▶ ザ、トラスティーズ オブ プリンストン ユニバーシティの特許一覧
特表2022-546559櫛形ポリマーおよびブロックコポリマーで安定化された、核酸および他の可溶性親水性化合物を封入するナノ粒子
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-11-04
(54)【発明の名称】櫛形ポリマーおよびブロックコポリマーで安定化された、核酸および他の可溶性親水性化合物を封入するナノ粒子
(51)【国際特許分類】
A61K 9/51 20060101AFI20221027BHJP
A61K 47/36 20060101ALI20221027BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20221027BHJP
【ＦＩ】
A61K9/51
A61K47/36
A61K31/7088
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022514218
(86)(22)【出願日】2020-09-02
(85)【翻訳文提出日】2022-04-28
(86)【国際出願番号】 US2020048986
(87)【国際公開番号】W WO2021046078
(87)【国際公開日】2021-03-11
(31)【優先権主張番号】62/895,695
(32)【優先日】2019-09-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．プルロニック
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】591003552
【氏名又は名称】ザ、トラスティーズ オブ プリンストン ユニバーシティ
(74)【代理人】
【識別番号】110000659
【氏名又は名称】弁理士法人広江アソシエイツ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ペイゲルス，ロバート，エフ．
(72)【発明者】
【氏名】マークウォルター，チェスター，イー．
(72)【発明者】
【氏名】プリュードム，ロバート，ケー．
【テーマコード（参考）】
4C076
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA65
4C076EE30
4C076FF36
4C076GG21
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA38
4C086NA03
(57)【要約】
水溶性材料を含有する親水性コアおよび疎水性シェルを有するナノ粒子を形成するための沈殿経路が記載される。このプロセスは、より極性の高い領域およびより非極性の領域から構成される安定化ポリマーを必要とする。これらの領域は、直鎖状ブロックコポリマーとして配置されるか、または直鎖状もしくは分岐鎖状の極性骨格と、非極性側鎖もしくは置換基とを有する櫛形ポリマーとして配置され得る。ＤＮＡおよびＲＮＡを含む核酸、ならびにタンパク質、ペプチド、および多糖、または組み合わせを、ナノ粒子コア中に封入できる。核酸の封入は、塩基で酸を部分的または完全に中和して、プロセス溶媒流における核酸の溶解度を高めることを必要とし得る。結果として得られるナノ粒子のコアまたはシェルを架橋できる。ナノ粒子は、水中に入れるために追加のポリマーでコーティングされてもよいし、処理してマイクロ粒子またはより大きなモノリスにされてもよい。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
櫛形ポリマーによって安定化された親水性コアを含むナノ粒子であって、前記櫛形ポリマーの親水性部分が前記ナノ粒子の中心に向かって配向される、ナノ粒子。
【請求項2】
前記ナノ粒子が架橋されていないか、前記親水性コアの少なくとも一部が架橋されているか、または前記櫛形ポリマーの疎水性部分が架橋されている、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項3】
前記コポリマーの前記親水性部分が非イオン性ポリマーを含む、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項4】
前記親水性部分の非イオン性コポリマーが多糖である、請求項３に記載のナノ粒子。
【請求項5】
前記親水性コアが、水溶性小分子、タンパク質、ペプチド、核酸、多糖、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項6】
前記核酸がＲＮＡまたはＤＮＡである、請求項５に記載のナノ粒子。
【請求項7】
ナノ粒子を製造するための方法であって、親水性部分および疎水性部分を有する安定化ポリマーを、第１のプロセス溶媒を有する極性溶媒流に溶解させることによって、第１のプロセス溶液を形成するステップと、
前記第１のプロセス溶媒または異なる極性溶媒であり得る極性溶媒に親水性活性物質を溶解させることによって、第２のプロセス溶液を形成するステップと、
前記親水性活性物質、安定化ポリマー、および溶媒を単数または複数の非プロセス流と組み合わせるステップであって、前記単数または複数の非プロセス流が、前記第１または第２のプロセス溶媒流において使用される前記溶媒よりも非極性である追加の溶媒を含有する、前記組み合わせるステップと、
前記親水性活性物質を沈殿させて親水性コアを形成するステップと、
前記安定化ポリマーの前記親水性部分を前記親水性コア上に沈殿させ、前記疎水性部分に前記コアを安定化させるステップとを含み、
前記安定化ポリマーは、ブロックコポリマーまたは櫛形ポリマーである、方法。
【請求項8】
前記親水性活性物質が、別個の極性プロセス溶媒に添加され、前記２つのプロセス溶媒流および前記非プロセス溶媒流が、連続流条件下で、制限された混合体積内で迅速にマイクロ混合される、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記別個の極性プロセス溶媒が前記溶媒と同じである、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記親水性活性物質が前記溶媒に添加される、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記親水性活性物質が核酸である、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記核酸が核酸塩である、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記核酸が、前記極性プロセス溶媒に添加される前に中和塩基と組み合わされる、請求項１１に記載の方法。
【請求項14】
ブロックコポリマーまたは櫛形ポリマーによって安定化された親水性コアを含むナノ粒子であって、前記親水性コアは核酸を含む、ナノ粒子。
【請求項15】
ナノ粒子を製造するための方法であって、親水性部分および疎水性部分を有する安定化ポリマーを極性溶媒流に溶解させることによってプロセス溶液を形成するステップであって、前記極性溶媒流が前記貧溶媒流よりも極性の高い溶媒を含有する、前記形成するステップと、
核酸を中和塩基に導入するステップと、
前記中和された核酸、安定化ポリマー、および溶媒を非プロセス流と組み合わせるステップであって、前記非プロセス流が、前記安定化ポリマーよりも非極性である追加の溶媒を含有する、前記組み合わせるステップと、
前記親水性活性物質を沈殿させて親水性コアを形成するステップと、
前記安定化ポリマーの前記親水性部分を前記親水性コア上に沈殿させ、前記疎水性部分に前記コアを安定化させるステップとを含み、
前記安定化ポリマーは、ブロックコポリマーまたは櫛形ポリマーである、方法。
【請求項16】
ナノ粒子を製造するための方法であって、親水性活性物質と、親水性部分および疎水性部分を有する安定化ポリマーとを、プロセス溶媒を有する極性溶媒流に溶解させることによって、第１のプロセス溶液を形成するステップと、
前記親水性活性物質、安定化ポリマー、および溶媒を単数または複数の非プロセス流と組み合わせるステップであって、前記単数または複数の非プロセス流が、前記プロセス溶媒流において使用される前記溶媒よりも非極性である追加の溶媒を含有する、前記組み合わせるステップと、
前記親水性活性物質を沈殿させて親水性コアを形成するステップと、
前記安定化ポリマーの前記親水性部分を前記親水性コア上に沈殿させ、前記疎水性部分に前記コアを安定化させるステップとを含み、
前記安定化ポリマーは、ブロックコポリマーまたは櫛形ポリマーである、方法。
【請求項17】
前記親水性活性物質が、別個の極性プロセス溶媒に添加され、前記２つのプロセス溶媒流および前記非プロセス溶媒流が、連続流条件下で、制限された混合体積内で迅速にマイクロ混合される、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記別個の極性プロセス溶媒が前記溶媒と同じである、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記親水性活性物質が前記溶媒に添加される、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記親水性活性物質が核酸である、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記核酸が核酸塩である、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記核酸が、前記極性プロセス溶媒に添加される前に中和塩基と組み合わされる、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、本明細書においてその全体が引用により援用される２０１９年９月４日に提出された米国仮特許出願第６２／８９５，６９５号に対する優先権を主張するものである。
本出願は、本明細書においてその全体が引用により援用される２０１９年９月４日に提出された米国仮特許出願第６２／８９５，６９５号に対する優先権を主張するものである。
【0002】
発明の分野
本発明は、ブロックコポリマーまたは櫛形ポリマーによって安定化された核酸から構成される親水性コアを有するナノ粒子を形成するプロセスと、それらのナノ粒子のその後の処理と、それらの組成物とに関する。本発明は、櫛形ポリマーによって安定化された親水性コアを有するナノ粒子を形成するプロセスと、それらのナノ粒子のその後の処理と、それらの組成物とに関する。
本発明は、ブロックコポリマーまたは櫛形ポリマーによって安定化された核酸から構成される親水性コアを有するナノ粒子を形成するプロセスと、それらのナノ粒子のその後の処理と、それらの組成物とに関する。本発明は、櫛形ポリマーによって安定化された親水性コアを有するナノ粒子を形成するプロセスと、それらのナノ粒子のその後の処理と、それらの組成物とに関する。
【背景技術】
【0003】
タンパク質、ペプチド、リボ核酸（ＲＮＡ：ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ：ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、および多糖を含む生物製剤は、高い効力および特異性を有するため、重要なクラスの医薬品である。しかし、それらはどのように患者に送達され得るかが制限される。ほとんどの生物製剤は、経口的に生体利用可能ではなく、非経口投与を必要とする。ペプチドおよび核酸を含むいくつかの生物製剤は、短い半減期を有し、それぞれプロテアーゼおよびＲＮａｓｅまたはＤＮａｓｅによって迅速に分解されて迅速に除去される。核酸およびその他の生物製剤は、免疫系にも認識されて除去され得る。生物製剤のさらなる制限は、それらが高い水溶解度を有するために細胞膜の透過が妨げられることである。したがって、ほとんどの生物学的治療薬は、細胞外受容体を標的とすることに限定されてきた。これらの理由から、生物学的形態の分解を保護し、半減期を延長し、注射の頻度を低減し、かつ／または細胞内送達を可能にするナノキャリアおよびマイクロキャリアを含む送達媒体が必要とされている。
【0004】
本明細書においてその全体が援用される国際公開特許の特許文献１および特許文献２は、ナノ粒子およびマイクロ粒子中に生物製剤を含む親水性化合物を封入するための方法を提示した。この発明は「逆フラッシュナノ沈殿」（ｉＦＮＰ：ｉｎｖｅｒｓｅ Ｆｌａｓｈ ＮａｎｏＰｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）と名付けられた。ｉＦＮＰプロセスにおいて、生物製剤および安定化ブロックコポリマーなどの親水性活性剤は極性溶媒流に溶解されており、それが非極性非溶媒流と迅速に混合される。混合の際に親水性活性物質が沈殿し、ナノ粒子コアを形成する。安定化ポリマーの親水性ブロック（単数または複数）はナノ粒子表面に付着し、安定化ポリマーの疎水性ブロック（単数または複数）は外部水相に面する。
【0005】
現在まで、ｉＦＮＰによるＲＮＡを含む核酸の封入は実証されていない。ここで本発明者らは、以前に記載されたものと同じ十分に規定されたブロックコポリマー安定剤によってＲＮＡを封入するためにｉＦＮＰを使用できることを示す。ｉＦＮＰプロセスにおいて一般的に使用されるブロックコポリマーはアニオン性の（負に帯電した）セクションを含み、これは負に帯電した核酸との好ましくない相互作用を有することが予期されたため、このことは予想外であった。加えて本発明者らは、ｉＦＮＰにおいて以前に使用されたことがない新しいクラスの安定剤である櫛形ポリマーを導入し、それらがＲＮＡおよび他の生物製剤を封入するために使用され得ることを示す。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】国際公開第２０１７／１１２８２８（Ａ１）号
【特許文献2】国際公開第２０１５／２０００５４号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明において、本発明者らは、ブロックコポリマーまたは櫛形ポリマーによって安定化された親水性コアを含むナノ粒子を記載する。これらのナノ粒子は、サイズが約１０ｎｍ～約５０００ｎｍの範囲であり得る。本発明の実施形態では、親水性コアは、水溶性小分子、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む核酸、ならびに／または多糖（親水性「薬剤」または「活性物質」または「治療薬」または「生物製剤」とも呼ばれる）を含み得る。
【0008】
本発明の実施形態において、親水性コアはＲＮＡおよび／またはＤＮＡを含む核酸を含み、ナノ粒子は、１つ以上の極性（親水性）ブロックおよび１つ以上の非極性（疎水性）ブロックから構成される直鎖状ブロックコポリマーによって安定化される。この実施形態では、極性ブロックは安定化ポリマーを粒子の親水性コアに固定し、非極性ブロックは外部に面して、非極性または低極性溶媒相中の立体安定性を提供する。
【0009】
本発明の別の実施形態において、親水性コアは、水溶性小分子、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む核酸、ならびに／または多糖を含み得る。水溶性活性物質は、０．０１ｍｇ／ｍＬを超える水溶解度および／または３未満のｌｏｇＰ値を有し得る。水溶性活性物質は、０．１ｍｇ／ｍＬを超える水溶解度および／または２未満のｌｏｇＰ値を有し得る。水溶性活性物質は、１ｍｇ／ｍＬを超える水溶解度および／または１未満のｌｏｇＰ値を有し得る。一般的に、活性物質の水溶解度は、非プロセス溶媒中での活性物質の溶解度ほど処理にとって重要ではない。活性物質が非極性非プロセス溶媒中で低い溶解度を有することが重要である。たとえば、活性物質は、非プロセス溶媒中で１ｍｇ／ｍＬ未満、０．１ｍｇ／ｍＬ未満、および／または０．０１ｍｇ／ｍＬ未満の溶解度を有し得る。水溶性活性物質の例としては、タンパク質（例、リゾチームおよびオボアルブミン）、ポリペプチド、直鎖状ポリペプチド（例、タンパク質）、環状ポリペプチド（例、バンコマイシン）、分岐鎖状ポリペプチド、グリコシル化ペプチド（例、バンコマイシン）、ならびにその他の生物製剤および非生物学的分子が挙げられる。たとえば、水溶性活性物質は、約１００Ｄａ、２００Ｄａ、５００Ｄａ、１０００Ｄａ、２０００Ｄａ、５０００Ｄａ、１００００Ｄａ、２００００Ｄａ、および４００００Ｄａから約１０００Ｄａ、２０００Ｄａ、５０００Ｄａ、１００００Ｄａ、２００００Ｄａ、４００００Ｄａ、１００ｋＤａ、２００ｋＤａ、５００ｋＤａ、１，０００ｋＤａ、および１０，０００ｋＤａの分子量を有し得る。この実施形態において、安定化ポリマーは、非極性（疎水性）側鎖を有する極性（親水性）骨格から構成される櫛形ポリマーである。親水性骨格は、安定化ポリマーを粒子の親水性コアに固定し、非極性側鎖は外部に面して、立体安定性を提供する。櫛形ポリマーの親水性骨格は、直鎖状または分岐鎖状であってよい。
【0010】
本発明の実施形態において、櫛形ポリマーの親水性骨格は多糖である。たとえば、骨格はセルロース、デキストラン、マルトデキストリン、デキストリン、硫酸デキストラン、硫酸デキストリン、ヒアルロン酸、ペクチン、アミロペクチン、アミロース、プルラン、キシラン、カラギーナン、キチン、キトサン、デンプン、またはこれらの組み合わせもしくは改変形であり得る。本発明の実施形態において、櫛形ポリマーの親水性骨格は、ポリ（アミノ酸）、たとえばポリ（グルタミン酸）、ポリ（アスパラギン酸）、ポリ（リジン）、ポリ（リジン）、ポリ（アルギニン）、ポリ（セリン）、ポリ（スレオニン）、ポリ（グルタミン）、ポリ（アスパラギン）、ポリ（システイン）、またはこれらの組み合わせもしくは改変形などである。本発明の実施形態では、非極性側鎖は、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ：ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ））、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ：ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ－ｃｏ－ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ））、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ：ｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ）、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリ［（カルボキシフェノキシ）プロパン－セバシン酸］、ポリリン酸エステル、ポリエステルアミド、ポリウレタン、ポリビニルアクリレート、ポリ（アミノ酸）、または疎水的に修飾された多糖である。
【0011】
本発明において、本発明者らは、櫛形ポリマーまたは直鎖状ブロックコポリマーによって安定化された親水性コアを含むナノ粒子を作製する方法を記載する。本発明によるプロセス（方法）では、安定化ポリマーをより極性の高い溶媒に溶解してプロセス溶液を形成する。たとえば、極性プロセス溶媒は、水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ：ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ：ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）、メタノール、エタノール、Ｎ－メチル－２－ピロリドン（ＮＭＰ：Ｎ－ｍｅｔｈｙｌ－２－ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ：ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ）、グリコフロール、またはその混合物であり得るが、これらに限定されない。本発明のある反復において、前述の親水性活性物質も安定化ポリマーと共にプロセス溶液中に含まれる。ある実施形態では、塩などの溶質がプロセス溶媒に含まれる。本発明の別の反復において、親水性活性物質は、コポリマープロセス溶液と同じ溶媒から構成されていてもいなくてもよい別個の極性プロセス溶液中に含まれる。本発明のある反復において、親水性活性物質は核酸である。核酸は、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ：ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、ＤＮＡ、またはプラスミドＤＮＡであり得る。核酸の分子量は、約５００Ｄａ、１０００Ｄａ、５０００Ｄａ、および１００００Ｄａから１０５Ｄａ、１０６Ｄａ、１０７Ｄａ、１０８Ｄａ、１０９Ｄａ、１０１０Ｄａ、１０１１Ｄａ、または１０１２Ｄａの範囲であり得る。本発明の方法において、核酸は酸の形態ではない。たとえば、本発明の方法において、核酸は、たとえばナトリウム、リチウム、トリス、アンモニウム、セシウム、カリウム、第４級アミン、第３級アミン、第２級アミン、または第１級アミン塩などのカチオンで部分的または完全に中和される。本発明の方法において、核酸塩の形態は、極性プロセス溶媒中の核酸の溶解度を高めるように改変される。
【0012】
プロセス溶液は、より非極性の溶媒（非プロセス流）と混合される。たとえば、非極性非プロセス溶媒は、クロロホルム、ジクロロメタン（ＤＣＭ：ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、アセトン、酢酸エチル、またはそれらの混合物であり得るが、これらに限定されない。本発明のいくつかの実施形態では、２つ以上の非プロセス流が存在し得る。プロセス流と非プロセス流とを混合するとき、親水性活性物質は急速に沈殿し、ナノ粒子のコアになる。直鎖状ブロックコポリマーの親水性ブロックまたは櫛形ポリマーの親水性骨格は、このナノ粒子コア上に沈殿し、安定化ポリマーの疎水性ブロックまたは分岐部はそれぞれ安定化シェルを形成する。
【0013】
本発明の実施形態において、プロセス溶液および非プロセス溶液は、連続プロセスにおいて迅速に混合される。本明細書で使用されるとき、「迅速に混合する」という用語は、特許文献１、特許文献２、および米国特許第８，１３７，６９９号にさらに記載されているとおり、プロセス溶媒／非プロセス溶媒混合の時間がナノ粒子のアセンブリ時間よりも迅速であることを意味する。たとえば、プロセス溶液（単数または複数）はプロセス流（単数または複数）中に存在することができ、非プロセス溶媒（単数または複数）は非プロセス溶媒流（単数または複数）中に存在できる。プロセス流は、制限された混合体積（ｃｏｎｆｉｎｅｄ ｍｉｘｉｎｇ ｖｏｌｕｍｅ）で非プロセス流と連続的に組み合わされてもよく、かつ／または形成されたナノ粒子は、出口流において制限された混合体積から出ることができる。たとえば、プロセス流および非プロセス流は、拘束衝突噴流ミキサー（Ｃｏｎｆｉｎｅｄ Ｉｍｐｉｎｇｉｎｇ Ｊｅｔ Ｍｉｘｅｒ）またはマルチインレットボルテックスミキサー（Ｍｕｌｔｉ－Ｉｎｌｅｔ Ｖｏｒｔｅｘ Ｍｉｘｅｒ）内で連続的に組み合わされることができ、これはリウ（Ｌｉｕ）、Ｙ．、チェン（Ｃｈｅｎｇ）、Ｃ．、プリュドム（Ｐｒｕｄ’ｈｏｍｍｅ）、Ｒ．Ｋ．、およびフォックス（Ｆｏｘ）、Ｒ．Ｏ．、２００８「フラッシュナノ沈殿のためのマルチインレットボルテックスミキサー（ＭＩＶＭ）内での混合（Ｍｉｘｉｎｇ ｉｎ ａ ｍｕｌｔｉ－ｉｎｌｅｔ ｖｏｒｔｅｘ ｍｉｘｅｒ（ＭＩＶＭ） ｆｏｒ ｆｌａｓｈ ｎａｎｏ－ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）。」ケミカル・エンジニアリング・サイエンス（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、６３（１１）、ｐｐ．２８２９－２８４２；またはジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）、Ｂ．Ｋ．およびプリュドム、Ｒ．Ｋ．、２００３「拘束衝突噴流における化学処理およびマイクロ混合（Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｍｉｘｉｎｇ ｉｎ ｃｏｎｆｉｎｅｄ ｉｍｐｉｎｇｉｎｇ ｊｅｔｓ）。」ＡＩＣｈＥジャーナル（ＡＩＣｈＥ Ｊｏｕｒｎａｌ）、４９（９）、ｐｐ．２２６４－２２８２に記載および定義されるとおりである。
