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特表2022-546768抗ＶＳＩＧ４抗体または抗原結合フラグメントおよびその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-11-08
(54)【発明の名称】抗ＶＳＩＧ４抗体または抗原結合フラグメントおよびその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20221031BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20221031BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20221031BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20221031BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20221031BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20221031BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20221031BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20221031BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20221031BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20221031BHJP
G01N 33/531 20060101ALI20221031BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20221031BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20221031BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20221031BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C07K16/28 ZNA
C12N15/63 Z
C12N5/10
C12P21/08
C12Q1/02
A61P35/00
A61K39/395 T
A61K45/00
A61K47/68
G01N33/531 A
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022514561
(86)(22)【出願日】2020-09-04
(85)【翻訳文提出日】2022-05-02
(86)【国際出願番号】 EP2020074825
(87)【国際公開番号】W WO2021044014
(87)【国際公開日】2021-03-11
(31)【優先権主張番号】10-2019-0109365
(32)【優先日】2019-09-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．プルロニック
(71)【出願人】
【識別番号】519039227
【氏名又は名称】ワイ－バイオロジクス・インコーポレイテッド
(71)【出願人】
【識別番号】506331240
【氏名又は名称】ピエール ファーブル メディカモン
【氏名又は名称原語表記】ＰＩＥＲＲＥ ＦＡＢＲＥ ＭＥＤＩＣＡＭＥＮＴ
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(74)【代理人】
【識別番号】100157956
【弁理士】
【氏名又は名称】稲井 史生
(74)【代理人】
【識別番号】100170520
【弁理士】
【氏名又は名称】笹倉 真奈美
(74)【代理人】
【識別番号】100221545
【弁理士】
【氏名又は名称】白江 雄介
(72)【発明者】
【氏名】ルキリ，ヌールディン
(72)【発明者】
【氏名】ベシュリエ－ティネ，フロランス
(72)【発明者】
【氏名】フェッレ，ピエール
(72)【発明者】
【氏名】パク，ヨンウ
(72)【発明者】
【氏名】パク，ボムチャン
(72)【発明者】
【氏名】パク，ジェウン
(72)【発明者】
【氏名】イ，ヒョンミ
(72)【発明者】
【氏名】キム，スヨン
【テーマコード（参考）】
4B063
4B064
4B065
4C076
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QQ79
4B063QR48
4B063QR77
4B063QS33
4B063QS36
4B064AG27
4B064CA10
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA44
4C076AA95
4C076BB13
4C076BB15
4C076BB16
4C076CC27
4C076CC41
4C076EE59
4C084AA19
4C084NA05
4C084ZB261
4C084ZC412
4C084ZC751
4C085AA14
4C085AA27
4C085BB01
4C085BB11
4C085BB33
4C085BB34
4C085BB35
4C085BB36
4C085BB37
4C085BB41
4C085BB43
4C085EE01
4C085EE03
4C085GG02
4C085GG03
4C085GG05
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA09
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
新規抗ＶＳＩＧ４(ＶセットＩｇドメイン含有４)抗体または抗原結合フラグメントが開示される。処置方法を含むこれら抗体の使用も提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ａ)配列番号３、４および５の配列の３個の重鎖ＣＤＲおよび配列番号６、７および８の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含む抗体；ｂ)配列番号９、１０および５の配列の３個の重鎖ＣＤＲおよび配列番号６、７および８の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｃ)配列番号１１、１２および１３の配列の３個の重鎖ＣＤＲおよび配列番号１４、１５および１６の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｄ)配列番号１７、１８および１９の配列の３個の重鎖ＣＤＲおよび配列番号２０、２１および２２の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｅ)配列番号２３、２４および３の配列の３個の重鎖ＣＤＲおよび配列番号６、７および２５の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｆ)配列番号２６、２７および２８の配列の３個の重鎖ＣＤＲおよび配列番号２９、３０および３１の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｇ)配列番号３２、３３および３４の配列の３個の重鎖ＣＤＲおよび配列番号３５、３６および１６の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｈ)配列番号３７、３８および３９の配列の３個の重鎖ＣＤＲおよび配列番号４０、４１および４２の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｉ)配列番号４３、４４および４５の配列の３個の重鎖ＣＤＲおよび配列番号４６、４７および４８の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｊ)配列番号４９、５０および５１の配列の３個の重鎖ＣＤＲおよび配列番号５２、５３および５４の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｋ)配列番号１７、１８および５５の配列の３個の重鎖ＣＤＲおよび配列番号５６、５７および５８の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含む抗体
からなる群から選択される、モノクローナル抗ＶＳＩＧ４抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項2】
抗体が一本鎖抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体の間で選択される、請求項１のモノクローナル抗ＶＳＩＧ４抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項3】
抗体がヒト抗体である、請求項１または２のモノクローナル抗ＶＳＩＧ４抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項4】
抗体がＩｇＡ１抗体、ＩｇＡ２抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、ＩｇＧ４抗体およびＩｇＭ抗体の間で選択される、請求項１～３の何れかのモノクローナル抗ＶＳＩＧ４抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項5】
抗原結合フラグメントがＦａｂ、Ｆａｂ’、(Ｆａｂ’)２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ(一本鎖であるｓｃ)、ビス－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃフラグメント、Ｆａｂ２、Ｆａｂ３、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディおよびナノボディからなる群から選択される、請求項１～３の何れかのモノクローナル抗ＶＳＩＧ４抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項6】
該抗原結合フラグメントがｓｃＦｖである、請求項１～５の何れかのモノクローナル抗ＶＳＩＧ４抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項7】
抗体がａ)配列番号１２９の配列または配列番号１２９と少なくとも８０％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号６、７および８の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｂ)配列番号１３１の配列または配列番号１３１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号６、７および８の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含むまたはそれからなる抗体；
ｃ)配列番号１３３の配列または配列番号１３３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号１４、１５および１６の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含むまたはそれからなる抗体；
ｄ)配列番号１３５の配列または配列番号１３５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号２０、２１および２２の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含むまたはそれからなる抗体；
ｅ)配列番号１３７の配列または配列番号１３７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号６、７および２５の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含むまたはそれからなる抗体；
ｆ)配列番号１３９の配列または配列番号１３９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号２９、３０および３１の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含むまたはそれからなる抗体；
ｇ)配列番号１４１の配列または配列番号１４１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号３５、３６および１６の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含むまたはそれからなる抗体；
ｈ)配列番号１４３の配列または配列番号１４３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号４０、４１および４２の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含むまたはそれからなる抗体；
ｉ)配列番号１４５の配列または配列番号１４５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号４６、４７および４８の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含むまたはそれからなる抗体；
ｊ)配列番号１４７の配列または配列番号１４７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号５２、５３および５４の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含むまたはそれからなる抗体；
ｋ)配列番号１４９の配列または配列番号１４９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号５６、５７および５８の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含むまたはそれからなる抗体
からなる群から選択される、請求項１～６の何れかのモノクローナル抗ＶＳＩＧ４抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項8】
抗体がａ)配列番号１３０の配列または配列番号１３０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインおよび配列番号３、４および５の配列の３個の重鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｂ)配列番号１３２の配列または配列番号１３２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインおよび配列番号９、１０および５の配列の３個の重鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｃ)配列番号１３４の配列または配列番号１３４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインおよび配列番号１１、１２および１３の配列の３個の重鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｄ)配列番号１３６の配列または配列番号１３６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインおよび配列番号１７、１８および１９の配列の３個の重鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｅ)配列番号１３８の配列または配列番号１３８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインおよび配列番号２３、２４および３の配列の３個の重鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｆ)配列番号１４０の配列または配列番号１４０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインおよび配列番号２６、２７および２８の配列の３個の重鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｇ)配列番号１４２の配列または配列番号１４２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインおよび配列番号３２、３３および３４の配列の３個の重鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｈ)配列番号１４４の配列または配列番号１４４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインおよび配列番号３７、３８および３９の配列の３個の重鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｉ)配列番号１４６の配列または配列番号１４６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインおよび配列番号４３、４４および４５の配列の３個の重鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｊ)配列番号１４８の配列または配列番号１４８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインおよび配列番号４９、５０および５１の配列の３個の重鎖ＣＤＲを含む抗体；および
ｋ)配列番号１５０の配列または配列番号１５０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインおよび配列番号１７、１８および５５の配列の３個の重鎖ＣＤＲを含む抗体
からなる群から選択される、請求項１～６の何れかのモノクローナル抗ＶＳＩＧ４抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項9】
抗体がａ)配列番号１２９の配列または配列番号１２９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号１３０の配列または配列番号１３０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインを含む抗体；
ｂ)配列番号１３１の配列または配列番号１３１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号１３２の配列または配列番号１３２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインを含む抗体；
ｃ)配列番号１３３の配列または配列番号１３３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号１３４の配列または配列番号１３４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインを含む抗体；
ｄ)配列番号１３５の配列または配列番号１３５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れらかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号１３６の配列または配列番号１３６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインを含む抗体；
ｅ)配列番号１３７の配列または配列番号１３７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号１３８の配列または配列番号１３８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインを含む抗体；
ｆ)配列番号１３９の配列または配列番号１３９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れらかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号１４０の配列または配列番号１４０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示すれかの配列の軽鎖可変ドメインを含む抗体；
ｇ)配列番号１４１の配列または配列番号１４１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号１４２の配列または配列番号１４２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインを含む抗体；
ｈ)配列番号１４３の配列または配列番号１４３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号１４４の配列または配列番号１４４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインを含む抗体；
ｉ)配列番号１４５の配列または配列番号１４５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号１４６の配列または配列番号１４６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインを含む抗体；
ｊ)配列番号１４７の配列または配列番号１４７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号１４８の配列または配列番号１４８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインを含む抗体；および
ｋ)配列番号１４９の配列または配列番号１４９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号１５０の配列または配列番号１５０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインを含む抗体
からなる群から選択される、請求項１～８の何れかのモノクローナル抗ＶＳＩＧ４抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項10】
抗体が内在化抗体である、請求項１～９の何れかのモノクローナル抗ＶＳＩＧ４抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項11】
抗体が１以上のエピトープにおける少なくとも１個のアミノ酸に結合する抗体であり、エピトープがａ)配列番号２に示す配列の残基Ｅ２４、Ｖ２５、Ｅ２７、Ｖ２９および／またはＴ３０を含むエピトープＭ１；
ｂ)配列番号２に示す配列の残基Ｄ３６、Ｎ３８、Ｌ３９および／またはＴ４２を含むエピトープＭ２；
ｃ)配列番号２に示す配列の残基Ｑ５９、Ｇ６１、Ｓ６２、Ｄ６３および／またはＶ６５を含むエピトープＭ３；
ｄ)配列番号２に示す配列の残基Ｉ７７、Ａ８０、Ｙ８２および／またはＱ８３を含むエピトープＭ４；
ｅ)配列番号２に示す配列の残基Ｈ８７、Ｈ９０、Ｋ９１および／またはＶ９２を含むエピトープＭ５；
ｆ)配列番号２に示す配列の残基Ｓ９７、Ｑ９９、Ｓ１０１および／またはＴ１０２を含むエピトープＭ６；
ｇ)配列番号２に示す配列の残基Ｒ１０８、Ｓ１０９、Ｈ１１０、Ｔ１１２および／またはＥ１１４を含むエピトープＭ７；
ｈ)配列番号２に示す配列の残基Ｔ１１９、Ｐ１２０、Ｄ１２１、Ｎ１２３、Ｑ１２４および／またはＶ１２５を含むエピトープＭ８
からなる群から選択される、請求項１～１０の何れかのモノクローナル抗ＶＳＩＧ４抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項12】
抗体がａ)Ｍ１のアミノ酸の少なくとも１個；
ｂ)Ｍ４のアミノ酸の少なくとも１個および所望によりＭ３の残基の少なくとも１個；
ｃ)Ｍ７のアミノ酸の少なくとも１個；
ｄ)Ｍ８のアミノ酸の少なくとも１個；
ｅ)Ｍ７のアミノ酸の少なくとも１個およびＭ８のアミノ酸の少なくとも１個；または
ｆ)Ｍ３のアミノ酸の少なくとも１個、Ｍ７のアミノ酸の少なくとも１個およびＭ８のアミノ酸の少なくとも１個および所望によりＭ２の残基の少なくとも１個および／またはＭ４の残基の少なくとも１個
に結合する、請求項１１のモノクローナル抗ＶＳＩＧ４抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項13】
請求項１～１２の何れかのモノクローナル抗ＶＳＩＧ４抗体またはその抗原結合フラグメントを含むイムノコンジュゲートであって、ここで、該抗体が細胞毒性剤にコンジュゲートする、イムノコンジュゲート。
【請求項14】
請求項１～１２の何れかのモノクローナル抗ＶＳＩＧ４抗体またはその抗原結合フラグメントの軽鎖(ＶＬ)の可変領域をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項15】
請求項１～１２の何れかのモノクローナル抗ＶＳＩＧ４抗体またはその抗原結合フラグメントの重鎖(ＶＨ)の可変領域をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項16】
請求項１～１２の何れかのモノクローナル抗ＶＳＩＧ４抗体のＶＬまたはその抗原結合フラグメントおよび請求項１～１２の何れかのモノクローナル抗ＶＳＩＧ４抗体またはその抗原結合フラグメントのＶＨをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項17】
・請求項１４のポリヌクレオチド；・請求項１５のポリヌクレオチド；
・請求項１４のポリヌクレオチドおよび請求項１５のポリヌクレオチド；または
・請求項１６のポリヌクレオチド
を含む、発現ベクター。
【請求項18】
請求項１７の発現ベクターで形質転換された、宿主細胞。
【請求項19】
ａ)請求項１８の宿主細胞を適当な条件下で培養し、ｂ)培養培地または培養細胞からモノクローナル抗ＶＳＩＧ４抗体またはその抗原結合フラグメントを回収する
ことを含む、請求項１～１２の何れかのモノクローナル抗ＶＳＩＧ４抗体またはその抗原結合フラグメントを産生する方法。
【請求項20】
請求項１～１２の何れかのモノクローナル抗ＶＳＩＧ４抗体またはその抗原結合フラグメントまたは請求項１３のイムノコンジュゲートおよび医薬許容される担体および／または添加物を含む、医薬組成物。
【請求項21】
さらに免疫チェックポイント阻害剤を含む、請求項２０の医薬組成物。
【請求項22】
該免疫チェックポイント阻害剤がＣＴＬＡ－４、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＣＤ１６０、ＣＧＥＮ－１５０４９、ＣＨＫ１およびＣＨＫ２キナーゼ、ＩＤＯ１、Ａ２ａＲおよびＢ－７ファミリーに属するリガンドの何れかの阻害剤である、請求項２１の医薬組成物。
【請求項23】
該免疫チェックポイント阻害剤がイピリムマブ、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、セミプリマブ、ピディリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ＢＭＳ ９３６５５９、ＪＮＪ ６１６１０５８８、ウレルマブ、９Ｂ１２、ＰＦ－０４５１８６００、ＢＭＳ－９８６０１６、ＴＳＲ－０２２、ＭＢＧ４５３、ＭＥＤＩ６４６９、ＭＥＤＩ６３８３およびエパカドスタットからなる群から選択される、請求項２０または２１の医薬組成物。
【請求項24】
同時、別々のまたは逐次使用のための、請求項２０または２１の医薬組成物。
【請求項25】
患者における癌の処置に使用するための、請求項１～１２の何れかのモノクローナル抗ＶＳＩＧ４抗体またはその抗原結合フラグメントまたは請求項１３のイムノコンジュゲートまたは請求項２０～２４の何れかの医薬組成物。
【請求項26】
癌患者における免疫応答の誘導に使用するための、請求項１～１２の何れかのモノクローナル抗ＶＳＩＧ４抗体またはその抗原結合フラグメントまたは請求項１３のイムノコンジュゲートまたは請求項２０～２４の何れかの医薬組成物。
【請求項27】
免疫応答がマクロファージによる炎症促進性サイトカイン遊離の誘導、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖の誘導、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖の誘導、ＣＤ４＋Ｔ細胞サイトカイン産生の誘導およびＣＤ８＋Ｔ細胞サイトカイン産生の誘導を含む、請求項２５のための、請求項１～１２の何れかのモノクローナル抗ＶＳＩＧ４抗体またはその抗原結合フラグメントまたは請求項１３のイムノコンジュゲートまたは請求項２０～２４の何れかの医薬組成物。
【請求項28】
癌が膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、卵管癌、胆嚢癌、消化器癌、頭頚部癌、血液学的癌(例えば、白血病、リンパ腫または骨髄腫)、喉頭癌、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、黒色腫、中皮腫、卵巣癌、原発性腹膜癌、唾液腺癌、肉腫、胃癌、甲状腺癌、膵臓癌、腎臓細胞癌腫、神経膠芽腫および前立腺癌から選択される、請求項２５～２７の何れかの使用のための、請求項１～１２の何れかのモノクローナル抗ＶＳＩＧ４抗体またはその抗原結合フラグメントまたは請求項１３のイムノコンジュゲートまたは請求項２０～２４の何れかの医薬組成物。
【請求項29】
２９)対象におけるＶＳＩＧ４発現癌を検出するためのインビトロ方法であって、ａ)該対象の生物学的サンプルと請求項１～１２の何れかのモノクローナル抗ＶＳＩＧ４抗体またはその抗原結合フラグメントを接触させ；そして
ｂ)該試薬と該生物学的サンプルの結合を検出する
ことを含み、
ここで、ＶＳＩＧ４の結合がＶＳＩＧ４発現癌の存在を示す、方法。
【請求項30】
モノクローナル抗ＶＳＩＧ４抗体またはその抗原結合フラグメントが検出可能標識で標識される、請求項２９の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
技術分野
本発明は、抗ＶＳＩＧ４(ＶセットＩｇドメイン含有４)抗体または抗原結合フラグメントおよびその使用に関する。
本発明は、抗ＶＳＩＧ４(ＶセットＩｇドメイン含有４)抗体または抗原結合フラグメントおよびその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
背景
癌細胞の免疫回避機構は、Ｔ細胞表面に存在する免疫チェックポイントタンパク質への結合により殺活性を有する、細胞毒性Ｔ細胞の不活性化により達成される。これにより、Ｔ細胞の活性化を増強するための標的として免疫チェックポイントを用いることにより機能回復させることを介して、ウイルス感染細胞または癌細胞を死滅できる免疫チェックポイント阻害剤の理論的背景が提供される。
癌細胞の免疫回避機構は、Ｔ細胞表面に存在する免疫チェックポイントタンパク質への結合により殺活性を有する、細胞毒性Ｔ細胞の不活性化により達成される。これにより、Ｔ細胞の活性化を増強するための標的として免疫チェックポイントを用いることにより機能回復させることを介して、ウイルス感染細胞または癌細胞を死滅できる免疫チェックポイント阻害剤の理論的背景が提供される。
【0003】
第三世代抗癌免疫療法剤としての免疫チェックポイント阻害剤は２０１０年に米国食品医薬品局で最初に承認され、黒色腫の臨床治験に始まり、肺癌、肝臓癌などに対する抗癌治療における優れた治療効果を示す研究結果がそれ以来続々と発表され続けている。直近の１０年間では、免疫チェックポイント阻害剤は、世界的に重要な主題となっている。抗癌免疫療法剤は、癌細胞がＴ細胞により攻撃されるように産生される抗体であるため、既存の抗癌剤との組み合わせ治療でも、優れた効果を示すことを証明する研究結果が報告されている。今日現在で、ＣＴＬＡ－４(細胞毒性Ｔリンパ球関連タンパク質４)、ＰＤ－１(プログラム細胞死タンパク質１)、ＴＩＭ－３(Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有３)、ＬＡＧ－３(リンパ球活性化遺伝子３)、ＴＩＧＩＴ(免疫グロブリンおよび免疫受容体チロシンベースの阻害性モチーフドメインを有するＴ細胞免疫受容体)およびＶＩＳＴＡ(Ｔ細胞活性化のｖドメインＩｇ含有サプレッサー)を含む、種々の免疫チェックポイントタンパク質が知られている。
【0004】
ＶセットＩｇドメイン含有４(ＶＳＩＧ４、ＣＲＩｇまたはＺ３９Ｉｇ)は、最近研究されている免疫チェックポイントタンパク質であり、Ｂ７関連ファミリータンパク質である。ＶＳＩＧ４は、肝臓、樹状細胞、好中球および休止マクロファージで高レベルで発現されるが、肺、心臓、脾臓およびリンパ節を含むその他の臓器では低レベルであり、一方、Ｔ細胞およびＢ細胞で発現されないことが知られている。ＶＳＩＧ４およびＢ７ファミリータンパク質は、保存的アミノ酸配列を共有し、ＶＳＩＧ４は、一つの完全ＩｇＶ型ドメインおよび開裂ＩｇＣ型ドメインを有する(Vogt L. et al., J Clin Invest. (2006) 116: 2817-2826; Helmy KY. et al., Cell (2006) 124: 915-927)。ＶＳＩＧ４は、コンベルターゼのサブユニットＣ３ｂへの結合により補体活性の補体第二経路を阻害することが知られる。さらに、未知Ｔ細胞受容体への結合により、ＶＳＩＧ４がＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を阻害できることが報告されている。ＶＳＩＧ４は、可溶性ＶＳＩＧ４－Ｆｃ融合タンパク質が実験的自己免疫性関節炎、網膜ブドウ膜炎および肝炎の発症に対して保護すると考えられることが示されたため、自己免疫および／または炎症性障害の発生と関連して研究されている(He et al., Mol. Immunol. (2008) Molecular Immunology 45(16): 4041-404)。しかしながら、ＶＳＩＧ４の発現が肺癌発症および高悪性度神経膠腫の予後不良などの抗腫瘍免疫の制御に関連することも最近報告されている(Liao Y. et al., Lab Invest. (2014) 94: 706-715; Xu T. et al., Am J Transl Res. (2015) 7: 1172-1180)。さらに、Jung et al. (Hepatology (2012) 56 (5):1838-48)の研究によると、抗炎症とＴ細胞阻害では、ＶＳＩＧ４の結合部位に違いがある。
【0005】
ＶＳＩＧ４に対する抗体は、先に公開されている(例えば、ＷＯ２０２０／０６９５０７参照)。しかしながら、これらの抗体はタンパク質の２形態の一方にしか結合せず、それによりその活性の部分的阻害にしか介在しない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
よって、最適抗腫瘍免疫を確立できる新規抗ＶＳＩＧ４抗体の提供に対する必要性がなお存在する。
【課題を解決するための手段】
【0007】
発明の記載
目的
本発明の目的は、ＶＳＩＧ４に対する新規抗体またはその抗原結合フラグメントの提供である。
目的
本発明の目的は、ＶＳＩＧ４に対する新規抗体またはその抗原結合フラグメントの提供である。
【0008】
本発明のさらなる目的は、故に、前記抗体または抗原結合フラグメントを含む、癌処置用組成物の提供である。
【0009】
上記目的を達成するための技術的方法
上記目的を達成するために、本発明は、ＶＳＩＧ４に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。ここに開示する抗体は長いおよび短い形態のＶＳＩＧ４両者に結合し、ＶＳＩＧ４介在抗炎症性シグナルの効率的抑制をもたらす。故に、ここに開示する抗ＶＳＩＧ４抗体は、処置を必要とする患者における免疫応答を活性化し、それにより患者に保護的抗腫瘍免疫を与える。
上記目的を達成するために、本発明は、ＶＳＩＧ４に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。ここに開示する抗体は長いおよび短い形態のＶＳＩＧ４両者に結合し、ＶＳＩＧ４介在抗炎症性シグナルの効率的抑制をもたらす。故に、ここに開示する抗ＶＳＩＧ４抗体は、処置を必要とする患者における免疫応答を活性化し、それにより患者に保護的抗腫瘍免疫を与える。
【0010】
本発明は、特に３個の重鎖ＣＤＲおよび３個の軽鎖ＣＤＲを有する抗ＶＳＩＧ４モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、ここで、ＣＤＲの配列は、配列番号３～５８に示す配列群から選択される。より具体的には、ここに開示する抗体は、表２に示す３個の重鎖ＣＤＲおよび３個の軽鎖ＣＤＲを含む。
【0011】
本発明は、さらに、配列番号１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７および１４９のアミノ酸配列からなる群から選択される何れかの重鎖可変領域；および配列番号１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８および１５０のアミノ酸配列からなる群から選択される何れかの軽鎖可変領域を含む抗ＶＳＩＧ４モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントおよび該モノクローナル抗体の抗原結合フラグメントを提供する。
【0012】
さらに、本発明は、本モノクローナル抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域またはその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。
【0013】
さらに、本発明は、本ポリヌクレオチドを含む発現ベクターをさらに提供する。
【0014】
さらに、本発明は、本発現ベクターで形質転換した形質転換体をさらに提供する。
【0015】
さらに、本発明は、本形質転換体の培養によりＶＳＩＧ４に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを産生する方法をさらに提供する。
【0016】
さらに、本発明は、有効成分としてＶＳＩＧ４に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、免疫応答を刺激するための組成物をさらに提供する。
【0017】
さらに、本発明は、有効成分としてＶＳＩＧ４に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含む癌の処置のための医薬組成物をさらに提供する。
【0018】
さらに、本発明は、個体に本癌の処置のための医薬組成物を投与することを含む、癌を処置する方法をさらに提供する。
【0019】
さらに、本発明は、ＶＳＩＧ４に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに連結された薬物を有する抗体－薬物コンジュゲートをさらに提供する。
【0020】
さらに、本発明は、ｉ)上記抗体；ii)膜貫通ドメインおよび；iii)上記ｉ)抗体の抗原への結合によりＴ細胞活性化を引き起こすことにより特徴づけられる細胞内シグナル伝達ドメインを有するＣＡＲ(キメラ抗原受容体)を含むＣＡＲ(キメラ抗原受容体)タンパク質をさらに提供する。
【0021】
さらに、本発明は、ＶＳＩＧ４に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含む多特異的抗体をなおさらに提供する。
【0022】
発明の利益
ＶＳＩＧ４に結合する本発明の新規抗体およびその抗原結合フラグメントが、ＶＳＩＧ４に結合して、ＶＳＩＧ４の活性を阻害できるため、ＶＳＩＧ４に関係する障害に対する種々の免疫療法剤の開発のために有利に利用され得ることが期待される。
ＶＳＩＧ４に結合する本発明の新規抗体およびその抗原結合フラグメントが、ＶＳＩＧ４に結合して、ＶＳＩＧ４の活性を阻害できるため、ＶＳＩＧ４に関係する障害に対する種々の免疫療法剤の開発のために有利に利用され得ることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【図1】ｈＶＳＩＧ４(Ｓ)およびｈＶＳＩＧ４(Ｌ)の構造および発現を示す。(Ａ)ＶＳＩＧ４タンパク質の２形態の構造を説明するダイアグラム(Small et al., Swiss Med Wkly. (2016) 146:w14301による)。(Ｂ)マクロファージにおけるｈＶＳＩＧ４(Ｌ)およびｈＶＳＩＧ４(Ｓ)の発現を試験するウェスタンブロットの結果。ｒｅｃｈＶＳＩＧ４：組み換えｈＶＳＩＧ４(長および短)；２６４、２６５および２６６：ＰＢＭＳを単離したドナー。ＡＦ４６４６：ポリクローナル抗ＶＳＩＧ４抗体(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)。
【0024】
【図2】ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化がｈＶＳＩＧ４(Ｓ)およびｈＶＳＩＧ４(Ｌ)により阻害されることを示す。ＣＤ４＋細胞を、組み換えタンパク質(ｈＶＳＩＧ４(Ｌ)－Ｆｃ、ｈＶＧＩＧ４(Ｓ)－Ｆｃ、ＰＤＬ１－Ｆｃ(R&D Systems 156-B7)またはアイソタイプ対照ｈＩｇＧ１(ｃ９Ｇ４))の存在下、抗ＣＤ３ ＯＫＴ３抗体(BioxCell ref BE0001-2 clone OKT3)と接触させた。ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖(Ａ)およびＩＦＮγ遊離(Ｂ)を、フローサイトメトリーにより決定した。
【0025】
【図3】ＶＳＩＧ４に特異的に結合するモノクローナル抗体をスクリーニングするためのここに開示する方法を説明するダイアグラムである。
【0026】
【図4】ＶＳＩＧ４抗原タンパク質のための発現ベクターを説明するダイアグラムである。
【0027】
【図5】精製ＶＳＩＧ４抗原タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す。
【0028】
【図6】抗原のパンニング工程の各ラウンド(すなわち、第一、第二および第三ラウンド)を介して得た陽性ポリｓｃＦｖ－ファージ抗体プールの特異性を試験するために実施するポリファージＥＬＩＳＡの結果を示す。
【0029】
【図7】抗原ＶＳＩＧ４に対する優れた結合性を有する陽性ファージの選択のために実施するＥＬＩＳＡの結果を示す。
【0030】
【図8】１１個の組み換えＶＳＩＧ４単一ヒト抗体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の結果を示す。
