ホーム > 特許ランキング > スキャンセル リミテッド
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-11-08
(54)【発明の名称】抗フコシル－ＧＭ１抗体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20221031BHJP
C07K 16/30 20060101ALI20221031BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20221031BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20221031BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20221031BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20221031BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C07K16/30 ZNA
A61P35/00
A61K39/395 E
A61K39/395 T
A61K45/00
A61K47/68
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022514457
(86)(22)【出願日】2020-09-02
(85)【翻訳文提出日】2022-04-26
(86)【国際出願番号】 EP2020074441
(87)【国際公開番号】W WO2021043810
(87)【国際公開日】2021-03-11
(31)【優先権主張番号】1912657.2
(32)【優先日】2019-09-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】520104123
【氏名又は名称】スキャンセル リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】デュラン，リンダ ギリアン
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA95
4C076BB01
4C076BB13
4C076BB15
4C076BB16
4C076BB21
4C076CC27
4C076CC41
4C076EE41
4C076EE59
4C076FF02
4C076FF04
4C076FF36
4C076FF61
4C076FF63
4C076FF68
4C084AA17
4C084MA05
4C084MA16
4C084MA52
4C084MA56
4C084MA65
4C084MA66
4C084NA10
4C084NA13
4C084ZB261
4C084ZB262
4C085AA13
4C085AA14
4C085AA16
4C085BB31
4C085BB36
4C085BB41
4C085CC22
4C085CC23
4C085DD62
4C085EE01
4C085GG02
4C085GG03
4C085GG04
4C085GG06
4C085GG08
4H045AA11
4H045AA30
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本発明は、フコシル－ＧＭ１（Ｆｕｃ－ＧＭ１）に特異的に結合可能である特異的結合メンバー、例えば抗体及びその断片に関する。本発明はまた、医学におけるこのような結合メンバーの使用及びこのような結合メンバーをコードする核酸、Ｆｕｃ－ＧＭ１を検出するための方法並びに抗Ｆｕｃ－ＧＭ１抗体を使用して癌を含む様々な疾患を処置するための方法にも関する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃβ１－４（Ｎｅｕ５Ａｃα２－３）Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ－セラミド（Ｆｕｃ－ＧＭ１糖脂質）に特異的に結合できるが、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃβ１－４（Ｎｅｕ５Ａｃα２－３）Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ（遊離糖）には結合できない、単離された特異的結合メンバー。
【請求項2】
図２ａ又は２ｂ又は２ｃ又は３ａの残基２７～３８（ＣＤＲＨ１）、５６～６５（ＣＤＲＨ２）又は１０５～１１６（ＣＤＲＨ３）として実質的に記載されるアミノ酸配列を有する結合ドメインから選択される１つ以上の結合ドメインを含む、請求項１に記載の結合メンバー。
【請求項3】
図２ａ又は２ｂ又は２ｃ又は３ａの残基１～１２７（ＶＨ）として実質的に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の結合メンバー。
【請求項4】
図２ｄ又は２ｅ又は２ｆ又は３ｂの残基２７～３８（ＣＤＲＬ１）、５６～６５（ＣＤＲＬ２）又は１０５～１１３（ＣＤＲＬ３）として実質的に記載されるアミノ酸配列を有する結合ドメインから選択される１つ以上の結合ドメインを含む、請求項１～３の何れかに記載の結合メンバー。
【請求項5】
図２ｄ又は２ｅ又は２ｆ又は３ｂの残基１～１２４（ＶＬ）として実質的に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の結合メンバー。
【請求項6】
図２ａ又は２ｂ又は２ｃ又は３ａのアミノ酸配列の残基１～１２７（ＶＨ）と、図２ｄ又は２ｅ又は２ｆ又は３ｂのアミノ酸配列の残基１～１２４（ＶＬ）とを含む、請求項１～５の何れかに記載の結合メンバー。
【請求項7】
前記又は各結合ドメインが、ヒト抗体フレームワークにより保有される、請求項２又は請求項４に記載の結合メンバー。
【請求項8】
ヒト定常領域をさらに含む、請求項１～７の何れかに記載の結合メンバー。
【請求項9】
前記結合メンバーが抗体又は抗体断片である、請求項１～８の何れかに記載の結合メンバー。
【請求項10】
図３ａで実質的に記載される重鎖アミノ酸配列と、図３ｂで実質的に記載される軽鎖アミノ酸配列とを含む、請求項８又は請求項９に記載の結合メンバー。
【請求項11】
請求項１～１０の何れか１項に記載の単離された特異的結合メンバーと競合する、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃβ１－４（Ｎｅｕ５Ａｃα２－３）Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ－セラミド（Ｆｕｃ－ＧＭ１糖脂質）に特異的に結合可能であるが、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃβ１－４（Ｎｅｕ５Ａｃα２－３）Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ（遊離糖）には結合可能ではない、単離された特異的結合メンバー。
【請求項12】
化学療法剤又は細胞傷害剤に結合させた又はそうでなければ会合させた、請求項１～１１の何れかに記載の結合メンバー。
【請求項13】
請求項１～１２の何れかに記載の結合メンバーと、薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤、担体、緩衝剤又は安定化剤とを含む医薬組成物。
【請求項14】
医学における使用のための、請求項１～１１の何れか１項に記載の結合メンバー。
【請求項15】
腫瘍を処置又は予防する方法における使用のための、請求項１～１１の何れか１項に記載の結合メンバー。
【請求項16】
腫瘍の処置における同時、個別又は連続使用のための組み合わせ調製物としての、請求項１～１１の何れか１項に記載の特異的結合メンバーと、活性薬剤と、を含有する製品。
【請求項17】
前記腫瘍が小細胞肺癌である、請求項１３若しくは請求項１５に記載の使用のための結合メンバー又は請求項１６に記載の製品。
【請求項18】
請求項１～１１の何れか１項に記載の結合メンバーをコードする核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、フコシル－ＧＭ１（Ｆｕｃ－ＧＭ１）に特異的に結合可能である特異的結合メンバー、例えば抗体及びその断片に関する。本発明はまた、医学におけるこのような結合メンバーの使用及びこのような結合メンバーをコードする核酸、Ｆｕｃ－ＧＭ１を検出するための方法、並びに抗Ｆｕｃ－ＧＭ１抗体を使用して癌を含む様々な疾患を処置するための方法にも関する。
【背景技術】
【0002】
Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃβ１－４（Ｎｅｕ５Ａｃα２－３）Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ－セラミド（本明細書中で以後、Ｆｕｃ－ＧＭ１糖脂質と呼ぶ）は、細胞膜中の分子を固定するセラミド脂質成分及び細胞表面で露出する炭水化物成分から構成されるスフィンゴ脂質モノシアロガングリオシドである。これは、異なるグルコシルトランスフェラーゼ（Ｉ型膜貫通タンパク質グリコシルセラミドシンテターゼ、β－ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＧＭ１シンテターゼ、α１，２－フコシルトランスフェラーゼ）を通じた、セラミド（スフィンゴシン及び脂肪酸）への糖及びシアル酸の逐次付加により生合成される（図１）（Ｋａｒｔａｌ Ｙａｎｄｉｍ，Ａｐｏｈａｎ，ａｎｄ Ｂａｒａｎ ２０１３；Ｔｏｋｕｄａ ｅｔ ａｌ．２００６）。これらの酵素のいくつかの過剰発現は、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）と関連付けられており（Ｍａｒｔｉｎ－Ｓａｔｕｅ ｅｔ ａｌ．１９９８）、Ｆｕｃ－ＧＭ１が腫瘍発達に関与することがさらに示唆される。糖鎖抗原は、癌の細胞表面で最も多く発現される抗原である（Ｆｅｉｚｉ １９８５）。ＳＣＬＣなどの一部の腫瘍タイプにおいて、化学療法に対する最初の応答は目を見張るものであるが、化学療法抵抗性の再発がすぐに続く。新規免疫療法による介入は、薬物抵抗性の再発の克服において成功を収める場合がある（Ｊｏｈｎｓｏｎ １９９５）。ガングリオシドＧＤ３及びＧＤ２などのいくつかの糖鎖抗原は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）による受動免疫療法の有効な標的として機能することが示されている（Ｉｒｉｅ ａｎｄ Ｍｏｒｔｏｎ １９８６；Ｈｏｕｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．１９８５）。ガングリオシド抗原は、臨床試験においてワクチンでの能動免疫療法の有効な標的であることも示されている（Ｋｒｕｇ ｅｔ ａｌ．２００４；Ｄｉｃｋｌｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９９；Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．１９９４）。実際に、ＫＬＨコンジュゲート抗原によるワクチン接種後にＦｕｃ－ＧＭ１に対する抗体価を生じたＳＣＬＣ患者由来の血清は、腫瘍細胞に対する特異的な結合及び腫瘍特異的な補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を示した。抗Ｆｕｃ－ＧＭ１抗体価関連毒性は軽度且つ一過性であり、限局型ＳＣＬＣの３名の患者は、１８、２４及び３０ヶ月で再発がなかった（Ｋｒｕｇ ｅｔ ａｌ．２００４；Ｄｉｃｋｌｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９９）。
【0003】
Ｆｕｃ－ＧＭ１発現は、ＳＣＬＣ症例の高いパーセンテージ、７５～９０％で示されており（Ｄｒｉｖｓｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ．１９９４）、他のガングリオシド抗原とは異なり、Ｆｕｃ－ＧＭ１糖脂質は正常組織では殆ど又は全く発現しない（Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．１９８４；Ｋｒｕｇ ｅｔ ａｌ．２００４；Ｂｒｅｚｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．１９８９；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．１９９７；Ｂｒｅｚｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．２０００；Ｆｒｅｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．１９８６；Ｂｒｅｚｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．１９９１；Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．１９８６）。Ｆｕｃ－ＧＭ１は、ＳＣＬＣ細胞株からの培養培地中、腫瘍抽出物及びヌードマウス異種移植片の血清中、並びに進行期疾患のＳＣＬＣ患者の血清中に存在することが実証されている（Ｖａｎｇｓｔｅｄ ｅｔ ａｌ．１９９１；Ｖａｎｇｓｔｅｄ ｅｔ ａｌ．１９９４）。これらの報告は、免疫療法剤により標的化され得る非常に特異的な腫瘍抗原としてのＦｕｃ－ＧＭ１に関する確かな証拠を提供する。
【0004】
従って、主にＦｕｃ－ＧＭ１糖脂質などのスフィンゴ糖脂質を標的とする肺癌抗原を認識する有効な薬剤及びこのような薬剤を使用する方法が所望される。Ｆｕｃ－ＧＭ１に結合するｍＡｂ（「Ｆ１２」）は当技術分野で公知である（Ｂｒｅｚｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．１９８９；Ｂｒｅｚｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．２０００）。さらに国際公開第２００７／０６７９９２号パンフレット及び同第２０１６／０４９２５６Ａ１号パンフレットは、抗Ｆｃ－ＧＭ１抗体を開示する。
【発明の概要】
【0005】
第１の態様では、本発明は、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃβ１－４（Ｎｅｕ５Ａｃα２－３）Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ－セラミド（Ｆｕｃ－ＧＭ１糖脂質）に特異的に結合可能であるが、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃβ１－４（Ｎｅｕ５Ａｃα２－３）Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ（遊離糖）には結合可能ではない、単離された特異的結合メンバーを提供する。
【0006】
本発明の単離された結合メンバーは、Ｆｕｃ－ＧＭ１糖脂質に結合するが、遊離糖には結合しない。本明細書中で実施例において詳述するように、細胞膜内で抗体がＦｕｃ－ＧＭ１を確実に認識するように、最初に免疫アジュバントとともにリポソーム中に製剤化したＦｕｃ－ＧＭ１糖脂質に対してｍＡｂを産生させた。しかし、これは高親和性抗体応答を誘導できなかった。Ｆｕｃ－ＧＭ１糖脂質の免疫原性を改善するために、これをＴ細胞キャリアであるヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）とコンジュゲートした。これは、親和性成熟に対するＴ細胞の支援を提供するために、オゾン分解による脂質鎖の１つの除去及びＨＳＡへの化学的コンジュゲーションにより達成された。さらなる免疫はＦｕｃ－ＧＭ１－ＨＳＡによって行った。予想外に、これは、Ｆｕｃ－ＧＭ１糖脂質に結合するが、遊離糖には結合しないＩｇＧ抗体を産生した。抗体は一般に脂質などの疎水性部分に結合しないので、抗体結合のために脂質鎖が存在する必要があることは、非常に驚くべきことである。興味深いことに、Ｆｕｃ－ＧＭ１－ＨＳＡに対して産生させたという事実にもかかわらず、これらの抗体は、１，０００～１０，０００倍高い親和性でＦｕｃ－ＧＭ１糖脂質及び腫瘍細胞に結合した。本明細書中で示される抗ＦｕｃＧＭ１ ｍａｂ、Ｆ１２は、ＧＭ１にも結合し、一方で本発明の結合メンバーはＧＭ１と交差反応しない。
【0007】
発明者らは、強力なインビボでの抗腫瘍活性を示す特異的結合メンバーを提供した。本発明の特異的結合メンバーは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及びＣＤＣを介して、インビトロでヒトＳＣＬＣ細胞に対する強力な免疫媒介性の細胞傷害活性を示す。発明者らは、細胞／グリカンコンジュゲートによって免疫することによって抗Ｆｕｃ－ＧＭ１糖脂質ｍＡｂを作製した。これらのｍＡｂの例は、本明細書中で、「ＦＬ１３３．６３」（図２ａ及びｄ）及び「ＦＬ１３３．６７（図２ｂ及びｅ）と呼ぶＩｇＧ３マウスｍＡｂ、「ＦＬ１３４．３３」と呼ぶＩｇＧ１ ｍＡｂ（図２ｃ及びｆ）及び「ＣＨ１３４」と呼ぶｈＩｇＧ１キメラＡｂ（図３）である。
【0008】
正常組織は２－ヒドロキシ脂肪酸含有脂質を発現しないので、本発明の特異的結合メンバーは、非常に限定的な通常の分布を有する。しかし、これらは、ＳＣＬＣに強く結合する。特異性は、ＦＬ１３３．６３／ＦＬ１３３．６７／ＦＬ１３４．３３／ＣＨ１３４．３３可変重鎖及び軽鎖領域の別個の配列において反映される。本発明の特異的結合メンバーは、２－ヒドロキシ脂肪酸含有脂質上で発現されるＳＣＬＣ特異的ガングリオシドに結合し得る。
【0009】
本発明の特異的結合メンバーは、好ましくは、図２ａ、ｂ、ｃ又は３ａの残基２７～３８（ＣＤＲＨ１）、５４～６５（ＣＤＲＨ２）又は１０５～１１６（ＣＤＲＨ３）として実質的に記載されるアミノ酸配列を有する結合ドメインから選択される１つ以上の結合ドメインを含む。特異的結合メンバーは、図２ａ、ｂ、ｃ又は３ａのアミノ酸配列の残基１０５～１１６（ＣＤＲＨ３）として実質的に記載されるアミノ酸配列を含む結合ドメインを含み得る。このような特異的結合メンバーは、図２ａ、ｂ、ｃ及び３ａで示されるアミノ酸配列の残基２７～３８（ＣＤＲＨ１）及び残基５６～６５（ＣＤＲＨ２）として実質的に記載されるアミノ酸配列を有する結合ドメインの一方又は両方、好ましくは両方をさらに含み得る。好ましい特異的結合メンバーは、
（ａ）図２ａのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３、
（ｂ）図２ｂのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３、
（ｃ）図２ｃのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３又は
（ｄ）図３ａのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３
を含む。
（ａ）図２ａのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３、
（ｂ）図２ｂのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３、
（ｃ）図２ｃのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３又は
（ｄ）図３ａのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３
を含む。
【0010】
本結合メンバーは、図２ａ、ｂ、ｃ又は３ａの１～１２７（ＶＨ）として実質的に記載されるアミノ酸配列を含み得る。
【0011】
特異的結合メンバーは、図２ｄ、ｅ、ｆ又は３ｂの残基２７～３８（ＣＤＲＬ１）、５６～６５（ＣＤＲＬ２）又は１０５～１１３（ＣＤＲＬ３）のアミノ酸配列を有する結合ドメインから選択される１つ以上の結合ドメインを含み得る。本結合メンバーは、図２ｄ、ｅ、ｆ又は３ｂのアミノ酸配列の残基１０５～１１３（ＣＤＲＬ３）として実質的に記載されるアミノ酸配列を有する結合ドメインを含み得る。このような特異的結合メンバーは、図２ｄ、ｅ、ｆ又は３ｂで示されるアミノ酸配列の残基２７～３８（ＣＤＲＬ１）及び残基５６～６５（ＣＤＲＬ２）として実質的に記載されるアミノ酸配列を有する結合ドメインの一方又は両方、好ましくは両方をさらに含み得る。好ましい特異的結合メンバーは、
（ａ）図２ｄのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３、
（ｂ）図２ｅのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３、
（ｃ）図２ｆのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３又は
（ｄ）図３ｂのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３
を含む。
（ａ）図２ｄのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３、
（ｂ）図２ｅのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３、
（ｃ）図２ｆのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３又は
（ｄ）図３ｂのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３
を含む。
【0012】
同じ又は異なる配列の複数の結合ドメインを含む特異的結合メンバー又はその組み合わせが本発明内に含まれる。従って、各結合ドメインは、ヒト抗体フレームワークにより保有され得る。例えば１つ以上の結合ドメインを、全ヒト抗体又はその可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）に置換してもよい。
【0013】
本発明の単離された特異的結合メンバーは、図２ｄ、ｅ、ｆ又は３ｂで示されるアミノ酸配列の残基１～１２４（ＶＬ）として実質的に記載されるアミノ酸配列を含む。
【0014】
本発明の単離された特異的結合メンバーは、図２ｄ、ｅ、ｆ又は３ｂの残基２７～３８（ＣＤＲＬ１）、５６～６５（ＣＤＲＬ２）又は１０５～１１３（ＣＤＲＬ３）として実質的に記載されるアミノ酸配列を有する結合ドメインのうち１つ以上、好ましくは全てと組み合わせて、図２ａ、ｂ、ｃ又は３ａの残基２７～３８（ＣＤＲＨ１）、５６～６５（ＣＤＲＨ２）又は１０５～１１６（ＣＤＲＨ３）として実質的に記載されるアミノ酸配列を有する結合ドメインのうち１つ以上、好ましくは全てを含み得る。本発明の好ましい単離された特異的結合メンバーは、
（ａ）図２ｄの残基２７～３８（ＣＤＲＬ１）、５６～６５（ＣＤＲＬ２）又は１０５～１１３（ＣＤＲＬ３）として実質的に記載されるアミノ酸配列を有する結合ドメインのうち１つ以上、好ましくは全てと組み合わせた、図２ａの残基２７～３８（ＣＤＲＨ１）、５６～６５（ＣＤＲＨ２）又は１０５～１１６（ＣＤＲＨ３）として実質的に記載されるアミノ酸配列を有する結合ドメインのうち１つ以上、好ましくは全て；
（ｂ）図２ｅの残基２７～３８（ＣＤＲＬ１）、５６～６５（ＣＤＲＬ２）又は１０５～１１３（ＣＤＲＬ３）として実質的に記載されるアミノ酸配列を有する結合ドメインのうち１つ以上、好ましくは全てと組み合わせた、図２ｂの残基２７～３８（ＣＤＲＨ１）、５６～６５（ＣＤＲＨ２）又は１０５～１１６（ＣＤＲＨ３）として実質的に記載されるアミノ酸配列を有する結合ドメインのうち１つ以上、好ましくは全て；
（ｃ）図２ｆの残基２７～３８（ＣＤＲＬ１）、５６～６５（ＣＤＲＬ２）又は１０５～１１３（ＣＤＲＬ３）として実質的に記載されるアミノ酸配列を有する結合ドメインのうち１つ以上、好ましくは全てと組み合わせた、図２ｃの残基２７～３８（ＣＤＲＨ１）、５６～６５（ＣＤＲＨ２）又は１０５～１１６（ＣＤＲＨ３）として実質的に記載されるアミノ酸配列を有する結合ドメインのうち１つ以上、好ましくは全て；又は
（ｄ）図３ｂの残基２７～３８（ＣＤＲＬ１）、５６～６５（ＣＤＲＬ２）又は１０５～１１３（ＣＤＲＬ３）として実質的に記載されるアミノ酸配列を有する結合ドメインのうち１つ以上、好ましくは全てと組み合わせた、図３ａの残基２７～３８（ＣＤＲＨ１）、５６～６５（ＣＤＲＨ２）又は１０５～１１６（ＣＤＲＨ３）として実質的に記載されるアミノ酸配列を有する結合ドメインのうち１つ以上、好ましくは全て
を含む。
（ａ）図２ｄの残基２７～３８（ＣＤＲＬ１）、５６～６５（ＣＤＲＬ２）又は１０５～１１３（ＣＤＲＬ３）として実質的に記載されるアミノ酸配列を有する結合ドメインのうち１つ以上、好ましくは全てと組み合わせた、図２ａの残基２７～３８（ＣＤＲＨ１）、５６～６５（ＣＤＲＨ２）又は１０５～１１６（ＣＤＲＨ３）として実質的に記載されるアミノ酸配列を有する結合ドメインのうち１つ以上、好ましくは全て；
（ｂ）図２ｅの残基２７～３８（ＣＤＲＬ１）、５６～６５（ＣＤＲＬ２）又は１０５～１１３（ＣＤＲＬ３）として実質的に記載されるアミノ酸配列を有する結合ドメインのうち１つ以上、好ましくは全てと組み合わせた、図２ｂの残基２７～３８（ＣＤＲＨ１）、５６～６５（ＣＤＲＨ２）又は１０５～１１６（ＣＤＲＨ３）として実質的に記載されるアミノ酸配列を有する結合ドメインのうち１つ以上、好ましくは全て；
（ｃ）図２ｆの残基２７～３８（ＣＤＲＬ１）、５６～６５（ＣＤＲＬ２）又は１０５～１１３（ＣＤＲＬ３）として実質的に記載されるアミノ酸配列を有する結合ドメインのうち１つ以上、好ましくは全てと組み合わせた、図２ｃの残基２７～３８（ＣＤＲＨ１）、５６～６５（ＣＤＲＨ２）又は１０５～１１６（ＣＤＲＨ３）として実質的に記載されるアミノ酸配列を有する結合ドメインのうち１つ以上、好ましくは全て；又は
（ｄ）図３ｂの残基２７～３８（ＣＤＲＬ１）、５６～６５（ＣＤＲＬ２）又は１０５～１１３（ＣＤＲＬ３）として実質的に記載されるアミノ酸配列を有する結合ドメインのうち１つ以上、好ましくは全てと組み合わせた、図３ａの残基２７～３８（ＣＤＲＨ１）、５６～６５（ＣＤＲＨ２）又は１０５～１１６（ＣＤＲＨ３）として実質的に記載されるアミノ酸配列を有する結合ドメインのうち１つ以上、好ましくは全て
を含む。
【0015】
本結合メンバーは、図２ａ、ｂ、ｃ又は３ａのアミノ酸配列の残基１～１２７（ＶＨ）として実質的に記載されるアミノ酸配列及び図２ｄ、ｅ、ｆ又は３ｂのアミノ酸配列の残基１～１２４（ＶＬ）として実質的に記載されるアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、本結合メンバーは、
