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特表2022-546908ＫＤＭ１Ａ阻害剤を使用した小細胞肺がんの個別化された処置のためのバイオマーカーおよび方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-11-10
(54)【発明の名称】ＫＤＭ１Ａ阻害剤を使用した小細胞肺がんの個別化された処置のためのバイオマーカーおよび方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/686 20180101AFI20221102BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20221102BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20221102BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20221102BHJP
A61K 31/132 20060101ALI20221102BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20221102BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20221102BHJP
C12N 9/99 20060101ALN20221102BHJP
C12Q 1/6851 20180101ALN20221102BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20221102BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/686 Z
A61P35/00
A61P11/00
A61P43/00 111
A61K31/132
A61K45/00
G01N33/53 M
C12N9/99 ZNA
C12Q1/6851 Z
C12N15/12
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022500505
(86)(22)【出願日】2019-07-05
(85)【翻訳文提出日】2022-03-04
(86)【国際出願番号】 EP2019068150
(87)【国際公開番号】W WO2021004610
(87)【国際公開日】2021-01-14
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】518329480
【氏名又は名称】オリゾン・ゲノミクス・ソシエダッド・アノニマ
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(72)【発明者】
【氏名】シセリ，フィリッポ
(72)【発明者】
【氏名】サシロット，ナタリア
(72)【発明者】
【氏名】ルナルディ，セレナ
【テーマコード（参考）】
4B063
4C084
4C206
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA05
4B063QA13
4B063QA19
4B063QQ02
4B063QQ08
4B063QQ53
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR56
4B063QR62
4B063QR84
4B063QS10
4B063QS13
4B063QS14
4B063QS25
4B063QS34
4B063QS36
4B063QS39
4B063QX02
4C084AA17
4C084NA14
4C084ZA592
4C084ZB262
4C206AA01
4C206AA02
4C206FA29
4C206MA01
4C206MA04
4C206NA14
4C206ZA59
4C206ZB26
(57)【要約】
本出願は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤による処置に対する小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）を有する患者の応答性を予測するためのバイオマーカーおよび方法、ならびに上記方法を使用して同定されたＳＣＬＣ患者のサブグループを処置する方法を開示する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高いＳＣＬＣを有する患者を同定する方法であって、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置を開始する前に、患者由来の試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを測定するステップを含む方法。
【請求項2】
試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の各レベルが閾値を超えた場合に、患者を、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高いものとして同定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを使用して、試料についてのスコアを生成するステップをさらに含み、試料についてのスコアが閾値を超えた場合に、患者を、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高いものとして同定される、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置が有益であり得るＳＣＬＣを有する患者を同定する方法であって、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置を開始する前に、患者由来の試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを測定するステップを含む方法。
【請求項5】
試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の各レベルが閾値を超えた場合に、患者を、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置が有益であり得るものとして同定するステップをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを使用して、試料についてのスコアを生成するステップをさらに含み、試料についてのスコアが閾値を超えた場合に、患者が、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置が有益であり得るものとして同定される、請求項４に記載の方法。
【請求項7】
ＳＣＬＣを有する患者の処置を選択する方法であって、処置を開始する前に、患者由来の試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを測定するステップを含む方法。
【請求項8】
ＡＳＣＬ１レベルおよびＳＯＸ２レベルがｍＲＮＡ発現レベルである、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
ｍＲＮＡ発現レベルがｑＲＴ－ＰＣＲによって測定される、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
ＡＳＣＬ１レベルおよびＳＯＸ２レベルがタンパク質発現レベルである、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
タンパク質発現レベルが蛍光免疫組織化学によって測定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
試料が生検である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
患者が、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高いものとして同定された場合に、患者にＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置の治療有効量を推奨するか、処方するかまたは投与するステップをさらに含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
ＳＣＬＣを有する患者の処置における使用のためのＫＤＭ１Ａ阻害剤であって、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置を開始する前に、患者が、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法を使用してＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高いものとして同定されているＫＤＭ１Ａ阻害剤。
【請求項15】
ＳＣＬＣを有する患者を処置する方法であって、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置を開始する前に、患者が、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法を使用して、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高いものとして同定された場合に、患者にＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置の治療有効量を投与するステップを含む方法。
【請求項16】
ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高い、ＳＣＬＣを有する患者を同定する方法におけるＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の使用。
【請求項17】
ＫＤＭ１Ａ阻害剤が（トランス）－Ｎ１－（（（１Ｒ，２Ｓ）－２－フェニルシクロプロピル）シクロヘキサン－１，４－ジアミンまたはその薬学的に許容される塩である、請求項１～１３に記載の方法、請求項１４に記載の使用のためのＫＤＭ１Ａ阻害剤、請求項１５に記載の処置する方法、または請求項１６に記載の使用。
【請求項18】
患者がヒト患者である、請求項１～１３もしくは１７に記載の方法、請求項１４もしくは１７に記載の使用のためのＫＤＭ１Ａ阻害剤、請求項１５もしくは１７に記載の処置する方法、または請求項１６もしくは１７に記載の使用。
【請求項19】
ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に対する、ＳＣＬＣを有する患者の応答の可能性を評価するためのキットであって、試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを測定するための１つ以上の薬剤、および場合により使用説明書を含むキット。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を使用した小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）の個別化された処置のためのバイオマーカーおよび方法に関する。本発明は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤による処置が有益であり得るＳＣＬＣを有する患者を同定する方法、およびこのような患者をＫＤＭ１Ａ阻害剤で処置する方法を提供する。
【背景技術】
【0002】
リジン特異的デメチラーゼ１（ＬＳＤ１、ＫＤＭ１Ａとしても公知である）は、ジメチルヒストン３リジン４（Ｈ３Ｋ４ｍｅ２）の脱メチル化に関与するヒストン修飾酵素である（Ｓｈｉら、Ｃｅｌｌ ２００４年）。いくつかのヒトがんにおいて、ＫＤＭ１Ａの過剰発現は、疾患の進行および不良な予後と関連しており、その阻害は、がん細胞の増殖、遊走および浸潤を低減させることが示されている。したがって、ＫＤＭ１Ａは、がんを処置するための新薬開発の目的の標的として認識されており、いくつかのＫＤＭ１Ａ阻害剤が現在、腫瘍学において臨床試験中である。
【0003】
特に、ＫＤＭ１Ａ阻害剤は小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）の処置に有効であることが報告されている。ＫＤＭ１Ａ阻害は、インビトロでＳＣＬＣ細胞株の増殖を低減させ、ＳＣＬＣ異種移植片担持マウスにおけるインビボでの腫瘍増殖を遅延させることが示されている（Ｍｏｈａｍｍａｄら、２０１５年、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２８巻、５７～６９頁）。しかしながら、公開されたデータは、ある種のＳＣＬＣはＫＤＭ１Ａ阻害に対して感受性が高いが、ＫＤＭ１Ａ阻害に対する感受性はＳＣＬＣ細胞の広範な特徴ではないことを示す。これにより、ＫＤＭ１Ａ阻害薬によるＳＣＬＣ処置を個別化する方法、特にＫＤＭ１Ａ阻害薬による処置を受けることが有益であるかまたは最も有益である、ＳＣＬＣを有する患者を同定することができる患者選択の方法を開発する必要性が高まっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
したがって、本発明の根底にある技術的課題は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤による処置に最も適したＳＣＬＣを有する患者を同定し、処置するための手段および方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を使用した小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）の個別化された処置のための手段および方法を提供する。
一態様では、本発明は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高い、ＳＣＬＣを有する患者を同定する方法であって、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置を開始する前に、患者由来の試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを測定することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の各レベルが閾値を超えた場合に、患者は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性がより高いものとして同定される。
一態様では、本発明は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高い、ＳＣＬＣを有する患者を同定する方法であって、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置を開始する前に、患者由来の試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを測定することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の各レベルが閾値を超えた場合に、患者は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性がより高いものとして同定される。
【0006】
例えば、患者は、ＳＣＬＣを有し、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置を開始する前に患者由来の試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルが測定された患者について試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の各レベルが閾値を超えなかった場合と比較して、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高いものとして同定される。比較対象の患者（試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の各レベルが閾値を超えない）は、反対に、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が低い。この例示的な説明は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤などを含む処置に応答する可能性が高い／応答性であるＳＣＬＣを有する患者を同定することに関与するか、包含するかまたは含む、本明細書において提供されるすべての態様および使用に適用される。
【0007】
一部の実施形態では、本方法は、試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを使用して、試料についてのスコアを生成することをさらに含み、試料についてのスコアが閾値を超えた場合に、患者は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性がより高いものとして同定される。
【0008】
別の態様では、本発明は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置が有益であり得るＳＣＬＣを有する患者を同定する方法であって、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置を開始する前に、患者由来の試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを測定することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の各レベルが閾値を超えた場合に、患者は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置が有益であり得るものとして同定される。一部の実施形態では、本方法は、試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを使用して、試料についてのスコアを生成することをさらに含み、試料についてのスコアが閾値を超えた場合に、患者は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置が有益であり得るものとして同定される。
【0009】
さらなる態様では、本発明は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に対するＳＣＬＣを有する患者の応答性を予測する方法であって、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置を開始する前に、患者由来の試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを測定することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の各レベルが閾値を超えた場合、患者は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答性である可能性が高いものとして同定される。一部の実施形態では、本方法は、試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを使用して、試料についてのスコアを生成することをさらに含み、試料についてのスコアが閾値を超えた場合に、患者は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答性である可能性が高いものとして同定される。
【0010】
さらなる態様では、本発明は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する、ＳＣＬＣを有する患者の可能性を評価する方法であって、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置を開始する前に、患者由来の試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを測定することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の各レベルが閾値を超えた場合に、患者は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高いものとして同定される。一部の実施形態では、本方法は、試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを使用して、試料についてのスコアを生成することをさらに含み、試料についてのスコアが閾値を超えた場合に、患者は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高いものとして同定される。
【0011】
さらなる態様では、本発明は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する患者におけるＳＣＬＣの可能性を評価する方法であって、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置を開始する前に、ＳＣＬＣを有する患者由来の試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを測定することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、ＳＣＬＣは、試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の各レベルが閾値を超えた場合に、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処理に応答する可能性が高いものとして同定される。一部の実施形態では、本方法は、試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを使用して、試料についてのスコアを生成することをさらに含み、ＳＣＬＣは、試料中のスコアが閾値を超えた場合に、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高いものとして同定される。
【0012】
さらなる態様では、本発明は、ＳＣＬＣを有する患者の処置を選択する方法であって、処置を開始する前に、患者由来の試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを測定することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の各レベルが閾値を超えた場合に、患者に対して選択された処置がＫＤＭ１Ａ阻害剤を含むという推奨を提供することを含む。一部の実施形態では、本方法は、試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを使用して、試料についてのスコアを生成し、試料についてのスコアが閾値を超えた場合に、患者に対して選択された処置がＫＤＭ１Ａ阻害剤を含むという推奨を提供することをさらに含む。換言すれば、ＳＣＬＣを有する患者に対して選択される処置は、例えば、試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の各レベルが閾値を超えた場合に、または試料中のスコアが閾値を超えた場合に、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置である。ＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の各レベルが閾値を超えない場合に、またはスコアが閾値を超えない場合に、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置以外の他の処置選択肢、例えば、ＫＤＭ１Ａ阻害剤以外の薬物／治療剤による処置が、患者に対して企図され得る。
【0013】
さらなる態様では、本発明は、ＳＣＬＣを有する患者を処置する方法であって、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置を開始する前に、患者が、前述の態様のいずれかによる方法を使用して、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高いものとして同定された場合に、患者にＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置の治療有効量を投与することを含む方法を提供する。
【0014】
さらなる態様では、本発明は、ＳＣＬＣを有する患者を処置する方法であって、処置を開始する前に、患者由来の試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを測定し、試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の各レベルが閾値を超えた場合に、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高いものとして患者を同定し、応答する可能性が高いものとして同定された場合に、患者にＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置の治療有効量を投与することを含む方法を特徴とする。
【0015】
さらなる態様では、本発明は、ＳＣＬＣを有する患者を処置する方法であって、処置を開始する前に、患者由来の試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを測定し、これらのレベルを使用して、試料についてのスコアを生成し、試料についてのスコアが閾値を超えた場合に、患者は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高いものとして同定され、応答する可能性が高いものとして同定された場合に、患者にＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置の治療有効量を投与することを含む方法を特徴とする。
【0016】
さらなる態様では、本発明は、ＳＣＬＣを有する患者の処置における使用のためのＫＤＭ１Ａ阻害剤であって、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置を開始する前に、患者は、前述の態様のいずれかによる方法を使用して、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高いものとして同定されているＫＤＭ１Ａ阻害剤を提供する。
【0017】
さらなる態様では、本発明は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高い、ＳＣＬＣを有する患者を同定する方法におけるＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の使用を提供する。
【0018】
さらなる態様では、本発明は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に対する、ＳＣＬＣを有する患者の応答の可能性を評価する方法におけるＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の使用を提供する。
【0019】
さらなる態様では、本発明は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高い、ＳＣＬＣを有する患者を同定する方法において、ＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを測定するための１つ以上の薬剤の使用を提供する。
【0020】
さらなる態様では、本発明は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に対する、ＳＣＬＣを有する患者の応答の可能性を評価する方法において、ＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを測定するための１つ以上の薬剤の使用を提供する。
【0021】
さらなる態様では、本発明は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高い、ＳＣＬＣを有する患者を同定するための診断薬を製造するためのＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の使用を提供する。
【0022】
さらなる態様では、本発明は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に対する、ＳＣＬＣを有する患者の応答の可能性を評価するための診断薬を製造するためのＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の使用を提供する。
【0023】
別の態様では、本発明は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高い、ＳＣＬＣを有する患者を同定するためのキットであって、試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを測定するための１つ以上の薬剤、および場合により使用説明書を含むキットを提供する。
【0024】
別の態様では、本発明は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に対する、ＳＣＬＣを有する患者の応答の可能性を評価するためのキットであって、試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを測定するための１つ以上の薬剤、および場合により使用説明書を含むキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【図1】実施例２により詳細に記載されるように、ＫＤＭ１Ａ阻害に対すＳＣＬＣ細胞株感受性（灰色の点）、部分的な感受性（空の正方形）または耐性（黒色の三角形）について、ＲＮＡ－ｓｅｑ（Ｌｏｇ２（ＲＰＫＭ）値）によって測定されたＡＳＣＬ１（Ｙ軸）およびＳＯＸ２（Ｘ軸）の発現を表すドットプロットを示す図である。
【図2】実施例３に記載されるように、ＫＤＭ１Ａ阻害に対するＳＣＬＣ細胞株感受性（灰色の点）、部分的な感受性（空の正方形）または耐性（黒色の菱形）について、ＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のｑＲＴ－ＰＣＲ（絶対Ｃｐ値）によって測定された遺伝子発現を表すドットプロットを示す図である。プロット値は、独立した実験の平均値である。括弧内の値は、ＳＯＸ２の発現について４０を超えるＣｐ値を有する。
【図3】実施例４に記載されるように、ＫＤＭ１Ａ阻害に対するＳＣＬＣ細胞株感受性（灰色の点）、部分的な感受性（空の正方形）または耐性（黒色の三角形）の拡張パネルにおけるＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のマイクロアレイＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ分析（ＲＭＡ値）によって測定された遺伝子発現を表すドットプロットを示す図である。
【図4A】実施例４に記載されるように、ＫＤＭ１Ａｉ感受性および耐性ＳＣＬＣ細胞を識別するための、ＡＳＣＬ１（図４Ａ）およびＳＯＸ２（図４Ｂ）の遺伝子発現に基づくＲＯＣ曲線を示す図である。所定の閾値に対するそれぞれの信頼区間の感度および特異度を各グラフの下の表に示す。
【図4B】実施例４に記載されるように、ＫＤＭ１Ａｉ感受性および耐性ＳＣＬＣ細胞を識別するための、ＡＳＣＬ１（図４Ａ）およびＳＯＸ２（図４Ｂ）の遺伝子発現に基づくＲＯＣ曲線を示す図である。所定の閾値に対するそれぞれの信頼区間の感度および特異度を各グラフの下の表に示す。
【図5A】実施例５．１に記載されるように、ＮＣＩ－Ｈ１４６、ＮＣＩ－Ｈ５１０Ａ、ＮＣＩ－Ｈ４４６およびＮＣＩ－Ｈ５２６細胞株におけるＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２タンパク質レベルのウエスタンブロット（ＷＢ）（図５Ａ）および定量（図５Ｂ）を示す図である。
【図5B】実施例５．１に記載されるように、ＮＣＩ－Ｈ１４６、ＮＣＩ－Ｈ５１０Ａ、ＮＣＩ－Ｈ４４６およびＮＣＩ－Ｈ５２６細胞株におけるＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２タンパク質レベルのウエスタンブロット（ＷＢ）（図５Ａ）および定量（図５Ｂ）を示す図である。
【図7A】実施例５．２によるＳＯＸ２（図７Ａ）、ＡＳＣＬ１（図７Ｂ）および陰性対照（一次抗体なし、図７Ｃ）の蛍光免疫組織化学染色を示す図であり、ＮＣＩ－Ｈ５２６細胞における両バイオマーカーの低レベル／検出不能レベル、ＮＣＩ－Ｈ４４６細胞におけるＡＳＣＬ１の低レベル／検出不能レベル、およびＮＣＩ－Ｈ１４６細胞における両バイオマーカーの最高レベルを示し、それらのｍＲＮＡレベルと一致する。ＤＡＰＩ：ＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）は、ＤＮＡ中のＡ－Ｔリッチ領域に強く結合し、核を染色する蛍光色素である。二次抗体のみの陰性対照（ＡＦ５４６：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６）ではシグナルは検出されない。
