特表 2022-547209 部位特異的タウリン酸化をベースとする診断および処置のための血液ベースアッセイ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-11-10

(54)【発明の名称】部位特異的タウリン酸化をベースとする診断および処置のための血液ベースアッセイ

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/68 20060101AFI20221102BHJP

   G01N 27/62 20210101ALI20221102BHJP

   C07K 14/47 20060101ALI20221102BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20221102BHJP

   C12Q 1/06 20060101ALI20221102BHJP

   A61K 51/00 20060101ALN20221102BHJP

【ＦＩ】

G01N33/68

G01N27/62 V

C07K14/47 ZNA

C07K16/18

C12Q1/06

A61K51/00 200

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022515666

(86)(22)【出願日】2020-09-10

(85)【翻訳文提出日】2022-04-27

(86)【国際出願番号】 US2020050208

(87)【国際公開番号】W WO2021050733

(87)【国際公開日】2021-03-18

(31)【優先権主張番号】62/898,407

(32)【優先日】2019-09-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】597025806

【氏名又は名称】ワシントン・ユニバーシティ

【氏名又は名称原語表記】Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ

(74)【代理人】

【識別番号】100101454

【弁理士】

【氏名又は名称】山田 卓二

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100157956

【弁理士】

【氏名又は名称】稲井 史生

(74)【代理人】

【識別番号】100170520

【弁理士】

【氏名又は名称】笹倉 真奈美

(72)【発明者】

【氏名】ベイトマン，ランドール

(72)【発明者】

【氏名】バルテルミー，ニコラ

【テーマコード（参考）】

2G041

2G045

4B063

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

2G041CA01

2G041EA04

2G041FA10

2G041FA12

2G045AA25

2G045CA25

2G045DA36

4B063QA01

4B063QA19

4B063QQ03

4B063QQ79

4B063QR48

4B063QR90

4B063QS33

4B063QS36

4B063QX01

4C085HH03

4C085KA29

4C085LL13

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA75

4H045EA50

4H045GA26

(57)【要約】

本開示は、血液試料を使用して、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害の発症までの時間を予測するため、アルツハイマー病をステージ分類するため、処置の決定の指針とするため、対象を臨床試験に選択するため、およびある特定の治療的介入の臨床的有効性を評価するための、特定のアミノ酸残基におけるタウリン酸化を定量するための方法を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

可溶性タウを濃縮するために血液試料を処理するための方法であって、
血液試料からタンパク質を、過塩素酸を使用して沈殿させ、それにより血液の酸可溶性抽出物を製造することと、
前記酸可溶性抽出物中の可溶性タウを、逆相吸着剤を使用する固相抽出および１つまたは複数のエピトープ結合剤を使用するアフィニティ精製により濃縮することと
を含み、少なくとも１つのエピトープ結合剤はタウのＮ末端中またはタウのｍｉｄドメイン中のエピトープに特異的に結合する、方法。

【請求項2】

前記血液試料が血漿である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記血液試料が血清である、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

過塩素酸が、約１％ｖ／ｖ～約１５％ｖ／ｖの最終濃度で添加される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

過塩素酸が、約３％ｖ／ｖ～約１５％ｖ／ｖまたは約３％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖの最終濃度で添加される、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

過塩素酸が、約３％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖの最終濃度で添加される、請求項４に記載の方法。

【請求項7】

前記逆相吸着剤が、Ｎ－ビニルピロリドンおよびジビニルベンゼンを含むポリマー、またはスチレンおよびジビニルベンゼンを含むポリマーである、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記逆相吸着剤が、Ｎ－ビニルピロリドンおよびジビニルベンゼンを含むポリマーである、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記固相抽出が、約０．０５％ｖ／ｖ～約１％ｖ／ｖ ＴＦＡを含む移動相を使用する、請求項７に記載の方法。

【請求項10】

前記固相抽出が、約０．０５％ｖ／ｖ～約０．５％ｖ／ｖ ＴＦＡまたは約０．１％ｖ／ｖ ＴＦＡ～約１％ｖ／ｖ ＴＦＡを含む移動相を使用する、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

可溶性タウが、約２０％ｖ／ｖ～約５０％ｖ／ｖアセトニトリルを含む移動相を使用して前記逆相吸着剤から溶出される、請求項７に記載の方法。

【請求項12】

可溶性タウが、約２０％ｖ／ｖ～約４０％ｖ／ｖアセトニトリルまたは約３０％ｖ／ｖ～約５０％ｖ／ｖアセトニトリルを含む移動相を使用して前記逆相吸着剤から溶出される、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

タウのＮ末端中の前記エピトープが、アミノ酸残基２７～３５を含み、タウのｍｉｄドメイン中の前記エピトープが、アミノ酸残基１９２～１９９を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記アフィニティ精製が、タウのＮ末端中のエピトープと特異的に結合する少なくとも１つのエピトープ結合剤、およびタウのｍｉｄドメイン中に特異的に結合する少なくとも１つのエピトープ結合剤を使用する、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

各エピトープ結合剤が抗体である、請求項１３または１４に記載の方法。

【請求項16】

可溶性タウを濃縮するために血液試料を処理するための方法であって、
血液試料からタンパク質を、過塩素酸を使用して沈殿させることであって、過塩素酸が約１％ｖ／ｖ～約１５％ｖ／ｖの最終濃度で添加され、それにより血液の酸可溶性抽出物が製造されることと、
前記酸可溶性抽出物中の可溶性タウを固相抽出およびアフィニティ精製により濃縮することと
を含み、
前記固相抽出工程が、（ｉ）前記酸可溶性抽出物を、可溶性タウを逆相吸着剤に付着させるのに十分な時間、逆相吸着剤とともに混合することであって、前記逆相吸着剤は、Ｎ－ビニルピロリドンおよびジビニルベンゼンを含むポリマー、またはスチレンおよびジビニルベンゼンを含むポリマーであること、（ｉｉ）逆相吸着剤に付着したタウを、約０．０５％ｖ／ｖ～約１％ｖ／ｖ ＴＦＡを含む移動相を用いて洗浄すること、および（ｉｉｉ）可溶性タウを、約０．０５％ｖ／ｖ～約１％ｖ／ｖ ＴＦＡおよび約２０％ｖ／ｖ～約５０％ｖ／ｖアセトニトリルを含む移動相を使用して前記逆相吸着剤から溶出することを含み、
前記アフィニティ精製工程が、タウのＮ末端中のエピトープと特異的に結合する少なくとも１つのエピトープ結合剤、およびタウのｍｉｄドメインのエピトープと特異的に結合する少なくとも１つのエピトープ結合剤を含む、方法。

【請求項17】

前記移動相が、約０．０５％ｖ／ｖ～約０．５％ｖ／ｖ ＴＦＡを含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記移動相が、約０．１％ｖ／ｖ ＴＦＡ～約１％ｖ／ｖ ＴＦＡを含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項19】

タウを溶出するのに使用される前記移動相が、約２０％ｖ／ｖ～約４０％ｖ／ｖアセトニトリルを含む、請求項１７または１８に記載の方法。

【請求項20】

タウを溶出するのに使用される前記移動相が、約３０％ｖ／ｖ～約５０％ｖ／ｖアセトニトリルを含む、請求項１７または１８に記載の方法。

【請求項21】

タウのＮ末端中の前記エピトープが、アミノ酸残基２７～３５を含み、タウのｍｉｄドメイン中の前記エピトープが、アミノ酸残基１９２～１９９を含む、請求項１６から２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

各エピトープ結合剤が抗体である、請求項１６から２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

血液試料中の可溶性タウを分析するための方法であって、請求項１から２２のいずれか一項に従って血液試料を処理して可溶性タウが濃縮された試料を製造すること、および可溶性タウが濃縮された試料を質量分析により分析することを含む方法。

【請求項24】

血液試料中の総タウの量を決定するための方法であって、請求項１から２２のいずれか一項に従って血液試料を処理して可溶性タウが濃縮された試料を製造すること、および可溶性タウが濃縮された試料を質量分析により分析することを含む方法。

【請求項25】

タウの１つまたは複数の残基におけるリン酸化の量を測定するための方法であって、請求項１から２２のいずれか一項に従って血液試料を処理して可溶性タウが濃縮された試料を製造すること、および質量分析によりタウの１つまたは複数の残基におけるリン酸化の量を測定することを含む方法。

【請求項26】

タウのリン酸化が、Ｔ１１１、Ｓ１１３、Ｔ１８１、Ｓ１９９、Ｓ２０２、Ｓ２０８、Ｔ１５３、Ｔ１７５、Ｔ２０５、Ｓ２１４、Ｔ２１７およびＴ２３１から選択される１つまたは複数の残基で測定される、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

タウのリン酸化が、Ｔ１８１、Ｓ２０２またはＴ２１７のうちの少なくとも１つを含む１つまたは複数の残基で測定される、請求項２５に記載の方法。

【請求項28】

タウのリン酸化が、Ｔ１８１、Ｓ２０２またはＴ２１７のうちの少なくとも１つを含む２つ以上の残基で測定される、請求項２５に記載の方法。

【請求項29】

前記血液試料が、少なくとも約１ｍｌの血漿または少なくとも２ｍｌの全血である、請求項２３から２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記血液試料が、少なくとも約１ｍｌ～約２０ｍｌの血漿である、請求項２３から２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

トリプシン、Ｌｙｓ－Ｎ、Ｌｙｓ－ＣまたはＡｒｇ－Ｎの存在下で実行される消化工程をさらに含み、前記消化工程が血液試料の処理の後に行われる、請求項２３から３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

トリプシン、Ｌｙｓ－Ｎ、Ｌｙｓ－ＣまたはＡｒｇ－Ｎの存在下で実行される消化工程をさらに含み、前記消化工程が、タウが少なくとも１つのエピトープ結合剤と結合している間に行われる、請求項２３から３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

前記消化工程がトリプシンの存在下で行われる、請求項３１または３２に記載の方法。

【請求項34】

前記血液試料が、無症候性の対象、アルツハイマー病の徴候または症状を呈するが、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害の臨床診断のための十分な認知障害も機能障害も示さない対象、ＡＤを有すると診断された対象、神経変性疾患と診断された対象、タウオパチーと診断された対象、認知症と診断された対象、または軽度認知障害と診断された対象から得られる、請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記血液試料が、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核症候群（ＣＢＳ）、ダウン症候群（ＤＳ）、パーキンソン病（ＰＤ）およびレビー小体型認知症（ＤＬＢ）と診断された対象から得られる、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

アルツハイマー病の発症の前に対象を診断するための方法であって、
（ａ）請求項１から３５のいずれか一項に記載の方法により製造される、前記対象から得られた単離されたタウ試料を用意すること、ならびに（ｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化を測定することと、
（ｂ）Ｔ２１７またはＴ１８１におけるタウリン酸化が約１．５σ以上であり、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が約１．５σ以下である場合に、前記対象を、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害への転換の増大したリスクを有すると診断することと
を含み、σは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団中で測定された、Ｔ２１７およびＴ２０５、Ｔ１８１およびＴ２０５またはＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である、方法。

【請求項37】

アルツハイマー病の発症の前に対象を診断するための方法であって、
（ａ）請求項１から３５のいずれか一項に記載の方法により製造される、前記対象から得られた単離されたタウ試料を用意すること、ならびに総タウを測定すること、ならびに（ｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化を測定することと、
（ｂ）Ｔ２１７またはＴ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比が２σを超え、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が２σを下回る場合に、前記対象を、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害への転換の増大したリスクを有すると診断することと
を含み、σは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団中で測定された、総タウ、ならびにＴ２１７およびＴ２０５、Ｔ１８１およびＴ２０５またはＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である、方法。

【請求項38】

アルツハイマー病の発症の前に対象を診断するための方法であって、
（ａ）請求項１から３５のいずれか一項に記載の方法により製造される、前記対象から得られた単離されたタウ試料を用意すること、ならびに（ｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化を測定することと、
（ｂ）（ｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化が約１．５σ以上である場合に、前記対象を、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害への転換の増大したリスクを有すると診断することと
を含み、σは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団中で測定された、Ｔ２１７およびＴ２０５、Ｔ１８１およびＴ２０５またはＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である、方法。

【請求項39】

アルツハイマー病の発症の前に対象を診断するための方法であって、
（ａ）請求項１から３５のいずれか一項に記載の方法により製造される、前記対象から得られた単離されたタウ試料を用意すること、ならびに総タウを測定すること、ならびに（ｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化を測定することと、
（ｂ）（ｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が約１．５σ以上である場合に、前記対象を、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害への転換の増大したリスクを有すると診断することと
を含み、σは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団中で測定された総タウ、およびＴ２１７およびＴ２０５、Ｔ１８１およびＴ２０５またはＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である、方法。

【請求項40】

それを必要とする対象を処置するための方法であって、
（ａ）請求項１から３５のいずれか一項に記載の方法により製造される、前記対象から得られた単離されたタウ試料を用意すること、ならびに（ｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化を測定することと、
（ｂ）Ｔ２１７またはＴ１８１におけるタウリン酸化が約１．５σ以上であり、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が約１．５σ以下である場合に、前記対象に医薬組成物を投与することと
を含み、σは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団中で測定された、Ｔ２１７およびＴ２０５、Ｔ１８１およびＴ２０５またはＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である、方法。

【請求項41】

それを必要とする対象を処置するための方法であって、
（ａ）請求項１から３５のいずれか一項に記載の方法により製造される、前記対象から得られた単離されたタウ試料を用意すること、ならびに総タウを測定すること、ならびに（ｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化を測定することと、
（ｂ）Ｔ２１７またはＴ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比が２σを超え、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が２σを下回る場合に、前記対象に医薬組成物を投与することと
を含み、σは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団中で測定された、総タウ、ならびにＴ２１７およびＴ２０５、Ｔ１８１およびＴ２０５またはＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である、方法。

【請求項42】

それを必要とする対象を処置するための方法であって、
（ａ）請求項１から３５のいずれか一項に記載の方法により製造される、前記対象から得られた単離されたタウ試料を用意すること、ならびに（ｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化を測定することと、
（ｂ）（ｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化が約１．５σ以上である場合に、前記対象に医薬組成物を投与することと
を含み、σは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団中で測定された、Ｔ２１７およびＴ２０５、Ｔ１８１およびＴ２０５またはＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である、方法。

【請求項43】

それを必要とする対象を処置するための方法であって、
（ａ）請求項１から３５のいずれか一項に記載の方法により製造される、前記対象から得られた単離されたタウ試料を用意すること、ならびに総タウを測定すること、ならびに（ｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化を測定することと、
（ｂ）（ｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が約１．５σ以上である場合に、前記対象に医薬組成物を投与することと
を含み、σは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団中で測定された総タウ、およびＴ２１７およびＴ２０５、Ｔ１８１およびＴ２０５またはＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である、方法。

【請求項44】

対象を臨床試験に登録するための方法であって、
（ａ）請求項１から３５のいずれか一項に記載の方法により製造される、前記対象から得られた単離されたタウ試料を用意すること、ならびに（ｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化を測定することと、
（ｂ）Ｔ２１７またはＴ１８１におけるタウリン酸化が約１．５σ以上であり、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が約１．５σ以下である場合に、前記対象を臨床試験に登録することと
を含み、σは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団中で測定された、Ｔ２１７およびＴ２０５、Ｔ１８１およびＴ２０５またはＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である、方法。

【請求項45】

対象を臨床試験に登録するための方法であって、
（ａ）請求項１から３５のいずれか一項に記載の方法により製造される、前記対象から得られた単離されたタウ試料を用意すること、ならびに総タウを測定すること、ならびに（ｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化を測定することと、
（ｂ）Ｔ２１７またはＴ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比が２σを超え、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が２σを下回る場合に、前記対象を臨床試験に登録することと
を含み、σは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団中で測定された、総タウ、ならびにＴ２１７およびＴ２０５、Ｔ１８１およびＴ２０５またはＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である、方法。

【請求項46】

対象を臨床試験に登録するための方法であって、
（ａ）請求項１から３５のいずれか一項に記載の方法により製造される、前記対象から得られた単離されたタウ試料を用意すること、ならびに（ｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化を測定することと、
（ｂ）（ｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化が約１．５σ以上である場合に、前記対象を臨床試験に登録することと
を含み、σは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団中で測定された、Ｔ２１７およびＴ２０５、Ｔ１８１およびＴ２０５またはＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である、方法。

【請求項47】

対象を臨床試験に登録するための方法であって、
（ａ）請求項１から３５のいずれか一項に記載の方法により製造される、前記対象から得られた単離されたタウ試料を用意すること、ならびに総タウを測定すること、ならびに（ｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化を測定することと、
（ｂ）（ｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が約１．５σ以上である場合に、前記対象を臨床試験に登録することと
を含み、σは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団中で測定された総タウ、およびＴ２１７およびＴ２０５、Ｔ１８１およびＴ２０５またはＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である、方法。

【請求項48】

それを必要とする対象を処置するための方法であって、
（ａ）請求項１から３５のいずれか一項に記載の方法により製造される、前記対象から得られた単離されたタウ試料を用意すること、および、前記単離されたタウ試料中、Ｔ２０５およびＴ１８１における、Ｔ２０５およびＴ２１７における、またはＴ２０５、Ｔ１８１およびＴ２１７におけるタウリン酸化を測定することと、
（ｂ）前記工程（ａ）において測定されたタウリン酸化の量を低減するかまたは安定化するために、前記対象に医薬組成物を投与することと
を含み、前記対象から得られた前記単離されたタウ試料が、
（ｉ）約１．５σ以上であるＴ１８１におけるタウリン酸化および／もしくは約１．５σ以上であるＴ２１７におけるタウリン酸化、および約１．５σを下回るＴ２０５におけるタウリン酸化、または
（ｉｉ）約１．５σ以上であるＴ１８１におけるタウリン酸化および／もしくは約１．５σ以上であるＴ２１７におけるタウリン酸化、および約１．５σ以上のＴ２０５におけるタウリン酸化
を含有し、σは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団中で測定された残基におけるタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である、方法。

【請求項49】

それを必要とする対象を処置するための方法であって、
（ａ）請求項１から３５のいずれか一項に記載の方法により製造される、前記対象から得られた単離されたタウ試料を用意すること、および、前記単離されたタウ試料中、Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７から選択される２つ以上の残基におけるタウリン酸化を測定することと、
（ｂ）前記工程（ａ）において測定されたタウリン酸化の量を低減するかまたは安定化するために、前記対象に医薬組成物を投与することと
を含み、前記対象から得られた前記単離されたタウ試料が、
（ｉ）約１．５σ以上であるＴ１８１におけるタウリン酸化および／もしくは約１．５σ以上であるＴ２１７におけるタウリン酸化、および約１．５σを下回るＴ２０５におけるタウリン酸化、または
（ｉｉ）約１．５σ以上であるＴ１８１におけるタウリン酸化および／もしくは約１．５σ以上であるＴ２１７におけるタウリン酸化、および約１．５σ以上のＴ２０５におけるタウリン酸化、または
（ｉｉｉ）１．５σを下回るＴ１８１におけるタウリン酸化および／もしくは約１．５σ以上であるＴ２１７におけるタウリン酸化
を含有し、σは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団中で測定された残基におけるタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である、方法。

【請求項50】

前記タウリン酸化が質量分析により測定される、請求項１から４９のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、その開示が参照により本明細書に組み込まれている、２０１９年９月１０日に出願された米国仮出願第６２／８９８，４０７号の優先権を主張するものである。

【0002】

政府支援
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈより授与されたＮＳ０９５７７３の下で政府の資金提供を受けて行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。

【0003】

配列表の参照
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出された配列表を含有し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２０年９月１０日に生成されたＡＳＣＩＩコピーは、６６５４４１＿ＳＴ２５．ｔｘｔと名付けられ、サイズは２４ＫＢバイトである。

【背景技術】

【0004】

微小管関連タンパク質タウ（ＭＡＰＴまたはタウ）は、ニューロンの形態学および生理学に必須の役割を果たす。タウは、６つの異なる全長タンパク質のアイソフォームを有し、アセチル化、グリコシル化およびリン酸化を含む多数の潜在的翻訳後修飾を受ける。リン酸化は軸索の安定化におけるタウの正常機能を制御するために重要であり、８０を超える異なる残基で起こり得る。しかし、過剰なタウのリン酸化は、タウが凝集し、主に高リン酸化型タウから構成される細胞内の不溶性の対らせん状細線維（ＰＨＦ）および神経原線維変化（ＮＦＴ）となる可能性を増大させるようである。

【0005】

タウは、アルツハイマー病（ＡＤ）タングルや神経突起の病態の主要な構成要素である。総タウ（ｔ－タウ）および一部のリン酸化タウ（ｐ－タウ）のアイソフォームレベルは、ＡＤ ＣＳＦにおいて有意に増大する。しかし、血漿タウとＣＳＦタウレベルとの間の相関が良好でないことは、血漿タウをＡＤのためのバイオマーカーとして開発することにおける課題であった。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

したがって、当該技術分野において、血液試料中のタウリン酸化を定量するための改善された方法についての必要性が、依然として存在する。

【課題を解決するための手段】

【0007】

一態様では、本開示は、対象を、アルツハイマー病（ＡＤ）に起因する軽度認知障害（ＭＣＩ）への転換についての増大したリスクを有すると診断するための方法を包含する。方法は、（ａ）対象から得た単離されたタウ試料を用意すること、ならびに単離されたタウ試料中でＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基におけるタウリン酸化を測定すること、ならびに適宜総タウを測定することと、（ｂ）測定されたリン酸化レベルが、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団における平均から有意に逸脱する場合に、対象をＡＤに起因するＭＣＩへの転換の増大したリスクを有すると診断すること、を含む。Ｔ１８１、Ｔ２０５および／またはＴ２１７におけるタウリン酸化の測定を使用する代わりに、またはそれに加えて、適宜総タウの測定を用いて、測定されたリン酸化レベルから算出された比、または測定されたリン酸化レベルおよび総タウから算出された比を使用してもよい。測定されたリン酸化レベルから算出された比は、ｐ－Ｔ１８１とｐ－Ｔ２０５との間、ｐ－Ｔ２１７とｐ－Ｔ２０５との間、またはｐ－Ｔ１８１とｐ－Ｔ２１７との間の比であってもよい。測定されたリン酸化レベルおよび総タウから算出された比は、ｐ－Ｔ１８１と総タウとの間、ｐ－Ｔ２０５と総タウとの間、またはｐ－Ｔ２１７と総タウとの間の比であってもよい。比以外の数学演算も使用してもよい。

【0008】

別の態様では、本開示は、アルツハイマー病（ＡＤ）に起因する軽度認知障害（ＭＣＩ）の発症前に対象をステージ分類するための方法を包含する。方法は、（ａ）対象から得た単離されたタウ試料を用意すること、ならびに単離されたタウ試料中でＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基におけるタウリン酸化を測定すること、ならびに適宜総タウを測定することと、（ｂ）測定されたリン酸化レベルが、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団における平均から有意に逸脱する場合に、対象をＡＤに起因するＭＣＩの発症まで数年であると診断すること、を含む。Ｔ１８１、Ｔ２０５および／またはＴ２１７におけるタウリン酸化の測定を使用する代わりに、またはそれに加えて、適宜総タウの測定を用いて、測定されたリン酸化レベルから算出された比、または測定されたリン酸化レベルおよび総タウから算出された比を使用してもよい。測定されたリン酸化レベルから算出された比は、ｐ－Ｔ１８１とｐ－Ｔ２０５との間、ｐ－Ｔ２１７とｐ－Ｔ２０５との間、またはｐ－Ｔ１８１とｐ－Ｔ２１７との間の比であってもよい。測定されたリン酸化レベルおよび総タウから算出された比は、ｐ－Ｔ１８１と総タウとの間、ｐ－Ｔ２０５と総タウとの間、またはｐ－Ｔ２１７と総タウとの間の比であってもよい。比以外の数学演算も使用してもよい。

【0009】

別の態様では、本開示は、アルツハイマー病（ＡＤ）症状の発症後に対象をステージ分類するための方法を包含する。方法は、（ａ）対象から得た単離されたタウ試料を用意すること、ならびに単離されたタウ試料中でＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基におけるタウリン酸化を測定すること、ならびに適宜総タウを測定することと、（ｂ）測定されたリン酸化レベルが、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団における平均から有意に逸脱する場合に、対象をＡＤに起因するＭＣＩの発症後数年であると診断すること、を含む。Ｔ１８１、Ｔ２０５および／またはＴ２１７におけるタウリン酸化の測定を使用する代わりに、またはそれに加えて、適宜総タウの測定を用いて、測定されたリン酸化レベルから算出された比、または測定されたリン酸化レベルおよび総タウから算出された比を使用してもよい。測定されたリン酸化レベルから算出された比は、ｐ－Ｔ１８１とｐ－Ｔ２０５との間、ｐ－Ｔ２１７とｐ－Ｔ２０５との間、またはｐ－Ｔ１８１とｐ－Ｔ２１７との間の比であってもよい。測定されたリン酸化レベルおよび総タウから算出された比は、ｐ－Ｔ１８１と総タウとの間、ｐ－Ｔ２０５と総タウとの間、またはｐ－Ｔ２１７と総タウとの間の比であってもよい。比以外の数学演算も使用してもよい。

【0010】

別の態様では、本開示は、それを必要とする対象を処置するための方法を包含する。方法は、（ａ）対象から得た単離されたタウ試料を用意すること、ならびに単離されたタウ試料中でＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基におけるタウリン酸化を測定すること、ならびに適宜総タウを測定することと、（ｂ）測定されたリン酸化レベルが、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団における平均から有意に逸脱する場合に、対象に医薬組成物を投与すること、を含む。Ｔ１８１、Ｔ２０５および／またはＴ２１７におけるタウリン酸化の測定を使用する代わりに、またはそれに加えて、適宜総タウの測定を用いて、測定されたリン酸化レベルから算出された比、または測定されたリン酸化レベルおよび総タウから算出された比を使用してもよい。測定されたリン酸化レベルから算出された比は、ｐ－Ｔ１８１とｐ－Ｔ２０５との間、ｐ－Ｔ２１７とｐ－Ｔ２０５との間、またはｐ－Ｔ１８１とｐ－Ｔ２１７との間の比であってもよい。測定されたリン酸化レベルおよび総タウから算出された比は、ｐ－Ｔ１８１と総タウとの間、ｐ－Ｔ２０５と総タウとの間、またはｐ－Ｔ２１７と総タウとの間の比であってもよい。比以外の数学演算も使用してもよい。

【0011】

別の態様では、本開示は、対象を臨床試験に登録するための方法を包含する。方法は、（ａ）対象から得た単離されたタウ試料を用意すること、ならびに単離されたタウ試料中でＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基におけるタウリン酸化を測定すること、ならびに適宜総タウを測定することと、（ｂ）測定されたリン酸化レベルが、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団における平均から有意に逸脱する場合に、対象を臨床試験に登録すること、を含む。Ｔ１８１、Ｔ２０５および／またはＴ２１７におけるタウリン酸化の測定を使用する代わりに、またはそれに加えて、適宜総タウの測定を用いて、測定されたリン酸化レベルから算出された比、または測定されたリン酸化レベルおよび総タウから算出された比を使用してもよい。測定されたリン酸化レベルから算出された比は、ｐ－Ｔ１８１とｐ－Ｔ２０５との間、ｐ－Ｔ２１７とｐ－Ｔ２０５との間、またはｐ－Ｔ１８１とｐ－Ｔ２１７との間の比であってもよい。測定されたリン酸化レベルおよび総タウから算出された比は、ｐ－Ｔ１８１と総タウとの間、ｐ－Ｔ２０５と総タウとの間、またはｐ－Ｔ２１７と総タウとの間の比であってもよい。比以外の数学演算も使用してもよい。

【0012】

本発明の他の態様および反復を、以下により十分に説明する。

【0013】

出願ファイルは、少なくとも１つのカラーで作成された写真を含有する。カラー写真を有するこの特許出願公開のコピーは、要求および必要な料金の支払いに応じて事務局が提供することとなる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】図１は、最長のヒトタウアイソフォーム（２Ｎ４Ｒ）およびタウ抗体のエピトープの概略図である。Ｎ末端、ｍｉｄドメイン、ＭＴＢＲおよびＣ末端が、このアイソフォームについて同定され、他のタウアイソフォーム（例えば２Ｎ３Ｒ、１ＮＲ４、１Ｎ３Ｒ、０Ｎ４Ｒおよび０Ｎ３Ｒ）については予測可能な形で変動するであろう。

【0015】

【図2】図２は、並列反応モニタリング実験の原理を示す概略図である。

【0016】

【図3】図３は、１０３～１２６（０Ｎアイソフォーム）における一リン酸化タウ配列のＰＲＭスクリーニングからのデータを示す。非修飾ペプチド１０３～１２６の近くで溶出され、Ｔ１１１（ａ）、Ｓ１１３（ｂ）またはＴ１２３（ｃ）におけるリン酸化が予測されるフラグメント系列を含有する、独自のＬＣ－ＭＳ／ＭＳパターンが同定された。各ｐ－タウペプチドからの仮定のｙイオンフラグメントには、配列上に下線を引いた。３つの推定上の一リン酸化ペプチドの潜在的な共溶出がデコンボリューションされた。ホスフェートを有しないイオンフラグメントｙ１５は、残基Ｔ１１１上でリン酸化されたペプチド（ｙ１５（ａ））に特異的であり、ホスフェートを有するｙ８フラグメントは、残基Ｔ１２３上のｐ－タウペプチド（ｙ８（ｃ））に特異的である。対応する抽出物イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）が、検出限界を超える低い存在量で検出され、２つの対応する一リン酸化タウペプチドの同定を支持する。対照的に、ｐＴ１１１およびｐＳ１１３により共有されるホスフェートを有するｙ１５フラグメント（ｙ１５（ａ＋ｂ））、ならびにｐＳ１１３およびｐＴ１２３により共有されるホスフェートを有しないｙ８フラグメント（ｙ８（ｂ＋ｃ））は、はるかにより豊富であった。これらのシグナルの差は、主なパターンの種（ｓｐｅｃｉｅ）としての残基Ｓ１１３（ｂ）で一リン酸化されたタウペプチドの存在を支持する。各クロマトグラムについて、ｘ軸は保持時間（分）であり、ｙ軸は強度である。

【0017】

【図4】図４は、６つの潜在的なリン酸化部位を含有する一リン酸化タウ配列６８～１２６（１Ｎアイソフォーム）のＰＲＭスクリーニングからのデータを示す。３つのリン酸化部位は、図３（ｄ～ｆ）に説明されるような残基１０３～１２６を含有するペプチドにより共有される。６つのＬＣ－ＭＳパターンが同定された。ｐＳ６８（ａ）またはｐＴ６９（ｂ）により共有されるホスフェートを有するＹ２８フラグメントは、２つのＬＣ－ＭＳパターン４および５において見出される。これは、２つのリン酸化ペプチドの存在を示すが、対応するＬＣ－ＭＳパターンは、ｐＳ６８およびｐＴ６９を区別するためのイオンフラグメントｙ２９の検出なしに、厳密に割り当てることができない。ｐＴ７１（ｃ）およびｐＴ１１１（ｄ）に対応する特異的フラグメントが、ＬＣ－ＭＳパターン６および１でそれぞれ見出される。ｐＳ１１３（ｅ）およびｐＴ１２３（ｆ）についての特異的フラグメント（ホスフェートを有するｙ１５）が、ＬＣ－ＭＳパターン２で見出される。このパターンは、ホスフェートを有するおよび有しない両方のｙ１０フラグメントを含有し、これらの２つのリン酸化ペプチドの共溶出を示唆する。ホスフェートを有しないｙ１０は、ホスフェートを有するｙ１０と比較してメジャーなシグナルを有するため、ｐＴ１２３の程度は、ｐＳ１１３よりも低いようである。ＬＣ－ＭＳパターン３は、非リン酸化ペプチドに見出されるように、パターン４からのリン酸化ペプチドのマイナーな配座異性体またはＬＣアーティファクトに起因するものである。各クロマトグラムについて、ｘ軸は保持時間（分）であり、ｙ軸は強度である。

【0018】

【図5】図５は、一リン酸化タウ配列４５～６７（１Ｎおよび２Ｎアイソフォーム）のＰＲＭスクリーニングからのデータを示す。配座異性体からの強力なシグナルが、非リン酸化ペプチドＬＣ－ＭＳパターンの前に同定された。よって、リン酸化ペプチドについての対応するＬＣ－ＭＳパターンは、ＬＣにより分離可能な配座異性体も有するであろうことが予測された。実際、ＰＲＭスキャン判読により、この配列（パターン２）上の主なリン酸化部位としてｐＴ５０（ｂ）が検出された。類似したフラグメント化フィンガープリントを有するパターン１は、ｐＴ５０の配座異性体に起因した。シグナルをｐＴ５０（ｂ）から区別することが可能なｐＳ４６（ａ）は検出されず、このリン酸化が存在しないか、または低度であり、類似の非特異的フラグメントを共有する他のリン酸化ペプチドと共溶出したであろうことを示唆する。ＬＣ－ＭＳパターン３におけるホスフェートを有しないｙ９、ｙ１５およびホスフェートを有するｙ１７中の共溶出は、残基Ｔ５２（ｃ）のリン酸化を同定した。パターン４／６および５／７は、それぞれ配座異性体として対となった。よって、２つのリン酸化ペプチドは分離することができなかった。これらのパターンにおいて見出されるフラグメントは、Ｓ６１（ｅ）、Ｔ６３（ｆ）およびＳ６４（ｇ）残基のうちの１つのリン酸化と一致した。ＭＳ／ＭＳ強度は、部位を同定するのに不十分であったが、これらの３つの部位のうち少なくとも２つは、この配列上でリン酸化されたようであった。加えて、ホスフェートを有しないマイナーなｙ９フラグメントはパターン７の肩部で見出され、これは残基Ｓ５６（ｄ）におけるマイナーなリン酸化に起因するであろう。各クロマトグラムについて、ｘ軸は保持時間（分）であり、ｙ軸は強度である。

【0019】

【図6】図６は、一リン酸化タウ配列８８～１２６（２Ｎアイソフォーム）のＰＲＭスクリーニングからのデータを示す。６つの潜在的なリン酸化部位はこの配列中に位置し、６つのＬＣ－ＭＳパターンが同定された。パターン１および２において見出されたフラグメントは、それぞれ、残基Ｔ１１１（ｄ）およびＳ１１３（ｅ）におけるリン酸化ペプチドと一致した。残基Ｔ１２３（ｆ）におけるリン酸化ペプチドからの特異的フラグメントは見出されなかった。パターン４および６は、残基Ｔ１０１（ｂ）またはＴ１０２（ｃ）上のリン酸化と合致するｙ２９フラグメントの低いシグナルを含有したが、これらを区別することが可能な特異的フラグメントは検出されなかった。パターン３および５は、パターン４および６において見出されたフラグメントを共有したが、存在量が低く、Ｎ末端における残基Ｇ１０９上のリン酸化残基に位置する。これは、おそらくは残基Ｔ９５（ａ）におけるさらなるリン酸化ペプチド、またはパターン４および６において見出されたペプチドからの配座異性体の存在を示す可能性がある。各クロマトグラムについて、ｘ軸は保持時間（分）であり、ｙ軸は強度である。

【0020】

【図7】図７は、４つの潜在的なリン酸化部位を含有する、一リン酸化タウ配列６８～８７のＰＲＭスキャンを示す。３つのＬＣ－ＭＳパターンが検出された。パターン２および３は、残基Ｓ６８（ａ）またはＴ６９（ｂ）におけるリン酸化と一致した。パターン１は、Ｔ７１（ｃ）およびＴ７６（ｄ）における２つの共溶出したリン酸化ペプチドの存在と適合する両方のフラグメントを含有した。パターン１におけるホスフェートを有するおよび有しないｙ１４ ＸＩＣの比較は、ｐＴ７１（ｃ）がｐＴ７６（ｄ）よりも豊富であることを示す。各クロマトグラムについて、ｘ軸は保持時間（分）であり、ｙ軸は強度である。

【0021】

【図8-1】図８Ａ、８Ｂ、８Ｃ、８Ｄ、８Ｅ、８Ｆ、８Ｇ、８Ｈ、８Ｉ、８Ｊ、８Ｋ、８Ｌは、脳のｐ－タウタンパク質のｍｉｄドメインおよびＣ末端におけるリン酸化部位の検出を示す。各クロマトグラムについて、ｘ軸は保持時間（分）であり、ｙ軸は強度である。

【図8-2】同上。

【図8-3】同上。

【図8-4】同上。

【図8-5】同上。

【図8-6】同上。

【図8-7】同上。

【図8-8】同上。

【図8-9】同上。

【図8-10】同上。

【図8-11】同上。

【図8-12】同上。

【0022】

【図9-1】図９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｄ、８９Ｅ、９Ｆは、タウ配列１９５～２０９（配列番号３８）および２１２～２２１（配列番号６４）からのリン酸化ペプチドプロファイルが、可溶性の脳画分、正常なＣＳＦおよびＡＤ ＣＳＦタウタンパク質の間で可変的であることを示す。脳の可溶性タウ抽出物は、対応するＣＳＦタウレベルとほぼ合致するように、示されるように希釈される。１９５～２０９上のリン酸化ペプチド：脳可溶化液中、２つのリン酸化ペプチドｐＳ１９９およびｐＳ２０２の共溶出に対応する１つのシグナルが観察される。ＣＳＦ中、２つのさらなるシグナルが観察される。フラグメント分析により、左のシグナルをｐＴ２０５へ割り当てることが可能となった。ＡＤ ＣＳＦ中、２つのシグナルが増大し、右のシグナルをｐＳ２０８に割り当てる特異的フラグメントの同定が可能となる。２１２～２２１上のリン酸化ペプチド：類似したＭＳ強度を有する、ｐＴ２１７およびｐＳ２１４に対応する２つのシグナルが、脳可溶化液中で同定される。ＣＳＦ中、ｐＴ２１７に対応するシグナルは最も強く、一方でｐＳ２１４は検出限界に近く、脳抽出物と比較したこれらの相対的な存在量の劇的な変化を示す。ＡＤ ＣＳＦ中、特定の高リン酸化に起因して、ｐＴ２１７は有意に増大する。各クロマトグラムについて、ｘ軸は保持時間（分）であり、ｙ軸は強度である。

【図9-2】同上。

【図9-3】同上。

【図9-4】同上。

【図9-5】同上。

【図9-6】同上。

【0023】

【図10-1】図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｅ、１０Ｆ、１０Ｇ、１０Ｈ、１０Ｉは、ＣＳＦ中で同定されたｐＴ１５３、ｐＴ１７５およびｐＴ２３１リン酸化ペプチドを示す。ＡＱＵＡ内部標準シグナルは、ｐＴ１７５およびｐＴ２３１について示される。ｐＴ１５３のフラグメント化パターンは、非修飾に類似する。各クロマトグラムについて、ｘ軸は保持時間（分）であり、ｙ軸は強度である。

【図10-2】同上。

【図10-3】同上。

【図10-4】同上。

【図10-5】同上。

【0024】

【図11】図１１は、Ｓ１１３リン酸化に対して、Ｔ１１１上のリン酸化存在量が、脳よりもＣＳＦ中で高いことを示す。脳およびＣＳＦの両方で、タウ配列１０３～１２６のすべての一リン酸化ペプチドに一般的なＭＳ／ＭＳフラグメントｙ１８が検出される。ｐＳ１１３（ｂ）からのｙ１５フラグメントの相対的な存在量は、脳抽出物と比較してＣＳＦ中で有意により低い。逆に、ｐＴ１１１（ａ）からのｙ１５フラグメントは、ＣＳＦ中で豊富であり、ＡＤ ＣＳＦタウレベルに合致するように希釈された脳可溶性抽出物中では検出不可能である。各クロマトグラムについて、ｘ軸は保持時間（分）であり、ｙ軸は強度である。

【0025】

【図12】図１２は、生物学的抽出物に依存し、タンパク質配列にわたり変動する、タウリン酸化の相対的な存在量を示す。ＨＪ８．５およびＴａｕ１を使用してイムノキャプチャーにより抽出された正常な脳可溶化液、正常なＣＳＦおよびＡＤ ＣＳＦ中でＭＳにより測定された、タウリン酸化存在量の比較。円形の領域は、部位のリン酸化存在量に比例する。赤色および緑色は、それぞれ、参照として採取された脳可溶物プロファイル（青）と比較した増大および低減を示す。タウはＣＳＦ中、Ｃ末端で短縮化され、これはリン酸化部位のＣ末端クラスターの検出がないことを説明する。Ｔ２０５およびＳ２０８上のリン酸化は、ＣＳＦに特異的である（脳可溶物上の赤のＸ－上部）。

【0026】

【図13】図１３は、タウリン酸化部位が、脳、正常なＣＳＦおよびＡＤ ＣＳＦにおいて異なって修飾されることを示す。測定は、対応する非リン酸化部位と比較したリン酸化シグナルの相対的な存在量である（ＨＪ８．５＋Ｔａｕ１ ＩＰ－ＭＳ）。脳の結果は、ＣＳＦタウレベルに合致するように５００×～８０００×の係数で希釈された可溶化液から得られる。Ｔ２０５およびＳ２０８上のリン酸化は、脳組織中で検出不可能である。Ｔ１１１上のリン酸化は５００×希釈可溶化液中で検出不可能であるが、１０×希釈可溶化液中で０．０２％の対応する存在量で検出された。説明文：^＊＊はｐ＝０．０１レベルにおける有意性を示し、^＊はｐ＝０．０５レベルにおける有意性を示す。

【0027】

【図14-1】図１４Ａ、１４Ｂ、１４Ｃ、１４Ｄは、ＩＰ－ＭＳによるリン酸化比測定に対する抗体の効果を示す。脳可溶化液プール、非ＡＤ（ｎ＝１）およびＡＤ ＣＳＦ（ｎ＝１）プールを、タウＮ末端プロジェクションドメインに対する抗体（Ｔａｕ１３またはＨＪ８．５）およびｍｉｄドメインに対する抗体（ＨＪ８．７、Ｔａｕ１またはＴａｕ５）を用いて、並行して免疫沈降した。主なＣＳＦ部位で測定されたリン酸化比のレーダープロット（ｌｏｇ_１０スケール）を、脳可溶化液（図１４Ａ、左パネル）、非ＡＤ ＣＳＦ（図１４Ａ、中央パネル）およびＡＤ ＣＳＦ（図１４Ａ、右パネル）において示す。（図１４Ａ）ｐＴ１８１／Ｔ１８１、ｐＴ２３１／Ｔ２３１に対するタウリン酸化比測定は、試験した抗体すべてで一致する。他の抗体と比較して、Ｔａｕ１またはＴａｕ１＋ＨＪ８．５を使用することにより、ＰＳ１９９／Ｓ１９９は低減する。（図１４Ｂ）Ｔａｕ１またはＴａｕ１＋ＨＪ８．５ ＩＰによるｐＳ１９９の低い回収率により、試験した他の抗体と比較して、ｐＳ１９９／Ｓ１９９比測定が過小評価される。Ｔａｕ１３、ＨＪ８．５およびＨＪ８．７抗体は、脳とＣＳＦとの間のｐＳ１９９リン酸化比の有意な変化を示さない。脳と比較して、ｐＳ２０２／Ｓ２０２ ＣＳＦ高リン酸化（図１４Ｃ）およびｐＴ２１７／ｐＴ２１７高リン酸化（図１４Ｄ）は、ＩＰ－ＭＳに使用される抗体とは無関係に独立して証明される。図１４Ｂ～Ｄについての説明は同様であり、図１４Ｃに示す－脳（青）、非ＡＤ ＣＳＦ（緑）およびＡＤ ＣＳＦ（赤）。

【図14-2】同上。

【図14-3】同上。

【0028】

【図15】図１５は、ＣＳＦインキュベーションがタウに対するリン酸化率測定に影響を与えないことを示す。

【0029】

【図16-1】図１６Ａ、図１６Ｂ、図１６Ｃ、図１６Ｄ、図１６Ｅ、図１６Ｆおよび図１６Ｇは、タウ高リン酸化と強く相関しているが、リン酸化の部位により異なるアミロイドプラークを示す。図１６Ａ 参加者をＡβ ＰｉＢ－ＰＥＴ（１．２５のＳＵＶＲカットオフ）に基づいてＡβ病変を有すると分類する際における、総タウ（青色線、ＡＵＣ＝０．６２）、および部位特異的リン酸化比に対する受信者動作の特徴であり、ｐ－Ｔ２１７（黄色線）は、Ａβ病変とのほぼ完全な関連性（ＡＵＣ＝０．９７）を実証し、ｐ－Ｔ１８１（ＡＵＣ＝０．８９）およびｐ－Ｔ２０５（ＡＵＣ＝０．７４）がそれに続く。標準化された（ｚ－スコア）リン酸化比は、Ａβ ＰｉＢ－ＰＥＴレベルが増加したリン酸化の部位特異的な差を強調する突然変異保持者（ｍｕｔａｔｉｏｎ ｃａｒｒｉｅｒ）のＡβ ＰｉＢ－ＰＥＴ四分位（ｎ＝４５、４７、２８、３０）により、ｐ－Ｔ２１７（図１６Ｂ）、ｐ－Ｔ１８１（図１６Ｃ）、ｐ－Ｓ２０２（図１６Ｄ）、ｐ－Ｔ２０５（図１６Ｅ）および総タウ（図１６Ｆ）レベルについて示されており、ｐ－Ｔ２１７およびｐ－Ｔ１８１は、Ａβ ＰｉＢ－ＰＥＴ量の最初の増加と共に最大に増加し、Ａβ ＰｉＢ－ＰＥＴの最高レベルと共に遅くなる一方、ｐ－Ｔ２０５および総タウは、継続した増加を実証する。ｐ－Ｓ２０２では、最高Ａβ ＰｉＢ－ＰＥＴ四分位で、最低のものと比べて、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ二標本検定（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ ｔｗｏ ｓａｍｐｌｅ ｔｅｓｔ）に基づきリン酸化の有意な低下；^＊＊＊ － ｐ－値＜０．００１、^＊＊ － ｐ－値＜０．０１が認められ、中心線は、中央値、ならびに上方および下方ノッチ＝中央値＋／－１．５８^＊四分位範囲／平方根（ｎ－観測値（ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ））、上方および下方ウィスカー＝上方／下方ヒンジ＋１．５８^＊ＩＱＲ以上／以下の最大観測値を表す。図１６Ｇ 無症状突然変異保持者（ｎ＝１３９）での、皮質および皮質下のＡβ ＰｉＢ－ＰＥＴ ＳＵＶＲと部位特異的リン酸化との間の二変量相関（Ｂｉｖａｒｉａｔｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｏｒｔｉｃａｌ ａｎｄ ｓｕｂ－ｃｏｒｔｉｃａｌ Ａβ ＰｉＢ－ＰＥＴ ＳＵＶＲ ａｎｄ ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）。色は、正の相関（黄色～赤色）および負の相関（青色）との相関を表し、すべての相関は、偽発見率（ｐ＜０．０５）を乗り越え統計的に有意な値を表し、相関の強さによって上から順に配置される。

【図16-2】同上。

【図16-3】同上。

【図16-4】同上。

【0030】

【図17-1】図１７Ａ、図１７Ｂ、図１７Ｃ、図１７Ｄ、図１７Ｅおよび図１７Ｆは、異なるリン酸化タウ部位の長期的な変化が、疾患特異的なステージおよびＡＤ進行と反対方向の変化であることを示す。症状発症までの推定年数（ＥＹＯ）にわたる、突然変異保持者［黒色＝無症状突然変異保持者（ｎ＝１５２）、赤色＝有症状突然変異保持者（７７）］および非保持者［青色（ｎ＝１４１）］での、（図１７Ａ）ｐ－Ｔ２１７、（図１７Ｂ）ｐ－Ｔ１８１、（図１７Ｃ）総タウ、（図１７Ｄ）ｐ－Ｔ２０５および（図１７Ｅ）ｐ－Ｓ２０２のリン酸化の比における個別のｚ－変換した長期的な変化。垂直破線は、予想される症状発症点であり、緑色線は、突然変異保持者で、非保持者と比較して各ｐ－タウアイソフォームの変化率が大きくなるモデル推定時間を表す。（図１７Ｆ）非保持者の率に標準化され、アミロイドＰＥＴ（赤色）および認知低下（黄色）を伴うＥＹＯにわたりプロットされた、リン酸化の各部位での、モデル推定長期的変化率。黒丸は、突然変異保持者での各変数の変化率が、非保持者と比較して最初に異なる時点を表す。これは、ＡＤスペクトルの間のｐ－タウアイソフォームの変化パターン、および、アミロイドプラークの成長とｐ－Ｔ２１７における増加との間の密接な関連を強調し、プラークは、－２１ＥＹＯで増加し始め、ｐ－Ｔ２１７（黒色）の高リン酸化は、－２１ＥＹＯで始まり、これらの２つの部位のリン酸化率低下は、認知の低下（黄色線）を伴う。対照的に、ｐ－Ｔ２０５（紫色）は、疾患進行を通じて増加し続け、総タウレベル（灰色）は、症状発症時付近において増加した速度で上昇する。

【図17-2】同上。

【図17-3】同上。

【0031】

【図18-1】図１８Ａおよび図１８Ｂは、リン酸化タウ部位が脳の代謝低下および萎縮に示差的に関連することを示す。図１８Ａ．無症状の突然変異保持者（ｎ＝１５２）における、皮質および皮質下の萎縮と部位特異的リン酸化比との間の二変量相関は、ｐ－Ｔ２０５およびｐ－Ｔ２１７のリン酸化の増加を実証し、ｐ－Ｔ１８１での関連はより少ない。総タウレベルは、複数の皮質および皮質下領域におけるより大幅な萎縮に関連する。図１８Ｂ．無症状の突然変異保持者（ｎ＝１４３）における、ＦＤＧ－ＰＥＴにより測定される皮質および皮質下の脳代謝と部位特異的リン酸化比との間の二変量相関は、ｐ－Ｔ２０５のリン酸化の増加を実証し、この増加は大半の皮質および皮質下領域における減少に関連するが、他のｐ－タウ部位またはタウでは関連しない。

