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特表2022-547224ナノ粒子がコンジュゲートした抗ヌクレオリン剤・ＰＥＧ
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-11-10
(54)【発明の名称】ナノ粒子がコンジュゲートした抗ヌクレオリン剤・ＰＥＧ
(51)【国際特許分類】
A61K 47/69 20170101AFI20221102BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20221102BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20221102BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20221102BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20221102BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20221102BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20221102BHJP
A61K 47/56 20170101ALI20221102BHJP
A61B 5/055 20060101ALI20221102BHJP
A61B 6/00 20060101ALI20221102BHJP
B82Y 5/00 20110101ALI20221102BHJP
A61K 47/02 20060101ALI20221102BHJP
【ＦＩ】
A61K47/69
A61P35/00
A61P35/02
A61P43/00 121
A61K45/00
A61K47/64
A61K47/68
A61K47/56
A61B5/055 383
A61B6/00 331A
B82Y5/00
A61K47/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022515728
(86)(22)【出願日】2020-09-10
(85)【翻訳文提出日】2022-04-15
(86)【国際出願番号】 US2020050261
(87)【国際公開番号】W WO2021050779
(87)【国際公開日】2021-03-18
(31)【優先権主張番号】62/898,527
(32)【優先日】2019-09-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】513036860
【氏名又は名称】ユニヴァーシティー・オブ・ルイスヴィル・リサーチ・ファウンデイション・インコーポレーテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100107984
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 雅紀
(74)【代理人】
【識別番号】100182305
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 鉄平
(74)【代理人】
【識別番号】100096482
【弁理士】
【氏名又は名称】東海 裕作
(74)【代理人】
【識別番号】100131093
【弁理士】
【氏名又は名称】堀内 真
(74)【代理人】
【識別番号】100150902
【弁理士】
【氏名又は名称】山内 正子
(74)【代理人】
【識別番号】100141391
【弁理士】
【氏名又は名称】園元 修一
(74)【代理人】
【識別番号】100221958
【弁理士】
【氏名又は名称】篠田 真希恵
(74)【代理人】
【識別番号】100192441
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 仁
(72)【発明者】
【氏名】アレン ニコラス シー．
(72)【発明者】
【氏名】バテス ポーラ ジェー．
(72)【発明者】
【氏名】オトゥール マーティン ジー．
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C093
4C096
【Ｆターム（参考）】
4C076AA65
4C076AA95
4C076CC27
4C076CC41
4C076EE17
4C076EE41
4C076EE59
4C084AA19
4C084MA02
4C084NA13
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZB27
4C084ZC751
4C093AA21
4C093EE20
4C096AA11
4C096AD19
4C096FC14
(57)【要約】
組成物は、ナノ粒子がコンジュゲートした抗ヌクレオリン剤及びＰＥＧを含む。好ましくは、ナノ粒子が、１～５０ｎｍの平均直径を有する。好ましくは、ナノ粒子が、金属、元素及び酸化物からなる群から選択される少なくとも１つの無機材料を含む。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ナノ粒子がコンジュゲートした抗ヌクレオリン剤及びＰＥＧを含む組成物であって、前記ナノ粒子が、１～５０ｎｍの平均直径を有する、前記組成物。
【請求項2】
ナノ粒子がコンジュゲートした抗ヌクレオリン剤及びＰＥＧを含む組成物であって、前記ナノ粒子が、金属、元素及び酸化物からなる群から選択される少なくとも１つの無機材料を含む、前記組成物。
【請求項3】
ナノ粒子が金を含む、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項4】
抗ヌクレオリン剤が、抗ヌクレオリンオリゴヌクレオチドを含む、請求項１～３のいずれかに記載の組成物。
【請求項5】
抗ヌクレオリン剤が、抗体を含む、請求項１～４のいずれかに記載の組成物。
【請求項6】
抗ヌクレオリン剤が、ヌクレオリン標的タンパク質を含む、請求項１～５のいずれかに記載の組成物。
【請求項7】
抗ヌクレオリン剤が、ＧＲＯを含む、請求項１～６のいずれかに記載の組成物。
【請求項8】
抗ヌクレオリン剤が、配列番号１～７；配列番号９～１６；配列番号１９～３０及び配列番号３１からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１～７のいずれかに記載の組成物。
【請求項9】
抗ヌクレオリン剤が、ＡＳ１４１１を含む、請求項１～８のいずれかに記載の組成物。
【請求項10】
シアニン色素をさらに含む、請求項１～９のいずれかに記載の組成物。
【請求項11】
ナノ粒子が、１～５０ｎｍの平均直径を有する、請求項１～１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項12】
ナノ粒子が、１～２０ｎｍの平均直径を有する、請求項１～１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項13】
ナノ粒子が、金、プラチナ、イリジウム及びパラジウムからなる群から選択される少なくとも１つの金属を含む、請求項１～１２のいずれかに記載の組成物。
【請求項14】
ガドリニウムをさらに含む、請求項１～１３のいずれかに記載の組成物。
【請求項15】
請求項１～１４のいずれかに記載の組成物と、薬学的に許容される担体とを含む、がんを治療するための組成物。
【請求項16】
ガドリニウムが、ガドリニウム（III）の錯体として存在する、請求項１～１５のいずれかに記載の組成物。
【請求項17】
ガドリニウムが、ガドリニウムイオン（Ｇｄ－ＤＯ３Ａ－ＳＨ）に配位した１０－（２－スルファニルエチル）－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７－三酢酸（Ｈ３－ＤＯ３Ａ－ＳＨ）として存在する、請求項１～１６のいずれかに記載の組成物。
【請求項18】
がんを治療する方法であって、有効量の請求項１～１７のいずれかに記載の組成物をそれを必要とする患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項19】
がんを治療する方法であって、有効量の請求項１～１７のいずれかに記載の組成物をそれを必要とする患者に投与し、その後放射線療法を行うことを含む、前記方法。
【請求項20】
がんが、黒色腫、リンパ腫、形質細胞腫、肉腫、グリオーマ、膠芽腫、胸腺腫、白血病、乳がん、前立腺がん、結腸がん、肝がん、食道がん、脳がん、肺がん、卵巣がん、子宮内膜がん、膀胱がん、腎がん、子宮頸がん、及び肝細胞がんからなる群から選択される、請求項１８又は１９に記載のがんを治療する方法。
【請求項21】
がんが、乳がん、前立腺がん、結腸がん、膠芽腫、及び肺がんからなる群から選択される、請求項１８～２０のいずれかに記載のがんを治療する方法。
【請求項22】
ビノレルビン、マイトマイシン、カンプトテシン、シクロホスファミド、メトトレキセート、クエン酸タモキシフェン、５－フルオロウラシル、イリノテカン、ドキソルビシン、フルタミド、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンブラスチン、メシル酸イマチニブ、アントラサイクリン、レトロゾール、三酸化ヒ素、アナストロゾール、トリプトレリンパモ酸塩、オゾガマイシン、塩酸イリノテカン、ＢＣＧ生菌、酢酸ロイプロリドインプラント（Ｖｉａｄｕｒ）、ベキサロテン、エキセメスタン、トポテカン塩酸塩、ゲムシタビンＨＣＬ、ダウノルビシン塩酸塩、ゲムシタビンＨＣＬ、クエン酸トレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン及び任意のその他のプラチナ含有腫瘍薬物、トラスツズマブ、ラパチニブ、ゲフィチニブ、セツキシマブ、パニツムマブ、テムシロリムス、エベロリムス、バンデタニブ、ベムラフェニブ、クリゾチニブ、ボリノスタット、ベバシズマブ、放射線療法、温熱療法、遺伝子治療、並びに光力学療法からなる群から選択される第２のがん治療を施すことをさらに含む、請求項１８～２１のいずれかに記載のがんを治療する方法。
【請求項23】
ＭＲＩ及び／又はＸ線画像化技術によってインビボでがんを画像化する方法であって、請求項１～１７のいずれかに記載の組成物を対象に投与することと、
ＭＲＩ及び／又はＸ線画像化技術によって前記対象中に存在する前記組成物の画像を形成することと
を含む、前記方法。
【請求項24】
投与することが、形成することの２４時間超前に行われる、請求項２４に記載のがんを画像化する方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
ヌクレオリン（Bandman O, Yue H, Corley N C, Shah P, "Human Nucleolin-like Protein" U.S. Pat. No. 5,932,475 (3 Aug. 1999)）は、リボソーム遺伝子転写及びプレリボソームＲＮＡのパッケージングの場所である核小体の豊富な非リボソームタンパク質である。この７１０アミノ酸のリンタンパク質は、ヒストン様Ｎ末端、４つのＲＮＡ認識モチーフを含有する中心ドメイン及びグリシン／アルギニンが豊富なＣ末端からなるマルチドメイン構造を有し、１１０ｋＤの見かけ上の分子量を有する。ヌクレオリンはすべての有核細胞に見られるが、細胞表面におけるヌクレオリンの発現は、新生物細胞の存在及び攻撃性と相関関係があるとされてきた（Bates P J, Miller D M, Trent J O, Xu X, "A New Method for the Diagnosis and Prognosis of Malignant Diseases" International Application, Int'l Pub. No. WO 03/086174 A2 (23 Oct. 2003)）。
【0002】