【図7B】実施例５．２によるＳＯＸ２（図７Ａ）、ＡＳＣＬ１（図７Ｂ）および陰性対照（一次抗体なし、図７Ｃ）の蛍光免疫組織化学染色を示す図であり、ＮＣＩ－Ｈ５２６細胞における両バイオマーカーの低レベル／検出不能レベル、ＮＣＩ－Ｈ４４６細胞におけるＡＳＣＬ１の低レベル／検出不能レベル、およびＮＣＩ－Ｈ１４６細胞における両バイオマーカーの最高レベルを示し、それらのｍＲＮＡレベルと一致する。ＤＡＰＩ：ＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）は、ＤＮＡ中のＡ－Ｔリッチ領域に強く結合し、核を染色する蛍光色素である。二次抗体のみの陰性対照（ＡＦ５４６：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６）ではシグナルは検出されない。
【図7C】実施例５．２によるＳＯＸ２（図７Ａ）、ＡＳＣＬ１（図７Ｂ）および陰性対照（一次抗体なし、図７Ｃ）の蛍光免疫組織化学染色を示す図であり、ＮＣＩ－Ｈ５２６細胞における両バイオマーカーの低レベル／検出不能レベル、ＮＣＩ－Ｈ４４６細胞におけるＡＳＣＬ１の低レベル／検出不能レベル、およびＮＣＩ－Ｈ１４６細胞における両バイオマーカーの最高レベルを示し、それらのｍＲＮＡレベルと一致する。ＤＡＰＩ：ＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）は、ＤＮＡ中のＡ－Ｔリッチ領域に強く結合し、核を染色する蛍光色素である。二次抗体のみの陰性対照（ＡＦ５４６：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６）ではシグナルは検出されない。
【図9】ＳＣＬＣ ＰＤＸ ＴＭＡからの代表的なＡＳＣＬ１、ＳＯＸ２、およびそれらの対応するＤＡＰＩ蛍光免疫組織化学画像は、実施例５．３に記載されるように、各染色分類レベル０、１、２および３について示される。
【図10A】９５％信頼区間を有する、ＳＯＸ２（図１０Ａおよび１０Ｂ）およびＡＳＣＬ１（図１０Ｃおよび１０Ｄ）についてのＲＮＡＳｅｑ（Ｌｏｇ２ＦＰＫＭ）とＩＦ（視覚スコア）データセット間の両側スピアマン相関検定が、実施例５．３に記載されるように、２つの独立した実験（各グラフの下部に係数を特定する）について示される図である。
【図10B】９５％信頼区間を有する、ＳＯＸ２（図１０Ａおよび１０Ｂ）およびＡＳＣＬ１（図１０Ｃおよび１０Ｄ）についてのＲＮＡＳｅｑ（Ｌｏｇ２ＦＰＫＭ）とＩＦ（視覚スコア）データセット間の両側スピアマン相関検定が、実施例５．３に記載されるように、２つの独立した実験（各グラフの下部に係数を特定する）について示される図である。
【図10C】９５％信頼区間を有する、ＳＯＸ２（図１０Ａおよび１０Ｂ）およびＡＳＣＬ１（図１０Ｃおよび１０Ｄ）についてのＲＮＡＳｅｑ（Ｌｏｇ２ＦＰＫＭ）とＩＦ（視覚スコア）データセット間の両側スピアマン相関検定が、実施例５．３に記載されるように、２つの独立した実験（各グラフの下部に係数を特定する）について示される図である。
【図10D】９５％信頼区間を有する、ＳＯＸ２（図１０Ａおよび１０Ｂ）およびＡＳＣＬ１（図１０Ｃおよび１０Ｄ）についてのＲＮＡＳｅｑ（Ｌｏｇ２ＦＰＫＭ）とＩＦ（視覚スコア）データセット間の両側スピアマン相関検定が、実施例５．３に記載されるように、２つの独立した実験（各グラフの下部に係数を特定する）について示される図である。
【図11】実施例６によるエキソソーム画分中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２についてのＷＢおよびポンソー染色を示す図である。ｍＲＮＡ発現と一致して、ＡＳＣＬ１は、ＮＣＩ－Ｈ４４６およびＮＣＩ－Ｈ５２６由来のエキソソームには検出されず、ＳＯＸ２は、ＮＣＩ－Ｈ５２６由来のエキソソームには存在しなかった。
【図12】実施例６による、エキソソームと対応する親細胞の両方におけるＡＳＣＬ１、ＳＯＸ２およびＣＤ１５１（肺がん特異的エキソソームマーカー）についてのＷＢ（左）およびポンソー染色（右）を示す図である。ＡＳＣＬ１、ＳＯＸ２およびＣＤ１５１シグナルは、５μＭのＧＷ４８６９（エキソソーム産生阻害剤）で４８時間のＮＣＩ－Ｈ５１０Ａ細胞の処理後、エキソソーム画分において有意に低減または除去され、一方、細胞におけるこれらのタンパク質の発現は影響を受けず、ＡＳＣＬ１、ＳＯＸ２およびＣＤ１５１の検出はエキソソーム特異的である。
【発明を実施するための形態】
【0026】
定義
別段の定義がない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似または同等の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。
別段の定義がない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似または同等の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。
【0027】
本明細書に言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願において使用される命名法は、特に断らない限り、ＩＵＰＡＣ系統命名法に基づく。
本出願において使用される命名法は、特に断らない限り、ＩＵＰＡＣ系統命名法に基づく。
【0028】
本明細書における構造中の炭素原子、酸素原子、硫黄原子または窒素原子上に現れる任意の開いた原子価は、特に断らない限り、水素の存在を示す。
本明細書において使用される立体化学的定義および慣例は、一般に、Ｓ．Ｐ．Ｐａｒｋｅｒ、編集、ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｒｍｓ（１９８４年）ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ Ｂｏｏｋ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｅｌｉｅｌ，Ｅ．およびＷｉｌｅｎ，Ｓ．、「Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９４年に従う。光学活性化合物の記載では、接頭辞ＤおよびＬ、またはＲおよびＳを使用して、そのキラル中心（複数可）についての分子の絶対的立体配置を示す。考慮中のキラル中心に結合した置換基は、Ｃａｈｎ、ＩｎｇｏｌｄおよびＰｒｅｌｏｇ（Ｃａｈｎら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｅｒ．編集、１９６６年、５巻、３８５頁；ｅｒｒａｔａ ５１１）の配列規則に従ってランク付けされる。接頭辞ＤおよびＬまたは（＋）および（－）は、化合物による平面偏光の回転の符号を示すために使用され、（－）またはＬは化合物が左旋性であることを示す。（＋）またはＤを接頭語とする化合物は右旋性である。
本明細書において使用される立体化学的定義および慣例は、一般に、Ｓ．Ｐ．Ｐａｒｋｅｒ、編集、ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｒｍｓ（１９８４年）ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ Ｂｏｏｋ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｅｌｉｅｌ，Ｅ．およびＷｉｌｅｎ，Ｓ．、「Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９４年に従う。光学活性化合物の記載では、接頭辞ＤおよびＬ、またはＲおよびＳを使用して、そのキラル中心（複数可）についての分子の絶対的立体配置を示す。考慮中のキラル中心に結合した置換基は、Ｃａｈｎ、ＩｎｇｏｌｄおよびＰｒｅｌｏｇ（Ｃａｈｎら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｅｒ．編集、１９６６年、５巻、３８５頁；ｅｒｒａｔａ ５１１）の配列規則に従ってランク付けされる。接頭辞ＤおよびＬまたは（＋）および（－）は、化合物による平面偏光の回転の符号を示すために使用され、（－）またはＬは化合物が左旋性であることを示す。（＋）またはＤを接頭語とする化合物は右旋性である。
【0029】
用語「場合による」または「場合により」は、続いて記載される事象または状況が起こり得るが、起こり得る必要はないこと、および、説明には、事象または状況が起こる事例および起こらない事例が含まれることを示す。
【0030】
用語「薬学的に許容される塩」は、生物学的にも、また他の点でも望ましくないことはない塩を示す。薬学的に許容される塩は、酸と塩基の付加塩の両方を含む。薬学的に許容される塩は、当該技術分野において周知である。
【0031】
「薬学的に許容される酸付加塩」という用語は、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、炭酸、リン酸、ならびに有機酸、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マレイン酸、マロニン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、アスパラギン酸、アスコルビン酸、グルタミン酸、アントラニル酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、エンボン酸、フェニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、およびサリチル酸の脂肪族、脂環式、芳香族、アリール脂肪族、複素環式、カルボン酸、およびスルホン酸のクラスから選択される有機酸で形成されるそれらの薬学的に許容される塩を指す。
【0032】
用語「薬学的に許容される塩基付加塩」は、有機塩基または無機塩基で形成された薬学的に許容される塩を示す。許容される無機塩基の例としては、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、およびアルミニウム塩が挙げられる。薬学的に許容される有機非毒性塩基から誘導される塩には、第一級、第二級および第三級アミンの塩、置換アミン、例えば、天然に存在する置換アミン、環状アミンおよび塩基性イオン交換レジン、例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２－ジエチルアミノエタノール、トリメタミン、ジシクロヘキシルアミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカフェイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルコサミン、テオブロミン、プリン、ピペリジン（piperizine）、ピペリジン、Ｎ－エチルピペリジン、およびポリアミンレジンが含まれる。
【0033】
用語「ＫＤＭ１Ａ阻害剤」または「ＫＤＭ１Ａｉ」は、互換的に使用され、本明細書で使用される場合、ＫＤＭ１Ａ活性を阻害することができる任意の化合物を意味する。ＫＤＭ１Ａ阻害活性を決定する方法は当該技術分野において周知である。好ましい実施形態では、ＫＤＭ１Ａ阻害剤は小分子である。ＫＤＭ１Ａ阻害剤の例は、本明細書の他の箇所に詳細に記載される。
【0034】
本明細書で使用される場合、「小分子」とは、９００ダルトン以下、好ましくは５００ダルトン以下の分子量を有する有機化合物を指す。分子量は分子の質量であり、各構成元素の原子重量に、分子式内のその元素の原子数を掛けたものの合計として計算される。
【0035】
「ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置」とは、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を組み込んだ治療または処置レジメンを意味し、単独の活性な医薬品成分（ＡＰＩ）としてであるか、または他の抗がん剤と同様に１つ以上の追加のＡＰＩと組み合わせているかを問わない。ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む上記処理は、典型的には、医薬組成物の形態である。ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処理が、ＫＤＭ１Ａ阻害剤に加えて１つ以上のＡＰＩを含む場合、それらは、すべてのＡＰＩを組み込んだ単一の医薬組成物の形態で投与することができ、または他には、同じ経路もしくは異なる経路（例えば、一方が経口投与され得、他方が非経口投与され得る）によって投与することができ、同時にまたは連続的に投与することができる、各ＡＰＩ（すなわち、ＫＤＭ１Ａ阻害剤および１つ以上の追加のＡＰＩ）のための個々の医薬組成物の形態で投与することができる。
【0036】
用語「医薬組成物」および「医薬製剤」は、互換的に使用され、哺乳動物、例えば、それを必要とするヒトに投与される１つ以上の薬学的に許容される賦形剤とともに、治療有効量の活性な薬学的成分（例えば、ＫＤＭ１Ａ阻害剤）を含む組成物（例えば、混合物または溶液）を示す。
【0037】
「薬学的に許容される」という用語は、一般に安全であり、毒性がなく、生物学的または他の方法で望ましくないことはなく、獣医およびヒトの医薬使用に許容される医薬組成物の調製に有用な材料の属性を意味する。
【0038】
用語「薬学的に許容される賦形剤」、「薬学的に許容される担体」および「治療的に不活性な賦形剤」は、互換的に使用することができ、治療活性がなく、医薬製品の製剤化に使用される崩壊剤、結合剤、充填剤、溶媒、緩衝剤、浸透圧剤、安定剤、酸化防止剤、界面活性剤、担体、希釈剤または滑沢剤などの、投与される対象に対して無毒性である医薬組成物中の薬学的に許容される任意の成分を示す。
【0039】
用語「治療有効量」（または「有効量」）は、患者に投与された場合、（ｉ）特定の疾患を処置もしくは予防し、（ｉｉ）疾患の１つ以上の症状を軽減し、改善し、もしくは除去し、または（ｉｉｉ）疾患の１つ以上の症状の発症を予防しもしくは遅延させる、本発明の化合物の量を示す。治療有効量は、化合物、処置される病状況、処置される疾患の重症度、患者の年齢および相対的な健康、投与経路および投与形態、担当医または獣医の判断、および他の要因に依存して変化する。
【0040】
疾患（例えば、ＳＣＬＳ）「を処置すること」またはその「処置」という用語は、疾患またはその１つ以上の症状の進行を逆転、軽減、または抑制することが含まれる。
「患者」または「対象」は、互換的に使用することができ、処置を必要とする哺乳動物を意味する。哺乳動物には、限定されないが、霊長類（例えば、ヒトおよび非ヒト霊長類、例えばサル）、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌおよびウマ）および実験動物（マウス、ラット、モルモットなど）が含まれる。好ましい実施形態では、患者はヒトである。患者として組み込まれることが意図されるのは、臨床研究試験に参加する任意の対象である。患者は、例えば、他の薬物および／または任意のＫＤＭ１Ａ阻害剤で以前に処置されていている場合がある。一態様では、患者は、いずれのＫＤＭ１Ａ阻害剤でも以前に処置されたことがない。患者は、他の薬物で、特に試料を得る時に処置され得るが、本発明の方法において使用するための試料を得る時には、いずれのＫＤＭ１Ａ阻害剤でも処置されてはならない（すなわち、患者は、試料を得る時にＫＤＭ１Ａ阻害剤と同時に処置されてはならない）。あるいは、バイオマーカーレベルが（残りの）ＫＤＭ１Ａ阻害剤によって、その期間内に調節され得る場合（例えば、バイオマーカーレベルがＫＤＭ１Ａ阻害剤による以前の処置（またはＫＤＭ１Ａ阻害剤の投与）の前のレベルに戻っていない場合）、患者は、試料を得る前の期間内に、いずれのＫＤＭ１Ａ阻害剤でも処置されてはならない。例えば、患者は、試料を得る前に、２週間以内、より好ましくは１カ月以内に、いずれのＫＤＭ１Ａ阻害剤でも処置されてはならない。後者は、バイオマーカーレベルが（残りの）ＫＤＭ１Ａ阻害剤によって依然として調節され得ることを回避することである。
「患者」または「対象」は、互換的に使用することができ、処置を必要とする哺乳動物を意味する。哺乳動物には、限定されないが、霊長類（例えば、ヒトおよび非ヒト霊長類、例えばサル）、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌおよびウマ）および実験動物（マウス、ラット、モルモットなど）が含まれる。好ましい実施形態では、患者はヒトである。患者として組み込まれることが意図されるのは、臨床研究試験に参加する任意の対象である。患者は、例えば、他の薬物および／または任意のＫＤＭ１Ａ阻害剤で以前に処置されていている場合がある。一態様では、患者は、いずれのＫＤＭ１Ａ阻害剤でも以前に処置されたことがない。患者は、他の薬物で、特に試料を得る時に処置され得るが、本発明の方法において使用するための試料を得る時には、いずれのＫＤＭ１Ａ阻害剤でも処置されてはならない（すなわち、患者は、試料を得る時にＫＤＭ１Ａ阻害剤と同時に処置されてはならない）。あるいは、バイオマーカーレベルが（残りの）ＫＤＭ１Ａ阻害剤によって、その期間内に調節され得る場合（例えば、バイオマーカーレベルがＫＤＭ１Ａ阻害剤による以前の処置（またはＫＤＭ１Ａ阻害剤の投与）の前のレベルに戻っていない場合）、患者は、試料を得る前の期間内に、いずれのＫＤＭ１Ａ阻害剤でも処置されてはならない。例えば、患者は、試料を得る前に、２週間以内、より好ましくは１カ月以内に、いずれのＫＤＭ１Ａ阻害剤でも処置されてはならない。後者は、バイオマーカーレベルが（残りの）ＫＤＭ１Ａ阻害剤によって依然として調節され得ることを回避することである。
【0041】
用語「バイオマーカー」または「マーカー」とは、本明細書で使用される場合、タンパク質またはポリヌクレオチドを指し、その発現または存在は、哺乳動物の組織もしくは細胞の内または上で、標準的な方法（または本明細書に開示される方法）によって検出することができ、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に対する哺乳動物の細胞または組織の感受性と関連する。本発明によるバイオマーカーは、ＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２である。
【0042】
バイオマーカーのレベルを「測定する」という用語は、本明細書で使用される場合、本明細書中の他の箇所に記載されるような適切な検出の方法を使用して、試料中のバイオマーカーの量を実験的に決定することを指す。
【0043】
用語「閾値」とは、本明細書で使用される場合、ＫＤＭ１Ａ阻害剤処置に応答する可能性が高いＳＣＬＣ患者対ＫＤＭ１Ａ阻害剤処置に応答しにくいＳＣＬＣ患者などの、集団の２つのカテゴリー／サブセット間のフロンティアを定義する所定の値、直線またはより複雑なｎ次元の関数を指す。本発明による方法において、異なる閾値は、個々のバイオマーカーレベル（すなわち、各バイオマーカー、ＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２は、それぞれの閾値を有する）に、または本明細書の他の箇所に記載されるような分類アルゴリズムの適用によって、バイオマーカーのレベルから導かれるスコアに適用することができる。当業者が理解するように、閾値は、異なるカテゴリーの試料間を最適に区別するために確立される。閾値は、当該技術分野において公知である方法に従って確立することができる。典型的には、閾値は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤による処置に対して既知の感受性または耐性を有する試料の訓練セットを使用して、実験的または理論的に決定することができる。訓練試料は、例えば、ＳＣＬＣ細胞株、患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）、またはＫＤＭ１Ａ阻害剤による処置に対して既知の感受性もしくは耐性を有するヒト臨床試料であり得る。閾値はまた、当業者によって認識されるように、既存の実験的および／または臨床的および／または規制的な要件に基づいて任意に選択することができる。優先的には、試験の機能およびベネフィット／リスクバランス（偽陽性および偽陰性の臨床的結果）に従って最適な感度および特異度を得るために、閾値が確立される。典型的には、添付の実施例に示されるように、最適な感度および特異度（したがって、閾値）は、実験データに基づく受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を使用して決定することができる。一部の実施態様では、閾値（threshold）は、閾値（threshold value）である。一部の実施形態では、バイオマーカーの閾値は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に対して感受性であるかまたは耐性である患者由来のＳＣＬＣ細胞のうちの１つ以上の試料において測定されたＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２レベルから誘導される。一部の実施形態では、閾値は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答したかまたは応答しなかった（ヒト）患者の１つ以上の試料において測定されたＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２レベルに誘導される。一部の実施形態では、閾値は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答したかまたは応答しなかった患者由来の異種移植片モデルから得られた１つ以上の試料において測定されたＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２レベルから誘導される。一部の実施形態では、閾値は、バイオマーカーのｍＲＮＡレベルから得られる。一部の実施形態では、閾値は、バイオマーカーのタンパク質レベルから得られる。
【0044】
用語「スコア」とは、本明細書で使用される場合、分類アルゴリズムによって試料中で測定されたバイオマーカーレベルから計算された出力を指す。スコアは、閾値と比較され、試料が由来する患者がＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高いかまたは低いかを決定するために使用される。例えば、スコアが閾値を超えた場合に、患者は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高いものとして同定され／患者は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置が有益であり得るものとして同定される。
【0045】
「分類アルゴリズム」は、本明細書で使用される場合、試料についてのスコアを計算し、試料がどのカテゴリーに属するかを評価する（「分類する」）ために使用される、すなわち、閾値を超えた場合に使用される数学的関数である。分類アルゴリズムは、当該技術分野において周知である。分類アルゴリズムの例としては、線形分類器、Ｆｉｓｈｅｒ線形判別、線形Ｂｏｏｌｅａｎ分類、ロジスティック回帰、ナイーブベイズ分類器、パーセプトロン、サポートベクトルマシン、最小二乗サポートベクトルマシン、二次分類器、カーネル推定、ｋ－近傍、決定木、ランダムフォレスト、ニューラルネットワーク、学習ベクトル量子化が挙げられる。１つまたは複数の分類アルゴリズムを組み込んだソフトウェアパッケージは、オンラインでの使用またはダウンロードのために容易に利用可能であり、例えば、ＤＴＲＥＧ、ＸＬＳＴａｔ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｕｐｐｏｒｔ－ｖｅｃｔｏｒ－ｍａｃｈｉｎｅｓ．ｏｒｇ／ＳＶＭ＿ｓｏｆｔ．ｈｔｍｌなどを含む。一部の実施形態では、分類アルゴリズムは、Ｂｏｏｌｅａｎ関数（真理関数）である。
【0046】
試料は、Ｂｏｏｌｅａｎ統合関数Ａ ＡＮＤ Ｂを使用して分類することができ、ＡおよびＢは、試料中の各バイオマーカー（ＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２）のレベルが、そのバイオマーカーのそれぞれの閾値を超えるかどうかを評価する。Ｂｏｏｌｅａｎ統合関数は、典型的には、すべての基準が満たされる場合（例えば、試料中の各バイオマーカー（ＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２）のレベルがバイオマーカーのそれぞれの閾値（複数可）を上回る／超える場合）、１（真）によって表され、または基準のうちの１つ（または両方）が満たされない場合（例えば、試料中の各バイオマーカー（ＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２）の１つのレベルだけがバイオマーカーのそれぞれの閾値（複数可）を上回る／超えるか、またはバイオマーカーのいずれのレベルも上回らない／超えない場合）０（偽）によって表されるスコアを生じる。試料を分類するためにＢｏｏｌｅａｎアルゴリズムによって生成されたスコアに適用される閾値は０であり、すなわち、この閾値を超える（すなわち、スコア＞０である）試料は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する／ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置が有益である可能性が高いものとして分類される。
【0047】
一部の実施形態では、分類アルゴリズムは、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）である。ＳＶＭを使用して、空間における訓練データセットをマッピングし、試料データを２つのカテゴリー（例えば、ＫＤＭ１Ａｉに対する感受性および耐性）に最適に分離し、したがって、閾値関数として作用するＮ次元超平面を構築することによって分類を行う。線形分類を行うことに加えて、ＳＶＭはカーネルトリックを使用して非線形分類を行うことができ、試料データを高次元特徴空間にマッピングする。次に、訓練されたＳＶＭのスコアリング関数を使用して、新しいデータがその同じ空間にマッピングされ、超平面のどの側にそれらが降下するのかに基づいてカテゴリーに属することが予測される。分類アルゴリズム（含まれる閾値）の性能は、アルゴリズムによって予測された分類を実験値と比較し、真の陽性、偽陽性、真の陰性、および偽陰性、ならびに感度、特異度などを計算することによってさらに評価することができ、場合により、モデルパラメータを調整しおよび／または性能を最適化するために、ＫＤＭ１Ａｉに対する公知の応答性／耐性の訓練試料を使用して、複数回の訓練に供することができる。
【0048】
用語「超える」とは、本明細書で使用される場合、以下を意味する：試験試料のバイオマーカーレベルまたはスコア（ＫＤＭ１Ａｉに対する未知の感受性を有する）、例えば、ＫＤＭ１Ａｉを含む処置を受けるために考慮されているＳＣＬＣ患者由来の試料は、その試験試料のレベルまたはスコア（場合による）をそれぞれの閾値と比較して、ＫＤＭ１Ａｉに対して感受性であることが公知である試料のカテゴリーにその試料を分類する場合の閾値を超えるかまたはそれと交わる。一部の実施形態では、閾値（threshold）は閾値（threshold value）であり、バイオマーカーレベルまたはスコアがそのそれぞれの閾値を上回る場合、バイオマーカーレベルまたはスコアは閾値（threshold）（閾値（threshold value））を超える。試料中のバイオマーカーまたはスコアのレベルと、バイオマーカーまたはスコアのそれぞれの閾値との比較は、思考によって、手動で行うことができ、またはコンピュータプログラムによって自動的に行うことができる。
【0049】
用語「試料」は、本発明による方法で使用される患者試料に関して本明細書で使用される場合、腫瘍試料（例えば、原発性または転移性ＳＣＬＣ病変のいずれかからの生検試料などの生検試料）、体液または患者由来細胞株、ＰＤＸ試料（「ＰＤＸ」とは「患者由来の異種移植片」、すなわち、マウスにおいて増殖させたヒト腫瘍）またはエキソソーム（複数可）であり得る。好ましくは、試料は、腫瘍細胞について富む／濃縮される。本発明による方法を行うために使用される患者由来の試料は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤による処置を開始する前に得られるべきである（すなわち、ＫＤＭ１Ａ阻害剤による現行の処置がない期間、および／または、例えば、バイオマーカーレベルが、その期間内に（残りの）ＫＤＭ１Ａ阻害剤によって調節され得る場合は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤による前回の処置（ＫＤＭ１Ａ阻害剤の投与）後の期間ではない期間に得られるべきである。例えば、本発明に従う方法に従って使用される患者由来の試料は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤による前回の処置（またはＫＤＭ１Ａ阻害剤の投与）後、２週間以内、好ましくは１カ月以内に得られるべきではない）。生検試料は、周知の技術によって得ることができ、新鮮であり得るかまたは、回収後の分取および保存技術（例えば、凍結、固定および／または包埋、例えば、ホルマリン固定、パラフィン包埋、新鮮スナップ冷凍、固定および凍結ＯＣＴ包埋など）に供することができる。体液の試料は、周知の技術によって得ることができ、血液、痰、気管支肺胞洗浄液、またはＳＣＬＣ細胞を含み得る任意の他の生体の分泌物もしくはその誘導体の試料を含む。分離された細胞は、遠心分離または細胞選別などの分離技術によって、体液または組織もしくは臓器から得ることができる。当然に、細胞試料は、試料中のマーカーのレベルを評価する前に、種々の周知の収集後調製および保存技術（例えば、核酸および／またはタンパク質抽出、固定、保存、凍結、限外濾過、濃縮、蒸発、遠心分離など）に供することができる。好ましくは、バイオマーカーレベルが測定される試料は、ＳＣＬＣ細胞の存在またはＳＣＬＣ細胞由来小胞（例えば、エキソソームなど）について富む／濃縮される。例えば、ＳＣＬＣ細胞は、文献（Ｃｈｅｓｔ．１９９２年８月；１０２巻（２号）：３７２～４頁）に記載される方法を使用して痰から単離することができる。ＳＣＬＣ循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）は、文献（Ｐｅｅｔｅｒｓら、Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２０１３年４月２日；１０８巻（６号）：１３５８～６７頁；Ｈｏｄｇｋｉｎｓｏｎら、Ｎａｔ Ｍｅｄ．２０１４年８月；２０巻（８号）：８９７～９０３頁；Ｃａｒｔｅｒら、Ｎａｔ Ｍｅｄ．２０１７年１月；２３巻（１号）：１１４～１１９頁）に記載される方法によって血液から精製することができ、ＳＣＬＣ由来のエキソソームは、文献（Ｌｉら、Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ．２０１７年；７巻（３号）：７８９～８０４頁；Ｓａｎｄｆｅｌｄ－Ｐａｕｌｓｅｎら、Ｊ Ｔｈｏｒａｃ Ｏｎｃｏｌ．２０１６年１０月；１１巻（１０号）：１７０１～１０頁）に記載される種々の方法によって血液から精製することができる。バイオマーカーレベルはまた、ＳＣＬＣ細胞に富む試料からの空間的に定義された領域において分析することができ、例えば、この分野において使用される標準的な方法を使用して解剖病理学者によって決定することができる。
【0050】
用語「に対する応答性」、「に応答性である」、「に応答する」、「に対する感受性」、「に感受性である」および似た表現は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置の文脈において、ＳＣＬＣ（または試料、ＳＣＬＣ細胞株など）を有する患者がＫＤＭ１Ａ阻害剤、すなわち、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に対して陽性応答を示すことを意味する。より単純化した形態では、用語「ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する」などは、「ＫＤＭ１Ａ阻害剤に応答する」、「ＫＤＭ１Ａ阻害に応答する」などと表現することができる。例えば、「ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に対する陽性応答」または「ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置が有益である」は、疾患ＳＣＬＣまたはその１つ以上の症状の進行を逆転し、軽減し、または阻害することができるかまたはそれを含むことができる。用語「応答する可能性が高い」とは、本明細書で使用される場合、「より応答性である」または単に「応答性である」を意味することができる。
【0051】
