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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-11-11
(54)【発明の名称】ビーズを用いたアルファ－シヌクレイン検出
(51)【国際特許分類】
G01N 33/68 20060101AFI20221104BHJP
C07K 14/47 20060101ALN20221104BHJP
【ＦＩ】
G01N33/68 ZNA
C07K14/47
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022514163
(86)(22)【出願日】2020-09-03
(85)【翻訳文提出日】2022-04-26
(86)【国際出願番号】 US2020049130
(87)【国際公開番号】W WO2021046174
(87)【国際公開日】2021-03-11
(31)【優先権主張番号】62/895,535
(32)【優先日】2019-09-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/073,424
(32)【優先日】2020-09-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/042,679
(32)【優先日】2020-06-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/073,420
(32)【優先日】2020-09-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/045,593
(32)【優先日】2020-06-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/040,144
(32)【優先日】2020-06-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】519404919
【氏名又は名称】アンプリオン、インコーポレイテッド
(71)【出願人】
【識別番号】522080661
【氏名又は名称】コンチャ、ルイス
(71)【出願人】
【識別番号】522080672
【氏名又は名称】ファリス、カーリー
(71)【出願人】
【識別番号】522080683
【氏名又は名称】オルギン、ブレット
(71)【出願人】
【識別番号】522080694
【氏名又は名称】レボヴィッツ、ラッセル
(71)【出願人】
【識別番号】522080708
【氏名又は名称】ヴォルラース、ベネディクト
(71)【出願人】
【識別番号】522080719
【氏名又は名称】エスピン、フランク、ジー．
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】コンチャ、ルイス
(72)【発明者】
【氏名】ファリス、カーリー
(72)【発明者】
【氏名】オルギン、ブレット
(72)【発明者】
【氏名】レボヴィッツ、ラッセル
(72)【発明者】
【氏名】ヴォルラース、ベネディクト
(72)【発明者】
【氏名】エスピン、フランク、ジー．
【テーマコード（参考）】
2G045
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G045AA25
2G045BA11
2G045CB30
2G045FB12
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA50
4H045CA40
4H045EA50
(57)【要約】
生物学的試料中の可溶性ミスフォールドα－シヌクレインタンパク質の存在を決定する方法が提供される。方法は、生物学的試料をプレインキュベーション混合物と接触させて、インキュベーション混合物を形成することを含み、プレインキュベーション混合物は、モノマーα－シヌクレインタンパク質；緩衝組成物；塩；および指示薬を含む。インキュベーションサイクルは、約１ｍｍ～約５ｍｍの直径を有する窒化ケイ素ビーズまたはホウケイ酸ガラスビーズのいずれかの存在下でインキュベーション混合物に対して行う。方法は、検出可能な量のミスフォールドα－シヌクレイン凝集体が生物学的試料中に存在するかどうかを決定することをさらに含む。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
生物学的試料中の可溶性ミスフォールドα－シヌクレイン（α－ｓｙｎ）タンパク質の存在を決定する方法であって（Ａ）前記生物学的試料を、プレインキュベーション混合物であって、
（１）モノマーα－ｓｙｎタンパク質；
（２）緩衝組成物；
（３）塩；および
（４）指示薬
を含むプレインキュベーション混合物と接触させて、インキュベーション混合物を形成すること；
（Ｂ）前記インキュベーション混合物に、インキュベーションサイクルを実施すること、ここで前記インキュベーションサイクルは、
各インキュベーションサイクルが、
（ｉ）前記可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の存在下で、前記モノマーα－ｓｙｎタンパク質の少なくとも一部のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こすのに有効な前記インキュベーション混合物をインキュベートすること；および
（ｉｉ）前記インキュベーション混合物を物理的に粉砕すること
を含み、
（１）前記モノマーα－ｓｙｎタンパク質からミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の増幅部分を形成するのに有効な前記インキュベーション混合物に対して２回以上、
（２）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のコーティングを含むＳｉ３Ｎ４ビーズの存在下で実施される；および
（Ｃ）検出可能な量のミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体が前記生物学的試料中に存在するかどうかを決定することを含み、ミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体の検出が、前記生物学的試料中の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の存在を示す、方法。
【請求項2】
前記Ｓｉ３Ｎ４ビーズが、約１ｍｍ～約５ｍｍの直径を有する、請求項１記載の方法。
【請求項3】
前記Ｓｉ３Ｎ４ビーズが、約２．３８ｍｍの直径を有する、請求項１記載の方法。
【請求項4】
前記生物学的試料がヒト脳脊髄液（ＣＳＦ）を含む、請求項１記載の方法。
【請求項5】
前記モノマーα－ｓｙｎタンパク質が、約１０μＭ～約３０μＭの濃度で存在する、請求項１記載の方法。
【請求項6】
前記モノマーα－ｓｙｎタンパク質が配列番号２を含む、請求項１記載の方法。
【請求項7】
前記モノマーα－ｓｙｎタンパク質が、約１９．６μＭの濃度で存在する、請求項６記載の方法。
【請求項8】
前記緩衝組成物が、約６．２～約６．５のｐＨを有する、請求項１記載の方法。
【請求項9】
前記緩衝組成物がＰＩＰＥＳを含む、請求項１記載の方法。
【請求項10】
前記塩がＮａＣｌを含む、請求項１記載の方法。
【請求項11】
前記塩がＮａＣｌを約５００ｍＭ～約７００ｍＭの濃度で含む、請求項１記載の方法。
【請求項12】
前記指示薬がチオフラビンＴ（ＴｈＴ）を含む、請求項１記載の方法。
【請求項13】
前記検出が、ＴｈＴ蛍光を測定することを含む、請求項１２記載の方法。
【請求項14】
前記物理的粉砕が振盪を含む、請求項１記載の方法。
【請求項15】
ヒトＣＳＦ中の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の存在を決定する方法であって（Ａ）前記ヒトＣＳＦを、プレインキュベーション混合物であって、
（１）約１０μＭ～約３０μＭの濃度のモノマーα－ｓｙｎタンパク質；
（２）約６．２～約６．５のｐＨを有する緩衝組成物；
（３）約５００ｍＭ～約７００ｍＭの濃度のＮａＣｌ；および
（４）ＴｈＴ
を含むプレインキュベーション混合物と接触させて、インキュベーション混合物を形成すること；
（Ｂ）前記インキュベーション混合物に、インキュベーションサイクルを実施すること、ここで前記インキュベーションサイクルは、
各インキュベーションサイクルが、
（ｉ）前記可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の存在下で、前記モノマーα－ｓｙｎタンパク質の少なくとも一部のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こすのに有効なインキュベーション混合物をインキュベートすること、および
（ｉｉ）前記インキュベーション混合物を振盪すること
を含み、
（１）前記モノマーα－ｓｙｎタンパク質からミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の増幅部分を形成するのに有効な前記インキュベーション混合物に対して２回以上、
（２）ＢＶＡのコーティングを含み、２．３ｍｍ超の直径を有するＳｉ３Ｎ４ビーズの存在下で実施される；および
（Ｃ）検出可能な量のミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体が前記生物学的試料中に存在するかどうかを決定することを含み、ミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体の検出が、前記生物学的試料中の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の存在を示し、前記検出が、ＴｈＴ蛍光を測定することを含む、方法。
【請求項16】
前記モノマーα－ｓｙｎタンパク質が配列番号２を含む、請求項１５記載の方法。
【請求項17】
前記モノマーα－ｓｙｎタンパク質が、約１９．６μＭの濃度で存在する、請求項１６記載の方法。
【請求項18】
生物学的試料中の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の存在を決定する方法であって（Ａ）前記生物学的試料を、プレインキュベーション混合物であって、
（１）配列番号２を含むモノマーα－ｓｙｎタンパク質；
（２）緩衝組成物；
（３）塩；および
（４）指示薬
を含むプレインキュベーション混合物と接触させて、インキュベーション混合物を形成すること；
（Ｂ）前記インキュベーション混合物に、インキュベーションサイクルを実施すること、ここで前記インキュベーションサイクルは、
各インキュベーションサイクルが、
（ｉ）前記可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の存在下で、前記モノマーα－ｓｙｎタンパク質の少なくとも一部のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こすのに有効な前記インキュベーション混合物をインキュベートすること、および
（ｉｉ）前記インキュベーション混合物を物理的に粉砕すること
を含み、
（１）前記モノマーα－ｓｙｎタンパク質からミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の増幅部分を形成するのに有効な前記インキュベーション混合物に対して２回以上、
（２）２．３ｍｍ超の直径を有するホウケイ酸ガラスビーズの存在下で実施される；および
（Ｃ）検出可能な量のミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体が前記生物学的試料中に存在するかどうかを決定することを含み、ミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体の検出が、前記生物学的試料中の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の存在を示す、方法。
【請求項19】
前記生物学的試料がヒトＣＳＦである、請求項１８記載の方法。
【請求項20】
（ｉ）前記モノマーα－Ｓタンパク質が、約１０μＭ～約３０μＭの濃度で存在し；（ｉｉ）前記緩衝組成物がＰＩＰＥＳを含み、かつ約６．２～約６．５のｐＨを有し；
（ｉｉｉ）前記塩が、約５００ｍＭ～約７００ｍＭの濃度でＮａＣｌを含み；
（ｉｖ）前記ホウケイ酸ガラスビーズが、２．４５ｍｍの直径を有し；
（ｖ）前記指示薬が、約５μＭ～約１０μＭの濃度のＴｈＴを含み；かつ
（ｖｉ）前記検出が、ＴｈＴ蛍光を測定することを含む、
請求項１８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年９月４日に提出された米国仮特許出願第６２／８９５，５３５号；２０２０年６月１７日に提出された米国仮特許出願第６３／０４０，１４４号；２０２０年６月２３日に提出された米国仮特許出願第６３／０４２，６７９号；２０２０年６月２９日に提出された米国仮特許出願第６３／０４５，５９３号；２０２０年９月１日に提出された米国仮特許出願第６３／０７３，４２０号；および２０２０年９月１日に提出された米国仮特許出願第６３／０７３，４２４号の優先権を主張し、これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年９月４日に提出された米国仮特許出願第６２／８９５，５３５号；２０２０年６月１７日に提出された米国仮特許出願第６３／０４０，１４４号；２０２０年６月２３日に提出された米国仮特許出願第６３／０４２，６７９号；２０２０年６月２９日に提出された米国仮特許出願第６３／０４５，５９３号；２０２０年９月１日に提出された米国仮特許出願第６３／０７３，４２０号；および２０２０年９月１日に提出された米国仮特許出願第６３／０７３，４２４号の優先権を主張し、これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
配列表
配列表はＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＡＳＣＩＩコピーは、２０２０年９月２日に作成され、Ａｍｐｒｉｏｎ－ＡＳ－ＦＡ－ＵＳ－１＿ＳＴ２５．ｔｘｔと名付けられ、サイズは２６，４６８バイトである。
配列表はＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＡＳＣＩＩコピーは、２０２０年９月２日に作成され、Ａｍｐｒｉｏｎ－ＡＳ－ＦＡ－ＵＳ－１＿ＳＴ２５．ｔｘｔと名付けられ、サイズは２６，４６８バイトである。
【背景技術】
【0003】
脳組織におけるα－シヌクレイン（α－ｓｙｎまたはα－Ｓ）凝集体の蓄積および沈着は、シヌクレイノパチーと呼ばれる種々の神経変性障害の病因における主要な事象である。シヌクレイノパチーには、パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体型認知症（ＬＢＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、および純粋自律神経不全症（ＰＡＦ）が含まれる。現在、これらの障害の診断は、主に臨床症状の認知に依存しており、残念ながら、典型的には神経変性が既に進行段階にある場合にのみ診断を提供する。
【0004】
様々なタンパク質ミスフォールディングサイクル増幅（ＰＭＣＡ）アッセイは、インビトロでのミスフォールディングおよび凝集プロセスの人工的加速および増幅を通してミスフォールディング凝集体を検出するための超高感度方法を提供する。ＰＭＣＡの基本概念は以前に開示されている（Ｓｏｔｏら、国際公開第２００２／０４９５４号；Ｅｓｔｒａｄａら、米国特許公開第２００８０１１８９３８号）。ＰＭＣＡアッセイは、非常に高い感度および特異性でミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質を検出するために首尾よく使用されている。全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２０１６／００７７１１１号を参照されたい。
【0005】
ＰＭＣＡアッセイは、以前の診断方法に対する重要な進歩である。しかしながら、増幅を促進するが、タンパク質モノマーの望ましくない自己凝集を回避するアッセイ条件、ならびにそのようなアッセイの使用を容易にする装置が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0006】
一態様では、生物学的試料中の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎの存在を決定する方法が提供される。方法は、生物学的試料をモノマーα－ｓｙｎタンパク質および約１．０ｍｍ～約５．０ｍｍの平均直径を有する１つ以上のビーズと接触させて、インキュベーション混合物を形成すること；インキュベーション混合物をインキュベートして、モノマーα－ｓｙｎタンパク質および生物学的試料の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎからミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体を形成すること；ミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体の少なくとも一部を脱凝集させること；インキュベートおよび脱凝集の工程を試料の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎを増幅するのに十分な回数繰り返して、検出可能な量のミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体を得ること；および検出可能な量のミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体が生物学的試料中に存在するかどうかを決定することを含み、ここでミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体の検出は、生体試料中の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎの存在を示す。
【0007】
いくつかの態様では、検出可能な量のミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体が生物学的試料中に存在するかどうかを決定する工程は、インキュベート混合物をタンパク質凝集指示薬と接触させることを含む。適切なタンパク質凝集指示薬の例は、チオフラビンＴ（ＴｈＴ）である。さらなる態様では、方法は、対象から生物学的試料を得る工程を含む。なおさらなる態様では、生物学的試料は脳脊髄液（ＣＳＦ）試料である。追加の態様では、方法は、生物学的試料中の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の量を決定することを含む。
【0008】
インキュベート混合物は、ミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体の形成を加速するための１つ以上のビーズを含む。いくつかの態様では、ビーズは窒化ケイ素（Ｓｉ３Ｎｉ４）を含む。いくつかの態様では、ビーズはホウケイ酸ガラスを含む。いくつかの態様では、ビーズは、約１ｍｍ～約３．５ｍｍの範囲の平均直径を有する。いくつかの態様では、ビーズは、２．３ｍｍ超～約３．５ｍｍの範囲の平均直径を有する。いくつかの態様では、ビーズがＳｉ３Ｎｉ４を含む場合などは、ビーズは約２．３８ｍｍ（３／３２インチ）の平均直径を有する。いくつかの態様では、ビーズがホウケイ酸ガラスを含む場合などは、ビーズは約２．４５ｍｍの平均直径を有する。いくつかの態様では、２．３ｍｍ以下の平均直径を有するビーズは特に除外される。いくつかの態様では、２．３ｍｍ以下の平均直径を有するガラスビーズは特に除外される。いくつかの態様では、インキュベート混合物は、複数のウェルを含むマルチウェルプレートに収容される。さらなる態様では、マルチウェルプレートの各ウェルは単一のビーズを含む。さらなる態様では、ビーズがＳｉ３Ｎｉ４を含む場合などは、ビーズの一部または全部の表面がタンパク質でブロッキングされる。
【0009】
ビーズを使用すると、インキュベーション条件が最適化されて、プロセスを加速しながらモノマーα－ｓｙｎタンパク質の自己凝集の量を減少させることができる。いくつかの態様では、インキュベーション混合物のモノマーα－ｓｙｎタンパク質は、約１０μＭ～約３０μＭの濃度範囲を有する。さらなる態様では、インキュベーション混合物は、Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳおよびＨＥＰＥＳの１つ以上を含み、約６～約８、例えば約６．２～約６．５のｐＨを有する。さらなる態様では、インキュベーション混合物のインキュベートは、約３５℃～約４２℃の温度で行われる。なお、さらなる態様では、インキュベーション混合物をインキュベートすること、およびミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体の少なくとも一部を脱凝集させることは、０．３～１時間続くインキュベーションサイクルを含む。さらなる態様では、脱凝集は、振盪（周期的攪拌を含む）、攪拌、または超音波処理によって行われる。いくつかの態様では、方法はまた、可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎに特異的に結合する抗体を使用して試料をインキュベートする前に、試料中の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎを濃縮する工程を含む。
【0010】
別の態様は、対象におけるα－ｓｙｎ凝集に関連する疾患を診断する方法を提供する。方法は、生物学的試料をモノマーα－ｓｙｎタンパク質および約１ｍｍ～約５ｍｍ、２．３ｍｍ超～約５ｍｍ、３ｍｍ超～約５ｍｍ、約２．３８ｍｍ、または約２．４５ｍｍの平均直径を有する１つ以上のビーズと接触させて、インキュベーション混合物を形成すること；インキュベーション混合物をインキュベートして、モノマーα－ｓｙｎタンパク質および生物学的試料の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎからミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体を形成すること；ミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体の少なくとも一部を脱凝集させること；インキュベートおよび脱凝集の工程を生物学的試料の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎを増幅するのに十分な回数繰り返して、検出可能な量のミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体を得ること；および検出可能な量のミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体が生物学的試料中に存在するかどうかを決定することを含み、ここでミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体の検出は、生物学的対象がα－ｓｙｎ凝集に関連する疾患を有することを示す。
【0011】
いくつかの態様では、α－ｓｙｎ凝集に関連する疾患はＰＤである。他の態様では、α－ｓｙｎ凝集に関連する疾患は、ＬＢＤ、ＭＳＡ、またはＰＡＦである。さらなる態様では、方法はまた、α－ｓｙｎ凝集に関連する疾患を有すると診断された対象をα－ｓｙｎ調節療法で治療することを含む。
