(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-11-04
(54)【発明の名称】脳癌型の識別
(51)【国際特許分類】
G01N 21/552 20140101AFI20221027BHJP
G01N 21/3577 20140101ALI20221027BHJP
G01N 33/49 20060101ALI20221027BHJP
【ＦＩ】
G01N21/552
G01N21/3577
G01N33/49 K
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022514006
(86)(22)【出願日】2020-09-02
(85)【翻訳文提出日】2022-04-20
(86)【国際出願番号】 EP2020074391
(87)【国際公開番号】W WO2021043787
(87)【国際公開日】2021-03-11
(31)【優先権主張番号】1912578.0
(32)【優先日】2019-09-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521154420
【氏名又は名称】ディーエックスカバー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100147485
【弁理士】
【氏名又は名称】杉村 憲司
(74)【代理人】
【識別番号】230118913
【弁護士】
【氏名又は名称】杉村 光嗣
(74)【代理人】
【識別番号】100119530
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 和幸
(72)【発明者】
【氏名】マシュー ジェイ ベイカー
(72)【発明者】
【氏名】ジェームス キャメロン
【テーマコード（参考）】
2G045
2G059
【Ｆターム（参考）】
2G045AA14
2G045AA26
2G045BB10
2G045CA25
2G045CA26
2G045CB17
2G045DA20
2G045FA14
2G045FA25
2G045JA01
2G059AA06
2G059BB04
2G059BB13
2G059CC16
2G059DD04
2G059EE01
2G059EE02
2G059EE12
2G059HH01
2G059HH06
2G059MM01
2G059MM05
2G059MM10
(57)【要約】
本発明は、脳腫瘍を有する疑いのある被検体が神経膠腫を有するかまたはリンパ腫を有するかを判定する方法に関する。本発明はまた、脳腫瘍を有する疑いのある被検体が神経膠腫を有するかまたはリンパ腫を有するかを判定するための診断キット、および、脳腫瘍を有する疑いのある被検体のための治療の選択を促進する方法に関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
脳腫瘍を有する疑いのある被検体が神経膠腫を有するかまたはリンパ腫を有するかを判定する方法であって、前記被検体から単離された血液サンプル（またはその成分）に分光分析を行って、前記血液サンプル（またはその成分）に特徴的な分光学的シグネチャを得ることであって、前記分光分析は、減衰全反射ＦＴＩＲ（ＡＴＲ－ＦＴＩＲ）である、ことと、
前記得られた血液サンプル（またはその成分）に特徴的な分光学的シグネチャを用いて、前記被検体が神経膠腫を有するかまたはリンパ腫を有するかを判定することと
を含む、方法。
【請求項2】
前記血液サンプル（またはその成分）に特徴的な分光学的シグネチャが、４００～４０００ｃｍ－１のスペクトルである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記血液サンプル（またはその成分）に特徴的な分光学的シグネチャが、９００～１８００ｃｍ－１のスペクトルである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記血液サンプル（またはその成分）に特徴的な分光学的シグネチャが、１４００～１８００ｃｍ－１のスペクトルである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記リンパ腫が、中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
シリコン内部反射要素が、分光分析中に前記血液サンプル（またはその成分）を支持する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
「ＡＴＲ結晶」が、分光分析中に前記血液サンプル（またはその成分）を支持する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記神経膠腫が、多形性神経膠芽腫である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記得られた血液サンプル（またはその成分）に特徴的な分光学的シグニチャの少なくとも一部が対照分光学的シグニチャの少なくとも一部よりも低い場合、前記被検体は前記神経膠腫を有すると判定され、前記得られた血液サンプル（またはその成分）に特徴的な分光学的シグニチャの少なくとも一部が対照分光学的シグニチャの少なくとも一部よりも高い場合、前記被検体は前記リンパ腫を有すると判定される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記対照分光学的シグネチャが、神経膠腫またはリンパ腫の判定との相関を導き出すために、データベース（例えば、「トレーニングセット」）に保存された複数の事前相関シグネチャを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記得られた血液サンプル（またはその成分）に特徴的な分光学的シグネチャを用いて前記被検体が神経膠腫を有するかまたはリンパ腫を有するかを判定することが、事前相関分析のデータベースの（例えば、パターン認識アルゴリズムを介した）「トレーニング」によって開発された予測モデルに基づいて、前記得られた分光学的シグネチャを神経膠腫またはリンパ腫の判定と相関させることを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記得られた血液サンプル（またはその成分）に特徴的な分光学的シグネチャを用いて前記被検体が神経膠腫を有するかまたはリンパ腫を有するかを判定することが、前記被検体の治療の決定を促進する、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記血液サンプルまたはその成分中の１つまたは複数の生物学的マーカーの状態を検出することをさらに含む、請求項１～１２のいずれかに記載の方法。
【請求項14】
前記１つまたは複数の生物学的マーカーの状態の検出が、前記マーカーが変異を含むか、あるいは野生型として存在するかを検出することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記血液サンプルまたはその成分中の前記１つまたは複数の生物学的マーカーの状態が、前記血液サンプルまたはその成分から得られたサイズ分画されたサンプルに対して行われる、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項16】
前記サイズ分画された血液サンプルまたはその成分が、前記サンプルの遠心濾過によって得られたものである、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記１つまたは複数の生物学的マーカーが、ＩＤＨを含む、請求項１３～１６のいずれかに記載の方法。
【請求項18】
前記被検体が前記神経膠腫を有すると判定された場合、前記被検体の少なくとも１つの治療の決定が促進され、前記被検体が前記リンパ腫を有すると判定された場合、前記被検体の少なくとも１つの他の異なる治療の決定が促進される、請求項１２～１７のいずれかに記載の方法。
【請求項19】
前記被検体が前記リンパ腫を有すると判定された場合、化学療法および／または放射線療法による治療が選択され、前記被検体が前記神経膠腫を有すると判定された場合、外科手術による治療が選択され、任意で、生物学的マーカーの状態が、行うべき切除の程度を外科医が決定するのに役立つ、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記血液サンプルが、血清または血漿である、請求項１～１９のいずれかに記載の方法。
【請求項21】
脳腫瘍を有する疑いのある被検体が神経膠腫を有するかまたはリンパ腫を有するかを判定するための診断キットであって、前記被検体から血液サンプル（またはその成分）を受け取り、前記被検体の血液サンプル（またはその成分）に分光分析を行って前記血液サンプル（またはその成分）に特徴的な分光学的シグニチャを作成するように構成される装置と、
前記得られた血液サンプル（またはその成分）に特徴的な分光学的シグニチャを用いて、前記被検体が神経膠腫を有するかまたはリンパ腫を有するかを判定する装置とを含み、
前記分光分析が、減衰全反射ＦＴＩＲ（ＡＴＲ－ＦＴＩＲ）である、
診断キット。
【請求項22】
前記血液サンプル（またはその成分）に分光分析を行う装置が、前記被検体が神経膠腫を有するかまたはリンパ腫を有するかを判定する装置と同一である、請求項２１に記載の診断キット。
【請求項23】
前記被検体が神経膠腫を有するかまたはリンパ腫を有するかを判定する装置が、コンピュータを含むか、コンピュータと通信し、前記コンピュータには、被検体の血液サンプルの分光学的シグニチャに基づいて神経膠腫およびリンパ腫に関する判定を行うように前記コンピュータを動作させるように構成されたコンピュータソフトウェアがインストールされる、請求項２１または２に記載の診断キット。
【請求項24】
血液サンプルを受け取るように構成された前記装置が、必要な厚さおよび乾燥度の血液サンプル（またはその成分）を自動的に調製するように構成される、請求項２１～２３のいずれかに記載の診断キット。
【請求項25】
請求項２３に記載のコンピュータソフトウェアを含む、コンピュータ可読媒体。
【請求項26】
脳腫瘍を有する疑いのある被検体のための治療の選択を促進する方法であって、前記被検体から単離された血液サンプル（またはその成分）に分光分析を行って、前記血液サンプル（またはその成分）に特徴的な分光学的シグニチャを得ることであって、前記分光分析は、減衰全反射ＦＴＩＲ（ＡＴＲ－ＦＴＩＲ）である、ことと、
前記得られた血液サンプル（またはその成分）に特徴的な分光学的シグニチャを用いて前記被検体が神経膠腫を有するかまたはリンパ腫を有するかを判定することと、前記神経膠腫またはリンパ腫の判定に基づいて治療を選択することと含む、方法。
【請求項27】
前記被検体が前記リンパ腫を有すると判定された場合、化学療法および／または放射線療法による治療が選択され、前記被検体が前記神経膠腫を有すると判定された場合、外科手術による治療が選択される、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、脳腫瘍を有する疑いのある被検体が神経膠腫を有するかまたはリンパ腫を有するかを判定する方法に関する。本発明はまた、脳腫瘍を有する疑いのある被検体が神経膠腫を有するかまたはリンパ腫を有するかを判定するための診断キット、および、脳腫瘍を有する疑いのある被検体のための治療の選択を促進する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
