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特表2022-546852温度勾配変性によるサンプル調製およびキャピラリー電気泳動およびＣＥ－ＥＳＩ－ＭＳのための血清のディープＮ－グリコミクス分析のスケールアップ
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-11-09
(54)【発明の名称】温度勾配変性によるサンプル調製およびキャピラリー電気泳動およびＣＥ－ＥＳＩ－ＭＳのための血清のディープＮ－グリコミクス分析のスケールアップ
(51)【国際特許分類】
G01N 33/50 20060101AFI20221101BHJP
G01N 27/447 20060101ALI20221101BHJP
G01N 27/62 20210101ALI20221101BHJP
C12N 9/24 20060101ALN20221101BHJP
C12P 19/00 20060101ALN20221101BHJP
【ＦＩ】
G01N33/50 Z
G01N27/447 301B
G01N27/62 V
G01N27/447 331J
C12N9/24
C12P19/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022515501
(86)(22)【出願日】2020-09-10
(85)【翻訳文提出日】2022-04-27
(86)【国際出願番号】 IB2020058433
(87)【国際公開番号】W WO2021048793
(87)【国際公開日】2021-03-18
(31)【優先権主張番号】62/898,045
(32)【優先日】2019-09-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】510075457
【氏名又は名称】ディーエイチ テクノロジーズ デベロップメント プライベート リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(72)【発明者】
【氏名】ガットマン， アンドラス
(72)【発明者】
【氏名】スィゲティ， マルトン
【テーマコード（参考）】
2G041
2G045
4B050
4B064
【Ｆターム（参考）】
2G041CA01
2G041DA05
2G041FA10
2G041FA12
2G045BA13
2G045BB12
2G045BB35
2G045CA26
2G045DA44
2G045FA34
2G045FA36
2G045FB01
2G045FB03
2G045FB12
4B050LL03
4B050LL05
4B064AF01
4B064CA21
4B064CB07
4B064CE14
4B064DA13
(57)【要約】
キャピラリー電気泳動とレーザー誘起蛍光（ＣＥ－ＬＩＦ）検出によるヒト血清のディープＮ－グリコミクス分析を容易にするサンプル調製ワークフローは、キャピラリー電気泳動に接続されたエレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＣＥ－ＥＳＩ－ＭＳ）のより高度なサンプル濃縮要件に適応する。温度勾配変性プロトコールが、沈殿を回避するために、アミン官能化磁性ビーズで分割した糖タンパク質に適用される。これはまた、血清の遊離糖含有量が有意に減少し、Ｎ結合型炭水化物のＰＮＧａｓｅ Ｆ媒介性放出を可能にすることを生じる。その遊離されたオリゴサッカリドを、改変された蒸発性標識プロトコールを利用して、アミノピレン－トリスルホネートでタグ化した。このワークフローは、例えば、陰イオン化モードでのＣＥ－ＥＳＩ－ＭＳ分析における使用のために、適切な量の材料を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
血清サンプルを分析する方法であって、前記方法は、前記血清サンプルとアミン官能化磁性ビーズとを、前記血清サンプル中に含まれる糖タンパク質を前記磁性ビーズ上に捕捉するように混合する工程であって、前記糖タンパク質は、ペプチド部分に接続されるグリカン部分を含む、工程；
変性溶液と前記磁性ビーズとを混合し、漸増温度勾配を一定期間にわたって適用することによって、前記糖タンパク質を変性させる工程；
酵素を使用して、前記磁性ビーズ上に捕捉された前記糖タンパク質におけるペプチド部分から前記グリカン部分を放出して、放出されたグリカン部分を形成する工程；および
前記放出されたグリカン部分を標識して、標識されたグリカン部分を形成する工程；および
前記標識されたグリカン部分を分析する工程、
を包含する方法。
【請求項2】
前記一定の期間は、少なくとも１５分間である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記漸増温度勾配は、５℃／分以下の勾配で適用される、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記漸増温度勾配は、３０℃～８０℃の温度の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記温度勾配を適用した後に、前記温度は、一定温度に維持される、請求項１～４に記載の方法。
【請求項6】
前記酵素は、ＰＮＧａｓｅ Ｆ酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記標識されたグリカン部分を分析する工程は、キャピラリー電気泳動－エレクトロスプレーイオン化質量分析法を使用して分析する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
キャピラリー電気泳動－エレクトロスプレーイオン化質量分析法を使用して分析する工程は、陰イオン化モード質量分析法の使用を包含する、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記標識されたグリカン部分を分析する工程は、キャピラリー電気泳動とレーザー誘起蛍光検出とを使用して分析する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記変性溶液は、ＮＰ－４０、ジチオスレイトールおよびドデシル硫酸ナトリウムを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
血清サンプルを分析する方法であって、前記方法は、前記血清サンプルとアミン官能化磁性ビーズとを、前記血清サンプル中に含まれる糖タンパク質を前記磁性ビーズ上に捕捉するように混合する工程であって、前記糖タンパク質は、ペプチド部分に接続されるグリカン部分を含む、工程；
捕捉された糖タンパク質を含む前記磁性ビーズを洗浄する工程；
変性溶液と前記磁性ビーズとを混合し、漸増温度勾配を一定期間にわたって適用することによって、前記磁性ビーズ上に捕捉された糖タンパク質を変性させる工程；
酵素を使用して、前記磁性ビーズ上に捕捉された前記糖タンパク質におけるペプチド部分から前記グリカン部分を放出して、放出されたグリカン部分を形成する工程；
前記放出されたグリカン部分を単離および標識する工程；
前記放出されたグリカン部分を標識して、標識されたグリカン部分を形成する工程；ならびに
前記標識されたグリカン部分を分析する工程、
を包含する方法。
【請求項12】
前記放出されたグリカン部分を標識する工程は、８－アミノピレン－１，３，６－トリスルホン酸を前記放出されたグリカン部分に添加する工程を包含する、請求項１または１１に記載の方法。
【請求項13】
前記標識されたグリカン部分を標識する工程は、キャピラリー電気泳動－エレクトロスプレーイオン化質量分析法の使用を包含する、請求項１１に記載の方法。
【請求項14】
前記標識されたグリカン部分を分析する工程は、キャピラリー電気泳動とレーザー誘起蛍光検出とを使用することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項15】
前記一定期間は、少なくとも１５分間である、請求項１１に記載の方法。
【請求項16】
前記漸増温度勾配は、５℃／分以下の勾配で適用される、請求項１１に記載の方法。
【請求項17】
前記漸増温度勾配は、３０℃～８０℃の温度の間である、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明者らの関連出願
本出願は、２０１９年９月１０日出願の米国仮特許出願第６２／８９８，０４５号（その内容全体は、本明細書に参考として援用される）の優先権の利益を主張する。
本出願は、２０１９年９月１０日出願の米国仮特許出願第６２／８９８，０４５号（その内容全体は、本明細書に参考として援用される）の優先権の利益を主張する。
【0002】
分野