【0031】
【図9】ＡＰＣ蛍光物質に結合した抗ヒトＶＳＩＧ４抗体の使用によるヒトＶＳＩＧ４を過発現する形質転換細胞のＦＡＣＳ分析の結果を示す。
【0032】
【図10】１１個のヒトＶＳＩＧ４抗体に対するヒトＶＳＩＧ４を過発現する細胞の結合特異性のＦＡＣＳ分析の結果を示す。(Ａ)ＨＥＫ２９３Ｅ：非特異的結合試験。(Ｂ)ｈＶＳＩＧ４／ＨＥＫ２９３Ｅ：細胞表面ＶＳＩＧ４への特異的結合。
【0033】
【図11】１１個のヒトモノクローナル抗ＶＳＩＧ４抗体のｈＶＳＩＧ４(Ｓ)およびｈＶＳＩＧ４(Ｌ)への結合を説明する。(Ａ)ｈＶＳＩＧ４(Ｓ)およびｈＶＳＩＧ４(Ｌ)への結合を、１１個のヒト抗ＶＳＩＧ４抗体の元のｓｃＦｖバージョンでＥＬＩＳＡでアッセイした。(Ｂ)ｈＶＳＩＧ４(Ｓ)およびｈＶＳＩＧ４(Ｌ)への結合を、１１個の完全長ヒト抗ＶＳＩＧ４抗体でウェスタンブロッティングによりアッセイした。ＮＲＨ：非還元、加熱；ＲＨ：還元、加熱。
【0034】
【図12】マウスｍ６Ｈ８およびそのヒト化バージョンｈｚ６Ｈ８－Ａ２がｈＶＳＩＧ４(Ｌ)に結合するが、ｈＶＳＩＧ４(Ｓ)に結合しないことを示す。(Ａ)ウェスタンブロット：ｒｅｃｈＶＳＩＧ４：組み換えｈＶＳＩＧ４(長いおよび短い)； ２６４、２６５および２６６：ＰＢＭＳを単離したドナー。ＡＦ４６４６：ポリクローナル抗ＶＳＩＧ４抗体(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)。(Ｂ)ｈＶＳＩＧ４－Ｈｉｓ(短い形態)およびｈＶＳＩＧ４ Ｆｃ(長い形態)でのＥＬＩＳＡ：ｍ９Ｇ４：アイソタイプ対照、ヤギＩｇＧ対照：陰性対照。
【0035】
【図13】定義した８個のエピトープ群を有する１１個のｓｃＦｖヒトモノクローナル抗ＶＳＩＧ４抗体のエピトープマッピングのために実施するＥＬＩＳＡの結果を示す。群のナンバリングは、抗原の配列または３Ｄ構造に関連する位置とリンクしていない。
【0036】
【図14】炎症性アッセイにおける１１個の完全長ヒトモノクローナル抗ＶＳＩＧ４抗体を試験するためのここに開示する方法を説明するダイアグラムである。
【0037】
【図15】免疫抑制アッセイにおける１１個の完全長ヒトモノクローナル抗ＶＳＩＧ４抗体を試験するためのここに開示する方法を説明するダイアグラムである。
【発明を実施するための形態】
【0038】
詳細な記載
以下の記載は、説明のためにのみ提供し、本発明が意図する範囲を限定するものではない。本発明は、ここに示す詳細な記載および添付する図面からより完全に理解される。
以下の記載は、説明のためにのみ提供し、本発明が意図する範囲を限定するものではない。本発明は、ここに示す詳細な記載および添付する図面からより完全に理解される。
【0039】
定義
特に定義されない限り、ここで使用する全ての技術的および科学的用語は、化学、生化学、細胞生物学、分子生物学および医科学において当業者により共通して理解されるのと同じ意味を有する。
特に定義されない限り、ここで使用する全ての技術的および科学的用語は、化学、生化学、細胞生物学、分子生物学および医科学において当業者により共通して理解されるのと同じ意味を有する。
【0040】
用語「約」または「凡そ」は、当業者に知られるある値または範囲についての通常の誤差範囲をいう。通常ある値または範囲の２０％以内、例えば１０％または５％以内(または１％またはそれ未満)を意味する。
【0041】
ここで使用する「投与」または「投与する」は、患者への、粘膜、皮内、静脈内、筋肉内送達および／またはここに記載するまたは当分野で知られる何れかの他の物理的送達方法によるなどの、体外に存在する物質(例えば、ここに提供される抗ＶＳＩＧ４抗体)の、注入またはその他物理的送達行為をいう。疾患またはその症状が処置されるとき、物質の投与は、一般に疾患またはその症状の発症後に行う。疾患またはその症状が予防されるとき、物質の投与は、一般に疾患またはその症状の発症前に行う。本発明の組成物の投与経路は、標的組織への組成物の送達が可能である限り、経口および非経腸経路を含む種々の経路の何れでもよい。具体的に、投与は、経口、結腸直腸、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、経皮、鼻腔内、吸入、眼内または皮内経路を介する一般的方法により行われ得る。
【0042】
用語「抗体」および「免疫グロブリン」または「Ｉｇ」は、ここでは相互交換可能に使用する。これら用語は、ここではその最も広い意味で使用され、具体的にＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥなどのあらゆるアイソタイプのモノクローナル抗体(完全長モノクローナル抗体を含む)、ポリクローナル抗体、多特異的抗体、キメラ抗体およびフラグメントが所望の生物学的機能を保持する限り、抗体フラグメントを含む。これら用語は、特異的分子抗原に結合でき、ジスルフィド結合で相互接続されたポリペプチド鎖の２個の同一対(ここで、各対は、１個の重鎖(約５０～７０kDa)および１個の軽鎖(約２５kDa)を有し、各鎖の各アミノ末端部分は、約１００～約１３０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含み、各鎖の各カルボキシ末端部分は、定常領域を含む)からなる、免疫グロブリンクラスのポリペプチド内のＢ細胞のポリペプチド産物を含むことを意図する(Borrebaeck (ed.) (1995) Antibody Engineering, Second Ed., Oxford University Press.; Kuby (1997) Immunology, Third Ed., W.H. Freeman and Company, New York参照)。各重鎖および軽鎖の各可変領域は、超可変領域としても知られる３個の相補性決定領域(ＣＤＲ)および可変ドメインのより高度に保存的部分である４個のフレームワーク(ＦＲ)からなり、アミノ末端からカルボキシ末端方向で次の順番で配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞(例えばエフェクター細胞)および古典的補体系の第一成分(Ｃ１ｑ)を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合に介在し得る。ある実施態様において、ここに提供する抗体により結合され得る特異的分子抗原は、標的ＶＳＩＧ４ポリペプチド、フラグメントまたはエピトープを含む。特異的抗原と反応性の抗体を、ファージにおける組み換え抗体もしくは類似ベクターのライブラリーの選択などの組み換え方法または抗原もしくは抗原コード化核酸での動物の免疫化により。産生できる
【0043】
抗体はまた、合成抗体、モノクローナル抗体、組み換えにより産生された抗体、多特異的抗体(二特異的抗体を含む)、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体、イントラボディ、抗イディオタイプ(抗Ｉｄ)抗体および上記の何れかの機能的フラグメント(該フラグメントが由来した抗体の生物学的機能の一部または全てを保持する抗体重鎖または軽鎖ポリペプチドの部分と称する)も含むが、これらに限定されない。ここに提供する抗体は、あらゆるタイプ(例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ)、あらゆるクラス(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２)またはあらゆるサブクラス(例えば、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ)の免疫グロブリン分子であり得る。
【0044】
用語「抗ＶＳＩＧ４抗体」、「ＶＳＩＧ４に結合する抗体」、「ＶＳＩＧ４エピトープに結合する抗体」および類似する用語は、ここでは相互交換可能に使用され、ＶＳＩＧ４抗原またはエピトープなどのＶＳＩＧ４ポリペプチドに結合する抗体をいう。このような抗体は、キメラ、ヒト化およびヒト抗体を含むポリクローナルおよびモノクローナル抗体を含む。ＶＳＩＧ４抗原に結合する抗体は、関連抗原に交差反応性であり得る。ある実施態様において、ＶＳＩＧ４に結合する抗体は、例えば、Ｂ７スーパーファミリーに属する他のペプチドまたはポリペプチドなどの他の抗原と交差反応しない。ＶＳＩＧ４に結合する抗体は、例えば、免疫アッセイ、BIAcoreまたは当業者に知られる他の技術により同定され得る。抗体はＶＳＩＧ４に結合し、例えば、放射免疫アッセイ(ＲＩＡ)および酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)などの実験的技術を使用して決定して、あらゆる交差反応性抗原より高い親和性でＶＳＩＧ４に結合するとき、例えば、ＶＳＩＧ４に特異的に結合する抗体である。一般に、特異的または選択的反応は、バックグラウンドシグナルまたはノイズの少なくとも２倍であり、バックグラウンドの１０倍を超え得る。例えば、抗体特異性の記載についてのPaul, ed., 1989, Fundamental Immunology Second Edition, Raven Press, New York at pages 332-336参照。ある実施態様において、目的の抗原「に結合する」抗体は、抗原を発現する細胞または組織のターゲティングにおいて、抗体が診断および／または治療剤として有用であり、他のタンパク質と顕著に交差反応しない、十分な親和性を有する抗原をいう。このような実施態様において、非標的タンパク質への抗体の結合の程度は、蛍光標示式細胞分取(ＦＡＣＳ)分析または放射性免疫沈降法(ＲＩＰＡ)により決定した抗体の特定の標的タンパク質の結合の約１０％より低い。標的分子への抗体の結合について、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド標的上のエピトープへの「特異的結合」または「特異的に結合する」または「特異的である」なる用語は、非特異的相互作用と測定可能な程度に異なる結合をいう。特異的結合は、例えば、一般に構造が類似するが、結合活性を有しない分子である対照分子の結合と比較した、分子の結合の決定により、測定され得る。例えば、特異的結合は、標的に類似する対照分子、例えば、過剰の非標識標的との競合により決定できる。この場合、標識標的のプローブへの結合が過剰の非標識標的により競合的に阻害されるならば、特異的結合が示される。ここで使用する特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド標的上のエピトープへの「特異的結合」または「特異的に結合する」または「特異的である」なる用語は、例えば、少なくとも約１０－４Ｍ、あるいは少なくとも約１０－５Ｍ、あるいは少なくとも約１０－６Ｍ、あるいは少なくとも約１０－７Ｍ、あるいは少なくとも約１０－８Ｍ、あるいは少なくとも約１０－９Ｍ、あるいは少なくとも約１０－１０Ｍ、あるいは少なくとも約１０－１１Ｍ、あるいは少なくとも約１０－１２Ｍまたはそれ以上の標的へのＫＤを有する分子により示され得る。ある実施態様において、用語「特異的結合」は、分子が、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド上のエピトープに、あらゆるその他のポリペプチドまたはポリペプチドエピトープに実質的に結合することなく結合するときの結合をいう。ある実施態様において、ＶＳＩＧ４に結合する抗体は、≦１μM、≦１００nM、≦１０nM、≦１nMまたは≦０.１nMの解離定数(ＫＤ)を有する。
【0045】
ここで使用する用語「抗原」は、抗体が選択的に結合できる予め決定された抗原をいう。標的抗原は、ポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質、ハプテンまたは他の天然に存在するもしくは合成化合物であり得る。ある実施態様において、標的抗原は、例えば、ＶＳＩＧ４ポリペプチドを含むポリペプチドである。
【0046】
用語「抗原結合フラグメント」、「抗原結合ドメイン」、「抗原結合領域」および類似する用語は、抗原と相互作用し、結合因子に抗原に対する特異性および親和性を付与するアミノ酸残基を含む、抗体の部分(例えば、相補性決定領域(ＣＤＲ))をいう。抗体の「抗原結合フラグメント」なる表現により、該抗体の標的(一般に抗原とも称する)、一般に同じエピトープに結合する能力を保持し、抗体のアミノ酸配列の少なくとも５連続アミノ酸残基、少なくとも１０連続アミノ酸残基、少なくとも１５連続アミノ酸残基、少なくとも２０連続アミノ酸残基、少なくとも２５連続アミノ酸残基、少なくとも４０連続アミノ酸残基、少なくとも５０連続アミノ酸残基、少なくとも６０連続アミノ残基、少なくとも７０連続アミノ酸残基、少なくとも８０連続アミノ酸残基、少なくとも９０連続アミノ酸残基、少なくとも１００連続アミノ酸残基、少なくとも１２５連続アミノ酸残基、少なくとも１５０連続アミノ酸残基、少なくとも１７５連続アミノ酸残基または少なくとも２００連続アミノ酸残基のアミノ酸配列を含むあらゆるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を指すことを意図する。特定の実施態様において、該抗原結合フラグメントは、それが由来する抗体のＣＤＲの少なくとも１個を含む。なお好ましい実施態様において、該抗原結合フラグメントは、それが由来する抗体のＣＤＲの２個、３個、４個または５個、より好ましくは６個のＣＤＲを含む。
【0047】
「抗原結合フラグメント」は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、(Ｆａｂ’)２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ(ｓｃは一本鎖)、ビス－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃフラグメント、Ｆａｂ２、Ｆａｂ３、ミニボディ、ダイアボディ抗体、トリアボディ、テトラボディおよびナノボディおよびＸＴＥＮ(伸張組み換えポリペプチド)またはＰＡＳモチーフなどの障害ペプチドとの融合タンパク質およびポリ(エチレン)グリコール(「ペグ化」)などのポリ(アルキレン)グリコールの付加などの化学修飾により半減期が延長されたあらゆるフラグメント(ペグ化フラグメントはＦｖ－ＰＥＧ、ｓｃＦｖ－ＰＥＧ、Ｆａｂ－ＰＥＧ、Ｆ(ａｂ’)２－ＰＥＧまたはＦａｂ’－ＰＥＧと称される)(「ＰＥＧ」はポリ(エチレン)グリコール)またはリポソームにおける取り込みにより、本発明の抗体の特徴的ＣＤＲの少なくとも１個を有する該フラグメントからなる群から選択され得るが、これらに限定されない。抗体フラグメントの中で、Ｆａｂは、軽鎖および重鎖の可変領域、軽鎖の定常領域および重鎖の第一定常領域(ＣＨ１)を含む構造を有し、１個の抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端に１以上のシステイン残基を含むヒンジ領域を有する点で、Ｆａｂと異なる。Ｆ(ａｂ’)２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合を形成するように産生される。Ｆｖは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域のみを有する最小抗体フラグメントであり、Ｆｖフラグメントを産生する組み換え技術は、国際公開ＷＯ８８／１０６４９などに記載される。二本鎖Ｆｖ(ｄｓＦｖ)に関して、重鎖可変領域および軽鎖可変領域は互いにジスルフィド結合により連結され、一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)に関して、重鎖可変領域および軽鎖可変領域は一般に互いにペプチドリンカーを介して共有結合される。これら抗体フラグメントは、プロテイナーゼの使用により得ることができ(例えば、Ｆａｂは、抗体全体のパパインでの制限消化により得ることができ、Ｆ(ａｂ’)２フラグメントはペプシンでの制限消化により得ることができる)、好ましくは遺伝子工学技術により産生される。好ましくは、該「抗原結合フラグメント」は、それが由来する抗体の重または軽可変鎖の部分的配列からなりまたはそれを含み、該部分的配列は、それが由来する抗体と同じ結合特異性および十分な、好ましくは標的に関してそれが由来する抗体の親和性の少なくとも１／１００、より好ましい方法においては少なくとも１／１０に等しい親和性を保持するのに十分である。このような抗体フラグメントの記載は、例えば、Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, 冷Spring Harbor Laboratory, New York (1989); Myers (ed.), Molec. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, New York: VCH Publisher, Inc.; Huston et al., Cell Biophysics, 22:189-224 (1993); Plueckthun and Skerra, Meth. Enzymol., 178:497-515 (1989) and in Day, E.D., Advanced Immunochemistry, Second Ed., Wiley-Liss, Inc., New York, NY (1990)に見られ得る。
【0048】
ここで使用する用語「結合する」または「結合」は、生理的条件下、比較的安定な複合体を形成する分子間の相互作用をいう。相互作用は、例えば、水素結合、イオン結合、疎水性相互作用および／またはファンデルワールス相互作用を含む、非共有結合的相互作用であり得る。複合体はまた共有結合または非共有結合的結合、相互作用または力により２以上の分子を一体化する結合も含み得る。抗体上の単一抗原結合部位と標的分子上の単一エピトープ、例えばＶＳＩＧ４の間の総非共有結合的相互作用の強度は、そのエピトープに対する抗体または機能的フラグメントの親和性である。単価抗原に対する抗体の会合(ｋ１)対解離(ｋ－１)の比(ｋ１／ｋ－１)は、親和性の指標である会合定数Ｋである。Ｋの値は、抗体と抗原の複合体が違えば変わり、ｋ１およびｋ－１両方に依存する。ここに提供する抗体の会合定数Ｋは、ここに提供する何れかの方法または当業者に周知の何れかの他の方法を使用して決定され得る。一結合部位での親和性は、抗体と抗原の間の相互作用の真の強度を常に反映するとは限らない。多価ＶＳＩＧ４などの複数、反復抗原決定基を含む複合体抗原が、複数結合部位を含む抗体と接触したとき、一か所での抗体と抗原の相互作用は、第二部位での反応の確立を上げる。多価抗体と抗原間のこのような複数相互作用の強度は、アビディティーと称される。抗体のアビディティーは、個々の結合部位の親和性より、結合能の良好な指標であり得る。例えば、高アビディティーは、五量体ＩｇＭ抗体で、ＩｇＧより低い親和性を有し得るが、多価に起因するＩｇＭの高アビディティーにより、効率的に抗原と結合することを可能とすることが時に見られるとおり、低親和性を相殺できる。２個の分子が結合するか否かを決定する方法は当分野で周知であり、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴などを含む。特定の実施態様において、該抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＢＳＡまたはカゼインなどの非特異的分子への結合についての親和性より少なくとも２倍高い親和性でＶＳＩＧ４に結合する。より特定の実施態様において、該抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＶＳＩＧ４にのみ結合する。
【0049】
ここで使用する用語「生物学的サンプル」または「サンプル」は、患者または対象などの生物学的起源から得ているサンプルをいう。ここで使用する「生物学的サンプル」は、特に生物全体またはその組織、細胞または構成部分のサブセット(例えば動脈、静脈および毛細血管を含む血管、血液、血清、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、羊膜帯血液、尿、膣液および精液を含むが、これらに限定されない体液)をいう。「生物学的サンプル」は、さらに、生物全体またはその組織、細胞または構成部分のサブセットから調製したホモジネート、溶解物または抽出物またはそれらの画分もしくは一部もいう。最後に、「生物学的サンプル」は、タンパク質または核酸分子などの細胞構成要素を含む、生物が増殖している栄養ブロスまたはゲルなどの培地をいう。
【0050】
ここで使用する用語「バイオパニング」は、ファージコート上にペプチドを提示するファージライブラリーから、標的分子(例えば、抗体、酵素および細胞表面受容体)への結合の性質を有するペプチドを表面上に提示するファージのみを選択する、工程を示す。ある実施態様において、ここで使用するバイオパニングは、ファージライブラリーを調製する工程である第一工程、ファージライブラリーと標的分子の接触を含む捕捉工程である第二工程、標的分子に結合しないファージの除去を含む洗浄工程である第三工程および目的のファージが回収される溶出工程である第四工程の４工程含む。バイオパニング例は、本明細書の実施例に示す。
【0051】
用語「遮断」またはその文法上の同等語は、抗体の文脈で使用するとき、抗体が結合する抗原の生物学的活性を阻止または停止させる抗体をいう。遮断抗体は、反応を起こすことなく抗原と合わさるが、他のタンパク質がその後その抗原と合わさるまたは複合化することを遮断する、抗体をいう。抗体の遮断効果は、抗原の生物学的活性に測定可能な変化をもたらすものであり得る。
【0052】
用語「細胞増殖性障害」および「増殖性障害」は、異常細胞増殖とある程度関係する障害をいう。ある実施態様において、細胞増殖性障害は、腫瘍または癌である。ここで使用する「腫瘍」は、悪性であれ、良性であれ、全ての新生物細胞成長および増殖および全ての前癌および癌細胞および組織をいう。用語「癌」、「癌性」、「細胞増殖性障害」、「増殖性障害」および「腫瘍」は、ここでいうとおり相互排他的ではない。用語「癌」および「癌性」は、一般に制御されない細胞増殖により特徴づけられる、哺乳動物における生理学的状態をいうまたは説明する。ここで使用する「癌」は、生物における障害細胞の望まない増殖、侵襲およびある条件下では転移に由来するあらゆる悪性新生物をいう。癌を生じさせる細胞は、遺伝的に障害されており、通常細胞分裂、細胞遊走挙動、分化状態および／または細胞死機構を制御する能力を失っている。大部分の癌は腫瘍を形成するが、白血病などの一部造血器癌は形成しない。故に、ここで使用する「癌」は、良性および悪性癌両者を含み得る。ここで使用する用語「癌」は、如何なる限定もせず、特に本発明のヒト抗体により処置できるあらゆる癌をいう。その例は、肝臓癌、乳癌、腎臓癌、脳腫瘍、胆管癌、食道癌、胃癌、結腸癌、結腸直腸癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、肺癌、上行結腸癌、子宮頸癌、甲状腺癌、白血病、ホジキン疾患、リンパ腫および多発性骨髄腫血液癌を含むが、これらに限定されない。
【0053】
「化学療法剤」は、作用機序と関係なく、癌の処置に有用な化学的または生物学的薬剤(例えば、小分子薬物または抗体または細胞などの生物学的を含む、薬剤)である。化学療法剤は、標的化治療および慣用の化学療法で使用する化合物を含む。化学療法剤は、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、有糸分裂阻害剤、クロマチン機能阻害剤、抗血管形成剤、抗エストロゲン剤、抗アンドロゲン剤または免疫調節剤を含むが、これらに限定されない。
【0054】
用語「キメラ」抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の起源または種に由来し、重鎖および／または軽鎖の残りが異なる起源または種に由来する、抗体をいう。ある実施態様において、「キメラ抗体」は、可変領域が異なる種のまたは他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する定常領域に結合するように、定常領域またはその一部が改変、置き換えまたは交換される、抗体をいう。他の実施態様において、「キメラ抗体」は、定常領域が異なる種のまたは他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する可変領域に結合するように、可変領域またはその一部が改変、置き換えまたは交換される、抗体をいう。
【0055】
ここで使用する「ＣＤＲ」は、免疫グロブリン(Ｉｇまたは抗体)ＶＨ βシートフレームワークの非フレームワーク領域内の３個の超可変領域(Ｈ１、Ｈ２またはＨ３)の１個または抗体ＶＬ βシートフレームワークの非フレームワーク領域内の３個の超可変領域(Ｌ１、Ｌ２またはＬ３)の１個をいう。従って、ＣＤＲは、フレームワーク領域配列内に散在する可変領域配列である。ＣＤＲ領域は当業者に周知であり、例えば、Ｋａｂａｔにより、抗体可変(Ｖ)ドメイン内の最も超可変性の領域として定義される(Kabat et al., J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977); Kabat, Adv. Prot. Chem. 32:1-75 (1978))。Ｋａｂａｔ ＣＤＲは配列可変性に基づき、最も汎用される(Kabat eta/., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。Ｃｈｏｔｈｉａは、代わりに、構造ループの位置をいう(Chothia and Lesk J Mol. Bioi. 196:901-917 (1987))。ＣＤＲ領域配列は、保存的βシートフレームワークの一部ではなく、故に、種々の立体構造を採用できる残基として、Ｃｈｏｔｈｉａにより構造的にも定義されている(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ－Ｈ１ループの最後は、Ｋａｂａｔナンバリング慣例を使用してナンバリングしたとき、ループの長さによって、Ｈ３２～Ｈ３４で変わる(これは、ＫａｂａｔナンバリングスキームがＨ３５ＡおよびＨ３５Ｂに挿入を配置するからである；３５Ａも３５Ｂも存在しないならば、ループは３２で終わる；３５Ａのみが存在するならば、ループは３３で終わる；３５Ａおよび３５Ｂ両方が存在するならば、ループは３４で終わる)。何れの命名法も当分野で十分に認識されている。ＣＤＲ領域配列はまたＡｂＭ、ＣｏｎｔａｃｔおよびＩＭＧＴによっても定義されている。ＡｂＭ超可変領域は、Ｋａｂａｔ ＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａ構造ループの間の妥協点を表し、Oxford Molecular's AbM抗体モデリングソフトウェアで使用される。「ｃｏｎｔａｃｔ」超可変領域は、利用可能な複合体結晶構造の分析に基づく。最近、普遍的ナンバリングシステムが開発され、広く採用されている、ImMunoGeneTics (IMGT) Information System(登録商標)(Lafranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27(1):55-77 (2003))。ＩＭＧＴ普遍的ナンバリングは、どんな抗原受容体、鎖タイプまたは種でも、可変ドメインを比較するよう定義されている[Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999)]。ＩＭＧＴ普遍的ナンバリングにおいて、保存的アミノ酸、例えばシステイン２３(１ｓｔ－ＣＹＳ)、トリプトファン４１(ＣＯＮＳＥＲＶＥＤ－ＴＲＰ)、疎水性アミノ酸８９、システイン１０４(２ｎｄ－ＣＹＳ)、フェニルアラニンまたはトリプトファン１１８(Ｊ－ＰＨＥまたはＪ－ＴＲＰ)は常に同じ位置である。ＩＭＧＴ普遍的ナンバリングは、フレームワーク領域(ＦＲ１－ＩＭＧＴ：位置１～２６、ＦＲ２－ＩＭＧＴ：３９～５５、ＦＲ３－ＩＭＧＴ：６６～１０４およびＦＲ４－ＩＭＧＴ：１１８～１２８)および相補性決定領域(ＣＤＲ１－ＩＭＧＴ：２７～３８、ＣＤＲ２－ＩＭＧＴ：５６～６５およびＣＤＲ３－ＩＭＧＴ：１０５～１１７)の標準化境界決めを提供する。ギャップが非占有位置を表すため、ＣＤＲ－ＩＭＧＴ長(括弧内に示し、ドットで分ける、例えば[８.８.１３])は、重要な情報となる。ＩＭＧＴ普遍的ナンバリングは、IMGT Colliers de Perles [Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002) / Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)]と指定された２Ｄ図形表現およびＩＭＧＴ／３Ｄ構造－ＤＢにおける３Ｄ構造[Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC 構造data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)]に使用される。カノニカル抗体可変ドメイン内のＣＤＲの位置は、多数の構造の比較により決定される(Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); Morea et al., Methods 20:267-279 (2000))。超可変領域内の残基数が抗体が異なれば変わるため、カノニカル位置に対する付加的残基が、慣習的にカノニカル可変ドメインナンバリングスキームにおける残基番号の隣にａ、ｂ、ｃなどを付けて番号付けされる(Al-Lazikani et al., supra (1997))。このような命名法も同様に当業者に周知である。
【0056】
超可変領域は、次のとおり「伸張超可変領域」を含み得る：ＶＬに２４～３６または２４～３４(Ｌ１)、４６～５６または５０～５６(Ｌ２)および８９～９７または８９～９６(Ｌ３) および２６～３５または２６～３５Ａ(Ｈ１)、５０～６５または４９～６５(Ｈ２)およびＶＨに９３～１０２、９４～１０２または９５～１０２(Ｈ３)。可変ドメイン残基は、これら定義の各々について、Kabat et al., supraに従い２５の番号が付けられている。ここで使用する用語「ＨＶＲ」および「ＣＤＲ」は相互交換可能に使用される。
【0057】
ここで使用する「チェックポイント阻害剤」は、免疫チェックポイントを標的とし、該免疫チェックポイントの機能を遮断する、例えば、小分子、可溶性受容体または抗体などの分子をいう。より具体的には、ここで使用する「チェックポイント阻害剤」は、免疫チェックポイントの生物学的活性の１以上を阻害または減少させる、例えば、小分子、可溶性受容体または抗体などの分子をいう。ある実施態様において、免疫チェックポイントタンパク質の阻害剤(例えば、ここに提供するアンタゴニスト抗体)は、例えば、該免疫チェックポイントタンパク質を発現する細胞(例えば、Ｔ細胞)の活性化および／または細胞シグナル伝達経路の阻害または減少させ、それによりアンタゴニストの非存在下の生物学的活性に比して細胞の生物学的活性を阻害することにより、作用する。免疫チェックポイント阻害剤の例は、小分子薬物、可溶性受容体および抗体を含む。
【0058】
用語「定常領域」または「定常ドメイン」は、抗体の抗原への結合には直接関与しないが、Ｆｃ受容体との相互作用など種々のエフェクター機能を示す、軽鎖および重鎖のカルボキシ末端部分をいう。本用語は、抗原結合部位を含む、免疫グロブリンの他の部分、可変ドメインと比較して、より保存的なアミノ酸配列を有する免疫グロブリン分子の部分をいう。定常ドメインは、重鎖のＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインおよび軽鎖のＣＬドメインを含む。
【0059】
ここで使用する「細胞毒性剤」は、対象に投与したとき、細胞機能を阻止または防止するおよび／または細胞死を引き起こすことにより、対象体内の細胞増殖の進展、好ましくは癌の進展を処置または予防する薬剤をいう。本発明において抗体－薬物コンジュゲートとして使用できる細胞毒性剤は、細胞毒性効果または細胞増殖に阻害効果を有するあらゆる薬剤、その一部または残基をいう。このような薬剤の例は、(ｉ)微小管阻害剤、有糸分裂阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤またはＤＮＡ挿入剤として機能できる化学療法剤；(ii)酵素的に機能できるタンパク質毒素；および(iii)放射性同位体(放射性核種)を含む。細胞毒性剤は、イムノコンジュゲートを形成するために、例えば抗ＶＳＩＧ４抗体などの抗体にコンジュゲートされ得る。好ましくは、細胞毒性剤は、特定の条件下、例えば酸性条件下、抗体から遊離され、それにより標的細胞に、例えば、増殖の防止によりまたは細胞毒性効果発揮により、治療的に影響する。
【0060】
ここで使用する用語「減少」は、その対照値より少なくとも１倍(例えば１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１０００、１０,０００倍またはそれ以上)低い、対象のバイオマーカー、例えばＶＳＩＧ４のレベルをいう。「減少」は、対象のバイオマーカー、例えばＶＳＩＧ４のレベルをいう限り、また、対照サンプルにおけるレベルまたは該マーカーの対照値に対して、少なくとも５％(例えば５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％低いことも意味する。
【0061】
ここで使用する用語「検出」は、定量的または定性的検出をいう。
【0062】
ここで使用する用語「検出可能プローブ」または「検出可能試薬」は、検出可能シグナルを提供する組成物をいう。本用語は、サンプルまたは対象における、ここに提供する抗体などの所望の分子の実存または存在を確認するために使用できる、物質をいう。検出可能試薬は、可視化され得る物質または他の方法で決定および／または測定ができる物質(例えば、定量化により)をいう。本用語は、活性を介して検出可能シグナルを提供するあらゆるフルオロフォア、発色団、放射標識、酵素、抗体または抗体フラグメントなどを含むが、これらに限定されない。
【0063】
ここで使用する「診断」または「有するとして対象を同定する」は、徴候および症状から疾患、状態または傷害を同定する過程をいう。診断は、特に個体が疾患または病気(例えば、癌)を有するかどうかを決定する過程である。癌は、例えば、ＶＳＩＧ４などの、癌と関連するマーカーの何れかの存在の検出により、例えば診断される。
【0064】
用語「コード化」またはその文法上の同等語は、核酸分子に関連して使用される限り、天然状態の核酸分子または当業者に周知の方法により操作されたとき、転写してｍＲＮＡを産生し、次いで、ポリペプチドおよび／またはそのフラグメントに翻訳され得るものをいう。アンチセンス鎖は、このような核酸分子の相補体であり、コード化配列をそこから推定できる。
【0065】
薬剤、例えば、医薬製剤の「有効量」または「治療有効量」は、対象における所望の生物学的応答を誘発するのに、必要な投与量および期間で、有効である量をいう。このような応答は、処置する疾患または障害の症状改善、疾患の症状または疾患自体の再発の阻止、阻害または遅延、処置非存在下と比較した対象の寿命の延長または疾患の症状または疾患自体の進行の阻止、阻害または遅延を含む。「有効量」は、特に所望の治療または予防結果を達成するのに有効な薬剤の量である。より具体的には、ここで使用する「有効量」は、治療上の利益を付与する薬剤の量である。治療有効量はまた、治療上有益な効果が、薬剤の何れかの毒性または有害作用を上回るものでもある。
【0066】
有効量を、１回以上の投与、適用または投与量で投与され得る。このような送達は、個々の投与単位が使用される期間、薬剤のバイオアベイラビリティ、投与経路などの多くの変数に依存する。ある実施態様において、有効量はまた特定した結果(例えば、Ｔ細胞活性化調節などの免疫チェックポイント生物学的活性の阻害)を達成する、ここに提供する抗体(例えば、抗ＶＳＩＧ４抗体)の量もいう。ある実施態様において、この用語は、ある疾患、障害または状態および／またはそれに関連する症状の重症度および／または期間を低減および／または改善するのに十分である、治療(例えば、抗ＶＳＩＧ４抗体などの、例えば、免疫チェックポイント阻害剤)の量をいう。この用語はまたある疾患、障害または状態の進展または進行の低減または改善、ある疾患、障害または状態の再発、進展または発症の低減または改善および／または他の治療(例えば、該免疫チェックポイント阻害剤以外の治療)の予防もしくは治療効果の改善または増強も包含する。癌治療の状況で、治療上の利益は、例えば癌の(例えば、癌のあるステージから次への)進行の停止または減速、癌の症状または徴候の増悪または悪化の停止または減速、癌の寛解を含む癌の重症度低減、腫瘍細胞増殖阻害、腫瘍サイズまたは腫瘍数または癌の指標のバイオマーカーレベルの低減の何れか一つまたは組み合わせを含む、癌の何らかの改善を意味する。ある実施態様において、有効量の抗体は、約０.１mg／kg(対象体重kgあたり抗体mg)～約１００mg／kgである。ある実施態様において、そこに提供される有効量の抗体は、約０.１mg／kg、約０.５mg／kg、約１mg／kg、３mg／kg、５mg／kg、約１０mg／kg、約１５mg／kg、約２０mg／kg、約２５mg／kg、約３０mg／kg、約３５mg／kg、約４０mg／kg、約４５mg／kg、約５０mg／kg、約６０mg／kg、約７０mg／kg、約８０mg／kg、約９０mg／kgまたは約１００mg／kg(またはその中の範囲)である。
【0067】
ここで使用する用語「エピトープ」は、抗体が結合するＶＳＩＧ４ポリペプチドまたはＶＳＩＧ４ポリペプチドフラグメントなどの抗原の領域をいう。好ましくは、ここで使用するエピトープは、１以上の抗体の抗原結合領域に結合でき、免疫応答を誘導できる哺乳動物(例えば、ヒト)などの動物における抗原性または免疫原性活性を有する、ＶＳＩＧ４ポリペプチドまたはＶＳＩＧ４ポリペプチドフラグメントなどの抗原表面の局在化領域である。免疫原性活性を有するエピトープは、動物で抗体応答を誘導するポリペプチドの部分である。抗原性活性を有するエピトープは、当分野で周知の何れかの方法、例えば、免疫アッセイで決定して、抗体が結合するポリペプチドの部分である。抗原性エピトープは、必ずしも免疫原性である必要はない。エピトープは、通常アミノ酸などの分子の化学活性表面グルーピングからなり、特異的三次構造特徴ならびに特異的荷電特徴を有する。ある実施態様において、エピトープは、糖側鎖、ホスホリル基またはスルホニル基などの分子の化学活性表面グルーピングである決定機を含み得て、ある実施態様において、特異的三次構造特徴および／または特異的荷電特徴を有し得る。エピトープは、連続残基または抗原性タンパク質折り畳みにより近位になる非連続残基により形成され得る。連続アミノ酸により形成されるエピトープは、一般に変性溶媒への暴露で維持され、一方非連続アミノ酸により形成されるエピトープは、一般に該暴露下で消失する。一般に、抗原は、数個または多数の異なるエピトープを有し、多数の種々抗体と反応する。抗体により決定されるエピトープの決定は、当業者に知られる何れかのエピトープマッピング技術により実施され得る。
【0068】
用語「完全長抗体」、「インタクト抗体」または「抗体全体」は相互交換可能に使用され、抗体フラグメントとは異なって、その実質的にインタクト形態の抗体をいう。具体的に、ここで使用する「完全長抗体」は、Ｆｃ領域を含む重鎖および軽鎖を有するものである。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン(例えば、ヒト天然配列定常ドメイン)またはそのアミノ酸配列バリアントであり得る。ある場合、インタクト抗体は、１以上のエフェクター機能を有し得る。
【0069】
ここに記載する用語「グリコシル化」は、タンパク質にグリコシル基を導入するための処理方法を意味する。グリコシル化は、グリコシルトランスフェラーゼにより介在される、標的タンパク質のセリン、スレオニン、アスパラギンまたはヒドロキシリシン残基へのグリコシル基の結合により実施される。グリコシル化タンパク質は、生存組織の構成物質として使用され得るだけでなく、細胞表面の細胞認識に重要な役割も有する。すなわち、本発明によると、本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントのグリコシル化またはグリコシル化パターンを変えることにより、抗体の効果が増強され得る。
【0070】
用語「重鎖」は、抗体に関連して使用するとき、約５０～７０kDaのポリペプチド鎖をいい、ここで、アミノ末端部分は約１２０～１３０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含み、定常領域を含むカルボキシ末端部分を含む。定常領域は、重鎖定常領域のアミノ酸配列に基づき、アルファ(α)、デルタ(δ)、イプシロン(ε)、ガンマ(γ)およびミュー(μ)と称される５つの異なるタイプの一つである。異なる重鎖は、サイズが異なる：α、δおよびγは凡そ４５０アミノ酸含み、一方μおよびεは、凡そ５５０アミノ酸含む。軽鎖と組み合わせたとき、これら異なるタイプの重鎖は、それぞれ、４個のサブクラスのＩｇＧ、すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む５つの周知クラスの抗体、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭをもたらす。重鎖はヒト重鎖であり得る。
【0071】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」および「宿主細胞培養物」は相互交換可能に使用され、外因性核酸が導入されている細胞を、そのような細胞の子孫を含み、いう。宿主細胞は、継代数に関係なく、一次形質転換細胞およびそこから由来する子孫を含む、「形質転換体」および「形質転換細胞」を含む。子孫は、親細胞と核酸内容物が完全に同じではなく、変異を含み得る。元の形質転換細胞でスクリーニングまたは選択したのと同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫は、ここに含まれる。
【0072】
「ヒト抗体」は、ヒトにより産生される抗体に対応するアミノ酸配列を有するおよび／またはここに開示するヒト抗体を製造する技術の何れかを使用して製造されている、抗体をいう。ヒト抗体のこの定義は、具体的に非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外する。ヒト抗体は、ここに開示するファージディスプレーライブラリーを含む、当分野で知られる種々の技術により産生できる。Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991);Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)。Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)に記載の方法もヒトモノクローナル抗体に利用可能である。van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001)もまた参照。ヒト抗体は、抗原負荷に応答してこのような抗体を産生するが、内因座位は障害されているトランスジェニック動物、例えば、免疫化xenomiceに抗原を投与することによっても、調製できる(例えば、XENOMOUSETMテクノロジーに関して、米国特許６,０７５,１８１および６,１５０,５８４参照)。例えば、ヒトＢ細胞ハイブリドーマテクノロジーにより産生するヒト抗体に関して、Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)もまた参照。