脳腫瘍罹患率は１９９０年代初頭から増加しており、イギリスだけでも３４％増加している。患者生存の改善にもかかわらず、診断後１０年以上生存する患者はわずか１４％であり、平均余命の２０年の短縮は全ての癌の中で最も高い。腫瘍型の迅速かつタイムリーな診断および判定は、管理と患者の転帰とを促進する上で重要である。
【0003】
脳腫瘍に最も頻繁に関連する症状は、頭痛など非特異的症状である。こういった一般的な症状がある患者のうちのどの患者に脳腫瘍の可能性が最も高く脳撮像を早期に行うべきかを特定することは、医師にとって課題である。結果として、診断までに患者は一般開業医（ｇｅｎｅｒａｌ ｐｒａｃｔｉｔｉｏｎｅｒ：ＧＰ）を何度も訪問することが多く、患者の３分の２近くは、悪化してから救急科で診断されることになる。既存の紹介ガイドラインは感度および特異度に欠けており、一次医療から緊急の脳撮像を紹介された患者のうち脳腫瘍を有するものはわずか１．６％であり、多くの脳スキャンが不要であることを示唆している。
【0004】
脳腫瘍は、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）やコンピュータ断層撮影法（ＣＴ）の脳撮像で診断されるが、その基となる起始細胞に応じてさまざまな種類がある。撮像だけでは腫瘍型を確実に特定することはできないということは重大な問題である。異なる脳腫瘍型、例えば、中枢神経系（ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ：ＣＮＳ）リンパ腫および神経膠芽腫（膠芽腫）（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ：ＧＢＭ）は、ＭＲＩで類似の外観を示し得るが、治療オプションは大きく異なる。また、神経膠腫の状態は、必要とされる手術の程度に影響し得る。例えば、最大限安全な外科的切除の試みは、ＩＤＨ１変異型神経膠腫の患者にとってはより理にかなっているが、ＩＤＨ１野生型神経膠腫の患者には、より限局的な切除の方がより適切であるかもしれない。
【0005】
脳腫瘍型には、外科手術による治療が最も一般的なものもあれば、放射線療法および／または化学療法を用いた治療が最も一般的なものもある。異なる脳腫瘍型を明確に区別するための検査がない場合、医師は、腫瘍型が判明することを期待して、および、もし腫瘍が外科手術で治療できる型であれば腫瘍を除去することを期待して、ファーストパスとして外科手術を採用することが多い。しかし、脳外科手術には、脳卒中や死亡などの深刻なリスクが伴う。一般的に外科手術で治療されない腫瘍型であることが判明した患者にとっては、不要なリスクに曝されることになる。また、化学療法および／または放射線療法などのより適した治療の開始が遅れることにもなる。
【0006】
最近、血液中のさまざまなバイオマーカーが特定の疾患の有用な指標として同定されている。例えば、サイトカイン、ケモカイン、および成長因子は、さまざまな生理学的反応を媒介する細胞シグナル伝達タンパク質であり、さまざまな疾患に関連する。このような分子は、一般に生物学的検定または免疫学的検定によって検出されるが、一度に１つの検体しか分析できない場合が多いため、どちらも時間がかかる可能性がある。
【0007】
より最近では、振動分光法に基づく分析手法が疾患診断の分野で登場している。特にフーリエ変換赤外分光法（Ｆｏｕｒｉｅｒ－ｔｒａｎｓｆｏｒｍ ｉｎｆｒａｒｅｄ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＦＴＩＲ）は、医学研究においてどんどん普及している。ＦＴＩＲ分光法では、生体サンプルに赤外線（ＩＲ）光を照射する。この光の吸光度は、サンプル内において分子振動および遷移を引き起こし、生化学的指紋を表すＩＲスペクトルを生じ、存在するタンパク質、脂質、炭水化物、および核酸のレベルを特性化および定量化することができる。これらの生体分子成分の不均衡は、疾患状態の目安となり得る。
【0008】
脳外科手術を要さずに脳腫瘍型を正確かつ迅速に区別できる方法が明らかに必要である。本発明は、上記の問題の１つまたは複数に対処することを目的とする。
【発明の概要】
【0009】
広義には、本開示は、被検体が神経膠腫を有するかまたはリンパ腫を有するかの判定における、被検体からのサンプルに対する減衰全反射ＦＴＩＲの使用に関する。
【0010】
第１の態様によれば、脳腫瘍を有する疑いのある被検体が神経膠腫を有するかまたはリンパ腫を有するかを判定する方法が提供される。本方法は、被検体から単離された血液サンプル（またはその成分）に分光分析を行って、血液サンプル（またはその成分）に特徴的な分光学的シグネチャを得ることを含む。ここで、分光分析は、減衰全反射ＦＴＩＲ（ＡＴＲ－ＦＴＩＲ）である。本方法はさらに、得られた血液サンプル（またはその成分）に特徴的な分光学的シグネチャを用いて被検体が神経膠腫を有するかまたはリンパ腫を有するかを判定することを含む。
【0011】
神経膠腫やリンパ腫などの異なる脳腫瘍型を区別することは非常に難しい。２つの脳腫瘍型を区別しようとするＭＲＩなどの現行の方法は、不正確であることが多く、コストも高い。脳外科手術などの他の方法は、患者に侵襲的であり、高リスクである。また、これらの方法は、時間がかかる。その結果、患者の治療の開始が遅れる可能性がある。脳腫瘍の深刻さを考えると、時間は極めて重要であり、不必要な遅延は被検体の生存率にかかわる。本発明は、患者の神経膠腫とリンパ腫とを区別するための迅速な検査を提供する。これにより、医師や臨床医は、被検体に最も適切な治療を迅速に選択して開始できるため、時間の遅れを軽減し、被検体が治療に反応する可能性を高めることができる。加えて、本方法は、脳外科手術と比較して非侵襲的であり、分析に必要なのは被検体からの血液サンプルのみである。こうして、有利なことに、被検体が脳外科手術の深刻なリスクに不必要にさらされることがなくなる。この検査はまた、神経膠腫とリンパ腫との区別においてかなり高い精度を有し、脳腫瘍型を判定する現行の方法よりも安価である。
【0012】
実施形態において、得られた血液サンプル（またはその成分）に特徴的な分光学的シグネチャを用いた被検体が神経膠腫を有するかまたはリンパ腫を有するかの判定は、得られた血液サンプル（またはその成分）に特徴的な分光学的シグネチャを分析して、被検体が神経膠腫を有するかまたはリンパ腫を有するかを示す分析を得ることを含む。
【0013】
得られた血液サンプル（またはその成分）に特徴的な分光学的シグネチャの分析は、得られた血液サンプル（またはその成分）に特徴的な分光学的シグネチャを１つまたは複数の対照分光学的シグネチャと比較することを含んでいてもよい。
【0014】
有利なことに、分析によって、被検体は、リンパ腫を有する被検体または神経膠腫を有する被検体に分類される。分析は、通常、臨床医の判断を促進するために臨床医に提示される。これにより、臨床医によるユーザーエラーの可能性が低下し、判定の精度が向上し、臨床医の負担が軽減される。
【0015】
本発明者らは、得られた分光学的シグネチャに１つまたは複数のアルゴリズムを適用することによって得られた分光学的シグネチャを分析できることを見出した。したがって、実施形態において、得られた血液サンプル（またはその成分）に特徴的な分光学的シグネチャの分析は、得られた血液サンプル（またはその成分）に特徴的な分光学的シグネチャにアルゴリズムを適用することを含む。
【0016】
いくつかの実施形態において、得られた血液サンプル（またはその成分）に特徴的な分光学的シグネチャへのアルゴリズムの適用は、（さらに）、得られた血液サンプル（またはその成分）に特徴的な分光学的シグネチャを１つまたは複数の対照分光学的シグネチャと比較することを含む。
【0017】
実施形態において、対照分光学的シグネチャは、リンパ腫および／または神経膠腫の被検体からのものであると以前に判定された１つまたは複数の事前相関シグネチャを含む。対照分光学的シグネチャは、神経膠腫またはリンパ腫の判定との相関を導き出すためにデータベース（例えば、「トレーニングセット」）に保存された複数の事前相関シグネチャを含んでもよい。例えば、本方法は、当該データベースを使用するかまたは当該データベースから少なくとも部分的に開発されたアルゴリズムを適用することを含んでいてもよい。１つまたは複数の対照分光学的シグネチャのさらなる詳細については後述する。
【0018】
得られた分光学的シグネチャに１つまたは複数のアルゴリズムを適用することにより、被検体を、神経膠腫を有する恐れのある被検体またはリンパ腫を有する恐れのある被検体に分類することができる。得られた血液サンプル（またはその成分）に特徴的な分光学的シグネチャを用いて被検体が神経膠腫を有するかまたはリンパ腫を有するかを判定するこの能力は、神経膠腫を有する被検体から得られる分光学的シグネチャとリンパ腫の被検体から得られる分光学的シグネチャとの間の違いがわずかであるかほとんどないことから鑑みて、とりわけ驚くべきものである。
【0019】
アルゴリズムは、予測モデルを含んでもよい。予測モデルは、事前相関シグネチャのデータベースを（例えば、パターン認識アルゴリズムを介して）「トレーニング」することによって開発されてもよい。このように、得られた血液サンプル（またはその成分）に特徴的な分光学的シグネチャを用いた被検体が神経膠腫を有するかまたはリンパ腫を有するかの判定は、予測モデルを使用して得られた分光学的シグネチャを神経膠腫またはリンパ腫の判定と相関させることを含んでいてもよい。
【0020】
「事前相関シグニチャ」は、神経膠腫またはリンパ腫の判定と相関するとすでに判定されたシグニチャを指す。例えば、事前相関シグネチャは、リンパ腫または神経膠腫を有することが知られている被検体から単離された血液サンプル（またはその成分）から得られたものであってもよい。このように、いくつかの実施形態において、本方法はさらに、神経膠腫またはリンパ腫を有することがすでに知られている被検体から単離された血液サンプル（またはその成分）から分光学的シグネチャを得ることによって事前相関シグネチャのデータベースをまとめることを含む。
【0021】
事前相関シグネチャのデータベースのトレーニングは、事前相関分光学的シグネチャに分類モデルを適用することを含んでいてもよい。こうして、分類モデルを用いて得られたパターン認識アルゴリズムなどのアルゴリズムを、得られた血液サンプル（またはその成分）に特徴的な分光学的シグネチャに適用して、被検体が神経膠腫を有するかまたはリンパ腫を有するかを判定することができる。
【0022】
適した分類モデルには、ランダムフォレスト、サポートベクターマシン、および部分最小二乗判別分析が含まれるが、これらに限定されない。本発明者らは、これらのモデルのそれぞれが、被検体が神経膠腫を有するかまたはリンパ腫を有するかを判定することができることを見出した。いくつかの実施形態において、分類モデルは、部分最小二乗判別分析を含む。理論に束縛されるものではないが、本発明者らは、部分最小二乗判別分析が、被検体が神経膠腫を有するかまたはリンパ腫を有するかの判定において特に正確であると考える。これは、本発明者にとって全く予想外である。
