特表 2022-546515 心血管リスク／イベントの予測及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-11-04

(54)【発明の名称】心血管リスク／イベントの予測及びその使用

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/68 20060101AFI20221027BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20221027BHJP

   G01N 33/573 20060101ALI20221027BHJP

   C12N 15/115 20100101ALN20221027BHJP

【ＦＩ】

G01N33/68

G01N33/53 D

G01N33/53 P

G01N33/53 B

G01N33/573 A

C12N15/115 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022513923

(86)(22)【出願日】2020-09-02

(85)【翻訳文提出日】2022-03-01

(86)【国際出願番号】 US2020048981

(87)【国際公開番号】W WO2021046074

(87)【国際公開日】2021-03-11

(31)【優先権主張番号】62/895,383

(32)【優先日】2019-09-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＵＮＩＸ

２．Ｌｉｎｕｘ

(71)【出願人】

【識別番号】505373306

【氏名又は名称】ソマロジック オペレーティング カンパニー インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ヒンターベルグ マイケル

(72)【発明者】

【氏名】ダッタ ガーギ

【テーマコード（参考）】

2G045

【Ｆターム（参考）】

2G045AA25

2G045CA25

2G045CA26

2G045CB03

2G045DA30

2G045DA36

2G045DA54

(57)【要約】

４年間にわたる一次または二次心血管（ＣＶ）イベントを発症するリスクを予測するために、個体を評価するために使用されるバイオマーカー、方法、装置、試薬、システム、及びキットが提供される。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象を心血管（ＣＶ）イベントのリスクについてスクリーニングするための方法であって、
（ａ）Ｎ末端プロＢＮＰ、ｓＴＲＥＭ－１、ＭＭＰ－１２、アンチトロンビンＩＩＩ、ＧＰＲ５６、ゲルゾリン、ＳＴ４Ｓ６、ＣＨＳＴＣ、ＦＳＨ、ＩＬ－１ ｓＲＩＩ、ＰＬＸＢ２、ＳＡＰ、及びＴＦＰＩから選択されるＮ種のタンパク質バイオマーカーを含むバイオマーカーパネルを形成することであって、Ｎが３～１３の整数である、前記形成することと、
（ｂ）前記パネルの前記Ｎ種のバイオマーカーの各々の前記対象由来の試料におけるレベルを検出することと、を含む、前記方法。

【請求項2】

対象を心血管（ＣＶ）イベントのリスクについてスクリーニングするための方法であって、
（ａ）ＢＮＰ、ｓＴＲＥＭ－１、ＭＭＰ－１２、ＳＶＥＰ１、ＡＲＬ１１、ＡＮＴＲ２、ＣＡ１２５、ＧＯＬＭ１、ＰＰＲ１Ａ、ＥＲＢＢ３、ｓｕＰＡＲ、ＧＤＦ－１１／８、ＪＡＭ－Ｂ、ＡＴＳ１３、スポンジン－１、ＮＣＡＭ－１２０、ＴＦＦ３、ＳＩＲＴ２、ＡＮＰ、ＮＥＬＬ１、ＬＲＰ１１、ＮＤＳＴ１、ＰＴＰＲＪ、ＣＩＬＰ２、ＣＡ２Ｄ３、ＩＴＩ重鎖Ｈ２、及びＩＧＤＣ４から選択されるＮ種のタンパク質バイオマーカーを含むバイオマーカーパネルを形成することであって、Ｎが８～２７の整数である、前記形成することと、
（ｂ）前記パネルの前記Ｎ種のバイオマーカーの各々の前記対象由来の試料におけるレベルを検出することと、を含む、前記方法。

【請求項3】

対象がＣＶイベントを起こす可能性を予測するための方法であって、
（ａ）ＢＮＰ、ｓＴＲＥＭ－１、ＭＭＰ－１２、アンチトロンビンＩＩＩ、ＧＰＲ５６、ゲルゾリン、ＳＴ４Ｓ６、ＣＨＳＴＣ、ＦＳＨ、ＩＬ－１ ｓＲＩＩ、ＰＬＸＢ２、ＳＡＰ、及びＴＦＰＩから選択されるＮ種のタンパク質バイオマーカーを含むバイオマーカーパネルを形成することであって、Ｎが３～１３の整数である、前記形成することと、
（ｂ）前記パネルの前記Ｎ種のバイオマーカーの各々の前記対象由来の試料におけるレベルを検出することと、を含む、前記方法。

【請求項4】

対象がＣＶイベントを起こす可能性を予測するための方法であって、
（ａ）ＢＮＰ、ｓＴＲＥＭ－１、ＭＭＰ－１２、ＳＶＥＰ１、ＡＲＬ１１、ＡＮＴＲ２、ＣＡ１２５、ＧＯＬＭ１、ＰＰＲ１Ａ、ＥＲＢＢ３、ｓｕＰＡＲ、ＧＤＦ－１１／８、ＪＡＭ－Ｂ、ＡＴＳ１３、スポンジン－１、ＮＣＡＭ－１２０、ＴＦＦ３、ＳＩＲＴ２、ＡＮＰ、ＮＥＬＬ１、ＬＲＰ１１、ＮＤＳＴ１、ＰＴＰＲＪ、ＣＩＬＰ２、ＣＡ２Ｄ３、ＩＴＩ重鎖Ｈ２、及びＩＧＤＣ４から選択されるＮ種のタンパク質バイオマーカーを含むバイオマーカーパネルを形成することであって、Ｎが８～２７の整数である、前記形成することと、
（ｂ）前記パネルの前記Ｎ種のバイオマーカーの各々の前記対象由来の試料におけるレベルを検出することと、を含む、前記方法。

【請求項5】

Ｎが、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、または１３である、請求項１または３に記載の方法。

【請求項6】

Ｎが、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、または２７である、請求項２または４に記載の方法。

【請求項7】

１組のバイオマーカーのうちの少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１１種、少なくとも１２種、または少なくとも１３種のバイオマーカーのレベルの各々が、それぞれのバイオマーカーの対照レベルと比較して異常である場合、４年以内に前記対象がＣＶイベントを起こすリスクまたは可能性が高い、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

前記ＣＶイベントが、心筋梗塞、脳卒中、一過性脳虚血発作、心不全による入院、または死亡である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記対象が冠状動脈疾患を有する、請求項２、４、または６～８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

前記対象がＣＶイベントの病歴を有さない、請求項１、３、５、７、または８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

前記対象が、少なくとも１つのＣＶイベントを起こしている、請求項２、４、または６～９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

前記試料が、血液試料、血清試料、血漿試料及び、尿試料から選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

前記試料が血液試料である、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記方法がインビトロで実行される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項15】

前記方法が、前記対象由来の前記試料のバイオマーカーを１組の捕捉試薬と接触させることを含み、前記１組の捕捉試薬の各捕捉試薬が、検出される異なるバイオマーカーに特異的に結合する、請求項１、３、５、７、８、１０、または１２～１４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項16】

前記方法が、前記対象由来の前記試料のバイオマーカーを１組の捕捉試薬と接触させることを含み、前記１組の捕捉試薬の各捕捉試薬が、検出される異なるバイオマーカーに特異的に結合する、請求項２、４、６～９、または１１～１４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項17】

各捕捉試薬が抗体またはアプタマーである、請求項１５または１６に記載の方法。

【請求項18】

各バイオマーカー捕捉試薬がアプタマーである、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

少なくとも１種のアプタマーが遅い解離速度のアプタマーである、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

少なくとも１種の遅い解離速度のアプタマーが、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０の修飾を有するヌクレオチドを含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

各遅い解離速度のアプタマーが、≧３０分、≧６０分、≧９０分、≧１２０分、≧１５０分、≧１８０分、≧２１０分、または≧２４０分の解離速度（ｔ_１／２）でその標的タンパク質に結合する、請求項１９または請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

１種の捕捉試薬がｓＴＲＥＭ１に特異的に結合する、請求項１５～２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項23】

１種の捕捉試薬がＭＭＰ－１２に特異的に結合する、請求項１５～２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項24】

１種の捕捉試薬がＮ末端プロＢＮＰに特異的に結合する、請求項１５または１７～２３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項25】

１種の捕捉試薬がアンチトロンビンＩＩＩに特異的に結合する、請求項１５または１７～２４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項26】

１種の捕捉試薬がＧＰＲ５６に特異的に結合する、請求項１５または１７～２５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項27】

１種の捕捉試薬がゲルゾリンに特異的に結合する、請求項１５または１７～２６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項28】

１種の捕捉試薬がＳＴ４Ｓ６に特異的に結合する、請求項１５または１７～２７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項29】

１種の捕捉試薬がＣＨＳＴＣに特異的に結合する、請求項１５または１７～２８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項30】

１種の捕捉試薬がＦＳＨに特異的に結合する、請求項１５または１７～２９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項31】

１種の捕捉試薬がＩＬ－１ ｓＲＩＩに特異的に結合する、請求項１５または１７～３０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項32】

１種の捕捉試薬がＰＬＸＢ２に特異的に結合する、請求項１５または１７～３１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項33】

１種の捕捉試薬がＳＡＰに特異的に結合する、請求項１５または１７～３２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項34】

１種の捕捉試薬がＴＦＰＩに特異的に結合する、請求項１５または１７～３３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項35】

前記１組のバイオマーカーが少なくとも１３種のバイオマーカーを含む、請求項１～３４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項36】

前記１組のバイオマーカーが１３種のバイオマーカーからなる、請求項１～３４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項37】

１種の捕捉試薬がＳＶＥＰ１に特異的に結合する、請求項１６～２３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項38】

１種の捕捉試薬がＡＲＬ１１に特異的に結合する、請求項１６～２３または３７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項39】

１種の捕捉試薬がＡＮＴＲ２に特異的に結合する、請求項１６～２３、３７、または３８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項40】

１種の捕捉試薬がＣＡ１２５に特異的に結合する、請求項１６～２３または３７～３９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項41】

１種の捕捉試薬がＧＯＬＭ１に特異的に結合する、請求項１６～２３または３７～４０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項42】

１種の捕捉試薬がＰＰＲ１Ａに特異的に結合する、請求項１６～２３または３７～４１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項43】

１種の捕捉試薬がＥＲＢＢ３に特異的に結合する、請求項１６～２３または３７～４２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項44】

１種の捕捉試薬がｓｕＰＡＲに特異的に結合する、請求項１６～２３または３７～４３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項45】

１種の捕捉試薬がＧＤＦ－１１／８に特異的に結合する、請求項１６～２３または３７～４４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項46】

１種の捕捉試薬がＪＡＭ－Ｂに特異的に結合する、請求項１６～２３または３７～４５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項47】

１種の捕捉試薬がＡＴＳ１３に特異的に結合する、請求項１６～２３または３７～４６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項48】

１種の捕捉試薬がスポンジン－１に特異的に結合する、請求項１６～２３または３７～４７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項49】

１種の捕捉試薬がＮＣＡＭ－１２０に特異的に結合する、請求項１６～２３または３７～４８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項50】

１種の捕捉試薬がＴＦＦ３に特異的に結合する、請求項１６～２３または３７～４９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項51】

１種の捕捉試薬がＳＩＲＴ２に特異的に結合する、請求項１６～２３または３７～５０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項52】

１種の捕捉試薬がＡＮＰに特異的に結合する、請求項１６～２３または３７～５１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項53】

１種の捕捉試薬がＮＥＬＬ１に特異的に結合する、請求項１６～２３または３７～５２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項54】

１種の捕捉試薬がＬＲＰ１１に特異的に結合する、請求項１６～２３または３７～５３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項55】

１種の捕捉試薬がＮＤＳＴ１に特異的に結合する、請求項１６～２３または３７～５４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項56】

１種の捕捉試薬がＰＴＰＲＪに特異的に結合する、請求項１６～２３または３７～５５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項57】

１種の捕捉試薬がＣＩＬＰ２に特異的に結合する、請求項１６～２３または３７～５６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項58】

１種の捕捉試薬がＣＡ２Ｄ３を特異的に結合する、請求項１６～２３または３７～５７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項59】

１種の捕捉試薬がＩＴＩ重鎖Ｈ２に特異的に結合する、請求項１６～２３または３７～５８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項60】

１種の捕捉試薬がＩＧＤＣ４に特異的に結合する、請求項１６～２３または３７～５９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項61】

１種の捕捉試薬がＢＮＰに特異的に結合する、請求項１６～２３または３７～６０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項62】

前記１組のバイオマーカーが少なくとも２７種のバイオマーカーを含む、請求項２、４、６～９、１１～１４、１６～２３、または３７～６１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項63】

前記１組のバイオマーカーが２７種のバイオマーカーからなる、請求項２、４、６～９、１１～１４、１６～２３または３７～６１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項64】

前記対象が明らかに安定した心血管疾患を有する、請求項２、４、６～９、１１～１４、１６～２３、または３７～６３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項65】

前記明らかに安定した心血管疾患が、心筋梗塞の病歴、脳卒中の病歴、心不全の病歴、血行再建の病歴、ストレステスト異常、冠動脈性心疾患を示唆するイメージング、または冠動脈カルシウムスコア異常を含む、請求項６４に記載の方法。

【請求項66】

前記心筋梗塞または前記脳卒中が、前記対象から前記試料が採取された日付の少なくとも６ヵ月前に発生した、請求項６５に記載の方法。

【請求項67】

前記ストレステスト異常がトレッドミル試験または核医学ベースの試験である、請求項６５に記載の方法。

【請求項68】

前記冠動脈性心疾患を示唆するイメージングが、５０％以上の冠状動脈狭窄を示す血管造影図である、請求項６５に記載の方法。

【請求項69】

前記対象が少なくとも４０歳である、請求項１～６８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項70】

前記対象から前記試料が採取された日付から４年以内に前記対象が心血管イベントを起こすリスクまたは可能性を決定することを含む、請求項１～６９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項71】

前記対象が前記心血管イベントを起こすリスクまたは可能性が、前記対象から前記試料が採取された日付から１、２、３、または４年以内のものである、請求項７０に記載の方法。

【請求項72】

前記心血管イベントが、心筋梗塞、脳卒中、一過性脳虚血発作、心不全による入院、または心血管疾患による死亡である、請求項７０または７１に記載の方法。

【請求項73】

前記リスクが定量的確率として決定される、請求項７０～７２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項74】

前記リスクがリスクの定性的レベルとして決定される、請求項７０～７２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項75】

前記リスクの定性的レベルが、低い、中間、または高いである、請求項７４に記載の方法。

【請求項76】

ＣＶイベントのリスクまたは可能性が、バイオマーカーレベルと、
ａ）心筋梗塞の既往、１本以上の冠血管における５０％超の狭窄の血管造影による証拠、トレッドミもしくは核医学試験による運動誘発性虚血、または冠血行再建の既往からなる群から選択される心血管系リスク因子の存在に相当する情報、
ｂ）前記対象の身体的な記述子に相当する情報、
ｃ）前記対象の体重変化に相当する情報、
ｄ）前記対象の民族性に相当する情報、
ｅ）前記対象の性別に相当する情報、
ｆ）前記対象の喫煙歴に相当する情報、
ｇ）前記対象の飲酒歴に相当する情報、
ｈ）前記対象の職業歴に相当する情報、
ｉ）前記対象の心血管疾患またはその他の循環器系状態の家族歴に相当する情報、
ｊ）前記対象または前記対象の家族におけるより心血管疾患のより高いリスクと関連する少なくとも１種の遺伝子マーカーの前記対象における存在または非存在に相当する情報、
ｋ）前記対象の臨床症状に相当する情報、
ｌ）その他の臨床検査に相当する情報、
ｍ）前記対象の遺伝子発現値に相当する情報、ならびに
ｎ）前記対象の既知の心血管系リスク因子、例えば、高飽和脂肪食、高塩分食、高コレステロール食の摂取に相当する情報、
ｏ）心電図、心エコー検査、内膜中膜複合体厚の頚動脈超音波診断、血流依存性血管拡張反応検査、脈波伝播速度、足関節上腕血圧比、ストレス心エコー検査、心筋血流イメージング、ＣＴによる冠動脈カルシウム検査、高分解能ＣＴ血管造影法、ＭＲＩイメージング、及び他のイメージング手法からなる群から選択される技術により得られた前記対象のイメージング結果に相当する情報、
ｐ）前記対象の薬物治療に関する情報、
ｑ）前記対象の年齢に相当する情報、ならびに
ｒ）前記対象の腎機能に関する情報から選択される追加の生物医学的情報のうちの少なくとも１つの項目と、に基づく、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項77】

前記追加の生物医学的情報のうちの少なくとも１つの項目が、前記対象の年齢に相当する情報である、請求項７６に記載の方法。

【請求項78】

前記方法が、医療保険料または生命保険料を決定するために前記ＣＶイベントのリスクまたは可能性を決定することを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項79】

前記方法が、医療保険または生命保険の補償範囲または保険料を決定することを更に含む、請求項７８に記載の方法。

【請求項80】

前記方法が、医療資源の利用を予測及び／または管理するために、前記方法により得られた情報を使用することを更に含む、請求項１～７９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項81】

前記方法が、医療事業、病院、または企業を取得または購入するという決定を可能にするために、前記方法により得られた情報を使用することを更に含む、請求項１～８０のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年９月３日に出願の米国仮出願第６２／８９５，３８３号の優先権の利益を主張し、これは、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本出願は、一般に、バイオマーカーの検出及び個体における将来の心血管イベントのリスクを評価する方法、ならびにより具体的には、４年間にわたる一次または二次心血管（ＣＶ）イベントを発症するリスクの予測について個体を評価するために使用される１つ以上のバイオマーカー、方法、装置、試薬、システム、及びキットに関する。かかるイベントとしては、限定されるものではないが、心筋梗塞、脳卒中、一過性脳虚血発作 、心不全による入院、及び死亡が挙げられる。

【背景技術】

【0003】

米国における主な死亡原因は、心血管疾患である。一次イベント（Ｄ’Ａｇｏｓｔｉｎｏ，Ｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｅｎｅｒａｌ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｉｓｋ Ｐｒｏｆｉｌｅ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃａｒｅ： Ｔｈｅ Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ Ｈｅａｒｔ Ｓｔｕｄｙ” Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １１７：７４３－５３（２００８）；及びＲｉｄｋｅｒ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｇｌｏｂａｌ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｉｓｋ ｉｎ Ｗｏｍｅｎ” ＪＡＭＡ ２９７（６）：６１１－６１９（２００７））及び二次イベント（Ｓｈｌｉｐａｋ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．“Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｔｏ Ｐｒｅｄｉｃｔ Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｔｈｅ Ｈｅａｒｔ ＆ Ｓｏｕｌ Ｓｔｕｄｙ” Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．１２１：５０－５７（２００８））のリスクの既に存在し、かつ重要な多数の予測因子が存在し、これらは臨床診療及び治療試験において広く使用されている。残念なことに、受信者動作特性曲線、ハザード比、及びコンコーダンスは、既存のリスク因子及びバイオマーカーの性能があまり高くないことを示す（約０．７５のＡＵＣは、これらの因子がコイントスと完全なものとの間の中間程度でしかないことを意味する）。診断性能の改善の必要性に加えて、短期かつ個人における有益な（及び有害な）介入及び生活様式の変化に自分自身で対応するリスク商品が必要とされている。広く利用されているフラミンガム方程式は、３つの主要な問題を有する。第１に、長期的すぎることである。フラミンガム方程式は、１０年のリスク計算を提供するが、人は将来的なリスクを軽視し、それに基づいて行動及び生活様式を変化させることを嫌う。第２に、介入にあまり応答しないことである。フラミンガム方程式は、減少し得ない暦年齢及び変更することが不可能な性別に非常に大きく依存する。第３に、ここで想定される高リスク集団において、フラミンガム因子は、高リスクと低リスクをうまく区別できないことである。高い四分位数と低い四分位数とのハザード比は、わずか２であり、対象をより細かい層（例えば、十分位数）に層別化することによりリスクを個別化するために、フラミンガムスコアを使用するよう試みる場合、観察されるイベント発生率は、十分位数の多くで同程度である。

【0004】

心血管疾患のリスク因子は、治療の強度及び性質を向上させるために広く使用されており、これらの使用は、過去２０年にわたり観察された心血管疾患の罹患率及び死亡率の低減に貢献してきたことは間違いない。これらの因子は定型的にアルゴリズムに組み込まれてきたが、残念ながら、それらは全てのリスクを捕捉するわけではない（心疾患の最も一般的な最初の発現は、依然として死亡である）。実際には、恐らくそれらは、リスクの半分を捕捉するにすぎない。かかるリスク因子の一次予防におけるＲＯＣ曲線下面積は、通常、約０．７６であり、二次予防においてははるかに悪い性能（通常は０．６２）であり、０．５のコイントスと１．０の完全なものとの間の性能の約１／４～１／２の数値にすぎない。

【0005】

更に、３２０９人でのフラミンガム研究（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｉｒｓｔ Ｍａｊｏｒ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｖｅｎｔｓ ａｎｄ Ｄｅａｔｈ” Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５５：２６３１－２６３７（２００６））において、１０種のバイオマーカーの追加（ＣＲＰ、ＢＮＰ、ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ、アルドステロン、レニン、フィブリノゲン、Ｄダイマー、プラスミノーゲン活性化抑制因子１、ホモシステイン、及び尿アルブミン対クレアチニン比）は、既存のリスク因子に追加される場合、ＡＵＣをそれほど改善しなかった。０～５年までのイベントのＡＵＣは、年齢、性別、及び従来のリスク因子を用いた場合は０．７６であり、この組み合わせに最良の組み合わせのバイオマーカーを追加した場合は０．７７であり、二次予防については、状況はより悪化する。

【0006】

高いリスクを有する個体により積極的な処置を行うことで結果が改善し得るため、１～５年の期間内に心血管イベントのより高リスクを有する患者を早期に同定することは重要である。従って、より高いリスクを有するとみなされる患者における心血管イベントのリスクを低減するための最適な管理には、積極的な介入が必要とされる一方で、心血管イベントのリスクがより低い患者は、患者に有益な効果をもたらさない可能性がある、高価かつ潜在的に侵襲的な処置を免れ得る。

【0007】

所定期間内に特定の病的状態または疾患状態に罹患するリスクを予測するためのバイオマーカーの選択は、最初に、特定の医療用途について、イベントの確率及び／またはタイミングとの測定可能かつ統計的に有意な関係を有するマーカーを同定することを伴う。バイオマーカーとしては、関心対象の状態に至る因果経路で、または疾患もしくは状態の発症もしくは進行に対して下流でもしくは並行してのいずれかで、あるいはこれらの両方で分泌または排出された分子が挙げられ得る。それらは、心血管イベントの素因になる生物学的プロセスに応答して、心血管組織または他の器官、ならびに周囲組織及び循環細胞から血流に放出されるか、またはそれらは、腎機能の低下などの病態生理の下流作用を反映するものであり得る。バイオマーカーとしては、低分子、ペプチド、タンパク質、及び核酸が挙げられ得る。バイオマーカーの同定に影響を及ぼす重要な問題の幾つかとしては、利用可能なデータの過剰適合及びデータのバイアスが挙げられる。

【0008】

バイオマーカーを同定し、疾患または状態に罹患するリスクを診断または予測する試みにおいて、種々な方法が利用されてきた。タンパク質に基づくのマーカーでは、これらの方法としては、二次元電気泳動、質量分析法、及びイムノアッセイ法が挙げられる。核酸マーカーでは、これらの方法としては、ｍＲＮＡ発現プロファイル、マイクロＲＮＡプロファイル、ＦＩＳＨ、遺伝子発現連鎖解析（ＳＡＧＥ）、大規模遺伝子発現アレイ、遺伝子配列決定、及び遺伝子型判定（ＳＮＰまたは小バリアント（ｓｍａｌｌ ｖａｒｉａｎｔ）解析）が挙げられる。

