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特表2022-546539粘液腫ウイルスを用いて癌を治療するための新しい腫瘍崩壊ウイルスプラットフォーム
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-11-04
(54)【発明の名称】粘液腫ウイルスを用いて癌を治療するための新しい腫瘍崩壊ウイルスプラットフォーム
(51)【国際特許分類】
C12N 15/863 20060101AFI20221027BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20221027BHJP
A61P 35/04 20060101ALI20221027BHJP
A61K 35/768 20150101ALI20221027BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20221027BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20221027BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20221027BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20221027BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20221027BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20221027BHJP
C12N 15/28 20060101ALN20221027BHJP
C12N 15/24 20060101ALN20221027BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20221027BHJP
【ＦＩ】
C12N15/863 Z
A61P35/00
A61P35/04
A61K35/768
A61K48/00
A61K45/00
A61P43/00 121
A61K35/12
A61K31/7088
C12N7/01
C12N15/28
C12N15/24
C12N15/113 100Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022514014
(86)(22)【出願日】2020-09-02
(85)【翻訳文提出日】2022-04-28
(86)【国際出願番号】 US2020049061
(87)【国際公開番号】W WO2021046125
(87)【国際公開日】2021-03-11
(31)【優先権主張番号】62/894,925
(32)【優先日】2019-09-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/944,233
(32)【優先日】2019-12-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】504318142
【氏名又は名称】アリゾナ ボード オブ リージェンツ オン ビハーフ オブ アリゾナ ステート ユニバーシティ
(71)【出願人】
【識別番号】522079023
【氏名又は名称】オンコミクス セラピューティクス，インク．
(74)【代理人】
【識別番号】100082072
【弁理士】
【氏名又は名称】清原 義博
(72)【発明者】
【氏名】マクファデン，ダグラス グラント
(72)【発明者】
【氏名】ラフマーン，モハメド マスムズール
(72)【発明者】
【氏名】ヴィラ，ナンシー
(72)【発明者】
【氏名】トーレス－ドミンゲス，リノ
(72)【発明者】
【氏名】フランコ アチュリ，リナ
(72)【発明者】
【氏名】シャープ，レスリー リン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C086
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90Y
4B065AA95X
4B065AA95Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA01
4B065CA24
4B065CA44
4C084AA13
4C084AA19
4C084MA55
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZC751
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA02
4C086MA04
4C086MA55
4C086NA05
4C086NA14
4C086ZB26
4C086ZC75
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB65
4C087BC83
4C087CA04
4C087CA12
4C087MA55
4C087NA05
4C087NA14
4C087ZB26
4C087ZC75
(57)【要約】
本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、組換え粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）および組換えＭＹＸＶをコードする核酸構築物である。いくつかの実施形態では、ＭＹＸＶは、Ｍ１５３タンパク質の活性または発現レベルを不活性化または減弱させるように操作される。いくつかの実施形態では、ＭＹＸＶは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、またはデコリンなどの１つ以上の導入遺伝子を発現するように操作される。また、本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、ＭＹＸＶを使用する方法である。いくつかの実施形態は、本明細書に記載されるようなＭＹＸＶを、それを必要とする対象に提供することを含む。
【選択図】図１Ａ
【選択図】図１Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗癌活性が増強された粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）であって、前記粘液腫ウイルスは、そのＭ１５３タンパク質の活性または発現レベルを減衰するように遺伝子操作されている、粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）。
【請求項2】
前記Ｍ１５３タンパク質の活性または発現レベルが少なくとも８０％減衰される、請求項１に記載のＭＹＸＶ。
【請求項3】
前記ＭＹＸＶは、前記Ｍ１５３タンパク質をコードする核酸に変異を導入するように操作され、ここで、前記変異は、挿入、欠失、または置換変異を含む、請求項１または請求項２に記載のＭＹＸＶ。
【請求項4】
前記変異が、野生型Ｍ１５３タンパク質に関連して細胞免疫応答活性を増強する、請求項３に記載のＭＹＸＶ。
【請求項5】
ＭＹＸＶゲノム中のＭ１５３タンパク質をコードする核酸の少なくとも一部がノックアウトされている、請求項１に記載のＭＹＸＶ。
【請求項6】
前記ＭＹＸＶが、前記Ｍ１５３転写物を標的とする阻害性分子を含み、それにより、Ｍ１５３タンパク質発現を減衰する、請求項１に記載のＭＹＸＶ。
【請求項7】
前記阻害性分子が阻害性ＲＮＡである、請求項６に記載のＭＹＸＶ。
【請求項8】
前記阻害性ＲＮＡが、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡを含む、請求項７に記載のＭＹＸＶ。
【請求項9】
非ウイルス分子をコードする核酸をさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のＭＹＸＶ。
【請求項10】
前記非ウイルス分子が腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）である、請求項９に記載のＭＹＸＶ。
【請求項11】
前記ＴＮＦαがヒトＴＮＦαである、請求項１０に記載のＭＹＸＶ。
【請求項12】
前記ＴＮＦαが可溶性ペプチドである、請求項１０または１１に記載のＭＹＸＶ。
【請求項13】
前記ＴＮＦαが膜または表面に結合したペプチドである、請求項１０～１２のいずれかに記載のＭＹＸＶ。
【請求項14】
前記ＴＮＦαが、抗腫瘍免疫細胞を活性化すること、または癌細胞死を誘導することによって、前記ＭＹＸＶの抗癌活性をさらに増強する、請求項１０～１３のいずれかに記載のＭＹＸＶ。
【請求項15】
前記非ウイルス分子がインターロイキン－１２（ＩＬ－１２）である、請求項９に記載のＭＹＸＶ。
【請求項16】
前記ＩＬ－１２がヒトＩＬ－１２である、請求項１５に記載のＭＹＸＶ。
【請求項17】
前記ＩＬ－１２が可溶性ペプチドである、請求項１５または請求項１６に記載のＭＹＸＶ。
【請求項18】
前記ＩＬ－１２が膜または表面に結合したペプチドである、請求項１５～１７のいずれか一項に記載のＭＹＸＶ。
【請求項19】
前記ＩＬ－１２が、免疫細胞の分化を促進すること、または免疫細胞の細胞毒性を誘発することによって、前記ＭＹＸＶの抗癌活性をさらに増強する、請求項１５～１８のいずれかに記載のＭＹＸＶ。。
【請求項20】
前記非ウイルス性分子がデコリンである、請求項９に記載のＭＹＸＶ。
【請求項21】
前記デコリンがヒトデコリンである、請求項２０に記載のＭＹＸＶ。
【請求項22】
前記デコリンが可溶性ペプチドである、請求項２０または２１に記載のＭＹＸＶ。
【請求項23】
前記デコリンが膜または表面に結合したペプチドである、請求項２０～２２のいずれかに記載のＭＹＸＶ。
【請求項24】
前記デコリンが、ＴＧＦ－βシグナル伝達を遮断または減少させることにより、ＭＹＸＶの抗癌活性をさらに増強する、請求項２０～２３のいずれかに記載のＭＹＸＶ。
【請求項25】
前記核酸が、ＴＮＦα、ＩＬ－１２、およびデコリンからなる群より選択される少なくとも２つの分子をコードする、請求項９に記載のＭＹＸＶ。
【請求項26】
前記核酸がＴＮＦα、ＩＬ－１２、およびデコリンをコードする、請求項９に記載のＭＹＸＶ。
【請求項27】
前記ＭＹＸＶがＬａｕｓａｎｎｅ株に由来する、請求項１～２４のいずれかに記載のＭＹＸＶ。
【請求項28】
請求項１～２７のいずれかのＭＹＸＶ、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む組成物。
【請求項29】
全身投与用に製剤化される、請求項２８に記載の組成物。
【請求項30】
局所投与用に製剤化される、請求項２８に記載の組成物。
【請求項31】
非経口投与用に製剤化される、請求項２８～３０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項32】
複数の細胞を含む組成物であって、前記複数の細胞が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄（ＢＭ）細胞、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載のＭＹＸＶによってエキソビボで処理された、組成物。
【請求項33】
請求項１～２７のいずれか一項に記載のＭＹＸＶまたは請求項２８～３２のいずれか一項に記載の組成物を必要とする対象に投与する工程を含む、対象における癌を阻害、軽減、または予防する方法。
【請求項34】
前記対象が癌を有するか、癌を有することが疑われるか、または癌を有するリスクがあり、前記方法は、前記対象を選択する工程をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
前記対象がヒトである、請求項３３または請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
前記投与が全身投与である、請求項３３～３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
前記投与が癌細胞の生存率を低下させるか、または前記癌における免疫原性細胞死を活性化する、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項38】
前記投与が前記対象の生存を改善する、請求項３３～３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項39】
前記癌が固形腫瘍を含む、請求項３３～３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項40】
前記癌が骨肉腫、トリプルネガティブ乳癌、または黒色腫である、請求項３３～３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項41】
前記癌が前記対象の１つの場所に転移している、請求項３３～４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項42】
前記場所が、前記対象の肺、脳、肝臓、および／またはリンパ節を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
前記対象に追加の治療薬を投与する工程をさらに含む、請求項３３～４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項44】
前記追加の治療薬が免疫チェックポイントモジュレーターである、請求項４３に記載の方法。
【請求項45】
前記組成物を投与する前に、前記追加の治療薬が前記対象に投与される、請求項４３または請求項４４に記載の方法。
【請求項46】
前記組成物を投与した後に、前記追加の治療薬が前記対象に投与される、請求項４３または請求項４４に記載の方法。
【請求項47】
前記追加の治療薬が、前記組成物との組み合わせとして前記対象に投与される、請求項４３または請求項４４に記載の方法。
【請求項48】
複数の細胞を含む組成物が前記対象に投与され、前記複数の細胞が前記対象に対して自己である細胞を含む、請求項３３～４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項49】
複数の細胞を含む組成物が前記対象に投与され、前記複数の細胞が前記対象に対して同種異系である細胞を含む、請求項３３～４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項50】
ＭＹＸＶゲノムの少なくとも一部を含む組換え核酸であって、ここで、前記ＭＹＸＶゲノムは、Ｍ１５３遺伝子の発現を低下させるように改変されている、組換え核酸。
【請求項51】
ＤＮＡを含む、請求項５０に記載の組換え核酸。
【請求項52】
前記ＭＹＸＶゲノムの一部が、前記ＭＹＸＶゲノムの一部におけるＭ１５３遺伝子の少なくとも一部をノックアウトするように改変される、請求項５０または請求項５１に記載の組換え核酸。
【請求項53】
前記組換えＭＹＸＶゲノムがＴＮＦαをコードする第１の核酸を含む、請求項５０～５２のいずれかに記載の組換え核酸。
【請求項54】
前記ＴＮＦαがヒトＴＮＦαである、請求項５３に記載の組換え核酸。
【請求項55】
前記第１の核酸が、前記ＭＹＸＶゲノムのＭ１３５Ｒ遺伝子を置き換えるか、またはこれに隣接する、請求項５３または請求項５４に記載の組換え核酸。
【請求項56】
前記ＭＹＸＶゲノムのＭ１３５Ｒ遺伝子とＭ１３６Ｒ遺伝子との間に第１の核酸が挿入されている、請求項５３～５５のいずれかに記載の組換え核酸。
【請求項57】
前記第１の核酸の発現が、ポックスウイルス合成初期／後期（ｓＥ／Ｌ）プロモーターによって駆動される、請求項５３～５６のいずれかに記載の組換え核酸。
【請求項58】
前記組換えＭＹＸＶゲノムが、インターロイキン－１２サブユニットアルファ（ＩＬ－１２α）をコードする第２の核酸を含む、請求項５０～５７のいずれかに記載の組換え核酸。
【請求項59】
前記ＩＬ－１２αがヒトＩＬ－１２αである、請求項５８に記載の組換え核酸。
【請求項60】
前記ＩＬ－１２αの発現が内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）によって駆動される、請求項５８または請求項５９に記載の組換え核酸。
【請求項61】
前記第２の核酸ＩＬ－１２αが、前記ＭＹＸＶゲノムのＭ１５３遺伝子の発現を破壊する、請求項５８～６０のいずれか一項に記載の組換え核酸。
【請求項62】
前記組換えＭＹＸＶゲノムが、インターロイキン－１２サブユニットベータ（ＩＬ－１２β）をコードする第３の核酸を含む、請求項５０～６１のいずれかに記載の組換え核酸。
【請求項63】
前記ＩＬ－１２βがヒトＩＬ－１２βである、請求項６２に記載の組換え核酸。
【請求項64】
前記第３の核酸の発現が、ｓＥ／Ｌプロモーターによって駆動される、請求項６２または請求項６３に記載の組換え核酸。
【請求項65】
前記第３の核酸が、前記ＭＹＸＶゲノムのＭ１５３遺伝子の発現を破壊する、請求項６２～６４のいずれかに記載の組換え核酸。
【請求項66】
前記組換えＭＹＸＶゲノムが、デコリンをコードする第４の核酸を含む、請求項５０～６５のいずれかに記載の組換え核酸。
【請求項67】
前記デコリンがヒトデコリンである、請求項６６に記載の組換え核酸。
【請求項68】
前記第４の核酸の発現が、ｓＥ／Ｌプロモーターによって駆動される、請求項６６または請求項６７に記載の組換え核酸。
【請求項69】
前記第４の核酸が、前記ＭＹＸＶゲノムのＭ１５３遺伝子の発現を破壊する、請求項６６～６８のいずれかに記載の組換え核酸。
【請求項70】
レポータータグをコードする第５の核酸をさらに含む、請求項５０～６９のいずれかに記載の組換え核酸。
【請求項71】
前記レポータータグが緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含む、請求項７０に記載の組換え核酸。
【請求項72】
前記第５の核酸の発現がｓＥ／Ｌプロモーターによって駆動される、請求項７０または請求項７１に記載の組換え核酸。
【請求項73】
第２のレポータータグをコードする第６の核酸をさらに含む、請求項７０に記載の組換え核酸。
【請求項74】
前記第２のレポータータグが赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を含む、請求項７３に記載の組換え核酸。
【請求項75】
前記第６の核酸の発現が、ポックスウイルスＰ１１後期プロモーターによって駆動される、請求項７３または請求項７４に記載の組換え核酸。
【請求項76】
前記組換え核酸が、任意選択でＧＦＰを含むｖＭｙｘ－ｈＴＮＦａカセットを含む、請求項５０～７５のいずれかに記載の組換え核酸。
【請求項77】
前記組換え核酸が、任意選択でｄｓＲｅｄを含むｈＤｅｃｏｒｉｎ－ｈＩＬ－１２カセットを含む、請求項５０～７６のいずれかに記載の組換え核酸。
【請求項78】
前記組換え核酸が、任意選択でｄｓＲｅｄおよび／またはＧＦＰを含むｖＭｙｘ－ｈＴＮＦａ－ｈＤｅｃｏｒｉｎ－ｈＩＬ－１２－Ｍ１５３ＫＯ（ｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅ）カセットを含むか、またはそれからなる、請求項５０～７７のいずれかに記載の組換え核酸。
【請求項79】
請求項５０～７８のいずれかに記載の組換え核酸を含む組換えＭＹＸＶ。
【請求項80】
請求項５０～７９のいずれか一項に記載の組換え核酸または請求項７９に記載の組換えＭＹＸＶを必要とする対象に投与する工程を含む、対象における癌を阻害、軽減、または予防する方法。
【請求項81】
前記対象が癌を有するか、癌を有することが疑われるか、または癌を有するリスクがあり、前記方法は、前記対象を選択する工程をさらに含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項82】
前記対象がヒトである、請求項８０または８１に記載の方法。
【請求項83】
前記投与が全身投与である、請求項８０～８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項84】
前記投与が細胞生存率を低下させるか、または癌における免疫原性細胞死を活性化する、請求項８０～８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項85】
前記投与が、前記対象のＰＢＭＣにおける少なくとも２つのサイトカインの発現を増加させるために有効な用量およびスケジュールで行われる、請求項３５～４９のいずれか一項または請求項８０～８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項86】
前記投与が、前記対象の癌細胞における少なくとも２つのサイトカインの発現を増加させるために有効な用量およびスケジュールで行われる、請求項３５～４９のいずれか一項または請求項８０～８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項87】
前記少なくとも２つのサイトカインが、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、またはＴＮＦ－αを含む、請求項８５または請求項８６に記載の方法。
【請求項88】
前記投与が、前記癌の体積を少なくとも１０％減少させるために有効な用量およびスケジュールで行われる、請求項３５～４９のいずれか一項または請求項８０～８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項89】
前記投与が、前記癌の増殖を少なくとも１０％減少させるために有効な用量およびスケジュールで行われる、請求項３５～４９のいずれか一項または請求項８０～８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項90】
前記ＩＬ－１２がＩＬ－１２αサブユニットおよびＩＬ－１２βサブユニットを含む、請求項１５に記載のＭＹＸＶ。
【請求項91】
前記ＩＬ－１２αサブユニットおよび前記ＩＬ－１２βサブユニットがポリペプチドリンカーによって結合されている、請求項９０に記載のＭＹＸＶ。
【請求項92】
前記ポリペプチドリンカーがエラスチンリンカーである、請求項９１に記載のＭＹＸＶ。
【請求項93】
低レベルのＩＬ－１２を発現する、請求項１５に記載のＭＹＸＶ。
【請求項94】
高レベルのＩＬ－１２を発現する、請求項１５に記載のＭＹＸＶ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
相互参照
本出願は、２０１９年９月２日に出願された米国仮出願第６２／８９４，９２５号および２０１９年１２月５日に出願された米国仮出願第６２／９４４，２３３号の利益を主張し、これらの各々はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年９月２日に出願された米国仮出願第６２／８９４，９２５号および２０１９年１２月５日に出願された米国仮出願第６２／９４４，２３３号の利益を主張し、これらの各々はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２０年９月１日に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーは、４２２０６－７２１＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔという名称で、７２，９２５バイトのサイズである。
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２０年９月１日に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーは、４２２０６－７２１＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔという名称で、７２，９２５バイトのサイズである。
【0003】
連邦政府により支援された研究に関する声明
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与されたＰ５０ ＣＡ１８６７８１の下での政府支援を用いて行われた。政府は本発明において特定の権利を有する。
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与されたＰ５０ ＣＡ１８６７８１の下での政府支援を用いて行われた。政府は本発明において特定の権利を有する。
【0004】
分野
本明細書に開示されているのは、組換え粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）、組換えＭＹＸＶをコードする核酸構築物、ならびにその使用方法である。
本明細書に開示されているのは、組換え粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）、組換えＭＹＸＶをコードする核酸構築物、ならびにその使用方法である。
【背景技術】
【0005】
背景
様々なタイプの癌を治療するために使用される現在の治療は、癌性細胞を中毒にし、または殺傷することによって作用する傾向があるが、癌細胞に毒性のある治療は、通常、健康な細胞にも同様に毒性がある傾向がある。さらに、腫瘍の不均一な性質は、癌の効果的な治療がとらえどころのないままである主な理由の１つである。化学療法や放射線療法などの現在の主流の治療法は、毒性の狭い治療ウィンドウ内で使用される傾向がある。これらのタイプの治療法は、腫瘍細胞のタイプが異なり、これらの治療を実施できるウィンドウが限られているため、適用範囲が限られている。
様々なタイプの癌を治療するために使用される現在の治療は、癌性細胞を中毒にし、または殺傷することによって作用する傾向があるが、癌細胞に毒性のある治療は、通常、健康な細胞にも同様に毒性がある傾向がある。さらに、腫瘍の不均一な性質は、癌の効果的な治療がとらえどころのないままである主な理由の１つである。化学療法や放射線療法などの現在の主流の治療法は、毒性の狭い治療ウィンドウ内で使用される傾向がある。これらのタイプの治療法は、腫瘍細胞のタイプが異なり、これらの治療を実施できるウィンドウが限られているため、適用範囲が限られている。
【発明の概要】
【0006】
要約
本明細書に開示されるのは、いくつかの態様において、増強された抗癌活性を有する粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）であり、この粘液腫ウイルスは、そのＭ１５３タンパク質の活性または発現レベルを減衰するように遺伝子操作されている。
本明細書に開示されるのは、いくつかの態様において、増強された抗癌活性を有する粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）であり、この粘液腫ウイルスは、そのＭ１５３タンパク質の活性または発現レベルを減衰するように遺伝子操作されている。
【0007】