【0023】
いくつかの実施形態において、分類モデルはさらに、１つまたは複数の非バイアス法を含む。非バイアス法は、例えば、リンパ腫を有する被検体に対して神経膠腫を有する被検体のサンプル数が多いなど、トレーニングセットまたはサンプルセットが一方向にバイアスされている場合に、バイアスがないようにするのに役立つ。
【0024】
適した非バイアス方法には、アップサンプリング、ダウンサンプリング、および合成マイノリティオーバーサンプリング手法（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍｉｎｏｒｉｔｙ ｏｖｅｒ－ｓａｍｐｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ：ＳＭＯＴＥ）が含まれるが、これらに限定されない。アップサンプリングは、マイノリティクラスを繰り返しサンプリングしてサンプル数を増やすことを含む（Ｓｉｍａｆｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。ダウンサンプリングでは、マジョリティクラスのサブセットをランダムに選択し、余分なサンプルを削除してマイノリティクラスと同じサイズにする。ＳＭＯＴＥでは、データを人為的に混合して「新しい」サンプルを作成し、よりバランスの取れたデータセットを実現する（Ｃｈａｗｌａ ｅｔ ａｌ．，２００２）。
【0025】
いくつかの実施形態において、分類モデルはさらに、アップサンプリングまたはＳＭＯＴＥを含む。分類モデルはさらに、ＳＭＯＴＥを含んでもよい。
【0026】
いくつかの実施形態において、分類モデルは、ＳＭＯＴＥおよびランダムフォレスト、サポートベクターマシン、および部分最小二乗判別分析のうちの１つを含む。
【0027】
実施形態において、分類モデルは、ランダムフォレストおよびＳＭＯＴＥ、部分最小二乗判別分析およびＳＭＯＴＥ、またはサポートベクターマシンおよびアップサンプリングを含む。
【0028】
いくつかの実施形態において、予測モデル、事前相関シグニチャのデータベース、および／またはアルゴリズムを提供する。
【0029】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法はさらに、血液サンプルまたはその成分中の１つまたは複数の生物学的マーカーの状態を検出することを含んでいてもよい。１つまたは複数の生物学的マーカーの状態の検出において、該１つまたは複数のマーカーが変異を含むか、あるいは野生型として存在するかを検出してもよい。バイオマーカーの状態の検出は、当技術分野で既知の任意の手段によって行われてもよいが、本発明者らは、ＡＴＲ－ＦＩＴＲを使用してバイオマーカーの状態を判定できることを有利に発見した。このように、本開示は、いくつかの実施形態において、血液サンプルまたはその成分にＡＴＲ－ＦＩＴＲを用いて被検体が神経膠腫を有するかまたはリンパ腫を有するかを識別する方法を提供するだけでなく、ＡＴＲ－ＦＩＴＲを用いたバイオマーカーの状態に基づいて神経膠腫の型または悪性度（ｇｒａｄｅ）を提供する。
【0030】
いくつかの実施形態において、血液サンプルまたはその成分中の１つまたは複数の生物学的マーカーの状態を検出する方法は、本開示に従って神経膠腫を有すると特定された被検体に対して行われる。あるいは、いくつかの実施形態において、血液サンプルまたはその成分中の１つまたは複数の生物学的マーカーの状態を検出する方法は、被検体が神経膠腫を有するかまたはリンパ腫を有するかの検出と同時にまたは並行して行われてもよい。
【0031】
血液サンプルまたはその成分中の１つまたは複数の生物学的マーカーの状態を検出する方法は、血液サンプルまたはその成分から得られたサイズ分画されたサンプルに対して行われてもよい。サイズ分画により、通常は遠心分離によって、異なる分子量の生体分子を異なる画分に分離することができる。例えば、市販の超遠心濾過装置（例えば、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ）によって、高分子量の物質が濃縮液内に保持され低分子量の物質がフィルタを通過して濾液内に維持されるようにサンプルを遠心分離することができる。高分子量の物質を低分子量の物質から分離するために、分子量カットオフ値の異なる遠心濾過装置が利用可能である。高分子量物質から特定のバイオマーカーを分離するために、２０、１５、１０、５、または３ｋＤａ未満の物質を濾過できる濾過装置を使用してもよい。
【0032】
一実施形態において、マーカーは、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ１（ＩＤＨ１）である。ヒトサイトゾルイソクエン酸デヒドロゲナーゼ１（ＩＤＨ１）遺伝子の体細胞変異は、神経膠腫で頻繁に観察される特徴である。ＩＤＨ１変異は、神経膠腫形成の初期段階で発生する傾向がある。これは、低悪性度神経膠腫、びまん性星状細胞腫、乏突起膠腫で最も一般的に見られる一方、神経膠芽腫（ＧＢＭ）が以前に診断されたびまん性または退形成星状細胞腫から発生する場合を除いて（＞８０％）、悪性神経膠腫、神経膠芽腫（ＧＢＭ）ではそれほど一般的ではない（１０％）。結果として、ＩＤＨ１変異は、組織病理学的分析だけでは区別がつきにくいが治療法と予後プロファイルが異なる腫瘍実体の分化を支援することによって、貴重な診断マーカーとして機能する。
【0033】
ＩＤＨ１と同様に、他のバイオマーカーも異なる悪性度や型の神経膠腫に関連することが知られており、そのようなバイオマーカーの状態を検出することで、被検体が持つ可能性のある神経膠腫の型をさらに区別できる可能性がある。以下の表は、主要な神経膠腫の亜型に関連する一般的な遺伝子および染色体異常を示している。
【0034】
【表1】
【0035】
ＮＦ１：神経線維腫症１型；ＦＧＦＲ１：線維芽細胞成長受容体１；ＩＤＨ２：イソクエン酸デヒドロゲナーゼ２；ＴＰ５３：腫瘍抑制タンパク質５３；ＡＴＲＸ：アルファサラセミア／精神遅滞症候群Ｘ連鎖変異；ＬＯＨ１７ｐ：１７番染色体上のヘテロ接合性の喪失；ＴＥＲＴ：テロメラーゼ逆転写酵素；ＰＴＥＮ：ホスファターゼおよびテンシンホモログ；ＭＧＭＴ：Ｏ（６）－メチルグアニン－ＤＮＡ－メチルトランスフェラーゼ；ＥＧＦＲ：上皮成長因子受容体。
【0036】
被検体の生物学的マーカーの状態（例：ＩＤＨ１状態）を理解することによって、予後の指標が与えられるため、切除の範囲を限定する方法や外科手術に対する積極性の観点から外科医に情報を提供することができる。例えば、最大限安全な外科的切除の試みは、ＩＤＨ１変異型神経膠腫の患者にとってはより理にかなっているかもしれないが、ＩＤＨ１野生型神経膠腫には、より限局的な切除の方がより適切であるかもしれない。
【0037】
本明細書において、血液サンプルの「成分」は、血漿または血清などの血液サンプルの成分を指す。本明細書において、「血漿」は、通常、全血中の血球を懸濁状態に保持する血液のわら色／淡黄色の液体成分を指す。これは、総血液量の約５５％を占める。これは、細胞外液（細胞外の全ての体液）の血管内液部分である。主に水（９３体積％）であり、溶解したタンパク質（主要なタンパク質は、フィブリノーゲン、グロブリン、およびアルブミンである）、グルコース、凝固因子、ミネラルイオン（Ｎａ＋、Ｃａ”、Ｍｇ”、ＨＣＯ３ ＣＩ－など）、ホルモン、および二酸化炭素（血漿は排泄物輸送の主な媒体である）を含む。なお、血漿サンプルには、ＥＤＴＡ血漿とクエン酸血漿の両方が適している。また、ヘパリン血漿も適している。本発明の文脈において、「血清」は、血球（血清は白血球や赤血球を含まない）でも凝固因子でもない成分を指す。これは、フィブリノーゲンが除去された血漿である。
【0038】
従来、ＡＴＲ－ＦＴＩＲ分光計には、内部反射要素（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ ｅｌｅｍｅｎｔ：ＩＲＥ）と呼ばれる分析ポイントがある。分光分析時に、赤外線ビームは、サンプルが支持されているＩＲＥを通過する。ビームはＩＲＥで内部反射され、ＩＲＥとサンプルとの界面でエバネッセント波を形成する。このエバネッセント波は、定義された侵入深さでサンプルを照合する。ビームまたは「エバネッセント波」がＩＲＥを出ると、ビームまたはエバネッセント波は赤外線検出器に受信される。エバネッセント波によるサンプルの各照合は、スキャンとも呼ばれる。
【0039】
よって、「分光分析」は、本明細書では赤外線分析とも呼ばれる。
【0040】
分光分析は、血液サンプル（またはその成分）の少なくとも１回のスキャンを含んでもよい。いくつかの実施形態において、分光分析は、血液サンプル（またはその成分）の複数回のスキャンを含む。複数回のスキャンは、血液サンプル（またはその成分）の少なくとも２回、少なくとも４回、少なくとも６回、少なくとも８回、少なくとも１０回、少なくとも１２回、少なくとも１４回、少なくとも１６回、少なくとも１８回、または少なくとも２０回のスキャンを含んでもよい。いくつかの実施形態において、分光分析は、血液サンプル（またはその成分）の少なくとも３０回、少なくとも４０回、少なくとも５０回、または少なくとも１００回のスキャンを含む。実施形態において、分光分析は、少なくとも２回および１００回以下のスキャン、任意に少なくとも３０回および１００回以下のスキャンを含む。実施形態において、分光分析は、少なくとも１０回および４０回以下のスキャン、任意に少なくとも１０回および３０回以下のスキャンを含む。いくつかの実施形態において、分光分析は、１６回のスキャンを含む。実施形態において、分光分析は、３２回のスキャンを含む。スキャン数は、データコンテンツとデータ取得時間を最適化するために適切に選択される。
【0041】
本発明の文脈において、「分光学的シグニチャ」は、血液サンプル（またはその成分）から得られる赤外スペクトルを指す。赤外スペクトルをグラフで視覚化して、赤外光吸収度または放射率を示すことができる。このように、実施形態において、得られた分光学的シグニチャは、赤外光吸収度を示すためにグラフで視覚化された血液サンプル（またはその成分）の赤外スペクトルを指す。
【0042】
当業者が理解するように、赤外線スペクトルのセクションの吸光度のレベルを使用して、血液サンプル（またはその成分）に存在する分子の種類および割合を示すことができる。これは、血液サンプル（またはその成分）の各分子が１つまたは複数の振動周波数を有するためである。赤外線放射の周波数が振動周波数と一致すると、吸光度が発生する。赤外線放射の周波数の典型的な単位はｃｍ－１である。
【0043】
実施形態において、血液サンプル（またはその成分）に特徴的な分光学的シグニチャは、４０００～４００ｃｍ－１のスペクトルである。４０００～４００ｃｍ－１のスペクトルは、４０００～４００ｃｍ－１の赤外線放射で得られる赤外線スペクトルを指す。
【0044】
実施形態において、血液サンプル（またはその成分）に特徴的な分光学的シグニチャは、３０００～５００ｃｍ－１のスペクトルである。任意に、血液サンプル（またはその成分）に特徴的な分光学的シグニチャは、２０００～６００ｃｍ－１のスペクトル、任意に９００～１８００ｃｍ－１のスペクトルである。９００～１８００ｃｍ－１のスペクトルは、９００～１８００ｃｍ－１の赤外線放射で得られる赤外線スペクトルを指す。
