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特表2022-547010大腸菌に基づく組換え株ならびにその構築方法および使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-11-10
(54)【発明の名称】大腸菌に基づく組換え株ならびにその構築方法および使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/52 20060101AFI20221102BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20221102BHJP
C07K 14/245 20060101ALI20221102BHJP
C12N 9/10 20060101ALI20221102BHJP
C12N 9/00 20060101ALI20221102BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20221102BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20221102BHJP
C12P 13/08 20060101ALI20221102BHJP
C12N 15/54 20060101ALI20221102BHJP
【ＦＩ】
C12N15/52 Z ZNA
C12N15/31
C07K14/245
C12N9/10
C12N9/00
C12N15/63 Z
C12N1/21
C12P13/08 C
C12N15/54
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022513939
(86)(22)【出願日】2020-08-27
(85)【翻訳文提出日】2022-02-28
(86)【国際出願番号】 CN2020111842
(87)【国際公開番号】W WO2021037166
(87)【国際公開日】2021-03-04
(31)【優先権主張番号】201910926295.8
(32)【優先日】2019-09-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】201910804679.2
(32)【優先日】2019-08-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】201910804688.1
(32)【優先日】2019-08-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522077960
【氏名又は名称】黒竜江伊品生物科技有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】特許業務法人ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】魏愛英
(72)【発明者】
【氏名】孟剛
(72)【発明者】
【氏名】賈慧萍
(72)【発明者】
【氏名】高暁航
(72)【発明者】
【氏名】馬風勇
(72)【発明者】
【氏名】周暁群
(72)【発明者】
【氏名】趙春光
(72)【発明者】
【氏名】楊立鵬
(72)【発明者】
【氏名】蘇厚波
【テーマコード（参考）】
4B050
4B064
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B050CC03
4B050CC04
4B050DD02
4B050LL05
4B064AE10
4B064BJ11
4B064CA02
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA10
4B064DA11
4B064DA20
4B065AA26X
4B065AA26Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA17
4B065CA41
4B065CA43
4B065CA44
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA11
4H045DA89
4H045EA01
4H045EA07
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、大腸菌株Ｋ１２及びその派生株に基づく部位特異的変異した組換え株ならびにその構築方法および使用を提供する。当該組換え株は、kｄｔＡ遺伝子、ｓｐｏＴ遺伝子またはｙｅｂＮ遺伝子に対して部位特異的変異してなるものであり、変異していない野生型株と比べて、より高濃度のＬ－スレオニンを生産することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す野生型kｄｔＡ遺伝子コード配列の８２番目の塩基が突然変異して形成された配列ｉ、または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示すｓｐｏＴ遺伝子コード配列の５２０番目の塩基が突然変異して形成されたヌクレオチド配列ｉｉ、または、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示す野生型ｙｅｂＮ遺伝子コード配列の７４番目の塩基が突然変異して形成されたヌクレオチド配列ｉｉｉ、
から選ばれたヌクレオチド配列。
【請求項2】
ｉにおける前記突然変異がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１における８２番目の塩基のグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）への突然変異である配列、または、ｉｉにおける前記突然変異がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３における５２０番目の塩基のグアニン（Ｇ）からチミン（Ｔ）への突然変異である配列、または、
ｉｉｉにおける前記突然変異がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３における７４番目の塩基のグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）への突然変異である配列、
から選ばれた配列を含む、請求項１に記載のヌクレオチド配列。
【請求項3】
前記突然変異された後のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示す配列ｉ、または、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示す配列ｉｉ、または、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示す配列ｉｉｉ、から選ばれた配列である、請求項１に記載のヌクレオチド配列。
【請求項4】
請求項１に記載のヌクレオチド配列によってコードされる組換えタンパク質であって、好ましくは、そのアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示され、または、
そのアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示されるものであり、または、
そのアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示される、組換えタンパク質。
【請求項5】
請求項１に記載のヌクレオチド配列を含む組換えベクター。
【請求項6】
前記組換えベクターは、前記ヌクレオチド配列をプラスミドに導入して構築されたものである、請求項５に記載の組換えベクター。
【請求項7】
請求項１に記載のヌクレオチド配列を含む組換え株。
【請求項8】
前記組換え株は、請求項５に記載の組換えベクターを宿主株に導入し、組換えして形成されたものであり、前記宿主株は、大腸菌から選択されたものであり、例えば、前記宿主株は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２、その派生株であるＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２（Ｗ３１１０）、または、Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＧＭＣＣ ７．２３２株である、請求項７に記載の組換え株。
【請求項9】
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示す野生型遺伝子のヌクレオチド配列を改変して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示す突然変異された後のヌクレオチド配列を得るステップ、（２）突然変異された後のヌクレオチド配列をプラスミドに接続して組換えベクターを構築し、好ましくは、前記プラスミドがｐＫＯＶプラスミドであるステップ、および、
（３）前記組換えベクターを宿主株に導入して組換え株を得るステップ、
を含む、請求項７に記載の組換え株の構築方法。
【請求項10】
Ｌ－スレオニンの発酵調製における、請求項１に記載のヌクレオチド配列、請求項４に記載の組換えタンパク質、請求項５に記載の組換えベクター、または、請求項７に記載の組換え株の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
本願出願は、２０１９年０９月２７日に中国国家知的財産局に提出された特許出願番号２０１９１０９２６２９５８の先願の優先権、２０１９年０８月２８日に中国国家知的財産局に提出された特許出願番号２０１９１０８０４６７９２の先願の優先権を主張し、および２０１９年０８月２８日に中国国家知的財産局に提出された特許出願番号２０１９１０８０４６８８１の先願の優先権を主張し、前述した先願の全文は、参照により本出願に組み込まれている。
【0002】
〔技術分野〕
本発明は、遺伝子工学および微生物技術の分野に属し、具体的には、kｄｔＡ遺伝子を改変した組換え株並びにその構築方法および使用に関する。
本発明は、遺伝子工学および微生物技術の分野に属し、具体的には、kｄｔＡ遺伝子を改変した組換え株並びにその構築方法および使用に関する。
【0003】
〔背景技術〕
Ｌ－スレオニンは８種類の必須アミノ酸の１種類であり、かつヒトや動物が自分で合成することはできないアミノ酸である。Ｌ－スレオニンは、穀物の吸収を強化し、体内の代謝のバランスを調整し、体の成長と発達を促進することができ、飼料、医薬品および食品業界で広く使用されている。
Ｌ－スレオニンは８種類の必須アミノ酸の１種類であり、かつヒトや動物が自分で合成することはできないアミノ酸である。Ｌ－スレオニンは、穀物の吸収を強化し、体内の代謝のバランスを調整し、体の成長と発達を促進することができ、飼料、医薬品および食品業界で広く使用されている。
【0004】
現在、Ｌ－スレオニンの生産は、主に化学合成法、タンパク質加水分解法、および、微生物発酵法があり、そのうち、微生物発酵法は生産コストが低く、生産強度が高く、環境汚染が少ないため、Ｌ－スレオニンの工業生産に最も広く採用されている方法になる。Ｌ－スレオニンの微生物発酵生産には、生産株として大腸菌、コリネバクテリウム属、セラチア属などの野生型誘導突然変異株などさまざまな細菌を使用することができる。具体的な例としては、アミノ酸アナログ耐性変異株や、メチオニン、スレオニン、イソロイシンなどのさまざまな栄養要求性変異株がある。しかし、伝統的な誘導突然変異育種では、ランダムな突然変異であるため、株の成長が遅くなり、多くの副産物を生成し、高収量の株を得ることが困難になる。したがって、代謝工学的手法を使用して組換え大腸菌を構築することは、Ｌ－スレオニンを生産する効果的なルールである。現在、大腸菌の遺伝子改変の主な手段として、発現プラスミドを介したアミノ酸合成経路および競合経路におけるキー酵素遺伝子の過剰発現または弱化（ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ）発現の利用がある。しかしながら、Ｌ－スレオニンをより経済的に高収率で製造する方法の開発は、望まれている。
【0005】
外来遺伝子発現の宿主として、大腸菌は、遺伝的背景が明確で、技術的な操作や培養条件が簡単で、大規模な発酵が経済的であり、遺伝子工学の専門家からの大きな注目を集めている。大腸菌のゲノムＤＮＡは擬核中の１つの環状分子であり、同時に複数の環状プラスミドＤＮＡを有することができる。大腸菌細胞の擬核には、長さが約４７０００００塩基対である１つのＤＮＡ分子があり、ＤＮＡ分子には約４４００の遺伝子が分布しており、各遺伝子の平均の長さは約１０００塩基対である。分子生物学で一般的に使用される大腸菌株は、いくつかの例外を除いて、ＤＮＡ組換え試験で使用されるほとんどの株が大腸菌株Ｋ１２とその誘導体である。
【0006】
〔発明の概要〕
本発明は、大腸菌株Ｋ１２またはその誘導体に基づく組換え株、その組換え構築方法、および発酵によるアミノ酸の生産における使用を提供する。
本発明は、大腸菌株Ｋ１２またはその誘導体に基づく組換え株、その組換え構築方法、および発酵によるアミノ酸の生産における使用を提供する。
【0007】
