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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-11-04
(54)【発明の名称】ＤＮＡ損傷応答のコンジュゲート阻害剤
(51)【国際特許分類】
A61K 31/407 20060101AFI20221027BHJP
A61K 31/55 20060101ALI20221027BHJP
A61K 31/4184 20060101ALI20221027BHJP
A61K 31/4523 20060101ALI20221027BHJP
A61K 31/497 20060101ALI20221027BHJP
A61K 31/5025 20060101ALI20221027BHJP
A61K 31/496 20060101ALI20221027BHJP
A61K 31/551 20060101ALI20221027BHJP
C07D 487/04 20060101ALI20221027BHJP
C07D 403/04 20060101ALI20221027BHJP
C07D 231/56 20060101ALI20221027BHJP
C07D 413/04 20060101ALI20221027BHJP
C07D 471/06 20060101ALI20221027BHJP
C07D 237/32 20060101ALI20221027BHJP
C07D 491/052 20060101ALI20221027BHJP
A61K 47/60 20170101ALI20221027BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20221027BHJP
A61K 31/77 20060101ALI20221027BHJP
【ＦＩ】
A61K31/407
A61K31/55
A61K31/4184
A61K31/4523
A61K31/497
A61K31/5025
A61K31/496
A61K31/551
C07D487/04 150
C07D403/04 CSP
C07D231/56 Z
C07D413/04
C07D471/06
C07D237/32
C07D487/04 151
C07D491/052
C07D487/04 137
A61K47/60
A61P35/00
A61K31/77
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022513556
(86)(22)【出願日】2020-08-28
(85)【翻訳文提出日】2022-04-19
(86)【国際出願番号】 US2020048608
(87)【国際公開番号】W WO2021041964
(87)【国際公開日】2021-03-04
(31)【優先権主張番号】62/893,075
(32)【優先日】2019-08-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＰＬＵＲＯＮＩＣ
(71)【出願人】
【識別番号】510340997
【氏名又は名称】プロリンクス エルエルシー
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100150500
【弁理士】
【氏名又は名称】森本 靖
(74)【代理人】
【識別番号】100176474
【弁理士】
【氏名又は名称】秋山 信彦
(72)【発明者】
【氏名】フォンテーヌ，ショーン ディ
(72)【発明者】
【氏名】ハーン，ブライアン アール
(72)【発明者】
【氏名】サンティ，ダニエル ブイ
【テーマコード（参考）】
4C050
4C063
4C065
4C076
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C050AA01
4C050AA02
4C050AA07
4C050BB04
4C050BB08
4C050CC04
4C050CC10
4C050CC11
4C050CC18
4C050DD01
4C050EE02
4C050EE04
4C050FF02
4C050FF05
4C050GG03
4C050HH01
4C050HH04
4C063AA01
4C063BB01
4C063CC26
4C063CC51
4C063DD03
4C063DD34
4C063EE01
4C065AA07
4C065AA18
4C065BB09
4C065CC09
4C065DD03
4C065EE02
4C065HH03
4C065JJ04
4C065KK05
4C065LL02
4C065PP02
4C065PP09
4C076CC27
4C076EE23
4C076FF31
4C076FF67
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086BC37
4C086BC39
4C086BC41
4C086BC67
4C086CB03
4C086CB09
4C086CB11
4C086CB22
4C086FA02
4C086FA06
4C086GA07
4C086GA09
4C086GA20
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA07
4C086NA12
4C086NA13
4C086NA15
4C086ZB26
(57)【要約】
本明細書において、疾患の治療において治療剤として使用するために好適なＤＮＡ損傷応答の阻害剤である放出可能なコンジュゲートを提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
式：Ｍ－(Ｚ＊－Ｌ－Ｄ)ｙ
[式中、Ｍは、高分子担体であり；
ｙは、Ｍに結合したリンカー－薬剤Ｌ－Ｄの数を示す数字であり；
Ｚ＊は、連結基であり；
Ｌは、放出可能なリンカーであり；および
Ｄは、ＤＮＡ損傷応答阻害剤である]
である、コンジュゲート。
【請求項2】
Ｄが、ＰＡＲＰ阻害剤、ＡＴＭ阻害剤またはＡＴＲ阻害剤である、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項3】
式：【化1】
[式中、
Ｚ＊は、連結基であり；ｎ＝０～６であり；Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、Ｈ、ＣＮまたはＳＯ２Ｒ５であって、ここでＲ５は、所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキル、所望により置換されていてもよいアリール、所望により置換されていてもよいヘテロアリールまたはＮ(Ｒ６)２であるか、またはＮ(Ｒ６)２が、４～８員環を形成しており、ここで各Ｒ６は、独立して、所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキル、所望により置換されていてもよいアリール、所望により置換されていてもよいヘテロアリールであり；各Ｒ４は、独立して、ＨまたはＣ１－Ｃ３アルキルであるか、または一緒になって３～６員環を形成し；Ｙは、存在しないか、または式：Ｎ(Ｒ７)ＣＨ２であって、式中のＲ７は、所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ４アルキルまたは所望により置換されていてもよいアリールである；但し、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは、Ｈ以外のものである]
である、請求項１または２に記載のコンジュゲート。
【請求項4】
Ｙが、存在せず、Ｄが、Ｄの第１級または第２級アミン窒素原子へのカルバメート結合を介してリンカーＬに連結されている、請求項３に記載のコンジュゲート。
【請求項5】
Ｄが、ルカパリブ、ベリパリブ、ニラパリブまたはベルゾセルチブである、請求項１～４のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項6】
Ｙが、式：Ｎ(Ｒ７)ＣＨ２であり、Ｄが、Ｄの非塩基性窒素原子とのアルキル結合を介してリンカーＬに連結されている、請求項１～３のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項7】
Ｄが、タラゾパリブ、オラパリブ、タミパリブ、Ｅ７０１６またはＣＥＰ－９７２２である、請求項６に記載のコンジュゲート。
【請求項8】
Ｍが、分子量１０００～１００,０００ダルトンのＰＥＧであって、ｙ＝１～８である、請求項１～７のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項9】
Ｍが、５～５０ｎｍの流体力学的半径を有する、請求項１～８のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項10】
Ｍが、不溶性高分子担体である、請求項１～７のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項11】
Ｚ＊が、カルボキサミド、カルバメート、尿素、オキシム、チオエーテルまたは１,２,３－トリアゾールである、請求項１～１０のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項12】
Ｒ１およびＲ２が、ｐＨ７.４、３７℃において、Ｄの放出半減期が１００～１０００時間となるように選択される、請求項３～１０のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項13】
式：【化2】
[式中、Ｍは、高分子担体であり；ｎ＝０～６であり；Ｚ＊は、連結基であり；Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、Ｈ、ＣＮまたはＳＯ２Ｒ５であって、ここでＲ５は、所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキル、所望により置換されていてもよいアリール、所望により置換されていてもよいヘテロアリールまたはＮ(Ｒ６)２であるか、またはＮ(Ｒ６)２が、４～８員環を形成しており、ここで各Ｒ６は、独立して、所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキル、所望により置換されていてもよいアリール、所望により置換されていてもよいヘテロアリールであり；各Ｒ４は、独立して、ＨまたはＣ１－Ｃ３アルキルであるか、または一緒になって３～６員環を形成しており；Ｒ７は、所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ３アルキルまたは所望により置換されていてもよいアリールであり；ｙ＝１～８である；但し、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは、Ｈ以外のものである]
である、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項14】
Ｍが、４０ｋＤａの４本アーム型ＰＥＧであり、ｙ＝４である、請求項１３に記載のコンジュゲート。
【請求項15】
Ｚ＊が、カルボキサミド、カルバメート、オキシム、チオエーテルまたはトリアゾールである、請求項１３または１４に記載のコンジュゲート。
【請求項16】
式：【化3】
[式中、Ｍは、高分子担体であり；ｎ＝０～６であり；Ｚ＊は、連結基であり；Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、Ｈ、ＣＮまたはＳＯ２Ｒ５であって、ここでＲ５は、所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキル、所望により置換されていてもよいアリール、所望により置換されていてもよいヘテロアリールまたはＮ(Ｒ６)２あるか、またはＮ(Ｒ６)２が、４～８員環を形成しており、ここで各Ｒ６は、独立して、所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキル、所望により置換されていてもよいアリール、所望により置換されていてもよいヘテロアリールであり；各Ｒ４は、独立して、ＨまたはＣ１－Ｃ３アルキルであるか、または一緒になって３～６員環を形成しており；ならびに、ｙ＝１～８である；但し、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは、Ｈ以外である]
である、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項17】
Ｍが、４０ｋＤａの４本アーム型ＰＥＧであり、ｙ＝４である、請求項１６に記載のコンジュゲート。
【請求項18】
式：【化4】
のリンカー－薬剤。
【請求項19】
癌の治療における、請求項１～１７のいずれか一項に記載のコンジュゲートの使用。
【請求項20】
ＤＮＡ損傷応答のコンジュゲート阻害剤の製造方法であって、請求項１８のリンカー－薬剤を、連結基Ｚ＊が形成されるような条件下で、官能基Ｚと反応することができる同族体基Ｚ'を含む活性高分子担体に接触させて、適宜コンジュゲートを単離する工程を特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
(関連出願の相互参照)
本願は、米国仮特許出願第６２/８９３,０７５号(２０１９年８月２８日出願)の優先権を主張し、その全体が引用によって本明細書に援用される。
本願は、米国仮特許出願第６２/８９３,０７５号(２０１９年８月２８日出願)の優先権を主張し、その全体が引用によって本明細書に援用される。
【背景技術】
【0002】
ＤＮＡは、活性酸素、紫外線および電離放射線などの作用により、各細胞周期中に何度も損傷を受ける。ＤＮＡ損傷応答(ＤＤＲ)は、損傷の性質に応じて様々な形態で行われる。一本鎖切断(ニック)は、ミスマッチ修復(ＭＭＲ)、ヌクレオチド除去修復(ＮＥＲ)または塩基除去修復(ＢＥＲ)により修復され得る。一本鎖ＤＮＡ切断が、ＤＮＡ複製(細胞分裂に先行する必要がある)の前に修復されない場合、毒性の高い二本鎖ＤＮＡ切断が複製過程で形成される可能性がある。細胞は、１日に約５０個の二本鎖切断を蓄積すると推定され、その殆どは活性酸素種によって誘発される。二本鎖切断の修復には、主に２つの経路がある。Ｓ期後半からＧ２期にかけて、姉妹染色分体が存在する場合、相同組換え修復(ＨＲＲ)によりエラーがない修復が行われる。姉妹染色分体が存在しない場合は、非相同末端結合(ＮＨＥＪ)が、鋳型なしで直接切断末端を結合し、頻繁に遺伝情報のエラーおよび損失を引き起こす。
【0003】
酵素(例えば、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２およびＰＡＬＢ２)は、エラーがない相同組換え修復(ＨＲＲ)の過程による前記二本鎖ＤＮＡ切断の修復にとって重要である。これらのタンパク質の変異は、がんに対する感受性を高めて、乳癌、卵巣癌および前立腺癌において最も多い。
【0004】
多くのがんは、１つ以上の各修復経路に欠陥があり、そのため、残りの機能的経路への依存度が高いことを考えると、ＤＮＡ損傷応答(ＤＤＲ)の阻害は、がんの治療にとって価値ある治療法としての可能性がある。遺伝毒性療法に対する耐性は、ＤＤＲシグナル伝達の増加と関連している可能性があり、前記シグナル伝達の阻害は、放射線療法および遺伝毒性療法を増強する可能性がある。
【0005】
ＰＡＲＰ阻害剤は、ＤＮＡ修復、ゲノム安定性およびプログラムされた細胞死に関与するタンパク質ファミリーであるポリ(ＡＤＰ－リボース)ポリメラーゼ(ＰＡＲＰ)という酵素の作用を阻害する。ＰＡＲＰは、化学物質および放射線などによるＤＮＡの一本鎖切断を検出し、ポリ(ＡＤＰ－リボース)の合成によって修復反応を開始し、ＤＮＡ鎖切断の修復に関与する酵素へのシグナルとして作用する。従って、ＰＡＲＰ阻害剤は、二本鎖ＤＮＡ切断の蓄積を引き起こし、最終的にＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２またはＰＡＬＢ２などの変異を持つＨＲＲ欠損細胞を死滅させる。同様に、腫瘍抑制因子ＰＴＥＮが欠損している細胞は、ＨＲＲ成分であるＲａｄ５１のダウンレギュレーションにより、ＰＡＲＰ阻害に感受性であり得る。
【0006】
いくつかのＰＡＲＰ阻害剤は、癌、例えば、オラパリブ(生殖細胞系ＢＲＣＡ変異型進行性卵巣癌患者)、ルカパリブ(ＢＲＣＡ変異型卵巣癌)、ニラパリブ(上皮癌、卵管癌および原発性腹膜癌)およびタラゾパリブ(生殖細胞系ＢＲＣＡ変異型乳癌)の治療のために承認されている。その他のＰＡＲＰ阻害剤は、例えば、ベリパリブ(進行性卵巣癌、トリプルネガティブ乳癌および非小細胞肺癌)、パミパリブ、ＣＥＰ－９７２２(非小細胞肺癌)およびＥ７０１６(メラノーマ)が臨床試験中である。
【0007】
ＤＤＲ経路におけるその他の主要な標的は、ＡＴＭキナーゼおよびＡＴＲキナーゼであって、これらは細胞周期の停止を誘導し、ＣＨＫ１およびＣＨＫ２などの下流の標的を通じてＤＮＡ損傷修復を促進する。ＡＴＭキナーゼおよびＡＴＲキナーゼは、サイクリン依存性キナーゼ(ＣＤＫ)活性を低下させるように作用し、その結果、Ｇ１－Ｓ期、Ｓ期、Ｇ２－Ｍ期の細胞周期チェックポイントにおける細胞周期進行の減退および停止をもらし、複製または有糸分裂前にＤＮＡ損傷を修復できる時間を増加させる。ＡＴＭおよびＡＴＲは、さらに、ＤＮＡ修復タンパク質の転写を誘導し、翻訳後修飾によりその活性化を促進する。
【0008】
ＤＮＡ修復に対する効果により、ＤＮＡ損傷応答の阻害剤は、ＤＮＡ損傷化学療法剤、特にＤＮＡ複製および転写中に起こるトポイソメラーゼ－１／ＤＮＡ切断複合体のトラップを介してＤＮＡ鎖切断を引き起こすトポイソメラーゼ阻害剤(カンプトテシン、イリノテカン、トポテカン、ＳＮ－３８、エトポシドおよび類似化合物)；白金錯体(オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン)などのＤＮＡ鎖架橋剤；および放射線、ブレオマイシンおよびエネディインなどの一本鎖切断誘導剤の効果と相乗効果をもたらす可能性もある。
【0009】
一本鎖ＤＮＡ損傷は、化学療法剤による治療により開始される可能性があるため、癌の治療においてＰＡＲＰ阻害剤と相乗的に作用することもできる。残念ながら、これらの薬剤の望ましくない毒性も相乗的であるのが一般的であるため、これらの組み合わせによる治療能力は大きく制限される。望ましくない毒性は、正常組織(すなわち、非腫瘍)において高いレベルで２つの薬剤が併存することに起因するため、腫瘍への同時曝露を提供しながらも化学療法剤およびＰＡＲＰ阻害剤が同時に全身曝露されない方法が必要である。この事を達成するための１つの方法は、２０１９年１月１１日に出願された係属中のＰＣＴ特許出願ＰＣＴ/ＵＳ１９/１３３１４“Synergistic Cancer Treatment”に開示されている。この内容は、２０１９年１月１１日に出願された係属中のＰＣＴ出願ＰＣＴ/ＵＳ１９/１３３０６“Protocol for Minimizing Toxicity of Combination Dosages and Imaging Agent for Verification”に開示されており、増強された透過性および保持(ＥＰＲ)効果により腫瘍組織中に蓄積するトポイソメラーゼ阻害剤の放出可能なＰＥＧコンジュゲートを使用する方法である。この方法においては、化学療法剤は、約１０ｎｍの流体力学的半径を有する大きなポリエチレングリコール担体に放出可能な形態でコンジュゲートされている。正常組織と比較して腫瘍組織のリンパ球排出が損なわれているため、そのようなナノ粒子コンジュゲートは、全身循環血および正常組織から排出される。一方でコンジュゲートは腫瘍組織中で捕捉された状態で、化学療法剤を放出し、腫瘍細胞に取り込まれ、ＤＮＡ損傷を引き起こす。コンジュゲートが全身循環から排除されると、コンジュゲートされた化学療法剤が腫瘍に存在し、かつ正常組織には存在しない期間に、ＤＮＡ損傷修復阻害剤が提供される。
【0010】
別の方法として、ＤＮＡ修復阻害剤はまた、腫瘍蓄積性コンジュゲートとして提供されてもよく、それによって腫瘍組織における蓄積を増幅し、ＤＮＡ損傷修復剤への正常組織の曝露を最小にすることが可能である。本発明は、そのようなＤＮＡ損傷修復に関するコンジュゲートを提供する。
【発明の詳細な説明】
【0011】
本発明は、疾患の治療における治療薬として使用するのに適したＤＮＡ損傷応答阻害剤を放出出来るコンジュゲートを提供するものである。可溶性コンジュゲートが腫瘍組織において蓄積する傾向および腫瘍内注射による不溶性コンジュゲートの腫瘍組織への直接投与の可能性を考えると、これらのコンジュゲートは、全身曝露を最小としながら腫瘍におけるＤＮＡ損傷応答阻害剤の高い局所濃度を提供するため、全身的な毒性を改善することが期待される。
【0012】
一態様において、本発明は、従って、式(Ｉ)：
Ｍ－(Ｚ＊－Ｌ－Ｄ)ｙ (Ｉ)
(式中、Ｍは、高分子担体であり；ｙは、Ｍに結合したリンカー－薬剤であるＬ－Ｄの数を示す数字であり；Ｚ＊は、連結基であり；Ｌは、放出可能なリンカーであり；および、Ｄは、ＤＮＡ損傷応答阻害剤である)
であるＤＮＡ損傷応答に関するコンジュゲート阻害剤を提供する。いくつかの実施形態において、Ｍは、可溶性高分子担体であり、ｙ＝１～８である。いくつかの実施形態では、Ｍは、分子量が１,０００～１００,０００ダルトンの可溶性高分子担体であり、ｙ＝１～８である。他の実施形態では、Ｍは、不溶性高分子担体であり、ｙは、Ｍに対するＤの濃度を示す重複度である。
Ｍ－(Ｚ＊－Ｌ－Ｄ)ｙ (Ｉ)
(式中、Ｍは、高分子担体であり；ｙは、Ｍに結合したリンカー－薬剤であるＬ－Ｄの数を示す数字であり；Ｚ＊は、連結基であり；Ｌは、放出可能なリンカーであり；および、Ｄは、ＤＮＡ損傷応答阻害剤である)
であるＤＮＡ損傷応答に関するコンジュゲート阻害剤を提供する。いくつかの実施形態において、Ｍは、可溶性高分子担体であり、ｙ＝１～８である。いくつかの実施形態では、Ｍは、分子量が１,０００～１００,０００ダルトンの可溶性高分子担体であり、ｙ＝１～８である。他の実施形態では、Ｍは、不溶性高分子担体であり、ｙは、Ｍに対するＤの濃度を示す重複度である。
【0013】
いくつかの実施形態において、本発明は、式(Ｉ)のコンジュゲート(式中、Ｄは、放出可能なカルバメート基を介してリンカーＬと結合した第１級または第２級アミンを含んでいる)を提供する。別の態様では、本発明は、式(Ｉ)のコンジュゲート(式中、Ｄは、カルバモイルメチレン基を介してリンカーＬと結合したアシルヒドラゾンを含んでいる)を提供する。
【0014】
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の化合物の製造方法および疾患の治療におけるその使用方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図5】図５は、ＭＸ－１マウス異種移植に対する放出可能なＰＥＧ－タラゾパリブ(ＰＥＧ－ＴＬＺ)の有効性を示す。パネルＡは、放出可能なＰＥＧ－ＴＬＺ(５、１０、２０または３０μｍｏｌ ＴＬＺ／ｋｇ)の単回ＩＰ投与による治療後の腫瘍体積と、遊離ＴＬＺ(０.２５または０.４μｍｏｌ／ｋｇ ＴＬＺ)の毎日の経口投与による治療後の腫瘍体積を示している。また、放出不可能なＰＥＧ化ＴＬＺも示したが、これは有効ではなかった。
【図10】図１０は、タラゾパリブ(ＢＭＮ－６７３)の放出可能なコンジュゲート(Ｒ７＝置換アリール)を、種々の緩衝液(パネルＡ：ｐＨ９.０；パネルＢ：ｐＨ７.４)に置いた時のマンニッヒ塩基Ｒ７－ＣＨ２－ＴＬＺ(Ｒ７＝置換されたアリール)の形成を示す。
【実施態様の詳細な説明】
【0016】
本発明は、式(Ｉ)：
Ｍ－(Ｚ＊－Ｌ－Ｄ)ｙ (Ｉ)
[式中、Ｍは、高分子担体であり；ｙは、Ｍに結合したリンカー－薬剤Ｌ－Ｄの数を示す数字(例えば、１以上の複数値)であり；Ｚ＊は、連結基であり；Ｌは、放出可能なリンカーであり；および、Ｄは、ＤＮＡ損傷応答阻害剤である]
であるコンジュゲート型ＤＮＡ損傷応答阻害剤を提供する。いくつかの実施形態では、ｙ＝１～複数値である。いくつかの実施形態では、Ｍは、可溶性高分子担体であり、ｙ＝１～８である。いくつかの実施形態では、Ｍは、分子量１,０００～１００,０００ダルトンの可溶性高分子担体であり、ｙ＝１～８である。別の実施形態では、Ｍは、不溶性高分子担体であり、ｙは、Ｍに対するＤの濃度を示す重複度である。
Ｍ－(Ｚ＊－Ｌ－Ｄ)ｙ (Ｉ)
[式中、Ｍは、高分子担体であり；ｙは、Ｍに結合したリンカー－薬剤Ｌ－Ｄの数を示す数字(例えば、１以上の複数値)であり；Ｚ＊は、連結基であり；Ｌは、放出可能なリンカーであり；および、Ｄは、ＤＮＡ損傷応答阻害剤である]
であるコンジュゲート型ＤＮＡ損傷応答阻害剤を提供する。いくつかの実施形態では、ｙ＝１～複数値である。いくつかの実施形態では、Ｍは、可溶性高分子担体であり、ｙ＝１～８である。いくつかの実施形態では、Ｍは、分子量１,０００～１００,０００ダルトンの可溶性高分子担体であり、ｙ＝１～８である。別の実施形態では、Ｍは、不溶性高分子担体であり、ｙは、Ｍに対するＤの濃度を示す重複度である。
【0017】
本発明のリンカーは、阻害剤を、放出可能な様に担体に連結させる。適切な条件下で、リンカーは、開裂して遊離の阻害剤を放出する。本発明の実施形態では、リンカー－薬剤は、式(ＩＩ)：
[式中、
Ｚは、リンカー－薬剤と高分子担体を連結させ得る連結基であり；ｎ＝０～６であり；Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、Ｈ、ＣＮまたはＳＯ２Ｒ５であって、ここでＲ５は、所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキル、所望により置換されていてもよいアリール、所望により置換されていてもよいヘテロアリールまたはＮ(Ｒ６)２であるか、またはＮ(Ｒ６)２が、４～８員環を形成しており、ここで各Ｒ６は、独立して、所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキル、所望により置換されていてもよいアリール、所望により置換されていてもよいヘテロアリールであり；各Ｒ４は、独立して、ＨまたはＣ１－Ｃ３アルキルであるか、または一緒になって３～６員環を形成しており；Ｙは、存在しないか、または式：Ｎ(Ｒ７)ＣＨ２であって、式中のＲ７は、所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ４アルキルまたは所望により置換されていてもよいアリールである；但し、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは、Ｈ以外のものである]に示されるものであり、例えば、米国特許第８,６８０,３１５号および第８,７５４,１９０号(いずれも参照により本明細書に組み込まれる)に開示されているように、非加水分解性のβ－脱離反応を介して薬剤を放出させる。いくつかの実施形態において、Ｚは、リンカー－薬剤を高分子担体に連結することを可能にする連結基であり；ｎ＝１～４であり；Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、Ｈ、ＣＮまたはＳＯ２Ｒ５であって、ここでＲ５は、所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキル、所望により置換されていてもよいアリール、所望により置換されていてもよいヘテロアリールまたはＮ(Ｒ６)２であるか、またはＮ(Ｒ６)２が、４～８員環を形成しており、ここで各Ｒ６は、独立して所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキル、所望により置換されていてもよいアリールまたは所望により置換されていてもよいヘテロアリールであり；各Ｒ４は、独立して、ＨまたはＣ１－Ｃ３アルキルであるか、または一緒になって３～６員環を形成し；および、Ｙは、存在しないか、または式：Ｎ(Ｒ７)ＣＨ２であって、式中のＲ７は、所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ４アルキルであり；但し、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは、Ｈ以外のものである。