【0045】
理論に束縛されるものではないが、本発明者らは、９００～１８００ｃｍ－１のスペクトルは、神経膠腫を有する被検体とリンパ腫を有する被検体との間で異なる分子の種類および比率を示すと考える。これらの違いはわずかかもしれないが、本発明者らは、得られた分光学的シグニチャのさらなる分析によって、これらの違いに基づいて被検体が神経膠腫を有するかまたはリンパ腫を有するかを判定できることを有利に見出した。
【0046】
いくつかの実施形態において、血液サンプルに特徴的な分光学的シグニチャは、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、または１４００から１５００、１６００、１７００、または１８００ｃｍ－１のスペクトルである。いくつかの実施形態において、血液サンプル（またはその成分）に特徴的な分光学的シグニチャは、１４００～１８００ｃｍ－１のスペクトルである。血液サンプル（またはその成分）に特徴的な分光学的シグニチャは、１５００～１７００ｃｍ－１のスペクトルであってもよく、任意に１５５０～１７００ｃｍ－１のスペクトルであってもよい。１５００～１７００ｃｍ－１のスペクトルは、アミドＩおよびアミドＩＩ領域を含む。アミドＩおよびアミドＩＩ領域は、血液サンプル（またはその成分）中のタンパク質の吸光度または放射率に関連することが当該技術分野で知られているスペクトルの領域である（Ｂａｒｔｈ ｅｔ ａｌ．およびＧｌａｓｓｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．）。本発明者らは、アミドＩおよび／またはアミドＩＩ領域が、神経膠腫の被検体とリンパ腫の被検体との間の差異を含むことを発見した。したがって、例えば、アミドＩおよび／またはアミドＩＩ領域を、１つまたは複数のアルゴリズムを使用して有利に分析して、被検体が神経膠腫を有するかまたはリンパ腫を有するかを判定することができる。
【0047】
１１５０～１０００ｃｍ－１のスペクトルは、核酸物質、グリコーゲン、および炭水化物の吸光度または放射率に関連している。
【0048】
分光学的シグニチャは、血液サンプルから得られたスペクトルの一部を含むか、または当該一部からなっていてもよい。よって、実施形態において、血液サンプル（またはその成分）から得られるスペクトルは、５０００～１００ｃｍ－１、４０００～４００ｃｍ－１
、または４０００～４５０ｃｍ－１の範囲にあってもよい。そして、分光学的シグニチャは、この得られた範囲の一部、例えば、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、または１４００から１５００、１６００、１７００、または１８００ｃｍ－１のスペクトルを含んでもよい。分光学的シグニチャは、被検体の生化学的指紋として効果的に機能する。
【0049】
スペクトルの分解能は、１０ｃｍ－１以下、５ｃｍ－１以下、または４ｃｍ－１以下であってもよい。実施形態において、スペクトルの分解能は、１～４ｃｍ－１であってもよい。
【0050】
実施形態において、「ＡＴＲ結晶」は、分光分析中に血液サンプル（またはその成分）を支持する。ＡＴＲ結晶は、固定ＩＲＥである。ＡＴＲ結晶は、ダイヤモンド、セレン化亜鉛、またはゲルマニウムで形成されてもよい。実施形態において、ＡＴＲ結晶は、単一の反射ダイヤモンド結晶を含むか、単一の反射ダイヤモンド結晶からなる。
【0051】
実施形態において、シリコン内部反射要素（ＩＲＥ）は、分光分析中に血液サンプル（またはその成分）を支持する。シリコンＩＲＥは、ＡＴＲ結晶よりも安価である。便利なことに、シリコンＩＲＥは使い捨てである（したがって、ＡＴＲ結晶のように固定されていない）ため、複数のサンプリング点の高スループット分析が可能である。シリコンＩＲＥでは、バッチ分析、および必要に応じて分析を繰り返すオプションも可能である。
【0052】
血液サンプルの容量は、約０．１～１０μＬであってもよく、任意に約０．１～５μＬであってもよい。いくつかの実施形態において、血液サンプルの容量は、約３μＬである。
【0053】
本方法はさらに、分光分析の前に血液サンプル（またはその成分）をＡＴＲ結晶またはシリコンＩＲＥの表面に塗布することを含んでいてもよい。ＡＴＲ結晶またはシリコンＩＲＥの表面に塗布した後、血液サンプルを分光分析の前にある期間、任意に５分～２時間乾燥させてもよい。いくつかの実施形態において、分光分析の前に、血液サンプルを３０分～９０分、任意に１時間乾燥させてもよい。乾燥は、２０℃以上４０℃以下、好ましくは３０℃以上３７℃以下の温度で行ってもよい。
【0054】
血液サンプルがＡＴＲ結晶またはシリコンＩＲＥの表面で乾燥したものは、血液サンプルフィルムとも呼ばれる。血液サンプルフィルムは、＋／－４０μｍ以下の誤差で実質的に均一な厚さであってもよい。
【0055】
ＡＴＲ結晶またはシリコンＩＲＥの表面全体の血液サンプル（またはその成分）（あるいは、少なくとも分光分析にさらされるその一部）の平均膜厚は、０．１～２００μｍ、任意に１～１００μｍ、任意に２～５０μｍであってもよい。ＡＴＲ結晶またはシリコンＩＲＥの表面全体の血液サンプル（またはその成分）（あるいは、少なくとも分光分析にさらされるその一部）の最大膜厚（すなわち、最大厚さ点）は、１～２００μｍ、任意に２～１００μｍであってもよい。実施形態において、最大膜厚は、５～５０μｍ、任意に２～８μｍである。ＡＴＲ結晶またはシリコンＩＲＥの表面全体の血液サンプル（またはその成分）（あるいは、少なくとも分光分析にさらされるその一部）の最小膜厚（すなわち、最小厚さ点）は、０～４０μｍ、任意に１～２０μｍ、さらに任意に２～１０μｍであってもよい。
【0056】
白色光干渉法による得られたフィルムの分析は、適切な膜厚を検証するようにＡＴＲ結晶またはシリコンＩＲＥの表面全体の膜厚を示すことができる。本発明者らは、適切な厚さのフィルムを作成することにより、サンプル調製に関連するシグネチャの変動を低減でき、観測される血液サンプル間のシグニチャの変動を、サンプル調製におけるばらつきよりも、相違する組成により確実に帰することができることを見出した。
【0057】
実施形態において、血液サンプル（またはその成分）は、被検体から単離されたバルク血液サンプルの一部を含む。こうして、バルク血液サンプルの他の部分は、後にさらなる分光分析に使用でき、結果の検証を支援することができる。各血液サンプルに、少なくとも２つ、任意に少なくとも３つの分光分析を行ってもよい。任意に、個々の分光分析を同じサンプルで少なくとも２回、好ましくは少なくとも３回繰り返して、結果の検証に役立てる。
【0058】
得られた血液サンプル（またはその成分）に特徴的な分光学的シグニチャを用いた被検体が神経膠腫を有するかまたはリンパ腫を有するかの判定は、臨床医によって実施されてもよい。実施形態において、得られた血液サンプル（またはその成分）に特徴的な分光学的シグニチャを用いた被検体が神経膠腫を有するかまたはリンパ腫を有するかの判定は、自動化される。自動化は、例えば、コンピュータまたはコンピュータ用媒体にインストールされたコンピュータソフトウェアによる計算であってもよい。
【0059】
実施形態において、得られた分光学的シグニチャへの１つまたは複数のアルゴリズムの適用は、自動化される。例えば、得られた分光学的シグニチャへの１つまたは複数のアルゴリズムの適用は、コンピュータソフトウェアによるものであってもよい。コンピュータソフトウェアは、コンピュータまたはコンピュータ用媒体にインストールされてもよい。
【0060】
本発明者らは、驚くべきことに、得られた分光学的シグニチャの少なくとも一部が、被検体が神経膠腫を有するかまたはリンパ腫を有するかによって異なることを見出した。これは、神経膠腫の被検体とリンパ腫の被検体のサンプルの光吸収が異なるためである。したがって、得られた分光学的シグニチャが赤外光吸収を示すためにグラフに表示された血液サンプル（またはその成分）の赤外スペクトルを参照する実施形態において、神経膠腫の被検体の得られた血液サンプル（またはその成分）に特徴的な分光学的シグニチャの少なくとも一部は、リンパ腫の被検体の得られた血液サンプル（またはその成分）に特徴的な分光学的シグニチャの対応する部分よりも低い赤外光吸収度を示し得る。同様に、リンパ腫の被検体の得られた血液サンプル（またはその成分）に特徴的な分光学的シグニチャの少なくとも一部は、神経膠腫の被検体の血液サンプル（または成分）に特徴的な得られた分光学的シグニチャの対応する部分よりも高い赤外光吸収度を示し得る。得られた分光学的シグニチャの少なくとも一部は、１４００～１８００ｃｍ－１のスペクトル、任意に１５００～１７００ｃｍ－１のスペクトル、または任意に１５５０～１７００ｃｍ－１のスペクトルを参照してもよい。
【0061】
得られた分光学的シグニチャの部分は、１４００～１８００ｃｍ－１の血液サンプル（またはその成分）から得られたスペクトルを含むか、または該スペクトルからなってもよく、任意に、１５００～１７００ｃｍ－１または１５５０～１７００ｃｍ－１の血液サンプル（またはその成分）から得られたスペクトルを含むか、または該スペクトルからなってもよい。
【0062】
例えば、得られた分光学的シグニチャの部分が、１４００～１８００ｃｍ－１の血液サンプル（またはその成分）から得られたスペクトルを含むかまたは該スペクトルからなる場合、得られた分光学的シグニチャの「対応する部分」は、１４００～１８００ｃｍ－１のスペクトルを含むかまたは該スペクトルからなる。
【0063】
実施形態において、得られた血液サンプル（またはその成分）に特徴的な分光学的シグニチャの少なくとも一部が対照分光学的シグニチャの少なくとも一部よりも低い場合、被検体は神経膠腫を有すると判定される。得られた血液サンプル（またはその成分）に特徴的な分光学的シグニチャの少なくとも一部が対照分光学的シグニチャの少なくとも一部よりも高い場合、被検体はリンパ腫を有すると判定されてもよい。このような実施形態において、比較できるように、血液サンプルから得られた分光学的シグニチャおよび対照分光学的シグニチャの両方が赤外光吸収度に関わるか、あるいは赤外光放射率に関わるものであるとよい。
【0064】
得られた分光学的シグニチャは、血液サンプル（またはその成分）に特徴的な得られた前処理分光学的シグニチャを用いて被検体が神経膠腫を有するかまたはリンパ腫を有するかを判定する前に、前処理されてもよい。
【0065】
前処理技術は、当業者に周知である。前処理は、得られた分光学的シグニチャの正規化、得られた分光学的シグニチャのベースライン補正、得られた分光学的シグニチャのデータ削減、および／または、得られた分光学的シグニチャのビニングのうちの１つまたは複数を含んでもよい。正規化は、健康な被検体または脳腫瘍でないことが知られている被検体からの１つまたは複数の分光学的シグニチャに対する、得られた分光学的シグニチャの正規化を含んでもよい。
【0066】
前処理は、コンピュータにインストールされたコンピュータソフトウェアを使用して行ってもよい。実施形態において、前処理コンピュータソフトウェアは、コンピュータソフトウェアＲＳｔｕｄｉｏを含む。前処理は、ＲＳｔｕｄｉｏコンピュータソフトウェアのＰＲＦＦＥＣＴツールボックスを使用して行ってもよい。有利なことに、前処理によって、スペクトルの不要な分散が低減される。