【0009】

二次元電気泳動の有用性は、低い検出感度；タンパク質の溶解性、電荷、及び疎水性に関する問題；ゲルの再現性；及び単一のスポットが複数のタンパク質を示す可能性により制限される。質量分析について中心となる制限事項は、使用されるフォーマットに応じて、試料の処理及び分離、低存在量のタンパク質に対する感度、シグナル対ノイズ比の考慮、ならびに検出されたタンパク質を直ちに同定できないことである。バイオマーカー発見へのイムノアッセイによるアプローチにおける制限事項は、多数の分析物を測定するための抗体ベースのマルチプレックスアッセイができないことが中心となる。単純に、高品質の抗体のアレイを作成し、サンドイッチすることなく、それらの抗体に結合した分析物を測定する者もいるかもしれない（これは、形式的には、生物または細胞中の全てのＤＮＡまたはＲＮＡ配列をハイブリダイゼーションにより測定するために、ゲノム全体の核酸配列を使用することに等しいであろう。ハイブリダイゼーション実験は、ハイブリダイゼーションが同一性についてストリンジェントな試験であり得るため、効果がある）。しかしながら、非常に良好な抗体であっても、血液または更には細胞抽出物の文脈においては、通常、それらの結合パートナーの選択において、機能するのに十分なストリンジェンシーを有するものではない。なぜならば、それらのマトリックス中のタンパク質集団は、存在量が幅広く異なり、このことが、不良なシグナル対ノイズ比をもたらし得るためである。従って、バイオマーカー発見へのイムノアッセイベースのアプローチに関しては、異なるアプローチを使用せねばならず、すなわち、多数の分析物を同時に測定して、どの分析物が本当のバイオマーカーであるかを決定するために十分なストリンジェンシーを得るために、多重化ＥＬＩＳＡアッセイ（すなわち、サンドイッチ）を使用する必要があるだろう。サンドイッチイムノアッセイは、高含有量スケールにすることができず、従って、標準的なアレイフォーマットを使用して、ストリンジェントなサンドイッチイムノアッセイを使用するバイオマーカーの発見は不可能である。最後に、抗体試薬は、大きなロット間変動及び試薬の不安定性の影響を被る。タンパク質バイオマーカー発見のための本発明のプラットフォームは、この問題を克服する。

【0010】

これらの方法の多くは、解析前の幾つかの種類の試料分画に依存するか、またはそれを必要とする。従って、一連の規定された試料集団における統計的に関連のあるバイオマーカーを同定及び発見するように設計された、十分に検出力のある研究を行うために必要とされる試料調製は極めて困難であり、高コストであり、時間がかかる。分画の間に、広範囲の変動が様々な試料にもたらされ得る。例えば、マーカー候補が処理に対して不安定であり得、マーカーの濃度が変化し得、不適切な凝集または解離が発生し得、不注意による試料汚染が発生し得、これらにより、疾患初期で予測される微妙な変化が不明瞭になる。

【0011】

これらの技術を使用するバイオマーカーの発見及び検出方法は、診断または予測バイオマーカーの同定に対して深刻な制限を有することが広く認められている。これらの制限としては、低存在量のバイオマーカーを検出できないこと、プロテオームの動的範囲全体を一貫して網羅できないこと、試料処理及び分画における非再現性、ならびにこの方法の全体的な非再現性及び頑健性の欠如が挙げられる。更に、これらの研究のデータにはバイアスが導入されており、標的疾患集団内でバイオマーカーを同定及び検証するのに必要とされる分布及び無作為化の観点から、適切な対照を含む試料集団の複雑性に適切に対処していない。

【0012】

新規のかつ有効なバイオマーカーの発見を目的とする試みが数十年間続けられているが、この試みのほとんどが成功していない。様々な疾患のバイオマーカーは、概していつも、幾つかの疾患プロセスに関する基礎研究をする間の偶発の発見により、大学の研究室で同定されてきた。この発見に基づき、少量の臨床データを用いて、新規なバイオマーカーの同定を示唆する論文が公表された。しかしながら、これらの提唱されたバイオマーカーのほとんどは、本当のまたは有用なバイオマーカーであると確認されていない。その主な原因は、少数の臨床試料での試験では、有効なバイオマーカーが実際に発見されたという弱い統計的証拠を提供するにすぎないためである。すなわち、初期の同定は、統計の基礎的な要素に関して厳密ではなかった。

【0013】

不成功に終わったバイオマーカー発見の試みの歴史に基づいて、疾患及び状態を発症するリスクの診断、予後予測 、または予測のためのバイオマーカーが発見されることは稀であり、発見することは困難であるという一般的理解を更に促進する説が提唱されてきた。二次元ゲルまたは質量分析に基づくバイオマーカーの研究は、これらの考えを支持する。これらのアプローチにより同定された有用なバイオマーカーは極めて少ない。しかしながら、二次元ゲル及び質量分析法が、約１ｎＭ以上の濃度で血液中に存在するタンパク質を測定すること、及びこのタンパク質集団が、おそらく疾患または特定の状態の発症に伴って変化しそうにないということは、通常見過ごされている。本発明のバイオマーカー発見プラットフォーム以外に、非常に低濃度でタンパク質発現レベルを正確に測定することができるプロテオミクスバイオマーカー発見プラットフォームは存在しない。

【0014】

複雑なヒト生物学の生化学的経路について多くのことがわかっている。多数の生化学的経路は、病理において局所的に機能するタンパク質の分泌を結果的にもたらすか、またはそれにより生化学的経路が開始される。例えば、増殖因子が分泌されて、病理において他の細胞の複製を刺激し、その他の因子が、免疫系を回避するために分泌されたりするなどである。これらの分泌されたタンパク質の多数がパラクリン様式で機能するが、幾つかは体内の遠位で作用する。生化学的経路の基礎的知識を有する当業者であれば、多数の病理特異的なタンパク質が、二次元ゲル及び質量分析の検出限界未満の濃度で（更にそれを下回る濃度で）血中に存在するはずであることを理解するであろう。この比較的豊富な数の疾患バイオマーカーの同定に先立って必要なものは、二次元ゲルまたは質量分析法により検出可能な濃度未満の濃度でタンパク質を解析することができるプロテオミクスプラットフォームである。

【0015】

前述したように、心血管イベントは、かかるイベントの傾向が正確に決定され得る場合、積極的な処置により予防され得、かかる介入を、それらを最も必要とする人々に標的化し、及び／またはそれらを最も必要としない人々からは遠ざけることにより、医療資源配分効率が改善され得、同時に費用が低減され得る。更に、患者が心血管イベントの個別化された可能性に関する正確かつ短期的な情報を有する場合、集団に基づく長期的な情報と比べて否定しづらく、生活様式の選択の改善及び利益につながるであろう服薬遵守の改善をもたらすであろう。既存の複数マーカー試験は、個体からの複数試料の回収を必要とするか、または試料が複数のアッセイの間で分割される必要がある。単一の血液、尿、または他の試料及び１回のアッセイのみを必要とする改善された試験が最適である。従って、５年の期間内の心血管イベントの予測を可能にするバイオマーカー、方法、装置、試薬、システム、及びキットの必要性が存在する。

【発明の概要】

【0016】

本出願は、例えば、４年間または他の一定期間内に心血管（ＣＶ）イベントを起こすリスクの予測のためのバイオマーカー、方法、試薬、装置、システム、及びキットを含む。幾つかの実施形態では、ＣＶイベントは、一次ＣＶイベントである。幾つかの実施形態では、ＣＶイベントは、二次ＣＶイベントである。

【0017】

心血管疾患には、複数の生物学的プロセス及び組織が関与する。心血管疾患に関連する生物学的系及びプロセスの例は、炎症、血栓症、疾患関連血管新生、血小板活性化、マクロファージ活性化、肝臓の急性期反応、細胞外基質リモデリング、及び腎機能である。これらのプロセスは、性別、閉経状態、及び年齢に応じて、ならびに凝固及び血管機能の状態に応じて観察され得る。これらの系は、部分的にタンパク質に基づくシグナル伝達系により情報交換し、複数のタンパク質が単一の血液試料において測定され得るため、本発明は、心血管疾患に関与する特定の生物学的系及びプロセスに由来するタンパク質に焦点を置いた、単一試料、単一アッセイによる複数タンパク質ベースの試験を提供する。

【0018】

幾つかの実施形態では、１組のバイオマーカーのレベルを検知する方法が提供される。幾つかの実施形態では、かかる方法は、以下のものである。
実施形態１．対象由来の試料中の１組のバイオマーカータンパク質のレベルを検出する方法であって、
ａ．前記対象由来の試料を１組の捕捉試薬と接触させることであって、各捕捉試薬が異なるバイオマーカータンパク質に特異的に結合し、１種の捕捉試薬がｓＴＲＥＭ１に特異的に結合する、前記接触させることと、
ｂ．各捕捉試薬が特異的に結合する前記バイオマーカータンパク質に結合した前記各捕捉試薬の量を検出することと、を含む、前記方法。

【0019】

実施形態２．１種の捕捉試薬がＭＭＰ－１２に特異的に結合する、実施形態１に記載の方法。

【0020】

実施形態３．１種の捕捉試薬がＮ末端プロＢＮＰに特異的に結合する、実施形態１または２に記載の方法。

【0021】

実施形態４．１種の捕捉試薬がアンチトロンビンＩＩＩに特異的に結合する、実施形態１～３のいずれか１項に記載の方法。

【0022】

実施形態５．１種の捕捉試薬がＧＰＲ５６に特異的に結合する、実施形態１～４のいずれか１項に記載の方法。

【0023】

実施形態６．１種の捕捉試薬がゲルゾリンに特異的に結合する、実施形態１～５のいずれか１項に記載の方法。

【0024】

実施形態７．１種の捕捉試薬がＳＴ４Ｓ６に特異的に結合する、実施形態１～６のいずれか１項に記載の方法。

【0025】

実施形態８．１種の捕捉試薬がＣＨＳＴＣに特異的に結合する、実施形態１～７のいずれか１項に記載の方法。

【0026】

実施形態９．１種の捕捉試薬がＦＳＨに特異的に結合する、実施形態１～８のいずれか１項に記載の方法。

【0027】

実施形態１０．１種の捕捉試薬がＩＬ－１ ｓＲＩＩに特異的に結合する、実施形態１～９のいずれか１項に記載の方法。

【0028】

実施形態１１．１種の捕捉試薬がＰＬＸＢ２に特異的に結合する、実施形態１～１０のいずれか１項に記載の方法。

【0029】

実施形態１２．１種の捕捉試薬がＳＡＰに特異的に結合する、実施形態１～１１のいずれか１項に記載の方法。

【0030】

実施形態１３．１種の捕捉試薬がＴＦＰＩに特異的に結合する、実施形態１～１２のいずれか１項に記載の方法。

【0031】

実施形態１４．前記１組のバイオマーカーが、少なくとも３種のバイオマーカーを含む、実施形態１～１３のいずれか１項に記載の方法。

【0032】

実施形態１５．前記１組のバイオマーカーが、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１１種、少なくとも１２種、または少なくとも１３種のバイオマーカーを含む、実施形態１～１３のいずれか１項に記載の方法。

【0033】

実施形態１６．前記１組のバイオマーカーが２～１３種のバイオマーカーからなる、実施形態１～１３のいずれか１項に記載の方法。

【0034】

実施形態１７．前記１組のバイオマーカーが少なくとも１３種のバイオマーカーを含む、実施形態１～１３のいずれか１項に記載の方法。

【0035】

実施形態１８．前記１組のバイオマーカーが１３種のバイオマーカーからなる、実施形態１～１３のいずれか１項に記載の方法。

【0036】

実施形態１９．前記対象が少なくとも４０歳である、実施形態１～１８のいずれか１項に記載の方法。

【0037】

実施形態２０．前記対象が心血管疾患の既往歴を有さない、実施形態１～１９のいずれか１項に記載の方法。

【0038】

実施形態２１．前記対象から前記試料が採取された日付から４年以内に前記対象が一次心血管イベントを起こすリスクを決定することを含む、実施形態１～２０のいずれか１項に記載の方法。

【0039】

実施形態２２．前記対象が一次心血管イベントを起こすリスクが、前記対象から前記試料が採取された日付から１、２、３、または４年以内のものである、実施形態２１に記載の方法。

【0040】

実施形態２３．前記一次心血管イベントが、心筋梗塞、脳卒中、一過性脳虚血発作、心不全による入院、または心血管疾患による死亡である、実施形態２１または２２に記載の方法。

【0041】

実施形態２４．前記リスクが定量的確率として決定される、実施形態２１～２３のいずれか１項に記載の方法。

【0042】

実施形態２５．前記リスクがリスクの定性的レベルとして決定される、実施形態２１～２３のいずれか１項に記載の方法。

【0043】

実施形態２６．前記リスクの定性的レベルが、低い、中間、または高いである、実施形態２５に記載の方法。

【0044】

実施形態２７．１種の捕捉試薬がＳＶＥＰ１に特異的に結合する、実施形態１または２に記載の方法。

【0045】

実施形態２８．１種の捕捉試薬がＡＲＬ１１に特異的に結合する、実施形態１、２、または２７のいずれか１項に記載の方法。

【0046】

実施形態２９．１種の捕捉試薬がＡＮＴＲ２に特異的に結合する、実施形態１、２、２７、または２８のいずれか１項に記載の方法。

【0047】

実施形態３０．１種の捕捉試薬がＣＡ１２５に特異的に結合する、実施形態１、２、または２７～２９のいずれか１項に記載の方法。

【0048】

実施形態３１．１種の捕捉試薬がＧＯＬＭ１に特異的に結合する、実施形態１、２、または２７～３０のいずれか１項に記載の方法。

【0049】

実施形態３２．１種の捕捉試薬がＰＰＲ１Ａに特異的に結合する、実施形態１、２、または２７～３１のいずれか１項に記載の方法。

【0050】

実施形態３３．１種の捕捉試薬がＥＲＢＢ３に特異的に結合する、実施形態１、２、または２７～３２のいずれか１項に記載の方法。

【0051】

実施形態３４．１種の捕捉試薬がｓｕＰＡＲに特異的に結合する、実施形態１、２、または２７～３３のいずれか１項に記載の方法。

【0052】

実施形態３５．１種の捕捉試薬がＧＤＦ－１１／８に特異的に結合する、実施形態１、２、または２７～３４のいずれか１項に記載の方法。

【0053】

実施形態３６．１種の捕捉試薬がＪＡＭ－Ｂに特異的に結合する、実施形態１、２、または２７～３５のいずれか１項に記載の方法。

【0054】

実施形態３７．１種の捕捉試薬がＡＴＳ１３に特異的に結合する、実施形態１、２、または２７～３６のいずれか１項に記載の方法。

【0055】

実施形態３８．１種の捕捉試薬がスポンジン－１に特異的に結合する、実施形態１、２、または２７～３７のいずれか１項に記載の方法。

【0056】

実施形態３９．１種の捕捉試薬がＮＣＡＭ－１２０に特異的に結合する、実施形態１、２、または２７～３８のいずれか１項に記載の方法。

【0057】

実施形態４０．１種の捕捉試薬がＴＦＦ３に特異的に結合する、実施形態１、２、または２７～３９のいずれか１項に記載の方法。

【0058】

実施形態４１．１種の捕捉試薬がＳＩＲＴ２に特異的に結合する、実施形態１、２、または２７～４０のいずれか１項に記載の方法。

【0059】

実施形態４２．１種の捕捉試薬がＡＮＰに特異的に結合する、実施形態１、２、または２７～４１のいずれか１項に記載の方法。

【0060】

実施形態４３．１種の捕捉試薬がＮＥＬＬ１に特異的に結合する、実施形態１、２、または２７～４２のいずれか１項に記載の方法。

【0061】

実施形態４４．１種の捕捉試薬がＬＲＰ１１に特異的に結合する、実施形態１、２、または２７～４３のいずれか１項に記載の方法。

【0062】

実施形態４５．１種の捕捉試薬がＮＤＳＴ１に特異的に結合する、実施形態１、２、または２７～４４のいずれか１項に記載の方法。

【0063】

実施形態４６．１種の捕捉試薬がＰＴＰＲＪに特異的に結合する、実施形態１、２、または２７～４５のいずれか１項に記載の方法。

【0064】

実施形態４７．１種の捕捉試薬がＣＩＬＰ２に特異的に結合する、実施形態１、２、または２７～４６のいずれか１項に記載の方法。

【0065】

実施形態４８．１種の捕捉試薬がＣＡ２Ｄ３に特異的に結合する、実施形態１、２、または２７～４７のいずれか１項に記載の方法。

【0066】

実施形態４９．１種の捕捉試薬がＩＴＩ重鎖Ｈ２に特異的に結合する、実施形態１、２、または２７～４８のいずれか１項に記載の方法。

【0067】

実施形態５０．１種の捕捉試薬がＩＧＤＣ４に特異的に結合する、実施形態１、２、または２７～４９のいずれか１項に記載の方法。

【0068】

実施形態５１．１種の捕捉試薬がＢＮＰに特異的に結合する、実施形態１、２、または２７～５０のいずれか１項に記載の方法。

【0069】

実施形態５２．前記１組のバイオマーカーが少なくとも３種のバイオマーカーを含む、実施形態２７～５１のいずれか１項に記載の方法。

【0070】

実施形態５３．前記１組のバイオマーカーが、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１１種、少なくとも１２種、少なくとも１３種、少なくとも１４種、少なくとも１５種、少なくとも１６種、少なくとも１７種、少なくとも１８種、少なくとも１９種、少なくとも２０種、少なくとも２１種、少なくとも２２種、少なくとも２３種、少なくとも２４種、少なくとも２５種、少なくとも２６種、または少なくとも２７種のバイオマーカーを含む、実施形態１、２、または２７～５１のいずれか１項に記載の方法。

【0071】

実施形態５４．前記１組のバイオマーカーが２～２７種バイオマーカーからなる、実施形態１、２、または２７～５１のいずれか１項に記載の方法。

【0072】

実施形態５５．前記１組のバイオマーカーが少なくとも２７種のバイオマーカーを含む、実施形態１、２、または２７～５１のいずれか１項に記載の方法。

【0073】

実施形態５６．前記１組のバイオマーカーが２７種のバイオマーカーからなる、実施形態１、２、または２７～５１のいずれか１項に記載の方法。

【0074】

実施形態５７．前記対象が少なくとも４０歳である、実施形態２７～５６のいずれか１項に記載の方法。

【0075】

実施形態５８．前記対象が明らかに安定した心血管疾患を有する、実施形態２７～５７のいずれか１項に記載の方法。

【0076】

実施形態５９．前記明らかに安定した心血管疾患が、心筋梗塞の病歴、脳卒中の病歴、心不全の病歴、血行再建の病歴、ストレステスト異常、冠動脈性心疾患を示唆するイメージング、または冠動脈カルシウムスコア異常を含む、実施形態５８に記載の方法。

【0077】

実施形態６０．前記心筋梗塞または前記脳卒中が、前記対象から前記試料が採取された日付の少なくとも６ヵ月前に発生した、実施形態５９に記載の方法。

【0078】

実施形態６１．前記ストレステスト異常がトレッドミル試験または核医学ベースの試験である、実施形態５９に記載の方法。

【0079】

実施形態６２．前記冠動脈性心疾患を示唆するイメージングが、５０％以上の冠状動脈狭窄を示す血管造影図である、実施形態５９に記載の方法。

【0080】

実施形態６３．前記対象から前記試料が採取された日付から４年以内に前記対象が二次心血管イベントを起こすリスクを決定することを含む、実施形態２７～６２のいずれか１項に記載の方法。

【0081】

実施形態６４．前記対象が二次心血管イベントを起こすリスクが、前記対象から前記試料が採取された日付から１、２、３、または４年以内のものである、実施形態６３に記載の方法。

【0082】

実施形態６５．前記二次心血管イベントが、心筋梗塞、脳卒中、一過性脳虚血発作、心不全による入院、または死亡である、実施形態６３または６４に記載の方法。

【0083】

実施形態６６．前記リスクが定量的確率として決定される、実施形態６３～６５のいずれか１項に記載の方法。

【0084】

実施形態６７．前記リスクがリスクの定性的レベルとして決定される、実施形態６３～６５のいずれか１項に記載の方法。

【0085】

実施形態６８．前記リスクの定性的レベルが、低い、中間、または高いである、実施形態６７に記載の方法。

【0086】

幾つかの実施形態では、対象を心血管（ＣＶ）イベントのリスクについてスクリーニングするための方法が提供される。幾つかのかかる実施形態では、方法は、
（ａ） Ｎ末端プロＢＮＰ、ｓＴＲＥＭ－１、ＭＭＰ－１２、アンチトロンビンＩＩＩ、ＧＰＲ５６、ゲルゾリン、ＳＴ４Ｓ６、ＣＨＳＴＣ、ＦＳＨ、ＩＬ－１ ｓＲＩＩ、ＰＬＸＢ２、ＳＡＰ、及びＴＦＰＩから選択されるＮ種のバイオマーカーを含むバイオマーカーパネルを形成することであって、Ｎが３～１３の整数である、当該形成することと、
（ｂ） 当該パネルの当該Ｎ種のバイオマーカーの各々の当該対象由来の試料におけるレベルを検出することと、を含む。

【0087】

幾つかの実施形態では、方法は、
（ａ） ＢＮＰ、ｓＴＲＥＭ－１、ＭＭＰ－１２、ＳＶＥＰ１、ＡＲＬ１１、ＡＮＴＲ２、ＣＡ１２５、ＧＯＬＭ１、ＰＰＲ１Ａ、ＥＲＢＢ３、ｓｕＰＡＲ、ＧＤＦ－１１／８、ＪＡＭ－Ｂ、ＡＴＳ１３、スポンジン－１、ＮＣＡＭ－１２０、ＴＦＦ３、ＳＩＲＴ２、ＡＮＰ、ＮＥＬＬ１、ＬＲＰ１１、ＮＤＳＴ１、ＰＴＰＲＪ、ＣＩＬＰ２、ＣＡ２Ｄ３、ＩＴＩ重鎖Ｈ２、及びＩＧＤＣ４から選択されるＮ種のタンパク質バイオマーカーを含むバイオマーカーパネルを形成することであって、Ｎが８～２７の整数である、当該形成することと、
（ｂ） 当該パネルの当該Ｎ種のバイオマーカーの各々の当該対象由来の試料におけるレベルを検出することと、を含む。

【0088】

幾つかの実施形態では、対象がＣＶイベントを起こす可能性を予測するための方法が提供される。幾つかのかかる実施形態では、方法は、
（ａ） Ｎ末端プロＢＮＰ、ｓＴＲＥＭ－１、ＭＭＰ－１２、アンチトロンビンＩＩＩ、ＧＰＲ５６、ゲルゾリン、ＳＴ４Ｓ６、ＣＨＳＴＣ、ＦＳＨ、ＩＬ－１ ｓＲＩＩ、ＰＬＸＢ２、ＳＡＰ、及びＴＦＰＩから選択されるＮ種のバイオマーカーを含むバイオマーカーパネルを形成することであって、Ｎが３～１３の整数である、当該形成することと、
（ｂ） 当該パネルの当該Ｎ種のバイオマーカーの各々の当該対象由来の試料におけるレベルを検出することと、を含む。