「患者を同定する」または「患者を選択する」という語句は、互換的に使用することができ、本明細書で使用される場合、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する（またはそれが有益である）可能性が高いか、または応答する（またはそれが有益である）可能性が低い患者を同定するかまたは選択するために、患者の試料中のバイオメーカレベルに関連して生成された情報またはデータを使用することを指す。使用もしくは生成される情報またはデータは、任意の形態であり、書面、口頭または電子的であり得る。本明細書に提供される方法および使用には、結果、情報またはデータを患者、および／または患者の処置に関与するかもしくは患者の処置を担当する任意の者（複数可）に通信することを含み得、処置はＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む。一部の実施形態では、生成された情報またはデータを使用することは、通信、提示、報告、保存、送信、転送、供給、伝送、分配、またはそれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、通信、提示、報告、記憶、送信、転送、供給、伝送、分配、またはそれらの組み合わせは、計算装置、分析装置ユニット、またはそれらの組み合わせによって行われる。さらなる一部の実施形態では、通信、提示、報告、保存、送信、転送、供給、伝送、分配、またはそれらの組み合わせは、実験室または医療専門家によって行われる。一部の実施形態では、情報またはデータは、バイオマーカーレベルと閾値の比較を含む。一部の実施形態では、情報またはデータは、患者がＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する（またはそれが有益である）可能性が高いかまたは低いという指示を含む。
【0052】
「患者の応答性を予測する」という語句は、本明細書で使用される場合、患者がＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性を評価するために、患者の試料中のバイオメーカレベルに関連して生成された情報またはデータを使用することを指す。使用もしくは生成される情報またはデータは、任意の形態、書面、口頭または電子的であり得る。一部の実施形態では、生成された情報またはデータを使用することは、通信、提示、報告、保存、送信、転送、供給、伝送、分配、またはそれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、通信、提示、報告、記憶、送信、転送、供給、伝送、分配、またはそれらの組み合わせは、計算装置、分析装置ユニット、またはそれらの組み合わせによって行われる。さらなる一部の実施形態では、通信、提示、報告、保存、送信、転送、供給、伝送、分配、またはそれらの組み合わせは、実験室または医療専門家によって行われる。一部の実施形態では、情報またはデータは、バイオマーカーレベルと閾値の比較を含む。一部の実施形態では、情報またはデータは、患者がＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高いかまたは低いという指示を含む。
【0053】
「処置を選択する」という語句は、本明細書で使用される場合、患者の処置（治療）を同定するかまたは選択するために、患者の試料中のバイオマーカーレベルに関連して生成された情報またはデータを使用することを指す。一部の実施形態では、処置は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含み得る。使用もしくは生成される情報またはデータは、任意の形態、書面、口頭または電子的であり得る。一部の実施形態では、生成された情報またはデータを使用することは、通信、提示、報告、保存、送信、転送、供給、伝送、分配、またはそれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、通信、提示、報告、記憶、送信、転送、供給、伝送、分配、またはそれらの組み合わせは、計算装置、分析装置ユニットまたはそれらの組み合わせによって行われる。さらなる一部の実施形態では、通信、提示、報告、保存、送信、転送、供給、伝送、分配、またはそれらの組み合わせは、実験室または医療専門家によって行われる。一部の実施形態では、情報またはデータは、バイオマーカーレベルと閾値の比較を含む。一部の実施形態では、情報またはデータは、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置が患者に適している（すなわち、患者が上記処置に応答する可能性が高い）という指示を含む。
【0054】
「処置を推奨する」という語句は、本明細書で使用される場合、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高いかまたは低いものとして同定されたかまたは選択された患者のための、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置を提案または選択するために、バイオマーカーレベルに関連して生成された情報またはデータを使用することを指す。使用もしくは生成される情報またはデータは、任意の形態、書面、口頭または電子的であり得る。一部の実施形態では、生成された情報またはデータを使用することには、通信、提示、報告、保存、送信、転送、供給、伝送、分配、またはそれらの組み合わせが含まれる。一部の実施形態では、通信、提示、報告、保存、送信、転送、供給、伝送、分配、またはそれらの組み合わせは、計算装置、分析装置ユニットまたはそれらの組み合わせによって行われる。さらなる一部の実施形態では、通信、提示、報告、保存、送信、転送、供給、伝送、分配、またはそれらの組み合わせは、実験室または医療専門家によって行われる。一部の実施形態では、情報またはデータは、バイオマーカーレベルと閾値の比較を含む。一部の実施形態では、情報またはデータは、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置が患者に適しているという指示を含む。
【0055】
本明細書で使用される場合、「キット」は、本明細書に記載されるように、ＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを測定するための１つ以上の薬剤を含む任意の製造物（例えば、パッケージまたは容器）であり、本発明の方法を実施するためのユニットとして、製造が促進されるか、分布されるか、または販売される。
【0056】
本明細書で使用される場合、ＡＳＣＬ１またはＳＯＸ２のレベルを測定するための「薬剤」には、バイオマーカーレベルを測定するための分野において典型的に使用される任意の試薬が含まれ、限定されないが、ＡＳＣＬ１またはＳＯＸ２タンパク質を特異的に認識する抗体、または本発明によるバイオマーカーを特異的に検出するためのＡＳＣＬ１またはＳＯＸ２ポリヌクレオチドとハイブリダイズするプローブおよび／もしくはプライマー、およびバイオマーカーレベルを測定するための方法に関連して本明細書の他の箇所でより詳細に記載される任意の他の試薬が含まれる。
【0057】
本発明は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤による処置に応答する可能性が高く、したがって、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に最も適した、ＳＣＬＣを有する患者を同定するための手段および方法、ならびにＫＤＭ１Ａ阻害剤を用いて患者を処置するための治療方法を提供する。本発明は、少なくとも部分的には、ＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルが、ＫＤＭ１Ａ阻害剤による処置に応答する可能性を予測する方法において、バイオマーカー（例えば、予測バイオマーカー）として使用され得るという発見に基づく。本明細書および添付の実施例に記載されるように、本発明者らは、ＳＣＬＣ細胞株中の高レベルのＡＳＣＬ１とＳＯＸ２の両方が、ＫＤＭ１Ａ阻害剤療法に対するＳＣＬＣの応答性（感受性）と相関することを見出されている。実施例２、３および４、ならびに図１～３に示されるように、高レベルのＡＳＣＬ１とＳＯＸ２の両方を発現するＳＣＬＣ細胞株は、通常、ＫＤＭ１Ａ阻害剤に対して応答性（感受性）であるが、低レベルのＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の一方または両方を示すＳＣＬＣ細胞株は、通常、ＫＤＭ１Ａ阻害処理に対して耐性である。したがって、ＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２レベルは、ＫＤＭ１Ａ阻害剤による処置に対してＳＣＬＣ患者を層別化するために使用することができ、ＫＤＭ１Ａ阻害剤による処置に応答する可能性が高い患者と、ＫＤＭ１Ａ阻害に応答性である可能性が低い患者とを識別する。ＡＳＬＣ１およびＳＯＸ２を使用する本発明の方法は、添付の実施例でより詳細に示されるように、使用されるバイオマーカーの数の低減に鑑みて顕著であるように、高い感度および特異度を有する、ＫＤＭ１Ａ阻害に対するＳＣＬＣの応答性を予測することができる。本発明による方法は、ＳＣＬＣ細胞株またはＳＣＬＣ ＰＤＸ試料のような患者由来試料のいずれかを使用して、実施例５に示されるように、それらのｍＲＮＡとタンパク質発現レベルとの間に良好な相関が示されているため、ｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルのいずれかとしてバイオマーカーを測定することができる。これは、がん患者から最も容易に入手できる試料は典型的には固定された腫瘍生検であり、標準的な生検試料固定手順がＲＮＡを断片化し、低減させることが公知であるため、タンパク質レベル分析に適しているため、本発明による方法を臨床現場、特に病院で使用するために特に有利にする。
【0058】
前述したように、本発明の方法は、ＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを測定することを含む。これらのマーカー自体は、当該技術分野において公知であり、また、以下に記載される。
【0059】
ＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の公開データベースエントリー：
ヒトＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のＤＮＡおよびタンパク質配列は、以前に報告されている。以下に列挙されるＧｅｎＢａｎｋ番号（ＮＣＢＩ－ＧｅｎＢａｎｋ Ｆｌａｔ Ｆｉｌｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ２２５．０、２０１８年４月１５日）およびＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ番号（Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ２０１８＿０４、２０１８年４月２５日）を参照されたい。各々は、すべての目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれる。このような配列は、当業者に公知である方法によりＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを測定するための手順を設計するために使用することができる。
ヒトＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のＤＮＡおよびタンパク質配列は、以前に報告されている。以下に列挙されるＧｅｎＢａｎｋ番号（ＮＣＢＩ－ＧｅｎＢａｎｋ Ｆｌａｔ Ｆｉｌｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ２２５．０、２０１８年４月１５日）およびＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ番号（Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ２０１８＿０４、２０１８年４月２５日）を参照されたい。各々は、すべての目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれる。このような配列は、当業者に公知である方法によりＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを測定するための手順を設計するために使用することができる。
【0060】
【表1】
【0061】
ヒトＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の例示的なヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、本明細書の配列番号１～４に示される。以下の表では、マーカーおよびそれぞれの配列を割り当てる。
【0062】
【表2】
【0063】
一態様では、本発明は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高い、ＳＣＬＣを有する患者を同定する方法であって、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置を開始する前に、患者由来の試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを測定することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の各レベルが閾値を超えた場合に、患者は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高いものとして同定される。一部の実施形態では、本方法は、さらに、試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを使用して、試料についてのスコアを生成することを含み、試料についてのスコアが閾値を超えた場合に、患者は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高いものとして同定される。したがって、一部の実施形態では、本発明は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高い、ＳＣＬＣを有する患者を同定する方法であって、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置を開始する前に、患者由来の試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを測定することを含み、試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の各レベルが閾値を超えた場合に、患者は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高いものとして同定される方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高い、ＳＣＬＣ患者を同定する方法であって、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置を開始する前に、患者由来の試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを測定し、試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを使用して、試料についてのスコアを生成することを含み、試料についてのスコアが閾値を超えた場合に、患者は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高いものとして同定される方法を提供する。
【0064】
別の態様では、本発明は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置が有益であり得る、ＳＣＬＣを有する患者を同定する方法であって、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置を開始する前に、患者由来の試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを測定することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の各レベルが閾値を超えた場合に、患者は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置が有益であり得るものとして同定される。一部の実施形態では、本方法は、さらに、試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを使用して、試料についてのスコアを生成することを含み、試料についてのスコアが閾値を超えた場合に、患者は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置が有益であり得るものとして同定される。したがって、一部の実施形態では、本発明は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置が有益であり得る、ＳＣＬＣを有する患者を同定する方法であって、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置を開始する前に、患者由来の試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを測定することを含み、試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の各レベルが閾値を超えた場合に、患者は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置が有益であり得るものとして同定される方法を特徴とする。一部の実施形態では、本発明は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置が有益であり得る、ＳＣＬＣを有する患者を同定する方法であって、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置を開始する前に、患者由来の試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを測定し、試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを使用して、試料についてのスコアを生成することを含み、試料についてのスコアが閾値を超えた場合に、患者は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置が有益であり得るものとして同定される方法を特徴とする。
【0065】
さらなる態様では、本発明は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に対する、ＳＣＬＣを有する患者の応答性を予測する方法であって、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置を開始する前に、患者由来の試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを測定することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の各レベルが閾値を超えた場合、患者は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答性である可能性が高いものとして同定される。一部の実施形態では、本方法は、さらに、試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを使用して、試料についてのスコアを生成することを含み、試料についてのスコアが閾値を超えた場合に、患者は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答性である可能性が高いものとして同定される。したがって、一部の実施形態では、本発明は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に対する、ＳＣＬＣを有する患者の応答性を予測する方法であって、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置を開始する前に、患者由来の試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを測定することを含み、試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の各レベルが閾値を超えた場合に、患者は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答性である可能性が高いものとして同定される方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に対する、ＳＣＬＣを有する患者の応答性を予測する方法であって、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置を開始する前に、患者由来の試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを測定し、試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを使用して、試料についてのスコアを生成することを含み、試料についてのスコアが閾値を超えた場合に、患者は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答性である可能性が高いものとして同定される方法を提供する。
【0066】
さらなる態様では、本発明は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する、ＳＣＬＣを有する患者の可能性を評価する方法であって、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置を開始する前に、患者由来の試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを測定することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の各レベルが閾値を超えた場合に、患者は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高いものとして同定される。一部の実施形態では、本方法は、試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを使用して、試料についてのスコアを生成することをさらに含み、試料についてのスコアが閾値を超えた場合に、患者は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高いものとして同定される。したがって、一部の実施形態では、本発明は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する、ＳＣＬＣを有する患者の可能性を評価する方法であって、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置を開始する前に、患者由来の試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを測定することを含み、試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の各レベルが閾値を超えた場合に、患者は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高いものとして同定される方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する、ＳＣＬＣを有する患者の可能性を評価する方法であって、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置を開始する前に、患者由来の試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを測定し、試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを使用して、試料についてのスコアを生成することを含み、試料についてのスコアが閾値を超えた場合に、患者は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高いものとして同定される方法を提供する。
【0067】
さらなる態様では、本発明は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する患者におけるＳＣＬＣの可能性を評価する方法であって、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置を開始する前に、ＳＣＬＣを有する患者由来の試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを測定することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、ＳＣＬＣは、試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の各レベルが閾値を超えた場合に、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処理に応答する可能性が高いものとして同定される。一部の実施形態では、本方法は、さらに、試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを使用して、試料についてのスコアを生成することを含み、試料についてのスコアが閾値を超えた場合に、ＳＣＬＣは、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高いものとして同定される。したがって、一部の実施形態では、本発明は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置にＳＣＬＣが応答する可能性を評価する方法であって、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置を開始する前に、ＳＣＬＣを有する患者由来の試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを測定することを含み、ＳＣＬＣは、試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の各レベルが閾値を超えた場合に、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高いものとして同定される方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置にＳＣＬＣが応答する可能性を評価する方法であって、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置を開始する前に、ＳＣＬＣを有する患者由来の試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを測定し、試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを使用して、試料についてのスコアを生成することを含み、試料についてのスコアが閾値を超えた場合に、ＳＣＬＣは、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高いものとして同定される方法を提供する。
【0068】
さらなる態様では、本発明は、ＳＣＬＣを有する患者の処置を選択する方法であって、処置を開始する前に、患者由来の試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを測定することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の各レベルが閾値を超えた場合に、患者に対して選択された処置がＫＤＭ１Ａ阻害剤を含むという推奨を提供することを含む。一部の実施形態では、本方法は、試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを使用して、試料についてのスコアを生成し、試料についてのスコアが閾値を超えた場合に、患者に対して選択された処置がＫＤＭ１Ａ阻害剤を含むという推奨を提供することをさらに含む。したがって、一部の実施形態では、本発明は、さらに、ＳＣＬＣを有する患者の処置を選択する方法であって、処置を開始する前に、患者由来の試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを測定し、試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の各レベルが閾値を超えた場合に、患者に対して選択された処置がＫＤＭ１Ａ阻害剤を含むという推奨を提供することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、さらに、ＳＣＬＣを有する患者の処置を選択する方法であって、処置を開始する前に、患者由来の試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを測定し、試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを使用して、試料についてのスコアを生成し、試料についてのスコアが閾値を超えた場合に、患者に対して選択された処置がＫＤＭ１Ａ阻害剤を含むという推奨を提供することを含む方法を提供する。
【0069】
本発明による上述の方法はすべて、試料中の本発明のバイオマーカー（ＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２）のレベルを測定し、上記バイオマーカーレベルまたは誘導されたスコア（上記レベルに基づく）対閾値を評価することを含む。典型的には、各バイオマーカー（すなわち、ＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２）は、その閾値（本明細書の他の箇所に記載されるように確立され得る）を有し、ＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の（測定された）レベルは、各々、そのそれぞれの閾値に対して評価され、試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の各レベルがその閾値を超えた場合に、患者は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤（または、該当する場合、患者は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤などを含む処置が有益であり得るものとして同定される）を含む処置に応答する可能性が高いものとして同定される。あるいは、試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の（測定された）レベルを用いて、分類アルゴリズムを使用して、試料についてのスコアを生成することができる；このような場合、スコアの閾値が適用され（本明細書の他の箇所に記載されるように確立され得る）、試料についてのスコアが閾値を超えた場合に、患者は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高いものとして同定される（または、該当する場合、患者は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤などを含む処置が有益であり得るものとして同定される）。
【0070】
前述の態様のいずれかの一部の実施形態では、本方法は、患者由来の試料を得るかまたは提供する工程をさらに含む。得る／提供する工程は、バイオマーカーのレベルの測定の前（および試料が得られる／提供される患者へのＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む任意の処置の投与の前）である。
【0071】
前述の態様のいずれかの一部の実施形態では、本方法は、患者がＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高いものとして同定された場合に、患者にＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置の治療有効量を推奨するか、処方するかまたは投与することをさらに含む。
【0072】
前述の態様のいずれかの一部の実施形態では、本方法は、患者がＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が低いものとして同定された場合に、患者がＫＤＭ１Ａ阻害剤で処置されないことを推奨することを場合によりさらに含むことができる。
【0073】
本発明による方法では、ＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルは、ｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルのいずれかとして、本明細書に記載される方法を含む、ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルを測定するための当該技術分野において公知である任意の方法を用いて決定することができる。
【0074】