本明細書中の技術は、分析のために、特に分析のために血清サンプルを調製する方法に関する。
本明細書中の技術は、分析のために、特に分析のために血清サンプルを調製する方法に関する。
【背景技術】
【0003】
背景
ヒト血清は、ｐｇ／ｍＬからｍｇ／ｍＬレベルまでの非常に広い範囲の濃度にわたって糖タンパク質を含む（１）。アルブミンおよび免疫グロブリンはともに、全タンパク質含有量のうちの３／４超を表し、いくつかの豊富な糖タンパク質は、高濃度範囲において存在する（例えば、ハプトグロビン、α１－アンチトリプシンおよびトランスフェリン）。これらの豊富なタンパク質は別として、大部分の血清糖タンパク質は、血清タンパク質のうちの１％未満を表し、従って、それらの分析は、より高い出発サンプル容積またはイムノアフィニティーベースの予備濃縮法による標的化された分画のいずれかを必要とする。ヒト血清タンパク質の大部分は、炭水化物の結合を含め、翻訳と同時にまたは翻訳後に修飾され、これは、報告によれば、非常に多数のそれらの生理学的および病理学的特性に影響を及ぼす。結論として、糖タンパク質の炭水化物部分の分析は、体医療分野（例えば、糖生体マーカー）および生物製剤分野（例えば、治療用ｍＡｂのエフェクター機能）において非常に重要であり、これら分野はともに、大規模処理において適用可能な強い高感度方法を必要とする。所定の部位での種々の糖形態の存在（ミクロ不均一性）または潜在的なグリコシル化部位の占有（マクロ不均一性）は、さらなる分析課題の代表である。
ヒト血清は、ｐｇ／ｍＬからｍｇ／ｍＬレベルまでの非常に広い範囲の濃度にわたって糖タンパク質を含む（１）。アルブミンおよび免疫グロブリンはともに、全タンパク質含有量のうちの３／４超を表し、いくつかの豊富な糖タンパク質は、高濃度範囲において存在する（例えば、ハプトグロビン、α１－アンチトリプシンおよびトランスフェリン）。これらの豊富なタンパク質は別として、大部分の血清糖タンパク質は、血清タンパク質のうちの１％未満を表し、従って、それらの分析は、より高い出発サンプル容積またはイムノアフィニティーベースの予備濃縮法による標的化された分画のいずれかを必要とする。ヒト血清タンパク質の大部分は、炭水化物の結合を含め、翻訳と同時にまたは翻訳後に修飾され、これは、報告によれば、非常に多数のそれらの生理学的および病理学的特性に影響を及ぼす。結論として、糖タンパク質の炭水化物部分の分析は、体医療分野（例えば、糖生体マーカー）および生物製剤分野（例えば、治療用ｍＡｂのエフェクター機能）において非常に重要であり、これら分野はともに、大規模処理において適用可能な強い高感度方法を必要とする。所定の部位での種々の糖形態の存在（ミクロ不均一性）または潜在的なグリコシル化部位の占有（マクロ不均一性）は、さらなる分析課題の代表である。
【0004】
最新の糖分析技術（例えば、ＨＰＬＣ、キャピラリー電気泳動および質量分析法）は、ディープグリコミクス分析の高感度を達成するために、非常に効率的なサンプル調製法を必要とする。これらの技術の大部分は、変性工程で始まって、エンドグリコシダーゼ酵素のアクセスを許容するために糖タンパク質の折りたたみをほどいて、それらの基質に到達し、その結合される糖タンパク質鎖を放出する。しかし、１０μＬ超の血清サンプルを用いる旧来から使用される変性方法では、沈殿が起こり、より多くのサンプル容積のためのより精巧な方法を必要とする。さらに、エンドグリコシダーゼ消化工程の間に、サンプル中の種々のモノサッカリドまたは低重合度（ＤＰ）糖（例えば、血中のグルコース、マルトースなど）の存在、および最も重要ことには、放出されたＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２コア含有糖構造は、インヒビターとして作用する。最終的に、高感度検出のための放出されたグリカンの発蛍光団タグ化は、高性能誘導体化プロセス（例えば、近年導入された蒸発性標識アプローチ）を必要とする。
【0005】
上記放出および標識されたＮ結合型炭水化物の分析は、十分に確立された液相分離技術（例えば、クロマトグラフィー、キャピラリーまたはマルチキャピラリー電気泳動）によって、および低い程度ではあるが、２Ｄ電気泳動またはマイクロチップによって、最も頻繁に達成される。質量分析法ベースの糖分析技術は、他方で、マトリクス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）飛行時間（ＴＯＦ）質量分析法（ＭＳ）およびエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）ベースの方法を含め、同様に広く利用されており、通常は、分析のための適切なサンプル濃縮を提供するために、スケールアップを必要とする。エレクトロスプレーイオン化は、シアル化およびコアフコシル化グリカン構造の分解を引きおこし得るか、またはさらに、イオン化プロセスの間に構造的再配置をさらにもたらし得、包括的な定性分析のための直交分析技術の使用を必要とする。ヒト血清サンプルのディープＮ－グリコミクス研究のために、上述の糖分析方法は全て、上記技術のための分析物の十分量を生成することができる効率的なサンプル調製法を必要とする。
【0006】
本技術は、変性工程の間の沈殿問題を最小限にする、広い範囲の容積にわたって血清サンプルを生成する血清サンプル調製法を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0007】
要旨
本教示によれば、分析のための血清サンプルを調製する方法が、開示される。
本教示によれば、分析のための血清サンプルを調製する方法が、開示される。
【0008】
本教示の１つの局面において、血清サンプルを分析する方法であって、上記血清サンプルとアミン官能化磁性ビーズとを、上記血清サンプル中に含まれる糖タンパク質を上記磁性ビーズに捕捉するように混合する工程であって、上記糖タンパク質は、ペプチド部分に接続されるグリカン部分を含む、工程；変性溶液と上記磁性ビーズとを混合し、漸増温度勾配を一定期間にわたって適用することによって、上記糖タンパク質を変性させる工程；酵素を使用して、上記磁性ビーズ上に捕捉された上記糖タンパク質におけるペプチド部分から上記グリカン部分を放出して、放出されたグリカン部分を形成する工程；および上記放出されたグリカン部分を標識して、標識されたグリカン部分を形成する工程；および上記標識されたグリカン部分を分析する工程を包含する方法が記載される。
【0009】
本発明の実施形態において、血清サンプルを分析する方法は、上記血清サンプルとアミン官能化磁性ビーズとを、上記血清サンプル中に含まれる糖タンパク質を上記磁性ビーズ上に捕捉するように混合する工程であって、上記糖タンパク質は、ペプチド部分に接続されるグリカン部分を含む、工程；捕捉された糖タンパク質を含む上記磁性ビーズを洗浄する工程；変性溶液と上記磁性ビーズとを混合し、漸増温度勾配を一定期間にわたって適用することによって、上記磁性ビーズ上に捕捉された糖タンパク質を変性させる工程；酵素を使用して、上記磁性ビーズ上に捕捉された上記糖タンパク質におけるペプチド部分から上記グリカン部分を放出して、放出されたグリカン部分を形成する工程；上記放出されたグリカン部分を単離および標識する工程；上記放出されたグリカン部分を標識して、標識されたグリカン部分を形成する工程；および上記標識されたグリカン部分を分析する工程を包含する。
【0010】
本教示の実施形態において、上記一定期間は、少なくとも１５分間である。
【0011】
本教示の実施形態において、上記漸増温度勾配は、５℃／分以下の勾配で適用される。
【0012】
本教示の実施形態において、上記漸増温度勾配は、３０℃～８０℃の温度の間である。
【0013】
本教示の実施形態において、上記温度勾配を適用した後に、上記温度は、一定温度に維持される。
【0014】
本教示の実施形態において、上記酵素は、ＰＮＧａｓｅ Ｆ酵素である。
【0015】
本教示の実施形態において、上記標識されたグリカン部分を分析する工程は、キャピラリー電気泳動－エレクトロスプレーイオン化質量分析法を使用して分析する工程を包含する。
【0016】
本教示の実施形態において、キャピラリー電気泳動－エレクトロスプレーイオン化質量分析法を使用して分析する工程は、陰イオン化モード質量分析法の使用を包含する。
【0017】
本教示の実施形態において、上記標識されたグリカン部分を分析する工程は、キャピラリー電気泳動とレーザー誘起蛍光検出とを使用して分析する工程を包含する。
【0018】
本教示の実施形態において、上記変性溶液は、ＮＰ－４０、ジチオスレイトールおよびドデシル硫酸ナトリウムを含む。
【0019】
実施形態において、上記放出されたグリカン部分を標識する工程は、８－アミノピレン－１，３，６－トリスルホン酸を上記放出されたグリカン部分に添加する工程を包含する。
【0020】