【0089】

幾つかの実施形態では、方法は、
（ａ） ＢＮＰ、ｓＴＲＥＭ－１、ＭＭＰ－１２、ＳＶＥＰ１、ＡＲＬ１１、ＡＮＴＲ２、ＣＡ１２５、ＧＯＬＭ１、ＰＰＲ１Ａ、ＥＲＢＢ３、ｓｕＰＡＲ、ＧＤＦ－１１／８、ＪＡＭ－Ｂ、ＡＴＳ１３、スポンジン－１、ＮＣＡＭ－１２０、ＴＦＦ３、ＳＩＲＴ２、ＡＮＰ、ＮＥＬＬ１、ＬＲＰ１１、ＮＤＳＴ１、ＰＴＰＲＪ、ＣＩＬＰ２、ＣＡ２Ｄ３、ＩＴＩ重鎖Ｈ２、及びＩＧＤＣ４から選択されるＮ種のタンパク質バイオマーカーを含むバイオマーカーパネルを形成することであって、Ｎが８～２７の整数である、当該形成することと、
（ｂ） 当該パネルの当該Ｎ種のバイオマーカーの各々の当該対象由来の試料におけるレベルを検出することと、を含む。

【0090】

幾つかの実施形態では、Ｎ種のバイオマーカーを含むパネルのバイオマーカーのうちの少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１１種、少なくとも１２種、少なくとも１３種、少なくとも１４種、少なくとも１５種、少なくとも１６種、少なくとも１７種、少なくとも１８種、少なくとも１９種、少なくとも２０種、少なくとも２１種、少なくとも２２種、少なくとも２３種、少なくとも２４種、少なくとも２５種、少なくとも２６種、または２７種のレベルを検出することを含む、心血管イベント（ＣＶ）イベントのリスクまたは可能性について対象をスクリーニングするための方法が提供される。

【0091】

幾つかの実施形態では、１組のバイオマーカーのうちの少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１１種、少なくとも１２種、または少なくとも１３種のバイオマーカーのレベルの各々が、それぞれのバイオマーカーの対照レベルと比較して異常である場合、４年以内に対象がＣＶイベントを起こすリスクまたは可能性が高い。

【0092】

幾つかの実施形態では、本方法は、表１における１種以上のバイオマーカーのレベルを検出することを含む。幾つかの実施形態では、本方法は、表２における１種以上のバイオマーカーのレベルを検出することを含む。

【0093】

幾つかの実施形態では、対象は冠状動脈疾患を有する。幾つかの実施形態では、対象は、ＣＶイベントの病歴を有さない。幾つかの実施形態では、対象は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ（ＡＣＣ）のプールコホート方程式（ｐｏｏｌｅｄ ｃｏｈｏｒｔ ｅｑｕａｔｉｏｎ、ＰＣＥ）で高リスクに分類される。Ｇｏｆｆ ＤＣ，Ｊｒ．ｅｔ ａｌ．，“ＡＣＣ／ＡＨＡ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ ｏｎ ｔｈｅ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｉｓｋ：Ａ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ／Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｔａｓｋ Ｆｏｒｃｅ ｏｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ．” Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２０１３を参照のこと。幾つかの実施形態では、対象は、ＰＣＥで中リスクに分類される。幾つかの実施形態では、対象は、ＰＣＥで低リスクに分類される。幾つかの実施形態では、対象は、少なくとも１つのＣＶイベントを起こしている。幾つかの実施形態では、ＣＶイベントは、心筋梗塞、脳卒中、心不全による入院、一過性脳虚血発作、及び死亡から選択される。

【0094】

幾つかの実施形態では、試料は、血液試料、血清試料、血漿試料、及び尿試料から選択される。幾つかの実施形態では、試料は、血漿試料である。幾つかの実施形態では、本方法は、インビトロで実行される。

【0095】

幾つかの実施形態では、各バイオマーカーは、タンパク質バイオマーカーである。幾つかの実施形態では、本方法は、対象由来の試料のバイオマーカーを１組のバイオマーカー捕捉試薬と接触させることを含み、当該１組のバイオマーカー捕捉試薬の各バイオマーカー捕捉試薬は、検出される異なるバイオマーカーに特異的に結合する。幾つかの実施形態では、各バイオマーカー捕捉試薬は、抗体またはアプタマーである。幾つかの実施形態では、各バイオマーカー捕捉試薬は、アプタマーである。幾つかの実施形態では、少なくとも１種のアプタマーは、遅い解離速度のアプタマーである。幾つかの実施形態では、少なくとも１種の遅い解離速度のアプタマーは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０の修飾を有するヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、各遅い解離速度のアプタマーは、≧３０分、≧６０分、≧９０分、≧１２０分、≧１５０分、≧１８０分、≧２１０分、または≧２４０分の解離速度（ｔ_１／２）でその標的タンパク質に結合する。

【0096】

幾つかの実施形態では、ＣＶイベントのリスクまたは可能性は、バイオマーカーレベルと、
ａ）心筋梗塞の既往、１本以上の冠血管における５０％超の狭窄の血管造影による証拠、トレッドミルもしくは核医学試験による運動誘発性虚血、または冠血行再建の既往からなる群から選択される心血管系リスク因子の存在に相当する情報、
ｂ）対象の身体的な記述子に相当する情報、
ｃ）対象の体重変化に相当する情報、
ｄ）対象の民族性に相当する情報、
ｅ）対象の性別に相当する情報、
ｆ）対象の喫煙歴に相当する情報、
ｇ）対象の飲酒歴に相当する情報、
ｈ）対象の職業歴に相当する情報、
ｉ）対象の心血管疾患またはその他の循環器系状態の家族歴に相当する情報、
ｊ）対象または対象の家族におけるより心血管疾患のより高いリスクと関連する少なくとも１種の遺伝子マーカーの対象における存在または非存在に相当する情報、
ｋ）対象の臨床症状に相当する情報、
ｌ）その他の臨床検査に相当する情報、
ｍ）対象の遺伝子発現値に相当する情報、ならびに
ｎ）対象の既知の心血管系リスク因子、例えば、高飽和脂肪食、高塩分食、高コレステロール食の摂取に相当する情報、
ｏ）心電図、心エコー検査、内膜中膜複合体厚の頚動脈超音波診断、血流依存性血管拡張反応検査、脈波伝播速度、足関節上腕血圧比、ストレス心エコー検査、心筋血流イメージング、ＣＴによる冠動脈カルシウム検査、高分解能ＣＴ血管造影法、ＭＲＩイメージング、及び他のイメージング手法からなる群から選択される技術により得られた対象のイメージング結果に相当する情報、
ｐ）対象の薬物治療に関する情報、
ｑ）対象の年齢に相当する情報、ならびに
ｒ）対象の腎機能に関する情報から選択される追加の生物医学的情報のうちの少なくとも１つの項目と、に基づく。

【0097】

幾つかの実施形態では、ＣＶイベントのリスクまたは可能性は、バイオマーカーレベル及び少なくとも対象の年齢に基づく。

【0098】

幾つかの実施形態では、本方法は、医療保険料または生命保険料を決定するためにＣＶイベントのリスクまたは可能性を決定することを含む。幾つかの実施形態では、本方法は、医療保険または生命保険の補償範囲または保険料を決定することを更に含む。幾つかの実施形態では、本方法は、医療資源の利用を予測及び／または管理するために、本方法により得られた情報を使用することを更に含む。幾つかの実施形態では、本方法は、医療事業、病院、または企業を取得または購入するという決定を可能にするために、本方法により得られた情報を使用することを更に含む。

【0099】

幾つかの実施形態では、心血管（ＣＶ）イベントのリスクまたは可能性を評価するためのコンピュータ実施方法が提供される。幾つかの実施形態では、本方法は、コンピュータ上で対象のバイオマーカー情報を検索することであって、当該バイオマーカー情報が、（ａ）当該対象由来の試料における表１から選択される３～１３種のバイオマーカーのレベル、または（ｂ）表２から選択される８～２７種のバイオマーカーのレベルを含む、前記検索すること；当該バイオマーカーの値の各々の分類を当該コンピュータで実行すること；複数の分類に基づいて、当該個体についてＣＶイベントのリスクの評価結果を示すことを含む。幾つかの実施形態では、対象についてＣＶイベントのリスクまたは可能性の評価結果を示すことは、コンピュータディスプレイ上に結果を表示することを含む。

【図面の簡単な説明】

【0100】

【図1】網掛け領域がカプランマイヤー推定値の９５％信頼区間を表す、一次ＣＶＤモデルの４つのリスクビンにより層別化された、ＨＵＮＴ３訓練セットでのカプランマイヤー生存曲線を示す。線は、上から順に、１ｘ（＜０．０２１５）、ｎ＝４６９；２ｘ～３ｘ（＜０．０５０５）、ｎ＝９４４；４ｘ～５ｘ（＜０．０７７）、ｎ＝２８５；６ｘ以上（＞０．０７７）、ｎ＝３１５である。

【図2】網掛け領域がカプランマイヤー推定値の９５％信頼区間を表す、二次ＣＶＤモデルの４つのリスクビンにより層別化された、ＨＵＮＴ３訓練セットでのカプランマイヤー生存曲線を示す。線は、上から順に、＜０．０７５、ｎ＝１１７；＜０．２５、ｎ＝２８５；＞０．５、ｎ＝１２１；＞０．５、ｎ＝８２である。

【図3】網掛け領域がカプランマイヤー推定値の９５％信頼区間を表す、二次ＣＶＤモデルの４つのリスクビンにより層別化された、ＡＲＩＣ研究の５回目来院時検証セットでのカプランマイヤー生存曲線を示す。線は、上から順に、＜０．０７５、ｎ＝３５；＜０．２５、ｎ＝１０３；＜０．５、ｎ＝４３；＞０．５、ｎ＝２７である。

【図4】カットオフ値により層別化されたＨＵＮＴ３有効性検証セットでの生存曲線を示す。線は、上から順に、＜０．０７５、ｎ＝２４；＜０．２５、ｎ＝６１；＜０．５、ｎ＝２５；＞０．５、ｎ＝２９である。

【図5】カットオフ値により層別化されたＡＲＩＣ研究の５回目来院時有効性検証セットでの生存曲線を示す。線は、上から順に、＜０．０７５、ｎ＝１３；＜０．２５、ｎ＝２０２；＜０．５、ｎ＝２７１；＞０．５、ｎ＝３４５である。

【図6】本明細書に記載される様々なコンピュータ実施方法と共に使用するための非限定的な例示的コンピュータシステムを示す。

【図7】生体試料中の１種以上のバイオマーカーを検出するために使用され得る非限定的な例示的なアプタマーアッセイを示す。

【図8A】遅い解離速度のアプタマーなどのアプタマーに組み込まれ得る特定の例示的な修飾ピリミジンを示す。

【図8B】遅い解離速度のアプタマーなどのアプタマーに組み込まれ得る特定の例示的な修飾ピリミジンを示す。

【発明を実施するための形態】

【0101】

本発明は、特定の代表的な実施形態と共に記載されるが、本発明は、特許請求の範囲により定義されるものであり、それらの実施形態に限定されるものではないことが理解されよう。

【0102】

当業者であれば、本発明の実施で使用され得る、本明細書に記載されるものと同様または同等の多くの方法及び材料を認識するであろう。本発明は、記載された方法及び材料に決して限定されない。

【0103】

特に定義しない限り、本明細書において使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解される意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法、装置、及び材料が本発明の実施において使用され得るが、特定の方法、装置、及び材料が本明細書に記載される。

【0104】

本明細書において引用される全ての刊行物、公開特許文献、及び特許出願は、各個別の刊行物、公開特許文献、または特許出願が参照により本明細書に組み込まれていると具体的かつ個々に示されているかのような程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。

【0105】

本明細書で使用する場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、及びそれらのあらゆる変化形は、非排他的な包含を網羅することを意図し、これにより、要素または一連の要素を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）、含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）、または含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）プロセス、方法、プロダクト・バイ・プロセス、または物質の組成物は、明示的に列挙されていない他の要素を含み得る。

【0106】

本出願は、既定期間内、例えば、１年以内、２年以内、３年以内、または４年以内の短期間のＣＶイベントのリスクを予測するためのバイオマーカー、方法、装置、試薬、システム、及びキットを含む。

【0107】

「心血管イベント」または「ＣＶイベント」は、循環器系の任意の部分の障害または機能不全を意味する。一実施形態では、「心血管イベント」は、脳卒中、一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）、心筋梗塞（ＭＩ）、循環器系の機能不全に起因する突然死、及び／または心不全による入院、または最も可能性の高い原因が心血管である集団における原因不明の突然死を意味する。一次ＣＶイベントは、対象により経験される最初のＣＶイベントである。二次ＣＶイベントは、対象により経験される２回目またはそれ以降のＣＶイベントである。

【0108】

心血管イベントとしては、血栓イベント、例えば、ＭＩ、一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）、脳卒中、急性冠症候群、及び冠血行再建の必要性が挙げられ得る。

【0109】

幾つかの実施形態では、４年の期間内の突然死または将来のＣＶイベントのリスクまたは可能性を評価するために、単独または様々な組み合わせのいずれかで使用されるバイオマーカーが提供され、ここで、ＣＶイベントは、心筋梗塞、脳卒中、一過性脳虚血発作、死亡、及び心不全による入院と定義される。後述するように、代表的実施形態は、表１または表２に掲示されるバイオマーカーを含む。

【0110】

記載されるＣＶイベントバイオマーカーのあるものは、それ単独でＣＶイベントのリスクまたは可能性を評価するのに有用であり得るが、複数サブセットのＣＶイベントバイオマーカーをグループ化するための方法も本明細書に記載され、ここで、各グループ化またはサブセット選択は、３種以上のバイオマーカーのパネルとして有用であり、本明細書において「バイオマーカーパネル」及びパネルと互換的に称される。従って、種々の実施形態は、表１のバイオマーカーのうちの少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１１種、少なくとも１２種、または全１３種を含む組み合わせを提供する。他の種々の実施形態は、表２のバイオマーカーのうちの少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１１種、少なくとも１２種、少なくとも１３種、少なくとも１４種、少なくとも１５種、少なくとも１６種、少なくとも１７種、少なくとも１８種、少なくとも１９種、少なくとも２０種、少なくとも２１種、少なくとも２２種、少なくとも２３種、少なくとも２４種、少なくとも２５種、少なくとも２６種、または全２７種を含む組み合わせを提供する。

【0111】

「生体試料」、「試料」、及び「試験試料」は、個体から得られたか、またはそうでなければ個体に由来する任意の物質、生体液、組織、または細胞を意味するように本明細書において互換的に使用される。例としては、血液（例えば、全血、白血球、末梢血単核細胞、バフィーコート、血漿、及び血清が含まれる）、痰、涙液、粘液、鼻腔洗浄液、鼻腔吸引液、尿、唾液、腹腔洗浄液、腹水、嚢胞液、腺液、リンパ液、気管支吸引液、滑液、関節吸引液、器官の分泌物、細胞、細胞抽出物、及び脳脊髄液が挙げられる。例としては、上記の全ての実験用に分離した画分も挙げられる。例えば、血液試料は、血清、血漿、または特定の種類の血液細胞、例えば、赤血球または白赤球（白血球）を含有する画分に分画され得る。幾つかの実施形態では、血液試料は、乾燥血液スポットである。幾つかの実施形態では、血漿試料は、乾燥血漿スポットである。幾つかの実施形態では、試料は、個体由来の試料の組み合わせ、例えば、組織及び液体試料の組み合わせであり得る。用語「生体試料」は、例えば、便試料、組織試料、または組織生検など由来の均質化された固体物質を含有する物質も含む。用語「生体試料」は、組織培養物または細胞培養物由来の物質も含む。生体試料を得るための任意の好適な方法が用いられ得、例示的な方法としては、例えば、静脈切開、綿棒（例えば、口腔スワブ）、及び微細針吸引生検法が挙げられる。微細針吸引が可能な例示的な組織としては、リンパ節、肺、甲状腺、乳房、膵臓、及び肝臓が挙げられる。試料は、例えば、顕微解剖（例えば、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）またはレーザーマイクロダイセクション（ＬＭＤ））、膀胱洗浄、塗抹標本（例えばＰＡＰ塗抹標本）、または乳管洗浄によっても収集され得る。対象から得られたか、または対象に由来する「生体試料」は、当該対象から得られた後に任意の好適な方法で処理された任意のかかる試料も含む。幾つかの実施形態では、生体試料は、血漿試料である。

【0112】

更に、幾つかの実施形態では、生体試料は、多数の対象から生体試料を採取し、それらをプールするか、または各対象の生体試料のアリコートをプールすることにより得られ得る。プールされた試料は、単一の対象由来の試料として本明細書に記載されるように処理され得、例えば、プールされた試料で予後不良が確証される場合、各対象の生体試料が再試験されて、どの対象（複数可）が高いまたは低いＣＶイベントのリスクを有するのかが決定され得る。

【0113】

本明細書の目的において、語句「対象由来の生体試料に帰属するデータ」は、何らかの形態の当該データが、当該対象の対象生体試料から得られたか、またはそれを使用して生成されたことを意味することを意図する。データは、生成された後に、再フォーマットされていてもよく、修正されていてもよく、またはある測定システムでの単位から別の測定システムでの単位への変換などによりある程度まで数値が変更されていてもよいが、データは、生体試料から得られたか、またはそれを使用して生成されたものと理解される。

【0114】

「標的」、「標的分子」、及び「分析物」は、生体試料中に存在し得る任意の関心対象の分子を指すように本明細書において互換的に使用される。「関心対象の分子」は、特定の分子の任意の軽微な変化、例えば、タンパク質の場合、例えば、アミノ酸配列、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化における軽微な変化、または他の任意の操作もしくは改変、例えば、標識成分とのコンジュゲーションを含み、これらは分子の同一性を実質的に変化させない。「標的分子」、「標的」、または「分析物」は、１種類または１種の分子または多分子構造の１組の複製物を指す。例示的な標的分子としては、タンパク質、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、多糖類、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、アフィボディ、抗体ミメティック、ウイルス、病原体、毒性物質 、基質、代謝産物、遷移状態類似体、補因子、阻害剤、薬物、色素、栄養素、増殖因子、細胞、組織、及び前述のうちのいずれかの任意のフラグメントまたは部分が挙げられる。幾つかの実施形態では、標的分子はタンパク質であり、この場合、当該標的分子は、「標的タンパク質」と称され得る。

【0115】

本明細書で使用する場合、「捕捉剤」または「捕捉試薬」は、バイオマーカーに特異的に結合することができる分子を指す。「標的タンパク質捕捉試薬」は、標的タンパク質に特異的に結合することができる分子を指す。非限定的な例示的捕捉試薬としては、アプタマー、抗体、アドネクチン、アンキリン、他の抗体ミメティック及び他のタンパク質スキャフォールド、自己抗体、キメラ、小分子、核酸、レクチン、リガンド結合受容体、インプリントポリマー、アビマー、ペプチドミメティック、ホルモン受容体、サイトカイン受容体、合成受容体、ならびに上記の捕捉試薬のいずれかの改変型またはフラグメントが挙げられる。幾つかの実施形態では、捕捉試薬は、アプタマー及び抗体から選択される。

【0116】

用語「抗体」は、任意の種の全長抗体、ならびにＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、一本鎖抗体、Ｆｖフラグメント、及び一本鎖Ｆｖフラグメントが含まれる、かかる抗体のフラグメント及び誘導体を指す。用語「抗体」は、合成により得られた抗体、例えば、ファージディスプレイにより得られた抗体及びフラグメント、アフィボディ、ナノボディなども指す。

【0117】

本明細書で使用する場合、「マーカー」及び「バイオマーカー」は、対象における正常もしくは異常なプロセスを示すか、もしくはその徴候であるか、または対象における疾患もしくは他の状態を示すか、もしくはその徴候である標的分子を指すように互換的に使用される。より具体的には、「マーカー」または「バイオマーカー」は、正常または異常にかかわらず、かつ異常である場合、慢性または急性にかかわらず、特定の生理的状態またはプロセスの存在に関連する解剖学的パラメータ、生理学的パラメータ、生化学的パラメータ、または分子パラメータである。バイオマーカーは、実験室のアッセイ及び医学画像などの種々の方法により検出及び測定が可能である。幾つかの実施形態では、バイオマーカーは、標的タンパク質である。

【0118】

本明細書で使用する場合、「バイオマーカーレベル」及び「レベル」とは、生体試料中のバイオマーカーを検出するための任意の分析法を使用して得られ、生体試料中のバイオマーカーの、生体試料中のバイオマーカーに関する、または生体試料中のバイオマーカーに対応する、存在、非存在、絶対量または濃度、相対量または濃度、力価、レベル、発現レベル、測定レベルの比率などを示す測定値を指す。「レベル」の正確な性質は、バイオマーカーを検出するために用いられる具体的な設計及び特定の分析法の構成要素に依存する。

【0119】

バイオマーカーが、対象における異常なプロセスまたは疾患もしくは他の状態を示すか、またはその徴候である場合、そのバイオマーカーは、一般的に、対象における正常なプロセスまたは疾患もしくは他の状態の非存在を示すか、またはその徴候であるバイオマーカーの発現レベルまたは値と比較して、過剰発現されているまたは過小発現されているのいずれかと記載される。「上方調節」、「上方調節された」、「過剰発現」、「過剰発現された」、及びそれらの任意の変化形は、生体試料中のバイオマーカーの値またはレベルであって、健常または正常な対象由来の類似の生体試料で通常検出される当該バイオマーカーの値またはレベル（または値もしくはレベルの範囲）を超える、当該値またはレベルを指すように互換的に使用される。この用語は、生体試料中のバイオマーカーの値またはレベルであって、特定の疾患の異なる段階で検出され得る当該バイオマーカーの値またはレベル（もまたは値もしくはレベルの範囲）を超える、当該値またはレベルも指し得る。

【0120】

「下方調節」、「下方調節された」、「過小発現」、「過小発現された」、及びそれらの任意の変化形は、生体試料中のバイオマーカーの値またはレベルであって、健常または正常な対象由来の類似の生体試料で通常検出される当該バイオマーカーの値またはレベル（または値もしくはレベルの範囲）未満である、当該値またはレベルを指すように互換的に使用される。この用語は、生体試料中のバイオマーカーの値またはレベルであって、特定の疾患の異なる段階で検出され得る当該バイオマーカーの値またはレベル（もまたは値もしくはレベルの範囲）未満である、当該値またはレベルも指し得る。

【0121】

更に、過剰発現されているか、または過小発現されているかのいずれかであるバイオマーカーは、対象における正常なプロセスまたは疾患もしくは他の状態の非存在を示すか、またはその徴候である当該バイオマーカーの「正常な」発現レベルまたは値と比較して、「差次的に発現されている」または「差次的なレベル」もしくは「差次的な値」を有するとも称され得る。従って、バイオマーカーの「差次的発現」は、当該バイオマーカーの「正常な」発現レベルからの変動とも称され得る。

【0122】

標的分子の「対照レベル」は、疾患もしくは状態を有さない対象由来の、または疾患もしくは状態を有すると疑われていないか、もしくはそのリスクがない対象由来の、または一次もしくは最初の心血管イベントを起こしたが、二次心血管イベントを起こしていない対象由来の、または安定した心血管疾患を有する対象由来の同じ種類の試料中の当該標的分子のレベルを指す。対照レベルは、疾患もしくは状態を有さない対象の、または疾患もしくは状態を有すると疑われていないか、もしくはそのリスクがない対象の、または一次もしくは最初の心血管イベントを起こしたが、二次心血管イベントを起こしていない対象の、または安定した心血管疾患を有する対象の、またはそれらの組み合わせの集団由来の試料中の標的分子の平均レベルを指し得る。