【化1】
Ｚは、リンカー－薬剤と高分子担体を連結させ得る連結基であり；ｎ＝０～６であり；Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、Ｈ、ＣＮまたはＳＯ２Ｒ５であって、ここでＲ５は、所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキル、所望により置換されていてもよいアリール、所望により置換されていてもよいヘテロアリールまたはＮ(Ｒ６)２であるか、またはＮ(Ｒ６)２が、４～８員環を形成しており、ここで各Ｒ６は、独立して、所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキル、所望により置換されていてもよいアリール、所望により置換されていてもよいヘテロアリールであり；各Ｒ４は、独立して、ＨまたはＣ１－Ｃ３アルキルであるか、または一緒になって３～６員環を形成しており；Ｙは、存在しないか、または式：Ｎ(Ｒ７)ＣＨ２であって、式中のＲ７は、所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ４アルキルまたは所望により置換されていてもよいアリールである；但し、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは、Ｈ以外のものである]に示されるものであり、例えば、米国特許第８,６８０,３１５号および第８,７５４,１９０号(いずれも参照により本明細書に組み込まれる)に開示されているように、非加水分解性のβ－脱離反応を介して薬剤を放出させる。いくつかの実施形態において、Ｚは、リンカー－薬剤を高分子担体に連結することを可能にする連結基であり；ｎ＝１～４であり；Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、Ｈ、ＣＮまたはＳＯ２Ｒ５であって、ここでＲ５は、所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキル、所望により置換されていてもよいアリール、所望により置換されていてもよいヘテロアリールまたはＮ(Ｒ６)２であるか、またはＮ(Ｒ６)２が、４～８員環を形成しており、ここで各Ｒ６は、独立して所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキル、所望により置換されていてもよいアリールまたは所望により置換されていてもよいヘテロアリールであり；各Ｒ４は、独立して、ＨまたはＣ１－Ｃ３アルキルであるか、または一緒になって３～６員環を形成し；および、Ｙは、存在しないか、または式：Ｎ(Ｒ７)ＣＨ２であって、式中のＲ７は、所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ４アルキルであり；但し、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは、Ｈ以外のものである。
【0018】
用語「アルキル」は、１～２０個、１～１２個、１～８個、１～６個または１～４個の炭素原子の直鎖、分枝または環状の飽和炭化水素基を含むことが理解される。いくつかの実施形態では、アルキルは、直鎖状または分枝状である。直鎖状または分岐状のアルキル基の例としては、限定されないが、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｔ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチル、ｎ－ノニル、ｎ－デシルおよび同様のものが含まれる。いくつかの実施形態において、アルキルは、環状である。環状アルキル基の例としては、限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンタジエニル、シクロヘキシルなどが挙げられる。
【0019】
用語「アルコキシ」は、酸素と結合したアルキル基、例えば、メトキシ、エトキシ、イソプロポキシ、シクロプロポキシ、シクロブトキシを含むことが理解される。
【0020】
用語「アルケニル」は、炭素－炭素の二重結合および２～２０個、２～１２個、２～８個、２～６個または２～４個の炭素原子を含む非芳香族不飽和炭化水素を含むことが理解される。
【0021】
用語「アルキニル」は、炭素－炭素の三重結合および２～２０個、２～１２個、２～８個、２～６個または２～４個の炭素原子を含む非芳香族不飽和炭化水素を含むことが理解される。
【0022】
用語「アリール」は、炭素数６～１８、好ましくは炭素数６～１０の芳香族炭化水素基、例えば、フェニル、ナフチルおよびアントラセニルなどの基を含むことが理解される。用語「ヘテロアリール」は、少なくとも１つのＮ、ＯまたはＳ原子を含む炭素数３～１５、好ましくは少なくとも１つのＮ、ＯまたはＳ原子を含む炭素数３～７を含む芳香環、例えば、ピロリル、ピリジル、ピリミジニル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、キノリル、インドリル、インデニルなどの基を含む。
【0023】
ある実施態様では、アルケニル、アルキニル、アリールまたはヘテロアリール基は、アルキル結合を介して分子の残余部と結合されていてもよい。その場合の環境下において、該置換基は、アルケニルアルキル、アルキニルアルキル、アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキルとして示され、該アルキレン基は、アルケニル、アルキニル、アリールまたはヘテロアリール基と、該アルケニル、該アルキニル、該アリールまたは該ヘテロアリールが結合されている分子の間に存在することを示す。
【0024】
用語「ハロゲン」または「ハロ」は、ブロモ、フルオロ、クロロおよびヨードを含むことが理解される。
【0025】
用語「複素環」または「ヘテロシクリル」は、少なくとも１つのＮ、ＯまたはＳ原子を含む３～１５員の芳香族環または非芳香族環を意味すると理解される。例示としては、以下のものに限定されないが、ピペリジニル、ピペラジニル、テトラヒドロピラニル、ピロリジンおよびテトラヒドロフラニルが挙げられ、また上記の用語「ヘテロアリール」として示された例示の基が挙げられる。いくつかの実施形態において、複素環またはヘテロシクリルは、非芳香族である。いくつかの実施形態では、ヘテロ環またはヘテロシクリルは、芳香族である。
【0026】
「所望により置換されていてもよい」とは、別段の指定がない限り、その基は、非置換であってもよく、または１つ以上(例えば、１、２、３、４または５)の同一または相違であり得る置換基で置換されていてもよいことを意味することが理解される。置換基の例としては、以下のものに限定されないが、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、－ＣＮ、－ＯＲａａ、－ＳＲａａ、－ＮＲａａＲｂｂ、－ＮＯ２、－Ｃ＝ＮＨ(ＯＲａａ)、Ｃ(Ｏ)Ｒａａ、－ＯＣ(Ｏ)Ｒａａ、－Ｃ(Ｏ)ＯＲａａ、－Ｃ(Ｏ)ＮＲａａＲｂｂ、－ＯＣ(Ｏ)ＮＲａａＲｂｂ、－ＮＲａａＣ(Ｏ)Ｒｂｂ、－ＮＲａａＣ(Ｏ)ＯＲｂｂ、－Ｓ(Ｏ)Ｒａａ、－Ｓ(Ｏ)２Ｒａａ、－ＮＲａａＳ(Ｏ)Ｒｂｂ、－Ｃ(Ｏ)ＮＲａａＳ(Ｏ)Ｒｂｂ、ＮＲａａＳ(Ｏ)２Ｒｂｂ、－Ｃ(Ｏ)ＮＲａａＳ(Ｏ)２Ｒｂｂ、－Ｓ(Ｏ)ＮＲａａＲｂｂ、－Ｓ(Ｏ)２ＮＲａａＲｂｂ、－Ｐ(Ｏ)(ＯＲａａ)(ＯＲｂｂ)、ヘテロシクリル、ヘテロアリールまたはアリールが挙げられ、ここで該アルキル、該アルケニル、該アルキニル、該シクロアルキル、該へテロシクリル、該ヘテロアリールおよび該アリールは、各々独立して、Ｒｃｃで所望により置換されていてもよく、ここで、
ＲａａおよびＲｂｂは、各々独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロシクリル、ヘテロアリールまたはアリールであるか、あるいは
ＲａａおよびＲｂｂは、それらが結合する窒素原子と一緒になって、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシまたは－ＣＮによって所望により置換されていてもよいヘテロシクリルを形成しており、
各Ｒｃｃは、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アリール、－ＣＮまたは－ＮＯ２である。
ＲａａおよびＲｂｂは、各々独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロシクリル、ヘテロアリールまたはアリールであるか、あるいは
ＲａａおよびＲｂｂは、それらが結合する窒素原子と一緒になって、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシまたは－ＣＮによって所望により置換されていてもよいヘテロシクリルを形成しており、
各Ｒｃｃは、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アリール、－ＣＮまたは－ＮＯ２である。
【0027】
本明細書における使用のために、別段の指示が明確にない限り、用語「ａ」、「ａｎ」等の使用は、１つまたは複数を意味する。
【0028】
脱離速度は、基Ｒ１およびＲ２によって主に制御され、そのうちの少なくとも１つは、ＣＮ、Ｃ１－Ｃ６アルキルスルホン、アリールスルホンまたはヘテロアリールスルホンまたはスルホンアミドなどの電子吸引基であり、これら各々は所望により置換されていてもよい。適切な電子吸引基の説明は、米国特許第８,６８０,３１５号および第８,７５４,１９０号に見出し得る。いくつかの実施形態において、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは、－ＣＮ、－ＳＯ２Ｎ(ＣＨ３)２、－ＳＯ２ＣＨ３、－ＳＯ２Ｐｈ、－ＳＯ２ＰｈＣｌ、－ＳＯ２Ｎ(ＣＨ２ＣＨ２)２Ｏ、－ＳＯ２ＣＨ(ＣＨ３)２、－ＳＯ２Ｎ(ＣＨ３)(ＣＨ２ＣＨ３)または－ＳＯ２Ｎ(ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３)２である。いくつかの実施形態では、Ｒ１およびＲ２のうちの一方は、ＳＯ２Ｒ５であり、他方はＨである。いくつかの実施形態では、Ｒ１およびＲ２のうちの一方は、－ＳＯ２ＣＨ３であり、他方はＨである。特定の実施態様において、Ｒ１およびＲ２は、ｐＨ７.４、３７℃で、１００～１０００時間の間にＤの放出半減期を提供するように選択される。基Ｒ４は、Ｈまたは所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ３アルキルであってもよいか、または両方のＲ４が、一緒になって、３～６員環を形成してもよい。いくつかの実施形態では、各Ｒ４は、独立して、ＨまたはＣ１－Ｃ３アルキルである。いくつかの実施形態では、各Ｒ４は、独立して、Ｈまたはメチルである。いくつかの実施形態では、Ｒ４は、Ｈである。Ｚは、同族体基Ｚ'との反応により、リンカーを高分子担体Ｍに連結することを可能にする官能基である。Ｚの典型的な例には、ハロゲン、アジド、アルケン、アルキン、チオール、マレイミド、カルボニル、カルボン酸、アミンおよびアミノオキシ基が挙げられ、Ｚ'が以下に記載された基の場合、Ｍ－Ｚ＊－Ｌの連結をもたらし、ここでＸは、エーテル、チオエーテル、１,２,３－トリアゾール、オキシムまたはカルボン酸アミド(カルボキサミド)である。
【0029】
いくつかの実施形態において、Ｙは存在しないか、またはＮ(Ｒ７)ＣＨ２である。いくつかの実施形態では、Ｙは存在しない。いくつかの実施形態では、ＹはＮ(Ｒ７)ＣＨ２である。いくつかの実施形態では、Ｒ７は所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ７は、Ｃ１－Ｃ６アルコキシまたは－ＯＨで所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ７は、－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３または－ＣＨ３である。いくつかの実施形態では、Ｒ７は、所望により置換されていてもよいアリールである。いくつかの実施形態では、Ｒ７は、所望により置換されていてもよいフェニルである。いくつかの実施形態では、Ｒ７は、－Ｃ(Ｏ)ＮＲａａＲｂｂによって所望により置換されていてもよいフェニルである。
【0030】
ＤＮＡ損傷応答阻害剤とは、ＤＮＡ鎖切断が修復される１つまたは複数のプロセスを妨害する化合物を意味する。一般的なＤＮＡ損傷応答阻害剤は、ＰＡＲＰ、ＡＴＲまたはＡＴＭのようなＤＮＡ修復酵素の活性を阻害する。
【0031】
本発明において有用なＤＮＡ損傷応答阻害剤は、一般的に、２つの構造クラスに分類される。一実施形態では、阻害剤は、塩基性アミン基を含んでおり、これにより薬剤が、カルバメート基を介するリンカーＬとの結合によってコンジュゲートされる。これらの阻害剤は、例として、ベリパリブ、ニラパリブ、ルカパリブおよびベルゾセルチブ(ＶＸ－９７０、ＶＥ－８２２)である。このような阻害剤は、Ｙが存在せず、かつＤが塩基性窒素を介して結合している式のリンカー－薬剤をもたらす。
【0032】
別の実施形態では、ＤＮＡ損傷応答阻害剤は、塩基性アミン基を含んでおらず、むしろアシルヒドラゾンを含んでおり、フタラゾン(または、フタラジン－１(２Ｈ)－オン)または関連する多環式２,７,８,９－テトラヒドロ－３Ｈ－ピリド[４,３,２－ｄｅ]フタラジン－３－オンの形態で存在することが多い。これらの阻害剤は、米国特許第８,７５４,１９０号に開示されているものと同様のＮ－(クロロメチル)カルバメートを用いてアシルヒドラゾンのＮＨをアルキル化して、連結基Ｙ＝Ｎ(Ｒ８)ＣＨ２を提供することにより、コンジュゲートさせることができる。これらの阻害剤の例には、タラゾパリブ(ＴＬＺ、ＢＭＮ６７３)、オラパリブ、ベリパリブ、ＣＥＰ－９７２２およびＥ７０１６が挙げられる。このような阻害剤は、Ｙが、式Ｎ(Ｒ７)ＣＨ２である、式(ＩＩ)のリンカー－薬剤を提供する。いくつかの実施形態では、Ｙは、式Ｎ(Ｒ７)ＣＨ２であり、Ｄは、Ｄの非塩基性窒素原子へのアルキル結合を介してリンカーＬに連結される。米国特許第８,７５４,１９０号のチオールおよびフェノールコンジュゲートとは対照的に、典型的なフタラゾンのｐＫａは１２であり、β脱離から生じる中間体のマンニッヒ塩基Ｙ－Ｄの分解速度を適切にするために、Ｒ８＝Ｈまたは所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ４アルキルが必要とされる。これらのリンカー－薬剤は、薬剤および強塩基(例えば、リチウムジイソプロピルアミド(ＬＤＡ)、またはナトリウム、リチウムまたはカリウムＨＭＤＳなどの金属ヘキサメチルジシラジド)の反応によって形成される薬剤のアニオン形態と、(Ｎ－クロロメチル)－カルバメートとの反応によって以下の実施例に記載される通りに製造され得る。非アルキル化グアニジン塩基として、例えば７－メチル－１,５,７－トリアザビシクロ[４.４.０]デカ－５－エン(ＭＴＢＤ)を使用することもできる。Ｎ－(クロロメチル)カルバメートは、リンカークロロホルメートと所望により置換されていてもよいアミンＲ７－ＮＨ２との反応によって形成されるリンカー－カルバメートを用いて、米国特許第８,７５４,１９０号に記載されている方法と同様に製造することができる。
【0033】
特定の実施形態では、ＤＮＡ損傷応答阻害剤は、塩基性窒素基および非塩基性窒素基の両方を含んでおり、この場合、得られる最終的なリンカー－薬剤は、生成物を形成するために使用される反応条件によって決まる。例えば、タラゾパリブは、塩基性および非塩基性窒素の両方を含んでいる。タラゾパリブを、リンカークロロホルメートを用いてアシル化して、Ｙが存在しない式(ＩＩ)のリンカー－薬剤を提供することは可能であるが、これらのアシル化タラゾパリブのコンジュゲートは、加水分解を受けやすいことが判明した。そのため、アシルヒドラゾンを含んでいるＤＤＲの阻害剤としては、Ｙ＝Ｎ(Ｒ７)ＣＨ２である式(ＩＩ)の化合物が好ましい。
【0034】
一実施形態では、式(ＩＩ)のリンカー－薬剤は、可溶性高分子担体Ｍと連結させて、コンジュゲートを提供する。Ｍの好適な例は、合成ポリマー(例えば、ポリエチレングリコール)および天然ポリマー(例えば、デキストラン、ヒアルロン酸ならびにランダム配列タンパク質および抗体などのタンパク質)である。Ｍの１つの機能としては、発達が不完全なリンパドレナージュに基づくＥＰＲ(enhanced permeability and retention)効果により、コンジュゲートされた薬剤の蓄積を腫瘍組織中に誘導して、急速に増殖している腫瘍組織中にナノ粒子を取り込ませることである。このメカニズムにより、抗腫瘍薬を腫瘍組織に重点的に送達して、非腫瘍組織への薬物曝露を最小にすることが可能となり、望ましくない毒性を改善することができる。ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／１３３０６；ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ２０１９／１４０２７１において実証されているように、５～５０ｎｍの流体力学的半径のコンジュゲートが、特に有効であると予想され、平均分子量約４０,０００ダルトンの複数のアームを持ったポリエチレングリコールを用いて製造したコンジュゲートが、腫瘍組織おける高い蓄積および寿命を示した。特定の実施形態において、Ｍは、５～５０ｎｍの流体力学的半径を有し、平均分子量が２０,０００～６０,０００ダルトンのポリエチレングリコールである。ある実施形態では、ｙ＝１～４である。最も好ましくは、Ｍは、４～８本のアーム(ｙ＝４～８)を持ち、かつ約４０,０００ダルトンの平均分子量を有する複数アーム型ポリエチレングリコールである。いくつかの実施形態において、Ｍは、平均分子量が１,０００～１００,０００ダルトンのポリエチレングリコールである。いくつかの実施形態において、Ｍは、５～５０ｎｍの流体力学的半径を有する。高分子のポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、デキストラン、ヒアルロン酸などは、通常、多分散性であることが理解される；それらは、存在するモノマー単位数の範囲に起因して、平均分子量について分子量範囲を有するタイプの混合物を含んでいる。モノマー含量(従って、分子量)におけるこのような多分散性は、通常、約±１５％、１０％または５％であり、本発明で使用するためのポリマーの実用性に影響を与えない。したがって、平均分子量４０,０００のポリエチレングリコールが特定された場合、これは、９００±１００のエチレンオキシド単位を有する個々のポリマーを含む約４０,０００±５,０００ダルトンの多分散系ポリマーを示すものである。図２および図３では、各アームが、ｚ個のエチレンオキシドモノマー単位を含む４本アーム型ポリマーを示しており、ポリマーの平均分子量が約４０,０００ダルトンの場合、ｚは２２７±２５である。
【0035】
別の実施形態では、式(ＩＩ)のリンカー－薬剤は、非循環型コンジュゲートを提供するために不溶性担体Ｍと結合される。不溶性Ｍの好適な例としては、バルク材料として、またはミクロスフェアなどの微粒子懸濁液としてのハイドロゲルデポーが挙げられる。この実施形態では、Ｍが、極めて高い分子量の架橋ポリマーである場合、ｙは、不溶性のＭマトリックスに結合したリンカー－薬剤の濃度を記述する重複度である。例えば、Ｍが、４本アーム型ポリマーを架橋して形成される場合、１、２、３または４つのリンカー－薬剤を、各ポリマー－ポリマー単位に結合させることができる。したがって、リンカー－薬剤とＭを適切な比率で反応させることにより、所望の重複度を達成することができる。このようにして、Ｍに対して適切な薬剤濃度を達成することができる。さらに、Ｍにおけるポリマー－ポリマー単位の密度は、ポリマーの分子量を選択することによって変更され得る：例えば、平均分子量２０ｋＤａを有する架橋した４本アーム型ＰＥＧからなるハイドロゲルは、ハイドロゲル１ｍｌ当たり最大５μｍｏｌの薬剤を結合させることができ、一方で、１０ｋＤａＰＥＧからなるハイドロゲルは、ハイドロゲル１ｍｌ当たり最大１０μｍｏｌの薬剤を結合させることができる。典型的な値は、ハイドロゲルＭの１ｍｌ当たりの結合したリンカー－薬剤が、０.１～５０μｍｏｌ、好ましくは０.１～１０μｍｏｌである。この実施形態において、Ｍは、好ましくは、Ｄが放出された後に不溶性担体を排出することができる分解可能な架橋を含んでいる。このようなハイドロゲル材料および該材料とリンカー－薬剤を結合するための方法の例示は、例えば、米国特許第９,６４９,３８５号に見出すことができる。
【0036】
Ｍは、リンカーの薬剤上の基Ｚと、Ｍ上の同族体基Ｚ'との反応により形成された官能基Ｚ＊を介してリンカー－薬剤に連結される。Ｚ／Ｚ'の典型的な例は、一方がアジドであり、他方がアルキンまたはシクロオクチンである場合、Ｚ＊＝１,２,３－トリアゾールを提供する；一方がアミンであり、他方がカルボン酸または活性エステルである場合、Ｚ＊＝カルボキサミドを提供する；一方がクロロホルメートまたは活性化カーボネートであり、他方がアミンである場合、Ｚ＊＝カルバメートを提供する；一方がアルコールであり、他方がイソシアネートである場合、Ｚ＊＝カルバメートを提供する；一方がイソシアネートであり、他方がアミンである場合、Ｚ＊＝尿素を提供する；一方がケトンまたはアルデヒドであり、他方がアミノオキシである場合、Ｚ＊＝オキシムを提供する；および、一方がチオールであり、他方がマレイミドまたはハロカルボニルである場合、Ｚ＊＝チオエーテルを提供する。特定の実施形態において、Ｚ＊は、アジドとシクロオクチン(例えば、アザジベンゾシクロオクチン(ＤＢＣＯ)、ビシクロ[６.１.０]ノン４－イン(ＢＣＮ)または５－ヒドロキシシクロオクチン(５ＨＣＯ))との環化付加により得られるトリアゾールである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ損傷応答のコンジュゲート阻害剤(例えば、式(ＩＩＩ)のコンジュゲート)の製造方法が提供され、この方法は、式(ＩＩ)のリンカー－薬剤を、連結基Ｚ＊が形成されるような条件下で、官能基Ｚと反応することができる同族体基Ｚ'を含む活性高分子担体に接触させて、適宜コンジュゲートを単離する工程を特徴とする。
【0037】
いくつかの実施形態において、式(Ｉ)のコンジュゲートは、式(ＩＩＩ)：
[式中、Ｍ、Ｚ＊、Ｄ、ｎ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｙおよびｙは、式(Ｉ)または(ＩＩ)に関して本明細書に開示される通りである]のコンジュゲートである。いくつかの実施形態では、Ｚ＊は連結基であり；ｎ＝０～６であり；Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、Ｈ、ＣＮまたはＳＯ２Ｒ５であって、ここでＲ５は、所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキル、所望により置換されていてもよいアリール、所望により置換されていてもよいヘテロアリールまたはＮ(Ｒ６)２であるか、またはＮ(Ｒ６)２は４～８員環を形成しており、ここで各Ｒ６は、独立して、所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキル、所望により置換されていてもよいアリール、所望により置換されていてもよいヘテロアリールである；各Ｒ４は、独立して、ＨまたはＣ１－Ｃ３アルキルであるか、または一緒になって３～６員環を形成しており；および、Ｙは存在しないか、または式Ｎ(Ｒ７)ＣＨ２であって、式中のＲ７は所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ４アルキルまたは所望により置換されていてもよいアリールである；但し、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは、Ｈ以外のものである。いくつかの実施形態では、ｎは１～４であり、Ｒ７は所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ４アルキルである。
【化2】
[式中、Ｍ、Ｚ＊、Ｄ、ｎ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｙおよびｙは、式(Ｉ)または(ＩＩ)に関して本明細書に開示される通りである]のコンジュゲートである。いくつかの実施形態では、Ｚ＊は連結基であり；ｎ＝０～６であり；Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、Ｈ、ＣＮまたはＳＯ２Ｒ５であって、ここでＲ５は、所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキル、所望により置換されていてもよいアリール、所望により置換されていてもよいヘテロアリールまたはＮ(Ｒ６)２であるか、またはＮ(Ｒ６)２は４～８員環を形成しており、ここで各Ｒ６は、独立して、所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキル、所望により置換されていてもよいアリール、所望により置換されていてもよいヘテロアリールである；各Ｒ４は、独立して、ＨまたはＣ１－Ｃ３アルキルであるか、または一緒になって３～６員環を形成しており；および、Ｙは存在しないか、または式Ｎ(Ｒ７)ＣＨ２であって、式中のＲ７は所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ４アルキルまたは所望により置換されていてもよいアリールである；但し、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは、Ｈ以外のものである。いくつかの実施形態では、ｎは１～４であり、Ｒ７は所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ４アルキルである。
【0038】
いくつかの実施形態において、式(Ｉ)のコンジュゲートは、式(ＩＶ)：
[式中、Ｍ、Ｚ＊、ｎ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ７およびｙは、式(Ｉ)または(ＩＩ)に関して本明細書に開示されるとおりである]のコンジュゲートである。いくつかの実施形態において、Ｍは、４０ｋＤａの４本アーム型ＰＥＧである。いくつかの実施形態では、ｎは４である。いくつかの実施形態では、Ｚ＊は、カルボキサミド、カルバメート、オキシム、チオエーテルまたはトリアゾールである。いくつかの実施形態では、ｙは４である。いくつかの実施形態では、Ｍは４０ｋＤａの４本アーム型ＰＥＧであり；ｎは４であり；Ｚ＊は、カルボキサミド、カルバメート、オキシム、チオエーテルまたはトリアゾールであり；および、ｙは４である。いくつかの実施形態では、Ｍは４０ｋＤａの４本アーム型ＰＥＧであり；ｎは１であり；各Ｒ４はアルキルであり；Ｒ７は所望により置換されていてもよいアルキルであり；Ｚ＊は、カルボキサミド、カルバメート、オキシム、チオエーテルまたはトリアゾールであり；および、ｙは４である。
【化3】
【0039】
いくつかの実施形態において、式(Ｉ)のコンジュゲートは、式(Ｖ)：
[式中、Ｍ、Ｚ＊、ｎ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびｙは、式(Ｉ)または(ＩＩ)に関して本明細書に開示されるとおりである]のコンジュゲートである。いくつかの実施形態において、Ｍは、４０ｋＤａの４本アーム型ＰＥＧである。いくつかの実施形態では、ｎは４である。いくつかの実施形態では、Ｚ＊は、カルボキサミド、カルバメート、オキシム、チオエーテルまたはトリアゾールである。いくつかの実施形態では、ｙは４である。いくつかの実施形態では、Ｍは４０ｋＤａの４本アーム型ＰＥＧであり；ｎは４であり；Ｚ＊は、カルボキサミド、カルバメート、オキシム、チオエーテルまたはトリアゾールであり；および、ｙは４である。いくつかの実施形態では、Ｍは、４０ｋＤａの４本アーム型ＰＥＧであり；ｎは１であり；各Ｒ４はアルキルであり；Ｒ７は、所望により置換されていてもよいアルキルであり；Ｚ＊は、カルボキサミド、カルバメート、オキシム、チオエーテルまたはトリアゾールであり；および、ｙは４である。