認識されるべきであるように、異なる実施形態からの種々の要素が、当業者の知識に従って他の実施形態と組み合わせるおよび／または他の実施形態を除去することができる。
【図面の簡単な説明】
【0021】
図面の簡単な説明
当業者は、以下に記載される図面が、例証目的に過ぎないことを理解する。図面は、出願人の教示の範囲をいかなる方法においても限定することを意図しない。
当業者は、以下に記載される図面が、例証目的に過ぎないことを理解する。図面は、出願人の教示の範囲をいかなる方法においても限定することを意図しない。
【0022】
【0023】
【0024】
【0025】
図３Ｂは、ＰＮＧａｓｅ Ｆグリカン放出反応に対する漸増量のグルコースの効果を示す。
【0026】
【0027】
【0028】
【0029】
【0030】
【0031】
【発明を実施するための形態】
【0032】
実施形態の詳細な説明
本教示は、沈殿を回避する温度勾配変性プロセスとともに血清糖タンパク質のアミンビーズベースの捕捉を含み、５０μＬにおいて１．５ｍｇ タンパク質程度の多さを含むサンプルの調製を可能にする方法を記載する。このアプローチの１つの利益は、サンプルマトリクスから高含有量の血中遊離糖（これは、ＰＮＧａｓｅＦ消化効率を阻害することが示されている）の除去である。上記サンプル調製法を、ｈＩｇＧ１およびヒト血清サンプルに対して試験した。
本教示は、沈殿を回避する温度勾配変性プロセスとともに血清糖タンパク質のアミンビーズベースの捕捉を含み、５０μＬにおいて１．５ｍｇ タンパク質程度の多さを含むサンプルの調製を可能にする方法を記載する。このアプローチの１つの利益は、サンプルマトリクスから高含有量の血中遊離糖（これは、ＰＮＧａｓｅＦ消化効率を阻害することが示されている）の除去である。上記サンプル調製法を、ｈＩｇＧ１およびヒト血清サンプルに対して試験した。
【0033】
実験手順
化学物質および試薬
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析のために使用した酢酸（氷酢酸）、酢酸アンモニウム（溶液中７．５Ｍ）、イソプロパノール、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＴＨＦ中１Ｍ）、テトラヒドロフラン、水（ＨＰＬＣグレード）、アセトニトリルおよび全ての化合物は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， ＵＳＡ）から得た。ヒト免疫グロブリンサンプル（ｈＩｇＧ１）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ（Ｎｏｖｉ， ＭＩ， ＵＳＡ）製であった。ヒト血清サンプルは、全ての必要とされる倫理的許可および患者の同意書を得て、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｄｅｂｒｅｃｅｎ（Ｄｅｂｒｅｃｅｎ， Ｈｕｎｇａｒｙ）が得た。Ｆａｓｔ Ｇｌｙｃａｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｋｉｔ（８－アミノピレン－１，３，６－トリスルホン酸（ＡＰＴＳ）のタグ化色素、ＨＲ－ＮＣＨＯ分離ゲル－緩衝液システムおよび過剰色素除去のための磁性ビーズを含む）は、Ｓｃｉｅｘ（Ｂｒｅａ， ＣＡ， ＵＳＡ）製であった。ＰＮＧａｓｅ Ｆ酵素は、Ａｓｐａｒｉａ ｇｌｙｃｏｍｉｃｓ（Ｓａｎ Ｓｅｂａｓｔｉａｎ， Ｓｐａｉｎ）製であった。アミン官能化磁性ビーズは、Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ（Ｂｅｒｌｉｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）製であった。
化学物質および試薬
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析のために使用した酢酸（氷酢酸）、酢酸アンモニウム（溶液中７．５Ｍ）、イソプロパノール、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＴＨＦ中１Ｍ）、テトラヒドロフラン、水（ＨＰＬＣグレード）、アセトニトリルおよび全ての化合物は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， ＵＳＡ）から得た。ヒト免疫グロブリンサンプル（ｈＩｇＧ１）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ（Ｎｏｖｉ， ＭＩ， ＵＳＡ）製であった。ヒト血清サンプルは、全ての必要とされる倫理的許可および患者の同意書を得て、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｄｅｂｒｅｃｅｎ（Ｄｅｂｒｅｃｅｎ， Ｈｕｎｇａｒｙ）が得た。Ｆａｓｔ Ｇｌｙｃａｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｋｉｔ（８－アミノピレン－１，３，６－トリスルホン酸（ＡＰＴＳ）のタグ化色素、ＨＲ－ＮＣＨＯ分離ゲル－緩衝液システムおよび過剰色素除去のための磁性ビーズを含む）は、Ｓｃｉｅｘ（Ｂｒｅａ， ＣＡ， ＵＳＡ）製であった。ＰＮＧａｓｅ Ｆ酵素は、Ａｓｐａｒｉａ ｇｌｙｃｏｍｉｃｓ（Ｓａｎ Ｓｅｂａｓｔｉａｎ， Ｓｐａｉｎ）製であった。アミン官能化磁性ビーズは、Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ（Ｂｅｒｌｉｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）製であった。
【0034】
サンプル調製
簡潔には、５０μＬの未希釈ヒト血清または５０μＬの３０ｍｇ／ｍＬのｈＩｇＧ１溶液からの糖タンパク質を、製造業者のプロトコールに従って、５０μＬの１Ｍ シアノ水素化ホウ素ナトリウム（テトラヒドロフラン中）および１．０ｍＬの０．１×ＰＢＳの混合物中に懸濁した２０μＬ（５０ｍｇ／ｍＬ）のアミン官能化磁性ビーズによって捕捉した。上清を除去した後、そのビーズを、１．０ｍＬのＨＰＬＣグレードの水で洗浄し、続いて、２０μＬのＨＰＬＣグレードの水で再懸濁した。上記捕捉されたタンパク質を、５．０℃／分の速度で３０℃から８０℃へと温度を上昇させ、さらに８０℃での５．０分間の等温インキュベーション工程によって、１０μＬの予め混合した変性溶液（１２．５％ グリセロールを補充した、Ｓｃｉｅｘ Ｆａｓｔ Ｇｌｙｃａｎ Ｋｉｔ）の存在下での温度勾配変性によって、ビーズ上でインサイチュ変性させた。上記変性工程に続いて、エンドグリコシダーゼ消化を行い、ビーズ上で再び、２．０μＬのＰＮＧａｓｅ Ｆ酵素（１．５ ＩＵＢ／μＬ）を上記反応混合物に添加し、５０℃で１．０時間インキュベートして、全てのＮ結合型グリカン構造タイプの完全な除去を確認した。グリカン放出プロセスの最後に、残りのポリペプチドを、１２０μＬ 氷冷アセトニトリルを添加することによって上記ビーズ上に結合させた。その上清（放出された糖を含む）を、６０℃において真空遠心分離機（２，５００ｒｐｍ， １．０時間）において乾燥させた。その乾燥サンプルを、ふたを閉めた状態で５０℃において１．０時間、続いて、ふたを開けた状態で５５℃において１．０時間のわずかな改変を伴って、本発明者らが近年公開した蒸発性標識プロトコール(Ｒｅｉｄｅｒ， Ｂ．， Ｓｚｉｇｅｔｉ， Ｍ．， ａｎｄ Ｇｕｔｔｍａｎ， Ａ． （２０１８） Ｅｖａｐｏｒａｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｏｆ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ ｖｉａ ｒｅｄｕｃｔｉｖｅ ａｍｉｎａｔｉｏｎ． Ｔａｌａｎｔａ １８５， ３６５－３６９（参考として援用される）)を使用してアミノピレン－トリスルホネート（ＡＰＴＳ）蛍光色素で標識した。標識工程の後に、過剰なＡＰＴＳ色素を、Ｆａｓｔ Ｇｌｙｃａｎ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓキット（Ｓｃｉｅｘ）からの磁性ビーズを使用して除去し、精製サンプルを、キャピラリー電気泳動－レーザー誘起蛍光（ＣＥ－ＬＩＦ）およびキャピラリー電気泳動－エレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＣＥ－ＥＳＩ－ＭＳ）方法によって分析した。