【0073】
「ヒト化」抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含む、キメラ抗体をいう。ある実施態様において、ヒト化抗体は、レシピエントのＣＤＲからの残基が所望の特異性、親和性および／または能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲからの残基で置き換えられる、ヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある例で、骨格セグメント残基(フレームワークについてＦＲと呼ぶ)のいくつかは、当業者に知られる技術により、結合親和性を保持するために修飾され得る(Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986)。ある実施態様において、ヒト免疫グロブリンのＦＲ残基は、対応する非ヒト残基に置き換えられる。ある実施態様において、ヒト化抗体は、少なくとも１個および一般に２個の、可変ドメインの実質的にすべてを含み、そのＣＤＲの全てまたは実質的に全ては非ヒト抗体に対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てはヒト抗体のものである。ヒト化抗体は、所望により抗体定常領域(Ｆｃ)、一般にヒト免疫グロブリンの少なくとも一部を含み得る。「ヒト化形態」の抗体、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化を受けている抗体である。ヒト化の目的は、ヒトへの導入のために、マウス抗体などの異種抗体の免疫原性を低減し、一方で、抗体の完全抗原結合親和性および特異性を維持することである。さらなる詳細について、例えば、Jones et al, Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988);およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)参照。また、例えば、Jones et al, Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988);およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)参照。また、例えば、Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1 :105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)；および米国特許６,９８２,３２１および７,０８７,４０９参照。
【0074】
ここで使用する「同定」は、ある状態を有する対象を評価し、対象がある状態を有する、例えば、癌を有すると決定する過程をいう。
【0075】
ここで使用する用語「免疫チェックポイント」または「免疫チェックポイントタンパク質」は、Ｔ細胞などのあるタイプの免疫系細胞および一部癌細胞により産生される、あるタンパク質をいう。このようなタンパク質は、免疫系におけるＴ細胞機能を制御する。特に、免疫応答の監視の維持を助け、Ｔ細胞が癌細胞を殺すことを助けることができる。該免疫チェックポイントタンパク質は、Ｔ細胞にシグナルを送り、Ｔ細胞機能を本質的にスイッチオフするか阻害する、特異的リガンドとの相互作用により、この結果を達成する。これらタンパク質の阻害は、Ｔ細胞機能および癌細胞への免疫応答の回復をもたらす。チェックポイントタンパク質の例は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４(ＣＤ２ファミリーの分子に属し、全ＮＫ、γδおよび記憶ＣＤ８＋(αβ)Ｔ細胞に発現される)、ＣＤ１６０(別名ＢＹ５５)、ＣＧＥＮ－１５０４９、ＣＨＫ１およびＣＨＫ２キナーゼ、ＩＤＯ１、Ａ２ａＲおよび種々のＢ７ファミリーリガンドを含むが、これらに限定されない。
【0076】
ここで使用する用語「増加」は、その対照値より少なくとも１倍(例えば１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１０００、１０,０００倍またはそれ以上)多い対象のバイオマーカー、例えばＶＳＩＧ４のレベルをいう。「増加」は、対象のバイオマーカー、例えばＶＳＩＧ４のレベルをいう限り、また対照サンプルにおけるレベルまたは該マーカーの対照値に対して、少なくとも５％(例えば５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％多いことも意味する。
【0077】
ここで使用する「阻害剤」または「アンタゴニスト」は、上記免疫チェックポイントタンパク質の何れかなどの標的タンパク質の生物学的活性の１以上を阻害または減少できる、分子をいう。
【0078】
「単離」抗体は、その天然環境の成分から分離されているものをいう。ある実施態様において、抗体は、例えば、電気泳動(例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動(ＩＥＦ)、毛細管電気泳動)またはクロマトグラフィー(例えば、イオン交換または逆相ＨＰＬＣ)により決定して、９５％または９９％より高い純度まで精製される。抗体純度の評価方法のレビューのために、例えば、Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)参照。
【0079】
「単離」核酸は、その天然環境の成分から分離されている核酸分子をいう。単離核酸は、通常該核酸分子を含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、該核酸分子は、染色体外または天然染色体位置と異なる染色体位置に存在する。
【0080】
ここで使用する用語「ＫＤ」は、特異的抗体－抗原相互作用の解離定数をいい、抗体の抗原に対する親和性を測定する手段である。ＫＤが低いほど、抗体の抗原に対する親和性が高いことを意味する。
【0081】
ここで意図されるバイオマーカー、例えばＶＳＩＧ４の「レベル」は、サンプル、例えば癌罹患患者から集めたサンプルにおけるバイオマーカーの定量値である。ある実施態様において、定量値は、実際に測定した絶対値からなるものではなく、使用したアッセイ形式で生ずるシグナル対ノイズ比を考慮に入れたおよび／またはアッセイ毎の癌マーカーレベルの測定の再現性を高めるために使用される較正対照値を考慮に入れた結果の最終値である。ある実施態様において、バイオマーカー、例えばＶＳＩＧ４の「レベル」は、同種の任意値を(ｉ)アッセイ毎または(ii)癌罹患患者毎または(iii)同じ患者で異なる時期に実施したアッセイまたは(iv)患者のサンプルおよび予め決定された対照値(ここでは「カットオフ」値とも称され得る)で測定されたバイオマーカーレベルで比較することが重要であるため、そのような任意値である。
【0082】
用語「軽鎖」は、抗体に関連して使用するとき、約２５kDaのポリペプチド鎖をいい、ここで、アミノ末端部分は、約１００～約１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含み、カルボキシ末端部分は定常領域を含む。軽鎖のおよその長さは２１１～２１７アミノ酸である。定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ(κ)またはラムダ(λ)と称される２つの異なるタイプがある。軽鎖アミノ酸配列は当分野で周知である。軽鎖は、ヒト軽鎖であり得る。
【0083】
ここで使用する用語「モノクローナル抗体」は、ほぼ均一の抗体集団から生ずる抗体を示し、ここで、集団は、最小割合で見られ得る天然に存在する可能性のある数変異以外、同一抗体である。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマなどの単一細胞クローンの増殖により生じ、１クラスの重鎖およびサブクラスおよび１タイプの軽鎖により特徴づけられる。ここで使用するモノクローナル抗体は、抗体が抗原に提示されたとき、単一抗原サイト(すなわち、単一エピトープ)に特異的に結合する。モノクローナル抗体は、対応する技術分野で周知である種々の方法により産生され得る。
【0084】
ここで使用する用語「ペグ化」は、前記モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントへのポリエチレングリコールの導入により、抗体の血液中の保持時間を延長させる処理方法である。具体的に、ポリエチレングリコールでのポリマーナノ粒子のペグ化により、ナノ粒子表面の親水性が増強され、従って、生体内での速い分解が、病原体、廃棄物および外部から導入された外来物質の食作用および消化を引き起こすためにヒト体内でマクロファージを含む免疫活性による認識を阻止するいわゆるステルス効果により、阻止され得る。すなわち、血液中の抗体の保持時間は、ペグ化により延長され得る。本発明で用いるペグ化は、アミド基がヒアルロン酸のカルボキシル基およびポリエチレングリコールのアミン基の間の結合に基づき形成される方法により実施されるが、それに限定されず、ペグ化は種々の方法により実施され得る。当時、使用するポリエチレングリコールに関して、分子量１００～１,０００および直鎖または分枝鎖構造を有するポリエチレングリコールが好ましくは使用されるが、それに特に限定されない。
【0085】
ここで使用する核酸またはアミノ酸の２配列間の「パーセンテージ同一性」または「％同一性」は、最適アラインメント後に得た比較する２配列間の同一ヌクレオチドまたはアミノ酸残基のパーセンテージをいい、このパーセンテージは純粋に統計的であり、２配列間の違いは、その長さ全体に無作為に分布している。２核酸またはアミノ酸配列の比較は、伝統的に配列を最適に整列させた後にそれらの比較により実施され、該比較は、セグメントまたは「アラインメントウィンドウ」を使用して実施できる。比較のための配列の最適アラインメントは、当業者に知られる方法の手段により、手動の比較に加えて実施できる。
【0086】
対照アミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一性を示すアミノ酸配列について、好ましい例は、制御配列を含むもの、ある修飾、特に少なくとも１個のアミノ酸の欠失、付加または置換、短縮化または伸張を含むものを含む。１以上の連続的または非連続的アミノ酸の置換の場合、置換されるアミノ酸が「等価」アミノ酸に置き換わる置換が好ましい。ここで、表現「等価アミノ酸」は、対応する抗体の生物学的活性を修飾することなく、構造アミノ酸の一つを置換する可能性の高いあらゆるアミノ酸を示すことを意味し、これらの具体例を下に定義する。等価アミノ酸は、置換されるアミノ酸との構造相同性に基づきまたは酸性される可能性のある種々の抗体間の生物学的活性の比較試験の結果に基づき、決定され得る。
【0087】
非限定的例として、下の表１は、対応する修飾抗原結合タンパク質の生物学的活性を顕著に修飾することなく、実施できる可能性のある、可能な置換を要約する；逆置換は、同じ条件下で、本質的に可能である。
【表1】
【0088】
ここで使用する用語「薬学的に許容される」は、連邦または州規制当局により承認されているまたは米国薬局方、欧州薬局方または他の一般に認識される薬局方に、動物およびより具体的にヒトへの使用について挙げられていることを意味する。より具体的には、担体をいうとき、表現「薬学的に許容される」は、担体が組成物の他の成分と適合性であり、そのレシピエントに有害ではないことを意味する。従って、ここで使用する表現「薬学的に許容される担体」は、生存生物を刺激することなく、投与する化合物の生物学的活性および特徴を阻害しない、担体または希釈剤をいう。担体のタイプは、意図する投与経路に基づき選択され得る。使用する各担体の量は、当分野で慣用の範囲内で変わり得る。液体溶液として調製される組成物における薬学的に許容される担体として、生理食塩水、滅菌水、緩衝化食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロールおよびこれら１以上の混合物を、生存生物に適する滅菌担体として使用できる。必要であれば、抗酸化剤、緩衝液および静菌剤などの一般的添加剤を加え得る。さらに、さらに希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤または滑沢剤を加えることにより、組成物を水溶液剤、懸濁液剤およびエマルジョン剤などの注射剤、丸剤、カプセル剤、顆粒または錠剤のための製剤として調製できる。
【0089】
ここで使用する用語「ポリクローナル抗体」は、１以上の他の、非同一抗体の中でまたは存在下で産生された抗体である。一般に、ポリクローナル抗体は、非同一抗体を産生するいくつかの他のＢリンパ球の存在下、Ｂリンパ球から産生される。通常、ポリクローナル抗体は、免疫化動物から直接得る。
【0090】
用語「対照値」、ここで使用するは、対照サンプルにおける検討中のバイオマーカー(例えばＶＳＩＧ４)の発現レベルをいう。ここで使用する「対照サンプル」は、疾患がないことが知られている対象、好ましくは２以上の対象から、あるいは、一般集団から得たサンプルを意味する。バイオマーカーの適当な対照発現レベルは、いくつかの適当な対象における該バイオマーカーの発現レベルの測定により決定でき、このような対照レベルを特異的対象集団に調整し得る。対照値または対照レベルは絶対値；相対値；上限または下限がある値；値の範囲；平均値；中央値、中間値または特定の対照またはベースライン値と比較した値であり得る。対照値は、例えば、試験する対象からであるが、先の時点で得ているサンプルから得た値などの個体サンプル値に基づき得る。対照値は、年代順年齢適合群の対象集団からなどの多数のサンプルまたは試験すべきサンプルを含むまたは含まないサンプルのプールに基づき得る。
【0091】
ここに記載する方法に付され得る「対象」は、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ブタ、イノシシ属、ヒツジおよびサルを含む哺乳動物の何れでもよい。ヒト対象は、患者として知られ得る。ある実施態様において、「対象」または「処置を必要とする対象」は、癌を有するまたは癌を有することが疑われるまたは癌を有すると診断されている哺乳動物をいう。ここで使用する「癌罹患対象」は、癌を有するまたは癌を有すると診断されている哺乳動物をいう。「対照対象」は、癌を有していないかつ癌を有していると疑われない哺乳動物をいう。
【0092】
ここで使用する対象における疾患の「処置」または疾患を有する対象の「処置」は、対象に疾患の程度が減少または予防されるように、医薬処置、例えば、薬物投与をすることをいう。例えば、処置は、疾患または状態の少なくとも１個の徴候または症状の低減をもたらす。処置は、医薬組成物などの組成物の投与を含み(しかしこれに限定されない)、予防的にまたは病的事象の開始の後の何れかに実施され得る。処置は、１回を超える薬剤投与および／または処置を必要とし得る。
【0093】
抗体の「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体の重鎖または軽鎖のアミノ末端ドメインをいう。重鎖の可変ドメインは「ＶＨ」と称し得る。軽鎖の可変ドメインは、「ＶＬ」と称し得る。これらドメインは、一般に抗体の最も可変の部分であり、抗原結合部位を含む。
【0094】
用語「ベクター」は、宿主細胞に核酸分子を導入するために使用される物質である。特に、ここで使用する「ベクター」は、結合している他の核酸分子の増殖ができる核酸分子である。ベクターの一例は「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントがライゲートされ得る環状二本鎖ＤＮＡループをいう。ベクターの他の例はウイルスベクターであり、ここで、さらなるＤＮＡセグメントは、ウイルスゲノムにライゲートされ得る。あるベクターは、導入された宿主細胞で自律的に複製できる(例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞への導入により宿主細胞ゲノムに統合され得て、それにより宿主ゲノムと共に複製される。用語「ベクター」は、故に、自己複製核酸構造としてのベクターならびに導入されている宿主細胞のゲノムに取り込まれたベクターを含む。使用に適用可能なベクターは、例えば、発現ベクター、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター、エピソームおよび人工染色体を含み、宿主細胞の染色体への安定な組込みのために操作可能な選択配列またはマーカーを含み得る。
【0095】
あるベクターは、操作可能に連結した遺伝子の発現を指示できる。このようなベクターを、ここでは、「組み換え発現ベクター」(または単に「発現ベクター」)と称する。一般に、組み換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターは、プラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドと、それがベクターの最も一般的形態であるため、相互交換可能に使用し得る。しかしながら、本発明は、発現ベクターの全ての形態、例えば細菌プラスミド、ＹＡＣ、コスミド、レトロウイルス、ＥＢＶ由来エピソームおよび目的の抗体の重鎖および／または軽鎖(例えば、抗ＶＳＩＧ４抗体)の発現を確実にするのに好都合であることが当業者に知られる他のベクター全てを含むことを意図する。当業者は、重鎖および軽鎖をコードするポリヌクレオチドを、異なるベクターまたは同じベクターにクローン化できることを認識する。
【0096】
ベクターは、１以上の選択可能マーカー遺伝子および適切な発現制御配列を含み得る。含まれ得る選択可能マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質または毒素に対する耐性、栄養要求性欠損補足または培養培地にない必須栄養素の供給を提供する。発現制御配列は、当分野で周知の構成的および誘導型プロモーター、転写エンハンサー、転写ターミネーターなどを含み得る。２以上の核酸分子が共発現されるとき(例えば抗体重鎖および軽鎖両方)、両核酸分子は、例えば、単一発現ベクターまたは別々の発現ベクターに導入し得る。単一ベクター発現について、コード化核酸は、一つの共通発現制御配列に操作可能に連結しまたは１誘導型プロモーターおよび１構成的プロモーターなど異なる発現制御配列に連結し得る。核酸分子の宿主細胞への導入は、当分野で周知の方法を使用して、確認できる。このような方法は、例えば、ノーザンブロットなどの核酸分析またはｍＲＮＡのポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)増幅または遺伝子産物発現のための免疫ブロッティングまたは導入核酸配列もしくはその対応する遺伝子産物の発現を試験する他の適当な分析方法を含む。核酸分子は、所望の産物(例えばここに提供される抗ＶＳＩＧ４抗体)を産生するのに十分な量で発現されることは当業者に理解され、発現レベルを、当分野で周知の方法を使用して十分な発現を得るために最適化できることもさらに理解される。
【0097】
用語「ＶＳＩＧ４」または「ＶＳＩＧ４ポリペプチド」および類似する用語は、ヒトＸ染色体の動原体周囲領域に位置し、免疫グロブリンスーパーファミリータンパク質Ｚ３９ＩＧとしても当分野で知られるヒトＶ－ｓｅｔおよび４(ＶＩＧ４)遺伝子を含む免疫グロブリンドメインによりコード化されるポリペプチド(「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、ここでは相互交換可能に使用する)をいい、Ｚ３９ＩＧは、免疫グロブリンスーパーファミリー、ＣＲＩｇの補体受容体である。ＶＳＩＧ４遺伝子配列は、例えばNo. NM_007268.2、NM_001100431.1、NM_001184831.1、NM_001184830.1またはNM_001257403.1などのＧｅｎＢａｎｋ受託番号を有する配列により表わされる。
【0098】
ＶＳＩＧ４(Ｖ－ｓｅｔおよびＩｇドメイン含有４)は、免疫制御タンパク質のＢ７ファミリーに構造的に関連するｖ－ｓｅｔおよび免疫グロブリンドメイン含有タンパク質である。ヒトでは、２つの異なる形態のＶＳＩＧ４タンパク質がある。長い形態は定常(Ｃ２型)および可変(Ｖ型)両方の免疫グロブリンドメインを含み、一方短い形態はＶ型免疫グロブリンドメインしか含まず、Ｃ２型がない。これら２形態を図１Ａに示す。ある実施態様において、ヒトＶＳＩＧ４タンパク質は、Uniprot受託番号Q9Y279の配列により表わされる配列を有する。ある実施態様において、長い形態のヒトＶＳＩＧ４タンパク質は、Uniprot受託番号Q9Y279-1の配列により表わされる配列を有する。好ましくは、長い形態のＶＳＩＧ４は、配列番号１に示す配列を有する。ある実施態様において、短い形態のヒトＶＳＩＧ４タンパク質は、Uniprot受託番号Q9Y279-3により表わされる配列を有する。好ましくは、短い形態のＶＳＩＧ４は、配列番号２に示す配列を有する。
【0099】
ＶＳＩＧ４は、補体受容体として機能し、補体ｉＣ３ｂおよびＣ３ｂセグメントへの結合により補体活性を機能的に阻害し、それによりＣ３ｂオプソニン化病原体のクリアランスに介在する。ＶＳＩＧ４発現は組織マクロファージに限定的であることが観察されており、リポ多糖(ＬＰＳ)への応答で下方制御されることが示されている(Vogt et al. (2006) J. of Clin. Invest. 116:2817)。
【0100】
ＶＳＩＧ４は、抗炎症性および免疫抑制性性質を有する免疫チェックポイントタンパク質である。可溶性ＶＳＩＧ４融合タンパク質は炎症(Small et al., Swiss Med Wkly. (2016) 146:w14301)を阻害し、一方ＶＳＩＧ４欠陥はマクロファージ介在炎症を介しする(Liao et al. (2014) Lab. Invest. 94:706)。ＶＳＩＧ４によるマクロファージ活性化のこの阻害は、Ｃ３ｂ非依存的と考えられる(Li et al. (2017) Nat Commun. 8(1):1322)。ＶＳＩＧ４は、Ｔ細胞活性化における制御機能を有する(Vogt et al. (2006) J. of Clin. Invest. 116:2817; Xu et al. (2010) Immunol Lett. 18;128(1):46-50; Jung et al. (2012) Hepatology. 56(5):1838-48; Jung et al. (2015) Immunol Lett. 165(2):78-83; Munawara et al. (2019) Front Immunol. 10;10:2892)。特に、ＶＳＩＧ４は、未確認Ｔ細胞リガンド受容体への結合により、Ｔ細胞増殖およびＩＬ－２産生の強力な負のレギュレーターである(Vogt et al. (2006) J. of Clin. Invest. 116:2817)。
【0101】
多くの免疫チェックポイントタンパク質と同様、ＶＳＩＧ４活性は、免疫耐容性促進により、腫瘍増殖を促す。Ｖｓｉｇ４欠損マウスの腫瘍増殖は野生型より小さく、ＶＳＩＧ４の不在が、腫瘍増殖を防止する免疫応答を活性化することを示唆する。ＶＳＩＧ４発現マクロファージの腫瘍微小環境への塊状浸潤は、非小細胞肺癌と診断された患者で観察されている(Liao et al. (2014) Lab. Invest. 94:706)。ＶＳＩＧ４遺伝子は、肺癌、卵巣癌、乳癌、肝細胞癌および複数の黒色腫など数種の癌細胞で過発現し、免疫応答を抑制し、腫瘍進行を促進する癌遺伝子のように作用する。高ＶＳＩＧ４発現は、実際高悪性度神経膠腫および患者予後不良と関連付けられている(Xu et al. (2015) Am. J. Transl. Res. 7: 1172)。
【0102】
抗ＶＳＩＧ４抗体
免疫チェックポイントは、生理的条件下で、自己免疫寛容維持および免疫介在組織損傷限定に重要な役割を有する。ＶＳＩＧ４は、休止マクロファージに発現されるＢ７関連免疫グロブリンスーパーファミリーに属するタイプＩ膜貫通タンパク質である。ＶＳＩＧ４は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞増殖およびＩＬ－２産生の阻害によりＴ細胞活性化を負に制御する共阻害性リガンドである。長い形態(ｈｕＶＳＩＧ４(Ｌ))および短い形態(ｈｕＶＳＩＧ４(Ｓ))の２形態のＶＳＩＧ４が知られ、長い形態ではＩｇＣ型免疫グロブリンドメインである膜近位ドメインの存在により異なる。
免疫チェックポイントは、生理的条件下で、自己免疫寛容維持および免疫介在組織損傷限定に重要な役割を有する。ＶＳＩＧ４は、休止マクロファージに発現されるＢ７関連免疫グロブリンスーパーファミリーに属するタイプＩ膜貫通タンパク質である。ＶＳＩＧ４は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞増殖およびＩＬ－２産生の阻害によりＴ細胞活性化を負に制御する共阻害性リガンドである。長い形態(ｈｕＶＳＩＧ４(Ｌ))および短い形態(ｈｕＶＳＩＧ４(Ｓ))の２形態のＶＳＩＧ４が知られ、長い形態ではＩｇＣ型免疫グロブリンドメインである膜近位ドメインの存在により異なる。
【0103】
本発明者らは、本発明により、両形態がマクロファージに発現されることを示す。さらに、両形態は機能的である：ｈｕＶＳＩＧ４(Ｌ)またはｈｕＶＳＩＧ４(Ｓ)の可溶性バージョンは、Ｔ細胞増殖およびＩＦＮγ産生阻害により証明されるとおり、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞活性化を阻害する。故に、長いおよび短い形態のＶＳＩＧ４両者は、タンパク質の制御活性に寄与し、これは、両者が免疫抑制を回復するために阻害されるべきであることを意味する。
【0104】
本発明は、ヒトＶＳＩＧ４に特異的に結合する新規モノクローナル抗体を提供する。より具体的には、本発明は、タンパク質の長い形態および短い形態の両者に結合できる、新規モノクローナル抗体を提供する。さらに、ここに開示する抗体は、ＶＳＩＧ４への結合に加えて内在化を誘導し、そうして受容体の細胞表面からの除去に寄与する。これは、例えば、長い形態のヒトＶＳＩＧ４にしか結合できず、内在化を誘導できない、ＷＯ２０２０／０６９５０７に記載の抗体などの先行技術の抗体と対照的である。
【0105】
本発明者らは、有効ＶＳＩＧ４遮断がここに開示する抗ＶＳＩＧ４抗体で達成されることを発見した。実際、これら抗体は、炎症促進性サイトカイン遊離を誘導し、マクロファージによる抗炎症性サイトカイン分泌を遮断し、Ｔ細胞活性化を促進する能力により証明されるとおり、ＶＳＩＧ４の抗炎症性機能を調節し、免疫抑制性性質を阻害する。ここに開示する抗ＶＳＩＧ４抗体は、それ故に、癌患者における抗腫瘍免疫応答の産生に有用である。
【0106】
第一の態様において、本発明は、ヒトＶＳＩＧ４に特異的に結合できるモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。ある実施態様において、該抗体は、長い形態のヒトＶＳＩＧ４および短い形態のＶＳＩＧ４両方に結合できる。ある実施態様において、長い形態のヒトＶＳＩＧ４タンパク質は、配列番号１に示す配列を有する。ある実施態様において、短い形態のヒトＶＳＩＧ４タンパク質は、配列番号２に示す配列を有する。
【0107】
ある実施態様において、抗ＶＳＩＧ４抗体は、ＶＳＩＧ４への結合により内在化を誘導する。
【0108】
ある実施態様において、本発明の抗体の内在化は、免疫蛍光(本明細書で下記に例示される)または内在化機構に特異的な当業者に知られる何れかの方法または工程により評価され得る。
【0109】
複合体ＶＳＩＧ４／抗体は、抗体のＶＳＩＧ４の細胞外ドメイン(ＥＣＤ)への結合後内在化し、それにより細胞表面のＶＳＩＧ４の量の減少を誘導する。この減少は、非限定的例として、ウェスタンブロット、ＦＡＣＳ、免疫蛍光などの当業者に知られる何れかの方法により定量され得る。
【0110】
ある実施態様において、この減少、故に内在化の反映は、ＦＡＣＳにより測定され、４℃で測定した平均蛍光強度(ＭＦＩ)と３７℃で測定したＭＦＩの間の差またはデルタとしてあらわされ、何れの場合も、細胞は４時間、抗体とインキュベートされた後である。
【0111】
このデルタは、例えば未処理細胞およびｉ)ここに記載する抗体と４時間インキュベーション後ＶＳＩＧ４－トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞およびii)Alexa488で標識した二次抗体を使用して、抗体で処理した細胞で得たＭＦＩである。このパラメータを次の式を使用して計算する：Δ(ＭＦＩ４℃－ＭＦＩ３７℃)。
【0112】
ＭＦＩのこの差は、ＭＦＩがＶＳＩＧ４の細胞表面発現に比例するため、ＶＳＩＧ４下方制御を反映する。
【0113】
有利に、ここに記載する抗体または任意のその抗原結合フラグメントは、ＶＳＩＧ４でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３に少なくとも２８０、好ましくは少なくとも３７０のΔ(ＭＦＩ４℃－ＭＦＩ３７℃)を誘導するモノクローナル抗体である。
【0114】
さらに詳細には、上記デルタは、説明であるが、非限定例であると解釈すべきである、次の過程により測定され得る：
ａ)目的の細胞と本発明の抗体を、冷(４℃)または温(３７℃)完全培養培地と接触させ；
ｂ)工程ａ)の細胞および、並行して、未処理細胞と二次抗体を接触させ；
ｃ)本発明の抗体に結合できる二次標識抗体と処理および非処理細胞のＭＦＩ(表面に存在するＶＳＩＧ４量を表す)を測定し；そして
ｄ)非処理細胞で得たＭＦＩから処理細胞で得たＭＦＩを減じて、デルタを計算する。
ａ)目的の細胞と本発明の抗体を、冷(４℃)または温(３７℃)完全培養培地と接触させ；
ｂ)工程ａ)の細胞および、並行して、未処理細胞と二次抗体を接触させ；
ｃ)本発明の抗体に結合できる二次標識抗体と処理および非処理細胞のＭＦＩ(表面に存在するＶＳＩＧ４量を表す)を測定し；そして
ｄ)非処理細胞で得たＭＦＩから処理細胞で得たＭＦＩを減じて、デルタを計算する。
【0115】
このデルタＭＦＩから、内在化パーセンテージは：
１００×(ＭＦＩ４℃－ＭＦＩ３７℃)／ＭＦＩ４℃
として決定できる
１００×(ＭＦＩ４℃－ＭＦＩ３７℃)／ＭＦＩ４℃
として決定できる
【0116】
ＶＳＩＧ４－トランスフェクトＨＥＫ２９３に存在する本発明の抗体または任意のその抗原結合フラグメントの内在化パーセンテージは、６０％～および９９％、優先的に６１％～および９６％を含む。
【0117】
ある実施態様において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、１０×１０－１０～１×１０－９Ｍに含まれるＥＣ５０でＶＳＩＧ４に結合できる。
【0118】
ここで使用する「ＥＣ５０」は、５０％有効濃度をいう。より厳密に用語最大半量有効濃度(ＥＣ５０)は、ある特定の暴露時間後、ベースラインと最大の半分の応答を誘導する、薬物、抗体または毒物の濃度に対応する。薬物の効力の指標として汎用される。それ故に、段階的用量応答曲線のＥＣ５０は、最大効果の５０％が観察される化合物の濃度を表す。計数的用量応答曲線のＥＣ５０は、特定の暴露時間後、集団の５０％が応答を示す化合物の濃度を表す。濃度測定は、一般にシグモイド曲線に従い、濃度の比較的小さな変化を超えて、急速に増加する。これは、ベストフィットラインの誘導により数学的に決定できる。
【0119】
好ましい実施態様として、ここで決定したＥＣ５０は、ヒトＨＥＫ２９３細胞に露出されるＶＳＩＧ４ ＥＣＤへの抗体結合の効力を特徴づける。ＥＣ５０パラメータは、ＦＡＣＳ分析を使用して決定する。ＥＣ５０パラメータは、ヒト腫瘍細胞で発現されるヒトＩＧＦ－１Ｒ最大結合の５０％が得られる抗体濃度を反映する。各ＥＣ５０値は、４パラメータ回帰曲線フィッティングプログラム(Prism Software)を使用する用量応答曲線の中点として計算した。このパラメータは、生理学的／病理学的状態の代表として選択されている。
【0120】
ここで使用する抗ＶＳＩＧ４モノクローナル抗体は、合成抗体、組み換えにより産生された抗体、多特異的抗体(二特異的抗体を含む)、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体、イントラボディ、抗イディオタイプ(抗Ｉｄ)抗体および上記の何れかの機能的フラグメントを含むが、これらに限定されない。抗ＶＳＩＧ４モノクローナル抗体は、ヒトまたは非ヒト起源であり得る。非ヒト起源の抗ＶＳＩＧ４抗体の例は、哺乳動物起源(例えば、類人猿、齧歯類、ヤギおよびウサギ)のものを含むが、これらに限定されない。ヒト抗体の全構造がヒトに由来するため、慣用のヒト化抗体またはマウス抗体と比較して、免疫応答を有する可能性はほんのわずかであり、故に、ヒトに投与したとき、何れかの望まない免疫応答を引き起こさない利点がある。それ故に、処置用抗体として極めて有利であり得る。従って、ヒトにおける治療のための抗ＶＳＩＧ４モノクローナル抗体は、好ましくはヒト化または完全ヒトである。より好ましくは、完全ヒトである。
【0121】
本発明のある実施態様によると、ここに記載する抗体は、本発明者らにより、ファージディスプレイ方法によりナイーブヒト単一鎖Ｆｖライブラリーのバイオパニングにより産生された、ＶＳＩＧ４に特異的に結合するヒト抗体である。
【0122】
ファージディスプレイ方法において、機能的抗体ドメインは、それをコードするポリヌクレオチド配列を担持するファージ粒子の表面に提示される。特に、ＶＨおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列は、動物ｃＤＮＡライブラリー(例えば、罹患組織のヒトまたはマウスｃＤＮＡライブラリー)から増幅される。ＶＨおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡを、ＰＣＲによりｓｃＦｖリンカーと一緒に組み換え、ファージミドベクターにクローン化する。ベクターは大腸菌に電気穿孔され、大腸菌はヘルパーファージで感染させる。これらの方法で使用するファージは、一般にｆｄおよびＭ１３を含む糸状ファージであり、ＶＨおよびＶＬドメインは、通常ファージ遺伝子IIIまたは遺伝子VIIIに組み換えにより融合される。特定の抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージを、抗原で、例えば、標識抗原または固体表面またはビーズに結合もしくは捕捉された抗原を使用して、選択または同定できる。ここに提供する抗体の製造に使用できるファージディスプレイ方法の例は、Brinkman et al., 1995, J. Immunol. Methods 182:41-50; Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods 184:177-186; Kettleborough et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:952-958; Persic et al., 1997, Gene 187:9-18; Burton et al., 1994, Advances in Immunology 57:191-280；ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＷＯ９０／０２８０９、ＷＯ９１／１０７３７、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／１８６１９、ＷＯ９３／１１２３６、ＷＯ９５／１５９８２、ＷＯ９５／２０４０１およびＷＯ９７／１３８４４；および米国特許５,６９８,４２６、５,２２３,４０９、５,４０３,４８４、５,５８０,７１７、５,４２７,９０８、５,７５０,７５３、５,８２１,０４７、５,５７１,６９８、５,４２７,９０８、５,５１６,６３７、５,７８０,２２５、５,６５８,７２７、５,７３３,７４３および５,９６９,１０８に記載のものを含む。
【0123】
上記引用文献に記載のとおり、ファージ選択後、ファージからの抗体コード領域を単離し、例えば、下記のとおり、ヒト抗体を含む抗体全体またはあらゆるその他の所望の抗原結合フラグメントの産生に使用し、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌を含むあらゆる所望の宿主で発現させ得る。Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ(ａｂ’)２フラグメントを組み換えにより産生する技術も、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／２２３２４； Mullinax et al., 1992, BioTechniques 12(6):864-869; Sawai et al., 1995, AJRI 34:26-34; and Better et al., 1988, Science 240:1041-1043に記載のものなど、当分野で知られる方法を使用して用い得る。
【0124】
抗体全体を産生するために、ＶＨまたはＶＬヌクレオチド配列、制限部位および制限部位を保護するフランキング配列を含むＰＣＲプライマーを使用して、ｓｃＦｖクローンでＶＨまたはＶＬ配列を増幅できる。当業者に知られるクローニング技術を使用して、ＰＣＲ増幅ＶＨドメインを、ＶＨ定常領域、例えば、ヒトガンマ４定常領域を発現するベクターにクローン化でき、ＰＣＲ増幅ＶＬドメインをＶＬ定常領域、例えば、ヒトカッパまたはラムダ定常領域を発現するベクターにクローン化できる。ＶＨおよびＶＬドメインを、必要な定常領域を発現する１ベクターにクローン化もできる。次いで、当業者に知られる技術を使用して、重鎖変換ベクターおよび軽鎖変換ベクターを細胞株に共トランスフェクトして、完全長抗体、例えば、ＩｇＧを発現する安定なまたは一過性細胞株を産生する。
【0125】
上記方法により産生した抗体は、抗原への親和性が増強した抗体である。用語「親和性」は、特異的抗原部位を特異的に認識し、結合する性質をいい、抗体の抗原に対する特異性と共に、高親和性は、免疫反応で重要な因子である。本発明において、ヒト化重鎖ライブラリー細胞は、重鎖可変領域の無作為変異により産生され、コロニーリフトアッセイが高抗原結合性を有する第一バリアントクローンの選択のためにライブラリー細胞で実施される。選択クローンの競合的ＥＬＩＳＡの実施のために、各クローンの親和性を試験した。これ以外の方法で、抗原の親和性を測定する種々の方法を用いてよく、表面プラズモン共鳴テクノロジーはこのような方法の一例である。
【0126】
ある実施態様において、ここに開示する抗ＶＳＩＧ４モノクローナル抗体は、ＶＳＩＧ４タンパク質内のエピトープに特異的に結合する。具体的に、本抗体により結合されるエピトープは、変異したとき抗体結合をなくすＶＳＩＧ４残基の決定により同定される。ある実施態様において、ＶＳＩＧ４は長バリアントである。他の実施態様において、ＶＳＩＧ４は短バリアントである。
【0127】
好ましくは、ここに開示する抗体は、１以上のエピトープにおける少なくとも１個のアミノ酸に結合する抗体であり、エピトープは、次のものからなる群から選択される：
ａ)配列番号２に示す配列の残基Ｅ２４、Ｖ２５、Ｅ２７、Ｖ２９および／またはＴ３０を含むエピトープＭ１；
ｂ)配列番号２に示す配列の残基Ｄ３６、Ｎ３８、Ｌ３９および／またはＴ４２を含むエピトープＭ２；
ｃ)配列番号２に示す配列の残基Ｑ５９、Ｇ６１、Ｓ６２、Ｄ６３および／またはＶ６５を含むエピトープＭ３；
ｄ)配列番号２に示す配列の残基Ｉ７７、Ａ８０、Ｙ８２および／またはＱ８３を含むエピトープＭ４；
ｅ)配列番号２に示す配列の残基Ｈ８７、Ｈ９０、Ｋ９１および／またはＶ９２を含むエピトープＭ５；
ｆ)配列番号２に示す配列の残基Ｓ９７、Ｑ９９、Ｓ１０１および／またはＴ１０２を含むエピトープＭ６；
ｇ)配列番号２に示す配列の残基Ｒ１０８、Ｓ１０９、Ｈ１１０、Ｔ１１２および／またはＥ１１４を含むエピトープＭ７；
ｈ)配列番号２に示す配列の残基Ｔ１１９、Ｐ１２０、Ｄ１２１、Ｎ１２３、Ｑ１２４および／またはＶ１２５を含むエピトープＭ８。
ａ)配列番号２に示す配列の残基Ｅ２４、Ｖ２５、Ｅ２７、Ｖ２９および／またはＴ３０を含むエピトープＭ１；
ｂ)配列番号２に示す配列の残基Ｄ３６、Ｎ３８、Ｌ３９および／またはＴ４２を含むエピトープＭ２；
ｃ)配列番号２に示す配列の残基Ｑ５９、Ｇ６１、Ｓ６２、Ｄ６３および／またはＶ６５を含むエピトープＭ３；
ｄ)配列番号２に示す配列の残基Ｉ７７、Ａ８０、Ｙ８２および／またはＱ８３を含むエピトープＭ４；
ｅ)配列番号２に示す配列の残基Ｈ８７、Ｈ９０、Ｋ９１および／またはＶ９２を含むエピトープＭ５；
ｆ)配列番号２に示す配列の残基Ｓ９７、Ｑ９９、Ｓ１０１および／またはＴ１０２を含むエピトープＭ６；
ｇ)配列番号２に示す配列の残基Ｒ１０８、Ｓ１０９、Ｈ１１０、Ｔ１１２および／またはＥ１１４を含むエピトープＭ７；
ｈ)配列番号２に示す配列の残基Ｔ１１９、Ｐ１２０、Ｄ１２１、Ｎ１２３、Ｑ１２４および／またはＶ１２５を含むエピトープＭ８。
【0128】
より好ましくは、ここに開示する抗体は、
ａ)Ｍ１のアミノ酸の少なくとも１個；
ｂ)Ｍ４のアミノ酸の少なくとも１個および所望によりＭ３の残基の少なくとも１個；
ｃ)Ｍ７のアミノ酸の少なくとも１個；
ｄ)Ｍ８のアミノ酸の少なくとも１個；
ｅ)Ｍ７のアミノ酸の少なくとも１個およびＭ８のアミノ酸の少なくとも１個；または
ｆ)Ｍ３のアミノ酸の少なくとも１個、Ｍ７のアミノ酸の少なくとも１個およびＭ８のアミノ酸の少なくとも１個および所望によりＭ２の残基の少なくとも１個および／またはＭ４の残基の少なくとも１個
に結合する抗体である。
ａ)Ｍ１のアミノ酸の少なくとも１個；
ｂ)Ｍ４のアミノ酸の少なくとも１個および所望によりＭ３の残基の少なくとも１個；
ｃ)Ｍ７のアミノ酸の少なくとも１個；
ｄ)Ｍ８のアミノ酸の少なくとも１個；
ｅ)Ｍ７のアミノ酸の少なくとも１個およびＭ８のアミノ酸の少なくとも１個；または
ｆ)Ｍ３のアミノ酸の少なくとも１個、Ｍ７のアミノ酸の少なくとも１個およびＭ８のアミノ酸の少なくとも１個および所望によりＭ２の残基の少なくとも１個および／またはＭ４の残基の少なくとも１個
に結合する抗体である。
【0129】
抗ＶＳＩＧ４抗体のエピトープへの結合の決定は、放射活性、BIAcore、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリーなどを含むが、これらに限定されない当業者に知られる何れかの方法または技術または本明細書に記載されるような方法により実施され得る。
【0130】