本発明による方法において、試料由来のｍＲＮＡは、バイオマーカーのレベルを決定するために直接使用することができる。本発明による方法では、レベルはハイブリダイゼーションによって決定することができる。本発明による方法において、当該技術分野において公知である方法を用いて、ＲＮＡをｃＤＮＡ（相補性ＤＮＡ）コピーに形質転換することができる。検出方法としては、限定されないが、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ－ＰＣＲ）、遺伝子発現分析、ＲＮＡ配列決定、ナノ細孔配列決定、マイクロアレイ分析、遺伝子発現チップ分析、（インサイチュ）ハイブリダイゼーション技術、ＲＮＡスコープ、およびクロマトグラフィー、ならびに当該技術分野において公知である任意の他の技術、例えば、Ｒａｌｐｈ Ｒａｐｌｅｙ、「Ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、２０００年公開、ＩＳＢＮ：９７８－０－８９６０３－４５９－４に記載されるものが含まれ得る。ＲＮＡを検出する方法としては、限定されないが、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、マイクロアレイ分析、および当該技術分野において公知である任意の他の技術、例えば、Ｌｅｌａｎｄら、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」、２０１１年公開、ＩＳＢＮ ９７８１４２００６９３８９に記載されるものが含まれ得る。
【0075】
本発明による方法において、本方法は、バイオマーカーのタンパク質発現レベルを検出することを含むことができる。タンパク質の検出、量子化および比較のための任意の適切な方法、例えば、Ｊｏｈｎ Ｍ．Ｗａｌｋｅｒ、「Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、２００９年公開、ＩＳＢＮ ９７８－１－５９７４５－１９８－７に記載されるものを使用してもよい。バイオマーカーのタンパク質発現レベルは、限定されないが、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫放射定量測定法、インサイチュイムノアッセイ、アルファＬＩＳＡイムノアッセイ、タンパク質近接アッセイ、近接ライゲーション技術（例えば、タンパク質ｑＰＣＲ）、ウエスタンブロットアッセイ、免疫沈降アッセイ、免疫蛍光アッセイ、フローサイトメトリー、免疫組織化学（ＩＨＣ）、免疫電気泳動、タンパク質免疫染色、共焦点顕微鏡法を含む抗体または抗体断片によるタンパク質またはタンパク質複合体の認識を含むイムノアッセイによって；あるいは抗体もしくは抗体断片が、特定の方法で、化学プローブ、アプタマー、受容体、相互作用するタンパク質、またはバイオマーカータンパク質を認識する他のいずれかの生体分子によって置換される同様の方法によって；あるいはフェルスター／蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、示差走査蛍光分析（ＤＳＦ）、マイクロ流体、分光分析、質量分析、酵素アッセイ、表面プラズモン共鳴、またはそれらの組み合わせによって決定することができる。イムノアッセイは、均一アッセイまたは不均一アッセイであり得る。均一アッセイでは、免疫学的反応は、通常、特異的抗体、標識された分析物、および目的の試料を伴う。標識から生じるシグナルは、標識された分析物への抗体の結合に際して、直接的または間接的に修飾される。免疫学的反応とその程度の検出の両方を均一な溶液中で行うことができる。使用され得る免疫化学的標識は、フリーラジカル、放射性同位元素、蛍光色素、酵素、バクテリオファージ、または補酵素を含み得る。不均一アッセイアプローチでは、試薬は、通常、試料、抗体、および検出可能なシグナルを生成する手段である。抗体は、ビーズ、プレートまたはスライドなどの支持体上に固定され得、液相中に抗原を含有する疑いのある検体と接触され得る。次に、支持体は、液相から分離され、支持相または液相のいずれかが、このようなシグナルを生成するための手段を使用する検出可能なシグナルについて調べられる。シグナルは、試料中の分析物の存在に関連する。検出可能なシグナルを生成する手段には、放射性標識、蛍光標識、または酵素標識の使用が含まれる。
【0076】
本発明による方法において、目的の対象のバイオマーカーに対する抗体を使用することができる。本発明による方法において、検出するためのキットを使用することができる。このような抗体およびキットは、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、生化学的アッセイについてはＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ａｖｉｖａ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｂｎｏｖａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃまたは他社の商業的供給源から入手可能である。あるいは、抗体はまた、任意の公知の方法によって合成することができる。用語「抗体」は、本明細書で使用される場合、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体およびキメラ抗体を含むことが意図される。抗体は、受動結合などの公知の技術に従って、適切な固体支持体（例えば、プロテインＡまたはタンパク質Ｇアガロースなどのビーズ、ラテックスもしくはポリスチレンなどの材料から形成されるミクロスフェア、プレート、スライドまたはウェル）にコンジュゲートされ得る。本明細書に記載される抗体は、同様に、放射性標識（例えば、３５Ｓ）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、蛍光標識（例えば、フルオレセイン、Ａｌｅｘａ、緑色蛍光タンパク質、ローダミン）、６８０ｎＭでの照射後に一重項酸素を放出し、その後にユーロピウムまたはセリビウムを含むアクセプタービーズによる光の吸収後に発光を誘発することができるビーズを含むフタロシアニン、およびオリゴヌクレオチド標識などのシグナルを作り出すことができる検出可能な標識または基にコンジュゲートされ得る。標識は、直接的または間接的にシグナルを生成することができる。生成されたシグナルは、公知の技術に従って、例えば、蛍光、放射活性、または発光を含むことができる。
【0077】
抗体は、分析されるタンパク質バイオマーカー、例えば、アプタマー、アフィマー、またはケモプローブに対して高い親和性および選択性を有する代替のタンパク質捕捉剤によって置換され得る。
【0078】
一部の実施形態では、バイオマーカータンパク質レベルを測定する場合、バイオマーカーのレベルは、ＳＣＬＣ腫瘍細胞の一部、例えば、生検の免疫蛍光分析において、腫瘍細胞の核内で評価することができる。
【0079】
バイオマーカーのレベルは、この分野において使用される任意の形態のｍＲＮＡ発現またはタンパク質発現測定で表すことができ、生データまたは処理されたデータ、すなわち、バックグラウンド減算、正規化もしくは他の修正、または他の数学的操作、もしくはこの分野において典型的に使用される変換に供される生データであることができる。例えば、マイクロアレイハイブリダイゼーションによって測定される場合、バイオマーカーレベルは、試料のハイブリダイゼーションシグナル強度値、Ｌｏｇ２（試料のハイブリダイゼーション強度値）、またはＬｏｇ２（試料のハイブリダイゼーションシグナル強度値／参照試料のハイブリダイゼーションシグナル強度値）によって表すことができる。適切な参照試料の例は、異種移植片またはＰＤＸモデルから得られたＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の高発現レベルを有する患者由来の腫瘍試料、またはＳＣＬＣ細胞ペレットである。ハイブリダイゼーションシグナル値は、単一色または２色ハイブリダイゼーションを使用して得ることができる。例えば、ｑＲＴ－ＰＣＲによって測定される場合、バイオマーカーレベルは、交点ＰＣＲ－サイクル（Ｃｐ）値（増幅関連蛍光が特異的な検出の閾値レベルに到達するのに必要なサイクル数を表す）によって、ΔＣｐ＝Ｃｐ－Ｃｐ，ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅによって、２－Ｃｐ値または２－ΔＣｐ値によって表すことができる。例えば、ＲＮＡ配列決定によって測定される場合、バイオマーカーレベルは、ＲＰＭ（Ｒｅａｄｓ Ｐｅｒ Ｍｉｌｌｉｏｎ）、ＲＰＫＭ（Ｒｅａｄｓ Ｐｅｒ Ｋｉｌｏｂａｓｅ Ｍｉｌｌｉｏｎ）、ＦＰＫＭ（Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ Ｐｅｒ Ｋｉｌｏｂａｓｅ Ｍｉｌｌｉｏｎ）、またはＴＰＭ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ Ｐｅｒ Ｍｉｌｌｉｏｎ）値によって表すことができる。例えば、ウエスタンブロットによって測定される場合、バイオマーカーレベルは、画像分析後に対応するバンドの積分密度（Ａ．Ｕ）として、生の積分密度としてまたはタンパク質含有量により正規化された、および／または参照試料に対する比として表すことができる。例えば、免疫染色によって測定される場合、バイオマーカーレベルは、画像分析後の核シグナルの積分密度（Ａ．Ｕ）として、生の積分密度（Ａ．Ｕ）／面積単位（画素２またはμｍ２）、または積分密度／核として、または参照試料に対する比として表すことができる。例えば、ＥＬＩＳＡにより測定される場合、バイオマーカーレベルは、Ｒ．Ｌ．Ｕ（相対光量単位）または吸光度単位として、生もしくはバックグラウンドで補正されるか、または総タンパク質含量により正規化されるか、および／または参照試料に対する比として表すことができる。
【0080】
本発明による方法のいずれかの一部の実施形態では、バイオマーカーレベル（すなわち、ＡＳＣＬ１レベルおよびＳＯＸ２レベル）はｍＲＮＡ発現レベルである。好ましくは、ｍＲＮＡ発現レベルはｑＲＴ－ＰＣＲによって測定される。
【0081】
本発明による方法のいずれかの一部の実施形態では、バイオマーカーレベルはタンパク質発現レベルである。好ましくは、タンパク質発現レベルは蛍光免疫組織化学法によって測定される。
【0082】
一部の実施形態では、免疫蛍光染色におけるバイオマーカー発現レベルは、染色強度レベルに基づいて、それぞれ３、２、１および０の値で高、中、低または検出不能として視覚的に分類される。中レベルおよび高レベル（値２および３）の試料は「陽性」とみなされ（すなわち、それぞれのバイオマーカーの閾値を超えている）、一方、検出不能なレベルまたは低レベル（値０および１）の試料は「陰性」とみなされる（すなわち、それぞれのバイオマーカーの閾値を超えていない）。試料が両方のバイオマーカーに対して「陽性」であるとみなされる場合（すなわち、試料中のＡＳＣＬ１とＳＯＸ２の両方のレベルは、各々、レベル２または３として分類される場合）に、患者は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高いものとして同定される／患者は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置が有益であり得るものとして同定される。
【0083】
あるいは、一部の実施形態では、免疫蛍光染色画像におけるバイオマーカー発現レベルを定量化することができる。ＤＮＡ色素、例えば、ＤＡＰＩ染色は、蛍光定量を用いて核を局在化するために使用することができる。核におけるＳＯＸ２およびＡＳＣＬ１の発現は、免疫蛍光定量を用いて分析することができる。バイオマーカーおよびＤＡＰＩ染色からの個々の画像は、画像ソフトウェア、例えば、ＩｍａｇｅＪを用いて分析することができる。シグナルは、バックグラウンド減算によって得ることができ、参照（キャリブレータ）試料に対して正規化され得る。適切なキャリブレータ試料は、両方のバイオマーカー、例えば、ＮＣＩ－Ｈ１４１７由来の異種移植片試料の高い均一な核発現を有する試料である。正規化された定量値は、キャリブレータ試料に対する％または比として表すことができる。各バイオマーカーの閾値は、キャリブレータ試料のシグナルの画分として確立することができ、使用した陰性対照試料（複数可）（例えば、正常な肺生検、または両方のバイオマーカーの発現が低いかもしくは検出不能である異種移植片試料であり得る）の（平均）シグナルよりも高いように選択される。好ましくは、閾値は、少なくとも陰性対照試料の平均シグナルに１ＳＤ、２ＳＤまたは３ＳＤを加えたものであり、ＳＤは標準偏差を意味する。
【0084】
本発明による方法および使用の一部の実施形態では、「試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の各レベルが閾値を超えた場合」などの用語は、「試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の各レベルが対照と比較して増加した場合」を意味し得る。この文脈において、試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の各レベルが対照と比較して増加した場合に、患者は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高いものとして同定される／患者は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置が有益であり得るものとして同定される。用語「対照」または「参照」は、本明細書において互換的に使用される。「対照」（例えば、「対照値」）または「参照」（例えば、「参照値」）の非限定的な例は、１つ以上の健常な個体（複数可）／対象（複数可）由来の試料または試料プールにおける、それぞれＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルであり得る。健康な個体／対象は、例えば、本明細書に定義されるＳＣＬＣに罹患していない個体／対象、特に、個体／対象から試料を得る時点でＳＣＬＣに罹患していない者であり得る。あるいは、健康な個体／対象は、例えば、ＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の各レベルの増加に関連する疾患または障害に罹患していない個体／対象であり得る。好ましくは、健康な個体／対象はヒトである。「対照」（例えば、「対照値」）または「参照」（例えば、「参照値」）の別の非限定的な例は、「非応答者」由来の試料または試料プールにおける、それぞれＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルであり得、例えば、ＳＣＬＣに罹患し、ＫＤＭ１Ａ阻害剤に応答しないことが公知である１つ以上の患者であり得る。「非応答者」対照の別の例は、（ａ）細胞株（複数可）／細胞（複数可）／組織（複数可）であり、インビトロ、エクスビボまたは（患者由来）異種移植片試験においてＫＤＭ１Ａ阻害剤に対して応答を示さない。「対照」の別の非限定的な例は、「内部標準」であり、例えば、精製または合成により生成されたタンパク質および／またはペプチド、またはそれらの混合物、または対応する核酸であり、各タンパク質／ペプチド（または対応する核酸）の量は、上記される「非応答者」対照を用いることによって測定される。特に、この「内部標準」は、本明細書に記載および定義されるように、タンパク質（複数可）（または対応する核酸）ＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２を含有することができる。「対照」（例えば、「対照値」）または「参照」（例えば、「参照値」）の非限定的な例は、例えば、試料が、患者がＳＣＬＣに罹患する前に、患者がＳＣＬＣがんに罹患する傾向がある（またはそのリスクがある）前に得られた場合、または試料が、患者が以前のＳＣＬＣから（完全に）回復していた場合に得られた場合に、本明細書において同定されるべき患者由来の試料中のそれぞれＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルであり得る。
【0085】
前述の態様のいずれかの一部の実施形態では、試料は、ＳＣＬＣ生検、好ましくは、ＳＣＬＣ細胞に富むＳＣＬＣ生検である。
好ましくは、本発明の方法のいずれにおいても、患者はヒト患者である
本明細書において、上記（診断）方法がインビトロ方法であることが好ましい。「インビトロ」とは、本明細書で使用される場合、ＫＤＭ１Ａ阻害剤などを含む処置に応答する可能性が高い、ＳＣＬＣを有する患者を同定する方法などの、上記される本発明の方法が、インビボではなく、すなわち、直接的に患者上ではないが、生きているヒト（または他の哺乳動物）の外部で、患者から得られ、患者から分離／単離された（すなわち、インビボでの位置から除去された）試料上で行われることを意味する。
好ましくは、本発明の方法のいずれにおいても、患者はヒト患者である
本明細書において、上記（診断）方法がインビトロ方法であることが好ましい。「インビトロ」とは、本明細書で使用される場合、ＫＤＭ１Ａ阻害剤などを含む処置に応答する可能性が高い、ＳＣＬＣを有する患者を同定する方法などの、上記される本発明の方法が、インビボではなく、すなわち、直接的に患者上ではないが、生きているヒト（または他の哺乳動物）の外部で、患者から得られ、患者から分離／単離された（すなわち、インビボでの位置から除去された）試料上で行われることを意味する。
【0086】
さらなる態様では、本発明は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高い、ＳＣＬＣを有する患者を同定する方法におけるＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の使用を提供する。
【0087】
さらなる態様では、本発明は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に対する、ＳＣＬＣを有する患者の応答の可能性を評価する方法におけるＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の使用を提供する。
【0088】
さらなる態様では、本発明は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高い、ＳＣＬＣを有する患者を同定する方法において、ＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを測定するための１つ以上の薬剤の使用を提供する。
【0089】
さらなる態様では、本発明は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に対するＳＣＬＣを有する患者の応答の可能性を評価する方法において、ＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを測定するための１つ以上の薬剤の使用を提供する。
【0090】
さらなる態様では、本発明は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高い、ＳＣＬＣを有する患者を同定するための診断薬の製造のためのＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の使用を提供する。
【0091】
さらなる態様では、本発明は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に対する、ＳＣＬＣを有する患者の応答の可能性を評価するための診断薬の製造のためのＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の使用を提供する。
【0092】
別の態様では、本発明は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高い、ＳＣＬＣを有する患者を同定するためのキットであって、試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを測定するための１つ以上の薬剤、および場合により使用説明書を含むキットを提供する。
【0093】
別の態様では、本発明は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に対するＳＣＬＣを有する患者の応答の可能性を評価するためのキットであって、試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを測定するための１つ以上の薬剤、および場合により使用説明書を含むキットを提供する。
【0094】
上記の方法を用いることにより、応答の機会が高い、すなわち、ＫＤＭ１Ａｉを含む処置に応答する可能性が高いかまたはそれが有益である可能性が高い、ＳＣＬＣを有する患者のサブグループを同定することが可能である。本発明はまた、そのように同定されたＳＣＬＣ患者を処置するための治療方法に関する。
【0095】
したがって、さらなる態様では、本発明は、ＳＣＬＣを有する患者を処置する方法であって、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置を開始する前に、患者が、前述の態様のいずれかによる方法を使用して、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高いものとして同定された場合に、患者にＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置の治療有効量を投与することを含む方法を提供する。
【0096】
さらなる態様では、本発明は、ＳＣＬＣを有する患者を処置する方法であって、処置を開始する前に、患者由来の試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを測定し、試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の各レベルが閾値を超えた場合に、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高いものとして患者を同定し、応答する可能性が高いものとして同定された場合に、患者にＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置の治療有効量を投与することを含む方法を特徴とする。
【0097】
さらなる態様では、本発明は、ＳＣＬＣを有する患者を処置する方法であって、処置を開始する前に、患者由来の試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを測定し、これらのレベルを使用して、試料についてのスコアを生成し、試料についてのスコアが閾値を超えた場合に、患者は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高いものとして同定され、応答する可能性が高いものとして同定された場合に、患者にＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置の治療有効量を投与することを含む方法を特徴とする。
【0098】
さらなる態様では、本発明は、ＳＣＬＣを有する患者の処置における使用のためのＫＤＭ１Ａ阻害剤であって、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置を開始する前に、患者は、前述の態様のいずれかによる方法を使用して、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高いものとして同定されているＫＤＭ１Ａ阻害剤を提供する。
【0099】
前述の態様のいずれかの一部の実施形態では、方法は、患者由来の試料を得るかまたは提供する工程をさらに含む。
好ましくは、本発明による治療方法および使用のいずれにおいても、患者はヒト患者である。
好ましくは、本発明による治療方法および使用のいずれにおいても、患者はヒト患者である。
【0100】
バイオマーカーレベル、試料タイプなどを測定する方法に関する他の箇所の開示も、同様に、上記の処置方法および関連する治療用途に適用可能である。
本発明に従って使用することができるＫＤＭ１Ａ阻害剤は、当該技術分野において現在公知であるか、または将来報告され得る任意のＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む。好ましくは、ＫＤＭ１Ａ阻害剤は小分子である。不可逆性と可逆性ＫＤＭ１Ａ阻害薬の両方が報告されている。不可逆性ＫＤＭ１Ａ阻害剤は、ＫＤＭ１Ａ活性部位内のＦＡＤ補因子に共有結合することによりそれらの阻害活性を発揮し、典型的には、２－（ヘテロ）アリールシクロプロピルアミノ部分などの２－シクリル－シクロプロピルアミノ部分に基づく。ＫＤＭ１Ａの可逆性阻害剤はまた開示されている。好ましくは、ＫＤＭ１Ａ阻害剤は、細胞において活性であるべきである。ＫＤＭ１Ａ阻害剤の細胞活性は、例えば、ＳＣＬＣ細胞生存性アッセイ（例えば、本明細書の実施例１に記載されるアッセイ、またはＭｏｈａｍｍａｄら、２０１５年、前掲に記載されるアッセイ）または急性骨髄性白血病細胞株分化アッセイ（例えば、Ｌｙｎｃｈら、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１３年１１月１日：４４２巻（１号）：１０４～６頁．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｂ．２０１３．０７．０３２に記載されるアッセイ）のようなＫＤＭ１Ａ阻害剤のための十分に確立されたインビトロ細胞アッセイを用いて決定することができる。
本発明に従って使用することができるＫＤＭ１Ａ阻害剤は、当該技術分野において現在公知であるか、または将来報告され得る任意のＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む。好ましくは、ＫＤＭ１Ａ阻害剤は小分子である。不可逆性と可逆性ＫＤＭ１Ａ阻害薬の両方が報告されている。不可逆性ＫＤＭ１Ａ阻害剤は、ＫＤＭ１Ａ活性部位内のＦＡＤ補因子に共有結合することによりそれらの阻害活性を発揮し、典型的には、２－（ヘテロ）アリールシクロプロピルアミノ部分などの２－シクリル－シクロプロピルアミノ部分に基づく。ＫＤＭ１Ａの可逆性阻害剤はまた開示されている。好ましくは、ＫＤＭ１Ａ阻害剤は、細胞において活性であるべきである。ＫＤＭ１Ａ阻害剤の細胞活性は、例えば、ＳＣＬＣ細胞生存性アッセイ（例えば、本明細書の実施例１に記載されるアッセイ、またはＭｏｈａｍｍａｄら、２０１５年、前掲に記載されるアッセイ）または急性骨髄性白血病細胞株分化アッセイ（例えば、Ｌｙｎｃｈら、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１３年１１月１日：４４２巻（１号）：１０４～６頁．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｂ．２０１３．０７．０３２に記載されるアッセイ）のようなＫＤＭ１Ａ阻害剤のための十分に確立されたインビトロ細胞アッセイを用いて決定することができる。
【0101】
本発明に従って使用することができるＫＤＭ１Ａ阻害剤の例としては、限定されないが、国際公開第2010/043721号、国際公開第2010/084160号、国際公開第2011/035941号、国際公開第2011/042217号、国際公開第2011/131697号、国際公開第2012/013727号、国際公開第2012/013728号、国際公開第2012/045883号、国際公開第2013/057320号、国際公開第2013/057322号、国際公開第2010/143582号、国際公開第2011/022489号、国際公開第2011/131576号、国際公開第2012/034116号、国際公開第2012/135113号、国際公開第2013/022047号、国際公開第2013/025805号、国際公開第2014/058071号、国際公開第2014/084298号、国際公開第2014/086790号、国際公開第2014/164867号、国際公開第2014/205213号、国際公開第2015/021128号、国際公開第2015/031564号、国際公開第2007/021839号、国際公開第2008/127734号、国際公開第2014/164867号、国際公開第2015/089192号、国際公開第2015/123408号、国際公開第2015/123424号、国際公開第2015/123437号、国際公開第2015/123465号、国際公開第2015/156417号、国際公開第2015/181380号、国際公開第2016/123387号、国際公開第2016/130952号、国際公開第2016/172496号、国際公開第2016/177656号、国際公開第2017/027678号、国際公開第2012/071469号、国際公開第2013/033688号、国際公開第2014/085613号、国際公開第2015/120281号、国際公開第2015/134973号、国際公開第2015/168466号、国際公開第2015/200843号、国際公開第2016/003917号、国際公開第2016/004105号、国際公開第2016/007722号、国際公開第2016/007727号、国際公開第2016/007731号、国際公開第2016/007736号、国際公開第2016/034946号、国際公開第2016/037005号、国際公開第2016/161282号、国際公開第2016172496号、国際公開第2017/004519号、国際公開第2017/027678号、国際公開第2017/079476号、国際公開第2017/079670号、国際公開第2017/090756号、国際公開第2017/109061号、国際公開第2017/116558号、国際公開第2017/114497号、国際公開第2017/149463号、国際公開第2017/157322号、国際公開第2017/195216号、国際公開第2017/198780号、国際公開第2017/215464号、国際公開第2018/081342号、国際公開第2018/081343号、米国特許出願公開第2010-0324147号、米国特許出願公開第2015-0065434号、米国特許出願公開第2017-0283397号、中国特許出願公開第106045862号、中国特許出願公開第104119280号、中国特許出願公開第103961340号、中国特許出願公開第103893163号、中国特許出願公開第103319466号、中国特許出願公開第103054869号、中国特許出願公開第105985265号、中国特許出願公開第106432248号、中国特許出願公開第106478639号、中国特許出願公開第106831489号、中国特許出願公開第106928235号、中国特許出願公開第107033148号、中国特許出願公開第107174584号、中国特許出願公開第107176927号、中国特許出願公開第107474011号、中国特許出願公開第107501169号、および中国特許出願公開第107936022号に開示されるもの、ならびに以下のものの任意の光学活性立体異性体、またはその任意の薬学的に許容される塩を含む、
【0102】
【化1-1】
【0103】
【化1-2】
【0104】
【化1-3】
【0105】
が挙げられる。
特に好ましいＫＤＭ１Ａ阻害剤は、（トランス）－Ｎ１－（（１Ｒ，２Ｓ）－２－フェニルシクロプロピル）シクロヘキサン－１，４－ジアミン［ＣＡＳ登録番号１４３１３０４－２１－０］またはその薬学的に許容される塩、より好ましくは、（トランス）－Ｎ１－（（１Ｒ，２Ｓ）－２－フェニルシクロプロピル）シクロヘキサン－１，４－ジアミンビス－塩酸塩［ＣＡＳ登録番号１４３１３０３－７２－８］である。化合物（トランス）－Ｎ１－（（１Ｒ，２Ｓ）－２－フェニルシクロプロピル）シクロヘキサン－１，４－ジアミンは、（１ｒ，４Ｓ）－Ｎ１－（（１Ｒ，２Ｓ）－２－フェニルシクロプロピル）シクロヘキサン－１，４－ジアミンとしても命名することができ、ＯＲＹ－１００１またはＩａｄａｄｅｍｓｔａｔとして公知であり、下記に示される化学構造を有する。
特に好ましいＫＤＭ１Ａ阻害剤は、（トランス）－Ｎ１－（（１Ｒ，２Ｓ）－２－フェニルシクロプロピル）シクロヘキサン－１，４－ジアミン［ＣＡＳ登録番号１４３１３０４－２１－０］またはその薬学的に許容される塩、より好ましくは、（トランス）－Ｎ１－（（１Ｒ，２Ｓ）－２－フェニルシクロプロピル）シクロヘキサン－１，４－ジアミンビス－塩酸塩［ＣＡＳ登録番号１４３１３０３－７２－８］である。化合物（トランス）－Ｎ１－（（１Ｒ，２Ｓ）－２－フェニルシクロプロピル）シクロヘキサン－１，４－ジアミンは、（１ｒ，４Ｓ）－Ｎ１－（（１Ｒ，２Ｓ）－２－フェニルシクロプロピル）シクロヘキサン－１，４－ジアミンとしても命名することができ、ＯＲＹ－１００１またはＩａｄａｄｅｍｓｔａｔとして公知であり、下記に示される化学構造を有する。
【0106】
【化2】
【0107】
ＯＲＹ－１００１は、例えば、国際公開第２０１３／０５７３２２号に開示されており、その中の実施例５を参照されたい。患者への投与のためのＯＲＹ－１００１を含む医薬製剤は、当業者に公知である方法、例えば、国際公開第２０１３／０５７３２２号に記載される方法に従って調製することができる。
【0108】
ＫＤＭ１Ａ阻害剤は、単独のＡＰＩとして、すなわち、単剤療法として投与することができ、またはＳＣＬＣの処置に使用される他の抗がん剤などの１つ以上の追加のＡＰＩの組み合わせで投与することができる。
【0109】
ＫＤＭ１Ａ阻害剤（またはＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置）は、このように直接的な治療に使用するために投与することができるが、典型的には、活性医薬成分としての化合物を１つ以上の薬学的に許容される賦形剤または担体とともに含む医薬組成物の形態で投与される。本明細書におけるＫＤＭ１Ａ阻害剤への任意の言及は、このような化合物、すなわち、非塩形態（例えば、遊離塩基として）またはそのいずれかの薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物の形態での対応する化合物への言及、ならびに上記化合物（またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物）および１つ以上の薬学的に許容される賦形剤もしくは担体を含む医薬組成物への言及を含む。
