特表 2022-546577 ＢＣＭＡと結合する二量体抗原受容体（ＤＡＲ）

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-11-04

(54)【発明の名称】ＢＣＭＡと結合する二量体抗原受容体（ＤＡＲ）

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20221027BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20221027BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20221027BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20221027BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20221027BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20221027BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20221027BHJP

   A61K 35/15 20150101ALI20221027BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20221027BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20221027BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20221027BHJP

   C07K 14/705 20060101ALN20221027BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20221027BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z

C07K19/00 ZNA

C12N15/63 Z

C12N5/10

C12P21/02 C

A61P35/00

A61P35/02

A61K35/15 Z

A61P37/04

A61K39/395 D

A61K39/395 N

A61K39/395 U

C07K16/28

C07K14/705

C12P21/08

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022514522

(86)(22)【出願日】2020-09-04

(85)【翻訳文提出日】2022-04-28

(86)【国際出願番号】 US2020049538

(87)【国際公開番号】W WO2021046445

(87)【国際公開日】2021-03-11

(31)【優先権主張番号】62/896,190

(32)【優先日】2019-09-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/896,990

(32)【優先日】2019-09-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/910,341

(32)【優先日】2019-10-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/943,069

(32)【優先日】2019-12-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/030,145

(32)【優先日】2020-05-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】514291864

【氏名又は名称】ソレント・セラピューティクス・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】Ｓｏｒｒｅｎｔｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ジ， ヘンリー ホンジュン

(72)【発明者】

【氏名】グオ， ウェンジョン

(72)【発明者】

【氏名】ジャン， ヤンリャン

(72)【発明者】

【氏名】ディン， ベイ ベイ

(72)【発明者】

【氏名】カウフマン， ガナー エフ．

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG20

4B064AG27

4B064CA10

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B065AA94X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB31

4C085BB33

4C085BB34

4C085BB35

4C085BB36

4C085CC22

4C085CC23

4C085EE01

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB37

4C087NA14

4C087ZB09

4C087ZB26

4C087ZB27

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA50

4H045DA76

4H045EA22

4H045EA28

4H045FA72

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、ＢＣＭＡ標的抗原と結合する二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物を提供し、ここで、ＤＡＲ構築物は、１つのポリペプチド鎖における重鎖結合領域、および別のポリペプチド鎖における軽鎖結合領域を含む。二量体抗原受容体を構成する２つのポリペプチド鎖は、二量体化して、抗原結合ドメインを形成することができる。二量体抗原受容体は、それらが標的抗原に特異的に結合するように、抗体様特性を有する。二量体抗原受容体は、指向性細胞療法のために使用することができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）重鎖リーダー配列、（ｉｉ）抗体重鎖可変領域、（ｉｉｉ）抗体重鎖定常領域、（ｉｖ）必要に応じたヒンジ領域、（ｖ）膜貫通領域、（ｖｉ）細胞内領域、（ｖｉｉ）自己切断配列、（ｖｉｉｉ）軽鎖リーダー配列、（ｉｘ）抗体軽鎖可変領域、および（ｘ）抗体軽鎖定常領域を含む前駆体ポリペプチドであって、前記自己切断配列が、前記前駆体ポリペプチドの第１および第２のポリペプチド鎖への切断を可能にする、前駆体ポリペプチド。

【請求項2】

アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）軽鎖リーダー配列、（ｉｉ）抗体軽鎖可変領域、（ｉｉｉ）抗体軽鎖定常領域、（ｉｖ）必要に応じたヒンジ領域、（ｖ）膜貫通領域、（ｖｉ）細胞内領域、（ｖｉｉ）自己切断配列、（ｖｉｉｉ）重鎖リーダー配列、（ｉｘ）抗体重鎖可変領域、および（ｘ）抗体重鎖定常領域を含む前駆体ポリペプチドであって、前記自己切断配列が、前記前駆体ポリペプチドの第１および第２のポリペプチド鎖への切断を可能にする、前駆体ポリペプチド。

【請求項3】

前記抗体重鎖可変領域が、配列番号６、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８のアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の前駆体ポリペプチド。

【請求項4】

前記抗体重鎖定常領域が、
ａ）ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥもしくはＩｇＭ ＣＨ１ドメイン；
ｂ）ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４ ＣＨ１ドメイン；
ｃ）ヒトＩｇＧ１ドメイン；
ｄ）配列番号７もしくは２９のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または
ｅ）配列番号７もしくは２９のアミノ酸配列
を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の前駆体ポリペプチド。

【請求項5】

前記抗体軽鎖可変領域が、配列番号８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７または３０のアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の前駆体ポリペプチド。

【請求項6】

前記抗体軽鎖定常領域が、
ａ）ヒトＩｇカッパ定常ドメイン；
ｂ）ヒトＩｇラムダ定常ドメイン；
ｃ）配列番号１１もしくは３１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または
ｄ）配列番号１１もしくは３１のアミノ酸配列
を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の前駆体ポリペプチド。

【請求項7】

前記ヒンジ領域が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥおよびＩｇＤからなる群より選択される抗体由来のヒンジ配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の前駆体ポリペプチド。

【請求項8】

前記ヒンジが、ＣＤ８αおよび／またはＣＤ２８ヒンジ領域を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の前駆体ポリペプチド。

【請求項9】

前記ヒンジ領域が、ＣＰＰＣまたはＳＰＰＣアミノ酸配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の前駆体ポリペプチド。

【請求項10】

前記ヒンジ領域が、配列番号３４、３５または３６のアミノ酸配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の前駆体ポリペプチド。

【請求項11】

前記膜貫通領域が、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲζ、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ６４、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ９、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＬＦＡ－１ Ｔ細胞共受容体、ＣＤ２ Ｔ細胞共受容体／接着分子、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ１５４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳおよびＦＧＦＲ２Ｂ由来の膜貫通配列を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の前駆体ポリペプチド。

【請求項12】

前記膜貫通領域が、配列番号３７、３８、３９または４０のアミノ酸配列を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の前駆体ポリペプチド。

【請求項13】

前記細胞内領域が、４－１ＢＢ、ＩＴＡＭ １、２および３を有するＣＤ３ゼータ、ＩＴＡＭ １を有するＣＤ３ゼータ、ＩＴＡＭ ３を有するＣＤ３ゼータ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＧＩＴＲ（ＴＮＦＲＳＦ１８）、ＤＲ３（ＴＮＦＲＳＦ２５）、ＴＮＦＲ２ならびに／またはＣＤ２２６からなる群より選択される１つの細胞内配列を含むか、または前記群から選択される細胞内配列の任意の順序および任意の組合せの、２～５つの細胞内配列を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の前駆体ポリペプチド。

【請求項14】

前記細胞内領域が、
ｉ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＩＴＡＭ １、２および３を有するＣＤ３ゼータ、
ｉｉ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤ３ゼータＩＴＡＭ １、
ｉｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤ３ゼータＩＴＡＭ ２、または
ｉｖ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＩＴＡＭ ３を有するＣＤ３ゼータ
を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の前駆体ポリペプチド。

【請求項15】

前記細胞内領域が、
ｉ）配列番号４８もしくは５０のアミノ酸配列を含む、ＣＤ２８由来ならびにＩＴＡＭ １、２および３を有するＣＤ３ゼータ由来の細胞内配列、または
ｉｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含む、４－１ＢＢ由来ならびにＩＴＡＭ １、２および３を有するＣＤ３ゼータ由来の細胞内配列、または
ｉｉｉ）配列番号５１もしくは８８のアミノ酸配列を含む、ＣＤ２８由来、４－１ＢＢ由来ならびにＩＴＡＭ １、２および３を有するＣＤ３ゼータ由来の細胞内配列、または
ｉｖ）配列番号５２のアミノ酸配列を含む、４－１ＢＢ由来およびＩＴＡＭ ３を有するＣＤ３ゼータ由来の細胞内配列、または
ｖ）ＣＤ２８（配列番号４２）由来およびＩＴＡＭ ３を有するＣＤ３ゼータ（配列番号４７）由来の細胞内配列、または
ｖｉ）配列番号５３もしくは８９のアミノ酸配列を含む、ＣＤ２８由来、４－１ＢＢ由来およびＩＴＡＭ ３を有するＣＤ３ゼータ由来の細胞内配列
を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の前駆体ポリペプチド。

【請求項16】

配列番号６３、６６、６９、７２、７５、７８、８１または８４のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の前駆体分子。

【請求項17】

図４ＡおよびＢに示される配向およびアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の前駆体分子。

【請求項18】

前記自己切断配列が、Ｔ２Ａ配列以外である、例えば、前記自己切断配列が、Ｐ２Ａ、Ｅ２ＡまたはＦ２Ａ配列である、先行する請求項のいずれか一項に記載の前駆体分子。

【請求項19】

ａ）アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）抗体重鎖可変領域、（ｉｉ）抗体重鎖定常領域、（ｉｉｉ）必要に応じたヒンジ領域、（ｉｖ）膜貫通領域、および（ｖ）細胞内領域を含む第１のポリペプチド鎖；
ｂ）アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）抗体軽鎖可変領域、および（ｉｉ）抗体軽鎖定常領域を含む第２のポリペプチド鎖
を含む二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物であって、
前記抗体重鎖定常領域および前記抗体軽鎖定常領域が、前記二量体抗原受容体（ＤＡＲ）の形成のための二量体化ドメインを形成し、
前記抗体重鎖可変領域および前記抗体軽鎖可変領域が、抗原結合ドメインを形成する、
二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物。

【請求項20】

ａ）アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）抗体軽鎖可変領域、（ｉｉ）抗体軽鎖定常領域、（ｉｉｉ）必要に応じたヒンジ領域、（ｉｖ）膜貫通領域、および（ｖ）細胞内領域を含む第１のポリペプチド鎖；
ｂ）アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）抗体重鎖可変領域、および（ｉｉ）抗体重鎖定常領域を含む第２のポリペプチド鎖
を含む二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物であって、
前記抗体重鎖定常領域および前記抗体軽鎖定常領域が、前記二量体抗原受容体（ＤＡＲ）の形成のための二量体化ドメインを形成し、
前記抗体重鎖可変領域および前記抗体軽鎖可変領域が、抗原結合ドメインを形成する、
二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物。

【請求項21】

前記抗体重鎖定常領域および前記抗体軽鎖定常領域が、１つまたは２つのジスルフィド結合を介して二量体化する、請求項１８または１９に記載の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物。

【請求項22】

前記ヒンジ領域が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥおよびＩｇＤからなる群より選択される抗体由来のヒンジ配列を含む、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の二量体抗原受容体構築物。

【請求項23】

前記ヒンジが、ＣＤ８αおよび／またはＣＤ２８ヒンジ領域を含む、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の二量体抗原受容体構築物。

【請求項24】

前記ヒンジ領域が、ＣＰＰＣまたはＳＰＰＣアミノ酸配列を含む、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の二量体抗原受容体構築物。

【請求項25】

前記膜貫通領域が、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲζ、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ６４、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ９、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＬＦＡ－１ Ｔ細胞共受容体、ＣＤ２ Ｔ細胞共受容体／接着分子、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ１５４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳおよびＦＧＦＲ２Ｂ由来の膜貫通配列を含む、請求項１８～２３のいずれか一項に記載の二量体抗原受容体構築物。

【請求項26】

前記細胞内領域が、４－１ＢＢ、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＧＩＴＲ（ＴＮＦＲＳＦ１８）、ＤＲ３（ＴＮＦＲＳＦ２５）、ＴＮＦＲ２および／またはＣＤ２２６からなる群より選択される１つの細胞内配列を含むか、または前記群から選択される細胞内配列の任意の順序および任意の組合せの、２～５つの細胞内配列を含む、請求項１８～２４のいずれか一項に記載の二量体抗原受容体構築物。

【請求項27】

前記抗原結合ドメインが、ＢＭＣＡ（Ｂ細胞成熟抗原）タンパク質と結合する、請求項１８～２５のいずれか一項に記載の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物。

【請求項28】

前記ＢＭＣＡ（Ｂ細胞成熟抗原）タンパク質が、配列番号１、２または３のアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物。

【請求項29】

前記抗体重鎖可変領域が、配列番号６、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８のアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物。

【請求項30】

前記抗体重鎖定常領域が、配列番号７または２９のアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物。

【請求項31】

前記抗体軽鎖可変領域が、配列番号８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７または３０のアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物。

【請求項32】

前記抗体軽鎖定常領域が、１１または３１のアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物。

【請求項33】

前記ヒンジ領域が、配列番号３４、３５または３６のアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物。

【請求項34】

前記膜貫通領域が、配列番号３７、３８、３９または４０のアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物。

【請求項35】

前記細胞内領域が、
ｉ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＩＴＡＭ １、２および３を有するＣＤ３ゼータ、
ｉｉ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤ３ゼータＩＴＡＭ １、
ｉｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤ３ゼータＩＴＡＭ ２、または
ｉｖ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＩＴＡＭ ３を有するＣＤ３ゼータ
を含む、請求項２７に記載の二量体抗原受容体。

【請求項36】

前記細胞内領域が、
ｉ）配列番号４８もしくは５０のアミノ酸配列を含む、ＣＤ２８由来ならびにＩＴＡＭ １、２および３を有するＣＤ３ゼータ由来の細胞内配列、または
ｉｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含む、４－１ＢＢ由来ならびにＩＴＡＭ １、２および３を有するＣＤ３ゼータ由来の細胞内配列、または
ｉｉｉ）配列番号５１もしくは８８のアミノ酸配列を含む、ＣＤ２８由来、４－１ＢＢ由来ならびにＩＴＡＭ １、２および３を有するＣＤ３ゼータ由来の細胞内配列、または
ｉｖ）配列番号５２のアミノ酸配列を含む、４－１ＢＢ由来およびＩＴＡＭ ３を有するＣＤ３ゼータ由来の細胞内配列、または
ｖ）ＣＤ２８（配列番号４２）由来およびＩＴＡＭ ３を有するＣＤ３ゼータ（配列番号４７）由来の細胞内配列、または
ｖｉ）配列番号５３もしくは８９のアミノ酸配列を含む、ＣＤ２８由来、４－１ＢＢ由来およびＩＴＡＭ ３を有するＣＤ３ゼータ由来の細胞内配列
を含む、請求項２７に記載の二量体抗原受容体。

【請求項37】

前記第１のポリペプチド鎖が、配列番号６４、６７、７０、７３、７６、７９、８２または８５のアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物。

【請求項38】

前記第２のポリペプチド鎖が、配列番号６５、６８、７１、７４、７７、８０、８３または８６のアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物。

【請求項39】

前記自己切断配列の切断の際に、前記重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域が、ＢＭＣＡ（Ｂ細胞成熟抗原）タンパク質と結合する抗原結合ドメインを形成することができ、必要に応じて、前記ＢＭＣＡ（Ｂ細胞成熟抗原）タンパク質が、配列番号１、２または３のアミノ酸配列を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の前駆体ポリペプチド。

【請求項40】

ａ）前記第１のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）配列番号６、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８のアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体重鎖可変領域；（ｉｉ）抗体重鎖定常領域；（ｉｉｉ）ＣＤ８およびＣＤ２８ヒンジ領域を含むヒンジ領域；（ｉｖ）ＣＤ２８膜貫通領域；ならびに（ｖ）ＣＤ２８共刺激配列ならびにＣＤ３ゼータＩＴＡＭ １、２および３細胞内配列を含む細胞内領域を含み；そして
ｂ）前記第２のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）配列番号８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７または３０のアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体軽鎖可変領域；および（ｉｉ）抗体軽鎖定常領域を含み、
前記抗体重鎖定常領域および前記抗体軽鎖定常領域が、二量体化ドメインを形成し、
前記抗体重鎖可変領域および前記抗体軽鎖可変領域が、ＢＣＭＡタンパク質と結合する抗原結合ドメインを形成し、
必要に応じて、前記二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物が、ＤＡＲ Ｖ１構築物である、
請求項２７に記載の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物。

【請求項41】

ａ）前記第１のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）配列番号６、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８のアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体重鎖可変領域；（ｉｉ）抗体重鎖定常領域；（ｉｉｉ）ＣＤ２８ヒンジ領域を含むヒンジ領域；（ｉｖ）ＣＤ２８膜貫通領域；ならびに（ｖ）４－１ＢＢ共刺激配列ならびにＣＤ３ゼータＩＴＡＭ １、２および３細胞内配列を含む細胞内領域を含み；そして
ｂ）前記第２のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）配列番号８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７または３０のアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体軽鎖可変領域；および（ｉｉ）抗体軽鎖定常領域を含み、
前記抗体重鎖定常領域および前記抗体軽鎖定常領域が、二量体化ドメインを形成し、
前記抗体重鎖可変領域および前記抗体軽鎖可変領域が、ＢＣＭＡタンパク質と結合する抗原結合ドメインを形成し、
必要に応じて、前記二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物が、ＤＡＲ Ｖ２ａ構築物である、
請求項２７に記載の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物。

【請求項42】

ａ）前記第１のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）配列番号６、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８のアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体重鎖可変領域；（ｉｉ）抗体重鎖定常領域；（ｉｉｉ）ヒンジ領域；（ｉｖ）ＣＤ２８膜貫通領域；ならびに（ｖ）ＣＤ２８共刺激配列およびＣＤ３ゼータＩＴＡＭ １、２ならびに３細胞内配列を含む細胞内領域を含み；そして
ｂ）前記第２のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）配列番号８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７または３０のアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体軽鎖可変領域；および（ｉｉ）抗体軽鎖定常領域を含み、
前記抗体重鎖定常領域および前記抗体軽鎖定常領域が、二量体化ドメインを形成し、
前記抗体重鎖可変領域および前記抗体軽鎖可変領域が、ＢＣＭＡタンパク質と結合する抗原結合ドメインを形成し、
必要に応じて、前記二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物が、ＤＡＲ Ｖ２ｂ構築物である、
請求項２７に記載の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物。

【請求項43】

ａ）前記第１のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）配列番号６、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８のアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体重鎖可変領域；（ｉｉ）抗体重鎖定常領域；（ｉｉｉ）ＣＤ２８ヒンジ領域を含むヒンジ領域；（ｉｖ）ＣＤ２８膜貫通領域；ならびに（ｖ）４－１ＢＢ共刺激配列、ＣＤ２８共刺激配列ならびにＣＤ３ゼータＩＴＡＭ １、２および３細胞内配列を含む細胞内領域を含み；そして
ｂ）前記第２のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）配列番号８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７または３０のアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体軽鎖可変領域；および（ｉｉ）抗体軽鎖定常領域を含み、
前記抗体重鎖定常領域および前記抗体軽鎖定常領域が、二量体化ドメインを形成し、
前記抗体重鎖可変領域および前記抗体軽鎖可変領域が、ＢＣＭＡタンパク質と結合する抗原結合ドメインを形成し、
必要に応じて、前記二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物が、ＤＡＲ Ｖ２ｃ構築物である、
請求項２７に記載の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物。

【請求項44】

ａ）前記第１のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）配列番号６、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体重鎖可変領域；（ｉｉ）抗体重鎖定常領域；（ｉｉｉ）ＣＤ２８ヒンジ領域を含むヒンジ領域；（ｉｖ）ＣＤ２８膜貫通領域；ならびに（ｖ）４－１ＢＢ共刺激配列およびＣＤ３ゼータＩＴＡＭ ３細胞内配列を含む細胞内領域であって、必要に応じて、細胞内ＣＤ２８共刺激配列を含む細胞内配列を含み；そして
ｂ）前記第２のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）配列番号８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７または３０のアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体軽鎖可変領域；および（ｉｉ）抗体軽鎖定常領域を含み、
前記抗体重鎖定常領域および前記抗体軽鎖定常領域が、二量体化ドメインを形成し、
前記抗体重鎖可変領域および前記抗体軽鎖可変領域が、ＢＣＭＡタンパク質と結合する抗原結合ドメインを形成し、
必要に応じて、前記二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物が、ＤＡＲ Ｖ３構築物である、
請求項２７に記載の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物。

【請求項45】

ａ）前記第１のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）配列番号６、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８のアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体重鎖可変領域；（ｉｉ）抗体重鎖定常領域；（ｉｉｉ）ＣＤ２８膜貫通領域；ならびに（ｉｖ）４－１ＢＢ共刺激配列およびＣＤ３ゼータＩＴＡＭ ３細胞内配列を含む細胞内領域を含み；そして
ｂ）前記第２のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）配列番号８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７または３０のアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体軽鎖可変領域；および（ｉｉ）抗体軽鎖定常領域を含み、
前記抗体重鎖定常領域および前記抗体軽鎖定常領域が、二量体化ドメインを形成し、
前記抗体重鎖可変領域および前記抗体軽鎖可変領域が、ＢＣＭＡタンパク質と結合する抗原結合ドメインを形成し、
必要に応じて、前記二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物が、ＤＡＲ Ｖ４構築物である、
請求項２７に記載の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物。

【請求項46】

ａ）前記第１のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）配列番号６、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体重鎖可変領域；（ｉｉ）抗体重鎖定常領域；（ｉｉｉ）ＣＤ２８ヒンジ領域を含むヒンジ領域；（ｉｖ）ＣＤ２８膜貫通領域；ならびに（ｖ）ＣＤ２８共刺激配列およびＣＤ３ゼータＩＴＡＭ ３細胞内配列を含む細胞内領域であって、必要に応じて、細胞内ＣＤ２８および４－１ＢＢ共刺激配列を含む細胞内配列を含み；そして
ｂ）前記第２のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）配列番号８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７または３０のアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体軽鎖可変領域；および（ｉｉ）抗体軽鎖定常領域を含み、
前記抗体重鎖定常領域および前記抗体軽鎖定常領域が、二量体化ドメインを形成し、
前記抗体重鎖可変領域および前記抗体軽鎖可変領域が、ＢＣＭＡタンパク質と結合する抗原結合ドメインを形成し、
必要に応じて、前記二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物が、ＤＡＲ Ｖ３ｃ構築物である、
請求項２７に記載の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物。

【請求項47】

ｃ）前記第１のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）配列番号６、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８のアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体重鎖可変領域；（ｉｉ）抗体重鎖定常領域；（ｉｉｉ）ＣＤ２８膜貫通領域；ならびに（ｉｖ）４－１ＢＢ共刺激配列およびＣＤ３ゼータＩＴＡＭ ３細胞内配列を含む細胞内領域を含み；そして
ｄ）前記第２のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）配列番号８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７または３０のアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体軽鎖可変領域；および（ｉｉ）抗体軽鎖定常領域を含み、
前記抗体重鎖定常領域および前記抗体軽鎖定常領域が、二量体化ドメインを形成し、
前記抗体重鎖可変領域および前記抗体軽鎖可変領域が、ＢＣＭＡタンパク質と結合する抗原結合ドメインを形成し、
必要に応じて、前記二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物が、ＤＡＲ Ｖ４構築物である、
請求項２７に記載の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物。

【請求項48】

前記４－１ＢＢ共刺激配列ならびにＣＤ３ゼータＩＴＡＭ １、２および３細胞内配列を含む前記細胞内領域が、配列番号４９のアミノ酸配列を含む、請求項４１に記載のＤＡＲ構築物。

【請求項49】

前記ＣＤ２８共刺激配列ならびにＣＤ３ゼータＩＴＡＭ １、２および３細胞内配列を含む前記細胞内領域が、配列番号５０のアミノ酸配列を含む、請求項４２に記載のＤＡＲ構築物。

【請求項50】

前記４－１ＢＢ共刺激配列、ＣＤ２８共刺激配列ならびにＣＤ３ゼータＩＴＡＭ １、２および３細胞内配列を含む前記細胞内領域が、配列番号５１または８８のアミノ酸配列を含む、請求項４３に記載のＤＡＲ構築物。

【請求項51】

前記４－１ＢＢ共刺激配列およびＣＤ３ゼータＩＴＡＭ ３細胞内配列を含む前記細胞内領域が、配列番号５２のアミノ酸配列を含むか、または４－１ＢＢ共刺激配列、ＣＤ２８共刺激配列およびＣＤ３ゼータＩＴＡＭ ３細胞内配列を含む前記細胞内領域が、配列番号５３または８９のアミノ酸配列を含む、請求項４４に記載のＤＡＲ構築物。

【請求項52】

前記４－１ＢＢ共刺激配列およびＣＤ３ゼータＩＴＡＭ ３細胞内配列を含む前記細胞内領域が、配列番号５２のアミノ酸配列を含む、請求項４５に記載のＤＡＲ構築物。

【請求項53】

前記ＣＤ２８共刺激配列およびＣＤ３ゼータＩＴＡＭ ３細胞内配列を含む前記細胞内領域が、配列番号８７のアミノ酸配列を含む、請求項４６に記載のＤＡＲ構築物。

【請求項54】

前記４－１ＢＢ共刺激配列およびＣＤ３ゼータＩＴＡＭ ３細胞内配列を含む前記細胞内領域が、配列番号５２のアミノ酸配列を含む、請求項４７に記載のＤＡＲ構築物。

【請求項55】

前記ＣＤ８およびＣＤ２８ヒンジ領域が、配列番号３６のアミノ酸配列を含む、請求項４０または５１に記載のＤＡＲ構築物。

【請求項56】

前記ヒンジ領域が、配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤ２８ヒンジ領域を含む、請求項４１～４４、４６～４９または５４のいずれか一項に記載のＤＡＲ構築物。

【請求項57】

前記ＣＤ２８膜貫通領域が、配列番号３７のアミノ酸配列を含む、請求項４０、４５または５０のいずれか一項に記載のＤＡＲ構築物。

【請求項58】

前記重鎖定常領域が、
ａ）ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥもしくはＩｇＭ ＣＨ１ドメイン；
ｂ）ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４ ＣＨ１ドメイン；
ｃ）ヒトＩｇＧ１ドメイン；
ｄ）配列番号７もしくは２９のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または
ｅ）配列番号７もしくは２９のアミノ酸配列
を含む、請求項４０～５５のいずれか一項に記載のＤＡＲ構築物。

【請求項59】

前記軽鎖定常領域が、
ａ）ヒトＩｇカッパ定常ドメイン；
ｂ）ヒトＩｇラムダ定常ドメイン；
ｃ）配列番号１１もしくは３１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または
ｄ）配列番号１１もしくは３１のアミノ酸配列
を含む、請求項４０～５６のいずれか一項に記載のＤＡＲ構築物。

【請求項60】

請求項１～１８のいずれか一項に記載の前駆体ポリペプチドをコードする核酸。

【請求項61】

プロモーターに作動可能に連結された請求項６０に記載の核酸を含む発現ベクター。

【請求項62】

プロモーターに作動可能に連結された請求項６０に記載の核酸を有する宿主細胞または宿主細胞の集団であって、必要に応じて、前記核酸が、発現ベクター中に存在する、宿主細胞または宿主細胞の集団。

【請求項63】

前記宿主細胞が、Ｔリンパ球（例えば、調節性Ｔ細胞、ガンマ－デルタＴ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞）、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞、マクロファージ、樹状細胞、肥満細胞、好酸球、Ｂリンパ球もしくは単球であるか、または前記宿主細胞の集団が、Ｔリンパ球（例えば、調節性Ｔ細胞、ガンマ－デルタＴ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞）、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞、マクロファージ、樹状細胞、肥満細胞、好酸球、Ｂリンパ球もしくは単球を含む、請求項６２に記載の宿主細胞または宿主細胞の集団。

【請求項64】

前記宿主細胞が、自己宿主細胞であるか、または前記集団が、自己宿主細胞を含む、請求項６２に記載の宿主細胞または宿主細胞の集団。

【請求項65】

前記宿主細胞が、同種異系宿主細胞であるか、または前記集団が、同種異系宿主細胞を含む、請求項６２に記載の宿主細胞または宿主細胞の集団。

【請求項66】

複数の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）を発現する宿主細胞の集団を調製するための方法であって、請求項６２～６５のいずれか一項に記載の宿主細胞の集団を、前記宿主細胞の集団によって複数の前駆体ポリペプチドを発現させるために好適な条件下、かつ前記宿主細胞の集団による前記複数の前駆体ポリペプチドの複数の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）へのプロセシングのために好適な条件下で培養することを含み、前記宿主細胞の集団による前記プロセシングが、前記複数の前駆体ポリペプチドを複数の第１のポリペプチド鎖および複数の第２のポリペプチド鎖に切断すること、前記複数の第１のポリペプチド鎖および前記複数の第２のポリペプチド鎖を互いとアセンブルさせて、複数の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）を形成すること、ならびに前記宿主細胞の集団の細胞膜に前記複数の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）を繋留することを含む、方法。

【請求項67】

発現ベクターが、前記前駆体ポリペプチドをコードする核酸の前記宿主細胞または前記宿主細胞の集団への一過性の導入を指示する、請求項６６に記載の方法。

【請求項68】

発現ベクターが、前記前駆体ポリペプチドをコードする核酸の前記宿主細胞のゲノムへの安定な挿入を指示する、請求項６６に記載の方法。

【請求項69】

発現ベクターが、前記宿主細胞または前記宿主細胞の集団における前記前駆体ポリペプチドをコードする核酸の転写および／または翻訳を指示する、請求項６６に記載の方法。

【請求項70】

発現ベクターが、前記宿主細胞または前記宿主細胞の集団における前記前駆体ポリペプチドをコードする核酸の発現を指示し、発現が、前記前駆体ポリペプチドをコードする核酸の転写および／または翻訳を含む、請求項６６に記載の方法。

【請求項71】

請求項６６～７０のいずれか一項に記載の方法によって調製される、宿主細胞の集団の細胞膜に繋留された複数の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）を含む、宿主細胞の集団。

【請求項72】

請求項１９～５９のいずれか一項に記載の複数の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物を発現する宿主細胞の集団であって、前記ＤＡＲ構築物が、宿主細胞の集団の細胞膜に繋留される、宿主細胞の集団。

【請求項73】

請求項７１または７２に記載の宿主細胞の集団および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。

【請求項74】

被験体における腫瘍抗原の有害な発現に関連する疾患、障害または状態を有する被験体を処置するための方法であって、前記被験体に、請求項７１もしくは７２に記載の宿主細胞の集団、または請求項７３に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。

【請求項75】

前記疾患が、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、慢性Ｂリンパ球性白血病（Ｂ－ＣＬＬ）、急性ＢおよびＴリンパ球性白血病（ＡＬＬ）、Ｔ細胞リンパ腫（ＴＣＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）および多発性骨髄腫（ＭＭ）からなる群より選択される血液がんである、請求項７４に記載の方法。

【請求項76】

請求項１９～５９のいずれか一項に記載の第１のポリペプチドをコードする第１の核酸。

【請求項77】

請求項１９～５９のいずれか一項に記載の第２のポリペプチドをコードする第２の核酸。

【請求項78】

請求項１９～５９のいずれか一項に記載の、第１のポリペプチドをコードする第１の核酸および第２のポリペプチドをコードする第２の核酸。

【請求項79】

プロモーターに作動可能に連結された請求項７８に記載の第１の核酸を含む第１の発現ベクター、およびプロモーターに作動可能に連結された請求項７８に記載の第２の核酸を含む第２の発現ベクター。

【請求項80】

プロモーターに作動可能に連結された請求項７８に記載の第１の核酸および第２の核酸を含む発現ベクター。

【請求項81】

請求項７９に記載の第１の発現ベクターを有する、第１の宿主細胞または第１の宿主細胞の集団。

【請求項82】

請求項７９に記載の第２の発現ベクターを有する、第２の宿主細胞または第２の宿主細胞の集団。

【請求項83】

請求項７９に記載の第１の発現ベクターを有する、第１の宿主細胞または第１の宿主細胞の集団、および請求項７９に記載の第２の発現ベクターを有する、第２の宿主細胞または第２の宿主細胞の集団。

【請求項84】

請求項７９に記載の第１の発現ベクターおよび第２の発現ベクターを有する、宿主細胞または宿主細胞の集団。

【請求項85】

請求項８０に記載の発現ベクターを有する、宿主細胞または宿主細胞の集団。

【請求項86】

前記宿主細胞が、Ｔリンパ球（例えば、調節性Ｔ細胞、ガンマ－デルタＴ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞）、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞、マクロファージ、樹状細胞、肥満細胞、好酸球、Ｂリンパ球もしくは単球であるか、または前記集団が、Ｔリンパ球（例えば、調節性Ｔ細胞、ガンマ－デルタＴ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞）、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞、マクロファージ、樹状細胞、肥満細胞、好酸球、Ｂリンパ球もしくは単球を含む、請求項８１～８４のいずれか一項に記載の宿主細胞または宿主細胞の集団。

【請求項87】

前記宿主細胞が、自己宿主細胞であるか、または前記集団が、自己宿主細胞を含む、請求項８１～８４のいずれか一項に記載の宿主細胞または宿主細胞の集団。

【請求項88】

前記宿主細胞が、同種異系宿主細胞であるか、または前記集団が、同種異系宿主細胞を含む、請求項８１～８４のいずれか一項に記載の宿主細胞または宿主細胞の集団。

【請求項89】

複数の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）を調製するための方法であって、請求項８３に記載の第１の宿主細胞の集団および第２の宿主細胞の集団を、複数の第１のポリペプチド鎖および複数の第２のポリペプチド鎖を発現させるために好適な条件下で培養することを含む、方法。

【請求項90】

複数の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）を調製するための方法であって、請求項８４に記載の宿主細胞の集団を、前記宿主細胞の集団によって複数の第１のポリペプチド鎖および複数の第２のポリペプチド鎖を発現させるために好適な条件下、かつ前記宿主細胞の集団によって複数の第１のポリペプチドおよび複数の第２のポリペプチドを複数の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）にプロセシングするために好適な条件下で培養することを含み、前記宿主細胞の集団による前記プロセシングが、前記複数の第１のポリペプチド鎖および前記複数の第２のポリペプチド鎖を互いとアセンブルさせて、複数の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）を形成すること、ならびに前記宿主細胞の集団の細胞膜に前記複数の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）を繋留することを含む、方法。

【請求項91】

複数の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）を調製するための方法であって、請求項８５に記載の宿主細胞の集団を、前記宿主細胞の集団によって複数の第１のポリペプチド鎖および複数の第２のポリペプチド鎖を発現させるために好適な条件下、かつ前記宿主細胞の集団によって複数の第１のポリペプチドおよび複数の第２のポリペプチドを複数の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）にプロセシングするために好適な条件下で培養することを含み、前記宿主細胞の集団による前記プロセシングが、前記複数の第１のポリペプチド鎖および前記複数の第２のポリペプチド鎖を互いとアセンブルさせて、複数の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）を形成すること、ならびに前記宿主細胞の集団の細胞膜に前記複数の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）を繋留することを含む、方法。

【請求項92】

第１の発現ベクターが、前記第１のポリペプチド鎖をコードする核酸の前記第１の宿主細胞または前記第１の宿主細胞の集団への一過性の導入を指示し、第２の発現ベクターが、前記第２のポリペプチド鎖をコードする核酸の前記第２の宿主細胞または前記第２の宿主細胞の集団への一過性の導入を指示する、請求項８９に記載の方法。

【請求項93】

第１の発現ベクターが、前記第１のポリペプチド鎖をコードする核酸の前記第１の宿主細胞のゲノムへの安定な挿入を指示し、第２の発現ベクターが、前記第２のポリペプチド鎖をコードする核酸の前記第２の宿主細胞のゲノムへの安定な挿入を指示する、請求項８９に記載の方法。

【請求項94】

第１の発現ベクターが、前記第１の宿主細胞または前記第１の宿主細胞の集団における前記第１のポリペプチド鎖をコードする核酸の転写および／または翻訳を指示し、第２の発現ベクターが、前記第２の宿主細胞または前記第２の宿主細胞の集団における前記第２のポリペプチド鎖をコードする核酸の転写および／または翻訳を指示する、請求項８９に記載の方法。

【請求項95】

第１の発現ベクターが、前記第１のポリペプチド鎖をコードする核酸の前記宿主細胞または前記宿主細胞の集団への一過性の導入を指示し、第２の発現ベクターが、前記第２のポリペプチド鎖をコードする核酸の前記宿主細胞または前記宿主細胞の集団への一過性の導入を指示する、請求項９０に記載の方法。

【請求項96】

第１の発現ベクターが、前記第１のポリペプチド鎖をコードする核酸の前記宿主細胞のゲノムへの安定な挿入を指示し、第２の発現ベクターが、前記第２のポリペプチド鎖をコードする核酸の前記宿主細胞のゲノムへの安定な挿入を指示する、請求項９０に記載の方法。

【請求項97】

第１の発現ベクターが、前記宿主細胞または前記宿主細胞の集団における前記第１のポリペプチド鎖をコードする核酸の転写および／または翻訳を指示し、第２の発現ベクターが、前記宿主細胞または前記宿主細胞の集団における前記第２のポリペプチド鎖をコードする核酸の転写および／または翻訳を指示する、請求項９０に記載の方法。

【請求項98】

発現ベクターが、前記第１および第２のポリペプチド鎖をコードする核酸の前記宿主細胞または前記宿主細胞の集団への一過性の導入を指示する、請求項９１に記載の方法。

【請求項99】

発現ベクターが、前記第１および第２のポリペプチド鎖をコードする核酸の前記宿主細胞のゲノムへの安定な挿入を指示する、請求項９１に記載の方法。

【請求項100】

発現ベクターが、前記宿主細胞または前記宿主細胞の集団における前記第１および第２のポリペプチド鎖をコードする核酸の転写および／または翻訳を指示する、請求項９１に記載の方法。

【請求項101】

請求項９０～１００のいずれか一項に記載の方法によって調製される、宿主細胞の集団の細胞膜に繋留された複数の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）を含む、宿主細胞の集団。

【請求項102】

宿主細胞の集団の細胞膜に繋留された、請求項１９～５９のいずれか一項に記載の複数の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物を発現する宿主細胞の集団。