（ａ）図２ａのアミノ酸配列の残基１～１２７（ＶＨ）として実質的に記載されるアミノ酸配列及び図２ｄのアミノ酸配列の残基１～１２４（ＶＬ）として実質的に記載されるアミノ酸配列、
（ｂ）図２ｂのアミノ酸配列の残基１～１２７（ＶＨ）として実質的に記載されるアミノ酸配列及び図２ｅのアミノ酸配列の残基１～１２４（ＶＬ）として実質的に記載されるアミノ酸配列、
（ｃ）図２ｃのアミノ酸配列の残基１～１２７（ＶＨ）として実質的に記載されるアミノ酸配列及び図２ｆのアミノ酸配列の残基１～１２４（ＶＬ）として実質的に記載されるアミノ酸配列、又は
（ｄ）図３ａのアミノ酸配列の残基１～１２７（ＶＨ）として実質的に記載されるアミノ酸配列及び図３ｂのアミノ酸配列の残基１～１２４（ＶＬ）として実質的に記載されるアミノ酸配列
を含む。
（ａ）図２ａのアミノ酸配列の残基１～１２７（ＶＨ）として実質的に記載されるアミノ酸配列及び図２ｄのアミノ酸配列の残基１～１２４（ＶＬ）として実質的に記載されるアミノ酸配列、
（ｂ）図２ｂのアミノ酸配列の残基１～１２７（ＶＨ）として実質的に記載されるアミノ酸配列及び図２ｅのアミノ酸配列の残基１～１２４（ＶＬ）として実質的に記載されるアミノ酸配列、
（ｃ）図２ｃのアミノ酸配列の残基１～１２７（ＶＨ）として実質的に記載されるアミノ酸配列及び図２ｆのアミノ酸配列の残基１～１２４（ＶＬ）として実質的に記載されるアミノ酸配列、又は
（ｄ）図３ａのアミノ酸配列の残基１～１２７（ＶＨ）として実質的に記載されるアミノ酸配列及び図３ｂのアミノ酸配列の残基１～１２４（ＶＬ）として実質的に記載されるアミノ酸配列
を含む。
【0016】
本明細書中に記載の所望の特性を有する単一の原型のｍＡｂ、例えばＦｕｃ－ＧＭ１糖脂質ｍＡｂが単離されると、当技術分野で公知の方法を使用することによって、同様の特性を持つ他のｍＡｂを作製することは容易である。例えば、Ｊｅｓｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４（Ｊｅｓｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．１９９４）の方法を使用して、同じエピトープ、及び従って原型のｍＡｂと同様の特性、を有するｍＡｂの選択を誘導してもよい。ファージディスプレイを使用して、最初に、原型抗体の重鎖を（好ましくはヒト）軽鎖のレパートリーと対にしてガングリオシド結合ｍＡｂを選択し、次に新しい軽鎖を（好ましくはヒト）重鎖のレパートリーと対にして、原型ｍＡｂと同じエピトープを有する（好ましくはヒト）ガングリオシド結合ｍＡｂを選択する。
【0017】
特異的結合メンバーは、抗体又は抗体断片、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ又はダイアボディーであり得る。本抗体はポリクローナル抗体であり得る。本抗体はモノクローナル抗体（ｍＡｂ）であり得る。本発明の抗体は、ヒト化されているか、キメラであるか又はベニヤ化（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）抗体であるか又は何らかの種の非ヒト抗体であり得る。
【0018】
マウス又はキメラ抗体は、患者において有害な抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応のリスク上昇を有する（Ｓｃｈｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．１９８５；Ａｚｉｎｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．２００６；Ｍｉｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．１９９９；Ｄ’Ａｒｃｙ ａｎｄ Ｍａｎｎｉｋ ２００１）。従って、殆どの承認済み治療用ｍＡｂは、ヒト化又は完全ヒトＩｇＧ抗体の何れかである。
【0019】
【0020】
【0021】
【0022】
【0023】
本発明は、図２ａ、ｂ、ｃ又は３ａの残基１～１２７のアミノ酸配列を有するＶＨ鎖及び図２ｄ、ｅ、ｆ又は３ｂの残基１～１２４のアミノ酸配列を有するＶＬ鎖、好ましくは、図２ｄのＶＬ鎖と組み合わせた図２ａのＶＨ鎖、図２ｅのＶＬ鎖と組み合わせた図２ｂのＶＨ鎖、図２ｆのＶＬ鎖と組み合わせた図２ｃのＶＨ鎖、図３ｂのＶＬ鎖と組み合わせた図３ａのＶＨ鎖、を含む抗体とＦｕｃ－ＧＭ１含有ガングリオシドへの結合について競合する結合メンバーをさらに提供する。
【0024】
Ｆｕｃ－ＧＭ１糖脂質に特異的に結合可能であるが、遊離糖（Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃβ１－４（Ｎｅｕ５Ａｃα２－３）Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）には結合できず、図２又は３のＶＨ又はＶＬドメインに対して、ＶＨ及び／又はＶＬドメインが少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％同一である特異的結合メンバーが本発明に含まれる。Ｆｕｃ－ＧＭ１に特異的に結合可能であり、図２又は３の重鎖及び／又は軽鎖と少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％同一である特異的結合メンバーが本発明に含まれる。好ましくは、このような抗体は、少数の機能的に重要ではないアミノ酸置換（例えば保存的置換）、欠失又は挿入により図２又は３の配列とは異なる。
【0025】
本発明の特異的結合メンバーは、検出可能又は機能性の標識を有し得る。
【0026】
さらなる態様では、本発明は、本発明の特異的結合メンバーをコードする単離された核酸、及び前記結合メンバーの発現をもたらす条件下で前記核酸を発現させること、及び結合メンバーを回収することを含む、本発明の特異的結合メンバーを調製する方法を提供する。Ｆｕｃ－ＧＭ１糖脂質に特異的に結合可能であるが、遊離糖（Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃβ１－４（Ｎｅｕ５Ａｃα２－３）Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）には結合できない特異的結合メンバーをコードし、本明細書中で提供される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％同一である、単離された核酸が本発明に含まれる。
【0027】
本発明の特異的結合メンバーは、ヒト又は動物の身体の処置又は診断方法、例えば患者（好ましくはヒト）に有効量の本発明の特異的結合メンバーを投与することを含む、患者（好ましくはヒト）における腫瘍の処置方法で使用され得る。本発明は、医学における使用のための、好ましくは腫瘍の処置での使用のための本発明の特異的結合メンバー、並びに腫瘍の診断又は処置のための薬剤の製造における本発明の特異的結合メンバーの使用も提供する。腫瘍は小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）であり得る。
【0028】
本発明の特異的結合メンバーが結合する抗原が本明細書中で開示される。本発明の特異的結合メンバーがより好ましくは特異的に結合可能なＦｕｃ－ＧＭ１糖脂質が提供され得る。Ｆｕｃ－ＧＭ１糖脂質は単離形態で提供され得、それに対するさらなる特異的結合メンバーを開発するためのスクリーニングにおいて使用され得る。例えば、Ｆｕｃ－ＧＭ１に特異的に結合するライブラリのメンバーに対して、化合物のライブラリがスクリーニングされ得る。Ｆｕｃ－ＧＭ１は脂質骨格上にあり得る。
【0029】
さらなる態様では、本発明は、ＳＣＬＣの診断又は予後判定での使用のための、本発明の第１の態様の単離された特異的結合メンバーを提供する。
【0030】
本発明は、個体からの試料中でＦｕｃ－ＧＭ１含有ＧＳＬを検出するために本発明の特異的結合メンバーを使用することを含む、癌の診断のための方法をさらに提供する。診断方法において、本結合メンバーにより検出されるガングリオシドのパターンは、個体に対する治療選択肢を層別化するために使用され得る。
【0031】
本発明のこれら及び他の態様を以下でさらに詳細に記載する。
【発明を実施するための形態】
【0032】
本明細書中で使用される場合、「特異的結合メンバー」は、互いに対して結合特異性を有する分子の対のメンバーである。特異的結合対のメンバーは、天然由来であってもよいし、又は完全に若しくは一部合成により作製されていてもよい。分子対の一方のメンバーは、その表面上で突出部又は空洞であり得る領域を有し、これは、分子対の他方のメンバーの特定の空間的及び正反対の構成に特異的に結合し、従ってそれと相補的である。このようにして、対のメンバーは、互いに対して特異的に結合する特性を有する。特異的な結合対のタイプの例は、抗原－抗体、ビオチン－アビジン、ホルモン－ホルモン受容体、受容体－リガンド、酵素－基質である。本発明は一般に、抗原－抗体型の反応に関するが、本明細書中で定義される抗原に結合する低分子にも関する。
【0033】
本明細書中で使用される場合、「処置」は、ヒト又は非ヒト動物、好ましくは哺乳動物に有益であり得る任意のレジメンを含む。処置は、既存の状態に関する処置であり得るか、又は予防的（予防的処置）であり得る。
【0034】
本明細書中で使用される場合、「腫瘍」は組織の異常な増殖である。これは、局所的（良性）であり得るか又は付近の組織（悪性）若しくは遠隔組織（転移性）に浸潤し得る。腫瘍は、癌を引き起こす新生物の増殖を含み、ＳＣＬＣ並びに癌性組織又は細胞株を含む。
【0035】
「抗体」という用語は、本明細書中で使用される場合、天然であれ、又は部分的若しくは全体に合成により作製されたものであれ、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性である部分、即ち抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子を指す。この用語は、抗体結合ドメインであるか又はそれと相同である結合ドメインを有するあらゆるポリペプチド又はタンパク質も包含する。これらは天然起源由来であってもよいし、又はこれらは、部分的若しくは完全に合成により作製されていてもよい。本発明の抗体の例は、免疫グロブリンアイソタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＡ）及びそれらのアイソタイプサブクラス；Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄなどの抗原結合ドメインを含む断片；及びダイアボディーである。好ましいアイソタイプは、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３である。抗体はポリクローナル又はモノクローナルであり得る。モノクローナル抗体は「ｍＡｂ」と呼ばれ得る。
【0036】
モノクローナル及び他の抗体並びに組み換えＤＮＡ技術を利用して、当初の抗体の特異性を保持する他の抗体又はキメラ分子を作製することが可能である。このような技術は、異なる免疫グロブリンの、定常領域、又は定常領域＋フレームワーク領域に、抗体の免疫グロブリン可変領域又はＣＤＲをコードするＤＮＡを導入することを含み得る。例えば欧州特許出願公開第Ａ－１８４１８７号明細書、英国特許第２１８８６３８Ａ号明細書又は欧州特許出願公開第Ａ－２３９４００号明細書を参照。抗体を産生するハイブリドーマ又は他の細胞は、産生される抗体の結合特異性を変更してもよいし又は変更しなくてもよい、遺伝子突然変異又は他の変化に供され得る。
【0037】
抗体は多くの方法で改変され得るので、「抗体」という用語は、何らかの特異的結合メンバー又は必要とされる特異性を有する結合ドメインを有する物質を包含するものとして解釈されるべきである。従って、この用語は、天然であれ、又は全体に若しくは部分的に合成により作製されたものであれ、免疫グロブリン結合ドメインを含む何らかのポリペプチドを含む、抗体、ヒト化抗体の、抗体断片、誘導体、機能的同等物及び相同体を包含する。従って、別のポリペプチドに融合される免疫グロブリン結合ドメインを含むキメラ分子又は同等物が含まれる。キメラ抗体のクローニング及び発現は、欧州特許出願公開第Ａ－０１２０６９４号明細書及び同第Ａ－０１２５０２３号明細書に記載されている。ヒト化抗体は、非ヒト、例えばマウスの抗体の可変領域及びヒト抗体の定常領域を有する改変抗体であり得る。ヒト化抗体を作製するための方法は、例えば米国特許第５２２５５３９号明細書に記載されている。
【0038】
全抗体の断片は、結合抗原の機能を発揮し得ることが示されている。結合断片の例は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片；（ｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｉｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．１９８９）；（ｖ）単離ＣＤＲ領域；（ｖｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、２つの連結したＦａｂ断片を含む二価断片；（ｖｉｉ）２つのドメインを会合させて抗原結合部位を形成可能にするペプチドリンカーによりＶＨドメイン及びＶＬドメインが連結した、１本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．１９８８；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．１９８８）；（ｖｉｉｉ）二特異性１本鎖Ｆｖ二量体（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５号パンフレット）及び；（ｉｘ）「ダイアボディー」、遺伝子融合により構築される多価又は多特異性断片（国際公開第９４／１３８０４号パンフレット；（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐｒｏｓｐｅｒｏ，ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ １９９３））である。
【0039】
ダイアボディーはポリペプチドの多量体であり、各ポリペプチドが免疫グロブリン軽鎖の結合領域を含む第１のドメイン及び免疫グロブリン重鎖の結合領域を含む第２のドメインを含み、（例えばペプチドリンカーにより）この２つのドメインが連結されるが、互いに会合して抗原結合部位を形成することはできず：抗原結合部位は、多量体内の１つのポリペプチドの第１のドメインと多量体内の別のポリペプチドの第２のドメインとの会合により形成される（国際公開第９４／１３８０４号パンフレット）。
【0040】
二特異性抗体を使用しようとする場合、これらは、様々な方法で製造され得る（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ １９９３）、例えば化学的に又はハイブリッドハイブリドーマから調製され得る、従来からの二特異性抗体であり得るか、又は上述の二特異性抗体断片の何れかであり得る。全抗体よりも、ｓｃＦｖ二量体又はダイアボディーを使用することは好適であり得る。ダイアボディー及びｓｃＦｖは、可変ドメインのみを使用してＦｃ領域なしで構築することができ、抗イディオタイプ反応の効果を低減させる可能性がある。二特異性抗体の他の形態は、（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ，Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ，ａｎｄ Ｋａｒｊａｌａｉｎｅｎ １９９１）に記載の１本鎖「Ｊａｎｕｓｉｎｓ」を含む。
【0041】
二特異性ダイアボディーは、二特異性全抗体とは対照的に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で容易に構築され、発現され得るので有用であり得る。適切な結合特異性のダイアボディー（及び抗体断片などの多くの他のポリペプチド）は、ファージディスプレイ（国際公開第９４／１３８０４号パンフレット）を使用してライブラリから容易に選択され得る。ダイアボディーの一方のアームが、例えば抗原Ｘに対する特異性に関して一定に維持される場合、他方のアームを変化させ、適切な特異性の抗体が選択されるライブラリを作製することができる。
【0042】
「結合ドメイン」は、抗原の一部又は全てと特異的に結合し、それと相補的である領域を含む特異的結合メンバーの一部である。結合メンバーが抗体又はそれらの抗原結合断片である場合、結合ドメインはＣＤＲであり得る。抗原が大きい場合、抗体は、エピトープと呼ばれる抗原の特定の部分にのみ結合し得る。抗原結合ドメインは、１つ以上の抗体可変ドメインにより提供され得る。抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含み得る。
【0043】
「特異的な」は一般に、特異的結合対の一方のメンバーが、その特異的結合パートナー以外の分子に対して全く有意な結合を示さない、例えば何らかの他の分子と約３０％未満、好ましくは２０％、１０％又は１％の交差反応性を有する状況を指すために使用される。この用語は、例えば抗原結合ドメインが、複数の抗原が保有する特定のエピトープに特異的である場合も適用可能であり、この場合、抗原結合ドメインを保有する特異的結合メンバーは、エピトープを保有する様々な抗原に結合可能である。
【0044】
「単離された」は、本発明に従って、本発明の特異的結合メンバー又はこのような結合メンバーをコードする核酸が好ましくはそうあるべき状況を指す。メンバー及び核酸は一般に、それらの天然の環境又はこのような調製がインビトロ若しくはインビボで実施される組み換えＤＮＡ技術による場合はそれらが調製される環境（例えば細胞培養）において、それらと一緒に見出される他のポリペプチド又は核酸など、それらが本来会合している物質を含まないか又は実質的に含まない。特異的結合メンバー及び核酸は、希釈剤又はアジュバントとともに製剤化されてもよく、それでもなお実践的な目的に関しては単離されており－例えばメンバーは通常、免疫アッセイで使用するためのマイクロタイタープレートをコーティングするために使用される場合はゼラチン若しくは他の担体と混合されるか、又は診断若しくは治療で使用される場合は薬学的に許容可能な担体若しくは希釈剤と混合される。特異的結合メンバーは、天然に若しくは異種真核細胞の系の何れかによりグリコシル化され得るか、又はそれらは、（例えば原核細胞での発現により作製される場合）非グリコシル化状態であり得る。
【0045】
「実質的に記載される」とは、本発明のアミノ酸配列が参照されるアミノ酸配列と同一であるか又は高度に相同であるかの何れかであることを意味する。「高度に相同であるい」とは、配列においてなされ得る１～５個、１～４個、１～３個、２個又は１個の置換があり得ることが企図される。
【0046】
本発明は、その範囲内に、図２又は３で記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、図２又は３で記載される核酸配列を有するポリヌクレオチド及びそれと実質的な同一性、例えばそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を有する配列も含む。２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列のパーセント同一性は一般に、最適な比較の目的のために配列を整列させ（例えば第２の配列との最良のアライメントのために第１の配列においてギャップを導入し得る）、対応する位置でアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較することによって決定される。「最良のアライメント」は、最大のパーセント同一性が得られる２つの配列のアライメントである。パーセント同一性は、配列内の同一であるアミノ酸残基又はヌクレオチドの数を比較することにより決定される（即ち％同一性＝同一である位置の数／位置の総数×１００）。
【0047】
２つの配列間のパーセント同一性の決定は、当業者に公知の数学アルゴリズムを使用して達成され得る。２つの配列を比較するための数学アルゴリズムの例は、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０（Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ １９９０）のアルゴリズムであり、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ，１９９３（Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ １９９３）のように改変されている。Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．１９９０）のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムはこのようなアルゴリズムを組み込んでいる。本発明の核酸分子に対して相同であるヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２でＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を行うことができる。本発明のタンパク質分子と相同であるアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３でＢＬＡＳＴタンパク質検索を行うことができる。比較目的のためにギャップ付きのアライメントを得る場合、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．１９９７）に記載されるＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用することができる。或いは、分子間の遠い関係を検出する繰り返し検索を行うために、ＰＳＩ－Ｂｌａｓｔを使用することができる（Ｉｄ．）。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ及びＰＳＩ－Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、個々のプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを使用することができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照。配列の比較のために利用される数学アルゴリズムの別の例は、Ｍｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒ，１９８９（Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ １９８９）のアルゴリズムである。ＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）はこのようなアルゴリズムを組み込んでいる。当技術分野で公知の配列分析のための他のアルゴリズムとしては、Ｔｏｒｅｌｌｉｓ及びＲｏｂｏｔｔｉ，１９９４（Ｔｏｒｅｌｌｉ ａｎｄ Ｒｏｂｏｔｔｉ １９９４）に記載されるＡＤＶＡＮＣＥ及びＡＤＡＭ；及びＰｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ、１９８８（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ １９８８）に記載のＦＡＳＴＡが挙げられる。ＦＡＳＴＡ内で、ｋｔｕｐは、検索の感度及び速度を設定するコントロールオプションである。
【0048】
本発明の単離された特異的結合メンバーは、特異的なスフィンゴ糖脂質（ＧＳＬ）に結合可能であるが、スフィンゴ糖脂質の遊離糖には結合できない。非常に異常なことであるが、本発明の結合メンバーは、結合するために脂質の存在を必要とする。ＧＳＬは、構造的にセラミド脂質部分（アミド結合により脂肪酸に連結されるスフィンゴシン）に連結されるグリカンからなる非常に多様な分子群である。セラミド構造は長さ及び飽和度が異なり、それがＧＳＬ種の多様性を増大させているが、多様性の主な起源はグリカン頭部基に由来する。直線的にしか結合できないアミノ酸又は核酸と比較して、炭水化物は、複数箇所で互いに結合することができる。図２ａ、ｂ、ｃ又は３ａの残基１０５～１１６（ＣＤＲＨ３）及び図２ｄ、ｅ、ｆ又は３ｂの１０５～１１３（ＣＤＲＬ３）として実質的に記載されるアミノ酸配列を含む、クラススイッチし、親和性成熟した抗体標的化ドメインは、Ｆｕｃ－ＧＭ１ガングリオシドへのこれらの領域の結合を可能にする構造において保有され得る。
【0049】
本発明の結合ドメインを保有するための構造は、一般に、結合ドメインが再構成された免疫グロブリン遺伝子によりコードされる天然に存在するＶＨ及びＶＬ抗体可変ドメインのＣＤＲ３領域に対応する位置に位置する、抗体重鎖又は軽鎖配列又はその実質的な部分である。免疫グロブリン可変ドメインの構造及び位置は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／を参照することによって決定され得る。図２ａ、ｂ、ｃ又は３ａの残基１０５～１１６として実質的に記載されるアミノ酸配列は、ヒト重鎖可変ドメイン又はその実質的な部分においてＣＤＲ３として保有され得、図２ｄ、ｅ、ｆ又は３ｂの残基及び１０５～１１３として実質的に記載されるアミノ酸配列は、ヒト軽鎖可変ドメイン又はその実質的な部分においてＣＤＲ３として保有され得る。
【0050】
可変ドメインは、何らかの生殖系列若しくは再構成されたヒト可変ドメイン由来であり得るか、又は公知のヒト可変ドメインのコンセンサス配列に基づく合成可変ドメインであり得る。本発明のＣＤＲ３由来配列は、組み換えＤＮＡ技術を使用して、ＣＤＲ３領域を欠く可変ドメインのレパートリーに導入され得る。例えばＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．１９９２）は、抗体可変ドメインのレパートリーを作製する方法を記載し、ＣＤＲ３を欠くＶＨ可変ドメインのレパートリーを提供するために、ヒトＶＨ遺伝子の第３のフレームワーク領域に対するコンセンサスプライマーとともに、可変ドメイン領域の５’末端に向けられるか又はそれに隣接するコンセンサスプライマーを使用する。Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．１９９２）は、どのようにこのレパートリーが特定の抗体のＣＤＲ３と組み合わせられ得るかをさらに記載する。類似の技術を使用して、本発明のＣＤＲ３由来配列をＣＤＲ３を欠くＶＨ又はＶＬドメインのレパートリーとシャッフルしてもよく、シャッフルされた完全なＶＨ又はＶＬドメインを、同族のＶＬ又はＶＨドメインと組み合わせて本発明の特異的結合メンバーを提供してもよい。次に、適切な特異的結合メンバーが選択され得るように、国際公開第９２／０１０４７号パンフレットのファージディスプレイ系などの適切な宿主系においてレパートリーを提示してもよい。レパートリーは、少なくとも１０４個の個々のメンバー、例えば１０６～１０８又は１０１０個のメンバーの何れかからなり得る。