【化4】
[式中、Ｍ、Ｚ＊、ｎ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびｙは、式(Ｉ)または(ＩＩ)に関して本明細書に開示されるとおりである]のコンジュゲートである。いくつかの実施形態において、Ｍは、４０ｋＤａの４本アーム型ＰＥＧである。いくつかの実施形態では、ｎは４である。いくつかの実施形態では、Ｚ＊は、カルボキサミド、カルバメート、オキシム、チオエーテルまたはトリアゾールである。いくつかの実施形態では、ｙは４である。いくつかの実施形態では、Ｍは４０ｋＤａの４本アーム型ＰＥＧであり；ｎは４であり；Ｚ＊は、カルボキサミド、カルバメート、オキシム、チオエーテルまたはトリアゾールであり；および、ｙは４である。いくつかの実施形態では、Ｍは、４０ｋＤａの４本アーム型ＰＥＧであり；ｎは１であり；各Ｒ４はアルキルであり；Ｒ７は、所望により置換されていてもよいアルキルであり；Ｚ＊は、カルボキサミド、カルバメート、オキシム、チオエーテルまたはトリアゾールであり；および、ｙは４である。
【0040】
本明細書の記載において、ある部分のあらゆる記載、変形、実施形態または態様は、その他の部分のあらゆる記載、変形、実施形態または態様と組み合わされてもよく、また各々記載された組み合わせは、具体的かつ個別に記載されている内容と同じように理解される。例えば、式(Ｉ)のＭに関して、本明細書で提供されるあらゆる説明、変形、実施形態または態様は、Ｚ＊、Ｌ、Ｄおよびｙのあらゆる説明、変形、実施形態または態様と、各々および全ての組み合わせが具体的かつ個別に列挙されているかのように組み合わせることができる。また、該当する場合、式(Ｉ)、(ＩＩ)、(ＩＩＩ)または(ＩＶ)のような任意の式のすべての記載、変形、実施形態または態様は、本明細書に詳述するその他の式にも同様に適用され、すべての式について、各々およびすべての記載、変形、実施形態または態様が、単独で、また個別に記載されているかのように記載されていると理解される。例えば、式(ＩＩ)の全ての記載、変形、実施形態または態様は、適用可能な場合、本明細書に詳述される式(Ｉ)、(ＩＩＩ)および(ＩＶ)のような式のいずれにも等しく適用され、各々および全ての記載、変形、実施形態または態様が、全ての式について単独および別個に記載されているかのように記載されている。
【0041】
本発明のコンジュゲートは、当技術分野において既知の標準的な方法を用いて製剤化することができる。最適な安定性は、通常、ｐＨ３～６、好ましくはｐＨ４～５の製剤において観察される。製剤用緩衝液は、所望により、浸透圧、イオン強度、無菌性および安定性を管理するために、当技術分野において公知の賦形剤を含んでいてもよい。製剤は、注射用の水溶液として、または溶解用の凍結乾燥物として提供されてもよい。
【0042】
本発明のコンジュゲートは、そのような治療を必要とするヒトまたは動物のいずれかの対象において様々な疾患または症状を治療するために使用することができる。いくつかの実施形態では、疾患が癌である。いくつかの実施形態では、疾患は、乳癌、卵巣癌または膵臓癌である。
【0043】
遺伝子変異によりＤＮＡ損傷応答における欠陥を起こさせるがんの治療におけるＰＡＲＰ阻害の有用性、即ち「合成致死」と呼ばれる概念は、十分に確立されている(例えば、Nijman, FEBS Letts 2011 Jan 3; 585(1):1-6およびその引用文献を参照)。遺伝子変異の主要な例は、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２およびＰＴＥＮ遺伝子の変異であり、ＤＮＡ損傷修復にとってＰＡＲＰに対する前記変異細胞の依存度が高いことから、ＰＡＲＰ阻害剤による治療について高感受性となることが判っている。ＰＡＲＰ阻害剤は、そのような変異遺伝子の背景における乳癌、卵巣癌および膵臓癌の治療において、特に成功を収めている(Zhu et al., Mol Cancer 19, 49(2020)；https://doi.org/10.1186/s12943-020-01167-9)。本発明のコンジュゲートは、ＰＡＲＰ阻害剤の長期的な放出および曝露を提供するため、ＤＮＡ損傷応答においてこのような遺伝子欠損を有する癌の治療にも有効であると期待される。
【0044】
ＰＡＲＰ阻害剤は、他の薬剤と組み合わせて使用した場合にも有効であることが判っている。併用薬剤の非限定的な例としては、ＤＮＡ損傷剤、例えばカンプトテシン類(例えば、イリノテカン、エキサテカン、ＳＮ－３８)およびそのコンジュゲート(例えば、米国特許第７,４６２,６２７号；同第７,７４４,８６１号；同第８,９０６,３５３号；同第９,８５５,２６１号；同第１０,６５３,６８９号；同第１０,０１６,４１１号；および同第１０,７２９,７８２号ならびにＰＣＴ公開公報ＷＯ２０１５／１５５９７６に記載のようなもの)；テモゾロマイドおよびその他のアルキル化剤；免疫療法剤(例えば、デュルバルマブ、ペムブロリズマブおよびイボルマブ)；キナーゼ阻害剤(例えば、イパタセルチブ、ベルゾセルチブ、ダクトリシブ、ＡＺＤ６７３８、ＶＥ－８２１およびＶＥ－８２２などのＡＴＭ、ＡＴＲおよびＡＫＴ阻害剤)；血管新生剤(例えば、セジラニブ)；アンドロゲン受容体リガンド(例えば、エンザルタミドおよびアビラテロン)；および放射線療法などである。例えば、C. Pezaro, Ther Adv Med Oncol. 2020; 12: 1758835919897537を参照されたい。遺伝子変異がない場合、ＰＡＲＰ阻害剤は、エピジェネティック修飾剤(例えば、ジヌクレオシド代謝拮抗薬グアデシタビンなどのＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤)との併用が有効であることがわかっている(Pulliam et al., Clin Cancer Res. 2018; 24(13)：3163-75)。本発明のコンジュゲートが、前記薬剤と組み合わせて、がんの治療において有用性を見出すことが同様に期待される。
【0045】
ＰＡＲＰ阻害剤は、ＰＡＲＰの過剰な活性化により、パータナトス(Parthanatos)と呼ばれる特定形態のプログラム細胞死が生じる場合の様々な神経変性疾患に対して活性を示す(Wang et al., Sci Signal. 2011 Apr 5; 4(167)：ra20)。神経変性疾患(例えば、網膜色素変性症(Sahaboglu et al., Sci. Rep. 2016；6：39537)、緑内障性網膜症および視神経網膜症(米国特許第６,４４４,６７６号)、アルツハイマー病(Gao et al., J. Enzyme Inhibition and Med Chem 2019, 34:1, 150-162))においてＰＡＲＰ阻害剤の活性を挙げることができる。
【0046】
コンジュゲートの投与は、あらゆる経路(例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、頭蓋内および眼窩内)によるものであってよい。
【0047】
以下に、代表的な特定の実施形態を示す：
実施形態１．式：
Ｍ－(Ｚ＊－Ｌ－Ｄ)ｙ
[式中、
Ｍは、可溶性高分子担体であり；
ｙ＝１～８であり；
Ｚ＊は、連結基であり；
Ｌは、放出可能なリンカーであり；および
Ｄは、ＤＮＡ損傷応答阻害剤である]
である、コンジュゲート。
実施形態２．Ｄが、ＰＡＲＰ阻害剤、ＡＴＭ阻害剤またはＡＴＲ阻害剤である、実施形態１に記載のコンジュゲート。
実施形態３．式：
[式中、Ｚ＊は連結基であり；ｎ＝１～４であり；Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、Ｈ、ＣＮまたはＳＯ２Ｒ５であって、ここでＲ５は、所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキル、所望により置換されていてもよいアリール、所望により置換されていてもよいヘテロアリールまたはＮ(Ｒ６)２であるか、またはＮ(Ｒ６)２が４～８個の原子で環を形成しており、ここで各Ｒ６は、独立して、所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキル、所望により置換されていてもよいアリール、所望により置換されていてもよいヘテロアリールである；各Ｒ４は、独立して、ＨまたはＣ１－Ｃ３アルキルであるか、または一緒になって３～６員環を形成し；および、Ｙは、存在しないか、または式Ｎ(Ｒ７)ＣＨ２であって、式中のＲ７は、所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ４アルキルである；但し、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは、Ｈ以外である]
である、実施形態１に記載のコンジュゲート。
実施形態４．Ｙは、存在せず、Ｄは、Ｄの第１級または第２級アミン窒素原子とのカルバメート結合を介してリンカーＬに連結される、実施形態３に記載のコンジュゲート。
実施形態５．Ｄは、ルカパリブ、ベリパリブ、ニラパリブまたはベルゾセルチブである、実施形態４に記載のコンジュゲート。
実施形態６．Ｙは、式Ｎ(Ｒ７)ＣＨ２であって、Ｄは、Ｄの非塩基性窒素原子とのアルキル結合を介してリンカーＬに連結される、実施形態３に記載のコンジュゲート。
実施形態７．Ｄは、タラゾパリブ、オラパリブ、タミパリブ、Ｅ７０１６またはＣＥＰ－９７２２である、実施形態６に記載のコンジュゲート
実施形態８．Ｍは、分子量１０００～１００,０００のＰＥＧであって、ｙ＝１～８である、実施形態１に記載のコンジュゲート。
実施形態９．Ｍの流体力学的半径が、５～５０ｎｍを有する、実施形態１に記載のコンジュゲート。
実施形態１０．Ｚ＊が、カルボキサミド、カルバメート、尿素、オキシム、チオエーテルまたは１,２,３－トリアゾールである、実施形態１に記載のコンジュゲート。
実施形態１１．Ｒ１およびＲ２が、ｐＨ７.４、３７℃において、Ｄの放出半減期が１００～１０００時間となるように選択される、実施形態１に記載のコンジュゲート。
実施形態１２．式：
[式中、Ｍは、高分子担体であり；ｎ＝１～４であり；Ｚ＊は、連結基であり；Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、Ｈ、ＣＮまたはＳＯ２Ｒ５であって、ここでＲ５は、所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキル、所望により置換されていてもよいアリール、所望により置換されていてもよいヘテロアリールまたはＮ(Ｒ６)２であるか、またはＮ(Ｒ６)２は４～８員環を形成しており、ここで各Ｒ６は、独立して、所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキル、所望により置換されていてもよいアリール、所望により置換されていてもよいヘテロアリールであり；各Ｒ４は、独立して、ＨまたはＣ１－Ｃ３アルキルであるか、または一緒になって３～６員環を形成しており；Ｒ７は、所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ３アルキルであり；および、ｙ＝１～複数である；但し、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは、Ｈ以外のものである]
である、実施形態１に記載のコンジュゲート。
実施形態１３．Ｍが、４０ｋＤａの４本アーム型ＰＥＧであって、ｙ＝４である、実施形態１２に記載のコンジュゲート。
実施形態１４．Ｍが、４０ｋＤａの４本アーム型ＰＥＧであり；ｎ＝４であり；Ｚ＊がカルボキサミド、カルバメート、オキシム、チオエーテルまたはトリアゾールであり；および、ｙ＝４である、実施形態１２に記載のコンジュゲート。
実施形態１５．式：
[式中、Ｍは、高分子担体であり；ｎ＝１～４であり；Ｚ＊は、連結基であり；Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、Ｈ、ＣＮまたはＳＯ２Ｒ５であって、ここでＲ５は、所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキル、所望により置換されていてもよいアリール、所望により置換されていてもよいヘテロアリールまたはＮ(Ｒ６)２であるか、またはＮ(Ｒ６)２は４～８員環を形成しており、ここで各Ｒ６は、独立して、所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキル、所望により置換されていてもよいアリール、所望により置換されていてもよいヘテロアリールである；各Ｒ４は、独立して、ＨまたはＣ１－Ｃ３アルキルであるか、または一緒になって３～６員環を形成し；および、ｙ＝１～複数であり；但し、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つはＨ以外である]
である、実施形態１に記載のコンジュゲート。
実施形態１６．Ｍが、４０ｋＤａの４本アーム型ＰＥＧであり；ｙ＝４であり；Ｚ＊が、カルボキサミド、カルバメート、オキシム、チオエーテルまたはトリアゾールであり；および、ｙ＝４である、実施形態１５に記載のコンジュゲート。
実施形態１７．式：
[式中、Ｚは、連結基であり；ｎ＝１～４であり；Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、Ｈ、ＣＮまたはＳＯ２Ｒ５であって、ここでＲ５は、所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキル、所望により置換されていてもよいアリール、所望により置換されていてもよいヘテロアリールまたはＮ(Ｒ６)２であるか、またはＮ(Ｒ６)２は、４～８員環を形成しており、ここで各Ｒ６は、独立して、所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキル、所望により置換されていてもよいアリール、所望により置換されていてもよいヘテロアリールであり；各Ｒ４は、独立して、ＨまたはＣ１－Ｃ３アルキルであるか、または一緒になって３～６員環を形成し；および、Ｙは、存在しないか、または式：Ｎ(Ｒ７)ＣＨ２であって、式中のＲ７は、所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ４アルキルであり；および、Ｄは、ＤＮＡ損傷応答の阻害剤であり；但し、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは、Ｈ以外のものである]
のリンカー－薬剤。
実施形態１．式：
Ｍ－(Ｚ＊－Ｌ－Ｄ)ｙ
[式中、
Ｍは、可溶性高分子担体であり；
ｙ＝１～８であり；
Ｚ＊は、連結基であり；
Ｌは、放出可能なリンカーであり；および
Ｄは、ＤＮＡ損傷応答阻害剤である]
である、コンジュゲート。
実施形態２．Ｄが、ＰＡＲＰ阻害剤、ＡＴＭ阻害剤またはＡＴＲ阻害剤である、実施形態１に記載のコンジュゲート。
実施形態３．式：
【化5】
[式中、Ｚ＊は連結基であり；ｎ＝１～４であり；Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、Ｈ、ＣＮまたはＳＯ２Ｒ５であって、ここでＲ５は、所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキル、所望により置換されていてもよいアリール、所望により置換されていてもよいヘテロアリールまたはＮ(Ｒ６)２であるか、またはＮ(Ｒ６)２が４～８個の原子で環を形成しており、ここで各Ｒ６は、独立して、所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキル、所望により置換されていてもよいアリール、所望により置換されていてもよいヘテロアリールである；各Ｒ４は、独立して、ＨまたはＣ１－Ｃ３アルキルであるか、または一緒になって３～６員環を形成し；および、Ｙは、存在しないか、または式Ｎ(Ｒ７)ＣＨ２であって、式中のＲ７は、所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ４アルキルである；但し、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは、Ｈ以外である]
である、実施形態１に記載のコンジュゲート。
実施形態４．Ｙは、存在せず、Ｄは、Ｄの第１級または第２級アミン窒素原子とのカルバメート結合を介してリンカーＬに連結される、実施形態３に記載のコンジュゲート。
実施形態５．Ｄは、ルカパリブ、ベリパリブ、ニラパリブまたはベルゾセルチブである、実施形態４に記載のコンジュゲート。
実施形態６．Ｙは、式Ｎ(Ｒ７)ＣＨ２であって、Ｄは、Ｄの非塩基性窒素原子とのアルキル結合を介してリンカーＬに連結される、実施形態３に記載のコンジュゲート。
実施形態７．Ｄは、タラゾパリブ、オラパリブ、タミパリブ、Ｅ７０１６またはＣＥＰ－９７２２である、実施形態６に記載のコンジュゲート
実施形態８．Ｍは、分子量１０００～１００,０００のＰＥＧであって、ｙ＝１～８である、実施形態１に記載のコンジュゲート。
実施形態９．Ｍの流体力学的半径が、５～５０ｎｍを有する、実施形態１に記載のコンジュゲート。
実施形態１０．Ｚ＊が、カルボキサミド、カルバメート、尿素、オキシム、チオエーテルまたは１,２,３－トリアゾールである、実施形態１に記載のコンジュゲート。
実施形態１１．Ｒ１およびＲ２が、ｐＨ７.４、３７℃において、Ｄの放出半減期が１００～１０００時間となるように選択される、実施形態１に記載のコンジュゲート。
実施形態１２．式：
【化6】
[式中、Ｍは、高分子担体であり；ｎ＝１～４であり；Ｚ＊は、連結基であり；Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、Ｈ、ＣＮまたはＳＯ２Ｒ５であって、ここでＲ５は、所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキル、所望により置換されていてもよいアリール、所望により置換されていてもよいヘテロアリールまたはＮ(Ｒ６)２であるか、またはＮ(Ｒ６)２は４～８員環を形成しており、ここで各Ｒ６は、独立して、所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキル、所望により置換されていてもよいアリール、所望により置換されていてもよいヘテロアリールであり；各Ｒ４は、独立して、ＨまたはＣ１－Ｃ３アルキルであるか、または一緒になって３～６員環を形成しており；Ｒ７は、所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ３アルキルであり；および、ｙ＝１～複数である；但し、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは、Ｈ以外のものである]
である、実施形態１に記載のコンジュゲート。
実施形態１３．Ｍが、４０ｋＤａの４本アーム型ＰＥＧであって、ｙ＝４である、実施形態１２に記載のコンジュゲート。
実施形態１４．Ｍが、４０ｋＤａの４本アーム型ＰＥＧであり；ｎ＝４であり；Ｚ＊がカルボキサミド、カルバメート、オキシム、チオエーテルまたはトリアゾールであり；および、ｙ＝４である、実施形態１２に記載のコンジュゲート。
実施形態１５．式：
【化7】
[式中、Ｍは、高分子担体であり；ｎ＝１～４であり；Ｚ＊は、連結基であり；Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、Ｈ、ＣＮまたはＳＯ２Ｒ５であって、ここでＲ５は、所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキル、所望により置換されていてもよいアリール、所望により置換されていてもよいヘテロアリールまたはＮ(Ｒ６)２であるか、またはＮ(Ｒ６)２は４～８員環を形成しており、ここで各Ｒ６は、独立して、所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキル、所望により置換されていてもよいアリール、所望により置換されていてもよいヘテロアリールである；各Ｒ４は、独立して、ＨまたはＣ１－Ｃ３アルキルであるか、または一緒になって３～６員環を形成し；および、ｙ＝１～複数であり；但し、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つはＨ以外である]
である、実施形態１に記載のコンジュゲート。
実施形態１６．Ｍが、４０ｋＤａの４本アーム型ＰＥＧであり；ｙ＝４であり；Ｚ＊が、カルボキサミド、カルバメート、オキシム、チオエーテルまたはトリアゾールであり；および、ｙ＝４である、実施形態１５に記載のコンジュゲート。
実施形態１７．式：
【化8】
[式中、Ｚは、連結基であり；ｎ＝１～４であり；Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、Ｈ、ＣＮまたはＳＯ２Ｒ５であって、ここでＲ５は、所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキル、所望により置換されていてもよいアリール、所望により置換されていてもよいヘテロアリールまたはＮ(Ｒ６)２であるか、またはＮ(Ｒ６)２は、４～８員環を形成しており、ここで各Ｒ６は、独立して、所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキル、所望により置換されていてもよいアリール、所望により置換されていてもよいヘテロアリールであり；各Ｒ４は、独立して、ＨまたはＣ１－Ｃ３アルキルであるか、または一緒になって３～６員環を形成し；および、Ｙは、存在しないか、または式：Ｎ(Ｒ７)ＣＨ２であって、式中のＲ７は、所望により置換されていてもよいＣ１－Ｃ４アルキルであり；および、Ｄは、ＤＮＡ損傷応答の阻害剤であり；但し、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは、Ｈ以外のものである]
のリンカー－薬剤。
【0048】
以下の実施例は、本発明を例示するが、本発明を限定するものではない。
製造例Ａ
リンカーのアルコール類、クロロホルメート類およびスクシンイミジルカーボネート類の合成
特定のリンカーアルコール類、クロロホルメート類およびスクシンイミジルカーボネート類の合成は、例えば、米国特許第８,６８０,３１５号および第８,７５４,１９０号、ならびにSanti et al.(2012) Proc Natl Acad Sci USA 109:6211-6において、以前に説明されている。追加のリンカーは、以下の方法に従って製造した。
(１)４－アジド－１－シアノ－３,３－ジメチル－２－ブタノール(ｎ＝１、Ｒ
１
＝ＣＮ、Ｒ
２
＝Ｈ、Ｒ
４
＝ＣＨ
３
、Ｚ＝Ｎ
３
)
製造例Ａ
リンカーのアルコール類、クロロホルメート類およびスクシンイミジルカーボネート類の合成
特定のリンカーアルコール類、クロロホルメート類およびスクシンイミジルカーボネート類の合成は、例えば、米国特許第８,６８０,３１５号および第８,７５４,１９０号、ならびにSanti et al.(2012) Proc Natl Acad Sci USA 109:6211-6において、以前に説明されている。追加のリンカーは、以下の方法に従って製造した。
【化9】
【0049】
３－アジド－２,２－ジメチルプロピオン酸メチル(Kim, Synthetic Communicationsに従って製造；３００ｍｇ，１.９ｍｍｏｌ)およびアセトニトリル(０.３６５ｍＬ, ７.０ｍｍｏｌ)／ＴＨＦ(７ｍＬ)の溶液に、－３０℃で、１Ｍ カリウムｔｅｒｔ－ブトキシド／ＴＨＦ (３.５ｍＬ, ３.５ｍｍｏｌ)の溶液を加えた。この混合物を、－３０℃で３０分間撹拌した後、１時間かけて周囲温度まで昇温させ、さらに３０分間撹拌した。混合物を、氷上で冷却し、６Ｎ ＨＣｌ(０.６２ｍＬ, ３.７ｍｍｏｌ)を加えてクエンチし、ＥｔＯＡｃおよび水の間に分配した。水相を、ＥｔＯＡｃで２回抽出し、有機相を合わせて、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させて、濾過して濃縮し、粗ケトンを得た。
【0050】
メタノール(７ｍＬ)中の粗ケトン(３００ｍｇ，約１.７５ｍｍｏｌ)溶液に、水素化ホウ素ナトリウム(３３ｍｇ，０.８８ｍｍｏｌ)を添加した。混合物を、１５分間撹拌し、６Ｎ ＨＣｌ(０.７ｍＬ)を加えてクエンチし、ＥｔＯＡｃおよび水の間に分配した。水相をＥｔＯＡｃで２回抽出し、有機相を合わせて、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、濾過して濃縮し、粗アルコールを得た。ＳｉＯ２(２０～４０％ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン)上で精製して、４－アジド－１－シアノ－３,３－ジメチル－２－ブタノール(１４２ｍｇ，０.８５ｍｍｏｌ)を得た。
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) d 3.83-3.92 (m,1H), 3.43 (d, J=12.1 Hz,1H), 3.21 (d, J=12.1 Hz, 1H), 2.41-2.62 (m,3H), 0.97 (s,3H), and 0.96 (s,3H).
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) d 3.83-3.92 (m,1H), 3.43 (d, J=12.1 Hz,1H), 3.21 (d, J=12.1 Hz, 1H), 2.41-2.62 (m,3H), 0.97 (s,3H), and 0.96 (s,3H).
【0051】
(２)４－アジド－１－シアノ－３,３－ジメチル－２－ブチル クロロホルメート(ｎ＝１、Ｒ
１
＝ＣＮ、Ｒ
２
＝Ｈ、Ｒ
４
＝ＣＨ
３
、Ｚ＝Ｎ
３
)
氷上で冷却したＴＨＦ(８ｍＬ)中の４－アジド－１－シアノ－３,３－ジメチル－２－ブタノール(１４２ｍｇ，０.８５ｍｍｏｌ)およびトリホスゲン(４２５ｍｇ，１.４４ｍｍｏｌ)の溶液に、ピリジン(１３６ｕＬ, １.７ｍｍｏｌ)を滴加した。得られた懸濁液を、周囲温度にまで昇温させて、１５分間撹拌した後、濾過して濃縮し、クロロホルメートを得た。
氷上で冷却したＴＨＦ(８ｍＬ)中の４－アジド－１－シアノ－３,３－ジメチル－２－ブタノール(１４２ｍｇ，０.８５ｍｍｏｌ)およびトリホスゲン(４２５ｍｇ，１.４４ｍｍｏｌ)の溶液に、ピリジン(１３６ｕＬ, １.７ｍｍｏｌ)を滴加した。得られた懸濁液を、周囲温度にまで昇温させて、１５分間撹拌した後、濾過して濃縮し、クロロホルメートを得た。
【0052】
(３)４－アジド－１－シアノ－３,３－ジメチル－２－ブチルスクシンイミジルカーボネート(ｎ＝１、Ｒ
１
＝ＣＮ、Ｒ
２
＝Ｈ、Ｒ
４
＝ＣＨ
３
、Ｚ＝Ｎ
３
)
上記から得たクロロホルメートを、ＴＨＦ(８ｍＬ)に溶解し、氷上で冷却し、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド(２９１ｍｇ，２.５ｍｍｏｌ)およびピリジン(２０４ｕＬ, ２.５３ｍｍｏｌ)で処理した。得られた懸濁液を、周囲温度に昇温し、１５分間撹拌した後、ＥｔＯＡｃおよび５％ＫＨＳＯ４間に分配した。水相を、ＥｔＯＡｃで２回抽出し、有機相を合わせて、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、濾過して濃縮し、粗スクシンイミジルカーボネートを得た。ＳｉＯ２(２０～４０％ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン)上での精製により、４－アジド－１－シアノ－３,３－ジメチル－２－ブチルスクシンイミジルカーボネート(１７４ｍｇ，０.５６ｍｍｏｌ)を得た。1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) d 5.03 (dd,J=7.0,5.1,1H), 3.27-3.41 (m,6H), 3.43 (d, J=12.1 Hz,1H), 3.21 (d, J=12.1 Hz, 1H), 2.41-2.62 (m,3H), 0.97 (s,3H), and 0.96 (s,3H).