【0014】
本発明の方法において、非プロセス溶媒は、クロロホルム、ジクロロメタン、アルカン、ヘキサン、エーテル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、トルエン、アセトン、グリコフロール、または組み合わせであり得る。たとえば、非プロセス溶媒は、クロロホルム、ジクロロメタン、アセトン、または組み合わせであり得る。たとえば、極性プロセス溶媒および非プロセス溶媒は混和性であり得る。ある実施形態において、プロセス溶媒および非プロセス溶媒は、ナノ粒子形成プロセスにおいて使用される体積比で完全に混和性である。ある実施形態においては、非プロセス溶媒に溶質を添加して、活性物質の沈殿を促進してもよい。代替的には、別の実施形態において、プロセス溶媒は非プロセス溶媒に実質的に可溶性であり、ここで実質的に可溶性とは、ナノ粒子形成プロセスにおいて使用される体積比下でプロセス溶媒の８０体積％が非プロセス溶媒に混和性であることと定義される。
【0015】
本発明の方法において、プロセス溶液と非プロセス溶媒との混合時間は、ナノ粒子のアセンブリ時間未満である。親水性活性物質および安定化ポリマーの親水性領域は、溶液中で１０～１０，０００の範囲の過飽和レベルを有し得る。
【0016】
本発明の方法は、ポリマーの架橋によってナノ粒子コアを安定化させることを含む。たとえば、ナノ粒子はアセンブリ中に架橋され得る。架橋はアセンブリ後に起こり得る。
【0017】
本発明の方法は、ポリマーの架橋によってナノ粒子シェルを安定化させることを含む。たとえば、ナノ粒子はアセンブリ中に架橋され得る。架橋はアセンブリ後に起こり得る。
【0018】
本発明の方法では、ナノ粒子を第２の安定化ポリマーでコーティングして親水性シェルを作製してもよい。ある実施形態では、コーティングポリマーは、１つ以上の親水性ブロックおよび疎水性ブロックから構成されるブロックコポリマーである。ある実施形態では、コーティングポリマーの親水性ブロック（単数または複数）はポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ：ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ））である。
【0019】
本発明の方法では、ナノ粒子を処理してマイクロ粒子を形成してもよい。ある実施形態では、マイクロ粒子は乳化プロセスで形成され得る。別の実施形態において、マイクロ粒子は噴霧乾燥によって形成され得る。所望の機能性を付与するために、ナノ粒子安定剤と同じタイプまたは異なるタイプのポリマーを含めることができる。得られた粉末は、当業者によく知られている技術に従って処理または製剤化されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】ブロックコポリマーによって安定化された活性物質充填逆ナノ粒子を作製するためのプロセスを示す図である。この図にはジブロックコポリマーが示されているが、このプロセスはジブロックに限定されない。
【図2】櫛形ポリマーによって安定化された活性物質充填逆ナノ粒子を作製するためのプロセスを示す図である。この図には直鎖状骨格を有する櫛形ポリマーが示されているが、このプロセスはこの構造に限定されない。
【図3】直鎖状ブロックコポリマー構築物の例を示す図である。
【図4】極性骨格が直鎖状である櫛形コポリマー構築物の例を示す図である。
【図5】極性骨格が分岐鎖状である櫛形コポリマー構築物の例を示す図である。
【図6】ナノ粒子コアはさまざまな方法によって架橋され得ることを示す図である。架橋は、ナノ粒子アセンブリの間または後に起こり得る。ブロックコポリマーおよび櫛形ポリマーで作製されたナノ粒子の両方に対して、コアが架橋され得る。
【図7】ナノ粒子シェルはさまざまな方法によって架橋され得ることを示す図である。架橋は、ナノ粒子アセンブリの間または後に起こり得る。ブロックコポリマーおよび櫛形ポリマーで作製されたナノ粒子の両方に対してシェルが架橋され得るが、この図は櫛形ポリマーで作製された粒子を特定的に示している。
【図8】実施例１のサンプル１Ａ～１Ｄのコア中にＲＮＡを含有するＰＳ－ｂ－ＰＡＡ安定化ナノ粒子の動的光散乱によるサイズ分布を示す図である。
【図9】実施例１のサンプル１Ｅおよび１Ｆの、貧溶媒としてＴＨＦを使用したコア中にＲＮＡを含有するＰＳ－ｂ－ＰＡＡ安定化ナノ粒子の動的光散乱によるサイズ分布を示す図である。
【図10】実施例２の溶媒対照、ＲＮＡ対照、および完全ナノ粒子製剤の水性抽出物の吸光度スペクトルを示す図である。２６０ｎｍにおける吸光度ピークはＲＮＡによるものである。ＰＳ－ｂ－ＰＡＡ安定剤は封入されたＲＮＡの水相への抽出を保護するので、ナノ粒子抽出相はＲＮＡ対照と比較してより低い２６０ｎｍ吸光度を有する。
【図11】実施例３のコア中にＲＮＡを含有するＰＳ－ｂ－ＰＥＧコーティングＰＳ－ｂ－ＰＡＡ安定化ナノ粒子の動的光散乱によるサイズ分布を示す図である。
【図12】ＴＨＦ中および水中処理後の動的光散乱による実施例４のＰＡｓｐ－ｂ－ＰＬＡ－ｂ－ＰＥＧ安定化ＲＮＡナノ粒子のサイズ分布を示す図である。
【図13】ＤＣＭ中での動的光散乱による実施例５のＰＡｓｐ－ｂ－ＰＬＡ安定化ＲＮＡナノ粒子のサイズ分布を示す図である。サンプル５Ａは溶媒流中に５ｖ％の水を有し、サンプル５Ｂは溶媒流中に１０ｖ％の水を有した。
【図14】ＤＣＭ中での動的光散乱による実施例６のＰＡｓｐ－ｂ－ＰＬＡ－ｂ－ＰＡｓｐ安定化ＲＮＡナノ粒子のサイズ分布を示す図である。サンプル６ＡはコアにＨＲＰを有し、サンプル６ＢはＲＮＡを有し、サンプル６ＣはＨＲＰおよびＲＮＡを有する。
【図15】ＰＡｓｐ／ＰＬＡ／ＰＥＧを使用するＲＮＡ製剤のためのミキサー入口流の構成および組成（実施例７）を示す図である。
【図16】表９（実施例７）の製剤によって生成されたクロロホルム中の逆ＮＰを示す図である。
【図17】５ｋＤａのＢＤを充填し、Ｄｅｘ－ＰＬＡによって安定化させた逆ナノ粒子を示す図である。製剤は表１１（実施例９）に与えられている。
【図18】２０ｋＤａのＢＤを充填し、Ｄｅｘ－ＰＬＡによって安定化させた逆ナノ粒子を示す図である。製剤は表１１（実施例９）に与えられている。サンプル９Ｅ、９Ｆ、および９Ｇはブライン抽出後に測定した。
【図19】Ｄｅｘ－ＰＬＡ逆ナノ粒子に封入されたナトリウム－ＲＮＡに対する、アセンブリ直後、ブライン抽出後、沈殿およびＴＨＦ中の再分散後、ならびに水中のＰＬＡ－ｂ－ＰＥＧでのコーティング後（実施例１１）の粒径分布を示す図である。
【図20】Ｄｅｘ－ＰＬＧＡ逆ナノ粒子に封入されたナトリウム－ＲＮＡ（実施例１２）に対する、アセンブリ直後および水中のＰＬＡ－ｂ－ＰＥＧでのコーティング後の粒径分布を示す図である。
【図21】Ｄｅｘ－ＰＬＡ逆ナノ粒子に封入されたリチウム－ＲＮＡ（実施例１３）に対する、アセンブリ直後および水中のＰＬＡ－ｂ－ＰＥＧでのコーティング後の粒径分布を示す図である。
【図22】非プロセス溶媒としてＤＣＭ、酢酸エチル、ＴＨＦ、またはアセトンを使用してＤｅｘ－ＰＬＡ逆ナノ粒子に封入されたポリミキシンＢ（実施例１４）の粒径分布を示す図である。すべてのサイズ測定は、それぞれの非プロセス溶媒中で行った。
【図23】Ｄｅｘ－ＰＬＡ逆ナノ粒子に封入された西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ：ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）（実施例１５）に対する、ＤＣＭ中の逆フラッシュナノ沈殿プロセス後、および水中のＰＬＡ－ｂ－ＰＥＧでのコーティング後の粒径分布を示す図である。
【図24】ＤＣＭ中のＤｅｘ－ＰＬＧＡ逆ナノ粒子に封入されたＲＮＡ（実施例２１）の粒径分布を示す図である。ＲＮＡは、プロセス流中ではナトリウム塩の形態であり、ナノ粒子アセンブリの際にカルシウム塩に転換された。
【図25】ＤＣＭ中のＤｅｘ－ＰＬＧＡ（１０ｋＤａデキストラン、８０重量％ＰＬＧＡ、１６ｋＤａ ＰＬＧＡ側鎖）に封入されたリラグルチド（実施例２２、サンプル２２Ｆ）の粒径分布を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0021】
本発明の実施形態を以下に詳細に考察する。実施形態を説明する際に、明確にするために特定の用語が使用される。しかし、本発明がそのように選択された特定の用語に限定されることは意図されていない。当業者は、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、他の等価の部分を使用でき、他の方法を開発できることを認識するであろう。本明細書に引用されるすべての参考文献は、あたかも各々が個別に組み込まれているかのように引用により援用される。
【0022】
フラッシュナノ沈殿（ＦＮＰ）：フラッシュナノ沈殿（ＦＮＰ）は、成分の高過飽和を達成するために、混和性の溶媒流および貧溶媒流の制限されたジオメトリにおける迅速なマイクロ混合を組み合わせるプロセスである。結果として得られる高過飽和によって、得られるナノ粒子の急速な沈殿および成長がもたらされる。製剤中の安定剤は、ナノ粒子の表面上に蓄積し、所望のサイズで成長を停止させる。このプロセスは、両親媒性コポリマーによってナノ粒子組成物を調製するためのプロセスおよび装置ならびにそれらの使用（Ｐｒｏｃｅｓｓ ａｎｄ ａｐｐａｒａｔｕｓｅｓ ｆｏｒ ｐｒｅｐａｒｉｎｇ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅ）、ＢＫジョンソン、ＲＫプリュドム、米国特許第８，１３７，６９９号、２０１２年に詳細に記載されている。このプロセスは、サアド（Ｓａａｄ）およびプリュドムによる総説においてさらに説明されている。（ダディオ（Ｄ’ａｄｄｉｏ）、Ｓ．Ｍ．；プリュドムＲ．Ｋ．、「急速な沈殿による薬物ナノ粒子形成の制御（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｄｒｕｇ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｙ ｒａｐｉｄ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）。」アドバンスド・ドラッグ・デリバリー・レビューズ（Ａｄｖａｎｃｅｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｒｅｖｉｅｗｓ）２０１１、６３（６）、４１７－４２６；ジョンソンＢ．Ｋ．；プリュドム、Ｒ．Ｋ．、「両親媒性コポリマーによってナノ粒子組成物を調製するためのプロセスおよび装置ならびにそれらの使用（Ｐｒｏｃｅｓｓ ａｎｄ ａｐｐａｒａｔｕｓｅｓ ｆｏｒ ｐｒｅｐａｒｉｎｇ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅ）。」グーグル・パテント（Ｇｏｏｇｌｅ Ｐａｔｅｎｔｓ）：２０１２；サアド、Ｗ．Ｓ．；プリュドム、Ｒ．Ｋ．、「フラッシュナノ沈殿によるナノ粒子形成の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｙ ｆｌａｓｈ ｎａｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）。」ナノ・トゥデイ（Ｎａｎｏ Ｔｏｄａｙ）２０１６、１１（２）、２１２－２２７を参照。）これらの参考文献は、その全体が本出願に含まれる。フラッシュナノ沈殿において、封入された薬剤は疎水性であり、貧溶媒は貧溶媒よりも極性が高い。
【0023】
フラッシュナノ沈殿プロセスは、そのプロセスのための混合体積に入る１つ以上の溶媒流と、混合体積に入る１つ以上の貧溶媒流と、（混合体積から出る）出口流とを有する制限された混合体積を含む。制限された混合体積への入口流の速度は、約０．０１ｍ／ｓ～１００ｍ／ｓ、または約０．１ｍ／ｓ～５０ｍ／ｓ、または約０．１ｍ／ｓ～１０ｍ／ｓであり得る。流れの速度は互いに等しくてもよいし、それらの流れが異なる速度を有していてもよい。速度が等しくない場合、最高流速の速度が規定速度である。
【0024】
逆フラッシュナノ沈殿（ｉＦＮＰ）：逆フラッシュナノ沈殿（ｉＦＮＰ）は、フラッシュナノ沈殿と同じ基本原理に従う。しかし、ｉＦＮＰにおいて、封入された薬剤は親水性であり、貧溶媒は溶媒よりも非極性である。逆フラッシュナノ沈殿プロセスは以下に記載されている。国際公開特許の特許文献２および特許文献１；ペイゲルス（Ｐａｇｅｌｓ）、Ｒ．Ｆ．；プリュドム、Ｒ．Ｋ．、「ペプチド、生物製剤、および可溶性治療薬の送達のためのポリマーナノ粒子およびマイクロ粒子（Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，ａｎｄ ｓｏｌｕｂｌｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）。」ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ）２０１５、ｖｏｌ．２１９、５１９－５３５；ペイゲルス、Ｒ．Ｆ．；プリュドム、Ｒ．Ｋ．、「生物製剤封入のための逆フラッシュナノ沈殿：ナノ粒子形成および有機溶媒中でのイオン安定化（Ｉｎｖｅｒｓｅ Ｆｌａｓｈ ＮａｎｏＰｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ：Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｏｎｉｃ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｏｌｖｅｎｔｓ）。」ＡＣＳシンポジウム・シリーズ（ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ）２０１７、Ｖｏｌ．１２７１、１１章、ｐｐ２４９－２７４；マークウォルター（Ｍａｒｋｗａｌｔｅｒ）、Ｃ．Ｅ．；プリュドム、Ｒ．Ｋ．、「生物製剤封入のための逆フラッシュナノ沈殿：抽出プロトコルによるプロセス損失の理解（Ｉｎｖｅｒｓｅ Ｆｌａｓｈ ＮａｎｏＰｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ：Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｌｏｓｓｅｓ ｖｉａ ａｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）。」ＡＣＳシンポジウム・シリーズ（ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ）２０１７、Ｖｏｌ．１２７１、１２章、ｐｐ２７５－２９６。これらの参考文献は、その全体が本出願に含まれる。場合によっては、逆フラッシュナノ沈殿を指すために単にフラッシュナノ沈殿が使用されることに留意されたい。しかし、封入された材料、プロセス溶媒、および非プロセス溶媒から、フラッシュナノ沈殿または逆フラッシュナノ沈殿のいずれが使用されているのかは明らかなはずである。
【0025】
逆フラッシュナノ沈殿プロセスを使用して、親水性コアおよび／または封入された水溶性薬剤、たとえば親水性ペプチド、タンパク質、および核酸などを有する「逆」粒子を作製し得る（図１および図２）。安定化コポリマーは、少なくとも０．１重量％の濃度で極性プロセス溶媒に溶解でき、第１のプロセス溶液を形成するためのコポリマーの濃度は少なくとも０．２重量％であり得る。ある実施形態では、コポリマーは、約０．１重量％、０．２重量％、０．５重量％、１重量％、２重量％、５重量％、１０重量％、または２０重量％から約０．２重量％、０．５重量％、１重量％、２重量％、５重量％、１０重量％、２０重量％、または４０重量％の範囲の濃度で極性プロセス溶媒に溶解できる。当業者は、プロセスの経済性などの因子が濃度の下限を制約することがあり、プロセス溶液の粘度または極性プロセス溶媒におけるコポリマーの溶解限度などの因子が濃度の上限を制約し得ることを認識するだろう。たとえば、第１のプロセス溶液の粘度が非プロセス溶媒の粘度よりもはるかに大きいときは、第１のプロセス溶液と非プロセス溶媒との混合が抑制されることがある。当業者は、コポリマーの分子量およびコポリマーの組成などの因子が、粘度が高くなりすぎる前にポリマー溶液中で達成され得る最大濃度に影響し得ることを認識するであろう。プロセス溶媒の例としては、水、アルコール、アセトン、アセトニトリル、グリコールエーテル、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド、Ｎ－メチル－２－ピロリドン、およびこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。溶媒中のコポリマーの溶解特性に応じて、ポリマーまたは親水性活性物質の溶解を促進するために、プロセス溶媒を加熱もしくは加圧するか、またはその両方を行うことができる。
【0026】
コポリマーを含有するプロセス溶媒を、たとえばクロロホルム、ジクロロメタン、またはアセトンなどのより極性の低い非プロセス溶媒とマイクロ混合すると、コポリマーの領域または部分の異なる溶解特性が現れ、コポリマーのより極性の高い部分はもはや可溶状態で存在することができなくなるため、「逆」ナノ粒子が沈殿する。
【0027】
ある実施形態では、たとえば親水性ペプチド、タンパク質、またはＤＮＡもしくはＲＮＡなどの核酸などの添加水溶性活性剤を、プロセス溶媒中のコポリマーに添加できる。親水性薬剤の濃度は通常、安定化ポリマーの濃度のオーダー以内である。親水性活性物質の濃度がポリマーの濃度よりもはるかに低いとき、最終的な薬物充填量は低くなる。親水性活性物質の濃度がポリマーの濃度よりもはるかに高いとき、ナノ粒子を安定化するのに十分な安定化ポリマーが存在しない可能性がある。コポリマーによってナノ粒子を作製するとき、添加親水性薬剤はナノ粒子に取り込まれる。非プロセス溶媒に難溶性である親水性薬剤は、粒子状コアとしてコーティングされるか、封入されるか、または閉じ込められ、コポリマーの保護コロイドによって立体的に安定化される。ナノ粒子は、非プロセス溶媒中で小さく安定なサイズを維持する。
【0028】
本発明の実施形態において、活性剤は、たとえばオリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの核酸である。これらの高度に負に帯電した化合物が、すべての他の方法が必要とするカチオン性錯体化を使用することなく、逆フラッシュナノ沈殿プロセスにおいて封入され得ることは、重要かつ予想外である（シン（Ｓｈｉｎ）、Ｈ．ら「ナノ粒子に基づくＲＮＡ治療薬およびＲＮＡ送達系における近年の進歩（Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ＲＮＡ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ ＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）。」アドバンスド・セラピューティクス（Ａｄｖ．Ｔｈｅｒａｐ．）２０１８、１、１８００６５を参照）。ここで安定化ポリマーに使用されるアニオン性ポリマーブロック（具体的にはポリ（アスパラギン酸）およびポリ（アクリル酸））は、負に帯電した核酸との好ましくない相互作用を有し、それらの封入を妨げるだろうと以前は考えられていた。同様に、たとえばデキストランなどの中性ポリマーと核酸との特異的相互作用の欠如は、高い封入効率または充填量を妨げるだろうと考えられていた。
【0029】
別の実施形態において、親水性薬剤およびコポリマーは、別個のプロセス溶媒流に溶解される。コポリマーを溶解するために使用されるプロセス溶媒と、親水性活性材料を溶解するために使用されるプロセス溶媒とは同じであってもよいが、そうである必要はない。たとえば、標的材料（水溶性薬剤）を第１の極性プロセス溶媒に溶解して水溶性薬剤溶液を形成でき、かつコポリマーを第２の極性プロセス溶媒に溶解してコポリマー溶液を形成できる。これらの水溶性薬剤溶液およびコポリマー溶液の流れは、非プロセス溶媒と混合され、たとえば同時に混合されて、混合溶液を形成する。第１の極性プロセス溶媒および第２の極性プロセス溶媒は、それらが混合される体積比にて混和性であり得るか、または完全に混和性であり得る（すなわち、別の相が形成されない）。第１の極性プロセス溶媒および非プロセス溶媒は、それらが混合される体積比にて混和性であり得るか、または完全に混和性であり得る（すなわち、別の相が形成されない）。第２の極性プロセス溶媒および非プロセス溶媒は、それらが混合される体積比にて混和性であり得るか、または完全に混和性であり得る（すなわち、別の相が形成されない）。別の実施形態において、親水性活性材料およびコポリマーは、単一のプロセス溶媒流に溶解される。次いで、この流れは非プロセス溶媒と迅速に混合される（すなわち、特許文献１、特許文献２、および米国特許第８，１３７，６９９号にさらに記載されているとおり、プロセス溶媒／非プロセス溶媒混合の時間がナノ粒子のアセンブリ時間よりも迅速である）。
【0030】
当業者は、すべての溶媒が互いにある程度混和性であることを認識するであろう。最初のナノ粒子沈殿プロセスでは混和性溶媒が使用される。本明細書で言及される「混和性」溶媒とは、ナノ粒子形成プロセスまたはマイクロ粒子プロセスで使用される比率で混合されたときに、多量相に溶解していない少量相（例、極性プロセス溶媒）の体積が２０％以下である溶液を生成するものである。本明細書で言及される完全に混和性の溶媒とは、ナノ粒子形成プロセスまたはマイクロ粒子プロセスで使用される比率で混合されたときに、相分離のない溶液を生成するものである。本明細書で言及される「非混和性」溶媒とは、プロセスで使用される体積比で混合されたときに、多量相への可溶化によって生じる少量相の体積の減少が２０％未満のものである。
【0031】
プロセス溶液と非プロセス溶媒との強力なマイクロ混合は、任意の数のジオメトリで行われ得る。本質的な意図は、高速の入口流によって乱流および中央キャビティ内で起こる混合を引き起こすということである。プロセス溶媒／非プロセス溶媒混合の時間は、ナノ粒子のアセンブリ時間よりも迅速である。限定することを意味するものではないが、２つのこうしたジオメトリが以前に記載され、分析されている。すなわち、拘束衝突噴流ミキサー（ＣＩＪ）（ジョンソン、Ｂ．Ｋ．、プリュドム、Ｒ．Ｋ．「拘束衝突噴流における化学処理およびマイクロ混合（Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｍｉｘｉｎｇ ｉｎ ｃｏｎｆｉｎｅｄ ｉｍｐｉｎｇｉｎｇ ｊｅｔｓ）。」ＡＩＣｈＥジャーナル（ＡＩＣｈＥ Ｊｏｕｒｎａｌ）２００３、４９、２２６４－２２８２；リウ、Ｙ．、フォックス、Ｒ．Ｏ．「拘束衝突噴流リアクタにおける化学処理のためのＣＦＤ予測（ＣＦＤ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｉｎ ａ ｃｏｎｆｉｎｅｄ ｉｍｐｉｎｇｉｎｇ－ｊｅｔｓ ｒｅａｃｔｏｒ）。」ＡＩＣｈＥジャーナル（ＡＩＣｈＥ Ｊｏｕｒｎａｌ）２００６、５２、７３１－７４４）と、マルチインレットボルテックスミキサー（ＭＩＶＭ）（リウ、Ｙ．、チェン、Ｃ．、リウ、Ｙ．、プリュドム、Ｒ．Ｋ．、フォックス、Ｒ．Ｏ．「フラッシュナノ沈殿のためのマルチインレットボルテックスミキサー（ＭＩＶＭ）内での混合（Ｍｉｘｉｎｇ ｉｎ ａ ｍｕｌｔｉ－ｉｎｌｅｔ ｖｏｒｔｅｘ ｍｉｘｅｒ（ＭＩＶＭ） ｆｏｒ ｆｌａｓｈ ｎａｎｏ－ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）。」ケミカル・エンジニアリング・サイエンス（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅ）２００８、６３、２８２９－２８４２）とである。これらの例は、限定的または網羅的なものではなく、例示的であることを意味する。