【図18-2】同上。

【0032】

【図19-1】図１９Ａ、図１９Ｂ、図１９Ｃおよび図１９Ｄは、ｐ－Ｔ２１７、ｐ－Ｔ１８１およびｐ－Ｔ２０５におけるリン酸化の減少が認知症および認知低下に関連することを示す。突然変異保持者での、ｐ－タウアイソフォームおよび総タウの個別の推定年次変化率（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｅｓｔｉｍａｔｅｄ ａｎｎｕａｌｉｚｅｄ ｒａｔｅｓ ｏｆ ｃｈａｎｇｅ）（ｙ－軸）は、全般的な認知機能における年次変化と相関しており、線は、単純線形回帰を表し、斜線部分は、９５％信頼区間を表す。各点は、測定間の個別レベルの相関を表す。線形回帰は、認知症がないもの（黒色、ｎ＝４７）および認知症のもの（赤、ｎ＝２５）に当てはめた。ｐ－Ｔ２１７（図１９Ａ）、ｒ＝０．４３（ｐ＝０．０２）、ｐ－Ｔ１８１（図１９Ｂ）、ｒ＝０．７２（ｐ＜．００１）およびｐ－Ｔ２０５（図１９Ｃ）、ｒ＝０．４１（ｐ＝０．０３）におけるリン酸化率の低下は、症状発症後の認知低下（赤色）に関連していた。総タウでは、認知との逆相関を示唆する傾向が認められた（図１９Ｄ）が、これは有意ではなかった。

【図19-2】同上。

【0033】

【図20】図２０は、ＤＩＡＤ突然変異保持者における、タウＰＥＴが症状発症近辺で増加することを示す。タウ－ＰＥＴ時間に先行して長期的なＣＳＦ評価を行った参加者での、症状発症までの推定年数（ＥＹＯ）、ｘ－軸にわたる、突然変異保持者（赤色、ｎ＝１２）および非保持者（青色、ｎ＝９）での平均の皮質標準化単位値比（ＳＵＶＲ）、ｙ－軸。プロットは、突然変異保持者では、推定症状発症点（ＥＹＯ＝０）までに、タウ－ＰＥＴにおける上昇はほとんど認めらなかったことを示す。この図は、ＡＶ－１４５１により検出される神経原線維変化（ＮＦＴ）病変が、複数の可溶性ホスホタウ部位における増加よりはるかに後で発生することを示し、これにより、これらのタウの可溶性マーカーは、ＮＦＴ病変のマーカーである可能性があるが、むしろＡＤ病変の特徴である高リン酸化不溶性タウ沈着の発症の素因になり得ることが示唆される。

【0034】

【図21-1】図２１Ａ、図２１Ｂ、図２１Ｃ、図２１Ｄおよび図２１Ｅは、タウおよびタウリン酸化部位における長期的変化が優性遺伝ＡＤにおける神経原線維のタウ（タウ－ＰＥＴ）に示差的に関連することを示す。タウ－ＰＥＴスキャン（ｘ－軸）の時間までに達するリン酸化および総タウの個別推定変化率（ｙ－軸）。垂直線は、１．２２のＳＵＶＲであり、ＮＦＴタウ－ＰＥＴ（複数の皮質および辺縁領域の複合）が、非保持者と比較して増加したと考えられる時点の控えめな推定（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｅｓｔｉｍａｔｅ）を表す。可溶性タウおよびｐ－Ｔ２０５の増加を示唆するプロットは、より高いレベルの凝集タウに関連する一方、ｐ－Ｔ２１７およびｐ－Ｔ１８１におけるリン酸化率は、凝集タウレベルが上昇するにつれて低下する。これらの知見から、タウレベルの上昇と異なる部位でのリン酸化との間に差が認められることが示唆され、いくつかの例では、可溶性ｐ－タウは、タウ病変の拡大と共に高リン酸化凝集物の負担（ｂｕｒｄｅｎ）が増加するにつれ、隔絶されることを示し得る。これらは、凝集タウにおける増加と共に、凝集タウ病変の負担がより大きい受動的または能動的放出を表し得る可溶性タウレベルにおける上昇が認められることも示唆する。

【図21-2】同上。

【図21-3】同上。

【0035】

【図22】図２２は、タウ病変が、アルツハイマー病において、別個のフェーズを通して発展することを示す例証である。決定的なアルツハイマー病突然変異を有する参加者群において、４種の異なる可溶性タウ種および不溶性タウを測定し、発明者らは、３５年間（ｘ－軸）にわたってタウ関連変化が展開し（ｙ－軸）、疾患のステージおよび他の測定可能なバイオマーカーに基づいて異なることを示す。Ａ．２１７位（紫色）および１８１位（青色）において、原繊維性アミロイド病変のリン酸化の発生でスタートし、増加し始める。Ｂ．神経細胞（ｎｅｕｒｏｎａｌ）機能不全（代謝変化に基づく）の増加と共に、可溶性タウ（橙色）と一緒に２０５位（緑色）でのリン酸化が増加し始める。Ｃ．最後に、神経変性（脳萎縮および認知低下に基づく）の発症と共に、タウＰＥＴタングル（赤色）が発生し始める一方、２１７および１８１のリン酸化が減少し始める。まとめると、これは、疾患の間の、可溶性および凝集タウの動的かつ多岐のパターン、ならびにアミロイド病変との密接な関係を強調する。

【0036】

【図23-1】図２３Ａ、図２３Ｂおよび図２３Ｃは、ＣＳＦ中のリン酸化タウアイソフォームの定量を示す。ＣＳＦ中のタウリン酸化ペプチドおよび対応する未修飾ペプチドの並列反応モニタリング（Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）（ＰＲＭ）分析から抽出されたイオンクロマトグラムの総計。図２３Ａ、ｍｉｃｒｏＬＣシステムを使用したＴ１８１モニタリング。図２３Ｂ、ｎａｎｏＬＣシステムを使用したＳ１９９、Ｓ２０２、Ｔ２０５（枠内シグナルにおける共溶出）およびＴ２１７モニタリング。内在シグナル（青色実線）、１５Ｎ標識ペプチド（赤色点線）、ＡＱＵＡペプチド（緑色点線）。図２３Ｃは、ペプチドフラグメント化のためのＢｉｅｍａｎｎ命名法による特異的ＰＲＭトランジションを示し、これにより、ｐＳ１９９、ｐＳ２０２またはｐＴ２０５を保有する３種の共溶出される一リン酸化ペプチドの同定が可能になった。Ｃｐｓ＝１秒当たりのカウント。

【図23-2】同上。

【図23-3】同上。

【0037】

【図24-1】図２４Ａ、図２４Ｂ、図２４Ｃ、図２４Ｄおよび図２４Ｅは、Ｔ２１７でのＣＳＦタウリン酸化が、アミロイドーシス状態に関連することを示す。図２４Ａ：Ｔ２１７ リン酸化は、アミロイドーシスを有する参加者において（ＰｉＢ－ＰＥＴおよびＣＳＦ Ａβ４２／４０比が陽性）、認知低下がない、または軽度なアミロイド陰性対照と比較して有意に増加する。図２４Ｂ：ＭＳによるＴ２１７、Ｔ１８１、およびＥＬＩＳＡによるＴ１８１のリン酸化率を使用して、アミロイド陰性の参加者からアミロイド陽性を診断するためのＲＯＣ曲線。図２４Ｃ：ｐＴ２１７／Ｔ２１７比の比較から、アミロイドーシスを有する参加者におけるＴ２１７での特異的リン酸化が実証される。図２４Ｄ～Ｅ：Ｔ２１７リン酸化と、ＭＳにより測定されるＣＳＦ Ａβ４２／４０変化、およびＰｉＢ－ＰＥＴにより測定されるアミロイドプラーク沈着との比較。図２４Ｄ：Ｔ２１７高リン酸化の程度は、Ａβ４０に対するＣＳＦ Ａβ４２の減少と相関していない。５件の不一致なケース（橙色三角形、ＰｉＢ－ＰＥＴおよびＴ２１７高リン酸化で陽性だが、ＣＳＦ Ａβで陰性）はすべて、アミロイド状態を定義するように選択された閾値０．１２をわずかに上回り、これにより、これらは、ＣＳＦアミロイドアッセイの不十分な感度に起因し得ることが示唆される。図２４Ｅ：ＰｉＢ－ＰＥＴ負荷（ＦＢＰ全皮質平均）は、アミロイド陽性の参加者におけるＴ２１７リン酸化状態と相関している。ＰｉＢによりアミロイド陽性をアミロイド陰性と区別するカットオフ値は、０．１８である。

【図24-2】同上。

【図24-3】同上。

【0038】

【図25】図２５は、Ｔ２１７でのＣＳＦタウリン酸化が、認知の状態と無関係であり、前臨床ＡＤにおいて有意に修飾されていることを示す。左パネル：Ｔ２１７リン酸化と臨床認知症評価ボックス合計（ＣＤＲ－ＳＢ）により測定される認知プロファイルとの間に相関が存在しない。右パネル：認知低下がない参加者（ＣＤＲ－ＳＢ＝０）のうち、Ｔ２１７は、アミロイド陽性群において、既に有意に高リン酸化されている。

【0039】

【図26-1】図２６Ａおよび図２６Ｂは、化学抽出および免疫精製後の血漿タウ短縮化プロファイルを例証する。図２６Ａは、全コホートからの結果を描写する。図２６Ｂは、コホートからの平均タウプロファイルを描写する。ａ、ｂ、ｃおよびｄと同定された減少は、以下のように記載されている。ａ：２Ｎおよび１Ｎ＋２Ｎのペプチド存在量の減少は、血漿タウにおける５／５／１ ０Ｎ／１Ｎ／２Ｎの寄与と一致する。ｂ：減少は、およそ１０％の１８１位におけるリン酸化の存在と一致する。Ｔ１８１におけるリン酸化は、残基１８０と１８１との間にトリプシン切断欠如を誘導する。これは、Ｔ１８１におけるリン酸化の程度に比例した、１７５～１８０および１８１～１９０のペプチド存在量の減少に寄与する。ｃ：減少は、残基２２１と２２６との間のタウ短縮化と一致する。Ｃｉｇｏｇｎｏｌａ ｅｔ ａｌ．は、ＣＳＦタウが、残基２２４で発生する主要な切断であると報告している。ｄ：減少は、残基２２４から上流領域である微小管結合領域への血漿タウのＣ末端での進行性分解と一致する。

【図26-2】同上。

【0040】

【図27-1】図２７Ａ、図２７Ｂ、図２７Ｃ、図２７Ｄ、図２７Ｅおよび図２７Ｆは、血漿タウおよび血漿リン酸化タウの群間変化を例証するグラフである。図２Ａ７は、血漿およびＣＳＦ中のｐＴ２１７／Ｔ２１７比の測定が、全コホートおよびＣＳＦ ｐＴ２１７陽性サブグループの両方で高度に相関することを示す。Ｓｐｅａｒｍａｎ相関および関連ｐ－値が示されている。ＣＳＦ測定と一致して、血漿ｐＴ２１７／Ｔ２１７比（図２７Ｂ）およびｐＴ２１７レベル（図２７Ｃ）は、認知の状態に関係なく、アミロイド陽性群からアミロイド陰性を識別する。ＣＳＦ ｐＴ２１７が高いアミロイド陰性も、他のアミロイド陰性群から分離した。図２７Ｄは、血漿タウレベルが、アミロイド状態およびＡＤ認知症のバイオマーカーではないことを示す。血漿ｐＴ１８１／Ｔ１８１比（図２７Ｅ）およびｐＴ１８１レベル（図２７Ｆ）は、アミロイド陽性群において上昇するが、異常タウリン酸化を検出するにはｐＴ２１７の測定より正確ではない。群間の分離は、受信者動作曲線下面積（ＡＵＲＯＣ）を使用して計算される。

【図27-2】同上。

【図27-3】同上。

【図27-4】同上。

【図27-5】同上。

【図27-6】同上。

【発明を実施するための形態】

【0041】

中枢神経系中の神経原線維変化中へのタウタンパク質凝集は、アルツハイマー病（ＡＤ）を含むある特定の神経変性障害の病因となる。タウ不安定化の機構はなお完全に理解されていないが、タウタンパク質はタウ凝集体中で高リン酸化されることが判明した。出願人らは、特定のアミノ酸残基におけるタウリン酸化を定量するある特定の方法を、ＡＤの過程を、その前臨床の無症状ステージから症状ステージまでにわたって追跡するために使用することができることを発見した。図２２は、出願人の方法により生成された、ＡＤに起因するＭＣＩの発症までの年数に関する、およびある特定の病態生理の変化の発生に関する、Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７で測定可能なタウリン酸化の動的パターンを例示する。本開示は、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害の発症までの時間を予測するため、処置の決定の指針とするため、対象を臨床試験に選択するため、およびある特定の治療的介入の臨床的有効性を評価するための、特定のアミノ酸残基におけるタウリン酸化を定量するための方法の使用を包含する。本発明の他の態様および反復を、以下により十分に説明する。

【0042】

Ｉ．定義
本発明がより容易に理解されるように、ある特定の用語を最初に定義する。別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明の実施形態が関係する当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書において記載されているものと類似するか、それを修正するか、またはそれと等価な多数の方法および材料を、本発明の実施形態の実践において不必要な実験を伴うことなく使用することができ、好ましい材料および方法は本明細書において記載されている。本発明の実施形態を説明し特許請求するにあたって、下記に記載する定義に従って以下の用語を使用する。

【0043】

「約」という用語は、本明細書において使用される場合、例えば典型的な測定技術および器具を通して発生することのある、限定されるものではないが質量、容量、時間、距離および量を含む任意の定量可能な変数に関する数量の変動を指す。さらに、実際に使用される固体および液体の操作手順を考慮すると、組成物を作製するかまたは方法を実行するため等に使用される成分の製造、供給源または純度の差異を通して起こる可能性のある、一定数の不慮の誤差および変動が存在する。「約」という用語は、最大±５％であり得るが、±４％、３％、２％、１％等でもあり得る、これらの変動も包含する。「約」という用語による修飾の有無を問わず、特許請求の範囲は量についての等価物を含む。

【0044】

本明細書において使用される場合、抗体は、当該技術分野において理解されるような完全な抗体、すなわち２つの重鎖および２つの軽鎖からなるものであり得るか、または抗原結合領域を有し、限定されるものではないが、フラグメント、例えばＦａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗体、Ｆｖおよび一本鎖抗体Ｆｖを含む、任意の抗体様の分子であり得る。抗体という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体も指す。様々な抗体ベースのコンストラクトおよびフラグメントを調製および使用するための技術は、当該技術分野において公知である。抗体を調製および特徴付けるための手段も、当該技術分野において公知である（例えばＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， １９８８を参照されたい、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

【0045】

本明細書において使用される場合、「アプタマー」という用語は、生化学的活性、分子の認識または結合特性に関して有用な生物学的活性を有するポリヌクレオチド、一般的にはＲＮＡまたはＤＮＡを指す。通常、アプタマーは分子活性を有し、例えば特定のエピトープ（領域）における標的分子へ結合する。アプタマーはポリペプチドと結合する点で特異的であり、インビトロ進化法（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）により、合成および／または同定できることが一般的に認められている。アプタマーを調製および特徴付ける手段は、インビトロ進化法を含め、当該技術分野において公知である。例えば、その全体を参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ７，９３９，３１３を参照されたい。

【0046】

「Ａβ」という用語は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）と呼ばれるより大きなタンパク質のカルボキシ末端中の領域に由来するペプチドを指す。ＡＰＰをコードする遺伝子は、第２１染色体に位置する。毒性を有し得る異なる多数の形態のＡβが存在し、Ａβペプチドは典型的に３７～４３アミノ酸配列長であるが、これらは全体のサイズを変化させる短縮化および修飾を有し得る。これらは、可溶性および不溶性の区画中、モノマー、オリゴマーおよび凝集体形態で、細胞内または細胞外で見出すことができ、他のタンパク質または分子と複合体形成し得る。Ａβの有害効果または毒性効果は、上記の形態のいずれかまたはすべて、ならびに具体的に記載されていないその他の点に起因し得る。例えば、２つのそのようなＡβアイソフォームにはＡβ４０およびＡβ４２が挙げられ、Ａβ４２アイソフォームは特に原線維形成的または不溶性であり、疾患状態に関連する。「Ａβ」という用語は、典型的に、個別のＡβ種間の区別なしに、複数のＡβ種を指す。特定のＡβ種は、ペプチドのサイズにより、例えばＡβ４２、Ａβ４０、Ａβ３８等と同定される。

【0047】

本明細書において使用される場合、「Ａβ４２／Ａβ４０値」という用語は、対象から得られた試料中のＡβ４２の濃度の、同じ試料中のＡβ４０の濃度と比較した比を意味する。

【0048】

「Ａβアミロイドーシス」は、脳内のＡβ沈着のエビデンスとして臨床的に定義される。Ａβアミロイドーシスを有すると臨床に決定される対象は、本明細書において「アミロイド陽性」と称され、一方でＡβアミロイドーシスを有しないと臨床的に決定される対象は、本明細書において「アミロイド陰性」と称される。Ａβアミロイドーシスは、現行の技術により検出可能となる前に存在するようである。それでもなお、Ａβアミロイドーシスの承認済みの指標が当該技術分野において存在する。本開示の時点では、Ａβアミロイドーシスは、典型的に、アミロイド画像化（例えばＰｉＢ ＰＥＴ、ｆｌｕｏｒｂｅｔａｐｉｒまたは当該技術分野において公知の他の画像化方法）により、または脳脊髄液（ＣＳＦ）Ａβ４２の低減もしくはＣＳＦ Ａβ４２／４０比の低減により、同定される。平均皮質結合能（ｍｅａｎ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）スコア＞０．１８を有する［^１１Ｃ］ＰＩＢ－ＰＥＴ画像は、Ａβアミロイドーシスの指標であり、免疫沈降および質量分析（ＩＰ／ＭＳ）による約１ｎｇ／ｍｌの脳脊髄液（ＣＳＦ）Ａβ４２濃度も同様である。これらのような、または当該技術分野において公知の他の値は、Ａβアミロイドーシスを臨床的に確認するために、単独でまたは組合せで使用することができる。例えば、各々がその全体を参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｌｕｎｋ Ｗ Ｅ ｅｔ ａｌ． Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ５５（３） ２００４， Ｆａｇａｎ Ａ Ｍ ｅｔ ａｌ． Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ， ２００６， ５９（３）， Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ ｅｔ． ａｌ， Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ， ２０１５， ７８（３）： ４３９－４５３、またはＪｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎｕｃ． Ｍｅｄ．， ２０１３， ５４（７）： １０１１－１０１３を参照されたい。Ａβアミロイドーシスを有する対象は、症候性であることもあればそうでないこともあり、症候性の対象は、Ａβアミロイドーシスに関連する疾患についての臨床基準を満たすこともあれば満たさないこともある。Ａβアミロイドーシスに関連する症状の非限定的な例には、認知機能障害、挙動変化、言語機能異常、情動調節不全、発作、認知症および神経系構造または機能の障害を挙げることができる。Ａβアミロイドーシスに関連する疾患には、限定されるものではないが、アルツハイマー病（ＡＤ）、脳アミロイド血管症、レビー小体型認知症および封入体筋炎が挙げられる。Ａβアミロイドーシスを有する対象は、Ａβアミロイドーシスに関連する疾患を発症する増大したリスクを有する。

【0049】

「Ａβアミロイドーシスの臨床徴候」は、当該技術分野において公知のＡβ沈着の尺度を指す。Ａβアミロイドーシスの臨床徴候には、限定されるものではないが、アミロイド画像化（例えばＰｉＢ ＰＥＴ、ｆｌｕｏｒｂｅｔａｐｉｒまたは当該技術分野において公知の他の画像化方法）により、または脳脊髄液（ＣＳＦ）Ａβ４２もしくはＡβ４２／４０比の低減により同定される、Ａβ沈着を挙げることができる。例えば、各々がその全体を参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｌｕｎｋ ＷＥ ｅｔ ａｌ． Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ５５（３） ２００４、およびＦａｇａｎ ＡＭ ｅｔ ａｌ． Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ５９（３） ２００６を参照されたい。各々がその全体を参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第１４／３６６，８３１号、第１４／５２３，１４８号および第１４／７４７，４５３号に記載されているように、Ａβアミロイドーシスの臨床徴候には、Ａβの代謝の測定、特に、単独での、または他のＡβ突然変異体（例えばＡβ３７、Ａβ３８、Ａβ３９、Ａβ４０および／または総Ａβ）の代謝の測定と比較した、Ａβ４２代謝の測定も挙げることができる。さらなる方法は、各々がその全体を参照により本明細書に組み込まれる、Ａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ． Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ＆ Ｄｅｍｅｎｔｉａ ２００７ Ｖｏｌ． ７， ｐｐ． １７０－１７９； ＭｃＫｈａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ＆ Ｄｅｍｅｎｔｉａ ２００７ Ｖｏｌ． ７， ｐｐ． ２６３－２６９；およびＳｐｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ． Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ＆ Ｄｅｍｅｎｔｉａ ２００７ Ｖｏｌ． ７， ｐｐ． ２８０－２９２に記載されている。重要なことに、Ａβアミロイドーシスの臨床徴候を有する対象は、Ａβ沈着に関連する症状を有することもあれば有しないこともある。また、Ａβアミロイドーシスの臨床徴候を有する対象には、Ａβアミロイドーシスに関連する疾患を発症する増大したリスクがある。

【0050】

「アミロイド画像化の候補」は、臨床医によりアミロイド画像化が臨床的に保証される個体として特定された対象を指す。非限定的な例として、アミロイド画像化の候補は、１つもしくは複数のＡβアミロイドーシスの臨床徴候、１つもしくは複数のＡβプラークに関連する症状、１つもしくは複数のＣＡＡに関連する症状、またはそれらの組合せを有する対象であり得る。非限定的な例として、アミロイド画像化の候補は、Ａβアミロイドーシスについて遺伝的素因を有する対象であり得る。臨床医は、彼らの臨床的ケアを指示するために、そのような対象についてのアミロイド画像化を推奨してもよい。別の非限定的な例として、アミロイド画像化の候補は、Ａβアミロイドーシスに関連する疾患についての臨床試験における潜在的な参加者（対照対象または試験対象のいずれか）であり得る。

【0051】

「Ａβプラークに関連する症状」または「ＣＡＡに関連する症状」は、それぞれ、アミロイド線維と呼ばれる規則的に配列された線維の凝集体から構成されるアミロイドプラークまたはＣＡＡの形成により引き起こされるかまたはそれに関連する、任意の症状を指す。代表的なＡβプラークに関連する症状には、限定されるものではないが、ニューロン変性、認知機能障害、記憶障害、挙動変化、情動調節不全、発作、神経系構造または機能の障害、およびアルツハイマー病またはＣＡＡの発症または悪化の増大したリスクを挙げることができる。ニューロン変性には、ニューロンの構造の変化（分子の変化、例えば毒性タンパク質の細胞内蓄積、タンパク質凝集等、およびマクロレベルの変化、例えば軸索または樹状突起の形状または長さの変化、ミエリン鞘組成の変化、ミエリン鞘の喪失等を含む）、ニューロンの機能の変化、ニューロンの機能の喪失、ニューロン死、またはそれらの任意の組合せを挙げることができる。認知機能障害には、限定されるものではないが、記憶、注意、集中、言語、論理的思考、創造性、実行機能、計画および系統化の困難さを挙げることができる。挙動変化には、限定されるものではないが、身体的または言語的な攻撃、衝動性、抑制の低下、無感動、自発性の低下、人格の変化、アルコール、タバコまたは薬物の乱用、および他の依存症関連の行動を挙げることができる。情動調節不全には、限定されるものではないが、うつ病、不安、躁病、興奮性および情動失禁を挙げることができる。発作には、限定されるものではないが、全身性強直性間代性発作、複雑部分発作、および非てんかん性の心因性発作を挙げることができる。神経系構造または機能の障害には、限定されるものではないが、水頭症、パーキンソニズム、睡眠障害、精神病、姿勢および共調運動の障害を挙げることができる。これには、運動障害、例えば単不全麻痺、片側不全麻痺、四肢不全麻痺、運動失調、バリスムスおよび振戦を挙げることができる。これには、嗅覚、触覚、味覚、視覚、聴覚を含む感覚喪失または機能障害も挙げることができる。さらに、これには、自律神経系障害、例えば腸および膀胱の機能障害、性機能障害、血圧および体温の調節不全を挙げることができる。最後に、これには、視床下部および下垂体の機能障害に起因するホルモン障害、例えば成長ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、ゴナドトロピン放出ホルモン、プロラクチンおよび無数の他のホルモンおよび調節因子の欠乏および調節不全を挙げることができる。

【0052】

本明細書において使用される場合、「対象」という用語は、哺乳動物、好ましくはヒトを指す。哺乳動物には、限定されるものではないが、ヒト、霊長類、家畜、げっ歯類および愛玩動物が挙げられる。対象は、医学的ケアもしくは処置の待機中であってもよく、医学的ケアもしくは処置を受けていてもよく、または医学的ケアもしくは処置を受けたことがあってもよい。

【0053】

本明細書において使用される場合、「健康な対照群」「正常群」という用語、または「健康な」対象からの試料は、内科医により、質的または定量的な試験結果に基づき、ＡβアミロイドーシスにもＡβアミロイドーシスに関連する臨床的疾患（限定されるものではないが、アルツハイマー病を含む）にも罹患していないと診断される対象、または群の対象を意味する。「正常な」対象は、通常、評価される個体とほぼ同じ年齢であり、限定されるものではないが、同じ年齢の対象および５～１０年の範囲内の対象を含む。

【0054】

本明細書において使用される場合、「血液試料」という用語は、血液、好ましくは末梢（または循環）血に由来する生物学的試料を指す。血液試料は全血、血漿または血清であることができるが、血漿が典型的に好ましい。

【0055】

「アイソフォーム」という用語は、本明細書において使用される場合、タンパク質をコードするｍＲＮＡの選択的スプライシング、タンパク質の翻訳後修飾、タンパク質のタンパク分解処理、遺伝的変異および体細胞組換えに起因して生じる、同じタンパク質突然変異体のいくつかの異なる形態のいずれかを指す。「アイソフォーム」および「突然変異体」という用語は、互換的に使用される。

【0056】

本明細書において特に指示の無い限り、「タウタンパク質」または「タウ」という用語は、全長であるか、短縮化されたか、または翻訳後修飾された、すべてのタウアイソフォームを包含する。限定されるものではないが、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類、魚類、ウシ、カエル、ヤギおよびニワトリを含む多数の動物では、タウは遺伝子ＭＡＰＴによりコードされる。ヒトでは、ＭＡＰＴのエクソン２、３および１０の選択的スプライシングにより生成される、タウの６つのアイソフォームが存在する。これらのアイソフォームは、３５２～４４１アミノ酸長の範囲にわたる。エクソン２および３は、Ｎ末端に各々２９個のアミノ酸インサートをコードし（Ｎと呼ばれる）、全長ヒトタウアイソフォームは、両方のインサート（２Ｎ）、１つのインサート（１Ｎ）を有するか、またはインサートを有しない（０Ｎ）ことがある。すべての全長ヒトタウアイソフォームは、微小管結合ドメイン（Ｒと呼ばれる）の３つの繰り返しも有する。Ｃ末端のエクソン１０を含むことで、エクソン１０によりコードされる第４の微小管結合ドメインを含むこととなる。したがって、全長ヒトタウアイソフォームは、微小管結合ドメインの４つの繰り返し（４Ｒ）（エクソン１０を含む）、または微小管結合ドメインの３つの繰り返し（３Ｒ）（エクソン１０を除く）から構成され得る。ヒトタウは、翻訳後修飾されることもあればされないこともある。例えば、タウがリン酸化、ユビキチン化、グリコシル化および糖化されることがあることは、当該技術分野において公知である。したがって、「ヒトタウ」という用語は、（２Ｎ、３Ｒ）、（２Ｎ、４Ｒ）、（１Ｎ、３Ｒ）、（１Ｎ、４Ｒ）、（０Ｎ、３Ｒ）および（０Ｎ、４Ｒ）アイソフォーム、それらのＮおよび／またはＣ末端で短縮化された種類のアイソフォーム、ならびにすべての翻訳後修飾されたアイソフォームを包含する。タウをコードする遺伝子の選択的スプライシングは、他の動物において同様に発生する。遺伝子がＭＡＰＴとして同定されていない動物では、ホモログが当該技術分野において公知の方法で同定され得る。

【0057】

脳内のタウ沈着に関連する疾患は、「タウオパチー」と称され得る。当該技術分野において公知のタウオパチーには、限定されるものではないが、進行性核上性麻痺、拳闘家認知症、慢性外傷性脳症、第１７番染色体に関連する前頭側頭型認知症およびパーキンソニズム、リティコ－ボディグ病、グアムのパーキンソン病認知症、神経原線維変化型老年期認知症、神経節腫および神経細胞腫、髄膜血管腫症、亜急性硬化性全脳炎、鉛脳症、結節性硬化症、ハラフォルデン－シュパッツ病、リポフスチン症、ピック病、皮質基底核変性症、嗜銀顆粒症（ａｒｇｙｒｏｐｈｉｌｉｃ ｇｒａｉｎ ｄｉｓｅａｓｅ）（ＡＧＤ）、前頭側頭葉変性症、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症が挙げられる。

【0058】

タウオパチーの臨床徴候は、限定されるものではないが神経原線維変化を含む、脳内のタウの凝集体であり得る。脳内のタウ凝集体を検出および定量するための方法は、当該技術分野において公知である（例えばタウ特異的リガンド、例えば［^１８Ｆ］ＴＨＫ５３１７、［^１８Ｆ］ＴＨＫ５３５１、［^１８Ｆ］ＡＶ１４５１、［１１Ｃ］ＰＢＢ３、［^１８Ｆ］ＭＫ－６２４０、［^１８Ｆ］ＲＯ－９４８、［^１８Ｆ］ＰＩ－２６２０、［^１８Ｆ］ＧＴＰ１、［^１８Ｆ］ＰＭ－ＰＢＢ３および［^１８Ｆ］ＪＮＪ６４３４９３１１、［^１８Ｆ］ＪＮＪ－０６７）等を使用するタウＰＥＴ）。

【0059】

「タウ画像化の候補」は、臨床医によりタウ画像化が臨床的に保証される個体として特定された対象を指す。非限定的な例として、タウ画像化の候補は、１つもしくは複数のＡβアミロイドーシスの臨床徴候、１つもしくは複数のＡβプラークに関連する症状、１つもしくは複数のタウオパチーの症状、またはそれらの組合せを有する対象であり得る。非限定的な例として、タウ画像化の候補は、Ａβアミロイドーシスまたはタウオパチーについて遺伝的素因を有する対象であり得る。臨床医は、彼らの臨床的ケアを指示するために、そのような対象についてのタウ画像化を推奨してもよい。別の非限定的な例として、タウ画像化の候補は、タウオパチーについての臨床試験の潜在的な参加者（対照対象または試験対象のいずれか）であり得る。

【0060】

「平均から有意に逸脱する」は、少なくとも１標準偏差、好ましくは少なくとも１．３標準偏差、より好ましくは少なくとも１．５標準偏差、またはさらにより好ましくは少なくとも２標準偏差、平均を上回るかまたは下回る値を指す。

【0061】

「特異的に結合する」という用語は、エピトープ結合剤に関して本明細書において使用される場合、目的のタンパク質（例えばタウ）または一般に他のタンパク質上の他のエピトープと有意な程度に交差反応しない、エピトープ結合剤を意味する。

【0062】

「Ａβおよびタウ治療」という句は、集合的に、ＡβアミロイドーシスもしくはＡＤを発症するリスクのある対象、Ａβアミロイドーシスを有すると診断された対象、タウオパチーを有すると診断された対象、またはＡＤを有すると診断された対象に対して企図される、または彼らと共に使用する、任意の造影剤または治療剤を指す。

【0063】

ＩＩ．可溶性タウを濃縮するために血液試料を処理するための方法
一態様では、本開示は、可溶性タウを濃縮するために血液試料を処理するための方法を提供する。血液中のタウの濃度が低いと、ＭＳ技術を使用する測定が困難である。例えば、イムノアッセイにより報告されるように、総タウ（ｔ－タウ）の血漿濃度は１～２０ｐｇ／ｍＬであり、一方でｐ－タウ１８１は、サブｐｇ／ｍＬ濃度で存在する。サブｐｇ／ｍＬ範囲は、近年アッセイされた血漿Ａβ４２ペプチドを含む、現在モニタリングされる血漿バイオマーカーの濃度をはるかに下回る。本開示のＭＳ方法は、単離されたタウ試料を使用することにより、これらの制限を克服する。本明細書において使用される場合、「単離されたタウ試料」は、タウを含む組成物であって、タウが対象から得られた血液試料から精製されている組成物を指す。

【0064】

一部の実施形態では、方法は、１つまたは複数の血液試料を対象から得る、第１のステップを含んでもよい。対象は、本明細書において使用される場合、哺乳動物、好ましくはヒトである。血液は、静脈内カテーテルの有無を問わない静脈穿刺によるか、またはフィンガースティック（またはその等価物）により収集してもよい。対象から同時に収集された複数の血液試料は、プールされてもよい。収集し、適宜プールしたら、血液試料を、当該技術分野において公知の方法（例えば、全細胞および細胞残屑を除去するための遠心分離、分析試験の前に標本を安定化および保存するためのプロテアーゼ阻害剤の使用等）に従って処理してもよい。血液試料は、即時に使用されてもよく、または冷凍し無期限に保管されてもよい。

【0065】

別の実施形態では、方法は、以前に対象から得られた血液試料を使用してもよい。対象から以前収集された複数の血液試料は、プールされてもよい。以前に得られた血液試料が全血である場合、方法は、典型的に、１つまたは複数の血液試料を処理して血漿試料または血清試料を得るステップを含む。好ましくは、以前に対象から得られた血液試料は、血漿試料または血清試料である。

【0066】

すべての実施形態では、血漿試料または血清試料は、次に、単離されたタウ試料を製造するために処理される。この処理は、タンパク質を血液試料またはプールされた血液試料から沈殿させ、それにより血液の酸可溶性抽出物を製造すること、固相抽出（ＳＰＥ）、およびタウと特異的に結合する１つまたは複数のエピトープ結合剤を使用するアフィニティ精製により、酸可溶性抽出物中の可溶性タウを濃縮することを含む。ある特定の実施形態では、アフィニティ精製は固相抽出の前に行われてもよい。

【0067】

出発材料（すなわち血液試料）の量は、下流の使用に依存して変動してもよい。一部の実施形態では、約０．５ｍｌ～約５０ｍｌの血漿（または対応する量の全血もしくは血清）を使用してもよい。一部の実施形態では、約１ｍｌ～約２０ｍｌの血漿（または対応する量の全血もしくは血清）を使用してもよい。一部の実施形態では、約１０ｍｌ～約２０ｍｌの血漿（または対応する量の全血もしくは血清）を使用してもよい。一部の実施形態では、約１ｍｌ～約１０ｍｌの血漿（または対応する量の全血もしくは血清）を使用してもよい。一部の実施形態では、約１ｍｌ～約５ｍｌの血漿（または対応する量の全血もしくは血清）を使用してもよい。

【0068】

血漿タンパク質は、１つまたは複数の以前に得られた血液試料から、過塩素酸を使用して沈殿させることができる。本明細書において使用される場合、「過塩素酸」は、７０％過塩素酸を指す。一部の実施形態では、過塩素酸は、約１％ｖ／ｖ～約１５％ｖ／ｖの最終濃度で添加される。他の実施形態では、過塩素酸は、約１％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖの最終濃度で添加される。他の実施形態では、過塩素酸は、約１％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖの最終濃度で添加される。他の実施形態では、過塩素酸は、約３％ｖ／ｖ～約１５％ｖ／ｖの最終濃度で添加される。他の実施形態では、過塩素酸は、約３％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖの最終濃度で添加される。他の実施形態では、過塩素酸は、約３％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖの最終濃度で添加される。他の実施形態では、過塩素酸は、３．５％ｖ／ｖ～約１５％ｖ／ｖ、３．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、または３．５％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖの最終濃度で添加される。他の実施形態では、過塩素酸は、約３．５％ｖ／ｖの最終濃度で添加される。過塩素酸の添加に続けて、試料は十分に混合され（例えばボルテックスミキサーにより）、沈殿を促進するために、低温で典型的に約１０分またはそれよりも長く保持される。例えば、試料は、約１０分～約６０分、約２０分～約６０分、または約３０分～約６０分保持されてもよい。他の例では、試料は、約１５分～約４５分、または約３０分～約４５分保持されてもよい。他の例では、試料は、約１５分～約３０分、または約２０分～約４０分保持されてもよい。他の例では、試料は、約３０分保持される。試料は次に、沈殿したタンパク質をペレットにするために低温で遠心分離にかけられ、可溶性タウを含む上清（すなわち、酸可溶性画分）は、新たな容器に移される。上記の文脈において使用される場合、「低温」は１０℃以下の温度を指す。例えば、低温は約１℃、約２℃、約３℃、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃または約１０℃であってもよい。一部の実施形態では、より狭い温度範囲、例えば約３℃～約５℃、またさらには約４℃が好ましいものであり得る。ある特定の実施形態では、低温は、試料を氷上に置くことにより達成されてもよい。

【0069】

可溶性タウは、逆相吸着剤を使用した固相抽出により濃縮される。簡潔には、可溶性タウを含む上清は、逆相吸着剤に適用され、好適な移動相を用いて洗浄され、次に溶出される。好適な逆相材料は当該技術分野において公知であり、限定されるものではないが、アルキル結合シリカ、アリール結合シリカ、スチレン／ジビニルベンゼン（ｄｉｖｙｎｌｂｅｎｚｅｎｅ）材料、Ｎ－ビニルピロリドン／ジビニルベンゼン材料が挙げられる。例示的な実施形態では、逆相材料は、Ｎ－ビニルピロリドンおよびジビニルベンゼンを含むポリマー、またはスチレンおよびジビニルベンゼンを含むポリマーである。可溶性タウを含む上清と接触させる前に、逆相吸着剤は製造元の使用説明書にしたがって、または当該技術分野において公知のように、予め調整される（例えば、水混和性有機溶媒、および次に移動相を含む緩衝液を用いる）。加えて、一部の逆相材料は他のものよりも強くイオン化された分析物を保持するため、上清を酸性化してもよい。移動相中の、および溶出のための揮発性成分の使用は、試料の乾燥を促進するため、好ましい。例示的な実施形態では、タウは、約０．０５％ｖ／ｖトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）～約１％ｖ／ｖ ＴＦＡを含む液体相、またはその等価物を用いて洗浄されてもよい。一部の例では、洗浄は、約０．０５％ｖ／ｖ～約０．５％ｖ／ｖ ＴＦＡまたは約０．０５％ｖ／ｖ～約０．１％ｖ／ｖ ＴＦＡを含む液体相を用いてもよい。一部の例では、洗浄は、約０．１％ｖ／ｖ～約１．０％ｖ／ｖ ＴＦＡまたは約０．１％ｖ／ｖ～約０．５％ｖ／ｖ ＴＦＡを含む液体相を用いてもよい。結合したタウは、次に約２０％ｖ／ｖ～約５０％ｖ／ｖアセトニトリル（ＡＣＮ）を含む液体相、またはその等価物を用いて溶出される。一部の例では、タウは約２０％ｖ／ｖ～約４０％ｖ／ｖ ＡＣＮまたは約２０％ｖ／ｖ～約３０％ｖ／ｖ ＡＣＮを含む液体相を用いて溶出されてもよい。一部の例では、タウは約３０％ｖ／ｖ～約５０％ｖ／ｖ ＡＣＮまたは約３０％ｖ／ｖ～約４０％ｖ／ｖ ＡＣＮを含む液体相を用いて溶出されてもよい。溶出液は、当該技術分野において公知の方法（例えば真空乾燥（例えばｓｐｅｅｄ－ｖａｃ）、凍結乾燥、窒素気流下での蒸発等）により乾燥されてもよい。

【0070】

可溶性タウは、タウに特異的に結合する１つまたは複数のエピトープ結合剤を使用して、アフィニティ精製される。典型的に、１つまたは複数のエピトープ結合は、固定される、すなわち固体支持体、例えばビーズ、樹脂、組織培養プレート等に接着する。好ましいエピトープ結合剤は、リン酸化されたタウおよびリン酸化されていないタウの両方に、特異的に結合する。一例では、好適なエピトープ結合剤は、タウのｍｉｄドメイン中のエピトープと結合してもよい。別の例では、好適なエピトープ結合剤は、タウのＮ末端中、好ましくはタウのアミノ酸１～３５中のエピトープと結合してもよい。別の例では、好適なエピトープ結合剤は、タウのＭＴＢＲ中のエピトープと結合してもよい。別の例では、好適なエピトープ結合剤は、タウのＣ末端中のエピトープと結合してもよい。なおさらなる実施形態では、２つ以上のエピトープ結合剤が使用されてもよい。一例では、第１のエピトープ結合剤は、タウのＮ末端中のエピトープと結合してもよく、第２のエピトープ結合剤は、タウのｍｉｄドメイン中のエピトープと結合してもよい。別の例では、第１のエピトープ結合剤は、タウのＭＴＢＲ中のエピトープと結合してもよく、第２のエピトープ結合剤は、タウのｍｉｄドメイン中のエピトープと結合してもよい。別の例では、第１のエピトープ結合剤は、タウのＣ末端中のエピトープと結合してもよく、第２のエピトープ結合剤は、タウのｍｉｄドメイン中のエピトープと結合してもよい。別の例では、第１のエピトープ結合剤は、タウのＣ末端中のエピトープと結合してもよく、第２のエピトープ結合剤は、タウのＮ末端中のエピトープと結合してもよい。別の例では、第１のエピトープ結合剤は、タウのＭＴＢＲ中のエピトープと結合してもよく、第２のエピトープ結合剤は、タウのＮ末端中のエピトープと結合してもよい。別の例では、第１のエピトープ結合剤は、タウのＭＴＢＲ中のエピトープと結合してもよく、第２のエピトープ結合剤は、タウのＣ末端中のエピトープと結合してもよい。上記の実施形態の各々では、リガンドは、抗体またはアプタマーであってもよい。好適な抗体の非限定的な例を、図１に示す。

【0071】

さらなる一実施形態では、１つまたは複数のさらなる血漿タンパク質は、追加の血漿タンパク質と特異的に結合する１つまたは複数の追加のエピトープ結合剤を使用して、同時にまたは順次にアフィニティ精製されてもよい。タウと同時にまたは順次にアフィニティ精製され得るさらなる血漿タンパク質の非限定的な例は、Ａβ、ＡｐｏＥ、アルファシヌクレイン、可溶性アミロイド前駆体タンパク質、アルファ－２マクログロブリン、Ｓ１００Ｂ、ミエリン塩基性タンパク質、インターロイキンおよびＴＮＦである。例示的な実施形態では、ＡｐｏＥ、アルファシヌクレインまたはそれらの任意の組合せもアフィニティ精製され、したがって単離されたタウ試料中に存在する。

【0072】

単離されたタウ試料は、即時に使用されてもよく、または当該技術分野において公知の方法により無期限に保管されてもよい。

【0073】

本明細書において記載されているように調製された単離されたタウ試料は、限定されるものではないが、イムノアッセイ、ｘＭＡＰアッセイおよび質量分析を含む任意の数の下流の用途で使用されてもよい。アッセイは、タウの総量、ホスホ－タウの総量、特定のアミノ酸残基におけるリン酸化、および／または他の翻訳後修飾を分析することができる。

【0074】

ＩＩＩ．単離されたタウ試料中のタウリン酸化の測定
タウ中の特定のアミノ酸（すなわち、「部位」および「残基」）のリン酸化は、結果としてリン酸化タウ（ｐ－タウ）アイソフォームを生じる。別の態様では、本開示は、タウの１つまたは複数の特定のアミノ酸残基におけるリン酸化を測定するための方法であって、（ａ）単離されたタウ試料を用意すること、および（ｂ）タウのさらに１つの残基におけるリン酸化を定量することとを含む方法を提供する。タウの２つ以上の残基におけるリン酸化が測定される場合、方法は、値の間の比または別の数学的関係を算出することをさらに含んでもよい。

【0075】

一部の実施形態では、タウのリン酸化は、Ｔ１１１、Ｓ１１３、Ｔ１８１、Ｓ１９９、Ｓ２０２、Ｓ２０８、Ｔ１５３、Ｔ１７５、Ｔ２０５、Ｓ２１４、Ｔ２１７およびＴ２３１から選択される１つまたは複数の残基において測定される。一部の実施形態では、タウのリン酸化は、Ｔ１１１、Ｔ１８１、Ｔ２０５、Ｓ２０８、Ｓ２１４、Ｔ２１７およびＴ２３１から選択される１つまたは複数の残基において測定される。別の実施形態では、タウのリン酸化は、Ｔ１８１、Ｓ２１４、およびＴ２１７から選択される１つまたは複数の残基において測定される。別の実施形態では、タウのリン酸化は、Ｔ１８１、Ｔ２０５、およびＴ２１７から選択される１つまたは複数の残基において測定される。別の実施形態では、タウのリン酸化は、Ｓ１９９および適宜１つまたは複数のさらなる残基において測定される。別の実施形態では、タウのリン酸化は、Ｓ２０２および適宜１つまたは複数のさらなる残基において測定される。別の実施形態では、タウのリン酸化は、Ｔ１８１および適宜１つまたは複数のさらなる残基において測定される。別の実施形態では、タウのリン酸化は、Ｔ２０５および適宜１つまたは複数のさらなる残基において測定される。別の実施形態では、タウのリン酸化は、Ｔ２１７および適宜１つまたは複数のさらなる残基において測定される。別の実施形態では、タウのリン酸化は、Ｔ１５３およびＴ１７５を含む２つ以上の残基において測定される。別の実施形態では、タウのリン酸化は、Ｔ１８１、Ｔ２０５、およびＴ２１７から選択される２つ以上の残基において測定される。別の実施形態では、タウのリン酸化は、Ｔ１８１、Ｔ２０５、およびＴ２１７を含む３つ以上の残基において測定される。別の実施形態では、タウのリン酸化は、Ｔ１８１およびＴ２１７を含む２つ以上の残基において測定される。

【0076】

単離されたタウ試料を調製するための方法を、第ＩＩ節に詳細に説明する。一部の実施形態では、対象は、神経変性疾患の診断を有する。一部の実施形態では、対象は、タウオパチーの診断を有する。一部の実施形態では、対象は、タウオパチーの診断を有するが、Ａβアミロイドーシスを有しない。一部の実施形態では、対象は、ＡＤの診断を有する。一部の実施形態では、対象は、ＣＡＡの診断を有する。一部の実施形態では、対象は、ＭＣＩまたは認知症の診断を有する。一部の実施形態では、対象は、神経変性疾患の臨床徴候を有しない。

【0077】

実施例は、タウリン酸化部位を発見し、単離されたタウタンパク質中のリン酸化部位の存在量を最初に定量するための、並列反応モニタリング（ＰＲＭ）を使用した、高度に感受性かつ特異的な質量分析（ＭＳ）法を開示する。しかし、本開示は、タウの部位特異的リン酸化を定量的に評価するための任意の１つの特定の方法に限定されない。好適な方法は、単一のアミノ酸のリン酸化状態のみが異なるタウアイソフォームを区別し、異なるアミノ酸でリン酸化されたｐ－タウアイソフォームを区別し、総タウの全体的変化から独立して特定の部位で起こるリン酸化の変化を定量するべきである。総タウの全体的変化から独立して特定の部位で起こるリン酸化化学量の変化を定量するための３つの手法を、実施例において詳述する：１）同じ配列を共有する各リン酸化ペプチドの相対的存在量を推定するために使用することのできる、リン酸化ペプチド異性体間の相対的比較、２）参照としてのタウタンパク質からの任意のペプチドを用いた、リン酸化ペプチドの標準化、および３）標識した合成内部標準（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｌａｂｅｌｅｄ ｓｔａｎｄａｒｄｓ）を使用した、各リン酸化および非リン酸化ペプチドについての絶対量定量、ここで各リン酸化ペプチドについての絶対量定量値は、タウタンパク質からの任意のペプチドについて得られた任意の絶対量定量値を用いて標準化される。すべての３つの手法は、各部位についての相対的なリン酸化の変化の比較のために、内部標準化を使用する。当該技術分野において公知の他の方法も使用してもよい。絶対量定量のために標識した合成内部標準を使用する場合、標識された標準は、好ましくは、可溶性タウを濃縮するための試料の処理前に、血液試料中にスパイクされる。したがって、第ＩＩ節の方法は、沈殿の前、典型的には直前に、標識された内部標準を血液試料に添加する、さらなるステップを含む。

【0078】

例示的な実施形態では、タウの部位特異的リン酸化は、高分解能質量分析により測定される。好適な種類の質量分析が当該技術分野において公知である。これらには、限定されるものではないが、四重極型、飛行時間型、イオントラップおよびＯｒｂｉｔｒａｐ、ならびに異なる種類の質量分析計を１つの構成に組み合わせたハイブリッド型質量分析計（例えばＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＯｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ（商標）Ｔｒｉｂｒｉｄ（商標）質量分析計）が挙げられる。単離されたタウ試料のさらなる処理は、ＭＳ分析の前位に行ってもよい。例えば、単離されたタウ試料は、１種または複数のさらなる血漿タンパク質を並行して定量することができるように、複数の試料に分けられてもよい。別の実施例として、タウは典型的に、ＭＳ分析の前にタンパク分解により消化される。好適なプロテアーゼには、限定されるものではないが、トリプシン、Ｌｙｓ－Ｎ、Ｌｙｓ－ＣおよびＡｒｇ－Ｎが挙げられる。消化は、免疫精製の後（例えばエピトープ結合剤からのタウの溶出の後）、またはアフィニティ精製の間（例えば、タウがエピトープ結合剤に結合している間）に行ってもよい。アフィニティ精製を、第ＩＩ節に詳細に説明する。１つまたは複数の浄化ステップに続き、消化されたタウペプチドは、高分解能質量分析計と適合する液体クロマトグラフィーシステムにより分離されてもよい。クロマトグラフィーシステムは、所望のＬＣ－ＭＳパターンを生成するために、慣習的な実験により最適化すれてもよい。多様なＬＣ－ＭＳ技術を、部位特異的タウリン酸化を定量的に分析するために使用してもよい。非限定的な例には、選択反応モニタリング、並列反応モニタリング、選択イオンモニタリングおよびデータ非依存型解析法（ｄａｔａ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ）が挙げられる。上記で述べたように、部位特異的タウリン酸化のすべての定量分析は、総タウの全体的変化を考慮するべきである。例示的な実施形態では、実施例において概説される質量分析プロトコールが使用される。