【0051】
類似のシャッフリング又はコンビナトリアル技術も、Ｓｔｅｍｍｅｒ，１９９４（Ｓｔｅｍｍｅｒ １９９４）によって開示されており、彼らはベータ－ラクタマーゼ遺伝子に関連する技術を記載しているが、このアプローチが抗体作製のために使用され得ることを述べている。さらなる代替法は、可変ドメイン全体内で突然変異を作製するために例えばＦｕｃ－ＧＭ１ ＶＨ又はＶＬ遺伝子のランダム突然変異誘発を使用して本発明のＣＤＲ３由来配列を保有する新規ＶＨ又はＶＬ領域を作製することである。このような技術は、エラープローンＰＣＲを使用したＧｒａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９２（Ｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．１９９２）により記載されている。
【0052】
使用され得る別の方法は、ＶＨ又はＶＬ遺伝子のＣＤＲ領域に対して突然変異誘発を方向づけることである。このような技術は、Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４（Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．１９９４）及びＳｃｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６（Ｓｃｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９６）によって開示される。免疫グロブリン可変ドメインの実質的な部分は一般に、それらの介在フレームワーク領域と共に、少なくとも３つのＣＤＲ領域を含む。この部分は、第１及び第４のフレームワーク領域の何れか又は両方の少なくとも約５０％も含み得、この５０％は、第１のフレームワーク領域のＣ末端５０％及び第４のフレームワーク領域のＮ末端５０％である。可変ドメインの実質的な部分のＮ末端又はＣ末端のさらなる残基は、天然に存在する可変ドメイン領域に通常は会合しない残基であり得る。例えば、組み換えＤＮＡ技術により作製される本発明の特異的結合メンバーの構築の結果、免疫グロブリン重鎖、他の可変ドメイン（例えばダイアボディーの作製において）又は以下で詳細に論じるようなタンパク質標識を含むさらなるタンパク質配列に本発明の可変ドメインを連結するためのリンカーの導入を含む、クローニング又は他の操作段階を促進するために導入されるリンカーによってコードされるＮ又はＣ末端残基の導入が起こり得る。
【0053】
本発明は、図２及び３で実質的に記載されるＶＬ及びＶＨ領域のアミノ酸配列、即ち図２ａ、ｂ、ｃ又は３ａのアミノ酸１～１２７（ＶＨ）及び図２ｄ、ｅ、ｆ又は３ｂのアミノ酸１～１２４（ＶＬ）に基づく、結合ドメインの対を含む特異的結合メンバーを提供する。これらの配列の何れかに基づく単一の結合ドメインは、本発明のさらなる態様を形成する。図２ａ、ｂ、ｃ又は３ａで実質的に記載されるＶＨ領域のアミノ酸配列に基づく結合ドメインの場合、このような結合ドメインは、免疫グロブリンＶＨドメインが標的抗原に特異的に結合可能であることが公知であるので、標的化物質として使用され得る。１本鎖特異的結合ドメインの何れかの場合、これらのドメインを使用して、本明細書中で開示されるＦＬ１３３／４抗体と同じように良好であるか又は同等であるインビボ特性を有する２ドメイン特異的結合メンバーを形成可能な相補性ドメインについてスクリーニングしてもよい。
【0054】
これは、国際公開第９２／０１０４７号パンフレットで開示されるいわゆる階層的二重コンビナトリアルアプローチを使用するファージディスプレイスクリーニング法により達成され得るが、この方法ではＨ又はＬ鎖クローンの何れかを含有する個々のコロニーを使用して、他の鎖（Ｌ又はＨ）をコードするクローンの完全ライブラリに感染させ、得られた２鎖特異的結合メンバーを、その参考文献に記載される技術などのファージディスプレイ技術に従い選択する。この技術は、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２（（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．１９９２）でも開示される。
【0055】
本発明の特異的結合メンバーは、抗体定常領域又はその一部をさらに含み得る。例えば、図２ｄ、ｅ、ｆ又は３ｂで示されるＶＬ領域に基づく特異的結合メンバーを、それらのＣ末端で抗体軽鎖定常ドメインに連結してもよい。同様に、図２ａ、ｂ、ｃ又は３ａで示されるＶＨ領域に基づく特異的結合メンバーを、それらのＣ末端で、何れかの抗体アイソタイプ、例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ及びＩｇＭ、並びにアイソタイプサブクラス、特にＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４の何れか由来の免疫グロブリン重鎖の全て又は一部に連結してもよい。
【0056】
本発明の特異的結合メンバーは、ヒト又は動物対象における腫瘍の診断及び処置の方法において使用することができる。
【0057】
診断で使用される場合、本発明の特異的結合メンバーは、抗体イメージングの技術分野で公知の従来の化学を使用して、本発明の特異的結合メンバーに連結され得る、検出可能な標識、例えば放射性標識、１３１Ｉ又は９９Ｔｃで標識され得る。標識は、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素標識も含む。標識は、特異的な同族の検出可能部分、例えば標識されたアビジンへの結合を介して検出され得るビオチンなどの化学部分をさらに含む。
【0058】
本発明の特異的結合メンバーは、機能的標識で標識され得る。機能的標識は、癌の部位に標的化されてその破壊を引き起こすように設計される物質を含む。このような機能的標識は、リシンなどの毒素及びプロドラッグを活性薬に変換可能な細菌性カルボキシペプチダーゼ又はニトロレダクターゼなどの酵素を含む。さらに、特異的結合メンバーを、化学療法剤又は細胞傷害剤、例えばマイタンシン（ＤＭ１及びＤＭ４）、オニド（ｏｎｉｄｅ）、アウリスタチン、カリケアマイシン、デュオカマイシン、ドキソルビシン又は放射性標識、例えば９０Ｙ又は１３１Ｉに結合させてもよく又はそうでなければ会合させてもよい。
【0059】
さらに、本発明の特異的結合メンバーは、処置される状態に応じて、単独で又は他の処置と組み合わせて、同時又は連続的の何れかで投与され得る。従って、本発明は、腫瘍の処置における同時、個別又は連続使用のための組み合わせ調製物としての本発明の特異的結合メンバー及び活性薬剤を含有する製品をさらに提供する。活性薬剤は、本発明の結合メンバーと相乗的に作用し得る、５－フルオロウラシル、シスプラチン、マイトマイシンＣ、オキサリプラチン及びタモキシフェンを含む、化学療法剤又は細胞傷害剤を含み得る。他の活性薬剤は、非ステロイド性抗炎症薬（例えばアスピリン、パラセタモール、イブプロフェン若しくはケトプロフェン）若しくはオピエート（ｏｐｉｔａｔｅ）、例えばモルヒネ、などの鎮痛薬、又は制吐薬の適切な用量を含み得る。
【0060】
理論により縛られることを望むものではないが、本発明の結合メンバーが腫瘍死滅を促進するための活性薬剤と相乗作用する能力は、免疫エフェクター機序によるのではなく、むしろ細胞表面結合Ｆｕｃ－ＧＭ１ガングリオシドに結合メンバーが結合することの直接的な結果であり得る。免疫チェックポイント分子に対する抗体を含む癌免疫療法は、様々な悪性腫瘍に対して、及び異なる免疫腫瘍処置モダリティーと組み合わせて、有効性を示した。
【0061】
本発明の特異的結合メンバーは通常、特異的結合メンバーに加えて、少なくとも１つの成分を含み得る医薬組成物の形態で投与される。本医薬組成物は、活性成分に加えて、薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤、担体、緩衝剤、安定化剤又は当業者にとって周知の他の物質を含み得る。このような物質は非毒性でなければならず、活性成分の有効性を妨害してはならない。担体又は他の物質の正確な性質は、経口、又注射、例えば静脈内であり得る投与経路に依存する。注射は、組成物の治療的投与のための主な経路であると予想されるが、カテーテル又は他の外科的チュービングを通じた送達も使用される。いくつかの適切な投与経路は、静脈内、皮下、腹腔内及び筋肉内投与を含む。液体製剤は、粉末製剤からの再構成後に利用され得る。
【0062】
静脈内注射又は罹患部位での注射の場合、活性成分は、パイロジェンフリーであり、適切なｐＨ、等張性及び安定性を有する非経口的に許容可能な水溶液の形態である。当業者は、例えば塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、ラクトリンゲル注射液など、等張ビヒクルを使用して適切な溶液を調製することが十分可能である。保存剤、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤及び／又は他の添加剤が必要に応じて含まれ得る。
【0063】
経口投与用の医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末又は液体形態であり得る。錠剤は、ゼラチン又はアジュバントなどの固形担体を含み得る。液体医薬組成物は一般に、水、石油、動物又は植物油、鉱物油又は合成油などの液体担体を含む。生理食塩水溶液、デキストロース若しくは他の糖溶液又はエチレングリコール、プロピレングリコール若しくはポリエチレングリコールなどのグリコールが含まれ得る。製剤が液体である場合、これは例えば、ｐＨ６．８～７．６の非リン酸緩衝液又は凍結乾燥粉末を含有する生理食塩水溶液であり得る。
【0064】
本組成物はまた、ミクロスフェア、リポソーム、他の微粒子送達系又は血液を含むある特定の組織中に留置される持続放出製剤を介して送達され得る。持続放出担体の適切な例は、シェアドアーティクル（ｓｈａｒｅｄ ａｒｔｉｃｌｅ）、例えば坐薬又はマイクロカプセルの形態の半透性のポリマーマトリクスを含む。埋め込み可能型又はマイクロカプセル型の持続放出マトリクスは、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号明細書；欧州特許出願公開第Ａ－００５８４８１号明細書）Ｌ－グルタミン酸とガンマエチル－Ｌ－グルタマートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．１９８３）、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリラート）を含む。ポリペプチドを含有するリポソームは、周知の方法：独国特許出願公開第３，２１８，１２１Ａ号明細書；（Ｅｐｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．１９８５）；（Ｈｗａｎｇ，Ｌｕｋ，ａｎｄ Ｂｅａｕｍｉｅｒ １９８０）；欧州特許出願公開第Ａ－００５２５２２号明細書；同第Ａ－００３６６７６号明細書；同第Ａ－００８８０４６号明細書；同第Ａ－０１４３９４９号明細書；同第Ａ－０１４２５４１号明細書；特開８３－１１８０８号公報；米国特許第４，４８５，０４５号明細書及び同第４，５４４，５４５号明細書によって調製される。通常、リポソームは、脂質含量が約３０ｍｏｌ．％コレステロールよりも多い小型の（約２００～８００オングストローム）単層タイプであり、選択される割合はポリペプチド漏出の最適比率となるように調整される。本組成物は、腫瘍部位若しくは他の所望の部位に局所的に投与され得るか、又はそれが腫瘍若しくは他の細胞を標的とするように送達され得る。
【0065】
本組成物は好ましくは、「治療的有効量」で個体に投与され、これは、個体に対する利益を示すために十分である。投与される実際の量及び投与の速度及び時間経過は、処置されるものの性質及び重症度に依存する。処置の処方、例えば投与量の選択などは、一般開業医及び他の医師の責任の範囲内であり、一般的には、処置される障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法及び医師にとって公知の他の要因を考慮する。本発明の組成物は、既存の腫瘍、特に癌の処置及び最初の処置又は外科手術後のこのような状態の再発の予防に特に適切である。上述の技術及びプロトコールの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｌｏ，Ａ．（ｅｄ），１９８０（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ １９８０）で見ることができる。
【0066】
最適な用量は、例えば年齢、性別、体重、処置している状態の重症度、投与される活性成分及び投与経路を含む多くのパラメーターに基づいて医師によって決定され得る。一般に、受容体の飽和を可能にするポリペプチド及び抗体の血清中濃度が所望される。およそ０．１ｎＭを超える濃度は通常十分である。例えば、抗体の１００ｍｇ／ｍ２の用量は、およそ８日間にわたりおよそ２０ｎＭの血清中濃度を提供する。
【0067】
大まかな指針として、抗体の用量は、１０～３００ｍｇ／ｍ２の量で毎週与えられ得る。Ｆｕｃ－ＧＭ１炭水化物の飽和を可能にする濃度を超過して血清レベルを維持するために、より頻繁な間隔で抗体断片の同等用量を使用すべきである。本組成物の用量は、十分に医師の技術の範囲内であるとおり、結合メンバーの特性、例えばその結合活性及びインビボ血漿中半減期、製剤中のポリペプチドの濃度、投与経路、投与部位及び投与速度、関与する患者の臨床忍容性、患者が罹患している病状などに依存する。例えば、抗体３００μｇ／患者／投与の用量が好ましいが、投与量は約１０μｇ～６ｍｇ／用量の範囲であり得る。一連の連続する接種中に異なる投与量が利用され；医師は、最初の接種を投与し、次に比較的より少量の抗体用量でブースト接種を行い得る。
【0068】
本発明は、癌に対する防御免疫応答を促進するための最適化された免疫スケジュールも対象とする。
【0069】
本発明の結合メンバーは、完全に又は部分的に化学合成により作製され得る。本結合メンバーは、十分に確立された標準的な液相、又は好ましくは、その全般的な説明が広く利用可能である固相ペプチド合成法に従い容易に調製され得るか（例えばＪ．Ｍ．Ｓｔｅｗａｒｔ及びＪ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ，１９８４において（Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ １９８４）、Ｍ．Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ及びＡ．Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ，１９８４（Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ ａｎｄ Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ １９８４）を参照）、又はそれらは、液相法による溶液中、又は固相、液相及び溶液化学の何れかの組み合わせにより、例えばそれぞれのペプチド部分を最初に完成させ、次いで所望され、適切である場合、存在する全ての保護基を除去した後、個々のカルボン酸又はスルホン酸又はその反応性誘導体の反応によって残基Ｘを導入することによって調製され得る。
【0070】
本発明による結合メンバーを作製する別の都合の良い方法は、発現系での核酸の使用によって、それをコードする核酸を発現させることである。
【0071】
本発明は、本発明の特異的結合メンバーをコードする単離核酸をさらに提供する。核酸はＤＮＡ及びＲＮＡを含む。好ましい態様では、本発明は、上記で定められる本発明の特異的結合メンバーをコードする核酸を提供する。このような核酸の例を図２及び３で示す。当業者は、本発明の特異的結合メンバーをなおも提供するこのような核酸に対する置換、欠失及び／又は付加を決定可能である。
【0072】
本発明はまた、上記の少なくとも１つの核酸を含むプラスミド、ベクター、転写又は発現カセットの形態のコンストラクトも提供する。本発明は、上記の１つ以上のコンストラクトを含む組み換え宿主細胞も提供する。言及したように、コード核酸からの発現を含む特異的結合メンバーの産生方法と同様に、本発明の特異的結合メンバーをコードする核酸は、本発明の一態様を形成する。発現は、核酸を含有する組み換え宿主細胞を適切な条件下で培養することによって、都合よく達成され得る。発現による産生後、特異的結合メンバーは、何れかの適切な技術を使用して単離及び／又は精製され、次いで適切に使用され得る。
【0073】
様々な異なる宿主細胞でのポリペプチドのクローニング及び発現のための系は周知である。適切な宿主細胞としては、細菌、哺乳動物細胞、酵母及びバキュロウイルス系が挙げられる。異種ポリペプチドの発現のための当技術分野で利用可能な哺乳動物細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、新生児ハムスター腎臓細胞、ＮＳＯマウスメラノーマ細胞及び多くの他の細胞が挙げられる。一般的な好ましい細菌宿主は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの原核細胞における抗体及び抗体断片の発現は、当技術分野で十分に確立されている。概説については、例えばＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，１９９１（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ １９９１）を参照のこと。培養における真核細胞での発現も特異的結合メンバー産生のための選択肢として当業者にとって利用可能であり、最新の概説については、例えばＲｅｆｆ，１９９３（Ｒｅｆｆ １９９３）；Ｔｒｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９５（Ｔｒｉｌｌ，Ｓｈａｔｚｍａｎ ａｎｄ Ｇａｎｇｕｌｙ １９９５）を参照のこと。
【0074】
必要に応じて、プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子及び他の配列を含む適切な制御配列を含有する適切なベクターが選択され得るか又は構築され得る。ベクターは、必要に応じて、プラスミド、ウイルス、例えばファージ又はファージミドであり得る。さらなる詳細については、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９（Ｓａｍｂｒｏｏｋ １９８９）を参照。例えば核酸コンストラクトの調製、突然変異誘発、シーケンシング、細胞へのＤＮＡの導入及び遺伝子発現及びタンパク質の分析における核酸の操作のための多くの既知の技術及びプロトコールは、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９２（Ａｕｓｕｂｅｌ １９９２）で詳述されている。
【0075】
従って、本発明のさらなる態様は、本明細書中で開示される核酸を含有する宿主細胞を提供する。またさらなる態様は、このような核酸を宿主細胞に導入することを含む方法を提供する。導入はあらゆる利用可能な技術を使用し得る。真核細胞の場合、適切な技術は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクション及び、レトロウイルス又は他のウイルス、例えばワクシニアを使用した、又は昆虫細胞の場合はバキュロウイルスを使用する形質導入を含み得る。細菌細胞の場合、適切な技術は、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーション及びバクテリオファージを使用するトランスフェクションを含み得る。導入の後、例えばその遺伝子の発現のための条件下で宿主細胞を培養することによって、核酸からの発現を引き起こすか又は発現を可能にし得る。
本発明の核酸は、宿主細胞のゲノム（例えば染色体）に組み込まれ得る。組み込みは、標準的な技術に従い、ゲノムとの組み換えを促進する配列を含むことによって促進され得る。
本発明の核酸は、宿主細胞のゲノム（例えば染色体）に組み込まれ得る。組み込みは、標準的な技術に従い、ゲノムとの組み換えを促進する配列を含むことによって促進され得る。
【0076】
本発明は、上記の特異的結合メンバー又はポリペプチドを発現させるために、発現系において上記のコンストラクトを使用することを含む方法も提供する。
【0077】
本発明の各態様の好ましい特性は、必要な変更を加えて他の態様のそれぞれに関するとおりである。本明細書中で言及される先行技術文書は、法律によって許可される最大限まで組み込まれる。
【0078】
本明細書中で開示されるＦＬ１３３／４ ｍＡｂは、ＡＤＣＣ及びＣＤＣを通じて強力なインビトロ細胞傷害性活性を示した。
【0079】
ここで次の非限定的な実施例及び添付の図面において、本発明をさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【0080】
【図1】Ｆｕｃ－ＧＭ１糖脂質の生合成経路。Ｃｅｒ、セラミド；Ｆｕｃ、フコース；ＦｕｃＧｍ１、フコシル－ＧＭ１；Ｇａｌ、ガラクトース；ＧａｌＮａｃ、Ｎ－アセチルガラクトサミン；Ｇｌｃ、グルコース；ＬａｃＣｅｒ ラクトシルセラミド；ＳＡ、シアル酸。
【図2a】マウスＦＬ１３３．６３ ＩｇＧ３重鎖可変ドメインのアミノ酸及びヌクレオチド配列。数字は、抗体配列のナンバリングのための規格化されたＩＭＧＴ系を指す（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．２００９）。
【図2b】マウスＦＬ１３３．６７ ＩｇＧ３重鎖可変ドメインのアミノ酸及びヌクレオチド配列。数字は、抗体配列のナンバリングのための規格化されたＩＭＧＴ系を指す（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．２００９）。
【図2c】マウスＦＬ１３４．３３ ＩｇＧ１重鎖のアミノ酸及びヌクレオチド配列。数字は、抗体配列のナンバリングのための規格化されたＩＭＧＴ系を指す（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．２００９）。
【図2d】マウスＦＬ１３３．６３カッパ鎖のアミノ酸及びヌクレオチド配列。数字は、抗体配列のナンバリングのための規格化されたＩＭＧＴ系を指す（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．２００９）。
【図2e】マウスＦＬ１３３．６７カッパ鎖のアミノ酸及びヌクレオチド配列。数字は、抗体配列のナンバリングのための規格化されたＩＭＧＴ系を指す（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．２００９）。
【図2f】マウスＦＬ１３４．３３カッパ鎖のアミノ酸及びヌクレオチド配列。数字は、抗体配列のナンバリングのための規格化されたＩＭＧＴ系を指す（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．２００９）。
【図3a】ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域にキメラ化されたマウスＦＬ１３４．３３重鎖可変領域のアミノ酸及びヌクレオチド配列。
【図3b】ヒトカッパ鎖定常領域にキメラ化されたマウスＦＬ１３４．３３カッパ鎖可変領域のアミノ酸及びヌクレオチド配列。
【図4】ＧＳＬフコシルＧＭ１のオゾン分解及び還元性アミノ化を介したタンパク質担体に対するその後の結合の略図。反応性オゾンは、ＧＳＬのスフィンゴシン部分の二重結合を攻撃し、安定な遊離アルデヒド基を生成させ、次にこれを使用して還元性アミノ化の工程によってタンパク質にＧＳＬを結合させることができる。ここで、アルデヒドは、一級アミンと反応して、最初に不安定なシッフ塩基を形成し、これは安定な二級アミンを形成させるためにさらに還元される必要がある。
【図5】オゾン分解された、及び当初のフコシルＧＭ１のフーリエ変換質量分析。Ａ）オゾン分解された、及びＢ）当初のフコシルＧＭ１をＦＴＭＳにより試験し、高解像度質量分析系、Ｅｘａｃｔｉｖｅを使用して分析した。分析は、脂肪アシル鎖の長さに応じて様々なフコシルＧＭ１種を示す。フコシルＧＭ１イオンは１価であった。説明文は存在する種の分子量を示す。
【図6】ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロット分析によるＨＳＡ－フコシルＧＭ１コンジュゲートの検出。Ａ）６２０ｎｍバックグランドに対して４５０ｎｍでの吸光度を読み取るＥＬＩＳＡにより検出されるＨＳＡ－フコシルＧＭ１コンジュゲートの３つの試料。ＨＳＡ又はＨＳＡ－フコシルＧＭ１コンジュゲートの何れかでプレートをコーティングした。一次抗体は、抗ＨＳＡ ＩｇＧ抗体（ＭＯＤ６ ６Ｌ）又は抗フコシル ＧＭ１ ｍＡｂ Ｆ１２を含有する何れかのマウス血清であった。抗マウスＩｇＧ－ビオチン及びストレプトアビジン－ＨＲＰを使用して一次抗体を検出した。一次抗体を添加しなかったウェルは陰性対照とした。Ｂ）抗ＨＳＡ ＩｇＧ抗体（ＭＯＤ６ ６Ｌ）又は抗フコシルＧＭ１ ｍＡｂ Ｆ１２を含有するマウス血清の何れかによって検出したＨＳＡ－フコシルＧＭ１コンジュゲートの３つの試料のウエスタンブロット分析。レーン１～４を対照として使用し、レーン１＝当初のＨＳＡ、レーン２＝反応性アミノ化手順を通じて得られたが、ガングリオシドが付加されなかったＨＳＡ、レーン３＝ＨＳＡ－ルイスＹコンジュゲート、レーン４＝ＨＳＡ－ＧＤ３コンジュゲート、レーン５＝ＨＳＡ－フコシルＧＭ１コンジュゲート試料１、レーン６＝ＨＳＡ－フコシルＧＭ１コンジュゲート試料２及びレーン７＝ＨＳＡ－フコシルＧＭ１コンジュゲート試料３。抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰを使用して一次抗体を検出した。二次抗体のみをブロットした同一の膜を陰性対照として使用した。ＥＣＬによって陽性バンドを発色させた。