【0012】
別の態様では、生物学的試料中の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎの存在を決定するためのキットが提供される。キットは、既知量のモノマーα－ｓｙｎタンパク質；既知量のタンパク質凝集指示薬；インキュベーション混合物をインキュベートするための容器；緩衝組成物；約１ｍｍ～約５ｍｍ、２．３ｍｍ超～約５ｍｍ、３ｍｍ超～約５ｍｍ、約２．３８ｍｍ、または約２．４５ｍｍの直径を有する１つ以上のビーズ；本明細書に記載の生物学的試料中の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎの存在を検出する方法の実施を使用者に指導する説明書；およびキットの構成要素を保持するための包装を含む。いくつかの態様では、キットに含まれる容器は、複数のウェルを含むマルチウェルプレートを含む。
【0013】
説明書は、容器内で生物学的試料を既知量のモノマーα－ｓｙｎタンパク質および１つ以上のビーズと接触させて、インキュベーション混合物を形成すること；インキュベーション混合物をインキュベートして、モノマーα－ｓｙｎタンパク質および生物学的試料の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎからミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体を形成すること；ミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体の少なくとも一部を脱凝集させること；インキュベートおよび脱凝集の工程を生物学的試料の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎを増幅するのに十分な回数繰り返して、検出可能な量のミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体を得ること；およびインキュベーション混合物を既知量のタンパク質凝集指示薬と接触させて、検出可能な量のミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体が生物学的試料中に存在するかどうかを決定することを使用者に指示し、ここでミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体の検出は、生物学的試料中の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎの存在を示す。
【0014】
別の態様では、生化学的アッセイ、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびＰＭＣＡのための装置が提供される。装置は、ビーズと共に使用するように構成され、トレイを含む。トレイの水平な上面は、ビーズを受け入れる大きさの開口を有する。開口は、垂直にトレイを貫いて伸びる。上面は、ビーズが上面の開口間にわたって回転移動し、上面から開口内へと入るのを妨害されない。
【0015】
装置はゲートをさらに含む。開口は、垂直にゲートを貫いて伸びる。ゲートの遮断部は、開口の間に位置する。ゲートは、第１の位置と第２の位置との間で水平方向に移動するように支持される。第１の位置では、ゲートの遮断部は、トレイの開口の下に垂直に合わせられている。第２の位置では、ゲートの開口は、トレイの開口の下に垂直に合わせられている。これにより、ゲートを第１の位置から第２の位置に移動させることによって、ビーズをトレイからゲートの開口を通して、さらにＥＬＩＳＡプレートのウェルなどのビーズレセプタクルへと落下させることが可能になる。
【0016】
トレイの各開口は、ゲートが第１の位置にある場合にビーズの１つのみを包含するように、サイズ設定することができる。さらに、トレイは、上面を囲む垂直壁を有してもよい。垂直壁は、ビーズが上面から垂直壁を通って転がり落ちることができる大きさの出口通路を有することができる。これにより、所望の数のビーズがトレイの開口に転がり入ったら、過剰なビーズをトレイから除去することが可能になる。過剰なビーズを除去することにより、使用者は、開口の各々が１つのビーズを含むことを目視検査によって確認することができる。
【0017】
トレイは、ゲートがトレイを通して見えるように透明材料で形成されてもよい。ビーズとゲートとの間の色のコントラストは、各ウェルに単一のビーズが提供されていることを使用者が視覚的に確認するのに役立ち得る。例えば、透明パネルを通して見える白色ゲートは、より暗い色相のビーズ（例えば、Ｓｉ３Ｎ４ビーズなど）をより明確に表示するのに役立つ。
【0018】
特許請求される発明は、以下の図を参照することによってより容易に理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】可溶性ミスフォールドα－Ｓタンパク質を検出するための、本明細書に開示および特許請求されるα－Ｓ ＰＭＣＡ技術の概略図である。
【0020】
【図2A】ＰＭＣＡ（３７℃、７００ｒｐｍ、オン１分、オフ２９分）を実施した場合の自己凝集に対する様々なＳｉ３Ｎ４ビーズサイズの例示的な効果を示し、人工ＣＳＦ（ａＣＳＦ）中１ｍｇ／ｍＬのα－ｓｙｎ、ビーズなしの場合の蛍光を示す。組換えＡｂｃａｍ α－ｓｙｎ種子を使用して、ＰＤ－ＣＳＦ中に存在するα－ｓｙｎ種子を模倣し、種子凝集を評価した。
【図2B】ＰＭＣＡ（３７℃、７００ｒｐｍ、オン１分、オフ２９分）を実施した場合の自己凝集に対する様々なＳｉ３Ｎ４ビーズサイズの例示的な効果を示し、ａＣＳＦ中１ｍｇ／ｍＬのα－Ｓおよび２ｍｍビーズを使用した場合の蛍光を示す。組換えＡｂｃａｍ α－ｓｙｎ種子を使用して、ＰＤ－ＣＳＦ中に存在するα－ｓｙｎ種子を模倣し、種子凝集を評価した。
【図2C】ＰＭＣＡ（３７℃、７００ｒｐｍ、オン１分、オフ２９分）を実施した場合の自己凝集に対する様々なＳｉ３Ｎ４ビーズサイズの例示的な効果を示し、ａＣＳＦ中１ｍｇ／ｍＬのα－Ｓおよび１．５ｍｍビーズを使用した場合の蛍光を示す。組換えＡｂｃａｍ α－ｓｙｎ種子を使用して、ＰＤ－ＣＳＦ中に存在するα－ｓｙｎ種子を模倣し、種子凝集を評価した。
【図2D】ＰＭＣＡ（３７℃、７００ｒｐｍ、オン１分、オフ２９分）を実施した場合の自己凝集に対する様々なＳｉ３Ｎ４ビーズサイズの例示的な効果を示し、ａＣＳＦ中１ｍｇ／ｍＬのα－Ｓおよび０．８ｍｍビーズを使用した場合の蛍光を示す。組換えＡｂｃａｍ α－ｓｙｎ種子を使用して、ＰＤ－ＣＳＦ中に存在するα－ｓｙｎ種子を模倣し、種子凝集を評価した。
【図2E】ＰＭＣＡ（３７℃、７００ｒｐｍ、オン１分、オフ２９分）を実施した場合の自己凝集に対する様々なＳｉ３Ｎ４ビーズサイズの例示的な効果を示し、ａＣＳＦ中１ｍｇ／ｍＬのα－Ｓおよび０．４ｍｍビーズを使用した場合の蛍光を示す。組換えＡｂｃａｍ α－ｓｙｎ種子を使用して、ＰＤ－ＣＳＦ中に存在するα－ｓｙｎ種子を模倣し、種子凝集を評価した。
【0021】
【図3A】４０ｕＬのａＣＳＦ中で１．５ｍｍビーズを使用した場合の、基質の濃度を低下させることによる自己凝集に対する例示的な効果を示す。ＰＭＣＡは、Ｓｉ３Ｎ４ビーズを、通常はウェルあたり１つのビーズで使用して、組換えＡｂｃａｍ α－ｓｙｎ種子を使用して、３７℃、７００ｒｐｍ、１分間オンおよび２９分間オフで実施した。４０ｕＬのａＣＳＦ中でビーズを用いずに１ｍｇ／ｍＬのα－Ｓを使用した場合の蛍光を示す。
【図3B】４０ｕＬのａＣＳＦ中で１．５ｍｍビーズを使用した場合の、基質の濃度を低下させることによる自己凝集に対する例示的な効果を示す。ＰＭＣＡは、Ｓｉ３Ｎ４ビーズを、通常はウェルあたり１つのビーズで使用して、組換えＡｂｃａｍ α－ｓｙｎ種子を使用して、３７℃、７００ｒｐｍ、１分間オンおよび２９分間オフで実施した。４０ｕＬのａＣＳＦ中で１ｍｇ／ｍＬのα－Ｓを１．５ｍｍビーズと共に使用した場合の蛍光を示す。
【図3C】４０ｕＬのａＣＳＦ中で１．５ｍｍビーズを使用した場合の、基質の濃度を低下させることによる自己凝集に対する例示的な効果を示す。ＰＭＣＡは、Ｓｉ３Ｎ４ビーズを、通常はウェルあたり１つのビーズで使用して、組換えＡｂｃａｍ α－ｓｙｎ種子を使用して、３７℃、７００ｒｐｍ、１分間オンおよび２９分間オフで実施した。４０ｕＬのａＣＳＦ中で０．５ｍｇ／ｍＬのα－Ｓを１．５ｍｍビーズと共に使用した場合の蛍光を示す。
【図3D】４０ｕＬのａＣＳＦ中で１．５ｍｍビーズを使用した場合の、基質の濃度を低下させることによる自己凝集に対する例示的な効果を示す。ＰＭＣＡは、Ｓｉ３Ｎ４ビーズを、通常はウェルあたり１つのビーズで使用して、組換えＡｂｃａｍ α－ｓｙｎ種子を使用して、３７℃、７００ｒｐｍ、１分間オンおよび２９分間オフで実施した。ａＣＳＦ中で０．１ｍｇ／ｍＬのα－Ｓを１．５ｍｍビーズと共に使用した場合の蛍光を示す。
【0022】
【図4A】温度を４２℃まで上げるＰＭＣＡアッセイに対する例示的な効果を示す。ＰＭＣＡは、Ｓｉ３Ｎ４ビーズおよび組換えＡｂｃａｍ α－ｓｙｎ種子を使用して、４２℃、７００ｒｐｍ、１分間オンおよび２９分間オフで実施した。ビーズを用いずに４０μＬのａＣＳＦ中で１ｍｇ／ｍＬの基質を使用した場合の蛍光を示す。
【図4B】温度を４２℃まで上げるＰＭＣＡアッセイに対する例示的な効果を示す。ＰＭＣＡは、Ｓｉ３Ｎ４ビーズおよび組換えＡｂｃａｍ α－ｓｙｎ種子を使用して、４２℃、７００ｒｐｍ、１分間オンおよび２９分間オフで実施した。０．８ｍｍビーズを用いて４０μＬのａＣＳＦ中で１ｍｇ／ｍＬの基質を使用した場合の蛍光を示す。
【図4C】温度を４２℃まで上げるＰＭＣＡアッセイに対する例示的な効果を示す。ＰＭＣＡは、Ｓｉ３Ｎ４ビーズおよび組換えＡｂｃａｍ α－ｓｙｎ種子を使用して、４２℃、７００ｒｐｍ、１分間オンおよび２９分間オフで実施した。１．５ｍｍビーズを用いて４０μＬのａＣＳＦ中で０．１ｍｇ／ｍＬの基質を使用した場合の蛍光を示す。
【0023】
【図5A】２．３８ｍｍのサイズを有するビーズがＰＭＣＡにおいて播種凝集を加速し、凝集勾配を増加させることを示す。ＰＭＣＡは、Ｓｉ３Ｎ４ビーズを通常はウェルあたり１つのビーズで使用して、３７℃、７００ｒｐｍ、１分間オンおよび２９分間オフで組換えＡｂｃａｍ α－ｓｙｎ種子を使用し、ａＣＳＦではなくヒトＣＳＦを使用して実施した。ビーズを用いずに４０μＬのヒトＣＳＦ中１ｍｇ／ｍＬの基質を使用した場合の蛍光を示す。
【図5B】２．３８ｍｍのサイズを有するビーズがＰＭＣＡにおいて播種凝集を加速し、凝集勾配を増加させることを示す。ＰＭＣＡは、Ｓｉ３Ｎ４ビーズを通常はウェルあたり１つのビーズで使用して、３７℃、７００ｒｐｍ、１分間オンおよび２９分間オフで組換えＡｂｃａｍ α－ｓｙｎ種子を使用し、ａＣＳＦではなくヒトＣＳＦを使用して実施した。０．８ｍｍビーズを用いて４０μＬのヒトＣＳＦ中１ｍｇ／ｍＬの基質を使用した場合の蛍光を示す。
【図5C】２．３８ｍｍのサイズを有するビーズがＰＭＣＡにおいて播種凝集を加速し、凝集勾配を増加させることを示す。ＰＭＣＡは、Ｓｉ３Ｎ４ビーズを通常はウェルあたり１つのビーズで使用して、３７℃、７００ｒｐｍ、１分間オンおよび２９分間オフで組換えＡｂｃａｍ α－ｓｙｎ種子を使用し、ａＣＳＦではなくヒトＣＳＦを使用して実施した。２．３８ｍｍビーズを用いて４０μＬのヒトＣＳＦ中１ｍｇ／ｍＬの基質を使用した場合の蛍光を示す。
【図5D】２．３８ｍｍのサイズを有するビーズがＰＭＣＡにおいて播種凝集を加速し、凝集勾配を増加させることを示す。ＰＭＣＡは、Ｓｉ３Ｎ４ビーズを通常はウェルあたり１つのビーズで使用して、３７℃、７００ｒｐｍ、１分間オンおよび２９分間オフで組換えＡｂｃａｍ α－ｓｙｎ種子を使用し、ａＣＳＦではなくヒトＣＳＦを使用して実施した。０．８ｍｍビーズを用いて４０μＬのヒトＣＳＦ中０．１ｍｇ／ｍＬの基質を使用した場合の蛍光を示す。
【図5E】２．３８ｍｍのサイズを有するビーズがＰＭＣＡにおいて播種凝集を加速し、凝集勾配を増加させることを示す。ＰＭＣＡは、Ｓｉ３Ｎ４ビーズを通常はウェルあたり１つのビーズで使用して、３７℃、７００ｒｐｍ、１分間オンおよび２９分間オフで組換えＡｂｃａｍ α－ｓｙｎ種子を使用し、ａＣＳＦではなくヒトＣＳＦを使用して実施した。１．５ｍｍビーズを用いて４０μＬのヒトＣＳＦ中０．１ｍｇ／ｍＬの基質を使用した場合の蛍光を示す。
【図5F】２．３８ｍｍのサイズを有するビーズがＰＭＣＡにおいて播種凝集を加速し、凝集勾配を増加させることを示す。ＰＭＣＡは、Ｓｉ３Ｎ４ビーズを通常はウェルあたり１つのビーズで使用して、３７℃、７００ｒｐｍ、１分間オンおよび２９分間オフで組換えＡｂｃａｍ α－ｓｙｎ種子を使用し、ａＣＳＦではなくヒトＣＳＦを使用して実施した。２．３８ｍｍビーズを用いて４０μＬのヒトＣＳＦ中０．１ｍｇ／ｍＬの基質を使用した場合の蛍光を示す。
【0024】
【図6A】２つの異なる濃度の基質（０．１および０．３ｍｇ／ｍｌ）を使用して、より高い温度、より大きなビーズ、およびより高い振盪を組み合わせた場合の経時的な自己凝集の減少を示す。ＰＭＣＡは、Ｓｉ３Ｎ４ビーズを、ウェルあたり１つのビーズで使用して、組換えＡｂｃａｍ α－ｓｙｎ種子を使用して、４２℃、８００ｒｐｍ、１分間オンおよび２９分間オフでａＣＳＦを使用して実施した。２．３８ｍｍビーズを用いて０．１ｍｇ／ｍＬの基質を使用した場合の蛍光を示す。
【図6B】２つの異なる濃度の基質（０．１および０．３ｍｇ／ｍｌ）を使用して、より高い温度、より大きなビーズ、およびより高い振盪を組み合わせた場合の経時的な自己凝集の減少を示す。ＰＭＣＡは、Ｓｉ３Ｎ４ビーズを、ウェルあたり１つのビーズで使用して、組換えＡｂｃａｍ α－ｓｙｎ種子を使用して、４２℃、８００ｒｐｍ、１分間オンおよび２９分間オフでａＣＳＦを使用して実施した。２ｍｍビーズを用いて０．１ｍｇ／ｍＬの基質を使用した場合の蛍光を示す。
【図6C】２つの異なる濃度の基質（０．１および０．３ｍｇ／ｍｌ）を使用して、より高い温度、より大きなビーズ、およびより高い振盪を組み合わせた場合の経時的な自己凝集の減少を示す。ＰＭＣＡは、Ｓｉ３Ｎ４ビーズを、ウェルあたり１つのビーズで使用して、組換えＡｂｃａｍ α－ｓｙｎ種子を使用して、４２℃、８００ｒｐｍ、１分間オンおよび２９分間オフでａＣＳＦを使用して実施した。１．５ｍｍビーズを用いて０．１ｍｇ／ｍＬの基質を使用した場合の蛍光を示す。
【図6D】２つの異なる濃度の基質（０．１および０．３ｍｇ／ｍｌ）を使用して、より高い温度、より大きなビーズ、およびより高い振盪を組み合わせた場合の経時的な自己凝集の減少を示す。ＰＭＣＡは、Ｓｉ３Ｎ４ビーズを、ウェルあたり１つのビーズで使用して、組換えＡｂｃａｍ α－ｓｙｎ種子を使用して、４２℃、８００ｒｐｍ、１分間オンおよび２９分間オフでａＣＳＦを使用して実施した。２．３８ｍｍビーズを用いて０．３ｍｇ／ｍＬの基質を使用した場合の蛍光を示す。
【図6E】２つの異なる濃度の基質（０．１および０．３ｍｇ／ｍｌ）を使用して、より高い温度、より大きなビーズ、およびより高い振盪を組み合わせた場合の経時的な自己凝集の減少を示す。ＰＭＣＡは、Ｓｉ３Ｎ４ビーズを、ウェルあたり１つのビーズで使用して、組換えＡｂｃａｍ α－ｓｙｎ種子を使用して、４２℃、８００ｒｐｍ、１分間オンおよび２９分間オフでａＣＳＦを使用して実施した。２ｍｍビーズを用いて０．３ｍｇ／ｍＬの基質を使用した場合の蛍光を示す。
【図6F】２つの異なる濃度の基質（０．１および０．３ｍｇ／ｍｌ）を使用して、より高い温度、より大きなビーズ、およびより高い振盪を組み合わせた場合の経時的な自己凝集の減少を示す。ＰＭＣＡは、Ｓｉ３Ｎ４ビーズを、ウェルあたり１つのビーズで使用して、組換えＡｂｃａｍ α－ｓｙｎ種子を使用して、４２℃、８００ｒｐｍ、１分間オンおよび２９分間オフでａＣＳＦを使用して実施した。１．５ｍｍビーズを用いて０．３ｍｇ／ｍＬの基質を使用した場合の蛍光を示す。
【0025】
【図7A】ａＣＳＦまたはヒトＣＳＦを使用した場合に得られた比較結果の例を示す。ＰＭＣＡは、Ｓｉ３Ｎ４ビーズをウェルあたり１つのビーズで使用して、組換えＡｂｃａｍ α－ｓｙｎ種子を４２℃、８００ｒｐｍ、１分間オンおよび２９分間オフで使用して実施した。０．３ｍｇ／ｍＬの基質、２．３８ｍｍビーズを使用した場合の蛍光を示す。
【図7B】ａＣＳＦまたはヒトＣＳＦを使用した場合に得られた比較結果の例を示す。ＰＭＣＡは、Ｓｉ３Ｎ４ビーズをウェルあたり１つのビーズで使用して、組換えＡｂｃａｍ α－ｓｙｎ種子を４２℃、８００ｒｐｍ、１分間オンおよび２９分間オフで使用して実施した。０．３ｍｇ／ｍＬの基質、２．３８ｍｍビーズ、およびヒトＣＳＦを使用した場合の蛍光を示す。
【0026】
【図8A】ＰＤを有すると臨床的に診断された対象から得られたＣＳＦ試料中の内因性α－Ｓ種子の、ビーズを使用した評価の例示的な結果を示す。４２℃、８００ｒｐｍ、１分間オンおよび２９分間オフで組換えα－ｓｙｎ種子を使用してＰＭＣＡを実施し、Ｓｉ３Ｎ４ビーズをウェルあたり１つのビーズで使用し、ＰＤを有する対象から得られた４０μＬのＣＳＦ試料中の０．３ｍｇ／ｍＬのα－Ｓを使用した場合の蛍光を示す。
【図8B】ＰＤを有すると臨床的に診断された対象から得られたＣＳＦ試料中の内因性α－Ｓ種子の、ビーズを使用した評価の例示的な結果を示す。４２℃、８００ｒｐｍ、１分間オンおよび２９分間オフで組換えα－ｓｙｎ種子を使用してＰＭＣＡを実施し、Ｓｉ３Ｎ４ビーズをウェルあたり１つのビーズで使用し、対照ＣＳＦの４０μＬ試料中の０．３ ｍｇのα－Ｓを使用した場合の蛍光を示す。
【図8C】ＰＤを有すると臨床的に診断された対象から得られたＣＳＦ試料中の内因性α－Ｓ種子の、ビーズを使用した評価の例示的な結果を示す。４２℃、８００ｒｐｍ、１分間オンおよび２９分間オフで組換えα－ｓｙｎ種子を使用してＰＭＣＡを実施し、ＰＤを有する対象から得られた４０μＬのＣＳＦ試料中の０．３ｍｇ／ｍＬのα－Ｓを使用して、ビーズなしでＰＭＣＡを実施した。
【0027】
【図9A】２．３８ｍｍのＳｉ３Ｎ４ビーズをウェルあたり１つのビーズで使用して、組換えα－ｓｙｎ種子を３７℃、８００ｒｐｍ、１分間オンおよび２９分間オフで使用してＰＭＣＡを実施した場合の例示的結果を示し、ＰＤを有する対象から得られたＣＳＦ試料に対して実施されたＰＭＣＡの凝集を表す蛍光を示す。
【図9B】２．３８ｍｍのＳｉ３Ｎ４ビーズをウェルあたり１つのビーズで使用して、組換えα－ｓｙｎ種子を３７℃、８００ｒｐｍ、１分間オンおよび２９分間オフで使用してＰＭＣＡを実施した場合の例示的結果を示し、対照ＣＳＦ試料を使用して得られた結果を示す。
【0028】
【0029】
【0030】
【0031】
【0032】
【図14A】１つのＰＤ ＣＳＦ試料（ＰＤ）および３つの対照に対して異なる種類のビーズを使用して高速アッセイ条件を実行した例示的な結果を示す。したがって、ＢＳＡでブロッキングした２．３８ｍｍのＳｉ３Ｎ４ビーズを使用した例示的な結果を示す。ＰＤ試料は約７５時間陽性であったが、３つの対照はすべて陰性であった。
【図14B】１つのＰＤ ＣＳＦ試料（ＰＤ）および３つの対照に対して異なる種類のビーズを使用して高速アッセイ条件を実行した例示的な結果を示す。ブロッキングしない２ｍｍホウケイ酸ガラスビーズを使用した例示的な結果を示す図である。ＰＤ試料は約１７０時間陽性であったが、３つの対照はすべて陰性であった。
【0033】
【図15A】異なるドナー（ＰＤ１およびＰＤ２）からの２つのＰＤ ＣＳＦ試料に対して異なる種類のビーズを使用して高速アッセイ条件を実行した例示的な結果を示す。グラフは、患者あたり３回の反復試験の平均を示す。ブロッキングした２．３８ｍｍのＳｉ３Ｎ４ビーズ（図１５Ａ）またはブッキングしない２．４５ｍｍのホウケイ酸ガラスビーズ（図１５Ｂ）のいずれかを使用した場合、両方のＰＤ試料は陽性であった。Ｓｉ３Ｎ４ビーズを用いると、ＰＤ２は約４０時間で、ＰＤ１は約５０時間で凝集を開始した。凝集曲線は非常に再現性があり、プラトーは非常に一貫した蛍光値を示す。２．４５ｍｍのホウケイ酸ガラスビーズを使用した場合、ＰＤ２およびＰＤ１についてそれぞれ１０時間および２５時間、凝集が遅延した。
【図15B】異なるドナー（ＰＤ１およびＰＤ２）からの２つのＰＤ ＣＳＦ試料に対して異なる種類のビーズを使用して高速アッセイ条件を実行した例示的な結果を示す。グラフは、患者あたり３回の反復試験の平均を示す。ブロッキングした２．３８ｍｍのＳｉ３Ｎ４ビーズ（図１５Ａ）またはブッキングしない２．４５ｍｍのホウケイ酸ガラスビーズ（図１５Ｂ）のいずれかを使用した場合、両方のＰＤ試料は陽性であった。Ｓｉ３Ｎ４ビーズを用いると、ＰＤ２は約４０時間で、ＰＤ１は約５０時間で凝集を開始した。凝集曲線は非常に再現性があり、プラトーは非常に一貫した蛍光値を示す。２．４５ｍｍのホウケイ酸ガラスビーズを使用した場合、ＰＤ２およびＰＤ１についてそれぞれ１０時間および２５時間、凝集が遅延した。
【0034】
【図16】ビーズ分配装置の分解斜視図である。
【0035】
【0036】
【0037】
【0038】
【0039】
【0040】
【図24A】例示的な高速アッセイ（ＢＳＡでブロッキングした２．３８ｍｍのＳｉ３Ｎ４ビーズをウェルあたり１つのビーズで使用して、組換えα－ｓｙｎ種子を３７℃、８００ｒｐｍ、１分間オンおよび２９分間オフで使用）に１Ｘ ＰＢＳ中０．１％ ｗ／ｖのサルコシル濃度を含めた例示的結果を示し、ＰＤを有する対象から得られたＣＳＦに対して実施されたＰＭＣＡの凝集を表す蛍光を示す。
【図24B】例示的な高速アッセイ（ＢＳＡでブロッキングした２．３８ｍｍのＳｉ３Ｎ４ビーズをウェルあたり１つのビーズで使用して、組換えα－ｓｙｎ種子を３７℃、８００ｒｐｍ、１分間オンおよび２９分間オフで使用）に１Ｘ ＰＢＳ中０．１％ ｗ／ｖのサルコシル濃度を含めた例示的結果を示し、対照ＣＳＦ試料を使用して得られた結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0041】
生物学的試料中の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎの存在を決定するための方法およびキットが提供される。方法およびキットは、生物学的試料をモノマーα－ｓｙｎタンパク質および約１ｍｍ～約５ｍｍ、２．３ｍｍ超～約５ｍｍ、３ｍｍ超～約５ｍｍ、約２．３８ｍｍ、または約２．４５ｍｍの平均直径を有する１つ以上のビーズと接触させて、インキュベーション混合物を形成すること；インキュベーション混合物をインキュベートして、モノマーα－ｓｙｎタンパク質および生物学的試料の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎからミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体を形成すること；ミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体の少なくとも一部を脱凝集させること；およびインキュベートおよび脱凝集の工程を生物学的試料の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎを増幅するのに十分な回数繰り返して、検出可能な量のミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体を得ることを含む。生物学的試料中の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎの存在を示す、検出可能な量のミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体が生物学的試料中に存在するかどうかを次いで決定することができる。
【0042】