【0123】

本明細書で使用する場合、「個体」、「対象」、及び「患者」は、哺乳動物を指すように互換的に使用される。哺乳動物対象は、ヒトまたは非ヒトであり得る。各種の実施形態では、対象はヒトである。健常または正常な対象は、従来の診断方法により関心対象の疾患または状態（例えば、心筋梗塞、脳卒中、及び心不全による入院などの心血管イベントが含まれる）が検出されない対象である。

【0124】

「診断する」、「診断すること」、「診断」、及びそれらの変化形は、対象の健康状態または状態を、１つ以上の徴候、症状、データ、またはその対象に関する他の情報に基づいて検出、決定、または識別することを指す。対象の健康状態は、健常／正常と診断され得（すなわち、疾患または状態がないという診断）、または病気／異常と診断され得る（すなわち、疾患もしくは状態があるという診断、または疾患もしくは状態の特徴の評価）。用語「診断する」、「診断すること」、「診断」などは、特定の疾患または状態に関して、当該疾患の初期検出；当該疾患の特徴付けまたは分類；当該疾患の進行、寛解、または再発の検出；及び対象に処置または治療を施した後の疾患応答の検出を包含する。ＣＶイベントリスクの予測は、高いＣＶイベントリスクを有する対象と有さない対象とを区別することを含む。

【0125】

「予後予測する（ｐｒｏｇｎｏｓｅ）」、「予後予測すること（ｐｒｏｇｎｏｓｉｎｇ）」、「予後予測（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）」、及びそれらの変化形は、疾患または状態を有する対象における当該疾患または状態の将来の経過の予測（例えば、患者生存を予測すること）を指し、かかる用語は、当該対象に処置または治療を施した後の疾患または状態の応答を評価することを包含する。

【0126】

「評価する」、「評価すること」、「評価」、及びそれらの変化形は、「診断」及び「予後予測」の両方を包含し、疾患を有さない対象における当該疾患または状態の将来の経過についての決定または予測、及び明らかに疾患が治癒したか、または状態が消退した対象において当該疾患もしくは状態が再発するリスクに関する決定または予測も包含する。用語「評価する」は、治療に対する対象の応答を評価すること、例えば、対象が、治療薬に良好に応答しそうか、もしくは治療薬に応答しそうにないのか（または例えば、毒性作用または他の好ましくない副作用を経験するのか）を予測すること、対象に投与する治療薬を選択すること、または対象に施された治療に対する対象の応答をモニタリングもしくは決定することも包含する。従って、ＣＶイベントのリスクを「評価すること」は、例えば、以下のうちいずれかを含み得る：対象における将来のＣＶイベントリスクを予測すること；明らかにＣＶの問題がない対象におけるＣＶイベントリスクを予測すること；特定の種類のＣＶイベントを予測すること；ＣＶイベントが起きる時を予測すること；あるいはＣＶ処置に対する対象の応答を決定もしくは予測すること、または対象の生体試料に由来するバイオマーカー値の決定に基づいて対象に施されるＣＶ処置を選択すること。ＣＶイベントのリスクの評価は、例えば、連続的尺度でのＣＶイベントのリスクの評価、または段階的に上昇する分類でのＣＶイベントのリスクの分類などの実施形態を含み得る。リスクの分類は、例えば、２つ以上の分類、例えば、「ＣＶイベントの中間リスク」、「ＣＶイベントの高リスク」、及び／または「ＣＶイベントの低リスク」への分類を含む。幾つかの実施形態では、ＣＶイベントリスクの評価は、既定の期間についてのものである。非限定的な例示的なかかる既定期間としては、１年、２年、３年、４年、５年、及び５年超が挙げられる。

【0127】

本明細書で使用する場合、「追加の生物医学的情報」は、ＣＶリスク、またはより具体的にはＣＶイベントリスクに関連する、本明細書に記載されるバイオマーカーのいずれか以外を使用した対象の１つ以上の評価を指す。「追加の生物医学的情報」は、以下のうちのいずれかを含み得る：対象の身長及び／または体重が含まれる対象の身体的な記述子；対象の年齢；対象の性別；体重変化；対象の民族性；職業歴；心血管疾患（または他の循環器系障害）の家族歴；対象または家族における心血管疾患（または他の循環器系障害）のより高いリスクと相関する遺伝子マーカー（複数可）の存在；頚動脈内膜厚の変化；胸痛などの臨床症状、体重増加、または遺伝子発現値の減少；放射線イメージングにより観察された身体的な記述子が含まれる対象の身体的な記述子；喫煙状態；飲酒歴；職業歴；食習慣、すなわち、塩、飽和脂肪、及びコレステロールの摂取量；カフェイン摂取；ならびに撮像情報、例えば、心電図、心エコー検査、内膜中膜複合体厚の頚動脈超音波診断、血流依存性血管拡張反応検査、脈波伝播速度、足関節上腕血圧比、ストレス心エコー検査、心筋血流イメージング、ＣＴによる冠動脈カルシウム検査、高分解能ＣＴ血管造影法、ＭＲＩイメージング、及び他のイメージング手法；及び対象の薬物治療。バイオマーカーレベルの検査と、他の臨床検査（例えば、ＨＤＬ、ＬＤＬ検査、ＣＲＰレベル、Ｎｔ－ｐｒｏＢＮＰ検査、ＢＮＰ検査、高感度トロポニン検査、ガレクチン－３検査、血清アルブミン検査、クレアチン検査）が含まれる任意の追加の生物医学的情報の評価との組み合わせは、例えば、バイオマーカー検査のみまたは追加の生物医学的情報のうちの任意の特定項目の評価のみ（例えば、頚動脈内膜厚のイメージングのみ）と比較して、ＣＶイベント予測の感度、特異性、及び／またはＡＵＣを改善し得る。追加の生物医学的情報は、当該技術分野において公知の定型的な技術を使用して対象から、例えば、定型的な患者質問表または健康歴質問表などを使用して対象自身から取得され得るか、または医療従事者などから取得され得る。バイオマーカーレベルの検査と任意の追加の生物医学的情報の評価との組み合わせは、例えば、バイオマーカー検査のみまたは追加の生物医学的情報のうちの任意の特定項目の評価のみ（例えば、ＣＴイメージングのみ）と比較して、ＣＶイベントの予測（または他の心血管関連の用途）について感度、特異性、及び／または閾値を改善し得る。

【0128】

本明細書で使用する場合、バイオマーカー値に関して「検出する」または「決定する」は、バイオマーカーレベルに対応するシグナルを観察及び記録するために使用される機器、ならびにそのシグナルを生成するために必要とされる物質／物質（複数）の両方の使用を含む。各種の実施形態では、バイオマーカーレベルは、蛍光、化学発光、表面プラズモン共鳴、表面弾性波、質量分析、赤外分光法、ラマン分光法、原子間力顕微鏡、走査型トンネル顕微鏡、電気化学的な検出方法、核磁気共鳴、量子ドットなどが含まれる任意の好適な方法を使用して検出される。

【0129】

本明細書で使用する場合、「ＰＣＥリスク分類」は、２０１３年１１月１２日にオンラインでＣｉｒｃｕｌａｔｉｏｎに公開された（Ｐｒｉｎｔ ＩＳＳＮ：０００９－７３２２、Ｏｎｌｉｎｅ ＩＳＳＮ：１５２４－４５３９）、Ｇｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，“２０１３ ＡＣＣ／ＡＨＡ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ ｏｎ ｔｈｅ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｉｓｋ：Ａ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ／Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｔａｓｋ Ｆｏｒｃｅ ｏｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ，”に従って決定される。本明細書で使用する場合、「高」ＰＣＥリスク分類は、アテローム動脈硬化性心血管疾患（ＡＳＣＶＤ）ハードイベント（非致死性心筋梗塞または冠動脈性心疾患（ＣＨＤ）による死亡、または致死性もしくは非致死性脳卒中の最初の発症として定義される）について２０．０％以上と予測された１０年のリスクであり、「中間」ＰＣＥリスク分類は、ＡＳＣＶＤハードイベントについて１０．０～１９．９％と予測された１０年のリスクであり、「低」ＰＣＥリスク分類は、ＡＳＣＶＤハードイベントについて１０．０％未満と予測された１０年のリスクである。Ｇｏｆｆの１６ページ、表５を参照のこと。

【0130】

本明細書において、「固体支持体」は、分子が共有結合または非共有結合のいずれかにより直接または間接的に結合され得る表面を有する任意の基質を指す。「固体支持体」は、種々の物理的形態を有し得、これには、例えば、メンブレン；チップ（例えば、タンパク質チップ）；スライド（例えば、スライドガラスまたはカバーガラス）；カラム；中空の、固体の、半固体の、孔または空洞を有する粒子、例えば、ビーズ；ゲル；光ファイバー材料が含まれるファイバー；マトリックス；及び試料容器が挙げられ得る。例示的な試料容器としては、試料ウェル、チューブ、毛細血管、バイアル、及び他の任意の容器、試料を保持することができる溝またはくぼみが挙げられる。試料容器は、多試料プラットフォーム、例えば、マイクロタイタープレート、スライドガラス、マイクロ流体装置などに含まれ得る。支持体は、天然または合成材料、有機または無機材料から構成され得る。捕捉試薬が結合される固体支持体の組成は、一般的に、結合の方法（例えば、共有結合）に依存する。他の例示的な容器としては、アッセイ及び関連する操作がその中で行われ得る、微小液滴、マイクロ流体制御された、またはバルクの水中油型エマルジョンが挙げられる。好適な固体支持体としては、例えば、プラスチック、樹脂、多糖類、シリカまたはシリカベースの材料、官能化ガラス、変性ケイ素、炭素、金属、無機ガラス、メンブレン、ナイロン、天然繊維（例えば、絹、羊毛、及び綿）、ポリマーなどが挙げられる。固体支持体を構成する材料は、例えば、カルボキシ、アミノ、またはヒドロキシル基などの反応性基を含み得、これらは捕捉試薬の結合に使用される。ポリマー固体支持体としては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレングリコールテトラフタレート、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリビニルピロリドン、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリル酸メチル、ポリテトラフルオロエチレン、ブチルゴム、スチレン・ブタジエンゴム、天然ゴム、ポリエチレン、ポリプロピレン、（ポリ）テトラフルオロエチレン、（ポリ）ビニリデンフルオリド、ポリカーボネート、及びポリメチルペンテンが挙げられる。使用され得る好適な固体支持体粒子としては、例えば、コード化粒子、例えば、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）タイプのコード化粒子、磁気粒子、及びガラス粒子が挙げられる。

【0131】

バイオマーカーの例示的な使用
各種の例示的実施形態では、例えば、本明細書に記載される分析方法のいずれかが含まれる多数の分析方法によって、対象の循環中、例えば、血液、血清、または血漿中に存在する１種以上のバイオマーカーに対応する１種以上のバイオマーカー値を検出することによる、対象におけるＣＶイベントのリスクまたは可能性を評価するための方法が提供される。これらのバイオマーカーは、例えば、ＣＶイベントの高いリスクを有する対象において、ＣＶイベントの高いリスクを有さない対象と比較して差次的に発現される。対象におけるバイオマーカーの差次的発現の検出は、例えば、１年、２年、３年、４年、または５年の期間内のＣＶイベントのリスクの予測を可能にするために使用される。

【0132】

独立した診断試験としてのバイオマーカーレベルの試験に加えて、バイオマーカーレベルは、疾患または状態の感受性のリスクの増加を示す一塩基多型（ＳＮＰ）または他の遺伝子損傷もしくは遺伝的変異性の決定と共になされてもよい。（例えば、Ａｍｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４０，６１６－６２２（２００９）を参照のこと）。バイオマーカーレベルは、放射線学的スクリーニングと共に使用されてもよい。バイオマーカーレベルは、関連する症状または遺伝子検査と共に使用されてもよい。本明細書に記載されるバイオマーカーのいずれかの検出は、ＣＶイベントのリスクが評価された後に、対象の臨床ケアを適切に管理するのに有用であり得、例えば、ＣＶイベントリスクが決定された後に、高リスクの対象の治療の程度をより積極的なものに上げることが含まれる。関連する症状またはリスク因子と共にバイオマーカーレベルを試験することに加えて、バイオマーカーに関する情報は、他の種類のデータ、特に、対象の心血管イベントのリスクを示すデータ（例えば、患者の病歴、症状、心血管疾患の家族歴、喫煙歴もしくは飲酒歴、リスク因子、例えば、遺伝子マーカー（複数可）の存在、及び／または他のバイオマーカーの状態など）と共に評価されてもよい。これらの様々なデータは、コンピュータまたは他の装置／デバイスで具体化され得るコンピュータプログラム／ソフトウェアなどの自動化された方法により評価され得る。

【0133】

高リスク対象において放射線学的スクリーニングと共にバイオマーカーレベルを試験すること（例えば、冠動脈造影図で検出された閉塞と共にバイオマーカーレベルを評価すること）に加えて、バイオマーカーに関する情報は、他の種類のデータ、特に、対象がＣＶイベントを起こすリスクを示すデータ（例えば、患者の病歴、症状、心血管疾患の家族歴、リスク因子、例えば、当該対象が喫煙者、アルコール多飲者であるかどうか、及び／または他のバイオマーカーの状態など）と共に評価されてもよい。これらの様々なデータは、コンピュータまたは他の装置／デバイスで具体化され得るコンピュータプログラム／ソフトウェアなどの自動化された方法により評価され得る。

【0134】

バイオマーカーの試験は、臨床診療において現在使用されているガイドライン及び心血管リスクアルゴリズムと組み合わされてもよい。例えば、フラミンガムリスクスコアでは、リスク因子を使用して、リスクスコアが得られ、かかるリスク因子としては、ＬＤＬ－コレステロール及びＨＤＬ－コレステロールレベル、グルコース濃度の異常、喫煙、収縮期血圧、及び糖尿病が挙げられる。高リスク患者の頻度は加齢に共に増加し、高リスク患者のうち男性のほうが女性よりも高い比率を占める。

【0135】

記載されるバイオマーカーのいずれかは、画像検査においても使用され得る。例えば、造影剤が記載されるバイオマーカーのいずれかに結合され得、これは、他の用途もあるが特に、心血管イベントリスクの予測を補助するため、治療介入への応答をモニタリングするため、臨床試験において標的集団を選択するために使用され得る。

【0136】

バイオマーカー及びバイオマーカーレベルの検出及び決定
本明細書に記載されるバイオマーカーのバイオマーカーレベルは、種々の既知の分析方法のいずれかを使用して検出され得る。一実施形態では、バイオマーカー値は、捕捉試薬を使用して検出される。各種の実施形態では、捕捉試薬は、溶液中でバイオマーカーに曝露され得るか、または捕捉試薬が固体支持体に固定された状態でバイオマーカーに曝露され得る。他の実施形態では、捕捉試薬は、特徴部であって、固体支持体上の第２の特徴部と反応する、当該特徴部を有する。これらの実施形態では、捕捉試薬が溶液中でバイオマーカーに曝露され得、次いで、バイオマーカーを固体支持体上に固定化するために、捕捉試薬上の特徴部が固体支持体上の第２の特徴部と共に使用され得る。捕捉試薬は、実施される分析の種類に基づいて選択される。捕捉試薬としては、限定されるものではないが、アプタマー、抗体、アドネクチン、アンキリン、他の抗体ミメティック、及び他のタンパク質スキャフォールド、自己抗体、キメラ、低分子、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、一本鎖抗体フラグメント、Ｆｖフラグメント、一本鎖Ｆｖフラグメント、核酸、レクチン、リガンド結合受容体、アフィボディ、ナノボディ、インプリントポリマー、アビマー、ペプチドミメティック、ホルモン受容体、サイトカイン受容体、及び合成受容体、ならびにこれらの改変型及びフラグメントが挙げられる。

【0137】

幾つかの実施形態では、バイオマーカーレベルは、バイオマーカー／捕捉試薬複合体を使用して検出される。

【0138】

幾つかの実施形態では、バイオマーカーレベルは、バイオマーカー／捕捉試薬複合体から得られ、例えば、バイオマーカー／捕捉試薬の相互作用に続く反応の結果として間接的に検出されるが、バイオマーカー／捕捉試薬複合体の形成に依存する。

【0139】

幾つかの実施形態では、バイオマーカーレベルは、生体試料中のバイオマーカーから直接検出される。

【0140】

幾つかの実施形態では、バイオマーカーは、生体試料中の２種以上のバイオマーカーの同時検出を可能にする多重化フォーマットを使用して検出される。多重化フォーマットの幾つかの実施形態では、捕捉試薬は、固体支持体上の別個の位置に、共有結合または非共有結合により、直接的または間接的に固定化される。幾つかの実施形態では、多重化フォーマットは、別個の固体支持体を使用し、ここで、各固体支持体は、その固体支持体、例えば、量子ドットと結合した固有の捕捉試薬を有する。幾つかの実施形態では、生体試料中の検出されるべき複数のバイオマーカーのそれぞれの検出のために、別個の装置が使用される。別個の装置は、生体試料中の各バイオマーカーが同時に処理されるのを可能にするよう構成され得る。例えば、マイクロタイタープレートが使用され得、その結果、プレート中の各ウェルが生体試料中の検出されるべき１種以上のバイオマーカーを固有に解析するために使用される。

【0141】

前述の実施形態のうちの１つ以上では、バイオマーカーレベルの検出を可能にするために、蛍光タグを使用して、バイオマーカー／捕捉試薬複合体の構成要素が標識され得る。各種な実施形態では、蛍光標識は、既知の技術を使用して、本明細書に記載されるバイオマーカーのいずれかに特異的な捕捉試薬にコンジュゲートされ得、次いで、蛍光標識を使用して、対応するバイオマーカーレベルが検出され得る。好適な蛍光標識としては、希土類キレート、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、アロフィコシアニン、ＰＢＸＬ－３、Ｑｄｏｔ ６０５、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ、フィコエリトリン、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ならびに他の類似の化合物が挙げられる。

【0142】

いくつかの実施形態では、蛍光標識は蛍光色素分子である。幾つかの実施形態では、蛍光色素分子は、インドリウム環の３位の炭素の置換基が化学反応性基またはコンジュゲートされた物質を含有する、少なくとも１つの置換インドリウム環系を含む。幾つかの実施形態では、色素分子としては、ＡｌｅｘＦｌｕｏｒ分子、例えば、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ ５３２、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ ６４７、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ ６８０、またはＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ ７００が挙げられる。他の実施形態では、色素分子は、第１の種類の色素分子及び第２の種類の色素分子、例えば、２種の異なるＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ分子を含む。幾つかの実施形態では、色素分子は、第１の種類の色素分子及び第２の種類の色素分子を含み、この２種の色素分子は、異なる放出スペクトルを有する。

【0143】

蛍光は、広範囲のアッセイフォーマットに適合可能な種々の計測手段で測定され得る。例えば、分光蛍光計は、マイクロタイタープレート、顕微鏡スライド、プリントされたアレイ、キュベットなどを解析するように設計されている。Ｊ．Ｒ．ＬａｋｏｗｉｃｚによるＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＋ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍｅｄｉａ，Ｉｎｃ．，２００４を参照のこと。Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ：Ｐｒｏｇｒｅｓｓ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ；Ｐｈｉｌｉｐ Ｅ．Ｓｔａｎｌｅｙ Ｌａｒｒｙ Ｊ．Ｋｒｉｃｋａ ｅｄｉｔｏｒｓ， Ｗｏｒｌｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｊａｎｕａｒｙ ２００２を参照のこと。

【0144】

１つ以上の実施形態では、バイオマーカーレベルの検出を可能にするために、化学発光タグを任意に使用して、バイオマーカー／捕捉複合体の構成要素が標識され得る。好適な化学発光物質としては、塩化オキサリル、ローダミン６Ｇ、Ｒｕ（ｂｉｐｙ）_３ ^２＋、ＴＭＡＥ（テトラキス（ジメチルアミノ）エチレン）、ピロガロール（１，２，３－トリヒドロキシベンゼン）、ルシゲニン、ペルオキシオキサレート、アリールオキサレート、アクリジニウムエステル、ジオキセタンなどのいずれかが挙げられる。

【0145】

幾つかの実施形態では、検出方法は、バイオマーカーレベルに対応する検出可能なシグナルを生成する酵素／基質の組み合わせを含む。一般的に、酵素は、発色基質の化学的変化を触媒し、この化学的変化は、分光光度法、蛍光、及び化学発光が含まれる、様々な技術を使用して測定され得る。好適な酵素としては、例えば、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、ウリカーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどが挙げられる。

【0146】

幾つかの実施形態では、検出方法は、測定可能なシグナルを生成する、蛍光、化学発光、放射性核種、または酵素／基質の組み合わせの組み合わせであり得る。幾つかの実施形態では、多様式のシグナルの生成が、バイオマーカーアッセイフォーマットにおいて固有かつ有利な特徴を有し得る。

【0147】

幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるバイオマーカーのバイオマーカーレベルは、後述するように、シングルプレックスアプタマーアッセイ、マルチプレックスアプタマーアッセイ、シングルプレックスまたはマルチプレックスイムノアッセイ、ｍＲＮＡ発現プロファイリング、ｍｉＲＮＡ発現プロファイリング、質量分光分析、組織学的／細胞学的方法などが含まれる、任意の分析方法を使用して検出され得る。

【0148】

アプタマーベースのアッセイを使用したバイオマーカーレベルの決定
生体試料及び他の試料中の生理学的に重要な分子の検出及び定量化を目的としたアッセイは、科学研究及びヘルスケア分野における重要なツールである。かかるアッセイの部類の１つは、固体支持体に固定化された１種以上のアプタマーを含むマイクロアレイの使用を伴う。アプタマーはそれぞれ、高度に特異的な様式で、かつ極めて高親和性で標的分子に結合することができる。例えば、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ」という表題の米国特許第５，４７５，０９６号を参照のこと。例えば、各々が「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｂｉｏｃｈｉｐ」という表題の米国特許第６，２４２，２４６号、米国特許第６，４５８，５４３号、及び米国特許第６，５０３，７１５号も参照のこと。マイクロアレイが試料と接触されると、アプタマーは試料中に存在するそれぞれの標的分子に結合し、これにより、バイオマーカーに対応するバイオマーカーレベルの測定を可能にする。

【0149】

本明細書で使用される場合、「アプタマー」は、標的分子に対して特異的な結合親和性を有する核酸を指す。親和性相互作用は程度の問題であることが認識されているが、しかしながら、この文脈において、アプタマーのその標的に対する「特異的な結合親和性」は、一般的に、アプタマーが、試験試料中の他の成分に結合するよりも非常に高い程度の結合親和性でその標的に結合することを意味する。「アプタマー」は、特定のヌクレオチド配列を含む１つのタイプまたは１種の核酸分子の１組のコピーである。アプタマーは、任意の数の化学修飾されたヌクレオチドが含まれる、任意の好適な数のヌクレオチドを含み得る。「アプタマー」は、２組以上のかかる分子を指す。異なるアプタマーは、同じ数または異なる数のいずれかのヌクレオチドを有し得る。アプタマーは、ＤＮＡもしくはＲＮＡまたは化学修飾された核酸であり得、一本鎖、二本鎖であり得るか、または二本鎖領域を含有し得、より高次の構造を含み得る。アプタマーは、当該アプタマーがその対応する標的に共有結合的に連結されるのを可能にするために、光反応性官能基または化学反応性官能基がアプタマーに含まれている、フォトアプタマーであってもよい。本明細書において開示されるアプタマーの方法のいずれかは、同じ標的分子に特異的に結合する２種以上のアプタマーの使用を含み得る。以下で更に記載されるように、アプタマーは、タグを含み得る。アプタマーがタグを含む場合、全コピーのアプタマーが同じタグを有している必要はない。更に、異なるアプタマーがそれぞれタグを含む場合、これらの異なるアプタマーは、同じタグまたは異なるタグのいずれかを有し得る。