細胞表面ヌクレオリンの存在と新生物細胞との相関関係は、形質膜上のヌクレオリンの存在を検出することによって細胞の新生物状態を判断する方法に使用されてきた（Bates P J, Miller D M, Trent J O, Xu X, "A New Method for the Diagnosis and Prognosis of Malignant Diseases" International Application, Int'l Pub. No. WO 03/086174 A2 (23 Oct. 2003)）。この知見は、ヌクレオリンを特異的に標的とする化合物を投与することに基づく新規のがん治療戦略も提供した（Bates P J, Miller D M, Trent J O, Xu X, "Method for the Diagnosis and Prognosis of Malignant Diseases" U.S. Patent App. Pub., Pub. No. US 2005/0053607 A1 (10 Mar. 2005)）。
【0003】
核酸アプタマーは、特定の標的タンパク質によって認識され得る固有の三次元構造に折り畳まれる短い合成オリゴヌクレオチドである。したがって、核酸アプタマーの標的メカニズムはモノクローナル抗体と同様であるが、核酸アプタマーはインビボにおけるより急速なクリアランス、より良好な腫瘍浸透、非免疫原性、並びにより容易な合成及び保存を含む、モノクローナル抗体にまさる大きな利点を有する場合もある。
【0004】
三重らせん形成のために設計されたグアノシンが豊富なオリゴヌクレオチド（ＧＲＯ，guanosine-rich oligonucleotide）は、ヌクレオリンと結合することが知られている。ヌクレオリンと結合するこの能力は、培養された前立腺がん細胞の抗増殖性を生じさせる予想外の能力をもたらすことが示された（Bates P J, Kahlon J B, Thomas S D, Trent J O, Miller D M, "Antiproliferative Activity of G-rich Oligonucleotides Correlates with Protein Binding" J. Biol. Chem. 274:26369-77 (1999)）。抗増殖効果は、三重性が媒介するメカニズム又はアンチセンスメカニズムとは一致せず、ＧＲＯは別の作用様式によって増殖を阻害するようである。Ｇ四重鎖を含有する高次構造を形成する傾向を示すＧＲＯは、ＧＲＯ構造の形状特異的認識のためにヌクレオリンとの結合を必要とするアプタマーメカニズムによって働き、その後、細胞表面ヌクレオリンとの結合がアポトーシスを誘導することが推測された。ＧＲＯの抗増殖効果は、前立腺（ＤＵ１４５）、乳房（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＣＦ－７）、又は頸部（ＨｅＬａ）がん由来の細胞株で示され、細胞表面ヌクレオリンと結合するＧＲＯの能力と相関関係にある（Bates P J, Kahlon J B, Thomas S D, Trent J O, Miller D M, "Antiproliferative Activity of G-rich Oligonucleotides Correlates with Protein Binding" J. Biol. Chem. 274:26369-77 (1999)）。
【0005】
がん細胞に対して抗増殖活性を有し、非悪性細胞にはほとんど影響のないＧＲＯヌクレオリン結合ＤＮＡアプタマーであるＡＳ１４１１（ＧＲＯ２６Ｂ、配列番号１０）が以前に開発された。ＡＳ１４１１の取り込みは、がん細胞ではマクロピノサイトーシスによって行われるようであるが、非悪性細胞では非マクロピノサイトーシス経路によって行われるようであり、結果として非悪性細胞の生存能力に影響を及ぼすことなく、がん細胞の選択的な死滅をもたらす（Reyes-Reyes E M, Teng Y, Bates P J, "A New Paradigm for Aptamer Therapeutic AS1411 Action: Uptake by Macropinocytosis and Its Stimulation by a Nucleolin-Dependent Mechanism" Cancer Res 70(21): 8617-29 (2010)）。ＡＳ１４１１は、ヒトにおいて試験された最初の抗がん性アプタマーであり、ＡＳ１４１１の（腎細胞がん又は急性骨髄性白血病の患者における第II相試験を含む）臨床試験の結果は、深刻な副作用の証拠はなく有望な臨床活性を示している。いくつかの非常に効果的な長続きする臨床応答にもかかわらず、ＡＳ１４１１に対する総応答率は低く、これは、ＡＳ１４１１の低い効力のためである可能性があった。
【0006】
金ナノ粒子がコンジュゲートアプタマーなどの粒子がコンジュゲートした抗ヌクレオリン剤は、がん及び腫瘍に対して抗増殖効果を有する。２０１２年６月１日に出願されたBates et alの「ANTI-NUCLEOLIN AGENT-CONJUGATED NANOPARTICLES」という名称の国際出願公開第２０１２／１６７１７３号パンフレットを参照。アプタマーがコンジュゲートした金ナノ粒子は、特に、アプタマー（抗ヌクレオリンオリゴヌクレオチド）単独と同様又はそれ以上の抗増殖効果を有し、１／１０～１／１００の投与量だけで同様の効果を示す。さらに、好ましくは、粒子がコンジュゲートした又は抗ヌクレオリン剤が結合した蛍光色素を有するこれらの同じ薬剤はまた、インビボ及びエクスビボの両方で造影剤としても使用することができる。（Malik, M. T., et al. AS1411-conjugated gold nanospheres and their potential for breast cancer therapy. Oncotarget 6(26) pp. 22270-22281 (2015)）も参照。
【0007】
金ナノ粒子がコンジュゲートしたアプタマーなどの金属を含む粒子がコンジュゲートした抗ヌクレオリン剤は、がんを治療するために有効な放射線増感剤である。ナノ粒子は、がん細胞によって選択的に取り込まれ、そうした細胞に対するＲＴの効果を増強させる。これは、ＲＴの有効性を増強する、及び／又はＲＴの間に使用される放射線の低い有効量を可能にする。さらに、ナノ粒子は、ガドリニウムも含んでもよく、ＭＲＩスキャン中に近くの水分子の緩和度を増大させ（緩和速度を上げる）、スキャンされる試料中に存在する場合、コントラストを増加させることができる。さらに、金ナノ粒子及びＧｄイオンはともに、ＣＴスキャン法などのＸ線ベースの画像化技術を使用してスキャン又は画像化される試料中に存在する場合、Ｘ線の吸収及び散乱を増大させ、コントラストを増加させる。抗ヌクレオリン剤（がんを標的とする）及びガドリニウム（ＭＲＩコントラスト増強）の組合せは、一緒になってがんを標的とするＭＲＩコントラスト剤をもたらす。さらに、抗ヌクレオリン剤（がんを標的とする）及び金ナノ粒子（Ｘ線コントラスト増強）並びに任意にガドリニウム（ＭＲＩコントラスト増強及びＸ線コントラスト増強）の組合せは一緒になって、がんを標的とするＭＲＩ及びＸ線（ＣＴスキャン）コントラスト剤をもたらす。２０１６年５月５日に出願されたBates et alの「ANTI-NUCLEOLIN AGENT-CONJUGATED NANOPARTICLES AS RADIO-SENSITIZERS AND MRI AND/OR X-RAY CONTRAST AGENTS」という名称の国際出願公開第２０１６／１７９３９４号パンフレットを参照。
【0008】
ＡＳ１４１１は、抗がん薬物又は複合体とともにがん細胞の選択的な治療のための、がんを標的とする薬剤として使用されてきた。例えば、ＰＬＧＡナノ粒子を含有する薬物が、ＡＳ１４１１で機能化され、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ，poly（ethylene glycol））とコンジュゲートし、がん細胞を特異的に標的とし、ＰＬＧＡは、その後、細胞内で分解されるときに薬物を放出する（Guo, J. et al., Aptamer-functionalized PEG-PLGA nanoparticles for enhanced anti-glioma drug delivery. Biomaterials 32 (2011) 8010-8020、Aravind, A. et al., AS1411 Aptamer Tagged PLGA-Lecithin-PEG Nanoparticles for Tumor Cell Targeting and Drug Delivery. Biotechnology and Bioengineering 109(11) pp. 2920-2931 (November 2012)）。
【0009】
ＰＥＧ化と呼ばれることも多い薬物のポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）修飾は、薬物の急速な腎クリアランスを妨げることによって溶解性及びインビボ安定性を向上させるために広く使用されてきた。さらに、ＰＥＧ化は、免疫系から薬物を隠すのに役立ち、その結果、患者が（生体工学によって作られた酵素及び抗体などの高分子量薬物を用いた場合に特に問題となる）治療の過程において薬物の効力を中和する免疫応答を生じる可能性を低くする。さらに、ＰＥＧ化は、腫瘍の漏れやすい血管系及び効果的なリンパ排出の欠如を利用して、効果的な腫瘍標的を向上させる血管透過性・滞留性亢進（ＥＰＲ，enhanced permeability and retention）効果を腫瘍にもたらす。例えば、キレート化基で修飾され、Ｃｕイオンとキレート化され、その後、ＡＳ１４１１と複合体を形成したＰＥＧが腫瘍細胞を標的とするために研究された（Takafuji, Y., Jo, J-I and Tabata, Y. Simple PEG Modification of DNA Aptamer Based on Copper Ion Coordination for Tumor Targeting. J. Biomaterials Science 22 (2011) 1179-1195）。
【0010】
膠芽腫（ＧＢＭ，Glioblastomas）は最も多い成人の原発性脳腫瘍であり、一般に１４か月の予後を有し、５年生存率は＜５％である（Deorah, S., et al., Trends in brain cancer incidence and survival in the United States: Surveillance, Epidemiology, and End Results Program, 1973 to 2001. Neurosurg Focus, 2006. 20(4): p. E1、Mujokoro., B., Nano-structures mediated co-delivery of therapeutic agents for glioblastoma treatment: A review. In Materials Science and Engineering 2016、QT., O., CBTRUS Statistical Report: Primary Brain and Central Nervous System Tumors Diagnosed in the United States in 2008-2012. . Neuro. Oncol. , 2015、Reardon, D.A., et al., Bevacizumab continuation beyond initial bevacizumab progression among recurrent glioblastoma patients. British Journal of Cancer, 2012. 107(9): p. 1481-1487、Zhang Y, C.N., Pahuski M, et al., Noncoding RNAs in Glioblastoma. In: De Vleeschouwer S, editor. 2017）。最も有望な治療は、化学療法及び放射線療法と組み合わせた手術である（Tamimi AF, J.M., Epidemiology and Outcome of Glioblastoma. In: De Vleeschouwer S, editor. Glioblastoma [Internet]. 2017 Sep 27、Stupp, R., et al., Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med, 2005. 