図１の概略説明に示される例示的な一例では、生物学的試料中の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の存在を決定する方法が提供される。以下、図１、および特許請求の範囲に記載されている工程の順序は、明確性のためにのみ提供されており、限定するものとみなされるべきではない。その注意と共に、本方法は、（Ａ）生物学的試料をプレインキュベーション混合物であって、（１）モノマーα－ｓｙｎタンパク質；（２）緩衝組成物；（３）塩；および（４）指示薬を含むプレインキュベーション混合物と接触させてインキュベーション混合物を形成すること；（Ｂ）インキュベーションサイクルであって、各インキュベーションサイクルが（ｉ）可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の存在下でモノマーα－ｓｙｎタンパク質の少なくとも一部のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こすのに有効なインキュベーション混合物をインキュベートすること；および（ｉｉ）インキュベーション混合物を物理的に粉砕することを含むインキュベーションサイクルを、（１）モノマーα－ｓｙｎタンパク質からミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の増幅部分を形成するのに有効なインキュベーション混合物に対して２回以上；（２）約１ｍｍ～約５ｍｍ、２．３ｍｍ超～約５ｍｍ、３ｍｍ超～約５ｍｍ、約２．３８ｍｍ、または約２．４５ｍｍの直径を有するＳｉ３Ｎ４ビーズまたはホウケイ酸ガラスビーズのいずれかの存在下で実施すること；（Ｃ）検出可能な量のミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体が生物学的試料中に存在するかどうかを決定することを含み、ミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体の検出は、生物学的試料中の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の存在を示す。
【0043】
方法のいくつかの態様では、ビーズは本質的にＳｉ３Ｎ４からなり、約２．３８ｍｍの直径を有する。いくつかの態様では、方法は、実施の前にＳｉ３Ｎ４ビーズの表面をＢＳＡでブッキングすることをさらに含む。いくつかの態様では、ブロッキングは、Ｓｉ３Ｎ４ビーズを水および／またはＰＩＰＥＳ緩衝液の少なくとも１つの中のＢＳＡの溶液に浸漬することを含む。いくつかの態様では、ビーズは本質的にホウケイ酸ガラスからなり、約２．４５の直径を有する。いくつかの態様では、ホウケイ酸ガラスはブッキングされていない。
本方法のいくつかの態様では、生物学的試料はヒトＣＳＦを含む。いくつかの態様では、モノマーα－ｓｙｎタンパク質は、配列番号１、配列番号２、またはそれらの保存的変異体の少なくとも１つを含む。いくつかの態様では、モノマーα－ｓｙｎタンパク質は、約１０μＭ～約３０μＭの濃度で存在する。いくつかの態様では、モノマーα－ｓｙｎタンパク質は、約１９．６μＭの濃度で存在する。いくつかの態様では、緩衝組成物は、約６．２～約６．５、例えば約６．３のｐＨを有する。いくつかの態様では、緩衝組成物はＰＩＰＥＳを含む。いくつかの態様では、緩衝組成物は、約１００ｍｍ ＰＩＰＥＳ、約５００ｍｍ ＰＩＰＥＳ、約６００ｍｍ ＰＩＰＥＳまたは約７００ｍｍ ＰＩＰＥＳを含む。いくつかの態様では、塩はＮａＣｌを含む。いくつかの態様では、塩は、約５００ｍｍ～約７００ｍｍ、例えば約６００ｍｍの濃度でＮａＣｌを含む。いくつかの態様では、指示薬はＴｈＴを含む。いくつかの態様では、検出は、約４４０ｎｍでの励起後に約４９０ｎｍでのＴｈＴ蛍光を測定することを含む。いくつかの態様では、指示薬は、約５μＭ～約１０μＭの濃度でＴｈＴを含む。いくつかの態様では、物理的粉砕は、軌道振盪を含む振盪を含む。
本方法のいくつかの態様では、生物学的試料はヒトＣＳＦを含む。いくつかの態様では、モノマーα－ｓｙｎタンパク質は、配列番号１、配列番号２、またはそれらの保存的変異体の少なくとも１つを含む。いくつかの態様では、モノマーα－ｓｙｎタンパク質は、約１０μＭ～約３０μＭの濃度で存在する。いくつかの態様では、モノマーα－ｓｙｎタンパク質は、約１９．６μＭの濃度で存在する。いくつかの態様では、緩衝組成物は、約６．２～約６．５、例えば約６．３のｐＨを有する。いくつかの態様では、緩衝組成物はＰＩＰＥＳを含む。いくつかの態様では、緩衝組成物は、約１００ｍｍ ＰＩＰＥＳ、約５００ｍｍ ＰＩＰＥＳ、約６００ｍｍ ＰＩＰＥＳまたは約７００ｍｍ ＰＩＰＥＳを含む。いくつかの態様では、塩はＮａＣｌを含む。いくつかの態様では、塩は、約５００ｍｍ～約７００ｍｍ、例えば約６００ｍｍの濃度でＮａＣｌを含む。いくつかの態様では、指示薬はＴｈＴを含む。いくつかの態様では、検出は、約４４０ｎｍでの励起後に約４９０ｎｍでのＴｈＴ蛍光を測定することを含む。いくつかの態様では、指示薬は、約５μＭ～約１０μＭの濃度でＴｈＴを含む。いくつかの態様では、物理的粉砕は、軌道振盪を含む振盪を含む。
【0044】
定義
「診断」という用語は、対象が疾患を発症する可能性または対象における疾患の存在もしくは性質を決定することを包含し得る。診断という用語はまた、疾患もしくは疾患のエピソードの重症度および予想される転帰、または一般に予後と呼ばれる回復の見込みを決定することを包含する。「診断」はまた、合理的な療法の状況での診断を包含することができ、そこで診断は、療法の最初の選択、療法の修正（例えば、用量または投薬レジメンの調整）などを含む療法を導く。
「診断」という用語は、対象が疾患を発症する可能性または対象における疾患の存在もしくは性質を決定することを包含し得る。診断という用語はまた、疾患もしくは疾患のエピソードの重症度および予想される転帰、または一般に予後と呼ばれる回復の見込みを決定することを包含する。「診断」はまた、合理的な療法の状況での診断を包含することができ、そこで診断は、療法の最初の選択、療法の修正（例えば、用量または投薬レジメンの調整）などを含む療法を導く。
【0045】
「予後」という用語は、疾患の予想され得る経過および転帰の予測、または疾患からの回復の可能性を指す。予後は、対象が疾患を有することが一般に既に知られているという点で診断とは区別されるが、予後と診断は同時に行うことができる。ＰＤの予後の場合、予後はＰＤの相対的重症度を分類し、これを使用して適切な療法の選択を導くことができる。
【0046】
「治療」、「治療する」などの用語は、所望の薬理学的または生理学的効果を得ることを指す。効果は、疾患の部分的もしくは完全な治癒、または疾患に起因する有害作用に関して治療的であり得る。「治療」は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の治療を包含し、疾患または状態を阻害すること、すなわちその発症を阻止することと、および疾患を軽減すること、すなわち疾患の退行を引き起こすこととを含むことができる。
【0047】
予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）または予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）とは、疾患の素因を有し得るが、それを有するとまだ診断されていない対象において（例えば、原発性疾患に関連し得るか、またはそれによって引き起こされ得る疾患を含む）、疾患または疾患の症状の発生を予防することを指す。予防は、疾患または症状を完全にまたは部分的に予防することを含み得る。
【0048】
「治療的に有効」および「薬理学的に有効」という用語は、各薬剤単独での治療を上回る疾患重症度および発生頻度の改善という目標を達成する薬剤の量を、代替療法に典型的に関連する有害な副作用を回避しながら限定することを意図している。治療の有効性は、可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎのレベルの低下または特定のシヌクレイノパチーに関連する他の症状の減少を評価することによって測定され得る。
【0049】
値の範囲が提供される場合、文脈上明確に指示されない限り下限の単位の１０分の１までの各介在値、その範囲の上限と下限との間の各介在値、およびその記載された範囲内の任意の他の記載値または介在値が包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立してより小さい範囲に含まれてもよく、記載された範囲内の特に除外された任意の限度を前提として包含される。記載された範囲が限度の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限度の一方または両方を除外した範囲も含まれる。
【0050】
別に定義されない限り、すべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【0051】
数字に関連する「約」という用語は、その数字の±１０％を含むことが意図されている。これは、「約」が独立した数字を修正するかどうか、または数字の範囲の端のいずれかまたは両方で数字を修正するかどうかにかかわらず当てはまる。言い換えると、「約１０」は９から１１を意味する。同様に、「約１０～約２０」は９～２２を意味する。「約」という用語がない場合、厳密な数が意図される。言い換えると、「１０」は１０を意味する。
【0052】
単数形「ａ」、「ａｎｄ」、および「ｔｈｅ」は、別途文脈が明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「試料」への言及は、１つの試料を含み、複数のそのような試料を含む。同様に、「モノマーα－ｓｙｎタンパク質」への言及には、１つ以上のタンパク質分子などへの言及が含まれる。
【0053】
生物学的試料中の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の存在を決定する
生物学的試料中の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の存在を決定する方法が提供される。いくつかの態様では、存在の決定は、可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質が試料中に存在するかどうかを検出することを含み、他の態様では、存在の決定は、試料中の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の量を決定することを含む。方法は、生物学的試料をモノマーα－ｓｙｎタンパク質および約１ｍｍ～約５ｍｍ、２．３ｍｍ超～約５ｍｍ、３ｍｍ超～約５ｍｍ、約２．３８ｍｍ、または約２．４５ｍｍの平均直径を有する１つ以上のビーズと接触させて、インキュベーション混合物を形成する工程；インキュベーション混合物をインキュベートして、モノマーα－ｓｙｎタンパク質および生物学的試料の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎからミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体を形成する工程；およびミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体の少なくとも一部を脱凝集させる工程を含む。インキュベーション混合物をインキュベートする工程および脱凝集する工程は、試料の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質を増幅して検出可能な量のミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体を得るのに十分な回数繰り返される。方法は、次いで検出可能な量のミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体が生物学的試料中に存在するかどうかを決定することを含む。ミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体の検出は、生物学的試料中の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の存在を示す。
生物学的試料中の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の存在を決定する方法が提供される。いくつかの態様では、存在の決定は、可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質が試料中に存在するかどうかを検出することを含み、他の態様では、存在の決定は、試料中の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の量を決定することを含む。方法は、生物学的試料をモノマーα－ｓｙｎタンパク質および約１ｍｍ～約５ｍｍ、２．３ｍｍ超～約５ｍｍ、３ｍｍ超～約５ｍｍ、約２．３８ｍｍ、または約２．４５ｍｍの平均直径を有する１つ以上のビーズと接触させて、インキュベーション混合物を形成する工程；インキュベーション混合物をインキュベートして、モノマーα－ｓｙｎタンパク質および生物学的試料の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎからミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体を形成する工程；およびミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体の少なくとも一部を脱凝集させる工程を含む。インキュベーション混合物をインキュベートする工程および脱凝集する工程は、試料の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質を増幅して検出可能な量のミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体を得るのに十分な回数繰り返される。方法は、次いで検出可能な量のミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体が生物学的試料中に存在するかどうかを決定することを含む。ミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体の検出は、生物学的試料中の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の存在を示す。
【0054】
本明細書で使用される場合、可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質のような「α－Ｓ」、「α－ｓｙｎ」または「α－シヌクレイン」は、全長の１４０アミノ酸の野生型α－ｓｙｎタンパク質、すなわち「αＳ－１４０」を指し得る。他のイソ型または断片は、例えばエクソン３の欠失に起因して残基４１～５４を欠くアルファ－ｓｙｎ－１２６、「αＳ－１２６」、および例えばエクソン５の欠失に起因して残基１０３～１３０を欠くアルファ－ｓｙｎ－１１２、「αＳ－１１２」を含み得る。様々なαＳイソ型は、αＳ－１４０、αＳ－１２６、およびαＳ－１１２を含み得るが、これらに限定されない。様々なα－ｓｙｎペプチドは、ＰＤなどのシヌクレイノパチーに関連するニューロン損傷に関連し得る。
【0055】
「可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質」は、溶液中に残るα－ｓｙｎタンパク質のミスフォールドモノマーまたは凝集体を指す。可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の例としては、ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質が可溶性のままである限り、任意の数の凝集したミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質モノマーが挙げられ得る。例えば、可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質は、ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質モノマーの２～約５０単位の凝集体を含み得る。いくつかの例では、凝集体はオリゴマーまたはポリマーと呼ばれ得る。いくつかの例では、凝集はオリゴマー化または重合と呼ばれ得る。
【0056】
可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質は、凝集またはオリゴマー化して不溶性凝集体および／またはより高いオリゴマーを形成し、プロトフィブリル、フィブリル、および最終的にプラークまたは封入体の形態のミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質凝集体をもたらし得る。核形成依存性重合は、典型的には、凝集した核が生じ得るゆっくりとした遅滞期によって特徴付けられ得、その後、さらなる凝集体および／またはより大きな凝集体の迅速な形成を刺激し得る。遅滞期は、予め形成された「核」または「種子」の添加によって最小化または排除され得る。「種子」または「核」は、さらなるミスフォールディング、オリゴマー化、および／または凝集を誘導する能力を有するミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質または断片化された短いフィブリル、特に可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質を指す。いくつかの例では、「種子」または「核」は、α－ｓｙｎタンパク質の非凝集モノマーを除外してもよい。理論に束縛されることを望むものではないが、少なくともいくつかの条件下では、モノマーα－ｓｙｎタンパク質は安定しない可能性があり、病原性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の最小安定サイズは、ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の２つのモノマー単位の凝集体であり得ると考えられる。
【0057】
本明細書で使用される場合、「可溶性」種は、可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎを含み、生理学的条件下で生体液中の溶液を形成し得るが、「不溶性」種は、そのような生体液中に沈殿物、フィブリル、沈着物、濃縮体、または他の非溶解形態として存在し得る。不溶性種の例としては、Ａβ、α－Ｓ、タウ等のフィブリルが挙げられる。生理学的条件下で非生体液に溶解するが生体液には溶解しない種は、不溶性と見なされ得る。例えば、α－ｓｙｎなどのフィブリルは、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの界面活性剤の水溶液に溶解され得るが、生理学的条件下では記載の生体液の１つ以上に依然として不溶性であり得るため、本明細書では不溶性とみなされる。
【0058】
いくつかの態様では、生物学的試料は、生理学的条件下で記載された生体液の１つ以上に不溶性であり得る沈殿物、フィブリル、沈着物、濃縮物、プラーク、または他の形態としてのミスフォールドタンパク質の不溶性種を除外し得る。試料は、不溶性形態のミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質を除外することができ、例えば、生物学的試料は、沈殿物、フィブリル、沈着物、濃縮物、プラーク、または他の不溶性形態としての、例えばフィブリル形態のミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質を除外することができる。
【0059】
本明細書で使用される場合、「ミスフォールドタンパク質」は、生物系内のその典型的な非病原性正常機能に存在するタンパク質の構造的立体配座の全部または一部をもはや含まないタンパク質である。ミスフォールドタンパク質は、凝集体であり得る。ミスフォールドタンパク質は、タンパク質凝集体に局在化し得る。ミスフォールドタンパク質は、非機能性タンパク質であり得る。ミスフォールドタンパク質は、タンパク質の病原性配座異性体であり得る。モノマーα－ｓｙｎタンパク質組成物は、種子に関連するミスフォールディング、オリゴマー化、および凝集のための触媒活性がなく、天然、非病原性を確認して提供され得る。モノマーα－ｓｙｎタンパク質組成物は、種子のない形態で提供され得る。
【0060】
「モノマーα－ｓｙｎタンパク質」および「モノマーα－ｓｙｎ基質」という語句は互換的に使用され、それらの天然の非病原性構造の１つ以上のα－ｓｙｎタンパク質分子を指す。いくつかの態様では、モノマーα－ｓｙｎタンパク質は、１４０個のアミノ酸を有し、１４，４６０Ｄａの分子質量を有し、以下の配列によって表される野生型または組換えヒトα－ｓｙｎタンパク質を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
【0061】
配列番号１
ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫ ＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥ ＫＴＫＱＧＶＡＥＡＡ ＧＫＴＫＥＧＶＬＹＶ ＧＳＫＴＫＥＧＶＶＨ ＧＶＡＴＶＡＥＫＴＫ ＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶ ＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫ ＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡ ＡＴＧＦＶＫＫＤＱＬ ＧＫＮＥＥＧＡＰＱＥ ＧＩＬＥＤＭＰＶＤＰ ＤＮＥＡＹＥＭＰＳＥ ＥＧＹＱＤＹＥＰＥＡ
ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫ ＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥ ＫＴＫＱＧＶＡＥＡＡ ＧＫＴＫＥＧＶＬＹＶ ＧＳＫＴＫＥＧＶＶＨ ＧＶＡＴＶＡＥＫＴＫ ＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶ ＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫ ＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡ ＡＴＧＦＶＫＫＤＱＬ ＧＫＮＥＥＧＡＰＱＥ ＧＩＬＥＤＭＰＶＤＰ ＤＮＥＡＹＥＭＰＳＥ ＥＧＹＱＤＹＥＰＥＡ
【0062】
いくつかの態様では、モノマーα－ｓｙｎタンパク質は、配列番号１の保存的変異体を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。保存的変異体は、１つまたは複数のアミノ酸による、類似の生化学的特性を有し、ＰＭＣＡアッセイにおいて得られたタンパク質の活性に対して最小または有益な影響を有するアミノ酸の置換においてのみ配列番号１から逸脱するペプチドまたはアミノ酸配列であり得る。保存的変異体は、基本成分、すなわち配列番号１と実質的に同様に機能的に作動しなければならない。例えば、配列番号１の保存的変異体は、ミスフォールドα－ｓｙｎと凝集し、同様の反応条件下で実質的に同様の速度論で凝集体を形成する。保存的変異体は、アミノ酸配列中に、例えば、１、２、３、４、５、６、７（５％）、最大１４（１０％）の置換を有し得る。
いくつかの態様では、モノマーα－ｓｙｎタンパク質は、配列番号１のＣ末端に６個の追加のヒスチジンアミノ酸（すなわち、ポリＨｉｓ精製タグ）を含み、１５，２８３Ｄａの分子質量になり、以下の配列によって表される組換えα－ｓｙｎタンパク質を含む。