ある実施態様において、ここに開示する抗ＶＳＩＧ４モノクローナル抗体は、３個の重鎖ＣＤＲＳおよび３個の軽鎖ＣＤＲを含む。好ましくは、抗体はａ 重鎖および軽鎖を含み、ここで、重鎖は３個の重鎖ＣＤＲを含み、軽鎖は３個の軽鎖ＣＤＲを含む。
【0131】
好ましくは、ここに開示する抗体は３個の重鎖ＣＤＲＳおよび３個の重鎖ＣＤＲを含み、ここで、各ＣＤＲの配列は、配列番号３～５８に示す群から選択される。
【0132】
ある実施態様において、抗ＶＳＩＧ４は、配列番号３、４、５、９、１０、１１、１２、１３、１７、１８、１９、２３、２４、２６、２７、２８、３２、３３、３４、３７、３８、３９、４３、４４、４５、４９、５０、５１および５５からなる群から選択される配列を含む、３個の重鎖ＣＤＲを含む。
【0133】
ある実施態様において、抗ＶＳＩＧ４は、配列番号６、７、８、１４、１５、１６、２０、２１、２２、２５、２９、３０、３１、３５、３６、４０、４１、４２、４６、４７、４８、５２、５３、５４、５６、５７および５８からなる群から選択される配列を含む、３個の軽鎖ＣＤＲを含む。
【0134】
好ましい実施態様は、配列番号３、４、５、９、１０、１１、１２、１３、１７、１８、１９、２３、２４、２６、２７、２８、３２、３３、３４、３７、３８、３９、４３、４４、４５、４９、５０、５１および５５からなる群から選択される配列を含む３個の重鎖ＣＤＲを含む重鎖を有する、抗ＶＳＩＧ４抗体を提供する。
【0135】
他の好ましい実施態様は、配列番号６、７、８、１４、１５、１６、２０、２１、２２、２５、２９、３０、３１、３５、３６、４０、４１、４２、４６、４７、４８、５２、５３、５４、５６、５７および５８からなる群から選択される配列を含む３個の軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖を有する、抗ＶＳＩＧ４抗体を提供する。
【0136】
他の好ましい実施態様において、抗ＶＳＩＧ４抗体は３個の重鎖ＣＤＲを含み、重鎖ＣＤＲは配列番号３、４、５、９、１０、１１、１２、１３、１７、１８、１９、２３、２４、２６、２７、２８、３２、３３、３４、３７、３８、３９、４３、４４、４５、４９、５０、５１および５５からなる群から選択される配列を含み；そして３個の軽鎖ＣＤＲを含み、軽鎖ＣＤＲは配列番号６、７、８、１４、１５、１６、２０、２１、２２、２５、２９、３０、３１、３５、３６、４０、４１、４２、４６、４７、４８、５２、５３、５４、５６、５７および５８からなる群から選択される配列を含む。
【0137】
さらに他の好ましい実施態様において、抗ＶＳＩＧ４抗体は重鎖を含み、重鎖は３個の重鎖ＣＤＲを含み、ここで、重鎖ＣＤＲは配列番号３、４、５、９、１０、１１、１２、１３、１７、１８、１９、２３、２４、２６、２７、２８、３２、３３、３４、３７、３８、３９、４３、４４、４５、４９、５０、５１および５５からなる群から選択される配列を含み；そして軽鎖を含み、軽鎖は３個の軽鎖ＣＤＲを含み、ここで、軽鎖ＣＤＲは配列番号６、７、８、１４、１５、１６、２０、２１、２２、２５、２９、３０、３１、３５、３６、４０、４１、４２、４６、４７、４８、５２、５３、５４、５６、５７および５８からなる群から選択される配列を含む。
【0138】
より好ましくは、ここに開示する抗体は、
ａ)配列番号３、４および５の配列の３個の重鎖ＣＤＲおよび配列番号６、７および８の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｂ)配列番号９、１０および５の配列の３個の重鎖ＣＤＲおよび配列番号６、７および８の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｃ)配列番号１１、１２および１３の配列の３個の重鎖ＣＤＲおよび配列番号１４、１５および１６の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｄ)配列番号１７、１８および１９の配列の３個の重鎖ＣＤＲおよび配列番号２０、２１および２２の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｅ)配列番号２３、２４および３の配列の３個の重鎖ＣＤＲおよび配列番号６、７および２５の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｆ)配列番号２６、２７および２８の配列の３個の重鎖ＣＤＲおよび配列番号２９、３０および３１の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｇ)配列番号３２、３３および３４の配列の３個の重鎖ＣＤＲおよび配列番号３５、３６および１６の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｈ)配列番号３７、３８および３９の配列の３個の重鎖ＣＤＲおよび配列番号４０、４１および４２の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｉ)配列番号４３、４４および４５の配列の３個の重鎖ＣＤＲおよび配列番号４６、４７および４８の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｊ)配列番号４９、５０および５１の配列の３個の重鎖ＣＤＲおよび配列番号５２、５３および５４の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｋ)配列番号１７、１８および５５の配列の３個の重鎖ＣＤＲおよび配列番号５６、５７および５８の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含む抗体
からなる群から選択される。
ａ)配列番号３、４および５の配列の３個の重鎖ＣＤＲおよび配列番号６、７および８の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｂ)配列番号９、１０および５の配列の３個の重鎖ＣＤＲおよび配列番号６、７および８の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｃ)配列番号１１、１２および１３の配列の３個の重鎖ＣＤＲおよび配列番号１４、１５および１６の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｄ)配列番号１７、１８および１９の配列の３個の重鎖ＣＤＲおよび配列番号２０、２１および２２の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｅ)配列番号２３、２４および３の配列の３個の重鎖ＣＤＲおよび配列番号６、７および２５の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｆ)配列番号２６、２７および２８の配列の３個の重鎖ＣＤＲおよび配列番号２９、３０および３１の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｇ)配列番号３２、３３および３４の配列の３個の重鎖ＣＤＲおよび配列番号３５、３６および１６の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｈ)配列番号３７、３８および３９の配列の３個の重鎖ＣＤＲおよび配列番号４０、４１および４２の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｉ)配列番号４３、４４および４５の配列の３個の重鎖ＣＤＲおよび配列番号４６、４７および４８の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｊ)配列番号４９、５０および５１の配列の３個の重鎖ＣＤＲおよび配列番号５２、５３および５４の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｋ)配列番号１７、１８および５５の配列の３個の重鎖ＣＤＲおよび配列番号５６、５７および５８の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含む抗体
からなる群から選択される。
【0139】
好ましい、しかし、非限定的実施態様において、本発明の抗体は、
ａ)配列番号１２９の配列または配列番号１２９と少なくとも８０％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号６、７および８の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｂ)配列番号１３１の配列または配列番号１３１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号６、７および８の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含むまたはそれからなる抗体；
ｃ)配列番号１３３の配列または配列番号１３３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号１４、１５および１６の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含むまたはそれからなる抗体；
ｄ)配列番号１３５の配列または配列番号１３５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号２０、２１および２２の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含むまたはそれからなる抗体；
ｅ)配列番号１３７の配列または配列番号１３７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号６、７および２５の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含むまたはそれからなる抗体；
ｆ)配列番号１３９の配列または配列番号１３９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号２９、３０および３１の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含むまたはそれからなる抗体；
ｇ)配列番号１４１の配列または配列番号１４１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号３５、３６および１６の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含むまたはそれからなる抗体；
ｈ)配列番号１４３の配列または配列番号１４３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れらかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号４０、４１および４２の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含むまたはそれからなる抗体；
ｉ)配列番号１４５の配列または配列番号１４５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号４６、４７および４８の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含むまたはそれからなる抗体；
ｊ)配列番号１４７の配列または配列番号１４７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号５２、５３および５４の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含むまたはそれからなる抗体；
ｋ)配列番号１４９の配列または配列番号１４９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号５６、５７および５８の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含むまたはそれからなる抗体
からなる群から選択される。
ａ)配列番号１２９の配列または配列番号１２９と少なくとも８０％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号６、７および８の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｂ)配列番号１３１の配列または配列番号１３１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号６、７および８の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含むまたはそれからなる抗体；
ｃ)配列番号１３３の配列または配列番号１３３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号１４、１５および１６の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含むまたはそれからなる抗体；
ｄ)配列番号１３５の配列または配列番号１３５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号２０、２１および２２の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含むまたはそれからなる抗体；
ｅ)配列番号１３７の配列または配列番号１３７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号６、７および２５の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含むまたはそれからなる抗体；
ｆ)配列番号１３９の配列または配列番号１３９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号２９、３０および３１の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含むまたはそれからなる抗体；
ｇ)配列番号１４１の配列または配列番号１４１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号３５、３６および１６の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含むまたはそれからなる抗体；
ｈ)配列番号１４３の配列または配列番号１４３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れらかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号４０、４１および４２の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含むまたはそれからなる抗体；
ｉ)配列番号１４５の配列または配列番号１４５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号４６、４７および４８の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含むまたはそれからなる抗体；
ｊ)配列番号１４７の配列または配列番号１４７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号５２、５３および５４の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含むまたはそれからなる抗体；
ｋ)配列番号１４９の配列または配列番号１４９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号５６、５７および５８の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含むまたはそれからなる抗体
からなる群から選択される。
【0140】
「配列番号１２９と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示すれかの配列」により、３個の重鎖ＣＤＲ配列番号３、４および５を示す配列、および、さらに、ＣＤＲ(すなわ配列番号３、４および５)に対応する以外の完全配列配列番号１２９と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す配列をいい、ここで、「ＣＤＲに対応する以外の配列」は、「ＣＤＲに対応する配列を除く」ことを意図する。
【0141】
他の好ましい、しかし、非限定的実施態様において、本発明の抗体は、
ａ)配列番号１３０の配列または配列番号１３０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインおよび配列番号３、４および５の配列の３個の重鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｂ)配列番号１３２の配列または配列番号１３２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインおよび配列番号９、１０および５の配列の３個の重鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｃ)配列番号１３４の配列または配列番号１３４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインおよび配列番号１１、１２および１３の配列の３個の重鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｄ)配列番号１３６の配列または配列番号１３６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインおよび配列番号１７、１８および１９の配列の３個の重鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｅ)配列番号１３８の配列または配列番号１３８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインおよび配列番号２３、２４および３の配列の３個の重鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｆ)配列番号１４０の配列または配列番号１４０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインおよび配列番号２６、２７および２８の配列の３個の重鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｇ)配列番号１４２の配列または配列番号１４２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインおよび配列番号３２、３３および３４の配列の３個の重鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｈ)配列番号１４４の配列または配列番号１４４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインおよび配列番号３７、３８および３９の配列の３個の重鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｉ)配列番号１４６の配列または配列番号１４６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインおよび配列番号４３、４４および４５の配列の３個の重鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｊ)配列番号１４８の配列または配列番号１４８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインおよび配列番号４９、５０および５１の配列の３個の重鎖ＣＤＲを含む抗体；および
ｋ)配列番号１５０の配列または配列番号１５０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインおよび配列番号１７、１８および５５の配列の３個の重鎖ＣＤＲを含む抗体
からなる群から選択される。
ａ)配列番号１３０の配列または配列番号１３０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインおよび配列番号３、４および５の配列の３個の重鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｂ)配列番号１３２の配列または配列番号１３２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインおよび配列番号９、１０および５の配列の３個の重鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｃ)配列番号１３４の配列または配列番号１３４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインおよび配列番号１１、１２および１３の配列の３個の重鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｄ)配列番号１３６の配列または配列番号１３６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインおよび配列番号１７、１８および１９の配列の３個の重鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｅ)配列番号１３８の配列または配列番号１３８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインおよび配列番号２３、２４および３の配列の３個の重鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｆ)配列番号１４０の配列または配列番号１４０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインおよび配列番号２６、２７および２８の配列の３個の重鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｇ)配列番号１４２の配列または配列番号１４２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインおよび配列番号３２、３３および３４の配列の３個の重鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｈ)配列番号１４４の配列または配列番号１４４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインおよび配列番号３７、３８および３９の配列の３個の重鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｉ)配列番号１４６の配列または配列番号１４６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインおよび配列番号４３、４４および４５の配列の３個の重鎖ＣＤＲを含む抗体；
ｊ)配列番号１４８の配列または配列番号１４８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインおよび配列番号４９、５０および５１の配列の３個の重鎖ＣＤＲを含む抗体；および
ｋ)配列番号１５０の配列または配列番号１５０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインおよび配列番号１７、１８および５５の配列の３個の重鎖ＣＤＲを含む抗体
からなる群から選択される。
【0142】
「配列番号１３０と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列」により、３個の軽鎖ＣＤＲ配列番号６、７および８を示す配列、および、さらに、ＣＤＲ(すなわ配列番号６、７および８)に対応する以外の完全配列配列番号１３０と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す配列をいうことを意図する。
【0143】
本発明の実施態様は、ＶＳＩＧ４を認識する抗体であり、
ａ)配列番号１２９の配列または配列番号１２９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号１３０の配列または配列番号１３０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインを含む抗体；
ｂ)配列番号１３１の配列または配列番号１３１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号１３２の配列または配列番号１３２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインを含む抗体；
ｃ)配列番号１３３の配列または配列番号１３３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号１３４の配列または配列番号１３４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインを含む抗体；
ｄ)配列番号１３５の配列または配列番号１３５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号１３６の配列または配列番号１３６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインを含む抗体；
ｅ)配列番号１３７の配列または配列番号１３７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号１３８の配列または配列番号１３８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインを含む抗体；
ｆ)配列番号１３９の配列または配列番号１３９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号１４０の配列または配列番号１４０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインを含む抗体；
ｇ)配列番号１４１の配列または配列番号１４１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号１４２の配列または配列番号１４２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインを含む抗体；
ｈ)配列番号１４３の配列または配列番号１４３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号１４４の配列または配列番号１４４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインを含む抗体；
ｉ)配列番号１４５の配列または配列番号１４５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号１４６の配列または配列番号１４６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインを含む抗体；
ｊ)配列番号１４７の配列または配列番号１４７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号１４８の配列または配列番号１４８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインを含む抗体；および
ｋ)配列番号１１４９の配列または配列番号１４９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号１５０の配列または配列番号１５０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインを含む抗体
からなる群から選択される。
ａ)配列番号１２９の配列または配列番号１２９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号１３０の配列または配列番号１３０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインを含む抗体；
ｂ)配列番号１３１の配列または配列番号１３１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号１３２の配列または配列番号１３２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインを含む抗体；
ｃ)配列番号１３３の配列または配列番号１３３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号１３４の配列または配列番号１３４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインを含む抗体；
ｄ)配列番号１３５の配列または配列番号１３５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号１３６の配列または配列番号１３６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインを含む抗体；
ｅ)配列番号１３７の配列または配列番号１３７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号１３８の配列または配列番号１３８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインを含む抗体；
ｆ)配列番号１３９の配列または配列番号１３９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号１４０の配列または配列番号１４０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインを含む抗体；
ｇ)配列番号１４１の配列または配列番号１４１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号１４２の配列または配列番号１４２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインを含む抗体；
ｈ)配列番号１４３の配列または配列番号１４３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号１４４の配列または配列番号１４４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインを含む抗体；
ｉ)配列番号１４５の配列または配列番号１４５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号１４６の配列または配列番号１４６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインを含む抗体；
ｊ)配列番号１４７の配列または配列番号１４７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号１４８の配列または配列番号１４８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインを含む抗体；および
ｋ)配列番号１１４９の配列または配列番号１４９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号１５０の配列または配列番号１５０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一性を示す何れかの配列の軽鎖可変ドメインを含む抗体
からなる群から選択される。
【0144】
本発明のある実施態様によるＶＳＩＧ４に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、好ましくは
ａ)配列番号１２９のアミノ酸により示される重鎖可変領域および配列番号１３０のアミノ酸により示される軽鎖可変領域を含む抗体；
ｂ)配列番号１３１のアミノ酸により示される重鎖可変領域および配列番号１３２のアミノ酸により示される軽鎖可変領域を含む抗体；
ｃ)配列番号１３３のアミノ酸により示される重鎖可変領域および配列番号１３４のアミノ酸により示される軽鎖可変領域を含む抗体；
ｄ)配列番号１３５のアミノ酸により示される重鎖可変領域および配列番号１３６のアミノ酸により示される軽鎖可変領域を含む抗体；
ｅ)配列番号１３７のアミノ酸により示される重鎖可変領域および配列番号１３８のアミノ酸により示される軽鎖可変領域を含む抗体；
ｆ)配列番号１３９のアミノ酸により示される重鎖可変領域および配列番号１４０のアミノ酸により示される軽鎖可変領域を含む抗体；
ｇ)配列番号１４１のアミノ酸により示される重鎖可変領域および配列番号１４２のアミノ酸により示される軽鎖可変領域を含む抗体；
ｈ)配列番号１４３のアミノ酸により示される重鎖可変領域および配列番号１４４のアミノ酸により示される軽鎖可変領域を含む抗体；
ｉ)配列番号１４５のアミノ酸により示される重鎖可変領域および配列番号１４６のアミノ酸により示される軽鎖可変領域を含む抗体；
ｊ)配列番号１４７のアミノ酸により示される重鎖可変領域および配列番号１４８のアミノ酸により示される軽鎖可変領域を含む抗体；および
ｋ)配列番号１４９のアミノ酸により示される重鎖可変領域および配列番号１５０のアミノ酸により示される軽鎖可変領域を含む抗体
からなる群から選択される抗体である。
ａ)配列番号１２９のアミノ酸により示される重鎖可変領域および配列番号１３０のアミノ酸により示される軽鎖可変領域を含む抗体；
ｂ)配列番号１３１のアミノ酸により示される重鎖可変領域および配列番号１３２のアミノ酸により示される軽鎖可変領域を含む抗体；
ｃ)配列番号１３３のアミノ酸により示される重鎖可変領域および配列番号１３４のアミノ酸により示される軽鎖可変領域を含む抗体；
ｄ)配列番号１３５のアミノ酸により示される重鎖可変領域および配列番号１３６のアミノ酸により示される軽鎖可変領域を含む抗体；
ｅ)配列番号１３７のアミノ酸により示される重鎖可変領域および配列番号１３８のアミノ酸により示される軽鎖可変領域を含む抗体；
ｆ)配列番号１３９のアミノ酸により示される重鎖可変領域および配列番号１４０のアミノ酸により示される軽鎖可変領域を含む抗体；
ｇ)配列番号１４１のアミノ酸により示される重鎖可変領域および配列番号１４２のアミノ酸により示される軽鎖可変領域を含む抗体；
ｈ)配列番号１４３のアミノ酸により示される重鎖可変領域および配列番号１４４のアミノ酸により示される軽鎖可変領域を含む抗体；
ｉ)配列番号１４５のアミノ酸により示される重鎖可変領域および配列番号１４６のアミノ酸により示される軽鎖可変領域を含む抗体；
ｊ)配列番号１４７のアミノ酸により示される重鎖可変領域および配列番号１４８のアミノ酸により示される軽鎖可変領域を含む抗体；および
ｋ)配列番号１４９のアミノ酸により示される重鎖可変領域および配列番号１５０のアミノ酸により示される軽鎖可変領域を含む抗体
からなる群から選択される抗体である。
【0145】
より明確にするために、次の表２は、好ましい抗体の配列(ＣＤＲ、フレームワーク、ＶＨおよびＶＬ)およびこれら抗体により結合されるエピトープを示す。
【0146】
【表2-1】
【表2-2】
【表2-3】
【0147】
ＶＳＩＧ４が特異的に認識される範囲内で、本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、ここに記載する本発明の抗ＶＳＩＧ４抗体の配列しか含まないのではなく、その生物学的等価も含み得る。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的特徴をさらに改善するために、抗体のアミノ酸配列にさらなる変化を付し得る。これらの修飾に含まれるのは、抗体のアミノ酸配列の欠失、挿入および／または置換である、例えば。アミノ酸のこのような修飾は、側鎖置換基のアミノ酸の相対的類似性、例えば、疎水性、親水性、荷電、サイズなどに基づき、行う。アミノ酸の側鎖置換基のサイズ、形態およびタイプの分析に基づき、アルギニン、リシンおよびヒスチジンが全て陽性荷電を有する残基であり；アラニン、グリシンおよびセリンが類似サイズであり；そしてフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンが類似形態を有することが判明している。従って、これらの考察に基づき、生物学的に、アルギニン、リシンおよびヒスチジン；アラニン、グリシンおよびセリン；およびフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは機能的に等価ということができる。
【0148】
ある実施態様において、ここに記載する抗ＶＳＩＧ４モノクローナル抗体は、完全長抗体、複数鎖または単一鎖抗体、ＶＳＩＧ４に選択的に結合するこのような抗体のフラグメント(Ｆａｂ、Ｆａｂ’、(Ｆａｂ’)２、ＦｖおよびｓｃＦｖを含むが、これらに限定されない)、サロボディ(サロゲート軽鎖構築物を含む)、単一ドメイン抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体などの携帯であり得る。それらはまた、例えば、ＩｇＡ(例えば、ＩｇＡｌまたはＩｇＡ２)、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ(例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４)またはＩｇＭを含む、あらゆるアイソタイプであるかまたはそれに由来し得る。ある実施態様において、抗ＶＳＩＧ４抗体はＩｇＧ(例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４)である。ある実施態様において、抗体はヒト定常領域をさらに含む。さらなる実施態様において、ヒト定常領域はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４からなる群から選択される。なおさらなる具体的実施態様において、ヒト定常領域はＩｇＧ１である。さらに、重鎖定常領域は、ガンマ(γ)、ミュー(μ)、アルファ(α)、デルタ(δ)およびイプシロン(ε)タイプを有し、サブクラスとして、ガンマ１(γ１)、ガンマ２(γ２)、ガンマ３(γ３)、ガンマ４(γ４)、アルファ１(α１)およびアルファ２(α２)を有する。軽鎖定常領域は、カッパ(κ)およびラムダ(λ)タイプを有する。
【0149】
抗ＶＳＩＧ４抗体は、診断適用に有用な標識抗体を含む。抗体は診断的に、例えば、特異的細胞、組織または血清における目的の標的の発現の検出；または例えば、ある処置レジメンの有効性を決定する臨床試験法の一部として免疫学的応答の進展または進行のモニターに、使用できる。検出は、抗体を検出可能物質または「標識」にカップリングすることにより促進され得る。標識を、本発明の抗ＶＳＩＧ４抗体に直接的にまたは間接的にコンジュゲートできる。標識はそれ自体検出可能(例えば、放射性同位体標識、同位体標識または蛍光標識)であってよく、または、酵素標識の場合、検出可能である基質化合物または組成物の化学的改変を触媒できる。検出可能物質の例は、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、種々のポジトロン放出断層撮影に使用する陽電子放出金属および非放射性常磁性金属イオンを含む。検出可能物質を、当分野で知られる技術を使用して、抗体(またはそのフラグメント)に直接的に、または介在物(例えば、当分野で知られるリンカーなど)を介して間接的に、結合またはコンジュゲートできる。酵素標識の例は、ルシフェラーゼ(例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ；米国特許４,７３７,４５６)、ルシフェリン、２,３－ジヒドロフタラジンジオン、マレートデヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(ＨＲＰＯ)などのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコアミラーゼ、リソザイム、サッカライドオキシダーゼ(例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼおよびグルコース－６－ホスフェートデヒドロゲナーゼ)、ヘテロ環式オキシダーゼ(例えばウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ)、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどを含む。適当な補欠分子族複合体は、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを含む；適当な蛍光物質の例は、ウンベリフェロン、フルオレッセイン、フルオレッセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレッセイン、ダンシルクロライド、ジメチルアミン－１－ナフタレンスルホニルクロライドまたはフィコエリスリンなどを含む；発光物質の例は、ルミノールを含む；生物発光物質の例は、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびイクオリンを含む；適当な同位体物質の例は、１３Ｃ、１５Ｎおよび重水素を含む；そして適当な放射性物質の例は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎまたは９９Ｔｃを含む。
【0150】
二特異的抗体
さらに、本発明は、ここに開示するモノクローナル抗ＶＳＩＧ４抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、多特異的抗体を提供する。
さらに、本発明は、ここに開示するモノクローナル抗ＶＳＩＧ４抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、多特異的抗体を提供する。
【0151】
上記本発明の多特異的抗体は、好ましくは二特異的抗体であり得るが、それに限定されない。
【0152】
本発明の多特異的抗体は、好ましくは、ここに記載する抗ＶＳＩＧ４抗体が免疫エフェクター細胞特異的標的分子に結合性を有する抗体またはそのフラグメントに結合した形態を有する。免疫エフェクター細胞特異的標的分子は好ましくは免疫チェックポイントであるが、それに限定されない。免疫エフェクター細胞特異的標的分子の例は、例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７－Ｈ３、ＴＣＲ／ＣＤ３、ＣＤ１６(ＦｃγＲIIIａ)ＣＤ４４、Ｃｄ５６、ＣＤ６９、ＣＤ６４(ＦｃγＲＩ)、ＣＤ８９およびＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８(ＣＲ３)を含む。