【0110】
ＫＤＭ１Ａ阻害剤は、意図された目的を達成する任意の手段によって投与することができる。例としては、経口または非経口（例えば、静脈内または皮下）経路による投与が挙げられる。
【0111】
経口送達のために、化合物は、結合剤（例えば、ゼラチン、セルロース、トラガカントゴム）、賦形剤（例えば、デンプン、ラクトース）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、二酸化ケイ素）、崩壊剤（例えば、アルギン酸塩、プリモゲル、およびトウモロコシデンプン）、および甘味剤または香味剤（例えば、グルコース、スクロース、サッカリン、サリチル酸メチル、およびペパーミント）などの薬学的に許容される担体を含む製剤中に組み込むことができる。製剤は、例えば、封入ゼラチンカプセル剤または圧縮錠剤の形態で経口的に送達することができる。カプセル剤および錠剤は、任意の従来技術によって調製することができる。カプセル剤および錠剤はまた、カプセル剤および錠剤の香味、味、色、および形状を修飾るために、当該技術分野において公知である種々の被覆剤で被覆することができる。さらに、脂肪油などの液体担体はまたカプセルに含めることができる。
【0112】
適切な経口製剤は、懸濁剤、シロップ剤、ガム剤、ウエハー（ｗａｆｗｅｒ）、エリキシル剤などの形態であり得る。所望であれば、特殊な形態の風味、味、色、および形状を修飾するための従来の薬剤も含めることができる。さらに、飲み込むことができない患者における経腸栄養チューブによる便利な投与のために、活性化合物は、オリーブ油、コーン油およびベニバナ油などの許容可能な脂溶性植物油ビヒクルに溶解することができる。
【0113】
化合物はまた、液剤もしくは懸濁剤の形態で、または使用前に、液剤もしくは懸濁剤の形態に変換可能である凍結乾燥形態で非経口的に投与することができる。このような製剤では、無菌の水および生理食塩水緩衝液などの希釈剤または薬学的に許容される担体を使用することができる。他の従来の溶媒、ｐＨ緩衝液、安定剤、抗菌剤、界面活性剤、および抗酸化剤をすべて含めることができる。例えば、有用な成分としては、塩化ナトリウム、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩緩衝液、グリセリン、デキストロース、固定油、メチルパラベン、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、重硫酸ナトリウム、ベンジルアルコール、アスコルビン酸などが挙げられる。非経口製剤は、バイアルおよびアンプルなどの任意の従来の容器に保存することができる。
【0114】
経口組成物および非経口組成物のような医薬組成物は、投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、単位投薬形態に製剤化することができる。本明細書で使用される場合、「単位投薬形態」とは、対象への投与のための単位投薬量として適切な物理的に離散した単位を指し、各単位は、１つ以上の適切な薬学的担体と関連して、所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性成分を含有する。
【0115】
治療用途において、医薬組成物は、医学分野における当業者によって決定されるように、処置される疾患に適した方法で投与されるべきである。適切な用量ならびに適切な投与期間および頻度は、とりわけ、患者の状態、疾患の重症度、投与される特定のＫＤＭ１Ａ阻害剤、投与方法、および主治医の判断などの要因によって決定される。一般に、適切な用量および投与レジメンは、治療有益性、例えば、より頻繁な完全寛解もしくは部分寛解、またはより長い無病生存および／または全生存、または症状の重症度の軽減、または臨床医が指摘するような、他の任意の明白に識別可能な改善などの改善された臨床転帰を提供するのに十分な量の医薬組成物を提供する。有効用量は、一般に、インビトロでまたは動物モデル試験系に由来する用量－応答曲線のような実験モデルを用いて評価または外挿することができる。当業者は、上記の要因に基づいて、適切な用法および処置レジメンを決定できることができる。
【0116】
本発明の医薬組成物は、投与のための説明書とともに、容器、パックまたはディスペンサ中に含まれ得る。
【実施例】
【0117】
以下の実施例は、本発明を例示するために提供される。それらは、本発明の範囲を限定するものとみなされるべきではなく、単にそれらを代表するものとみなされるべきである。
【0118】
実施例１：ＫＤＭ１Ａ阻害剤に対する感受性および耐性の細胞株の分類
バイオマーカー同定のために、７つのＳＣＬＣ細胞株を、ＫＤＭ１Ａ阻害剤ＯＲＹ－１００１（本明細書の他の箇所に記載される）での４日間または１０日間のいずれか処置後に行われた生存性アッセイの結果に基づいて、ＫＤＭ１Ａ阻害剤処理に対するそれらの応答について分類した。４日間の生存性アッセイのために、ＳＣＬＣ細胞株は、ＯＲＹ－１００１（最大濃度：５０μＭ；１８連続の１：２希釈を試験した）を補足した、各細胞株の提供者により推奨された最適化培地の最終体積４０μＬ中で３８４ウェルプレートに播種された。３７℃で５％ＣＯ２調節された雰囲気中で４日間インキュベートした後、製造業者プロトコール（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従って、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（登録商標）アッセイを用いて細胞生存性を評価した。ＥＣ５０値は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌソフトウェアを用いて算出され、未処理細胞（１００％増殖）およびＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（登録商標）試薬なし（１００％増殖阻害）に対して正規化した。ＯＲＹ－１００１に１０日間曝露した後の生存性の定量は、９６ウェルプレートフォーマット（ＮＣＩ－Ｈ１８７細胞株については最大濃度１μＭ、１００ｎＭ）で行われた。細胞は、最初に、１００μＬの培地（ＲＰＭＩ－１６４０ １０％ＦＢＳ ２ｍＭグルタミン、ただし、ＨＩＴＥＳ培地中で培養したＮＣＩ－Ｈ１８７６細胞株を除き、４．５ｍＭグルタミン、０．００５ｍｇ／ｍＬインスリン、０．０１ｍｇ／ｍＬトランスフェリン、３０ｎＭセレン酸ナトリウム、１０ｎＭヒドロコルチゾン、１０ｎＭベータ－エストラジオールをＤＭＥＭ：Ｆ１２ ５％ＦＢＳに加えて調製した）に播種され、５％ＣＯ２調節された雰囲気中で３７℃でインキュベートした。６日目に、さらに１００μＬのＯＲＹ－１００１含有培地を添加した。さらに４日後、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（登録商標）アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて残存生存率を測定した。バックグラウンド減算後、ビヒクル処理された細胞に対して正規化を行った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて非線形モデルを適合させた後、ＥＣ５０値を算出した。
バイオマーカー同定のために、７つのＳＣＬＣ細胞株を、ＫＤＭ１Ａ阻害剤ＯＲＹ－１００１（本明細書の他の箇所に記載される）での４日間または１０日間のいずれか処置後に行われた生存性アッセイの結果に基づいて、ＫＤＭ１Ａ阻害剤処理に対するそれらの応答について分類した。４日間の生存性アッセイのために、ＳＣＬＣ細胞株は、ＯＲＹ－１００１（最大濃度：５０μＭ；１８連続の１：２希釈を試験した）を補足した、各細胞株の提供者により推奨された最適化培地の最終体積４０μＬ中で３８４ウェルプレートに播種された。３７℃で５％ＣＯ２調節された雰囲気中で４日間インキュベートした後、製造業者プロトコール（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従って、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（登録商標）アッセイを用いて細胞生存性を評価した。ＥＣ５０値は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌソフトウェアを用いて算出され、未処理細胞（１００％増殖）およびＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（登録商標）試薬なし（１００％増殖阻害）に対して正規化した。ＯＲＹ－１００１に１０日間曝露した後の生存性の定量は、９６ウェルプレートフォーマット（ＮＣＩ－Ｈ１８７細胞株については最大濃度１μＭ、１００ｎＭ）で行われた。細胞は、最初に、１００μＬの培地（ＲＰＭＩ－１６４０ １０％ＦＢＳ ２ｍＭグルタミン、ただし、ＨＩＴＥＳ培地中で培養したＮＣＩ－Ｈ１８７６細胞株を除き、４．５ｍＭグルタミン、０．００５ｍｇ／ｍＬインスリン、０．０１ｍｇ／ｍＬトランスフェリン、３０ｎＭセレン酸ナトリウム、１０ｎＭヒドロコルチゾン、１０ｎＭベータ－エストラジオールをＤＭＥＭ：Ｆ１２ ５％ＦＢＳに加えて調製した）に播種され、５％ＣＯ２調節された雰囲気中で３７℃でインキュベートした。６日目に、さらに１００μＬのＯＲＹ－１００１含有培地を添加した。さらに４日後、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（登録商標）アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて残存生存率を測定した。バックグラウンド減算後、ビヒクル処理された細胞に対して正規化を行った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて非線形モデルを適合させた後、ＥＣ５０値を算出した。
【0119】
ＯＲＹ－１００１による処理後の増殖阻害が２５％以上であり、ＥＣ５０が１０ｎＭ未満である場合、細胞株はＫＤＭ１Ａ阻害に感受性であるものとして分類された。ここで試験された条件下では感受性ではないが、他のアッセイではＯＲＹ－１００１に感受性があることが報告されているため、ＳＨＰ７７を部分的に感受性であるものとして分類した。得られた結果を以下の表１に示す。表で報告されているのは、５０％の増殖低減を達成した濃度（ＥＣ５０）、および試験された最高用量で達成された増殖抑制の最大パーセンテージ（最大応答％）である。
【0120】
【表3】
【0121】
実施例２．ＫＤＭ１Ａ阻害剤に対する応答性のバイオマーカーとしてのＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の同定
ＫＤＭ１Ａ阻害剤処理に感受性および耐性であるＳＣＬＣ細胞株を識別できる遺伝子を同定するために、ＫＤＭ１Ａｉ感受性、１つのＫＤＭ１Ａｉ部分的感受性、および２つのＫＤＭ１Ａｉ耐性であるものとして同定された４つのＳＣＬＣ細胞株について、ＲＮＡＳｅｑ分析を行った。ＫＤＭ１Ａｉに対するそれらの応答性および分類に関する詳細は、上記の実施例１において提供される。
ＫＤＭ１Ａ阻害剤処理に感受性および耐性であるＳＣＬＣ細胞株を識別できる遺伝子を同定するために、ＫＤＭ１Ａｉ感受性、１つのＫＤＭ１Ａｉ部分的感受性、および２つのＫＤＭ１Ａｉ耐性であるものとして同定された４つのＳＣＬＣ細胞株について、ＲＮＡＳｅｑ分析を行った。ＫＤＭ１Ａｉに対するそれらの応答性および分類に関する詳細は、上記の実施例１において提供される。
【0122】
遺伝子発現分析用の細胞ペレット
細胞をフラスコ内で連続６日間増殖させた。アッセイの最終日に、細胞をＦａｌｃｏｎチューブに回収し、計数し、次に４分間、１２００ｒｐｍで遠心分離した。上清を捨て、１ｍＬのＰＢＳに細胞を懸濁し、エッペンドルフに試料に移し、４℃にてエッペンドルフ遠心分離機で５分間、３０００ｒｐｍで遠心分離した。最後に上清を捨て、ペレットを－８０℃で凍結させた。
細胞をフラスコ内で連続６日間増殖させた。アッセイの最終日に、細胞をＦａｌｃｏｎチューブに回収し、計数し、次に４分間、１２００ｒｐｍで遠心分離した。上清を捨て、１ｍＬのＰＢＳに細胞を懸濁し、エッペンドルフに試料に移し、４℃にてエッペンドルフ遠心分離機で５分間、３０００ｒｐｍで遠心分離した。最後に上清を捨て、ペレットを－８０℃で凍結させた。
【0123】
ＲＮＡ配列決定
ＱＩＡＧＥＮ ｍｉＲＮｅａｓｙミニキットを用いて検体から総ＲＮＡを単離した。ＲＮＡ分離は、ＱＩＡｇｅｎ ＲＮｅａｓｙミニキットを用いて行われた。ＲＮｅａｓｙミニキットは、シリカゲル系メンブランの選択的結合特性とマイクロスピン技術の速度を組み合わせている。簡単に説明すると、組織をホモジナイズし、Ｌｙｓｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ Ｄチューブ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ ＬＬＣ）またはボルテックスを用いて、ＲＬＴ緩衝液（ベータ－メルカプトエタノールを含む）中で溶解した。エタノールをホモジネートに添加して、２００ヌクレオチド（ｎｔ）より長いすべての総ＲＮＡ分子について適切な結合条件を提供した。試料をＲＮｅａｓｙミニカラムに適用し、総ＲＮＡをメンブランに結合させ、汚染物質を効率的に洗い流した。次に、高品質ＲＮＡを、ヌクレアーゼを含まない水で溶出させた。得られたＲＮＡを定量し、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて完全性を評価した。
ＱＩＡＧＥＮ ｍｉＲＮｅａｓｙミニキットを用いて検体から総ＲＮＡを単離した。ＲＮＡ分離は、ＱＩＡｇｅｎ ＲＮｅａｓｙミニキットを用いて行われた。ＲＮｅａｓｙミニキットは、シリカゲル系メンブランの選択的結合特性とマイクロスピン技術の速度を組み合わせている。簡単に説明すると、組織をホモジナイズし、Ｌｙｓｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ Ｄチューブ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ ＬＬＣ）またはボルテックスを用いて、ＲＬＴ緩衝液（ベータ－メルカプトエタノールを含む）中で溶解した。エタノールをホモジネートに添加して、２００ヌクレオチド（ｎｔ）より長いすべての総ＲＮＡ分子について適切な結合条件を提供した。試料をＲＮｅａｓｙミニカラムに適用し、総ＲＮＡをメンブランに結合させ、汚染物質を効率的に洗い流した。次に、高品質ＲＮＡを、ヌクレアーゼを含まない水で溶出させた。得られたＲＮＡを定量し、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて完全性を評価した。
【0124】
ライブラリー生成はＩｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡライブラリー調製を用いて行われた。ライブラリーのクラスター生成および配列決定はＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ上で行われた。総ＲＮＡ試料は、ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡ試料調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いてｃＤＮＡライブラリーに変換された。１００ｎｇの総ＲＮＡから開始して、ポリアデニル化ＲＮＡ（主にｍＲＮＡ）を選択し、オリゴｄＴ結合磁性ビーズを用いて精製した。このｍＲＮＡを化学的に断片化し、逆転写酵素およびランダム六量体プライマーを用いて一本鎖ｃＤＮＡに変換し、アクチノマイシンＤを加えて第二鎖のＤＮＡ依存性合成を抑制した。二本鎖ｃＤＮＡは、ＲＮＡ鋳型を除去し、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰの存在下で第二鎖を合成することによって作製された。単一のＡ塩基を３’末端に加えて、単一のＴ塩基オーバーハングを含む配列決定アダプターの連結を容易にした。アダプター連結されたｃＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、配列調製ライブラリー（ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｒｅａｄｙ ｌｉｂｒａｒｙ）の量を増加させた。この増幅の間に、ポリメラーゼはＵ塩基に遭遇した場合に停止し、第二鎖を不十分な鋳型にする。したがって、増幅された材料は、鋳型として第一鎖を使用し、それによって鎖情報を保存した。最終ｃＤＮＡライブラリーをサイズ分布について分析し、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（ＤＮＡ １０００キット）を用いて、ｑＰＣＲ（ＫＡＰＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔ Ｋｉｔ）により定量し、次に、配列決定の準備のために２ｎＭに正規化した。標準クラスター生成キットｖ５は、ｃＤＮＡライブラリーをフローセル表面に結合させた。ｃＢｏｔは付着したｃＤＮＡ構築物を等温増幅し、それぞれ約１０００コピーのクローンクラスターを作製した。ＤＮＡ配列は、ＴｒｕＳｅｑ ＳＢＳ Ｋｉｔを介した合成による配列決定技術を用いて直接決定した。
【0125】
以下の品質管理指標を適用した：ライブラリー調製を進めるために、試料は、入力ＲＮＡが１００ｎｇであり、ＲＩＮ値が７．０以上である。各試料ごとに、少なくとも３０００万の５０ｂｐの対合末端リードが生成された。リボソームＲＮＡ、ｐｈｉＸ、ホモポリマーリピート、およびグロビンＲＮＡなど種々のオフターゲット配列を減算した後、少なくとも２，８５０万のリードが送達された。
【0126】
Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｈｉｓｅｑソフトウェアは、各レーンに装填されたクラスター（ＤＮＡ断片）の総数、通過するシークエンシング品質フィルターの（過負荷およびシークエンシングケミストリーによるエラーを識別する）パーセント、各配列リードの各塩基のｐｈｒｅｄ品質スコア、各配列決定サイクルの全体的な平均ｐｈｒｅｄスコア、および全体的なエラーパーセント（参照ゲノムへのアラインメントに基づく）を報告する。各ＲＮＡ－ｓｅｑ試料について、ミトコンドリアＲＮＡおよびリボソームＲＮＡを含むリードのパーセンテージを計算する。ＦＡＳＴＱＣパッケージは、追加のＱＣメトリック（塩基分布、配列の重複、過剰に表された配列、および濃縮されたｋｍｅｒ）およびグラフィカルな要約を提供するために使用される。ＧＳＮＡＰ、およびＲＮＡＳｅｑデータの推奨オプションを用いて、生のリードをヒトゲノム（ｈｇ１９）に対して整列させた。ゲノム配列に加えて、ＧＳＮＡＰは、Ｅｎｓｅｍｂｌ ｖ７３に基づくヒトスプライスジャンクションおよび転写物のデータベースを与えられる。次に、結果のＳＡＭファイルは、Ｓａｍｔｏｏｌｓを使用して選別されたＢＡＭファイルに変換される。遺伝子発現値は、Ｍｏｒｔａｚａｖｉら（Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００８年）５巻（７号）：６２１～８頁）に従ってＲＰＫＭ値として、およびリードカウントして計算した。正規化されたリードカウントは、ＲパッケージＤＥＳｅｑ２を用いて得られた。データは３つの独立した実験のＬｏｇ２（ＲＰＫＭ）の平均として報告される。ＲＰＫＭは、キロベースパーミリオンあたりのリード値を表す。
【0127】
結果
ＲＮＡＳｅｑにより測定したＳＣＬＣ細胞株におけるＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の遺伝子発現を下記の表２に示す。表は、Ｌｏｇ２（ＲＰＫＭ）の平均値（Ａｖ．）と標準偏差（ＳＤ）を示す。示されたカラーコードは、遺伝子発現レベルに基づいており、色が濃いほど、バイオマーカーの発現が高い。比較のために、ＧＡＰＤＨ発現は、この参照遺伝子の試料にわたって安定な発現を示すために並行して報告される。
ＲＮＡＳｅｑにより測定したＳＣＬＣ細胞株におけるＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の遺伝子発現を下記の表２に示す。表は、Ｌｏｇ２（ＲＰＫＭ）の平均値（Ａｖ．）と標準偏差（ＳＤ）を示す。示されたカラーコードは、遺伝子発現レベルに基づいており、色が濃いほど、バイオマーカーの発現が高い。比較のために、ＧＡＰＤＨ発現は、この参照遺伝子の試料にわたって安定な発現を示すために並行して報告される。
【0128】
【表4】
【0129】
これらの結果は、図１においてグラフで表され、ＫＤＭ１Ａ阻害に対して感受性であるか、部分的に感受性であるかまたは耐性であるＳＣＬＣ細胞株について上記されるように、ＲＮＡ－ｓｅｑによって測定されたＡＳＣＬ１（Ｙ軸）およびＳＯＸ２（Ｘ軸）の発現を表すドットプロットである。
【0130】
これらの細胞株について生成されたＲＮＡＳｅｑデータに基づいて、すべてのＯＲＹ－１００１感受性および部分的に感受性の細胞株が高レベルのＡＳＣＬ１および中～高レベルのＳＯＸ２を発現することが同定されたが、ＯＲＹ－１００１処理に耐性のＳＣＬＣ細胞株においては、表２および図１に示されるように、ＡＳＣＬ１またはＳＯＸ２のいずれかが非常に低いレベル（Ｌｏｇ２（ＲＰＫＭ）≦０）で検出された。したがって、ＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２は、ＯＲＹ－１００１などのＫＤＭ１Ａ阻害剤による処置に感受性（すなわち応答性）であるか、または感受性（応答性）である可能性が高いＳＣＬＣ細胞、またはＳＣＬＣを有する対象を同定するためのバイオマーカーとして使用され得る。
【0131】
実施例３．ｑＲＴ－ＰＣＲを用いたＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の検証
次に、実施例２において同定されたＫＤＭ１Ａ阻害剤に対して応答性のバイオマーカーＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２は、実施例１および２に記載されたＳＣＬＣ細胞株の同じパネル上でＴａｑｍａｎ ｑＲＴ－ＰＣＴ分析により検証され、１つがＫＤＭ１Ａｉ処理に対して感受性であるものとして同定され（ＤＭＳ５３）、１つが部分的に感受性であるものとして同定された（ＮＣＩＨ５２６）、２つの追加のＳＣＬＣ細胞株を含む。
次に、実施例２において同定されたＫＤＭ１Ａ阻害剤に対して応答性のバイオマーカーＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２は、実施例１および２に記載されたＳＣＬＣ細胞株の同じパネル上でＴａｑｍａｎ ｑＲＴ－ＰＣＴ分析により検証され、１つがＫＤＭ１Ａｉ処理に対して感受性であるものとして同定され（ＤＭＳ５３）、１つが部分的に感受性であるものとして同定された（ＮＣＩＨ５２６）、２つの追加のＳＣＬＣ細胞株を含む。
【0132】
ｑＲＴ－ＰＣＲによる遺伝子発現分析
ＲＮｅａｓｙミニキットを用いて総ＲＮＡを抽出し、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ－ｃＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃４３９０７７９）を用いて、標準手順に従ってｃＤＮＡを得た。ｑＲＴ－ＰＣＲは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ Ｐｒｏｂｅｓ Ｍａｓｔｅｒ（ＰＮＴ－Ｌ－０３４；Ｒｏｃｈｅ ＃０４８８７３０１００１）を用い、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃからの予め設計され、予め最適化されたＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイを用いて行われた。ｑＲＴ－ＰＣＲは、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ；ＰＮＴ－Ｌ－０３５）を用いて３重にして行われた。ｑＲＴ－ＰＣＲによるＣｐ値の分析は、以下のＴａｑｍａｎプライマー／プローブセットを用いて３重にして行われた：
－ＡＳＣＬ１：Ｈｓ０４１８７５４６＿ｇ１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；アンプリコン長８１ｂｐ、エクソン１－２境界を標的とする、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００４３１６．３、配列番号１を参照されたい）
－ＳＯＸ２：Ｈｓ０１０５３０４９＿ｓ１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；アンプリコン長９１ ｂｐ、エクソン１－１境界を標的とする、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００３１０６．３、配列番号３を参照されたい）
－ＧＡＰＤＨ：Ｈｓ０２７５８９９１＿ｇ１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；アンプリコン長９３ｂｐ、エクソン６－７境界を標的とする、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００１２５６７９９．２）
結果
ｑＲＴ－ＰＣＲにより測定されたＳＣＬＣ細胞株のこのパネルにおけるＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２遺伝子発現を表３に示す。表はＣｐ値を報告する。Ｅｘｐ．Ｒ：実験複製；Ａｖ：平均；ｎ．ｄ．：検出されない。各実験の複製値は、３回の技術的複製の平均値である。試料あたりの同じＲＮＡ量をｑＲＴ－ＰＣＲにより分析した。比較として、ＧＡＰＤＨ参照遺伝子の平均Ｃｐ発現が報告され、それらは全試料の間で２３～２６Ｃｐの範囲であった（表３を参照されたい）。
ＲＮｅａｓｙミニキットを用いて総ＲＮＡを抽出し、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ－ｃＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃４３９０７７９）を用いて、標準手順に従ってｃＤＮＡを得た。ｑＲＴ－ＰＣＲは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ Ｐｒｏｂｅｓ Ｍａｓｔｅｒ（ＰＮＴ－Ｌ－０３４；Ｒｏｃｈｅ ＃０４８８７３０１００１）を用い、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃからの予め設計され、予め最適化されたＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイを用いて行われた。ｑＲＴ－ＰＣＲは、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ；ＰＮＴ－Ｌ－０３５）を用いて３重にして行われた。ｑＲＴ－ＰＣＲによるＣｐ値の分析は、以下のＴａｑｍａｎプライマー／プローブセットを用いて３重にして行われた：
－ＡＳＣＬ１：Ｈｓ０４１８７５４６＿ｇ１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；アンプリコン長８１ｂｐ、エクソン１－２境界を標的とする、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００４３１６．３、配列番号１を参照されたい）
－ＳＯＸ２：Ｈｓ０１０５３０４９＿ｓ１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；アンプリコン長９１ ｂｐ、エクソン１－１境界を標的とする、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００３１０６．３、配列番号３を参照されたい）
－ＧＡＰＤＨ：Ｈｓ０２７５８９９１＿ｇ１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；アンプリコン長９３ｂｐ、エクソン６－７境界を標的とする、ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００１２５６７９９．２）
結果
ｑＲＴ－ＰＣＲにより測定されたＳＣＬＣ細胞株のこのパネルにおけるＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２遺伝子発現を表３に示す。表はＣｐ値を報告する。Ｅｘｐ．Ｒ：実験複製；Ａｖ：平均；ｎ．ｄ．：検出されない。各実験の複製値は、３回の技術的複製の平均値である。試料あたりの同じＲＮＡ量をｑＲＴ－ＰＣＲにより分析した。比較として、ＧＡＰＤＨ参照遺伝子の平均Ｃｐ発現が報告され、それらは全試料の間で２３～２６Ｃｐの範囲であった（表３を参照されたい）。
【0133】
【表5】
【0134】
表４は、ｑＲＴ－ＰＣＲにより測定したＳＣＬＣ細胞株におけるＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２についてのすべての実験的複製の平均Ｃｐ値を示す。示されたカラーコードは、遺伝子発現レベルに基づいており、色が濃いほど、バイオマーカーの発現が高い。
【0135】
【表6】
【0136】
表３および表４に示されるように、ＫＤＭ１Ａｉ耐性細胞におけるＡＳＣＬ１またはＳＯＸ２の発現は、全く検出されなかったか（Ｃｐ値＞４０）、または３５を超える絶対Ｃｐ値を有し、非常に低い発現を示した。他方、すべてのＫＤＭ１Ａｉ感受性ＳＣＬＣ細胞株はＡＳＣＬ１とＳＯＸ２の両方を発現し、したがって、実施例２に記載されるＲＮＡＳｅｑデータを用いて所見を確認した。部分的に感受性である細胞株のうち、一方はＡＳＣＬ１とＳＯＸ２の両方の高レベルを発現することが確認されたが、他方はＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の発現が非常に低かった。
【0137】
これらの結果はまた、図２においてグラフで示されており、ＫＤＭ１Ａ阻害に対して感受性であるか、部分的に感受性であるかまたは耐性である、上記で同定されたＳＣＬＣ細胞株について、ｑＲＴ－ＰＣＲによって測定されたＡＳＣＬ１（Ｙ軸）およびＳＯＸ２（Ｘ軸）の遺伝子発現（絶対Ｃｐ値）を表すドットプロットである。プロット値は、表３に示されるように、独立した実験の平均である。細胞株の１つはＳＯＸ２の発現について４０を超えるＣｐ値を示し、これは図２中、括弧でドットを示すことによって示される。
【0138】
したがって、本明細書に記載される結果は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤処理に感受性であるＳＣＬＣが、ＡＳＣＬ１とＳＯＸ２の両方の全体的な高発現を示す一方で、耐性ＳＣＬＣは、ＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の一方または両方の低発現を有することをさらに確認する。したがって、ＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２レベルは、ＫＤＭ１Ａ阻害剤療法に応答する可能性が増加している、ＳＣＬＣ細胞またはＳＣＬＣを有する対象を同定するための予測バイオマーカーとして用いることができる。
【0139】
実施例４．ＳＣＬＣ細胞株の拡大パネルにおけるＫＤＭ１Ａ阻害剤に対する応答の予測されるバイオマーカーの評価
ＫＤＭ１Ａ阻害に対する応答性のバイオマーカーとしてのＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のさらなるバイオマーカー検証のために、より大きなデータセットを構築し、分析した。ＯＲＹ－１００１を用いて得られたＳＣＬＣ生存性アッセイデータは、Ｍｏｈａｍｍａｄら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２０１５年、２８巻：５７～６９頁（具体的には、参照により本明細書に組み込まれる図Ｓ２Ａ－Ｂを参照されたい）に記載されるように、２つの追加のＫＤＭ１Ａ阻害剤ＧＳＫ２８７９５５２およびＧＳＫ－ＬＳＤ１に対するＳＣＬＣ細胞株の応答に関する公衆に入手可能なデータと統合され、次に、より大きなセットのＳＣＬＣ細胞株を、ＫＤＭ１Ａ阻害剤による処理に対して感受性または耐性であるものとして分類するために使用された。このＳＣＬＣ細胞株の拡大パネルを下記の表５に示す。ＧＳＫ２８７９５５２およびＧＳＫ－ＬＳＤ１の化学構造は文献に提供されている。
ＫＤＭ１Ａ阻害に対する応答性のバイオマーカーとしてのＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のさらなるバイオマーカー検証のために、より大きなデータセットを構築し、分析した。ＯＲＹ－１００１を用いて得られたＳＣＬＣ生存性アッセイデータは、Ｍｏｈａｍｍａｄら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２０１５年、２８巻：５７～６９頁（具体的には、参照により本明細書に組み込まれる図Ｓ２Ａ－Ｂを参照されたい）に記載されるように、２つの追加のＫＤＭ１Ａ阻害剤ＧＳＫ２８７９５５２およびＧＳＫ－ＬＳＤ１に対するＳＣＬＣ細胞株の応答に関する公衆に入手可能なデータと統合され、次に、より大きなセットのＳＣＬＣ細胞株を、ＫＤＭ１Ａ阻害剤による処理に対して感受性または耐性であるものとして分類するために使用された。このＳＣＬＣ細胞株の拡大パネルを下記の表５に示す。ＧＳＫ２８７９５５２およびＧＳＫ－ＬＳＤ１の化学構造は文献に提供されている。
