(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-11-10
(54)【発明の名称】キメラ共刺激受容体ならびにその方法および使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20221102BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20221102BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20221102BHJP
C07K 14/715 20060101ALI20221102BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20221102BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20221102BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20221102BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20221102BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20221102BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20221102BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20221102BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C12N15/12
C07K19/00
C07K14/715
C07K14/705
C12N5/0783
C12N5/10
C12N15/63 Z
A61K35/17 A
A61P35/00
A61P35/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022508991
(86)(22)【出願日】2020-09-16
(85)【翻訳文提出日】2022-04-11
(86)【国際出願番号】 CA2020051245
(87)【国際公開番号】W WO2021051195
(87)【国際公開日】2021-03-25
(31)【優先権主張番号】62/900,911
(32)【優先日】2019-09-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】594073439
【氏名又は名称】マックマスター、ユニバーシティー
【氏名又は名称原語表記】ＭＣＭＡＳＴＥＲ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
(74)【代理人】
【識別番号】100082072
【弁理士】
【氏名又は名称】清原 義博
(72)【発明者】
【氏名】ブランソン，ジョナサン
(72)【発明者】
【氏名】マーヴィン，フィリップ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94X
4B065AB01
4B065AC20
4B065BA02
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB37
4C087NA14
4C087ZB26
4C087ZB27
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA50
4H045DA51
4H045EA22
4H045EA28
4H045FA74
(57)【要約】
本明細書に記載されているのは、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバーの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーからの細胞質共刺激シグナル伝達ドメインを有するキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）分子である。ＣＣＲを発現するＴ細胞を有する医薬組成物、ならびに癌を治療するためのそのようなＴ細胞の方法および使用もまた提供される。
【選択図】図２Ａ
【選択図】図２Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸であって、（ａ）腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外ドメインをコードする第１のポリヌクレオチド、（ｂ）膜貫通ドメインポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、および（ｃ）細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチドを含む、キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項2】
前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第３のポリヌクレオチドが、ＴＮＦＲＳＦの異なるメンバーに由来する、請求項１に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項3】
前記第１のポリヌクレオチドが、デスドメインを有するＴＮＦＲＳＦメンバーの細胞外ドメインをコードする、請求項１に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項4】
前記第１のポリヌクレオチドが、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、Ｆａｓ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＤＲ３、ＤＲ６、ＥＤＡＲ、ＸＥＤＡＲ、ＴＲＯＹ、またはＮＧＦＲの細胞外ドメインをコードする、請求項１に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項5】
前記第１のポリヌクレオチドがＴＮＦＲ１の細胞外ドメインをコードする、請求項１に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項6】
前記第１のポリヌクレオチドがＴＮＦＲ２の細胞外ドメインをコードする、請求項１に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項7】
前記第１のポリヌクレオチドがＦａｓの細胞外ドメインをコードする、請求項１に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項8】
前記第１のポリヌクレオチドがＤＲ４の細胞外ドメインをコードする、請求項１に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項9】
前記第１のポリヌクレオチドがＤＲ５の細胞外ドメインをコードする、請求項１に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項10】
前記第１のポリヌクレオチドが、配列番号１に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一であるオリゴペプチドをコードする、請求項１に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項11】
前記第１のポリヌクレオチドが、配列番号２に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一であるオリゴペプチドをコードする、請求項１に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項12】
前記第３のポリヌクレオチドが、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）メンバーからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする、請求項１に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項13】
前記第３のポリヌクレオチドが、４－１ＢＢ、ＢＡＦＦＲ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、ＲＥＬＴ、ＴＡＣＩ、ＴＲＯＹ、またはＴＷＥＡＫからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする、請求項１に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項14】
前記第３のポリヌクレオチドが、ＢＡＦＦＲからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする、請求項１に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項15】
前記第３のポリヌクレオチドは、４－１ＢＢからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする、請求項１に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項16】
前記第３のポリヌクレオチドが、ＣＤ２７からの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする、請求項１に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項17】
前記第３のポリヌクレオチドが、ＨＶＥＭからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする、請求項１に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項18】
前記第３のポリヌクレオチドが、ＯＸ４０からの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする、請求項１に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項19】
前記第３のポリヌクレオチドが、ＧＩＴＲからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする、請求項１に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項20】
前記第３のポリヌクレオチドが、ＴＡＣＩからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする、請求項１に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項21】
前記第３のポリヌクレオチドが、配列番号３に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一であるオリゴペプチドをコードする、請求項１に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項22】
前記第３のポリヌクレオチドが、配列番号４に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一であるオリゴペプチドをコードする、請求項１に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項23】
前記膜貫通ドメインポリペプチドが、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーからの膜貫通ドメインポリペプチドである、請求項１に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項24】
前記第２のポリヌクレオチドが、配列番号５に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一であるオリゴペプチドをコードする、請求項１に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項25】
前記第２のポリヌクレオチドが、配列番号６に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一であるオリゴペプチドをコードする、請求項１に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項26】
前記膜貫通ドメインおよび前記細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインが同じ共刺激シグナル伝達タンパク質に由来する、請求項１に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項27】
前記膜貫通ドメインおよび前記細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインが、４－１ＢＢ、ＢＡＦＦＲ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、ＲＥＬＴ、ＴＡＣＩ、ＴＲＯＹ、またはＴＷＥＡＫに由来する、請求項１に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項28】
前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドが前記第３のポリヌクレオチドに直接的におよび／または間接的に結合されている、請求項１に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項29】
前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第３のポリヌクレオチドが前記第２のポリヌクレオチドに直接的におよび／または間接的に結合されている、請求項１に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項30】
前記第１のポリヌクレオチドおよび／または前記第２のポリヌクレオチドが、リンカーによって前記第３のポリヌクレオチドに間接的に結合されている、請求項１に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項31】
前記第１のポリヌクレオチドおよび／または前記第３のポリヌクレオチドが、リンカーによって前記第２のポリヌクレオチドに間接的に結合されている、請求項１に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項32】
キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸であって、（ａ）腫瘍壊死因子受容体１（ＴＮＦＲ１）の細胞外ドメインをコードする第１のポリヌクレオチド、（ｂ）膜貫通ドメインポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、および（ｃ）細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチドを含む、キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項33】
前記第１のポリヌクレオチドが、配列番号１に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一であるオリゴペプチドをコードする、請求項３２に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項34】
前記第３のポリヌクレオチドが、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）メンバーからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする、請求項３２に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項35】
前記第３のポリヌクレオチドが、４－１ＢＢ、ＢＡＦＦＲ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、ＲＥＬＴ、ＴＡＣＩ、ＴＲＯＹ、またはＴＷＥＡＫからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする、請求項３２に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項36】
前記第３のポリヌクレオチドが、ＢＡＦＦＲからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする、請求項３２に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項37】
前記第３のポリヌクレオチドが、４－１ＢＢからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする、請求項３２に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項38】
前記第３のポリヌクレオチドが、ＣＤ２７からの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする、請求項３２に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項39】
前記第３のポリヌクレオチドが、ＨＶＥＭからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする、請求項３２に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項40】
前記第３のポリヌクレオチドが、ＯＸ４０からの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする、請求項３２に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項41】
前記第３のポリヌクレオチドが、ＧＩＴＲからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする、請求項３２に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項42】
前記第３のポリヌクレオチドが、ＴＡＣＩからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする、請求項３２に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項43】
前記第３のポリヌクレオチドが、配列番号３に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一であるオリゴペプチドをコードする、請求項３２に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項44】
前記第３のポリヌクレオチドが、配列番号４に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一であるオリゴペプチドをコードする、請求項３２に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項45】
前記膜貫通ドメインポリペプチドが、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーからの膜貫通ドメインポリペプチドである、請求項３２に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項46】
前記第２のポリヌクレオチドが、配列番号５に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一であるオリゴペプチドをコードする、請求項３２に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項47】
前記第２のポリヌクレオチドが、配列番号６に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一であるオリゴペプチドをコードする、請求項３２に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項48】
前記膜貫通ドメインおよび前記細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインが同じ共刺激シグナル伝達タンパク質に由来する、請求項３２に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項49】
前記膜貫通ドメインおよび前記細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインが、４－１ＢＢ、ＢＡＦＦＲ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、ＲＥＬＴ、ＴＡＣＩ、ＴＲＯＹ、またはＴＷＥＡＫに由来する、請求項３２に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項50】
前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドが前記第３のポリヌクレオチドに直接的におよび／または間接的に結合されている、請求項３２に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項51】
前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第３のポリヌクレオチドが前記第２のポリヌクレオチドに直接的におよび／または間接的に結合されている、請求項３２に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項52】
前記第１のポリヌクレオチドおよび／または前記第２のポリヌクレオチドが、リンカーによって前記第３のポリヌクレオチドに間接的に結合されている、請求項３２に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項53】
前記第１のポリヌクレオチドおよび／または前記第３のポリヌクレオチドが、リンカーによって前記第２のポリヌクレオチドに間接的に結合されている、請求項３２に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項54】
キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸であって、（ａ）腫瘍壊死因子受容体２（ＴＮＦＲ２）の細胞外ドメインをコードする第１のポリヌクレオチド、（ｂ）膜貫通ドメインポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、および（ｃ）細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチドを含む、キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項55】
前記第３のポリヌクレオチドが、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）メンバーからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする、請求項５４に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項56】
前記第３のポリヌクレオチドが、４－１ＢＢ、ＢＡＦＦＲ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、ＲＥＬＴ、ＴＡＣＩ、ＴＲＯＹ、またはＴＷＥＡＫからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする、請求項５４に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項57】
前記第３のポリヌクレオチドが、ＢＡＦＦＲからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする、請求項５４に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項58】
前記第３のポリヌクレオチドが、４－１ＢＢからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする、請求項５４に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項59】
前記第３のポリヌクレオチドが、ＣＤ２７からの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする、請求項５４に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項60】
前記第３のポリヌクレオチドが、ＨＶＥＭからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする、請求項５４に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項61】
前記第３のポリヌクレオチドが、ＯＸ４０からの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする、請求項５４に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項62】
前記第３のポリヌクレオチドが、ＧＩＴＲからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする、請求項５４に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項63】
前記第３のポリヌクレオチドが、ＴＡＣＩからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする、請求項５４に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項64】
前記第３のポリヌクレオチドが、配列番号３に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一であるオリゴペプチドをコードする、請求項５４に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項65】
前記第３のポリヌクレオチドが、配列番号４に対して、オリゴペプチドを少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一である、請求項５４に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項66】
前記膜貫通ドメインポリペプチドが、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーからの膜貫通ドメインポリペプチドである、請求項５４に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項67】
前記第２のポリヌクレオチドが、配列番号５に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一であるオリゴペプチドをコードする、請求項５４に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項68】
前記第２のポリヌクレオチドが、配列番号６に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一であるオリゴペプチドをコードする、請求項５４に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項69】
前記膜貫通ドメインおよび前記細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインが同じ共刺激シグナル伝達タンパク質に由来する、請求項５４に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項70】
前記膜貫通ドメインおよび前記共刺激シグナル伝達ドメインが、４－１ＢＢ、ＢＡＦＦＲ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、ＲＥＬＴ、ＴＡＣＩ、ＴＲＯＹ、またはＴＷＥＡＫに由来する、請求項５４に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項71】
前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドが前記第３のポリヌクレオチドに直接的におよび／または間接的に結合されている、請求項５４に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項72】
前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第３のポリヌクレオチドが前記第２のポリヌクレオチドに直接的におよび／または間接的に結合されている、請求項５４に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項73】
前記第１のポリヌクレオチドおよび／または前記第２のポリヌクレオチドが、リンカーによって前記第３のポリヌクレオチドに間接的に結合されている、請求項５４に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項74】
前記第１のポリヌクレオチドおよび／または前記第３のポリヌクレオチドが、リンカーによって前記第２のポリヌクレオチドに間接的に結合されている、請求項５４に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項75】
キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸であって、（ａ）腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー６（ＴＮＦＲＳＦ６；Ｆａｓ）の細胞外ドメインをコードする第１のポリヌクレオチド、（ｂ）膜貫通ドメインポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、および（ｃ）細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチドを含む、キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項76】
前記第１のポリヌクレオチドが、配列番号２に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一であるオリゴペプチドをコードする、請求項７５に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項77】
前記第３のポリヌクレオチドが、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）メンバーからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする、請求項７５に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項78】
前記第３のポリヌクレオチドが、４－１ＢＢ、ＢＡＦＦＲ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、ＲＥＬＴ、ＴＡＣＩ、ＴＲＯＹ、またはＴＷＥＡＫからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする、請求項７５に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項79】
前記第３のポリヌクレオチドが、ＢＡＦＦＲからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする、請求項７５に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項80】
前記第３のポリヌクレオチドが、４－１ＢＢからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする、請求項７５に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項81】
前記第３のポリヌクレオチドが、ＣＤ２７からの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする、請求項７５に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項82】
前記第３のポリヌクレオチドが、ＨＶＥＭからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする、請求項７５に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項83】
前記第３のポリヌクレオチドが、ＯＸ４０からの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする、請求項７５に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項84】
前記第３のポリヌクレオチドが、ＧＩＴＲからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする、請求項７５に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項85】
前記第３のポリヌクレオチドが、ＴＡＣＩからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする、請求項７５に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項86】
前記第３のポリヌクレオチドが、配列番号３に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一であるオリゴペプチドをコードする、請求項７５に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項87】
前記第３のポリヌクレオチドが、配列番号４に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一であるオリゴペプチドをコードする、請求項７５に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項88】
前記膜貫通ドメインポリペプチドが、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーからの膜貫通ドメインポリペプチドである、請求項７５に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項89】
前記第２のポリヌクレオチドが、配列番号５に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一であるオリゴペプチドをコードする、請求項７５に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項90】