【0067】
ビニングは、２、４、６、８、または１０倍であってもよい。実施形態において、ビニングは８倍である。
【0068】
本明細書において、「リンパ腫」は、リンパ球の癌を定義する。リンパ腫の発症は、一般的にリンパ節および／またはリンパ系の臓器で発生する。リンパ腫は、中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、任意に原発性ＣＮＳリンパ腫または続発性ＣＮＳリンパ腫であってもよい。リンパ腫は、脳にあってもよい。
【0069】
悪性神経膠腫の３つの主な種類は、星状細胞腫、上衣腫、および乏突起膠腫である。本発明は、これらの種類の神経膠腫のうちの１つまたは複数に関係し得る。３つの主な種類の神経膠腫にある組織学的特徴の混合を有する腫瘍は、混合神経膠腫として知られており、本発明はまた、これをリンパ腫と区別してもよい。以下の［表１］は、高悪性度および低悪性度神経膠腫の亜型を示す。
【0070】
【表2】
【0071】
実施形態において、神経膠腫は、低悪性度神経膠腫である。あるいは、神経膠腫は、高悪性度神経膠腫であってもよい。神経膠腫は、毛様細胞性星状細胞腫、乏突起膠腫、星状細胞腫、退形成星状細胞腫、乏突起膠腫、多形性神経膠芽腫の亜型のうちの１つまたは複数を含んでもよい。
【0072】
実施形態において、神経膠腫は、悪性度ＩＩＩまたは悪性度ＩＶの神経膠腫である。神経膠腫は、多形性神経膠芽腫であってもよい。
【0073】
磁気共鳴画像（ＭＲＩ）などの被検体の脳を以前に撮影した画像によって、被検体は脳腫瘍を有する疑いがあるとしてもよい。いくつかの実施形態において、本方法は、被検体の脳を撮像する予備ステップを含み、撮像は、任意に、ＭＲＩスキャナを用いた被検体の脳の撮像を含む。
【0074】
脳腫瘍の症状には、頭痛、吐き気、および／または、嘔吐、錯乱、記憶喪失、人格変化、バランス困難、尿失禁、視力喪失、言語障害、および発作のうちの１つまたは複数が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。
【0075】
したがって、被検体が上記の症状のうちの１つまたは複数を示す場合、被検体は脳腫瘍を有する疑いがあるとしてもよい。
【0076】
被検体は、動物、好ましくは哺乳動物である。哺乳動物には、馬、犬、猫、鳥、およびヒトが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、被検体は、ヒト被検体である。
【0077】
実施形態において、血液サンプルは、血清または血漿である。いくつかの実施形態において、血液サンプルは、血清である。
【0078】
実施形態において、血清は、全血清であり、最も好ましくは全ヒト血清である。全血清は、分光分析に直接使用してもよい。あるいは、血清サンプルは、分光器の要件（例えば、感度）および分析されるサンプルに必要な均一性に応じて希釈されてもよい。
【0079】
他の実施形態において、血清は、遠心濾過された血清であり、特定の分子量を超える分子が除去されている。例えば、血清を遠心濾過して、１００ｋＤａ（キロダルトン）を超える分子量を有する成分を除去してもよい。他の実施形態において、血清を遠心濾過して、１０ｋＤａを超える分子量を有する成分を除去してもよい。他の実施形態において、血清を遠心濾過して、３ｋＤａを超える分子量を有する成分を除去してもよい。上記の遠心濾過された血清のいずれかまたは全ては、分光分析に直接使用してもよい。あるいは、遠心濾過された血清サンプルは、分光器の要件（例えば、感度）および分析されるサンプルに必要な均一性に応じて希釈されてもよい。
【0080】
血液サンプルが血清である場合、血清サンプルは、抽出された血液サンプルを、適切には室温で、適切には２５分から１時間１０分の間、最初に凝固させることによって適切に調製される。次に、血清を適切に遠心分離または濾過して、沈殿物のサンプルを取り除く。遠心分離は、９０００～２００００ｒｐｍ、適切には１００００～１５０００ｒｐｍ、適切には５～２０分間、適切には２～８℃で適切に行われる。血清サンプルの濾過には、機器の目詰まりを防ぐために０．８／０．２２ｐｍのデュアルフィルタで濾過することが適切に含まれる。続いて、血清を直ちにアッセイ（測定）するか、あるいはアリコートして血清サンプルを－７０℃で使い捨てアリコートに保存する必要がある。適切には、アッセイ前に、血清サンプルを適切なサンプル希釈剤で希釈する。適切には、１容量の血清サンプルを２～５容量のサンプル希釈剤で、適切には３容量のサンプル希釈剤で希釈してもよい。血清は、１：５０または１：１００で希釈されてもよい。
【0081】
いくつかの実施形態において、得られた血液サンプル（またはその成分）に特徴的な分光学的シグニチャを用いて被検体が神経膠腫を有するかまたはリンパ腫を有するかを判定することによって、被検体の治療の決定が促進される。例えば、被検体が神経膠腫を有すると判定された場合、被検体の少なくとも１つの治療の決定が促進され得る。被検体がリンパ腫を有すると判定された場合、被検体の少なくとも１つの他の異なる治療の決定が促進され得る。リンパ腫および神経膠腫の一般的な治療法はさまざまである。例えば、被検体に神経膠腫を有する疑いがある場合、腫瘍を除去するための脳外科手術による治療が選択され得る。また、被検体にリンパ腫を有する疑いがある場合、化学療法および／または放射線療法などの非外科的介入がより適していると考えられる。このように、本方法によって、医師は、被検体に適切な治療を迅速かつ正確に選択できる。適切な治療を迅速かつ正確に選択することで、被検体の回復の可能性が高まる。また、被検体がリンパ腫を有すると判定された場合の不必要な脳外科手術を防ぐ。
【0082】
実施形態において、被検体がリンパ腫を有すると判定された場合、化学療法および／または放射線療法による治療が選択され、被検体が神経膠腫を有すると判定された場合、外科手術による治療が選択される。外科手術は、被検体の脳から神経膠腫を取り除くことを目的とした脳外科手術を指す。
【0083】
第２の態様によれば、脳腫瘍を有する疑いのある被検体が神経膠腫を有するかまたはリンパ腫を有するかを判定するための診断キットが提供される。本キットは、被検体から血液サンプル（またはその成分）を受け取り、被検体の血液サンプル（またはその成分）に分光分析を行って血液サンプル（またはその成分）に特徴的な分光学的シグニチャを作成するように構成される装置と、得られた血液サンプル（またはその成分）に特徴的な分光学的シグニチャを用いて、被検体が神経膠腫を有するかまたはリンパ腫を有するかを判定する装置とを含み、分光分析は、減衰全反射ＦＴＩＲ（ＡＴＲ－ＦＴＩＲ）である。
【0084】
実施形態において、血液サンプル（またはその成分）に分光分析を行う装置は、被検体が神経膠腫を有するかまたはリンパ腫を有するかを判定する装置と同一である。
【0085】
被検体が神経膠腫を有するかまたはリンパ腫を有するかを判定する装置は、コンピュータを含むか、コンピュータと通信していてもよい。コンピュータには、被検体の血液サンプルの分光学的シグニチャに基づいて神経膠腫およびリンパ腫に関する判定を行うようにコンピュータを動作させるように構成されたコンピュータソフトウェアがインストールされてもよい。
【0086】
実施形態において、血液サンプルを受け取るように構成される装置は、ＡＴＲ結晶を含む。他の実施形態において、血液サンプルを受け取るように構成される装置は、シリコンＩＲＥを含む。
【0087】
血液サンプルを受け取るように構成される装置は、必要な厚さおよび乾燥度の血液サンプル（またはその成分）を自動的に調製するように構成されてもよい。
【0088】
本明細書で詳しく説明するように、キットは、低分子量物質から高分子量物質を分離できる遠心フィルタ装置を含んでもよい。
【0089】
第３の態様によれば、得られた被検体の血液サンプルの分光学的シグニチャに基づいて神経膠腫およびリンパ腫に関する判定を行うようにコンピュータを動作させるように構成されたコンピュータソフトウェアを含むコンピュータ可読媒体が提供される。
【0090】
第４の態様によれば、脳腫瘍を有する疑いのある被検体の治療の選択を促進する方法が提供される。本方法は、被検体から単離された血液サンプル（またはその成分）に分光分析を行って、血液サンプル（またはその成分）に特徴的な分光学的シグニチャを得る。分光分析は、減衰全反射ＦＴＩＲ（ＡＴＲ－ＦＴＩＲ）である。本方法はさらに、得られた血液サンプル（またはその成分）に特徴的な分光学的シグニチャを用いて被検体が神経膠腫を有するかまたはリンパ腫を有するかを判定し、神経膠腫またはリンパ腫の判定に基づいて治療を選択する。
【0091】
被検体がリンパ腫を有すると判定された場合、化学療法および／または放射線療法による治療が選択されてもよい、被検体が神経膠腫を有すると判定された場合、外科手術による治療が選択されてもよい。
【0092】
実施形態において、本方法はさらに、選択した治療を被検体に行う。例えば、被検体がリンパ腫を有すると判定された場合、被検体は、化学療法および／または放射線療法で治療されてもよい。被検体が神経膠腫を有すると判定された場合、被検体は脳外科手術で治療されてもよい。
【0093】
本明細書に記載される全ての特徴（付随する特許請求の範囲、要約、および図面を含む）は、特に明記しない限り、上記の態様のいずれかと任意に組み合わせてもよい。
【発明を実施するための形態】
【0094】
詳細説明
次に、以下の添付図面を参照して、本発明の実施形態を、実施例により説明する。
次に、以下の添付図面を参照して、本発明の実施形態を、実施例により説明する。
【図面の簡単な説明】
【0095】
【0096】
実施例１ リンパ腫対神経膠芽腫
概要
神経科医は、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫と高侵襲性ＩＶ期腫瘍である多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）との区別にとりわけ関心がある。血清診断は、２つの理由で有益である。第一に、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）などの脳スキャンではこれらを区別することが難しい場合が多い。第二に、腫瘍が外科的に切除されるかどうかを判定する。ＭＲＩスキャンで患者がＧＢＭであることが示唆されると、患者は緊急切除の対象となる。一方、腫瘍がリンパ腫であると考えられる場合、すぐに患者に外科手術を行わず、患者は化学療法や放射線療法で治療される。脳スキャンの曖昧さのため、神経科医が最良の方針を効果的に決定することは非常に困難である。
概要
神経科医は、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫と高侵襲性ＩＶ期腫瘍である多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）との区別にとりわけ関心がある。血清診断は、２つの理由で有益である。第一に、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）などの脳スキャンではこれらを区別することが難しい場合が多い。第二に、腫瘍が外科的に切除されるかどうかを判定する。ＭＲＩスキャンで患者がＧＢＭであることが示唆されると、患者は緊急切除の対象となる。一方、腫瘍がリンパ腫であると考えられる場合、すぐに患者に外科手術を行わず、患者は化学療法や放射線療法で治療される。脳スキャンの曖昧さのため、神経科医が最良の方針を効果的に決定することは非常に困難である。