352(10): p. 987-96）。完全切除がいつも利用可能なわけではなく、化学／放射線療法による治療は毒性の可能性がある（Ahmed, R., et al., Malignant gliomas: current perspectives in diagnosis, treatment, and early response assessment using advanced quantitative imaging methods. Cancer Manag Res, 2014. 6: p. 149-70、Wadajkar, A.S., et al., Tumor-targeted nanotherapeutics: overcoming treatment barriers for glioblastoma. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol, 2017. 9(4)、Fernandes, C., et al., Current Standards of Care in Glioblastoma Therapy, in Glioblastoma, S. De Vleeschouwer, Editor. 2017, Codon Publications、Hart, M.G., et al., Temozolomide for high grade glioma. Cochrane Database of Systematic Reviews, 2013(4)）。ＧＢＭは、ＧＢＭの増殖、移動、及び生存の乗っ取りを可能にさせる、シグナル伝達経路の異常な改変を特徴とする（Zhang Y, C.N., Pahuski M, et al., Noncoding RNAs in Glioblastoma. In: De Vleeschouwer S, editor. 2017、Lee, Y.S. and A. Dutta, MicroRNAs in cancer. Annu Rev Pathol, 2009. 4: p. 199-227、Moller, H.G., et al., A systematic review of microRNA in glioblastoma multiforme: micro-modulators in the mesenchymal mode of migration and invasion. Mol Neurobiol, 2013. 47(1): p. 131-44、Shea, A., et al., MicroRNAs in glioblastoma multiforme pathogenesis and therapeutics. Cancer Med, 2016. 5(8): p. 1917-46、Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature, 2008. 455(7216): p. 1061-8）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0011】
【特許文献1】国際出願公開第２０１２／１６７１７３号パンフレット
【特許文献2】国際出願公開第２０１６／１７９３９４号パンフレット
【非特許文献】
【0012】
【非特許文献1】Bandman O, Yue H, Corley N C, Shah P, "Human Nucleolin-like Protein" U.S. Pat. No. 5,932,475 (3 Aug. 1999)
【非特許文献2】Bates P J, Miller D M, Trent J O, Xu X, "A New Method for the Diagnosis and Prognosis of Malignant Diseases" International Application, Int'l Pub. No. WO 03/086174 A2 (23 Oct. 2003)
【非特許文献3】Bates P J, Miller D M, Trent J O, Xu X, "Method for the Diagnosis and Prognosis of Malignant Diseases" U.S. Patent App. Pub., Pub. No. US 2005/0053607 A1 (10 Mar. 2005)
【非特許文献4】Bates P J, Kahlon J B, Thomas S D, Trent J O, Miller D M, "Antiproliferative Activity of G-rich Oligonucleotides Correlates with Protein Binding" J. Biol. Chem. 274:26369-77 (1999)
【非特許文献5】Reyes-Reyes E M, Teng Y, Bates P J, "A New Paradigm for Aptamer Therapeutic AS1411 Action: Uptake by Macropinocytosis and Its Stimulation by a Nucleolin-Dependent Mechanism" Cancer Res 70(21): 8617-29 (2010)
【非特許文献6】Malik, M. T., et al. AS1411-conjugated gold nanospheres and their potential for breast cancer therapy. Oncotarget 6(26) pp. 22270-22281 (2015)
【非特許文献7】Guo, J. et al., Aptamer-functionalized PEG-PLGA nanoparticles for enhanced anti-glioma drug delivery. Biomaterials 32 (2011) 8010-8020
【非特許文献8】Aravind, A. et al., AS1411 Aptamer Tagged PLGA-Lecithin-PEG Nanoparticles for Tumor Cell Targeting and Drug Delivery. Biotechnology and Bioengineering 109(11) pp. 2920-2931 (November 2012)
【非特許文献9】Takafuji, Y., Jo, J-I and Tabata, Y. Simple PEG Modification of DNA Aptamer Based on Copper Ion Coordination for Tumor Targeting. J. Biomaterials Science 22 (2011) 1179-1195
【非特許文献10】Deorah, S., et al., Trends in brain cancer incidence and survival in the United States: Surveillance, Epidemiology, and End Results Program, 1973 to 2001. Neurosurg Focus, 2006. 20(4): p. E1
【非特許文献11】Mujokoro., B., Nano-structures mediated co-delivery of therapeutic agents for glioblastoma treatment: A review. In Materials Science and Engineering 2016
【非特許文献12】QT., O., CBTRUS Statistical Report: Primary Brain and Central Nervous System Tumors Diagnosed in the United States in 2008-2012. . Neuro. Oncol. , 2015
【非特許文献13】Reardon, D.A., et al., Bevacizumab continuation beyond initial bevacizumab progression among recurrent glioblastoma patients. British Journal of Cancer, 2012. 107(9): p. 1481-1487
【非特許文献14】Zhang Y, C.N., Pahuski M, et al., Noncoding RNAs in Glioblastoma. In: De Vleeschouwer S, editor. 2017
【非特許文献15】Tamimi AF, J.M., Epidemiology and Outcome of Glioblastoma. In: De Vleeschouwer S, editor. Glioblastoma [Internet]. 2017 Sep 27
【非特許文献16】Stupp, R., et al., Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med, 2005. 352(10): p. 987-96
【非特許文献17】Ahmed, R., et al., Malignant gliomas: current perspectives in diagnosis, treatment, and early response assessment using advanced quantitative imaging methods. Cancer Manag Res, 2014. 6: p. 149-70
【非特許文献18】Wadajkar, A.S., et al., Tumor-targeted nanotherapeutics: overcoming treatment barriers for glioblastoma. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol, 2017. 9(4)
【非特許文献19】Fernandes, C., et al., Current Standards of Care in Glioblastoma Therapy, in Glioblastoma, S. De Vleeschouwer, Editor. 2017, Codon Publications
【非特許文献20】Hart, M.G., et al., Temozolomide for high grade glioma. Cochrane Database of Systematic Reviews, 2013(4)
【非特許文献21】Lee, Y.S. and A. Dutta, MicroRNAs in cancer. Annu Rev Pathol, 2009. 4: p. 199-227
【非特許文献22】Moller, H.G., et al., A systematic review of microRNA in glioblastoma multiforme: micro-modulators in the mesenchymal mode of migration and invasion. Mol Neurobiol, 2013. 47(1): p. 131-44
【非特許文献23】Shea, A., et al., MicroRNAs in glioblastoma multiforme pathogenesis and therapeutics. Cancer Med, 2016. 5(8): p. 1917-46
【非特許文献24】Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature, 2008. 455(7216): p. 1061-8
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0013】
第１の態様において、本発明は、ナノ粒子がコンジュゲートした抗ヌクレオリン剤及びＰＥＧを含む組成物である。ナノ粒子が、１～５０ｎｍの平均直径を有する。
【0014】