前記第２のポリヌクレオチドが、配列番号６に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一であるオリゴペプチドをコードする、請求項７５に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項91】
前記膜貫通ドメインおよび前記細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインが同じ共刺激シグナル伝達タンパク質に由来する、請求項７５に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項92】
前記膜貫通ドメインおよび前記細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインが、４－１ＢＢ、ＢＡＦＦＲ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、ＲＥＬＴ、ＴＡＣＩ、ＴＲＯＹ、またはＴＷＥＡＫに由来する、請求項７５に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項93】
前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドが前記第３のポリヌクレオチドに直接的におよび／または間接的に結合されている、請求項７５に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項94】
前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第３のポリヌクレオチドが前記第２のポリヌクレオチドに直接的におよび／または間接的に結合されている、請求項７５に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項95】
前記第１のポリヌクレオチドおよび／または前記第２のポリヌクレオチドが、リンカーによって前記第３のポリヌクレオチドに間接的に結合されている、請求項７５に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項96】
前記第１のポリヌクレオチドおよび／または前記第３のポリヌクレオチドが、リンカーによって前記第２のポリヌクレオチドに間接的に結合されている、請求項７５に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項97】
キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチドであって、（ａ）腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外ドメインを含む第１のオリゴペプチド、（ｂ）膜貫通ドメインポリペプチドを含む第２のオリゴペプチド、および（ｃ）細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインポリペプチドを含む第３のオリゴペプチドを含む、キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項98】
前記第１のオリゴペプチドおよび前記第３のオリゴペプチドは、ＴＮＦＲＳＦの異なるメンバーに由来する、請求項９７に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項99】
前記第１のオリゴペプチドが、デスドメインを有するＴＮＦＲＳＦメンバーの細胞外ドメインを含む、請求項９７に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項100】
前記第１のオリゴペプチドが、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、Ｆａｓ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＤＲ３、ＤＲ６、ＥＤＡＲ、ＸＥＤＡＲ、ＴＲＯＹ、またはＮＧＦＲの細胞外ドメインを含む、請求項９７に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項101】
前記第１のオリゴペプチドがＴＮＦＲ１の細胞外ドメインを含む、請求項９７に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項102】
前記第１のオリゴペプチドがＴＮＦＲ２の細胞外ドメインを含む、請求項９７に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項103】
前記第１のオリゴペプチドが、Ｆａｓの細胞外ドメインを含む、請求項９７に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項104】
前記第１のオリゴペプチドがＤＲ４の細胞外ドメインを含む、請求項９７に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項105】
前記第１のオリゴペプチドがＤＲ５の細胞外ドメインを含む、請求項９７に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項106】
前記第１のオリゴペプチドが、配列番号１に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一の配列を含む、請求項９７に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項107】
前記第１のオリゴペプチドが、配列番号２に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一の配列を含む、請求項９７に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項108】
前記第３のオリゴペプチドが、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）メンバーからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項９７に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項109】
前記第３のオリゴペプチドが、４－１ＢＢ、ＢＡＦＦＲ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、ＲＥＬＴ、ＴＡＣＩ、ＴＲＯＹ、またはＴＷＥＡＫからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項９７に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項110】
前記第３のオリゴペプチドが、ＢＡＦＦＲからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項９７に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項111】
前記第３のオリゴペプチドが、４－１ＢＢからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項９７に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項112】
前記第３のオリゴペプチドが、ＣＤ２７からの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項９７に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項113】
前記第３のオリゴペプチドが、ＨＶＥＭからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項９７に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項114】
前記第３のオリゴペプチドが、ＯＸ４０からの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項９７に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項115】
前記第３のオリゴペプチドが、ＧＩＴＲからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項９７に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項116】
前記第３のオリゴペプチドが、ＴＡＣＩからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項９７に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項117】
前記第３のオリゴペプチドが、配列番号３に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一の配列を含む、請求項９７に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項118】
前記第３のオリゴペプチドが、配列番号４に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一の配列を含む、請求項９７に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項119】
前記膜貫通ドメインポリペプチドが、前記腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーからの膜貫通ドメインポリペプチドである、請求項９７に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項120】
前記第２のオリゴペプチドが、配列番号５に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一の配列を含む、請求項９７に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項121】
前記第２のオリゴペプチドが、配列番号６に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一の配列を含む、請求項９７に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項122】
前記膜貫通ドメインおよび前記細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインが同じ共刺激シグナル伝達タンパク質に由来する、請求項９７に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項123】
前記膜貫通ドメインおよび前記細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインが、４－１ＢＢ、ＢＡＦＦＲ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、ＲＥＬＴ、ＴＡＣＩ、ＴＲＯＹ、またはＴＷＥＡＫに由来する、請求項９７に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項124】
前記第１のオリゴペプチドおよび前記第２のオリゴペプチドが、前記第３のポリヌクレオチドに直接的におよび／または間接的に結合されている、請求項９７に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項125】
前記第１のオリゴペプチドおよび前記第３のオリゴペプチドが、前記第２のオリゴペプチドに直接的におよび／または間接的に結合されている、請求項９７に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項126】
前記第１のオリゴペプチドおよび／または前記第２のオリゴペプチドが、リンカーによって前記第３のオリゴペプチドに間接的に結合されている、請求項９７に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項127】
前記第１のオリゴペプチドおよび／または前記第３のオリゴペプチドが、リンカーによって前記第２のオリゴペプチドに間接的に結合されている、請求項９７に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項128】
キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチドであって、（ａ）腫瘍壊死因子受容体１（ＴＮＦＲ１）の細胞外ドメインを含む第１のオリゴペプチド、（ｂ）膜貫通ドメインポリペプチドを含む第２のオリゴペプチド、および（ｃ）細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインポリペプチドを含む第３のオリゴペプチドを含む、キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項129】
前記第１のオリゴペプチドが、配列番号１に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一の配列を含む、請求項１２８に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項130】
前記第３のオリゴペプチドが、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）メンバーからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項１２８に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項131】
前記第３のオリゴペプチドが、４－１ＢＢ、ＢＡＦＦＲ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、ＲＥＬＴ、ＴＡＣＩ、ＴＲＯＹ、またはＴＷＥＡＫからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項１２８に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項132】
前記第３のオリゴペプチドが、ＢＡＦＦＲからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項１２８に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項133】
前記第３のオリゴペプチドが、４－１ＢＢからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項１２８に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項134】
前記第３のオリゴペプチドが、ＣＤ２７からの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項１２８に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項135】
前記第３のオリゴペプチドが、ＨＶＥＭからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項１２８に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項136】
前記第３のオリゴペプチドが、ＯＸ４０からの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項１２８に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項137】
前記第３のオリゴペプチドが、ＧＩＴＲからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項１２８に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項138】
前記第３のオリゴペプチドが、ＴＡＣＩからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項１２８に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項139】
前記第３のオリゴペプチドが、配列番号３に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一の配列を含む、請求項１２８に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項140】
前記第３のオリゴペプチドが、配列番号４に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一の配列を含む、請求項１２８に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項141】
前記膜貫通ドメインポリペプチドが、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーからの膜貫通ドメインポリペプチドである、請求項１２８に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項142】
前記第２のオリゴペプチドが、配列番号５に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一の配列を含む、請求項１２８に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項143】
前記第２のオリゴペプチドが、配列番号６に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一の配列を含む、請求項１２８に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項144】
前記膜貫通ドメインポリペプチドおよび前記細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインが同じ共刺激シグナル伝達タンパク質に由来する、請求項１２８に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項145】
前記膜貫通ドメインおよび前記細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインが、４－１ＢＢ、ＢＡＦＦＲ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、ＲＥＬＴ、ＴＡＣＩ、ＴＲＯＹ、またはＴＷＥＡＫに由来する、請求項１２８に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項146】
前記第１のオリゴペプチドおよび前記第２のオリゴペプチドが前記第３のオリゴペプチドに直接的におよび／または間接的に結合されている、請求項１２８に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項147】
前記第１のオリゴペプチドおよび前記第３のオリゴペプチドが前記第２のオリゴペプチドに直接的におよび／または間接的に結合されている、請求項１２８に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項148】
前記第１のオリゴペプチドおよび／または前記第２のオリゴペプチドは、リンカーによって前記第３のオリゴペプチドに間接的に結合されている、請求項１２８に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項149】
前記第１のオリゴペプチドおよび／または前記第３のオリゴペプチドが、リンカーによって前記第２のオリゴペプチドに間接的に結合されている、請求項１２８に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項150】
キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチドであって、（ａ）腫瘍壊死因子受容体２（ＴＮＦＲ２）の細胞外ドメインを含む第１のオリゴペプチド、（ｂ）膜貫通ドメインポリペプチドを含む第２のオリゴペプチド、および（ｃ）細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインポリペプチドを含む第３のオリゴペプチドを含む、キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項151】
前記第３のオリゴペプチドが、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）メンバーからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項１５０に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項152】
前記第３のオリゴペプチドが、４－１ＢＢ、ＢＡＦＦＲ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、ＲＥＬＴ、ＴＡＣＩ、ＴＲＯＹ、またはＴＷＥＡＫからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項１５０に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項153】
前記第３のオリゴペプチドが、ＢＡＦＦＲからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項１５０に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項154】
前記第３のオリゴペプチドが、４－１ＢＢからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項１５０に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項155】
前記第３のオリゴペプチドが、ＣＤ２７からの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項１５０に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項156】
前記第３のオリゴペプチドが、ＨＶＥＭからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項１５０に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項157】
前記第３のオリゴペプチドが、ＯＸ４０からの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項１５０に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項158】
前記第３のオリゴペプチドが、ＧＩＴＲからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項１５０に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項159】
前記第３のオリゴペプチドが、ＴＡＣＩからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項１５０に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項160】
前記第３のオリゴペプチドが、配列番号３に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一の配列を含む、請求項１５０に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項161】
前記第３のオリゴペプチドが、配列番号４に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一の配列を含む、請求項１５０に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項162】
前記膜貫通ドメインポリペプチドが、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーからの膜貫通ドメインポリペプチドである、請求項１５０に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項163】
前記第２のオリゴペプチドが、配列番号５に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一の配列を含む、請求項１５０に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項164】
前記第２のオリゴペプチドが、配列番号６に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一の配列を含む、請求項１５０に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項165】
前記膜貫通ドメインポリペプチドおよび前記細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインが同じ共刺激シグナル伝達タンパク質に由来する、請求項１５０に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項166】
前記膜貫通ドメインおよび前記細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインが、４－１ＢＢ、ＢＡＦＦＲ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、ＲＥＬＴ、ＴＡＣＩ、ＴＲＯＹ、またはＴＷＥＡＫに由来する、請求項１５０に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項167】
前記第１のオリゴペプチドおよび前記第２のオリゴペプチドが前記第３のオリゴペプチドに直接的におよび／または間接的に結合されている、請求項１５０に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項168】
前記第１のオリゴペプチドおよび前記第３のオリゴペプチドが前記第２のオリゴペプチドに直接的におよび／または間接的に結合されている、請求項１５０に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項169】
前記第１のオリゴペプチドおよび／または前記第２のオリゴペプチドが、リンカーによって前記第３のオリゴペプチドに間接的に結合されている、請求項１５０に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項170】
前記第１のオリゴペプチドおよび／または前記第３のオリゴペプチドが、リンカーによって前記第２のオリゴペプチドに間接的に結合されている、請求項１５０に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項171】
キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチドであって、（ａ）腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー６（ＴＮＦＲＳＦ６；Ｆａｓ）の細胞外ドメインを含む第１のオリゴペプチド、（ｂ）膜貫通ドメインポリペプチドを含む第２のオリゴペプチド、および（ｃ）細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインポリペプチドを含む第３のオリゴペプチドを含む、キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項172】
前記第１のオリゴペプチドが、配列番号２に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一の配列を含む、請求項１７１に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項173】
前記第３のオリゴペプチドが、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）メンバーからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項１７１に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項174】
前記第３のオリゴペプチドが、４－１ＢＢ、ＢＡＦＦＲ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、ＲＥＬＴ、ＴＡＣＩ、ＴＲＯＹ、またはＴＷＥＡＫからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項１７１に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項175】
前記第３のオリゴペプチドが、ＢＡＦＦＲからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項１７１に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項176】
前記第３のオリゴペプチドは、４－１ＢＢからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項１７１に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項177】
前記第３のオリゴペプチドが、ＣＤ２７からの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項１７１に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項178】
前記第３のオリゴペプチドが、ＨＶＥＭからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項１７１に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項179】
前記第３のオリゴペプチドが、ＯＸ４０からの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項１７１に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項180】
前記第３のオリゴペプチドが、ＧＩＴＲからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項１７１に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項181】
前記第３のオリゴペプチドが、ＴＡＣＩからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項１７１に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項182】
前記第３のオリゴペプチドが、配列番号３に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一の配列を含む、請求項１７１に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項183】
前記第３のオリゴペプチドが、配列番号４に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一の配列を含む、請求項１７１に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項184】
前記膜貫通ドメインポリペプチドが、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーからの膜貫通ドメインポリペプチドである、請求項１７１に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項185】
前記第２のオリゴペプチドが、配列番号５に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一の配列を含む、請求項１７１に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項186】
前記第２のオリゴペプチドが、配列番号６に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一の配列を含む、請求項１７１に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸。
【請求項187】
前記膜貫通ドメインポリペプチドおよび前記細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインが同じ共刺激シグナル伝達タンパク質に由来する、請求項１７１に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項188】
前記膜貫通ドメインポリペプチドおよび前記細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインが、４－１ＢＢ、ＢＡＦＦＲ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、ＲＥＬＴ、ＴＡＣＩ、ＴＲＯＹ、またはＴＷＥＡＫに由来する、請求項１７１に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項189】
前記第１のオリゴペプチドおよび前記第２のオリゴペプチドが前記第３のオリゴペプチドに直接的におよび／または間接的に結合されている、請求項１７１に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項190】
前記第１のオリゴペプチドおよび前記第３のオリゴペプチドが、前記第２のオリゴペプチドに直接的におよび／または間接的に結合されている、請求項１７１に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項191】
前記第１のオリゴペプチドおよび／または前記第２のオリゴペプチドは、リンカーによって前記第３のオリゴペプチドに間接的に結合されている、請求項１７１に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項192】
前記第１のオリゴペプチドおよび／または前記第３のオリゴペプチドは、リンカーによって前記第２のオリゴペプチドに間接的に結合されている、請求項１７１に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項193】
配列番号７に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一であるキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項194】
配列番号８に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％同一であるキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項195】
配列番号９に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％同一であるキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項196】