【0150】

アプタマーは、ＳＥＬＥＸプロセスが含まれる、任意の既知の方法を使用して同定され得る。同定されたら、アプタマーは、化学合成法及び酵素合成法が含まれる任意の既知の方法に従って調製または合成され得る。

【0151】

用語「ＳＥＬＥＸ」及び「ＳＥＬＥＸプロセス」は、一般に、（１）所望の様式で標的分子と相互作用する、例えば、タンパク質と高親和性で結合するアプタマーの選択と、（２）それらの選択された核酸の増幅との組み合わせを指すように本明細書において互換的に使用される。ＳＥＬＥＸプロセスは、特異的な標的またはバイオマーカーに対して高親和性を有するアプタマーを同定するために使用され得る。

【0152】

ＳＥＬＥＸは、一般に、候補の核酸混合物を調製すること、候補混合物を所望の標的分子に結合させて、親和性複合体を形成させること、当該親和性複合体を結合していない候補核酸から分離すること、当該親和性複合体から核酸を分離及び単離すること、核酸を精製すること、ならびに特異的なアプタマー配列を同定することを含む。選択されたアプタマーの親和性を更に改良するために、このプロセスは、複数ラウンド行われ得る。このプロセスは、プロセスの１つ以上の時点での増幅ステップを含み得る。例えば、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ」という表題の米国特許第５，４７５，０９６号を参照のこと。ＳＥＬＥＸプロセスは、標的に共有結合するアプタマーだけでなく、標的に非共有結合するアプタマーを生成するためにも使用され得る。例えば、「Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：Ｃｈｅｍｉ－ＳＥＬＥＸ」という表題の米国特許第５，７０５，３３７号を参照のこと。

【0153】

ＳＥＬＥＸプロセスは、例えば、改善されたインビボ安定性または改善された送達特性などの改善された特性をアプタマーに付与する修飾ヌクレオチドを含有する高親和性アプタマーを同定するために使用され得る。かかる修飾の例としては、リボース及び／またはリン酸及び／または塩基の位置での化学的置換が挙げられる。ＳＥＬＥＸプロセスにより同定された修飾ヌクレオチドを含有するアプタマーは、ピリミジンの５’位及び２’位で化学修飾されたヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドを記載している、「Ｈｉｇｈ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」という表題の米国特許第５，６６０，９８５号に記載されている。米国特許第５，５８０，７３７号（上記を参照のこと）は、２’－アミノ（２’－ＮＨ２）、２’－フルオロ（２’－Ｆ）、及び／または２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）で修飾された１つ以上のヌクレオチドを含有する高度に特異的なアプタマーを記載している。物理的及び化学的特性が高められた核酸ライブラリーならびにＳＥＬＥＸ及びフォトＳＥＬＥＸ（ｐｈｏｔｏＳＥＬＥＸ）におけるその使用を記載している、「ＳＥＬＥＸ ａｎｄ ＰＨＯＴＯＳＥＬＥＸ」という表題の米国特許出願公開番号第２００９００９８５４９号も参照のこと。

【0154】

ＳＥＬＥＸは、所望の解離速度特性を有するアプタマーを同定するためにも使用され得る。標的分子に結合することができるアプタマーを作製するための改善されたＳＥＬＥＸプロセスを記載している、「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ａｐｔａｍｅｒｓ ｗｉｔｈ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｏｆｆ－Ｒａｔｅｓ」という表題の米国特許出願公開第２００９０００４６６７号を参照のこと。それぞれの標的分子からのより遅い解離速度を有するアプタマー及びフォトアプタマーを作製する方法が記載される。この方法は、候補混合物を標的分子と接触させること、核酸－標的複合体を形成させること、及び遅い解離速度のアプタマーを濃縮するプロセスであって、速い解離速度を有する核酸－標的複合体は解離し、再形成しないが、遅い解離速度を有する複合体はインタクトなままである、当該プロセスを実行することを含む。加えて、この方法は、解離速度性能が改善されたアプタマーを作製するために、候補核酸混合物の生成において修飾ヌクレオチドを使用することを含む。非限定的な例示的修飾ヌクレオチドとしては、例えば、図８に示される修飾ピリミジンが挙げられる。幾つかの実施形態では、アプタマーは、塩基修飾などの修飾を有する、少なくとも１つのヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、アプタマーは、標的タンパク質との疎水性接触を可能にする疎水性塩基修飾などの疎水性修飾を有する、少なくとも１つのヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、かかる疎水性接触は、アプタマーによるより高い親水性及び／またはより遅い解離速度の結合に寄与する。非限定的な例示的疎水性修飾を有するヌクレオチドを、図８に示す。幾つかの実施形態では、アプタマーは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０の、疎水性修飾を有するヌクレオチドを含み、ここでは、各疎水性修飾は、互いに同一であってもまたは異なってもよい。幾つかの実施形態では、アプタマーにおける少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、または少なくとも１０種の疎水性修飾は、図８に示される疎水性修飾から独立して選択され得る。

【0155】

幾つかの実施形態では、遅い解離速度のアプタマー（疎水性修飾を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含むアプタマーが含まれる）は、≧３０分、≧６０分、≧９０分、≧１２０分、≧１５０分、≧１８０分、≧２１０分、または≧２４０分の解離速度（ｔ１／２）を有する。

【0156】

幾つかの実施形態では、アッセイは、アプタマーがその標的分子に共有結合するか、またはそれに「光架橋」されることを可能にする光反応性官能基を含むアプタマーを用いる。例えば「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｂｉｏｃｈｉｐ」という表題の米国特許第６，５４４，７７６号を参照のこと。これらの光反応性アプタマーは、フォトアプタマーとも称される。例えば、それぞれ「Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：Ｐｈｏｔｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ ａｎｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ＳＥＬＥＸ」という表題の米国特許第５，７６３，１７７号、米国特許第６，００１，５７７号、及び米国特許第６，２９１，１８４号を参照のこと。例えば「Ｐｈｏｔｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ」という表題の米国特許第６，４５８，５３９号も参照のこと。マイクロアレイが試料と接触され、フォトアプタマーがその標的分子に結合する機会が与えられた後、フォトアプタマーが光活性化され、固体支持体が洗浄され、任意の非特異的に結合した分子が除去される。フォトアプタマー上の光活性化された官能基（複数可）により生成された共有結合のために、フォトアプタマーに結合している標的分子は通常除去されないため、厳格な洗浄条件が使用され得る。このようにして、アッセイは、試験試料中のバイオマーカーに対応するバイオマーカーレベルの検出を可能にする。

【0157】

幾つかのアッセイフォーマットにおいて、アプタマーは、試料と接触させる前に固体支持体に固定化される。しかしながら、特定の状況下では、試料と接触させる前にアプタマーを固定化すると、最適なアッセイを提供しない可能性がある。例えば、アプタマーの事前の固定化は、固体支持体表面上でのアプタマーの標的分子との非効率的な混合をもたらし得、反応時間が長期化する可能性があり、従って、インキュベート時間の延長により、アプタマーのその標的分子との効率的な結合が可能となる。更に、フォトアプタマーがアッセイに用いられる場合、固体支持体として利用される物質に応じて、固体支持体は、フォトアプタマーとその標的分子との間の共有結合の形成に影響を与えるために使用される光を散乱させるか、または吸収する傾向を有し得る。更に用いられる方法に応じて、固体支持体の表面が使用される任意の標識薬剤にも曝露され得、それにより影響も受け得るため、アプタマーに結合したその標的分子の検出は不正確になりやすい。最後に、固体支持体上へのアプタマーの固定化は、一般に、アプタマーの試料への曝露前のアプタマー調製ステップ（すなわち、固定）を含み、この調製ステップは、アプタマーの活性または官能性に影響を及ぼし得る。

【0158】

アプタマーが溶液中でその標的を捕捉するのを可能にし、次いで、検出前にアプタマー－標的混合物の特定の成分を除去するように設計されている分離ステップを用いるアプタマーアッセイも記載されている（「Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ Ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ Ｔｅｓｔ Ｓａｍｐｌｅｓ」という表題の米国特許出願公開第２００９００４２２０６号を参照のこと）。記載されるアプタマーアッセイは、核酸（すなわち、アプタマー）を検出及び定量化することにより、試験試料中の非核酸標的（例えば、タンパク質標的）の検出及び定量化を可能にする。記載される方法は、非核酸標的を検出及び定量化するための核酸代用物（すなわち、アプタマー）を作製し、これにより、増幅が含まれる多種多様な核酸技術が、タンパク質標的が含まれるより広範囲の所望の標的に適用されることを可能にする。

【0159】

アプタマーは、アプタマーバイオマーカー複合体（またはフォトアプタマーバイオマーカーの共有結合複合体）からのアッセイ成分の分離を容易にし、検出及び／または定量化のためのアプタマーの単離を可能にするように構築され得る。一実施形態では、これらの構築物は、アプタマー配列内に切断可能な要素または遊離可能な要素を含み得る。他の実施形態では、さらなる機能性をアプタマーに導入することができ、例えば、標識または検出可能成分、スペーサー成分、または特異的結合タグもしくは固定化要素を導入することができる。例えば、アプタマーは、切断可能な部分を介してアプタマーに連結されたタグ、標識、標識を隔てるスペーサー構成要素、及び切断可能な部分を含み得る。一実施形態では、切断可能な要素は、光切断性リンカーである。光切断性リンカーは、ビオチン部分及びスペーサー部分に結合され得、アミンの誘導体化のためのＮＨＳ基を含み得、ビオチン基をアプタマーに導入して、これにより、アッセイ法において後にアプタマーの放出を可能にするために使用され得る。

【0160】

溶液中の全てのアッセイ成分を用いて行われる均一アッセイは、シグナル検出前の試料及び試薬の分離を必要としない。これらの方法は迅速であり、使いやすい。これら方法は、分子の捕捉または特異的な標的と反応する結合試薬に基づいてシグナルを生成する。本明細書に記載される方法の幾つかの実施形態では、分子捕捉試薬は、１種以上のアプタマーまたは抗体などを含み、当該１種以上のアプタマーまたは抗体などの各々の特異的な標的は、表１または表２に示されるバイオマーカーであり得る。

【0161】

幾つかの実施形態では、シグナル生成方法は、フルオロフォア標識された捕捉試薬とその特異的なバイオマーカー標的との相互作用に起因する異方性のシグナル変化を利用する。標識された捕捉試薬がその標的と反応すると、分子量の増加により複合体に結合されたフルオロフォアの回転運動が非常に遅くなり、異方性値が変化する。異方性変化をモニタリングすることにより、結合事象を使用して、溶液中のバイオマーカーが定量的に測定され得る。他の方法としては、蛍光偏光アッセイ、分子ビーコン法、時間分解蛍光消光、化学発光、蛍光共鳴エネルギー移動などが挙げられる。

【0162】

生体試料中のバイオマーカーレベルを検出するために使用され得る例示的な溶液ベースのアプタマーアッセイは、以下を含む： （ａ）当該生体試料を、第１のタグを含み、当該バイオマーカーに対して特異的な親和性を有するアプタマーと接触させることにより混合物を調製することであって、当該バイオマーカーが当該試料中に存在する場合、アプタマー親和性複合体が形成される、当該調製すること；（ｂ）当該混合物を第１の捕捉要素を含む第１の固体支持体に曝露させ、当該第１のタグを当該第１の捕捉要素と会合させること；（ｃ）当該第１の固体支持体と会合していない当該混合物の任意の成分を除去すること；（ｄ）第２のタグを当該アプタマー親和性複合体のバイオマーカー成分に結合させること；（ｅ）当該第１の固体支持体から当該アプタマー親和性複合体を放出させること；（ｆ）放出されたアプタマー親和性複合体を第２の捕捉要素を含む第２の固体支持体に曝露し、当該第２のタグを当該第２の捕捉要素と会合させること；（ｇ）複合体化していない任意のアプタマーを当該アプタマー親和性複合体から分けることにより、任意の複合体化していないアプタマーを当該混合物から除去すること；（ｈ）固体支持体から当該アプタマーを溶出させること；及び（ｉ）当該アプタマー親和性複合体の当該アプタマー成分を検出することにより当該バイオマーカーを検出すること、を含む。

【0163】

アプタマー親和性複合体のアプタマー成分を検出することによりバイオマーカー値を検出するために、当該技術分野において公知の任意の手段が使用され得る。親和性複合体のアプタマー成分を検出するための多数の異なる検出方法、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ、質量分析、またはＱＰＣＲなどが使用され得る。幾つかの実施形態では、アプタマー親和性複合体のアプタマー成分を検出し、これにより、バイオマーカー値を検出するために、核酸配列決定法が使用され得る。要約すると、試験試料中に存在する１種以上のアプタマーの配列または複数の配列を同定及び定量化するために、当該試験試料が任意の種類の核酸配列決定法に供され得る。幾つかの実施形態では、配列は、アプタマー分子の全体または当該分子を一意的に識別するために使用され得る当該分子の任意の部分を含む。他の実施形態では、識別配列は、アプタマーに付加された特定の配列であり、かかる配列は、多くの場合、「タグ」、「バーコード」、または「ジップコード」と称される。幾つかの実施形態では、配列決定法は、アプタマー配列を増幅するため、または任意の位置に化学修飾を含有するＲＮＡ及びＤＮＡが含まれる任意の種類の核酸を配列決定に適した任意の他の種類の核酸に変換するための酵素ステップを含む。

【0164】

幾つかの実施形態では、配列決定法は、１つ以上のクローニングステップを含む。他の実施形態では、配列決定法は、クローニングを用いない直接配列決定法を含む。

【0165】

幾つかの実施形態では、配列決定法は、試験試料中の１種以上のアプタマーを標的とする特異的プライマーを用いる指向性アプローチを含む。他の実施形態では、配列決定法は、試験試料中の全てのアプタマーを標的とするショットガンアプローチを含む。

【0166】

幾つかの実施形態では、配列決定法は、配列決定の標的とされる分子を増幅するための酵素ステップを含む。他の実施形態では、配列決定法は、単一の分子を直接配列決定する。生体試料中のバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を検出するために使用され得る例示的な核酸配列決定ベースの方法は、以下を含む：（ａ）酵素ステップを用いて化学修飾されたヌクレオチドを含むアプタマーの混合物を、未修飾の核酸に変換すること；（ｂ）大規模並列配列決定プラットフォーム、例えば、４５４シーケンシングシステム（４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｒｏｃｈｅ）、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングシステム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、ＡＢＩ ＳＯＬｉＤシーケンシングシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＨｅｌｉＳｃｏｐｅ１分子シーケンサー（Ｈｅｌｉｃｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）もしくはＰａｃｉｆｉｃ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓリアルタイム１分子シーケンシングシステム（Ｐａｃｉｆｉｃ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）、またはＰｏｌｏｎａｔｏｒ Ｇシーケンシングシステムズ（Ｄｏｖｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ）などを用いて得られた未修飾の核酸をショットガン配列決定すること；ならびに（ｃ）特異的な配列及び配列カウントにより当該混合物中に存在する当該アプタマーを同定及び定量化すること、を含む。

【0167】

アプタマーを使用して生体試料中のバイオマーカーを検出する非限定的な例示的方法は、実施例１に記載される。更にＫｒａｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６（１０）：ｅ２６３３２も参照のこと。

【0168】

イムノアッセイを使用したバイオマーカーレベルの決定
イムノアッセイ法は、抗体のその対応する標的または分析物に対する反応に基づいており、特定のアッセイフォーマットに応じて、試料中の分析物を検出することができる。免疫反応性に基づくアッセイ方法の特異性及び感度を改善するために、モノクローナル抗体及びそのフラグメントが、それらの特異的なエピトープ認識のために、頻繁に使用される。ポリクローナル抗体も、モノクローナル抗体と比較して標的に対する親和性が高いために、様々なイムノアッセイにおいて成功裏に使用されている。イムノアッセイは、広範囲の生物学的試料マトリックスと共に使用するように設計されている。イムノアッセイフォーマットは、定性的、半定量的、及び定量的な結果をもたらすように設計されている。

【0169】

定量的な結果は、既知の濃度の検出されるべき特異的分析物を用いて作成された検量線を使用することにより得られる。未知の試料からの反応またはシグナルを検量線にプロットされ、未知の試料中の標的に対応する量またはレベルが決定される。

【0170】

多数のイムノアッセイフォーマットが設計されている。ＥＬＩＳＡまたはＥＩＡは、分析物の検出について定量的であり得る。この方法は、分析物または抗体のいずれかへの標識の結合に基づいており、標識の構成要素は、直接的または間接的のいずれかで酵素を含む。ＥＬＩＳＡ試験は、分析物の直接的検出、間接的検出、競合的検出、またはサンドイッチ検出用のフォーマットであり得る。他の方法は、例えば、放射性同位体（Ｉ^１２５）または蛍光などの標識に基づく。追加の技術としては、例えば、凝集、ネフェロメトリー、比濁法、ウェスタンブロット、免疫沈降、免疫細胞染色、免疫組織染色、フローサイトメトリー、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイなどが挙げられる（ＩｍｍｕｎｏＡｓｓａｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ，Ｂｒｉａｎ Ｌａｗ編，Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｌｔｄ．出版，２００５年版を参照のこと）。

【0171】

例示的なアッセイフォーマットとしては、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法、蛍光、化学発光、及び蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）または時間分解ＦＲＥＴ（ＴＲ－ＦＲＥＴ）イムノアッセイが挙げられる。バイオマーカーを検出するための手法の例としては、バイオマーカー免疫沈降、それに続くサイズ及びペプチドレベルの識別を可能にする定量方法、例えば、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、平面電気クロマトグラフィーなどが挙げられる。

【0172】

検出可能な標識またはシグナル生成物質を検出及び／または定量化する方法は、標識の性質に依存する。適切な酵素により触媒される反応の産物（ここで、検出可能な標識は酵素である；上記を参照のこと）は、限定されるものではないが、蛍光、発光、もしくは放射能であり得、またはそれらは、可視光もしくは紫外線を吸収し得る。かかる検出可能な標識の検出に好適な検出器の例としては、限定されるものではないが、Ｘ線フィルム、放射能カウンター、シンチレーションカウンター、分光光度計、比色計、蛍光光度計、ルミノメーター、及び濃度計が挙げられる。

【0173】

検出方法のいずれかは、任意の好適な調製、処理、及び反応の解析を可能にする任意のフォーマットで実行され得る。検出方法は、例えば、マルチウェルアッセイプレート（例えば、９６ウェルまたは３８６ウェル）で、または任意の好適なアレイもしくはマイクロアレイを使用して実行され得る。様々な薬剤の貯蔵液が、手作業でまたはロボットにより作成され得、その後のピペット操作、希釈、混合、分配、洗浄、インキュベーション、試料読み取り、データ収集、及び解析の全てが、検出可能な標識を検出することができる市販の解析ソフトウェア、ロボット、及び検出機器を使用してロボットにより行われ得る。

【0174】

遺伝子発現プロファイリングを使用したバイオマーカーレベルの決定
幾つかの実施形態では、当該生体試料中の対応するタンパク質のレベルを検出するために、生体試料中のｍＲＮＡ測定が代用として利用され得る。従って、幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるバイオマーカーまたはバイオマーカーパネルは、適切なＲＮＡを検出することにより検出され得る。

【0175】

幾つかの実施形態では、ｍＲＮＡ発現レベルは、逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲに続くｑＰＣＲ）により測定される。ＲＴ－ＰＣＲは、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを作製するために使用される。ｃＤＮＡは、ＤＮＡ増幅プロセスが進行するにつれて蛍光を発生させるために、ｑＰＣＲアッセイで使用され得る。ｑＰＣＲでは、検量線との比較により、細胞当たりのｍＲＮＡのコピー数などの絶対測定が得られ得る。ノーザンブロット、マイクロアレイ、インベーダーアッセイ、及びＲＴ－ＰＣＲと、キャピラリー電気泳動との組み合わせは、いずれも試料中のｍＲＮＡ発現レベルを測定するために使用されてきた。Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｒｉｃｈａｒｄ Ａ．Ｓｈｉｍｋｅｔｓ，ｅｄｉｔｏｒ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００４を参照のこと。

【0176】

インビボ分子イメージング技術を使用したバイオマーカーの検出
幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるバイオマーカーは、分子イメージング試験において使用され得る。例えば、造影剤が、インビボでバイオマーカーを検出するために使用され得る捕捉試薬に結合され得る。

【0177】

インビボイメージング技術は、対象の身体における特定の疾患の状態を決定するための非侵襲的方法を提供する。例えば、身体の全ての部分または身体全体が三次元画像として表示され得、これにより、体の形態及び構造に関する有益な情報を提供する。かかる技術は、インビボでのバイオマーカーに関する情報を提供するために、本明細書に記載されるバイオマーカーの検出と組み合わされ得る。

【0178】

様々な技術の進歩により、インビボ分子イメージング技術が発展している。これらの進歩としては、身体内で強いシグナルを発生させ得る放射標識及び／または蛍光標識などの新規のコントラスト剤または標識の開発；ならびに身体外部からこれらのシグナルを十分な感度及び精度で検出及び解析して、有用な情報を提供することができる強力な新規のイメージング技術の開発が挙げられる。コントラスト剤は、適切なイメージングシステムで可視化され得、これにより、コントラスト剤が存在する身体の一部または複数部分の画像を提供する。コントラスト剤は、例えば、アプタマーもしくは抗体などの捕捉試薬、及び／またはペプチドもしくはタンパク質またはオリゴヌクレオチド（例えば、遺伝子発現を検出するため）、またはこれらのいずれかを１種以上の巨大分子及び／または他の粒子形態と共に含む複合体に結合され得るか、またはそれらと会合し得る。

【0179】

コントラスト剤は、イメージングにおいて有用な放射性原子を特徴とするものであってもよい。好適な放射性原子としては、シンチグラフィー検査のためのテクネチウム９９ｍまたはヨウ素１２３が挙げられる。他の容易に検出可能な部分としては、例えば、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）用のスピン標識であり、例えば、同様にヨウ素１２３、ヨウ素１３１、インジウム１１１、フッ素１９、炭素１３、窒素１５、酸素１７、ガドリニウム、マンガン、または鉄などが挙げられる。かかる標識は、当該技術分野において周知であり、当業者により容易に選択され得る。

【0180】

標準的なイメージング技術としては、限定されるものではないが、磁気共鳴画像、コンピュータ断層撮影、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）、単光子放射型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）などが挙げられる。インビボ診断イメージングでは、利用可能な検出機器の種類が、所与のコントラスト剤、例えば、所与の放射性核種及びそれを使用して標的化される特定のバイオマーカー（タンパク質、ｍＲＮＡなど）の選択において重要な因子となる。通常選択される放射性核種は、所与の種類の機器により検出可能なある種の減衰を示す。またインビボでの診断のために放射性核種を選択する場合、その半減期は、標的組織により最大限取り込まれた時に検出を可能にするほど十分に長く、宿主への有害な放射線が最小限にされるほど十分に短いものであるべきである。