【0079】

さらなる実施形態では、方法は、対象から得られた血液試料中の総タウを測定すること、対象から得られた血液試料中のさらに１つのさらなる血漿タンパク質を測定すること、および／またはＡｐｏＥ状態を決定することをさらに含み、単一の単離されたタウ試料は、すべての測定に使用されてもよい。総タウを測定するための方法を、第ＩＶ節に説明する。ＡｐｏＥ状態を決定することは、核酸レベル（例えばシークエンシング、核酸ベースアレイ（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｂａｓｅｄ ａｒｒａｙｓ）等による）またはタンパク質レベル（例えば、質量分析、イムノアッセイ等による）のいずれかで、対象のＡｐｏＥ変異体（すなわち、ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３またはＡｐｏＥ４）を決定することを意味する。１つまたは複数のさらなる血漿タンパク質を測定するための方法も、当該技術分野において公知である。例えば、質量分析、イムノアッセイ、ｘＭＡＰ（登録商標）アッセイ等は、様々な血漿タンパク質を測定するために、当該技術分野において使用される。タウと組み合わせて測定され得るさらなる血漿タンパク質の非限定的な例には、アミロイドベータ（Ａβ）、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ｊ、アルファシヌクレイン、可溶性アミロイド前駆体タンパク質、アルファ－２マクログロブリン、Ｓ１００Ｂ、ミエリン塩基性タンパク質、インターロイキンおよびＴＮＦが挙げられる。一部の例では、１つまたは複数のＡβペプチドが測定される。例えば、Ａβ３８、Ａβ４０および／またはＡβ４２が測定されてもよい。上記の実施形態では、方法は、１つまたは複数の残基におけるタウリン酸化とさらなる測定（例えばさらなる血漿タンパク質の総量、ＡｐｏＥ状態等）との間の比または別の数学的関係を算出することをさらに含んでもよい。

【0080】

上記の実施形態の各々では、方法は、対象にさらなる診断試験を行うこと、または測定されたリン酸化レベルが対照集団における平均から有意に逸脱する場合に対象に治療剤を投与することをさらに含んでもよい。「平均から有意に逸脱する」は、少なくとも１標準偏差、好ましくは少なくとも１．３標準偏差、より好ましくは少なくとも１．５標準偏差、またはさらにより好ましくは少なくとも２標準偏差、平均を上回るかまたは下回る値（すなわち、それぞれ１σ、１．３σ、１．５σまたは１．５σであり、σは対照集団において測定された正規分布により定義される標準偏差である）を指す。さらなる診断試験は、ＰＥＴ画像化（例えばアミロイド画像化、タウ画像化等）、対象から得られたＣＳＦ試料中のさらに１つのタンパク質の定量測定等であってもよい。治療剤は、抗炎症剤、血管新生阻害剤、ベータセクレターゼ阻害剤、ガンマセクレターゼ阻害剤、コリンエステラーゼ阻害剤、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、抗Ａβ抗体、抗タウ抗体、抗ＡｐｏＥ抗体、アミロイド沈着の増大を予防するために設計された薬剤、対象の既存のプラーク負荷を減少させるために設計された薬剤、タウ凝集を防止するための薬剤、ＮＦＴを標的とする薬剤等であってもよい。

【0081】

ＩＶ．単離されたタウ試料中の総タウの測定
別の態様では、本開示は、総タウを測定するための方法であって、（ａ）単離されたタウ試料を用意すること、および（ｂ）総タウを定量することとを含む方法を提供する。「総タウ」は、本明細書において使用される場合、所与の試料中のすべてのタウアイソフォームを指す。タウは、可溶性および不溶性の区画中、モノマーおよび凝集体形態で、規則的なまたは不規則な構造で、細胞内または細胞外で見出され、他のタンパク質または分子と複合体形成し得る。したがって、生物学的試料の供給源（例えば脳組織、ＣＳＦ、血液等）および生物学的試料の任意の下流処理は、所与の試料中のタウアイソフォームの全体量に影響を与えることとなる。

【0082】

タウペプチド測定は質量分析により行うことができ、測定の精度は、標識された内部標準を参照として使用することにより改善することができる。あるいは、総タウは、イムノアッセイまたはタウ濃度を定量する他の方法により測定することができる。

【0083】

総タウは、未修飾のタウペプチドの存在量をモニタリングすることにより測定されてもよい。タウリン酸化も測定される実施形態では、各リン酸化タウ部位について、目的のリン酸化ペプチドと一般的なアミノ酸配列を共有するタウペプチドは、総タウレベルを測定するために優先的に使用されてもよい。あるいは、タウ配列からの任意のペプチドを使用することができる。特定の実施形態では、総タウは、質量分析によりＴＰＳＬトリプシンペプチド（すなわちＴＰＳＬＰＴＰＰＴＲ）を定量することにより、測定されてもよい。

【0084】

Ｖ．対象のＡＤのステージを診断するための、ＡＤに起因するＭＣＩの発症の前に対象を診断するための方法
本開示の別の態様は、対象を、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害への転換の高いリスクを有すると診断するための方法、および適宜、ＡＤに起因するＭＣＩの発症までの年数に関して対象をステージ分類するかまたは分類するための方法を包含する。アルツハイマー病（ＡＤ）に起因する軽度認知障害（ＭＣＩ）は、ＡＤの症候性の認知症前の段階を指す。この認知障害の程度は年齢に対して正常なものではなく、よって、年齢に関連する記憶障害および年齢に関連する認知の低下のようなコンストラクトは当てはまらない。ＡＤに起因するＭＣＩは臨床診断であり、ＡＤに起因するＭＣＩの診断についての臨床基準は当該技術分野において公知である。例えば、Ａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ． Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ＆ Ｄｅｍｅｎｔｉａ， ２０１１， ７（３）： ２７０－２７９を参照されたい。認知試験は、対象についての認知障害の程度を客観的に評価するために最適である。ＭＣＩを有する対象についての認知試験のスコアは、典型的に、文化的に適切な規範データ上で（すなわち、利用可能な場合、障害のあるドメインについて）、彼らの年齢および教育について合致する同等者についての平均から１～１．５標準偏差下回る。ＭＣＩの指定は、多くの場合、臨床的認知症尺度（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｍｅｎｔｉａ Ｒａｔｉｎｇ）（ＣＤＲ）スケール上での０．５の包括的尺度により支持される。ＣＤＲは、認知症の症状の重症度を定量するために使用される数値上のスケールである。他の好適な認知試験は、当該技術分野において公知である。認知障害の重症度を評価するのに好適な試験は存在するが、ＡＤに起因するＭＣＩの発症の数年前であると確信される対象を特定するための試験が、当該技術分野において必要とされている。

【0085】

一実施形態では、対象をＡＤに起因するＭＣＩへの転換の高いリスクを有すると診断するための方法は、（ａ）対象から得た単離されたタウ試料を用意すること、ならびに単離されたタウ試料中でＴ１１１、Ｓ１１３、Ｔ１８１、Ｓ１９９、Ｓ２０２、Ｓ２０８、Ｔ１５３、Ｔ１７５、Ｔ２０５、Ｓ２１４、Ｔ２１７およびＴ２３１から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基におけるタウリン酸化を測定すること、ならびに適宜総タウを測定することと、（ｂ）測定されたリン酸化レベルが、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団における平均から有意に逸脱する場合に、対象をＡＤに起因するＭＣＩへの転換の高いリスクを有すると診断すること、を含んでもよい。別の実施形態では、対象をＡＤに起因するＭＣＩへの転換の高いリスクを有すると診断するための方法は、（ａ）対象から得た第１のおよび第２の単離されたタウ試料を用意すること、ならびに各単離されたタウ試料中でＴ１１１、Ｓ１１３、Ｔ１８１、Ｓ１９９、Ｓ２０２、Ｓ２０８、Ｔ１５３、Ｔ１７５、Ｔ２０５、Ｓ２１４、Ｔ２１７およびＴ２３１から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基におけるタウリン酸化を測定すること、ならびに適宜総タウを測定することと、（ｂ）測定された各残基における部位特異的タウリン酸化の変化、および適宜総タウの変化を算出することと、（ｃ）算出された変化が、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団における平均から有意に逸脱する場合に、対象をＡＤに起因するＭＣＩへの転換の高いリスクを有すると診断すること、を含んでもよい。「平均から有意に逸脱する」は、少なくとも１標準偏差、好ましくは少なくとも１．３標準偏差、より好ましくは少なくとも１．５標準偏差、またはさらにより好ましくは少なくとも２標準偏差、平均を上回るかまたは下回る値（すなわち、それぞれ１σ、１．３σ、１．５σまたは１．５σであり、σは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団において測定された正規分布により定義される標準偏差である）を指す。閾値（例えば、少なくとも１標準偏差、平均を上回るかまたは下回る）を使用することに加えて、一部の実施形態では、平均を上回るかまたは下回る変化の程度を、対象を診断するために使用してもよい。単離されたタウ試料は、無症候性であり得るかまたはそうではあり得ない対象から得ることができる。「無症候性の対象」は、ＡＤのいかなる徴候も症状も示さない対象を指す。しかし、対象は、ＡＤの徴候または症状（例えば記憶喪失、物を置き忘れること、気分または挙動の変化等）を呈し得るが、軽度認知障害の臨床診断についての十分な認知障害も機能障害も示さない。さらなる一実施形態では、対象は、優性遺伝性アルツハイマー病を引き起こすことが公知の遺伝子突然変異のうちの１つを有し得る。代わりの一実施形態では、対象は、優性遺伝性アルツハイマー病を引き起こすことが公知の遺伝子突然変異を有し得ない。特定の家族的な関連を有しないアルツハイマー病は、散発性アルツハイマー病と称される。

【0086】

本開示の別の態様は、対象のアルツハイマー病のステージを診断するための方法を包含する。様々な実施形態では、「ＡＤのステージ」は、ＡＤに起因するＭＣＩの発症から経過した時間の量（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヶ月等）として定義されてもよい。ＡＤの臨床診断についての基準は存在するが、臨床現場では、所与の対象についての症状発症の時期が不明であるか、またはＭＣＩもしくはＡＤのいずれかの診断が疑わしいことが多い。そのため、対象のＡＤのステージを客観的に診断する試験が、当該技術分野において必要とされている。

【0087】

一実施形態では、対象のＡＤのステージを診断するための方法は、（ａ）対象から得た単離されたタウ試料を用意すること、ならびに単離されたタウ試料中でＴ１１１、Ｓ１１３、Ｔ１８１、Ｓ１９９、Ｓ２０２、Ｓ２０８、Ｔ１５３、Ｔ１７５、Ｔ２０５、Ｓ２１４、Ｔ２１７およびＴ２３１から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基におけるタウリン酸化を測定すること、ならびに適宜総タウを測定することと、（ｂ）測定されたリン酸化レベルが、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団における平均から有意に逸脱する場合に、対象のＡＤのステージを診断すること、を含んでもよい。別の実施形態では、ＡＤに起因するＭＣＩの発症の前に対象を診断するための方法は、（ａ）対象から得た第１のおよび第２の単離されたタウ試料を用意すること、ならびに各単離されたタウ試料中でＴ１１１、Ｓ１１３、Ｔ１８１、Ｓ１９９、Ｓ２０２、Ｓ２０８、Ｔ１５３、Ｔ１７５、Ｔ２０５、Ｓ２１４、Ｔ２１７およびＴ２３１から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基におけるタウリン酸化を測定すること、ならびに適宜総タウを測定することと、（ｂ）測定された各残基における部位特異的タウリン酸化の変化、および適宜総タウの変化を算出することと、（ｃ）算出された変化が、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団における平均から有意に逸脱する場合に、対象をＡＤに起因するＭＣＩの発症まで数年であると診断すること、を含んでもよい。「平均から有意に逸脱する」は、少なくとも１標準偏差、好ましくは少なくとも１．３標準偏差、またはより好ましくは少なくとも１．５標準偏差、またはさらにより好ましくは少なくとも２標準偏差、平均を上回るかまたは下回る値（すなわち、それぞれ１σ、１．３σ、１．５σまたは１．５σであり、σは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団において測定された正規分布により定義される標準偏差である）を含む。閾値（例えば、少なくとも１標準偏差、平均を上回るかまたは下回る）を使用することに加えて、一部の実施形態では、平均を上回るかまたは下回る変化の程度を、対象を診断するために使用してもよい。単離されたタウ試料は、ＡＤに起因するＭＣＩ、認知症またはＡＤの臨床診断を有し得るかまたは有し得ない対象から得ることができる。さらなる一実施形態では、対象は、優性遺伝性アルツハイマー病を引き起こすことが公知の遺伝子突然変異のうちの１つを有し得る。代わりの一実施形態では、対象は、優性遺伝性アルツハイマー病を引き起こすことが公知の遺伝子突然変異を有し得ない。

【0088】

部位特異的タウリン酸化の測定を使用する代わりに、またはそれに加えて、適宜総タウの測定を用いて、上記の実施形態のいずれかでは、測定されたリン酸化レベルから算出された比、または測定されたリン酸化レベルおよび総タウから算出された比を使用してもよい。両方の手法を、実施例において詳述する。比以外の数学演算も使用してもよい。例えば、実施例では、様々な統計学的モデル（例えば線形回帰、ＬＭＥ曲線、ＬＯＥＳＳ曲線等）における部位特異的タウリン酸化値を、他の公知のバイオマーカー（例えばＡＰＯＥε４状態、年齢、性別、認知試験スコア、機能試験スコア等）と併せて使用する。測定の選択および数学演算の選択は、方法の特異性を最大化するために最適化されてもよい。例えば、診断の精度は、ＲＯＣ曲線下面積により評価されてもよく、一部の実施形態では、０．７以上のＲＯＣ ＡＵＣ値（例えば０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５等）が閾値として設定される。

【0089】

ヒトにおける脳のアミロイドプラークは、慣習的に、アミロイド陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）により測定される。例えば、皮質Ａβプラークの^１１Ｃ－Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ化合物Ｂ（ＰｉＢ）ＰＥＴ画像化は、Ａβプラーク病態を検出するために一般的に使用される。皮質ＰｉＢ－ＰＥＴの標準取込値比（ｓｔａｎｄａｒｄ ｕｐｔａｋｅ ｖａｌｕｅ ｒａｔｉｏ）（ＳＵＶＲ）は、有意な皮質Ａβプラークを確実に同定し、対象を ＰＩＢ陽性（ＳＵＶＲ≧１．２５）または陰性（ＳＵＶＲ＜１．２５）と分類するために使用される。したがって、上記の実施形態では、ＰＥＴ画像化により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団は、皮質ＰｉＢ－ＰＥＴ ＳＵＶＲ＜１．２５を有する対象の集団を指すことがある。ＰｉＢ結合の他の値（例えば平均皮質結合能）または皮質領域以外の目的の領域の分析も、対象をＰＩＢ陽性または陰性と分類するために使用されてもよい。他のＰＥＴ造影剤も使用されてもよい。

【0090】

ＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団は、Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ， Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ， ２０１５に記載されるように、質量分析により測定される場合、＜０．１２のＡβ４２／４０測定を有する対象の集団を指すことがある。

【0091】

例示的な実施形態では、対象をＡＤに起因するＭＣＩへの転換の高いリスクを有すると診断する、または対象のＡＤのステージを診断するための方法は、（ａ）対象から得た単離されたタウ試料を用意すること、ならびに単離されたタウ試料中でＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基におけるタウリン酸化を測定すること、ならびに適宜総タウを測定することと、（ｂ）測定されたリン酸化レベルが、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団における平均から有意に逸脱する場合に、対象を、ＡＤに起因するＭＣＩへの転換の高いリスクを有すると診断すること、またはＡＤに起因するＭＣＩの発症まで数年であると診断すること、または対象のＡＤをステージ分類することとを含んでもよい。図２２は、ＡＤに起因するＭＣＩの発症までの年数に関して、単離されたタウ試料中のＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７で測定可能なタウリン酸化の動的パターンを例示する。平均から有意に逸脱するＴ２１７におけるリン酸化レベルは、ＡＤに起因するＭＣＩの発症まで約２１年で最初に起こり、平均から有意に逸脱するＴ１８１におけるリン酸化レベルは、ＡＤに起因するＭＣＩの発症まで約１９年で最初に起こり、平均から有意に逸脱する総タウの増大は、ＡＤに起因するＭＣＩの発症まで約１７年で最初に起こり、平均から有意に逸脱するＴ２０５におけるリン酸化レベルは、ＡＤに起因するＭＣＩの発症まで約１３年で最初に起こる。症状を（例えばＡＤに起因するＭＣＩ）発症すると、Ｔ２１７およびＴ１８１におけるリン酸化レベルはプラトーとなり、次に低減する。

【0092】

上述のように、限定されるものではないが、測定されたリン酸化レベルの間の比、および測定されたリン酸化と総タウとの間の比を含むさらなる数学演算を、Ｔ１８１、Ｔ２０５および／またはＴ２１７におけるリン酸化の測定とともに行うことができる。測定されたリン酸化レベルから算出された比は、ｐ－Ｔ１８１とｐ－Ｔ２０５との間、ｐ－Ｔ２１７とｐ－Ｔ２０５との間、またはｐ－Ｔ１８１とｐ－Ｔ２１７との間の比であってもよい。測定されたリン酸化レベルおよび総タウから算出された比は、ｐ－Ｔ１８１と総タウとの間、ｐ－Ｔ２０５と総タウとの間、またはｐ－Ｔ２１７と総タウとの間の比であってもよい。

【0093】

一例では、本開示の方法は、（ａ）対象から得られた単離されたタウ試料を用意すること、ならびに（ｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化を測定することと、（ｂ）Ｔ２１７および／またはＴ１８１におけるタウリン酸化が約１．５σ以上であり、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が約１．５σ以下である場合に、対象を、ＡＤに起因するＭＣＩの発症まで約１０～約２５年、または約１０～約２０年であると診断することとを含み、σは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団中で測定された、Ｔ２１７およびＴ２０５、Ｔ１８１およびＴ２０５またはＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である。様々な実施形態では、Ｔ２１７におけるタウリン酸化および／またはＴ１８１におけるタウリン酸化は、約１．３σ、約１．３５σ、約１．４σ、約１．４５σ、約１．５σ、約１．６σ、約１．７σ、約１．８σ、約１．９σ、約２σであるか、または２σを上回ってもよい。他の実施形態では、Ｔ２１７におけるタウリン酸化および／またはＴ１８１におけるタウリン酸化は、約１．８５σ、約１．９σ、約１．９５σ、約２σ、約２．１σ、約２．２σ、約２．３σ、約２．４σ、約２．５σであるか、または２．５σを上回ってもよい。上記の実施形態の各々では、Ｔ２０５におけるタウリン酸化は、約１．３σ、約１．３５σ、約１．４σ、約１．４５σ、約１．５σ、約１．５１σ、約１．５５σ、約１．６σ、約１．７σ、約１．８σ、約１．９σ、約２．０σであるか、または２．０σを下回ってもよい。あるいは、Ｔ２０５におけるリン酸化は、約２．０σ、約２．０５σ、約２．１σ、約２．２σ、約２．３σ、約２．４σ、約２．５σであるか、または２．５σを下回ってもよい。さらなる例では、Ｔ２１７におけるタウリン酸化および／またはＴ１８１におけるタウリン酸化は、約２σ以上であってもよく、Ｔ２０５におけるタウリン酸化は、約２σ以下であってもよい。閾値（例えば、少なくとも１標準偏差、平均を上回るかまたは下回る）を使用することに加えて、一部の実施形態では、平均を上回るかまたは下回る変化の程度を、対象を診断するために使用してもよい。なおさらなる実施形態では、Ｔ２０５における、ならびにＴ１８１および／またはＴ２１７におけるタウリン酸化の測定されたレベルは、各々それ自身と比較して予測力を改善するために、様々な数学演算において使用されてもよい。例えば、比は、測定されたリン酸化レベルから算出されてもよい。比以外の数学演算も使用してもよい。

【0094】

別の例では、本開示の方法は、（ａ）対象から得られた単離されたタウ試料を用意すること、ならびに総タウ、および（ｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化を測定することと、（ｂ）Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比、および／またはＴ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比が約１．５σ以上であり、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が約１．５σ以下である場合に、対象を、ＡＤに起因するＭＣＩの発症まで約１０～約２５年、または約１０～約２０年であると診断することとを含み、σは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団中で測定された、総タウ、ならびにＴ２１７およびＴ２０５、Ｔ１８１およびＴ２０５またはＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である。様々な実施形態では、Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比および／またはＴ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比は、約１．３σ、約１．３５σ、約１．４σ、約１．４５σ、約１．５σ、約１．６σ、約１．７σ、約１．８σ、約１．９σ、約２σであるか、または２σを上回ってもよい。他の実施形態では、Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比および／またはＴ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比は、約１．８５σ、約１．９σ、約１．９５σ、約２σ、約２．１σ、約２．２σ、約２．３σ、約２．４σ、約２．５σであるか、または２．５σを上回ってもよい。上記の実施形態の各々では、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比は、約１．３σ、約１．３５σ、約１．４σ、約１．４５σ、約１．５０σ、約１．５５σ、約１．６σ、約１．７σ、約１．８σ、約１．９σ、約２．０σであるか、または２σを下回ってもよい。あるいは、Ｔ２０５におけるリン酸化の総タウに対する比は、約２．０σ、約２．０５σ、約２．１σ、約２．２σ、約２．３σ、約２．４σ、約２．５σであるか、または２．５σを下回ってもよい。さらなる例では、Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比および／またはＴ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比は、約２σ以上であってもよく、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比は、約２σ以下であってもよい。閾値（例えば、少なくとも１標準偏差、平均を上回るかまたは下回る）を使用することに加えて、一部の実施形態では、平均を上回るかまたは下回る変化の程度を、対象を診断するために使用してもよい。

【0095】

別の例では、本開示の方法は、（ａ）対象から得られた単離されたタウ試料を用意すること、ならびに（ｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２１７およびＴ２０５におけるタウリン酸化を測定することと、（ｂ）（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特異的部位におけるタウリン酸化が約１．５σ以上である場合に、対象をＡＤに起因するＭＣＩの発症まで約１５年以下、または約１０年以下であると診断することとを含み、σは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団中で測定された、Ｔ２１７およびＴ２０５、Ｔ１８１およびＴ２０５またはＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である。様々な実施形態では、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特異的部位におけるタウリン酸化は、約１．３σ、約１．３５σ、約１．４σ、約１．４５σ、約１．５σ、約１．６σ、約１．７σ、約１．８σ、約１．９σ、約２σであるか、または２σを上回ってもよい。他の実施形態では、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特異的部位におけるタウリン酸化は、約１．８５σ、約１．９σ、約１．９５σ、約２σ、約２．１σ、約２．２σ、約２．３σ、約２．４σ、約２．５σであるか、または２．５σを上回ってもよい。さらなる実施形態では、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特異的部位におけるタウリン酸化は、約２σ以上であってもよい。閾値（例えば、少なくとも１標準偏差、平均を上回るかまたは下回る）を使用することに加えて、一部の実施形態では、平均を上回るかまたは下回る変化の程度を、対象を診断するために使用してもよい。なおさらなる実施形態では、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特異的部位におけるタウリン酸化の測定されたレベルは、各々それ自身と比較して予測力を改善するために、様々な数学演算において使用されてもよい。例えば、比は、測定されたリン酸化レベルから算出されてもよい。比以外の数学演算も使用してもよい。

【0096】

別の例では、本開示の方法は、（ａ）対象から得られた単離されたタウ試料を用意すること、ならびに総タウ、および（ｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２１７およびＴ２０５におけるタウリン酸化を測定することと、（ｂ）（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特異的部位におけるタウリン酸化の総タウに対する比が約１．５σ以上である場合に、対象をＡＤに起因するＭＣＩの発症まで約１５年以下、または約１０年以下であると診断することとを含み、σは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団中で測定された、総タウ、ならびにＴ２１７およびＴ２０５、Ｔ１８１およびＴ２０５またはＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である。様々な実施形態では、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特異的部位におけるタウリン酸化の総タウに対する比は、約１．３σ、約１．３５σ、約１．４σ、約１．４５σ、約１．５σ、約１．６σ、約１．７σ、約１．８σ、約１．９σ、約２σであるか、または２σを上回ってもよい。他の実施形態では、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特異的部位におけるタウリン酸化の総タウに対する比は、約１．８５σ、約１．９σ、約１．９５σ、約２σ、約２．１σ、約２．２σ、約２．３σ、約２．４σ、約２．５σであるか、または２．５σを上回ってもよい。さらなる実施形態では、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特異的部位におけるタウリン酸化の総タウに対する比は、約２σ以上であってもよい。閾値（例えば、少なくとも１標準偏差、平均を上回るかまたは下回る）を使用することに加えて、一部の実施形態では、平均を上回るかまたは下回る変化の程度を、対象を診断するために使用してもよい。

【0097】

別の例では、本開示の方法は、（ａ）対象から得た第１のおよび第２の単離されたタウ試料を用意することであって、「第１の」および「第２の」は、試料が収集された順序を指すこと、ならびに（ｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５、または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２１７およびＴ２０５におけるタウリン酸化を測定することと、（ｂ）測定された各残基における部位特異的タウリン酸化の変化、および適宜総タウの変化を算出することと、（ｃ）Ｔ１８１および／またはＴ２１７におけるリン酸化レベルが低減するかまたは同じままであり、Ｔ２０５におけるリン酸化レベルおよび適宜総タウが増大する場合、対象のＡＤのステージを診断することとを含む。第１のおよび第２の単離されたタウ試料は、数日、数週または数ヶ月の間隔で収集されてもよい。典型的に、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特異的部位におけるタウリン酸化も、両方の試料について約１．５σ以上となり、σは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団中で測定された、Ｔ２１７およびＴ２０５、Ｔ１８１およびＴ２０５またはＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である。なおさらなる実施形態では、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特異的部位におけるタウリン酸化の測定されたレベルは、各々それ自身と比較して予測力を改善するために、様々な数学演算において使用されてもよい。例えば、比は、測定されたリン酸化レベルから算出されてもよい。比以外の数学演算も使用してもよい。

【0098】

別の例では、本開示の方法は、（ａ）対象から得た第１のおよび第２の単離されたタウ試料を用意することであって、「第１の」および「第２の」は、試料が収集された順序を指すこと、ならびに総タウ、および（ｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５、または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２１７およびＴ２０５におけるタウリン酸化を測定することと、（ｂ）測定された各残基における部位特異的タウリン酸化の変化、および総タウの変化を算出することと、（ｃ）Ｔ１８１および／またはＴ２１７におけるリン酸化レベルが低減するかまたは同じままであり、Ｔ２０５におけるリン酸化レベルが低減するかまたは同じままであり、総タウが増大する場合、対象のＡＤのステージを診断することとを含む。第１のおよび第２の単離されたタウ試料は、数日、数週または数ヶ月の間隔で収集されてもよい。典型的に、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特異的部位におけるタウリン酸化も、両方の試料について約１．５σ以上となり、σは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団中で測定された、Ｔ２１７およびＴ２０５、Ｔ１８１およびＴ２０５またはＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である。なおさらなる実施形態では、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特異的部位におけるタウリン酸化の測定されたレベルは、各々それ自身と比較して予測力を改善するために、様々な数学演算において使用されてもよい。例えば、比は、測定されたリン酸化レベルから算出されてもよい。比以外の数学演算も使用してもよい。

【0099】

タウリン酸化および総タウを測定するための方法を、第ＩＩＩ節および第ＩＶ節に説明し、この節に参照により組み込む。例えば、実施例５－９について詳述したプロトコールを使用すると、ＰＥＴ画像化により測定される場合、ＣＳＦから精製された単離されたタウ試料中で測定される場合、脳アミロイドプラークを有しない対照集団中、ｐタウ／タウ比のパーセンテージとして示されるＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化は、それぞれ２１．７±２．３、０．３４±０．１３および１．２±０．６６である（表３、突然変異非保有者の列を参照されたい）。したがって、突然変異非保持者集団について見出されたｐ－Ｔ１８１／Ｔ１８１、ｐ－Ｔ２０５／Ｔ２０５およびｐ－Ｔ２１７／Ｔ２１７についての平均を上回る標準偏差の２倍（すなわち２σ）は、それぞれ４３．４、０．６８および２．４である。しかし、当業者は、絶対値が、絶対量定量に使用されるプロトコールおよび内部標準の供給源／規格に依存して変動し得ることを諒解するであろう。

【0100】

好ましい一実施形態では、単離されたタウ試料は、血液からアフィニティ精製により精製されたタウを含み、タウリン酸化は、質量分析により測定される。別の好ましい一実施形態では、単離されたタウ試料は、血液からアフィニティ精製により、タウのｍｉｄドメイン中のエピトープと特異的に結合するリガンドを使用して、および適宜タウのＮ末端中のエピトープと特異的に結合する第２のリガンドを用いて精製されたタウを含み、タウリン酸化は、高分解能質量分析により測定される。別の好ましい一実施形態では、単離されたタウ試料は、血液からアフィニティ精製により、タウのｍｉｄドメイン中のエピトープと特異的に結合するリガンドを使用して、および適宜タウのＭＴＢＲまたはＣ末端のエピトープと特異的に結合する第２のリガンドを用いて精製されたタウを含み、タウリン酸化は、高分解能質量分析により測定される。例示的な実施形態では、実施例において概説される質量分析プロトコールが使用される。

【0101】

ＶＩ．処置の方法
本開示の別の態様は、それを必要とする対象を処置するための方法である。「処置する」、「処置すること」または「処置」という用語は、本明細書において使用される場合、訓練を受け免許を受けた専門家による、それを必要とする対象への医学的ケアの提供を指す。医学的ケアは、診断試験、治療処置、および／または予防もしくは防止手段であってもよい。さらなる診断試験は、本明細書において開示されている方法により得られたタウリン酸化の測定に基づいて示され得る。例えば、本明細書において開示されているタウリン酸化を測定するための方法は、臨床家が、さらなる、および多くの場合より高価な診断試験についての必要性を決定することを支援するために、Ａβアミロイドーシスの最初のスクリーニングとして使用することができる。治療および予防的処置の目的は、所望されない生理学的変化または疾患／障害を防止するかまたは緩慢化する（和らげる）ことである。治療または予防的処置の有益なまたは所望の臨床結果には、限定されるものではないが、検出可能かまたは検出不可能かにかかわらず、症状の緩和、疾患の程度の減弱、安定化した（すなわち、悪化しない）病態、疾患進行の遅延または緩慢化、病態の改善または軽減、および寛解（部分または完全のいずれか）が挙げられる。「処置」は、処置を受けない場合に予測される生存期間と比較して生存期間を延長することも意味することができる。処置を必要とする者には、疾患、状態もしくは障害を既に有する者、ならびに疾患、状態もしくは障害を有する傾向にある者、または疾患、状態もしくは障害を防止する予定の者が挙げられる。一部の実施形態では、処置を受けている対象は無症候性である。「無症候性の対象」は、本明細書において使用される場合、ＡＤのいかなる徴候も症状も示さない対象を指す。別の実施形態では、対象は、ＡＤの徴候または症状（例えば記憶喪失、物を置き忘れること、気分または挙動の変化等）を呈し得るが、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害の臨床診断についての十分な認知障害も機能障害も示さない。「アルツハイマー病に起因する軽度認知障害」という句を、第Ｖ節において定義する。症候性または無症候性の対象はＡβアミロイドーシスを有し得るが、Ａβアミロイドーシスの事前知識は、処置のための必要条件ではない。なおさらなる実施形態では、対象はＡＤを有すると診断されてもよい。上述の実施形態のいずれかでは、対象は、優性遺伝性アルツハイマー病を引き起こすことが公知の遺伝子突然変異のうちの１つを有し得る。代わりの一実施形態では、対象は、優性遺伝性アルツハイマー病を引き起こすことが公知の遺伝子突然変異を有し得ない。

【0102】

一実施形態では、上記のような対象を処置するための方法は、（ａ）対象から得た単離されたタウ試料を用意すること、ならびに単離されたタウ試料中でＴ１１１、Ｓ１１３、Ｔ１８１、Ｓ１９９、Ｓ２０２、Ｓ２０８、Ｔ１５３、Ｔ１７５、Ｔ２０５、Ｓ２１４、Ｔ２１７およびＴ２３１から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基におけるタウリン酸化を測定すること、ならびに適宜総タウを測定することと、（ｂ）測定されたリン酸化レベルが、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団における平均から有意に逸脱する場合に、対象に医薬組成物を投与すること、を含んでもよい。別の実施形態では、上記のような対象を処置するための方法は、（ａ）対象から得た第１のおよび第２の単離されたタウ試料を用意すること、ならびに各単離されたタウ試料中でＴ１１１、Ｓ１１３、Ｔ１８１、Ｓ１９９、Ｓ２０２、Ｓ２０８、Ｔ１５３、Ｔ１７５、Ｔ２０５、Ｓ２１４、Ｔ２１７およびＴ２３１から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基におけるタウリン酸化を測定すること、ならびに適宜総タウを測定することと、（ｂ）測定された各残基における部位特異的タウリン酸化の変化、および適宜総タウの変化を算出することと、（ｃ）算出された変化が、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団における平均から有意に逸脱する場合に、対象に医薬組成物を投与すること、を含んでもよい。「平均から有意に逸脱する」は、少なくとも１標準偏差、好ましくは少なくとも１．３標準偏差、より好ましくは少なくとも１．５標準偏差、またはさらにより好ましくは少なくとも２標準偏差、平均を上回るかまたは下回る値（すなわち、それぞれ１σ、１．３σ、１．５σまたは１．５σであり、σは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団において測定された正規分布により定義される標準偏差である）を指す。閾値（例えば、少なくとも１標準偏差、平均を上回るかまたは下回る）を使用することに加えて、一部の実施形態では、平均を上回るかまたは下回る変化の程度を、対象を処置するための基準として使用してもよい。

【0103】

部位特異的タウリン酸化の測定を使用する代わりに、またはそれに加えて、適宜総タウの測定を用いて、上記の実施形態のいずれかでは、測定されたリン酸化レベルから算出された比、または測定されたリン酸化レベルおよび総タウから算出された比を使用してもよい。測定されたリン酸化レベルから算出された比は、ｐ－Ｔ１８１とｐ－Ｔ２０５との間、ｐ－Ｔ２１７とｐ－Ｔ２０５との間、またはｐ－Ｔ１８１とｐ－Ｔ２１７との間の比であってもよい。測定されたリン酸化レベルおよび総タウから算出された比は、ｐ－Ｔ１８１と総タウとの間、ｐ－Ｔ２０５と総タウとの間、またはｐ－Ｔ２１７と総タウとの間の比であってもよい。比以外の数学演算も使用してもよい。例えば、実施例では、様々な統計学的モデル（例えば線形回帰、ＬＭＥ曲線、ＬＯＥＳＳ曲線等）における部位特異的タウリン酸化値を、他の公知のバイオマーカー（例えばＡＰＯＥε４状態、年齢、性別、認知試験スコア、機能試験スコア等）と併せて使用する。血漿Ａβ４０、Ａβ４２またはＡβ４２／Ａβ４０比と組み合わせた部位特異的タウリン酸化値を使用してもよい。

【0104】

ＡβアミロイドーシスもしくはＡＤを発症するリスクのある対象、Ａβアミロイドーシスを有すると診断された対象、タウオパチーを有すると診断された対象、またはＡＤを有すると診断された対象に対して企図される、または彼らと共に使用される多数の造影剤および治療剤は、特定の病態生理の変化を標的とする。例えば、Ａβ標的療法は、一般的に、Ａβ産生を低減するか、Ａβ凝集に拮抗するか、または脳のＡβクリアランスを増大させるように設計され、タウ標的療法は、一般的にタウリン酸化パターンを変化させるか、タウ凝集に拮抗するか、またはＮＦＴクリアランスを増大させるように設計され、様々な療法は、ＣＮＳ炎症または脳のインスリン耐性を減少するように設計される、等である。これらの様々な薬剤の有効性は、本明細書において開示されている方法により測定される場合、Ｔ１１１、Ｓ１１３、Ｔ１８１、Ｓ１９９、Ｓ２０２、Ｓ２０８、Ｔ１５３、Ｔ１７５、Ｔ２０５、Ｓ２１４、Ｔ２１７およびＴ２３１におけるある特定のタウリン酸化レベルを有する対象に薬剤を投与することにより、改善することができる。

【0105】

例示的な実施形態では、ＡβアミロイドーシスもしくはＡＤを発症するリスクのある対象、Ａβアミロイドーシスを有すると診断された対象、タウオパチーを有すると診断された対象、またはＡＤを有すると診断された対象に対して企図される、または彼らと共に使用される造影剤および治療剤（集合的に、本明細書において「Ａβおよびタウ療法」と称する）の有効性は、本明細書において開示され、例えば図２２において例示される方法により測定される場合、Ｔ１８１、Ｔ２０５および／またはＴ２１７におけるある特定のタウリン酸化レベルを有する対象にＡβまたはタウ療法を投与することにより、改善することができる。例えば、Ｔ２１７におけるタウリン酸化が約１．５σ以上であり、Ｔ１８１およびＴ２０５におけるタウリン酸化が約１．５σ以下である場合、好ましい治療剤には、対象がアミロイド陽性となるのを防止するように設計されたもの（例えばＡβ産生を低減する、Ａβ凝集に拮抗するように設計されたアミロイド標的療法等）を挙げることができる。別の例として、Ｔ２１７および／またはＴ１８１におけるタウリン酸化が約１．５σ以上であり、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が約１．５σ以下である場合、好ましい治療剤には、アミロイド沈着が増大するのを防止するか、または対象の既存のプラーク負荷を減少するように設計されたものを挙げることができる。別の例では、Ｔ２１７、Ｔ１８１およびＴ２０５におけるタウリン酸化が約１．５σ以上である場合、好ましい治療剤には、アミロイド沈着が増大するのを防止するか、対象の既存のプラーク負荷を減少するか、タウ凝集を防止するか、またはＮＦＴを標的とするように設計されたものを挙げることができる。別の例として、Ｔ２１７、Ｔ１８１およびＴ２０５におけるタウリン酸化が約１．５σ以上であり、Ｔ２１７またはＴ１８１におけるタウリン酸化がプラトーとなるかまたは低減し、総タウおよび／またはＴ２０５におけるタウリン酸化が増大している場合、好ましい治療剤には、アミロイド沈着が増大するのを防止するか、対象の既存のプラーク負荷を減少するか、タウ凝集を防止するか、またはＮＦＴを標的とするように設計されたもの、ならびにＡＤを有する対象に特異的なものを挙げることができる。本明細書において開示されている詳細は、限定されるものではないが、以下の段落において特定されるものを含む、他の標的（例えばＣＮＳ炎症、ＡｐｏＥ等）のために設計された治療剤を投与するために、同様に使用することができる。

【0106】

一例では、本開示は、ＡＤに起因するＭＣＩへの転換の増大したリスクを有する対象を処置するための方法であって、（ａ）対象から得られた単離されたタウ試料を用意すること、ならびに（ｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化を測定することと、（ｂ）Ｔ２１７および／またはＴ１８１におけるタウリン酸化が約１．５σ以上であり、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が約１．５σ以下である場合に、対象に医薬組成物を投与することとを含み、σは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団中で測定された、Ｔ２１７およびＴ２０５、Ｔ１８１およびＴ２０５またはＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である、方法を提供する。様々な実施形態では、Ｔ２１７におけるタウリン酸化および／またはＴ１８１におけるタウリン酸化は、約１．３σ、約１．３５σ、約１．４σ、約１．４５σ、約１．５σ、約１．６σ、約１．７σ、約１．８σ、約１．９σ、約２σであるか、または２σを上回ってもよい。他の実施形態では、Ｔ２１７におけるタウリン酸化および／またはＴ１８１におけるタウリン酸化は、約１．８５σ、約１．９σ、約１．９５σ、約２σ、約２．１σ、約２．２σ、約２．３σ、約２．４σ、約２．５σであるか、または２．５σを上回ってもよい。上記の実施形態の各々では、Ｔ２０５におけるタウリン酸化は、約１．３σ、約１．３５σ、約１．４σ、約１．４５σ、約１．５σ、約１．５１σ、約１．５５σ、約１．６σ、約１．７σ、約１．８σ、約１．９σ、約２．０σであるか、または２．０σを下回ってもよい。あるいは、Ｔ２０５におけるリン酸化は、約２．０σ、約２．０５σ、約２．１σ、約２．２σ、約２．３σ、約２．４σ、約２．５σであるか、または２．５σを下回ってもよい。さらなる例では、Ｔ２１７におけるタウリン酸化および／またはＴ１８１におけるタウリン酸化は、約２σ以上であってもよく、Ｔ２０５におけるタウリン酸化は、約２σ以下であってもよい。閾値（例えば、少なくとも１標準偏差、平均を上回るかまたは下回る）を使用することに加えて、一部の実施形態では、平均を上回るかまたは下回る変化の程度を、対象を処置するための基準として使用してもよい。なおさらなる実施形態では、Ｔ２０５における、ならびにＴ１８１および／またはＴ２１７におけるタウリン酸化の測定されたレベルは、各々それ自身と比較して予測力を改善するために、様々な数学演算において使用されてもよい。例えば、比は、測定されたリン酸化レベルから算出されてもよい。比以外の数学演算も使用してもよい。

【0107】

別の例では、本開示は、ＡＤに起因するＭＣＩへの転換の増大したリスクを有する対象を処置するための方法であって、（ａ）対象から得られた単離されたタウ試料を用意すること、ならびに総タウ、および（ｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化を測定することと、（ｂ）Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比、および／またはＴ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比が約１．５σ以上であり、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が約１．５σ以下である場合に、対象に医薬組成物を投与することとを含み、σは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団中で測定された、総タウ、ならびにＴ２１７およびＴ２０５、Ｔ１８１およびＴ２０５またはＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である、方法を提供する。様々な実施形態では、Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比および／またはＴ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比は、約１．３σ、約１．３５σ、約１．４σ、約１．４５σ、約１．５σ、約１．６σ、約１．７σ、約１．８σ、約１．９σ、約２σであるか、または２σを上回ってもよい。他の実施形態では、Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比および／またはＴ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比は、約１．８５σ、約１．９σ、約１．９５σ、約２σ、約２．１σ、約２．２σ、約２．３σ、約２．４σ、約２．５σであるか、または２．５σを上回ってもよい。上記の実施形態の各々では、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比は、約１．３σ、約１．３５σ、約１．４σ、約１．４５σ、約１．５０σ、約１．５５σ、約１．６σ、約１．７σ、約１．８σ、約１．９σ、約２．０σであるか、または２σを下回ってもよい。あるいは、Ｔ２０５におけるリン酸化の総タウに対する比は、約２．０σ、約２．０５σ、約２．１σ、約２．２σ、約２．３σ、約２．４σ、約２．５σであるか、または２．５σを下回ってもよい。さらなる例では、Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比および／またはＴ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比は、約２σ以上であってもよく、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比は、約２σ以下であってもよい。閾値（例えば、少なくとも１標準偏差、平均を上回るかまたは下回る）を使用することに加えて、一部の実施形態では、平均を上回るかまたは下回る変化の程度を、対象を処置するための基準として使用してもよい。

【0108】

別の例では、本開示は、ＡＤに起因するＭＣＩへの転換の増大したリスクを有する対象を処置するための方法であって、（ａ）対象から得られた単離されたタウ試料を用意すること、ならびに（ｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２１７およびＴ２０５におけるタウリン酸化を測定することと、（ｂ）（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特異的部位におけるタウリン酸化が約１．５σ以上である場合に、対象に医薬組成物を投与することとを含み、σは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団中で測定された、Ｔ２１７およびＴ２０５、Ｔ１８１およびＴ２０５またはＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である、方法を提供する。様々な実施形態では、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特異的部位におけるタウリン酸化は、約１．３σ、約１．３５σ、約１．４σ、約１．４５σ、約１．５σ、約１．６σ、約１．７σ、約１．８σ、約１．９σ、約２σであるか、または２σを上回ってもよい。他の実施形態では、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特異的部位におけるタウリン酸化は、約１．８５σ、約１．９σ、約１．９５σ、約２σ、約２．１σ、約２．２σ、約２．３σ、約２．４σ、約２．５σであるか、または２．５σを上回ってもよい。さらなる実施形態では、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特異的部位におけるタウリン酸化は、約２σ以上であってもよい。閾値（例えば、少なくとも１標準偏差、平均を上回るかまたは下回る）を使用することに加えて、一部の実施形態では、平均を上回るかまたは下回る変化の程度を、対象を処置するための基準として使用してもよい。なおさらなる実施形態では、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特異的部位におけるタウリン酸化の測定されたレベルは、各々それ自身と比較して予測力を改善するために、様々な数学演算において使用されてもよい。例えば、比は、測定されたリン酸化レベルから算出されてもよい。比以外の数学演算も使用してもよい。

【0109】

別の例では、本開示は、ＡＤに起因するＭＣＩへの転換の増大したリスクを有する対象を処置するための方法であって、（ａ）対象から得られた単離されたタウ試料を用意すること、ならびに総タウ、および（ｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２１７およびＴ２０５におけるタウリン酸化を測定することと、（ｂ）（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特異的部位におけるタウリン酸化の総タウに対する比が約１．５σ以上である場合に、対象に医薬組成物を投与することとを含み、σは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団中で測定された、総タウ、ならびにＴ２１７およびＴ２０５、Ｔ１８１およびＴ２０５またはＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である、方法を提供する。様々な実施形態では、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特異的部位におけるタウリン酸化の総タウに対する比は、約１．３σ、約１．３５σ、約１．４σ、約１．４５σ、約１．５σ、約１．６σ、約１．７σ、約１．８σ、約１．９σ、約２σであるか、または２σを上回ってもよい。他の実施形態では、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特異的部位におけるタウリン酸化の総タウに対する比は、約１．８５σ、約１．９σ、約１．９５σ、約２σ、約２．１σ、約２．２σ、約２．３σ、約２．４σ、約２．５σであるか、または２．５σを上回ってもよい。さらなる実施形態では、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特異的部位におけるタウリン酸化の総タウに対する比は、約２σ以上であってもよい。閾値（例えば、少なくとも１標準偏差、平均を上回るかまたは下回る）を使用することに加えて、一部の実施形態では、平均を上回るかまたは下回る変化の程度を、対象を処置するための基準として使用してもよい。

【0110】

別の例では、本開示は、ＡＤの症状を有する対象を処置するための方法であって、（ａ）対象から得た第１のおよび第２の単離されたタウ試料を用意することであって、「第１の」および「第２の」は、試料が収集された順序を指すこと、ならびに（ｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５、または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２１７およびＴ２０５におけるタウリン酸化を測定することと、（ｂ）測定された各残基における部位特異的タウリン酸化の変化、および適宜総タウの変化を算出することと、（ｃ）Ｔ１８１および／またはＴ２１７におけるリン酸化レベルが低減するかまたは同じままであり、Ｔ２０５におけるリン酸化レベルおよび適宜総タウが増大する場合、対象に医薬組成物を投与することとを含む方法を提供する。第１のおよび第２の単離されたタウ試料は、数日、数週または数ヶ月の間隔で収集されてもよい。典型的に、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特異的部位におけるタウリン酸化も、両方の試料について約１．５σ以上となり、σは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団中で測定された、Ｔ２１７およびＴ２０５、Ｔ１８１およびＴ２０５またはＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である。なおさらなる実施形態では、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特異的部位におけるタウリン酸化の測定されたレベルは、各々それ自身と比較して予測力を改善するために、様々な数学演算において使用されてもよい。例えば、比は、測定されたリン酸化レベルから算出されてもよい。比以外の数学演算も使用してもよい。

【0111】

別の例では、本開示は、ＡＤの症状を有する対象を処置するための方法であって、（ａ）対象から得た第１のおよび第２の単離されたタウ試料を用意することであって、「第１の」および「第２の」は、試料が収集された順序を指すこと、ならびに総タウ、および（ｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５、または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２１７およびＴ２０５におけるタウリン酸化を測定することと、（ｂ）測定された各残基における部位特異的タウリン酸化の変化、および総タウの変化を算出することと、（ｃ）Ｔ１８１および／またはＴ２１７におけるリン酸化レベルが低減するかまたは同じままであり、Ｔ２０５におけるリン酸化レベルが低減するかまたは同じままであり、総タウが増大する場合、対象に医薬組成物を投与することとを含む方法を提供する。第１のおよび第２の単離されたタウ試料は、数日、数週または数ヶ月の間隔で収集されてもよい。典型的に、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特異的部位におけるタウリン酸化も、両方の試料について約１．５σ以上となり、σは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団中で測定された、Ｔ２１７およびＴ２０５、Ｔ１８１およびＴ２０５またはＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である。なおさらなる実施形態では、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特異的部位におけるタウリン酸化の測定されたレベルは、各々それ自身と比較して予測力を改善するために、様々な数学演算において使用されてもよい。例えば、比は、測定されたリン酸化レベルから算出されてもよい。比以外の数学演算も使用してもよい。

【0112】

上記の実施形態の各々では、医薬組成物は、造影剤を含んでもよい。造影剤の非限定的な例には、機能的造影剤（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｍａｇｉｎｇ ａｇｅｎｔ）（例えば、フルオロデオキシグルコース等）および分子造影剤（例えばＰｉｔｔｓｂｕｒｇｈ化合物Ｂ、フロルベタベン、フロルベタピル、フルテメタモル、放射性核種標識抗体等）が挙げられる。

