タンパク質の種々の希釈液で確認され、ヤギ抗ｇｐ４１ｐＡｂと比較された（図２０）。特に、７２Ｄ７は、検出Ａｂとしての４Ｇ１－ｂｉｏｔ及びヤギ抗ｇｐ４１ｐＡｂ－ｂｉｏｔの両方と共に捕捉Ａｂとして用いることが可能であり、ＥＣ５０は非常に類似しており、抗ｇｐ４１ｐＡｂ－ｂｉｏｔを用いた場合は０．５６μｇ／ｍｌであり、４Ｇ１－ｂｉｏｔを用いた場合は０．３４μｇ／ｍｌであった（図２０）。

【0106】

７．単一分子アレイ（ＳＩＭＯＡ）技術を用いたＨＩＶ血症の血漿におけるｇｐ４１断片の検出及び定量の試験
ＨＩＶウイルス血症の血漿におけるｇｐ４１の濃度はおそらく非常に低く、それは、抗ｇｐ４１抗体がウイルス血症患者の血漿でよく説明されているとしても、ｇｐ４１タンパク質自体が従来のＥＬＩＳＡ又はイムノブロットアッセイで検出されていないことの説明となるであろう。抗ＰＥＰ３及び７２Ｄ７ｍＡｂは、一般にＥＬＩＳＡと比較して感度を１０００倍増大する超高感度技術のＳＩＭＯＡを用いたＶＰ血漿中のｇｐ４１を検出するのに用いられ得る。

【0107】