【図7】マウス血清ＩｇＧのＨＳＡ－Ｆｕｃ－ＧＭ１コンジュゲート及び精製Ｆｕｃ－ＧＭ１への結合。ＨＳＡ－Ｆｕｃ－ＧＭ１コンジュゲート（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ）又は精製Ｆｕｃ－ＧＭ１（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ）の何れかに対する結合について、マウス血清ＩｇＧをスクリーニングした。６２０ｎｍバックグラウンドに対して４５０ｎｍでの吸光度を読み取るＥＬＩＳＡによってマウス血清を分析した。二次抗体単独を対照として使用した。抗ＨＳＡ ＩｇＧ抗体及び抗Ｆｕｃ－ＧＭ１ ｍＡｂ Ｆ１２を含有するマウス血清を陽性対照として使用した。＊は、一次抗体なしと比較してｐ＜０．０５であることを表し、１／１００希釈のみを分析した。
【図8】マウス血清ＩｇＧのＤＭＳ７９細胞表面への結合。Ｆｕｃ－ＧＭ１陽性細胞株ＤＭＳ７９の細胞表面へのマウス血清ＩｇＧの結合。最初に細胞を１／１００希釈でマウス血清とともにインキュベートした。１０μｇ／ｍｌの抗マウスＩｇＧ ＦＩＴＣを用いて一次抗体の結合を検出した。フローサイトメトリーにより細胞を分析した。アイソタイプＩｇＧ１を陰性対照として使用し（データは示さない）、ｍＡｂ Ｆ１２を陽性対照として使用し、両者とも１０μｇ／ｍｌで使用した。抗体結合の強度を幾何平均により表す。
【図9】Ｆｕｃ－ＧＭ１発現細胞の細胞表面へのＦｕｃ－ＧＭ１－特異的ｍＡｂの結合。間接的免疫蛍光及びフローサイトメトリー分析により、Ｆｕｃ－ＧＭ１陽性細胞株ＤＭＳ７９、ＤＭＳ５３、Ｈ１２８及びＨ６９の細胞表面への精製ｍＡｂ、ＦＬ１３３．６３、ＦＬ１３３．６７及びＦＬ１３４．３３の結合を評価した。抗マウスＩｇＧ ＦＩＴＣを用いて表面結合を検出した。アイソタイプＩｇＧ１を陰性対照として使用し（データは示さない）、ｍＡｂ Ｆ１２を陽性対照として使用した。抗体結合の強度を幾何平均として表す。
【図10】健康なヒトボランティアの全血へのＦｕｃ－ＧＭ１－特異的ｍＡｂの結合。間接的免疫蛍光及びフローサイトメトリー分析により評価した、健康なヒトボランティアの全血への、Ａ）アイソタイプＩｇＧ１、Ｂ）アイソタイプＩｇＧ３、Ｃ）抗ＭＨＣクラス１ ｍＡｂ、Ｄ）ｍＡｂ Ｆ１２、Ｅ）ｍＡｂ ＦＬ１３３．６３、Ｆ）ｍＡｂ ＦＬ１３３．６７及びＧ）ｍＡｂ ＦＬ１３４．３３の結合。最初に１０μｇ／ｍｌの一次抗体とともに全血をインキュベートし、次に１０μｇ／ｍｌの抗マウスＩｇＧ ＦＩＴＣで検出した。分析前に、赤血球細胞を溶解させた。マウスＩｇＧ１アイソタイプ、マウスＩｇＧ３アイソタイプ及びｍＡｂ Ｆ１２を陰性対照として使用した。抗ＭＨＣクラスＩ ｍＡｂを陽性対照として使用した。陰性対照を使用してドットプロット四分円を設定した。
【図11】様々な精製糖脂質へのＦｕｃ－ＧＭ１ ｍＡｂの結合。６２０ｎｍのバックグラウンドに対して４５０ｎｍでの吸光度を読み取るＥＬＩＳＡにより分析した、様々な精製ガングリオシドへの、Ａ）ＦＬ１３３．６３、Ｂ）ＦＬ１３３．６７、Ｃ）ＦＬ１３４．３３の結合。ビオチン化抗マウスＩｇＧ及びストレプトアビジン－ＨＲＰにより一次抗体の結合を検出した。Ｄ）Ｆ１２、Ｅ）抗ＧＤ３ ｍＡｂ Ｒ２４及びＦ）抗ＧＭ１毒素ＣＴｘＢ－ＨＲＰを陽性対照として使用した。残りのガングリオシドに対するＭＡｂはまだ作製されていない。＊は、ラクトシルセラミドと比較したｐ＜０．０５を表し、１／１００希釈のみを分析した。
【図12】ＤＭＳ７９細胞株への、精製ガングリオシドＦｕｃ－ＧＭ１とプレインキュベートしたＦｕｃ－ＧＭ１ ｍＡｂの競合的結合。２μｇのｍＡｂを、最初に５μｇの精製Ｆｕｃ－ＧＭ１とともに室温で１時間インキュベートした。間接的免疫蛍光及びフローサイトメトリー分析によって、ＤＭＳ７９細胞の細胞表面への結合を評価した。アイソタイプＩｇＧ１（データは示さない）及びＭＨＣ Ｉを陰性対照として使用した。Ｆ１２を陽性対照として使用した。精製Ｆｕｃ－ＧＭ１とプレインキュベートしなかった一次抗体も陽性対照として使用した。抗体結合の強度を幾何平均として表す。
【図13】６１０個の哺乳動物グリカン標的から構成されるＴｈｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｌｙｃｏｍｉｃｓのグリカンアレイに対して、ＦＬ１３３．６３及びＦＬ１３４．３３の結合をスクリーニングした。ａ）ＦＬ１３３．６３、ｂ）ＦＬ１３４．３３の間の微細特異性を比較する。
【図14】精製Ｆｕｃ－ＧＭ１及びＤＭＳ７９ ＰＭ ＴＧＬへのＦｕｃ－ＧＭ１ ｍＡｂの結合。ＤＭＳ７９ ＰＭ ＴＧＬ（細胞１×１０７個／レーン）への精製ガングリオシドＦｕｃ－ＧＭ１（５μｇ／レーン）及び、ＧＭ１（５μｇ／レーン）へのＡ）ＦＬ１３３．６３、Ｂ）ＦＬ１３３．６７及びＣ）ＦＬ１３４．３３の結合。免疫検出によるＴＬＣ分析によって結合を分析した。一次抗体を１μｇ／ｍｌで使用した。１／１００００で使用したＩＲＤｙｅ ６８０ＣＷ抗－マウスＩｇＧによって、一次抗体の結合を検出した。Ｄ）抗Ｆｕｃ－ＧＭ１ ｍＡｂ Ｆ１２で免疫ブロットしたＴＬＣプレートを陽性対照として使用した。Ｅ）二次抗体のみで免疫ブロットしたＴＬＣプレートを陰性対照として使用した。
【図15】ＨＳＡ－Ｆｕｃ－ＧＭ１コンジュゲートへの抗Ｆｕｃ－ＧＭ１ ｍＡｂの結合。６２０ｎｍバックグラウンドに対して４５０ｎｍでの吸光度を読み取るＥＬＩＳＡによって、ＨＳＡ－Ｆｕｃ－ＧＭ１コンジュゲートへのＡ）ｍＡｂ ＦＬ１３３．６３、Ｂ）ｍＡｂ ＦＬ１３３．６７、Ｃ）ｍＡｂ ＦＬ１３４．３３ Ｄ）ｍＡｂ Ｆ１２の結合を分析した。抗マウスＩｇＧビオチン及びストレプトアビジンＨＲＰコンジュゲートを使用して一次抗体を検出した。当初のＨＳＡを陰性対照として使用した。ＭＡｂ Ｆ１２を陽性対照として使用した。
【図16】精製Ｆｕｃ－ＧＭ１及びＤＭＳ７９細胞への抗Ｆｕｃ－ＧＭ１ ｍＡｂの結合。抗Ｆｕｃ－ＧＭ１ ｍＡｂ（ＦＬ１３３．６３、ＦＬ１３３．６７及びＦＬ１３４．３３）を、１００～０．００１ｎＭの濃度範囲の精製Ｆｕｃ－ＧＭ１への結合についてＥＬＩＳＡによって、評価した。アイソタイプＩｇＧ１を陰性対照として使用した。非線形的用量反応カーブフィッティング（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）を使用して、ＥＣ５０値を確立した。同じ濃度範囲を使用して、フローサイトメトリーによってＳＣＬＣ細胞株ＤＭＳ７９への結合についてもｍＡｂを評価した。アイソタイプＩｇＧ１を陰性対照として使用した。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍにおいて非線形的結合カーブフィッティング（１部位特異的結合）を使用して、Ｋｄ値を確立した。
【図17】ＤＭＳ７９細胞のＦｕｃ－ＧＭ１ ｍＡｂ媒介ＡＤＣＣ及びＣＤＣ。Ｆｕｃ－ＧＭ１陽性細胞株ＤＭＳ７９の、ＭＡｂ ＦＬ１３３．６３、ＦＬ１３３．６７及びＦＬ１３４．３３媒介Ａ）ＡＤＣＣ及びＢ）ＣＤＣ。陽性対照として抗Ｌｅｗｉｓｙ／ｂｍＡｂ ＳＣ１０１を使用した。＊はｐ＜０．０５を表す。
【図18】ｍＡｂ ＦＬ１３４．３３、ＦＬ１３３．６３及びＦＬ１３３．６７のＶＨ領域の配列。生殖系列抗体配列をアミノ酸コドンとして示す。下記で各Ｆｕｃ－ＧＭ１特異的抗体における突然変異を示す。
【図19】ｍＡｂ ＦＬ１３４．３３、ＦＬ１３３．６３及びＦＬ１３３．６７のＶＬ領域の配列。生殖系列抗体配列をアミノ酸コドンとして示す。下記で各Ｆｕｃ－ＧＭ１特異的抗体での突然変異を示す。
【図20】ＥＬＩＳＡによる精製抗原への抗体結合の特異性。Ｆｕｃ－ＧＭ１コーティングプレートを抗体とともにインキュベートし、抗マウスＦｃ特異的又は抗ヒトγ鎖特異的ＩｇＧビオチン及びストレプトアビジンＨＲＰを使用して検出した。ＭＡｂＦ１２を陽性対照として使用した。
【図21】間接的免疫蛍光による抗体の細胞表面結合の評価。ｍＡｂ ＦＬ１３４．３３、ＦＬ１３３．６３、ＦＬ１３３．６７及びＣＨ１３４．３３を細胞とインキュベートし、抗マウスＦｃ特異的又は抗ヒトγ鎖特異的ＩｇＧ ＦＩＴＣを使用して結合を検出した。Ａ）細胞株を用いたフローサイトメトリーにより作成したヒストグラムＢ）全ての細胞株に対するＧｍ値の棒グラフ。ＭＡｂ Ｆ１２を陽性対照として使用した。
【実施例】
【0081】
方法
全ての実験は、適用可能な安全性規制に従い行った。実験方法は、特定の条件に対して改変を行い、標準作業手順書に従って実施した。
全ての実験は、適用可能な安全性規制に従い行った。実験方法は、特定の条件に対して改変を行い、標準作業手順書に従って実施した。
【0082】
免疫
動物の作業は、Ｈｏｍｅ Ｏｆｆｉｃｅ ｐｒｏｊｅｃｔ ｌｉｃｅｎｓｅ下で行われた。使用した試薬は全て、別段述べない限り、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）から購入した。全ての免疫実験は、６～８週齢のＢａｌｂ／ｃ又はＣＤ１マウスの何れかを使用して行った。マウスは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＮｏｔｔｉｎｇｈａｍのＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｕｎｉｔでスタッフによって、指定病原体フリー状態で飼育され、維持された。０．５ｍｌインスリンシリンジを使用して、皮下（ｓ．ｃ．）又は腹腔内（ｉ．ｐ．）の何れかで最大１００μｌ ＰＢＳ中で希釈した抗原によってマウスを免疫した。注射の頻度は各免疫によって異なり、適切な結果の章で概説する。免疫に対するマウス抗体応答を評価するために、各免疫から７日後、尾静脈を介してマウスから採血した。血液を、最大速度（１７９６８ｘｇ）で２分間、２回遠心分離して（ＳＩＧＭＡ、１－１５ＰＫ Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ，Ｏｓｔｅｒｏｄｅ ａｍ Ｈａｒｚ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、赤血球細胞を除去し、さらなる使用まで－２０℃で血清を保管した。
動物の作業は、Ｈｏｍｅ Ｏｆｆｉｃｅ ｐｒｏｊｅｃｔ ｌｉｃｅｎｓｅ下で行われた。使用した試薬は全て、別段述べない限り、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）から購入した。全ての免疫実験は、６～８週齢のＢａｌｂ／ｃ又はＣＤ１マウスの何れかを使用して行った。マウスは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＮｏｔｔｉｎｇｈａｍのＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｕｎｉｔでスタッフによって、指定病原体フリー状態で飼育され、維持された。０．５ｍｌインスリンシリンジを使用して、皮下（ｓ．ｃ．）又は腹腔内（ｉ．ｐ．）の何れかで最大１００μｌ ＰＢＳ中で希釈した抗原によってマウスを免疫した。注射の頻度は各免疫によって異なり、適切な結果の章で概説する。免疫に対するマウス抗体応答を評価するために、各免疫から７日後、尾静脈を介してマウスから採血した。血液を、最大速度（１７９６８ｘｇ）で２分間、２回遠心分離して（ＳＩＧＭＡ、１－１５ＰＫ Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ，Ｏｓｔｅｒｏｄｅ ａｍ Ｈａｒｚ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、赤血球細胞を除去し、さらなる使用まで－２０℃で血清を保管した。
【0083】
細胞培養
全ての組織培養は、クラスＩＩ安全キャビネットにおいて無菌的に行った。２０％ ＨＩ－ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ１６４０中で維持したＨ１２８及び１０％ＨＩ－ＦＢＳを添加したＷｅｙｍｏｕｔｈ培地中で維持したＤＭＳ５３を除き、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＨＩ－ＦＢＳ）を添加したＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ培地（ＲＰＭＩ１６４０）中でヒト由来癌細胞株を維持した。新たに購入した細胞株はドライアイス中で配達され、それらを－８０℃で凍結して維持した。細胞培養凍結培地を除去するために、細胞を３７℃の水浴中で融解し、１０ｍｌの適切な培養培地とともに３０ｍｌユニバーサル容器（Ｓｔｅｒｉｌｉｎ，Ｎｅｗｐｏｒｔ，ＵＫ）に移した。１０００ｇで５分間、細胞を遠心分離した。次に、上清を除去し、７ｍｌの適切な培養培地中で細胞ペレットを再懸濁した。次に、細胞をＴ２５ Ｃｅｌｌｓｔａｒ細胞培養フラスコ（ＶＷＲ，Ｌｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，ＵＫ）に移し、３７℃、５％ＣＯ２中でインキュベートした。細胞が約８０％コンフルエンシーに到達すると、これらを分割するか又はより大きな細胞培養フラスコに移した。接着細胞株の場合、使用済み培養培地をフラスコから吸引し、５ｍｌの１×トリプシン／ＥＤＴＡを添加した。細胞が剥離するまで（通常１０分前後）トリプシン処理細胞を３７℃でインキュベートした。次に、剥離した細胞を３０ｍＬユニバーサル容器に回収し、細胞に対するトリプシンの影響を低下させるために、５ｍｌの培養培地を添加した。次に、細胞を１０００ｇで５分間遠心分離した。上清を除去し、新鮮な培養培地で細胞ペレットを再懸濁した。次に、細胞をＴ７５Ｃｅｌｌｓｔａｒ培養フラスコに移した。それらの培養培地が消費された後（オレンジ色から黄色に変色）、又は細胞が不健康であるように見える／死滅し始めると、浮遊凝集体として育つ細胞を分割した。培養培地を含む細胞を直接Ｔ７５培養フラスコに移し、１０ｍｌの新鮮な培養培地を添加した。新たに購入した細胞株のストックを増やし、維持するために、上記方法によって、８０％コンフルエンシーのＴ７５培養フラスコからの細胞を回収した。血球計算盤及び１：１の比で適用されるトリパンブルー生死判別染色を使用して、細胞を計数した。５％ジメチルスルフィド（ＤＭＳＯ）／適切な培養培地中で細胞を５×１０６個／ｍｌで再懸濁し、２ｍｌマイクロチューブあたり１ｍｌを添加した（Ｓａｒｓｔｅｄｔ，Ｌｅｉｃｅｓｔｅｒ，ＵＫ）。最初にバイアルを－８０℃の冷凍庫に最短でも２４時間入れ、次いで液体窒素に移し、それらを－１７０℃で維持した。
全ての組織培養は、クラスＩＩ安全キャビネットにおいて無菌的に行った。２０％ ＨＩ－ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ１６４０中で維持したＨ１２８及び１０％ＨＩ－ＦＢＳを添加したＷｅｙｍｏｕｔｈ培地中で維持したＤＭＳ５３を除き、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＨＩ－ＦＢＳ）を添加したＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ培地（ＲＰＭＩ１６４０）中でヒト由来癌細胞株を維持した。新たに購入した細胞株はドライアイス中で配達され、それらを－８０℃で凍結して維持した。細胞培養凍結培地を除去するために、細胞を３７℃の水浴中で融解し、１０ｍｌの適切な培養培地とともに３０ｍｌユニバーサル容器（Ｓｔｅｒｉｌｉｎ，Ｎｅｗｐｏｒｔ，ＵＫ）に移した。１０００ｇで５分間、細胞を遠心分離した。次に、上清を除去し、７ｍｌの適切な培養培地中で細胞ペレットを再懸濁した。次に、細胞をＴ２５ Ｃｅｌｌｓｔａｒ細胞培養フラスコ（ＶＷＲ，Ｌｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，ＵＫ）に移し、３７℃、５％ＣＯ２中でインキュベートした。細胞が約８０％コンフルエンシーに到達すると、これらを分割するか又はより大きな細胞培養フラスコに移した。接着細胞株の場合、使用済み培養培地をフラスコから吸引し、５ｍｌの１×トリプシン／ＥＤＴＡを添加した。細胞が剥離するまで（通常１０分前後）トリプシン処理細胞を３７℃でインキュベートした。次に、剥離した細胞を３０ｍＬユニバーサル容器に回収し、細胞に対するトリプシンの影響を低下させるために、５ｍｌの培養培地を添加した。次に、細胞を１０００ｇで５分間遠心分離した。上清を除去し、新鮮な培養培地で細胞ペレットを再懸濁した。次に、細胞をＴ７５Ｃｅｌｌｓｔａｒ培養フラスコに移した。それらの培養培地が消費された後（オレンジ色から黄色に変色）、又は細胞が不健康であるように見える／死滅し始めると、浮遊凝集体として育つ細胞を分割した。培養培地を含む細胞を直接Ｔ７５培養フラスコに移し、１０ｍｌの新鮮な培養培地を添加した。新たに購入した細胞株のストックを増やし、維持するために、上記方法によって、８０％コンフルエンシーのＴ７５培養フラスコからの細胞を回収した。血球計算盤及び１：１の比で適用されるトリパンブルー生死判別染色を使用して、細胞を計数した。５％ジメチルスルフィド（ＤＭＳＯ）／適切な培養培地中で細胞を５×１０６個／ｍｌで再懸濁し、２ｍｌマイクロチューブあたり１ｍｌを添加した（Ｓａｒｓｔｅｄｔ，Ｌｅｉｃｅｓｔｅｒ，ＵＫ）。最初にバイアルを－８０℃の冷凍庫に最短でも２４時間入れ、次いで液体窒素に移し、それらを－１７０℃で維持した。
【0084】
様々な実験に対して生細胞の大きなストックが必要とされた場合、Ｔ１７５培養フラスコへと細胞を徐々に拡大し、使用済み培養培地を新しいものに交換し、細胞の対数相増殖を確実するために分割することによって健康な状態で維持した。非接着細胞株について作業する場合、細胞をユニバーサル容器に移し、５分間静置した。これにより、生細胞を含有する浮遊凝集体がユニバーサル容器の底に沈み、次に死細胞を含有する上清を除去することができた。次に、適切な培養培地で細胞ペレットを再懸濁し、細胞を培養フラスコに戻した。
【0085】
抗体
抗ＨＬＡ－ＡＢＣ（クローンＷ６／３２）及び抗ＣＤ４４はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｈａｔｆｉｅｌｄ，ＵＫ）から購入した。抗ＣＤ５９（ＢＲＩＣ ２２９）はＩＢＧＲＬ（Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＵＫ）から購入した。抗シアリルルイスａ（ＣＡ１９．９）、抗ルイスｂ（２－２５ Ｌｅ）、抗ルイスＸ（Ｐ１２）、抗ＧＤ２（クローン２Ｑ５４９）、抗ＧＭ２、抗Ｇｂ３、抗プロヒビチン（クローンＩＩ－１４－１０）はＡｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）から購入した。抗ＮｅｕＧｃ ＧＭ３（クローンＭ２５９０）はＣＯＳＭＯ ＢＩＯ ＣＯ．，ＬＴＤ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）から購入した。抗ＣＤ４６、抗ＣＤ１４（クローンＭ５Ｅ２）、抗ＣＤ１１ｃ（クローンＢ－ｌｙ６）及びＩｇＧ１アイソタイプはＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃｒａｗｌｅｙ，ＵＫ）から購入した。抗Ｌｅｗｉｓ Ｙ（ＢＲ９６）はＡＴＣＣ（Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ，ＵＫ）から購入した。抗シアリルルイスＸ（ＫＭ９３）及び抗ＣＡ１２５（ＯＣ１２５）はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。抗Ｇｌｏｂｏ Ｈ（クローンＭＢｒ１）はＥＮＺＯ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｅｘｅｔｅｒ，ＵＫ）から購入した。抗Ｆｕｃ－ＧＭ１（Ｆ１２）はＦｕｊｉｒｅｂｉｏ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）から購入した。抗トランスフェリン（ＵＮＣＯＮＪ）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）から購入した。抗ＥＧＦＲ（ＩＦ４）及び抗カルネキシンはＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，ＵＳＡ）から購入した。抗ＥｐＣＡＭ（ＢｅｒＥＰ４）はＤａｋｏ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｈｉｒｅ，ＵＫ）から購入した。抗ＥＧＦＲ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）及び抗Ｈｅｒ２（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）はＮＨＳからの寄贈であった。抗ＧＤ３（Ｒ２４）は、Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｎ Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ ＣｅｎｔｅｒからのＰｈｉｌｉｐ Ｏ．Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎからの寄贈であった。ストレプトアビジン－ＨＲＰＯコンジュゲートは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）から購入した。ウサギ抗マウス免疫グロブリンＦＩＴＣ及びブタ抗ウサギＩｇＧ１ ＦＩＴＣは、Ｄａｋｏ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｈｉｒｅ、ＵＫ）から購入した。ストレプトアビジンＰＥは、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｈａｔｆｉｅｌｄ，ＵＫ）から購入した。コレラ毒素、Ｂサブユニットビオチンは、Ｓｔｒａｔｅｃｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｌｔｄ．，（Ｎｅｗｍａｒｋｅｔ，ＵＫ）から購入した。ＩＲＤｙｅ ６８０ＲＤロバ抗マウス及びＩＲＤｙｅ ８００ＣＷストレプトアビジンは、ＬＩ－ＣＯＲ，Ｎｅｂｒａｓｋａ，ＵＳＡから購入した。
抗ＨＬＡ－ＡＢＣ（クローンＷ６／３２）及び抗ＣＤ４４はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｈａｔｆｉｅｌｄ，ＵＫ）から購入した。抗ＣＤ５９（ＢＲＩＣ ２２９）はＩＢＧＲＬ（Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＵＫ）から購入した。抗シアリルルイスａ（ＣＡ１９．９）、抗ルイスｂ（２－２５ Ｌｅ）、抗ルイスＸ（Ｐ１２）、抗ＧＤ２（クローン２Ｑ５４９）、抗ＧＭ２、抗Ｇｂ３、抗プロヒビチン（クローンＩＩ－１４－１０）はＡｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）から購入した。抗ＮｅｕＧｃ ＧＭ３（クローンＭ２５９０）はＣＯＳＭＯ ＢＩＯ ＣＯ．，ＬＴＤ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）から購入した。抗ＣＤ４６、抗ＣＤ１４（クローンＭ５Ｅ２）、抗ＣＤ１１ｃ（クローンＢ－ｌｙ６）及びＩｇＧ１アイソタイプはＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃｒａｗｌｅｙ，ＵＫ）から購入した。抗Ｌｅｗｉｓ Ｙ（ＢＲ９６）はＡＴＣＣ（Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ，ＵＫ）から購入した。抗シアリルルイスＸ（ＫＭ９３）及び抗ＣＡ１２５（ＯＣ１２５）はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。抗Ｇｌｏｂｏ Ｈ（クローンＭＢｒ１）はＥＮＺＯ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｅｘｅｔｅｒ，ＵＫ）から購入した。抗Ｆｕｃ－ＧＭ１（Ｆ１２）はＦｕｊｉｒｅｂｉｏ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）から購入した。抗トランスフェリン（ＵＮＣＯＮＪ）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）から購入した。抗ＥＧＦＲ（ＩＦ４）及び抗カルネキシンはＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，ＵＳＡ）から購入した。抗ＥｐＣＡＭ（ＢｅｒＥＰ４）はＤａｋｏ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｈｉｒｅ，ＵＫ）から購入した。抗ＥＧＦＲ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）及び抗Ｈｅｒ２（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）はＮＨＳからの寄贈であった。抗ＧＤ３（Ｒ２４）は、Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｎ Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ ＣｅｎｔｅｒからのＰｈｉｌｉｐ Ｏ．Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎからの寄贈であった。ストレプトアビジン－ＨＲＰＯコンジュゲートは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）から購入した。ウサギ抗マウス免疫グロブリンＦＩＴＣ及びブタ抗ウサギＩｇＧ１ ＦＩＴＣは、Ｄａｋｏ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｈｉｒｅ、ＵＫ）から購入した。ストレプトアビジンＰＥは、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｈａｔｆｉｅｌｄ，ＵＫ）から購入した。コレラ毒素、Ｂサブユニットビオチンは、Ｓｔｒａｔｅｃｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｌｔｄ．，（Ｎｅｗｍａｒｋｅｔ，ＵＫ）から購入した。ＩＲＤｙｅ ６８０ＲＤロバ抗マウス及びＩＲＤｙｅ ８００ＣＷストレプトアビジンは、ＬＩ－ＣＯＲ，Ｎｅｂｒａｓｋａ，ＵＳＡから購入した。