【0181】

例示的なイメージング技術としては、限定されるものではないが、対象に放射性核種が全身または局所投与されるイメージング技術であるＰＥＴ及びＳＰＥＣＴが挙げられる。その後の放射性トレーサーの取り込みが経時的に測定され、標的とされる組織及びバイオマーカーに関する情報を得るために使用される。用いられる特定の同位体の高エネルギー（ガンマ線）放出、ならびにそれを検出するために使用される機器の感度及び精巧さにより、放射能の二次元分布が身体外部から推定され得る。

【0182】

ＰＥＴにおいて一般的に使用される陽電子放出核種としては、例えば、炭素１１、窒素１３、酸素１５、及びフッ素１８が挙げられる。ＳＰＥＣＴでは、電子捕獲及び／またはガンマ放射により減衰する同位体が使用され、例えば、ヨウ素１２３及びテクネチウム９９ｍが挙げられる。アミノ酸をテクネチウム９９ｍで標識するための例示的な方法は、キレート前駆体の存在下で過テクネチウム酸イオンを還元して、不安定なテクネチウム９９ｍ－前駆体複合体を形成させることであり、次に、これは、二官能性修飾された走化性ペプチドの金属結合基と反応し、テクネチウム９９ｍ－走化性ペプチドコンジュゲートを形成する。

【0183】

かかるインビボイメージング診断方法においては、抗体が頻繁に使用される。インビボでの診断用の抗体の調製及び使用は当該技術分野において周知である。同様に、アプタマーが、かかるインビボイメージング診断方法に使用されてもよい。例えば、本明細書に記載される特定のバイオマーカーを同定するために使用されたアプタマーが、インビボでバイオマーカーを検出するために、適切に標識され、対象に注射され得る。使用される標識は、前述したように、使用されるイメージング手法に従って選択される。アプタマー指向性造影剤は、組織透過性、生体内分布、動態、除去、効力、及び選択性に関して、他の造影剤と比較して固有かつ有利な特性を有し得る。

【0184】

かかる技術は、任意に、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたイメージングにより遺伝子発現を検出するために、標識されたオリゴヌクレオチドを用いて実行されてもよい。これらの方法は、例えば、標識として蛍光分子または放射性核種を用いるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションで使用される。遺伝子発現を検出するための他の方法としては、例えば、レポーター遺伝子の活性の検出が挙げられる。

【0185】

別の一般的な種類のイメージング技術は、対象内の蛍光シグナルが対象の外部にある光学装置により検出される光学イメージングである。これらのシグナルは、実際の蛍光及び／または生物発光に起因し得る。光学検出装置の感度の改善により、インビボでの診断アッセイのための光学イメージングの有用性が高まっている。

【0186】

他の技術の総論については、Ｎ．Ｂｌｏｗ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，６，４６５－４６９，２００９を参照のこと。

【0187】

質量分析法を使用したバイオマーカーレベルの決定
バイオマーカーレベルを検出するために、種々の構成の質量分析計が使用され得る。数種類の質量分析計が利用可能であり、または様々な構成で製造され得る。一般的に、質量分析計は、以下の主な構成要素を有する：試料インレット、イオン源、質量分析器、検出器、真空システム、及び機器制御システム、及びデータシステム。試料インレット、イオン源、及び質量分析器における相違は、概して計測器のタイプ及びその能力を規定する。例えば、インレットは、キャピラリーカラム液体クロマトグラフィー源であり得、またはマトリックス支援レーザー脱離において使用されるようなダイレクトプローブもしくはステージであり得る。一般的なイオン源は、例えば、ナノスプレー及びマイクロスプレーが含まれるエレクトロスプレー、またはマトリックス支援レーザー脱離である。一般的な質量分析器としては、四重極質量フィルター、イオントラップ質量分析器、及び飛行時間型質量分析器が挙げられる。更なる質量分析法が当該技術分野において周知である（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７０：６４７Ｒ－７１６Ｒ（１９９８）；Ｋｉｎｔｅｒ ａｎｄ Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０００）を参照のこと）。

【0188】

タンパク質バイオマーカー及びバイオマーカーレベルは、以下のうちいずれかにより検出及び測定され得る：エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）、ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ－ＭＳ／（ＭＳ）ｎ、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ）、表面増強レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ）、シリコンを用いた脱離／イオン化（ＤＩＯＳ）、二次イオン質量分析（ＳＩＭＳ）、四重極飛行時間型（Ｑ－ＴＯＦ）、ＵｌｔｒａＦｌｅｘ ＩＩＩ ＴＯＦ／ＴＯＦと呼ばれるタンデム飛行時間型（ＴＯＦ／ＴＯＦ）技術、大気圧化学イオン化質量分析（ＡＰＣＩ－ＭＳ）、ＡＰＣＩ－ＭＳ／ＭＳ、ＡＰＣＩ－（ＭＳ）Ｎ、大気圧光イオン化質量分析（ＡＰＰＩ－ＭＳ）、ＡＰＰＩ－ＭＳ／ＭＳ、及びＡＰＰＩ－（ＭＳ）Ｎ、四重極質量分析、フーリエ変換質量分析（ＦＴＭＳ）、定量的質量分析、ならびにイオントラップ質量分析。

【0189】

質量分析法によるタンパク質バイオマーカーの特徴付け及びバイオマーカーレベルの決定の前に、試料を標識及び濃縮するための試料調製戦略が使用される。標識方法としては、限定されるものではないが、相対または絶対定量用の等質量タグ（ｉＴＲＡＱ）、及び細胞培養液中のアミノ酸による安定同位体標識法（ＳＩＬＡＣ）が挙げられる。質量分光分析の前に試料中のバイオマーカータンパク質候補を選択的に濃縮するために使用される捕捉試薬としては、限定されるものではないが、アプタマー、抗体、核酸プローブ、キメラ、低分子物質、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、一本鎖抗体フラグメント、Ｆｖフラグメント、一本鎖Ｆｖフラグメント、核酸、レクチン、リガンド結合受容体、アフィボディ、ナノボディ、アンキリン、ドメイン抗体、代替的抗体スキャフォールド（例えば、ダイアボディなど）、インプリントポリマー、アビマー、ペプチドミメティック、ペプトイド、ペプチド核酸、トレオース核酸、ホルモン受容体、サイトカイン受容体、及び合成受容体、ならびにこれらの改変型及びフラグメントが挙げられる。

【0190】

近接ライゲーションアッセイを使用したバイオマーカーレベルの決定
バイオマーカー値を決定するために、近接ライゲーションアッセイが使用され得る。要約すると、一対の各メンバーがオリゴヌクレオチドで延長された、一対の抗体または一対のアプタマーであり得る一対の親和性プローブと試験試料が接触される。一対の親和性プローブの標的は、１種のタンパク質上の２つの異なる決定基であり得、またはホモもしくはヘテロ多量体の複合体として存在し得る２種の異なるタンパク質上の各々の１種の決定基であり得る。プローブが標的の決定基に結合すると、オリゴヌクレオチド延長部の自由端が、共にハイブリダイズするほど十分に近接する。オリゴヌクレオチド延長部のハイブリダイゼーションは、オリゴヌクレオチド延長部が十分に近接して配置される場合に、それらを共に架橋するのに役立つ共通のコネクターオリゴヌクレオチドにより促進される。プローブのオリゴヌクレオチド延長部がハイブリダイズしたら、延長部の末端が、酵素によるＤＮＡライゲーションによって共に連結される。

【0191】

各オリゴヌクレオチド延長部は、ＰＣＲ増幅のためのプライマー領域を含む。オリゴヌクレオチド延長部が共にライゲーションされると、オリゴヌクレオチドは連続したＤＮＡ配列を形成し、この配列は、ＰＣＲ増幅により、標的タンパク質の同一性及び量に関する情報、ならびに標的決定基が２種の異なるタンパク質上に存在する場合、タンパク質－タンパク質相互作用に関する情報を明らかにする。近接ライゲーションは、リアルタイムＰＣＲを使用することによりリアルタイムのタンパク質濃度及び相互作用情報に関する高感度かつ特異的なアッセイを提供し得る。関心対象の決定基に結合しないプローブは、対応するオリゴヌクレオチド延長部を近接させることはなく、ライゲーションまたはＰＣＲ増幅は進行できず、シグナルの生成をもたらさない。

【0192】

前述のアッセイは、ＣＶイベントのリスクを予測するための方法に有用なバイオマーカー値の検出を可能にし、ここで、当該方法は、対象由来の生体試料中の、表１のバイオマーカーから選択される少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１１種、少なくとも１２種、もしくは１３種のバイオマーカー；または表２のバイオマーカーのうちの少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１１種、少なくとも１２種、少なくとも１３種、少なくとも１４種、少なくとも１５種、少なくとも１６種、少なくとも１７種、少なくとも１８種、少なくとも１９種、少なくとも２０種、少なくとも２１種、少なくとも２２種、少なくとも２３種、少なくとも２４種、少なくとも２５種、少なくとも２６種、もしくは全２７種を検出することを含み、下記で述べるように、バイオマーカー値を使用した分類は、当該対象が、１年、２年、３年、または４年の期間内にＣＶイベントが発生する高いリスクを有するかどうかを示す。本明細書に記載される方法のいずれかによれば、バイオマーカー値は、個別に検出及び分類され得、または例えば、マルチプレックスアッセイフォーマットにおける様に、まとめて検出及び分類され得る。

【0193】

バイオマーカーの分類及び疾患スコアの計算
幾つかの実施形態では、所与の診断試験のバイオマーカー「シグネチャ」は、１組のバイオマーカーを含み、各バイオマーカーは、関心対象の集団において特徴的なレベルを有する。幾つかの実施形態では、特徴的なレベルは、特定の群内の対象についてのバイオマーカーの平均または平均値を指し得る。幾つかの実施形態では、本明細書に記載される診断方法は、対象由来の未知の試料を、２つの群のうちの一方、ＣＶイベントの高いリスクを有する群またはそうでない群のいずれかに割り当てるために使用され得る。

【0194】

試料を２つ以上の群のうちの１つに割り当てることは、分類として公知であり、この割り当てを達成するために使用される手法は分類子または分類法として公知である。分類法は、スコア化法とも称され得る。１組のバイオマーカーレベルから診断分類子を構築するために使用され得る多数の分類方法が存在する。場合によっては、分類法は、区別したい２つ（または多重分類状態の場合はそれより多く）の別個の群の個体から得られた試料を使用してデータセットが収集される、教師あり学習技術を使用して実行される。各試料が属するクラス（群または集団）が、予め試料毎に分かっているため、所望の分類応答が得られるように分類法が訓練され得る。教師なし学習技術を使用して、診断分類子を生成することも可能である。

【0195】

診断分類子を開発するための一般的な手法としては、決定木；バギング＋ブースティング＋フォレスト；推論規則に基づく学習；パルゼン窓；線形モデル；ロジスティック曲線；ニューラルネットワーク法；教師なしクラスタリング；Ｋ平均法；階層的昇順分類／降順分類；半教師あり学習；プロトタイプ法；最近傍法；カーネル密度推定；サポートベクトルマシン；隠れマルコフモデル；ボルツマン学習が挙げられ、分類子は、単純に組み合わされ得るか、または特定の目的関数を最小化する方法で組み合わされ得る。総論に関して、例えば、Ｐａｔｔｅｒｎ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｒ．Ｏ．Ｄｕｄａ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１を参照のこと。Ｔｈｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｌｅａｒｎｉｎｇ － Ｄａｔａ Ｍｉｎｉｎｇ，Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ，ａｎｄ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ，Ｔ．Ｈａｓｔｉｅ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ＋Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍｅｄｉａ，ＬＬＣ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００９も参照のこと。

【0196】

教師あり学習技術を使用して分類子を生成するために、訓練データと呼ばれる１組の試料が取得される。診断試験の文脈において、訓練データは、後に未知の試料が割り当てられる異なる群（クラス）からの試料を含む。例えば、対照集団の対象から収集された試料、及び特定の疾患集団の対象から収集された試料は、未知の試料（または、より具体的には試料が取得された対象）を、疾患を有する、または疾患を有さないのいずれかに分類することができる分類子を開発するための訓練データを構成し得る。訓練データからの分類子の開発は、分類子の訓練として公知である。分類子の訓練に関する具体的な詳細は、教師あり学習技術の性質に依存する。単純ベイズ分類子の訓練は、このような教師あり学習技術の一例である（例えば、Ｐａｔｔｅｒｎ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｒ．Ｏ．Ｄｕｄａ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１；を参照のこと；Ｔｈｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｌｅａｒｎｉｎｇ － Ｄａｔａ Ｍｉｎｉｎｇ，Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ，ａｎｄ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ，Ｔ．Ｈａｓｔｉｅ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ＋Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍｅｄｉａ，ＬＬＣ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００９も参照のこと）。単純ベイズ分類子の訓練は、例えば、米国特許公開第２０１２／０１０１００２号及び同第２０１２／００７７６９５号に記載されている。

【0197】

通常、訓練セットの試料と比べて多数のより高いバイオマーカーレベルが存在する可能性があるため、過剰適合を回避するように配慮する必要がある。過剰適合は、統計モデルが、基礎をなす関係の代わりにランダムエラーまたはノイズを表す場合に起こる。過剰適合は、例えば、分類子開発の際に使用されたバイオマーカーの数を制限すること、バイオマーカーの応答が互いに独立していると仮定すること、用いられる基礎をなす統計モデルの複雑さを制限すること、及び基礎をなす統計モデルがデータに適合することを確実にすること、が含まれる種々の方法で回避され得る。

【0198】

１組のバイオマーカーを使用した診断試験の開発の具体的な例としては、バイオマーカーの厳密な独立した処理によるベイズの定理に基づく単純な確率的分類子である、単純ベイズ分類子の適用が挙げられる。各バイオマーカーは、各クラスにおける測定されたＲＦＵ値または対数ＲＦＵ（相対蛍光単位）値に関するクラス依存性確率密度関数（ｐｄｆ）によって説明される。１つのクラスにおける１組のバイオマーカーに関する結合ｐｄｆは、各バイオマーカーに関する個々のクラス依存性ｐｄｆの積であると推定される。この文脈において単純ベイズ分類子を訓練することは、クラス依存性ｐｄｆを特徴付けるために、パラメータを割り当てること（「パラメータ化」）に等しい。クラス依存性ｐｄｆのために任意の基礎となるモデルが使用され得るが、モデルは、一般に、訓練セットにおいて観察されるデータに適合しなければならない。

【0199】

単純ベイズ分類子の性能は、分類子を構築及び訓練するために使用されるバイオマーカーの数及び質に依存する。単一のバイオマーカーは、ＫＳ（コルモボロフ・スミルノフ）距離に従って働くであろう。良好なＫＳ距離（例えば、＞０．３）を有するバイオマーカーのその後の追加は、その後に追加されるバイオマーカーが第１のバイオマーカーから独立している場合、一般に、分類性能を改善するであろう。分類子スコアとして感度に加えて特異度を使用することにより、多数の高スコア化分類子が、グリーディ法の一種を用いて生成され得る。（グリーディ法は、大域的最適解を見つけるという目的で各段階において局所的に最適な選択を行う、問題解決のためのメタヒューリスティックに従う任意のアルゴリズムである）。

【0200】

分類子性能を描写するための別の方法は、受信者動作特性（ＲＯＣ）、または単純にＲＯＣ曲線もしくはＲＯＣプロットによるものである。ＲＯＣは、２値分類子システムの識別閾値の変化に従う２値分類子システムの感度または真陽性率対偽陽性率（１－特異度または１－真陰性率）のグラフィカルプロットである。このＲＯＣは、陽性のうちの真陽性の比率（ＴＰＲ＝真陽性率）を、陰性のうちの偽陽性の比率（ＦＰＲ＝偽陽性率）に対してプロットすることによっても同等に表され得る。これは、基準の変化に従う２つの動作特性（ＴＰＲ及びＦＰＲ）の比較であるため、相対動作特性曲線としても知られている。ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）は、診断精度の集約尺度として一般的に使用される。これは、０．０～１．０の値を取り得る。ＡＵＣは、重要な統計的性質を有する。すなわち、分類子のＡＵＣは、分類子が無作為に選択された正事例を無作為に選択された負事例よりも上位に順位付けする確率に等しい（Ｆａｗｃｅｔｔ Ｔ，２００６．Ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ ＲＯＣ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｐａｔｔｅｒｎ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ．２７：８６１－８７４）。これは、ウィルコクソンの順位検定に相当する（Ｈａｎｌｅｙ，Ｊ．Ａ．，ＭｃＮｅｉｌ，Ｂ．Ｊ．，１９８２．Ｔｈｅ ｍｅａｎｉｎｇ ａｎｄ ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ａ ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ （ＲＯＣ） ｃｕｒｖｅ．Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ １４３，２９－３６）。既知の参照基準に対する診断試験の性能を表現するための別の方法は、純再分類改善度であり、これは、新しい試験が、参照基準試験と比較して、リスクを正確に増加または減少させる能力である。例えば、Ｐｅｎｃｉｎａ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｓｔａｔ．Ｍｅｄ．３０：１１－２１を参照のこと。ＲＯＣ曲線下のＡＵＣが、２クラスの分類子の性能を評価するのに最適であるが、層別化及び個別化医療は、集団が２よりも多くのクラスを含むという推論に依存する。かかる比較については、上位四分位数対下位四分位数（または十分位数などの他の階層化）のハザード比がより適切に使用され得る。

【0201】

本発明によって可能になるリスク及び可能性予測は、初期治療中の対象もしくは専門心血管センターにおける対象に適用されてもよく、または更には消費者を対象としてもよい。幾つかの実施形態では、イベントを予測するために使用される分類子は、これらが適用される集団に対するいくらかの較正を必要とし得、これは、例えば、民族性または地域に起因する変動が存在し得るためである。幾つかの実施形態では、かかる較正は、大集団での試験によりあらかじめ確立され得、従って、個々の患者に適用される場合に、これらがリスク予測を行う前に組み込まれる。静脈血試料が採取され、適切に処理され、本明細書に記載されるように解析される。解析が完了すると、リスク予測が、遺伝学または人口統計などの本明細書に記載される医療記録からの他のメタデータを組み込み、または組み込まずに、数学的になされ得る。消費者の専門知識のレベルに応じて、様々な形式の情報の出力が可能である。最も単純な種類の出力を求める消費者に対しては、幾つかの実施形態では、情報は、「この人は、今後ｘ年（ここで、ｘは１～４である）にイベントを起こす可能性があるか、はい／いいえ」であってもよく、または代替的に「信号機」の赤色／オレンジ色／緑色に類似するものであってもよく、または高／中／低リスクなどの言葉または書面によるその等価物であってもよい。より詳細を求める消費者に対しては、幾つかの実施形態では、リスクは、単位時間当たりのイベントの確率を連続的なスコアとして示す数もしくは図式として、またはより多数の層（例えば、十分位数）として、及び／またはイベント及び／または最も可能性の高い種類のイベントが起きるまでの平均時間として、出力され得る。幾つかの実施形態では、出力は、治療勧告を含み得る。同じ患者の経時的な縦断的モニタリングは、介入に対する応答または生活様式の変化をグラフに示すことを可能にするであろう。幾つかの実施形態では、患者のニーズ及び異なるレベルの専門知識を有する医療管理チームの個々のメンバーのニーズを満たすために、２種類以上の出力が同時に提供され得る。

【0202】

幾つかの実施形態では、対象由来の血液試料（例えば、血漿試料または血清試料）中の表１または表２に示されるバイオマーカーが、例えば、遅い解離速度のアプタマーなどのアプタマーを使用して検出される。対数ＲＦＵ値を使用して、対象がＣＶイベントを起こすリスクもしくは可能性、または予後予測指数（ＰＩ）が計算される。

【0203】

ＰＩが与えられれば、対象が今後「ｔ」年に心血管イベント（ＣＶイベント）に罹患する確率は、以下の式により得られる。

【数1】

式中、ＰＩは、予後予測指数（または線形予測子）であり、ｓは、極値分布の関連する尺度パラメータである。各種の実施形態では、「ｔ」は、５年以下、４年以下、３年以下、または２年以下である。

【0204】

キット
例えば、本明細書において開示される方法を実行するのに使用するための好適なキットを使用して、本明細書に記載されるバイオマーカーの任意の組み合わせが検出され得る。更に、任意のキットが、本明細書に記載されるような１種以上の検出可能な標識、例えば、蛍光部分などを含み得る。

【0205】

幾つかの実施形態では、キットは、（ａ）生体試料中の１種以上のバイオマーカーであって、当該バイオマーカーが、表１のバイオマーカーから選択される少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１１種、少なくとも１２種、もしくは１３種のバイオマーカー；または表２のバイオマーカーの少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１１種、少なくとも１２種、少なくとも１３種、少なくとも１４種、少なくとも１５種、少なくとも１６種、少なくとも１７種、少なくとも１８種、少なくとも１９種、少なくとも２０種、少なくとも２１種、少なくとも２２種、少なくとも２３種、少なくとも２４種、少なくとも２５種、少なくとも２６種、もしくは２７種全てを含む、当該１種以上のバイオマーカーを検出するための１種以上の捕捉試薬（例えば、少なくとも１種のアプタマーまたは抗体）；及び任意に、（ｂ）当該生体試料が得られた対象を、本明細書において更に記載されるように、高いＣＶイベントリスクを有するもしくは有さないのいずれかに分類するための、または対象が高いＣＶイベントリスクを有する可能性を決定するための１つ以上のソフトウェアまたはコンピュータプログラム製品を含む。あるいは、１つ以上のコンピュータプログラム製品ではなく、上記のステップを人が手作業で実行するための１つ以上の使用説明書が提供され得る。

【0206】

幾つかの実施形態では、キットは、固体支持体、捕捉試薬、及びシグナルを生成する物質を含む。キットは、装置及び試薬の使用、試料の取り扱い、及びデータ解析についての使用説明書も含み得る。更に、キットは、生体試料を解析し、その解析結果を報告するためのコンピュータシステムまたはソフトウェアと共に使用され得る。

【0207】

キットは、生体試料を処理するための１種以上の試薬（例えば、可溶化緩衝液、界面活性剤、洗浄液、または緩衝液）も含み得る。本明細書に記載されるキットのいずれかは、例えば、緩衝液、ブロッキング剤、質量分析用マトリックス物質、抗体捕捉剤、陽性対照試料、陰性対照試料、ソフトウェア、及び情報、例えば、プロトコール、指針、及び参考データも含み得る。

【0208】

幾つかの実施形態では、ＣＶイベントリスクの状態を解析するためのキットが提供され、ここで、当該キットは、本明細書に記載されるバイオマーカーに特異的な１種以上のアプタマー用のＰＣＲプライマーを含む。幾つかの実施形態では、キットは、バイオマーカーの使用説明書及びＣＶイベントのリスクの予測との関係に関する説明書を更に含み得る。幾つかの実施形態では、キットは、本明細書に記載されるバイオマーカーに特異的な１種以上のアプタマーの相補体を含有するＤＮＡアレイ、試薬、及び／または試料ＤＮＡを増幅または単離するための酵素も含み得る。幾つかの実施形態では、キットは、リアルタイムＰＣＲのための試薬、例えば、ＴａｑＭａｎプローブ及び／またはプライマー、ならびに酵素を含み得る。