【0153】
多特異的抗体は、同じ抗原または２以上の別々の抗原の異なる多(二または高次)エピトープを同時に認識できる抗体であり、多特異的抗体に属する抗体は、ｓｃＦｖベースの抗体、Ｆａｂベースの抗体、ＩｇＧベースの抗体などに分類され得る。多特異的、例えば、二特異的抗体の場合、２個のシグナルが同時に抑制または増幅され得て、故に、１シグナルが抑制／増幅される場合よりも有効であり得る。各シグナルが各シグナル阻害剤で処置される場合と比較して、低用量投与が達成でき、２シグナルが同じ時に同じ空間で抑制／増幅され得る。
【0154】
二特異的抗体を産生する方法は、広く知られる。慣習的に、二特異的抗体の組み換え産生は、２個の重鎖が異なる特異性を有する条件下での、２個の免疫グロブリンの重鎖／軽鎖対の共発現に基づく。
【0155】
ｓｃＦｖベースの二特異的抗体の場合、異なるｓｃＦｖのＶＬおよびＶＨを合わせることにより、ハイブリッドｃＦｖベースがダイアボディ抗体を得るためのヘテロ二量体形態で提供され(Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,90:6444, 1993)、異なるｓｃＦｖｓを互いに結合することにより、タンデムＳｃＦｖが産生され得る。各ｓｃＦｖの末端でＦａｂのＣＨ１およびＣＬを発現することにより、ヘテロ二量体ミニ抗体が産生され得る(Muller et al., FEBS lett., 432:45, 1998)。さらに、Ｆｃのホモ二量体ドメインとしてＣＨ３ドメインの部分的アミノ酸を置換することにより、ヘテロ二量体構造となるような「ノブ・イントゥ・ホール」形態への構造変化がなされ、これら修飾ＣＨ３ドメインは、各異なるｓｃＦｖの末端で発現され、故に、ヘテロ二量体ｓｃＦｖ形態のミニボディが産生され得る(Merchant et al., Nat. Biotechnol., 16:677, 1998)。
【0156】
Ｆａｂベースの二特異的抗体の場合、ジスルフィド結合またはメディエーターの利用による特異的抗原のための別々のＦａｂ’の組み合わせにより、抗体がヘテロ二量体Ｆａｂ形態で産生され得て、特異的Ｆａｂの重鎖または軽鎖の末端に異なる抗原のｓｃＦｖを発現させることにより、抗原結合価２が得られ得る。さらに、ＦａｂとｓｃＦｖの間にヒンジ領域を有することにより、抗原結合価４がホモ二量体形態で得られる。さらに、次の製造方法が当業者には知られる：Ｆａｂの軽鎖末端および重鎖末端に異なる抗原のｓｃＦｖを融合することにより、抗原結合価３が得られる、デュアル標的ビボディ、Ｆａｂの軽鎖末端および重鎖末端の異なるｓｃＦｖの融合により、抗原結合価３が得られるトリプル標的ビボディおよび３個の異なるＦａｂの化学融合に得られる単純な形態のトリプル標的抗体Ｆ(ａｂ’)３。
【0157】
ＩｇＧベースの二特異的抗体の場合、マウスおよびラットハイブリドーマの再ハイブリダイゼーションに基づくハイブリッドハイブリドーマ、いわゆるクアドローマの製造による、二特異的抗体を産生する方法がTrion Pharmaにより知られる。さらに、異なる重鎖のＦｃのＣＨ３ホモ二量体ドメインの部分的アミノ酸が、軽鎖部分を共有しながら修飾される、いわゆる「ホールおよびノブ」形態の二特異的抗体を産生する方法が知られる(Merchant et al., Nat. Biotechnol., 16:677, 1998)、ヘテロ二量体形態の二特異的抗体以外、ＩｇＧの、軽鎖および重鎖の、可変ドメインではなく、定常ドメインの２個の異なるｓｃＦｖの融合と続く発現によりホモ二量体形態の(ｓｃＦｖ)４－ＩｇＧを産生する方法が知られる。さらに、ImClone Systemsから、ヒトＶＥＧＦＲ－２のキメラモノクローナル抗体としてのＩＭＣ－１Ｃ１１に基づき、マウス血小板由来増殖因子受容体－αの単一可変ドメインのみを、二特異的抗体を産生するために抗体の軽鎖のアミノ末端に融合することが報告されている。さらに、ＣＤ２０の高抗原結合価を有する抗体が、タンパク質キナーゼＡ(ＰＫＡ)Ｒサブユニットの二量体化およびドッキングドメイン(ＤＤＤ)およびＰＫＡのアンカリングドメインを使用するいわゆる「ドックおよびロック(ＤＮＬ)」方法に基づき、Rossi et al. により報告される(Rossi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 103:6841, 2006)。
【0158】
抗体誘導体
本発明の抗ＶＳＩＧ４抗体を、当分野で知られ、容易に利用可能なさらなる非タンパク性部分を含むよう、さらに修飾し得る。特に、ここに含まれるのは、診断および治療適用のための他の分子で誘導体化、共有結合的修飾またはコンジュゲートされた、抗ＶＳＩＧ４モノクローナル抗体である。例えば、限定的ではないが、誘導体化抗体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知保護／遮断基による誘導体化、タンパク分解性切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への結合などにより、修飾されている抗体を含む。多数の化学修飾の何れも、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含むが、これらに限定されない既知技術により実施され得る。さらに、誘導体は、１以上の非古典的アミノ酸を含み得る。
本発明の抗ＶＳＩＧ４抗体を、当分野で知られ、容易に利用可能なさらなる非タンパク性部分を含むよう、さらに修飾し得る。特に、ここに含まれるのは、診断および治療適用のための他の分子で誘導体化、共有結合的修飾またはコンジュゲートされた、抗ＶＳＩＧ４モノクローナル抗体である。例えば、限定的ではないが、誘導体化抗体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知保護／遮断基による誘導体化、タンパク分解性切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への結合などにより、修飾されている抗体を含む。多数の化学修飾の何れも、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含むが、これらに限定されない既知技術により実施され得る。さらに、誘導体は、１以上の非古典的アミノ酸を含み得る。
【0159】
特に、本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、抗体が投与される生体における滞在時間を延長するため、上記のとおり、特に例えば、グリコシル化および／またはペグ化により、誘導体化され得る。
【0160】
グリコシル化および／またはペグ化に関して、種々のパターンのグリコシル化および／またはペグ化が、本発明の抗体の機能が維持される限り、当分野で周知の方法により修飾され得て、本発明の抗体に含まれるのは、種々のパターンのグリコシル化および／またはペグ化が修飾されているバリアントモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである。
【0161】
好ましくは、抗体の誘導体化に適する部分は、水可溶性ポリマーである。水可溶性ポリマーの非限定的例は、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１,３－ジオキソラン、ポリ－ｌ,３,６－トリオキサン、エチレン／マレイン無水物コポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマーまたは無作為コポリマー)およびデキストランまたはポリ(ｎ－ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共ポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール(例えば、グリセロール)、ポリビニルアルコールおよびそれらの混合物を含むが、これらに限定されない。ポリマーはどんな分子量であってもよく、分岐または非分岐であり得る。抗体に結合するポリマーの数は変わってよく、１を超えるポリマーが結合するならば、同じ分子でも、異なる分子でもよい。一般に、誘導体化に使用するポリマーの数および／またはタイプは、抗体の改善すべき特定の性質または機能、抗体誘導体を規定された条件下で治療に使用するかなどを含むが、これらに限定されない考察に基づき、決定され得る。
【0162】
具体例において、本発明の抗ＶＳＩＧ４抗体は、ポリ(エチレングリコール)(ＰＥＧ)部分に結合できる。具体的実施態様において、抗体は抗体フラグメントであり、ＰＥＧ部分は抗体フラグメントに位置する何れかの利用可能なアミノ酸側鎖または末端アミノ酸官能基、例えば何れかの遊離アミノ、イミノ、チオール、ヒドロキシルまたはカルボキシル基に結合する。このようなアミノ酸は、抗体フラグメントで天然に生じ得てまたは組み換えＤＮＡ方法を使用してフラグメントに操作し得る。例えば米国特許５,２１９,９９６参照。複数部位を、２以上のＰＥＧ分子の結合に使用できる。ＰＥＧ部分は、抗体フラグメントに位置する少なくとも１個のシステイン残基のチオール基を介して共有結合する。チオール基が結合点として使用されるとき、適切に活性化されたエフェクター部分、例えばマレイミドなどのチオール選択的誘導体およびシステイン誘導体が使用され得る。
【0163】
具体例において、抗ＶＳＩＧ４抗体コンジュゲートは、例えば、ＥＰ０９４８５４４に開示の方法により、ペグ化、すなわち、共有結合したＰＥＧ(ポリ(エチレングリコール))を有する修飾Ｆａｂ’フラグメントである。またPoly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications, (J. Milton Harris (ed.), Plenum Press, New York, 1992); Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications, (J. Milton Harris and S. Zalipsky, eds., American Chemical Society, Washington D.C., 1997); and Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences, (M. Aslam and A. Dent, eds., Grove Publishers, New York, 1998); and Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 54:531-545も参照。ＰＥＧは、ヒンジ領域のシステインに結合できる。一例において、ＰＥＧ修飾Ｆａｂ’フラグメントは、修飾ヒンジ領域の一チオール基に共有結合したマレイミド基を有する。リシン残基は、マレイミド基に共有結合およびリシン残基のアミン基の各々に、凡そ２０,０００Daの分子量を有するメトキシポリ(エチレングリコール)ポリマーを結合できる。Ｆａｂ’フラグメントに結合したＰＥＧの総分子量は、それ故、凡そ４０,０００Daであり得る。
【0164】
他の実施態様において、放射線への暴露により選択的に加熱し得る、抗体および非タンパク性部分のコンジュゲートが提供される。ある実施態様において、非タンパク性部分は、カーボンナノチューブである(Kam et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005))。放射線はどんな波長でもよく、通常の細胞には有害ではないが、非タンパク性部分を抗体－非タンパク性部分近位の細胞が死ぬ温度まで加熱する波長を含むが、これに限定されない。
【0165】
イムノコンジュゲート
他の態様において、本発明は、細胞毒性剤とコンジュゲートされた、ここに記載する抗ＶＳＩＧ４抗体を含む、イムノコンジュゲート(相互交換可能に「抗体－薬物コンジュゲート」または「ＡＤＣ」をいう)を提供する。
他の態様において、本発明は、細胞毒性剤とコンジュゲートされた、ここに記載する抗ＶＳＩＧ４抗体を含む、イムノコンジュゲート(相互交換可能に「抗体－薬物コンジュゲート」または「ＡＤＣ」をいう)を提供する。
【0166】
多くの細胞毒性剤が単離または合成されており、決定的にではないにしても、少なくとも顕著に腫瘍細胞の細胞増殖を阻害するまたは、破壊するもしくは低減することを可能とする。しかしながら、これら薬剤の毒性活性は腫瘍細胞に限定されず、非腫瘍細胞も影響を受け、破壊され得る。より具体的に、副作用が造血細胞または上皮、特に粘膜の細胞などの急速に再生している細胞で観察される。腫瘍細胞への高細胞毒性を維持しながら、正常細胞に対する副作用を制限するために、イムノコンジュゲートが癌処置における細胞毒性剤の局所送達のために使用されている(Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5:543-549; Wu et al (2005) Nature Biotechnology 23(9): 1137-1146; Payne, G. (2003) i 3:207-212; Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drug Deliv. Rev. 26:151-172；米国特許４,９７５,２７８)。イムノコンジュゲートは薬物部分(すなわち、細胞毒性剤)の腫瘍への標的化送達および、非コンジュゲート薬物の全身投与が、正常細胞への許容されないレベルの毒性をもたらし得て、腫瘍細胞が排除されるべきであるところでの細胞内蓄積を可能とする(Baldwin et al, Lancet (Mar. 15, 1986) pp. 603-05; Thorpe (1985) “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,” in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications (A. Pinchera et al., eds) pp. 475-506)。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体両者が、これら戦略で有用であると報告されている(Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother. 21 :183-87)。
【0167】
ここに開示するイムノコンジュゲートで使用する細胞毒性剤は、薬物(すなわ「抗体－薬物コンジュゲート」)、毒素(すなわ「免疫毒素」または「抗体－毒素コンジュゲート」)、放射性同位体(すなわ「放射性イムノコンジュゲート」または「抗体－放射性同位体コンジュゲート」)などであり得るが、これらに限定されない。
【0168】
好ましくは、イムノコンジュゲートは、少なくとも１個の薬物または医薬に結合する結合タンパク質である。このようなイムノコンジュゲートは、結合タンパク質が抗体またはその抗原結合フラグメントであるとき、通常抗体－薬物コンジュゲート(または「ＡＤＣ」)と称される。
【0169】
第一実施態様において、このような薬物は、その作用形態に関して説明され得る。非限定的例として、アルキル化剤、例えば窒素マスタード、アルキル－スルホネート、ニトロソ尿素、オキサゾホリン、アジリジンまたはイミン－エチレン、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、有糸分裂阻害剤、クロマチン機能阻害剤、抗血管形成剤、抗エストロゲン剤、抗アンドロゲン剤、キレート剤、鉄吸収刺激剤、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、ホスホジエステラーゼ阻害剤、ＤＮＡ阻害剤、ＤＮＡ合成阻害剤、アポトーシス刺激剤、チミジレート阻害剤、Ｔ細胞阻害剤、インターフェロンアゴニスト、リボヌクレオシドトリホスフェートレダクターゼ阻害剤、アロマターゼ阻害剤、エストロゲン受容体アンタゴニスト、チロシンキナーゼ阻害剤、細胞周期阻害剤、タキサン、チューブリン阻害剤、血管形成阻害剤、マクロファージ刺激剤、ニューロキニン受容体アンタゴニスト、カンナビノイド受容体アゴニスト、ドーパミン受容体アゴニスト、顆粒球刺激因子アゴニスト、エリスロポエチン受容体アゴニスト、ソマトスタチン受容体アゴニスト、ＬＨＲＨアゴニスト、カルシウム増感剤、ＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト、インターロイキン受容体アンタゴニスト、破骨細胞阻害剤、ラジカル形成刺激剤、エンドセリン受容体アンタゴニスト、ビンカアルカロイド、抗ホルモンまたは免疫調節剤またはあらゆるその他の細胞毒性または毒素の活性基準を満たす新規薬物を列挙し得る。
【0170】
このような薬物は、例えば、ＶＩＤＡＬ ２０１０の、腫瘍学および血液学カラム「細胞毒性物質」に結合した化合物に特化した部分に引用され、この文献を引用して引用されるこれら細胞毒性化合物を、ここで好ましい細胞毒性剤として例示する。
【0171】
より具体的に、次の薬物が、本発明で好ましいが、これらに限定されない：メクロレタミン、クロラムブコール、メルファレン、塩化水素、ピポブロメン、プレドニマスチン、ジソディック－ホスフェート、エストラムスチン、シクロホスファミド、アルトレタミン、トロホスファミド、スルホフォスファミド、イホスファミド、チオテパ、トリエチルエナミン、アルテラミン、カルムスチン、ストレプトゾシン、フォテムスチン、ロムスチン、ブスルファン、トレオスルファン、インプロスルファン、ダカルバジン、シスプラチン、オキサリプラチン、ロバプラチン、ヘプタプラチン、ミリプラチン水和物、カルボプラチン、メトトレキサート、ペメトレキセド、５－フルオロウラシル、フロクスウリジン、５－フルオロデオキシウリジン、カペシタビン、シタラビン、フルダラビン、シトシンアラビノシド、６－メルカプトプリン(６－ＭＰ)、ネララビン、６－チオグアニン(６－ＴＧ)、クロロデスオキシアデノシン、５－アザシチジン、ゲムシタビン、クラドリビン、デオキシコホルマイシン、テガフール、ペントスタチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、バルルビシン、ミトキサントロン、ダクチノマイシン、ミトラマイシン、プリカマイシン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、プロカルバジン、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、トポテカン、イリノテカン、エトポシド、バルルビシン、アムルビシンヒドロクロライド、ピラルビシン、エリプチニウムアセテート、ゾルビシン、エピルビシン、イダルビシンおよびテニポシド、ラゾキシン、マリマスタット、バチマスタット、プリノマスタット、タノマスタット、イロモスタット、ＣＧＳ－２７０２３Ａ、ハロフギノン、ＣＯＬ－３、ネオバスタット、サリドマイド、ＣＤＣ５０１、ＤＭＸＡＡ、Ｌ－６５１５８２、スクアラミン、エンドスタチン、ＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８、インターフェロン－アルファ、ＥＭＤ１２１９７４、インターロイキン－１２、ＩＭ８６２、アンジオスタチン、タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、イドキシフェン、アナストロゾール、レトロゾール、エキセメスタン、フルタミド、ニルタミド、スピロノラクトン、シプロテロンアセテート、フィナステリド、シミチジン、ボルテゾミド、ベルケイド、ビカルタミド、シプロテロン、フルタミド、フルベストラン、エキセメスタン、ダサチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ラパチニブ、ニロチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、レチノイド、レキシノイド、メトキサレン、アミノレブリン酸メチル、アルデスロイキン、ＯＣＴ－４３、デニロイキン ジフチトクス、インターロイキン－２、タソネルミン、レンチナン、シゾフィラン、ロキニメクス、ピドチモド、ペガデマーゼ、チモペンチン、ポリＩ：Ｃ、プロコダゾール、Ｔｉｃ ＢＣＧ、コリネバクテリウム・パルバム、ＮＯＶ－００２、ウカリン、レバミソール、１３１１－ｃｈＴＮＴ、Ｈ－１０１、セルモロイキン、インターフェロンアルファ２ａ、インターフェロンアルファ２ｂ、インターフェロンガンマ１ａ、インターロイキン－２、モベナキン、Ｒｅｘｉｎ－Ｇ、テセロイキン、アクラルビシン、アクチノマイシン、アルグラビン、アスパラギナーゼ、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダウノマイシン、ロイコボリン、マソプロコール、ネオカルジノスタチン、ペプロマイシン、サルコマイシン、ソラマルギン、トラベクテジン、ストレプトゾシン、テストステロン、クネカテキン、シネカテキン、アリトレチノイン、ベロテカンヒドロクロライド、カルステロン、ドロモスタノロン、エリプチニウムアセテート、エチニルエストラジオール、エトポシド、フルオキシメステロン、フォルメスタン、ホスホテロール、ゴセレリンアセテート、ヘキシルアミノリューベリネート、ヒステリリン、ヒドロキシプロゲステロン、イクサベピロン、リュープロリド、メドロキシプロゲステロンアセテート、メゲステロールアセテート、メチルプレドニゾロン、メチルテストステロン、ミルテホシン、ミトブロニトール、ナドロロンフェニルプロピオネート、ノレチミドロンアセテート、プレドニゾロン、プレドニゾン、テムシロリムス、テストラクトン、トリアムコノロン、トリプトレリン、バプレオチドアセテート、ジノスタチンスチマラマー、アムサクリン、三酸化ヒ素、ビスアントレンヒドロクロライド、クロラムブシル、クロルトリアニセン、ｃｉｓ－ジアミンクロロプラチン、シクロホスファミド、ジエチルスチルベストロール、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシ尿素、レナリドマイド、ロニダミン、メクロルエタナミン、ミトタン、ネダプラチン、ニムスチンヒドロクロライド、パミドロネート、ピポブロマン、ポルフィマーナトリウム、ラニムスチン、ラゾキサン、セムスチン、ソブゾキサン、メシラート、トリエチレンメラミン、ゾレドロン酸、カモスタットメシラート、ファドロゾールＨＣｌ、ナフォキサジン、アミノグルテチミド、カルモフール、クロファラビン、シトシンアラビノシド、デシタビン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フルダラビンホスフェート、フルオロウラシル、フトラフール、ウラシルマスタード、アバレリクス、ベキサロテン、ラルチテレキシド、タミバロテン、テモゾロミド、ボリノスタット、メガステロール、コンドロナートジナトリウム、レバミソール、フェルモキシトール、鉄イソマルトシド、セレコキシブ、イブジラスト、ベンダムスチン、アルトレタミン、ミトラクトール、テムシロリムス、プララトレキサート、ＴＳ－１、デシタビン、ビカルタミド、フルタミド、レトロゾール、クロドナートジナトリウム、デガレリクス、トレミフェンシトレート、ヒスタミンジヒドロクロライド、ＤＷ－１６６ＨＣ、ニトラクリン、デシタビン、イリノテカンヒドロクロライド、アムサクリン、ロミデプシン、トレチノイン、カバジタキセル、バンデタニブ、レナリドマイド、イバンドロン酸、ミルテホシン、ビテスペン、ミファムルチド、ナドロパリン、グラニセトロン、オンダンセトロン、トロピセトロン、アリザプリド、ラモセトロン、ドラセトロンメシラート、フォサプレピタントジメグルミン、ナビロン、アプレピタント、ドロナビノール、ＴＹ－１０７２１、リスリド水素マレアート、エピセラム、デフィブロチド、ダビガトランエテキシレート、フィルグラスチム、ペグフィルグラスチム、デジツクス、エポエチン、モルグラモスチム、オプレルベキン、シプロイセルＴ、Ｍ－Ｖａｘ、アセチルＬ－カルニチン、ドネペジルヒドロクロライド、５－アミノレブリン酸、メチルアミノリューベリネート、セトロレリクスアセテート、イコデキストリン、ロイプロレリン、メチルフェニダート、オクトレオチド、アムレキサノクス、プレリキサホル、メナテトレノン、アネトホールジチオールチオン、ドキセルカルシフェロール、シアナカルセットヒドロクロライド、アレファセプト、ロミプロスチム、サイモグロブリン、シマルファシン、ウベニメクス、イミキモド、エベロリムス、シロリムス、Ｈ－１０１、ラソフォキシフェン、トリロスタン、インカドロネート、ガングリオシド、ペガプタニブオクタナトリウム、ベルトルフィン、ミドロン酸、ゾレドロン酸、ガリウムニトレート、アレンドロネートナトリウム、エチドロネートジナトリウム、ジナトリウムパミドロネート、デュタステライド、ナトリウムスチボグルコネート、アルモダフィニル、デキサラゾキサン、アミフォスチン、ＷＦ－１０、テモポルフィン、ダルベポエチンアルファ、アンセスチム、サルグラモスチム、パリフェルミン、Ｒ－７４４、ネピデルミン、オプレルベキン、デニロイキンジフチトクス、クリサンタスパーゼ、ブセレリン、デスロレリン、ランレオチド、オクトレオチド、ピロカルピン、ボセンタン、カリケアミシン、メイタンシノイドおよびシクロニケート。
【0172】
さらに詳細には、当業者は、“Association Francaise des Enseignants de Chimie Therapeutique”により編集され、“Traite de chimie therapeutique, vol. 6, Medicaments antitumouraux et perspectives dans le traitement des cancers, edition TEC & DOC, 2003”なる表題のマニュアルを引用し得る。
【0173】
あるいは、イムノコンジュゲートは、少なくとも１個の放射性同位体に結合した結合タンパク質を含み得る。このようなイムノコンジュゲートは、結合タンパク質が抗体またはその抗原結合フラグメントであるとき、通常抗体－放射性同位体コンジュゲート(または「ＡＲＣ」)と称される。
【0174】
腫瘍の選択的破壊のために、抗体は高度に放射性の原子を含み得る。Ａｔ２１１、Ｃ１３、Ｎ１５、Ｏ１７、Ｆｌ１９、Ｉ１２３、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｉｎ１１１、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、ｔｃ９９ｍ、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２またはＬｕ、ガドリニウム、マンガンもしくは鉄の放射性同位体を含むが、これらに限定されない多様な放射性同位体が、ＡＲＣの産生に利用可能である。
【0175】
当業者により知られるあらゆる方法または工程を、このような放射性同位体のＡＲＣへの取り込みに使用できる(例えば“Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy”, Chatal, CRC Press 1989参照)。非限定的例として、Ｔｃ９９ｍまたはＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８およびＩｎ１１１を、システイン残基を介して結合できる。Ｙ９０を、リシン残基を介して結合できる。Ｉ１２３を、IODOGEN方法を使用して、結合できる(Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57)。
【0176】
チオ尿素リンカー－キレーターにより結合した抗ＣＤ２０モノクローナル抗体およびＩｎ１１１またはＹ９０放射性同位体からなるゼヴァリン(登録商標)(Wiseman et at (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77; Wiseman et al (2002) Blood 99(12):4336-42; Witzig et at (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63; Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69)；またはカリケアミシンに結合した抗ＣＤ３３抗体からなるマイロターグ(登録商標(米国特許４,９７０,１９８；５,０７９,２３３；５,５８５,０８９；５,６０６,０４０；５,６９３,７６２；５,７３９,１１６；５,７６７,２８５；５,７７３,００１)などのＡＲＣの分野における当業者の知識を説明するために、数例を例挙し得る。より最近、ＦＤＡによりホジキンリンパ腫の処置に細菌が承認された、アドセトリス(ブレンツキシマブ ベドチンに対応)と称されるＡＤＣも例挙できる(Nature, vol. 476, pp380-381, 25 August 2011)。
【0177】
本発明のさらに他の実施態様において、イムノコンジュゲートは、毒素に結合した結合タンパク質を含む。このようなイムノコンジュゲートは、結合タンパク質が抗体またはその抗原結合フラグメントであるとき、通常抗体－毒素コンジュゲート(または「ＡＴＣ」)と称される。
【0178】
毒素は、生存生物により産生される、有効かつ特異的毒物である。通常アミノ酸鎖からなり、分子量は、２、３００(ペプチド)から１０００００ダルトン(タンパク質)の間で変動し得る。低分子有機化合物でもあり得る。毒素は、多数の生物、例えば、細菌、真菌、藻類および植物によっても産生される。その多くは、きわめて有毒であり、神経毒物剤より数桁大きい毒性強度である。
【0179】
ＡＴＣで使用される毒素は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合またはトポイソメラーゼ阻害を含む機構により細胞毒性効果を発揮し得る種類の毒素を含み得るが、これらに限定されない。
【0180】
使用できる酵素活性毒素およびそのフラグメントは、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖(緑膿菌から)、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ－サルシン、シナアブラギリタンパク質、ダイアンシンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質(ＰＡＰＩ、ＰＡＰIIおよびＰＡＰ－Ｓ)、ツルレイシ阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセンを含む。
【0181】
ドラスタチン、アウリスタチン、トリコテセンおよびＣＣ１０６５および毒素活性を有するこれら毒素の誘導体などの小分子毒素も、ここで意図される。ドラスタチンおよびアウリスタチンは、微小管運動、ＧＴＰ加水分解ならびに核および細胞分裂を妨害することが示されており、抗癌および抗真菌活性を有する。
【0182】
ここに記載するイムノコンジュゲートは、さらにリンカーを含み得る。
【0183】
「リンカー」、「リンカー単位」または「連結」は、少なくとも１個の細胞毒性剤に結合タンパク質を共有結合により結合させる共有結合または原子鎖を含む、化学部分を意味する。
【0184】
リンカーは、Ｎ－スクシンイミジル－３－(２－ピリジルジチオ)プロピオネート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル－４－(Ｎ－マレイミドメチル)シクロヘキサン－１－カルボキシラート(ＳＭＣＣ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステルの二機能性誘導体(例えばジメチルアジピミデートＨＣｌ)、活性エステル(例えばジスクシンイミジルスベラート)、アルデヒド(例えばグルタラルデヒド)、ビス－アジド化合物(例えばビス(ｐ－アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス－ジアゾニウム誘導体(例えばビス－(ｐ－ジアゾニウムベンゾイル)－エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えばトルエン２,６－ジイソシアネート)およびビス－活性フッ素化合物(例えば１,５－ジフルオロ－２,４－ジニトロベンゼン)などの多様な二機能性タンパク質カップリング剤を使用して、製造できる。炭素－１４－標識１－イソチオシアナトベンジル－３－メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸(ＭＸ－ＤＴＰＡ)は、細胞毒性剤のアドレシングシステムへのコンジュゲーションのためのキレート剤の例である。他の架橋剤は、市販のＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ－ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ－ＥＭＣＳ、スルホ－ＧＭＢＳ、スルホ－ＫＭＵＳ、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＭＣＣおよびスルホ－ＳＭＰＢおよびＳＶＳＢ (スクシンイミジル－(４－ビニルスルホン)ベンゾエート)であり得る(例えば、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, Ill., U.S.Aから)。
【0185】
リンカーは「非開裂可能」または「開裂可能」リンカーであり得る。
【0186】
好ましくは、リンカーは、細胞毒性剤の細胞における遊離を促進する「開裂可能リンカー」である。例えば、酸不安定リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、感光性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカーが使用され得る。リンカーは、好ましくは、リンカーの切断が細胞内環境において結合タンパク質からの細胞毒性剤を放出するように細胞内条件下で開裂する。
【0187】
例えば、ある実施態様において、リンカーは、細胞内環境(例えば、リソソームまたはエンドソームまたはカベオラ内)に存在する開裂因子により開裂され得る。リンカーは、例えば、リソソームまたはエンドソームプロテアーゼを含むが、これらに限定されない細胞内ペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素により開裂される、ペプチジルリンカーである。一般に、ペプチジルリンカーは、少なくとも２アミノ酸長または少なくとも３アミノ酸長である。開裂因子は、カテプシンＢおよびＤおよびプラスミンであり得て、この全てが、ジペプチド薬物誘導体を加水分解し、標的細胞内で活性薬物の遊離をもたらすことが知られる。例えば、癌組織で高度に発現されるチオール依存性プロテアーゼカテプシン－Ｂにより開裂可能なペプチジルリンカーが使用され得る(例えば、Ｐｈｅ－ＬｅｕまたはＧｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙリンカー)。具体的実施態様において、細胞内プロテアーゼにより開裂可能なペプチジルリンカーは、Ｖａｌ－ＣｉｔリンカーまたはＰｈｅ－Ｌｙｓリンカーである。細胞毒性剤の細胞内タンパク分解性遊離を利用する利点の一つは、コンジュゲートされたとき薬物が一般に弱毒化され、コンジュゲートの血清安定性が一般に高いことである。
【0188】
他の実施態様において、開裂可能リンカーはｐＨ感受性、すなわち、あるｐＨ値で加水分解に感受性である。一般に、ｐＨ感受性リンカーは、酸性条件下加水分解性である。例えば、リソソームで加水分解性である酸不安定リンカー(例えば、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、ｃｉｓ－アコニチックアミド、オルトエステル、アセタール、ケタールなど)が使用され得る。このようなリンカーは、血液におけるような中性ｐＨ条件下で比較的安定であるが、リソソームのｐＨに近似のｐＨ５.５または５.０未満で不安定である。ある実施態様において、加水分解性リンカーは、チオエーテルリンカー(例えば、アシルヒドラゾン結合を介して治療剤に結合するチオエーテルなど)である。
【0189】
さらに他の実施態様において、リンカーは、還元条件下で開裂され得る(例えば、ジスルフィドリンカー)。多様なジスルフィドリンカーが同分野で知られ、例えば、ＳＡＴＡ(Ｎ－スクシンイミジル－Ｓ－アセチルチオアセテート)、ＳＰＤＰ(Ｎ－スクシンイミジル－３－(２－ピリジルジチオ)プロピオネート)、ＳＰＤＢ(Ｎ－スクシンイミジル－３－(２－ピリジルジチオ)ブチレート)およびＳＭＰＴ(Ｎ－スクシンイミジル－オキシカルボニル－アルファ－メチル－アルファ－(２－ピリジル－ジチオ)トルエン)－、ＳＰＤＢおよびＳＭＰＴを使用して形成され得るものを含むが、これらに限定されない。
【0190】
非開裂可能リンカーは、対照的に、明らかな薬物遊離機構はない。このような非開裂可能リンカーを含むイムノコンジュゲートは、内在化後細胞毒性剤を遊離する抗体の完全リソソームタンパク分解に依存する。
【0191】
非開裂可能リンカーを含むイムノコンジュゲートの例として、化学療法剤、トラスツズマブを連結したメイタンシンと組み合わせた、イムノコンジュゲートトラスツズマブ－エムタンシン－(ＴＤＭ１)を例示し得る(Cancer Research 2008; 68: (22). November 15, 2008)。
【0192】
好ましい実施態様において、ここに開示するイムノコンジュゲートは、ｉ)抗原結合タンパク質の求核基と二価リンカーの反応、続く細胞毒性剤との反応またはii)細胞毒性剤の求核基と二価リンカーの反応、続く抗原結合タンパク質の求核基との反応を含むが、これらに限定されない、当業者に知られる何れかの方法により製造できる。
【0193】
抗原結合タンパク質の求核基は、Ｎ末端アミン基、側鎖アミン基、例えばリシン、側鎖チオール基および抗原結合タンパク質がグリコシル化されているとき糖ヒドロキシルまたはアミノ基を含むが、これらに限定されない。アミン、チオールおよびヒドロキシル基は求核性であり、活性エステル、例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメートおよび酸ハライド；アルキルおよびベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；アルデヒド、ケトン、カルボキシルおよびマレイミド基を含むが、これらに限定されない、リンカー部分およびリンカー剤の求電子基と共有結合を形成するよう反応できる。抗原結合タンパク質は、還元可能鎖間ジスルフィド、すなわちシステイン架橋を有し得る。抗原結合タンパク質は、ＤＴＴ(ジチオトレイトール)などの還元剤での処理により、リンカー剤とのコンジュゲーションについて反応性とし得る。各システイン架橋は、故に、理論的に、２個の反応性チオール求核試薬を形成する。さらなる求核基を、当業者に知られる何れかの反応を介して抗原結合タンパク質に導入できる。非限定例として、反応性チオール基を、１以上のシステイン残基の導入により、抗原結合タンパク質に導入し得る。
【0194】
イムノコンジュゲートは、リンカー剤または細胞毒性剤の求核性置換基と反応できる求電子部分の導入のために、抗原結合タンパク質を修飾することによっても、産生され得る。グリコシル化抗原結合タンパク質の糖を酸化して、リンカー剤または細胞毒性剤のアミン基と反応し得るアルデヒドまたはケトン基を形成し得る。得られたイミンシッフ塩基基は、安定な結合を形成できまたは安定なアミン結合を形成するよう還元し得る。ある実施態様において、グリコシル化抗原結合タンパク質の炭水化物部分とガラクトースオキシダーゼまたは過ヨウ素酸ナトリウムの反応は、タンパク質における、薬物の適切な基と反応できるカルボニル(アルデヒドおよびケトン)基を生じ得る。他の実施態様において、Ｎ末端セリンまたはスレオニン残基を含むタンパク質を過ヨウ素酸ナトリウムと反応して、１級アミノ酸の代わりにアルデヒドの産生をもたらし得る。
【0195】
キメラ抗原受容体
本発明は、ｉ)本発明の抗体；ii)膜貫通ドメインおよび；iii)上記ｉ)の抗体の抗原への結合により、Ｔ細胞活性化を引き起こすことにより特徴づけられる細胞内シグナル伝達ドメインを含む、ＣＡＲ(キメラ抗原受容体)タンパク質をさらに提供する。
本発明は、ｉ)本発明の抗体；ii)膜貫通ドメインおよび；iii)上記ｉ)の抗体の抗原への結合により、Ｔ細胞活性化を引き起こすことにより特徴づけられる細胞内シグナル伝達ドメインを含む、ＣＡＲ(キメラ抗原受容体)タンパク質をさらに提供する。
【0196】
本発明において、ＣＡＲタンパク質は、本発明のモノクローナル抗体、公に知られている膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインからなることにより、特徴づけられる。
【0197】
ここで使用する用語「ＣＡＲ(キメラ抗原受容体)」は、免疫エフェクター細胞の特異的抗原に特異性を付与できる、非天然受容体をいう。一般に、ＣＡＲは、モノクローナル抗体にＴ細胞への特異性を付与するために使用される受容体である。ＣＡＲは、一般に細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインからなる。細胞外ドメインは、抗原認識領域を含み、本発明において、抗原認識部位は、ＶＳＩＧ４特異的抗体である。ＶＳＩＧ４特異的抗体は上記のとおりであり、ＣＡＲに使用する抗体は、好ましくは抗体フラグメントの形態である。より好ましくはＦａｂまたはｓｃＦｖの形態であるが、それに限定されない。
【0198】
さらに、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、細胞外ドメインに接続するおよび天然または合成形態何れかに由来し得る。天然形態に由来するとき、それは膜結合または膜貫通タンパク質に由来し得、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤＳ、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４またはＣＤ８などの種々のタンパク質の膜貫通ドメインに由来する一部であり得る。これら膜貫通ドメインの配列は、当該分野でよく知られている文献から得られ、膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインは十分に記載されているが、それらに限られない。
【0199】
本発明のＣＡＲは、細胞内ＣＡＲドメインの一部であり、膜貫通ドメインに接続する。本発明の細胞内ドメインは、ＣＡＲの抗原認識部位への抗原の結合により、Ｔ細胞活性化、好ましくはＴ細胞増殖を引き起こす性質を有することにより特徴づけられる細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞外に存在するＣＡＲの抗原認識部位への抗原の結合によりＴ細胞活性化を引き起こす限り、タイプに関して