【請求項103】

請求項１０１または１０２に記載の宿主細胞の集団および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。

【請求項104】

被験体における腫瘍抗原の有害な発現もしくは過剰発現に関連する疾患、障害または状態を有する被験体を処置するための方法であって、前記被験体に、請求項１０１もしくは１０２に記載の宿主細胞の集団、または請求項１０３に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。

【請求項105】

前記疾患が、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、慢性Ｂリンパ球性白血病（Ｂ－ＣＬＬ）、急性ＢおよびＴリンパ球性白血病（ＡＬＬ）、Ｔ細胞リンパ腫（ＴＣＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）および多発性骨髄腫（ＭＭ）からなる群より選択される血液がんである、請求項１０４に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、２０１９年９月５日に出願された米国仮特許出願第６２／８９６，１９０号、２０１９年９月６日に出願された米国仮特許出願第６２／８９６，９９０号、２０１９年１０月３日に出願された米国仮特許出願第６２／９１０，３４１号、２０１９年１２月３日に出願された米国仮特許出願第６２／９４３，０６９号、および２０２０年５月２６日に出願された米国仮特許出願第６３／０３０，１４５号に対する優先権を主張し、これらのそれぞれの全内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。

【0002】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２０年７月２４日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０２０－０７－２４＿０１２２３－００１２－００ＰＣＴ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称であり、１６７，９３６バイトのサイズである。

【0003】

技術分野
本開示は、標的抗原に特異的に結合する二量体抗原受容体（ＤＡＲ）タンパク質構築物、二量体抗原受容体をコードする核酸、核酸を含むベクター、およびベクターを有する宿主細胞を提供する。

【背景技術】

【0004】

背景および概要
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、特に、がんに関連する抗原を標的にするために開発されている。第一世代のＣＡＲは、活性化刺激（シグナル１）のみを送達するシグナル伝達ドメイン（ＴＣＲζ）を含有するように操作された（Ｇｅｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６２（１０）： ５９３１－５９３９， １９９９；Ｈａｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６６（１）： １８２－１８７， ２００１）（Ｈｏｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６１（５）： １９７６－１９８２， ２００１；Ｈｏｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６７（１１）： ６１２３－６１３１， ２００１；Ｍａｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０（１）： ７０－７５， ２００２）。第一世代のＣＡＲを単独で移植されたＴ細胞は、準最適な活性化に起因して、限定的な抗腫瘍有効性を示した（Ｂｅｅｃｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ２３（６）： ６３１－６４２， ２０００）。第二世代のＣＡＲである免疫グロブリン－ＣＤ２８－Ｔ細胞受容体（ＩｇＣＤ２８ＴＣＲ）は、第一世代の受容体に共刺激ＣＤ２８（シグナル２）を組み込み（Ｇｅｒｓｔｍａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５８（１０）： ４５８４－４５９０， １９９７；Ｅｍｔａｇｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １４（２４）： ８１１２－８１２２， ２００８；Ｌｏ， Ｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １６（１０）： ２７６９－２７８０， ２０１０）、これは、より大きな抗腫瘍能力を有するＣＡＲ－Ｔ細胞をもたらした（Ｆｉｎｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６１（６）： ２７９１－２７９７，１９９８；Ｈｏｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６１（５）： １９７６－１９８２， ２００１、Ｍａｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０（１）： ７０－７５， ２００２）。さまざまなＣＡＲバリアントが、ＴＣＲζまたはＣＤ２８のシグナルドメインをＦｃＲγ、４－１ＢＢおよびＯＸ４０などの類似の機能を有する分子で置き換えることによって、開発されている（Ｅｓｈｈａｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ Ｓ Ａ ９０（２）： ７２０－７２４， １９９３）。さまざまな腫瘍抗原に対するＴＣＲ ＣＡＲ－Ｔ細胞が開発されている（Ｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １１（４）： ２９７－３０６， ２００４；Ｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｓｔａｔｅ ６１（１）： １２－２５， ２００４；Ｌｏ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １６（１０）： ２７６９－２７８０， ２０１０；Ｋｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １８（２１）： ５９４９－５９６０， ２０１２；Ｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｓｔａｔｅ ７４（３）： ２８６－２９６， ２０１４；Ｋａｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２１（１４）： ３１４９－３１５９， ２０１５；Ｊｕｎｇｈａｎｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１６ Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ， ７６（１４）：１２５７－１２７０）。
指向性が変更された殺腫瘍活性のためにキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）で操作されたＴ細胞の注入による養子免疫療法は、転移性がんの処置のための潜在的に非常に特異的なモダリティを表す。Ｂ細胞上で発現する分子であるＣＤ１９を標的にするＣＡＲ－Ｔ細胞は、Ｂ細胞悪性疾患の処置において成功を示しており、ＦＤＡの承認を受け、いくつかの治験は、持続的な完全奏効を含む最大で７０％の応答率を示した。それにも関わらず、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、非特異的な活性化を示す場合があり、これは、不適切な免疫活性による潜在的に深刻な有害事象をもたらす場合がある。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Ｍａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（２００４）１１（４）：２９７～３０６

【非特許文献2】Ｍａら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ（２００４）６１（１）：１２～２５

【非特許文献3】Ｌｏら、Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２０１０）１６（１０）：２７６９～２７８０

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

そのため、特異性が増加したＣＡＲ処置の強力な有効性を利用する必要性が本分野に残されたままである。

【課題を解決するための手段】

【0007】

別個のポリペプチド鎖に抗体重鎖結合領域および抗体軽鎖結合領域の両方を含む抗原受容体、ならびに指向性細胞療法におけるそれらの使用が、この必要性を満たすため、および／または他の利点を提供するため、もしくは少なくとも、有用な選択肢を公共に提供するための試みにおいて、本明細書に開示される。一部の実施形態では、本開示は、例えば、膜貫通領域および細胞内領域に連結されたＦａｂ断片を形成する第１および第２のポリペプチド鎖を含む二量体抗原受容体（ＤＡＲ）、ならびにそのようなＤＡＲを発現する細胞を提供する。一部の実施形態では、ＤＡＲを発現するＴ細胞は、例えば、伝統的なＣＡＲを発現するＴ細胞との比較において、標的特異的な増殖および細胞傷害を示し得る。本開示による実施形態は、特許請求の範囲および詳細な説明に記述される。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】図１Ａは、２つの細胞内シグナル伝達配列を含む例示的な二量体抗原受容体を示す概略図である。

【0009】

図１Ｂは、３つの細胞内シグナル伝達配列を含む例示的な二量体抗原受容体を示す概略図である。

【0010】

【図2】図２Ａは、２つの細胞内シグナル伝達配列を含む例示的な二量体抗原受容体を示す概略図である。

【0011】

図２Ｂは、３つの細胞内シグナル伝達配列を含む例示的な二量体抗原受容体を示す概略図である。

【0012】

【図3】図３Ａは、自己切断配列および３つの細胞内シグナル伝達配列を含む例示的な前駆体ポリペプチド分子を示す概略図である。

【0013】

図３Ｂは、自己切断配列および２つの細胞内シグナル伝達配列を含む例示的な前駆体ポリペプチド分子を示す概略図である。

【0014】

【図4】図４Ａは、自己切断配列および３つの細胞内シグナル伝達配列を含む例示的な前駆体ポリペプチド分子を示す概略図である。

【0015】

図４Ｂは、自己切断配列および２つの細胞内シグナル伝達配列を含む例示的な前駆体ポリペプチド分子を示す概略図である。

【0016】

【図5A】図５Ａは、ＢＣＭＡキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物の２つの異なるバージョンを発現するトランスジェニックＴ細胞（ドナー１）を比較する、フローサイトメトリー研究の結果を示す。データを、トランスフェクションの１３日後に収集した。陰性対照は、非トランスジェニック活性化Ｔ細胞（ＡＴＣ）である。別の陰性対照は、ＴＲＡＣ－マイナスＴ細胞系（Ｔ細胞受容体アルファ定常－マイナス）である。トランスフェクション効率および発現レベルのフローサイトメトリー研究を、実施例５に記載する。

【0017】

【図5B】図５Ｂは、ＢＣＭＡ－２Ｃ５二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物の３つの異なるバージョンを発現するトランスジェニックＴ細胞（ドナー１）を比較する、フローサイトメトリー研究（１１日目）の結果を示す。陰性対照は、図５ＡからのＴＲＡＣ－マイナスＴ細胞系である。さまざまなＤＡＲ構築物：ＤＡＲ Ｖ２ｃ構築物；ＤＡＲ Ｖ３ａ構築物；およびＤＡＲ Ｖ３ｂ構築物を発現するトランスジェニック細胞の比較を示す。データを、トランスフェクションの１３日後に収集した。トランスフェクション効率および発現レベルのフローサイトメトリー研究を、実施例５に記載する。

【0018】

【図6】図６は、ＲＰＭＩ８２２６標的細胞における、ＢＣＭＡ ＣＡＲまたはＢＣＭＡ ＤＡＲを発現するＴ細胞（ドナー１）の細胞傷害パーセントを示すグラフである。ラインＡは、陰性対照のＴＲＡＣ－マイナスＴ細胞系（Ｔ細胞受容体アルファ定常－マイナス）を示し；ラインＢは、ＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ２ｃ構築物を示し；ラインＣは、ＣＡＲ ｂｂ２１２１構築物を示し；ラインＤ（点線）は、ＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ３ａ構築物を示し；ラインＥは、ＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ３ｂ構築物を示し；ラインＦは、ＣＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５構築物を示す。細胞傷害研究を、実施例６に記載する。

【0019】

【図7A】図７Ａは、陰性対照のＴＲＡＣ－マイナスＴ細胞系（Ｔ細胞受容体アルファ定常－マイナス）、またはＣＡＲ ｂｂ２１２１構築物；ＣＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５構築物；ＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ２ｃ構築物；ＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ３ａ構築物；もしくはＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ３ｂ構築物を発現するＴ細胞（ドナー１）からのＩＦＮ－ガンマ放出のレベル（標的刺激の４０時間後）を示す棒グラフである。それぞれのデータセットは、左から右に、Ｕ２６６細胞（ＢＣＭＡ陽性細胞）、Ｋ５６２細胞（ＢＣＭＡ陰性細胞）、培地のみ、またはＲＰＭＩ８２２６細胞（ＢＣＭＡ陽性細胞）を示す。サイトカイン放出研究を、実施例７に記載する。

【0020】

【図7B】図７Ｂは、陰性対照のＴＲＡＣ－マイナスＴ細胞系（Ｔ細胞受容体アルファ定常－マイナス）、またはＣＡＲ ｂｂ２１２１構築物；ＣＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５構築物；ＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ２ｃ構築物；ＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ３ａ構築物；もしくはＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ３ｂ構築物を発現するＴ細胞（ドナー１）からのＧＭ－ＣＳＦ放出のレベル（標的刺激の４０時間後）を示す棒グラフである。それぞれのデータセットは、左から右に、Ｕ２６６細胞（ＢＣＭＡ陽性細胞）、Ｋ５６２細胞（ＢＣＭＡ陰性細胞）、培地のみ、またはＲＰＭＩ８２２６細胞（ＢＣＭＡ陽性細胞）を示す。サイトカイン放出研究を、実施例７に記載する。

【0021】

【図8A】図８Ａは、Ｋ５６２、ＲＰＭＩ８２２６、Ｕ２６６または培地のみと共培養した場合の陰性対照のＴＲＡＣ－マイナスＴ細胞系（Ｔ細胞受容体アルファ定常－マイナス）の増殖能力を比較する、フローサイトメトリー研究の結果を示す。データを、共培養の３日目に収集した。共培養フローサイトメトリー研究を、実施例８に記載する。

【0022】

【図8B】図８Ｂは、Ｋ５６２、ＲＰＭＩ８２２６、Ｕ２６６または培地のみと共培養した場合のＣＡＲ ＢＣＭＡ ｂｂ２１２１構築物を発現するトランスジェニックＴ細胞（ドナー１）の増殖能力を比較する、フローサイトメトリー研究の結果を示す。データを、共培養の３日目に収集した。共培養フローサイトメトリー研究を、実施例８に記載する。

【0023】

【図8C】図８Ｃは、Ｋ５６２、ＲＰＭＩ８２２６、Ｕ２６６または培地のみと共培養した場合のＣＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５構築物を発現するトランスジェニックＴ細胞（ドナー１）の増殖能力を比較する、フローサイトメトリー研究の結果を示す。データを、共培養の３日目に収集した。共培養フローサイトメトリー研究を、実施例８に記載する。

【0024】

【図8D】図８Ｄは、Ｋ５６２、ＲＰＭＩ８２２６、Ｕ２６６または培地のみと共培養した場合のＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ２ｃ構築物を発現するトランスジェニックＴ細胞（ドナー１）の増殖能力を比較する、フローサイトメトリー研究の結果を示す。データを、共培養の３日目に収集した。共培養フローサイトメトリー研究を、実施例８に記載する。

【0025】

【図9】図９は、図８Ａ～Ｄからのデータを使用して、トランスジェニックＴ細胞の増殖の倍数変化（ｆｏｌｄ－ｃｈａｎｇｅ）を示す棒グラフであり、ここで、トランスジェニックＴ細胞は、ＣＡＲ ｂｂ２１２１構築物；ＣＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５構築物；またはＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ２ｃ構築物を発現する。Ｔ細胞を、Ｋ５６２、ＲＰＭＩ８２２６またはＵ２６６細胞系と共培養した。データを、共培養の３日目に収集した。倍数変化増殖研究を、実施例８に記載する。

【0026】

【図10A】図１０Ａは、Ｋ５６２、ＲＰＭＩ８２２６、Ｕ２６６または培地のみと共培養した場合の陰性対照のＴＲＡＣ－マイナスＴ細胞系（Ｔ細胞受容体アルファ定常－マイナス）の増殖能力を比較する、フローサイトメトリー研究の結果を示す（図８Ａに表されたものと同じデータ）。データを、共培養の３日目に収集した。共培養研究を、実施例８に記載する。

【0027】

【図10B】図１０Ｂは、Ｋ５６２、ＲＰＭＩ８２２６、Ｕ２６６または培地のみと共培養した場合のＣＡＲ ＢＣＭＡ ｂｂ２１２１構築物を発現するトランスジェニックＴ細胞（ドナー１）の増殖能力を比較する、フローサイトメトリー研究の結果を示す（図１０Ｂに表されたものと同じデータ）。データを、共培養の３日目に収集した。共培養研究を、実施例８に記載する。

【0028】

【図10C】図１０Ｃは、Ｋ５６２、ＲＰＭＩ８２２６、Ｕ２６６または培地のみと共培養した場合のＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ２ａ構築物を発現するトランスジェニックＴ細胞（ドナー１）の増殖能力を比較する、フローサイトメトリー研究の結果を示す。データを、共培養の３日目に収集した。共培養研究を、実施例８に記載する。

【0029】

【図10D】図１０Ｄは、Ｋ５６２、ＲＰＭＩ８２２６、Ｕ２６６または培地のみと共培養した場合のＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ２ｃ構築物を発現するトランスジェニックＴ細胞（ドナー１）の増殖能力を比較する、フローサイトメトリー研究の結果を示す。データを、共培養の３日目に収集した。共培養研究を、実施例８に記載する。

【0030】

【図10E】図１０Ｅは、Ｋ５６２、ＲＰＭＩ８２２６、Ｕ２６６または培地のみと共培養した場合のＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ３ａ構築物を発現するトランスジェニックＴ細胞（ドナー１）の増殖能力を比較する、フローサイトメトリー研究の結果を示す。データを、共培養の３日目に収集した。共培養研究を、実施例８に記載する。

【0031】

【図10F】図１０Ｆは、Ｋ５６２、ＲＰＭＩ８２２６、Ｕ２６６または培地のみと共培養した場合のＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ３ｂ構築物を発現するトランスジェニックＴ細胞（ドナー１）の増殖能力を比較する、フローサイトメトリー研究の結果を示す。データを、共培養の３日目に収集した。共培養研究を、実施例８に記載する。

【0032】

【図11】図１１は、図１０Ａ～Ｅからのデータを使用して、トランスジェニックＴ細胞の増殖の倍数変化を示す棒グラフであり、ここで、トランスジェニックＴ細胞は、ＣＡＲ ｂｂ２１２１構築物；ＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ２ｃ構築物；ＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ３ａ構築物；またはＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ３ｂ構築物を発現する。Ｔ細胞を、Ｋ５６２、ＲＰＭＩ８２２６またはＵ２６６細胞系と共培養した。データを、共培養の３日目に収集した。倍数変化増殖研究を、実施例８に記載する。

【0033】

【図12】図１２は、ＲＰＭＩ８２２６標的細胞における、ＢＣＭＡ ＣＡＲまたはＢＣＭＡ ＤＡＲを発現するＴ細胞（ドナー１）の細胞傷害パーセントを示すグラフである。ラインＡは、陰性対照のＴＲＡＣ－マイナスＴ細胞系（Ｔ細胞受容体アルファ定常－マイナス）を示し；ラインＢは、ＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ２ｃ構築物を示し；ラインＣ（点線）は、ＣＡＲ ｂｂ２１２１構築物を示し；ラインＤは、ＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ３ａ構築物を示し；ラインＥは、ＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ２ｂ構築物を示し；ラインＦは、ＣＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５構築物を示す。細胞傷害研究を、実施例６に記載する。

【0034】

【図13A】図１３Ａは、ＢＣＭＡ－２Ｃ５二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物の３つの異なるバージョンを発現するＴ細胞（ドナー１）を比較する、図５Ａに示される同じＢＣＭＡ－２Ｃ５二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物のフローサイトメトリー研究（１３日目）の結果を示す。陰性対照は、図５ＡからのＴＲＡＣ－マイナスＴ細胞系である。さまざまなＤＡＲ構築物：ＤＡＲ Ｖ２ｃ構築物；ＤＡＲ Ｖ３ａ構築物；およびＤＡＲ Ｖ３ｂ構築物を発現するトランスジェニック細胞の比較を示す。データを、トランスフェクションの１３日後に収集した。トランスフェクション効率および発現レベルのフローサイトメトリー研究を、実施例５に記載する。

【0035】

【図13B】図１３Ｂは、図１３Ａに記載される同じ細胞を使用する、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞およびＤＡＲ Ｔ細胞の集団におけるセントラルメモリーＴ細胞の画分を検出するためのフローサイトメトリー研究の結果を示す。セントラルメモリーＴ細胞研究を、実施例９に記載する。

【0036】

【図13C】図１３Ｃは、図１３Ａに記載される同じ細胞を使用する、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞およびＤＡＲ Ｔ細胞からＴ細胞疲弊マーカーのＰＤ１およびＴＩＭ３を検出するためのフローサイトメトリー研究の結果を示す。Ｔ細胞疲弊研究を、実施例１０に記載する。

【0037】

【図14】図１４は、ＢＣＭＡキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物またはＢＣＭＡ二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物の２つの異なるバージョンを発現するトランスジェニックＴ細胞（ドナー２）を比較する、フローサイトメトリー研究の結果を示す。データを、トランスフェクションの１１日後および１５日の増殖の後に収集した。陰性対照は、非トランスジェニック活性化Ｔ細胞（ＡＴＣ）である。別の陰性対照は、ＴＲＡＣ－マイナスＴ細胞系（Ｔ細胞受容体アルファ定常－マイナス）である。比較は、ＣＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５構築物；ＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ２ａ構築物；またはＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ３ａ構築物を発現するトランスジェニックＴ細胞を含む。トランスフェクション効率および発現レベルのフローサイトメトリー研究を、実施例５に記載する。

【0038】

【図15】図１５は、ＲＰＭＩ８２２６標的細胞における、ＢＣＭＡ－２Ｃ５ ＣＡＲまたはＢＣＭＡ－２Ｃ５ ＤＡＲ構築物を発現するトランスジェニックＴ細胞（ドナー２）の細胞傷害パーセントを示すグラフである。ラインＡは、陰性対照のＴＲＡＣ－マイナスＴ細胞系（Ｔ細胞受容体アルファ定常－マイナス）を示し；ラインＢは、ＣＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５構築物を発現するＴ細胞を示し；ラインＣは、ＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ３ａ構築物を発現するＴ細胞を示し；ラインＤは、ＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ２ａ構築物を発現するＴ細胞を示す。細胞傷害研究を、実施例６に記載する。

【0039】

【図16A】図１６Ａは、Ｋ５６２、ＲＰＭＩ８２２６、Ｒａｊｉまたは培地のみと共培養した場合の陰性対照のＴＲＡＣ－マイナスＴ細胞系（Ｔ細胞受容体アルファ定常－マイナス）の増殖能力を比較する、フローサイトメトリー研究の結果を示す。データを、共培養の６日目に収集した。共培養研究を、実施例８に記載する。

【0040】

【図16B】図１６Ｂは、Ｋ５６２、ＲＰＭＩ８２２６、Ｒａｊｉまたは培地のみと共培養した場合の非トランスジェニック活性化Ｔ細胞（ＡＴＣ）（ドナー２）の増殖能力を比較する、フローサイトメトリー研究の結果を示す。データを、共培養の６日目に収集した。共培養研究を、実施例８に記載する。

【0041】

【図16C】図１６Ｃは、Ｋ５６２、ＲＰＭＩ８２２６、Ｒａｊｉまたは培地のみと共培養した場合のＣＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５構築物を発現するトランスジェニックＴ細胞（ドナー２）の増殖能力を比較する、フローサイトメトリー研究の結果を示す。データを、共培養の６日目に収集した。共培養研究を、実施例８に記載する。

【0042】

【図16D】図１６Ｄは、ＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ２ａ構築物を発現するトランスジェニックＴ細胞（ドナー２）の増殖能力を比較する（Ｋ５６２、ＲＰＭＩ８２２６、Ｒａｊｉまたは培地のみと共培養した場合のＢＢＺ）、フローサイトメトリー研究の結果を示す。データを、共培養の６日目に収集した。共培養研究を、実施例８に記載する。

【0043】

【図16E】図１６Ｅは、Ｋ５６２、ＲＰＭＩ８２２６、Ｒａｊｉまたは培地のみと共培養した場合のＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ３ａ構築物を発現するトランスジェニックＴ細胞（ドナー２）の増殖能力を比較する、フローサイトメトリー研究の結果を示す。データを、共培養の６日目に収集した。共培養研究を、実施例８に記載する。

【0044】

【図17】図１７は、ＣＡＲ構築物またはＢＣＭＡ－２Ｃ５由来の抗原結合領域を有する異なるＤＡＲ構築物のいずれかを発現するトランスジェニックＴ細胞（ドナー２）の増殖の倍数変化を示す棒グラフである。比較は、ＣＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５構築物；ＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ２ａ構築物；およびＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ３ａ構築物を発現するＴ細胞を含む。データを、共培養の６日目に収集した。倍数変化増殖研究を、実施例８に記載する。

【0045】

【図18A】図１８Ａは、異種移植マウスモデルにおけるＢＣＭＡ ＤＡＲを発現するＴ細胞の殺腫瘍活性の生物発光イメージングを示す（最長で処置後１２週目まで）。生物発光腫瘍を有するマウスに、ＰＢＳ緩衝液、ＴＲＡＣ－マイナスＴ細胞、またはＤＡＲ Ｖ２ｃ、ＤＡＲ Ｖ３ｂもしくはＤＡＲ Ｖ３ａを含むＢＣＭＡ－２Ｃ５ ＤＡＲ構築物を発現するトランスジェニックＴ細胞を投与した。異種移植マウス研究を、実施例１１に記載する。

【0046】

【図18B】図１８Ｂは、図１８Ａに記載される処置マウスから測定された総フラックス（光子／秒）を示すグラフである。ラインＡは、ＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ３ａを示し；ラインＢは、ＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ３ｂを示し；ラインＣは、ＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ２ｃを示し；ラインＤは、ＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ ＴＲＡＣ－マイナスＴ細胞を示し；ラインＥは、ＰＢＳ処置マウスを示す。実施例１１を参照されたい。

【0047】

【図18C】図１８Ｃは、図１８Ａに記載されるマウスから得られた腫瘍成長阻害指数を列挙する表である。表は、最長で処置後８週目までに得られたデータを列挙する。実施例１１を参照されたい。

【0048】

【図18D】図１８Ｄは、図１８Ａに記載されるマウスからの血液試料中で検出されたＣＤ４５陽性細胞の数を示すグラフである。グラフは、最長で処置後１２週目までに得られたデータを示す。ラインＡは、ＰＢＳ処置マウスを示し；ラインＢは、ＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ２ｃを示し；ラインＣは、ＴＲＡＣ－マイナスＴ細胞を示し；ラインＤは、ＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ３ｂを示し；ラインＥは、ＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ３ａを示す。実施例１１を参照されたい。

【0049】

【図18E】図１８Ｅは、図１８Ａに記載されるマウスからの血液試料中で検出されたＤＡＲ陽性細胞の数を示すグラフである。グラフは、最長で処置後１２週目までに得られたデータを示す。ラインＡは、ＴＲＡＣ－マイナスＴ細胞を示し；ラインＢは、ＰＢＳ処置マウスを示し；ラインＣは、ＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ２ｃを示し；ラインＤは、ＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ３ｂを示し；ラインＥは、ＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ３ａを示す。実施例１１を参照されたい。

【0050】

【図18F】図１８Ｆは、図１８Ａに記載されるマウスからの血液試料中で検出されたＣＤ３陰性細胞の数を示すグラフである。グラフは、最長で処置後１２週目までに得られたデータを示す。ラインＡは、ＰＢＳ処置マウスを示し；ラインＢは、ＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ２ｃを示し；ラインＣは、ＴＲＡＣ－マイナスＴ細胞を示し；ラインＤは、ＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ３ｂを示し；ラインＥは、ＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ３ａを示す。実施例１１を参照されたい。

【0051】

【図18G】図１８Ｇは、図１８Ａに記載されるマウスからの血液試料中で検出されたＣＤ３陽性細胞の数を示すグラフである。グラフは、最長で処置後１２週目までに得られたデータを示す。ラインＡは、ＰＢＳ処置マウスを示し；ラインＢは、ＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ２ｃを示し；ラインＣは、ＴＲＡＣ－マイナスＴ細胞を示し；ラインＤは、ＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ３ａを示し；ラインＥは、ＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ３ｂを示す。実施例１１を参照されたい。

【0052】

【図18H】図１８Ｈは、図１８Ａに記載されるマウスの生存率を示すグラフである。ラインＡは、ＰＢＳ処置マウスを示し；ラインＢは、ＴＲＡＣ－マイナスＴ細胞を示し；ラインＣは、ＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ２ｃを示し；ラインＤは、ＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ３ｂを示し；ラインＥは、ＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ３ａを示す。実施例１１を参照されたい。

【0053】

【図19A】図１９Ａは、異種移植マウスモデルにおけるＢＣＭＡ ＤＡＲを発現するＴ細胞の殺腫瘍活性の生物発光イメージングを示す（最長で処置後１２週目まで）。生物発光ＲＰＭＩ８２２６腫瘍を有するマウスに、ＰＢＳ緩衝液、ＴＲＡＣ－マイナスＴ細胞、またはＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ３ａ構築物を発現するトランスジェニックＴ細胞の３つの異なる用量の１つを投与した。異種移植マウス研究を、実施例１２に記載する。

【0054】

【図19B】図１９Ｂは、図１９Ａに記載される処置マウスから測定された総フラックス（光子／秒）を示すグラフである。グラフは、最長で処置後７６日目までに得られたデータを示す。ラインＡは、６×１０^６個細胞のＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ３ａを投与されたマウスを示し；ラインＢは、１．２×１０^６個細胞のＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ３ａを投与されたマウスを示し；ラインＣは、２．４×１０^５個細胞のＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ３ａを投与されたマウスを示し；ラインＤは、ＴＲＡＣ－マイナスＴ細胞を投与されたマウスを示し；ラインＥは、ＰＢＳを投与されたマウスを示す。実施例１２を参照されたい。

【0055】

【図19C】図１９Ｃは、図１９Ａに記載されるマウスから得られた腫瘍成長阻害指数を列挙する表である。表は、最長で処置後７週目までに得られたデータを列挙する。実施例１２を参照されたい。

【0056】

【図19D】図１９Ｄは、図１９Ａに記載されるマウスからの血液試料中で検出されたＣＤ４５陽性細胞の数を示すグラフである。グラフは、最長で処置後６５日目までに得られたデータを示す。ラインＡは、ＰＢＳ処置マウスを示し；ラインＢは、ＴＲＡＣ－マイナスＴ細胞を示し；ラインＣは、２．４×１０^５個のＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ３ａを投与されたマウスを示し；ラインＤは、１．２×１０^６個のＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ３ａを投与されたマウスを示し；ラインＥは、６×１０^６個のＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ３ａを投与されたマウスを示す。実施例１２を参照されたい。

【0057】

【図19E】図１９Ｅは、図１９Ａに記載されるマウスからの血液試料中で検出されたＤＡＲ陽性細胞の数を示すグラフである。グラフは、最長で処置後６５日目までに得られたデータを示す。ラインＡは、ＰＢＳ処置マウスを示し；ラインＢは、ＴＲＡＣ－マイナスＴ細胞を示し；ラインＣは、２．４×１０^５個のＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ３ａを投与されたマウスを示し；ラインＤは、１．２×１０^６個のＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ３ａを投与されたマウスを示し；ラインＥは、６×１０^６個のＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ３ａを投与されたマウスを示す。実施例１２を参照されたい。

【0058】

【図19F】図１９Ｆは、図１９Ａに記載されるマウスからの血液試料中で検出されたＣＤ３陰性細胞の数を示すグラフである。グラフは、最長で処置後６５日目までに得られたデータを示す。ラインＡは、ＰＢＳ処置マウスを示し；ラインＢは、ＴＲＡＣ－マイナスＴ細胞を示し；ラインＣは、２．４×１０^５個のＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ３ａを投与されたマウスを示し；ラインＤは、１．２×１０^６個のＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ３ａを投与されたマウスを示し；ラインＥは、６×１０^６個のＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ３ａを投与されたマウスを示す。実施例１２を参照されたい。

【0059】

【図19G】図１９Ｇは、図１９Ａに記載されるマウスからの血液試料中で検出されたＣＤ３陽性細胞の数を示すグラフである。グラフは、最長で処置後６５日目までに得られたデータを示す。ラインＡは、ＰＢＳ処置マウスを示し；ラインＢは、２．４×１０^５個のＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ３ａを投与されたマウスを示し；ラインＣは、１．２×１０^６個のＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ３ａを投与されたマウスを示し；ラインＤは、ＴＲＡＣ－マイナスＴ細胞を投与されたマウスを示し；ラインＥは、６×１０^６個のＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ３ａを投与されたマウスを示す。実施例１２を参照されたい。

【0060】

【図19H】図１９Ｈは、図１９Ａに記載されるマウスの生存率を示すグラフである。ラインＡは、ＰＢＳを投与されたマウスを示し；ラインＢは、ＴＲＡＣ－マイナスＴ細胞を投与されたマウスを示し；ラインＣは、１．２×１０^６個のＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ３ａを投与されたマウスを示し；ラインＤは、１．２×１０^６個のＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ３ａを投与されたマウスを示し；ラインＥは、６×１０^６個のＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ３ａを投与されたマウスを示す。実施例１２を参照されたい。

【0061】

【図20A】図２０Ａは、異種移植マウスモデルにおけるＢＣＭＡ ＤＡＲを発現するＴ細胞の殺腫瘍活性の生物発光イメージングを示し、ここで、図１９Ａに記載されるマウスを、ＲＰＭＩ８２２６生物発光腫瘍で再チャレンジしたが、追加のＤＡＲ Ｔ細胞は投与しなかった。生物発光データを、最長で再チャレンジ後７週目まで示す。異種移植マウス研究を、実施例１３に記載する。

【0062】

【図20B】図２０Ｂは、図２０Ａに記載される腫瘍再チャレンジマウスからの血液試料中で検出されたＣＤ４５陽性細胞の数を示すグラフである。グラフは、最長で処置後６５日目までに得られたデータを示す。ラインＡは、ＲＰＭＩ腫瘍細胞で再チャレンジされたマウスを示し；ラインＢは、ＰＢＳで再チャレンジされたマウスを示す。

【0063】

【図20C】図２０Ｃは、図２０Ａに記載される腫瘍再チャレンジマウスからの血液試料中で検出されたＤＡＲ陽性細胞の数を示すグラフである。グラフは、最長で処置後６５日目までに得られたデータを示す。ラインＡは、ＲＰＭＩ腫瘍細胞で再チャレンジされたマウスを示し；ラインＢは、ＰＢＳで再チャレンジされたマウスを示す。

【0064】

【図21】図２１は、野生型ヒトＢＣＭＡ抗原、変異体－１ヒトＢＣＭＡ抗原、変異体－２ヒトＢＣＭＡ抗原、ヒトＡＰＲＩＬ抗原およびヒトＢＡＦＦ抗原のアミノ酸配列を示す。

【0065】

【図22】図２２は、抗ＢＣＭＡ－２Ｃ５重鎖可変領域、重鎖定常領域、軽鎖可変領域および軽鎖定常領域のアミノ酸配列を示す。

【0066】

【図23】図２３は、抗ＢＣＭＡ－２Ｅ１、－ＢＣ４Ｃ９および－ＢＣ５Ｃ４の抗ＢＣＭＡ重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。

【0067】

【図24】図２４は、抗ＢＣＭＡ－ＢＣ６Ｇ８、－２Ｄ１１および－２Ｇ２の抗ＢＣＭＡ重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。

【0068】

【図25】図２５は、抗ＢＣＭＡ－２Ｄ８および－２Ｅ８の抗ＢＣＭＡ重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。

【0069】

【図26】図２６は、抗ＢＣＭＡ－ｂｂ２１２１の抗ＢＣＭＡ重鎖可変領域、重鎖定常領域、軽鎖可変領域および軽鎖定常領域のアミノ酸配列を示す。

【0070】

【図27】図２７は、ＣＡＲ ＧＳリンカー、ＣＡＲ ｂｂ２１２１リンカー、ＣＤ８ヒンジ領域、ＣＤ２８ヒンジ領域、ＣＤ８およびＣＤ２８ヒンジ領域、ＣＤ２８膜貫通領域、ＣＤ８膜貫通領域、４－１ＢＢ膜貫通領域、ならびにＣＤ３ゼータ膜貫通領域のアミノ酸配列を示す。

【0071】

【図28】図２８は、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＣＤ３ゼータ（ＩＴＡＭ １、２および３）、ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ １、ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ ２およびＣＤ３ゼータＩＴＡＭ ３についての細胞内領域のアミノ酸配列を示す。

【0072】

【図29】図２９は、ＣＡＲ細胞内ドメイン２８Ｚ、ならびにＶ１、Ｖ２ａ、Ｖ２ｂ、Ｖ２ｃ、Ｖ３ａ、Ｖ３ｂおよびＶ４についてのＤＡＲ細胞内ドメインのアミノ酸配列を示す。

【0073】

【図30】図３０は、Ｖ３ｃ、Ｖ２ｃ－ａｌｔおよびＶ３ｂ－ａｌｔについてのＤＡＲ細胞内ドメインのアミノ酸配列を示す。

【0074】

【図31】図３１は、重鎖および軽鎖リーダー配列、ならびにＴ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２ＡおよびＦ２Ａを含む４つの異なる自己切断配列のアミノ酸配列を示す。

【0075】

【図32】図３２は、ＣＡＲ ２８Ｚ ＢＣＭＡ－２Ｃ５およびＢＣＭＡ－ｂｂ２１２１のアミノ酸配列を示す。

【0076】

【図33】図３３は、ＤＡＲ Ｖ１ ＢＣＭＡ－２Ｃ５についての前駆体、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドのアミノ酸配列を示す。

【0077】

【図34】図３４は、ＤＡＲ Ｖ２ａ ＢＣＭＡ－２Ｃ５についての前駆体、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドのアミノ酸配列を示す。

【0078】

【図35】図３５は、ＤＡＲ Ｖ２ｂ ＢＣＭＡ－２Ｃ５についての前駆体、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドのアミノ酸配列を示す。

【0079】

【図36】図３６は、ＤＡＲ Ｖ２ｃ ＢＣＭＡ－２Ｃ５についての前駆体、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドのアミノ酸配列を示す。

【0080】

【図37】図３７は、ＤＡＲ Ｖ３ａ ＢＣＭＡ－２Ｃ５についての前駆体、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドのアミノ酸配列を示す。

【0081】

【図38】図３８は、ＤＡＲ Ｖ３ｂ ＢＣＭＡ－２Ｃ５についての前駆体、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドのアミノ酸配列を示す。

【0082】

【図39】図３９は、ＤＡＲ Ｖ４ ＢＣＭＡ－２Ｃ５についての前駆体、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドのアミノ酸配列を示す。

【0083】

【図40】図４０は、ＤＡＲ Ｖ２ａ ＢＣＭＡ－ｂｂ２１２１についての前駆体、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドのアミノ酸配列を示す。

【発明を実施するための形態】

【0084】

詳細な説明
定義：

【0085】

他に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、他に定義されなければ当業者によって通常理解される意味を有する。一般に、本明細書に記載される、細胞および組織培養の技法、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、トランスジェニック細胞の生成、タンパク質化学および核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションに関する専門用語は、周知であり、当技術分野において通常使用されている。本明細書に提供される方法および技法は、他に指示されない限り、一般に、当技術分野において周知の従来の手順に従って、ならびに本明細書で引用および論述されるさまざまな一般的およびより具体的な参考文献に記載されるようにして行われる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． （１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ （１９９２）を参照されたい。Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ （ｅｄ） Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， ＮＹ， １９９５；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ． Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， Ｅｎｇｌａｎｄ， １９９６；およびＰａｕｌ （１９９５） Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｗａｔａ， Ｎ．Ｊ．， １９９５；Ｐａｕｌ （ｅｄ．）， Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ， １９９３；Ｃｏｌｉｇａｎ （１９９１） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ， ＮＹ；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ （１９８９） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ；Ｓｔｉｔｅｓ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．） Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （４ｔｈ ｅｄ．） Ｌａｎｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｌｏｓ Ａｌｔｏｓ， Ｃａｌｉｆ．、およびそこで引用された参考文献；Ｃｏｄｉｎｇ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ （２ｎｄ ｅｄ．） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， １９８６ならびにＫｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｎａｔｕｒｅ ２５６： ４９５－４９７， １９７５を含む、多くの基本的な教科書が、標準的な抗体生成プロセスを記載している。本明細書に引用されるすべての参考文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。酵素反応および富化／精製技法も周知であり、製造者の仕様に従って、当技術分野で通常達成されるように、または本明細書に記載されるように、行われる。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学ならびに医薬および製薬化学に関連して使用される専門用語、ならびにそれらの実験室手順および技法は、当技術分野において周知であり、一般に使用されている。標準的な技法を、化学合成、化学分析、医薬品調製、製剤化および送達、ならびに患者の処置のために使用することができる。