配列番号１０に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％同一であるキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチド。
【請求項197】
請求項１～９６のいずれか一項に記載の核酸を含むＴ細胞。
【請求項198】
前記Ｔ細胞が細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、またはガンマ－デルタＴ細胞である、請求項１９７に記載のＴ細胞。
【請求項199】
操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）または標的特異的リガンドを認識できる合成抗原受容体ポリペプチドをコードする第２の核酸をさらに含む、請求項１９７に記載のＴ細胞。
【請求項200】
前記標的特異的リガンドが癌性細胞上の抗原に結合する、請求項１９７に記載のＴ細胞。
【請求項201】
合成抗原受容体ポリヌクレオチドがキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞抗原カプラー（ＴＡＣ）、またはＢｉＴＥである、請求項１９７に記載のＴ細胞。
【請求項202】
合成抗原受容体ポリヌクレオチドがＴ細胞抗原カプラー（ＴＡＣ）である、請求項１９７に記載のＴ細胞。
【請求項203】
請求項９７～１９４のいずれか一項に記載のポリペプチドを含むＴ細胞。
【請求項204】
前記Ｔ細胞が細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、またはガンマ－デルタＴ細胞である、請求項２０３に記載のＴ細胞。
【請求項205】
標的特異的リガンドを認識できる操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）または合成抗原受容体ポリペプチドをさらに含む、請求項２０３に記載のＴ細胞。
【請求項206】
標的特異的リガンドが癌性細胞上の抗原に結合する、請求項２０３に記載のＴ細胞。
【請求項207】
合成抗原受容体ポリペプチドがキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞抗原カプラー（ＴＡＣ）、またはＢｉＴＥである、請求項２０３に記載のＴ細胞。
【請求項208】
合成抗原受容体ポリペプチドがＴ細胞抗原カプラー（ＴＡＣ）である、請求項２０３に記載のＴ細胞。
【請求項209】
請求項１９７～２０８のいずれか一項に記載のＴ細胞を個体に投与する工程を含む、治療を必要とする個体の癌を治療する方法。
【請求項210】
前記癌が白血病またはリンパ腫である、請求項２０９に記載の方法。
【請求項211】
前記癌が混合系統白血病（ＭＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、高悪性度Ｂ細胞リンパ腫、または濾胞性リンパ腫に起因する大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である、請求項２０９に記載の方法。
【請求項212】
前記癌が、肺癌、乳癌、結腸癌、多発性骨髄腫、膠芽細胞腫、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、卵巣癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、結腸直腸癌、尿路上皮癌、子宮内膜癌、または黒色腫である、請求項２０９に記載の方法。
【請求項213】
前記癌が肺癌である、請求項２０９に記載の方法。
【請求項214】
前記癌が乳癌である、請求項２０９に記載の方法。
【請求項215】
前記癌が結腸癌である、請求項２０９に記載の方法。
【請求項216】
前記癌が多発性骨髄腫である、請求項２０９に記載の方法。
【請求項217】
前記癌が膠芽細胞腫である、請求項２０９に記載の方法。
【請求項218】
前記癌が胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）である、請求項２０９に記載の方法。
【請求項219】
前記癌が卵巣癌である、請求項２０９に記載の方法。
【請求項220】
前記癌が胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）である、請求項２０９に記載の方法。
【請求項221】
前記癌が結腸直腸癌である、請求項２０９に記載の方法。
【請求項222】
前記癌が尿路上皮癌である、請求項２０９に記載の方法。
【請求項223】
前記癌が子宮内膜癌である、請求項２０９に記載の方法。
【請求項224】
前記癌が黒色腫である、請求項２０９に記載の方法。
【請求項225】
（ａ）請求項１９７～２０８のいずれか一項に記載のＴ細胞、および（ｂ）薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
【請求項226】
（ａ）請求項１～９６のいずれか一項に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸、および（ｂ）哺乳動物細胞において機能するプロモーターを含む、ベクター構築物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、２０１９年９月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／９００，９１１号からの優先権の利益を主張し、その内容は、参照によりその全体が組み込まれる。
本出願は、２０１９年９月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／９００，９１１号からの優先権の利益を主張し、その内容は、参照によりその全体が組み込まれる。
【0002】
分野
本出願は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーに由来するキメラ受容体に関する。特に、本出願は、免疫細胞を共刺激することができるキメラ腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー受容体、ならびにそれらに関連する方法および癌治療への使用に関する。
本出願は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーに由来するキメラ受容体に関する。特に、本出願は、免疫細胞を共刺激することができるキメラ腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー受容体、ならびにそれらに関連する方法および癌治療への使用に関する。
【背景技術】
【0003】
背景
免疫監視は、形質転換された細胞について身体を継続的にモニターする免疫系の能力である。癌はこのシステムを回避し、免疫制御から逃れることができる。Ｔ細胞は、免疫監視と癌制御の主要な要因であると考えられている。過去数十年にわたって、腫瘍に応答して根絶するためにＴ細胞の生来の能力を利用することを試みる治療法が開発されてきた。最初のアプローチでは、自己の天然に存在する腫瘍浸潤リンパ球を使用し、これらのリンパ球は、インビトロで増殖させて多くの数を得て、患者に再注入された。これらのアプローチに対して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からＴ細胞を分離すること、およびこれらを操作して改変されたＴ細胞受容体を発現することによって、改善が行われた。他のアプローチは、限られた有効性で、標的化された二重特異性抗体を用いてインビボでＴ細胞を刺激または再方向付けすることに焦点を合わせてきた。
免疫監視は、形質転換された細胞について身体を継続的にモニターする免疫系の能力である。癌はこのシステムを回避し、免疫制御から逃れることができる。Ｔ細胞は、免疫監視と癌制御の主要な要因であると考えられている。過去数十年にわたって、腫瘍に応答して根絶するためにＴ細胞の生来の能力を利用することを試みる治療法が開発されてきた。最初のアプローチでは、自己の天然に存在する腫瘍浸潤リンパ球を使用し、これらのリンパ球は、インビトロで増殖させて多くの数を得て、患者に再注入された。これらのアプローチに対して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からＴ細胞を分離すること、およびこれらを操作して改変されたＴ細胞受容体を発現することによって、改善が行われた。他のアプローチは、限られた有効性で、標的化された二重特異性抗体を用いてインビボでＴ細胞を刺激または再方向付けすることに焦点を合わせてきた。
【0004】
細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、細胞傷害性エフェクター分子および分泌されたサイトカインを介して、形質転換細胞および／またはウイルス感染細胞の同定およびクリアランスを媒介する。自然のＴＣＲ成熟は、ＭＨＣ依存性ＴＣＲ相互作用を通して抗原を認識するために、複数ラウンドの選択を受ける。ＭＨＣ－ＴＣＲ相互作用は、Ｔ細胞の活性化を開始し、腫瘍細胞に作用するエフェクター分子の放出を引き起こして、アポトーシスを感作および誘導する。癌性細胞は、しばしばＭＨＣペプチド提示機構に障害があり、抗原提示のダウンレギュレーションを生じる。抗原の喪失、したがって形質転換細胞の認識の喪失は、適応免疫応答を弱める。非ＭＨＣ制限合成抗原受容体を有する操作されたＴ細胞の使用は、適応免疫系が負担をクリアするために十分な強力な応答を生成していない腫瘍を標的とする戦略を提供する。非ＭＨＣ制限合成抗原受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、三機能抗原受容体（ＴＡＣ）、および抗原結合後にＴ細胞を活性化できる他の受容体を含む新しいクラスのＴ細胞活性化受容体を包含する。これらの新規合成抗原受容体を発現するように設計されたＴ細胞は、ネイティブＴＣＲに加えて、新規抗原を標的とする能力を獲得し、腫瘍－抗原相互作用時に、認識およびＴ細胞活性化を媒介する。興味深いことに、これらの受容体は、天然のＴＣＲレパートリーを超えてエピトープを標的とする能力を可能にし、炭水化物および糖脂質などの分子まで抗原選択を拡大する。操作Ｔ細胞療法は、ＭＨＣに制限されていない腫瘍抗原を標的とする能力、ＰＢＭＣの入手の容易さ、およびアゴニスト抗体の全身投与を超えた安全性の向上により、癌治療への魅力的なアプローチを提供する。ＣＡＲで操作されたＴ細胞の臨床的成功は、この新たなクラスの細胞薬物の実現可能性および治療効力を確立した。
【0005】
共刺激／共抑制シグナルは、ＴＣＲライゲーションと同時に起こり、Ｔ細胞機能を調節するシグナルである。共刺激／共抑制シグナルのタイプおよび強度は、適応免疫応答の進行を決定付ける。腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）およびリガンドは、鍵となる共刺激／共抑制分子である。ＴＮＦＲＳＦのメンバーは、複数の方法でＴ細胞の応答を媒介する。炎症環境に依存して、ＴＮＦＲＳＦによって伝播されるシグナルは、抗原に応答して、および記憶応答中に、ナイーブＴ細胞から生成されるメモリーＴ細胞へのエフェクターの分化を刺激または抑制する可能性がある。Ｔ細胞は、ナイーブ、エフェクター、記憶の各段階を含む、応答の各段階で固有の活性化または生存シグナルを受け取り、共刺激シグナルは、これらの応答を駆動する主要な構成要素である。興味深いことに、共刺激シグナルが使用されて、共抑制シグナルを制限しながらＴ細胞応答を駆動することができる。しかし、これらの応答がどのように調整されるかは完全には理解されていない。いくつかのＴＮＦＲＳＦの発現は、Ｔ細胞の活性化に続いて誘導されることが示され、これらの分子の発現は遍在しないことから、これらの分子がさまざまな集団の免疫応答を調節する役割を果たしている可能性が示唆されている。また、さまざまな刺激が、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によるＴＮＦＲＳＦリガンドの発現を促進する可能性があり、これには、先天性（細菌性リガンド）および適応シグナル（炎症性サイトカイン）が含まれる。したがって、ＴＮＦＲＳＦは、適応免疫応答の各段階で、Ｔ細胞上の受容体の発現と他の免疫細胞でのリガンド発現の両方を介してＴ細胞免疫を調節するために役立つ。
【発明の概要】
【0006】
概要
本発明者らは、様々な腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）受容体からの機能的ドメインから構成されるキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）が、Ｔ細胞刺激応答を含む所望の応答に対するＴＮＦＲＳＦリガンドによって引き起こされるシグナル伝達を再プログラムできることを実証した。
本発明者らは、様々な腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）受容体からの機能的ドメインから構成されるキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）が、Ｔ細胞刺激応答を含む所望の応答に対するＴＮＦＲＳＦリガンドによって引き起こされるシグナル伝達を再プログラムできることを実証した。
【0007】
したがって、本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸であって（ａ）腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーの細胞外ドメインをコードする第１のポリヌクレオチド、（ｂ）膜貫通ドメインポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、および（ｃ）細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド（例えば、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）メンバーから）を含む、キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸である。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドおよび第３のポリヌクレオチドは、ＴＮＦＲＳＦの異なるメンバーに由来する。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、デスドメインを有するＴＮＦＲＳＦメンバーの細胞外ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、腫瘍壊死因子受容体１（ＴＮＦＲ１）、腫瘍壊死因子受容体２（ＴＮＦＲ２）、Ｆａｓ受容体、デスドメイン４（ＤＲ４）、デスドメイン５（ＤＲ５）、デスドメイン３（ＤＲ３）、デスドメイン６（ＤＲ６）、外胚葉異形成受容体（ＥＤＡＲ）、。Ａ２受容体（ＸＥＤＡＲ）、ＴＲＯＹ、または神経成長因子受容体（ＮＧＦＲ）の細胞外ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、ＴＮＦＲ１の細胞外ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、ＴＮＦＲ２の細胞外ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、Ｆａｓの細胞外ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、ＤＲ４の細胞外ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、ＤＲ５の細胞外ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、配列番号１に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一であるオリゴペプチドをコードする。第１のポリヌクレオチドは、配列番号２に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一であるオリゴペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、４－１ＢＢ、ＢＡＦＦＲ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、ＲＥＬＴ、ＴＡＣＩ、ＴＲＯＹ、またはＴＷＥＡＫからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、ＢＡＦＦＲからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、４－１ＢＢからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、ＣＤ２７からの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、ＨＶＥＭからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、ＯＸ４０からの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、ＧＩＴＲからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、ＴＡＣＩからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、配列番号３に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一であるオリゴペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、配列番号４に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一であるオリゴペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインポリペプチドは、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーからの膜貫通ドメインポリペプチドである。いくつかの実施形態において、第２のポリヌクレオチドは、配列番号５に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一であるオリゴペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、第２のポリヌクレオチドは、配列番号６に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一であるオリゴペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインおよび細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインは、同じ共刺激シグナル伝達タンパク質に由来する。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢ、ＢＡＦＦＲ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、ＲＥＬＴ、ＴＡＣＩ、ＴＲＯＹ、またはＴＷＥＡＫに由来する。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、直接的におよび／または間接的に（例えば、リンカーを介して）第３のポリヌクレオチドに結合される。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドおよび第３のポリヌクレオチドは、直接的におよび／または間接的に（例えば、リンカーを介して）第２のポリヌクレオチドに結合される。
【0008】
本明細書でさらに開示されるのは、特定の実施形態において、キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸であって、（ａ）腫瘍壊死因子受容体１の細胞外ドメインをコードする第１のポリヌクレオチド、（ｂ）膜貫通ドメインポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、および（ｃ）細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド（例えば、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）メンバーから）を含むキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸である。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、配列番号１に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一であるオリゴペプチドをコードする。細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢ、ＢＡＦＦＲ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、ＲＥＬＴ、ＴＡＣＩ、ＴＲＯＹ、またはＴＷＥＡＫからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインである。いくつかの実施形態において、細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインは、ＢＡＦＦＲからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインである。いくつかの実施形態において、細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインである。いくつかの実施形態において、細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７からの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインである。いくつかの実施形態において、細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインは、ＨＶＥＭからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインである。いくつかの実施形態において、細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインは、ＯＸ４０からの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインである。いくつかの実施形態において、細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインは、ＧＩＴＲからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインである。いくつかの実施形態において、細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインは、ＴＡＣＩからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインである。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、配列番号３に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一であるオリゴペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、配列番号４に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一であるオリゴペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインポリペプチドは、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーからの膜貫通ドメインポリペプチドである。いくつかの実施形態において、第２のポリヌクレオチドは、配列番号５に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一であるオリゴペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、第２のポリヌクレオチドは、配列番号６に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一であるオリゴペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインおよび細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインは、同じ共刺激シグナル伝達タンパク質に由来する。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢ、ＢＡＦＦＲ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、ＲＥＬＴ、ＴＡＣＩ、ＴＲＯＹ、またはＴＷＥＡＫに由来する。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、直接的におよび／または間接的に（例えば、リンカーを介して）第３のポリヌクレオチドに結合される。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドおよび第３のポリヌクレオチドは、直接的にまたは間接的に（例えば、リンカーを介して）第２のポリヌクレオチドに結合される。
【0009】
本明細書でさらに開示されるのは、特定の実施形態において、キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸であって、（ａ）腫瘍壊死因子受容体２の細胞外ドメインをコードする第１のポリヌクレオチド。（ｂ）膜貫通ドメインポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド；（ｃ）細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド（例えば、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）メンバーから）を含む、キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸である。いくつかの実施形態において、細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢ、ＢＡＦＦＲ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、ＲＥＬＴ、ＴＡＣＩ、ＴＲＯＹ、またはＴＷＥＡＫからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインである。いくつかの実施形態において、細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインは、ＢＡＦＦＲからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインである。いくつかの実施形態において、細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインである。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、ＣＤ２７からの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、ＨＶＥＭからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、ＯＸ４０からの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、ＧＩＴＲからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、ＴＡＣＩからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、配列番号３に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一であるオリゴペプチドをコードする。第３のポリヌクレオチドは、配列番号４に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一であるオリゴペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインポリペプチドは、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーからの膜貫通ドメインポリペプチドである。いくつかの実施形態において、第２のポリヌクレオチドは、配列番号５に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一であるオリゴペプチドをコードする。第２のポリヌクレオチドは、配列番号６に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一であるオリゴペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインおよび細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインは、同じ共刺激シグナル伝達タンパク質に由来する。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢ、ＢＡＦＦＲ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、ＲＥＬＴ、ＴＡＣＩ、ＴＲＯＹ、またはＴＷＥＡＫに由来する。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、直接的におよび／または間接的に（例えば、リンカーを介して）第３のポリヌクレオチドに結合される。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドおよび第３のポリヌクレオチドは、直接的におよび／または間接的に（例えば、リンカーを介して）第２のポリヌクレオチドに結合される。
【0010】
本明細書でさらに開示されるのは、特定の実施形態において、キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸であって、（ａ）腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー６（ＴＮＦＲＳＦ６；Ｆａｓ）の細胞外ドメインをコードする第１のポリヌクレオチド、（ｂ）膜貫通ドメインポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、および（ｃ）細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド（例えば、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）メンバーから）を含むキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸である。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、配列番号２に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一であるオリゴペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢ、ＢＡＦＦＲ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、ＲＥＬＴ、ＴＡＣＩ、ＴＲＯＹ、またはＴＷＥＡＫからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインである。いくつかの実施形態において、細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインは、ＢＡＦＦＲからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインである。いくつかの実施形態において、細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインである。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、ＣＤ２７からの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、ＨＶＥＭからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、ＯＸ４０からの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、ＧＩＴＲからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、ＴＡＣＩからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、配列番号３に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一であるオリゴペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、配列番号４に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一であるオリゴペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインポリペプチドは、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーからの膜貫通ドメインポリペプチドである。いくつかの実施形態において、第２のポリヌクレオチドは、配列番号５に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一であるオリゴペプチドをコードする。第２のポリヌクレオチドは、配列番号６に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一であるオリゴペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインおよび細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインは、同じ共刺激シグナル伝達タンパク質に由来する。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢ、ＢＡＦＦＲ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、ＲＥＬＴ、ＴＡＣＩ、ＴＲＯＹ、またはＴＷＥＡＫに由来する。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、直接的におよび／または間接的に（例えば、リンカーを介して）第３のポリヌクレオチドに結合される。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドおよび第３のポリヌクレオチドは、直接的におよび／または間接的に（例えば、リンカーを介して）第２のポリヌクレオチドに結合される。
【0011】
本明細書でさらに開示されるのは、特定の実施形態において、本明細書に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸によってコードされるポリペプチドである。
【0012】