【0140】
【表7】
【0141】
ＫＤＭ１Ａ阻害に対するこれらの細胞株の感受性はアッセイに依存し、他のアッセイ条件では異なる結果が得られていることから、ある種の細胞株を部分的に感受性であるものとして分類した。ここで試験された条件下では感受性であるが、他のアッセイではＯＲＹ－１００１に耐性であることが報告されているため、ＮＣＩＨ５２６細胞株を部分的に感受性であるものとして分類した。ＯＲＹ－１００１に対する一部の応答がインビトロで観察されたが、最大増殖阻害は非常に低かった（１０％）ため、ＮＣＩＨ２０８１を部分的に感受性であるものとして分類した。
【0142】
次に、ＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の発現は、Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ；ｈｔｔｐｓ：／／ｐｏｒｔａｌｓ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｃｃｌｅ；ＣＣＬＥ＿Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ＿Ｅｎｔｒｅｚ＿２０１２－０９－２９．ｇｃｔ．ｔｘｔ）によって監修された細胞株トランスクリプトームデータセットを用いて、これらのＫＤＭ１Ａｉ感受性および耐性の細胞において評価された。ＣＣＬＥデータベース（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイデータ；ＲＭＡ値）におけるような上記ＳＣＬＣ細胞株におけるＡＳＣＬ１、ＳＯＸ２、およびＧＡＰＤＨの遺伝子発現を下記の表６に示す。両側ステューデントｔ検定のｐ値は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｏｆｆｉｃｅ Ｅｘｃｅｌを用いて算出した。
【0143】
【表8】
【0144】
ＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２は、ＫＤＭ１Ａｉによる処理に対して感受性および耐性である細胞株間で差次的に発現された（表６）。詳細には、ＡＳＣＬ１の平均発現は、感受性および耐性の細胞株についてそれぞれ１２．２５および７．１９の正規化プローブ強度単位であった（ｐ値＝３．０Ｅ－０５）。同じ細胞株において、平均正規化プローブ強度値は、ＳＯＸ２について８．９６（感受性群）および５．７５（耐性群）（ｐ値＝２．０Ｅ－０３）であった。ＧＡＰＤＨ参照遺伝子の発現は、全試料で類似していた（感受性細胞株について１４．６０平均正規化プローブ強度単位、耐性細胞株について１４．５６平均正規化プローブ強度単位、ｐ値＝６．１Ｅ－０１）。
【0145】
実施例２および３に記載された結果と一致して、ＫＤＭ１Ａｉに対して感受性であるの８つのＳＣＬＣ細胞株のうち７つは、ＡＳＣＬ１とＳＯＸ２の両方を高度に発現し、一方、ほとんどすべての耐性ＳＣＬＣ細胞株は、ＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の一方または両方について低レベルを発現していた。これは、図３においてさらに強調され、ＫＤＭ１Ａ阻害に対して感受性であるか、部分的に感受性であるか、または耐性であるＳＣＬＣ細胞株のこの拡大パネルにおいて、ＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のマイクロアレイＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ分析（ＲＭＡ値）によって測定された遺伝子発現を表すドットプロットを示す。図３に示されるように、ＫＤＭ１Ａ阻害剤に感受性である細胞株において、ＡＳＣＬ１とＳＯＸ２の両方の高レベルを有する細胞株の間で明瞭な富化が観察され（およびその反対）、ＫＤＭ１Ａ阻害剤に耐性である細胞株における明瞭な富化が、ＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の一方または両方の低発現を有する細胞株の間で存在する。
【0146】
したがって、本明細書の実施例４に記載された結果は、ＯＲＹ－１００１のようなＫＤＭ１Ａ阻害剤による処置に応答性である可能性が高い対象を同定／選択するために、これら２つのバイオマーカーを組み合わせて使用することをさらに支持する。
【0147】
感受性および耐性の細胞株の遺伝子発現値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０１ソフトウェア（分析から除外された「部分的な感受性」細胞株）により、受信者動作特性曲線（ＲＯＣ曲線）を用いて、選択された各バイオマーカーについて分析した。ＲＯＣ曲線は、様々な閾値設定で偽陽性率（ＦＰＲ）に対して真陽性率（ＴＰＲ）をプロットすることによって作成される。図４は、ＫＤＭ１Ａ阻害剤に対して感受性および耐性のＳＣＬＣ細胞を識別するためのＡＳＣＬ１（図４Ａ）およびＳＯＸ２（図４Ｂ）の発現に関するＲＯＣ曲線を示す。各バイオマーカーのＲＯＣ曲線に基づき、選択性と特異性（最尤比）の間の最良のトレードオフについてそれぞれの閾値レベルが報告される。表６の発現データセットに対して閾値レベル≧８．９３５を有するＡＳＣＬ１バイオマーカーのみを用いると、ＫＤＭ１Ａ感受性および耐性の細胞株は、感度６８．４２％、特異度１００％で識別することができる。所定の発現データセットの閾値レベルが≧８．０３０であるＳＯＸ２バイオマーカーのみを用いると、ＫＤＭ１Ａ感受性および耐性の細胞株を感度８４．２１％および特異度８７．５０％で識別することができる。
【0148】
次に、異なるアルゴリズムを用いて、表６に記載されるＳＣＬＣ細胞株（分析から除外された「部分的に感受性の」細胞株）のパネル上でＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の組み合わせに基づいて、ＫＤＭ１Ａ阻害に対する応答に関する予測を行った。
【0149】
第一に、上記で示されたＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２についての個々の閾値を超えるバイオマーカーの同時コンプライアンスに基づいて、Ｂｏｏｌｅａｎ統合モデル分類アルゴリズムを構築した（図４ＡおよびＢ）；アルゴリズムが下記の表７の第１行に示された条件を満たす場合、スコア「１」が得られ、そうでなければスコア「０」が得られた。次に、細胞株は、スコアが閾値を超えた場合、すなわち、＞０（この場合、１に等しい）であった場合は、ＫＤＭ１Ａｉに応答する可能性が高いものとして分類され、スコアが０に等しかった場合は、ＫＤＭ１Ａｉに応答する可能性が低いものとして分類された（以下の表７参照）。最後に、Ｂｏｏｌｅａｎ統合分類アルゴリズムの性能を評価した。感度（真陽性率；ＴＰＲとも呼ばれる）、特異度（真陰性率；ＴＮＲとも呼ばれる）、陽性予測値（ＰＰＶ、精度とも呼ばれる）、陰性予測値（ＮＰＶ）は、ＴＰＲとＴＮＲ、およびＰＰＶとＮＰＶの幾何平均とともに計算された。感度は、真陽性と陽性の総数の間の比として計算された。同様に、特異度は、真陰性の数と陰性の総数間の比として得られた。陽性予測値（ＰＰＶ；精度とも呼ばれる）および陰性予測値（ＮＰＶ）は、以下の式：
ＰＰＶ＝ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＰ）
ＮＰＶ＝ＴＮ／（ＴＮ＋ＦＮ）
ＴＰは真の陽性数、ＴＮは真の陰性数、ＦＰは偽陽性数、ＦＮは偽陰性数を表す
を用いて計算された。
ＰＰＶ＝ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＰ）
ＮＰＶ＝ＴＮ／（ＴＮ＋ＦＮ）
ＴＰは真の陽性数、ＴＮは真の陰性数、ＦＰは偽陽性数、ＦＮは偽陰性数を表す
を用いて計算された。
【0150】
【表9】
【0151】
ＡＳＣＬ１／ＳＯＸ２シグネチャは、高い感度（８８％）、特異度（１００％）、精度（１００％）および陰性予測値（９５％）を示す。
あるいは、ＤＴＲＥＧ予測モデリングソフトウェアのサポートベクターマシン（ＳＶＭ）モデリングを用いて、バイオマーカーを使用して試料を分類するために使用できるアルゴリズムを開発した。特に、ＫＤＭ１Ａ阻害剤に対する応答性の予測バイオマーカーとしてのＡＳＣＬ１とＳＯＸ２の組み合わせを評価するために、表８の上段に反映された異なるカーネル関数、多項式および放射基底関数（ＲＢＦ）とそれぞれのパラメータ（Ｃ：コストパラメータ；ガンマ：カーネル係数）を有する２つの異なるアルゴリズムを用いた。これらのアルゴリズムによって決定されたスコアおよび閾値（関数）を用いて、細胞株を、示されたように、ＫＤＭ１Ａｉに応答する可能性が高いかまたは応答する可能性が低いものとして分類し、試料を分類するためのＳＶＭモデルの性能を表８の下部に示し、これは、ＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２発現の組み合わせを用いて感受性および耐性を予測するために生成されたＳＶＭモデルについての特異度、感度および混同行列を反映している。
あるいは、ＤＴＲＥＧ予測モデリングソフトウェアのサポートベクターマシン（ＳＶＭ）モデリングを用いて、バイオマーカーを使用して試料を分類するために使用できるアルゴリズムを開発した。特に、ＫＤＭ１Ａ阻害剤に対する応答性の予測バイオマーカーとしてのＡＳＣＬ１とＳＯＸ２の組み合わせを評価するために、表８の上段に反映された異なるカーネル関数、多項式および放射基底関数（ＲＢＦ）とそれぞれのパラメータ（Ｃ：コストパラメータ；ガンマ：カーネル係数）を有する２つの異なるアルゴリズムを用いた。これらのアルゴリズムによって決定されたスコアおよび閾値（関数）を用いて、細胞株を、示されたように、ＫＤＭ１Ａｉに応答する可能性が高いかまたは応答する可能性が低いものとして分類し、試料を分類するためのＳＶＭモデルの性能を表８の下部に示し、これは、ＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２発現の組み合わせを用いて感受性および耐性を予測するために生成されたＳＶＭモデルについての特異度、感度および混同行列を反映している。
【0152】
【表10】
【0153】
このアルゴリズムを使用すると、ＡＳＣＬ１／ＳＯＸ２組み合わせを採用するＳＶＭアルゴリズムは、多項式とＲＢＦフィッティングの両方を使用して高い感度（８８％）と高い特異度（≧９５％）を有する。
【0154】
あるいは、ＤＴＲＥＧ予測モデリングソフトウェアの線形回帰を用いて、表６のデータセット上の選択されたバイオマーカーの組み合わせの関数において、ＫＤＭ１Ａｉに応答する可能性が高いかまたは可能性が低い試料を分類するアルゴリズムを開発した（表９）。このアルゴリズムは、各試料についてのスコアを計算し、各試料についてのスコアを閾値と比較することによって、ＫＤＭ１Ａｉに対する感受性または耐性として細胞株を分類する。ＡＳＣＬ１／ＳＯＸ２バイオマーカーの組み合わせに基づいて作製された線形回帰モデルの性能は、ＫＤＭ１Ａｉに対する感受性を予測する感度が８７．５％であり、特異度が９４．７４％である（表９）。
【0155】
下記の表９は、ＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２発現の組み合わせを用いて感受性および耐性を予測するために生成された線形回帰モデルのパラメータ、特異度、感度および混同行列を示す。Ｃ：Ｃｏｓｔパラメータ、ガンマ：それぞれの関数のカーネル係数。
【0156】
【表11】
【0157】
全体として、ＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２発現レベルを組み合わせた異なる分類アルゴリズム（Ｂｏｏｌｅａｎ統合モデル、ＳＶＭモデルおよび線形モデル）の使用は、この２マーカーシグネチャがＫＤＭ１Ａ阻害剤に対するＳＣＬＣ応答を予測する際に最適な性能を有することを確認する。
【0158】
実施例５．ウエスタンブロット（ＷＢ）および蛍光免疫組織化学（ＩＦ）によるＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２ ｍＲＮＡならびにタンパク質発現レベルの相関
バイオマーカーｍＲＮＡとタンパク質レベルとの相関を試験するために、ＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２は、これらのバイオマーカーの高、中または低／検出不可能な発現のいずれかを有するＳＣＬＣ細胞株、ならびに同じ切片化されたＳＣＬＣ細胞ペレットおよび公知のｍＲＮＡレベルを有するＳＣＬＣ患者由来異種移植片（ＰＤＸ）の蛍光免疫組織化学によってＷＢにより分析された。
バイオマーカーｍＲＮＡとタンパク質レベルとの相関を試験するために、ＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２は、これらのバイオマーカーの高、中または低／検出不可能な発現のいずれかを有するＳＣＬＣ細胞株、ならびに同じ切片化されたＳＣＬＣ細胞ペレットおよび公知のｍＲＮＡレベルを有するＳＣＬＣ患者由来異種移植片（ＰＤＸ）の蛍光免疫組織化学によってＷＢにより分析された。
【0159】
５．１ ＷＢによるＳＣＬＣ細胞株におけるＳＯＸ２およびＡＳＣＬ１分析
ヒト小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）細胞株ＮＣＩ－Ｈ１４６、ＮＣＩ－Ｈ５１０Ａ、ＮＣＩ－Ｈ４４６、ＮＣＩ－Ｈ５２６を、２ｍＭグルタミンと１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）を補足したＲＰＭＩ培地（Ｓｉｇｍａ）中で、湿った雰囲気において３７℃および５％ＣＯ２で増殖させた。５００万個の指数増殖細胞のペレットを生成し、プロテアーゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ）を補足したＲＩＰＡ緩衝液（Ｓｉｇｍａ）中の総タンパク質抽出に使用し、続いて１２％ＰＡＧＥ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中のＷＢによるＡＳＣＬ１（Ａｂｃａｍ、ａｂ２１３１５１）およびＳＯＸ２（Ａｂｃａｍ、ａｂ９７９５９）レベルを決定した。タンパク質をｉＢｌｏｔ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて転写し、二次抗体インキュベーションおよび洗浄後、ＥＣＬ Ｐｒｉｍｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてブロットを発色させ、Ｇ：ＢＯＸ Ｃｈｅｍｉ ＸＲＱ（Ｓｙｎｇｅｎｅ）で撮影した。転写ブロットのポンソーＳ染色を装填対照として用いた。ＷＢシグナルの定量は、Ｉｍａｇｅ Ｊを用いて行った。各ＷＢバンドの積分密度は、ポンソー染色からの対応する全タンパク質積分密度によって正規化し、ＮＣＩ－Ｈ１４６シグナルに対して作製した。
ヒト小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）細胞株ＮＣＩ－Ｈ１４６、ＮＣＩ－Ｈ５１０Ａ、ＮＣＩ－Ｈ４４６、ＮＣＩ－Ｈ５２６を、２ｍＭグルタミンと１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）を補足したＲＰＭＩ培地（Ｓｉｇｍａ）中で、湿った雰囲気において３７℃および５％ＣＯ２で増殖させた。５００万個の指数増殖細胞のペレットを生成し、プロテアーゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ）を補足したＲＩＰＡ緩衝液（Ｓｉｇｍａ）中の総タンパク質抽出に使用し、続いて１２％ＰＡＧＥ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中のＷＢによるＡＳＣＬ１（Ａｂｃａｍ、ａｂ２１３１５１）およびＳＯＸ２（Ａｂｃａｍ、ａｂ９７９５９）レベルを決定した。タンパク質をｉＢｌｏｔ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて転写し、二次抗体インキュベーションおよび洗浄後、ＥＣＬ Ｐｒｉｍｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてブロットを発色させ、Ｇ：ＢＯＸ Ｃｈｅｍｉ ＸＲＱ（Ｓｙｎｇｅｎｅ）で撮影した。転写ブロットのポンソーＳ染色を装填対照として用いた。ＷＢシグナルの定量は、Ｉｍａｇｅ Ｊを用いて行った。各ＷＢバンドの積分密度は、ポンソー染色からの対応する全タンパク質積分密度によって正規化し、ＮＣＩ－Ｈ１４６シグナルに対して作製した。
【0160】
結果
ＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２タンパク質レベルは、ｑＲＴ－ＰＣＲ（実施例３）により決定されたように、これらのバイオマーカーの高、中または低／検出不可能な発現のいずれかを有するＳＣＬＣ細胞株においてＷＢにより分析され、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ（ＣＣＬＥ）（実施例４を参照されたい）からの公衆に利用可能なＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ｍＲＮＡ発現データにより確認された。得られたＷＢを図５Ａに示し、ＮＣＩ－Ｈ１４６、ＮＣＩ－Ｈ５１０Ａ、ＮＣＩ－Ｈ４４６およびＮＣＩ－Ｈ５２６細胞株におけるＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２タンパク質レベルの対応する定量化を図５Ｂに示す。ＮＣＩ－Ｈ４４６ではＡＳＣＬ１が検出されず、ＮＣＩ－Ｈ５２６細胞ではＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のいずれも検出されなかったが、ＮＣＩ－Ｈ１４６細胞ではそれらの発現が最も高く、使用された抗体のｍＲＮＡ発現レベルと特異性の両方が確認されたことから、ＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のＷＢによるタンパク質発現レベルは、それらのそれぞれのｍＲＮＡレベルと相関していた。ＳＯＸ２およびＡＳＣＬ１のタンパク質とｍＲＮＡ（ＣＣＬＥ Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）レベル間の相関をそれぞれ図６Ａおよび６Ｂにプロットした；良好な相関が観察され、Ｒ値はＳＯＸ２では０．８９５７であり、ＡＳＣＬ１では０．９９１０であった。
ＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２タンパク質レベルは、ｑＲＴ－ＰＣＲ（実施例３）により決定されたように、これらのバイオマーカーの高、中または低／検出不可能な発現のいずれかを有するＳＣＬＣ細胞株においてＷＢにより分析され、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ（ＣＣＬＥ）（実施例４を参照されたい）からの公衆に利用可能なＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ｍＲＮＡ発現データにより確認された。得られたＷＢを図５Ａに示し、ＮＣＩ－Ｈ１４６、ＮＣＩ－Ｈ５１０Ａ、ＮＣＩ－Ｈ４４６およびＮＣＩ－Ｈ５２６細胞株におけるＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２タンパク質レベルの対応する定量化を図５Ｂに示す。ＮＣＩ－Ｈ４４６ではＡＳＣＬ１が検出されず、ＮＣＩ－Ｈ５２６細胞ではＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のいずれも検出されなかったが、ＮＣＩ－Ｈ１４６細胞ではそれらの発現が最も高く、使用された抗体のｍＲＮＡ発現レベルと特異性の両方が確認されたことから、ＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のＷＢによるタンパク質発現レベルは、それらのそれぞれのｍＲＮＡレベルと相関していた。ＳＯＸ２およびＡＳＣＬ１のタンパク質とｍＲＮＡ（ＣＣＬＥ Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）レベル間の相関をそれぞれ図６Ａおよび６Ｂにプロットした；良好な相関が観察され、Ｒ値はＳＯＸ２では０．８９５７であり、ＡＳＣＬ１では０．９９１０であった。
【0161】
５．２ ＳＣＬＣ細胞ペレットに対する蛍光免疫組織化学によるＳＯＸ２およびＡＳＣＬ１分析
１０００万個の指数増殖性細胞（ＮＣＩ－Ｈ１４６、ＮＣＩ－Ｈ５１０Ａ、ＮＣＩ－Ｈ４４６およびＮＣＩ－Ｈ５２６）を、１０％ホルマリン（Ｓｉｇｍａ）中で１時間，室温で固定し、１×ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）中で洗浄し、ペレット化し、１．３％アガロース（Ｓｉｇｍａ）中に含め、その後，脱水し、ミクロトーム切断のためにパラフィン中に含めた。スーパーフロストスライド上に５μｍ切片を置き、ＨｉｓｔｏＣｈｏｉｃｅ除去剤（Ｓｉｇｍａ）中で脱パラフィン化し、５分間で２回、減少エタノールシリーズ（２×１００％で５分間、９０％で１分間、７０％で１分間、３０％で１分間、２×流水）を通して水和した。次に、切片は、沸騰ｐＨ６クエン酸緩衝液１×（Ｓｉｇｍａ）中で２０分間、熱誘導抗原回収に供された。室温で２０分間放置した後、スライドをＰＢＳ－Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００ ０．１％（０．１％ＰＢＳ－Ｔｘ）中で洗浄し、０，１％ＰＢＳ－Ｔｘ中の５％ヤギ血清中で１時間、室温にてブロックした。ブロッキング後、過剰な液体を毛細管により紙ティシュで除去し、切片を０．１％ＰＢＳ－Ｔｘ中の１％ヤギ血清の希釈した一次抗体（ＳＯＸ２については１：５００希釈、Ａｂｃａｍ ａｂ ９７９５９；ＡＳＣＬ１については１：１００希釈、Ａｂｃａｍ ａｂ ２１３１５１）とともに、および対応する陰性対照（０．１％ＰＢＳ－Ｔｘ中の１％ヤギ血清のみ）とともに一晩４℃でインキュベートした。０．１％ＰＢＳ－Ｔｘ中で各５分間、３回洗浄した後、スライドをヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６二次抗体（１：１５００希釈、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ａ１１０１０）とともに１時間、室温にて、遮光してインキュベートした。各々５分間の０．１％ＰＢＳ－Ｔｘ中で５回洗浄した後、過剰な液体を毛細管により紙ティシュで除去し、試料をＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）を補足したＦｌｕｏｒｏｓｈｉｅｌｄマウント培地中にマウントした。ＤＡＰＩは４’、６－ジアミジノ－２－フェニルインドールであり、ＤＮＡ中のＡ－Ｔに富む領域に強く結合し、核を染色するために使用される蛍光色素である。ＤＡＰＩ染色核からのシグナルを用いて、核特異的ＳＯＸ２およびＡＳＣＬ１シグナルの共局在を同定および分析した（下記参照）。画像は、接続したＡｘｉｏＣａｍカメラ（Ｚｅｉｓｓ）を用いてＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏ蛍光顕微鏡で撮影された。
１０００万個の指数増殖性細胞（ＮＣＩ－Ｈ１４６、ＮＣＩ－Ｈ５１０Ａ、ＮＣＩ－Ｈ４４６およびＮＣＩ－Ｈ５２６）を、１０％ホルマリン（Ｓｉｇｍａ）中で１時間，室温で固定し、１×ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）中で洗浄し、ペレット化し、１．３％アガロース（Ｓｉｇｍａ）中に含め、その後，脱水し、ミクロトーム切断のためにパラフィン中に含めた。スーパーフロストスライド上に５μｍ切片を置き、ＨｉｓｔｏＣｈｏｉｃｅ除去剤（Ｓｉｇｍａ）中で脱パラフィン化し、５分間で２回、減少エタノールシリーズ（２×１００％で５分間、９０％で１分間、７０％で１分間、３０％で１分間、２×流水）を通して水和した。次に、切片は、沸騰ｐＨ６クエン酸緩衝液１×（Ｓｉｇｍａ）中で２０分間、熱誘導抗原回収に供された。室温で２０分間放置した後、スライドをＰＢＳ－Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００ ０．１％（０．１％ＰＢＳ－Ｔｘ）中で洗浄し、０，１％ＰＢＳ－Ｔｘ中の５％ヤギ血清中で１時間、室温にてブロックした。ブロッキング後、過剰な液体を毛細管により紙ティシュで除去し、切片を０．１％ＰＢＳ－Ｔｘ中の１％ヤギ血清の希釈した一次抗体（ＳＯＸ２については１：５００希釈、Ａｂｃａｍ ａｂ ９７９５９；ＡＳＣＬ１については１：１００希釈、Ａｂｃａｍ ａｂ ２１３１５１）とともに、および対応する陰性対照（０．１％ＰＢＳ－Ｔｘ中の１％ヤギ血清のみ）とともに一晩４℃でインキュベートした。０．１％ＰＢＳ－Ｔｘ中で各５分間、３回洗浄した後、スライドをヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６二次抗体（１：１５００希釈、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ａ１１０１０）とともに１時間、室温にて、遮光してインキュベートした。各々５分間の０．１％ＰＢＳ－Ｔｘ中で５回洗浄した後、過剰な液体を毛細管により紙ティシュで除去し、試料をＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）を補足したＦｌｕｏｒｏｓｈｉｅｌｄマウント培地中にマウントした。ＤＡＰＩは４’、６－ジアミジノ－２－フェニルインドールであり、ＤＮＡ中のＡ－Ｔに富む領域に強く結合し、核を染色するために使用される蛍光色素である。ＤＡＰＩ染色核からのシグナルを用いて、核特異的ＳＯＸ２およびＡＳＣＬ１シグナルの共局在を同定および分析した（下記参照）。画像は、接続したＡｘｉｏＣａｍカメラ（Ｚｅｉｓｓ）を用いてＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏ蛍光顕微鏡で撮影された。
【0162】
ＩＦ強度の定量化
ＩＦ画像を処理し、ｉｍａｇｅＪソフトウェアで定量化した。ＳＯＸ２およびＡＳＣＬ１核特異的シグナルの定量化について、核で覆われた領域を包囲するマスクをＤＡＰＩ染色画像から作製し、次に対応するＩＦ画像に転写し、それにより、積分密度を核のみによって規定される選択された領域で決定した。
ＩＦ画像を処理し、ｉｍａｇｅＪソフトウェアで定量化した。ＳＯＸ２およびＡＳＣＬ１核特異的シグナルの定量化について、核で覆われた領域を包囲するマスクをＤＡＰＩ染色画像から作製し、次に対応するＩＦ画像に転写し、それにより、積分密度を核のみによって規定される選択された領域で決定した。
【0163】
結果
蛍光免疫組織化学において使用するための抗体を検証し、ＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２タンパク質とｍＲＮＡレベルとの間の相関をさらに確認するために、ホルマリン固定されたパラフィン包埋切片化されたＳＣＬＣ細胞ペレット中のこれらのバイオマーカーのレベルを調べるために、ＷＢに使用されるのと同じ抗体を蛍光免疫組織化学において試験した。ＳＯＸ２、ＡＳＣＬ１および陰性対照の蛍光免疫組織化学を図７に示す（図７Ａ－ＳＯＸ２、図７Ｂ－ＡＳＣＬ１、図７Ｃ－二次抗体のみを用いた陰性対照（ＡＦ５４６））。以前に示されたデータと一致して、ＳＯＸ２レベルはＮＣＩ－Ｈ１４６において高く、ＮＣＩ－Ｈ５１０Ａにおいて中程度であり、ＮＣＩ－Ｈ４４６細胞株で低かったが、ＮＣＩ－Ｈ５２６細胞では核特異的発現は検出されなかった。一方、ＡＳＣＬ１レベルはＮＣＩ－Ｈ１４６において高く、ＮＣＩ－Ｈ５１０Ａにおいて中程度であり、ＮＣＩ－Ｈ４４６およびＮＣＩ－Ｈ５２６細胞では認められなかった／検出されなかった。発現は、二次抗体のみ（ＡＦ５４６：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６）の陰性対照では観察されなかった。染色強度に基づいて、以下の染色強度レベルが確立され、以下の実施例において、これから採用される：高レベルは「レベル３」、中レベルは「レベル２」、低レベルは「レベル１」、シグナルの欠如は「レベル０」として定義される。
蛍光免疫組織化学において使用するための抗体を検証し、ＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２タンパク質とｍＲＮＡレベルとの間の相関をさらに確認するために、ホルマリン固定されたパラフィン包埋切片化されたＳＣＬＣ細胞ペレット中のこれらのバイオマーカーのレベルを調べるために、ＷＢに使用されるのと同じ抗体を蛍光免疫組織化学において試験した。ＳＯＸ２、ＡＳＣＬ１および陰性対照の蛍光免疫組織化学を図７に示す（図７Ａ－ＳＯＸ２、図７Ｂ－ＡＳＣＬ１、図７Ｃ－二次抗体のみを用いた陰性対照（ＡＦ５４６））。以前に示されたデータと一致して、ＳＯＸ２レベルはＮＣＩ－Ｈ１４６において高く、ＮＣＩ－Ｈ５１０Ａにおいて中程度であり、ＮＣＩ－Ｈ４４６細胞株で低かったが、ＮＣＩ－Ｈ５２６細胞では核特異的発現は検出されなかった。一方、ＡＳＣＬ１レベルはＮＣＩ－Ｈ１４６において高く、ＮＣＩ－Ｈ５１０Ａにおいて中程度であり、ＮＣＩ－Ｈ４４６およびＮＣＩ－Ｈ５２６細胞では認められなかった／検出されなかった。発現は、二次抗体のみ（ＡＦ５４６：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６）の陰性対照では観察されなかった。染色強度に基づいて、以下の染色強度レベルが確立され、以下の実施例において、これから採用される：高レベルは「レベル３」、中レベルは「レベル２」、低レベルは「レベル１」、シグナルの欠如は「レベル０」として定義される。
【0164】
下記の表１０は、ＮＣＩ－Ｈ１４６、ＮＣＩ－Ｈ５１０Ａ、ＮＣＩ－Ｈ４４６およびＮＣＩ－Ｈ５２６細胞におけるＣＣＬＥ Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘからの対応する強度レベルおよびＲＭＡ値とともに、図７に示される免疫蛍光画像における核バイオマーカーシグナルの定量化を示す。シグナルはバックグラウンド修正され、ＮＣＩ－Ｈ１４６シグナル（１００％に相当する）に対して表された。
【0165】
【表12】
【0166】
核シグナルの定量化は、分析された細胞株について、蛍光免疫組織化学により検出されたＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２タンパク質レベルと、対応するｍＲＮＡレベルとの間に非常に統計的に有意な相関があることを明らかにした（図８Ａ－ＳＯＸ２、および図８Ｂ－ＡＳＣＬ１を参照されたい）。対応するＲ値は、ＳＯＸ２およびＡＳＣＬ１についてそれぞれ０．８７１０および０．９５９４である。
【0167】
上記の実施例５．１および５．２に示されるように、ＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２ ｍＲＮＡとタンパク質レベルとの間に良好な相関関係が得られたことから、ＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２は、それらのｍＲＮＡまたはタンパク質レベルのいずれかを測定する、ＫＤＭ１Ａ阻害に対する応答性の予測バイオマーカーとして用いることができることが確認された。
【0168】
５．３ 患者由来のＳＣＬＣ異種移植片（ＰＤＸ）組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）上の蛍光免疫組織化学によるＳＯＸ２およびＡＳＣＬ１分析
ヒト試料におけるＳＯＸ２とＡＳＣＬ１のｍＲＮＡとタンパク質レベルの間の相関をさらに確認するために、ＳＯＸ２およびＡＳＣＬ１ ＩＦを、利用可能なＳＯＸ２およびＡＳＣＬ１ ＲＮＡＳｅｑデータを有する患者由来のＳＣＬＣ異種移植組織マイクロアレイ上で行った。
ヒト試料におけるＳＯＸ２とＡＳＣＬ１のｍＲＮＡとタンパク質レベルの間の相関をさらに確認するために、ＳＯＸ２およびＡＳＣＬ１ ＩＦを、利用可能なＳＯＸ２およびＡＳＣＬ１ ＲＮＡＳｅｑデータを有する患者由来のＳＣＬＣ異種移植組織マイクロアレイ上で行った。
【0169】
患者由来のＳＣＬＣ異種移植片の４４例を含む組織マイクロアレイの切片は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ（現在のクラウン・バイオサイエンス）およびｈｔｔｐｓ：／／ｏｎｃｏｅｘｐｒｅｓｓ．ｃｒｏｗｎｂｉｏ．ｃｏｍ／ＯｎｃｏＥｘｐｒｅｓｓ／ｉｎｄｅｘ．ａｓｐｘからダウンロードしたそれらの対応する入手可能なＲＮＡＳｅｑデータから購入された。
【0170】
ＴＭＡは、ＨｉｓｔｏＣｈｏｉｃｅ洗浄剤（Ｓｉｇｍａ）で５分間、２回脱パラフィンし、減少エタノールシリーズ（２×１００％で５分間、９０％で１分間、７０％で１分間、３０％で１分間、２×流水）で水和した。次に、切片は、沸騰ｐＨ６クエン酸緩衝液１×（Ｓｉｇｍａ）中で２０分間、熱誘導抗原回収に供された。室温で２０分間放置した後、スライドをＰＢＳ－Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００ ０．１％（０．１％ＰＢＳ－Ｔｘ）中で洗浄し、０，１％ＰＢＳ－Ｔｘ中の５％ヤギ血清中で１時間、室温にてブロックした。ブロッキング後、過剰な液体を毛細管により紙ティシュで除去し、切片を０．１％ＰＢＳ－Ｔｘ中の１％ヤギ血清の希釈した一次抗体（ＳＯＸ２については１：５００希釈、Ａｂｃａｍ ａｂ ９７９５９；ＡＳＣＬ１については１：１００希釈、Ａｂｃａｍ ａｂ ２１３１５１）とともに、および対応する陰性対照（０．１％ＰＢＳ－Ｔｘ中の１％ヤギ血清のみ）とともに一晩４℃でインキュベートした。０．１％ＰＢＳ－Ｔｘ中で各５分間、３回洗浄した後、スライドをヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６二次抗体（１：１５００希釈、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ａ１１０１０）とともに１時間、室温にて、遮光してインキュベートした。各々５分間の０．１％ＰＢＳ－Ｔｘ中で５回洗浄した後、過剰な液体を毛細管により紙ティシュで除去し、試料をＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）を補足したＦｌｕｏｒｏｓｈｉｅｌｄマウント培地中にマウントした。画像は、接続したＡｘｉｏＣａｍカメラ（Ｚｅｉｓｓ）を用いてＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏ蛍光顕微鏡で撮影された。