本発明者らは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株およびその派生株（例えば、ＭＧ１６５５、Ｗ３１１０など）における野生型kｄｔＡ遺伝子（ＯＲＦ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＰ０３２６６７．１における配列７３５５６－７４８３３に示す。）、野生型ｓｐｏＴ遺伝子（ＯＲＦ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＰ００９０４８．１における配列３８１５９０７－３８１８０１５に示す。）、および、野生型ｙｅｂＮ遺伝子（ＯＲＦ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＰ００９０４８．１における配列１９０７４０２－１９０７９６８に示す。）に焦点を当てて、前記遺伝子を部位特異的変異した後に得られた突然変異遺伝子および前記遺伝子を含む組換え株が、Ｌ－スレオニンの生産に使用でき、変異していない野生型株と比べて、得られた株がＬ－スレオニンの生産量を大幅に増加させることができ、かつ株の安定性が優れ、Ｌ－スレオニン生産株として生産コストが削減されることを見出した。
【0008】
上記の発明に基づいて、本発明は、以下の３つの部分の構成を提供する。
【0009】
第一部分として、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す野生型kｄｔＡ遺伝子コード配列の８２番目の塩基が突然変異して形成された配列を含むヌクレオチド配列を提供する。
【0010】
本発明によれば、前記突然変異とは、前記部位の塩基／ヌクレオチドが変化することを意味し、前記突然変異の方法は、誘発、ＰＣＲ部位特異的突然変異法、および／または相同組換えなどの方法から選ばれた少なくとも１種であってもよい。
【0011】
本発明によれば、前記突然変異は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１における８２番目の塩基のグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）への突然変異であり、具体的には、前記突然変異された後のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示す。
【0012】
本発明は、さらに前述したヌクレオチド配列でコードされる組換えタンパク質を提供する。
【0013】
本発明の組換えタンパク質によれば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示すアミノ酸配列を含む。
【0014】
本発明は、さらに前記ヌクレオチド配列または組換えタンパク質を含む組換えベクターを提供する。
【0015】
本発明の組換えベクターによれば、前記ヌクレオチド配列をプラスミドに導入することによって構築してなり、１つの実施形態として、前記プラスミドはｐＫＯＶプラスミドである。具体的に、前記ヌクレオチド配列と前記プラスミドを、エンドヌクレアーゼで消化して相補的な粘着末端を形成し、両者を接続して組換えベクターを構築してもよい。
【0016】
本発明は、さらに，コード配列に点突然変異を有するkｄｔＡ遺伝子コードヌクレオチド配列を含む組換え株を提供する。
【0017】
本発明の組換え株によれば、前述したヌクレオチド配列を含む。
【0018】
本発明の１つの実施形態によれば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示すヌクレオチド配列を含む。
【0019】
本発明の１つの実施形態によれば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示すアミノ酸配列を含む。
【0020】
本発明の組換え株によれば，前述した組換えベクターを宿主株に導入し、組換えして形成され、前記宿主株は、特に限定されておらず、当業界に周知されたkｄｔＡ遺伝子が保持されているＬ－スレオニン産生株、例えば、大腸菌から選ばれた少なくとも１種であってもよい。本発明の１つの実施形態によれば、前記宿主株はＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２（Ｗ３１１０）株、Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＧＭＣＣ ７．２３２株である。
【0021】
本発明の組換え株によれば，ｐＫＯＶプラスミドをベクターとする。
【0022】
本発明の組換え株によれば，さらに他の改変をさらに含んでも、または、含まなくでもよい。
【0023】
本発明は、さらにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す野生型kｄｔＡ遺伝子コード領域のヌクレオチド配列をその８２番目の塩基を突然変異させるように改変して、突然変異されたkｄｔＡコード遺伝子を含むＬ－スレオニン産生組換え株を得ることを含む組換え株の構築方法を提供する。
【0024】
本発明の構築方法によれば、前記改変は、誘発、ＰＣＲ部位特異的突然変異法、および／または相同組換えなどの方法のうちの少なくとも１種を含む。
【0025】
本発明の構築方法によれば，前記突然変異とは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１における８２番目の塩基のグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）への突然変異を意味し、具体的に、前記突然変異され後のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示す。
【0026】
さらに、前記構築方法は、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す野生型kｄｔＡ遺伝子のオープンリーディングフレーム領域のヌクレオチド配列を、その８２番目の塩基を突然変異させように改変して、突然変異されたkｄｔＡ遺伝子のオープンリーディングフレーム領域を得るステップ、
（２）前記突然変異されたヌクレオチド配列とプラスミドを接続して、組換えベクターを構築するステップ、および、
（３）前記組換えベクターを宿主株に導入して、前記点突然変異を含むＬ－スレオニン産生組換え株を得るステップ、
を含む。
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す野生型kｄｔＡ遺伝子のオープンリーディングフレーム領域のヌクレオチド配列を、その８２番目の塩基を突然変異させように改変して、突然変異されたkｄｔＡ遺伝子のオープンリーディングフレーム領域を得るステップ、
（２）前記突然変異されたヌクレオチド配列とプラスミドを接続して、組換えベクターを構築するステップ、および、
（３）前記組換えベクターを宿主株に導入して、前記点突然変異を含むＬ－スレオニン産生組換え株を得るステップ、
を含む。
【0027】
本発明の構築方法によれば，前記ステップ（１）は、点突然変異されたkｄｔＡ遺伝子コード領域の構築、すなわち、kｄｔＡ遺伝子コード配列に従って、kｄｔＡ遺伝子コード領域の断片を増幅するための２対のプライマーを合成し、ＰＣＲ部位特異的突然変異法により、野生型kｄｔＡ遺伝子コード領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に点突然変異を導入し、点突然変異されたkｄｔＡ遺伝子コード領域のヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を取り得、kｄｔＡ（Ｇ８２Ａ）と表記されることを含む。
【0028】
本発明の１つの実施形態において、前記ステップ（１）において、前記プライマーは、以下に示す。
【0029】
Ｐ１： ５’ ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＧＴＧＡＡＣＣＧＣＣＡＡＣＡ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
Ｐ２： ５’ ＴＧＣＧＣＧＧＡＣＧＴＡＡＧＡＣＴＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）
Ｐ３： ５’ ＧＡＧＴＣＴＴＡＣＧＴＣＣＧＣＧＣＡ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）
Ｐ４： ５’ ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＣＣＣＧＣＡＣＣＴＴＴＡＴＴＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）
本発明の１つの実施形態において、前記ステップ（１）は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２をテンプレートとし、プライマーとしてそれぞれＰ１／Ｐ２、および、Ｐ３／Ｐ４を使用してＰＣＲ増幅を行って、kｄｔＡ遺伝子コード領域を含む分離しているサイズがそれぞれ９２７ｂｐ、６９５ｂｐである２つのＤＮＡ断片（kｄｔＡ ＵｐとkｄｔＡ Ｄｏｗｎ）を得ることを含む。上記の２つのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で分離・精製した後、上記の２つのＤＮＡ断片をテンプレートとして使用し、Ｐ１とＰ４をプライマーとしてオーバーラップＰＣＲ（Ｏｖｅｒｌａｐ ＰＣＲ）で増幅してkｄｔＡ（Ｇ８２Ａ）－Ｕｐ－Ｄｏｗｎを得ることを含む。
Ｐ２： ５’ ＴＧＣＧＣＧＧＡＣＧＴＡＡＧＡＣＴＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）
Ｐ３： ５’ ＧＡＧＴＣＴＴＡＣＧＴＣＣＧＣＧＣＡ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）
Ｐ４： ５’ ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＣＣＣＧＣＡＣＣＴＴＴＡＴＴＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）
本発明の１つの実施形態において、前記ステップ（１）は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２をテンプレートとし、プライマーとしてそれぞれＰ１／Ｐ２、および、Ｐ３／Ｐ４を使用してＰＣＲ増幅を行って、kｄｔＡ遺伝子コード領域を含む分離しているサイズがそれぞれ９２７ｂｐ、６９５ｂｐである２つのＤＮＡ断片（kｄｔＡ ＵｐとkｄｔＡ Ｄｏｗｎ）を得ることを含む。上記の２つのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で分離・精製した後、上記の２つのＤＮＡ断片をテンプレートとして使用し、Ｐ１とＰ４をプライマーとしてオーバーラップＰＣＲ（Ｏｖｅｒｌａｐ ＰＣＲ）で増幅してkｄｔＡ（Ｇ８２Ａ）－Ｕｐ－Ｄｏｗｎを得ることを含む。
【0030】
本発明の１つの実施形態において、前記kｄｔＡＧ８２Ａ－Ｕｐ－Ｄｏｗｎヌクレオチド配列は、サイズが１６２２ｂｐである。
【0031】
本発明の１つの実施形態において、前記ＰＣＲ増幅では、９４℃で３０ｓの変性，５２℃で３０ｓのアニーリングおよび７２℃で３０ｓの伸長（３０サイクル）を行う。
【0032】
本発明の１つの実施形態において、前記オーバーラップＰＣＲ増幅では、９４°Ｃで３０ｓの変性、５２°Ｃで３０ｓのアニーリングおよび７２°Ｃで６０ｓの伸長（３０サイクル）を行う。
【0033】
本発明の構築方法によれば，前記ステップ（２）は、組換えベクターの構築を含み、すなわち、前記kｄｔＡ（Ｇ８２Ａ）－Ｕｐ－Ｄｏｗｎ断片を、アガロースゲル電気泳動で分離・精製した後、それとｐＫＯＶプラスミドをそれぞれＢａｍＨ Ｉ／Ｎｏｔ Ｉで二重消化し、消化された後のkｄｔＡ（Ｇ８２Ａ）－Ｕｐ－Ｄｏｗｎ断片とｐＫＯＶプラスミドをアガロースゲル電気泳動で分離・精製し、かつ接続して、組換えベクターｐＫＯＶ－kｄｔＡ（Ｇ８２Ａ）を得ることを含む。
【0034】
本発明の構築方法によれば，前記ステップ（３）は、組換え株の構築を含み、すなわち、組換えベクターｐＫＯＶ－kｄｔＡ（Ｇ８２Ａ）を宿主株に形質転換して組換え株を得ることを含む。
【0035】
本発明の１つの実施形態において、前記ステップ（３）における形質転換は、エレクトロポレーション法で行い、例示的に、前記ステップ（３）において、組換えベクターを前記宿主株に導入する。
【0036】
本発明の構築方法によれば，さらに組換え株をスクリーニングするステップを含み、例示的に、例えば、クロラムフェニコール培地でスクリーニングすることがある。
【0037】
本発明は、さらに前述した構築方法で得られた組換え株を提供する。
【0038】
本発明は、さらにＬ－スレオニンの製造またはＬ－スレオニンの発酵量の向上における前述した組換え株の使用を提供する。
【0039】
本発明に係るＬ－スレオニンの製造における前記組換え株の使用によれば、前記組換え株を用いて発酵してＬ－スレオニンを製造することを含む。
【0040】
第二部分として、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示すｓｐｏＴ遺伝子コード配列の５２０番目の塩基の突然変異によって形成されたヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を提供する。
【0041】
本発明によれば、前記突然変異とは、前記位点の塩基／ヌクレオチドが変化することを指し、前記突然変異の方法は、誘発、ＰＣＲ部位特異的突然変異法、および／または相同組換えなどの方法から選ばれた少なくとも１種であってもよい。