簡潔には、５０μＬの未希釈ヒト血清または５０μＬの３０ｍｇ／ｍＬのｈＩｇＧ１溶液からの糖タンパク質を、製造業者のプロトコールに従って、５０μＬの１Ｍ シアノ水素化ホウ素ナトリウム（テトラヒドロフラン中）および１．０ｍＬの０．１×ＰＢＳの混合物中に懸濁した２０μＬ（５０ｍｇ／ｍＬ）のアミン官能化磁性ビーズによって捕捉した。上清を除去した後、そのビーズを、１．０ｍＬのＨＰＬＣグレードの水で洗浄し、続いて、２０μＬのＨＰＬＣグレードの水で再懸濁した。上記捕捉されたタンパク質を、５．０℃／分の速度で３０℃から８０℃へと温度を上昇させ、さらに８０℃での５．０分間の等温インキュベーション工程によって、１０μＬの予め混合した変性溶液（１２．５％ グリセロールを補充した、Ｓｃｉｅｘ Ｆａｓｔ Ｇｌｙｃａｎ Ｋｉｔ）の存在下での温度勾配変性によって、ビーズ上でインサイチュ変性させた。上記変性工程に続いて、エンドグリコシダーゼ消化を行い、ビーズ上で再び、２．０μＬのＰＮＧａｓｅ Ｆ酵素（１．５ ＩＵＢ／μＬ）を上記反応混合物に添加し、５０℃で１．０時間インキュベートして、全てのＮ結合型グリカン構造タイプの完全な除去を確認した。グリカン放出プロセスの最後に、残りのポリペプチドを、１２０μＬ 氷冷アセトニトリルを添加することによって上記ビーズ上に結合させた。その上清（放出された糖を含む）を、６０℃において真空遠心分離機（２，５００ｒｐｍ， １．０時間）において乾燥させた。その乾燥サンプルを、ふたを閉めた状態で５０℃において１．０時間、続いて、ふたを開けた状態で５５℃において１．０時間のわずかな改変を伴って、本発明者らが近年公開した蒸発性標識プロトコール(Ｒｅｉｄｅｒ， Ｂ．， Ｓｚｉｇｅｔｉ， Ｍ．， ａｎｄ Ｇｕｔｔｍａｎ， Ａ． （２０１８） Ｅｖａｐｏｒａｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｏｆ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ ｖｉａ ｒｅｄｕｃｔｉｖｅ ａｍｉｎａｔｉｏｎ． Ｔａｌａｎｔａ １８５， ３６５－３６９（参考として援用される）)を使用してアミノピレン－トリスルホネート（ＡＰＴＳ）蛍光色素で標識した。標識工程の後に、過剰なＡＰＴＳ色素を、Ｆａｓｔ Ｇｌｙｃａｎ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓキット（Ｓｃｉｅｘ）からの磁性ビーズを使用して除去し、精製サンプルを、キャピラリー電気泳動－レーザー誘起蛍光（ＣＥ－ＬＩＦ）およびキャピラリー電気泳動－エレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＣＥ－ＥＳＩ－ＭＳ）方法によって分析した。
【0035】
キャピラリー電気泳動
ＣＥ－ＬＩＦ： 固体レーザー誘起蛍光検出（λｅｘ＝４８８ｎｍ／λｅｍ＝５２０ｎｍ）を備えたＰＡ８００ Ｐｌｕｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｃｉｅｘ）を、５０ｃｍおよび２０ｃｍ 有効長（それぞれの合計の長さは６０ｃｍおよび３０ｃｍ）の５０μｍ ＩＤ 露出された溶融シリカキャピラリーにおいてＨＲ－ＮＣＨＯ分離ゲル緩衝液を使用して、全てのキャピラリーゲル電気泳動分離のために使用した。印加した電位は、逆極性モード（注入側のカソード）において３０ｋＶであり、分離温度を３０℃に設定した。以下を含む３工程サンプル注入プロトコールを適用した： １）３０ｃｍおよび６０ｃｍのキャピラリーに関して、それぞれ、３．０および５．０ｐｓｉにおいて、５．０秒 水予備注入、２）キャピラリー長およびサンプル濃縮に基づいて、１．０秒間から３．０秒間のサンプル注入に対して１．０ｋＶから６．０ｋＶ（それぞれの図のキャプションの中で特定される）、および３）１．０ｋＶで１．０秒間のブラケット標準注入（マルトースおよびマルトペンタオース）。３２Ｋａｒａｔ（バージョン１０．１）ソフトウェアパッケージ（Ｓｃｉｅｘ）を、データ獲得および処理のために使用した。
ＣＥ－ＬＩＦ： 固体レーザー誘起蛍光検出（λｅｘ＝４８８ｎｍ／λｅｍ＝５２０ｎｍ）を備えたＰＡ８００ Ｐｌｕｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｃｉｅｘ）を、５０ｃｍおよび２０ｃｍ 有効長（それぞれの合計の長さは６０ｃｍおよび３０ｃｍ）の５０μｍ ＩＤ 露出された溶融シリカキャピラリーにおいてＨＲ－ＮＣＨＯ分離ゲル緩衝液を使用して、全てのキャピラリーゲル電気泳動分離のために使用した。印加した電位は、逆極性モード（注入側のカソード）において３０ｋＶであり、分離温度を３０℃に設定した。以下を含む３工程サンプル注入プロトコールを適用した： １）３０ｃｍおよび６０ｃｍのキャピラリーに関して、それぞれ、３．０および５．０ｐｓｉにおいて、５．０秒 水予備注入、２）キャピラリー長およびサンプル濃縮に基づいて、１．０秒間から３．０秒間のサンプル注入に対して１．０ｋＶから６．０ｋＶ（それぞれの図のキャプションの中で特定される）、および３）１．０ｋＶで１．０秒間のブラケット標準注入（マルトースおよびマルトペンタオース）。３２Ｋａｒａｔ（バージョン１０．１）ソフトウェアパッケージ（Ｓｃｉｅｘ）を、データ獲得および処理のために使用した。
【0036】
ＣＥ－ＭＳ： 全てのＣＥ－ＭＳ分析を、露出された溶融シリカＯｐｔｉＭＳキャピラリーカートリッジ（９１ｃｍ全長、３０μｍ ＩＤ、１５０μｍ ＯＤ）を使用して、６５００＋ ＱＴＲＡＰ質量分析器に接続したＣＥＳＩ ８０００ Ｐｌｕｓ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ － ＥＳＩ Ｍｏｄｕｌｅ（ともにＳｃｉｅｘ製）を使用することによって達成した。上記質量分析法に都合の良いバックグラウンド電解質は、１０ｍＭの酢酸アンモニウム、０．１％ 酢酸（ｐＨ４．５）および２０％ イソプロパノールを含んだ。分離を、分離ラインおよび導電ラインの両方に対して２．０ｐｓｉの前方への圧力を印加して、２０℃での逆極性モードにおいて、２０ｋＶ 印加電圧で行った。ここで、以下を含む２工程サンプル注入プロトコールを適用した： １）１．０ｐｓｉで５．０秒間の水予備注入、２）１０ｋＶで２０秒間のサンプル注入。
【0037】
質量分析法
Ｔｈｅ ６５００＋ ＱＴＲＡＰ質量分析器（Ｓｃｉｅｘ）を、エッチングした噴霧器側の露出した溶融シリカ（ＢＦＳ）カラムＯｐｔｉＭＳカートリッジを利用して、ナノソースインターフェースを伴う全ＣＥ－ＥＳＩ－ＭＳ実験のために陰イオン化モードで使用した。ＥＳＩ電圧を、－１，６００Ｖで１分間に設定して、スプレーを安定化し、次いで、高感度検出のために－１，４００ｋＶへと減少させた。オリフィスプレート温度は８０℃であり、カーテンガス圧は、上記システムの超低流速（２０．４ｎＬ／分）でのエレクトロスプレーの安定性を担保するために、５．０ｐｓｉであった。ＭＲＭスキャンは、１５ｍ秒時間において二重荷電されたＡＰＴＳ標識された標的グリカン質量を標的化した。その結果を評価し、ＰｅａｋＶｉｅｗソフトウェアパッケージ（バージョン２．２， Ｓｃｉｅｘ）で可視化した。
Ｔｈｅ ６５００＋ ＱＴＲＡＰ質量分析器（Ｓｃｉｅｘ）を、エッチングした噴霧器側の露出した溶融シリカ（ＢＦＳ）カラムＯｐｔｉＭＳカートリッジを利用して、ナノソースインターフェースを伴う全ＣＥ－ＥＳＩ－ＭＳ実験のために陰イオン化モードで使用した。ＥＳＩ電圧を、－１，６００Ｖで１分間に設定して、スプレーを安定化し、次いで、高感度検出のために－１，４００ｋＶへと減少させた。オリフィスプレート温度は８０℃であり、カーテンガス圧は、上記システムの超低流速（２０．４ｎＬ／分）でのエレクトロスプレーの安定性を担保するために、５．０ｐｓｉであった。ＭＲＭスキャンは、１５ｍ秒時間において二重荷電されたＡＰＴＳ標識された標的グリカン質量を標的化した。その結果を評価し、ＰｅａｋＶｉｅｗソフトウェアパッケージ（バージョン２．２， Ｓｃｉｅｘ）で可視化した。
【0038】
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