【0032】
このプロセスに関与する高速混合および高エネルギー散逸は、粒子の核形成および成長のための時間スケールよりも短い混合時間スケールを提供し、これは、他の技術によって提供されない活性剤充填含有量およびサイズ分布を有するナノ粒子の形成をもたらす。フラッシュナノ沈殿を介してナノ粒子を形成するとき、凝集の開始前にすべての成分がたとえば１０，０００などの高さの高い過飽和レベルに達することを十分可能にする高速の混合が起こる。過飽和レベルとは、溶媒中のたとえばコポリマーなどの材料の実際の濃度の、その溶媒中のその材料の飽和濃度に対する比率である。たとえば、過飽和レベルは少なくとも約１、３、１０、３０、１００、３００、１０００、または３０００であってもよく、最大で約３、１０、３０、１００、３００、１０００、３０００、１０，０００、３０，０００、または１００，０００であり得る。親水性活性材料の凝集およびコポリマー自己組織化の時間スケールが釣り合う。したがって、親水性活性材料およびポリマーは同時に沈殿し、低速の溶媒交換（例、透析）に基づく広く使用される技術で見出される低い活性剤取り込みおよび凝集の制限が克服される。フラッシュナノ沈殿プロセスは、成分の化学的特異性に対して非感受性であるため、普遍的なナノ粒子形成技術となる。
【0033】
このプロセスから得られるナノ粒子のサイズは、それらを作製するために使用される混合速度、プロセス溶媒中のコポリマーおよび親水性活性分子の総質量濃度、プロセス溶媒および非プロセス溶媒、コポリマーと親水性活性分子との比率、ならびに非プロセス溶媒と混合する際の親水性活性分子およびコポリマーの非可溶性部分の過飽和度を制御することによって制御され得る。
【0034】
ナノ粒子は、親水性活性材料が添加されていないプロセス溶媒に溶解したコポリマーから生成できる。
【0035】
本発明による方法を使用して、１５ｎｍ～１０５００ｎｍの範囲のサイズ、２０ｎｍ～６０００ｎｍの範囲のサイズ、２０ｎｍ～１０００ｎｍの範囲のサイズ、３５ｎｍ～４００ｎｍの範囲のサイズ、または４０ｎｍ～３００ｎｍの範囲のサイズを有する粒子を作製できる。サイズは、動的光散乱によって定められ得る。たとえば、少なくとも約１５ｎｍ、２０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、６００ｎｍ、９００ｎｍ、１０００ｎｍ、２０００ｎｍ、４０００ｎｍ、または６０００ｎｍのサイズを有し、最大で約２０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、６００ｎｍ、９００ｎｍ、１０００ｎｍ、２０００ｎｍ、４０００ｎｍ、６０００ｎｍ、または１０５００ｎｍのサイズを有する粒子を作製できる。本明細書で報告および引用されるサイズは、２０００ｎｍより小さい粒子についてはマルバーン・ナノサイザー（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｎａｎｏｓｉｚｅｒ）デコンボリューションプログラムによって定められ、２０００ｎｍより大きいサイズについては走査型電子顕微鏡または光学顕微鏡およびイメージＪ（Ｉｍａｇｅ Ｊ）を使用した画像解析によって定められた強度の平均報告値である。他の強度重み付けデコンボリューション法を使用して、ナノ粒子のサイズを定めることもできる。
【0036】
逆フラッシュナノ沈殿は、親水性ブロックまたはドメインのブロックまたはドメインから分離された疎水性の別個のブロックまたはドメインを含む安定化ブロックコポリマーの使用を必要とすると以前は考えられていた。これらはジブロックコポリマーおよびトリブロックコポリマーとして、特許文献１および特許文献２の特許実施例に記載および提示された。これらのブロックコポリマーでは、より親水性／極性の高いブロック（単数または複数）がナノ粒子表面上に沈殿し、疎水性ブロックは非プロセス溶媒中に可溶性のままであり、立体シェルを形成した。特許文献２における実施例は、ポリ（ｎ－ブチルアクリレート）－ｂ－ポリ（アクリル酸）のジブロックコポリマーを使用した。使用されてきた他のポリマーとしては、ポリ（スチレン）－ｂ－ポリ（アクリル酸）、ポリ（乳酸）－ｂ－ポリ（アスパラギン酸）、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）－ｂ－ポリ（アスパラギン酸）、およびポリ（エチレングリコール）－ｂ－ポリ（乳酸）－ｂ－ポリ（アスパラギン酸）が挙げられる。
【0037】
櫛形ポリマーなどの高度に分岐したポリマーは、櫛形ポリマーの骨格に対する貧溶媒であり分岐部に対する溶媒である溶媒中で単分子ミセルを形成する傾向を有する（ファン（Ｆａｎ）、Ｘ．ら「機能性材料としての単分子ミセルの最近の開発および用途（Ｒｅｃｅｎｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｕｎｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｅｌｌｅｓ ａｓ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）。」ポリマー・ケミストリー（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２０１６、７、５８９８－５９１９を参照）。櫛形骨格が不溶性であり、分岐部が可溶性である条件下では、安定化コロナに対する分岐部が単分子ミセルをもたらす一方で骨格が崩壊する。ミセルは凝集しないため、フラッシュナノ沈殿プロセス中に成長するナノ粒子の表面にミセルを固定することはできないと考えられていた。したがって、フラッシュナノ沈殿中に非プロセス溶媒中で骨格が崩壊する櫛形ポリマーを使用して、凝集しない安定なナノ粒子をうまく作製できるという本出願の結果は、予想外であった。
【0038】
以前は、逆フラッシュナノ沈殿によって生成されたナノ粒子をその後のプロセスステップに対して安定にするために、ナノ粒子コアの架橋が必要であると推測されていた（特許文献１および特許文献２、ペイゲルス、Ｒ．Ｆ．；プリュドム、Ｒ．Ｋ．、「ペプチド、生物製剤、および可溶性治療薬の送達のためのポリマーナノ粒子およびマイクロ粒子（Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，ａｎｄ ｓｏｌｕｂｌｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）。」ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ）２０１５、ｖｏｌ．２１９、５１９－５３５；ペイゲルス、Ｒ．Ｆ．；プリュドム、Ｒ．Ｋ．、「生物製剤封入のための逆フラッシュナノ沈殿：ナノ粒子形成および有機溶媒中でのイオン安定化（Ｉｎｖｅｒｓｅ Ｆｌａｓｈ ＮａｎｏＰｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ：Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｏｎｉｃ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｏｌｖｅｎｔｓ）。」ＡＣＳシンポジウム・シリーズ（ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ）２０１７、Ｖｏｌ．１２７１、１１章、ｐｐ２４９－２７４；マークウォルター、Ｃ．Ｅ．；プリュドム、Ｒ．Ｋ．、「生物製剤封入のための逆フラッシュナノ沈殿：抽出プロトコルによるプロセス損失の理解（Ｉｎｖｅｒｓｅ Ｆｌａｓｈ ＮａｎｏＰｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ：Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｌｏｓｓｅｓ ｖｉａ ａｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）。」ＡＣＳシンポジウム・シリーズ（ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ）２０１７、Ｖｏｌ．１２７１、１２章、ｐｐ２７５－２９６を参照）。ここで本発明者らは、非架橋ナノ粒子を架橋することなく処理して、コーティングされたナノ粒子またはマイクロ粒子にできるという驚くべき結果を示す。このことは、たとえば多糖などの親水性領域が非イオン性かつ非架橋性のポリマーである新たな安定化ポリマーの使用を可能にする。これは、分解に対して感受性である活性材料にとって特に重要である。たとえば、ＲＮＡは、Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋、およびＭｇ２＋などの多価カチオンが存在すると分解することが公知である（ブレスロー（Ｂｒｅｓｌｏｗ）、Ｒ．、ファン（Ｈｕａｎｇ）、Ｄ．－Ｌ．、「Ｍｇ２＋およびランタニドを含む金属イオンのリボヌクレオチドおよびＲＮＡモデル化合物の切断に対する影響（Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍｅｔａｌ ｉｏｎｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｍｇ２＋ ａｎｄ ｌａｎｔｈａｎｉｄｅｓ，ｏｎ ｔｈｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ ＲＮＡ ｍｏｄｅｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）。」科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ｖ８８、４０８０－４０８３、１９９１を参照）。これらの金属カチオンは、逆フラッシュナノ沈殿によって生成されたナノ粒子コアを架橋するために一般的に使用されてきたので、これらの架橋剤を伴わない粒子が安定に処理され得ることは重要である。しかし、核酸または他の活性物質を含有するナノ粒子は、なおも架橋されてもよい。たとえば、ナノ粒子のコアまたはシェルは架橋されてもよい。
【0039】
活性物質（封入材料）の説明
活性物質とは、所望の性能または結果を与える成分または材料のことである。これは、医薬活性物質（例、薬物、治療薬、または診断（例、追跡）用物質）、芳香剤、化粧品、殺虫剤、除草剤、インクもしくは染料、内密セキュリティ標識を可能にする分子もしくは組成物、または何らかのプロセス事象を受けたときに色の変化を表す分子もしくは組成物であってもよい。本文書において、本発明者らは、親水性活性物質、親水性薬剤、および標的という用語を互換的に使用する。
活性物質とは、所望の性能または結果を与える成分または材料のことである。これは、医薬活性物質（例、薬物、治療薬、または診断（例、追跡）用物質）、芳香剤、化粧品、殺虫剤、除草剤、インクもしくは染料、内密セキュリティ標識を可能にする分子もしくは組成物、または何らかのプロセス事象を受けたときに色の変化を表す分子もしくは組成物であってもよい。本文書において、本発明者らは、親水性活性物質、親水性薬剤、および標的という用語を互換的に使用する。
【0040】
封入される活性物質（標的分子）は、より極性の低い非プロセス溶媒中で急速に沈殿するように十分に極性が高くなければならない。これらの基準を満たさない分子は、自身の水溶解度および有機非プロセス溶媒中で沈殿する傾向を増加させるために化学的に修飾されてもよい。封入され得る生物学的材料の例としては、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖類、ならびにそれらの誘導体、コンジュゲート、および／または類似体が挙げられるが、これらに限定されない。小分子水溶性治療薬および造影剤も封入されてもよい。粒子の使用またはその後の処理ステップのために粒子に安定性を提供するために、可溶性安定剤が粒子に封入されてもよい。これらの材料のいずれかが、単一粒子内で共沈してもよい。親水性材料は、後処理中に粒子に安定性を付加する目的のみのために封入されてもよい。たとえば、１００～１０，０００，０００ダルトン（Ｄａ）の分子量を有する材料が封入されてもよい。２５０～１０，０００，０００Ｄａの分子量を有する材料が封入されてもよい。１００～１，０００，０００Ｄａの分子量を有する材料が封入されてもよい。２５０～１，０００，０００Ｄａの分子量を有する材料が封入されてもよい。１００～２００，０００Ｄａの分子量を有する材料が封入されてもよい。
【0041】
特定の封入材料は、多機能性であってもよい。たとえば、トブラマイシンはカチオン性であり、それ自体がコポリマーと架橋され得る。複数のカチオン性残基を有する他のカチオン性活性材料も同様にアニオン性ポリマーブロックを架橋するだろう。
【0042】
封入材料は、ある範囲の充填量で粒子に取り込まれてもよい。たとえば、封入材料の質量は、コポリマーの質量以上であってもよい。たとえば、第１のプロセス溶液中の封入材料の濃度は、約０．１重量％、０．２重量％、０．５重量％、１重量％、２重量％、５重量％、１０重量％、または２０重量％から約０．２重量％、０．５重量％、１重量％、２重量％、５重量％、１０重量％、２０重量％、または４０重量％であってもよい。
【0043】
ここで本発明者らは、封入材料がたとえばＲＮＡまたはＤＮＡなどの核酸であり得ることを初めて実証する。活性物質は、プロセス溶媒流に可溶性でなければならない。一般的なプロセス溶媒としては、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＮＭＰ、メタノール、エタノール、およびそれらの混合物が挙げられる。場合によっては、少量の水をプロセス溶媒に添加して、活性剤の溶解度を高めることができる。核酸が、これらの一般的なプロセス溶媒に可溶となるために特定の塩形態を必要とすることは予想外であった。ポリ（アクリル酸）およびポリ（アスパラギン酸）を含む他のアニオン性ポリマーは、プロトン化された酸形態でＤＭＳＯに可溶であり、ナトリウム塩から（ｆｒｏｍ）は可溶でないので、核酸の酸（プロトン化）形態が、ＤＭＳＯなどのプロセス溶媒において最も可溶となることが予期された。しかし、逆フラッシュナノ沈殿のためのプロセス溶媒中に核酸を可溶化するためには、水酸化ナトリウム、水酸化リチウム、トリス、アンモニア、水酸化セシウム、水酸化カリウム、第１級アミン、第２級アミン、第４級アミン、または第３級アミンによる核酸の部分的または完全な中和が必要である。
【0044】
安定化ポリマーの説明
安定化ポリマーは、１つ以上の極性ブロックおよび１つ以上の非極性ブロックから構成される直鎖状ポリマーであり得る（図３）。たとえば、非極性ブロック（単数または複数）は、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリ［（カルボキシフェノキシ）プロパン－セバシン酸］、ポリリン酸エステル、ポリエステルアミド、ポリウレタン、ポリビニルアクリレート、ポリ（アミノ酸）、または疎水的に修飾された多糖であり得る。たとえば、極性ブロック（単数または複数）はポリ（アミノ酸）、たとえばポリ（グルタミン酸）（ＰＧｌｕ：ｐｏｌｙ（ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ））、ポリ（アスパラギン酸）（ＰＡｓｐ：ｐｏｌｙ（ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ））、ポリ（リジン）、ポリ（リジン）、ポリ（アルギニン）、ポリ（セリン）、ポリ（スレオニン）、ポリ（グルタミン）、ポリ（アスパラギン）、ポリ（システイン）、またはこれらの組み合わせもしくは改変形などであり得る。たとえば、極性ブロック（単数または複数）は多糖、たとえばセルロース、デキストラン、マルトデキストリン、デキストリン、硫酸デキストラン、硫酸デキストリン、ヒアルロン酸、ペクチン、アミロペクチン、アミロース、プルラン、キシラン、カラギーナン、キチン、キトサン、デンプン、またはこれらの組み合わせもしくは改変形などであり得る。たとえば、安定化ポリマーは、ＰＡｓｐ－ｂ－ＰＬＡ、ＰＡｓｐ－ｂ－ＰＬＧＡ、ＰＡｓｐ－ｂ－ＰＣＬ、ＰＡｓｐ－ｂ－ＰＬＡ－ｂ－ＰＡｓｐ、ＰＡｓｐ－ｂ－ＰＬＧＡ－ｂ－ＰＡｓｐ、ポリ（エチレングリコール）－ｂ－ＰＬＡ－ｂ－ＰＡｓｐ、ポリ（エチレングリコール）－ｂ－ＰＬＧＡ－ｂ－ＰＡｓｐ、ポリ（エチレングリコール）－ｂ－ＰＣＬ－ｂ－ＰＡｓｐ、ＰＧｌｕ－ｂ－ＰＬＡ、ＰＧｌｕ－ｂ－ＰＬＧＡ、ＰＧｌｕ－ｂ－ＰＣＬ、ＰＧｌｕ－ｂ－ＰＬＡ－ｂ－ＰＧｌｕ、ＰＧｌｕ－ｂ－ＰＬＧＡ－ｂ－ＰＧｌｕ、ポリ（エチレングリコール）－ｂ－ＰＬＡ－ｂ－ＰＧｌｕ、ポリ（エチレングリコール）－ｂ－ＰＬＧＡ－ｂ－ＰＧｌｕ、ポリ（エチレングリコール）－ｂ－ＰＣＬ－ｂ－ＰＧｌｕ、またはそれらの他の組み合わせであり得る。たとえば、安定化ポリマーは、多糖－ｂ－ＰＬＧＡ、多糖－ｂ－ＰＬＡ、多糖－ｂ－ＰＣＬ、または多糖とＰＬＡ、ＰＣＬ、および／もしくはＰＬＧＡブロックとから構成されるより高次のブロックコポリマーであり得る。
安定化ポリマーは、１つ以上の極性ブロックおよび１つ以上の非極性ブロックから構成される直鎖状ポリマーであり得る（図３）。たとえば、非極性ブロック（単数または複数）は、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリ［（カルボキシフェノキシ）プロパン－セバシン酸］、ポリリン酸エステル、ポリエステルアミド、ポリウレタン、ポリビニルアクリレート、ポリ（アミノ酸）、または疎水的に修飾された多糖であり得る。たとえば、極性ブロック（単数または複数）はポリ（アミノ酸）、たとえばポリ（グルタミン酸）（ＰＧｌｕ：ｐｏｌｙ（ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ））、ポリ（アスパラギン酸）（ＰＡｓｐ：ｐｏｌｙ（ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ））、ポリ（リジン）、ポリ（リジン）、ポリ（アルギニン）、ポリ（セリン）、ポリ（スレオニン）、ポリ（グルタミン）、ポリ（アスパラギン）、ポリ（システイン）、またはこれらの組み合わせもしくは改変形などであり得る。たとえば、極性ブロック（単数または複数）は多糖、たとえばセルロース、デキストラン、マルトデキストリン、デキストリン、硫酸デキストラン、硫酸デキストリン、ヒアルロン酸、ペクチン、アミロペクチン、アミロース、プルラン、キシラン、カラギーナン、キチン、キトサン、デンプン、またはこれらの組み合わせもしくは改変形などであり得る。たとえば、安定化ポリマーは、ＰＡｓｐ－ｂ－ＰＬＡ、ＰＡｓｐ－ｂ－ＰＬＧＡ、ＰＡｓｐ－ｂ－ＰＣＬ、ＰＡｓｐ－ｂ－ＰＬＡ－ｂ－ＰＡｓｐ、ＰＡｓｐ－ｂ－ＰＬＧＡ－ｂ－ＰＡｓｐ、ポリ（エチレングリコール）－ｂ－ＰＬＡ－ｂ－ＰＡｓｐ、ポリ（エチレングリコール）－ｂ－ＰＬＧＡ－ｂ－ＰＡｓｐ、ポリ（エチレングリコール）－ｂ－ＰＣＬ－ｂ－ＰＡｓｐ、ＰＧｌｕ－ｂ－ＰＬＡ、ＰＧｌｕ－ｂ－ＰＬＧＡ、ＰＧｌｕ－ｂ－ＰＣＬ、ＰＧｌｕ－ｂ－ＰＬＡ－ｂ－ＰＧｌｕ、ＰＧｌｕ－ｂ－ＰＬＧＡ－ｂ－ＰＧｌｕ、ポリ（エチレングリコール）－ｂ－ＰＬＡ－ｂ－ＰＧｌｕ、ポリ（エチレングリコール）－ｂ－ＰＬＧＡ－ｂ－ＰＧｌｕ、ポリ（エチレングリコール）－ｂ－ＰＣＬ－ｂ－ＰＧｌｕ、またはそれらの他の組み合わせであり得る。たとえば、安定化ポリマーは、多糖－ｂ－ＰＬＧＡ、多糖－ｂ－ＰＬＡ、多糖－ｂ－ＰＣＬ、または多糖とＰＬＡ、ＰＣＬ、および／もしくはＰＬＧＡブロックとから構成されるより高次のブロックコポリマーであり得る。
【0045】
本発明の実施形態において、安定化ポリマーは、親水性骨格および疎水性分岐部またはグラフトからなる櫛形ポリマーである（図４）。本発明の実施形態において、櫛形ポリマーの骨格は、縮合重合によって生成されるデキストランまたはポリ（アスパラギン酸）と同様に分岐し得る（図５）。本発明の実施形態において、櫛形ポリマーの骨格は、セルロースと同様に直鎖状であり得る。本発明の実施形態において、櫛形ポリマーの親水性骨格は多糖である。たとえば、骨格はセルロース、デキストラン、マルトデキストリン、デキストリン、硫酸デキストラン、硫酸デキストリン、ヒアルロン酸、ペクチン、アミロペクチン、アミロース、プルラン、キシラン、カラギーナン、キチン、キトサン、デンプン、またはこれらの組み合わせもしくは改変形であり得る。本発明の実施形態において、櫛形ポリマーの親水性骨格は、ポリ（アミノ酸）、たとえばポリ（グルタミン酸）、ポリ（アスパラギン酸）、ポリ（リジン）、ポリ（リジン）、ポリ（アルギニン）、ポリ（セリン）、ポリ（スレオニン）、ポリ（グルタミン）、ポリ（アスパラギン）、ポリ（システイン）、またはこれらの組み合わせもしくは改変形などである。本発明の実施形態において、骨格はポリビニルアルコールである。本発明の実施形態では、非極性側鎖は、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリ［（カルボキシフェノキシ）プロパン－セバシン酸］、ポリリン酸エステル、ポリエステルアミド、ポリウレタン、ポリビニルアクリレート、ポリ（アミノ酸）、または疎水的に修飾された多糖である。櫛形ポリマーは、２０、３０、４０、５０、６０、７０、または８０重量％から７０、８０、９０、９５重量％の非極性側鎖からなるべきである。櫛形ポリマーの骨格は、５００Ｄａ、１０００Ｄａ、２５００Ｄａ、５０００Ｄａ、１００００Ｄａ、または２００００Ｄａから２００００Ｄａ、５００００Ｄａ、１０００００Ｄａ、または５０００００Ｄａであり得る。各非極性側鎖またはグラフトは、１００、５００、１０００、５０００Ｄａ、１００００Ｄａ、または２００００Ｄａから２００００Ｄａ、５００００Ｄａ、１０００００Ｄａ、または５０００００Ｄａであり得る。櫛形ポリマーは、２０、３０、４０、５０、６０、７０、または８０重量％から７０、８０、９０、９５重量％の非極性側鎖からなるべきである。当業者は、非極性基の適切な重量％をもたらすこととなる極性骨格当たりの非極性側鎖の数が、各々の種の分子量に依存することを認識するであろう。たとえば、安定化ポリマーは、デキストラン－グラフト－ＰＬＧＡ、デキストラン－グラフト－ＰＬＡ、デキストラン－グラフト－ＰＣＬ、またはＰＬＡ、ＰＣＬ、もしくはＰＬＧＡがグラフト化された別の多糖であり得る。たとえば、安定化櫛形ポリマーは、ＰＡｓｐ－グラフト－ＰＬＡ、ＰＡｓｐ－グラフト－ＰＬＧＡ、ＰＡｓｐ－グラフト－ＰＣＬ、またはＰＬＡ、ＰＬＧＡ、もしくはＰＣＬがグラフト化された別のポリ（アミノ酸）であり得る。
【0046】
より一般的には、安定化ポリマーは、１つ以上の非極性ブロックと結合した１つ以上の極性ブロックのコポリマーであり得る。「ブロック」という用語は、単一の分子組成を有する別個のドメインとして解釈されてもよいし、主により極性が高い領域と、より極性が低い他の領域とを有するポリマー鎖の領域を意味してもよい。極性は、ポリマー骨格または主ポリマー骨格に付着したグラフト化ペンダント基もしくは鎖を含むモノマーによって付与されてもよい。たとえば、コポリマーは両親媒性（より非極性のブロックは水溶性ではない）であってもよいが、これは必要条件ではなく、ブロックの溶解度が非プロセス溶媒中で有意に異なる限り、コポリマーは完全に水溶性であっても完全に非水溶性であってもよい。コポリマーは、非プロセス溶媒中で自己組織化すべきであり、このときより極性の高いブロックは沈殿し、より非極性のブロックは可溶性のままである。粒子を作製するためにＦＮＰプロセスにおいて使用されるとき、より極性の高いブロックは粒子のコアに行き、より非極性のブロックは立体的に保護的なシェルを形成する。立体的に保護的なシェルは、粒子の凝集を防止し、かつ後処理ステップの際の封入材料の浸出を防止する。