第２の態様において、本発明は、ナノ粒子がコンジュゲートした抗ヌクレオリン剤及びＰＥＧを含む組成物である。ナノ粒子が、金属、元素及び酸化物からなる群から選択される少なくとも１つの無機材料を含む。
【0015】
第３の態様において、本発明は、がんを治療する方法であって、有効量の上記の組成物のいずれかをそれを必要とする患者に投与することを含む、前記方法である。
【0016】
第４の態様において、本発明は、がんを治療する方法であって、有効量の上記の組成物のいずれかをそれを必要とする患者に投与し、その後放射線療法を行うことを含む、前記方法である。
【0017】
第５の態様において、本発明は、ＭＲＩ及び／又はＸ線画像化技術によってインビボでがんを画像化する方法であって、上記の組成物のいずれかを対象に投与することと、ＭＲＩ及び／又はＸ線画像化技術によって対象中に存在する組成物の画像を形成することとを含む、前記方法である。
【0018】
定義
「コンジュゲートした」という用語は、「化学的に結合した」ことを意味する。
「コンジュゲートした」という用語は、「化学的に結合した」ことを意味する。
【0019】
「抗ヌクレオリンオリゴヌクレオチド」という用語は、ヌクレオリンに結合するオリゴヌクレオチドを指す。
【0020】
「当量アプタマー濃度」という用語は、コンジュゲート物中に存在する抗ヌクレオリンオリゴヌクレオチドの濃度を指す。
【0021】
ＰＥＧとも呼ばれるポリ（エチレングリコール）は、薬物、ナノ粒子又はその他の物質とコンジュゲートしてもよい。ＰＥＧにコンジュゲートする場合、それらは、ＰＥＧ化されると呼ばれることが多く、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）－部分を含有することになる。ＰＥＧの分子量は、他に指定がない限り、好ましくは、製造業者又は販売業者によってラベルに表示されているとおり、結合前のＰＥＧの数平均分子量（Ｍｎ）であると理解される。
【0022】
腫瘍及びがんとしては、固形、異常増殖性組織変化及び散在性腫瘍が挙げられる。腫瘍及びがんの例としては、黒色腫、リンパ腫、形質細胞腫、肉腫、グリオーマ、膠芽腫、胸腺腫、白血病、乳がん、前立腺がん、結腸がん、肝がん、食道がん、脳がん、肺がん、卵巣がん、子宮内膜がん、膀胱がん、腎がん、子宮頸がん、肝細胞がん、及びその他の新生物が挙げられる。腫瘍及びがんのさらなる例に関しては、例えば、Stedmanを参照（Stedman, T.L. 2000. Stedman's medical dictionary. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia. xxxvi, [127], 2098）。
【0023】
「腫瘍を治療すること」又は「がんを治療すること」は、腫瘍若しくはがんの増殖及び／若しくは転移を著しく阻害すること、並びに／又はがん細胞を死滅させることを意味する。増殖阻害は、腫瘍体積の縮小又は転移の発生の減少によって示すことができる。腫瘍増殖は、例えば、（ダイヤルノギスにより二次元測定値を得ることなどの）通常の手順により腫瘍体積を調べることによって判定することができる。転移は、二次部位の腫瘍細胞を検査すること又はインビトロにおいて生検腫瘍細胞の転移の可能性を調べることによって判定することができる。
【0024】
「化学療法剤」は、ヒトでがんを治療するために効果的に使用することができる化学的化合物である。
【0025】
「薬学的に許容される担体」としては、薬学的投与に適合した任意及びすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌及び抗真菌剤、等張化剤並びに吸収遅延剤が挙げられる。そのような担体又は希釈剤の好適な例としては、水、生理的食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液が挙げられる。追加の活性化合物も組成物に組み込まれてもよい。
【0026】
「医薬」、「治療用組成物」及び「医薬組成物」は、同義に使用されて、対象において治療効果を発揮する化合物、物質、混合物又は調製物を示す。
【0027】
「抗体」は、最も広い意味で使用され、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体、抗体フラグメント及び化学修飾抗体を指し、この化学修飾は、実質的に抗体又は抗体フラグメントの選択性及び特異性に干渉しない。
【0028】
「抗ヌクレオリン剤」としては、ヌクレオリンと相互作用するあらゆる分子又は化合物が挙げられる。そのような薬剤としては、例えば、抗ヌクレオリン抗体、ＧＲＯなどのアプタマー及びヌクレオリン標的タンパク質が挙げられる。
【0029】
「Ｘ線ベースの画像化技術」としては、例えば、ＣＴスキャン（Ｘ線コンピューター断層撮影又はコンピューター体軸断層撮影スキャン（ＣＡＴ（computerized axial tomography）スキャン）とも呼ばれる）を含む、Ｘ線を使用して、直接的又は間接的に画像を形成するあらゆる画像化技術が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【0030】
【図1】共コンジュゲート金ナノ粒子のカトゥーン表示を示す図である。
【図2D】コンジュゲートしたオリゴヌクレオチドのＤＴＴ分離及び分離前後のＵＶ－ＶＩＳスペクトル分析に基づく金ナノ粒子に搭載されたＡＳ１４１１分子の推定数のグラフである。図２Ｄは、２つの独立した粒子合成物の平均を表し、値は平均±標準偏差として報告される。
【図2E】２１０～４５０ｎｍの粒子吸収を示す粒子合成物のＵＶ－ＶＩＳ分析のグラフである。
【図2F】４５０～１０００ｎｍの粒子吸収を金の表面プラズモン共鳴波長とともに示す粒子合成物のＵＶ－ＶＩＳ分析のグラフである。
【図3】共コンジュゲートＡｕＮＰ粒子による処理後のＵ８７ＭＧのインビトロ代謝活性を示すグラフである。データは、平均±標準偏差として示す（ｎ＝３）。棒は、Ｕ８７ＭＧ生存率と比例して関連する処理されたＵ８７ＭＧのＸＴＴ絶対吸光度を表す。６×粒子及び９×粒子の統計学的に有意な細胞傷害性は、二元配置ＡＮＯＶＡ分析によって判定され、α＝０．０５、＊は、０及び１０μＭのＡＳ群と比較した場合のｐ＜０．０００１を示す。有意性は、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して判定される。
【図4】有意な６×粒子及び９×粒子のＥＣ５０分析を示すグラフである。曲線は、各群に対して最も適合した非線形回帰線を表す。ＥＣ５０値は、それぞれ９×粒子及び６×粒子に対して１３０３ｎＭ（ｒ２＝０．８７２２）及び２１２ｎＭ（ｒ２＝０．９１８１）オリゴであると求められた。分析はＧｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて完了された。
【図5】７２時間後の細胞の形態及び密度を示す粒子処理Ｕ８７ＭＧの１０×明視野画像を示す図である。画像は、Nikon社落射蛍光顕微鏡及びＮＩＳ ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェアを使用して取得された。ＡｕＮＰ処理は、１０μＭのＡＳ１４１１条件を除いて、約１０００ｎＭのオリゴ濃度である。スケールバーは、１００ミクロンを示す。
【図6】９×ＡＳ／ＣＲＯ ＡｕＮＰによる処理後のＵ８７ＭＧのインビトロ代謝活性を示すグラフである。データは、平均±標準偏差として示す（ｎ＝５）。棒は、Ｕ８７ＭＧ生存率と比例して関連する処理されたＵ８７ＭＧのＸＴＴ絶対吸光度を表す。９×粒子の統計学的に有意な特異性は、二元配置ＡＮＯＶＡ分析によって判定され、α＝０．０５、＊は、９×が同等のＣＲＯ群と比較された場合のｐ＜０．００１を示す。有意性は、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して判定される。
【図7】９×共コンジュゲートＡｕＮＰ粒子のＥＣ５０分析を示すグラフである。曲線は、最良適合の非線形回帰線を表す。ＥＣ５０値は、９３５ｎＭオリゴ（ｒ２＝０．７０１５）であると求められ、ＣＲＯ曲線は得られなかった。分析はＧｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて完了された。
【発明を実施するための形態】
【0031】
本発明は、がん及び腫瘍に対して抗増殖効果を有する、粒子がコンジュゲートした抗ヌクレオリン剤及びＰＥＧ、例えば、金ナノ粒子がコンジュゲートしたアプタマー及びＰＥＧを利用する。ＰＥＧ／抗ヌクレオリン剤コンジュゲート物はまた、共コンジュゲート物と呼ばれることもある。共コンジュゲート物としてＰＥＧの付加は、循環半減期を延長することによってなど、ナノ粒子がコンジュゲートした抗ヌクレオリン剤の薬物動態を向上させて、インビボにおける効力をさらに改善することができるか、又は肝臓及び／若しくは肺などの臓器における蓄積を避けることができる。さらに、アプタマー／ＰＥＧがコンジュゲートした金ナノ粒子は、特にアプタマー（抗ヌクレオリンオリゴヌクレオチド）単独、又はさらに金ナノ粒子がコンジュゲートしたアプタマーと同様又はそれ以上の抗増殖効果を有し、１／１０～１／１００の投与量だけで同様の効果を示すことができる。さらに、これらの同じ薬剤、好ましくは、粒子がコンジュゲートした、又は抗ヌクレオリン剤若しくはＰＥＧに結合した蛍光色素を有する薬剤は、インビボ及びエクスビボの両方で造影剤として使用することもできる。これらはまた、放射線療法（ＲＴ，radiation therapy）を増強するための薬剤として並びにＸ線及びＣＴスキャン用のコントラスト剤としても使用することができる。最後に、ガドリニウムともコンジュゲートする場合、これらは、ＭＲＩスキャンのコントラストを増強させるために使用することができる。
【0032】
ナノ粒子がコンジュゲートしたＰＥＧ及び抗ヌクレオリン剤のモル比は変動してもよい。例えば、抗ヌクレオリン剤：ＰＥＧの比は、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１又は１２：１であってもよい。或いは、ＰＥＧ：抗ヌクレオリン剤の比は、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１又は１２：１であってもよい。好ましくは、抗ヌクレオリン剤は、ＡＳ１４１１である。好ましくは、ナノ粒子は、４、５、１０、１５、２０、又は１００ｎｍの直径を有する金ナノ粒子である。膠芽腫又はその他の脳がんを治療するためには、血液脳関門を通る浸透を向上させるためにナノ粒子が４、５又は１０ｎｍの直径を有するのが好ましい。
【0033】
（ＡＳ１４１１などの）抗ヌクレオリン剤及び／又はＰＥＧを（金ナノ粒子などの）ナノ粒子にコンジュゲートする場合、一般に、ナノ粒子の表面は、表面にコンジュゲートした薬剤で飽和状態にされる。したがって、（ＡＳ１４１１及びＰＥＧなどの）薬剤の混合物が形成されるとき、薬剤の比が制御され、これが、ナノ粒子がコンジュゲートした薬剤の比、及び各ナノ粒子上の各薬剤の数を制御する。例えば、ＡＳ１４１１及びＰＥＧとコンジュゲートする４ｎｍの金ナノ粒子の場合、コンジュゲートする薬剤分子の総数は１２個となるため、ナノ粒子がコンジュゲートするＡＳ１４１１及びＰＥＧ分子の合計が１２個になる。ＡＳ１４１１：ＰＥＧの比を特定するために使用される用語は、ナノ粒子がコンジュゲートしたＡＳ１４１１分子の総数に基づく。４ｎｍの金ナノ粒子の場合、「１２×」は、１２個のＡＳ１４１１分子、及び１２：０のＡＳ１４１１：ＰＥＧ比を意味し、同様に、「９×」、「６×」、「３×」及び「０×」は、それぞれ９、６、３及び０個のＡＳ１４１１分子、並びにそれぞれ９：３、６：６、３：９及び０：１２（或いは、それぞれ３：１、１：１、１：３及び０）のＡＳ１４１１：ＰＥＧ比を有する。５ｎｍ又は１０ｎｍの金ナノ粒子などのさらに大きな金ナノ粒子を用いる場合、コンジュゲートすることができる薬剤の総量がさらに多くなるため、「９×」は、さらに小さなＡＳ１４１１：ＰＥＧ比を意味するであろう。合成中にコンジュゲート物の分散が生じるが、最も主要な結合比から外れたそれらのナノ粒子は、異なる結合比のナノ粒子の異なるゼータ電位を利用した「塩析」によって分離することができる。
【0034】