Ｃｌｅａｖｅｒ ｎａｎｏＰＡＣ－３００（Ｗａｒｗｉｃｋｓｈｉｒｅ， ＵＫ）スラブゲル電気泳動システムを、全てのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析に関して使用した。分離ゲルは、１０％の上側濃縮部分および１２％の下側分離ゲルを有した。上記濃縮ゲルは、０．３７５ｍＬの４０％ アクリルアミド（２．６７％ Ｎ，Ｎ’－メチレンビスアクリルアミドを含む）、０．３７５ｍＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、３０μＬの１０％ ＡＰＳ、３０μＬの１０％ ＳＤＳ、３．０μＬのＴＥＭＥＤおよび２．２ｍＬの水を含んだ。分離ゲルは、１．８ｍＬの４０％ アクリルアミド溶液（２．６７％ Ｎ，Ｎ’－メチレンビスアクリルアミドを含む）、１．５ｍＬの１．５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、６０μＬの１０％ ＡＰＳ、６０μＬの１０％ ＳＤＳ、３．０μＬのＴＥＭＥＤおよび２．６ｍＬの水を含んだ。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の前に、上記サンプルを、９５℃において５．０分間、４．０ｍＬのグリセロール、１．０ｍＬの２－メルカプトエタノール、１．２ｇのＳＤＳ、５．０ｍＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）および０．０３ｇのブロモフェノールブルーを含むサンプル緩衝液の１：１比で熱変成させた。分離緩衝液は、３．０Ｌの水に溶解した３６．０ｇのＴｒｉｓ、１７２．８ｇ グリシンおよび１２０ｍＬの１０％ ＳＤＳを含んだ。電気泳動を、１５０Ｖ 一定電圧を印加し、７５ｍＡ 電流を発生させることによって行った。その分離したタンパク質を、クーマシーブルー（１．０ｇのクーマシーブルーＲ２５０を、３００ｍＬのメタノール、６５０ｍＬの水および５０ｍＬの氷酢酸の混合物中に溶解した）で一晩染色し、続いて、３００ｍＬのメタノール、６５０ｍＬの水および５０ｍＬの氷酢酸の混合物中で脱色した。その発色させたゲル画像を、Ｎｉｋｏｎカメラによってデジタル化した。
Ｃｌｅａｖｅｒ ｎａｎｏＰＡＣ－３００（Ｗａｒｗｉｃｋｓｈｉｒｅ， ＵＫ）スラブゲル電気泳動システムを、全てのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析に関して使用した。分離ゲルは、１０％の上側濃縮部分および１２％の下側分離ゲルを有した。上記濃縮ゲルは、０．３７５ｍＬの４０％ アクリルアミド（２．６７％ Ｎ，Ｎ’－メチレンビスアクリルアミドを含む）、０．３７５ｍＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、３０μＬの１０％ ＡＰＳ、３０μＬの１０％ ＳＤＳ、３．０μＬのＴＥＭＥＤおよび２．２ｍＬの水を含んだ。分離ゲルは、１．８ｍＬの４０％ アクリルアミド溶液（２．６７％ Ｎ，Ｎ’－メチレンビスアクリルアミドを含む）、１．５ｍＬの１．５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、６０μＬの１０％ ＡＰＳ、６０μＬの１０％ ＳＤＳ、３．０μＬのＴＥＭＥＤおよび２．６ｍＬの水を含んだ。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の前に、上記サンプルを、９５℃において５．０分間、４．０ｍＬのグリセロール、１．０ｍＬの２－メルカプトエタノール、１．２ｇのＳＤＳ、５．０ｍＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）および０．０３ｇのブロモフェノールブルーを含むサンプル緩衝液の１：１比で熱変成させた。分離緩衝液は、３．０Ｌの水に溶解した３６．０ｇのＴｒｉｓ、１７２．８ｇ グリシンおよび１２０ｍＬの１０％ ＳＤＳを含んだ。電気泳動を、１５０Ｖ 一定電圧を印加し、７５ｍＡ 電流を発生させることによって行った。その分離したタンパク質を、クーマシーブルー（１．０ｇのクーマシーブルーＲ２５０を、３００ｍＬのメタノール、６５０ｍＬの水および５０ｍＬの氷酢酸の混合物中に溶解した）で一晩染色し、続いて、３００ｍＬのメタノール、６５０ｍＬの水および５０ｍＬの氷酢酸の混合物中で脱色した。その発色させたゲル画像を、Ｎｉｋｏｎカメラによってデジタル化した。
【0039】
本教示は、ＣＥ－ＬＩＦによるヒト血清のディープＮ－グリコミクス分析およびＣＥ－ＥＳＩ－ＭＳのより高度なサンプル濃縮要件を支援するためにスケールアップされ得る。スケールアップは、ＣＥ－ＥＳＩ－ＭＳにとっては特に重要であった。なぜなら放出されたグリカンもＡＰＴＳタグも、エレクトロスプレープロセスにおいて十分にイオン化されなかったからである。さらに、ＡＰＴＳ標識を用いると、陰イオン化モードが印加されなければならず、これは、陽イオンモード操作と比較して、より低いシグナル強度を生じる。
【0040】
ＣＥ－ＬＩＦによるヒト血清のディープグリコミクス分析のために、およびＣＥ－ＥＳＩ－ＭＳによってＡＰＴＳ標識Ｎ－グリカンを分析するための適切なサンプル量を確認するために、サンプル濃縮のかなりの増大が必要であった。以前は、ＣＥ－ＬＩＦおよびＣＥ－ＥＳＩ－ＭＳのサンプル調製法は、高い糖タンパク質濃度（＞１０ｍｇ／ｍＬ）で開始する。しかし、＞１０μＬ サンプル容積（およそ１００μｇ タンパク質に相当する）の使用は、変性工程の間に、大部分の場合において沈殿を引きおこし、酵素によるグリカン放出および発蛍光団タグ化という下流のサンプル調製工程を妨げる。例えば、図８に示される実験は、ｈＩｇＧ１が、旧来の変性技術を使用する場合、２０ｍｇ／ｍＬ（１０μＬ サンプル容積； ２００μｇ タンパク質）濃度においてまたはそれを上回る濃度で沈殿したことを示す。この問題を軽減するために、本教示の温度勾配変性法を利用した。温度を、３０℃から８０℃へと、５．０℃／分の速度で上昇させ、続いて、さらに８０℃で５．０分間、インキュベートした。このアプローチは、別の点で旧来の等温変性に伴う深刻な問題を表す３５ｍｇ／ｍＬ（１０μＬ サンプル容積； ３５０μｇ タンパク質）までの濃度においてタンパク質沈殿を軽減した。
【0041】
２．０μＬおよび５．０μＬ ヒト血清サンプルから始まる、放出されたＮ－グリカン分析の間に観察された別の現象は、変性工程の間にいずれの場合にも沈殿は観察されないが、より高いサンプル容積（５．０μＬ）で開始すると、より小さなピーク強度が生じることであった。図２を参照すると、２．０μＬ（上側の軌跡）および５．０μＬ（下側の軌跡）の初期サンプル容積からのＰＮＧａｓｅ Ｆで放出してＡＰＴＳで標識したヒト血清Ｎ－グリカンプールのＣＥ－ＬＩＦ分離が示される。図の上のＤＰ数は、マルトオリゴサッカリドラダーのグルコース単位（ＧＵ）を示す。分離条件： ＨＲ－ＮＣＨＯゲル緩衝液で充填した５０ｃｍ 有効（６０ｃｍ 合計）、５０μｍ ＩＤ 露出された溶融シリカキャピラリーカラム。印加電圧： ３０ｋＶ。分離温度： ３０℃。注入シーケンス： １）５．０ｐｓｉ／５．０秒 水； ２）６．０ｋＶ／３．０秒 サンプルおよび３）１．０ｋＶ／１．０秒 ブラケット標準。図２は、２．０μＬおよび５．０μＬのヒト血清から調製した、ＰＮＧａｓｅ Ｆ放出され、ＡＰＴＳ標識されたＮ－グリカンのＣＥ－ＬＩＦ分析軌跡を比較する。観察され得るように、いくつかのピークのシグナル強度は、小さい方（２．０μＬ）のサンプル容積がサンプル調製のために使用される場合のほぼ３倍高かった。
【0042】
反直感的な結果は、ＡＰＴＳ標識工程の間に放出された糖と競合する非常に多量の遊離血清糖（例えば、図２中で強調されるとおりのグルコース）含有量によって引きおこされることが見出された。図３ＡおよびＢを参照すると、得られるピーク強度に関するＡＰＴＳ標識反応（図３Ａ）およびＰＮＧａｓｅ Ｆグリカン放出反応（図３Ｂ）に対するグルコースの漸増量の影響。挿入図は、ＦＡ２Ｇ２構造のピーク強度変化を示す。ＣＥ－ＬＩＦ分離条件は、キャピラリー長（２０ｃｍ 有効、３０ｃｍ 全長、５０μｍ ＩＤ）および注入シーケンス： １）３．０ｐｓｉ／５．０秒 水； ２）１．０ｋＶ／１．０秒 サンプルおよび３）１．０ｋＶ／１．０秒 ブラケット標準を除いて、図２に示されるものと同じであった。実験において、漸増量のグルコースを、図３Ａに示されるＰＮＧａｓｅ Ｆ消化の後であるがＡＰＴＳ標識の前に、１０μＬの１０ｍｇ／ｍＬ ｈＩｇＧ１試験タンパク質サンプルに添加した。これは、ＡＴＰＳ標識工程前のグルコースの添加が、血清Ｎ－グライコームピークのシグナル強度において見かけ上の変化を生じなかったことを示す。右上角の挿入図は、ＦＡ２Ｇ２ピークの４．３％ ピーク面積ＲＳＤを示す（構造の略語は、Ｈａｒｖｅｙ， Ｄ． Ｊ．， Ｍｅｒｒｙ， Ａ． Ｈ．， Ｒｏｙｌｅ， Ｌ．， Ｃａｍｐｂｅｌｌ， Ｍ． Ｐ．， ａｎｄ Ｒｕｄｄ， Ｐ． Ｍ． （２０１１） Ｓｙｍｂｏｌ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｆｏｒ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｇｌｙｃａｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ： Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｔｏ ｃｏｖｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｔｙｐｅｓ． Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １１， ４２９１－４２９５（参考として援用される）に示唆される命名法に倣った）。反応混合物中で使用されるＡＴＰＳ濃度が、サンプル中の全ヒト血清Ｎ－グリカンおよび多量の添加されるグルコースの完全な標識を容易にするために十分であったことを注記することは重要である。第２の実験において、余分なグルコースを、ＰＮＧａｓｅ Ｆ消化の前にｈＩｇＧ１サンプルに添加したところ、これは、他方で、図３Ｂに示されるように、全てのピークのシグナル強度の顕著な減少を引きおこした。