いくつかの態様では、モノマーα－ｓｙｎタンパク質は、配列番号１のＣ末端に６個の追加のヒスチジンアミノ酸（すなわち、ポリＨｉｓ精製タグ）を含み、１５，２８３Ｄａの分子質量になり、以下の配列によって表される組換えα－ｓｙｎタンパク質を含む。
【0063】
配列番号２
ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫ ＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥ ＫＴＫＱＧＶＡＥＡＡ ＧＫＴＫＥＧＶＬＹＶ ＧＳＫＴＫＥＧＶＶＨ ＧＶＡＴＶＡＥＫＴＫ ＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶ ＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫ ＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡ ＡＴＧＦＶＫＫＤＱＬ ＧＫＮＥＥＧＡＰＱＥ ＧＩＬＥＤＭＰＶＤＰ ＤＮＥＡＹＥＭＰＳＥ ＥＧＹＱＤＹＥＰＥＡ ＨＨＨＨＨＨ
ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫ ＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥ ＫＴＫＱＧＶＡＥＡＡ ＧＫＴＫＥＧＶＬＹＶ ＧＳＫＴＫＥＧＶＶＨ ＧＶＡＴＶＡＥＫＴＫ ＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶ ＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫ ＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡ ＡＴＧＦＶＫＫＤＱＬ ＧＫＮＥＥＧＡＰＱＥ ＧＩＬＥＤＭＰＶＤＰ ＤＮＥＡＹＥＭＰＳＥ ＥＧＹＱＤＹＥＰＥＡ ＨＨＨＨＨＨ
【0064】
したがって、配列番号２は、Ｃ末端上の６個の追加のヒスチジンアミノ酸によって配列番号１と識別可能である。配列番号２はさらに、例えば、１つ以上のアミノ酸がＮ末端に付加されている配列番号１の変異体と識別可能である。いくつかの態様では、１つ以上のアミノ酸がＮ末端に付加されている配列番号１の変異体は除外される。しかしながら、いくつかの態様は、Ｎ末端付加物を含む。したがって、
【0065】
配列番号３
ＨＨＨＨＨＨ ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫ ＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥ ＫＴＫＱＧＶＡＥＡＡ ＧＫＴＫＥＧＶＬＹＶ ＧＳＫＴＫＥＧＶＶＨ ＧＶＡＴＶＡＥＫＴＫ ＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶ ＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫ ＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡ ＡＴＧＦＶＫＫＤＱＬ ＧＫＮＥＥＧＡＰＱＥ ＧＩＬＥＤＭＰＶＤＰ ＤＮＥＡＹＥＭＰＳＥ ＥＧＹＱＤＹＥＰＥＡ
ＨＨＨＨＨＨ ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫ ＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥ ＫＴＫＱＧＶＡＥＡＡ ＧＫＴＫＥＧＶＬＹＶ ＧＳＫＴＫＥＧＶＶＨ ＧＶＡＴＶＡＥＫＴＫ ＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶ ＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫ ＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡ ＡＴＧＦＶＫＫＤＱＬ ＧＫＮＥＥＧＡＰＱＥ ＧＩＬＥＤＭＰＶＤＰ ＤＮＥＡＹＥＭＰＳＥ ＥＧＹＱＤＹＥＰＥＡ
【0066】
例えば、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ＭｙｃおよびＶ５を含むさらなる精製タグが企図され、したがって、以下の配列番号を生成する。
【0067】
配列番号４：
ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫ ＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥ ＫＴＫＱＧＶＡＥＡＡ ＧＫＴＫＥＧＶＬＹＶ ＧＳＫＴＫＥＧＶＶＨ ＧＶＡＴＶＡＥＫＴＫ ＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶ ＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫ ＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡ ＡＴＧＦＶＫＫＤＱＬ ＧＫＮＥＥＧＡＰＱＥ ＧＩＬＥＤＭＰＶＤＰ ＤＮＥＡＹＥＭＰＳＥ ＥＧＹＱＤＹＥＰＥＡ ＤＹＫＤＤＤＤ
ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫ ＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥ ＫＴＫＱＧＶＡＥＡＡ ＧＫＴＫＥＧＶＬＹＶ ＧＳＫＴＫＥＧＶＶＨ ＧＶＡＴＶＡＥＫＴＫ ＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶ ＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫ ＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡ ＡＴＧＦＶＫＫＤＱＬ ＧＫＮＥＥＧＡＰＱＥ ＧＩＬＥＤＭＰＶＤＰ ＤＮＥＡＹＥＭＰＳＥ ＥＧＹＱＤＹＥＰＥＡ ＤＹＫＤＤＤＤ
【0068】
配列番号５：
ＤＹＫＤＤＤＤ ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫ ＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥ ＫＴＫＱＧＶＡＥＡＡ ＧＫＴＫＥＧＶＬＹＶ ＧＳＫＴＫＥＧＶＶＨ ＧＶＡＴＶＡＥＫＴＫ ＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶ ＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫ ＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡ ＡＴＧＦＶＫＫＤＱＬ ＧＫＮＥＥＧＡＰＱＥ ＧＩＬＥＤＭＰＶＤＰ ＤＮＥＡＹＥＭＰＳＥ ＥＧＹＱＤＹＥＰＥＡ
ＤＹＫＤＤＤＤ ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫ ＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥ ＫＴＫＱＧＶＡＥＡＡ ＧＫＴＫＥＧＶＬＹＶ ＧＳＫＴＫＥＧＶＶＨ ＧＶＡＴＶＡＥＫＴＫ ＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶ ＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫ ＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡ ＡＴＧＦＶＫＫＤＱＬ ＧＫＮＥＥＧＡＰＱＥ ＧＩＬＥＤＭＰＶＤＰ ＤＮＥＡＹＥＭＰＳＥ ＥＧＹＱＤＹＥＰＥＡ
【0069】
配列番号６：
ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫ ＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥ ＫＴＫＱＧＶＡＥＡＡ ＧＫＴＫＥＧＶＬＹＶ ＧＳＫＴＫＥＧＶＶＨ ＧＶＡＴＶＡＥＫＴＫ ＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶ ＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫ ＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡ ＡＴＧＦＶＫＫＤＱＬ ＧＫＮＥＥＧＡＰＱＥ ＧＩＬＥＤＭＰＶＤＰ ＤＮＥＡＹＥＭＰＳＥ ＥＧＹＱＤＹＥＰＥＡ ＤＹＫＤＤＤＤＫ
ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫ ＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥ ＫＴＫＱＧＶＡＥＡＡ ＧＫＴＫＥＧＶＬＹＶ ＧＳＫＴＫＥＧＶＶＨ ＧＶＡＴＶＡＥＫＴＫ ＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶ ＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫ ＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡ ＡＴＧＦＶＫＫＤＱＬ ＧＫＮＥＥＧＡＰＱＥ ＧＩＬＥＤＭＰＶＤＰ ＤＮＥＡＹＥＭＰＳＥ ＥＧＹＱＤＹＥＰＥＡ ＤＹＫＤＤＤＤＫ
【0070】
配列番号７：
ＤＹＫＤＤＤＤＫ ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫ ＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥ ＫＴＫＱＧＶＡＥＡＡ ＧＫＴＫＥＧＶＬＹＶ ＧＳＫＴＫＥＧＶＶＨ ＧＶＡＴＶＡＥＫＴＫ ＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶ ＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫ ＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡ ＡＴＧＦＶＫＫＤＱＬ ＧＫＮＥＥＧＡＰＱＥ ＧＩＬＥＤＭＰＶＤＰ ＤＮＥＡＹＥＭＰＳＥ ＥＧＹＱＤＹＥＰＥＡ
ＤＹＫＤＤＤＤＫ ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫ ＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥ ＫＴＫＱＧＶＡＥＡＡ ＧＫＴＫＥＧＶＬＹＶ ＧＳＫＴＫＥＧＶＶＨ ＧＶＡＴＶＡＥＫＴＫ ＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶ ＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫ ＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡ ＡＴＧＦＶＫＫＤＱＬ ＧＫＮＥＥＧＡＰＱＥ ＧＩＬＥＤＭＰＶＤＰ ＤＮＥＡＹＥＭＰＳＥ ＥＧＹＱＤＹＥＰＥＡ
【0071】
配列番号８：
ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫ ＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥ ＫＴＫＱＧＶＡＥＡＡ ＧＫＴＫＥＧＶＬＹＶ ＧＳＫＴＫＥＧＶＶＨ ＧＶＡＴＶＡＥＫＴＫ ＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶ ＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫ ＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡ ＡＴＧＦＶＫＫＤＱＬ ＧＫＮＥＥＧＡＰＱＥ ＧＩＬＥＤＭＰＶＤＰ ＤＮＥＡＹＥＭＰＳＥ ＥＧＹＱＤＹＥＰＥＡ ＤＹＫＤＤＤＫ
ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫ ＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥ ＫＴＫＱＧＶＡＥＡＡ ＧＫＴＫＥＧＶＬＹＶ ＧＳＫＴＫＥＧＶＶＨ ＧＶＡＴＶＡＥＫＴＫ ＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶ ＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫ ＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡ ＡＴＧＦＶＫＫＤＱＬ ＧＫＮＥＥＧＡＰＱＥ ＧＩＬＥＤＭＰＶＤＰ ＤＮＥＡＹＥＭＰＳＥ ＥＧＹＱＤＹＥＰＥＡ ＤＹＫＤＤＤＫ
【0072】
配列番号９：
ＤＹＫＤＤＤＫ ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫ ＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥ ＫＴＫＱＧＶＡＥＡＡ ＧＫＴＫＥＧＶＬＹＶ ＧＳＫＴＫＥＧＶＶＨ ＧＶＡＴＶＡＥＫＴＫ ＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶ ＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫ ＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡ ＡＴＧＦＶＫＫＤＱＬ ＧＫＮＥＥＧＡＰＱＥ ＧＩＬＥＤＭＰＶＤＰ ＤＮＥＡＹＥＭＰＳＥ ＥＧＹＱＤＹＥＰＥＡ
ＤＹＫＤＤＤＫ ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫ ＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥ ＫＴＫＱＧＶＡＥＡＡ ＧＫＴＫＥＧＶＬＹＶ ＧＳＫＴＫＥＧＶＶＨ ＧＶＡＴＶＡＥＫＴＫ ＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶ ＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫ ＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡ ＡＴＧＦＶＫＫＤＱＬ ＧＫＮＥＥＧＡＰＱＥ ＧＩＬＥＤＭＰＶＤＰ ＤＮＥＡＹＥＭＰＳＥ ＥＧＹＱＤＹＥＰＥＡ
【0073】
配列番号１０：
ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫ ＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥ ＫＴＫＱＧＶＡＥＡＡ ＧＫＴＫＥＧＶＬＹＶ ＧＳＫＴＫＥＧＶＶＨ ＧＶＡＴＶＡＥＫＴＫ ＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶ ＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫ ＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡ ＡＴＧＦＶＫＫＤＱＬ ＧＫＮＥＥＧＡＰＱＥ ＧＩＬＥＤＭＰＶＤＰ ＤＮＥＡＹＥＭＰＳＥ ＥＧＹＱＤＹＥＰＥＡ ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ
ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫ ＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥ ＫＴＫＱＧＶＡＥＡＡ ＧＫＴＫＥＧＶＬＹＶ ＧＳＫＴＫＥＧＶＶＨ ＧＶＡＴＶＡＥＫＴＫ ＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶ ＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫ ＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡ ＡＴＧＦＶＫＫＤＱＬ ＧＫＮＥＥＧＡＰＱＥ ＧＩＬＥＤＭＰＶＤＰ ＤＮＥＡＹＥＭＰＳＥ ＥＧＹＱＤＹＥＰＥＡ ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ
【0074】
配列番号１１：
ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫ ＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥ ＫＴＫＱＧＶＡＥＡＡ ＧＫＴＫＥＧＶＬＹＶ ＧＳＫＴＫＥＧＶＶＨ ＧＶＡＴＶＡＥＫＴＫ ＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶ ＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫ ＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡ ＡＴＧＦＶＫＫＤＱＬ ＧＫＮＥＥＧＡＰＱＥ ＧＩＬＥＤＭＰＶＤＰ ＤＮＥＡＹＥＭＰＳＥ ＥＧＹＱＤＹＥＰＥＡ
ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫ ＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥ ＫＴＫＱＧＶＡＥＡＡ ＧＫＴＫＥＧＶＬＹＶ ＧＳＫＴＫＥＧＶＶＨ ＧＶＡＴＶＡＥＫＴＫ ＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶ ＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫ ＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡ ＡＴＧＦＶＫＫＤＱＬ ＧＫＮＥＥＧＡＰＱＥ ＧＩＬＥＤＭＰＶＤＰ ＤＮＥＡＹＥＭＰＳＥ ＥＧＹＱＤＹＥＰＥＡ
【0075】
配列番号１２：
ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫ ＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥ ＫＴＫＱＧＶＡＥＡＡ ＧＫＴＫＥＧＶＬＹＶ ＧＳＫＴＫＥＧＶＶＨ ＧＶＡＴＶＡＥＫＴＫ ＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶ ＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫ ＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡ ＡＴＧＦＶＫＫＤＱＬ ＧＫＮＥＥＧＡＰＱＥ ＧＩＬＥＤＭＰＶＤＰ ＤＮＥＡＹＥＭＰＳＥ ＥＧＹＱＤＹＥＰＥＡ ＹＡＹＤＶＰＤＹＡ
ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫ ＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥ ＫＴＫＱＧＶＡＥＡＡ ＧＫＴＫＥＧＶＬＹＶ ＧＳＫＴＫＥＧＶＶＨ ＧＶＡＴＶＡＥＫＴＫ ＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶ ＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫ ＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡ ＡＴＧＦＶＫＫＤＱＬ ＧＫＮＥＥＧＡＰＱＥ ＧＩＬＥＤＭＰＶＤＰ ＤＮＥＡＹＥＭＰＳＥ ＥＧＹＱＤＹＥＰＥＡ ＹＡＹＤＶＰＤＹＡ
【0076】
配列番号１３：
ＹＡＹＤＶＰＤＹＡ ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫ ＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥ ＫＴＫＱＧＶＡＥＡＡ ＧＫＴＫＥＧＶＬＹＶ ＧＳＫＴＫＥＧＶＶＨ ＧＶＡＴＶＡＥＫＴＫ ＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶ ＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫ ＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡ ＡＴＧＦＶＫＫＤＱＬ ＧＫＮＥＥＧＡＰＱＥ ＧＩＬＥＤＭＰＶＤＰ ＤＮＥＡＹＥＭＰＳＥ ＥＧＹＱＤＹＥＰＥＡ
ＹＡＹＤＶＰＤＹＡ ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫ ＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥ ＫＴＫＱＧＶＡＥＡＡ ＧＫＴＫＥＧＶＬＹＶ ＧＳＫＴＫＥＧＶＶＨ ＧＶＡＴＶＡＥＫＴＫ ＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶ ＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫ ＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡ ＡＴＧＦＶＫＫＤＱＬ ＧＫＮＥＥＧＡＰＱＥ ＧＩＬＥＤＭＰＶＤＰ ＤＮＥＡＹＥＭＰＳＥ ＥＧＹＱＤＹＥＰＥＡ
【0077】
配列番号１４：
ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫ ＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥ ＫＴＫＱＧＶＡＥＡＡ ＧＫＴＫＥＧＶＬＹＶ ＧＳＫＴＫＥＧＶＶＨ ＧＶＡＴＶＡＥＫＴＫ ＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶ ＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫ ＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡ ＡＴＧＦＶＫＫＤＱＬ ＧＫＮＥＥＧＡＰＱＥ ＧＩＬＥＤＭＰＶＤＰ ＤＮＥＡＹＥＭＰＳＥ ＥＧＹＱＤＹＥＰＥＡ ＹＤＶＰＤＹＡＳＬ
ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫ ＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥ ＫＴＫＱＧＶＡＥＡＡ ＧＫＴＫＥＧＶＬＹＶ ＧＳＫＴＫＥＧＶＶＨ ＧＶＡＴＶＡＥＫＴＫ ＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶ ＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫ ＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡ ＡＴＧＦＶＫＫＤＱＬ ＧＫＮＥＥＧＡＰＱＥ ＧＩＬＥＤＭＰＶＤＰ ＤＮＥＡＹＥＭＰＳＥ ＥＧＹＱＤＹＥＰＥＡ ＹＤＶＰＤＹＡＳＬ