特定の実施形態において、Ｍ１５３タンパク質の活性または発現レベルは、少なくとも８０％減衰される。あるいは、および／またはさらに、ＭＹＸＶは、Ｍ１５３タンパク質をコードする核酸に変異を導入するように操作され、ここで、変異は、挿入、欠失、または置換変異を含む。いくつかの実施形態において、変異は、野生型Ｍ１５３タンパク質に関連して細胞免疫応答活性を増強する。特定の実施形態では、ＭＹＸＶゲノム中のＭ１５３タンパク質をコードする核酸の少なくとも一部がノックアウトされている。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、Ｍ１５３転写物を標的とする阻害性分子を含み、それによって、Ｍ１５３タンパク質発現を減衰する。いくつかの実施形態において、阻害性分子は、阻害性ＲＮＡである。いくつかの実施形態において、阻害性ＲＮＡは、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、非ウイルス分子をコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、非ウイルス分子は、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）である。いくつかの実施形態において、ＴＮＦαはヒトＴＮＦαである。いくつかの実施形態において、ＴＮＦαは可溶性ペプチドである。いくつかの実施形態において、ＴＮＦαは、膜または表面に結合したペプチドである。いくつかの実施形態において、ＴＮＦαは、抗腫瘍免疫細胞を活性化すること、または癌細胞死を誘導することによって、ＭＹＸＶの抗癌活性をさらに増強する。いくつかの実施形態において、非ウイルス分子は、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）である。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２は、ヒトＩＬ－１２である。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２は、可溶性ペプチドである。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２は、膜または表面に結合したペプチドである。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２は、免疫細胞の分化を促進すること、または免疫細胞の細胞毒性を誘発することによって、ＭＹＸＶの抗癌活性をさらに増強する。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２は、ＩＬ－１２αサブユニットおよびＩＬ－１２βサブユニットを含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２αサブユニットおよびＩＬ－１２βサブユニットは、ポリペプチドリンカーによって結合されている。いくつかの実施形態において、ポリペプチドリンカーはエラスチンリンカーである。いくつかの実施形態において、非ウイルス分子はデコリンである。いくつかの実施形態において、デコリンはヒトデコリンである。いくつかの実施形態において、デコリンは可溶性ペプチドである。いくつかの実施形態において、デコリンは、膜または表面に結合したペプチドである。いくつかの実施形態において、デコリンは、ＴＧＦ－βシグナル伝達を遮断または減少させることにより、ＭＹＸＶの抗癌活性をさらに増強する。いくつかの実施形態において、上記核酸は、ＴＮＦα、ＩＬ－１２、およびデコリンからなる群から選択される少なくとも２つの分子をコードする。いくつかの実施形態において、上記核酸は、ＴＮＦα、ＩＬ－１２、およびデコリンをコードする。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶはＬａｕｓａｎｎｅ株に由来する。
【0008】
本明細書に開示されるのは、いくつかの態様において、上記の実施形態のいずれかのＭＹＸＶ、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む組成物である。
【0009】
いくつかの実施形態において、組成物は、全身投与のために製剤化される。いくつかの実施形態において、組成物は、局所投与のために製剤化される。いくつかの実施形態において、組成物は、非経口投与のために製剤化される。
【0010】
本明細書で開示されるのは、いくつかの態様において、上記の実施形態のいずれかのＭＹＸＶによってエキソビボで処理された複数の細胞を含む組成物であり、上記複数の細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄（ＢＭ）細胞、またはそれらの組み合わせを含む。
【0011】
本明細書に開示されるのは、いくつかの態様において、上記の実施形態のいずれか１つのＭＹＸＶまたは組成物を対象に投与する工程を含む、必要とする対象における癌を阻害、軽減、または予防する方法である。
【0012】
いくつかの実施形態において、対象は、癌を有するか、癌を有することが疑われるか、または癌を有するリスクがあり、上記方法は、対象を選択する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、対象はヒトである。いくつかの実施形態において、投与は全身投与である。いくつかの実施形態において、投与は、癌細胞の生存率を低下させるか、または癌における免疫原性細胞死を活性化する。いくつかの実施形態において、投与は対象の生存を改善する。いくつかの実施形態において、癌は固形腫瘍を含む。いくつかの実施形態において、癌は、骨肉腫、Ｔｒｉｐｌｅネガティブ乳癌、または黒色腫である。いくつかの実施形態において、癌は対象の１つの場所に転移している。いくつかの実施形態において、上記場所は、対象の肺、脳、肝臓、および／またはリンパ節を含む。いくつかの実施形態において、上記方法は、対象に追加の治療薬を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記追加の治療薬は、免疫チェックポイントモジュレーターである。いくつかの実施形態において、上記追加の治療薬は、上記組成物を投与する前に対象に投与される。いくつかの実施形態において、上記追加の治療薬は、上記組成物を投与した後に対象に投与される。いくつかの実施形態において、上記追加の治療薬は、上記組成物との組み合わせとして対象に投与される。いくつかの実施形態において、複数の細胞を含む組成物が、対象に投与され、ここで、上記複数の細胞は、対象に対して自己である細胞を含む。いくつかの実施形態において、上記複数の細胞を含む組成物は、対象に投与され、ここで、複数の細胞は、対象に対して同種異系である細胞を含む。
【0013】
本明細書に開示されるのは、いくつかの態様において、ＭＹＸＶゲノムの少なくとも一部を含む組換え核酸であり、ここで、ＭＹＸＶゲノムは、Ｍ１５３遺伝子の発現を低減するように改変されている。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶゲノムの一部は、ＭＹＸＶゲノムの一部におけるＭ１５３遺伝子の少なくとも一部をノックアウトするように改変される。いくつかの実施形態において、組換えＭＹＸＶゲノムは、ＴＮＦαをコードする第１の核酸を含む。いくつかの実施形態において、ＴＮＦαはヒトＴＮＦαである。いくつかの実施形態において、第１の核酸は、ＭＹＸＶゲノムのＭ１３５Ｒ遺伝子を置き換えるか、または隣接する。いくつかの実施形態において、第１の核酸は、ＭＹＸＶゲノムのＭ１３５Ｒ遺伝子とＭ１３６Ｒ遺伝子との間に挿入されている。いくつかの実施形態において、第１の核酸の発現は、ポックスウイルス合成初期／後期（ｓＥ／Ｌ）プロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態において、組換えＭＹＸＶゲノムは、インターロイキン－１２サブユニットアルファ（ＩＬ－１２α）をコードする第２の核酸を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２αは、ヒトＩＬ－１２αである。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２αの発現は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）によって駆動される。いくつかの実施形態において、第２の核酸ＩＬ－１２αは、ＭＹＸＶゲノムのＭ１５３遺伝子の発現を破壊する。いくつかの実施形態において、組換えＭＹＸＶゲノムは、インターロイキン－１２サブユニットベータ（ＩＬ－１２β）をコードする第３の核酸を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２βは、ヒトＩＬ－１２βである。いくつかの実施形態において、第３の核酸の発現は、ｓＥ／Ｌプロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態において、第３の核酸は、ＭＹＸＶゲノムのＭ１５３遺伝子の発現を破壊する。いくつかの実施形態において、組換えＭＹＸＶゲノムは、デコリンをコードする第４の核酸を含む。いくつかの実施形態において、デコリンはヒトデコリンである。いくつかの実施形態において、第４の核酸の発現は、ｓＥ／Ｌプロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態において、第４の核酸は、ＭＹＸＶゲノムのＭ１５３遺伝子の発現を破壊する。いくつかの実施形態において、組換えＭＹＸＶゲノムは、レポータータグをコードする第５の核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、レポータータグは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含む。いくつかの実施形態において、第５の核酸の発現は、ｓＥ／Ｌプロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、第２のレポータータグをコードする第６の核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、第２のレポータータグは、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を含む。いくつかの実施形態において、第６の核酸の発現は、ポックスウイルスＰ１１後期プロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、任意選択でＧＦＰを含む、ｖＭｙｘ－ｈＴＮＦａカセットを含む。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、任意選択でｄｓＲｅｄを含む、ｈＤｅｃｏｒｉｎ－ｈＩＬ－１２カセットを含む。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、任意選択でｄｓＲｅｄおよび／またはＧＦＰを含む、ｖＭｙｘ－ｈＴＮＦａ－ｈＤｅｃｏｒｉｎ－ｈＩＬ－１２－Ｍ１５３ＫＯ（ｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅ）カセットを含むか、またはそれからなる。
【0014】
本明細書に開示されるのは、いくつかの態様において、上記の実施形態のいずれかの組換え核酸を含む組換えＭＹＸＶである。
【0015】
本明細書に開示されるのは、いくつかの態様において、先行する実施形態のいずれか１つの組換え核酸または組換えＭＹＸＶを対象に投与する工程を含む、必要とする対象における癌を阻害、軽減、または予防する方法である。
【0016】
いくつかの実施形態において、対象は、癌を有するか、癌を有することが疑われるか、または癌を有するリスクがあり、上記方法は、対象を選択する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、対象はヒトである。いくつかの実施形態において、投与は全身投与である。いくつかの実施形態において、投与は、細胞生存率を低下させるか、または癌における免疫原性細胞死を活性化する。いくつかの実施形態において、投与は、対象のＰＢＭＣにおける少なくとも２つのサイトカインの発現を増加させるために有効な用量およびスケジュールで実施される。いくつかの実施形態において、投与は、対象の癌細胞における少なくとも２つのサイトカインの発現を増加させるのに有効な用量およびスケジュールで実施される。いくつかの実施形態において、上記少なくとも２つのサイトカインは、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、またはＴＮＦ－αを含む。いくつかの実施形態において、上記投与は、癌の体積を少なくとも１０％減少させるために有効な用量およびスケジュールで行われる。いくつかの実施形態において、上記投与は、癌の増殖を少なくとも１０％減少させるために有効な用量およびスケジュールで実施される。
【0017】
本明細書に開示されるのは、いくつかの態様において、増強された抗癌活性を有する粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）であり、ＭＹＸＶは、そのＭ１５３タンパク質の活性または発現レベルを減衰するように遺伝子操作される。
【0018】
いくつかの実施形態において、Ｍ１５３タンパク質の活性または発現レベルは、少なくとも８０％減衰される。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、Ｍ１５３タンパク質をコードする核酸に変異を導入するように操作され、ここで、変異は、挿入、欠失、または置換変異を含む。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶゲノム中のＭ１５３タンパク質をコードする核酸の少なくとも一部がノックアウトされる。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、Ｍ１５３転写物を標的とする阻害分子を含み、それによって、Ｍ１５３タンパク質発現を減衰し、ここで、阻害分子は、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、非ウイルス分子を発現するようにさらに遺伝子操作されている。いくつかの実施形態において、非ウイルス分子は、サイトカインまたは細胞マトリックスタンパク質である。いくつかの実施形態において、非ウイルス性分子は、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、インターロイキン－１２サブユニットアルファ（ＩＬ－１２α）、インターロイキン－１２サブユニットベータ（ＩＬ－１２β）、またはデコリンである。いくつかの実施形態において、非ウイルス分子はヒトタンパク質である。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、ＴＮＦα、ＩＬ－１２α、ＩＬ－１２β、およびデコリンからなる群より選択される少なくとも２つの非ウイルス分子を発現する。
【0019】
本明細書に開示されるのは、いくつかの態様において、ＭＹＸＶによってエキソビボで処理された複数の細胞を含む組成物であり、ＭＹＸＶは、そのＭ１５３タンパク質の活性または発現レベルを減衰させ、非ウイルス分子を発現するように遺伝子操作される。
【0020】
いくつかの実施形態において、複数の細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄（ＢＭ）細胞、またはそれらの組み合わせを含む。
【0021】
本明細書に開示されるのは、いくつかの態様において、ＭＹＸＶゲノムの少なくとも一部を含む組換え核酸であり、ここで、ＭＹＸＶゲノムの一部は、Ｍ１５３遺伝子の発現を減少させるように改変される。
【0022】
いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶゲノムの一部は、ＭＹＸＶゲノムの一部におけるＭ１５３遺伝子の少なくとも一部をノックアウトするように改変される。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、非ウイルス分子をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態において、非ウイルス分子は、ヒトＴＮＦα、ヒトＩＬ－１２α（ｈＴＮＦα）、ヒトＩＬ－１２β、またはヒトデコリンである。いくつかの実施形態において、非ウイルス分子をコードする核酸は、ｖＭｙｘ－ｈＴＮＦαカセットを含み、非ウイルス分子をコードする核酸は、ＭＹＸＶゲノムのＭ１３５Ｒ遺伝子を置き換えるか、またはこれに隣接している。いくつかの実施形態において、非ウイルス分子をコードする核酸は、ｖＭｙｘ－ｈＴＮＦαカセットを含み、非ウイルス分子をコードする核酸は、ＭＹＸＶゲノムのＭ１３５Ｒ遺伝子とＭ１３６Ｒ遺伝子との間に挿入される。いくつかの実施形態において、非ウイルス分子をコードする核酸は、ｈＤｅｃｏｒｉｎ－ｈＩＬ－１２カセットを含み、非ウイルス分子をコードする核酸は、ＭＹＸＶゲノムのＭ１５３遺伝子の少なくとも一部を置き換える。いくつかの実施形態において、非ウイルス分子をコードする核酸は、ｖＭｙｘ－ｈＴＮＦα－ｈＤｅｃｏｒｉｎ－ｈＩＬ－１２－Ｍ１５３ＫＯ（ｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅ）カセットを含む。
【0023】
本明細書に開示されるのは、いくつかの態様において、ＭＹＸＶまたはＭＹＸＶで処理された複数の細胞を対象に投与する工程を含む、必要とする対象における癌を阻害、軽減、または予防する方法であり、ＭＹＸＶは、そのＭ１５３タンパク質の活性または発現レベルを減衰させるように遺伝子操作されている。
【0024】
いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、非ウイルス性分子を発現するようにさらに遺伝子操作される。いくつかの実施形態において、非ウイルス性分子は、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、インターロイキン－１２サブユニットアルファ（ＩＬ－１２α）、インターロイキン－１２サブユニットベータ（ＩＬ－１２β）、またはデコリンである。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶまたは複数の細胞は、全身投与によって投与される。いくつかの実施形態において、投与は、腫瘍細胞の生存率を低下させるか、または癌における免疫原性細胞死を活性化する。いくつかの実施形態において、癌は、固形腫瘍、骨肉腫、Ｔｒｉｐｌｅネガティブ乳癌、または黒色腫である。いくつかの実施形態において、癌は、対象の肺、脳、肝臓、またはリンパ節に転移している。いくつかの実施形態において、この方法は、免疫チェックポイントモジュレーターを対象に投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記投与は、対象のＰＢＭＣまたは癌細胞における少なくとも２つのサイトカインの発現を増加させるために有効な用量およびスケジュールで実施され、ここで、少なくとも２つのサイトカインは、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、またはＴＮＦ－αを含む。いくつかの実施形態において、投与は、癌の体積を少なくとも１０％減少させために有効な用量およびスケジュールで実施される。
【0025】
本明細書に開示されるのは、いくつかの態様において、増強された抗癌活性を有する粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）であり、上記粘液腫ウイルスは、そのＭ１５３タンパク質の活性または発現レベルを減衰するように遺伝子操作される。
【0026】
いくつかの実施形態において、Ｍ１５３タンパク質の活性または発現レベルは、少なくとも８０％減衰される。いくつかの実施形態において、上記ＭＹＸＶは、Ｍ１５３タンパク質をコードする核酸に変異を導入するように操作され、ここで、上記変異は、挿入、欠失、または置換変異を含む。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶゲノム中のＭ１５３タンパク質をコードする核酸の少なくとも一部がノックアウトされる。いくつかの実施形態において、上記ＭＹＸＶは、Ｍ１５３転写物を標的とする阻害分子を含み、それによって、Ｍ１５３タンパク質発現を減衰し、ここで、阻害分子は、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、上記ＭＹＸＶは、非ウイルス分子をコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記非ウイルス分子は、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、インターロイキン－１２サブユニットアルファ（ＩＬ－１２α）、インターロイキン－１２サブユニットベータ（ＩＬ－１２β）、またはデコリンである。いくつかの実施形態において、上記非ウイルス分子はヒトタンパク質である。いくつかの実施形態において、上記核酸は、ＴＮＦα、ＩＬ－１２α、ＩＬ－１２β、およびデコリンからなる群から選択される少なくとも２つの非ウイルス分子をコードする。
【0027】
本明細書に開示されるのは、いくつかの態様において、ＭＹＸＶによってエキソビボで処理された複数の細胞を含む組成物であり、上記ＭＹＸＶは、そのＭ１５３タンパク質の活性または発現レベルを減衰させるように遺伝子操作され、複数の細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄（ＢＭ）細胞、またはそれらの組み合わせを含む。
【0028】
いくつかの実施形態において、上記組成物は、必要とする対象における癌を阻害、軽減、または予防する際の使用のためであり、複数の細胞は、上記対象に対して自己である細胞を含む。いくつかの実施形態において、上記組成物は、必要とする対象における癌を阻害、軽減、または予防する際の使用のためであり、上記複数の細胞は、対象に対して同種異系である細胞を含む。
【0029】
本明細書に開示されるのは、いくつかの態様において、必要とする対象における癌を阻害、軽減、または予防する際に使用するためのＭＹＸＶであり、上記ＭＹＸＶは、そのＭ１５３タンパク質の活性または発現レベルを減衰するように遺伝子操作される。
【0030】
いくつかの実施形態において、上記ＭＹＸＶは、全身投与によって上記対象に投与される。いくつかの実施形態において、上記ＭＹＸＶは、癌細胞の生存率を低下させるか、または癌における免疫原性細胞死を活性化する。いくつかの実施形態において、上記癌は、固形腫瘍、骨肉腫、Ｔｒｉｐｌｅネガティブ乳癌、または黒色腫である。いくつかの実施形態において、上記癌は、上記対象の肺、脳、肝臓、またはリンパ節に転移している。いくつかの実施形態において、上記ＭＹＸＶは、免疫チェックポイントモジュレーターと共に対象に投与される。いくつかの実施形態において、上記ＭＹＸＶは、対象のＰＢＭＣまたは癌細胞における少なくとも２つのサイトカインの発現を増加させるのに有効な用量およびスケジュールで投与され、ここで、少なくとも２つのサイトカインは、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、またはＴＮＦ－αを含む。いくつかの実施形態において、上記ＭＹＸＶは、癌の体積を少なくとも１０％減少させるために有効な用量およびスケジュールで投与される。
【0031】
本明細書に開示されるのは、いくつかの態様において、ＭＹＸＶゲノムの少なくとも一部を含む組換え核酸であり、上記ＭＹＸＶゲノムの一部は、Ｍ１５３の発現を低下させるように改変されている。
【0032】
いくつかの実施形態において、上記ＭＹＸＶゲノムの一部は、ＭＹＸＶゲノムの一部におけるＭ１５３遺伝子の少なくとも一部をノックアウトするように改変される。いくつかの実施形態において、上記組換え核酸は、非ウイルス分子をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態において、上記非ウイルス分子は、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、インターロイキン－１２サブユニットアルファ（ＩＬ－１２α）、インターロイキン－１２サブユニットベータ（ＩＬ－１２β）、またはデコリンである。いくつかの実施形態において、上記非ウイルス分子はヒトタンパク質である。いくつかの実施形態において、上記非ウイルス分子をコードする核酸は、上記ＭＹＸＶゲノムのＭ１３５Ｒ遺伝子とＭ１３６Ｒ遺伝子との間に挿入される。いくつかの実施形態において、非ウイルス分子をコードする核酸は、ＭＹＸＶゲノムのＭ１５３遺伝子の少なくとも一部を置き換えるために挿入される。いくつかの実施形態において、上記非ウイルス分子をコードする核酸は、任意選択でＧＦＰを含むｖＭｙｘ－ｈＴＮＦαカセットを含み、上記非ウイルス分子をコードする核酸は、上記ＭＹＸＶゲノムのＭ１３５Ｒ遺伝子を置き換えるか、またはこれに隣接する。いくつかの実施形態において、上記非ウイルス分子をコードする核酸は、ｖＭｙｘ－ｈＴＮＦαカセットを含み、上記非ウイルス分子をコードする核酸は、上記ＭＹＸＶゲノムのＭ１３５Ｒ遺伝子とＭ１３６Ｒ遺伝子との間に挿入される。いくつかの実施形態において、上記非ウイルス分子をコードする核酸は、任意選択でｄｓＲｅｄを含む、ｈＤｅｃｏｒｉｎ－ｈＩＬ－１２カセットを含み、非ウイルス分子をコードする核酸は、上記ＭＹＸＶゲノムのＭ１５３遺伝子の少なくとも一部を置き換える。いくつかの実施形態において、非ウイルス分子をコードする核酸は、任意選択でｄｓＲｅｄを含む、ｖＭｙｘ－ｈＴＮＦα－ｈＤｅｃｏｒｉｎ－ｈＩＬ－１２－Ｍ１５３ＫＯ（ｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅ）カセットを含む。
【図面の簡単な説明】
【0033】
本発明の特定の実施形態の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲において具体性を伴って示されている。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明、およびその添付の図面を参照することによって得られ、その図面の説明は以下の通りである。
【図1A】本明細書に開示される粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）を生成するために使用することができる組換え核酸の構築を示す概略図である。上の画像は、ｖＭｙｘ－ｈＴＮＦａ－ＧＦＰカセットおよびＭ１５３遺伝子座を含む組換え核酸を示す。組換え核酸は、本開示のＭＹＸＶ、例えば、ｖＭｙｘ－ｈＴＮＦａ－ＧＦＰウイルスのゲノムに存在することができる。真ん中の画像は、ＭＹＸＶゲノム（Ｍ１５２およびＭ１５４）のＭ１５３遺伝子に隣接する配列に対応する隣接配列を有するｈＤｅｃｏｒｉｎ－ｈＩＬ－１２－ｄｓＲｅｄカセットを含む組換え核酸を示す。この組換え核酸は、ＭＹＸＶに導入して改変組換えウイルスを生成することができる組換えプラスミドに存在することができる。下の画像は、改変されたｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅ組換え核酸を示す。組換え核酸は、本開示のＭＹＸＶのゲノムに存在することができる。例えば、真ん中の画像に示されている組換えプラスミドは、ＭＹＸＶに導入できる（例えば、ＲＫ１３細胞にｖＭｙｘ－ｈＴＮＦａ－ＧＦＰウイルスを感染させることによって、および細胞に組換えプラスミドをトランスフェクトすることによって）。組換えが起こり、ｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅ組換え核酸が生成される可能性がある。ｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅ組換え核酸を含む組換えウイルスは選択マーカー、例えば、ｄｓＲｅｄに基づいて同定および精製することができる。