上記から得たクロロホルメートを、ＴＨＦ(８ｍＬ)に溶解し、氷上で冷却し、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド(２９１ｍｇ，２.５ｍｍｏｌ)およびピリジン(２０４ｕＬ, ２.５３ｍｍｏｌ)で処理した。得られた懸濁液を、周囲温度に昇温し、１５分間撹拌した後、ＥｔＯＡｃおよび５％ＫＨＳＯ４間に分配した。水相を、ＥｔＯＡｃで２回抽出し、有機相を合わせて、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、濾過して濃縮し、粗スクシンイミジルカーボネートを得た。ＳｉＯ２(２０～４０％ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン)上での精製により、４－アジド－１－シアノ－３,３－ジメチル－２－ブチルスクシンイミジルカーボネート(１７４ｍｇ，０.５６ｍｍｏｌ)を得た。1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) d 5.03 (dd,J=7.0,5.1,1H), 3.27-3.41 (m,6H), 3.43 (d, J=12.1 Hz,1H), 3.21 (d, J=12.1 Hz, 1H), 2.41-2.62 (m,3H), 0.97 (s,3H), and 0.96 (s,3H).
【0053】
リンカー(ｎ＝２～６)は、対応する同族体ハロエステルから順に製造される
５－アジド－１－シアノ－３,３－ジメチル－２－ペンチルスクシンイミジルカーボネート(ｎ＝２、Ｒ １ ＝ＣＮ、Ｒ ２ ＝Ｈ、Ｒ ４ ＝ＣＨ ３ 、Ｚ＝Ｎ ３ )
(ａ) エチル４－クロロ－２,２－ジメチルブタノエート
スターラーバー、ゴム製セプタム、窒素導入口および熱電対プローブを備えた、ヒートガンで乾燥させた５００ｍＬ丸底フラスコに、ｉＰｒ２ＮＨ(５.３０ｍＬ, ３７.４ｍｍｏｌ, １.１等量, 終濃度０.２７Ｍ)およびＴＨＦ(１００ｍＬ)を入れた。内部温度が＋１０℃を超えない速度にて、シリンジを介してｎＢｕＬｉ(ヘキサン中で１.２８Ｍ, ２７.８ｍＬ, ３５.７ｍｍｏｌ, １.０５等量, 終濃度０.２６Ｍ)の溶液を滴加しながら、反応混合物を０℃で冷却した(～１０分)。反応混合物を、０℃で１５分間撹拌し、－７８℃に冷却し、ＴＨＦ(５ｍＬ)中のイソ酪酸エチル(４.６ｍＬ, ４.０ｇ, ３４ｍｍｏｌ, １.０等量, 終濃度０.２４Ｍ)の溶液を、シリンジを介して内部温度が－６５℃(～５分間)を超えない速度で滴加した。反応混合物を－７８℃で４５分間撹拌した後、１－ブロモ－２－クロロエタン(２.８ｍＬ, ３４ｍｍｏｌ, １.０等量, 終濃度０.２４Ｍ)／ＴＨＦ(５ｍＬ)の溶液を、内部温度が－６８℃を超えない速度で滴加した。反応混合物を、－７８℃で１５分間撹拌し、０℃に昇温させて、０℃で１５分間撹拌した。反応混合物を、ＥｔＯＡｃ(１００ｍＬ)および５％ＫＨＳＯ４(１００ｍＬ)で希釈した。水相を分離し、ＥｔＯＡｃ(３ｘ５０ｍＬ)で抽出した。水相を分離し、ＥｔＯＡｃ(３ｘ５０ｍＬ)で抽出した。有機相を合わせて、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、濾過し、トルエン(１０ｍＬｘ２)から濃縮して、所望の塩化物[４.８５ｇ(２７ｍｍｏｌ, ７９％)]を淡黄色油状物として得た。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 4.14 (q, J=7.2 Hz, 2 H), 3.43 - 3.57 (m, 2 H), 1.94 - 2.19 (m, 2 H), 1.27 (t, J=7.1 Hz, 3 H), 1.22 (s, 6 H)
５－アジド－１－シアノ－３,３－ジメチル－２－ペンチルスクシンイミジルカーボネート(ｎ＝２、Ｒ １ ＝ＣＮ、Ｒ ２ ＝Ｈ、Ｒ ４ ＝ＣＨ ３ 、Ｚ＝Ｎ ３ )
(ａ) エチル４－クロロ－２,２－ジメチルブタノエート
スターラーバー、ゴム製セプタム、窒素導入口および熱電対プローブを備えた、ヒートガンで乾燥させた５００ｍＬ丸底フラスコに、ｉＰｒ２ＮＨ(５.３０ｍＬ, ３７.４ｍｍｏｌ, １.１等量, 終濃度０.２７Ｍ)およびＴＨＦ(１００ｍＬ)を入れた。内部温度が＋１０℃を超えない速度にて、シリンジを介してｎＢｕＬｉ(ヘキサン中で１.２８Ｍ, ２７.８ｍＬ, ３５.７ｍｍｏｌ, １.０５等量, 終濃度０.２６Ｍ)の溶液を滴加しながら、反応混合物を０℃で冷却した(～１０分)。反応混合物を、０℃で１５分間撹拌し、－７８℃に冷却し、ＴＨＦ(５ｍＬ)中のイソ酪酸エチル(４.６ｍＬ, ４.０ｇ, ３４ｍｍｏｌ, １.０等量, 終濃度０.２４Ｍ)の溶液を、シリンジを介して内部温度が－６５℃(～５分間)を超えない速度で滴加した。反応混合物を－７８℃で４５分間撹拌した後、１－ブロモ－２－クロロエタン(２.８ｍＬ, ３４ｍｍｏｌ, １.０等量, 終濃度０.２４Ｍ)／ＴＨＦ(５ｍＬ)の溶液を、内部温度が－６８℃を超えない速度で滴加した。反応混合物を、－７８℃で１５分間撹拌し、０℃に昇温させて、０℃で１５分間撹拌した。反応混合物を、ＥｔＯＡｃ(１００ｍＬ)および５％ＫＨＳＯ４(１００ｍＬ)で希釈した。水相を分離し、ＥｔＯＡｃ(３ｘ５０ｍＬ)で抽出した。水相を分離し、ＥｔＯＡｃ(３ｘ５０ｍＬ)で抽出した。有機相を合わせて、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、濾過し、トルエン(１０ｍＬｘ２)から濃縮して、所望の塩化物[４.８５ｇ(２７ｍｍｏｌ, ７９％)]を淡黄色油状物として得た。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 4.14 (q, J=7.2 Hz, 2 H), 3.43 - 3.57 (m, 2 H), 1.94 - 2.19 (m, 2 H), 1.27 (t, J=7.1 Hz, 3 H), 1.22 (s, 6 H)
【0054】
(ｂ)エチル４－アジド－２,２－ジメチルブタノエート
スターラーバー、ゴム製セプタム、窒素導入口を備えた、１００ｍＬ丸底フラスコに、４－クロロ－２,２－ジメチルブタン酸エチル(２－１)(４.８５ｇ, ２７ｍｍｏｌ, １.０等量, 終濃度０.５４Ｍ)、ＤＭＳＯ(５０ｍＬ)およびアジ化ナトリウム(２.２８ｇ, ３５ｍｍｏｌ, １.３等量, ０.７０Ｍ)を入れた。反応混合物を、７０℃で１８時間ブラストシールドの後ろで撹拌した。反応混合物を、周囲温度まで冷却し、ＥｔＯＡｃ(２００ｍＬ)およびＨ２Ｏ(１００ｍＬ)で希釈した。有機相を分離し、Ｈ２Ｏ(３×１００ｍＬ)およびブライン(１００ｍＬ)で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、濾過して濃縮した。カラムクロマトグラフィー(４０ｇシリカゲルカートリッジ；段階的なグラジエント溶出：０％、５％、１０％、２０％ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン)により精製し、目的のアジド[４.３３ｇ(２３.３ｍｍｏｌ, ８７％)]を、淡黄色油状物として得た。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 4.15 (q, J=7.1 Hz, 2 H), 3.22 - 3.35 (m, 2 H), 1.81 - 1.96 (m, 2 H), 1.27 (t, J=7.2 Hz, 3 H), 1.15 - 1.24 (m, 6 H)
【化10】
1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 4.15 (q, J=7.1 Hz, 2 H), 3.22 - 3.35 (m, 2 H), 1.81 - 1.96 (m, 2 H), 1.27 (t, J=7.2 Hz, 3 H), 1.15 - 1.24 (m, 6 H)
【0055】
(ｃ)５－アジド－１－(メチルスルホニル)－３,３－ジメチル－２－ペンタノン
スターラーバー、３つのゴム製セプタム、熱電対プローブおよび窒素導入口を備えた５００ｍＬの３つ首丸底フラスコに、ジメチルスルホン(５.５９ｇ, ５９.４ｍｍｏｌ, ２.２等量, 終濃度０.４２Ｍ)およびＴＨＦ(１００ｍＬ)を入れた。混合物を周囲温度で１５分間撹拌し、０℃で冷却しながら、ｎ－ＢｕＬｉ(４２ｍＬ, ５４ｍｍｏｌ, ２.０等量, 終濃度０.３９Ｍ)の溶液を、内部温度が＋５℃を超えない速度で滴加した(添加には約１０分間を要した)。反応混合物を０℃で１５分間撹拌した後、－７８℃で冷却し、エステル(５.０ｇ, ２７.０ｍｍｏｌ, １.０等量, 終濃度０.１９Ｍ)／ＴＨＦ(１０ｍＬ)の溶液を、内部温度が－７０℃(添加には約５分間を要した)を超えない速度でカニューレを介して滴加した。反応混合物を－７８℃で１０分間攪拌し、０℃に昇温させて(浴を取り外して)、０℃で３０分間攪拌した。反応の進行をＴＬＣで分析して、出発物質よりも極性が高い生成物への変換が示された。反応混合物を０℃で冷却しながら、１Ｍ ＨＣｌを加え、反応混合物をＨ２Ｏ(１００ｍＬ)およびＥｔＯＡｃ(２００ｍＬ)でさらに希釈した。水相を分離し、ＥｔＯＡｃ(３ｘ１００ｍＬ)で抽出した。有機相を合わせて、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過して濃縮し、黄色の油状物を得た。カラムクロマトグラフィー(１２０ｇ シリカゲルカートリッジ；段階的グラジエント溶出３０％, ４０％, ５０％ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン)による精製により、所望の生成物[３.４９ｇ(１５.０ｍｍｏｌ, ５５％収率)]を、白色の固体として得た。
【化11】
スターラーバー、３つのゴム製セプタム、熱電対プローブおよび窒素導入口を備えた５００ｍＬの３つ首丸底フラスコに、ジメチルスルホン(５.５９ｇ, ５９.４ｍｍｏｌ, ２.２等量, 終濃度０.４２Ｍ)およびＴＨＦ(１００ｍＬ)を入れた。混合物を周囲温度で１５分間撹拌し、０℃で冷却しながら、ｎ－ＢｕＬｉ(４２ｍＬ, ５４ｍｍｏｌ, ２.０等量, 終濃度０.３９Ｍ)の溶液を、内部温度が＋５℃を超えない速度で滴加した(添加には約１０分間を要した)。反応混合物を０℃で１５分間撹拌した後、－７８℃で冷却し、エステル(５.０ｇ, ２７.０ｍｍｏｌ, １.０等量, 終濃度０.１９Ｍ)／ＴＨＦ(１０ｍＬ)の溶液を、内部温度が－７０℃(添加には約５分間を要した)を超えない速度でカニューレを介して滴加した。反応混合物を－７８℃で１０分間攪拌し、０℃に昇温させて(浴を取り外して)、０℃で３０分間攪拌した。反応の進行をＴＬＣで分析して、出発物質よりも極性が高い生成物への変換が示された。反応混合物を０℃で冷却しながら、１Ｍ ＨＣｌを加え、反応混合物をＨ２Ｏ(１００ｍＬ)およびＥｔＯＡｃ(２００ｍＬ)でさらに希釈した。水相を分離し、ＥｔＯＡｃ(３ｘ１００ｍＬ)で抽出した。有機相を合わせて、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過して濃縮し、黄色の油状物を得た。カラムクロマトグラフィー(１２０ｇ シリカゲルカートリッジ；段階的グラジエント溶出３０％, ４０％, ５０％ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン)による精製により、所望の生成物[３.４９ｇ(１５.０ｍｍｏｌ, ５５％収率)]を、白色の固体として得た。
【0056】
(ｄ)５－アジド－１－(メチルスルホニル)－３,３－ジメチル－２－ペンタノール
ゴム製セプタム、スターラーバーおよび窒素導入口を備えた２００ｍＬの収集フラスコに、５－アジド－１－(メチルスルホニル)－３,３－ジメチル－２－ペンタノン(３.４４ｇ, １４.８ｍｍｏｌ, １.０等量, 終濃度０.２５Ｍ)およびメタノール(６０ｍＬ)を入れた。溶液を、０℃で冷却しながら、ＮａＢＨ４(２７９ｍｇ，７.３７ｍｍｏｌ, ０.５等量, 終濃度０.１２Ｍ)を、固体として少量ずつ加えた。反応混合物を、０℃で３０分間撹拌した。反応混合物を、酢酸エチル(ＥｔＯＡｃ)(１００ｍＬ)、５％ＫＨＳＯ４(１００ｍＬ)および水(１００ｍＬ)で希釈した。水相を分離し、ＥｔＯＡｃ(３ｘ１００ｍＬ)で抽出した。有機相を合わせて、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過して濃縮し、白色の半固体を得た。カラムクロマトグラフィーによる精製(１２０ｇシリカゲルカートリッジ；段階的なグラジエント溶出：４０％、５０％ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン)により精製し、所望のアルコール(３.４ｇ)(１３.７ｍｍｏｌ, ９３％収率)を、白色固体として得た。
【化12】
ゴム製セプタム、スターラーバーおよび窒素導入口を備えた２００ｍＬの収集フラスコに、５－アジド－１－(メチルスルホニル)－３,３－ジメチル－２－ペンタノン(３.４４ｇ, １４.８ｍｍｏｌ, １.０等量, 終濃度０.２５Ｍ)およびメタノール(６０ｍＬ)を入れた。溶液を、０℃で冷却しながら、ＮａＢＨ４(２７９ｍｇ，７.３７ｍｍｏｌ, ０.５等量, 終濃度０.１２Ｍ)を、固体として少量ずつ加えた。反応混合物を、０℃で３０分間撹拌した。反応混合物を、酢酸エチル(ＥｔＯＡｃ)(１００ｍＬ)、５％ＫＨＳＯ４(１００ｍＬ)および水(１００ｍＬ)で希釈した。水相を分離し、ＥｔＯＡｃ(３ｘ１００ｍＬ)で抽出した。有機相を合わせて、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過して濃縮し、白色の半固体を得た。カラムクロマトグラフィーによる精製(１２０ｇシリカゲルカートリッジ；段階的なグラジエント溶出：４０％、５０％ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン)により精製し、所望のアルコール(３.４ｇ)(１３.７ｍｍｏｌ, ９３％収率)を、白色固体として得た。
【0057】
(ｅ)５－アジド－１－(メチルスルホニル)－３,３－ジメチル－２－ペンチル スクシンイミジルカーボネート
【化13】
【0058】
スターラーバー、ゴム製セプタムおよび窒素導入口を備えた１００ｍＬの丸底フラスコに、５－アジド－１－(メチルスルホニル)－３,３－ジメチル－２－ペンタノール(２.００ｇ, ８.５０ｍｍｏｌ, １.０等量, 終濃度０.２５Ｍ)、ＤＣＭ(３５ｍＬ)およびトリホスゲン(０.９３ｇ, ３.１ｍｍｏｌ, ０.３７等量)を入れて、０℃で冷却した。ピリジン(０.７２ｍＬ, ８.９ｍｍｏｌ)をシリンジで滴加し、反応混合物を０℃で５分間撹拌し、１０分かけて周囲温度まで昇温させて、周囲温度で４５分間撹拌した。反応の進行は、ＴＬＣでモニタリングし、クロロホルメートへの完全な変換が示された。Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド(１.１７ｇ, １０.２ｍｍｏｌ, １.２等量)を、固体として一度に加え、その後ピリジン(０.８２ｍＬ, １０.２０ｍｍｏｌ, １.２等量)を滴加した。反応混合物を、周囲温度で３０分間攪拌した。反応の進行をＴＬＣでモニタリングし、クロロギ酸塩から目的のスクシンイミジルカーボネートへの完全な変換が示された。反応混合物を、ジクロロメタン(ＤＣＭ)(３０ｍＬ)および５％ＫＨＳＯ４(３０ｍＬ)で希釈した。水相をＤＣＭ(２ｘ３０ｍＬ)で抽出した。有機相を合わせて、飽和ＮａＨＣＯ３(３０ｍＬ)およびブライン(３０ｍＬ)で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、濾過して、濃縮した。カラムクロマトグラフィー(８０ｇ, シリカゲルカートリッジ；段階的グラジエント４０、５０、６０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン)による精製により、所望のスクシンイミジルカーボネート(２.３６ｇ)(６.２７ｍｍｏｌ, ７４％収率)を、無色油状物として得た。
【0059】
これらの手順に従って、それらから製造される追加のアルコールおよびクロロホルメートおよびスクシンイミジルカーボネート化合物は、ｎ＝１～３であり、Ｒ２＝Ｈであり、各Ｒ４＝Ｍｅであり、およびＲ１＝ＭｅＳＯ２、ＰｈＳＯ２、(４－クロロフェニル)ＳＯ２、(４－メチルフェニル)ＳＯ２、イソプロピルＳＯ２、Ｎ,Ｎ－ジメチルアミノＳＯ２、(４－メチルピペリジニル)ＳＯ２、モルホリノＳＯ２、チオモルホリノＳＯ２、Ｎ－エチル－Ｎ－メチルアミノＳＯ２およびＮ,Ｎ－ビス(２－メトキシエチル)アミノ－ＳＯ２である化合物が挙げられる。
【0060】
実施例１
ＰＥＧ－タラゾパリブコンジュゲート(ここで、Ｒ７＝置換されたアルキルである)の合成
ＰＥＧ－タラゾパリブコンジュゲートの合成は、Ｒ１＝ＭｅＳＯ２であり、Ｒ２および各Ｒ４がＨであり、ｎ＝４であり、Ｒ７が２－メトキシエチルであり、Ｚ＊がトリアゾールであるコンジュゲートの製造により説明される。異なるＲ１または他の基を有する類似のコンジュゲートを、適切なクロロホルメートまたはスクシンイミジルカーボネートから開始する同じ方法に従って製造することができる(製造例Ａ)。
ＰＥＧ－タラゾパリブコンジュゲート(ここで、Ｒ７＝置換されたアルキルである)の合成
【化14】
【0061】
Ｎ－(クロロメチル)カルバメートの合成
スターラーバーおよびスクリューキャップを付けた２０ｍＬのシンチレーションバイアルに、７－アジド－１－(メチルスルホニル)－２－ヘプチルスクシンイミジルカーボネート(５６０ｍｇ，１.４９ｍｍｏｌ, １.０等量, 終濃度０.２３Ｍ)(Santi et al, 2012 Proc Natl Acad Sci USA 109:6211-6)、ＭｅＣＮ(６ｍＬ)、メトキシエチルアミン(１４３μＬ, １.６４ｍｍｏｌ, １.１等量, 終濃度０.２５Ｍ)およびｉＰｒ２ＮＥｔ(０.３９ｍＬ, ２.２９ｍｍｏｌ, １.５等量, 終濃度０.３５Ｍ)を入れた。反応混合物を周囲温度で３０分間攪拌した。反応混合物を、ＥｔＯＡｃ(３０ｍＬ)および５％ＫＨＳＯ４水溶液(３０ｍＬ)で希釈した。水相を分離し、ＥｔＯＡｃ(３ｘ３０ｍＬ)で抽出した。有機相を合わせて、ブライン(３０ｍＬ)で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過して濃縮した。カラムクロマトグラフィー(８０ＳｉＯ２；段階的グラジエント溶出：５０％、６０％、７０％、１００％ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン)による精製により、カルバメート[３１８ｍｇ(０.９４８ｍｍｏｌ, ６３％)]を、無色油状物として得た。1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 5.14 - 5.23 (m, 1 H), 5.04 - 5.13 (m, 1 H), 3.43 - 3.50 (m, 2 H), 3.32 - 3.41 (m, 6 H), 3.28 (t, J=6.8 Hz, 2 H), 3.15 (m, J=4.9 Hz, 1 H), 3.00 (s, 3 H), 1.78 (br. s., 2 H), 1.51 - 1.69 (m, 2 H), 1.42 (d, J=4.3 Hz, 4 H). LCMS (ESI) m/z [M+Na]+ C12H24N4O5Sとしての計算値:337.2;実測値:337.1.
スターラーバーおよびスクリューキャップを付けた２０ｍＬのシンチレーションバイアルに、７－アジド－１－(メチルスルホニル)－２－ヘプチルスクシンイミジルカーボネート(５６０ｍｇ，１.４９ｍｍｏｌ, １.０等量, 終濃度０.２３Ｍ)(Santi et al, 2012 Proc Natl Acad Sci USA 109:6211-6)、ＭｅＣＮ(６ｍＬ)、メトキシエチルアミン(１４３μＬ, １.６４ｍｍｏｌ, １.１等量, 終濃度０.２５Ｍ)およびｉＰｒ２ＮＥｔ(０.３９ｍＬ, ２.２９ｍｍｏｌ, １.５等量, 終濃度０.３５Ｍ)を入れた。反応混合物を周囲温度で３０分間攪拌した。反応混合物を、ＥｔＯＡｃ(３０ｍＬ)および５％ＫＨＳＯ４水溶液(３０ｍＬ)で希釈した。水相を分離し、ＥｔＯＡｃ(３ｘ３０ｍＬ)で抽出した。有機相を合わせて、ブライン(３０ｍＬ)で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過して濃縮した。カラムクロマトグラフィー(８０ＳｉＯ２；段階的グラジエント溶出：５０％、６０％、７０％、１００％ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン)による精製により、カルバメート[３１８ｍｇ(０.９４８ｍｍｏｌ, ６３％)]を、無色油状物として得た。1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 5.14 - 5.23 (m, 1 H), 5.04 - 5.13 (m, 1 H), 3.43 - 3.50 (m, 2 H), 3.32 - 3.41 (m, 6 H), 3.28 (t, J=6.8 Hz, 2 H), 3.15 (m, J=4.9 Hz, 1 H), 3.00 (s, 3 H), 1.78 (br. s., 2 H), 1.51 - 1.69 (m, 2 H), 1.42 (d, J=4.3 Hz, 4 H). LCMS (ESI) m/z [M+Na]+ C12H24N4O5Sとしての計算値:337.2;実測値:337.1.