任意のＰＥＧの分子量が使用されてもよい。好ましくは、ＰＥＧ分子量は、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００及び９０００、並びにその間の値を含む、２００～２０，０００、より好ましくは、１０００～１０，０００である。当こうした分子量の値は、測定の精度の有効数字まで表される値を表す数平均分子量であり、そのような組成物は、報告された分子量付近のＰＥＧ分子の分布を有することが理解される。
【0035】
放射線治療（ＲＴ）は、Ｘ線（例えば、メガボルトエネルギーＸ線）、ブラキセラピー、陽子線、及び中性子線などの放射線の任意の形態によるものであってもよい。通常、臨床以下と考えられるであろうＲＴの線量及び／又はエネルギーを使用することも可能であり、ナノ粒子がコンジュゲートした抗ヌクレオリン剤・ＰＥＧがＲＴの有効性を増強するため、その放射線量が、がん細胞及び腫瘍を死滅させるか、又はその増殖を低減するのに有効である。
【0036】
ガドリニウムを含有する、ナノ粒子がコンジュゲートした抗ヌクレオリン剤・ＰＥＧは、有効なＭＲＩコントラスト剤であり、個々のがん細胞を含むがん細胞を画像化するためにも使用することができる。例えば、ガドリニウムを含有する、ナノ粒子がコンジュゲートした抗ヌクレオリン剤・ＰＥＧは、がん細胞がリンパ節に存在するかどうかを判断するために患者に投与されてもよく、それにより、リンパ節ががん細胞を含有するかどうかを判断するためだけにリンパ節を除去することを回避する。別の使用は、バイオプシーの必要性を回避することである場合がある。ガドリニウムを含有する、ナノ粒子がコンジュゲートした抗ヌクレオリン剤・ＰＥＧは、がんがしこりに存在するか、身体の他の位置に転移したかどうかを判断するため、又は手術中に腫瘍からすべてのがんが除去されたかどうかを判断するために患者に投与されてもよい。
【0037】
ガドリニウムを含有してもよい、ナノ粒子がコンジュゲートした抗ヌクレオリン剤・ＰＥＧは、効果的なＸ線コントラスト剤であり、個々のがん細胞を含むがん細胞を画像化するために使用されてもよい。例えば、ガドリニウムを含有してもよい抗ヌクレオリン剤・ＰＥＧ結合ナノ粒子は、がん細胞がリンパ節に存在するかどうかを判断するために患者に投与されてもよく、それにより、リンパ節ががん細胞を含有するかどうかを判断するためだけにリンパ節を除去することを回避する。別の使用は、バイオプシーの必要性を回避することである場合がある。ガドリニウムを含有してもよい、ナノ粒子がコンジュゲートした抗ヌクレオリン剤・ＰＥＧは、がんがしこりに存在するか、身体の他の位置に転移したかどうかを判断するため、又は手術中に腫瘍からすべてのがんが除去されたかどうかを判断するために患者に投与されてもよい。
【0038】
抗ヌクレオリン剤としては、（ｉ）アプタマー、例えば、ＧＲＯ；（ii）抗ヌクレオリン抗体；及び（iii）ヌクレオリン標的タンパク質が挙げられる。アプタマーの例としては、グアノシンが豊富なオリゴヌクレオチド（ＧＲＯ）が挙げられる。適切なオリゴヌクレオチド及びアッセイの例は、Miller et al.（Miller D M, Bates P J, Trent J O, Xu X, "Method for the Diagnosis and Prognosis of Malignant Diseases" U.S. Patent App. Pub., Pub. No. US 2003/0194754 A1 (16 Oct. 2003)）において示されている。ＧＲＯの特徴としては、
（１）少なくとも１つのＧＧＴモチーフを有すること、
（２）多くのさらなるヌクレオチドを有するＧＲＯが可能であるが、好ましくは、４～１００ヌクレオチドを有すること、
（３）安定性を向上させるための化学修飾を有してもよいこと
が挙げられる。
（１）少なくとも１つのＧＧＴモチーフを有すること、
（２）多くのさらなるヌクレオチドを有するＧＲＯが可能であるが、好ましくは、４～１００ヌクレオチドを有すること、
（３）安定性を向上させるための化学修飾を有してもよいこと
が挙げられる。
【0039】
特に有用なＧＲＯは、２９５ｎｍでの可逆性の熱変性／再生プロファイルによって示されるＧ四重鎖構造を形成する（Bates P J, Kahlon J B, Thomas S D, Trent J O, Miller D M, "Antiproliferative Activity of G-rich Oligonucleotides Correlates with Protein Binding" J. Biol. Chem. 274:26369-77 (1999)）。好適なＧＲＯはまた、電気泳動移動度シフトアッセイにおいて標的細胞タンパク質との結合に関してテロメアオリゴヌクレオチドと競合する（Bates P J, Kahlon J B, Thomas S D, Trent J O, Miller D M, "Antiproliferative Activity of G-rich Oligonucleotides Correlates with Protein Binding" J. Biol. Chem. 274:26369-77 (1999)）。ある場合には、ＧＲＯヌクレオチドをより大きな核酸配列に組み込むことが有利な場合もあり、例えば、ヌクレオリン結合部位を変性させることなくＧＲＯ核酸の基質との結合を促進する。オリゴヌクレオチドの例を表１に示す。好適なオリゴヌクレオチドとしては、表１の配列番号１～７；９～１６；１９～３０及び３１が挙げられる。
【0040】
【表1】
【0041】
ヌクレオリンと結合する任意の抗体も使用されてもよい。特定の例において、モノクローナル抗体は、単一の特異的な定義されたエピトープと結合するため好適である。ただし、その他の例において、ヌクレオリン上の２つ以上のエピトープと相互作用することができるポリクローナル抗体が使用されてもよい。多くの抗ヌクレオリン抗体が商業的に入手可能であり、そうでなければ、容易に作製される。例えば、Sutkowski et alの米国特許出願公開第２０１３／０１１５６７４号明細書を参照。表２は、少数の商業的に入手可能な抗ヌクレオリン抗体を列記する。
【0042】
【表2】
【0043】
ヌクレオリン標的タンパク質は、ヌクレオリンと特異的及び選択的に結合する抗体以外のタンパク質である。例としては、リボソームタンパク質Ｓ３、腫瘍ホーミングＦ３ペプチド（Cooper et al. [2014], Front. Chem. 14, 2, 86、Alkilany, A.M. and C.J. Murphy, Toxicity and cellular uptake of gold nanoparticles: what we have learned so far? Journal of Nanoparticle Research, 2010. 12(7): p. 2313-2333）及びミオシンＨ９（腫瘍形成過程における新生血管中の内皮細胞の細胞表面ヌクレオリンと結合する非筋肉ミオシン）が挙げられる。
【0044】
抗ヌクレオリン剤は、（１）金属及び元素；（２）酸化物；（３）半導体；並びに（４）ポリマーを含む、さまざまな固体材料でできた粒子とコンジュゲートしてもよい。金属及び元素、好ましくは、非磁性金属及び元素としては、金、銀、パラジウム、イリジウム、プラチナ及びそれらの合金が挙げられ、元素としては、ケイ素、ホウ素及び炭素（例えば、ダイヤモンド、グラフェン及びカーボンナノチューブ）、並びにそれらの固体化合物が挙げられる。酸化物としては、二酸化チタン、二酸化ケイ素、酸化亜鉛、酸化鉄、酸化ジルコニウム、酸化マグネシウム、酸化アルミニウム及びそれらの複合酸化物、例えば、チタン酸バリウムが挙げられる。半導体としては、量子ドット、硫化亜鉛、ケイ素／ゲルマニウム合金、窒化ホウ素、窒化アルミニウム、及びそれらの固溶体が挙げられる。ポリマーとしては、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート及びポリメタクリレート、並びにポリシロキサンが挙げられる。好ましくは、粒子は、無毒性である。粒子は、好ましくは、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０及び９５ｎｍを含む、１～１００ｎｍ、より好ましくは、１～５０ｎｍの平均粒子径（average particle diameter）を有するナノ粒子である。
【0045】
オリゴヌクレオチド及びタンパク質は、さまざまな技術によって金属及び元素、酸化物、半導体及びポリマーなどの固体材料に結合させられてきた。これらの同じ技術が、抗ヌクレオリン剤を粒子に結合させるために使用することができる。ナノ粒子がコンジュゲートした抗ヌクレオリン剤・ＰＥＧ（コンジュゲート物）とのシアニン色素などの色素のさらなる結合は、コンジュゲート物がインビボ及びエクスビボの両方で造影剤として使用されるのを可能にする。
【0046】
ナノ粒子がコンジュゲートした抗ヌクレオリン剤・ＰＥＧは、ナノ粒子がコンジュゲートした抗ヌクレオリン剤・ＰＥＧと、薬学的に許容される担体との混合物、例えば、医薬組成物を形成することによって、がん及び腫瘍を治療し、細胞表面ヌクレオリンを発現するがん細胞を標的とするための医薬組成物を製剤化するために使用されてもよい。対象のがんを治療する方法は、治療有効量の、ナノ粒子がコンジュゲートした抗ヌクレオリン剤・ＰＥＧを投与することを含む。
【0047】
特に好適な組成物は、金ナノ粒子がコンジュゲートしたアプタマーである。金ナノ粒子（ＧＮＰ，gold nanoparticle）は、低毒性、多機能な表面化学、光吸収／散乱特性、及び調節可能なサイズを示す。アプタマーは、効果的に金粒子を覆い、凝集を防ぎ、安全で、安定であり、合成が容易で、非免疫原性である。ＧＮＰがコンジュゲートしたアプタマーは、がん細胞においてＡＳ１４１１単独よりも増大した抗増殖活性及びインビボにおける改善された効果などの代替的なアプローチにまさる多くの利点を提供して、副作用の徴候なく、マウスにおいて確立された乳がん異種移植の持続的な退縮をもたらす。ＧＮＰがコンジュゲートしたアプタマーは、正常な細胞よりもがん細胞に対して極めて選択的であり、例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ（登録商標）５．５、Ｃｙ７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７５０、ＩＲＤｙｅ（登録商標）６８０、及びＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷ（LI-COR Biosciences社、リンカン、ＮＥ）などのシアニン色素と結合させられた場合、優れた造影剤である。ＧＮＰがコンジュゲートしたアプタマーは、造影剤として使用されてもよく、薬学的に許容される担体をさらに含有する組成物として投与されてもよい。造影剤は、インビボにおいてがんを画像化する方法において、対象中に存在する造影剤の画像を形成するために対象に投与されてもよい。
【0048】
本明細書に記載されている組成物の量及び比はすべて、別に明記されない限り重量による。したがって、１ナノ粒子当たりの抗ヌクレオリン剤の数は、ナノ粒子の重量が変動すると、当量抗ヌクレオリン剤濃度（又は当量アプタマー濃度）が別に同じであっても、変化することがある。例えば、１ナノ粒子当たりの抗ヌクレオリン剤分子の数は、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００及び９００を含む、２～１０，０００、又は１０～１０００で変化することもある。
【0049】
医薬組成物は、静脈内、皮内、皮下、経口、吸入、経皮、経粘膜、及び直腸投与を含む意図される投与経路と適合するよう製剤化される。非経口、皮内又は皮下適用に使用される溶液及び懸濁液は、滅菌した希釈剤、例えば、注射用水、生理食塩水、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又はその他の合成溶媒；抗菌剤、例えば、ベンジルアルコール又はメチルパラベン；酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウム；緩衝剤、例えば、酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩、及び張性の調節のための薬剤、例えば、塩化ナトリウム又はデキストロースを含んでもよい。塩酸若しくは水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基でｐＨが調節されてもよい。