本明細書でさらに開示されるのは、特定の実施形態において、配列番号７に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一であるキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチドである。
【0013】
本明細書でさらに開示されるのは、特定の実施形態において、配列番号８に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一であるキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチドである。
【0014】
本明細書でさらに開示されるのは、特定の実施形態において、配列番号９に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一であるキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチドである。
【0015】
本明細書でさらに開示されるのは、特定の実施形態において、配列番号１０に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一であるキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）ポリペプチドである。
【0016】
さらに、本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、本明細書に記載のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸を発現するか、または本明細書に開示されるポリペプチドを含むＴ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、またはガンマ－デルタＴ細胞である。
【0017】
また、本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、（例えば、治療を必要とする対象における癌を治療するための）Ｔ細胞であって、（ａ）本明細書に開示されるキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸、（ｂ）標的特異的リガンドを認識できる操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）または合成抗原受容体ポリペプチドをコードする第２の核酸を含むＴ細胞である。いくつかの実施形態において、標的特異的リガンドは、癌性細胞上の抗原に結合する。いくつかの実施形態において、合成抗原受容体ポリヌクレオチドは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞抗原カプラー（ＴＡＣ）、またはＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）である。いくつかの実施形態において、合成抗原受容体ポリヌクレオチドは、Ｔ細胞抗原カプラー（ＴＡＣ）である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、またはガンマ－デルタＴ細胞である。
【0018】
また、本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、（例えば、治療を必要とする対象における癌を治療するための）Ｔ細胞であって、上記Ｔ細胞は、（ａ）（ｉ）腫瘍壊死因子受容体１からの細胞外ドメインをコードする第１のポリヌクレオチド、（ｉｉ）膜貫通ドメインポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、および（ｉｉｉ）細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド（例えば、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）メンバーから）含むキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸、ならびに（ｂ）標的特異的リガンドを認識できる、操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）または合成抗原受容体ポリペプチドをコードする第２の核酸を含む。いくつかの実施形態において、キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸の第３のポリヌクレオチドは、４－１ＢＢ、ＢＡＦＦＲ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、ＲＥＬＴ、ＴＡＣＩ、ＴＲＯＹ、またはＴＷＥＡＫからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸の第３のポリヌクレオチドは、ＢＡＦＦＲからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸の第３のポリヌクレオチドは、４－１ＢＢからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、ＣＤ２７からの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、ＨＶＥＭからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、ＯＸ４０からの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、ＧＩＴＲからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、ＴＡＣＩからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインおよび細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインは、同じ共刺激シグナル伝達タンパク質に由来する。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢ、ＢＡＦＦＲ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、ＲＥＬＴ、ＴＡＣＩ、ＴＲＯＹ、またはＴＷＥＡＫに由来する。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、直接的にまたは間接的に（例えば、リンカーを介して）第３のポリヌクレオチドに結合される。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドおよび第３のポリヌクレオチドは、直接的にまたは間接的に（例えば、リンカーを介して）第２のポリヌクレオチドに結合される。いくつかの実施形態において、標的特異的リガンドは、癌性細胞上の抗原に結合する。いくつかの実施形態において、合成抗原受容体ポリヌクレオチドは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞抗原カプラー（ＴＡＣ）、またはＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）である。いくつかの実施形態において、合成抗原受容体ポリヌクレオチドは、Ｔ細胞抗原カプラー（ＴＡＣ）である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、またはガンマ－デルタＴ細胞である。
【0019】
また、本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、（例えば、治療を必要とする対象における癌を治療するための）Ｔ細胞であって、上記Ｔ細胞は、（ａ）（ｉ）腫瘍壊死因子受容体２からの細胞外ドメインをコードする第１のポリヌクレオチド、（ｉｉ）膜貫通ドメインポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、および（ｉｉｉ）細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド（例えば、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）メンバーから）を含むキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸、ならびに（ｂ）標的特異的リガンドを認識できる操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）または合成抗原受容体ポリペプチドをコードする第２の核酸を含む。いくつかの実施形態において、キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸の第３のポリヌクレオチドは、４－１ＢＢ、ＢＡＦＦＲ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、ＲＥＬＴ、ＴＡＣＩ、ＴＲＯＹ、またはＴＷＥＡＫからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸の第３のポリヌクレオチドは、ＢＡＦＦＲからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸の第３のポリヌクレオチドは、４－１ＢＢからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸の第３のポリヌクレオチドは、ＣＤ２７からの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸の第３のポリヌクレオチドは、ＨＶＥＭからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸の第３のポリヌクレオチドは、ＯＸ４０からの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸の第３のポリヌクレオチドは、ＧＩＴＲからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸の第３のポリヌクレオチドは、ＴＡＣＩからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインおよび細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインは、同じ共刺激シグナル伝達タンパク質に由来する。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢ、ＢＡＦＦＲ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、ＲＥＬＴ、ＴＡＣＩ、ＴＲＯＹ、またはＴＷＥＡＫに由来する。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、直接的にまたは間接的に（例えば、リンカーを介して）第３のポリヌクレオチドに結合される。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドおよび第３のポリヌクレオチドは、直接的にまたは間接的に（例えば、リンカーを介して）第２のポリヌクレオチドに結合される。いくつかの実施形態において、標的特異的リガンドは、癌性細胞上の抗原に結合する。いくつかの実施形態において、合成抗原受容体ポリヌクレオチドは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞抗原カプラー（ＴＡＣ）、またはＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）である。いくつかの実施形態において、合成抗原受容体ポリヌクレオチドは、Ｔ細胞抗原カプラー（ＴＡＣ）である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、またはガンマ－デルタＴ細胞である。
【0020】
また、本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、（例えば、治療を必要とする対象における癌を治療するための）Ｔ細胞であって、上記Ｔ細胞は、（ａ）（ｉ）Ｆａｓ受容体からの細胞外ドメインをコードする第１のポリヌクレオチド、（ｉｉ）膜貫通ドメインポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、および（ｉｉｉ）細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド（例えば、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）メンバーから）を含むキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸、ならびに（ｂ）標的特異的リガンドを認識できる操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）または合成抗原受容体ポリペプチドをコードする第２の核酸を含む。いくつかの実施形態において、キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸の第３のポリヌクレオチドは、４－１ＢＢ、ＢＡＦＦＲ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、ＲＥＬＴ、ＴＡＣＩ、ＴＲＯＹ、またはＴＷＥＡＫからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸の第３のポリヌクレオチドは、ＢＡＦＦＲからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸の第３のポリヌクレオチドは、４－１ＢＢからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸の第３のポリヌクレオチドは、ＣＤ２７からの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸の第３のポリヌクレオチドは、ＨＶＥＭからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸の第３のポリヌクレオチドは、ＯＸ４０からの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸の第３のポリヌクレオチドは、ＧＩＴＲからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸の第３のポリヌクレオチドは、ＴＡＣＩからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインおよび細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインは、同じ共刺激シグナル伝達タンパク質に由来する。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢ、ＢＡＦＦＲ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、ＲＥＬＴ、ＴＡＣＩ、ＴＲＯＹ、またはＴＷＥＡＫに由来する。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、直接的にまたは間接的に（例えば、リンカーを介して）第３のポリヌクレオチドに結合される。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドおよび第３のポリヌクレオチドは、直接的にまたは間接的に（例えば、リンカーを介して）第２のポリヌクレオチドに結合される。いくつかの実施形態において、標的特異的リガンドは、癌性細胞上の抗原に結合する。いくつかの実施形態において、合成抗原受容体ポリヌクレオチドは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞抗原カプラー（ＴＡＣ）、またはＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）である。いくつかの実施形態において、合成抗原受容体ポリヌクレオチドは、Ｔ細胞抗原カプラー（ＴＡＣ）である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、またはガンマ－デルタＴ細胞である。
【0021】
本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、治療を必要とする個体における癌を治療する方法であって、キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸を含む免疫細胞を個体に投与する工程を含み、上記免疫細胞は、（ａ）腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外ドメインをコードする第１のポリヌクレオチド、（ｂ）膜貫通ドメインポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、および（ｃ）細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド（例えば、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）メンバーから）を含む。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドおよび第３のポリヌクレオチドは、ＴＮＦＲＳＦの異なるメンバーに由来する。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、デスドメインを有するＴＮＦＲＳＦメンバーの細胞外ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、Ｆａｓ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＤＲ３、ＤＲ６、ＥＤＡＲ、ＸＥＤＡＲ、ＴＲＯＹ、またはＮＧＦＲの細胞外ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、４－１ＢＢ、ＢＡＦＦＲ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、ＲＥＬＴ、ＴＡＣＩ、ＴＲＯＹ、またはＴＷＥＡＫからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、免疫細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、操作されたＴ細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞はナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）である。いくつかの実施形態において、免疫細胞はマクロファージである。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は単球である。いくつかの実施形態では、免疫細胞はＢ細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、本明細書に開示される免疫細胞である。いくつかの実施形態では、癌は白血病またはリンパ腫である。いくつかの実施形態では、癌は、混合系統白血病（ＭＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、高悪性度Ｂ細胞リンパ腫、または濾胞性リンパ腫に起因する大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である。いくつかの実施形態では、癌は、肺癌、乳癌、結腸癌、多発性骨髄腫、膠芽細胞腫、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、卵巣癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、結腸直腸癌、尿路上皮癌、子宮内膜癌、または黒色腫である。いくつかの実施形態では、癌は肺癌である。いくつかの実施形態では、癌は乳癌である。いくつかの実施形態では、癌は結腸癌である。いくつかの実施形態では、癌は多発性骨髄腫である。いくつかの実施形態では、癌は膠芽細胞腫である。いくつかの実施形態では、癌は胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）である。いくつかの実施形態では、癌は卵巣癌である。いくつかの実施形態では、癌は胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）である。いくつかの実施形態では、癌は尿路上皮癌である。いくつかの実施形態では、癌は子宮内膜癌である。いくつかの実施形態では、癌は黒色腫である。
【0022】
本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、医薬組成物であって、（ａ）（ｉ）腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外ドメインをコードする第１のポリヌクレオチド、（ｉｉ）膜貫通ドメインポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、および（ｉｉｉ）細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド（例えば、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）メンバーから）、ならびに（ｂ）薬学的に許容可能な担体を含む、免疫細胞を含む医薬組成物である。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドおよび第３のポリヌクレオチドは、ＴＮＦＲＳＦの異なるメンバーに由来する。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、デスドメインを有するＴＮＦＲＳＦメンバーの細胞外ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、Ｆａｓ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＤＲ３、ＤＲ６、ＥＤＡＲ、ＸＥＤＡＲ、ＴＲＯＹまたはＮＧＦＲの細胞外ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、ＴＮＦＲ１の細胞外ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、ＴＮＦＲ２の細胞外ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、Ｆａｓの細胞外ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、４－１ＢＢ、ＢＡＦＦＲ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、ＲＥＬＴ、ＴＡＣＩ、ＴＲＯＹ、またはＴＷＥＡＫからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、ＢＡＦＦＲからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、４－１ＢＢからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、ＣＤ２７からの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、ＨＶＥＭからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、ＯＸ４０からの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、ＧＩＴＲからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、ＴＡＣＩからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインおよび細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインは、同じ共刺激シグナル伝達タンパク質に由来する。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢ、ＢＡＦＦＲ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、ＲＥＬＴ、ＴＡＣＩ、ＴＲＯＹ、またはＴＷＥＡＫに由来する。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、直接的にまたは間接的に（例えば、リンカーを介して）第３のポリヌクレオチドに結合される。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドおよび第３のポリヌクレオチドは、直接的にまたは間接的に（例えば、リンカーを介して）第２のポリヌクレオチドに結合される。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、マクロファージ、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、単球、またはＢ細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、本明細書に開示される免疫細胞である。
【0023】
本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、（ａ）本明細書に開示されるキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）、および（ｂ）哺乳動物細胞において機能するプロモーターを含むベクター構築物である。
【0024】
本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、本明細書に開示されるベクター構築物でトランスフェクトされた、単離もしくは操作されたＴリンパ球、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、腫瘍浸潤リンパ球または単球である。
【0025】
本出願の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかしながら、詳細な説明および特定の例は、出願の実施形態を示すが、例示としてのみ与えられ、特許請求の範囲は、これらの実施形態によって限定されるべきではなく、全体としての説明と一致する最も広い解釈が与えられるべきであることを理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【0026】
ここで、本出願の実施形態を、以下の添付の図面を参照してより詳細に説明する。
【図1】ＴＮＦＲ１－４－１ＢＢキメラ共刺激受容体の原理である。ネイティブＴ細胞受容体（ＴＣＲ）との関連におけるＴＮＦＲ１－４－１ＢＢキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）の仮想生物学を図解する。ＴＣＲのライゲーション後に活性化Ｔ細胞によって分泌されるＴＮＦαはＴＮＦαの産生をもたらし、これがＣＣＲをライゲーションし、生存率の向上につながる下流経路の活性化を促進する。
【図2A】キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）の設計である。図２Ａは、ネイティブＴＮＦＲ１の細胞外ドメインと膜貫通ドメインの両方を含むＴＮＦ－ブロッカー受容体である、全長ネイティブＴＮＦＲ１受容体（ａ）を、切断された非シグナル伝達細胞質ドメイン（ｂ）、ならびに、４－１ＢＢの細胞質共刺激シグナル伝達ドメインに結合したＴＮＦＲ１の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含むキメラ共刺激受容体（ｃ）と比較する。
【図2B】キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）の設計である。図２Ｂは、ネイティブＦａｓの細胞外ドメインと膜貫通ドメインの両方を含むＦａｓ－ＴＲＵＮＣ受容体である、全長ネイティブＦａｓ受容体（ａ）を、切断された非シグナル伝達細胞質ドメイン（ｂ）、ならびに、４－１ＢＢまたはＢＡＦＦＲの細胞質共刺激シグナル伝達ドメインに結合したＦａｓの細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含むＦａｓキメラ（ｃ）と比較する。
【図3】ＴＮＦＲ１－４－１ＢＢはＮＦκＢプロモーターの発現を増強する図である。ＴＮＦＲ融合受容体シグナル伝達活性は、３×ＮＦκＢエンハンサーエレメントの制御下で、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を使用して評価された。図２ＡからのＴＮＦＲ融合受容体は、ＮＦκＢ－ルシフェラーゼレポータープラスミドとともにＨＥＫ２９３ＴＭ細胞株に個別に導入された。ルシフェラーゼ活性は、ＴＮＦＲ融合受容体のリガンドであるＴＮＦαの濃度を上げながら測定した。ネイティブＴＮＦＲ１受容体を有するＨＥＫ２９３ＴＭ細胞は、ＮＦκＢレポーター活性の用量依存的な増加を示した。ＴＮＦ－ブロッカー受容体は、ＴＮＦαリガンドの増加に応答して、レポーター活性の無効化を示した。ＴＮＦＲ１－４－１ＢＢ ＣＣＲは、すべての濃度のＴＮＦαでＮＦκＢレポーター活性を増強することを実証した。
【図4】ＣＣＲ刺激によるＩκＢαの時間依存性分解である。ＩκＢαの分解は、活性ＮＦκＢの放出をもたらす。ジャーカット細胞株を形質導入して、シグナル伝達ドメインを含まないＴＮＦＲ１－４－１ＢＢ ＣＣＲまたはＴＮＦ－ブロッカー受容体を発現させた（図２Ａを参照）。ジャーカット細胞を２０ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦαで０、５、１５、３０、４５分間刺激した。ＣＣＲで操作されたジャーカット細胞は、操作されていない野生型細胞と比較して、ＩκＢαの分解が増加している。ＴＮＦ－ブロッカー受容体は、評価されたすべての時点でＩκＢα分解を無効にした（ｎ＝４）。
【図5】ｐ３８の時間依存性リン酸化である。ｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化および活性化は、ｐ３８遺伝子のアップレギュレーションをもたらす。ジャーカット細胞株は、シグナル伝達ドメインを含まないＣＣＲまたはＴＮＦ－ブロッカー受容体を発現するように形質導入された（図２Ａを参照）。ジャーカット細胞を２０ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦαで０、５、１５、３０、４５分間刺激した。ＣＣＲで操作されたジャーカット細胞では、操作されていない野生型細胞と比較して、ｐ３８のリン酸化が増加している。ＴＮＦ－ブロッカー受容体は、評価されたすべての時点でｐ３８リン酸化を妨害し無効にした（ｎ＝１）。
【図6】図６Ａおよび６Ｂは、初代ヒトＴ細胞サブセットにおけるＴＮＦＲ１－４－１ＢＢ ＣＣＲの表面発現である。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズで刺激され、ＩＬ２およびＩＬ７中で増殖されたヒトＰＢＭＣは、ＴＮＦＲ１－４－１ＢＢ ＣＣＲで操作された。培養の１４日目に、操作された細胞をＣＣＲについて染色し、フローサイトメトリーによって評価した。図６ＡはＣＤ４＋Ｔ細胞を表し、図６ＢはＣＤ８＋Ｔ細胞を表す。
【図7】インビトロでのＴＮＦＲ１－４－１ＢＢ ＣＣＲ形質導入初代ヒトＴ細胞の増殖速度である。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズで刺激され、ＩＬ２およびＩＬ７中で増殖されたヒトＰＢＭＣは、ＴＮＦＲ１－４－１ＢＢ ＣＣＲで操作された。生細胞数は、１４日間の培養期間にわたって記録された。
【図8】図８Ａおよび図８Ｂは、サイトカイン除去後のＴＮＦＲ１－４－１ＢＢ ＣＣＲを発現するＴ細胞の生存を示す。図８Ａは、成長因子を補充せずに抗ＣＤ３単独で刺激されたＴ細胞を示す。図８Ｂは、サイトカインを補充せずにＴＮＦα単独で刺激されたＴ細胞を示す。
【図9】ＴＮＦＲ１－４－１ＢＢ ＣＣＲ刺激がサイトカインプロファイルを変化させる図である。ＴＮＦＲ１－４－１ＢＢ ＣＣＲで操作されたＴ細胞は、抗ＣＤ３刺激後のサイトカイン産生について培養の１４日目に試験された。細胞を、ゴルジ輸送阻害剤（ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（登録商標））の存在下で、抗ＣＤ３コートしたプレート上で４時間インキュベートした。細胞を染色し、細胞内サイトカイン産生についてフローサイトメトリーで評価した。
【図10】２Ａ発現系で操作されたＴＡＣ＋ＣＣＲ Ｔ細胞の表現型。Ｔ細胞は、０日目に抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズで活性化された。１日後、Ｔ細胞に、骨髄腫タンパク質、ＢＣＭＡに対するＴＡＣ受容体を有するレンチウイルス、またはピコルナウイルス２Ａ配列によって分離されたＴＮＦＲ１－４－１ＢＢ ＣＣＲを伴う、同じＴＡＣ受容体（ＴＡＣ＋ＣＣＲ）をコードするレンチウイルスのいずれかを形質導入した。細胞は、ＩＬ２およびＩＬ７を有する培養中で、２日ごとに新鮮な培地を添加して維持した。フローサイトメトリーによる表面ＴＡＣおよびＣＣＲの染色および検出は、培養の１４日目に実行した。２ＡシステムにおけるＴＡＣの表面タンパク質レベルは、単一発現系よりも低かった。ＴＮＦＲ１－４－１ＢＢ ＣＣＲタンパク質は、２Ａ操作Ｔ細胞の表面で検出された。
【図11】ＴＡＣ＋ＣＣＲ Ｔ細胞はＢＣＭＡ＋腫瘍細胞標的の溶解を実証する。インビトロ腫瘍標的のＴ細胞媒介性溶解。Ｔ細胞は、ルシフェラーゼ酵素を発現するＫＭＳ１１腫瘍標的とともに２４時間共インキュベートされた。ルシフェラーゼ活性は、腫瘍細胞溶解の尺度として使用された。ＵＴ（非操作）Ｔ細胞は、ＫＭＳ１１腫瘍標的の検出不可能な腫瘍崩壊を実証した。ＴＡＣまたはＴＡＣ＋ＣＣＲで操作されたＴ細胞は、図１０に記載される通りである。両方の操作されたＴ細胞集団は、２４時間のアッセイにわたって腫瘍標的の同様の溶解を実証した。
【図12】ＣＣＲで操作されたＴＡＣ Ｔ細胞は、刺激による炎症性サイトカインの産生が少ない。操作されたＴ細胞は、ゴルジ輸送阻害剤（Ｇｏｌｇｉ Ｐｌｕｇ）の存在下でＫＭＳ１１腫瘍標的と共インキュベートされた。４時間の共インキュベーション後、細胞内サイトカイン産生について細胞を染色した。サイトカインＩＬ２、ＴＮＦα、およびＩＦＮγを評価した。ＴＡＣ Ｔ細胞は、同族のリガンドを認識した後、ＴＮＦαとＩＦＮγを容易に産生する。ＴＮＦＲ１－４－１ＢＢ ＣＣＲを共発現するＴＡＣ Ｔ細胞は、サイトカイン分泌細胞の産生が少ないようである。
【図13】図１３Ａ－Ｂは、ＴＡＣ＋ＣＣＲ操作Ｔ細胞の増殖および富化である。図１３Ａは、増殖する操作されたＴ細胞の希釈ピークを示すＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）Ｖｉｏｌｅｔヒストグラムを示す。図１３Ｂは、ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞の分裂指数および増殖指数の定量化を示す。データ点は、対の増殖アッセイを示す。分裂指数は、分裂細胞となったＴ細胞の平均数を表す。増殖アッセイは、最初の細胞Ｔ細胞となった平均数を表す。ＢＣＭＡ特異的ＴＡＣおよびＴＮＦＲ１－４－１ＢＢ ＣＣＲを発現するように設計されたＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞（ＴＡＣ＋ＣＯＳＴＩＭ）は、ＢＣＭＡ特異的ＴＡＣ単独を発現するＴ細胞（ＴＡＣ）と比較して高い分裂指数値を示した。ＢＣＭＡ特異的ＴＡＣおよびＴＮＦＲ１－４－１ＢＢ ＣＣＲを発現するように設計されたＣＤ４＋Ｔ細胞（ＴＡＣ＋ＣＯＳＴＩＭ）は、ＢＣＭＡ特異的ＴＡＣのみを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞（ＴＡＣ）よりも高い増殖指数値を示した（＊ｐ＜０．０５）。