【0062】
スターラーバーおよびスクリューキャップを付けた２０ｍＬのシンチレーションバイアルに、カルバメート(１５０ｍｇ，０.４４５ｍｍｏｌ, １.０等量, 終濃度０.１Ｍ)、１,２－ジクロロエタン(４.５ｍＬ)、パラホルムアルデヒド(２７ｍｇ，０.８９２ｍｍｏｌ, ２等量, ０.２Ｍ)およびＴＭＳＣｌ(０.２３ｍＬ, １.８ｍｍｏｌ, ４等量, ０.４０Ｍ)を入れた。反応混合物を、５０℃で２４時間加熱した。反応の進行を、Ｃ１８ ＨＰＬＣ(ＥＬＳＤ, ０～１００％Ｂ)でモニタリングして、出発物質(ＲＴ＝８.９２分)が極性の低い生成物(ＲＴ＝１０.８９分)に変換されることを確認した。反応混合物を周囲温度まで冷却し、濾過して濃縮し、５０％ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン(１０ｍＬ)に溶解した。得られた濁った溶液を、０.２μｍシリンジフィルターでろ過し、得られたろ液を濃縮して、１７５ｍｇ(約０.４５ｍｍｏｌ, ｑｕａｎｔ収率)を得た。生成物のＮ－(クロロメチル)カルバメートを、直ぐにＴＨＦ(１.８ｍＬ)に溶解し、更なる精製をせずに使用した。
【0063】
Ｚ＝アジド、ｎ＝２、Ｒ１＝ＭｅＳＯ２、Ｒ２＝Ｈ、各Ｒ４＝ＭｅおよびＹ＝Ｎ(Ｒ７)ＣＨ２(式中、Ｒ７＝２－メトキシエチル)である、Ｎ－(クロロメチル)カルバメートを、製造例Ａの対応するリンカーのスクシンイミジルカーボネートから開始して同様に製造した。スターラーバー、ゴム製セプタムおよび窒素注入口を備えた２５ｍＬの丸底フラスコに、スクシンイミジルカーボネート(１.０ｇ, ２.７ｍｍｏｌ, １.０等量, 終濃度０.２３Ｍ)、アセトニトリル(１０.８ｍＬ)およびメトキシエチルアミン(０.２８ｍＬ, ３.２ｍｍｏｌ, １.２等量)を入れた。ｉＰｒ２ＮＥｔ(０.７１ｍＬ, ４.１ｍｍｏｌ, １.５等量)をシリンジで滴加しながら、反応混合物を周囲温度で撹拌した。反応混合物を、周囲温度で３０分間撹拌した。ＴＬＣ分析により、炭酸塩から新規生成物への完全な変換が確認された。反応混合物を、ＥｔＯＡｃ(３０ｍＬ)および５％ＫＨＳＯ４(２０ｍＬ)で希釈した。水相を分離し、ＥｔＯＡｃ(３ｘ２０ｍＬ)で抽出した。有機相を合わせて、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過して濃縮した。カラムクロマトグラフィー(４０ｇシリカゲル；４０、５０、８０％ ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで段階的にグラジエント溶出)による精製により、目的物[８２８ｍｇ(２.７１ｍｍｏｌ, ９１％収率)]を無色油として得た。スターラーバーおよびスクリューキャップを付けた２０ｍＬのシンチレーションバイアルに、カルバメート(１５３ｍｇ，０.４５ｍｍｏｌ, １.０等量, 終濃度０.１０Ｍ)、ＤＣＥ(４.５ｍＬ)、パラホルムアルデヒド(５５ｍｇ，１.８２ｍｍｏｌ, ４.０等量)およびＴＭＳＣｌ(２３０μＬ, １.８２ｍｍｏｌ, ４等量)を入れた。バイアルを、プラスチック製スクリューキャップにより密封して、反応混合物を５０℃で２４時間攪拌した。反応の進行は、５ｍＭ ｉＰｒ２ＮＥｔ／ブタノール(２００μＬ)に希釈した反応混合物のアリコート(２μＬ)をＣ１８ ＨＰＬＣ／ＥＬＳＤ(０～１００％Ｂ)によりモニタリングすることで、カルバメート(ＲＴ＝８.５６分)が、極性の低い生成物(ＲＴ＝１０.６４ｍｉｎ)に完全に変換されたことが確認された。反応混合物を周囲温度まで冷却し、綿栓でろ過し、濃縮し、５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン(５ｍＬ)に再溶解し、ろ過して濃縮し、淡黄色の油状物とした。粗生成物を、ＴＨＦに溶解して、更なる精製をせずに直ちに使用した。
【化15】
【0064】
放出可能なリンカー－タラゾパリブの合成(式(ＩＩ)：Ｄ＝タラゾパリブである)
スターラーバー、ゴム製セプタムおよび窒素導入用ニードルを備えた１０ｍＬのヒートガンで乾燥させた丸底フラスコに、タラゾパリブ(１００ｍｇ, ０.２６３ｍｍｏｌ, １.０等量, 終濃度６５ｍＭ)およびＴＨＦ(２.５ｍＬ)を入れた。溶液を、－７８℃で冷却しながら、ＮａＨＭＤＳ(ＴＨＦ中で１Ｍ, ０.２６ｍＬ, ０.２６３ｍｍｏｌ, １.０等量, 終濃度６５ｍＭ)の溶液を、シリンジでゆっくりと滴加した。反応混合物を、－７８℃で５分間撹拌した後、Ｎ－(クロロメチル)カルバメートの溶液(ＴＨＦ中で０.２６Ｍ, １.３ｍＬ, ０.３４２ｍｍｏｌ, １.３等量, 終濃度８４ｍＭ)を、シリンジでゆっくりと滴加した。反応混合物を、－７８℃で１５分間撹拌し、１５分かけて０℃まで昇温させ、０℃で３０分間撹拌した。反応の進行を、Ｃ１８ ＨＰＬＣ(０～１００％Ｂ, ３１０ｎｍ)でモニタリングして、タラゾパリブ(ＲＴ＝８.５５分)が、極性の低い生成物(ＲＴ＝１０.６７分)に変換されていることを確認した。反応混合物をＥｔＯＡｃ(１０ｍＬ)および１０％クエン酸(１０ｍＬ)で希釈した。水相を分離して、ＥｔＯＡｃ(３ｘ１０ｍＬ)で抽出した。有機相を合わせて、ブライン(１０ｍＬ)で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、濾過して濃縮し、黄色残留物を得た。Ｃ１８ 分取ＨＰＬＣ(３５～７０％Ｂ ＴＦＡ含まず)による精製により、９５ｍｇ(０.１３０ｍｍｏｌ，５０％)の所望の生成物[式(ＩＩ)のリンカー－薬剤：Ｚ＝アジド、ｎ＝４、Ｒ１＝ＭｅＳＯ２、Ｒ２および各Ｒ４＝Ｈ、Ｙ＝Ｎ(Ｒ７)ＣＨ２、Ｒ７＝２－メトキシエチルおよびＤ＝タラゾパリブ]を、白色固体として得た。LCMS(ESI) m/z [M+H]+, C32H38F2N10O6Sについての計算値：729.3；実測値：729.2. Ｃ１８ ＨＰＬＣを３１０ｎｍでモニターした：９１％(０～１００％Ｂ，ＲＴ＝９.９５分)。アルキル化の位置化学は、２Ｄ－ＮＭＲ相関によって決定した。
スターラーバー、ゴム製セプタムおよび窒素導入用ニードルを備えた１０ｍＬのヒートガンで乾燥させた丸底フラスコに、タラゾパリブ(１００ｍｇ, ０.２６３ｍｍｏｌ, １.０等量, 終濃度６５ｍＭ)およびＴＨＦ(２.５ｍＬ)を入れた。溶液を、－７８℃で冷却しながら、ＮａＨＭＤＳ(ＴＨＦ中で１Ｍ, ０.２６ｍＬ, ０.２６３ｍｍｏｌ, １.０等量, 終濃度６５ｍＭ)の溶液を、シリンジでゆっくりと滴加した。反応混合物を、－７８℃で５分間撹拌した後、Ｎ－(クロロメチル)カルバメートの溶液(ＴＨＦ中で０.２６Ｍ, １.３ｍＬ, ０.３４２ｍｍｏｌ, １.３等量, 終濃度８４ｍＭ)を、シリンジでゆっくりと滴加した。反応混合物を、－７８℃で１５分間撹拌し、１５分かけて０℃まで昇温させ、０℃で３０分間撹拌した。反応の進行を、Ｃ１８ ＨＰＬＣ(０～１００％Ｂ, ３１０ｎｍ)でモニタリングして、タラゾパリブ(ＲＴ＝８.５５分)が、極性の低い生成物(ＲＴ＝１０.６７分)に変換されていることを確認した。反応混合物をＥｔＯＡｃ(１０ｍＬ)および１０％クエン酸(１０ｍＬ)で希釈した。水相を分離して、ＥｔＯＡｃ(３ｘ１０ｍＬ)で抽出した。有機相を合わせて、ブライン(１０ｍＬ)で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、濾過して濃縮し、黄色残留物を得た。Ｃ１８ 分取ＨＰＬＣ(３５～７０％Ｂ ＴＦＡ含まず)による精製により、９５ｍｇ(０.１３０ｍｍｏｌ，５０％)の所望の生成物[式(ＩＩ)のリンカー－薬剤：Ｚ＝アジド、ｎ＝４、Ｒ１＝ＭｅＳＯ２、Ｒ２および各Ｒ４＝Ｈ、Ｙ＝Ｎ(Ｒ７)ＣＨ２、Ｒ７＝２－メトキシエチルおよびＤ＝タラゾパリブ]を、白色固体として得た。LCMS(ESI) m/z [M+H]+, C32H38F2N10O6Sについての計算値：729.3；実測値：729.2. Ｃ１８ ＨＰＬＣを３１０ｎｍでモニターした：９１％(０～１００％Ｂ，ＲＴ＝９.９５分)。アルキル化の位置化学は、２Ｄ－ＮＭＲ相関によって決定した。
【0065】
放出可能なリンカー－タラゾパリブ[Ｄ＝タラゾパリブである式(ＩＩ)]も、以下に示す手順に従い製造した。スターラーバー、ゴム製セプタム、窒素導用ニードルおよび熱電対プローブを備えた１０ｍＬのヒートガンで乾燥させた丸底フラスコに、ＴＬＺ(１００ｍｇ，０.２６３ｍｍｏｌ，１.０等量，終濃度０.１Ｍ)およびＴＨＦ(２.６ｍＬ)を入れた。ＮａＨＭＤＳ(ＴＨＦ中で１Ｍ, ０.２６ｍＬ, ０.２６ｍｍｏｌ，１.０等量, 終濃度０.１Ｍ)の溶液を、内部温度が－７２℃を超えないように(約２分かけて)滴加しながら、混合物を－７８℃に冷却した。反応混合物を－７８℃で５分間撹拌した後、リンカー－クロロメチルカルバメートの溶液(ＴＨＦ中で０.５Ｍ，０.６８ｍＬ, ０.３４ｍｍｏｌ, １.３等量, 終濃度０.１Ｍ)を、内部温度が－７２℃を超えないような速度で滴加した。反応混合物を－７８℃で５分間撹拌し、１５分間かけて０℃に昇温させて、０℃で１時間撹拌した。反応の進行を、Ｃ１８ ＨＰＬＣ(１０分かけて０～１００％, ３１０ｎｍ)でモニターし、ＴＬＺ(ＲＴ＝８.４３分)が極性の低い生成物(ＲＴ＝７.６４分)に変換されたことが確認された。次に、反応混合物を－７８℃に冷却し、０.１Ｍ Ｔｒｉｓ(ｐＨ７.５, ３ｍＬ)を、内部温度が－５０℃を超えないようにゆっくりと添加した。得られた混合物を、一旦可能な限り激しく攪拌しながら周囲温度まで昇温させた(冷浴を外す)(水層を溶解させねばならない)。その後、この混合物を、ＥｔＯＡｃ(３０ｍＬ)および０.１Ｍ Ｔｒｉｓ(ｐＨ７.５，３０ｍＬ)間に分配した。有機層を分離し、ＥｔＯＡｃ(３ｘ３０ｍＬ)で抽出した。有機相を合わせて、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過して濃縮し、黄色の油状物を得た。分取Ｃ１８ ＨＰＬＣ(１５分かけて３５～７０％Ｂ, ３１０ｎｍ)による精製により、９０ｍｇ(０.１４１ｍｍｏｌ, ５４％収率)の所望のコンジュゲートを、黄色のガラス様油状物として得た。
【0066】
同様の方法を用いて、式(ＩＩ)のリンカー－ドラッグ(式中、Ｚ＝アジド、ｎ＝２、Ｒ１＝ＭｅＳＯ２、Ｒ２＝Ｈ、各Ｒ４＝Ｍｅ、Ｙ＝Ｎ(Ｒ７)ＣＨ２、Ｒ７＝２－メトキシエチルおよびＤ＝タラゾパリブである)を製造した。スターラーバー、セプタムスクリューキャップおよび窒素注入口を備えた４ｍＬバイアルに、ＴＬＺ(２２ｍｇ，０.０６ｍｍｏｌ，１等量, 終濃度５０ｍＭ)およびＴＨＦ(０.６ｍＬ)を入れた。グアニジン塩基７－メチル－１,５,７－トリアザビシクロ[４.４.０]デカ－５－エン(ＭＴＢＤ)(１１μＬ, ０.０８０ｍｍｏｌ, １.３等量)を加え、反応混合物を１～２分間撹拌した後に、クロロメチルカルバメートの溶液[ＴＨＦ中の１００ｍＭ(０.７８ｍＬ, ０.０８０ｍｍｏｌ, １.３等量)]を添加した。反応混合物を、周囲温度で１時間撹拌した。反応アリコート(２μＬ)を、５ｍＭｉＰｒ２ＮＥｔ／ブタノール(２００μＬ)に希釈してクエンチし、Ｃ１８ ＨＰＬＣにより、反応の進行をモニターした。ＨＰＬＣ分析では、約５３％の全転換率(１５分～１時間の変換が５％変化)にて、ＴＬＺ(ＲＴ＝８.５３分)がより極性の低い生成物(１０.０７分)に変換されることが示された。反応混合物を、－７８℃で冷却し、２ｍＬの０.１Ｎ Ｔｒｉｓ(ｐＨ７.５)を滴加した。得られた混合物を、可能な限り一度激しく攪拌しながら周囲温度まで昇温させた。反応混合物を、ＥｔＯＡｃ(１０ｍＬ)および０.１ＮＴｒｉｓ(ｐＨ７.５)(１０ｍＬ)で希釈した。水相を分離して、ＥｔＯＡｃ(３ｘ５ｍＬ)で抽出した。有機相を合わせて、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。分取ＨＰＬＣ(３５～７０％Ｂ ＴＦＡを含まない)による精製で、１４ｍｇ(０.０２ｍｍｏｌ, ３２％収率)の所望のリンカーＴＬＺが得られた。純度は、３１０ｎｍでモニターしてＣ１８ ＨＰＬＣで測定した：９８％(０～１００％Ｂ、ＲＴ＝１０.００分)。
【0067】
同じ方法を用いて、式(ＩＩ)の別のリンカー－薬剤を製造した：式中、
Ｚ＝アジド、ｎ＝４、Ｒ１＝ＭｅＳＯ２、Ｒ２＝Ｈ、各Ｒ４＝Ｈ、Ｙ＝Ｎ(Ｒ７)ＣＨ２、Ｒ７＝２－メトキシエチルおよびＤ＝オラパリブである；
Ｚ＝アジド、ｎ＝４、Ｒ１＝ＭｅＳＯ２、Ｒ２＝Ｈ、各Ｒ４＝Ｈ、Ｙ＝Ｎ(Ｒ７)ＣＨ２、Ｒ７＝４－(Ｎ,Ｎ－ジエチルカルボキサミド)フェニルおよびＤ＝タラゾパリブである；
Ｚ＝アジド、ｎ＝２、Ｒ１＝チオモルホリン－ＳＯ２、Ｒ２＝Ｈ、各Ｒ４＝Ｍｅ、Ｙ＝Ｎ(Ｒ７)ＣＨ２、Ｒ７＝２－メトキシエチルおよびＤ＝タラゾパリブである。
Ｚ＝アジド、ｎ＝４、Ｒ１＝ＭｅＳＯ２、Ｒ２＝Ｈ、各Ｒ４＝Ｈ、Ｙ＝Ｎ(Ｒ７)ＣＨ２、Ｒ７＝２－メトキシエチルおよびＤ＝オラパリブである；
Ｚ＝アジド、ｎ＝４、Ｒ１＝ＭｅＳＯ２、Ｒ２＝Ｈ、各Ｒ４＝Ｈ、Ｙ＝Ｎ(Ｒ７)ＣＨ２、Ｒ７＝４－(Ｎ,Ｎ－ジエチルカルボキサミド)フェニルおよびＤ＝タラゾパリブである；
Ｚ＝アジド、ｎ＝２、Ｒ１＝チオモルホリン－ＳＯ２、Ｒ２＝Ｈ、各Ｒ４＝Ｍｅ、Ｙ＝Ｎ(Ｒ７)ＣＨ２、Ｒ７＝２－メトキシエチルおよびＤ＝タラゾパリブである。
【0068】
放出可能なＰＥＧ－タラゾパリブのコンジュゲートの合成
２０ｍＬのシンチレーションバイアルに、ＰＥＧ４０ｋＤａ－[５ＨＣＯ]４(ＭｅＣＮ中で２４.５ｍＭ，４.１ｍＬ，０.１ｍｍｏｌ，１.０等量，終濃度２５ｍＭ)および式(ＩＩ)のアジド－リンカー－タラゾパリブ(式中、Ｚ＝アジド、ｎ＝４、Ｒ１＝ＭｅＳＯ２、Ｒ２および各Ｒ４＝Ｈ、Ｙ＝Ｎ(Ｒ７)ＣＨ２、Ｒ７＝２－メトキシエチルおよびＤ＝タラゾパリブ)(９５ｍｇ，０.１３０ｍｍｏｌ, １.３等量, 終濃度３２ｍＭ)であった。反応混合物を、３７℃で２４時間加熱した。反応の進行を、Ｃ１８ ＨＰＬＣ(０～１００％Ｂ, ３１０ｎｍ)でモニターし、リンカー－タラゾパリブ(ＲＴ＝９.９５分)がより極性の高い生成物(ＲＴ＝９.１７分)に変換されていることを確認した。反応混合物を、４００ｍＬのＭｅＯＨに対して１８時間透析した(１２,０００～１４,０００ＭＷＣＯ)。保持液を濃縮して、ＴＨＦ(１０ｍＬ)に再溶解して、激しく撹拌しているＭＴＢＥ(１００ｍＬ)にゆっくりと加えて沈殿させた。得られた固体を、焼結ガラス製漏斗で真空濾過して回収して、ＭＴＢＥ(３ｘ１００ｍＬ)で洗浄し、高真空下で乾燥させて、７００ｍｇ(０.０６４ｍｍｏｌ ＴＬＺ, ６４％収率)のＰＥＧコンジュゲートを、無色の残留物として得た。Ｃ１８ ＨＰＬＣを、３１０ｎｍでモニターした：９０％(０～１００％Ｂ、ＲＴ＝９.１７分)。
２０ｍＬのシンチレーションバイアルに、ＰＥＧ４０ｋＤａ－[５ＨＣＯ]４(ＭｅＣＮ中で２４.５ｍＭ，４.１ｍＬ，０.１ｍｍｏｌ，１.０等量，終濃度２５ｍＭ)および式(ＩＩ)のアジド－リンカー－タラゾパリブ(式中、Ｚ＝アジド、ｎ＝４、Ｒ１＝ＭｅＳＯ２、Ｒ２および各Ｒ４＝Ｈ、Ｙ＝Ｎ(Ｒ７)ＣＨ２、Ｒ７＝２－メトキシエチルおよびＤ＝タラゾパリブ)(９５ｍｇ，０.１３０ｍｍｏｌ, １.３等量, 終濃度３２ｍＭ)であった。反応混合物を、３７℃で２４時間加熱した。反応の進行を、Ｃ１８ ＨＰＬＣ(０～１００％Ｂ, ３１０ｎｍ)でモニターし、リンカー－タラゾパリブ(ＲＴ＝９.９５分)がより極性の高い生成物(ＲＴ＝９.１７分)に変換されていることを確認した。反応混合物を、４００ｍＬのＭｅＯＨに対して１８時間透析した(１２,０００～１４,０００ＭＷＣＯ)。保持液を濃縮して、ＴＨＦ(１０ｍＬ)に再溶解して、激しく撹拌しているＭＴＢＥ(１００ｍＬ)にゆっくりと加えて沈殿させた。得られた固体を、焼結ガラス製漏斗で真空濾過して回収して、ＭＴＢＥ(３ｘ１００ｍＬ)で洗浄し、高真空下で乾燥させて、７００ｍｇ(０.０６４ｍｍｏｌ ＴＬＺ, ６４％収率)のＰＥＧコンジュゲートを、無色の残留物として得た。Ｃ１８ ＨＰＬＣを、３１０ｎｍでモニターした：９０％(０～１００％Ｂ、ＲＴ＝９.１７分)。
【0069】
上記した手順に従って製造した放出可能なＰＥＧ－ＴＬＺコンジュゲートのサンプルを、ｐＨ９.０または９.４のいずれかの緩衝液に溶解し、３７℃に保持した。ＨＰＬＣ分析から、遊離タラゾパリブは放出されて、半減期が各々３.４０時間および１.６９時間を示し、ｐＨ７.４での半減期は１６８～１３５時間と推定された。対照的に、類似の安定なコンジュゲート(Ｒ１がＨである)は、１８時間にわたり、ｐＨ５.０、７.４または９.４で遊離タラゾパリブを放出しないことが確認された。
【0070】
上記に示した手順に従って製造した放出可能なＰＥＧ－ＴＬＺコンジュゲート[式(ＩＩＩ)：式中、Ｚ＊＝トリアゾール、ｎ＝４、Ｒ１＝ＭｅＳＯ２、Ｒ２および各Ｒ４＝Ｈ、Ｙ＝Ｎ(Ｒ７)ＣＨ２、Ｒ７＝２－メトキシエチル、ｙ＝４およびＤ＝タラゾパリブ]の溶液を、ｐＨ９.４、８.４、７.４、５.０およびｐＨ１.１の緩衝液中で、３７℃で加熱した。各溶液に放出されたＴＬＺ画分の量を測定し、その結果を図８に示した。水酸化物触媒作用による放出が、ｐＨ７.４～９.４にかけて観察された。挿入図は、ｍ＝１.００, Ｒ２＝０.９９８０のＴＬＺ放出についてのｐＨ－ｌｏｇｏｂｓｄプロットを示す。
【0071】
式(ＩＩＩ)(式中、Ｚ＊＝トリアゾール、ｎ＝２、Ｒ１＝ＭｅＳＯ２、Ｒ２＝Ｈ、各Ｒ４＝Ｍｅ、Ｙ＝Ｎ(Ｒ７)ＣＨ２、Ｒ７＝２－メトキシエチル、ｙ＝１およびＤ＝タラゾパリブ)と同様のコンジュゲートは、２０ｋＤａＰＥＧ－ＤＢＣＯを用いて同様に製造され、ｐＨ７.４で半減期が３００時間を提示するタラゾパリブを放出した。
【0072】
実施例２
アシル化タラゾパリブコンジュゲートの製造および安定性試験
アシル化タラゾパリブコンジュゲートの製造および安定性試験
【化16】
【0073】
アシル化による「放出不可能な」ＰＥＧ－タラゾパリブ
スターラーバー、ゴム製セプタムおよび窒素注入口を備えた１０ｍＬのヒートガンで乾燥させた丸底フラスコに、タラゾパリブ(１５ｍｇ，３９μｍｏｌ，１.０当量)およびＴＨＦ(１ｍＬ)を入れて、次に－７８℃に冷却した。ＮａＨＭＤＳ(ＴＨＦ中で１.０Ｍ，３９μＬ，３９μｍｏｌ，１.０当量)の溶液を、シリンジを介して滴加し、反応混合物を－７８℃で５分間攪拌した。リンカークロロホルメート１－１の溶液(ＴＨＦ中で０.５Ｍ，９４μＬ，４７μｍｏｌ，１.２当量)を、シリンジを介して滴加し、反応混合物を－７８℃で５分間撹拌し、２０分かけて０℃まで昇温させて、０℃で４５分間撹拌した。反応の進行を、Ｃ１８ ＨＰＬＣ(０～１００％Ｂ, ３１０ｎｍ)でモニターし、タラゾパリブ(ＲＴ＝８.３６分)が極性の低い生成物(ＲＴ＝１０.７８分)へと変換していることが確認された。反応混合物を、ＥｔＯＡｃ(１０ｍＬ)および１０％クエン酸(１０ｍＬ)間に分配した。水相を分離し、ＥｔＯＡｃ(３ｘ１０ｍＬ)で抽出した。有機相を合わせて、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過して濃縮した。この粗生成物をＭｅＣＮ(２ｍＬ)に溶解し、更なる精製をせずに使用した。ＬＣＭＳ(ＥＳＩ)ｍ／ｚ[Ｍ＋Ｈ]＋ Ｃ２６Ｈ２５Ｆ２Ｎ９Ｏ３についての計算値：５５０.２；実測値：５５０.１を得た。Ｃ１８ ＨＰＬＣを３１０ｎｍでモニターした：９０％(１０％ＴＬＺ；０～１００％Ｂ、ＲＴ＝１０.７８分)。