【図1B】変異または導入遺伝子の挿入により改変され得る組換え核酸中のＭ１５３遺伝子座の概略図である。改変されたＭ１５３遺伝子座を有する組換え核酸は、本明細書に開示される方法を使用してＭＹＸＶゲノムに導入することができる。
【図2A】図２Ａ－２Ｄは、組換えＭＹＸＶ構築物の遺伝的制御を示すアガロースゲルの画像である。図２Ａは、ｈＤｅｃｏｒｉｎ－ｈＩＬ－１２の存在を確認するためのプライマーを使用したｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅ構築物クローンからのゲノムウイルスＤＮＡを示す。
【図2D】図２Ａ－２Ｄは、組換えＭＹＸＶ構築物の遺伝的制御を示すアガロースゲルの画像である。図２Ｄは、Ｍ１５３が存在しないこと、および組換えｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅ構築物の純度を示す。レーン１には、ＭＹＸＶ－ＬａｕからのＤＮＡ、またはｈＤｅｃ－Ｈｉｌ１２およびｈＴＮＦの発現プラスミドが含まれる。ＭＭは既知のサイズのＤＮＡラダーを表す。
【図3】図３Ａ－３Ｃは、ｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅウイルスにおける導入遺伝子のタンパク質発現を示すウエスタンブロットの画像である。ウエスタンブロット分析は、ｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅウイルス感染細胞の細胞溶解物と上清に対して、３つの導入遺伝子、ｈＴＮＦ（図３Ａ）、ｈＤｅｃｏｒｉｎ（図３Ｂ）、およびｈＩＬ－１２（図３Ｃ）のタンパク質発現を確認するための特異的抗体を使用して実施した。
【図4】組換えｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅウイルスの単一ステップ増殖分析を示すチャートである。ｖＭｙｘ－ＴｒｉｐｌｅウイルスのＲＫ１３細胞の複製能力は、親ウイルスｖＭｙｘ－ＴＮＦ－ＧＦＰと同様であった。ＭＯＩ＝１。
【図5】図５Ａおよび５Ｂは、細胞生存率アッセイの結果を示すグラフである。ｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅウイルスの細胞殺傷能力は、ＣＴ２６（マウス結腸癌）およびＨＥＬＡ（ヒト子宮頸癌）の２つの異なる細胞株でテストした。細胞をＭＯＩ＝１０で４８時間感染させた後、ＭＴＳアッセイを実施した。
【図6】野生型ＭＹＸＶまたはＭ１５３ＫＯ ＭＹＸＶを用いるウイルス感染によって誘導される細胞死を示し、未処理のＢ１６Ｆ１０細胞（モック）における細胞死を示すチャートである。
【図7】図７Ａおよび７Ｂは、Ｂ１６Ｆ１０マウス細胞においてインビトロでＭ１５３ＫＯ ＭＹＸＶによって誘導される免疫原性細胞死を示すグラフである。図７Ａは、感染後（ｐ．ｉ．）のさまざまな時間でのドキソルビシン（陽性対照）、ｗｔ ＭＹＸＶ、およびＭ１５３ＫＯ ＭＹＸＶによって引き起こされたＡＴＰ放出を示す。バーが存在しない場合、ＡＴＰのレベルはアッセイの検出限界を下回っていた。図７Ｂは、未処理（モック）、ドキソルビシン処理（陽性対照）、Ｍ１３５ＫＯ ＭＹＸＶ感染、およびＭ１５３ＫＯ ＭＹＸＶ感染細胞のカルレティキュリン外部発現の定量的表示を示す。データは、各細胞を表す核染色（ＤＡＰＩ）に正規化されたシグナルを使用して、処理の３６時間後に撮影された共焦点画像に基づいて細胞ごとの外部発現を定量化する。
【図8】マウスを、未処理（対照、中央の線）、Ｍ１５３ＫＯ ＭＹＸＶで処理（１５３ＫＯ、右に伸びる線）または第２の対照としてＭ１３５ＫＯ ＭＹＸＶで処理した場合（Ｍ１３５ＫＯ、左の線）の転移性黒色腫マウスモデル（Ｂ１６Ｆ１０）における生存曲線を示すチャートである。日数ｐ．ｉ．＝移植後の日数。
【図9C】図９Ａ－９Ｄは、本開示のＭＹＸＶに感染したベロ細胞の上清中のサイトカインの濃度を示す。図９ＣはヒトＩＬ－１２濃度を示す。バーが存在しない場合、分析物のレベルはアッセイの検出限界を下回っていた。
【図9D】図９Ａ－９Ｄは、本開示のＭＹＸＶに感染したベロ細胞の上清中のサイトカインの濃度を示す。図９Ｄは、マウスＩＬ－１２濃度を示す。バーが存在しない場合、分析物のレベルはアッセイの検出限界を下回っていた。
【図10A】本開示のＭＹＸＶに感染したベロ細胞の上清への曝露後のＬ９２９細胞の生存率を示し、これは、ＴＮＦ生物活性を示す。
【図10B】本開示のＭＹＸＶに感染したベロ細胞の上清へのＨＥＫ Ｂｌｕｅ ＩＬ－１２細胞の曝露後のレポーター遺伝子の発現を示す。バーが存在しない場合、分析物のレベルはアッセイの検出限界を下回っていた。
【図11A】ｖＭｙｘ－ＧＦＰとの６日間のインキュベーション後のヒト急性骨髄性白血病患者からの細胞の生存率を示す。
【図11B】ｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅとの６日間のインキュベーション後のヒト急性骨髄性白血病患者からの細胞の生存率を示す。
【図12A】感染後４時間で、１０のＭＯＩで、示されたＭＹＸＶに感染したヒトＰＢＭＣの上清中のサイトカインの濃度を示す。平均＋／－ＳＤがプロットされる。バーが存在しない場合、分析物のレベルはアッセイの検出限界を下回っていた。
【図12B】感染後１６時間で、１０のＭＯＩで、示されたＭＹＸＶに感染したヒトＰＢＭＣの上清中のサイトカインの濃度を示す。平均＋／－ＳＤがプロットされる。バーが存在しない場合、分析物のレベルはアッセイの検出限界を下回っていた。
【図13A】示された用量のｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅで週に１回（ＱＷ）処理された免疫不全マウスにおける経時的なＮＣＩ－Ｈ１９７１（肺癌）異種移植腫瘍の体積をプロットする。
【図13B】週に１回（ＱＷ）、４日ごと（Ｑ４Ｄ）、または２日ごと（Ｑ２Ｄ）に、示された用量のｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅで処理された免疫不全マウスにおける経時的なＡ６７３（肉腫）異種移植腫瘍の体積をプロットする。
【図13C】週に１回（ＱＷ）、４日ごと（Ｑ４Ｄ）、または２日ごと（Ｑ２Ｄ）、示された用量のｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅで処理された免疫不全マウスにおける経時的なＳＪＳＡ（肉腫）異種移植腫瘍の体積をプロットする。
【図14A】ＳＪＳＡ－１腫瘍を有する免疫不全マウスからの血清および腫瘍組織において検出されたＩＬ－１２およびＴＮＦ－αの濃度を示す。マウスを静脈内（ＩＶ）または腫瘍内（ＩＴ）経路を介してｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅで処理し、処理後４時間（４Ｈ）または２４時間（２４Ｈ）にサンプルを収集した。平均±ＳＤがプロットされる。バーが存在しない場合、分析物のレベルはアッセイの検出限界を下回っていた。
【図14B】Ａ６７３腫瘍を有する免疫不全マウスからの血清および腫瘍組織において検出されたＩＬ－１２およびＴＮＦ－αの濃度を示す。マウスを静脈内（ＩＶ）または腫瘍内（ＩＴ）経路を介してｖＭｙｘ Ｔｒｉｐｌｅで処理し、治療後４時間（４Ｈ）または２４時間（２４Ｈ）にサンプルを収集した。平均±ＳＤがプロットされる。バーが存在しない場合、分析物のレベルはアッセイの検出限界を下回っていた。
【図15】Ｂ１６－Ｆ１０マウス黒色腫細胞を移植され、Ｍ１５３およびＭ１３５がノックアウトされたＴＮＦ発現ＭＹＸＶ（ＴＮＦ１３５／１５３ＫＯ）または両方の遺伝子の野生型コピーを有するＴＮＦ発現ＭＹＸＶ（ＴＮＦ１３５／１５３ＷＴ）で処理されたＣ５７ＢＬ／６マウスの経時的な腫瘍体積をプロットする。
【図16】図１６Ａおよび図１６Ｂは、ＭＣ３８マウス結腸直腸癌細胞を移植されたＣ５７ＢＬ／６マウスの経時的な腫瘍体積および生存をプロットする。動物は、２×１０７ＦＦＵ／用量の腫瘍内（ＩＴ）注射により、４日に１回、示された粘液腫ウイルスを４回投与して処理された。マウスＴｒｉｐｌｅ低は、比較的低レベルで、ヒトＩＬ－１２ではなくマウスＩＬ－１２を発現するｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅを指す。マウスＴｒｉｐｌｅ高は、マウスＩＬ－１２を比較的高いレベルで発現するｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅを指す。マウスＴｒｉｐｌｅウイルスはまた、ヒトのデコリンとＴＮＦも発現し、そしてＭ１５３遺伝子をノックアウトする。ＧＦＰはｖＭｙｘ－ＧＦＰを指し、いかなるサイトカインもコードせず、インタクトなＭ１５３遺伝子を含む。腫瘍体積の測定値は週に３回記録され、図１６Ａにプロットされている。生存率は図１６Ｂにプロットされている。
【図17】図１７Ａおよび図１７Ｂは、Ｂ１６－Ｆ１０マウス黒色腫細胞を移植されたＣ５７ＢＬ／６マウスの経時的な腫瘍体積および生存をプロットする。動物は、示された粘液腫ウイルスで、１日目および８日目に２×１０７ＦＦＵ／用量の腫瘍内注射を介して処理された。マウスＴｒｉｐｌｅ低は、比較的低レベルで、ヒトＩＬ－１２ではなくマウスＩＬ－１２を発現するｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅを指す。マウスＴｒｉｐｌｅ高は、マウスＩＬ－１２を比較的高いレベルで発現するｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅを指す。マウスＴｒｉｐｌｅウイルスはまた、ヒトのデコリンおよびＴＮＦも発現し、Ｍ１５３遺伝子がノックアウトされている。ＧＦＰはｖＭｙｘ－ＧＦＰを指し、これはサイトカインをいずれもコードせず、インタクトなＭ１５３遺伝子を含む。腫瘍体積の測定値は週に３回記録され、図１７Ａにプロットされる。生存率は図１７Ｂにプロットされる。
【図18A】Ｂ１６－Ｆ１０マウス黒色腫細胞を移植され、比較的高レベルのマウスＩＬ－１２を発現し、ヒトデコリンとヒトＴＮＦも発現し、Ｍ１５３遺伝子をノックアウトしているＭＹＸＶであるマウスＴｒｉｐｌｅ高の示された用量で処理されたＣ５７ＢＬ／６マウスの経時的な腫瘍体積をプロットする。ウイルスは腫瘍内（ＩＴ）または静脈内（ＩＶ）に投与された。
【図18B】ＣＴ２６マウス結腸直腸癌細胞を移植され、指示された用量のマウスＴｒｉｐｌｅ高で処理されたＢａｌｂ／ｃマウスの経時的な腫瘍体積をプロットする。ウイルスは腫瘍内（ＩＴ）または静脈内（ＩＶ）に投与された。
【図19】Ｋ７Ｍ２肉腫細胞を移植されたＢａｌｂ／ｃマウスの生存曲線を示す。マウスの群は、２×１０７ＦＦＵ／用量のｖＭｙｘ－マウスＴｒｉｐｌｅ（低ＩＬ－１２）の眼窩後洞への注射、および／または１０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ－１もしくは抗ＰＤ－Ｌ１抗体の腹腔内注射によって処理された。
【図20A】ＭＣ３８マウス結腸直腸癌細胞を移植されたＣ５７ＢＬ／６マウスの経時的な腫瘍体積をプロットする。動物の群は、ランダム化後１日目と８日目に２×１０７ＦＦＵ／用量のｖＭｙｘ－マウスＴｒｉｐｌｅ（低ＩＬ－１２）の腫瘍内注射を介して、および／または１０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ－１抗体を用いて、４日に１回の４回の投与で処理された。実線で結ばれた円はビヒクル処理、四角はｖＭｙｘ－マウスＴｒｉｐｌｅのみ、破線の円は抗ＰＤ－１、三角形はｖＭｙｘ－マウスＴｒｉｐｌｅと抗ＰＤ－１の組み合わせである。
【発明を実施するための形態】
【0034】
詳細な説明
本明細書に記載されているのは、腫瘍溶解性ウイルス、具体的には、腫瘍溶解性粘液腫ウイルスなどの腫瘍溶解性ポックスウイルスである。粘液腫ウイルスは、本明細書ではＭＹＸＶまたはｖＭｙｘと呼ぶことができる。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、Ｍ１５３遺伝子またはタンパク質の発現を不活性化、破壊、または減衰するように操作される活性または発現レベルを減衰するように遺伝子操作され、例えば、Ｍ１５３遺伝子またはタンパク質の活性または発現レベルを減衰するように遺伝子操作される。本明細書に記載の粘液腫ウイルスへの改変は、改変されていないＭＹＸＶ、インタクトな野生型Ｍ１５３遺伝子を含むＭＹＸＶ、または別の遺伝子座で改変されたＭＹＸＶと比較した場合、ＭＹＸＶの腫瘍溶解活性を予想外に改善した。Ｍ１５３遺伝子座での改変に加えて、ＭＹＸＶはまた、ＴＮＦα、ＩＬ－１２、および／またはデコリンなどの非ウイルス分子をコードする１つ以上の導入遺伝子を含み、腫瘍溶解活性をさらに高め、抗腫瘍免疫応答を増加させ、またはＭＹＸＶの有害な副作用を減少させることもできる。
本明細書に記載されているのは、腫瘍溶解性ウイルス、具体的には、腫瘍溶解性粘液腫ウイルスなどの腫瘍溶解性ポックスウイルスである。粘液腫ウイルスは、本明細書ではＭＹＸＶまたはｖＭｙｘと呼ぶことができる。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、Ｍ１５３遺伝子またはタンパク質の発現を不活性化、破壊、または減衰するように操作される活性または発現レベルを減衰するように遺伝子操作され、例えば、Ｍ１５３遺伝子またはタンパク質の活性または発現レベルを減衰するように遺伝子操作される。本明細書に記載の粘液腫ウイルスへの改変は、改変されていないＭＹＸＶ、インタクトな野生型Ｍ１５３遺伝子を含むＭＹＸＶ、または別の遺伝子座で改変されたＭＹＸＶと比較した場合、ＭＹＸＶの腫瘍溶解活性を予想外に改善した。Ｍ１５３遺伝子座での改変に加えて、ＭＹＸＶはまた、ＴＮＦα、ＩＬ－１２、および／またはデコリンなどの非ウイルス分子をコードする１つ以上の導入遺伝子を含み、腫瘍溶解活性をさらに高め、抗腫瘍免疫応答を増加させ、またはＭＹＸＶの有害な副作用を減少させることもできる。
【0035】
いくつかの実施形態は、ＭＹＸＶなどの三重（ｔｒｉｐｌｅ）導入遺伝子で武装した腫瘍溶解性ウイルス、および転移性癌などの癌の治療のためのそれらの使用方法に関する。いくつかの実施形態は、３つのヒト導入遺伝子である、肺または身体の他の部分に転移する癌の治療の有効性を改善するヒトサイトカイン（ｈＴＮＦ）、抗腫瘍免疫応答を増幅することができるｈＩＬ－１２、および腫瘍床内のＴＧＦ－βシグナル伝達を遮断するヒトデコリン（ｈＤｅｃｏｒｉｎ）を発現する組換えＭＹＸＶ構築物を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるウイルスは、粘液腫ウイルスＭ１５３遺伝子またはその少なくとも一部のノックアウト（例えば、欠失または破壊）を有し、これは、いくつかの実施形態において、これらのウイルス構築物を用いる治療後の抗腫瘍免疫応答も改善する。いくつかの実施形態は、ＭＹＸＶをコードするウイルス三重導入遺伝子構築物などの核酸構築物に関する。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶに対する導入遺伝子および他の改変は、癌治療の有効性を改善する。
【0036】
定義
本明細書で使用されるセクション見出しは、組織的な目的のためだけであり、記載された主題を限定するものとして解釈されるべきではない。
本明細書で使用されるセクション見出しは、組織的な目的のためだけであり、記載された主題を限定するものとして解釈されるべきではない。
【0037】
以下の用語の説明は、特定の実施形態および例を説明することのみを目的として提供されており、限定することを意図するものではない。
【0038】
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、複数形も含むことを意図している。
【0039】
本明細書で使用される場合、「および／または」という用語は、関連するリストされた項目の１つ以上の任意のおよびすべての可能な組み合わせ、ならびに代替（「または」）で解釈される場合の組み合わせの欠如を指し、包含する。
【0040】
本明細書で使用される場合、「１以上」または少なくとも１とは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上、任意の数までを意味し得る。
【0041】
「有効量」または「治療有効量」は、治療的および／または有益な効果であり得る所望の効果を生み出すのに十分な本発明の化合物または組成物の量を指す。
【0042】
「それを必要とする対象」または「必要とする対象」は、癌などの疾患または状態を有することが知られているか、または有することが疑われる対象である。
【0043】
本明細書で使用される場合、疾患を「阻害する」または「治療する」という用語は、疾患または状態の完全な発症を阻害することを指す。「治療」とは、疾患または病的状態が発症し始めた後、その疾患または病的状態の兆候または症状を改善する治療的介入を指す。疾患または病的状態に関連する「改善する」という用語は、治療の観察可能で有益なあらゆる効果を指す。有益な効果は、例えば、感受性のある対象における疾患の臨床症状の発症の遅延、疾患の一部またはすべての臨床症状の重症度の低下、転移などの疾患の進行の遅延、対象の全体的な健康または幸福の改善によって、あるいは、特定の疾患に特有である当該技術分野でよく知られている他のパラメーターによって証明することができる。「予防的」治療は、病状、例えば、転移性癌を発症するリスクを低減する目的で、疾患の兆候を示さないか、または初期の兆候のみを示す対象に投与される治療である。
【0044】
ＭＹＸＶは、不十分な生来の抗ウイルス応答を有する細胞に感染する可能性がある。本明細書で使用される「不十分な生来の抗ウイルス応答」を有することは、ウイルスに曝露されたとき、またはウイルスに侵入されたときに、ウイルス複製の阻害、インターフェロンの産生、インターフェロン応答経路の誘導、およびアポトーシスを含み得る、抗ウイルス防御メカニズムを誘導しない。この用語は、正常細胞、例えば、非感染細胞または非癌細胞と比較して、ウイルスへの曝露またはウイルスによる感染時に、減少したまたは不十分な生来の抗ウイルス応答を有する、癌細胞などの細胞を含む。これには、インターフェロンに反応しない細胞、およびアポトーシス反応の低下または不十分またはアポトーシス経路の誘導を有する細胞が含まれる。欠乏は、感染症、遺伝的欠陥、または環境ストレスを含むさまざまな原因による可能性がある。しかしながら、欠乏が既存の感染によって引き起こされる場合、ＭＹＸＶによる重感染は除外され得、当業者はそのような例を容易に特定することができることが理解される。当業者は、任意の所定の細胞型が不十分な生来の抗ウイルス応答を有し、したがってＭＹＸＶによる感染に対して感受性であるかどうかを過度の実験なしに容易に決定することができる。したがって、特定の実施形態において、ＭＹＸＶは、不十分な生来の抗ウイルス応答を有する細胞に感染することができる。特定の実施形態において、細胞は、インターフェロンに対して応答しない。特定の実施形態において、細胞は哺乳動物の癌細胞である。特定の実施形態において、細胞は、ヒト固形腫瘍細胞を含むヒト癌細胞である。特定の実施形態において、不十分な生来の抗ウイルス応答を有する細胞は、癌細胞を含む。
【0045】
操作された粘液腫ウイルス
本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）である。ＭＹＸＶは、ＭＹＸＶの野生型株を含み得るか、またはＭＹＸＶの遺伝子改変株を含み得る。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶはＬａｕｓａｎｎｅ株を含む。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶのＬａｕｓａｎｎｅ株は、２０１９年７月１１日に公開されたＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ１７０７２６．２を含む。
本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）である。ＭＹＸＶは、ＭＹＸＶの野生型株を含み得るか、またはＭＹＸＶの遺伝子改変株を含み得る。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶはＬａｕｓａｎｎｅ株を含む。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶのＬａｕｓａｎｎｅ株は、２０１９年７月１１日に公開されたＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ１７０７２６．２を含む。
【0046】
いくつかの場合において、ＭＹＸＶは、Ｓｙｌｖｉｌａｇｕｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ．の中で移動する南米のＭＹＸＶ株を含む。いくつかの場合において、ＭＹＸＶは、Ｓｙｌｖｉｌａｇｕｓ ｂａｃｈｍａｎｉを移動するカリフォルニアのＭＹＸＶ株を含む。いくつかの場合において、ＭＹＸＶは、遺伝子Ｍ００９Ｌ、Ｍ０３６Ｌ、Ｍ１３５Ｒ、およびＭ１４８Ｒの改変を含む減衰スペイン野外株（例えば、２０１９年７月１１日に公開されたＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＥＵ５５２５３０）である６９１８を含む。いくつかの場合において、ＭＹＸＶは６９１８ＶＰ６０－Ｔ２（２０１９年７月１１日に公開されたＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＥＵ５５２５３１）を含む。いくつかの場合において、ＭＹＸＶは標準実験室株（ＳＬＳ）を含む。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、本明細書に記載されるような核酸構築物またはＭＹＸＶゲノムを含む。
【0047】
いくつかの場合において、ＭＹＸＶは、このような開示のために参照により組み込まれる、Ｃａｍｅｒｏｎ，ｅｔ ａｌ．，「Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｍｙｘｏｍａ Ｖｉｒｕｓ」，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２６４：２９８－３１８（１９９９）に開示されている配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％、例えば、少なく９５％から９８％の間、９５％から９９％の間であって、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を含む、核酸配列同一性を含む。いくつかの場合において、ＭＹＸＶは、Ｃａｍｅｒｏｎ、ｅｔ ａｌ．，「Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｍｙｘｏｍａ Ｖｉｒｕｓ」，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２６４：２９８－３１８（１９９９）に開示されている配列を含む。
【0048】
いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、ウイルス遺伝子またはタンパク質の活性または発現レベルを不活性化または減衰するように操作される。いくつかの実施形態において、ウイルス遺伝子またはタンパク質は、Ｍ１５３である。いくつかの実施形態において、ウイルス遺伝子またはタンパク質の不活性化または減衰された活性または発現レベルは、野生型ＭＹＸＶに関して、あるいはウイルス遺伝子またはタンパク質の不活性化または減衰された活性もしくは発現レベルを有さないＭＹＸＶに関して、例えば、野生型Ｍ１５３遺伝子を含み、および／または野生型Ｍ１５３タンパク質を発現するＭＹＸＶに関して、増強された抗癌活性を示すＭＹＸＶをもたらす。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、１つより多くのウイルス遺伝子またはタンパク質の活性または発現レベルを不活性化または減衰するように操作される。
【0049】
いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、非ウイルス分子、例えば、サイトカインをコードする導入遺伝子をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、本明細書に記載される導入遺伝子などの導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ、例えば、ＴＮＦα）、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、またはデコリンをコードする。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の導入遺伝子は、ＭＹＸＶゲノムにノックインされる。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、ＭＹＸＶゲノム中の遺伝子を破壊し、例えば、導入遺伝子は、ＭＹＸＶゲノム中の遺伝子内に挿入されるか、またはその遺伝子の一部を置換し、それによって、遺伝子および／またはそれがコードするタンパク質の発現を破壊する。このような破壊は、ノックアウト（ＫＯ）と呼ばれ得る。
【0050】
ＭＹＸＶは、ＭＹＸＶの抗癌効果を増強する任意の非ウイルス分子を生成するように改変され得る（例えば、任意の導入遺伝子を有するように改変され得る）。このような非ウイルス分子は、アポトーシスの誘発、または感染細胞を免疫破壊に標的化することに関与することができ、例えば、インターフェロンへの応答を刺激する（例えば、インターフェロンへの応答の欠如を修復する）か、または病原体関連分子パターン、例えば細菌の細胞表面抗原などの抗体応答を刺激する細胞表面マーカーの発現を生じる非ウイルス分子である。ＭＹＸＶはまた、新生物細胞または癌細胞の増殖および成長を遮断することに関与する非ウイルス分子を生成するように改変することもでき、それによって細胞の分裂を防ぐ。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、化学療法剤の合成に関与する分子などの治療用非ウイルス分子を生成するように改変されるか、または阻害もしくは殺傷される細胞が由来する特定の種の細胞、例えば、ヒト細胞において複製レベルが増加するように改変され得る。
【0051】
いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、１つ、２つ、または３つの別個の非ウイルス分子、例えば、ヒト導入遺伝子（例えば、ヒトＴＮＦ、ヒトデコリンおよびヒトＩＬ－１２）をコードまたは発現する組換え構築物を含む。いくつかの実施形態において、組換え構築物は、１つ以上のレポータータグ、例えば、ｅＧＦＰおよびｄｓＲｅｄなどの蛍光タンパク質をさらにコードまたは発現する。
【0052】
いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、そのＭ１５３遺伝子またはタンパク質の活性または発現レベルを減衰するように遺伝子操作され、例えば、ウイルスＭ１５３遺伝子の破壊を含む（Ｍ１５３ノックアウト：Ｍ１５３ＫＯ）。いくつかの実施形態において、Ｍ１５３の活性または発現レベルを減衰することは、ウイルスに感染した癌細胞に対するＭＨＣ依存性の抗腫瘍免疫応答を改善する。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、癌の治療における使用のための腫瘍溶解性ウイルスを含む。いくつかの実施形態は、Ｍ１５３ＫＯバックボーンを、本明細書に開示される導入遺伝子の免疫増強特性と組み合わせて、ＭＹＸＶの腫瘍溶解特性を増強する。
【0053】
いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、ＴＮＦ（例えば、ＴＮＦα）導入遺伝子、ＩＬ－１２導入遺伝子、デコリン導入遺伝子、またはそれらのうちの２つ以上の任意の組み合わせをコードする。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、ＴＮＦ（例えば、ＴＮＦα）導入遺伝子、ＩＬ－１２導入遺伝子、およびデコリン導入遺伝子を含む。いくつかのそのような実施形態において、そのようなＭＹＸＶを対象に投与すると、ＴＮＦは、抗腫瘍免疫系の先天性および後天性のアームを活性化およびジャンプスタートさせ、バイスタンダー傍分泌様の方法で癌細胞死を促進する。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２は、生じる抗癌の自然免疫応答および適応免疫応答を増幅する。いくつかの実施形態において、デコリンは、ＴＧＦ－βによって媒介される局所免疫抑制作用を妨害し、したがって、ＴＮＦとＩＬ－１２の両方の作用を増強し、そして抗癌免疫応答を促進する。いくつかの実施形態において、３つの導入遺伝子の相乗作用に加えて、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）におけるＭＹＸＶの効果が、腫瘍溶解性ＭＹＸＶベクターの免疫療法の可能性を高める。いくつかの実施形態において、非ウイルス分子（ｈＴＮＦ、ｈＩＬ－１２、および／またはｈＤｅｃｏｒｉｎ）をコードするヒト導入遺伝子のＭＹＸＶゲノムへの追加は、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）において強固な抗腫瘍免疫応答を誘発するＭＹＸＶの能力を改善する。
【0054】
いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、感染状態の検出の容易さを高めるように改変される。例えば、ＭＹＸＶは、位相差顕微鏡、蛍光顕微鏡、またはラジオイメージングによって容易に検出できるマーカーを発現するように遺伝子改変され得る。このマーカーは、比色反応または放射性標識反応に関与する発現蛍光タンパク質または発現酵素であり得る。いくつかの実施形態において、マーカーは、試験されている細胞の特定の機能を妨害または阻害する遺伝子産物を含む。
【0055】
いくつかの実施形態において、操作されたＭＹＸＶは、蛍光タンパク質を含む。例示的な蛍光タンパク質には、ＴａｇＢＦＰ、Ａｚｕｒｉｔｅ、Ｓｉｒｕｓ、またはＳａｐｐｈｉｒｅなどの青色／ＵＶタンパク質、ＥＣＦＰ、セルリアン（ｃｅｒｕｌｅａｎ）、またはｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅなどのシアンタンパク質、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、Ｅｍｅｒａｌｄ、ｍＵＫＧ、ｍＷａｓａｂｉ、またはＣｌｏｖｅｒなどの緑色タンパク質、ＥＹＦＰ、シトリン（ｃｉｔｒｉｎｅ）、ヴィーナス（ｖｅｎｕｓ）、またはＳＹＦＰ２などの黄色のタンパク質、単量体Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＫＯ２、またはｍＯｒａｎｇｅなどのオレンジ色タンパク質、ｄｓＲｅｄ、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙｍ ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＡｐｐｌｅ、またはｍＲｕｂｙなどの赤色タンパク質、ＰＡ－ＧＦＰ、ＰＡｍＣｈｅｒｒｙ１、ＰＡＴａｇＲＦＰなどの光活性化タンパク質、ならびにＤｒｏｐｎａなどの光スイッチ可能なタンパク質が含まれる。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、１つより多くの蛍光タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、操作されたＭＹＸＶは、蛍光タンパク質をコードしない。
【0056】
いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、ｖＭｙｘ－ｈＴＮＦａ－ＧＦＰ－ｈＤｅｃｏｒｉｎ－ｈＩＬ－１２－ｄｓＲｅｄ－Ｍ１５３ＫＯ（ｖＭｙｘ－ＴｒｉｐｌｅまたはｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅ－レッド）構築物を含み、そしてｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅウイルスである。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、ｖＭｙｘ－ｈＴＮＦａ－ＧＦＰ－ｈＤｅｃｏｒｉｎ－ｈＩＬ－１２－Ｍ１５３ＫＯ（ｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅ－ホワイト）構築物を含み、そしてｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅ－ホワイトウイルスである。
【0057】
いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、ウサギ細胞向性に関連する１つ以上の遺伝子での、またはそれに隣接する修飾を含む。いくつかの場合において、ウサギ細胞向性に関連する１つ以上の遺伝子は、Ｍ１１Ｌ、Ｍ０６３、Ｍ１３５Ｒ、Ｍ１３６Ｒ、Ｍ－Ｔ２、Ｍ－Ｔ４、Ｍ－Ｔ５、またはＭ－Ｔ７を含む。いくつかの場合において、ウサギ細胞向性に関連する１つ以上の遺伝子は、Ｍ１３５Ｒ、Ｍ１３６Ｒ、またはそれらの組み合わせを含む。
【0058】
ＭＹＸＶは、当該技術分野において公知である標準的な技術を使用して調製することができる。例えば、ウイルスは、培養ウサギ細胞、または不死化許容ヒトまたは霊長類細胞に、使用されるＭＹＸＶ株を感染させることによって調製され、ウイルスが培養細胞内で複製して細胞表面を破壊し、それによってウイルス粒子を放出して採取するための当該技術分野で知られている標準的な方法によって、放出できるように感染を進行させることによって調製することができる。一旦採取されると、ウイルス力価は、ウサギ細胞のコンフルエントなローンを感染させ、プラークアッセイを実行することによって決定され得る。
【0059】
Ｍ１５３の改変
Ｍ１５３遺伝子産物は、多様な細胞受容体およびタンパク質のダウンレギュレーション、例えば、ヒト細胞におけるＭＨＣクラスＩおよびＣＤ４の分解に関与し得るＥ３－ユビキチンリガーゼである。いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、Ｍ１５３タンパク質の活性および／または発現レベルの減衰を有する。いくつかの実施形態において、Ｍ１５３タンパク質の活性および／または発現レベルの減衰は、免疫エピトープの提示、例えば、ウイルスおよび／または癌免疫ペプチドのＭＨＣ依存性提示を増強することができる。感染した癌細胞による免疫エピトープの提示の増強は、抗癌ＣＤ８＋Ｔ細胞応答などの抗癌Ｔ細胞応答を含むより強い免疫応答を誘発できる。いくつかの実施形態において、Ｍ１５３タンパク質の活性および／または発現レベルの減衰は、ＭＨＣ－ＩによるＭ１５３ＫＯウイルス感染腫瘍細胞からの直接抗原提示を増加させ、ＭＹＸＶによって媒介される免疫活性化を増強する。
Ｍ１５３遺伝子産物は、多様な細胞受容体およびタンパク質のダウンレギュレーション、例えば、ヒト細胞におけるＭＨＣクラスＩおよびＣＤ４の分解に関与し得るＥ３－ユビキチンリガーゼである。いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、Ｍ１５３タンパク質の活性および／または発現レベルの減衰を有する。いくつかの実施形態において、Ｍ１５３タンパク質の活性および／または発現レベルの減衰は、免疫エピトープの提示、例えば、ウイルスおよび／または癌免疫ペプチドのＭＨＣ依存性提示を増強することができる。感染した癌細胞による免疫エピトープの提示の増強は、抗癌ＣＤ８＋Ｔ細胞応答などの抗癌Ｔ細胞応答を含むより強い免疫応答を誘発できる。いくつかの実施形態において、Ｍ１５３タンパク質の活性および／または発現レベルの減衰は、ＭＨＣ－ＩによるＭ１５３ＫＯウイルス感染腫瘍細胞からの直接抗原提示を増加させ、ＭＹＸＶによって媒介される免疫活性化を増強する。
【0060】
いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、Ｍ１５３遺伝子の改変を含む。いくつかの場合において、この改変は、Ｍ１５３遺伝子によってコードされるタンパク質の活性または発現レベルを減衰させる（例えば、Ｍ１５３遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を損なう）変異である。
【0061】
いくつかの場合において、変異は、欠失、例えば、Ｍ１５３遺伝子によってコードされるタンパク質の活性または発現レベルを減衰する欠失である。いくつかの実施形態において、この変異は、Ｍ１５３遺伝子の核酸配列の少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％の欠失である。いくつかの実施形態において、この変異は、Ｍ１５３遺伝子全体の欠失である。いくつかの場合において、この改変は部分的欠失であり、例えば、Ｍ１５３遺伝子の核酸配列の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９５％の欠失である。いくつかの実施形態において、この欠失は、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも７個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、または少なくとも３００個の核酸の欠失である。いくつかの実施形態において、欠失は、プロモーター（例えば、野生型ＭＹＸＶにおいてＭ１５３の発現を駆動するプロモーター）を破壊する。いくつかの実施形態において、欠失は、終止コドン、例えば、完全長のＭ１５３転写物および／またはタンパク質の発現を妨げる時期尚早の終止コドンをＭ１５３遺伝子配列に導入する。
【0062】
いくつかの場合において、変異は挿入、例えば、Ｍ１５３遺伝子によってコードされるタンパク質の活性または発現レベルを減衰する挿入である。いくつかの実施形態において、挿入は、非ウイルス分子をコードする導入遺伝子、例えば、ＴＮＦ、デコリン、ＩＬ－１２、またはそれらの組み合わせをコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、挿入は２つの導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、挿入は３つの導入遺伝子を含む。導入遺伝子は、ウイルスのＭ１５３遺伝子を破壊し（例えば、中断し）、Ｍ１５３転写物および／またはタンパク質の活性または発現レベルを減衰することができる。いくつかの実施形態において、挿入は、ＴＮＦをコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、挿入は、ＩＬ－１２をコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、挿入は、デコリンをコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、挿入は、ＴＮＦをコードする導入遺伝子およびＩＬ－１２をコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、挿入は、ＴＮＦをコードする導入遺伝子およびデコリンをコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、挿入は、ＩＬ－１２をコードする導入遺伝子およびデコリンをコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、挿入は、ＴＮＦをコードする導入遺伝子、ＩＬ－１２をコードする導入遺伝子、およびデコリンをコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、挿入は、１つ以上のプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、挿入は、プロモーター（例えば、野生型ＭＹＸＶにおいてＭ１５３の発現を駆動するプロモーター）を破壊する。いくつかの実施形態において、Ｍ１５３遺伝子破壊を導入遺伝子発現と組み合わせることは、得られる組換えウイルスの抗腫瘍特性を改善する。
【0063】
いくつかの実施形態において、挿入は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも７つ、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも３００個、少なくとも４００個、少なくとも５００個、少なくとも６００個、少なくとも７００個、少なくとも８００個、少なくとも９００個、少なくとも１０００個、少なくとも１５００個、または少なくとも２０００個の核酸の挿入である。
【0064】
いくつかの実施形態において、挿入は、終止コドン、例えば、完全長のＭ１５３転写物および／またはタンパク質の発現を妨げる時期尚早の終止コドンをＭ１５３遺伝子配列に導入する。いくつかの実施形態において、挿入は、Ｍ１５３遺伝子配列のリーディングフレームを変更し、それによって、Ｍ１５３転写物および／またはタンパク質の発現を破壊する。
【0065】
いくつかの場合において、変異は、置換、例えば、Ｍ１５３遺伝子によってコードされるタンパク質の活性または発現レベルを減衰する置換である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも７つ、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個の核酸が置換されている。いくつかの実施形態において、置換は、終止コドン、例えば、完全長のＭ１５３転写物および／またはタンパク質の発現を妨げる時期尚早の終止コドンをＭ１５３遺伝子配列に導入する。いくつかの実施形態において、置換は、プロモーター（例えば、野生型ＭＹＸＶにおいてＭ１５３の発現を駆動するプロモーター）を破壊する。
【0066】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される改変または変異は、Ｍ１５３遺伝子および／またはタンパク質の活性レベルを、野生型ＭＹＸＶ、または機能的な野生型Ｍ１５３をコードするＭＹＸＶと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％減衰させる。
【0067】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される改変または変異は、野生型ＭＹＸＶ、または機能的な野生型Ｍ１５３をコードするＭＹＸＶと比較して、Ｍ１５３遺伝子および／またはタンパク質の発現レベルを、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％減衰させる。
【0068】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＭＹＸＶは、野生型ＭＹＸＶ、または機能的な野生型Ｍ１５３をコードするＭＹＸＶと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％減衰されるＭ１５３遺伝子および／またはタンパク質の活性レベルを有する。
【0069】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＭＹＸＶは、野生型ＭＹＸＶ、または機能的な野生型Ｍ１５３をコードするＭＹＸＶと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％減衰されるＭ１５３遺伝子および／またはタンパク質の発現レベルを有する。
【0070】
ＴＮＦ
いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、非ウイルス分子を含み（例えば、コードし）、例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）タンパク質をコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ＴＮＦタンパク質は、ＴＮＦαタンパク質である。いくつかの実施形態において、ＴＮＦαタンパク質は、ヒトＴＮＦαタンパク質である。いくつかの実施形態において、ＴＮＦαタンパク質は可溶性である。いくつかの実施形態において、ＴＮＦαタンパク質は、膜または表面に結合している。いくつかの実施形態において、ＴＮＦαタンパク質は、抗腫瘍免疫細胞を活性化するか、または癌細胞死を誘導することによって、ＭＹＸＶの抗癌活性を増強する。
いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、非ウイルス分子を含み（例えば、コードし）、例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）タンパク質をコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ＴＮＦタンパク質は、ＴＮＦαタンパク質である。いくつかの実施形態において、ＴＮＦαタンパク質は、ヒトＴＮＦαタンパク質である。いくつかの実施形態において、ＴＮＦαタンパク質は可溶性である。いくつかの実施形態において、ＴＮＦαタンパク質は、膜または表面に結合している。いくつかの実施形態において、ＴＮＦαタンパク質は、抗腫瘍免疫細胞を活性化するか、または癌細胞死を誘導することによって、ＭＹＸＶの抗癌活性を増強する。
【0071】
いくつかの実施形態において、ＴＮＦαは、ＭＹＸＶゲノムのＭ１３５Ｒ遺伝子を置換するか、またはそれに隣接する遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＴＮＦα遺伝子は、ＭＹＸＶゲノムのＭ１３５Ｒ遺伝子とＭ１３６Ｒ遺伝子との間に挿入される。いくつかの実施形態において、ＴＮＦα遺伝子は、ＭＹＸＶゲノムのＭ１３５Ｒ遺伝子とＭ１３６Ｒ遺伝子との間の遺伝子間領域に挿入される。いくつかの実施形態において、ＴＮＦαは、ＭＹＸＶゲノムのＭ１５３遺伝子を置換または破壊する遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＴＮＦα遺伝子は、ＭＹＸＶゲノムのＭ１５３遺伝子を置換または破壊する。
【0072】
いくつかの実施形態において、ＴＮＦα遺伝子の発現は、ポックスウイルス合成初期／後期（ｓＥ／Ｌ）プロモーターなどのプロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態において、ＴＮＦα遺伝子の発現は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）によって駆動される。ＴＮＦは、先天性炎症性免疫応答の一部であるサイトカインである。いくつかの実施形態において、ＴＮＦは、後天的な（例えば、適応性の）免疫応答の増幅に関与する。ＴＮＦは細胞表面免疫リガンドとして発現することができ、例えば、骨髄系の細胞において高レベルで発現している、可溶性リガンドの切断と放出を触媒する変換タンパク質分解酵素（ＴＡＣＥなど）を発現する特定の細胞で産生されると、切断された可溶性三量体サイトカインとして分泌されることもあり得る。１つのＴＮＦエフェクター経路は、ＴＮＦ受容体－１（ＴＮＦＲ１）経路を通しての細胞死の誘導である。いくつかの実施形態において、ＴＮＦによるＴＮＦＲ１経路の誘導は、アポトーシスまたはネクロトーシスをもたらす。いくつかの実施形態において、ＴＮＦは、例えば、抗腫瘍ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞を活性化することによって、自然免疫応答および適応免疫応答を活性化する。
【0073】
可溶性ＴＮＦの全身投与が強力な抗腫瘍薬としてヒトにおいて機能し得るという初期の希望にもかかわらず、いくつかの臨床試験は、分泌されたサイトカインが可溶性リガンドで全身的に治療された患者において重度の全身毒性を引き起こすことを示した。さらに、全身性ＴＮＦ治療は、前臨床的に報告された患者に劇的な抗腫瘍効果を誘発しなかった。ウイルス由来のＴＮＦの発現、例えば、ＴＮＦの細胞表面膜形態は、全身性のＴＮＦを介した有害な毒性作用を最小限に抑えながら、腫瘍微小環境においてより高度なバイスタンダー細胞殺傷を誘発することによって局所癌細胞死を改善し、また同じ腫瘍床内に存在する様々なクラスの免疫細胞を刺激し得る。
【0074】
いくつかの場合において、ＴＮＦタンパク質は、２０１９年７月３日に公開されたＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１３７５（エントリーバージョン２４７）に示される配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む。いくつかの場合において、ＴＮＦタンパク質は、２０１９年７月３日に公開されたＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１３７５（エントリーバージョン２４７）に示されている配列に対して、９５％から９８％の間、または９５％から９９％の間の配列同一性を含む。いくつかの場合において、ＴＮＦタンパク質は、２０１９年７月３日に公開されたＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１３７５（エントリーバージョン２４７）に示されている配列に対して、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、ＴＮＦタンパク質は、２０１９年７月３日に公開されたＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１３７５（エントリーバージョン２４７）に示されている配列を含む。
【0075】
いくつかの場合において、ＴＮＦタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１３７５の残基７７～２３３に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む。いくつかの場合において、ＴＮＦタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１３７５の残基７７～２３３に対して９５％から９８％の間、または９５％から９９％の間の配列同一性を含む。いくつかの場合において、ＴＮＦタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１３７５の残基７７－２３３に対して約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、ＴＮＦタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１３７５の残基７７～２３３を含む。
【0076】
いくつかの場合において、ＴＮＦタンパク質は、配列番号１２または配列番号２４に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む遺伝子によってコードされる。いくつかの場合において、ＴＮＦタンパク質は、配列番号１２または配列番号２４に対して９５％から９８％の間、または９５％から９９％の間の配列同一性を含む遺伝子によってコードされる。いくつかの場合において、ＴＮＦタンパク質は、配列番号１２または配列番号２４に対して、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を含む遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＴＮＦタンパク質は、配列番号１２または配列番号２４を含むか、またはそれらからなる遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＴＮＦは、配列番号１２または配列番号２４の配列を含む遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＴＮＦをコードする遺伝子は、配列番号１２または配列番号２４の配列と、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列、または上述のパーセンテージの任意の２つによって規定される一定のパーセンテージの範囲を含む。
【0077】
いくつかの場合において、ＴＮＦタンパク質は、配列番号３１、または配列番号３１の残基７７～２３３に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む。いくつかの場合において、ＴＮＦタンパク質は、配列番号３１、または配列番号３１の残基７７～２３３に対して９５％から９８％の間の配列同一性を含むか、または９５％から９９％の間の配列同一性を含む。いくつかの場合において、ＴＮＦタンパク質は、配列番号３１、または配列番号３１の残基７７～２３３に対して、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、ＴＮＦタンパク質は、配列番号３１または配列番号３１の残基７７～２３３を含む。
【0078】
ＩＬ－１２
いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、非ウイルス分子を含み（例えば、コードし）、例えば、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）タンパク質をコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２タンパク質は、ヒトＩＬ－１２タンパク質である。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２タンパク質は可溶性である。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２タンパク質は、膜または表面に結合している。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２タンパク質は、免疫細胞の分化を促進すること、または免疫細胞の細胞毒性を誘発することによって、ＭＹＸＶの抗癌活性をさらに増強する。
いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、非ウイルス分子を含み（例えば、コードし）、例えば、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）タンパク質をコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２タンパク質は、ヒトＩＬ－１２タンパク質である。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２タンパク質は可溶性である。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２タンパク質は、膜または表面に結合している。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２タンパク質は、免疫細胞の分化を促進すること、または免疫細胞の細胞毒性を誘発することによって、ＭＹＸＶの抗癌活性をさらに増強する。
【0079】
いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２は、ＩＬ１２αサブユニット（ｐ３５サブユニット）を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２αサブユニットは、ＩＬ－１２α遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２α遺伝子は、ヒトＩＬ－１２α遺伝子である。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２α遺伝子は、ＩＲＥＳによって駆動される。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２α遺伝子は、ｓＥ／Ｌプロモーターなどのプロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２α遺伝子は、Ｍ１５３遺伝子を置換または破壊する。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２α遺伝子は、ＭＹＸＶゲノムのＭ１３５Ｒ遺伝子とＭ１３６Ｒ遺伝子との間の遺伝子間領域に挿入される。
【0080】
いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２は、ＩＬ１２β（ｐ４０）サブユニットを含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２βサブユニットは、ＩＬ－１２β遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２β遺伝子は、ヒトＩＬ－１２β遺伝子である。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２β遺伝子は、ＩＲＥＳによって駆動される。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２β遺伝子は、ｓＥ／Ｌプロモーターなどのプロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２β遺伝子は、ＭＹＸＶ Ｍ１５３遺伝子を置換または破壊する。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２β遺伝子は、ＭＹＸＶゲノムのＭ１３５Ｒ遺伝子とＭ１３６Ｒ遺伝子との間の遺伝子間領域に挿入される。
【0081】
いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２は、ＩＬ１２αサブユニットおよびＩＬ－１２βサブユニットを含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ１２αサブユニットおよびＩＬ－１２βサブユニットは共有結合している。いくつかの実施形態において、ＩＬ１２αサブユニットおよびＩＬ－１２βサブユニットは共有結合されていない。いくつかの実施形態において、ＩＬ１２αサブユニットおよびＩＬ－１２βサブユニットは、１つの転写物として発現される。いくつかの実施形態において、ＩＬ１２αサブユニットおよびＩＬ－１２βサブユニットは、１つのポリペプチドとして、例えば、２つのサブユニットを結合するペプチドリンカーと共に発現される。リンカー配列は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０アミノ酸残基の長さであり得る。リンカーは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０アミノ酸残基の長さであり得る。リンカーは、最大４、最大５、最大６、最大７、最大８、最大９、最大１０、最大１５、最大２０、最大２５、最大３０、最大４０、または最大５０アミノ酸残基の長さであり得る。柔軟なリンカーは、グリシン残基およびセリン残基のストレッチを含む配列を持つことができる。グリシン残基およびセリン残基のサイズが小さいため、柔軟性があり、接続された機能ドメインの移動が可能になる。セリンまたはスレオニンの取り込みは、水分子と水素結合を形成することによって水溶液中のリンカーの安定性を維持し、それによってリンカーとタンパク質部分の間の好ましくない相互作用を減らすことができる。柔軟なリンカーには、柔軟性を維持するためのスレオニンやアラニンなどの追加のアミノ酸、ならびに溶解性を向上させるためのリジンおよびグルタミンなどの極性アミノ酸を含めることもできる。リジッドなリンカーは、例えば、アルファヘリックス構造を有することができる。アルファヘリックスリジッドリンカーは、タンパク質ドメイン間のスペーサーとして機能することができる。リンカーは、配列番号３３～４３の配列のいずれか、またはその繰り返しを含むことができる。配列番号３３～３８および４３は、柔軟なリンカー配列の例を提供する。配列番号３９～４２は、リジッドなリンカー配列の例を提供する。
【0082】
いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、比較的低レベルのＩＬ－１２を発現する。ＩＬ－１２の比較的低い発現は、例えば、ＩＬ－１２サブユニットをコードする配列間のＩＲＥＳ配列の使用によって達成することができる。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、比較的高レベルのＩＬ－１２を発現する。ＩＬ－１２の比較的高い発現は、例えば、単一のポリペプチドにおいてＩＬ－１２のサブユニットを結合する適切なリンカー、例えば、配列番号４３のリンカーなどのエラスチンリンカーの使用によって達成することができる。
【0083】
いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２発現のレベルは、実施例６のアッセイによって決定され得る。例えば、ベロ細胞は、１のＭＯＩで本開示のＭＹＸＶに感染され得、感染から２４時間後、上清は採取され得、ＥＬＩＳＡでＩＬ－１２の量を測定できる。いくつかの実施形態において、低レベルのＩＬ－１２発現は、実施例６のアッセイによって決定されるように、５０ｎｇ／ｍＬ未満、４０ｎｇ／ｍＬ未満、３０ｎｇ／ｍＬ未満、２０ｎｇ／ｍＬ未満、１０ｎｇ／ｍＬ未満、または５ｎｇ／ｍＬ未満のＩＬ－１２であり得る。いくつかの実施形態において、高レベルのＩＬ－１２発現は、実施例６のアッセイによって決定されるように、２０ｎｇ／ｍＬを超える、３０ｎｇ／ｍＬを超える、４０ｎｇ／ｍＬを超える、５０ｎｇ／ｍＬを超える、６０ｎｇ／ｍＬを超える、７０ｎｇ／ｍＬを超える、８０ｎｇ／ｍＬを超える、９０ｎｇ／ｍＬを超える、１００ｎｇ／ｍＬを超える、または１５０ｎｇ／ｍＬを超えるＩＬ－１２であり得る。いくつかの実施形態において、高レベルのＩＬ－１２発現は、２０ｎｇ／ｍＬを超えるＩＬ－１２であり、および低レベルのＩＬ－１２発現は、２０ｎｇ／ｍＬ未満のＩＬ－１２であり得る。
【0084】
いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２サブユニットの一方または両方を切り詰めることができる。短縮型サブユニットを有するＩＬ－１２の例は、配列番号５０に提供され、これは、マウスＩＬ－１２Ｂ（配列番号５１）、エラスチンリンカー（配列番号４３）、および短縮型マウスＩＬ－１２Ａ（配列番号５２）を含む。
【0085】
ＩＬ－１２はサイトカインである。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２は、Ｔヘルパー１型（Ｔｈ１）分化を促進し、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の細胞傷害性を増強する。いくつかの実施形態において、このＩＬ－１２の作用は、抗癌免疫応答を促進するために、自然免疫および適応免疫の要素間の相互接続の改善を作り出す。いくつかの実施形態において、これが自然免疫および適応免疫を橋渡しすることに起因して、ＩＬ－１２は、ＭＹＸＶの抗腫瘍効果を増強する。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１１２は、ＩＦＮ－γ（抗癌防御のメカニズムを調整するサイトカイン）の産生を強力に刺激し、それによって、ＭＹＸＶの抗腫瘍効果を増強する。
【0086】
組換えＩＬ－１２サイトカイン療法の全身送達の臨床試験は、毒性事象、全身投与されたＩＬ－１２の一過性の性質、および腫瘍誘発性免疫抑制のために、癌患者において満足のいく結果を誘発しなかった。それにもかかわらず、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）内で局所的にＩＬ－１２を発現するウイルスは、強力な抗腫瘍効果をもたらす可能性がある。いくつかの実施形態において、導入遺伝子がＴＭＥ内で局所的に発現されるように、腫瘍床に制限される腫瘍溶解性ウイルスからのＩＬ－１２の発現は、このサイトカインの全身送達に関連する毒性効果を低減する。したがって、いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２の２つのサブユニットの共発現は、異なるタイプの癌に対する武装ＭＹＸＶによって誘導される抗腫瘍免疫を改善する。
【0087】
いくつかの場合において、ＩＬ１２αサブユニットは、配列番号２８、配列番号２８の残基３５～２５３、または配列番号２８の残基５７～２５３に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む。いくつかの場合において、ＩＬ１２αサブユニットは、配列番号２８、または配列番号２８の残基３５～２５３、または配列番号２８の残基５７～２５３に対して９５％～９８％、または９５％～９９％の配列同一性を含む。いくつかの場合において、ＩＬ１２αサブユニットは、配列番号２８、配列番号２８の残基３５～２５３、または配列番号２８の残基５７～２５３に対して、少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ１２αサブユニットは、配列番号２８、配列番号２８の残基３５～２５３、または配列番号２８の残基５７～２５３を含む。
【0088】
いくつかの場合において、ＩＬ－１２βサブユニットは、配列番号２９に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性、または配列番号２９の残基２３～３２８を含む。いくつかの場合において、ＩＬ－１２βサブユニットは、配列番号２９に対して９５％～９８％の間、または９５％～９９％の間の配列同一性、または配列番号２９の残基２３～３２８を含む。いくつかの場合において、ＩＬ－１２βサブユニットは、配列番号２９に対して約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性、または配列番号２９の残基２３～３２８を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２βサブユニットは、配列番号２９または配列番号２９の残基２３～３２８を含む。
【0089】
デコリン
いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、非ウイルス分子を含み（例えば、コードし）、例えば、デコリンをコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、デコリンタンパク質は、ヒトデコリンタンパク質である。いくつかの実施形態において、デコリンタンパク質は可溶性である。いくつかの実施形態において、デコリンタンパク質は、膜または表面に結合している。いくつかの実施形態において、デコリンタンパク質は、ＴＧＦ－βシグナル伝達を遮断または減少させることにより、ＭＹＸＶの抗癌活性を増強する。
いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、非ウイルス分子を含み（例えば、コードし）、例えば、デコリンをコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、デコリンタンパク質は、ヒトデコリンタンパク質である。いくつかの実施形態において、デコリンタンパク質は可溶性である。いくつかの実施形態において、デコリンタンパク質は、膜または表面に結合している。いくつかの実施形態において、デコリンタンパク質は、ＴＧＦ－βシグナル伝達を遮断または減少させることにより、ＭＹＸＶの抗癌活性を増強する。
【0090】
いくつかの実施形態において、デコリンタンパク質は、デコリン遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態において、デコリン遺伝子は、ヒトデコリン遺伝子である。いくつかの実施形態において、デコリン遺伝子は、ＩＲＥＳによって駆動される。いくつかの実施形態において、デコリン遺伝子は、ｓＥ／Ｌプロモーターなどのプロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態において、デコリン遺伝子は、Ｍ１５３遺伝子を置換または破壊する。いくつかの実施形態において、デコリン遺伝子は、ＭＹＸＶゲノムのＭ１３５Ｒ遺伝子とＭ１３６Ｒ遺伝子との間の遺伝子間領域に挿入される。
【0091】
デコリンは、間質組織および上皮細胞内に存在し、機能する細胞外マトリックスプロテオグリカンファミリーのメンバーである。いくつかの実施形態において、デコリンは、細胞増殖、生存、転移および／または血管新生に関与するシグナル伝達分子を直接的または間接的に標的化することによって、異なるタイプの癌の生物学に影響を与える。いくつかの実施形態において、デコリンは、ＴＧＦ－β誘導性シグナル伝達を遮断する。いくつかの実施形態において、ＴＧＦ－βは、いくつかの腫瘍微小環境（ＴＭＥ）における免疫抑制に寄与するサイトカインである。いくつかの場合において、ＴＧＦ－βは、他の場合では、癌細胞を認識して攻撃する可能性があるエフェクターＴ細胞を、調節（サプレッサー）Ｔ細胞に変換し、この調節Ｔ細胞は、代わりに、癌細胞を認識および排除するために必要な生来の炎症反応および獲得免疫経路をオフにする。複数の種類の癌では、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路の一部が変異しており、このサイトカインはもはや細胞標的の少なくとも一部を制御していない。これらの癌細胞は増殖し、ＴＧＦ－βの内因性産生を増加させる可能性があり、これは周囲の間質細胞、免疫細胞、内皮および平滑筋に作用して、癌組織内の局所免疫抑制および腫瘍床血管新生を引き起こし、これは、癌をより侵襲的にさえする。したがって、いくつかの実施形態において、デコリンを発現する腫瘍溶解性ＭＹＸＶベクターは、ＴＭＥ内で直接ＴＧＦ－βを遮断し、それによって、デコリンを発現しないＭＹＸＶよりも強い抗腫瘍免疫応答を誘導する。
【0092】
さらに、デコリンは、腫瘍細胞の増殖および成長を阻害することができる。さまざまな固形腫瘍へのデコリンのウイルス送達は、腫瘍形成を直接打ち消す可能性がある。いくつかの実施形態において、デコリンは、ＴＧＦ－βの局所的な過剰発現によって保護される少なくともいくつかのタイプの癌の抗癌標的として使用される。
【0093】
いくつかの実施形態において、デコリンは、配列番号２５の配列を含む遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態において、デコリンをコードする遺伝子は、配列番号２５の配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるか、または上述のパーセンテージのいずれか２つで定義されたパーセンテージの範囲で同一である配列を含む。いくつかの場合において、デコリンは、配列番号２５と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む遺伝子によってコードされる。いくつかの場合において、デコリンは、配列番号２５に対して９５％から９８％の間、または９５％から９９％の間の配列同一性を含む遺伝子によってコードされる。いくつかの場合において、デコリンは、配列番号２５に対して約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を含む遺伝子によってコードされる。
【0094】
いくつかの場合において、デコリンタンパク質は、配列番号１４の残基３１～３５９、または配列番号１４～１９のいずれかに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む。いくつかの場合において、デコリンタンパク質は、配列番号１４の残基３１～３５９、または配列番号１４～１９のいずれか１つに対して、９５％～９８％の間、または９５％～９９％の間の配列同一性を含む。いくつかの場合において、デコリンタンパク質は、配列番号１４の残基３１～３５９、または配列番号１４～１９のいずれか１つに対して、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、デコリンタンパク質は、配列番号１４の残基３１～３５９、または配列番号１４～１９のいずれか１つを含む。
【0095】
組換え核酸
本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、組換え核酸である。いくつかの実施形態は、ＭＹＸＶゲノムの少なくとも一部を含む組換え核酸に関する。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶゲノムまたはＭＹＸＶゲノムの一部は、Ｍ１５３遺伝子の発現を減少させるように改変される。いくつかの実施形態において、Ｍ１５３遺伝子は、ＭＹＸＶゲノム中のＭ１５３遺伝子の少なくとも一部をノックアウトするように改変される。
本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、組換え核酸である。いくつかの実施形態は、ＭＹＸＶゲノムの少なくとも一部を含む組換え核酸に関する。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶゲノムまたはＭＹＸＶゲノムの一部は、Ｍ１５３遺伝子の発現を減少させるように改変される。いくつかの実施形態において、Ｍ１５３遺伝子は、ＭＹＸＶゲノム中のＭ１５３遺伝子の少なくとも一部をノックアウトするように改変される。
【0096】
いくつかの実施形態において、組換え核酸は、Ｍ１５３遺伝子に変異を導入するように操作される。変異は、例えば、挿入、欠失、置換（ｓｕｂｓｔａｔｉｏｎ）、またはそれらの組み合わせを含むことができる。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、Ｍ１５３遺伝子が破壊される遺伝子ノックインを含む。
【0097】
いくつかの実施形態において、組換え核酸は、非ウイルス性分子をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、非ウイルス分子、例えば、タンパク質をコードする導入遺伝子をコードする１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の核酸を含む。
【0098】
いくつかの実施形態において、組換え核酸は、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態において、ＴＮＦαは、ヒトＴＮＦαである。いくつかの実施形態において、ＴＮＦαをコードする核酸は、ＭＹＸＶゲノムのＭ１３５Ｒ遺伝子を置き換えるか、またはそれに隣接している。いくつかの実施形態において、ＴＮＦαをコードする核酸は、ＭＹＸＶゲノムのＭ１３５Ｒ遺伝子とＭ１３６Ｒ遺伝子との間に挿入される。いくつかの実施形態において、ＴＮＦαの発現は、ポックスウイルス合成初期／後期（ｓＥ／Ｌ）プロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態において、ＴＮＦαをコードする核酸は、ＭＹＸＶゲノムのＭ１５３遺伝子を置き換えるか、またはそれに隣接している。
【0099】
いくつかの実施形態において、組換え核酸は、インターロイキン－１２サブユニットアルファ（ＩＬ－１２α）をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２αは、ヒトＩＬ－１２αである。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２αの発現は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）によって駆動される。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２αをコードする核酸は、ＭＹＸＶゲノムのＭ１５３遺伝子の発現を破壊する。
【0100】
いくつかの実施形態において、組換え核酸は、インターロイキン－１２サブユニットベータ（ＩＬ－１２β）をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２βは、ヒトＩＬ－１２β遺伝子である。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２βの発現は、ｓＥ／Ｌプロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２βをコードする核酸は、ＭＹＸＶゲノムのＭ１５３遺伝子の発現を破壊する。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２βをコードする核酸およびＩＬ－１２αをコードする核酸は両方とも、ＭＹＸＶゲノムのＭ１５３遺伝子の発現を破壊する。
【0101】
いくつかの実施形態において、組換え核酸は、デコリンをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態において、デコリンはヒトデコリンである。いくつかの実施形態において、デコリンの発現は、ｓＥ／Ｌプロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、デコリンをコードし、ＭＹＸＶゲノムのＭ１５３遺伝子の発現を破壊する核酸を含む。
【0102】
いくつかの実施形態において、組換え核酸は、レポータータグ、例えば、蛍光タンパク質をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態において、レポータータグは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含む。いくつかの実施形態において、レポータータグの発現は、ｓＥ／Ｌプロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、第２のレポータータグをコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、第２のレポータータグは、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、例えば、ｄｓＲｅｄを含む。いくつかの実施形態において、第２のレポータータグの発現は、ポックスウイルスＰ１１後期プロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態において、第２のレポータータグをコードする核酸は、ＭＹＸＶゲノムのＭ１５３遺伝子の発現を破壊する。
【0103】
いくつかの実施形態において、組換え核酸は、任意選択でＧＦＰを含む、ｖＭｙｘ－ｈＴＮＦａカセットを含む。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、任意選択でｄｓＲｅｄを含む、ｈＤｅｃｏｒｉｎ－ｈＩＬ－１２カセットを含む。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、任意選択でＧＦＰおよび／またはｄｓＲｅｄを含む、ｖＭｙｘ－ｈＴＮＦａ－ｈＤｅｃｏｒｉｎ－ｈＩＬ－１２－Ｍ１５３ＫＯ（ｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅ）カセットを含むか、またはそれからなる。
【0104】
組成物および投与
本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、本明細書に記載されるようなＭＹＸＶを含む組成物である。いくつかの実施形態において、組成物は医薬組成物を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。
本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、本明細書に記載されるようなＭＹＸＶを含む組成物である。いくつかの実施形態において、組成物は医薬組成物を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。
【0105】
いくつかの実施形態において、薬学的に許容される担体は、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、デキストロース水溶液、グリセロールなどの注射可能な流体を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、粉末、丸薬、錠剤、またはカプセルなどの固形組成物を含む。固形組成物を含むものなどのいくつかの実施形態において、薬学的に許容される担体は、マンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを含む。いくつかの実施形態において、薬学的に許容される担体は、生物学的に中性の担体を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、湿潤剤または乳化剤、防腐剤、およびｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはモノラウリン酸ソルビタンを含む。
【0106】