【図14】ＴＮＦＲＳＦスクリーニングのための抗ＣＤ３刺激増殖。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズで刺激され、ＩＬ２およびＩＬ７中で増殖されたＰＢＭＣは、ＴＮＦＲ１－４－１ＢＢ ＣＣＲ、ＴＮＦ－ブロッカー、およびＮＧＦＲ（形質導入対照）で操作された。培養の１４日目に、操作された細胞は、プレート結合抗ＣＤ３刺激を５日間行った後、増殖について評価した。細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）Ｖｉｏｌｅｔで標識し、生成ピークをフローサイトメトリーで評価した。プレート結合抗ＣＤ３は、すべてのグループにおいて、ＣＤ４とＣＤ８Ｔ細胞の両方で増殖を刺激した。ＴＮＦＲ１－４－１ＢＢ ＣＣＲで操作されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＮＧＦＲまたはＴＮＦ－ブロッカーで操作された細胞よりも増殖性が高かった。
【図15】ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞のＴＮＦＲＳＦ ＣＣＲ操作効率。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズで刺激され、ＩＬ２およびＩＬ７中で増殖されたＰＢＭＣは、Ｙ軸に列挙されたＴＮＦＲＳＦ ＣＣＲ構築物で操作された。培養の１４日目に、バルク細胞集団の操作効率を評価した。遺伝子カセットに含まれる形質導入マーカーであるＮＧＦＲについて細胞を染色した。細胞はリンパ球／単一細胞／ＣＤ４＋またはＣＤ８＋／ＮＧＦＲ＋でゲートされた（Ｎ＝１－５）。
【図16】ＣＣＲの平均蛍光強度。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズで刺激され、ＩＬ２およびＩＬ７中で増殖されたＰＢＭＣは、Ｙ軸に列挙されたＴＮＦＲＳＦ ＣＣＲスクリーニング構築物で操作された。培養の１４日目に、操作された細胞のＣＣＲ表面発現について評価した。細胞を、ＣＣＲ（ＴＮＦＲ１）の細胞外部分について染色した。ＣＣＲ ＭＦＩは、集団ゲートリンパ球／単一細胞／ＣＤ４＋またはＣＤ８＋／ＮＧＦＲ＋に対して計算された。ＣＣＲ ＭＦＩは、実験間のバッチ効果を修正するために、元のＴＮＦＲ１－４－１ＢＢ ＣＣＲ（ＯＧ４－１ＢＢ）ＭＦＩに正規化されて報告される（Ｎ＝１－５）。
【図17】ＣＣＲ Ｔ細胞の増殖。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズで刺激され、ＩＬ２およびＩＬ７中で増殖されたＰＢＭＣは、Ｙ軸に列挙されたＴＮＦＲＳＦ ＣＣＲスクリーニング構築物で操作された。培養物には、２日ごとに新鮮な培地とサイトカインを供給した。培養１４日目に、バルク細胞集団について生細胞数を記録した。培養は１０５個のＰＢＭＣで開始された。ＮＧＦＲで形質導入された対照は赤色でマークされる（Ｎ＝１－５）。
【図18】ＣＤ４ ＣＣＲ Ｔ細胞増殖。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズで刺激され、ＩＬ２およびＩＬ７中で増殖されたＰＢＭＣは、Ｙ軸に列挙されたＴＮＦＲＳＦ ＣＣＲスクリーニング構築物で操作された。培養の１４日目に、プレートに結合した抗ＣＤ３で５日間刺激した後、操作された細胞を増殖について評価した。細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）Ｖｉｏｌｅｔで標識し、生成ピークをフローサイトメトリーで評価した。増殖はＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）増殖モデリングによって定量化され、増殖指数によって表される。ＮＧＦＲ形質導入マーカー単独で操作された対照細胞が識別される（赤色の線）。細胞集団は、生細胞／リンパ球／単一細胞／ＣＤ４＋／ＮＧＦＲ＋でゲートされた。ＮＧＦＲで形質導入された対照は赤色でマークされる。
【図19】ＣＤ８ ＣＣＲ Ｔ細胞増殖スクリーニング。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズで刺激され、ＩＬ２およびＩＬ７中で増殖されたＰＢＭＣは、Ｙ軸に列挙されたＴＮＦＲＳＦ ＣＣＲスクリーニング構築物で操作された。培養の１４日目に、プレートに結合した抗ＣＤ３で５日間刺激した後、操作された細胞を増殖について評価した。細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）Ｖｉｏｌｅｔで標識し、生成ピークをフローサイトメトリーで評価した。増殖はＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）増殖モデリングによって定量化され、増殖指数によって表される。ＮＧＦＲ形質導入マーカーの単独で操作された対照細胞が識別される（赤色の線）。細胞集団は、生細胞／リンパ球／単一細胞／ＣＤ８＋／ＮＧＦＲ＋でゲートされた。ＮＧＦＲで形質導入された対照は赤色でマークされる。
【図20】ＣＣＲスクリーニング構築物のクラスタリング重心の相関ヒートマップ。ＴＮＦＲＳＦ ＣＣＲ操作されたＴ細胞の表現型および機能的データは、主成分分析（ＰＣＡ）およびＫ－ｍｅａｎｓクラスタリングによって分析された。クラスタリング重心の相関ヒートマップは、類似した属性を有するＣＣＲをグループ化する。異なる膜貫通ドメインとシグナル伝達ドメインは、樹状図でのグループ化を示すために異なる色で示される。分析で特定されたグループは、さらなる調査に重要なＣＣＲを強調するのに役立つ。
【図21】図２１Ａ－Ｂは、ＣＣＲ Ｔ細胞の増殖を示す。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズで刺激され、ＩＬ２およびＩＬ７中で増殖されたＰＢＭＣは、ＴＮＦＲ１－４－１ＢＢ、ＴＮＦＲ１－ＢＡＦＦＲ、ＴＮＦ－ブロッカー、またはＮＧＦＲ（形質導入対照）で操作された。培養の１４日目に、プレートに結合した抗ＣＤ３で５日間刺激した後、操作された細胞を増殖について評価した。細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）Ｖｉｏｌｅｔで標識し、生成ピークをフローサイトメトリーで評価した。増殖はＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）増殖モデリングによって定量化され、増殖指数によって表される。示される値は、ドナー内でＮＧＦＲ（形質導入対照）に正規化される。すべての条件において、プレートに結合した抗ＣＤ３刺激は、ＣＤ４とＣＤ８Ｔの両方の細胞サブセットで増殖をもたらした。図２１Ａは、ＴＮＦＲ－ＢＡＦＦＲおよびＴＮＦＲ１－４－１ＢＢＣ ＣＲで操作されたＣＤ４Ｔ細胞が、ＮＧＦＲまたはＴＮＦ－ブロッカーで操作された細胞よりも５日間にわたって増殖性が高かったことを示す。図２１Ｂにおいて、ＴＮＦＲ－ＢＡＦＦＲおよびＴＮＦＲ１－４－１ＢＢ ＣＣＲで操作されたＣＤ８Ｔ細胞は、ＮＧＦＲまたはＴＮＦ－ブロッカーで操作された細胞よりも、５日間にわたって増殖性が高かった（＊＝ｐ＜０．０５）。
【図22】図２２Ａ－Ｂは、ＣＣＲ操作Ｔ細胞の細胞内サイトカイン産生を示す。ＣＣＲ受容体で操作されたＴ細胞は、抗ＣＤ３刺激後のサイトカイン産生について、培養の１４日目に試験された。細胞を、ゴルジ輸送阻害剤（ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（登録商標））の存在下で、抗ＣＤ３コートされたプレート上で４時間インキュベートした。細胞を染色し、細胞内サイトカイン産生についてフローサイトメトリーによって評価した。図２２Ａは、刺激時に高いパーセンテージのＴ細胞がＩＦＮγを分泌することを示す。４－１ＢＢ／ＢＡＦＦＲ ＣＣＲまたはＴＮＦ－ブロッカーのいずれかで操作されたＴ細胞は、ＮＧＦＲ形質導入対照と比較してＩＦＮγ産生を変化させなかった。図２２Ｂは、高いパーセンテージの５３１（ＮＧＦＲ形質導入対照）操作されたＴ細胞が、抗ＣＤ３刺激時にＴＮＦαを産生することを示す。ＴＮＦ－ブロッカー、ＢＡＦＦＲ、または４－１ＢＢ ＣＣＲで操作された細胞は、ＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞の両方のサブセットで刺激を受けた後、ＴＮＦαを発現するＴ細胞の量が減少する。
【図23】図２３Ａ－ＣはＴＮＦＲ融合構築物を示す。ＰＣＲおよびｐＣＣＬベクターへのライゲーションのためのＴＮＦＲ融合構築物の代表的な図である。図２３Ａは、全長ＴＮＦＲ１ネイティブ受容体が、ＴＮＦＲ融合物の特徴付けにおける対照受容体としての使用のためにクローニングされたことを例証する。図２３Ｂは、ＴＮＦＲ１受容体の細胞外ドメインと膜貫通ドメインの両方を、４－１ＢＢの細胞内シグナル伝達ドメインに融合することによってＣＣＲ受容体がクローニングされ、共刺激ＴＮＦＲ１－４－１ＢＢ ＣＣＲ受容体を作製したことを示す。図２３Ｃは、ドミナントネガティブ受容体としての使用を例証しており、ネイティブＴＮＦＲ１受容体は、細胞質シグナル伝達ドメインを除去するために短縮化され、ＴＮＦブロッカー受容体と称した。
【図24】Ｆａｓ－キメラＴ細胞の操作効率。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズで活性化されたヒトＰＢＭＣを、図２Ｂに記載されるような、短縮型Ｆａｓ（ＦａｓＲ－ＴＲＵＮＣ）をコードするレンチウイルス、またはＦａｓの細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインならびに４－１ＢＢまたはＢＡＦＦ－Ｒの細胞質ドメインを含むＦａｓキメラのいずれか（それぞれ、Ｆａｓ－４１ＢＢおよびＦａｓ－ＢＡＦＦＲ）で形質導入した。対照として、ＰＢＭＣにＮＧＦＲをコードするレンチウイルスを形質導入した。細胞をＩＬ２／ＩＬ７中で増殖させ、２日ごとに新鮮な培地を添加した。培養の１４日目に、細胞を収集し、フローサイトメトリーを介する形質導入効率のために染色した。プロットのＸ軸は、指定された受容体を発現するように設計されたＴ細胞を示す（ｎ＝３、独立した実験）。
【図25】図２５Ａ－Ｂは、Ｆａｓキメラ操作Ｔ細胞の表面発現を示す。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズで活性化されたヒトＰＢＭＣを、図２Ｂに記載されるような、短縮型Ｆａｓをコードするレンチウイルス（ＦａｓＲ－ＴＲＵＮＣ）、またはＦａｓの細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインならびに４－１ＢＢまたはＢＡＦＦ－Ｒの細胞質ドメインを含むＦａｓキメラ（それぞれ、Ｆａｓ－４１ＢＢおよびＦａｓ－ＢＡＦＦＲ）のいずれかを形質導入した。対照として、ＰＢＭＣにＮＧＦＲをコードするレンチウイルスを形質導入した。細胞をＩＬ２／ＩＬ７中で増殖させ、２日ごとに新鮮な培地を添加した。培養の１４日目に、細胞を収集し、フローサイトメトリーを介してＦａｓについて染色した。図２５Ａは、ベースライン発現を超えるＦａｓを示すＮＧＦＲ陽性細胞％として示される、Ｆａｓキメラ操作Ｔ細胞におけるＦａｓおよびＮＧＦＲ発現のドットプロットである。図２５Ｂは。操作されたＴ細胞におけるＦａｓ発現（ＭＦＩ）の棒グラフである。ＮＧＦＲを超えるＦａｓ発現は、修飾されたＦａｓ受容体の間接的な尺度である。Ｘ軸は、指定された受容体を発現するように設計されたＴ細胞を示す。（（ｎ＝３）、独立した実験）。
【図26】初期拡大中のＦａｓキメラＴ細胞の増殖。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズで活性化されたヒトＰＢＭＣを、図２Ｂに記載されるような、短縮型Ｆａｓ（ＦａｓＲ－ＴＲＵＮＣ）をコードするレンチウイルス、またはＦａｓの細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインならびに４－１ＢＢまたはＢＡＦＦ－Ｒの細胞質ドメインを含むＦａｓキメラ（それぞれ、Ｆａｓ－４１ＢＢおよびＦａｓ－ＢＡＦＦＲ）のいずれかで形質導入した。対照として、ＰＢＭＣにＮＧＦＲをコードするレンチウイルスを形質導入した。細胞は、２日ごとに新鮮な培地を補充したＩＬ２／ＩＬ７中で増殖させた。培養の１４日目に細胞拡大を総生細胞数として測定した。ｘ軸は、指定された受容体を発現するように操作されたＴ細胞を示す（ｎ＝３、独立した実験）。
【図27A】Ｆａｓ操作されたＴ細胞の増殖。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズで活性化されたヒトＰＢＭＣは、改変されたＦａｓ受容体を発現するか（Ｆａｓ－ＴＲＵＮＣ、Ｆａｓ－４－１ＢＢ、Ｆａｓ－ＢＡＦＦＲ）、または受容体を発現しない（ＮＧＦＲ）ように操作された。操作されたＴ細胞はＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔで標識され、抗ＣＤ３で刺激され、そして４日間培養された。増殖はＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）増殖モデリングによって定量化され、操作されていないものに対して正規化された増殖指数によって表される。ｘ軸は、ＣＤ８（図２７Ａ）またはＣＤ４（図２７Ｂ）を発現するように操作された刺激されたＴ細胞を示す（ｎ＝３、独立した実験）。
【図27B】Ｆａｓ操作されたＴ細胞の増殖。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズで活性化されたヒトＰＢＭＣは、改変されたＦａｓ受容体を発現するか（Ｆａｓ－ＴＲＵＮＣ、Ｆａｓ－４－１ＢＢ、Ｆａｓ－ＢＡＦＦＲ）、または受容体を発現しない（ＮＧＦＲ）ように操作された。操作されたＴ細胞はＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔで標識され、抗ＣＤ３で刺激され、そして４日間培養された。増殖はＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）増殖モデリングによって定量化され、操作されていないものに対して正規化された増殖指数によって表される。ｘ軸は、ＣＤ８（図２７Ａ）またはＣＤ４（図２７Ｂ）を発現するように操作された刺激されたＴ細胞を示す（ｎ＝３、独立した実験）。
【図28】ＦａｓＬの存在下でのＦａｓキメラＴ細胞の生存率を示す。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズで活性化されたヒトＰＢＭＣは、改変されたＦａｓ受容体（Ｆａｓ－ＴＲＵＮＣ、Ｆａｓ－４－１ＢＢ、Ｆａｓ－ＢＡＦＦＲ）を発現するか、または受容体を発現しない（ＮＧＦＲ）ように操作された。操作されたＴ細胞は、増加濃度のＦａｓＬの存在下で培養された。生存率は、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅによって４８時間後に測定された（ｎ＝３回の反復、３回の独立した実験を表す図）。
【図29】増殖しているＦａｓ操作Ｔ細胞のＡｌａｍａｒＢｌｕｅアッセイを示す。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズで活性化されたヒトＰＢＭＣは、改変されたＦａｓ受容体（Ｆａｓ－ＴＲＵＮＣ、Ｆａｓ－４－１ＢＢ、Ｆａｓ－ＢＡＦＦＲ）を発現するか、またはまたは受容体を発現しない（ＮＧＦＲ）ように操作された。操作されたＴ細胞はＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔで標識され、抗ＣＤ３で刺激され、増加濃度のＦａｓＬの存在下または非存在下で（ｘ軸）、４日間培養された。増殖はＡｌａｍａｒＢｌｕｅによって測定された。凡例：指定された受容体で操作されたＴ細胞。（ｎ＝３回の反復、３回の独立した実験を表す）。
【発明を実施するための形態】
【0027】
詳細な説明
定義
本明細書で使用される「細胞」という用語は、単一の細胞ならびに複数の細胞を含む。
定義
本明細書で使用される「細胞」という用語は、単一の細胞ならびに複数の細胞を含む。
【0028】
本明細書で使用される「Ｔ細胞」という用語は、細胞性免疫において中心的な役割を果たすリンパ球のタイプを指す。Ｔリンパ球とも呼ばれるＴ細胞は、細胞表面にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が存在することにより、Ｂ細胞やナチュラルキラー細胞などの他のリンパ球と区別できる。Ｔヘルパー細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞を含むがこれらに限定されない、異なる機能を有するＴ細胞のサブセットがいくつか存在する。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、操作されたＴ細胞である。
【0029】
「操作されたＴＣＲ」または「操作されたＴ細胞受容体」という用語は、その天然に存在する形態から改変された任意のＴＣＲを意味する。操作されたＴＣＲは、ＴＣＲが特定の抗原（例えば、新抗原）を認識できるようにするアルファおよび／またはベータ鎖、あるいはガンマおよび／またはデルタ鎖（前述の鎖のいずれかの置き換えを含む）に対する改変を有し得る。操作されたＴＣＲは、抗原認識ドメイン（例えば、抗体、ｓｃＦｖ、ＤＡＲＰｉｎ）の追加を含む、任意のＣＤ３サブユニット（例えば、ＴＲｕＣ受容体の場合のようにＣＤ３ε）への改変を有し得る。操作されたＴＣＲは、アルファおよび／またはベータ鎖、あるいはガンマおよび／またはデルタ鎖の膜貫通ドメインに結合された抗原認識ドメイン（例えば、抗体、ｓｃＦｖ、ＤＡＲＰｉｎ）を有し得る。
【0030】
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」および／または「核酸配列」および／または「核酸」という用語は、塩基、糖および糖間（骨格）結合からなるヌクレオシドまたはヌクレオチドモノマーの配列を指す。この用語はまた、天然に存在しないモノマーまたはその一部を含む修飾または置換された配列を含む。本出願の核酸配列は、デオキシリボ核酸配列（ＤＮＡ）またはリボ核酸配列（ＲＮＡ）であり得、そしてアデニン、グアニン、シトシン、チミジン、およびウラシルを含む天然に存在する塩基を含み得る。これらの配列はまた、修飾された塩基を含み得る。そのような修飾された塩基の例には、アザおよびデアザ アデニン、グアニン、シトシン、チミジンおよびウラシル、キサンチンおよびヒポキサンチンが含まれる。本開示の核酸は、生物から単離することができ、遺伝子組換えの実験室的方法によって形成されるか、または化学合成もしくは核酸を作製するための他の既知のプロトコルによって得られる。
【0031】
本明細書で使用される「単離されたポリヌクレオチド」または「単離された核酸配列」という用語は、組換えＤＮＡ技術によって生成される場合には細胞材料もしくは培養培地を実質的に含まない核酸を指し、または化学的に合成される場合には化学前駆体もしくは他の化学物質を指す。単離された核酸はまた、その核酸が由来する核酸に自然に隣接する配列（すなわち、核酸の５’ 末端および３’末端に位置する配列）を実質的に含まない。「核酸」という用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むことを意図しており、二本鎖または一本鎖のいずれかであり得、センス鎖またはアンチセンス鎖を表す。さらに、「核酸」という用語は、相補的な核酸配列を含む。
【0032】
本明細書で使用される「組換え核酸」または「操作された核酸」という用語は、生物において見出されない核酸またはポリヌクレオチドを指す。例えば、組換え核酸は、遺伝子組換えの実験室的方法（分子クローニングなど）によって形成され、他の方法では自然界には見られない配列を作成することができる。組換え核酸はまた、核酸を作成するための化学合成または他の既知のプロトコルによって作成され得る。別段の指示がない限り、このセクションおよび他のセクションで説明される定義および実施形態は、当業者によって理解されるように適切である、本明細書で説明される本出願のすべての実施形態および態様に適用可能であることが意図される。
【0033】
本明細書で使用される「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、核酸によってコードされるものに対応するアミノ酸の鎖を説明する。本開示のポリペプチドまたはタンパク質は、通常２から約３０アミノ酸のアミノ酸の鎖を説明するペプチドであり得る。本明細書で使用されるタンパク質という用語はまた、３０アミノ酸を超えるアミノ酸の鎖を説明し、タンパク質または全長タンパク質のフラグメントまたはドメインであり得る。さらに、本明細書で使用される場合、タンパク質という用語は、アミノ酸の直鎖を指すことができ、またはそれは、機能性タンパク質にプロセシングされて折りたたまれたアミノ酸の鎖を指すことができる。しかしながら、３０は、ペプチドおよびタンパク質を区別することに関して任意の数であり、これらの用語は、アミノ酸の鎖について交換可能に使用することができることが理解される。本開示のタンパク質は、それらが自然に産生される細胞からのタンパク質の単離および精製によって、酵素的（例えば、タンパク質分解）切断によって、および／または本開示のタンパク質またはフラグメントをコードする核酸の発現によって組換え的に得ることができる。本開示のタンパク質および／またはフラグメントはまた、化学合成、またはタンパク質およびフラグメントを生成するための他の既知のプロトコルによって得ることができる。
【0034】
「単離されたポリペプチド」という用語は、組換えＤＮＡ技術によって産生される場合は細胞材料または培養培地を実質的に含まないポリペプチド、または化学的に合成される場合は化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まないポリペプチドを指す。
【0035】
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、核酸を細胞の内部に送達するために使用することができるポリヌクレオチドを指す。一実施形態では、ベクターは、細胞内で発現される核酸に作動可能に連結された発現制御配列（例えば、プロモーター）を含む発現ベクターである。当技術分野で知られているベクターには、プラスミド、ファージ、コスミド、およびウイルスが含まれるが、これらに限定されない。
【0036】
「レシピエント」、「個体」、「対象」、「宿主」、および「患者」という用語は、本明細書では互換的に使用され、診断、治療、または治療が望まれる任意の哺乳動物対象、特にヒトを指す。治療の目的での「哺乳動物」とは、ヒト、家畜および農業用動物、ならびに実験動物、動物園の動物、競技用動物、またはペット動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サルなどを含む、哺乳動物として分類される任意の動物を指す。いくつかの実施形態において、哺乳動物はヒトである。これらの用語はいずれも、医療関係者の監督を必要としない。
【0037】
本明細書で使用される場合、「治療」、「治療すること」などの用語は、いくつかの実施形態において、効果を得る目的のために、薬剤を投与すること、または手順を実行することを指す。効果は、疾患またはその症状を完全にまたは部分的に予防するという点で予防的であり得、ならびに／あるいは疾患および／または疾患の症状の部分的または完全な治癒に影響を与えるという点で治療的であり得る。本明細書で使用される「治療」は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患または障害（例えば、癌）の治療を含み得、以下を含む：（ａ）疾患の素因があるかもしれないが、まだその疾患であると診断されていない（例えば、原発性疾患に関連するか、またはその疾患によって引き起こされる可能性のある疾患を含む）対象において疾患または疾患の症状が発生するのを予防すること、（ｂ）疾患を阻害すること、すなわちその発症を阻止すること、および（ｃ）疾患を緩和すること、すなわち、疾患の退行を引き起こすこと。治療とは、軽減、寛解、症状の減少、または疾患の症状を患者にとってより耐えられる状態にすること、変性または衰退の速度を低下させること、または変性の最終点の衰弱を少なくすることなどの客観的または主観的なパラメーターを含む、癌の治療または改善または予防における成功の何らjかの兆候を指す場合がある。症状の治療または改善は、１つ以上の客観的または主観的なパラメーターに基づいており、これには、医師による検査の結果が含まれる。したがって、「治療することに」という用語は、疾患（例えば、癌）に関連する症状または状態の発症を予防、遅延、緩和、阻止または阻害するための本発明の化合物または薬剤の投与が含まれる。「治療効果」という用語は、対象における疾患、疾患の症状、または疾患の副作用の軽減、排除、または予防を指す。
【0038】
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「抗体」への言及は、複数の抗体を含み、いくつかの実施形態における「抗体」への言及は、複数の抗体などを含む。
【0039】
本明細書で使用される場合、すべての数値または数値範囲は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、そのような範囲内にあるかまたはそのような範囲を含む整数全体、およびこれらの値または範囲内にあるかもしくは範囲を含む整数の一部を含む。したがって、たとえば、９０～１００％の範囲との言及には、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５％、９６％、９７％など、ならびに９１．１％、９１．２％、９１．３％、９１．４％、９１．５％など、９２．１％、９２．２％、９２．３％、９２．４％、９２．５％などが含まれる。別の例において、１～５，０００倍の範囲への言及には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８１９、２０倍など、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５倍など、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５倍などが含まれる。
【0040】
本明細書で使用される「約」数値は、その数を含み、その数より１０％下からその数より１０％上までの範囲を指す。「約」範囲は、範囲の下限を１０％下回り、範囲の上限の１０％上までにわたる範囲を指す。
【0041】
「同一性パーセント（％）」とは、２つの配列（ヌクレオチドまたはアミノ酸）がアラインメントの同じ位置に同じ残基を有する程度を指す。例えば、「アミノ酸配列が配列番号ＹとＸ％同一である」とは、配列番号Ｙに対するアミノ酸配列の同一性％を指し、アミノ酸配列中の残基のＸ％が配列番号Ｙに開示される配列の残基と同一であるものとして述べられる。一般に、コンピュータープログラムがそのような計算に使用される。配列の対を比較および整列させる例示的なプログラムには、ＡＬＩＧＮ（Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ，１９８８）、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８；Ｐｅａｒｓｏｎ，１９９０）およびギャップ付きＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、またはＧＣＧが含まれる（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４）。
【0042】
本出願の範囲を理解する上で、本明細書で使用される「含む」という用語およびその派生語は、述べられた特徴、要素、構成要素、群、整数、および／または工程を特定するオープンエンドの用語であることを意図しているが、他の記述されていない機能、要素、構成要素、群、整数、および／または工程の存在を除外しない。上記はまた、「含む」、「有する」という用語およびそれらの派生語などの同様の意味を有する単語にも適用される。本明細書で使用される「からなる」という用語およびその派生語は、述べられた特徴、要素、構成要素、群、整数、および／または工程の存在を特定するが、他の述べられていない特徴、要素、構成要素、群、整数、および／または工程の存在を除外する閉じた用語を意図する。本明細書で使用される「から本質的になる」という用語は、記載された特徴、要素、構成要素、群、整数、および／または工程の存在、ならびに、機能、要素、構成要素、群、整数、および／または工程の基本的かつ新規な特性に実質的に影響を及ぼさないものの存在を特定することを意図する。
【0043】
本明細書で使用される「実質的に」、「約」および「およそ」などの程度の用語は、最終結果が大幅に変更されないような、修正された用語の合理的な量の逸脱を意味する。程度のこれらの用語は、この逸脱が変更する単語の意味を否定しない場合、変更された用語の少なくとも±５％の逸脱を含むと解釈されるべきである。
【0044】
本明細書で使用される「および／または」という用語は、リストされたアイテムが、個別にまたは組み合わせて存在する、または使用されることを意味する。事実上、この用語は、列挙された品目の「少なくとも１つ」または「１つ以上」が使用されるかまたは存在することを意味する。
【0045】
キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）
本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸であって、これは、（ａ）腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーの細胞外ドメインをコードする第１のポリヌクレオチド、（ｂ）膜貫通ドメインポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、および（ｃ）細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド（例えば、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）メンバーから）を含む。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドおよび第３のポリヌクレオチドは、ＴＮＦＲＳＦの異なるメンバーに由来する。
本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸であって、これは、（ａ）腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーの細胞外ドメインをコードする第１のポリヌクレオチド、（ｂ）膜貫通ドメインポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、および（ｃ）細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド（例えば、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）メンバーから）を含む。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドおよび第３のポリヌクレオチドは、ＴＮＦＲＳＦの異なるメンバーに由来する。
【0046】
いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、ＴＮＦＲＳＦのメンバーの細胞外ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドおよび第３のポリヌクレオチドは、ＴＮＦＲＳＦの異なるメンバーに由来する。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、デスドメインを有するＴＮＦＲＳＦメンバーの細胞外ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、Ｆａｓ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＤＲ３、ＤＲ６、ＥＤＡＲ、ＸＥＤＡＲ、ＴＲＯＹ、またはＮＧＦＲの細胞外ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、ＴＮＦＲ１の細胞外ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、ＴＮＦＲ２の細胞外ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、Ｆａｓの細胞外ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、ＤＲ４の細胞外ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、ＤＲ５の細胞外ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、ＤＲ３の細胞外ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、ＤＲ６の細胞外ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、ＥＤＡＲの細胞外ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、ＸＥＤＡＲの細胞外ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、ＴＲＯＹの細胞外ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、ＮＧＦＲの細胞外ドメインをコードする。
【0047】
腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）は、細胞外システインリッチドメインを介して腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に結合する能力を特徴とするサイトカイン受容体のタンパク質スーパーファミリーである。ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、Ｆａｓ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＤＲ３、ＤＲ６、ＥＤＡＲ、ＸＥＤＡＲ、ＴＲＯＹ、またはＮＧＦＲを含むＴＮＦＲスーパーファミリーの２７のメンバーが存在する。
【0048】
腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１Ａ（ＴＮＦＲＳＦ１Ａ）およびＣＤ１２０ａとしても知られる腫瘍壊死因子受容体１（ＴＮＦＲ１）は、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）に結合する膜結合受容体である。ＴＮＦＲ１は転写因子ＮＦ－κＢを活性化し、アポトーシスを媒介し、そして炎症の調節因子として機能する。
【0049】
腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１Ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）およびＣＤ１２０ｂとしても知られる腫瘍壊死因子受容体２（ＴＮＦＲ２）は、腫瘍壊死因子－アルファ（ＴＮＦα）に結合する膜結合受容体である。
【0050】
Ｆａｓ、ＦａｓＲ、アポトーシス抗原１（ＡＰＯ－１またはＡＰＴ）、分化クラスター９５（ＣＤ９５）または腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー６（ＴＮＦＲＳＦ６）としても知られるＦａｓ受容体は、ヒトにおけるＦＡＳ遺伝子によってコードされるそのタンパク質である。Ｆａｓの複数のスプライスシングバリアントが同定されており、これらはタンパク質の７つのアイソフォームに変換される。アポトーシスを誘導するＦａｓ受容体はアイソフォーム１と呼ばれ、１型膜貫通型タンパク質である。他のアイソフォームの多くは、通常、疾患の状態に関連するまれなハプロタイプである。Ｆａｓの任意の適切なアイソフォームが、本明細書に開示される実施形態と共に使用するために企図される。
【0051】