【0097】
方法
サンプルの採集と準備
血清サンプルを、Ｗａｌｔｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ ＮＨＳ Ｔｒｕｓｔ（リバプール、イギリス）、Ｒｏｙａｌ Ｐｒｅｓｔｏｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（プレストン、イギリス）、および商用ソースのＴｉｓｓｕｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｌｔｄ（グラスゴー、イギリス）の３つのソースから取得した。各ソースから得た血清サンプルの数を［表２］に示す。この研究は倫理審査により承認されたものである（Ｗａｌｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂａｎｋ ａｎｄ ＢＴＮＷ／ＷＲＴＢ １３＿０１／ＢＴＮＷ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ＃１１０８）。
サンプルの採集と準備
血清サンプルを、Ｗａｌｔｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ ＮＨＳ Ｔｒｕｓｔ（リバプール、イギリス）、Ｒｏｙａｌ Ｐｒｅｓｔｏｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（プレストン、イギリス）、および商用ソースのＴｉｓｓｕｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｌｔｄ（グラスゴー、イギリス）の３つのソースから取得した。各ソースから得た血清サンプルの数を［表２］に示す。この研究は倫理審査により承認されたものである（Ｗａｌｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂａｎｋ ａｎｄ ＢＴＮＷ／ＷＲＴＢ １３＿０１／ＢＴＮＷ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ＃１１０８）。
【0098】
【表3】
【0099】
この研究の対象となる癌患者は、病理学的に確認された原発性リンパ腫または神経膠芽腫の脳腫瘍でなければならず、また、採集時に化学療法や放射線療法を受けていてはならない。血液サンプルを血清採集チューブに採集し、最大１時間凝固させた。チューブを２２００ｇで１５分間室温で遠心分離した後、分離した血清成分をアリコートし、－８０℃の冷凍庫に保存した。
【0100】
スペクトル分析前に、凍結血清サンプルを保管場所から取り出し、室温（１８～２５℃）で平均１５～２０分間解凍した。マイクロピペットを使用して、一人の患者からの３μＬの血清を光学サンプルスライドの３つのサンプルウェル（ウェル１、２、および３）のそれぞれに沈着させた一方、ウェル０をバックグラウンド採集のために清潔に保った（ＣｌｉｎＳｐｅｃ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｌｔｄ、イギリス）。薄い血清フィルムを生成しより均一な沈着のためにＩＲＥ全体を覆うために、ピペットチップを用いて血清液滴をウェル全体に広げた。準備されたスライドを、バッチ乾燥を可能にするように設計された３Ｄプリントポリ乳酸（ＰＬＡ）スライドホルダに積み重ねた。その後、積み重ねたスライドを乾燥ユニットインキュベータ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（商標）Ｈｅｒａｔｈｅｒｍ（商標）、ドイツ）に３５℃で１時間保存した。このステップにより、血清液滴の制御乾燥ダイナミクスのために熱と空気の流れが均一になり、滑らかで平らな均質サンプリング表面が得られた。
【0101】
スペクトル収集
この研究では、スペクトル収集にＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ２ ＦＴＩＲ分光計（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、イギリス）を使用した。Ｓｐｅｃａｃ Ｑｕｅｓｔ ＡＴＲアクセサリユニットに鏡面反射パック（Ｓｐｅｃａｃ Ｌｔｄ、イギリス）を取り付け、ＳＩＲＥ（シリコンＩＲＥ）を開口部の上に配置して従来の固定ダイヤモンドＩＲＥを置き換えることができた。スライドインデックスユニット（ＣｌｉｎＳｐｅｃ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｌｔｄ、イギリス）は、鏡面反射パックに亘る正確で再現性のある動きを可能にし、サンプルウェル間の光学スライドにインデックスを付けた。最初のウェルがバックグラウンドとして機能し、３つのサンプルウェルが生物学的繰り返しを提供する。各ウェルを３度分析し、患者ごとに９つのスペクトルを得た。スペクトルは、４０００～４５０ｃｍ－１の範囲で、４ｃｍ－１の解像度で、１ｃｍ－１のデータ間隔と１６回の共追加スキャンで得られた。
この研究では、スペクトル収集にＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ２ ＦＴＩＲ分光計（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、イギリス）を使用した。Ｓｐｅｃａｃ Ｑｕｅｓｔ ＡＴＲアクセサリユニットに鏡面反射パック（Ｓｐｅｃａｃ Ｌｔｄ、イギリス）を取り付け、ＳＩＲＥ（シリコンＩＲＥ）を開口部の上に配置して従来の固定ダイヤモンドＩＲＥを置き換えることができた。スライドインデックスユニット（ＣｌｉｎＳｐｅｃ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｌｔｄ、イギリス）は、鏡面反射パックに亘る正確で再現性のある動きを可能にし、サンプルウェル間の光学スライドにインデックスを付けた。最初のウェルがバックグラウンドとして機能し、３つのサンプルウェルが生物学的繰り返しを提供する。各ウェルを３度分析し、患者ごとに９つのスペクトルを得た。スペクトルは、４０００～４５０ｃｍ－１の範囲で、４ｃｍ－１の解像度で、１ｃｍ－１のデータ間隔と１６回の共追加スキャンで得られた。
【0102】
スペクトル前処理
分光分析のためにＲＳｔｕｄｉｏソフトウェア内のＰＲＦＦＥＣＴツールボックスを使用した。これは、スペクトル前処理およびスペクトル分類の２つの部分に分けることができる。前処理ステップは、データセットの不要な分散を低減するため、分光学的研究で一般的に適用される。ベースライン補正と、正規化と、データ削減との組み合わせにより、重要な生物学的情報を強調し、分類性能を向上させることができる。最適な前処理プロトコルを、試行錯誤の段階的手法によって決定した。ＰＲＦＦＥＣＴツールボックスは、ビニング、平滑化、正規化、数値微分などのさまざまな前処理方法を提供する。このオープンソースプログラムの使用の詳細については、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ（２）を参照されたい。図１は、データの前処理の例を示す。（ａ）は未処理データセット全体の平均プロットであり、（ｂ）は、ベースライン補正とベクトル正規化とが適用されスペクトル変動が大幅に低減した、指紋領域（分光シグニチャ）にカットされたスペクトルを示す。
分光分析のためにＲＳｔｕｄｉｏソフトウェア内のＰＲＦＦＥＣＴツールボックスを使用した。これは、スペクトル前処理およびスペクトル分類の２つの部分に分けることができる。前処理ステップは、データセットの不要な分散を低減するため、分光学的研究で一般的に適用される。ベースライン補正と、正規化と、データ削減との組み合わせにより、重要な生物学的情報を強調し、分類性能を向上させることができる。最適な前処理プロトコルを、試行錯誤の段階的手法によって決定した。ＰＲＦＦＥＣＴツールボックスは、ビニング、平滑化、正規化、数値微分などのさまざまな前処理方法を提供する。このオープンソースプログラムの使用の詳細については、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ（２）を参照されたい。図１は、データの前処理の例を示す。（ａ）は未処理データセット全体の平均プロットであり、（ｂ）は、ベースライン補正とベクトル正規化とが適用されスペクトル変動が大幅に低減した、指紋領域（分光シグニチャ）にカットされたスペクトルを示す。
【0103】
最適な前処理パラメータは（順に）次の通りであることが分かった：拡張乗法信号補正（ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｖｅ ｓｉｇｎａｌ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ：ＥＭＳＣ）、指紋領域（１８００～１０００ｃｍ－１）へのスペクトルカット、ミニマックス正規化、およびビニング係数８。
【0104】
スペクトル分析
分類ステップは、実際の病気予測からなる。この手法の目的は、既知の患者コホートからバイオシグニチャ（生命存在指標）を特定して、トレーニングされた分類モデルを開発し、この情報を用いて未知の集団における疾患の存在を予測することである。
分類ステップは、実際の病気予測からなる。この手法の目的は、既知の患者コホートからバイオシグニチャ（生命存在指標）を特定して、トレーニングされた分類モデルを開発し、この情報を用いて未知の集団における疾患の存在を予測することである。
【0105】
分類モデルをトレーニングするために、患者をランダムに７０：３０でトレーニングセットと検査セットとに分けた。よりロバストな予測のために、これらの部分のうちの２つ以上に１人の患者が含まれることはない。モデルをトレーニングセット（７０％）に調整した後、５分割のｋ交差検証を使用しながら、モデルを用いて検査セット（３０％）のスペクトルを予測した。各患者について分析された９つのスペクトル間のコンセンサス投票を、診断結果（ＧＢＭまたはリンパ腫）として報告した。
【0106】
モデルの性能は、感度、特異度、カッパ、およびバランス精度（ｂａｌａｎｃｅｄ ａｃｃｕｒａｃｙ）の観点から報告される。感度および特異度（式１および２）は、外部検査セットの正しい予測と誤った予測の数に基づく。感度は、一般に、疾患のある患者を正しく識別する検査の能力を指し、特異度は、疾患のない患者を正しく選ぶ能力を表す傾向がある（Ｌａｌｋｈｅｎ ｅｔ ａｌ．）。しかし、この場合、感度はＧＢＭに適用し、特異度はリンパ腫を識別する能力を指す。この分析では、真陽性は、収集された９つのスペクトルのうちの５つ以上のスペクトルが正しく識別されたＧＢＭの患者から生じ、真陰性は、９つのスペクトルのうちの少なくとも５つのスペクトルが正しく識別されたリンパ腫の患者を指す。偽陽性は、５つ以上のスペクトルが誤ってＧＢＭと識別されたリンパ腫患者から生じ、偽陰性は、５つ以上のスペクトルが誤ってリンパ腫と分類されたＧＢＭ患者から生じる。
【0107】