【0042】
本発明によれば、前記突然変異は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３における５２０番目の塩基のグアニン（Ｇ）からチミン（Ｔ）への突然変異であり、具体的に、前記突然変異された後のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示す。
【0043】
本発明は、前述したヌクレオチド配列でコードされる組換えタンパク質を提供する。
【0044】
本発明の組換えタンパク質によれば、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示すアミノ酸配列を含み、具体的に、前記組換えタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示すアミノ酸配列の１７４番目のグリシンをシステインに置き換えてなるものを含む。
【0045】
本発明は、前記ヌクレオチド配列または組換えタンパク質を含む組換えベクターを提供する。
【0046】
本発明の組換えベクターによれば、前記ヌクレオチド配列をプラスミドに導入することによって構築してなり、１つの実施形態として、前記プラスミドはｐＫＯＶプラスミドである。具体的に、前記ヌクレオチド配列と前記プラスミドを、エンドヌクレアーゼで消化して相補的な粘着末端を形成し、両者を接続して組換えベクターを構築してもよい。
【0047】
本発明は、さらに、コード配列が点突然変異したｓｐｏＴ遺伝子コードヌクレオチド配列、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示すｓｐｏＴ遺伝子コードヌクレオチド配列の５２０番目の塩基が点突然変異してなる配列を含む組換え株を提供する。
【0048】
本発明の組換え株によれば，前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３配列における５２０番目の塩基は、グアニン（Ｇ）からチミン（Ｔ）へ突然変異する。
【0049】
本発明の１つの実施形態によれば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示すヌクレオチド配列を含む。
【0050】
本発明の１つの実施形態によれば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示すアミノ酸配列を含む。
【0051】
本発明の組換え株によれば、前述した組換えベクターを宿主株に導入して組換えして形成され、前記宿主株は、特に限定されておらず、当業界に周知されたｓｐｏＴ遺伝子が保持されているＬ－スレオニン産生株から選ばれたものであってもよく、例えば、大腸菌から選ばれたものであってもよい。本発明の１つの実施形態によれば、前記宿主株はＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２（Ｗ３１１０）株、Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＧＭＣＣ ７．２３２株である。
【0052】
本発明の組換え株によれば、ｐＫＯＶプラスミドをベクターとする。
【0053】
本発明の組換え株によれば、さらに他の改変を含んでもよく、含んでいなくでもよい。
【0054】
本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示すｓｐｏＴ遺伝子コード領域のヌクレオチド配列を、その５２０番目の塩基を突然変異させるように改変して、突然変異したｓｐｏＴコード遺伝子を含む組換え株を得るステップを含む組換え株の構築方法を提供する。
【0055】
本発明の構築方法によれば，前記改変は、誘発、ＰＣＲ部位特異的突然変異法、及び／または相同組換えなどの方法のうちの少なくとも１種を含む。
【0056】
本発明の構築方法によれば，前記突然変異とは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３における５２０番目の塩基のグアニン（Ｇ）からチミン（Ｔ）への突然変異であり、具体的に、突然変異して得られたヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示す。
【0057】
さらに、前記構築方法は、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示す野生型ｓｐｏＴ遺伝子のオープンリーディングフレーム領域のヌクレオチド配列を、その５２０番目の塩基を突然変異させように改変して、突然変異されたヌクレオチド配列を得るステップ、
（２）前記突然変異されたヌクレオチド配列とプラスミドを接続して、組換えベクターを構築するステップ、および、
（３）前記組換えベクターを宿主株に導入して、前記点突然変異を含む組換え株を得るステップ、
を含む。
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示す野生型ｓｐｏＴ遺伝子のオープンリーディングフレーム領域のヌクレオチド配列を、その５２０番目の塩基を突然変異させように改変して、突然変異されたヌクレオチド配列を得るステップ、
（２）前記突然変異されたヌクレオチド配列とプラスミドを接続して、組換えベクターを構築するステップ、および、
（３）前記組換えベクターを宿主株に導入して、前記点突然変異を含む組換え株を得るステップ、
を含む。
【0058】
本発明の構築方法によれば，前記ステップ（１）は、点突然変異したｓｐｏＴ遺伝子コード領域の構築、すなわち、ｓｐｏＴ遺伝子コード配列に従って、ｓｐｏＴ遺伝子コード領域の断片を増幅するための２対のプライマーを合成し、ＰＣＲ部位特異的突然変異法により、野生型ｓｐｏＴ遺伝子コード領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）に点突然変異を導入し、点突然変異されたｓｐｏＴ遺伝子コード領域ヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）を取り得、ｓｐｏＴ（Ｇ５２０Ｔ）と表記されることを含む。
【0059】
本発明の１つの実施形態において、前記ステップ（１）において、前記プライマーは、下記に示す。
【0060】
Ｐ１： ５’ ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＡＡＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＡＡＧＣ ３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）
Ｐ２： ５’ ＴＧＴＧＧＴＧＧＡＴＡＣＡＴＡＡＡＣＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）
Ｐ３： ５’ ＧＣＡＣＣＧＴＴＴＡＴＧＴＡＴＣＣＡＣＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）
Ｐ４： ５’ ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＧＡＣＡＡＡＧＴＴＣＡＧＣＣＡＡＧＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）。
Ｐ２： ５’ ＴＧＴＧＧＴＧＧＡＴＡＣＡＴＡＡＡＣＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）
Ｐ３： ５’ ＧＣＡＣＣＧＴＴＴＡＴＧＴＡＴＣＣＡＣＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）
Ｐ４： ５’ ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＧＡＣＡＡＡＧＴＴＣＡＧＣＣＡＡＧＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）。
【0061】
本発明の１つの実施形態において、前記ステップ（１）では、下記を含む。すなわち、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２をテンプレートとし、プライマーとしてそれぞれＰ１とＰ２、Ｐ３とＰ４を使用してＰＣＲ増幅を行って、点突然変異されたｓｐｏＴ遺伝子コード領域が分離しているサイズがそれぞれ６２０ｂｐ、８８０ｂｐである２つのＤＮＡ断片（ｓｐｏＴ（Ｇ５２０Ｔ）－ＵｐとｓｐｏＴ（Ｇ５２０Ｔ）－Ｄｏｗｎ断片）を得る。上記の２つのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で分離・精製した後、再び上記の２つのＤＮＡ断片をテンプレートとして使用し、Ｐ１とＰ４をプライマーとしてオーバーラップＰＣＲ（Ｏｖｅｒｌａｐ ＰＣＲ）で増幅してｓｐｏＴ（Ｇ５２０Ｔ）－Ｕｐ－Ｄｏｗｎ断片を得る。
【0062】
本発明の１つの実施形態において、前記ｓｐｏＴ（Ｇ５２０Ｔ）－Ｕｐ－Ｄｏｗｎ断片ヌクレオチド配列は、サイズが１５００ｂｐである。
【0063】
本発明の１つの実施形態において、前記ＰＣＲ増幅では、９４°Ｃで３０ｓの変性、５２°Ｃで３０ｓのアニーリングおよび７２°Ｃで３０ｓの伸長（３０サイクル）を行う。
【0064】
本発明の１つの実施形態において、前記オーバーラップＰＣＲ増幅では、９４°Ｃで３０ｓの変性、５２°Ｃで３０ｓのアニーリングおよび７２°Ｃで６０ｓの伸長（３０サイクル）を行う。
【0065】
本発明の構築方法によれば，前記ステップ（２）は、組換えベクターの構築を含み、すなわち、前記ｓｐｏＴ（Ｇ５２０Ｔ）－Ｕｐ－Ｄｏｗｎ断片を、アガロースゲル電気泳動で分離・精製した後、これとｐＫＯＶプラスミドをそれぞれＢａｍＨ Ｉ／Ｎｏｔ Ｉで二重消化し、消化された後のｓｐｏＴ（Ｇ５２０Ｔ） －Ｕｐ－Ｄｏｗｎ断片とｐＫＯＶプラスミドをアガロースゲル電気泳動で分離・精製し、かつ接続して、組換えベクターｐＫＯＶ－ｓｐｏＴ（Ｇ５２０Ｔ）を得ることを含む。
【0066】
本発明の構築方法によれば，前記ステップ（３）は、組換え株の構築を含み、すなわち、組換えベクターｐＫＯＶ－ｓｐｏＴ（Ｇ５２０Ｔ）を宿主株に導入して組換え株を得ることを含む。
【0067】
本発明の１つの実施形態において、前記ステップ（３）における導入は、エレクトロポレーション法で行う。
【0068】
本発明の構築方法によれば，さらに組換え株をスクリーニングするステップを含み、例示的に、例えば、クロラムフェニコール含有培地でスクリーニングすることがある。
【0069】
本発明は、さらに前述した構築方法で得られた組換え株を提供する。
【0070】
本発明は、Ｌ－スレオニンの製造おける前述した組換え株の使用を提供する。
【0071】
本発明に係るＬ－スレオニンの製造における前記ヌクレオチド配列、組換えタンパク質、組換えベクター、組換え株の使用によれば、前記組換え株を用いて発酵してＬ－スレオニンを製造することを含む。
【0072】
第三部分において、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示す野生型ｙｅｂＮ遺伝子コード配列の７４番目の塩基の突然変異によって形成されたヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を提供する。
【0073】
本発明によれば、前記突然変異は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３における７４番目の塩基のグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）への突然変異であり、具体的に、前記ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示す。前記突然変異とは、前記部位の塩基／ヌクレオチドが変化することを意味し、前記突然変異の方法は、誘発、ＰＣＲ部位特異的突然変異法、および／または相同組換えなどの方法から選ばれた少なくとも１種であってもよい。
【0074】
本発明は、前述したヌクレオチド配列でコードされる組換えタンパク質を提供する。
【0075】
本発明の組換えタンパク質によれば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示すアミノ酸配列を含み、具体的に、前記組換えタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示すアミノ酸配列の２５番目のリシンをアスパラギン酸に置き換えてなるものを含む。
【0076】
本発明は、前述したヌクレオチド配列または組換えタンパク質を含む組換えベクターを提供する。
【0077】
本発明の組換えベクターによれば、前記ヌクレオチド配列をプラスミドに導入することによって構築してなり、１つの実施形態として、前記プラスミドはｐＫＯＶプラスミドである。具体的に、前記ヌクレオチド配列と前記プラスミドを、エンドヌクレアーゼで消化して相補的な粘着末端を形成し、両者を接続して組換えベクターを構築してもよい。
【0078】
本発明は、さらに、コード配列に点突然変異したｙｅｂＮ遺伝子コードヌクレオチド配列を含む組換え株を提供する。例えば、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３における７４番目の塩基が点突然変異した組換え体株である。
【0079】
