特表2022-547426 | 知財ポータル「IP Force」

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特表2022-547426β－カテニン／ＴＣＦ４相互作用のモジュレーターとしての複素環化合物

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-11-14

(54)【発明の名称】β－カテニン／ＴＣＦ４相互作用のモジュレーターとしての複素環化合物

(51)【国際特許分類】

A61K 31/4196 20060101AFI20221107BHJP

A61P 35/00 20060101ALI20221107BHJP

A61P 25/00 20060101ALI20221107BHJP

A61P 3/00 20060101ALI20221107BHJP

A61P 9/00 20060101ALI20221107BHJP

A61P 11/00 20060101ALI20221107BHJP

A61P 19/00 20060101ALI20221107BHJP

A61P 35/02 20060101ALI20221107BHJP

A61P 43/00 20060101ALI20221107BHJP

C07D 249/12 20060101ALI20221107BHJP

C07D 405/06 20060101ALI20221107BHJP

C07D 401/12 20060101ALI20221107BHJP

【ＦＩ】

A61K31/4196

A61P35/00

A61P25/00

A61P3/00

A61P9/00

A61P11/00

A61P19/00

A61P35/02

A61P43/00 105

C07D249/12 512

C07D405/06 CSP

C07D401/12

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022513284

(86)(22)【出願日】2020-09-03

(85)【翻訳文提出日】2022-03-30

(86)【国際出願番号】 SG2020050512

(87)【国際公開番号】W WO2021045686

(87)【国際公開日】2021-03-11

(31)【優先権主張番号】10201908175Q

(32)【優先日】2019-09-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】SG

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

２．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】504354117

【氏名又は名称】エイジェンシー・フォー・サイエンス，テクノロジー・アンド・リサーチ

(74)【代理人】

【識別番号】100120857

【弁理士】

【氏名又は名称】渡邉聡

(72)【発明者】

【氏名】ロウジューレン

(72)【発明者】

【氏名】ドゥーウェイナ

(72)【発明者】

【氏名】ダスグプタラマヌジ

(72)【発明者】

【氏名】ファンハオ

(72)【発明者】

【氏名】ゴチャテンジン

【テーマコード（参考）】

4C063

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C063AA01

4C063BB03

4C063BB08

4C063CC41

4C063CC75

4C063DD10

4C063DD41

4C063EE01

4C086AA01

4C086AA02

4C086AA03

4C086BC60

4C086GA02

4C086GA07

4C086GA08

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZA02

4C086ZA36

4C086ZA59

4C086ZA96

4C086ZB26

4C086ZB27

4C086ZC01

4C086ZC21

(57)【要約】

本明細書では、β－カテニンを阻害すること若しくはβ－カテニンとＴ細胞因子４との相互作用を妨害することに有用な化合物、又はβ－カテニンを阻害するか若しくはβ－カテニンとＴ細胞因子４との相互作用を妨害する方法が提供され、これらは、癌、神経変性疾患、代謝性疾患、心血管疾患、線維症、及び骨疾患等の疾患又は健康状態の治療に有用である。１つの態様では、当該化合物は式１を有し、式１中、Ｒ^１は－（ＣＲ^４ _２）_ｍＸＲ^５であり、Ｒ^２は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、アリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、又はヘテロアリールであり、Ｒ^３は－（ＣＲ^６ _２）_ｎＲ^７である。

【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

β－カテニン（β－Ｃａｔ）を阻害することによって、又はβ－ｃａｔとＴ細胞因子４（ＴＣＦ４）との相互作用を妨害することによって改善される疾患又は健康状態の治療のための医薬の製造における化合物の使用であって、前記化合物は式１を有するか、又はその薬学的に許容できる塩であり、

【化1】

前記式１中、
Ｒ^１は－（ＣＲ^４ _２）_ｍＸＲ^５であり、
Ｒ^２は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、アリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、又はヘテロアリールであり、
Ｒ^３は－（ＣＲ^６ _２）_ｎＲ^７であり、
Ｒ^４は、出現ごとに、独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、及びヘテロアラルキルからなる群から選択されるか、又はＲ^４の２つのインスタンスは、それらが結合する１つ以上の炭素と一緒になって、３～７員のシクロアルキルを形成し、
Ｒ^５は、水素、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、アリール、又はヘテロアリールであり、
Ｒ^６は、出現ごとに、独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、及びヘテロアラルキルからなる群から選択されるか、又はＲ^６の２つのインスタンスは、それらが結合する１つ以上の炭素と一緒になって、３～７員のシクロアルキルを形成し、
Ｒ^７は、－（Ｃ＝Ｏ）Ｒ^８、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^８、若しくは－（Ｃ＝Ｏ）Ｎ（Ｒ^８）_２であるか、又はＲ^７は、式２を有する部分であり、

【化2】

Ｒ^８は、出現ごとに、独立に、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、及びヘテロアラルキルからなる群から選択されるか、又は２つのＲ^８は、それらが結合する窒素と一緒になって、３～７員のヘテロシクロアルキルを形成するか、又はＲ^６及びＲ^８は、それらが結合する原子と一緒になって、４～７員の置換されていてもよいシクロアルキル若しくは４～７員の置換されていてもよいヘテロシクロアルキルを形成し、
ｍは、０～４から選択される整数であり、
ｎは、０～４から選択される整数であり、
Ｘは、－Ｏ－、－Ｓ－であるか、又は存在しない
使用。

【請求項2】

ｍが１又は２であり、Ｘが－Ｏ－であるか、又は存在しない請求項１に記載の使用。

【請求項3】

Ｒ^５がシクロアルキル又はアリールである請求項２に記載の使用。

【請求項4】

Ｒ^２が、シクロアルキル、アラルキル、又はヘテロアラルキルである請求項１に記載の使用。

【請求項5】

Ｒ^２が－（ＣＲ^９ _２）_ｐＲ^１０であり、ｐが０～４から選択される整数であり、Ｒ^９が、出現ごとに、独立に、水素又はアルキルであり、Ｒ^１０がシクロアルキル、アリール又はヘテロアリールである請求項１に記載の使用。

【請求項6】

ｎが１又は２であり、Ｒ^６が、出現ごとに、独立に、水素又はアルキルであり、Ｒ^７が－（Ｃ＝Ｏ）Ｒ^８、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^８、若しくは－（Ｃ＝Ｏ）Ｎ（Ｒ^８）_２であるか、又はＲ^７が式２を有する部分であり、

【化3】

Ｒ^８が、出現ごとに、独立に、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、及びヘテロアラルキルからなる群から選択されるか、又は２つのＲ^８が、それらが結合する窒素と一緒になって、３～６員のヘテロシクロアルキルを形成するか、又はＲ^６及びＲ^８が、それらが結合する原子と一緒になって、５～６員のシクロアルキルを形成する
請求項１に記載の使用。

【請求項7】

Ｒ^８が、出現ごとに、独立に、アルキル、シクロアルキル、及びアリールからなる群から選択されるか、又はＲ^８の２つのインスタンスが、それらが結合する窒素と一緒になって、５～６員のヘテロシクロアルキルを形成するか、又はＲ^６及びＲ^８が、それらが結合する原子と一緒になって、５～６員のシクロアルキルを形成する請求項６に記載の使用。

【請求項8】

化合物が式３を有するか、又はその薬学的に許容できる塩であり、

【化4】

前記式３中、
Ｒ^４は、出現ごとに、独立に、水素及びアルキルからなる群から選択され、
Ｒ^５は、アリール又はヘテロアリールであり、
Ｒ^６は、出現ごとに、独立に、水素及びアルキルからなる群から選択され、
Ｒ^７は、－（Ｃ＝Ｏ）Ｒ^８、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^８、若しくは－（Ｃ＝Ｏ）Ｎ（Ｒ^８）_２であるか、又はＲ^７は、式４を有する部分であり、

【化5】

Ｒ^８は、出現ごとに、独立に、アルキル、シクロアルキル、及びアリールからなる群から選択されるか、又はＲ^８の２つのインスタンスは、それらが結合する窒素と一緒になって、５～６員のヘテロシクロアルキルを形成するか、又はＲ^６及びＲ^８は、それらが結合する原子と一緒になって、５～６員のシクロアルキルを形成し、
Ｒ^９は、出現ごとに、独立に、水素及びアルキルからなる群から選択され、
Ｒ^１０は、シクロアルキル、アリール又はヘテロアリールであり、
Ｘは、－Ｏ－であるか、又は存在しない
請求項１に記載の使用。

【請求項9】

前記化合物が、

【化6】

又はその薬学的に許容できる塩からなる群から選択される請求項１に記載の使用。

【請求項10】

前記疾患又は健康状態が、癌、神経変性疾患、代謝性疾患、心血管疾患、線維症、及び骨疾患からなる群から選択される請求項１に記載の使用。

【請求項11】

前記疾患又は健康状態が、結直腸癌、肝細胞癌、黒色腫、肝癌、乳癌、前立腺癌、及び白血病からなる群から選択される癌である請求項１の使用。

【請求項12】

β－ｃａｔを阻害するか又はβ－ｃａｔとＴＣＦ４との相互作用を妨害する方法であって、β－ｃａｔを式１の化合物又はその薬学的に許容できる塩と接触させる工程を含み、

【化7】

【化8】

【請求項13】

ｍが１又は２であり、Ｘが－Ｏ－であるか、又は存在しない請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

Ｒ^５がシクロアルキル又はアリールである請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

Ｒ^２が、シクロアルキル、アラルキル又はヘテロアラルキルである請求項１２に記載の方法。

【請求項16】

Ｒ^２が－（ＣＲ^９ _２）_ｐＲ^１０であり、ｐが０～４から選択される整数であり、Ｒ^９が、出現ごとに、独立に、水素又はアルキルであり、Ｒ^１０がシクロアルキル、アリール又はヘテロアリールである請求項１２に記載の方法。

【請求項17】

ｎが１であり、Ｒ^６が、出現ごとに、独立に、水素又はアルキルであり、Ｒ^７が－（Ｃ＝Ｏ）Ｒ^８、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^８、若しくは－（Ｃ＝Ｏ）Ｎ（Ｒ^８）_２であるか、又はＲ^７が式２を有する部分であり、

【化9】

Ｒ^８は、出現ごとに、独立に、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、及びヘテロアラルキルからなる群から選択されるか、又は２つのＲ^８が、それらが結合する窒素と一緒になって、３～６員のヘテロシクロアルキルを形成するか、又はＲ^６及びＲ^８が、それらが結合する原子と一緒になって、５～６員のシクロアルキルを形成する
請求項１２に記載の方法。

【請求項18】

【請求項19】

前記化合物が式３を有するか、又はその薬学的に許容できる塩であり、

【化10】

【化11】

【請求項20】

前記化合物が、

【化12】

又はその薬学的に許容できる塩からなる群から選択される請求項１２に記載の方法。

【請求項21】

必要とする対象における、β－ｃａｔを阻害することによって、又はβ－ｃａｔとＴＣＦ４との相互作用を妨害することによって改善される疾患又は健康状態の治療方法であって、治療有効量の式１の化合物又はその薬学的に許容できる塩を投与する工程を含み、

【化13】

【化14】

【請求項22】

β－ｃａｔを阻害することによって、又はβ－ｃａｔとＴＣＦ４との相互作用を妨害することによって改善される疾患又は健康状態の治療において使用するための化合物であって、前記化合物は、式１を有するか、又はその薬学的に許容できる塩であり、