【0086】
抗原の調製
乾燥細胞ペレット（リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄）を使用するまで－８０℃冷凍庫で保管した。原形質膜（ＰＭ）を抽出するために、細胞２×１０８個からの細胞ペレットを一緒にプールし、連続的により小さい針（２３Ｇ、２５Ｇ及び最後は２９Ｇ）を使用して２ｍｌの５０ｍＭマンニトール／５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）及び１０ｍＭ塩化カルシウム溶液中、手作業でホモジナイズした。次に、試料を氷上で２０分間静置し、次に３０００×ｇで１５分間遠心分離して、細胞内の膜及び核を除去した。上清をポリアロマー超遠心チューブ（Ｂｅｃｋｍａｎｎ，Ｈｉｇｈ Ｗｙｃｏｍｂｅ，ＵＫ）に移し、４℃で３０分間４８，０００×ｇで遠心分離して、サイトゾルを含有する上清からＰＭ含有ペレットを分離した。次にペレットを２００μｌのＰＢＳで再懸濁し、使用するまで－２０℃で保管した。
乾燥細胞ペレット（リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄）を使用するまで－８０℃冷凍庫で保管した。原形質膜（ＰＭ）を抽出するために、細胞２×１０８個からの細胞ペレットを一緒にプールし、連続的により小さい針（２３Ｇ、２５Ｇ及び最後は２９Ｇ）を使用して２ｍｌの５０ｍＭマンニトール／５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）及び１０ｍＭ塩化カルシウム溶液中、手作業でホモジナイズした。次に、試料を氷上で２０分間静置し、次に３０００×ｇで１５分間遠心分離して、細胞内の膜及び核を除去した。上清をポリアロマー超遠心チューブ（Ｂｅｃｋｍａｎｎ，Ｈｉｇｈ Ｗｙｃｏｍｂｅ，ＵＫ）に移し、４℃で３０分間４８，０００×ｇで遠心分離して、サイトゾルを含有する上清からＰＭ含有ペレットを分離した。次にペレットを２００μｌのＰＢＳで再懸濁し、使用するまで－２０℃で保管した。
【0087】
ポリアロマー超遠心チューブ中のＰＭペレットに直接、又は２００μｌのＰＢＳ中で懸濁したＰＭの何れかに２ｍｌのメタノール及び２ｍｌのクロロホルムを添加することによって、ＰＭ ＴＧＬを抽出した。次に、材料を１５ｍｌポリプロピレンチューブに移し、十分にボルテックスミキサーで攪拌し、室温（ＲＴ）にて３０分間、ローラー上でインキュベートした。２０００×ｇで１０分間遠心した後、ＴＧＬ含有上清を回収し、－２０℃で一晩インキュベートした。翌日、試料を同じ設定で再び遠心分離し、上清を回収し、４℃で保管した。
【0088】
アジュバント
抗原に対する免疫応答を促進するために、本論題の過程において様々なアジュバントを使用した。リポソームの製剤化の際に、α－ＧａｌＣｅｒ（アルファ－ガラクトシルセラミド）、α－ＧａｌＣｅｒ類似体７又はα－ＧａｌＣｅｒ類似体８、（ＥＮＺＯ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｅｘｅｔｅｒ，ＵＫ）を脂質の残りと一緒に乾燥させた（１０μｇ～２５μｇ／マウス）。抗マウスＣＤ４０（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｂｉｎｇｄｏｎ，ＵＫ）、Ｃ型ＣｐＧオリゴヌクレオチド及びＳ．メンネソタ（Ｓ．ｍｅｎｎｅｓｏｔａ）からのモノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬＡ）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を１０μｇ／マウスで使用し、既に形成されたリポソームに混合した。タンパク質抗原に対する免疫応答を促進するために、フロイントの完全又は不完全アジュバントを使用した。これらを抗原と１：１の比（ｖ：ｖ）で混合した。
抗原に対する免疫応答を促進するために、本論題の過程において様々なアジュバントを使用した。リポソームの製剤化の際に、α－ＧａｌＣｅｒ（アルファ－ガラクトシルセラミド）、α－ＧａｌＣｅｒ類似体７又はα－ＧａｌＣｅｒ類似体８、（ＥＮＺＯ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｅｘｅｔｅｒ，ＵＫ）を脂質の残りと一緒に乾燥させた（１０μｇ～２５μｇ／マウス）。抗マウスＣＤ４０（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｂｉｎｇｄｏｎ，ＵＫ）、Ｃ型ＣｐＧオリゴヌクレオチド及びＳ．メンネソタ（Ｓ．ｍｅｎｎｅｓｏｔａ）からのモノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬＡ）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を１０μｇ／マウスで使用し、既に形成されたリポソームに混合した。タンパク質抗原に対する免疫応答を促進するために、フロイントの完全又は不完全アジュバントを使用した。これらを抗原と１：１の比（ｖ：ｖ）で混合した。
【0089】
タンパク質への精製ガングリオシドのコンジュゲーション
精製ガングリオシドを、アルデヒド含有ガングリオシドがアミン（リジン）含有タンパク質と反応して、安定なアミン結合を形成する間接的還元的アミノ化によって共有結合によりＨＳＡにコンジュゲートした。反応性アルデヒド基をガングリオシドに導入するために、以前に記載されたオゾン分解方法（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１１）を使用した。オゾン生成装置ＯＺＶ－８（Ｏｚｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）によって、乾燥空気（Ａｉｒ ｄｒｉｅｒ ＭＡＧ－６００，Ｏｚｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｈｕｌｌ，Ｉｏｗａ，ＵＳ）から反応性オゾンを新たに生成させた。２：１クロロホルム：メタノールの５００μｌの最小体積中で１分間再懸濁した糖脂質含有試料にオゾンを通過させたところ、青色が持続した。次に、５０μｌのジメチルスルフィドを添加して、残留オゾンを破壊し、室温で１時間インキュベートした後、窒素流下で溶液を乾燥させた。ＤＭＳＯ中で再懸濁したオゾン分解Ｆｕｃ－ＧＭ１（Ｍａｔｒｅｙａ，ＰＡ，ＵＳＡ）を、１０倍モル濃度過剰で炭酸－重炭酸緩衝液、ｐＨ＞９中で再懸濁したヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に添加した。次に反応１ｍｌあたり１０μｌの１Ｍ ＮａＯＨ 中の５Ｍ水素化ホウ素ナトリウム（Ｈ４ＢＮａ）を添加した。次に、各試料を室温で２時間インキュベートした。反応１ｍｌあたり２０μｌの３Ｍエタノールアミンを１５分間添加することによって、非反応アルデヒド部位をブロッキングした。コンジュゲートを、ＰＢＳに対する透析によって精製した。
精製ガングリオシドを、アルデヒド含有ガングリオシドがアミン（リジン）含有タンパク質と反応して、安定なアミン結合を形成する間接的還元的アミノ化によって共有結合によりＨＳＡにコンジュゲートした。反応性アルデヒド基をガングリオシドに導入するために、以前に記載されたオゾン分解方法（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１１）を使用した。オゾン生成装置ＯＺＶ－８（Ｏｚｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）によって、乾燥空気（Ａｉｒ ｄｒｉｅｒ ＭＡＧ－６００，Ｏｚｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｈｕｌｌ，Ｉｏｗａ，ＵＳ）から反応性オゾンを新たに生成させた。２：１クロロホルム：メタノールの５００μｌの最小体積中で１分間再懸濁した糖脂質含有試料にオゾンを通過させたところ、青色が持続した。次に、５０μｌのジメチルスルフィドを添加して、残留オゾンを破壊し、室温で１時間インキュベートした後、窒素流下で溶液を乾燥させた。ＤＭＳＯ中で再懸濁したオゾン分解Ｆｕｃ－ＧＭ１（Ｍａｔｒｅｙａ，ＰＡ，ＵＳＡ）を、１０倍モル濃度過剰で炭酸－重炭酸緩衝液、ｐＨ＞９中で再懸濁したヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に添加した。次に反応１ｍｌあたり１０μｌの１Ｍ ＮａＯＨ 中の５Ｍ水素化ホウ素ナトリウム（Ｈ４ＢＮａ）を添加した。次に、各試料を室温で２時間インキュベートした。反応１ｍｌあたり２０μｌの３Ｍエタノールアミンを１５分間添加することによって、非反応アルデヒド部位をブロッキングした。コンジュゲートを、ＰＢＳに対する透析によって精製した。
【0090】
全タンパク質ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析によってタンパク質－Ｆｕｃ－ＧＭ１コンジュゲートを分析した。試料を調製するために、ｚｉｐｔｉｐ Ｃ４ピペットチップ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＡ，ＵＳ）を最初に５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル：Ｈ２Ｏ溶液により活性化し、次にＨ２Ｏ中の０．１％ＴＦＡで平衡化した。次に、１５回上下にピペッティングすることによって試料をｚｉｐｔｉｐのレジンに結合させた。次いでレジンに結合した試料をＨ２Ｏ中の０．１％ＴＦＡで１５回洗浄し、溶出液（０．１％ＴＦＡを有する５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル：Ｈ２Ｏ中の飽和シナピン酸）によってＭＡＬＤＩプレート上に分注した。
【0091】
ｍＡｂの作製
融合の少なくとも１週間前に、１０％ＨＩ－ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ培地中でＮＳ０骨髄細胞を有するいくつかのフラスコを成長させた。最も健康に見える細胞を含有するフラスコを選択し、融合の１日前に培養培地を再補給した。除去した使用済みＮＳ０培地を－４℃で保管した。融合日に、全ての試薬を最初に３７℃に加熱した。ＮＳ０細胞を回収し、４回カウントした。次に、血清不含ＲＰＭＩを使用して、１０００×ｇで５分間、２回遠心分離することによってこれらを洗浄した。免疫したマウスを屠殺し、７０％（ｖ／ｖ）エタノールを使用して切開部位を無菌状態に保って脾臓を摘出した。針を通じてＲＰＭＩ培地を脾臓に押し入れることによって、及び同時に鉗子で圧力をかけることによって、単一の細胞懸濁液を調製した。次に、ＲＰＭＩ培地中で脾細胞を１０００×ｇで１０分間遠心分離し、４回カウントした。次に、脾細胞をＮＳ０骨髄細胞と１０：１細胞比で融合させた。より詳細には、１×１０８個の脾細胞及び１×１０７個のＮＳ０骨髄細胞を合わせ、１０００×ｇで５分間遠心分離した。上清を除去し、細胞原形質膜を透過処理する役目を果たす８００μｌのポリエチレングリコール１５００を、細胞ペレット中に穏やかに１分間混合した。次に、穏やかに混合しながら、１ｍｌのＲＰＭＩ培地を１分間かけて細胞にゆっくりと添加した。さらに５ｍｌのＲＰＭＩをゆっくりと５分間かけて細胞の上に層状に重ねた。最後に、さらに２０ｍｌのＲＰＭＩを上部に層状に重ねた。融合工程を助けるために、次に細胞を１２００×ｇで７分間遠心分離した。上清を除去し、１０％ＨＩ－ＦＢＳ、５％ヒポキサンチンメトトレキサートチミジン（ＨＭＴ選択試薬；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）、５％ハイブリドーマクローニング因子（ＨＣＦ；ＰＡＡ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＵＳ）及び１０％のろ過した使用済みＮＳ０上清を添加したＲＰＭＩ培地中で細胞を慎重に再懸濁した。次に、細胞を９６ウェル培養プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＵＫ）に播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。
融合の少なくとも１週間前に、１０％ＨＩ－ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ培地中でＮＳ０骨髄細胞を有するいくつかのフラスコを成長させた。最も健康に見える細胞を含有するフラスコを選択し、融合の１日前に培養培地を再補給した。除去した使用済みＮＳ０培地を－４℃で保管した。融合日に、全ての試薬を最初に３７℃に加熱した。ＮＳ０細胞を回収し、４回カウントした。次に、血清不含ＲＰＭＩを使用して、１０００×ｇで５分間、２回遠心分離することによってこれらを洗浄した。免疫したマウスを屠殺し、７０％（ｖ／ｖ）エタノールを使用して切開部位を無菌状態に保って脾臓を摘出した。針を通じてＲＰＭＩ培地を脾臓に押し入れることによって、及び同時に鉗子で圧力をかけることによって、単一の細胞懸濁液を調製した。次に、ＲＰＭＩ培地中で脾細胞を１０００×ｇで１０分間遠心分離し、４回カウントした。次に、脾細胞をＮＳ０骨髄細胞と１０：１細胞比で融合させた。より詳細には、１×１０８個の脾細胞及び１×１０７個のＮＳ０骨髄細胞を合わせ、１０００×ｇで５分間遠心分離した。上清を除去し、細胞原形質膜を透過処理する役目を果たす８００μｌのポリエチレングリコール１５００を、細胞ペレット中に穏やかに１分間混合した。次に、穏やかに混合しながら、１ｍｌのＲＰＭＩ培地を１分間かけて細胞にゆっくりと添加した。さらに５ｍｌのＲＰＭＩをゆっくりと５分間かけて細胞の上に層状に重ねた。最後に、さらに２０ｍｌのＲＰＭＩを上部に層状に重ねた。融合工程を助けるために、次に細胞を１２００×ｇで７分間遠心分離した。上清を除去し、１０％ＨＩ－ＦＢＳ、５％ヒポキサンチンメトトレキサートチミジン（ＨＭＴ選択試薬；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）、５％ハイブリドーマクローニング因子（ＨＣＦ；ＰＡＡ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＵＳ）及び１０％のろ過した使用済みＮＳ０上清を添加したＲＰＭＩ培地中で細胞を慎重に再懸濁した。次に、細胞を９６ウェル培養プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＵＫ）に播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。
【0092】
融合のおよそ２週間後、確立されたハイブリドーマがウェルの約１／３を占有したときに、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって抗原特異的な抗体の産生についてこれらをスクリーニングした。所望の特異性を有する抗体を産生するハイブリドーマコロニーを、その目的が単一細胞コロニーを作製することであるさらなるクローニングのために選択した。これは、モノクローナル抗体作製における重大な段階である。これを行うために、選択したハイブリドーマを細胞０．３個／ウェルの細胞密度で９６ウェル培養プレートに播種した。コロニーが再びスクリーニングを行うために十分大きくなるまで、ハイブリドーマを３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。全てのクローンが抗原に対して陽性結合を示すまで、クローニングを最低でも２回反復した。
【0093】
ＭＡｂ精製
２回クローニングしたハイブリドーマを、１０％低Ｉｇ新生児仔牛血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加したＧＩＢＣＯハイブリドーマ血清不含培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）中で、増大させた。使用済み培地を回収し、２０００×ｇで１５分間遠心分離して、細胞残屑と一緒にハイブリドーマ細胞を除去した。次に、０．２μｍ Ｍｉｎｉｓａｒｔ使い捨てフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ，Ｓｕｒｒｅｙ，ＵＫ）に通して、抗体を含有する上清をろ過した。１ｍｌ組み換えプロテインＧカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用してＦＰＬＣによって抗体を精製し、１００ｍＭグリシンｐＨ１２で溶出し、中和後、２Ｌ ＰＢＳに対して一晩透析した。２８０ｎｍで吸光度を読み取って、分光光度計によって精製抗体の最終濃度を決定した。製造者の指針に従い、マウスモノクローナル抗体アイソタイピング試験キット（ＡＢＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｋｉｄｌｉｎｇｔｏｎ，ＵＫ）を使用した。
２回クローニングしたハイブリドーマを、１０％低Ｉｇ新生児仔牛血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加したＧＩＢＣＯハイブリドーマ血清不含培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）中で、増大させた。使用済み培地を回収し、２０００×ｇで１５分間遠心分離して、細胞残屑と一緒にハイブリドーマ細胞を除去した。次に、０．２μｍ Ｍｉｎｉｓａｒｔ使い捨てフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ，Ｓｕｒｒｅｙ，ＵＫ）に通して、抗体を含有する上清をろ過した。１ｍｌ組み換えプロテインＧカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用してＦＰＬＣによって抗体を精製し、１００ｍＭグリシンｐＨ１２で溶出し、中和後、２Ｌ ＰＢＳに対して一晩透析した。２８０ｎｍで吸光度を読み取って、分光光度計によって精製抗体の最終濃度を決定した。製造者の指針に従い、マウスモノクローナル抗体アイソタイピング試験キット（ＡＢＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｋｉｄｌｉｎｇｔｏｎ，ＵＫ）を使用した。
【0094】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
糖脂質ＥＬＩＳＡの場合、９６ウェルフレキシブルＰＶＣ平底プレート（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）を、１００ｎｇ精製ガングリオシド／ウェル又は細胞１×１０４個／ウェルと同等のＷＣ ＴＧＬ抽出物又は１００％エタノール中で再懸濁した細胞５×１０４個／ウェルと同等のＰＭ ＴＧＬの何れかでコーティングし、一晩室温で乾燥させた。
糖脂質ＥＬＩＳＡの場合、９６ウェルフレキシブルＰＶＣ平底プレート（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）を、１００ｎｇ精製ガングリオシド／ウェル又は細胞１×１０４個／ウェルと同等のＷＣ ＴＧＬ抽出物又は１００％エタノール中で再懸濁した細胞５×１０４個／ウェルと同等のＰＭ ＴＧＬの何れかでコーティングし、一晩室温で乾燥させた。
【0095】
２：１（ｖ／ｖ）クロロホルム：メタノール中で精製ガングリオシドを１ｍｇ／ｍｌとなるように再懸濁した。ＰＭ ＴＧＬの抽出は、上記の抗原の調製に記載される。１ｍｌメタノール及び１ｍｌのクロロホルムを乾燥細胞ペレットに添加することによって、ＷＣ ＴＧＬを調製した。細胞を激しくボルテックスミキサーで攪拌し、ＲＴにて３０分間ローラー上でインキュベートした。２０００×ｇで１０分間の遠心分離後、ＴＧＬ含有上清を回収し、－２０℃で一晩保管した。翌日、試料を再び遠心分離し、上清を回収し、４℃で保管した。
【0096】
タンパク質ＥＬＩＳＡの場合、炭酸－重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中で再懸濁された１００ｎｇのタンパク質／ウェルで９６ウェルのフレキシブルＰＶＣ平底プレートをコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。翌日、ＰＢＳ中の２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でＲＴにて１時間、プレートをブロッキングした。次に、ブロッキング緩衝液を除去し、次いでＰＢＳ中の１％ＢＳＡ中で調製した一次抗体又はマウス血清をウェルに添加した。ＲＴで１時間インキュベート後、ＰＢＳ中でプレートを３回洗浄した。適切な二次及び三次抗体によって、一次抗体の結合を検出した。次にプレートを洗浄し、ウェルあたり９０μｌのリン酸／クエン酸／過ホウ酸緩衝液中の３，３’５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を添加することによって発色させた。３０μｌの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４の添加によって、反応を停止させた。分光光度計により、６２０ｎｍバックグラウンドに対して４５０ｎｍでの吸光度を読み取り、この結果を分析した。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌを使用して、データの平均及び標準偏差を計算した。陰性対照に対して多重比較を伴う通常の一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、群間の有意差を計算し、ｐ＜０．０５を統計学的に有意とみなした。
【0097】
グリコーム分析
ＦＬ１３３及び１３４ｍＡｂの微細特異性を明らかにするために、抗体をＦＩＴＣ標識し、Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｌｙｃｏｍｉｃｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｌｙｃｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ／ｓｔａｔｉｃ／ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｃｏｒｅｈ８．ｓｈｔｍｌ］）に送り、ここでそれらを≧６００種類の天然及び合成グリカンに対してスクリーニングした。簡潔に述べると、アミノリンカーとともに合成及び哺乳動物グリカンをＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）活性化ガラス顕微鏡スライド上にプリントし、アミド結合を形成させた。この作業は、Ｅｍｏｒｙ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＣＦＧのＣｏｒｅ Ｈにより行われた。ＦＧ２７を、室温にてＰＢＳ中１μｇ／ｍｌで試験した。簡潔に述べると、マイクロアレイのプリント面に抗体試料を適用し、加湿チャンバー中で１時間インキュベートした。次に、このスライドをＰＢＳで４回すすぎ、続いて蛍光標識された（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８）抗ウサギＩｇＧを添加し、１時間インキュベートした。次にこのスライドをＰＢＳ中で４回すすぎ、Ｐｅｒｋｉｎ－ＥｌｍｅｒマイクロアレイＸＬ４０００スキャナーで蛍光を測定し、Ｉｍａｇｅｎｅソフトウェア（ＢｉｏＤｉｓｃｏｖｅｒｙ）を使用して分析した。
ＦＬ１３３及び１３４ｍＡｂの微細特異性を明らかにするために、抗体をＦＩＴＣ標識し、Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｌｙｃｏｍｉｃｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｌｙｃｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ／ｓｔａｔｉｃ／ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｃｏｒｅｈ８．ｓｈｔｍｌ］）に送り、ここでそれらを≧６００種類の天然及び合成グリカンに対してスクリーニングした。簡潔に述べると、アミノリンカーとともに合成及び哺乳動物グリカンをＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）活性化ガラス顕微鏡スライド上にプリントし、アミド結合を形成させた。この作業は、Ｅｍｏｒｙ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＣＦＧのＣｏｒｅ Ｈにより行われた。ＦＧ２７を、室温にてＰＢＳ中１μｇ／ｍｌで試験した。簡潔に述べると、マイクロアレイのプリント面に抗体試料を適用し、加湿チャンバー中で１時間インキュベートした。次に、このスライドをＰＢＳで４回すすぎ、続いて蛍光標識された（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８）抗ウサギＩｇＧを添加し、１時間インキュベートした。次にこのスライドをＰＢＳ中で４回すすぎ、Ｐｅｒｋｉｎ－ＥｌｍｅｒマイクロアレイＸＬ４０００スキャナーで蛍光を測定し、Ｉｍａｇｅｎｅソフトウェア（ＢｉｏＤｉｓｃｏｖｅｒｙ）を使用して分析した。
【0098】
使用したプロトコールのさらなる詳細を以下で示す：
非標識モノクローナル抗体によるグリカン結合アッセイ
１．導入：
１．１．Ｃｏｒｅ Ｈの主目的は、プリントされたグリカンマイクロアレイを使用して、研究者により提出されるグリカン結合タンパク質（ＧＢＰ）及び様々な生物の結合特異性を決定することである。
非標識モノクローナル抗体によるグリカン結合アッセイ
１．導入：
１．１．Ｃｏｒｅ Ｈの主目的は、プリントされたグリカンマイクロアレイを使用して、研究者により提出されるグリカン結合タンパク質（ＧＢＰ）及び様々な生物の結合特異性を決定することである。
【0099】
２．参考文献：
２．１．ｗｗｗ．ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｌｙｃｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ
２．１．ｗｗｗ．ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｌｙｃｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ
【0100】
３．必要な材料：