本発明の組換え株によれば，前記ｙｅｂＮ遺伝子コードヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３における７４番目の塩基のグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）への突然変異を含む。
【0080】
本発明の１つの実施形態によれば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示すヌクレオチド配列を含む。
【0081】
本発明の１つの実施形態によれば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示すアミノ酸配列を含む。
【0082】
本発明の組換え株によれば，前述した組換えベクターを宿主株に導入し、組換えして形成され、前記宿主株は、特に限定されておらず、当業界に周知されたｙｅｂＮ遺伝子が保持されているＬ－スレオニン産生株、例えば、大腸菌から選ばれたものであってもよい。本発明の１つの実施形態によれば、前記宿主株はＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２、その派生株としてのＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２（Ｗ３１１０）株、または、Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＧＭＣＣ ７．２３２株である。
【0083】
本発明の組換え株によれば、ｐＫＯＶプラスミドをベクターとする。
【0084】
本発明の組換え株によれば、さらに他の改変を含んでもよく、含んでいなくでもよい。
【0085】
本発明は、さらに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示す野生型ｙｅｂＮ遺伝子コード領域のヌクレオチド配列を、その７４番目の塩基を突然変異させるように改変して、突然変異されたｙｅｂＮコード遺伝子を含む組換え株を得るステップを含む組換え株の構築方法を提供する。
【0086】
本発明の構築方法によれば，前記改変は、誘発、ＰＣＲ部位特異的突然変異法、及び／または相同組換えなどの方法から選ばれた少なくとも１種を含む。
【0087】
本発明の構築方法によれば，前記突然変異とは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３における７４番目の塩基のグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）への突然変異を意味し、具体的に、前記突然変異された後のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示す。
【0088】
さらに、前記構築方法は、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示す野生型ｙｅｂＮ遺伝子のオープンリーディングフレーム領域のヌクレオチド配列を、その７４番目の塩基を突然変異させように改変して、突然変異されたｙｅｂＮ遺伝子オープンリーディングフレーム領域ヌクレオチド配列を得るステップ、
（２）前記突然変異されたヌクレオチド配列とプラスミドを接続して、組換えベクターを構築するステップ、および、
（３）前記組換えベクターを宿主株に導入して、前記点突然変異を含む組換え株を得るステップ、
を含む。
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示す野生型ｙｅｂＮ遺伝子のオープンリーディングフレーム領域のヌクレオチド配列を、その７４番目の塩基を突然変異させように改変して、突然変異されたｙｅｂＮ遺伝子オープンリーディングフレーム領域ヌクレオチド配列を得るステップ、
（２）前記突然変異されたヌクレオチド配列とプラスミドを接続して、組換えベクターを構築するステップ、および、
（３）前記組換えベクターを宿主株に導入して、前記点突然変異を含む組換え株を得るステップ、
を含む。
【0089】
本発明の構築方法によれば，前記ステップ（１）では、点突然変異されたｙｅｂＮ遺伝子コード領域の構築、すなわち、ｙｅｂＮ遺伝子コード配列に従って、ｙｅｂＮ遺伝子コード領域断片を増幅するための２対のプライマーを合成し、ＰＣＲ部位特異的突然変異法により、野生型ｙｅｂＮ遺伝子コード領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）に点突然変異を導入し、点突然変異されたｙｅｂＮ遺伝子コード領域ヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）を取り得、ｙｅｂＮ（Ｇ７４Ａ）と表記されることを含む。
【0090】
本発明の１つの実施形態において、前記ステップ（１）において、前記プライマーは、下記に示す。
【0091】
Ｐ１： ５’ ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＴＣＧＣＣＡＡＴＧＴＣＴＧＧＡＴＴＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）
Ｐ２： ５’ ＡＴＧＧＡＧＧＧＴＧＧＣＡＴＣＴＴＴＡＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）
Ｐ３： ５’ ＴＧＣＡＴＣＡＡＴＣＧＧＴＡＡＡＧＡＴＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）
Ｐ４： ５’ ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＡＣＴＣＣＧＣＡＣＴＣＴＧＣＴＧＴＡ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）
本発明の１つの実施形態において、前記ステップ（１）では、下記を含む。すなわち、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２をテンプレートとし、プライマーとしてそれぞれＰ１とＰ２、Ｐ３とＰ４を使用してＰＣＲ増幅を行って、点突然変異されたｙｅｂＮ遺伝子コード領域を含む分離しているサイズがそれぞれ６９０ｂｐ、７００ｂｐである２つのＤＮＡ断片（ｙｅｂＮ（Ｇ７４Ａ）－ＵｐとｙｅｂＮ（Ｇ７４Ａ）－Ｄｏｗｎ断片）を得る。上記の２つのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で分離・精製した後、再び上記の２つのＤＮＡ断片をテンプレートとし、Ｐ１とＰ４をプライマーとしてオーバーラップＰＣＲ（Ｏｖｅｒｌａｐ ＰＣＲ）で増幅してｙｅｂＮ（Ｇ７４Ａ）－Ｕｐ－Ｄｏｗｎを得る。
Ｐ２： ５’ ＡＴＧＧＡＧＧＧＴＧＧＣＡＴＣＴＴＴＡＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）
Ｐ３： ５’ ＴＧＣＡＴＣＡＡＴＣＧＧＴＡＡＡＧＡＴＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）
Ｐ４： ５’ ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＡＣＴＣＣＧＣＡＣＴＣＴＧＣＴＧＴＡ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）
本発明の１つの実施形態において、前記ステップ（１）では、下記を含む。すなわち、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２をテンプレートとし、プライマーとしてそれぞれＰ１とＰ２、Ｐ３とＰ４を使用してＰＣＲ増幅を行って、点突然変異されたｙｅｂＮ遺伝子コード領域を含む分離しているサイズがそれぞれ６９０ｂｐ、７００ｂｐである２つのＤＮＡ断片（ｙｅｂＮ（Ｇ７４Ａ）－ＵｐとｙｅｂＮ（Ｇ７４Ａ）－Ｄｏｗｎ断片）を得る。上記の２つのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で分離・精製した後、再び上記の２つのＤＮＡ断片をテンプレートとし、Ｐ１とＰ４をプライマーとしてオーバーラップＰＣＲ（Ｏｖｅｒｌａｐ ＰＣＲ）で増幅してｙｅｂＮ（Ｇ７４Ａ）－Ｕｐ－Ｄｏｗｎを得る。
【0092】
本発明の１つの実施形態において、前記ｙｅｂＮ（Ｇ７４Ａ）－Ｕｐ－Ｄｏｗｎ断片ヌクレオチド配列は、サイズが１３４０ｂｐである。
【0093】
本発明の１つの実施形態において、前記ＰＣＲ増幅では、９４°Ｃで３０ｓの変性、５２°Ｃで３０ｓのアニーリングおよび７２°Ｃで３０ｓの伸長（３０サイクル）を行う。
【0094】
本発明の１つの実施形態において、前記オーバーラップＰＣＲ増幅では、９４°Ｃで３０ｓの変性、５２°Ｃで３０ｓのアニーリングおよび７２°Ｃで６０ｓの伸長（３０サイクル）を行う。
【0095】
本発明の構築方法によれば，前記ステップ（２）では、組換えベクターの構築を含み、すなわち、前記ｙｅｂＮ（Ｇ７４Ａ）－Ｕｐ－Ｄｏｗｎ断片を、アガロースゲル電気泳動で分離・精製した後、これとｐＫＯＶプラスミドをそれぞれＢａｍＨ Ｉ／Ｎｏｔ Ｉで二重消化し、消化された後のｙｅｂＮ（Ｇ７４Ａ） －Ｕｐ－Ｄｏｗｎ断片とｐＫＯＶプラスミドをアガロースゲル電気泳動で分離・精製し、かつ接続して、組換えベクターｐＫＯＶ－ｙｅｂＮ（Ｇ７４Ａ）を得ることを含む。
【0096】
本発明の構築方法によれば，前記ステップ（３）は、組換え株の構築を含み、すなわち、組換えベクターｐＫＯＶ－ｙｅｂＮ（Ｇ７４Ａ）を宿主株に導入して組換え株を得ることを含む。
【0097】
本発明の１つの実施形態において、前記ステップ（３）における導入は、エレクトロポレーション法で行う。
【0098】
本発明の構築方法によれば、さらに組換え株をスクリーニングするステップを含み、例示的に、例えば、クロラムフェニコール含有培地でスクリーニングすることがある。
【0099】
本発明は、さらに前述した構築方法で得られた組換え株を提供する。
【0100】
本発明は、Ｌ－スレオニンの製造における前述したヌクレオチド配列、組換えタンパク質、組換えベクター、組換え株の使用を提供する。
【0101】
本発明に係るＬ－スレオニンの製造における前記組換え株の使用によれば、前記組換え株を用いて発酵してＬ－スレオニンを製造することを含む。
【0102】
〔発明を実施するための形態〕
以下、本発明の実施例の説明を通じて、本発明の上記および他の特徴および利点をより詳細に解釈および説明する。以下の実施例は、本発明の構成を例示的に説明することを意図しており、特許請求の範囲およびそれらの同等物によって定義される本発明の保護範囲を決して制限することを意図するものではないと理解されたい。
以下、本発明の実施例の説明を通じて、本発明の上記および他の特徴および利点をより詳細に解釈および説明する。以下の実施例は、本発明の構成を例示的に説明することを意図しており、特許請求の範囲およびそれらの同等物によって定義される本発明の保護範囲を決して制限することを意図するものではないと理解されたい。
【0103】
特に明記しない限り、本明細書の材料および試薬はすべて市販の製品であるか、または先行技術に従って当業者によって調製することができる。
【0104】
実施例１
（１）kｄｔＡ遺伝子コード領域の部位特異的突然変異（Ｇ８２Ａ）に用いるプラスミドｐＫＯＶ－kｄｔＡ（Ｇ８２Ａ）の構築
（対応する野生型コードされるタンパク質のアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３における２８番目のアラニンがスレオニンに置換され（Ａ２８Ｔ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示す）
３－デオキシ－Ｄ－マンノース－スルファミン酸転移酵素は、kｄｔＡ遺伝子でコードされ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株およびその派生株（例えば、ＭＧ１６５５など）において、野生型のkｄｔＡ遺伝子ＯＲＦ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＰ０３２６６７．１における配列７３５５６－７４８３３に示す。当該配列に基づいてkｄｔＡを増幅するための２対のプライマーを設計および合成し、開始株におけるkｄｔＡ遺伝子コード領域配列の８２番目の塩基ＧをＡに変異させることに用いるベクターを構築した。プライマーは、以下のように設計した（中国上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より合成された）。
（１）kｄｔＡ遺伝子コード領域の部位特異的突然変異（Ｇ８２Ａ）に用いるプラスミドｐＫＯＶ－kｄｔＡ（Ｇ８２Ａ）の構築
（対応する野生型コードされるタンパク質のアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３における２８番目のアラニンがスレオニンに置換され（Ａ２８Ｔ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示す）