【0047】
開示されたプロセスによって形成されるナノ粒子は、グラフト、ブロック、またはランダムコポリマーによって形成され得る。たとえば、これらのコポリマーは、約１０００ｇ／モル～約１，０００，０００ｇ／モル、または約３０００ｇ／モル～約２５，０００ｇ／モル、または少なくとも約２０００ｇ／モルの分子量を有し得る。
【0048】
コポリマーは、異なる溶解度特性を有する繰り返し単位またはブロックを含む。通常、これらの繰り返し単位は、所与の特性のブロックを含む少なくとも２つのグループになっている。合成方法に応じて、これらのブロックは、すべて同じ繰り返し単位であってもよいし、ブロック全体に分散された異なる繰り返し単位を含有してもよいが、依然として極性部分およびより非極性の部分を有するコポリマーのブロックをもたらすものである。これらのブロックは、ブロックコポリマーの骨格を形成する一連の２ブロック（ジブロック）もしくは３ブロック（トリブロック）、またはそれ以上（マルチブロック）として配置され得る。加えてポリマー鎖は、骨格に共有結合またはグラフト化された化学的部分を有し得る。こうしたポリマーはグラフトポリマーである。コポリマーを構成するブロック単位は、規則的な間隔で存在してもよいし、ランダムに存在してランダムコポリマーとなることもできる。加えてグラフト化側鎖は、ポリマー骨格に沿って規則的な間隔で存在してもよいし、ランダムに存在してランダムにグラフト化されたコポリマーとなることもできる。グラフトポリマーにおいて、極性ブロックは非極性ポリマー上にグラフト化されてもよい。より一般的には、非極性ブロックまたは非極性置換基は、より極性の高いポリマー鎖上にグラフト化される。グラフトコポリマーにおいて、グラフト化部分の長さは変動し得る。好ましくは、グラフト化置換基の長さは、２～２２エチレン単位と等価である。コポリマーの少なくとも１つの低極性領域を生成するグラフト化疎水性置換基は、トコフェロール、トコフェロール誘導体、脂質、炭素数１２～４０のアルコール、コレステロール、不飽和および／または水素化脂肪酸、それらの塩、エステルまたはアミド、脂肪酸モノ－、ジ－、またはトリグリセリド、ワックス、セラミド、コレステロール誘導体、または組み合わせを含んでもよい。グラフト化置換基は、一般的に非極性修飾多糖ポリマーを作製するために糖モノマー単位上にグラフト化されるエチル、プロピル、またはブチル基であってもよい。加えて、ポリマー骨格のグラフト化は、溶媒和またはナノ粒子安定化特性を増強するために有用であり得る。
【0049】
本発明の組成物および方法において使用されるコポリマーは、少なくとも２つの繰り返し単位のブロックか、または少なくとも２５のエチレン単位と等価の最小輪郭長を有するブロックを含んでもよい。輪郭長とは、ポリマー骨格の線形和であり、その分子寸法は、ここにその全体が引用により援用される「ポリマーハンドブック（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｈａｎｄｂｏｏｋ）」、第４版、編集Ｊ．ブランドラップ（Ｂｒａｎｄｒｕｐ）、Ｅ．Ｈ．イマーグット（Ｉｍｍｅｒｇｕｔ）、およびＥ．Ａ．グラルケ（Ｇｒｕｌｋｅ）、共同編集Ａ．エイブ（Ａｂｅ）、Ｄ．Ｒ．ブロック（Ｂｌｏｃｈ）、１９９９、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）を用いて概算できる。
【0050】
コポリマー中の好適な非極性ブロックの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：メチルアクリレート、エチルアクリレート、プロピルアクリレート、ｎ－ブチルアクリレート（ＢＡ：ｂｕｔｙｌ ａｃｒｙｌａｔｅ）、イソブチルアクリレート、２－エチルアクリレート、およびｔ－ブチルアクリレートを含むアクリレート類；エチルメタクリレート、ｎ－ブチルメタクリレート、およびイソブチルメタクリレートを含むメタクリレート類；アクリロニトリル；メタクリロニトリル；酢酸ビニル、ビニルベルサテート、プロピオン酸ビニル、ビニルホルムアミド、ビニルアセトアミド、ビニルピリジン、ビニルフェノール、およびビニリミダゾール（ｖｉｎｙｌｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ）を含むビニル類；アミノアルキルアクリレート、アミノアルキルスメタクリレート（ａｍｉｎｏａｌｋｙｌｓｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅｓ）、およびアミノアルキル（メタ）アクリルアミドを含むアミノアルキル類；スチレン；酢酸フタル酸セルロース、酢酸コハク酸セルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－ｃｏ－グリコリド）、ポリ（グリコリド）、ポリ（ヒドロキシブチレート）、ポリ（アルキルカーボネート）、およびポリ（オルトエステル）、ポリエステル、ポリ（ヒドロキシ吉草酸）、ポリジオキサノン、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（リンゴ酸）、ポリ（タルトロン酸）、ポリ無水物、ポリホスファゼン、ポリ（アミノ酸）、乳酸、カプロラクトン、グリコール酸、およびそれらのコポリマー（一般的に、イルム（Ｉｌｌｕｍ）、Ｌ．、デービッズ（Ｄａｖｉｄｓ）、Ｓ．Ｓ．（編）「制御された薬物送達におけるポリマー（Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」ライト（Ｗｒｉｇｈｔ）、ブリストル（Ｂｒｉｓｔｏｌ）、１９８７；アルシャディ（Ａｒｓｈａｄｙ）、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ）１７：１－２２、１９９１；ピット（Ｐｉｔｔ）、インターナショナル・ジャーナル・オブ・ファーマシューティクス（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒ．）５９：１７３－１９６、１９９０；ホランド（Ｈｏｌｌａｎｄ）ら、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ）４：１５５－０１８０、１９８６を参照）；ポリ（Ｌ－アミノ酸）に基づく疎水性ペプチドベースのポリマーおよびコポリマー（ラバサニファー（Ｌａｖａｓａｎｉｆａｒ）、Ａ．ら（ｉｔ ａｌ．）、アドバンスド・ドラッグ・デリバリー・レビューズ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ）（２００２）５４：１６９－１９０）、ポリ（エチレン－酢酸ビニル）（ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｖｉｎｙｌ ａｃｅｔａｔｅ））（「ＥＶＡ」）コポリマー、シリコーンゴム、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリジエン類（ポリブタジエン、ポリイソプレン、およびこれらのポリマーの水素化形態）、ビニルメチルエーテルおよび他のビニルエーテルの無水マレイン酸コポリマー、ポリアミド（ナイロン６，６）、ポリウレタン、ポリ（エステルウレタン）、ポリ（エーテルウレタン）、ポリ（エステル尿素）。たとえば、ポリマーブロックとしては、ポリ（エチレン酢酸ビニル）、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸）オリゴマーおよびポリマー、ポリ（Ｌ－乳酸）オリゴマーおよびポリマー、ポリ（グリコール酸）、乳酸とグリコール酸とのコポリマー、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（バレロラクトン）、ポリ無水物、ポリ（カプロラクトン）もしくはポリ（乳酸）のコポリマー、またはポリ（プロピレンスルフィド）が挙げられ得る。生物学的に関連しない用途に対するポリマーブロックとしては、たとえばポリスチレン、ポリアクリレート、およびブタジエンなどが挙げられ得る。
【0051】
ポリマーの非極性部分として作用するために十分な疎水性を有する天然産物としては、疎水性ビタミン（たとえばビタミンＥ、ビタミンＫ、およびビタミンＡなど）、カロテノイド、およびレチノール（たとえばベータカロチン、アスタキサンチン、トランスおよびシス型レチナール、レチノイン酸、葉酸、ジヒドロ葉酸、酢酸レチニル、パルミチン酸レチニル）、コレカルシフェロール、カルシトリオール、ヒドロキシコレカルシフェロール、エルゴカルシフェロール、アルファ－トコフェロール、酢酸アルファ－トコフェロール、ニコチン酸アルファトコフェロール、エストラジオール、脂質、炭素数１２～４０のアルコール、コレステロール、不飽和および／または水素化脂肪酸、それらの塩、エステル、またはアミド、脂肪酸モノ－、ジ－、またはトリグリセリド、ワックス、セラミド、コレステロール誘導体、またはそれらの混合物が挙げられる。たとえば、天然産物は、ビタミンＥコハク酸として容易に得ることができるビタミンＥであり、これは活性種上のアミンおよびヒドロキシルに対する機能化を促進する。
【0052】
ブロックコポリマーである両親媒性ポリマー中の好適な極性ブロックの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、およびマレイン酸を含むカルボン酸；ポリオキシエチレンまたはポリエチレンオキシド；ポリアクリルアミドおよびそのジメチル－アミノエチル－メタクリレート、ジアリル－ジメチル－アンモニウムクロリド、ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド、アクリル酸、メタクリル酸、２－アクリアミデオ（ａｃｒｙａｍｉｄｅｏ）－２－メチルプロパンスルホン酸、およびスチレンスルホネートとのコポリマー、ポリビニルピロリドン、デンプンおよびデンプン誘導体、デキストランおよびデキストラン誘導体；たとえばポリリジン、ポリアルギニン、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸などのポリペプチド；ポリヒアルロン酸、アルギン酸、ポリラクチド、ポリエチレンイミン、ポリイオネン、ポリアクリル酸、およびポリイミノカルボキシレート、ゼラチン、ならびに不飽和エチレン性モノまたはジカルボン酸。アニオン性コポリマーを調製するために、アクリル酸、メタクリル酸、および／またはポリアスパラギン酸ポリマーを使用できる。カチオン性コポリマーを生成するために、ＤＭＡＥＭＡ（ジメチルアミノエチルメタクリレート（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ））、ポリビニルピリジン（ＰＶＰ：ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ｐｙｒｉｄｉｎｅ）、および／またはジメチルアミノエチルアクリルアミド（ＤＭＡＭＡＭ：ｄｉｍｅｔｈｙｌ ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）を使用できる。好適な極性水溶性ポリマーのリストは、「水溶性ゴムおよび樹脂のハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｗａｔｅｒ－Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｇｕｍｓ ａｎｄ Ｒｅｓｉｎｓ）」、Ｒ．デビッドソン（Ｄａｖｉｄｓｏｎ）、マグロウヒル（ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ）（ｌ９８０）に見出すことができる。
【0053】
非極性ポリマーおよび極性ポリマーの上記リストは、互いに排他的であるとみなされるべきではない。単一のリストに与えられた２つのポリマーのコポリマーは、このプロセスで使用される所与の非プロセス溶媒中での溶解度に十分な差異を有してもよい。例示的な実施例として、ポリ（エチレンオキシド）およびポリ（アクリル酸）は両方とも極性ポリマーのリストに与えられている。しかし、ポリ（エチレンオキシド）はクロロホルムおよびアセトンに可溶性であるが、ポリ（アクリル酸）は可溶性ではない。したがって、ポリ（エチレンオキシド）とポリ（アクリル酸）とのコポリマーは、このプロセスにおいて非プロセス溶媒としてのクロロホルムまたはアセトンと共に使用されてもよい。
【0054】
安定化ランダムコポリマーは、約０．１ｋＤａ、１ｋＤａ、１０ｋＤａ、１００ｋＤａ、または１０００ｋＤａから約５ｋＤａ、５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、または１０００ｋＤａ以上の範囲の分子量を有し得る。
【0055】
プロセス溶媒および非プロセス溶媒の説明
ナノ粒子の形成は、１つ以上のプロセス溶媒および１つ以上の非プロセス溶媒の流れを必要とする。プロセス溶媒および非プロセス溶媒は、純粋な（すなわち、単一の）液体化合物であっても、２つ以上の純粋な液体化合物の混合物であってもよい。流れの溶媒品質を補助する他の非液体化合物が添加されてもよく、これも溶媒の一部とみなされる。たとえば、界面活性剤、塩、または共溶媒を溶媒に添加して、溶媒の一部とみなしてもよい。最終生成物の要件に応じて、これらの賦形剤化合物は、最終ナノ粒子またはマイクロ粒子構築物中にあってもなくてもよい。
ナノ粒子の形成は、１つ以上のプロセス溶媒および１つ以上の非プロセス溶媒の流れを必要とする。プロセス溶媒および非プロセス溶媒は、純粋な（すなわち、単一の）液体化合物であっても、２つ以上の純粋な液体化合物の混合物であってもよい。流れの溶媒品質を補助する他の非液体化合物が添加されてもよく、これも溶媒の一部とみなされる。たとえば、界面活性剤、塩、または共溶媒を溶媒に添加して、溶媒の一部とみなしてもよい。最終生成物の要件に応じて、これらの賦形剤化合物は、最終ナノ粒子またはマイクロ粒子構築物中にあってもなくてもよい。
【0056】
場合によっては、たとえば核酸を伴う場合には、核酸を可溶化するためにプロセス溶媒中に中和塩または塩基が必要とされる。たとえば、ＮａＯＨ、ＬｉＯＨ、ＣｓＯＨ、ＫＯＨ、トリス塩基、水酸化アンモニウム、またはその他の塩基性の有機もしくは無機化合物を添加して、核酸の溶解を助け得る。たとえば、核酸を可溶化するために、第１級、第２級、第４級、または第３級アミンが添加され得る。
【0057】
コポリマーを含有する極性プロセス溶媒は、コポリマーが分子的に溶解されるように選択される。これは、プロセス溶媒がコポリマーのすべての部分を可溶化することを必要とする。封入されるべき材料を含有するプロセス溶媒が存在するときは、このプロセス溶媒も材料を分子的に溶解するように選択される。これらのプロセス溶媒は同じであってもよいが、同じである必要はない。場合によっては、コポリマーおよび封入されるべき材料の両方がプロセス溶媒の単一の溶液に溶解されてもよい。封入されるべき水溶性材料を溶解させるために、プロセス溶媒は非プロセス溶媒よりも極性が高い。プロセス溶媒の例としては、水、アルコール、メタノール、エタノール、グリコールエーテル、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトニトリル、アセトン、Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）、およびそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。酸、塩基、および塩は、プロセス溶媒におけるコポリマーおよび封入材料の可溶化を補助するために使用され得る添加剤のいくつかの例である。
【0058】
コポリマーおよび封入されるべき材料を含有するプロセス溶媒の溶液は、非プロセス溶媒と混合される。非プロセス溶媒は、コポリマーの局所的分子環境を変化させて、コポリマーの親水性成分の局所的沈殿を引き起こすことができなければならない。非プロセス溶媒は、コポリマーのより極性の高い部分が急速に沈殿する一方で、コポリマーのより非極性の成分が可溶化されたままであるように選択される。よって、非プロセス溶媒中でコポリマーは自己組織化して、所望のナノ粒子形態となる。非プロセス溶媒は、封入されるべき親水性活性材料が最終混合物中で急速に沈殿するように選択される。ほとんどの場合、プロセス溶媒および非プロセス溶媒は、最終組成物において完全に混和性であることが好ましい。場合によっては、最終組成物中で２０体積パーセント以下のプロセス溶媒が相分離してもよい。このことは一般的に、相分離した溶媒が粒子のコアに行き、かつ巨視的な分離がないときにのみ許容され得る。たとえば、プロセス溶媒中のいくらかの水は、非プロセス溶媒から相分離して、親水性ナノ粒子コア内に隔離されてもよい。非プロセス溶媒としては、クロロホルム、ジクロロメタン、ヘキサンなどのアルカン、ジエチルエーテルなどのエーテル類、酢酸エチル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、トルエン、アセトン、およびそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。酸、塩基、および塩は、封入材料およびコポリマーのセクションの沈殿を補助するために使用され得る添加剤のいくつかの例である。溶媒の選択は、コポリマーおよび封入材料の溶解度に基づいて行われる。１つの系のプロセス溶媒は、別の系における非プロセス溶媒として良好に作用し得ることに留意することが重要であり、よってプロセス溶媒および非プロセス溶媒について上記に与えられた例は、別個のものとみなされるべきではない。
【0059】
ナノ粒子の架橋
本発明の方法は、コポリマーの架橋によってナノ粒子コアを安定化させることを含む（図６）。たとえば、ナノ粒子は、ナノ粒子のアセンブリ中に架橋され得る。たとえば、ナノ粒子は、ナノ粒子のアセンブリ後に架橋され得る。架橋は、共有結合架橋であり得る。たとえば、架橋はジスルフィド架橋であり得る。たとえば、架橋は「クリックケミストリー（Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｙ）」を通じて起こり得る。架橋は、米国特許出願第１３／９６９，４４９号、「活性剤の放出のための微粒子構築物（Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ｆｏｒ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ａｃｔｉｖｅ Ａｇｅｎｔｓ）」（ローレンス・メイヤー（Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｍａｙｅｒ）ら）に記載されているタイプの切断可能なエステル結合を含み得る。架橋は、非共有結合であり得る。たとえば、架橋はイオン性架橋、キレート化架橋、酸－塩基架橋、または水素結合架橋であり得る。
本発明の方法は、コポリマーの架橋によってナノ粒子コアを安定化させることを含む（図６）。たとえば、ナノ粒子は、ナノ粒子のアセンブリ中に架橋され得る。たとえば、ナノ粒子は、ナノ粒子のアセンブリ後に架橋され得る。架橋は、共有結合架橋であり得る。たとえば、架橋はジスルフィド架橋であり得る。たとえば、架橋は「クリックケミストリー（Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｙ）」を通じて起こり得る。架橋は、米国特許出願第１３／９６９，４４９号、「活性剤の放出のための微粒子構築物（Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ｆｏｒ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ａｃｔｉｖｅ Ａｇｅｎｔｓ）」（ローレンス・メイヤー（Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｍａｙｅｒ）ら）に記載されているタイプの切断可能なエステル結合を含み得る。架橋は、非共有結合であり得る。たとえば、架橋はイオン性架橋、キレート化架橋、酸－塩基架橋、または水素結合架橋であり得る。
【0060】
コポリマーを架橋するために、架橋剤を添加できる。たとえば、架橋剤は、アニオン性の官能性または特性を有するコポリマーの基を架橋するために添加され得る。たとえば、架橋剤は、アルカリ土類ハロゲン化物、ハロゲン化マグネシウム、塩化マグネシウム、ハロゲン化カルシウム、塩化カルシウム、遷移金属ハロゲン化物、ハロゲン化鉄、塩化鉄（ＩＩＩ）、スペルミン、または組み合わせであり得る。たとえば、架橋剤は、金属酢酸塩、アルカリ土類酢酸塩、遷移金属酢酸塩、酢酸カルシウム、または組み合わせであり得る。たとえば、架橋剤は、酢酸クロム（ＩＩＩ）または別のクロム（ＩＩＩ）塩であり得る。たとえば、架橋剤は、金属硝酸塩、アルカリ土類硝酸塩、遷移金属硝酸塩、硝酸カルシウム、硝酸亜鉛、硝酸鉄、または組み合わせであり得る。たとえば、他の生体適合性の多カチオン性水溶性薬剤を架橋剤として使用して、コポリマーのアニオン性部分を架橋してもよい。たとえば、水溶性薬剤はトブラマイシンを含むことができ、トブラマイシンはコポリマーを架橋できる。１つの例はテトラエチレンペンタミンである。カチオン性架橋剤とコポリマーの親水性基との間のイオン性相互作用を促進するために、それらの親水性基がアニオン性の官能性を有するときは、アンモニアまたは塩基性の特性を有する別の化学物質を添加できる。
【0061】
代替的には、ナノ粒子のシェルを架橋させてナノ粒子の安定性を高めてもよい（図７）。たとえば、疎水性（非極性）ポリマー鎖またはブロックの末端基またはその他の基を架橋できる。たとえば、架橋はイオン性または共有結合性であり得る。たとえば、２つ以上の疎水性ポリマー鎖が直接架橋されてもよいし、多官能性架橋剤の添加を通じて架橋されてもよい。たとえば、官能性「Ｙ」に対して反応性である官能性「Ｘ」を有する基を（鎖末端または鎖全体に）含有する疎水性ポリマーシェルは、２つ以上の「Ｙ」官能基を有する架橋剤を使用して架橋されてもよい。たとえば、ＸおよびＹ官能基は、チオールおよびアクリレート、チオールおよびマレイミド、アジドおよびアルキエン（ａｌｋｙｅｎｅｓ）、アミンおよび酸、またはその逆であり得る。官能基ＸおよびＹは、「クリックケミストリー」を通じて反応する基であり得る。シェルの架橋を誘導するために、触媒またはその他の薬剤の添加が必要とされてもよい。
【0062】
本発明者らは、本発明の別の方法において、架橋が必要とされないことを初めて示す。
【0063】
反転（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ）ナノ粒子のさらなる処理