ＴＲＡＩＬ受容体１（ＴＲＡＩＬＲ１）および腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０Ａ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ）としても知られるデスドメイン４（ＤＲ４）は、ＴＲＡＩＬに結合し、アポトーシスを媒介するＴＮＦ受容体スーパーファミリーの細胞表面受容体である。
【0052】
ＴＲＡＩＬ受容体２（ＴＲＡＩＬＲ２）および腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０Ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ）としても知られるデスドメイン５（ＤＲ５）は、ＴＲＡＩＬに結合し、アポトーシスを媒介するＴＮＦ受容体スーパーファミリーの細胞表面受容体である。
【0053】
腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー２５（ＴＮＦＲＳＦ２５）としても知られるデスドメイン３（ＤＲ３）は、アポトーシスシグナル伝達および分化を媒介する腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーの細胞表面受容体である。その唯一の既知のＴＮＦＳＦリガンドはＴＮＦ様タンパク質１Ａ（ＴＬ１Ａ）である。
【0054】
腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー２１（ＴＮＦＲＳＦ２１）としても知られるデスドメイン６（ＤＲ６）は、ＪＮＫおよびＮＦ－κＢ経路を活性化する腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーの細胞表面受容体である。
【0055】
外胚葉異形成受容体（ＥＤＡＲ）は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーである。これは外胚葉分化の過程で重要な役割を果たす。
【0056】
エクトジスプラシンＡ２受容体（ＸＥＤＡＲ；腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー２７）は、ヒトにおいてＥＤＡ２Ｒ遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＥＤＡ－Ａ１およびＥＤＡ－Ａ２は、無汗性外胚葉異形成症（ＥＤＡ）遺伝子によってコードされるエクトジスプラシンの２つのアイソフォームである。
【0057】
ＴＲＯＹ（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１９、ＴＮＦＲＳＦ１９）は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーである。この受容体は、胚発生の間に高度に発現する。これは、ＴＮＦ受容体関連因子（ＴＲＡＦ）ファミリーのメンバーと相互作用し、細胞中で過剰発現するときにｃ－Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）シグナル伝達経路を活性化することが示されている。この受容体は、カスパーゼに依存しないメカニズムでアポトーシスを誘導することができ、胚発生に必須の役割を果たしていると考えられている。
【0058】
ＮＧＦＲ（低親和性神経成長因子受容体、神経成長因子受容体、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー１６、ＬＮＧＦＲ、ｐ７５ニューロトロフィン受容体）は、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ受容体）スーパーファミリーのメンバーである。これは、神経細胞が生き残り、分化するように刺激するタンパク質成長因子のファミリーであるニューロトロフィンの２つの受容体タイプのうちの１つである。
【0059】
いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、配列番号１に記載の配列を有するオリゴペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、このポリヌクレオチドは、配列番号１に記載の配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する配列を有するオリゴペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、配列番号２に記載の配列を有するオリゴペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、このポリヌクレオチドは、配列番号2に記載の配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する配列を有するオリゴペプチドをコードする。
【0060】
【表1】
【0061】
いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｔ、ＯＸ－４０、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、プログラムされた細胞死（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｄｅａｔｈ）－１（ＰＤ－１）、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１、ＣＤ１－ＣＤ１８）、ＣＤ２４７、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＬＩＧＨＴ、（ＴＮＦＳＦ１４）、ＮＫＧ２Ｃ、Ｉｇ ａｌｐｈａ（ＣＤ７９ａ）、ＤＡＰ－１０、ＩＣＡＭ－１、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８ａｌｐｈａ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ－２Ｒベータ、ＩＬ－２Ｒガンマ、ＩＬ－７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１ ｌｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ １０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１ ｌａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１ ｌｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１ ｌｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ １６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、またはＣＤ１９ａからの細胞質共刺激シグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする。
【0062】
いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、４－１ＢＢ、ＢＡＦＦＲ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、ＲＥＬＴ、ＴＡＣＩ、ＴＲＯＹ、またはＴＷＥＡＫからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、ＢＡＦＦＲからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、４－１ＢＢからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、ＣＤ２７からの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、ＨＶＥＭからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、ＯＸ４０からの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、ＧＩＴＲからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、ＴＡＣＩからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。
【0063】
いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、配列番号３に記載の配列を有するオリゴペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、このポリヌクレオチドは、配列番号３に記載の配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する配列を有するオリゴペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、配列番号４に記載の配列を有するオリゴペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、配列番号４に記載の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有するオリゴペプチドをコードする。
【0064】
【表2】
【0065】
いくつかの実施形態において、第２のポリヌクレオチドは、ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーからの膜貫通ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第２のポリヌクレオチドは、４－１ＢＢ、ＢＡＦＦＲ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、ＲＥＬＴ、ＴＡＣＩ、ＴＲＯＹ、またはＴＷＥＡＫからの膜貫通ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、細胞質ゾルの共刺激シグナル伝達ドメインとは異なる分子に由来する。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインと同じ分子に由来する。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインおよび細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢ、ＢＡＦＦＲ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、ＲＥＬＴ、ＴＡＣＩ、ＴＲＯＹ、およびＴＷＥＡＫから選択される同じ共刺激分子に由来する。
【0066】
いくつかの実施形態において、第２のポリヌクレオチドは、配列番号５に記載の配列を有するオリゴペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、このポリヌクレオチドは、配列番号５に記載の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する配列を有するオリゴペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、第２のポリヌクレオチドは、配列番号６に記載の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有するオリゴペプチドをコードする。
【0067】
【表3】
【0068】
単一分子
いくつかの実施形態において、ＣＣＲは単一分子である。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、直接的にまたは間接的に（例えば、リンカーを介して）第３のポリヌクレオチドに結合される。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドおよび第３のポリヌクレオチドは、直接的にまたは間接的に（例えば、リンカーを介して）第２のポリヌクレオチドに結合される。本明細書に開示される分子と共に使用するために、任意の適切なリンカーが企図される。いくつかの実施形態において、リンカーは小分子である。いくつかの実施形態において、リンカーは、ペプチドリンカーである。
いくつかの実施形態において、ＣＣＲは単一分子である。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、直接的にまたは間接的に（例えば、リンカーを介して）第３のポリヌクレオチドに結合される。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドおよび第３のポリヌクレオチドは、直接的にまたは間接的に（例えば、リンカーを介して）第２のポリヌクレオチドに結合される。本明細書に開示される分子と共に使用するために、任意の適切なリンカーが企図される。いくつかの実施形態において、リンカーは小分子である。いくつかの実施形態において、リンカーは、ペプチドリンカーである。
【0069】
いくつかの実施形態において、ＣＣＲは、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、そのポリヌクレオチドは、配列番号７に記載の配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する配列を有するオリゴヌクレオチドをコードする。いくつかの実施形態において、ＣＣＲは、配列番号８に記載のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、そのポリヌクレオチドは、配列番号８に記載の配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する配列を有するオリゴペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、ＣＣＲは、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、そのポリヌクレオチドは、配列番号９に記載の配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する配列を有するオリゴペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、ＣＣＲは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、そのポリヌクレオチドは、配列番号１０に記載の配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する配列を有するオリゴペプチドをコードする。
【0070】
【表4】
【0071】
免疫細胞
本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸を含む免疫細胞であって、以下を含む：（ａ）腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外ドメインをコードする第１のポリヌクレオチド、（ｂ）膜貫通ドメインポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、および（ｃ）細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインポリペプチド（例えば、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）メンバーから）をコードする第３のポリヌクレオチド。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドおよび第３のポリヌクレオチドは、ＴＮＦＲＳＦの異なるメンバーに由来する。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、デスドメインを有するＴＮＦＲＳＦメンバーの細胞外ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、Ｆａｓ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＤＲ３、ＤＲ６、ＥＤＡＲ、ＸＥＤＡＲ、ＴＲＯＹ、またはＮＧＦＲの細胞外ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、４－１ＢＢ、ＢＡＦＦＲ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、ＲＥＬＴ、ＴＡＣＩ、ＴＲＯＹ、またはＴＷＥＡＫからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ガンマ－デルタＴ細胞）である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、操作されたＴ細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞はナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）である。いくつかの実施形態において、免疫細胞はマクロファージである。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は単球である。いくつかの実施形態において、免疫細胞はＢ細胞である。
本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸を含む免疫細胞であって、以下を含む：（ａ）腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外ドメインをコードする第１のポリヌクレオチド、（ｂ）膜貫通ドメインポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、および（ｃ）細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインポリペプチド（例えば、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）メンバーから）をコードする第３のポリヌクレオチド。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドおよび第３のポリヌクレオチドは、ＴＮＦＲＳＦの異なるメンバーに由来する。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、デスドメインを有するＴＮＦＲＳＦメンバーの細胞外ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、Ｆａｓ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＤＲ３、ＤＲ６、ＥＤＡＲ、ＸＥＤＡＲ、ＴＲＯＹ、またはＮＧＦＲの細胞外ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、４－１ＢＢ、ＢＡＦＦＲ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、ＲＥＬＴ、ＴＡＣＩ、ＴＲＯＹ、またはＴＷＥＡＫからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ガンマ－デルタＴ細胞）である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、操作されたＴ細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞はナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）である。いくつかの実施形態において、免疫細胞はマクロファージである。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は単球である。いくつかの実施形態において、免疫細胞はＢ細胞である。
【0072】
Ｔ細胞
本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸を含むＴ細胞であって、（ａ）腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外ドメインをコードする第１のポリヌクレオチド、（ｂ）膜貫通ドメインポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、および（ｃ）細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインポリペプチド（例えば、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）メンバーから）をコードする第３のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドおよび第３のポリヌクレオチドは、ＴＮＦＲＳＦの異なるメンバーに由来する。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、デスドメインを有するＴＮＦＲＳＦメンバーの細胞外ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、Ｆａｓ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＤＲ３、ＤＲ６、ＥＤＡＲ、ＸＥＤＡＲ、ＴＲＯＹ、またはＮＧＦＲの細胞外ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、４－１ＢＢ、ＢＡＦＦＲ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、ＲＥＬＴ、ＴＡＣＩ、ＴＲＯＹ、またはＴＷＥＡＫからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする。
本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸を含むＴ細胞であって、（ａ）腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外ドメインをコードする第１のポリヌクレオチド、（ｂ）膜貫通ドメインポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、および（ｃ）細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインポリペプチド（例えば、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）メンバーから）をコードする第３のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドおよび第３のポリヌクレオチドは、ＴＮＦＲＳＦの異なるメンバーに由来する。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、デスドメインを有するＴＮＦＲＳＦメンバーの細胞外ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、Ｆａｓ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＤＲ３、ＤＲ６、ＥＤＡＲ、ＸＥＤＡＲ、ＴＲＯＹ、またはＮＧＦＲの細胞外ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、４－１ＢＢ、ＢＡＦＦＲ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、ＲＥＬＴ、ＴＡＣＩ、ＴＲＯＹ、またはＴＷＥＡＫからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする。
【0073】
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、またはガンマ－デルタＴ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、標的特異的リガンドを認識し得る、操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）または合成抗原受容体ポリペプチドをコードする第２の核酸を含む。いくつかの実施形態において、合成抗原受容体ポリヌクレオチドは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。いくつかの実施形態において、合成抗原受容体ポリヌクレオチドは、Ｔ細胞抗原カプラー（ＴＡＣ）をコードする。
【0074】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン）を含む。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファまたはベータ、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、およびＣＤ１５４からなる群より選択される幕貫通ドメインである。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｔ、ＯＸ－４０、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、プログラムされた細胞死（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｄｅａｔｈ）－１（ＰＤ－１）、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１、ＣＤ１－ＣＤ１８）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ２４７、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＬＩＧＨＴ、（ＴＮＦＳＦ１４）、ＮＫＧ２Ｃ、Ｉｇアルファ（ＣＤ７９ａ）、ＤＡＰ－１０、Ｆｃガンマ受容体、ＭＨＣクラス１分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリンタンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＩＣＡＭ－１、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ－２Ｒベータ、ＩＬ－２Ｒガンマ、ＩＬ－７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１ ｌｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ １０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１ ｌａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１ ｌｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１ ｌｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ １６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、またはＣＤ１９ａに由来するシグナル伝達ドメインである。
【0075】
いくつかの実施形態において、ＴＡＣは、抗原結合ドメイン、ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質に結合するドメイン、および細胞質ゾルドメインおよび膜貫通ドメインを含むＴ細胞補助受容体ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ複合体に関連するタンパク質は、ＣＤ３である。いくつかの実施形態において、ＴＡＣは、共刺激ドメインおよび／または活性化ドメインを含まない。いくつかの実施形態において、細胞質ゾルドメインは、ＣＤ４細胞質ゾルドメインであり、膜貫通ドメインは、ＣＤ４膜貫通ドメインである。いくつかの実施形態において、ＴＡＣは、抗原結合ドメイン、ＣＤ３結合ドメイン、ならびにＣＤ４細胞質ゾルドメインおよびＣＤ４膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ３抗原結合ドメインは、ＵＣＨＴ１に由来する。
【0076】
いくつかの実施形態において、操作されたＴＣＲは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）である。いくつかの実施形態において、ＴＦＰは、少なくとも１つの操作されたＣＤ３鎖を含み、この操作されたＣＤ３鎖は、（ａ）細胞外ドメインの少なくとも一部、（ｂ）細胞内シグナル伝達ドメインからの刺激ドメインを含む細胞内ドメイン、および（ｃ）抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。いくつかの実施形態において、細胞外ドメインおよび細胞内ドメインは、ＣＤ３α、ＣＤ３β、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、またはＣＤ３εに由来する。いくつかの実施形態において、操作されたＣＤ３鎖は、膜貫通ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態において、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインは、ＣＤ３εに由来する。いくつかの実施形態において、操作されたＣＤ３鎖は、ＴＣＲの少なくとも１つの天然に存在するＣＤ３ε鎖を置き換える。
【0077】
いくつかの実施形態において、操作されたＴＣＲは、キメラ抗体－Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）構築物（ｃａＴＣＲ）である。いくつかの実施形態において、ｃａＴＣＲは、標的抗原に特異的に結合する抗原結合モジュール、および少なくとも１つのＴＣＲ関連シグナル伝達分子を動員することができるＴ細胞受容体モジュール（ＴＣＲＭ）を含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲＭは、第１のＴＣＲ膜貫通ドメイン（ＴＣＲ－ＴＭ）を含む第１のＴＣＲドメイン（ＴＣＲＤ）、および第２のＴＣＲ－ＴＭを含む第２のＴＣＲＤを含み、ここで、ＴＣＲ－ＴＭは、少なくとも１つのＴＣＲ関連シグナル伝達分子の動員を促進する。いくつかの実施形態において、第１のＴＣＲ－ＴＭは、Ｔ細胞受容体（αβＴＣＲ、またはγδＴＣＲなど）の膜貫通ドメインの１つに由来し、第２のＴＣＲ－ＴＭは、Ｔ細胞受容体の他方の膜貫通ドメインに由来する。いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、αβＴＣＲであり、第１および第２のＴＣＲ－ＴＭは、ＴＣＲ ａおよびβサブユニット膜貫通ドメインに由来する。いくつかの実施形態において、ＴＣＲはγδＴＣＲであり、第１および第２のＴＣＲ－ＴＭは、ＴＣＲγおよびδサブユニット膜貫通ドメインに由来する。いくつかの実施形態において、ＴＣＲＤおよびＴＣＲ－ＴＭは、抗体に由来するＦ（ａｂ）に融合される。いくつかの実施形態において、ＴＣＲＤおよびＴＣＲ－ＴＭは、抗体のＦ（ｖ）部分に由来する単鎖抗体（ｓｃＦｖ）に融合される。
【0078】
いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、癌性細胞上の抗原に結合する。いくつかの実施形態において、抗原は、癌性細胞上で差次的に発現される。いくつかの実施形態において、抗原は、癌性細胞上で上方制御される。いくつかの実施形態において、抗原は表面抗原であり、ＭＨＣによって提示されない。いくつかの実施形態において、抗原は、ＭＨＣ／ペプチド複合体である。
【0079】
いくつかの実施形態において、抗原は、ＨＥＲ２（ｅｒｂＢ－２）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ１９、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胚性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ－１２５、ＭＵＣ－１、上皮腫瘍抗原である。（ＥＴＡ）、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、グリオーマ関連抗原、β－ヒト絨毛性ゴナドトロピン、サイログロブリン、ＲＡＧＥ－１、ＭＮ－ＣＡ ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸のカルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、Ｍ－ＣＳＦ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－１ａ、ｐ５３、プロスタイン、ＰＳＭＡ、サバイビンおよびテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１）、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、ＣＤ２２、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）－Ｉ、ＩＧＦ－ＩＩ、ＩＧＦ－Ｉ受容体およびメソセリン。いくつかの実施形態において、抗原は、ＨＥＲ２、ＢＣＭＡ、またはＣＤ１９である。いくつかの実施形態において、抗原はＨＥＲ２である。いくつかの実施形態において、抗原はＢＣＭＡである。いくつかの実施形態において、抗原は、ＣＤ１９である。
【0080】
使用の方法
本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、治療を必要とする個体の癌を治療する方法であり、キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸を含む免疫細胞を個体に投与することを含み、上記核酸は、（ａ）腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外ドメインをコードする第１のポリヌクレオチド、（ｂ）膜貫通ドメインポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、および（ｃ）細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインポリペプチド（例えば、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）メンバーから）をコードする第３のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドおよび第３のポリヌクレオチドは、ＴＮＦＲＳＦの異なるメンバーに由来する。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、デスドメインを有するＴＮＦＲＳＦメンバーの細胞外ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、Ｆａｓ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＤＲ３、ＤＲ６、ＥＤＡＲ、ＸＥＤＡＲ、ＴＲＯＹ、またはＮＧＦＲの細胞外ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、４－１ＢＢ、ＢＡＦＦＲ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、ＲＥＬＴ、ＴＡＣＩ、ＴＲＯＹ、またはＴＷＥＡＫからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ガンマ－デルタＴ細胞）である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、操作されたＴ細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞はナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）である。いくつかの実施形態において、免疫細胞はマクロファージである。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は単球である。いくつかの実施形態において、免疫細胞はＢ細胞である。