【0043】
反応混合物中の漸増グルコース濃度は、ＰＮＧａｓｅ Ｆ酵素反応をおそらく阻害したと考えられる。参照軌跡と比較したピーク面積の連続的な減少を、５種の主要なｈＩｇＧ１グリカンに関して図４に示す。図４では、５種の主要なｈＩｇＧ１グリカン構造の生じるピーク面積に対する、ＰＮＧａｓｅ Ｆ消化反応の間の反応混合物中の漸増グルコース濃度の効果が、示される（シアル化－ＦＡ２Ｇ２Ｓ１、ガラクトシル化－ＦＡ２Ｇ２、ＦＡ２［６］Ｇ１、非ガラクトシル化－ＦＡ２、およびバイセクト型－ＦＡ２Ｂ）。
【0044】
上記で考察した問題、すなわち、ｈＩｇＧ１サンプル濃縮の３５ｍｇ／ｍＬ（１０μＬ中３５０μｇ タンパク質）を上回る変性工程の間の沈殿を回避し、ヒト血清サンプルからの多量のＰＮＧａｓｅ Ｆ阻害遊離糖（主にグルコース）を除去するために、アミン官能化磁性微粒子媒介性ワークフローを利用した。糖タンパク質を、シアノ水素化ホウ素ナトリウムの存在下でＰＢＳ緩衝液中の２０μＬの十分に懸濁したアミン官能化ビーズの表面上に捕捉した。捕捉工程の後、上記ビーズを、磁石スタンドによって下に引きつけて、その上清を除去し、ビーズを、ＨＰＬＣグレードの水で洗浄した。
【0045】
アミン官能化磁性ビーズ捕捉工程の効率を、１０μＬの１０ｍｇ／ｍＬ（１００μｇ タンパク質）および５０μＬの３０ｍｇ／ｍＬ（１．５ｍｇ タンパク質） ｈＩｇＧ１サンプルをそれぞれ使用することによって評価した。両方の場合に、１０μＬのサンプルを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる捕捉および洗浄工程の後に、ならびに５０ｍＭのクエン酸（ｐＨ３．０）での溶離後に、分析した。図５を参照すると、１０μＬの１０ｍｇ／ｍＬ ｈＩｇＧ１（パネルＡ）および５０μＬの３０ｍｇ／ｍＬ（パネルＢ） ｈＩｇＧ１のアミン官能化磁性ビーズ捕捉の効率のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。ストリップ１および４：非結合オーバーフロー； ストリップ２および５：洗浄工程； ストリップ３および６：５０ｍＭ クエン酸（ｐＨ３．０）でのタンパク質溶離。図５は、アミン官能化磁性ビーズによって捕捉されたタンパク質量が、適用されるビーズ量によってのみ制限されたことを示す。１０μＬの１０ｍｇ／ｍＬ（１００μｇ タンパク質） ｈＩｇＧ１サンプルの場合、タンパク質の全量を、図５の第１のストリップにおいて認められるようにビーズの表面上に捕捉した。これは、いかなるシグナルもないことを示す。また、この場合の洗浄工程は、図５のストリップ２においてバンドがないことによって示されるように、いかなるタンパク質をも除去しなかった。クエン酸溶離液において、ｈＩｇＧ１の軽鎖および重鎖はともに、図５のストリップ３における相当する２つのバンドによって示されるように明らかであった。他方で、その過負荷効果は、５０μＬの３０μｇ／ｍＬ（１．５ｍｇ タンパク質） ｈＩｇＧ１サンプルを注入した場合に容易に明らかであった。なぜならその構成要素（重鎖および軽鎖）は、図５のストリップ４において示されるように、ビーズ捕捉工程後のフロースルーにおいてなお明らかだったからである。より重要なことには、上記洗浄工程は、図５のストリップ５における構成要素の欠如によって認められるように、いかなる結合したタンパク質をも除去せず、図５のストリップ３および６に類似して、クエン酸が軽鎖および重鎖バンドを溶離することを示した。
【0046】
サンプル調製プロトコール
本教示は、変性、ＰＮＧａｓｅ Ｆ消化およびＡＰＴＳ標識を含む、生物学的サンプル（例えば、ヒト血清）のＮ－グリコシル化分析のための調製プロトコールを提供する。アミン官能化磁性ビーズベースのタンパク質捕捉と、温度勾配変性および本発明者らが以前に報告した蒸発性標識技術とを組み合わせると、３０ｍｇ／ｍＬ程度の高さの濃度および５０μＬ サンプル容積（１．５ｍｇ 全タンパク質） － 例えば、ｈＩｇＧ１およびヒト血清 － を有するサンプルが、いかなる沈殿問題もなしに、Ｎ－グリコシル化分析のために成功裡に調製された。上記プロトコールはまた、全ＰＮＧａｓｅ Ｆ阻害遊離糖（例えば、ヒト血清サンプル中に存在する多量のグルコース）の効率的除去を提供した。
本教示は、変性、ＰＮＧａｓｅ Ｆ消化およびＡＰＴＳ標識を含む、生物学的サンプル（例えば、ヒト血清）のＮ－グリコシル化分析のための調製プロトコールを提供する。アミン官能化磁性ビーズベースのタンパク質捕捉と、温度勾配変性および本発明者らが以前に報告した蒸発性標識技術とを組み合わせると、３０ｍｇ／ｍＬ程度の高さの濃度および５０μＬ サンプル容積（１．５ｍｇ 全タンパク質） － 例えば、ｈＩｇＧ１およびヒト血清 － を有するサンプルが、いかなる沈殿問題もなしに、Ｎ－グリコシル化分析のために成功裡に調製された。上記プロトコールはまた、全ＰＮＧａｓｅ Ｆ阻害遊離糖（例えば、ヒト血清サンプル中に存在する多量のグルコース）の効率的除去を提供した。
【0047】
キャピラリー電気泳動とレーザー誘起蛍光検出（ＣＥ－ＬＩＦ）
ｈＩｇＧ１およびヒト血清サンプルから放出されかつＡＰＴＳ標識したＮ－グリカンを、ＣＥ－ＬＩＦによって先ず分析した。図６を参照すると、ヒトｈＩｇＧ１（パネルＡ）およびヒト血清（パネルＢ）のＰＮＧａｓｅ Ｆで放出されかつＡＰＴＳ標識されたＮ結合型グリカンのＣＥ－ＬＩＦ分析。存在量が低い方の血清Ｎ－グリカンの拡大図は、パネルＢの挿入図の中に示される。サンプルを、多量のｈＩｇＧ１（１．５ｍｇ）および高容積のヒト血清（５０μＬ）サンプルから出発して、最適化したアミン官能化磁性ビーズ媒介性サンプル調製および温度勾配変性プロトコールに従って調製した。分離条件は、サンプルを１．０ｋＶ／１．０秒（注入シーケンス、工程２）によって注入したことを除いて、図２におけるものと同じであった。高強度シグナルは、以下の実施例１に記載される最適化したサンプル調製プロトコールを使用することによって、ｈＩｇＧ１（図６の第１のパネル）およびヒト血清サンプル（図６の第２のパネル）について観察された。温度勾配変性アプローチとともに適用したアミン官能化磁性ビーズベースのタンパク質捕捉プロトコールは、いかなるタンパク質沈殿問題もなしに、血清サンプルの２５倍超の量（図２において認められるように、２．０μＬの代わりに５０μＬ）の使用を可能にした。また、多量のグルコースを、血清サンプルから除去した（図６、パネルＢにおいて強調される）ところ、ＰＮＧａｓｅ Ｆ消化効率の阻害を大きく低減した。従って、実施例１のワークフローの後に処理した５０μＬ 血清サンプルからの１．０ｋＶで１．０秒（１ｋＶｓ）の動電的注入は、旧来のサンプル調製プロトコールに伴う６．０ｋＶ／３．０秒（１８ｋＶｓ）注入パラメーターを使用して２．０μＬ サンプル容積から観察された類似のピーク強度を生じた。このスケールアッププロトコールが、ヒト血清のディープＮ－グリコミクス分析のための十分な材料を提供した、すなわち、別の方法で基底ノイズにおいて失われたピークを明らかにしたことは、図６、パネルＢの挿入図から明らかである。サンプル調製および分析方法の相当する再現性は、表１に示される。上記ヒト血清サンプルからのより高い％ ＲＳＤ値は、アミン官能化磁性ビーズが、サンプル調製プロセスの間に反応バイアルの壁に貼り付く傾向にあることにおそらく原因があったことに注意すること。