ナノ粒子の形成後、望ましい製剤を生成するために追加の処理ステップが行われ得る。ナノ粒子が水非混和性溶媒中に分散されているとき、抽出プロセスを使用して残留ＤＭＳＯを除去できる。水溶液の組成は、ポリマー安定剤の安定性を促進するように修正され得る。たとえば、水性流は、浸透圧を調整するために１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含有してもよい。糖、ＰＥＧ、またはその他のオスモライトを使用して同様の効果を達成してもよい。安定剤の溶解度を制限するためにｐＨを調整できる。酢酸またはクエン酸などの有機酸を使用でき、塩酸などの鉱酸も使用できる。同様に、水酸化アンモニウムおよび水酸化ナトリウムなどの塩基を添加できる。ホウ酸塩またはカルボン酸塩などの緩衝系を使用してもよい。抽出は、処理規模に対して許容される標準的なプロトコルを用いて３０分間以上行われ得る。界面と共に水相は廃棄され、有機相はさらなる処理のために保持される。このことは、その全体が包含されているマークウォルター、Ｃ．Ｅ．；プリュドム、Ｒ．Ｋ．、「生物製剤封入のための逆フラッシュナノ沈殿：抽出プロトコルによるプロセス損失の理解（Ｉｎｖｅｒｓｅ Ｆｌａｓｈ ＮａｎｏＰｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ：Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｌｏｓｓｅｓ ｖｉａ ａｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）。」ＡＣＳシンポジウム・シリーズ（ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ）２０１７、Ｖｏｌ．１２７１、１２章、ｐｐ２７５－２９６に記載されている。
ナノ粒子の形成後、望ましい製剤を生成するために追加の処理ステップが行われ得る。ナノ粒子が水非混和性溶媒中に分散されているとき、抽出プロセスを使用して残留ＤＭＳＯを除去できる。水溶液の組成は、ポリマー安定剤の安定性を促進するように修正され得る。たとえば、水性流は、浸透圧を調整するために１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含有してもよい。糖、ＰＥＧ、またはその他のオスモライトを使用して同様の効果を達成してもよい。安定剤の溶解度を制限するためにｐＨを調整できる。酢酸またはクエン酸などの有機酸を使用でき、塩酸などの鉱酸も使用できる。同様に、水酸化アンモニウムおよび水酸化ナトリウムなどの塩基を添加できる。ホウ酸塩またはカルボン酸塩などの緩衝系を使用してもよい。抽出は、処理規模に対して許容される標準的なプロトコルを用いて３０分間以上行われ得る。界面と共に水相は廃棄され、有機相はさらなる処理のために保持される。このことは、その全体が包含されているマークウォルター、Ｃ．Ｅ．；プリュドム、Ｒ．Ｋ．、「生物製剤封入のための逆フラッシュナノ沈殿：抽出プロトコルによるプロセス損失の理解（Ｉｎｖｅｒｓｅ Ｆｌａｓｈ ＮａｎｏＰｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ：Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｌｏｓｓｅｓ ｖｉａ ａｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）。」ＡＣＳシンポジウム・シリーズ（ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ）２０１７、Ｖｏｌ．１２７１、１２章、ｐｐ２７５－２９６に記載されている。
【0064】
製剤の要件に応じて、いくつかの異なる処理経路が想定されてもよい。経路１において、非混和性溶媒相は、界面活性剤を含有する外部水相中で乳化され得る。たとえば、ナノ粒子相は、ポリ（ビニルアルコール）を含有する水中で乳化され得る。小分子またはポリマーを含む疎水性添加剤をナノ粒子油相に添加してもよい。乳化の後に、溶媒を除去してマイクロ粒子を形成できる。このプロセスは、国際公開特許の特許文献１；ペイゲルス、Ｒ．Ｆ．；プリュドム、Ｒ．Ｋ．、「ペプチド、生物製剤、および可溶性治療薬の送達のためのポリマーナノ粒子およびマイクロ粒子（Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，ａｎｄ ｓｏｌｕｂｌｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）。」ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ）２０１５、ｖｏｌ．２１９、５１９－５３５；ペイゲルス、Ｒ．Ｆ．；プリュドム、Ｒ．Ｋ．、「生物製剤封入のための逆フラッシュナノ沈殿：ナノ粒子形成および有機溶媒中でのイオン安定化（Ｉｎｖｅｒｓｅ Ｆｌａｓｈ ＮａｎｏＰｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ：Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｏｎｉｃ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｏｌｖｅｎｔｓ）。」ＡＣＳシンポジウム・シリーズ（ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ）２０１７、Ｖｏｌ．１２７１、１１章、ｐｐ２４９－２７４に記載されている。これらの参考文献は、その全体が本出願に含まれる。
【0065】
経路２では、有機溶媒を乾燥させて粉末を形成することによってナノ粒子を直接回収して、たとえば追加の賦形剤と共に錠剤化することなどの従来の経路によって処理してもよい。経路３では、（元の有機溶媒から、または溶媒交換後に）ナノ粒子を追加の賦形剤と共に噴霧乾燥して、マイクロ粒子を形成する。
【0066】
しばしば、経路１の処理に進む前に有機流を調整することが望ましい。溶媒を蒸発させて、より濃縮されたナノ粒子分散物を生成できる。追加のポリマーを結合剤、接着剤、または特性改質剤として添加できる。たとえば、乳化の前に追加の腸溶性ポリマーを添加できる。そのポリマーは、ナノ粒子安定剤と同じであってもよいし、異なっていてもよい。乳化は、水中油中ナノ粒子系を形成する。界面活性剤安定剤は、ポリ（ビニルアルコール）、プルロニック、ツイン（Ｔｗｅｅｎ）、または別の安定剤であり得る。特定の機能を達成するために、たとえば塩、糖、ｐＨ調整剤、オスモライト、または有機溶媒などの添加剤が水相に含まれてもよい。乳化は、当業者によく知られた技術を用いて行われ得る。残留有機相の除去は、好適な条件下での蒸発によって達成され得る。粒子は洗浄されて凍結乾燥されてもよい。
【0067】
経路３は、噴霧乾燥を使用する、マイクロ粒子を形成するための代替的方法である。しばしば、たとえば追加のポリマーなどの追加の賦形剤が含まれる必要があり得る。この場合、元の有機溶媒が溶解度を制限するときは、たとえばテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）などの好適な溶媒への溶媒交換を行う必要があり得る。ナノ粒子安定剤の架橋は、このステップにおけるコロイドの安定性を確保すると同時に、噴霧乾燥ステップの前に遊離ポリマーを添加することを可能にする。噴霧乾燥は、当業者によく知られた技術を用いて行われてもよい。
【0068】
水中に分散されたナノ粒子が所望されるとき、経路４は、たとえばＰＬＡ－ｂ－ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ＰＬＧＡ－ｂ－ＰＥＧ、ＰＣＬ－ｂ－ＰＥＧ、または別の両親媒性ポリマーなどの第２の安定化ポリマーで粒子をコーティングすることを含む。たとえば、非極性溶媒中のナノ粒子および安定剤を、ナノ粒子表面およびコーティングポリマーの非極性ブロックに対する非溶媒である極性溶媒と混合して、コーティングポリマーの非極性部分をナノ粒子の非極性表面に付着させることができる。一実施形態において、極性溶媒は水であるか、または水と他の溶媒もしくは塩との混合物である。これは、たとえばＤＭＳＯ、ＤＭＦ、メタノール、アセトン、テトラヒドロフラン、エタノール、またはこれらの混合物などの水混和性溶媒中に粒子を分散させることを含み得る。溶媒は、ナノ粒子を溶解しないように選択されるべきである。逆フラッシュナノ沈殿プロセスにおいて水混和性溶媒が使用されたとき、ナノ粒子は水混和性溶媒中に既に分散されていてもよい。そうでないときは、蒸留に基づく溶媒交換を通じて、またはナノ粒子を沈殿もしくは乾燥させ、それらを水混和性溶媒に再懸濁することによって、ナノ粒子を水混和性溶媒中に移し得る。次いで、ナノ粒子をコーティングするために、ナノ粒子分散物およびコーティングポリマーを、水、緩衝剤、塩溶液、または水と別の水混和性溶媒との混合物と混合できる。コーティングされたナノ粒子を凍結乾燥または噴霧乾燥して、乾燥生成物を形成してもよい。
【実施例】
【0069】
【実施例1】
【0070】
ＰＳ－ｂ－ＰＡＡによるＲＮＡの封入
トルラ・ユチリス（Ｔｏｒｕｌａ ｕｔｉｌｉｓ）由来のＲＮＡ（Ｍｒ５０００～８０００）をモデル核酸活性物質として使用し、ポリスチレン（５ｋＤａ）－ｂ－ポリ（アクリル酸）（４．８ｋＤａ）（ＰＳ－ｂ－ＰＡＡ）中に封入した。ＲＮＡを、ＲＮＡ中のリン酸基に対して０．５または１電荷当量のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（「トリス」）またはアンモニアを含む水に１００ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。ＲＮＡストック溶液をＰＳ－ｂ－ＰＡＡのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液で希釈して、５ｍｇ／ｍＬ ＲＮＡ、５ｍｇ／ｍＬ ＰＳ－ｂ－ＰＡＡ、および５ｖ％水のＤＭＳＯ溶液を生成した。このプロセス溶液（０．５ｍＬ）を拘束衝突噴流（ＣＩＪ）ミキサー内で非プロセス溶媒流（０．５ｍＬ）と迅速に混合し、ミキサーからの流出物を４ｍＬの非プロセス溶媒浴中に収集した。非プロセス溶媒は、クロロホルム（ＣＨＣｌ３）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、またはテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）のいずれかであった。表１に特定の製剤が与えられている。対照として、すべての製剤を任意のブロックコポリマーなしで試験し、結果として大きな可視ＲＮＡ凝集体が形成された。
トルラ・ユチリス（Ｔｏｒｕｌａ ｕｔｉｌｉｓ）由来のＲＮＡ（Ｍｒ５０００～８０００）をモデル核酸活性物質として使用し、ポリスチレン（５ｋＤａ）－ｂ－ポリ（アクリル酸）（４．８ｋＤａ）（ＰＳ－ｂ－ＰＡＡ）中に封入した。ＲＮＡを、ＲＮＡ中のリン酸基に対して０．５または１電荷当量のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（「トリス」）またはアンモニアを含む水に１００ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。ＲＮＡストック溶液をＰＳ－ｂ－ＰＡＡのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液で希釈して、５ｍｇ／ｍＬ ＲＮＡ、５ｍｇ／ｍＬ ＰＳ－ｂ－ＰＡＡ、および５ｖ％水のＤＭＳＯ溶液を生成した。このプロセス溶液（０．５ｍＬ）を拘束衝突噴流（ＣＩＪ）ミキサー内で非プロセス溶媒流（０．５ｍＬ）と迅速に混合し、ミキサーからの流出物を４ｍＬの非プロセス溶媒浴中に収集した。非プロセス溶媒は、クロロホルム（ＣＨＣｌ３）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、またはテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）のいずれかであった。表１に特定の製剤が与えられている。対照として、すべての製剤を任意のブロックコポリマーなしで試験し、結果として大きな可視ＲＮＡ凝集体が形成された。
【表1】
【0071】
すべての製剤は、可視凝集体のないナノ粒子をもたらした。ナノ粒子サイズ分布は、製剤において使用した非プロセス溶媒中の動的光散乱（ＤＬＳ：ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）によって測定した。マルバーン・ゼータサイザー（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ）ＤＬＳソフトウェアによるＰＫ１直径および多分散指数（ＰＤＩ：ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ ｉｎｄｅｘ）を表２に与えており、サイズ分布はサンプル１Ａ～１Ｄについて図８に、サンプル１Ｅおよび１Ｆについて図９に与えている。
【0072】
【表2】
【実施例2】
【0073】
ＰＳ－ｂ－ＰＡＡ／ＲＮＡナノ粒子の金属カチオン架橋および非封入ＲＮＡの抽出
トルラ・ユチリス（Ｔｏｒｕｌａ ｕｔｉｌｉｓ）由来のＲＮＡ（Ｍｒ５０００～８０００）をモデル核酸活性物質として使用し、ポリスチレン（５ｋＤａ）－ｂ－ポリ（アクリル酸）（４．８ｋＤａ）（ＰＳ－ｂ－ＰＡＡ）中に封入した。ＲＮＡを、ＲＮＡ中のリン酸基に対して０．５電荷当量のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（「トリス」）を含む水に１００ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。ＲＮＡストック溶液をＰＳ－ｂ－ＰＡＡのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液で希釈して、５ｍｇ／ｍＬ ＲＮＡ、５ｍｇ／ｍＬ ＰＳ－ｂ－ＰＡＡ、および５ｖ％水のＤＭＳＯ溶液を生成した。このプロセス溶液（０．５ｍＬ）を拘束衝突噴流（ＣＩＪ）ミキサー内でＣＨＣｌ３非プロセス溶媒流（０．５ｍＬ）と迅速に混合し、ミキサーからの流出物を４ｍＬのＣＨＣｌ３非プロセス溶媒浴中に収集した。なお、これは実施例１のサンプル１Ｄと同じである。最終的なナノ粒子分散物に、ＣａＣｌ２、ＺｎＣｌ２を含有するか、または塩を含有しない１００μＬのメタノールを撹拌しながら滴下添加して、ＰＡＡ中の酸基に対して１電荷当量のＣａ２＋またはＺｎ２＋が存在するようにした。金属カチオンは、ＰＡＡをイオン的に架橋してナノ粒子をさらに安定化できる。対照として、上記のプロセスをブロックコポリマーなし（大きな可視凝集体をもたらす、「ＲＮＡ対照」）、およびブロックコポリマーもＲＮＡもなし（溶媒および塩のみ、「溶媒対照」）で繰り返した。
トルラ・ユチリス（Ｔｏｒｕｌａ ｕｔｉｌｉｓ）由来のＲＮＡ（Ｍｒ５０００～８０００）をモデル核酸活性物質として使用し、ポリスチレン（５ｋＤａ）－ｂ－ポリ（アクリル酸）（４．８ｋＤａ）（ＰＳ－ｂ－ＰＡＡ）中に封入した。ＲＮＡを、ＲＮＡ中のリン酸基に対して０．５電荷当量のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（「トリス」）を含む水に１００ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。ＲＮＡストック溶液をＰＳ－ｂ－ＰＡＡのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液で希釈して、５ｍｇ／ｍＬ ＲＮＡ、５ｍｇ／ｍＬ ＰＳ－ｂ－ＰＡＡ、および５ｖ％水のＤＭＳＯ溶液を生成した。このプロセス溶液（０．５ｍＬ）を拘束衝突噴流（ＣＩＪ）ミキサー内でＣＨＣｌ３非プロセス溶媒流（０．５ｍＬ）と迅速に混合し、ミキサーからの流出物を４ｍＬのＣＨＣｌ３非プロセス溶媒浴中に収集した。なお、これは実施例１のサンプル１Ｄと同じである。最終的なナノ粒子分散物に、ＣａＣｌ２、ＺｎＣｌ２を含有するか、または塩を含有しない１００μＬのメタノールを撹拌しながら滴下添加して、ＰＡＡ中の酸基に対して１電荷当量のＣａ２＋またはＺｎ２＋が存在するようにした。金属カチオンは、ＰＡＡをイオン的に架橋してナノ粒子をさらに安定化できる。対照として、上記のプロセスをブロックコポリマーなし（大きな可視凝集体をもたらす、「ＲＮＡ対照」）、およびブロックコポリマーもＲＮＡもなし（溶媒および塩のみ、「溶媒対照」）で繰り返した。
【0074】
３０分間撹拌した後、５ｍＬの１５０ｍＭ ＮａＣｌを各５ｍＬナノ粒子（または対照）分散物の頂部に添加した。ブライン相は、ＤＭＳＯならびに任意の非封入ＲＮＡおよび塩を抽出した。任意のブロックコポリマーを伴わない対照の場合、ＲＮＡは１００％封入されない。溶液を穏やかに撹拌しながら３０分間抽出した後、水相を取り出し、水で４倍希釈した。希釈した水相の吸光度を２３０～３５０ｎｍで測定した。任意の金属添加のない抽出物（ＲＮＡもＰＳ－ｂ－ＰＡＡもない溶媒ブランク、ＰＳ－ｂ－ＰＡＡのないＲＮＡ対照、およびＲＮＡ／ＰＳ－ｂ－ＰＡＡナノ粒子）の水相の吸光度スペクトルを図１０に示す。これらのスペクトルから、ＲＮＡの大部分がＰＳ－ｂ－ＰＡＡブロックコポリマーによって封入されるために、それが水相中に抽出されることが防止されることが明らかである。２６０ｎｍでの吸光度（Ａｂｓ：ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）を使用して、以下の式を用いて封入効率（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）（％ＥＥ）を算出した。
％ＥＥ＝１００％－１００％＊｛（Ａｂｓナノ粒子抽出物－Ａｂｓ溶媒対照抽出物）／（ＡｂｓＲＮＡ対照抽出物－Ａｂｓ溶媒対照抽出物）｝
％ＥＥ＝１００％－１００％＊｛（Ａｂｓナノ粒子抽出物－Ａｂｓ溶媒対照抽出物）／（ＡｂｓＲＮＡ対照抽出物－Ａｂｓ溶媒対照抽出物）｝
【0075】
逆フラッシュナノ沈殿によって生成された逆ナノ粒子中のＲＮＡの封入効率を表３に与えている。金属カチオン架橋剤の添加によって、％ＥＥは約９４％から約９８％にわずかに増加したが、測定されたすべての封入効率は非常に高い。
【0076】
【表3】
【実施例3】
【0077】
ＰＳ－ｂ－ＰＡＡ／ＲＮＡナノ粒子のＰＳ－ｂ－ＰＥＧによるコーティング
実施例１のサンプル１ＥをＣａ２＋で架橋し、ポリスチレン（１．６ｋＤａ）－ｂ－ポリ（エチレングリコール）（５ｋＤａ）（ＰＳ－ｂ－ＰＥＧ）でコーティングした。ＣａＣｌ２（ＰＡＡに対して１電荷当量のＣａ２＋）を含有するメタノール（１００μＬ）を、ＴＨＦ中のナノ粒子の撹拌分散物に滴下添加した。ナノ粒子を３０分間架橋させた。架橋後、ナノ粒子をＰＳ－ｂ－ＰＥＧのＴＨＦ溶液で希釈して、１ｍｇ／ｍＬナノ粒子（０．５ｍｇ／ｍＬ ＰＳ－ｂ－ＰＡＡおよび０．５ｍｇ／ｍＬ ＲＮＡ）および１ｍｇ／ｍＬ ＰＳ－ｂ－ＰＥＧの最終溶液を生成した。この溶液をＣＩＪミキサー内で等体積の水と迅速に混合して水浴中に収集して、最終溶媒組成が約２５％ＴＨＦおよび約７５％水となるようにした。コーティングされたナノ粒子分散物のサイズ分布を、水中の動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した。マルバーン・ゼータサイザーＤＬＳソフトウェアにより、ＰＫ１直径は約５０ｎｍであり、多分散指数（ＰＤＩ）は０．３であった。サイズ分布を図１１に与えている。可視凝集体は存在せず、＞１０００ｎｍの広いピークはサンプル中の気泡によるものである。
実施例１のサンプル１ＥをＣａ２＋で架橋し、ポリスチレン（１．６ｋＤａ）－ｂ－ポリ（エチレングリコール）（５ｋＤａ）（ＰＳ－ｂ－ＰＥＧ）でコーティングした。ＣａＣｌ２（ＰＡＡに対して１電荷当量のＣａ２＋）を含有するメタノール（１００μＬ）を、ＴＨＦ中のナノ粒子の撹拌分散物に滴下添加した。ナノ粒子を３０分間架橋させた。架橋後、ナノ粒子をＰＳ－ｂ－ＰＥＧのＴＨＦ溶液で希釈して、１ｍｇ／ｍＬナノ粒子（０．５ｍｇ／ｍＬ ＰＳ－ｂ－ＰＡＡおよび０．５ｍｇ／ｍＬ ＲＮＡ）および１ｍｇ／ｍＬ ＰＳ－ｂ－ＰＥＧの最終溶液を生成した。この溶液をＣＩＪミキサー内で等体積の水と迅速に混合して水浴中に収集して、最終溶媒組成が約２５％ＴＨＦおよび約７５％水となるようにした。コーティングされたナノ粒子分散物のサイズ分布を、水中の動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した。マルバーン・ゼータサイザーＤＬＳソフトウェアにより、ＰＫ１直径は約５０ｎｍであり、多分散指数（ＰＤＩ）は０．３であった。サイズ分布を図１１に与えている。可視凝集体は存在せず、＞１０００ｎｍの広いピークはサンプル中の気泡によるものである。
【実施例4】
【0078】
ＰＡｓｐ－ｂ－ＰＬＡ－ｂ－ＰＥＧによるＲＮＡの封入
トルラ・ユチリス（Ｔｏｒｕｌａ ｕｔｉｌｉｓ）由来のＲＮＡ（Ｍｒ５０００～８０００）をモデル核酸活性物質として使用し、ポリ（アスパラギン酸）（５ｋＤａ）－ｂ－ポリ（乳酸）（１０ｋＤａ）－ｂ－ポリ（エチレングリコール）（５ｋＤａ）（ＰＡｓｐ－ｂ－ＰＬＡ－ｂ－ＰＥＧ）中に封入した。ＲＮＡを、ＲＮＡ中のリン酸基に対して１電荷当量のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（「トリス」）を含む水に１００ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。ＲＮＡストック溶液をＰＡｓｐ－ｂ－ＰＬＡ－ｂ－ＰＥＧのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液で希釈して、５ｍｇ／ｍＬ ＲＮＡ、１０ｍｇ／ｍＬポリマー、および５ｖ％水のＤＭＳＯ溶液を生成した。このプロセス溶液（０．５ｍＬ）を拘束衝突噴流（ＣＩＪ）ミキサー内で非プロセス溶媒流（ＴＨＦ、０．５ｍＬ）と迅速に混合し、ミキサーからの流出物を４ｍＬのＴＨＦ非プロセス溶媒浴中に収集した。ＴＨＦはＲＮＡおよびトリブロックコポリマーのＰＡｓｐブロックを沈殿させるが、ＰＬＡおよびＰＥＧブロックは可溶性のままである。ナノ粒子サイズ分布は、ＴＨＦ中の動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した。マルバーン・ゼータサイザーＤＬＳソフトウェアによるＰＫ１直径および多分散指数（ＰＤＩ）を表４に与えており、サイズ分布を図１２に与えている。
トルラ・ユチリス（Ｔｏｒｕｌａ ｕｔｉｌｉｓ）由来のＲＮＡ（Ｍｒ５０００～８０００）をモデル核酸活性物質として使用し、ポリ（アスパラギン酸）（５ｋＤａ）－ｂ－ポリ（乳酸）（１０ｋＤａ）－ｂ－ポリ（エチレングリコール）（５ｋＤａ）（ＰＡｓｐ－ｂ－ＰＬＡ－ｂ－ＰＥＧ）中に封入した。ＲＮＡを、ＲＮＡ中のリン酸基に対して１電荷当量のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（「トリス」）を含む水に１００ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。ＲＮＡストック溶液をＰＡｓｐ－ｂ－ＰＬＡ－ｂ－ＰＥＧのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液で希釈して、５ｍｇ／ｍＬ ＲＮＡ、１０ｍｇ／ｍＬポリマー、および５ｖ％水のＤＭＳＯ溶液を生成した。このプロセス溶液（０．５ｍＬ）を拘束衝突噴流（ＣＩＪ）ミキサー内で非プロセス溶媒流（ＴＨＦ、０．５ｍＬ）と迅速に混合し、ミキサーからの流出物を４ｍＬのＴＨＦ非プロセス溶媒浴中に収集した。ＴＨＦはＲＮＡおよびトリブロックコポリマーのＰＡｓｐブロックを沈殿させるが、ＰＬＡおよびＰＥＧブロックは可溶性のままである。ナノ粒子サイズ分布は、ＴＨＦ中の動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した。マルバーン・ゼータサイザーＤＬＳソフトウェアによるＰＫ１直径および多分散指数（ＰＤＩ）を表４に与えており、サイズ分布を図１２に与えている。
【0079】
【表4】
【0080】