特に限定はなく、様々な種類の細胞内シグナル伝達ドメインが使用され得る。その例は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ(ＩＴＡＭ)を含み、ＩＴＡＭは、ＣＤ３ゼータ(ξ)、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤＳ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ６６ｄまたはＦｃεＲＩγに由来するものを含み得るが、それに限定されない。
特に限定はなく、様々な種類の細胞内シグナル伝達ドメインが使用され得る。その例は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ(ＩＴＡＭ)を含み、ＩＴＡＭは、ＣＤ３ゼータ(ξ)、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤＳ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ６６ｄまたはＦｃεＲＩγに由来するものを含み得るが、それに限定されない。
【0200】
さらに、本発明のＣＡＲの細胞内ドメインが細胞内シグナル伝達ドメインと共に共刺激ドメインをさらに含むことが好ましいが、それに限定されない。共刺激ドメインは、本発明のＣＡＲに含まれる一部であり、細胞内シグナル伝達ドメインからのシグナルに加えて、Ｔ細胞へのシグナル伝達に役割を有し、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの細胞内部分を示す。
【0201】
共刺激分子は、細胞表面分子として、リンパ球が抗原に対する十分な反応を有するために必要な分子を意味し、その例は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ－１(リンパ球機能関連抗原－１)、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２ＣおよびＢ７－Ｈ３を含むが、それに限定されない。共刺激ドメインは、これら共刺激分子およびそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の細胞内部分であり得る。
【0202】
さらに、選択的に、短オリゴペプチドまたはポリペプチドリンカーは細胞内ドメインおよびＣＡＲの膜貫通ドメインを連結し得る。このリンカーは本発明のＣＡＲに含まれ得るが、細胞外抗体に対する抗原の細胞内ドメイン結合を介してＴ細胞活性化を誘導できる限り、リンカー長に関して特に制限はない。
【0203】
核酸および発現系
本発明は、抗体、特に抗ＶＳＩＧ４抗体の免疫グロブリン軽鎖および重鎖遺伝子をコードするポリヌクレオチド、このような核酸を含むベクターおよび本発明の抗体を産生できる宿主細胞を包含する。またここで提供されるのは、ここに提供する抗体または修飾抗体をコードするポリヌクレオチドに、例えば、上記高ストリンジェンシー、中または低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドである。
本発明は、抗体、特に抗ＶＳＩＧ４抗体の免疫グロブリン軽鎖および重鎖遺伝子をコードするポリヌクレオチド、このような核酸を含むベクターおよび本発明の抗体を産生できる宿主細胞を包含する。またここで提供されるのは、ここに提供する抗体または修飾抗体をコードするポリヌクレオチドに、例えば、上記高ストリンジェンシー、中または低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドである。
【0204】
第一の態様において、本発明は、抗体、特に上記のとおりＶＳＩＧ４またはそのフラグメントに特異的に結合できる抗体をコードする１以上のポリヌクレオチドに関する。本発明は、特にモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを提供する。より具体的には、ある実施態様において、ここに提供する核酸分子は、ここに開示する重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードする核酸配列またはそれらの何れかの組み合わせ(例えば、ここに提供する抗体、例えば、ここに提供する完全長抗体、抗体の重鎖および／または軽鎖または一本鎖抗体をコードするヌクレオチド配列として)を含むまたはそれからなる。
【0205】
ある実施態様において、ポリヌクレオチドは、ここに記載する抗ＶＳＩＧ４抗体の３個の重鎖ＣＤＲをコード化する。ある実施態様において、ポリヌクレオチドは、ここに記載する抗ＶＳＩＧ４抗体の３個の軽鎖ＣＤＲをコード化する。ある実施態様において、ポリヌクレオチドは、３個の重鎖ＣＤＲおよびここに記載する抗ＶＳＩＧ４抗体の３個の軽鎖ＣＤＲをコード化する。他の実施態様はポリヌクレオチドのカップルを提供し、ここで、第一ポリヌクレオチドは、ここに記載する抗ＶＳＩＧ４抗体の３個の重鎖ＣＤＲをコード化し、そして第二ポリヌクレオチドは、同じくここに記載する抗ＶＳＩＧ４抗体の３個の軽鎖ＣＤＲをコード化する。
【0206】
ある実施態様において、ポリヌクレオチドは、ここに記載する抗ＶＳＩＧ４抗体の重鎖可変領域をコード化する。ある実施態様において、ポリヌクレオチドは、ここに記載する抗ＶＳＩＧ４抗体の軽鎖可変領域をコード化する。ある実施態様において、ポリヌクレオチドは、ここに記載する抗ＶＳＩＧ４抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコード化する。他の実施態様はポリヌクレオチドのカップルを提供し、ここで、第一ポリヌクレオチドは、ここに記載する抗ＶＳＩＧ４抗体の重鎖可変領域をコード化し、そして第二ポリヌクレオチドは、同じここに記載する抗ＶＳＩＧ４抗体の軽鎖可変領域をコード化する。
【0207】
ある実施態様において、ポリヌクレオチドは、ここに記載する抗ＶＳＩＧ４抗体の重鎖をコード化する。ある実施態様において、ポリヌクレオチドは、ここに記載する抗ＶＳＩＧ４抗体の軽鎖をコード化する。ある実施態様において、ポリヌクレオチドは、ここに記載する抗ＶＳＩＧ４抗体の重鎖および軽鎖をコード化する。他の実施態様はポリヌクレオチドのカップルを提供し、ここで、第一ポリヌクレオチドは、ここに記載する抗ＶＳＩＧ４抗体の重鎖をコード化し、そして第二ポリヌクレオチドは、同じここに記載する抗ＶＳＩＧ４抗体の軽鎖をコード化する。
【0208】
ある実施態様において、上記抗ＶＳＩＧ４抗体Ａ１９５６の重鎖をコード化するポリヌクレオチドが提供される。好ましくは、該重鎖は、配列番号３、４および５の配列の３個の重鎖ＣＤＲを含む。より好ましくは、該重鎖は、配列番号１２９の配列の可変領域を含む重鎖を含む。
【0209】
他の実施態様において、ポリヌクレオチドは、上記抗ＶＳＩＧ４抗体Ａ１９５６の軽鎖をコード化する。好ましくは、該軽鎖は、配列番号６、７および８の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含む。より好ましくは、該軽鎖は、配列番号１３０の配列の可変領域を含む軽鎖を含む。
【0210】
他の実施態様において、上記抗ＶＳＩＧ４抗体Ａ１９５７の重鎖をコードするポリヌクレオチドが提供される。好ましくは、該重鎖は、配列番号９、１０および５の配列の３個の重鎖ＣＤＲを含む。より好ましくは、該重鎖は、配列番号１３１の配列の可変領域を含む重鎖を含む。
【0211】
他の実施態様において、ポリヌクレオチドは、上記抗ＶＳＩＧ４抗体Ａ１９５７の軽鎖をコード化する。好ましくは、該軽鎖は、配列番号６、７および８の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含む。より好ましくは、該軽鎖は、配列番号１３２の配列の可変領域を含む軽鎖を含む。
【0212】
他の実施態様において、上記抗ＶＳＩＧ４抗体Ａ１９７５の重鎖をコードするポリヌクレオチドが提供される。好ましくは、該重鎖は、配列番号１１、１２および１３の配列の３個の重鎖ＣＤＲを含む。より好ましくは、該重鎖は、配列番号１３３の配列の可変領域を含む重鎖を含む。
【0213】
他の実施態様において、ポリヌクレオチドは、上記抗ＶＳＩＧ４抗体Ａ１９７５の軽鎖をコード化する。好ましくは、該軽鎖は、配列番号１４、１５および１６の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含む。より好ましくは、該軽鎖は、配列番号１３４の配列の可変領域を含む軽鎖を含む。
【0214】
他の実施態様において、上記抗ＶＳＩＧ４抗体Ａ２２８３の重鎖をコードするポリヌクレオチドが提供される。好ましくは、該重鎖は、配列番号１７、１８および１９の配列の３個の重鎖ＣＤＲを含む。より好ましくは、該重鎖は、配列番号１３５の配列の可変領域を含む重鎖を含む。
【0215】
他の実施態様において、ポリヌクレオチドは、上記抗ＶＳＩＧ４抗体Ａ２２８３の軽鎖をコード化する。好ましくは、該軽鎖は、配列番号２０、２１および２２の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含む。より好ましくは、該軽鎖は、配列番号１３６の配列の可変領域を含む軽鎖を含む。
【0216】
他の実施態様において、上記抗ＶＳＩＧ４抗体Ａ２２８５の重鎖をコードするポリヌクレオチドが提供される。好ましくは、該重鎖は、配列番号２３、２４および３の配列の３個の重鎖ＣＤＲを含む。より好ましくは、該重鎖は、配列番号１３７の配列の可変領域を含む重鎖を含む。
【0217】
他の実施態様において、ポリヌクレオチドは、上記抗ＶＳＩＧ４抗体Ａ２２８５の軽鎖をコード化する。好ましくは、該軽鎖は、配列番号６、７および２５の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含む。より好ましくは、該軽鎖は、配列番号１３８の配列の可変領域を含む軽鎖を含む。
【0218】
他の実施態様において、上記抗ＶＳＩＧ４抗体Ａ２２８７の重鎖をコードするポリヌクレオチドが提供される。好ましくは、該重鎖は、配列番号２６、２７および２８の配列の３個の重鎖ＣＤＲを含む。より好ましくは、該重鎖は、配列番号１３９の配列の可変領域を含む重鎖を含む。
【0219】
他の実施態様において、ポリヌクレオチドは、上記抗ＶＳＩＧ４抗体Ａ２２８７の軽鎖をコード化する。好ましくは、該軽鎖は、配列番号２９、３０および３１の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含む。より好ましくは、該軽鎖は、配列番号１４０の配列の可変領域を含む軽鎖を含む。
【0220】
他の実施態様において、上記抗ＶＳＩＧ４抗体Ａ２２９０の重鎖をコードするポリヌクレオチドが提供される。好ましくは、該重鎖は、配列番号３２、３３および３４の配列の３個の重鎖ＣＤＲを含む。より好ましくは、該重鎖は、配列番号１４１の配列の可変領域を含む重鎖を含む。
【0221】
他の実施態様において、ポリヌクレオチドは、上記抗ＶＳＩＧ４抗体Ａ２２９０の軽鎖をコード化する。好ましくは、該軽鎖は、配列番号３５、３６および１６の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含む。より好ましくは、該軽鎖は、配列番号１４２の配列の可変領域を含む軽鎖を含む。
【0222】
他の実施態様において、上記抗ＶＳＩＧ４抗体Ａ２２９１の重鎖をコードするポリヌクレオチドが提供される。好ましくは、該重鎖は、配列番号３７、３８および３９の配列の３個の重鎖ＣＤＲを含む。より好ましくは、該重鎖は、配列番号１４３の配列の可変領域を含む重鎖を含む。
【0223】
他の実施態様において、ポリヌクレオチドは、上記抗ＶＳＩＧ４抗体Ａ２２９１の軽鎖をコード化する。好ましくは、該軽鎖は、配列番号４０、４１および４２の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含む。より好ましくは、該軽鎖は、配列番号１４４の配列の可変領域を含む軽鎖を含む。
【0224】
他の実施態様において、上記抗ＶＳＩＧ４抗体Ａ２３８６の重鎖をコードするポリヌクレオチドが提供される。好ましくは、該重鎖は、配列番号４３、４４および４５の配列の３個の重鎖ＣＤＲを含む。より好ましくは、該重鎖は、配列番号１４５の配列の可変領域を含む重鎖を含む。
【0225】
他の実施態様において、ポリヌクレオチドは、上記抗ＶＳＩＧ４抗体Ａ２３８６の軽鎖をコード化する。好ましくは、該軽鎖は、配列番号４６、４７および４８の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含む。より好ましくは、該軽鎖は、配列番号１４６の配列の可変領域を含む軽鎖を含む。
【0226】
他の実施態様において、上記抗ＶＳＩＧ４抗体Ａ２３９０の重鎖をコードするポリヌクレオチドが提供される。好ましくは、該重鎖は、配列番号４９、５０および５１の配列の３個の重鎖ＣＤＲを含む。より好ましくは、該重鎖は、配列番号１４７の配列の可変領域を含む重鎖を含む。
【0227】
他の実施態様において、ポリヌクレオチドは、上記抗ＶＳＩＧ４抗体Ａ２３９０の軽鎖をコード化する。好ましくは、該軽鎖は、配列番号５２、５３および５４の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含む。より好ましくは、該軽鎖は、配列番号１４８の配列の可変領域を含む軽鎖を含む。
【0228】
他の実施態様において、上記抗ＶＳＩＧ４抗体Ａ２４５５の重鎖をコードするポリヌクレオチドが提供される。好ましくは、該重鎖は、配列番号１７、１８および５５の配列の３個の重鎖ＣＤＲを含む。より好ましくは、該重鎖は、配列番号１４９の配列の可変領域を含む重鎖を含む。
【0229】
他の実施態様において、ポリヌクレオチドは、上記抗ＶＳＩＧ４抗体Ａ２４５５の軽鎖をコード化する。好ましくは、該軽鎖は、配列番号５６、５７および５８の配列の３個の軽鎖ＣＤＲを含む。より好ましくは、該軽鎖は、配列番号１５０の配列の可変領域を含む軽鎖を含む。
【0230】
コドン縮重またはヒト抗体またはそのフラグメントの軽鎖および重鎖を発現する生物における好ましいコドンの考察により、本発明のモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖またはその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドは、コード領域から発現される抗体の軽鎖および重鎖のアミノ酸配列が変化しない範囲内でコード領域に種々の多様性を有し得て、コード領域以外の領域内で、遺伝子発現が影響されない範囲内で種々の変化または修飾を行い得る。当業者は、これらバリアント遺伝子も本発明の範囲内に入ることを容易に理解する。すなわち、等価活性を有するタンパク質が本発明のポリヌクレオチドによりコード化される限り、１以上の核酸塩基を置換、欠失、挿入またはそれらの組み合わせにより変えることができ、これらも本発明の範囲内に入る。ポリヌクレオチドの配列は一本鎖または二本鎖であり得て、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ(ｍＲＮＡ)分子であり得る。
【0231】
本発明によると、多様な発現系を、本発明の抗体の発現に使用できる。ある態様において、このような発現系は、目的のコード配列が産生され、続いて精製される媒体を表し、また、適切なヌクレオチドコード配列で一過性にトランスフェクトしたとき、インサイチュでＩｇＧ抗体を発現し得る細胞も表す。
【0232】
本発明は、上記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。ある実施態様において、ベクターは、目的の抗体(例えば、抗ＶＳＩＧ４抗体)の重鎖をコードするポリヌクレオチドを含む。他の実施態様において、ポリヌクレオチドは、目的の抗体(例えば、抗ＶＳＩＧ４抗体)の軽鎖をコード化する。他の実施態様において、ポリヌクレオチドは、目的の抗体(例えば、抗ＶＳＩＧ４抗体)の重鎖および軽鎖をコード化する。さらに他の実施態様において、ポリヌクレオチドのカップルが提供され、ここで、第一ポリヌクレオチドは目的の抗体(例えば、抗ＶＳＩＧ４抗体)の重鎖をコード化し、そして第二ポリヌクレオチドは、同じ目的の抗体(例えば、抗ＶＳＩＧ４抗体)の軽鎖をコード化する。
【0233】
本発明はまた、融合タンパク質、修飾抗体、抗体フラグメントおよびそれらのプローブをコードするポリヌクレオチド分子を含むベクターを提供する。
【0234】
目的の抗体(例えば、抗ＶＳＩＧ４抗体)の重鎖および／または軽鎖を発現するために、該重鎖および／または軽鎖をコードするポリヌクレオチドを、遺伝子が転写および翻訳配列に操作可能に連結するように発現ベクターに導入する。好ましい実施態様において、これらポリヌクレオチドは、２個のベクターにクローン化される。
【0235】
「操作可能に連結された」配列は、目的の遺伝子と連続する発現制御配列および目的の遺伝子の制御のためにトランスでまたは遠位で作用する発現制御配列両者を含む。ここで使用する用語「発現制御配列」は、ライゲートされたコード配列の発現および処理に影響するのに必要なポリヌクレオチド配列をいう。発現制御配列は、適切な転写開始、終結、プロモーターおよびエンハンサー配列；スプライシングおよびポリアデニル化シグナルなどの効率的ＲＮＡ処理シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を上げる配列(すなわち、コザックコンセンサス配列)；タンパク質安定性を増強する配列；および望ましいとき、タンパク質分泌を増強する配列を含む。このような制御配列の性質は宿主生物により異なる；原核生物において、このような制御配列は、一般にプロモーター、リボソーム結合部位および転写終結配列を含む；真核生物において、一般に、このような制御配列はプロモーターおよび転写終結配列を含む。用語「制御配列」は、最小で、存在が発現および処理に必要である全構成要素を含むことを意図し、存在が有利であるさらなる構成要素、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列も含み得る。
【0236】
本発明のポリヌクレオチドおよびこれら分子を含むベクターが、適当な宿主細胞の形質転換のために使用され得る。ここで使用する用語「宿主細胞」は、組み換え発現ベクターが目的の抗体(例えば、抗ＶＳＩＧ４抗体)の発現のために導入されている細胞をいうことを意図する。このような用語は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の子孫もいうことは理解されるべきである。ある修飾が、変異または環境的影響何れかにより後代で生じ得るため、このような子孫は、事実、親細胞と同一ではないかもしれないが、なおここで使用する用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。
【0237】
形質転換は、細胞宿主にポリヌクレオチドを導入するための何れかの既知方法により実施され得る。このような方法は当業者に周知であり、デキストラン介在形質転換、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン介在トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチドのリポソームへのカプセル封入、微粒子銃注入および核へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションを含む。
【0238】
宿主細胞を、１以上の発現ベクターと共トランスフェクトし得る。例えば、宿主細胞を、上記目的の抗体(例えば、抗ＶＳＩＧ４抗体)の重鎖および軽鎖両者をコードするベクターでトランスフェクトし得る。あるいは、宿主細胞を、目的の抗体(例えば、抗ＶＳＩＧ４抗体)の重鎖をコードする第一ベクターおよび該抗体の軽鎖をコードする第二ベクターで形質転換し得る。哺乳動物細胞は、組み換え治療免疫グロブリンの発現、特に組み換え抗体全体の発現のために一般に使用される。例えば、ＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞と、ヒトサイトメガロウイルスからの主要中間初期遺伝子プロモーター要素を担持するもののような発現シグナルを含むベクターの組み合わせは、ヒト化本発明の抗ＶＳＩＧ４抗体の発現に有効な系である(Foecking et al., 1986, Gene 45:101; Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8: 2)。
【0239】
さらに、所望の特異的方法で挿入配列の発現を調節するまたは遺伝子産物を修飾および処理する宿主細胞を選択し得る。このような修飾(例えば、グリコシル化)およびタンパク質産物の処理は、タンパク質の機能のために重要であり得る。種々の宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後処理および修飾のための性質および特異的機構を有する。適切な細胞株または宿主系を選択して、発現された目的の抗体の正確な修飾および処理を確実にする。故に、一次転写物の適切な処理、遺伝子産物のグリコシル化のための細胞機構を有する真核生物宿主細胞が使用され得る。このような哺乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＮＳ／０、ＢＨＫ、Ｙ２／０、３Ｔ３または骨髄腫細胞を含むが、これらに限定されない(これら細胞株全てはCollection Nationale des Cultures de Microorganismes, Paris, FranceまたはAmerican Type Culture Collection, Manassas, VA, U.S.A.などの公的寄託期間から入手可能である)。
【0240】
組み換えタンパク質の長期、高収率産生のために、安定な発現が好ましい。本発明のある実施態様において、抗体を安定に発現する細胞株が設計され得る。ウイルス複製起源を含む発現ベクターを使用するより、宿主細胞を、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位および当業者に知られる他の適切な配列を含む適切な発現制御要素および選択可能マーカーの制御下、ＤＮＡで形質転換する。外来ＤＮＡの導入後、設計細胞を富化培地で１～２日間増殖させ得て、次いで選択培地に移す。組み換えプラスミドの選択可能マーカーは、選択に対する体制を付与し、細胞がプラスミドを染色体に安定に統合させ、細胞株内で増殖させることを可能とする。安定な細胞株を構築する他の方法は当分野で知られる。特に、部位特異的組込みの方法が開発されている。これら方法により、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位および他の適切な配列を含む適切な発現制御要素制御下の形質転換ＤＮＡが、あらかじめ開裂されている特異的標的部位で宿主細胞ゲノムに統合される(Moele et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 104(9): 3055-3060；ＵＳ５,７９２,６３２；ＵＳ５,８３０,７２９；ＵＳ６,２３８,９２４；ＷＯ２００９／０５４９８５；ＷＯ０３／０２５１８３；ＷＯ２００４／０６７７５３)。
【0241】
それぞれｔｋ、ｈｇｐｒｔまたはａｐｒｔ細胞における、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wigler et al., Cell 11:223, 1977)、ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalska et al., Proc Natl Acad Sci USA 48: 202, 1992)、メチオニンスルホキシミド存在下のグルタメートシンターゼ選択(Adv Drug Del Rev, 58: 671, 2006および Lonza Group Ltd.のウェブサイトまたは文献)およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowy et al., Cell 22: 817, 1980)遺伝子を含むが、これらに限定されない多数の選択系が、本発明により使用され得る。また、代謝拮抗剤耐性が、次の遺伝子の選択の基礎として使用され得る：メトトレキサートに耐性を付与するｄｈｆｒ(Wigler et al., Proc Natl Acad Sci USA 77: 357, 1980)；ミコフェノール酸に耐性を付与するｇｐｔ(Mulligan et al., Proc Natl Acad Sci USA 78: 2072, 1981)；アミノグリコシド、Ｇ－４１８に耐性を付与するｎｅｏ(Wu et al., Biotherapy 3: 87, 1991)；およびハイグロマイシンに耐性を付与するｈｙｇｒｏ(Santerre et al., Gene 30: 147, 1984)。組み換えＤＮＡテクノロジー分野で知られる方法を、所望の組み換えクローンの選択のために規定通り適用でき、このような方法は、例えば、Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1993)に記載される。抗体の発現レベルを、ベクター増幅により増加させ得る。抗体発現ベクター系におけるマーカーが増幅可能であるならば、培養に存在する阻害剤のレベルの増加により、マーカー遺伝子のコピー数が増加する。増幅領域が本発明のＩｇＧ抗体をコードする遺伝子と関連するため、該抗体の産生も増加する(Crouse et al., Mol Cell Biol 3: 257, 1983)。本発明の遺伝子を発現する別の方法が存在し、当業者に知られる。例えば、本発明の遺伝子の上流の発現制御要素の結合ができる修飾亜鉛フィンガータンパク質を設計できる；本発明の宿主細胞における該設計亜鉛フィンガータンパク質(ＺＦＮ)の発現は、タンパク質産生を増加させる(例えばReik et al., Biotechnol. Bioeng., 97(5): 1180-1189, 2006参照)。さらに、ＺＦＮは、予め決定されたゲノム位置へのＤＮＡの組込みを刺激でき、高効率的部位特異的遺伝子付加をもたらす(Moehle et al, Proc Natl Acad Sci USA, 104: 3055, 2007)。
【0242】
目的の抗体(例えば、抗ＶＳＩＧ４抗体)は、所望の抗体の発現に必要な培養条件下での形質転換宿主細胞の培養物の増殖により、調製され得る。次いで、得られた発現抗体を培養培地または細胞抽出物から精製し得る。可溶性形態の目的の抗体(例えば、抗ＶＳＩＧ４抗体)は培養上清から回収され得る。次いで、免疫グロブリン分子の精製について当分野で知られる何れらかの方法、例えば、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換、親和性、特にＦｃに対するプロテインＡ親和性など)、遠心分離、示差的溶解度またはタンパク質の精製のためのあらゆるその他の標準技術により精製し得る。適当な精製方法は、当業者には明らかである。
【0243】
本発明の他の態様は、故に、ここに記載する抗体(例えば、抗ＶＳＩＧ４抗体)を産生方法であって
ａ)上記宿主細胞を適当な培養条件下で培養培地で増殖させ；そして
ｂ)培養培地または該培養細胞から抗体(例えば、抗ＶＳＩＧ４抗体)を回収する
工程を含む、方法に関する。
ａ)上記宿主細胞を適当な培養条件下で培養培地で増殖させ；そして
ｂ)培養培地または該培養細胞から抗体(例えば、抗ＶＳＩＧ４抗体)を回収する
工程を含む、方法に関する。
【0244】
形質転換体の培養により得た抗体は、非精製状態で使用され得る。不純物を、遠心分離または限外濾過などのさらなる種々の一般法により除去でき、結果物を透析、塩沈殿、クロマトグラフィーなどに付してよく、ここで、これら方法を単独でもその組み合わせでも使用し得る。これらの中で、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどを含む親和性クロマトグラフィーが最も広範に使用される。
【0245】
医薬組成物
他の態様において、本発明は、例えば、ここに記載する抗ＶＳＩＧ４抗体の何れかなどの抗ＶＳＩＧ４抗体またはその抗原結合フラグメントまたはそのコンジュゲート、すなわち、ここに記載する抗ＶＳＩＧ４抗体の１個を含むイムノコンジュゲートを含む組成物を提供する。
他の態様において、本発明は、例えば、ここに記載する抗ＶＳＩＧ４抗体の何れかなどの抗ＶＳＩＧ４抗体またはその抗原結合フラグメントまたはそのコンジュゲート、すなわち、ここに記載する抗ＶＳＩＧ４抗体の１個を含むイムノコンジュゲートを含む組成物を提供する。
【0246】
これら組成物は、特に例えば対象における免疫応答の刺激のために有用である。ＶＳＩＧ４に特異的に結合する本発明の抗体は、Ｔ細胞活性化を阻害するＶＳＩＧ４タンパク質への結合によりＴ細胞活性化を誘導し、故に、抗体は免疫応答を刺激できる。
【0247】
ここに記載する組成物は、癌の処置にも有用である。保護的抗腫瘍免疫が、ここに開示する抗ＶＳＩＧ４抗体、その抗原結合フラグメントまたはそのコンジュゲートを含むこのような組成物の投与により、確立され得る。
【0248】
所望により、組成物は、下記免疫チェックポイント阻害剤などの１以上のさらなる治療剤を含み得る。組成物は、通常無菌、医薬組成物の一部として提供され、これは、通常薬学的に許容される担体および／または添加物を含む。他の態様において、本発明は、故に、抗ＶＳＩＧ４抗体またはそのコンジュゲートおよび医薬許容される担体および／または添加物を含む医薬組成物を提供する。
【0249】
この組成物は、あらゆる適当な形態であり得る(患者への所望の投与方法による)。ここに記載する方法で利用される組成物は、例えば、硝子体内(例えば、硝子体内注射により)、点眼、筋肉内、静脈内、皮内、経皮、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、髄腔内、鼻腔内、膣内、直腸内、局所的、腫瘍内、腹膜内、皮下、結膜下、膀胱内、粘膜、心膜内、臍下、眼内、眼窩内、経口、局所的、経皮、吸入、注射、埋め込み、点滴、連続的点滴、直接浴標的細胞局在化灌流、カテーテル、洗浄、クレームまたは脂質組成物で投与し得る。ここに記載する方法で利用される組成物は、全身または局所投与し得る。投与方法は、種々の因子(例えば、投与される化合物または組成物および処置する状態、疾患または障害の重症度)により変わる。ある所定の場合の最も適当な投与経路は、特定の抗体、対象および疾患の性質および重症度および対象の身体状態に依存する。抗ＶＳＩＧ４抗体、その抗原結合フラグメントまたはそのコンジュゲートは水溶液として製剤化され、皮下注射により投与され得る。
【0250】
医薬組成物は、好都合には、用量あたり抗ＶＳＩＧ４、その抗原結合フラグメントまたはそのコンジュゲートの予め決定された量を含む、単位剤形で提供される。このような単位は、例えば、５mg～５ｇ、例えば１０mg～１ｇまたは２０～５０mgを含み得るが、これらに限定されない。本発明において使用するための薬学的に許容される担体は、例えば、処置する状態または投与経路により、多種多様な形態をとり得る。
【0251】
本発明の医薬組成物は、所望の程度の純度を有する抗体と当分野で一般に用いられる任意的な薬学的に許容される担体、添加物または安定化剤(これらすべてここでは「担体」と称する)、すなわち、緩衝剤、安定化剤、防腐剤、等張化剤、非イオン界面活性剤、抗酸化剤および他の雑多な添加物の混合により、凍結乾燥製剤または水溶液として保存するために調製され得る。Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th edition (Osol, ed. 1980)参照。このような添加物は、用いる投与量および濃度でレシピエントに非毒性でなければならない。
【0252】
緩衝剤は、生理学的条件に近似する範囲にｐＨを維持することを助ける。約２mM～約５０mMの範囲の濃度で存在し得る。本発明で使用するのに適する緩衝剤は、有機および無機両方の酸およびその塩、例えば、クエン酸緩衝液(例えば、クエン酸一ナトリウム－クエン酸二ナトリウム混合物、クエン酸－クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸－クエン酸一ナトリウム混合物など)、スクシネート緩衝液(例えば、コハク酸－コハク酸一ナトリウム混合物、コハク酸－水酸化ナトリウム混合物、コハク酸－コハク酸二ナトリウム混合物など)、酒石酸緩衝液(例えば、酒石酸－酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸－酒石酸カリウム混合物、酒石酸－水酸化ナトリウム混合物など)、フマル酸緩衝液(例えば、フマル酸－フマル酸一ナトリウム混合物、フマル酸－フマル酸二ナトリウム混合物、フマル酸一ナトリウム－フマル酸二ナトリウム混合物など)、グルコン酸緩衝液(例えば、グルコン酸－ナトリウムグルコン酸混合物、グルコン酸－水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸－カリウムグルコン酸混合物など)、シュウ酸緩衝液(例えば、シュウ酸－シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸－水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸－シュウ酸カリウム混合物など)、乳酸緩衝液(例えば、乳酸－乳酸ナトリウム混合物、乳酸－水酸化ナトリウム混合物、乳酸－乳酸カリウム混合物など)およびアセテート緩衝液(例えば、酢酸－酢酸ナトリウム混合物、酢酸－水酸化ナトリウム混合物など)を含む。さらに、ホスフェート緩衝液、ヒスチジン緩衝液およびトリメチルアミン塩、例えばＴｒｉｓが使用され得る。
【0253】
防腐剤を微生物増殖を遅延させるために添加でき、０.２％～１％(ｗ／ｖ)の範囲の量で加え得る。本発明で使用するのに適する防腐剤は、フェノール、ベンジルアルコール、ｍｅｔａ－クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、ベンザルコニウムハライド(例えば、クロライド、ブロマイドおよびアイオダイド)、ヘキサメトニウムクロライドおよびアルキルパラベン、例えばメチルまたはプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノールおよび３－ペンタノールを含む。等張化剤は、「安定化剤」として知られることもあり、本発明の液体組成物の等張性を確実にするために添加でき、多価糖アルコール、例えば３価または高級糖アルコール、例えばグリセリン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトールを含む。安定化剤は、増量剤から、治療剤(すなわち、抗ＶＳＩＧ４抗体、その抗原結合フラグメントまたはそのコンジュゲート)を溶解するまたは変性または容器壁への付着の防止に役立つまでの範囲で機能し得る、広範な添加物をいう。典型的安定化剤は、多価糖アルコール(上に列記)；アミノ酸例えばアルギニン、リシン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチンｅ、Ｌ－ロイシン、２－フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニンなど、有機糖または糖アルコール、例えばラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイノシトール、ガラクチトール、シクリトール、例えばイノシトールを含むグリセロールなど；ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー；硫黄含有還元剤、例えば尿素、グルタチオン、チオクト酸、ナトリウムチオグリコラート、チオグリセロール、α－モノチオグリセロールおよびナトリウムチオスルフェート；低分子量ポリペプチド(例えば、１０未満の残基のペプチド)；タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン単糖、例えばキシロース、マンノース、フルクトース、グルコース；二糖、例えばラクトース、マルトース、スクロースおよび三糖、例えばラフィノース；および多糖、例えばデキストランであり得る。安定化剤は、活性タンパク質(例えば、抗ＶＳＩＧ４抗体またはこのような抗体を含むコンジュゲート)の重量部当たり、０.１～１０,０００重量の範囲で存在し得る。
【0254】
非イオン界面活性剤または界面活性剤(「湿潤剤」としても知られる)を、抗ＶＳＩＧ４抗体(またはそのコンジュゲート)の可溶化を助けるためおよび撹拌誘導凝集に対して治療タンパク質を保護するために添加でき、またタンパク質の変性を引き起こすことなく、剪断表面圧に製剤をさらすことも可能とする。適当な非イオン界面活性剤は、ポリソルベート(２０、８０など)、ポロキサマー(１８４、１８８など)、プルロニックポリオール、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル(ＴＷＥＥＮ(登録商標)－２０、ＴＷＥＥＮ(登録商標)－８０など)を含む。非イオン界面活性剤は、約０.０５mg／ml～約１.０mg／ml、例えば約０.０７mg／ml～約０.２mg／mlの範囲で存在し得る。
【0255】
さらなる雑多な添加物は、増量剤(例えば、デンプン)、キレート剤(例えば、ＥＤＴＡ)、抗酸化剤(例えば、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ)および共溶媒を含む。
【0256】
本発明は、さらに、同時の、別々のまたは逐次的使用のための組み合わせ製品として、少なくとも
ｉ)ここに開示する抗ＶＳＩＧ４抗体、その抗原結合フラグメントまたはそのコンジュゲートおよび
ii)第二治療剤、例えば下記免疫チェックポイント阻害剤
を含む、医薬組成物に関する。
ｉ)ここに開示する抗ＶＳＩＧ４抗体、その抗原結合フラグメントまたはそのコンジュゲートおよび
ii)第二治療剤、例えば下記免疫チェックポイント阻害剤
を含む、医薬組成物に関する。
【0257】
ここで使用する「同時使用」は、単一および同一医薬形態での本発明の医薬組成物の２化合物の投与をいう。
【0258】
ここで使用する「別々の使用」は、異なる医薬形態での本発明の医薬組成物の２化合物の、同じ時間の投与をいう。
【0259】
ここで使用する「逐次使用」は、それぞれ異なる医薬形態での本発明の医薬組成物の２化合物の、連続的投与をいう。
【0260】
抗ＶＳＩＧ４抗体(またはその抗原結合フラグメントまたはそのコンジュゲート)および例えば、免疫チェックポイント阻害剤などの第二治療剤の組成物は、１以上の抗ＶＳＩＧ４抗体(またはその抗原結合フラグメントまたはそのコンジュゲート)および／または１以上の第二治療剤(例えば下記免疫チェックポイント阻害剤)の混合物として、癌の処置に有用なもしくは癌のための他の治療に補助的な他の薬剤との混合物または組み合わせとして、一回で投与され得る。適当な組み合わせおよび補助的治療の例は、下に提供される。
【0261】
ここに記載する抗ＶＳＩＧ４抗体(またはその抗原結合フラグメントまたはそのコンジュゲート)を含む医薬キットは、本発明により包含される。医薬キットは、抗ＶＳＩＧ４抗体(例えば、凍結乾燥形態または水溶液として)および１以上の次のもの：
・第二治療剤、例えば下記免疫チェックポイント阻害剤；
・抗ＶＳＩＧ４抗体を投与するためのデバイス、例えばペン、針および／またはシリンジ；および
・阻害剤が抗体携帯であるならば、抗体を歳懸濁するための医薬グレード水または緩衝液
を含む、パッケージである。
・第二治療剤、例えば下記免疫チェックポイント阻害剤；
・抗ＶＳＩＧ４抗体を投与するためのデバイス、例えばペン、針および／またはシリンジ；および
・阻害剤が抗体携帯であるならば、抗体を歳懸濁するための医薬グレード水または緩衝液
を含む、パッケージである。
【0262】
抗ＶＳＩＧ４抗体(またはその抗原結合フラグメントまたはそのコンジュゲート)の書く単位用量を別々に包装でき、キットは、１以上の単位用量(例えば、２単位用量、３単位用量、４単位用量、５単位用量、８単位用量、１０単位用量またはそれ以上)含み得る。具体的実施態様において、１以上の単位用量は、シリンジまたはペンに入れられる。
【0263】
有効量
所望により免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせた抗ＶＳＩＧ４抗体、その抗原結合フラグメントおよびそのコンジュゲートは、一般に意図する結果を達成するのに有効な量、例えばそれを必要とする対象における癌を処置するのに有効な量で使用される。抗ＶＳＩＧ４抗体(またはその抗原結合フラグメントまたはそのコンジュゲート)および／または免疫チェックポイント阻害剤を含む医薬組成物は、治療有効投与量で患者(例えば、ヒト対象)に投与され得る。
所望により免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせた抗ＶＳＩＧ４抗体、その抗原結合フラグメントおよびそのコンジュゲートは、一般に意図する結果を達成するのに有効な量、例えばそれを必要とする対象における癌を処置するのに有効な量で使用される。抗ＶＳＩＧ４抗体(またはその抗原結合フラグメントまたはそのコンジュゲート)および／または免疫チェックポイント阻害剤を含む医薬組成物は、治療有効投与量で患者(例えば、ヒト対象)に投与され得る。
【0264】
有効量の決定は、特にここに提供される詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。化合物またはコンジュゲートの毒性および治療有効性は、細胞培養および実験動物における標準製薬法により決定され得る。対象に投与すべき本組み合わせまたは他の治療剤の有効量は、疾患(例えば、癌)のステージ、分離および状態および一般的健康状態、年齢、性別、体重および薬物耐容性などの対象の特徴による。投与される本治療剤または組み合わせの有効量は、投与経路および剤形にも依存する。投与される投与量および間隔は、所望の治療効果の維持に十分な活性化合物の血漿レベルを提供するように個々に調節され得る。
【0265】
投与される抗ＶＳＩＧ４抗体またはその抗原結合フラグメントまたはそのコンジュゲートの量は、処置する疾患(例えば、癌)の性質およびステージ、投与の携帯、経路および部位、治療レジメン(例えば、治療剤を免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて使用するか否か)、処置する特定の対象の年齢および状態、抗体またはコンジュゲートで処置される患者の感受性を含む、多様な因子に依存する。適切な投与量は、当業者により容易に決定される。最終的に、医師が使用すべき適切な投与量を決定する。この投与量を、適切である頻度で反復し得る。副作用が生じたら、投与量および／または頻度を、通常の診療に従い、変えるかまたは減少し得る。適切な投与量および処置レジメンは、当業者に知られる慣用の技術を使用する治療の進行のモニタリングにより確立され得る。
【0266】