３－デオキシ－Ｄ－マンノース－スルファミン酸転移酵素は、kｄｔＡ遺伝子でコードされ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株およびその派生株（例えば、ＭＧ１６５５など）において、野生型のkｄｔＡ遺伝子ＯＲＦ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＰ０３２６６７．１における配列７３５５６－７４８３３に示す。当該配列に基づいてkｄｔＡを増幅するための２対のプライマーを設計および合成し、開始株におけるkｄｔＡ遺伝子コード領域配列の８２番目の塩基ＧをＡに変異させることに用いるベクターを構築した。プライマーは、以下のように設計した（中国上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より合成された）。
【0105】
Ｐ１：５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＧＴＧＡＡＣＣＧＣＣＡＡＣＡ ３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
Ｐ２：５’ＴＧＣＧＣＧＧＡＣＧＴＡＡＧＡＣＴＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）
Ｐ３：５’ＧＡＧＴＣＴＴＡＣＧＴＣＣＧＣＧＣＡ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）
Ｐ４：５’ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＣＣＣＧＣＡＣＣＴＴＴＡＴＴＧ ３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）
構築方法として、野生型株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ゲノムをテンプレートとし、プライマーとしてそれぞれＰ１とＰ２、Ｐ３とＰ４を用いてＰＣＲ増幅を行って、長さがそれぞれ９２７ｂｐ、６９５ｂｐの２つの点突然変異を含むＤＮＡ断片（kｄｔＡ（Ｇ８２Ａ）－ＵｐおよびkｄｔＡ（Ｇ８２Ａ）－Ｄｏｗｎ断片）を得た。ＰＣＲでは、９４℃で３０ｓの変性、５２℃で３０ｓのアニーリング、および７２℃で３０ｓの伸長（３０サイクル）を行った。前記の２つのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で分離・精製した後、精製された２つのＤＮＡ断片をテンプレートとし、Ｐ１とＰ４をプライマーとし、ＯｖｅｒｌａｐＰＣＲで長さ約１６２２ｂｐの断片（kｄｔＡ（Ｇ８２Ａ）－Ｕｐ－Ｄｏｗｎ断片）を増幅した。Ｏｖｅｒｌａｐ ＰＣＲでは、９４℃で３０ｓの変性、５２℃で３０ｓのアニーリングおよび７２℃で６０ｓの伸長（３０サイクル）を行った。前述したkｄｔＡ（Ｇ８２Ａ）－Ｕｐ－Ｄｏｗｎ断片をアガロースゲル電気泳動で分離・精製した後、それとｐＫＯＶプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ社から購入）を、それぞれＢａｍＨ Ｉ／Ｎｏｔ Ｉで二重消化し、消化されたkｄｔＡ（Ｇ８２Ａ）－Ｕｐ－Ｄｏｗｎ断片とｐＫＯＶプラスミドをアガロースゲル電気泳動で分離・精製し、かつ接続してベクターｐＫＯＶ－kｄｔＡ（Ｇ８２Ａ）を得た。ベクターｐＫＯＶ－kｄｔＡ（Ｇ８２Ａ）が、配列決定のために配列決定会社に送り、得られた配列決定結果は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示され、正しい点突然変異（kｄｔＡ（Ｇ８２Ａ））を含むベクターｐＫＯＶ－kｄｔＡ（Ｇ８２Ａ）を置いておく。
Ｐ２：５’ＴＧＣＧＣＧＧＡＣＧＴＡＡＧＡＣＴＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）
Ｐ３：５’ＧＡＧＴＣＴＴＡＣＧＴＣＣＧＣＧＣＡ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）
Ｐ４：５’ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＣＣＣＧＣＡＣＣＴＴＴＡＴＴＧ ３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）
構築方法として、野生型株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ゲノムをテンプレートとし、プライマーとしてそれぞれＰ１とＰ２、Ｐ３とＰ４を用いてＰＣＲ増幅を行って、長さがそれぞれ９２７ｂｐ、６９５ｂｐの２つの点突然変異を含むＤＮＡ断片（kｄｔＡ（Ｇ８２Ａ）－ＵｐおよびkｄｔＡ（Ｇ８２Ａ）－Ｄｏｗｎ断片）を得た。ＰＣＲでは、９４℃で３０ｓの変性、５２℃で３０ｓのアニーリング、および７２℃で３０ｓの伸長（３０サイクル）を行った。前記の２つのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で分離・精製した後、精製された２つのＤＮＡ断片をテンプレートとし、Ｐ１とＰ４をプライマーとし、ＯｖｅｒｌａｐＰＣＲで長さ約１６２２ｂｐの断片（kｄｔＡ（Ｇ８２Ａ）－Ｕｐ－Ｄｏｗｎ断片）を増幅した。Ｏｖｅｒｌａｐ ＰＣＲでは、９４℃で３０ｓの変性、５２℃で３０ｓのアニーリングおよび７２℃で６０ｓの伸長（３０サイクル）を行った。前述したkｄｔＡ（Ｇ８２Ａ）－Ｕｐ－Ｄｏｗｎ断片をアガロースゲル電気泳動で分離・精製した後、それとｐＫＯＶプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ社から購入）を、それぞれＢａｍＨ Ｉ／Ｎｏｔ Ｉで二重消化し、消化されたkｄｔＡ（Ｇ８２Ａ）－Ｕｐ－Ｄｏｗｎ断片とｐＫＯＶプラスミドをアガロースゲル電気泳動で分離・精製し、かつ接続してベクターｐＫＯＶ－kｄｔＡ（Ｇ８２Ａ）を得た。ベクターｐＫＯＶ－kｄｔＡ（Ｇ８２Ａ）が、配列決定のために配列決定会社に送り、得られた配列決定結果は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示され、正しい点突然変異（kｄｔＡ（Ｇ８２Ａ））を含むベクターｐＫＯＶ－kｄｔＡ（Ｇ８２Ａ）を置いておく。
【0106】
（２）点突然変異遺伝子kｄｔＡ（Ｇ８２Ａ）を含む操作された株の構築
野生型大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２（Ｗ３１１０）と高生産性でＬ－スレオニンを生産する株Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＧＭＣＣ ７．２３２（中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センターに寄託され、Ｃｈｉｎａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ）は、いずれも染色体上に野生型のkｄｔＡ遺伝子が保持されている。構築されたプラスミドｐＫＯＶ－kｄｔＡ（Ｇ８２Ａ）を、それぞれＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ （Ｗ３１１０）およびＥ．ｃｏｌｉ ＣＧＭＣＣ ７．２３２に形質転換し、対立遺伝子の置き換えによって当該２つの株の染色体のkｄｔＡ遺伝子配列の８２番目の塩基ＧをＡに改変した。具体的なプロセスとして、プラスミドｐＫＯＶ－kｄｔＡ（Ｇ８２Ａ）をエレクトロポレーションにより宿主菌コンピテントセルに形質転換した後、ＳＯＣ液体培地０．５ｍＬを添加し、シェーカーで３０°Ｃ、１００ ｒｐｍで２ｈ蘇生し、培養液１００μＬを取り、クロラムフェニコール含有量３４ｍｇ／ｍＬのＬＢ固体培地に塗り、３０°Ｃで１８ｈ培養し、成長したモノクローナルコロニーを選択し、それらをＬＢ液体培地１０ｍＬに接種し、３７°Ｃ、２００ ｒｐｍで８ｈ培養し、培養液１００μＬをクロラムフェニコール含有量３４ｍｇ／ｍＬのＬＢ固体培地に塗り、４２°Ｃで１２ｈ培養し、１～５個の単一コロニーを選択してＬＢ液体培地１ｍＬに接種し、３７°Ｃ、２００ｒｐｍで４ｈ培養し、培養液１００μＬを、１０％スクロース含有ＬＢ固体培地に塗り、３０°Ｃで２４ｈ培養し、モノクローナルを選択し、かつ対応したＬＢ固体培地およびクロラムフェニコール含有量３４ｍｇ／ｍＬのＬＢ固体培地に線を引き、対応したＬＢ固形培地で増殖し、かつクロラムフェニコール含有量３４ｍｇ／ｍＬのＬＢ固体培地で増殖しなかった菌株を選択し、ＰＣＲ増幅を行って同定した。ＰＣＲ増幅は、下記のプライマー（中国上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より合成された）を採用した。
野生型大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２（Ｗ３１１０）と高生産性でＬ－スレオニンを生産する株Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＧＭＣＣ ７．２３２（中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センターに寄託され、Ｃｈｉｎａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ）は、いずれも染色体上に野生型のkｄｔＡ遺伝子が保持されている。構築されたプラスミドｐＫＯＶ－kｄｔＡ（Ｇ８２Ａ）を、それぞれＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ （Ｗ３１１０）およびＥ．ｃｏｌｉ ＣＧＭＣＣ ７．２３２に形質転換し、対立遺伝子の置き換えによって当該２つの株の染色体のkｄｔＡ遺伝子配列の８２番目の塩基ＧをＡに改変した。具体的なプロセスとして、プラスミドｐＫＯＶ－kｄｔＡ（Ｇ８２Ａ）をエレクトロポレーションにより宿主菌コンピテントセルに形質転換した後、ＳＯＣ液体培地０．５ｍＬを添加し、シェーカーで３０°Ｃ、１００ ｒｐｍで２ｈ蘇生し、培養液１００μＬを取り、クロラムフェニコール含有量３４ｍｇ／ｍＬのＬＢ固体培地に塗り、３０°Ｃで１８ｈ培養し、成長したモノクローナルコロニーを選択し、それらをＬＢ液体培地１０ｍＬに接種し、３７°Ｃ、２００ ｒｐｍで８ｈ培養し、培養液１００μＬをクロラムフェニコール含有量３４ｍｇ／ｍＬのＬＢ固体培地に塗り、４２°Ｃで１２ｈ培養し、１～５個の単一コロニーを選択してＬＢ液体培地１ｍＬに接種し、３７°Ｃ、２００ｒｐｍで４ｈ培養し、培養液１００μＬを、１０％スクロース含有ＬＢ固体培地に塗り、３０°Ｃで２４ｈ培養し、モノクローナルを選択し、かつ対応したＬＢ固体培地およびクロラムフェニコール含有量３４ｍｇ／ｍＬのＬＢ固体培地に線を引き、対応したＬＢ固形培地で増殖し、かつクロラムフェニコール含有量３４ｍｇ／ｍＬのＬＢ固体培地で増殖しなかった菌株を選択し、ＰＣＲ増幅を行って同定した。ＰＣＲ増幅は、下記のプライマー（中国上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より合成された）を採用した。
【0107】
Ｐ５：５’ ＣＴＴＣＣＣＧＡＡＡＧＣＣＧＡＴＴＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）
Ｐ６：５’ ＡＣＡＡＡＡＴＡＴＡＣＴＴＴＡＡＴＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）
前記ＰＣＲ増幅産物に対してＳＳＣＰ（一本鎖高次構造多型、Ｓｉｎｇｌｅ－Ｓｔｒａｎｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）電気泳動を行い、プラスミドｐＫＯＶ－kｄｔＡ（Ｇ８２Ａ）増幅断片を陽性対照とし、野生型大腸菌増幅断片を陰性対照とし、水をブランクコントロールとして使用した。ＳＳＣＰ電気泳動において、同じ長さで配列が異なる一本鎖オリゴヌクレオチド鎖は、氷浴で形成する空間構造が異なり、電気泳動中の移動度も異なる。したがって、断片の電気泳動位置が陰性対照断片の位置と一致せず、かつ陽性対照断片の位置と一致する株は、対立遺伝子置換が成功した株であった。対立遺伝子置換が成功した株をテンプレートとし、プライマーとしてＰ５とＰ６を用いて再び目的断片をＰＣＲで増幅し、かつ目的断片をｐＭＤ１９－Ｔベクターに接続して配列決定した。配列決定結果を比較する結果から分かるように、kｄｔＡ遺伝子コード領域配列の８２番目の塩基のＧがＡに変更した組換え体は、成功に改変された株であり、配列決定結果は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示した。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２（Ｗ３１１０）から由来した組換え体（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）を、ＹＰＴｈｒ０７と名付け、Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＧＭＣＣ ７．２３２から由来した組換え体を、ＹＰＴｈｒ０８と名付けた。
Ｐ６：５’ ＡＣＡＡＡＡＴＡＴＡＣＴＴＴＡＡＴＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）