【0171】
ＰＤＸ ＩＦ強度の分類
ＩＦ染色はＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏ蛍光顕微鏡を用いて分析され、腫瘍領域は核形態学によって定義された。腫瘍領域内の核特異的シグナル強度は、実施例５．２に記載されるように、４つのレベルに視覚的に分類された：
レベル 強度
３ 高
２ 中
１ 低
０ なし
ＳＣＬＣ細胞ペレットおよびそれらに対応する公知のｍＲＮＡ発現に関して行われた蛍光免疫組織化学において得られた強度に基づいて（実施例５．２）、ＡＳＣＬ１とＳＯＸ２の両方について１の個々のバイオマーカー閾値を超える発現レベル（すなわち、中～高発現レベル２および３）を有する試料、または代替的に処方された、閾値を超える（＞０）（すなわち、個々のバイオマーカーについての両方の条件を同時に満たす）ＡＳＣＬ１／ＳＯＸ２ Ｂｏｏｌｅａｎ統合スコアを有する試料は、ＫＤＭ１Ａｉに応答する可能性が高い患者に由来するものとして分類された。図９では、スコアが閾値を超えている試料は「陽性」と示され、閾値を超えていない試料は「陰性」と示される。
ＩＦ染色はＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏ蛍光顕微鏡を用いて分析され、腫瘍領域は核形態学によって定義された。腫瘍領域内の核特異的シグナル強度は、実施例５．２に記載されるように、４つのレベルに視覚的に分類された：
レベル 強度
３ 高
２ 中
１ 低
０ なし
ＳＣＬＣ細胞ペレットおよびそれらに対応する公知のｍＲＮＡ発現に関して行われた蛍光免疫組織化学において得られた強度に基づいて（実施例５．２）、ＡＳＣＬ１とＳＯＸ２の両方について１の個々のバイオマーカー閾値を超える発現レベル（すなわち、中～高発現レベル２および３）を有する試料、または代替的に処方された、閾値を超える（＞０）（すなわち、個々のバイオマーカーについての両方の条件を同時に満たす）ＡＳＣＬ１／ＳＯＸ２ Ｂｏｏｌｅａｎ統合スコアを有する試料は、ＫＤＭ１Ａｉに応答する可能性が高い患者に由来するものとして分類された。図９では、スコアが閾値を超えている試料は「陽性」と示され、閾値を超えていない試料は「陰性」と示される。
【0172】
統計
ＳＯＸ２およびＡＳＣＬ１のＲＮＡＳｅｑ（Ｌｏｇ２ＦＰＫＭ）およびＩＦ（視覚スコア）データセット間の９５％信頼区間を有する両側スピアマン相関検定をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて行った。
ＳＯＸ２およびＡＳＣＬ１のＲＮＡＳｅｑ（Ｌｏｇ２ＦＰＫＭ）およびＩＦ（視覚スコア）データセット間の９５％信頼区間を有する両側スピアマン相関検定をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて行った。
【0173】
結果
ＳＯＸ２およびＡＳＣＬ１ ＩＦは、利用可能なＳＯＸ２およびＡＳＣＬ１ ＲＮＡＳｅｑデータを用いて、患者由来ＳＣＬＣ異種移植組織マイクロアレイ上で行われた。すべての試料を蛍光顕微鏡で視覚的に分析し、上記で説明したように、腫瘍領域内で観察された核シグナルに従って、核形態によって定義された腫瘍領域および与えられた強度レベルを分析した。ＳＣＬＣ ＰＤＸ ＴＭＡからの代表的なＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２染色を各染色強度分類レベルについて図９に示す。
ＳＯＸ２およびＡＳＣＬ１ ＩＦは、利用可能なＳＯＸ２およびＡＳＣＬ１ ＲＮＡＳｅｑデータを用いて、患者由来ＳＣＬＣ異種移植組織マイクロアレイ上で行われた。すべての試料を蛍光顕微鏡で視覚的に分析し、上記で説明したように、腫瘍領域内で観察された核シグナルに従って、核形態によって定義された腫瘍領域および与えられた強度レベルを分析した。ＳＣＬＣ ＰＤＸ ＴＭＡからの代表的なＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２染色を各染色強度分類レベルについて図９に示す。
【0174】
２つの連続したＳＣＬＣ ＰＤＸ ＴＭＡ切片（それぞれ、Ｎ＝３５およびＮ＝４３）の２つの独立した染色では、ＩＦ視覚スコアおよびＲＮＡＳｅｑデータは非常に統計的に有意な（Ｐ＜０．０００１）相関を示し、ＳＯＸ２ではＳｐｅａｒｍａｎ ｒ値が０．７５３５および０．７６５９（図１０Ａおよび１０Ｂ）、ＡＳＣＬ１では０．８８０３および０．８９８９（図１０Ｃおよび１０Ｄ）であった。
【0175】
上記の結果は、ＳＯＸ２およびＡＳＣＬ１タンパク質ならびにｍＲＮＡレベルが患者由来の試料においても相関しており、したがって、ＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２は、それらのｍＲＮＡまたはタンパク質レベルのいずれかを測定する、ＫＤＭ１Ａ阻害に対する応答性の予測バイオマーカーとして、ヒト試料において使用することができることを確認する。
【0176】
実施例６：ＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２はエキソソーム中に検出することができる
エキソソームは、それらの内容物において、親細胞のプロテアソーム、ゲノムおよびトランスクリプトームを反映する体液中に存在する微小胞である。したがって、エキソソームは、定量的なバイオマーカー検出のための優れた低侵襲性ツールを構成する。したがって、本発明者らは、ＫＤＭ１Ａ阻害剤、ＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２に対する応答性の予測バイオマーカーの検出が、エキソソーム含有試料を採用する方法において適切であるかどうかを試験した。
エキソソームは、それらの内容物において、親細胞のプロテアソーム、ゲノムおよびトランスクリプトームを反映する体液中に存在する微小胞である。したがって、エキソソームは、定量的なバイオマーカー検出のための優れた低侵襲性ツールを構成する。したがって、本発明者らは、ＫＤＭ１Ａ阻害剤、ＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２に対する応答性の予測バイオマーカーの検出が、エキソソーム含有試料を採用する方法において適切であるかどうかを試験した。
【0177】
エキソソームは、ＳＣＬＣ細胞株からの沈殿により単離され、ＳＯＸ２およびＡＳＣＬ１タンパク質レベルはＷＢにより決定された。
エキソソームにおけるＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２検出
２，０００万個のＮＣＩ－Ｈ１４６、ＮＣＩ－Ｈ５１０Ａ、ＮＣＩ－Ｈ４４６およびＮＣＩ－Ｈ５２６ ＳＣＬＣ細胞を、２ｍＭグルタミン（Ｓｉｇｍａ）および１０％エキソソーム不含ＦＢＳ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を補足した２０ｍｌ ＲＰＭＩ培地（Ｓｉｇｍａ）中に播種し、湿った雰囲気において３７℃および５％ＣＯ２でＴ７５フラスコ中でインキュベートした。４８時間後、十分に再懸濁させた細胞１５ｍｌを２，０００×ｇで３０分間室温で遠心し、上清を清浄なチューブに移し、細胞ペレットを－２０℃に保持した。１０ｍｌの清浄培地を用いて、製造業者の指示に正確に従って総エキソソーム単離試薬（細胞培養培地から）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によりエキソソームを沈殿させた。次に、エキソソームペレットを、ＷＢ用に８０μｌの１×ＳＤＳ装填緩衝液中に、またはタンパク質抽出用にプロテアーゼインヒビターを補足した４０μｌのＲＩＰＡ緩衝液（Ｓｉｇｍａ）中のいずれかに再懸濁した。定量後、２体積のＲＩＰＡ抽出物を１体積の３×ＳＤＳ装填緩衝液と混合し、９５℃で加熱し、ＷＢで使用するまで－２０℃に保持した。
エキソソームにおけるＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２検出
２，０００万個のＮＣＩ－Ｈ１４６、ＮＣＩ－Ｈ５１０Ａ、ＮＣＩ－Ｈ４４６およびＮＣＩ－Ｈ５２６ ＳＣＬＣ細胞を、２ｍＭグルタミン（Ｓｉｇｍａ）および１０％エキソソーム不含ＦＢＳ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を補足した２０ｍｌ ＲＰＭＩ培地（Ｓｉｇｍａ）中に播種し、湿った雰囲気において３７℃および５％ＣＯ２でＴ７５フラスコ中でインキュベートした。４８時間後、十分に再懸濁させた細胞１５ｍｌを２，０００×ｇで３０分間室温で遠心し、上清を清浄なチューブに移し、細胞ペレットを－２０℃に保持した。１０ｍｌの清浄培地を用いて、製造業者の指示に正確に従って総エキソソーム単離試薬（細胞培養培地から）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によりエキソソームを沈殿させた。次に、エキソソームペレットを、ＷＢ用に８０μｌの１×ＳＤＳ装填緩衝液中に、またはタンパク質抽出用にプロテアーゼインヒビターを補足した４０μｌのＲＩＰＡ緩衝液（Ｓｉｇｍａ）中のいずれかに再懸濁した。定量後、２体積のＲＩＰＡ抽出物を１体積の３×ＳＤＳ装填緩衝液と混合し、９５℃で加熱し、ＷＢで使用するまで－２０℃に保持した。
【0178】
エキソソーム単離法は、５μＭのエキソソーム放出阻害剤ＧＷ４８６９（ＳｅｌｌｅｃｋＣｈｅｍ）またはビヒクルの存在下で、上記の条件下でＮＣＩ－Ｈ５１０Ａ細胞を増殖させ、および総エキソソーム単離試薬（細胞培養培地から）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で単離したエキソソームを用いて、製造業者の指示に従って正確に検証した。
【0179】
－２０℃に保持した細胞ペレットを、プロテアーゼインヒビダーを補足したＲＩＰＡ緩衝液（Ｓｉｇｍａ）中でタンパク質抽出に使用した。タンパク質アッセイ色素試薬（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いたタンパク質の定量後、１×ＳＤＳ装填緩衝液中で９５℃で予め加熱した７μｇの総タンパク質を、ＡＳＣＬ１（Ａｂｃａｍ、ａｂ２１３１５１）、ＳＯＸ２（Ａｂｃａｍ、ａｂ９７９５９）および肺がんエキソソーム特異的ＣＤ１５１マーカー（Ａｂｃａｍ、ａｂ３３１５）抗体を用いて、１５μｌのエキソソームタンパク質抽出物とともに１２％ＰＡＧＥ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）におけるＷＢ用に使用した。ブロットをＥＣＬ Ｐｒｉｍｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で発色し、Ｇ：ＢＯＸ Ｃｈｅｍｉ ＸＲＱ（Ｓｙｎｇｅｎｅ）で撮影した。転写されたブロットのポンソーＳ染色を装填対照として用いた。
【0180】
結果
エキソソームにおけるＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２検出の可能性を調べるために、ＮＣＩ－Ｈ１４６、ＮＣＩ－Ｈ５１０Ａ、ＮＣＩ－Ｈ４４６およびＮＣＩ－Ｈ５２６ ＳＣＬＣ細胞からの微小胞画分を沈殿により単離し、ＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２タンパク質レベルを実施例５．１に記載される方法を用いてＷＢにより分析した。得られた結果を図１１に示し、ＡＳＣＬ１とＳＯＸ２の両方がエキソソームにおいて検出され得、それらの発現が親細胞における発現と一致することを実証する（図５を参照されたい）。ＡＳＣＬ１はＮＣＩ－Ｈ４４６由来エキソソームでもＮＣＩ－Ｈ５２６由来エキソソームでも検出されなかったが（図１１を参照されたい）、ＮＣＩ－Ｈ１４６細胞およびＮＣＩ－Ｈ５１０Ａ細胞において高度に検出された。その代わり、ＳＯＸ２はＮＣＩ－Ｈ５２６由来のエキソソームでは検出されず（図１１）、図５において報告されたＳＯＸ２の発現とも一致していた。
エキソソームにおけるＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２検出の可能性を調べるために、ＮＣＩ－Ｈ１４６、ＮＣＩ－Ｈ５１０Ａ、ＮＣＩ－Ｈ４４６およびＮＣＩ－Ｈ５２６ ＳＣＬＣ細胞からの微小胞画分を沈殿により単離し、ＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２タンパク質レベルを実施例５．１に記載される方法を用いてＷＢにより分析した。得られた結果を図１１に示し、ＡＳＣＬ１とＳＯＸ２の両方がエキソソームにおいて検出され得、それらの発現が親細胞における発現と一致することを実証する（図５を参照されたい）。ＡＳＣＬ１はＮＣＩ－Ｈ４４６由来エキソソームでもＮＣＩ－Ｈ５２６由来エキソソームでも検出されなかったが（図１１を参照されたい）、ＮＣＩ－Ｈ１４６細胞およびＮＣＩ－Ｈ５１０Ａ細胞において高度に検出された。その代わり、ＳＯＸ２はＮＣＩ－Ｈ５２６由来のエキソソームでは検出されず（図１１）、図５において報告されたＳＯＸ２の発現とも一致していた。
【0181】
さらに、ＡＳＣＬ１、ＳＯＸ２および肺がん特異的エキソソームマーカーＣＤ１５１シグナルは、５μＭのＧＷ４８６９（エキソソーム放出阻害剤）で処理したＮＣＩ－Ｈ５１０Ａ細胞のエキソソーム画分において、ビヒクルと比較して有意に低減または除去されたが、一方、親細胞におけるこれらのタンパク質の発現は変化しなかった（図１２）。したがって、これらの結果は、エキソソーム由来のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２シグナルが、沈殿によって得られたこの微小胞画分に特異的であることを示し、採用したエキソソーム単離法を検証する。
【0182】
全体として、この実施例６の結果は、本発明の予測バイオマーカーであるＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のタンパク質レベルの測定が、出発物質／試料としてエキソソームを用いてＫＤＭ１Ａ阻害剤に対する応答性を決定するために行うことができることを確認する。
【0183】
本発明は、以下のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を指す：
本明細書に提供される配列は、ＮＣＢＩデータベースで入手可能であり、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ？ｄｂ＝ｇｅｎｅから検索することができる；これらの配列はまた、注釈付き配列および修飾配列に関連する。本発明はまた、相同な配列、および本明細書に提供される簡潔な配列の変異体が使用される技術および方法を提供する。好ましくは、このような「変異体」は、遺伝的変異体、例えばスプライス変異体である。
本明細書に提供される配列は、ＮＣＢＩデータベースで入手可能であり、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ？ｄｂ＝ｇｅｎｅから検索することができる；これらの配列はまた、注釈付き配列および修飾配列に関連する。本発明はまた、相同な配列、および本明細書に提供される簡潔な配列の変異体が使用される技術および方法を提供する。好ましくは、このような「変異体」は、遺伝的変異体、例えばスプライス変異体である。
【0184】
ヒトＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の例示的なアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、本明細書中の以下の配列番号１～４に示される。実施例の一部において調節遺伝子として使用されるヒトＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ）の例示的なヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、配列番号５および６に示される。
【0185】
配列番号１：Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ａｃｈａｅｔｅ－ＳｃｕｔｅファミリーｂＨＬＨ転写因子１（ＡＳＣＬ１）、ｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列
ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００４３１６．３。コード領域は、ヌクレオチド５７２からヌクレオチド１２８２の範囲（太字で強調される）である。ｍＲＮＡは、「ｔ」（チミジン）残基が「ウラシル」（ｕ）残基で置換されることを除いて、下記の配列に対応する（すなわち、その配列と同一である）ことが理解される。
起源
1 agcactctct cacttctggc cagggaacgt ggaaggcgca ccgacaggga tccggccagg
61 gagggcgagt gaaagaagga aatcagaaag gaagggagtt aacaaaataa taaaaacagc
121 ctgagccacg gctggagaga ccgagacccg gcgcaagaga gcgcagcctt agtaggagag
181 gaacgcgaga cgcggcagag cgcgttcagc actgactttt gctgctgctt ctgctttttt
241 ttttcttaga aacaagaagg cgccagcggc agcctcacac gcgagcgcca cgcgaggctc
301 ccgaagccaa cccgcgaagg gaggagggga gggaggagga ggcggcgtgc agggaggaga
361 aaaagcattt tcactttttt tgctcccact ctaagaagtc tcccggggat tttgtatata
421 ttttttaact tccgtcaggg ctcccgcttc atatttcctt ttctttccct ctctgttcct
481 gcacccaagt tctctctgtg tccccctcgc gggccccgca cctcgcgtcc cggatcgctc
541 tgattccgcg actccttggc cgccgctgcg catggaaagc tctgccaaga tggagagcgg
601 cggcgccggc cagcagcccc agccgcagcc ccagcagccc ttcctgccgc ccgcagcctg
661 tttctttgcc acggccgcag ccgcggcggc cgcagccgcc gcagcggcag cgcagagcgc
721 gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcaggcg ccgcagctga gaccggcggc
781 cgacggccag ccctcagggg gcggtcacaa gtcagcgccc aagcaagtca agcgacagcg
841 ctcgtcttcg cccgaactga tgcgctgcaa acgccggctc aacttcagcg gctttggcta
901 cagcctgccg cagcagcagc cggccgccgt ggcgcgccgc aacgagcgcg agcgcaaccg
961 cgtcaagttg gtcaacctgg gctttgccac ccttcgggag cacgtcccca acggcgcggc
1021 caacaagaag atgagtaagg tggagacact gcgctcggcg gtcgagtaca tccgcgcgct
1081 gcagcagctg ctggacgagc atgacgcggt gagcgccgcc ttccaggcag gcgtcctgtc
1141 gcccaccatc tcccccaact actccaacga cttgaactcc atggccggct cgccggtctc
1201 atcctactcg tcggacgagg gctcttacga cccgctcagc cccgaggagc aggagcttct
1261 cgacttcacc aactggttct gaggggctcg gcctggtcag gccctggtgc gaatggactt
1321 tggaagcagg gtgatcgcac aacctgcatc tttagtgctt tcttgtcagt ggcgttggga
1381 gggggagaaa aggaaaagaa aaaaaaaaga agaagaagaa gaaaagagaa gaagaaaaaa
1441 acgaaaacag tcaaccaacc ccatcgccaa ctaagcgagg catgcctgag agacatggct
1501 ttcagaaaac gggaagcgct cagaacagta tctttgcact ccaatcattc acggagatat
1561 gaagagcaac tgggacctga gtcaatgcgc aaaatgcagc ttgtgtgcaa aagcagtggg
1621 ctcctggcag aagggagcag cacacgcgtt atagtaactc ccatcacctc taacacgcac
1681 agctgaaagt tcttgctcgg gtcccttcac ctcctcgccc tttcttaaag tgcagttctt
1741 agccctctag aaacgagttg gtgtctttcg tctcagtagc ccccacccca ataagctgta
1801 gacattggtt tacagtgaaa ctatgctatt ctcagccctt tgaaactctg cttctcctcc
1861 agggcccgat tcccaaaccc catggcttcc ctcacactgt cttttctacc attttcatta
1921 tagaatgctt ccaatctttt gtgaattttt tattataaaa aatctatttg tatctatcct
1981 aaccagttcg gggatatatt aagatatttt tgtacataag agagaaagag agagaaaaat
2041 ttatagaagt tttgtacaaa tggtttaaaa tgtgtatatc ttgatacttt aacatgtaat
2101 gctattacct ctgcatattt tagatgtgta gttcacctta caactgcaat tttccctatg
2161 tggttttgta aagaactctc ctcataggtg agatcaagag gccaccagtt gtacttcagc
2221 accaatgtgt cttactttat agaaatgttg ttaatgtatt aatgatgtta ttaaatactg
2281 ttcaagaaga acaaagttta tgcagctact gtccaaactc aaagtggcag ccagttggtt
2341 ttgataggtt gccttttgga gatttctatt actgcctttt tttttcttac tgttttatta
2401 caaacttaca aaaatatgta taaccctgtt ttatacaaac tagtttcgta ataaaacttt
2461 ttcctttttt taaaatgaaa ataaaaaaaa//
配列番号２：Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ａｃｈａｅｔｅ－ＳｃｕｔｅファミリーｂＨＬＨ転写因子１（ＡＳＣＬ１）タンパク質のアミノ酸配列
ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：ＡＳＣＬ１＿ＨＵＭＡＮ、Ｐ５０５５３
MESSAKMESGGAGQQPQPQPQQPFLPPAACFFATAAAAAAAAAAAAAQSAQQQQQQQQQQ
QQAPQLRPAADGQPSGGGHKSAPKQVKRQRSSSPELMRCKRRLNFSGFGYSLPQQQPAAV
ARRNERERNRVKLVNLGFATLREHVPNGAANKKMSKVETLRSAVEYIRALQQLLDEHDAV
SAAFQAGVLSPTISPNYSNDLNSMAGSPVSSYSSDEGSYDPLSPEEQELLDFTNWF
配列番号３：Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＳＲＹボックス２（ＳＯＸ２）、ｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列
ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０００３１０６．３。コード領域はヌクレオチド４３８からヌクレオチド１３９１の範囲（太字で強調される）である。ｍＲＮＡは、「ｔ」（チミジン）残基が「ウラシル」（ｕ）残基で置換されることを除いて、下記の配列に対応する（すなわち、その配列と同一である）ことが理解される。
起源
1 ggatggttgt ctattaactt gttcaaaaaa gtatcaggag ttgtcaaggc agagaagaga
61 gtgtttgcaa aagggggaaa gtagtttgct gcctctttaa gactaggact gagagaaaga
121 agaggagaga gaaagaaagg gagagaagtt tgagccccag gcttaagcct ttccaaaaaa
181 taataataac aatcatcggc ggcggcagga tcggccagag gaggagggaa gcgctttttt
241 tgatcctgat tccagtttgc ctctctcttt ttttccccca aattattctt cgcctgattt
301 tcctcgcgga gccctgcgct cccgacaccc ccgcccgcct cccctcctcc tctccccccg
361 cccgcgggcc ccccaaagtc ccggccgggc cgagggtcgg cggccgccgg cgggccgggc
421 ccgcgcacag cgcccgcatg tacaacatga tggagacgga gctgaagccg ccgggcccgc
481 agcaaacttc ggggggcggc ggcggcaact ccaccgcggc ggcggccggc ggcaaccaga
541 aaaacagccc ggaccgcgtc aagcggccca tgaatgcctt catggtgtgg tcccgcgggc
601 agcggcgcaa gatggcccag gagaacccca agatgcacaa ctcggagatc agcaagcgcc
661 tgggcgccga gtggaaactt ttgtcggaga cggagaagcg gccgttcatc gacgaggcta
721 agcggctgcg agcgctgcac atgaaggagc acccggatta taaataccgg ccccggcgga
781 aaaccaagac gctcatgaag aaggataagt acacgctgcc cggcgggctg ctggcccccg
841 gcggcaatag catggcgagc ggggtcgggg tgggcgccgg cctgggcgcg ggcgtgaacc
901 agcgcatgga cagttacgcg cacatgaacg gctggagcaa cggcagctac agcatgatgc
961 aggaccagct gggctacccg cagcacccgg gcctcaatgc gcacggcgca gcgcagatgc
1021 agcccatgca ccgctacgac gtgagcgccc tgcagtacaa ctccatgacc agctcgcaga
1081 cctacatgaa cggctcgccc acctacagca tgtcctactc gcagcagggc acccctggca
1141 tggctcttgg ctccatgggt tcggtggtca agtccgaggc cagctccagc ccccctgtgg
1201 ttacctcttc ctcccactcc agggcgccct gccaggccgg ggacctccgg gacatgatca
1261 gcatgtatct ccccggcgcc gaggtgccgg aacccgccgc ccccagcaga cttcacatgt
1321 cccagcacta ccagagcggc ccggtgcccg gcacggccat taacggcaca ctgcccctct
1381 cacacatgtg agggccggac agcgaactgg aggggggaga aattttcaaa gaaaaacgag
1441 ggaaatggga ggggtgcaaa agaggagagt aagaaacagc atggagaaaa cccggtacgc
1501 tcaaaaagaa aaaggaaaaa aaaaaatccc atcacccaca gcaaatgaca gctgcaaaag
1561 agaacaccaa tcccatccac actcacgcaa aaaccgcgat gccgacaaga aaacttttat
1621 gagagagatc ctggacttct ttttggggga ctatttttgt acagagaaaa cctggggagg
1681 gtggggaggg cgggggaatg gaccttgtat agatctggag gaaagaaagc tacgaaaaac
1741 tttttaaaag ttctagtggt acggtaggag ctttgcagga agtttgcaaa agtctttacc
1801 aataatattt agagctagtc tccaagcgac gaaaaaaatg ttttaatatt tgcaagcaac
1861 ttttgtacag tatttatcga gataaacatg gcaatcaaaa tgtccattgt ttataagctg
1921 agaatttgcc aatatttttc aaggagaggc ttcttgctga attttgattc tgcagctgaa
1981 atttaggaca gttgcaaacg tgaaaagaag aaaattattc aaatttggac attttaattg
2041 tttaaaaatt gtacaaaagg aaaaaattag aataagtact ggcgaaccat ctctgtggtc
2101 ttgtttaaaa agggcaaaag ttttagactg tactaaattt tataacttac tgttaaaagc
2161 aaaaatggcc atgcaggttg acaccgttgg taatttataa tagcttttgt tcgatcccaa
2221 ctttccattt tgttcagata aaaaaaacca tgaaattact gtgtttgaaa tattttctta
2281 tggtttgtaa tatttctgta aatttattgt gatattttaa ggttttcccc cctttatttt
2341 ccgtagttgt attttaaaag attcggctct gtattatttg aatcagtctg ccgagaatcc
2401 atgtatatat ttgaactaat atcatcctta taacaggtac attttcaact taagttttta
2461 ctccattatg cacagtttga gataaataaa tttttgaaat atggacactg aaaaaaaaaa//
配列番号４：Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＳＲＹ－ボックス２（ＳＯＸ２）タンパク質のアミノ酸配列
ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：ＳＯＸ２＿ＨＵＭＡＮ、Ｐ４８４３１
MYNMMETELKPPGPQQTSGGGGGNSTAAAAGGNQKNSPDRVKRPMNAFMVWSRGQRRKMA
QENPKMHNSEISKRLGAEWKLLSETEKRPFIDEAKRLRALHMKEHPDYKYRPRRKTKTLM
KKDKYTLPGGLLAPGGNSMASGVGVGAGLGAGVNQRMDSYAHMNGWSNGSYSMMQDQLGY
PQHPGLNAHGAAQMQPMHRYDVSALQYNSMTSSQTYMNGSPTYSMSYSQQGTPGMALGSM
GSVVKSEASSSPPVVTSSSHSRAPCQAGDLRDMISMYLPGAEVPEPAAPSRLHMSQHYQS
GPVPGTAINGTLPLSHM
配列番号５：Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、ｍＲＮＡ