いくつかの実施形態において、薬学的に許容される担体または賦形剤の同一性または割合は、投与経路、生ウイルスとの適合性、または標準的な製薬慣行に基づいて決定される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、ＭＹＸＶの生物学的特性を著しく損なうことのない成分を配合されている。医薬組成物は、有効量の活性物質または複数の物質が薬学的に許容されるビヒクルと混合して組み合わされるように、対象への投与に適した薬学的に許容される組成物を調製するための既知の方法によって調製することができる。いくつかの実施形態において、組成物は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤、ビヒクル、または希釈剤と関連し、適切なｐＨおよび生理学的液体と等浸透圧である緩衝溶液に含まれるＭＹＸＶの溶液を含む。
【0107】
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、対象への投与のために製剤化される。当業者によって理解されるように、医薬組成物は、選択された投与経路に応じて様々な形態で対象に投与され得る。いくつかの場合において、医薬組成物は全身投与されるか、または全身投与用に製剤化される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、局所的に投与されるか、または局所投与用に製剤化される。
【0108】
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、非経口的に投与されるか、または非経口投与用に製剤化される。非経口投与の例には、静脈内、腫瘍内、腹腔内、皮下、筋肉内、経上皮、鼻、肺内、髄腔内、直腸および局所の投与様式が含まれる。非経口投与は、選択された期間にわたる持続注入によるものであり得る。
【0109】
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、経口投与されるか、または経口投与用に製剤化される。医薬組成物は、例えば、不活性希釈剤または担体と共に経口投与され得るか、またはそれは、ハードシェルまたはソフトシェルゼラチンカプセルに封入され得るか、またはそれは錠剤に圧縮され得る。経口治療投与の場合、ＭＹＸＶは賦形剤と一緒に組み込まれ、摂取可能な錠剤、口腔内錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウエハースなどの形で使用され得る。
【0110】
ＭＹＸＶの溶液は、生理学的に適切な緩衝液中で調製することができる。いくつかの実施形態において、通常の貯蔵および使用の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐための防腐剤を含むが、それは生ウイルスを不活性化しない。いくつかの実施形態において、使用される医薬組成物の用量は、治療される特定の状態、状態の重症度、年齢、体調、サイズおよび体重を含む個々の対象のパラメーター、治療の期間、同時療法（もしあれば）の性質、特定の投与経路、および医療従事者の知識と専門知識の範囲内にある他の同様の要因に依存する。特定の実施形態において、治療用ウイルスは、室温での保存のために凍結乾燥され得る。
【0111】
医薬組成物は、追加の抗癌剤などの追加の治療剤をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、組成物は化学療法剤を含む。化学療法剤は、例えば、対象の癌細胞または腫瘍性細胞に対して腫瘍溶解効果を示し、ＭＹＸＶの腫瘍殺傷効果を阻害または減少させない実質的に任意の薬剤であり得る。例えば、化学療法剤は、アントラサイクリン、アルキル化剤、アルキルスルホネート、アジリジン、エチレンイミン、メチルメラミン、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、抗生物質、代謝拮抗剤、葉酸類似体、プリン類似体、ピリミジン類似体、酵素、ポドフィロトキシン、白金含有剤またはサイトカインであり得るが、これらに限定されない。好ましくは、化学療法剤は、癌性または腫瘍性である特定の細胞型に対して有効であることが知られているものである。いくつかの場合において、追加の治療剤は免疫チェックポイントモジュレーターを含む。
【0112】
いくつかの実施形態において、組成物は、本明細書に記載のＭＹＸＶによってエキソビボで処理された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄（ＢＭ）細胞、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、ＰＢＭＣ、ＢＭ細胞、またはそれらの組み合わせは、自己細胞を含む。いくつかの実施形態において、ＰＢＭＣ、ＢＭ細胞、またはそれらの組み合わせは、同種異系ドナーから得られる。いくつかの実施形態において、ＰＢＭＣ、ＢＭ細胞、またはそれらの組み合わせは、異種ドナーから得られる。
【0113】
使用の方法
本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、本明細書に記載の組成物または医薬組成物を対象に投与する工程を含む、必要とする対象における癌を阻害、軽減、または予防する方法である。特定の実施形態において、この方法は、ヒト対象などの対象に、本明細書に記載のＭＹＸＶを投与し、それによって、必要とする対象の癌を治療および／または阻害する工程を含む。
本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、本明細書に記載の組成物または医薬組成物を対象に投与する工程を含む、必要とする対象における癌を阻害、軽減、または予防する方法である。特定の実施形態において、この方法は、ヒト対象などの対象に、本明細書に記載のＭＹＸＶを投与し、それによって、必要とする対象の癌を治療および／または阻害する工程を含む。
【0114】
いくつかの実施形態は、ＭＹＸＶを用いる予防的治療を含む。いくつかの実施形態において、対象は、癌を有するか、癌を有する疑いがあるか、または癌を有するリスクがある。いくつかの実施形態は、有することが疑われる対象を選択する工程を含む。いくつかの実施形態は、癌を有するリスクのある対象を選択する工程を含む。いくつかの実施形態において、対象は癌を有する。いくつかの実施形態において、方法は、癌を有する対象を選択する工程を含む。
【0115】
いくつかの実施形態において、対象はヒトである。いくつかの実施形態において、対象は患者である。いくつかの実施形態において、対象は動物または非ヒト動物である。非ヒト動物の例には、哺乳動物および非哺乳動物などの脊椎動物が含まれる。哺乳動物のいくつかの例には、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、およびマウスやラットなどの齧歯動物が含まれる。
【0116】
いくつかの実施形態において、癌は固形腫瘍である。肉腫および癌腫などの固形腫瘍の例には、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、骨形成性肉腫、および他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ性悪性疾患、膵臓癌、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺腫、髄質癌、気管支癌、腎細胞癌、肝細胞腫、胆管癌、絨毛腫、ウィルムス腫瘍、頸部癌、精巣腫瘍、膀胱癌、およびＣＮＳ腫瘍（神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、メナンギオーマ、黒色腫、神経芽細胞腫および網膜芽細胞腫など）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、癌は、骨肉腫、Ｔｒｉｐｌｅネガティブ乳癌、または黒色腫を含む。
【0117】
いくつかの実施形態において、癌は、対象におけるある場所に転移している。いくつかの実施形態において、場所は、対象の肺、脳、肝臓、および／またはリンパ節を含む。
【0118】
いくつかの実施形態において、癌は、ホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫などの血液癌を含む。いくつかの実施形態において、血液癌は、Ｂ細胞またはＴ細胞の血液癌を含む。
【0119】
いくつかの実施形態において、組成物は、癌細胞の生存率を低下させるか、または癌における免疫原性細胞死を活性化する。いくつかの実施形態において、癌は、組成物の投与時に阻害、軽減、または予防される。いくつかの実施形態において、投与は対象の生存を改善する。
【0120】
ＭＹＸＶまたはＭＹＸＶを含む組成物は、標準的な投与方法を使用して対象に投与することができる。いくつかの実施形態において、ウイルスまたはウイルスを含む組成物は、全身投与される（例えば、ＩＶ注射）。いくつかの実施形態において、ウイルスまたはウイルスを含む組成物は、疾患部位への注射によって（例えば、腫瘍内に）投与される。いくつかの実施形態において、ウイルスまたはウイルスを含む組成物は、経口的または非経口的に、または当該技術分野で知られている任意の標準的な方法によって投与される。特定の実施形態において、ＭＹＸＶまたはＭＹＸＶを含む組成物は、腫瘍および／または転移の部位に投与される。
【0121】
ＭＹＸＶは、対象の臨床反応に応じて、必要に応じて調整され得る適切な量で最初に投与され得る。ウイルスの有効量は経験的に決定することができ、安全に投与できるＭＹＸＶの最大量、および望ましい結果を生み出すウイルスの最小量に依存する。
【0122】
投与されるウイルスの濃度は、投与されるＭＹＸＶの特定の株の毒性、および標的とされる細胞の性質に応じて変化し得る。一実施形態では、「感染性ユニット」とも呼ばれる、約３×１０１０未満の焦点形成単位（「ｆｆｕ」）の用量が、様々な実施形態においてヒト対象に投与され、約１０２～約１０９ｐｆｕの間、約１０２～約１０７ｐｆｕの間、約１０３～約１０６ｐｆｕの間、または約１０４～約１０５ｐｆｕの間を単回投与で投与することができる。
【0123】
いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、対象における免疫細胞（例えば、ＰＢＭＣ）によるサイトカインの発現を増加させるのに有効な用量およびスケジュールで投与される。免疫細胞によるサイトカインの発現は、例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約１０００倍だけ増加させることができる。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、対象の免疫細胞による２、３、４、５、６、またはそれ以上のサイトカインの発現を増加させるのに有効な用量およびスケジュールで投与される。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、対象における免疫細胞による少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、またはそれ以上のサイトカインの発現を増加させるために有効な用量およびスケジュールで投与される。サイトカインは、例えば、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＴＮＦ－α、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。いくつかの実施形態において、ＴＮＦ－αの発現が増加する。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２の発現が増加する。いくつかの実施形態において、デコリンの発現が増加する。いくつかの実施形態において、ＩＦＮ－γの発現が増加する。
【0124】
いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、対象における癌細胞によるサイトカインの発現を増加させるために有効な用量およびスケジュールで投与される。癌細胞によるサイトカインの発現は、例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約１０００倍だけ増加させることができる。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、対象の癌細胞による２、３、４、５、６、またはそれ以上のサイトカインの発現を増加させるのに有効な用量およびスケジュールで投与される。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、対象における癌細胞による少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、またはそれ以上のサイトカインの発現を増加させるのに有効な用量およびスケジュールで投与される。サイトカインは、例えば、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＴＮＦ－α、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。いくつかの実施形態において、ＴＮＦ－αの発現が増加する。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２の発現が増加する。いくつかの実施形態において、デコリンの発現が増加する。いくつかの実施形態において、ＩＦＮ－γの発現が増加する。
【0125】
いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、対象における腫瘍の体積を減少させるために有効な用量およびスケジュールで投与される。腫瘍の体積は、例えば、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％減少させることができる。
【0126】
いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、対象における腫瘍または癌細胞の増殖速度を低下させるために有効な用量およびスケジュールで投与される。腫瘍または癌細胞の増殖速度は、例えば、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％だけ減少させることができる。
【0127】
ＭＹＸＶは、単独療法として投与することができ、または化学療法、免疫療法および／または放射線療法を含む他の療法と組み合わせて投与してもよい。例えば、ＭＹＸＶは、原発腫瘍の外科的除去の前または後で、あるいは放射線療法または従来の化学療法薬物の投与などの治療の前、同時、または後のいずれかに投与することができる。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、他の治療の少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１．５週間、２週間、または３週間前に投与することができる。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、他の治療の少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１．５週間、２週間、または３週間後に投与することができる。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、他の治療から１日、２日、３日、４日、５日、６日、または７日以内に投与することができる。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、他の治療と同時に投与することができる。
【0128】
いくつかの実施形態は、対象に追加の治療薬を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、追加の治療薬は、免疫チェックポイントモジュレーターである。いくつかの実施形態において、追加の治療薬は、組成物を投与する前に対象に投与される。いくつかの実施形態において、追加の治療薬は、組成物を投与した後に対象に投与される。いくつかの実施形態において、追加の治療薬は、組成物との組み合わせとして対象に投与される。
【0129】
いくつかの実施形態において、追加の治療薬は、免疫調節剤、例えば、免疫チェックポイントモジュレーターまたは阻害剤を含む。例示的な免疫チェックポイントモジュレーターには、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａのデュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈのアテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）、ＥＭＤ Ｓｅｒｏｎｏ／Ｐｆｉｚｅｒのアベルマブ、ＣｙｔｏｍＸ ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓのＣＸ－０７２、Ｎｏｖａｒｔｉｓ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＦＡＺ０５３、３Ｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ／ＡｌｐｈａｍａｂのＫＮ０３５、Ｅｌｉ ＬｉｌｌｙのＬＹ３３０００５４、またはＥＭＤ ＳｅｒｏｎｏのＭ７８２４（抗ＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦベータトラップ）などのＰＤ－Ｌ１阻害剤；ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅのＡＭＰ－２２４（Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ）およびｒＨＩｇＭ１２Ｂ７などのＰＤ－Ｌ２阻害剤；Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂのニボルマブ（オプジーボ）、Ｍｅｒｃｋのペムブロリズマブ（キイトルーダ）、ＡｇｅｎｕｓのＡＧＥＮ ２０３４、ＢｅｉＧｅｎｅのＢＧＢ－Ａ３１７、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ－Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＢｌ－７５４０９１、ＣＢＴ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＣＢＴ－５０１（ジェノリムズマブ）、ＩｎｃｙｔｅのＩＮＣＳＨＲ１２１０、Ｊａｎｓｓｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔのＪＮＪ－６３７２３２８３、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅのＭＥＤＩ０６８０、ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓのＭＧＡ ０１２、Ｎｏｖａｒｔｉｓ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＰＤＲ００１、ＰｆｉｚｅｒのＰＦ－０６８０１５９１、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／ＳａｎｏｆｉのＲＥＧＮ２８１０（ＳＡＲ４３９６８４）、またはＴＥＳＡＲＯのＴＳＲ－０４２などのＰＤ－１阻害剤；Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｅｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂのイピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標）、ＭＤＸ－０１０、ＢＭＳ－７３４０１６、およびＭＤＸ－１０１としても知られる）、Ｐｆｉｚｅｒのトレメリムマブ（ＣＰ－６７５，２０６、チシリムマブ）、またはＡｇｅｎｕｓのＡＧＥＮ１８８４などのＣＴＬＡ－４阻害剤；Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ ＳｑｕｉｂｂのＢＭＳ－９８６０１６、Ｎｏｖａｒｔｉｓ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＩＭＰ７０１、Ｎｏｖａｒｔｉｓ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＬＡＧ５２５、またはＲｅｇｅｎｅｒｏｎ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＲＥＧＮ３７６７などのＬＡＧ３阻害剤；ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓのエノブリツズマブ（ＭＧＡ２７１）などのＢ７－Ｈ３阻害剤；Ｉｎｎａｔｅ ＰｈａｒｍａのＬｉｒｉｌｕｍａｂ（ＩＰＨ２１０１；ＢＭＳ－９８６０１５）などのＫＩＲ阻害剤；ｕｒｅｌｕｍａｂ（ＢＭＳ－６６３５１３、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ＰＦ－０５０８２５６６（抗４－１ＢＢ、ＰＦ－２５６６、Ｐｆｉｚｅｒ）、またはＸｍＡｂ－５５９２（Ｘｅｎｃｏｒ）などのＣＤ１３７阻害剤；バビツキシマブなどのＰＳ阻害剤；および抗体またはその断片（例えば、モノクローナル抗体、ヒト、ヒト化、またはキメラ抗体）、ＲＮＡｉ分子、またはＴＩＭ３、ＣＤ５２、ＣＤ３０、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ２７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＬＡＩＲ１、ＴＩＧＨＴ、ＬＩＧＨＴ、ＤＲ３、ＣＤ２２６、ＣＤ２、またはＳＬＡＭに対する小分子などの阻害剤が含まれるが、これらに限定されない。
【0130】
さらに開示されるのは、治療用ＭＹＸＶウイルスが、癌患者への再注入などの注入の前に、骨髄または末梢血単核細胞のいずれかからの混合白血球に最初にエキソビボで吸着される送達戦略である。この戦略においては、ＭＹＸＶは、エキソビボでウイルスに事前感染した白血球の移動を介して転移性癌部位に送達することができる。この全身送達法は、ウイルスが患者に注入される前に単離された白血球に最初に送達されるため、「エキソビボウイルス療法」またはＥＶＶ（別名ＥＶ２）と呼ばれることもある。ＭＹＸＶ構築物およびこの送達戦略は、腫瘍の負担を大幅に軽減し、必要としている対象の生存を増加させ得る。いくつかの実施形態において、ＢＭまたはＰＢＭＣ細胞は、エキソビボにて１時間ＭＹＸＶ構築物で吸着され、次いで、ＭＹＸＶがロードされた白血球が、レシピエントに注入されて戻される。
【0131】
特定の実施形態において、単核末梢血細胞および／または骨髄細胞は、例えば、自己細胞として、対象から得られる。いくつかの実施形態において、単核末梢血細胞および／または骨髄細胞は、１つ以上の同種異系ドナー、例えば、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、または少なくとも８つのＨＬＡ対立遺伝子（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ａ、および／またはＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子の一方または両方のコピーなど）についてレシピエントに一致するドナーから得られる。ＨＬＡ対立遺伝子は、例えば、ＤＮＡベースの方法を使用したタイプであり得る。いくつかの実施形態において、単核末梢血細胞および／または骨髄細胞は、１人以上の異種ドナーから得られる。
【実施例】
【0132】
これらの実施例は、例示のみを目的として提供されており、本明細書で提供される特許請求の範囲を限定するものではない。
【0133】
実施例１－ウイルスの構築
組換えプラスミドは、ｄｓＲｅｄ核酸配列の有無にかかわらず、粘液腫ウイルスＭ１５３遺伝子座におけるｈＤｅｃｏｒｉｎおよびｈＩＬ１２核酸配列の挿入のために設計した。ヒトデコリン遺伝子は、ＯＨｕ１６４０８（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）のｃＤＮＡ ＯＲＦクローンからＰＣＲ増幅した。ヒトサブユニットＩＬ－１２ ｐ３５およびｐ４０は、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２００７年１１月、Ｐ．１２７０４－１２７０８に記載されているｖＭｙｘ－ｈｕＩＬ－１２－ＧＦＰから得られ、この開示は参照により本明細書に組み込まれる。赤色蛍光タンパク質（ｄｓＲｅｄ）遺伝子は、ｈＤｅｃｏｒｉｎ－ｈＩＬ－１２発現カセットのすぐ下流に挿入され、その発現はポックスウイルスＰ１１後期プロモーターによって駆動された。この組換え核酸は、ｖＭｙｘ－ＴｒｉｐｌｅまたはｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅ－レッドと称する。ＭＹＸＶ感染はｄｓＲｅｄ発現のライブイメージングによってモニタリングできるため、ｄｓＲｅｄはインビトロおよびインビボでのＭＹＸＶ複製の蛍光マーカーとして機能した。この組換え核酸の第２のバージョンは、ｄｓＲｅｄマーカーを欠いて作製した（ｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅ－ホワイトと称する）。
組換えプラスミドは、ｄｓＲｅｄ核酸配列の有無にかかわらず、粘液腫ウイルスＭ１５３遺伝子座におけるｈＤｅｃｏｒｉｎおよびｈＩＬ１２核酸配列の挿入のために設計した。ヒトデコリン遺伝子は、ＯＨｕ１６４０８（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）のｃＤＮＡ ＯＲＦクローンからＰＣＲ増幅した。ヒトサブユニットＩＬ－１２ ｐ３５およびｐ４０は、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２００７年１１月、Ｐ．１２７０４－１２７０８に記載されているｖＭｙｘ－ｈｕＩＬ－１２－ＧＦＰから得られ、この開示は参照により本明細書に組み込まれる。赤色蛍光タンパク質（ｄｓＲｅｄ）遺伝子は、ｈＤｅｃｏｒｉｎ－ｈＩＬ－１２発現カセットのすぐ下流に挿入され、その発現はポックスウイルスＰ１１後期プロモーターによって駆動された。この組換え核酸は、ｖＭｙｘ－ＴｒｉｐｌｅまたはｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅ－レッドと称する。ＭＹＸＶ感染はｄｓＲｅｄ発現のライブイメージングによってモニタリングできるため、ｄｓＲｅｄはインビトロおよびインビボでのＭＹＸＶ複製の蛍光マーカーとして機能した。この組換え核酸の第２のバージョンは、ｄｓＲｅｄマーカーを欠いて作製した（ｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅ－ホワイトと称する）。
【0134】