【0113】

あるいは、医薬組成物は、医薬品有効成分を含んでもよい。医薬品有効成分の非限定的な例には、コリンエステラーゼ阻害剤、Ｎ－メチルＤ－アスパルテート（ＮＭＤＡ）アンタゴニスト、抗うつ剤（例えば選択的セロトニン再取り込み阻害剤、非定型抗うつ剤、アミノケトン、選択的セロトニンおよびノルエピネフリン再取り込み阻害剤、三環系抗うつ剤等）、ガンマ－セクレターゼ阻害剤、ベータ－セクレターゼ阻害剤、抗Ａβ抗体（抗原結合フラグメント、その変異体または誘導体を含む）、抗タウ抗体（抗原結合フラグメント、その変異体または誘導体を含む）、幹細胞、栄養補助食品（例えばリチウム水、リポ酸を有するオメガ３脂肪酸、長鎖トリグリセリド、ゲニステイン、レスベラトロール、クルクミンおよびグレープシード抽出物等）、セロトニン受容体６のアンタゴニスト、ｐ３８アルファＭＡＰＫ阻害剤、組換え顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、受動免疫療法、活性ワクチン（例えばＣＡＤ１０６、ＡＦ２０５１３等）、タウタンパク質凝集阻害剤（例えばＴＲｘ０２３７、塩化メチルチオニミウム等）、血糖管理を改善するための治療（例えばインスリン、エキセナチド、リラグルチドピオグリタゾン等）、抗炎症剤、ホスホジエステラーゼ９Ａ阻害剤、シグマ１受容体アゴニスト、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ活性化剤、ホスファターゼ阻害剤、アンジオテンシン受容体遮断薬、ＣＢ１および／またはＣＢ２エンドカンナビノイド受容体部分アゴニスト、β－２アドレナリン受容体アゴニスト、ニコチン性アセチルコリン受容体アゴニスト、５－ＨＴ２Ａ逆アゴニスト、アルファ－２ｃアドレナリン受容体アンタゴニスト、５－ＨＴ１Ａおよび１Ｄ受容体アゴニスト、グルタミニル－ペプチドシクロトランスフェラーゼ阻害剤、ＡＰＰ産生の選択的阻害剤、モノアミンオキシダーゼＢ阻害剤、グルタミン酸受容体アンタゴニスト、ＡＭＰＡ受容体アゴニスト、神経成長因子興奮剤、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、神経栄養剤（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ａｇｅｎｔ）、ムスカリン性Ｍ１受容体アゴニスト、ＧＡＢＡ受容体調節因子、ＰＰＡＲ－ガンマアゴニスト、微小管タンパク質調節因子、カルシウムチャネル遮断薬、抗高血圧薬、スタチン、ならびにそれらの任意の組合せが挙げられる。

【0114】

別の代替では、医薬組成物は、キナーゼ阻害剤を含んでもよい。好適なキナーゼ阻害剤は、ｔｈｏｕｓａｎｄ－ａｎｄ－ｏｎｅアミノ酸キナーゼ（ＴＡＯＫ）、ＣＤＫ、ＧＳＫ－３β、ＭＡＲＫ、ＣＤＫ５、Ｆｙｎ、５’アデノシン一リン酸活性化タンパク質キナーゼ（ＡＭＰＫ）、カルシウム－カルモジュリンキナーゼＩＩ、サイクリン依存性キナーゼ－５（ｃｄｋ５）、カゼインキナーゼ１（ＣＫ１）、カゼインキナーゼ２（ＣＫ２）、環状ＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ（ＰＫＡ）、二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ１Ａ（ＤＹＲＫ１Ａ）、グリコーゲン合成酵素キナーゼ－３（ＧＳＫ－３）、ＪＮＫ、ＬＲＲＫ２、微小管親和性調節キナーゼ（ＭＡＲＫ）、ＭＳＫ１、ｐ３５／４１、ｐ４２／ｐ４４分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＥＲＫｓ１／２）、ｐ３８分裂促進因子活性化キナーゼ（ｐ３８ＭＡＰＫ）、ｐ７０Ｓ６キナーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、ＰＫＢ／ＡＫＴ、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）、タンパク質キナーゼＮ（ＰＫＮ）、前立腺由来ｓｔｅｒｉｌｅ２０様キナーゼ１アルファ／ベータ、９０ｋＤａリボソームＳ６キナーゼ（ＲＳＫ１／２）（ＰＳＫ１／ＴＡＯＫ２）、前立腺由来ｓｔｅｒｉｌｅ２０様キナーゼ２（ＰＳＫ２／ＴＡＯＫ１）、ストレス活性化タンパク質キナーゼ（ＳＡＰＫ）１ガンマ、ＳＡＰＫ２ａ、ＳＡＰＫ２ｂ、ＳＡＰＫ３、ＳＡＰＫ４、ＳＧＫ１、ＳＲＰＫ２またはタウ－チューブリンキナーゼ１／２（ＴＴＢＫ１／２）を阻害し得る。

【0115】

なお別の代替では、医薬組成物は、ホスファターゼ活性化剤を含んでもよい。非限定的な例として、ホスファターゼ活性化剤は、プロテインホスファターゼ１、２Ａ、２Ｂまたは５の活性を増大させ得る。

【0116】

タウリン酸化および総タウを測定するための方法を、第ＩＩＩ節および第ＩＶ節に説明し、この節に参照により組み込む。好ましい一実施形態では、単離されたタウ試料は、血液からアフィニティ精製により精製されたタウを含み、タウリン酸化は、質量分析により測定される。別の好ましい一実施形態では、単離されたタウ試料は、血液からアフィニティ精製により、タウのｍｉｄドメイン中のエピトープと特異的に結合するリガンドを使用して、および適宜タウのＮ末端中のエピトープと特異的に結合する第２のリガンドを用いて精製されたタウを含み、タウリン酸化は、高分解能質量分析により測定される。別の好ましい一実施形態では、単離されたタウ試料は、血液からアフィニティ精製により、タウのｍｉｄドメイン中のエピトープと特異的に結合するリガンドを使用して、および適宜タウのＭＴＢＲまたはＣ末端のエピトープと特異的に結合する第２のリガンドを用いて精製されたタウを含み、タウリン酸化は、高分解能質量分析により測定される。例示的な実施形態では、実施例において概説される質量分析プロトコールが使用される。

【0117】

ＶＩＩ．臨床試験
本開示の別の態様は、臨床試験についてのすべての他の基準に合致することを条件として、対象を臨床試験、特にＡβまたはタウ療法のための臨床試験に登録するための方法である。一実施形態では、対象を臨床試験に登録するための方法は、（ａ）対象から得た単離されたタウ試料を用意すること、ならびに単離されたタウ試料中でＴ１１１、Ｓ１１３、Ｔ１８１、Ｓ１９９、Ｓ２０２、Ｓ２０８、Ｔ１５３、Ｔ１７５、Ｔ２０５、Ｓ２１４、Ｔ２１７およびＴ２３１から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基におけるタウリン酸化を測定すること、ならびに適宜総タウを測定することと、（ｂ）測定されたリン酸化レベルが、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団における平均から有意に逸脱する場合に、対象を臨床試験に登録すること、を含んでもよい。別の実施形態では、対象を臨床試験に登録するための方法は、（ａ）対象から得た第１のおよび第２の単離されたタウ試料を用意すること、ならびに各単離されたタウ試料中でＴ１１１、Ｓ１１３、Ｔ１８１、Ｓ１９９、Ｓ２０２、Ｓ２０８、Ｔ１５３、Ｔ１７５、Ｔ２０５、Ｓ２１４、Ｔ２１７およびＴ２３１から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基におけるタウリン酸化を測定すること、ならびに適宜総タウを測定することと、（ｂ）測定された各残基における部位特異的タウリン酸化の変化、および適宜総タウの変化を算出することと、（ｃ）算出された変化が、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団における平均から有意に逸脱する場合に、対象を臨床試験に登録すること、を含んでもよい。「ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団」という句を、第Ｖ節において定義する。「平均から有意に逸脱する」は、少なくとも１標準偏差、好ましくは少なくとも１．３標準偏差、より好ましくは少なくとも１．５標準偏差、またはさらにより好ましくは少なくとも２標準偏差、平均を上回るかまたは下回る値（すなわち、それぞれ１σ、１．３σ、１．５σまたは１．５σであり、σは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団において測定された正規分布により定義される標準偏差である）を指す。閾値（例えば、少なくとも１標準偏差、平均を上回るかまたは下回る）を使用することに加えて、一部の実施形態では、平均を上回るかまたは下回る変化の程度を、対象を登録するための基準として使用してもよい。

【0118】

部位特異的タウリン酸化の測定を使用する代わりに、またはそれに加えて、適宜総タウの測定を用いて、上記の実施形態のいずれかでは、測定されたリン酸化レベルから算出された比、または測定されたリン酸化レベルおよび総タウから算出された比を使用してもよい。測定されたリン酸化レベルから算出された比は、ｐ－Ｔ１８１とｐ－Ｔ２０５との間、ｐ－Ｔ２１７とｐ－Ｔ２０５との間、またはｐ－Ｔ１８１とｐ－Ｔ２１７との間の比であってもよい。測定されたリン酸化レベルおよび総タウから算出された比は、ｐ－Ｔ１８１と総タウとの間、ｐ－Ｔ２０５と総タウとの間、またはｐ－Ｔ２１７と総タウとの間の比であってもよい。比以外の数学演算も使用してもよい。例えば、実施例では、様々な統計学的モデル（例えば線形回帰、ＬＭＥ曲線、ＬＯＥＳＳ曲線等）における部位特異的タウリン酸化値を、他の公知のバイオマーカー（例えばＡＰＯＥε４状態、年齢、性別、認知試験スコア、機能試験スコア等）と併せて使用する。

【0119】

Ａβおよびタウ治療についての臨床試験の設計は、本明細書において開示されている方法により大いに支援することができる。多数の臨床試験は、ＡＤ症状の発症の前に起こる特異的な病態生理の変化を標的とする造影剤または治療剤の有効性を試験するために設計される。第ＶＩ節において上記で議論されたように、これらの様々な薬剤の有効性は、本明細書において開示および例示されている方法により測定される場合、ある特定の部位特異的タウリン酸化レベルを有する対象に薬剤を投与することにより、改善することができる。同様に、ＡＤの症状を有する（例えばＡＤに起因するＭＣＩの発症後の）対象を登録する臨床試験は、有効性が特定のＡＤのステージに関連するか決定するために登録者のＡＤ状態を正確にステージ分類することが可能であることからも、利益を得られるであろう。したがって、対象を臨床試験、特に臨床試験の処置群に登録する前に、本明細書において記載されているようにタウリン酸化レベルを測定することは、より小規模な試験および／または改善された転帰をもたらし得る。一部の場合では、本明細書において記載されている方法は、治療剤についてのコンパニオン診断として展開および使用されてもよい。

【0120】

例示的な実施形態では、対象を臨床試験に登録するための方法は、（ａ）対象から得た単離されたタウ試料を用意すること、ならびに単離されたタウ試料中でＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基におけるタウリン酸化を測定すること、ならびに適宜総タウを測定することと、（ｂ）測定されたリン酸化レベルが、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団における平均から有意に逸脱する場合に、対象を臨床試験に登録すること、を含んでもよい。別の例示的な実施形態では、対象を臨床試験に登録するための方法は、（ａ）対象から得た第１のおよび第２の単離されたタウ試料を用意すること、ならびに各単離されたタウ試料中でＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基におけるタウリン酸化を測定すること、ならびに適宜総タウを測定することと、（ｂ）測定された各残基における部位特異的タウリン酸化の変化、および適宜総タウの変化を算出することと、（ｃ）算出された変化が、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団における平均から有意に逸脱する場合に、対象を臨床試験に登録すること、を含んでもよい。「ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団」という句を、第Ｖ節において定義する。「平均から有意に逸脱する」は、少なくとも１標準偏差、好ましくは少なくとも１．３標準偏差、より好ましくは少なくとも１．５標準偏差、またはさらにより好ましくは少なくとも２標準偏差、平均を上回るかまたは下回る値（すなわち、それぞれ１σ、１．３σ、１．５σまたは１．５σであり、σは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団において測定された正規分布により定義される標準偏差である）を指す。閾値（例えば、少なくとも１標準偏差、平均を上回るかまたは下回る）を使用することに加えて、一部の実施形態では、平均を上回るかまたは下回る変化の程度を、対象を登録するための基準として使用してもよい。

【0121】

一例では、本開示は、対象を臨床試験に登録するための方法であって、（ａ）対象から得られた単離されたタウ試料を用意すること、ならびに（ｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化を測定することと、（ｂ）Ｔ２１７および／またはＴ１８１におけるタウリン酸化が約１．５σ以上であり、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が約１．５σ以下である場合に、対象に医薬組成物を投与することとを含み、σは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団中で測定された、Ｔ２１７およびＴ２０５、Ｔ１８１およびＴ２０５またはＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である、方法を提供する。様々な実施形態では、Ｔ２１７におけるタウリン酸化および／またはＴ１８１におけるタウリン酸化は、約１．３σ、約１．３５σ、約１．４σ、約１．４５σ、約１．５σ、約１．６σ、約１．７σ、約１．８σ、約１．９σ、約２σであるか、または２σを上回ってもよい。他の実施形態では、Ｔ２１７におけるタウリン酸化および／またはＴ１８１におけるタウリン酸化は、約１．８５σ、約１．９σ、約１．９５σ、約２σ、約２．１σ、約２．２σ、約２．３σ、約２．４σ、約２．５σであるか、または２．５σを上回ってもよい。上記の実施形態の各々では、Ｔ２０５におけるタウリン酸化は、約１．３σ、約１．３５σ、約１．４σ、約１．４５σ、約１．５σ、約１．５１σ、約１．５５σ、約１．６σ、約１．７σ、約１．８σ、約１．９σ、約２．０σであるか、または２．０σを下回ってもよい。あるいは、Ｔ２０５におけるリン酸化は、約２．０σ、約２．０５σ、約２．１σ、約２．２σ、約２．３σ、約２．４σ、約２．５σであるか、または２．５σを下回ってもよい。さらなる例では、Ｔ２１７におけるタウリン酸化および／またはＴ１８１におけるタウリン酸化は、約２σ以上であってもよく、Ｔ２０５におけるタウリン酸化は、約２σ以下であってもよい。閾値（例えば、少なくとも１標準偏差、平均を上回るかまたは下回る）を使用することに加えて、一部の実施形態では、平均を上回るかまたは下回る変化の程度を、対象を登録するための基準として使用してもよい。なおさらなる実施形態では、Ｔ２０５における、ならびにＴ１８１および／またはＴ２１７におけるタウリン酸化の測定されたレベルは、各々それ自身と比較して予測力を改善するために、様々な数学演算において使用されてもよい。例えば、比は、測定されたリン酸化レベルから算出されてもよい。比以外の数学演算も使用してもよい。

【0122】

別の例では、本開示は、対象を臨床試験に登録するための方法であって、（ａ）対象から得られた単離されたタウ試料を用意すること、ならびに総タウ、および（ｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化を測定することと、（ｂ）Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比、および／またはＴ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比が約１．５σ以上であり、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が約１．５σ以下である場合に、対象に医薬組成物を投与することとを含み、σは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団中で測定された、総タウ、ならびにＴ２１７およびＴ２０５、Ｔ１８１およびＴ２０５またはＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である、方法を提供する。様々な実施形態では、Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比および／またはＴ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比は、約１．３σ、約１．３５σ、約１．４σ、約１．４５σ、約１．５σ、約１．６σ、約１．７σ、約１．８σ、約１．９σ、約２σであるか、または２σを上回ってもよい。他の実施形態では、Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比および／またはＴ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比は、約１．８５σ、約１．９σ、約１．９５σ、約２σ、約２．１σ、約２．２σ、約２．３σ、約２．４σ、約２．５σであるか、または２．５σを上回ってもよい。上記の実施形態の各々では、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比は、約１．３σ、約１．３５σ、約１．４σ、約１．４５σ、約１．５０σ、約１．５５σ、約１．６σ、約１．７σ、約１．８σ、約１．９σ、約２．０σであるか、または２σを下回ってもよい。あるいは、Ｔ２０５におけるリン酸化の総タウに対する比は、約２．０σ、約２．０５σ、約２．１σ、約２．２σ、約２．３σ、約２．４σ、約２．５σであるか、または２．５σを下回ってもよい。さらなる例では、Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比および／またはＴ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比は、約２σ以上であってもよく、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比は、約２σ以下であってもよい。閾値（例えば、少なくとも１標準偏差、平均を上回るかまたは下回る）を使用することに加えて、一部の実施形態では、平均を上回るかまたは下回る変化の程度を、対象を登録するための基準として使用してもよい。

【0123】

別の例では、本開示は、対象を臨床試験に登録するための方法であって、（ａ）対象から得られた単離されたタウ試料を用意すること、ならびに（ｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２１７およびＴ２０５におけるタウリン酸化を測定することと、（ｂ）（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特異的部位におけるタウリン酸化が約１．５σ以上である場合に、対象に医薬組成物を投与することとを含み、σは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団中で測定された、Ｔ２１７およびＴ２０５、Ｔ１８１およびＴ２０５またはＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である、方法を提供する。様々な実施形態では、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特異的部位におけるタウリン酸化は、約１．３σ、約１．３５σ、約１．４σ、約１．４５σ、約１．５σ、約１．６σ、約１．７σ、約１．８σ、約１．９σ、約２σであるか、または２σを上回ってもよい。他の実施形態では、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特異的部位におけるタウリン酸化は、約１．８５σ、約１．９σ、約１．９５σ、約２σ、約２．１σ、約２．２σ、約２．３σ、約２．４σ、約２．５σであるか、または２．５σを上回ってもよい。さらなる実施形態では、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特異的部位におけるタウリン酸化は、約２σ以上であってもよい。閾値（例えば、少なくとも１標準偏差、平均を上回るかまたは下回る）を使用することに加えて、一部の実施形態では、平均を上回るかまたは下回る変化の程度を、対象を登録するための基準として使用してもよい。なおさらなる実施形態では、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特異的部位におけるタウリン酸化の測定されたレベルは、各々それ自身と比較して予測力を改善するために、様々な数学演算において使用されてもよい。例えば、比は、測定されたリン酸化レベルから算出されてもよい。比以外の数学演算も使用してもよい。

【0124】

別の例では、本開示は、対象を臨床試験に登録するための方法であって、（ａ）対象から得られた単離されたタウ試料を用意すること、ならびに総タウ、および（ｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２１７およびＴ２０５におけるタウリン酸化を測定することと、（ｂ）（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特異的部位におけるタウリン酸化の総タウに対する比が約１．５σ以上である場合に、対象に医薬組成物を投与することとを含み、σは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団中で測定された、総タウ、ならびにＴ２１７およびＴ２０５、Ｔ１８１およびＴ２０５またはＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である、方法を提供する。様々な実施形態では、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特異的部位におけるタウリン酸化の総タウに対する比は、約１．３σ、約１．３５σ、約１．４σ、約１．４５σ、約１．５σ、約１．６σ、約１．７σ、約１．８σ、約１．９σ、約２σであるか、または２σを上回ってもよい。他の実施形態では、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特異的部位におけるタウリン酸化の総タウに対する比は、約１．８５σ、約１．９σ、約１．９５σ、約２σ、約２．１σ、約２．２σ、約２．３σ、約２．４σ、約２．５σであるか、または２．５σを上回ってもよい。さらなる実施形態では、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特異的部位におけるタウリン酸化の総タウに対する比は、約２σ以上であってもよい。閾値（例えば、少なくとも１標準偏差、平均を上回るかまたは下回る）を使用することに加えて、一部の実施形態では、平均を上回るかまたは下回る変化の程度を、対象を登録するための基準として使用してもよい。

【0125】

別の例では、本開示は、対象を臨床試験に登録するための方法であって、（ａ）対象から得た第１のおよび第２の単離されたタウ試料を用意することであって、「第１の」および「第２の」は、試料が収集された順序を指すこと、ならびに（ｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５、または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２１７およびＴ２０５におけるタウリン酸化を測定することと、（ｂ）測定された各残基における部位特異的タウリン酸化の変化、および適宜総タウの変化を算出することと、（ｃ）Ｔ１８１および／またはＴ２１７におけるリン酸化レベルが低減するかまたは同じままであり、Ｔ２０５におけるリン酸化レベルおよび適宜総タウが増大する場合、対象を臨床試験に登録することとを含む方法を提供する。第１のおよび第２の単離されたタウ試料は、数日、数週または数ヶ月の間隔で収集されてもよい。典型的に、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特異的部位におけるタウリン酸化も、両方の試料について約１．５σ以上となり、σは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団中で測定された、Ｔ２１７およびＴ２０５、Ｔ１８１およびＴ２０５またはＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である。なおさらなる実施形態では、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特異的部位におけるタウリン酸化の測定されたレベルは、各々それ自身と比較して予測力を改善するために、様々な数学演算において使用されてもよい。例えば、比は、測定されたリン酸化レベルから算出されてもよい。比以外の数学演算も使用してもよい。

【0126】

別の例では、本開示は、対象を臨床試験に登録するための方法であって、（ａ）対象から得た第１のおよび第２の単離されたタウ試料を用意することであって、「第１の」および「第２の」は、試料が収集された順序を指すこと、ならびに総タウ、および（ｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５、または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２１７およびＴ２０５におけるタウリン酸化を測定することと、（ｂ）測定された各残基における部位特異的タウリン酸化の変化、および総タウの変化を算出することと、（ｃ）Ｔ１８１および／またはＴ２１７におけるリン酸化レベルが低減するかまたは同じままであり、Ｔ２０５におけるリン酸化レベルが低減するかまたは同じままであり、総タウが増大する場合、対象を臨床試験に登録することとを含む方法を提供する。第１のおよび第２の単離されたタウ試料は、数日、数週または数ヶ月の間隔で収集されてもよい。典型的に、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特異的部位におけるタウリン酸化も、両方の試料について約１．５σ以上となり、σは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団中で測定された、Ｔ２１７およびＴ２０５、Ｔ１８１およびＴ２０５またはＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である。なおさらなる実施形態では、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特異的部位におけるタウリン酸化の測定されたレベルは、各々それ自身と比較して予測力を改善するために、様々な数学演算において使用されてもよい。例えば、比は、測定されたリン酸化レベルから算出されてもよい。比以外の数学演算も使用してもよい。

【0127】

タウリン酸化および総タウを測定するための方法を、第ＩＩＩ節および第ＩＶ節に説明し、この節に参照により組み込む。例えば、実施例５－９について詳述したプロトコールを使用すると、ＰＥＴ画像化により測定される場合、ＣＳＦから精製された単離されたタウ試料中で測定される場合、脳アミロイドプラークを有しない対照集団中、Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化は、それぞれ２１．７±２．３、０．３４±０．１３および１．２±０．６６である（表３、突然変異非保有者の列を参照されたい）。したがって、突然変異非保持者集団について見出されたｐ－Ｔ１８１、ｐ－Ｔ２０５およびｐ－Ｔ２１７についての平均を上回る標準偏差の２倍（すなわち２σ）は、それぞれ４３．４、０．６８および２．４である。しかし、当業者は、絶対値が、プロトコールに依存して変動し得ることを諒解するであろう。

【0128】

好ましい一実施形態では、単離されたタウ試料は、血液からアフィニティ精製により精製されたタウを含み、タウリン酸化は、質量分析により測定される。別の好ましい一実施形態では、単離されたタウ試料は、血液からアフィニティ精製により、タウのｍｉｄドメイン中のエピトープと特異的に結合するリガンドを使用して、および適宜タウのＮ末端中のエピトープと特異的に結合する第２のリガンドを用いて精製されたタウを含み、タウリン酸化は、高分解能質量分析により測定される。別の好ましい一実施形態では、単離されたタウ試料は、血液からアフィニティ精製により、タウのｍｉｄドメイン中のエピトープと特異的に結合するリガンドを使用して、および適宜タウのＭＴＢＲまたはＣ末端のエピトープと特異的に結合する第２のリガンドを用いて精製されたタウを含み、タウリン酸化は、高分解能質量分析により測定される。例示的な実施形態では、実施例において概説される質量分析プロトコールが使用される。

【0129】

上記の実施形態の各々では、対象は、臨床試験の処置群に登録されてもよい。「処置」を、第ＶＩ節において定義する。臨床試験の処置群に登録された対象は、医薬組成物を投与されてもよい。一部の実施形態では、医薬組成物は、造影剤を含んでもよい。造影剤の非限定的な例には、機能的造影剤（例えば、フルオロデオキシグルコース等）および分子造影剤（例えばＰｉｔｔｓｂｕｒｇｈ化合物Ｂ、フロルベタベン、フロルベタピル、フルテメタモル、放射性核種標識抗体等）が挙げられる。あるいは、医薬組成物は、医薬品有効成分を含んでもよい。医薬品有効成分の非限定的な例には、コリンエステラーゼ阻害剤、Ｎ－メチルＤ－アスパルテート（ＮＭＤＡ）アンタゴニスト、抗うつ剤（例えば選択的セロトニン再取り込み阻害剤、非定型抗うつ剤、アミノケトン、選択的セロトニンおよびノルエピネフリン再取り込み阻害剤、三環系抗うつ剤等）、ガンマ－セクレターゼ阻害剤、ベータ－セクレターゼ阻害剤、抗Ａβ抗体（抗原結合フラグメント、その変異体または誘導体を含む）、抗タウ抗体（抗原結合フラグメント、その変異体または誘導体を含む）、幹細胞、栄養補助食品（例えばリチウム水、リポ酸を有するオメガ３脂肪酸、長鎖トリグリセリド、ゲニステイン、レスベラトロール、クルクミンおよびグレープシード抽出物等）、セロトニン受容体６のアンタゴニスト、ｐ３８αＭＡＰＫ阻害剤、組換え顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、受動免疫療法、活性ワクチン（例えばＣＡＤ１０６、ＡＦ２０５１３等）、タウタンパク質凝集阻害剤（例えばＴＲｘ０２３７、塩化メチルチオニニウム等）、血糖管理を改善するための治療（例えばインスリン、エキセナチド、リラグルチドピオグリタゾン等）、抗炎症剤、ホスホジエステラーゼ９Ａ阻害剤、シグマ１受容体アゴニスト、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ活性化剤、ホスファターゼ阻害剤、アンジオテンシン受容体遮断薬、ＣＢ１および／またはＣＢ２エンドカンナビノイド受容体部分アゴニスト、β－２アドレナリン受容体アゴニスト、ニコチン性アセチルコリン受容体アゴニスト、５－ＨＴ２Ａ逆アゴニスト、アルファ－２ｃアドレナリン受容体アンタゴニスト、５－ＨＴ１Ａおよび１Ｄ受容体アゴニスト、グルタミン－ペプチドシクロトランスフェラーゼ阻害剤、ＡＰＰ産生の選択的阻害剤、モノアミンオキシダーゼＢ阻害剤、グルタミン酸受容体アンタゴニスト、ＡＭＰＡ受容体アゴニスト、神経成長因子興奮剤、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、神経栄養剤、ムスカリン性Ｍ１受容体アゴニスト、ＧＡＢＡ受容体調節因子、ＰＰＡＲ－ガンマアゴニスト、微小管タンパク質調節因子、カルシウムチャネル遮断薬、抗高血圧薬、スタチン、ならびにそれらの任意の組合せが挙げられる。例示的な実施形態では、医薬組成物は、キナーゼ阻害剤を含んでもよい。好適なキナーゼ阻害剤は、ｔｈｏｕｓａｎｄ－ａｎｄ－ｏｎｅアミノ酸キナーゼ（ＴＡＯＫ）、ＣＤＫ、ＧＳＫ－３β、ＭＡＲＫ、ＣＤＫ５またはＦｙｎを阻害し得る。別の例示的な実施形態では、医薬組成物は、ホスファターゼ活性化剤を含んでもよい。非限定的な例として、ホスファターゼ活性化剤は、プロテインホスファターゼ２Ａの活性を増大させ得る。

【0130】

上記の実施形態の各々では、対象は、症候性であることもあればそうでないこともある。「無症候性の対象」は、本明細書において使用される場合、ＡＤのいかなる徴候も症状も示さない対象を指す。あるいは、対象は、ＡＤの徴候または症状（例えば記憶喪失、物を置き忘れること、気分または挙動の変化等）を呈し得るが、軽度認知障害の臨床診断についての十分な認知障害も機能障害も示さない。症候性または無症候性の対象はＡβアミロイドーシスを有し得るが、Ａβアミロイドーシスの事前知識は、処置のための必要条件ではない。なおさらなる実施形態では、対象はＡＤを有してもよい。上述の実施形態のいずれかでは、対象は、優性遺伝性アルツハイマー病を引き起こすことが公知の遺伝子突然変異のうちの１つを有し得る。代わりの一実施形態では、対象は、優性遺伝性アルツハイマー病を引き起こすことが公知の遺伝子突然変異を有し得ない。

【0131】

以下の例を、好ましい本発明の実施形態を表すために含める。以下の例において開示されている技術は、本発明の実践において良好に機能するために発明者らにより発見された技術を表すことが、当業者により理解されるべきである。しかし、当業者は、本開示に照らして、開示されている特定の実施形態における変更を行うことができ、本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様の又は類似した結果をなお得られることを理解するべきである。したがって、添付の図面において記載されるかまたは示されるすべての事柄は、例示的なものとして解釈されることとなり、意味を限定するものではない。

【0132】

ＶＩＩＩ．番号付き実施形態
実施形態１：可溶性タウを濃縮するために血液試料を処理するための方法であって、血液試料からのタンパク質を、過塩素酸を使用して沈殿させ、それにより血液の酸可溶性抽出物を製造することと、酸可溶性抽出物中の可溶性タウを、逆相吸着剤を使用する固相抽出および１つまたは複数のエピトープ結合剤を使用するアフィニティ精製により濃縮することとを含み、少なくとも１つのエピトープ結合剤はタウのＮ末端中またはタウのｍｉｄドメイン中のエピトープに特異的に結合する、方法。

【0133】

実施形態２：血液試料が血漿である、実施形態１の方法。

【0134】

実施形態３：血液試料が血清である、実施形態１の方法。

【0135】

実施形態４：過塩素酸が、約１％ｖ／ｖ～約１５％ｖ／ｖの最終濃度で添加される、先行する実施形態のいずれか１つの方法。

【0136】

実施形態５：過塩素酸が、約３％ｖ／ｖ～約１５％ｖ／ｖまたは約３％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖの最終濃度で添加される、実施形態４に記載の方法。

【0137】

実施形態６：過塩素酸が、約３％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖの最終濃度で添加される、実施形態４の方法。

【0138】

実施形態７：逆相吸着剤が、Ｎ－ビニルピロリドンとジビニルベンゼンとを含むポリマー、またはスチレンとジビニルベンゼンとを含むポリマーである、先行する実施形態のいずれか１つの方法。

【0139】

実施形態８：逆相吸着剤が、Ｎ－ビニルピロリドンとジビニルベンゼンとを含むポリマーである、実施形態７の方法。

【0140】

実施形態９：固相抽出が、約０．０５％ｖ／ｖ～約１％ｖ／ｖＴＦＡを含む移動相を使用する、実施形態７の方法。

【0141】

実施形態１０：固相抽出が、約０．０５％ｖ／ｖ～約０．５％ｖ／ｖ ＴＦＡまたは約０．１％ｖ／ｖ ＴＦＡ～約１％ｖ／ｖ ＴＦＡを含む移動相を使用する、実施形態９の方法。

【0142】

実施形態１１：可溶性タウが、約２０％ｖ／ｖ～約５０％ｖ／ｖアセトニトリルを含む移動相を使用して逆相吸着剤から溶出される、実施形態７の方法。

【0143】

実施形態１２：可溶性タウが、約２０％ｖ／ｖ～約４０％ｖ／ｖアセトニトリルまたは約３０％ｖ／ｖ～約５０％ｖ／ｖアセトニトリルを含む移動相を使用して逆相吸着剤から溶出される、実施形態１１の方法。

【0144】

実施形態１３：タウのＮ末端中のエピトープが、アミノ酸残基２７～３５を含み、タウのｍｉｄドメイン中のエピトープが、アミノ酸残基１９２～１９９を含む、先行する実施形態のいずれか１つの方法。

【0145】

実施形態１４：アフィニティ精製が、タウのＮ末端中のエピトープと特異的に結合する少なくとも１つのエピトープ結合剤、およびタウのｍｉｄドメイン中に特異的に結合する少なくとも１つのエピトープ結合剤を使用する、先行する実施形態のいずれか１つの方法。

【0146】

実施形態１５：各エピトープ結合剤が抗体である、実施形態１３または１４の方法。

【0147】

実施形態１６：可溶性タウを濃縮するために血液試料を処理するための方法であって、（ａ）血液試料からのタンパク質を、過塩素酸を使用して沈殿させ、過塩素酸が約１％ｖ／ｖ～約１５％ｖ／ｖの最終濃度で添加され、それにより血液の酸可溶性抽出物を製造することと、（ｂ）酸可溶性抽出物中の可溶性タウを固相抽出およびアフィニティ精製により濃縮することとを含み、固相抽出工程が、（ｉ）酸可溶性抽出物を、可溶性タウを逆相吸着剤に付着させるのに十分な時間、逆相吸着剤とともに混合することであって、逆相吸着剤は、Ｎ－ビニルピロリドンとジビニルベンゼンとを含むポリマー、またはスチレンとジビニルベンゼンとを含むポリマーであること、（ｉｉ）逆相吸着剤に付着したタウを、約０．０５％ｖ／ｖ～約１％ｖ／ｖＴＦＡを含む移動相を用いて洗浄すること、および（ｉｉｉ）可溶性タウを、約０．０５％ｖ／ｖ～約１％ｖ／ｖＴＦＡおよび約２０％ｖ／ｖ～約５０％ｖ／ｖアセトニトリルを含む移動相を使用して逆相吸着剤から溶出することを含み、アフィニティ精製工程が、タウのＮ末端中のエピトープと特異的に結合する少なくとも１つのエピトープ結合剤、およびタウのｍｉｄドメイン中のエピトープに特異的に結合する少なくとも１つのエピトープ結合剤を含む、方法。

【0148】

実施形態１７：移動相が、約０．０５％ｖ／ｖ～約０．５％ｖ／ｖＴＦＡを含む、実施形態１６の方法。

【0149】

実施形態１８：移動相が、約０．１％ｖ／ｖ ＴＦＡ～約１％ｖ／ｖ ＴＦＡを含む、実施形態１６の方法。

【0150】

実施形態１９：タウを溶出するのに使用される移動相が、約２０％ｖ／ｖ～約４０％ｖ／ｖアセトニトリルを含む、実施形態１７または１８の方法。

【0151】

実施形態２０：タウを溶出するのに使用される移動相が、約３０％ｖ／ｖ～約５０％ｖ／ｖアセトニトリルを含む、実施形態１７または１８の方法。

【0152】

実施形態２１：タウのＮ末端中のエピトープが、アミノ酸残基２７～３５を含み、タウのｍｉｄドメイン中のエピトープが、アミノ酸残基１９２～１９９を含む、実施形態１６から２０のいずれか１つの方法。

【0153】

実施形態２２：各エピトープ結合剤が抗体である、実施形態１６から２１のいずれか１つの方法。

【0154】

実施形態２３：血液試料中の可溶性タウを分析するための方法であって、（ａ）実施形態１から２２のいずれか１つの血液試料を処理して可溶性タウが濃縮された試料を製造することと、（ｂ）可溶性タウが濃縮された試料を質量分析により分析することとを含む方法。

【0155】

実施形態２４：血液試料中の総タウの量を決定する為の方法であって、（ｂ）実施形態１から２２のいずれか１つの血液試料を処理して可溶性タウが濃縮された試料を製造することと、（ｂ）可溶性タウが濃縮された試料を質量分析により分析することとを含む方法。

【0156】

実施形態２５：タウの１つまたは複数の残基におけるリン酸化の量を測定するための方法であって、（ａ）実施形態１から２２のいずれか１つの血液試料を処理して可溶性タウが濃縮された試料を製造することと、（ｂ）質量分析によりタウの１つまたは複数の残基におけるリン酸化の量を測定することとを含む方法。

【0157】

実施形態２６：タウのリン酸化が、Ｔ１１１、Ｓ１１３、Ｔ１８１、Ｓ１９９、Ｓ２０２、Ｓ２０８、Ｔ１５３、Ｔ１７５、Ｔ２０５、Ｓ２１４、Ｔ２１７およびＴ２３１から選択される１つまたは複数の残基において測定される、実施形態２５の方法。

【0158】

実施形態２７：タウのリン酸化が、Ｔ１８１、Ｓ２０２またはＴ２１７のうちの少なくとも１つを含む１つまたは複数の残基において測定される、実施形態２５の方法。

【0159】

実施形態２８：タウのリン酸化が、Ｔ１８１、Ｓ２０２またはＴ２１７のうちの少なくとも１つを含む２つ以上の残基において測定される、実施形態２５の方法。

【0160】

実施形態２９：血液試料が、少なくとも約１ｍｌの血漿または少なくとも２ｍｌの全血である、実施形態２３から２８のいずれか１つの方法。

【0161】

実施形態３０：血液試料が、少なくとも約１ｍｌ～約２０ｍｌの血漿である、実施形態２３から２８のいずれか１つの方法。

【0162】

実施形態３１：トリプシン、Ｌｙｓ－Ｎ、Ｌｙｓ－ＣまたはＡｒｇ－Ｎの存在下で実行される消化工程をさらに含み、消化工程が血液試料の処理の後に行われる、実施形態２３から３０のいずれか１つの方法。

【0163】

実施形態３２：トリプシン、Ｌｙｓ－Ｎ、Ｌｙｓ－ＣまたはＡｒｇ－Ｎの存在下で実行される消化工程をさらに含み、消化工程が、タウが少なくとも１つのエピトープ結合剤と結合している間に行われる、実施形態２３から３０のいずれか１つの方法。

【0164】

実施形態３３：消化工程がトリプシンの存在下で行われる、実施形態３１または３２の方法。

【0165】

実施形態３４：血液試料が、無症候性の対象、アルツハイマー病の徴候または症状を呈するが、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害の臨床診断についての十分な認知障害も機能障害も示さない対象、ＡＤを有すると診断された対象、神経変性疾患と診断された対象、タウオパチーと診断された対象、認知症と診断された対象、または軽度認知障害と診断された対象から得られる、先行する実施形態のいずれか１つの方法。

【0166】

実施形態３５：血液試料が進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核症候群（ＣＢＳ）、ダウン症候群（ＤＳ）、パーキンソン病（ＰＤ）およびレビー小体型認知症（ＤＬＢ）と診断された対象から得られる、実施形態３４の方法。

【0167】

実施形態３６：アルツハイマー病の発症の前に対象を診断するための方法であって、（ａ）対象から得られた単離されたタウ試料を用意すること、ならびに（ｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化を測定することと、（ｂ）Ｔ２１７またはＴ１８１におけるタウリン酸化が約１．５σ以上であり、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が約１．５σ以下である場合に、対象を、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害への転換の増大したリスクを有すると診断することとを含み、σは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団中で測定された、Ｔ２１７およびＴ２０５、Ｔ１８１およびＴ２０５またはＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である、方法。

【0168】

実施形態３７：Ｔ２１７におけるタウリン酸化が１．５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が１．５σを下回る場合に、対象が診断される、実施形態２６の方法。

【0169】

実施形態３８：（ｉ）Ｔ２１７におけるタウリン酸化が１．７５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が１．７５σを下回る場合、（ｉｉ）Ｔ２１７におけるタウリン酸化が１．８σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が１．８σを下回る場合、または（ｉｉｉ）Ｔ２１７におけるタウリン酸化が１．９σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が１．９σを下回る場合に、対象が診断される、実施形態３７の方法。

【0170】

実施形態３９：Ｔ２１７におけるタウリン酸化が２σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が２σを下回る場合に、対象が診断される、実施形態３７の方法。

【0171】

実施形態４０：Ｔ１８１におけるタウリン酸化が１．５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が１．５σを下回る場合に、対象が診断される、実施形態２６の方法。

【0172】

実施形態４１：（ｉ）Ｔ１８１におけるタウリン酸化が１．７５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が１．７５σを下回る場合、（ｉｉ）Ｔ１８１におけるタウリン酸化が１．８σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が１．８σを下回る場合、または（ｉｉｉ）Ｔ１８１におけるタウリン酸化が１．９σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が１．９σを下回る場合に、対象が診断される、実施形態４０の方法。

【0173】

実施形態４２：Ｔ１８１におけるタウリン酸化が２σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が２σを下回る場合に、対象が診断される、実施形態４０の方法。

【0174】

実施形態４３：Ｔ１８１およびＴ２１７におけるタウリン酸化が１．５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が１．５σを下回る場合に、対象が診断される、実施形態３６の方法。

【0175】

実施形態４４：（ｉ）Ｔ１８１およびＴ２１７におけるタウリン酸化が１．７５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が１．７５σを下回る場合、（ｉｉ）Ｔ１８１およびＴ２１７におけるタウリン酸化が１．８σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が１．８σを下回る場合、または（ｉｉｉ）Ｔ１８１およびＴ２１７におけるタウリン酸化が１．９σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が１．９σを下回る場合に、対象が診断される、実施形態４３の方法。

【0176】

実施形態４５：Ｔ１８１およびＴ２１７におけるタウリン酸化が２σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が２σを下回る場合に、対象が診断される、実施形態４３の方法。

【0177】

実施形態４６：診断が、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害の発症まで約１０～約２５年として対象を識別することをさらに含む、実施形態３６から４５のいずれか１つの方法。

【0178】

実施形態４７：診断が、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害の発症まで約１０～約２０年として対象を識別することをさらに含む、実施形態４６の方法。

【0179】

実施形態４８：アルツハイマー病の発症の前に対象を診断するための方法であって、（ａ）対象から得られた単離されたタウ試料を用意すること、ならびに総タウを測定すること、ならびに（ｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化を測定することと、（ｂ）Ｔ２１７またはＴ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比が２σを超え、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が２σを下回る場合に、対象を、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害への転換の増大したリスクを有すると診断することとを含み、σは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団中で測定された、総タウ、ならびにＴ２１７およびＴ２０５、Ｔ１８１およびＴ２０５またはＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である、方法。

【0180】

実施形態４９：Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．５σを下回る場合に、対象が診断される、実施形態４８の方法。

【0181】

実施形態５０：（ｉ）Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．７５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．７５σを下回る場合、（ｉｉ）Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウＴ２１７に対する比が１．８σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウＴ２０５に対する比が１．８σを下回る場合、または（ｉｉｉ）Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．９σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．９σを下回る場合に、対象が診断される、実施形態３９の方法。

【0182】

実施形態５１：Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が２σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が２σを下回る場合に、対象が診断される、実施形態３９の方法。

【0183】

実施形態５２：Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．５σを下回る場合に、対象が診断される、実施形態４８の方法。

【0184】

実施形態５３：（ｉ）Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．７５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．７５σを下回る場合、（ｉｉ）Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．８σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．８σを下回る場合、または（ｉｉｉ）Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．９σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．９σを下回る場合に、対象が診断される、実施形態５２の方法。

【0185】

実施形態５４：Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比が２σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が２σを下回る場合に、対象が診断される、実施形態５２の方法。

【0186】

実施形態５５：Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比およびＴ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．５σを下回る場合に、対象が診断される、実施形態４８の方法。

【0187】

実施形態５６：（ｉ）Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比およびＴ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．７５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．７５σを下回る場合、（ｉｉ）Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比およびＴ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．８σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．８σを下回る場合、または（ｉｉｉ）Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比およびＴ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．９σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．９σを下回る場合に、対象が診断される、実施形態５５の方法。

【0188】

実施形態５７：Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比およびＴ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が２σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が２σを下回る場合に、対象が診断される、実施形態５５の方法。

【0189】

実施形態５８：診断が、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害の発症まで約１０～約２５年として対象を識別することをさらに含む、実施形態４８から５７のいずれか１つの方法。

【0190】

実施形態５９：診断が、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害の発症まで約１０～約２０年として対象を識別することをさらに含む、実施形態５８の方法。

【0191】

実施形態６０：アルツハイマー病の発症の前に対象を診断するための方法であって、（ａ）対象から得られた単離されたタウ試料を用意すること、ならびに（ｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化を測定することと、（ｂ）（ｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化が約１．５σ以上である場合に、対象を、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害への転換の増大したリスクを有すると診断することとを含み、σは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団中で測定された、Ｔ２１７およびＴ２０５、Ｔ１８１およびＴ２０５またはＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である、方法。

【0192】

実施形態６１：Ｔ２１７およびＴ２０５におけるタウリン酸化が１．５σを上回る場合に、対象が診断される、実施形態６０の方法。

【0193】

実施形態６２：Ｔ２１７およびＴ２０５におけるタウリン酸化が１．７５σを上回るか、１．８σを上回るか、または１．９σを上回る場合に、対象が診断される、実施形態６１の方法。

【0194】

実施形態６３：Ｔ２１７およびＴ２０５におけるタウリン酸化が２σを上回る場合に、対象が診断される、実施形態６１の方法。

【0195】

実施形態６４：Ｔ１８１およびＴ２０５におけるタウリン酸化が１．５σを上回る場合に、対象が診断される、実施形態６０の方法。

【0196】

実施形態６５：Ｔ１８１およびＴ２０５におけるタウリン酸化が１．７５σを上回るか、１．８σを上回るか、または１．９σを上回る場合に、対象が診断される、実施形態６４の方法。

【0197】

実施形態６６：Ｔ１８１およびＴ２０５におけるタウリン酸化が２σを上回る場合に、対象が診断される、実施形態６４の方法。

【0198】

実施形態６７：Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化が１．５σを上回る場合に、対象が診断される、実施形態６０の方法。

【0199】

実施形態６８：Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化が１．７５σを上回るか、１．８σを上回るか、または１．９σを上回る場合に、対象が診断される、実施形態６７の方法。

【0200】

実施形態６９：Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化が２σを上回る場合に、対象が診断される、実施形態６７の方法。

【0201】

実施形態７０：診断が、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害の発症まで約１５年以下として対象を識別することをさらに含む、実施形態６０から６９のいずれか１つの方法。

【0202】

実施形態７１：診断が、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害の発症まで約１０年以下として対象を識別することをさらに含む、実施形態６０の方法。

【0203】

実施形態７２：アルツハイマー病の発症の前に対象を診断するための方法であって、（ａ）対象から得られた単離されたタウ試料を用意すること、ならびに総タウを測定すること、ならびに（ｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化を測定することと、（ｂ）（ｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が約１．５σ以上である場合に、対象を、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害への転換の増大したリスクを有すると診断することとを含み、σは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団中で測定された総タウ、ならびにＴ２１７およびＴ２０５、Ｔ１８１およびＴ２０５またはＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である、方法。

【0204】

実施形態７３：Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．５σを上回る場合に、対象が診断される、実施形態７２の方法。

【0205】

実施形態７４：（ｉ）Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．７５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．７５σを上回る場合、（ｉｉ）Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．８σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．８σを上回る場合、（ｉｉｉ）Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．９σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．９σを上回る場合に、対象が診断される、実施形態７３の方法。

【0206】

実施形態７５：Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が２σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が２σを上回る場合に、対象が診断される、実施形態７３の方法。

【0207】

実施形態７６：Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．５σを上回る場合に、対象が診断される、実施形態７２の方法。

【0208】

実施形態７７：（ｉ）Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．７５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．７５σを上回る場合、（ｉｉ）Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．８σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．８σを上回る場合、（ｉｉｉ）Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．９σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．９σを上回る場合に、対象が診断される、実施形態７６の方法。

【0209】

実施形態７８：Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比が２σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が２σを上回る場合に、対象が診断される、実施形態７６の方法。

【0210】

実施形態７９：Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．５σを上回り、Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．５σを上回る場合に、対象が診断される、実施形態７２の方法。

【0211】

実施形態８０：（ｉ）Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．７５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．７５σを上回り、Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．７５σを上回る場合、（ｉｉ）Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．８σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．８σを上回り、Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．８σを上回る場合、または（ｉｉｉ）Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．９σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．９σを上回り、Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．９σを上回る場合に、対象が診断される、実施形態７９の方法。

【0212】

実施形態８１：Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比が２σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が２σを上回り、Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が２σを上回る場合に、対象が診断される、実施形態７９の方法。

【0213】

実施形態８２：診断が、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害の発症まで約１５年以下として対象を識別することをさらに含む、実施形態７２から８１のいずれか１つの方法。

【0214】

実施形態８３：診断が、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害の発症まで約１０年以下として対象を識別することをさらに含む、実施形態８２の方法。

【0215】

実施形態８４：それを必要とする対象を処置するための方法であって、（ａ）対象から得られた単離されたタウ試料を用意すること、ならびに（ｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化を測定することと、（ｂ）Ｔ２１７またはＴ１８１におけるタウリン酸化が約１．５σ以上であり、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が約１．５σ以下である場合に、対象に医薬組成物を投与することとを含み、σは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団中で測定された、Ｔ２１７およびＴ２０５、Ｔ１８１およびＴ２０５またはＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である、方法。

【0216】

実施形態８５：Ｔ２１７におけるタウリン酸化が１．５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が１．５σを下回る場合に、対象に医薬組成物が投与される、実施形態８４の方法。

【0217】

実施形態８６：（ｉ）Ｔ２１７におけるタウリン酸化が１．７５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が１．７５σを下回る場合、（ｉｉ）Ｔ２１７におけるタウリン酸化が１．８σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が１．８σを下回る場合、または（ｉｉｉ）Ｔ２１７におけるタウリン酸化が１．９σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が１．９σを下回る場合に、対象に医薬組成物が投与される、実施形態８５の方法。

【0218】

実施形態８７：Ｔ２１７におけるタウリン酸化が２σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が２σを下回る場合に、対象に医薬組成物が投与される、実施形態８５の方法。

【0219】

実施形態８８：Ｔ１８１におけるタウリン酸化が１．５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が１．５σを下回る場合に、対象に医薬組成物が投与される、実施形態８４の方法。

【0220】

実施形態８９：（ｉ）Ｔ１８１におけるタウリン酸化が１．７５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が１．７５σを下回る場合、（ｉｉ）Ｔ１８１におけるタウリン酸化が１．８σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が１．８σを下回る場合、または（ｉｉｉ）Ｔ１８１におけるタウリン酸化が１．９σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が１．９σを下回る場合に、対象に医薬組成物が投与される、実施形態８８の方法。

【0221】

実施形態９０：Ｔ１８１におけるタウリン酸化が２σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が２σを下回る場合に、対象に医薬組成物が投与される、実施形態８８の方法。

【0222】

実施形態９１：Ｔ１８１およびＴ２１７におけるタウリン酸化が１．５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が１．５σを下回る場合に、対象に医薬組成物が投与される、実施形態８４の方法。

【0223】

実施形態９２：（ｉ）Ｔ１８１およびＴ２１７におけるタウリン酸化が１．７５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が１．７５σを下回る場合、（ｉｉ）Ｔ１８１およびＴ２１７におけるタウリン酸化が１．８σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が１．８σを下回る場合、または（ｉｉｉ）Ｔ１８１およびＴ２１７におけるタウリン酸化が１．９σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が１．９σを下回る場合に、対象に医薬組成物が投与される、実施形態９１の方法。