スターラーバー、ゴム製セプタムおよび窒素注入口を備えた１０ｍＬのヒートガンで乾燥させた丸底フラスコに、タラゾパリブ(１５ｍｇ，３９μｍｏｌ，１.０当量)およびＴＨＦ(１ｍＬ)を入れて、次に－７８℃に冷却した。ＮａＨＭＤＳ(ＴＨＦ中で１.０Ｍ，３９μＬ，３９μｍｏｌ，１.０当量)の溶液を、シリンジを介して滴加し、反応混合物を－７８℃で５分間攪拌した。リンカークロロホルメート１－１の溶液(ＴＨＦ中で０.５Ｍ，９４μＬ，４７μｍｏｌ，１.２当量)を、シリンジを介して滴加し、反応混合物を－７８℃で５分間撹拌し、２０分かけて０℃まで昇温させて、０℃で４５分間撹拌した。反応の進行を、Ｃ１８ ＨＰＬＣ(０～１００％Ｂ, ３１０ｎｍ)でモニターし、タラゾパリブ(ＲＴ＝８.３６分)が極性の低い生成物(ＲＴ＝１０.７８分)へと変換していることが確認された。反応混合物を、ＥｔＯＡｃ(１０ｍＬ)および１０％クエン酸(１０ｍＬ)間に分配した。水相を分離し、ＥｔＯＡｃ(３ｘ１０ｍＬ)で抽出した。有機相を合わせて、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過して濃縮した。この粗生成物をＭｅＣＮ(２ｍＬ)に溶解し、更なる精製をせずに使用した。ＬＣＭＳ(ＥＳＩ)ｍ／ｚ[Ｍ＋Ｈ]＋ Ｃ２６Ｈ２５Ｆ２Ｎ９Ｏ３についての計算値：５５０.２；実測値：５５０.１を得た。Ｃ１８ ＨＰＬＣを３１０ｎｍでモニターした：９０％(１０％ＴＬＺ；０～１００％Ｂ、ＲＴ＝１０.７８分)。
【0074】
１.５ｍＬの遠心管に、ＰＥＧ２０ｋＤａ－ＤＢＣＯ(４.４ｍＭ，１.０ｍＬ，４.４μｍｏｌ，１.０当量)および上記の安定なリンカー－タラゾパリブ(ＭｅＣＮ中で２３ｍＭ, ２４０μＬ, ５.５μｍｏｌ, １.３等量)の溶液を入れた。反応混合物を、３７℃で１時間加熱した。反応の進行をＣ１８ ＨＰＬＣ(０～１００％Ｂ, ３１０ｎｍ)でモニターし、Ｎ３－Ｌ(Ｓｔ)－タラゾパリブ(ＲＴ＝１０.７８分)およびＰＥＧ－ＤＢＣＯ(ＲＴ＝９.２０分)が、中間の極性の生成物へと変換(ＲＴ＝９.３６分)していることが確認できた。反応混合物を周囲温度に冷却し、４００ｍＬのＭｅＯＨで２４時間透析(１２,０００～１４,０００ＭＷＣＯ)した。保持液を濃縮して黄色残渣とし、これをＭｅＣＮ(２ｍＬ)に溶解させた。Ｃ１８ ＨＰＬＣを３１０ｎｍでモニターした：８３％(０～１００％Ｂ, ＲＴ＝９.３６分)。
【化17】
【0075】
アシル化による「放出可能な」ＰＥＧ－タラゾパリブ
スターラーバー、ゴム製セプタムおよび窒素注入口を備えた１０ｍＬのヒートガンで乾燥させた丸底フラスコに、タラゾパリブ(８ｍｇ，２０μｍｏｌ，１.０当量)およびＴＨＦ(１ｍＬ)を入れて、その後－７８℃に冷却した。ＮａＨＭＤＳ(ＴＨＦ中で１.０Ｍ，２１μＬ，２１μｍｏｌ，１.０当量)の溶液を、シリンジを介して添加し、反応混合物を－７８℃で１０分間攪拌した。リンカークロロホルメート１－４の溶液(ＴＨＦ中で４００ｍＭ，６３μＬ，２５μｍｏｌ，１.２当量)を、シリンジを介して滴加し、反応混合物を－７８℃で５分間撹拌し、２０分かけて０℃まで温めて、０℃で４５分間撹拌した。反応混合物を、ＥｔＯＡｃ(１０ｍＬ)およびＨ２Ｏ(１０ｍＬ)間に分配した。水相を分離し、ＥｔＯＡｃ(３ｘ１０ｍＬ)で抽出した。有機相を合わせて、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。この粗生成物をさらに精製することなく使用した。ＬＣＭＳ(ＥＳＩ)ｍ／ｚ Ｃ２８Ｈ２９Ｆ２Ｎ９Ｏ５Ｓについての計算値：６４２.２；実測値：６４２.１；Ｃ１８ＨＰＬＣを３１０ｎｍでモニターした：５０％(５０：５０ 生成物：ＴＬＺ；０～１００％Ｂ，ＲＴ＝１０.２１分)。
スターラーバー、ゴム製セプタムおよび窒素注入口を備えた１０ｍＬのヒートガンで乾燥させた丸底フラスコに、タラゾパリブ(８ｍｇ，２０μｍｏｌ，１.０当量)およびＴＨＦ(１ｍＬ)を入れて、その後－７８℃に冷却した。ＮａＨＭＤＳ(ＴＨＦ中で１.０Ｍ，２１μＬ，２１μｍｏｌ，１.０当量)の溶液を、シリンジを介して添加し、反応混合物を－７８℃で１０分間攪拌した。リンカークロロホルメート１－４の溶液(ＴＨＦ中で４００ｍＭ，６３μＬ，２５μｍｏｌ，１.２当量)を、シリンジを介して滴加し、反応混合物を－７８℃で５分間撹拌し、２０分かけて０℃まで温めて、０℃で４５分間撹拌した。反応混合物を、ＥｔＯＡｃ(１０ｍＬ)およびＨ２Ｏ(１０ｍＬ)間に分配した。水相を分離し、ＥｔＯＡｃ(３ｘ１０ｍＬ)で抽出した。有機相を合わせて、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。この粗生成物をさらに精製することなく使用した。ＬＣＭＳ(ＥＳＩ)ｍ／ｚ Ｃ２８Ｈ２９Ｆ２Ｎ９Ｏ５Ｓについての計算値：６４２.２；実測値：６４２.１；Ｃ１８ＨＰＬＣを３１０ｎｍでモニターした：５０％(５０：５０ 生成物：ＴＬＺ；０～１００％Ｂ，ＲＴ＝１０.２１分)。
【0076】
４ｍＬのガラス製バイアルにおいて、粗製リンカー－ＴＬＺ(ＭｅＯＨ中で１２ｍＭ，４１７μＬ，５.０μｍｏｌ，１.０当量)の溶液を、ＰＥＧ２０ｋＤａ－ＤＢＣＯ(ＭｅＣＮ中で４.３ｍＭ，１.８ｍＬ，７.７μｍｏｌ，１.５当量)の溶液に加えた。反応混合物を、３７℃で１時間加熱した。４００ｍＬのＭｅＯＨに対して１６時間、透析(１２,０００～１４,０００ＭＷＣＯ)により精製し、保持液を濃縮して、目的の化合物を得た。Ｃ１８ ＨＰＬＣを３１０ｎｍでモニターした：９３％(０～１００％Ｂ、ＲＴ＝９.２８分)。
【0077】
コンジュゲート１－３(Ｍｏｄ＝Ｈ)の安定性を、ｐＨ９.４、７.４および５.０にて３７℃で評価し、その結果を図９Ａに示す。コンジュゲートは、ｐＨ５.０にて適度に安定であり、１１時間の間に２％が損失した。しかし、ｐＨ９.４および７.４では、ｐＨ依存性の不安定性が認められ、各々９５％および７５％のコンジュゲートの損失が見られた。コンジュゲート１－６の安定性を、ｐＨ９.０および５.０において３７℃で評価し、その結果を図９Ｂに示した。放出可能なコンジュゲート(Ｒ１＝ＳＯ２Ｍｅ)は、ｐＨ９.４でコンジュゲートが急速に消失されたことを示しただけでなく、ｐＨ５にて有意な排除を示した。
【0078】
実施例３
タラゾパリブの放出可能なコンジュゲート(Ｒ７＝置換アリールである)
米国特許第８,７５４,１９０号のリンカー(即ち、Ｒ７＝アリール)を用いて、上記実施例１に記載の方法に従って、タラゾパリブのコンジュゲートを製造した。リンカー－クロロメチルカルバメートで処理する前に、ＮａＨＭＤＳでタラゾパリブを脱プロトン化すると、５０～８０％の変換率で変換が進行した。安定にアルキル化されたタラゾパリブのコンジュゲートは、３７℃でｐＨ９.４、７.４および５.０で約１５時間にわたり、消失は観察されず、優れた安定性を実証した。図１０に示すように、放出可能なコンジュゲートを、緩衝液中に置くと、ｐＨ９.０および７.４の両方で中間体の蓄積が見られられた。この中間体は、ＬＣＭＳによってマンニッヒ塩基Ｒ７－ＣＨ２－ＴＬＺであることが同定された。ｐＨ７.４でのＰＥＧ－コンジュゲートの半減期は約８８時間であり、マンニッヒ塩基のＴＬＺ放出に対する推定ｔ１／２は、１１.７３時間であった。
タラゾパリブの放出可能なコンジュゲート(Ｒ７＝置換アリールである)
米国特許第８,７５４,１９０号のリンカー(即ち、Ｒ７＝アリール)を用いて、上記実施例１に記載の方法に従って、タラゾパリブのコンジュゲートを製造した。リンカー－クロロメチルカルバメートで処理する前に、ＮａＨＭＤＳでタラゾパリブを脱プロトン化すると、５０～８０％の変換率で変換が進行した。安定にアルキル化されたタラゾパリブのコンジュゲートは、３７℃でｐＨ９.４、７.４および５.０で約１５時間にわたり、消失は観察されず、優れた安定性を実証した。図１０に示すように、放出可能なコンジュゲートを、緩衝液中に置くと、ｐＨ９.０および７.４の両方で中間体の蓄積が見られられた。この中間体は、ＬＣＭＳによってマンニッヒ塩基Ｒ７－ＣＨ２－ＴＬＺであることが同定された。ｐＨ７.４でのＰＥＧ－コンジュゲートの半減期は約８８時間であり、マンニッヒ塩基のＴＬＺ放出に対する推定ｔ１／２は、１１.７３時間であった。
【化18】
【0079】
実施例４
リンカー－オラパリブの製造および安定性試験
ステップ１
６－アジドヘキシル Ｎ－(２－メトキシエチル)－Ｎ－クロロメチルカルバメート
パラホルムアルデヒド(３７ｍｇ，１.２ｍｍｏｌ)およびクロロトリメチルシラン(３１１μＬ, ２.４６ｍｍｏｌ)を、６－アジドヘキシルＮ－(２－メトキシエチル)カルバメート(１５０ｍｇ，０.６１５ｍｍｏｌ, 終濃度０.１Ｍ)／１,２－ジクロロエタン(６ｍＬ)の溶液に連続的に添加した。攪拌反応混合物を、５０℃の油浴に入れて、Ｃ１８ ＨＰＬＣでモニターした。２４時間後、反応が完了したと判断した。反応混合物を濃縮乾固し、得られた残留物を１：１のＥｔＯＡｃ：ヘキサン(１０ｍＬ)で処理した。懸濁液を０.２μｍシリンジフィルターで濾過し、濾液を濃縮乾固させて、粗製表題化合物(１８７ｍｇ)を無色液体として得て、これを更なる精製をせずに使用した。
リンカー－オラパリブの製造および安定性試験
【化19】
ステップ１
６－アジドヘキシル Ｎ－(２－メトキシエチル)－Ｎ－クロロメチルカルバメート
パラホルムアルデヒド(３７ｍｇ，１.２ｍｍｏｌ)およびクロロトリメチルシラン(３１１μＬ, ２.４６ｍｍｏｌ)を、６－アジドヘキシルＮ－(２－メトキシエチル)カルバメート(１５０ｍｇ，０.６１５ｍｍｏｌ, 終濃度０.１Ｍ)／１,２－ジクロロエタン(６ｍＬ)の溶液に連続的に添加した。攪拌反応混合物を、５０℃の油浴に入れて、Ｃ１８ ＨＰＬＣでモニターした。２４時間後、反応が完了したと判断した。反応混合物を濃縮乾固し、得られた残留物を１：１のＥｔＯＡｃ：ヘキサン(１０ｍＬ)で処理した。懸濁液を０.２μｍシリンジフィルターで濾過し、濾液を濃縮乾固させて、粗製表題化合物(１８７ｍｇ)を無色液体として得て、これを更なる精製をせずに使用した。
【0080】
ステップ２
６－アジドヘキシルＮ－(２－メトキシエチル)－Ｎ－(メチレン－オラパリブ)カルバメート
ヒートガン／真空にて乾燥させた丸底フラスコにおいて、オラパリブ(１０.８ｍｇ，２４.９μｍｏｌ，終濃度０.０２Ｍ)を、Ｎ２下でＴＨＦ(１.０ｍＬ)に懸濁させた。懸濁液を、－７８℃のアセトン／ドライアイス浴で冷却し、ＮａＨＭＤＳ(３０μＬ, ３０μｍｏｌ)／ＴＨＦの１.０Ｍ溶液を加えた。－７８℃で５分間撹拌した後、５分間空気で温めている間に反応混合物はオレンジ色になった。－７８℃に再度冷却した後、６－アジドヘキシル Ｎ－(２－メトキエチル)－Ｎ－クロロメチルカルバメート(１０８μＬ, ３２.４μｍｏｌ)／ＴＨＦの０.３Ｍ溶液を加えた。冷却浴を取り外して、オレンジ色の反応混合物を、空気で温めた。２０分以内で、色は橙色から明るい黄色に変化した。２時間後、反応混合物を、１：１のＥｔＯＡｃ：Ｈ２Ｏ(２０ｍＬ)間に分配した。層を分離して、有機相を：Ｈ２Ｏおよびブライン(各１０ｍＬ)で洗浄した。次に、有機層を分離して、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、ロータリーエバポレーションにより濃縮した。粗製濃縮物を、ＳｉｌｉａＳｅｐカラム(４ｇ)にロードし、生成物をアセトン／ヘキサンの段階的グラジエントで溶出した(０％、２０％および４０％；各３０ｍＬ、その後６０％および８０％；各４０ｍＬ)。精製後の生成物含有画分を合わせ、濃縮乾固させて、表題化合物(６ｍｇ，９μｍｏｌ, ３７％収率)を無色のフィルム状物として得た。Ｃ１８ ＨＰＬＣの純度は、２８０ｎｍで測定した：９２.１％(ＲＶ＝１０.５６ｍＬ)。ＬＣ－ＭＳ(ｍ／ｚ)：計算値６９１.３；実測値６９１.４[Ｍ＋Ｈ]＋。
６－アジドヘキシルＮ－(２－メトキシエチル)－Ｎ－(メチレン－オラパリブ)カルバメート
ヒートガン／真空にて乾燥させた丸底フラスコにおいて、オラパリブ(１０.８ｍｇ，２４.９μｍｏｌ，終濃度０.０２Ｍ)を、Ｎ２下でＴＨＦ(１.０ｍＬ)に懸濁させた。懸濁液を、－７８℃のアセトン／ドライアイス浴で冷却し、ＮａＨＭＤＳ(３０μＬ, ３０μｍｏｌ)／ＴＨＦの１.０Ｍ溶液を加えた。－７８℃で５分間撹拌した後、５分間空気で温めている間に反応混合物はオレンジ色になった。－７８℃に再度冷却した後、６－アジドヘキシル Ｎ－(２－メトキエチル)－Ｎ－クロロメチルカルバメート(１０８μＬ, ３２.４μｍｏｌ)／ＴＨＦの０.３Ｍ溶液を加えた。冷却浴を取り外して、オレンジ色の反応混合物を、空気で温めた。２０分以内で、色は橙色から明るい黄色に変化した。２時間後、反応混合物を、１：１のＥｔＯＡｃ：Ｈ２Ｏ(２０ｍＬ)間に分配した。層を分離して、有機相を：Ｈ２Ｏおよびブライン(各１０ｍＬ)で洗浄した。次に、有機層を分離して、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、ロータリーエバポレーションにより濃縮した。粗製濃縮物を、ＳｉｌｉａＳｅｐカラム(４ｇ)にロードし、生成物をアセトン／ヘキサンの段階的グラジエントで溶出した(０％、２０％および４０％；各３０ｍＬ、その後６０％および８０％；各４０ｍＬ)。精製後の生成物含有画分を合わせ、濃縮乾固させて、表題化合物(６ｍｇ，９μｍｏｌ, ３７％収率)を無色のフィルム状物として得た。Ｃ１８ ＨＰＬＣの純度は、２８０ｎｍで測定した：９２.１％(ＲＶ＝１０.５６ｍＬ)。ＬＣ－ＭＳ(ｍ／ｚ)：計算値６９１.３；実測値６９１.４[Ｍ＋Ｈ]＋。
【0081】
ステップ３
６－アジドヘキシルＮ－(２－メトキシエチル)－Ｎ－(メチレン－オラパリブ)カルバメート(放出不可能なＰＥＧ－オラパリブ)のＭｅＯ－ＰＥＧ２０ｋＤａ－ＤＢＣＯトリアゾール
１.５ｍＬのエッペンドルフチューブに、５ｍＭ ｍ－ＰＥＧ２０ｋＤａ－ＤＢＣＯの溶液(４００μＬ，２.０μｍｏｌ)を、５ｍＭ ６－アジドヘキシルＮ－(２－メトキシエチル)－Ｎ－(メチレン－オラパリブ)カルバメート／ＭｅＣＮの溶液と混合した(０.４２ｍＬ, ２.１μｍｏｌ，終濃度２.５ｍＭ)。反応チューブを、３７℃の水浴に１時間置いた後、Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃを用いて０.１ｍＬまで濃縮した。残留物を、Ｈ２Ｏで１.０ｍＬに希釈し、ＰＤＭｉｄｉＴｒａｐカラムで精製した。水で溶出し、１.２ｍＬの標題化合物を水溶液として得た。Ｃ１８ ＨＰＬＣの純度を２８０ｎｍで測定した：９３.６％(ＲＶ＝９.３６ｍＬ)。
６－アジドヘキシルＮ－(２－メトキシエチル)－Ｎ－(メチレン－オラパリブ)カルバメート(放出不可能なＰＥＧ－オラパリブ)のＭｅＯ－ＰＥＧ２０ｋＤａ－ＤＢＣＯトリアゾール
１.５ｍＬのエッペンドルフチューブに、５ｍＭ ｍ－ＰＥＧ２０ｋＤａ－ＤＢＣＯの溶液(４００μＬ，２.０μｍｏｌ)を、５ｍＭ ６－アジドヘキシルＮ－(２－メトキシエチル)－Ｎ－(メチレン－オラパリブ)カルバメート／ＭｅＣＮの溶液と混合した(０.４２ｍＬ, ２.１μｍｏｌ，終濃度２.５ｍＭ)。反応チューブを、３７℃の水浴に１時間置いた後、Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃを用いて０.１ｍＬまで濃縮した。残留物を、Ｈ２Ｏで１.０ｍＬに希釈し、ＰＤＭｉｄｉＴｒａｐカラムで精製した。水で溶出し、１.２ｍＬの標題化合物を水溶液として得た。Ｃ１８ ＨＰＬＣの純度を２８０ｎｍで測定した：９３.６％(ＲＶ＝９.３６ｍＬ)。
【化20】
【0082】
ステップ１
７－アジド－１－(メチルスルホニル)－２－ヘプチル Ｎ－(２－メトキシエチル)－Ｎ－クロロメチルカルバメート
７－アジド－１－(メチルスルホニル)－２－ヘプチル Ｎ－(２－メトキシエチル)－Ｎ－クロロメチルカルバメート(６７ｍｇ，０.２０ｍｍｏｌ, 終濃度０.２Ｍ)／１,２－ジクロロエタン(１ｍＬ)の溶液に、パラホルムアルデヒド(２４ｍｇ，０.８０ｍｍｏｌ)およびクロロトリメチルシラン(１０１μＬ, ０.８０ｍｍｏｌ)を連続して加えた。攪拌した反応混合物を、５０℃の油浴におき、ＨＰＬＣでモニターした。２０時間後、反応は完了したと判断された。反応混合物を、濃縮乾固させて、得られた残留物を１：１のＥｔＯＡｃ：ヘキサン(１.５ｍＬ)で処理した。懸濁液を０.２μｍシリンジフィルターで濾過し、濾液を濃縮乾固させ、粗製表題化合物(８０ｍｇ)を無色液体として得て、これをさらに精製することなく使用した。
７－アジド－１－(メチルスルホニル)－２－ヘプチル Ｎ－(２－メトキシエチル)－Ｎ－クロロメチルカルバメート
７－アジド－１－(メチルスルホニル)－２－ヘプチル Ｎ－(２－メトキシエチル)－Ｎ－クロロメチルカルバメート(６７ｍｇ，０.２０ｍｍｏｌ, 終濃度０.２Ｍ)／１,２－ジクロロエタン(１ｍＬ)の溶液に、パラホルムアルデヒド(２４ｍｇ，０.８０ｍｍｏｌ)およびクロロトリメチルシラン(１０１μＬ, ０.８０ｍｍｏｌ)を連続して加えた。攪拌した反応混合物を、５０℃の油浴におき、ＨＰＬＣでモニターした。２０時間後、反応は完了したと判断された。反応混合物を、濃縮乾固させて、得られた残留物を１：１のＥｔＯＡｃ：ヘキサン(１.５ｍＬ)で処理した。懸濁液を０.２μｍシリンジフィルターで濾過し、濾液を濃縮乾固させ、粗製表題化合物(８０ｍｇ)を無色液体として得て、これをさらに精製することなく使用した。
【0083】
ステップ２
７－アジド－１－(メチルスルホニル)－２－ヘプチル Ｎ－(２－メトキシエチル)－Ｎ－(メチレン－オラパリブ)カルバメート