【0209】

例えば、キットは、（ａ）試験試料中の１種以上のバイオマーカーのレベルを決定するための少なくとも１種の捕捉試薬を含む試薬、及び任意に、（ｂ）当該試験試料中の定量化された各バイオマーカーの量を１つ以上の所定のカットオフ値と比較するステップを実行するための１以上のアルゴリズムまたはコンピュータプログラムを含み得る。幾つかの実施形態では、アルゴリズムまたはコンピュータプログラムは、上記比較に基づいて、定量化された各バイオマーカーにスコアを割り当て、幾つかの実施形態では、合計スコアを得るために、定量化された各バイオマーカーの割り当てられたスコアを合わせる。更に、幾つかの実施形態では、アルゴリズムまたはコンピュータプログラムは、合計スコアを所定のスコアと比較し、対象が高いＣＶイベントリスクを有するかどうかを決定するために、この比較を使用する。あるいは、１つ以上のアルゴリズムまたはコンピュータプログラムではなく、上記のステップを人が手作業で実行するための１つ以上の使用説明書が提供され得る。

【0210】

バイオマーカーパネル
幾つかの実施形態では、表１に列挙されるバイオマーカーのうちの１つ以上が検出される。幾つかの実施形態では、以下の表に列挙されるバイオマーカーのうちの全てが検出される。幾つかの実施形態では、表１に列挙される各タンパク質のレベルが検出される。幾つかの実施形態では、対象が既定期間内に一次ＣＶイベントを起こすリスクまたは可能性を決定するために、１種以上のバイオマーカーまたは全てバイオマーカーの検出が実行される。幾つかのかかる実施形態では、既定期間は、１年、２年、３年、４年、または５年である。幾つかの実施形態では、既定期間は、４年である。

【表1】

【0211】

幾つかの実施形態では、表２に列挙されるバイオマーカーのうちの１つ以上が検出される。幾つかの実施形態では、以下の表に列挙されるバイオマーカーのうちの全てが検出される。幾つかの実施形態では、表２に列挙される各タンパク質のレベルが検出される。幾つかの実施形態では、対象が既定期間内に二次ＣＶイベントを起こすリスクまたは可能性を決定するために、１種以上のバイオマーカーまたは全てバイオマーカーの検出が実行される。幾つかのかかる実施形態では、既定期間は、１年、２年、３年、４年、または５年である。幾つかの実施形態では、既定期間は、４年である。

【表2-1】

【表2-2】

【0212】

コンピュータ方法及びソフトウェア
対象におけるＣＶイベントのリスクまたは可能性を評価するための方法は、以下を含み得る：１）生体試料を得ること；２）分析方法を実行して、生体試料中のパネルのバイオマーカーまたはバイオマーカーのセットを検出及び測定すること；３）任意のデータの正規化または標準化を任意に実行すること；４）各バイオマーカーのレベルを決定すること；及び５）結果を報告すること。幾つかの実施形態では、結果は、集団／対象の民族性に対して較正される。幾つかの実施形態では、バイオマーカーレベルは、何らかの方法で組み合わされ、組み合わされたバイオマーカーレベルについての単一の値が報告される。このアプローチにおいて、幾つかの実施形態では、スコアは、疾患の存在または非存在の指標である予め設定された閾値と比較される、全てのバイオマーカーの統合により決定される単一の数値であり得る。あるいは診断または予測スコアは、各々がバイオマーカー値を示す一連のバーであり得、応答パターンが、疾患、状態、またはイベントの高い（または高くない）リスクの存在または非存在の決定のための予め設定されたパターンと比較され得る。

【0213】

本明細書に記載される方法の少なくとも幾つかの実施形態は、コンピュータを用いて実施され得る。図６にコンピュータシステム１００の例を示す。図６を参照すると、システム１００は、プロセッサ１０１、入力装置１０２、出力装置１０３、記憶装置１０４、コンピュータ可読記憶媒体リーダー１０５ａ、通信システム１０ ６、加速処理装置（例えば、ＤＳＰまたは特殊用途のプロセッサ）１０７、及びメモリ１０９を含む、バス１０８を介して電気的に接続されたハードウェア要素から構成されることが示される。コンピュータ可読記憶媒体リーダー１０５ａは、更にコンピュータ可読記憶媒体１０５ｂに接続され、この組み合わせは、包括的に、コンピュータ可読情報を一時的及び／またはより持続的に収容するための、遠隔、局所、固定、及び／または取り外し可能な記憶装置を加えた記憶媒体、メモリなどに相当し、この組み合わせは、記憶装置１０４、メモリ１０９、及び／または他のかかる任意のアクセス可能なシステム１００リソースを含む。システム１００は、オペレーティングシステム１９２、及び他のコード１９３、例えば、プログラム、データなどが含まれるソフトウェア要素（ここでは作業メモリ１９１内に存在するものとして示される）も含む。

【0214】

図６を参照すると、システム１００は、幅広い柔軟性及び構成可能性を有する。従って、例えば、単一のアーキテクチャーが１つ以上のサーバーを実装するために利用され得、かかるサーバーは更に、一般に望ましいプロトコール、プロトコール変更、拡張などに従って更に構成され得る。しかしながら、より特定のアプリケーション要求に従って実施形態が利用されるであろうことが、当業者にとって明らかである。例えば、１つ以上のシステム要素が、システム１００の構成要素内の（例えば、通信システム１０６内の）下位要素として実装され得る。カスタマイズされたハードウェアが利用されてもよく、及び／またはハードウェア、ソフトウェア、もしくは両方において特定の要素が実装され得る。更に、ネットワーク入力／出力装置（図示せず）などの他のコンピューティングデバイスへの接続が用いられ得るが、他のコンピューティングデバイスへの有線、無線、モデム、及び／または他の接続または複数の接続が利用されていてもよいことを理解されたい。

【0215】

一態様では、システムは、ＣＶイベントのリスクの予測特性を示すバイオマーカーの特徴を含むデータベースを含み得る。バイオマーカーデータ（またはバイオマーカー情報）は、コンピュータ実施方法の一部として使用するためのコンピュータへの入力として利用され得る。バイオマーカーデータは、本明細書に記載されるデータを含み得る。

【0216】

一態様では、システムは、入力データを１つ以上のプロセッサに提供するための１つ以上の装置を更に含む。

【0217】

システムは、順位付けされたデータ要素のデータセットを保存するためのメモリを更に含む。

【0218】

別の態様では、入力データを提供するための装置は、例えば、質量分析計または遺伝子チップリーダーなどのデータ要素の特徴を検出するための検出器を含む。

【0219】

システムは、追加的にデータベース管理システムを含み得る。ユーザーの要求または問い合わせは、問い合わせを処理して訓練セットのデータベースからの関連情報を抽出するデータベース管理システムにより理解される適切な言語でフォーマットされ得る。

【0220】

システムは、ネットワークサーバー及び１つ以上のクライエントが接続されるネットワークに接続可能であり得る。ネットワークは、当該技術分野において周知のように、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）または広域エリアネットワーク（ＷＡＮ）であり得る。好ましくは、サーバーは、ユーザーの要求を処理するためにデータベースのデータにアクセスするためのコンピュータプログラム製品（例えば、ソフトウェア）を実行するのに必要なハードウェアを含む。

【0221】

システムは、データベース管理システムからの命令を実行するためのオペレーティングシステム（例えば、ＵＮＩＸまたはＬｉｎｕｘ）を含み得る。一態様では、オペレーティングシステムは、インターネットなどのグローバル通信ネットワーク上で動作し得、このようなネットワークに接続するためのグローバル通信ネットワークサーバーを利用し得る。

【0222】

システムは、当該技術分野において公知のグラフィカルユーザーインターフェースにおいて通常見出されるようなボタン、プルダウンメニュー、スクロールバー、テキスト入力用フィールドなどインターフェース要素を含むグラフィカルディスプレイインターフェースを含む１つ以上の装置を含み得る。ユーザーインターフェースで入力される要求は、１つ以上のシステムデータベースで関連情報を検索するためにフォーマットするためのシステム中のアプリケーションプログラムに送信され得る。ユーザーにより入力される要求または問い合わせは、任意の好適なデータベース言語で構築され得る。

【0223】

グラフィカルユーザーインターフェースは、オペレーティングシステムの一部としてグラフィカルユーザーインターフェースコードにより生成され得、データを入力するため、及び／または入力されたデータを表示するために使用され得る。処理されたデータの結果は、インターフェースに表示され得、システムと通信する印刷機で印刷され得、記憶装置に保存され得、及び／またはネットワークを介して送信され得、またはコンピュータ可読媒体の形態で提供され得る。

【0224】

システムは、システムにデータ要素に関するデータ（例えば、発現値）を提供するための入力装置と通信し得る。一態様では、入力装置は、例えば、質量分析計、遺伝子チップ、またはアレイリーダーなどが含まれる、遺伝子発現プロファイリングシステムを含み得る。

【0225】

種々の実施形態に従って、ＣＶイベントリスク予測のバイオマーカー情報を解析するための方法及び装置が、任意の好適な方式で、例えば、コンピュータシステムで動作するコンピュータプログラムを使用して実装され得る。リモートアクセス可能なアプリケーションサーバー、ネットワークサーバー、パーソナルコンピュータ、またはワークステーションなどの、プロセッサ及びランダムアクセスメモリを含む従来のコンピュータシステムが使用され得る。追加のコンピュータシステム要素としては、記憶装置または情報記憶システム、例えば、大容量記憶システム及びユーザーインターフェース、例えば、従来型のモニター、キーボード、及びトラッキング装置が挙げられ得る。コンピュータシステムは、独立型システム、またはサーバー及び１つ以上のデータベースを含むコンピュータのネットワークの一部であり得る。

【0226】

ＣＶイベントリスク予測バイオマーカー解析システムは、データ収集、処理、解析、報告、及び／または診断などのデータ解析を完了するための機能及び操作を提供し得る。例えば、一実施形態では、コンピュータシステムは、ＣＶイベントリスク予測バイオマーカーに関する情報を受信、保存、検索、解析、及び報告し得るコンピュータプログラムを実行し得る。コンピュータプログラムは、様々な機能または操作を実行する複数のモジュール、例えば、生データを処理し、補足データを生成するための処理モジュール、ならびに生データ及び補足データを解析して、ＣＶイベントリスクの予測状態及び／または診断またはリスク計算を生成するための解析モジュールを含み得る。ＣＶイベントのリスク状態の計算は、疾患、状態、またはイベントと関連する個体の状態に関する追加の生物医学的情報が含まれる、任意の他の情報を生成または回収すること、更なる試験が望ましい可能性があるかどうかを確認すること、またはそうでなければ個体の健康状態を評価すること、を任意に含み得る。

【0227】

本明細書に記載される幾つかの実施形態は、コンピュータプログラム製品を含むように実装され得る。コンピュータプログラム製品は、アプリケーションプログラムをデータベースを有するコンピュータで実行させるための媒体で具体化されたコンピュータ可読プログラムコードを有するコンピュータ可読媒体を含み得る。

【0228】

本明細書で使用する場合、「コンピュータプログラム製品」は、任意の性質（例えば、文書、電子、磁気、光学、または別の様式）の物理媒体に含まれ、コンピュータまたは他の自動データ処理システムで使用され得る、自然またはプログラミング言語ステートメントの形態で組織化された命令セットを指す。かかるプログラミング言語ステートメントは、コンピュータまたはデータ処理システムで実行される場合、コンピュータまたはデータ処理システムを、特定の内容のステートメントに従って作動させる。コンピュータプログラム製品としては、限定されるものではないが、ソース及びオブジェクトコードでのプログラム、及び／またはコンピュータ可読媒体に記憶されたテストまたはデータライブラリーが挙げられる。更に、コンピュータシステムまたはデータ処理装置を事前に選択された方式で作動させることを可能にするコンピュータプログラム製品が、限定されるものではないが、オリジナルソースコード、アセンブリコード、オブジェクトコード、機械言語、前述の暗号化または圧縮されたバージョン、及び任意の等価物が含まれる、多数の形態で提供され得る。

【0229】

一態様では、ＣＶイベントのリスクを評価するためのコンピュータプログラム製品が提供される。コンピュータプログラム製品は、コンピューティングデバイスまたはシステムのプロセッサにより実行可能なプログラムコードを具体化するコンピュータ可読媒体を含み、当該プログラムコードは、対象由来の生体試料に起因するデータであって、各々が表１または表２のバイオマーカーのうちの１種に対応するバイオマーカーレベルを含む、当該データを取り出すコード；及びバイオマーカー値の関数として当該対象のＣＶイベントリスクの状態を示す分類法を実行するコードを含む。

【0230】

更に別の態様では、ＣＶイベントの可能性またはリスクを示すためのコンピュータプログラム製品が提供される。コンピュータプログラム製品は、コンピューティングデバイスまたはシステムのプロセッサにより実行可能なプログラムコードを具体化するコンピュータ可読媒体を含み、当該プログラムコードは、対象由来の生体試料に起因するデータであって、表１または表２に提供されるバイオマーカーから選択される少なくとも１種のバイオマーカーに対応する当該生体試料における少なくとも１種のバイオマーカー値を含む、当該データを取り出すコード；及びバイオマーカー値の関数として当該対象のＣＶイベントリスクの状態を示す分類法を実行するコードを含む。

【0231】

種々の実施形態が方法または装置として記載されたが、実施形態は、コンピュータと併用されるコード、例えば、コンピュータに内在するか、またはコンピュータによりアクセス可能なコードを介して実施され得ることを理解するべきである。例えば、ソフトウェア及びデータベースが、多数の上記の方法を実施するために利用され得る。従って、ハードウェアにより達成される実施形態に加えて、これらの実施形態が、本明細書で開示された機能の実行可能性をもたらす、コンピュータ可読プログラムコードを具体化したコンピュータ使用可能な媒体から構成される製造物品を使用することより達成され得ることにも留意されたい。従って、それらのプログラムコード手段においても実施形態が本特許によって同様に保護されるものとみなされることが望ましい。更に、実施形態は、ＲＡＭ、ＲＯＭ、磁気媒体、光学媒体、または磁気光学媒体が含まれるが、それらに限定されない、実質的に任意の種類のコンピュータ可読メモリに保存されたコードとして具体化され得る。更により一般的には、実施形態は、限定されるものではないが、汎用プロセッサで作動するソフトウェア、マイクロコード、プログラマブルロジックアレイ（ＰＬＡ）、または特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）が含まれる、ソフトウェアで、またはハードウェアで、またはそれらの任意の組み合わせで実施され得る。

【0232】

更に実施形態が、搬送波で具体化されるコンピュータシグナル、及び伝送媒体を介して伝搬されるシグナル（例えば、電気及び光学）として達成され得ることも想定される。従って、上記の様々な種類の情報は、データ構造などの構造でフォーマットされ得、伝送媒体を介して電気信号として送信され得るか、またはコンピュータ可読媒体に保存され得る。

【0233】

本明細書に列挙された多数の構造、材料、及び行為が、機能を実行するための手段または機能を実行するためのステップとして列挙され得ることにも留意されたい。従って、かかる言葉は、参照により組み込まれる事項を含め、本明細書内で開示されたかかる全ての構造、材料、または行為、及びそれらの等価物を包含することができることを理解すべきである。

【0234】

本明細書において開示されたバイオマーカーの利用、及びバイオマーカー値を決定するための種々の方法は、ＣＶイベントのリスクの評価に関して詳述される。しかしながら、プロセスの用途、同定されたバイオマーカーの使用、及びバイオマーカー値を決定するための方法は、他の特定種類の心血管状態、任意の他の疾患もしくは医学的状態、または補助的な医学的処置により恩恵を受ける可能性があるか、もしくはその可能性がない対象の同定に十分に適用可能である。

【0235】

他の方法
幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるバイオマーカー及び方法は、医療保険料もしくは補償範囲決定及び／または生命保険料もしくは補償範囲決定を決定するために使用される。幾つかの実施形態では、本明細書に記載される方法の結果は、医療保険料及び／または生命保険料を決定するために使用される。幾つかのかかる例では、医療保険または生命保険を提供する組織は、対象のＣＶイベントのリスクまたは可能性に関する情報を要求または別様に取得し、その情報を使用して、対象の適切な医療保険または生命保険料を決定する。幾つかの実施形態では、医療保険または生命保険を提供する組織により検査が要求され、当該組織により代金が支払われる。幾つかの実施形態では、検査は、事業または保険制度または企業の買収候補者により、将来の債務またはコストを予測し、買収を進めるべきかを決定するために使用される。

【0236】

幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるバイオマーカー及び方法は、医療資源の利用を予測及び／または管理するために使用される。幾つかのかかる実施形態では、本方法はかかる予測の目的で実施されないが、本方法により取得された情報は、このような医療資源の利用の予測及び／または管理において使用される。例えば、検査施設または病院は、特定の施設または特定の地理的地域における医療資源の利用を予測及び／または管理するために、本方法により多数の対象に関する情報を集め得る。

【実施例】

【0237】

以下の実施例は、単に例示目的で提供されるものであり、添付の特許請求の範囲により定義される本出願の範囲を限定することを意図しない。以下の実施例に記載される定型的な分子生物学技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ．ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（２００１）などの標準的な実験マニュアルに記載されるように実行され得る。

【0238】

実施例１：アプタマーを使用した例示的なバイオマーカー検出
試料中の１種以上のバイオマーカータンパク質を検出する例示的な方法は、例えば、Ｋｒａｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６（１０）：ｅ２６３３２において記載されており、以下に記載される。３つの異なる定量化方法：マイクロアレイベースのハイブリダイゼーション、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズベースの方法、及びｑＰＣＲが記載される。

【0239】

試薬
ＨＥＰＥＳ、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＭｇＣｌ_２、及びＴｗｅｅｎ－２０は、例えば、Ｆｉｓｈｅｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入され得る。名目上分子量が８０００のデキストラン硫酸ナトリウム塩（ＤｘＳＯ４）は、例えば、ＡＩＣから購入され得、１回の交換で少なくとも２０時間、脱イオン水に対して透析される。ＫＯＤ ＥＸ ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、ＶＷＲから購入され得る。塩化テトラメチルアンモニウム及びＣＡＰＳＯは、例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入され得、ストレプトアビジン－フィコエリトリン（ＳＡＰＥ）は、例えば、Ｍｏｓｓ Ｉｎｃから購入され得る。４－（２－アミノエチル）－ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩（ＡＥＢＳＦ）は、例えば、Ｇｏｌｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入され得る。ストレプトアビジンがコーティングされた９６ウェルプレートは、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入され得る（Ｐｉｅｒｃｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃｏａｔｅｄ Ｐｌａｔｅｓ ＨＢＣ、透明、９６ウェル、製品番号１５５００または１５５０１）。ＮＨＳ－ＰＥＯ４－ビオチンは、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入され得（ＥＺ－Ｌｉｎｋ ＮＨＳ－ＰＥＯ４－Ｂｉｏｔｉｎ、製品番号２１３２９）、無水ＤＭＳＯ中に溶解され、１回使用アリコートで凍結保存され得る。ＩＬ－８、ＭＩＰ－４、リポカリン－２、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＭＰ－７、及びＭＭＰ－９は、例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入され得る。レジスチン及びＭＣＰ－１は、例えば、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈから購入され得、ｔＰＡは、例えば、ＶＷＲから購入され得る。

【0240】

核酸
従来のオリゴデオキシヌクレオチド（アミン置換及びビオチン置換を含む）は、例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）から購入され得る。Ｚ－ブロック（Ｚ－Ｂｌｏｃｋ）は、５’－（ＡＣ－ＢｎＢｎ）７－ＡＣ－３’の配列の一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドであり、ここで、Ｂｎはベンジル置換デオキシウリジン残基を示す。Ｚ－ブロックは、従来のホスホロアミダイト化学を使用して合成され得る。アプタマー捕捉試薬は、従来のホスホロアミダイト化学により合成され得、例えば、Ｗａｔｅｒｓ Ａｕｔｏｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２７６７システム（またはＷａｔｅｒｓ ６００シリーズ半自動システム）で８０℃にて動作する２１．５×７５ｍｍのＰＲＰ－３カラムで、例えば、ｔｉｍｂｅｒｌｉｎｅ ＴＬ－６００またはＴＬ－１５０ヒーター及び生成物を溶出させるための重炭酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）／ＡＣＮの勾配を使用して精製され得る。検出は２６０ｎｍで実行され、主ピークにわたって画分が回収された後に、最も良好な画分がプールされる。

【0241】

緩衝液
緩衝液ＳＢ１８は、４０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０１ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、及び０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ ２０から構成され、ＮａＯＨでｐ Ｈ７．５に調整される。緩衝液ＳＢ１７は、１ｍＭのＥＤＴＡ三ナトリウムを補足したＳＢ１８である。緩衝液ＰＢ１は、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０１ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ三ナトリウム、及び０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ－２０から構成され、ＮａＯＨでｐＨ７．５に調整される。ＣＡＰＳＯ溶出緩衝液は、１００ｍＭのＣＡＰＳＯ（ｐＨ１０．０）及び１ＭのＮａＣｌからなる。中和緩衝液は、５００ｍＭのＨＥＰＥＳ、５００ｍＭのＨＣｌ、及び０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ－２０を含有する。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒは、キット（Ｏｌｉｇｏ ａＣＧＨ／ＣｈＩＰ－ｏｎ－ｃｈｉｐハイブリダイゼーションキット）の一部として供給される独自の配合物である。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ １は、独自の配合物である（Ｏｌｉｇｏ ａＣＧＨ／ＣｈＩＰ－ｏｎ－ｃｈｉｐ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ １、Ａｇｉｌｅｎｔ）。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ ２は、独自の配合物である（Ｏｌｉｇｏ ａＣＧＨ／ＣｈＩＰ－ｏｎ－ｃｈｉｐ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ ２、Ａｇｉｌｅｎｔ）。ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液は、４．５Ｍの塩化テトラメチルアンモニウム、６ｍＭのＥＤＴＡ三ナトリウム、７５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、及び０．１５％（ｖ／ｖ）のサルコシルからなる。ＫＯＤ緩衝液（１０倍濃縮）は、１２００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１５ｍＭのＭｇＳＯ４、１００ｍＭのＫＣｌ、６０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１％ｖ／ｖのトリトン－Ｘ１００、及び１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡからなる。

【0242】

試料調製
血清（１００μＬのアリコートで－８０℃にて保存）を２５℃のウオーターバスで１０分間解凍し、次いで、試料希釈前に氷上で保存する。試料を、穏やかに８秒間ボルテックスすることにより混合する。０．６ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭの三ナトリウムＥＧＴＡ、０．８ｍＭのＡＥＢＳＦ、及び２μＭのＺ－Ｂｌｏｃｋを補足した０．９４×ＳＢ１７中に希釈することにより６％の血清試料溶液を調製する。６％の血清貯蔵液の一部をＳＢ１７中に１０倍希釈して、０．６％の血清貯蔵液を作成する。幾つかの実施形態では、６％及び０．６％の貯蔵液を、それぞれ高存在量及び低存在量分析物を検出するために使用する。

【0243】

捕捉試薬（アプタマー）及びストレプトアビジンプレートの調製
アプタマーを、それらの関連する分析物（またはバイオマーカー）の相対存在量に従って２つの混合物に分類する。貯蔵液濃度は、各アプタマーについて４ｎＭであり、各アプタマーの最終濃度は、０．５ｎＭである。アプタマー貯蔵液混合物をＳＢ１７緩衝液中に４倍希釈し、使用前に９５℃まで５分間加熱し、１５分間にわたり３７℃まで冷却する。この変性－再生サイクルは、アプタマーの立体構造異性体分布を正常化し、これにより、履歴の変動にかかわらず再現性のあるアプタマー活性を確実にすることを目的とする。ストレプトアビジンプレートを、使用前に１５０μＬの緩衝液ＰＢ１で２回洗浄する。