【0078】
配列番号１５：
ＹＤＶＰＤＹＡＳＬ ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫ ＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥ ＫＴＫＱＧＶＡＥＡＡ ＧＫＴＫＥＧＶＬＹＶ ＧＳＫＴＫＥＧＶＶＨ ＧＶＡＴＶＡＥＫＴＫ ＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶ ＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫ ＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡ ＡＴＧＦＶＫＫＤＱＬ ＧＫＮＥＥＧＡＰＱＥ ＧＩＬＥＤＭＰＶＤＰ ＤＮＥＡＹＥＭＰＳＥ ＥＧＹＱＤＹＥＰＥＡ
ＹＤＶＰＤＹＡＳＬ ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫ ＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥ ＫＴＫＱＧＶＡＥＡＡ ＧＫＴＫＥＧＶＬＹＶ ＧＳＫＴＫＥＧＶＶＨ ＧＶＡＴＶＡＥＫＴＫ ＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶ ＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫ ＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡ ＡＴＧＦＶＫＫＤＱＬ ＧＫＮＥＥＧＡＰＱＥ ＧＩＬＥＤＭＰＶＤＰ ＤＮＥＡＹＥＭＰＳＥ ＥＧＹＱＤＹＥＰＥＡ
【0079】
配列番号１６：
ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫ ＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥ ＫＴＫＱＧＶＡＥＡＡ ＧＫＴＫＥＧＶＬＹＶ ＧＳＫＴＫＥＧＶＶＨ ＧＶＡＴＶＡＥＫＴＫ ＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶ ＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫ ＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡ ＡＴＧＦＶＫＫＤＱＬ ＧＫＮＥＥＧＡＰＱＥ ＧＩＬＥＤＭＰＶＤＰ ＤＮＥＡＹＥＭＰＳＥ ＥＧＹＱＤＹＥＰＥＡ ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ
ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫ ＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥ ＫＴＫＱＧＶＡＥＡＡ ＧＫＴＫＥＧＶＬＹＶ ＧＳＫＴＫＥＧＶＶＨ ＧＶＡＴＶＡＥＫＴＫ ＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶ ＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫ ＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡ ＡＴＧＦＶＫＫＤＱＬ ＧＫＮＥＥＧＡＰＱＥ ＧＩＬＥＤＭＰＶＤＰ ＤＮＥＡＹＥＭＰＳＥ ＥＧＹＱＤＹＥＰＥＡ ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ
【0080】
配列番号１７：
ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫ ＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥ ＫＴＫＱＧＶＡＥＡＡ ＧＫＴＫＥＧＶＬＹＶ ＧＳＫＴＫＥＧＶＶＨ ＧＶＡＴＶＡＥＫＴＫ ＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶ ＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫ ＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡ ＡＴＧＦＶＫＫＤＱＬ ＧＫＮＥＥＧＡＰＱＥ ＧＩＬＥＤＭＰＶＤＰ ＤＮＥＡＹＥＭＰＳＥ ＥＧＹＱＤＹＥＰＥＡ
ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫ ＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥ ＫＴＫＱＧＶＡＥＡＡ ＧＫＴＫＥＧＶＬＹＶ ＧＳＫＴＫＥＧＶＶＨ ＧＶＡＴＶＡＥＫＴＫ ＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶ ＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫ ＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡ ＡＴＧＦＶＫＫＤＱＬ ＧＫＮＥＥＧＡＰＱＥ ＧＩＬＥＤＭＰＶＤＰ ＤＮＥＡＹＥＭＰＳＥ ＥＧＹＱＤＹＥＰＥＡ
【0081】
配列番号１８：
ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫ ＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥ ＫＴＫＱＧＶＡＥＡＡ ＧＫＴＫＥＧＶＬＹＶ ＧＳＫＴＫＥＧＶＶＨ ＧＶＡＴＶＡＥＫＴＫ ＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶ ＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫ ＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡ ＡＴＧＦＶＫＫＤＱＬ ＧＫＮＥＥＧＡＰＱＥ ＧＩＬＥＤＭＰＶＤＰ ＤＮＥＡＹＥＭＰＳＥ ＥＧＹＱＤＹＥＰＥＡ ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ
ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫ ＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥ ＫＴＫＱＧＶＡＥＡＡ ＧＫＴＫＥＧＶＬＹＶ ＧＳＫＴＫＥＧＶＶＨ ＧＶＡＴＶＡＥＫＴＫ ＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶ ＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫ ＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡ ＡＴＧＦＶＫＫＤＱＬ ＧＫＮＥＥＧＡＰＱＥ ＧＩＬＥＤＭＰＶＤＰ ＤＮＥＡＹＥＭＰＳＥ ＥＧＹＱＤＹＥＰＥＡ ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ
【0082】
配列番号１９：
ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫ ＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥ ＫＴＫＱＧＶＡＥＡＡ ＧＫＴＫＥＧＶＬＹＶ ＧＳＫＴＫＥＧＶＶＨ ＧＶＡＴＶＡＥＫＴＫ ＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶ ＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫ ＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡ ＡＴＧＦＶＫＫＤＱＬ ＧＫＮＥＥＧＡＰＱＥ ＧＩＬＥＤＭＰＶＤＰ ＤＮＥＡＹＥＭＰＳＥ ＥＧＹＱＤＹＥＰＥＡ
ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫ ＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥ ＫＴＫＱＧＶＡＥＡＡ ＧＫＴＫＥＧＶＬＹＶ ＧＳＫＴＫＥＧＶＶＨ ＧＶＡＴＶＡＥＫＴＫ ＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶ ＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫ ＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡ ＡＴＧＦＶＫＫＤＱＬ ＧＫＮＥＥＧＡＰＱＥ ＧＩＬＥＤＭＰＶＤＰ ＤＮＥＡＹＥＭＰＳＥ ＥＧＹＱＤＹＥＰＥＡ
【0083】
いくつかの態様では、方法は、モノマーα－ｓｙｎタンパク質を標識された形態で提供することを含み得る。標識されたモノマーα－ｓｙｎタンパク質は、保存的変異体と見なされ得る。標識された形態のモノマーα－ｓｙｎタンパク質は、共有結合的に組み込まれた放射性アミノ酸、共有結合的に組み込まれた同位体的標識アミノ酸、共有結合的に組み込まれたフルオロフォアなどのうちの１つ以上を含み得る。したがって、可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の検出は、ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の増幅部分に組み込まれた標識形態のモノマーα－ｓｙｎタンパク質を検出することを含み得る。
【0084】
インキュベーション条件
方法は、生物学的試料をモノマーα－ｓｙｎタンパク質、および１ｍｍ～５ｍｍ、２．３ｍｍ超～５ｍｍ、３ｍｍ超～５ｍｍ、２．３８ｍｍ、または２．４５ｍｍの平均直径を有する１つ以上のビーズと接触させて、インキュベーション混合物を形成すること、およびインキュベーション混合物をインキュベートして、モノマーα－ｓｙｎタンパク質および生物学的試料の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎからミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体を形成することを含む。本明細書で使用される「接触させる」とは、様々な薬剤を近接させて、かつそれらが相互作用して所望の効果が生じ得る条件下に置くことを指す。例えば、生物学的試料をモノマーα－ｓｙｎタンパク質と接触させることにより、モノマーα－ｓｙｎタンパク質が、生物学的試料中に存在する任意の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質と相互作用し、それによってモノマーα－ｓｙｎタンパク質の凝集を刺激することが可能になる。
方法は、生物学的試料をモノマーα－ｓｙｎタンパク質、および１ｍｍ～５ｍｍ、２．３ｍｍ超～５ｍｍ、３ｍｍ超～５ｍｍ、２．３８ｍｍ、または２．４５ｍｍの平均直径を有する１つ以上のビーズと接触させて、インキュベーション混合物を形成すること、およびインキュベーション混合物をインキュベートして、モノマーα－ｓｙｎタンパク質および生物学的試料の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎからミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体を形成することを含む。本明細書で使用される「接触させる」とは、様々な薬剤を近接させて、かつそれらが相互作用して所望の効果が生じ得る条件下に置くことを指す。例えば、生物学的試料をモノマーα－ｓｙｎタンパク質と接触させることにより、モノマーα－ｓｙｎタンパク質が、生物学的試料中に存在する任意の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質と相互作用し、それによってモノマーα－ｓｙｎタンパク質の凝集を刺激することが可能になる。
【0085】
ミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体を形成するためのインキュベーション条件には、様々な可変因子、例えばビーズの種類および数、モノマーα－ｓｙｎタンパク質の同一性および濃度、インキュベーションの実施に使用される容器の種類、温度、ｐＨ、緩衝組成物、塩濃度またはイオン強度、ならびにインキュベーションに使用される液体培地の他の特性が含まれる。インキュベーション混合物中にビーズを含めると、モノマーα－ｓｙｎタンパク質による自己凝集も回避するより速い条件下でインキュベーションを起こすことが可能になる。
【0086】
インキュベーション混合物は、様々な異なる濃度のモノマーα－ｓｙｎタンパク質を含むことができる。ビーズを含めることにより、ＰＭＣＡアッセイを実施するために必要なモノマーα－ｓｙｎタンパク質基質の濃度を低下させることができる。いくつかの態様では、インキュベーション混合物は、モノマーα－ｓｙｎタンパク質を、約５００ ｎＭ～約５００μＭ；約１μＭ～約２００μＭ；約５μＭ～約１００μＭ；約１０μＭ～約５０μＭ；約６５μＭ；約１０μＭ～約３０μＭ；１０μＭ超かつ３０μＭ未満；約２０μＭ；約１９．６μＭ；または１９．６μＭの濃度または濃度範囲で含み得る。
【0087】
インキュベーション混合物は、様々な緩衝組成物を含むことができる。緩衝組成物は、インキュベーション混合物のｐＨを約ｐＨ５～約ｐＨ９、約ｐＨ６～約ｐＨ８、約ｐＨ６～約ｐＨ７、約ｐＨ７～約ｐＨ８、約ｐＨ７、約ｐＨ７．４、約ｐＨ６．２～約ｐＨ６．５（ｐＨ６．３、６．４および６．５を含む）の範囲に維持するのに有効である。いくつかの態様では、インキュベーション混合物は、緩衝液Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、およびＨＥＰＥＳの１つ以上を含む。いくつかの態様では、インキュベーション緩衝液は、約１００ｍＭ、約５００ｍＭ、約６００ｍＭおよび約７００ｍＭの濃度のＰＩＰＥＳを含む。
【0088】
いくつかの態様では、インキュベーション混合物は、所与の濃度の塩を含む。塩は、例えば、蛍光検出におけるシグナルノイズ比を増強することができる。一態様では、塩はＮａＣｌを含む。他の適切な塩としては、ＫＣｌが挙げられ得る。一態様では、塩、例えばＮａＣｌは、約５０ｍＭ～約１，０００ｍＭ、約５０ｍＭ～約５００ｍＭ、約５０～約１５０ｍＭ、約１５０ｍＭ～約５００ｍＭ、約５０ｍＭ、約１５０ｍＭ、約３００ｍＭ、約５００ｍＭ、約６００ｍＭ、または約７００ｍＭの濃度で存在してもよい。一態様では、塩、例えばＮａＣｌは、約５００ｍＭの濃度で存在する。
【0089】
一態様では、インキュベーション混合物は、界面活性剤または洗浄剤、例えばＳＤＳを排除する。
【0090】
様々な温度がインキュベーションサイクルの実施に適している。℃単位の温度でのインキュベーション混合物の温度は、各インキュベーションサイクルで、独立して約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、または前述の値のいずれか２つの間の範囲、例えば、約１５℃～約５０℃、または約２５℃～約４５℃、または約３０℃～約４２℃であり得る。いくつかの態様では、インキュベーションは、温血動物のほぼ正常の生理学的温度で行われる。さらなる態様では、インキュベーション混合物のインキュベーションは、約３５℃～約４０℃または約３７℃～約４２℃の温度で行われる。
【0091】
インキュベーション混合物は、１つ以上のビーズを含む。ビーズは、典型的には小さい球形の物体、例えば、ベアリングビーズとして一般的に使用される低摩擦表面を有する高密度ビーズである。インキュベーション混合物にビーズを含めると、モノマーα－ｓｙｎタンパク質、および生物学的試料の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎからのミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体の形成速度が増加する。これらのビーズは、既知の濃縮および／または免疫枯渇工程で使用される抗体被覆磁性または常磁性のビーズまたは粒子（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）と区別されるべきである。例えば、米国特許公開第２０１６／００７７１１１号を参照されたい。
【0092】
ビーズは、様々な生物学的に不活性な材料から形成することができる。いくつかの態様では、ビーズは合成または天然ポリマーから形成され、他の態様では、ビーズは鉱物、セラミック、ガラスまたは金属から形成される。ビーズは均質であってもよく、または異なる材料から作製されたコアを含んでもよい。合成ポリマーの例としては、アクリルポリマー、ポリアミド、ポリイミド、ポリエステル、ポリエーテル、ポリマービニル化合物、ポリアルケン、およびそれらの置換誘導体、ならびに２つ以上のそのようなポリマーを含むコポリマーが挙げられる。特定の合成ポリマーの例としては、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリメチルメタクリレートなどが挙げられる。天然ポリマーの例としては、アガロースなどの炭水化物系ポリマーが挙げられる。
【0093】
いくつかの態様では、ポリマーは、鉱物、セラミック、ガラス、または金属などの非ポリマー材料を含む。ビーズ用の非ポリマー材料のより具体的な例としては、酸化ジルコニウム、シリカ／ジルコニウム、シリカ、ガラス、ホウケイ酸ガラス、石英、鋼、チタン、炭化タングステン、炭化ケイ素、およびＳｉ３Ｎ４が挙げられる。いくつかの態様では、アッセイに存在するバックグラウンド蛍光を低減するために、Ｓｉ３Ｎ４などのより暗い色相を有する材料を使用することが適切であり得る。
【0094】
いくつかの態様では、ビーズは、Ｓｉ３Ｎ４を含むか、本質的にＳｉ３Ｎ４からなるか、またはＳｉ３Ｎ４からなる。いくつかの態様では、ビーズは、ホウケイ酸ガラスを含むか、本質的にホウケイ酸ガラスからなるか、またはホウケイ酸ガラスからなる。一態様では、ジルコニウム／シリカビーズは除外される。一態様では、ホウケイ酸ガラスビーズ以外のガラスビーズは除外される。一態様では、鋼ビーズは除外される。一態様では、ポリスチレンビーズは除外される。
【0095】
ビーズのサイズは、タンパク質凝集速度を増加させるその能力に有意な影響を及ぼし得る。いくつかの実施形態では、インキュベーション混合物に含まれるビーズは、０．５ｍｍを超える平均直径を有し得る。いくつかの態様では、ビーズは、０．５ｍｍ超～約１０ｍｍの平均直径を有する。いくつかの態様では、ビーズは、０．５ｍｍ超～約５ｍｍの平均直径を有する。さらなる態様では、ビーズは、０．５ｍｍ超～約３．５ｍｍの範囲の平均直径を有する。いくつかの態様では、ビーズは約１．０～約１０ｍｍの平均直径を有するが、追加の態様では、ビーズは約１．０ｍｍ～約５ｍｍの平均直径を有する。さらなる態様では、ビーズは、１．０ｍｍ超～約３．５ｍｍの範囲の平均直径を有する。いくつかの態様では、ビーズは２．３８～約１０ｍｍの平均直径を有するが、追加の態様では、ビーズは２．３８ｍｍ～約５ｍｍの平均直径を有する。さらなる態様では、ビーズは、約２．３ｍｍ以上～約３．５ｍｍ、約２．３８～約３．５ｍｍ、または約２．４５ｍｍ～約３．５ｍｍの範囲の平均直径を有する。さらなる態様では、ビーズは、約１ｍｍ～約５ｍｍ、２．３ｍｍ超～約５ｍｍ、３ｍｍ超～約５ｍｍ、約２．３８ｍｍ、または約２．４５ｍｍの平均直径を有し得る。いくつかの態様では、ビーズは、Ｓｉ３Ｎ４を含むか、本質的にＳｉ３Ｎ４からなるか、またはＳｉ３Ｎ４からなり、２．３８ｍｍの平均直径を有し、ＢＳＡでブロッキングされる。いくつかの態様では、ビーズは、ホウケイ酸ガラスを含むか、本質的にホウケイ酸ガラスからなるか、またはホウケイ酸ガラスからなり、２．４５ｍｍの平均直径を有し、ブロッキングされない。いくつかの態様では、２．３ｍｍ以下の平均直径を有するビーズは、本発明から除外される。いくつかの態様では、２．３ｍｍ以下の平均直径を有するガラスビーズは、本発明から除外される。いくつかの態様では、３ｍｍ以下の平均直径を有するガラスビーズは、本発明から除外される。ビーズのサイズ分布は、ビーズの９０％超が平均ビーズ直径の８０～１２０％の間、または平均ビーズ直径の９０～１１０％の間にあるように定義される。
【0096】
インキュベーション混合物に含まれるビーズの数は、インキュベーション混合物のサイズに応じて変更してもよい。いくつかの態様では、インキュベーション混合物は複数のビーズを含む。いくつかの態様では、インキュベーションは、インキュベーション混合物２００μＬあたり１つのビーズを含む。さらなる態様では、インキュベーション混合物は、１～１０個、１～２０個、１～１００個、５～５０個、２０～１００個または５０～５００個のビーズを含む。いくつかの態様では、インキュベーション混合物は単一のビーズを含む。
【0097】
いくつかの態様では、１つ以上のビーズの表面はタンパク質で「ブロッキングされる」。ビーズの表面をタンパク質でブロッキングすることは、ビーズの表面の全部または相当な部分の上にコーティングまたは層を提供することを指す。任意の適切な生体適合性タンパク質を使用して、ビーズの表面をコーティングすることができる。ビーズの表面のブロッキングでの使用に適したタンパク質は、ＢＳＡなどのアルブミンである。他の適切なブロッキングタンパク質としては、カゼインまたは粉乳が挙げられ得る。１つ以上のビーズは、１つ以上のビーズをタンパク質を含む溶液に浸漬することによってブロッキングすることができる。溶液は、ＰＩＰＥＳ、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳおよびＨＥＰＥＳなどの水溶液および／または緩衝溶液であり得る。
【0098】
インキュベーション混合物は、適切なサイズの容器、例えば試験管内に保持される。適切な滅菌インキュベーション容器は、当業者に知られている。いくつかの態様では、インキュベート混合物は、複数のウェルを含むマルチウェルプレートに収容される。例えば、マルチウェルプレートは、９６個のウェルを含むことができる。マルチウェルプレートのウェルは、１００～１０００μＬ、１５０～７５０μＬ、または２００～３５０μＬの容積を有することができる。一態様では、例えばビーズがＳｉ３Ｎ４ビーズである場合では、容器は黒色底部９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ ３９１６）である。一態様では、例えばビーズがホウケイ酸ガラスビーズである場合では、容器は透明底部９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ ３６０３）である。
【0099】