【0086】

本明細書に提供される見出しは、本開示のさまざまな態様の限定ではなく、それらの態様は、全体として本明細書を参照することによって理解することができる。

【0087】

本明細書の文脈によって他に要求されない限り、単数形の用語は複数を含むものとし、複数形の用語は単数を含むものとする。単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」、ならびに任意の語の単数での使用は、明示的かつ明確に１つの指示対象に限定されない限り、複数の指示対象を含む。

【0088】

本明細書における選択肢（例えば、「または」）の使用は、選択肢の一方もしくは両方またはそれらの任意の組合せのいずれかを意味するように解釈されることが理解される。

【0089】

本明細書で使用される「および／または」という用語は、他のものとともに、または他のものなしで、指定された特徴または構成要素のそれぞれの具体的な開示を意味するように解釈されるべきである。例えば、本明細書で「Ａおよび／またはＢ」などの語句において使用される「および／または」という用語は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）および「Ｂ」（単独）を含むことが意図される。同様に、「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」などの語句において使用される「および／または」という用語は、以下の態様のそれぞれを包含することが意図される：Ａ、ＢおよびＣ；Ａ、ＢまたはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）。

【0090】

本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語、ならびにそれらの文法的変形は、本明細書で使用される場合、リスト中の１つの項目または複数の項目が、列挙された項目を置換することができるか、またはそれらに追加することができる他の項目を排除しないように、非限定的であることが意図される。態様が「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言語とともに本明細書に記載されていようとも、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」および／または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語で記載される他の類似の態様も提供されることが理解される。

【0091】

本明細書で使用される場合、「約」という用語は、当業者によって決定される特定の値または組成に対して許容される誤差範囲内にある値または組成を指し、これは、一部分では、その値または組成を測定または決定する方法、すなわち、測定系の限界に依存する。例えば、「約」または「およそ」は、当技術分野における実施に従って、１または１を超える標準偏差内を意味し得る。あるいは、「約」または「およそ」は、測定系の限界に応じて、最大で１０％までの範囲（すなわち、±１０％）またはそれを超える範囲を意味し得る。例えば、約５ｍｇは、４．５ｍｇおよび５．５ｍｇの間の任意の数を含むことができる。さらにまた、生物システムまたはプロセスに関して特に、この用語は、最大で１桁までの大きさ、または最大で５倍までの値を意味し得る。特定の値または組成が本開示に提供される場合、他に言及されない限り、「約」または「およそ」の意味は、その特定の値または組成に対する許容される誤差範囲内であると想定されるべきである。

【0092】

本明細書で使用される「ペプチド」、「ポリペプチド」、「ポリペプチド鎖」および「タンパク質」という用語ならびに他の関連する用語は、互換的に使用され、アミノ酸のポリマーを指し、任意の特定の長さに限定されない。ポリペプチドは、天然および非天然のアミノ酸を含み得る。ポリペプチドは、組換え形態または化学合成された形態を含む。ポリペプチドは、前駆体分子および成熟分子も含む。前駆体分子は、切断、例えば、分泌シグナルペプチドによるか、またはある特定のアミノ酸残基での非酵素的切断による切断にまだ供されていないものを含む。ポリペプチドには、切断を受けた成熟分子が含まれる。これらの用語は、ネイティブタンパク質、組換えタンパク質および人工タンパク質、タンパク質断片、ならびにタンパク質配列のポリペプチドアナログ（ムテイン、バリアント、キメラタンパク質および融合タンパク質など）だけでなく、翻訳後にまたは他に、共有結合的もしくは非共有結合的に修飾されたタンパク質も包含する。２つまたはそれよりも多くのポリペプチド（例えば、２～６、またはそれよりも多くのポリペプチド鎖）は、共有結合的および／または非共有結合的な会合を介して互いと会合して、ポリペプチド複合体を形成することができる。ポリペプチド鎖の会合は、ペプチドのフォールディングも含み得る。そのため、ポリペプチド複合体は、複合体を形成するポリペプチド鎖の数に応じて、二量体、三量体、四量体、またはそれよりも高次の複合体であり得る。２つのポリペプチド鎖を含む二量体抗原受容体（ＤＡＲ）が、本明細書に記載される。

【0093】

本明細書で使用される「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語ならびに他の関連する用語は、互換的に使用され、ヌクレオチドのポリマーを指し、任意の特定の長さに限定されない。核酸は、組換え形態および化学合成された形態を含む。核酸は、ＤＮＡ分子（ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチドアナログ（例えば、ペプチド核酸および天然に存在しないヌクレオチドアナログ）を使用して作製されたＤＮＡまたはＲＮＡのアナログ、およびそれらのハイブリッドを含む。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得る。一実施形態では、本開示の核酸分子は、二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物、またはその断片もしくはｓｃＦＶ、誘導体、ムテインもしくはバリアントをコードする連続したオープンリーディングフレームを含む。一実施形態では、核酸は、１種類のポリヌクレオチド、または２種類もしくはそれよりも多くの異なる種類のポリヌクレオチドの混合物を含む。二量体抗原受容体（ＤＡＲ）またはその抗原結合性部分をコードする核酸が、本明細書に記載される。第１の核酸（例えば、第１のポリペプチドをコードする）および第２の核酸（例えば、第２のポリペプチドをコードする）を含む実施形態に関して、第１の核酸および第２の核酸は、別々の分子として、または同じ連続する分子（例えば、第１および第２のコード配列を含有するプラスミドまたは他の構築物）内のいずれかで提供され得る。

【0094】

「回収する（ｒｅｃｏｖｅｒ）」または「回収（ｒｅｃｏｖｅｒｙ）」または「回収する（ｒｅｃｏｖｅｒｉｎｇ）」という用語および他の関連する用語は、宿主細胞の培養培地から、または宿主細胞溶解物から、または宿主細胞膜から、タンパク質（例えば、ＤＡＲまたはその前駆体もしくは抗原結合性部分）を得ることを指す。一実施形態では、タンパク質は、宿主細胞から（例えば、哺乳動物宿主細胞から）発現したタンパク質の分泌を媒介する分泌シグナルペプチド（リーダーペプチド配列）配列に融合された組換えタンパク質として、宿主細胞によって発現される。分泌したタンパク質は、宿主細胞の培地から回収することができる。一実施形態では、タンパク質は、分泌シグナルペプチド配列が欠如している組換えタンパク質として、宿主細胞によって発現され、これは、宿主細胞溶解物から回収することができる。一実施形態では、タンパク質は、膜結合タンパク質として、宿主細胞によって発現され、これは、宿主細胞膜から発現したタンパク質を放出させる界面活性剤を使用して、回収することができる。一実施形態では、タンパク質を回収するために使用される方法に関わりなく、タンパク質は、回収されたタンパク質から細胞残屑を除去する手順に供すことができる。例えば、回収されたタンパク質は、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動および／または透析に供すことができる。一実施形態では、クロマトグラフィーは、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーおよび／またはシリカ上のクロマトグラフィーを含む手順の、いずれか１つ、または任意の組合せ、または２つもしくはそれよりも多くを含む。一実施形態では、アフィニティークロマトグラフィーは、プロテインＡまたはＧ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来の細胞壁構成成分）を含む。

【0095】

「単離された」という用語は、他の細胞物質を実質的に含まないタンパク質（例えば、ＤＡＲ、またはその前駆体もしくは抗原結合性部分）またはポリヌクレオチドを指す。タンパク質は、当技術分野において周知のタンパク質精製技法を使用して、単離によって、天然に関連する構成成分（または、ＤＡＲを生成するために使用される細胞発現系もしくは化学合成法に関連する構成成分）を実質的に含まない状態になり得る。単離されたという用語は、一部の実施形態では、同じ種の他の分子、例えば、それぞれ異なるアミノ酸もしくはヌクレオチド配列を有する他のタンパク質またはポリヌクレオチドを実質的に含まないタンパク質またはポリヌクレオチドも指す。所望の分子の純度または均一性は、ゲル電気泳動などの低分解能の方法およびＨＰＬＣまたは質量分析などの高分解能の方法を含む、当技術分野において周知の技法を使用して、アッセイすることができる。一実施形態では、本開示の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）またはその抗原結合性部分の単離された前駆体ポリペプチドならびに第１および第２のポリペプチド鎖は、単離される。

【0096】

本明細書に記載される二量体抗原受容体（ＤＡＲ）を含む抗体は、多様な抗原特異性を有する免疫グロブリンを含有する血清または血漿などの供給源から得ることができる。そのような抗体がアフィニティー精製に供される場合、それらは、特定の抗原特異性について富化され得る。抗体のそのような富化された調製物は、通常、特定の抗原に対する特異的結合活性を有する約１０％未満の抗体で構成される。これらの調製物をアフィニティー精製の数回のラウンドに供すことで、抗原に対する特異的結合活性を有する抗体の割合を増加させることができる。この方法で調製される抗体は、多くの場合、「単一特異性」と称される。単一特異性抗体調製物は、特定の抗原に対する特異的結合活性を有する、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％または９９．９％の抗体で構成され得る。抗体は、下記に記載される組換え核酸技術を使用して、生成することができる。

【0097】

「リーダー配列」または「リーダーペプチド」または「ペプチドシグナル配列」または「シグナルペプチド」または「分泌シグナルペプチド」という用語は、ポリペプチドのＮ末端に位置するペプチド配列を指す。リーダー配列は、ポリペプチド鎖を細胞分泌経路に導き、細胞膜の脂質二重層へのポリペプチドの組み込みおよび繋留を指示することができる。典型的には、リーダー配列は、約１０～５０アミノ酸長である。リーダー配列は、細胞質から小胞体への前駆体ポリペプチドの輸送を指示することができる。一実施形態では、リーダー配列としては、ＣＤ８α、ＣＤ２８またはＣＤ１６リーダー配列を含むシグナル配列が挙げられる。一実施形態では、シグナル配列は、例えば、マウスまたはヒトＩｇガンマ分泌シグナルペプチドを含む哺乳動物の配列を含む。一実施形態では、リーダー配列は、マウスＩｇガンマリーダーペプチド配列ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ（配列番号９０）を含む。

【0098】

本明細書で使用される「抗原結合タンパク質」および関連する用語は、抗原に結合する部分、および必要に応じて、抗原結合性部分が抗原結合タンパク質の抗原への結合を促進するコンフォメーションを採用するのを可能にするスキャフォールドまたはフレームワーク部分を含むタンパク質を指す。抗原結合タンパク質の例としては、二量体抗原受容体（ＤＡＲ）、抗体、抗体断片（例えば、抗体の抗原結合性部分）、抗体誘導体および抗体アナログが挙げられる。抗原結合タンパク質は、例えば、グラフト化ＣＤＲまたはＣＤＲ誘導体を有する代替タンパク質スキャフォールドまたは人工スキャフォールドを含むことができる。そのようなスキャフォールドとしては、限定されるものではないが、例えば、抗原結合タンパク質の三次元構造を安定化するために導入された変異を含む抗体由来スキャフォールド、および例えば、生体適合性ポリマーを含む完全合成スキャフォールドが挙げられる。例えば、Ｋｏｒｎｄｏｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｆｕｎｃｔｉｏｎ， ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， Ｖｏｌｕｍｅ ５３， Ｉｓｓｕｅ １：１２１－１２９； Ｒｏｑｕｅ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ． ２０：６３９－６５４を参照されたい。加えて、ペプチド抗体ミメティック（「ＰＡＭ」）を使用することができるだけでなく、スキャフォールドとしてフィブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｏｎ）構成成分を利用する抗体ミメティックに基づくスキャフォールドも使用することができる。二量体抗原受容体（ＤＡＲ）を含む抗原結合タンパク質が、本明細書に記載される。

【0099】

抗原結合タンパク質は、例えば、免疫グロブリンの構造を有することができる。一実施形態では、「免疫グロブリン」は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対で構成され、それぞれの対が１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０～７０ｋＤａ）を有する、四量体分子を指す。それぞれの鎖のアミノ末端部分は、抗原認識の主に原因となる約１００～１１０またはそれよりも多くのアミノ酸の可変領域を含む。それぞれの鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能の主に原因となる定常領域を規定する。ヒト軽鎖は、カッパまたはラムダ軽鎖として分類される。重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファまたはイプシロンとして分類され、それぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥとして抗体のアイソタイプを規定する。軽鎖および重鎖内で、可変領域および定常領域は、約１２またはそれよりも多くのアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結され、重鎖も、約１０よりも多くのアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。一般に、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｈ． ７ （Ｐａｕｌ， Ｗ．， ｅｄ．， ２ｎｄ ｅｄ． Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ． （１９８９））を参照されたい（すべての目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。重鎖および／または軽鎖は、分泌のためのリーダー配列を含んでいてもよく、または含んでいなくてもよい。それぞれの軽鎖／重鎖の対の可変領域は、無傷免疫グロブリンが２つの抗原結合部位を有するように、抗体結合部位を形成する。一実施形態では、抗原結合タンパク質は、四量体免疫グロブリン分子とは異なるが、依然として、１つの標的抗原と結合するまたは２つもしくはそれよりも多くの標的抗原と結合する構造を有する合成分子であり得る。例えば、合成抗原結合タンパク質は、抗体断片、１～６もしくはそれよりも多くのポリペプチド鎖、ポリペプチドの非対称アセンブリー、または他の合成分子を含み得る。標的抗原（例えば、ＢＣＭＡ抗原）に特異的に結合する免疫グロブリン様特性を有する二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構造を有する抗原結合タンパク質が、本明細書に記載される。

【0100】

免疫グロブリン鎖の可変領域は、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる３つの超可変領域によって連結された比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般構造を示す。Ｎ末端からＣ末端に、軽鎖および重鎖は両方とも、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４のセグメントを含む。

【0101】

１つまたは複数のＣＤＲは、共有結合的または非共有結合的のいずれかで分子に組み込まれて、それを抗原結合タンパク質にし得る。抗原結合タンパク質は、より大きなポリペプチド鎖の一部としてＣＤＲを組み込んでもよく、別のポリペプチド鎖にＣＤＲを共有結合的に連結してもよく、または非共有結合的にＣＤＲを組み込んでもよい。ＣＤＲは、抗原結合タンパク質が特定の目的の抗原に特異的に結合することを可能にする。

【0102】

アミノ酸のそれぞれのドメインへの割当は、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５^ｔｈ Ｅｄ．， ＵＳ Ｄｅｐｔ． ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， ＰＨＳ， ＮＩＨ， ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｏ． ９１－３２４２， １９９１のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．の定義に従う（「Ｋａｂａｔ番号付け」）。免疫グロブリン鎖中のアミノ酸についての他の番号付けシステムとしては、ＩＭＧＴ．ＲＴＭ．（ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ； Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ， Ｄｅｖ． Ｃｏｍｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２９：１８５－２０３； ２００５）およびＡＨｏ（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３０９（３）：６５７－６７０； ２００１）；Ｃｈｏｔｈｉａ（Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．， １９９７ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２７３：９２７－９４８）；Ｃｏｎｔａｃｔ（Ｍａｃｃａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．， １９９６ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２６２：７３２－７４５）およびＡｈｏ（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ２００１ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３０９：６５７－６７０）が挙げられる。

【0103】

本明細書で使用される「抗体」および「複数の抗体」ならびに関連する用語は、無傷免疫グロブリン、または抗原に特異的に結合するその抗原結合性部分を指す。抗原結合性部分は、組換えＤＮＡ技法によって、または無傷抗体の酵素的もしくは化学的切断によって、生成し得る。抗原結合性部分としては、とりわけ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、ならびに特異的な抗原結合をポリペプチドに付与するのに十分である免疫グロブリンの少なくとも一部分を含有するポリペプチドが挙げられる。

【0104】

抗体としては、組換え的に生成された抗体および抗原結合性部分が挙げられる。抗体としては、非ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体および完全ヒト抗体が挙げられる。抗体としては、単一特異的、多重特異的（例えば、二重特異的、三重特異的およびより高次に特異的）が挙げられる。抗体としては、四量体抗体、軽鎖単量体、重鎖単量体、軽鎖二量体、重鎖二量体が挙げられる。抗体としては、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆａｂ’断片およびＦａｂ断片が挙げられる。抗体としては、単一ドメイン抗体、一価抗体、一本鎖抗体、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ラクダ化抗体（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、抗イディオタイプ抗体（抗Ｉｄ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）が挙げられる。抗体としては、モノクローナルおよびポリクローナルの集団が挙げられる。二量体抗原受容体（ＤＡＲ）を含む抗体様分子が、本明細書に記載される。

【0105】

本明細書で使用される「抗原結合ドメイン」、「抗原結合領域」または「抗原結合部位」および他の関連する用語は、抗原と相互作用し、抗原結合タンパク質の抗原に対する特異性および親和性に寄与するアミノ酸残基（または他の部分）を含有する、抗原結合タンパク質の一部分を指す。その抗原に特異的に結合する抗体について、これは、そのＣＤＲドメインの少なくとも１つの少なくとも一部を含む。抗原結合ドメインを形成する抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域を有する二量体抗原受容体（ＤＡＲ）が、本明細書に記載される。

【0106】

抗体または抗原結合タンパク質または抗体断片の文脈において本明細書で使用される場合、「特異的結合」、「特異的に結合する」または「特異的に結合している」という用語および他の関連する用語は、他の分子または部分と比べて、抗原への非共有結合的または共有結合的な優先的結合を指す（例えば、抗体は、他の利用可能な抗原と比べて、特定の抗原に特異的に結合する）。一実施形態では、抗体が、１０^－５Ｍもしくはそれよりも低い、または１０^－６Ｍもしくはそれよりも低い、または１０^－７Ｍもしくはそれよりも低い、または１０^－８Ｍもしくはそれよりも低い、または１０^－９Ｍもしくはそれよりも低い、または１０^－１０Ｍもしくはそれよりも低い、または１０^－１１Ｍもしくはそれよりも低い解離定数Ｋ_Ｄで抗原に結合する場合、抗体は、標的抗原に特異的に結合する。一実施形態では、それらの標的抗原（例えば、ＢＣＭＡ抗原）に特異的に結合する二量体抗原受容体（ＤＡＲ）が、本明細書に記載される。

【0107】

一実施形態では、抗体または抗原結合タンパク質または抗体断片の結合特異性は、ＥＬＩＳＡ、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、電気化学発光アッセイ（ＥＣＬ）、イムノラジオメトリックアッセイ（ＩＲＭＡ）、または酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）によって、測定することができる。

【0108】

一実施形態では、解離定数（Ｋ_Ｄ）は、ＢＩＡＣＯＲＥ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイを使用して、測定することができる。表面プラズモン共鳴は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥシステム（ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＢｉａｃｏｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ部門、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用して、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化の検出によって、リアルタイムの相互作用の分析を可能にする光学現象を指す。

【0109】

本明細書で使用される「エピトープ」および関連する用語は、抗原結合タンパク質が（例えば、抗体またはその抗原結合性部分が）結合する抗原の一部分を指す。エピトープは、抗原結合タンパク質が結合する２つまたはそれよりも多くの抗原の部分を含むことができる。エピトープは、１つの抗原または２つもしくはそれよりも多くの抗原の非連続部分（例えば、抗原の一次配列中で連続しないが、抗原の三次構造および四次構造の文脈では、抗原結合タンパク質が結合するために互いに十分近い、アミノ酸残基）を含むことができる。一般には、抗体の可変領域、特にＣＤＲが、エピトープと相互作用する。一実施形態では、ＢＣＭＡ抗原のエピトープと結合する二量体抗原受容体（ＤＡＲ）またはその抗原結合性部分が、本明細書に記載される。

【0110】

本明細書で使用される「抗体断片」、「抗体部分」、「抗体の抗原結合性断片」または「抗体の抗原結合性部分」および他の関連する用語は、無傷抗体が結合する抗原と結合する無傷抗体の一部分を含む無傷抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、限定されるものではないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２；Ｆｄ；およびＦｖ断片、ならびにｄＡｂ；ダイアボディ；直鎖抗体；一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；特異的な抗原結合をポリペプチドに付与するのに十分である抗体の少なくとも一部分を含有するポリペプチドが挙げられる。抗体の抗原結合性部分は、組換えＤＮＡ技法によって、または無傷抗体の酵素的もしくは化学的切断によって、生成し得る。抗原結合性部分としては、とりわけ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、キメラ抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ならびに抗原結合特性を抗体断片に付与するのに十分である免疫グロブリンの少なくとも一部分を含有するポリペプチドが挙げられる。一実施形態では、ヒンジ、膜貫通および細胞内領域に連結されたＦａｂ断片を含む二量体抗原受容体が、本明細書に記載される。

【0111】

「Ｆａｂ」、「Ｆａｂ断片」という用語および他の関連する用語は、可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）、定常軽鎖領域（Ｃ_Ｌ）、可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）および第１の定常領域（Ｃ_Ｈ１）を含む一価断片を指す。Ｆａｂは、抗原と結合することができる。Ｆ（ａｂ’）_２断片は、ヒンジ領域において、ジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片である。Ｆ（Ａｂ’）_２は、抗原結合能力を有する。Ｆｄ断片は、Ｖ_ＨおよびＣ_Ｈ１領域を含む。Ｆｖ断片は、Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈ領域を含む。Ｆｖは、抗原と結合することができる。ｄＡｂ断片は、Ｖ_Ｈドメイン、Ｖ_Ｌドメイン、またはＶ_ＨもしくはＶ_Ｌドメインの抗原結合性断片を有する（米国特許第６，８４６，６３４号および同第６，６９６，２４５号；米国特許出願公開第２００２／０２５１２号、同第２００４／０２０２９９５号、同第２００４／００３８２９１号、同第２００４／０００９５０７号、同第２００３／００３９９５８号；ならびにＷａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６， １９８９）。一実施形態では、ヒンジ、膜貫通および細胞内領域に連結されたＦａｂ断片を含む二量体抗原受容体が、本明細書に記載される。

【0112】

一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈ領域が、リンカー（例えば、アミノ酸残基の合成配列）を介して連結されて、連続するタンパク質鎖を形成する、抗体である。一実施形態では、リンカーは、タンパク質鎖が、それ自体に対してフォールディングする（ｆｏｌｄ ｂａｃｋ）こと、および一価抗原結合部位を形成することを可能にするのに十分に長い（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－２６およびＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：５８７９－８３を参照されたい）。

【0113】

ダイアボディは、２つのポリペプチド鎖を含む二価抗体であり、ここで、それぞれのポリペプチド鎖は、同じ鎖における２つのドメイン間で対形成を可能にするには短すぎ、そのため、それぞれのドメインが別のポリペプチド鎖における相補的なドメインと対形成するのを可能にするリンカーによって連結されたＶ_ＨおよびＶ_Ｌドメインを含む（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：６４４４－４８およびＰｏｌｊａｋ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１－２３を参照されたい）。ダイアボディの２つのポリペプチド鎖が同一である場合、それらの対形成から得られるダイアボディは、２つの同一の抗原結合部位を有する。異なる配列を有するポリペプチド鎖は、２つの異なる抗原結合部位を有するダイアボディを作製するために使用することができる。同様に、トリボディ（ｔｒｉｂｏｄｙ）およびテトラボディは、それぞれ、３つおよび４つのポリペプチド鎖を含む抗体であり、それぞれ、同じまたは異なり得る３つおよび４つの抗原結合部位を形成する。ダイアボディ、トリボディおよびテトラボディ構築物は、本明細書に記載される二量体抗原受容体（ＤＡＲ）のいずれか由来の抗原結合性部分を使用して、調製することができる。

【0114】

「ヒト抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する１つまたは複数の可変領域および定常領域を有する抗体を指す。一実施形態では、可変領域および定常ドメインのすべてが、ヒト免疫グロブリン配列に由来する（例えば、完全ヒト抗体）。これらの抗体は、組換え方法論によるか、またはヒト重鎖および／もしくは軽鎖のコード遺伝子に由来する抗体を発現するよう遺伝子改変されたマウスの目的の抗原による免疫化によることを含む、その例が下記に記載される、各種の方法で調製され得る。完全ヒト抗体重鎖可変領域および完全ヒト抗体軽鎖可変領域を含む二量体抗原受容体（ＤＡＲ）が、本明細書に記載される。

【0115】

「ヒト化」抗体は、１つもしくは複数のアミノ酸置換、欠失および／または付加によって、非ヒト種に由来する抗体の配列と異なる配列を有する抗体を指し、その結果、ヒト化抗体は、それがヒト被験体に投与された場合に、非ヒト種抗体と比較して、免疫応答を誘導する可能性が低い、および／またはより重篤度が低い免疫応答を誘導する。一実施形態では、非ヒト種抗体の重鎖および／または軽鎖のフレームワークおよび定常ドメイン中のある特定のアミノ酸は、ヒト化抗体を生成するために変異される。別の実施形態では、ヒト抗体由来の定常ドメインは、非ヒト種の可変ドメインに融合される。別の実施形態では、非ヒト抗体の１つまたは複数のＣＤＲ配列中の１つまたは複数のアミノ酸残基は、それがヒト被験体に投与された場合に、非ヒト抗体の可能性がある免疫原性を低減するように変更され、ここで、変更されたアミノ酸残基は、抗体のその抗原への免疫特異的な結合に重要ではないか、または行われるアミノ酸配列に対する変更は、保存的変更であるかのいずれかであり、その結果、ヒト化抗体の抗原に対する結合は、非ヒト抗体の抗原に対する結合よりも著しく悪化しない。ヒト化抗体を作製する方法の例は、米国特許第６，０５４，２９７号、同第５，８８６，１５２号および同第５，８７７，２９３号に見出され得る。

【0116】

本明細書で使用される「キメラ抗体」という用語および関連する用語は、第１の抗体由来の１つまたは複数の領域、および１つまたは複数の他の抗体由来の１つまたは複数の領域を含有する抗体を指す。一実施形態では、ＣＤＲの１つまたは複数は、ヒト抗体に由来する。別の実施形態では、ＣＤＲのすべてが、ヒト抗体に由来する。別の実施形態では、１つよりも多くのヒト抗体由来のＣＤＲは、キメラ抗体中で、混合され、適合される。例えば、キメラ抗体は、第１のヒト抗体の軽鎖由来のＣＤＲ１、第２のヒト抗体の軽鎖由来のＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに第３の抗体由来の重鎖由来のＣＤＲを含んでいてもよい。別の例では、ＣＤＲは、ヒトおよびマウス、またはヒトおよびウサギ、またはヒトおよびヤギなどの異なる種が起源である。当業者は、他の組合せが可能であることを理解するだろう。

【0117】

さらに、フレームワーク領域は、同じ抗体の１つに、１つもしくは複数の異なる抗体、例えば、ヒト抗体に、またはヒト化抗体に由来していてもよい。キメラ抗体の一例では、重鎖および／または軽鎖の一部分は、特定の種由来の抗体または特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体と同一であるか、それらと相同であるか、あるいはそれらに由来するが、鎖の残りは、別の種由来の抗体または別の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体と同一であるか、それらと相同であるか、あるいはそれらに由来する。所望の生物活性（すなわち、標的抗原と特異的に結合する能力）を示すそのような抗体の断片も含まれる。キメラ抗体は、二量体抗原受容体（ＤＡＲ）のいずれかの部分、その抗原結合性部分から調製することができ、本明細書に記載される。

【0118】

本明細書で使用される場合、「バリアント」ポリペプチドおよびポリペプチドの「バリアント」という用語は、参照ポリペプチド配列と比べて、アミノ酸配列に挿入され、アミノ酸配列から欠失され、および／またはアミノ酸配列に置換された、１つまたは複数のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。ポリペプチドバリアントは、融合タンパク質を含む。同じ方法で、バリアントポリヌクレオチドは、別のポリヌクレオチド配列と比べて、ヌクレオチド配列に挿入され、ヌクレオチド配列から欠失され、および／またはヌクレオチド配列に置換された、１つまたは複数のヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を含む。ポリヌクレオチドバリアントは、融合ポリヌクレオチドを含む。

【0119】

本明細書で使用される場合、ポリペプチドの「誘導体」という用語は、例えば、ポリエチレングリコール、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）などの別の化学的部分へのコンジュゲーション、リン酸化、およびグリコシル化を例えば介して、化学的に改変されたポリペプチド（例えば、抗体）である。他に指示されない限り、「抗体」という用語は、完全長重鎖および完全長軽鎖を含む抗体に加えて、その誘導体、バリアント、断片、およびムテインを含み、それらの例を、下記に記載する。

【0120】

「ヒンジ」という用語は、一般に、タンパク質の２つのドメイン間で見出され、構築物全体の柔軟性および互いに対してドメインの一方または両方の運動を可能にし得る、アミノ酸セグメントを指す。構造的には、ヒンジ領域は、約１０～約１００アミノ酸、例えば、約１５～約７５アミノ酸、約２０～約５０アミノ酸、または約３０～約６０アミノ酸を含む。一実施形態では、ヒンジ領域は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００アミノ酸長である。由来し得るヒンジ領域は、ＣＤ８ヒンジ領域もしくはその断片、ＣＤ８αヒンジ領域もしくはその断片、抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥまたはＩｇＤ抗体）のヒンジ領域、または抗体の定常ドメインＣＨ１およびＣＨ２を連結するヒンジ領域などの、天然に存在するタンパク質のヒンジ領域である。ヒンジ領域は、抗体に由来し得、抗体の１つもしくは複数の定常領域を含んでもよく、または含んでいなくてもよく、あるいはヒンジ領域は、抗体のヒンジ領域および抗体のＣＨ３定常領域を含むか、あるいはヒンジ領域は、抗体のヒンジ領域ならびに抗体のＣＨ２およびＣＨ３定常領域を含むか、あるいはヒンジ領域は、天然に存在しないペプチドであるか、またはヒンジ領域は、ｓｃＦｖのＣ末端および膜貫通ドメインのＮ末端の間に配置される。一実施形態では、ヒンジ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４免疫グロブリン分子由来の上部、コアまたは下部のヒンジ配列を含む２つまたはそれよりも多くの領域のいずれか１つまたは任意の組合せを含む。一実施形態では、ヒンジ領域は、ＩｇＧ１上部ヒンジ配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴ（配列番号９１）を含む。一実施形態では、ヒンジ領域は、ＩｇＧ１コアヒンジ配列

【化1】

（ここで、

【化2】

は、Ｐ、ＲまたはＳである）（配列番号９２）を含む。一実施形態では、ヒンジ領域は、下部ヒンジ／ＣＨ２配列ＰＡＰＥＬＬＧＧＰ（配列番号９３）を含む。一実施形態では、ヒンジは、アミノ酸配列ＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴ（配列番号９４）を有するＦｃ領域（ＣＨ２）に連結されている。一実施形態では、ヒンジ領域は、上部、コアおよび下部ヒンジのアミノ酸配列を含み、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰ ＥＬＬＧＧＰ（配列番号９５）を含む。一実施形態では、ヒンジ領域は、少なくとも１つ、２つ、３つまたはそれよりも多くの鎖間ジスルフィド結合を形成することができる、１つ、２つ、３つまたはそれよりも多くのシステインを含む。

【0121】

「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒンジ領域中またはその後で始まり、重鎖のＣ末端で終わる、抗体重鎖定常領域の部分を指す。Ｆｃ領域は、ＣＨ２およびＣＨ３領域の少なくとも一部分を含み、ヒンジ領域の一部分を含んでいてもよく、または含んでいなくてもよい。Ｆｃ領域は、Ｆｃ細胞表面受容体および免疫補体系の一部のタンパク質と結合することができる。Ｆｃ領域は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性ファゴサイトーシス（ＡＤＰ）、オプソニン化および／または細胞結合を含む、２つまたはそれよりも多くの活性のいずれか１つまたは任意の組合せを含むエフェクター機能を示す。一実施形態では、Ｆｃ領域は、これらの機能のいずれか１つまたは任意の組合せを増加または減少させる変異を含み得る。Ｆｃ領域は、ＦｃγＲＩ（例えば、ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（例えば、ＣＤ３２）および／またはＦｃγＲＩＩＩ（例えば、ＣＤ１６ａ）を含むＦｃ受容体と結合することができる。Ｆｃ領域は、補体成分Ｃ１ｑと結合することができる。一実施形態では、Ｆｃドメインは、エフェクター機能を低減するＬＡＬＡ－ＰＧ変異（例えば、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇに等価）を含む。一実施形態では、Ｆｃドメインは、タンパク質複合体の血清半減期を媒介し、Ｆｃドメイン中の変異は、タンパク質複合体の血清半減期を増加または減少させることができる。一実施形態では、Ｆｃドメインは、タンパク質複合体の熱的安定性に影響を与え、Ｆｃドメイン中の変異は、タンパク質複合体の熱的安定性を増加または減少させることができる。

【0122】

「標識された」という用語または関連する用語は、ポリペプチドに関連して本明細書で使用される場合、検出可能な標識または検出のための部分へのそれらの連結部（ｊｏｉｎｄｅｒ）を指す。例示的な検出可能な標識または部分としては、放射性標識／部分、比色標識／部分、抗原標識／部分、酵素標識／部分、検出可能なビーズ（磁気または高電子密度（例えば、金）ビーズなど）、ビオチン、ストレプトアビジンまたはプロテインＡが挙げられる。限定されるものではないが、放射性核種、蛍光体、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤およびリガンド（例えば、ビオチン、ハプテン）を含む、各種の標識を用いることができる。本明細書に記載される二量体抗原受容体（ＤＡＲ）またはその抗原結合性部分のいずれも、非標識であり得るか、または検出可能な標識もしくは検出可能な部分に連結され得る。

【0123】

本明細書で使用される「同一性パーセント」または「相同性パーセント」および関連する用語は、２つのポリペプチド配列間または２つのポリヌクレオチド配列間の類似性の定量的測定値を指す。２つのポリペプチド配列間の同一性パーセントは、２つのポリペプチド配列のアライメントを最適化するために導入する必要があり得るギャップの数およびそれぞれのギャップの長さを考慮した、２つのポリペプチド配列間で共有されるアライメントされた位置の同一のアミノ酸の数の関数である。同様の方法で、２つのポリヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、２つのポリヌクレオチド配列のアライメントを最適化するために導入する必要があり得るギャップの数およびそれぞれのギャップの長さを考慮した、２つのポリヌクレオチド配列間で共有されるアライメントされた位置の同一のヌクレオチドの数の関数である。２つのポリペプチド配列間、または２つのポリヌクレオチド配列間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、数学アルゴリズムを使用して達成されてもよい。例えば、２つのポリペプチド配列または２つのポリヌクレオチド配列の「同一性パーセント」または「相同性パーセント」は、そのデフォルトパラメータを使用して、ＧＡＰコンピュータプログラム（ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン１０．３（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）の一部）を使用して配列を比較することによって、決定されてもよい。試験配列に関して「Ｙと少なくともＸ％の同一性を有する配列を含む」などの表現は、上記に記載されるようにして配列Ｙにアライメントされる場合に、試験配列が、Ｙの残基の少なくともＸ％と同一の残基を含むことを意味する。

【0124】

一実施形態では、試験構築物（例えば、ＤＡＲ）のアミノ酸配列は、本明細書に記載される所与の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）またはその抗原結合性部分を構成するポリペプチドのアミノ酸配列のいずれかと類似していてもよいが、必ずしも同一でなくてもよい。試験構築物およびポリペプチドの間の類似性は、本明細書に記載される二量体抗原受容体（ＤＡＲ）またはその抗原結合性部分を構成するポリペプチドのいずれかと、少なくとも９５％同一、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一であり得る。一実施形態では、類似のポリペプチドは、重鎖および／または軽鎖内にアミノ酸置換を含有することができる。一実施形態では、アミノ酸置換は、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換を含む。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されるものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能特性を実質的に変化させない。２つまたはそれよりも多くのアミノ酸配列が、保存的置換によって互いに異なる場合、配列同一性パーセントまたは類似度は、置換の保存的性質について補正するために上方に調整される場合がある。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰｅａｒｓｏｎ （１９９４） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２４： ３０７－３３１を参照されたい。類似の化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸の群の例としては、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン；（２）脂肪族－ヒドロキシル側鎖：セリンおよびトレオニン；（３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン；（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン；（５）塩基性側鎖：リシン、アルギニンおよびヒスチジン；（６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸、ならびに（７）硫黄含有側鎖はシステインおよびメチオニンが挙げられる。

【0125】

「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」という用語は、細胞内シグナル伝達ドメインに融合された細胞外抗原結合タンパク質を含む一本鎖融合タンパク質を指す。ＣＡＲ細胞外結合ドメインは、ヒトモノクローナル抗体などのモノクローナル抗体の可変重領域および軽領域を融合することに由来する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖまたはｓＦｖ）である。一実施形態では、ＣＡＲは、（ｉ）重鎖可変（ＶＨ）ドメインおよび軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む抗原結合タンパク質であって、ここで、ＶＨおよびＶＬドメインは、ペプチドリンカーによって互いに連結されている、抗原結合タンパク質；（ｉｉ）ヒンジドメイン；（ｉｉｉ）膜貫通ドメイン；ならびに（ｉｖ）細胞内シグナル伝達配列を含む細胞内ドメインを含む。開示される構築物は、ＤＡＲであり、これは、ＤＡＲが標的化のために一本鎖抗体を使用しないが、代わりに、別個の重鎖および軽鎖可変ドメイン領域を使用する点で、ＣＡＲと異なる。