３．１．グリカンがプリントされたスライド（Ｃｏｒｅ Ｄ）、白色で刻印されたバーコード及び黒字で－この面に触れないでください（ＤＯ ＮＯＴ ＴＯＵＣＨ ＴＨＩＳ ＡＲＥＡ）と記載されている側のスライド面上にプリント。
３．２．カバースリップ（Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，１２－５４５Ｆ）
３．３．加湿されたスライドプロセシングチャンバー（Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＮＣ９０９１４１６）又は、チャンバーの底部に湿った紙タオルが置かれたペトリ皿を使用する自家製の系
３．４．スライドを洗浄するための１００ｍｌコプリンジャー
３．５．Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＢＰ１５２－１）
３．６．ＮａＣｌ（Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓ２７１－３）
３．７．ＣａＣｌ２（Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃ７９－５００）
３．８．ＭｇＣｌ２（Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＢＰ２１４－５００）
３．９．一塩基性リン酸カリウム（Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐ２８５－３）
３．１０．ｄＨ２０
３．１１．シアニン５－ストレプトアビジン（ＺＹＭＥＤ４３－４３１６）
３．１２．適切な二次抗体、必要に応じて蛍光標識
３．１３．ＢＳＡ（Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｐ１６００－１００）
３．１４．Ｔｗｅｅｎ－２０（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，６５５２０５）
３．１５．アジ化ナトリウム（ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓ２２７－５００）
３．１６．ＰｒｏＳｃａｎＡｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）
４．緩衝液：
４．１．ＴＳＭ＝２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４ １５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ ＭｇＣｌ２
４．２．ＴＳＭ洗浄緩衝液（ＴＳＭＷ）＝ＴＳＭ緩衝液＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０
４．３．ＴＳＭ結合緩衝液（ＴＳＭＢＢ）＝ＴＳＭ緩衝液＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０＋１％ＢＳＡ
５．プロトコール：
５．１．洗浄緩衝液の作業用保存液を作製（ＴＳＭ、ＴＳＭ洗浄緩衝液及びＨ２Ｏ）又は試薬を集め、それらが冷蔵庫に入っている場合は室温にする。
５．１．１．緩衝液（Ａ）ＴＳＭ－２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４ １５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ ＭｇＣｌ２
５．１．２．緩衝液（Ｂ）ＴＳＭ洗浄緩衝液（ＴＳＭＷ）－ＴＳＭ緩衝液＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０
５．１．３．緩衝液（Ｃ）ＴＳＭ結合緩衝液（ＴＳＭＢＢ）－ＴＳＭ緩衝液＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０＋１％ＢＳＡ
５．１．４．ｄＨ２Ｏ
５．２．５～５０μｇ／ｍｌの最終濃度又は分析に必要とされる適切な濃度となるように、抗体の特性に基づいてＴＳＭＢＢ又は適切な結合緩衝液中で抗体を希釈することによって１００μｌの試料を調製。
５．３．スライドをデシケーターから取り出し、スライドの黒い印の外側のバーコードの付近に試料名を書く。
５．４．スライドを１００ｍｌのＴＳＭＷを含有するガラスコプリン染色ジャー中に５分間入れることによってスライドを水和する。
５．５．スライドをまっすぐ立てて液体を流出させることによりスライドから過剰な液体を除去する。
５．６．黒い印の間で左端のスライド近くに７０μｌの試料を慎重に適用する（５．２参照）。
５．７．カバースリップの下で試料中に気泡が形成されないようにカバースリップをスライド上にゆっくりと置く。必要に応じてピペットチップでカバースリップを穏やかにタッピングするか又はカバースリップの片側をゆっくりと持ち上げることによって気泡を全て除去する。カバースリップが黒い印の間にあることを確実にする。
３．１．グリカンがプリントされたスライド（Ｃｏｒｅ Ｄ）、白色で刻印されたバーコード及び黒字で－この面に触れないでください（ＤＯ ＮＯＴ ＴＯＵＣＨ ＴＨＩＳ ＡＲＥＡ）と記載されている側のスライド面上にプリント。
３．２．カバースリップ（Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，１２－５４５Ｆ）
３．３．加湿されたスライドプロセシングチャンバー（Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＮＣ９０９１４１６）又は、チャンバーの底部に湿った紙タオルが置かれたペトリ皿を使用する自家製の系
３．４．スライドを洗浄するための１００ｍｌコプリンジャー
３．５．Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＢＰ１５２－１）
３．６．ＮａＣｌ（Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓ２７１－３）
３．７．ＣａＣｌ２（Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃ７９－５００）
３．８．ＭｇＣｌ２（Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＢＰ２１４－５００）
３．９．一塩基性リン酸カリウム（Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐ２８５－３）
３．１０．ｄＨ２０
３．１１．シアニン５－ストレプトアビジン（ＺＹＭＥＤ４３－４３１６）
３．１２．適切な二次抗体、必要に応じて蛍光標識
３．１３．ＢＳＡ（Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｐ１６００－１００）
３．１４．Ｔｗｅｅｎ－２０（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，６５５２０５）
３．１５．アジ化ナトリウム（ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓ２２７－５００）
３．１６．ＰｒｏＳｃａｎＡｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）
４．緩衝液：
４．１．ＴＳＭ＝２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４ １５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ ＭｇＣｌ２
４．２．ＴＳＭ洗浄緩衝液（ＴＳＭＷ）＝ＴＳＭ緩衝液＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０
４．３．ＴＳＭ結合緩衝液（ＴＳＭＢＢ）＝ＴＳＭ緩衝液＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０＋１％ＢＳＡ
５．プロトコール：
５．１．洗浄緩衝液の作業用保存液を作製（ＴＳＭ、ＴＳＭ洗浄緩衝液及びＨ２Ｏ）又は試薬を集め、それらが冷蔵庫に入っている場合は室温にする。
５．１．１．緩衝液（Ａ）ＴＳＭ－２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４ １５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ ＭｇＣｌ２
５．１．２．緩衝液（Ｂ）ＴＳＭ洗浄緩衝液（ＴＳＭＷ）－ＴＳＭ緩衝液＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０
５．１．３．緩衝液（Ｃ）ＴＳＭ結合緩衝液（ＴＳＭＢＢ）－ＴＳＭ緩衝液＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０＋１％ＢＳＡ
５．１．４．ｄＨ２Ｏ
５．２．５～５０μｇ／ｍｌの最終濃度又は分析に必要とされる適切な濃度となるように、抗体の特性に基づいてＴＳＭＢＢ又は適切な結合緩衝液中で抗体を希釈することによって１００μｌの試料を調製。
５．３．スライドをデシケーターから取り出し、スライドの黒い印の外側のバーコードの付近に試料名を書く。
５．４．スライドを１００ｍｌのＴＳＭＷを含有するガラスコプリン染色ジャー中に５分間入れることによってスライドを水和する。
５．５．スライドをまっすぐ立てて液体を流出させることによりスライドから過剰な液体を除去する。
５．６．黒い印の間で左端のスライド近くに７０μｌの試料を慎重に適用する（５．２参照）。
５．７．カバースリップの下で試料中に気泡が形成されないようにカバースリップをスライド上にゆっくりと置く。必要に応じてピペットチップでカバースリップを穏やかにタッピングするか又はカバースリップの片側をゆっくりと持ち上げることによって気泡を全て除去する。カバースリップが黒い印の間にあることを確実にする。
【0101】
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）
１μｇ／レーンの精製脂質又はＷＣ ＴＧＬ（細胞１×１０６個／レーン）又は上記のように細胞株から抽出されたＰＭ ＴＧＬ（細胞１×１０７個／ウェル）をＴＬＣプレート（ＴＬＣプレート上のナノシリカゲル）にロードした。大量の細胞由来ＴＧＬのローディングを助けるために、６０℃に設定した加熱ブロックを使用してＴＧＬを最初に乾燥させ、次いで最大２０μＬの２：１クロロホルム／メタノール中で再懸濁した。ローディング後、プレートを、溶媒１（クロロホルム：メタノール：ｄＨ２Ｏ、６０：３０：５）中で２回展開することによって脂質を５ｃｍの距離まで移動させ、溶媒２（ヘキサン：ジエチルエーテル：氷酢酸、８０：２０：１．５）中で１回、８ｃｍの距離まで移動させた。次に、脂質を、１２０℃にて２０分で発色させるオルシノール（２０ｍｌの５％Ｈ２ＳＯ４中２０ｍｇオルシノール）又は免疫ブロッティングの何れかによって可視化した。
１μｇ／レーンの精製脂質又はＷＣ ＴＧＬ（細胞１×１０６個／レーン）又は上記のように細胞株から抽出されたＰＭ ＴＧＬ（細胞１×１０７個／ウェル）をＴＬＣプレート（ＴＬＣプレート上のナノシリカゲル）にロードした。大量の細胞由来ＴＧＬのローディングを助けるために、６０℃に設定した加熱ブロックを使用してＴＧＬを最初に乾燥させ、次いで最大２０μＬの２：１クロロホルム／メタノール中で再懸濁した。ローディング後、プレートを、溶媒１（クロロホルム：メタノール：ｄＨ２Ｏ、６０：３０：５）中で２回展開することによって脂質を５ｃｍの距離まで移動させ、溶媒２（ヘキサン：ジエチルエーテル：氷酢酸、８０：２０：１．５）中で１回、８ｃｍの距離まで移動させた。次に、脂質を、１２０℃にて２０分で発色させるオルシノール（２０ｍｌの５％Ｈ２ＳＯ４中２０ｍｇオルシノール）又は免疫ブロッティングの何れかによって可視化した。
【0102】
免疫ブロッティングの場合、糖脂質を移動させた後、ＴＬＣプレートを最初にアセトン中のポリイソブチルメタクリラート５０ｍｇ／５０ｍｌの薄い噴霧コートでブロッキングした。次に、ＰＢＳ中の１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ中、ＲＴで１時間インキュベートすることによって、プレートをさらにブロッキングした。次に、一次抗体（プレートあたり１０ｍｌ中１０μｇ）又はマウス血清（プレートあたり１０ｍｌ中で１／１００希釈）中でプレートをインキュベートし、これを抗マウスＩｇＧビオチン（１／１０００）及びロバ抗マウスＩＲＤ ８００ ＣＷ（ＬＩＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｔｄ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）によって検出した。穏やかに揺らしながら各抗体のインキュベーションを行い、１時間継続した。暗所で三次抗体のインキュベーションを行った。全ての抗体をＰＢＳ中の１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ中で調製した。各抗体のインキュベーション後、ＰＢＳを直接プレート上に注ぐことによってプレートを洗浄した。最後に、プレートを洗浄し、暗所で一晩乾燥させ、Ｏｄｙｓｓｅｙ ＳＡ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩＣＯＲ）により分析した。
【0103】
抗体及び補体依存性細胞傷害
死細胞の原形質細胞膜の透過性の増加によって死細胞により放出される放射性標識クロム酸ナトリウム（Ｃｒ５１）を使用して通常の食塩水中で抗体及び補体依存性細胞傷害を評価した。詳細には、２×１０６個の標的細胞を４０μｌ（１ｍＢｑ）のＣｒ５１（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）で標識し、最短でも１時間、３７℃でインキュベートした。インキュベート後、１４００×ｇで５分間、標識された標的細胞を２５ｍｌのＳＦ ＲＰＭＩ培地中で２回洗浄した。次にこれらを２５ｍｌのＳＦ ＲＰＭＩ培地中で再懸濁し、３７℃で２０分間静置した。次にこれらを再び遠心分離してＳＦ ＲＰＭＩ培地を除去し、１ｍｌの培養培地（１０％ＦＣＳ及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ）中で再懸濁し、計数した。最後に、標識した標的細胞を細胞１×１０５個／１ｍｌになるように再懸濁し、５０μｌ（細胞５×１０３個）を９６ウェル丸底プレートの適切なウェルに添加した。抗体の希釈液を、作業用希釈液が確実に最終濃度の４倍になるように培養培地中で調製した。希釈抗体の５０μｌの体積を適切なウェルに添加した。
死細胞の原形質細胞膜の透過性の増加によって死細胞により放出される放射性標識クロム酸ナトリウム（Ｃｒ５１）を使用して通常の食塩水中で抗体及び補体依存性細胞傷害を評価した。詳細には、２×１０６個の標的細胞を４０μｌ（１ｍＢｑ）のＣｒ５１（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）で標識し、最短でも１時間、３７℃でインキュベートした。インキュベート後、１４００×ｇで５分間、標識された標的細胞を２５ｍｌのＳＦ ＲＰＭＩ培地中で２回洗浄した。次にこれらを２５ｍｌのＳＦ ＲＰＭＩ培地中で再懸濁し、３７℃で２０分間静置した。次にこれらを再び遠心分離してＳＦ ＲＰＭＩ培地を除去し、１ｍｌの培養培地（１０％ＦＣＳ及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ）中で再懸濁し、計数した。最後に、標識した標的細胞を細胞１×１０５個／１ｍｌになるように再懸濁し、５０μｌ（細胞５×１０３個）を９６ウェル丸底プレートの適切なウェルに添加した。抗体の希釈液を、作業用希釈液が確実に最終濃度の４倍になるように培養培地中で調製した。希釈抗体の５０μｌの体積を適切なウェルに添加した。
【0104】
末梢単核細胞（ＰＢＭＣ）を、緑色のキャップが付いたヘパリンコーティングされたバキュテイナーチューブ（ＢＤ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ，ＵＫ）を使用して、実験日に健康なボランティアから単離した。最初に全血をＳＦ ＲＰＭＩ中で１：１に希釈した。ＰＢＭＣを分離するために、５０ｍｌファルコンチューブ中で２５ｍｌの希釈血液を穏やかに１５ｍｌのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ －１０７７の上に層状に重ねた。加速を１に設定し、減速を０に設定して２１００×ｇで２０分間、血液を遠心分離した。次に、１０ｍｌピペットを使用してＰＢＭＣを含有するバフィーコートを回収し、２０００×ｇで５分間、２０ｍｌのＳＦ ＲＰＭＩ中で２回洗浄した。次に、ＰＢＭＣを計数し、細胞５×１０６個／１ｍｌ培養培地で再懸濁し、１００μｌの細胞を適切なウェルに添加した。
【0105】
血清を調製するために、健康なボランティアからの血液を赤いキャップ付きの凝固活性化因子含有バキュテイナーチューブ（ＢＤ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ，ＵＫ）に回収した。凝固した血液を３０ｍｌのユニバーサル容器に移し、全ての赤血球細胞が確実に除去されるように２０００×ｇで５分間、２回遠心分離した。最後に、培養培地中２０％血清を調製し、１００μｌを適切なウェルに添加した。
【0106】
１滴（２５μｌ）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を５０μｌの標識された標的細胞及び１２５μｌの培地に適用することにより、最大細胞死を誘導した。５０μｌの標識した標的細胞を１５０μｌの培養培地中でインキュベートすることによって自然な細胞死を評価した。直接的なＰＢＭＣ誘導性の殺滅レベルを評価するために、１００μｌのＰＢＭＣ及び５０μｌの培養培地とともに５０μｌの標的細胞をインキュベートした。
【0107】
プレートを３７℃で２４時間インキュベートし、その後、５０μｌの上清をＬｕｍａｐｌａｔｅに移し、２４時間乾燥させた。次に、ＴｏｐＣｏｕｎｔ Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を使用して、Ｌｕｍａｐｌａｔｅを分析した。
【0108】
親和性研究
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）により表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の原理を使用して、親和性定数を決定した。製造者の説明書に従い、アミンカップリングを介して、多価ＨＳＡ－Ｆｕｃ－ＧＭ１コンジュゲート（５μｇ／ｍｌの社内コンジュゲート、６８６応答単位／チップ）をＣＭ５バイオセンサーチップのフローセルにカップリングさせた。同様に処理したがコンジュゲートを含まない参照フローセルを参照セルとして使用した。５０μｌ／ｍｉｎの流速でＦｕｃ－ＧＭ１でコーティングしたフローセルを使用して、ＨＢＳ－Ｐ緩衝液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０）中で希釈し、透析した抗体のいくつかの既知の濃度から、結合速度論パラメーターを決定した。Ｂｉａｃｏｒｅ機器により提供されたカーブフィッティングソフトウェア（ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎ）を使用して、会合及び解離速度の推定値を生成し、そこから二価検体モデルを使用して親和性を計算する。
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）により表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の原理を使用して、親和性定数を決定した。製造者の説明書に従い、アミンカップリングを介して、多価ＨＳＡ－Ｆｕｃ－ＧＭ１コンジュゲート（５μｇ／ｍｌの社内コンジュゲート、６８６応答単位／チップ）をＣＭ５バイオセンサーチップのフローセルにカップリングさせた。同様に処理したがコンジュゲートを含まない参照フローセルを参照セルとして使用した。５０μｌ／ｍｉｎの流速でＦｕｃ－ＧＭ１でコーティングしたフローセルを使用して、ＨＢＳ－Ｐ緩衝液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０）中で希釈し、透析した抗体のいくつかの既知の濃度から、結合速度論パラメーターを決定した。Ｂｉａｃｏｒｅ機器により提供されたカーブフィッティングソフトウェア（ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎ）を使用して、会合及び解離速度の推定値を生成し、そこから二価検体モデルを使用して親和性を計算する。
【0109】
データ分析
一元配置ＡＮＯＶＡダネットの多重比較検定を使用して、ＥＬＩＳＡの結果の統計学的有意性を決定した。差異は、Ｐ＜０．０５のレベルで統計学的に有意であるとみなした。＊の印はＰ≦０．０５を表し、＊＊の印はＰ≦０．０１を表し、＊＊＊の印はＰ≦０．００１を表し、＊＊＊＊の印はＰ≦０．０００１を表す。
一元配置ＡＮＯＶＡダネットの多重比較検定を使用して、ＥＬＩＳＡの結果の統計学的有意性を決定した。差異は、Ｐ＜０．０５のレベルで統計学的に有意であるとみなした。＊の印はＰ≦０．０５を表し、＊＊の印はＰ≦０．０１を表し、＊＊＊の印はＰ≦０．００１を表し、＊＊＊＊の印はＰ≦０．０００１を表す。
【0110】
血液に対する結合：５０μｌの健康なドナー血液を５０μｌ一次抗体とともに４℃で１時間インキュベートした。血液を１５０μｌのＲＰＭＩ １０％ＮＢＣＳで洗浄し、１，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を廃棄し、５０μｌ ＦＩＴＣコンジュゲート抗マウスＩｇＧ Ｆｃ特異的ｍＡｂ（ＲＰＭＩ １０％ＮＢＣＳ中１／１００）を二次抗体として使用した。細胞を４℃の暗所で１時間インキュベートし、次いで１５０μｌ ＲＰＭＩ １０％ＮＢＣＳで洗浄し、１，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を廃棄した後、５０μｌ／ウェルのＣａｌ－Ｌｙｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）を使用し、続いて５００μｌ／ウェル蒸留水を使用して赤血球細胞を溶解させた。引き続いて１，０００ｒｐｍで５分間血液を遠心分離した。上清を廃棄し、０．４％ホルムアルデヒドを使用して細胞を固定した。ＦＣ－５００フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）上で試料を分析した。生データを分析し、プロットするために、ＷｉｎＭＤＩ ２．９ソフトウェアを使用した。
【0111】
ＲＮＡ抽出及びｃＤＮＡ合成
ハイブリドーマ ＦＬ１３４．３３、ＦＬ１３３．６３及びＦＬ１３３．６７からの細胞およそ１×１０６個を組織培養から採取し、ＰＢＳ中で１回洗浄し、５００μＬのトリゾール（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で処理した。ホモジナイズした試料を０．１ｍｌのクロロホルムで処理し、遠心分離して、混入ＤＮＡ及びタンパク質からＲＮＡを分離した。０．２５ｍｌのプロパン－２－オールを使用してＲＮＡを沈殿させ、遠心分離して小さなペレットを形成させた。次に、エタノール７５％でペレットを洗浄し、ＲＮＡｓｅフリー水中で再懸濁した。製造者の推奨に従い、ＲＮＡをＤＮＡａｓｅ（ＤＮＡｓｅ Ｉ組み換え、ＲＮａｓｅフリー、Ｒｏｃｈｅ）で処理してゲノムＤＮＡを除去した。製造者の説明書に従い、オリゴ（ｄＴ）１５プライマーとともにＡＭＶ逆転写酵素キット（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ．Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、１μｇの総ＲＮＡからファーストストランドｃＤＮＡを調製した。ｃＤＮＡ合成後、９５℃で５分間のインキュベーションによって酵素を変性させた。次にｃＤＮＡを－２０℃で保管した。
ハイブリドーマ ＦＬ１３４．３３、ＦＬ１３３．６３及びＦＬ１３３．６７からの細胞およそ１×１０６個を組織培養から採取し、ＰＢＳ中で１回洗浄し、５００μＬのトリゾール（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で処理した。ホモジナイズした試料を０．１ｍｌのクロロホルムで処理し、遠心分離して、混入ＤＮＡ及びタンパク質からＲＮＡを分離した。０．２５ｍｌのプロパン－２－オールを使用してＲＮＡを沈殿させ、遠心分離して小さなペレットを形成させた。次に、エタノール７５％でペレットを洗浄し、ＲＮＡｓｅフリー水中で再懸濁した。製造者の推奨に従い、ＲＮＡをＤＮＡａｓｅ（ＤＮＡｓｅ Ｉ組み換え、ＲＮａｓｅフリー、Ｒｏｃｈｅ）で処理してゲノムＤＮＡを除去した。製造者の説明書に従い、オリゴ（ｄＴ）１５プライマーとともにＡＭＶ逆転写酵素キット（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ．Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、１μｇの総ＲＮＡからファーストストランドｃＤＮＡを調製した。ｃＤＮＡ合成後、９５℃で５分間のインキュベーションによって酵素を変性させた。次にｃＤＮＡを－２０℃で保管した。
【0112】
可変領域ＰＣＲ
アイソタイピング試験キット（Ｓｅｒｏｔｅｃ．Ｋｉｄｌｉｎｇｔｏｎ，ＵＫ）によって抗体を事前に評価し、ＦＬ１３４．３３がサブタイプＩｇＧ１であり、ＦＬ１３３．６３及び１３３．６７がＩｇＧ３（データは示さない）であると決定された。以前に公開されたプライマーセット（Ｊｏｎｅｓ ＆ Ｂｅｎｄｉｇ，１９９１）を使用してＰＣＲによって可変領域を決定した。軽鎖に対して１３個のＶＫ領域特異的プライマー及び１個のＣＫ特異的プライマー及び重鎖に対して１２個のＶＨ領域特異的プライマー及び１個の定常領域サブクラス特異的プライマーを用いてＰＣＲ増幅を行った。１Ｕのポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ３６０，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）、各０．２ｍＭの最終濃度の２’－デオキシヌクレオシド５’－トリホスフェート（ｄＮＴＰ）の混合物、１．５ｍＭの最終濃度の塩化マグネシウム及び１μＭのフォワード及びリバースプライマーの両方を使用して、５０μｌ ＰＣＲ反応を設定した。反応のホットスタート段階を９５℃で５分間行った。次に、増幅を３５サイクル行った：９４℃で１分間、続いて６０℃で１分間及び７２℃で２分間。最後に、７２℃で２０分間、ポリッシング段階を行った。臭化エチジウムを有するＴＡＥ緩衝液中の１％ＵｌｔｒａＰｕｒｅアガロース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）を用いて調製したアガロースゲル電気泳動を使用し、９０ボルトで泳動して、増幅産物を評価した。ＵＶ透過照明を使用してゲルを可視化した。