【化15】

【化16】

Ｒ^８は、出現ごとに、独立に、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、及びヘテロアラルキルからなる群から選択されるか、又は２つのＲ^８は、それらが結合する窒素と一緒になって、３～７員のヘテロシクロアルキルを形成するか、又はＲ^６及びＲ^８は、それらが結合する原子と一緒になって、４～７員のシクロアルキル若しくは４～７員のヘテロシクロアルキルを形成し、
ｍは、０～４から選択される整数であり、
ｎは、０～４から選択される整数であり、
Ｘは、－Ｏ－、－Ｓ－であるか、又は存在しない
使用するための化合物。

【請求項23】

前記疾患又は健康状態が、癌、神経変性疾患、代謝性疾患、心血管疾患、線維症、及び骨疾患からなる群から選択される請求項２２に記載の使用するための化合物。

【請求項24】

治療法において使用するための化合物であって、前記化合物は式１を有するか、又はその薬学的に許容できる塩であり、

【化17】

【化18】

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本願は、２０１９年９月４日出願のシンガポール特許出願第１０２０１９０８１７５Ｑ号の優先権の利益を主張するものであり、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

技術分野
本開示は、全体として、Ｗｎｔ／カテニン（β－ｃａｔ）シグナル伝達経路の阻害方法に関する。より詳細には、本開示は、下流のＷｎｔ発現の減衰をもたらすβ－ｃａｔ／Ｔ細胞因子４（ＴＣＦ４）相互作用の低分子阻害剤を提供する。本明細書で提供される化合物及び方法は、β－ｃａｔ及びＴＣＦ４の相互作用を阻害することによって改善される疾患、例えば、癌、神経変性疾患、代謝性疾患、心血管疾患、線維症、及び骨疾患の治療、管理又は予防に有用である。

【背景技術】

【0003】

古典的Ｗｎｔ／β－ｃａｔシグナル伝達経路は、胚の正常な発生及び成体組織の自己再生に必要な重要なシグナル伝達経路である。この経路の活性化は、Ｗｎｔリガンドタンパク質がＦｒｉｚｚｌｅｄ及び低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６）に結合することで起こる。Ｗｎｔが活性化されていない状態では、アキシン（Ａｘｉｎ）、カゼインキナーゼ１α（ＣＫ１α）、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）、大腸腺腫症（ＡＰＣ）を含む分解複合体が、Ｗｎｔシグナル伝達の主要な核内エフェクターであるβ－ｃａｔをリン酸化し、β－ｃａｔをユビキチン化及びプロテアソーム分解の標的とする。Ｗｎｔリガンドによって上記経路が活性化されると、分解複合体が膜に結合し（動員され）、分解複合体が不活性化される。分解複合体が阻害されると、リン酸化されていないβ－ｃａｔが細胞質に蓄積され、続いて核内に移行し、そこでβ－ｃａｔは、リンパ系エンハンサー因子／Ｔ細胞因子（ＬＥＦ／ＴＣＦ）ファミリーの転写因子や、Ｂｃｌ－９及びＰｙｇｏｐｕｓ等の多くの他の補因子と結合して、下流の標的遺伝子の発現を活性化する。

【0004】

Ｗｎｔ経路が組織の恒常性の維持に重要であることに起因して、Ｗｎｔ経路の異常な活性化は、とりわけ幹細胞においては、しばしば癌等の疾患の要因となる。特に、大多数の結直腸癌（ＣＲＣ）では、ＡＰＣ腫瘍抑制遺伝子の機能低下が腫瘍形成の初期の要因となり、腺腫が形成されることが明らかになっている。加えて、Ａｘｉｎ（アキシン）２の機能喪失型変異及びβ－ｃａｔの活性化変異は、肝細胞癌（ＨＣＣ）に多く見られるが、低頻度でＣＲＣにも見られる。癌以外にも、Ｗｎｔ経路の誤制御は、神経変性疾患、代謝性疾患、及び骨疾患等の疾患の発症にも関与している。そのため、低分子の阻害剤、及び抗体を用いた治療法等、Ｗｎｔ経路を標的とした薬剤が長年にわたって数多く報告されている。Ｗｎｔを標的とした薬剤についての数多くの有望な発見にもかかわらず、そのほとんどがヒトでの臨床試験には至っていない。低分子阻害剤で第１相試験まで進んだ個別の例はあるが、しかしながら、これまでに臨床使用が認められたものはない。これらの薬剤が治療法として開発される際に直面する課題の１つは、Ｗｎｔシグナル伝達経路と、Ｎｏｔｃｈ及びＨｅｄｇｅｈｏｇ等の他の経路との間に大きなクロストークがあることである。これらの経路間のクロストークは、これらの薬剤の特異性を制限したり、代償的な活性化を通して治療応答におけるそれら薬剤の有効性に影響を及ぼしたりする可能性がある。加えて、Ｗｎｔ経路の線形カスケード内の様々な構成要素のドライバー変異も、これらの薬剤の経路阻害効果を制限する可能性がある。

【0005】

その結果、下流のＷｎｔ標的遺伝子の発現に必要なβ－ｃａｔ－ＴＣＦ４相互作用を阻害することにより、Ｗｎｔ経路の効果的かつ特異的な下方制御が達成できると予測されている。この戦略の利点は２つある。第一に、Ｗｎｔ経路の下流の構成要素に変異があり、これにより上流の阻害剤が効きにくくなっている疾患では、β－ｃａｔ－ＴＣＦ４相互作用を標的とすることはより効果的である。第二に、この戦略は、β－ｃａｔの転写機能を特異的に標的とし、細胞と細胞の接着結合（ＡＪ）でのＥカドヘリン（ＥＣＡＤ）との相互作用に影響を与えないと思われる。β－ｃａｔ－ＥＣＡＤ結合ポケットとは異なるβ－ｃａｔ－ＴＣＦ４結合ポケットを選択的に標的とすることにより、特異性が得られるということが提案されている。

【0006】

β－ｃａｔ－ＴＣＦ４相互作用を阻害する化合物を特定した細胞ベースのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を用いた化学遺伝学的スクリーニングが、これまでに報告されている。このスクリーニングから、β－ｃａｔとＥＣＡＤとの相互作用に影響を与えることなく、β－ｃａｔ－ＴＣＦ４相互作用を妨害することができる３つの化合物、ｉＣＲＴ３、ｉＣＲＴ５及びｉＣＲＴ１４が発見された。β－ｃａｔへのｉＣＲＴ３のインシリコでのドッキングは、ＴＣＦ４の拡張領域（残基１３～２５）に結合するβ－ｃａｔ上の部位にｉＣＲＴ３が結合することを予測した。この予測されたβ－ｃａｔ上のｉＣＲＴ３結合部位は、Ａｒｇ４６９、及びＴＣＦ４のＡｓｐ１６と塩橋を形成し、ＴＣＦ４のβ－ｃａｔへの高い親和性には欠かせないものであるＬｙｓ４３５によって囲まれている。この結合ポケットは、β－ｃａｔ－ＴＣＦ４相互作用に関して重要であることから、長年にわたり、β－ｃａｔ－ＴＣＦ４相互作用の阻害剤を特定するためのインシリコのドッキング研究の魅力的な標的部位として機能してきた。

【0007】

従って、β－ｃａｔ－ＴＣＦ４相互作用を阻害し、それに伴って下流のＷｎｔシグナルを減衰させるための、上述の課題の少なくとも一部を解決又は克服する改良された方法が必要とされている。

【0008】

また、β－ｃａｔを阻害することによって、又はβ－ｃａｔとＴＣＦ４との相互作用を妨害することによって改善される疾患又は健康状態を治療することができる治療剤が必要とされている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0009】

既存のタンパク質のＸ線結晶構造及び公知のβ－ｃａｔ－ＴＣＦ４相互作用阻害剤の生物学的活性を用いて、このタンパク質－タンパク質相互作用表面の有望な低分子阻害剤をより良く予測する計算モデルが本明細書に記載される。この計算モデル系の予測可能性を実証するために、低分子ライブラリのインシリコスクリーニングを実施し、２７種の化合物をβ－ｃａｔの結合剤候補として特定した。ヒットした化合物を実験的に検証して、３種類の強力なＷｎｔレポーター活性阻害剤が特定された。そのうち、化合物ＧＢ１８７４は、インビトロ及びインビボの表現型アッセイの両方で、強固なＷｎｔ腫瘍阻害表現型を誘発することがわかった。これらの結果、並びにさらなるインシリコでのスクリーニング及び生物学的スクリーニングに基づいて、Ｗｎｔレポーター活性を強く阻害する化合物群が特定された。

【0010】

１つの態様では、本明細書で提供されるのは、β－カテニン（β－ｃａｔ）を阻害することによって、又はβ－ｃａｔとＴ細胞因子４（ＴＣＦ４）との相互作用を妨害することによって改善される疾患又は健康状態の治療のための医薬の製造における化合物の使用であって、この化合物は式１を有するか、又はその薬学的に許容できる塩であり、

【化1】

上記式１中、
Ｒ^１は－（ＣＲ^４ _２）_ｍＸＲ^５であり、
Ｒ^２は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、アリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、又はヘテロアリールであり、
Ｒ^３は－（ＣＲ^６ _２）_ｎＲ^７であり、
Ｒ^４は、出現ごとに、独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、及びヘテロアラルキルからなる群から選択されるか、又はＲ^４の２つのインスタンス（登場する２つのＲ^４）は、それらが結合する１つ以上の炭素と一緒になって、３～７員のシクロアルキルを形成し、
Ｒ^５は、水素、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、アリール、又はヘテロアリールであり、
Ｒ^６は、出現ごとに、独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、及びヘテロアラルキルからなる群から選択されるか、又はＲ^６の２つのインスタンス（登場する２つのＲ^６）は、それらが結合する１つ以上の炭素と一緒になって、３～７員のシクロアルキルを形成し、
Ｒ^７は、－（Ｃ＝Ｏ）Ｒ^８、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^８、若しくは－（Ｃ＝Ｏ）Ｎ（Ｒ^８）_２であるか、又はＲ^７は、式２を有する部分であり、

【化2】

Ｒ^８は、出現ごとに、独立に、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、及びヘテロアラルキルからなる群から選択されるか、又は２つのＲ^８は、それらが結合する窒素と一緒になって、３～７員のヘテロシクロアルキルを形成するか、又はＲ^６及びＲ^８は、それらが結合する（複数の）原子と一緒になって、４～７員の置換されていてもよいシクロアルキル若しくは４～７員の置換されていてもよいヘテロシクロアルキルを形成し、
ｍは、０～４から選択される整数であり、
ｎは、０～４から選択される整数であり、
Ｘは、－Ｏ－、－Ｓ－であるか、又は存在しない
使用である。

【0011】

別の態様では、本明細書で提供されるのは、β－ｃａｔを阻害するか又はβ－ｃａｔとＴＣＦ４との相互作用を妨害する方法であって、β－ｃａｔを式１の化合物又はその薬学的に許容できる塩と接触させる工程を含み、