【0126】

本明細書で使用される「ベクター」および関連する用語は、外来遺伝物質（例えば、核酸導入遺伝子）に作動可能に連結され得る核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を指す。ベクターは、外来遺伝物質を細胞（例えば、宿主細胞）に導入するためのビヒクルとして使用することができる。ベクターは、導入遺伝子のベクターへの挿入のための少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含むことができる。ベクターは、抗生物質耐性またはベクター－導入遺伝子構築物を有する宿主細胞の選択に役立つ選択可能な特徴を付与する少なくとも１つの遺伝子配列を含むことができる。ベクターは、一本鎖または二本鎖の核酸分子であり得る。ベクターは、直鎖状または環状の核酸分子であり得る。ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを用いる遺伝子編集法のために使用されるドナー核酸は、ベクターの一種であり得る。ベクターの１つの種類は、「プラスミド」であり、これは、導入遺伝子に連結することができ、宿主細胞中で複製することができ、導入遺伝子を転写および／または翻訳することができる、直鎖状または環状の二本鎖染色体外ＤＮＡ分子を指す。ウイルスベクターは、典型的には、導入遺伝子に連結することができるウイルスのＲＮＡまたはＤＮＡ骨格配列を含有する。ウイルス骨格配列は、感染を無効にするが、ウイルス骨格および共連結導入遺伝子の宿主細胞ゲノムへの挿入を保持するように修飾することができる。ウイルスベクターの例としては、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウイルス、パポバウイルス、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルスおよびエプスタインバーウイルスのベクターが挙げられる。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞中で自律複製することができる（例えば、細菌複製起点を含む細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入の際に、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって、宿主ゲノムと一緒に複製される。

【0127】

「発現ベクター」は、誘導性プロモーターおよび／または構成的プロモーターならびにエンハンサーなどの１つまたは複数の調節配列を含有することができるベクターの一種である。発現ベクターは、リボソーム結合部位および／またはポリアデニル化部位を含むことができる。発現ベクターは、１つまたは複数の複製起点配列を含むことができる。調節配列は、宿主細胞に形質導入される発現ベクターに連結された導入遺伝子の転写、または転写および翻訳を指示する。調節配列は、導入遺伝子の発現のレベル、タイミングおよび／または場所を制御することができる。調節配列は、例えば、導入遺伝子に対するその効果を直接発揮することができ、または１つもしくは複数の他の分子（例えば、調節配列および／または核酸に結合するポリペプチド）の作用により発揮することができる。調節配列は、ベクターの一部であり得る。調節配列のさらなる例は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ， １９９０， Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ．およびＢａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３：３６０５－３６０６に記載されている。発現ベクターは、本明細書に記載される二量体抗原受容体（ＤＡＲ）またはその抗原結合性部分のいずれかの少なくとも一部分をコードする核酸を含むことができる。

【0128】

導入遺伝子は、ベクターに含有される導入遺伝子配列の機能または発現を可能にする導入遺伝子およびベクターの間の連結が存在する場合、ベクターに「作動可能に連結されて」いる。一実施形態では、導入遺伝子は、調節配列が導入遺伝子の発現（例えば、発現のレベル、タイミングまたは場所）に影響を与える場合、調節配列に「作動可能に連結され」ている。

【0129】

本明細書で使用される「トランスフェクトされた」もしくは「形質転換された」もしくは「形質導入された」という用語または他の関連する用語は、外因性核酸（例えば、導入遺伝子）が宿主細胞に移入または導入されるプロセスを指す。「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」宿主細胞は、外因性核酸（導入遺伝子）を導入されたものである。宿主細胞は、初代対象細胞およびその子孫を含む。本明細書に記載される二量体抗原受容体（ＤＡＲ）またはその抗原結合性部分のいずれかの少なくとも一部分をコードする外因性核酸は、宿主細胞に導入することができる。本明細書に記載される二量体抗原受容体（ＤＡＲ）またはその抗原結合性部分のいずれかの少なくとも一部分を含む発現ベクターは、宿主細胞に導入することができ、宿主細胞は、本明細書に記載される二量体抗原受容体（ＤＡＲ）またはその抗原結合性部分の少なくとも一部分を含むポリペプチドを発現することができる。

【0130】

「宿主細胞」もしくは「宿主細胞の集団」という用語または関連する用語は、本明細書で使用される場合、外来（外因性または導入遺伝子）核酸が導入されている細胞（またはその集団）を指す。外来核酸は、導入遺伝子に作動可能に連結された発現ベクターを含むことができ、宿主細胞を、核酸、および／または外来核酸（導入遺伝子）によってコードされたポリペプチドを発現させるために使用することができる。宿主細胞（またはその集団）は、培養細胞であり得るか、または被験体から抽出され得る。宿主細胞（またはその集団）は、継代の数を問わず、初代対象細胞およびその子孫を含む。宿主細胞（またはその集団）は、不死化細胞系を含む。子孫細胞は、親細胞と比較して、同一の遺伝物質を有していてもよく、または有していなくてもよい。宿主細胞は、子孫細胞を包含する。一実施形態では、宿主細胞は、本明細書に開示されるように、抗体を発現させるための任意の方法で改変、トランスフェクト、形質導入、形質転換および／または操作されている任意の細胞（その子孫を含む）を記載する。一例では、宿主細胞（またはその集団）は、本明細書に記載される所望の抗体またはその抗原結合性部分をコードする核酸に作動可能に連結された発現ベクターを導入され得る。宿主細胞およびその集団は、宿主のゲノムに安定に組み込まれた発現ベクターを有することができ、または染色体外発現ベクターを有することができる。一実施形態では、宿主細胞およびその集団は、数回の細胞分裂後に存在するか、または一時的に存在し、数回の細胞分裂後に消失する、染色体外ベクターを有することができる。

【0131】

トランスジェニック宿主細胞は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮＳ、メガヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを使用する遺伝子編集によるものを含む、周知のデザイナーヌクレアーゼを含む非ウイルス法を使用して、調製することができる。導入遺伝子は、ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用して、宿主細胞のゲノムに導入することができる。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、操作されたジンクフィンガーモチーフ由来のＤＮＡ結合ドメインに融合された制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）の非特異的エンドヌクレアーゼドメインをそれぞれ含有する、一対のキメラタンパク質を含む。ＤＮＡ結合ドメインは、宿主のゲノム中の特異的な配列と結合するように操作することができ、エンドヌクレアーゼドメインは、二本鎖切断を行う。ドナーＤＮＡは、導入遺伝子、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲまたはＤＡＲ構築物をコードする核酸のいずれか、および宿主細胞のゲノム中の意図する挿入部位のいずれかの側にある領域に対して相同である隣接配列を持つ。宿主細胞のＤＮＡ修復機構は、相同的ＤＮＡ修復による導入遺伝子の正確な挿入を可能にする。トランスジェニック哺乳動物宿主細胞は、ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用して調製されている（米国特許第９，５９７，３５７号、同第９，６１６，０９０号、同第９，８１６，０７４号および同第８，９４５，８６８号）。トランスジェニック宿主細胞は、それらが、正確な導入遺伝子挿入を送達することができるＤＮＡ結合ドメインに融合された非特異的エンドヌクレアーゼドメインを含む点で、ジンクフィンガーヌクレアーゼと類似するＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）を使用して調製することができる。ジンクフィンガーヌクレアーゼと同様に、ＴＡＬＥＮも、宿主のＤＮＡに二本鎖切断を導入する。トランスジェニック宿主細胞は、約１２～４０塩基対長の二本鎖ＤＮＡ上の認識部位を認識する部位特異的かつまれな切断を行うエンドヌクレアーゼとして作用するメガヌクレアーゼを使用して調製することができる。メガヌクレアーゼとしては、真核単細胞生物のミトコンドリアおよび葉緑体中で最も頻繁に見出されるＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー由来のものが挙げられる。ゲノムを改変するために使用されるメガヌクレアーゼ系の例は、例えば、米国特許第９，８８９，１６０号に記載されている。トランスジェニック宿主細胞は、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）を使用して調製することができる。ＣＲＩＳＰＲは、標的特異的なドナーＤＮＡ組み込みのためのガイドＲＮＡにカップリングされたＣａｓエンドヌクレアーゼを用いる。ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡ中のｇＲＮＡ結合領域の上流のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を含有する保存されたマルチヌクレオチドを含み、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが二本鎖標的ＤＮＡを切断する宿主細胞標的部位にハイブリダイズする。ガイドＲＮＡは、特異的な標的部位にハイブリダイズするように設計することができる。ジンクフィンガーヌクレアーゼおよびＴＡＬＥＮと同様に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、挿入部位に対して相同性を有する隣接配列を有するドナーＤＮＡの部位特異的挿入を導入するために使用することができる。ゲノムを改変するために使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の例は、例えば、米国特許第８，６９７，３５９号、同第１０，０００，７７２号、同第９，７９０，４９０号および米国特許出願公開第２０１８／０３４６９２７号に記載されている。一実施形態では、トランスジェニック宿主細胞は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して調製することができ、宿主標的部位は、ＴＲＡＣ遺伝子（Ｔ細胞受容体アルファ定常）であり得る。ドナーＤＮＡは、例えば、本明細書に記載されるＣＡＲまたはＤＡＲ構築物をコードする核酸のいずれかを含むことができる。電気穿孔、ヌクレオフェクションまたはリポフェクションを、宿主細胞にドナーＤＮＡをジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系とともに共送達するために使用することができる。

【0132】

トランスジェニック宿主細胞は、宿主細胞（例えば、Ｔ細胞）をＣＡＲまたはＤＡＲ構築物をコードする核酸を運ぶレトロウイルスベクターで形質導入することによって調製することができる。形質導入は、本質的に、Ｍａ ｅｔ ａｌ．， ２００４ Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ ６１：１２－２５；およびＭａ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ ７４（３）：２８６－２９６， ２０１４（それらの開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているようにして行うことができる。レトロウイルスベクターは、ＦｕＧｅｎｅ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用してＰｈｏｅｎｉｘ－Ｅｃｏ細胞系（ＡＴＣＣ）にトランスフェクトして、エコトロピックレトロウイルスを生成することができ、次いで、回収物の一過性ウイルス上清（エコトロピックウイルス）を使用して、ＰＧ１３パッケージング細胞をＧａｌ－Ｖエンベロープで形質導入して、ヒト細胞を感染するレトロウイルスを生成することができる。ＰＧ１３細胞からのウイルス上清は、ＣＤ３またはＣＤ３／ＣＤ２８活性化の２～３日後に、活性化Ｔ細胞（またはＰＢＭＣ）を形質導入するために使用することができる。活性化ヒトＴ細胞は、正常な健康ドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、製造業者のマニュアルのように１００ｎｇ／ｍｌのマウス抗ヒトＣＤ３抗体ＯＫＴ３（Ｏｒｔｈ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｒａｒｔｉａｎ、ＮＪ）または抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８ＴｒａｎｓＡｃｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｇｅｒｍａｎ）で、および３００～１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ２で、５％ＦＢＳが追加補充されたＡＩＭ－Ｖ成長培地（ＧＩＢＣＯ－Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）中で２日間、活性化することによって調製することができる。およそ５×１０^６個の活性化ヒトＴ細胞を、１０ｕｇ／ｍｌのレトロネクチン（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ）で事前にコーティングされた６ウェルプレート中、３ｍＬのウイルス上清で形質導入し、１０００ｇで約１時間、およそ３２℃で遠心分離することができる。形質導入後、形質導入されたＴ細胞を、５％のＦＢＳおよび３００～１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ２が追加補充されたＡＩＭ－Ｖ成長培地中で増殖させることができる。

【0133】

宿主細胞は、原核生物、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉであり得、または真核生物、例えば、単細胞真核生物（例えば、酵母または他の真菌）、植物細胞（例えば、タバコまたはトマト植物細胞）、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞、サル細胞、ハムスター細胞、ラット細胞、マウス細胞また昆虫細胞）もしくはハイブリドーマであり得る。一実施形態では、宿主細胞に、所望の抗体をコードする核酸に作動可能に連結された発現ベクターを導入し、それによって、トランスフェクト／形質転換された宿主細胞による抗体の発現に好適な条件下で培養されるトランスフェクト／形質転換された宿主細胞を作製することができ、必要に応じて、トランスフェクト／形質転換された宿主細胞から抗体を回収する（例えば、宿主細胞溶解物から回収する）、または培養培地から回収することができる。一実施形態では、宿主細胞は、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０およびＹＢ２／０を含む非ヒト細胞を含む。一実施形態では、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３、ＨＴ－１０８０、Ｈｕｈ－７およびＰＥＲ．Ｃ６を含むヒト細胞を含む。宿主細胞の例としては、サル腎臓細胞のＣＯＳ－７系（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９８１， Ｃｅｌｌ ２３： １７５を参照されたい）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １６３）、無血清培地で成長するＶｅｇｇｉｅ ＣＨＯおよび関連する細胞系（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２８：３１を参照されたい）もしくはＤＨＦＲが欠損したＣＨＯ株ＤＸ－Ｂ１１（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．， １９８０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：４２１６－２０を参照されたい）などのチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞もしくはその派生物、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０）細胞系、アフリカミドリザル腎臓細胞系ＣＶ１に由来するＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞系（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）（ＭｃＭａｈａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９１， ＥＭＢＯ Ｊ． １０：２８２１を参照されたい）、２９３、２９３ＥＢＮＡまたはＭＳＲ２９３などのヒト胎児腎臓細胞、ヒト上皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、他の形質転換された霊長類細胞系、正常な２倍体細胞、初代組織のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養物に由来する細胞株、初代外植片、ＨＬ－６０、Ｕ９３７、ＨａＫまたはＪｕｒｋａｔ細胞が挙げられる。一実施形態では、宿主細胞は、Ｙ０、ＮＳ０またはＳｐ２０などのリンパ系細胞を含む。一実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞であるが、ヒト宿主細胞ではない。典型的には、宿主細胞は、ポリペプチドをコードする核酸（これは、その後、宿主細胞中で発現され得る）で形質転換またはトランスフェクトされ得る培養細胞である。「トランスジェニック宿主細胞」または「組換え宿主細胞」という語句は、発現されるか、もしくは発現されないかのいずれかの外因性核酸を導入された（例えば、形質導入された、形質転換された、またはトランスフェクトされた）宿主細胞を表すために使用することができる。宿主細胞はまた、核酸を含むが、調節配列が核酸と作動可能に連結されるように調節配列が宿主細胞に導入されない限り、所望のレベルで核酸を発現しない、細胞であり得る。宿主細胞という用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫または潜在的子孫も指すことが理解される。ある特定の改変が、例えば、変異または環境的影響に起因して後続の世代で起こり得るので、そのような子孫は、実際には、親細胞と同一でない場合があるが、本明細書で使用される用語の範囲内に依然として含まれる。二量体抗原受容体（ＤＡＲ）またはその抗原結合性部分を含む１つもしくは複数のポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸に作動可能に連結されたベクター（例えば、発現ベクター）を有する宿主細胞または宿主細胞の集団が、本明細書に記載される。

【0134】

宿主細胞または宿主細胞の集団は、Ｔリンパ球（例えば、Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞、ガンマ－デルタＴ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞）、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞、マクロファージ、樹状細胞、肥満細胞、好酸球、Ｂリンパ球、単球を含む。一実施形態では、ＮＫ細胞は、臍帯血由来ＮＫ細胞または胎盤由来ＮＫ細胞を含む。

【0135】

本開示のポリペプチド（例えば、二量体抗原受容体（ＤＡＲ））は、当技術分野において公知の任意の方法を使用して生成することができる。一例では、ポリペプチドは、宿主細胞に導入され、発現を促進する条件下で宿主細胞によって発現される組換え発現ベクターにポリペプチドをコードする核酸配列（例えば、ＤＮＡ）を挿入することによる、組換え核酸法によって生成される。

【0136】

組換え核酸操作のための一般的な技法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｖｏｌｓ． １－３， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ２ ｅｄ．， １９８９、またはＦ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ： Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７）、および定期的な改訂版に記載されており、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。ポリペプチドをコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）は、哺乳動物、ウイルスまたは昆虫遺伝子に由来する１つまたは複数の好適な転写調節エレメントまたは翻訳調節エレメントを運ぶ発現ベクターに作動可能に連結されている。そのような調節エレメントとしては、転写プロモーター、転写を制御するための必要に応じたオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列が挙げられる。発現ベクターは、宿主細胞中で複製能力を付与する複製起点を含むことができる。発現ベクターは、トランスジェニック宿主細胞（例えば、形質転換体）の認識を容易にするための選択を付与する遺伝子を含むことができる。

【0137】

組換えＤＮＡは、タンパク質を精製するために有用であり得る任意の種類のタンパク質タグ配列をコードすることもできる。タンパク質タグの例としては、限定されるものではないが、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグまたはＧＳＴタグが挙げられる。細菌、真菌、酵母および哺乳動物細胞宿主とともに使用するための適切なクローニングおよび発現ベクターは、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， （Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎ．Ｙ．， １９８５）に見出すことができる。

【0138】

発現ベクター構築物は、宿主細胞に適切な方法を使用して、宿主細胞に導入することができる。限定されるものではないが、電気穿孔；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ－デキストランまたは他の物質を用いるトランスフェクション；ウイルストランスフェクション；非ウイルストランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；および感染（例えば、ベクターが感染病原体である場合）を含む、宿主細胞に核酸を導入するための各種の方法が、当技術分野において公知である。好適な宿主細胞としては、原核生物、酵母、哺乳動物細胞または細菌細胞が挙げられる。

【0139】

好適な細菌としては、グラム陰性またはグラム陽性の生物、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．が挙げられる。酵母、例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種由来の酵母も、ポリペプチドの産生のために使用され得る。さまざまな哺乳動物または昆虫細胞培養系も、組換えタンパク質を発現させるために用いることができる。昆虫細胞中での異種タンパク質の産生のためのバキュロウイルス系は、Ｌｕｃｋｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ， （Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ６：４７， １９８８）によって概説されている。好適な哺乳動物宿主細胞系の例としては、内皮細胞、ＣＯＳ－７サル腎臓細胞、ＣＶ－１、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ヒト胎児腎臓細胞、ＨｅＬａ、２９３、２９３ＴおよびＢＨＫ細胞系が挙げられる。精製されたポリペプチドは、組換えタンパク質を発現するための好適な宿主／ベクター系を培養することによって調製される。次いで、タンパク質は、培養培地または細胞抽出物から精製される。二量体抗原受容体（ＤＡＲ）またはその抗原結合性部分を含むポリペプチド鎖のいずれかは、トランスジェニック宿主細胞によって発現され得る。

【0140】

本明細書に開示される抗体および抗原結合タンパク質は、細胞－翻訳系を使用して産生することもできる。そのような目的のために、ポリペプチドをコードする核酸は、ｍＲＮＡを産生するためにｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写を可能にするように、および用いられる特定の無細胞系（哺乳動物または酵母無細胞翻訳系などの真核生物、または細菌無細胞翻訳系などの原核生物）においてｍＲＮＡの無細胞翻訳を可能にするように、改変されなければならない。

【0141】

本明細書に開示されるさまざまなポリペプチドのいずれかをコードする核酸は、化学的に合成されてもよい。コドン使用を、細胞中での発現を改善するために、選択してもよい。そのようなコドン使用は、選択される細胞型に依存する。特殊化されたコドン使用パターンが、Ｅ．ｃｏｌｉおよび他の細菌、ならびに哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞および昆虫細胞について開発されている。例えば、Ｍａｙｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ２００３ １００（２）：４３８－４２；Ｓｉｎｃｌａｉｒ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ． Ｐｕｒｉｆ． ２００２ （１）：９６－１０５；Ｃｏｎｎｅｌｌ Ｎ Ｄ． Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００１ １２（５）：４４６－９；Ｍａｋｒｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． １９９６ ６０（３）：５１２－３８；およびＳｈａｒｐ ｅｔ ａｌ． Ｙｅａｓｔ． １９９１ ７（７）：６５７－７８を参照されたい。

【0142】

本明細書に記載される抗体および抗原結合タンパク質はまた、化学合成によって（例えば、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ２ｎｄ ｅｄ．， １９８４， Ｔｈｅ Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， Ｉｌｌ．に記載される方法によって）生成することができる。タンパク質に対する修飾も、化学合成によって生成することができる。

【0143】

本明細書に記載される抗体および抗原結合タンパク質は、タンパク質化学の分野において一般に公知のタンパク質のための単離／精製法によって精製することができる。非限定的な例としては、抽出、再結晶、塩析（例えば、硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウムによる）、遠心分離、透析、限外濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、ゲル透過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動、向流分配またはこれらの任意の組合せが挙げられる。精製後、ポリペプチドは、限定されるものではないが、濾過および透析を含む、当技術分野で公知の各種の方法のいずれかによって、異なる緩衝液に交換されてもよく、および／または濃縮されてもよい。

【0144】

一実施形態では、トランスジェニックＤＡＲ Ｔ細胞の調製物は、二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物を発現するＴ細胞について富化することができる。例えば、抗ＢＣＭＡ ＤＡＲ Ｔ細胞は、ＰＢＭＣから調製して、非トランスジェニックＴ細胞およびトランスジェニックＴ細胞の混合物を含有するＴ細胞集団を作製することができる。抗ＢＣＭＡ ＤＡＲ構築物を発現するトランスジェニックＴ細胞は、細胞選別（例えば、蛍光標識細胞分取）、勾配精製、または非トランスジェニックＴ細胞に対してトランスジェニックＴ細胞の増殖を優先的に誘導するために好適な培養法を使用して、非トランスジェニックＴ細胞のパーセントまたは数を低減するように富化することができる。一実施形態では、富化ステップは、非トランスジェニックＴ細胞と比較して、トランスジェニックＤＡＲ Ｔ細胞の数を、約２～５倍、または約５～１０倍、または約１０～１５倍、または約１５～２０倍、または約２０～５０倍、またはそれよりも高い倍数の富化のレベルだけ増加させる。

【0145】

ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体および抗原結合タンパク質（例えば、ＤＡＲ）は、翻訳後修飾をさらに含むことができる。例示的な翻訳後タンパク質修飾としては、リン酸化、アセチル化、メチル化、ＡＤＰリボシル化、ユビキチン化、グリコシル化、非フコシル化（ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）、カルボニル化、ＳＵＭＯ化、ビオチン化、またはポリペプチド側鎖もしくは疎水性基の付加が挙げられる。結果として、修飾されたポリペプチドは、脂質、多糖または単糖およびホスフェートなどの非アミノ酸要素を含有し得る。一実施形態では、グリコシル化は、１つまたは複数のシアル酸部分をポリペプチドにコンジュゲートするシアリル化であり得る。シアル酸部分は、タンパク質の可能性がある免疫原性も低減しながら、溶解度および血清半減期を改善する。Ｒａｊｕ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ２００１ ３１； ４０（３０）：８８６８－７６を参照されたい。

【0146】

本開示は、薬学的に許容される賦形剤との混合物中の、本明細書に記載される二量体抗原受容体（ＤＡＲ）もしくはその抗原結合性部分またはトランスジェニック宿主細胞（例えば、ＤＡＲを発現する）のいずれかを含む治療用組成物を提供する。賦形剤は、担体、安定剤および賦形剤を包含する。薬学的に許容される賦形剤の賦形剤としては、例えば、不活性な希釈剤または充填剤（例えば、スクロースおよびソルビトール）、滑沢剤、流動促進剤（ｇｌｉｄａｎｔ）および抗接着剤（ａｎｔｉ－ａｄｈｅｓｉｖｅ）（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、シリカ、水素化植物油またはタルク）が挙げられる。追加の例としては、緩衝化剤、安定剤、保存剤、非イオン性界面活性剤、抗酸化剤および等張化剤（ｉｓｏｔｏｎｉｆｉｅｒ）が挙げられる。治療用組成物が細胞を含む場合、薬学的に許容される賦形剤は、細胞の生存度または活性を妨げないように選択される。

【0147】

治療用組成物およびそれらを調製するための方法は、当技術分野において周知であり、例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ” （２０ｔｈ ｅｄ．， ｅｄ． Ａ． Ｒ． Ｇｅｎｎａｒｏ Ａ Ｒ．， ２０００， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， Ｐａ．）に見出される。治療用組成物は、非経口投与のために製剤化することができ、例えば、賦形剤、滅菌水、生理食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物起源の油、または水素化ナフタレンを含有してもよく、およびそれらを含有することができる。生体適合性の生分解性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマーまたはポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンコポリマーが、本明細書に記載される抗体（またはその抗原結合タンパク質）の放出を制御するために使用されてもよい。ナノ粒子製剤（例えば、生分解性ナノ粒子、固体脂質ナノ粒子、リポソーム）が、抗体（またはその抗原結合タンパク質）の生体内分布を制御するために使用されてもよい。他の潜在的に有用な非経口送達システムとしては、エチレン－酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、埋め込み可能な注入システムおよびリポソームが挙げられる。製剤中の抗体（またはその抗原結合タンパク質）の濃度は、投与される薬物の投薬量および投与の経路を含む多くの因子に応じて変わる。

【0148】

本明細書に記載される二量体抗原受容体（ＤＡＲ）またはその抗原結合性部分のいずれかは、製薬産業において一般に使用される、非毒性の酸付加塩または金属錯体などの薬学的に許容される塩として投与されてもよい。酸付加塩の例としては、酢酸、乳酸、パモ酸、マレイン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸、パルミチン酸、スベリン酸、サリチル酸、酒石酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸またはトリフルオロ酢酸などのような有機酸；タンニン酸、カルボキシメチルセルロースなどのようなポリマー酸；および塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などのような無機酸が挙げられる。金属錯体は、亜鉛、鉄などを含む。一例では、ＤＡＲ（またはその抗原結合性部分）は、熱的安定性を増加させるために酢酸ナトリウムの存在下で製剤化される。

【0149】

「被験体」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒト、ならびに脊椎動物、哺乳動物および非哺乳動物を含む非ヒト動物を指す。一実施形態では、被験体は、ヒト、非ヒト霊長類、サル、類人猿、ネズミ科（例えば、マウスおよびラット）、ウシ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、ヤギ、オオカミ、カエルまたは魚であり得る。

【0150】

「投与すること」、「投与された」という用語および文法的変形は、当業者に公知のさまざまな方法および送達システムのいずれかを使用した、薬剤の被験体への物理的導入を指す。本明細書に開示される製剤のための例示的な投与の経路としては、例えば、注射または注入による、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、脊髄または他の非経口的な投与の経路が挙げられる。「非経口投与」という語句は、本明細書で使用される場合、通常、注射による、腸および局所投与以外の投与の様式を意味し、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、リンパ内、病巣内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内の注射および注入、ならびにｉｎ ｖｉｖｏ電気穿孔が挙げられる。一実施形態では、製剤は、非経口ではない経路を介して、例えば、経口で投与される。他の非経口ではない経路としては、局所、上皮または粘膜の投与の経路、例えば、鼻腔内、膣内、直腸内、舌下または局所が挙げられる。投与することは、例えば、１回、複数回、および／または１もしくは複数の長期間にわたって行うこともできる。本明細書に記載される二量体抗原受容体（ＤＡＲ）またはその抗原結合性部分のいずれかは、当技術分野で公知の方法および送達経路を使用して、被験体に投与することができる。

【0151】

「有効量」、「治療有効量」もしくは「有効用量」という用語または関連する用語は、互換的に使用されてもよく、被験体に投与された場合に、腫瘍またはがん抗原発現に関連する疾患または障害の測定可能な改善または予防をもたらすのに十分である、本明細書に記載される二量体抗原受容体（ＤＡＲ）のいずれかの量を指す。本明細書に提供されるＤＡＲの治療有効量は、単独または組み合わせて使用される場合に、抗体および組合せの相対活性（例えば、細胞成長の阻害における）に応じて、ならびに処置されている被験体および疾患状態、被験体の体重および年齢および性別、被験体における疾患状態の重症度、投与の様式などに応じて変わり、当業者によって容易に決定することができる。

【0152】

一実施形態では、治療有効量は、処置される被験体および処置される障害のある特定の態様に依存し、公知の技法を使用して、当業者によって確認され得る。一般に、ＤＡＲ Ｔ細胞は、約１０^３～１０^４個細胞／ｋｇ、または約１０^４～１０^５個細胞／ｋｇ、または約１０^５～１０^６個細胞／ｋｇ、または約１０^６～１０^７個細胞／ｋｇ、または約１０^７～１０^８個細胞／ｋｇ、または約１０^８～１０^９個細胞／ｋｇ、または約１０^９～１０^１２個細胞／ｋｇで被験体に投与することができる。ＤＡＲ Ｔ細胞は、一回のみ、または毎日（例えば、毎日１回、２回、３回または４回）、またはより少ない頻度（例えば、毎週、２週間ごと、３週間ごと、毎月または四半期ごと）で投与することができる。加えて、当技術分野において公知であるように、年齢、ならびに体重、全体的な健康、性別、食事、投与の時期、薬物相互作用、および疾患の重症度についての調整が必要な場合がある。

【0153】

一実施形態では、治療有効量は、被験体に投与される約１０^３～１０^１２個のトランスジェニック宿主細胞の用量を含む。一実施形態では、トランスジェニック宿主細胞は、本明細書に記載されるＤＡＲのいずれかを構成するポリペプチド鎖を発現する１つまたは複数の発現ベクターを有する。治療有効量は、治療有効量を受ける被験体および処置される疾患／障害を考慮することによって決定することができ、これは、公知の技法を使用して、当業者によって確認され得る。治療有効量は、年齢、体重、全体的な健康、性別、食事、投与の時期、薬物相互作用、および疾患／障害の重症度などの被験体に付随する因子を考慮し得る。治療有効量は、トランスジェニック宿主細胞の純度を考慮してもよく、これは、約６５～９８％またはそれよりも高い純度のレベルであり得る。トランスジェニック宿主細胞の治療有効量は、少なくとも１回、または２回、３回、４回、５回もしくはそれよりも多くの回数を、一定期間にわたって、被験体に投与することができる。一定期間は、日ごと、週ごと、月ごと、または年ごとであり得る。被験体に投与されるトランスジェニック細胞の治療有効量は、それぞれの時に同じであり得るか、またはそれぞれの投与事象で増加もしくは減少させることができる。トランスジェニック細胞の治療有効量は、腫瘍サイズまたはがん細胞の数が、トランスジェニック宿主細胞の投与の前の腫瘍サイズまたはがん細胞の数と比較して、５％～９０％またはそれよりも大きく低減されるまで、被験体に投与することができる。

【0154】

本開示は、１つまたは複数の腫瘍関連抗原の発現または過剰発現に関連する疾患／障害を有する被験体を処置するための方法を提供する。疾患は、例えば、ＢＣＭＡ抗原などの腫瘍関連抗原を発現するがんまたは腫瘍細胞を含む。一実施形態では、がんまたは腫瘍としては、前立腺、乳房、卵巣、頭頸部、膀胱、皮膚、結腸直腸、肛門、直腸、膵臓、肺（非小細胞肺がんおよび小細胞肺がんを含む）、平滑筋腫、脳、神経膠腫、神経膠芽腫、食道、肝臓、腎臓、胃、結腸、子宮頸部（ｃｅｒｖｉｘ）、子宮、子宮内膜、外陰部、喉頭、腟、骨、鼻腔、副鼻腔、鼻咽頭、口腔、中咽頭、喉頭、下喉頭（ｈｙｐｏｌａｒｙｎｘ）、唾液腺、尿管、尿道、陰茎および精巣のがんが挙げられる。

【0155】

一実施形態では、がんは、白血病、リンパ腫、骨髄腫およびＢ細胞リンパ腫を含む血液がんを含む。血液がんとしては、多発性骨髄腫（ＭＭ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）を含む非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、慢性Ｂリンパ球性白血病（Ｂ－ＣＬＬ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、急性ＢおよびＴリンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）、濾胞性リンパ腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、マントル細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、形質細胞骨髄腫、前駆Ｂ細胞リンパ芽球性白血病／リンパ腫、形質細胞腫、巨細胞骨髄腫、形質細胞骨髄腫、重鎖骨髄腫（ｈｅａｖｙ－ｃｈａｉｎ ｍｙｅｌｏｍａ）、軽鎖またはベンスジョーンズ骨髄腫、リンパ腫様肉芽腫症、移植後リンパ増殖性障害、免疫調節障害、関節リウマチ、重症筋無力症、特発性血小板減少性紫斑病、抗リン脂質症候群、シャーガス病、グレーブス病、ウェゲナー肉芽腫症、結節性多発動脈炎、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡、強皮症、多発性硬化症、抗リン脂質症候群、ＡＮＣＡ関連血管炎、グッドパスチャー病、川崎病、自己免疫性溶血性貧血、および急速進行性糸球体腎炎、重鎖病、原発性または免疫細胞関連アミロイドーシス、ならびに意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症が挙げられる。

【0156】

二量体抗原受容体（ＤＡＲ）
本開示は、膜貫通領域および細胞内領域に連結されたＦａｂ断片を含む二量体抗原受容体（ＤＡＲ）を提供する。一実施形態では、ＤＡＲ構築物は、Ｆａｂ断片および膜貫通領域の間に必要に応じたヒンジ領域を含む。一部の実施形態では、本開示のＤＡＲ構造は、例えば、Ｆａｂ型式の抗体を有するＤＡＲ構造を同じ抗体のｓｃＦｖ型式を有するＣＡＲ構造と比較することに基づくと予想外の驚くべき結果を提供する。また、ＤＡＲおよびＣＡＲ型式は、ヒンジ領域、膜貫通領域および２つの細胞内領域が同じであり得るので、直接比較することができる。さらに、ＤＡＲ型式は、標的抗原を発現する細胞への結合（例えば、特異的結合）、抗原誘導サイトカイン放出および／または抗原誘導細胞傷害において、対応するＣＡＲ型式と比べて優れた結果を提供することができる。

【0157】

本開示は、１つのポリペプチド鎖における重鎖結合領域、および別のポリペプチド鎖における軽鎖結合領域を含む二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物を提供する。二量体抗原受容体を構成する２つのポリペプチド鎖は、二量体化して、ｓｃＦｖと比較して、Ｆａｂ構造をより密接に模倣するタンパク質複合体を形成することができる。二量体抗原受容体は、それらが標的抗原に特異的に結合するように、抗体様特性を有する。二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物では、１つのポリペプチド鎖における重鎖可変領域および定常領域は、介在するリンカー配列が欠如し得、別のポリペプチド鎖における軽鎖可変領域および定常領域も、介在するリンカー配列が欠如し得る。ＤＡＲポリペプチド鎖における介在するリンカー配列の欠如は、可変重鎖領域および可変軽鎖領域の間に介在するリンカー配列を含有するｓｃＦｖと比較して、免疫原性を低減し得る。二量体抗原受容体は、それらが標的抗原に特異的に結合するように、抗体様特性を有する。二量体抗原受容体は、指向性細胞療法のために使用することができる。

【0158】

本開示は、抗原結合細胞外部分、必要に応じたヒンジ部分、膜貫通部分ならびに共刺激領域および／または細胞内シグナル伝達領域を有する細胞内部分を有する抗ＢＣＭＡ二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物を発現するように操作されたトランスジェニックＴ細胞を提供する。細胞外部分は、ＢＣＭＡを発現する病的造血細胞と結合するための高い親和性およびアビディティーを示し、正常細胞を残しながら、Ｔ細胞の活性化および病的細胞殺滅をもたらす。抗ＢＣＭＡ ＤＡＲ構築物の細胞内部分は、抗原結合の際にＴ細胞活性化を媒介する共刺激領域および／またはシグナル伝達領域を含み、これは、メモリーＴ細胞の形成、Ｔ細胞の増殖（例えば、メモリーＴ細胞の増殖）の増強および／またはＴ細胞疲弊の低減をもたらし得る。メモリーＴ細胞の形成が、ＢＣＭＡ過剰発現を含む疾患を患う被験体における疾患の再発を予防するために重要であると推論される。強く迅速なエフェクター応答を生成するためのＤＡＲ構築物（例えば、細胞内ＣＤ２８共刺激領域を含むＤＡＲ構築物）および／またはより長く続くメモリーＴ細胞集団を発生させるためのＤＡＲ構築物（例えば、細胞内４－１ＢＢ共刺激領域を含むＤＡＲ構築物）の設計における柔軟性を提供する、細胞内共刺激およびシグナル伝達領域の種類および数が異なるＤＡＲ構築物の複数の構成が本明細書に記載される。