形成後、２．８５ｍｇ／ｍＬの水酸化アンモニウムのメタノール溶液１００μＬを、撹拌中のナノ粒子溶液に滴下添加した（ＰＡｓｐの酸基に対して０．７５当量のアンモニア）。その後、ＣａＣｌ２のメタノール溶液１００μＬを撹拌中のナノ粒子に添加して、最終溶液がＰＡｓｐの酸基に対して１．２電荷当量のＣａ２＋（０．６モル当量）を有するようにした。粒子を３０分間架橋させた。次いで、架橋ナノ粒子をＣＩＪミキサー内で等体積の水と迅速に混合し、流出物を水浴中に収集して、最終溶液が約７５％の水となるようにした。水は内部のＰＬＡブロックを崩壊させる。ナノ粒子サイズ分布は、水中の動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した。マルバーン・ゼータサイザーＤＬＳソフトウェアによるＰＫ１直径および多分散指数（ＰＤＩ）を表４に与えており、サイズ分布を図１２に与えている。水中ではＰＬＡ内部ブロックが崩壊してＲＮＡ／ＰＡｓｐコアの周囲にガラス質のシェルを形成するため、粒子はＴＨＦ中よりも水中の方が小さい。ＰＤＩがより高いのは、主に、粒子と水との屈折率の差が小さいことによる低い散乱強度の影響によるものである。
【実施例5】
【0081】
ＰＡｓｐ－ｂ－ＰＬＡによるＲＮＡの封入
トルラ・ユチリス（Ｔｏｒｕｌａ ｕｔｉｌｉｓ）由来のＲＮＡ（Ｍｒ５０００～８０００）をモデル核酸活性物質として使用し、ポリ（アスパラギン酸）（２ｋＤａ）－ｂ－ポリ（乳酸）（１２ｋＤａ）中に封入した。ＲＮＡを、ＲＮＡ中のリン酸基に対して１電荷当量のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（「トリス」）を含む水に１００ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。ＲＮＡストック溶液をＰＡｓｐ－ｂ－ＰＬＡのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液で希釈して、５ｍｇ／ｍＬ ＲＮＡ、１０ｍｇ／ｍＬポリマー、および５ｖ％水（サンプル５Ａ）または１０ｖ％水（サンプル５Ｂ）のＤＭＳＯ溶液を生成した。このプロセス溶液（０．５ｍＬ）を拘束衝突噴流（ＣＩＪ）ミキサー内で非プロセス溶媒流（ＤＣＭ、０．５ｍＬ）と迅速に混合し、ミキサーからの流出物を４ｍＬのＤＣＭ非プロセス溶媒浴中に収集した。ナノ粒子サイズ分布は、ＤＣＭ中の動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した。マルバーン・ゼータサイザーＤＬＳソフトウェアによるＰＫ１直径および多分散指数（ＰＤＩ）を表５に与えており、サイズ分布を図１３に与えている。水は親水性コアの一部になるので、ナノ粒子サイズは、プロセス溶媒流中の水が５ｖ％から１０ｖ％になると増加した。
トルラ・ユチリス（Ｔｏｒｕｌａ ｕｔｉｌｉｓ）由来のＲＮＡ（Ｍｒ５０００～８０００）をモデル核酸活性物質として使用し、ポリ（アスパラギン酸）（２ｋＤａ）－ｂ－ポリ（乳酸）（１２ｋＤａ）中に封入した。ＲＮＡを、ＲＮＡ中のリン酸基に対して１電荷当量のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（「トリス」）を含む水に１００ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。ＲＮＡストック溶液をＰＡｓｐ－ｂ－ＰＬＡのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液で希釈して、５ｍｇ／ｍＬ ＲＮＡ、１０ｍｇ／ｍＬポリマー、および５ｖ％水（サンプル５Ａ）または１０ｖ％水（サンプル５Ｂ）のＤＭＳＯ溶液を生成した。このプロセス溶液（０．５ｍＬ）を拘束衝突噴流（ＣＩＪ）ミキサー内で非プロセス溶媒流（ＤＣＭ、０．５ｍＬ）と迅速に混合し、ミキサーからの流出物を４ｍＬのＤＣＭ非プロセス溶媒浴中に収集した。ナノ粒子サイズ分布は、ＤＣＭ中の動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した。マルバーン・ゼータサイザーＤＬＳソフトウェアによるＰＫ１直径および多分散指数（ＰＤＩ）を表５に与えており、サイズ分布を図１３に与えている。水は親水性コアの一部になるので、ナノ粒子サイズは、プロセス溶媒流中の水が５ｖ％から１０ｖ％になると増加した。
【0082】
【表5】
【実施例6】
【0083】
ＰＡｓｐ－ｂ－ＰＬＡ－ｂ－ＰＡｓｐによるＲＮＡおよびモデルタンパク質の共封入
トルラ・ユチリス（Ｔｏｒｕｌａ ｕｔｉｌｉｓ）由来のＲＮＡ（Ｍｒ５０００～８０００）をモデル核酸活性物質として使用し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ：ｈｏｒｓｅ ｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）をモデルタンパク質として使用した。ＲＮＡおよびＨＲＰを、ポリ（アスパラギン酸）（５ｋＤａ）－ｂ－ポリ（乳酸）（１０ｋＤａ）－ポリ（アスパラギン酸）（５ｋＤａ）（ＰＡｓｐ－ｂ－ＰＬＡ－ｂ－ＰＡｓｐ）中に封入した。ＤＭＳＯプロセス溶媒流組成物を表６に与えている。対照（６Ｄ～６Ｇ）は安定化ポリマーを含有しなかった。すべての製剤中のＲＮＡを、ＲＮＡ中のリン酸基に対して１当量のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（「トリス」）で中和した。このプロセス溶液（０．５ｍＬ）を拘束衝突噴流（ＣＩＪ）ミキサー内で非プロセス溶媒流（ＤＣＭ、０．５ｍＬ）と迅速に混合し、ミキサーからの流出物を４ｍＬのＤＣＭ非プロセス溶媒浴中に収集した。サンプル６Ａ～６Ｃには可視凝集体はなく、ナノ粒子サイズ分布をＤＣＭ中の動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した。マルバーン・ゼータサイザーＤＬＳソフトウェアによるＰＫ１直径および多分散指数（ＰＤＩ）を表７に与えており、サイズ分布を図１４に与えている。サンプル６Ｄ～６Ｆは、予想どおり大きな凝集体をもたらした。
トルラ・ユチリス（Ｔｏｒｕｌａ ｕｔｉｌｉｓ）由来のＲＮＡ（Ｍｒ５０００～８０００）をモデル核酸活性物質として使用し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ：ｈｏｒｓｅ ｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）をモデルタンパク質として使用した。ＲＮＡおよびＨＲＰを、ポリ（アスパラギン酸）（５ｋＤａ）－ｂ－ポリ（乳酸）（１０ｋＤａ）－ポリ（アスパラギン酸）（５ｋＤａ）（ＰＡｓｐ－ｂ－ＰＬＡ－ｂ－ＰＡｓｐ）中に封入した。ＤＭＳＯプロセス溶媒流組成物を表６に与えている。対照（６Ｄ～６Ｇ）は安定化ポリマーを含有しなかった。すべての製剤中のＲＮＡを、ＲＮＡ中のリン酸基に対して１当量のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（「トリス」）で中和した。このプロセス溶液（０．５ｍＬ）を拘束衝突噴流（ＣＩＪ）ミキサー内で非プロセス溶媒流（ＤＣＭ、０．５ｍＬ）と迅速に混合し、ミキサーからの流出物を４ｍＬのＤＣＭ非プロセス溶媒浴中に収集した。サンプル６Ａ～６Ｃには可視凝集体はなく、ナノ粒子サイズ分布をＤＣＭ中の動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した。マルバーン・ゼータサイザーＤＬＳソフトウェアによるＰＫ１直径および多分散指数（ＰＤＩ）を表７に与えており、サイズ分布を図１４に与えている。サンプル６Ｄ～６Ｆは、予想どおり大きな凝集体をもたらした。
【0084】
【表6】
【0085】
【表7】
【0086】
すべてのナノ粒子および対照を３ｍＬの１５０ｍＭ ＮａＣｌ水溶液で抽出して、任意の非封入ＨＲＰまたはＲＮＡを取り出した。抽出された相の吸光度を測定し、ＲＮＡ濃度を測定するために２６０ｎｍでの吸光度を用い、ＨＲＰ濃度を測定するために４００ｎｍでの吸光度を用いて、実施例２に与えられるとおりにＲＮＡおよびＨＲＰの封入効率を算出した。測定した封入効率を表８に与えている。なお、追加の共コア材料の存在は、ＲＮＡまたはＨＲＰのいずれの％ＥＥにも影響を与えない。
【0087】
【表8】
【実施例7】
【0088】
ＲＮＡのＰＡｓｐ／ＰＬＡ／ＰＥＧ ＮＰへの封入
実施例７の方法：トルラ・ユチリス（Ｔｏｒｕｌａ ｕｔｉｌｉｓ）由来のリボ核酸（ＲＮＡ）（Ｍｒ５０００～８０００）を２００ｍｇ／ｍｌにて水酸化ナトリウム水溶液（１８．７ｍｇ／ｍｌ、ＲＮＡ酸基に対して０．７５当量）に溶解した。２５ｍｇ／ｍｌのＰＡｓｐ（５ｋＤａ）－ＰＬＡ（４０ｋＤａ）－ＰＡｓｐ（５ｋＤａ）のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液を調製した。２０ｋＤａのＰＬＡブロックを有する以外は類似のブロックコポリマーを１２．５ｍｇ／ｍｌにてＤＭＳＯに溶解した。アンモニアのメタノール溶液（１．４８ｍｇ／ｍｌ、ＮＨ３主成分は３０％水酸化アンモニウム水溶液を用いて作製した）およびＣａＣｌ２二水和物のメタノール溶液（１０．６７ｍｇ／ｍｌ）も調製した。
実施例７の方法：トルラ・ユチリス（Ｔｏｒｕｌａ ｕｔｉｌｉｓ）由来のリボ核酸（ＲＮＡ）（Ｍｒ５０００～８０００）を２００ｍｇ／ｍｌにて水酸化ナトリウム水溶液（１８．７ｍｇ／ｍｌ、ＲＮＡ酸基に対して０．７５当量）に溶解した。２５ｍｇ／ｍｌのＰＡｓｐ（５ｋＤａ）－ＰＬＡ（４０ｋＤａ）－ＰＡｓｐ（５ｋＤａ）のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液を調製した。２０ｋＤａのＰＬＡブロックを有する以外は類似のブロックコポリマーを１２．５ｍｇ／ｍｌにてＤＭＳＯに溶解した。アンモニアのメタノール溶液（１．４８ｍｇ／ｍｌ、ＮＨ３主成分は３０％水酸化アンモニウム水溶液を用いて作製した）およびＣａＣｌ２二水和物のメタノール溶液（１０．６７ｍｇ／ｍｌ）も調製した。
【0089】
ＲＮＡを含有する逆ＮＰは、マルチインレットボルテックスミキサー（図１５）内で、製剤成分を含有する１つの溶媒流と、クロロホルムを含有する等しい流速の３つの貧溶媒流とによって製剤化された。溶媒流組成物は、表９に示されるストック溶液から調製した。最終ＤＭＳＯ含有量が１０体積％未満となるように、追加のクロロホルムを含有するバイアルに流出液を収集した。粒子アセンブリ後、５０μＬのカルシウム溶液を添加して、ＰＡｓｐ残基を架橋した。１５～３０分間のエージング後、５０μＬのアンモニア溶液を迅速に撹拌しながら滴下添加して架橋を促進した。動的光散乱（ＤＬＳ）分析後、ＮＰを２～８℃にて一晩エージングさせた。
【0090】
【表9】
【0091】
３０分間穏やかに撹拌しながら３ｍＬの１５０ｍＭ ＮａＣｌ水溶液で抽出することにより、残留ＤＭＳＯを除去した。水相のＲＮＡ損失をアッセイした。ＮＰバッチと、ＲＮＡまたはＲＮＡおよびＢＣＰの両方のいずれかを欠く対照とに対する２３０ｎｍ～３３０ｎｍのＵＶ－ＶＩＳ吸光度を収集した。ＲＮＡおよびＢＣＰを欠く対照によって定義されるベースラインを用いて、ＲＮＡのみを含有する対照から抽出された総量の割合として、ＮＰ製剤からの損失を報告した（実施例２を参照）。
【0092】
３．７５ｍｇのＰＬＡ－ｂ－ＰＥＧをテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中でクロロホルム分散物に添加した。次いで、このＮＰ分散物を含有する有機相を、ＴＨＦを用いた溶媒交換によって処理した。分散物は透明なままであり、凝集体を含まなかった。ＮＰをＴＨＦ中で５ｍｇ／ｍｌに濃縮し（＜５％残留ＣＨＣｌ３）、ＣＩＪ中で脱イオン水か、またはオスモライトバランサーとして作用する５０ｍｇ／ｍｌ（３００ｍＭ）ＰＥＧ（ＭＷ約３５０ｇ／ｍｏｌ）の脱イオン水溶液のいずれかに対して混合した。分散物は透明であり、凝集体を含まなかった。そのサイズおよびゼータ電位をＤＬＳによって特徴付けた。分散物を３００ｋＤａカットオフポール（Ｐａｌｌ）フィルターで濾過した。フロースルー（ＦＴ：ｆｌｏｗ－ｔｈｒｏｕｇｈ）またはＤＭＳＯで１０倍希釈したＮＰ分散物のいずれかのＵＶ－ＶＩＳ分析によって、ＥＥを決定した。２８０ｎｍでのＵＶ－ＶＩＳシグナルを使用して、全溶液に対するＦＴ中の画分含有量を算出した。適切なＴＨＦ含有量を含む水溶液を希釈することによって、ベースラインを定めた。
【0093】
実施例７の結果：最初に、ＰＡｓｐ５－ＰＬＡ２０－ＰＡｓｐ５によって安定化された逆ＮＰをある範囲の条件下で合成した（表９、図１６）。最も狭いサイズ分布を有し、凝集体を欠いた候補（製剤「７Ｃ」）は、ＤＭＳＯ流中に３．７５ｍＭ ＮａＣｌを含有した（より高濃度の水溶液として添加された）。次いで、ＰＡｓｐ５－ＰＬＡ４０－ＰＡｓｐ５ＢＣＰを使用して、この製剤を３つ組で調製した（製剤「７Ｄ」）。ＢＣＰ濃度を増加させて、ＲＮＡとＰＡｓｐブロックとの一定の質量比を維持した。表１０に要約されるとおり、製剤Ｄの３つ組をＤＬＳによって特徴付けた。この製剤は非常に小さいが、処理に対して高度に安定であり、再現性があり、かつＢＣＰ安定剤を含有しない対照と明確に区別された。逆ＮＰの形成において、これらの対照は大きな凝集体および濁った溶液を生成した。コーティングステップにおいて、ＰＥＧ ＢＣＰのない対照は、高度に負のゼータ電位（－４２ｍＶ）を有する大きなＮＰ（約４００ｎｍ）を生成した。
【0094】
【表10】
【0095】
ｉＦＮＰおよびコーティングステップの両方について封入効率を測定した。逆ＮＰは、ＢＣＰなしの対照に基づいて算出された９５％±１％のＥＥを有した。貧溶媒が脱イオン水であったとき、コーティングステップは４８％±７％のＥＥを有した。ＮＰ膨潤を防止するための浸透圧バランスとして作用するＰＥＧオリゴマー溶液（濃度３００ｍＭ）の使用によって、ＥＥはわずかに増加して５２％±３％となった。この濃度は、ＮＰコア中の高濃度の帯電部分によって生じる強力な浸透圧駆動力を克服するために十分な高さではないようだった。このことは、２つの貧溶媒の選択に対するＤＬＳ特性の高い一致によってさらに支持される。
【実施例8】
【0096】
デキストラン－分岐－ＰＬＧＡを合成するための方法
これは、デキストラン骨格およびＰＬＡまたはＰＬＧＡ側鎖を有する櫛形ポリマーを作製する方法の例であることに留意されたい。しかし、ナノ粒子を安定化するために使用され得る櫛形ポリマーは、これらの組成物またはこの方法によって生成されることに限定されない。
これは、デキストラン骨格およびＰＬＡまたはＰＬＧＡ側鎖を有する櫛形ポリマーを作製する方法の例であることに留意されたい。しかし、ナノ粒子を安定化するために使用され得る櫛形ポリマーは、これらの組成物またはこの方法によって生成されることに限定されない。
【0097】
ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）およびポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）酸をデキストラン骨格上にグラフト化して、櫛形ポリマーを生成した。方法１では、最初に単官能性ヒドロキシル末端ＰＬＧＡを酸末端ＰＬＧＡに転換する。トルエンから１０グラムのモノヒドロキシル末端ＰＬＧＡ（５０：５０ Ｌ：Ｇ、約６、約１６、または約２４ｋＤａ）を乾燥させた。ＰＬＧＡに３モル当量の４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ：ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ）および４モル当量の無水コハク酸を添加し、混合物を高真空下で乾燥させた。ＰＬＧＡ、ＤＭＡＰ、および無水コハク酸を２０ｍＬの無水ＤＣＭに溶解し、次いで３モル当量のトリメチルアミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）（ＴＥＡ）を溶液に添加した。反応を４８時間進行させた後、溶液を氷上で冷却し、冷０．５Ｍ ＨＣｌで洗浄してＤＭＡＰおよびＴＥＡを除去し、続いて冷水で洗浄した。次いで、ポリマーを過剰量の氷冷イソプロピルアルコール（ＩＰＡ：ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）中で３回沈殿させ、最後にヘキサン中で沈殿させ、高真空下で乾燥させた。ヒドロキシル基のカルボン酸への転換をＮＭＲによって確認した。ポリマー（１ｇ）を涙形フラスコ中でトルエンから乾燥させ、その後ＤＭＡＰ（２当量）および（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩（ｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）（ＥＤＣ、３当量）をポリマーに添加し、混合物を高真空下で乾燥させた。デキストラン（約１０ｋＤａ）を秤量し、丸底フラスコ中でトルエンから乾燥させ、高真空下で乾燥させた。デキストランの質量を変化させて、異なる重量％ＰＬＧＡ（６ｋＤａ ＰＬＧＡについては６５、７０、７５、および８０重量％ＰＬＧＡ、１６ｋＤａ ＰＬＧＡについては７５、８０、８５、および９０重量％ＰＬＧＡ、２４ｋＤａ ＰＬＧＡについては８０、８５、９０、および９２．５重量％ＰＬＧＡ）を有するデキストラン－分岐－ＰＬＧＡを標的とした。乾燥後、１０ｍＬの無水ＤＭＳＯをデキストランに添加し、２０ｍＬの無水ＤＭＳＯをＰＬＧＡ／ＤＭＡＰ／ＥＤＣに添加した。すべての材料が溶解してから、ＰＬＧＡ溶液をアルゴン下で撹拌中のデキストラン溶液に滴下添加した。ＰＬＧＡの酸末端とデキストランのヒドロキシル基とのエステル化を５日間進行させた。完了時に反応物をＤＣＭで４倍希釈し、氷上で冷却した。デキストランはＤＣＭ中で崩壊せず、ＰＬＧＡがコンジュゲートしたことを示した。溶液を氷冷０．１Ｍ ＨＣｌで３回洗浄し、続いて氷冷水で３回洗浄した。ポリマーを含有するＤＣＭ相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、０．２ミクロンフィルターで濾過して過剰の硫酸マグネシウムを除去した。次いで、ポリマーを濃縮し、ヘキサン中で沈殿させ、高真空下で乾燥させた。
【0098】
方法２では、同じ手順に従ったが、出発材料は対称的なジヒドロキシ末端ＨＯ－ＰＬＡ－ＳＳ－ＰＬＡ－ＯＨであった。総ＰＬＡ分子量は２０ｋＤａであり、ジスルフィドが切断されたときに２つの１０ｋＤａのＰＬＡ鎖がもたらされる。方法１において与えられる無水コハク酸の開環によって、ＰＬＡのヒドロキシル末端基をカルボン酸に転換した。次いで、方法１において与えられるＥＤＣ媒介エステル化によって、ＰＬＡ上の酸基を１０ｋＤａデキストランにコンジュゲートし、かつ方法１において与えられるとおりに精製した。４００ｍｇの最終ポリマーは、８０重量％ＰＬＡ、２０重量％デキストランであった。ポリマーを、１００μＬのトリブチルホスフィンを含む２０ｍＬの乾燥ＣＨＣｌ３に溶解してジスルフィドを還元した。２時間後、過剰量のヘキサンおよびジエチルエーテル（１：１）のドライアイス冷却混合物中でポリマーを３回沈殿させた。ポリマーを高真空下で一晩乾燥させて、任意の残留溶媒を除去した。ＰＬＡコロナを有する逆ナノ粒子では、ＰＬＡ鎖の末端のチオール基を架橋して、その後の処理ステップ中にナノ粒子を安定化できる。たとえば、チオールは、複数のアクリレート基を有するポリマーまたは小分子（たとえばトリアクリレートなど）を使用して架橋され得る。
【実施例9】
【0099】
デキストラン－分岐－ＰＬＡを用いたブルーデキストランの封入および処理
ブルーデキストラン（Ｂｌｕｅ ｄｅｘｔｒａｎ）（ＢＤ、５ｋＤａまたは２０ｋＤａ）を、デキストラン－分岐－ＰＬＡ（１０ｋＤａデキストラン、１０ｋＤａ ＰＬＡ側鎖、８０重量％ＰＬＡ）（Ｄｅｘ－ＰＬＡ）によって安定化された逆ナノ粒子中に封入した。ＢＤおよびＤｅｘ－ＰＬＡを、表１１に与えられる濃度でＤＭＳＯに溶解した。場合によっては、少量の水がＤＭＳＯプロセス溶媒に含まれた（表１１を参照）。このプロセス溶液（０．５ｍＬ）を拘束衝突噴流（ＣＩＪ）ミキサー内で非プロセス溶媒流（表１１に示すＤＣＭまたはＣＨＣｌ３、０．５ｍＬ）と迅速に混合し、ミキサーからの流出物を４ｍＬの非プロセス溶媒浴（ＤＣＭまたはＣＨＣｌ３）中に収集した。サンプル９Ａ～９Ｈには可視凝集体はなく、ナノ粒子サイズ分布をＤＣＭ中の動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した。マルバーン・ゼータサイザーＤＬＳソフトウェアによるＰＫ１直径および多分散指数（ＰＤＩ）を表１２に与えており、サイズ分布はサンプル９Ａ～９Ｃについて図１７に、サンプル９Ｄ～９Ｈについて図１８に与えている。
ブルーデキストラン（Ｂｌｕｅ ｄｅｘｔｒａｎ）（ＢＤ、５ｋＤａまたは２０ｋＤａ）を、デキストラン－分岐－ＰＬＡ（１０ｋＤａデキストラン、１０ｋＤａ ＰＬＡ側鎖、８０重量％ＰＬＡ）（Ｄｅｘ－ＰＬＡ）によって安定化された逆ナノ粒子中に封入した。ＢＤおよびＤｅｘ－ＰＬＡを、表１１に与えられる濃度でＤＭＳＯに溶解した。場合によっては、少量の水がＤＭＳＯプロセス溶媒に含まれた（表１１を参照）。このプロセス溶液（０．５ｍＬ）を拘束衝突噴流（ＣＩＪ）ミキサー内で非プロセス溶媒流（表１１に示すＤＣＭまたはＣＨＣｌ３、０．５ｍＬ）と迅速に混合し、ミキサーからの流出物を４ｍＬの非プロセス溶媒浴（ＤＣＭまたはＣＨＣｌ３）中に収集した。サンプル９Ａ～９Ｈには可視凝集体はなく、ナノ粒子サイズ分布をＤＣＭ中の動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した。マルバーン・ゼータサイザーＤＬＳソフトウェアによるＰＫ１直径および多分散指数（ＰＤＩ）を表１２に与えており、サイズ分布はサンプル９Ａ～９Ｃについて図１７に、サンプル９Ｄ～９Ｈについて図１８に与えている。
【0100】
【表11】
【0101】
【表12】
【0102】
ナノ粒子有機相の頂部に３ｍＬの１５０ｍＭ ＮａＣｌを添加して、３０分間穏やかに撹拌することによってＤＭＳＯを抽出した（いわゆる「ブライン抽出」）。抽出後、ナノ粒子を含有する有機相を取り出した。サンプル９Ａについては、逆ナノ粒子にＴＨＦを添加し、４０℃での回転蒸発によって濃縮し、４回繰り返して水不溶性ＤＣＭを除去することによる蒸発溶媒交換を行った。サンプル９Ｂ～９Ｈについては、ナノ粒子を８倍過剰量のヘキサン中で沈殿させ、遠心分離によって回収した。沈殿したナノ粒子をイソプロピルアルコールで洗浄し、次いでポリ（乳酸）（４．６ｋＤａ）－ｂ－ポリ（エチレングリコール）（５ｋＤａ）（ＰＬＡ－ｂ－ＰＥＧ）を含むＴＨＦ中に再分散させた。ＰＬＡ－ｂ－ＰＥＧ：Ｄｅｘ－ＰＬＡ：ＢＤの最終比は５：５：２であり、最終総質量濃度（ＰＬＡ－ｂ－ＰＥＧ＋Ｄｅｘ－ＰＬＡ＋ＢＤ）は２４ｍｇ／ｍＬであった。次いで、ナノ粒子溶液をＣＩＪミキサー内で等体積の水と迅速に混合して水浴中に収集して、最終溶媒混合物が１０ｖ％ＴＨＦとなるようにした。ナノ粒子サイズ分布をＤＬＳによって測定し、マルバーン・ソフトウェアによるＰＫ１直径およびＰＤＩを表１３に与えている。封入効率は、３００ｋＤａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔ－ｏｆｆ）ポールフィルターを使用して、ナノ粒子分散物から非封入ＢＤを分離することによって測定した。ブルーデキストラン濃度はＵＶ－Ｖｉｓによって測定した。結果として得られた封入効率を表１３に与えている。全般的に封入効率は高く、６５～７５％程度であった。いくつかの場合には、過剰なＰＬＡ－ｂ－ＰＥＧが別個のミセル相（約４０ｎｍ）を形成したためにＰＤＩが高かった。
【0103】
【表13】
【実施例10】
【0104】
デキストラン－分岐－ＰＬＡを使用したＴＨＦ貧溶媒によるブルーデキストランの封入および処理
ブルーデキストラン（ＢＤ、２０ｋＤａ）を、デキストラン－分岐－ＰＬＡ（１０ｋＤａデキストラン、１０ｋＤａ ＰＬＡ側鎖、８０重量％ＰＬＡ）（Ｄｅｘ－ＰＬＡ）によって安定化された逆ナノ粒子中に封入した。ＢＤ（５ｍｇ／ｍＬ）およびＤｅｘ－ＰＬＡ（１２．５ｍｇ／ｍＬ）をＤＭＳＯに溶解した。このプロセス溶液（０．５ｍＬ）を拘束衝突噴流（ＣＩＪ）ミキサー内でＴＨＦ非プロセス溶媒流と迅速に混合し、流出物を空のバイアル（希釈なし）に収集した。ナノ粒子サイズ分布は、ＴＨＦ中の動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した。マルバーン・ゼータサイザーＤＬＳソフトウェアにより、ＰＫ１直径は１１５ｎｍであり、多分散指数（ＰＤＩ）は０．０７であった。