【0224】

実施形態９３：Ｔ１８１およびＴ２１７におけるタウリン酸化が２σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が２σを下回る場合に、対象に医薬組成物が投与される、実施形態９１の方法。

【0225】

実施形態９４：それを必要とする対象を処置するための方法であって、（ａ）対象から得られた単離されたタウ試料を用意すること、ならびに総タウを測定すること、ならびに（ｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化を測定することと、（ｂ）Ｔ２１７またはＴ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比が２σを超え、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が２σを下回る場合に、対象に医薬組成物を投与することとを含み、σは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団中で測定された、総タウ、ならびにＴ２１７およびＴ２０５、Ｔ１８１およびＴ２０５またはＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である、方法。

【0226】

実施形態９５：Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．５σを下回る場合に、対象に医薬組成物が投与される、実施形態９４の方法。

【0227】

実施形態９６：（ｉ）Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．７５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．７５σを下回る場合、（ｉｉ）Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウＴ２１７に対する比が１．８σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウＴ２０５に対する比が１．８σを下回る場合、または（ｉｉｉ）Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．９σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．９σを下回る場合に、対象に医薬組成物が投与される、実施形態９５の方法。

【0228】

実施形態９７：Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が２σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が２σを下回る場合に、対象に医薬組成物が投与される、実施形態９５の方法。

【0229】

実施形態９８：Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．５σを下回る場合に、対象に医薬組成物が投与される、実施形態９４の方法。

【0230】

実施形態９９：（ｉ）Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．７５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．７５σを下回る場合、（ｉｉ）Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．８σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．８σを下回る場合、または（ｉｉｉ）Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．９σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．９σを下回る場合に、対象に医薬組成物が投与される、実施形態９８の方法。

【0231】

実施形態１００：Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比が２σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が２σを下回る場合に、対象に医薬組成物が投与される、実施形態９８の方法。

【0232】

実施形態１０１：Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比およびＴ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．５σを下回る場合に、対象に医薬組成物が投与される、実施形態９７の方法。

【0233】

実施形態１０２：（ｉ）Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比およびＴ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．７５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．７５σを下回る場合、（ｉｉ）Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比およびＴ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．８σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．８σを下回る場合、または（ｉｉｉ）Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比およびＴ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．９σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．９σを下回る場合に、対象に医薬組成物が投与される、実施形態１０１の方法。

【0234】

実施形態１０３：Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比およびＴ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が２σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が２σを下回る場合に、対象に医薬組成物が投与される、実施形態１０１の方法。

【0235】

実施形態１０４：それを必要とする対象を処置するための方法であって、（ａ）対象から得られた単離されたタウ試料を用意すること、ならびに（ｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化を測定することと、（ｂ）（ｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化が約１．５σ以上である場合に、対象に医薬組成物を投与することとを含み、σは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団中で測定された、Ｔ２１７およびＴ２０５、Ｔ１８１およびＴ２０５またはＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である、方法。

【0236】

実施形態１０５：Ｔ２１７およびＴ２０５におけるタウリン酸化が１．５σを上回る場合に、対象に医薬組成物が投与される、実施形態１０４の方法。

【0237】

実施形態１０６：Ｔ２１７およびＴ２０５におけるタウリン酸化が１．７５σを上回るか、１．８σを上回るか、または１．９σを上回る場合に、対象に医薬組成物が投与される、実施形態１０５の方法。

【0238】

実施形態１０７：Ｔ２１７およびＴ２０５におけるタウリン酸化が２σを上回る場合に、対象に医薬組成物が投与される、実施形態１０５の方法。

【0239】

実施形態１０８：Ｔ１８１およびＴ２０５におけるタウリン酸化が１．５σを上回る場合に、対象に医薬組成物が投与される、実施形態１０４の方法。

【0240】

実施形態１０９：Ｔ１８１およびＴ２０５におけるタウリン酸化が１．７５σを上回るか、１．８σを上回るか、または１．９σを上回る場合に、対象に医薬組成物が投与される、実施形態１０８の方法。

【0241】

実施形態１１０：Ｔ１８１およびＴ２０５におけるタウリン酸化が２σを上回る場合に、対象に医薬組成物が投与される、実施形態１０８の方法。

【0242】

実施形態１１１：Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化が１．５σを上回る場合に、対象に医薬組成物が投与される、実施形態１０４の方法。

【0243】

実施形態１１２：Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化が１．７５σを上回るか、１．８σを上回るか、または１．９σを上回る場合に、対象に医薬組成物が投与される、実施形態１１２の方法。

【0244】

実施形態１１３：Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化が２σを上回る場合に、対象に医薬組成物が投与される、実施形態１１２の方法。

【0245】

実施形態１１４：それを必要とする対象を処置するための方法であって、（ａ）対象から得られた単離されたタウ試料を用意すること、ならびに総タウを測定すること、ならびに（ｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化を測定することと、（ｂ）（ｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が約１．５σ以上である場合に、対象に医薬組成物を投与することとを含み、σは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団中で測定された総タウ、ならびにＴ２１７およびＴ２０５、Ｔ１８１およびＴ２０５またはＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である、方法。

【0246】

実施形態１１５：Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．５σを上回る場合に、対象に医薬組成物が投与される、実施形態１１４の方法。

【0247】

実施形態１１６：（ｉ）Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．７５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．７５σを上回る場合、（ｉｉ）Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．８σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．８σを上回る場合、（ｉｉｉ）Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．９σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．９σを上回る場合に、対象に医薬組成物が投与される、実施形態１１５の方法。

【0248】

実施形態１１７：Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が２σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が２σを上回る場合に、対象に医薬組成物が投与される、実施形態１１５の方法。

【0249】

実施形態１１８：Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．５σを上回る場合に、対象に医薬組成物が投与される、実施形態１１４の方法。

【0250】

実施形態１１９：Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．７５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．７５σを上回る場合、（ｉｉ）Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．８σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．８σを上回る場合、（ｉｉｉ）Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．９σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．９σを上回る場合に、対象に医薬組成物が投与される、実施形態１１８の方法。

【0251】

実施形態１２０：Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比が２σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が２σを上回る場合に、対象に医薬組成物が投与される、実施形態１１８の方法。

【0252】

実施形態１２１：Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．５σを上回り、Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．５σを上回る場合に、対象に医薬組成物が投与される、実施形態１１４の方法。

【0253】

実施形態１２２：（ｉ）Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．７５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．７５σを上回り、Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．７５σを上回る場合、（ｉｉ）Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．８σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．８σを上回り、Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．８σを上回る場合、または（ｉｉｉ）Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．９σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．９σを上回り、Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．９σを上回る場合に、対象に医薬組成物が投与される、実施形態１２１の方法。

【0254】

実施形態１２３：Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比が２σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が２σを上回り、Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が２σを上回る場合に、対象に医薬組成物が投与される、実施形態１２１の方法。

【0255】

実施形態１２４：対象を臨床試験に登録するための方法であって、（ａ）対象から得られた単離されたタウ試料を用意すること、ならびに（ｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化を測定することと、（ｂ）Ｔ２１７またはＴ１８１におけるタウリン酸化が約１．５σ以上であり、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が約１．５σ以下である場合に、対象を臨床試験に登録することとを含み、σは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団中で測定された、Ｔ２１７およびＴ２０５、Ｔ１８１およびＴ２０５またはＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である、方法。

【0256】

実施形態１２５：Ｔ２１７におけるタウリン酸化が１．５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が１．５σを下回る場合に、対象が臨床試験に登録される、実施形態１２４の方法。

【0257】

実施形態１２６：（ｉ）Ｔ２１７におけるタウリン酸化が１．７５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が１．７５σを下回る場合、（ｉｉ）Ｔ２１７におけるタウリン酸化が１．８σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が１．８σを下回る場合、または（ｉｉｉ）Ｔ２１７におけるタウリン酸化が１．９σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が１．９σを下回る場合に、対象が臨床試験に登録される、実施形態１２５の方法。

【0258】

実施形態１２７：Ｔ２１７におけるタウリン酸化が２σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が２σを下回る場合に、対象が臨床試験に登録される、実施形態１２５の方法。

【0259】

実施形態１２８：Ｔ１８１におけるタウリン酸化が１．５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が１．５σを下回る場合に、対象が臨床試験に登録される、実施形態１２４の方法。

【0260】

実施形態１２９：（ｉ）Ｔ１８１におけるタウリン酸化が１．７５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が１．７５σを下回る場合、（ｉｉ）Ｔ１８１におけるタウリン酸化が１．８σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が１．８σを下回る場合、または（ｉｉｉ）Ｔ１８１におけるタウリン酸化が１．９σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が１．９σを下回る場合に、対象が臨床試験に登録される、実施形態１２８の方法。

【0261】

実施形態１３０：Ｔ１８１におけるタウリン酸化が２σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が２σを下回る場合に、対象が臨床試験に登録される、実施形態１２８の方法。

【0262】

実施形態１３１：Ｔ１８１およびＴ２１７におけるタウリン酸化が１．５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が１．５σを下回る場合に、対象が臨床試験に登録される、実施形態１２４の方法。

【0263】

実施形態１３２：（ｉ）Ｔ１８１およびＴ２１７におけるタウリン酸化が１．７５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が１．７５σを下回る場合、（ｉｉ）Ｔ１８１およびＴ２１７におけるタウリン酸化が１．８σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が１．８σを下回る場合、または（ｉｉｉ）Ｔ１８１およびＴ２１７におけるタウリン酸化が１．９σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が１．９σを下回る場合に、対象が臨床試験に登録される、実施形態１３１の方法。

【0264】

実施形態１３３：Ｔ１８１およびＴ２１７におけるタウリン酸化が２σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が２σを下回る場合に、対象が臨床試験に登録される、実施形態１３１の方法。

【0265】

実施形態１３４：対象を臨床試験に登録するための方法であって、（ａ）対象から得られた単離されたタウ試料を用意すること、ならびに総タウを測定すること、ならびに（ｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化を測定することと、（ｂ）Ｔ２１７またはＴ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比が２σを超え、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が２σを下回る場合に、対象を臨床試験に登録することとを含み、σは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団中で測定された、総タウ、ならびにＴ２１７およびＴ２０５、Ｔ１８１およびＴ２０５またはＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である、方法。

【0266】

実施形態１３５：Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．５σを下回る場合に、対象が臨床試験に登録される、実施形態１３４の方法。

【0267】

実施形態１３６：（ｉ）Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．７５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．７５σを下回る場合、（ｉｉ）Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウＴ２１７に対する比が１．８σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウＴ２０５に対する比が１．８σを下回る場合、または（ｉｉｉ）Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．９σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．９σを下回る場合に、対象が臨床試験に登録される、実施形態１３５の方法。

【0268】

実施形態１３７：Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が２σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が２σを下回る場合に、対象が臨床試験に登録される、実施形態１３５の方法。

【0269】

実施形態１３８：Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．５σを下回る場合に、対象が臨床試験に登録される、実施形態１３４の方法。

【0270】

実施形態１３９：（ｉ）Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．７５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．７５σを下回る場合、（ｉｉ）Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウＴに対する比が１．８σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．８σを下回る場合、または（ｉｉｉ）Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．９σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．９σを下回る場合に、対象が臨床試験に登録される、実施形態１３８の方法。

【0271】

実施形態１４０：Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比が２σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が２σを下回る場合に、対象が臨床試験に登録される、実施形態１３８の方法。

【0272】

実施形態１４１：Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比およびＴ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．５σを下回る場合に、対象が臨床試験に登録される、実施形態１３４の方法。

【0273】

実施形態１４２：（ｉ）Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比およびＴ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．７５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．７５σを下回る場合、（ｉｉ）Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比およびＴ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．８σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．８σを下回る場合、または（ｉｉｉ）Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比およびＴ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．９σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．９σを下回る場合に、対象が臨床試験に登録される、実施形態１４１の方法。

【0274】

実施形態１４３：Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比およびＴ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が２σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化が２σを下回る場合に、対象が臨床試験に登録される、実施形態１４１の方法。

【0275】

実施形態１４４：対象を臨床試験に登録するための方法であって、（ａ）対象から得られた単離されたタウ試料を用意すること、ならびに（ｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化を測定することと、（ｂ）（ｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化が約１．５σ以上である場合に、対象を臨床試験に登録することとを含み、σは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団中で測定された、Ｔ２１７およびＴ２０５、Ｔ１８１およびＴ２０５またはＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である、方法。

【0276】

実施形態１４５：Ｔ２１７およびＴ２０５におけるタウリン酸化が１．５σを上回る場合に、対象が臨床試験に登録される、実施形態１４４の方法。

【0277】

実施形態１４６：Ｔ２１７およびＴ２０５におけるタウリン酸化が１．７５σを上回るか、１．８σを上回るか、または１．９σを上回る場合に、対象が臨床試験に登録される、実施形態１４５の方法。

【0278】

実施形態１４７：Ｔ２１７およびＴ２０５におけるタウリン酸化が２σを上回る場合に、対象が臨床試験に登録される、実施形態１４５の方法。

【0279】

実施形態１４８：Ｔ１８１およびＴ２０５におけるタウリン酸化が１．５σを上回る場合に、対象が臨床試験に登録される、実施形態１４４の方法。

【0280】

実施形態１４９：Ｔ１８１およびＴ２０５におけるタウリン酸化が１．７５σを上回るか、１．８σを上回るか、または１．９σを上回る場合に、対象が臨床試験に登録される、実施形態１４８の方法。

【0281】

実施形態１５０：Ｔ１８１およびＴ２０５におけるタウリン酸化が２σを上回る場合に、対象が臨床試験に登録される、実施形態１４８の方法。

【0282】

実施形態１５１：Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化が１．５σを上回る場合に、対象が臨床試験に登録される、実施形態１４４の方法。

【0283】

実施形態１５２：Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化が１．７５σを上回るか、１．８σを上回るか、または１．９σを上回る場合に、対象が臨床試験に登録される、実施形態１５１の方法。

【0284】

実施形態１５３：Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化が２σを上回る場合に、対象が臨床試験に登録される、実施形態１５１の方法。

【0285】

実施形態１５４：対象を臨床試験に登録するための方法であって、（ａ）対象から得られた単離されたタウ試料を用意すること、ならびに総タウを測定すること、ならびに（ｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化を測定することと、（ｂ）（ｉ）Ｔ２１７およびＴ２０５、（ｉｉ）Ｔ１８１およびＴ２０５または（ｉｉｉ）Ｔ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が約１．５σ以上である場合に、対象を臨床試験に登録することとを含み、σは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団中で測定された総タウ、ならびにＴ２１７およびＴ２０５、Ｔ１８１およびＴ２０５またはＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である、方法。

【0286】

実施形態１５５：Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．５σを上回る場合に、対象が臨床試験に登録される、実施形態１５４の方法。

【0287】

実施形態１５６：（ｉ）Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．７５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．７５σを上回る場合、（ｉｉ）Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．８σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．８σを上回る場合、（ｉｉｉ）Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．９σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．９σを上回る場合に、対象が臨床試験に登録される、実施形態１５５の方法。

【0288】

実施形態１５７：Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が２σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が２σを上回る場合に、対象が臨床試験に登録される、実施形態１５５の方法。

【0289】

実施形態１５８：Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．５σを上回る場合に、対象が臨床試験に登録される、実施形態１５４の方法。

【0290】

実施形態１５９：Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．７５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．７５σを上回る場合、（ｉｉ）Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．８σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．８σを上回る場合、（ｉｉｉ）Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．９σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．９σを上回る場合に、対象が臨床試験に登録される、実施形態１５８の方法。

【0291】

実施形態１６０：Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比が２σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が２σを上回る場合に、対象が臨床試験に登録される、実施形態１５８の方法。

【0292】

実施形態１６１：Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．５σを上回り、Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．５σを上回る場合に、対象が臨床試験に登録される、実施形態１５４の方法。

【0293】

実施形態１６２：（ｉ）Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．７５σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．７５σを上回り、Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．７５σを上回る場合、（ｉｉ）Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．８σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．８σを上回り、Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．８σを上回る場合、または（ｉｉｉ）Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．９σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．９σを上回り、Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が１．９σを上回る場合に、対象が臨床試験に登録される、実施形態１６１の方法。

【0294】

実施形態１６３：Ｔ１８１におけるタウリン酸化の総タウに対する比が２σを上回り、Ｔ２０５におけるタウリン酸化の総タウに対する比が２σを上回り、Ｔ２１７におけるタウリン酸化の総タウに対する比が２σを上回る場合に、対象が臨床試験に登録される、実施形態１６１の方法。

【0295】

実施形態１６４：対象が臨床試験の処置群に登録される、実施形態１２４から１６３のいずれか１つに列挙されるような方法。

【0296】

実施形態１６５：臨床試験の処置群が対象に医薬組成物を投与することを含む、実施形態１６４の方法。

【0297】

実施形態１６６：医薬組成物がＡβまたはタウ療法を含む、実施形態８４から１２４または実施形態１５７のいずれか１つに列挙されるような方法。

【0298】

実施形態１６７：Ａβまたはタウ療法が、アミロイドベータ標的療法、キナーゼ、キナーゼ阻害剤またはホスファターゼである、実施形態１６６の方法。

【0299】

実施形態１６８：対象が、優性遺伝性アルツハイマー病を引き起こすことが公知の遺伝子突然変異を有する、実施形態３６から１６７のいずれか１つに列挙されるような方法。

【0300】

実施形態１６９：対象が、優性遺伝性アルツハイマー病を引き起こすことが公知の遺伝子突然変異を有しない、実施形態３６から１６７のいずれか１つに列挙されるような方法。

【0301】

実施形態１７０：単離されたタウ試料が、血液またはＣＳＦからアフィニティ精製により精製されたタウを含むか、または単離されたタウ試料が、実施形態１から３５のいずれか１つに従って血液から精製されたタウを含む、実施形態３６から１６７のいずれか１つに列挙されるような方法。

【0302】

実施形態１７１：単離されたタウ試料が、血液またはＣＳＦからアフィニティ精製により、タウのｍｉｄドメイン中のエピトープと特異的に結合するリガンドを使用して、および適宜タウのＮ末端中のエピトープと特異的に結合する第２のリガンドを用いて精製されたタウを含む、実施形態１７０の方法。

【0303】

実施形態１７２：タウリン酸化が質量分析により測定される、実施形態１から１７１のいずれか１つに列挙されるような方法。

【実施例】

【0304】

以下の実施例は、本発明の様々な反復を例証する。

【0305】

以下に列挙されている参考文献は、後続する実施例で引用される。

【0306】

Ａｌｏｎｓｏ， Ａ． ｄｅｌ Ｃ．， Ｚａｉｄｉ， Ｔ．， Ｎｏｖａｋ， Ｍ．， Ｇｒｕｎｄｋｅ－Ｉｑｂａｌ， Ｉ．， ａｎｄ Ｉｑｂａｌ， Ｋ． （２００１）． Ｈｙｐｅｒｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ τ ｉｎｔｏ ｔａｎｇｌｅｓ ｏｆ ｐａｉｒｅｄ ｈｅｌｉｃａｌ ｆｉｌａｍｅｎｔｓ／ｓｔｒａｉｇｈｔ ｆｉｌａｍｅｎｔｓ． ＰＮＡＳ ９８， ６９２３－６９２８． ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１２１１１９２９８．

【0307】

Ａｒｒｉａｇａｄａ， Ｐ． Ｖ．， Ｇｒｏｗｄｏｎ， Ｊ． Ｈ．， Ｈｅｄｌｅｙ－Ｗｈｙｔｅ， Ｅ． Ｔ． ＆ Ｈｙｍａｎ， Ｂ． Ｔ． Ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ｔａｎｇｌｅｓ ｂｕｔ ｎｏｔ ｓｅｎｉｌｅ ｐｌａｑｕｅｓ ｐａｒａｌｌｅｌ ｄｕｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ４２， ６３１－６３１， ｄｏｉ：１０．１２１２／ｗｎｌ．４２．３．６３１ （１９９２）．

【0308】

Ａｕｇｕｓｔｉｎａｃｋ， Ｊ． Ｃ．， Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ， Ａ．， Ｍａｎｄｅｌｋｏｗ， Ｅ．－Ｍ．， ａｎｄ Ｈｙｍａｎ， Ｂ． Ｔ． （２００２）． Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔａｕ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｅ ｗｉｔｈ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｃｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ １０３， ２６－３５． ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００４０１０１００４２３．

【0309】

Ｂａｒｔｈｅｌｅｍｙ， Ｎ． Ｒ．， Ｆｅｎａｉｌｌｅ， Ｆ．， Ｈｉｒｔｚ， Ｃ．， Ｓｅｒｇｅａｎｔ， Ｎ．， Ｓｃｈｒａｅｎ－Ｍａｓｃｈｋｅ， Ｓ．， Ｖｉａｌａｒｅｔ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ． （２０１６）． Ｔａｕ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ Ｆｌｕｉｄ ｂｙ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｔ Ｈｉｇｈ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｖｅｒａｇｅ Ｐｒｏｖｉｄｅｓ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ Ｉｔｓ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ． Ｊ． Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ． １５， ６６７－６７６． ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓ．ｊｐｒｏｔｅｏｍｅ．５ｂ０１００１．

【0310】

Ｂａｔｅｍａｎ， Ｒ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６７， ７９５－８０４， ｄｏｉ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ１２０２７５３ （２０１２）．

【0311】

Ｂａｔｅｍａｎ， Ｒ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ＤＩＡＮ－ＴＵ Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｔｒｉａｌ： Ａｄａｐｔｉｖｅ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｍｏｄｅｌ． Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ｄｅｍｅｎｔ １３， ８－１９， ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊａｌｚ．２０１６．０７．００５ （２０１７）．

【0312】

Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ， Ｙ．， ａｎｄ Ｈｏｃｈｂｅｒｇ， Ｙ． ． Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｔｈｅ ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ： ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｎｄ ｐｏｗｅｒｆｕｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｔｅｓｔｉｎｇ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｓｅｒｉｅｓ Ｂ， ２８９－３００ （１９９５）．

【0313】

Ｂｅｎｚｉｎｇｅｒ， Ｔ． Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｒｅｇｉｏｎａｌ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｉｍａｇｉｎｇ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ａｕｔｏｓｏｍａｌ ｄｏｍｉｎａｎｔ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １１０， Ｅ４５０２－４５０９， ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１３１７９１８１１０ （２０１３）．

【0314】

Ｂｉｅｒｎａｔ， Ｊ．， Ｇｕｓｔｋｅ， Ｎ．， Ｄｒｅｗｅｓ， Ｇ．， Ｍａｎｄｅｌｋｏｗ， Ｅ．－， ａｎｄ Ｍａｎｄｅｌｋｏｗ， Ｅ． （１９９３）． Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｒ２６２ ｓｔｒｏｎｇｌｙ ｒｅｄｕｃｅｓ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｔａｕ ｔｏ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅｓ： Ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ＰＨＦ－ｌｉｋｅ ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ｂｉｎｄｉｎｇ． Ｎｅｕｒｏｎ １１， １５３－１６３． ｄｏｉ：１０．１０１６／０８９６－６２７３（９３）９０２７９－Ｚ．

【0315】

Ｂｒａａｋ， Ｈ．， ａｎｄ Ｂｒａａｋ， Ｅ． （１９９５）． Ｓｔａｇｉｎｇ ｏｆ ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ｃｈａｎｇｅｓ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｇｉｎｇ １６， ２７１－２７８． ｄｏｉ：１０．１０１６／０１９７－４５８０（９５）０００２１－６．

【0316】

Ｂｕｅｒｇｅｒ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． ＣＳＦ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ｔａｕ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｎｅｏｃｏｒｔｉｃａｌ ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｂｒａｉｎ ： ａ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １２９， ３０３５－３０４１， ｄｏｉ：１０．１０９３／ｂｒａｉｎ／ａｗｌ２６９ （２００６）．

【0317】

Ｃｏｈｅｎ， Ａ． Ｄ． ｅｔ ａｌ． Ｅａｒｌｙ ｓｔｒｉａｔａｌ ａｍｙｌｏｉｄ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｓ Ｄｏｗｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ａｎｄ ａｕｔｏｓｏｍａｌ ｄｏｍｉｎａｎｔ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｆｒｏｍ ｌａｔｅ－ｏｎｓｅｔ ａｍｙｌｏｉｄ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ． Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ＆ ｄｅｍｅｎｔｉａ ： ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ， ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊａｌｚ．２０１８．０１．００２ （２０１８）．

【0318】

Ｃｈｕｎｇ， Ｐ． Ｊ．， Ｓｏｎｇ， Ｃ．， Ｄｅｅｋ， Ｊ．， Ｍｉｌｌｅｒ， Ｈ． Ｐ．， Ｌｉ， Ｙ．， Ｃｈｏｉ， Ｍ． Ｃ．， ｅｔ ａｌ． （２０１６）． Ｔａｕ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ｂｕｎｄｌｅ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅｓ ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ ｆａｓｃｉｃｌｅｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅｓ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｔｈｅ ａｘｏｎ ｉｎｉｔｉａｌ ｓｅｇｍｅｎｔ． Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ７， １２２７８． ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１２２７８．

【0319】

Ｃｒｏｗｔｈｅｒ， Ｒ． Ａ． Ｓｔｒａｉｇｈｔ ａｎｄ ｐａｉｒｅｄ ｈｅｌｉｃａｌ ｆｉｌａｍｅｎｔｓ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｈａｖｅ ａ ｃｏｍｍｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｕｎｉｔ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ８８， ２２８８－２２９２， ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．８８．６．２２８８ （１９９１）．

【0320】

Ｄｅｓｐｒｅｓ， Ｃ．， Ｂｙｒｎｅ， Ｃ．， Ｑｉ， Ｈ．， Ｃａｎｔｒｅｌｌｅ， Ｆ．－Ｘ．， Ｈｕｖｅｎｔ， Ｉ．， Ｃｈａｍｂｒａｕｄ， Ｂ．， ｅｔ ａｌ． （２０１７）． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｔａｕ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎ ｔｈａｔ ｄｒｉｖｅｓ ｉｔｓ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ． ＰＮＡＳ １１４， ９０８０－９０８５． ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１７０８４４８１１４．

【0321】

Ｆａｇａｎ， Ａ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ ｔａｕ／ｂｅｔａ－ａｍｙｌｏｉｄ（４２） ｒａｔｉｏ ａｓ ａ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｄｅｃｌｉｎｅ ｉｎ ｎｏｎｄｅｍｅｎｔｅｄ ｏｌｄｅｒ ａｄｕｌｔｓ． Ａｒｃｈ Ｎｅｕｒｏｌ ６４， ３４３－３４９， ｄｏｉ：１０．１００１／ａｒｃｈｎｅｕｒ．６４．３．ｎｏｃ６０１２３ （２００７）．

【0322】

Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ， Ａ． Ｗ． Ｐ． ｅｔ ａｌ． Ｃｒｙｏ－ＥＭ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｔａｕ ｆｉｌａｍｅｎｔｓ ｆｒｏｍ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｎａｔｕｒｅ ５４７， １８５， ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ２３００２ （２０１７）．

【0323】

Ｆｌｅｉｓｈｅｒ， Ａ． Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ａｎｄ ａｇｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ １ Ｅ２８０Ａ ａｕｔｏｓｏｍａｌ ｄｏｍｉｎａｎｔ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｋｉｎｄｒｅｄ： ａ ｃｒｏｓｓ－ｓｅｃｔｉｏｎａｌ ｓｔｕｄｙ． ＪＡＭＡ Ｎｅｕｒｏｌ ７２， ３１６－３２４， ｄｏｉ：１０．１００１／ｊａｍａｎｅｕｒｏｌ．２０１４．３３１４ （２０１５）．

【0324】

Ｆｕｎｋ， Ｋ． Ｅ．， Ｔｈｏｍａｓ， Ｓ． Ｎ．， Ｓｃｈａｆｅｒ， Ｋ． Ｎ．， Ｃｏｏｐｅｒ， Ｇ． Ｌ．， Ｌｉａｏ， Ｚ．， Ｃｌａｒｋ， Ｄ． Ｊ．， ｅｔ ａｌ． （２０１４）． Ｌｙｓｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｉｓ ａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｕ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ ａｎｄ ａ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ ｏｆ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｐｒｏｐｅｎｓｉｔｙ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ４６２， ７７－８８． ｄｏｉ：１０．１０４２／ＢＪ２０１４０３７２．

【0325】

Ｇａｌｌｉｅｎ， Ｓ．， Ｂｏｕｒｍａｕｄ， Ａ．， Ｋｉｍ， Ｓ． Ｙ．， ａｎｄ Ｄｏｍｏｎ， Ｂ． （２０１４）． Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｐａｒａｌｌｅｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １００， １４７－１５９． ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｐｒｏｔ．２０１３．１０．０２９．

【0326】

Ｇａｌｌｉｅｎ， Ｓ．， Ｄｕｒｉｅｚ， Ｅ．， Ｃｒｏｎｅ， Ｃ．， Ｋｅｌｌｍａｎｎ， Ｍ．， Ｍｏｅｈｒｉｎｇ， Ｔ．， ａｎｄ Ｄｏｍｏｎ， Ｂ． （２０１２）． Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｎ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １１， １７０９－１７２３． ｄｏｉ：１０．１０７４／ｍｃｐ．Ｏ１１２．０１９８０２．

【0327】

Ｇｉｌｌｅｔｔｅ， Ｍ． Ａ．， ａｎｄ Ｃａｒｒ， Ｓ． Ａ． （２０１３）． Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ｂｙ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０， ２８－３４． ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．２３０９．

【0328】

Ｇｏｅｄｅｒｔ， Ｍ．， Ｓｐｉｌｌａｎｔｉｎｉ， Ｍ． Ｇ．， Ｊａｋｅｓ， Ｒ．， Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ， Ｄ． ＆ Ｃｒｏｗｔｈｅｒ， Ｒ． Ａ． Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｉｓｏｆｏｒｍｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔａｕ： ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ｔａｎｇｌｅｓ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｎｅｕｒｏｎ ３， ５１９－５２６， ｄｏｉ：１０．１０１６／０８９６－６２７３（８９）９０２１０－９ （１９８９）．

【0329】

Ｇｏｒｄｏｎ， Ｂ． Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｓｐａｔｉａｌ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｎｅｕｒｏｉｍａｇｉｎｇ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ ｆｒｏｍ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｗｉｔｈ ａｕｔｏｓｏｍａｌ ｄｏｍｉｎａｎｔ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ： ａ ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ｓｔｕｄｙ． Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ． Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １７， ２４１－２５０， ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ１４７４－４４２２（１８）３００２８－０ （２０１８）．

【0330】

Ｇｏｒｄｏｎ， Ｂ． Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｔａｕ ＰＥＴ ｉｎ ａｕｔｏｓｏｍａｌ ｄｏｍｉｎａｎｔ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ： ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｔｏ ｃｏｇｎｉｔｉｏｎ， ｄｅｍｅｎｔｉａ ａｎｄ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ． Ｂｒａｉｎ ： ａ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ Ａｃｃｅｐｔｅｄ ｆｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ （２０１９）．

【0331】

Ｇｒｕｎｄｋｅ－Ｉｑｂａｌ， Ｉ． ｅｔ ａｌ． Ａｂｎｏｒｍａｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔａｕ （ｔａｕ） ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ８３， ４９１３－４９１７， ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．８３．１３．４９１３ （１９８６）．

【0332】

Ｈａｍｐｅｌ， Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ｔａｕ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ： ａ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ ｓｔｕｄｙ． Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ ｇｅｎｅｒａｌ ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ６１， ９５－１０２， ｄｏｉ：１０．１００１／ａｒｃｈｐｓｙｃ．６１．１．９５ （２００４）．

【0333】

Ｈａｎｇｅｒ， Ｄ． Ｐ．， Ｂｅｔｔｓ， Ｊ． Ｃ．， Ｌｏｖｉｎｙ， Ｔ． Ｌ．， Ｂｌａｃｋｓｔｏｃｋ， Ｗ． Ｐ．， ａｎｄ Ａｎｄｅｒｔｏｎ， Ｂ． Ｈ． （１９９８ａ）． Ｎｅｗ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｉｎ ｈｙｐｅｒｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ｔａｕ （ｐａｉｒｅｄ ｈｅｌｉｃａｌ ｆｉｌａｍｅｎｔ－ｔａｕ） ｆｒｏｍ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｂｒａｉｎ ｕｓｉｎｇ ｎａｎｏｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． ７１， ２４６５－２４７６．

【0334】

Ｈａｎｇｅｒ， Ｄ． Ｐ．， Ｂｅｔｔｓ， Ｊ． Ｃ．， Ｌｏｖｉｎｙ， Ｔ． Ｌ． Ｆ．， Ｂｌａｃｋｓｔｏｃｋ， Ｗ． Ｐ．， ａｎｄ Ａｎｄｅｒｔｏｎ， Ｂ． Ｈ． （１９９８ｂ）． Ｎｅｗ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ Ｓｉｔｅｓ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｉｎ Ｈｙｐｅｒｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ Ｔａｕ （Ｐａｉｒｅｄ Ｈｅｌｉｃａｌ Ｆｉｌａｍｅｎｔ－Ｔａｕ） ｆｒｏｍ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｂｒａｉｎ Ｕｓｉｎｇ Ｎａｎｏｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７１， ２４６５－２４７６． ｄｏｉ：１０．１０４６／ｊ．１４７１－４１５９．１９９８．７１０６２４６５．ｘ．

【0335】

Ｈａｎｇｅｒ， Ｄ． Ｐ．， Ｂｙｅｒｓ， Ｈ． Ｌ．， Ｗｒａｙ， Ｓ．， Ｌｅｕｎｇ， Ｋ．－Ｙ．， Ｓａｘｔｏｎ， Ｍ． Ｊ．， Ｓｅｅｒｅｅｒａｍ， Ａ．， ｅｔ ａｌ． （２００７）． Ｎｏｖｅｌ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ Ｓｉｔｅｓ ｉｎ Ｔａｕ ｆｒｏｍ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｂｒａｉｎ Ｓｕｐｐｏｒｔ ａ Ｒｏｌｅ ｆｏｒ Ｃａｓｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ １ ｉｎ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８２， ２３６４５－２３６５４． ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ７０３２６９２００．

【0336】

Ｈａｓｅｇａｗａ， Ｍ．， Ｍｏｒｉｓｈｉｍａ－Ｋａｗａｓｈｉｍａ， Ｍ．， Ｔａｋｉｏ， Ｋ．， Ｓｕｚｕｋｉ， Ｍ．， Ｔｉｔａｎｉ， Ｋ．， ａｎｄ Ｉｈａｒａ， Ｙ． （１９９２）． Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ｔａｕ ｉｎ ｔｈｅ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｂｒａｉｎ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７， １７０４７－１７０５４．

【0337】

Ｈｅ， Ｚ． ｅｔ ａｌ． Ａｍｙｌｏｉｄ－ｂｅｔａ ｐｌａｑｕｅｓ ｅｎｈａｎｃｅ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｂｒａｉｎ ｔａｕ－ｓｅｅｄｅｄ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅｓ ｂｙ ｆａｃｉｌｉｔａｔｉｎｇ ｎｅｕｒｉｔｉｃ ｐｌａｑｕｅ ｔａｕ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ． Ｎａｔ Ｍｅｄ ２４， ２９－３８， ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．４４４３ （２０１８）．

【0338】

Ｈｕ， Ｗ． Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｒｅｄｕｃｅｄ ＣＳＦ ｐ－Ｔａｕ１８１ ｔｏ Ｔａｕ ｒａｔｉｏ ｉｓ ａ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ＦＴＬＤ－ＴＤＰ． Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ８１， １９４５－１９５２， ｄｏｉ：１０．１２１２／０１．ｗｎｌ．００００４３６６２５．６３６５０．２７ （２０１３）．

【0339】

Ｉｑｂａｌ， Ｋ．， Ａｌｏｎｓｏ， Ａ． ｄｅｌ Ｃ．， Ｃｈｅｎ， Ｓ．， Ｃｈｏｈａｎ， Ｍ． Ｏ．， Ｅｌ－Ａｋｋａｄ， Ｅ．， Ｇｏｎｇ， Ｃ．－Ｘ．， ｅｔ ａｌ． （２００５）． Ｔａｕ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｔａｕｏｐａｔｈｉｅｓ． Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １７３９， １９８－２１０． ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｂａｄｉｓ．２００４．０９．００８．

【0340】

Ｉｔｔｎｅｒ， Ｌ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔａｕ Ｍｅｄｉａｔｅｓ Ａｍｙｌｏｉｄ－β Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌｓ． Ｃｅｌｌ １４２， ３８７－３９７， ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１０．０６．０３６ （２０１０）．

【0341】

Ｉｔｔｎｅｒ， Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｕ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ａｍｙｌｏｉｄ－β ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｍｉｃｅ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５４， ９０４－９０８ （２０１６）．

【0342】

Ｊａｃｋ， Ｃ． Ｒ．， Ｊｒ． ｅｔ ａｌ． ＮＩＡ－ＡＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ： Ｔｏｗａｒｄ ａ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ｄｅｍｅｎｔ １４， ５３５－５６２， ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊａｌｚ．２０１８．０２．０１８ （２０１８）．

【0343】

Ｊａｃｋ， Ｃ． Ｒ．， Ｊｒ． ｅｔ ａｌ． Ａ／Ｔ／Ｎ： Ａｎ ｕｎｂｉａｓｅｄ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｖｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｃｈｅｍｅ ｆｏｒ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ． Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ８７， ５３９－５４７， ｄｏｉ：１０．１２１２／ｗｎｌ．００００００００００００２９２３ （２０１６）．

【0344】

Ｊｉｎ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｓｏｌｕｂｌｅ ａｍｙｌｏｉｄ β－ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｍｅｒｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｃｏｒｔｅｘ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｉｎｄｕｃｅ Ｔａｕ ｈｙｐｅｒｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｅｕｒｉｔｉｃ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １０８， ５８１９－５８２４ （２０１１）．

【0345】

Ｋａｎｍｅｒｔ， Ｄ．， Ｃａｎｔｌｏｎ， Ａ．， Ｍｕｒａｔｏｒｅ， Ｃ． Ｒ．， Ｊｉｎ， Ｍ．， Ｏ’Ｍａｌｌｅｙ， Ｔ． Ｔ．， Ｌｅｅ， Ｇ．， ｅｔ ａｌ． （２０１５）． Ｃ－Ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ Ｆｏｒｍｓ ｏｆ Ｔａｕ， Ｂｕｔ Ｎｏｔ Ｆｕｌｌ－Ｌｅｎｇｔｈ Ｔａｕ ｏｒ Ｉｔｓ Ｃ－Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ， Ａｒｅ Ｒｅｌｅａｓｅｄ ｆｒｏｍ Ｎｅｕｒｏｎｓ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ３５， １０８５１－１０８６５． ｄｏｉ：１０．１５２３／ＪＮＥＵＲＯＳＣＩ．０３８７－１５．２０１５．

【0346】

Ｋａｒｃｈ， Ｃ． Ｍ．， Ｊｅｎｇ， Ａ． Ｔ．， ａｎｄ Ｇｏａｔｅ， Ａ． Ｍ． （２０１２）． Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔａｕ Ｌｅｖｅｌｓ Ａｒｅ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ ｂｙ Ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ Ｔａｕ Ｔｈａｔ Ｉｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｔａｕｏｐａｔｈｉｅｓ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８７， ４２７５１－４２７６２． ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１２．３８０６４２．

【0347】

Ｋｉｍｕｒａ， Ｔ．， Ｓｈａｒｍａ， Ｇ．， Ｉｓｈｉｇｕｒｏ， Ｋ． ＆ Ｈｉｓａｎａｇａ， Ｓ．－ｉ． Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｔａｕ Ｂａｒ Ｃｏｄｅ： Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｈｏｓｐｈｏｉｓｏｔｙｐｅｓ ｏｆ Ｔａｕ ａｎｄ Ｉｔｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ Ｔａｕｏｐａｔｈｙ． Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １２， ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｎｉｎｓ．２０１８．０００４４ （２０１８）．

【0348】

Ｋｏｐｋｅ， Ｅ．， Ｔｕｎｇ， Ｙ． Ｃ．， Ｓｈａｉｋｈ， Ｓ．， Ａｌｏｎｓｏ， Ａ． Ｃ．， Ｉｑｂａｌ， Ｋ．， ａｎｄ Ｇｒｕｎｄｋｅ－Ｉｑｂａｌ， Ｉ． （１９９３）． Ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔａｕ． Ａｂｎｏｒｍａｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｎ－ｐａｉｒｅｄ ｈｅｌｉｃａｌ ｆｉｌａｍｅｎｔ ｐｏｏｌ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８， ２４３７４－２４３８４．

【0349】

Ｌｉｍ， Ｙ． Ｙ． ｅｔ ａｌ． ＢＤＮＦ Ｖａｌ６６Ｍｅｔ ｍｏｄｅｒａｔｅｓ ｍｅｍｏｒｙ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ， ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔａｕ ｉｎ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ａｕｔｏｓｏｍａｌ ｄｏｍｉｎａｎｔ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｂｒａｉｎ ： ａ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １３９， ２７６６－２７７７， ｄｏｉ：１０．１０９３／ｂｒａｉｎ／ａｗｗ２００ （２０１６）．

【0350】

Ｌｉｕ， Ｗ．－Ｋ．， Ｍｏｏｒｅ， Ｗ． Ｔ．， Ｗｉｌｌｉａｍｓ， Ｒ． Ｔ．， Ｈａｌｌ， Ｆ． Ｌ．， ａｎｄ Ｙｅｎ， Ｓ．－Ｈ． （１９９３）． Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｈｏｓｐｈｏ－ ａｎｄ ｕｎｐｈｏｓｐｈｏ－ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ａ ｓｕｂｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔａｕ ｍｏｌｅｃｕｌｅ， ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３４， ３７１－３７６． ｄｏｉ：１０．１００２／ｊｎｒ．４９０３４０３１５．

【0351】

Ｌｕｏ， Ｊ．， Ｄ’Ａｎｇｅｌｏ， Ｇ．， Ｇａｏ， Ｆ．， Ｄｉｎｇ， Ｊ． ＆ Ｘｉｏｎｇ， Ｃ． Ｂｉｖａｒｉａｔｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ ｉｎ ｆａｍｉｌｙ－ｔｙｐｅ ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｓｔｕｄｉｅｓ． Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ５７， １０８４－１１０９， ｄｏｉ：ｄｏｉ：１０．１００２／ｂｉｍｊ．２０１４００１３１ （２０１５）．

【0352】

Ｍａｉｒ， Ｗ．， Ｍｕｎｔｅｌ， Ｊ．， Ｔｅｐｐｅｒ， Ｋ．， Ｔａｎｇ， Ｓ．， Ｂｉｅｒｎａｔ， Ｊ．， Ｓｅｅｌｅｙ， Ｗ． Ｗ．， ｅｔ ａｌ． （２０１６）． ＦＬＥＸＩＴａｕ： Ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ Ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｔａｕ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ． Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ８８， ３７０４－３７１４． ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓ．ａｎａｌｃｈｅｍ．５ｂ０４５０９．

【0353】

Ｍａｉａ， Ｌ． Ｆ． ｅｔ ａｌ． Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ Ａｍｙｌｏｉｄ－β ａｎｄ Ｔａｕ ｉｎ ｔｈｅ Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ Ｆｌｕｉｄ ｏｆ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｉｃｅ Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ａｍｙｌｏｉｄ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５， １９４ｒｅ１９２－１９４ｒｅ１９２ （２０１３）．

【0354】

Ｍａｌｉａ， Ｔ． Ｊ．， Ｔｅｐｌｙａｋｏｖ， Ａ．， Ｅｒｎｓｔ， Ｒ．， Ｗｕ， Ｓ．－Ｊ．， Ｌａｃｙ， Ｅ． Ｒ．， Ｌｉｕ， Ｘ．， ｅｔ ａｌ． （２０１６）． Ｅｐｉｔｏｐｅ ｍａｐｐｉｎｇ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ｔａｕ ｂｙ ｔｈｅ ａｎｔｉ－ｔａｕ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＡＴ８． Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｆｕｎｃｔｉｏｎ， ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ８４， ４２７－４３４． ｄｏｉ：１０．１００２／ｐｒｏｔ．２４９８８．

【0355】

Ｍａｔｓｕｏ， Ｅ．Ｓ．， Ｓｈｉｎ， Ｒ－Ｗ．， Ｂｉｌｌｉｎｇｓｌｅｙ， Ｍ．Ｌ．， Ｖａｎ ｄｅＶｏｏｒｄｅ， Ａ．， Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ， Ｍ．， Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋｉ， Ｊ．Ｑ．， ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｂｉｏｐｓｙ－ｄｅｒｉｖｅｄ ａｄｕｌｔ ｂｒａｉｎ ｔａｕ ｉｓ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ａｔ ｍａｎｙ ｏｆ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｓｉｔｅｓ ａｓ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｐａｉｒｅｄ ｈｅｌｉｃａｌ ｆｉｌａｍｅｎｔ ｔａｕ． Ｎｅｕｒｏｎ １３， ９８９－１００２．

【0356】

ＭｃＤａｄｅ， Ｅ． ｅｔ ａｌ． Ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ９１， ｅ１２９５－ｅ１３０６， ｄｏｉ：１０．１２１２／ｗｎｌ．００００００００００００６２７７ （２０１８）．

【0357】

Ｍｅｄｉｎａ， Ｍ． ＆ Ａｖｉｌａ， Ｊ． Ｆｕｒｔｈｅｒ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｏｆ ｔａｕ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ： ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｅｘｐｅｒｔ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｎｅｕｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ １５， １１５－１２２， ｄｏｉ：１０．１５８６／１４７３７１７５．２０１５．１０００８６４ （２０１５）．

【0358】

Ｍｏｒｒｉｓ， Ｊ． Ｃ． Ｔｈｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｍｅｎｔｉａ Ｒａｔｉｎｇ （ＣＤＲ）： ｃｕｒｒｅｎｔ ｖｅｒｓｉｏｎ ａｎｄ ｓｃｏｒｉｎｇ ｒｕｌｅｓ． Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ４３， ２４１２－２４１４ （１９９３）．

【0359】

Ｍｏｒｒｉｓ， Ｊ． Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ａｎ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｎｅｔｗｏｒｋ ｆｏｒ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ： Ｔｈｅ Ｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｎｅｔｗｏｒｋ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ２， ９７５－９８４， ｄｏｉ：１０．４１５５／ｃｌｉ．１２．９３ （２０１２）．

【0360】

Ｍｏｒｒｉｓ， Ｍ．， Ｋｎｕｄｓｅｎ， Ｇ． Ｍ．， Ｍａｅｄａ， Ｓ．， Ｔｒｉｎｉｄａｄ， Ｊ． Ｃ．， Ｉｏａｎｏｖｉｃｉｕ， Ａ．， Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， Ａ． Ｌ．， ｅｔ ａｌ． （２０１５）． Ｔａｕ ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ． Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １８， １１８３－１１８９． ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｎ．４０６７．

【0361】

Ｎｅｄｄｅｎｓ， Ｊ．， Ｔｅｍｍｅｌ， Ｍ．， Ｆｌｕｎｋｅｒｔ， Ｓ．， Ｋｅｒｓｃｈｂａｕｍｅｒ， Ｂ．， Ｈｏｅｌｌｅｒ Ｃ．， Ｌｏｅｆｆｌｅｒ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． （２０１８）． Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔａｕ ｓｉｔｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｇｉｃａ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ６， ５２． ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ４０４７８－０１８－０５５７－６

【0362】

Ｐｅｔｅｒｓｏｎ， Ａ． Ｃ．， Ｒｕｓｓｅｌｌ， Ｊ． Ｄ．， Ｂａｉｌｅｙ， Ｄ． Ｊ．， Ｗｅｓｔｐｈａｌｌ， Ｍ． Ｓ．， ａｎｄ Ｃｏｏｎ， Ｊ． Ｊ． （２０１２）． Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｆｏｒ Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｍａｓｓ Ａｃｃｕｒａｃｙ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ， Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １１， １４７５－１４８８． ｄｏｉ：１０．１０７４／ｍｃｐ．Ｏ１１２．０２０１３１．

【0363】

Ｐｏｔｔｅｒ， Ｒ． ｅｔ ａｌ． Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ Ｖｉｖｏ Ａｍｙｌｏｉｄ－β４２ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ， Ｅｘｃｈａｎｇｅ， ａｎｄ Ｌｏｓｓ ｉｎ Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｃａｒｒｉｅｒｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５， １８９ｒａ１７７－１８９ｒａ１７７ （２０１３）．

【0364】

Ｐｒｉｃｅ， Ｊ． Ｌ．， Ｄａｖｉｓ， Ｐ． Ｂ．， Ｍｏｒｒｉｓ， Ｊ． Ｃ． ＆ Ｗｈｉｔｅ， Ｄ． Ｌ． Ｔｈｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｎｇｌｅｓ， ｐｌａｑｕｅｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ａｇｉｎｇ ａｎｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ａｇｉｎｇ １２， ２９５－３１２ （１９９１）．

【0365】

Ｐｒｉｃｅ， Ｊ． Ｌ． ＆ Ｍｏｒｒｉｓ， Ｊ． Ｃ． Ｔａｎｇｌｅｓ ａｎｄ ｐｌａｑｕｅｓ ｉｎ ｎｏｎｄｅｍｅｎｔｅｄ ａｇｉｎｇ ａｎｄ “
ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ” Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ４５， ３５８－３６８ （１９９９）．

【0366】

Ｑｉａｎ， Ｊ．， Ｈｙｍａｎ， Ｂ． Ｔ． ＆ Ｂｅｔｅｎｓｋｙ， Ｒ． Ａ． Ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ Ｔａｎｇｌｅ Ｓｔａｇｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｒａｔｅ ｏｆ Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｓｙｍｐｔｏｍｓ： Ｍｏｄｅｌｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ ａｎ Ａｕｔｏｐｓｙ Ｃｏｈｏｒｔ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌ Ｄｅｓｉｇｎ． ＪＡＭＡ Ｎｅｕｒｏｌ ７４， ５４０－５４８， ｄｏｉ：１０．１００１／ｊａｍａｎｅｕｒｏｌ．２０１６．５９５３ （２０１７）．