【0159】

一実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＤＡＲを発現するトランスジェニックＴ細胞の集団は、ナイーブＴ細胞（Ｔ_Ｎ）、またはメモリーＴ細胞（Ｔ_Ｍ）への分化のさまざまな段階にある、抗原を経験したＴ細胞のいずれかであるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物を含む。メモリーＴ細胞（Ｔ_Ｍ）の集団は、不均一で、その細胞受容体発現パターンが異なるセントラルメモリーＴ細胞（Ｔ_ＣＭ）およびエフェクターメモリーＴ細胞（Ｔ_ＥＭ）のサブセットの集団を含有しており、様々な程度の抗腫瘍効力、ｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖能力およびｉｎ ｖｉｖｏ持続を示し得る。一般に、ヒトナイーブＴ細胞（Ｔ_Ｎ）における細胞受容体発現パターンは、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ４５ＲＯ－およびＣＤ２７＋を含む。セントラルメモリーＴ細胞（Ｔ_ＣＭ）は、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ４５ＲＯ＋およびＣＤ２７＋である。エフェクターメモリーＴ細胞（Ｔ_ＥＭ）は、ＣＤ６２Ｌ－、ＣＣＲ７－、ＣＤ４５ＲＡ－、ＣＤ４５ＲＯ－およびＣＤ２７－である。一方、エフェクターＴ細胞（Ｔ_Ｅ）は、ＣＤ６２Ｌ－、ＣＣＲ７－、ＣＤ４５ＲＯ－およびＣＤ２７－である。抗原を経験したメモリーＴ細胞は、幹細胞様メモリーＴ細胞（Ｔ_ＳＣＭ）から、セントラルメモリーＴ細胞（Ｔ_ＣＭ）に、エフェクターメモリーＴ細胞（Ｔ_ＥＭ）に、最終的に、分化したエフェクターＴ細胞に分化すると推論される。セントラルメモリーＴ細胞（Ｔ_ＣＭ）は、早期に分化した前駆細胞として分類され、自己で更新（再生）することができ、長寿命の幹細胞様Ｔ細胞メモリー特性を維持することができる。エフェクターメモリーＴ細胞（Ｔ_ＥＭ）は、セントラルメモリーＴ細胞（Ｔ_ＣＭ）よりも分化していると思われ、これは、最終的に、細胞傷害性であり、炎症性サイトカインを生じさせ、わずかな増殖能力を有する、分化したエフェクターＴ細胞（Ｔ_Ｅ）に分化することができる。抗原刺激に応答して、ＣＤ８＋セントラルメモリーＴ細胞（Ｔ_ＣＭ）およびエフェクターメモリーＴ細胞（Ｔ_ＥＭ）は、上昇したレベルのパーフォリンおよびグランザイム（例えば、グランザイムＡおよび／またはＢ）を発現し、短命の細胞溶解性エフェクターＴ細胞（Ｔ_Ｅ）に分化することができる。したがって、細胞溶解性エフェクターＴ細胞（Ｔ_Ｅ）と比較して、抗腫瘍効力、増加したｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖能力およびｉｎ ｖｉｖｏ持続を示す、増加したレベルのセントラルメモリーＴ細胞（Ｔ_ＣＭ）およびエフェクターメモリーＴ細胞（Ｔ_ＥＭ）を含有する抗ＢＣＭＡ ＤＡＲ Ｔ細胞の集団を生じさせることが有利である。

【0160】

一実施形態では、本明細書に記載されるトランスジェニックＤＡＲ Ｔ細胞は、セントラルメモリーＴ細胞（Ｔ_ＣＭ）およびエフェクターメモリーＴ細胞（Ｔ_ＥＭ）の特徴的な細胞受容体発現パターンを示し、それらが抗腫瘍効力、ｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖能力およびｉｎ ｖｉｖｏ持続を示すように、ｉｎ ｖｉｖｏ養子移入にそれらを好適なものにする特性を有する、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋メモリーＴ細胞を含む。

【0161】

一実施形態では、トランスジェニック抗ＢＣＭＡ ＤＡＲ Ｔ細胞は、腫瘍負荷を低減するために、ＢＣＭＡ抗原を過剰発現する腫瘍またはがんを有する被験体に投与することができる。一実施形態では、トランスジェニックＤＡＲ Ｔ細胞は、単回用量または複数回用量で、被験体に投与することができる。抗ＢＣＭＡ ＤＡＲ Ｔ細胞は、被験体中で（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏで）増殖することができ、これは、メモリーＴ細胞の特性を有するＤＡＲ Ｔ細胞の存在と相関していてもよく、または相関していなくてもよい。一実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＤＡＲ Ｔ細胞は、単回用量後に、処置された被験体中でｉｎ ｖｉｖｏで増殖することができる。増殖は、処置後、数日、数週間、または数か月検出することができる。抗ＢＣＭＡ ＤＡＲ Ｔ細胞は、被験体中で、処置後、数日、数週間、または数か月持続することができる。

【0162】

一実施形態では、被験体中のトランスジェニック抗ＢＣＭＡ ＤＡＲ Ｔ細胞の機能の持続は、数日間、数週間、数か月間の長期の腫瘍免疫を付与する。持続のレベルは、動物モデルにおける腫瘍再チャレンジ実験を実施することによって評価することができる。例えば、抗ＢＣＭＡ ＤＡＲ Ｔ細胞の単回用量を、原発性腫瘍負荷を有する少なくとも１頭の動物被験体に投与することができる。原発性腫瘍負荷が低減された後、動物を、二次腫瘍細胞で再チャレンジし、二次腫瘍負荷をモニターする。二次腫瘍成長（腫瘍の再発）の遅延または腫瘍消失は、抗ＢＣＭＡ ＤＡＲ Ｔ細胞の単回用量が、ｉｎ ｖｉｖｏで持続することを示し、長期のｉｎ ｖｉｖｏ増殖を示し得る。遅延は、数日、数週間または数か月測定され得る。腫瘍処置のために抗ＢＣＭＡ ＤＡＲ Ｔ細胞を受けるヒト被験体はまた、数日間、数週間または数か月間にわたり長期の腫瘍免疫から利益を得ることができる。

【0163】

一実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＤＡＲを発現するトランスジェニックＴ細胞の集団は、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ（キメラ抗原受容体）を発現するトランスジェニックＴ細胞と比較して、Ｔ細胞疲弊のレベルの低減を示す。一実施形態では、ＤＡＲ Ｔ細胞の集団中のＤＡＲ Ｔ細胞のパーセンテージの低減は、ＣＡＲ Ｔ細胞の集団と比較して、Ｔ細胞疲弊を示す。Ｔ細胞疲弊は、持続する抗原刺激によって引き起こされる機能障害の状態を指す。ＣＤ８＋およびＣＤ４＋ＤＡＲ Ｔ細胞の両方で、疲弊は、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４、ＣＤ１６０および／もしくはＴＩＧＩＴの２つまたはそれよりも多くの任意の組合せを含む、阻害性受容体の共発現によって特徴付けられる。ＤＡＲ Ｔ細胞におけるＴ細胞疲弊は、ＩＬ－２産生の喪失、増殖能力および細胞傷害活性の大幅な低減または喪失によっても特徴付けられる。ＣＤ８＋Ｔ細胞では、疲弊は、Ｔ細胞死をもたらし得る。Ｔ細胞疲弊は、後期Ｔ細胞分化を表すことが推論される。Ｔ細胞疲弊は、ＣＡＲ Ｔ細胞療法の失敗の原因であると考えられる。

【0164】

一実施形態では、Ｔ細胞疲弊受容体マーカー（例えば、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４、ＣＤ１６０および／またはＴＩＧＩＴの２つまたはそれよりも多くの任意の組合せ）を示すＤＡＲ Ｔ細胞の数は、同じＴ細胞疲弊受容体を示すＣＡＲ Ｔ細胞の数と比較して低減され、ここで、低減は、約２分の１、または約３分の１、または約４分の１、または約５分の１、またはそれよりも高い倍数の低減レベル、または約２分の１未満の低減レベルである。

【0165】

一実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＤＡＲ Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞またはメモリーＴ細胞の集団（例えば、セントラルメモリーＴ細胞またはエフェクターメモリーＴ細胞）の事前富化なしのポリクローナルＴ細胞集団（例えば、ＰＢＭＣ）から調製することができる。事前富化手順としては、細胞培養法、細胞選別（例えば、蛍光標識細胞分取）または勾配精製が挙げられ得る。

【0166】

トランスジェニック抗ＢＣＭＡ ＤＡＲ Ｔ細胞を調製することができ、次いで、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおける将来の使用のため、または被験体への投与のために、保存することができる。一実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＤＡＲ Ｔ細胞は、数時間、数日間または数か月間、凍結保存条件下で保存することができる。一実施形態では、凍結保存された抗ＢＣＭＡ ＤＡＲ Ｔ細胞を解凍することができ、解凍されたＤＡＲ Ｔ細胞は、凍結保存および解凍されていない新鮮な調製された抗ＢＣＭＡ ＤＡＲ Ｔ細胞と比較して、同様のレベルの生存度および機能を維持する。一実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＤＡＲ Ｔ細胞は、約１～２４時間凍結保存される。一実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＤＡＲ Ｔ細胞は、約１～３０日間凍結保存される。一実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＤＡＲ Ｔ細胞は、約１～２か月間、または約２～３か月間、または約３～４か月間、または約４～５か月間、または約５～６か月間、または６か月間より長く凍結保存される。一実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＤＡＲ Ｔ細胞は、約－８０～－１００℃、または約－１００～－１５０℃の温度範囲で凍結保存することができる。一実施形態では、凍結保存された抗ＢＣＭＡ ＤＡＲ Ｔ細胞は、解凍することができ、生存度を維持することができ、ここで、解凍された細胞の約５５～６５％が生存しているか、または解凍された細胞の約６５～７５％、もしくは約７５～８５％、もしくは約８５～９５％、もしくは約９５～９９％が生存している。

【0167】

一実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＤＡＲ Ｔ細胞は、７０％のＡＩＭ－Ｖ培地、２０％のＦＢＳおよび１０％のＤＭＳＯを含む凍結培地中で凍結保存することができる。一実施形態では、約１×１０^５～１×１０^９個の抗ＢＣＭＡ ＤＡＲ Ｔ細胞を、凍結培地中で凍結保存することができる。一実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＤＡＲ Ｔ細胞は、凍結培地に再懸濁させ、－８０℃で終夜置き、次いで、保管のために－１５０℃に移すことができる。一実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＤＡＲ Ｔ細胞は、凍結培地に再懸濁させ、保管のために、－８０℃または－１５０℃に直接置くことができる。一実施形態では、凍結保存された抗ＢＣＭＡ ＤＡＲ Ｔ細胞を、解凍されるまで３７℃に置き、次いで、使用のための準備まで氷上に置くことができる。

【0168】

本開示は、互いと会合して、ＢＣＭＡタンパク質（例えば、標的抗原）と結合する抗原結合ドメインを形成する、第１および第２のポリペプチド鎖を有する二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物を提供する。一実施形態では、ＢＣＭＡタンパク質は、ヒト、類人猿（例えば、チンパンジー）、サル（例えば、カニクイザル）、ネズミ科（例えば、マウスおよび／またはラット）、イヌ科（例えば、イヌ）および／またはネコ科（例えば、ネコ）由来である。一実施形態では、ＢＣＭＡタンパク質は、ヒトＢＣＭＡ（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ０２２２３）を含む。一実施形態では、ＢＣＭＡタンパク質は、野生型ヒト（例えば、配列番号１）または変異体ヒトＢＣＭＡタンパク質（例えば、配列番号２または３）を含む。一実施形態では、二量体抗原受容体（ＤＡＲ）は、野生型ヒトＢＣＭＡタンパク質（配列番号１）またはその任意の部分と結合するが、変異体ＢＣＭＡタンパク質（配列番号２および３）と結合しない。一実施形態では、二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物は、ＡＰＲＩＬ

【化3】

（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｏ７５８８８ ＴＮＦ１３ヒト、配列番号４）および／またはＢＡＦＦ（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ９Ｙ２７５ ＴＮ１３Ｂヒト、配列番号５）と結合することができる。

【0169】

本開示は、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を有するＤＡＲ（二量体抗原受容体）構築物のための構造であって、第１のポリペプチド鎖が、抗体の重鎖可変領域を含み、第２のポリペプチド鎖が、抗体の軽鎖可変領域を含み、第１のポリペプチド鎖が、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖の両方が同じ細胞によって発現される場合に、形質導入された細胞の外側の領域で１つまたは複数のジスルフィド結合によって第２のポリペプチド鎖に連結されている、ＤＡＲ構築物のための構造を提供する。一部の実施形態では、ＤＡＲ構築物は、配列中に、可変ドメイン領域およびＣＨ１領域を有する抗体重鎖、ヒンジ領域、膜貫通領域および２～５つのシグナル伝達ドメインを有する細胞内領域を含む第１のポリペプチド鎖、ならびに対応するＣＬ／ＣＫ領域を有する抗体軽鎖可変ドメイン領域（カッパ（Ｋ）またはラムダ（Ｌ））を含む第２のポリペプチド鎖を含み、ここで、それぞれの第１および第２のポリペプチド鎖中のＣＨ１およびＣＬ／ＣＫ領域は、１つまたは２つのジスルフィド結合で連結されている（例えば、図１ＡおよびＢを参照されたい）。

【0170】

本開示は、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を有するＤＡＲ（二量体抗原受容体）構築物のための構造であって、第１のポリペプチド鎖が、抗体の軽鎖可変領域を含み、第２のポリペプチド鎖が、抗体の重鎖可変領域を含み、第１のポリペプチド鎖が、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖の両方が同じ細胞によって発現される場合に、形質導入された細胞の外側の領域で１つまたは複数のジスルフィド結合によって第２のポリペプチド鎖に連結されている、ＤＡＲ構築物のための構造を提供する。一部の実施形態では、ＤＡＲ構築物は、配列中に、対応するＣＬ／ＣＫ領域を有する可変ドメイン領域（カッパ（Ｋ）またはラムダ（Ｌ））を有する抗体軽鎖、ヒンジ領域、膜貫通領域および２～５つのシグナル伝達ドメインを有する細胞内領域を含む第１のポリペプチド鎖、ならびに抗体重鎖可変ドメイン領域およびＣＨ１領域を含む第２のポリペプチド鎖を含み、ここで、それぞれの第１および第２のポリペプチド鎖中のＣＬ／ＣＫおよびＣＨ１領域は、１つまたは２つのジスルフィド結合で連結されている（例えば、図２ＡおよびＢを参照されたい）。

【0171】

一実施形態では、ＤＡＲ構築物は、別のポリペプチド鎖上に抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域を含み、ここで、重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、抗原結合ドメインを形成する。

【0172】

一実施形態では、ヒンジ領域は、約１０～約１００アミノ酸長である。一実施形態では、ヒンジ領域は、独立して、ＣＤ８ヒンジ領域またはその断片、ＣＤ８αヒンジ領域またはその断片、抗体の定常ドメインＣＨ１およびＣＨ２と連結している抗体（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥまたはＩｇＤ）のヒンジ領域からなる群より選択される。ヒンジ領域は、抗体に由来し得、抗体の１つもしくは複数の定常領域を含んでいてもよく、または含んでいなくてもよい。

【0173】

一実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲζ、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ６４、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ９、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＬＦＡ－１ Ｔ細胞共受容体、ＣＤ２ Ｔ細胞共受容体／接着分子、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ１５４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳおよびＦＧＦＲ２Ｂからなる群より選択される膜タンパク質配列領域に由来し得る。

【0174】

一実施形態では、シグナル伝達領域は、ＣＤ３ゼータ鎖、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ卵母細胞機能関連抗原１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＧＩＴＲ（ＴＮＦＲＳＦ１８）、ＤＲ３（ＴＮＦＲＳＦ２５）、ＴＮＦＲ２、ＣＤ２２６およびそれらの組合せ由来のシグナル伝達領域からなる群より選択される。

【0175】

一実施形態では、二量体抗原受容体の一般設計は、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含み、ここで、第１のポリペプチド鎖は、二量体化領域に接続され、ヒンジ領域に接続され、膜貫通領域に接続され、細胞内配列領域の１つまたは複数に接続された抗原結合領域を含み、第２のポリペプチド鎖は、抗原結合ドメインおよび二量体化ドメインを含む。一実施形態では、第１および第２のポリペプチド鎖の一方または両方における抗原結合ドメインは、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、サイトカイン受容体の細胞外領域、単一ドメイン抗体、およびそれらの組合せからなる群より選択される。一実施形態では、第１および第２のポリペプチド鎖の一方または両方における二量体化ドメインは、カッパ軽鎖定常領域、ラムダ軽鎖定常領域、ロイシンジッパー、ｍｙｃ－ｍａｘ構成成分、およびそれらの組合せからなる群より選択される。図１Ａ～Ｂおよび２Ａ～Ｂでは、「Ｓ－Ｓ」は、ジスルフィド結合、ロイシンジッパーまたはｍｙｃ－ｍａｘ構成成分を含む、第１および第２のポリペプチド鎖の二量体化をもたらす任意の化学結合または会合を表す。

【0176】

本開示は、二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物であって、第１のポリペプチド鎖が、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）を持ち、第２のポリペプチド鎖が、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）を持つ、二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物を提供する（例えば、図１ＡおよびＢ）。一実施形態では、二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物は、（ａ）アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）抗体重鎖可変領域（ＶＨ）、（ｉｉ）抗体重鎖定常領域（ＣＨ）、（ｉｉｉ）必要に応じたヒンジ領域、（ｉｖ）膜貫通領域（ＴＭ）、および（ｖ）細胞内領域を含む第１のポリペプチド鎖；（ｂ）アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）（例えば、カッパまたはラムダ）、および（ｉｉ）抗体軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む第２のポリペプチド鎖を含む。

【0177】

本開示は、二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物であって、第１のポリペプチド鎖が、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）を持ち、第２のポリペプチド鎖が、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）を持つ、二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物を提供する（例えば、図２ＡおよびＢ）。一実施形態では、二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物は、（ａ）アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）、（ｉｉ）抗体軽鎖定常領域（ＣＬ）、（ｉｉｉ）必要に応じたヒンジ領域、（ｉｖ）膜貫通領域（ＴＭ）、および（ｖ）細胞内領域を含む第１のポリペプチド鎖；（ｂ）アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）抗体重鎖可変領域（ＶＨ）、および（ｉｉ）抗体重鎖定常領域（ＣＨ）を含む第２のポリペプチド鎖を含む。

【0178】

一実施形態では、図１ＡおよびＢならびに２ＡおよびＢに示される二量体抗原受容体について、抗体重鎖定常領域（ＣＨ）および抗体軽鎖定常領域（ＣＬ）は、二量体化して、二量体化ドメインを形成することができる。一実施形態では、抗体重鎖定常領域および抗体軽鎖定常領域は、１つまたは２つのジスルフィド結合を介して二量体化する。

【0179】

一実施形態では、図１ＡおよびＢならびに図２ＡおよびＢに示される二量体抗原受容体について、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）および抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）は、互いと会合して、抗原結合ドメインを形成する。例えば、抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域は、抗体重鎖定常領域および抗体軽鎖定常領域が二量体化する時に、互いと会合する。

【0180】

一実施形態では、図１ＡおよびＢならびに２ＡおよびＢに示される二量体抗原受容体について、抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域から形成される抗原結合ドメインは、標的抗原と結合する。

【0181】

一実施形態では、図１ＡおよびＢならびに２ＡおよびＢに示される二量体抗原受容体について、抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域は、完全ヒト抗体領域、ヒト化抗体領域またはキメラ抗体領域である。

【0182】

一実施形態では、図１ＡおよびＢならびに２ＡおよびＢに示される二量体抗原受容体について、ヒンジ領域は、約１０～約１００アミノ酸長である。一実施形態では、ヒンジ領域は、抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥまたはＩｇＤ）由来のヒンジ領域またはその断片を含む。一実施形態では、ヒンジ領域は、ＣＤ８（例えば、ＣＤ８α）および／もしくはＣＤ２８ヒンジ領域、またはそれらの断片を含む。一実施形態では、ヒンジ領域は、ＣＰＰＣまたはＳＰＰＣアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ヒンジ領域は、ＣＤ８およびＣＤ２８ヒンジ配列の両方（例えば、長いヒンジ領域）、ＣＤ８配列のみ（短いヒンジ）またはＣＤ２８ヒンジ配列のみ（例えば、短いヒンジ領域）を含む。一実施形態では、図１ＡもしくはＢまたは図２ＡもしくはＢに示される二量体抗原受容体のいずれかは、ヒンジ領域が欠如している。

【0183】

一実施形態では、図１ＡおよびＢならびに２ＡおよびＢに示される二量体抗原受容体について、第１および第２のポリペプチド鎖の膜貫通領域は、独立して、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲζ、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ６４、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ９、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＬＦＡ－１ Ｔ細胞共受容体、ＣＤ２ Ｔ細胞共受容体／接着分子、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ１５４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳおよびＦＧＦＲ２Ｂに由来し得る。

【0184】

一実施形態では、図１ＡおよびＢならびに２ＡおよびＢに示される二量体抗原受容体について、第１のポリペプチドの細胞内領域は、４－１ＢＢ、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＧＩＴＲ（ＴＮＦＲＳＦ１８）、ＤＲ３（ＴＮＦＲＳＦ２５）、ＴＮＦＲ２、ＣＤ２２６およびそれらの組合せからの２～５つの細胞内配列の任意の順序および任意の組合せの、細胞内共刺激および／または細胞内シグナル伝達配列を含む。一実施形態では、細胞内領域は、ＣＤ２８、４－１ＢＢおよび／またはＣＤ３ゼータ細胞内配列のいずれか１つまたはそれらのうちの２つもしくはそれよりも多くの任意の組合せを含む。一実施形態では、細胞内領域は、ＣＤ２８共刺激およびＣＤ３ゼータ細胞内シグナル伝達配列、または４－１ＢＢ共刺激およびＣＤ３ゼータ細胞内シグナル伝達配列を含む。一実施形態では、細胞内シグナル伝達領域のＣＤ３ゼータ部分は、ＩＴＡＭ（免疫受容活性化チロシンモチーフ）モチーフ１、２および３を含む（例えば、長いＣＤ３ゼータ）。一実施形態では、細胞内シグナル伝達領域のＣＤ３ゼータ部分は、ＩＴＡＭ １、２または３のみなどのＩＴＡＭモチーフ１つのみを含む（例えば、短いＣＤ３ゼータ）。

【0185】

一実施形態では、二量体抗原受容体（図１Ａおよび１Ｂ）の第１のポリペプチド鎖は、配列番号６、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗体重鎖定常領域は、ヒト抗体定常領域、例えば、ヒトＣＨ１ドメインに由来する配列を含む。一実施形態では、抗体重鎖定常領域は、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥまたはＩｇＤ抗体に由来し得る。一実施形態では、抗体重鎖定常領域は、配列番号７または２９のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、抗体重鎖定常領域は、配列番号７または２９のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ヒンジ領域は、配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤ２８ヒンジ、または配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤ８ヒンジ、または配列番号３６のＣＤ２８およびＣＤ８ヒンジ配列を含むヒンジ領域（例えば、長いヒンジ）を含む。一実施形態では、第１のポリペプチドは、ヒンジ領域が欠如している。一実施形態では、膜貫通領域は、配列番号３７（ＣＤ２８由来）、配列番号３８（ＣＤ８由来）、配列番号３９（４－１ＢＢ由来）または配列番号４０（ＣＤ３ゼータ由来）のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、細胞内領域は、配列番号４１（４－１ＢＢ由来）、配列番号４２（ＣＤ２８由来）、配列番号４３（ＯＸ４０由来）、配列番号４４（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ １、２および３）、配列番号４５（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ １）、配列番号４６（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ ２）および／または配列番号４７（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ ３）からなる群より選択される２つまたはそれよりも多くの細胞内配列のいずれか１つまたは任意の組合せ由来のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号５４もしくは５６のアミノ酸配列を含むリーダー配列を含むか、または第１のポリペプチドは、リーダー配列が欠如している。

【0186】

一実施形態では、二量体抗原受容体（図１Ａおよび１Ｂ）の第２のポリペプチド鎖は、配列番号８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７または３０のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗体軽鎖定常領域は、ヒト軽鎖定常領域由来の配列を含む。一実施形態では、抗体軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ軽鎖定常領域由来の配列を含む。一実施形態では、抗体軽鎖定常領域は、配列番号１１または３１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、抗体軽鎖定常領域は、配列番号１１または３１のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、配列番号５５もしくは５６のアミノ酸配列を含むリーダー配列を含むか、または第２のポリペプチドは、リーダー配列が欠如している。

【0187】

一実施形態では、二量体抗原受容体（図２Ａおよび２Ｂ）の第１のポリペプチド鎖は、配列番号８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７または３０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗体軽鎖定常領域は、配列番号１１または３１のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ヒンジ領域は、配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤ２８ヒンジ、または配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤ８ヒンジ、または配列番号３６のＣＤ２８およびＣＤ８ヒンジ配列を含むヒンジ領域（例えば、長いヒンジ）を含む。一実施形態では、第１のポリペプチドは、ヒンジ領域が欠如している。一実施形態では、膜貫通領域は、配列番号３７（ＣＤ２８由来）、配列番号３８（ＣＤ８由来）、配列番号３９（４－１ＢＢ由来）または配列番号４０（ＣＤ３ゼータ由来）のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、細胞内領域は、配列番号４１（４－１ＢＢ由来）、配列番号４２（ＣＤ２８由来）、配列番号４３（ＯＸ４０由来）、配列番号４４（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ １、２および３）、配列番号４５（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ １）、配列番号４６（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ ２）および／または配列番号４７（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ ３）からなる群より選択される２つまたはそれよりも多くの細胞内配列のいずれか１つまたは任意の組合せ由来のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号５５もしくは５６のアミノ酸配列を含むリーダー配列を含むか、または第１のポリペプチドは、リーダー配列が欠如している。

【0188】

一実施形態では、二量体抗原受容体（図２Ａおよび２Ｂ）の第２のポリペプチド鎖は、配列番号６、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８のアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗体重鎖定常領域は、配列番号７または２９のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、配列番号５４もしくは５６のアミノ酸配列を含むリーダー配列を含むか、または第２のポリペプチドは、リーダー配列が欠如している。

【0189】

本開示は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）を持つ第１のポリペプチド鎖、ならびに軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）を持つ第２のポリペプチド鎖を含むバージョン１（例えば、Ｖ１）二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物であって（例えば、図１）、（ａ）第１のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）抗体重鎖可変領域（ＶＨ）、（ｉｉ）抗体重鎖定常領域（ＣＨ）、（ｉｉｉ）ＣＤ８およびＣＤ２８ヒンジ配列（例えば、配列番号３６）を含む長いヒンジ領域、（ｉｖ）ＣＤ２８膜貫通配列（例えば、配列番号３７）を含む膜貫通領域（ＴＭ）、ならびに（ｖ）ＣＤ２８共刺激配列（例えば、配列番号４２）ならびにＩＴＡＭモチーフ１、２および３を有するＣＤ３ゼータシグナル伝達配列（例えば、配列番号４４）を含む細胞内領域を含み；（ｂ）第２のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）（例えば、カッパまたはラムダ）、および（ｉｉ）抗体軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む、バージョン１（例えば、Ｖ１）二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物を提供する。一実施形態では、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号６、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡ重鎖可変領域を含み、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７または３０のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡ軽鎖可変領域配列を含む。

【0190】

本開示は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）を持つ第１のポリペプチド鎖、ならびに軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）を持つ第２のポリペプチド鎖を含むバージョン２（例えば、Ｖ２）二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物であって（例えば、図１および２）、（ａ）第１のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）抗体重鎖可変領域（ＶＨ）、（ｉｉ）抗体重鎖定常領域（ＣＨ）、（ｉｉｉ）ＣＤ２８ヒンジ配列（例えば、配列番号３５）を含む短いヒンジ領域、（ｉｖ）ＣＤ２８膜貫通配列（例えば、配列番号３７）を含む膜貫通領域（ＴＭ）、ならびに（ｖ）（１）４－１ＢＢ共刺激配列（例えば、配列番号４１）ならびにＩＴＡＭモチーフ１、２および３を有するＣＤ３ゼータ（例えば、配列番号４４）、または（２）ＣＤ２８（例えば、配列番号４２）シグナル伝達配列ならびにＩＴＡＭモチーフ１、２および３を有するＣＤ３ゼータ（例えば、配列番号４４）、または（３）４－１ＢＢ（例えば、配列番号４１）シグナル伝達配列ならびにＣＤ２８（例えば、配列番号４２）シグナル伝達配列ならびにＩＴＡＭモチーフ１、２および３を有するＣＤ３ゼータ（例えば、配列番号４４）のいずれかを含む細胞内領域を含み；（ｂ）第２のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）（例えば、カッパまたはラムダ）、および（ｉｉ）抗体軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む、バージョン２（例えば、Ｖ２）二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物を提供する。

【0191】

一実施形態では、バージョン２ａ（Ｖ２ａ）ＤＡＲ構築物は、４－１ＢＢ共刺激配列（例えば、配列番号４１）ならびにＩＴＡＭモチーフ１、２および３を有するＣＤ３ゼータ（例えば、配列番号４４）を有する細胞内領域を含む。

【0192】

一実施形態では、バージョン２ｂ（Ｖ２ｂ）ＤＡＲ構築物は、ＣＤ２８（例えば、配列番号４２）シグナル伝達配列ならびにＩＴＡＭモチーフ１、２および３を有するＣＤ３ゼータ（例えば、配列番号４４）を有する細胞内領域を含む。

【0193】

一実施形態では、バージョン２ｃ（Ｖ２ｃ）ＤＡＲ構築物は、４－１ＢＢ（例えば、配列番号４１）シグナル伝達配列ならびにＣＤ２８（例えば、配列番号４２）シグナル伝達配列ならびにＩＴＡＭモチーフ１、２および３を有するＣＤ３ゼータ（例えば、配列番号４４）を有する細胞内領域を含む。

【0194】

一実施形態では、ＤＡＲ Ｖ２ａおよびＶ２ｂは、第二世代のＤＡＲ構築物であるが、ＤＡＲ Ｖ２ｃは、第三世代のＤＡＲ構築物である。

【0195】

一実施形態では、ＤＡＲ Ｖ２ａ、Ｖ２ｂおよびＶ２ｃ構築物において、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号６、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡ重鎖可変領域を含み、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７または３０のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡ軽鎖可変領域配列を含む。

【0196】

本開示は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）を持つ第１のポリペプチド鎖、ならびに軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）を持つ第２のポリペプチド鎖を含むバージョン３ａ、３ｂおよび３ｃ（例えば、Ｖ３ａ、Ｖ３ｂおよびＶ３ｃ）二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物であって（例えば、図１）、（ａ）第１のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）抗体重鎖可変領域（ＶＨ）、（ｉｉ）抗体重鎖定常領域（ＣＨ）、（ｉｉｉ）ＣＤ２８ヒンジ配列（例えば、配列番号３５）を含む短いヒンジ領域、（ｉｖ）ＣＤ２８膜貫通配列（例えば、配列番号３７）を含む膜貫通領域（ＴＭ）、ならびに（ｖ）４－１ＢＢ共刺激配列（例えば、配列番号４１）およびＩＴＡＭモチーフ３のみを有するＣＤ３ゼータシグナル伝達配列（例えば、配列番号４７）を含む細胞内領域を含み；（ｂ）第２のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）（例えば、カッパまたはラムダ）、および（ｉｉ）抗体軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む、バージョン３ａ、３ｂおよび３ｃ（例えば、Ｖ３ａ、Ｖ３ｂおよびＶ３ｃ）二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物を提供する。

【0197】

一実施形態では、バージョン３ａ（Ｖ３ａ）ＤＡＲ構築物は、４－１ＢＢ共刺激配列（例えば、配列番号４１）およびＩＴＡＭモチーフ３を有するＣＤ３ゼータ（例えば、配列番号４７）を有する細胞内領域を含む。

【0198】

一実施形態では、バージョン３ｂ（Ｖ３ｂ）ＤＡＲ構築物は、ＣＤ２８（例えば、配列番号４２）シグナル伝達配列およびＩＴＡＭモチーフ３を有するＣＤ３ゼータ（例えば、配列番号４７）を有する細胞内領域を含む。

【0199】

一実施形態では、バージョン３ｃ（Ｖ３ｃ）ＤＡＲ構築物は、４－１ＢＢ（例えば、配列番号４１）シグナル伝達配列およびＣＤ２８（例えば、配列番号４２）シグナル伝達配列およびＩＴＡＭモチーフ３を有するＣＤ３ゼータ（例えば、配列番号４７）を有する細胞内領域を含む。

【0200】

一実施形態では、ＤＡＲ Ｖ３ａおよびＶ３ｂは、第二世代のＤＡＲ構築物であるが、ＤＡＲ Ｖ３ｃは、第三世代のＤＡＲ構築物である。

【0201】

一実施形態では、ＤＡＲ Ｖ３ａ、Ｖ３ｂおよびＶ３ｃ構築物において、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号６、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡ重鎖可変領域を含み、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７または３０のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡ軽鎖可変領域配列を含む。一実施形態では、ＤＡＲバージョン３ｂ（例えば、Ｖ３ｂ）は、ＣＤ２８共刺激配列（例えば、配列番号４２）を含む第三世代のＤＡＲ構築物である。

【0202】

本開示は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）を持つ第１のポリペプチド鎖、ならびに軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）を持つ第２のポリペプチド鎖を含むバージョン４（例えば、Ｖ４）二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物であって、（ａ）第１のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）抗体重鎖可変領域（ＶＨ）、（ｉｉ）抗体重鎖定常領域（ＣＨ）、（ｉｉｉ）ＣＤ２８膜貫通配列（例えば、配列番号３７）を含む膜貫通領域（ＴＭ）、ならびに（ｉｖ）４－１ＢＢ共刺激配列（例えば、配列番号４１）およびＩＴＡＭモチーフ３のみを有するＣＤ３ゼータシグナル伝達配列（例えば、配列番号４７）を含む細胞内領域を含み；（ｂ）第２のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）（例えば、カッパまたはラムダ）、および（ｉｉ）抗体軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む、バージョン４（例えば、Ｖ４）二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物を提供する。ＤＡＲ Ｖ４構築物は、ヒンジ配列が欠如している。一実施形態では、ＤＡＲ Ｖ４構築物において、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号６、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡ重鎖可変領域を含み、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７または３０のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡ軽鎖可変領域配列を含む。

【0203】

前駆体ポリペプチド
本開示は、前駆体ポリペプチドを提供する。一実施形態では、前駆体ポリペプチドは、プロセシングされて、会合／アセンブルして二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物を形成する第１および第２のポリペプチド鎖になり得る。自己切断配列を含む本明細書に記載される前駆体ポリペプチドの実施形態のいずれかでは、自己切断配列は、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２ＡまたはＦ２Ａ配列であり得る。一部の実施形態では、自己切断配列は、Ｔ２Ａ配列以外である、例えば、自己切断配列は、Ｐ２Ａ、Ｅ２ＡまたはＦ２Ａ配列である。

【0204】

本開示は、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）重鎖リーダー配列、（ｉｉ）抗体重鎖可変領域、（ｉｉｉ）抗体重鎖定常領域、（ｉｖ）必要に応じたヒンジ領域、（ｖ）膜貫通領域、（ｖｉ）細胞内領域、（ｖｉｉ）自己切断配列、（ｖｉｉｉ）軽鎖リーダー配列、（ｉｘ）抗体軽鎖可変領域、および（ｘ）抗体軽鎖定常領域を含む前駆体ポリペプチドを提供する（図３ＡおよびＢ）。非限定的な例では、細胞内領域は、４－１ＢＢ、ＣＤ３ゼータおよび／またはＣＤ２８の少なくとも２つの任意の組合せを含む（図３ＡおよびＢ）。当業者は、他の細胞内共刺激および／またはシグナル伝達配列の組合せが可能であることを理解するだろう。自己切断配列は、リボソームスキッピング、および２つの別々のポリペプチドを生じるタンパク質翻訳の再開を促進するアミノ酸配列である。一実施形態では、前駆体ポリペプチドの集団は、自己切断配列で切断されたか、または切断されていないポリペプチドの混合物、ならびに／あるいは重鎖および／もしくは軽鎖リーダー配列で切断されたか、または切断されていないポリペプチドの混合物を含む。

【0205】

本開示は、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）軽鎖リーダー配列、（ｉｉ）抗体軽鎖可変領域、（ｉｉｉ）抗体軽鎖定常領域、（ｉｖ）必要に応じたヒンジ領域、（ｖ）膜貫通領域、（ｖｉ）細胞内領域、（ｖｉｉ）自己切断配列、（ｖｉｉｉ）重鎖リーダー配列、（ｉｘ）抗体重鎖可変領域、および（ｘ）抗体重鎖定常領域を含む前駆体ポリペプチドを提供する（図４ＡおよびＢ）。非限定的な例では、細胞内領域は、４－１ＢＢ、ＣＤ３ゼータおよび／またはＣＤ２８の少なくとも２つの任意の組合せを含む（図４ＡおよびＢ）。当業者は、他の細胞内共刺激および／またはシグナル伝達配列の組合せが可能であることを理解するだろう。自己切断配列は、リボソームスキッピング、および２つの別々のポリペプチドを生じるタンパク質翻訳の再開を促進するアミノ酸配列である。一実施形態では、前駆体ポリペプチドの集団は、自己切断配列で切断されたか、または切断されていないポリペプチドの混合物、ならびに／あるいは重鎖および／もしくは軽鎖リーダー配列で切断されたか、または切断されていないポリペプチドの混合物を含む。

【0206】

一実施形態では、図３ＡおよびＢならびに図４ＡおよびＢに示される前駆体ポリペプチドについて、重鎖および軽鎖リーダー配列は、細胞の分泌経路へポリペプチド鎖（例えば、第１および第２のポリペプチド鎖）を標的化し、細胞膜の脂質二重層へのポリペプチドの組み込みおよび繋留を可能にする、ペプチドシグナル配列を含む。重鎖および軽鎖リーダー配列は、宿主細胞の細胞質から小胞体への前駆体ポリペプチドの輸送を指示することができる。重鎖および軽鎖リーダー配列は、小胞体から細胞膜の脂質二重層への前駆体ポリペプチドの輸送を指示することができる。重鎖および軽鎖リーダー配列は、ＣＤ８α、ＣＤ２８またはＣＤ１６リーダー配列を含むシグナル配列を含む。

【0207】

一実施形態では、図３ＡおよびＢならびに図４ＡおよびＢに示される前駆体ポリペプチドについて、前駆体ポリペプチドのＮ末端は、第１のペプチドシグナル配列（例えば、重鎖または軽鎖リーダー配列）を含む。

【0208】

一実施形態では、図３ＡおよびＢならびに図４ＡおよびＢに示される前駆体ポリペプチドについて、前駆体ポリペプチドは、切断配列の後に位置する第２のペプチドシグナル配列（例えば、重鎖または軽鎖リーダー配列）を含むことができる。

【0209】

一実施形態では、前駆体ポリペプチドは、切断配列で切断され得、それによって、それらのＮ末端にペプチドシグナル配列をそれぞれ有する第１および第２のポリペプチド鎖を生じさせることができる。

【0210】

一実施形態では、図３ＡおよびＢならびに図４ＡおよびＢに示される前駆体ポリペプチドについて、前駆体ポリペプチドのプロセシングは、前駆体を第１および第２のポリペプチド鎖に切断すること、前駆体を分泌させること、および／または前駆体を細胞膜に繋留することを含む。