有効投与量は、最初にインビトロアッセイから推定され得る。例えば、動物で使用するための初期用量を、インビトロで測定したＶＳＩＧ４に対する抗体の結合親和性以上の抗ＶＳＩＧ４抗体の循環血液または血清濃度を達成するように、設定し得る。特定の抗体のバイオアベイラビリティを考慮に入れたこのような循環血液または血清濃度を達成する投与量の計算は、十分に当業者の能力の範囲内である。指針として、読者は、Fingl & Woodbury, “General Principles” in Goodman and Gilman’s The Pharmaceutical Basis of Therapeutics, Chapter 1, 最新版, Pagamonon Pressおよびその中の引用文献を紹介する。初期投与量を、動物モデルなどのインビボデータから推定し得る。癌などの特定の疾患の処置のための化合物の有効性の試験に有用な動物モデルは、一般に当分野で周知である。通常当業者は、ヒト投与に適する投与量を決定するためにこのような情報を日常的に応用できる。
【0267】
ここに記載する抗ＶＳＩＧ４抗体の有効用量は、処置する状態、投与経路および対象の年齢、体重および状態に依存して、単回(例えば、ボーラス)投与、複数投与または連続的投与あたり約０.００１～約７５mg／kg、または単回(例えば、ボーラス)投与、複数投与または連続的投与あたり０.０１～５０００μg／ml血清濃度の血清濃度を達成する範囲であってよく、またはその中のあらゆる有効範囲または値であり得る。ある実施態様において、各用量は、約０.５μg～約５０μg／体重キログラム、例えば約３μg～約３０μg／体重キログラムの範囲であり得る。
【0268】
投与の量、頻度および期間は、患者の年齢、体重および疾患状態などの多様な因子に依存する。投与の治療レジメンは、２週間～無期限、２週間～６か月間、３か月間～５年間、６か月間～１または２年間、８か月間～１８か月間など継続され得る。所望により、治療レジメンは、反復投与、例えば、１日１回、１日２回、２日毎、３日毎、１週毎、２週毎または１か月毎提供される。反復投与は、同じ用量または異なる用量であり得る。投与を、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回またはそれ以上繰り返し売る。治療有効量の抗ＶＳＩＧ４抗体またはそのコンジュゲート(所望により免疫チェックポイント阻害剤との組み合わせ)を、単回投与としてまたは治療レジメンの間に、例えば、１週間、２週間、３週間、１か月、３か月、６か月、１年またはそれより長期の間に投与し得る。
【0269】
処置方法
本抗ＶＳＩＧ４抗体が、例えば、Ｍ２マクロファージ分化促進およびＶＳＩＧ４介在免疫抑制阻害により、免疫応答を刺激する能力により、癌を含むＶＳＩＧ４により介在される多様な状態の処置に有用となる。ＶＳＩＧ４阻害性経路への治療介入は、故に、多種多様な癌の処置のための炎症およびＴ細胞介在免疫を調節する有望なアプローチを代表する。
本抗ＶＳＩＧ４抗体が、例えば、Ｍ２マクロファージ分化促進およびＶＳＩＧ４介在免疫抑制阻害により、免疫応答を刺激する能力により、癌を含むＶＳＩＧ４により介在される多様な状態の処置に有用となる。ＶＳＩＧ４阻害性経路への治療介入は、故に、多種多様な癌の処置のための炎症およびＴ細胞介在免疫を調節する有望なアプローチを代表する。
【0270】
ここに記載する抗ＶＳＩＧ４抗体、その抗原結合フラグメントまたはコンジュゲートは、故に、癌の処置、マクロファージによる炎症促進性サイトカインの遊離の誘導、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖誘導、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖誘導、ＣＤ４＋Ｔ細胞サイトカイン産生誘導およびＣＤ８＋Ｔ細胞サイトカイン産生誘導のための方法に使用でき、ここで、該方法は、それを必要とする対象に有効量の抗ＶＳＩＧ４抗体、その抗原結合フラグメントまたはコンジュゲートを投与することを含む。ここに記載する治療方法は、ここに記載するＶＳＩＧ４に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントまたはここに記載するこれら抗体を含むコンジュゲートの、それを必要とする患者への投与を含み得る。ここに開示するＶＳＩＧ４抗体、抗原結合フラグメントおよびそのコンジュゲートは、故に、癌の処置のための免疫、特にＴ細胞免疫の制御に有用である。
【0271】
従って、本発明の態様は、患者における癌の処置に使用するための、抗ＶＳＩＧ４抗体またはその抗原結合フラグメントまたはそのコンジュゲートに関する。また提供されるのは、癌の処置を必要とする対象におけるその処置方法、であって、患者に、ここに開示する抗ＶＳＩＧ４抗体、その抗原結合フラグメントまたはコンジュゲートを投与することを含む、方法である。本発明はまた癌の処置用医薬の製造のための、抗ＶＳＩＧ４抗体またはその抗原結合フラグメントまたはそのコンジュゲートの使用に関する。
【0272】
ある実施態様において、本発明は、患者における癌の処置にしようするための、ここに記載する抗ＶＳＩＧ４抗体または抗原結合フラグメントまたはそのコンジュゲートを含む組成物に関する。またここで提供されるのは、癌の処置を必要とする対象におけるその処置方法であって、患者にここに記載する抗ＶＳＩＧ４抗体または抗原結合フラグメントまたはそのコンジュゲートを含む組成物を投与することを含む、方法である。本発明はまた、癌の処置用医薬の製造のための、ここに記載する抗ＶＳＩＧ４抗体または抗原結合フラグメントまたはそのコンジュゲートを含む組成物の使用にも関する。
【0273】
ある実施態様において、癌は、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、卵管癌、胆嚢癌、消化器癌、頭頚部癌、血液学的癌(例えば、白血病、リンパ腫または骨髄腫)、喉頭癌、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、黒色腫、中皮腫、卵巣癌、原発性腹膜癌、唾液腺癌、肉腫、胃癌、甲状腺癌、膵臓癌、腎臓細胞癌腫、神経膠芽腫および前立腺癌から選択される。
【0274】
ある実施態様は、癌患者における免疫応答の誘導に使用するための、抗ＶＳＩＧ４抗体またはその抗原結合フラグメントまたはそのコンジュゲートを提供する。またここで提供されるのは、処置を必要とする癌患者における免疫応答の誘導をする方法であって、患者に、ここに開示する抗ＶＳＩＧ４抗体、その抗原結合フラグメントまたはコンジュゲートを投与することを含む、方法である。本発明はまた、癌患者における免疫応答の誘導のための医薬の製造のための、抗ＶＳＩＧ４抗体またはその抗原結合フラグメントまたはそのコンジュゲートの使用にも関する。
【0275】
ある実施態様において、本発明は、癌患者における免疫応答の誘導に使用するための、ここに記載する抗ＶＳＩＧ４抗体または抗原結合フラグメントまたはそのコンジュゲートを含む組成物に関する。またここで提供されるのは、処置を必要とする癌患者における免疫応答の方法であって、患者にここに記載する抗ＶＳＩＧ４抗体または抗原結合フラグメントまたはそのコンジュゲートを含む組成物を投与することを含む、方法である。本発明はまた、癌患者における免疫応答の誘導のための医薬の製造のための、ここに記載する抗ＶＳＩＧ４抗体または抗原結合フラグメントまたはそのコンジュゲートを含む組成物、の使用にも関する。
【0276】
ここに開示する抗体によりこうして産生された免疫応答は、マクロファージによる炎症促進性サイトカイン遊離の誘導、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖の誘導、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖の誘導、ＣＤ４＋Ｔ細胞サイトカイン産生の誘導およびＣＤ８＋Ｔ細胞サイトカイン産生の誘導を含むが、これらに限定されない。
【0277】
抗ＶＳＩＧ４抗体または抗原結合フラグメントまたはそのコンジュゲートを、さらなる化学療法剤、細胞毒性剤、抗体、リンホカインまたは造血増殖因子と混合し得る。特に、ここに記載する治療方法は、抗ＶＳＩＧ４抗体または抗原結合フラグメントまたはそのコンジュゲートと共に免疫チェックポイント阻害剤の投与を含む。免疫チェックポイント阻害剤および抗ＶＳＩＧ４抗体または抗原結合フラグメントまたはそのコンジュゲートは、同時に、別々にまたは逐次的に投与され得る。
【0278】
ここで使用する「チェックポイント阻害剤」は、免疫チェックポイントを標的とし、該免疫チェックポイントの機能を遮断する、例えば、小分子、可溶性受容体または抗体などの分子をいう。より具体的には、ここで使用する「チェックポイント阻害剤」は、Ｔ細胞などのあるタイプの免疫系細胞および一部癌細胞で産生されるあるタンパク質を遮断する、例えば、小分子、可溶性受容体または抗体などの分子をいう。
【0279】
第一の実施態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４(分子のＣＤ２ファミリーに属し、全ＮＫ、γδおよび記憶ＣＤ８＋(αβ)Ｔ細胞で発現される)、ＣＤ１６０(別名ＢＹ５５)、ＣＧＥＮ－１５０４９、ＣＨＫ１およびＣＨＫ２キナーゼ、ＩＤＯ１、Ａ２ａＲおよび種々のＢ－７ファミリーリガンドの何れかの阻害剤である。
【0280】
免疫チェックポイント阻害剤の例は、抗ＣＴＬＡ－４抗体(例えば、イピリムマブ)、抗ＬＡＧ－３抗体(例えば、ＢＭＳ－９８６０１６)、抗Ｂ７－Ｈ３抗体、抗Ｂ７－Ｈ４抗体、抗Ｔｉｍ３抗体(例えば、ＴＳＲ－０２２、ＭＢＧ４５３)、抗ＢＴＬＡ抗体、抗ＫＩＲ抗体、抗Ａ２ａＲ抗体、抗ＣＤ２００抗体、抗ＰＤ－１抗体(例えば、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、セミプリマブ、ピディリズマブ)、抗ＰＤ－Ｌ１抗体(例えば、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ＢＭＳ９３６５５９)、抗ＶＩＳＴＡ抗体(例えば、ＪＮＪ６１６１０５８８)、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ８０または－ＣＤ８６抗体、抗Ｂ７ＲＰ１抗体、抗Ｂ７－Ｈ３抗体、抗ＨＶＥＭ抗体、抗ＣＤ１３７抗体(例えば、ウレルマブ)、抗ＣＤ１３７Ｌ抗体、抗ＯＸ４０(例えば、９Ｂ１２、ＰＦ－０４５１８６００、ＭＥＤＩ６４６９)、抗ＯＸ４０Ｌ抗体、抗ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌ抗体、抗ＧＡＬ９抗体、抗ＩＬ－１０抗体、ＰＤ－１リガンドの細胞外ドメインの融合タンパク質、例えばＰＤＬ－１またはＰＤ－Ｌ２およびＩｇＧ１(例えば、ＡＭＰ－２２４)、ＯＸ４０リガンドの細胞外ドメインの融合タンパク質、例えばＯＸ４０ＬおよびＩｇＧ１(例えば、ＭＥＤＩ６３８３)、ＩＤＯ１薬物(例えば、エパカドスタット)およびＡ２ａＲ薬物を含む。多数の免疫チェックポイント阻害剤が承認されているか、現在臨床治験中である。このような阻害剤は、イピリムマブ、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、セミプリマブ、ピディリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ＢＭＳ９３６５５９、ＪＮＪ６１６１０５８８、ウレルマブ、９Ｂ１２、ＰＦ－０４５１８６００、ＢＭＳ－９８６０１６、ＴＳＲ－０２２、ＭＢＧ４５３、ＭＥＤＩ６４６９、ＭＥＤＩ６３８３およびエパカドスタットを含む。
【0281】
免疫チェックポイント阻害剤の例は、例えば、Marin-Acevedo et al., Journal of Hematology & Oncology 11: 8, 2018; Kavecansky and Pavlick, AJHO 13(2): 9-20, 2017; Wei et al., Cancer Discov 8(9): 1069-86, 2018に挙げられる。
【0282】
好ましくは、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、Ｔｉｍ３、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ１３７、ＯＸ４０またはＩＤＯ１の阻害剤である。
【0283】
診断方法
ＶＳＩＧは、多様な癌で過発現され、ＶＳＩＧ４が癌の診断のための信頼できるバイオマーカーであることを示す。故に、ＶＳＩＧ４タンパク質に結合するここに提供する標識抗体などの試薬を、診断目的で使用して、例えば、癌などの細胞増殖性疾患、障害または状態を検出、診断またはモニターできる。
ＶＳＩＧは、多様な癌で過発現され、ＶＳＩＧ４が癌の診断のための信頼できるバイオマーカーであることを示す。故に、ＶＳＩＧ４タンパク質に結合するここに提供する標識抗体などの試薬を、診断目的で使用して、例えば、癌などの細胞増殖性疾患、障害または状態を検出、診断またはモニターできる。
【0284】
ここに提供される抗ＶＳＩＧ４抗体が、ここに記載するまたは当業者に知られる古典的免疫組織学的方法を使用して、生物学的サンプルにおけるＶＳＩＧ４の検出またはＶＳＩＧ４レベルのアッセイに使用され得る(例えば、Jalkanen et al., 1985, J. Cell. Biol. 101:976-985; and Jalkanen et al., 1987, J. Cell. Biol. 105:3087-3096参照)。タンパク質遺伝子発現の検出に有用な他の抗体ベースの方法は、酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)および放射免疫アッセイ(ＲＩＡ)などの免疫アッセイを含む。適当な抗体アッセイ標識は当分野で知られ、グルコースオキシダーゼなどの酵素標識；ヨウ素(１２５Ｉ、１２１Ｉ)、炭素(１４Ｃ)、硫黄(３５Ｓ)、トリチウム(３Ｈ)、インジウム(１２１Ｉｎ)およびテクネチウム(９９Ｔｃ)などの放射性同位体；ルミノールなどの発光標識；およびフルオレッセインおよびローダミンおよびビオチンなどの蛍光標識を含む。
【0285】
故に、第一の態様において、本発明は、対象におけるＶＳＩＧ４発現癌を検出するためのインビトロ方法であって、
ａ)該対象の生物学的サンプルとここに開示する抗ＶＳＩＧ４抗体またはその抗原結合フラグメントを接触させ；そして
ｂ)該試薬と該生物学的サンプルの結合を検出する
工程を含む、方法。
ａ)該対象の生物学的サンプルとここに開示する抗ＶＳＩＧ４抗体またはその抗原結合フラグメントを接触させ；そして
ｂ)該試薬と該生物学的サンプルの結合を検出する
工程を含む、方法。
【0286】
本方法によると、ＶＳＩＧ４の結合は、ＶＳＩＧ４発現癌の存在を示す。好ましくは、腫瘍微小環境の免疫浸潤物における抗ＶＳＩＧ４抗体の結合は、ＶＳＩＧ４発現癌の存在を示す。
【0287】
本発明はまた対象におけるＶＳＩＧ４発現癌を検出するためのインビトロ方法であって、
ａ)該対象の生物学的サンプルと抗ＶＳＩＧ４抗体またはその抗原結合フラグメントを接触させ；そして
ｂ)該試薬と該生物学的サンプルの結合を定量する
工程を含む、方法にも関する。
ａ)該対象の生物学的サンプルと抗ＶＳＩＧ４抗体またはその抗原結合フラグメントを接触させ；そして
ｂ)該試薬と該生物学的サンプルの結合を定量する
工程を含む、方法にも関する。
【0288】
本方法によると、ＶＳＩＧ４の結合は、ＶＳＩＧ４発現癌の存在を示す。好ましくは、腫瘍微小環境の免疫浸潤物における抗ＶＳＩＧ４抗体の結合は、ＶＳＩＧ４発現癌の存在を示す。
【0289】
当業者には明らかなとおり、ＶＳＩＧ４に結合する抗体のレベルは、後期のとおり、当業者に知られる何れかの手段により定量され得る。好ましい方法は、ＥＬＩＳＡまたはＥＬＩＳＰＯＴなどの免疫酵素アッセイ、免疫蛍光、免疫組織化学(ＩＨＣ)、放射免疫アッセイ(ＲＩＡ)またはＦＡＣＳの使用を含む。
【0290】
本方法の工程ｂ)の定量は、サンプル、特に腫瘍微小環境の免疫浸潤物におけるＶＳＩＧ４発現レベルを直接反映する。本方法は、故に、上記のとおり、ＶＳＩＧ４の発現レベルの決定により、ＶＳＩＧ４発現癌の同定を可能とする。好ましい実施態様において、該サンプル、特に腫瘍微小環境の免疫浸潤物におけるＶＳＩＧ４の発現レベルを、対照レベルと比較する。
【0291】
さらに好ましい実施態様によると、本発明は、対象におけるＶＳＩＧ４発現癌を検出するためのインビトロ方法であって、
ａ)該対象の生物学的サンプルにおけるＶＳＩＧ４の発現レベルを決定し；そして
ｂ)工程ａ)の発現レベルと対照レベルを比較する；
工程を含み、ここで、対照レベルと比較して、工程ａ)でアッセイされたＶＳＩＧ４レベルの増加がＶＳＩＧ４発現癌の指標である、方法に関する。
ａ)該対象の生物学的サンプルにおけるＶＳＩＧ４の発現レベルを決定し；そして
ｂ)工程ａ)の発現レベルと対照レベルを比較する；
工程を含み、ここで、対照レベルと比較して、工程ａ)でアッセイされたＶＳＩＧ４レベルの増加がＶＳＩＧ４発現癌の指標である、方法に関する。
【0292】
本発明はまた対象におけるＶＳＩＧ４発現癌を診断するためのインビトロ方法であって、
ａ)該対象の生物学的サンプルにおけるＶＳＩＧ４の発現レベルを決定し；そして
ｂ)工程ａ)の発現レベルと対照レベルを比較する；
工程を含み、ここで、対照レベルと比較した工程(ｂ)でアッセイされたＶＳＩＧ４レベルの増加がＶＳＩＧ４発現癌の指標である、方法に関する。
ａ)該対象の生物学的サンプルにおけるＶＳＩＧ４の発現レベルを決定し；そして
ｂ)工程ａ)の発現レベルと対照レベルを比較する；
工程を含み、ここで、対照レベルと比較した工程(ｂ)でアッセイされたＶＳＩＧ４レベルの増加がＶＳＩＧ４発現癌の指標である、方法に関する。
【0293】
ＶＳＩＧ４の発現レベルを、有利に「対照レベル」または「対照発現レベル」とも称される対照細胞またはサンプルのレベルと比較するまたはそれに対して測定する。「対照レベル」、「対照発現レベル」、「対照レベル」および「対照」は、本明細書において相互交換可能に使用される。「対照レベル」は、一般に疾患または癌がない比較可能な対照細胞で測定される別のベースラインレベルである。該対照細胞は、癌患者であっても、腫瘍の部位である組織はなお非腫瘍健常組織を含むため、同じ個体からであり得る。正常または罹患または試験サンプルを得たのと同じ疾患を示さない、他の個体由来でもあり得る。本発明の状況において、用語「対照レベル」は、患者の癌細胞含有サンプルにおけるＶＳＩＧ４の発現試験レベルの評価に使用する、ＶＳＩＧ４の発現の「対照レベル」をいう。例えば、患者の生物学的サンプルにおけるＶＳＩＧ４レベルがＶＳＩＧ４の対照レベルより高いとき、細胞は、ＶＳＩＧ４の高レベルの発現または過発現を有すると考えられる。対照レベルは、複数の方法により決定され得る。発現レベルは、故に、ＶＳＩＧ４担持細胞、あるいは、ＶＳＩＧ４発現細胞数と無関係にＶＳＩＧ４の発現レベルを規定し得る。故に、各患者に対する対照レベルは、ＶＳＩＧ４の対照比により指示され得て、ここで、対照比は、ここに記載する対照レベルを決定する方法の何れかにより決定され得る。
【0294】
例えば、対照は、多様な形態をとり得る予め決定された値であり得る。それは、中央または平均などの単一カットオフ値であり得る。「対照レベル」は、全患者に個々に適用可能な単一数値であってよくまたは対照レベルは、患者の特異的下位集団で変わり得る。故に、例えば、高齢男性は、同じ癌の若齢男性と異なる対照レベルを有し得て、女性は、同じ癌について男性と異なる対照レベルを有し得る。あるいは、「対照レベル」は、試験する新生物細胞の組織と同じ組織からの非発癌性癌細胞におけるＶＳＩＧ４の発現レベルの測定により決定され得る。同様に、「対照レベル」は、患者の新生物細胞におけるＶＳＩＧ４対同じ患者内の非腫瘍細胞におけるＶＳＩＧ４レベルの特定の比である。「対照レベル」は、腫瘍細胞を模倣するよう操作され得るまたは対照レベルを正確に決定する発現レベルを生じるあらゆるその他の方法で操作できる、インビトロ培養細胞のＶＳＩＧ４レベルでもあり得る。他方で、「対照レベル」は、ＶＳＩＧ４レベルが上昇していない群およびＶＳＩＧ４レベルが上昇した群などの群比較に基づき、確立され得る。比較群の他の例は、特定の疾患、状態または症状を有する群および疾患がない群である。予め決定された値を、例えば、試験集団が、群に均等に(または不均等)分けられるとき、低リスク群、中リスク群および高リスク群などに配置し得る。
【0295】
対照レベルはまた同じ癌を有する患者の集団におけるＶＳＩＧ４レベルの比較によっても決定され得る。これは、例えば、患者のコホート全体がグラフ提示され、ここで、第一軸がＶＳＩＧ４レベルを表し、第二軸がコホートにおける腫瘍細胞があるレベルでＶＳＩＧ４を発現する患者数を表す、ヒストグラム分析により達成され得る。２以上の別々の患者群を、ＶＳＩＧ４が 同じまたは類似レベルであるコホートのサブセット集団の同定により、決定できる。次いで、対照レベルの決定を、これら別々の群を最良に区別するレベルに基づき行い得る。対照レベルは、２以上のマーカーのレベルを表し得て、その一方がＶＳＩＧ４である。２以上のマーカーは、例えば、各マーカーのレベルについての値の比により表わされ得る。
【0296】
同様に、見掛け上健常集団は、ＶＳＩＧ４の発現と関連する状態を有する集団と異なる‘正常’範囲を有する。従って、予め決定された選択値を、個体が入るカテゴリーの考慮に入れ得る。適切な範囲およびカテゴリーは、当業者の日常的を超えない実験により選択され得る。「上昇」、「増加」により、選択対照より高いことを意味する。一般に、対照は、適切な年齢層の見掛け上健常正常個体に基づく。
【0297】
本発明の対照は、予め決定された値に加えて、実験的物質と並行して試験した物質のサンプルであり得ることも理解される。冷は、同じ対象から同時に得た組織または細胞、例えば、対象からの単一生検の部分または単一細胞サンプルの部分を含む。
【0298】
好ましくは、ＶＳＩＧ４の対照レベルは、正常組織サンプル(例えば、ＶＳＩＧ４発現癌を有しない患者または疾患発症前の同じ患者から)におけるＶＳＩＧ４の発現レベルである。
【0299】
ＶＳＩＧ４発現癌のより確定的な診断により、医療従事者は、早期に予防手段または積極的処置を用いることが可能となり、それにより、ＶＳＩＧ４発現癌の発症またはさらなる進行を予防し得る。
【0300】
以下に、本発明を、実施例の観点で詳細に説明する。しかしながら、次の実施例は、本発明を説明するためのみに提供され、本発明が次の実施例に限定されないことは明らかである。
【実施例】
【0301】
実施例１：ＶＳＩＧ４の長いおよび短い形態の性質
１－１. マクロファージ上のＶＳＩＧ４長いおよび短い形態の発現
ＶＳＩＧ４は、マクロファージで発現することが知られる。発現差異の有無を試験するために、２形態のＶＳＩＧ４、すなわち、ＶＳＩＧ４(Ｌ)およびＶＳＩＧ４(Ｓ)の各々の存在を、Ｍ１およびＭ２マクロファージの抽出物で探索した。
５０ng／mlのＩＦＮ－γ(２８５－ＩＦ、R&D)をＧＭ－ＣＳＦ分化Ｍ０－マクロファージに加えて、炎症促進性Ｍ１－マクロファージに分極させた。各２０ng／mlの次のサイトカイン：ＩＬ－４(１３０.０９３.９２２、Miltenyi Biotec)、ＩＬ－１０(２１７－ＩＬ／ＣＦ、R&D)およびＴＧＦ－β(１３０.０９５.０６６、Miltenyi Biotec)をＭ－ＣＳＦ分化Ｍ０－マクロファージに加えて、免疫抑制性Ｍ２－マクロファージに分極させた。分化Ｍ０－マクロファージを、サイトカインと３７℃、５％ＣＯ２で２日間インキュベートした。Ｍ１およびＭ２分極マクロファージを８日目に得た。分極マクロファージを、１００ng／ml ＬＰＳ(Ｌ４５１６、Sigma)と４時間、３７℃、５％ＣＯ２で反応させた。マクロファージを次いで採取し、培養培地で洗浄した。分極Ｍ１－およびＭ２－マクロファージ上の標的抗体の結合を、ＬＰＳ活性化後フローサイトメトリーにより評価した。
１５μgのＭ１およびＭ２タンパク質抽出物を、１００ngのｈＶＳＩＧ４(Ｌ)－ｈＦｃおよびｈＶＳＩＧ４(Ｓ)－ｈＦｃと共にＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで流し、膜に移し、ＶＳＩＧ４に特異的なポリクローナル抗体(ＡＦ４６４６、R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)またはヤギアイソタイプ対照でプローブした。
予測サイズの２バンドがＭ２マクロファージからの抽出物で見られた(図１Ｂ)。この結果は、マクロファージにおけるＶＳＩＧ４の発現の先のデータを確認する。さらに、ｈＶＳＩＧ４(Ｓ)およびｈＶＳＩＧ４(Ｌ)両者がマクロファージで発現されることが示される。
１－１. マクロファージ上のＶＳＩＧ４長いおよび短い形態の発現
ＶＳＩＧ４は、マクロファージで発現することが知られる。発現差異の有無を試験するために、２形態のＶＳＩＧ４、すなわち、ＶＳＩＧ４(Ｌ)およびＶＳＩＧ４(Ｓ)の各々の存在を、Ｍ１およびＭ２マクロファージの抽出物で探索した。
５０ng／mlのＩＦＮ－γ(２８５－ＩＦ、R&D)をＧＭ－ＣＳＦ分化Ｍ０－マクロファージに加えて、炎症促進性Ｍ１－マクロファージに分極させた。各２０ng／mlの次のサイトカイン：ＩＬ－４(１３０.０９３.９２２、Miltenyi Biotec)、ＩＬ－１０(２１７－ＩＬ／ＣＦ、R&D)およびＴＧＦ－β(１３０.０９５.０６６、Miltenyi Biotec)をＭ－ＣＳＦ分化Ｍ０－マクロファージに加えて、免疫抑制性Ｍ２－マクロファージに分極させた。分化Ｍ０－マクロファージを、サイトカインと３７℃、５％ＣＯ２で２日間インキュベートした。Ｍ１およびＭ２分極マクロファージを８日目に得た。分極マクロファージを、１００ng／ml ＬＰＳ(Ｌ４５１６、Sigma)と４時間、３７℃、５％ＣＯ２で反応させた。マクロファージを次いで採取し、培養培地で洗浄した。分極Ｍ１－およびＭ２－マクロファージ上の標的抗体の結合を、ＬＰＳ活性化後フローサイトメトリーにより評価した。
１５μgのＭ１およびＭ２タンパク質抽出物を、１００ngのｈＶＳＩＧ４(Ｌ)－ｈＦｃおよびｈＶＳＩＧ４(Ｓ)－ｈＦｃと共にＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで流し、膜に移し、ＶＳＩＧ４に特異的なポリクローナル抗体(ＡＦ４６４６、R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)またはヤギアイソタイプ対照でプローブした。
予測サイズの２バンドがＭ２マクロファージからの抽出物で見られた(図１Ｂ)。この結果は、マクロファージにおけるＶＳＩＧ４の発現の先のデータを確認する。さらに、ｈＶＳＩＧ４(Ｓ)およびｈＶＳＩＧ４(Ｌ)両者がマクロファージで発現されることが示される。
【0302】
１－２. 腫瘍におけるＶＳＩＧ４長および短い形態の発現
腫瘍における両ＶＳＩＧ４形態の発現を試験した。ＶＳＩＧ４遺伝子はＸ染色体に存在し、７エクソンが遺伝子モデルで示される。これにより、選択的スプライシングにより産生される２メッセンジャーＲＮＡが生ずる。それぞれｈＶＳＩＧ４(Ｌ)およびｈＶＳＩＧ４(Ｓ)を生ずる１個の長い形態、長－VSIG4(uc004dwh.2)および１個の短い形態、短－VSIG4(uc004dwi.2)。The Cancer Genome Atlas(ＴＣＧＡ)は、２０,０００を超える原発癌および３３癌タイプにわたる調和正常サンプルの特徴づけから得たデータを含む。ＴＣＧＡ腫瘍発現データ(Tumor TCGA RNASeq)を使用して、ISOexpresso(Yang et al., BMC Genomics (2016) 17: 631 ; http://wiki.tgilab.org/ISOexpresso/)で２アイソフォームの発現パターンを決定した。
結果を表３に示す。
腫瘍における両ＶＳＩＧ４形態の発現を試験した。ＶＳＩＧ４遺伝子はＸ染色体に存在し、７エクソンが遺伝子モデルで示される。これにより、選択的スプライシングにより産生される２メッセンジャーＲＮＡが生ずる。それぞれｈＶＳＩＧ４(Ｌ)およびｈＶＳＩＧ４(Ｓ)を生ずる１個の長い形態、長－VSIG4(uc004dwh.2)および１個の短い形態、短－VSIG4(uc004dwi.2)。The Cancer Genome Atlas(ＴＣＧＡ)は、２０,０００を超える原発癌および３３癌タイプにわたる調和正常サンプルの特徴づけから得たデータを含む。ＴＣＧＡ腫瘍発現データ(Tumor TCGA RNASeq)を使用して、ISOexpresso(Yang et al., BMC Genomics (2016) 17: 631 ; http://wiki.tgilab.org/ISOexpresso/)で２アイソフォームの発現パターンを決定した。
結果を表３に示す。
【0303】
【表3】
長および短の両ＶＳＩＧ４アイソフォームが腫瘍において発現される。
【0304】
１－３. ｈＶＳＩＧ４(Ｓ)およびｈＶＳＩＧ４(Ｌ)によるＣＤ４
＋
Ｔ細胞活性化の阻害
９６ウェルプレートを、１００μl／ウェルで４時間、３７℃で２.５μg／mlの抗ＣＤ３ ＯＫＴ３抗体(BioxCell ref BE0001-2 clone OKT3)で被覆し、２回ＰＢＳで洗浄し、１０μg／mlの組み換えタンパク質(ＶＳＩＧ４(Ｌ)－Ｆｃ(配列番号１８３)、ＶＧＩＧ４(Ｓ)－Ｆｃ(配列番号１８４)、ＰＤＬ１－Ｆｃ(R&D Systems 156-B7)またはアイソタイプ対照ｈＩｇＧ１(ｃ９Ｇ４))で被覆し、一夜、４℃でインキュベートした。ウェルを２回ＰＢＳで洗浄し、２００,０００の健常ドナーから陰性精製したＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＦＳＥ標識を、２００μlの培養培地中各ウェルに加えた。
３日間養後、上清を新しいプレートに移し、ＩＦＮ γ遊離についてＭＳＤにより分析した。さらに、細胞を、フローサイトメトリーにより分析して、増殖速度を評価した。
図２Ａは、両形態のＶＳＩＧ４(ＶＳＩＧ４(Ｓ)およびＶＳＩＧ４(Ｌ))がＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を阻害することを示す。同様に、両形態は、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＦＮγ遊離を阻害する(図２Ｂ)。
９６ウェルプレートを、１００μl／ウェルで４時間、３７℃で２.５μg／mlの抗ＣＤ３ ＯＫＴ３抗体(BioxCell ref BE0001-2 clone OKT3)で被覆し、２回ＰＢＳで洗浄し、１０μg／mlの組み換えタンパク質(ＶＳＩＧ４(Ｌ)－Ｆｃ(配列番号１８３)、ＶＧＩＧ４(Ｓ)－Ｆｃ(配列番号１８４)、ＰＤＬ１－Ｆｃ(R&D Systems 156-B7)またはアイソタイプ対照ｈＩｇＧ１(ｃ９Ｇ４))で被覆し、一夜、４℃でインキュベートした。ウェルを２回ＰＢＳで洗浄し、２００,０００の健常ドナーから陰性精製したＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＦＳＥ標識を、２００μlの培養培地中各ウェルに加えた。
３日間養後、上清を新しいプレートに移し、ＩＦＮ γ遊離についてＭＳＤにより分析した。さらに、細胞を、フローサイトメトリーにより分析して、増殖速度を評価した。
図２Ａは、両形態のＶＳＩＧ４(ＶＳＩＧ４(Ｓ)およびＶＳＩＧ４(Ｌ))がＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を阻害することを示す。同様に、両形態は、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＦＮγ遊離を阻害する(図２Ｂ)。
【0305】
実施例２. ＶＳＩＧ４抗原の産生および精製
２－１. ＶＳＩＧ４抗原タンパク質を発現するベクターの構築
ＶＳＩＧ４タンパク質クローニングのために、ＶＳＩＧ４用プライマー(表４)を使用するポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)により、Ｊｕｒｋａｔ細胞ｃＤＮＡライブラリー(Stratagene, USA)を増幅し、プライマーは、細胞外ドメイン(２０Ａｒｇ～Ｓｅｒ２８１)のみを得るために、５’および３’に制限酵素部位ＳｆｉＩを含む。増幅ＰＣＲ産物を、Ｎ２９３Ｆベクターカルボキシ末端でヒトＦｃ(ｈＦｃ)またはマウスＦｃ(ｍＦｃ)と融合させる(図４)。
２－１. ＶＳＩＧ４抗原タンパク質を発現するベクターの構築
ＶＳＩＧ４タンパク質クローニングのために、ＶＳＩＧ４用プライマー(表４)を使用するポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)により、Ｊｕｒｋａｔ細胞ｃＤＮＡライブラリー(Stratagene, USA)を増幅し、プライマーは、細胞外ドメイン(２０Ａｒｇ～Ｓｅｒ２８１)のみを得るために、５’および３’に制限酵素部位ＳｆｉＩを含む。増幅ＰＣＲ産物を、Ｎ２９３Ｆベクターカルボキシ末端でヒトＦｃ(ｈＦｃ)またはマウスＦｃ(ｍＦｃ)と融合させる(図４)。
【0306】
【表4】
【0307】
２－２. ＶＳＩＧ４抗原タンパク質発現および精製
ＰＥＩ(ポリエチレンイミン：#23966, Polysciences, USA)の使用により、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞(Invitrogen, USA)を、調製したＶＳＩＧ４抗原プラスミドでトランスフェクトした。その後、細胞を、７日間、無血清培地であるＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３発現培地(#AG100009, Thermo Fisher Scientific, USA)で培養した。ＶＳＩＧ４抗原を含む細胞培養物を集め、１０分間、５,０００rpmで遠心分し、残存細胞および浮遊物を、０.２２μm ＴＯＰ－フィルター(Millipore, USA)を使用して除去した。プロテインＡアガロース樹脂を使用する親和性クロマトグラフィーに基づき、抗原の第一精製を実施した。第一精製後得たタンパク質を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００(１.５cm×１００cm)ゲル濾過クロマトグラフィーを使用する第二精製に付した。
精製タンパク質の純度を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ(ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動)で還元条件で決定した。その結果、図５に示すとおり、精製ＶＳＩＧ４－ｈＦｃおよびＶＳＩＧ４－ｍＦｃタンパク質の純度は９５％以上であることが判明した。
ＰＥＩ(ポリエチレンイミン：#23966, Polysciences, USA)の使用により、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞(Invitrogen, USA)を、調製したＶＳＩＧ４抗原プラスミドでトランスフェクトした。その後、細胞を、７日間、無血清培地であるＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３発現培地(#AG100009, Thermo Fisher Scientific, USA)で培養した。ＶＳＩＧ４抗原を含む細胞培養物を集め、１０分間、５,０００rpmで遠心分し、残存細胞および浮遊物を、０.２２μm ＴＯＰ－フィルター(Millipore, USA)を使用して除去した。プロテインＡアガロース樹脂を使用する親和性クロマトグラフィーに基づき、抗原の第一精製を実施した。第一精製後得たタンパク質を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００(１.５cm×１００cm)ゲル濾過クロマトグラフィーを使用する第二精製に付した。
精製タンパク質の純度を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ(ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動)で還元条件で決定した。その結果、図５に示すとおり、精製ＶＳＩＧ４－ｈＦｃおよびＶＳＩＧ４－ｍＦｃタンパク質の純度は９５％以上であることが判明した。
【0308】
実施例３. ＶＳＩＧ４ヒト抗体の選択
３－１. バイオパニング
実施例２で調製したＶＳＩＧ４－ｈＦｃおよびＶＳＩＧ４－ｍＦｃおよびSino Biological Inc.から購入したＶＳＩＧ４－ｈｉｓ(１２１６３－Ｈ０８Ｈ)タンパク質抗原および非特異的結合の指標として使用するＩＴＧＡ６－Ｆｃを、immunosorbチューブに被覆(５０μg)し、続いて遮断した。
ヒト抗体ライブラリーファージに関して、細菌を、２.７×１０１０バラエティを有するヒトｓｃＦｖ(一本鎖可変フラグメント)ライブラリーに感染させ、次いで１６時間、３０℃で培養した。培養後、遠心分離を実施して、上清をＰＥＧ(ポリエチレングリコール、Sigma)で濃縮し、結果物をＰＢＳ緩衝液に溶解して、ヒト抗体ライブラリーを調製した。ライブラリーファージをimmunosorbチューブに加え、２時間、室温で反応させた。次いで、１回ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０(ＰＢＳ－Ｔ)および１回ＰＢＳで洗浄後、抗原に特異的に結合したｓｃＦｖ－ファージのみを溶出した。
増幅のために細菌を溶出ファージに再感染させるパンニング工程を介して、陽性ファージのプールを得た。第一ラウンドで増幅したファージに関して、第二および第三ラウンドパニングを、ＰＢＳ－Ｔ洗浄工程数を増やした以外、第一ラウンドと同じ方法で実施した。その結果、表５に示すとおり、第三ラウンドパニング中抗原に結合したファージ数は、インプットに比してアウトプットの観点で増加した。
３－１. バイオパニング
実施例２で調製したＶＳＩＧ４－ｈＦｃおよびＶＳＩＧ４－ｍＦｃおよびSino Biological Inc.から購入したＶＳＩＧ４－ｈｉｓ(１２１６３－Ｈ０８Ｈ)タンパク質抗原および非特異的結合の指標として使用するＩＴＧＡ６－Ｆｃを、immunosorbチューブに被覆(５０μg)し、続いて遮断した。
ヒト抗体ライブラリーファージに関して、細菌を、２.７×１０１０バラエティを有するヒトｓｃＦｖ(一本鎖可変フラグメント)ライブラリーに感染させ、次いで１６時間、３０℃で培養した。培養後、遠心分離を実施して、上清をＰＥＧ(ポリエチレングリコール、Sigma)で濃縮し、結果物をＰＢＳ緩衝液に溶解して、ヒト抗体ライブラリーを調製した。ライブラリーファージをimmunosorbチューブに加え、２時間、室温で反応させた。次いで、１回ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０(ＰＢＳ－Ｔ)および１回ＰＢＳで洗浄後、抗原に特異的に結合したｓｃＦｖ－ファージのみを溶出した。
増幅のために細菌を溶出ファージに再感染させるパンニング工程を介して、陽性ファージのプールを得た。第一ラウンドで増幅したファージに関して、第二および第三ラウンドパニングを、ＰＢＳ－Ｔ洗浄工程数を増やした以外、第一ラウンドと同じ方法で実施した。その結果、表５に示すとおり、第三ラウンドパニング中抗原に結合したファージ数は、インプットに比してアウトプットの観点で増加した。
【表5】
【0309】
３－２. ポリファージＥＬＩＳＡ
実施例３－１のパンニング工程の各ラウンドから得ている陽性ポリｓｃＦｖ－ファージ抗体プールの抗原特異性を試験するため、ポリファージＥＬＩＳＡ(酵素結合免疫吸着アッセイ)を実施した。
第一～第三ラウンドの各パニング後凍結させた細胞ストックを、ＯＤ６００が０.１となるように２×ＹＴＣＭ(酵母抽出物１０ｇ、トリプトン１７ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、クロラムフェニコール３４μg／ml)、２％グルコースおよび５mM塩化マグネシウム(ＭｇＣｌ２)を含む培地に加え、２～３時間、３７℃で培養した(ＯＤ６００＝０.５～０.７)。次いで、Ｍ１ヘルパーファージで感染後、１６時間、３０℃で、２×ＹＴＣＭＫ(２×ＹＴＣＭ、カナマイシン３５μg／ml)、５mM塩化マグネシウムおよび１mM ＩＰＴＧを含む培地での培養を実施した。培養細胞を遠心分離(４,５００rpm、１５分、４℃)し、上清を新しいチューブに移した。９６ウェル免疫プレート(#439454, NUNC, USA)で、２抗原の各々を、１００ng／ウェルの量で、４℃で１６時間、コーティング緩衝液を使用して被覆し、次いで各ウェルを、ＰＢＳに溶解した４％スキムミルクを使用して遮断した。その後、各ウェルを０.２mlのＰＢＳ－Ｔで洗浄し、第一～第三パニングポリｓｃＦｖ－ファージを、各ウェルに、各１００μl量で加え、続いて、２時間、室温で反応させた。その後また、各ウェルを４回０.２mlのＰＢＳ－Ｔで洗浄し、抗Ｍ１３－ＨＲＰ(Amersham 27-9421-01)を二次抗体として１：２,０００希釈後、抗体との反応を、１時間、室温で実施した。ＰＢＳ－Ｔで洗浄後、ＯＰＤ錠(Sigma。８７８７－ＴＡＢ)をＰＣ緩衝液(０.１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、０.００５Ｍ Ｎａ－シトレート、ｐＨ５.０)中で調製し、ウェルに加え(１００μl／ウェル)、１０分間発色させた。次いで、４９０nmの吸光を分光光度計(Molecular Device, USA)を使用して、測定した。
図６に結果を示し、ＥＬＩＳＡにより、抗原の結合性が２ＶＳＩＧ４抗原について、第三ポリｓｃＦｖ－ファージで富化されたことが確認された。
実施例３－１のパンニング工程の各ラウンドから得ている陽性ポリｓｃＦｖ－ファージ抗体プールの抗原特異性を試験するため、ポリファージＥＬＩＳＡ(酵素結合免疫吸着アッセイ)を実施した。
第一～第三ラウンドの各パニング後凍結させた細胞ストックを、ＯＤ６００が０.１となるように２×ＹＴＣＭ(酵母抽出物１０ｇ、トリプトン１７ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、クロラムフェニコール３４μg／ml)、２％グルコースおよび５mM塩化マグネシウム(ＭｇＣｌ２)を含む培地に加え、２～３時間、３７℃で培養した(ＯＤ６００＝０.５～０.７)。次いで、Ｍ１ヘルパーファージで感染後、１６時間、３０℃で、２×ＹＴＣＭＫ(２×ＹＴＣＭ、カナマイシン３５μg／ml)、５mM塩化マグネシウムおよび１mM ＩＰＴＧを含む培地での培養を実施した。培養細胞を遠心分離(４,５００rpm、１５分、４℃)し、上清を新しいチューブに移した。９６ウェル免疫プレート(#439454, NUNC, USA)で、２抗原の各々を、１００ng／ウェルの量で、４℃で１６時間、コーティング緩衝液を使用して被覆し、次いで各ウェルを、ＰＢＳに溶解した４％スキムミルクを使用して遮断した。その後、各ウェルを０.２mlのＰＢＳ－Ｔで洗浄し、第一～第三パニングポリｓｃＦｖ－ファージを、各ウェルに、各１００μl量で加え、続いて、２時間、室温で反応させた。その後また、各ウェルを４回０.２mlのＰＢＳ－Ｔで洗浄し、抗Ｍ１３－ＨＲＰ(Amersham 27-9421-01)を二次抗体として１：２,０００希釈後、抗体との反応を、１時間、室温で実施した。ＰＢＳ－Ｔで洗浄後、ＯＰＤ錠(Sigma。８７８７－ＴＡＢ)をＰＣ緩衝液(０.１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、０.００５Ｍ Ｎａ－シトレート、ｐＨ５.０)中で調製し、ウェルに加え(１００μl／ウェル)、１０分間発色させた。次いで、４９０nmの吸光を分光光度計(Molecular Device, USA)を使用して、測定した。