【化3】

上記式１中、
Ｒ^１は－（ＣＲ^４ _２）_ｍＸＲ^５であり、
Ｒ^２は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、アリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、又はヘテロアリールであり、
Ｒ^３は－（ＣＲ^６ _２）_ｎＲ^７であり、
Ｒ^４は、出現ごとに、独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、及びヘテロアラルキルからなる群から選択されるか、又はＲ^４の２つのインスタンスは、それらが結合する１つ以上の炭素と一緒になって、３～７員のシクロアルキルを形成し、
Ｒ^５は、水素、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、アリール、又はヘテロアリールであり、
Ｒ^６は、出現ごとに、独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、及びヘテロアラルキルからなる群から選択されるか、又はＲ^６の２つのインスタンスは、それらが結合する１つ以上の炭素と一緒になって、３～７員のシクロアルキルを形成し、
Ｒ^７は、－（Ｃ＝Ｏ）Ｒ^８、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^８、若しくは－（Ｃ＝Ｏ）Ｎ（Ｒ^８）_２であるか、又はＲ^７は、式２を有する部分であり、

【化4】

【0012】

別の態様では、本明細書で提供されるのは、必要とする対象における、β－ｃａｔを阻害することによって、又はβ－ｃａｔとＴＣＦ４との相互作用を妨害することによって改善される疾患又は健康状態の治療方法であって、治療有効量の式１の化合物又はその薬学的に許容できる塩を投与する工程を含み、

【化5】

上記式１中、
Ｒ^１は－（ＣＲ^４ _２）_ｍＸＲ^５であり、
Ｒ^２は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、アリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、又はヘテロアリールであり、
Ｒ^３は－（ＣＲ^６ _２）_ｎＲ^７であり、
Ｒ^４は、出現ごとに、独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、及びヘテロアラルキルからなる群から選択されるか、又はＲ^４の２つのインスタンスは、それらが結合する１つ以上の炭素と一緒になって、３～７員のシクロアルキルを形成し、
Ｒ^５は、水素、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、アリール、又はヘテロアリールであり、
Ｒ^６は、出現ごとに、独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、及びヘテロアラルキルからなる群から選択されるか、又はＲ^６の２つのインスタンスは、それらが結合する１つ以上の炭素と一緒になって、３～７員のシクロアルキルを形成し、
Ｒ^７は、－（Ｃ＝Ｏ）Ｒ^８、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^８、若しくは－（Ｃ＝Ｏ）Ｎ（Ｒ^８）_２であるか、又はＲ^７は、式２を有する部分であり、

【化6】

【0013】

別の態様では、本明細書で提供されるのは、β－ｃａｔを阻害することによって、又はβ－ｃａｔとＴＣＦ４との相互作用を妨害することによって改善される疾患又は健康状態の治療において使用するための化合物であって、この化合物は、式１を有するか、又はその薬学的に許容できる塩であり、

【化7】

上記式１中、
Ｒ^１は－（ＣＲ^４ _２）_ｍＸＲ^５であり、
Ｒ^２は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、アリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、又はヘテロアリールであり、
Ｒ^３は（ＣＲ^６ _２）_ｎＲ^７であり、
Ｒ^４は、出現ごとに、独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、及びヘテロアラルキルからなる群から選択されるか、又はＲ^４の２つのインスタンスは、それらが結合する１つ以上の炭素と一緒になって、３～７員のシクロアルキルを形成し、
Ｒ^５は、水素、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、アリール、又はヘテロアリールであり、
Ｒ^６は、出現ごとに、独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、及びヘテロアラルキルからなる群から選択されるか、又はＲ^６の２つのインスタンスは、それらが結合する１つ以上の炭素と一緒になって、３～７員のシクロアルキルを形成し、
Ｒ^７は、－（Ｃ＝Ｏ）Ｒ^８、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^８、若しくは－（Ｃ＝Ｏ）Ｎ（Ｒ^８）_２であるか、又はＲ^７は、式２を有する部分であり、

【化8】

Ｒ^８は、出現ごとに、独立に、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、及びヘテロアラルキルからなる群から選択されるか、又は２つのＲ^８は、それらが結合する窒素と一緒になって、３～７員のヘテロシクロアルキルを形成するか、又はＲ^６及びＲ^８は、それらが結合する原子と一緒になって、４～７員のシクロアルキル若しくは４～７員のヘテロシクロアルキルを形成し、
ｍは、０～４から選択される整数であり、
ｎは、０～４から選択される整数であり、
Ｘは、－Ｏ－、－Ｓ－であるか、又は存在しない
化合物である。

【0014】

別の態様では、本明細書で提供されるのは、治療法において使用するための化合物であって、この化合物は式１を有するか、又はその薬学的に許容できる塩であり、

【化9】

上記式１中
Ｒ^１は－（ＣＲ^４ _２）_ｍＸＲ^５であり、
Ｒ^２は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、アリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、又はヘテロアリールであり、
Ｒ^３は－（ＣＲ^６ _２）_ｎＲ^７であり、
Ｒ^４は、出現ごとに、独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、及びヘテロアラルキルからなる群から選択されるか、又はＲ^４の２つのインスタンスは、それらが結合する１つ以上の炭素と一緒になって、３～７員のシクロアルキルを形成し、
Ｒ^５は、水素、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、アリール、又はヘテロアリールであり、
Ｒ^６は、出現ごとに、独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、及びヘテロアラルキルからなる群から選択されるか、又はＲ^６の２つのインスタンスは、それらが結合する１つ以上の炭素と一緒になって、３～７員のシクロアルキルを形成し、
Ｒ^７は、－（Ｃ＝Ｏ）Ｒ^８、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^８、若しくは－（Ｃ＝Ｏ）Ｎ（Ｒ^８）_２であるか、又はＲ^７は、式２を有する部分であり、

【化10】

【図面の簡単な説明】

【0015】

本開示の上記の目的及び特徴並びに他の目的及び特徴は、添付の図面と併せて考慮すると、本開示の以下の説明から明らかになるであろう。

【0016】

【図1】図１は、リガンド発見のためのβ－カテニン構造の生成に使用されるモデリング及びドッキングプラットフォームを描く。３つの結晶構造が出発モデルとして使用された（Ｎ＝３）。小分子の訓練ライブラリは、３つのβ－カテニンの公知の阻害剤を含む（Ｍ＝３）。１回の反復の中で、すべてのターゲット構造は、ドッキングされた３つの公知のリガンドのそれぞれの存在下でさらに最適化される。

【図2(1)】図２は、Ｗｎｔシグナル伝達阻害のために予測された化合物のインシリコでの検討を描く。（ａ）ＨＥＫ２９３ＴＳＴＦ細胞における予測化合物のＴＯＰＦｌａｓｈレポーター活性。細胞は１０μＭの化合物で処理され、同時に５００ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３Ａで２４時間刺激された後、ルシフェラーゼ活性が測定された。化合物で処理された細胞のＴＯＰＦｌａｓｈレポーター活性は細胞生存率で正規化され、ＤＭＳＯ処理した細胞に対する倍率変化として提示された。エラーバーは４反復の標準偏差を表す。（ｂ）ｉＣＲＴ３及びヒット化合物によるＴＯＰＦｌａｓｈレポーター活性の二次用量反応阻害。ＳＴＦ細胞が異なる濃度の化合物で処理され、同時に５００ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３Ａで２４時間刺激された後、ルシフェラーゼ活性が測定された。様々な濃度の化合物で処理された細胞のルシフェラーゼ活性は、まず同じ濃度での細胞生存率で正規化され、ＤＭＳＯ処理された細胞に対する倍率変化として提示された。ＩＣ_５０値は、４パラメータの非線形回帰を用いて算出された。エラーバーは３反復の標準偏差を表す。

【図2(2)】図２は、Ｗｎｔシグナル伝達阻害のために予測された化合物のインシリコでの検討を描く。（ｃ）ｉＣＲＴ３及び上位３つのヒット化合物の化学構造。（ｄ）ｉＣＲＴ３（ｉ）、及び本研究で発見された３つの新規ヒット化合物ＧＢ８６７９（ｉｉ）、ＧＢ６８５３（ｉｉｉ）、及びＧＢ１８７４（ｉｖ）の、最適化された最も充実したβ－カテニン構造（部分的に透明な表面）における予測される結合様式。ドッキングされたリガンドはハイライトされ（実線の棒）、重要なβ－カテニン結合部位の残基も示されている（部分的に透明な棒）。ＰＰＩインターフェースを示すために、β－カテニン／ＴＣＦ４結晶複合体構造（ＰＤＢＩＤ１ＪＰＷ）からのＴＣＦ４ペプチドフラグメント（実線）もここに示されている。

【図3(1)】図３は、ヒット化合物がＷｎｔシグナル伝達経路を介してＨＣＴ１１６細胞に及ぼす影響を描く。（ａ）β－カテニンとその内因性結合パートナーの共免疫沈降。ＨＣＴ１１６細胞が、表示濃度のヒット化合物で１８時間処理された。処理された細胞のタンパク質ライセート（可溶化液）からβ－カテニンが免疫沈降され、β－カテニンに結合したＴＣＦ４及びＥカドヘリンの量がウエスタンブロットにより分析された（上段）。異なる処理のもとでβ－カテニンに結合したＴＣＦ４（右下パネル）又はＥカドヘリン（左下パネル）が定量され、ＤＭＳＯ処理細胞に対して正規化された。エラーバーは、ｎ＝４の独立した実験の標準偏差を表す。対応のある両側のスチューデント（Ｓｔｕｄｅｎｔ）のｔ検定が、ＤＭＳＯ対照と化合物処理との間で実施された。^＊Ｐ＜０．０５、ｎｓＰ＞０．０５。

【図3(2)】図３は、ヒット化合物がＷｎｔシグナル伝達経路を介してＨＣＴ１１６細胞に及ぼす影響を描く。（ｂ）ＨＣＴ１１６細胞がＤＭＳＯ又は５０μＭの化合物のいずれかで１８時間処理された。Ｗｎｔ標的タンパク質であるｃ－Ｍｅｔ、サイクリンＤ１、及びサバイビンの発現がウエスタンブロット法により測定された。（ｃ）ＨＣＴ１１６細胞が、ＤＭＳＯ又は５０μＭの化合物のいずれかで１８時間処理された。Ｗｎｔ経路関連タンパク質であるＥカドヘリン、β－カテニン、及びＴＣＦ４の発現がウエスタンブロット法により測定された。

【図3(3)】図３は、ヒット化合物がＷｎｔシグナル伝達経路を介してＨＣＴ１１６細胞に及ぼす影響を描く。（ｄ）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法による化合物ＧＢ１８７４のカテニンに対する代表的な結合曲線。定常応答値が化合物ＧＢ１８７４のそれぞれの濃度に対してプロットされ、解離定数Ｋ_Ｄ（ｎ＝３）が、Ｈｉｌｌスロープ（Ｈｉｌｌｓｌｏｐｅ）カーブフィッティング式による特異的結合を用いて算出された。（ｅ）化合物ＧＢ１８７４によるβ－カテニン及びＧＳＴ－ＴＣＦ４の結合のＳＰＲ用量反応阻害。ＩＣ_５０値（ｎ＝２）は、４パラメータの非線形回帰を用いて算出された。

【図4(1)】図４は、ヒット化合物による成長阻害、及びそれらがＷｎｔ駆動細胞の幹細胞性に及ぼす影響を描く。（ａ）１０μＭの化合物で毎日処理されたＨＣＴ１１６細胞の成長曲線。化合物処理とＤＭＳＯ対照との間の有意性を判断するために、ダネット（Ｄｕｎｎｅｔｔ）の多重比較検定を用いた一元配置反復測定ＡＮＯＶＡが実施された。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊＊ｐ＜０．００１。（ｂ）ＨＣＴ１１６細胞のコロニー形成に対するヒット化合物の効果。ＨＣＴ１１６細胞が６ウェルプレートで培養され、ＤＭＳＯ又は３０μＭの化合物で７日間処理された後、細胞は固定され、クリスタルバイオレットで染色された。得られたコロニーの数がカウントされた。両側のスチューデントのｔ検定が、化合物処理とＤＭＳＯ対照との間で実施された。^＊＊＊Ｐ＜０．００１。