【0211】

一実施形態では、図３ＡおよびＢならびに図４ＡおよびＢに示される前駆体ポリペプチドについて、前駆体ポリペプチド鎖が切断されて、第１および第２のポリペプチド鎖が生じた後、抗体重鎖定常領域（ＣＨ）（ポリペプチド鎖の一方のもの）および抗体軽鎖定常領域（ＣＬ）（他方のポリペプチド鎖のもの）は、二量体化して、二量体化ドメインを形成することができる。一実施形態では、抗体重鎖定常領域および抗体軽鎖定常領域は、１つまたは２つのジスルフィド結合を介して二量体化する（例えば、図１ＡおよびＢならびに２ＡおよびＢを参照されたい）。

【0212】

一実施形態では、図３ＡおよびＢならびに図４ＡおよびＢに示される前駆体ポリペプチドについて、前駆体ポリペプチド鎖が切断されて、第１および第２のポリペプチド鎖が生じた後、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）（ポリペプチド鎖の一方のもの）および抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）（他方のポリペプチド鎖のもの）は、互いと会合して、抗原結合ドメインを形成する。例えば、抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域は、抗体重鎖定常領域および抗体軽鎖定常領域が二量体化する時に、互いと会合する（例えば、図１ＡおよびＢならびに２ＡおよびＢを参照されたい）。

【0213】

一実施形態では、図３ＡおよびＢならびに図４ＡおよびＢに示される前駆体ポリペプチドについて、抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域から形成される抗原結合ドメインは、標的抗原と結合する。

【0214】

一実施形態では、図３ＡおよびＢならびに図４ＡおよびＢに示される前駆体ポリペプチドについて、抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域は、完全ヒト、ヒト化またはキメラである抗体領域を含む。

【0215】

一実施形態では、図３ＡおよびＢならびに図４ＡおよびＢに示される前駆体ポリペプチドについて、ヒンジ領域は、約１０～約１００アミノ酸長である。一実施形態では、ヒンジ領域は、抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥまたはＩｇＤ）由来のヒンジ領域またはその断片を含む。一実施形態では、ヒンジ領域は、ＣＤ８（例えば、ＣＤ８α）もしくはＣＤ２８ヒンジ領域、またはそれらの断片を含む。一実施形態では、ヒンジ領域は、ＣＰＰＣまたはＳＰＰＣアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ヒンジ領域は、ＣＤ８およびＣＤ２８ヒンジ配列の両方（例えば、長いヒンジ領域）、ＣＤ８配列のみ（短いヒンジ）またはＣＤ２８ヒンジ配列のみ（例えば、短いヒンジ領域）を含む。一実施形態では、前駆体ポリペプチドは、ヒンジ領域が欠如している。

【0216】

一実施形態では、図３ＡおよびＢならびに図４ＡおよびＢに示される前駆体ポリペプチドについて、前駆体ポリペプチド鎖の膜貫通領域は、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲζ、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ６４、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ９、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＬＦＡ－１ Ｔ細胞共受容体、ＣＤ２ Ｔ細胞共受容体／接着分子、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ１５４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳおよびＦＧＦＲ２Ｂに由来し得る。

【0217】

一実施形態では、図３ＡおよびＢならびに図４ＡおよびＢに示される前駆体ポリペプチドについて、第１のポリペプチドの細胞内領域は、４－１ＢＢ、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＧＩＴＲ（ＴＮＦＲＳＦ１８）、ＤＲ３（ＴＮＦＲＳＦ２５）、ＴＮＦＲ２および／またはＣＤ２２６を含む２～５つの細胞内配列の任意の順序および任意の組合せの、細胞内シグナル伝達および／または細胞内共刺激配列を含む。一実施形態では、細胞内領域は、ＣＤ２８、４－１ＢＢおよび／またはＣＤ３ゼータのいずれか１つまたはそれらのうちの２つもしくはそれよりも多くの任意の組合せ由来の配列を含む。一実施形態では、細胞内領域は、ＣＤ２８およびＣＤ３ゼータ細胞内配列、または４－１ＢＢおよびＣＤ３ゼータ細胞内配列を含む。一実施形態では、細胞内領域のＣＤ３ゼータ部分は、ＩＴＡＭ（免疫受容活性化チロシンモチーフ）モチーフ１、２および３を含む（例えば、長いＣＤ３ゼータ）。一実施形態では、細胞内領域のＣＤ３ゼータ部分は、ＩＴＡＭ １、２または３のみなどのＩＴＡＭモチーフ１つのみを含む（例えば、短いＣＤ３ゼータ）。

【0218】

本開示は、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域；（ｉ）配列番号５４または５６のアミノ酸配列を含む重鎖リーダー配列；（ｉｉ）配列番号６、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体重鎖可変領域；（ｉｉｉ）配列番号７または２９のアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体重鎖定常領域；（ｉｖ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤ２８ヒンジ領域、および必要に応じて、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤ８ヒンジ；（ｖ）配列番号３７（ＣＤ２８由来）、配列番号３８（ＣＤ８由来）、配列番号３９（４－１ＢＢ由来）または配列番号４０（ＣＤ３ゼータ由来）のアミノ酸配列を含む膜貫通領域；（ｖｉ）配列番号４１（４－１ＢＢ由来）、配列番号４２（ＣＤ２８由来）、配列番号４３（ＯＸ４０由来）、配列番号４４（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ １、２および３）、配列番号４５（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ １）、配列番号４６（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ ２）および／または配列番号４７（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ ３）からなる群より選択される２つまたはそれよりも多くの細胞内配列のいずれか１つまたは任意の組合せを含む細胞内領域；（ｖｉｉ）配列番号５７、５８、５９または６０のアミノ酸配列のいずれか１つを含む自己切断配列；（ｖｉｉｉ）配列番号５５または５６のアミノ酸配列を含む軽鎖リーダー配列；（ｉｘ）配列番号８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７または３０のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体軽鎖可変領域；ならびに（ｘ）配列番号１１または３１のアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体軽鎖定常領域を含む前駆体ポリペプチドを提供する。一実施形態では、全長前駆体ポリペプチドは、配列番号６３、６６、６９、７２、７５、７８、８１または８４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一実施形態では、前駆体ポリペプチドは、自己切断配列で切断されて、第１および第２のポリペプチド鎖を放出すること、および前駆体を分泌させること、および／または前駆体を細胞膜に繋留することによって、プロセシングされ得る。第１および第２のポリペプチド鎖は、抗体重鎖定常領域および抗体軽鎖定常領域の間の少なくとも１つのジスルフィド結合を介して二量体化することができ、抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域は、ＢＣＭＡ抗原と結合する抗原結合ドメインを形成することができる。一実施形態では、前駆体ポリペプチドは、ヒンジ領域が欠如している。

【0219】

本開示は、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）配列番号５５または５６のアミノ酸配列を含む軽鎖リーダー配列；（ｉｉ）配列番号８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７または３０のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体軽鎖可変領域；（ｉｉｉ）配列番号１１または３１のアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体軽鎖定常領域；（ｉｖ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤ２８ヒンジ領域、および必要に応じて、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤ８ヒンジ；（ｖ）配列番号３７（ＣＤ２８由来）、配列番号３８（ＣＤ８由来）、配列番号３９（４－１ＢＢ由来）または配列番号４０（ＣＤ３ゼータ由来）のアミノ酸配列を含む膜貫通領域；（ｖｉ）配列番号４１（４－１ＢＢ由来）、配列番号４２（ＣＤ２８由来）、配列番号４３（ＯＸ４０由来）、配列番号４４（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ １、２および３）、配列番号４５（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ １）、配列番号４６（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ ２）および／または配列番号４７（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ ３）からなる群より選択される２つまたはそれよりも多くの細胞内配列のいずれか１つまたは任意の組合せを含む細胞内領域；（ｖｉｉ）配列番号５７、５８、５９または６０のアミノ酸配列のいずれか１つを含む自己切断配列；（ｖｉｉｉ）配列番号５４または５６のアミノ酸配列を含む重鎖リーダー配列；（ｉｘ）配列番号６、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体重鎖可変領域；ならびに（ｘ）配列番号７または２９のアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体重鎖定常領域を含む前駆体ポリペプチドを提供する。一実施形態では、前駆体ポリペプチドは、自己切断配列で切断されて、第１および第２のポリペプチド鎖を放出すること、および前駆体を分泌させること、および／または前駆体を細胞膜に繋留することによって、プロセシングされ得る。第１および第２のポリペプチド鎖は、抗体重鎖定常領域および抗体軽鎖定常領域の間の少なくとも１つのジスルフィド結合を介して二量体化することができ、抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域は、ＢＣＭＡ抗原と結合する抗原結合ドメインを形成することができる。一実施形態では、前駆体ポリペプチドは、ヒンジ領域が欠如している。

【0220】

二量体抗原受容体をコードする核酸および関連分子
本開示は、本明細書に記載される、第１のポリペプチド鎖、第２のポリペプチド鎖、第１および第２のポリペプチド鎖、二量体抗原受容体または前駆体ポリペプチドのいずれかをコードする核酸を提供する。自己切断配列を含む前駆体ポリペプチドをコードする本明細書に記載される核酸の実施形態のいずれかでは、自己切断配列は、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２ＡまたはＦ２Ａ配列であり得る。一部の実施形態では、自己切断配列は、Ｔ２Ａ配列以外である、例えば、自己切断配列は、Ｐ２Ａ、Ｅ２ＡまたはＦ２Ａ配列である。

【0221】

本開示は、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）重鎖リーダー領域、（ｉｉ）抗体重鎖可変領域、（ｉｉｉ）抗体重鎖定常領域、（ｉｖ）ヒンジ領域、（ｖ）膜貫通領域、（ｖｉ）２～５つの細胞内配列を有する細胞内領域、（ｖｉｉ）自己切断配列領域、（ｖｉｉｉ）軽鎖リーダー領域、（ｉｘ）抗体軽鎖可変領域（例えば、カッパまたはラムダ）、および（ｘ）抗体軽鎖定常領域を含む前駆体ポリペプチドをコードする核酸を提供する。一実施形態では、核酸は、図３ＡまたはＢに例示される前駆体ポリペプチドをコードする。一実施形態では、前駆体ポリペプチドをコードする核酸は、ヒンジ領域が欠如している。一実施形態では、前駆体ポリペプチドをコードする核酸は、重鎖リーダー領域および／または軽鎖リーダー領域が欠如している。

【0222】

本開示は、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域；（ｉ）配列番号５４または５６のアミノ酸配列を含む重鎖リーダー配列；（ｉｉ）配列番号６、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体重鎖可変領域；（ｉｉｉ）配列番号７または２９のアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体重鎖定常領域；（ｉｖ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤ２８ヒンジ領域、および必要に応じて、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤ８ヒンジ；（ｖ）配列番号３７（ＣＤ２８由来）、配列番号３８（ＣＤ８由来）、配列番号３９（４－１ＢＢ由来）または配列番号４０（ＣＤ３ゼータ由来）のアミノ酸配列を含む膜貫通領域；（ｖｉ）配列番号４１（４－１ＢＢ由来）、配列番号４２（ＣＤ２８由来）、配列番号４３（ＯＸ４０由来）、配列番号４４（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ １、２および３）、配列番号４５（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ １）、配列番号４６（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ ２）および／または配列番号４７（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ ３）からなる群より選択される２つまたはそれよりも多くの細胞内配列のいずれか１つまたは任意の組合せを含む細胞内領域；（ｖｉｉ）配列番号５７、５８、５９または６０のアミノ酸配列のいずれか１つを含む自己切断配列；（ｖｉｉｉ）配列番号５５または５６のアミノ酸配列を含む軽鎖リーダー配列；（ｉｘ）配列番号８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７または３０のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体軽鎖可変領域；ならびに（ｘ）配列番号１１または３１のアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体軽鎖定常領域を含む前駆体ポリペプチドをコードする核酸を提供する。一実施形態では、核酸は、図３ＡまたはＢに例示される前駆体ポリペプチドをコードする。一実施形態では、前駆体ポリペプチドをコードする核酸は、ヒンジ領域が欠如している。一実施形態では、前駆体ポリペプチドをコードする核酸は、重鎖リーダー領域および／または軽鎖リーダー領域が欠如している。

【0223】

本開示は、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）軽鎖リーダー領域、（ｉｉ）抗体軽鎖可変領域（例えば、カッパまたはラムダ）、（ｉｉｉ）抗体軽鎖定常領域、（ｉｖ）ヒンジ領域、（ｖ）膜貫通領域、（ｖｉ）２～５つの細胞内配列を有する細胞内領域、（ｖｉｉ）自己切断配列領域、（ｖｉｉｉ）重鎖リーダー領域、（ｉｘ）抗体重鎖可変領域、および（ｘ）抗体重鎖定常領域を含む前駆体ポリペプチドをコードする核酸を提供する。一実施形態では、核酸は、図４ＡまたはＢに例示される前駆体ポリペプチドをコードする。一実施形態では、前駆体ポリペプチドをコードする核酸は、ヒンジ領域が欠如している。一実施形態では、前駆体ポリペプチドをコードする核酸は、重鎖リーダー領域および／または軽鎖リーダー領域が欠如している。

【0224】

本開示は、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）配列番号５５または５６のアミノ酸配列を含む軽鎖リーダー配列；（ｉｉ）配列番号８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７または３０のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体軽鎖可変領域；（ｉｉｉ）配列番号１１または３１のアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体軽鎖定常領域；（ｉｖ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤ２８ヒンジ領域、および必要に応じて、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤ８ヒンジ；（ｖ）配列番号３７（ＣＤ２８由来）、配列番号３８（ＣＤ８由来）、配列番号３９（４－１ＢＢ由来）または配列番号４０（ＣＤ３ゼータ由来）のアミノ酸配列を含む膜貫通領域；（ｖｉ）配列番号４１（４－１ＢＢ由来）、配列番号４２（ＣＤ２８由来）、配列番号４３（ＯＸ４０由来）、配列番号４４（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ １、２および３）、配列番号４５（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ １）、配列番号４６（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ ２）および／または配列番号４７（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ ３）からなる群より選択される２つまたはそれよりも多くの細胞内配列のいずれか１つまたは任意の組合せを含む細胞内領域；（ｖｉｉ）配列番号５７、５８、５９または６０のアミノ酸配列のいずれか１つを含む自己切断配列；（ｖｉｉｉ）配列番号５４または５６のアミノ酸配列を含む重鎖リーダー配列；（ｉｘ）配列番号６、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体重鎖可変領域；ならびに（ｘ）配列番号７または２９のアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体重鎖定常領域を含む前駆体ポリペプチドをコードする核酸を提供する。一実施形態では、核酸は、図４ＡまたはＢに例示される前駆体ポリペプチドをコードする。一実施形態では、前駆体ポリペプチドをコードする核酸は、ヒンジ領域が欠如している。一実施形態では、前駆体ポリペプチドをコードする核酸は、重鎖リーダー領域および／または軽鎖リーダー領域が欠如している。

【0225】

本開示は、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）重鎖リーダー領域、（ｉｉ）抗体重鎖可変領域、（ｉｉｉ）抗体重鎖定常領域、（ｉｖ）ヒンジ領域、（ｖ）膜貫通領域、および（ｖｉ）細胞内領域を含む第１のポリペプチド鎖をコードする第１の核酸を提供する。一実施形態では、第１の核酸は、重鎖リーダー領域が欠如している第１のポリペプチドをコードする。一実施形態では、第１の核酸は、ヒンジ領域が欠如している第１のポリペプチドをコードする。一実施形態では、第１の核酸は、図１ＡまたはＢに例示される第１のポリペプチド鎖をコードする。

【0226】

本開示は、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）軽鎖リーダー領域、（ｉｉ）抗体軽鎖可変領域（例えば、カッパまたはラムダ）、および（ｉｉｉ）抗体軽鎖定常領域を含む第２のポリペプチド鎖をコードする第２の核酸を提供する。一実施形態では、第２の核酸は、軽鎖リーダー領域が欠如している第２のポリペプチドをコードする。一実施形態では、第２の核酸は、図１ＡまたはＢに例示される第２のポリペプチド鎖をコードする。

【0227】

一実施形態では、核酸は、（ａ）アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）重鎖リーダー配列、（ｉｉ）抗体重鎖可変領域、（ｉｉｉ）抗体重鎖定常領域、（ｉｖ）ヒンジ領域、（ｖ）膜貫通領域、および（ｖｉ）２～５つの細胞内配列を有する細胞内領域を含む第１のポリペプチド鎖；ならびに（ｂ）アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）抗体軽鎖可変領域（例えば、カッパまたはラムダ）、および（ｉｉ）抗体軽鎖定常領域を含む第２のポリペプチド鎖を含む、第１および第２のポリペプチド鎖をコードする。一実施形態では、単一の核酸は、重鎖リーダー領域が欠如している第１のポリペプチドをコードし、および／または単一の核酸は、軽鎖リーダー領域が欠如している第２のポリペプチドをコードする。一実施形態では、単一の核酸は、ヒンジ領域が欠如している第１のポリペプチドをコードする。一実施形態では、単一の核酸は、図１ＡまたはＢに例示される第１および第２のポリペプチド鎖をコードする。

【0228】

本開示は、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）軽鎖リーダー領域、（ｉｉ）抗体軽鎖可変領域（例えば、カッパまたはラムダ）、（ｉｉｉ）抗体軽鎖定常領域、（ｉｖ）ヒンジ領域、（ｖ）膜貫通領域、および（ｖｉ）細胞内領域を含む第１のポリペプチド鎖をコードする第１の核酸を提供する。一実施形態では、第１の核酸は、軽鎖リーダー領域が欠如している第１のポリペプチドをコードする。一実施形態では、第１の核酸は、ヒンジ領域が欠如している第１のポリペプチドをコードする。一実施形態では、第１の核酸は、図２ＡまたはＢに例示される第１のポリペプチド鎖をコードする。

【0229】

本開示は、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）重鎖リーダー領域、（ｉｉ）抗体重鎖可変領域、および（ｉｉｉ）抗体軽鎖定常領域を含む第２のポリペプチド鎖をコードする第２の核酸を提供する。一実施形態では、第２の核酸は、重鎖リーダー領域が欠如している第２のポリペプチドをコードする。一実施形態では、第２の核酸は、図２ＡまたはＢに例示される第２のポリペプチド鎖をコードする。

【0230】

一実施形態では、核酸は、（ａ）アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）軽鎖リーダー配列、（ｉｉ）抗体軽鎖可変領域（例えば、カッパまたはラムダ）、（ｉｉｉ）抗体軽鎖定常領域、（ｉｖ）ヒンジ領域、（ｖ）膜貫通領域、および（ｖｉ）２～５つの細胞内配列を有する細胞内領域を含む第１のポリペプチド鎖；ならびに（ｂ）アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）抗体重鎖可変領域、および（ｉｉ）抗体重鎖定常領域を含む第２のポリペプチド鎖を含む、第１および第２のポリペプチド鎖をコードする。一実施形態では、単一の核酸は、軽鎖リーダー領域が欠如している第１のポリペプチドをコードし、および／または単一の核酸は、重鎖リーダー領域が欠如している第２のポリペプチドをコードする。一実施形態では、単一の核酸は、ヒンジ領域が欠如している第１のポリペプチドをコードする。一実施形態では、単一の核酸は、図２ＡまたはＢに例示される第１および第２のポリペプチド鎖をコードする。

【0231】

本開示は、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）配列番号６、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体重鎖可変領域；（ｉｉ）配列番号７または２９のアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体重鎖定常領域；（ｉｉｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤ２８ヒンジ領域、および必要に応じて、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤ８ヒンジ；（ｉｖ）配列番号３７（ＣＤ２８由来）、配列番号３８（ＣＤ８由来）、配列番号３９（４－１ＢＢ由来）または配列番号４０（ＣＤ３ゼータ由来）のアミノ酸配列を含む膜貫通領域；ならびに（ｖ）配列番号４１（４－１ＢＢ由来）、配列番号４２（ＣＤ２８由来）、配列番号４３（ＯＸ４０由来）、配列番号４４（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ １、２および３）、配列番号４５（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ １）、配列番号４６（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ ２）および／または配列番号４７（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ ３）からなる群より選択される２つまたはそれよりも多くの細胞内配列のいずれか１つまたは任意の組合せ由来のアミノ酸配列を含む細胞内領域を含む第１のポリペプチド鎖をコードする核酸を提供する。一実施形態では、核酸は、配列番号６４、６７、７０、７３、７６、７９、８２または８５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖をコードし、ここで、第１のポリペプチド鎖は、リーダー配列（例えば、配列番号５４または５５）を含むか、またはそれが欠如している。一実施形態では、核酸は、ヒンジ領域が欠如している第１のポリペプチド鎖をコードする。

【0232】

本開示は、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）配列番号６、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体軽鎖可変領域、および（ｉｉ）配列番号８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７または３０のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体軽鎖定常領域を含む第２のポリペプチド鎖をコードする核酸を提供する。一実施形態では、核酸は、配列番号６５、６８、７１、７４、７７、８０、８３または８６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖をコードし、ここで、第２のポリペプチド鎖は、リーダー配列（例えば、配列番号５５または５６）を含むか、またはそれが欠如している。

【0233】

本開示は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）を持つ第１のポリペプチド鎖、ならびに軽鎖可変領域（ＶＬ）（例えば、カッパまたはラムダ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）を持つ第２のポリペプチド鎖を含むバージョン１（例えば、Ｖ１）二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物（例えば、図１Ａ）をコードする核酸であって、（ａ）第１の核酸が、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）抗体重鎖可変領域（ＶＨ）、（ｉｉ）抗体重鎖定常領域（ＣＨ）、（ｉｉｉ）ＣＤ８およびＣＤ２８ヒンジ配列（例えば、配列番号３６）を含む長いヒンジ領域、（ｉｖ）ＣＤ２８膜貫通配列（例えば、配列番号３７）を含む膜貫通領域（ＴＭ）、ならびに（ｖ）ＣＤ２８共刺激配列（例えば、配列番号４２）ならびにＩＴＡＭモチーフ１、２および３を有するＣＤ３ゼータシグナル伝達配列（例えば、配列番号４４）を含む細胞内領域を含む第１のポリペプチド鎖をコードし；（ｂ）第２の核酸が、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）（例えば、カッパまたはラムダ）、および（ｉｉ）抗体軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む第２のポリペプチド鎖をコードする、核酸を提供する。一実施形態では、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号６、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する抗ＢＣＭＡ重鎖可変領域配列を含む。一実施形態では、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７または３０のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する抗ＢＣＭＡ軽鎖可変領域配列を含む。

【0234】

本開示は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）を持つ第１のポリペプチド鎖、ならびに軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）を持つ第２のポリペプチド鎖を含むバージョン２（例えば、Ｖ２）二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物（例えば、図１ＡまたはＢ）をコードする核酸であって、（ａ）第１の核酸が、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）抗体重鎖可変領域（ＶＨ）、（ｉｉ）抗体重鎖定常領域（ＣＨ）、（ｉｉｉ）ＣＤ２８ヒンジ配列（例えば、配列番号３７）を含む短いヒンジ領域、（ｉｖ）ＣＤ２８膜貫通配列（例えば、配列番号３７）を含む膜貫通領域（ＴＭ）、ならびに（ｖ）（１）４－１ＢＢ共刺激配列（例えば、配列番号４１）ならびにＩＴＡＭモチーフ１、２および３を有するＣＤ３ゼータシグナル伝達配列（例えば、配列番号４４）、または（２）ＣＤ２８共刺激配列（例えば、配列番号４２）ならびにＩＴＡＭモチーフ１、２および３を有するＣＤ３ゼータシグナル伝達配列（例えば、配列番号４４）、または（３）４－１ＢＢ共刺激配列（例えば、配列番号４１）ならびにＣＤ２８共刺激配列（例えば、配列番号４２）ならびにＩＴＡＭモチーフ１、２および３を有するＣＤ３ゼータシグナル伝達配列（例えば、配列番号４４）のいずれかを含む細胞内領域を含む第１のポリペプチド鎖をコードし；（ｂ）第２の核酸が、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）（例えば、カッパまたはラムダ）、および（ｉｉ）抗体軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む第２のポリペプチド鎖をコードする、核酸を提供する。

【0235】

一実施形態では、核酸は、４－１ＢＢ共刺激配列（例えば、配列番号４１）ならびにＩＴＡＭモチーフ１、２および３を有するＣＤ３ゼータシグナル伝達配列（例えば、配列番号４４）を有する細胞内領域を含むバージョン２ａ（Ｖ２ａ）ＤＡＲ構築物をコードする。

【0236】

一実施形態では、核酸は、ＣＤ２８共刺激配列（例えば、配列番号４２）ならびにＩＴＡＭモチーフ１、２および３を有するＣＤ３ゼータシグナル伝達配列（例えば、配列番号４４）を有する細胞内領域を含むバージョン２ｂ（Ｖ２ｂ）ＤＡＲ構築物をコードする。

【0237】

一実施形態では、核酸は、４－１ＢＢ共刺激領域（例えば、配列番号４１）ならびにＣＤ２８共刺激領域（例えば、配列番号４２）ならびにＩＴＡＭモチーフ１、２および３を有するＣＤ３ゼータシグナル伝達配列（例えば、配列番号４４）を有する細胞内領域を含むバージョン２ｃ（Ｖ２ｃ）ＤＡＲ構築物をコードする。一実施形態では、ＤＡＲ Ｖ２ａおよびＶ２ｂは、第二世代のＤＡＲ構築物であるが、ＤＡＲ Ｖ２ｃは、第三世代のＤＡＲ構築物である。一実施形態では、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号６、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する抗ＢＣＭＡ重鎖可変領域配列を含む。一実施形態では、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７または３０のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する抗ＢＣＭＡ軽鎖可変領域配列を含む。

【0238】

本開示は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）を持つ第１のポリペプチド鎖、ならびに軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）を持つ第２のポリペプチド鎖を含むバージョン３ａ（例えば、Ｖ３ａ）二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物（例えば、図１Ａ）をコードする核酸であって、（ａ）第１の核酸が、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）抗体重鎖可変領域（ＶＨ）、（ｉｉ）抗体重鎖定常領域（ＣＨ）、（ｉｉｉ）ＣＤ２８ヒンジ配列（例えば、配列番号３５）を含む短いヒンジ領域、（ｉｖ）ＣＤ２８膜貫通配列（例えば、配列番号３７）を含む膜貫通領域（ＴＭ）、ならびに（ｖ）（１）４－１ＢＢ共刺激配列（例えば、配列番号４１）およびＩＴＡＭモチーフ３を有するＣＤ３ゼータシグナル伝達配列（例えば、配列番号４７）、または（２）ＣＤ２８（例えば、配列番号４２）シグナル伝達配列およびＩＴＡＭモチーフ３を有するＣＤ３ゼータ（例えば、配列番号４７）、または（３）４－１ＢＢ（例えば、配列番号４１）シグナル伝達配列およびＣＤ２８（例えば、配列番号４２）シグナル伝達配列およびＩＴＡＭモチーフ３を有するＣＤ３ゼータ（例えば、配列番号４７）のいずれかを含む細胞内領域を含む第１のポリペプチド鎖をコードし；（ｂ）第２の核酸が、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）（例えば、カッパまたはラムダ）、および（ｉｉ）抗体軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む第２のポリペプチド鎖をコードする、核酸を提供する。一実施形態では、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号６、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する抗ＢＣＭＡ重鎖可変領域配列を含む。一実施形態では、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７または３０のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する抗ＢＣＭＡ軽鎖可変領域配列を含む。

【0239】

一実施形態では、核酸は、４－１ＢＢ共刺激配列（例えば、配列番号４１）およびＩＴＡＭモチーフ３を有するＣＤ３ゼータ（例えば、配列番号４７）を有する細胞内領域を含むバージョン３ａ（Ｖ３ａ）ＤＡＲ構築物をコードする。

【0240】

一実施形態では、核酸は、ＣＤ２８（例えば、配列番号４２）シグナル伝達配列およびＩＴＡＭモチーフ３を有するＣＤ３ゼータ（例えば、配列番号４７）を有する細胞内領域を含むバージョン３ｂ（Ｖ３ｂ）ＤＡＲ構築物をコードする。

【0241】

一実施形態では、核酸は、４－１ＢＢ（例えば、配列番号４１）シグナル伝達配列およびＣＤ２８（例えば、配列番号４２）シグナル伝達配列およびＩＴＡＭモチーフ３を有するＣＤ３ゼータ（例えば、配列番号４７）を有する細胞内領域を含むバージョン３ｃ（Ｖ３ｃ）ＤＡＲ構築物をコードする。

【0242】

一実施形態では、ＤＡＲ Ｖ３ａおよびＶ３ｂは、第二世代のＤＡＲ構築物であるが、ＤＡＲ Ｖ３ｃは、第三世代のＤＡＲ構築物である。

【0243】

一実施形態では、ＤＡＲ Ｖ３ａ、Ｖ３ｂおよびＶ３ｃ構築物において、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号６、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡ重鎖可変領域を含み、抗体軽鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７または３０のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡ軽鎖可変領域配列を含む。

【0244】

本開示は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）を持つ第１のポリペプチド鎖、ならびに軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）を持つ第２のポリペプチド鎖を含むバージョン４（例えば、Ｖ４）二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物（例えば、図１Ａであるがヒンジを欠く）をコードする核酸であって、（ａ）第１の核酸が、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）抗体重鎖可変領域（ＶＨ）、（ｉｉ）抗体重鎖定常領域（ＣＨ）、（ｉｉｉ）ＣＤ２８膜貫通配列（例えば、配列番号３７）を含む膜貫通領域（ＴＭ）、ならびに（ｉｖ）４－１ＢＢ共刺激配列（例えば、配列番号４１）およびＩＴＡＭモチーフ３を有するＣＤ３ゼータシグナル伝達配列（例えば、配列番号４７）を含む細胞内領域を含む第１のポリペプチド鎖をコードし；（ｂ）第２の核酸が、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）（例えば、カッパまたはラムダ）、および（ｉｉ）抗体軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む第２のポリペプチド鎖をコードする、核酸を提供する。ＤＡＲ Ｖ４構築物は、ヒンジ配列が欠如している。一実施形態では、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号６、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する抗ＢＣＭＡ重鎖可変領域配列を含む。一実施形態では、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７または３０のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する抗ＢＣＭＡ軽鎖可変領域配列を含む。

【0245】

ベクター
本開示は、本明細書に記載される、前駆体ポリペプチド、第１のポリペプチド鎖、第２のポリペプチド鎖、または第１および第２のポリペプチド鎖のいずれかをコードする１つまたは複数の核酸に作動可能に連結されたベクターを提供する。

【0246】

本開示は、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）重鎖リーダー領域、（ｉｉ）抗体重鎖可変領域、（ｉｉｉ）抗体重鎖定常領域、（ｉｖ）ヒンジ領域、（ｖ）膜貫通領域、（ｖｉ）２～５つの細胞内配列を有する細胞内領域、（ｖｉｉ）自己切断配列領域、（ｖｉｉｉ）軽鎖リーダー領域、（ｉｘ）抗体軽鎖可変領域、および（ｘ）抗体軽鎖定常領域を含む前駆体ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたベクターを提供する。一実施形態では、前駆体ポリペプチドは、ヒンジ領域が欠如している。一実施形態では、前駆体ポリペプチドは、重鎖リーダー領域および／または軽鎖リーダー領域が欠如している。一実施形態では、前駆体ポリペプチドは、図３ＡまたはＢに例示される。

【0247】

本開示は、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域；（ｉ）配列番号５４または５６のアミノ酸配列を含む重鎖リーダー配列；（ｉｉ）配列番号６、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体重鎖可変領域；（ｉｉｉ）配列番号７または２９のアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体重鎖定常領域；（ｉｖ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤ２８ヒンジ領域、および必要に応じて、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤ８ヒンジ；（ｖ）配列番号３７（ＣＤ２８由来）、配列番号３８（ＣＤ８由来）、配列番号３９（４－１ＢＢ由来）または配列番号４０（ＣＤ３ゼータ由来）のアミノ酸配列を含む膜貫通領域；（ｖｉ）配列番号４１（４－１ＢＢ由来）、配列番号４２（ＣＤ２８由来）、配列番号４３（ＯＸ４０由来）、配列番号４４（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ １、２および３）、配列番号４５（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ １）、配列番号４６（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ ２）および／または配列番号４７（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ ３）からなる群より選択される２つまたはそれよりも多くの細胞内配列のいずれか１つまたは任意の組合せを含む細胞内領域；（ｖｉｉ）配列番号５７、５８、５９または６０のアミノ酸配列のいずれか１つを含む自己切断配列；（ｖｉｉｉ）配列番号５５または５６のアミノ酸配列を含む軽鎖リーダー配列；（ｉｘ）配列番号８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７または３０のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体軽鎖可変領域；ならびに（ｘ）配列番号１１または３１のアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体軽鎖定常領域を含む前駆体ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたベクターを提供する。一実施形態では、核酸は、図３ＡまたはＢに例示される前駆体ポリペプチドをコードする。一実施形態では、前駆体ポリペプチドをコードする核酸は、ヒンジ領域が欠如している。一実施形態では、前駆体ポリペプチドをコードする核酸は、重鎖リーダー領域および／または軽鎖リーダー領域が欠如している。

【0248】

本開示は、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）軽鎖リーダー領域、（ｉｉ）抗体軽鎖可変領域、（ｉｉｉ）抗体軽鎖定常領域、（ｉｖ）ヒンジ領域、（ｖ）膜貫通領域、（ｖｉ）２～５つの細胞内配列を有する細胞内領域、（ｖｉｉ）自己切断配列領域、（ｖｉｉｉ）重鎖リーダー領域、（ｉｘ）抗体重鎖可変領域、および（ｘ）抗体重鎖定常領域を含む前駆体ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたベクターを提供する。一実施形態では、前駆体ポリペプチドは、ヒンジ領域が欠如している。一実施形態では、前駆体ポリペプチドは、重鎖リーダー領域および／または軽鎖リーダー領域が欠如している。一実施形態では、前駆体ポリペプチドは、図４ＡまたはＢに例示される。

【0249】

本開示は、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）配列番号５５または５６のアミノ酸配列を含む軽鎖リーダー配列；（ｉｉ）配列番号８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７または３０のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体軽鎖可変領域；（ｉｉｉ）配列番号１１または３１のアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体軽鎖定常領域；（ｉｖ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤ２８ヒンジ領域、および必要に応じて、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤ８ヒンジ；（ｖ）配列番号３７（ＣＤ２８由来）、配列番号３８（ＣＤ８由来）、配列番号３９（４－１ＢＢ由来）または配列番号４０（ＣＤ３ゼータ由来）のアミノ酸配列を含む膜貫通領域；（ｖｉ）配列番号４１（４－１ＢＢ由来）、配列番号４２（ＣＤ２８由来）、配列番号４３（ＯＸ４０由来）、配列番号４４（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ １、２および３）、配列番号４５（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ １）、配列番号４６（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ ２）および／または配列番号４７（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ ３）からなる群より選択される２つまたはそれよりも多くの細胞内配列のいずれか１つまたは任意の組合せを含む細胞内領域；（ｖｉｉ）配列番号５７、５８、５９または６０のアミノ酸配列のいずれか１つを含む自己切断配列；（ｖｉｉｉ）配列番号５４または５６のアミノ酸配列を含む重鎖リーダー配列；（ｉｘ）配列番号６、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体重鎖可変領域；ならびに（ｘ）配列番号７または２９のアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体重鎖定常領域を含む前駆体ポリペプチドをコードする核酸を提供する。一実施形態では、核酸は、図４ＡまたはＢに例示される前駆体ポリペプチドをコードする。一実施形態では、前駆体ポリペプチドをコードする核酸は、ヒンジ領域が欠如している。一実施形態では、前駆体ポリペプチドをコードする核酸は、重鎖リーダー領域および／または軽鎖リーダー領域が欠如している。

【0250】

本開示は、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）重鎖リーダー領域、（ｉｉ）抗体重鎖可変領域、（ｉｉｉ）抗体重鎖定常領域、（ｉｖ）ヒンジ領域、（ｖ）膜貫通領域、および（ｖｉ）細胞内領域を含む第１のポリペプチド鎖をコードする第１の核酸に作動可能に連結された第１のベクターを提供する。一実施形態では、第１のベクターは、重鎖リーダー領域が欠如している、および／またはヒンジ領域が欠如している、第１のポリペプチド鎖をコードする第１の核酸に作動可能に連結されている。一実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、図１ＡまたはＢに例示される。

【0251】

一実施形態では、第１のベクターは、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含む重鎖リーダー配列；（ｉｉ）配列番号６、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体重鎖可変領域；（ｉｉｉ）配列番号７または２９のアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体重鎖定常領域；（ｉｖ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤ２８ヒンジ領域、および必要に応じて、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤ８ヒンジ；（ｖ）配列番号３７（ＣＤ２８由来）、配列番号３８（ＣＤ８由来）、配列番号３９（４－１ＢＢ由来）または配列番号４０（ＣＤ３ゼータ由来）のアミノ酸配列を含む膜貫通領域；（ｖｉ）配列番号４１（４－１ＢＢ由来）、配列番号４２（ＣＤ２８由来）、配列番号４３（ＯＸ４０由来）、配列番号４４（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ １、２および３）、配列番号４５（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ １）、配列番号４６（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ ２）および／または配列番号４７（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ ３）からなる群より選択される２つまたはそれよりも多くの細胞内配列のいずれか１つまたは任意の組合せを含む細胞内領域を含む第１のポリペプチド鎖をコードする第１の核酸に作動可能に連結されている。一実施形態では、第１のベクターは、重鎖リーダー領域が欠如している、および／またはヒンジ領域が欠如している、第１のポリペプチド鎖をコードする第１の核酸に作動可能に連結されている。一実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、図１ＡまたはＢに例示される。