図１Ａは、ｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅ組換え核酸の構築を示す。上の画像は、ｖＭｙｘ－ｈＴＮＦａ－ＧＦＰゲノムおよび発現しているｈＤｅｃｏｒｉｎ－ｈＩＬ－１２－ｄｓＲｅｄカセットの挿入部位（Ｍ１５３遺伝子座）を示す。真ん中の画像はｈＤｅｃｏｒｉｎ－ｈＩＬ－１２－ｄｓＲｅｄカセットを示し、下の画像はｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅ構築物を示す。ｈＤｅｃｏｒｉｎ－ｈＩＬ－１２－ｄｓＲｅｄカセットのデコリンおよびＩＬ－１２導入遺伝子は、ポックスウイルス合成初期／後期プロモーター（ｓＥ／Ｌ）の制御下で発現するのに対し、ｄｓＲｅｄの発現はポックスウイルス後期プロモーターであるＰ１１によって制御された。ｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅ－ホワイト構築物は、ｄｓＲｅｄカセットを欠いている以外は、ｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅ－レッドと同じである。
【0135】
ｖＭｙｘ－ＴｒｉｐｌｅおよびｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅホワイトウイルスを作製するために、最初に、ゲートウェイシステム（Ｇａｔｅｗａｙ Ｓｙｓｔｅｍ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して組換えプラスミドを構築した。上流および下流のハイブリダイズする配列をＰＣＲによって増幅し、適切なｐＤＯＮＲベクターを用いたＧａｔｅｗａｙ ＢＰ組換えによってエントリークローンを生成した。最終的な組換えプラスミドは、３つのエントリークローンをデスティネーションベクターと順次再結合することによって構築した。ｈＤｅｃｏｒｉｎ－ｈＩＬ１２－ｄｓＲｅｄ発現カセットは、ＲＫ１３細胞にｖＭｙｘ－ｈＴＮＦａ－ＧＦＰウイルスを感染させ、適切な組換えプラスミドでトランスフェクトすることにより、ＭＹＸＶゲノムに挿入された。蛍光ｄｓＲｅｄタンパク質を選択マーカーとして使用して、組換えウイルスの純粋なストックを得るために、複数回の集約型（ｆｏｃｉ）精製を行った。導入遺伝子の存在は、ｈＴＮＦ、ｈＤｅｃｏｒｉｎおよびｈＩＬ－１２に特異的なプライマーを使用したＰＣＲ（図２Ａおよび２Ｂ）によって確認された。これらの図に示されているこのＰＣＲ分析により、導入遺伝子がさまざまなｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅクローンに存在し、図に示されているバンドが予想されたサイズであることが確認された。表１には、構築物の生成に使用されるプライマー配列が含まれる。
【0136】
【表1】
【0137】
組換えｖＭｙｘ－ＴｒｉｐｌｅおよびｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅホワイトウイルスの純度、およびＭ１５３の欠如は、適切なプライマーセットを使用するＰＣＲによって確認した（図２Ｃおよび２Ｄ）。図２Ｃに示すＰＣＲ分析では、１３５および１３６遺伝子の隣接領域においてプライマーを使用することにより、クローンに野生型ウイルスが含まれていないことを確認した。ウエスタンブロットにより、３つの導入遺伝子のタンパク質発現が確認された（図３Ａ－３Ｃ）。したがって、トランスジェニックヒトＴＮＦα、デコリン、およびＩＬ－１２を発現し、Ｍ１５３を欠く組換えＭＹＸＶが生成された（ｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅ）。導入遺伝子の発現を検出するために使用された抗体は次のとおりである。ヒトＴＮＦ－α：モノクローナルマウスＩｇＧ１クローン＃２８４０１（ＭＡＢ６１０－１００、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）；ヒトデコリン：ウサギポリクローナル抗体（ａｂ１７５４０４、Ａｂｃａｍ）；ヒトＩＬ－１２：ＩＬ－１２ ｐ７０抗体（ａｂ２５１０５、Ａｂｃａｍ）に対するウサギポリクローナル。
【0138】
ヒトＩＬ－１２ではなくマウスＩＬ－１２を発現する組換えＭＹＸＶは、ヒトＩＬ－１２を発現するウイルスのために使用されるのと同じゲートウェイシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して生成された。比較的低レベルのマウスＩＬ－１２を発現するウイルスは、ＩＬ－１２のサブユニット間にＩＲＥＳ配列を有する合成初期／後期プロモーター（マウスＴｒｉｐｌｅ ＩＬ－１２低）を使用して生成され、比較的高レベルのマウスＩＬ－１２を発現するｖＭｙｘｖ－マウスＴｒｉｐｌｅは、ＩＬ－１２のサブユニット間にエラスチンリンカーを含むマウスＩＬ－１２を含む合成初期／後期プロモーター（マウスＴｒｉｐｌｅ ＩＬ－１２高）を使用して生成された。
【0139】
実施例２－組換えＭＹＸＶの複製および細胞殺傷能力
実施例１で調製されたｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅウイルスの複製能力は、ＲＫ１３細胞で試験された。ｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅウイルスの複製能力は、親のｖＭｙｘ－ｈＴＮＦａ－ＧＦＰウイルスと同様であった（図４）。したがって、トランスジェニックヒトＴＮＦα、デコリン、およびＩＬ－１２を発現し、Ｍ１５３を欠く組換えＭＹＸＶは、宿主細胞で効果的に複製される。
実施例１で調製されたｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅウイルスの複製能力は、ＲＫ１３細胞で試験された。ｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅウイルスの複製能力は、親のｖＭｙｘ－ｈＴＮＦａ－ＧＦＰウイルスと同様であった（図４）。したがって、トランスジェニックヒトＴＮＦα、デコリン、およびＩＬ－１２を発現し、Ｍ１５３を欠く組換えＭＹＸＶは、宿主細胞で効果的に複製される。
【0140】
次に、ｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅウイルスの細胞殺傷能力を、２つの異なる細胞株、ＣＴ２６（結腸癌）およびＨＥＬＡ（ヒト子宮頸癌）で試験した（図５Ａおよび５Ｂ）。細胞毒性を測定するために（およびしたがって細胞傷害性）を推測するために、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓＯｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（ＭＴＳ）を使用した（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）。ＣＴ２６およびＨＥＬＡ細胞を、感染多重度（ＭＯＩ）１０で４８時間異なるウイルスに感染させた。数時間後、テトラゾリウム基質（ＭＴＳ）をＣＴ２６およびＨＥＬＡ細胞に添加し、生細胞で生成されたＡ４９０ホルマザン産物を、２時間のインキュベーション後にマイクロプレートリーダーを使用して測定した。各サンプルを３連で定量し、合計２回の独立した実験を実施した。ｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅウイルスは、親ウイルスｖＭｙｘ－ｈＴＮＦａと比較して、またｖＭｙｘ－ＧＦＰと比較して、両方の細胞株で同様のレベルの細胞死を誘発した。他のウイルスと比較して、ｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅウイルスによる癌細胞殺傷の増加傾向が存在した。したがって、トランスジェニックヒトＴＮＦα、デコリン、およびＩＬ－１２を発現し、Ｍ１５３を欠く組換えＭＹＸＶは、癌細胞に対して細胞傷害性を示した。
【0141】
実施例３－組換えＭＹＸＶの複製および細胞殺傷能力
図１Ｂは、本開示の組換え核酸およびＭＹＸＶにおいて改変され得るＭ１５３遺伝子座を示す。改変は、Ｍ１５３配列における変異、例えば、挿入、欠失、置換、またはそれらの組み合わせを含み得る。改変は、Ｍ１５３の活性または発現レベルを減衰することができる。改変には、Ｍ１５３遺伝子の欠失および／またはＭ１５３遺伝子の１つ以上の導入遺伝子による置換が含まれ得る。置換遺伝子は、ｈＴＮＦａ、ｈＤｅｃｏｒｉｎ、ＩＬ－１２、または腫瘍溶解活性を増強するか、ＭＹＸＶの有害な副作用を減少させるのに役立つ別の導入遺伝子から選択することができる。
図１Ｂは、本開示の組換え核酸およびＭＹＸＶにおいて改変され得るＭ１５３遺伝子座を示す。改変は、Ｍ１５３配列における変異、例えば、挿入、欠失、置換、またはそれらの組み合わせを含み得る。改変は、Ｍ１５３の活性または発現レベルを減衰することができる。改変には、Ｍ１５３遺伝子の欠失および／またはＭ１５３遺伝子の１つ以上の導入遺伝子による置換が含まれ得る。置換遺伝子は、ｈＴＮＦａ、ｈＤｅｃｏｒｉｎ、ＩＬ－１２、または腫瘍溶解活性を増強するか、ＭＹＸＶの有害な副作用を減少させるのに役立つ別の導入遺伝子から選択することができる。
【0142】
ｖＭｙｘ構築物を作製するために、組換えプラスミドは、最初に、ゲートウェイシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して構築され得る。上流および下流のハイブリダイズする配列をＰＣＲによって増幅し、適切なｐＤＯＮＲベクターを用いたゲートウェイＢＰ組換えによってエントリークローンを生成する。最終的な組換えプラスミドは、１つ以上のエントリークローンをデスティネーションベクターと順次再結合することによって構築する。組換えプラスミドは、ＲＫ１３細胞にｖＭｙｘを感染させ、次に適切な組換えプラスミドでトランスフェクトすることにより、ＭＹＸＶゲノムに挿入する。組換えウイルスの純粋なストックを得るために、複数回の集約型（ｆｏｃｉ）精製を行う。蛍光タンパク質、例えば、ｄｓＲｅｄなどの選択マーカーを使用することができる。導入遺伝子の存在は、ＰＣＲおよび／または配列決定によって確認することができる。
【0143】
Ｍ１５３ノックアウトウイルスは、この方法で構築することができる。組換えプラスミドは、Ｍ１５３遺伝子配列なしでＭ１５３遺伝子の配列に隣接する配列を含むように設計することができる。任意選択で、蛍光タンパク質の発現カセットを含めることができる。Ｍ１５３ノックアウトは、ＲＫ１３細胞にＭＹＸＶを感染させ、細胞に組換えプラスミドをトランスフェクトすることによって生成できる。複数回の集約型（ｆｏｃｉ）精製は、Ｍ１５３ＫＯウイルスの純粋なストックを得るために行われ、任意選択で選択マーカーとして蛍光タンパク質を使用する。Ｍ１５３ノックアウトとウイルスの純度は、適切なプライマーを使用するＰＣＲ分析によって確認される。
【0144】
改変されたｖＭｙｘウイルスの複製能力は、ＲＫ１３細胞で試験することができる。改変されたｖＭｙｘウイルスの複製能力は、親のｖＭｙｘウイルスと同様であり得る。次に、改変されたｖＭｙｘウイルスの細胞殺傷能力は、２つの異なる癌細胞株でテストされる。細胞生存率を測定する（したがって細胞毒性を推測する）ために、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓＯｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（ＭＴＳ）（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）が使用される。癌細胞は、ＭＯＩ＝１０で４８時間さまざまなウイルスに感染される。４８時間後、テトラゾリウム基質（ＭＴＳ）を細胞に添加し、生細胞で生成されたＡ４９０ホルマザン生成物を２時間のインキュベーション後にマイクロプレートリーダーを使用して測定する。各サンプルは３連で定量され、合計２回の独立した実験が実行される。改変されたｖＭｙｘウイルスは、親ウイルスｖＭｙｘと比較して、またｖＭｙｘ－ＧＦＰと比較して、両方の細胞株で同様のレベルの細胞死、またはより高いレベルの細胞死を誘発することができる。
【0145】
実施例４－Ｍ１５３ＫＯ ＭＹＸＶを使用したインビトロの結果
治療用導入遺伝子は、２つのタイプのゲノム遺伝子座において、すなわち、組換えウイルスがそのウイルス遺伝子の遺伝的「ノックアウト」であるように、その結果、タンパク質コード遺伝子内の破壊構築物として、またはさもなければ、組換えウイルスの生物学や腫瘍溶解の可能性に影響を与えないと予測されている、「無害な」遺伝子間遺伝子座において、ＭＹＸＶに加えることができる。内在性ウイルス遺伝子がノックアウトされると、新しいノックアウト構築物は、どの導入遺伝子が遺伝子座に挿入されるかに関係なく、癌細胞に対する腫瘍溶解能の点で親ウイルスとは異なるという可能性がある。
治療用導入遺伝子は、２つのタイプのゲノム遺伝子座において、すなわち、組換えウイルスがそのウイルス遺伝子の遺伝的「ノックアウト」であるように、その結果、タンパク質コード遺伝子内の破壊構築物として、またはさもなければ、組換えウイルスの生物学や腫瘍溶解の可能性に影響を与えないと予測されている、「無害な」遺伝子間遺伝子座において、ＭＹＸＶに加えることができる。内在性ウイルス遺伝子がノックアウトされると、新しいノックアウト構築物は、どの導入遺伝子が遺伝子座に挿入されるかに関係なく、癌細胞に対する腫瘍溶解能の点で親ウイルスとは異なるという可能性がある。
【0146】
ＭＹＸＶのＭ１５３遺伝子は、ＭＨＣクラスＩおよびＣＤ４タンパク質を含む多様な細胞受容体のダウンレギュレーションに関与するＥ３－ユビキチンリガーゼのファミリーからの免疫調節タンパク質をコードする。理論に拘束されることを望まないが、Ｍ１５３の不活性化またはノックダウンは、ＭＨＣ－Ｉ依存性免疫エピトープの発現の増強、例えば、ウイルスおよび／または腫瘍抗原の直接提示の増加をもたらし、それによって、宿主Ｔ細胞によるウイルス感染細胞（例えば、癌細胞）の認識を増加させることができる。これにより、不活性化されたＭ１５３遺伝子を有する粘液腫ウイルスが、腫瘍溶解性ベクターとして使用できるようになる。この実施例と次の実施例のデータは、Ｍ１５３ノックアウト粘液腫ウイルス（Ｍ１５３ＫＯ ＭＹＸＶ）バックボーンが、免疫応答性モデルにおいてインタクトなＭ１５３遺伝子を有する親ＭＹＸＶよりもインビトロおよびインビボで高い腫瘍溶解活性を示したことを示す。このように、導入遺伝子のないＭ１５３ＫＯ ＭＹＸＶは、親のＭＹＸＶまたはｗｔＭＹＸＶよりも大きな腫瘍溶解活性を示した。さらに、１つ以上の導入遺伝子を持つＭ１５３ＫＯ ＭＹＸＶはまた、親のＭＹＸＶまたはｗｔＭＹＸＶよりも腫瘍溶解活性の増強を示すこともあり得る。
【0147】
マウス黒色腫細胞株であるＢ１６Ｆ１０細胞において、Ｍ１５３ＫＯ ＭＹＸＶは、インタクトな野生型Ｍ１５３（ｗｔ ＭＹＸＶ）を含む野生型粘液腫ウイルスと比較して、細胞殺傷の誘導について試験した。このＭ１５３ＫＯＭＹＸＶには、ｈＴＮＦａ、ｈＤｅｃｏｒｉｎ、ｈＩＬ－１２Ａ、またはｈＩＬ－１２Ｂ導入遺伝子は含まれていなかった。Ｍ１５３ＫＯ ＭＹＸＶは、感染後の初期の時点で、感染後約３６時間まで、ｗｔ ＭＹＸＶよりもＢ１６Ｆ１０細胞の細胞生存率を大幅に低下させた（図６）。これらの結果は、Ｍ１５３の不活性化またはノックダウンを伴うＭＹＸＶが、野生型またはＭ１５３の不活性化を伴わないＭＹＸＶよりも大幅に細胞死を誘導することを示唆する。
【0148】
この結果に基づいて、Ｍ１５３ＫＯウイルスが免疫原性細胞死（ＩＣＤ）と呼ばれる特定のタイプの細胞死を誘発する可能性を評価して、癌細胞においてＩＣＤを誘発する腫瘍溶解性ベクターとしてのＭ１５３ＫＯ ＭＹＸＶの可能性を決定した。免疫系（例えば、適応免疫系）を刺激することができるＩＣＤの誘導を示すことができるインビトロでのさまざまな特徴がある。この場合、２つのシグナル、細胞外環境へのＡＴＰの放出、および細胞表面でのカルレティキュリンの発現または外部発現がこの研究の焦点であった。
【0149】
死滅しつつある細胞からのＡＴＰの放出は、ＩＣＤを示し得る。ｗｔ ＭＹＸＶの感染後に観察されたＡＴＰ放出は、ネガティブコントロールと有意差はなかった。一方、Ｍ１５３ＫＯ ＭＹＸＶ感染後に放出されるＡＴＰの量は、未処理の細胞よりも多く、ｗｔ ＭＹＸＶに感染した細胞よりも最大で約４倍高かった（例えば、図７Ａを参照、感染後１０時間のピーク値）。Ｍ１５３ＫＯ ＭＹＸＶ感染のピーク結果は、薬物誘発陽性対照（ドキソルビシン）で得られたピーク値と同様であったが、しかしこれはより後においてであった（図７Ａ、感染後６～１０時間の結果を参照）。したがって、Ｍ１５３の不活性化またはノックダウンを伴うＭＹＸＶは、ｗｔ ＭＹＸＶと比較して、またはＭ１５３の不活性化またはノックダウンを伴わないＭＹＸＶと比較して、優れた腫瘍溶解特性を有する。特に、Ｍ１５３の不活性化またはノックダウンを伴うＭＹＸＶは、Ｍ１５３の不活性化またはノックダウンを伴わないＭＹＸＶまたはＷＴＭＹＸＶよりも大きな程度で免疫原性細胞死を誘導する。
【0150】
カルレティキュリンは、通常、小胞体内で発現されるが、ＩＣＤが起こっている場合、それは細胞表面で発現され得る（外部発現）。カルレティキュリンの外部発現は、共焦点顕微鏡を使用して評価され、各細胞を表す核染色（ＤＡＰＩ）のシグナルごとに観察されたカルレティキュリンのシグナルの比率を使用して定量化した。この場合、Ｍ１３５ＫＯ ＭＹＸＶは、親ＭＹＸＶによって引き起こされる細胞殺傷を変化させず、この点でｗｔ ＭＹＸＶと同様に動作する、無関係のウイルス遺伝子（Ｍ１３５）に遺伝子ノックアウト病変を有する非武装ウイルスの代表として使用した。Ｍ１３５ＫＯ ＭＹＸＶ感染細胞またはドキソルビシン処理細胞よりもＭ１５３ＫＯＭＹＸＶ感染細胞で高いカルレティキュリンの外部発現の誘導（図７Ｂ）。
【0151】
全体として、これらの結果は、Ｍ１５３ＫＯ ＭＹＸＶがインビトロでＢ１６Ｆ１０細胞においてＩＣＤの特徴を誘導することができ、そしてインビボで使用される場合に免疫系（例えば、適応免疫系）を誘導し得ることを示した。したがって、Ｍ１５３の不活性化またはノックダウンを伴うＭＹＸＶは、黒色腫または癌細胞でＩＣＤを誘発する。Ｍ１５３の不活性化またはノックダウンを伴うＭＹＸＶもまた、免疫系（適応免疫系など）を刺激することができる。
【0152】
実施例５－Ｍ１５３ＫＯＭＹＸＶを使用したインビボの結果
さらに、インビトロ研究に使用されたのと同じマウス癌細胞株、Ｂ１６Ｆ１０を使用して、同系の転移性黒色腫マウスモデルを用いて研究を実施した。この場合、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＢ１６Ｆ１０細胞を尾静脈に静脈内注射して播種し、肺において分散した転移性黒色腫病変を誘発した。黒色腫細胞の移植の３日後、マウスを２×１０７ｆｆｕのＭ１５３ＫＯ ＭＹＸＶまたは生理食塩水対照を用いる眼窩後部への静脈内注射を介して治療した。 Ｍ１５３ＫＯウイルスの１回投与で治療されたマウスは、転移性疾患の兆候が少なく、対照マウスよりも長く生存した（図８）。Ｍ１３５ＫＯ ＭＹＸＶは、ウサギの病因に関与する無関係のウイルス遺伝子の遺伝子ノックアウトを含み、Ｍ１５３ＫＯの非存在下でウイルスによって引き起こされる何らかの腫瘍溶解効果を測定するためのコントロールとしてここで使用する。このモデルにおいては、Ｍ１５３ＫＯウイルスは、未処理の対照マウスと比較して有意に長期の生存を提供したが、Ｍ１３５ＫＯウイルスは提供しなかった。
さらに、インビトロ研究に使用されたのと同じマウス癌細胞株、Ｂ１６Ｆ１０を使用して、同系の転移性黒色腫マウスモデルを用いて研究を実施した。この場合、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＢ１６Ｆ１０細胞を尾静脈に静脈内注射して播種し、肺において分散した転移性黒色腫病変を誘発した。黒色腫細胞の移植の３日後、マウスを２×１０７ｆｆｕのＭ１５３ＫＯ ＭＹＸＶまたは生理食塩水対照を用いる眼窩後部への静脈内注射を介して治療した。 Ｍ１５３ＫＯウイルスの１回投与で治療されたマウスは、転移性疾患の兆候が少なく、対照マウスよりも長く生存した（図８）。Ｍ１３５ＫＯ ＭＹＸＶは、ウサギの病因に関与する無関係のウイルス遺伝子の遺伝子ノックアウトを含み、Ｍ１５３ＫＯの非存在下でウイルスによって引き起こされる何らかの腫瘍溶解効果を測定するためのコントロールとしてここで使用する。このモデルにおいては、Ｍ１５３ＫＯウイルスは、未処理の対照マウスと比較して有意に長期の生存を提供したが、Ｍ１３５ＫＯウイルスは提供しなかった。
【0153】
これらの結果は、Ｍ１５３ＫＯ ＭＹＸＶが、インタクトなＭ１５３遺伝子を有する親ＭＹＸＶと比較して、またはｗｔ ＭＹＸＶと比較して、優れた抗癌効果を有する腫瘍溶解性ベクタープラットフォームとして使用できることを示す。したがって、Ｍ１５３の不活性化またはノックダウンを伴うＭＹＸＶは、癌（例えば、黒色腫）を有する対象の生存を延長する。癌または黒色腫は転移性である可能性がある。Ｍ１５３ノックアウトで治療されたマウスは、対照群よりも生存率および生存期間の有意な改善を示した。
【0154】
実施例６－感染細胞による導入遺伝子の発現
この実施例は、本開示の粘液腫ウイルスに感染した細胞がＴＮＦ、デコリン、およびＩＬ－１２を分泌することを実証し、さらに、分泌されたＴＮＦおよびＩＬ－１２が生物学的活性を有することを実証する。
この実施例は、本開示の粘液腫ウイルスに感染した細胞がＴＮＦ、デコリン、およびＩＬ－１２を分泌することを実証し、さらに、分泌されたＴＮＦおよびＩＬ－１２が生物学的活性を有することを実証する。
【0155】
ベロ細胞を、それぞれＭＯＩが１である、ｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅ（ヒトＴｒｉｐｌｅレッドおよびヒトＴｒｉｐｌｅホワイト）、マウスＴｒｉｐｌｅ ＩＬ１２低、マウスＴｒｉｐｌｅ ＩＬ－１２高に感染させた。対照として、細胞を、サイトカインをコードせず、インタクトなＭ１５３遺伝子を含んでいるｖＭｙｘ－ＧＦＰに感染させた。２４時間後、上清を採取し、ＥＬＩＳＡアッセイを実施して、上清中の各サイトカインの濃度を決定した（図９Ａ～９Ｄ）。結果は、さまざまなｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅウイルスに感染した細胞がＴＮＦ（図９Ａ）、デコリン（図９Ｂ）、およびＩＬ－１２（図９Ｃ－ヒトＩＬ－１２、図９Ｄ－マウスＩＬ－１２）を分泌することを示す。対照的に、サイトカインは、モック感染細胞、またはｖＭｙｘ－ＧＦＰに感染した細胞では検出されなかった。マウスＴｒｉｐｌｅ ＩＬ－１２高による感染は、マウスＴｒｉｐｌｅＩＬ－１２低による感染よりもマウスＩＬ－１２のより発現を誘発することが示された。
【0156】
感染細胞によって分泌されたＴＮＦが生物学的に活性であるかどうかを試験するために、感受性ＴＮＦであり、生物学的に活性なＴＮＦへの十分な曝露で生存能力を失うＬ９２９細胞を利用してアッセイを行った。Ｌ２９２細胞は、示されたウイルスに感染したベロ細胞からの上清に曝露した。図１０Ａに示すように、さまざまなｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅウイルスに感染した細胞は、生物学的に活性なＴＮＦを生成するが、ｖＭｙｘ－ＧＦＰに感染した細胞は生成しない。これらの結果は、ＴＮＦをコードする本開示のＭＹＸＶが生物学的に活性なＴＮＦの発現を誘発し得ることを示す。
【0157】
感染細胞によって分泌されたＩＬ－１２が生物学的に活性であるかどうかを試験するために、ＨＥＫ Ｂｌｕｅ ＩＬ－１２レポーターアッセイを実施した。ＨＥＫ Ｂｌｕｅ ＩＬ－１２細胞は、生物学的に活性なＩＬ－１２に応答してレポーター遺伝子を発現し、比色アッセイを使用してレポーター遺伝子を検出できる。図１０Ｂに示すように、ｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅウイルスに感染したベロ細胞からの上清はレポーター遺伝子の発現を誘発したが、ｖＭｙｘ－ＧＦＰに感染した細胞からの上清を含む対照は誘発しなかった。これらの結果は、ＩＬ－１２をコードする本開示のＭＹＸＶが生物学的に活性なＩＬ－１２の発現を誘発できることを示す。
【0158】
実施例７－ｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅによるインビトロでの癌細胞株の増殖の阻害
複数の癌細胞株の増殖を阻害するｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅの能力をインビトロで評価した。細胞は、細胞あたり０．１、１、または１０のフォーカス形成単位（ＦＦＵ）の感染多重度（ＭＯＩ）で感染した。７２時間のインキュベーション後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙを使用して細胞生存率をテストし、平均増殖阻害を決定した。結果は、ｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅが、さまざまな組織に由来する一定範囲のヒトおよびマウスの癌細胞株の増殖を阻害できることを示した。結果を表２に示す。
複数の癌細胞株の増殖を阻害するｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅの能力をインビトロで評価した。細胞は、細胞あたり０．１、１、または１０のフォーカス形成単位（ＦＦＵ）の感染多重度（ＭＯＩ）で感染した。７２時間のインキュベーション後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙを使用して細胞生存率をテストし、平均増殖阻害を決定した。結果は、ｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅが、さまざまな組織に由来する一定範囲のヒトおよびマウスの癌細胞株の増殖を阻害できることを示した。結果を表２に示す。
【0159】
【表2】
【0160】
癌細胞株の増殖を阻害するｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅの能力をさらに特徴づけるために、インビトロで、１７例のヒト肺癌細胞株を、０．０１ＦＦＵ／細胞から１００ＦＦＵ／細胞の範囲の９つの異なる感染多重度で感染させた。７２時間のインキュベーション後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙを使用して細胞生存率を評価した。ＥＣ５０は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを介した非線形回帰分析を使用したカーブフィットによって決定した、最大成長阻害の５０％を達成したＭＯＩとして、各細胞株について計算した。ｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅは、多くのヒト肺がん腫瘍細胞株の阻害を実証し、ＥＣ５０を表３に示した。
【0161】
【表3】
【0162】
インビトロで癌細胞株の増殖を阻害するｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅの能力をさらに特徴づけるために、８例のヒト肉腫細胞株を、０．０１ＦＦＵ／細胞から１００ＦＦＵ／細胞の範囲の９つの異なる感染多重度で感染させた。７２時間のインキュベーション後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙを使用して細胞生存率を評価した。ＥＣ５０は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを介した非線形回帰分析を使用したカーブフィットによって決定された、最大成長阻害の５０％を達成したＭＯＩとして、各細胞株について計算した。ｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅは、多くのヒト肉腫細胞株の阻害を実証し、ＥＣ５０を表４に示した。