ｈＩｇＧ１およびヒト血清サンプルから放出されかつＡＰＴＳ標識したＮ－グリカンを、ＣＥ－ＬＩＦによって先ず分析した。図６を参照すると、ヒトｈＩｇＧ１（パネルＡ）およびヒト血清（パネルＢ）のＰＮＧａｓｅ Ｆで放出されかつＡＰＴＳ標識されたＮ結合型グリカンのＣＥ－ＬＩＦ分析。存在量が低い方の血清Ｎ－グリカンの拡大図は、パネルＢの挿入図の中に示される。サンプルを、多量のｈＩｇＧ１（１．５ｍｇ）および高容積のヒト血清（５０μＬ）サンプルから出発して、最適化したアミン官能化磁性ビーズ媒介性サンプル調製および温度勾配変性プロトコールに従って調製した。分離条件は、サンプルを１．０ｋＶ／１．０秒（注入シーケンス、工程２）によって注入したことを除いて、図２におけるものと同じであった。高強度シグナルは、以下の実施例１に記載される最適化したサンプル調製プロトコールを使用することによって、ｈＩｇＧ１（図６の第１のパネル）およびヒト血清サンプル（図６の第２のパネル）について観察された。温度勾配変性アプローチとともに適用したアミン官能化磁性ビーズベースのタンパク質捕捉プロトコールは、いかなるタンパク質沈殿問題もなしに、血清サンプルの２５倍超の量（図２において認められるように、２．０μＬの代わりに５０μＬ）の使用を可能にした。また、多量のグルコースを、血清サンプルから除去した（図６、パネルＢにおいて強調される）ところ、ＰＮＧａｓｅ Ｆ消化効率の阻害を大きく低減した。従って、実施例１のワークフローの後に処理した５０μＬ 血清サンプルからの１．０ｋＶで１．０秒（１ｋＶｓ）の動電的注入は、旧来のサンプル調製プロトコールに伴う６．０ｋＶ／３．０秒（１８ｋＶｓ）注入パラメーターを使用して２．０μＬ サンプル容積から観察された類似のピーク強度を生じた。このスケールアッププロトコールが、ヒト血清のディープＮ－グリコミクス分析のための十分な材料を提供した、すなわち、別の方法で基底ノイズにおいて失われたピークを明らかにしたことは、図６、パネルＢの挿入図から明らかである。サンプル調製および分析方法の相当する再現性は、表１に示される。上記ヒト血清サンプルからのより高い％ ＲＳＤ値は、アミン官能化磁性ビーズが、サンプル調製プロセスの間に反応バイアルの壁に貼り付く傾向にあることにおそらく原因があったことに注意すること。
【表1】
【0048】
キャピラリー電気泳動とエレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＣＥ－ＥＳＩ－ＭＳ）
本教示、および特に、以下の実施例１で詳述される調製プロトコールを利用することによって調製されたｈＩｇＧ１およびヒト血清サンプルのＰＮＧａｓｅ Ｆ放出され、ＡＰＴＳ標識したＮ－グリカンをまた、ＣＥ－ＥＳＩ－ＭＳによって分析したところ、陰イオン化モードにおける負に荷電した糖－ＡＰＴＳ結合体の低いイオン化効率にもかかわらず、高強度ＭＳデータが生じた。図７を参照すると、ＣＥ－ＥＳＩ－ＭＳ ＴＩＣ、ならびにそれぞれ、ヒトＩｇＧ１（パネルＡおよびＣ）およびヒト血清（パネルＢおよびＤ）から放出されたＮ結合型グリカンの同定された構造の相当する面積が示される。条件： １０ｍＭ ＡｍＡｃ緩衝液（１０％ イソプロピルアルコールを有するｐＨ４．５）を充填した、９１ｃｍ 有効長（３０μｍ ＩＤ） 露出された溶融シリカキャピラリーカラム（ＯｐｔｉＭＳ）。印加電圧： ２．０ｐｓｉ 前方圧力で２０ｋＶ。分離温度：２０℃。注入シーケンス： １）１．０ｐｓｉ／５．０秒 水； ２）１０ｋＶ／２０秒 サンプル。パネルＡおよびＢは、それぞれ、ｈＩｇＧ１および血清サンプルの、放出されかつＡＰＴＳ標識されたＮ－グリカンプールの全イオン電気泳動図を示す。その相当するグリカン構造とそれらの積分されたピーク面積値は、図７のパネルＣおよびＤに示される。全ての同定されたグリカンの詳細な構造情報は、図９および１０に列挙される。
本教示、および特に、以下の実施例１で詳述される調製プロトコールを利用することによって調製されたｈＩｇＧ１およびヒト血清サンプルのＰＮＧａｓｅ Ｆ放出され、ＡＰＴＳ標識したＮ－グリカンをまた、ＣＥ－ＥＳＩ－ＭＳによって分析したところ、陰イオン化モードにおける負に荷電した糖－ＡＰＴＳ結合体の低いイオン化効率にもかかわらず、高強度ＭＳデータが生じた。図７を参照すると、ＣＥ－ＥＳＩ－ＭＳ ＴＩＣ、ならびにそれぞれ、ヒトＩｇＧ１（パネルＡおよびＣ）およびヒト血清（パネルＢおよびＤ）から放出されたＮ結合型グリカンの同定された構造の相当する面積が示される。条件： １０ｍＭ ＡｍＡｃ緩衝液（１０％ イソプロピルアルコールを有するｐＨ４．５）を充填した、９１ｃｍ 有効長（３０μｍ ＩＤ） 露出された溶融シリカキャピラリーカラム（ＯｐｔｉＭＳ）。印加電圧： ２．０ｐｓｉ 前方圧力で２０ｋＶ。分離温度：２０℃。注入シーケンス： １）１．０ｐｓｉ／５．０秒 水； ２）１０ｋＶ／２０秒 サンプル。パネルＡおよびＢは、それぞれ、ｈＩｇＧ１および血清サンプルの、放出されかつＡＰＴＳ標識されたＮ－グリカンプールの全イオン電気泳動図を示す。その相当するグリカン構造とそれらの積分されたピーク面積値は、図７のパネルＣおよびＤに示される。全ての同定されたグリカンの詳細な構造情報は、図９および１０に列挙される。
【実施例】
【0049】
実施例１
キャピラリー電気泳動およびＣＥ－ＥＳＩ－ＭＳによるヒト血清サンプルのディープＮ－グリコミクス分析に関する１つの実施形態のサンプル調製スケールアッププロトコールを、以下に記載する。手順に対する他の改変は、当業者の知識の範囲内である。
キャピラリー電気泳動およびＣＥ－ＥＳＩ－ＭＳによるヒト血清サンプルのディープＮ－グリコミクス分析に関する１つの実施形態のサンプル調製スケールアッププロトコールを、以下に記載する。手順に対する他の改変は、当業者の知識の範囲内である。
【0050】
サンプル：５０μＬのヒト血清／５０μＬのｍＡｂ（３０～５０ｍｇ／ｍＬ）溶液。
【0051】
１．アミン官能化磁性ビーズによるタンパク質捕捉。
［１］５０μＬのサンプルを１．５ｍＬ エッペンドルフチューブに入れる。
［２］５０μＬの１Ｍ ＮａＢＨ３ＣＮ（ＴＨＦ中）を上記サンプルに添加する。
［３］上記サンプルを最大速度で５秒間、ボルテックスにかける。
［４］１分間静置する。
［５］１．０ｍＬの０．１×ＰＢＳ溶液を添加する。
［６］２０μＬのアミン官能化磁性ビーズ（５０ｍｇ／ｍＬ； １．０μｍ 直径）を添加する。
［７］３０分間室温（ＲＴ）で静置する。
［１］５０μＬのサンプルを１．５ｍＬ エッペンドルフチューブに入れる。
［２］５０μＬの１Ｍ ＮａＢＨ３ＣＮ（ＴＨＦ中）を上記サンプルに添加する。
［３］上記サンプルを最大速度で５秒間、ボルテックスにかける。
［４］１分間静置する。
［５］１．０ｍＬの０．１×ＰＢＳ溶液を添加する。
［６］２０μＬのアミン官能化磁性ビーズ（５０ｍｇ／ｍＬ； １．０μｍ 直径）を添加する。
［７］３０分間室温（ＲＴ）で静置する。
【0052】
２．ビーズ洗浄
［８］磁石スタンドによって上記磁性ビーズを下に引きつけた後に、上清を除去する。
［９］上記ビーズを、５００μＬのＨＰＬＣグレードの水中で再構成する。
［１０］上記サンプルを最大速度で１０秒間、ボルテックスにかける。
［１１］卓上型微量遠心分離機の中で短時間（２～３秒間）遠心分離を適用する。
［１２］５分間ＲＴで静置する。
［１３］上記バイアルが磁石スタンドに置かれている間に、上清を除去する。
［８］磁石スタンドによって上記磁性ビーズを下に引きつけた後に、上清を除去する。
［９］上記ビーズを、５００μＬのＨＰＬＣグレードの水中で再構成する。
［１０］上記サンプルを最大速度で１０秒間、ボルテックスにかける。
［１１］卓上型微量遠心分離機の中で短時間（２～３秒間）遠心分離を適用する。
［１２］５分間ＲＴで静置する。
［１３］上記バイアルが磁石スタンドに置かれている間に、上清を除去する。
【0053】
３．温度勾配変性
［１４］７０μＬのＦａｓｔ Ｇｌｙｃａｎ Ｋｉｔ変性溶液に１０μＬのグリセロールを補充することによって、上記変性溶液を調製する（変性溶液 － Ｆａｓｔ Ｇｌｙｃａｎ Ｋｉｔ： ５０μＬの０．５％ ＮＰ－４０ ＋ １０μＬ １００ｍＭ ジチオスレイトール ＋ １０μＬの５％ ドデシル硫酸ナトリウム）。他の業者からの他の類似目的の変性溶液が、グリセロール補充とともに使用されてもよい。
［１５］２０μＬのＨＰＬＣグレードの水を、上記ビーズに添加する。
［１６］卓上型微量遠心分離機の中で短時間（２～３秒間）遠心分離を適用して、エッペンドルフバイアルの壁からいかなるサンプルをも移動させる。
［１７］１０μＬの変性溶液を上記サンプルに添加する（ピペット先端でビーズに触れてはならない）。
［１８］上記サンプルを最大速度で１０秒間、ボルテックスにかける。
［１９］卓上型微量遠心分離機の中で短時間（２～３秒間）遠心分離を適用する。
［２０］上記サンプルを、以下の温度勾配を使用して１５分間変性させる： ５℃／分加熱プログラムを使用して３０℃から８０℃へ、続いて、８０℃において５．０分間インキュベーション。
［１４］７０μＬのＦａｓｔ Ｇｌｙｃａｎ Ｋｉｔ変性溶液に１０μＬのグリセロールを補充することによって、上記変性溶液を調製する（変性溶液 － Ｆａｓｔ Ｇｌｙｃａｎ Ｋｉｔ： ５０μＬの０．５％ ＮＰ－４０ ＋ １０μＬ １００ｍＭ ジチオスレイトール ＋ １０μＬの５％ ドデシル硫酸ナトリウム）。他の業者からの他の類似目的の変性溶液が、グリセロール補充とともに使用されてもよい。
［１５］２０μＬのＨＰＬＣグレードの水を、上記ビーズに添加する。
［１６］卓上型微量遠心分離機の中で短時間（２～３秒間）遠心分離を適用して、エッペンドルフバイアルの壁からいかなるサンプルをも移動させる。
［１７］１０μＬの変性溶液を上記サンプルに添加する（ピペット先端でビーズに触れてはならない）。