ブルーデキストラン（ＢＤ、２０ｋＤａ）を、デキストラン－分岐－ＰＬＡ（１０ｋＤａデキストラン、１０ｋＤａ ＰＬＡ側鎖、８０重量％ＰＬＡ）（Ｄｅｘ－ＰＬＡ）によって安定化された逆ナノ粒子中に封入した。ＢＤ（５ｍｇ／ｍＬ）およびＤｅｘ－ＰＬＡ（１２．５ｍｇ／ｍＬ）をＤＭＳＯに溶解した。このプロセス溶液（０．５ｍＬ）を拘束衝突噴流（ＣＩＪ）ミキサー内でＴＨＦ非プロセス溶媒流と迅速に混合し、流出物を空のバイアル（希釈なし）に収集した。ナノ粒子サイズ分布は、ＴＨＦ中の動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した。マルバーン・ゼータサイザーＤＬＳソフトウェアにより、ＰＫ１直径は１１５ｎｍであり、多分散指数（ＰＤＩ）は０．０７であった。
【0105】
ＰＬＡ－ｂ－ＰＥＧ（４ｍｇ）をナノ粒子に添加して、５ｍｇ／ｍＬのＰＬＡ－ｂ－ＰＥＧおよび８．７５ｍｇ／ｍＬのナノ粒子（６．２５ｍｇ／ｍＬのＤｅｘ－ＰＬＡおよび２．５ｍｇ／ｍＬのＢＤ）を含む溶液を生成した。溶液をＣＩＪミキサー内で等体積の水と迅速に混合して水浴中に収集して、最終溶媒組成が１：１：１８のＴＨＦ：ＤＭＳＯ：水となるようにした。コーティングされたナノ粒子のサイズ分布を、水中の動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した。マルバーン・ゼータサイザーＤＬＳソフトウェアにより、ＰＫ１直径は７０ｎｍであり、多分散指数（ＰＤＩ）は０．１５であった。封入効率は、３００ｋＤａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔ－ｏｆｆ）ポールフィルターを使用して、ナノ粒子分散物から非封入ＢＤを分離することによって測定した。ブルーデキストラン濃度はＵＶ－Ｖｉｓによって測定した。結果として得られた封入効率は５３％であった。
【実施例11】
【0106】
デキストラン－分岐－ＰＬＡを用いたナトリウム塩形態のＲＮＡの封入および処理
トルラ・ユチリス（Ｔｏｒｕｌａ ｕｔｉｌｉｓ）由来のＲＮＡ（Ｍｒ５０００～８０００）をモデル核酸活性物質として使用し、Ｄｅｘ－ＰＬＡ（１０ｋＤａデキストラン、１０ｋＤａ ＰＬＡ分岐部、８０重量％ＰＬＡ）中に封入した。ＲＮＡを、ＲＮＡ中のリン酸基に対して０．７５または１電荷当量のＮａＯＨを含む水に２００ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解して、ナトリウム塩を形成した（表１４を参照）。ＲＮＡストック溶液を、Ｄｅｘ－ＰＬＡのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液と、水と、３００ｍＭ ＮａＣｌ水溶液とで希釈して、５ｍｇ／ｍＬ ＲＮＡ、１２．５ｍｇ／ｍＬポリマー、および５ｖ％水を含み、かつ０、３．７５、または７．５ｍＭの総ＮａＣｌ濃度を有する溶液を生成した（表１４を参照）。すべての製剤情報を表１４に提供している。このプロセス溶液（０．５ｍＬ）をマルチインレットボルテックスミキサー（ＭＩＶＭ）内で３つの非プロセス溶媒流（ＣＨＣｌ３、各０．５ｍＬ）と迅速に混合し、ミキサーからの流出物を３ｍＬのＣＨＣｌ３非プロセス溶媒浴中に収集した。ナノ粒子サイズ分布は、ＣＨＣｌ３中の動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した。マルバーン・ゼータサイザーＤＬＳソフトウェアによるＰＫ１直径および多分散指数（ＰＤＩ）を表１５に与えており、サンプル１１Ｄのサイズ分布を図１９に与えている。サンプル１１Ａおよび１１Ｄは透明な溶液をもたらしたが、サンプル１１Ｂおよび１１Ｃは濁っていた（サンプル１１Ｂは最も濁っていたため、ＤＬＳ測定を行わなかった）。
トルラ・ユチリス（Ｔｏｒｕｌａ ｕｔｉｌｉｓ）由来のＲＮＡ（Ｍｒ５０００～８０００）をモデル核酸活性物質として使用し、Ｄｅｘ－ＰＬＡ（１０ｋＤａデキストラン、１０ｋＤａ ＰＬＡ分岐部、８０重量％ＰＬＡ）中に封入した。ＲＮＡを、ＲＮＡ中のリン酸基に対して０．７５または１電荷当量のＮａＯＨを含む水に２００ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解して、ナトリウム塩を形成した（表１４を参照）。ＲＮＡストック溶液を、Ｄｅｘ－ＰＬＡのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液と、水と、３００ｍＭ ＮａＣｌ水溶液とで希釈して、５ｍｇ／ｍＬ ＲＮＡ、１２．５ｍｇ／ｍＬポリマー、および５ｖ％水を含み、かつ０、３．７５、または７．５ｍＭの総ＮａＣｌ濃度を有する溶液を生成した（表１４を参照）。すべての製剤情報を表１４に提供している。このプロセス溶液（０．５ｍＬ）をマルチインレットボルテックスミキサー（ＭＩＶＭ）内で３つの非プロセス溶媒流（ＣＨＣｌ３、各０．５ｍＬ）と迅速に混合し、ミキサーからの流出物を３ｍＬのＣＨＣｌ３非プロセス溶媒浴中に収集した。ナノ粒子サイズ分布は、ＣＨＣｌ３中の動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した。マルバーン・ゼータサイザーＤＬＳソフトウェアによるＰＫ１直径および多分散指数（ＰＤＩ）を表１５に与えており、サンプル１１Ｄのサイズ分布を図１９に与えている。サンプル１１Ａおよび１１Ｄは透明な溶液をもたらしたが、サンプル１１Ｂおよび１１Ｃは濁っていた（サンプル１１Ｂは最も濁っていたため、ＤＬＳ測定を行わなかった）。
【0107】
【表14】
【0108】
【表15】
【0109】
逆ナノ粒子を３ｍＬの１５０ｍＭ ＮａＣｌ水溶液で抽出して、ＤＭＳＯおよび任意の非封入ＲＮＡを取り出した。ブライン相をＵＶ－Ｖｉｓによって分析して、表１６に与える初期逆フラッシュナノ沈殿ステップの封入効率（「ｉＦＮＰ％ＥＥ」）を決定した。場合によっては、抽出後のナノ粒子に対してＤＬＳ測定を行った（表１５）。次いで、ナノ粒子を８倍体積過剰量のヘキサン中で沈殿させ、溶液から遠心分離した。ナノ粒子を乾燥させることなく、ペレットからできる限り多くのヘキサンを除去するように注意した。次いで、５ｍｇ／ｍＬ ＰＬＡ－ｂ－ＰＥＧを含むＴＨＦ中に粒子を再分散させて、５ｍｇ／ｍＬ ＰＬＡ－ｂ－ＰＥＧおよび７ｍｇ／ｍＬナノ粒子（２ｍｇ／ｍＬ ＲＮＡおよび５ｍｇ／ｍＬ Ｄｅｘ－ＰＬＡ）を含む溶液を生成した。場合によっては、ＴＨＦ中に再分散させたナノ粒子に対してＤＬＳ測定を行った（表１５）。この溶液をＣＩＪミキサー内で等体積の水と迅速に混合して水浴中に収集して、最終溶液が１０ｖ％ＴＨＦとなるようにした。３００ｋＤａ ＭＷＣＯポールフィルターを使用してナノ粒子から非封入ＲＮＡを分離し、封入ＲＮＡおよび非封入ＲＮＡの量をＵＶ－Ｖｉｓによってアッセイした。コーティングプロセスの封入効率（「コーティング％ＥＥ」）を表１６に与えている。ナノ粒子サイズ分布を水中でＤＬＳによって測定し、ＰＫ１直径およびＰＤＩを表１６に与えている。図１９は、ＣＨＣｌ３中での作製時、ブライン抽出後、ＴＨＦ中の再分散、および水中でのコーティングというプロセス全体にわたるサンプル１０Ｄを示す。
【0110】
【表16】
【実施例12】
【0111】
デキストラン－分岐－ＰＬＧＡを用いたナトリウム塩形態のＲＮＡの封入および処理
トルラ・ユチリス（Ｔｏｒｕｌａ ｕｔｉｌｉｓ）由来のＲＮＡ（Ｍｒ５０００～８０００）をモデル核酸活性物質として使用し、Ｄｅｘ－ＰＬＧＡ（１０ｋＤａデキストラン、１６ｋＤａ ＰＬＧＡ分岐部、８０重量％ＰＬＧＡ）中に封入した。ＲＮＡを、ＲＮＡ中のリン酸基に対して１電荷当量のＮａＯＨを含む水に２００ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解して、ナトリウム塩を形成した。ＲＮＡストック溶液を、Ｄｅｘ－ＰＬＡのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液と、３００ｍＭ ＮａＣｌ水溶液とで希釈して、５ｍｇ／ｍＬ ＲＮＡ、１２．５ｍｇ／ｍＬポリマー、および５ｖ％水を含み、かつ７．５ｍＭの総ＮａＣｌ濃度を有する溶液を生成した。このプロセス溶液（０．５ｍＬ）をマルチインレットボルテックスミキサー（ＭＩＶＭ）内で３つの非プロセス溶媒流（ＣＨＣｌ３、各０．５ｍＬ）と迅速に混合し、ミキサーからの流出物を３ｍＬのＣＨＣｌ３非プロセス溶媒浴中に収集した。ナノ粒子サイズ分布は、ＣＨＣｌ３中の動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した。マルバーン・ゼータサイザーＤＬＳソフトウェアにより、ＰＫ１直径は２６０ｎｍであり、多分散指数（ＰＤＩ）は０．２７であった。ＣＨＣｌ３中のナノ粒子のサイズ分布を図２０に与えている。
トルラ・ユチリス（Ｔｏｒｕｌａ ｕｔｉｌｉｓ）由来のＲＮＡ（Ｍｒ５０００～８０００）をモデル核酸活性物質として使用し、Ｄｅｘ－ＰＬＧＡ（１０ｋＤａデキストラン、１６ｋＤａ ＰＬＧＡ分岐部、８０重量％ＰＬＧＡ）中に封入した。ＲＮＡを、ＲＮＡ中のリン酸基に対して１電荷当量のＮａＯＨを含む水に２００ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解して、ナトリウム塩を形成した。ＲＮＡストック溶液を、Ｄｅｘ－ＰＬＡのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液と、３００ｍＭ ＮａＣｌ水溶液とで希釈して、５ｍｇ／ｍＬ ＲＮＡ、１２．５ｍｇ／ｍＬポリマー、および５ｖ％水を含み、かつ７．５ｍＭの総ＮａＣｌ濃度を有する溶液を生成した。このプロセス溶液（０．５ｍＬ）をマルチインレットボルテックスミキサー（ＭＩＶＭ）内で３つの非プロセス溶媒流（ＣＨＣｌ３、各０．５ｍＬ）と迅速に混合し、ミキサーからの流出物を３ｍＬのＣＨＣｌ３非プロセス溶媒浴中に収集した。ナノ粒子サイズ分布は、ＣＨＣｌ３中の動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した。マルバーン・ゼータサイザーＤＬＳソフトウェアにより、ＰＫ１直径は２６０ｎｍであり、多分散指数（ＰＤＩ）は０．２７であった。ＣＨＣｌ３中のナノ粒子のサイズ分布を図２０に与えている。
【0112】
逆ナノ粒子を３ｍＬの１５０ｍＭ ＮａＣｌ水溶液で抽出して、ＤＭＳＯおよび任意の非封入ＲＮＡを取り出した。ブライン相をＵＶ－Ｖｉｓによって分析して、初期逆フラッシュナノ沈殿ステップの封入効率（「ｉＦＮＰ％ＥＥ」）を決定し、これは８８％であることが見出された（ＲＮＡの１２％が抽出された）。次いで、ナノ粒子を８倍体積過剰量のヘキサン中で沈殿させ、溶液から遠心分離した。ナノ粒子を乾燥させることなく、ペレットからできる限り多くのヘキサンを除去するように注意した。次いで、５ｍｇ／ｍＬ ＰＬＡ－ｂ－ＰＥＧを含むＴＨＦ中に粒子を再分散させて、５ｍｇ／ｍＬ ＰＬＡ－ｂ－ＰＥＧおよび７ｍｇ／ｍＬナノ粒子（２ｍｇ／ｍＬ ＲＮＡおよび５ｍｇ／ｍＬ Ｄｅｘ－ＰＬＧＡ）を含む溶液を生成した。この溶液をＣＩＪミキサー内で等体積の水と迅速に混合して水浴中に収集して、最終溶液が１０ｖ％ＴＨＦとなるようにした。３００ｋＤａ ＭＷＣＯポールフィルターを使用してナノ粒子から非封入ＲＮＡを分離し、封入ＲＮＡおよび非封入ＲＮＡの量をＵＶ－Ｖｉｓによってアッセイした。コーティングプロセスの封入効率（「コーティング％ＥＥ」）は、６６％であることが見出された。ナノ粒子サイズ分布を水中でＤＬＳによって測定し、ＰＫ１直径は１９０ｎｍであり、ＰＤＩは０．５であった。図２０は、コーティング後の粒径分布を示す。高いＰＤＩは、有意なＰＬＡ－ｂ－ＰＥＧミセル集団の存在によるものである。
【実施例13】
【0113】
デキストラン－分岐－ＰＬＡを用いたリチウム塩形態のＲＮＡの封入および処理
トルラ・ユチリス（Ｔｏｒｕｌａ ｕｔｉｌｉｓ）由来のＲＮＡ（Ｍｒ５０００～８０００）をモデル核酸活性物質として使用し、Ｄｅｘ－ＰＬＡ（１０ｋＤａデキストラン、１０ｋＤａ ＰＬＡ分岐部、８０重量％ＰＬＡ）中に封入した。ＲＮＡを、ＲＮＡ中のリン酸基に対して１電荷当量のＬｉＯＨを含む水に２００ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解して、リチウム塩を形成した。ＲＮＡストック溶液を、Ｄｅｘ－ＰＬＡのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液と、３００ｍＭ ＬｉＣｌ水溶液とで希釈して、５ｍｇ／ｍＬ ＲＮＡ、１２．５ｍｇ／ｍＬポリマー、および５ｖ％水を含み、かつ７．５ｍＭの総ＬｉＣｌ濃度を有する溶液を生成した。このプロセス溶液（０．５ｍＬ）をマルチインレットボルテックスミキサー（ＭＩＶＭ）内で３つの非プロセス溶媒流（ＣＨＣｌ３、各０．５ｍＬ）と迅速に混合し、ミキサーからの流出物を３ｍＬのＣＨＣｌ３非プロセス溶媒浴中に収集した。ナノ粒子サイズ分布は、ＣＨＣｌ３中の動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した。マルバーン・ゼータサイザーＤＬＳソフトウェアにより、ＰＫ１直径は１９０ｎｍであり、多分散指数（ＰＤＩ）は０．２８であった。ＣＨＣｌ３中のナノ粒子のサイズ分布を図２１に与えている。
トルラ・ユチリス（Ｔｏｒｕｌａ ｕｔｉｌｉｓ）由来のＲＮＡ（Ｍｒ５０００～８０００）をモデル核酸活性物質として使用し、Ｄｅｘ－ＰＬＡ（１０ｋＤａデキストラン、１０ｋＤａ ＰＬＡ分岐部、８０重量％ＰＬＡ）中に封入した。ＲＮＡを、ＲＮＡ中のリン酸基に対して１電荷当量のＬｉＯＨを含む水に２００ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解して、リチウム塩を形成した。ＲＮＡストック溶液を、Ｄｅｘ－ＰＬＡのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液と、３００ｍＭ ＬｉＣｌ水溶液とで希釈して、５ｍｇ／ｍＬ ＲＮＡ、１２．５ｍｇ／ｍＬポリマー、および５ｖ％水を含み、かつ７．５ｍＭの総ＬｉＣｌ濃度を有する溶液を生成した。このプロセス溶液（０．５ｍＬ）をマルチインレットボルテックスミキサー（ＭＩＶＭ）内で３つの非プロセス溶媒流（ＣＨＣｌ３、各０．５ｍＬ）と迅速に混合し、ミキサーからの流出物を３ｍＬのＣＨＣｌ３非プロセス溶媒浴中に収集した。ナノ粒子サイズ分布は、ＣＨＣｌ３中の動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した。マルバーン・ゼータサイザーＤＬＳソフトウェアにより、ＰＫ１直径は１９０ｎｍであり、多分散指数（ＰＤＩ）は０．２８であった。ＣＨＣｌ３中のナノ粒子のサイズ分布を図２１に与えている。
【0114】
逆ナノ粒子を３ｍＬの１５０ｍＭ ＮａＣｌ水溶液で抽出して、ＤＭＳＯおよび任意の非封入ＲＮＡを取り出した。ブライン相をＵＶ－Ｖｉｓによって分析して、初期逆フラッシュナノ沈殿ステップの封入効率（「ｉＦＮＰ％ＥＥ」）を決定し、これは９３％であることが見出された（ＲＮＡの７％が抽出された）。次いで、ナノ粒子を８倍体積過剰量のヘキサン中で沈殿させ、溶液から遠心分離した。ナノ粒子を乾燥させることなく、ペレットからできる限り多くのヘキサンを除去するように注意した。次いで、５ｍｇ／ｍＬ ＰＬＡ－ｂ－ＰＥＧを含むＴＨＦ中に粒子を再分散させて、５ｍｇ／ｍＬ ＰＬＡ－ｂ－ＰＥＧおよび７ｍｇ／ｍＬナノ粒子（２ｍｇ／ｍＬ ＲＮＡおよび５ｍｇ／ｍＬ Ｄｅｘ－ＰＬＡ）を含む溶液を生成した。この溶液をＣＩＪミキサー内で等体積の水と迅速に混合して水浴中に収集して、最終溶液が１０ｖ％ＴＨＦとなるようにした。３００ｋＤａ ＭＷＣＯポールフィルターを使用してナノ粒子から非封入ＲＮＡを分離し、封入ＲＮＡおよび非封入ＲＮＡの量をＵＶ－Ｖｉｓによってアッセイした。コーティングプロセスの封入効率（「コーティング％ＥＥ」）は、６１％であることが見出された。ナノ粒子サイズ分布を水中でＤＬＳによって測定し、ＰＫ１直径は１４５ｎｍであり、ＰＤＩは０．３６であった。図２１は、コーティング後の粒径分布を示す。高いＰＤＩは、有意なＰＬＡ－ｂ－ＰＥＧミセル集団の存在によるものである。
【実施例14】
【0115】
デキストラン－分岐－ＰＬＡを用いたポリミキシンＢの封入
ポリミキシンＢ（ＰＭＢ：Ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ Ｂ）をモデルペプチド活性物質として使用し、Ｄｅｘ－ＰＬＡ（１０ｋＤａデキストラン、１０ｋＤａ ＰＬＡ分岐部、８０重量％ＰＬＡ）中に封入した。ＰＭＢを３０ｍｇ／ｍＬにてＤＭＳＯに一晩溶解した。ＰＭＢストック溶液をＤｅｘ－ＰＬＡのＤＭＳＯ溶液で希釈して、５ｍｇ／ｍＬ ＰＭＢおよび１２．５ｍｇ／ｍＬポリマーを含む溶液を生成した。水はプロセス溶媒に添加しなかった。このプロセス溶液（０．５ｍＬ）をＣＩＪミキサー内で非プロセス溶媒流（０．５ｍＬ）と迅速に混合し、ミキサーからの流出物を４ｍＬの非プロセス溶媒浴中に収集した。使用した非プロセス溶媒は、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、酢酸エチル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、およびアセトンであった。試験したすべての非プロセス溶媒は、可視凝集体が存在しない透明なナノ粒子溶液をもたらした。ナノ粒子サイズ分布は、非プロセス溶媒中の動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した。マルバーン・ゼータサイザーＤＬＳソフトウェアによるＰＫ１直径および多分散指数（ＰＤＩ）を、各製剤について表１７に与えている。ナノ粒子のサイズ分布を図２２に与えている。
ポリミキシンＢ（ＰＭＢ：Ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ Ｂ）をモデルペプチド活性物質として使用し、Ｄｅｘ－ＰＬＡ（１０ｋＤａデキストラン、１０ｋＤａ ＰＬＡ分岐部、８０重量％ＰＬＡ）中に封入した。ＰＭＢを３０ｍｇ／ｍＬにてＤＭＳＯに一晩溶解した。ＰＭＢストック溶液をＤｅｘ－ＰＬＡのＤＭＳＯ溶液で希釈して、５ｍｇ／ｍＬ ＰＭＢおよび１２．５ｍｇ／ｍＬポリマーを含む溶液を生成した。水はプロセス溶媒に添加しなかった。このプロセス溶液（０．５ｍＬ）をＣＩＪミキサー内で非プロセス溶媒流（０．５ｍＬ）と迅速に混合し、ミキサーからの流出物を４ｍＬの非プロセス溶媒浴中に収集した。使用した非プロセス溶媒は、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、酢酸エチル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、およびアセトンであった。試験したすべての非プロセス溶媒は、可視凝集体が存在しない透明なナノ粒子溶液をもたらした。ナノ粒子サイズ分布は、非プロセス溶媒中の動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した。マルバーン・ゼータサイザーＤＬＳソフトウェアによるＰＫ１直径および多分散指数（ＰＤＩ）を、各製剤について表１７に与えている。ナノ粒子のサイズ分布を図２２に与えている。
【0116】
【表17】
【実施例15】
【0117】
デキストラン－分岐－ＰＬＡを用いた西洋ワサビペルオキシダーゼの封入および処理
西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）をモデルタンパク質として使用し、Ｄｅｘ－ＰＬＡ（１０ｋＤａデキストラン、１０ｋＤａ ＰＬＡ分岐部、８０重量％ＰＬＡ）中に封入した。ＨＲＰおよびＤｅｘ－ＰＬＡを、１０ｖ％の水を含むジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して、５ｍｇ／ｍＬのＨＲＰ、１２．５ｍｇ／ｍＬのポリマー、および１０ｖ％の水を含む溶液を生成した。このプロセス溶液（０．５ｍＬ）をＣＩＪミキサー内で非プロセス溶媒流（ＤＣＭ、０．５ｍＬ）と迅速に混合し、ミキサーからの流出物を４ｍＬのＤＣＭ非プロセス溶媒浴中に収集した。ナノ粒子サイズ分布は、ＤＣＭ中の動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した。マルバーン・ゼータサイザーＤＬＳソフトウェアにより、ＰＫ１直径は６０ｎｍであり、多分散指数（ＰＤＩ）は０．１７であった。ＤＣＭ中のナノ粒子のサイズ分布を図２３に与えている。
西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）をモデルタンパク質として使用し、Ｄｅｘ－ＰＬＡ（１０ｋＤａデキストラン、１０ｋＤａ ＰＬＡ分岐部、８０重量％ＰＬＡ）中に封入した。ＨＲＰおよびＤｅｘ－ＰＬＡを、１０ｖ％の水を含むジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して、５ｍｇ／ｍＬのＨＲＰ、１２．５ｍｇ／ｍＬのポリマー、および１０ｖ％の水を含む溶液を生成した。このプロセス溶液（０．５ｍＬ）をＣＩＪミキサー内で非プロセス溶媒流（ＤＣＭ、０．５ｍＬ）と迅速に混合し、ミキサーからの流出物を４ｍＬのＤＣＭ非プロセス溶媒浴中に収集した。ナノ粒子サイズ分布は、ＤＣＭ中の動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した。マルバーン・ゼータサイザーＤＬＳソフトウェアにより、ＰＫ１直径は６０ｎｍであり、多分散指数（ＰＤＩ）は０．１７であった。ＤＣＭ中のナノ粒子のサイズ分布を図２３に与えている。
【0118】
逆ナノ粒子を３ｍＬの１５０ｍＭ ＮａＣｌ水溶液で抽出して、ＤＭＳＯおよび任意の非封入ＨＲＰを取り出した。有機相はＨＲＰのオレンジ－ピンク色を保持し、良好な封入を示した。次いで、ナノ粒子を８倍体積過剰量のヘキサン中で沈殿させ、溶液から遠心分離した。ナノ粒子ペレットをイソプロパノールで１回洗浄した。次いで、５ｍｇ／ｍＬ ＰＬＡ－ｂ－ＰＥＧを含むアセトン中に粒子を再分散させて、５ｍｇ／ｍＬ ＰＬＡ－ｂ－ＰＥＧおよび７ｍｇ／ｍＬナノ粒子（２ｍｇ／ｍＬ ＨＲＰおよび５ｍｇ／ｍＬ Ｄｅｘ－ＰＬＡ）を含む溶液を生成した。ナノ粒子サイズ分布を水中でＤＬＳによって測定し、ＰＫ１直径は３３０ｎｍであり、ＰＤＩは０．５であった。図２３は、コーティング後の粒径分布を示す。高いＰＤＩは、有意なＰＬＡ－ｂ－ＰＥＧミセル集団の存在によるものである。
【実施例16】
【0119】
デキストラン－分岐－ＰＬＡを用いた５ｋＤａブルーデキストランの封入およびシェルの架橋
ブルーデキストラン（ＢＤ、５ｋＤａ）を、デキストラン－分岐－ＰＬＡ（１０ｋＤａデキストラン、１０ｋＤａ ＰＬＡ側鎖、８０重量％ＰＬＡ）（Ｄｅｘ－ＰＬＡ）によって安定化された逆ナノ粒子に封入し、ここでＰＬＡは、実施例９のサンプル９Ａと同じ製剤および方法を使用してチオール基で終結させた。ナノ粒子アセンブリの後、トリアクリレートを用いてＰＬＡシェルを架橋した。エトキシ化（６）トリメチロールプロパントリアクリレート（トリアクリレート－６、分子量５６０Ｄａ、３つのアクリレート基を含有し、各々が２つのエチレングリコール繰り返し単位によってトリメチロールプロパンに結合している）を、１ｍｇ／ｍＬの濃度でＤＭＳＯに溶解した。１５μＬのトリアシレート－６溶液を２ｍＬのナノ粒子溶液に添加して、アクリレート基対チオール基の１：１モル比をもたらした。反応を触媒するために、１当量のトリエチルアミン（ＴＥＡ：ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）か、１当量のＤＭＡＰか、０．２当量のトリブチルホスフィンか、または０．２当量のヘキシル－アミンのいずれかをナノ粒子に添加した（注：すべての当量はチオール基に対するものである）。対照ナノ粒子溶液は添加触媒を含有しなかった。ナノ粒子分散物を４８時間混合して架橋を生じさせた。４８時間後、１ｍＬの１５０ｍＭ ＮａＣｌ水溶液を各ナノ粒子分散物の頂部に添加した。添加触媒を有するナノ粒子分散物は透明のままであったが、添加触媒のない分散物はより乳白色となった／濁った。触媒なしのナノ粒子は水（よって、より不透明な溶液）の存在下で膨潤し得るが、架橋は粒子の膨潤を防止する。