【図4(2)】図４は、ヒット化合物による成長阻害、及びそれらがＷｎｔ駆動細胞の幹細胞性に及ぼす影響を描く。（ｃ）ＨＣＴ１１６細胞のスフェロイド形成に対するヒット化合物の効果。ＨＣＴ１１６細胞が超低付着性の９６ウェルプレートで培養され、ＤＭＳＯ又は３０μＭの上記化合物のいずれかで１４日間処理された後、２００μｍ以上のサイズのスフェロイドの数が測定された。両側のスチューデントのｔ検定が、化合物処理とＤＭＳＯ対照との間で実施された。^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊ｐ＜０．０１。スケールバーは１ｍｍを表す。（ｄ）ＨＣＴ１１６細胞を異種移植したＮＳＧマウスが、ビヒクル対照（ｎ＝６）又は５０ｍｇ／ｋｇのＧＢ１８７４（ｎ＝６）で１日おきに２週間、ｉ．ｐ．経由で処理された。腫瘍体積が経時的に追跡された。１７日目に、両側のスチューデントのｔ検定が、対照と処理との間で実施された。^＊Ｐ＜０．０５。

【図5(1)】図５は、ｉＣＲＴの類似体について、インシリコで予測されたドッキングスコア及びインビトロの細胞ベースのＩＣ_５０値を描く。ＤＯＣＫスコアが低いほど、より良い結合が予測される。ＲＡＮＫスコアが低いほど、より良い結合が予測される。好ましい（１）、中立（０）、好ましくない（－１）。（^＊）が多いほど、ランキングが高い。ｎｄ＝決定せず。

【図5(2)】図５（１）の続きである。

【図5(3)】図５（２）の続きである。

【図6A】図６Ａは、Ｅｎａｍｉｎｅ（エナミン）薬理学的多様性化合物ライブラリから特定された上位２７種の化合物のＤＯＣＫスコアを示す。

【図6B(1)】図６Ｂは、Ｅｎａｍｉｎｅ薬理学的多様性化合物ライブラリから特定された上位２７種の化合物の構造を描く。

【図6B(2)】図６Ｂ（１）の続きである。

【図7】図７は、（ａ）２４時間の化合物処理の後のＳＴＦ細胞の細胞生存率を描く。化合物で処理した細胞の生存率の測定値は、ＤＭＳＯ処理した細胞に対して正規化された。エラーバーは４反復の標準偏差を表す。（ｂ）２４時間処理後のＳＴＦ細胞の生存率に対するｉＣＲＴ３及びヒット化合物の用量応答効果。化合物で処理された細胞の生存率測定値は、ＤＭＳＯ処理された細胞に対して正規化された。ＩＣ_５０値は、４パラメータの非線形回帰を用いて算出された。エラーバーは３反復の標準偏差を表す。

【図8(1)】図８は、（ａ）β－カテニンリガンドに対する異なる濃度の分析対象化合物ＧＢ１８７４の結合センサグラムを描く。

【図8(2)】（ｂ）ＧＳＴ－ＴＣＦ４リガンドに対する５０ｎＭのβ－カテニン分析対象の結合センサグラム。β－カテニンは、ＧＳＴ－ＴＣＦ４への結合の前に、異なる濃度の化合物ＧＢ１８７４と１５分間プレインキュベートされた。

【図9(1)】図９は、（ａ）ＤＬＤ－１及び（ｂ）ＳＷ４８０細胞のスフェロイド形成に対するヒット化合物の影響を描く。この細胞は、超低付着性の９６ウェルプレートで培養され、ＤＭＳＯ又は３０μＭの化合物で７日間処理された後、２００μｍ以上のサイズのスフェロイドの数が測定された。両側のスチューデントのｔ検定が、化合物処理とＤＭＳＯ対照との間で実施された。^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊ｐ＜０．０５。スケールバーは１ｍｍを表す。

【図9(2)】（ｃ）ＨＣＴ１１６細胞を異種移植したＮＳＧマウスが、ビヒクル対照（ｎ＝６）又は５０ｍｇ／ｋｇのＧＢ１８７４（ｎ＝６）で１日おきに２週間、ｉ．ｐ．経由で処理された。マウスの体重が経時的に追跡された。１７日目に、両側のスチューデントのｔ検定が、対照と治療との間で実施された。ｎｓＰ＞０．０５。

【図10】図１０は、β－カテニン（ＣＴＮＮＢ１）及びＷｎｔ標的遺伝子の発現に対するＧＢ１８７４及びその類似体の効果を描く。

【図11】図１１は、ＧＢ１８７４がＷｎｔシグナル伝達の阻害を介して、インビボでＷｎｔ駆動細胞の成長を阻害したことを描く。（ａ）ＨＣＴ１１６細胞を異種移植したＮＳＧマウスが、ビヒクル対照（ｎ＝６）又は５０ｍｇ／ｋｇのＧＢ１８７４（ｎ＝６）で１日おきに２週間、ｉ．ｐ．経由で処理された。腫瘍体積（左パネル）が経時的に追跡された。ビヒクル対照と処理腫瘍体積との間で二元配置のＡＮＯＶＡが実施された。^＊Ｐ＜０．０５。エラーバーは平均±ＳＥＭを表す。処理終了時の腫瘍の画像が右パネルに示されている。スケールバーは１ｃｍを表す。（ｂ）Ｋｉ６７及びサイクリンＤ１の発現に関する腫瘍の代表的なＩＨＣ染色（左パネル）。スケールバーは１００μｍを表す。単位腫瘍面積あたりのサイクリンＤ１及びＫｉ６７を発現する細胞の数の定量化（右パネル）。各マーカーについて、ビヒクル対照と処置の間で片側のスチューデントのｔ検定が実施された。^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊Ｐ＜０．０５、ｎｓＰ＞０．０５。エラーバーは３つの腫瘍の平均±ＳＤを表す。

【発明を実施するための形態】

【0017】

以下は、本発明の説明を理解するのに役立つと思われるいくつかの定義である。これらは、一般的な定義として意図されており、決して本発明の範囲をそれらの用語のみに限定することはないが、以下の説明をよりよく理解するために出されたものである。

【0018】

文脈と矛盾する場合を除いて、又は明確に反対に記述されない限り、単数形の整数、工程、又は要素として本明細書に記載されている本発明の整数、工程、又は要素は、記載されている整数、工程、又は要素の単数形及び複数形の両方を明らかに包含する。

【0019】

本明細書全体を通して、文脈と矛盾する場合を除いて、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」という語、又は「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」又は「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」等の変化形は、記載された工程若しくは要素若しくは整数、又は工程若しくは要素若しくは整数のグループを含むことを意味するが、任意の他の工程若しくは要素若しくは整数又は要素若しくは整数のグループを除外することを意味しないと理解される。従って、本明細書の文脈では、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」という用語は、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｐｒｉｎｃｉｐａｌｌｙ，ｂｕｔｎｏｔｎｅｃｅｓｓａｒｉｌｙｓｏｌｅｌｙ（主に含むが、必ずしも単独にではない）」ことを意味する。

【0020】

当業者であれば、本明細書に記載される本発明は、具体的に記載されたもの以外の変形及び変更が可能であることを理解するであろう。本発明は、そのようなすべての変形及び変更を含むと理解されたい。また、本発明は、本明細書で言及され又は示されているすべての工程、特徴、組成物及び化合物を、個別に又はまとめて、並びに上記工程又は特徴の任意の及びすべての組み合わせ又は任意の２つ以上を含む。

【0021】

本明細書の文脈において、用語「アミノ酸」は、少なくとも１つの第１級、第２級、第３級又は第４級のアミノ基、及び少なくとも１つの酸基を有すると定義され、この酸基は、カルボン酸、スルホン酸、若しくはホスホン酸、又はそれらの混合物であってもよい。アミノ基は、酸基（１つ以上）に関して、「α」、「β」、「γ」・・・から「ω」であってもよい。「アミノ酸」の骨格は、ハロゲン、ヒドロキシ、グアニド、複素環式基から選択される１つ以上の基で置換されていてもよい。従って、「アミノ酸」は、その範囲内に、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、リジン、アルギニン及びヒスチジン、タウリン、ベタイン、Ｎ－メチルアラニン等も含む。（Ｌ）体及び（Ｄ）体のアミノ酸が、本発明の範囲に含まれる。

【0022】

本明細書で使用する場合、用語「アルキル基」は、その意味の中に、１～１０個の炭素原子、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、若しくは１０個の炭素原子を有する一価（「アルキル」）及び二価（「アルキレン」）の直鎖又は分岐鎖の飽和脂肪族基を含む。例えば、用語アルキルとしては、メチル、エチル、１－プロピル、イソプロピル、１－ブチル、２－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、アミル、１，２－ジメチルプロピル、１，１－ジメチルプロピル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシル、４－メチルペンチル、１－メチルペンチル、２－メチルペンチル、３－メチルペンチル、２，２－ジメチルブチル、３，３－ジメチルブチル、１，２－ジメチルブチル、１，３－ジメチルブチル、１，２，２－トリメチルプロピル、１，１，２－トリメチルプロピル、２－エチルペンチル、３－エチルペンチル、ヘプチル、１－メチルヘキシル、２，２－ジメチルペンチル、３，３－ジメチルペンチル、４，４－ジメチルペンチル、１，２－ジメチルペンチル、１，３－ジメチルペンチル、１，４－ジメチルペンチル、１，２，３－トリメチルブチル、１，１，２－トリメチルブチル、１，１，３－トリメチルブチル、５－メチルヘプチル、１－メチルヘプチル、オクチル、ノニル、デシル等が挙げられるが、これらに限定されない。

【0023】

用語「アルケニル基」は、その意味の中に、２～１０個の炭素原子、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、又は１０個の炭素原子を有し、アルキル鎖のどこかに、該当する場合はＥ、Ｚ、シス又はトランスの立体化学のいずれかの少なくとも１つの二重結合を有する一価（「アルケニル」）及び二価（「アルケニレン」）の直鎖又は分岐鎖の不飽和脂肪族炭化水素基を含む。アルケニル基の例としては、エテニル、ビニル、アリル、１－メチルビニル、１－プロペニル、２－プロペニル、２－メチル－１－プロペニル、２－メチル－１－プロペニル、１－ブテニル、２－ブテニル、３－ブテニル、１，３－ブタジエニル、１－ペンテニル、２－ペンテニル、３－ペンテニル、４－ペンテニル、１，３－ペンタジエニル、２，４－ペンタジエニル、１，４－ペンタジエニル、３－メチル－２－ブテニル、１－ヘキセニル、２－ヘキセニル、３－ヘキセニル、１，３－ヘキサジエニル、１，４－ヘキサジエニル、２－メチルペンテニル、１－ヘプテニル、２－ヘプテニル、３－ヘプテニル、１－オクテニル、１－ノネニル、１－デセニル等が挙げられるが、これらに限定されない。