感度＝真陽性／（真陽性＋偽陰性） （１）
特異度＝真陰性／（真陰性＋偽陽性） （２）
特異度＝真陰性／（真陰性＋偽陽性） （２）
【0108】
診断モデルの信頼性を理解するために、カッパ値κは、オブザーバ間の一致の大きさの定量的尺度を与えることができる。
【0109】
【数1】
【0110】
ここで、ｐｏは相対的な観測された一致であり、ｐｅは偶然一致の仮想確率である。κの値は、０～１の範囲であり、一致レベルに相当する。κが≦０では一致はなく、０．０１～０．２０ではわずかな一致であり、０．２１～０．４０ではそれなりの一致であり、０．４１～０．６０では適度な一致であり、０．６１～０．８０では実質的な一致であり、０．８～１．００ではほぼ完全な一致である（Ｖｉｅｒａ ｅｔ ａｌ．，ＭｃＨｕｇｈ）。
【0111】
トレーニングデータに対してｎ分割交差検定（ｎ＝５）を行い、調整パラメータの最適値を求めた。ＧＢＭ（７１人の患者）とリンパ腫（４１人の患者）との違いを調べる際のわずかなクラス不均衡のため、モデル内にバイアスが存在しないことを確認するべくこの研究全体でアップサンプリング、ダウンサンプリング、および合成マイノリティオーバーサンプリング手法（ＳＭＯＴＥ）といったさまざまなサンプリング方法を用いた。アップサンプリングでは、マイノリティクラスを繰り返しサンプリングしてサンプル数を増やす。ダウンサンプリングでは、マジョリティクラスのサブセットをランダムに選択し、余分なサンプルを削除してマイノリティクラスと同じサイズにする（Ｓｉｍａｆｏｒｅ）。ＳＭＯＴＥは、データを人為的に混合して「新しい」サンプルを作成しよりバランスの取れたデータセットを実現する点で独特である（Ｃｈａｗｌａ ｅｔ ａｌ．）。
【0112】
ランダムフォレスト
ＲＦは、分類およびＣｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｒｅｅｓ（ＣＡＲＴ）アルゴリズム（Ｂｒｅｉｍａｎ ｅｔ ａｌ．）を用いてトレーニングデータから決定木のアンサンブルを構築するロバスト機械学習手法である。ＲＦ分析では、真陽性、偽陽性、真陰性、偽陰性の数に基づいて統計値を抽出し、分類の精度と信頼性との両方を判断できる。さらに、スペクトルの重要度の結果を、ジニプロットの形式でグラフィカルに表示できる。波数に対するジニ係数の平均減少の合計から生成されるジニ不純度メトリックを使用して、ＲＦは、どの波数が２つのクラスを最も区別するかなど、スペクトルの特徴を重要度の順にランク付けできる（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（１））。
ＲＦは、分類およびＣｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｒｅｅｓ（ＣＡＲＴ）アルゴリズム（Ｂｒｅｉｍａｎ ｅｔ ａｌ．）を用いてトレーニングデータから決定木のアンサンブルを構築するロバスト機械学習手法である。ＲＦ分析では、真陽性、偽陽性、真陰性、偽陰性の数に基づいて統計値を抽出し、分類の精度と信頼性との両方を判断できる。さらに、スペクトルの重要度の結果を、ジニプロットの形式でグラフィカルに表示できる。波数に対するジニ係数の平均減少の合計から生成されるジニ不純度メトリックを使用して、ＲＦは、どの波数が２つのクラスを最も区別するかなど、スペクトルの特徴を重要度の順にランク付けできる（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（１））。
【0113】
部分最小二乗判別分析
部分最小二乗判別分析（ＰＬＳ－ＤＡ）は、ＰＬＳ回帰（ＰＬＳＲ）と線形判別分析（ＬＤＡ）とを組み合わせた教師あり（ｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ）機械学習法である。この手法では、次元を減らしてデータ内の隠れたパターンを明らかにすることにより、複雑なデータセットから重要な情報を抽出できる。この手法は、データ空間を２つの異なる領域に分割する直線を探すことによってクラスを分離する（Ｂａｌｌａｂｉｏ ｅｔ ａｌ．）。データポイントは、ディスクリミネータ（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．）と呼ばれる線に垂直に投影される。ディスクリミネータからの距離は、ディスクリミネータスコアと呼ばれる（Ｂｒｅｒｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）。この情報は、ＰＬＳ成分と呼ばれる新しい変数の形で提供される。ここで、第１ＰＬＳ成分（ＰＬＳ１）はデータセットの最大の変動を表し、ＰＬＳ２は次に大きな変動を表す。以降も同様である。ＰＬＳスコアプロットは、大きなデータセット内の一般的な不整合の概要を示し、負荷プロットは、どのスペクトル領域が最も高い差異を表しているかなど、最も変動しやすい領域がどこにあるかを示唆することにより、分散をさらに説明する。
部分最小二乗判別分析（ＰＬＳ－ＤＡ）は、ＰＬＳ回帰（ＰＬＳＲ）と線形判別分析（ＬＤＡ）とを組み合わせた教師あり（ｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ）機械学習法である。この手法では、次元を減らしてデータ内の隠れたパターンを明らかにすることにより、複雑なデータセットから重要な情報を抽出できる。この手法は、データ空間を２つの異なる領域に分割する直線を探すことによってクラスを分離する（Ｂａｌｌａｂｉｏ ｅｔ ａｌ．）。データポイントは、ディスクリミネータ（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．）と呼ばれる線に垂直に投影される。ディスクリミネータからの距離は、ディスクリミネータスコアと呼ばれる（Ｂｒｅｒｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）。この情報は、ＰＬＳ成分と呼ばれる新しい変数の形で提供される。ここで、第１ＰＬＳ成分（ＰＬＳ１）はデータセットの最大の変動を表し、ＰＬＳ２は次に大きな変動を表す。以降も同様である。ＰＬＳスコアプロットは、大きなデータセット内の一般的な不整合の概要を示し、負荷プロットは、どのスペクトル領域が最も高い差異を表しているかなど、最も変動しやすい領域がどこにあるかを示唆することにより、分散をさらに説明する。
【0114】
サポートベクターマシン
サポートベクターマシン（ＳＶＭ）は、分類目的で一般的に使用される教師ありアルゴリズムである（Ｃｏｒｔｅｓ ｅｔ ａｌ．）。ＳＶＭは、既知のデータから、超平面と呼ばれるデータの分離に最適な次元を出力する。サポートベクターは個々の観測の座標であり、超平面を用いて新しいサンプルを分類できる（ｄｅ Ｂｏｖｅｓ Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ）。ＳＶＭチューニングパラメータの最適化により、分類効率を劇的に変えることができる。コストＣは、ペナルティパラメータと呼ばれ、滑らかな境界間のトレードオフとデータを分類する能力に関与する。ガンマパラメータ?は、適合レベルに関与する。モデルがデータに過剰適合しないようにすることが重要であり、これは、グリッド検索を用いて最適な分類性能を特定することで実現される（Ｂｅｎ－Ｈｕｒ ｅｔ ａｌ．）。
サポートベクターマシン（ＳＶＭ）は、分類目的で一般的に使用される教師ありアルゴリズムである（Ｃｏｒｔｅｓ ｅｔ ａｌ．）。ＳＶＭは、既知のデータから、超平面と呼ばれるデータの分離に最適な次元を出力する。サポートベクターは個々の観測の座標であり、超平面を用いて新しいサンプルを分類できる（ｄｅ Ｂｏｖｅｓ Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ）。ＳＶＭチューニングパラメータの最適化により、分類効率を劇的に変えることができる。コストＣは、ペナルティパラメータと呼ばれ、滑らかな境界間のトレードオフとデータを分類する能力に関与する。ガンマパラメータ?は、適合レベルに関与する。モデルがデータに過剰適合しないようにすることが重要であり、これは、グリッド検索を用いて最適な分類性能を特定することで実現される（Ｂｅｎ－Ｈｕｒ ｅｔ ａｌ．）。
【0115】
遠心濾過
ＡＴＲ－ＦＴＩＲ分光法がＩＤＨ１変異型を検出できるかどうかを評価するために、血清サンプルの低分子量（ＬＭＷ）画分の分析を可能にするために遠心濾過を行った。７２人の脳腫瘍患者からの全血清を濾過して、より豊富な高分子量（ＨＭＷ）生体分子を除去した。血清サンプルの分画には、カットオフポイントが３ｋＤａの市販のＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ遠心濾過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ－Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）を使用した。血清を、「濾液」および「濃縮液」という２つの画分に分けた。濾液は、３ｋＤａカットオフポイント未満の生体分子成分を占め、濃縮液は、より高いＭＷ血清成分を表す。各患者の血清（０．３ｍＬ）を遠心フィルタに入れ、濾過チューブを１４０００ｇの速度で３０分間遠心分離した。濾液はメンブレンを通過して収集バイアルに入った。その後、フィルタを逆さにし、１０００ｇで２分間遠心分離して、ＨＭＷ濃縮液を収集した。濾液と濃縮液とを、分析時まで－８０℃の冷凍庫に保管した。
ＡＴＲ－ＦＴＩＲ分光法がＩＤＨ１変異型を検出できるかどうかを評価するために、血清サンプルの低分子量（ＬＭＷ）画分の分析を可能にするために遠心濾過を行った。７２人の脳腫瘍患者からの全血清を濾過して、より豊富な高分子量（ＨＭＷ）生体分子を除去した。血清サンプルの分画には、カットオフポイントが３ｋＤａの市販のＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ遠心濾過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ－Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）を使用した。血清を、「濾液」および「濃縮液」という２つの画分に分けた。濾液は、３ｋＤａカットオフポイント未満の生体分子成分を占め、濃縮液は、より高いＭＷ血清成分を表す。各患者の血清（０．３ｍＬ）を遠心フィルタに入れ、濾過チューブを１４０００ｇの速度で３０分間遠心分離した。濾液はメンブレンを通過して収集バイアルに入った。その後、フィルタを逆さにし、１０００ｇで２分間遠心分離して、ＨＭＷ濃縮液を収集した。濾液と濃縮液とを、分析時まで－８０℃の冷凍庫に保管した。
【0116】
遠心濾過の研究では、最初に、平均化濾液スペクトルを基準として、スペクトルを拡張乗法信号補正（ＥＭＳＣ）で補正した（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．を参照）。濾過した血清スペクトルには１０００～８００ｃｍ－１に２つの顕著なバンドが存在したため、データセットを８００ｃｍ－１にカットして、潜在的に重要な生物学的情報が全て保持されるようにした。したがって、４０００～８００ｃｍ－１、１８００～８００ｃｍ－１、および１８００～１０００ｃｍ－１の３つのスペクトルカットを検査した。他の全てのパラメータは、全血清分析から一貫していた。