ブルーデキストラン（ＢＤ、５ｋＤａ）を、デキストラン－分岐－ＰＬＡ（１０ｋＤａデキストラン、１０ｋＤａ ＰＬＡ側鎖、８０重量％ＰＬＡ）（Ｄｅｘ－ＰＬＡ）によって安定化された逆ナノ粒子に封入し、ここでＰＬＡは、実施例９のサンプル９Ａと同じ製剤および方法を使用してチオール基で終結させた。ナノ粒子アセンブリの後、トリアクリレートを用いてＰＬＡシェルを架橋した。エトキシ化（６）トリメチロールプロパントリアクリレート（トリアクリレート－６、分子量５６０Ｄａ、３つのアクリレート基を含有し、各々が２つのエチレングリコール繰り返し単位によってトリメチロールプロパンに結合している）を、１ｍｇ／ｍＬの濃度でＤＭＳＯに溶解した。１５μＬのトリアシレート－６溶液を２ｍＬのナノ粒子溶液に添加して、アクリレート基対チオール基の１：１モル比をもたらした。反応を触媒するために、１当量のトリエチルアミン（ＴＥＡ：ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）か、１当量のＤＭＡＰか、０．２当量のトリブチルホスフィンか、または０．２当量のヘキシル－アミンのいずれかをナノ粒子に添加した（注：すべての当量はチオール基に対するものである）。対照ナノ粒子溶液は添加触媒を含有しなかった。ナノ粒子分散物を４８時間混合して架橋を生じさせた。４８時間後、１ｍＬの１５０ｍＭ ＮａＣｌ水溶液を各ナノ粒子分散物の頂部に添加した。添加触媒を有するナノ粒子分散物は透明のままであったが、添加触媒のない分散物はより乳白色となった／濁った。触媒なしのナノ粒子は水（よって、より不透明な溶液）の存在下で膨潤し得るが、架橋は粒子の膨潤を防止する。
【実施例17】
【0120】
デキストラン－分岐－ＰＬＡを用いた２０ｋＤａブルーデキストランの封入およびシェルの架橋
ブルーデキストラン（ＢＤ、２０ｋＤａ）を、デキストラン－分岐－ＰＬＡ（１０ｋＤａデキストラン、１０ｋＤａ ＰＬＡ側鎖、８０重量％ＰＬＡ）（Ｄｅｘ－ＰＬＡ）によって安定化された逆ナノ粒子に封入し、ここでＰＬＡは、実施例９のサンプル９Ｄと同じ製剤および方法を使用してチオール基で終結させた。ナノ粒子アセンブリの後、トリアクリレートを用いてＰＬＡシェルを架橋した。エトキシ化（６）トリメチロールプロパントリアクリレート（トリアクリレート－６、分子量５６０Ｄａ、３つのアクリレート基を含有し、各々が２つのエチレングリコール繰り返し単位によってトリメチロールプロパンに結合している）を、１ｍｇ／ｍＬの濃度でＤＭＳＯに溶解した。エトキシ化（１５）トリメチロールプロパントリアクリレート（トリアクリレート－１５、分子量９５６Ｄａ、３つのアクリレート基を含有し、各々が５つのエチレングリコール繰り返し単位によってトリメチロールプロパンに結合している）を、１ｍｇ／ｍＬの濃度でＤＭＳＯに溶解した。７５μＬのトリアシレート－６溶液または１２７．５μＬのトラクリレート（ｔｒａｃｒｙｌａｔｅ）－１５溶液を５ｍＬのナノ粒子溶液に添加して、アクリレート基対チオール基の１：１モル比をもたらした。触媒するために、０．２当量のトリブチルホスフィンをナノ粒子に添加した（注：すべての当量はチオール基に対するものである）。対照ナノ粒子溶液は添加触媒を含有しなかった。ナノ粒子分散物を４８時間混合して、すべての架橋を生じさせた。４８時間後、３ｍＬの１５０ｍＭ ＮａＣｌ水溶液を各ナノ粒子分散物の頂部に添加した。添加触媒を有するナノ粒子分散物は透明のままであったが、添加触媒のない分散物はより乳白色となった／濁った。触媒なしのナノ粒子は水（よって、より不透明な溶液）の存在下で膨潤し得るが、架橋は粒子の膨潤を防止する。
ブルーデキストラン（ＢＤ、２０ｋＤａ）を、デキストラン－分岐－ＰＬＡ（１０ｋＤａデキストラン、１０ｋＤａ ＰＬＡ側鎖、８０重量％ＰＬＡ）（Ｄｅｘ－ＰＬＡ）によって安定化された逆ナノ粒子に封入し、ここでＰＬＡは、実施例９のサンプル９Ｄと同じ製剤および方法を使用してチオール基で終結させた。ナノ粒子アセンブリの後、トリアクリレートを用いてＰＬＡシェルを架橋した。エトキシ化（６）トリメチロールプロパントリアクリレート（トリアクリレート－６、分子量５６０Ｄａ、３つのアクリレート基を含有し、各々が２つのエチレングリコール繰り返し単位によってトリメチロールプロパンに結合している）を、１ｍｇ／ｍＬの濃度でＤＭＳＯに溶解した。エトキシ化（１５）トリメチロールプロパントリアクリレート（トリアクリレート－１５、分子量９５６Ｄａ、３つのアクリレート基を含有し、各々が５つのエチレングリコール繰り返し単位によってトリメチロールプロパンに結合している）を、１ｍｇ／ｍＬの濃度でＤＭＳＯに溶解した。７５μＬのトリアシレート－６溶液または１２７．５μＬのトラクリレート（ｔｒａｃｒｙｌａｔｅ）－１５溶液を５ｍＬのナノ粒子溶液に添加して、アクリレート基対チオール基の１：１モル比をもたらした。触媒するために、０．２当量のトリブチルホスフィンをナノ粒子に添加した（注：すべての当量はチオール基に対するものである）。対照ナノ粒子溶液は添加触媒を含有しなかった。ナノ粒子分散物を４８時間混合して、すべての架橋を生じさせた。４８時間後、３ｍＬの１５０ｍＭ ＮａＣｌ水溶液を各ナノ粒子分散物の頂部に添加した。添加触媒を有するナノ粒子分散物は透明のままであったが、添加触媒のない分散物はより乳白色となった／濁った。触媒なしのナノ粒子は水（よって、より不透明な溶液）の存在下で膨潤し得るが、架橋は粒子の膨潤を防止する。
【実施例18】
【0121】
デキストラン－分岐－ＰＬＧＡを用いた異なる塩形態のＲＮＡの封入
トルラ・ユチリス（Ｔｏｒｕｌａ ｕｔｉｌｉｓ）由来のＲＮＡ（Ｍｒ５０００～８０００）をモデル核酸活性物質として使用し、Ｄｅｘ－ＰＬＧＡ（１０ｋＤａデキストラン、１６ｋＤａ ＰＬＧＡ分岐部、８０重量％ＰＬＧＡ）中に封入した。ＲＮＡを、ＲＮＡ中のリン酸基に対して０．９電荷当量の（１）ＮａＯＨ、（２）Ｎ－アセチルヒスタミン（ＮＡＨ：Ｎ－ａｃｅｔｙｌ ｈｉｓｔａｍｉｎｅ）、（３）トリエチルアミン（ＴＥＡ）、または（４）トリエタノールアミン（ＴＥｔＯＨＡ：ｔｒｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）のいずれかを含む水に２００ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解して、異なる塩形態を形成した。ＲＮＡストック溶液を、Ｄｅｘ－ＰＬＡのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液と、３００ｍＭ ＮａＣｌ水溶液とで希釈して、５ｍｇ／ｍＬ ＲＮＡ、１２．５ｍｇ／ｍＬポリマー、および５ｖ％水を含み、かつ７．５ｍＭの総ＮａＣｌ濃度を有する溶液を生成した。このプロセス溶液（０．５ｍＬ）をマルチインレットボルテックスミキサー（ＭＩＶＭ）内で３つの非プロセス溶媒流（ＣＨＣｌ３、合計４．５ｍＬ）と迅速に混合した。ナノ粒子サイズ分布は、ＣＨＣｌ３中の動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した（表１８）。
トルラ・ユチリス（Ｔｏｒｕｌａ ｕｔｉｌｉｓ）由来のＲＮＡ（Ｍｒ５０００～８０００）をモデル核酸活性物質として使用し、Ｄｅｘ－ＰＬＧＡ（１０ｋＤａデキストラン、１６ｋＤａ ＰＬＧＡ分岐部、８０重量％ＰＬＧＡ）中に封入した。ＲＮＡを、ＲＮＡ中のリン酸基に対して０．９電荷当量の（１）ＮａＯＨ、（２）Ｎ－アセチルヒスタミン（ＮＡＨ：Ｎ－ａｃｅｔｙｌ ｈｉｓｔａｍｉｎｅ）、（３）トリエチルアミン（ＴＥＡ）、または（４）トリエタノールアミン（ＴＥｔＯＨＡ：ｔｒｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）のいずれかを含む水に２００ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解して、異なる塩形態を形成した。ＲＮＡストック溶液を、Ｄｅｘ－ＰＬＡのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液と、３００ｍＭ ＮａＣｌ水溶液とで希釈して、５ｍｇ／ｍＬ ＲＮＡ、１２．５ｍｇ／ｍＬポリマー、および５ｖ％水を含み、かつ７．５ｍＭの総ＮａＣｌ濃度を有する溶液を生成した。このプロセス溶液（０．５ｍＬ）をマルチインレットボルテックスミキサー（ＭＩＶＭ）内で３つの非プロセス溶媒流（ＣＨＣｌ３、合計４．５ｍＬ）と迅速に混合した。ナノ粒子サイズ分布は、ＣＨＣｌ３中の動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した（表１８）。
【0122】
【表18】
【実施例19】
【0123】
デキストラン－分岐－ＰＬＧＡで安定化されたナノ粒子におけるＲＮＡ－カルシウム塩の形成
実施例１８で作製されたＲＮＡ充填ナノ粒子の塩形態を、ナノ粒子アセンブリ後にＣａ２＋を添加することによって変化させた。塩化カルシウム二水和物を１９．４ｍｇ／ｍＬの濃度でメタノールに溶解し、２９．４ｕＬのこの溶液を撹拌中のナノ粒子分散物に添加した（ＲＮＡ中のリン酸基当たり１電荷当量のＣａ２＋）。粒子を一晩撹拌して、カルシウムをＲＮＡと相互作用させた。ナノ粒子サイズ分布は、ＣＨＣｌ３中の動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した（以下の表１９を参照）。カルシウムを添加した後にＤＬＳ測定の計数率が増加し、新たに形成されたカルシウム－ＲＮＡ塩によるより大きな散乱を示した（表１９）。
実施例１８で作製されたＲＮＡ充填ナノ粒子の塩形態を、ナノ粒子アセンブリ後にＣａ２＋を添加することによって変化させた。塩化カルシウム二水和物を１９．４ｍｇ／ｍＬの濃度でメタノールに溶解し、２９．４ｕＬのこの溶液を撹拌中のナノ粒子分散物に添加した（ＲＮＡ中のリン酸基当たり１電荷当量のＣａ２＋）。粒子を一晩撹拌して、カルシウムをＲＮＡと相互作用させた。ナノ粒子サイズ分布は、ＣＨＣｌ３中の動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した（以下の表１９を参照）。カルシウムを添加した後にＤＬＳ測定の計数率が増加し、新たに形成されたカルシウム－ＲＮＡ塩によるより大きな散乱を示した（表１９）。
【0124】
【表19】
【実施例20】
【0125】
ポリ（アスパラギン酸）－ｂ－ＰＬＧＡを用いた異なる塩形態のＲＮＡの封入
トルラ・ユチリス（Ｔｏｒｕｌａ ｕｔｉｌｉｓ）由来のＲＮＡ（Ｍｒ５０００～８０００）をモデル核酸活性物質として使用し、ＰＡｓｐ－ｂ－ＰＬＧＡ（２ｋＤａポリ（アスパラギン酸）、１６ｋＤａ ＰＬＧＡ）中に封入した。ＲＮＡを、ＲＮＡ中のリン酸基に対して０．９電荷当量の（１）ＮａＯＨ、（２）Ｎ－アセチルヒスタミン（ＮＡＨ）、（３）トリエチルアミン（ＴＥＡ）、または（４）トリエタノールアミン（ＴＥｔＯＨＡ）のいずれかを含む水に２００ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解して、異なる塩形態を形成した。ＲＮＡストック溶液を、ＰＡｓｐ－ｂ－ＰＬＧＡのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液と、３００ｍＭ ＮａＣｌ水溶液とで希釈して、５ｍｇ／ｍＬ ＲＮＡ、１２．５ｍｇ／ｍＬポリマー、および５ｖ％水を含み、かつ７．５ｍＭの総ＮａＣｌ濃度を有する溶液を生成した。このプロセス溶液（０．５ｍＬ）をマルチインレットボルテックスミキサー（ＭＩＶＭ）内で３つの非プロセス溶媒流（ＣＨＣｌ３、合計４．５ｍＬ）と迅速に混合した。ナノ粒子サイズ分布は、ＣＨＣｌ３中の動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した（表２０）。
トルラ・ユチリス（Ｔｏｒｕｌａ ｕｔｉｌｉｓ）由来のＲＮＡ（Ｍｒ５０００～８０００）をモデル核酸活性物質として使用し、ＰＡｓｐ－ｂ－ＰＬＧＡ（２ｋＤａポリ（アスパラギン酸）、１６ｋＤａ ＰＬＧＡ）中に封入した。ＲＮＡを、ＲＮＡ中のリン酸基に対して０．９電荷当量の（１）ＮａＯＨ、（２）Ｎ－アセチルヒスタミン（ＮＡＨ）、（３）トリエチルアミン（ＴＥＡ）、または（４）トリエタノールアミン（ＴＥｔＯＨＡ）のいずれかを含む水に２００ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解して、異なる塩形態を形成した。ＲＮＡストック溶液を、ＰＡｓｐ－ｂ－ＰＬＧＡのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液と、３００ｍＭ ＮａＣｌ水溶液とで希釈して、５ｍｇ／ｍＬ ＲＮＡ、１２．５ｍｇ／ｍＬポリマー、および５ｖ％水を含み、かつ７．５ｍＭの総ＮａＣｌ濃度を有する溶液を生成した。このプロセス溶液（０．５ｍＬ）をマルチインレットボルテックスミキサー（ＭＩＶＭ）内で３つの非プロセス溶媒流（ＣＨＣｌ３、合計４．５ｍＬ）と迅速に混合した。ナノ粒子サイズ分布は、ＣＨＣｌ３中の動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した（表２０）。
【0126】
【表20】
【0127】
ナノ粒子アセンブリの後、ナノ粒子分散物にカルシウムを添加して、安定化ポリマーのポリ（アスパラギン酸）ブロックの酸基およびＲＮＡのリン酸骨格を架橋した。塩化カルシウム二水和物を１９．４ｍｇ／ｍＬの濃度でメタノールに溶解した。次いで、この溶液を撹拌中のナノ粒子分散物に添加して、ＰＡｓｐの酸基およびＲＮＡのリン酸基のすべてに対して１電荷当量のＣａ２＋が存在するようにした。ナノ粒子分散物を少なくとも３０分間混合して、カルシウムをＰＡｓｐおよびＲＮＡと相互作用させた。
【実施例21】
【0128】
ＲＮＡのカルシウム塩のインサイツ形成およびデキストラン－分岐－ＰＬＧＡによる封入
トルラ・ユチリス（Ｔｏｒｕｌａ ｕｔｉｌｉｓ）由来のＲＮＡ（Ｍｒ５０００～８０００）をモデル核酸活性物質として使用し、Ｄｅｘ－ＰＬＧＡ（１０ｋＤａデキストラン、１６ｋＤａ ＰＬＧＡ分岐部、８０重量％ＰＬＧＡ）中に封入した。ＲＮＡを、ＲＮＡ中のリン酸基に対して０．９電荷当量のＮａＯＨを含む水に２００ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解して、ナトリウム塩を形成した。ＲＮＡストック溶液を、Ｄｅｘ－ＰＬＡのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液と、３００ｍＭ ＮａＣｌ水溶液とで希釈して、５ｍｇ／ｍＬ ＲＮＡ、１２．５ｍｇ／ｍＬポリマー、および５ｖ％水を含み、かつ７．５ｍＭの総ＮａＣｌ濃度を有する５００ｕＬプロセス溶液を生成した。塩化カルシウム二水和物を１９．４ｍｇ／ｍＬの濃度でメタノールに溶解し、２９．４ｕＬのこの溶液を５００ｕＬのクロロホルムに添加して、非プロセス溶媒を生成した。プロセス溶液（５００ｕＬ）と、カルシウム含有非プロセス溶媒（５００ｕＬ）と、過剰量の非プロセス溶媒（クロロホルム、２ｍＬ）とをＭＩＶＭ中で迅速に混合した。最終混合物は、ナノ粒子アセンブリ中にＲＮＡのカルシウム塩を形成するために、ＲＮＡ中のリン酸基当たり１電荷当量のＣａ２＋を有した。ナノ粒子サイズ分布は、ＣＨＣｌ３中の動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した。ＰＫ１直径は９０ｎｍであり、ＰＤＩは０．２２であり、粒径分布は図２４に与えられている。
トルラ・ユチリス（Ｔｏｒｕｌａ ｕｔｉｌｉｓ）由来のＲＮＡ（Ｍｒ５０００～８０００）をモデル核酸活性物質として使用し、Ｄｅｘ－ＰＬＧＡ（１０ｋＤａデキストラン、１６ｋＤａ ＰＬＧＡ分岐部、８０重量％ＰＬＧＡ）中に封入した。ＲＮＡを、ＲＮＡ中のリン酸基に対して０．９電荷当量のＮａＯＨを含む水に２００ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解して、ナトリウム塩を形成した。ＲＮＡストック溶液を、Ｄｅｘ－ＰＬＡのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液と、３００ｍＭ ＮａＣｌ水溶液とで希釈して、５ｍｇ／ｍＬ ＲＮＡ、１２．５ｍｇ／ｍＬポリマー、および５ｖ％水を含み、かつ７．５ｍＭの総ＮａＣｌ濃度を有する５００ｕＬプロセス溶液を生成した。塩化カルシウム二水和物を１９．４ｍｇ／ｍＬの濃度でメタノールに溶解し、２９．４ｕＬのこの溶液を５００ｕＬのクロロホルムに添加して、非プロセス溶媒を生成した。プロセス溶液（５００ｕＬ）と、カルシウム含有非プロセス溶媒（５００ｕＬ）と、過剰量の非プロセス溶媒（クロロホルム、２ｍＬ）とをＭＩＶＭ中で迅速に混合した。最終混合物は、ナノ粒子アセンブリ中にＲＮＡのカルシウム塩を形成するために、ＲＮＡ中のリン酸基当たり１電荷当量のＣａ２＋を有した。ナノ粒子サイズ分布は、ＣＨＣｌ３中の動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した。ＰＫ１直径は９０ｎｍであり、ＰＤＩは０．２２であり、粒径分布は図２４に与えられている。
【実施例22】
【0129】
異なるポリマー安定剤組成を有するデキストラン－分岐－ＰＬＧＡによるリラグルチドの封入
ペプチド治療薬であるリラグルチドを、異なるポリマー組成を有するＤｅｘ－ＰＬＧＡによって安定化されたナノ粒子中に封入した。すべての櫛形ポリマーは、ＰＬＧＡ（１：１のＬ：Ｇ比）側鎖を有する１０ｋＤａデキストラン骨格から構成された。ＰＬＧＡ側鎖は、分子量が６．３ｋＤａ、１６ｋＤａ、または２３ｋＤａのいずれかであった。櫛形ポリマーの組成は、６５～９２．５重量％ＰＬＧＡの範囲であった（以下の表２１を参照）。プロセス溶媒流は、５ｍｇ／ｍＬリラグルチド（ＨＣｌ塩）と、５ｍｇ／ｍＬ Ｄｅｘ－ＰＬＧＡと、１５ｍＭ ＮａＣｌとを含む、１０ｖ％の水を含むＤＭＳＯであった。このプロセス溶液（０．５ｍＬ）をマルチインレットボルテックスミキサー（ＭＩＶＭ）内で３つの非プロセス溶媒流（ジクロロメタン、ＤＣＭ、合計４．５ｍＬ）と迅速に混合した。ナノ粒子サイズ分布は、ＣＨＣｌ３中の動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した（表２０）。サンプル２２Ｆの粒径分布を図２５に与えている。
ペプチド治療薬であるリラグルチドを、異なるポリマー組成を有するＤｅｘ－ＰＬＧＡによって安定化されたナノ粒子中に封入した。すべての櫛形ポリマーは、ＰＬＧＡ（１：１のＬ：Ｇ比）側鎖を有する１０ｋＤａデキストラン骨格から構成された。ＰＬＧＡ側鎖は、分子量が６．３ｋＤａ、１６ｋＤａ、または２３ｋＤａのいずれかであった。櫛形ポリマーの組成は、６５～９２．５重量％ＰＬＧＡの範囲であった（以下の表２１を参照）。プロセス溶媒流は、５ｍｇ／ｍＬリラグルチド（ＨＣｌ塩）と、５ｍｇ／ｍＬ Ｄｅｘ－ＰＬＧＡと、１５ｍＭ ＮａＣｌとを含む、１０ｖ％の水を含むＤＭＳＯであった。このプロセス溶液（０．５ｍＬ）をマルチインレットボルテックスミキサー（ＭＩＶＭ）内で３つの非プロセス溶媒流（ジクロロメタン、ＤＣＭ、合計４．５ｍＬ）と迅速に混合した。ナノ粒子サイズ分布は、ＣＨＣｌ３中の動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した（表２０）。サンプル２２Ｆの粒径分布を図２５に与えている。
【0130】
【表21】
【実施例23】
【0131】
リラグルチド充填Ｄｅｘ－ＰＬＧＡ安定化逆ナノ粒子のマイクロ粒子へのアセンブリ。
（上記の実施例２２の）サンプル２２Ｆのリラグルチド充填ナノ粒子をアセンブルして、デポー送達用途のためのマイクロ粒子にした。
最初に、３ｍＬの１５０ｍＭ ＮａＣｌをナノ粒子分散物（５ｍＬ）の頂部に添加し、穏やかに混合してＤＭＳＯを抽出した。１０００ｒｃｆで５分間遠心分離することによって水相および有機相を分離し、ナノ粒子を含有する有機相を取り出した。デキストラン粉末をナノ粒子分散物に添加して任意の水分を吸収させ、１ミクロンフィルターで濾過することによってデキストラン粉末を除去した。この処理によるリラグルチドの回収率は約７０％と測定された。ＰＬＧＡホモポリマーを、リラグルチドに対して２：１の質量比でナノ粒子分散物に添加した（リラグルチド１ｍｇ当たり２ｍｇのＰＬＧＡ）。トリクロロ（オクタデシル）シランを使用してシラン処理したガラスバイアル中で、３５℃および４００トルの回転蒸発によって、ナノ粒子およびＰＬＧＡを約１０ｍｇ／ｍＬの総質量濃度まで濃縮した。この有機相（５００ｕＬ）を、リン酸緩衝食塩水および１重量％ポリビニルアルコールで構成される水相５ｍＬに添加した。この混合物を７５０ｒｐｍで１分間ボルテックスすることによって、水中油型エマルジョンを生成した。このエマルジョンを、攪拌棒を有するロッカー上に置き、３００トルで１５分間、２５０トルで１５分間、２００トルで１５分間、１５０トルで１５分間、１００トルで３０分間、および５０トルで１時間（合計時間：２．５時間）の真空下での蒸発によって、室温で有機溶媒をストリッピングして、硬化したマイクロ粒子を生成した。マイクロ粒子を７０ミクロンのストレーナーに通して任意の大きな粒子を除去し、１０ミクロンのふるい上で水で洗浄して、任意の小さな粒子、断片、または非封入リラグルチドを除去した。洗浄した粒子を凍結乾燥させた。最終粒子は２４．３重量％リラグルチドを含んだ。標的充填量は２５重量％（２５重量％リラグルチド、２５重量％Ｄｅｘ－ＰＬＧＡ、および５０重量％ＰＬＧＡホモポリマー）であるため、これは９７％の封入効率である。
（上記の実施例２２の）サンプル２２Ｆのリラグルチド充填ナノ粒子をアセンブルして、デポー送達用途のためのマイクロ粒子にした。
最初に、３ｍＬの１５０ｍＭ ＮａＣｌをナノ粒子分散物（５ｍＬ）の頂部に添加し、穏やかに混合してＤＭＳＯを抽出した。１０００ｒｃｆで５分間遠心分離することによって水相および有機相を分離し、ナノ粒子を含有する有機相を取り出した。デキストラン粉末をナノ粒子分散物に添加して任意の水分を吸収させ、１ミクロンフィルターで濾過することによってデキストラン粉末を除去した。この処理によるリラグルチドの回収率は約７０％と測定された。ＰＬＧＡホモポリマーを、リラグルチドに対して２：１の質量比でナノ粒子分散物に添加した（リラグルチド１ｍｇ当たり２ｍｇのＰＬＧＡ）。トリクロロ（オクタデシル）シランを使用してシラン処理したガラスバイアル中で、３５℃および４００トルの回転蒸発によって、ナノ粒子およびＰＬＧＡを約１０ｍｇ／ｍＬの総質量濃度まで濃縮した。この有機相（５００ｕＬ）を、リン酸緩衝食塩水および１重量％ポリビニルアルコールで構成される水相５ｍＬに添加した。この混合物を７５０ｒｐｍで１分間ボルテックスすることによって、水中油型エマルジョンを生成した。このエマルジョンを、攪拌棒を有するロッカー上に置き、３００トルで１５分間、２５０トルで１５分間、２００トルで１５分間、１５０トルで１５分間、１００トルで３０分間、および５０トルで１時間（合計時間：２．５時間）の真空下での蒸発によって、室温で有機溶媒をストリッピングして、硬化したマイクロ粒子を生成した。マイクロ粒子を７０ミクロンのストレーナーに通して任意の大きな粒子を除去し、１０ミクロンのふるい上で水で洗浄して、任意の小さな粒子、断片、または非封入リラグルチドを除去した。洗浄した粒子を凍結乾燥させた。最終粒子は２４．３重量％リラグルチドを含んだ。標的充填量は２５重量％（２５重量％リラグルチド、２５重量％Ｄｅｘ－ＰＬＧＡ、および５０重量％ＰＬＧＡホモポリマー）であるため、これは９７％の封入効率である。
【0132】
当業者は、本明細書中に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、またはルーチン的な実験のみを使用して確認し得るだろう。こうした等価物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【国際調査報告】