【0024】

本明細書で使用する用語「アルキニル基」は、その意味の中に、２～１０個の炭素原子を有し、炭素鎖のどこかに、少なくとも１つの三重結合を有する一価（「アルキニル」）及び二価（「アルキニレン」）の直鎖又は分岐鎖の不飽和脂肪族炭化水素基を含む。アルキニル基の例としては、エチニル、１－プロピニル、１－ブチニル、２－ブチニル、１－メチル－２－ブチニル、３－メチル－１－ブチニル、１－ペンチニル、１－ヘキシニル、メチルペンチニル、１－ヘプチニル、２－ヘプチニル、１－オクチニル、２－オクチニル、１－ノニル、１－デシニル等が挙げられるが、これらに限定されない。

【0025】

本明細書で使用する場合、「アリール」は、芳香族単環式炭化水素環系、又は２つ以上の芳香族炭化水素環が一緒に縮合している（すなわち、共通の結合を有する）か、若しくは少なくとも１つの芳香族単環式炭化水素環が１つ以上のシクロアルキル及び／若しくはシクロヘテロアルキル環に縮合している多環式環系を指す。アリール基は、その環系に６～２４個の炭素原子を有することができ（例えば、Ｃ_６～Ｃ_２４アリール基）、複数の縮合環を含むことができる。特定の実施形態では、多環式アリール基は、８～２４個の炭素原子を有することができる。アリール基の任意の適切な環位置は、定義された化学構造に共有結合することができる。芳香族炭素環（複数可）のみを有するアリール基の例としては、フェニル、１－ナフチル（二環式）、２－ナフチル（二環式）、アントラセニル（三環式）、フェナントレニル（三環式）、ペンタセニル（五環式）等の基が挙げられる。少なくとも１つの芳香族炭素環が１つ以上のシクロアルキル環及び／又はシクロヘテロアルキル環に縮合している多環式環系の例としては、とりわけ、シクロペンタンのベンゾ誘導体（すなわち、５，６－二環式シクロアルキル／芳香族環系であるインダニル基）、シクロヘキサンのベンゾ誘導体（すなわち、６，６－二環式シクロアルキル／芳香族環系であるテトラヒドロナフチル基）、イミダゾリンのベンゾ誘導体（５，６－二環式シクロヘテロアルキル／芳香族環系であるベンゾイミダゾリニル基）、及びピランのベンゾ誘導体（すなわち、６，６－二環式シクロヘテロアルキル／芳香族環系であるクロメニル基）が挙げられる。アリール基の他の例としては、ベンゾジオキサニル基、ベンゾジオキソリル基、クロマニル基、インドリニル基等が挙げられる。特定の実施形態では、アリール基は、任意に置換されていてもよい。特定の実施形態では、アリール基は別のアリール基で置換されており、このアリール基はビアリール基と呼ぶことができる。ビアリール基のアリール基の各々は、任意に置換されていてもよい。

【0026】

本明細書で使用する場合、「ヘテロアリール」は、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）、ケイ素（Ｓｉ）、及びセレン（Ｓｅ）から選択される少なくとも１つの環ヘテロ原子を含む芳香族単環式環系、又は、環系に存在する環の少なくとも１つが芳香族であり、少なくとも１つの環ヘテロ原子を含む多環式環系を指す。多環式ヘテロアリール基は、２つ以上のヘテロアリール環が縮合したものだけでなく、１つ以上の芳香族炭素環、非芳香族炭素環、及び／又は非芳香族シクロヘテロアルキル環と縮合した少なくとも１つの単環式ヘテロアリール環を有するものも含む。ヘテロアリール基は、全体として、例えば、５～２４個の環原子を有し、１～５個の環ヘテロ原子を含むことができる（すなわち、５～２０員のヘテロアリール基）。ヘテロアリール基は、安定した構造をもたらす任意のヘテロ原子又は炭素原子で、定義された化学構造に結合することができる。一般に、ヘテロアリール環は、Ｏ－Ｏ、Ｓ－Ｓ、又はＳ－Ｏ結合を含まない。しかしながら、ヘテロアリール基中の１つ以上のＮ原子又はＳ原子は、酸化されてもよい（例えば、ピリジンＮ－オキシド、チオフェンＳ－オキシド、チオフェンＳ，Ｓ－ジオキシド）。ヘテロアリール基の例としては、例えば、以下に示す５員又は６員の単環式及び５～６員の二環式の環系が挙げられる。ここで、Ｔは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、Ｎ－アルキル、Ｎ－アリール、Ｎ－（アリールアルキル）（例えば、Ｎ－ベンジル）、ＳｉＨ_２、ＳｉＨ（アルキル）、Ｓｉ（アルキル）_２、ＳｉＨ（アリールアルキル）、Ｓｉ（アリールアルキル）_２、又はＳｉ（アルキル）（アリールアルキル）である。このようなヘテロアリール環の例としては、ピロリル基、フリル基、チエニル基、ピリジル基、ピリミジル基、ピリダジニル基、ピラジニル基、トリアゾリル基、テトラゾリル基、ピラゾリル基、イミダゾリル基、イソチアゾリル基、チアゾリル基、チアジアゾリル基、イソオキサゾリル基、オキサゾリル基、オキサジアゾリル基、インドリル基、イソインドリル基、ベンゾフリル基、ベンゾチエニル基、キノリル基、２－メチルキノリル基、イソキノリル基、キノキサリル基、キナゾリル基、ベンゾトリアゾリル基、ベンゾイミダゾリル基、ベンゾチアゾリル基、ベンゾイソチアゾリル基、ベンゾイソオキサゾリル基、ベンゾオキジアゾリル基、ベンゾオキサゾリル基、シンノリニル基、１Ｈ－インダゾリル基、２Ｈ－インダゾリル基、インドリジニル基、イソベンゾフリル基、ナフチリジニル基、フタラジニル基、プテリジニル基、プリニル基、オキサゾロピリジニル基、チアゾロピリジニル基、イミダゾピリジニル基、フロピリジニル基、チエノピリジニル基、ピリドピリミジニル基、ピリドピラジニル基、ピリドピリダジニル基、チエノチアゾリル基、チエノオキサゾリル基、チエノイミダゾリル基等が挙げられる。ヘテロアリール基のさらなる例としては、４，５，６，７－テトラヒドロインドリル基、テトラヒドロキノリニル基、ベンゾチエノピリジニル基、ベンゾフロピリジニル基等が挙げられる。特定の実施形態では、ヘテロアリール基は、任意に置換されていてもよい。

【0027】

本明細書で使用する用語「シクロアルキル」は、環状の飽和脂肪族基を指し、その意味の中に、３～１０個の炭素原子、例えば、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、又は１０個の炭素原子を有する一価（「シクロアルキル」）及び二価（「シクロアルキレン」）の飽和、単環式、二環式、多環式、又は縮合多環式の炭化水素ラジカルを含む。シクロアルキル基の例としては、シクロプロピル、２－メチルシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、２－メチルシクロペンチル、３－メチルシクロペンチル、シクロヘキシル等が挙げられるが、これらに限定されない。

【0028】

本明細書で使用する用語「シクロアルケニル」は、環状の不飽和脂肪族基を指し、その意味の中に、３～１０個の炭素原子を有し、アルキル鎖のどこかに、該当する場合はＥ、Ｚ、シス又はトランスの立体化学のいずれかの少なくとも１つの二重結合を有する一価（「シクロアルケニル」）及び二価（「シクロアルケニレン」）の単環式、二環式、多環式又は縮合多環式の炭化水素ラジカルを含む。シクロアルケニル基の例としては、シクロプロペニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル等が挙げられるが、これらに限定されない。

【0029】

本明細書で使用する用語「ヘテロシクロアルキル」は、その意味の中に、３～１０個の環原子を有し、１～５個の環原子がＯ、Ｎ、ＮＨ、又はＳから選択されるヘテロ原子である一価（「ヘテロシクロアルキル」）及び二価（「ヘテロシクロアルキレン」）の飽和、単環式、二環式、多環式の又は縮合した炭化水素ラジカルを含む。例としては、ピロリジニル、ピペリジニル、キヌクリジニル、アゼチジニル、モルホリニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル等が挙げられる。

【0030】

本明細書で使用する用語「ヘテロシクロアルケニル」は、その意味の中に、３～１０個の環原子を有し、少なくとも１つの二重結合を有し、１～５個の環原子がＯ、Ｎ、ＮＨ又はＳから選択されるヘテロ原子である一価（「ヘテロシクロアルケニル」）及び二価（「ヘテロシクロアルケニレン」）の飽和、単環式、二環式、多環式又は縮合多環式の炭化水素ラジカルを含む。

【0031】

本明細書で使用する用語「ヘテロ芳香族基」及び「ヘテロアリール」又は「ヘテロアリーレン」等の変化形は、その意味の中に、６～２０個の原子を有し、１～６個の原子がＯ、Ｎ、ＮＨ及びＳから選択されるヘテロ原子である一価（「ヘテロアリール」）及び二価（「ヘテロアリーレン」）の単核の、多核の、共役した、及び縮合した芳香族ラジカルを含む。このような基の例としては、ピリジル、２，２’－ビピリジル、フェナントロリニル、キノリニル、チオフェニル等が挙げられる。

【0032】

本明細書で使用する用語「ハロゲン」又は「ハライド」若しくは「ハロ」等の変化形は、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素を指す。

【0033】

本明細書で使用する用語「ヘテロ原子」又は「ヘテロ」等の変化形は、Ｏ、Ｎ、ＮＨ及びＳを指す。

【0034】

本明細書で使用する用語「アルコキシ」は、直鎖又は分岐鎖のアルキルオキシ基を指す。例としては、メトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ、イソプロポキシ、ｔｅｒｔ－ブトキシ等が挙げられる。

【0035】

本明細書で使用する用語「アミノ」は、－ＮＲ_ａＲ_ｂの形の基を指し、式中、Ｒ_ａ及びＲ_ｂは、水素、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアルケニル基、置換されていてもよいアルキニル基、及び置換されていてもよいアリール基を含むがこれらに限定されない群から個別に選択される。

【0036】

本明細書で使用する用語「芳香族基」、又は「アリール」若しくは「アリーレン」等の変化形は、６～１０個の炭素原子を有する芳香族炭化水素の一価（「アリール」）及び二価（「アリーレン」）の単核の、多核の、共役した、及び縮合した残基を指す。そのような基の例としては、フェニル、ビフェニル、ナフチル、フェナントレニル等が挙げられる。

【0037】

本明細書で使用する用語「アラルキル」は、その意味の中に、二価の飽和の、直鎖及び分岐鎖のアルキレンラジカルに結合した一価（「アリール」）及び二価（「アリーレン」）の単核の、多核の、共役した、及び縮合した芳香族炭化水素ラジカルを含む。

【0038】

本明細書で使用する用語「ヘテロアラルキル」は、その意味の中に、二価の飽和の、直鎖及び分岐鎖のアルキレンラジカルに結合した、一価（「ヘテロアリール」）及び二価（「ヘテロアリーレン」）の単核の、多核の、共役した、及び縮合した芳香族炭化水素ラジカルを含む。