アイソタイピング試験キット（Ｓｅｒｏｔｅｃ．Ｋｉｄｌｉｎｇｔｏｎ，ＵＫ）によって抗体を事前に評価し、ＦＬ１３４．３３がサブタイプＩｇＧ１であり、ＦＬ１３３．６３及び１３３．６７がＩｇＧ３（データは示さない）であると決定された。以前に公開されたプライマーセット（Ｊｏｎｅｓ ＆ Ｂｅｎｄｉｇ，１９９１）を使用してＰＣＲによって可変領域を決定した。軽鎖に対して１３個のＶＫ領域特異的プライマー及び１個のＣＫ特異的プライマー及び重鎖に対して１２個のＶＨ領域特異的プライマー及び１個の定常領域サブクラス特異的プライマーを用いてＰＣＲ増幅を行った。１Ｕのポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ３６０，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）、各０．２ｍＭの最終濃度の２’－デオキシヌクレオシド５’－トリホスフェート（ｄＮＴＰ）の混合物、１．５ｍＭの最終濃度の塩化マグネシウム及び１μＭのフォワード及びリバースプライマーの両方を使用して、５０μｌ ＰＣＲ反応を設定した。反応のホットスタート段階を９５℃で５分間行った。次に、増幅を３５サイクル行った：９４℃で１分間、続いて６０℃で１分間及び７２℃で２分間。最後に、７２℃で２０分間、ポリッシング段階を行った。臭化エチジウムを有するＴＡＥ緩衝液中の１％ＵｌｔｒａＰｕｒｅアガロース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）を用いて調製したアガロースゲル電気泳動を使用し、９０ボルトで泳動して、増幅産物を評価した。ＵＶ透過照明を使用してゲルを可視化した。
【0113】
ＰＣＲ生成物の精製（重鎖及び軽鎖）
残留ヌクレオチド又はプライマーのキャリーオーバーを回避し、明確な配列グラフを得るために、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ．Ｖｅｎｌｏ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用してＰＣＲ生成物を精製した。１５０μｌの重鎖及び軽鎖ＰＣＲ生成物を１％アガロースゲルにロードし、８５ボルトで泳動した。ＤＮＡ断片をゲルから切り出し、溶解し、製造者のプロトコールに従ってカラム上で精製した。得られたＤＮＡの最終濃度をＵＶ分光法（Ｎａｎｏｄｒｏｐ，Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ．Ｗａｌｔｈａｍ，ＵＳＡ）により決定した。
残留ヌクレオチド又はプライマーのキャリーオーバーを回避し、明確な配列グラフを得るために、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ．Ｖｅｎｌｏ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用してＰＣＲ生成物を精製した。１５０μｌの重鎖及び軽鎖ＰＣＲ生成物を１％アガロースゲルにロードし、８５ボルトで泳動した。ＤＮＡ断片をゲルから切り出し、溶解し、製造者のプロトコールに従ってカラム上で精製した。得られたＤＮＡの最終濃度をＵＶ分光法（Ｎａｎｏｄｒｏｐ，Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ．Ｗａｌｔｈａｍ，ＵＳＡ）により決定した。
【0114】
プルーフリーディングＰＣＲ
プルーフリーディングＰＣＲを行うためのプライマーを、配列データに基づき、読み枠を維持し、アミノ酸配列を保存するように設計した。開始コドン、翻訳過程開始のためのＫｏｚａｋコンセンサス配列を考慮し、二重発現ベクターへの組み込みを可能にするための制限酵素部位を組み込んだ。鋳型としてｃＤＮＡを用いてクローニングプライマー及びプルーフリーディングポリメラーゼ（ＰＨＵｓｉｏｎ，ＮＥＢ．Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＵＫ）を使用してＰＣＲ増幅を行った。この反応は、生成物の収率を改善するために３つ組で行った。前に述べたように５０μＬの反応を設定した。９８℃で３分間、ホットスタート段階を行った。次に、増幅を３５サイクル行った：９８℃で３０秒、続いて５８℃で３０秒及び６８℃で６０秒。７２℃で１０分間、ポリッシング段階を行った。
プルーフリーディングＰＣＲを行うためのプライマーを、配列データに基づき、読み枠を維持し、アミノ酸配列を保存するように設計した。開始コドン、翻訳過程開始のためのＫｏｚａｋコンセンサス配列を考慮し、二重発現ベクターへの組み込みを可能にするための制限酵素部位を組み込んだ。鋳型としてｃＤＮＡを用いてクローニングプライマー及びプルーフリーディングポリメラーゼ（ＰＨＵｓｉｏｎ，ＮＥＢ．Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＵＫ）を使用してＰＣＲ増幅を行った。この反応は、生成物の収率を改善するために３つ組で行った。前に述べたように５０μＬの反応を設定した。９８℃で３分間、ホットスタート段階を行った。次に、増幅を３５サイクル行った：９８℃で３０秒、続いて５８℃で３０秒及び６８℃で６０秒。７２℃で１０分間、ポリッシング段階を行った。
【0115】
ＰＣＲ生成物のＴＯＰＯクローニング
プルーフリーディングポリメラーゼによって作製したＰＣＲ産物を、製造者の説明書に従い、Ｔａｑポリメラーゼ（ＮＥＢ）により７２℃で１５分間処理して、アデニンオーバーハングを付加し、ＴＡ（ＴＯＰＯ）ベクター（ｐＣＲ２．１，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、その後の酵素消化及びｐＤＣＯｒｉｇ－ｈＩｇＧ１ベクターへのライゲーションのために、化学的コンピテントＴＯＰ１０Ｆ細胞へと形質転換した。８０μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ寒天プレート又は液体培地中で、形質転換細菌を増殖させた。
プルーフリーディングポリメラーゼによって作製したＰＣＲ産物を、製造者の説明書に従い、Ｔａｑポリメラーゼ（ＮＥＢ）により７２℃で１５分間処理して、アデニンオーバーハングを付加し、ＴＡ（ＴＯＰＯ）ベクター（ｐＣＲ２．１，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、その後の酵素消化及びｐＤＣＯｒｉｇ－ｈＩｇＧ１ベクターへのライゲーションのために、化学的コンピテントＴＯＰ１０Ｆ細胞へと形質転換した。８０μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ寒天プレート又は液体培地中で、形質転換細菌を増殖させた。
【0116】
核酸の精製
適切な抗体を添加した液体培養中の形質転換細菌の３７℃及び１２０ｒｐｍでの一晩培養物から、プラスミドＤＮＡを調製した。両方とも製造者の説明書に従い、ｓｐｉｎｉミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して少量を調製し、プラスミドマキシキット（Ｑｉａｇｅｎ）で大量の調製を行った。製造者の手順に従い、以前に記載されたアガロースゲル電気泳動及びＤＮＡを回収するためのゲル抽出キットの使用によってＤＮＡの精製を行った。
適切な抗体を添加した液体培養中の形質転換細菌の３７℃及び１２０ｒｐｍでの一晩培養物から、プラスミドＤＮＡを調製した。両方とも製造者の説明書に従い、ｓｐｉｎｉミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して少量を調製し、プラスミドマキシキット（Ｑｉａｇｅｎ）で大量の調製を行った。製造者の手順に従い、以前に記載されたアガロースゲル電気泳動及びＤＮＡを回収するためのゲル抽出キットの使用によってＤＮＡの精製を行った。
【0117】
制限酵素消化及び二重発現ベクターのクローニング
ＤＮＡの酵素消化は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び各酵素自身の最適緩衝液の存在下で、１０μＬのＤＮＡについて、各制限酵素の８単位を添加して行った。各酵素の活性温度で２時間、インキュベーションを行った。二重発現ベクターＰＤＣＯｒｉｇ－ｈＩｇＧ１及び軽鎖インサートを消化し、アガロースゲルで精製し、製造者の指示に従い、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を使用して１６℃で一晩ライゲーションを行った。ベクター及び重鎖の第２の消化後に、ゲル抽出を介した別の精製及び１６℃で一晩の第２のライゲーションを行った。各消化後、ベクターを化学的コンピテントＴＯＰ１０Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。３５μｇ／ｍｌのゼオシン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を添加したＬＢ寒天プレート又は液体培地中で、形質転換細菌を増殖させた。
ＤＮＡの酵素消化は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び各酵素自身の最適緩衝液の存在下で、１０μＬのＤＮＡについて、各制限酵素の８単位を添加して行った。各酵素の活性温度で２時間、インキュベーションを行った。二重発現ベクターＰＤＣＯｒｉｇ－ｈＩｇＧ１及び軽鎖インサートを消化し、アガロースゲルで精製し、製造者の指示に従い、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を使用して１６℃で一晩ライゲーションを行った。ベクター及び重鎖の第２の消化後に、ゲル抽出を介した別の精製及び１６℃で一晩の第２のライゲーションを行った。各消化後、ベクターを化学的コンピテントＴＯＰ１０Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。３５μｇ／ｍｌのゼオシン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を添加したＬＢ寒天プレート又は液体培地中で、形質転換細菌を増殖させた。
【0118】
キメラ化抗体ベクターのシーケンシング及びトランスフェクション
ＰＣＲ産物及びプラスミドを、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ ＤＮＡシーケンシング施設で適切な５’及び３’プライマーを使用してシーケンシングし、ＧｅｎｅＴｏｏｌソフトウェアパッケージ及びマウス免疫グロブリンヌクレオチド配列に対するＩＭＧＴデータベースを使用して分析した。リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＯｐｔｉ－ｍｅｍ血清低減培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．Ｗａｌｔｈａｍ，ＵＳＡ）を使用して、ＣＨＯ細胞をトランスフェクトした。それが消費されるまで、細胞を、ＣＨＯ－Ｓ－ＳＦＭＩＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で、培地が消費されるまで浮遊培養した。上清を回収し、プロテイン－Ｇセファロース充填済みカラム（ＨｉＴｒａｐプロテインＧ ＨＰ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する分取クロマトグラフィー（Ａｋｔａ ＦＰＬＣ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）によって抗体を精製した。精製後、抗体を透析し、ＵＶ分光法によって最終収率を決定した。
ＰＣＲ産物及びプラスミドを、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ ＤＮＡシーケンシング施設で適切な５’及び３’プライマーを使用してシーケンシングし、ＧｅｎｅＴｏｏｌソフトウェアパッケージ及びマウス免疫グロブリンヌクレオチド配列に対するＩＭＧＴデータベースを使用して分析した。リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＯｐｔｉ－ｍｅｍ血清低減培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．Ｗａｌｔｈａｍ，ＵＳＡ）を使用して、ＣＨＯ細胞をトランスフェクトした。それが消費されるまで、細胞を、ＣＨＯ－Ｓ－ＳＦＭＩＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で、培地が消費されるまで浮遊培養した。上清を回収し、プロテイン－Ｇセファロース充填済みカラム（ＨｉＴｒａｐプロテインＧ ＨＰ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する分取クロマトグラフィー（Ａｋｔａ ＦＰＬＣ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）によって抗体を精製した。精製後、抗体を透析し、ＵＶ分光法によって最終収率を決定した。
【0119】
実施例１－ＦＵＣ－ＧＭ１ ｍＡｂの作製及び最初の特徴付け：
ｉ．ｐ投与されるマウスの免疫あたり１０μｇフコシルＧＭ１含有する古典的リポソームによってマウスを免疫した。１回目及び３回目の免疫ではアルファ－ＧａｌＣｅｒをアジュバントとして使用し、一方で２回目及び４回目の免疫では抗ＣＤ４０ｍＡｂをアジュバントとして使用した。全てのマウスに４回の免疫を行った。最初の３回の免疫を２週間間隔で行い、最後の免疫は３回目の４週間後に行った。２回目の免疫以降、免疫から１週間後にマウスから採血し、血清を、精製フコシルＧＭ１へのＩｇＧ及びＩｇＭ結合についてＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。免疫後、マウスは、エンドポイント抗体価１／１００でフコシルＧＭ１に対する顕著なＩｇＧ免疫応答を生じた。マウス血清ＩｇＧを、フコシルＧＭ１を発現するＤＭＳ７９細胞株の細胞表面に対する結合についても評価した。残念ながら、細胞株に対して弱い結合しか見られなかった。マウス血清は、脂質が細胞の原形質膜に組み込まれると近づくことができないフコシルＧＭ１抗原のエピトープを認識したと推定することが可能である。
ｉ．ｐ投与されるマウスの免疫あたり１０μｇフコシルＧＭ１含有する古典的リポソームによってマウスを免疫した。１回目及び３回目の免疫ではアルファ－ＧａｌＣｅｒをアジュバントとして使用し、一方で２回目及び４回目の免疫では抗ＣＤ４０ｍＡｂをアジュバントとして使用した。全てのマウスに４回の免疫を行った。最初の３回の免疫を２週間間隔で行い、最後の免疫は３回目の４週間後に行った。２回目の免疫以降、免疫から１週間後にマウスから採血し、血清を、精製フコシルＧＭ１へのＩｇＧ及びＩｇＭ結合についてＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。免疫後、マウスは、エンドポイント抗体価１／１００でフコシルＧＭ１に対する顕著なＩｇＧ免疫応答を生じた。マウス血清ＩｇＧを、フコシルＧＭ１を発現するＤＭＳ７９細胞株の細胞表面に対する結合についても評価した。残念ながら、細胞株に対して弱い結合しか見られなかった。マウス血清は、脂質が細胞の原形質膜に組み込まれると近づくことができないフコシルＧＭ１抗原のエピトープを認識したと推定することが可能である。
【0120】
リポソームに組み込まれた精製糖脂質が高い抗体価のＩｇＧ応答を生成することができなかったので、他の免疫方法を評価した。伝統的に、炭水化物及び糖脂質は、主にＩｇＭ抗体応答を誘発するＴ細胞非依存性抗原としてクラス分けされる。高親和性ＩｇＧ抗体応答は、主にタンパク質抗原に応答して生じる。従って、関連するＴ細胞の助けがあれば、炭水化物及び糖脂質抗原に対してより大きくより一貫した高親和性ＩｇＧ抗体応答を生成すると仮定された。従ってフコシルＧＭ１をヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）にコンジュゲートした。
【0121】
タンパク質に対するフコシルＧＭ１のコンジュゲーションは２段階工程に従った。最初に、精製ガングリオシドフコシルＧＭ１にオゾン分解を行い、ここで反応性オゾンが糖スフィンゴ脂質のスフィンゴシン部分に存在する炭素－炭素二重結合を酸化して、遊離アルデヒド基を生成させる。次の段階で、オゾン分解されたフコシルＧＭ１を、還元性アミノ化の工程によってＨＳＡにコンジュゲートした。これにより、オゾン分解されたフコシルＧＭ１の新たに生成されたアルデヒドがＨＳＡにおいてリジンの一級アミン基と反応できるようになり、不安定なシッフ塩基を最初に形成し、これを水素化ホウ素ナトリウムにより還元すると、非常に安定な２級アミン結合を形成する。コンジュゲートの作製の模式的な代表例を（図４）で例示する。
【0122】
オゾン分解後、フーリエ変換質量分析（ＦＴＭＳ）によって、当初のフコシルＧＭ１及びオゾン分解したフコシルＧＭ１の両方からの試料を分析した。当初の試料は、脂肪酸鎖の長さが様々であるフコシルＧＭ１のいくつかの種を含有した。最も豊富な種の分子量は１，７４６Ｄａであった。オゾン分解試料もまた、様々なサイズの脂肪酸鎖を有する種も含有した。オゾン分解フコシルＧＭ１試料において、主な種の分子量は１，５６６Ｄａであり、正確に１８０Ｄａの質量シフトを示し、これはスフィンゴシン部分の喪失に相当した。さらに、当初のフコシルＧＭ１種は、オゾン分解試料では検出可能ではなかった（図５）。炭酸－重炭酸緩衝液中で再懸濁したＨＳＡにＤＭＳＯ中で再懸濁したオゾン分解フコシルＧＭ１を添加した。これに、還元剤、水素化ホウ素ナトリウム（Ｈ４ＢＮａ）を添加し、この反応を室温で８時間インキュベートし、次いで１００μｌのＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液中で再懸濁した。次に、スルホ－ＭＢＳ架橋剤を添加し、室温で１時間インキュベートした。
【0123】
ＨＳＡ－フコシルＧＭ１コンジュゲートの作製の成功を、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング及び質量分析によって評価した。ＥＬＩＳＡでは、ＨＳＡに対するＩｇＧ抗体を含有するマウス血清（１／１０，０００エンドポイント抗体価）により、当初のＨＳＡ並びに全ての３つのＨＳＡ－フコシルＧＭ１コンジュゲート試料が検出され、一方で抗フコシルＧＭ１ ｍＡｂ Ｆ１２（１／１０，０００エンドポイント抗体価）によってＨＳＡ－フコシルＧＭ１コンジュゲートのみが検出された（図６Ａ）。ウエスタンブロット分析では、３つ全ての試料におけるＨＳＡ－フコシルＧＭ１コンジュゲートの生成も確認された。抗ＨＳＡマウス血清は、当初のＨＳＡに、還元性アミノ化に供されたがフコシルＧＭ１が付加されなかったＨＳＡに、ＨＳＡ－ＬｅｗｉｓＹコンジュゲートに、ＨＳＡ－ＧＤ３コンジュゲートに、及びＨＳＡ－フコシルＧＭ１コンジュゲートの３つ全ての試料に結合した。一方で、抗フコシルＧＭ１ ｍＡｂ Ｆ１２はＨＳＡ－フコシルＧＭ１コンジュゲートのみを検出し、それらは６７ｋＤａの予想サイズであった。この分析は、当初のＨＳＡと比較した場合の、ＨＳＡ－フコシルＧＭ１コンジュゲートの分子量の僅かな上昇も示した。これは、ＨＳＡへのフコシルＧＭ１分子の付加と一致した（図６Ｂ）。
【0124】
Ｆｕｃ－ＧＭ１含有リポソーム（１０μｇ／免疫）及びＦｕｃ－ＧＭ１陽性ＳＣＬＣ細胞株ＤＭＳ７９（細胞１×１０６個／免疫）とともにＨＳＡ－Ｆｕｃ－ＧＭ１コンジュゲート（１０μｇ／免疫）によってマウスを免疫した。１５匹のマウスを各群マウス３匹からなる５つの群に分け、タイプ及び順序が異なる免疫アジュバントを使用した。
【0125】
群１に、最初にＦｕｃ－ＧＭ１リポソームによって３回の免疫を行い、続いてＨＳＡ－Ｆｕｃ－ＧＭ１コンジュゲートによって２回の免疫を行った。アジュバントとして、１回目の免疫でα－ＧａｌＣｅｒを使用し、続く２回の免疫では抗ＣＤ４０を使用し、ＨＳＡ－Ｆｕｃ－ＧＭ１コンジュゲートに関しては、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）をアジュバントとして使用した。細胞表面上のＦｕｃ－ＧＭ１を認識可能なｍＡｂを生成させる機会を改善するために、群２を、最初に１×１０６個のＤＭＳ７９細胞によって免疫し、続いてＦｕｃ－ＧＭ１含有リポソームによって２回免疫し、ＨＳＡ－Ｆｕｃ－ＧＭ１コンジュゲートによって２回免疫した。２回目及び３回目の免疫ではα－ＧａｌＣｅｒを使用し、一方でＨＳＡ－Ｆｕｃ－ＧＭ１コンジュゲートについては不完全フロイントアジュバントを使用した。群３を、最初にＨＳＡ－Ｆｕｃ－ＧＭ１コンジュゲートによって免疫し、続いてＦｕｃ－ＧＭ１リポソームによって免疫した。ＨＳＡ－Ｆｕｃ－ＧＭ１コンジュゲートでは完全フロイントアジュバントをアジュバントとして使用し、２回目の免疫ではアジュバントとして抗ＣＤ４０を使用し、３回目ではα－ＧａｌＣｅｒを使用した。群４は、これらの抗原の順序を逆にし；マウスを最初にＦｕｃ－ＧＭ１リポソームによって２回免疫し、続いてＨＳＡ－Ｆｕｃ－ＧＭ１コンジュゲートによって１回免疫した。最初の免疫ではアジュバントとしてα－ＧａｌＣｅｒを使用し、２回目では抗ＣＤ４０、３回目ではＩＦＡを使用した。群５では、ＨＳＡ－Ｆｕｃ－ＧＭ１コンジュゲートによって３回免疫した。１回目の免疫ではアジュバントとしてＣＦＡを使用し、続く２回の免疫ではＩＦＡを使用した。これらの群及びそれらの免疫原を（表１）でまとめる。
【表1】
【0126】
マウスを、ｉ．ｐ．経路を介して免疫した。最初の３回の免疫は２週間の間隔で行った。群１及び２には、３回目の６週間後に４回目の免疫、及び４回目から３週間後に５回目の免疫を行った。
【0127】
１回目を除く各免疫後、マウスの尾から採血し、ＥＬＩＳＡによってＨＳＡ－Ｆｕｃ－ＧＭ１コンジュゲートへの結合についてマウス血清ＩｇＧをスクリーニングした。さらに、発明者らは、（リジン残基に連結したＦｕｃ－ＧＭ１ではなくて）Ｆｕｃ－ＧＭ１のみを認識するｍＡｂを作製することを意図していたので、精製Ｆｕｃ－ＧＭ１への結合についてもマウス血清をスクリーニングした。これらの分析は、全てのマウスがＨＳＡ－Ｆｕｃ－ＧＭ１コンジュゲートに対してＩｇＧ免疫応答を生じた（エンドポイント抗体価１／１０，０００）が、所望の精製Ｆｕｃ－ＧＭ１応答を生じたのは１５匹のマウスのうち６匹のみであったことを示した。群１（３×リポソーム＋２×コンジュゲート）からの２匹のマウスでは、精製Ｆｕｃ－ＧＭ１に対する有意なＩｇＧ応答が検出され、両方ともエンドポイント抗体価は１／１，０００であった。さらに、群２（ＤＭＳ７９細胞＋２ｘリポソーム＋２ｘコンジュゲート）からの２匹のマウスでは検出可能な抗体価が存在し、マウス２Ｐのエンドポイント抗体価は１／１０００、及びマウス２Ｒの抗体価は１／１００であり、Ｇ５（３ｘコンジュゲート）からの２匹のマウスでは、マウス５Ｐのエンドポイント抗体価は１／１００及びマウス５Ｒの抗体価は１／１０００であった。陽性抗Ｆｕｃ－ＧＭ１応答を示すマウスからのデータのみを（図７）で示す。
【0128】
血清分析により、６匹のマウスが精製Ｆｕｃ－ＧＭ１に対してＩｇＧ免疫応答を発したことが示された。これらの抗体がインタクトな細胞原形質膜の状況でＦｕｃ－ＧＭ１も認識し得るか否かを評価するために、フローサイトメトリーによりＤＭＳ７９細胞への結合についてこれらをスクリーニングした。この分析から、（ＤＭＳ７９細胞によって免疫され、その後リポソームによって２回及びコンジュゲートによって２回免疫された）群２からの２匹のマウスのみが、細胞表面上のＦｕｃ－ＧＭ１に結合し得る抗体を産生した（ＧＭ≒５００）ことが示された。Ｆｕｃ－ＧＭ１特異的ＩｇＧ応答を生じた他の群では、生細胞の表面にも結合したものはなく、これにより、ＤＭＳ７９生細胞を免疫プロトコールに含めることは欠かせない価値があったことが示唆された（図８）。
【0129】
有望な抗Ｆｕｃ－ＧＭ１ ＩｇＧ応答を示すデータの獲得後、マウス２Ｒを屠殺し、その脾細胞をＮＳ０骨髄細胞と融合させた。融合の５日前に、リポソーム中の１０μｇのＦｕｃ－ＧＭ１及びα－ＧａｌＣｅｒをｉ．ｖ投与してマウス免疫応答をブーストした。確立後、ＥＬＩＳＡによって精製Ｆｕｃ－ＧＭ１へのＩｇＧ抗体結合の産生について個々のハイブリドーマコロニーをスクリーニングした。抗体結合が最大である４つのハイブリドーマを同定し、細胞０．３個／ウェルで２回クローニングした。各ラウンドのクローニング後、ＥＬＩＳＡによって、ハイブリドーマ上清を精製Ｆｕｃ－ＧＭ１に結合するＩｇＧ抗体の分泌について再スクリーニングした（結果は示していない）。クローニング後、ハイブリドーマＦＬ１３３．６３、ＦＬ１３３．６７及びＦＬ１３４．３３を選択し、増殖させ、ハイブリドーマ上清からｍＡｂを精製した。アイソタイプ試験キットを使用して、ｍＡｂ ＦＬ１３３．６３及びＦＬ１３３．６７はＩｇＧ３、カッパであることが見出され、一方でｍＡｂ ＦＬ１３４．３３はＩｇＧ１、カッパとして同定された。
【0130】
クローニング、増殖及び精製後、Ｆｕｃ－ＧＭ１陽性癌細胞株の細胞表面へのこれらのｍＡｂの結合を評価することは重要であった。全ての抗体を、直接比較を可能にするために、１０μｇ／ｍｌの同じ濃度で使用した。ＭＡｂ ＦＬ１３３．６３は、細胞株ＤＭＳ７９には強く結合したが（ＧＭ≒１０００）、細胞株ＤＭＳ５３への結合は弱かった（ＧＭ≒１００）。ＭＡｂ ＦＬ１３３．６７は、ＤＭＳ７９に強く結合したが（ＧＭ≒１０００）、他のＦｕｃ－ＧＭ１陽性細胞株の何れにも結合しなかった。ＭＡｂ ＦＬ１３４．３３は、ＤＭＳ７９には強く結合し（ＧＭ≒１０００）、Ｈ１２８には穏やかに結合し（ＧＭ≒３００）、ＤＭＳ５３への結合は弱かった（ＧＭ≒１００）。陽性対照ｍＡｂ Ｆ１２は、非常に強い染色強度を示す４つ全ての細胞株に結合し、ＤＭＳ７９に対してＧＭ≒２０００、ＤＭＳ５３に対してＧＭ≒７００、Ｈ１２８に対してＧＭ≒５００及び細胞株Ｈ６９に対してＧＭ≒１００であり；全てのｍＡｂのうち、ｍＡｂ Ｆ１２のみが細胞株Ｈ６９に結合した。ＭＡｂ ＦＬ１３４．３３は、細胞株ＤＭＳ５３への結合より強い強度で細胞株Ｈ１２８に結合するという点で異常な挙動を示したが；ＤＭＳ５３は、細胞株Ｈ１２８よりも大量のＦｕｃ－ＧＭ１を発現することが報告され、この結果は本明細書においてｍＡｂ Ｆ１２染色により確認された（図９）。