本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、治療を必要とする個体の癌を治療する方法であり、キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）核酸を含む免疫細胞を個体に投与することを含み、上記核酸は、（ａ）腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外ドメインをコードする第１のポリヌクレオチド、（ｂ）膜貫通ドメインポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、および（ｃ）細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインポリペプチド（例えば、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）メンバーから）をコードする第３のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドおよび第３のポリヌクレオチドは、ＴＮＦＲＳＦの異なるメンバーに由来する。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、デスドメインを有するＴＮＦＲＳＦメンバーの細胞外ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、Ｆａｓ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＤＲ３、ＤＲ６、ＥＤＡＲ、ＸＥＤＡＲ、ＴＲＯＹ、またはＮＧＦＲの細胞外ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、４－１ＢＢ、ＢＡＦＦＲ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、ＲＥＬＴ、ＴＡＣＩ、ＴＲＯＹ、またはＴＷＥＡＫからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ガンマ－デルタＴ細胞）である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、操作されたＴ細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞はナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）である。いくつかの実施形態において、免疫細胞はマクロファージである。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は単球である。いくつかの実施形態において、免疫細胞はＢ細胞である。
【0081】
いくつかの実施形態において、癌は、固形癌または液状癌である。いくつかの実施形態において、癌は、癌腫、芽細胞腫、黒色腫、肉腫、血液癌、またはリンパ性悪性腫瘍である。
【0082】
いくつかの実施形態において、癌は、白血病またはリンパ腫である。いくつかの実施形態において、癌は、混合系統白血病（ＭＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、高悪性度Ｂである－細胞性リンパ腫、または濾胞性リンパ腫から生じる大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である。
【0083】
いくつかの実施形態において、癌は、肺癌、乳癌、結腸癌、多発性骨髄腫、膠芽細胞腫、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、卵巣癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、結腸直腸癌、尿路上皮癌、子宮内膜癌、または黒色腫である。いくつかの実施形態において、癌は肺癌である。いくつかの実施形態において、癌は乳癌である。いくつかの実施形態において、癌は結腸癌である。いくつかの実施形態において、癌は多発性骨髄腫である。いくつかの実施形態において、癌は膠芽腫である。いくつかの実施形態において、癌は胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）である。いくつかの実施形態において、癌は卵巣癌である。いくつかの実施形態において、癌は胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）である。いくつかの実施形態において、癌は結腸直腸癌である。いくつかの実施形態において、癌は尿路上皮癌である。いくつかの実施形態において、癌は子宮内膜癌である。いくつかの実施形態において、癌は黒色腫である。
【0084】
医薬組成物
本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、（ａ）（ｉ）腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外ドメインをコードする第１のポリヌクレオチド、（ｉｉ）膜貫通ドメインポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、および（ｉｉｉ）細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインポリペプチド（例えば、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）メンバーから）をコードする第３のポリヌクレオチドを含む免疫細胞、ならびに、（ｂ）薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物である。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドおよび第３のポリヌクレオチドは、ＴＮＦＲＳＦの異なるメンバーに由来する。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、デスドメインを有するＴＮＦＲＳＦメンバーの細胞外ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、Ｆａｓ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＤＲ３、ＤＲ６、ＥＤＡＲ、ＸＥＤＡＲ、ＴＲＯＹ、またはＮＧＦＲの細胞外ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、ＴＮＦＲ１の細胞外ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、ＴＮＦＲ２の細胞外ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、Ｆａｓの細胞外ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、４－１ＢＢ、ＢＡＦＦＲ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、ＲＥＬＴ、ＴＡＣＩ、ＴＲＯＹ、またはＴＷＥＡＫからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、ＢＡＦＦＲからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、４－１ＢＢからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインおよび細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインは、同じ共刺激シグナル伝達タンパク質に由来する。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢ、ＢＡＦＦＲ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、ＲＥＬＴ、ＴＡＣＩ、ＴＲＯＹ、またはＴＷＥＡＫに由来する。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、直接的にまたは間接的に（例えば、リンカーを介して）第３のポリヌクレオチドに結合される。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドおよび第３のポリヌクレオチドは、直接的にまたは間接的に（例えば、リンカーを介して）第２のポリヌクレオチドに結合される。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、調節性Ｔ細胞、ガンマ－デルタＴ細胞）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、マクロファージ、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、単球、またはＢ細胞である。
本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、（ａ）（ｉ）腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外ドメインをコードする第１のポリヌクレオチド、（ｉｉ）膜貫通ドメインポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、および（ｉｉｉ）細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインポリペプチド（例えば、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）メンバーから）をコードする第３のポリヌクレオチドを含む免疫細胞、ならびに、（ｂ）薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物である。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドおよび第３のポリヌクレオチドは、ＴＮＦＲＳＦの異なるメンバーに由来する。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、デスドメインを有するＴＮＦＲＳＦメンバーの細胞外ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、Ｆａｓ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＤＲ３、ＤＲ６、ＥＤＡＲ、ＸＥＤＡＲ、ＴＲＯＹ、またはＮＧＦＲの細胞外ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、ＴＮＦＲ１の細胞外ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、ＴＮＦＲ２の細胞外ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、Ｆａｓの細胞外ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、４－１ＢＢ、ＢＡＦＦＲ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、ＲＥＬＴ、ＴＡＣＩ、ＴＲＯＹ、またはＴＷＥＡＫからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、ＢＡＦＦＲからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、第３のポリヌクレオチドは、４－１ＢＢからの細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインおよび細胞質ゾル共刺激シグナル伝達ドメインは、同じ共刺激シグナル伝達タンパク質に由来する。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢ、ＢＡＦＦＲ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＯＸ４０、ＲＥＬＴ、ＴＡＣＩ、ＴＲＯＹ、またはＴＷＥＡＫに由来する。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、直接的にまたは間接的に（例えば、リンカーを介して）第３のポリヌクレオチドに結合される。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドおよび第３のポリヌクレオチドは、直接的にまたは間接的に（例えば、リンカーを介して）第２のポリヌクレオチドに結合される。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、調節性Ｔ細胞、ガンマ－デルタＴ細胞）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、マクロファージ、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、単球、またはＢ細胞である。
【0085】
本明細書に開示される医薬組成物は、有効量の免疫細胞が、薬学的に許容可能な担体との混合中で組み合わされるように、対象に投与される薬学的に許容可能な組成物の調製のためのそれ自体公知の方法によって調製される。適切な担体は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡ，２０００）に記載される。これに基づいて、組成物は、排他的ではないが、１つ以上の薬学的に許容可能な担体または希釈剤が付随する物質の溶液を含み、これは、適切なｐＨを有する緩衝溶液に含まれ、生理学的液体と等浸透圧である。
【0086】
適切な薬学的に許容可能な担体には、医薬組成物の生物学的活性の有効性に干渉しない、本質的に化学的に不活性でかつ毒性のない組成物が含まれる。適切な医薬担体の例には、水、食塩水、グリセロール溶液、Ｎ－（１（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）Ｎ、Ｎ、Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、ジオレシルホスホチジル－エタノールアミン（ＤＯＰＥ）、およびリポソームが含まれるがこれらに限定されない。。いくつかの実施形態において、そのような組成物は、患者への直接投与のための形態を提供するために、適切な量の担体とともに、治療有効量の化合物を含む。
【0087】
医薬組成物は、治療される（または予防される）疾患に適切な様式で投与される。投与の量と頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患の型および重症度などの要因によって決定されるが、適切な投与量は臨床試験によって決定される。「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍抑制有効量」、または「治療有効量」が示される場合、投与される本発明の組成物の正確な量は、年齢、体重、腫瘍の大きさ、感染または転移の程度、および患者（対象）の状態の個人差を考慮して、医師によって決定される。
【0088】
医薬組成物が「実質的に含まれていない」とは、例えば、エンドトキシン、マイコプラズマ、複製コンピテントレンチウイルス（ＲＣＬ）、ｐ２４、ＶＳＶ－Ｇ核酸、ＨＩＶｇａｇ、残留抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８コーティングビーズ、マウス抗体、プールされたヒト血清、ウシ血清アルブミン、ウシ血清、培地成分、ベクターパッケージング細胞またはプラスミド成分、細菌、真菌、マイコプラズマ、ＩＬ－２、およびＩＬ－７からなる群より選択される、例えば、検出可能なレベルの汚染物質が存在しないことを示す。
【0089】
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、単回または複数回、例えば、毎日、毎週、隔週、もしくは毎月、１時間ごとに投与されるか、または医薬組成物は、治療される癌の再発、逆戻り、または進行時に投与される。
【0090】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される医薬組成物は、静脈内または注入によるものを含むがこれらに限定されない任意の適切な方法によって投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される医薬組成物は、免疫療法において一般的に知られている注入技術を使用して投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される医薬組成物は、腫瘍、リンパ節、または感染部位に直接注射される。
【実施例】
【0091】
以下の非限定的な例は、本出願の例示である。
【0092】
実施例１．キメラ共刺激受容体
以前に述べたように、共刺激および共抑制は、Ｔ細胞の活性化、増殖および持続性を調節するために、ＴＣＲシグナル伝達と並行して作用する。ＴＮＦＲＳＦシグナル伝達を介してＴ細胞応答を調節することは、各受容体が独自の生物学的効果を与えるため、Ｔ細胞治療にとって魅力的である。さらに、ＴＮＦＲＳＦの構造生物学の類似性を考えると、ＴＮＦＲＳＦに基づくキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）の作成を通じて、ＴＮＦＲＳＦによる共抑制（すなわち抑制シグナル伝達）を共刺激（すなわち刺激シグナル伝達）に向け直すことが可能であるはずである。実際、以前の報告において、ＴＮＦＲＳＦメンバーは、シグナル伝達を再方向付けするために交換できるモジュラードメインを有することが確立されている。
以前に述べたように、共刺激および共抑制は、Ｔ細胞の活性化、増殖および持続性を調節するために、ＴＣＲシグナル伝達と並行して作用する。ＴＮＦＲＳＦシグナル伝達を介してＴ細胞応答を調節することは、各受容体が独自の生物学的効果を与えるため、Ｔ細胞治療にとって魅力的である。さらに、ＴＮＦＲＳＦの構造生物学の類似性を考えると、ＴＮＦＲＳＦに基づくキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）の作成を通じて、ＴＮＦＲＳＦによる共抑制（すなわち抑制シグナル伝達）を共刺激（すなわち刺激シグナル伝達）に向け直すことが可能であるはずである。実際、以前の報告において、ＴＮＦＲＳＦメンバーは、シグナル伝達を再方向付けするために交換できるモジュラードメインを有することが確立されている。
【0093】
抗腫瘍Ｔ細胞は高レベルのＴＮＦαを産生するが、実験データは、天然のＴＮＦαシグナル伝達がＴ細胞免疫を制限することを示唆している。ＴＮＦＲ１が媒介するＴＮＦαシグナル伝達は、Ｔ細胞の拡大および機能を制限する細胞死を引き起こす。したがって、抗原刺激に応答してＴＮＦαを生成した後、Ｔ細胞機能を増強するキメラＴＮＦＲ１を通してＴＮＦα生物学を再方向付けすることを検討することは興味深いことである。Ｔ細胞刺激に向けたＴＮＦＲ１シグナル伝達の再方向付けは、別のＴＮＦＲＳＦからの共刺激ドメインのためのＴＮＦＲ１細胞内シグナル伝達ドメインを切り替えることによって達成することができた。原則として、このようなキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）の刺激は、同族の抗原の認識後にＴ細胞によって産生されるＴＮＦαを介してオートクリンおよびパラクリンで送達される。しかし、ＴＮＦαが局所環境の他の細胞（マクロファージなど）によって産生され得る可能性もある。ＣＡＲ分野における共刺激ドメインを用いる最近の成功は、Ｔ細胞において最も有望な特性を有するものとして４－１ＢＢの共刺激シグナル伝達ドメインを指摘している。４－１ＢＢ共刺激ドメインを有するＣＡＲ操作されたＴ細胞は、記憶マーカーの増加、高い持続性、およびアネルギーに対する耐性を示す。ＣＤ１９抗原に対する４－１ＢＢ ＣＡＲを利用した臨床試験は、患者への注入の際の印象的な増殖、および６か月間の高レベルの持続性を実証した。したがって、ＴＮＦαに結合するＴＮＦＲ１の細胞外ドメインを有し、共刺激シグナル伝達を提供する４－１ＢＢの細胞質ドメインに結合したＣＣＲは、強力な概念実証を提供するはずである（図１）。もちろん、ＴＮＦＲ１ベースのＣＣＲは４－１ＢＢの細胞質ドメインに限定されず、他のＴＮＦＲＳＦの細胞質ドメイン、またはそれらの組み合わせは、さらに強力な結果を提供する可能性がある。
【0094】
ＴＮＦＲ１－４－１ＢＢ ＣＣＲがＴＮＦαシグナル伝達を再方向付けできるという仮説に取り組むために、４－１ＢＢの細胞内シグナル伝達ドメインに結合したＴＮＦＲ１受容体の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインに結合するＴＮＦαから構成される融合受容体を構築した（図２Ａ）。対照として、サイトカインに結合するがシグナルを伝達しないＴＮＦ－ブロッカー受容体もまた生成された（図２Ａ）。
【0095】
実験方法
クローニング
全長ＴＮＦＲ１コード配列は、ｇＢｌｏｃｋｓ遺伝子フラグメント（ＩＤＴ）としてオーダーされ、ＰＣＲによって増幅されて、制限部位ＡｓｃＩおよびＮｈｅＩを追加して、ｐＣＣＬ転移ベクターにライゲーションした。共刺激性ＴＮＦＲ１－４－１ＢＢ融合物は、ＰＣＲプライマーによって追加されたＴＮＦＲ細胞外ドメインおよび４－１ＢＢ細胞間ドメインの重複する末端を使用するステッチＰＣＲ増幅を通して作成された。制限部位ＡｓｃＩおよびＮｈｅＩを追加するためのプライマーを用いたこの産物の増幅は、ｐＣＣＬ転移ベクターへのライゲーションが可能になった。
クローニング
全長ＴＮＦＲ１コード配列は、ｇＢｌｏｃｋｓ遺伝子フラグメント（ＩＤＴ）としてオーダーされ、ＰＣＲによって増幅されて、制限部位ＡｓｃＩおよびＮｈｅＩを追加して、ｐＣＣＬ転移ベクターにライゲーションした。共刺激性ＴＮＦＲ１－４－１ＢＢ融合物は、ＰＣＲプライマーによって追加されたＴＮＦＲ細胞外ドメインおよび４－１ＢＢ細胞間ドメインの重複する末端を使用するステッチＰＣＲ増幅を通して作成された。制限部位ＡｓｃＩおよびＮｈｅＩを追加するためのプライマーを用いたこの産物の増幅は、ｐＣＣＬ転移ベクターへのライゲーションが可能になった。
【0096】
実施例２．キメラ共刺激受容体の特徴付け
ＴＮＦＲＳＦ共刺激ドメインの活性化は、炎症、生存および増殖を含むＮＦκＢ関連遺伝子の転写を増強するためのＮＦκＢ経路の下流の活性化をもたらす。ＴＮＦＲ１－４－１ＢＢ ＣＣＲがＮＦκＢ関連遺伝子の転写を増強するかどうかを決定するために、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の転写が２つのＮＦκＢエンハンサー領域によって制御されるレポーターシステムを利用した。ＨＥＫ２９３ＴＭ細胞は、リポフェクタミンを介して、ＮＦ－κＢ駆動型ルシフェラーゼレポーター、および（ｉ）完全長ＴＮＦＲ１、（ｉｉ）ＴＮＦ－ブロッカー、（ｉｉｉ）ＴＮＦＲ１－４－１ＢＢ ＣＣＲのいずれかでトランスフェクトした（図２Ａ））。続いて、トランスフェクトされた細胞を組換えヒトＴＮＦαで刺激した。ルシフェラーゼ基質であるＤ－ルシフェリンを培養物に添加し、ルシフェラーゼの存在量の直接的な尺度である発光をルミノメトリーによって定量化した。これらのデータは、ルシフェラーゼレポーター活性の増加によって実証されるように、ＴＮＦＲ１－４－１ＢＢ ＣＣＲの発現（図３、実線）が野生型ＴＮＦＲ１（図３、大きな破線）と比較してＮＦκＢトランス活性化の増強をもたらしたことを示す。ドミナントネガティブＴＮＦ－ブロッカー（図２Ｂ）受容体の発現は、ＴＮＦαを介したＮＦκＢシグナル伝達を無効にする（図３、短い破線）。しかし、これらのデータはまた、ＴＮＦαの非存在下でＮＦ－κＢトランス活性化が観察されたため、ＴＮＦＲ１－４－１ＢＢがＨＥＫ２９３ＴＭ細胞中で構成的に活性であることも示唆する。
ＴＮＦＲＳＦ共刺激ドメインの活性化は、炎症、生存および増殖を含むＮＦκＢ関連遺伝子の転写を増強するためのＮＦκＢ経路の下流の活性化をもたらす。ＴＮＦＲ１－４－１ＢＢ ＣＣＲがＮＦκＢ関連遺伝子の転写を増強するかどうかを決定するために、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の転写が２つのＮＦκＢエンハンサー領域によって制御されるレポーターシステムを利用した。ＨＥＫ２９３ＴＭ細胞は、リポフェクタミンを介して、ＮＦ－κＢ駆動型ルシフェラーゼレポーター、および（ｉ）完全長ＴＮＦＲ１、（ｉｉ）ＴＮＦ－ブロッカー、（ｉｉｉ）ＴＮＦＲ１－４－１ＢＢ ＣＣＲのいずれかでトランスフェクトした（図２Ａ））。続いて、トランスフェクトされた細胞を組換えヒトＴＮＦαで刺激した。ルシフェラーゼ基質であるＤ－ルシフェリンを培養物に添加し、ルシフェラーゼの存在量の直接的な尺度である発光をルミノメトリーによって定量化した。これらのデータは、ルシフェラーゼレポーター活性の増加によって実証されるように、ＴＮＦＲ１－４－１ＢＢ ＣＣＲの発現（図３、実線）が野生型ＴＮＦＲ１（図３、大きな破線）と比較してＮＦκＢトランス活性化の増強をもたらしたことを示す。ドミナントネガティブＴＮＦ－ブロッカー（図２Ｂ）受容体の発現は、ＴＮＦαを介したＮＦκＢシグナル伝達を無効にする（図３、短い破線）。しかし、これらのデータはまた、ＴＮＦαの非存在下でＮＦ－κＢトランス活性化が観察されたため、ＴＮＦＲ１－４－１ＢＢがＨＥＫ２９３ＴＭ細胞中で構成的に活性であることも示唆する。
【0097】
ＮＦκＢ経路の活性化は、ユビキチン－プロテアソーム経路の活性化を媒介することに関与するいくつかのキナーゼの活性化を含む複雑なシグナル伝達カスケードに起因する。ＮＦκＢシグナル伝達の鍵となる阻害剤であるκＢ阻害剤（ＩκＢ）は、重要なＮＦκＢ因子を隔離し、ＮＦκＢの活性化により、ユビキチン－プロテアソーム経路を介した分解の標的とされる。ＩκＢの分解はＮＦκＢ転写因子を活性化して遺伝子転写を増強する。ＣＣＲの活性化がＩκＢの分解をもたらすかどうかを決定するために、ウエスタンブロットを実施した。ＴＮＦＲ１－４－１ＢＢ ＣＣＲの見かけの構成的活性化は、ＨＥＫ２９３ＴＭ細胞における発現に起因する可能性があるため、これらの実験では、ＴＮＦＲ１およびバリアントＴＮＦＲ１受容体を、レンチウイルス形質導入を介してＴ細胞株、ジャーカットに導入した。ＴＮＦαで刺激すると、ＴＮＦＲ１－４－１ＢＢ ＣＣＲが形質導入されたジャーカット細胞は、ＩκＢの時間依存性分解を明らかにし、その分解速度は、親の操作されていない（非操作）（ＷＴ）ジャーカット細胞と比較して増強されており、このことは、ＴＮＦＲ１－４－１ＢＢ ＣＣＲの強力な効果を示す（図４）。切断された非シグナル伝達細胞質ドメインを有するＴＮＦ－ブロッカー受容体は、ＴＮＦαを刺激してＩκＢα分解を無効にし（図４）、このことは、ＴＮＦＲ１－４－１ＢＢ ＣＣＲによるＩκＢの分解の増強が細胞質ドメインに起因するものであることを示す。野生型ＴＮＦＲ１の毒性作用に起因して、ジャーカット細胞中では、野生型ＴＮＦＲ１を過剰発現させることができなかった。
【0098】
４－１ＢＢシグナル伝達は、ＭＡＰＫシグナル伝達経路を活性化することが示されてきた。ｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化および活性化は、下流の転写因子の活性化をもたらす。ホスホ－ｐ３８タンパク質レベルは、ＴＮＦＲ１－４－１ＢＢ ＣＣＲおよびＴＮＦ－ブロッカー操作ジャーカット細胞のＴＮＦα刺激後に評価した。ＴＮＦαによる刺激は、非操作のＷＴ細胞とＴＮＦＲ１－４１ＢＢ ＣＣＲで操作された細胞の両方でホスホ－ｐ３８レベルの誘導を誘導した。ホスホ－ｐ３８レベルは、刺激後５分でピークに達した。ピーク応答は、非操作（ＷＴ）ジャーカット細胞と比較して、ＴＮＦＲ１－４－１ＢＢ ＣＣＲで操作されたジャーカット細胞でより高かった（図５）。ＩκＢで観察された結果と同様に、ＴＮＦ－ブロッカー受容体の発現、ＴＮＦ－ブロッカー受容体は、ｐ３８リン酸化を無効にした（図５）。
【0099】
これらの結果は、ＴＮＦＲ１－４－１ＢＢ ＣＣＲが、Ｔ細胞における増強されたＮＦ－κＢシグナル伝達に向けてＴＮＦαシグナル伝達を再方向付けすることができることを明確に示す。
【0100】
第三世代の自己不活化レンチウイルス発現系を使用して、初代Ｔ細胞を操作して、図２Ａ－Ｃの受容体の１つを安定に発現させた。形質導入されたＴ細胞は、染色およびフローサイトメトリーを介して受容体の表面発現について評価した。ＴＮＦＲ１－４－１ＢＢ ＣＣＲの発現は、ＣＤ８＋とＣＤ４＋の両方のＴ細胞サブセットで明白であり、ＣＤ４＋Ｔ細胞でより高い形質導入率が認められた（図６Ａ－Ｂ）。Ｔ細胞の活性化および形質導入に続いて、初代培養物の増殖を１４日間にわたって追跡した。Ｔ細胞におけるＴＮＦＲ１－４－１ＢＢ ＣＣＲの発現は、インビトロでの細胞の増殖に影響を及ぼさず、このことは、形質導入されたＴ細胞がＴＮＦＲ１－４－１ＢＢ ＣＣＲの導入を許容したことを示唆する（図７）。
【0101】
ＴＮＦＲＳＦ共刺激は、持続性を改善するためにＴ細胞における生存シグナル伝達を増強することが示されてきた。ＴＮＦＲ１－４－１ＢＢ ＣＣＲによって提供される４－１ＢＢ共刺激は、形質導入されたＴ細胞に強化された生存特性を提供することが期待される。初代ヒトＴ細胞にＴＮＦＲ１－４－１ＢＢＣＣＲを形質導入し、ＩＬ２およびＩＬ７成長因子で１４日間増殖させた。１４日目に、細胞をサイトカインから取り出し、シグナル１（抗ＣＤ３）またはシグナル２（ＴＮＦα）のいずれかで刺激し、生細胞数を４日間追跡した。Ｔ細胞からの成長因子の除去は、対照Ｔ細胞培養物のアポトーシスおよび死滅をもたらす。しかし、ＴＮＦＲ１－４－１ＢＢ ＣＣＲで形質導入されたＴ細胞は、両方の刺激条件でより良好な生存を示し（図８Ａ－Ｂ）、このことは、ＴＮＦＲ１－４－１ＢＢＣＣＲのＴＮＦα刺激が、抗アポトーシス経路をアップレギュレートする操作されたＴ細胞への生存シグナル伝達を増強したことを示唆する。これらのデータはまた、抗ＣＤ３刺激Ｔ細胞が、ＴＮＦＲ１－４－１ＢＢ ＣＣＲ生存シグナル伝達を刺激するために十分なレベルのＴＮＦαを分泌することを示唆する。
【0102】
シグナル１（抗ＣＤ３）で刺激されたＴＮＦＲ１－４－１ＢＢ ＣＣＲ形質導入Ｔ細胞は、活性化されて、ＴＮＦαとＩＦＮγの両方を分泌するようになる。ＣＣＲ Ｔ細胞のサイトカインプロファイルは、対照細胞と比較してＩＦＮγ産生に偏っている（図９）。
【0103】
ＴＮＦＲ１－４－１ＢＢ ＣＣＲの有望な機能を考えて、次に、ＣＣＲの発現が、合成抗原受容体を介したＴ細胞活性化の状況において共刺激活性を提供するかどうかを決定した。この目的のために、ＣＣＲはＢＣＭＡに特異的なＴＡＣ受容体（ＢＣＭＡ－ＴＡＣ）と共発現させた。ＴＮＦＲ１－４－１ＢＢ ＣＣＲまたは２Ａペプチドによって分離されたＴＮＦ－ブロッカーのいずれかでＴＡＣ受容体を発現するレンチウイルスを構築した（図１０）。
【0104】
２Ａ発現系下でのＢＣＭＡ－ＴＡＣおよびＴＮＦＲ１－４－１ＢＢ ＣＣＲの発現がＴＡＣ機能に干渉しないことを確実にするために、抗腫瘍活性を評価するための機能的アッセイを実施した。ＴＡＣおよびＴＡＣ＋ＣＣＲで操作されたＴ細胞は、ルシフェラーゼを発現するＢＣＭＡ陽性ＫＭＳ１１細胞と２４時間共培養した。殺傷活性は、ＫＭＳ１１標的の発光の減少によって測定した。ＴＡＣ＋ＣＣＲ Ｔ細胞は、ＴＡＣ Ｔ細胞と同様の殺傷活性を示し（図１１）、２Ａ発現系が機能的受容体発現をもたらすことを示す。Ｔ細胞の活性化および細胞毒性はＴＡＣ受容体のみを介して媒介されるため、４－１ＢＢ－ＣＣＲによって提供される追加のシグナルが、インビトロでの殺傷アッセイに影響を与えるとは予想されていなかった。
【0105】
活性化されたＴ細胞は、分泌されたサイトカインを含むいくつかの可溶性メディエーターを通して細胞毒性および炎症誘発性シグナル伝達を媒介する。ＩＦＮγおよびＴＮＦαの発現は、抗原陽性腫瘍細胞標的との共培養後のインビトロ細胞内サイトカインアッセイにおいて評価された。抗原が関与すると、ＴＡＣ操作されたＴ細胞とＴＡＣ＋ＣＣＲで操作されたＴ細胞の両方が、ＩＦＮγおよびＴＮＦαを発現した。ＣＤ４＋ Ｔ細胞と、ＣＤ８＋ＴＡＣ＋ＣＣＲ Ｔ細胞の両方でサイトカイン発現の減少が観察されたことは興味深い（図１２）。クリニックでは、ＣＡＲで操作されたＴ細胞の使用は、サイトカインストームを通して部分的に媒介される、患者への毒性の高いリスクを示す。ＣＣＲの発現と並行して抗原が関与した後のＴ細胞分泌サイトカインの減少は、抗腫瘍活性を維持しながらＣＡＲ Ｔ細胞毒性を軽減する効果的な手段である可能性がある。
【0106】
ＴＡＣ操作されたＴ細胞におけるＣＣＲ発現の機能的結果を決定するために、増殖アッセイを実施して、抗原陽性腫瘍標的との共培養後のＴ細胞分裂を追跡した。抗原の関与とＴ細胞の活性化により、Ｔ細胞は急速な分裂と増殖を起こし、抗腫瘍活性を媒介する娘細胞を産生する。ＴＡＣ単独、ＴＡＣ＋ＣＣＲ、およびＴＡＣ＋ＴＮＦ－ブロッカーで操作されたＴ細胞を増殖アッセイで比較した。７日間の増殖アッセイに続いて、４－１ＢＢ－ＣＣＲで操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞と、ＣＤ８＋ＴＡＣ Ｔ細胞の両方が、増強された増殖を示した（図１３Ａ－Ｂ）。この効果は、ＣＤ８＋Ｔ細胞と比較して、ＣＤ４＋でより顕著である。ＴＮＦ－ブロッカーで操作されたＴ細胞は、ＴＡＣ単独と比較して、増殖にネガティブな影響を及ぼした。データは、ＣＣＲの発現がＴＡＣ Ｔ細胞の増殖能を増強するためのシグナルを媒介していることを示唆する。ＴＡＣと、操作されたＴＡＣ＋ＣＣＲの間で増殖指数および分裂指数を比較すると、ＴＡＣ＋ＣＣＲがＴＡＣ Ｔ細胞の増殖を促進することが観察された。これらの値はまた、平均して、ＴＡＣ＋ＣＣＲがＴＡＣ Ｔ細胞単独よりも３０～５０％多い増殖細胞を生成することも示す。
【0107】
ＴＮＦＲＳＦは、増殖、生存および記憶発達を増強することができる４－１ＢＢ、ＯＸ４０、およびＣＤ２７を含む、Ｔ細胞を共刺激することが知られているいくつかの分子を含む。プロトタイプのＴＮＦＲ１－４－１ＢＢ ＣＣＲを用いて有望な結果が得られたため、他の共刺激ドメインが同等以上の活性を有するかどうかを決定することが求められた。代替のＴＮＦＲＳＦ共刺激シグナルは、抗腫瘍活性を改善するための独自の特性を備えたＴＡＣ操作Ｔ細胞を誘導する可能性がある。評価するために１８の細胞内ドメインが選択され（表５に記載）、膜貫通ドメインがＴＮＦＲ１またはそれぞれのＴＮＦＲＳＦに由来する一連のＴＮＦＲＳＦ ＣＣＲを設計した（表５を参照）。
【0108】
ＴＮＦＲＳＦ ＣＣＲの有用性をスクリーニングするために、プレート結合抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）による刺激後の操作されたＴ細胞の増殖を増強するそれらの能力について、ＣＣＲを評価した。
【0109】
スクリーニングの有用性を確認するために、Ｔ細胞を元のＴＮＦＲ１－４－１ＢＢ、ＴＮＦ－ブロッカー、または対照受容体（短縮型ＮＧＦＲ）で操作し、プレート結合抗ＣＤ３で活性化した（図１４）。以前のデータと一致して、スクリーニングは、対照（短縮型ＮＧＦＲ）と比較して、ＴＮＦＲ１－４－１ＢＢＣＣＲによる増殖増強およびＴＮＦ－ブロッカーの阻害効果を同定した。したがって、プレート結合ＣＤ３は、ＴＮＦＲＳＦ共刺激受容体のスクリーニングのために有効なアッセイである。
【0110】