【0039】

本明細書で使用される用語「置換されていてもよい」は、この用語が参照する基が非置換であってもよいし、独立に、アルキル、アルケニル、アルキニル、チオアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、ハロ、カルボキシル、ハロアルキル、ハロアルキニル、ヒドロキシル、アルコキシ、チオアルコキシ、アルケニルオキシ、ハロアルコキシ、ハロアルケニルオキシ、ニトロ、アミノ、ニトロアルキル、ニトロアルケニル、ニトロアルキニル、ニトロヘテロシクリル、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルケニルアミン、アルキニルアミノ、アシル、アルケノイル、アルキノイル、アシルアミノ、ジアシルアミノ、アシルオキシ、アルキルスルホニルオキシ、ヘテロシクロキシ、ヘテロシクロアミノ、ハロヘテロシクロアルキル、アルキルスルフェニル、アルキルカルボニルオキシ、アルキルチオ、アシルチオ、ホスホノ及びホスフィニル等のリン含有基、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、シアノ、シアネート、イソシアネート、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ（アルキル）、及び－Ｃ（Ｏ）Ｎ（アルキル）_２から選択される１つ以上の基で置換されていてもよいことを意味する。

【0040】

本発明は、本明細書に開示される化合物の、すべてのジアステレオマー異性体、ラセミ化合物及びエナンチオマーを含めてすべての異性体をその範囲内に含む。従って、式（Ｉ）及び（ＩＩ）は、例えば、Ｅ体、Ｚ体、シス体、トランス体、（Ｒ）体、（Ｓ）体、（Ｌ）体、（Ｄ）体、（＋）体、及び／又は（－）体の化合物を、いずれの場合も適宜含むと理解されるべきである。

【0041】

本発明の文脈では、用語「投与すること」、及び「投与する」及び「投与」を含むその用語の変化形は、任意の適切な手段によって、本発明の化合物又は組成物を生物若しくは表面に接触させる、塗布する、送達する、又は提供することを含む。

【0042】

本明細書で使用する用語「対象」は、治療、観察、及び／又は実験の目的物となる、又はなったことのある動物、典型的には哺乳動物又はヒトを指す。この用語が化合物又は薬剤の投与と関連して使用される場合、この対象は、治療、観察、及び／又は化合物若しくは薬剤の投与の目的物となったことがある。本明細書の文脈において、用語「対象」は、ヒト及び社会的、経済的又は研究的に重要な任意の種の個体を含み、その例としては、ヒツジ属、ウシ属、ウマ属、イノシシ属、ネコ属、イヌ属、霊長類（ヒト及び非ヒト霊長類を含む）、げっ歯類、ネズミ属、ヤギ属、ウサギ属、及び鳥類のメンバーを含むがこれらに限定されない。特定の実施形態では、対象はヒトである。特定の実施形態では、用語「対象」は、例えば、培養細胞株、生検、血液試料、又は細胞を含む流体試料を含む、対象に由来する細胞試料、組織試料、又は臓器試料を指すことができる。

【0043】

用語「置換された」は、「置換された」を用いた表現で示された基上の１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ又は５つ、いくつかの実施形態では１つ、２つ又は３つ、他の実施形態では１つ又は２つ）の水素原子が、示された有機基若しくは無機基からの選択物、又は当業者に公知である適切な有機基若しくは無機基で置き換えられていることを示すことを意図しているが、ただし、示された原子の通常の原子価は超えられておらず、かつ置換により安定した化合物が得られることを条件としている。適切な示された有機基又は無機基としては、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシルカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリフルオロメチルチオ、ジフルオロメチル、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルシリル、及びシアノが挙げられる。加えて、適切な示された基としては、例えば、－Ｘ、－Ｒ、－Ｏ－、－ＯＲ、－ＳＲ、－Ｓ－、－ＮＲ_２、－ＮＲ_３、＝ＮＲ、－ＣＸ_３、－ＣＮ、－ＯＣＮ、－ＳＣＮ、－Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、－ＮＣＳ、－ＮＯ、－ＮＯ_２、＝Ｎ_２、－Ｎ_３、－ＮＲＣ（＝Ｏ）Ｒ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ_２、－Ｓ（＝Ｏ）_２Ｏ－、－Ｓ（＝Ｏ）_２Ｒ、－ＯＳ（＝Ｏ）_２ＯＲ、－Ｓ（＝Ｏ）_２ＮＲ_２、－ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲ）_２、－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ）_２、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｘ、－Ｃ（Ｓ）Ｒ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ、－Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ、－Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ_２、－Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ_２、－Ｃ（＝ＮＲ）ＮＲ_２を挙げることができ、式中、各Ｘは、独立にハロゲン（又は「ハロ」基）、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩであり、各Ｒは、独立にＨ、アルキル、アリール、複素環、保護基又はプロドラッグ部分である。当業者であれば容易に理解できるように、置換基がケト（すなわち、＝Ｏ）又はチオキソ（すなわち、＝Ｓ）等である場合、置換された原子上の２つの水素原子がその置換基で置き換えられる。

【0044】

本明細書の文脈において、用語「治療」は、疾患の状態若しくは症状を改善するか、疾患の確立を防ぐか、又は何らかの方法で疾患若しくは他の望ましくない症状の進行を防ぐか、妨げるか、遅らせるか、若しくは逆転させる任意のあらゆる使用を指す。

【0045】

本明細書の文脈において、用語「治療有効量」は、その意味の中に、所望の治療効果をもたらすのに十分な量の本発明の化合物又は組成物を含む。必要とされる正確な量は、治療される種、対象の年齢及び一般的な状態、治療される状態の重症度、投与される特定の薬剤、投与方法等の要因に応じて、対象ごとに異なる。そのため、正確な「有効量」を特定することはできない。しかしながら、任意の所与の症例について、適切な「有効量」は、当業者によって日常的な実験のみを用いて決定されてもよい。

【0046】

本開示は、β－ｃａｔを阻害すること、又はβ－ｃａｔとＴＣＦ４との相互作用を妨害することに有用な化合物であって、この化合物は式１を有するか、又はその薬学的に許容できる塩であり、

【化11】

上記式１中、
Ｒ^１は－（ＣＲ^４ _２）_ｍＸＲ^５であり、
Ｒ^２は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、アリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、又はヘテロアリールであり、
Ｒ^３は、－（ＣＲ^６ _２）_ｎＲ^７であり、
Ｒ^４は、出現ごとに、独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、及びヘテロアラルキルからなる群から選択されるか、又はＲ^４の２つのインスタンスは、それらが結合する１つ以上の炭素と一緒になって、３～７員のシクロアルキルを形成し、
Ｒ^５は、水素、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、アリール、又はヘテロアリールであり、
Ｒ^６は、出現ごとに、独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、及びヘテロアラルキルからなる群から選択されるか、又はＲ^６の２つのインスタンスは、それらが結合する１つ以上の炭素と一緒になって、３～７員のシクロアルキルを形成し、
Ｒ^７は、－（Ｃ＝Ｏ）Ｒ^８、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^８、若しくは－（Ｃ＝Ｏ）Ｎ（Ｒ^８）_２であるか、又はＲ^７は、式２を有する部分であり、

【化12】

【0047】

特定の実施形態では、式Ｉの化合物は、下記化合物を含まない。

【化13】

【0048】

特定の実施形態では、Ｘは、－Ｏ－、－Ｓ－であるか、又は存在しない。Ｘが存在しない例では、Ｒ^１は、構造－（ＣＲ^４ _２）_ｍＲ^５を有することができ、この式中、ｍ、Ｒ^４、及びＲ^５は、本明細書に記載される任意の実施形態（複数可）で定義されているとおりである。

【0049】

特定の実施形態では、ｍは、０～３、０～２、０～１、又は１～２である。特定の実施形態では、ＸはＯ又はＳであり、ｍは１である。特定の実施形態では、Ｘは存在せず、ｍは１又は２である。

【0050】

特定の実施形態では、ｍは０～３、０～２、０～１、又は１～２である。

【0051】

特定の実施形態では、ｎは、０～３、０～２、０～１、又は１～２である。

【0052】

特定の実施形態では、Ｒ^２は、アルキル、アラルキル、ヘテロアラルキル、又は－（ＣＲ^９ _２）_ｐＲ^１０であり、この式中、ｐは、０～４から選択される整数であり、Ｒ^９は、出現ごとに、独立に、水素又はアルキルであり、Ｒ^１０は、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、又はヘテロアラルキルである。特定の実施形態では、Ｒ^１０は、置換されていてもよいフェニル、置換されていてもよいフラン、置換されていてもよいチオフェン、置換されていてもよいピロール、置換されていてもよいイミダゾール、置換されていてもよいオキサゾール、置換されていてもよいイソオキサゾール、置換されていてもよいチアゾール、置換されていてもよいピリジン、置換されていてもよいピラジン、又は置換されていてもよいトリアジンである。

【0053】

Ｒ^２が－（ＣＲ^９ _２）_ｐＲ^１０である例では、Ｐは、０～３、０～２、０～１、又は１～２であることができる。特定の実施形態では、Ｒ^９は、出現ごとに、独立に、水素又はアルキルである。特定の実施形態では、Ｒ^２は－（ＣＨ_２）Ｒ^１０又は－（ＣＨＭｅ）Ｒ^１０であり、Ｒ^１０は本明細書で定義されるとおりである。

【0054】

特定の実施形態では、Ｒ^４は、出現ごとに、水素又はアルキルであるか、又はＲ^４の２つのインスタンスは、それらが結合する１つ以上の炭素と一緒になって、３～７員又は３～６員のシクロアルキルを形成する。特定の実施形態では、Ｒ^４は水素である。

【0055】

特定の実施形態では、Ｒ^５は、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、アリール、又はヘテロアリールである。特定の実施形態では、Ｒ^５は、アリール、又はヘテロアリールである。特定の実施形態では、Ｒ^５は、置換されていてもよいフェニルである。

【0056】

特定の実施形態では、Ｒ^７は、－（Ｃ＝Ｏ）Ｒ^８、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^８、若しくは－（Ｃ＝Ｏ）Ｎ（Ｒ^８）_２であり、Ｒ^８はアルキル、シクロアルキル、アリールであるか、又は２つのＲ^８は、それらが結合する窒素と一緒になって、３～７員のヘテロシクロアルキルを形成するか、又はＲ^６及びＲ^８は、それらが結合する原子と一緒になって、４～７員の置換されていてもよいシクロアルキル若しくは４～７員の置換されていてもよいヘテロシクロアルキルを形成する。

【0057】

２つのＲ^８が、それらが結合する窒素と一緒になって、３～７員のヘテロシクロアルキルを形成する例では、この３～７員のヘテロシクロアルキルは、その環系において、酸素、硫黄及び窒素から選択される１つ又は２つのヘテロ原子を含むことができる。

【0058】

Ｒ^６及びＲ^８が、それらが結合する原子と一緒になって、４～７員の置換されていてもよいヘテロシクロアルキルを形成する例では、当該化合物は、式５を有することができ、又はその薬学的に許容できる塩であることができ、

【化14】

上記式５中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^６及びＲ^８の各々は、独立に、本明細書で定義されているとおりであり、ｍは０～４であり、Ａは、環系に酸素、硫黄及び窒素から選択される１つ若しくは２つのヘテロ原子を含む４～７員の置換されていてもよいシクロアルキル又は４～７員の置換されていてもよいヘテロシクロアルキルを表し、Ｙは、－Ｏ－、－Ｎ（Ｒ^８）－であるか、又は存在せず、あるいは、当該化合物は、式６を有することができ、又はその薬学的に許容できる塩であることができ、

【化15】

上記式６中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^６、及びＲ^８の各々は、独立に、本明細書で定義されているとおりであり、ｍは０～３であり、Ａは、環系に酸素、硫黄及び窒素から選択される１つ若しくは２つのヘテロ原子を含む４～７員の置換されていてもよいシクロアルキル又は４～７員の置換されていてもよいヘテロシクロアルキルを表し、Ｙは、－Ｏ－、－Ｎ（Ｒ^８）－であるか、又は存在しない。