【0131】
３つ全てのｍＡｂを、健康なヒトボランティアの全血に対する結合についてスクリーニングしたところ、存在する有核細胞の何れに対しても結合は示さなかった。アイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ３及びＦ１２を陰性対照として使用し、抗ＭＨＣクラス１ｍＡｂを陽性対照として使用した（図１０）。
【0132】
実施例２－Ｆｕｃ－ＧＭ１ ｍＡｂにより認識されるエピトープの定義
Ｆｕｃ－ＧＭ１に対するｍＡｂ、ＦＬ１３３．６３、ＦＬ１３３．６７及びＦＬ１３４．３３の特異性を、一連の利用可能な精製ガングリオシド、即ちＦｕｃ－ＧＭ１、ＧＤ３、ＧＭ１、ＧＭ３、ＧＤ１ａ、ＧＴ１ｂ、Ｇｂ３及びラクトシルセラミドへの結合についてｍＡｂを試験する糖脂質ＥＬＩＳＡによって評価した。３つ全てのｍＡｂが、１～０．０１μｇ／ｍｌの濃度でガングリオシドＦｕｃ－ＧＭ１のみを認識した。陽性対照ｍＡｂ Ｆ１２も１～０．０１μｇ／ｍｌの濃度でＦｕｃ－ＧＭ１を認識する。ガングリオシドＧＤ３は、１～０．０１μｇ／ｍｌの濃度で陽性対照ｍＡｂ Ｒ２４によって検出された。ガングリオシドＦｕｃ－ＧＭ１、ＧＭ１及びＧＤ１ａは、１μｇ／ｍｌで陽性対照コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴｘＢ）によって検出された。ＧＭ３、ＧＴ１ｂ、Ｇｂ３及びＬａｃＣｅｒに特異的なＩｇＧ ｍＡｂはまだ作製されていない（図１１）。
Ｆｕｃ－ＧＭ１に対するｍＡｂ、ＦＬ１３３．６３、ＦＬ１３３．６７及びＦＬ１３４．３３の特異性を、一連の利用可能な精製ガングリオシド、即ちＦｕｃ－ＧＭ１、ＧＤ３、ＧＭ１、ＧＭ３、ＧＤ１ａ、ＧＴ１ｂ、Ｇｂ３及びラクトシルセラミドへの結合についてｍＡｂを試験する糖脂質ＥＬＩＳＡによって評価した。３つ全てのｍＡｂが、１～０．０１μｇ／ｍｌの濃度でガングリオシドＦｕｃ－ＧＭ１のみを認識した。陽性対照ｍＡｂ Ｆ１２も１～０．０１μｇ／ｍｌの濃度でＦｕｃ－ＧＭ１を認識する。ガングリオシドＧＤ３は、１～０．０１μｇ／ｍｌの濃度で陽性対照ｍＡｂ Ｒ２４によって検出された。ガングリオシドＦｕｃ－ＧＭ１、ＧＭ１及びＧＤ１ａは、１μｇ／ｍｌで陽性対照コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴｘＢ）によって検出された。ＧＭ３、ＧＴ１ｂ、Ｇｂ３及びＬａｃＣｅｒに特異的なＩｇＧ ｍＡｂはまだ作製されていない（図１１）。
【0133】
Ｆｕｃ－ＧＭ１へのｍＡｂ、ＦＬ１３３．６３、ＦＬ１３３．６７及びＦＬ１３４．３３の結合をさらに検証するために、精製Ｆｕｃ－ＧＭ１と細胞株ＤＭＳ７９上で発現されるこのガングリオシドとの間の競合アッセイにおいてそれらを評価した。この実験では、ｍＡｂを精製Ｆｕｃ－ＧＭ１とともにプレインキュベートし、その後、それらをフローサイトメトリーにおける一次試薬として使用した。ｍＡｂ ＦＬ１３３．６３とガングリオシドＦｕｃ－ＧＭ１とのプレインキュベーションによって、ＤＭＳ７９細胞株へのその結合がＧＭ＝５２３からＧＭ＝４に低下し、ｍＡｂ ＦＬ１３３．６７の結合はＧＭ＝２０１からＧＭ＝３に低下し、ｍＡｂ ＦＬ１３４．３３の結合はＧＭ＝４３４からＧＭ＝２９に低下し、陽性対照ｍＡｂＦ１２の結合はＧＭ＝１１９５からＧＭ＝６に低下した。陰性対照ｍＡｂ抗ＭＨＣクラス１とガングリオシドＦｕｃ－ＧＭ１とのプレインキュベーションは、ＤＭＳ７９細胞へのその結合に影響を及ぼさなかった（図１２）。
【0134】
ＦＬ１３３／１３４ｍＡｂの微細特異性をさらに明らかにするために、Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｌｙｃｏｍｉｃｓによって、これらを≧６００種類の天然及び合成グリカンに対してスクリーニングした。グリカンアレイへのＦＬ１３３．６３の結合（図１３Ａ）は、予想外に（表２）、ＦｕｃＧＭ１（遊離糖）をチップに直接結合させたＦｕｃＧＭ１ｓｐ０（チャート番号６３）、又はＦｕｃＧＭ１（遊離糖）を炭素９個のスペーサーを介してチップに結合させたＦｕｃ－Ｇｍ１ｓｐ９（チャート番号６４）に結合できなかったことを示した。
【表2】
【0135】
グリカンアレイへのＦＬ１３４．３３の結合（図１３Ｂ）は、予想外に（表３）、ＦｕｃＧＭ１（遊離糖）をチップに直接結合させたＦｕｃＧＭ１ｓｐ０（チャート番号６３）には結合できず、ＦｕｃＧＭ１（遊離糖）が炭素９個のスペーサーを介してチップに結合させたＦｕｃ－Ｇｍ１ｓｐ９（チャート番号６４）には非常に弱く結合したことを示した。
【表3】
【0136】
最終的に、Ｆｕｃ－ＧＭ１に対するこれらのｍＡｂの特異性は、ＴＬＣ分析によっても実証された。精製ガングリオシドＦｕｃ－ＧＭ１、精製ガングリオシドＧＭ１及びＤＭＳ７９ ＰＭ ＴＧＬをシリカプレート上にローディングした。３つ全てのＦｕｃ－ＧＭ１ ｍＡｂが、精製Ｆｕｃ－ＧＭ１を認識し、ＤＭＳ７９ ＰＭ ＴＧＬに存在するバンドは精製Ｆｕｃ－ＧＭ１と同じ距離を移動した。精製ガングリオシドＧＭ１に結合した抗体はなかった。本明細書で生成されたＦｕｃ－ＧＭ１ ｍＡｂの認識パターンは、精製Ｆｕｃ－ＧＭ１及びＤＭＳ７９ ＰＭ ＴＧＬを認識する陽性対照ｍＡｂ Ｆ１２のパターンと同一であった。驚くべきことに、ｍＡｂ Ｆ１２も精製ガングリオシドＧＭ１に弱く結合し、その結合は以前のアッセイでは検出されていなかった（図１４）。
【0137】
Ｂｉａｃｏｒｅ ＸによるＳＰＲによって、それらの抗原に対する抗Ｆｕｃ－ＧＭ１ ｍＡｂの親和性を決定した。３つの抗Ｆｕｃ－ＧＭ１ ｍＡｂの作製のために当初使用されたＨＳＡ－Ｆｕｃ－ＧＭ１コンジュゲートを、分析のための標的として使用した。コンジュゲートへの抗Ｆｕｃ－ＧＭ１ ｍＡｂの結合を、ＥＬＩＳＡによって確認した。（図１５）
【0138】
ＨＳＡ－Ｆｕｃ－ＧＭ１コンジュゲートをＣＭ５バイオセンサーチップにカップリングするために、チップを最初にＨＳＢ－Ｐ緩衝液で洗浄し、その後、架橋剤ＥＤＣ－ＮＨＳを適用した。次に、酢酸４．５カップリング緩衝液中で希釈したＨＳＡ－Ｆｕｃ－ＧＭ１コンジュゲートを、２０μｇ／ｍｌでフローセルに注入した。５μｌの体積の注入後に、コンジュゲートの６８６応答単位をチップに結合させた。最終的に、未反応のカップリング剤をエタノールアミンによりブロッキングした。ＨＳＡ－Ｆｕｃ－ＧＭ１をコーティングしたフローセルを使用して、ＨＢＳ－Ｐ緩衝液中で希釈した抗体のいくつかの既知の濃度から、結合速度論パラメーターを決定した。Ｂｉａｃｏｒｅ装置とともに提供されるカーブフィッティングソフトウェア（ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎ）を使用して、結合及び解離速度の推定値を生成させ、これから、最もよく適合するｂｉｖａｌｅｎｔ ａｎａｌｙｔｅ ｍｏｄｅｌを使用して親和性を計算した。このモデルは、二価タンパク質に対する親和性を計算するが、抗体の第１のアームの結合に対する意味のあるデータを計算することのみ可能である。このモデルによれば、Ｆｕｃ－ＧＭ１ ｍＡｂは、平均結合速度定数ｋｏｎ（Ａｂ ＦＬ１３３．６３に対して３．５６ｘ１０４Ｍｓ－１、ｍＡｂ ＦＬ１３３．６７に対して９．４３ｘ１０３Ｍｓ－１及びｍＡｂ ＦＬ１３４．３３に対して２．０１×１０３Ｍｓ－１）を有するが、解離速度定数ｋｏｆｆが非常に速く（ｍＡｂ ＦＬ１３３．６３に対して０．０６３７ｓ－１、ｍＡｂ ＦＬ１３３．６７に対して０．０７８３ｓ－１及びｍＡｂ ＦＬ１３４．３３に対して０．１１７ｓ－１）、そのためこれらのｍＡｂに対する機能的親和性は全体的に低い（ｍＡｂ ＦＬ１３３．６３に対して１．８×１０－６Ｍ、ｍＡｂ ＦＬ１３３．６７に対して８．３×１０－６Ｍ及びｍＡｂ ＦＬ１３４．３３に対して５．８×１０－５Ｍ（表４）。
【表4】
【0139】
３つのＦｕｃ－ＧＭ１抗体のＥＣ５０及び平衡解離定数（Ｋｄ）を、精製Ｆｕｃ－ＧＭ１及びＤＭＳ７９細胞においてそれぞれそれらを滴定することによって決定した（図１６）。Ｆｕｃ－ＧＭ１ ＥＬＩＳＡからのＥＣ５０値及びＤＭＳ７９細胞でのフローサイトメトリー分析により表される機能的親和性は、ＳＰＲ評価により与えられた親和性よりも高かった。ＭＡｂ ＦＬ１３３．６３はＦｕｃ－ＧＭ１ ＥＬＩＳＡにおいて１×１０－９のＥＣ５０を有し、ＤＭＳ７９細胞においてＫｄ＝７．５×１０－９を有した。これは、ＳＰＲにより確立された親和性よりも１０００倍高い。ＭＡｂ ＦＬ１３３．６７は、Ｆｕｃ－ＧＭ１ ＥＬＩＳＡにおいて２．１×１０－９のＥＣ５０を有し、ＤＭＳ７９細胞においてＫｄ＝１．２×１０－８を有した。これは、ＳＰＲにより確立された親和性よりも１００～１０００倍高い。ＭＡｂ ＦＬ１３４．３３は、Ｆｕｃ－ＧＭ１ ＥＬＩＳＡにおいて９．２×１０－１０のＥＣ５０を有し、ＤＭＳ７９細胞においてＫｄ＝６．３×１０－９を有した。これは、ＳＰＲにより確立された親和性よりも１０，０００倍高い。これらの結果から、ＳＰＲ分析は１価抗体結合を測定したことが示唆される。細胞表面上の抗原に結合する場合、抗体のアビディティは大きく促進される。
【0140】
実施例３－機能的アッセイ
３つ全てのＦｕｃ－ＧＭ１ ｍＡｂがＤＭＳ７９細胞株に結合したことから、それらのエフェクター機能を確立することも重要であった。Ｍａｂ ＦＬ１３４．３３（ＩｇＧ１）は、ＡＤＣＣにより５０％～８０％の細胞傷害性（ドナーに依存）を実証したが、ＣＤＣによる細胞傷害性はわずか２０％であった。ｍＡｂ、ＦＬ１３３．６３（ＩｇＧ３）及びＦＬ１３３．６７（ＩｇＧ３）はいずれも、ＡＤＣＣにより２０％の細胞傷害性を示したが、６０～８０％の細胞傷害性がＣＤＣによって媒介された。これらの結果は、ＩｇＧ１アイソタイプのｍＡｂがＡＤＣＣの誘導においてより強力であり、ＩｇＧ３アイソタイプのｍＡｂがＣＤＣの誘導においてより強力であることを示した以前に報告された試験と一致する（Ｌｏｐｅｚ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｎｉｗａ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｓｕｍｅ ｅｔ ａｌ．，２００８）。対照的に、陽性対照のマウスｍＡｂ ＳＣ１０１（ＩｇＧ１）は、ＤＭＳ７９細胞の７０％ＡＤＣＣ媒介及び８０％ＣＤＣ媒介細胞傷害性を示した（図１７）。
３つ全てのＦｕｃ－ＧＭ１ ｍＡｂがＤＭＳ７９細胞株に結合したことから、それらのエフェクター機能を確立することも重要であった。Ｍａｂ ＦＬ１３４．３３（ＩｇＧ１）は、ＡＤＣＣにより５０％～８０％の細胞傷害性（ドナーに依存）を実証したが、ＣＤＣによる細胞傷害性はわずか２０％であった。ｍＡｂ、ＦＬ１３３．６３（ＩｇＧ３）及びＦＬ１３３．６７（ＩｇＧ３）はいずれも、ＡＤＣＣにより２０％の細胞傷害性を示したが、６０～８０％の細胞傷害性がＣＤＣによって媒介された。これらの結果は、ＩｇＧ１アイソタイプのｍＡｂがＡＤＣＣの誘導においてより強力であり、ＩｇＧ３アイソタイプのｍＡｂがＣＤＣの誘導においてより強力であることを示した以前に報告された試験と一致する（Ｌｏｐｅｚ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｎｉｗａ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｓｕｍｅ ｅｔ ａｌ．，２００８）。対照的に、陽性対照のマウスｍＡｂ ＳＣ１０１（ＩｇＧ１）は、ＤＭＳ７９細胞の７０％ＡＤＣＣ媒介及び８０％ＣＤＣ媒介細胞傷害性を示した（図１７）。
【0141】
実施例４－キメラｍＡｂ
ＭＡｂＦＬ１３３．６３、ＦＬ１３３．６７及びＦＬ１３４．３３のシーケンシングを行い、ＶＨ及びＶＬ鎖の配列を、プログラムＩＭＧＴ／Ｖ＿ＱＵＥＳＴを使用して生殖系列ＩｇＧ抗体の配列と比較した。全体として、全てのデータが体細胞高頻度突然変異の証拠を実証し、幾分かの親和性成熟の存在も示唆する。３つ全てのＦｕｃ－ＧＭ１抗体のＶＨ鎖は遺伝子Ｖ３、サブグループ１及びアレル０２にマッピングされた。生殖系列配列と比較して、ｍＡｂ ＦＬ１３４．３３のＶＨ領域は、１４個の置換突然変異及び７個のアミノ酸の変化を含有し、ｍＡｂ ＦＬ１３３．６３は８個の置換突然変異及び６個のアミノ酸の変化を含有し、一方でｍＡｂ ＦＬ１３３．６７は、６個の置換突然変異及び４個のアミノ酸の変化を含有した（図１８及び表５）。
ＭＡｂＦＬ１３３．６３、ＦＬ１３３．６７及びＦＬ１３４．３３のシーケンシングを行い、ＶＨ及びＶＬ鎖の配列を、プログラムＩＭＧＴ／Ｖ＿ＱＵＥＳＴを使用して生殖系列ＩｇＧ抗体の配列と比較した。全体として、全てのデータが体細胞高頻度突然変異の証拠を実証し、幾分かの親和性成熟の存在も示唆する。３つ全てのＦｕｃ－ＧＭ１抗体のＶＨ鎖は遺伝子Ｖ３、サブグループ１及びアレル０２にマッピングされた。生殖系列配列と比較して、ｍＡｂ ＦＬ１３４．３３のＶＨ領域は、１４個の置換突然変異及び７個のアミノ酸の変化を含有し、ｍＡｂ ＦＬ１３３．６３は８個の置換突然変異及び６個のアミノ酸の変化を含有し、一方でｍＡｂ ＦＬ１３３．６７は、６個の置換突然変異及び４個のアミノ酸の変化を含有した（図１８及び表５）。
【0142】
ＦＲ２において、３つ全てのｍＡｂは、アミノ酸変化Ｍ５３＞Ｖをもたらすトランジション突然変異ａ１５７＞ｇを含有した。ＣＤＲ２において、３つ全てのｍＡｂは、アミノ酸変化Ｓ５９＞Ｒをもたらすトランスバージョン突然変異ａ１５７＞ｃ、及びアミノ酸変化Ｓ６４＞Ｎをもたらすトランジション突然変異ｇ１９１＞ａを含有した。ＦＲ３において、３つ全てのｍＡｂは、サイレントトランスバージョン突然変異ｔ２３１＞ａ、アミノ酸変化Ｓ８３＞Ｙをもたらすトランスバージョン突然変異ｃ２４８＞ａ及び最後にサイレントトランジション突然変異ｃ３０９＞ｔを含有した。
【0143】
ＭＡｂ ＦＬ１３４．３３はまた、ＦＲ１において、アミノ酸変化Ｄ１＞Ａをもたらすトランスバージョン突然変異ａ２＞ｃ、サイレントトランジション突然変異ｇ９＞ａ及びサイレントトランジション突然変異ｃ６９＞ｔを含有し；ＦＲ３において、サイレントトランジション突然変異ｃ１９８＞ｔ、アミノ酸変化Ｉ７６＞Ｖをもたらすトランジション突然変異ａ２２６＞ｇ、サイレントランジション突然変異ｇ２６７＞ａ、サイレントトランジション突然変異ｇ２７３＞ａ及びアミノ酸変化Ｖ９４＞Ｌをもたらすトランスバージョン突然変異ｇ２８０＞ｃを含有した。
【0144】
ＭＡｂ ＦＬ１３３．６３はまた、アミノ酸変化Ｆ８７＞Ｌをもたらすトランジション突然変異ｔ２５９＞ｃ及びアミノ酸変化Ｑ９０＞Ｒをもたらすトランジション突然変異ａ２６９＞ｇを含有した。
【表5】
【0145】
３つ全てのＦｕｃ－ＧＭ１抗体のＶＬ鎖は、遺伝子Ｋ５、サブグループ３９及びアレル０１にマッピングされた。生殖系列配列と比較して、ｍＡｂ ＦＬ１３４．３３のＶＬ領域は、１０個の置換突然変異及び６個のアミノ酸の変化を含有し、ｍＡｂ ＦＬ１３３．６３は、７個の置換突然変異及び６個のアミノ酸の変化を含有し、一方でｍＡｂ ＦＬ１３３．６７は、７個の置換突然変異及び６個のアミノ酸の変化を含有した（図１９及び表６）。
【表6】
【0146】
ＣＤＲ１において、３つ全てのｍＡｂは、アミノ酸変化Ｙ３８＞Ｄをもたらすトランスバージョン突然変異ｔ１１２＞ｇを含有した。ＣＤＲ２において、３つ全てのｍＡｂは、アミノ酸変化Ａ５７＞Ｖをもたらすトランジション突然変異ｃ１７０＞ｔを含有した。ＦＲ３において、３つ全てのｍＡｂは、アミノ酸変化Ｓ９０＞Ｔをもたらすトランスバージョン突然変異ｇ２６９＞ｃ及びサイレントトランジション突然変異ｇ３０３＞ａを含有した。
【0147】
ＭＡｂ ＦＬ１３４．３３はまた、ＦＲ１においてアミノ酸変化Ａ９＞Ｄをもたらすトランスバージョン突然変異ｃ２６＞ａ；ＦＲ２においてサイレントトランジション突然変異ｇ１５３＞ａ；ＣＤＲ２においてサイレントトランジション突然変異ｃ１９５＞ｔ；ＦＲ３においてアミノ酸変化Ｇ８４＞Ｒをもたらすトランジション突然変異ｇ２５０＞ａ及びｇ２５２＞ａ及びアミノ酸変化Ｖ１０１＞Ｌをもたらすトランスバージョン突然変異ｇ３０１＞ｃも含有した。
【0148】
ＭＡｂ ＦＬ１３３．６３はまた、ＦＲ１においてアミノ酸変化Ｔ５＞Ｓをもたらすトランスバージョン突然変異ｃ１４＞ｇ；ＣＤＲ１においてアミノ酸変化Ｓ３６＞Ｇをもたらすトランジション突然変異ａ１０６＞ｇ及びＦＲ３においてアミノ酸変化Ｄ８６＞Ｙをもたらすトランスバージョン突然変異ａ２５６＞ｔも含有した。
【0149】
ＭＡｂ ＦＬ１３３．６７はまた、ＦＲ１においてアミノ酸変化Ｔ５＞Ｓをもたらすトランスバージョン突然変異ｃ１４＞ｇ；アミノ酸変化Ｓ６７＞Ｙをもたらすトランスバージョン突然変異ｃ２００＞ａ及びアミノ酸変化Ｎ９２＞Ｋをもたらすトランスバージョン突然変異ｃ２７６＞ｇも含有した。
【0150】
可変領域配列が得られているこの３つの抗体の中から、キメラ化のために選択した抗体はＦＬ１３４．３３であった。抗体の両方の配列のクローニングを可能にするために、プライマーをそれらに対して特異的に設計しなければならず、制限酵素部位をそれらに組み込まれなければならなかった。二重発現ベクターは、軽鎖に関して酵素ＢａｍＨＩ及びＢｓｉＷＩ、及び重鎖に関して酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｆｅＩに対する制限部位を含有する。プライマー可変領域インサートは、消化後にベクターのオーバーハングと適合するオーバーハングを生成する部位も有しなければならない。しかしＦＬ１３４．３３の場合、ＢａｍＨＩによる消化のための制限部位は、前記部位が軽鎖の内部配列にも存在したので、プライマーに付加することができなかった。そのため、ＢａｍＨＩのオーバーハングと適合するオーバーハングを生成する代替的な消化部位が必要であった。前記特徴を有する制限酵素はＢｇｌＩＩであることが見出された。
【0151】
ＰＣＲ増幅及びその後のクローニング手順を行うために設計され、使用されるプライマーは、ＢｇｌＩＩ制限部位を含む軽（κ）鎖フォワードプライマー５’－ＡＴＴＡＡＧＡＴＣＴＡＡＧＡＴＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＴＣＴＣＡＧＣＴＣ－３’であり、ＢｓｉＷＩ制限部位を含む軽（κ）鎖リバースプライマー５’－ＡＡＴＴＣＧＴＡＣＧＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＧＣ ＴＴＧＧＴＧＣＣＴ－３’であった。さらに、５’－ＴＡＡＴＡＡＧＣＴＴＡＡＧＡＴＧＡＧＡＧＴＧＣＴＧＡＴＴＣＴＴＴＴＧ－３’は、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含む重鎖フォワードプライマーであり、５’－ＡＧＡＧＣＡＧＣＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＴ ＧＡＧＧＴ－３’は、ＡｆｅＩ制限部位を含む重鎖リバースプライマーであった。フォワード及びリバースプライマーの両方を用いて、及びプルーフリーディングポリメラーゼを使用して、ＰＣＲ反応を設定した。アガロースゲル電気泳動における生成物の存在によって、軽及び重鎖の両方の増幅を確認した。重鎖及び軽鎖をＴＯＰＯベクターにクローニングし、選択的増殖のためにアンピシリンを添加した化学的コンピテント細胞に形質転換した。軽鎖を保有する６個のコロニー及び重鎖を保有する６個のコロニーを選択して液体培養中で増殖させ、ミニプレップによってプラスミドＤＮＡを調製した。ＢａｍＨＩの内部制限部位が表す長所によって、酵素消化は、正確な配列が実際にベクターにクローニングされたか否かを知る確信的な方法を証明し得る。次に、ＥｃｏＲＩ（クローニング部位の５’及び３’両末端に２つの部位が存在）及びＢａｍＨＩ＋ＢｓｉＷＩ（それぞれ、配列の中ほどの内部部位及びプライマー組み込み部位）を使用して酵素消化を行い、アガロースゲル電気泳動によって評価した。ベクターのＥｃｏＲＩ消化は、軽鎖についてスクリーニングした２個のコロニー、及び重鎖についてスクリーニングした３個のコロニーにおいて予想されるサイズ（４００ｂｐ）の配列を示した。ＢａｍＨＩ＋ＢｓｉＷＩは、軽鎖についてスクリーニングした２個のコロニー及び重鎖についてスクリーニングした３個のコロニーにおいて予想されるサイズ（２００ｂｐ）の配列を示した。シーケンシングを介した正確なクローニングの確認後、各重鎖及び軽鎖の１個のコロニーを選択し、後のマキシプレップを介したプラスミドＤＮＡ調製のために、アンピシリン添加培地中で一晩増殖させた。
【0152】
二重発現ベクターへのＰＣＲ産物の直接的なクローニングは、以前に相対的に非効率的であることが示されているが、それが適切に作用すると期待してそれでもなおクローニングを試行した。ｐＤＣＯｒｉｇ－ｈＩｇＧ１ベクターへの軽鎖のＰＣＲ産物のクローニング後、形質転換を行い、ゼオシン添加培地中で細胞を一晩培養した。ミニプレップによりプラスミドＤＮＡを調製し、続いてＢａｍＨＩ及びＢｓｉＷＩによりプラスミドの酵素消化を行った。予想は、正確な重鎖がベクターに組み込まれれば、小さな２００ｂｐバンドがゲル上に現れるということであった（配列中に存在する内部ＢａｍＨＩから）。しかし重鎖が組み込まれず、当初の鎖がベクター中に残存した場合、これは４００ｂｐのバンドを示す（当初の配列は内部ＢａｍＨＩ部位を欠いた）。少数のコロニーが正確なインサートの予想されるバンド（ｂａｄ）を示し、後の配列は、ベクターへの軽鎖の直接クローニングの成功を確認した。この後、１個のコロニーを選択し、後のマキシプレップを介したプラスミドＤＮＡ調製のために、ゼオシン添加培地中で一晩増殖させた。
【0153】
軽鎖がｐＤＣＯｒｉｇ－ｈＩｇＧ１ベクターに組み込まれたことが確認されるまでに、重鎖のＴＯＰＯクローニングも準備し、プラスミドを調製した。そして、ＰＣＲ産物の直接クローニングを試す代わりに、重鎖を、アガロースゲル精製及び抽出を介して、予め調製したＴＯＰＯベクターの酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｆｅＩによる酵素消化を介して得た。重鎖のゲル精製配列を、軽鎖を含有するｐＤＣＯｒｉｇ－ｈＩｇＧ１ベクターにクローニング後、形質転換を行い、ゼオシン添加培地中で細胞を一晩培養した。プラスミドＤＮＡをミニプレップにより調製し、続いてＨｉｎｄＩＩＩ＋ＡｆｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ＋ＢａｍＨＩ＋ＡｆｅＩによって酵素消化した。予想は、２つのみの酵素では消化によって約４００ｂｐのバンドが示され、３つの酵素では（重鎖はその中ほど周辺にＢａｍＨＩ部位も含有するので）約２００ｂｐのバンドが示されることであった。小さい２００ｂｐを示したコロニーをシーケンシングのために送付し、正確なクローニングの確認後、それらのうち１個を選択し、後のマキシプレップを介したプラスミドＤＮＡ調製のために、ゼオシン添加培地中で一晩増殖させた。プラスミド調製の収率は分光法により７７６ｎｇ／μｌであると決定された。抗体ＦＬ１３４．３３の軽鎖及び重鎖の両方の配列を確認した後、プラスミドを使用してＣＨＯ細胞をランスフェクトした。
【0154】
配列が、ヒト定常領域にカップリングした予想されるマウス重鎖及び軽鎖可変領域を含むことを確認した後、一過性のトランスフェクションを行った。キメラ抗体ＣＨ１３４．３３を含有する１５μｇのベクターを、リポフェクタミンの存在下でＣＨＯ－Ｓ細胞とともにインキュベートし、５００ｍｌの培地中で１週間浮遊培養した。ｍＡｂを含有する上清をプロテインＧカラム上で精製し、ｐＨ８で溶出した。抗体の最終収量は０．４ｍｇであった。
【0155】
抗体機能に関するアッセイ
マウス型とキメラ型との間で、並びに３つのマウス抗体間で直接比較を行うために、アッセイで試験したｍＡｂは次の通りであった：ＦＬ１３４．３３、ＦＬ１３３．６３、ＦＬ１３３．６７及びＣｈ１３４．３３。全ての抗体はＦｕｃ－ＧＭ１によく結合した（図２０）。これらの抗体は、様々なＦｕｃ－Ｇｍ１発現レベルを示す４つの細胞株ＤＭＳ７９、ＤＭＳ５３（ＡＴＣＣ．Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ，ＵＫ）、Ｈ１２８及びＨ６９（ＥＣＡＣＣ．Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，ＵＫ）に対する結合についても試験した。陽性対照は、市販の抗Ｆｕｃ－Ｇｍ１（Ｆｕｊｉｒｅｂｉｏ．Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）であり、陰性対照は、マウスＩｇＧ１アイソタイプ（Ｄａｋｏ．Ｓｔｏｃｋｐｏｒｔ，ＵＫ）であった。最大のシグナルは、ＤＭＳ７９を除く全ての細胞株において陽性対照Ｆ１２により与えられ、ＦＬ１３４．３３がより強いことが示された。キメラｃｈ１３４．３３は、ＤＭＳ７９細胞への良好な結合を示した（図２１）。
マウス型とキメラ型との間で、並びに３つのマウス抗体間で直接比較を行うために、アッセイで試験したｍＡｂは次の通りであった：ＦＬ１３４．３３、ＦＬ１３３．６３、ＦＬ１３３．６７及びＣｈ１３４．３３。全ての抗体はＦｕｃ－ＧＭ１によく結合した（図２０）。これらの抗体は、様々なＦｕｃ－Ｇｍ１発現レベルを示す４つの細胞株ＤＭＳ７９、ＤＭＳ５３（ＡＴＣＣ．Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ，ＵＫ）、Ｈ１２８及びＨ６９（ＥＣＡＣＣ．Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，ＵＫ）に対する結合についても試験した。陽性対照は、市販の抗Ｆｕｃ－Ｇｍ１（Ｆｕｊｉｒｅｂｉｏ．Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）であり、陰性対照は、マウスＩｇＧ１アイソタイプ（Ｄａｋｏ．Ｓｔｏｃｋｐｏｒｔ，ＵＫ）であった。最大のシグナルは、ＤＭＳ７９を除く全ての細胞株において陽性対照Ｆ１２により与えられ、ＦＬ１３４．３３がより強いことが示された。キメラｃｈ１３４．３３は、ＤＭＳ７９細胞への良好な結合を示した（図２１）。
【0156】
参考文献
【化1】
【図1】
【図2a】
【図2b】
【図2c】
【図2d】
【図2e】
【図2f】
【図3a】
【図3b】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図10E】
【図10F】
【図10G】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14A】
【図14B】
【図14C】
【図14D】
【図14E】
【図15A】
【図15B】
【図15C】
【図15D】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【手続補正書】
【提出日】2022-07-08
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】