ヒートガン／真空で乾燥させた丸底フラスコに、オラパリブ(４４ｍｇ，０.１０ｍｍｏｌ, 終濃度０.０５Ｍ)を、Ｎ２下でＴＨＦ(１.５ｍＬ)に懸濁した。懸濁液を、－７８℃のアセトン／ドライアイス浴で冷却し、１.０ＭのＮａＨＭＤＳ(１００μＬ，１００μｍｏｌ)／ＴＨＦの溶液を加えた。懸濁液は、紫色に変化した。－７８℃で５分間攪拌した後、反応溶液を５分間空気により温めた。－７８℃に再度冷却した後、０.３Ｍ ７－アジド－１－(メチルスルホニル)－２－ヘプチル Ｎ－(２－メトキシエチル)－Ｎ－クロロメチルカルバメート(０.４３ｍＬ, ０.１３ｍｍｏｌ)／ＴＨＦの溶液を加えた。紫色が直ちに消失し、得られたオレンジ色の反応溶液を空気で温めた。２０分以内に、色が、オレンジ色から明るい黄色に変化した。２時間後、反応混合物を、１：１のＥｔＯＡｃ：Ｈ２Ｏ(４０ｍＬ)間に分配した。層を分離し、有機相を、Ｈ２Ｏおよびブライン(各２０ｍＬ)で洗浄した。次いで、有機層を分離して、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、濾過し、ロータリーエバポレーションにより濃縮した。粗製濃縮物を、分取ＨＰＬＣで精製した。精製後の生成物含有画分を合わせて、ＭｅＣＮを除去するために～５０％まで濃縮した。得られた水性濃縮物を、ＥｔＯＡｃ(４０ｍＬ)で抽出し、有機相を、Ｈ２Ｏ、ＮａＨＣＯ３(飽和ａｑ)およびブライン(各４０ｍＬ)で洗浄した。次いで、有機層を、ＭｇＳＯ４上で乾燥させて、濾過し、ロータリーエバポレーションにより濃縮乾固させて、表題化合物(２０ｍｇ，２６μｍｏｌ，２６％収率)を、無色油状物として得た。
Ｃ１８ ＨＰＬＣの純度を、２８０ｎｍで決定した：８８.０％(ＲＶ＝９.８７ｍＬ)
ＬＣ－ＭＳ(ｍ／ｚ)：計算値７８３.３；実測値７８３.４[Ｍ＋Ｈ]＋
７－アジド－１－(メチルスルホニル)－２－ヘプチル Ｎ－(２－メトキシエチル)－Ｎ－(メチレン－オラパリブ)カルバメート
ヒートガン／真空で乾燥させた丸底フラスコに、オラパリブ(４４ｍｇ，０.１０ｍｍｏｌ, 終濃度０.０５Ｍ)を、Ｎ２下でＴＨＦ(１.５ｍＬ)に懸濁した。懸濁液を、－７８℃のアセトン／ドライアイス浴で冷却し、１.０ＭのＮａＨＭＤＳ(１００μＬ，１００μｍｏｌ)／ＴＨＦの溶液を加えた。懸濁液は、紫色に変化した。－７８℃で５分間攪拌した後、反応溶液を５分間空気により温めた。－７８℃に再度冷却した後、０.３Ｍ ７－アジド－１－(メチルスルホニル)－２－ヘプチル Ｎ－(２－メトキシエチル)－Ｎ－クロロメチルカルバメート(０.４３ｍＬ, ０.１３ｍｍｏｌ)／ＴＨＦの溶液を加えた。紫色が直ちに消失し、得られたオレンジ色の反応溶液を空気で温めた。２０分以内に、色が、オレンジ色から明るい黄色に変化した。２時間後、反応混合物を、１：１のＥｔＯＡｃ：Ｈ２Ｏ(４０ｍＬ)間に分配した。層を分離し、有機相を、Ｈ２Ｏおよびブライン(各２０ｍＬ)で洗浄した。次いで、有機層を分離して、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、濾過し、ロータリーエバポレーションにより濃縮した。粗製濃縮物を、分取ＨＰＬＣで精製した。精製後の生成物含有画分を合わせて、ＭｅＣＮを除去するために～５０％まで濃縮した。得られた水性濃縮物を、ＥｔＯＡｃ(４０ｍＬ)で抽出し、有機相を、Ｈ２Ｏ、ＮａＨＣＯ３(飽和ａｑ)およびブライン(各４０ｍＬ)で洗浄した。次いで、有機層を、ＭｇＳＯ４上で乾燥させて、濾過し、ロータリーエバポレーションにより濃縮乾固させて、表題化合物(２０ｍｇ，２６μｍｏｌ，２６％収率)を、無色油状物として得た。
Ｃ１８ ＨＰＬＣの純度を、２８０ｎｍで決定した：８８.０％(ＲＶ＝９.８７ｍＬ)
ＬＣ－ＭＳ(ｍ／ｚ)：計算値７８３.３；実測値７８３.４[Ｍ＋Ｈ]＋
【0084】
ステップ３
７－アジド－１－(メチルスルホニル)－２－ヘプチルＮ－(２－メトキシエチル)－Ｎ－(メチレン－オラパリブ)カルバメート(Ｒ１＝ＭｅＳＯ２である放出可能なＰＥＧ－オラパリブ)のＭｅＯ－ＰＥＧ２０ｋＤａ－ＤＢＣＯトリアゾール
１.５ｍＬエッペンドルフチューブにおいて、ｍ－ＰＥＧ２０ｋＤａ－ＤＢＣＯの５ｍＭ溶液(０.４０ｍＬ, ２.０μｍｏｌ)を、７－アジド－１－(メチルスルホニル)－２－ヘプチルＮ－(２－メトキシエチル)－Ｎ－(メチレンオラパリブ)カルバメート／ＭｅＣＮの１０ｍＭ 溶液(０.２１ｍＬ, ２.１μｍｏｌ, 終濃度３ｍＭ)と混合した。反応チューブを、３７℃の水浴に１時間置いた後、Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃを用いて０.１ｍＬに濃縮した。残留物を、Ｈ２Ｏで１.０ｍＬに希釈し、ＰＤ ＭｉｄｉＴｒａｐカラムで精製した。水で溶出することにより、１.２ｍＬの表題化合物[式(ＩＩＩ)：式中、Ｚ＊＝トリアゾール、ｎ＝４、Ｒ１＝ＭｅＳＯ２、Ｒ２および各Ｒ４＝Ｈ、Ｙ＝Ｎ(Ｒ７)ＣＨ２、Ｒ７＝２－メトキシエチル、ｙ＝１およびＤ＝オラパリブ]を、水溶液として得た。Ｃ１８ ＨＰＬＣの純度を、２８０ｎｍで測定した：９７.２％(ＲＶ＝９.２９ｍＬ)。
７－アジド－１－(メチルスルホニル)－２－ヘプチルＮ－(２－メトキシエチル)－Ｎ－(メチレン－オラパリブ)カルバメート(Ｒ１＝ＭｅＳＯ２である放出可能なＰＥＧ－オラパリブ)のＭｅＯ－ＰＥＧ２０ｋＤａ－ＤＢＣＯトリアゾール
１.５ｍＬエッペンドルフチューブにおいて、ｍ－ＰＥＧ２０ｋＤａ－ＤＢＣＯの５ｍＭ溶液(０.４０ｍＬ, ２.０μｍｏｌ)を、７－アジド－１－(メチルスルホニル)－２－ヘプチルＮ－(２－メトキシエチル)－Ｎ－(メチレンオラパリブ)カルバメート／ＭｅＣＮの１０ｍＭ 溶液(０.２１ｍＬ, ２.１μｍｏｌ, 終濃度３ｍＭ)と混合した。反応チューブを、３７℃の水浴に１時間置いた後、Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃを用いて０.１ｍＬに濃縮した。残留物を、Ｈ２Ｏで１.０ｍＬに希釈し、ＰＤ ＭｉｄｉＴｒａｐカラムで精製した。水で溶出することにより、１.２ｍＬの表題化合物[式(ＩＩＩ)：式中、Ｚ＊＝トリアゾール、ｎ＝４、Ｒ１＝ＭｅＳＯ２、Ｒ２および各Ｒ４＝Ｈ、Ｙ＝Ｎ(Ｒ７)ＣＨ２、Ｒ７＝２－メトキシエチル、ｙ＝１およびＤ＝オラパリブ]を、水溶液として得た。Ｃ１８ ＨＰＬＣの純度を、２８０ｎｍで測定した：９７.２％(ＲＶ＝９.２９ｍＬ)。
【0085】
オラパリブを安定に連結させたＰＥＧコンジュゲートのインビトロ安定性
１.５ｍＬのガラス製ＨＰＬＣバイアルにおいて、６－アジドヘキシルＮ－(２－メトキシエチル)－Ｎ－(メチレンオラパリブ)カルバメートのＭｅＯ－ＰＥＧ２０ｋＤａ－ＤＢＣＯトリアゾールの水溶液(０.１ｍＬ)を、Ｈ－Ｌｙｓ(ＤＮＰ)－ＯＨ(ＤＭＳＯ中で１０ｍＭ、５μＬ；内部標準)を含めた緩衝液(０.８５ｍＬ)およびＤＭＳＯ(４５μＬ)の事前に温めた溶液に加えた。バイアルを、加熱した(３７℃)ＨＰＬＣオートサンプラーに保持し、安定性アッセイを、Ｃ１８ ＨＰＬＣで定期的にモニターした。１週間後、遊離オラパリブは観察されなかった。
１.５ｍＬのガラス製ＨＰＬＣバイアルにおいて、６－アジドヘキシルＮ－(２－メトキシエチル)－Ｎ－(メチレンオラパリブ)カルバメートのＭｅＯ－ＰＥＧ２０ｋＤａ－ＤＢＣＯトリアゾールの水溶液(０.１ｍＬ)を、Ｈ－Ｌｙｓ(ＤＮＰ)－ＯＨ(ＤＭＳＯ中で１０ｍＭ、５μＬ；内部標準)を含めた緩衝液(０.８５ｍＬ)およびＤＭＳＯ(４５μＬ)の事前に温めた溶液に加えた。バイアルを、加熱した(３７℃)ＨＰＬＣオートサンプラーに保持し、安定性アッセイを、Ｃ１８ ＨＰＬＣで定期的にモニターした。１週間後、遊離オラパリブは観察されなかった。
【0086】
可溶性ＰＥＧコンジュゲート(ここで、Ｒ１＝ＭｅＳＯ２である)からオラパリブの開裂に関するインビトロでの速度
２つの１.５ｍＬのガラス製ＨＰＬＣバイアルの各々に、ＰＥＧ化リンカー－オラパリブ水溶液(０.１ｍＬ)を、Ｈ－Ｌｙｓ(ＤＮＰ)－ＯＨ(ＤＭＳＯ中で１０ｍＭ，５μＬ，内部標準)を含む緩衝液(０.８５ｍＬ)およびＤＭＳＯ(４５μＬ)の事前に温めた溶液に加えた。バイアルを、加熱した(３７℃)ＨＰＬＣオートサンプラーに保持し、β－脱離反応をＣ１８ ＨＰＬＣで定期的にモニターした。３７℃、ｐＨ９.５８のホウ酸塩中で観察されたオラパリブの放出半減期は、１.５６時間であった。これらのデータを用いると、ｐＨ７.４での半減期は、２３６時間であった。
２つの１.５ｍＬのガラス製ＨＰＬＣバイアルの各々に、ＰＥＧ化リンカー－オラパリブ水溶液(０.１ｍＬ)を、Ｈ－Ｌｙｓ(ＤＮＰ)－ＯＨ(ＤＭＳＯ中で１０ｍＭ，５μＬ，内部標準)を含む緩衝液(０.８５ｍＬ)およびＤＭＳＯ(４５μＬ)の事前に温めた溶液に加えた。バイアルを、加熱した(３７℃)ＨＰＬＣオートサンプラーに保持し、β－脱離反応をＣ１８ ＨＰＬＣで定期的にモニターした。３７℃、ｐＨ９.５８のホウ酸塩中で観察されたオラパリブの放出半減期は、１.５６時間であった。これらのデータを用いると、ｐＨ７.４での半減期は、２３６時間であった。
【0087】
実施例５
４本アーム型ＰＥＧ－オラパリブコンジュゲートの製造
ＰＥＧ４０ｋＤａ－{７－[(カルバモイルオキシ)－４,５,６,７,８,９－ヘキサヒドロ－１Ｈ－シクロオクタ[ｄ][１,２,３]トリアゾール－１－イル]－１－(メチルスルホニル)－２－ヘプチル Ｎ－(２－メトキシエチル)－Ｎ－(メチレン－オラパリブ}４
１０ｍＭ ７－アジド－１－(メチルスルホニル)－２－ヘプチル Ｎ－(２－メトキシエチル)－Ｎ－(メチレン－オラパリブ)カルバメートの溶液(実施例４，２.３ｍＬ，２３μｍｏｌ，終濃度７ｍＭ)を、ＰＥＧ４０ｋＤａ－[５ＨＣＯ]４(２１.２ｍＭ シクロオクチン，０.９４ｍＬ，２０μｍｏｌシクロオクチン；５μｍｏｌＰＥＧ；ヘニスらのエンジニアリングレポートに従って製造)／ＭｅＣＮの溶液と混合した。反応バイアルを、Ｐａｒａｆｉｌｍで密封し、３７℃の水浴に入れ、Ｃ１８ ＨＰＬＣで定期的にモニターした。５２時間後、反応混合物をＭｅＯＨに対して２０時間透析した(１２～１４ｋ ＭＷＣＯ)。保持液を除去し、～０.２ｍＬに濃縮した。濃縮物を、ＴＨＦ(１ｍＬ)で希釈し、空荷時で１５ｍＬファルコンチューブ中の氷冷ＭＴＢＥ(１０ｍＬ)に加えた。この混合物を、０℃で２０分間保持した後、遠心分離し(２０００ｘｇ，１分間)、デカンテーションした。固体をＭＴＢＥ(２ｘ１０ｍＬ)で洗浄して、上記の通りに単離した。湿性の固体を、高真空下で乾燥させ、表題化合物(１９１ｍｇ，４.３１μｍｏｌ ＰＥＧ, ８６％収率)を、白色固体として得た。Ｃ１８ ＨＰＬＣの純度を、２８０ｎｍで測定した：９７.５％(ＲＶ＝９.３２ｍＬ)。
４本アーム型ＰＥＧ－オラパリブコンジュゲートの製造
【化21】
ＰＥＧ４０ｋＤａ－{７－[(カルバモイルオキシ)－４,５,６,７,８,９－ヘキサヒドロ－１Ｈ－シクロオクタ[ｄ][１,２,３]トリアゾール－１－イル]－１－(メチルスルホニル)－２－ヘプチル Ｎ－(２－メトキシエチル)－Ｎ－(メチレン－オラパリブ}４
１０ｍＭ ７－アジド－１－(メチルスルホニル)－２－ヘプチル Ｎ－(２－メトキシエチル)－Ｎ－(メチレン－オラパリブ)カルバメートの溶液(実施例４，２.３ｍＬ，２３μｍｏｌ，終濃度７ｍＭ)を、ＰＥＧ４０ｋＤａ－[５ＨＣＯ]４(２１.２ｍＭ シクロオクチン，０.９４ｍＬ，２０μｍｏｌシクロオクチン；５μｍｏｌＰＥＧ；ヘニスらのエンジニアリングレポートに従って製造)／ＭｅＣＮの溶液と混合した。反応バイアルを、Ｐａｒａｆｉｌｍで密封し、３７℃の水浴に入れ、Ｃ１８ ＨＰＬＣで定期的にモニターした。５２時間後、反応混合物をＭｅＯＨに対して２０時間透析した(１２～１４ｋ ＭＷＣＯ)。保持液を除去し、～０.２ｍＬに濃縮した。濃縮物を、ＴＨＦ(１ｍＬ)で希釈し、空荷時で１５ｍＬファルコンチューブ中の氷冷ＭＴＢＥ(１０ｍＬ)に加えた。この混合物を、０℃で２０分間保持した後、遠心分離し(２０００ｘｇ，１分間)、デカンテーションした。固体をＭＴＢＥ(２ｘ１０ｍＬ)で洗浄して、上記の通りに単離した。湿性の固体を、高真空下で乾燥させ、表題化合物(１９１ｍｇ，４.３１μｍｏｌ ＰＥＧ, ８６％収率)を、白色固体として得た。Ｃ１８ ＨＰＬＣの純度を、２８０ｎｍで測定した：９７.５％(ＲＶ＝９.３２ｍＬ)。
【0088】
実施例６
放出可能なＰＥＧ－ルカパリブ(Ｒ１＝ＭｅＳＯ２)の製造
アジド－リンカー－ルカパリブの合成
キャップおよびスターラーバーを備えた１.５ｍＬガラス製バイアルに、順に７－アジド－１－(メチルスルホニル)－２－ヘプチルスクシンイミジルカーボネート(１８ｍｇ，４７μｍｏｌ，１.０等量，終濃度４７ｍＭ)、ＭｅＣＮ(１ｍＬ)、リン酸ルカパリブ(２０ｍｇ，４７μｍｏｌ，１.０等量，終濃度４７ｍＭ)、ｉＰｒ２ＮＥｔ(１６μＬ，９４μｍｏｌ，２.０等量，終濃度９４ｍＭ)およびＤＭＳＯ(０.５ｍＬ)を加えた。反応溶液を、周囲温度で３０分間攪拌した。反応の進行を、Ｃ１８ ＨＰＬＣ(０～１００％Ｂ, ３５５ｎｍ)によりモニターし、ルカパリブ(ＲＴ＝７.２５分)が極性の低い生成物(ＲＴ＝１０.７９分)に変換されていることを示した。反応混合物を、ＥｔＯＡｃ(５ｍＬ)および１０％クエン酸(５ｍＬ)間に分配した。水相を分離し、ＥｔＯＡｃ(３ｘ５ｍＬ)で抽出した。有機相を合わせて、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。カラムクロマトグラフィー(４ｇシリカゲルカートリッジ：５０％、７５％、１００％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン，１０％アセトン／ＥｔＯＡｃ)の精製により、目的の生成物[１７ｍｇ(２９μｍｏｌ，６２％)]を得た。ＬＣＭＳ(ＥＳＩ)ｍ／ｚ[Ｍ＋Ｈ]＋Ｃ２８Ｈ３３ＦＮ６Ｏ５Ｓについての計算値：５８５.２；実測値：５８５.２．Ｃ１８ ＨＰＬＣを３５５ｎｍでモニターした：９８％(０～１００％Ｂ，ＲＴ＝９.９３分)。
放出可能なＰＥＧ－ルカパリブ(Ｒ１＝ＭｅＳＯ２)の製造
【化22】
キャップおよびスターラーバーを備えた１.５ｍＬガラス製バイアルに、順に７－アジド－１－(メチルスルホニル)－２－ヘプチルスクシンイミジルカーボネート(１８ｍｇ，４７μｍｏｌ，１.０等量，終濃度４７ｍＭ)、ＭｅＣＮ(１ｍＬ)、リン酸ルカパリブ(２０ｍｇ，４７μｍｏｌ，１.０等量，終濃度４７ｍＭ)、ｉＰｒ２ＮＥｔ(１６μＬ，９４μｍｏｌ，２.０等量，終濃度９４ｍＭ)およびＤＭＳＯ(０.５ｍＬ)を加えた。反応溶液を、周囲温度で３０分間攪拌した。反応の進行を、Ｃ１８ ＨＰＬＣ(０～１００％Ｂ, ３５５ｎｍ)によりモニターし、ルカパリブ(ＲＴ＝７.２５分)が極性の低い生成物(ＲＴ＝１０.７９分)に変換されていることを示した。反応混合物を、ＥｔＯＡｃ(５ｍＬ)および１０％クエン酸(５ｍＬ)間に分配した。水相を分離し、ＥｔＯＡｃ(３ｘ５ｍＬ)で抽出した。有機相を合わせて、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。カラムクロマトグラフィー(４ｇシリカゲルカートリッジ：５０％、７５％、１００％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン，１０％アセトン／ＥｔＯＡｃ)の精製により、目的の生成物[１７ｍｇ(２９μｍｏｌ，６２％)]を得た。ＬＣＭＳ(ＥＳＩ)ｍ／ｚ[Ｍ＋Ｈ]＋Ｃ２８Ｈ３３ＦＮ６Ｏ５Ｓについての計算値：５８５.２；実測値：５８５.２．Ｃ１８ ＨＰＬＣを３５５ｎｍでモニターした：９８％(０～１００％Ｂ，ＲＴ＝９.９３分)。
【化23】
【0089】
放出可能なＰＥＧ－ルカパリブコンジュゲートの合成
１.５ｍＬの遠心管に、ＰＥＧ２０ｋＤａ－ＤＢＣＯ溶液(４.９ｍＭ，１.０ｍＬ，４.９μｍｏｌ，１.０当量，終濃度４.９ｍＭ)およびアジド－リンカー－ルカパリブ溶液(３１ｍＭ リンカー－ルカパリブ，１７４μＬ，５.４μｍｏｌ，１.１当量，終濃度５.５ｍＭ)を入れた。反応混合物を、３７℃で１６時間加熱した。反応の進行を、Ｃ１８ ＨＰＬＣ(０～１００％Ｂ, ３５５ｎｍ)でモニターし、リンカー－ルカパリブ(ＲＴ＝９.９４分)が、より極性の高い生成物(ＲＴ＝９.２３分)に変換されていることを確認した。その後、反応混合物を、４００ｍＬに対して１８時間透析した(１２～１４,００ＭＷＣＯ)。保持液を濃縮して、９７ｍｇのＰＥＧコンジュゲートを、無色残留物として得た。Ｃ１８ ＨＰＬＣを、３５５ｎｍでモニターした：９６％(０～１００％Ｂ，ＲＴ＝９.２３分)。
１.５ｍＬの遠心管に、ＰＥＧ２０ｋＤａ－ＤＢＣＯ溶液(４.９ｍＭ，１.０ｍＬ，４.９μｍｏｌ，１.０当量，終濃度４.９ｍＭ)およびアジド－リンカー－ルカパリブ溶液(３１ｍＭ リンカー－ルカパリブ，１７４μＬ，５.４μｍｏｌ，１.１当量，終濃度５.５ｍＭ)を入れた。反応混合物を、３７℃で１６時間加熱した。反応の進行を、Ｃ１８ ＨＰＬＣ(０～１００％Ｂ, ３５５ｎｍ)でモニターし、リンカー－ルカパリブ(ＲＴ＝９.９４分)が、より極性の高い生成物(ＲＴ＝９.２３分)に変換されていることを確認した。その後、反応混合物を、４００ｍＬに対して１８時間透析した(１２～１４,００ＭＷＣＯ)。保持液を濃縮して、９７ｍｇのＰＥＧコンジュゲートを、無色残留物として得た。Ｃ１８ ＨＰＬＣを、３５５ｎｍでモニターした：９６％(０～１００％Ｂ，ＲＴ＝９.２３分)。
【0090】
実施例７
放出可能なＰＥＧ－ＶＸ９７０(Ｒ１＝ＭｅＳＯ２)の製造
放出可能なＰＥＧ－ＶＸ９７０(Ｒ１＝ＭｅＳＯ２)の製造
【化24】
【0091】
アジド－リンカー－ＶＸ９７０(Ｒ１＝ＭｅＳＯ２)
キャップおよびスターラーバーを取り付けた１.５ｍＬのガラス製バイアルに、順に７－アジド－１－(メチルスルホニル)－２－ヘプチルスクシンイミジルカーボネート(１５ｍｇ，３９μｍｏｌ，０.９等量)、ＭｅＣＮ(０.５ｍＬ)、ＶＸ９７０(２０ｍｇ，４３μｍｏｌ，１.０等量)、ｉＰｒ２ＮＥｔ(１０μＬ，６０μｍｏｌ, １.５等量)およびＤＭＳＯ(０.５ｍＬ)を添加した。反応溶液を、周囲温度で３０分間攪拌した。反応の進行を、Ｃ１８ ＨＰＬＣ(０～１００％Ｂ, ３１０ｎｍ)によりモニターし、ＶＸ９７０(ＲＴ＝８.５６分)が極性の低い生成物(ＲＴ＝１０.８５分)に変換されていることを確認した。反応混合物を、後処理または更なる精製をせずに使用した。ＬＣＭＳ(ＥＳＩ)ｍ／ｚ[Ｍ＋Ｈ]＋ Ｃ３３Ｈ４０Ｎ８Ｏ７Ｓ２についての計算値：７２５.３；実測値７２５.３を得た。Ｃ１８ ＨＰＬＣを、３１０ｎｍでモニターした：９０％(０～１００％Ｂ、ＲＴ＝１０.８５).
キャップおよびスターラーバーを取り付けた１.５ｍＬのガラス製バイアルに、順に７－アジド－１－(メチルスルホニル)－２－ヘプチルスクシンイミジルカーボネート(１５ｍｇ，３９μｍｏｌ，０.９等量)、ＭｅＣＮ(０.５ｍＬ)、ＶＸ９７０(２０ｍｇ，４３μｍｏｌ，１.０等量)、ｉＰｒ２ＮＥｔ(１０μＬ，６０μｍｏｌ, １.５等量)およびＤＭＳＯ(０.５ｍＬ)を添加した。反応溶液を、周囲温度で３０分間攪拌した。反応の進行を、Ｃ１８ ＨＰＬＣ(０～１００％Ｂ, ３１０ｎｍ)によりモニターし、ＶＸ９７０(ＲＴ＝８.５６分)が極性の低い生成物(ＲＴ＝１０.８５分)に変換されていることを確認した。反応混合物を、後処理または更なる精製をせずに使用した。ＬＣＭＳ(ＥＳＩ)ｍ／ｚ[Ｍ＋Ｈ]＋ Ｃ３３Ｈ４０Ｎ８Ｏ７Ｓ２についての計算値：７２５.３；実測値７２５.３を得た。Ｃ１８ ＨＰＬＣを、３１０ｎｍでモニターした：９０％(０～１００％Ｂ、ＲＴ＝１０.８５).