【0252】

本開示は、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）軽鎖リーダー領域、（ｉｉ）抗体軽鎖可変領域、および（ｉｉｉ）抗体軽鎖定常領域を含む第２のポリペプチド鎖をコードする第２の核酸に作動可能に連結された第２のベクターを提供する。一実施形態では、第２のベクターは、軽鎖リーダー領域が欠如している第２のポリペプチド鎖をコードする第２の核酸に作動可能に連結されている。一実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、図１ＡまたはＢに例示される。

【0253】

一実施形態では、第２のベクターは、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）配列番号５５のアミノ酸配列を含む軽鎖リーダー配列；（ｉｉ）配列番号８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７または３０のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体軽鎖可変領域；および（ｉｉｉ）配列番号１１または３１のアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体軽鎖定常領域を含む第２のポリペプチド鎖をコードする第２の核酸に作動可能に連結されている。一実施形態では、第２のベクターは、軽鎖リーダー領域が欠如している第２のポリペプチド鎖をコードする第２の核酸に作動可能に連結されている。一実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、図１ＡまたはＢに例示される。

【0254】

本開示は、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）軽鎖リーダー領域、（ｉｉ）抗体軽鎖可変領域、（ｉｉｉ）抗体軽鎖定常領域、（ｉｖ）ヒンジ領域、（ｖ）膜貫通領域、および（ｖｉ）細胞内領域を含む第１のポリペプチド鎖をコードする第１の核酸に作動可能に連結された第１のベクターを提供する。一実施形態では、第１のベクターは、重鎖リーダー領域が欠如している、および／またはヒンジ領域が欠如している、第１のポリペプチド鎖をコードする第１の核酸に作動可能に連結されている。一実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、図２ＡまたはＢに例示される。

【0255】

本開示は、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）配列番号５５のアミノ酸配列を含む軽鎖リーダー配列；（ｉｉ）配列番号８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７または３０のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体軽鎖可変領域；（ｉｉｉ）配列番号１１または３１のアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体軽鎖定常領域；（ｉｖ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤ２８ヒンジ領域、および必要に応じて、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤ８ヒンジ；（ｖ）配列番号３７（ＣＤ２８由来）、配列番号３８（ＣＤ８由来）、配列番号３９（４－１ＢＢ由来）または配列番号４０（ＣＤ３ゼータ由来）のアミノ酸配列を含む膜貫通領域；（ｖｉ）配列番号４１（４－１ＢＢ由来）、配列番号４２（ＣＤ２８由来）、配列番号４３（ＯＸ４０由来）、配列番号４４（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ １、２および３）、配列番号４５（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ １）、配列番号４６（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ ２）および／または配列番号４７（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ ３）からなる群より選択される２つまたはそれよりも多くの細胞内配列のいずれか１つまたは任意の組合せを含む細胞内領域を含む第１のポリペプチド鎖をコードする第１の核酸に作動可能に連結された第１のベクターを提供する。一実施形態では、第１のベクターは、軽鎖リーダー領域が欠如している、および／またはヒンジ領域が欠如している、第１のポリペプチド鎖をコードする第１の核酸に作動可能に連結されている。一実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、図２ＡまたはＢに例示される。

【0256】

本開示は、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）重鎖リーダー領域、（ｉｉ）抗体重鎖可変領域、および（ｉｉｉ）抗体軽鎖定常領域を含む第２のポリペプチド鎖をコードする第２の核酸に作動可能に連結された第２のベクターを提供する。一実施形態では、第２のベクターは、重鎖リーダー領域が欠如している第２のポリペプチド鎖をコードする第２の核酸に作動可能に連結されている。一実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、図２ＡまたはＢに例示される。

【0257】

本開示は、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含む重鎖リーダー配列；（ｉｉ）配列番号６、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体重鎖可変領域；および（ｉｉｉ）配列番号７または２９のアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体重鎖定常領域を含む第２のポリペプチド鎖をコードする第２の核酸に作動可能に連結された第２のベクターを提供する。一実施形態では、第２のベクターは、重鎖リーダー領域が欠如している第２のポリペプチド鎖をコードする第２の核酸に作動可能に連結されている。一実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、図２ＡまたはＢに例示される。

【0258】

本開示は、第１および第２のポリペプチド鎖をコードする核酸に作動可能に連結されたベクターであって、（ａ）第１の核酸が、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）重鎖リーダー配列、（ｉｉ）抗体重鎖可変領域、（ｉｉｉ）抗体重鎖定常領域、（ｉｖ）ヒンジ領域、（ｖ）膜貫通領域、および（ｖｉ）２～５つの細胞内配列を有する細胞内領域を含む第１のポリペプチド鎖をコードし；（ｂ）第２の核酸が、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）抗体軽鎖可変領域、および（ｉｉ）抗体軽鎖定常領域を含む第２のポリペプチド鎖をコードする、ベクターを提供する。一実施形態では、第１の核酸は、重鎖リーダー領域が欠如している、および／またはヒンジ領域が欠如している、第１のポリペプチド鎖をコードする。一実施形態では、第２の核酸は、軽鎖リーダー領域が欠如している第２のポリペプチド鎖をコードする。一実施形態では、第１および第２のポリペプチド鎖は、図１ＡまたはＢに例示される。

【0259】

本開示は、第１および第２のポリペプチド鎖をコードする核酸に作動可能に連結されたベクターであって、（ａ）第１の核酸が、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域；（ｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含む重鎖リーダー配列；（ｉｉ）配列番号６、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体重鎖可変領域；（ｉｉｉ）配列番号７または２９のアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体重鎖定常領域；（ｉｖ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤ２８ヒンジ領域、および必要に応じて、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤ８ヒンジ；（ｖ）配列番号３７（ＣＤ２８由来）、配列番号３８（ＣＤ８由来）、配列番号３９（４－１ＢＢ由来）または配列番号４０（ＣＤ３ゼータ由来）のアミノ酸配列を含む膜貫通領域；（ｖｉ）配列番号４１（４－１ＢＢ由来）、配列番号４２（ＣＤ２８由来）、配列番号４３（ＯＸ４０由来）、配列番号４４（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ １、２および３）、配列番号４５（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ １）、配列番号４６（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ ２）および／または配列番号４７（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ ３）からなる群より選択される２つまたはそれよりも多くの細胞内配列のいずれか１つまたは任意の組合せを含む細胞内領域を含む第１のポリペプチドをコードし；（ｂ）第２の核酸が、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）配列番号５５のアミノ酸配列を含む軽鎖リーダー配列；（ｉｉ）配列番号８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７または３０のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体軽鎖可変領域；および（ｉｉｉ）配列番号１１または３１のアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体軽鎖定常領域を含む第２のポリペプチドをコードする、ベクターを提供する。一実施形態では、第１の核酸は、重鎖リーダー領域が欠如している、および／またはヒンジ領域が欠如している、第１のポリペプチド鎖をコードする。一実施形態では、第２の核酸は、軽鎖リーダー領域が欠如している第２のポリペプチド鎖をコードする。一実施形態では、第１および第２のポリペプチド鎖は、図１ＡまたはＢに例示される。

【0260】

本開示は、第１および第２のポリペプチド鎖をコードする核酸に作動可能に連結されたベクターであって、（ａ）第１の核酸が、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）軽鎖リーダー配列、（ｉｉ）抗体軽鎖可変領域、（ｉｉｉ）抗体軽鎖定常領域、（ｉｖ）ヒンジ領域、（ｖ）膜貫通領域、および（ｖｉ）２～５つの細胞内配列を有する細胞内領域を含む第１のポリペプチド鎖をコードし；（ｂ）第２の核酸が、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）抗体重鎖可変領域、および（ｉｉ）抗体重鎖定常領域を含む第２のポリペプチド鎖をコードする、ベクターを提供する。一実施形態では、第１の核酸は、軽鎖リーダー領域が欠如している、および／またはヒンジ領域が欠如している、第１のポリペプチド鎖をコードする。一実施形態では、第２の核酸は、重鎖リーダー領域が欠如している第２のポリペプチド鎖をコードする。一実施形態では、第１および第２のポリペプチド鎖は、図２ＡまたはＢに例示される。

【0261】

本開示は、第１および第２のポリペプチド鎖をコードする核酸に作動可能に連結されたベクターであって、（ａ）第１の核酸が、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域；（ｉ）配列番号５５のアミノ酸配列を含む軽鎖リーダー配列；（ｉｉ）配列番号８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７または３０のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体軽鎖可変領域；（ｉｉｉ）配列番号１１または３１のアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体軽鎖定常領域；（ｉｖ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤ２８ヒンジ領域、および必要に応じて、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤ８ヒンジ；（ｖ）配列番号３７（ＣＤ２８由来）、配列番号３８（ＣＤ８由来）、配列番号３９（４－１ＢＢ由来）または配列番号４０（ＣＤ３ゼータ由来）のアミノ酸配列を含む膜貫通領域；（ｖｉ）配列番号４１（４－１ＢＢ由来）、配列番号４２（ＣＤ２８由来）、配列番号４３（ＯＸ４０由来）、配列番号４４（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ １、２および３）、配列番号４５（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ １）、配列番号４６（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ ２）および／または配列番号４７（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ ３）からなる群より選択される２つまたはそれよりも多くの細胞内配列のいずれか１つまたは任意の組合せを含む細胞内領域を含む第１のポリペプチドをコードし；（ｂ）第２の核酸が、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含む重鎖リーダー配列；（ｉｉ）配列番号６、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体重鎖可変領域；および（ｉｉｉ）配列番号７または２９のアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ抗体重鎖定常領域を含む第２のポリペプチドをコードする、ベクターを提供する。一実施形態では、第１の核酸は、軽鎖リーダー領域が欠如している、および／またはヒンジ領域が欠如している、第１のポリペプチド鎖をコードする。一実施形態では、第２の核酸は、重鎖リーダー領域が欠如している第２のポリペプチド鎖をコードする。一実施形態では、第１および第２のポリペプチド鎖は、図２ＡまたはＢに例示される。

【0262】

宿主細胞
本開示は、宿主細胞または宿主細胞の集団であって、本明細書に記載される、第１のポリペプチド鎖、第２のポリペプチド鎖、第１および第２のポリペプチド鎖、二量体抗原受容体、または前駆体ポリペプチドのいずれかをコードする核酸導入遺伝子に作動可能に連結された１つまたは複数の発現ベクターを有する、宿主細胞または宿主細胞の集団を提供する。

【0263】

一実施形態では、宿主細胞または宿主細胞の集団は、１つまたは複数の発現ベクターで導入され、ここで、ベクターは、本明細書に記載される二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物のいずれかをコードする核酸導入遺伝子に作動可能に連結されている。宿主細胞または宿主細胞の集団は、Ｔリンパ球（例えば、Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞、ガンマ－デルタＴ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞）、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞、マクロファージ、樹状細胞、肥満細胞、好酸球、Ｂリンパ球、単球を含む。一実施形態では、ＮＫ細胞は、臍帯血由来ＮＫ細胞または胎盤由来ＮＫ細胞を含む。

【0264】

一実施形態では、宿主細胞または宿主細胞の集団は、自己であり、二量体抗原受容体（ＤＡＲ）を発現する宿主細胞の処置を受ける被験体（例えば、レシピエント被験体）に由来する。一実施形態では、血液（例えば、全血）は、レシピエント被験体から得ることができ、所望の細胞（例えば、Ｔ細胞）は、レシピエント被験体の血液から回収／富化することができ、自己トランスジェニック細胞は、本明細書に記載される二量体抗原受容体のいずれかをコードする核酸に作動可能に連結された１つまたは複数の発現ベクターを所望の細胞に導入することによって、調製することができる。二量体抗原受容体構築物を発現する自己トランスジェニックＴ細胞をレシピエント被験体に投与することで、被験体における移植片対宿主病を大いに低減することができる。

【0265】

一実施形態では、被験体を処置するために使用される宿主細胞または宿主細胞の集団は、同種異系であり、異なる被験体（例えば、ドナー被験体）または複数のドナー被験体に由来する。一実施形態では、ドナー被験体は、二量体抗原受容体（ＤＡＲ）を発現する宿主細胞の処置を受けない。一実施形態では、同種異系宿主細胞は、二量体抗原受容体（ＤＡＲ）を発現する宿主細胞の処置を受けない同一の双子のドナーに由来する同系宿主細胞を含む。同種異系細胞は、自己細胞のために用いられる同様の方法で、少なくとも１人のドナー由来の血液（例えば、全血）から得ることができる。一実施形態では、血液（例えば、全血）は、少なくとも１人のドナーから得ることができ、所望の細胞は、ドナーの（または複数のドナーの）血液から回収／富化することができ、同種異系トランスジェニック細胞は、本明細書に記載される二量体抗原受容体のいずれかをコードする核酸に作動可能に連結された１つまたは複数の発現ベクターをドナーの（または複数のドナーの）所望の細胞に導入することによって、調製することができる。二量体抗原受容体構築物を発現する同種異系トランスジェニックＴ細胞を被験体に投与することで、被験体における移植片対宿主病をもたらすことができる。

【0266】

一実施形態では、被験体の血液からまたはドナーの血液から回収される所望の細胞としては、Ｔリンパ球（例えば、Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞、ガンマ－デルタＴ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞）、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞、マクロファージ、樹状細胞、肥満細胞、好酸球、Ｂリンパ球、単球が挙げられる。一実施形態では、ＮＫ細胞は、臍帯血由来ＮＫ細胞または胎盤由来ＮＫ細胞を含む。

【0267】

一実施形態では、宿主細胞または宿主細胞の集団は、導入遺伝子の宿主細胞への一過性の導入または導入遺伝子の宿主細胞のゲノムへの安定な挿入を指示することができる、１つまたは複数の発現ベクターを有し、ここで、導入遺伝子は、本明細書に記載される二量体抗原受容体のいずれかをコードする核酸を含む。発現ベクターは、宿主細胞中での導入遺伝子の転写および／または翻訳を指示することができる。発現ベクターは、誘導性プロモーターおよび／または構成的プロモーターならびにエンハンサーなどの１つまたは複数の調節配列を含むことができる。発現ベクターは、リボソーム結合部位および／またはポリアデニル化部位を含むことができる。一実施形態では、二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物をコードする核酸に作動可能に連結された発現ベクターは、トランスジェニック宿主細胞の表面上で提示され得る二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物の産生を指示することができ、または二量体抗原受容体は、細胞培養培地に分泌され得る。一実施形態では、宿主細胞は、二量体抗原受容体のいずれかをコードする核酸導入遺伝子に作動可能に連結された１つまたは複数の発現ベクターを有することができ、宿主細胞は、二量体抗原受容体構築物を一過性または安定に発現させるのに適切な培養培地中で培養することができる。

【0268】

一実施形態では、宿主細胞または宿主細胞の集団は、ウイルス、例えば、レトロウイルス、レンチウイルスまたはアデノウイルスに由来する核酸骨格配列を含む１つまたは複数の発現ベクターを有する。一実施形態では、発現ベクターは、導入遺伝子の宿主細胞ゲノムへの挿入または置換のためのＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）系を用いる使用のための相同指向性修復のための導入遺伝子および配列を含むことができる。一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系において使用される導入遺伝子は、二量体抗原受容体の構成的転写または誘導性転写を媒介するためのプロモーターに作動可能に連結することができる。一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲとしては、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）が挙げられる。一実施形態では、発現ベクターは、トランスポザーゼに基づく系による使用のために、トランスポゾン中に導入遺伝子を含む。トランスポザーゼ系の例としては、ＰＩＧＧＹＢＡＣ、ＳＵＰＥＲ ＰＩＧＧＹＢＡＣおよびＳＬＥＥＰＩＮＧ ＢＥＡＵＴＹ（ＳＢ１００Ｘを含む）などの市販の系が挙げられる。

【0269】

本開示は、宿主細胞または宿主細胞の集団であって、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）重鎖リーダー領域、（ｉｉ）抗体重鎖可変領域、（ｉｉｉ）抗体重鎖定常領域、（ｉｖ）ヒンジ領域、（ｖ）膜貫通領域、（ｖｉ）２～５つの細胞内共刺激および／またはシグナル伝達配列を有する細胞内領域、（ｖｉｉ）自己切断配列領域、（ｖｉｉｉ）軽鎖リーダー領域、（ｉｘ）抗体軽鎖可変領域、ならびに（ｘ）抗体軽鎖定常領域を含む前駆体ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結された発現ベクターを有する、宿主細胞または宿主細胞の集団を提供する。一実施形態では、前駆体ポリペプチドをコードする核酸は、ヒンジ領域が欠如している。一実施形態では、前駆体ポリペプチドをコードする核酸は、重鎖リーダー領域および／または軽鎖リーダー領域が欠如している。一実施形態では、前駆体ポリペプチドは、図３ＡまたはＢに例示される。一実施形態では、宿主細胞または宿主細胞の集団は、配列番号６３、６６、６９、７２、７５、７８、８１または８４のアミノ酸配列を有する前駆体ポリペプチドのいずれか１つをコードする核酸に作動可能に連結された発現ベクターを有する。一実施形態では、宿主細胞または宿主細胞の集団は、前駆体ポリペプチドを発現する。

【0270】

本開示は、宿主細胞または宿主細胞の集団であって、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）軽鎖リーダー領域、（ｉｉ）抗体軽鎖可変領域、（ｉｉｉ）抗体軽鎖定常領域、（ｉｖ）ヒンジ領域、（ｖ）膜貫通領域、（ｖｉ）２～５つの細胞内共刺激および／またはシグナル伝達配列を有する細胞内領域、（ｖｉｉ）自己切断配列領域、（ｖｉｉｉ）重鎖リーダー領域、（ｉｘ）抗体重鎖可変領域、ならびに（ｘ）抗体重鎖定常領域を含む前駆体ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結された発現ベクターを有する、宿主細胞または宿主細胞の集団を提供する。一実施形態では、前駆体ポリペプチドをコードする核酸は、ヒンジ領域が欠如している。一実施形態では、前駆体ポリペプチドをコードする核酸は、重鎖リーダー領域および／または軽鎖リーダー領域が欠如している。一実施形態では、前駆体ポリペプチドは、図４ＡまたはＢに例示される。一実施形態では、宿主細胞または宿主細胞の集団は、前駆体ポリペプチドを発現する。

【0271】

一実施形態では、宿主細胞または宿主細胞の集団は、（ａ）アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）重鎖リーダー配列、（ｉｉ）抗体重鎖可変領域、（ｉｉｉ）抗体重鎖定常領域、（ｉｖ）ヒンジ領域、（ｖ）膜貫通領域、および（ｖｉ）２～５つの細胞内配列を有する細胞内領域を含む第１のポリペプチド鎖；ならびに（ｂ）アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）抗体軽鎖可変領域、および（ｉｉ）抗体軽鎖定常領域を含む第２のポリペプチド鎖を含む、第１および第２のポリペプチド鎖をコードする核酸に作動可能に連結された発現ベクターを有する。一実施形態では、第１の核酸は、重鎖リーダー領域が欠如している、および／またはヒンジ領域が欠如している、第１のポリペプチド鎖をコードする。一実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、図１ＡまたはＢに例示される。一実施形態では、第２の核酸は、軽鎖リーダー領域が欠如している第２のポリペプチド鎖をコードする。一実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、図１ＡまたはＢに例示される。一実施形態では、宿主細胞または宿主細胞の集団は、第１および第２のポリペプチド鎖を発現する。

【0272】

一実施形態では、宿主細胞または宿主細胞の集団は、（ａ）アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）軽鎖リーダー配列、（ｉｉ）抗体軽鎖可変領域、（ｉｉｉ）抗体軽鎖定常領域、（ｉｖ）ヒンジ領域、（ｖ）膜貫通領域、および（ｖｉ）２～５つの細胞内配列を有する細胞内領域を含む第１のポリペプチド鎖；ならびに（ｂ）アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）抗体重鎖可変領域、および（ｉｉ）抗体重鎖定常領域を含む第２のポリペプチド鎖を含む、第１および第２のポリペプチド鎖をコードする核酸に作動可能に連結された発現ベクターを有する。一実施形態では、第１の核酸は、重鎖リーダー領域が欠如している、および／またはヒンジ領域が欠如している、第１のポリペプチド鎖をコードする。一実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、図２ＡまたはＢに例示される。一実施形態では、第２の核酸は、軽鎖リーダー領域が欠如している第２のポリペプチド鎖をコードする。一実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、図２ＡまたはＢに例示される。一実施形態では、宿主細胞または宿主細胞の集団は、第１および第２のポリペプチド鎖を発現する。

【0273】

一実施形態では、宿主細胞または宿主細胞の集団は、第１のポリペプチド鎖をコードする核酸に作動可能に連結された第１の発現ベクターを有し、かつ第２のポリペプチド鎖をコードする核酸に作動可能に連結された第２の発現ベクターを有し、ここで、（ａ）第１のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）重鎖リーダー配列、（ｉｉ）抗体重鎖可変領域、（ｉｉｉ）抗体重鎖定常領域、（ｉｖ）ヒンジ領域、（ｖ）膜貫通領域、および（ｖｉ）２～５つの細胞内配列を有する細胞内領域を含み；（ｂ）第２のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）抗体軽鎖可変領域、および（ｉｉ）抗体軽鎖定常領域を含む。一実施形態では、第１の核酸は、重鎖リーダー領域が欠如している、および／またはヒンジ領域が欠如している、第１のポリペプチド鎖をコードする。一実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、図１ＡまたはＢに例示される。一実施形態では、第２の核酸は、軽鎖リーダー領域が欠如している第２のポリペプチド鎖をコードする。一実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、図１ＡまたはＢに例示される。一実施形態では、宿主細胞または宿主細胞の集団は、第１および第２のポリペプチド鎖を発現する。

【0274】

一実施形態では、宿主細胞または宿主細胞の集団は、第１のポリペプチド鎖をコードする核酸に作動可能に連結された第１の発現ベクターを有し、かつ第２のポリペプチド鎖をコードする核酸に作動可能に連結された第２の発現ベクターを有し、ここで、（ａ）第１のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）軽鎖リーダー配列、（ｉｉ）抗体軽鎖可変領域、（ｉｉｉ）抗体軽鎖定常領域、（ｉｖ）ヒンジ領域、（ｖ）膜貫通領域、および（ｖｉ）２～５つの細胞内配列を有する細胞内領域を含み；（ｂ）第２のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）抗体重鎖可変領域、および（ｉｉ）抗体重鎖定常領域を含む。一実施形態では、第１の核酸は、重鎖リーダー領域が欠如している、および／またはヒンジ領域が欠如している、第１のポリペプチド鎖をコードする。一実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、図２ＡまたはＢに例示される。一実施形態では、第２の核酸は、軽鎖リーダー領域が欠如している第２のポリペプチド鎖をコードする。一実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、図２ＡまたはＢに例示される。一実施形態では、宿主細胞または宿主細胞の集団は、第１および第２のポリペプチド鎖を発現する。

【0275】

本開示は、第１の宿主細胞または第１の宿主細胞の集団であって、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）重鎖リーダー領域、（ｉｉ）抗体重鎖可変領域、（ｉｉｉ）抗体重鎖定常領域、（ｉｖ）ヒンジ領域、（ｖ）膜貫通領域、および（ｖｉ）細胞内領域を含む第１のポリペプチド鎖をコードする核酸に作動可能に連結された第１の発現ベクターを有する、第１の宿主細胞または第１の宿主細胞の集団を提供する。一実施形態では、第１の核酸は、重鎖リーダー領域が欠如している、および／またはヒンジ領域が欠如している、第１のポリペプチド鎖をコードする。一実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、図１ＡまたはＢに例示される。一実施形態では、第１の宿主細胞または第１の宿主細胞の集団は、第１のポリペプチド鎖を発現する。

【0276】

本開示は、第２の宿主細胞または第２の宿主細胞の集団であって、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）軽鎖リーダー領域、（ｉｉ）抗体軽鎖可変領域、および（ｉｉｉ）抗体軽鎖定常領域を含む第２のポリペプチド鎖をコードする核酸に作動可能に連結された第２の発現ベクターを有する、第２の宿主細胞または第２の宿主細胞の集団を提供する。一実施形態では、第２の核酸は、軽鎖リーダー領域が欠如している第２のポリペプチド鎖をコードする。一実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、図１ＡまたはＢに例示される。一実施形態では、第２の宿主細胞または第２の宿主細胞の集団は、第２のポリペプチド鎖を発現する。

【0277】

本開示は、第１の宿主細胞または第１の宿主細胞の集団であって、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）軽鎖リーダー領域、（ｉｉ）抗体軽鎖可変領域、（ｉｉｉ）抗体軽鎖定常領域、（ｉｖ）ヒンジ領域、（ｖ）膜貫通領域、および（ｖｉ）細胞内領域を含む第１のポリペプチド鎖をコードする核酸に作動可能に連結された第１の発現ベクターを有する、第１の宿主細胞または第１の宿主細胞の集団を提供する。一実施形態では、第１の核酸は、重鎖リーダー領域が欠如している、および／またはヒンジ領域が欠如している、第１のポリペプチド鎖をコードする。一実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、図２ＡまたはＢに例示される。一実施形態では、第１の宿主細胞または第１の宿主細胞の集団は、第１のポリペプチド鎖を発現する。

【0278】

本開示は、第２の宿主細胞または第２の宿主細胞の集団であって、アミノ末端からカルボキシル末端へと順序付けられた複数の領域：（ｉ）重鎖リーダー領域、（ｉｉ）抗体重鎖可変領域、および（ｉｉｉ）抗体軽鎖定常領域を含む第２のポリペプチド鎖をコードする核酸に作動可能に連結された第２の発現ベクターを有する、第２の宿主細胞または第２の宿主細胞の集団を提供する。一実施形態では、第２の核酸は、軽鎖リーダー領域が欠如している第２のポリペプチド鎖をコードする。一実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、図１ＡまたはＢに例示される。一実施形態では、第２の宿主細胞または第２の宿主細胞の集団は、第２のポリペプチド鎖を発現する。

【0279】

本開示は、宿主細胞または宿主細胞の集団であって、二量体抗原受容体をコードする１つまたは複数の核酸に作動可能に連結された少なくとも発現ベクターを有し、核酸が、前駆体ポリペプチドをコードするか、または第１および／もしくは第２のポリペプチド鎖をコードする、宿主細胞または宿主細胞の集団を提供する。

【0280】

一実施形態では、ＢＣＭＡ抗体重鎖可変領域は、配列番号６、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

【0281】

一実施形態では、ＢＣＭＡ抗体重鎖定常領域は、配列番号７または２９のアミノ酸配列を含む。

【0282】

一実施形態では、ヒンジ領域は、配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤ２８ヒンジ領域、および必要に応じて、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤ８ヒンジ領域を含む。

【0283】

一実施形態では、膜貫通領域は、配列番号３７（ＣＤ２８由来）、配列番号３８（ＣＤ８由来）、配列番号３９（４－１ＢＢ由来）または配列番号４０（ＣＤ３ゼータ由来）のアミノ酸配列のいずれか１つを含むＣＤ２８膜貫通領域を含む。

【0284】

一実施形態では、細胞内領域は、配列番号４１（４－１ＢＢ由来）、配列番号４２（ＣＤ２８由来）、配列番号４３（ＯＸ４０由来）、配列番号４４（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ １、２および３）、配列番号４５（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ １）、配列番号４６（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ ２）および／または配列番号４７（ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ ３）からなる群より選択される２～５つの細胞内配列の任意の順序および任意の組合せを含む。

【0285】

一実施形態では、ＢＣＭＡ抗体軽鎖可変領域は、配列番号８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７または３０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

【0286】

一実施形態では、ＢＣＭＡ抗体軽鎖定常領域は、配列番号１１または３１のアミノ酸配列を含む。

【0287】

一実施形態では、重鎖リーダー配列は、配列番号５４または５６のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、軽鎖リーダー配列は、配列番号５５または５６のアミノ酸配列を含む。

【0288】

一実施形態では、自己切断配列は、配列番号５７、５８、５９または６０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

【0289】

組成物および医薬組成物
本開示は、Ｖ１、Ｖ２ａ、Ｖ２ｂ、Ｖ２ｃ、Ｖ３ａ、Ｖ３ｂ、Ｖ３ｃまたはＶ４二量体抗原受容体（ＤＡＲ）のいずれか１つを含む二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物のいずれか１つを発現するように操作されたトランスジェニック宿主細胞の集団を含む組成物を提供する。一実施形態では、トランスジェニック宿主細胞の集団の選択は、処置される疾患の種類および／または被験体における所望される応答の種類に基づき得る。

【0290】

一実施形態では、組成物は、Ｖ１、Ｖ２ａ、Ｖ２ｂ、Ｖ２ｃ、Ｖ３ａ、Ｖ３ｂ、Ｖ３ｃまたはＶ４二量体抗原受容体（ＤＡＲ）のいずれか１つを含むＢＣＭＡ抗原と結合する二量体抗原受容体（ＤＡＲ）を発現する複数のトランスジェニック宿主細胞を含む。一実施形態では、複数のトランスジェニック宿主細胞は、本明細書に記載される、第１のポリペプチド鎖もしくは第２のポリペプチド鎖のいずれか、または第１および第２のポリペプチド鎖のいずれか、または前駆体ポリペプチド鎖のいずれかをコードする１つまたは複数の核酸に作動可能に連結された少なくとも１つの発現ベクターを有し、これは、トランスジェニック宿主細胞によって発現およびプロセシングされて、互いと会合して二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物を形成する第１および第２のポリペプチドを生じさせることができる。一実施形態では、トランスジェニック宿主細胞の集団は、薬学的に許容される賦形剤と混合される。

【0291】

本開示は、異なる二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物を発現するトランスジェニック宿主細胞の２つまたはそれよりも多くの集団の組合せを含む組成物を提供する。一実施形態では、組成物は、第１および第２のトランスジェニック宿主細胞の集団を含み、ここで、第１および第２の集団は、異なる二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物を発現するように操作されている。一実施形態では、第１および第２のトランスジェニック宿主細胞の集団の選択は、処置される疾患の種類および／または被験体における所望される応答の種類に基づき得る。

【0292】

一実施形態では、組成物は、Ｖ１、Ｖ２ａ、Ｖ２ｂ、Ｖ２ｃ、Ｖ３ａ、Ｖ３ｂ、Ｖ３ｃまたはＶ４二量体抗原受容体（ＤＡＲ）のいずれか１つを含むＢＣＭＡ抗原と結合する第１の種類の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）を発現する複数の第１のトランスジェニック宿主細胞を含む第１の集団を含む。一実施形態では、複数の第１のトランスジェニック宿主細胞は、本明細書に記載される、第１のポリペプチド鎖もしくは第２のポリペプチド鎖のいずれか、または第１および第２のポリペプチド鎖のいずれか、または前駆体ポリペプチド鎖のいずれかをコードする１つまたは複数の核酸に作動可能に連結された少なくとも１つの発現ベクターを有し、ここで、核酸は、トランスジェニック宿主細胞によって発現され得、発現したポリペプチドは、トランスジェニック宿主細胞によってプロセシングされて、互いと会合して第１の種類の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物を形成する第１および第２のポリペプチドを生じさせることができる。一実施形態では、第１のトランスジェニック宿主細胞の集団は、薬学的に許容される賦形剤と混合される。

【0293】

一実施形態では、組成物は、Ｖ１、Ｖ２ａ、Ｖ２ｂ、Ｖ２ｃ、Ｖ３ａ、Ｖ３ｂ、Ｖ３ｃまたはＶ４二量体抗原受容体（ＤＡＲ）を含むＢＣＭＡ抗原と結合する第２の種類の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）を発現し得る複数の第２のトランスジェニック宿主細胞を含む第２の集団を含み、ここで、第２の種類の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）は、第１の種類の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）とは異なる。一実施形態では、複数の第２のトランスジェニック宿主細胞は、本明細書に記載される、第１のポリペプチド鎖もしくは第２のポリペプチド鎖のいずれか、または第１および第２のポリペプチド鎖のいずれか、または前駆体ポリペプチド鎖のいずれかをコードする１つまたは複数の核酸に作動可能に連結された少なくとも１つの発現ベクターを有し、ここで、核酸は、トランスジェニック宿主細胞によって発現され得、発現したポリペプチドは、トランスジェニック宿主細胞によってプロセシングされて、互いと会合して第２の種類の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物を形成する第１および第２のポリペプチドを生じさせることができる。一実施形態では、第２のトランスジェニック宿主細胞の集団は、薬学的に許容される賦形剤と混合される。

【0294】

一実施形態では、組成物のための第１および第２のＤＡＲを発現するトランスジェニック宿主細胞の種類の選択は、例えば、細胞殺滅能力、メモリーＴ細胞を発生させる能力、ｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖能力、ｉｎ ｖｉｖｏ持続能力、Ｔ細胞疲弊特性の減少、および／または凍結保存特性を含む、ＤＡＲ Ｔ細胞の任意の特徴に基づき得る。

【0295】

一実施形態では、第１のトランスジェニック宿主細胞の集団は、（ｉ）ＣＤ２８細胞内配列を有する細胞内領域、ならびに（ｉｉ）ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ １、２および３、またはＩＴＡＭ ３細胞内配列のいずれかを含む、Ｖ１、Ｖ２ｂまたはＶ３ｂ二量体抗原受容体（ＤＡＲ）を発現することができる。一実施形態では、Ｖ１、Ｖ２ｂまたはＶ３ｂを発現するトランスジェニック宿主細胞（例えば、第１のトランスジェニック宿主細胞の集団）は、被験体に投与された場合に、強く、迅速なエフェクター応答を誘導することができ、ここで、応答は、選択されたＤＡＲ Ｔ細胞のＣＤ２８細胞内領域によって媒介され得る。

【0296】

一実施形態では、第２のトランスジェニック宿主細胞の集団は、（ｉ）４－１ＢＢ細胞内配列を有する細胞内領域、ならびに（ｉｉ）ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ １、２および３、またはＩＴＡＭ ３細胞内配列のいずれかを含む、Ｖ２ａ、Ｖ３ａまたはＶ４二量体抗原受容体（ＤＡＲ）を発現することができる。一実施形態では、Ｖ２ａ、Ｖ３ａまたはＶ４を発現するトランスジェニック宿主細胞（例えば、第２のトランスジェニック宿主細胞の集団）は、被験体に投与された場合に、より長く続くメモリーＴ細胞集団の発生を誘導することができ、ここで、ＤＡＲ Ｔ細胞の特性は、選択されたＤＡＲ Ｔ細胞の４－１ＢＢ細胞内領域によって媒介され得る。

【0297】

一実施形態では、第１または第２のトランスジェニック宿主細胞の集団は、（ｉ）ＣＤ２８および４－１ＢＢ細胞内配列を有する細胞内領域、ならびに（ｉｉ）ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ １、２および３、またはＩＴＡＭ ３細胞内配列のいずれかを含む、Ｖ２ｃまたはＶ３ｃ二量体抗原受容体（ＤＡＲ）を発現することができる。一実施形態では、Ｖ２ｃまたはＶ３ｃを発現するトランスジェニック宿主細胞（例えば、第１および第２のトランスジェニック宿主細胞の集団）は、被験体における、強く、迅速なエフェクター応答、およびより長く続くメモリーＴ細胞集団の発生の組合せを誘導することができ、ここで、ＤＡＲ Ｔ細胞の特性は、選択されたＤＡＲ Ｔ細胞のＣＤ２８および４－１ＢＢ細胞内領域によって媒介され得る。

【0298】

本開示は、少なくとも第１および第２のトランスジェニック宿主細胞の集団を含む、トランスジェニック宿主細胞の２つまたはそれよりも多くの集団の混合物を含む治療用組成物であって、（ｉ）第１の集団が、本明細書に記載される、第１のポリペプチド鎖もしくは第２のポリペプチド鎖のいずれか、または第１および第２のポリペプチド鎖のいずれか、または前駆体ポリペプチド鎖のいずれかをコードする１つまたは複数の核酸に作動可能に連結された少なくとも１つの発現ベクターを有する第１の複数のトランスジェニック宿主細胞であって、この発現ベクターは、複数の第１のトランスジェニック宿主細胞によって発現およびプロセシングされて、互いと会合して第１の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物を形成する第１および第２のポリペプチドを生じさせることができる、第１の複数のトランスジェニック宿主細胞を含み、（ｉｉ）第２の集団が、本明細書に記載される、第１のポリペプチド鎖もしくは第２のポリペプチド鎖のいずれか、または第１および第２のポリペプチド鎖のいずれか、または前駆体ポリペプチド鎖のいずれかをコードする１つまたは複数の核酸に作動可能に連結された少なくとも１つの発現ベクターを有する第２の複数のトランスジェニック宿主細胞であって、この発現ベクターは、複数の第２のトランスジェニック宿主細胞によって発現およびプロセシングされて、互いと会合して、第１の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）とは異なる第２の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物を形成する第１および第２のポリペプチドを生じさせることができる、第２の複数のトランスジェニック宿主細胞を含む、治療用組成物を提供する。一実施形態では、第１の複数の宿主細胞は、Ｖ１、Ｖ２ａ、Ｖ２ｂ、Ｖ２ｃ、Ｖ３ａ、Ｖ３ｂ、Ｖ３ｃまたはＶ４を含む第１の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物を発現する。一実施形態では、第２の複数の宿主細胞は、Ｖ１、Ｖ２ａ、Ｖ２ｂ、Ｖ２ｃ、Ｖ３ａ、Ｖ３ｂ、Ｖ３ｃまたはＶ４を含む第２の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物を発現し、ここで、第２のＤＡＲ構築物は、第１のＤＡＲ構築物とは異なる。一実施形態では、治療用組成物は、第１の量の第１のトランスジェニック宿主細胞の集団、および第２の量の第２のトランスジェニック宿主細胞の集団を含み、ここで、第１および第２の量は、同じであるか、または異なる。一実施形態では、治療用組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。

【0299】

処置するための方法
本開示は、Ｖ１、Ｖ２ａ、Ｖ２ｂ、Ｖ２ｃ、Ｖ３ａ、Ｖ３ｂ、Ｖ３ｃまたはＶ４ ＤＡＲ構築物のいずれか１つを含む抗ＢＣＭＡ二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物のいずれか１つを発現するように操作された、有効量のトランスジェニック宿主細胞の集団を被験体に投与することによる、養子細胞療法を実施するための方法をさらに提供する。ＤＡＲを発現するトランスジェニック宿主細胞の集団の選択は、処置される疾患の種類および被験体における所望される応答の種類に基づき得る。