ＮＣＢＩ参考配列：ＮＭ＿００２０４６．６。コード領域は、ヌクレオチド７７からヌクレオチド１０８４（太字で強調される）の範囲である。ｍＲＮＡは、「ｔ」（チミジン）残基が「ウラシル」（ｕ）残基で置換されることを除いて、下記の配列に対応する（すなわち、その配列と同一である）ことが理解される。
起源
1 gctctctgct cctcctgttc gacagtcagc cgcatcttct tttgcgtcgc cagccgagcc
61 acatcgctca gacaccatgg ggaaggtgaa ggtcggagtc aacggatttg gtcgtattgg
121 gcgcctggtc accagggctg cttttaactc tggtaaagtg gatattgttg ccatcaatga
181 ccccttcatt gacctcaact acatggttta catgttccaa tatgattcca cccatggcaa
241 attccatggc accgtcaagg ctgagaacgg gaagcttgtc atcaatggaa atcccatcac
301 catcttccag gagcgagatc cctccaaaat caagtggggc gatgctggcg ctgagtacgt
361 cgtggagtcc actggcgtct tcaccaccat ggagaaggct ggggctcatt tgcagggggg
421 agccaaaagg gtcatcatct ctgccccctc tgctgatgcc cccatgttcg tcatgggtgt
481 gaaccatgag aagtatgaca acagcctcaa gatcatcagc aatgcctcct gcaccaccaa
541 ctgcttagca cccctggcca aggtcatcca tgacaacttt ggtatcgtgg aaggactcat
601 gaccacagtc catgccatca ctgccaccca gaagactgtg gatggcccct ccgggaaact
661 gtggcgtgat ggccgcgggg ctctccagaa catcatccct gcctctactg gcgctgccaa
721 ggctgtgggc aaggtcatcc ctgagctgaa cgggaagctc actggcatgg ccttccgtgt
781 ccccactgcc aacgtgtcag tggtggacct gacctgccgt ctagaaaaac ctgccaaata
841 tgatgacatc aagaaggtgg tgaagcaggc gtcggagggc cccctcaagg gcatcctggg
901 ctacactgag caccaggtgg tctcctctga cttcaacagc gacacccact cctccacctt
961 tgacgctggg gctggcattg ccctcaacga ccactttgtc aagctcattt cctggtatga
1021 caacgaattt ggctacagca acagggtggt ggacctcatg gcccacatgg cctccaagga
1081 gtaagacccc tggaccacca gccccagcaa gagcacaaga ggaagagaga gaccctcact
1141 gctggggagt ccctgccaca ctcagtcccc caccacactg aatctcccct cctcacagtt
1201 gccatgtaga ccccttgaag aggggagggg cctagggagc cgcaccttgt catgtaccat
1261 caataaagta ccctgtgctc aaccagttaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa//
配列番号６：Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、タンパク質のアミノ酸配列 ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｇ３Ｐ＿ＨＵＭＡＮ、Ｐ０４４０６
MGKVKVGVNGFGRIGRLVTRAAFNSGKVDIVAINDPFIDLNYMVYMFQYDSTHGKFHGTV
KAENGKLVINGNPITIFQERDPSKIKWGDAGAEYVVESTGVFTTMEKAGAHLQGGAKRVI
ISAPSADAPMFVMGVNHEKYDNSLKIISNASCTTNCLAPLAKVIHDNFGIVEGLMTTVHA
ITATQKTVDGPSGKLWRDGRGALQNIIPASTGAAKAVGKVIPELNGKLTGMAFRVPTANV
SVVDLTCRLEKPAKYDDIKKVVKQASEGPLKGILGYTEHQVVSSDFNSDTHSSTFDAGAG
IALNDHFVKLISWYDNEFGYSNRVVDLMAHMASKE
ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００４３１６．３。コード領域は、ヌクレオチド５７２からヌクレオチド１２８２の範囲（太字で強調される）である。ｍＲＮＡは、「ｔ」（チミジン）残基が「ウラシル」（ｕ）残基で置換されることを除いて、下記の配列に対応する（すなわち、その配列と同一である）ことが理解される。
起源
1 agcactctct cacttctggc cagggaacgt ggaaggcgca ccgacaggga tccggccagg
61 gagggcgagt gaaagaagga aatcagaaag gaagggagtt aacaaaataa taaaaacagc
121 ctgagccacg gctggagaga ccgagacccg gcgcaagaga gcgcagcctt agtaggagag
181 gaacgcgaga cgcggcagag cgcgttcagc actgactttt gctgctgctt ctgctttttt
241 ttttcttaga aacaagaagg cgccagcggc agcctcacac gcgagcgcca cgcgaggctc
301 ccgaagccaa cccgcgaagg gaggagggga gggaggagga ggcggcgtgc agggaggaga
361 aaaagcattt tcactttttt tgctcccact ctaagaagtc tcccggggat tttgtatata
421 ttttttaact tccgtcaggg ctcccgcttc atatttcctt ttctttccct ctctgttcct
481 gcacccaagt tctctctgtg tccccctcgc gggccccgca cctcgcgtcc cggatcgctc
541 tgattccgcg actccttggc cgccgctgcg catggaaagc tctgccaaga tggagagcgg
601 cggcgccggc cagcagcccc agccgcagcc ccagcagccc ttcctgccgc ccgcagcctg
661 tttctttgcc acggccgcag ccgcggcggc cgcagccgcc gcagcggcag cgcagagcgc
721 gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcaggcg ccgcagctga gaccggcggc
781 cgacggccag ccctcagggg gcggtcacaa gtcagcgccc aagcaagtca agcgacagcg
841 ctcgtcttcg cccgaactga tgcgctgcaa acgccggctc aacttcagcg gctttggcta
901 cagcctgccg cagcagcagc cggccgccgt ggcgcgccgc aacgagcgcg agcgcaaccg
961 cgtcaagttg gtcaacctgg gctttgccac ccttcgggag cacgtcccca acggcgcggc
1021 caacaagaag atgagtaagg tggagacact gcgctcggcg gtcgagtaca tccgcgcgct
1081 gcagcagctg ctggacgagc atgacgcggt gagcgccgcc ttccaggcag gcgtcctgtc
1141 gcccaccatc tcccccaact actccaacga cttgaactcc atggccggct cgccggtctc
1201 atcctactcg tcggacgagg gctcttacga cccgctcagc cccgaggagc aggagcttct
1261 cgacttcacc aactggttct gaggggctcg gcctggtcag gccctggtgc gaatggactt
1321 tggaagcagg gtgatcgcac aacctgcatc tttagtgctt tcttgtcagt ggcgttggga
1381 gggggagaaa aggaaaagaa aaaaaaaaga agaagaagaa gaaaagagaa gaagaaaaaa
1441 acgaaaacag tcaaccaacc ccatcgccaa ctaagcgagg catgcctgag agacatggct
1501 ttcagaaaac gggaagcgct cagaacagta tctttgcact ccaatcattc acggagatat
1561 gaagagcaac tgggacctga gtcaatgcgc aaaatgcagc ttgtgtgcaa aagcagtggg
1621 ctcctggcag aagggagcag cacacgcgtt atagtaactc ccatcacctc taacacgcac
1681 agctgaaagt tcttgctcgg gtcccttcac ctcctcgccc tttcttaaag tgcagttctt
1741 agccctctag aaacgagttg gtgtctttcg tctcagtagc ccccacccca ataagctgta
1801 gacattggtt tacagtgaaa ctatgctatt ctcagccctt tgaaactctg cttctcctcc
1861 agggcccgat tcccaaaccc catggcttcc ctcacactgt cttttctacc attttcatta
1921 tagaatgctt ccaatctttt gtgaattttt tattataaaa aatctatttg tatctatcct
1981 aaccagttcg gggatatatt aagatatttt tgtacataag agagaaagag agagaaaaat
2041 ttatagaagt tttgtacaaa tggtttaaaa tgtgtatatc ttgatacttt aacatgtaat
2101 gctattacct ctgcatattt tagatgtgta gttcacctta caactgcaat tttccctatg
2161 tggttttgta aagaactctc ctcataggtg agatcaagag gccaccagtt gtacttcagc
2221 accaatgtgt cttactttat agaaatgttg ttaatgtatt aatgatgtta ttaaatactg
2281 ttcaagaaga acaaagttta tgcagctact gtccaaactc aaagtggcag ccagttggtt
2341 ttgataggtt gccttttgga gatttctatt actgcctttt tttttcttac tgttttatta
2401 caaacttaca aaaatatgta taaccctgtt ttatacaaac tagtttcgta ataaaacttt
2461 ttcctttttt taaaatgaaa ataaaaaaaa//
配列番号２：Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ａｃｈａｅｔｅ－ＳｃｕｔｅファミリーｂＨＬＨ転写因子１（ＡＳＣＬ１）タンパク質のアミノ酸配列
ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：ＡＳＣＬ１＿ＨＵＭＡＮ、Ｐ５０５５３
MESSAKMESGGAGQQPQPQPQQPFLPPAACFFATAAAAAAAAAAAAAQSAQQQQQQQQQQ
QQAPQLRPAADGQPSGGGHKSAPKQVKRQRSSSPELMRCKRRLNFSGFGYSLPQQQPAAV
ARRNERERNRVKLVNLGFATLREHVPNGAANKKMSKVETLRSAVEYIRALQQLLDEHDAV
SAAFQAGVLSPTISPNYSNDLNSMAGSPVSSYSSDEGSYDPLSPEEQELLDFTNWF
配列番号３：Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＳＲＹボックス２（ＳＯＸ２）、ｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列
ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０００３１０６．３。コード領域はヌクレオチド４３８からヌクレオチド１３９１の範囲（太字で強調される）である。ｍＲＮＡは、「ｔ」（チミジン）残基が「ウラシル」（ｕ）残基で置換されることを除いて、下記の配列に対応する（すなわち、その配列と同一である）ことが理解される。
起源
1 ggatggttgt ctattaactt gttcaaaaaa gtatcaggag ttgtcaaggc agagaagaga
61 gtgtttgcaa aagggggaaa gtagtttgct gcctctttaa gactaggact gagagaaaga
121 agaggagaga gaaagaaagg gagagaagtt tgagccccag gcttaagcct ttccaaaaaa
181 taataataac aatcatcggc ggcggcagga tcggccagag gaggagggaa gcgctttttt
241 tgatcctgat tccagtttgc ctctctcttt ttttccccca aattattctt cgcctgattt
301 tcctcgcgga gccctgcgct cccgacaccc ccgcccgcct cccctcctcc tctccccccg
361 cccgcgggcc ccccaaagtc ccggccgggc cgagggtcgg cggccgccgg cgggccgggc
421 ccgcgcacag cgcccgcatg tacaacatga tggagacgga gctgaagccg ccgggcccgc
481 agcaaacttc ggggggcggc ggcggcaact ccaccgcggc ggcggccggc ggcaaccaga
541 aaaacagccc ggaccgcgtc aagcggccca tgaatgcctt catggtgtgg tcccgcgggc
601 agcggcgcaa gatggcccag gagaacccca agatgcacaa ctcggagatc agcaagcgcc
661 tgggcgccga gtggaaactt ttgtcggaga cggagaagcg gccgttcatc gacgaggcta
721 agcggctgcg agcgctgcac atgaaggagc acccggatta taaataccgg ccccggcgga
781 aaaccaagac gctcatgaag aaggataagt acacgctgcc cggcgggctg ctggcccccg
841 gcggcaatag catggcgagc ggggtcgggg tgggcgccgg cctgggcgcg ggcgtgaacc
901 agcgcatgga cagttacgcg cacatgaacg gctggagcaa cggcagctac agcatgatgc
961 aggaccagct gggctacccg cagcacccgg gcctcaatgc gcacggcgca gcgcagatgc
1021 agcccatgca ccgctacgac gtgagcgccc tgcagtacaa ctccatgacc agctcgcaga
1081 cctacatgaa cggctcgccc acctacagca tgtcctactc gcagcagggc acccctggca
1141 tggctcttgg ctccatgggt tcggtggtca agtccgaggc cagctccagc ccccctgtgg
1201 ttacctcttc ctcccactcc agggcgccct gccaggccgg ggacctccgg gacatgatca
1261 gcatgtatct ccccggcgcc gaggtgccgg aacccgccgc ccccagcaga cttcacatgt
1321 cccagcacta ccagagcggc ccggtgcccg gcacggccat taacggcaca ctgcccctct
1381 cacacatgtg agggccggac agcgaactgg aggggggaga aattttcaaa gaaaaacgag
1441 ggaaatggga ggggtgcaaa agaggagagt aagaaacagc atggagaaaa cccggtacgc
1501 tcaaaaagaa aaaggaaaaa aaaaaatccc atcacccaca gcaaatgaca gctgcaaaag
1561 agaacaccaa tcccatccac actcacgcaa aaaccgcgat gccgacaaga aaacttttat
1621 gagagagatc ctggacttct ttttggggga ctatttttgt acagagaaaa cctggggagg
1681 gtggggaggg cgggggaatg gaccttgtat agatctggag gaaagaaagc tacgaaaaac
1741 tttttaaaag ttctagtggt acggtaggag ctttgcagga agtttgcaaa agtctttacc
1801 aataatattt agagctagtc tccaagcgac gaaaaaaatg ttttaatatt tgcaagcaac
1861 ttttgtacag tatttatcga gataaacatg gcaatcaaaa tgtccattgt ttataagctg
1921 agaatttgcc aatatttttc aaggagaggc ttcttgctga attttgattc tgcagctgaa
1981 atttaggaca gttgcaaacg tgaaaagaag aaaattattc aaatttggac attttaattg
2041 tttaaaaatt gtacaaaagg aaaaaattag aataagtact ggcgaaccat ctctgtggtc
2101 ttgtttaaaa agggcaaaag ttttagactg tactaaattt tataacttac tgttaaaagc
2161 aaaaatggcc atgcaggttg acaccgttgg taatttataa tagcttttgt tcgatcccaa
2221 ctttccattt tgttcagata aaaaaaacca tgaaattact gtgtttgaaa tattttctta
2281 tggtttgtaa tatttctgta aatttattgt gatattttaa ggttttcccc cctttatttt
2341 ccgtagttgt attttaaaag attcggctct gtattatttg aatcagtctg ccgagaatcc
2401 atgtatatat ttgaactaat atcatcctta taacaggtac attttcaact taagttttta
2461 ctccattatg cacagtttga gataaataaa tttttgaaat atggacactg aaaaaaaaaa//
配列番号４：Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＳＲＹ－ボックス２（ＳＯＸ２）タンパク質のアミノ酸配列
ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：ＳＯＸ２＿ＨＵＭＡＮ、Ｐ４８４３１
MYNMMETELKPPGPQQTSGGGGGNSTAAAAGGNQKNSPDRVKRPMNAFMVWSRGQRRKMA
QENPKMHNSEISKRLGAEWKLLSETEKRPFIDEAKRLRALHMKEHPDYKYRPRRKTKTLM
KKDKYTLPGGLLAPGGNSMASGVGVGAGLGAGVNQRMDSYAHMNGWSNGSYSMMQDQLGY
PQHPGLNAHGAAQMQPMHRYDVSALQYNSMTSSQTYMNGSPTYSMSYSQQGTPGMALGSM
GSVVKSEASSSPPVVTSSSHSRAPCQAGDLRDMISMYLPGAEVPEPAAPSRLHMSQHYQS
GPVPGTAINGTLPLSHM
配列番号５：Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、ｍＲＮＡ
ＮＣＢＩ参考配列：ＮＭ＿００２０４６．６。コード領域は、ヌクレオチド７７からヌクレオチド１０８４（太字で強調される）の範囲である。ｍＲＮＡは、「ｔ」（チミジン）残基が「ウラシル」（ｕ）残基で置換されることを除いて、下記の配列に対応する（すなわち、その配列と同一である）ことが理解される。
起源
1 gctctctgct cctcctgttc gacagtcagc cgcatcttct tttgcgtcgc cagccgagcc
61 acatcgctca gacaccatgg ggaaggtgaa ggtcggagtc aacggatttg gtcgtattgg
121 gcgcctggtc accagggctg cttttaactc tggtaaagtg gatattgttg ccatcaatga
181 ccccttcatt gacctcaact acatggttta catgttccaa tatgattcca cccatggcaa
241 attccatggc accgtcaagg ctgagaacgg gaagcttgtc atcaatggaa atcccatcac
301 catcttccag gagcgagatc cctccaaaat caagtggggc gatgctggcg ctgagtacgt
361 cgtggagtcc actggcgtct tcaccaccat ggagaaggct ggggctcatt tgcagggggg
421 agccaaaagg gtcatcatct ctgccccctc tgctgatgcc cccatgttcg tcatgggtgt
481 gaaccatgag aagtatgaca acagcctcaa gatcatcagc aatgcctcct gcaccaccaa
541 ctgcttagca cccctggcca aggtcatcca tgacaacttt ggtatcgtgg aaggactcat
601 gaccacagtc catgccatca ctgccaccca gaagactgtg gatggcccct ccgggaaact
661 gtggcgtgat ggccgcgggg ctctccagaa catcatccct gcctctactg gcgctgccaa
721 ggctgtgggc aaggtcatcc ctgagctgaa cgggaagctc actggcatgg ccttccgtgt
781 ccccactgcc aacgtgtcag tggtggacct gacctgccgt ctagaaaaac ctgccaaata
841 tgatgacatc aagaaggtgg tgaagcaggc gtcggagggc cccctcaagg gcatcctggg
901 ctacactgag caccaggtgg tctcctctga cttcaacagc gacacccact cctccacctt
961 tgacgctggg gctggcattg ccctcaacga ccactttgtc aagctcattt cctggtatga
1021 caacgaattt ggctacagca acagggtggt ggacctcatg gcccacatgg cctccaagga
1081 gtaagacccc tggaccacca gccccagcaa gagcacaaga ggaagagaga gaccctcact
1141 gctggggagt ccctgccaca ctcagtcccc caccacactg aatctcccct cctcacagtt
1201 gccatgtaga ccccttgaag aggggagggg cctagggagc cgcaccttgt catgtaccat
1261 caataaagta ccctgtgctc aaccagttaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa//
配列番号６：Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、タンパク質のアミノ酸配列 ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｇ３Ｐ＿ＨＵＭＡＮ、Ｐ０４４０６
MGKVKVGVNGFGRIGRLVTRAAFNSGKVDIVAINDPFIDLNYMVYMFQYDSTHGKFHGTV
KAENGKLVINGNPITIFQERDPSKIKWGDAGAEYVVESTGVFTTMEKAGAHLQGGAKRVI
ISAPSADAPMFVMGVNHEKYDNSLKIISNASCTTNCLAPLAKVIHDNFGIVEGLMTTVHA
ITATQKTVDGPSGKLWRDGRGALQNIIPASTGAAKAVGKVIPELNGKLTGMAFRVPTANV
SVVDLTCRLEKPAKYDDIKKVVKQASEGPLKGILGYTEHQVVSSDFNSDTHSSTFDAGAG
IALNDHFVKLISWYDNEFGYSNRVVDLMAHMASKE
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図11】
【図12】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2022-07-05
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高いＳＣＬＣを有する患者を同定する方法であって、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置を開始する前に、患者由来の試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを測定するステップを含む方法。
【請求項2】
試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の各レベルが閾値を超えた場合に、患者を、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高いものとして同定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを使用して、試料についてのスコアを生成するステップをさらに含み、試料についてのスコアが閾値を超えた場合に、患者を、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高いものとして同定される、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置が有益であり得るＳＣＬＣを有する患者を同定する方法であって、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置を開始する前に、患者由来の試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを測定するステップを含む方法。
【請求項5】
試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の各レベルが閾値を超えた場合に、患者を、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置が有益であり得るものとして同定するステップをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを使用して、試料についてのスコアを生成するステップをさらに含み、試料についてのスコアが閾値を超えた場合に、患者が、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置が有益であり得るものとして同定される、請求項４に記載の方法。
【請求項7】
ＳＣＬＣを有する患者の処置を選択する方法であって、処置を開始する前に、患者由来の試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを測定するステップを含む方法。
【請求項8】
ＡＳＣＬ１レベルおよびＳＯＸ２レベルがｍＲＮＡ発現レベルである、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
ｍＲＮＡ発現レベルがｑＲＴ－ＰＣＲによって測定される、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
ＡＳＣＬ１レベルおよびＳＯＸ２レベルがタンパク質発現レベルである、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
タンパク質発現レベルが蛍光免疫組織化学によって測定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
試料が生検である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
患者が、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高いものとして同定された場合に、患者にＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置の治療有効量を推奨するか、または処方するステップをさらに含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
ＳＣＬＣを有する患者の処置における使用のためのＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む医薬組成物であって、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置を開始する前に、患者が、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法を使用してＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高いものとして同定されている、前記医薬組成物。
【請求項15】
ＳＣＬＣを有する患者を処置するための医薬品の製造におけるＫＤＭ１Ａ阻害剤の使用であって、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置を開始する前に、患者が、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法を使用して、ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高いとして同定されている、前記使用。
【請求項16】
ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に応答する可能性が高い、ＳＣＬＣを有する患者を同定する方法におけるＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２の使用。
【請求項17】
ＫＤＭ１Ａ阻害剤が（トランス）－Ｎ１－（（（１Ｒ，２Ｓ）－２－フェニルシクロプロピル）シクロヘキサン－１，４－ジアミンまたはその薬学的に許容される塩である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
患者がヒト患者である、請求項１～１３または１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
ＫＤＭ１Ａ阻害剤が（トランス）－Ｎ１－（（（１Ｒ，２Ｓ）－２－フェニルシクロプロピル）シクロヘキサン－１，４－ジアミンまたはその薬学的に許容される塩である、請求項１４に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項20】
患者がヒト患者である、請求項１４または１９に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項21】
ＫＤＭ１Ａ阻害剤が（トランス）－Ｎ１－（（（１Ｒ，２Ｓ）－２－フェニルシクロプロピル）シクロヘキサン－１，４－ジアミンまたはその薬学的に許容される塩である、請求項１５または１６に記載の使用。
【請求項22】
患者がヒト患者である、請求項１５、１６または２１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項23】
ＫＤＭ１Ａ阻害剤を含む処置に対する、ＳＣＬＣを有する患者の応答の可能性を評価するためのキットであって、試料中のＡＳＣＬ１およびＳＯＸ２のレベルを測定するための１つ以上の薬剤、および場合により使用説明書を含むキット。
【国際調査報告】