【0059】

特定の実施形態では、Ｒ^８は、Ｃ_１～Ｃ_１０アルキル、Ｃ_３～Ｃ_７シクロアルキル、ビアリール、若しくは多環式炭化水素であるか、又は２つのＲ^８が、それらが結合する窒素と一緒になって、３～７員、４～７員、５～７員、又は５～６員の置換されていてもよいヘテロシクロアルキルを形成するか、又は当該化合物は、Ａが５～６員の置換されていてもよいシクロアルキルである式６を有する。

【0060】

Ｒ^７が式２を有する部位である例では、当該化合物は式７によって表すことができ、又はその薬学的に許容できる塩であることができ、

【化16】

上記式中、各Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^６、及びｍは、それぞれ独立に、本明細書で定義されたとおりである。

【0061】

特定の実施形態では、当該化合物は、式３を有するか、又はその薬学的に許容できる塩であり、

【化17】

上記式３中、
Ｒ^４は、出現ごとに、独立に、水素及びアルキルからなる群から選択され、
Ｒ^５は、アリール又はヘテロアリールであり、
Ｒ^６は、出現ごとに、独立に、水素及びアルキルからなる群から選択され、
Ｒ^７は、－（Ｃ＝Ｏ）Ｒ^８、－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^８、若しくは－（Ｃ＝Ｏ）Ｎ（Ｒ^８）_２であるか、又はＲ^７は、式４を有する部分であり、

【化18】

【0062】

特定の実施形態では、当該化合物は、Ｒ^４が水素であり、Ｒ^５がアリールであり、Ｒ^９が、出現ごとに、独立に、水素及びアルキルからなる群から選択され、Ｒ^１０がアリールであり、Ｒ^６が、出現ごとに、独立に、水素及びアルキルからなる群から選択され、Ｒ^７が－（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^８又は－（Ｃ＝Ｏ）Ｎ（Ｒ^８）_２であり、Ｒ^８が、出現ごとに、独立に、アルキル、シクロアルキル、及びアリールからなる群から選択されるか、又はＲ^８の２つのインスタンスが、それらが結合する窒素と一緒になって、５～６員のヘテロシクロアルキルを形成する式３を有する。

【0063】

特定の実施形態では、当該化合物は、式８を有するか、又はその薬学的に許容できる塩であり、

【化19】

上記式８中、
ｑは、０～２から選択される整数であり、
ｔは、１又は２であり、
Ｒ^５は、置換されていてもよいフェニルであり、
Ｒ^９は、水素又はアルキルであり、
Ｒ^１０は、置換されていてもよいフェニルであり、
Ｒ^１１は、出現ごとに、独立に、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、－ＳＲ、－ＯＲ、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－ＮＲ_２、又は－Ｎ（Ｒ）（Ｃ＝Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２からなる群から選択され、式中、Ｒは、出現ごとに、独立に、水素、アルキル、アリール、若しくはヘテロアリールであるか、又は２つのＲは、それらが結合する１つ以上の窒素と一緒になって、３～７員のヘテロシクロアルキルを形成する。

【0064】

特定の実施形態では、当該化合物は、ｑが０又は１であり、ｔが１であり、Ｒ^９が水素又はＣ_１～Ｃ_３アルキルであり、Ｒ^１１がアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、又はヘテロアラルキルである式８を有する。

【0065】

特定の実施形態では、当該化合物は、

【化20】

又はその薬学的に許容できる塩からなる群から選択される。

【0066】

本明細書に記載される化合物の薬学的に許容できる塩は、例えば、非毒性の有機酸又は無機酸からの、当該化合物の従来の非毒性の塩又は第４級アンモニウム塩を含むことができる。例えば、そのような従来の非毒性の塩としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸等の無機酸から誘導される塩、及び酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パルミチン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２－アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イソチオン酸等の有機酸から調製される塩等が挙げられる。

【0067】

他の場合では、本明細書に記載される化合物は、１つ以上の酸性官能基を含んでもよく、従って、薬学的に許容できる塩基と薬学的に許容できる塩を形成することができる。これらの例における用語「薬学的に許容できる塩」は、本明細書に記載される化合物の比較的非毒性の無機及び有機の塩基付加塩を指すことができる。これらの塩は、同様に、投与ビヒクル若しくは剤形製造プロセスにおいてその場で調製することができ、又は、遊離酸形態にある精製された化合物を、適切な塩基、例えば、薬学的に許容できる金属カチオンの水酸化物、炭酸塩若しくは炭酸水素塩と、アンモニアと、又は薬学的に許容できる有機の第一級、第二級若しくは第三級のアミンと別途反応させることによって調製することができる。代表的なアルカリ塩又はアルカリ土類塩としては、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、及びアルミニウム塩等が挙げられる。塩基付加塩の形成に有用な代表的な有機アミンとしては、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジン等が挙げられる。

【0068】

β－ｃａｔの阻害又はβ－ｃａｔとＴＣＦ４との相互作用の妨害は、インビトロ、インビボ、又はエキソビボで実施されてもよい。

【0069】

β－ｃａｔの阻害又はβ－ｃａｔとＴＣＦ４との相互作用の妨害は、本明細書に記載される化合物の１つ以上を、β－ｃａｔ及びβ－ｃａｔ－ＴＣＦ４複合体の少なくとも一方と接触させることによって実施されてもよい。

【0070】

β－ｃａｔ又はβ－ｃａｔ－ＴＣＦ４複合体を式１の化合物と接触させると、β－ｃａｔの機能の阻害、β－ｃａｔとＴＣＦ４との相互作用の阻害、及びβ－ｃａｔ／ＴＣＦ４複合体の妨害のうちの１つ以上をもたらすことができ、さらにＷｎｔシグナル伝達の減衰をもたらすことができる。

【0071】

従って、β－ｃａｔを阻害するか又はβ－ｃａｔとＴＣＦ４との相互作用を妨害する方法は、β－ｃａｔの阻害、β－ｃａｔ／ＴＣＦ４複合体の妨害、及び／又はＷｎｔシグナル伝達経路の減衰が、疾患又は健康状態の改善をもたらす疾患を治療するために使用することができる。

【0072】

β－ｃａｔとＴＣＦ４との相互作用を妨害するとは、β－ｃａｔとＴＣＦ４の会合を阻害すること、又はβ－ｃａｔ－ＴＣＦ４複合体の解離を誘導してβ－ｃａｔ及びＴＣＦ４を形成することの一方又は両方を指すことができる。

【0073】

投与するために必要な式１の化合物の量又は濃度は、当業者であれば、周知の方法及び本明細書で提供される開示を用いて容易に決定することができる。

【0074】

本明細書で提供されるのは、必要とする対象における、β－ｃａｔとＴＣＦ４との相互作用を阻害することによって改善される疾患又は健康状態の治療方法であって、治療有効量の本明細書に記載される化合物を投与する工程を含む方法である。特定の実施形態では、この対象はヒトである。

【0075】

本開示は、β－ｃａｔを阻害することによって、又はβ－ｃａｔとＴＣＦ４との相互作用を妨害することによって改善される疾患又は健康状態の治療に使用するための本明細書に記載される化合物も提供する。

【0076】

本開示はさらに、β－ｃａｔを阻害することによって、又はβ－ｃａｔとＴＣＦ４との相互作用を妨害することによって改善される疾患又は健康状態の治療のための医薬の製造における、本明細書に記載される化合物の使用を提供する。

【0077】

上記疾患又は健康状態は、癌、神経変性疾患、代謝性疾患（代謝病）、心血管疾患、線維症、又は骨疾患であることができる。

【0078】

特定の実施形態では、上記疾患又は健康状態は、Ｗｎｔシグナル伝達経路、Ｍｙｃシグナル伝達経路及びＨｉｐｐｏシグナル伝達経路のうちの１つ以上の異常な活性化を特徴とする癌である。

【0079】

特定の実施形態では、上記疾患又は健康状態は、Ｗｎｔ／β－ｃａｔシグナル伝達経路の異常な活性化を特徴とする癌である。

【0080】

異常なＷｎｔ／β－ｃａｔ経路のシグナル伝達は、多くの異なる癌に関与するとされており、この経路における多くの遺伝子異常は、腫瘍の促進及び進行に寄与している可能性がある^１。Ｗｎｔ／β－ｃａｔ経路の活性化は、結腸直腸癌（大腸癌）^２、黒色腫^３、肝芽腫^４、髄芽腫^５、前立腺癌^６、並びに子宮及び卵巣の類内膜腺癌^７～１０等、いくつかのヒトの癌において最も頻繁に見られるシグナル伝達異常の１つである。Ｗｎｔ／β－ｃａｔ経路の活性化は乳房の化生癌でもよく見られる^１１。

【0081】

従って、提供される方法は、結直腸癌（大腸癌）、肝細胞癌、黒色腫、肝臓癌、乳癌、前立腺癌、白血病、甲状腺癌、脳癌、髄芽腫、肝芽腫、類腱腫、骨腫、頭頸部癌、並びに子宮及び卵巣の類内膜腺癌からなる群から選択される癌の治療に用いることができる。

【0082】

特定の実施形態では、上記癌は、Ｗｎｔ／β－ｃａｔシグナル伝達経路の異常な活性化を特徴とする結直腸癌である。

【実施例】

【0083】

仮想化学ライブラリの生成
訓練ライブラリは、ｉＣＲＴ３、ｉＣＲＴ５、及びｉＣＲＴ１４^１２を含む３つの公知のβ－ｃａｔ－ＴＣＦ４複合体の阻害剤、並びに陰性対照としてＤＵＤ－Ｅアプローチ^１４によりＺＩＮＣデータベース^１３から選択された１５０種の特性適合計算デコイとから構成される。検証用ライブラリは、ＤａｓＧｕｐｔａ研究室で合成された６３種のｉＣＲＴ３類似体から構成される。バーチャルスクリーニングライブラリは、Ｅｎａｍｉｎｅ（ｈｔｔｐｓ：／／ｅｎａｍｉｎｅ．ｎｅｔ／）から購入した１０２４０種の化合物で構成される。

【0084】

分子ドッキングスクリーン
ドッキングの前に球及びグリッドを生成した。リガンド由来の球体を受容体由来の球体で補強することにより、データベース化合物をサイト内に配向させるのに役立つ４５個のマッチング球体を生成した。リガンド由来の球体は、最初はＴＣＦ４ペプチド断片の結晶構造の非水素原子の位置で表され、以降のラウンドではｉＣＲＴリガンドのドッキングポーズに置き換えた。受容体由来の球体は、ＳＰＨＧＥＮ^１５というプログラムを用いて、結合部位の分子表面から算出した。ドッキングスクリーンは、ＤＯＣＫバージョン３．６^１６を用いて行った。ドッキングした化合物は、ｖａｎｄｅｒＷａａｌｓ項、Ｐｏｉｓｓｏｎ－Ｂｏｌｔｚｍａｎｎ静電項、及びリガンド脱溶媒ペナルティ項の合計であるドッキングエネルギーによってランク付けした。

【0085】

ドッキング性能評価
リガンド予測における構造モデルの精度は、上位スコアの化合物における公知のリガンドに対する改善度（充実度、ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）により評価し、この改善度は、初期改善係数ＥＦ１と、受信者動作特性（ＲＯＣ）の）曲線下面積（ＡＵＣ）に類似しているが初期の改善をより重視する^{１６、１７}総合改善度ｌｏｇＡＵＣとによって測定した。