【0367】

Ｑｕｉｒｏｚ， Ｙ． Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｃｏｒｔｉｃａｌ ａｔｒｏｐｈｙ ｉｎ ｐｒｅｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ １ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｃａｒｒｉｅｒｓ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ８４， ５５６－５６１， ｄｏｉ：１０．１１３６／ｊｎｎｐ－２０１２－３０３２９９ （２０１３）．

【0368】

Ｑｕｉｒｏｚ， Ｙ． Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｂｅｔｗｅｅｎ Ａｍｙｌｏｉｄ ａｎｄ Ｔａｕ Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｙｏｕｎｇ Ａｄｕｌｔｓ Ｗｉｔｈ Ａｕｔｏｓｏｍａｌ Ｄｏｍｉｎａｎｔ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ． ＪＡＭＡ Ｎｅｕｒｏｌ ７５， ５４８－５５６， ｄｏｉ：１０．１００１／ｊａｍａｎｅｕｒｏｌ．２０１７．４９０７ （２０１８）．

【0369】

Ｒｉｄｈａ， Ｂ． Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｔｒａｃｋｉｎｇ ａｔｒｏｐｈｙ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｆａｍｉｌｉａｌ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ： ａ ｓｅｒｉａｌ ＭＲＩ ｓｔｕｄｙ． Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ ５， ８２８－８３４， ｄｏｉ：１０．１０１６／ｓ１４７４－４４２２（０６）７０５５０－６ （２００６）．

【0370】

Ｒｕｓｓｅｌｌ， Ｃ． Ｌ．， Ｍｉｔｒａ， Ｖ．， Ｈａｎｓｓｏｎ， Ｋ．， Ｂｌｅｎｎｏｗ， Ｋ．， Ｇｏｂｏｍ， Ｊ．， Ｚｅｔｔｅｒｂｅｒｇ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ． （２０１６）． Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ Ｔａｕ ａｎｄ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ Ｔａｕ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ Ｆｌｕｉｄ ｂｙ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｐｒｏｖｉｄｅｓ Ｎｅｗ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ５５， ３０３－３１３． ｄｏｉ：１０．３２３３／ＪＡＤ－１６０６３３．

【0371】

Ｒｙｍａｎ， Ｄ． Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｓｙｍｐｔｏｍ ｏｎｓｅｔ ｉｎ ａｕｔｏｓｏｍａｌ ｄｏｍｉｎａｎｔ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ： ａ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ ａｎｄ ｍｅｔａ－ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ８３， ２５３－２６０， ｄｏｉ：１０．１２１２／ＷＮＬ．０００００００００００００５９６ （２０１４）．

【0372】

Ｓａｍａｎ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｅｘｏｓｏｍｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｔａｕ Ｉｓ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｉｎ Ｔａｕｏｐａｔｈｙ Ｍｏｄｅｌｓ ａｎｄ Ｉｓ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ｉｎ Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ Ｆｌｕｉｄ ｉｎ Ｅａｒｌｙ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８７， ３８４２－３８４９， ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１１．２７７０６１ （２０１２）．

【0373】

Ｓａｔｏ， Ｃ．， Ｂａｒｔｈｅｌｅｍｙ， Ｎ． Ｒ．， Ｍａｗｕｅｎｙｅｇａ， Ｋ． Ｇ．， Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ， Ｂ． Ｗ．， Ｇｏｒｄｏｎ， Ｂ． Ａ．， Ｊｏｃｋｅｌ－Ｂａｌｓａｒｏｔｔｉ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ． （２０１８）． Ｔａｕ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ． Ｎｅｕｒｏｎ ９７， １２８４－１２９８．ｅ７． ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｎｅｕｒｏｎ．２０１８．０２．０１５．

【0374】

Ｓｃｈｅｌｌｅ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｕ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ ｏｆ ＡＰＰ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＢＡＣＥ１ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ． Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ＆ Ｄｅｍｅｎｔｉａ： Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ １３， ７０１－７０９， ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊａｌｚ．２０１６．０９．００５ （２０１７）．

【0375】

Ｓｃｈｏｌｌ， Ｍ．， Ｌｏｃｋｈａｒｔ， Ｓ． Ｎ．， Ｓｃｈｏｎｈａｕｔ， Ｄ． Ｒ．， Ｏ’Ｎｅｉｌ， Ｊ． Ｐ．， Ｊａｎａｂｉ， Ｍ．， Ｏｓｓｅｎｋｏｐｐｅｌｅ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ． （２０１６）． ＰＥＴ Ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ Ｔａｕ Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ａｇｉｎｇ Ｈｕｍａｎ Ｂｒａｉｎ． Ｎｅｕｒｏｎ ８９， ９７１－９８２． ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｎｅｕｒｏｎ．２０１６．０１．０２８．

【0376】

Ｓｔｏｒａｎｄｔ， Ｍ．， Ｂａｌｏｔａ， Ｄ． Ａ．， Ａｓｃｈｅｎｂｒｅｎｎｅｒ， Ａ． Ｊ． ＆ Ｍｏｒｒｉｓ， Ｊ． Ｃ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｐｓｙｃｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｌ ｃｏｈｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｎｅｔｗｏｒｋ （ＤＩＡＮ）． Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｌｏｇｙ ２８， １９－２９， ｄｏｉ：１０．１０３７／ｎｅｕ０００００３０ （２０１４）．

【0377】

Ｓｕ， Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ｐａｒｔｉａｌ ｖｏｌｕｍｅ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｍｙｌｏｉｄ ｉｍａｇｉｎｇ． Ｎｅｕｒｏｉｍａｇｅ １０７， ５５－６４， ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｎｅｕｒｏｉｍａｇｅ．２０１４．１１．０５８ （２０１５）．

【0378】

Ｔｈｏｍａｓ， Ｓ． Ｎ．， Ｆｕｎｋ， Ｋ． Ｅ．， Ｗａｎ， Ｙ．， Ｌｉａｏ， Ｚ．， Ｄａｖｉｅｓ， Ｐ．， Ｋｕｒｅｔ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ． （２０１２）． Ｄｕａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ＰＨＦ－ｔａｕ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ ｌｙｓｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｂｉｑｕｉｔｙｌａｔｉｏｎ： ａ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｐｐｒｏａｃｈ． Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ １２３， １０５－１１７． ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００４０１－０１１－０８９３－０．

【0379】

Ｔｏｌｅｄｏ， Ｊ． Ｂ．， Ｘｉｅ， Ｓ． Ｘ．， Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋｉ， Ｊ． Ｑ． ＆ Ｓｈａｗ， Ｌ． Ｍ． Ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ＣＳＦ Ｔａｕ ａｎｄ Ａｂｅｔａ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｕｐ ｔｏ ４８ ｍｏｎｔｈｓ ｉｎ ＡＤＮＩ． Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ １２６， ６５９－６７０， ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００４０１－０１３－１１５１－４ （２０１３）．

【0380】

Ｖａｎｄｅｒｍｅｅｒｅｎ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｕ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ ｗｉｔｈ ａ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｓａｎｄｗｉｃｈ ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ ６１， １８２８－１８３４ （１９９３）．

【0381】

Ｖｉｌｌｅｍａｇｎｅ， Ｖ． Ｌ．， Ｆｏｄｅｒｏ－Ｔａｖｏｌｅｔｔｉ， Ｍ． Ｔ．， Ｍａｓｔｅｒｓ， Ｃ． Ｌ．， ａｎｄ Ｒｏｗｅ， Ｃ． Ｃ． （２０１５）． Ｔａｕ ｉｍａｇｉｎｇ： ｅａｒｌｙ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ． Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １４， １１４－１２４． ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ１４７４－４４２２（１４）７０２５２－２．

【0382】

Ｗａｎｇ， Ｙ．， ａｎｄ Ｍａｎｄｅｌｋｏｗ， Ｅ． （２０１６）． Ｔａｕ ｉｎ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １７， ２２－３５． ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｎ．２０１５．

【0383】

Ｗａｎｇ， Ｙ． ＆ Ｍａｎｄｅｌｋｏｗ， Ｅ． Ｔａｕ ｉｎ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １７， ５－２１， ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｎ．２０１５．１ （２０１６）．

【0384】

Ｘｉｏｎｇ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ａｍｏｎｇ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ Ａｄｕｌｔ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ Ｓｔｕｄｙ． Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ８６， １４９９－１５０６， ｄｏｉ：１０．１２１２／ＷＮＬ．００００００００００００２５９３ （２０１６）．

【0385】

Ｙａｍａｄａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｍｉｃｒｏｄｉａｌｙｓｉｓ Ｒｅｖｅａｌｓ Ａｇｅ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｄｅｃｒｅａｓｅ ｏｆ Ｂｒａｉｎ Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ Ｆｌｕｉｄ Ｔａｕ Ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ Ｐ３０１Ｓ Ｈｕｍａｎ Ｔａｕ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｉｃｅ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ３１， １３１１０－１３１１７， ｄｏｉ：１０．１５２３／ｊｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５６９－１１．２０１１ （２０１１）．

【0386】

Ｙａｍａｄａ， Ｋ．， Ｈｏｌｔｈ， Ｊ． Ｋ．， Ｌｉａｏ， Ｆ．， Ｓｔｅｗａｒｔ， Ｆ． Ｒ．， Ｍａｈａｎ， Ｔ． Ｅ．， Ｊｉａｎｇ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ． （２０１４）． Ｎｅｕｒｏｎａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔａｕ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． ２１１， ３８７－３９３． ｄｏｉ：１０．１０８４／ｊｅｍ．２０１３１６８５．

【0387】

Ｚｅｍｐｅｌ， Ｈ．， Ｔｈｉｅｓ， Ｅ．， Ｍａｎｄｅｌｋｏｗ， Ｅ． ＆ Ｍａｎｄｅｌｋｏｗ， Ｅ． Ｍ． Ａｂｅｔａ ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ ｃａｕｓｅ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ Ｃａ（２＋） ｅｌｅｖａｔｉｏｎ， ｍｉｓｓｏｒｔｉｎｇ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｔａｕ ｉｎｔｏ ｄｅｎｄｒｉｔｅｓ， Ｔａｕ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅｓ ａｎｄ ｓｐｉｎｅｓ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３０， １１９３８－１１９５０， ｄｏｉ：１０．１５２３／ｊｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３５７－１０．２０１０ （２０１０）．

［実施例１］

【0388】

正常な非ＡＤヒト脳におけるタウタンパク質でのリン酸化部位
正常な可溶性脳タウのリン酸化部位を判定するために、健常対照からの抽出物を、リン酸化および非リン酸化タウの両方を濃縮する、タウ－１およびＨＪ８．５タウ抗体を使用したイムノキャプチャーにより精製した。脳タウアイソフォームのトリプシン消化により、ＬＣ－ＭＳにより検出されるのに十分なほど長く、疎水性の２７種の未修飾ペプチドが生成された（Ｂａｒｔｈｅｌｅｍｙ ｅｔ ａｌ．， ２０１６）。２５種のペプチドが、潜在的なリン酸化部位としてセリンおよび／またはトレオニンを含有していた。いくつかのペプチドは、複数の潜在的なリン酸化部位（４～９箇所）を含有しており、これにより発明者らは、ＬＣ分離中に一緒に、潜在的に共溶出する異なる一リン酸化ペプチドを考慮した。この後、上記のＰＲＭスクリーニング法を、これらのペプチドに適用した。

【0389】

タウ配列におけるプロジェクションドメイン（１０３～１２６）の分析からの結果により、重なり合った複雑なＬＣ－ＭＳ／ＭＳパターン中に溶出する複数のｐ－タウペプチドが明らかになった（図３～７）。発明者らは、タウタンパク質の最短アイソフォームである０Ｎアイソフォームから、３つのリン酸化部位を同定した。ＬＣシステムは、３種のリン酸化ペプチドを区別する分解能を有さなかったが、フラグメントの同定および対応する強度を使用して、残基Ｓ１１３における１つの主要なリン酸化部位、ならびに残基Ｔ１１１およびＴ１２３における２つのマイナーなリン酸化部位で構成されるシグナルをデコンボリューションした（図３）。対照的に、より長い１Ｎおよび２Ｎアイソフォームからのタウ配列をＰＲＭスクリーニングする場合、とりわけ複数の潜在的な一リン酸化部位が、同一のペプチド配列内と予測される場合、リン酸化ペプチド溶出パターンを単純化するために、さらなるクロマトグラフィー分離が必要であった（図４～６）。ＬＣ分離により、発明者らは、リン酸化残基を示差的に含有し、共溶出される半特異的ＭＳ／ＭＳフラグメントを同定することが可能となった。しかし、発明者らは、ＬＣアーティファクト（ＬＣ ａｒｔｉｆａｃｔ）に起因し得るいくつかのシグナルも同定し、これは、溶液中における同一ペプチドの２つの立体配座による可能性がある（図５）。この効果は、未修飾およびリン酸化ペプチドの両方で、アミノ酸残基４５～６７（０Ｎアイソフォームにおける）を含有するペプチド配列に重要であり（図５）、配列６８～１２６（１Ｎ）および８８～１２６（２Ｎ）ではそれほど優勢ではなかった（図４および６）。

【0390】

残基Ｓ１１３、Ｔ１１１およびＴ１２３におけるリン酸化は、ペプチド配列６８～１２６（１Ｎ）および８８～１２６（２Ｎ）で確認された。すべてのケースにおいて、Ｓ１１３シグナルが３つのうち最大であり、リン酸化率は０．２～０．５％であった（図４および図６、表１）。残基Ｔ５０、Ｔ５２およびＳ５６のリン酸化は、ペプチド配列４５～６７（１Ｎおよび２Ｎアイソフォームにより共有される）で明確に同定された。同一のペプチドにおいて、ＬＣ－ＭＳシグナルは、３つの残基（Ｓ６１、Ｔ６３およびＳ６４）のうち少なくとも２つがリン酸化されたことを示した（図５）。残基Ｓ４６で潜在的なリン酸化を同定する特異的シグナルは、見出せなかった。残基Ｓ６８およびＴ６９におけるリン酸化は、配列６８～１２６（１Ｎ）および６８～８７（２Ｎ）で証明されたが、それらのＬＣ－ＭＳパターンを区別する特異的フラグメントは検出されなかった。同一の１Ｎおよび２Ｎペプチド配列において、Ｔ７１でのより低いレベルのリン酸化が検出された。Ｔ７６、Ｔ１０１およびＴ１０２残基における２Ｎ特異的リン酸化も同定された（図８で要約されている）。

【0391】

トリプシン切断欠如の誘導も、以前に報告されているトリプシン部位の後に位置するリン酸化残基（部位Ｔ１７５、Ｔ１８１、Ｓ２１２、Ｔ２３１およびＳ３９６）（Ｈａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９８）をスクリーニングするために考慮された。発明者らのＰＲＭスクリーニングは、正常な脳組織においてＨａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌにより既に記載されたリン酸化タウペプチドに対応するＬＣ－ＭＳパターンを検出することに成功した（Ｔ１８１、Ｓ１９９、Ｓ２０２およびＳ４０４。図８）。対応するＬＣ－ＭＳシグナルは高く、これにより、正常なヒト脳において以前に報告されているｐ－タウペプチドが最も多い可能性があることが示唆された。発明者らのＳ１９９およびＳ２０２リン酸化の比較により、Ｓ２０２におけるリン酸化の非常に優勢の存在量が示された（図８）。１９２～１９９アミノ酸配列における非リン酸化エピトープに会合する、タウ抽出のために抗タウ１抗体を使用すると、抽出物におけるＳ１９９リン酸化の回収率が低いことが説明され得る。抽出物におけるＳ２０２およびＳ４０４リン酸化の存在量を踏まえ、発明者らは、配列１９５～２０９および３８６～４０６から二リン酸化ペプチド（ｄｉ－ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ）の存在について調査した。発明者らは、Ｓ２０２／Ｓ１９９およびＳ２０２／Ｓ１９８における２箇所のリン酸化に対応する特異的フラグメント有する２つのＬＣ－ＭＳパターン、ならびに３９６／４０４における２箇所のリン酸化に対応する１つのＬＣ－ＭＳパターンを検出した（図８）。

【0392】

脳抽出物における可溶性タウのさらなるスクリーニングにより、Ｔ１７５、Ｓ２１４、Ｔ２１７、Ｔ２３１およびＳ３９６におけるリン酸化残基に対応する、量がさほど多くない他の一リン酸化ペプチドが証明された。Ｓ１８４またはＳ１８５におけるリン酸化ペプチドに対応するフラグメントからのシグナルも、一リン酸化ペプチド配列１８１～１９０がスクリーニングされた場合、低レベルで検出された（図８）。長い配列４０７～４３８における一リン酸化の調査は、残基Ｓ４０９およびＳ４１６におけるリン酸化、ならびに残基Ｓ４１２／Ｓ４１３／Ｔ４１４の群における少なくとも１つのリン酸化と一致するパターンを発見した。

【0393】

全体として、発明者らは、ＰＲＭスクリーニング法を使用して、正常な非ＡＤ脳から抽出される可溶性タウ画分で検出可能な、最少２９箇所の特有のリン酸化部位を同定した（表１）。そのうち２５箇所は、特有のＬＣ－ＭＳシグナルに一義的に割り当てることができ、４箇所の追加のリン酸化部位は、正確なＬＣ－ＭＳパターンへの割り当てなしで証明された。これらの部位は、３つのクラスターに位置し、Ｎ末端プロジェクションドメインに、最少１４箇所、配列の中央におけるプロリンリッチドメインに１０箇所、およびＣ末端に６箇所のリン酸化部位が位置していた（図１４）。

【表1-1】

【表1-2】

［実施例２］

【0394】

ＣＳＦ中のタウタンパク質でのリン酸化部位
脳タウの消化物と比較して、タウ特異的抗体および消化を使用したＣＳＦタウ精製は、主にタンパク質配列のｍｉｄドメイン（残基１５０～２２１）から、検出可能なペプチドを生成した。ペプチドは、低度にＮ末端から検出可能であり、配列は、微小管結合反復（ＭＴＢＲ）ドメインまたはタウのＣ末端から、ほぼ検出不可能であった（Ｂａｒｔｈｅｌｅｍｙ ｅｔ ａｌ．， ２０１６； Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）。シグナル回収率におけるこの差は、ニューロンからの放出中のタウ短縮化に起因し得る（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）。このｍｉｄドメインのペプチド回収率は、現在のＰＲＭ法を使用して、対応するマイナーなリン酸化アイソフォームをモニターするのに十分であった。反対に、ＭＳ方法の著しい技術的進歩が、ＭＴＢＲおよびＣ末端ドメイン中のリン酸化ペプチドを検出するのに必要とされる。

【0395】

正常な対照のＣＳＦからのタウホスホペプチドのＰＲＭスクリーニングにより、脳の可溶性タウと同じように、Ｔ１８１（示されていない）、Ｓ１９９、Ｓ２０２およびＴ２１７におけるいくつかのリン酸化部位を同定した（図９）。ｐＳ２１４に対応する低シグナルも検出された（図９）。ＣＳＦ抽出物中のｐＴ２０５に対応する特異的フラグメント化パターンを同定し、クロマトグラフィーによりｐＳ１９９／ｐＳ２０２シグナルから分離した（図９）。

【0396】

ＣＳＦタウ中のさらなるリン酸化部位を検出する確率を上昇させるために、発明者らは、軽度から中等度の認知症を有するＡＤ患者からのＣＳＦプールを分析した。発明者らは、ＡＤ ＣＳＦプールが、上昇濃度のタウ、ならびに上昇レベルのリン酸化タウを含有すると予想した。正常なＣＳＦで見出されるものと同一のリン酸化残基（Ｔ１８１、Ｓ１９９、Ｓ２０２、Ｔ２１７およびＴ２３１）を、ＡＤ ＣＳＦで検出した。さらに、脳からのタウで以前に見出されたが、正常なＣＳＦでは見出されなかったｐＳ１１３およびｐＴ１７５に対応するシグナルが、ＡＤ ＣＳＦで検出された（図９、図１０）。Ｓ２０２／Ｓ１９９リン酸化ペプチドからの特異的フラグメントおよび固有の保持時間を含有するＬＣ－ＭＳ／ＭＳパターンにより、Ｓ２０８での新たなリン酸化ペプチドの同定が可能となった。発明者らが正常なＣＳＦ中でｐＳ２０８を再検査したとき、発明者らは、対応するシグナルを少ない存在量で検出した。残基Ｔ１５３での新たなリン酸化ペプチドと適合するＬＣ－ＭＳ／ＭＳパターンを、対応する非リン酸化ペプチドのレベル付近で検出した（図１０）。脳抽出物のデータを注意深く再検査すると、この部位に対応するシグナルは少ない存在量で存在することが示唆された。最終的に、発明者らは、ＡＤ ＣＳＦ中の０Ｎアイソフォームからの１０３～１２６アミノ酸配列におけるリン酸化に対応する特異的シグナルを見出し、これは、このペプチドにおける主要なリン酸化部位としてＴ１１１を示した一方、Ｓ１１３はほとんどリン酸化されなかった（図１１）。全体として、ＣＳＦタウ中の１２箇所のリン酸化部位を検出し、そのうち２箇所は脳可溶化液中で検出不可能であった（図１２）。
［実施例３］

【0397】

脳におけるｐ－タウ存在量と比較した差を強調するＣＳＦ ｐ－タウ存在量の測定値
脳では、Ｓ４０４は、検査したリン酸化部位のうち最も高度にリン酸化された（ｐＳ４０４／Ｓ４０４＝１１０％、すなわちＳ４０４の５２％がリン酸化される）。したがって、Ｓ２０２およびＴ１８１における他の高度にリン酸化された部位（それぞれ９．７％および９．５％）と比較して、脳タウの半分超がＳ４０４でリン酸化された。Ｓ１９９の１．３％がリン酸化されたが、抽出に使用されるタウ１抗体がその対応するリン酸化エピトープに結合不能（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， １９９３）なため、これは過小評価されている可能性がある。Ｓ４０４以外のＣ末端部位におけるリン酸化は、およそ１％であると見出された。Ｎ末端では、Ｔ５２、Ｓ６８／Ｔ６９、Ｔ５０およびＳ１１３も、およそ０．５％～２％の範囲の存在量でリン酸化された。他の検出された部位は、はるかに低いレベル（＜０．５％）でリン酸化されていると思われる。

【0398】

脳ではなくＣＳＦタウ中のｐＴ２０５およびｐＳ２０８に特有な検出に加えて、脳タウで検出されるある他のリン酸化部位の相対的リン酸化存在量は、対照のＣＳＦタウと比較して変化した（図１３）。脳と比較して、ＣＳＦタウのリン酸化は、以下の部位で有意に低かった、ｐＳ１９９（６分の１に低下、ｐ＝０．００８）、ｐＳ２０２（５分の１に低下、ｐ＝０．０１６）およびｐＳ２１４（２分の１に低下、ｐ＝０．０１６）。反対に、ＣＳＦタウのリン酸化は、０Ｎからの部位ｐＴ２１７（４倍上昇、ｐ＝０．０１６）、ｐＴ２３１（７倍上昇、ｐ＝０．０１６）およびｐＴ１１１（１６倍上昇）で有意に高かった。ＰＴ１８１の存在量は、ＣＳＦおよび脳中で類似していた（約１０％）。ＡＤ ＣＳＦ中で測定した場合、ｐＴ１７５は、低いままであった（脳における０．１％と比較して０．１～０．２％）。

【0399】

脳およびＣＳＦタウは、異なる短縮化のパターンを有し、脳タウアイソフォームは主に完全長である一方、ＣＳＦタウアイソフォームは短縮化される。ＩＰ後に回収される脳およびＣＳＦタウアイソフォーム、ならびに対応するペプチドは、免疫沈降に使用される抗体に依存する（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）。類似して、タウを免疫沈降させるのに使用される抗体は、タウリン酸化の回収率に影響を及ぼし得る。ｐ－タウ回収率に対するこの影響を評価するために、発明者らは、タウ１＋ＨＪ８．５の組合せに加えて、異なる抗体（タウ１３、ＨＪ８．５、ＨＪ８．７、タウ１およびタウ５）を使用して、リン酸化率でのＩＰ－ＭＳの結果を比較した（図１４）。タウ１またはタウ１＋ＨＪ８．５が脳およびＣＳＦにおいて使用された場合、ｐＳ１９９／Ｓ１９９率の有意な低下が観察された。これにより、Ｎ末端とｍｉｄドメインとの間のＣＳＦ短縮化は、脳と比較して、ｐＳ１９９リン酸化の測定に影響を与え得ることが示唆される。他の抗体を用いて脳およびＣＳＦ中で測定したＰＳ１９９／Ｓ１９９率は、比較的類似しているように思われた。興味深いことに、Ｓ１９９リン酸化は、報告されたタウ１エピトープ（１９２～１９９）の末端に存在するが、脳抽出物におけるｐＳ１９９で多少の反応性が依然として観察され、ＣＳＦ中では低度であり、これにより、タウ１の非特異的結合が示唆される。

【0400】

剖検前の死後経過時間（ＰＭＩ）中のホスファターゼ活性は、脳抽出物中で測定されるタウリン酸化を低下させ得るので、発明者らは、ＣＳＦおよび脳抽出物において通例見出されるＰＭＩのリン酸化率に対する影響を調査した。ＰＭＩが５～１６時間の範囲である参加者から収集された１０例のタウ病変がない脳試料（中前頭回）を分析した。最初に分析された脳抽出物に、１６時間超のＰＭＩを有するものはなかった。発明者らは、Ｔ１８１、Ｓ１９９、Ｓ２０２、Ｓ２１４、Ｔ２１７、Ｔ２３１およびＳ４０４部位で測定されたＰＭＩとリン酸化率との間に有意な関連を見出さなかった（Ｓｐｅａｒｍａｎ検定、９５％信頼区間、示されていない）。
［実施例４］

【0401】

ＣＳＦ中のＡＤ特異的ｐ－タウ変化
ＡＤにおいて通例報告されているＣＳＦ ｐ－タウの増加は、２つの潜在的な効果：１）そのリン酸化状態に関係なくタウの全般的な増加、または２）特定部位における高リン酸化の増加の結果であり得る。非リン酸化タウを使用してｐ－タウシグナルまたはレベルを標準化すると、総タウの全般的変化から独立して特定部位で起こるリン酸化の化学量論の変化（すなわち正常なＣＳＦまたは脳タウと比較した高または低リン酸化）の定量が可能となる。発明者らが最近実証したように、可溶性タウ生成物は、ＡＤにおいて増加し、アミロイドプラークと相関する。したがって、量だけではなくリン酸化率についても制御することが理解には重要である。ｐＴ１８１、ｐＴ２１７、ｐＴ２３１、ｐＴ２０５、ｐＳ２０８およびｐＳ２１４は、０Ｎ－特異的ｐＴ１１１のようにＡＤ ＣＳＦ中で高リン酸化された（図１３）。ｐＴ１５３およびｐＴ１７５は、非ＡＤで検出されず、ＡＤ中でわずかに増加した可能性がある。非ＡＤと比較して有意な高リン酸化を示す部位は、ｐＴ１８１（ｐ＝０．０１０）、ｐＳ２１４（ｐ＝０．００５）およびｐＴ２１７（ｐ＝０．００３）であった。ｐＴ１８１、ｐＳ２１４およびｐＴ２１７は、それぞれおよそ１．２倍、１．６倍および４倍のリン酸化の増加を示した。興味深いことに、モニターされた部位のすべてが高リン酸化されたわけではなく、ｐＳ１９９／Ｓ１９９は有意に変化せず、ｐＳ２０２／Ｓ２０２は有意に低く（ｐ＝０．０３０）、およそ１．２分の１に減少した。

【0402】

リン酸化比のロバスト性は、ＣＳＦを１６時間インキュベーションすることにより評価した。インキュベーションは、非ＡＤとＡＤ ＣＳＦとの間で観察されたタウリン酸化比の差に有意に影響を与えなかった（図１５）。さらに、インキュベーション後にＣＳＦ中でスパイクした組換え１５Ｎ－タウにおいてリン酸化が検出されないことにより、ＣＳＦタウにキナーゼ活性がないことを確認した（示されていない）。

【0403】

実施例１～４の考察
ｐ－タウ測定におけるＰＲＭの技術進歩 － 発明者らは、正常な脳組織およびＣＳＦ中におけるｐ－タウの、現在までの最も包括的な定性的および定量的分析を報告する。発明者らのアプローチは、潜在的にマイナーなリン酸化部位を捕捉していなかった可能性があるタウリン酸化に対する以前のＤＤＡ研究とは対照的である。しかし、発明者らのアプローチは、高感度のＰＲＭモードのターゲットＭＳ（ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｔａｒｇｅｔｅｄ－ＭＳ ｉｎ ＰＲＭ ｍｏｄｅ）を使用して、マイナーなリン酸化を検出および定量する。リン酸化部位の同定は、検査される各ホスホペプチドに対する、特異的イオンフラグメントの共溶出を同定するＬＣ－ＭＳ／ＭＳパターンの注意深い手動解釈に依存する。先行する研究では、脳タウリン酸化は主に、ＰＨＦからの高リン酸化タウに富んだ不溶性抽出物（ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｉｎ ｈｙｐｅｒｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ｔａｕ ｆｒｏｍ ＰＨＦ）で調査され、これまで、最も詳述されている研究では、正常なヒトタウタンパク質における９箇所のリン酸化部位が報告されている（Ｈａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ． ２００７）。発明者らの掘り下げたＰＲＭデータ分析から、２９を超えるリン酸化残基が検出され、その大部分は存在量が非常に少なかった。実際に、以前に報告されている９箇所の部位は、中でもタンパク質において存在量が最も多い修飾であった。ＰＲＭ分析を、脳と比較してはるかに少ない存在量で存在する正常なＣＳＦタウに適用することにより、最初に９箇所のリン酸化部位の検出につながり、ＡＤ ＣＳＦ中にさらに３箇所の部位が検出された。

【0404】

検出されたリン酸化部位数の有意な増加に加えて、発明者らは、高感度ＰＲＭスクリーニングにより、全般的なタウ濃度とは無関係に、タウリン酸化率または化学量論を定量的に評価することを可能にする方法を実証した。この概念は、見過ごされることが多いが、ＣＳＦ ｐ－タウ絶対濃度は、全般的なタウアイソフォーム濃度における上昇によってのみ上昇し、相対的なリン酸化タウ存在量の変化によっては上昇し得ない場合、ＡＤにおける変化の評価において重大である。この研究によるリン酸化率の測定で初めて、異なる区画（細胞内脳対細胞外ＣＳＦ）における、また、異なる病理学的状態（ＡＤ対非ＡＤ）における、タンパク質全体のリン酸化率の変化の度合いおよび分布の比較（高リン酸化対低リン酸化）が可能になった。

【0405】

ＰＲＭスクリーニングプロセスのいくつかの注意点は、発見のスループットが低いこと、およびｐ－タウ種、または研究で仮定されていない他の翻訳後修飾（ＰＴＭ）を失う危険性があることである。ＭＳデータからの同定は、より大きい検証または臨床コホートにおいてさらに使用して、スケジュール化されたＬＣ－ＭＳ方法を設計し、多重化およびスループットを向上させることができる（Ｇｉｌｌｅｔｔｅ ａｎｄ Ｃａｒｒ， ２０１３）。他のプロテアーゼ、例えばＡｓｐＮは、トリプシン消化物とは異なる１組のタウおよびｐ－タウペプチドを生じることがあり、これによりタウ、すなわちＣ末端ドメインのより良好な被服が可能となる（Ｈａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９８； Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ． ２０１８）。調査は、この研究で考慮されていないさらなる二重または三重のリン酸化タウペプチドをスクリーニングすることによりさらに精緻化することができるが、部位リン酸化の生物学的協調がない限り、存在量は最小限になり得る。

【0406】

タウプロジェクションドメインにおけるリン酸化部位のクラスターの同定 － 発明者らは、選択的スプライシング依存性ペプチドを含有するタウのＮ末端プロジェクションドメインにおいて、以前に記載されていないリン酸化残基のクラスターを見出した。興味深いことに、このドメインは、不溶性ヒト脳画分中のＰＨＦにおいて広範にリン酸化されていることが以前には見出されていなかった（Ｆｕｎｋ ｅｔ ａｌ．， ２０１４； Ｈａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００７； Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， ２０１６； Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１２）。このクラスターは、マウス脳におけるマウスタウタンパク質で行われた最近の包括的研究においても広範に特徴付けられなかった（Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）。これらの食い違いは、少数の特異的ＭＳ／ＭＳフラグメント、および／またはＬＣでの細かい保持時間のシフトによってのみ識別可能な、リン酸化ペプチドの複雑な混合物を特徴付けることの困難さに起因する可能性がある。例えば、Ｓ４６は、正常なヒトタウ中のこのドメインで以前に報告された唯一のリン酸化部位である（Ｈａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９８）。しかし、発明者らは、この種に対する特異的シグナルを検出せず、この種は、調査アルゴリズムにより、近いフラグメント化パターンを共有する、隣接するＴ５０またはＴ５２におけるリン酸化部位と混同されている可能性がある。この点において、各リン酸化部位に対応するＬＣ－ＭＳ／ＭＳパターンを明確に解釈および読み解くために、手動で調べることが不可欠である。この食い違いの別の考えられる説明は、ＭＴＢＲドメイン、ｍｉｄドメインおよびＣ末端と比較して、ＰＨＦにおけるＮ末端ドメインの存在量が比較的少ないことの可能性がある（Ｍａｉｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１６）。

【0407】

このＮ末端プロジェクションドメインは最近、隣接する微小管（ＭＴＢＲドメインを経由してタウに結合する）が互いに近付くのを予防する反発バリアの主成分の一部として割り当てられている（Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１６）。この配列は、多数の酸性残基を含有しており、リン酸化の増加は、全般的な酸度の上昇に寄与し、反発バリアを強化し得る。エクソン２～３における選択的スプライシングにより誘導される可変量のＮ末端伸長と共に、タウリン酸化は、タウ／タウＮ末端相互作用および微小管の分子間距離を調節し得る。

【0408】

脳対ＣＳＦにおける異なるｐ－タウプロファイルの生物学的意味合い － タウは主に、微小管の安定性において機能する細胞内タンパク質であり、旧来より神経傷害または細胞死の際にしか細胞外に放出されないと考えられていた。しかし、最近の研究から、タウは、生理学的および病理学的条件下で、調節された手段で分泌されることが示唆されている（Ｋａｒｃｈ ｅｔ ａｌ． ２０１２； Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ． ２０１４）。可溶性脳タウおよびＣＳＦタウプロファイル、並行して、神経細胞モデルにおける細胞内および細胞外タウプロファイルならびに代謝を比較することにより、発明者らは最近、タウ分泌が、短縮化されたタウおよびｐ－タウを含むタウアイソフォームの異なる代謝回転速度に関与する能動的プロセスであることを示した（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）。脳とＣＳＦ ｐ－タウプロファイルとの間の比較を介した、この能動的分泌とタウのリン酸化との間の関連を理解することにより、ＡＤ病因への潜在的な洞察が得られる。

【0409】

発明者らは、ＣＳＦ中で豊富なｐ－タウアイソフォームは、微小管に対する親和性が低く、分泌される可能性が高いと推測している。反対に、ＣＳＦ中で欠乏するｐ－タウアイソフォームは、ニューロンの内部にとどまり、かつ／または切断を避ける傾向をより高く有し得る。発明者らの結果から、いくつかのリン酸化残基は、脳抽出物、例えばＴ２１７、Ｔ２３１、Ｔ１５３およびＴ１１１と比較してＣＳＦ中で有意に豊富なことが実証される。すべてがプロリン指向性部位であり、ＧＳＫ－３βタンパク質キナーゼの潜在的基質であり、およびキナーゼ依存性調節を受け得る。ｐＴ２１７とは異なり、ｐＳ２１４は、脳と比較してＣＳＦ中で増加しなかった。ｐＳ２１４を上回るｐＴ２１７のこの細胞外濃縮は、発明者らが以前にこれらのアイソフォームについて細胞内で同定した動態学的な差と合致し（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）、ｐＴ２１７は、非リン酸化タウおよびタウ－ｐＳ２１４よりも短い代謝回転速度を有する。あるいは、ＣＳＦと比較した脳抽出物中のタウ部位の一部で観察されたリン酸化の減少は、ＰＭＩ中起こる部分的脱リン酸化にも起因し得る（Ｍａｔｓｕｏ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。そのような減少は、５～１６時間のＰＭＩ範囲内で観察されなかったが、死亡とこの調査された間隔との間のリン酸化比の変更は排除できない。質量分析により、脳生検によるこれらのタウ部位の脱リン酸化の動力学を評価することは、将来、ＣＳＦ／脳の比較結果に対するこの現象の影響に対処する助けとなるであろう。脳タウリン酸化の測定に影響を与える潜在的な脳ホスファターゼのバイアスを考慮すると、ＣＳＦタウのリン酸化状態は、死後に収集した脳抽出物よりも、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）でのニューロンにおけるタウリン酸化状態を反映しやすいことが裏付けられる。しかし、ＣＳＦ中のインビボでのタウリン酸化モニタリングは、ＣＳＦタウ短縮化のため、主にタウのｍｉｄドメインで検出された部位に限定され得る。

【0410】

反対に、ｐＳ２０２は、ＣＳＦ中で有意に低く、ｐＳ１９９およびｐＳ２０２はＡＤ中で増加せず、これにより、これらのリン酸化は、ニューロン内側のタウ隔離を促し得ることが示された。Ｔ１８１は、ＣＳＦおよび脳中で等しくリン酸化される。ｐＴ２０５およびｐＳ２０８はもっぱらＣＳＦタウ中で検出され、脳における可溶性タウタンパク質中では検出されなかった。これは、Ｓ２０２、Ｔ２０５およびＳ２０８での３箇所でのリン酸化が、脳におけるタウ凝集のＢｒａａｋステージ（Ｂｒａａｋ ａｎｄ Ｂｒａａｋ， １９９５）を特徴付けるために通例使用される抗ＡＴ８抗体（Ｍａｌｉａ ｅｔ ａｌ．， ２０１６）により認識されることを考慮すると興味深い。実際に、ｐＳ２０８は、ＭＳによりＰＨＦ中で検出された（Ｈａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９８）。ｐＴ２０５およびｐＳ２０８は、発明者らの研究では、正常な可溶性脳タウに存在せず、正常な脳タウにおけるＡＴ８の免疫反応性を検出する可能性はないことを確認した。さらに、最近の研究により、ｐＴ２０５およびｐＳ２０８は、ｐＳ２０２と共にタウ自己凝集を導く組合せリン酸化パターンであることを示唆する（Ｄｅｓｐｒｅｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１７）。ＡＤにおいて、ＣＳＦ中にｐＴ２０５およびｐＳ２０８が排他的に存在すること、および両方の部位でリン酸化率がさらに高まることは、細胞から、これらの病変となりやすいｐ－タウ種を除去する、ニューロンに対する潜在的な保護クリアランス機構を示し得る。同時に、ＡＤ ＣＳＦ中のｐＳ２０２が減少することは、ＡＤ脳における濃縮されたＡＴ８－陽性のタングル（ｅｎｒｉｃｈｅｄ ＡＴ８－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｔａｎｇｌｅ）において、ｐＴ２０５およびｐＳ２０８と凝集する場合、関連するアイソフォームの隔離の増加にも相当し得る。あるいは、脳抽出物中のｐＴ２０５およびｐＳ２０８にリン酸化がないことは、ＰＭＩ中に発生するホスファターゼによる、それらの特異的分解に起因し得る。脳生検から収集されたタウにおいて報告されているＡＴ８反応性の迅速な消失（＜３時間）は、この考えを裏付ける（Ｍａｔｓｕｏ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。したがって、ｐＴ２０５およびｐＳ２０８を効率的に標的化するそのようなホスファターゼ活性は、ニューロンにおけるＡＴ８－陽性物質の長い半減期を予防する追加の機構としても見ることができる。ＡＤ ＣＳＦ中で見出されるｐＴ２０５およびｐＳ２０８の増加は、次いでこの保護機構の潜在的に病理学的な低下を示し得る。最終的に、ＡＤ ＣＳＦ中のｐＳ２０２の同時減少は、ＡＤ脳における濃縮されたＡＴ８－陽性のタングルにおいて、ｐＴ２０５およびｐＳ２０８と凝集した場合、関連するアイソフォームの隔離の増加にも相当し得る。

【0411】

発明者らは、正常な脳からの可溶性画分におけるＭＴＢＲドメインからリン酸化残基を、説得力をもって検出することが不可能であった。ＭＴＢＲドメインにおけるリン酸化部位は、タウの微小管への親和性を低下させるとされている（Ｂｉｅｒｎａｔ ｅｔ ａｌ．， １９９３）。正常なタウ中におけるそのようなリン酸化がないことは、ＰＨＦ中で見出されるこれらの修飾の異常を裏付け得る（Ｈａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ． ２００７）。ＣＳＦタウ短縮化では、ＭＴＢＲドメインは、タウ短縮化後に細胞内で分解される可能性があり（Ｋａｎｍｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）、したがってこの研究で使用されるイムノキャプチャー方法により回収されないので、インビボでのリン酸化の変化の検査が限られる。

【0412】

ＡＤバイオマーカーとしてのＣＳＦ ｐ－タウ率 － 検出されるリン酸化部位数の有意な増加に加えて、発明者らは、全般的なタウ濃度に関係なく、タウリン酸化率または化学量論を定量することができる方法を実証した。この概念は、見過ごされることが多いが、ＣＳＦ ｐ－タウ絶対濃度が、総タウ濃度（すなわちｐＴ１８１）の上昇によってのみ上昇し、相対的なリン酸化率自体の上昇では上昇し得ない場合、ＡＤにおけるＣＳＦタウリン酸化の変化の評価において重大である。この研究からのリン酸化率の測定により初めて、異なる区画（細胞内脳対細胞外ＣＳＦ）における、また、異なる病理学的状態（ＡＤ対非ＡＤ）における、タンパク質全体の、リン酸化率の変化の度合いおよび分布の比較（高リン酸化対低リン酸化）が可能となった。この方法は、免疫化学を使用して最近行われたように（Ｎｅｄｄｅｎｓ ｅｔ ａｌ． ２０１８）、脳領域およびＢｒａａｋステージ全体の多数の部位で、ＡＤ脳リン酸化の変動を調べるために将来使用され得る。

【0413】

この研究では、発明者らは、ＡＤ ＣＳＦ中のタウは、非ＡＤ ＣＳＦと比較して一般的に高リン酸化されることを実証した。しかし、高リン酸化の度合いは部位依存的である。Ｔ１１１、Ｔ２０５、Ｓ２０８およびＴ２１７は、ＡＤに対するｐ－タウバイオマーカーとして使用され、最も一般的に測定される標的であるＴ１８１よりも高リン酸化された（Ｆａｇａｎ ｅｔ ａｌ． ２００９）。発明者らは、もっぱらＡＤ ＣＳＦで見出されるＴ１５３リン酸化も同定した。興味深いことに、ＡＤ ＣＳＦ中で高リン酸化されていると見出される部位は、脳と比較して、正常なＣＳＦ中で既に有意に増加した部位に相当する（すなわち、Ｔ１１１、Ｔ２０５、Ｓ２０８およびＴ２１７、ならびに低度でＴ２３１）。これにより、ＡＤ病変は、タウのＣＳＦ中への放出中の特異的ｐ－タウアイソフォーム濃縮に寄与する細胞機構を悪化させることが示され得る。全体として、これらの部位で見出される大規模な変化により、発明者らはＡＤを検出する高感度バイオマーカーとしての使用を構想する。発明者らの研究は、限定された数のＣＳＦプールに依拠しており、将来、より大きいＣＳＦコホートでの研究により、ｐ－タウ変化と、疾患の間の脳アミロイドーシスおよびタウ凝集との間のより良い潜在的な関係が確立されるであろう。発明者らは、他の非ＡＤタウオパチー、例えばＰＳＰ、ＣＢＤおよびＦＴＤにおいて、何らかの特異的ｐ－タウプロファイルの変化が存在するかどうかを問うこともできる。あるいは、この方法は、インビボおよびインビトロで異なるキナーゼ活性を追跡するために使用することができ、異常なタウ代謝を標的とする新たな薬物を評価する有望なツールを提供することもできる。

【0414】

実施例１～４の方法
脳の可溶性タウ抽出 － 参加者を伴う脳およびＣＳＦ研究は、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｕｍａｎ Ｓｔｕｄｉｅｓ ＣｏｍｍｉｔｔｅｅおよびＧｅｎｅｒａｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒにより承認された。すべての参加者から、研究に加わる前に書面によるインフォームドコンセントを得た。脳の可溶性タウを、以前に説明されているように抽出した（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）。簡潔には、以前に説明された（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）、アミロイドおよびタウ病変がない対照からの冷凍ヒト脳組織をＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ （Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）のＫｎｉｇｈｔ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＡＤＲＣ）から得た。サルコシル可溶性タウを、文献（Ｈａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９８）で報告されている超遠心分離により、推定上の（ｐｕｔａｔｉｖｅ）タウ凝集物から分離し、プールした。冷凍ヒト脳（２００～４００ｍｇ、前頭部）を、氷上においてトリス－ＨＣｌ緩衝剤（２５ｍＭトリス－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、ホスファターゼ阻害剤カクテル３、Ｒｏｃｈｅプロテアーゼ阻害剤、ｐＨ ７．４。最終的に３．２５ｍＬ／ｍｇ組織）中でホモジナイズした。ホモジネートを４℃にて６０分、１１，０００×ｇで遠心分離した。上澄みを１％サルコシル中で６０分間可溶化し、２時間、１００，０００×ｇで遠心分離した。サルコシル可溶性画分をプールし、免疫沈降の前に５０μＬ画分を０．５％ヒト血漿で１０倍希釈した。脳／ＣＳＦの比較では、免疫精製の前に脳可溶化液プールを５００～８０００倍希釈して、ＣＳＦタウレベルに適合させた。

【0415】

ＣＳＦタウ抽出 － ヒトＣＳＦを、アミロイド陰性および認知に関して正常な（ＣＤＲ＝０）対照（ｎ＝４７、年齢６０＋）ならびにアミロイド陽性およびＣＤＲ＞０ ＡＤ患者（ｎ＝３３、年齢６０＋）を含む参加者８０名のコホートからプールした。対照およびＡＤ群から、それぞれ５００μＬ ＣＳＦアリコートの５つおよび７つのプールを生成した。最初の収集時に、ＣＳＦを１，０００×ｇで１０分間スピンダウンして、細胞デブリを除去し、－８０℃にて直ちに冷凍した。プロテアーゼ阻害剤カクテルを実験中に添加した。タウを、一部変更を加えて、以前に説明されているように（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）、免疫沈降させ、脱塩した。簡潔には、ＣＮＢｒ－活性化セファロースビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ １７－０４３０－０１）を、ビーズｇ当たり３ｍｇ抗体の濃度で、抗体タウ１およびＨＪ８．５に別々に架橋した。試料を、目的の各配列に対して、試料ｍＬ当たり１０ｆｍｏｌのリン酸化および１００ｆｍｏｌの非リン酸化タウに相当するＡＱＵＡペプチド（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でスパイクする。タウおよびｐ－タウ濃度は、これらの内部標準を使用して計算する。可溶性タウは、洗剤（１％ＮＰ－４０）、カオトロピック試薬（５ｍＭグアニジン）およびプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ）中で免疫沈降させた。セファロースビーズにコンジュゲートした抗タウ１およびＨＪ８．５抗体は、不活化したセファロースビーズ中でそれぞれ１０倍および５倍希釈し、３０μＬの抗体ビーズの５０％スラリーを、溶液と共に室温にて９０分間回転させた。ビーズを２５ｍＭ重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝剤（ＴＥＡＢＣ、Ｆｌｕｋａ １７９０２）中で３回洗浄した。結合したタウを、４００ｎｇ ＭＳグレードトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｖ５１１１）を用いて、３７℃にて１６時間ビーズ上で消化した。消化物をＴｏｐＴｉｐ Ｃ１８（Ｇｌｙｇｅｎ、ＴＴ２Ｃ１８．９６）上にロードし、脱塩し、製造者の使用説明書に従って溶出させた。溶出させたペプチドを真空遠心分離（ＣｅｎｔｒｉＶａｐ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ Ｌａｂｃｏｎｃｏ）により乾燥させ、２％アセトニトリルおよびＭＳグレード水中０．１％ギ酸の２５μＬの溶液中で再懸濁した。

【0416】

質量分析 － ペプチド再懸濁液の５μＬアリコートを、ＭＳ分析のためにｎａｎｏ－Ａｃｑｕｉｔｙ ＬＣに注入した。ｎａｎｏ－Ａｃｑｕｉｔｙ ＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）に、ＨＳＳ Ｔ３ ７５μｍ×１００μｍ、１．８μｍカラムを取り付け、流速０．５μＬ／分の溶液ＡおよびＢのグラジエントを使用して、ペプチドを分離した。溶液Ａを、ＭＳグレード水中０．１％ギ酸で構成し、溶液Ｂを、アセトニトリル中０．１％ギ酸で構成した。ペプチドは、２％から２０％の溶液Ｂで２８分、次いで２０％から４０％の溶液Ｂでさらに１３分、その後８５％の溶液Ｂまでさらに３分上昇させるグラジエントでカラムから溶出させて、カラムを清掃した。Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓは、Ｎａｎｏｓｐｒａｙ Ｆｌｅｘエレクトロスプレーイオン源（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を備えていた。１０μｍ ＳｉｌｉｃａＴｉｐエミッター（Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ、Ｗｏｂｕｒｎ、Ｍａ）からイオン源中へとスプレーされたペプチドイオンは、四重極子を標的化し、四重極子において単離された。次いでこれらをＨＣＤによりフラグメント化し、Ｏｒｂｉｔｒａｐでイオンフラグメントを検出した（分解能６０，０００、質量範囲１５０～１２００ｍ／ｚ）。ペプチドプロファイリングのための親水性ペプチド（ＳＳＲｃａｌｃ＜９、すべてロイシンなし）のモニタリングを、ＨＳＳ Ｔ３ ３００μｍ×１００μｍ、１．８ｍｍカラム、４μｌ／分の流速で行い、２％から１２％の溶液Ｂのグラジエントで溶出を発生させ、スプレーを３０ｍｍ ＳｉｌｉｃａＴｉｐエミッター上で作動させた。