いくつかの態様では、マルチウェルプレートの各ウェルは単一のビーズを含む。そのような態様の１つでは、マルチウェルプレートは、図１６に示すビーズ分配装置１０などのビーズ分配装置と共に使用することができる。装置１０は、例えばＥＬＩＳＡなど、マルチウェルプレート中のビーズを用いて実施される任意のアッセイ、または本明細書に記載および／もしくは特許請求されるものなどのＰＭＣＡアッセイにおいて使用することができる。図示の例では、装置１０は、トレイ１２、ゲート１４、およびレセプタクルプレート１８を含む。ゲート１４は、図１７および図１８に示すように、トレイ１２およびレセプタクルプレート１８に対して移動可能である。これにより、図２１～図２３に示すように、球状ビーズ２０、例えば２．３ｍｍ超の平均直径を有するＳｉ３Ｎ４ビーズをトレイ１２に充填し、レセプタクルプレート１８に個別に分配することが可能になる。
【0100】
図示例中のトレイ１２は、概して長方形であり、対向する側面３０、３２は、対向する端部３４、３６の間で長手方向に伸びている。トレイ１２の側面３０、３２および端部３４、３６は、周壁４０の対応する部分によって画定される。パネル４２は、取り囲む周壁４０内のトレイ１２の長さおよび幅全体に及ぶ。パネル４２は、ビーズ開口４９の配列を含む水平な上面４６を有する。ビーズ開口４９は、パネル４２を貫通している。所与の例では、図１７および図１８に見られるように、平行な行および列の８×１２の配列に９６個のビーズ開口４９がある。ビーズ出口５１は、周壁４０の角を貫通している。スロット５３は、周壁４０の１つ目の端部３４を貫通している。
【0101】
ゲート１４は、長方形のカードとして構成されている。スロット６１は、ゲート１４を貫通し、トレイ１２のビーズ開口４９の列と一致するように配置される。したがって、図示の例は、ゲート１４を貫通する１２個の平行なスロット６１を有する。スロット６１は、各々が一対の隣接するスロット６１の間に位置するゲート１４の遮断部６４によって離間されている。
【0102】
レセプタクルプレート１８は、トレイ１２のビーズ開口の配列に対応するウェル７１の配列を有する。この例では、レセプタクルプレート１８は、ウェル７１が８×１２配列に配置されている既知の構成を有する、標準的な９６ウェルＥＬＩＳＡプレートである。
【0103】
使用の際に、トレイ１２を図１９に示すようにレセプタクルプレート１８の上に配置する。次いで、トレイ１２のビーズ開口４９を、レセプタクルプレート１８のウェル７１上に垂直に合わせる。周壁４０の下側スカート部分７６は、レセプタクルプレート１８の肩部分７８上に載置される。スカート７６は、パネル４２がレセプタクルプレート１８から上方に離間した位置でトレイ１２を支持する。これは、ゲート１４が周壁４０の１つ目の端部３４のスロット５３を通って挿入されるための空間を提供する。挿入されたゲート１４は、パネル４２とレセプタクルプレート１８との間に垂直に介在する。使用者は、ゲート１４をスロット５３の内側および外側にスライドさせて、図１７および図１８の位置の間でゲート１４を前後に動かすことができる。パネル４２は、図１７および図１８に示すように、パネル４２を通してゲート１４を見ることができるように、透明材料で形成することができる。
【0104】
ゲートが図１７の位置にある場合、ゲート１４の各遮断部６４は、図２０に示すように、トレイ１２のビーズ開口４９の対応する列の下に位置する。使用者は、不確定数のコーティングされたビーズ２０をトレイ１２上に注ぐことができ、その結果、ビーズ２０は開口４９の間でパネル４２の上面４６にわたって自由に転がり、ビーズ２０の一部は、図２１に示すように上面４６から開口４９内に転がる。図示の例では、各ビーズ開口４９は、単一のビーズ２０のみを受け入れるようなサイズになっている。次いで、使用者は、トレイ１２を持ち上げて傾け、過剰なビーズ２０を周壁４０の出口通路５１を通して上面４６から転がして出すことができる。したがって、トレイ１２には、図２２に示すようにビーズ２０が充填される。使用者がゲート１４を図１８の位置まで内側にスライドさせると、図２３に示すように、ゲート１４のスロット６１がトレイ１２の開口４９の下に移動する。次いで、ビーズ２０は開口４９からスロット６１を通ってウェル７１内に落下し、各ウェル７１は単一のビーズ２０のみを受容する。
【0105】
出口開口５１を通して過剰なビーズを除去することは、ゲート１４が図１８および図２３の位置に移動したときに、単一のビーズ２０のみが各ウェル７１に落下されることを確保するのに役立つ。ビーズ２０とゲート１４との間の色のコントラストを有する透明なトレイパネル４２はまた、単一のビーズ２０のみの沈着を確実にするのに役立つ。例えば、装置１０は、透明パネル４２を通して見える白色ゲート１４を含んで、より暗い色相のビーズ２０をより明確に表示することができる。
【0106】
ビーズが適所に配置されたら、インキュベーション混合物を十分な時間インキュベートして、モノマーα－ｓｙｎタンパク質、および生物学的試料の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎからミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体を形成する。インキュベーション混合物をインキュベートしてミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体を形成した後、サイクルを繰り返す前に、インキュベーション混合物の少なくとも一部を脱凝集させる。
【0107】
本明細書で使用される場合、ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の凝集体は、可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質を含むタンパク質の非共有結合性会合を指す。ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の凝集体は、「脱凝集」、破壊、または粉砕されて、より小さな断片または凝集体、例えば可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質および断片化されたフィブリルを放出することができる。ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質凝集体種子の集合体の触媒活性は、混合物中の種子の数に少なくとも部分的に比例し得る。したがって、混合物中のミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の凝集体を粉砕して可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質および断片化フィブリル種子を放出すると、モノマーα－ｓｙｎタンパク質の凝集のための触媒活性の増加につながり得る。
【0108】
いくつかの態様では、インキュベーション混合物の脱凝集は、振盪、超音波処理、撹拌、凍結／解凍、レーザー照射、オートクレーブインキュベーション、高圧、均質化などから選択される１つ以上の種類の物理的粉砕を含み得る。振盪は、軌道撹拌などの周期的撹拌を含み得る。周期的攪拌は、約５０回転／分（ＲＰＭ）～１０，０００ＲＰＭで行われてもよい。周期的攪拌は、約２００ＲＰＭ～約２０００ＲＰＭで行われてもよい。周期的攪拌は、約６００～８００ＲＰＭで行われてもよい。インキュベーション混合物の脱凝集は、各インキュベーションサイクル後に１回、約５秒～約１０分間、約３０秒～約１分間、約４５秒～約１分間、約１分間等、行ってもよい。
【0109】
インキュベーション混合物をインキュベートする工程および脱凝集する工程は、試料の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎを増幅して検出可能な量のミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体を得るのに十分な回数繰り返される。インキュベーション混合物をインキュベートし、次いでインキュベーション混合物を脱凝集する２つの工程は、本明細書ではインキュベーションサイクルと呼ばれる。インキュベーションサイクルは、約２回～約１０００回、約５回～約５００回、約５０回～約５００回、約１５０回～約２５０回等、繰り返されてもよい。インキュベーションサイクルの最終回では、インキュベーション混合物を分析する前に脱凝集工程を省略することが好ましい場合がある。
【0110】
インキュベーションサイクルは、約１分～約５時間、約１０分～約２時間、約１５分～約１時間、約２５分～約４５分などの時間行われてもよい。いくつかの態様では、インキュベーション混合物をインキュベートすること、およびミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体の少なくとも一部を脱凝集させることは、０．３～１時間続くインキュベーションサイクルを含む。各インキュベーションサイクルは、約１分～約５時間のインキュベーションおよび約５秒～約１０分の脱凝集；約１０分～約２時間のインキュベーションおよび約３０秒～約１分の脱凝集；約１５分～約１時間のインキュベーションおよび約４５秒～約１分の脱凝集；約２５分～約４５分のインキュベーションおよび約４５秒～約１分の脱凝集；ならびに約１分のインキュベーションおよび約１分の物理的粉砕、の１つ以上でインキュベーション混合物を独立してインキュベートおよび脱凝集することを含み得る。
【0111】
生物学的試料
本明細書に記載の方法の態様は、対象から生物学的試料を得る工程を含み得る。本明細書で使用される「生物学的試料」は、ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の検出のための分析に適した、対象からの任意の生物学的試料を含むことを意味する。適切な生物学的試料としては、体液、例えば血液関連試料（例えば、全血、血清、血漿、および他の血液由来試料）、尿、痰、唾液、尿、ＣＳＦなどが挙げられるが、これらに限定されない。生物学的試料の別の例は、組織試料である。α－ｓｙｎタンパク質は定量的または定性的に評価することができ、検出はインビトロまたはエクスビボのいずれかで決定することができる。
本明細書に記載の方法の態様は、対象から生物学的試料を得る工程を含み得る。本明細書で使用される「生物学的試料」は、ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の検出のための分析に適した、対象からの任意の生物学的試料を含むことを意味する。適切な生物学的試料としては、体液、例えば血液関連試料（例えば、全血、血清、血漿、および他の血液由来試料）、尿、痰、唾液、尿、ＣＳＦなどが挙げられるが、これらに限定されない。生物学的試料の別の例は、組織試料である。α－ｓｙｎタンパク質は定量的または定性的に評価することができ、検出はインビトロまたはエクスビボのいずれかで決定することができる。
【0112】
方法は、生物学的試料を準備することまたは対象から得ることを含む。いくつかの態様では、方法は、対象から生物学的試料を得る工程を含む。生物学的試料は、針刺し、針生検、スワブなどを含む任意の公知の手段によって得ることができる。例示的な方法では、生物学的試料はＣＳＦ試料であり、例えば、針をくも膜下腔に挿入し、次いでＣＳＦを抽出する腰椎穿刺によって得ることができる。
【0113】
いくつかの態様では、本発明の方法は、提供される生物学的試料に対して実施される。生物学的試料は、新鮮であっても貯蔵されてもよい。生物学的試料は、適切な組織保存条件下で貯蔵または保存され得るか、貯蔵または保存された。生物学的試料は、本明細書に記載のアッセイのために明示的に得られた生物学的試料、または本明細書に記載のアッセイのためにサブサンプリングされ得る別の目的のために得られた試料であり得る。好ましくは、生物学的試料は、それらが貯蔵される場合、試料の劣化を防ぐために収集直後に冷却または凍結される。例えば、ＣＳＦ試料をポリプロピレンチューブに－８０℃で貯蔵することができる。ＣＳＦ試料は、液体窒素中で（「スナップ凍結」）、または試料を－８０℃に保たれた環境（例えば、冷蔵室または冷凍庫）に置くことによって凍結され得る。
【0114】
生物学的試料は、必要に応じて適切な緩衝溶液中での希釈によって前処理されても、要望に応じて濃縮されても、または任意の数の方法、例えば、限定されないが超遠心分離、高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）もしくはＨＰＬＣによる分画、または硫酸デキストランによるタンパク質の沈殿または他の方法によって分画されてもよい。生理学的ｐＨのいくつかの標準的な緩衝水溶液、例えばホスファート、Ｔｒｉｓなどのいずれかを使用することができる。
【0115】
対象
用語「個体」、「対象」、および「患者」は、対象が任意の形態の治療を受けるか、または現在受けているかに関係なく、本明細書では互換的に使用される。本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、一般に、哺乳動物を含むがこれに限定されない任意の脊椎動物を指す。哺乳動物の例としては、サルおよびヒトを含む霊長類、ウマ科動物（例えば、ウマ）、イヌ科動物（例えば、イヌ）、ネコ科動物、様々な家畜（例えば、ブタ（ｓｗｉｎｅ）、ブタ（ｐｉｇ）、ヤギ、ヒツジなどの有蹄動物）、ならびに飼育ペット（例えば、ネコ、ハムスター、マウスおよびモルモット）が挙げられる。ヒト対象由来の生物学的試料の分析は特に興味深い。
用語「個体」、「対象」、および「患者」は、対象が任意の形態の治療を受けるか、または現在受けているかに関係なく、本明細書では互換的に使用される。本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、一般に、哺乳動物を含むがこれに限定されない任意の脊椎動物を指す。哺乳動物の例としては、サルおよびヒトを含む霊長類、ウマ科動物（例えば、ウマ）、イヌ科動物（例えば、イヌ）、ネコ科動物、様々な家畜（例えば、ブタ（ｓｗｉｎｅ）、ブタ（ｐｉｇ）、ヤギ、ヒツジなどの有蹄動物）、ならびに飼育ペット（例えば、ネコ、ハムスター、マウスおよびモルモット）が挙げられる。ヒト対象由来の生物学的試料の分析は特に興味深い。
【0116】
いくつかの態様では、対象は、ＰＤを発症するリスク、ＰＤを有するリスクがあるか、またはＰＤについて治療中であり得、α－ｓｙｎの調節不全、ミスフォールディング、凝集、または沈着に関連する疾患、例えばＭＳＡ、ＬＢＤ、またはＰＡＦを有するリスクがあり得、α－ｓｙｎの調節不全、ミスフォールディング、凝集または沈着に関連する疾患を有し得、α－ｓｙｎの調節不全、ミスフォールディング、凝集または沈着に関連する疾患の治療中などであり得る。別の実施形態では、対象は、アルツハイマー病を発症するリスクがあり得るか、またはα－ｓｙｎの調節不全、ミスフォールディング、凝集または沈着、ならびにＡベータおよびタウなどの他のミスフォールドタンパク質種の凝集体に関連する神経変性疾患を発症するリスクがあり得る。
【0117】
可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の存在を決定する
方法は、検出可能な量のミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体が生物学的試料中に存在するかどうかを決定することを含み得る。ミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体の検出は、生物学的試料中の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎの存在を示す。ミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体を検出するプロセスは、各インキュベーションサイクル中または後に行うことができ、または所定数のインキュベーションサイクルの完了時に行うことができる。
方法は、検出可能な量のミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体が生物学的試料中に存在するかどうかを決定することを含み得る。ミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体の検出は、生物学的試料中の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎの存在を示す。ミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体を検出するプロセスは、各インキュベーションサイクル中または後に行うことができ、または所定数のインキュベーションサイクルの完了時に行うことができる。
【0118】
いくつかの態様では、方法は、インキュベーション混合物をタンパク質凝集指示薬と接触させて、検出可能な量のミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体がインキュベーション混合物中に存在するかどうかを決定する工程を含む。タンパク質凝集指示薬は、ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質凝集体の存在下で表示状態を、ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質凝集体の非存在下で非表示状態を提示することを特徴とし得る。生物学的試料の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の存在を決定することは、ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質凝集体の指示薬の表示状態を検出することを含み得る。指示薬の表示状態および指示薬の非表示状態は、特定の指示薬に応じた蛍光、光吸収、または放射能の差異によって特徴付けることができる。生物学的試料中の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の存在を決定する工程は、使用される特定の指示薬に応じて蛍光、光吸収、または放射能の差異を検出する工程を含み得る。
【0119】
いくつかの態様では、方法は、モル過剰のタンパク質凝集指示薬を、インキュベーション混合物または検出混合物の一方または両方に接触させることを含み得る。モル過剰は、インキュベーション混合物中のα－ｓｙｎタンパク質モノマーおよび可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の総モル量よりも多くてもよい。
【0120】
いくつかの態様では、タンパク質凝集指示薬は、ＴｈＴ、コンゴレッド、ｍ－Ｉ－スチルベン、クリサミンＧ、ＰＩＢ、ＢＦ－２２７、Ｘ－３４、ＴＺＤＭ、ＦＤＤＮＰ、ＭｅＯ－Ｘ－０４、ＩＭＰＹ、ＮＩＡＤ－４、発光共役ポリチオフェン、緑色蛍光タンパク質および黄色蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質との融合物、それらの誘導体などのうちの１つ以上を含み得る。適切なタンパク質凝集指示薬は、ＴｈＴである。
【0121】
様々な異なる方法を使用して、可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質を検出することができる。これらには、ウエスタンブロットアッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＴｈＴ結合アッセイ、コンゴレッド結合アッセイ、沈降アッセイ、電子顕微鏡法、原子間力顕微鏡法、表面プラズモン共鳴、分光法などの使用が含まれる。ＥＬＩＳＡは、両側サンドイッチＥＬＩＳＡを含み得る。分光法は、準光散乱分光法、マルチスペクトル紫外線分光法、共焦点二色蛍光相関分光法、フーリエ変換赤外分光法、分光検出を備えたキャピラリー電気泳動、電子スピン共鳴分光法、核磁気共鳴分光法、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）分光法などのうちの１つ以上を含み得る。
【0122】
いくつかの態様では、可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質を検出することは、検出混合物をプロテアーゼ、例えばプロテアーゼＫまたはサーモリシンと接触させることを含む。可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質は、ウエスタンブロットアッセイまたはＥＬＩＳＡのいずれかを使用して、配列ベースまたは抗ミスフォールドタンパク質の抗体を使用して検出することができる。
【0123】
いくつかの態様では、生物学的試料中の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の存在を決定することは、生物学的試料中の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の量を決定することを含む。試料中の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の量は、対照試料と比較して決定され得る。生物学的試料中の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の量は、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、および１００％の少なくとも約１つまたは複数の感度および特異性で検出され得る。検出される試料中の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の量は、１００ｎｍｏｌ、１０ｎｍｏｌ、１ｎｍｏｌ、１００ｐｍｏｌ、１０ｐｍｏｌ、１ｐｍｏｌ、１００ｆｍｏｌ、１０ｆｍｏｌ、３ｆｍｏｌ、１ｆｍｏｌ、１００ａｔｔｏｍｏｌ、１０ａｔｔｏｍｏｌ、および１ａｔｔｏｍｏｌの約１つ未満または複数であり得る。試料中の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の量は、モノマーα－ｓｙｎタンパク質に対するモル比で検出され得る。
【0124】
可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎは、分析装置、例えばキット、または携帯型もしくは定置型のいずれかであり得る従来の実験装置などによって検出または測定することができる。いくつかの態様では、可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎのレベルは、検出される可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎの量を定量化するための分析を実施する際に、１つまたは複数の試料中の対応する内部標準のレベルと比較することができる。
【0125】
可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎの存在および／またはレベルが決定されると、それは様々な方法で表示することができる。例えば、レベルは、数値もしくは比例棒（すなわち、棒グラフ）、または当業者に知られている任意の他の表示方法として表示器上にグラフィック表示することができる。グラフィック表示は、評価されている生物学的試料中の分散の量の視覚的表現を提供することができる。
【0126】
可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎの濃縮