【0300】

本開示は、腫瘍抗原の有害な発現（例えば、上昇した発現）に関連する疾患、障害または状態を有する被験体を処置するための方法をさらに提供する。そのような方法は、本明細書に記載される、第１のポリペプチド鎖もしくは第２のポリペプチド鎖のいずれか、または第１および第２のポリペプチド鎖のいずれか、または前駆体ポリペプチド鎖のいずれかをコードする１つまたは複数の核酸に作動可能に連結された少なくとも１つの発現ベクターを有する、有効量の宿主細胞の集団を被験体に投与することを含む。一実施形態では、宿主細胞または宿主細胞の集団は、本明細書に記載される、第１および第２のポリペプチド鎖のいずれか、または前駆体ポリペプチド鎖のいずれかを発現する。

【0301】

本開示は、有効量のトランスジェニック宿主細胞の少なくとも２つの集団の組合せを被験体に投与することによる、養子細胞療法を実施するための方法であって、それぞれの集団が、異なる二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物を発現するように操作されている、方法を提供する。一実施形態では、養子細胞療法を実施するための方法は、有効量の第１および第２のトランスジェニック宿主細胞の集団の組合せを被験体に投与することを含み、ここで、第１および第２の集団は、異なる二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物を発現するように操作されている。第１および第２のトランスジェニック宿主細胞の集団の選択は、処置される疾患の種類および／または被験体における所望される応答の種類に基づき得る。

【0302】

一実施形態では、第１の集団は、Ｖ１、Ｖ２ａ、Ｖ２ｂ、Ｖ２ｃ、Ｖ３ａ、Ｖ３ｂ、Ｖ３ｃまたはＶ４二量体抗原受容体（ＤＡＲ）のいずれか１つを含むＢＣＭＡ抗原と結合する第１の種類の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）を発現する複数の第１のトランスジェニック宿主細胞を含む。一実施形態では、複数の第１のトランスジェニック宿主細胞は、本明細書に記載される、第１のポリペプチド鎖もしくは第２のポリペプチド鎖のいずれか、または第１および第２のポリペプチド鎖のいずれか、または前駆体ポリペプチド鎖のいずれかをコードする１つまたは複数の核酸に作動可能に連結された少なくとも１つの発現ベクターを有し、ここで、核酸は、トランスジェニック宿主細胞によって発現され得、発現したポリペプチドは、トランスジェニック宿主細胞によってプロセシングされて、互いと会合して第１の種類の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物を形成する第１および第２のポリペプチドを生じさせることができる。一実施形態では、第１のトランスジェニック宿主細胞の集団は、薬学的に許容される賦形剤と混合される。

【0303】

一実施形態では、第２の集団は、Ｖ１、Ｖ２ａ、Ｖ２ｂ、Ｖ２ｃ、Ｖ３ａ、Ｖ３ｂ、Ｖ３ｃまたはＶ４二量体抗原受容体（ＤＡＲ）を含むＢＣＭＡ抗原と結合する第２の種類の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）を発現し得る複数の第２のトランスジェニック宿主細胞を含み、ここで、第２の種類の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）は、第１の種類の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）とは異なる。一実施形態では、複数の第２のトランスジェニック宿主細胞は、本明細書に記載される、第１のポリペプチド鎖もしくは第２のポリペプチド鎖のいずれか、または第１および第２のポリペプチド鎖のいずれか、または前駆体ポリペプチド鎖のいずれかをコードする１つまたは複数の核酸に作動可能に連結された少なくとも１つの発現ベクターを有し、ここで、核酸は、トランスジェニック宿主細胞によって発現され得、発現したポリペプチドは、トランスジェニック宿主細胞によってプロセシングされて、互いと会合して第２の種類の二量体抗原受容体（ＤＡＲ）構築物を形成する第１および第２のポリペプチドを生じさせることができる。一実施形態では、第２のトランスジェニック宿主細胞の集団は、薬学的に許容される賦形剤と混合される。

【0304】

一実施形態では、被験体に投与するための第１および第２のＤＡＲを発現するトランスジェニック宿主細胞の種類の選択は、例えば、細胞殺滅能力、メモリーＴ細胞を発生させる能力、ｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖能力、ｉｎ ｖｉｖｏ持続能力、Ｔ細胞疲弊特性の減少、および／または凍結保存特性を含む、ＤＡＲ Ｔ細胞の任意の特徴に基づき得る。

【0305】

一実施形態では、第１のトランスジェニック宿主細胞の集団は、（ｉ）ＣＤ２８細胞内配列を有する細胞内領域、ならびに（ｉｉ）ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ １、２および３、またはＩＴＡＭ ３細胞内配列のいずれかを含む、Ｖ１、Ｖ２ｂまたはＶ３ｂ二量体抗原受容体（ＤＡＲ）を発現することができる。一実施形態では、Ｖ１、Ｖ２ｂまたはＶ３ｂを発現するトランスジェニック宿主細胞（例えば、第１のトランスジェニック宿主細胞の集団）は、選択されたＤＡＲ Ｔ細胞のＣＤ２８細胞内領域によって媒介され得る、被験体における強く、迅速なエフェクター応答を誘導することができる。

【0306】

一実施形態では、第２のトランスジェニック宿主細胞の集団は、（ｉ）４－１ＢＢ細胞内配列を有する細胞内領域、ならびに（ｉｉ）ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ １、２および３、またはＩＴＡＭ ３細胞内配列のいずれかを含む、Ｖ２ａ、Ｖ３ａまたはＶ４二量体抗原受容体（ＤＡＲ）を発現することができる。一実施形態では、Ｖ２ａ、Ｖ３ａまたはＶ４を発現するトランスジェニック宿主細胞（例えば、第２のトランスジェニック宿主細胞の集団）は、選択されたＤＡＲ Ｔ細胞の４－１ＢＢ細胞内領域によって媒介され得る、被験体におけるより長く続くメモリーＴ細胞集団の発生を誘導することができる。

【0307】

一実施形態では、第１または第２のトランスジェニック宿主細胞の集団は、（ｉ）ＣＤ２８および４－１ＢＢ細胞内配列を有する細胞内領域、ならびに（ｉｉ）ＣＤ３ゼータＩＴＡＭ １、２および３、またはＩＴＡＭ ３細胞内配列のいずれかを含む、Ｖ２ｃまたはＶ３ｃ二量体抗原受容体（ＤＡＲ）を発現することができる。一実施形態では、Ｖ２ｃまたはＶ３ｃを発現するトランスジェニック宿主細胞（例えば、第１および第２のトランスジェニック宿主細胞の集団）は、選択されたＤＡＲ Ｔ細胞のＣＤ２８および４－１ＢＢ細胞内領域によって媒介され得る、被験体における、強く、迅速なエフェクター応答、およびより長く続くメモリーＴ細胞集団の発生の組合せを誘導することができる。

【0308】

一実施形態では、第１および第２のトランスジェニック宿主細胞の集団は、被験体に、同じ時（例えば、同時に、または本質的に同時に）投与することができる。

【0309】

一実施形態では、第１および第２のトランスジェニック宿主細胞の集団は、被験体に、いずれかの順序で逐次的に投与することができる。

【0310】

一実施形態では、同じ用量または異なる用量の第１および第２のトランスジェニック宿主細胞の集団を、被験体に投与することができる。

【0311】

一実施形態では、単回用量の第１および第２のトランスジェニック宿主細胞の集団を、被験体に投与することができる。

【0312】

一実施形態では、少なくとも２回用量の第１および第２のトランスジェニック宿主細胞の集団を、被験体に投与することができる。

【0313】

一実施形態では、被験体に投与される第１および第２のトランスジェニック宿主細胞の集団の用量の数は、同じまたは異なり得る。

【0314】

本開示は、腫瘍抗原の有害な発現に関連する疾患、障害または状態を有する被験体を処置するための方法であって、障害が、限定されるものではないが、血液学的な、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、頭頸部がん、肺がん、膀胱がん、黒色腫、結腸直腸がん、膵臓がん、肺がん、肝臓がん、腎臓がん、食道がん、平滑筋腫、平滑筋肉腫、神経膠腫および神経膠芽腫を含むがんである、方法を提供する。

【0315】

一実施形態では、がんは、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、慢性Ｂリンパ球性白血病（Ｂ－ＣＬＬ）、急性ＢおよびＴリンパ球性白血病（ＡＬＬ）、Ｔ細胞リンパ腫（ＴＣＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）および多発性骨髄腫（ＭＭ）からなる群より選択される血液がんである。一部の実施形態では、がんは、ＢＣＭＡ陽性血液がん、例えば、ＢＣＭＡ陽性Ｂ細胞血液がん（例えば、リンパ腫（ＮＨＬなど）、白血病（ＣＬＬなど）、または骨髄腫）などのＢＣＭＡ陽性がんである。

【実施例】

【0316】

以下の実施例は、例示であることが意図され、本開示の実施形態をさらに理解するために使用することができ、決して本教示の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。

【0317】

（実施例１）
ヒトＰＢＭＣ細胞および初代Ｔ細胞の単離

【0318】

初代ヒトＴ細胞を、健康なヒトドナー、軟膜（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ血液バンク）、新鮮な血液または白血球除去生成物（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）のいずれかから単離した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、密度勾配遠心分離によって単離した。

【0319】

ドナー１細胞の調製：Ｔ細胞を、製造業者の指示に従って、ＥＡＳＹＳＥＰ Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製、カタログ番号１７９５１）を使用する負の磁気選択、またはＤＹＮＡＢＥＡＤＳ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ｅｘｐａｎｄｅｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製、カタログ番号１１１４１Ｄ）による正の選択および活性化によって、ＰＢＭＣから単離した。ドナー１細胞に、ＢＣＭＡ ＣＡＲまたはＤＡＲをコードする核酸を導入して、ＣＡＲまたはＤＡＲ構築物を発現するトランスジェニックＴ細胞を作製した。トランスジェニック細胞を、アッセイのために使用して、図５Ａ～１１に示すデータを得た。

【0320】

ドナー２細胞の調製：単球を枯渇させるために、ＰＢＭＣを、細胞培養コーティングフラスコに、１～２時間、蒔いた。非接着性リンパ球を、フラスコから洗い流し、製造者の指示に従って、新しいフラスコ中で、Ｔ Ｃｅｌｌ ＴＲＡＮＳＡＣＴ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ製、カタログ番号１３０－１１１－１６０）で活性化した。ドナー２細胞に、ＢＣＭＡ ＣＡＲまたはＤＡＲをコードする核酸を導入して、ＣＡＲまたはＤＡＲ構築物を発現するトランスジェニックＴ細胞を作製した。トランスジェニック細胞を、アッセイのために使用して、図１２～１５に示すデータを得た。

【0321】

（実施例２）
初代Ｔ細胞培養

【0322】

初代Ｔ細胞を、３００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）を有する５％のＣＴＳ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ ＳＲ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が追加補充されたＣＴＳ ＯＰＴＭＩＺＥＲ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭ中、１ｍＬ当たり１０^６個細胞の密度で培養した。新たに、または凍結されたタンクから、単離されたＴ細胞を刺激した。細胞を、３ｕＬ／１ｍＬあたり１０^６個細胞のＴ Ｃｅｌｌ ＴＲＡＮＳＡＣＴ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で、２～３日間、活性化した。トランスフェクション後、Ｔ細胞を、３００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２を有する培地中で培養した。

【0323】

（実施例３）
ＣＡＲおよびＤＡＲ Ｔ細胞の調製

【0324】

活性化Ｔ細胞（およそ９×１０^６個細胞）に、ＣＡＲ構築物または前駆体ＤＡＲのいずれかをコードする核酸を導入した。ＢＣＭＡ ＣＡＲおよびＢＣＭＡ ＤＡＲ構築物の命名した名称を、それらのそれぞれのヒンジおよび細胞内領域とともに、下記の表１に列挙する。

【0325】

【表1】

【0326】

トランスジェニックＣＡＲおよびＤＡＲ Ｔ細胞を、新鮮に使用したか、または将来の使用のために凍結保存した。凍結保存されたＣＡＲおよびＤＡＲ Ｔ細胞について、細胞を、凍結培地（７０％のＡＩＭ－Ｖ培地、２０％のＦＢＳおよび１０％のＤＭＳＯ）に再懸濁させ、無菌の遠心分離管に移し、１３００ＲＰＭで、４℃で５分間、遠心分離した。上清を、取り出し、廃棄した。細胞ペレットを、２ｍＬの凍結培地を１×１０^８個細胞に添加することによって、素早く再懸濁させた。細胞を、－８０℃で終夜、凍結させた。細胞を、典型的には１～２か月以内で、－１５０℃に移した。

【0327】

細胞を解凍するために、細胞を、－１５０℃の冷凍庫から取り出し、解凍されるまで、３７℃の水浴中で保持した。解凍された細胞を、５０ｍＬのＤＰＢＳを有する無菌の遠心分離管に移し、１３００ＲＰＭで、５分間、遠心分離した。上清を、取り出し、廃棄した。新鮮なＤＰＢＳを添加し、細胞を再懸濁した。細胞をカウントした。細胞濃度を、必要により調整し、３０ｕｍの細胞ストレーナーを通して濾過した。細胞を、使用するまで、氷上に置いた。ＣＡＲおよびＤＡＲ Ｔ細胞を、－８０℃で最長で２か月間、または－１５０℃で最長で４～６か月間保存し、優れたｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの腫瘍殺滅能力を依然として示した。

【0328】

（実施例４）
腫瘍細胞系

【0329】

多発性骨髄腫細胞系ＲＰＭＩ ８２２６を、ＡＴＣＣから入手し、ルシフェラーゼおよびＧＦＰ遺伝子を持つレンチウイルスを使用して、形質導入した。ルシフェラーゼおよびＧＦＰ発現を有する単一細胞クローンを選択した（ＲＰＭＩ８２２６－ＦＬｕｃ）。Ｋ５６２／ＲＰＥ細胞を、ＲＰＥ遺伝子を持つレンチウイルスでＫ５６２細胞を形質導入することによって、同様に作製した。両方の細胞系を、１０％のウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ）が追加補充されたＲＰＭＩ１６４０培地（ＡＴＣＣ）中で培養した。

【0330】

（実施例５）
ＤＡＲを発現するＴ細胞のトランスフェクション効率および発現レベル

【0331】

トランスジェニックＴ細胞からの抗ＢＣＭＡキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または抗ＢＣＭＡ二量体抗原受容体（ＤＡＲ）のいずれかのトランスフェクションおよび発現レベルを、フローサイトメトリーを使用して比較した。

【0332】

さまざまなＢＣＭＡ（ｂｂ２１２１または２Ｃ５）ＣＡＲまたはＤＡＲ構築物を発現するトランスジェニックＴ細胞（ドナー１）のトランスフェクション効率は、互いに類似する（１１日目での図５ＡおよびＢ；１３日目での図３７）。ＢＣＭＡ－２Ｃ５ ＣＡＲ（８３×）を発現する細胞の細胞増殖レベルは、ＢＣＭＡ－ｂｂ２１２１ ＣＡＲ（４２×）のほぼ２倍であった。ＢＣＭＡ－２Ｃ５ ＤＡＲ Ｖ３ｂ（７２×）を発現する細胞の細胞増殖レベルは、ＢＣＭＡ－２Ｃ５ ＤＡＲ Ｖ２ｃ（５７×）およびＶ３ａ（５６×）を発現する細胞と比較して、高かった（図５Ｂ）。ＢＣＭＡ ｂｂ２１２１ ＤＡＲを発現するトランスジェニックＴ細胞のトランスフェクション効率は、１０％未満であった（データは示さない）。

【0333】

ＢＣＭＡ－２Ｃ５ ＣＡＲまたはＤＡＲ構築物を発現するトランスジェニックＴ細胞（ドナー２）のトランスフェクション効率は、変化し、ここで、ＢＣＭＡ－２Ｃ５ ＣＡＲを発現するＴ細胞は、ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ２ａ（２７％）またはＶ３ａ（１７％）を発現するＴ細胞と比較して、より高い効率（６２％）を示した。ＢＣＭＡ－２Ｃ５ ＣＡＲ（７２×）を発現する細胞の細胞増殖レベルは、ＢＣＭＡ－２Ｃ５ ＤＡＲ Ｖ２ｃ（１５×）またはＶ３ａ（４９×）を発現する細胞と比較して、より高かった（図１２）。

【0334】

（実施例６）
ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害アッセイ

【0335】

ＣＡＲ、ＤＡＲおよび対照Ｔ細胞の調製の２～３週間後、細胞を、ＩＬ－２とともに、終夜、栄養飢餓に供した。細胞を、ＢＣＭＡ陽性ＲＰＭＩ－８２２６／ＧＦＰ細胞またはＢＣＭＡ陰性Ｋ５６２／ＲＰＥ細胞の標的細胞混合物とともに共培養した。エフェクター細胞の標的細胞に対する比は、０．１６：１～５：１の範囲であった。終夜のインキュベーション後、細胞を、フローサイトメトリーに供して、ＧＦＰ細胞集団を測定して、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲまたはＤＡＲ Ｔ細胞による標的細胞比殺滅（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌ ｋｉｌｌｉｎｇ）を決定した。

【0336】

ＢＣＭＡ－２Ｃ５ ＣＡＲ（ラインＦ）を発現するトランスジェニック細胞（ドナー１）は、ＢＣＭＡ－２Ｃ５ ＤＡＲ Ｖ３ｂ（ラインＥ）、ＤＡＲ Ｖ３ａ（ラインＤ）およびＤＡＲ Ｖ３ａ（ラインＢ）と比較して、より高いレベルの細胞殺滅を示した。ＢＣＭＡ ｂｂ２１２１ ＣＡＲを発現するトランスジェニック細胞（ラインＣ）は、ＢＣＭＡ－２Ｃ５ ＤＡＲ Ｖ３ａ（ラインＢ）と比較して、より高いレベルの細胞殺滅を示した（図６）。

【0337】

ＢＣＭＡ－２Ｃ５ ＤＡＲ Ｖ２ａ（ラインＤ）を発現するトランスジェニック細胞（ドナー２）は、ＢＣＭＡ－２Ｃ５ ＤＡＲ Ｖ３ａ（ラインＣ）またはＣＡＲ（ラインＢ）を発現する細胞と比較して、より高いレベルの細胞殺滅を示した（図１３）。図４０も参照されたい。

【0338】

（実施例７）
ｉｎ ｖｉｔｒｏサイトカイン分泌アッセイ

【0339】

ＣＡＲ、ＤＡＲおよび対照Ｔ細胞の調製の２～３週間後、細胞を、ＩＬ－２とともに、終夜、栄養飢餓に供した。細胞を、ＢＣＭＡ陰性Ｋ５６２細胞、またはＢＣＭＡ陽性Ｕ２６６もしくはＲＰＭＩ８２２６細胞とともに共培養した。エフェクター細胞の標的細胞に対する比は、２：１であった。４０時間のインキュベーション後、細胞を、製造業者の指示に従って、サイトカインのＩＦＮ－ガンマ（ＥＬＩＳＡ ＭＡＸ Ｄｅｌｕｘ Ｓｅｔ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ製、カタログ番号４３０１０４）またはＧＭ－ＣＳＦ（Ｈｕｍａｎ Ｇｍ－ＣＳＦ Ｕｎｃｏａｔｅｄ ＥＬＩＳＡキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ製、カタログ番号８８－８３３７）を検出するために、遠心分離して、上清を収集した。

【0340】

図７Ａの結果は、ＢＣＭＡ－２Ｃ５ ＤＡＲ Ｖ３ａまたはＶ３ｂを発現するＴ細胞（ドナー１）が、ＲＰＭＩ８２２６細胞と共培養された場合に、ＢＣＭＡ－ｂｂ２１２１ ＣＡＲ、ＢＣＭＡ－２Ｃ５ ＣＡＲまたはＢＣＭＡ－２Ｃ５ ＤＡＲ Ｖ２ｃと比較して、より高いレベルのＩＦＮ－ガンマを分泌することを示す。

【0341】

図７Ｂの結果は、ＢＣＭＡ－２Ｃ５ ＤＡＲ Ｖ３ａまたはＶ３ｂを発現するＴ細胞（ドナー１）が、ＲＰＭＩ８２２６細胞と共培養された場合に、ＢＣＭＡ－ｂｂ２１２１ ＣＡＲ、ＢＣＭＡ－２Ｃ５ ＣＡＲまたはＢＣＭＡ－２Ｃ５ ＤＡＲ Ｖ２ｃと比較して、非常に高いレベルのＧＭ－ＣＳＦを分泌することを示す。

【0342】

（実施例８）
共培養されたトランスジェニック細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖

【0343】

ＣＡＲ、ＤＡＲおよび対照Ｔ細胞の調製の２～３週間後、細胞を、ＩＬ－２とともに、終夜、栄養飢餓に供した。細胞を、ＢＣＭＡ陰性Ｋ５６２細胞、またはＢＣＭＡ陽性Ｕ２６６もしくはＲＰＭＩ８２２６細胞とともに共培養した。細胞増殖のレベルを、フローサイトメトリーを使用して測定した。

【0344】

陰性対照細胞は、わずかな増殖を示したか、または増殖を示さなかった（図８Ａおよび１０Ａ）。ＢＣＭＡ ｂｂ２１２１ ＣＡＲを発現するトランスジェニック細胞（ドナー１）は、ＲＰＭＩ８２２６またはＵ２６６細胞と共培養された場合に、Ｋ５６２細胞との共培養と比較して、より高い増殖レベルを示した（図８Ｂおよび１０Ｂ）。ＢＣＭＡ－２Ｃ５ ＣＡＲを発現するトランスジェニック細胞は、予想外にも、ＲＰＭＩ８２２６、Ｕ２６６およびＫ５６２細胞と共培養された場合に、高レベルの増殖を示し（図８Ｃ）、非特異的応答を示した。ＢＣＭＡ－２Ｃ５ ＤＡＲ Ｖ２ｃを発現するトランスジェニック細胞は、ＲＰＭＩ８２２６またはＵ２６６細胞と共培養された場合に、Ｋ５６２細胞との共培養と比較して、より高い増殖レベルを示した（図８Ｄ）。

【0345】

図８Ａ～Ｄからの共培養されたトランスジェニック細胞の細胞増殖における倍数変化を、図９の棒グラフに示す。ＢＣＭＡ ｂｂ２１２１ ＣＡＲを発現するトランスジェニック細胞（ドナー１）は、ＲＰＭＩ８２２６またはＵ２６６細胞と共培養された場合に、ＢＣＭＡ－２Ｃ５ ＤＡＲ Ｖ２ａを発現するトランスジェニック細胞と比較して、より高い細胞増殖の倍数変化を有する。ＢＣＭＡ－２Ｃ５ ＣＡＲを発現するトランスジェニック細胞は、非常に低い細胞増殖の倍数変化を有する。

【0346】

ＢＣＭＡ－２Ｃ５ ＤＡＲ Ｖ２ｃを発現するトランスジェニック細胞（ドナー１）は、ＲＰＭＩ８２２６またはＵ２６６細胞と共培養された場合に、Ｋ５６２細胞との共培養と比較して、より高い増殖レベルを示した（図１０Ｃおよび４４Ｂ）。ＢＣＭＡ－２Ｃ５ ＤＡＲ Ｖ２ａ（図４４Ａ）またはＢＣＭＡ－２Ｃ５ ＤＡＲ Ｖ３ａ（図１０Ｄ）またはＢＣＭＡ－２Ｃ５ ＤＡＲ Ｖ３ｂ（図１０Ｅ）を発現するトランスジェニック細胞は、ＲＰＭＩ８２２６またはＵ２６６細胞と共培養された場合に、Ｋ５６２細胞との共培養と比較して、さらに高い増殖レベルを示した。

【0347】

図１０Ａ～Ｅからの共培養されたトランスジェニック細胞の細胞増殖における倍数変化を、図１１の棒グラフに示す。ＢＣＭＡ ｂｂ２１２１ ＣＡＲを発現するトランスジェニック細胞（ドナー１）は、ＲＰＭＩ８２２６細胞と共培養された場合に、ＢＣＭＡ－２Ｃ５ ＤＡＲ Ｖ２ｃ、Ｖ３ａおよびＶ３ｂを発現するトランスジェニック細胞と比較して、より高い細胞増殖の倍数変化を有する。ＢＣＭＡ－２Ｃ５ ＤＡＲ Ｖ３ａを発現するトランスジェニック細胞は、Ｕ２６６細胞と共培養された場合に、ＢＣＭＡ ｂｂ２１２１ ＣＡＲまたはＢＣＭＡ－２Ｃ５ ＤＡＲ Ｖ２ｃもしくはＤＡＲ Ｖ３ｂを発現するトランスジェニック細胞と比較して、より高い細胞増殖の倍数変化を有する。

【0348】

陰性対照細胞（ＴＣＲ－マイナスおよびＡＴＣ）は、Ｋ５６２、ＲＰＭＩ８２２６またはＲａｊｉ細胞と共培養された場合に、わずかな増殖を示したか、または増殖を示さなかった（図１４ＡおよびＢ）。ＢＣＭＡ－２Ｃ５ ＣＡＲを発現するトランスジェニック細胞（ドナー２）は、予想外にも、Ｋ５６２、ＲＰＭＩ８２２６またはＲａｊｉ細胞と共培養された場合に、高レベルの増殖を示し（図１４Ｃ）、非特異的応答を示した。ＢＣＭＡ－２Ｃ５ ＤＡＲ Ｖ２ａを発現するトランスジェニック細胞は、Ｒａｊｉ細胞と共培養された場合に、Ｋ５６２またはＲＰＭＩ８２２６細胞との共培養と比較して、より高い増殖レベルを示した（図１４Ｄ）。ＢＣＭＡ－２Ｃ５ ＤＡＲ Ｖ３ａを発現するトランスジェニック細胞は、Ｒａｊｉ細胞と共培養された場合に、Ｋ５６２またはＲＰＭＩ８２２６細胞との共培養と比較して、より高い増殖レベルを示した（図１４Ｅ）。

【0349】

図１４Ａ～Ｅからの共培養されたトランスジェニック細胞の細胞増殖における倍数変化を、図１５の棒グラフに示す。ＢＣＭＡ－２Ｃ５ ＤＡＲ Ｖ２ａおよびＶ３ａを発現するトランスジェニック細胞（ドナー２）は、Ｒａｊｉ細胞と共培養された場合に、Ｋ５６２またはＲＰＭＩ８２２６細胞と共培養された場合のＢＣＭＡ－２Ｃ５ ＤＡＲ Ｖ２ａおよびＶ３ａを発現するトランスジェニック細胞と比較して、同様のより高い細胞増殖の倍数変化を有する。

【0350】

（実施例９）
メモリーＴ細胞およびセントラルメモリーＴ細胞の検出

【0351】

抗ＢＣＭＡ－２Ｃ５ ＤＡＲ Ｔ細胞（ドナー２細胞由来）を、ＤＰＢＳ５％ヒト血清アルブミンで洗浄し、次いで、４℃で３０～６０分間、抗ＣＤ３－ＢＶ４２１抗体（ＳＫ７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）およびＰＥまたはＡＰＣコンジュゲート化ＢＣＭＡ－Ｆｃタンパク質（Ｃｈｉｍｅｒｉｇｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で染色した。ＣＤ３およびＢＣＭＡを、ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ Ｐｌｕｓ（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔｅ Ｃｏ）またはＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴ（ＡＦＣ２）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、検出した。エフェクターメモリーＴ細胞およびＴ細胞のセントラルメモリー画分を同定するためのマーカーは、ＣＤ４５ＲＯ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）およびＣＣＲ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）であった。セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯおよびＣＣＲ７二重陽性集団であり、エフェクターメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ陽性ＣＣＲ７陰性集団であった。結果を図１３Ｂに示す。

【0352】

（実施例１０）
Ｔ細胞疲弊マーカーの検出

【0353】

抗ＢＣＭＡ ２Ｃ５ ＤＡＲ Ｔ細胞または対照Ｔ細胞を、ＤＰＢＳ５％ヒト血清アルブミンで洗浄し、次いで、４℃で３０～６０分間、ＢＶ４２１コンジュゲート化抗ＰＤ１抗体（ＥＨ１２．２Ｈ７またはＮＡＴ１０５、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ製）およびＡＰＣ／Ｃｙ７コンジュゲート化ＴＩＭ３抗体（Ｆ３８－２Ｅ２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ製）で染色した。ＰＤ１およびＴＩＭ３細胞マーカーを、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ（ＡＦＣ２）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、検出した。結果を図１３Ｃに示す。

【0354】

（実施例１１）
３つの異なるＤＡＲ構築物の１つを発現するトランスジェニックＴ細胞を比較するマウスモデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍殺滅

【0355】

抗ＢＣＭＡ ＤＡＲ Ｔ細胞の殺腫瘍活性を、ＲＰＭＩ８２２６異種移植マウスモデルにおいて試験した。８週齢の雌ＮＳＧマウスを研究のために使用した。多発性骨髄腫細胞系ＲＰＭＩ８２２６を、ＡＴＣＣから得て、ルシフェラーゼおよびＧＦＰ遺伝子を有するレンチウイルスベクターによって、トランスフェクトした。ルシフェラーゼおよびＧＦＰ発現を有する単一クローンを選択した（ＲＰＭＩ８２２６－ＦＬｕｃ）。合計で８×１０^６個細胞のＲＰＭＩ８２２６－Ｆｌｕｃを、２００μＬのＰＢＳに懸濁させ、次いで、それぞれのマウスの尾静脈に静脈内注射した。非常に小さいまたは非常に大きい腫瘍負荷を有する動物を、ＩＶＩＳイメージングからの生物発光に基づいて、除外した。研究で選択された動物を、異なる群に無作為化した。

【0356】

それぞれの動物に、腫瘍接種後の２２日目に、２００μＬのＰＢＳ中、尾静脈を介して、ＰＢＳ、対照ＴＣＲ－マイナスＴ細胞または操作された抗ＢＣＭＡ ＤＡＲ Ｔ細胞（ドナー１由来のＴ細胞）の単回用量を投与した。投与された用量を、下記の表２に列挙する。

【0357】

【表2】

【0358】

腫瘍成長を、腫瘍細胞の接種後に毎週、それぞれマウスの背側上で、ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＩＩＩ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ）を用いて、総光子フラックスを測定することによって、モニターした。腫瘍接種後１週目に、ＢＣＭＡ－２Ｃ５ ＤＡＲ Ｖ２ｃ、Ｖ３ｂまたはＶ３ａ構築物を発現するＴ細胞で処置されたマウスは、ＴＣＲ－マイナスＴ細胞またはＰＢＳで処置されたマウスと比較して、著しく低減された腫瘍負荷を示した（図１８Ａ）。図１８Ｂは、図１８Ａに示される発光データに対応する生物発光シグナルフラックス（マウスのそれぞれの群について平均される）を示すグラフである。図１８Ｃは、図１８Ａに示される発光データに対応する腫瘍成長阻害指数を列挙する表である。

【0359】

末梢血ＦＡＣＳ解析：

【0360】

血液試料を、それぞれの動物から、用量の投与後１日目、およびその後は毎週、収集した。４０ｕＬの血液試料を、マウス尾静脈から得た。血液試料からの細胞を、染色し、ＣＤ４５陽性細胞（図１８Ｄ）、ＢＣＭＡ ＤＡＲ陽性細胞（図１８Ｅ）、ＣＤ３陰性細胞（図１８Ｆ）およびＣＤ３陰性細胞（図１８Ｇ）のパーセントおよび総数について、フローサイトメトリーを介して分析した。動物の生存率も決定した（図１８Ｈ）。

【0361】

（実施例１２）
３つの異なる用量のＶ３ａ ＤＡＲ構築物を発現するトランスジェニックＴ細胞を比較するマウスモデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍殺滅

【0362】

ＤＡＲ ＢＣＭＡ－２Ｃ５ Ｖ３ａ構築物を発現する抗ＢＣＭＡ ＤＡＲ Ｔ細胞の３つの異なる用量の殺腫瘍活性を、ＲＰＭＩ８２２６異種移植マウスモデルにおいて試験した。８週齢の雌ＮＳＧマウスを研究のために使用した。多発性骨髄腫細胞系ＲＰＭＩ８２２６を、ＡＴＣＣから得て、ルシフェラーゼおよびＧＦＰ遺伝子を有するレンチウイルスベクターによって、トランスフェクトした。ルシフェラーゼおよびＧＦＰ発現を有する単一クローンを選択した（ＲＰＭＩ８２２６－ＦＬｕｃ）。合計で８×１０^６個細胞のＲＰＭＩ８２２６－Ｆｌｕｃを、２００μＬのＰＢＳに懸濁させ、次いで、それぞれのマウスの尾静脈に静脈内注射した。非常に小さいまたは非常に大きい腫瘍負荷を有する動物を、ＩＶＩＳイメージングからの生物発光に基づいて、除外した。研究で選択された動物を、異なる群に無作為化した。

【0363】

それぞれの動物に、腫瘍接種後の２２日目に、２００μＬのＰＢＳ中、尾静脈を介して、ＰＢＳ、対照ＴＣＲ－マイナスＴ細胞、またはＤＡＲ ＢＣＭａ－２Ｃ５ Ｖ３ａ構築物を発現する操作された抗ＢＣＭＡ ＤＡＲ Ｔ細胞の３種の用量の１つの単回用量を投与した。投与された用量を、下記の表３に列挙する。

【0364】

【表3】

【0365】

腫瘍成長を、腫瘍細胞の接種後に毎週、それぞれマウスの背側上で、ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＩＩＩ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ）を用いて、総光子フラックスを測定することによって、モニターした。腫瘍接種後１週目および２週目に、最高用量（６×１０^６個）のＢＣＭＡ－２Ｃ５ ＤＡＲ Ｖ３ａ構築物を発現するＴ細胞で処置されたマウスは、中および低用量（１．２×１０^６個または２．４×１０^５個）のＢＣＭＡ－２Ｃ５ ＤＡＲ Ｖ３ａ構築物を発現するＴ細胞で処置されたマウスと比較して、著しく低減された腫瘍負荷を示した（図１９Ａ）。図１９Ｂは、図１９Ａに示される発光データに対応する生物発光シグナルフラックス（マウスのそれぞれの群について平均される）を示すグラフである。図１９Ｃは、図１９Ａに示される発光データに対応する腫瘍成長阻害指数を列挙する表である。

【0366】

末梢血ＦＡＣＳ解析：

【0367】

血液試料を、それぞれの動物から、用量の投与後１日目、およびその後は毎週、収集した。４０ｕＬの血液試料を、マウス尾静脈から得た。血液試料からの細胞を、染色し、ＣＤ４５陽性細胞（図１９Ｄ）、ＢＣＭＡ ＤＡＲ陽性細胞（図１９Ｅ）、ＣＤ３陰性細胞（図１９Ｆ）およびＣＤ３陽性細胞（図１９Ｇ）のパーセントおよび総数について、フローサイトメトリーを介して分析した。動物の生存率も決定した（図１９Ｈ）。

【0368】

（実施例１３）
ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍再チャレンジ研究

【0369】

上記の実施例１２に記載される用量研究のために使用されたマウスを、腫瘍再チャレンジ研究のために使用した。ＤＡＲ Ｔ細胞（Ｖ３ａ）で処置されたマウスのそれぞれの群において、半分は、２００ｕＬのＰＢＳを投与し、他の半分は、２００ｕＬ中の１×１０^７個のＲＰＭＩ８２２６－Ｆｌｕｃを投与することによって再チャレンジした。この再チャレンジ研究では、ＤＡＲ Ｔ細胞（Ｖ３ａ）の２回目の用量を受けたマウスはなかった。

【0370】

腫瘍の成長および再成長を、７週間の間、毎週、それぞれマウスの背側上で、ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＩＩＩ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ）を用いて、総光子フラックスを測定することによって、モニターした。腫瘍再チャレンジ研究の開始前１２週目のマウスの生物発光画像を、図２０Ａの上側に示す。ＰＢＳまたは腫瘍再チャレンジ研究に供されたマウスの画像を、それぞれの用量群について、図２０Ａに示す。腫瘍成長は、腫瘍再チャレンジに供された最高用量のマウス（６×１０^６個のＤＡＲ Ｔ細胞Ｖ３ａ）において検出されなかった（図２０Ａ）。腫瘍の成長および再成長を、腫瘍再チャレンジに供された中用量のマウス（１．２×１０^６個）の４頭で検出し、１頭のマウスは、腫瘍成長を示さなかった（塗りつぶされた黒三角によって示す）（図２０Ａ）。腫瘍の成長および再成長を、腫瘍再チャレンジに供された最低用量のマウス（２．４×１０^５個）の４頭で検出し（これらのマウスの３頭が死亡した）、１頭のマウスは、腫瘍成長を示さなかった（塗りつぶされた黒三角によって示す）（図２０Ａ）。

【0371】

末梢血ＦＡＣＳ解析：

【0372】

血液試料を、それぞれの動物から、用量の投与後１日目、およびその後は毎週、収集した。４０ｕＬの血液試料を、マウス尾静脈から得た。血液試料からの細胞を、染色し、ＣＤ４５陽性細胞（図２０Ｂ）およびＢＣＭＡ ＤＡＲ陽性細胞（図２０Ｃ）のパーセントおよび総数について、フローサイトメトリーを介して分析した。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図10E】

【図10F】

【図11】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図14】

【図15】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【図16D】

【図16E】

【図17】

【図18A】

【図18B】

【図18C】

【図18D】

【図18E】

【図18F】

【図18G】

【図18H】

【図19A】

【図19B】

【図19C】

【図19D】

【図19E】

【図19F】

【図19G】

【図19H】

【図20A】

【図20B】

【図20C】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【配列表】

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【国際調査報告】