【0244】

インキュベーション及びプレートでの捕捉
加熱－冷却した２×アプタマー混合物（５５μＬ）を、等容量の６％または０．６％の血清希釈物と合わせ、３％及び０．３％の血清を含有する混合物を作成する。プレートをシリコン製シーリングマット（Ａｘｙｍａｔのシリコン製シーリングマット、ＶＷＲ）で密閉し、３７℃で１．５時間インキュベートする。次いで、混合物を洗浄済みの９６ウェルストレプトアビジンプレートのウェルに移し、３７℃に設定したＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ上で８００ｒｐｍで振盪しながら更に２時間インキュベートする。

【0245】

手動でのアッセイ
特に明記しない限り、液体は、それを廃棄し、続いて、重ねたペーパータオル上で２回タップすることにより除去する。洗浄容量は１５０μＬであり、全ての振盪インキュベーションは、２５℃、８００ｒｐｍに設定したＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ上で行う。混合物をピペット操作により除去し、プレートを、１ｍＭの硫酸デキストラン及び５００μＭのビオチンを補足した緩衝液ＰＢ１で１分間、２回洗浄し、次いで、緩衝液ＰＢ１で１５秒間、４回洗浄する。緩衝液ＰＢ１（１５０μＬ／ウェル）中１ｍＭのＮＨＳ－ＰＥＯ４－ビオチンの新たに作成した溶液を添加し、プレートを振盪しながら５分間インキュベートする。ＮＨＳ－ビオチン溶液を除去し、プレートを２０ｍＭのグリシンを補足した緩衝液ＰＢ１で３回洗浄し、緩衝液ＰＢ１で３回洗浄する。次いで、１ｍＭのＤｘＳＯ４を補足した８５μＬの緩衝液ＰＢ１を各ウェルに添加し、プレートをＢｌａｃｋＲａｙ紫外線ランプ（表示波長３６５ｎｍ）下で５ｃｍ離して振盪しながら２０分間照射する。試料を、新たな洗浄済みのストレプトアビジンがコーティングされたプレート、または既存の洗浄済みストレプトアビジンプレートの未使用ウェルに移し、高及び低希釈試料混合物を単一のウェルに合わせる。試料を振盪しながら室温にて１０分間インキュベートする。未吸着物質を除去し、３０％のグリセロールを補足した緩衝液ＰＢ１でそれぞれ１５秒間、８回洗浄する。次いで、プレートを緩衝液ＰＢ１で１回洗浄する。１００μＬのＣＡＰＳＯ溶出緩衝液を用いて、アプタマーを室温で５分間溶出させる。９０μＬの溶出液を９６ウェルのＨｙｂＡｉｄプレートに移し、１０μＬの中和緩衝液を添加する。

【0246】

半自動化アッセイ
吸着された混合物を有するストレプトアビジンプレートを、ＢｉｏＴｅｋ ＥＬ４０６プレート洗浄機のデッキに配置する。洗浄機は、以下のステップを実行するようにプログラムされている。未吸着物質を吸引により除去し、ウェルを１ｍＭの硫酸デキストラン及び５００μＭのビオチンを補足した３００μＬの緩衝液ＰＢ１で４回洗浄する。次いで、ウェルを３００μＬの緩衝液ＰＢ１で３回洗浄する。新たに調製した（ＤＭＳＯ中１００ｍＭの貯蔵液から）１５０μＬの緩衝液ＰＢ１中１ｍＭのＮＨＳ－ＰＥＯ４－ビオチンの溶液を添加する。プレートを振盪しながら５分間インキュベートする。液体を吸引し、ウェルを１０ｍＭのグリシンを補足した３００μＬの緩衝液ＰＢ１で８回洗浄する。１ｍＭの硫酸デキストランを補足した１００μＬの緩衝液ＰＢ１を添加する。これらの自動化ステップの後、プレートをプレート洗浄機から取り出し、ＵＶ光源（ＢｌａｃｋＲａｙ、表示波長３６５ｎｍ）下に取り付けたｔｈｅｒｍｏｓｈａｋｅｒ上に５ｃｍ離して２０分間配置した。ｔｈｅｒｍｏｓｈａｋｅｒは、８００ｒｐｍ及び２５℃に設定される。２０分間の照射後、試料を、新たな洗浄済みストレプトアビジンプレート（または既存の洗浄済みプレートの未使用のウェル）に手作業で移した。高存在量（３％の血清＋３％のアプタマー混合物）及び低存在量の反応混合物（０．３％の血清＋０．３％のアプタマー混合物）を、この時点で単一のウェルに合わせた。この「Ｃａｔｃｈ－２」プレートを、ＢｉｏＴｅｋ ＥＬ４０６プレート洗浄機のデッキに配置する。洗浄機は、以下のステップを実行するようプログラムされている。プレートを振盪しながら１０分間インキュベーションする。液体を吸引し、ウェルを３０％のグリセロールを補足した３００μＬの緩衝液ＰＢ１で２１回洗浄する。ウェルを３００μＬの緩衝液ＰＢ１で５回洗浄し、最終洗浄液を吸引する。１００μＬのＣＡＰＳＯ溶出緩衝液を添加し、振盪しながら５分間アプタマーを溶出させる。これらの自動化ステップ後、次いで、プレートをプレート洗浄機のデッキから取り出し、試料の９０μＬのアリコートを、１０μＬの中和緩衝液を含有するＨｙｂＡｉｄ ９６ウェルプレートのウェルに手作業で移す。

【0247】

特注のＡｇｉｌｅｎｔ ８×１５ｋマイクロアレイへのハイブリダイゼーション
２４μＬの中和された溶出液を新たな９６ウェルプレートに移し、１０種のＣｙ３アプタマーから構成される１組のハイブリダイゼーション対照を含有する、６μＬの１０×Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｌｏｃｋ（Ｏｌｉｇｏ ａＣＧＨ／ＣｈＩＰ－ｏｎ－ｃｈｉｐハイブリダイゼーションキット、大容量、Ａｇｉｌｅｎｔ ５１８８－５３８０）を各ウェルに添加する。３０μＬの２×Ａｇｉｌｅｎｔハイブリダイゼーション緩衝液を各試料に添加し、混合する。４０μＬの得られたハイブリダイゼーション溶液を、ハイブリダイゼーションガスケットスライド（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｇａｓｋｅｔ Ｓｌｉｄｅ、スライドフォーマット当たり８マイクロアレイ、Ａｇｉｌｅｎｔ）の各「ウェル」にピペットを用いて手動で加える。各アプタマーのランダムな４０ヌクレオチド領域に相補的な、アレイ当たり１０種のプローブを、２０×ｄＴリンカーと共に有する特注のアジレントマイクロアレイスライドを、製造業者のプロトコールに従って、ガスケットスライド上に配置する。アセンブリ（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｃｈａｍｂｅｒ Ｋｉｔ、ＳｕｒｅＨｙｂ対応、Ａｇｉｌｅｎｔ）をクランプし、２０ｒｐｍで回転させながら、６０℃で１９時間インキュベートする。

【0248】

ハイブリダイゼーション後の洗浄
約４００ｍＬのＡｇｉｌｅｎｔ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ １を、２つの別個のガラス染色皿のそれぞれに入れる。Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ １に浸しながらスライド（一度に２つ以内）を分解及び分離し、次いで、同様にＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ １を含有する第２の染色皿のスライドラックに移す。スライドを、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ １中で撹拌しながら更に５分間インキュベートする。スライドを、事前に３７℃に平衡化したＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ ２に移し、撹拌しながら５分間インキュベートする。スライドを、アセトニトリルを含有する第４の染色皿に移し、撹拌しながら５分間インキュベートする。

【0249】

マイクロアレイの画像化
マイクロアレイスライドを、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇ２５６５ＣＡマイクロアレイスキャナーシステムを用いて、５μｍの解像度、１００％のＰＭＴ設定でのＣｙ３－チャンネル、及び０．０５で可能になるＸＲＤオプションを使用して画像化する。得られたＴＩＦＦ画像を、ＧＥ１＿１０５＿Ｄｅｃ０８プロトコールにより、Ａｇｉｌｅｎｔの特徴抽出ソフトウェア（バージョン１０．５．１．１）を使用して処理する。

【0250】

Ｌｕｍｉｎｅｘプローブの設計
ビーズに固定化されたプローブは、標的アプタマーの３’末端のランダムな４０ヌクレオチド領域に相補的な４０個のデオキシヌクレオチドを有する。アプタマー相補性領域は、５’アミノ末端を有するヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）リンカーを介して、Ｌｕｍｉｎｅｘマイクロスフェアに結合される。ビオチン化された検出用デオキシオリゴヌクレオチドは、標的アプタマーの５’プライマー領域に相補的な１７～２１個のデオキシヌクレオチドを含む。ビオチン部分は、検出用オリゴの３’末端に付加される。

【0251】

プローブのＬｕｍｉｎｅｘマイクロスフェアへの結合
プローブは、殆ど製造者の使用説明書に従って、Ｌｕｍｉｎｅｘマイクロスフェアに結合されるが、以下のように変更される：アミノ末端オリゴヌクレオチドの量は、２．５×１０^６個のマイクロスフェア当たり０．０８ｎモルであり、２回目のＥＤＣ添加は、１０ｍｇ／ｍＬで５μＬである。カップリング反応は、２５℃及び６００ｒｐｍに設定したＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ＴｈｅｒｍｏＳｈａｋｅｒで行う。

【0252】

マイクロスフェアのハイブリダイゼーション
マイクロスフェア貯蔵液（約４００００個のマイクロスフェア／μＬ）をボルテックスし、Ｈｅａｌｔｈ Ｓｏｎｉｃｓ超音波洗浄機（モデル：Ｔ１．９Ｃ）で６０秒間超音波処理し、マイクロスフェアを懸濁させる。懸濁したマイクロスフェアを、１．５×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液中に、反応当たり２０００個のマイクロスフェアに希釈し、ボルテックス及び超音波処理により混合する。反応当たり３３μＬのビーズ混合物を、９６ウェルのＨｙｂＡｉｄプレートに移す。１×ＴＥ緩衝液中１５ｎＭのビオチン化された検出用オリゴヌクレオチド貯蔵液の７μＬを、各反応に添加し、混合する。１０μＬの中和されたアッセイ試料を添加し、プレートをシリコンキャップのマットシールで密封する。このプレートを初めに９６℃で５分間インキュベートし、通常のハイブリダーゼーションオーブン内で撹拌することなく、５０℃で一晩インキュベートする。フィルタープレート（Ｄｕｒａ ｐｏｒｅ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ部品番号ＭＳＢＶＮ１２５０、１．２μｍの孔径）を、０．５％（ｗ／ｖ）のＢＳＡを補足した７５μＬの１×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液で事前に湿らせる。ハイブリダイゼーション反応から試料容量全体を、フィルタープレートに移す。ハイブリダイゼーションプレートを、０．５％のＢＳＡを含有する７５μＬの１×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液でリンスし、あらゆる残存する物質をフィルタープレートに移す。試料を、１５０μＬの緩衝液を用いて、緩徐な減圧下で濾過し、約８秒間にわたり排気する。フィルタープレートを、０．５％のＢＳＡを含有する７５μＬの１×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液で１回洗浄し、フィルタープレート内のマイクロスフェアを、０．５％のＢＳＡを含有する７５μＬの１×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液中に再懸濁させる。フィルタープレートを光から保護し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍａｌｍｉｘｅｒ Ｒ上で１０００ｒｐｍにて５分間インキュベートする。次いで、フィルタープレートを、０．５％のＢＳＡを含有する７５μＬの１×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液で１回洗浄する。１×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液中１０μｇ／ｍＬの７５μＬのストレプトアビジンフィコエリトリン（ＳＡＰＥ－１００、ＭＯＳＳ，Ｉｎｃ．）を各反応に添加し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍａｌｍｉｘｅｒ Ｒ上で２５℃にて１０００ｒｐｍで６０分間インキュベートする。フィルタープレートを、０．５％のＢＳＡを含有する７５μＬの１×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液で２回洗浄し、フィルタープレート内のマイクロスフェアを、０．５％のＢＳＡを含有する７５μＬの１×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液中に再懸濁させる。次いで、フィルタープレートを光から保護し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍａｌｍｉｘｅｒ Ｒ上で１０００ｒｐｍにて５分間インキュベートする。次いで、フィルタープレートを、０．５％のＢＳＡを含有する７５μＬの１×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液で１回洗浄する。マイクロスフェアを、０．５％のＢＳＡを補足した７５μＬの１×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液中に再懸濁し、ＸＰｏｎｅｎｔ ３．０ソフトウェアを実行するＬｕｍｉｎｅｘ １００機器で解析する。高ＰＭＴ較正及び７５００～１８０００のダブレットディスクリミネータの設定下で、ビーズの種類当たり少なくとも１００個のマイクロスフェアを計数する。

【0253】

ＱＰＣＲの読み取り
ｑＰＣＲの検量線試料を、水を用いて１０倍希釈で、１０８～１０２コピーの範囲で調製し、テンプレートなしの対照を調製する。中和されたアッセイ試料を、ｄｉＨ２Ｏ中に４０倍希釈する。ｑＰＣＲマスターミックスを、２×最終濃度（２×ＫＯＤ緩衝液、４００μＭのｄＮＴＰミックス、４００ｎＭのフォワード及びリバースプライマーミックス、２×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ、ならびに０．５Ｕ ＫＯＤ ＥＸ）で調製する。１０μＬの２×ｑＰＣＲマスターミックスを、１０μＬの希釈したアッセイ試料に添加する。ｑＰＣＲを、ＢｉｏＲａｄ ＭｙＩＱ ｉＣｙｃｌｅｒを用いて、９６℃で２分間、続いて、９６℃で５秒間及び７２℃で３０秒間の４０サイクルで実行する。

【0254】

実施例２．一次心血管イベントの予測のための心血管イベントモデル
心血管疾患の既往歴のない対象が４年以内に一次ＣＶイベントを起こすリスクまたは可能性を予測するために、１３種のバイオマーカータンパク質のパネルを含有する一次心血管疾患（ＣＶＤ）モデルを開発した。一次ＣＶイベントは、心筋梗塞、脳卒中、一過性脳虚血発作、心不全による入院、またはＣＶＤに起因する死亡と定義された。一次ＣＶＤイベントを豊富に含む症例コホート研究デザインであるＨＵＮＴ３データセットを使用して、訓練／検証解析を開始した。研究は２，５１５人を含み、そのうちの４１．５１％が５年以内にＣＶＤイベントを起こした。Ｋｒｏｋｓｔａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．２０１３；４２：９６８－９７７を参照のこと。データを訓練用の８０％及び検証用の２０％に分割した。Ｗｈｉｔｅｈａｌｌ ＩＩ研究（Ｍａｒｍｏｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｅａｌｔｈ ｉｎｅｑｕａｌｉｔｉｅｓ ａｍｏｎｇ Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｉｖｉｌ Ｓｅｒｖａｎｔｓ：ｔｈｅ Ｗｈｉｔｅｈａｌｌ ＩＩ ｓｔｕｄｙ．”Ｌａｎｃｅｔ １９９１；３３７：１３８７－１３９３を参照のこと）からの独立した複製セットでの予測を有効性検証段階で実施した。

【0255】

モデル
心血管疾患（ＣＶＤ）一次モデルは、ワイブル分布を用いた加速死亡時間（ＡＦＴ）パラメトリック生存モデルである。このモデルは、その特徴として１３種のバイオマーカー、年齢、及び年齢との相互作用を有する。４年のリスクが報告された。予測を、４つのリスクビン及び３つのリスク分類にビニングした。４年にわたる訓練セットでのスコア化及び対応する実際のイベント発生率を表３に報告する。

【表3】

【0256】

結果
コンコーダンス統計量（Ｃ統計量）、ＲＯＣ曲線（ＡＵＣ）下面積、及び再適合されたＰＣＥモデル（ＨＵＮＴ３訓練データに再適合された）と比較した、分類を作らない純再分類改善度（ＮＲＩ）、ならびに５年間の予測について公開されたＰＣＥモデルを以下の表４に示す。最終モデルを、ＨＵＮＴ３の２０％のホールドアウト検証データセットでも評価した。

【表4】

ＨＵＮＴ３訓練セットでは、４６８人の患者が７．５％未満のＰＣＥリスクスコアを有した。最も近い計算された４年のプロテオミクスリスクカットオフ値は、２．１５％であり、４６９人の患者が２．１５％未満のリスクを有すると予測された。従って、健常なベースライン層は、４年で２．１５％未満のプロテオミクスリスクを有すると予測された個体として定義された。この集団における平均プロテオミクスリスクは、１．５３％であった。４つのリスクビンを、１ｘ、２ｘ、３ｘ、４ｘ、５ｘ、及び６ｘ以上として計算した（表３を参照のこと）。図１は、ＨＵＮＴ３訓練セットについての４つのリスクビンに層別化されたカプランマイヤー生存曲線を示す。図１は、経時的なＣＶＤ一次イベントの経験分布が異なる予測リスクビン群間でどれだけ分離しているかの概観を提供し、網掛け領域はカプランマイヤー推定値の９５％信頼区間を表す。図１は、明白にリスクビン間の分離を示し、４年で生存分布が重なっていない。

【0257】

最終モデルを訓練及び検証データセットの全個体（０．０５未満を含む全てのＰＣＥリスクスコア）についても評価した。結果を表５に示す。最終モデルは、全個体についても、競合する再適合された臨床的ＰＣＥモデルと比べて性能がより良好であった。

【表5】

一次ＣＶＤモデルは、幾つかのパラメータの改良により更に特徴付けられた。性別に基づく顕著な影響または予備的な干渉物質評価における顕著な影響は見られなかった。モデルを２００５反復のアッセイＱＣ試料に適用した。予測には再現性があり、０．０５の平均及び０．００８の標準偏差であった。試料処理時間に基づく大きな変動は見られなかった。

【0258】

有効性検証
モデル有効性検証を、２６５人の個体を含み、そのうちの１０１人がＣＶイベントを有した（３８．１１％）Ｗｈｉｔｅｈａｌｌ ＩＩデータセットで実行した。データセットにおける分析物のＲＦＵ値は、解析前にｌｏｇ１０変換した。範囲外のｌｏｇ１０ ＲＦＵ値を、ＨＵＮＴ３訓練データを使用したモデル開発時にウィンザー化により計算されたアプタマー特異的な最大値及び最小値を使用して補完した。次いで、最終プロテオミクスモデルを、５年の時点でのデータセットで評価し、公開されたＰＣＥモデルとの比較として純再分類改善度（ＮＲＩ）を計算した。これを表６に示す。

【表6】

プロテオミクスモデルを使用したＷｈｉｔｅｈａｌｌ ＩＩ有効性検証データセットでの予測のＮＲＩは正であり、結果は、再適合されたＰＣＥモデル（ＨＵＮＴ３訓練データで開発された）のＨＵＮＴ３検証データでの結果より良好であった。

【0259】

実施例３．二次心血管イベントの予測のための心血管イベントパネル
既知の明らかに安定した心血管疾患を有する対象が４年以内に二次ＣＶイベントを起こすリスクまたは可能性を予測するために、２７種のバイオマーカータンパク質のパネルを含有する二次心血管疾患（ＣＶＤ）モデルを開発した。二次ＣＶイベントは、心筋梗塞、脳卒中、一過性脳虚血発作、心不全による入院、または死亡と定義された。訓練／検証解析を、既知の明らかに安定したＣＶＤを有する適格基準を満たした個体から構成されるＨＵＮＴ３データセットのサブコホートを使用して開始した。ＨＵＮＴ３研究は、試料がＱＣメトリックを通過した７５４人の個体を含み、４年以内に２０８（２８％）のＣＶイベントが観察された。データを訓練用の８０％及び有効性検証用の２０％に分割した。解析を、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ Ｒｉｓｋ ｉｎ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ（ＡＲＩＣ）研究の５回目来院時データセットの２０％の検証サブセットにより補完した。（Ｔｈｅ Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ Ｒｉｓｋ ｉｎ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ（ＡＲＩＣ） Ｓｔｕｄｙ：ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅｓ．Ｔｈｅ ＡＲＩＣ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ．Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．１９８９；１２９（４）：６８７－７０２を参照のこと）。ＡＲＩＣ研究の５回目来院時の残りの８０％及びＨＵＮＴ３データセットの２０％を使用する独立した複製セットでの予測は、有効性検証の間、開鍵された。

【0260】

モデル
二次心血管疾患（ＣＶＤ）モデルは、ワイブル分布を用いたＡＦＴパラメトリック生存モデルである。このモデルは、２７種のバイオマーカー（ｌｏｇ１０スケールに変換され、中心化及びスケール化された）のパネルを特徴として有する。４年のリスクが報告された。予測を、４つのリスクビン及び３つのリスク分類にビニングした。４年にわたる訓練セットでのスコア化及び対応する実際のイベント発生率を表７に報告する。

【表7】

【0261】

結果
４年間の予測についてのＣ統計量、ＡＵＣ、及び再適合されたＰＣＥモデルと比較したＮＲＩ（ＨＵＮＴ３訓練データに再適合された）を、以下の表８に示す。二次ＣＶＤモデルは、訓練（ＨＵＮＴ３）及び検証（ＡＲＩＣ研究の５回目来院時）データセットにおいて、４年間でより高いＣ統計量及びＡＵＣ値及び正のＮＲＩを有した。

【表8】

次いで、ベースライン群が相対的に健常（４年で５％のイベント発生率）であり、高リスク群が顕著に増進したイベント発生率（４年で６５％のイベント発生率）を有するように、訓練セットのリスク確率を４つのビンに分類した。上記の表７を参照のこと。４つ全ての分類は、４年間で９５％信頼度で異なった。ＨＵＮＴ３訓練セット（図２）及びＡＲＩＣ５回目来院時検証セット（図３）について、４つのリスクビンにより層別化された群を、図２及び３のカプランマイヤー生存曲線に示す。図２及び３は、経時的な二次ＣＶＤイベントの経験分布が異なる予測リスクビン群間でどれだけ分離しているかの概観を提供し、網掛け領域はカプランマイヤー推定値の９５％信頼区間を表す。

【0262】

有効性検証
モデル有効性検証を、ＨＵＮＴ３の２０％ホールドアウト及びＡＲＩＣの８０％ホールドアウト有効性検証セットで実行した。データセットにおける分析物のＲＦＵ値は、解析前にｌｏｇ１０変換した。次いで、分析物ＲＦＵ値を、訓練セットの分布のみに基づいて中心化及びスケール化し、範囲外のｌｏｇ１０ ＲＦＵ値をウィンザー化により計算された値を使用して補完した。二次ＣＶＤ最終モデルのＣ統計量及びＡＵＶを、４年の時点でのデータセットで評価し、再適合されたＰＣＥモデルと比較した。再適合されたＰＣＥモデルと比較したＮＲＩを計算した。これを表９に示す。

【表9】

二次ＣＶＤモデルは、訓練、検証、及び有効性検証セットにおいて、４年でイベントありの対象とイベントなしの対象との分類、及びより早期のイベントの予測のコンコーダンス統計量において、再適合されたＰＣＥ臨床モデル（性別及び民族性による分離係数が含まれる、ＡＣＣリスク方程式からの臨床的及び人口統計的パラメータを使用）より優れていた。ＮＲＩは、両方の有効性検証セット（ＨＵＮＴ３及びＡＲＩＣの５回目来院時）で正であった。図４及び５は、カットオフ値により層別化された、ＨＵＮＴ３及びＡＲＩＣの５回目来院時の有効性検証セットについての生存曲線を示す。分類別の順序及び傾きは、訓練セット及び経験的に観察されたイベント発生率から予想される分布と同様であった。最も高いリスク群が区別された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【国際調査報告】