【0163】
【表4】
【0164】
実施例８－ｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅによるエキソビボでのヒト急性骨髄性白血病サンプルの阻害
患者からのヒト癌細胞を殺傷するためのｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅの能力を試験した。ヒト患者からの急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）サンプルは、０．０１ＦＦＵ／細胞から１００ＦＦＵ／細胞の範囲の６つの異なる感染多重度（ＭＯＩ）で、ｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅまたは親ウイルスｖＭｙｘ－ＧＦＰにエキソビボで曝露された。６日間の連続培養でのインキュベーション後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙを使用して細胞生存率をテストした。ＩＣ５０は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを介した非線形回帰分析を使用したカーブフィットによって決定された、最大成長阻害の５０％を達成したＭＯＩとして、各サンプルについて計算した。
患者からのヒト癌細胞を殺傷するためのｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅの能力を試験した。ヒト患者からの急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）サンプルは、０．０１ＦＦＵ／細胞から１００ＦＦＵ／細胞の範囲の６つの異なる感染多重度（ＭＯＩ）で、ｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅまたは親ウイルスｖＭｙｘ－ＧＦＰにエキソビボで曝露された。６日間の連続培養でのインキュベーション後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙを使用して細胞生存率をテストした。ＩＣ５０は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを介した非線形回帰分析を使用したカーブフィットによって決定された、最大成長阻害の５０％を達成したＭＯＩとして、各サンプルについて計算した。
【0165】
図１１Ａに示すように、親ウイルスに曝露された３つのサンプルのうちの２つについてはＩＣ５０を計算できなかったが、他のサンプルについては１９６６０のＩＣ５０が計算された。図１１Ｂに示すように、ｖＭｙｘ－ＴｒｉｐｌｅはヒトＡＭＬサンプルの優れた阻害を示し、ＩＣ５０は４．２０３、６．５２４、および１０．２５と計算された。結果は、ｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅがヒト癌患者からの癌細胞の増殖を阻害でき、ＴＮＦ、デコリン、ＩＬ－１２を欠き、インタクトな野生型Ｍ１５３遺伝子を含む親ウイルスと比較して優れた抗癌効果を示すことを示す。
【0166】
実施例９－ＭＹＸＶに感染したＰＢＭＣによるサイトカイン産生
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）によるサイトカイン産生を誘発するｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅの能力を試験した。ヒトＰＢＭＣは、それぞれＭＯＩが１０のＭＹＸＶに感染させた。使用したＭＹＸＶは、ｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅ（「ヒトＴｒｉｐｌｅ」）、親ウイルスｖＭｙｘ－ＧＦＰ（「親ＭＹＸＶ」）、ｖＭｙｘ－ｈＴＮＦａ－ＧＦＰ（「ＴＮＦ単独」）、および細胞表面でＴＮＦを発現するＭＹＸＶ（「膜結合ＴＮＦ」）であった。細胞表面でＴＮＦを発現するＭＹＸＶは、配列番号４５のＴＮＦαをコードし、これは、膜に結合したままである変更されたＴＮＦα配列を含む。
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）によるサイトカイン産生を誘発するｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅの能力を試験した。ヒトＰＢＭＣは、それぞれＭＯＩが１０のＭＹＸＶに感染させた。使用したＭＹＸＶは、ｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅ（「ヒトＴｒｉｐｌｅ」）、親ウイルスｖＭｙｘ－ＧＦＰ（「親ＭＹＸＶ」）、ｖＭｙｘ－ｈＴＮＦａ－ＧＦＰ（「ＴＮＦ単独」）、および細胞表面でＴＮＦを発現するＭＹＸＶ（「膜結合ＴＮＦ」）であった。細胞表面でＴＮＦを発現するＭＹＸＶは、配列番号４５のＴＮＦαをコードし、これは、膜に結合したままである変更されたＴＮＦα配列を含む。
【0167】
未処理のＰＢＭＣを陰性対照として使用し、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８共刺激によって活性化されたＰＢＭＣを陽性対照として使用した。感染後４時間および１６時間で、上清を採取し、ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）Ｕ－Ｐｌｅｘ６－アッセイ ９６－ウェルＳＥＣＴＯＲプレートを使用して、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２、ＩＬ－４、およびＴＮＦαの濃度を分析した。図１２Ａは、感染後４時間での上清中のサイトカインの平均（＋／－ＳＤ）濃度を示しているのに対し、図１２Ｂは、感染後１６時間での上清中のサイトカインの平均（＋／－ＳＤ）濃度を示す。バーが存在しない場合、これはサイトカインレベルがアッセイの検出限界を下回っていたことを示す。
【0168】
結果は、ｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅウイルスが、ＩＬ－１２およびＴＮＦαを含むヒトＰＢＭＣによるサイトカインの産生を誘発することを実証する。ｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅの感染に応答して観察されたＩＬ－１２のレベルは、他のウイルスのいずれかで観察されたレベルよりも高かった。さらに、特に感染後４時間で、ｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅウイルスに応答して、より高いレベルのＩＦＮ－γが観察された。
【0169】
実施例１０－ヒト異種移植腫瘍モデルにおけるｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅの抗癌活性
インビボでヒト腫瘍の増殖を阻害するｖＭＹＸ Ｔｒｉｐｌｅの能力を、異種移植モデルで試験した。ヒト癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ１９７１（肺癌）、Ａ６７３（肉腫）、およびＳＪＳＡ－１（肉腫）を、免疫不全マウス（ＮＣＩ－Ｈ１９７５およびＳＪＳＡ－１の場合は無胸腺ヌードマウス、Ａ６７３の場合はＣＤ１７．ＳＣＩＤマウス）の脇腹に、マウス当たり５００万個の腫瘍細胞を皮下移植した。担癌動物は、平均腫瘍体積が１００～１５０ｍｍ３である群あたり７～８匹の動物の治療群にランダム化された。動物は、１×１０７フォーカス形成単位（ＦＦＵ）または２×１０７ＦＦＵの用量でｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅの腫瘍内注射で処理された。用量は、週に１回（ＱＷ）、４日に１回（Ｑ４Ｄ）、または２日に１回（Ｑ２Ｄ）投与した。腫瘍体積および体重を週に３回測定した。
インビボでヒト腫瘍の増殖を阻害するｖＭＹＸ Ｔｒｉｐｌｅの能力を、異種移植モデルで試験した。ヒト癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ１９７１（肺癌）、Ａ６７３（肉腫）、およびＳＪＳＡ－１（肉腫）を、免疫不全マウス（ＮＣＩ－Ｈ１９７５およびＳＪＳＡ－１の場合は無胸腺ヌードマウス、Ａ６７３の場合はＣＤ１７．ＳＣＩＤマウス）の脇腹に、マウス当たり５００万個の腫瘍細胞を皮下移植した。担癌動物は、平均腫瘍体積が１００～１５０ｍｍ３である群あたり７～８匹の動物の治療群にランダム化された。動物は、１×１０７フォーカス形成単位（ＦＦＵ）または２×１０７ＦＦＵの用量でｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅの腫瘍内注射で処理された。用量は、週に１回（ＱＷ）、４日に１回（Ｑ４Ｄ）、または２日に１回（Ｑ２Ｄ）投与した。腫瘍体積および体重を週に３回測定した。
【0170】
図１３Ａは、経時的なＮＣＩ－Ｈ１９７１（肺癌）異種移植腫瘍の体積をプロットし、このモデルにおいて、ｖＭＹＸＴｒｉｐｌｅの腫瘍内注射が用量依存的に腫瘍増殖を阻害することを示す。
【0171】
図１３Ｂは、経時的なＡ６７３（肉腫）異種移植腫瘍の体積をプロットし、ｖＭＹＸＴｒｉｐｌｅをより頻繁に投与すると、このモデルにおいて腫瘍増殖のより大きな阻害がもたらされることを示す。
【0172】
図１３Ｃは、経時的なＳＪＳＡ－１（肉腫）異種移植腫瘍の体積をプロットし、ｖＭＹＸＴｒｉｐｌｅをより頻繁に投与すると、このモデルにおいて腫瘍増殖のより大きな阻害がもたらされることを示す。
【0173】
これらの結果は、ｖＭＹＸ－Ｔｒｉｐｌｅが、免疫不全宿主の状況においてさえ、インビボでヒト腫瘍の増殖を阻害できることを実証する。
【0174】
実施例１１－ヒト異種移植腫瘍モデルにおけるＩＬ－１２およびＴＮＦαの産生
インビボでＩＬ－１２およびＴＮＦα産生を誘発するｖＭＹＸ Ｔｒｉｐｌｅの能力を、異種移植片モデルで試験した。ヒト肉腫癌細胞株ＳＪＳＡ－１およびＡ６７３を免疫不全マウス（ＳＪＳＡ－１の場合は無胸腺ヌードマウス、Ａ６７３の場合はＣＤ１７．ＳＣＩＤマウス）の脇腹に皮下移植した。担癌動物は、移植後１日目に２×１０７ＦＦＵのｖＭＹＸＴｒｉｐｌｅの腫瘍内（ＩＴ）または静脈内（ＩＶ）注射によって治療された（群あたりｎ＝３匹の動物）。血清サンプルは、治療の４時間後と２４時間後に収集した。腫瘍は治療の２４時間後に収集し、サイトカイン測定のために処理した。サイトカイン分析は、ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）Ｕ－Ｐｌｅｘ ６－アッセイ ９６－Ｗｅｌｌ ＳＥＣＴＯＲプレートを使用して実行した。
インビボでＩＬ－１２およびＴＮＦα産生を誘発するｖＭＹＸ Ｔｒｉｐｌｅの能力を、異種移植片モデルで試験した。ヒト肉腫癌細胞株ＳＪＳＡ－１およびＡ６７３を免疫不全マウス（ＳＪＳＡ－１の場合は無胸腺ヌードマウス、Ａ６７３の場合はＣＤ１７．ＳＣＩＤマウス）の脇腹に皮下移植した。担癌動物は、移植後１日目に２×１０７ＦＦＵのｖＭＹＸＴｒｉｐｌｅの腫瘍内（ＩＴ）または静脈内（ＩＶ）注射によって治療された（群あたりｎ＝３匹の動物）。血清サンプルは、治療の４時間後と２４時間後に収集した。腫瘍は治療の２４時間後に収集し、サイトカイン測定のために処理した。サイトカイン分析は、ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）Ｕ－Ｐｌｅｘ ６－アッセイ ９６－Ｗｅｌｌ ＳＥＣＴＯＲプレートを使用して実行した。
【0175】
図１４Ａは、ＳＪＳＡ－１腫瘍を有する動物において、治療後４時間および２４時間の血清、ならびに治療後２４時間の腫瘍において検出されたＩＬ－１２およびＴＮＦαの濃度を示す。平均±ＳＤがプロットされる。バーが存在しない場合、分析物のレベルはアッセイの検出限界を下回っていた。
【0176】
図１４Ｂは、Ａ６７３腫瘍を有する動物において、治療後４時間および２４時間の血清、ならびに治療後２４時間の腫瘍において検出されたＩＬ－１２およびＴＮＦαの濃度を示す。平均±ＳＤがプロットされる。バーが存在しない場合、分析物のレベルはアッセイの検出限界を下回っていた。
【0177】
結果は、ｖＭＹＸ Ｔｒｉｐｌｅによる静脈内および腫瘍内治療が、腫瘍内でのＩＬ－１２およびＴＮＦα産生、ならびに循環中のサイトカインのレベルの増加を誘発し得ることを実証する。
【0178】
実施例１２－インビボでのＭ１５３ＫＯ ＭＹＸＶの抗腫瘍効果
この実施例は、ノックアウトされたＭ１５３遺伝子を有するＭＹＸＶによって達成された腫瘍増殖阻害の程度を、野生型Ｍ１５３を発現するＭＹＸＶに対して比較した。両方のＭＹＸＶウイルスには、Ｍ１３５領域とＭ１３６領域との間に挿入されたＴＮＦの発現のための導入遺伝子が含まれていた。
この実施例は、ノックアウトされたＭ１５３遺伝子を有するＭＹＸＶによって達成された腫瘍増殖阻害の程度を、野生型Ｍ１５３を発現するＭＹＸＶに対して比較した。両方のＭＹＸＶウイルスには、Ｍ１３５領域とＭ１３６領域との間に挿入されたＴＮＦの発現のための導入遺伝子が含まれていた。
【0179】
Ｂ１６－Ｆ１０マウス黒色腫細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスに移植した。担癌動物は、平均腫瘍体積が７５～１００ｍｍ３である群あたり８匹の動物の治療群にランダム化された。動物は、ランダム化後１日目および８日目に２×１０７ＦＦＵ／用量の示された粘液腫ウイルスの腫瘍内注射を介して治療された。
【0180】
図１５は、経時的な腫瘍体積をプロットし、Ｍ１５３をノックアウトしたウイルスが、野生型Ｍ１５３を発現するウイルスよりも腫瘍増殖を大幅に阻害したことを示す。
【0181】
実施例１３－ＭＣ３８癌モデルにおけるｖＭＹＸマウスＴｒｉｐｌｅの抗腫瘍効力
ｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅの抗癌効力をＭＣ３８マウスモデルにおいて評価した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＭＣ３８マウス結腸直腸癌細胞を移植した。担癌動物は、平均腫瘍体積が７５～１００ｍｍ３である群あたり８匹の動物の治療群にランダム化された。動物は、２×１０７ＦＦＵ／用量の腫瘍内（ＩＴ）注射を介して、４日に１回、示された粘液腫ウイルスを４回投与して治療した。
ｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅの抗癌効力をＭＣ３８マウスモデルにおいて評価した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＭＣ３８マウス結腸直腸癌細胞を移植した。担癌動物は、平均腫瘍体積が７５～１００ｍｍ３である群あたり８匹の動物の治療群にランダム化された。動物は、２×１０７ＦＦＵ／用量の腫瘍内（ＩＴ）注射を介して、４日に１回、示された粘液腫ウイルスを４回投与して治療した。
【0182】
マウスＴｒｉｐｌｅ低は、比較的低レベルで、ヒトＩＬ－１２ではなくマウスＩＬ－１２を発現するｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅを指す。マウスＴｒｉｐｌｅ高は、ヒトＩＬ－１２ではなくマウスＩＬ－１２を比較的高いレベルで（ＩＬ－１２サブユニットにエラスチンリンカーが結合した単一のポリペプチドとして）発現するｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅを指す。マウスＴｒｉｐｌｅウイルスはまた、ヒトのデコリンおよびＴＮＦも発現し、Ｍ１５３遺伝子をノックアウトする。ＧＦＰはｖＭｙｘ－ＧＦＰを指し、これは、いずれのサイトカインもコードせず、インタクトな野生型Ｍ１５３遺伝子を含む。
【0183】
腫瘍体積測定値は、週に３回記録され、図１６Ａにプロットされている。生存率は図１６Ｂにプロットされている。腫瘍体積が１５００ｍｍ３以上の場合（個々の動物の場合）、または動物が最終的な屠殺のためのＩＡＣＵＣガイドラインを満たした場合、生存エンドポイントが満たされた。
【0184】
これらの結果は、ＭＹＸＶがインビボで腫瘍増殖を阻害できること、およびより高レベルのマウスＩＬ－１２を発現するＭＹＸＶがこのモデルにおいて腫瘍増殖のより大きな阻害を示すことを示す。
【0185】
実施例１４－Ｂ１６－Ｆ１０癌モデルにおけるｖＭＹＸマウスＴｒｉｐｌｅの抗腫瘍効力
マウスＩＬ－１２を発現するｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅの抗癌効力を、Ｂ１６－Ｆ１０マウスモデルで評価した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＢ１６－Ｆ１０マウス黒色腫細胞を移植した。担癌動物は、平均腫瘍体積が７５～１００ｍｍ３である群あたり８匹の動物の治療群にランダム化された。動物は、示された粘液腫ウイルスで、１日目および８日目に２×１０７ＦＦＵ／用量の腫瘍内注射を介して治療された。
マウスＩＬ－１２を発現するｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅの抗癌効力を、Ｂ１６－Ｆ１０マウスモデルで評価した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＢ１６－Ｆ１０マウス黒色腫細胞を移植した。担癌動物は、平均腫瘍体積が７５～１００ｍｍ３である群あたり８匹の動物の治療群にランダム化された。動物は、示された粘液腫ウイルスで、１日目および８日目に２×１０７ＦＦＵ／用量の腫瘍内注射を介して治療された。
【0186】
マウスＴｒｉｐｌｅ低は、比較的低レベルで、ヒトＩＬ－１２ではなくマウスＩＬ－１２を発現するｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅを指す。マウスＴｒｉｐｌｅ高は、比較的高いレベルで、ヒトＩＬ－１２ではなくマウスＩＬ－１２を（ＩＬ－１２サブユニットにエラスチンリンカーが結合した単一のポリペプチドとして）発現するｖＭｙｘ－Ｔｒｉｐｌｅを指す。マウスＴｒｉｐｌｅウイルスはまた、ヒトのデコリンおよびＴＮＦも発現し、Ｍ１５３遺伝子をノックアウトする。ＧＦＰはｖＭｙｘ－ＧＦＰを指し、いずれのサイトカインもコードせず、インタクトなＭ１５３遺伝子を含む。
【0187】
腫瘍体積測定値は、週に３回記録され、１７Ａにプロットされている。生存率は図１７Ｂにプロットされている。腫瘍体積が１５００ｍｍ３以上の場合（個々の動物の場合）、
または動物が最終的な屠殺のためのＩＡＣＵＣガイドラインを満たした場合、生存エンドポイントが満たされた。
または動物が最終的な屠殺のためのＩＡＣＵＣガイドラインを満たした場合、生存エンドポイントが満たされた。
【0188】
結果は、ＭＹＸＶがインビボでの腫瘍増殖を阻害し、生存を増強することができることを示す。高レベルのマウスＩＬ－１２を発現するＭＹＸＶは、このモデルで腫瘍増殖のより大きな阻害を示し、他の２つの粘液腫ウイルスと比較してより大きな生存の利益をもたらした。
【0189】
実施例１５－静脈内投与経路対腫瘍内投与経路による癌治療としてのｖＭＹＸマウスＴｒｉｐｌｅ
ｖＭｙｘマウスＴｒｉｐｌｅの抗腫瘍効力を、静脈内および腫瘍内の投与経路の比較を用いて、マウス同系癌モデルにおいて評価した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにはＢ１６－Ｆ１０メラノーマ細胞を皮下移植し、Ｂａｌｂ／ｃマウスにはＣＴ２６結腸直腸癌細胞を皮下移植した。担癌動物は、平均腫瘍体積が７５～１００ｍｍ３である群あたり８匹の動物の治療群にランダム化された。動物は、腫瘍内（ＩＴ）または静脈内（ＩＶ）注射のマウスＴｒｉｐｌｅ高、比較的高レベルのマウスＩＬ－１２を発現するＭＹＸＶ（ＩＬ－１２サブユニットに結合するエラスチンリンカーを有する単一のポリペプチドとして）を介して治療された。マウスＴｒｉｐｌｅ高はまた、ヒトのデコリンおよびＴＮＦも発現し、Ｍ１５３遺伝子がノックアウトされている。２×１０７フォーカス形成単位（ＦＦＵ）または１×１０８ＦＦＵを、４日ごとに、４回投与した。腫瘍体積の測定値は、週に３回記録された。
ｖＭｙｘマウスＴｒｉｐｌｅの抗腫瘍効力を、静脈内および腫瘍内の投与経路の比較を用いて、マウス同系癌モデルにおいて評価した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにはＢ１６－Ｆ１０メラノーマ細胞を皮下移植し、Ｂａｌｂ／ｃマウスにはＣＴ２６結腸直腸癌細胞を皮下移植した。担癌動物は、平均腫瘍体積が７５～１００ｍｍ３である群あたり８匹の動物の治療群にランダム化された。動物は、腫瘍内（ＩＴ）または静脈内（ＩＶ）注射のマウスＴｒｉｐｌｅ高、比較的高レベルのマウスＩＬ－１２を発現するＭＹＸＶ（ＩＬ－１２サブユニットに結合するエラスチンリンカーを有する単一のポリペプチドとして）を介して治療された。マウスＴｒｉｐｌｅ高はまた、ヒトのデコリンおよびＴＮＦも発現し、Ｍ１５３遺伝子がノックアウトされている。２×１０７フォーカス形成単位（ＦＦＵ）または１×１０８ＦＦＵを、４日ごとに、４回投与した。腫瘍体積の測定値は、週に３回記録された。
【0190】
図１８Ａは、Ｂ１６－Ｆ１０腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスの腫瘍体積を示す。
【0191】
図１８Ｂは、ＣＴ２６腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスの腫瘍体積を示す。
【0192】
マウスＴｒｉｐｌｅ高は、ビヒクル対照と比較して、試験したすべての用量および投与経路で腫瘍増殖を阻害した。Ｂ１６－Ｆ１０モデルにおいて、１回の投与量あたり２×１０７ＦＦＵの腫瘍内注射は、１回の投与量あたり１×１０８または２×１０７ＦＦＵの静脈内投与よりも腫瘍増殖の抑制が大きかった。
【0193】
実施例１６－ｖＭＹＸマウスＴｒｉｐｌｅプラス免疫チェックポイント阻害剤併用療法
Ｂａｌｂ／ｃマウスに、尾静脈への静脈内注射を介してＫ７Ｍ２肉腫細胞を移植した。腫瘍接種後３日目から、動物（群あたりｎ＝１０）を、ｖＭｙｘ－マウスＴｒｉｐｌｅ（低ＩＬ－１２）の２×１０７ＦＦＵ／用量の眼窩後洞への注射により治療した。この粘液腫ウイルスは、ヒトデコリン、ヒトＴＮＦ、および比較的低レベルのマウスＩＬ－１２を発現する。ｖＭｙｘ－マウスＴｒｉｐｌｅ（低ＩＬ－１２）はまたＭ１５３遺伝子がノックアウトされている。ウイルスは４日に１回、４回投与された。一部の群には、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体を１０ｍｇ／ｋｇで、４日に１回、４回腹腔内注射した。
Ｂａｌｂ／ｃマウスに、尾静脈への静脈内注射を介してＫ７Ｍ２肉腫細胞を移植した。腫瘍接種後３日目から、動物（群あたりｎ＝１０）を、ｖＭｙｘ－マウスＴｒｉｐｌｅ（低ＩＬ－１２）の２×１０７ＦＦＵ／用量の眼窩後洞への注射により治療した。この粘液腫ウイルスは、ヒトデコリン、ヒトＴＮＦ、および比較的低レベルのマウスＩＬ－１２を発現する。ｖＭｙｘ－マウスＴｒｉｐｌｅ（低ＩＬ－１２）はまたＭ１５３遺伝子がノックアウトされている。ウイルスは４日に１回、４回投与された。一部の群には、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体を１０ｍｇ／ｋｇで、４日に１回、４回腹腔内注射した。
【0194】
図１９は、群の生存曲線を示す。未治療の対照群のすべての動物は、移植後約８０日までに感染に屈した。移植後１３０日目に、抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－Ｌ１を投与された動物の約３０～４０％が生存し、ｖＭｙｘ－マウスＴｒｉｐｌｅ（低ＩＬ－１２）で治療された動物の５０％超が生存した。また、ｖＭｙｘ－マウスＴｒｉｐｌｅ（低ＩＬ－１２）と抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－Ｌ１のいずれかを併用して治療した動物は、約８０％以上が生存しており、最も高い生存率を示した。
【0195】
これらのデータは、本開示の粘液腫ウイルスが癌を有する対象の生存を改善することができ、免疫チェックポイント阻害剤との併用療法が生存をさらに改善することができることを示す。
【0196】
別の実験において、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＭＣ３８マウス結腸直腸癌細胞を脇腹の皮下に移植した。担癌動物は、平均腫瘍体積が７５～１００ｍｍ３である群あたり８匹の動物の治療群にランダム化された。
【0197】
動物は、ｖＭｙｘ－マウスＴｒｉｐｌｅ（低ＩＬ－１２）を用いて、無作為化後１日目および８日目に２×１０７ ＦＦＵ／用量の腫瘍内注射によって治療された。一部の群には、１０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ－１抗体を、４日に１回、４回腹腔内注射した。腫瘍の体積と体重を週に３回測定した。
【0198】
図２０Ａは、経時的な腫瘍体積をプロットしている。ビヒクル処置対照マウスの腫瘍体積は、実線で結ばれた円で示されている。ｖＭｙｘ－マウスＴｒｉｐｌｅ単独で処理されたマウス（四角）は、抗ＰＤ－１のみで処理されたマウス（破線の円）と同様に、ビヒクルで処理されたコントロールと比較して、腫瘍体積の減少と腫瘍増殖の遅延を示した。腫瘍増殖の最大の阻害は、ｖＭｙｘ－マウスＴｒｉｐｌｅと抗ＰＤ－１（三角形）の両方を投与された群で観察された。
【0199】
図２０Ｂは、群の生存曲線を示す。腫瘍体積と同様に、ｖＭｙｘ－マウスＴｒｉｐｌｅと抗ＰＤ－１の両方を投与された群は、最高の生存プロファイルを示した。
【0200】
これらのデータは、本開示の粘液腫ウイルスが腫瘍増殖を阻害し、癌を有する対象の生存を増強することができ、免疫チェックポイント阻害剤との併用療法が相乗効果を有することができることを示す。
【0201】
追加の配列
本明細書に記載の組成物および方法に対応する例示的な配列を表５に示す。
本明細書に記載の組成物および方法に対応する例示的な配列を表５に示す。
【0202】
【表5】
【0203】
本発明の好ましい実施形態が本明細書に示され、説明されてきたが、そのような実施形態が単なる例として提供されることは当業者には明らかであろう。多数の変形、変更、および置換が、本発明から逸脱することなく、当業者に今や起こるであろう。本明細書に記載の本発明の実施形態に対する様々な代替案が、本発明を実施する際に使用され得ることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法および構造、ならびにそれらの同等物は、それによってカバーされることが意図されている。
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図10A】
【図10B】
【図11A】
【図11B】
【図12A】
【図12B】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図14A】
【図14B】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18A】
【図18B】
【図19】
【図20A】
【図20B】
【国際調査報告】