表５に記載される合成ＴＮＦＲ１－ＣＣＲのｃＤＮＡは、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔによって合成し、レンチウイルスベクターにサブクローニングした。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズで刺激されたＰＢＭＣは、ＣＣＲでレンチウイルス操作され、ＩＬ２およびＩＬ７中で１４日間増殖され、その時点で、プレート結合した抗ＣＤ３による刺激後の全体的な増殖、操作効率、受容体発現、および増殖についてＴ細胞が評価された。すべてのレンチウイルスに含まれる形質導入マーカー（ＮＧＦＲ）によって評価されるように、ＣＣＲを使用したヒトＰＢＭＣの操作効率は、１５～８５％の範囲であった（図１５）。表面の受容体の量を評価するために、操作された細胞を細胞外ＴＮＦＲ１ドメインに対する抗体で染色した。ＣＣＲの表面発現はバックグラウンドより０～１５００％高い範囲であった（図１６）。バルクＣＣＲ操作培養物の倍率拡大は、対照の５０～４５０％の範囲であった（図１７）。１４日目の操作されたＴ細胞は、抗ＣＤ３刺激後の５日間の増殖アッセイにおいて評価した。ＣＣＲ操作Ｔ細胞の増殖は、ＣＤ４（図１８）とＣＤ８（図１９）の両方のＴ細胞サブセットで１（増殖なし）から１５（平均１５細胞が単一細胞から生成された）の範囲であった。ＣＣＲの増殖スクリーニングのポジティブヒット閾値は、共刺激シグナルを受け取らなかったＮＧＦＲ形質導入制御の増殖指数に設定した。ＣＣＲで操作されたＣＤ４ Ｔ細胞の増殖は、ＣＤ８ Ｔ細胞よりも増殖に対してより顕著な効果を実証した。最も増殖性の高いＣＣＲ ＣＤ４細胞は、ＮＧＦＲ操作細胞よりも７５％増殖性が高かったのに対し、最も増殖性の高いＣＣＲ ＣＤ８ Ｔ細胞は、対応するＮＧＦＲ操作細胞よりも６０％増殖性が高かった。
【0111】
設計された構築物からの多因子スクリーニング結果は、ＣＣＲ操作されたＴ細胞間の類似性を評価するためにクラスタリングアルゴリズムを使用して分析した。クラスタリングアルゴリズムに含まれるデータは、表面発現、操作効率、およびＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞の両方のサブセットの増殖であった。データの次元は、主成分分析を使用して最初に削減され、重心はＫ－ｍｅａｎｓクラスタリング法を使用して計算した。相関ヒートマップは、構築物間の類似性を説明する（図２０）。樹状図のグループ化により、同様の属性を有する受容体を同定する。上のグループには、より高い表面発現、培養物の成長の改善、および増殖の増強を実証した４－１ＢＢおよびＢＡＦＦＲＣＣＲが含まれている。中央のグループには、ＣＣＲ発現がなく、増殖への影響が最小限で、増殖の増強がないＮＧＦＲ形質導入対照が含まれている。中央のグループにはまた、ＣＣＲの発現がほとんどなく、増殖の改善が最小限で、増殖の強化がいくらかある元々の４－１ＢＢＣＣＲも含まれている。下のグループには、ＴＮＦ－ブロッカー、ＬＩＧＨＴ、およびＦＡＳの共刺激ドメインが含まれており、これらのドメインは、培養物の増殖を遅らせ、増殖にネガティブな影響を与えることが実証されている。これらのグループがマルチパラメータークラスタリングに基づいて形成されたことは興味深いことであり、これは、共刺激ドメインへの洞察を提供し、増殖スクリーニングからのポジティブヒットとともにクラスター化された上位グループのメンバーを強調する。このグループのすべての受容体が増殖を促進したわけではないが、それでも追求する価値があるかもしれない。共刺激受容体は、増殖を促進するだけでなく、細胞毒性機能ならびに生存および持続性も促進する。この共刺激グループ化における受容体は、増殖以外の他の共刺激特性の可能性を秘めているかもしれない。
【0112】
重心のクラスター化から作成されたＴＮＦＲＳＦ ＣＣＲのグループ化を評価することにより、望ましい機能的属性を有する操作されたＴ細胞が明らかになった。４－１ＢＢおよびＢＡＦＦＲ共刺激シグナル伝達ドメインを有するＣＣＲは、ＰＢＭＣの拡大の改善、高い操作効率、および増殖能力の改善を実証した。４－１ＢＢおよびＢＡＦＦＲドメインの有用性を検証するために、ＴＮＦＲ１－４－１ＢＢおよびＴＮＦＲ－ＢＡＦＦＲ構築物を３人のＰＢＭＣドナーを用いた増殖アッセイで実行した（図２１Ａ－Ｂ）。選択された構築物は、スクリーニング結果と同等に機能し、対照受容体よりも増殖が増強されることを実証する。これらのデータは、スクリーニングデータの信頼性を提供しただけでなく、操作されたＴ細胞の共刺激に４－１ＢＢおよびＢＡＦＦＲシグナル伝達ドメインを使用する際の可能性を確認する。細胞傷害性Ｔ細胞の重要な機能は、活性化後のサイトカインの分泌である。ＴＮＦＲ１－４－１ＢＢおよびＴＮＦＲ－ＢＡＦＦＲ操作Ｔ細胞は、抗ＣＤ３刺激後のサイトカイン産生について評価し（図２２Ａ－Ｂ）、同等レベルのＩＦＮ－γ産生細胞が観察されたが、ＴＮＦ－α産生細胞のレベルの低下が観察され、これはおそらく、ＴＮＦ－αがＣＣＲに結合しているためである。
【0113】
考察
Ｔ細胞活性化は、複雑で十分に組織化されたシグナル伝達カスケードの結果である。ＴＣＲ複合体、補助受容体、アダプター分子の完全な動員、ならびに共刺激分子と共抑制分子の統合により、受容体シグナル強度が合計され、活性化Ｔ細胞プログラミングの誘導をもたらす。ＴＣＲはこの回路の重要な構成要素である。ＴＣＲは、Ｔ細胞の細胞傷害性の焦点を病原体の固有のエピトープに向けて方向付ける。Ｔ細胞抗原カプラー（ＴＡＣ）を含む合成抗原受容体の開発により、Ｔ細胞の細胞毒性の特質を新しい標的に向ける能力をもたらし、強化された腫瘍監視および抗腫瘍活性を用いてヒトの免疫システムを転用する。ＴＡＣ分子は、２シグナル仮説のシグナル１を提供する。操作された細胞内でシグナル２を関与させると、Ｔ細胞の活性化に対してより強い刺激が誘発され得る。Ｔ細胞活性化キメラ受容体の成功は、操作された細胞に独特の特徴を誘発するための新規キメラ共刺激受容体を開発するというアイデアを想像させる。ＣＤ２８、４－１ＢＢ、およびＯＸ４０を含む共刺激受容体は、活性化、増殖、および細胞毒性機能を促進する活性化Ｔ細胞に第２のシグナルを提供する、よく説明されている受容体である。上記のように、活性化されたＴ細胞分泌リガンドＴＮＦαの制御下で共刺激を提供することができるキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）が開発された。この設計手法の背後にあるインスピレーションは、Ｔ細胞の活性化後にのみ共刺激を提供することであった。これらの研究により、活性化されたＴ細胞が豊富なＴＮＦαを分泌することがわかった。原理的には、分泌されたＴＮＦαは、ＣＣＲに結合しかつ刺激するはずである。初期のＣＣＲ構築物の設計には、ＴＮＦＲＳＦの共刺激分子である４－１ＢＢが含まれていた。ＣＣＲは、共刺激シグナルを別個の受容体として操作し、あらゆる型のＴ細胞治療（例えば、操作されたＴ細胞、ＴＩＬ）む、ＮＫ細胞の応用、および操作された単球療法を含む、多くの細胞療法にわたってその有用性をもたらす。ＣＣＲは、このプロジェクトで、単独で発現した場合とＴＡＣ受容体と組み合わせて発現した場合の両方で、増殖能の増強およびサイトカイン産生の変化を示す。ＣＣＲで操作されたＴ細胞において観察される増殖の増強は、養子Ｔ細胞移植の分野に課題を提示し続ける、定着した腫瘍塊の抑制的な微小環境を克服するために必要な適応エッジを提供し得る。ＣＣＲ Ｔ細胞のサイトカイン産生プロファイルの変化は、増殖、細胞毒性、または生存に障害をもたらさないようである。サイトカイン産生の低下は、操作されたＴ細胞の投与後の患者への毒性が低いことさえ証明するかもしれない。現在、患者におけるＣＡＲ Ｔ細胞の注入および拡大は、サイトカイン産生プロファイルが変化したＴ細胞を操作することに伴って軽減される可能性のあるサイトカインストームに起因する毒性をもたらす。
Ｔ細胞活性化は、複雑で十分に組織化されたシグナル伝達カスケードの結果である。ＴＣＲ複合体、補助受容体、アダプター分子の完全な動員、ならびに共刺激分子と共抑制分子の統合により、受容体シグナル強度が合計され、活性化Ｔ細胞プログラミングの誘導をもたらす。ＴＣＲはこの回路の重要な構成要素である。ＴＣＲは、Ｔ細胞の細胞傷害性の焦点を病原体の固有のエピトープに向けて方向付ける。Ｔ細胞抗原カプラー（ＴＡＣ）を含む合成抗原受容体の開発により、Ｔ細胞の細胞毒性の特質を新しい標的に向ける能力をもたらし、強化された腫瘍監視および抗腫瘍活性を用いてヒトの免疫システムを転用する。ＴＡＣ分子は、２シグナル仮説のシグナル１を提供する。操作された細胞内でシグナル２を関与させると、Ｔ細胞の活性化に対してより強い刺激が誘発され得る。Ｔ細胞活性化キメラ受容体の成功は、操作された細胞に独特の特徴を誘発するための新規キメラ共刺激受容体を開発するというアイデアを想像させる。ＣＤ２８、４－１ＢＢ、およびＯＸ４０を含む共刺激受容体は、活性化、増殖、および細胞毒性機能を促進する活性化Ｔ細胞に第２のシグナルを提供する、よく説明されている受容体である。上記のように、活性化されたＴ細胞分泌リガンドＴＮＦαの制御下で共刺激を提供することができるキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）が開発された。この設計手法の背後にあるインスピレーションは、Ｔ細胞の活性化後にのみ共刺激を提供することであった。これらの研究により、活性化されたＴ細胞が豊富なＴＮＦαを分泌することがわかった。原理的には、分泌されたＴＮＦαは、ＣＣＲに結合しかつ刺激するはずである。初期のＣＣＲ構築物の設計には、ＴＮＦＲＳＦの共刺激分子である４－１ＢＢが含まれていた。ＣＣＲは、共刺激シグナルを別個の受容体として操作し、あらゆる型のＴ細胞治療（例えば、操作されたＴ細胞、ＴＩＬ）む、ＮＫ細胞の応用、および操作された単球療法を含む、多くの細胞療法にわたってその有用性をもたらす。ＣＣＲは、このプロジェクトで、単独で発現した場合とＴＡＣ受容体と組み合わせて発現した場合の両方で、増殖能の増強およびサイトカイン産生の変化を示す。ＣＣＲで操作されたＴ細胞において観察される増殖の増強は、養子Ｔ細胞移植の分野に課題を提示し続ける、定着した腫瘍塊の抑制的な微小環境を克服するために必要な適応エッジを提供し得る。ＣＣＲ Ｔ細胞のサイトカイン産生プロファイルの変化は、増殖、細胞毒性、または生存に障害をもたらさないようである。サイトカイン産生の低下は、操作されたＴ細胞の投与後の患者への毒性が低いことさえ証明するかもしれない。現在、患者におけるＣＡＲ Ｔ細胞の注入および拡大は、サイトカイン産生プロファイルが変化したＴ細胞を操作することに伴って軽減される可能性のあるサイトカインストームに起因する毒性をもたらす。
【0114】
４－１ＢＢ ＣＣＲを含むときに見出されるＴ細胞増殖の改善は、操作されたＴ細胞の共刺激のためのＴＮＦＲＳＦの幅広いファミリーに由来する他の共刺激ドメインの有用性の分析をもたらす。ＴＮＦＲ１－キメラプラットフォーム内のＴＮＦＲＳＦ共刺激シグナル伝達ドメインの増殖スクリーニングは、Ｔ細胞機能を増強する可能性のあるＣＣＲのさまざまな特性を明らかにした。注目すべきことに、このスクリーニングは、ＢＡＦＦ－Ｒ共刺激ドメインの有用性を明らかにし、これは、通常、Ｔ細胞の共刺激因子とは考えられていない。重要なことに、これらのさまざまなＣＣＲの有用性は、用途によって異なる場合があり、これによって、生成されたＣＣＲのコレクション全体に価値が生まれる。目的は、インビボでの抗腫瘍活性が強化されたＴＡＣ＋ＣＣＲ Ｔ細胞製品を生成することである。今後の方向性には、操作されたＴ細胞に対するＣＣＲの効果を評価することを継続することが含まれる。実際、これらのデータの結果は、本明細書に記載のＣＣＲ設計を使用して、Ｔ細胞への抑制性および／または細胞死のシグナルを媒介するＴＮＦＲＳＦのいずれかを通してのシグナル伝達を再方向付けできることを示唆する。さらなる反復の例として、活性化後にＦａｓＬとＴＲＡＩＬの両方がＴ細胞死を促進できるように、ＦＡＳの細胞外ドメイン（ＴＮＦＲＳＦ６）を使用してＦａｓＬ（ＴＮＦＳＦ６）またはＤＲ４／ＤＲ５（ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ／Ｂ）からの細胞死のシグナル伝達を破壊し、ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦＳＦ１０）からの細胞死のシグナル伝達を破壊するＣＣＲを設計することができる。ＣＣＲ操作されたＴ細胞は、増殖が増強されることが実証され、今後の作業により、これらの共刺激されたＴ細胞のサイトカイン産生プロファイルが決定される。ＣＣＲシグナル伝達によって変化する遺伝子経路を調査し、ヒトＴ細胞における増殖の調節因子を発見することは興味深い。
【0115】
実験方法
Ｔ細胞増殖
末梢血単核細胞は、健康なドナーから受容し、ＩＬ－２（１００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ－７（１０ｎｇ／ｍｌ）が補充されたＲＰＭＩ培養培地中の抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８磁気ビーズで刺激される。１日後、第３世代レンチウイルスベクターとパッケージング系を使用して細胞を形質導入した。Ｔ細胞培養は２日ごとにＩＬ－２およびＩＬ－７を添加して１×１０６細胞／ｍｌに維持する。培養１４日後、Ｔ細胞はＣＤ４／ＣＤ８、キメラ受容体、ＮＧＦＲ（形質導入マーカー）について特徴付ける。
Ｔ細胞増殖
末梢血単核細胞は、健康なドナーから受容し、ＩＬ－２（１００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ－７（１０ｎｇ／ｍｌ）が補充されたＲＰＭＩ培養培地中の抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８磁気ビーズで刺激される。１日後、第３世代レンチウイルスベクターとパッケージング系を使用して細胞を形質導入した。Ｔ細胞培養は２日ごとにＩＬ－２およびＩＬ－７を添加して１×１０６細胞／ｍｌに維持する。培養１４日後、Ｔ細胞はＣＤ４／ＣＤ８、キメラ受容体、ＮＧＦＲ（形質導入マーカー）について特徴付ける。
【0116】
レンチウイルス産生
レンチウイルスは、パッケージングプラスミドｐＲＳＶ－Ｒｅｖ、ｐＭＤＬｇ－ｐＲＲＥ、ｐＭＤ２．Ｇ、およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００トランスフェクション試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によるｐＣＣＬ転移プラスミドを用いたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクションによって調製した。粒子は、２８，０００ＲＰＭでの超遠心分離によって濃縮した。ウイルス力価は、ウイルスの希釈およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞の形質導入によって決定した。形質導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、フローサイトメトリーによってＮＧＦＲ＋（形質導入マーカー）％について定量化し、力価は形質導入単位（ＴＵ／ｍｌ）で計算した。
レンチウイルスは、パッケージングプラスミドｐＲＳＶ－Ｒｅｖ、ｐＭＤＬｇ－ｐＲＲＥ、ｐＭＤ２．Ｇ、およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００トランスフェクション試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によるｐＣＣＬ転移プラスミドを用いたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクションによって調製した。粒子は、２８，０００ＲＰＭでの超遠心分離によって濃縮した。ウイルス力価は、ウイルスの希釈およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞の形質導入によって決定した。形質導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、フローサイトメトリーによってＮＧＦＲ＋（形質導入マーカー）％について定量化し、力価は形質導入単位（ＴＵ／ｍｌ）で計算した。
【0117】
タンパク質レベルの決定（ウエスタンブロット）
Ｔ細胞を、溶解緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、ｐＨ８．０）中で、組織ホモジナイザーを使用して、プロテアーゼ阻害剤カクテル（１：１００）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に氷上で均質化し、続いて４℃で１５分間９，０００×ｇで遠心分離した。サンプルタンパク質濃度は、ビシンコニン酸アッセイ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）によって決定した。２－メルカプトエタノールを含むＬａｅｍｍｌｉ緩衝液をサンプルに添加した後、９５℃で５分間熱変性を行った。サンプルを１０％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで電気泳動し、定常３５０ｍＡで９０分間ニトロセルロースメンブレンに湿式転写した。ＴＢＳＴ中の５％（ｗ／ｖ）スキムミルクブロッカーを使用して、メンブレンを４℃で一晩ブロックした。一次抗体（２％ブロッカーを含むＴＢＳＴ中で１：１０００）とともに室温で２時間振とうしながら、メンブレンをインキュベートした。メンブレンをＴＢＳＴ中で３回洗浄し、蛍光結合体化二次抗体（２％スキムミルクブロッカーを含むＴＢＳＴ中１：５０００）とともに１時間インキュベートした。メンブレンをＴＢＳＴで３回洗浄した。
Ｔ細胞を、溶解緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、ｐＨ８．０）中で、組織ホモジナイザーを使用して、プロテアーゼ阻害剤カクテル（１：１００）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に氷上で均質化し、続いて４℃で１５分間９，０００×ｇで遠心分離した。サンプルタンパク質濃度は、ビシンコニン酸アッセイ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）によって決定した。２－メルカプトエタノールを含むＬａｅｍｍｌｉ緩衝液をサンプルに添加した後、９５℃で５分間熱変性を行った。サンプルを１０％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで電気泳動し、定常３５０ｍＡで９０分間ニトロセルロースメンブレンに湿式転写した。ＴＢＳＴ中の５％（ｗ／ｖ）スキムミルクブロッカーを使用して、メンブレンを４℃で一晩ブロックした。一次抗体（２％ブロッカーを含むＴＢＳＴ中で１：１０００）とともに室温で２時間振とうしながら、メンブレンをインキュベートした。メンブレンをＴＢＳＴ中で３回洗浄し、蛍光結合体化二次抗体（２％スキムミルクブロッカーを含むＴＢＳＴ中１：５０００）とともに１時間インキュベートした。メンブレンをＴＢＳＴで３回洗浄した。
【0118】
フローサイトメトリー表面染色
Ｔ細胞を収集し、１５００ｒｐｍでペレット化し、原形質膜タンパク質に対する蛍光標識抗体と共に３０分間インキュベートした。Ｔ細胞をＦＡＣＳ緩衝液（１％ＢＳＡ、１×ＰＢＳ、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ）中で洗浄し、ペレット化した。Ｔ細胞を３００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に懸濁し、ろ過した後、フローサイトメーターで泳動した。フローサイトメーターは、標識抗体について、前方散乱、側方散乱、および適切な蛍光チャネルを記録する。ＦｌｏｗＪｏ Ｖ１０ソフトウェアを使用してサイトメーターデータを分析し、散布図として表示した。
Ｔ細胞を収集し、１５００ｒｐｍでペレット化し、原形質膜タンパク質に対する蛍光標識抗体と共に３０分間インキュベートした。Ｔ細胞をＦＡＣＳ緩衝液（１％ＢＳＡ、１×ＰＢＳ、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ）中で洗浄し、ペレット化した。Ｔ細胞を３００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に懸濁し、ろ過した後、フローサイトメーターで泳動した。フローサイトメーターは、標識抗体について、前方散乱、側方散乱、および適切な蛍光チャネルを記録する。ＦｌｏｗＪｏ Ｖ１０ソフトウェアを使用してサイトメーターデータを分析し、散布図として表示した。
【0119】
インビトロ細胞内サイトカイン産生
Ｔ細胞を収集し、抗原陽性腫瘍細胞株で３７℃にて４時間刺激した。サイトカインのＴ細胞分泌を妨害するために、ＧｏｌｇｉＰｌｕｇおよびＧｏｌｇｉＳｔｏｐ試薬（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を加えた。４時間後、０．０２Ｍ ＥＤＴＡを添加して刺激を停止し、室温で１５分間インキュベートする。細胞を収集して洗浄した後、遠心分離および染色を行った。細胞内サイトカインは、細胞を固定および透過処理した後、ＴＮＦ－アルファ、ＩＦＮ－ガンマ、およびＩＬ－２に対する蛍光標識抗体を用いて染色することにより評価する。蛍光はフローサイトメトリーによって評価し、ＦｌｏｗＪｏ Ｖ１０ソフトウェア上で分析する。
Ｔ細胞を収集し、抗原陽性腫瘍細胞株で３７℃にて４時間刺激した。サイトカインのＴ細胞分泌を妨害するために、ＧｏｌｇｉＰｌｕｇおよびＧｏｌｇｉＳｔｏｐ試薬（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を加えた。４時間後、０．０２Ｍ ＥＤＴＡを添加して刺激を停止し、室温で１５分間インキュベートする。細胞を収集して洗浄した後、遠心分離および染色を行った。細胞内サイトカインは、細胞を固定および透過処理した後、ＴＮＦ－アルファ、ＩＦＮ－ガンマ、およびＩＬ－２に対する蛍光標識抗体を用いて染色することにより評価する。蛍光はフローサイトメトリーによって評価し、ＦｌｏｗＪｏ Ｖ１０ソフトウェア上で分析する。
【0120】
インビトロ細胞毒性
Ｔ細胞を収集し、ルシフェラーゼ発現抗原陽性腫瘍細胞株と、８から０．２５までのエフェクター対標的比で、１６～１８時間共インキュベートした。インキュベーション後、Ｄ－ルシフェリンを培養物に添加し、室温で１０分間インキュベートする。輝度はプレートリーダーで読み取る。輝度の量は、ウェル内の腫瘍細胞の生存率と相関する。データは、エフェクターと標的の比率にわたってプロットする。
Ｔ細胞を収集し、ルシフェラーゼ発現抗原陽性腫瘍細胞株と、８から０．２５までのエフェクター対標的比で、１６～１８時間共インキュベートした。インキュベーション後、Ｄ－ルシフェリンを培養物に添加し、室温で１０分間インキュベートする。輝度はプレートリーダーで読み取る。輝度の量は、ウェル内の腫瘍細胞の生存率と相関する。データは、エフェクターと標的の比率にわたってプロットする。
【0121】
増殖アッセイ
Ｔ細胞を収集し、１５００ｒｐｍでペレット化し、ＰＢＳ中の１：１０００ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ染色液に３７℃で２０分間再懸濁し、１×１０６細胞／ｍｌで細胞を染色する。Ｔ細胞培地を４：１の量の染色液で添加し、３７℃でインキュベートして残りのＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）色素をクエンチする。染色した細胞を１５００ｒｐｍでペレット化し、Ｔ細胞培地に再懸濁して、サイトカインを含まない２４ウェルプレートに０．５×１０６細胞／ｍｌで播種する。腫瘍標的は、１：２のエフェクター：標的比でウェルに加える。ＣＣＲを単発現させるために、１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３クローン）でコーティングしたプレートで細胞を刺激する。Ｔ細胞を５日間または７日間のいずれかで追跡し、細胞数と生存率を記録する。５日目または７日目に細胞を収集し、フローサイトメトリー用に染色する。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ希釈ピークは分裂したＴ細胞を表しており、これから増殖の測定値を計算できる。
Ｔ細胞を収集し、１５００ｒｐｍでペレット化し、ＰＢＳ中の１：１０００ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ染色液に３７℃で２０分間再懸濁し、１×１０６細胞／ｍｌで細胞を染色する。Ｔ細胞培地を４：１の量の染色液で添加し、３７℃でインキュベートして残りのＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）色素をクエンチする。染色した細胞を１５００ｒｐｍでペレット化し、Ｔ細胞培地に再懸濁して、サイトカインを含まない２４ウェルプレートに０．５×１０６細胞／ｍｌで播種する。腫瘍標的は、１：２のエフェクター：標的比でウェルに加える。ＣＣＲを単発現させるために、１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３クローン）でコーティングしたプレートで細胞を刺激する。Ｔ細胞を５日間または７日間のいずれかで追跡し、細胞数と生存率を記録する。５日目または７日目に細胞を収集し、フローサイトメトリー用に染色する。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ希釈ピークは分裂したＴ細胞を表しており、これから増殖の測定値を計算できる。
【0122】
実施例３：Ｆａｓキメラ共刺激受容体
ＴＮＦＲＳＦ、ＦａｓまたはＣＤ９５は、Ｔ細胞アポトーシスの重要な調節因子である。ＦａｓＬの発現はＴ細胞および腫瘍で実証されてきた。Ｆａｓ－ＦａｓＬ相互作用は、ＦａｓＬ発現Ｔ細胞とＦａｓ発現Ｔ細胞の相互作用を介して活性化Ｔ細胞の細胞死を促進することができ、フラトリサイド（ｆｒａｔｒｉｃｉｄｅ）をもたらす。腫瘍上のＦａｓＬとＦａｓ発現Ｔ細胞との間の相互作用はまた、腫瘍特異的Ｔ細胞の細胞死にも関連している。デスシグナルは、アダプタータンパク質、ＦＡＤＤと相互作用するＦａｓ受容体、またはデスドメインを有するＦａｓ関連タンパク質の細胞質ドメインを介して媒介され、カスパーゼ－８およびカスパーゼ－１０を動員して細胞死誘導シグナル伝達複合体（ＤＩＳＣ）を形成する。ＤＩＳＣは、カスパーゼ－８／カスパーゼ－１０を切断および活性化して、エフェクターカスパーゼをトリガーしてアポトーシスを媒介する。
ＴＮＦＲＳＦ、ＦａｓまたはＣＤ９５は、Ｔ細胞アポトーシスの重要な調節因子である。ＦａｓＬの発現はＴ細胞および腫瘍で実証されてきた。Ｆａｓ－ＦａｓＬ相互作用は、ＦａｓＬ発現Ｔ細胞とＦａｓ発現Ｔ細胞の相互作用を介して活性化Ｔ細胞の細胞死を促進することができ、フラトリサイド（ｆｒａｔｒｉｃｉｄｅ）をもたらす。腫瘍上のＦａｓＬとＦａｓ発現Ｔ細胞との間の相互作用はまた、腫瘍特異的Ｔ細胞の細胞死にも関連している。デスシグナルは、アダプタータンパク質、ＦＡＤＤと相互作用するＦａｓ受容体、またはデスドメインを有するＦａｓ関連タンパク質の細胞質ドメインを介して媒介され、カスパーゼ－８およびカスパーゼ－１０を動員して細胞死誘導シグナル伝達複合体（ＤＩＳＣ）を形成する。ＤＩＳＣは、カスパーゼ－８／カスパーゼ－１０を切断および活性化して、エフェクターカスパーゼをトリガーしてアポトーシスを媒介する。
【0123】
Ｆａｓの細胞質領域の除去は、細胞死シグナルを弱めると予想されるドミナントネガティブ受容体をもたらす。Ｆａｓ細胞質ドメインを４－１ＢＢまたはＢＡＦＦＲのいずれかの細胞質ドメインで置き換えると、細胞死のシグナルを抑え込み、それをＴ細胞の生存を増強できる共刺激シグナルに置き換えることが期待される。
【0124】
Ｆａｓキメラは、Ｆａｓ受容体の細胞外ドメインが、図２Ｂに示されるように、４－１ＢＢまたはＢＡＦＦＲのいずれかの細胞質ドメインに結合された場合に生成された。
【0125】
Ｆａｓ－キメラ共刺激受容体の操作および発現
初代ヒトＴ細胞に、Ｆａｓ－キメラまたはＦａｓ－ＴＲＵＮＣを発現するレンチウイルスを形質導入した。対照として、初代ヒトＴ細胞にＦａｓ受容体（ＮＧＦＲ）をコードしない対照レンチウイルスを形質導入した。すべてのレンチウイルスベクターはＮＧＦＲを発現し、ＮＧＦＲの発現に基づいて形質導入効率を決定することができた。操作されたＴ細胞のすべての構築物は、ＮＧＦＲ形質導入マーカーの発現に基づいて４０～５０％の間の効率を示し、これは対照ウイルスに匹敵した（図２４）。
初代ヒトＴ細胞に、Ｆａｓ－キメラまたはＦａｓ－ＴＲＵＮＣを発現するレンチウイルスを形質導入した。対照として、初代ヒトＴ細胞にＦａｓ受容体（ＮＧＦＲ）をコードしない対照レンチウイルスを形質導入した。すべてのレンチウイルスベクターはＮＧＦＲを発現し、ＮＧＦＲの発現に基づいて形質導入効率を決定することができた。操作されたＴ細胞のすべての構築物は、ＮＧＦＲ形質導入マーカーの発現に基づいて４０～５０％の間の効率を示し、これは対照ウイルスに匹敵した（図２４）。
【0126】
Ｆａｓキメラは、ネイティブＦａｓに対する抗体を用いて細胞表面上で検出された。上記のように、操作されていない（非操作）Ｔ細胞は、培養期間の１４日目に高レベルのＦａｓを発現する。４－１ＢＢおよびＢＡＦＦＲ共刺激ドメインを含むＦａｓキメラを発現するように形質導入されたＴ細胞は、平均蛍光強度によって評価されるように、ネイティブＦａｓレベルよりも高いＦａｓ発現レベルを実証した（図２５）。Ｆａｓ－４－１ＢＢおよびＦａｓ－ＢＡＦＦＲキメラの細胞表面発現は、平均蛍光強度で評価した場合、ＮＧＦＲ対照の１．３５×１０４と比較して、４．９×１０４および７．９×１０４であった。興味深いことに、Ｆａｓ－ＴＲＵＮＣ受容体の発現は、ＮＧＦＲレベル（ＭＦＩ＝２．０×１０４）よりもわずかに上であった。
【0127】
Ｆａｓキメラを発現するように操作されたＴ細胞は、ＮＧＦＲ対照と比較して、製造プロセスの間に同等の速度で増殖し、このことは、修飾Ｆａｓ受容体の発現が製造期間の間のＴ細胞増殖に影響を及ぼさないことを示す（図２６）。
【0128】
改変されたＦａｓ受容体は増殖を増強する
改変されたＦａｓ受容体の発現がＴ細胞増殖に影響を与えるかどうかを決定するために、初代ヒトＴ細胞を、Ｆａｓ－ＴＲＵＮＣ、Ｆａｓ－４－１ＢＢ、またはＦａｓ－ＢＡＦＦＲのいずれかを発現するレンチウイルスで操作した。対照Ｔ細胞は、ＮＧＦＲのみを発現するレンチウイルスで操作された。操作されたＴ細胞は、Ｔ細胞受容体の代理刺激としてアゴニストＣＤ３抗体で刺激された。改変されたＦａｓ受容体で操作されたすべてのＴ細胞は、対照のＮＧＦＲＴ細胞と比較して増強された増殖を示した。Ｆａｓ－４－１ＢＢまたはＦａｓ－ＢＡＦＦＲで操作されたＴ細胞は、Ｆａｓ－ＴＲＵＮＣと同等に増殖し、このことは、Ｆａｓシグナルを抑え込むことが、追加の共刺激シグナル伝達を必要とせずに増殖を促進するために十分であることを示す（図２７）。
改変されたＦａｓ受容体の発現がＴ細胞増殖に影響を与えるかどうかを決定するために、初代ヒトＴ細胞を、Ｆａｓ－ＴＲＵＮＣ、Ｆａｓ－４－１ＢＢ、またはＦａｓ－ＢＡＦＦＲのいずれかを発現するレンチウイルスで操作した。対照Ｔ細胞は、ＮＧＦＲのみを発現するレンチウイルスで操作された。操作されたＴ細胞は、Ｔ細胞受容体の代理刺激としてアゴニストＣＤ３抗体で刺激された。改変されたＦａｓ受容体で操作されたすべてのＴ細胞は、対照のＮＧＦＲＴ細胞と比較して増強された増殖を示した。Ｆａｓ－４－１ＢＢまたはＦａｓ－ＢＡＦＦＲで操作されたＴ細胞は、Ｆａｓ－ＴＲＵＮＣと同等に増殖し、このことは、Ｆａｓシグナルを抑え込むことが、追加の共刺激シグナル伝達を必要とせずに増殖を促進するために十分であることを示す（図２７）。
【0129】
Ｆａｓ－キメラは、外因性のＦａｓＬシグナル伝達を克服する
Ｆａｓキメラは、ＦａｓＬのアポトーシスシグナルを再方向付けするように設計された。ＦａｓキメラがＦａｓＬからのアポトーシスをブロックできるかどうかを決定するために、操作されたＴ細胞を可溶性三量体ＦａｓＬで刺激し、４８時間後に代謝色素ＡｌａｍａｒＢｌｕｅを使用して生存率を評価した。対照細胞をＦａｓＬに曝露すると、濃度の増加に伴いＴ細胞の生存率が低下した。対照Ｔ細胞（ＮＧＦＲ）は、外因性ＦａｓＬの存在下で生存率の用量依存的な喪失を示した。改変されたＦａｓ受容体で操作されたすべてのＴ細胞は、外因性ＦａｓＬの存在下で対照細胞と比較して増強された生存率を示した。Ｆａｓ－ＢＡＦＦＲで操作されたＴ細胞は、外因性ＦａｓＬに対して最大の耐性を示し、このことは、Ｔ細胞の生存に対する共刺激ドメインの利点を示す（図２８）。
Ｆａｓキメラは、ＦａｓＬのアポトーシスシグナルを再方向付けするように設計された。ＦａｓキメラがＦａｓＬからのアポトーシスをブロックできるかどうかを決定するために、操作されたＴ細胞を可溶性三量体ＦａｓＬで刺激し、４８時間後に代謝色素ＡｌａｍａｒＢｌｕｅを使用して生存率を評価した。対照細胞をＦａｓＬに曝露すると、濃度の増加に伴いＴ細胞の生存率が低下した。対照Ｔ細胞（ＮＧＦＲ）は、外因性ＦａｓＬの存在下で生存率の用量依存的な喪失を示した。改変されたＦａｓ受容体で操作されたすべてのＴ細胞は、外因性ＦａｓＬの存在下で対照細胞と比較して増強された生存率を示した。Ｆａｓ－ＢＡＦＦＲで操作されたＴ細胞は、外因性ＦａｓＬに対して最大の耐性を示し、このことは、Ｔ細胞の生存に対する共刺激ドメインの利点を示す（図２８）。
【0130】
Ｆａｓキメラは、ＦａｓＬの存在下で増殖を増強する
改変されたＦａｓ受容体で操作されたＴ細胞は、サイトカイン除去後のＦａｓＬ媒介細胞死から保護されたので、改変されたＦａｓ受容体で操作されたＴ細胞の増殖に対する外因性ＦａｓＬの影響を決定することが求められた。抗ＣＤ３で活性化された、改変Ｆａｓ受容体で操作されたＴ細胞および細胞密度は、３日後にＡｌａｍａｒＢｌｕｅを介して評価された。外因性ＦａｓＬの存在は、対照Ｔ細胞の密度を低下させた（図２９）。Ｆａｓ－ＴＲＵＮＣ受容体で操作されたＴ細胞でも同様の細胞密度の低下が観察された。しかしながら、共刺激シグナル伝達ドメインを含むＦａｓキメラを発現するように操作されたＴ細胞は、ＮＧＦＲ対照操作されたＴ細胞と比較して、５００および１０００ｎｇ／ｍｌ ＦａｓＬの存在下で増強された増殖を実証した（図２９）。Ｆａｓ－ＢＡＦＦＲを発現するように操作されたＴ細胞は、ＦａｓＬの濃度の上昇に伴って増殖を増強する能力を実証したが、Ｆａｓ－４－１ＢＢで操作されたＴ細胞は外因性ＦａｓＬの影響を受けなかった（図２９）。
改変されたＦａｓ受容体で操作されたＴ細胞は、サイトカイン除去後のＦａｓＬ媒介細胞死から保護されたので、改変されたＦａｓ受容体で操作されたＴ細胞の増殖に対する外因性ＦａｓＬの影響を決定することが求められた。抗ＣＤ３で活性化された、改変Ｆａｓ受容体で操作されたＴ細胞および細胞密度は、３日後にＡｌａｍａｒＢｌｕｅを介して評価された。外因性ＦａｓＬの存在は、対照Ｔ細胞の密度を低下させた（図２９）。Ｆａｓ－ＴＲＵＮＣ受容体で操作されたＴ細胞でも同様の細胞密度の低下が観察された。しかしながら、共刺激シグナル伝達ドメインを含むＦａｓキメラを発現するように操作されたＴ細胞は、ＮＧＦＲ対照操作されたＴ細胞と比較して、５００および１０００ｎｇ／ｍｌ ＦａｓＬの存在下で増強された増殖を実証した（図２９）。Ｆａｓ－ＢＡＦＦＲを発現するように操作されたＴ細胞は、ＦａｓＬの濃度の上昇に伴って増殖を増強する能力を実証したが、Ｆａｓ－４－１ＢＢで操作されたＴ細胞は外因性ＦａｓＬの影響を受けなかった（図２９）。
【0131】
本出願は実施例を参照して説明されてきたが、特許請求の範囲は、実施例に記載された実施形態によって限定されるべきではなく、全体として説明と一致する最も広い解釈を与えられるべきであることが理解されるべきである。。
【0132】
すべての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許または特許出願のそれぞれが、参照によりその全体が組み込まれることが具体的かつ個別に示されるのと同じ程度に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本出願の用語が、参照により本明細書に組み込まれる文書において異なって定義されることが見出される場合、本明細書で提供される定義は、その用語の定義として機能することである。
【0133】
【表5】
【0134】
表５は、キメラ共刺激受容体スクリーニングの構築物設計を示す。ＴＮＦＲ融合受容体は、インビトロで操作されたＴ細胞の機能強化を実証したため、ＴＮＦＲスーパーファミリー内の新しい共刺激ドメインを追求することは魅力的である。共刺激スクリーニングは、ＴＮＦＲ１細胞外ドメインとＴＮＦＲＳＦメンバーの共刺激シグナル伝達ドメインとの間の融合物のＴ細胞共刺激機能を評価するように設計されている。この表は、スクリーニング内での各構築物のために使用される膜貫通ドメインと共刺激ドメインを示す。この表にはまた、設計されたＣＣＲにカスパーゼカスケードのシグナル伝達で知られる古典的なデスドメインが含まれているかどうかもリストされている。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27A】
【図27B】
【図28】
【図29】
【国際調査報告】