【0050】
注射に適切な医薬組成物としては、滅菌した注射可能な溶液又は分散液の即席の調製のための滅菌水溶液又は分散液が挙げられる。静脈内投与に適切な担体としては、生理的食塩水、静菌水、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ ＥＬ（登録商標）（BASF社；パーシッパニー、ＮＪ）又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ，phosphate buffered saline）が挙げられる。あらゆる場合において、組成物は、滅菌されていなければならず、シリンジを使用して投与されるよう流体であるべきである。そのような組成物は、製造及び保管の間、安定でなければならず、好ましくは、細菌及び真菌などの微生物の汚染から保護される。担体は、例えば、水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール）、及びその他の適合した適切な混合物を含有する分散媒であってもよい。さまざまな抗菌及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、及びチメロサールは、微生物汚染を阻止することができる。糖、ポリアルコールなどの等張化剤、例えば、マンニトール、ソルビトール、及び塩化ナトリウムが組成物中に含まれてもよい。吸収を遅延させることができる組成物としては、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの薬剤が挙げられる。
【0051】
滅菌した注射可能な溶液は、活性薬剤、及び他の治療用構成成分を、必要とされる量で適切な溶媒に、必要に応じて、１つの成分又はその組合せとともに混合し、続いて滅菌することによって調製することができる。滅菌した注射可能な溶液の調製のための滅菌固体の調製の方法としては、固体を得るための真空乾燥及びフリーズドライが挙げられる。
【0052】
本明細書に記載されている医薬組成物は、その他の治療的に活性な化合物をさらに含んでもよく、及び／又はがん及び腫瘍の治療に適切な本明細書において述べたとおりの理学的技術と併せて使用されてもよい。一般的に使用される治療的に活性な化合物の例としては、ビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））、マイトマイシン、カンプトテシン、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘｉｎ（登録商標））、メトトレキセート、クエン酸タモキシフェン、５－フルオロウラシル、イリノテカン、ドキソルビシン、フルタミド、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、ドセタキセル、ビンブラスチン、メシル酸イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標））、アントラサイクリン、レトロゾール、三酸化ヒ素（Ｔｒｉｓｅｎｏｘ（登録商標））、アナストロゾール、トリプトレリンパモ酸塩、オゾガマイシン、塩酸イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標））、ＢＣＧ生菌（Ｐａｃｉｓ（登録商標））、酢酸ロイプロリドインプラント（Ｖｉａｄｕｒ）、ベキサロテン（Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ（登録商標））、エキセメスタン（Ａｒｏｍａｓｉｎ（登録商標））、トポテカン塩酸塩（Ｈｙｃａｍｔｉｎ（登録商標））、ゲムシタビンＨＣＬ（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、ダウノルビシン塩酸塩（Ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ ＨＣＬ（登録商標））、ゲムシタビンＨＣＬ（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、クエン酸トレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）、カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標））、シスプラチン（Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標）及びＰｌａｔｉｎｏｌ－ＡＱ（登録商標））オキサリプラチン及び任意のその他のプラチナ含有腫瘍薬物、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、ラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ（登録商標））、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ（登録商標））、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））、パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標））、テムシロリムス（Ｔｏｒｉｓｅｌ（登録商標））、エベロリムス（Ａｆｉｎｉｔｏｒ（登録商標））、バンデタニブ（Ｚａｃｔｉｍａ（商標））、ベムラフェニブ（Ｚｅｌｂｏｒａｆ（商標））、クリゾチニブ（Ｘａｌｋｏｒｉ（登録商標））、ボリノスタット（Ｚｏｌｉｎｚａ（登録商標））、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））、放射線療法、温熱療法、遺伝子治療並びに光力学療法が挙げられる。
【0053】
がんの治療において、治療用薬剤の適切な投与量レベルは、一般に１日当たり患者の体重１ｋｇにつき約０．０１～５００ｍｇになり、これは、単回又は複数用量で投与されてもよい。好ましくは、投与量レベルは、１日当たり約０．１～約２５０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは、１日当たり約０．５～約１００ｍｇ／ｋｇになる。適切な投与量レベルは、１日当たり約０．０１～２５０ｍｇ／ｋｇ、１日当たり約０．０５～１００ｍｇ／ｋｇ、又は１日当たり約０．１～５０ｍｇ／ｋｇであってもよい。この範囲内で、投与量は、１日当たり０．０５～０．５、０．５～５又は５～５０ｍｇ／ｋｇであってもよい。化合物は、１日１～４回、好ましくは、１日１回又は２回のレジメンで投与されてもよい。継続的な注入による投与も好ましい。
【0054】
医薬調製物は、そのまま投与できる形態に、単位剤形と呼ばれる単回投与に適した単回投与量と一致する量で予め包装されていてもよい。単位剤形は、ガラス又はプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ又はバイアルに密封されてもよい。
【0055】
ただし、任意の特定の患者のための投与量の特定の用量レベル及び頻度は、変動することもあり、利用される特定の化合物の活性、その化合物の代謝安定性及び作用の長さ、年齢、体重、全身の健康状態、性別、食事、投与の様式及び時間、排出の速度、薬物の組合せ、特定の状態の重症度、並びに治療を受けている患者を含む、さまざまな要因により決まることになる。
［実施例］
目的：ＧＢＭを標的とする能力を示すと同時に膠芽腫細胞型に対する組合せ治療の追加を可能にする共コンジュゲートＰＥＧ：ＡＳ１４１１金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）を合成及び最適化する。
［実施例］
目的：ＧＢＭを標的とする能力を示すと同時に膠芽腫細胞型に対する組合せ治療の追加を可能にする共コンジュゲートＰＥＧ：ＡＳ１４１１金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）を合成及び最適化する。
【0056】
材料
ＨＡｕＣｌ４・３Ｈ２Ｏを、Alfa Aesar社（チュークスベリ、ＭＡ）から購入した。クエン酸三ナトリウム塩（Ｎａ３Ｃ６Ｈ５Ｏ７）、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）及び無水炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）をSigma Aldrich社（セントルイス、ＭＯ）から購入した。１０．０×リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）。すべての水溶液を調製するためにNanopure超純水（Barnstead社、１８．２ＭΩ・ｃｍの抵抗率）を使用した。塩酸（ＨＣｌ）及び硝酸（ＨＮＯ３）は、分析グレードであり、VWR社（ランドール、ＰＡ）から購入した。ＧＮＰ合成のためのすべてのガラス製品をきれいにするために王水溶液（３部のＨＣｌ及び１部のＨＮＯ３）を使用した。チオールポリエチレングリコール－４－アルコール（ＳＨ－ＰＥＧ－ＯＨ；分子量２１０．３ｇ／ｍｏｌ；９５％純度）を、BroadPharm社（サンディエゴ、ＣＡ）から購入し、企業の仕様書により調製した。規則的なＤＮＡ主鎖（リン酸ジエステル）、５’－チオール Ｃ６ Ｓ－Ｓ修飾（チオ－ＭＣ６－Ｄ）、５’－６Ｔスペーサー（ＡＳ１４１１及びＣＲＯに対する）を有するオリゴヌクレオチド及び高速液体クロマトグラフィー精製は、Integrated DNA Technologies社（コーラルビル、ＩＡ）によって供給された。使用したオリゴヌクレオチド配列は、5'-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG（ＡＳ１４１１；配列番号１０）及び5’-CCTCCTCCTCCTTCTCCTCCTCCTCC（ＣＲＯ；配列番号１７）であり、それぞれ５’末端が６つのチミン塩基で修飾され、３’末端が３つのチミン塩基で修飾されていた。フルオロフォア修飾オリゴヌクレオチド（Ｃｙ５－ＡＳ１４１１及びＣｙ５－ＣＲＯ）は構造的に類似しており、３’修飾蛍光シアニン－５（Ｃｙ５）を有するオリゴヌクレオチドをIntegrated DNA Technologies社から入手した。Illustra NAP-25 DNAサイズ排除クロマトグラフィーグラビティカラムを、GE Healthcare Life Sciences社（ピッツバーグ、ＰＡ）から入手した。Ｕｌｔｒａｃｅｌ－３０（３００００ＭＷＣＯ）を備えたＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ １５．０ｍｌ遠心フィルターを、Merck Millipore社（ビレリカ、ＭＡ）から購入した。ナノ粒子配合物及びオリゴのＵＶ吸収スペクトルをＵＶ可視分光計（Varian Cary 50 BIO UV、Agilent Technologies社、サンタクララ、ＣＡ）で測定した。ナノ粒子配合物に対する動的光散乱及びゼータ電位測定値を、NanoBrook Zeta PALS Zeta Potential Analyzer（Brookhaven Instruments社、ホルツビル、ＮＹ）を使用して得た。Ｕ８７ＭＧ膠芽腫がん細胞を、ATCC（マナッサス、ＶＡ）から購入した。ダルベッコ変法イーグル培地、熱失活ウシ胎仔血清、１０×トリプシン、ペニシリン／ストレプトマイシンを、Thermo Fisher Scientific社（ウォルサム、ＭＡ）から購入した。ＧＢＭ細胞を、Corning Incorporated社（チュークスベリ、ＭＡ）のＴ２５又はＴ７５滅菌培養プレートにおいて継代培養した。Ｕ８７ＭＧを、明視野顕微鏡法及び代謝研究のためにVWR社（ラドノー、ＰＡ）の滅菌培養プレートにおいて、又は共焦点研究のためにMatTek Life Sciences社（アシュラン、ＭＡ）から購入した１０ｍｍのガラス底、ポリ－ｄ－リジンコーティングMatTek社ディッシュにおいて培養した。ナノ粒子又は対照処理Ｕ８７ＭＧに関する代謝活性を、Biotum社（フリーモント、ＣＡ）から入手した（２，３－ビス－（メトキシ－４－ニトロ－５－スルホフェニル－２Ｈ－テトラゾリウム－５－カルボキシアニリド）（ＸＴＴ）の分光光度測定を使用して測定した。