図６に結果を示し、ＥＬＩＳＡにより、抗原の結合性が２ＶＳＩＧ４抗原について、第三ポリｓｃＦｖ－ファージで富化されたことが確認された。
【0310】
３－３. 陽性ファージ選択
高結合性を有する多クローンファージ抗体群から得たコロニー(第三パニング)を、２×ＹＴＣＭ、２％グルコースおよび５mM塩化マグネシウムを含む１ml 培地を使用して、１６時間、３７℃で９６深ウェルプレート(#90030, Bioneer, Korea)で培養した。培養細胞から、ＯＤ６００が０.１となるよう１００～２００μlを採り、次いで１ml ２×ＹＴＣＭ、２％グルコースおよび５mM塩化マグネシウムを含む培地に加え、２～３時間、３７℃で、ＯＤ６００が０.５～０.７となるよう、９６深ウェルプレートで培養した。Ｍ１ヘルパーファージの感染をＭＯＩ値が１：２０となるよう実施し、次いで２×ＹＴＣＭＫ、５mM塩化マグネシウムおよび１mM ＩＰＴＧを含む培地で、１６時間、３０℃で培養した。
９６ウェル免疫プレートで、抗原ＶＳＩＧ４を、１００ng／ウェル量で、４℃で１６時間被覆し、次いで各ウェルをＰＢＳに溶解した４％スキムミルクを使用して遮断した。その後、各ウェルを０.２mlのＰＢＳ－Ｔで洗浄し、１６時間培養した単一クローンｃＦｖ－ファージ(各１００ ｓｃＦｖ－ファージ)を、１００μl量で各ウェルに加え、２時間、室温で反応させた。その後また、各ウェルを４回０.２mlのＰＢＳ－Ｔで洗浄し、抗Ｍ１３－ＨＲＰを二次抗体として１：２,０００希釈後、抗体と、１時間、室温で反応させた。ＰＢＳ－Ｔで洗浄後(０.２ml)、発色させ、４９０nmの吸光度を測定した。
結果は図７に示し、各抗原に高結合性を有する単一ファージクローンに関して、合わせて数十の単一ファージクローンをＶＳＩＧ４に対して得た。
高結合性を有する多クローンファージ抗体群から得たコロニー(第三パニング)を、２×ＹＴＣＭ、２％グルコースおよび５mM塩化マグネシウムを含む１ml 培地を使用して、１６時間、３７℃で９６深ウェルプレート(#90030, Bioneer, Korea)で培養した。培養細胞から、ＯＤ６００が０.１となるよう１００～２００μlを採り、次いで１ml ２×ＹＴＣＭ、２％グルコースおよび５mM塩化マグネシウムを含む培地に加え、２～３時間、３７℃で、ＯＤ６００が０.５～０.７となるよう、９６深ウェルプレートで培養した。Ｍ１ヘルパーファージの感染をＭＯＩ値が１：２０となるよう実施し、次いで２×ＹＴＣＭＫ、５mM塩化マグネシウムおよび１mM ＩＰＴＧを含む培地で、１６時間、３０℃で培養した。
９６ウェル免疫プレートで、抗原ＶＳＩＧ４を、１００ng／ウェル量で、４℃で１６時間被覆し、次いで各ウェルをＰＢＳに溶解した４％スキムミルクを使用して遮断した。その後、各ウェルを０.２mlのＰＢＳ－Ｔで洗浄し、１６時間培養した単一クローンｃＦｖ－ファージ(各１００ ｓｃＦｖ－ファージ)を、１００μl量で各ウェルに加え、２時間、室温で反応させた。その後また、各ウェルを４回０.２mlのＰＢＳ－Ｔで洗浄し、抗Ｍ１３－ＨＲＰを二次抗体として１：２,０００希釈後、抗体と、１時間、室温で反応させた。ＰＢＳ－Ｔで洗浄後(０.２ml)、発色させ、４９０nmの吸光度を測定した。
結果は図７に示し、各抗原に高結合性を有する単一ファージクローンに関して、合わせて数十の単一ファージクローンをＶＳＩＧ４に対して得た。
【0311】
３－４. 陽性ファージ抗体のヌクレオチドシーケンシング
上記のとおり選択した単一クローンについて、ＤＮＡ－ｐｒｅｐを、ＤＮＡ精製キット(Qiagen, Germany)を使用して実施して、ＤＮＡを得た。Macrogen, Koreaに、ＤＮＡシーケンシングを依頼した。シーケンシング結果から、選択抗体の重鎖可変領域(ＶＨ)および軽鎖可変領域(ＶＬ)のＣＤＲ部位を決定した。次いで、これら抗体と生殖系列抗体群の間の類似性を、ＮＣＢＩウェブページに提供されるＩｇ ＢＬＡＳＴプログラムを使用して、試験した(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)。その結果、３９タイプのＶＳＩＧ４特異的ファージ抗体を得て、１１種をより具体的に特徴づけした。表２に要約する。
上記のとおり選択した単一クローンについて、ＤＮＡ－ｐｒｅｐを、ＤＮＡ精製キット(Qiagen, Germany)を使用して実施して、ＤＮＡを得た。Macrogen, Koreaに、ＤＮＡシーケンシングを依頼した。シーケンシング結果から、選択抗体の重鎖可変領域(ＶＨ)および軽鎖可変領域(ＶＬ)のＣＤＲ部位を決定した。次いで、これら抗体と生殖系列抗体群の間の類似性を、ＮＣＢＩウェブページに提供されるＩｇ ＢＬＡＳＴプログラムを使用して、試験した(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)。その結果、３９タイプのＶＳＩＧ４特異的ファージ抗体を得て、１１種をより具体的に特徴づけした。表２に要約する。
【0312】
実施例４. ＶＳＩＧ４ヒト抗体の産生
４－１. ｓｃＦｖ形態のＩｇＧ形態への変換
ＶＳＩＧ４の３９タイプの選択単一クローンファージ抗体をＩｇＧ形に完全変換させるために、重鎖および軽鎖の可変領域に対応するＤＮＡ配列を、それぞれＳｆｉＩ／ＮｈｅＩおよびＳｆｉＩ／ＢｇｌＩＩの制限酵素部位を含むプライマーを使用するＰＣＲ(ｉＣｙｃｌｅｒ ｉＱ、ＢＩＯ－ＲＡＤ、ＵＳＡ)に付した。重鎖および軽鎖ＰＣＲ産物を、対応する制限酵素部位を有する各発現ベクターで消化させ、ＤＮＡをＤＮＡ－ゲル抽出キット(Ｑｉａｇｅｎ)で精製した。ライゲーションについて、ベクター(１μl、１０ng)、重鎖または軽鎖(１００～２００ng、１５μl)、１０Ｘ緩衝液(２μl)、リガーゼ(１Ｕ／μl、１μl)および水を互いに混合し、１～２時間、室温に維持し、細胞に形質転換のために加えた(コンピテント細胞、XL1-blue)。結果物を５分間氷上に維持し、次いでヒートショックを４２℃で９０秒間かけた。ヒートショック後、細胞に１mlの培地を加え、１時間、３７℃で培養し、続いて、ＬＢ Ａｍｐプレートに広げ、１６時間、３７℃で培養した。こうして得たコロニーを回収し、５mlのＬＢ Ａｍｐ培地に広げた。１６時間、３７℃で培養後、ＤＮＡ－ｐｒｅｐを、ＤＮＡ－ｐｒｅｐキット(Nuclogen)を使用して実施した。こうして得たＤＮＡのＤＮＡシーケンシングを依頼した(Macrogen, Korea)。
その結果、完全ＩｇＧに変換されたＶＳＩＧ４の１１タイプの抗体クローンの重鎖および軽鎖の各々が、ファージ抗体の配列に対応することが確認された。その後、配列が同定された重鎖および軽鎖プラスミドＤＮＡを、抗体産生のために使用した。
４－１. ｓｃＦｖ形態のＩｇＧ形態への変換
ＶＳＩＧ４の３９タイプの選択単一クローンファージ抗体をＩｇＧ形に完全変換させるために、重鎖および軽鎖の可変領域に対応するＤＮＡ配列を、それぞれＳｆｉＩ／ＮｈｅＩおよびＳｆｉＩ／ＢｇｌＩＩの制限酵素部位を含むプライマーを使用するＰＣＲ(ｉＣｙｃｌｅｒ ｉＱ、ＢＩＯ－ＲＡＤ、ＵＳＡ)に付した。重鎖および軽鎖ＰＣＲ産物を、対応する制限酵素部位を有する各発現ベクターで消化させ、ＤＮＡをＤＮＡ－ゲル抽出キット(Ｑｉａｇｅｎ)で精製した。ライゲーションについて、ベクター(１μl、１０ng)、重鎖または軽鎖(１００～２００ng、１５μl)、１０Ｘ緩衝液(２μl)、リガーゼ(１Ｕ／μl、１μl)および水を互いに混合し、１～２時間、室温に維持し、細胞に形質転換のために加えた(コンピテント細胞、XL1-blue)。結果物を５分間氷上に維持し、次いでヒートショックを４２℃で９０秒間かけた。ヒートショック後、細胞に１mlの培地を加え、１時間、３７℃で培養し、続いて、ＬＢ Ａｍｐプレートに広げ、１６時間、３７℃で培養した。こうして得たコロニーを回収し、５mlのＬＢ Ａｍｐ培地に広げた。１６時間、３７℃で培養後、ＤＮＡ－ｐｒｅｐを、ＤＮＡ－ｐｒｅｐキット(Nuclogen)を使用して実施した。こうして得たＤＮＡのＤＮＡシーケンシングを依頼した(Macrogen, Korea)。
その結果、完全ＩｇＧに変換されたＶＳＩＧ４の１１タイプの抗体クローンの重鎖および軽鎖の各々が、ファージ抗体の配列に対応することが確認された。その後、配列が同定された重鎖および軽鎖プラスミドＤＮＡを、抗体産生のために使用した。
【0313】
４－２. ヒト抗体の産生
重鎖および軽鎖を含む調製した発現ベクターを、６：４比でＨＥＫ－２９３Ｆ細胞に共トランスフェクションした。共トランスフェクション７日後、上清を集め、細胞および浮遊物質を遠心分離および０.２２μm Ｔｏｐ－フィルターで除去した。上清を集め、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーに付して、ＩｇＧ抗体を生成した。精製後、抗体をリシン緩衝液を使用して分離し、緩衝液交換を、最終再懸濁液緩衝液がＰＢＳであるように実施した。精製抗体をＢＣＡおよびNano-dropにより定量して、産生量を決定した。次いで、抗体を、還元条件および非還元条件各５μgの負荷で、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析に付した。従って、精製タンパク質の純度および移動性状態を決定した。
結果を図８に示し、１１タイプタイプのＶＳＩＧ４単一ヒト抗体が、非還元条件下で最小１５０kDaサイズで検出され、産生量は種々であり、すなわち、５mg／Ｌほど低くから、１４２.６mg／Ｌほど高いものまでであった。
重鎖および軽鎖を含む調製した発現ベクターを、６：４比でＨＥＫ－２９３Ｆ細胞に共トランスフェクションした。共トランスフェクション７日後、上清を集め、細胞および浮遊物質を遠心分離および０.２２μm Ｔｏｐ－フィルターで除去した。上清を集め、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーに付して、ＩｇＧ抗体を生成した。精製後、抗体をリシン緩衝液を使用して分離し、緩衝液交換を、最終再懸濁液緩衝液がＰＢＳであるように実施した。精製抗体をＢＣＡおよびNano-dropにより定量して、産生量を決定した。次いで、抗体を、還元条件および非還元条件各５μgの負荷で、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析に付した。従って、精製タンパク質の純度および移動性状態を決定した。
結果を図８に示し、１１タイプタイプのＶＳＩＧ４単一ヒト抗体が、非還元条件下で最小１５０kDaサイズで検出され、産生量は種々であり、すなわち、５mg／Ｌほど低くから、１４２.６mg／Ｌほど高いものまでであった。
【0314】
実施例５. ＶＳＩＧ４ヒト抗体のＶＳＩＧ４結合性
５－１. 細胞表面のＶＳＩＧ４への抗体結合特異性
ヒトＶＳＩＧ４が過発現する形質転換細胞プールを得るために、ＨＥＫ２９３Ｅを、ヒトＶＳＩＧ４含有ｐｃＤＮＡ３.１プラスミドでトランスフェクトし、次いで選択過程を、４００μg／mlゼオシン(#R25001, Thermo Fisher Scientific)含有選択培地で実施した。選択過程後、ＶＳＩＧ４が過発現する細胞プールを、ＡＰＣ(アロフィコシアニン)蛍光物質に連結した抗ヒトＶＳＩＧ４抗体(#17-5757-42, ebioscience, USA)を使用するＦＡＣＳ(蛍光標示式細胞分取)分析による、発現状態の決定により、分離し(図９Ｂ)、ヒトＶＳＩＧ４が過発現するＨＥＫ２９３Ｅ細胞プールにおける母細胞として使用するＨＥＫ２９３Ｅ細胞において、ＡＰＣ蛍光物質に連結した抗ヒトＶＳＩＧ４抗体を使用するによりＶＳＩＧ４の基底発現がないことを決定後(図９Ａ)、抗体性質分析の評価を、１１タイプの抗ヒトＶＳＩＧ４抗体で、これら２タイプの細胞を使用して、実施した。
ＶＳＩＧ４抗体による細胞結合の確認のため、０.５×１０６細胞を各サンプルについて調製し、抗体と、０.０８μg／ml、０.４μg／mlまたは２μg／mlで３０分間、４℃で反応させた。その後、細胞を、３回２％ＰＢＳ含有緩衝液で洗浄し、２０分間、４℃でＦＩＴＣ(フルオレッセインイソチオシアネート)蛍光物質に連結した抗ヒトＩｇＧ抗体(＃ＦＩ－３０００、Vectorlabs)と反応後、細胞を上記と同じ洗浄過程で、続いて２％ＦＰＳ含有０.５ml ＰＢＳの懸濁液で洗浄した。次いで、細胞を、FACSCanto IIフローサイトメーターで分析した。その結果、１１個のタイプのヒトＶＳＩＧ４単一抗体全て、ヒトＶＳＩＧ４過発現細胞に、濃度依存的方法で良好に結合することが判明した(図１０Ｂ)。しかしながら、ＶＳＩＧ４の基底発現がないＨＥＫ２９３Ｅ細胞に結合しなかった(図１０Ａ)。この結果は、１１個タイプのヒトＶＳＩＧ４単一抗体がヒトＶＳＩＧ４抗原に特異的に結合することを示す。
５－１. 細胞表面のＶＳＩＧ４への抗体結合特異性
ヒトＶＳＩＧ４が過発現する形質転換細胞プールを得るために、ＨＥＫ２９３Ｅを、ヒトＶＳＩＧ４含有ｐｃＤＮＡ３.１プラスミドでトランスフェクトし、次いで選択過程を、４００μg／mlゼオシン(#R25001, Thermo Fisher Scientific)含有選択培地で実施した。選択過程後、ＶＳＩＧ４が過発現する細胞プールを、ＡＰＣ(アロフィコシアニン)蛍光物質に連結した抗ヒトＶＳＩＧ４抗体(#17-5757-42, ebioscience, USA)を使用するＦＡＣＳ(蛍光標示式細胞分取)分析による、発現状態の決定により、分離し(図９Ｂ)、ヒトＶＳＩＧ４が過発現するＨＥＫ２９３Ｅ細胞プールにおける母細胞として使用するＨＥＫ２９３Ｅ細胞において、ＡＰＣ蛍光物質に連結した抗ヒトＶＳＩＧ４抗体を使用するによりＶＳＩＧ４の基底発現がないことを決定後(図９Ａ)、抗体性質分析の評価を、１１タイプの抗ヒトＶＳＩＧ４抗体で、これら２タイプの細胞を使用して、実施した。
ＶＳＩＧ４抗体による細胞結合の確認のため、０.５×１０６細胞を各サンプルについて調製し、抗体と、０.０８μg／ml、０.４μg／mlまたは２μg／mlで３０分間、４℃で反応させた。その後、細胞を、３回２％ＰＢＳ含有緩衝液で洗浄し、２０分間、４℃でＦＩＴＣ(フルオレッセインイソチオシアネート)蛍光物質に連結した抗ヒトＩｇＧ抗体(＃ＦＩ－３０００、Vectorlabs)と反応後、細胞を上記と同じ洗浄過程で、続いて２％ＦＰＳ含有０.５ml ＰＢＳの懸濁液で洗浄した。次いで、細胞を、FACSCanto IIフローサイトメーターで分析した。その結果、１１個のタイプのヒトＶＳＩＧ４単一抗体全て、ヒトＶＳＩＧ４過発現細胞に、濃度依存的方法で良好に結合することが判明した(図１０Ｂ)。しかしながら、ＶＳＩＧ４の基底発現がないＨＥＫ２９３Ｅ細胞に結合しなかった(図１０Ａ)。この結果は、１１個タイプのヒトＶＳＩＧ４単一抗体がヒトＶＳＩＧ４抗原に特異的に結合することを示す。
【0315】
５.２ ＦＡＣＳ分析によるＶＳＩＧ４ヒト抗体のヒト天然ＶＳＩＧ４への結合
一連の抗ＶＳＩＧ４抗体の結合性を、抗体濃度を増加させながら、ヒトＶＳＩＧ４を発現するＨＥＫ２９３ＥでのＦＡＣＳ分析により評価した。同じ実験を、ＶＳＩＧ４を認識し、ＷＯ２０２０／０６９５０７に記載されるマウスモノクローナル抗体であるｍ６Ｈ８で実施した。その目的で、細胞(１×１０６細胞／ml)を、１１個の完全Ｉｇ、抗ＶＳＩＧ４抗体またはｍ６Ｈ８各々と２０分間、４℃で、ＦＡＣＳ緩衝液(ＰＢＳ、０.１％ＢＳＡ、０.０１％ＮａＮ３)中インキュベートした。次いで３回洗浄し、適切なAlexa 488に結合した二次抗体と、さらに２０分間、４℃で暗所でインキュベートし、３回ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。抗ＶＳＩＧ４抗体またはｍ６Ｈ８の結合を、ヨウ化プロピジウム(死細胞を染色)を使用して同定した生存可能細胞ですぐに実施した。各抗体で得たシグナル強度の最大をＢｍａｘと指定し、平均蛍光強度(ＭＦＩ)で表した。モル濃度(Ｍ)で表す結合のＥＣ５０を非線形回帰分析(GraphPad Prims 4.0)を使用して、計算した。
各マウスまたはキメラＡｂのタイトレーション曲線は、産生された全抗体が、典型的飽和プロファイルで天然ＶＳＩＧ４形態を認識できることを示す。各抗体の結合ＥＣ５０を非線形回帰分析を使用して、計算した。ＥＣ５０は、１.２×１０－９～９.３×１０－１０の範囲であった。ＥＣ５０値を表６に要約する。
一連の抗ＶＳＩＧ４抗体の結合性を、抗体濃度を増加させながら、ヒトＶＳＩＧ４を発現するＨＥＫ２９３ＥでのＦＡＣＳ分析により評価した。同じ実験を、ＶＳＩＧ４を認識し、ＷＯ２０２０／０６９５０７に記載されるマウスモノクローナル抗体であるｍ６Ｈ８で実施した。その目的で、細胞(１×１０６細胞／ml)を、１１個の完全Ｉｇ、抗ＶＳＩＧ４抗体またはｍ６Ｈ８各々と２０分間、４℃で、ＦＡＣＳ緩衝液(ＰＢＳ、０.１％ＢＳＡ、０.０１％ＮａＮ３)中インキュベートした。次いで３回洗浄し、適切なAlexa 488に結合した二次抗体と、さらに２０分間、４℃で暗所でインキュベートし、３回ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。抗ＶＳＩＧ４抗体またはｍ６Ｈ８の結合を、ヨウ化プロピジウム(死細胞を染色)を使用して同定した生存可能細胞ですぐに実施した。各抗体で得たシグナル強度の最大をＢｍａｘと指定し、平均蛍光強度(ＭＦＩ)で表した。モル濃度(Ｍ)で表す結合のＥＣ５０を非線形回帰分析(GraphPad Prims 4.0)を使用して、計算した。
各マウスまたはキメラＡｂのタイトレーション曲線は、産生された全抗体が、典型的飽和プロファイルで天然ＶＳＩＧ４形態を認識できることを示す。各抗体の結合ＥＣ５０を非線形回帰分析を使用して、計算した。ＥＣ５０は、１.２×１０－９～９.３×１０－１０の範囲であった。ＥＣ５０値を表６に要約する。
【0316】
【表6】
【0317】
５.３ 長いおよび短い形態のＶＳＩＧ４へのＶＳＩＧ４ヒト抗体の結合
第一シリーズの実験で、１１個のｓｃＦｖ抗ＶＳＩＧ４抗体の長いおよび短い形態のＶＳＩＧ４各々への結合を、ＥＬＩＳＡにより試験した。試験した１１抗体各々の両形態への特異的結合を、これらの条件下決定した(図１１Ａ)。
この結果を確認するため、長いおよび短い形態のＶＳＩＧ４各々への１１抗ＶＳＩＧ４抗体の結合を、ウェスタンブロッティングによりアッセイした。各場合、１００ngのｈＶＳＩＧ４ 長－ｈＦｃ(Ｌ)およびｈＶＳＩＧ４ 短－ｈＦｃ(Ｓ)を、特異的抗ＶＳＩＧ４抗体でプローブした。図１１Ｂに示す、予測サイズの２バンドが１１抗ＶＳＩＧ４抗体各々で観察された。対照的に、ＶＳＩＧ４を認識し、ＷＯ２０２０／０６９５０７に記載されるマウスモノクローナル抗体であるｍ６Ｈ８は、長い形態のＶＳＩＧ４にしか結合しなかった(図１２Ａ)。この結果は、ＥＬＩＳＡアッセイで確認された(図１２Ｂ)。
第一シリーズの実験で、１１個のｓｃＦｖ抗ＶＳＩＧ４抗体の長いおよび短い形態のＶＳＩＧ４各々への結合を、ＥＬＩＳＡにより試験した。試験した１１抗体各々の両形態への特異的結合を、これらの条件下決定した(図１１Ａ)。
この結果を確認するため、長いおよび短い形態のＶＳＩＧ４各々への１１抗ＶＳＩＧ４抗体の結合を、ウェスタンブロッティングによりアッセイした。各場合、１００ngのｈＶＳＩＧ４ 長－ｈＦｃ(Ｌ)およびｈＶＳＩＧ４ 短－ｈＦｃ(Ｓ)を、特異的抗ＶＳＩＧ４抗体でプローブした。図１１Ｂに示す、予測サイズの２バンドが１１抗ＶＳＩＧ４抗体各々で観察された。対照的に、ＶＳＩＧ４を認識し、ＷＯ２０２０／０６９５０７に記載されるマウスモノクローナル抗体であるｍ６Ｈ８は、長い形態のＶＳＩＧ４にしか結合しなかった(図１２Ａ)。この結果は、ＥＬＩＳＡアッセイで確認された(図１２Ｂ)。
【0318】
５－４. 抗ＶＳＩＧ４抗体のエピトープマッピング
１１個のヒト抗ＶＳＩＧ４抗体の各々に認識されるエピトープを線引きするために、特異的変異を担持する一連の可溶性ＶＳＩＧ４タンパク質に結合する能力を、ＥＬＩＳＡによりアッセイした。使用した構築物を表７に詳述する。
１１個のヒト抗ＶＳＩＧ４抗体の各々に認識されるエピトープを線引きするために、特異的変異を担持する一連の可溶性ＶＳＩＧ４タンパク質に結合する能力を、ＥＬＩＳＡによりアッセイした。使用した構築物を表７に詳述する。
【0319】
【表7】
注：ｈＶＳＩＧ４－Ｆｃは長いＶＳＩＧ４形態である。ｈＶＳＩＧ４－Ｖ－Ｆｃは短いＶＳＩＧ４形態である。全変異は、短い形態で行った。
【0320】
９６ウェル免疫プレートで、種々の抗原を、１００ng／ウェル量で、４℃で１６時間被覆し、次いで各ウェルをＰＢＳに溶解した４％スキムミルクを使用して遮断した。その後、各ウェルを０.２mlのＰＢＳ－Ｔで洗浄し、１６時間培養した１１個のｓｃＦｖ－ファージの各々を、各ウェルに１００μl量で加え、２時間、室温で反応させた。その後また、各ウェルを４回０.２mlのＰＢＳ－Ｔで洗浄し、抗Ｍ１３－ＨＲＰを二次抗体として１：２,０００希釈後、抗体との反応を１時間、室温で実施した。ＰＢＳ－Ｔで洗浄後(０.２ml)、発色させ、４９０nmの吸光度を測定した。
【0321】
アッセイ結果を図１３に示す。
抗体Ａ１９５６、ＳＡ１９５７およびＳＡ２２８５により認識されるエピトープは、アミノ酸Ｅ２４、Ｖ２５、Ｅ２７、Ｖ２９およびＴ３０の少なくとも１個を含む。
抗体Ａ１９７５およびＳＡ２２９０により認識されるエピトープは、アミノ酸Ｉ７７、Ａ８０、Ｙ８２およびＱ８３の少なくとも１個を含む。残基Ｑ５９、Ｇ６１、Ｓ６２、Ｄ６３およびＶ６５の少なくとも１個は、ＳＡ２２９０のＶＳＩＧ４への結合にも寄与し得る。
抗体Ａ２２８３により認識されるエピトープは、アミノ酸Ｒ１０８、Ｓ１０９、Ｈ１１０、Ｔ１１２およびＥ１１４の少なくとも１個を含む。
抗体Ａ２２８７により認識されるエピトープは、アミノ酸Ｔ１１９、Ｐ１２０、Ｄ１２１、Ｎ１２３、Ｑ１２４およびＶ１２５の少なくとも１個を含む。
抗体Ａ２２９１により認識されるエピトープは、アミノ酸Ｒ１０８、Ｓ１０９、Ｈ１１０、Ｔ１１２およびＥ１１４の少なくとも１個、アミノ酸Ｔ１１９、Ｐ１２０、Ｄ１２１、Ｎ１２３、Ｑ１２４およびＶ１２５の少なくとも１個を含む。
抗体Ａ２３９０により認識されるエピトープは、アミノ酸Ｑ５９、Ｇ６１、Ｓ６２、Ｄ６３およびＶ６５の少なくとも１個、アミノ酸Ｓ９７、Ｑ９９、Ｓ１０１およびＴ１０２の少なくとも１個、アミノ酸Ｒ１０８、Ｓ１０９、Ｈ１１０、Ｔ１１２およびＥ１１４の少なくとも１個およびアミノ酸Ｔ１１９、Ｐ１２０、Ｄ１２１、Ｎ１２３、Ｑ１２４およびＶ１２５の少なくとも１個を含む。さらに、残基Ｄ３６Ｔ、Ｎ３８Ｒ、Ｌ３９Ｍ、Ｔ４２の少なくとも１個および残基Ｉ７７、Ａ８０、Ｙ８２およびＱ８３の少なくとも１個は、ＳＡ２３９０のＶＳＩＧ４への結合にも寄与し得る。
抗体Ａ２４５５により認識されるエピトープは、アミノ酸Ｑ５９、Ｇ６１、Ｓ６２、Ｄ６３およびＶ６５の少なくとも１個、アミノ酸Ｓ９７、Ｑ９９、Ｓ１０１およびＴ１０２の少なくとも１個、アミノ酸Ｒ１０８、Ｓ１０９、Ｈ１１０、Ｔ１１２およびＥ１１４の少なくとも１個およびアミノ酸Ｔ１１９、Ｐ１２０、Ｄ１２１、Ｎ１２３、Ｑ１２４およびＶ１２５の少なくとも１個を含む。さらに、残基Ｄ３６Ｔ、Ｎ３８Ｒ、Ｌ３９Ｍ、Ｔ４２の少なくとも１個は、ＳＡ２３９０のＶＳＩＧ４への結合にも寄与し得る。
抗体Ａ１９５６、ＳＡ１９５７およびＳＡ２２８５により認識されるエピトープは、アミノ酸Ｅ２４、Ｖ２５、Ｅ２７、Ｖ２９およびＴ３０の少なくとも１個を含む。
抗体Ａ１９７５およびＳＡ２２９０により認識されるエピトープは、アミノ酸Ｉ７７、Ａ８０、Ｙ８２およびＱ８３の少なくとも１個を含む。残基Ｑ５９、Ｇ６１、Ｓ６２、Ｄ６３およびＶ６５の少なくとも１個は、ＳＡ２２９０のＶＳＩＧ４への結合にも寄与し得る。
抗体Ａ２２８３により認識されるエピトープは、アミノ酸Ｒ１０８、Ｓ１０９、Ｈ１１０、Ｔ１１２およびＥ１１４の少なくとも１個を含む。
抗体Ａ２２８７により認識されるエピトープは、アミノ酸Ｔ１１９、Ｐ１２０、Ｄ１２１、Ｎ１２３、Ｑ１２４およびＶ１２５の少なくとも１個を含む。
抗体Ａ２２９１により認識されるエピトープは、アミノ酸Ｒ１０８、Ｓ１０９、Ｈ１１０、Ｔ１１２およびＥ１１４の少なくとも１個、アミノ酸Ｔ１１９、Ｐ１２０、Ｄ１２１、Ｎ１２３、Ｑ１２４およびＶ１２５の少なくとも１個を含む。
抗体Ａ２３９０により認識されるエピトープは、アミノ酸Ｑ５９、Ｇ６１、Ｓ６２、Ｄ６３およびＶ６５の少なくとも１個、アミノ酸Ｓ９７、Ｑ９９、Ｓ１０１およびＴ１０２の少なくとも１個、アミノ酸Ｒ１０８、Ｓ１０９、Ｈ１１０、Ｔ１１２およびＥ１１４の少なくとも１個およびアミノ酸Ｔ１１９、Ｐ１２０、Ｄ１２１、Ｎ１２３、Ｑ１２４およびＶ１２５の少なくとも１個を含む。さらに、残基Ｄ３６Ｔ、Ｎ３８Ｒ、Ｌ３９Ｍ、Ｔ４２の少なくとも１個および残基Ｉ７７、Ａ８０、Ｙ８２およびＱ８３の少なくとも１個は、ＳＡ２３９０のＶＳＩＧ４への結合にも寄与し得る。
抗体Ａ２４５５により認識されるエピトープは、アミノ酸Ｑ５９、Ｇ６１、Ｓ６２、Ｄ６３およびＶ６５の少なくとも１個、アミノ酸Ｓ９７、Ｑ９９、Ｓ１０１およびＴ１０２の少なくとも１個、アミノ酸Ｒ１０８、Ｓ１０９、Ｈ１１０、Ｔ１１２およびＥ１１４の少なくとも１個およびアミノ酸Ｔ１１９、Ｐ１２０、Ｄ１２１、Ｎ１２３、Ｑ１２４およびＶ１２５の少なくとも１個を含む。さらに、残基Ｄ３６Ｔ、Ｎ３８Ｒ、Ｌ３９Ｍ、Ｔ４２の少なくとも１個は、ＳＡ２３９０のＶＳＩＧ４への結合にも寄与し得る。
【0322】
実施例６：ＶＳＩＧ４ヒト抗体の内在化
１１個の完全Ｉｇ、抗ＶＳＩＧ４抗体を、内在化アッセイで評価した。
このアッセイのために、８０％コンフルエンスのＨＥＫ－ＶＳＩＧ４細胞(すなわち、ＶＳＩＧ４でトランスフェクトし、表面に発現するＨＥＫ２９３細胞)を、トリプシンで脱着させ、ViCellsカウンターで計数した。１００,０００ ＨＥＫ－ＶＳＩＧ４細胞を、２０分間、４℃で、計１００μlの冷培養培地：抗ＶＳＩＧ４、ｍ６Ｈ８抗体および、そのＡ２ヒト化バージョン、(ＷＯ２０２０／０６９５０７)または抗ＩＧＦ１Ｒ(Ｈｚ２０８Ｆ２－４)の各抗体１０μg／mlの存在下、インキュベートした。次いで細を２０００rpmで遠心分離し、２回２００μlの冷培地で洗浄した。
１１個の完全Ｉｇ、抗ＶＳＩＧ４抗体を、内在化アッセイで評価した。
このアッセイのために、８０％コンフルエンスのＨＥＫ－ＶＳＩＧ４細胞(すなわち、ＶＳＩＧ４でトランスフェクトし、表面に発現するＨＥＫ２９３細胞)を、トリプシンで脱着させ、ViCellsカウンターで計数した。１００,０００ ＨＥＫ－ＶＳＩＧ４細胞を、２０分間、４℃で、計１００μlの冷培養培地：抗ＶＳＩＧ４、ｍ６Ｈ８抗体および、そのＡ２ヒト化バージョン、(ＷＯ２０２０／０６９５０７)または抗ＩＧＦ１Ｒ(Ｈｚ２０８Ｆ２－４)の各抗体１０μg／mlの存在下、インキュベートした。次いで細を２０００rpmで遠心分離し、２回２００μlの冷培地で洗浄した。
【0323】
時間Ｔ０：細胞を、直接２００μlの１／５００希釈二次ヤギ抗ヒトAlexa 488抗体と、２０分間、４℃でインキュベートした。次いで冷培地で２回洗浄し、ＦＡＣＳで分析した。
【0324】
時間４ｈ：細胞を、１００μlの冷培地(４℃)または温培地(３７℃)と４時間インキュベートした。各バッチの細胞を２０００rpmで回転させ、２回２００μlの冷培地で洗浄し、二次ヤギ抗ヒトAlexa 488抗体と２０分間、４℃で冷培地でインキュベートした。次いで、細胞を２回冷培地で洗浄し、ＦＡＣＳで分析した。
【0325】
内在化のレベルを、(ＭＦＩ(４℃)－ＭＦＩ(３７℃))に対応するデルタＭＦＩを計算し、４℃と３７℃の間で減少したＭＦＩのパーセンテージの計算により、内在化のパーセンテージを計算した。(全ＭＦＩはアイソタイプＭＦＩ値減算後計算)。
内在化抗ＩＧＦ－１Ｒ抗体、Ｈｚ２０８Ｆ２－４(ＷＯ２０１５／１６２２９２)を、ＨＥＫ細胞が細胞表面にＩＧＦ－１Ｒを発現するため、このアッセイにおける陽性対照として使用した。
本抗ＶＳＩＧ４抗体は種々のレベルの内在化を示した(表８参照)。他方で、ｍ６Ｈ８抗体およびそのヒト化バージョンＡ２は、如何なるタイプの内在化も誘導しなかった。
内在化抗ＩＧＦ－１Ｒ抗体、Ｈｚ２０８Ｆ２－４(ＷＯ２０１５／１６２２９２)を、ＨＥＫ細胞が細胞表面にＩＧＦ－１Ｒを発現するため、このアッセイにおける陽性対照として使用した。
本抗ＶＳＩＧ４抗体は種々のレベルの内在化を示した(表８参照)。他方で、ｍ６Ｈ８抗体およびそのヒト化バージョンＡ２は、如何なるタイプの内在化も誘導しなかった。
【0326】
【表8】
【0327】
実施例７：ＶＳＩＧ４ヒト抗体によるＶＳＩＧ４抗炎症性および免疫抑制性機能の阻害
７－１. 炎症性アッセイ
抗ＶＳＩＧ４抗体がマクロファージの炎症性表現型を調節する能力について、サイトカイン遊離アッセイを、完全Ｉｇ、ヒト抗ＶＳＩＧ４抗体の各々で処理したマクロファージで実施した。実験的スキームを図１４に示す。
末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)を、ＥＦＳ(Etablissement Francais du Sang)から提供された細胞吸着環からの密度勾配遠心分離により、ヒト血液から単離した。次いで、単球を製造業者の指示に従う、陽性免疫磁気細胞選択によりＰＢＭＣから精製した(130-050-201, Miltenyi Biotec)。
新鮮単球を、９６ウェル平底処理培養プレート(353072, Falcon)で、５０ng／ml Ｍ－ＣＳＦ(130-096-492, Miltenyi Biotec)含有培養培地(ＲＰＭＩ １６４０培地＋１％ペニシリンストレプトマイシン＋１％ピルビン酸ナトリウム＋１％Ｌ－グルタミン＋１０％ウシ胎児血清に播種した。３７℃、５％ＣＯ２で６日間インキュベートして、マクロファージに分化させた。分化Ｍ０－マクロファージを６日目に得た。
分化Ｍ０－マクロファージ上の標的抗体の結合を、フローサイトメトリーで６日目に評価した。ＬＰＳ(Ｌ４５１６、Sigma)を、分化Ｍ０－マクロファージに最終濃度１００ng／mlで加えた。試験抗体または対応するアイソタイプを、分化Ｍ０－マクロファージに３濃度(２.５μg／ml、５μg／mlおよび１０μg／ml)で加えた。マウス抗体ｍ６Ｈ８およびそのヒト化形態、Ａ２(何れもＷＯ２０２０／０６９５０７に記載)も、本アッセイで試験した。対照として、Ｍ０マクロファージの炎症促進性表現型に向けてのサイトカインの遊離を刺激することが知られる対照抗体(R&D, RefMAB2078、クローン２８７２１９、ｍＩｇＧ２ａ)を、最終濃度５μg／mlで使用した。ＳＡ１９５６、ＳＡ２３８６、ＳＡ２３９０およびＳＡ２４５５について、５０μg／ml Ｃ３ｂ(Ａ１１４、Complement Technology)を培養培地に加えた。
分化Ｍ０－マクロファージをＬＰＳおよび試験抗体と２４時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。細胞培養上清を７日目に集め、サイトカイン分析のために新規Ｖ底９６ウェルプレートに移した。ＩＬ－１０、ＩＬ－６、ＩＬ－１β、ＩＬ－１２／２３ｐ４０およびＴＮＦ－αの濃度を測定した。製造業者の指示に従いMeso Scale Discoveryテクノロジーを使用して、定量を実施した(K15UQK-4およびK151AOH-4, Meso Scale Discovery)。
健常ドナー間の不均一性を考慮に入れるため、少なくとも５ドナーを評価した。各実験的状態はトリプリケートで、１回の実験で実施した。
アッセイの結果を表９に示す。
７－１. 炎症性アッセイ
抗ＶＳＩＧ４抗体がマクロファージの炎症性表現型を調節する能力について、サイトカイン遊離アッセイを、完全Ｉｇ、ヒト抗ＶＳＩＧ４抗体の各々で処理したマクロファージで実施した。実験的スキームを図１４に示す。
末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)を、ＥＦＳ(Etablissement Francais du Sang)から提供された細胞吸着環からの密度勾配遠心分離により、ヒト血液から単離した。次いで、単球を製造業者の指示に従う、陽性免疫磁気細胞選択によりＰＢＭＣから精製した(130-050-201, Miltenyi Biotec)。
新鮮単球を、９６ウェル平底処理培養プレート(353072, Falcon)で、５０ng／ml Ｍ－ＣＳＦ(130-096-492, Miltenyi Biotec)含有培養培地(ＲＰＭＩ １６４０培地＋１％ペニシリンストレプトマイシン＋１％ピルビン酸ナトリウム＋１％Ｌ－グルタミン＋１０％ウシ胎児血清に播種した。３７℃、５％ＣＯ２で６日間インキュベートして、マクロファージに分化させた。分化Ｍ０－マクロファージを６日目に得た。
分化Ｍ０－マクロファージ上の標的抗体の結合を、フローサイトメトリーで６日目に評価した。ＬＰＳ(Ｌ４５１６、Sigma)を、分化Ｍ０－マクロファージに最終濃度１００ng／mlで加えた。試験抗体または対応するアイソタイプを、分化Ｍ０－マクロファージに３濃度(２.５μg／ml、５μg／mlおよび１０μg／ml)で加えた。マウス抗体ｍ６Ｈ８およびそのヒト化形態、Ａ２(何れもＷＯ２０２０／０６９５０７に記載)も、本アッセイで試験した。対照として、Ｍ０マクロファージの炎症促進性表現型に向けてのサイトカインの遊離を刺激することが知られる対照抗体(R&D, RefMAB2078、クローン２８７２１９、ｍＩｇＧ２ａ)を、最終濃度５μg／mlで使用した。ＳＡ１９５６、ＳＡ２３８６、ＳＡ２３９０およびＳＡ２４５５について、５０μg／ml Ｃ３ｂ(Ａ１１４、Complement Technology)を培養培地に加えた。
分化Ｍ０－マクロファージをＬＰＳおよび試験抗体と２４時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。細胞培養上清を７日目に集め、サイトカイン分析のために新規Ｖ底９６ウェルプレートに移した。ＩＬ－１０、ＩＬ－６、ＩＬ－１β、ＩＬ－１２／２３ｐ４０およびＴＮＦ－αの濃度を測定した。製造業者の指示に従いMeso Scale Discoveryテクノロジーを使用して、定量を実施した(K15UQK-4およびK151AOH-4, Meso Scale Discovery)。
健常ドナー間の不均一性を考慮に入れるため、少なくとも５ドナーを評価した。各実験的状態はトリプリケートで、１回の実験で実施した。
アッセイの結果を表９に示す。
【0328】
【表9】
ＳＡ２２８５以外の全抗ＶＳＩＧ４抗体は、マクロファージによる炎症促進性サイトカイン遊離増加および／または抗炎症性サイトカイン分泌減少に至る。
これらの抗体は、故に、ヒトマクロファージの表現型の調製ができる。
【0329】
７－２. 免疫抑制性アッセイ
末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)を、ＥＦＳ(Etablissement Francais du Sang)により提供された細胞吸着環からの密度勾配遠心分離により、ヒト血液から単離した。次いで、単球およびＣＤ４＋Ｔ細胞を同じドナーからのＰＢＭＣから精製した：単球は、単球を製造業者の指示に従う、陽性免疫磁気細胞選択により精製し(130-050-201, Miltenyi Biotec)、一方、ＣＤ４＋Ｔ細胞は単球を製造業者の指示に従う、陰性免疫磁気細胞選択による単球精製の非陽性フラクションから単離した(19052, STEMCELL Technologies)。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、さらに共培養に使用するために、クライオチューブあたり１５×１０６細胞で、１mlの凍結培地(07930, STEMCELL Technologies)中凍結させた。
新鮮単球を、９６ウェル平底処理培養プレート(353072, Falcon)に、さらなるＭ２－マクロファージ分極のための５０ng／ml Ｍ－ＣＳＦ(１３０－０９６－４９２、Miltenyi Biotec)またはさらなるＭ１－マクロファージ分極のための５０ng／ml ＧＭ－ＣＳＦ (１３０－０９３－８６６、Miltenyi Biotec)の何れかを含む、培養培地(ＲＰＭＩ １６４０培地＋１％ペニシリンストレプトマイシン＋１％ピルビン酸ナトリウム＋１％Ｌ－グルタミン＋１０％ウシ胎児血清)に播種した。３７℃、５％ＣＯ２で６日間インキュベートして、マクロファージに分化させた。分化Ｍ０－マクロファージを６日目に得た。
５０ng／mlのＩＦＮ－γ(２８５－ＩＦ、R&D)を、炎症促進性Ｍ１－マクロファージへの分極のためにＧＭ－ＣＳＦ分化Ｍ０－マクロファージに加えた。次のサイトカインの各々の２０ng／ml：ＩＬ－４(１３０.０９３.９２２、Miltenyi Biotec)、ＩＬ－１０(２１７－ＩＬ／ＣＦ、R&D)およびＴＧＦ－β(１３０.０９５.０６６、Miltenyi Biotec)を、免疫抑制性Ｍ２－マクロファージへの分極のためにＭ－ＣＳＦ分化Ｍ０－マクロファージに加えた。分化Ｍ０－マクロファージを、サイトカインと、３７℃、５％ＣＯ２で２日間インキュベートした。Ｍ１およびＭ２分極マクロファージを８日目に得た。分極マクロファージを、１００ng／ml ＬＰＳ(Ｌ４５１６、Sigma)と４時間、３７℃、５％ＣＯ２で反応させた。マクロファージを次いで採取し、培養培地で洗浄した。分極Ｍ１－およびＭ２－マクロファージ上の標的抗体の結合を、ＬＰＳ活性化後フローサイトメトリーにより評価した。
末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)を、ＥＦＳ(Etablissement Francais du Sang)により提供された細胞吸着環からの密度勾配遠心分離により、ヒト血液から単離した。次いで、単球およびＣＤ４＋Ｔ細胞を同じドナーからのＰＢＭＣから精製した：単球は、単球を製造業者の指示に従う、陽性免疫磁気細胞選択により精製し(130-050-201, Miltenyi Biotec)、一方、ＣＤ４＋Ｔ細胞は単球を製造業者の指示に従う、陰性免疫磁気細胞選択による単球精製の非陽性フラクションから単離した(19052, STEMCELL Technologies)。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、さらに共培養に使用するために、クライオチューブあたり１５×１０６細胞で、１mlの凍結培地(07930, STEMCELL Technologies)中凍結させた。
新鮮単球を、９６ウェル平底処理培養プレート(353072, Falcon)に、さらなるＭ２－マクロファージ分極のための５０ng／ml Ｍ－ＣＳＦ(１３０－０９６－４９２、Miltenyi Biotec)またはさらなるＭ１－マクロファージ分極のための５０ng／ml ＧＭ－ＣＳＦ (１３０－０９３－８６６、Miltenyi Biotec)の何れかを含む、培養培地(ＲＰＭＩ １６４０培地＋１％ペニシリンストレプトマイシン＋１％ピルビン酸ナトリウム＋１％Ｌ－グルタミン＋１０％ウシ胎児血清)に播種した。３７℃、５％ＣＯ２で６日間インキュベートして、マクロファージに分化させた。分化Ｍ０－マクロファージを６日目に得た。
５０ng／mlのＩＦＮ－γ(２８５－ＩＦ、R&D)を、炎症促進性Ｍ１－マクロファージへの分極のためにＧＭ－ＣＳＦ分化Ｍ０－マクロファージに加えた。次のサイトカインの各々の２０ng／ml：ＩＬ－４(１３０.０９３.９２２、Miltenyi Biotec)、ＩＬ－１０(２１７－ＩＬ／ＣＦ、R&D)およびＴＧＦ－β(１３０.０９５.０６６、Miltenyi Biotec)を、免疫抑制性Ｍ２－マクロファージへの分極のためにＭ－ＣＳＦ分化Ｍ０－マクロファージに加えた。分化Ｍ０－マクロファージを、サイトカインと、３７℃、５％ＣＯ２で２日間インキュベートした。Ｍ１およびＭ２分極マクロファージを８日目に得た。分極マクロファージを、１００ng／ml ＬＰＳ(Ｌ４５１６、Sigma)と４時間、３７℃、５％ＣＯ２で反応させた。マクロファージを次いで採取し、培養培地で洗浄した。分極Ｍ１－およびＭ２－マクロファージ上の標的抗体の結合を、ＬＰＳ活性化後フローサイトメトリーにより評価した。
【0330】
Ｍ１－およびＭ２－マクロファージを、古典的平底９６ウェルプレートに、培養培地中２００００細胞／ウェルで播種した。３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、マクロファージに、１マクロファージ：５ＣＤ４ Ｔ細胞の比で加えた。ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ(111-32D, Gibco)を共培養に加えて、３２細胞に対し１ビーズの比でＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化した。
試験抗体または対応するアイソタイプを、共培養に最終濃度１０μg／mlで加えた。抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体であるアベルマブを陽性対照として使用した。ＳＡ２３８６について、５０μg／ml Ｃ３ｂ(Ａ１１４、Complement Technology)を培養培地に加えた。共培養中のマクロファージおよびＣＤ４＋Ｔ細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で５日間インキュベートした。細胞培養上清を１４日目に取得し、サイトカイン分析のために新規Ｖ底９６ウェルプレートに移した。ＩＦＮ－γの濃度を測定した。製造業者の指示に従いMeso Scale Discoveryテクノロジーを使用して、定量を実施した(K151AEB-4, Meso Scale Discovery)。
健常ドナー間の不均一性を考慮に入れるため、少なくとも５ドナーを評価した。各実験的状態はトリプリケートで、１回の実験で実施した。
アッセイの結果を表１０に示す。
試験抗体または対応するアイソタイプを、共培養に最終濃度１０μg／mlで加えた。抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体であるアベルマブを陽性対照として使用した。ＳＡ２３８６について、５０μg／ml Ｃ３ｂ(Ａ１１４、Complement Technology)を培養培地に加えた。共培養中のマクロファージおよびＣＤ４＋Ｔ細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で５日間インキュベートした。細胞培養上清を１４日目に取得し、サイトカイン分析のために新規Ｖ底９６ウェルプレートに移した。ＩＦＮ－γの濃度を測定した。製造業者の指示に従いMeso Scale Discoveryテクノロジーを使用して、定量を実施した(K151AEB-4, Meso Scale Discovery)。
健常ドナー間の不均一性を考慮に入れるため、少なくとも５ドナーを評価した。各実験的状態はトリプリケートで、１回の実験で実施した。
アッセイの結果を表１０に示す。
【0331】
【表10】
【0332】
ＳＡ２２８５以外の全抗ＶＳＩＧ４抗体は、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＦＮ－γの遊離を誘導し、それらがＴ細胞活性化を誘導することが示唆される。これらの抗体は、故に、ＶＳＩＧ４の免疫抑制性機能の阻害が可能である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図11A】
【図11B】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【配列表】
【国際調査報告】