いくつかの態様では、方法は、試料、インキュベーション混合物および検出混合物の１つ以上の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質を選択的に濃縮することを含み得る。いくつかの態様では、方法は、可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎに特異的に結合する抗体を使用して生物学的試料をインキュベートする前に、試料中の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎを濃縮する工程をさらに含む。可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質を選択的に濃縮することは、インキュベーション混合物を形成する前に生物学的試料を前処理することを含み得る。可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質を選択的に濃縮する工程は、インキュベーション混合物をインキュベートする前にインキュベーション混合物を前処理することを含み得る。可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質を選択的に濃縮する工程は、インキュベーション混合物を可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎに特異的に結合する抗体と接触させて、捕捉された可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質を形成することを含み得る。
いくつかの態様では、方法は、試料、インキュベーション混合物および検出混合物の１つ以上の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質を選択的に濃縮することを含み得る。いくつかの態様では、方法は、可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎに特異的に結合する抗体を使用して生物学的試料をインキュベートする前に、試料中の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎを濃縮する工程をさらに含む。可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質を選択的に濃縮することは、インキュベーション混合物を形成する前に生物学的試料を前処理することを含み得る。可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質を選択的に濃縮する工程は、インキュベーション混合物をインキュベートする前にインキュベーション混合物を前処理することを含み得る。可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質を選択的に濃縮する工程は、インキュベーション混合物を可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎに特異的に結合する抗体と接触させて、捕捉された可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質を形成することを含み得る。
【0127】
抗体は、抗体の相補性決定領域の生物学的分析物のエピトープへの親和性の結果としての、特異的結合のために設計される。抗体は、抗体が標的構造またはそのサブユニットに優先的に結合するが、標的構造ではない生物学的分子には実質的により低い程度で結合するかまたは結合しない場合、「特異的に結合する」。いくつかの態様では、抗体は、１０－８Ｍ～１０－１１Ｍの特異的親和性で可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎに特異的に結合する。いくつかの態様では、抗体または抗体断片は、１０－７Ｍ超、１０－８Ｍ超、１０－９Ｍ超、１０－１０Ｍ超、または１０－１１Ｍ、１０－８Ｍ－１０－１１Ｍ、１０－９Ｍ－１０－１０Ｍ、および１０－１０Ｍ－１０－１１Ｍの特異的親和性で可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎに結合する。一態様では、特異的活性は、Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ（１９９４）に記載されている競合結合アッセイを使用して測定される。分子生物学における現行のプロトコルＣｈｉｃｈｅｓｔｅｒ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（「Ａｕｓｕｂｅｌ」）、参照によって本明細書に組み込まれている。
【0128】
可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎに特異的に結合する抗体は、α／β－ｓｙｎ Ｎ－１９；α－ｓｙｎ Ｃ－２０－Ｒ；α－ｓｙｎ ２１１；α－ｓｙｎ Ｓｙｎ ２０４；α－ｓｙｎ ２Ｂ２Ｄ１；α－ｓｙｎ ＬＢ ５０９；α－ｓｙｎ ＳＰＭ４５１；α－ｓｙｎ ３Ｇ２８２；α－ｓｙｎ ３Ｈ２８９７；α／β－ｓｙｎ Ｓｙｎ ２０２；α／β－ｓｙｎ ３Ｂ６；α／β／γ－ｓｙｎ ＦＬ－１４０などのうちの１つ以上を含み得る。１つ以上のα－ｓｙｎ特異的抗体は、α／β－ｓｙｎ Ｎ－１９；α－ｓｙｎ Ｃ－２０－Ｒ；α－ｓｙｎ ２１１；α－ｓｙｎ Ｓｙｎ ２０４などのうちの１つ以上を含み得る。そのような抗体は、以下の通り入手することができる：α／β－ｓｙｎ Ｎ－１９（カタログ番号ＳＣ－７０１２、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｄａｌｌａｓ，Ｔｅｘ）；α－ｓｙｎ Ｃ－２０－Ｒ（ＳＣ－７０１１－Ｒ）；α－ｓｙｎ ２１１（ＳＣ－１２７６７）；α－ｓｙｎ Ｓｙｎ ２０４（ＳＣ－３２２８０）；α－ｓｙｎ ２Ｂ２Ｄ１（ＳＣ－５３９５５）；α－ｓｙｎ ＬＢ ５０９（ＳＣ－５８４８０）；α－ｓｙｎ ＳＰＭ４５１（ＳＣ－５２９７９）；α－ｓｙｎ ３Ｇ２８２（ＳＣ－６９９７８）；α－ｓｙｎ ３Ｈ２８９７（ＳＣ－６９９７７）；α／β－ｓｙｎ Ｓｙｎ ２０２（ＳＣ－３２２８１）；α／β－ｓｙｎ ３Ｂ６（ＳＣ－６９６９９）；およびα／β／γ－ｓｙｎ ＦＬ－１４０（ＳＣ－１０７１７）。１つ以上のα－ｓｙｎ特異的抗体は、α－ｓｙｎのアミノ酸配列に特異的な抗体および可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の立体配座に特異的な抗体の１つ以上を含み得る。１つ以上のα－ｓｙｎ特異的抗体は、固相に結合され得る。
【0129】
固相は、常磁性粒子（例えば、酸化鉄）およびマルチウェルプレートのうち１つ以上を含み得る。例えば、ＥＬＩＳＡプレートを、生物学的試料からα－ｓｙｎを捕捉するために使用される抗体でコーティングすることができる。抗体コーティングＥＬＩＳＡプレートを生物学的試料とインキュベートしてもよく、未結合材料を洗い流してもよく、濃縮試料に対してＰＭＣＡ反応を行ってもよい。抗体は、粒子（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）にも結合され得る。粒子を患者試料とインキュベートし、生物学的試料の残りの部分からα－ｓｙｎ－抗体複合体を分離するために使用することができる。
【0130】
いくつかの態様では、生物学的試料中の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎを濃縮する方法は、超遠心分離を含み得る。可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎは、高速遠心分離を使用して生物学的試料からペレット化することができる。次いで、得られたペレットを緩衝液に再懸濁し、本出願に記載の方法のいずれかを使用して分析する。遠心分離工程は、例えばサルコシル、Ｔｗｅｅｎ－２０、Ｔｒｉｔｏｎなどの界面活性剤を使用してもよい。
【0131】
α－ｓｙｎ凝集に関連する疾患の診断方法
別の態様は、対象におけるα－ｓｙｎ凝集に関連する疾患（すなわち、シヌクレイノパチー）を診断する方法を提供する。方法は、生物学的試料をモノマーα－ｓｙｎタンパク質および約１ｍｍ～約５ｍｍ、２．３ｍｍ超～約５ｍｍ、３ｍｍ超～約５ｍｍ、約２．３８ｍｍ、または約２．４５ｍｍの平均直径を有する１つ以上のビーズと接触させて、インキュベーション混合物を形成すること；インキュベーション混合物をインキュベートして、モノマーα－ｓｙｎタンパク質および生物学的試料の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎからミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体を形成すること；ミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体の少なくとも一部を脱凝集させること；インキュベートおよび脱凝集の工程を試料の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎを増幅するのに十分な回数繰り返して、検出可能な量のミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体を得ること；検出可能な量のミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体が試料中に存在するかどうかを決定することを含み、ここでミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体の検出は、対象がα－ｓｙｎ凝集に関連する疾患を有することを示す。方法は、生物学的試料中の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の量を所定の閾値量と比較することによって、対象におけるα－ｓｙｎ凝集に関連する疾患の存在を決定または診断することを含み得、閾値量よりも高いレベルは、対象におけるα－ｓｙｎ凝集に関連する疾患の診断をもたらす。
別の態様は、対象におけるα－ｓｙｎ凝集に関連する疾患（すなわち、シヌクレイノパチー）を診断する方法を提供する。方法は、生物学的試料をモノマーα－ｓｙｎタンパク質および約１ｍｍ～約５ｍｍ、２．３ｍｍ超～約５ｍｍ、３ｍｍ超～約５ｍｍ、約２．３８ｍｍ、または約２．４５ｍｍの平均直径を有する１つ以上のビーズと接触させて、インキュベーション混合物を形成すること；インキュベーション混合物をインキュベートして、モノマーα－ｓｙｎタンパク質および生物学的試料の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎからミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体を形成すること；ミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体の少なくとも一部を脱凝集させること；インキュベートおよび脱凝集の工程を試料の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎを増幅するのに十分な回数繰り返して、検出可能な量のミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体を得ること；検出可能な量のミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体が試料中に存在するかどうかを決定することを含み、ここでミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体の検出は、対象がα－ｓｙｎ凝集に関連する疾患を有することを示す。方法は、生物学的試料中の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の量を所定の閾値量と比較することによって、対象におけるα－ｓｙｎ凝集に関連する疾患の存在を決定または診断することを含み得、閾値量よりも高いレベルは、対象におけるα－ｓｙｎ凝集に関連する疾患の診断をもたらす。
【0132】
例えば、ＰＤの診断のための１つの方法は、ＰＤを有することが臨床的に疑われる対象から試料を得ること、および試料を３連で本明細書中に記載されるＰＭＣＡアッセイに、健康な対照と共に供することを含む。陽性試料は、約４４０ｎｍでの励起後の約４９０ｎｍでのＴｈＴ蛍光が５，０００相対蛍光単位（ＲＦＵ）を超えるものとみなされる。５，０００ＲＦＵを超えるＴｈＴ蛍光を反復試験で示さない、または１回のみ示す場合、対象はＰＤ陰性とみなされる。５，０００ＲＦＵを超えるＴｈＴ蛍光を反復試験で２回示す場合、対象はＰＤ不確定とみなされる。不確定な結果である場合、試料を三連で再試験して、最終的な結果を得ることを試みてもよい。５，０００ＲＦＵを超えるＴｈＴ蛍光を反復試験の３回すべてで示す場合、対象はＰＤ陽性とみなされる。本明細書に記載の方法では、９０％超の症例において、ＰＤ試験陽性が臨床的にＰＤが疑われる試料と相関する。別の例では、１つ以上のアルゴリズムを使用して、ＰＤ試験陽性を臨床的にＰＤが疑われる試料に関連づけることができる。アルゴリズムは、米国仮特許出願第６３／０７３，４２０号および米国仮特許出願第６３／０７３，４２４号に見出すことができ、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0133】
タンパク質ミスフォールディング障害（ＰＭＤ）には、アルツハイマー病（ＡＤ）、ＰＤ、２型糖尿病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、全身性アミロイドーシス、プリオン病などが含まれる。ＰＭＤには、α－ｓｙｎ凝集に関連する疾患も含まれる。異なるタンパク質のミスフォールド凝集体が形成され、蓄積し得る。ミスフォールド凝集体は、いくつかの影響の中でとりわけ、細胞機能障害および組織損傷を誘発し得る。いくつかの態様では、α－ｓｙｎ凝集に関連する疾患はＰＤであり、さらなる態様では、α－ｓｙｎ凝集に関連する疾患はＬＢＤ、ＭＳＡ、またはＰＡＦである。
【0134】
方法は、生物学的試料中の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の検出に基づいて、対象のＰＤを診断することを含み得る。α－ｓｙｎミスフォールディングおよび凝集は、ＰＤ病因に関連することが示されている。Ｓａｈａｙら、Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ Ｓｃｉ．，１８（７）：６５６－６７６（２０１７）．ＰＤの診断はまた、生物学的試料中の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の量を対照対象から採取した対照試料と比較して、可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質のレベルを健康な対象に存在するものに対して決定することを含み得る。方法は、生物学的試料中の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の存在に従って、対象におけるα－ｓｙｎ凝集に関連する疾患の存在を決定または診断することを含み得る。方法は、生物学的試料中の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の存在に従って、ＰＤ、ＭＳＡ、ＬＢＤまたはＰＡＦの存在をそれ自身で、または対象において決定または診断することを含み得る。
【0135】
いくつかの態様では、試料は、ＰＤの臨床徴候を示さない対象から採取され得る。他の態様では、生物学的試料は、ＰＤの臨床徴候を示す対象から採取され得る。ＰＤの最も認識可能な症状は、運動関連機能障害である。しかしながら、さらなる症状には、自律神経機能障害、精神神経障害（気分、認知、行動または思考の変化）、感覚機能障害（特に、嗅覚の変化）、および睡眠障害が含まれる。
【0136】
いくつかの態様では、方法は、α－ｓｙｎ凝集に関連する疾患を有すると診断された対象をα－ｓｙｎ調節療法で治療することを含む。様々な機構を介してα－ｓｙｎ恒常性を標的とするいくつかの新規治療法が現在開発中である。α－ｓｙｎ調節療法は、例えば、適切な阻害剤を用いてα－ｓｙｎの凝集を阻害するα－ｓｙｎの生成を阻害すること、能動または受動免疫療法アプローチなどを含み得る。α－ｓｙｎ恒常性を標的とする治療的アプローチは、ＰＤ０１Ａ＋もしくはＰＤ０３Ａ＋などの能動免疫化、またはＰＲＸ００２、ＢＩＩＢ０５４、ＡＴＶ：ａＳｙｎ、ＡＢＢＶ－０８０５もしくはＭＥＤＩ１３４１などの受動免疫化を含み得る。α－ｓｙｎ調節療法はまた、患者の免疫応答を刺激してα－ｓｙｎ凝集体を除去する方法を含み得る。可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎの存在を検出するための本明細書に記載の方法を使用して、どの患者がα－ｓｙｎ調節療法で治療され得るかを決定することができる。現在、ＰＤは治癒しないが、レボドパ、ドーパミンアゴニストおよびモノアミンオキシダーゼＢ阻害剤などの様々な薬物がＰＤの運動症状の治療に有用である。
【0137】
いくつかの態様では、方法を使用して、対象におけるシヌクレイノパチーの治療を監視する。生物学的試料は、α－ｓｙｎ調節療法下の対象からある期間にわたって異なる時間に採取され得る。方法は、対象が一定期間にわたる可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の変化によるα－ｓｙｎ調節療法に反応するか、または一定期間にわたる可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の恒常性によるα－ｓｙｎ調節療法に無反応であるかを決定または診断することを含み得る。方法は、α－ｓｙｎ調節療法に反応すると判定された対象をα－ｓｙｎ調節療法で治療することを含み得る。
【0138】
キット
別の態様は、生物学的試料中の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎの存在を決定するためのキットを提供する。キットは、既知量のモノマーα－ｓｙｎタンパク質；既知量のタンパク質凝集指示薬；インキュベーション混合物をインキュベートするための容器；緩衝組成物；約１ｍｍ～約５ｍｍ、２．３ｍｍ超～約５ｍｍ、３ｍｍ超～約５ｍｍ、約２．３８ｍｍ、または約２．４５ｍｍの平均直径を有する１つ以上のビーズ；および本明細書に記載の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎを検出する方法の実施を使用者に指導する説明書を含む。キットはまた、キットの構成要素を保持するための包装を含むべきである。
別の態様は、生物学的試料中の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎの存在を決定するためのキットを提供する。キットは、既知量のモノマーα－ｓｙｎタンパク質；既知量のタンパク質凝集指示薬；インキュベーション混合物をインキュベートするための容器；緩衝組成物；約１ｍｍ～約５ｍｍ、２．３ｍｍ超～約５ｍｍ、３ｍｍ超～約５ｍｍ、約２．３８ｍｍ、または約２．４５ｍｍの平均直径を有する１つ以上のビーズ；および本明細書に記載の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎを検出する方法の実施を使用者に指導する説明書を含む。キットはまた、キットの構成要素を保持するための包装を含むべきである。
【0139】
キットは、試薬を、１つ以上の別個の組成物として、または場合により試薬の適合性が可能にする混合物として保持する１つ以上の容器を有する包装を含む。キットは、緩衝液、標識剤、対照、およびα－ｓｙｎの検出を実施するために必要な任意の他の材料をさらに含み得る。キットはまた、対象から試料を得るためのツール、例えば腰椎穿刺を行うための皮下注射針を含むことができる。
【0140】
キットはまた、キットを使用して、対象のシヌクレイノパチーの治療を誘導する方法を実施するための説明書を含み得る。いくつかの態様では、シヌクレイノパチーはＰＤである。キットに含まれる説明書は、包装材料に添付することができ、または添付文書として含めることができる。説明書は、通常、書面または印刷物であるが、これらに限定されない。そのような説明書を格納し、それらをエンドユーザに伝達することができる任意の媒体が、本開示によって企図される。そのような媒体には、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤ－ＲＯＭ）などが含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「説明書」という用語は、説明書を提供するインターネットサイトのアドレスを含むことができる。
【0141】
説明書は、容器内で生物学的試料を既知量のモノマーα－ｓｙｎタンパク質および１つ以上のビーズと接触させて、インキュベーション混合物を形成すること；インキュベーション混合物をインキュベートして、モノマーα－ｓｙｎタンパク質および生物学的試料の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎからミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体を形成すること；ミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体の少なくとも一部を脱凝集させること；インキュベートおよび脱凝集の工程を生物学的試料の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎを増幅するのに十分な回数繰り返して、検出可能な量のミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体を得ること；およびインキュベーション混合物を既知量のタンパク質凝集指示薬と接触させて、検出可能な量のミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体が生物学的試料中に存在するかどうかを決定することを使用者に指示する。ミスフォールドα－ｓｙｎ凝集体の検出は、生物学的試料中の可溶性ミスフォールドα－ｓｙｎの存在を示す。
【0142】
様々な態様では、キットは、既知量のモノマーフォールドα－ｓｙｎタンパク質、およびミスフォールドα－ｓｙｎタンパク質の既知量の指示薬を含み得る。キットは、ビーズ分配装置、複数のウェルを含むマルチウェルプレート、マイクロ流体プレート、振盪装置、インキュベート装置、および蛍光測定装置の１つ以上を含み得、１つ以上の個々のプレートもしくは装置として、または組み合わせデバイスとして含まれる。例えば、振盪マイクロプレート読み取り装置を使用して、インキュベーションおよび振盪のサイクルを実施し、実験の経過中にＴｈＴ蛍光発光を自動的に測定することができる（例えば、ＦＬＵＯｓｔａｒ ＯＰＴＩＭＡ，ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ Ｉｎｃ．，Ｃａｒｙ，Ｎ．Ｃ．）。
【0143】
本発明の特定の実施形態およびその関連する利点をより明確に説明するための例が含まれている。しかしながら、本発明の範囲内には多種多様な他の態様があり、これらは本明細書で提供される特定の例に限定されるべきではない。
【0144】
例
例１：ＰＤ患者のＣＳＦ中のα－ｓｙｎ種子を検出するための高速α－ｓｙｎ ＰＭＣＡ（αＳ－ＰＭＣＡ）
例を実施して、モノマータンパク質の自己凝集を回避または軽減しながら、対象から得られた試料からのα－ｓｙｎの迅速な検出を容易にする条件を示した。これらの例の結果を図２～図９に示す。
例１：ＰＤ患者のＣＳＦ中のα－ｓｙｎ種子を検出するための高速α－ｓｙｎ ＰＭＣＡ（αＳ－ＰＭＣＡ）
例を実施して、モノマータンパク質の自己凝集を回避または軽減しながら、対象から得られた試料からのα－ｓｙｎの迅速な検出を容易にする条件を示した。これらの例の結果を図２～図９に示す。
【0145】