ＨＡｕＣｌ４・３Ｈ２Ｏを、Alfa Aesar社（チュークスベリ、ＭＡ）から購入した。クエン酸三ナトリウム塩（Ｎａ３Ｃ６Ｈ５Ｏ７）、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）及び無水炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）をSigma Aldrich社（セントルイス、ＭＯ）から購入した。１０．０×リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）。すべての水溶液を調製するためにNanopure超純水（Barnstead社、１８．２ＭΩ・ｃｍの抵抗率）を使用した。塩酸（ＨＣｌ）及び硝酸（ＨＮＯ３）は、分析グレードであり、VWR社（ランドール、ＰＡ）から購入した。ＧＮＰ合成のためのすべてのガラス製品をきれいにするために王水溶液（３部のＨＣｌ及び１部のＨＮＯ３）を使用した。チオールポリエチレングリコール－４－アルコール（ＳＨ－ＰＥＧ－ＯＨ；分子量２１０．３ｇ／ｍｏｌ；９５％純度）を、BroadPharm社（サンディエゴ、ＣＡ）から購入し、企業の仕様書により調製した。規則的なＤＮＡ主鎖（リン酸ジエステル）、５’－チオール Ｃ６ Ｓ－Ｓ修飾（チオ－ＭＣ６－Ｄ）、５’－６Ｔスペーサー（ＡＳ１４１１及びＣＲＯに対する）を有するオリゴヌクレオチド及び高速液体クロマトグラフィー精製は、Integrated DNA Technologies社（コーラルビル、ＩＡ）によって供給された。使用したオリゴヌクレオチド配列は、5'-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG（ＡＳ１４１１；配列番号１０）及び5’-CCTCCTCCTCCTTCTCCTCCTCCTCC（ＣＲＯ；配列番号１７）であり、それぞれ５’末端が６つのチミン塩基で修飾され、３’末端が３つのチミン塩基で修飾されていた。フルオロフォア修飾オリゴヌクレオチド（Ｃｙ５－ＡＳ１４１１及びＣｙ５－ＣＲＯ）は構造的に類似しており、３’修飾蛍光シアニン－５（Ｃｙ５）を有するオリゴヌクレオチドをIntegrated DNA Technologies社から入手した。Illustra NAP-25 DNAサイズ排除クロマトグラフィーグラビティカラムを、GE Healthcare Life Sciences社（ピッツバーグ、ＰＡ）から入手した。Ｕｌｔｒａｃｅｌ－３０（３００００ＭＷＣＯ）を備えたＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ １５．０ｍｌ遠心フィルターを、Merck Millipore社（ビレリカ、ＭＡ）から購入した。ナノ粒子配合物及びオリゴのＵＶ吸収スペクトルをＵＶ可視分光計（Varian Cary 50 BIO UV、Agilent Technologies社、サンタクララ、ＣＡ）で測定した。ナノ粒子配合物に対する動的光散乱及びゼータ電位測定値を、NanoBrook Zeta PALS Zeta Potential Analyzer（Brookhaven Instruments社、ホルツビル、ＮＹ）を使用して得た。Ｕ８７ＭＧ膠芽腫がん細胞を、ATCC（マナッサス、ＶＡ）から購入した。ダルベッコ変法イーグル培地、熱失活ウシ胎仔血清、１０×トリプシン、ペニシリン／ストレプトマイシンを、Thermo Fisher Scientific社（ウォルサム、ＭＡ）から購入した。ＧＢＭ細胞を、Corning Incorporated社（チュークスベリ、ＭＡ）のＴ２５又はＴ７５滅菌培養プレートにおいて継代培養した。Ｕ８７ＭＧを、明視野顕微鏡法及び代謝研究のためにVWR社（ラドノー、ＰＡ）の滅菌培養プレートにおいて、又は共焦点研究のためにMatTek Life Sciences社（アシュラン、ＭＡ）から購入した１０ｍｍのガラス底、ポリ－ｄ－リジンコーティングMatTek社ディッシュにおいて培養した。ナノ粒子又は対照処理Ｕ８７ＭＧに関する代謝活性を、Biotum社（フリーモント、ＣＡ）から入手した（２，３－ビス－（メトキシ－４－ニトロ－５－スルホフェニル－２Ｈ－テトラゾリウム－５－カルボキシアニリド）（ＸＴＴ）の分光光度測定を使用して測定した。
【0057】
共コンジュゲートＡＳ１４１１及びＰＥＧ ＧＮＰ合成
４ナノメートル（ｎｍ）のクエン酸キャッピングＧＮＰを、以前に報告されたプロトコルを使用して滅菌的に合成した（Kim, H., et al., Integrative genome analysis reveals an oncomir/oncogene cluster regulating glioblastoma survivorship. Proc Natl Acad Sci U S A, 2010. 107(5): p. 2183-8、Li, Y., et al., MicroRNA-34a inhibits glioblastoma growth by targeting multiple oncogenes. Cancer Res, 2009. 69(19): p. 7569-76）。チオール修飾ＡＳ１４１１（ＳＨ－ＡＳ１４１１）は、購入時には保存及び安定性のためのジスルフィド結合を含み、これを、ＳＨ－ＡＳ１４１１、１．０Ｍ ＤＴＴ、０．２５Ｍリン酸バッファー（ＰＢ，phosphate buffer）、及びＮａｎｏｐｕｒｅ超純水の所望の混合物の１時間沸騰させることに続いてさらに１時間冷却することにより結合に先立って切断した。ＳＨ－ＡＳ１４１１を、Ｉｌｌｕｓｔｒａ ＮＡＰ－２５ ＤＮＡグラビティカラム及び溶離液として０．１Ｍ ＰＢを使用したサイズ排除クロマトグラフィーにより単離した。ＳＨ－ＰＥＧアルコールを、製造仕様書に従ってＤＭＳＯ中で希釈した。その後、切断及び精製したＳＨ－ＡＳ１４１１及びＳＨ－ＰＥＧアルコールを、さまざまな比（次の段落を参照）でＧＮＰとコンジュゲートして、二構成成分ＡＳ１４１１／ＰＥＧコーティングを形成した。９６時間の期間にわたる１×濃度までの１０×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）の段階的な添加に続く、水浴における１０分間の最大超音波処理。１３，５００ｇでの２０分間の遠心分離に続く３回の１×ＰＢＳ洗浄及び各洗浄後の再遠心分離により、いかなる非コンジュゲート構成成分も除去した。
４ナノメートル（ｎｍ）のクエン酸キャッピングＧＮＰを、以前に報告されたプロトコルを使用して滅菌的に合成した（Kim, H., et al., Integrative genome analysis reveals an oncomir/oncogene cluster regulating glioblastoma survivorship. Proc Natl Acad Sci U S A, 2010. 107(5): p. 2183-8、Li, Y., et al., MicroRNA-34a inhibits glioblastoma growth by targeting multiple oncogenes. Cancer Res, 2009. 69(19): p. 7569-76）。チオール修飾ＡＳ１４１１（ＳＨ－ＡＳ１４１１）は、購入時には保存及び安定性のためのジスルフィド結合を含み、これを、ＳＨ－ＡＳ１４１１、１．０Ｍ ＤＴＴ、０．２５Ｍリン酸バッファー（ＰＢ，phosphate buffer）、及びＮａｎｏｐｕｒｅ超純水の所望の混合物の１時間沸騰させることに続いてさらに１時間冷却することにより結合に先立って切断した。ＳＨ－ＡＳ１４１１を、Ｉｌｌｕｓｔｒａ ＮＡＰ－２５ ＤＮＡグラビティカラム及び溶離液として０．１Ｍ ＰＢを使用したサイズ排除クロマトグラフィーにより単離した。ＳＨ－ＰＥＧアルコールを、製造仕様書に従ってＤＭＳＯ中で希釈した。その後、切断及び精製したＳＨ－ＡＳ１４１１及びＳＨ－ＰＥＧアルコールを、さまざまな比（次の段落を参照）でＧＮＰとコンジュゲートして、二構成成分ＡＳ１４１１／ＰＥＧコーティングを形成した。９６時間の期間にわたる１×濃度までの１０×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）の段階的な添加に続く、水浴における１０分間の最大超音波処理。１３，５００ｇでの２０分間の遠心分離に続く３回の１×ＰＢＳ洗浄及び各洗浄後の再遠心分離により、いかなる非コンジュゲート構成成分も除去した。
【0058】
ＰＥＧ及びＡＳ１４１１の搭載比によって異なる複数のＰＥＧ／ＡＳ１４１１共コンジュゲートＧＮＰ配合物を合成した。ＧＮＰへのＡＳ１４１１の可能な最大搭載は、紫外可視（ＵＶ－ＶＩＳ，ultraviolet visible）スペクトロメトリーによって測定される場合、コロイド溶液内に存在する金の濃度の１２倍（１２×と表される）で一定に保った。この１２×搭載を、ＰＥＧ：ＡＳ１４１１の複数の比に分割し、この文書全体を通して保持される以下の実験条件を得た：ＰＥＧを搭載せず、ＡＳ１４１１最大搭載（０：１又は１２×）、ＰＥＧ最大搭載でＡＳ１４１１を搭載せず（１：０又は０×）、及びＡＳ１４１１：ＰＥＧの３つの異なる搭載比（１：３又は３×、１：１又は６×、及び３：１又は９×）。１２×ＡＳ１４１１の最大未満の配合物に関して、ＰＥＧは、１２×の最大搭載要件を満たすよう組み込んだ。最適な搭載比が求められたら、ＳＨ－ＰＥＧ及びＣＲＯ配列を担持する共コンジュゲートＧＮＰ並びに蛍光共コンジュゲート及び対照ＧＮＰ（それぞれ、ＳＨ－ＡＳ１４１１－Ｃｙ５又はＳＨ－ＣＲＯ－Ｃｙ５、励起／発光 ６５０／６７０）を、上で明記されるのと同様に合成した。
【0059】
ナノ粒子の特徴付け
すべてのナノ粒子タイプに関して、ＺｅｔａＰＡＬＳソフトウェアを実行してNanoBrook Zeta PALS Zeta Potential Analyzer（Brookhaven Instruments社、ホルツビル、ＮＹ）で（ナノメートル単位で測定される）粒子サイズ、（ミリボルト単位で測定される）ゼータ電位、及び多分散指数（単位なし）を測定した。Varian Cary 50 BIO UV（Agilent Technologies社、サンタクララ、ＣＡ）分光計から報告された吸収スペクトルが結合を実証した。１．０Ｍ ＤＴＴを含む１×ＰＢＳの混合物中における処理によるＧＮＰからオリゴの７２時間の切断に続く、切断及び単離されたオリゴのＵＶ－ＶＩＳ測定（溶離液として０．１Ｍリン酸バッファーを用いたＩｌｌｕｓｔｒａ ＮＡＰ－２５ ＤＮＡグラビティカラムによる）により各ＧＮＰ配合物に関するオリゴ搭載を評価した。ベールの法則を使用してＵＶ測定値からオリゴのモルを計算し、コロイド溶液中に存在する金のモルと比較して、１ＧＮＰ当たりの平均ＡＳ１４１１又はＣＲＯを求めた。
すべてのナノ粒子タイプに関して、ＺｅｔａＰＡＬＳソフトウェアを実行してNanoBrook Zeta PALS Zeta Potential Analyzer（Brookhaven Instruments社、ホルツビル、ＮＹ）で（ナノメートル単位で測定される）粒子サイズ、（ミリボルト単位で測定される）ゼータ電位、及び多分散指数（単位なし）を測定した。Varian Cary 50 BIO UV（Agilent Technologies社、サンタクララ、ＣＡ）分光計から報告された吸収スペクトルが結合を実証した。１．０Ｍ ＤＴＴを含む１×ＰＢＳの混合物中における処理によるＧＮＰからオリゴの７２時間の切断に続く、切断及び単離されたオリゴのＵＶ－ＶＩＳ測定（溶離液として０．１Ｍリン酸バッファーを用いたＩｌｌｕｓｔｒａ ＮＡＰ－２５ ＤＮＡグラビティカラムによる）により各ＧＮＰ配合物に関するオリゴ搭載を評価した。ベールの法則を使用してＵＶ測定値からオリゴのモルを計算し、コロイド溶液中に存在する金のモルと比較して、１ＧＮＰ当たりの平均ＡＳ１４１１又はＣＲＯを求めた。
【0060】
細胞培養
Ｕ８７ＭＧを、１０％熱失活ウシ胎仔血清及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ，Dulbecco's Modified Eagle's Medium）において培養した。すべての継代培養は、０．２５％トリプシンを使用して継代し、５０００細胞／ｃｍ２の最小密度で播いた。Ｕ８７ＭＧを、１０００細胞／ウェルに相当する密度で滅菌した透明なポリスチレン９６ウェルプレート又は１０ｍｍのMatTek社ガラス底ディッシュに播いた。ガラス底ディッシュに播いた細胞を、培養に先立って１時間付着させた。プレート又はディッシュに播いたＵ８７ＭＧを、細胞を培養条件に慣らさせるためにＧＮＰ処理に先立って２日間培養した。