前記ＰＣＲ増幅産物に対してＳＳＣＰ（一本鎖高次構造多型、Ｓｉｎｇｌｅ－Ｓｔｒａｎｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）電気泳動を行い、プラスミドｐＫＯＶ－kｄｔＡ（Ｇ８２Ａ）増幅断片を陽性対照とし、野生型大腸菌増幅断片を陰性対照とし、水をブランクコントロールとして使用した。ＳＳＣＰ電気泳動において、同じ長さで配列が異なる一本鎖オリゴヌクレオチド鎖は、氷浴で形成する空間構造が異なり、電気泳動中の移動度も異なる。したがって、断片の電気泳動位置が陰性対照断片の位置と一致せず、かつ陽性対照断片の位置と一致する株は、対立遺伝子置換が成功した株であった。対立遺伝子置換が成功した株をテンプレートとし、プライマーとしてＰ５とＰ６を用いて再び目的断片をＰＣＲで増幅し、かつ目的断片をｐＭＤ１９－Ｔベクターに接続して配列決定した。配列決定結果を比較する結果から分かるように、kｄｔＡ遺伝子コード領域配列の８２番目の塩基のＧがＡに変更した組換え体は、成功に改変された株であり、配列決定結果は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示した。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２（Ｗ３１１０）から由来した組換え体（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）を、ＹＰＴｈｒ０７と名付け、Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＧＭＣＣ ７．２３２から由来した組換え体を、ＹＰＴｈｒ０８と名付けた。
【0108】
（３）スレオニン発酵試験
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２（Ｗ３１１０）株、Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＧＭＣＣ ７．２３２株および突然変異株ＹＰＴｈｒ０７、ＹＰＴｈｒ０８を、それぞれ表１に記載の液体培地２５ｍＬに接種し、３７℃、２００ｒｐｍで１２ｈ培養した。そして、各株の培養物１ｍＬをそれぞれ表１に記載の液体培地２５ｍＬに接種し、３７℃、２００ｒｐｍで３６ｈ発酵培養した。そして、ＨＰＬＣでＬ－スレオニンの含有量を測定し、１株あたり３回の並行試験を行い、平均値を算出し、結果を表２に示した。
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２（Ｗ３１１０）株、Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＧＭＣＣ ７．２３２株および突然変異株ＹＰＴｈｒ０７、ＹＰＴｈｒ０８を、それぞれ表１に記載の液体培地２５ｍＬに接種し、３７℃、２００ｒｐｍで１２ｈ培養した。そして、各株の培養物１ｍＬをそれぞれ表１に記載の液体培地２５ｍＬに接種し、３７℃、２００ｒｐｍで３６ｈ発酵培養した。そして、ＨＰＬＣでＬ－スレオニンの含有量を測定し、１株あたり３回の並行試験を行い、平均値を算出し、結果を表２に示した。
【0109】
【表1】
【0110】
【表2】
【0111】
表２の結果から示したように、Ｌ－スレオニン生産が高収率または低収率である元の株（ｏｒｉｇｉｎａｌ ｓｔｒａｉｎ）にも関わらず、kｄｔＡ遺伝子のアミノ酸配列の２８番目のアラニンからスレオニンへの置換は、Ｌ－スレオニン収率の向上に寄与した。
【0112】
実施例２
（１）ｓｐｏＴ遺伝子コード領域の部位特異的突然変異（Ｇ５２０Ｔ）（対応するコードされるタンパク質のアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５の１７４番目のグリシンをシステインに置き換え（Ｇ１７４Ｃ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６になる）に用いるプラスミドｐＫＯＶ－ｓｐｏＴ（Ｇ５２０Ｔ）の構築
ｓｐｏＴ酵素は、ｓｐｏＴ遺伝子でコードされ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ 株およびその派生株（例えば、Ｗ３１１０など）において、野生型のｓｐｏＴ遺伝子ＯＲＦ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＰ００９０４８．１における配列３８１５９０７－３８１８０１５に示す。当該配列に基づいてｓｐｏＴを増幅するための２対のプライマーを設計および合成し、開始株のｓｐｏＴ遺伝子コード領域配列の５２０番目の塩基ＧをＴに変異させることに用いるベクターを構築した。プライマーは、以下のように設計した（中国上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より合成された）。
（１）ｓｐｏＴ遺伝子コード領域の部位特異的突然変異（Ｇ５２０Ｔ）（対応するコードされるタンパク質のアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５の１７４番目のグリシンをシステインに置き換え（Ｇ１７４Ｃ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６になる）に用いるプラスミドｐＫＯＶ－ｓｐｏＴ（Ｇ５２０Ｔ）の構築
ｓｐｏＴ酵素は、ｓｐｏＴ遺伝子でコードされ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ 株およびその派生株（例えば、Ｗ３１１０など）において、野生型のｓｐｏＴ遺伝子ＯＲＦ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＰ００９０４８．１における配列３８１５９０７－３８１８０１５に示す。当該配列に基づいてｓｐｏＴを増幅するための２対のプライマーを設計および合成し、開始株のｓｐｏＴ遺伝子コード領域配列の５２０番目の塩基ＧをＴに変異させることに用いるベクターを構築した。プライマーは、以下のように設計した（中国上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より合成された）。
【0113】
Ｐ１：５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＡＡＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＡＡＧＣ ３’ （下線が引かれた部分は制限エンドヌクレアーゼ切断部位ＢａｍＨ Ｉである。） （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）
Ｐ２：５’ＴＧＴＧＧＴＧＧＡＴＡＣＡＴＡＡＡＣＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）
Ｐ３：５’ＧＣＡＣＣＧＴＴＴＡＴＧＴＡＴＣＣＡＣＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）
Ｐ４：５’ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＧＡＣＡＡＡＧＴＴＣＡＧＣＣＡＡＧＣ ３’（下線が引かれた部分は制限エンドヌクレアーゼ切断部位Ｎｏｔ Ｉである。）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）。
Ｐ２：５’ＴＧＴＧＧＴＧＧＡＴＡＣＡＴＡＡＡＣＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）
Ｐ３：５’ＧＣＡＣＣＧＴＴＴＡＴＧＴＡＴＣＣＡＣＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）
Ｐ４：５’ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＧＡＣＡＡＡＧＴＴＣＡＧＣＣＡＡＧＣ ３’（下線が引かれた部分は制限エンドヌクレアーゼ切断部位Ｎｏｔ Ｉである。）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）。
【0114】
構築方法は、野生型株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ゲノムをテンプレートとし、プライマーとしてそれぞれＰ１とＰ２、Ｐ３とＰ４を用いてＰＣＲ増幅を行って、長さがそれぞれ６２０ｂｐ、８８０ｂｐの点突然変異を含む２つのＤＮＡ断片（ｓｐｏＴ（Ｇ５２０Ｔ）－ＵｐおよびｓｐｏＴ（Ｇ５２０Ｔ）－Ｄｏｗｎ断片）を得た。ＰＣＲシステム：１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（それぞれ２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）それぞれ２μＬ，Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、総体積５０μＬ。前記ＰＣＲは、下記のように行い、すなわち、９４℃で３０ｓの変性、５２℃で３０ｓのアニーリング、および７２℃で３０ｓの伸長（３０回サイクル）を行った。前記の２つのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で分離・精製した後、精製された２つのＤＮＡ断片をテンプレートとし、Ｐ１とＰ４をプライマーとし、ＯｖｅｒｌａｐＰＣＲで長さ約１５００ｂｐの断片（ｓｐｏＴ（Ｇ５２０Ｔ）－Ｕｐ－Ｄｏｗｎ断片）を増幅した。ＰＣＲシステム：１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（それぞれ２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）それぞれ２μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、総体積５０μＬ。前記Ｏｖｅｒｌａｐ ＰＣＲは、下記のように行い、すなわち、９４℃で３０ｓの変性、５２℃で３０ｓのアニーリングおよび７２℃で６０ｓの伸長（３０サイクル）を行った。前述したｓｐｏＴ（Ｇ５２０Ｔ）－Ｕｐ－Ｄｏｗｎ断片をアガロースゲル電気泳動で分離・精製した後、それとｐＫＯＶプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ社から購入）を、それぞれＢａｍＨ Ｉ／Ｎｏｔ Ｉで二重消化し、消化されたｓｐｏＴ（Ｇ５２０Ｔ）－Ｕｐ－Ｄｏｗｎ断片およびｐＫＯＶプラスミドをアガロースゲル電気泳動で分離・精製し、かつＤＮＡリガーゼにより接続して、ベクターｐＫＯＶ－ｓｐｏＴ（Ｇ５２０Ｔ）を得た。ベクターｐＫＯＶ－ｓｐｏＴ（Ｇ５２０Ｔ）を、配列決定のために配列決定会社に送り、正しい点突然変異（ｓｐｏＴ（Ｇ５２０Ｔ））を含むベクターｐＫＯＶ－ｓｐｏＴ（Ｇ５２０Ｔ）を置いておく。
【0115】
（２）点突然変異遺伝子ｓｐｏＴ（Ｇ５２０Ｔ）を含む操作された株の構築
野生型大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２（Ｗ３１１０）と高生産性でＬ－スレオニンを生産する株Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＧＭＣＣ ７．２３２（中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センターに寄託され、Ｃｈｉｎａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ）は、いずれも染色体上に野生型のｓｐｏＴ遺伝子が保持されている。構築されたプラスミドｐＫＯＶ－ｓｐｏＴ（Ｇ５２０Ｔ）を、それぞれＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ （Ｗ３１１０）とＥ．ｃｏｌｉ ＣＧＭＣＣ ７．２３２に形質転換し、対立遺伝子の置き換えによって当該２つの株の染色体のｓｐｏＴ遺伝子配列の５２０番目の塩基ＧをＴに改変した。具体的なプロセスとして、プラスミドｐＫＯＶ－ｓｐｏＴ（Ｇ５２０Ｔ）をエレクトロポレーションにより宿主菌コンピテントセルに形質転換した後、ＳＯＣ液体培地０．５ｍＬを添加し、シェーカーで３０°Ｃ、１００ ｒｐｍで２ｈ蘇生し、培養液１００μＬを取り、クロラムフェニコール含有量３４μｇ／ｍＬのＬＢ固体培地に塗り、３０°Ｃで１８ｈ培養し、成長したモノクローナルコロニーを選択し、それらをＬＢ液体培地１０ｍＬに接種し、３７°Ｃ、２００ ｒｐｍで８ｈ培養し、培養液１００μＬをクロラムフェニコール含有量３４μｇ／ｍＬのＬＢ固体培地に塗り、４２°Ｃで１２ｈ培養し、１～５個の単一コロニーを選択してＬＢ液体培地１ｍＬに接種し、３７°Ｃ、２００ｒｐｍで４ｈ培養し、培養液１００μＬを、１０％スクロース含有ＬＢ固体培地に塗り、３０°Ｃで２４ｈ培養し、モノクローナルを選択し、かつ対応したＬＢ固体培地およびクロラムフェニコール含有量３４μｇ／ｍＬのＬＢ固体培地に線を引き、対応したＬＢ固形培地で増殖し、かつクロラムフェニコール含有量３４μｇ／ｍＬのＬＢ固体培地で増殖しなかった菌株を選択し、ＰＣＲ増幅を行って同定した。ＰＣＲ増幅は、下記のプライマー（中国上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より合成された）を採用した。