【0417】

ｐ－タウペプチド発見のためのＰＲＭの原理 － タウ濃縮生物学的抽出物、例えばヒト脳可溶性画分からのタンパク質の消化により、仮定のリン酸化部位を含有するタウペプチドを生成した。これらのペプチドは、四重極子－Ｏｒｂｉｔｒａｐ機器、例えばＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｌｕｍｏｓを使用するターゲットＭＳ分析によりスクリーニングする。各リン酸化ペプチドに関して、ターゲットＭＳパラメーター、例えば前駆体質量、衝突エネルギー、または予想される保持時間の選択は、インシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）で行い、試料における存在量がはるかに多い対応する未修飾ペプチドで測定される生物物理学的性質を使用して精密化した。リン酸化ペプチドを検出するために、四重極子は、仮定の前駆体質量を含む質量ウィンドウを選択するように設定される。前駆体衝突後、生成されたフラグメントはすべて、クロマトグラフィーの溶出時間にわたり、Ｏｒｂｉｔｒａｐで同時に測定される。潜在的にリン酸化されたペプチドは、生成されたデータの後分析で調査され得る。Ｓｋｙｌｉｎｅソフトウェア（ＭａｃＣｏｓｓ Ｌａｂ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＷＡ）を使用して、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳデータを抽出した。スクリーニングされる仮定のペプチドは、予測されるＭＳ／ＭＳフラグメントから抽出される質量の厳密な共溶出により構成されるＬＣ－ＭＳ／ＭＳフィンガープリントとして検出される（図２）。古くからのＤＤＡまたはターゲットＭＳ法を上回るＰＲＭ法の利点は、ＭＳ機器を考えられる最高感度の構成で使用する、および発見能力を保つ能力である。

【0418】

スクリーニング中の四重極子－Ｏｒｂｉｔｒａｐ機器の最大感度は、マイナーなイオンフラグメントを検出するのに不可欠であり、リン酸化部位の局在化と共にリン酸化ペプチドの同定を促進する。ＰＲＭ測定の感度は主に、Ｏｒｂｉｔｒａｐ分析器へと移された目的の標的からのイオンの数に依存する。この数は、１つのＭＳ／ＨＲＭＳスキャンを取得するのに使用される充填時間を長くすることにより増加した。充填時間は、イオンビームからイオントラップデバイスへと、標的の前駆体質量を蓄積するために費やされる時間に相当する。蓄積した前駆体を、次いでフラグメント化し、生成フラグメントをＯｒｂｉｔｒａｐに移して分析する。したがって、充填時間は、クロマトグラムシグナルを記載するのに十分なデータポイントを取得するのに十分なＭＳスキャン速度（すなわちクロマトグラフィーのピーク当たり８～１５スキャン）の必要性により限定される最大値に設定される。調査した各リン酸化ペプチドに対するＰＲＭスクリーニングの充填時間は、典型的には１秒に設定した。

【0419】

充填時間は、トラップが飽和する危険性によっても限定される。これは、同一のスキャン内でサンプリングされ、Ｏｒｂｉｔｒａｐに移されるイオンが多過ぎる場合に発生し、空間電荷効果により質量測定が不正確になる。そのような飽和を避けるために、マトリックス上の標的を濃縮する適切な試料精製（免疫精製）と共に、狭い前駆体単離（０．７Ｄａ）を選択して、潜在的な近同重体干渉（ｎｅａｒ－ｉｓｏｂａｒｉｃ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）の寄与を減少させる。

【0420】

ＰＲＭ発見実験の特異性は、ＬＣ－Ｑ Ｏｒｂｉｔｒａｐシステムの分解能力に依存する。分解能力は、様々な分析パラメーターにより改善され得、最終目標は、標的ペプチドの干渉のないＬＣ－ＭＳ／ＭＳフィンガープリントを得ることである。これにより、偽陽性シグナルによる曖昧なフラグメントを割り当てる危険性が限定される。ｐ－タウを優先的に濃縮する試料精製も、マイナーなリン酸化タウペプチドの発見における特異性を改善し得る。クロマトグラフィーのピークキャパシティおよび分解能が高いと、共溶出の可能性が限定される。前駆体に対する四重極子単離ウィンドウが狭いと、ＭＳ／ＭＳスペクトル上での干渉の確率が低下し、それと共に上記のようにトラップが飽和する危険性が限定される。Ｏｒｂｉｔｒａｐの高い分解能および分析器の較正により、データ加工中に質量フラグメントの正確な抽出が可能となり、これにより、トランジション干渉（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）の危険性が限定される（Ｇａｌｌｉｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１２； Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１２）。Ｏｒｂｉｔｒａｐ分解能の選択（６０ｋ）は、より多い取得時間を必要とする高い分解能と、クロマトグラフィーの取得と両立できる妥当なスキャン速度との間のバランスである。

【0421】

タウの部位特異的リン酸化率の定量的評価 － 脳およびＣＳＦからのタウにおける特定部位のリン酸化の相対的な存在量を定量的に評価するために、発明者らは、検出された各部位でのリン酸化の程度を測定した。発明者らは、この目的のために３種の方法を使用した。１）リン酸化ペプチド異性体間の相対的比較：トランジションイオン（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｉｏｎ）からのシグナルの比較を使用して、各リン酸化部位を同定する。これは、同一の配列を共有する各リン酸化ペプチドの相対的な存在量を推定することができる。２）リン酸化ペプチドを、非リン酸化ペプチドを基準として用いて標準化する：各リン酸化ペプチドに特異的なＬＣ－ＭＳ／ＭＳトランジションを、非リン酸化ペプチドからの対応するトランジションと比較する。得られた各リン酸化部位の比を、タンパク質配列にわたり比較することができる。この方略は、非リン酸化ペプチドとリン酸化ペプチドとの間のフラグメント化効率における差によりバイアスがかかることがある。この方法は、リン酸化部位がトリプシン切断欠如の一部である場合、適用することができない。３）各リン酸化および非リン酸化ペプチドの標識した合成内部標準（例えばＡＱＵＡ）を使用した絶対量定量：リン酸化および非リン酸化標準からのシグナルを使用して、内部比を定義する。この方略は、比較される各ペプチドのフラグメント化特異性を計算に入れるが、モニターされる各種のペプチド合成を必要とする。

【0422】

この研究では、トリプシン切断欠如を含むものを除いて、第２の方法を利用して、リン酸化率を計算した。発明者らは、合成リン酸化ペプチドが利用可能な場合、脳およびＣＳＦ抽出物の両方に見出されたリン酸化部位（すなわちＴ１７５、Ｔ１８１、Ｓ１９９、Ｓ２０２、Ｔ２０５、Ｔ２１７およびＴ２３１）の限定されたセット、ならびに脳にのみ見出された１つの部位（Ｓ４０４）に、第３の方法（ＡＱＵＡ標準化）も適用した（表１）。ＡＱＵＡ測定では、脳抽出物を、ＣＳＦタウレベルと同等になるように５００～８０００倍に希釈した。この希釈は、ＡＱＵＡ内部標準と脳対ＣＳＦ中のタウペプチドレベルとの著しく異なる比に起因し得るマトリックス効果を最小化した。第１の方法は、多数のリン酸化残基を含有するｐ－タウ配列からの複雑なＬＣ－ＭＳ／ＭＳパターンを最初に解釈するのに使用した。

【0423】

統計値 － データは、特に指定がない限り平均±ＳＤとして表す。データの正規分布を確認した後で、タウリン酸化率を比較するために、一元配置ＡＮＯＶＡ、続いてポストホック分析（Ｔｕｋｅｙ検定）を行った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．からのＧｒａｐｈＰａｄバージョン８．０．１（２４４）を使用して、追加の統計分析を完了した。関連性がある群間の統計学的有意性は、両側、対応のないＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ ｔ－検定で判定した。有意性は、０．０１および０．０５レベルで評価した。
［実施例５］

【0424】

大脳のアミロイド病変は、タウ高リン酸化における部位特異的な差に関連する
皮質ＰｉＢ－ＰＥＴの標準取込値比（ＳＵＶＲ）は、有意な皮質Ａβ－プラークを確実に同定し、対象をＰＩＢ陽性（アミロイド＋、ＳＵＶＲ≧１．２５）または陰性（アミロイド－、ＳＵＶＲ＜１．２５）として分類するために使用される。アミロイドプラークおよび可溶性タウ種の関係を探査するために、発明者らは、皮質ＰｉＢ－ＰＥＴのＳＵＶＲを、ＣＳＦ総タウ、および複数の部位におけるＣＳＦタウのリン酸化（すなわちタウの、リン酸化部位の非リン酸化部位に対する比）と比較した。（図１６Ａ）突然変異保持者（ＭＣ）を皮質Ａβ－プラーク（すなわち、アミロイド＋）を有するものと分類するための、Ｔｈｒ２１７におけるタウのリン酸化（ｐ－Ｔ２１７）は、曲線下面積（ＡＵＣ）、９７．２％［０．９４、０．９９の９５％信頼区間（ＣＩ）］］を有し、Ｔｈｒ１８１におけるタウのリン酸化（ｐ－Ｔ１８１）は、ＡＵＣ ８９．１％（ＣＩ ０．８３、０．９４）を有し、Ｔｈｒ２０５におけるタウのリン酸化（ｐ－Ｔ２０５）は、ＡＵＣ ７４．５％（ＣＩ ０．６９、０．８２）を有し、総タウは、ＡＵＣ ７２％（ＣＩ ０．６５、０．７９）を有した。これらのデータから、有意な原線維性Ａβ陽性プラークの早期ステージにおいて、その時間内にこれらの２つのプロセスを結び付ける特定部位におけるリン酸化の増加が既に始まっていることが示される。これらのデータから、Ｔ２１７の非リン酸化に対するリン酸化の比の上昇は、原線維性Ａβプラーク病変に対する高感度の診断マーカーとしての役割を果たし得ることも実証される。

【0425】

発明者らは、次いで、ＰｉＢ－ＰＥＴ ＳＵＶＲ四分位による４箇所のリン酸化部位の平均標準化リン酸化比および総タウレベルを比較して、Ａβ－プラーク総負荷とリン酸化との間の関係を探査した、図１６Ｂ。Ｓｅｒ２０２（ｐ－Ｓ２０２）を除くすべてのリン酸化部位から、より大きいＡβ－プラーク病変を伴うリン酸化の増加が実証された。他の３箇所の部位の間の差も発見された。ｐ－Ｔ２１７およびｐ－Ｔ１８１は、プラークがスタートすると最大の増加を示した（四分位２～３）が、これらの増加の規模は、プラーク負担が大きくなるにつれて低下し、対照的に、ｐ－Ｔ２０５におけるリン酸化の増加および総タウレベルの上昇がＡβプラークと共に高まり続けた。これらの結果から、ＡＤにおいて最初にタウリン酸化の増加を引き起こす事象は、潜在的に、リン酸化部位に特異的な固有のキナーゼおよびホスファターゼの調節を通して、Ａβ－プラーク病変に関連している可能性があることが示唆される。さらに、データから、ｐ－Ｔ２１７は、原線維性Ａβ－プラーク病変の代理のバイオマーカーとしての役割を果たし得ることが示唆され、Ａβ－関連タウ処理の潜在的に特有のシグネチャーが同定される。重要なことに、突然変異非保持者（ＮＣ）のうち、Ｔ２１７におけるリン酸化の増加を示した参加者のみが、ＰｉＢ＋（ＳＵＶＲ＞１．２５、ｎ＝４）である者であった。

【0426】

発明者らは次に、ＰｉＢ－ＰＥＴ ＳＵＶＲにより測定した特異的タウリン酸化部位と、アミロイドプラーク沈着の皮質および皮質下領域との間の相関を探査することにより、部位特異的なタウリン酸化が、大脳のＡβ－プラーク病変の解剖学的分布に関連していたかどうかを評価した、図１６Ｃ。Ｔ２１７、Ｔ１８１およびＴ２０５におけるリン酸化は、脳全体にわたってＡβ－プラークと正に相関していたが、Ｓ２０２におけるリン酸化は、負に相関していた。早期のアミロイドプラーク沈着の領域である楔前部では、タウアイソフォームとの相関を、年齢、性および症状発症までの推定年数（ＥＹＯ）について制御する二変量回帰の強度に基づいて比較し、多重比較に調整した。発明者らは、ｐ－Ｔ２１７（β＝０．６８、ｐ＜１０－３０）、ｐ－Ｔ１８１（β＝０．４６、ｐ＜１０－６）、ｐ－Ｔ２０５（β＝０．４１、ｐ＜１０－５）および総タウ（β＝０．３５、ｐ＜０．００１）であり、Ａβ－プラークと正の相関である相関の順位を見出した。対照的に、ｐ－Ｓ２０２は、逆相関（β＝－０．４７、ｐ＜１０^－７）を有し、これにより、この部位におけるリン酸化は、Ａβ病変の増大に伴って減少することが示唆された。これらの関係は、神経変性の証拠がほとんどない場合、発症前（ｐｒｅ－ｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ）のＭＣに存在しており、これにより、ＣＳＦ中のリン酸化タウにおける増加は、死にかけているニューロンからの受動放出の結果ではなく、Ａβ－プラーク病変^２２の存在に関連した能動的プロセスの可能性が高いことが示唆された。
［実施例６］

【0427】

疾患ステージおよび進行は、タウ高リン酸化および長期的な変化率における部位特異的な差に関連する
ＤＩＡＤの疾患発症の確実性および症状発症の予測可能性により、ＥＹＯ（すなわち、評価時の個人の、突然変異を有する他者の発症年齢と比べた年齢）に基づいて個人のステージ分類が可能になる^{９、１０、３０}。発明者らは次に、ＣＳＦタウのリン酸化パターンに時間差が存在するかどうかを判定した。これは、ＥＹＯに基づいてＭＣとＮＣとの間の経時的なリン酸化の量および変化率における差を推定することにより行われた。２つの重要な知見が存在した。第一に、総タウおよび特定部位におけるリン酸化の増加は、慎重な（ｄｉｓｃｒｅｅｔ）順序で起こる証拠が存在していた。Ｔ２１７のリン酸化は、－２１ＥＹＯ付近で起こり、－１９ＥＹＯ付近でＴ１８１のリン酸化、次いで－１７ＥＹＯ付近で総タウの増加、次いで－１３ＥＹＯ付近でＴ２０５のリン酸化が続いた（図１７Ａ～Ｆ）。Ｔ２１７における最初のリン酸化の増加、およびそれより低度のＴ１８１における増加は、Ａβ－プラークが増加し始めたときと同様の時間（－１９ＥＹＯ）に発生した。第二に、Ｔ２１７およびＴ１８１のリン酸化の比は、症状発症時付近で有意に低下し始めた一方、Ｔ２０５におけるリン酸化は増加したままであり、総タウレベルは上昇し続けた。注目すべきは、すべての非リン酸化ペプチドの濃度が疾患進行に伴って上昇し（データは示さず）、これにより、Ｔ２１７およびＴ１８１でのリン酸化比の低下が、これらの部位を特異的に含む非リン酸化ペプチドの不均衡な増加の結果ではないことが示唆された。Ｓ２０２では、疾患の間にリン酸化の有意な変化は認められなかった、図１７Ｅ。これらの結果から、タウのリン酸化は、各部位で示差的に起こり、疾患ステージにより特定部位で増加または減少することが示される。これらの部位特異的変化から、以前に認識委されたものよりも動的な、可溶性タウの変化が連鎖すること、また、タウは、リン酸化状態または比が単調に増加しないことが示唆される。Ａβアミロイドプラークの出現および臨床的悪化の発症は、間が２０年離れており、可溶性タウリン酸化が変化するステージの２つの重要な分界をマークしている。
［実施例７］

【0428】

疾患進行の神経画像化マーカーは、タウ高リン酸化における部位特異的な差に関連する
家族歴を使用した症状発症の推定（ＥＹＯ）に加えて、疾患進行の様々な要素、例えば脳萎縮および代謝低下を追跡する神経画像化測定値を使用してＤＩＡＤにおける疾患進行も推定することができる。これらの測定値は、症状発症前の異なる期間に変化することが示されており、大脳代謝の低下（［Ｆ１８］フルオロデオキシグルコース［ＦＤＧ］－ＰＥＴにより測定された）は、症状発症前１８年までに発生し、脳萎縮（ＭＲＩにより判定された）は、症状発症前１３年までに発生した^{２８、３１～３３}。これにより、これらのバイオマーカーが同じく特定部位においてタウリン酸化と相関しているかどうかという疑問が生じる。これを検査するために、発明者らは、性、年齢およびＥＹＯについて制御する３４箇所の皮質脳領域および６箇所の皮質下脳領域からの画像化測定値を用いて、リン酸化部位と総タウとの間の二変量横断的相関付け（ｃｒｏｓｓ－ｓｅｃｔｉｏｎａｌ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）を行った。発明者らは、疾患進行の最も早いステージにおける何らかの関連を同定するために、分析の焦点を無症状ＭＣに合わせた。Ｓ２０２におけるタウのリン酸化状態は、疾患進行にわたり変化がないことを踏まえこれらの分析に含めなかった。

【0429】

ＭＲＩ － 高リン酸化は、無症状ＭＣにおける皮質の厚さと逆相関していた。ｐ－Ｔ２０５は、脳全体で皮質および皮質下の厚さの減少と最も強く関連していた、図１８Ａ、一方、ｐ－Ｔ２１７および総タウレベルは、乏しい領域的関連（ｒｅｄｉｏｎａｌ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）および弱い相関を示した。ｐ－Ｔ１８１における高リン酸化は、皮質萎縮と最も低い包括的相関を有し、頭頂葉内側および頭頂葉外側ならびに背内側核－内側前頭葉（ｍｅｄｉａｌ ｄｏｒｓａｌ－ｍｅｄｉａｌ ｆｒｏｎｔａｌ ｌｏｂｅｓ）に限られた。これにより、－１３ＥＹＯでのｐ－Ｔ２０５の初期上昇は、発明者らが楔前部においておよそ－１３ＥＹＯで始まることを以前に示した２８、皮質萎縮の根底にある病因に関連し得ることが示唆される。

【0430】

ＦＤＧ ＰＥＴ － 皮質萎縮に加えて、ニューロンおよびグリアにおけるグルコース代謝の低下は、ＡＤにおける疾患進行に関連する。したがって発明者らは、皮質または皮質下の代謝障害とタウリン酸化の間に固有の関連が認められるかどうかをテストした。無症状ＭＣでは、Ｔ２０５におけるリン酸化は、ＦＤＧ－ＰＥＴにより測定される皮質および皮質下領域全体にわたるグルコース代謝低下と相関していた、図１８Ｂ。無症状ＭＣにおける他のｐ－タウ部位または総タウレベルについて同定された最小限の関連が認められた。

【0431】

まとめると、これらの結果から、神経画像化により測定された、無症状の疾患進行中に、神経細胞障害および神経変性を引き起こす根底にあるプロセスが示され、これが、ｐ－Ｔ２０５と最も密接に関連している。最近の研究は、ｆｙｎ－キナーゼ経路を通した、Ａβ－誘導シナプス後細胞毒性^３４に応答する、シナプス後終末におけるｐ－Ｔ２０５に対する保護的役割を同定した。シナプス機能が低下している場合、ここで見出される関連は、Ｔ２０５におけるリン酸化の増加を生じさせる保護プロセスを表し得る可能性がある。しかし高リン酸化は、経時的にタウが凝集する素因になり得る。一方、Ｔ１８１およびＴ２１７におけるリン酸化は、皮質のＡβ－プラーク病変の存在により強く関連すると思われ、潜在的には、Ｔ２０５の高リン酸化および可溶性非リン酸化タウレベルの上昇の上流で発生する。
［実施例８］

【0432】

認知低下は、タウ高リン酸化における部位特異的な差に特異的かつ示差的に関連する
先行する研究から、ＡＤ認知症は、新皮質Ａβ病変よりも新皮質ＮＦＴ病変に密接に関連することが示されているが^３５、可溶性タウと認知との間の関係は依然不確定なままである。したがって、発明者らは、臨床転帰を比較して、可溶性タウのリン酸化比および総タウレベルにおける長期的な変化を経時的に評価した^３６。発明者らは、転帰として神経心理学的複合（ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔ）に対する長期的な認知パフォーマンス（ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）、ならびに予測因子としてＣＳＦタウの測定値における変化（個別の線形混合効果モデルに由来する）、時間およびそれらの相互作用を伴う混合効果モデルを行い、年齢、性、教育および家族関係について調整した。発明者らは、この分析のためにすべてのＭＣ（有症状および無症状）をテストし、リン酸化部位と臨床的悪化および認知低下との間の示差的効果を見出した。非リン酸化タウは、認知の悪化に伴って単調に増加し、Ｔ２１７およびＴ１８１におけるリン酸化は、認知の悪化に伴って減少したが、ｐＴ２０５は、認知低下と比べて変化を実証しなかった。

【0433】

Ｔ２１７およびＴ１８１のリン酸化比が減少するにつれて、認知低下が加速した（ｔ値２．３５、ｐ＝０．０２および２．１１、ｐ＝０．０４）、表３および図１９。これにより、可溶性タウの増加よりも大きいＴ２１７およびＴ１８１のリン酸化の減少は、認知低下の重要なマーカーとなることが示唆される。

【0434】

これらの知見は、ＣＳＦ ｐ－タウにおける連続した上昇が、認知機能不全に関連する現在のパラダイムに異を唱えている。この研究では、発明者らは２つの一般的なパターンを明らかにした。一部の部位で、認知の低下が始まるとリン酸化は有意に減少する一方、他の部位では、疾患進行に伴って連続した増加が示されたか、または変化がなかった（図１９における増加率対減少率を参照されたい）。さらに、発明者らが同定した、他の疾患進行のマーカー（Ａβ－プラーク、脳萎縮および代謝）と、総タウレベルおよび異なる部位におけるリン酸化との間の関連により、ＡＤにおけるタウリン酸化を引き起こすプロセスは、多因子性の可能性があり、等価ではないことがさらに強調される。
［実施例９］

【0435】

非リン酸化タウの増加は、タウＰＥＴによる皮質ＮＦＴと相関しているが、古典的なリン酸化－タウ種（ｐｈｏｓｐｈｏ－ｔａｕ ｓｐｅｃｉｅｓ）とは関連しない
ＤＩＡＤ参加者での最近のタウ－ＰＥＴ（^１８Ｆ ＡＶ－１４５１またはフロルタウシピル（ｆｌｏｒｔａｕｃｉｐｉｒ））研究により、ＮＦＴの増加は、臨床症状の発症後にのみ発生することが示唆されている^{３７、３８}。発明者らは、可溶性ｐ－タウがＮＦＴ病変のマーカーである一方、可溶性非リン酸化タウは、神経変性の指標として、死にかけているニューロンから受動放出される^１４という仮説をテストした。発明者らは、タウ－ＰＥＴが行われた時間にまでつながるＣＳＦタウとｐ－タウアイソフォームとの間の長期的な変化の関係を探査した。限定された数の参加者（ＭＣ１０名およびＮＣ４名）で、単回のタウ－ＰＥＴスキャンをＣＳＦ試料が得られた７２時間以内に行った。これらの個人では、ＣＳＦ試料は、以前の訪問（１～３年以内）でも得られており、これにより発明者らは、可溶性タウ測定値における長期的な変化がタウ－ＰＥＴレベルを予測する能力を評価することが可能となった。

【0436】

第一に、発明者らは、ＭＣにおける皮質ＮＦＴレベルは、症状発症時付近のみで上昇することを確認し、図２０、これにより、ＤＩＡＤ ＭＣにおいて、タウ凝集物が増加し始めると、臨床的悪化が始まることが示唆された。第二に、発明者らは、ＣＳＦの非リン酸化タウにおける長期的な増加は、皮質タウ－ＰＥＴ（ｐ＝０．０３）値の上昇に関連することを見出した、表４。Ｔ２０５のリン酸化の増加は、より高いレベルのタウ－ＰＥＴに関連し、反対に、Ｔ２１７、Ｔ１８１およびＳ２０２のリン酸化の減少は、タウ－ＰＥＴのレベルの上昇に関連する傾向が認められた、図２１。まとめると、これらの知見から、ｐ－タウではなくＣＳＦ中の非リン酸化タウの増加は、ＮＦＴ病変の広がりに、より密接に結び付くことが示唆される。対照的に、凝集タウが増加していると可溶性ｐ－タウ種は減少し、これは、高リン酸化された凝集物による隔離プロセスを表し得る。

【表2】

【表3】

【表4】

【0437】

実施例５～９の考察
タウは、ＡＤ病変の特質を構成し、凝集形態または可溶性形態で測定され得るが、この重大な神経細胞タンパク質の翻訳後修飾が、ヒトにおけるＮＦＴ^２および神経変性の発症にどのようにつながるかについての我々の理解には、大きなギャップが残っている。発明者らはここで、ＡＤ進行の間、ＣＳＦ中のタウのリン酸化パターンがどのように変動するかを実証する。発明者らは、ＤＩＡＤにおいて、タウリン酸化および中枢神経系中への放出プロセスは、１）Ａβ－プラーク負担（ＰｉＢ－ＰＥＴにより測定される）が確立される（発症の数十年前）と始まり、続いてほぼ２０年の期間にわたり展開し、その間、タウタンパク質の異なるリン酸化部位は、疾患進行の異なるマーカーを伴う別個の相でリン酸化され；また、２）認知低下および凝集タウの増加（タウ－ＰＥＴにより測定される）の時間付近で部位依存的な手段で有意に減少する、能動的プロセスであるという実証を既存の臨床文献に追加する。まとめると、これらの結果から、可溶性リン酸化／非リン酸化タウペプチドを定量するこの方法は、前臨床ステージから症状ステージ（ｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ ｓｔａｇｅ）にわたるＡＤプロセスを追跡し、この疾患におけるリン酸化－タウ病変のシグネチャーを得ることができることが示される。さらに、これらは、ＤＩＡＤおよび場合によりＡＤ全般におけるタウ／ｐ－タウの役割とされているものに異を唱え、Ａβ病変をタウ高リン酸化^{２１、２３、２５、３９}、および死にかけているニューロンの放出の結果ではなく能動的な細胞の放出に結び付ける動物研究からのそのような知見をヒトにおいて再現する。

【0438】

因果関係は将来の研究で検討する必要があるが、ｐ－Ｔ２１７、ｐ－Ｔ１８１およびＰｉＢ－ＰＥＴが同時に増加することにより、ＡＤにおけるタウの広範なリン酸化のレベルは、Ａβ病変に密接に結び付くことが示唆される。この仮説は、最近のＡＤトランスジェニックマウスにおける研究^{２０、２１、２３、３４、４０}および安定同位体標識動力学（ＳＩＬＫ）における研究と一致し、これにより、ｐ－タウアイソフォームは、Ａβ－プラークの存在下で増加する能動的プロセスにおいて細胞から放出されることが実証される２２。発明者らの結果は、Ａβ病変を、可溶性タウペプチド濃度およびリン酸化パターンにおける固有の変化に結び付け、ＡＤにおいてｐ－タウの有意な上昇が発生するが、他の神経変性のタウオパチーにおいては発生しない現象１６、１７を解明する。これらの知見から、臨床症状の発症前に早期ＡＤ病変の潜在的な治療標的、ならびにバイオマーカーへの重要な洞察も得られる。

【0439】

最近の研究は、体細胞ＮＦＴが確立されるかなり前に発生するＡβトランスジェニックマウスにおけるＡＤ脳からのＮＦＴ単離物により誘導される神経突起タウ凝集物（変性神経突起中の対になったらせん状フィラメント）の増加および広がりを示している２０。ｐ－Ｔ２１７およびｐ－Ｔ１８１における非常に初期の増加は、Ａβ－プラークに応答したこの「初期」のタウ凝集を反映し得、ＰｉＢ ＰＥＴと、発明者らが同定したこれらのアイソフォームの全般的な関連を説明し得る可能性がある。さらに、これにより、有意な神経変性の何年も前に発生することから、ｐ－タウにおけるこの初期上昇中に見られる臨床症状の欠如がより良く説明され得る。この研究は、ｐ－Ｔ２１７を、アミロイドを標的とする治療法において治療応答の指標として有望な用途を有する非常に初期のバイオマーカーとしても提案する。これは、有効な治療法を同定するために疾患進行の代理マーカーが必須な予防研究において特に重要であり得る。

【0440】

可溶性タウおよびｐ－タウの診断の役割に関するいくつかの一般的な仮定は、ここで疑問視されている。具体的には、ＡＤにおける現在の診断の枠組みは、ＡＤに特異的および非特異的な病変を表すバイオマーカー（例えばＡβ、ｐ－タウおよびタウ）の存在を強調する１４。この診断の枠組み内では、可溶性ｐ－タウおよび非リン酸化タウは、変性するニューロンから受動的に放出されると推測されることが多く、ｐ－タウは、凝集ＮＦＴに関連し、非リン酸化タウは、軸索変性に関連する。あるいは、発明者らのＤＩＡＤにおける結果から、ＡＤタウオパチーは、可溶性タウリン酸化状態（リン酸化比）の変動と定義され得ることが示唆される。さらに、特異的リン酸化部位における状態変化のタイミング（推定される症状発症の２１～１３年前）を考慮すると、これにより、リン酸化の増加は、病変のマーカーであるが、必ずしもタウ関連毒性または細胞体ＮＦＴのマーカーではないことも示唆される。実際に、発明者らの結果から、ＮＦＴ病変が急速に増加しているとき、ｐＴ２１７およびｐＴ１８１では、リン酸化は、増加し続けるのではなく３７、その劇的な減少が認められることが示される。これについての考えられる説明の１つは、可溶性／凝集Ａβで観察されたものと同様であり４１、凝集タウの劇的な増加によって、リン酸化タウが脳に隔離され４２、ＣＳＦレベルが低下する。しかし、タンパク質恒常性機構を通したタウの減少は排除することができない。いずれのケースでも、Ｔ２１７またはＴ１８１のリン酸化比と長期的な認知低下との間における負の相関の発明者らの知見は、疾患進行におけるこの事象の重要性を強調する。この低下の原因を解明することは、可溶性タウと神経細胞機能不全との間の結び付き、ならびにＡＤ予後判定におけるＣＳＦ ｐ－タウ／タウの使用のより良い理解につながり得る。

【0441】

タウのリン酸化におけるキナーゼの役割を踏まえると、この酵素群は現在ＡＤ治療の潜在的な標的とみなされている４３。発明者らは、ｐ－タウのすべての形態が疾患進行のマーカーに関連しているわけではなく、実際に一部はそれに反して作用し（ｗｏｒｋ ａｇａｉｎｓｔ ｉｔ）得ることをここで実証したので、ｐ－タウ変化を生じるあるキナーゼ／ホスファターゼ活性は、少なくとも疾患プロセスの初期に有害ではないことがある。

【0442】

要約すれば、発明者らは、常染色体優性突然変異に関連するＡＤにおいて、ＣＳＦタウ高リン酸化は、非常に初期に起こり、疾患の異なるステージで部位特異的変化のパターンを示すことをここで実証している。これらの知見の背後の根本的な機構は、疾患の理解およびＡＤのためのタウ指向性治療法に重要な意味合いを有するであろう。

【0443】

実施例５～９の材料および方法
参加者 － ＰＳＥＮ１、ＰＳＥＮ２またはＡＰＰに遺伝的突然変異が確認された家族からのＤＩＡＤ突然変異を継承する危険性が少なくとも５０％の参加者が、Ｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｎｅｔｗｏｒｋ研究（ＤＩＡＮ， ＮＩＡ Ｕ１９ ＡＧ０３２４３８）（ｄｉａｎ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ；ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ ｎｕｍｂｅｒ ＮＣＴ００８６９８１７）に登録された^４４。すべての手順は、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの治験審査委員会（ＩＲＢ）により承認され、研究が行われている地域のＩＲＢおよび倫理委員会に従った。ＤＩＡＤ突然変異の有無は、適切なエクソンのＰＣＲに基づく増幅、続いてＳａｎｇｅｒ配列決定法を使用して判定した。各研究訪問で、参加者は包括的な臨床評価、認知テスト、神経画像化およびＣＳＦ研究を受けた。しかし、各訪問で、各参加者はすべての研究手順を完了しないことがあった。研究構造および評価の詳細は、既刊行物１０、４４で見出され得る。フォローアップの間隔は、各参加者の臨床状態（正常または損なわれた）により、および症状発症までの推定年数（ＥＹＯ）により判定され、１年に１回～３年に１回の範囲であった。データは、品質管理されたデータ（２００９年１月２６日～２０１７年６月３０日の不規則な結果および欠落データの年毎の品質評価）から得、参加者３７０名（長期的なＣＳＦ評価ｎ＝１５０、訪問間の時間中央値２．８年）を含んでいた。

【0444】

症状発症までの推定年数（ＥＹＯ） － 優性遺伝ＡＤでは、ほぼ１００％の浸透率であり、突然変異保持者における症状発症時の年齢は、各突然変異で、また各家族内で比較的一貫している。これにより、症状発症までの推定年数（ＥＹＯ）を指定することが可能となる。ＥＹＯは、以下のように定義した。最も早い症状発症時の親の年齢を、半構造化された問診により各参加者で確定した。次いで、各突然変異に対する発症時の親の年齢を、ＤＩＡＮおよびＤＩＡＤコホートによる既刊行物からの組み合わせた症状発症の値からなるデータベースに入れた。これらを使用して、各突然変異に特異的な発症平均年齢を計算した２９。突然変異に特異的な発症年齢を、臨床評価の時間における各参加者の年齢から引いて、個人のＥＹＯを定義した。特異的な突然変異の発症平均年齢が不明な場合は、親または代理の発症年齢を使用してＥＹＯを定義した２９。ＣＤＲ＞０により評価されるベースラインで有症状であった参加者では、報告されている実際の症状発症年齢を、各臨床評価の年齢から引いて、ＥＹＯを定義した。

【0445】

臨床評価 － 研究パートナーの使用を含む標準化された臨床評価を各参加者に行った。臨床的認知症尺度（ＣＤＲ）を使用して、認知症のステージを示した。参加者は、認知に関して正常な（ＣＤＲ＝０）、または非常に軽度の認知症（ＣＤＲ＝０・５）、軽度の認知症（ＣＤＲ＝１）もしくは中等度の認知症（ＣＤＲ＝２）を有すると査定した４５。評価する臨床医は、遺伝的状態を盲検化された。一般的な認知機能、記憶、注意力、実行機能、視空間機能および言語を評価する包括的な神経心理学的バッテリーを各訪問で行った４６。これらのテストから、発明者らは、ＥＹＯおよびＣＤＲの範囲にわたる悪化を、確実に検出する認知複合を開発した４７。複合は、エピソード記憶、複雑性注意および処理速度、ならびに一般的認知のスクリーニングを含むテスト（ミニメンタルステート検査）からのｚスコアの平均を表す。

【0446】

ＣＳＦタウ分析 － ＣＳＦは、非外傷性Ｓｐｒｏｔｔｅ脊髄針（２２Ｇａ）を使用する標準的な腰椎穿刺手順（Ｌ４／Ｌ５）により、２本の１３ｍｌポリプロピレン管中に収集した。ＣＳＦを、ドライアイス上で直立させて瞬間凍結した。米国で収集した試料は、ドライアイス上で、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡのＤＩＡＮのバイオマーカー中核研究室（ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｃｏｒｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）へと終夜輸送した一方、各国の拠点（ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｓｉｔｅ）で収集した試料は、－８０℃にて保存し、年４回ドライアイス上で輸送した。到着すると、各試料を続いて解凍し、単一のポリプロピレン管中に組み合わせ、ポリプロピレン微量遠心分離管（＃０５－５３８－６９Ｃ、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）中にアリコートし（各５００μｌ）、その後これらをドライアイス上で再度瞬間凍結し、－８０℃にて保存した。

【0447】

解凍した各ＣＳＦ試料を、１５Ｎ－４４１タウ内部標準（試料ごとに２．５ｎｇ）、５０ｍＭグアニジン、１０％ ＮＰ－４０および１０×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含有する２５μｌの溶液と混合した。タウは、タウ１（タウエピトープ１９２～１９９）およびＨＪ８．５（タウエピトープ２７～３５）抗体に架橋させた２０μｌのセファロースビーズと共に、室温にて２時間、回転下でのインキュベーションを使用するイムノキャプチャーにより抽出した。ビーズを遠心分離によりスピンさせ、次いで１ｍｌの２５ｍＭ ＴＥＡＢＣで３回すすいだ。試料を４００ｎｇのｔｒｙｐｓｉｎ Ｇｏｌｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）で、３７℃にて終夜消化した。ＡＱＵＡペプチド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）をスパイクして、各試料中の標識リン酸化ペプチド当たり５ｆｍｏｌおよび標識未修飾ペプチド当たり５０ｆｍｏｌの量を得た。ペプチド混合物をＴｏｐＴｉｐ Ｃ１８チップにロードし、０．１％ギ酸（ＦＡ）溶液で洗浄し、６０％ＡＣＮ ０．１％ＦＡ溶液で溶出した。Ｓｐｅｅｄｖａｃを使用して溶出液を乾燥させ、乾燥試料を－８０℃にて保存した後分析した。試料を２５μｌの２％ＡＣＮ ０．１％ＦＡ中で再懸濁した。抽出物は、ＨＣＤフラグメント化を使用する並列反応モニタリングを使用するｎａｎｏＬＣ－ＭＳ／ＨＲＭＳにより分析した。Ｆｕｓｉｏｎ Ｔｒｉｂｒｉｄ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に連結したｎａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を使用してＮａｎｏＬＣ－ＭＳ／ＭＳ実験を行った。５μｌを各試料に注入した。ペプチド分離は、Ｗａｔｅｒｓ ＨＳＳ Ｔ３カラム（７５μｍ×１００ｍｍ、１．８μｍ）上で６０℃にて２４分で達成した。移動相は、（Ａ）水中０．１％ギ酸および（Ｂ）アセトニトリル中０．１％ギ酸であった。使用したグラジエントは、０分～０．５％Ｂ；７．５分～５％Ｂ；２２分～１８％Ｂであり、次いでカラムを９５％Ｂで２分すすいだ。流速を７．５分間、７００ｎｌ／分、次いで残りの分析を４００ｎｌ／分に設定した。データを、２２００Ｖのスプレー電圧（Ｎａｎｏｓｐｒａｙ Ｆｌｅｘ Ｉｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、および２７０℃に設定したイオントランスファーチューブ（ｉｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｕｂｅ）で、陽イオンモードで取得した。Ｓ－レンズＲＦ電圧は６０Ｖに設定した。ＭＳ／ＨＲＭＳトランジション（ＭＳ／ＨＲＭＳ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）は、Ｓｋｙｌｉｎｅソフトウェア（ＭａｃＣｏｓｓ ｌａｂ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）を使用して抽出した。ＣＳＦタウリン酸化レベルは、内在非リン酸化ペプチドとタンパク質内部標準からの１５Ｎ標識ペプチドのＭＳ／ＨＲＭＳトランジション間で測定した比を使用して計算した。Ｔ１８１、Ｓ２０２、Ｔ２０５およびＴ２１７でのリン酸化の比は、リン酸化ペプチドと対応する非リン酸化ペプチドからのＭＳ／ＨＲＭＳトランジションの比を使用して測定した。内在する各リン酸化／非リン酸化ペプチドの比は、対応するＡＱＵＡリン酸化／非リン酸化ペプチド内部標準のＭＳ／ＨＲＭＳトランジション上で測定した比を使用して標準化した。

【0448】

脳の画像化 － アミロイド沈着、グルコース代謝、タウ（ＮＦＴ）ＰＥＴおよび皮質の厚さ／皮質下の容量はそれぞれ、１１Ｃ－ＰｉＢ－ＰＥＴ、１８Ｆ－ＦＤＧ－ＰＥＴ、１８Ｆ－ＡＶ－１４５１（別名フロルタウシピル）、および容量測定Ｔ１－強調ＭＲＩスキャンを使用して評価した。標準手順を使用して、すべてのＤＩＡＮ部位のデータ収集における整合性を確実にした２８。１１Ｃ－ＰｉＢ－ＰＥＴスキャンは、約１３ｍＣｉのＰｉＢをボーラス注射した後の７０分のダイナミックスキャンからなっており、４０～７０分時間枠の領域標準取込値比（ＳＵＶＲ）を判定した。１８Ｆ－ＦＤＧ－ＰＥＴスキャンは、約５ｍＣｉのボーラス注射の３０分後にスタートし、３０分続けた。１８Ｆ－ＡＶ－１４５１データは、ボーラス注射後の８０～１００分のウィンドウから取得し、ＳＵＶＲに変換した。Ｔ１ ＭＲ配列は、３Ｔスキャナー（パラメーター：ＴＲ＝２３０００、ＴＥ＝２．９５および１．０×１．０×１．２ｍｍ３の分解能）で取得した、加速された、磁化準備型グラジエントエコーによる迅速取得（ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｍａｇｎｅｔｉｚａｔｉｏｎ－ｐｒｅｐａｒｅｄ ｒａｐｉｄ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｅｃｈｏ）（ＭＰＲＡＧＥ）であった。

【0449】

ＦｒｅｅＳｕｒｆｅｒソフトウェア（ｓｕｒｆｅｒ．ｎｍｒ．ｍｇｈ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／）を使用して、目的の３４箇所の皮質および６箇所の皮質下領域（ＲＯＩ）からＰＩＢおよびＦＤＧ ＳＵＶＲを得た。ＳＵＶＲは、参照領域として小脳の灰白質（ｇｒｅｙ ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ）で処理し、ＲＯＩ データは、幾何伝達マトリックスフレームワーク（ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍａｔｒｉｘ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）で領域の点広がり関数（ＲＳＦ）４８を使用して部分的容量効果に関して補正した。

【0450】

統計分析 － 参加者のベースラインの特徴は、連続変数については平均±ＳＤとして、およびカテゴリー変数についてはｎ（列パーセント）と要約した。ベースラインで定義されている無症状ＭＣ、有症状ＭＣおよびＮＣの間の差を比較するためのＰ－値は、連続変数についての一般的な線形混合効果モデル（ＬＭＥ）およびカテゴリー変数についてのロジスティックリンクを備えた一般化線形混合効果モデルを使用して得られる。すべてのモデルは、同一の家族内の参加者の間における転帰の測定値の相関を明らかにするために、ランダムな家族効果を組み込んだ。ベースラインの皮質ＰｉＢ ＰＥＴ ＳＵＶＲのカットポイントは、ＭＣとＮＣとの間の、皮質ＰｉＢ ＰＥＴの長期的な変化率における差が最初に０とは有意に異なり始めるように選択される。

【0451】

すべての無症状ＭＣ（ＣＤＲ＝０、ｎ＝１５２）において、各ＲＯＩに対して二変量ＬＭＥを使用して、様々なタウリン酸化部位と、ＰｉＢ、ＦＤＧおよび皮質の厚さ／皮質下の容量との横断関係を評価した。モデルは、家族レベルでのＥＹＯ、教育、性別およびランダムインターセプトの固定効果を含んでいた。単純相関の推定方法（ＰｅａｒｓｏｎまたはＳｐｅａｒｍａｎ相関）と比較して、二変量ＬＭＥは、共変量、例えばＥＹＯに調整することができ、また、家族クラスター内の相関を説明する（ａｃｃｏｕｎｔｉｎｇ ｆｏｒ）ことができる４９、５０。相関をテストするためのＰ－値は、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法を使用して補正して５１、多重検定による偽発見率を制御した。

【0452】

長期的なフォローアップにわたる個人内の年次変化率に関して、ＬＭＥを使用して各バイオマーカーに対する最良線形不偏予測量を推定し、次いでこれを、ベースラインＥＹＯに対してプロットして、バイオマーカーの軌跡を検査した。適切な場合は、線形または線形スプライン混合効果モデルを次いで使用して、ＭＣがＮＣと、ベースラインレベルおよび各バイオマーカーに対する変化率に関して有意に異なるようになるベースラインＥＹＯポイントを判定した。線形スプライン混合効果モデルの詳細は、最近の刊行物で見出すことができる９。線形または線形スプライン混合効果モデルは、突然変異群（ＭＣまたはＮＣ）、ベースラインＥＹＯ、ベースラインからの時間およびそれらのうち考えられるすべての二元配置または三元配置交互作用（ｔｗｏ－ｗａｙ ｏｒ ｔｈｒｅｅ－ｗａｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）の固定効果を含んでいた。性別、教育年数およびＡＰＯＥ ε４の状態を共変量と考えたが、有意な効果のみをモデルに保った。モデルに含まれるランダム効果は、繰り返し測定による対象内相関を明らかにするための、家族クラスターのランダムインターセプト、個人のランダムインターセプト、および構造化されていない共分散マトリックスでのランダム勾配であった。ベースラインにおける平均レベルでの調整された差、およびＭＣとＮＣとの間の変化率における差は、次いで、モデルに由来する近似ｔ－検定を使用してテストして、差が有意になる第１のＥＹＯポイントを判定した。

【0453】

ＥＹＯの範囲にわたる総タウ、タウリン酸化部位、皮質ＰｉＢおよび全般的な認知のうち、変化率における差を視覚化するために、最初に、ＮＣの平均および標準偏差を使用してＭＣの測定値を標準化した。次いで、ＬＭＥを使用して各ＭＣに対する各測定値の変化率を計算し、ＬＯＥＳＳ曲線を当てはめて（ＬＯＥＳＳ ｃｕｒｖｅｓ ｗｅｒｅ ｆｉｔｔｅｄ）、ＥＹＯに対する標準化された変化率の軌跡を視覚的に表した。

【0454】

長期的な認知低下の予測におけるベースラインの総タウおよびｐ－タウの有用性は、ＬＭＥを使用して評価した。モデルにおける固定効果は、突然変異群、ベースライン年齢、性別、ＡＰＯＥ ε４状態、時間およびそれらのうち考えられるすべての二元配置または三元配置交互作用を含んでいた。モデルにおけるランダム効果は、家族クラスターのランダムインターセプト、個人のランダムインターセプト、および構造化されていない共分散マトリックスでのランダム勾配を含んでいた。

【0455】

線形回帰を使用して、タウＰＥＴが行われた時点までにつながる、およびその時点を含むＭＣおよびＮＣでのタウおよびリン酸化－タウ位置の年次変化率が、年齢の効果について制御して、タウＰＥＴ ＳＵＶＲを予測することができるかどうかを検査した。参加者の数が限定されていたため、家族クラスターは含まれなかった。

【0456】

すべての分析は、ＳＡＳ ９．４（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．、Ｃａｒｙ、ＮＣ）を使用して実施した。ｐ－値＜０．０５は、統計的に有意と考えられた。
［実施例１０］

【0457】

アルツハイマー病（ＡＤ）は、世界的に認知症の主因である。その診断および処置は、特定かつ初期のバイオマーカーが存在しないと、依然としてきわめて難易度が高い。最近の脳脊髄液（ＣＳＦ）バイオマーカーおよび脳陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）画像化の開発により、アミロイド－Ａβプラークおよび神経原線維高リン酸化タウのタングルの特徴的なＡＤ脳病変を検出する価値あるツールが得られた。現在、ＡＤ患者のＣＳＦプロファイルは、アミロイド－ベータ４２（Ａβ４２）の減少、ならびに、標準的なイムノアッセイで測定される総タウおよびリン酸化タウ（ｐ－タウ１８１）の増加により特徴付けられる。このプロファイルにより、ＡＤ対非ＡＤの病変の弁別、および認知症状または病訴の何年も前にＡＤプロセスの検出が可能となる。しかし、ＣＳＦタウおよびｐ－タウの変化は、ＡＤに特異的ではない。ｐ－タウ１８１の増加は、タングルが形成されることによる高リン酸化の結果と解釈されているが、ＣＳＦ ｐ－タウは、総タウに付随して増加する。脳研究は、多数の部位におけるタウリン酸化を示すが、ＣＳＦにおけるこれらのさらなるリン酸化部位の診断における妥当性（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｒｅｌｅｖａｎｃｅ）は、完全に検討されていない。質量分析（ＭＳ）に基づく方法は、リン酸化ペプチドのおよびそれらの対応する未修飾対応物の独立した定量が可能になるため、特定部位のリン酸化レベルにおける変化を、総タウレベルから独立して評価するのにイムノアッセイよりも適当である。したがって、ホスホペプチド勾配と非リン酸化ペプチド勾配との間の相関を比較して、リン酸化率を評価することができる。ＣＳＦ中のリン酸化タウアイソフォームを定量するために、発明者らは、タンパク質配列のｍｉｄドメイン中のタウリン酸化ペプチドを標的とする、革新的なターゲット高分解能ＭＳ（ＨＲＭＳ）方法を使用し、ｍｉｄドメインは、ＣＳＦ中で最も存在量が多いドメインであり、脳タウおよびＡＤタウ凝集物中において多数の部位でリン酸化される。

【0458】

発明者らは、認知に関して正常な個人、ならびに、ＣＳＦ Ａβ４２／４０比およびＰＥＴ－ＰＩＢ画像化に基づいてアミロイド状態により層別化された軽度認知障害を有する患者を含むコホートを使用して、ＣＳＦ中のＴ１８１、Ｓ１９９、Ｓ２０２、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化を分析した。この検証により、発明者らは、ＡＤ診断のためにＣＳＦ ｐＴ２１７の可能性を強調すること、およびｐＴ２１７と、疾患の早期ステージにおいてタウ修飾の根底にあるアミロイドーシスとの間に相関を確立することが可能となった。

【0459】

参加者 － Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ． ２０１５により以前に報告されており、ＣＳＦおよびアミロイド ＰｉＢ－ＰＥＴデータを利用できるＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ ＡＤＲＣ研究から、認知に関して正常な（ＣＤＲ＝０）、または軽度認知障害を有する参加者８６名を募集した。このコホートは、ＰｉＢ－ＰＥＴ（カットオフとして使用した０．１８超で陽性とみなした）およびＭＳにより測定されるＣＳＦ Ａβ４２／Ａβ４０比（カットオフとして使用した０．１２未満で病変とみなした）の結果によれば、アミロイド陽性２９名およびアミロイド陰性４７名の参加者、ならびにＰＥＴ－ＰＩＢとＣＳＦプロファイルとの間の結果と不一致の１０例（５例のＰｉＢ－ＰＥＴ（＋）／ＣＳＦ（－）および５例のＰｉＢ－ＰＥＴ（－）／ＣＳＦ（＋）アミロイドーシスプロファイル）を含んでいた。７種のＣＳＦ試料を二連で、１種を三連で抽出して、ばらつきを評価した。