Ｕ８７ＭＧを、１０％熱失活ウシ胎仔血清及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ，Dulbecco's Modified Eagle's Medium）において培養した。すべての継代培養は、０．２５％トリプシンを使用して継代し、５０００細胞／ｃｍ２の最小密度で播いた。Ｕ８７ＭＧを、１０００細胞／ウェルに相当する密度で滅菌した透明なポリスチレン９６ウェルプレート又は１０ｍｍのMatTek社ガラス底ディッシュに播いた。ガラス底ディッシュに播いた細胞を、培養に先立って１時間付着させた。プレート又はディッシュに播いたＵ８７ＭＧを、細胞を培養条件に慣らさせるためにＧＮＰ処理に先立って２日間培養した。
【0061】
細胞傷害性及び特異性研究
９６ウェルプレート中の細胞及び対照ウェルを、０～５０００マイクロモル濃度（μＭ）のＡＳ１４１１の範囲でＤＭＥＭと混合したナノ粒子配合物とともに培地を変えずに７２時間インキュベートした。対照細胞を、１０μＭのＡＳ１４１１、最高の金濃度を示す裸のＧＮＰにより処理するか、又は未処理とした。ＸＴＴ吸光度データを、ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏ７．０ソフトウェアを実行してMolecular Devices社SpectraMax M2分光計から得、細胞プレートによるＧＮＰ干渉に関してベースライン補正をした。Ｕ８７ＭＧに対するＧＮＰ配合物の統計学的に有意な細胞傷害性を、二元配置ＡＮＯＶＡ分析により判定した。最適に決定されたＡＳ１４１１を担持する共コンジュゲートＧＮＰの細胞傷害性を、ＣＲＯを担持するものの細胞傷害性と比較することによってＡＳ１４１１の特異性を実証した。Ｗｉｎｄｏｗｓ用ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン７．０．０、GraphPad Software社（サンディエゴ、カリフォルニア；www.graphpad.com）を使用したＩＣ５０（又は５０％の生存を効果的に阻害する濃度）分析は、最適な共コンジュゲートＧＮＰの有効性を確認した。
９６ウェルプレート中の細胞及び対照ウェルを、０～５０００マイクロモル濃度（μＭ）のＡＳ１４１１の範囲でＤＭＥＭと混合したナノ粒子配合物とともに培地を変えずに７２時間インキュベートした。対照細胞を、１０μＭのＡＳ１４１１、最高の金濃度を示す裸のＧＮＰにより処理するか、又は未処理とした。ＸＴＴ吸光度データを、ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏ７．０ソフトウェアを実行してMolecular Devices社SpectraMax M2分光計から得、細胞プレートによるＧＮＰ干渉に関してベースライン補正をした。Ｕ８７ＭＧに対するＧＮＰ配合物の統計学的に有意な細胞傷害性を、二元配置ＡＮＯＶＡ分析により判定した。最適に決定されたＡＳ１４１１を担持する共コンジュゲートＧＮＰの細胞傷害性を、ＣＲＯを担持するものの細胞傷害性と比較することによってＡＳ１４１１の特異性を実証した。Ｗｉｎｄｏｗｓ用ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン７．０．０、GraphPad Software社（サンディエゴ、カリフォルニア；www.graphpad.com）を使用したＩＣ５０（又は５０％の生存を効果的に阻害する濃度）分析は、最適な共コンジュゲートＧＮＰの有効性を確認した。
【0062】
顕微鏡研究
ＮＩＳ Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェアを用いて使用可能なCoolsnap HQ CCDカメラ（Roper社、ダルース、ＧＡ）を備えたNikon社TE200落射蛍光顕微鏡（メルビル、ＮＹ）を使用して、ＸＴＴ処理に先立ってＧＮＰ配合物及び対照で７２時間処理したＵ８７ＭＧに対する１０×明視野画像を、９６ウェルプレートにおいて取得した。共コンジュゲートＣｙ５－ＡＳ１４１１又はＣｙ５－ＣＲＯ ＧＮＰの細胞取り込み及び細胞傷害性を、生細胞チャンバーを備えたNikon社A1Rスペクトル共焦点顕微鏡を使用して検証した。MatTek社ディッシュに播いたＵ８７ＭＧを、細胞傷害性研究から報告された以前に求めたＩＣ５０で処理し、３０分当たり１画像の割合で７２時間、２０×倍で画像化した。画像は、各条件に対して５つの別個のｘｙ位置から取得した。Nikon社Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェアを使用して、その後、画像を、．ａｖｉビデオに変換し、粒子の分布を確認した。代表的な写真を、すべての条件に対して０、２４、４８、及び７２時間に関して選択した。
ＮＩＳ Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェアを用いて使用可能なCoolsnap HQ CCDカメラ（Roper社、ダルース、ＧＡ）を備えたNikon社TE200落射蛍光顕微鏡（メルビル、ＮＹ）を使用して、ＸＴＴ処理に先立ってＧＮＰ配合物及び対照で７２時間処理したＵ８７ＭＧに対する１０×明視野画像を、９６ウェルプレートにおいて取得した。共コンジュゲートＣｙ５－ＡＳ１４１１又はＣｙ５－ＣＲＯ ＧＮＰの細胞取り込み及び細胞傷害性を、生細胞チャンバーを備えたNikon社A1Rスペクトル共焦点顕微鏡を使用して検証した。MatTek社ディッシュに播いたＵ８７ＭＧを、細胞傷害性研究から報告された以前に求めたＩＣ５０で処理し、３０分当たり１画像の割合で７２時間、２０×倍で画像化した。画像は、各条件に対して５つの別個のｘｙ位置から取得した。Nikon社Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェアを使用して、その後、画像を、．ａｖｉビデオに変換し、粒子の分布を確認した。代表的な写真を、すべての条件に対して０、２４、４８、及び７２時間に関して選択した。
【0063】
統計分析
全データを収集し、Microsoft社Ｅｘｃｅｌで処理した。α＝０．０５の有意レベルを使用し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して適切な統計検定を完了した。データは、平均値＋／－標準偏差として示す。報告した統計検定は、ボンフェローニ事後検定を伴う二元配置ＡＮＯＶＡである。サンプル規模は、必要とされる場合、記載される。
全データを収集し、Microsoft社Ｅｘｃｅｌで処理した。α＝０．０５の有意レベルを使用し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して適切な統計検定を完了した。データは、平均値＋／－標準偏差として示す。報告した統計検定は、ボンフェローニ事後検定を伴う二元配置ＡＮＯＶＡである。サンプル規模は、必要とされる場合、記載される。
【0064】
結果
ＧＢＭ適用のためのＰＥＧ・ＡＳ１４１１・ＧＮＰの最適な構成を決定するために、ヒトＧＢＭを代表する細胞株（Ｕ８７ＭＧ）を、ＰＥＧ及びＡＳ１４１１構成成分の搭載比が異なるＧＮＰに曝露した。ＰＥＧ及びＡＳ１４１１の搭載比によって異なる複数のＰＥＧ／ＡＳ１４１１共コンジュゲートＧＮＰ配合物を合成した。ＰＥＧは、汚損防止分子であり、それにより粒子をタンパク質凝集から保護し、ＧＮＰのさらなる修飾を可能にする表面改質剤として、追加の抗ＧＢＭ療法とともに使用される。ＧＮＰへのＡＳ１４１１及びＰＥＧの可能な最大搭載は、ＵＶ－ＶＩＳスペクトロメトリーによって測定される場合、コロイド溶液内に存在する金の濃度の１２倍（１２×と表される）で一定に保たれた。この１２×搭載を、ＰＥＧ：ＡＳ１４１１の複数の比に分割し、この結果を通して保持される以下の実験条件を得た：ＰＥＧを搭載せず、ＡＳ１４１１最大搭載（０：１又は１２×）、ＰＥＧ最大搭載でＡＳ１４１１を搭載せず（１：０又は０×）、及びＡＳ１４１１：ＰＥＧの３つの異なる搭載比（１：３又は３×、１：１又は６×、及び３：１又は９×）。１２×ＡＳ１４１１の最大未満の配合物に関して、ＰＥＧは、最大搭載要件を満たすよう組み込んだ。ＧＮＰの概略図（図１）は、提案される構造の特徴を示す。その後、細胞傷害性及び明視野画像化を完了し、ＧＢＭ適用のための最良の粒子設計を決定するために粒子合成物の特徴と併せて利用した。最適化した粒子上でのＡＳ１４１１の特異性の保持を検証するために、ＡＳ１４１１又は対照オリゴヌクレオチド配列であるＣＲＯのいずれかを担持する最適なＧＮＰ配合物を用いて細胞傷害性研究を完了した。その後、生細胞画像化研究を完了して、最適に設計されたＰＥＧ・ＡＳ１４１１・ＧＮＰの全体的な取り込み及び分布を検証した。
ＧＢＭ適用のためのＰＥＧ・ＡＳ１４１１・ＧＮＰの最適な構成を決定するために、ヒトＧＢＭを代表する細胞株（Ｕ８７ＭＧ）を、ＰＥＧ及びＡＳ１４１１構成成分の搭載比が異なるＧＮＰに曝露した。ＰＥＧ及びＡＳ１４１１の搭載比によって異なる複数のＰＥＧ／ＡＳ１４１１共コンジュゲートＧＮＰ配合物を合成した。ＰＥＧは、汚損防止分子であり、それにより粒子をタンパク質凝集から保護し、ＧＮＰのさらなる修飾を可能にする表面改質剤として、追加の抗ＧＢＭ療法とともに使用される。ＧＮＰへのＡＳ１４１１及びＰＥＧの可能な最大搭載は、ＵＶ－ＶＩＳスペクトロメトリーによって測定される場合、コロイド溶液内に存在する金の濃度の１２倍（１２×と表される）で一定に保たれた。この１２×搭載を、ＰＥＧ：ＡＳ１４１１の複数の比に分割し、この結果を通して保持される以下の実験条件を得た：ＰＥＧを搭載せず、ＡＳ１４１１最大搭載（０：１又は１２×）、ＰＥＧ最大搭載でＡＳ１４１１を搭載せず（１：０又は０×）、及びＡＳ１４１１：ＰＥＧの３つの異なる搭載比（１：３又は３×、１：１又は６×、及び３：１又は９×）。１２×ＡＳ１４１１の最大未満の配合物に関して、ＰＥＧは、最大搭載要件を満たすよう組み込んだ。ＧＮＰの概略図（図１）は、提案される構造の特徴を示す。その後、細胞傷害性及び明視野画像化を完了し、ＧＢＭ適用のための最良の粒子設計を決定するために粒子合成物の特徴と併せて利用した。最適化した粒子上でのＡＳ１４１１の特異性の保持を検証するために、ＡＳ１４１１又は対照オリゴヌクレオチド配列であるＣＲＯのいずれかを担持する最適なＧＮＰ配合物を用いて細胞傷害性研究を完了した。その後、生細胞画像化研究を完了して、最適に設計されたＰＥＧ・ＡＳ１４１１・ＧＮＰの全体的な取り込み及び分布を検証した。
【0065】
【0066】
【0067】
ＤＴＴは、コンジュゲートしたＡＳ１４１１を分離させる。分離前後のＵＶ－ＶＩＳスペクトル分析を、それぞれ図２Ｅ及び図２Ｆに示す。ＵＶ－ＶＩＳスペクトルは、金の表面プラズモン共鳴（約５２０ｎｍ）及び搭載を実証するＤＮＡ（約２６０ｎｍ）を示す。
【0068】
Ｕ８７ＭＧ細胞の代謝活性に対する共コンジュゲート（ＡＳ１４１１及びＰＥＧ）ＡｕＮＰの効果を図３に示す。共コンジュゲートＡｕＮＰの同じ細胞に対するＥＣ５０分析を図４に示す。粒子処理Ｕ８７ＭＧ細胞の１０×明視野画像を図５に示す。ＸＴＴ吸光度が低いほど、代謝活性が低く、細胞死滅効果が大きい。
【0069】
【0070】
この結果は、ナノ粒子がコンジュゲートした抗ヌクレオリン剤と比較して、ナノ粒子がコンジュゲートした抗ヌクレオリン剤・ＰＥＧの驚くべき予想外の改善を示す。特にＡＳ１４１１の２５００ｎｍ及び５０００ｎｍ濃度において、ナノ粒子がコンジュゲートした抗ヌクレオリン剤・ＰＥＧのすべての形態は、図３に示されるとおり、細胞を死滅させることにおいてナノ粒子抗ヌクレオリン剤結合と比較してほぼ２倍効果的であった。これは、驚くべき予想外のことであり、それは、ＰＥＧ化の利点は、ここで示されるような、インビトロではなくインビボにおいてのみ予想されたためである。さらに、生細胞共焦点研究は、ナノ粒子がコンジュゲートした抗ヌクレオリン剤・ＰＥＧの選択性を立証した。同様の結果が他のタイプのがんにおいても見込めるであろう。
（参考文献）
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【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【国際調査報告】