野生型大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２（Ｗ３１１０）と高生産性でＬ－スレオニンを生産する株Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＧＭＣＣ ７．２３２（中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センターに寄託され、Ｃｈｉｎａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ）は、いずれも染色体上に野生型のｓｐｏＴ遺伝子が保持されている。構築されたプラスミドｐＫＯＶ－ｓｐｏＴ（Ｇ５２０Ｔ）を、それぞれＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ （Ｗ３１１０）とＥ．ｃｏｌｉ ＣＧＭＣＣ ７．２３２に形質転換し、対立遺伝子の置き換えによって当該２つの株の染色体のｓｐｏＴ遺伝子配列の５２０番目の塩基ＧをＴに改変した。具体的なプロセスとして、プラスミドｐＫＯＶ－ｓｐｏＴ（Ｇ５２０Ｔ）をエレクトロポレーションにより宿主菌コンピテントセルに形質転換した後、ＳＯＣ液体培地０．５ｍＬを添加し、シェーカーで３０°Ｃ、１００ ｒｐｍで２ｈ蘇生し、培養液１００μＬを取り、クロラムフェニコール含有量３４μｇ／ｍＬのＬＢ固体培地に塗り、３０°Ｃで１８ｈ培養し、成長したモノクローナルコロニーを選択し、それらをＬＢ液体培地１０ｍＬに接種し、３７°Ｃ、２００ ｒｐｍで８ｈ培養し、培養液１００μＬをクロラムフェニコール含有量３４μｇ／ｍＬのＬＢ固体培地に塗り、４２°Ｃで１２ｈ培養し、１～５個の単一コロニーを選択してＬＢ液体培地１ｍＬに接種し、３７°Ｃ、２００ｒｐｍで４ｈ培養し、培養液１００μＬを、１０％スクロース含有ＬＢ固体培地に塗り、３０°Ｃで２４ｈ培養し、モノクローナルを選択し、かつ対応したＬＢ固体培地およびクロラムフェニコール含有量３４μｇ／ｍＬのＬＢ固体培地に線を引き、対応したＬＢ固形培地で増殖し、かつクロラムフェニコール含有量３４μｇ／ｍＬのＬＢ固体培地で増殖しなかった菌株を選択し、ＰＣＲ増幅を行って同定した。ＰＣＲ増幅は、下記のプライマー（中国上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より合成された）を採用した。
【0116】
Ｐ５：５’ ｃｔｔｔｃｇｃａａｇａｔｇａｔｔａｔｇｇ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）
Ｐ６：５’ ｃａｃｇｇｔａｔｔｃｃｃｇｃｔｔｃｃｔｇ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）
上述ＰＣＲシステム：１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（それぞれ２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）それぞれ２μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、総体積５０μＬ。前記ＰＣＲ増幅は、下記のように行い、すなわち、９４℃で５ｍｉｎ予備変性し、そして９４℃で３０ｓの変性、５２℃で３０ｓのアニーリングおよび７２℃で９０ｓの伸長を３０回サイクルし、そして７２℃で１０ｍｉｎ過伸長した。前記ＰＣＲ増幅産物に対してＳＳＣＰ（一本鎖高次構造多型、Ｓｉｎｇｌｅ－Ｓｔｒａｎｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）電気泳動を行い、プラスミドｐＫＯＶ－ｓｐｏＴ（Ｇ５２０Ｔ）増幅断片を陽性対照とし、野生型大腸菌増幅断片を陰性対照とし、水をブランクコントロールとして使用した。ＳＳＣＰ電気泳動では、同じ長さで配列が異なる一本鎖オリゴヌクレオチド鎖は、氷浴で形成する空間構造が異なり、電気泳動中の移動度も異なる。したがって、断片の電気泳動位置が陰性対照断片の位置と一致せず、かつ陽性対照断片の位置と一致する株は、対立遺伝子置換が成功した株であった。対立遺伝子置換が成功した株をテンプレートとし、プライマーとしてＰ５とＰ６を用いて再び目的断片をＰＣＲで増幅し、かつ目的断片をｐＭＤ１９－Ｔベクターに接続して配列決定した。配列決定結果を比較すると、ｓｐｏＴ遺伝子コード領域配列の５２０番目の塩基のＧがＴに変更した組換え体は、成功に改変された株であった。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２（Ｗ３１１０）から由来した組換え体を、ＹＰＴｈｒ０３と名付け、Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＧＭＣＣ ７．２３２から由来した組換え体を、ＹＰＴｈｒ０４と名付けた。
Ｐ６：５’ ｃａｃｇｇｔａｔｔｃｃｃｇｃｔｔｃｃｔｇ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）
上述ＰＣＲシステム：１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（それぞれ２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）それぞれ２μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、総体積５０μＬ。前記ＰＣＲ増幅は、下記のように行い、すなわち、９４℃で５ｍｉｎ予備変性し、そして９４℃で３０ｓの変性、５２℃で３０ｓのアニーリングおよび７２℃で９０ｓの伸長を３０回サイクルし、そして７２℃で１０ｍｉｎ過伸長した。前記ＰＣＲ増幅産物に対してＳＳＣＰ（一本鎖高次構造多型、Ｓｉｎｇｌｅ－Ｓｔｒａｎｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）電気泳動を行い、プラスミドｐＫＯＶ－ｓｐｏＴ（Ｇ５２０Ｔ）増幅断片を陽性対照とし、野生型大腸菌増幅断片を陰性対照とし、水をブランクコントロールとして使用した。ＳＳＣＰ電気泳動では、同じ長さで配列が異なる一本鎖オリゴヌクレオチド鎖は、氷浴で形成する空間構造が異なり、電気泳動中の移動度も異なる。したがって、断片の電気泳動位置が陰性対照断片の位置と一致せず、かつ陽性対照断片の位置と一致する株は、対立遺伝子置換が成功した株であった。対立遺伝子置換が成功した株をテンプレートとし、プライマーとしてＰ５とＰ６を用いて再び目的断片をＰＣＲで増幅し、かつ目的断片をｐＭＤ１９－Ｔベクターに接続して配列決定した。配列決定結果を比較すると、ｓｐｏＴ遺伝子コード領域配列の５２０番目の塩基のＧがＴに変更した組換え体は、成功に改変された株であった。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２（Ｗ３１１０）から由来した組換え体を、ＹＰＴｈｒ０３と名付け、Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＧＭＣＣ ７．２３２から由来した組換え体を、ＹＰＴｈｒ０４と名付けた。
【0117】
（３）スレオニン発酵試験
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２（Ｗ３１１０）株、Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＧＭＣＣ ７．２３２株および突然変異株ＹＰＴｈｒ０３、ＹＰＴｈｒ０４を、それぞれ表１に記載の液体培地２５ｍＬに接種し、３７℃、２００ｒｐｍで１２ｈ培養した。そして、各株の培養物１ｍＬをそれぞれ表１に記載の液体培地２５ｍＬに接種し、３７℃、２００ｒｐｍで３６ｈ発酵培養した。そして、ＨＰＬＣでＬ－スレオニンの含有量を測定し、１株あたり３回の並行試験を行い、平均値を算出し、結果を表２に示した。
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２（Ｗ３１１０）株、Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＧＭＣＣ ７．２３２株および突然変異株ＹＰＴｈｒ０３、ＹＰＴｈｒ０４を、それぞれ表１に記載の液体培地２５ｍＬに接種し、３７℃、２００ｒｐｍで１２ｈ培養した。そして、各株の培養物１ｍＬをそれぞれ表１に記載の液体培地２５ｍＬに接種し、３７℃、２００ｒｐｍで３６ｈ発酵培養した。そして、ＨＰＬＣでＬ－スレオニンの含有量を測定し、１株あたり３回の並行試験を行い、平均値を算出し、結果を表２に示した。
【0118】
【表3】
【0119】
【表4】
【0120】
表２の結果から示したように、Ｌ－スレオニン生産が高収率または低収率である元の株（ｏｒｉｇｉｎａｌ ｓｔｒａｉｎ）にも関わらず、ｓｐｏＴ遺伝子のアミノ酸配列の１７４番目のグリシンからシステインへの置換は、Ｌ－スレオニン収率の向上に寄与した。
【0121】
実施例３：
（１）ｙｅｂＮ遺伝子コード領域の部位特異的突然変異（Ｇ７４Ａ）（対応するコードされるタンパク質のアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５における２５番目のグリシンをアスパラギン酸に置き換え（Ｇ２５Ｄ）、置換された後のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示す。）に用いるプラスミドｐＫＯＶ－ｙｅｂＮ（Ｇ７４Ａ）の構築
ＹＥＢＮ酵素は、ｙｅｂＮ遺伝子でコードされ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ 株およびその派生株（例えばＷ３１１０など）において、野生型ｙｅｂＮ遺伝子ＯＲＦ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＰ００９０４８．１における配列１９０７４０２－１９０７９６８に示した。当該配列に基づいてｙｅｂＮを増幅するための２対のプライマーを設計および合成し、開始株のｙｅｂＮ遺伝子コード領域配列の７４番目の塩基ＧをＡに変異させることに用いるベクターを構築した。プライマーは、以下のように設計した（中国上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より合成された）。
（１）ｙｅｂＮ遺伝子コード領域の部位特異的突然変異（Ｇ７４Ａ）（対応するコードされるタンパク質のアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５における２５番目のグリシンをアスパラギン酸に置き換え（Ｇ２５Ｄ）、置換された後のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示す。）に用いるプラスミドｐＫＯＶ－ｙｅｂＮ（Ｇ７４Ａ）の構築
ＹＥＢＮ酵素は、ｙｅｂＮ遺伝子でコードされ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ 株およびその派生株（例えばＷ３１１０など）において、野生型ｙｅｂＮ遺伝子ＯＲＦ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＰ００９０４８．１における配列１９０７４０２－１９０７９６８に示した。当該配列に基づいてｙｅｂＮを増幅するための２対のプライマーを設計および合成し、開始株のｙｅｂＮ遺伝子コード領域配列の７４番目の塩基ＧをＡに変異させることに用いるベクターを構築した。プライマーは、以下のように設計した（中国上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より合成された）。
【0122】
Ｐ１：５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＴＣＧＣＣＡＡＴＧＴＣＴＧＧＡＴＴＧ ３’ （下線が引かれた部分は制限エンドヌクレアーゼ切断部位ＢａｍＨ Ｉである。）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）
Ｐ２：５’ＡＴＧＧＡＧＧＧＴＧＧＣＡＴＣＴＴＴＡＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）
Ｐ３：５’ＴＧＣＡＴＣＡＡＴＣＧＧＴＡＡＡＧＡＴＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）
Ｐ４：５’ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＡＣＴＣＣＧＣＡＣＴＣＴＧＣＴＧＴＡ ３’（下線が引かれた部分は制限エンドヌクレアーゼ切断部位であるＮｏｔ Ｉである。）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）
構築方法として、野生型株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ゲノムをテンプレートとし、プライマーとしてそれぞれＰ１とＰ２、Ｐ３とＰ４を用いてＰＣＲ増幅を行って、長さがそれぞれ６９０ｂｐ、７００ｂｐである点突然変異を含む２つのＤＮＡ断片（ｙｅｂＮ（Ｇ７４Ａ）－ＵｐおよびｙｅｂＮ（Ｇ７４Ａ）－Ｄｏｗｎ断片）を得た。ＰＣＲシステム：１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（それぞれ２．５ｍＭ） ４μＬ、Ｍｇ２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）それぞれ２μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、総体積５０μＬ。前記ＰＣＲ増幅では、９４℃で３０ｓの変性、５２℃で３０ｓのアニーリングおよび７２℃で３０ｓの伸長（３０サイクル）を行った。前記の２つのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で分離・精製した後、精製された２つのＤＮＡ断片をテンプレートとし、Ｐ１とＰ４をプライマーとし、ＯｖｅｒｌａｐＰＣＲで長さ約１３４０ｂｐの断片（ｙｅｂＮ（Ｇ７４Ａ）－Ｕｐ－Ｄｏｗｎ断片）を増幅した。