【0460】

免疫沈降を使用したＣＳＦタウ精製 － Ａβ免疫沈降および－８０Ｃでの保存後に得た８００μｌのＣＳＦ上澄みをタウ分析に使用した。解凍した上澄みに１５Ｎタウ内部標準（試料当たり５ｎｇ）をスパイクし、タウ１免疫沈降を使用して抽出した。５ｍＭグアニジン、１％ ＮＰ－４０およびプロテアーゼ阻害剤カクテルを試料に添加し、次いで試料を、タウ１抗体に架橋させた２０μｌのセファロースビーズと共に、室温にて３時間混合した。ビーズを沈殿させ、次いで０．５ＭグアニジンおよびＴＥＡＢＣ ２５ｍＭですすいだ。試料を４００ｎｇのトリプシンで消化した。ＡＱＵＡペプチド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）をスパイクして、試料当たりの標識ホスホペプチド当たり１０ｆｍｏｌおよび標識ペプチド当たり１００ｆｍｏｌの個別量を達成した。ＡＱＵＡ ＴＰＳＬＰｐＴＰＰＴＲ（ｐＴ２１７）は、発見コホートに使用した切断欠如バージョンを置き換えた。トリプシンペプチドは、ＴｏｐＴｉｐ Ｃ１８チップにロードし、０．１％ＦＡ溶液で洗浄し、６０％ＡＣＮ ０．１％ＦＡ溶液で溶出した。溶出液をｓｐｅｅｄｖａｃで乾燥させた。試料を－８０Ｃにて保存した。ＬＣ－ＭＳ分析の前に、試料を２５μｌ ２％ＡＣＮ ０．１％ＦＡ中に再懸濁した。抽出物をｎａｎｏＬＣ－ＭＳ／ＨＲＭＳにより分析した。

【0461】

タウペプチドおよびリン酸化ペプチド定量（検証）－ １５Ｎ標識ペプチドを使用する安定な同位体希釈ＭＳ定量を使用して、未修飾ペプチドの絶対レベルを計算した。各部位に対するリン酸化率は、ＡＱＵＡ非リン酸化およびリン酸化ペプチド対応物で得られた面積比と、対応する内因性ペプチドで測定した面積比を比較する単一点較正により計算した。リン酸化ペプチドレベルは、未修飾ペプチドレベルの対応物および対応する部位のリン酸化率を組み合わせることにより計算した。

【0462】

統計値 － 回帰直線の勾配の比較を含む統計的分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（７．０）を使用して行った。調査した群にわたって得られた値の間の統計学的有意性は、ノンパラメトリックＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を使用して計算した。ノンパラメトリックＳｐｅａｒｍａｎ順位相関係数ｒｈｏ（Ｎｏｎ－ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ Ｓｐｅａｒｍａｎ’ｓ ｒｈｏ ｒａｎｋ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）を使用して、２つの一連の値間の相関を評価した。統計学的有意性を、ｐ＜０．０５により定義した。

【0463】

ＣＳＦタウリン酸化ペプチドの定量（結果） － ＡＤにおけるＴ２１７でのタウのリン酸化の増加は、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｓａｉｎｔ ＬｏｕｉｓのＫｎｉｇｈｔ ＡＤ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＡＤＲＣ）からの、認知の病訴がないか、または軽度認知障害を有する参加者８６名を含むコホートで検出された。ＰｉＢ－ＰＥＴおよびＭＳにより測定されるＣＳＦ Ａβ４２／Ａβ４０比の結果と一致して、参加者をアミロイド陽性２９名、アミロイド陰性４７名の参加者、ならびにＰＥＴ－ＰＩＢとＣＳＦプロファイルの間の結果と不一致の１０例に層別化した。アッセイ感度を改善するために、タウ１抗体での免疫精製を行った。リン酸化および非リン酸化ペプチドの両方の同位体標識バージョンを使用して、部位のリン酸化比を測定した。タウ１抗体により回収されないペプチドを含有するｐＳ１９９を除いて、すべての試料で、標的化されたすべてのリン酸化ペプチドを検出した。このコホートでは、発明者らは、疾患の早期ステージでのｐＴ２１７バイオマーカーの陽性診断における妥当性を確認した。ｐＴ２１７／Ｔ２１７比により、アミロイド陽性および陰性群が明確に分離された（図２４Ｂおよび図２４Ｃ、ＡＵＣ ０．９９９）。さらに、ｐＴ１８１／Ｔ１８１比の測定により、アミロイド陽性およびアミロイド陰性群（図２４Ｂ、ＡＵＣ０．９５６）が弁別された。Ｔ２１７およびＴ１８１リン酸化比も相関しており（ｒ＝０．５２４、ｐ＝０．０００２）、これにより、これらの部位のリン酸化は、共通の経路に起因し得ることが示唆された。しかし、ｐＴ１８１の診断感度は、ｐＴ２１７のものよりも低かった。両方のリン酸化比は、ＥＬＩＳＡにより測定されるｐ－タウ（１８１）およびｔ－タウレベルよりも優れた弁別因子（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｏｒ）であった（それぞれＡＵＣ０．８７４および０．９３２）。

【0464】

Ｔ２１７高リン酸化、アミロイド病変および認知の状態の間の相関（結果） － 発明者らは次に、この新たなバイオマーカーとアミロイドプロセスとの間の相関を判定した。ＡＤＲＣコホートからの結果から、Ｔ２１７高リン酸化とアミロイド状態との間に強い関係が示唆された。重要なことには、Ｔ２１７リン酸化率は、ＦＢＰ Ｔｏｔａｌ Ｃｏｒｔｉｃａｌ Ｍｅａｎにより測定されるＰｉＢ－ＰＥＴの程度と有意に関連していた（図２４Ｅ、ｒ＝０．６０、ｐ＝０．００１）。さらに、ＰｉＢ－ＰＥＴ（＋）／ＣＳＦ（－）アミロイドーシスプロファイルを有する５例の不一致ケースはすべて、Ｔ２１７で高リン酸化されていた（図２４Ｄ、Ｅ）。対照的に、Ｔ２１７リン酸化とＣＳＦ Ａβ４２／Ａβ４０比との間に有意な相関は見出されなかった。ＰｉＢ－ＰＥＴとＣＳＦ Ａβ４２／Ａβ４０との間の食い違いは、対応するＣＳＦ Ａβ４２／Ａβ４０ＭＳ比が、定量の閾値に近かった（０．１２±０．０２、図２４Ｅ）ので、ＣＳＦアミロイドアッセイの不十分な感度に起因し得る。逆のＰｉＢ－ＰＥＴ（－）／ＣＳＦ（＋）アミロイドーシスを有する参加者５名のうち、２名は、高リン酸化Ｔ２１７を示した（図２４Ｄ、Ｅ）。これにより、高いタウ高リン酸化により強調されるこれらのケースは、アミロイドプラーク沈着の検出前に、有意なＣＳＦ Ａβ変化を有し得ることが示唆される。ＣＳＦ Ａβ４２／Ａβ４０比とＴ２１７リン酸化率の組合せにより、ＰｉＢ－ＰＥＴデータがなく、ＣＳＦ Ａβ４２／Ａβ４０比の値が閾値をわずかに超える（０．１２±２０％）中間の範囲であっても、アミロイド陽性参加者が確実に同定される。認知の病訴がない参加者（ＣＤＲ－ＳＢ＝０）のうち、Ｔ２１７リン酸化により、アミロイド陽性参加者（ｎ＝９）とアミロイド陰性参加者（ｎ＝２６、ＡＵＣ１．００、図２５）を完全に識別することができ、このマーカーが前臨床ＡＤ参加者を確実に同定する能力がさらに裏付けられた。しかし、この集団において、ＣＤＲ－ＳＢで測定される全般的な認知性能とＴ２１７リン酸化比との間に相関は観察されなかった（図２５）。

【0465】

考察 － 存在量が少ないリン酸化タウペプチド、およびＣＳＦ中の未修飾の対応物を同時に測定する革新的なターゲットＨＲＭＳ法を使用して、発明者らは、アミロイド変化と同時に起こり、ＣＳＦタウ濃度の上昇と異なるＣＳＦタウリン酸化率における変化の直接的な証拠を初めて提供する。このアプローチにより、根底にある異常な代謝を示す高リン酸化および低リン酸化を評価する、ＡＤ特異的タウリン酸化率の研究が可能となる。

【0466】

現在の研究の最も顕著な結果は、２つの独立し、十分に特徴付けられたコホートで調査した、前臨床、軽度および中等度ＡＤ参加者からのＣＳＦタウにおけるＴ２１７の高度に特異的な高リン酸化である。ＡＤタウオパチーの前に発生する可能性があるアミロイド病変と、Ｔ２１７におけるタウ高リン酸化は、疾患ステージ全体を通して強く関連していた。これにより、アミロイドーシスは、タウリン酸化の変化に関連し得るという仮説が裏付けられる。この研究においてＡβ－アミロイドーシスおよび正常なＴ２１７リン酸化を有する参加者がいないことから、このタウリン酸化部位は、アミロイドプロセスに後続し得ることが示唆される。Ｔ２１７の高リン酸化は、ＡＤ病態生理学プロセスにおける中心的存在であり得、その役割は、他のタウバイオマーカーと異なる。発明者らのコホートでは、ＥＬＩＳＡにより評価されたＣＳＦタウまたはｐ－タウレベルの上昇は、ｐＴ２１７／Ｔ２１７比よりもアミロイドーシス状態の同定に有効ではなかった。これらのＡＤタウバイオマーカーの特異性は、最終的に臨床的ＡＤへと進行する個人における認知低下の危険性の予測を改善し得る。したがって、アミロイドーシスバイオマーカーとｐＴ２１７／Ｔ２１７比の測定を組み合わせて、ＡＤを検出することにより、前臨床ＡＤの診断が劇的に改善されるはずである。Ｔ２１７高リン酸化は、ＰｉＢ－ＰＥＴ負荷で測定されるアミロイドプラークに、ＣＳＦ中のアミロイドマーカーよりも高度に相関するが、タウ修飾は、原線維プラークの存在によってのみ引き起こされるわけではない可能性がある。Ｔ２１７高リン酸化、および少ないＣＳＦ Ａβ ４２／４０を有し、脳アミロイド負荷がない参加者２名（図２４Ｅ）に関しては、ＰｉＢ－ＰＥＴによっては検出されないが、ＣＳＦ Ａβ４２レベルの低下に寄与するびまん性プラークまたはＡβオリゴマー形成のみのケースであり得る。

【0467】

診療所においてｐＴ１８１がＡＤマーカーとして広範に使用されるのは、必ずしも高い特異性ではなく高いレベルの検出性による可能性がある。ｐＴ１８１の測定は、非ＡＤ認知症と比較してＡＤにおけるリン酸化の化学量論のわずかな変化を強調する。Ｔ１８１のリン酸化率の上昇は、検証コホートで調査された十分に特徴付けられたアミロイド陽性群でより一層明らかとなった。両方の研究で、ＥＬＩＳＡのｔ－タウおよびｐ－タウ１８１を組み合わせた比では、Ｔ１８１で起こるリン酸化比の変化を実証することができず、ＥＬＩＳＡでこれらの変化を正確にモニターすることの限界が強調された。したがって、ｐＴ１８１の増加は、ＡＤ ＣＳＦにおいて広く報告されており、これは、Ｔ１８１リン酸化の化学量論の有意な変化ではなく同時に起こるタウアイソフォームレベルの上昇に主に由来する。アミロイド－Ａβ病変は、Ｔ１８１における高リン酸化を誘導するが、生じた変動は、Ｔ２１７で観察される相対的な増加と比較して、さほど特異的ではないか、または有意ではないと思われる。

【0468】

ＡＤ ＣＳＦにおけるＳ１９９、Ｓ２０２およびＴ２０５で観察されるリン酸化の化学量論の変動は、ＡＤ脳で以前に観察されたタウリン酸化における特異的変化を反映する可能性がある。実際に、ｐＳ２０２およびｐＴ２０５は、ＡＴ８抗体により認識される二重リン酸化エピトープの一部である。ＡＴ８は、ＡＤ脳の解剖で見出されるタウ凝集物に結合し、ＡＴ８－免疫反応性凝集物の程度は、タウオパチーの重症度（Ｂｒａａｋステージ）と相関する。ＡＴ８は、正常なタウまたはＣＳＦで測定されたＡＤに関連するタウに対して反応性を有さない。さらに、Ｓ１９９を含有する非リン酸化エピトープで正常なタウに結合するタウ１抗体は、ＡＤタウ凝集物に対して親和性を有さない。まとめると、これらの知見は、ＡＤ脳からのタウ凝集物において、同時に起こり、および存在量が多いＳ１９９、Ｓ２０２およびＴ２０５の高リン酸化を裏付ける。しかし、ＡＤにおけるタウ凝集を促す、そのようなリン酸化タウアイソフォームの固有の性質については議論が存在する。軽度および中等度ＡＤ ＣＳＦで観察されるＳ１９９およびＳ２０２のリン酸化の量の減少は、凝集物における対応するリン酸化タウアイソフォームの蓄積と一致する。さらに、主に中等度ＡＤ ＣＳＦ中のＴ２０５リン酸化の検出から、アミロイド関連タウオパチーの根底にある病理学的機構におけるこの部位の重要な役割が示唆される。Ｓ２０２／Ｔ２０５リン酸化の変動は、前臨床および軽度のＡＤ参加者で構成される第２のコホートで検出されず（データは示さず）、疾患の間の特定部位におけるタウリン酸化の動的プロセスが示唆された。

【0469】

本知見は、ＡＤアミロイドーシスと、Ｔ２１７、および低度のＴ１８１におけるタウの高リン酸化との間の相互作用を示唆し得る。これらの部位はいずれも、プロリン指向性のセリン／トレオニンキナーゼＧＳＫ－３の基質であり、ＡβオリゴマーによるＧＳＫ－３の活性化は、アミロイドペプチドとタウリン酸化との間の相互作用として提唱されている。アミロイドーシスを有する患者におけるこれらの２つＧＳＫ－３部位での一般的および比較的相関が高い高リン酸化は、そのような機構と一致し得る。タウＰＥＴにより測定されるタウ凝集物を含むＣＳＦおよび脳におけるタウリン酸化率を比較するように設計されたさらなる研究により、ＡＤ病態生理学に新規な洞察をもたらす可能性があり、新規な治療手段を同定し得る。これらの知見は、ＡＤにおけるアミロイドプラークとタウオパチーとの間の特定の結び付きを指摘し、ＡＤを生じる分子の事象の連鎖における潜在的な結び付きをもたらす。したがって、ＡＤプロセス内のｐＴ２１７の特異性を踏まえると、これは、将来の治療的開発のための重要な標的、およびこの異常なタウ代謝を限定する抗アミロイド薬物の潜在的な効果を追う興味深いツールを表し得る。
［実施例１１］

【0470】

１ｍＬの血漿アリコートを４℃にて終夜解凍した。およそ２０ｍＬ血漿試料（およそ４０ｍＬ全血に相当する）は、同一の参加者からの１ｍＬ血漿アリコートを、５０ｍＬ Ｆａｌｃｏｎ管中で組み合わせることによりプールした。１６，０００ｇで遠心分離した３０分後、２０ｍＬを新たな管に移し、容量を測定し、試料を１ｎｇの１５Ｎ－標識組換え２Ｎ４Ｒタウでスパイクした。タウおよびｐ－タウ濃度は、これらの内部標準を使用して計算した。

【0471】

血漿タンパク質を過塩素酸（３．５％ｖ／ｖ、最終）と共に沈殿させ、試料をボルテックスにより混合し、氷上に３０分間置いた。試料を１６．０００ｇで４℃にて３０分間遠心分離した。可溶性タウを含有する上澄みを、新たな管に移した。

【0472】

上澄みを次いでＴＦＡで１％の最終濃度にスパイクした。試料をＯａｓｉｓ ＨＬＢ ＶＡＣ ＲＣ ３０ｍｇ抽出カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）にロードし、１ｍＬ ＭｅＯＨおよび１ｍＬ ０．１％ＴＦＡであらかじめ条件付けした。ロードした後で、試料を１ｍＬ ０．１％ＴＦＡで脱塩し、次いで７００μｌ ２７．５％ ＡＣＮ ０．１％ＴＦＡで溶出した。溶出液を、ｓｐｅｅｄ－ｖａｃにより凍結乾燥させ、２×－ＰＢＳ中に再懸濁した。

【0473】

タウは、いくつかの変更を加えて、以前に記載されているように免疫沈降させた（Ｒｅｆ．１４およびＲｅｆ．１８）。簡潔には、ＣＮＢｒ－活性化セファロースビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ １７－０４３０－０１）を抗体タウ１およびＨＪ８．５に、ビーズｇ当たり３ｍｇ抗体の濃度で別々に架橋した。セファロースビーズにコンジュゲートした抗タウ１およびＨＪ８．５抗体を、復元された溶出液と室温にて９０分間混合した。ビーズを２５ｍＭ 重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝剤（ＴＥＡＢＣ、Ｆｌｕｋａ １７９０２）中で３回洗浄した。結合したタウを、４００ｎｇ ＭＳグレードトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｖ５１１１）でビーズ上において３７℃にて１６時間消化した。消化物をＴｏｐＴｉｐ Ｃ１８（Ｇｌｙｇｅｎ、ＴＴ２Ｃ１８．９６）にロードし、脱塩し、製造者の使用説明書に従って溶出した。溶出したペプチドを真空遠心分離（ＣｅｎｔｒｉＶａｐ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ Ｌａｂｃｏｎｃｏ）により乾燥させ、２％アセトニトリルおよびＭＳグレード水中の０．１％ギ酸の２５μＬの溶液中で再懸濁した。

【0474】

ＬＣ－ＭＳも、以前に記載されているように行った（Ｒｅｆ．１４およびＲｅｆ．１８）。ペプチド再懸濁液の５μＬアリコートを、ＭＳ分析のためにｎａｎｏ－Ａｃｑｕｉｔｙ ＬＣ中に注入した。ｎａｎｏ－Ａｃｑｕｉｔｙ ＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）に、ＨＳＳ Ｔ３ ７５μｍ×１００μｍ、１．８μｍカラムを取り付け、流速０．５μＬ／分の溶液ＡおよびＢのグラジエントを使用して、ペプチドを分離した。溶液Ａを、ＭＳグレード水中０．１％ギ酸で構成し、溶液Ｂを、アセトニトリル中０．１％ギ酸で構成した。ペプチドは、２％～２０％の溶液Ｂで２８分間、次いで２０％～４０％の溶液Ｂでさらに１３分間、その後８５％の溶液Ｂまでさらに３分間上昇させるグラジエントでカラムから溶出させて、カラムを清掃した。Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓは、Ｎａｎｏｓｐｒａｙ Ｆｌｅｘエレクトロスプレーイオン源（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を備えていた。１０μｍ ＳｉｌｉｃａＴｉｐエミッター（Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ、Ｗｏｂｕｒｎ、Ｍａ、ＵＳＡ）からイオン源中へとスプレーされたペプチドイオンは、四重極子を標的化し、四重極子において単離された。次いでこれらをＨＣＤによりフラグメント化し、Ｏｒｂｉｔｒａｐでイオンフラグメントを検出した（分解能６０，０００、質量範囲１５０～１，２００ｍ／ｚ）。ペプチドプロファイリングのための親水性ペプチド（ＳＳＲｃａｌｃ＜９、すべてロイシンなし）のモニタリングを、ＨＳＳ Ｔ３ ３００μｍ×１００μｍ、１．８ｍｍカラム、４μｌ／分の流速で行い、２％～１２％の溶液Ｂのグラジエントで溶出を発生させ、スプレーを３０ｍｍ ＳｉｌｉｃａＴｉｐエミッター上で作動させた。
［実施例１２］

【0475】

この実施例は、濃縮プロトコールおよび質量分析を使用して、血漿中の非常に低い濃度のタウアイソフォームを測定する実行可能性を実証する。データは、異なるリン酸化状態を有するが、ＣＮＳで生成されたタウと比較して類似した短縮化プロファイルを有する末梢で生成されたタウを示す。末梢ｐ－タウとＣＮＳ ｐ－タウとの間の差にもかかわらず、記載されている方法を実証するこの実施例を使用して、アミロイドーシスを示すＣＳＦにおける高度に特異的な変動を映し出す血漿ｐ－タウ、とりわけｐ－タウ２１７およびｐ－タウ１８１における変化を測定することができる。

【0476】

参加者、試料収集、試料選択：タウの安定同位体標識動力学（ＳＩＬＫ）研究に登録された参加者５８名で、初期参加者プールを形成した^１８。タウＳＩＬＫ研究中、参加者は、標識１３Ｃロイシン注入を１６時間、続いて５回の腰椎穿刺（ＬＰ）を４ヶ月にわたり受けた１８。およそ１０ｍＬの血漿を、１２の時点でそれぞれ１９．５時間かけて注入手順中に、およびロイシン濃縮をモニターするために各ＬＰで収集した３０。

【0477】

参加者５８名からのＣＳＦを、報告されているようにＣＳＦ４２／４０およびタウアイソフォームについてＭＳにより分析した１４、３１。これらの参加者のうち１１名は、アミロイドＡＶ４５ ＰＥＴ（カットオフ１．３）を使用してアミロイド陽性と同定され、この血漿研究に含まれた。アミロイドＰＥＴデータがないさらなるアミロイド陽性参加者４名は、ＣＳＦ４２／４０比（カットオフ０．０８６）により同定され、含まれた。すべてのアミロイド陽性参加者は、ＣＳＦ ｐＴ２１７／Ｔ２１７比（カットオフ４．６％）が異常であった。アミロイド陽性参加者１５名は、様々な臨床的認知症評価（ＣＤＲ）、０（参加者５名）、０．５（参加者７名）および１（参加者２名）を有していた。すべての前臨床ＡＤ参加者（アミロイド陽性、ＣＤＲ＝０）は、陰性タウＰＥＴ ＡＶ－１４５１スキャン（表５）を受けた。正常なＣＳＦ４２／４０を有するがｐＴ２１７／Ｔ２１７が異常な参加者２名が含まれた。残りの参加者４１名は、利用できる場合はＡＶ４５により、またはＣＳＦ４２／４０によりアミロイド陰性であり、ｐＴ２１７／２１７について陰性であった。そのうち１７名は、対照として選択された（若年対照９名および高齢対照８名）。最終的に、参加者３名が軽度の認知障害［ＭＣＩ、大脳皮質基底核症候群（ＣＢＳ）を有する参加者１名、および判定されていない認知症を有する２名を含む」と確認され、参加者３８名の血漿コホートを完了した。

【0478】

血漿およびＣＳＦタウＩＰ－ＬＣ－ＭＳ分析：血漿試料を、実施例１１に記載されているように処理した。ＣＳＦ試料を、Ｒｅｆ１４およびＲｅｆ１８に記載されているように処理した。ＬＣ－ＭＳプロトコールは、Ｒｅｆ１４およびＲｅｆ１８に記載されているものと同一であった。

【0479】

統計値：一元配置ＡＮＯＶＡおよびポストホック分析（Ｋｒｕｓｋａｌ－ Ｗａｌｌｉｓ検定）を、ＡＤおよび対照のサブグループ全体のｐ－タウ比の比較に使用した。Ｐｅａｒｓｏｎ相関を使用して、血漿とＣＳＦタウとの間の相関を分析した。データは、特に指定がない限り平均±ＳＤとして表す。

【0480】

血漿タウは、ＣＳＦ中のように短縮化する：調査したすべての試料のうち、０Ｎ、１Ｎ、２Ｎおよび３Ｒの特異的ペプチドを含む残基６～２５４の１５種のタウペプチドを検出した。０Ｎ／１Ｎ／２Ｎペプチドの推測される存在量から、脳およびＣＳＦで以前に報告されているものと同様の寄与が示された（それぞれおよそ５／５／１）。とりわけ、残基２５４後のペプチド（２Ｎ４Ｒ－タウにおける３０６～３１７残基に等価の、低存在量の残基で見出される３Ｒペプチドを除く）は検出されず、これにより、血漿抽出物にアイソフォームを含有する検出可能な全長のタウまたは微小管結合領域がないことが示唆された。血漿タウペプチドの存在量は、ＣＳＦ中で、以前に報告されているように、残基２２１（図２６）後に有意に低下し１８、２０、２１、これにより、神経細胞と同様に１８、末梢細胞は、短縮化されたタウを放出し得ることが示唆された。しかし、血漿プロテアーゼによるタウのさらなる分解は、タウＣ末端で優先的に排除され得ない。

【0481】

血漿抽出物中のタウリン酸化ペプチドの検出：タウｍｉｄドメインからのＴ１８１、Ｓ２０２およびＴ２１７におけるリン酸化ペプチドは、すべての血漿抽出物で定量し、これにより、これらの低存在量のペプチドのＭＳ測定の実行可能性が実証された。コホートにおける最低存在量の試料での、ｐＴ１８１、ｐＳ２０２およびｐＴ２１７リン酸化ペプチドで得られたＬＣ－ＭＳシグナルはそれぞれ、定量下限（ＬＬＯＱ）のおよそ７、３および２倍超であった。とりわけ、ｐＴ２１７レベルは、０．１３ｐｇ／ｍＬ（２８ａｍｏｌ／ｍＬ）の平均濃度で対照において定量した（表５）。発明者らの知る限り、ヒト血漿中のタンパク質マーカーについて質量分析により測定された中でも、これは最低濃度である。Ｔ２０５におけるリン酸化ペプチドは、ＬＬＯＱ未満の試料３８例のうち１９例で一貫性なく検出され、さらなる分析に含まれなかった。Ｔ２３１、Ｔ１７５、Ｓ２１４、Ｓ１９９、Ｔ１５３またはＳ２０８においてＣＳＦ１４で報告されている他の存在量が少ないリン酸化部位は、抽出物中で検出されなかった。

【0482】

ＣＳＦと血漿タウアイソフォームとの間の関連：イムノアッセイにより以前に報告されているように、ＣＳＦと血漿ｔ－タウレベルとの間で相関は見出されなかった９、１０。しかし、高い相関は、ＣＳＦと血漿ｐタウ２１７測定値との間で見出された（図２７Ａ、表６、ｐＴ２１７レベルおよびｐＴ２１７／Ｔ２１７比、それぞれＳｐｅａｒｍａｎ ｒｈｏ ０．７９および０．７９、すべてのコホートで）。また、ｐタウ１８１測定値についてＣＳＦと血漿との間で、より低度で有意な相関が見出された（表６、ｐＴ１８１レベルおよびｐＴ１８１／Ｔ１８１比、それぞれＳｐｅａｒｍａｎ ｒｈｏ ０．６９および０．５９、すべてのコホートで）。ＣＳＦとｐＳ２０２の血漿測定値との間で相関は見出されなかった。すべての有意なＣＳＦ／血漿の相関は、アミロイド陰性／ｐ－タウ陰性群（示されていない）に相関は見出されなかったので、主にアミロイド陽性／リン酸化－タウ陽性参加者の値により推進される。一貫して、血漿ｐタウ－２１７およびｐタウ－１８１の測定値から、認知の状態に関係ないアミロイド陽性参加者と陰性参加者との間の、ＣＳＦで得られた隔たりが再現された（図２６、表６、それぞれのＣＳＦおよび血漿中ＡＵＣ：ｐＴ２１７／Ｔ２１７で１．００および０．９８；ｐＴ１８１／Ｔ１８１で０．９５および０．９８）。これにより、血漿ｐタウ－２１７およびｐタウ－１８１は、ＣＮＳ可溶性タウの変化の代理として作用し得るので、有用なバイオマーカーとしての役割を果たすことが示唆される。

【0483】

ＡＤ ＣＳＦおよび血漿中のｐ－タウ１８１よりも劇的なＰ－タウ２１７の変化：対照と異なるアミロイド臨床群のと間の変化の規模を計算した（表６）。ＣＳＦ中で、アミロイド陽性と対照との間の振幅における最大差は、ｐＴ２１７レベル（＋８００％）群で、続いてｐＴ１８１レベル（＋２５０％）群で見出された。しかし、これらの変化は、部分的には、ｔ－タウ（＋１９０％）で測定されるように、ＣＳＦタウアイソフォーム増加の同時に起こる寄与の結果であった。ｐタウ／タウ比を使用してタウ変形形態から標準化された場合、ｐＴ２１７／Ｔ２１７は、ｐＴ１８１／Ｔ１８１（＋２２０％対＋２５％）よりも大きい変化を実証した。血漿中において、アミロイド陽性群におけるｐＴ２１７レベルでの高度な上昇は、臨床群のすべてにおいてｐＴ１８１測定値よりも高いままであった（ｐＴ２１７／Ｔ２１７で＋２８０％～＋３５０％、およびｐＴ１８１／Ｔ１８１で＋６０～＋８０％）。重要なことには、ＣＳＦおよび血漿ｐＴ２１７（図２７Ｂ～Ｃ）の測定により、対照からアミロイド陽性、タウＰＥＴ陰性参加者を同定した。これにより、検出可能なタウ凝集前にリン酸化－タウバイオマーカーが変化すること、および、脳Ａβ病変に付随して発生する異常な可溶性タウ代謝を反映することが示唆される。

【0484】

末梢タウリン酸化状態は正常およびＡＤ ＣＮＳタウとは異なる：血漿ｔ－タウの主要な起源は、ＣＮＳではなく末梢からの可能性がある。これは、ＣＳＦと血漿ｔ－タウレベルとの間に相関が存在しないことにより裏付けられる（表２）。血漿ｔ－タウレベルは、急性卒中、脳傷害患者２２～２５名、脳転移患者２６名でのみＣＮＳタウ変化を反映すると思われ、また、多くのＣＮＳ ｔ－タウ放出があるＡＤ患者でも可能性がある１２、２７。したがって、その寄与が末梢タウ寄与よりもはるかに高くなる場合にのみ、ＣＮＳ中に放出されたタウは、有意な血漿ｔ－タウ増加に寄与し得る。

【0485】

血漿中の、ＣＮＳタウを上回る末梢タウのより高い寄与は、ＣＳＦと血漿との間のｐ－タウ／タウ比で観察される差によっても裏付けられる（表２）。ｐＴ２１７／Ｔ２１７およびｐＴ１８１／Ｔ１８１比のいずれも血漿中で有意に低下し、これにより、はるかに少ないｐＴ２１７、およびわずかに少ないｐＴ１８１存在量を有する末梢タウにおける、ＣＮＳタウの希釈が裏付けられる（表６、アミロイド陰性対照中のＣＳＦに対してそれぞれ４．５および１．８分の１に低下した）。ｐＳ２０２では、血漿中のｐＳ２０２／Ｓ２０２比の有意な上昇（１．７倍）により、末梢タウは、この部位でＣＳＦ中よりもリン酸化することが裏付けられる。一貫して、正常なＣＳＦと比較して末梢タウにおいてリン酸化された部位が少ないほど、ＣＮＳタウ変化は、対応するタウアイソフォームの血漿レベルに大きな影響を及ぼし得る。これは、ＣＳＦおよび血漿ｐＴ２１７レベルが、ｐＴ１８１レベルよりも良好に相関し、ｐＳ２０２で見出される相関がない理由を説明し得る。

【0486】

最終的に、末梢のタウは、有意量のｐＴ２１７を含有しないという仮説を立てることにより、発明者らは、対照において最大血漿タウレベル全体のおよそ２０％に、ＣＮＳタウが寄与する可能性が高いと推定した。ＡＤにおいてＣＮＳタウ放出は３倍まで増加させることができると仮定すれば２８，２９、より高いＣＮＳ ＡＤタウ寄与が、ＡＤ血漿タウレベルを４０％超上昇させる可能性は低い。さらに、末梢のタウレベルは、血漿中の変化に対するＣＮＳタウ寄与を潜在的に妨げる、異なる生物学的要因により影響を受け得る。

【0487】

まとめると、これらの知見は、末梢タウの寄与を克服し、血漿中のＣＮＳタウがモニターするための、ｔ－タウまたはｐＳ２０２に勝るより特異的なＣＮＳタウアイソフォーム、例えばｐＴ２１７およびｐＴ１８１の使用を支持する。最終的に、結果から、ＣＳＦ中のように、血漿中のｐ－タウ２１７は、異常なＣＮＳタウ代謝の検出について、ｐ－タウ１８１より優れている可能性があることが示唆される。

【表5-1】

【表5-2】

【表6】

【0488】

実施例１１および１２の参考文献
参考文献１： Ｒｏｂｅｒｔｓ ＫＦ， Ｅｌｂｅｒｔ ＤＬ， Ｋａｓｔｅｎ ＴＰ， ｅｔ ａｌ． Ａｍｙｌｏｉｄ－３ ｅｆｆｌｕｘ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｐｌａｓｍａ． Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ． ２０１４；７６（６）：８３７－８４４； ｄｏｉ：１０．１００２／ａｎａ．２４２７０．

【0489】

参考文献２： Ｏｖｏｄ Ｖ， Ｒａｍｓｅｙ ＫＮ， Ｍａｗｕｅｎｙｅｇａ ＫＧ， ｅｔ ａｌ． Ａｍｙｌｏｉｄ ３ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｓｔａｂｌｅ ｉｓｏｔｏｐｅ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｏ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ． Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ｄｅｍｅｎｔ． ２０１７； １３（８）：８４１－８４９； ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊａｌｚ．２０１７．０６．２２６６．

【0490】

参考文献３： Ｎａｋａｍｕｒａ Ａ， Ｋａｎｅｋｏ Ｎ， Ｖｉｌｌｅｍａｇｎｅ ＶＬ， ｅｔ ａｌ． Ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｐｌａｓｍａ ａｍｙｌｏｉｄ－３ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｎａｔｕｒｅ． ２０１８； ５５４（７６９１）：２４９－２５４； ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ２５４５６．

【0491】

参考文献４： Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ ＳＥ， Ｂｏｌｌｉｎｇｅｒ ＪＧ， Ｏｖｏｄ Ｖ， ｅｔ ａｌ． Ｈｉｇｈ－ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｐｌａｓｍａ ３－ａｍｙｌｏｉｄ ４２／４０ ｐｒｅｄｉｃｔｓ ｃｕｒｒｅｎｔ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｂｒａｉｎ ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ． Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ． Ａｕｇｕｓｔ ２０１９：１０．１２１２／ＷＮＬ．００００００００００００８０８１． ｄｏｉ：１０．１２１２／ＷＮＬ．００００００００００００８０８１

【0492】

参考文献５： Ｂａｃｉｏｇｌｕ Ｍ， Ｍａｉａ ＬＦ， Ｐｒｅｉｓｃｈｅ Ｏ， ｅｔ ａｌ． Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ Ｌｉｇｈｔ Ｃｈａｉｎ ｉｎ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ ＣＳＦ ａｓ Ｍａｒｋｅｒ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌｓ ａｎｄ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ． Ｎｅｕｒｏｎ． ２０１６； ９１（１）：５６－６６； ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｎｅｕｒｏｎ．２０１６．０５．０１８．

【0493】

参考文献６： Ｐｒｅｉｓｃｈｅ Ｏ， Ｓｃｈｕｌｔｚ ＳＡ， Ａｐｅｌ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｓｅｒｕｍ ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｐｒｅｄｉｃｔｓ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｐｒｅｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｎａｔ Ｍｅｄ． ２０１９；２５（２）：２７７－２８３； ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５９１－０１８－０３０４－３．

【0494】

参考文献７： Ｂａｔｅｍａｎ ＲＪ， Ｘｉｏｎｇ Ｃ， Ｂｅｎｚｉｎｇｅｒ ＴＬＳ， ｅｔ ａｌ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ Ｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ２０１２；３６７（９）：７９５－８０４； ｄｏｉ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ１２０２７５３．

【0495】

参考文献８： Ｆａｇａｎ ＡＭ， Ｘｉｏｎｇ Ｃ， Ｊａｓｉｅｌｅｃ ＭＳ， ｅｔ ａｌ． Ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ Ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ＣＳＦ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ Ａｕｔｏｓｏｍａｌ－Ｄｏｍｉｎａｎｔ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ． Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ． ２０１４；６（２２６）：２２６ｒａ３０－２２６ｒａ３０； ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．３００７９０１．

【0496】

参考文献９： Ｚｅｔｔｅｒｂｅｒｇ Ｈ， Ｗｉｌｓｏｎ Ｄ， Ａｎｄｒｅａｓｓｏｎ Ｕ， ｅｔ ａｌ． Ｐｌａｓｍａ ｔａｕ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ． ２０１３；５（２）：９； ｄｏｉ：１０．１１８６／ａｌｚｒｔ１６３．

【0497】

参考文献１０： Ｍａｔｔｓｓｏｎ Ｎ， Ｚｅｔｔｅｒｂｅｒｇ Ｈ， Ｊａｎｅｌｉｄｚｅ Ｓ， ｅｔ ａｌ． Ｐｌａｓｍａ ｔａｕ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ． ２０１６；８７（１７）：１８２７－１８３５； ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１２１２／ＷＮＬ．００００００００００００３２４６．

【0498】

参考文献１１： Ｍｉｅｌｋｅ ＭＭ， Ｈａｇｅｎ ＣＥ， Ｗｅｎｎｂｅｒｇ ＡＭＶ， ｅｔ ａｌ． Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｓｍａ Ｔｏｔａｌ Ｔａｕ Ｌｅｖｅｌ Ｗｉｔｈ Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ Ｄｅｃｌｉｎｅ ａｎｄ Ｒｉｓｋ ｏｆ Ｍｉｌｄ Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ Ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ ｏｒ Ｄｅｍｅｎｔｉａ ｉｎ ｔｈｅ Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ａｇｉｎｇ． ＪＡＭＡ Ｎｅｕｒｏｌ． ２０１７；７４（９）：１０７３－１０８０； ｄｏｉ：１０．１００１／ｊａｍａｎｅｕｒｏｌ．２０１７．１３５９．

【0499】

参考文献１２： Ｍｉｅｌｋｅ ＭＭ， Ｈａｇｅｎ ＣＥ， Ｘｕ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｐｌａｓｍａ ｐｈｏｓｐｈｏ－ｔａｕ１８１ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ａｎｄ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔａｕ－ ａｎｄ ａｍｙｌｏｉｄ－ｐｏｓｉｔｒｏｎ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ． Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ｄｅｍｅｎｔ． ２０１８； １４（８）：９８９－９９７； ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊａｌｚ．２０１８．０２．０１３．

【0500】

参考文献１３： Ｔａｔｅｂｅ Ｈ， Ｋａｓａｉ Ｔ， Ｏｈｍｉｃｈｉ Ｔ， ｅｔ ａｌ． Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ｔａｕ ｔｏ ｕｓｅ ａｓ ａ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｂｒａｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ： ｐｉｌｏｔ ｃａｓｅ－ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｄｏｗｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ． Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒ． ２０１７； １２（１）：６３； ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ１３０２４－０１７－０２０６－８．

【0501】

参考文献１４： Ｂａｒｔｈｅｌｅｍｙ ＮＲ， Ｍａｌｌｉｐｅｄｄｉ Ｎ， Ｍｏｉｓｅｙｅｖ Ｐ， Ｓａｔｏ Ｃ， Ｂａｔｅｍａｎ ＲＪ． Ｔａｕ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ Ｒａｔｅｓ Ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｄｉｆｆｅｒ ｉｎ ｔｈｅ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｒａｉｎ ｖｓ． Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ Ｆｌｕｉｄ Ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ ａｎｄ Ａｒｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ Ａｆｆｅｃｔｅｄ ｂｙ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ． Ｆｒｏｎｔ Ａｇｉｎｇ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２０１９； １１； ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｎａｇｉ．２０１９．００１２１．

【0502】

参考文献１５： Ｂａｒｔｈｅｌｅｍｙ Ｎ， Ｈｉｒｔｚ Ｃ， Ｓｃｈｒａｅｎ Ｓ， ｅｔ ａｌ． Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｆｏｌｌｏｗ－ｕｐ ｏｆ ｔ１８１， ｓ１９９， ｓ２０２， ｔ２０５， ａｎｄ Ｔ２１７ ｔａｕ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｐａｔｔｅｒｎ． Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ｄｅｍｅｎｔ Ｊ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ａｓｓｏｃ． ２０１５； １１（７）：Ｐ８７０； ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊａｌｚ．２０１５．０８．０６３．

【0503】

参考文献１６： Ｂａｒｔｈｅｌｅｍｙ ＮＲ， Ｂａｔｅｍａｎ ＲＪ， Ｍａｒｉｎ Ｐ， ｅｔ ａｌ． Ｔａｕ ｈｙｐｅｒｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｎ Ｔ２１７ ｉｎ ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ ｉｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｏ ａｍｙｌｏｉｄ－３ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ． ｂｉｏＲｘｉｖ． Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１７：２２６９７７； ｄｏｉ：１０．１１０１／２２６９７７．

【0504】

参考文献１７： Ｂａｒｔｈｅｌｅｍｙ ＮＲ， Ｌｉ Ｙ， Ｗａｎｇ Ｇ， ｅｔ ａｌ． ＭＡＳＳ ＳＰＥＣＴＲＯＭＥＴＲＹ－ＢＡＳＥＤ ＭＥＡＳＵＲＥＭＥＮＴ ＯＦ ＬＯＮＧＩＴＵＤＩＮＡＬ ＣＳＦ ＴＡＵ ＩＤＥＮＴＩＦＩＥＳ ＤＩＦＦＥＲＥＮＴ ＰＨＯＳＰＨＯＲＹＬＡＴＥＤ ＳＩＴＥＳ ＴＨＡＴ ＴＲＡＣＫ ＤＩＳＴＩＮＣＴ ＳＴＡＧＥＳ ＯＦ ＰＲＥＳＹＭＰＴＯＭＡＴＩＣ ＤＯＭＩＮＡＮＴＬＹ ＩＮＨＥＲＩＴＥＤ ＡＤ． Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ｄｅｍｅｎｔ Ｊ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ａｓｓｏｃ． ２０１８； １４（７）：Ｐ２７３－Ｐ２７４； ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊａｌｚ．２０１８．０６．０２４．

【0505】

参考文献１８： Ｓａｔｏ Ｃ， Ｂａｒｔｈｅｌｅｍｙ ＮＲ， Ｍａｗｕｅｎｙｅｇａ ＫＧ， ｅｔ ａｌ． Ｔａｕ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ． Ｎｅｕｒｏｎ． ２０１８； ９７（６）：１２８４－１２９８．ｅ７； ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｎｅｕｒｏｎ．２０１８．０２．０１５．

【0506】

参考文献１９： Ｇｅｙｅｒ ＰＥ， Ｈｏｌｄｔ ＬＭ， Ｔｅｕｐｓｅｒ Ｄ， Ｍａｎｎ Ｍ． Ｒｅｖｉｓｉｔｉｎｇ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｂｙ ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ． Ｍｏｌ Ｓｙｓｔ Ｂｉｏｌ． ２０１７； ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１５２５２／ｍｓｂ．２０１５６２９７．

【0507】

参考文献２０： Ｂａｒｔｈｅｌｅｍｙ ＮＲ， Ｆｅｎａｉｌｌｅ Ｆ， Ｈｉｒｔｚ Ｃ， ｅｔ ａｌ． Ｔａｕ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ Ｆｌｕｉｄ ｂｙ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｔ Ｈｉｇｈ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｖｅｒａｇｅ Ｐｒｏｖｉｄｅｓ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ Ｉｔｓ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ． Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ． ２０１６； １５（２）：６６７－６７６； ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓ．ｊｐｒｏｔｅｏｍｅ．５ｂ０１００１．

【0508】

参考文献２１： Ｃｉｃｏｇｎｏｌａ Ｃ， Ｂｒｉｎｋｍａｌｍ Ｇ， Ｗａｈｌｇｒｅｎ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｎｏｖｅｌ ｔａｕ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｉｎ ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ： ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｔａｎｇｌｅ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｄｅｃｌｉｎｅ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ （Ｂｅｒｌ）． ２０１９； １３７（２）：２７９－２９６； ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００４０１－０１８－１９４８－２．

【0509】

参考文献２２： Ｎｅｓｅｌｉｕｓ Ｓ， Ｚｅｔｔｅｒｂｅｒｇ Ｈ， Ｂｌｅｎｎｏｗ Ｋ， ｅｔ ａｌ． Ｏｌｙｍｐｉｃ ｂｏｘｉｎｇ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｅｌｅｖａｔｅｄ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔａｕ ｉｎ ｐｌａｓｍａ． Ｂｒａｉｎ Ｉｎｊ． ２０１３； ２７（４）：４２５－４３３； ｄｏｉ：１０．３１０９／０２６９９０５２．２０１２．７５０７５２．

【0510】

参考文献２３： Ｂｏｇｏｓｌｏｖｓｋｙ Ｔ， Ｗｉｌｓｏｎ Ｄ， Ｃｈｅｎ Ｙ， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｏｆ Ｐｌａｓｍａ Ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ Ｇｌｉａｌ Ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ， Ｔａｕ， ａｎｄ Ａｍｙｌｏｉｄ ３ ｕｐ ｔｏ ９０ Ｄａｙｓ ａｆｔｅｒ Ｔｒａｕｍａｔｉｃ Ｂｒａｉｎ Ｉｎｊｕｒｙ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ． ２０１６； ３４（１）：６６－７３； ｄｏｉ：１０．１０８９／ｎｅｕ．２０１５．４３３３．

【0511】

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【0512】

参考文献２５： Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ Ｒ， Ｃｈａｎｇ Ｂ， Ｙｕｅ ＪＫ， ｅｔ ａｌ． Ｃｏｍｐａｒｉｎｇ Ｐｌａｓｍａ Ｐｈｏｓｐｈｏ Ｔａｕ， Ｔｏｔａｌ Ｔａｕ， ａｎｄ Ｐｈｏｓｐｈｏ Ｔａｕ－Ｔｏｔａｌ Ｔａｕ Ｒａｔｉｏ ａｓ Ａｃｕｔｅ ａｎｄ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｔｒａｕｍａｔｉｃ Ｂｒａｉｎ Ｉｎｊｕｒｙ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ． ＪＡＭＡ Ｎｅｕｒｏｌ． ２０１７； ７４（９）：１０６３－１０７２； ｄｏｉ：１０．１００１／ｊａｍａｎｅｕｒｏｌ．２０１７．０６５５．

【0513】

参考文献２６： Ｄａｒｌｉｘ Ａ， Ｈｉｒｔｚ Ｃ， Ｔｈｅｚｅｎａｓ Ｓ， ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｔａｕ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｒｕｍ ｌｅｖｅｌ ｉｎ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｂｒａｉｎ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ． ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ． ２０１９； １９（１）：１１０； ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ１２８８５－０１９－５２８７－ｚ

【0514】

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【0515】

参考文献２８： Ｆａｇａｎ ＡＭ， Ｒｏｅ ＣＭ， Ｘｉｏｎｇ Ｃ， Ｍｉｎｔｕｎ ＭＡ， Ｍｏｒｒｉｓ ＪＣ， Ｈｏｌｔｚｍａｎ ＤＭ． Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ Ｆｌｕｉｄ ｔａｕ／３－Ａｍｙｌｏｉｄ４２ Ｒａｔｉｏ ａｓ ａ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ Ｄｅｃｌｉｎｅ ｉｎ Ｎｏｎｄｅｍｅｎｔｅｄ Ｏｌｄｅｒ Ａｄｕｌｔｓ． Ａｒｃｈ Ｎｅｕｒｏｌ． ２００７； ６４（３）：３４３－３４９； ｄｏｉ：１０．１００１／ａｒｃｈｎｅｕｒ．６４．３．ｎｏｃ６０１２３．

【0516】

参考文献２９： Ｚｅｔｔｅｒｂｅｒｇ Ｈ． Ｒｅｖｉｅｗ： Ｔａｕ ｉｎ ｂｉｏｆｌｕｉｄｓ － ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ． Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ａｐｐｌ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． ２０１７； ４３（３）：１９４－１９９； ｄｏｉ：１０．１１１１／ｎａｎ．１２３７８．

【0517】

参考文献３０： Ｐｏｔｔｅｒ Ｒ， Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ ＢＷ， Ｅｌｂｅｒｔ ＤＬ， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ Ｖｉｖｏ Ａｍｙｌｏｉｄ－３４２ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ， Ｅｘｃｈａｎｇｅ， ａｎｄ Ｌｏｓｓ ｉｎ Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｃａｒｒｉｅｒｓ． Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ． ２０１３； ５（１８９）：１８９ｒａ７７－１８９ｒａ７７； ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．３００５６１５．

【0518】

参考文献３１： Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ ＢＷ， Ｅｌｂｅｒｔ ＤＬ， Ｍａｗｕｅｎｙｅｇａ ＫＧ， ｅｔ ａｌ． Ａｇｅ ａｎｄ ａｍｙｌｏｉｄ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ａｍｙｌｏｉｄ－ｂｅｔａ ｋｉｎｅｔｉｃｓ． Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ． ２０１５； ７８（３）：４３９－４５３； ｄｏｉ：１０．１００２／ａｎａ．２４４５４．

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8-1】

【図8-2】

【図8-3】

【図8-4】

【図8-5】

【図8-6】

【図8-7】

【図8-8】

【図8-9】

【図8-10】

【図8-11】

【図8-12】

【図9-1】

【図9-2】

【図9-3】

【図9-4】

【図9-5】

【図9-6】

【図10-1】

【図10-2】

【図10-3】

【図10-4】

【図10-5】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14-1】

【図14-2】

【図14-3】

【図15】

【図16-1】

【図16-2】

【図16-3】

【図16-4】

【図17-1】

【図17-2】

【図17-3】

【図18-1】

【図18-2】

【図19-1】

【図19-2】

【図20】

【図21-1】

【図21-2】

【図21-3】

【図22】

【図23-1】

【図23-2】

【図23-3】

【図24-1】

【図24-2】

【図24-3】

【図25】

【図26-1】

【図26-2】

【図27-1】

【図27-2】

【図27-3】

【図27-4】

【図27-5】

【図27-6】

【配列表】

2022547209000001.app

【国際調査報告】