［１８］上記サンプルを最大速度で１０秒間、ボルテックスにかける。
［１９］卓上型微量遠心分離機の中で短時間（２～３秒間）遠心分離を適用する。
［２０］上記サンプルを、以下の温度勾配を使用して１５分間変性させる： ５℃／分加熱プログラムを使用して３０℃から８０℃へ、続いて、８０℃において５．０分間インキュベーション。
【0054】
ビーズ上でのＰＮＧａｓｅ Ｆ消化
［２１］卓上型微量遠心分離機の中で短時間（２～３秒間）遠心分離を適用する。
［２２］５０μＬのＨＰＬＣグレードの水を、上記変性工程後に添加する。
［２３］２．０μＬのＰＮＧａｓｅ Ｆ酵素を添加する。
［２４］上記サンプルを最大速度で５秒間、ボルテックスにかける。
［２５］卓上型微量遠心分離機の中で短時間（２～３秒間）遠心分離を適用する。
［２６］上記サンプルを、５０℃において１．０時間インキュベートする。
［２１］卓上型微量遠心分離機の中で短時間（２～３秒間）遠心分離を適用する。
［２２］５０μＬのＨＰＬＣグレードの水を、上記変性工程後に添加する。
［２３］２．０μＬのＰＮＧａｓｅ Ｆ酵素を添加する。
［２４］上記サンプルを最大速度で５秒間、ボルテックスにかける。
［２５］卓上型微量遠心分離機の中で短時間（２～３秒間）遠心分離を適用する。
［２６］上記サンプルを、５０℃において１．０時間インキュベートする。
【0055】
予備標識工程
［２７］卓上型微量遠心分離機の中で短時間（２～３秒間）遠心分離を適用する。
［２８］１２０μＬの氷冷アセトニトリルを添加する。
［２９］上記サンプルを、－２０℃において１５分間維持する。
［３０］上記サンプルを、１０，７００×ｇにおいて５分間遠心分離する。
［３１］上記サンプル上清（２００μＬ）を新しい０．５ｍＬ エッペンドルフバイアルに移す。
［３２］上記サンプルを、ＳｐｅｅｄＶａｃの中で６０分間にわたって６０℃で乾燥させる。
［２７］卓上型微量遠心分離機の中で短時間（２～３秒間）遠心分離を適用する。
［２８］１２０μＬの氷冷アセトニトリルを添加する。
［２９］上記サンプルを、－２０℃において１５分間維持する。
［３０］上記サンプルを、１０，７００×ｇにおいて５分間遠心分離する。
［３１］上記サンプル上清（２００μＬ）を新しい０．５ｍＬ エッペンドルフバイアルに移す。
［３２］上記サンプルを、ＳｐｅｅｄＶａｃの中で６０分間にわたって６０℃で乾燥させる。
【0056】
６．蒸発性ＡＰＴＳ標識
［３３］１サンプルあたり９．０μＬの２０ｍＭ ＡＰＴＳ（２０％ 酢酸中）、１．０μＬの１Ｍ ＮａＢＨ３ＣＮ（ＴＨＦ中）および１０μＬのさらなるＴＨＦの標識ストック溶液を調製する。
［３４］２０μＬの標識溶液を乾燥したサンプルに添加する（上記サンプルをエッペンドルフの壁から標識溶液で洗い落とす）。
［３５］上記サンプルを最大速度で１０秒間、ボルテックスにかける。
［３６］卓上型微量遠心分離機の中で１０秒間、遠心分離を適用する。
［３７］上記サンプルを、１時間、５０℃で蓋を閉じた状態でインキュベートする。
［３８］上記サンプルを、さらに１時間、５５℃で蓋を開けた状態で（または上記サンプルが完全に乾燥するまで）インキュベートする。
［３９］代替の標識： サンプルを、３７℃で一晩蓋を開けてインキュベートする。
［３３］１サンプルあたり９．０μＬの２０ｍＭ ＡＰＴＳ（２０％ 酢酸中）、１．０μＬの１Ｍ ＮａＢＨ３ＣＮ（ＴＨＦ中）および１０μＬのさらなるＴＨＦの標識ストック溶液を調製する。
［３４］２０μＬの標識溶液を乾燥したサンプルに添加する（上記サンプルをエッペンドルフの壁から標識溶液で洗い落とす）。
［３５］上記サンプルを最大速度で１０秒間、ボルテックスにかける。
［３６］卓上型微量遠心分離機の中で１０秒間、遠心分離を適用する。
［３７］上記サンプルを、１時間、５０℃で蓋を閉じた状態でインキュベートする。
［３８］上記サンプルを、さらに１時間、５５℃で蓋を開けた状態で（または上記サンプルが完全に乾燥するまで）インキュベートする。
［３９］代替の標識： サンプルを、３７℃で一晩蓋を開けてインキュベートする。
【0057】
７．過剰な色素除去
［４０］上記乾燥したサンプルを、水中の２０μＬのＦａｓｔ Ｇｌｙｃａｎ Ｋｉｔ磁性ビーズ（磁石スタンド上で水での貯蔵溶液交換によって、２００μＬのＭ１ プロセス溶媒から濃縮される）で再構成する。
［４１］上記サンプルを最大速度で１０秒間、ボルテックスにかける（ビーズの添加後に完全な再構成のために３分間静置し、次いで、再びボルテックスにかける）。
［４２］１８０μＬのアセトニトリルを上記サンプルに添加する（この工程の後にはボルテックスにかけてはならない）。
［４３］ＲＴで１分間静置する。
［４４］磁石スタンド上にバイアルを置いた後、上清を除去する。
［４５］Ｆａｓｔ Ｇｌｙｃａｎ Ｋｉｔユーザーマニュアルに従って、２０μＬのＨＰＬＣグレードの水および１８０μＬのアセトニトリルを使用して、工程［４１］～［４３］をさらに３回反復する。
［４０］上記乾燥したサンプルを、水中の２０μＬのＦａｓｔ Ｇｌｙｃａｎ Ｋｉｔ磁性ビーズ（磁石スタンド上で水での貯蔵溶液交換によって、２００μＬのＭ１ プロセス溶媒から濃縮される）で再構成する。
［４１］上記サンプルを最大速度で１０秒間、ボルテックスにかける（ビーズの添加後に完全な再構成のために３分間静置し、次いで、再びボルテックスにかける）。
［４２］１８０μＬのアセトニトリルを上記サンプルに添加する（この工程の後にはボルテックスにかけてはならない）。
［４３］ＲＴで１分間静置する。
［４４］磁石スタンド上にバイアルを置いた後、上清を除去する。
［４５］Ｆａｓｔ Ｇｌｙｃａｎ Ｋｉｔユーザーマニュアルに従って、２０μＬのＨＰＬＣグレードの水および１８０μＬのアセトニトリルを使用して、工程［４１］～［４３］をさらに３回反復する。
【0058】
８．サンプル溶離
［４６］最後の上清除去工程の後に、５０μＬのＨＰＬＣグレードの水を添加する。
［４７］上記サンプルを最大速度で１０秒間、ボルテックスにかける。
［４８］卓上型微量遠心分離機の中で短時間（２～３秒間）の遠心分離を適用する。
［４９］上記サンプルを磁石スタンド上に少なくとも１分間置く。
［５０］新しい２００μＬ ＰＣＲチューブの中に４５μＬのサンプルを移す（磁性ビーズ移動を回避する）。
［５１］上記サンプルを、分析するまで４℃で貯蔵する。
［５２］５．０μＬのサンプルを、ＣＥＳＩ－ＭＳ測定のためのＣＥ ｎａｎｏＶｉａｌにおける５回までの連続注入に使用する。
［４６］最後の上清除去工程の後に、５０μＬのＨＰＬＣグレードの水を添加する。
［４７］上記サンプルを最大速度で１０秒間、ボルテックスにかける。
［４８］卓上型微量遠心分離機の中で短時間（２～３秒間）の遠心分離を適用する。
［４９］上記サンプルを磁石スタンド上に少なくとも１分間置く。
［５０］新しい２００μＬ ＰＣＲチューブの中に４５μＬのサンプルを移す（磁性ビーズ移動を回避する）。
［５１］上記サンプルを、分析するまで４℃で貯蔵する。
［５２］５．０μＬのサンプルを、ＣＥＳＩ－ＭＳ測定のためのＣＥ ｎａｎｏＶｉａｌにおける５回までの連続注入に使用する。
【0059】
上記の手順を使用して、ヒト血清Ｎ－グライコームの高感度ＣＥ－ＬＩＦ分析が可能になり、陰イオン化モードにおいてすらＣＥ－ＥＳＩ－ＭＳ分析のための適切なサンプル濃縮が提供される。
【0060】
本教示は、高濃度の糖タンパク質が使用される場合に、ＡＰＴＳ標識したサンプルのＣＥ－ＬＩＦおよびＣＥ－ＥＳＩ－ＭＳによって、ディープＮ－グリコミクス分析を可能にした。本教示は、沈殿問題を軽減し、エンドグリコシダーゼ媒介性グリカン放出反応を別な点で後に阻害される遊離血清糖の濃度を減少させた。
【0061】
多くの変更が、本教示の範囲から逸脱することなく開示される実施形態に対して行われ得ることは、理解されるべきである。前述の図面および実施例は、具体的な要素に言及するが、これは、例示および例証によるものであるに過ぎず、限定によるものでないことが意図される。種々の変更が、添付の特許請求の範囲によって包含される教示の範囲から逸脱することなく開示される実施形態に対して、形態および詳細において行われ得ることは、当業者によって認識されるべきである。
【0062】
略語： ＡＰＴＳ＝８－アミノピレン－１，３，６－トリスルホン酸三ナトリウム塩； ＣＥ－ＬＩＦ＝キャピラリー電気泳動とレーザー誘起蛍光検出； ＴＩＣ＝全イオンカウント； ＸＩＣ＝抽出イオンカウント； ｈＩｇＧ１＝ヒト免疫グロブリンＧ１； ＢＳＴ＝ブラケット標準； ＭＳ＝質量分析法； ＥＳＩ＝エレクトロスプレーイオン化； ＰＢＳ＝リン酸緩衝化生理食塩水、ＰＮＧａｓｅ Ｆ＝ペプチドＮ－グリコシダーゼＦ； ＤＰ＝重合度； ＲＴ＝室温。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【国際調査報告】