【化25】
【0092】
放出可能なＰＥＧ－ＶＸ－９７０(Ｒ１＝ＭｅＳＯ２)
１.５ｍＬの遠心管に、ＰＥＧ２０ｋＤａ－ＤＢＣＯ(ＭｅＣＮ中で４.４ｍＭ, １.０ｍＬ, ４.４μｍｏｌ, １.０等量)の溶液およびアジド－リンカー－ＶＸ９７０(１７１μＬ, ４.８μｍｏｌ, １.１等量)の溶液を入れた。反応混合物を、３７℃で３０分間加熱した後、追加のＰＥＧ－ＤＢＣＯ(１００μＬ, ０.４μｍｏｌ, ０.１等量)を添加した。反応混合物を３７℃で１時間加熱した。反応の進行を、Ｃ１８ ＨＰＬＣ(０～１００％Ｂ, ３１０ｎｍ)でモニターし、リンカーＶＸ９７０(ＲＴ＝１０.８５分)がより極性が高い生成物(ＲＴ＝９.４２分)に変換されたことを確認した。反応混合物を周囲温度まで冷却し、５００ｍＬのＭｅＯＨに対して１８時間透析した(１２,０００～１４,０００ＭＷＣＯ)。保持溶液を濃縮して、得られた白色残留物を、１０ｍＭ ＮａＯＡｃ(ｐＨ５)に溶解して無色溶液を得た(約４ｍＭ)。Ｃ１８ ＨＰＬＣを、３１０ｎｍでモニターした：＞９８％以上(０～１００％Ｂ、ＲＴ＝９.４２分)。
１.５ｍＬの遠心管に、ＰＥＧ２０ｋＤａ－ＤＢＣＯ(ＭｅＣＮ中で４.４ｍＭ, １.０ｍＬ, ４.４μｍｏｌ, １.０等量)の溶液およびアジド－リンカー－ＶＸ９７０(１７１μＬ, ４.８μｍｏｌ, １.１等量)の溶液を入れた。反応混合物を、３７℃で３０分間加熱した後、追加のＰＥＧ－ＤＢＣＯ(１００μＬ, ０.４μｍｏｌ, ０.１等量)を添加した。反応混合物を３７℃で１時間加熱した。反応の進行を、Ｃ１８ ＨＰＬＣ(０～１００％Ｂ, ３１０ｎｍ)でモニターし、リンカーＶＸ９７０(ＲＴ＝１０.８５分)がより極性が高い生成物(ＲＴ＝９.４２分)に変換されたことを確認した。反応混合物を周囲温度まで冷却し、５００ｍＬのＭｅＯＨに対して１８時間透析した(１２,０００～１４,０００ＭＷＣＯ)。保持溶液を濃縮して、得られた白色残留物を、１０ｍＭ ＮａＯＡｃ(ｐＨ５)に溶解して無色溶液を得た(約４ｍＭ)。Ｃ１８ ＨＰＬＣを、３１０ｎｍでモニターした：＞９８％以上(０～１００％Ｂ、ＲＴ＝９.４２分)。
【0093】
実施例８
ＰＥＧ－タラゾパリブの薬物動態試験
式(ＩＩＩ)のコンジュゲート：式中、Ｚ＊＝トリアゾール、ｎ＝４、Ｒ１＝ＭｅＳＯ２、Ｒ２および各Ｒ４＝Ｈ、Ｙ＝Ｎ(Ｒ７)ＣＨ２、Ｒ７＝２－メトキシエチル、ｙ＝４およびＤ＝タラゾパリブ
ＰＥＧ－タラゾパリブの薬物動態試験
式(ＩＩＩ)のコンジュゲート：式中、Ｚ＊＝トリアゾール、ｎ＝４、Ｒ１＝ＭｅＳＯ２、Ｒ２および各Ｒ４＝Ｈ、Ｙ＝Ｎ(Ｒ７)ＣＨ２、Ｒ７＝２－メトキシエチル、ｙ＝４およびＤ＝タラゾパリブ
【0094】
雄のＣＤ－１マウス(Ｎ＝２０，平均体重３０ｇ)に、等張酢酸緩衝液(ｐＨ５)中の実施例１に従って製造した放出可能なＰＥＧ－タラゾパリブ(Ｒ１＝ＳＯ２Ｍｅ)または放出不可能なＰＥＧ－タラゾパリブ(３０μｍｏｌ／ｋｇ，２.０３ｍＭ，１４.８ｍＬ／ｋｇ)の溶液を、ＩＰ投与した。様々な時点での血液サンプル(Ｎ＝４匹のマウス，２００μＬ)を採血し、直ちに１Ｍクエン酸／０.１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８(ｐＨ４.５)溶液(得られたサンプル量の１０％)で処理し、遠心分離して血漿サンプル(１００μＬ)を得て、これを処理中は氷上に保持し、分析まで－８０℃で凍結させた。採血スケジュールは、以下の通りである：マウス１～４は、１時間と２４時間、マウス５～８は、２時間と４８時間、マウス９～１２は、４時間と７２時間、マウス１３～１６は８時間と９６時間、マウス１７～２０は１２時間と１２０時間に採血した。
【0095】
各ＰＫサンプルまたは標準物(１０μＬ)のアリコートを、内部標準として１５μＭ ＤＮＰ－Ｌｙｓを含むＭｅＯＨ／０.５％ＡｃＯＨ(５０μＬ)で処理した。サンプルを、激しくボルテックスし、遠心分離(２１,０００ｘｇ，４℃，１０分)し、Ｈ２Ｏ／０.５％ＡｃＯＨ(２００μＬ)の入ったＨＰＬＣバイアルに移した。サンプルを、Ｃ１８ ＨＰＬＣカラムに注入し(２２０μＬ)、Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ／０.１％ＴＦＡで溶出した(１５分かけて０～１００％Ｂ)。標準曲線は、ＰＥＧ－タラゾパリブ(ＰＥＧに対して１ｍＭ タラゾパリブ；０.２５ｍＭコンジュゲート)の溶液を、氷上でマウス血清に連続希釈することにより作成した。アリコートを、上記と同様に処理および分析した。ピーク面積を、濃度に対してプロットし、線形方程式に当てはめた。ＰＥＧ－タラゾパリブのＬＬＯＱは、１６ｐｍｏｌ(１０μＬ血清中で２μＭ)であると決定された。ＰＫサンプル濃度は、標準曲線に対する内挿ピーク面積に基づいて計算され、時間に対してプロットされ、結果を図１１に示した。吸収および消失半減期は、得られたデータに対して、１／Ｙ２による重み付き双指数関数にフィッティングさせて算出した。
【0096】
ＰＫパラメータを、以下の表１に示す。
表１．放出可能なＰＥＧ－タラゾパリブ(Ｍｏｄ＝ＳＯ２Ｍｅ)ａのＰＫパラメータ
ａ薬物動態データの双指数関数へのフィッティングから得られるＰＫパラメータ(ｙ＝Ｃ０＊((ｅｘｐ(－ｋ１＊ｔ)－ｅｘｐ(－ｋ２＊ｔ)))。
ｂＣ０は、ｔ１／２,βの外挿により得られ、かつ上記式において計算されたｔ＝０の時点での理論濃度である
ｃＣｍａｘおよびＴｍａｘは、最高血中濃度および最高血中濃度到達時間である
表１．放出可能なＰＥＧ－タラゾパリブ(Ｍｏｄ＝ＳＯ２Ｍｅ)ａのＰＫパラメータ
【表1】
ｂＣ０は、ｔ１／２,βの外挿により得られ、かつ上記式において計算されたｔ＝０の時点での理論濃度である
ｃＣｍａｘおよびＴｍａｘは、最高血中濃度および最高血中濃度到達時間である
【0097】
実施例９
マウスＭＸ－１異種移植におけるＰＥＧ－タラゾパリブコンジュゲートの有効性
ＭＸ－１ヒトのトリプルネガティブ乳癌細胞株を、Charles River Labs(Frederick, Meryland)より入手した。細胞を、ＲＰＭＩ－１６４０、１０％ＦＢＳおよび１％ ２ｍＭ Ｌ－グルタミンにおいて、３７℃で９５％空気／５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。
マウスＭＸ－１異種移植におけるＰＥＧ－タラゾパリブコンジュゲートの有効性
ＭＸ－１ヒトのトリプルネガティブ乳癌細胞株を、Charles River Labs(Frederick, Meryland)より入手した。細胞を、ＲＰＭＩ－１６４０、１０％ＦＢＳおよび１％ ２ｍＭ Ｌ－グルタミンにおいて、３７℃で９５％空気／５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。
【0098】
腫瘍異種移植は、ＭＸ－１腫瘍細胞(マトリゲルと１：１で混合した無血清培地１００μｌ中で２ｘ１０６細胞)を、雌性ＮＣｒヌードマウスの右脇腹に皮下注射することにより行った。ドナーマウスにおける腫瘍異種移植片が、１０００～１５００ｍｍ３に達した時点で切除し、同じサイズの断片(約２.５×２.５ｍｍ)に分断し、マトリゲルに埋め込み、移植されるマウスに、皮下トロッカー移植を行い再度移植した。
【0099】
タラゾパリブの溶液(５０μＭ)は、タラゾパリブ／ＤＭＳＯの溶液(５５ｍＭ，４５４μＬ)を１０％ジメチルアセトアミド、６％ソルトールおよび８４％ＰＢＳを含む経口投与用緩衝液に加えることにより調製された。タラゾパリブ含有量は、１０％ジメチルアセトアミド、６％ソルトールおよび８４％ＰＢＳにおいて、ε３１０ｎｍ＝９８７２Ｍ－１ｃｍ－１により決定した。溶液を、０.４～０.９μｍｏｌ／ｋｇタラゾパリブを送達するために８.５～１９ｍＬ／ｋｇにて経口(ｐ.ｏ.)投与した。最大８ｍＭのタラゾパリブ(２ｍＭ ＰＥＧ－[タラゾパリブ]４)を含むＰＥＧ－タラゾパリブ[実施例１、Ｒ１＝ＭｅＳＯ２、Ｒ７＝ＭｅＯ(ＣＨ２)２]の溶液を、等張酢酸緩衝液(ｐＨ５)中で調製し、０.２μＭシリンジフィルターで無菌ろ過し、ＴＬＺ含有量を、１０％のジメチルアセトアミド、６％のソルトールおよび８４％のＰＢＳにおいて、ε３１０ｎｍ＝９８７２Ｍ－１ｃｍ－１により定量した。投薬は、１５～１２０μｍｏｌ薬剤／ｋｇを送達するために、～１５ｍＬ／ｋｇにてＩＰ送達された。
【0100】
ＭＸ－１腫瘍を担持するマウスは、腫瘍が～１００～３００ｍｍ３のサイズに達した時点で投与される。投与溶液を、上記に示した通りに投与した。腫瘍の体積[ノギス測定、０.５ｘ(長さｘ幅２)]および体重を、週２回測定した。データを、時間に対する相対的な腫瘍体積としてプロットし、平均＋／－ＳＥＭとして表示した。大きな腫瘍を担持するマウスは、腫瘍が１０００～３０００ｍｍ３に達した時点で投薬された。結果を、以下の図５～７および表３に示す。
【0101】
個々のマウスにおける疾患を記述するために使用した用語体系は、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら(Pediatric Blood & Cancer, 2007 49:928-40)によって提案された通りであり、表２にまとめた。進行性疾患(ＰＤ)は、イベントまでの日数として計算された腫瘍成長遅延値(ＴＧＤ)に基づいて、ＰＤ１またはＰＤ２に分類される。各マウスについて、ＴＧＤは、イベントまでの時間を対照群におけるイベントまでの時間の中央値で割ることによって算出された。ＰＤを示し、かつ処置群においてイベントが生じた個々のマウスについて、ＴＧＤ値は、マウスのイベントまでの時間を対照群におけるイベントまでの時間の中央値で割ることによって算出された。イベントまでの時間の中央値は、カプラン・マイヤーの無イベント生存率分布に基づいて推定された。
【0102】
表２．個々のマウスの疾患を説明する用語体系
【表2】
【0103】
【表3】
【0104】
実施例１０
マウス異種移植におけるＰＥＧ－タラゾパリブコンジュゲートの有効性
実施例１に従って製造した放出可能なＰＥＧ－タラゾパリブコンジュゲートの有効性も、実施例９と同様にしてマウスＭＸ－１、ＫＴ－１０、ＴＣ－７１、ＤＬＤ－１ ＢＲＣＡ２－／－およびＤＬＤ－１ ＢＲＣＡ２ｗｔ／ｗｔ異種移植において検討した。結果を、図１２に示した。
マウス異種移植におけるＰＥＧ－タラゾパリブコンジュゲートの有効性
実施例１に従って製造した放出可能なＰＥＧ－タラゾパリブコンジュゲートの有効性も、実施例９と同様にしてマウスＭＸ－１、ＫＴ－１０、ＴＣ－７１、ＤＬＤ－１ ＢＲＣＡ２－／－およびＤＬＤ－１ ＢＲＣＡ２ｗｔ／ｗｔ異種移植において検討した。結果を、図１２に示した。
【0105】
皮下ＫＴ－１０腫瘍を担持するマウスのコホート(ｎ＝５)を、５～４０μｍｏｌ／ｋｇのＰＥＧ－タラゾパリブコンジュゲートの単回ＩＰ注射により処理した。腫瘍体積を毎週測定し、各群について無イベント生存率(ＥＦＳ)を算出した(ここで、イベントとは、治療初日の最初の腫瘍体積の４倍と定義した)。ＰＥＧ－タラゾパリブコンジュゲートを、４０μｍｏｌ／ｋｇで投与すると、７日目に平均～１７％の体重減少が生じたが、１４日目には全ての動物が回復した。ＰＥＧ－タラゾパリブコンジュゲートに関する用量依存的な腫瘍増殖反応およびカプラン－マイヤー無イベント生存分布を、図１２Ａおよび１２Ｂに示す；対照腫瘍のＥＦＳ中央値は１１日であった。５μｍｏｌ／ｋｇのＴＬＺのＰＥＧ－タラゾパリブコンジュゲートでは、３匹の腫瘍がわずかに退縮し、ＥＦＳ中央値は２５日であって、全ての腫瘍がイベントに到達した。１０μｍｏｌ／ｋｇでは、全ての腫瘍が＞５０％退縮し、ＥＦＳ中央値は４８日であって、４／５匹の腫瘍がイベントに達した。２０μｍｏｌ／ｋｇおよび４０μｍｏｌ／ｋｇである高用量ＰＥＧ－タラゾパリブコンジュゲートでは、全ての腫瘍がＥＦＳ＞８週間を示した；完全に退縮したが、２０μｍｏｌ／ｋｇで治療した群では５匹中４匹の腫瘍が再度増殖し、４０μｍｏｌ／ｋｇで治療したマウスでは５匹中２匹の腫瘍が再度増殖していた。１０μｍｏｌ／ｋｇのＰＥＧ－タラゾパリブコンジュゲート用量のＥＦＳ Ｔ／Ｃは４.３であり、この腫瘍に対する高活性の薬剤として適格性が示された。
【0106】
ＴＬＺ感受性ＢＲＣＡ１欠損ＭＸ－１腫瘍を担持するマウスを、ＴＬＺ経口投与およびＰＥＧ－タラゾパリブコンジュゲートの単回ＩＰ注射により毎日処置した。ＰＥＧ－タラゾパリブコンジュゲートの用量依存的な腫瘍増殖反応およびカプラン－マイヤー無イベント生存分布を、図１２Ｃおよび１２Ｄに示す。０.４μｍｏｌ／ｋｇ(０.１５ｍｇ／ｋｇ)のＴＬＺを、毎日投与した場合、全ての腫瘍において最初のサイズの４倍に達しなかった為、イベントの定義を、最初の腫瘍体積の２倍とした(図１２Ｄ)；対照の腫瘍は、２ｘ－ＥＦＳの中央値が７日であり、０.４μｍｏｌ／ｋｇ ＴＬＺでは、～３週間の成長抑制があり、その後腫瘍が成長して３５日にＥＦＳ中央値に達した。明らかに、ＭＸ－１腫瘍は、１２週間にわたる０.１ｍｇ／ｋｇ ＴＬＺの連日投与により、ＣＲの維持を示したＫＴ－１０ほどＴＬＺに感受性が低かった(２６)。４０μｍｏｌ／ｋｇ ＴＬＺでのＰＥＧ－タラゾパリブコンジュゲートでは、動物は、８日目までに～９％の体重減少を示し、５匹中２匹が死亡した。残りの３匹のマウスは、最初の体重まで回復し、５０日間経過しても腫瘍の進行が見られなかった；打ち切られた死亡マウスでは、信頼できるＥＦＳ解析ができなかった。マウスは、体重減少もなく、５～３０μｍｏｌ／ｋｇのＰＥＧ－タラゾパリブコンジュゲートの単回投与に耐性であった。１３μｍｏｌ／ｋｇのＰＥＧ－タラゾパリブコンジュゲート投与時のＥＦＳ中央値は３１日であり、０.４μｍｏｌ(０.１５ｍｇ)／ｋｇ／日の遊離ＴＬＺの３５日のＥＦＳとほぼ同じであった。１３μｍｏｌ／ｋｇのＰＥＧ－タラゾパリブコンジュゲートのＥＦＳ Ｔ／Ｃは４.４であって、このような低用量で高い活性があることが示された。
【0107】
ＴＣ－７１腫瘍を担持するマウスに、ＴＬＺを毎日経口投与し、ＰＥＧ－タラゾパリブコンジュゲートを単回ＩＰ注射により投与した。腫瘍の成長は、４０μｍｏｌ／ｋｇという高濃度のＰＥＧ－タラゾパリブコンジュゲートにより阻害されず、ＥＦＳ曲線から、活性が有意では無いことが示された(図１２Ｅおよび１２Ｆ)。
【0108】
ＢＲＣＡ２－／－およびＤＬＤ－１ ＢＲＣＡ２ｗｔ／ｗｔ腫瘍を担持するマウスに、ＴＬＺを毎日経口投与し、ＰＥＧ－タラゾパリブコンジュゲートを単回ＩＰ注射により投与した。ＢＲＣＡ２－／－では、２０μｍｏｌ／ｋｇのＰＥＧ－タラゾパリブコンジュゲートの１回注射は、０.８７μｍｏｌ(０.３３ｍｇ)／ｋｇ／日の２１日間の投与と同等の腫瘍増殖抑制効果があった(図１２Ｇ)。無イベント生存期間の中央値は、１０μｍｏｌ／ｋｇのＰＥＧ－タラゾパリブコンジュゲートにより処置された動物では、～５倍増加し、ＴＬＺ×２１日の連日投与または２０μｍｏｌ／ｋｇのＰＥＧ－タラゾパリブコンジュゲートの単回投与により処置された動物では、各々１１または１３倍増加した(図１２Ｈ)。これに対して、ＢＲＣＡ２repletＤＬＤ－１腫瘍は、ＱＤ経口ＴＬＺまたはＩＰ ＰＥＧ-ＴＬＺのいずれに対しても耐性である(図１２Ｉおよび１２Ｊ)；ここでは、対照に対して、処置した動物のＥＦＳ中央値の増加は見られなかった。
【0109】
実施例１１
４本アーム型放出可能なコンジュゲートの製造
２０ｍＬシンチレーションバイアルに、リンカー－タラゾパリブ[式中、Ｚ＝アジドであり、ｎ＝５であり、Ｒ１＝ＭｅＳＯ２であり、Ｒ２および各Ｒ４＝Ｈであり、Ｙ＝Ｎ(Ｒ７)ＣＨ２であり、Ｒ７＝２－メトキシエチルであり、およびＤ＝タラゾパリブ(３９２ｍｇ，０.５３８ｍｍｏｌ，１.３等量，終濃度３４ｍＭ)である]およびＰＥＧ４０ｋＤａ－[５ＨＣＯ]４(１５.６ｍＬ，０.４１４ｍｍｏｌ，１等量，終濃度２７ｍＭ)の溶液を添加した。反応混合物を、３７℃で４８時間加熱した。Ｃ１８ ＨＰＬＣ(０～１００％Ｂ，３１０ｎｍ)による分析では、リンカー－ＴＬＺは、より極性が高い生成物に変換されていることが確認された。次いで、反応混合物を、５０％ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ(１Ｌ)に対して１８時間、１００％ＭｅＯＨに対して４時間および１００％ＭｅＯＨに対して４時間透析した。透析保持物を濃縮して、ＴＨＦ(３０ｍＬ)に溶解し、撹拌しているＭＴＢＥ(２５０ｍＬ)に添加した。得られた懸濁液を、周囲温度で１５分間撹拌し、焼結ガラス製漏斗を用いた真空濾過により固体を回収した。回収した固体を、ＭＴＢＥ(３ｘ１００ｍＬ)で洗浄し、真空下で乾燥させて、所望の生成物[２.９３ｇ(０.２６４ｍｍｏｌ ＴＬＺ，６４％収率)]である式(ＩＩＩ)(式中、Ｚ＊は、トリアゾールであり、ｎ＝５であり、Ｒ１はＭｅＳＯ２であり、Ｒ２はＨであり、各Ｒ４はＨであり、ＹはＮ(Ｒ７)ＣＨ２であり、Ｒ７は２－メトキシエチルであり、Ｄはタラゾパリブである)を、白色固体として得た。Ｃ１８ＨＰＬＣの純度を、３１０ｎｍで測定した：９２％(０～１００％Ｂ、ＲＴ＝１０.３９)。
４本アーム型放出可能なコンジュゲートの製造
【化26】
【0110】
１００ｍｇ／ｍＬのコンジュゲートを含有する溶液を、ＰＥＧおよびＴＬＺ含量についてアッセイした。ＰＥＧ含量を、改変ＢａＣｌ２/Ｉ２アッセイ(４,５)を用いて測定し、ＰＥＧ－ＴＬＺ含量を、９８７２Ｍ－１ｃｍ－１を用いて等張酢酸緩衝液中のＡ３１０により測定して、３.６の割合を得た(ＰＥＧ ＲＥＧに基づいて９５％の理論値)。
【0111】
コンジュゲート含有溶液(～１００μＭ)を、Ｈ－Ｌｙｓ(ＤＮＰ)－ＯＨ(１０ｍＭ ＤＭＳＯ, １０μＬ, 終濃度１００μＭ)を含有する反応速度アッセイ用緩衝液(１００ｍＭ ホウ酸塩, ｐＨ９.４または９.０, ３７℃；１００ｍＭ バイシン, ｐＨ８.４, ３７℃；１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ, ｐＨ７.４, ３７℃；１００ｍＭ ＮａＯＡｃ, ｐＨ５.０, ３７℃)中で、３７℃で加熱した。定期的に反応の進行を、反応アリコートを直接注入(１０μＬ)して、Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ／０.１％ ＴＦＡにより溶出し、Ｃ１８ ＨＰＬＣ(３１０ｎｍ)でモニタリングした。ピーク面積を、時間に対してプロットした。１６０時間ｐＨ７.４でタラゾパリブの放出半減期を決定した。
【0112】
実施例１２
コンジュゲート(式中、Ｚ＊＝カルボキサミドである)の製造
Ｚ＊＝カルボキサミドであるコンジュゲートの製造は、ＰＥＧ－タラゾパリブコンジュゲート(Ｒ１＝ＭｅＳＯ２)の製造により説明され、関連するコンジュゲートは、上記実施例からの式(ＩＩ)の適切なリンカー－薬剤を置き換えることにより製造できる。
コンジュゲート(式中、Ｚ＊＝カルボキサミドである)の製造
Ｚ＊＝カルボキサミドであるコンジュゲートの製造は、ＰＥＧ－タラゾパリブコンジュゲート(Ｒ１＝ＭｅＳＯ２)の製造により説明され、関連するコンジュゲートは、上記実施例からの式(ＩＩ)の適切なリンカー－薬剤を置き換えることにより製造できる。
【化27】
【0113】
式(ＩＩ)のアジド－リンカー－タラゾパリブ(式中、Ｚ＝アジドであり、ｎ＝２であり、Ｒ１＝ＭｅＳＯ２であり、Ｒ２＝Ｈであり、各Ｒ４＝Ｍｅであり、Ｙ＝Ｎ(Ｒ７)ＣＨ２であり、Ｒ７＝２－メトキシエチルであり、およびＤ＝タラゾパリブである) (実施例１)を、ＴＨＦに溶解して、氷上で冷却し、酢酸(２.５Ｅｑ)で処理した後、１.０Ｍトリメチルホスフィン／ＴＨＦ(５.０Ｅｑ)で処理した。ＨＰＬＣ分析によりアジドが消失するまで反応させて(～２時間)、次いで水(１０Ｅｑ)を加えて、中間体のホスフィンイミンを分解する。混合溶液を、周囲温度まで昇温させ、２０容量のメチル ｔ－ブチルエーテル(ＭＴＢＥ)を加えて、相を分離させる。水相を収集して、ＭＴＢＥで洗浄し、真空下で乾燥させて、アンモニウム塩を得て、これを水および０.１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルを用いた分取逆相ＨＰＬＣにより精製し、次いで真空下で乾燥させる。乾燥させたアンモニウム塩を、ＴＨＦに溶解し、Ｎ２雰囲気下で４本アーム型４０ｋＤａ ＰＥＧ－(スクシンイミジルエステル)４(アンモニウム塩に対してスクシンイミジルエステルの０.９当量)／ＴＨＦの溶液に加え、次いでＮ,Ｎ－ジイソプロピル－エチルアミン(２Ｅｑ)を加えた。反応が完了した後(～１時間)、反応混合物を、５倍容量の撹拌した氷冷ＭＴＢＥにゆっくりと加えることによって生成物を沈殿させ、濾過により回収して、真空下で乾燥させて、式(ＩＩＩ)(式中、Ｍは４０ｋＤａの４本アーム型のＰＥＧであり、Ｚ＊はカルボキサミドであり、ｎ＝２であり、Ｒ１＝ＭｅＳＯ２であり、Ｒ２＝Ｈであり、各Ｒ４＝Ｍｅであり、Ｙ＝Ｎ(ＣＨ２ＣＨ２ＯＭｅ)ＣＨ２であり、Ｄ＝タラゾパリブおよびｙ＝４)のコンジュゲートを得ることができる。
【0114】
平均分子量１０～４０ｋＤａの種々のＰＥＧ－スクシンイミジルエステルが販売されており、上記方法における使用に適している。これらは、一般式：Ｗ－{[ＣＨ２ＣＨ２Ｏ]ｑ(ＣＨ２)ｒＣＯＯＳｕ}ｙ(式中、Ｗが、コア基またはエンドキャップ基であり、ｑ＝上述した通りのＰＥＧ鎖当たりのエチレンオキシドモノマー数であり、ｒ＝１～６であり、ｙ＝１～８である)である。典型的なＷコア基としては、ペンタエリスリトール(ｙ＝４)、ヘキサグリセロール(ｙ＝８)、トリペンタエリスリトール(ｙ＝８)、ジペンタエリスリトール(ｙ＝６)、ソルビトール(ｙ＝６)、グリセロール(ｙ＝３)ならびに別のポリオール(複数のＰＥＧ鎖を、中心に結合する働きをするもの)が挙げられる。特定の実施形態において、Ｗはペンタエリスリトールであり、ｙ＝４である。典型的なエンドキャップ基Ｗには、(Ｃ１－Ｃ６)アルコキシ基および炭水化物基が挙げられる。ｙ＝２の場合に、ＰＥＧは、式(ＳｕＯＯＣ)(ＣＨ２)ｒＯ[ＣＨ２ＣＨ２Ｏ]ｑ(ＣＨ２)ｒＣＯＯＳｕを有する。
【0115】
Ｚ＊＝カルバメートであるコンジュゲートは、ＰＥＧ－(スクシンイミジルエステル)を活性化ＰＥＧ－炭酸塩(例えば、ＰＥＧ－(ニトロフェニル炭酸塩))に置換することにより製造することができる。Ｚ＊＝尿素であるコンジュゲートは、ＰＥＧ－(スクシンイミジルエステル)を、ＰＥＧ－イソシアネートに置き換えることによって製造することができる。
【0116】
実施例１３
Ｍが不溶性高分子担体であるコンジュゲートの製造
β脱離により分解する架橋を含むハイドロゲル担体の製造および注射用マイクロスフィアとしての製造は、例えば、米国特許９,６４９,３８５号、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１９／１５２６７２およびヘニスらのエンジニアリングレポート(２０２０年４月７日)ｅ１２２１３において既に説明されている。これらの不溶性高分子担体は、以下のように公知の方法に従って、ＤＮＡ損傷応答阻害剤のコンジュゲートの製造に使用することができる。一実施形態では、非反応性有機溶媒、例えばアセトニトリルに懸濁した遊離アミノ基を含むハイドロゲルマイクロスフィアの無菌懸濁液を、アミノ基に活性化基Ｚ'を結合させる薬剤を用いて処理する。活性化担体Ｍ－Ｚ'を溶媒で洗浄して、過剰量の試薬および副産物を除去した後、式(ＩＩ)のリンカー－薬剤を、リンカー薬剤上の官能基Ｚと、活性化担体上のＺ'との反応をもたらすのに必要な別の試薬とともに加えて、式(Ｉ)のコンジュゲートを形成させる(式中、Ｍは、不溶性高分子担体であり、ｙは、Ｍ上のＬ－Ｄの濃度を表す数字である)。
Ｍが不溶性高分子担体であるコンジュゲートの製造
β脱離により分解する架橋を含むハイドロゲル担体の製造および注射用マイクロスフィアとしての製造は、例えば、米国特許９,６４９,３８５号、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１９／１５２６７２およびヘニスらのエンジニアリングレポート(２０２０年４月７日)ｅ１２２１３において既に説明されている。これらの不溶性高分子担体は、以下のように公知の方法に従って、ＤＮＡ損傷応答阻害剤のコンジュゲートの製造に使用することができる。一実施形態では、非反応性有機溶媒、例えばアセトニトリルに懸濁した遊離アミノ基を含むハイドロゲルマイクロスフィアの無菌懸濁液を、アミノ基に活性化基Ｚ'を結合させる薬剤を用いて処理する。活性化担体Ｍ－Ｚ'を溶媒で洗浄して、過剰量の試薬および副産物を除去した後、式(ＩＩ)のリンカー－薬剤を、リンカー薬剤上の官能基Ｚと、活性化担体上のＺ'との反応をもたらすのに必要な別の試薬とともに加えて、式(Ｉ)のコンジュゲートを形成させる(式中、Ｍは、不溶性高分子担体であり、ｙは、Ｍ上のＬ－Ｄの濃度を表す数字である)。
【0117】
ヘニスら(２０２０)の手順に従って、アセトニトリル中のハイドロゲルマイクロスフィアの滅菌懸濁液を、シクロオクチン試薬である５－ヒドロキシシクロオクチンスクシンイミジルカーボネートおよびトリエチルアミン(４モル等量)の過剰量(ハイドロゲルアミンに対して１.５モル等量)と反応させる。周囲温度で１４時間撹拌した後、懸濁液を排出し、活性化マイクロスフィア：Ｍ－(Ｚ')ｙ(Ｚ'＝シクロオクチン)を洗浄して、過剰量の試薬および副生成物を除去する。未反応のアミノ基は、無水酢酸で処理することによりキャッピングされる。次に、実施例１のアジド－リンカー－薬剤の１.２等量(対応するシクロオクチン基)を、反応容器に加えて、その後、反応容器を３７℃に９０時間加熱してコンジュゲートの反応を完了させる。得られたコンジュゲート：Ｍ－(Ｚ＊－Ｌ－Ｄ)ｙを洗浄して、未反応試薬および副生成物を除去し、適宜投与に適した製剤用緩衝液に交換する。
【0118】
本明細書において引用された文書は、参照により本明細書に組み込まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【国際調査報告】