【0117】
結果
初期のランダムフォレスト（ＲＦ）モデルは、リンパ腫患者とＧＢＭ患者との間の生化学的差異を提示する。ジニプロット（図２）は、アミドＩＩ領域が重要であり、そのすぐ後にアミドＩバンドが続くことを示唆する。１１５０～１０００ｃｍ－１に、核酸物質、グリコーゲン、および炭水化物内の振動に関連するさまざまな重要なバンドがある（［表３］）。
初期のランダムフォレスト（ＲＦ）モデルは、リンパ腫患者とＧＢＭ患者との間の生化学的差異を提示する。ジニプロット（図２）は、アミドＩＩ領域が重要であり、そのすぐ後にアミドＩバンドが続くことを示唆する。１１５０～１０００ｃｍ－１に、核酸物質、グリコーゲン、および炭水化物内の振動に関連するさまざまな重要なバンドがある（［表３］）。
【0118】
【表4】
【0119】
ＰＬＳ－ＤＡスコアプロットは、第２ＰＬＳ成分（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）に亘ってリンパ腫患者とＧＢＭ患者とを分離することが分かった（図３）。ここでも、最も高い区別は、負荷プロットのアミドＩＩバンドおよび低波数領域から生じる（図４）。リンパ腫対ＧＢＭでは、アミドＩ領域も高い区別を示し、［表３］で前述したＲＦジニ係数の結果を裏付けている。
【0120】
ブートストラップ分析をリンパ腫対ＧＢＭトレーニングセットに行って、許容可能な反復回数を求めた。この場合、５１回のリサンプルで十分であることが分かり、この時点で標準誤差が収束した（図５）。
【0121】
ＳＭＯＴＥがＲＦおよびＰＬＳ－ＤＡに最良のサンプリング手法である一方、アップサンプリングがＳＶＭベースのモデルに最適であることが分かった（［表４］）。
【0122】
【表5】
【0123】
この特定のデータセットでは、感度はＧＢＭを検出する能力を指し、特異度はリンパ腫に関する。［表４］に示すように、このデータセットにとって最も効果の低いモデルはＲＦであった。感度が高いにもかかわらず、特異度は７０．８％とかなり低かった。アップサンプリングと組み合わせたＳＶＭは良好に機能し、８６．４％のバランス精度を示した。ＰＬＳ－ＤＡ＋ＳＭＯＴＥ法は、感度９０．１％、特異度８６．３％、および全３つのモデルの中で最も高いκ値（平均κ＝０．７６）を有する最適モデルであると考えられた。各手法は、５１回の反復のうち少なくとも１回の感度と特異度とについて１００％を報告した。感度は比較的安定していたが、リンパ腫の予測はより変動的であった。例えば、ＲＦリサンプルのうちの１つが４２％の感度を報告し、最終的に平均値が低下した。とはいえ、ＳＶＭベースのモデルのＲＯＣ曲線は、ＡＵＣ値が０．９２であり、有望な診断機能を示している（図６）。
【0124】
ＡＴＲ－ＦＩＴＲＩＤＨ分析
星状細胞腫、乏突起膠腫、ＧＢＭのいずれかの脳腫瘍患者を、ＡＴＲ－ＦＴＩＲ血清分光法を用いてＩＤＨ１の状態に基づいて分けた。含まれた７２人の患者のうち、３６人がＩＤＨ１変異型であり、３６人がＩＤＨ１野生型であった。ＲＦ、ＰＬＳ－ＤＡ、およびＳＶＭによってそれぞれに１００回のリサンプルでデータを分類した。結果を「患者ごと」に［表６］に示す。全血清データセットについて、ＳＶＭモデルは７５．９％の有望な感度を報告したが、特異度は２８％と非常に低かった。各ケースで感度が特異度よりもはるかに高かったため、どのモデルも、検査セットからＩＤＨ１変異型血清サンプルを選択するのにより効果的であるようであった。各クラスに同数のサンプルがあることからモデルにバイアスが存在しないはずであるため、この理由は不明である。とはいえ、結果は信頼できるものではなく、バランス精度が低い（～５０％）ことから、最終的に正しい予測が偶然行われたと推測できる。
星状細胞腫、乏突起膠腫、ＧＢＭのいずれかの脳腫瘍患者を、ＡＴＲ－ＦＴＩＲ血清分光法を用いてＩＤＨ１の状態に基づいて分けた。含まれた７２人の患者のうち、３６人がＩＤＨ１変異型であり、３６人がＩＤＨ１野生型であった。ＲＦ、ＰＬＳ－ＤＡ、およびＳＶＭによってそれぞれに１００回のリサンプルでデータを分類した。結果を「患者ごと」に［表６］に示す。全血清データセットについて、ＳＶＭモデルは７５．９％の有望な感度を報告したが、特異度は２８％と非常に低かった。各ケースで感度が特異度よりもはるかに高かったため、どのモデルも、検査セットからＩＤＨ１変異型血清サンプルを選択するのにより効果的であるようであった。各クラスに同数のサンプルがあることからモデルにバイアスが存在しないはずであるため、この理由は不明である。とはいえ、結果は信頼できるものではなく、バランス精度が低い（～５０％）ことから、最終的に正しい予測が偶然行われたと推測できる。
【0125】
【表6】
【0126】
血清は、より豊富なＨＭＷ血清アルブミン（５０ｇ／Ｌ）からトロポニン（１ｎｇ／Ｌ）のようなＬＭＷタンパク質に至るまで、何千もの異なるタンパク質を構成している。正常血清サンプルにはさまざまな生体分子が豊富に存在するため、ＩＤＨ１変異型に関連している可能性のある、血液組成の微妙な変化を特定することは重要な課題であると想定された。血清のＬＭＷ画分は疾患固有の情報を含むと考えられており、この画分の分光学的シグニチャが診断に役立つ。したがって、全血清データの分類性能が低いため、遠心濾過を使用することで個別の分子の違いを強調できる可能性があると考えられた。
【0127】
図７は、全血清、＞３ｋＤａ「ＨＭＷ」画分、および＜３ｋＤａ「ＬＭＷ」画分のＩＲスペクトルの例を示す。濃縮液は、全血清スペクトルとほぼ同じように見える。特に、アミド領域内に存在する、アルブミンや免疫グロブリンなどのより豊富なタンパク質から非常に類似した吸光度を有する。これらの大きなタンパク質と他のＨＭＷ成分とを除去すると、濾液のスペクトルは著しく異なり、指紋領域に少数の明確なピークがある（赤いスペクトル）。検査のために、９５０ｃｍ－１および８５０ｃｍ－１付近の２つの明確なピークを含む４０００～８００ｃｍ－１および１８００～８００ｃｍ－１と典型的な生物学的指紋領域（１８００～１０００ｃｍ－１）との３つのスペクトル領域を選択した。分類結果を［表７］に示す。
【0128】
いずれの場合も、ＩＤＨ１野生型患者の検出において、濾液モデルは、６０％を超える特異度値を報告し、全血清モデルよりも優れていた。濾過ステップによる診断能力の向上は、３つの全血清分類器の単一モデルＲＯＣ曲線（図８ａ）および３つの濾液データセットのそれぞれの最良モデル（図８ｂ）を示す図８で強調されている。良くない分類結果から想定されるように、全血清モデルのＲＯＣ曲線は対角線上にある。つまり、行われている予測はランダムな推測に勝るものではなく、報告されたＡＵＣ値～０．５は、検査に本質的に診断精度がないことを示唆する。ただし、遠心濾過を含めることで、２つのＩＤＨ１クラスを区別できる能力が向上した。図８ｂの対応するＲＯＣ曲線は、ＡＵＣ値＞０．７を報告しており、これは「許容可能な」区別レベルであるとしばしば見なされるものである。
【0129】
【表7】
【0130】
＜３ｋＤａの濾過血清「フルスペクトル」データセット（４０００～８００ｃｍ－１）は、ＰＬＳ－ＤＡモデルで分類した場合、６９．１％という最高のバランス精度を発揮した。図９ａのＰＬＳスコアプロットは、データセット内の一般的な変動を表す。主な分散は、通常、第１ＰＬＳ成分（ＰＬＳ１）によって表される。ＰＬＳ１の負荷は、～３４００ｃｍ－１と～１６５０ｃｍ－１の大きな差を示唆しているが、スコアプロットではＰＬＳ１全体に明らかなクラス分離はない。いくつかの重複はあるが、第２ＰＬＳ成分がＰＬＳ１よりも２つのクラスをより適切に分離していることが分かる。ＰＬＳ２の負荷は、～１６５０ｃｍ－１付近の大きなスペクトル差も強調する（図９ｂ）。興味深いことに、これは正常血清スペクトルにおける大きなアミドＩバンドの典型的な位置であり、豊富なタンパク質分子内の結合振動の主要因である。アルブミンや免疫グロブリンなどのサンプルからＨＭＷタンパク質が濾過されたとしても、非常に低分子量（＜３ｋＤａ）である分子を調べる場合、これは依然として重要な領域であるように思われる。このことは、より小さいタンパク質分子でも診断ポテンシャルがあることを示唆する。
【0131】
一般に、バランス精度は、検査された全てのモデルで６０～７０％に向上した。遠心濾過ステップにより、よりバランスの取れた感度と特異度が実現され、モデル性能が大幅に向上した。
【0132】
結論
ＧＰ設定での脳腫瘍の早期発見のための迅速な血清検査の実施は、患者の生活の質と予後に大きな影響を与え得る。
ＧＰ設定での脳腫瘍の早期発見のための迅速な血清検査の実施は、患者の生活の質と予後に大きな影響を与え得る。
【0133】
本発明の方法は、脳腫瘍型を区別する能力を有する。とりわけ、ＡＴＲ－ＦＴＩＲ分光法によるリンパ腫とＧＢＭとの分離は、画像診断の結果が明確でない場合、二次医療環境の神経科医にとって特に興味深い。この原理実証研究には１１２人の患者が参加し、９０．１％の感度と８６．３％の特異度を示した。κ値０．７６は、この手法が信頼できることを表す。
【0134】
生検前の血清から分子状態を同定することで、一部の患者を代替治療法へ導き得る。当初、全血清分類器の性能は低く、バランス精度は～５０％であった。しかし、遠心濾過の導入により、分類性能が大幅に向上し、感度と特異度が約７０％に上昇した。これらの方法は、将来の臨床研究においてさらに最適化できる可能性があり、脳腫瘍型を術前に層別化可能な、ＡＴＲＸ喪失、１ｐ／１９ｑ同時欠失、および／またはＭＧＷＴ高メチル化などの他の重要な分子変化を特定するように拡張できる。
【0135】
参考文献
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（１）Ｂ．Ｒ．Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，‘Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｒａｎｄｏｍ ｆｏｒｅｓｔ ａｎｄ ２Ｄ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｓｅｒｕｍ ｓｐｅｃｔｒａｌ ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ ｆｏｒ ｎｅｕｒｏ－ｏｎｃｏｌｏｇｙ’，Ａｎａｌｙｓｔ，ｖｏｌ．１４１，ｎｏ．１２，ｐｐ．３６６８-３６７８，２０１６．
（２）Ｂ．Ｒ．Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｊ．Ｂａｋｅｒ，ａｎｄ Ｄ．Ｓ．Ｐａｌｍｅｒ，‘ＰＲＦＦＥＣＴ：Ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｓｔｓ’，Ｃｈｅｍｏｍｅｔｒｉｃｓ ａｎｄ Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ｖｏｌ．１７２，ｐｐ．３３-４２，Ｊａｎ．２０１８．
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【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【国際調査報告】