Ｐ２：５’ＡＴＧＧＡＧＧＧＴＧＧＣＡＴＣＴＴＴＡＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）
Ｐ３：５’ＴＧＣＡＴＣＡＡＴＣＧＧＴＡＡＡＧＡＴＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）
Ｐ４：５’ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＡＣＴＣＣＧＣＡＣＴＣＴＧＣＴＧＴＡ ３’（下線が引かれた部分は制限エンドヌクレアーゼ切断部位であるＮｏｔ Ｉである。）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）
構築方法として、野生型株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ゲノムをテンプレートとし、プライマーとしてそれぞれＰ１とＰ２、Ｐ３とＰ４を用いてＰＣＲ増幅を行って、長さがそれぞれ６９０ｂｐ、７００ｂｐである点突然変異を含む２つのＤＮＡ断片（ｙｅｂＮ（Ｇ７４Ａ）－ＵｐおよびｙｅｂＮ（Ｇ７４Ａ）－Ｄｏｗｎ断片）を得た。ＰＣＲシステム：１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（それぞれ２．５ｍＭ） ４μＬ、Ｍｇ２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）それぞれ２μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、総体積５０μＬ。前記ＰＣＲ増幅では、９４℃で３０ｓの変性、５２℃で３０ｓのアニーリングおよび７２℃で３０ｓの伸長（３０サイクル）を行った。前記の２つのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で分離・精製した後、精製された２つのＤＮＡ断片をテンプレートとし、Ｐ１とＰ４をプライマーとし、ＯｖｅｒｌａｐＰＣＲで長さ約１３４０ｂｐの断片（ｙｅｂＮ（Ｇ７４Ａ）－Ｕｐ－Ｄｏｗｎ断片）を増幅した。
【0123】
ＰＣＲシステム：１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（それぞれ２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）それぞれ２μＬ，Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、総体積５０μＬ。前記Ｏｖｅｒｌａｐ ＰＣＲでは、９４℃で３０ｓの変性、５２℃で３０ｓのアニーリングおよび７２℃で６０ｓの伸長（３０サイクル）を行った。
【0124】
前記ｙｅｂＮ（Ｇ７４Ａ）－Ｕｐ－Ｄｏｗｎ断片をアガロースゲル電気泳動で分離・精製した後、それとｐＫＯＶプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ社から購入）を、それぞれＢａｍＨ Ｉ／Ｎｏｔ Ｉで二重消化し、消化されたｙｅｂＮ（Ｇ７４Ａ）－Ｕｐ－Ｄｏｗｎ断片とｐＫＯＶプラスミドをアガロースゲル電気泳動で分離・精製し、かつ接続してベクターｐＫＯＶ－ｙｅｂＮ（Ｇ７４Ａ）を得た。ベクターｐＫＯＶ－ｙｅｂＮ（Ｇ７４Ａ）を、配列決定のために配列決定会社に送り、正しい点突然変異（ｙｅｂＮ（Ｇ７４Ａ））を含むベクターｐＫＯＶ－ｙｅｂＮ（Ｇ７４Ａ）を置いておく。
【0125】
（２）点突然変異された遺伝子ｙｅｂＮ（Ｇ７４Ａ）を含む操作された株の構築
野生型大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ （Ｗ３１１０）と高生産性でＬ－スレオニンを生産する株Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＧＭＣＣ ７．２３２（中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センターに寄託されている）は、いずれも染色体上に野生型のｙｅｂＮ遺伝子が保持されている。構築されたプラスミドｐＫＯＶ－ｙｅｂＮ（Ｇ７４Ａ）をそれぞれＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２（Ｗ３１１０）とＥ．ｃｏｌｉ ＣＧＭＣＣ ７．２３２に形質転換し、対立遺伝子の置き換えによって当該２つの株の染色体のｙｅｂＮ遺伝子配列の７４番目の塩基ＧをＡに改変した。
野生型大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ （Ｗ３１１０）と高生産性でＬ－スレオニンを生産する株Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＧＭＣＣ ７．２３２（中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センターに寄託されている）は、いずれも染色体上に野生型のｙｅｂＮ遺伝子が保持されている。構築されたプラスミドｐＫＯＶ－ｙｅｂＮ（Ｇ７４Ａ）をそれぞれＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２（Ｗ３１１０）とＥ．ｃｏｌｉ ＣＧＭＣＣ ７．２３２に形質転換し、対立遺伝子の置き換えによって当該２つの株の染色体のｙｅｂＮ遺伝子配列の７４番目の塩基ＧをＡに改変した。
【0126】
具体的なプロセスとして、プラスミドｐＫＯＶ－ｙｅｂＮ（Ｇ７４Ａ）を、エレクトロポレーションによって宿主菌コンピテントセルに形質転換した後、ＳＯＣ液体培地０．５ｍＬを添加し、シェーカーで３０°Ｃ、１００ ｒｐｍで２ｈ蘇生し、培養液１００μＬを取り、クロラムフェニコール含有量３４μｇ／ｍＬのＬＢ固体培地に塗り、３０°Ｃで１８ｈ培養し、成長したモノクローナルコロニーを選択し、それらをＬＢ液体培地１０ｍＬに接種し、３７°Ｃ、２００ ｒｐｍで８ｈ培養し、培養液１００μＬをクロラムフェニコール含有量３４μｇ／ｍＬのＬＢ固体培地に塗り、４２°Ｃで１２ｈ培養し、１～５個の単一コロニーを選択してＬＢ液体培地１ｍＬに接種し、３７°Ｃ、２００ｒｐｍで４ｈ培養し、培養液１００μＬを取り、１０％スクロース含有ＬＢ固体培地に塗り、３０°Ｃで２４ｈ培養し、モノクローナルを選択し、かつ対応したＬＢ固体培地およびクロラムフェニコール含有量３４μｇ／ｍＬのＬＢ固体培地に線を引き、対応したＬＢ固形培地で増殖し、かつクロラムフェニコール含有量３４μｇ／ｍＬのＬＢ固体培地で増殖しなかった菌株を選択し、ＰＣＲ増幅を行って同定した。ＰＣＲ増幅は、下記のプライマー（中国上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より合成された）を採用した。
【0127】
Ｐ５：５’ ＣＣＡＴＣＡＣＧＧＣＴＴＧＴＴＧＴＴＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）
Ｐ６：５’ ＡＣＧＡＡＡＡＣＣＣＴＣＡＡＴＡＡＴＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）
上述ＰＣＲシステム：１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（それぞれ２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）それぞれ２μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、総体積５０μＬ。前記ＰＣＲ増幅では、９４℃で５ｍｉｎ予備変性し、そして９４℃で３０ｓの変性、５２℃で３０ｓのアニーリングおよび７２℃で３０ｓの伸長（３０サイクル）を行い、そして７２℃で１０ｍｉｎの過伸長を行った。ＰＣＲ増幅産物に対してＳＳＣＰ（一本鎖高次構造多型、Ｓｉｎｇｌｅ－Ｓｔｒａｎｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）電気泳動を行い、プラスミドｐＫＯＶ－ｙｅｂＮ（Ｇ７４Ａ）増幅断片を陽性対照とし、野生型大腸菌増幅断片を陰性対照とし、水をブランクコントロールとして使用した。ＳＳＣＰ電気泳動において、同じ長さで配列が異なる一本鎖オリゴヌクレオチド鎖は、氷浴で形成する空間構造が異なり、電気泳動中の移動度も異なる。したがって、断片の電気泳動位置が陰性対照断片の位置と一致せず、かつ陽性対照断片の位置と一致する株は、対立遺伝子置換が成功した株であった。対立遺伝子置換が成功した株をテンプレートとし、プライマーとしてＰ５とＰ６を用いて再び目的断片をＰＣＲで増幅し、かつ目的断片をｐＭＤ１９－Ｔベクターに接続して配列決定した。配列決定結果を比較すると、ｙｅｂＮ遺伝子コード領域配列の７４番目の塩基のＧがＡに変更した組換え体は、成功に改変された株であった。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２（Ｗ３１１０）から由来した組換え体を、ＹＰＴｈｒ０５と名付け、Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＧＭＣＣ ７．２３２から由来した組換え体を、ＹＰＴｈｒ０６と名付けた。
Ｐ６：５’ ＡＣＧＡＡＡＡＣＣＣＴＣＡＡＴＡＡＴＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）
上述ＰＣＲシステム：１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（それぞれ２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）それぞれ２μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、総体積５０μＬ。前記ＰＣＲ増幅では、９４℃で５ｍｉｎ予備変性し、そして９４℃で３０ｓの変性、５２℃で３０ｓのアニーリングおよび７２℃で３０ｓの伸長（３０サイクル）を行い、そして７２℃で１０ｍｉｎの過伸長を行った。ＰＣＲ増幅産物に対してＳＳＣＰ（一本鎖高次構造多型、Ｓｉｎｇｌｅ－Ｓｔｒａｎｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）電気泳動を行い、プラスミドｐＫＯＶ－ｙｅｂＮ（Ｇ７４Ａ）増幅断片を陽性対照とし、野生型大腸菌増幅断片を陰性対照とし、水をブランクコントロールとして使用した。ＳＳＣＰ電気泳動において、同じ長さで配列が異なる一本鎖オリゴヌクレオチド鎖は、氷浴で形成する空間構造が異なり、電気泳動中の移動度も異なる。したがって、断片の電気泳動位置が陰性対照断片の位置と一致せず、かつ陽性対照断片の位置と一致する株は、対立遺伝子置換が成功した株であった。対立遺伝子置換が成功した株をテンプレートとし、プライマーとしてＰ５とＰ６を用いて再び目的断片をＰＣＲで増幅し、かつ目的断片をｐＭＤ１９－Ｔベクターに接続して配列決定した。配列決定結果を比較すると、ｙｅｂＮ遺伝子コード領域配列の７４番目の塩基のＧがＡに変更した組換え体は、成功に改変された株であった。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２（Ｗ３１１０）から由来した組換え体を、ＹＰＴｈｒ０５と名付け、Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＧＭＣＣ ７．２３２から由来した組換え体を、ＹＰＴｈｒ０６と名付けた。
【0128】
（３）スレオニン発酵試験
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２（Ｗ３１１０）株、Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＧＭＣＣ ７．２３２株および突然変異株ＹＰＴｈｒ０５、ＹＰＴｈｒ０６を、それぞれ表１に記載の液体培地２５ｍＬに接種し、３７℃、２００ｒｐｍで１２ｈ培養した。そして、各株の培養物１ｍＬをそれぞれ表１に記載の液体培地２５ｍＬに接種し、３７℃、２００ｒｐｍで３６ｈ発酵培養した。そして、ＨＰＬＣでＬ－スレオニンの含有量を測定し、１株あたり３回の並行試験を行い、平均値を算出し、結果を表２に示した。
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２（Ｗ３１１０）株、Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＧＭＣＣ ７．２３２株および突然変異株ＹＰＴｈｒ０５、ＹＰＴｈｒ０６を、それぞれ表１に記載の液体培地２５ｍＬに接種し、３７℃、２００ｒｐｍで１２ｈ培養した。そして、各株の培養物１ｍＬをそれぞれ表１に記載の液体培地２５ｍＬに接種し、３７℃、２００ｒｐｍで３６ｈ発酵培養した。そして、ＨＰＬＣでＬ－スレオニンの含有量を測定し、１株あたり３回の並行試験を行い、平均値を算出し、結果を表２に示した。
【0129】
【表5】
【0130】
【表6】
【0131】
表２の結果から示したように、Ｌ－スレオニン生産が高収率または低収率である元の株にも関わらず、ｙｅｂＮ遺伝子のアミノ酸配列の２５番目のグリシンからアスパラギン酸への置換は、Ｌ－スレオニン収率の向上に寄与した。
【0132】
以上、本発明の具体的な実施形態について説明したが、本発明は、上記の実施形態に限定されるものではない。本発明の要旨および原則の範囲内でのいかなる修正、同等の置換、改善なども、本発明の請求の範囲内に属する。
【配列表】
【国際調査報告】