特に記述されない限り、図２～図９に示すデータを生成するために使用したαＳ－ＰＭＣＡ反応条件は、１６０μＬのＰＭＣＡ混合物（１００ｍＭ ＰＩＰＥＳ－ＮａＯＨ ｐＨ６．５［Ｓｉｇｍａ、カタログ番号８０６３５－５０Ｇ］、５００ｍＭ ＮａＣｌ［Ｌｏｎｚａ、カタログ番号５１２０２］、１０μＭ ＴｈＴ［Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ３５１６－２５Ｇ］、および０．３ｍｇ／ｍｌ（１９．６μＭ）の配列番号２（ｒｅｃ－αＳ）、および４０μＬのＣＳＦを含んでいた。Ｓｉ３Ｎ４ビーズを反応に使用して、凝集を加速させた。ビーズの直径は２．３８ｍｍであった。
【0146】
アッセイを９６ウェルＥＬＩＳＡプレート［Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３９１６］で組み立てた。１つのビーズを各ウェルに添加し、プレートを突き刺し可能な光学フィルム［Ｅｘｃｅｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＸＰ－１００］で覆い、アッセイを準備しながら交差汚染を回避した。すべてのＰＭＣＡ反応物をプレートにピペットで入れた後、突き刺し可能な光学フィルムを取り外し、蛍光適合性フィルムを使用してプレートを覆った（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３１１９７１）。
【0147】
プレートを、振盪し、インキュベートし、蛍光を自動的に読み取る装置であるＦＬＵＯｓｔａｒ（登録商標）Ｏｍｅｇａマイクロプレートリーダー［ＢＭＧ］に移した。プレートを８００ｒｐｍで１分間軌道的に振盪し、読み取り（４４０～１０励起および４９０～１０発光）、３７℃でインキュベートした。プレートを２９分毎に１分間振盪し、これが３０分のαＳ－ＰＭＣＡサイクルを構成する。ビーズを含有する高速アッセイ用に２００サイクルを実施し（１００時間、約４日間）、ビーズを含有しない低速アッセイの６００サイクル（３００時間、約１２日間）と比較した。
【0148】
実験で使用したビーズは、均一な圧縮（３．２５ｇ／ｃｍ３）による極めて高密度の純粋なＳｉ３Ｎ４材料から作製した。ビーズは高精度「グレード３」であり、真球度における正確な円形から３／１，０００，０００インチの純粋なＳｉ３Ｎ４セラミックボールであることを意味する。
【0149】
Ａｂｃａｍ合成種子はＰＭＣＡにおいて非常に迅速に凝集し、それらをαＳ凝集体モデルとして使用して、ａＣＳＦ中の播種凝集の加速を評価した。図２Ａ～図２Ｅを参照されたい。種子を４０μＬのａＣＳＦに添加して、内因性αＳ種子を含有するＣＳＦ試料（例えば、ヒトＰＤ－ＣＳＦから）を模倣した。合成種子の急速な凝集を考えると、それらの凝集における小規模の加速は、αＳ種子を担持するヒトＣＳＦへの実質的な加速を示す。
【0150】
図２Ａは、ビーズを用いない１ｍｇ／ｍＬの基質を示す。２０ｆｇのＡｂｃａｍ種子の播種凝集が１０時間後に始まり、自己凝集はなかった（種子のない対照は凝集を示さない）。ＰＭＣＡ反応に０．４ｍｍ超のビーズを含めると、自己凝集が誘導された（図２Ｂ、図２Ｃ、および図２Ｄ）。ビーズが大きいほど、Ａｂ種子（２０ｆｇ）の凝集は速くなる。０．４ｍｍビーズは、播種凝集を促進する効果を有さないようであった（図２Ａ対図２Ｅ）。０．４ｍｍのビーズは取り扱いが非常に困難であり、これ以上使用しなかったが、ＰＭＣＡに有害な影響を及ぼさないようであった（すなわち、自己凝集がなかった）。
【0151】
図３Ａは、ビーズを用いない１ｍｇ／ｍＬの基質を示す。１．５ｍｍビーズを添加すると、種子のない対照の自己凝集を誘導した（図３Ｂ）。自己凝集を減少させるために、ｒｅｃ－αＳの濃度を０．５および０．１ｍｇ／ｍＬに減少させた。０．５ｍｇ／ｍｌ、および１．５ｍｍビーズを使用した場合（図３Ｃ）、１ｍｇ／ｍｌと比較して自己凝集の減少があったが、２０ｆｇではやはり１０時間前に凝集が始まった。０．１ｍｇ／ｍｌを使用した場合（図３Ｄ）、自己凝集はなかったが、２０ｆｇ凝集の加速もないか、またはビーズなしの場合（図３Ａ）と比較して不十分であった。さらに、０．１ｍｇ／ｍｌを使用した場合、陽性と対照との間の蛍光の差（約５０，０００ＲＦＵ）（図３Ｄ）は、０．５ｍｇ／ｍｌを使用した場合（約１５０，０００ＲＦＵ）（図３Ａ）よりも小さかった。
【0152】
αＳ－ＰＭＣＡアッセイをさらに加速するために、温度を４２℃まで上げる効果を評価した。ビーズを省いた場合（図４Ａ）、５０時間で自己凝集が始まり、約１５時間で２０ｆｇの播種凝集が始まった。０．８ｍｍのビーズを１つ添加した後（図４Ｂ）、２０ｆｇの凝集は速くなったが、自己凝集も４０時間まで加速した。自己凝集は、基質の０．１ｍｇ／ｍｌへの減少、およびより大きなビーズの使用によって劇的に減少した（図４Ｃ）。
【0153】
以前の結果は、ビーズが大きくなるとαＳ－ＰＭＣＡへの効果がより重大になることを示唆した。したがって、マトリックスとしてヒト対照ＣＳＦを使用して増幅を評価した。播種および種子なし対照それぞれに関して、水で希釈した２０ｆｇのＡｂｃａｍ αＳ種子をＣＳＦに添加した（図５Ａ）。これらの条件において、異なるサイズのビーズを３７℃で評価した。１ｍｇ／ｍｌの基質では、ビーズなし対照（図５Ａ）と比較して、２．３８ｍｍビーズ（図５Ｃ）のみが播種凝集の加速を示したが、０．８ｍｍビーズは効果を示さなかった（図５Ｂ）。種子なし対照がすべて平坦であるという事実によって証明されるように、ヒトＣＳＦの使用によって自己凝集が減少した（図５Ａ～図５Ｃ）。０．１ｍｇ／ｍｌでは、より大きなビーズが播種凝集を加速し、凝集勾配を増加させることが確認された（図５Ｄ～図５Ｆ）。しかしながら、シグナルは１ｍｇ／ｍｌと比較して低かった。
【0154】
２つの異なる濃度の基質（０．１および０．３ｍｇ／ｍｌ）を使用して、より高い温度、より大きなビーズ、およびより高い振盪を組み合わせた。ＰＭＣＡは、Ｓｉ３Ｎ４ビーズをウェルあたり１つのビーズで使用して、組換えＡｂｃａｍ α－ｓｙｎ種子を４２℃、８００ｒｐｍ、１分間オンおよび２９分間オフを使用して、ａＣＳＦを使用して実施した。ａＣＳＦ中の播種凝集は、０．１ｍｇ／ｍｌ（図６Ａ～図６Ｃ）よりも０．３ｍｇ／ｍｌ（図６Ｄ～図６Ｆ）を使用した場合の方が速かった。
【0155】
ａＣＳＦを使用して、０．３ｍｇ／ｍｌの基質、４２℃、８００ｒｐｍおよび２．３８ｍｍビーズを使用して実験を繰り返した。２０ｆｇの種子は、ａＣＳＦにスパイクされた場合、１０時間までは陽性であったが（図７Ａ）、種子なし対照は４０時間後に蛍光のわずかな増加を示した。ヒト対照ＣＳＦも使用して、これらのαＳ－ＰＭＣＡ条件を評価した。２０ｆｇの種子が１０時間で凝集し始めたが、種子を含まない対照ＣＳＦはほぼ１００時間平らなままであった（図７Ｂ）。
【0156】
次の工程は、１．５ｍｍ、２ｍｍ、および２．３８ｍｍのＳｉ３Ｎ４ビーズを使用して、ＰＤ ＣＳＦ試料中のヒト内因性αＳ種子を評価することであった（図８Ａ）。ＰＤ試料は、６０時間までは３つすべてのビーズで凝集した。比較として、低速アッセイ条件（以下に定義する）でより速く凝集するＰＤ試料は１００～１５０時間かかり、ＰＤ試料の平均は１５０～２５０時間で凝集する（図８Ｃ）。
【0157】
【0158】
温度を３７℃に戻すことによって、対照試料は平坦なままであったが、ＰＤ試料は５０時間まで陽性であった（図９Ａおよび図９Ｂ）。アッセイを４２℃で実行した場合、ＰＤ ＣＳＦ試料の最大凝集の５０％に達する時間（Ｔ５０）は３５時間であったが、３７℃でのＴ５０は４１時間であった。したがって、温度を下げることによる自己凝集の排除で生じたＰＤ－ＣＳＦ試料の凝集の遅延は、わずか６時間であった。
【0159】
例２：「低速」および「高速」ＰＭＣＡを使用して得られた結果の比較
低速（ＳＡ）および高速（ＦＡ）ＰＭＣＡアッセイを使用して得られた結果を比較するために実験を行った。明確にするために、ＳＡおよびＦＡを以下に定義する。
低速（ＳＡ）および高速（ＦＡ）ＰＭＣＡアッセイを使用して得られた結果を比較するために実験を行った。明確にするために、ＳＡおよびＦＡを以下に定義する。
【表1】
【0160】
１３９の非特定化ＣＳＦ試料、６つの健常対照プールＣＳＦ試料、および６つのＰＤプールＣＳＦ試料を、ＳＡおよびＦＡ αＳ－ＰＭＣＡアッセイを使用して並行して分析した。この直接比較には、同じ基質、同じ消耗品ロット、および同じ試薬を使用した。ＰＭＣＡは、両方のケースにおいて３連で行った。５９のＰＤ試料があり、ＦＡは５１を陽性として検出し、ＳＡは３６を検出した。６０の対照試料のうち、ＳＡは５６の陰性を特定し、ＦＡは５２を陰性として特定した（米国仮特許出願第６３／０７３，４２４号明細書に記載されているアルゴリズムを使用して５７）。
【0161】
試料のいくつかは、ＳＡを使用した場合にＴ５０に関して変動性を示したが（図１０Ｂ）、ＦＡにおいて３回の反復試験は非常に一貫しているように見える（図１０Ａ）。ＳＡでかろうじて陽性であった１つの試料（図１１Ｂ）は、ＦＡで陽性として迅速に検出された（図１１Ａ）。さらに、シグナルおよび完全な曲線によって、ＳＡよりもＦＡにおいてはるかに確実にこの試料をＰＤとして特定することができる。ＳＡで陰性としてカウントされた１つのＰＤサンプル（図１２Ｂ）は、実際に、ＦＡで強陽性として正しく特定された（図１２Ａ）。このような試料は、ＦＡがＳＡと比較して低い検出限界または全体的な高い感度を有することを強く示唆する。図１３ＢはＳＡの変動性を示し、プラトーに達しないか、または非典型的な凝集曲線を描く曲線を示している。一方、ＦＡ（図１３Ａ）は、分析されたＰＤ ＣＳＦの３回すべての反復試験において、再現性のある完全な典型的凝集曲線を示す。
【0162】
【0163】
例３：ブロッキングされたビーズを使用したα－ｓｙｎ種子検出のための高速α－ｓｙｎ ＰＭＣＡ（αＳ－ＰＭＣＡ）
【0164】
合理的な濃度の基質を使用し、完全な凝集曲線を生成して速度論パラメータを抽出し、より低速のＰＭＣＡアッセイよりも速く、計測およびワークフローに関してスケールアップすることができるアッセイが現在開発されている。方法は、０．３ｍｇ／ｍｌ（１９．６μＭ）の組換えα－Ｓを使用し、１５０時間実行し、凝集曲線の全体を記録し（完全な勾配およびプラトー）、３０分毎に１分間振盪し、これは、１つの機器が一度に８～９プレートで実行できることを意味する。重要な特徴は、ブロッキングされた２．３８ｍｍのＳｉ３Ｎ４ビーズを含むことである。
ビーズは、最初にビーズ供給会社であるＢＣ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎから入手した。いくつかのサイズのビーズを比較し、例１に記載されているように、２．３８ｍｍのビーズで最も速い凝集が生じることが分かった。具体的には、ビーズは、重量０．０００８１８６３オンス／０．０２３２ｇのグレード５、３／３２インチ／２．３８１２５ｍｍのＳｉ３Ｎ４セラミックボールであった。４５のＣＳＦ試料を、ＢＣ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎのこれらの２．３８ｍのＳｉ３Ｎ４ビーズ（ＢＣビーズ）を使用して評価し、いくつかの実行は予想される結果を示すが、他のいくつかは示さない（表１Ｂ、列１）ことが分かった。ロット番号Ｂ２１のビーズをほとんどの実験に使用し、対照試料のほぼ５０％が自己凝集を示し、試料の１６．７％が不確定であることが分かった。別のロット番号Ｂ３７を使用して、少数の試料を評価し、これらのビーズの不適切さを確認した。分析した３つの試料のうち、２つは陽性であり、１つは不確定であった（表１Ｂ、列２）。理論に拘束されることを意図するものではないが、ビーズが振盪効率を上げ、ＰＤ－ＣＳＦ中に存在するα－Ｓ凝集体の成長を加速するのでＰＤ試料がより速く凝集すると考えられる。対照ドナーの場合では、ＣＳＦ中にα－Ｓ凝集体は存在せず、これは、ビーズがデノボ種子の核形成を加速することを意味する。振盪は既に形成された種子の断片化を加速するので、種子のデノボ形成は、ビーズと反応の成分との表面相互作用で説明できる。自己凝集の問題を解決するために、例４に記載されるように、ＢＳＡの水溶液を使用してビーズの表面をブロッキングした。
ビーズは、最初にビーズ供給会社であるＢＣ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎから入手した。いくつかのサイズのビーズを比較し、例１に記載されているように、２．３８ｍｍのビーズで最も速い凝集が生じることが分かった。具体的には、ビーズは、重量０．０００８１８６３オンス／０．０２３２ｇのグレード５、３／３２インチ／２．３８１２５ｍｍのＳｉ３Ｎ４セラミックボールであった。４５のＣＳＦ試料を、ＢＣ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎのこれらの２．３８ｍのＳｉ３Ｎ４ビーズ（ＢＣビーズ）を使用して評価し、いくつかの実行は予想される結果を示すが、他のいくつかは示さない（表１Ｂ、列１）ことが分かった。ロット番号Ｂ２１のビーズをほとんどの実験に使用し、対照試料のほぼ５０％が自己凝集を示し、試料の１６．７％が不確定であることが分かった。別のロット番号Ｂ３７を使用して、少数の試料を評価し、これらのビーズの不適切さを確認した。分析した３つの試料のうち、２つは陽性であり、１つは不確定であった（表１Ｂ、列２）。理論に拘束されることを意図するものではないが、ビーズが振盪効率を上げ、ＰＤ－ＣＳＦ中に存在するα－Ｓ凝集体の成長を加速するのでＰＤ試料がより速く凝集すると考えられる。対照ドナーの場合では、ＣＳＦ中にα－Ｓ凝集体は存在せず、これは、ビーズがデノボ種子の核形成を加速することを意味する。振盪は既に形成された種子の断片化を加速するので、種子のデノボ形成は、ビーズと反応の成分との表面相互作用で説明できる。自己凝集の問題を解決するために、例４に記載されるように、ＢＳＡの水溶液を使用してビーズの表面をブロッキングした。
【0165】
【表1A】
【表1B】
【0166】
例４：水中のＢＳＡでブロックしたＢＣビーズ
水中のＢＳＡでブロッキングされたＢＣビーズを使用して１３３の試料を分析し、８９．５％の感度および９４．３の特異性に達した（表１Ｂ、列７）。これは、ブロッキングされていないＢ２１ビーズ（表１Ｂ、列４）と比較して実質的な改善であり、特異性の改善は４４．３％である。再現性は、同じビーズの他のロット（Ｂ３３、Ｂ３６、Ｂ３７）を同じアッセイ条件で使用することによって評価した。主な問題は自己凝集であったため、対照試料のみを分析した。ブロッキングしたＢ３７（表１Ｃ、列１０）は、ブロッキングしないＢ３７ビーズ（表１Ｂ、列５）と比較して実質的な改善を示した。ブロッキングしたＢ３６ ＢＣビーズは、非常に類似した結果を示した（表１Ｃ、列９）。しかしながら、ロットＢ３３の性能は非常に低かった（表１Ｃ、列８）のは、対照試料の６６％が自己凝集を示し、したがって陽性（偽陽性）または不確定のいずれかに分類されたためである。
水中のＢＳＡでブロッキングされたＢＣビーズを使用して１３３の試料を分析し、８９．５％の感度および９４．３の特異性に達した（表１Ｂ、列７）。これは、ブロッキングされていないＢ２１ビーズ（表１Ｂ、列４）と比較して実質的な改善であり、特異性の改善は４４．３％である。再現性は、同じビーズの他のロット（Ｂ３３、Ｂ３６、Ｂ３７）を同じアッセイ条件で使用することによって評価した。主な問題は自己凝集であったため、対照試料のみを分析した。ブロッキングしたＢ３７（表１Ｃ、列１０）は、ブロッキングしないＢ３７ビーズ（表１Ｂ、列５）と比較して実質的な改善を示した。ブロッキングしたＢ３６ ＢＣビーズは、非常に類似した結果を示した（表１Ｃ、列９）。しかしながら、ロットＢ３３の性能は非常に低かった（表１Ｃ、列８）のは、対照試料の６６％が自己凝集を示し、したがって陽性（偽陽性）または不確定のいずれかに分類されたためである。
【0167】
【表1C】
【0168】
ビーズを、ＢＳＡのＰＩＰＥＳ溶液（１００ｍＭのＰＩＰＥＳ中１％ ＢＳＡ、ｐＨ６．５０）（表１Ｃ；表１Ｄ）でブロッキングした。この新しいブロッキング手順は、Ｂ３７ビーズを使用した場合に自己凝集を大幅に減少させた（表１Ｄ、列１３）。これらのＢ３７ビーズは、水中のＢＳＡでのブロッキングで許容レベルまで既に機能したが（表１Ｃ、列１０）、ＰＩＰＥＳ中のＢＳＡでブロッキングした場合、不確定試料の数は１１．１％から０％に減少した。Ｂ３３ビーズは、ＰＩＰＥＳ中のＢＳＡでブロッキングした場合でさえも機能しなかった。これは、ブロッキングによって固定され得なかったＢ３３のいくつかの独特な特徴があることを示している。
【0169】
ビーズ製造業者であるツバキ・ナカシマ（ＴＮ）は、十分な品質ドキュメンテーションおよび厳格な仕様で高品質のＳｉ３Ｎ４ビーズを製造している。ＢＣ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎのグレード５ビーズよりも丸みがあり滑らかなグレード３ビーズを使用した。ＴＮはまた、Ｓｉ３Ｎ４原料の品質がＡＳＴＭに従うことを明記している。ＢＳＡ－ＰＩＰＥＳブロッキングはＢ３７の自己凝集を効果的に減少させたので（ブロッキングなし、または水中でのブロッキングと比較して）、αＳ－ＰＭＣＡアッセイのためのＴＮビーズをブロッキングするために使用した（表１Ｄ、列１４、表１Ｅ 列１５～１７）。Ｂ４１、Ｂ４６、およびＢ４７は、同一の製造ロットの異なる購入品である。６１０の試料を分析し、高い感度および特異性が達成され、不確定結果は８％のみであった。２つのさらなる製造ロットＢ４４およびＢ４５－Ｂ４８－Ｂ４９（これら３つは同じ製造ロットの３つの購入品である）を評価した。対照試料のみを評価に使用した場合、これらの２つのさらなる製造ロットは、Ｂ４１－Ｂ４６－Ｂ４７と一致して自己凝集を示さなかった。
【表1D】
【表1E】
【0170】
例５：ブロッキングしたＳｉ３Ｎ４ビーズの使用とブロッキングしないホウケイ酸ガラスビーズの使用との比較
図１４Ａ、図１４Ｂ、図１５Ａ、および図１５Ｂに示すデータを生成するために使用したαＳ－ＰＭＣＡ反応条件は、１６０μＬのＰＭＣＡ混合物（１００ｍＭ ＰＩＰＥＳ－ＮａＯＨ ｐＨ６．５［Ｓｉｇｍａ、カタログ番号８０６３５－５０Ｇ］、５００ｍＭ ＮａＣｌ［Ｌｏｎｚａ、カタログ番号５１２０２］、１０μＭ ＴｈＴ［Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ３５１６－２５Ｇ］、および０．３ｍｇ／ｍｌ（１９．６μＭ）の配列番号２（ｒｅｃ－αＳ）、および４０μＬのＣＳＦを含んでいた。
図１４Ａ、図１４Ｂ、図１５Ａ、および図１５Ｂに示すデータを生成するために使用したαＳ－ＰＭＣＡ反応条件は、１６０μＬのＰＭＣＡ混合物（１００ｍＭ ＰＩＰＥＳ－ＮａＯＨ ｐＨ６．５［Ｓｉｇｍａ、カタログ番号８０６３５－５０Ｇ］、５００ｍＭ ＮａＣｌ［Ｌｏｎｚａ、カタログ番号５１２０２］、１０μＭ ＴｈＴ［Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ３５１６－２５Ｇ］、および０．３ｍｇ／ｍｌ（１９．６μＭ）の配列番号２（ｒｅｃ－αＳ）、および４０μＬのＣＳＦを含んでいた。
【0171】
Ｓｉ３Ｎ４ビーズを使用した場合は、ビーズをインキュベーション混合物と接触させる前に、ｐＨ６．５を有する１００ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液中の１％ ＢＳＡでビーズをブロッキングした。ブロッキングしたビーズを、ｐＨ６．５を有する１００ｍＭ ＰＩＰＥＳで２回洗浄した。ビーズの直径は２．３８ｍｍであった。
【0172】
ホウケイ酸ガラスビーズを使用した場合は、ビーズをブロッキングしなかった。ビーズの直径は２．４５ｍｍであった。
【0173】
図１４Ａ～図１４Ｂは、ＰＤ ＣＳＦ試料（ＰＤ）および３つの対照に対して２つの異なるビーズタイプを使用した例の結果を示す。したがって、ＢＳＡでブロッキングした２．３８ｍｍのＳｉ３Ｎ４ビーズを使用した例示的な結果を示す。ＰＤ試料は約７５時間陽性であったが、３つの対照はすべて陰性であった。図１４Ｂは、ブロッキングしていない２．４５ｍｍホウケイ酸ガラスビーズを使用した例の結果を示す図である。ＰＤ試料は約１７０時間陽性であったが、３つの対照はすべて陰性であった。
【0174】
図１５Ａ～図１５Ｂは、異なるドナー（ＰＤ１およびＰＤ２）からの２つのＰＤ ＣＳＦ試料に対して２つの異なる種類のビーズを使用した例の結果を示す。グラフは、患者あたり３回の反復試験の平均を示す。ブロッキングした２．３８ｍｍのＳｉ３Ｎ４ビーズ（図１５Ａ）またはブッキングしない２．４５ｍｍのホウケイ酸ガラスビーズ（図１５Ｂ）のいずれかを使用した場合、両方のＰＤ試料は陽性であった。Ｓｉ３Ｎ４ビーズを用いると、ＰＤ２は約４０時間で、ＰＤ１は約５０時間で凝集を開始した。凝集曲線は非常に再現性があり、プラトーは非常に一貫した蛍光値を示す。２．４５ｍｍのホウケイ酸ガラスビーズを使用した場合、ＰＤ２およびＰＤ１についてそれぞれ１０時間および２５時間、凝集が遅延した。
【0175】
例５：サルコシルのＦＡ条件への追加
図２４Ａおよび図２４Ｂに示すデータを生成するために使用したαＳ－ＰＭＣＡ反応条件は、１６０μＬのＰＭＣＡ混合物（１００ｍＭ ＰＩＰＥＳ－ＮａＯＨ ｐＨ６．５［Ｓｉｇｍａ、カタログ番号８０６３５－５０Ｇ］、５００ｍＭ ＮａＣｌ［Ｌｏｎｚａ、カタログ番号５１２０２］、１０μＭ ＴｈＴ［Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ３５１６－２５Ｇ］、および０．３ｍｇ／ｍｌ（１９．６μＭ）の配列番号２（ｒｅｃ－αＳ）、および４０μＬのＣＳＦを、１Ｘ ＰＢＳ中０．１％ ｗ／ｖのサルコシル濃度と共に含んでいた。
図２４Ａおよび図２４Ｂに示すデータを生成するために使用したαＳ－ＰＭＣＡ反応条件は、１６０μＬのＰＭＣＡ混合物（１００ｍＭ ＰＩＰＥＳ－ＮａＯＨ ｐＨ６．５［Ｓｉｇｍａ、カタログ番号８０６３５－５０Ｇ］、５００ｍＭ ＮａＣｌ［Ｌｏｎｚａ、カタログ番号５１２０２］、１０μＭ ＴｈＴ［Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ３５１６－２５Ｇ］、および０．３ｍｇ／ｍｌ（１９．６μＭ）の配列番号２（ｒｅｃ－αＳ）、および４０μＬのＣＳＦを、１Ｘ ＰＢＳ中０．１％ ｗ／ｖのサルコシル濃度と共に含んでいた。
【0176】
図２４Ａは、例示的な高速アッセイ（ＢＳＡでブロッキングされた２．３８ｍｍのＳｉ３Ｎ４ビーズをウェルあたり１つのビーズで使用して、組換えα－ｓｙｎ種子を３７℃、８００ｒｐｍ、１分間オンおよび２９分間オフで使用）に１Ｘ ＰＢＳ中０．１％ ｗ／ｖのサルコシル濃度を含めた例の結果を示す。Ａ）はＰＤを有する対象から得られたＣＳＦに対して実施されたＰＭＣＡの凝集を表す蛍光を示し、Ｂ）は対照ＣＳＦ試料を使用して得られた結果を示す。図２４Ａは、１日以内での陽性結果、著しい加速を示した。
【0177】
本明細書に引用されたすべての特許、特許出願、および刊行物、および電子的に利用可能な資料の完全な開示は、参照により組み込まれる。上記の詳細な説明および例は、理解を明確にするためにのみ与えられている。そこから不必要な制限が理解されるべきではない。本発明は、表示および記載された正確な詳細に限定されず、当業者に明らかな変形例は、特許請求の範囲によって定義される本発明内に含まれる。
【配列表フリーテキスト】
【0178】
配列表１～１９ ＜２２３＞合成
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図6F】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図9A】
【図9B】
【図10A】
【図10B】
【図11A】
【図11B】
【図12A】
【図12B】
【図13A】
【図13B】
【図14A】
【図14B】
【図15A】
【図15B】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24A】
【図24B】
【配列表】
【国際調査報告】