【0086】

細胞株
ＷｎｔＳＴＦレポーター細胞（ＴＯＰＦｌａｓｈレポーターを安定的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞）及びＳＴＦ３Ａレポーター細胞（Ｗｎｔ３Ａを構成的に分泌するＳＴＦ細胞）は、ＤａｖｉｄＶｉｒｓｈｕｐ（Ｄｕｋｅ－ＮＵＳＧｒａｄｕａｔｅＭｅｄｉｃａｌＳｃｈｏｏｌ（デューク－シンガポール国立大学医学部）、シンガポール）からの親切な贈り物であった。ＨＣＴ１１６、ＤＬＤ－１、及びＳＷ４８０の細胞株はＡＴＣＣから入手した。Ｈｉｐｐｏ経路ＴＥＡＤレポーター（カタログ番号６０６１８）及びＭｙｃシグナル経路レポーター（カタログ番号６０５２０）の細胞株は、ＢＰＳＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．（ビーピーエス・バイオサイエンス）から購入した。

【0087】

培養培地
ＳＴＦ細胞、ＳＴＦ３Ａ細胞、及びＤＬＤ－１細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ（ハイクローン）、カタログ番号ＳＶ３０１６０．０３）及び１００Ｕ／ｍＬペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ（ギブコ）、カタログ番号１５１４０１２２）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏカタログ番号１１９６５０８４）で培養した。ＨＣＴ１１６、ＳＷ４８０、及びＭｙｃのシグナル伝達経路レポーター細胞は、１０％ＦＢＳ及び１００Ｕ／ｍＬペニシリン－ストレプトマイシンを添加したマッコイの５Ａ培地（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１６６００１０８）で培養した。Ｍｙｃシグナル伝達経路レポーター細胞用の培地には、さらに４００μｇ／ｍＬのＧ－４１８硫酸塩（ＧｏｌｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ゴールド・バイオテクノロジー）、カタログ番号Ｇ－４１８－５）を添加した。Ｈｉｐｐｏ経路ＴＥＡＤレポーター細胞は、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン－ストレプトマイシン、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１１４００５０）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１３６００７０）、４００μｇ／ｍＬＧ－４１８硫酸塩、及び１０μｇ／ｍＬインスリン（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ（シグマ・アルドリッチ）、カタログ番号Ｉ１８８２－１００ＭＧ）を添加したＥａｒｌｅ（アール）平衡塩溶液（Ｅａｒｌｅ’ｓｂａｌａｎｃｅｄｓａｌｔｓ、ＥＢＳＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３００２４．０１）を含む最小必須培地（ＭＥＭ）で培養した。スフェロイド形成用の培地は、Ｂ２７（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１２５８７０１０）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン－ストレプトマイシン、２０ｎｇ／ｍＬＥＧＦ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号ＰＨＧ０３１３）、２０ｎｇ／ｍＬｂＦＧＦ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号ＰＨＧ００２３）、及び３％マトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ（コーニング）、カタログ番号３５４２３４）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ－１２（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１３２００８２）であった。

【0088】

ＴＯＰＦｌａｓｈ（Ｗｎｔシグナル伝達）レポータースクリーン
ＳＴＦ細胞を、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３９０３及び３９０４）に１ウェルあたり１００μＬの培養培地に２０，０００細胞として播種した。翌日、ＤＭＳＯ中の候補化合物を１０μＭ、１％ＤＭＳＯの最終濃度で細胞に添加した。また、Ｗｎｔ３Ａ馴化培地で細胞を刺激した。２４時間のインキュベーションの後、製造者のプロトコルに従い、ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ細胞生存率試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（インビトロジェン）、カタログ番号Ａ１３２６２）を用いて細胞の生存率を測定し、一方、ＴＯＰＦｌａｓｈレポーター活性はＳｔｅａｄｙ－Ｇｌｏルシフェラーゼ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ（プロメガ）、カタログ番号Ｅ２５５０）を用いて測定した。

【0089】

レポーター株の用量反応
Ｗｎｔシグナル伝達レポーター
ＷｎｔＳＴＦレポーター細胞を、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３９０３、Ｆａｌｃｏｎ（ファルコン）、カタログ番号３５３０７２）に、１ウェルあたり１００μＬの培養培地に２０，０００細胞として播種した。翌日、ＤＭＳＯで５倍に希釈した化合物を１％ＤＭＳＯの最終濃度で細胞に添加した。また、５００ｎｇ／ｍＬの組み換えヒトＷｎｔ３Ａ（ＲｎＤｓｙｓｔｅｍｓ（アールアンドディ・システムズ）、カタログ番号５０３６－ＷＮ－０１０）で細胞を刺激した。２４時間のインキュベーションの後、製造者のプロトコルに従い、細胞計数キット－８（ＣＣＫ－８、Ｄｏｊｉｎｄｏ（同仁化学研究所）カタログ番号ＣＫ０４）細胞生存率試薬を用いて細胞の生存率を測定し、一方、ＴＯＰＦｌａｓｈレポーター活性はＳｔｅａｄｙ－Ｇｌｏルシフェラーゼ試薬を用いて測定した。

【0090】

ＷｎｔＳＴＦ３Ａレポーター細胞を、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３９０３、Ｆａｌｃｏｎ、カタログ番号３５３０７２）に１ウェルあたり１００μＬの培養培地に２０，０００細胞として播種した。翌日、ＤＭＳＯで５倍に希釈した化合物を１％ＤＭＳＯの最終濃度で細胞に添加した。２４時間のインキュベーションの後、製造者のプロトコルに従い、細胞計数キット－８（ＣＣＫ－８、Ｄｏｊｉｎｄｏカタログ番号ＣＫ０４）細胞生存率試薬を用いて細胞の生存率を測定し、一方、ＴＯＰＦｌａｓｈレポーター活性はＳｔｅａｄｙ－Ｇｌｏルシフェラーゼ試薬を用いて測定した。

【0091】

Ｍｙｃシグナル伝達レポーター
Ｍｙｃレポーター（Ｌｕｃ）－ＨＣＴ１１６細胞を、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３９０３、Ｆａｌｃｏｎ、カタログ番号３５３０７２）に、１ウェルあたり１００μＬのアッセイ培地に２５，０００細胞として播種した。アッセイ培地は、Ｇ－４１８を含まない成長培地からなる。翌日、ＤＭＳＯで４倍に希釈した化合物を１％ＤＭＳＯの最終濃度で細胞に添加した。２４時間のインキュベーションの後、ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ細胞生存率試薬を用いて細胞の生存率を測定し、一方、Ｓｔｅａｄｙ－Ｇｌｏルシフェラーゼ試薬を用いてルシフェラーゼレポーター活性を測定した。

【0092】

Ｈｉｐｐｏシグナル伝達レポーター
ＨｉｐｐｏＴＥＡＤレポーター細胞を、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３９０３、Ｆａｌｃｏｎ、カタログ番号３５３０７２）に、１ウェルあたり１００μＬのアッセイ培地に１００，０００細胞として播種した。アッセイ培地はＧ－４１８を含まない成長培地からなる。翌日、ＤＭＳＯで５倍に希釈した化合物を１％ＤＭＳＯの最終濃度で細胞に添加した。２４時間のインキュベーションの後、ＣＣＫ－８細胞生存率試薬を用いて細胞の生存率を測定し、一方、Ｓｔｅａｄｙ－Ｇｌｏルシフェラーゼ試薬を用いてルシフェラーゼレポーター活性を測定した。

【0093】

ＣＲＣ細胞株を用いた用量反応試験
ＨＣＴ１１６細胞、ＤＬＤ－１細胞、及びＳＷ４８０細胞を、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３９０３）に１ウェルあたり１００μＬの成長培地に５，０００細胞として播種した。翌日、ＤＭＳＯで５倍に希釈した化合物を、１％のＤＭＳＯの最終濃度で細胞に添加した。２４時間のインキュベーションの後、製造者のプロトコルに従ってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発光細胞生存率試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ７５７３）を用いて細胞の生存率を測定した。

【0094】

用量反応試験のデータ解析
各プレートについて、ＤＭＳＯ処理したウェルからの平均シグナルを算出し、各処理ウェルからのシグナルを、それぞれのプレートからの平均ＤＭＳＯシグナルに対して正規化した。正規化した値をＧｒａｐｈＰａｄ（グラフパッド）Ｐｒｉｓｍ５を用いて試験した濃度に対してプロットし、３パラメータ又は４パラメータの非線形回帰によりＥＣ_５０値を決定した。

【0095】

増殖アッセイ
ＨＣＴ１１６細胞を、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３９０３）に１ウェルあたり１００μＬの成長培地に３，０００細胞として播種し、一晩付着させた。その後、細胞を、１０μＭ、０．１％ＤＭＳＯの最終濃度の化合物で４日間連続処理し、毎日培地交換を行った。毎日の細胞増殖は、製造者のプロトコルに従ってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発光細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ７５７３）を用いて測定した。

【0096】

スフェロイド形成アッセイ
ＨＣＴ１１６細胞、ＤＬＤ－１細胞、及びＳＷ４８０細胞を、９６ウェル超低付着性プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３４７４）に１ウェルあたり２００μＬのスフェロイド培地に１５０細胞として播種した。上記化合物は、３０μＭ、０．５％ＤＭＳＯの最終濃度で、細胞播種の日に添加した。細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で培養し、細胞播種後７日目及び１０日目に、形成されたスフェロイドの画像を、ＯｐｅｒｅｔｔａＣＬＳシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（パーキン・エルマー））を用いて取得した。

【0097】

ウエスタンブロット法
ＨＣＴ１１６細胞を、５０μＭ、１％ＤＭＳＯの最終濃度で、化合物で１８時間処理した。細胞を、ｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ（ロシュ）、カタログ番号１１６９７４９８００１）及びＰｈｏｓＳＴＯＰホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号０４９０６８３７００１）を含むＲＩＰＡバッファ（Ｔｈｅｒｍｏ（サーモ）、カタログ番号８９９００）中で氷上で溶解した。試料あたり３０μｇの全細胞タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（ミリポア）、カタログ番号ＩＰＶＨ０００１０）にブロッティングした。一次抗体を４℃で一晩インキュベートし、ブロットをＩＲＤｙｅ８００ＣＷヤギ抗ウサギ抗体（ＬＩ－ＣＯＲ、カタログ番号９２６－３２２１１）又はＩＲＤｙｅ６８０ＲＤヤギ抗マウス抗体（ＬＩ－ＣＯＲ、カタログ番号９２６－６８０７０）のいずれかで１：５０００の希釈で検出した。シグナルはＬＩ－ＣＯＲＯｄｙｓｓｅｙＣＬｘイメージングシステムで可視化し、バンドはＬＩ－ＣＯＲＩｍａｇｅＳｔｕｄｉｏデータ解析ソフトウェアを用いて数値化した。使用した一次抗体は、Ｍｅｔ（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（セル・シグナリング・テクノロジー）、カタログ番号８１９８、１：１０００）、サイクリンＤ１（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号２９７８、１：１０００）、サバイビン（ＳａｎｔａＣｒｕｚ（サンタクルーズ）、カタログ番号ｓｃ－１０８１１、１：５００）、ＥＣＡＤ（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号３１９５、１：１０００）、ＴＣＦ４／ＴＣＦ７Ｌ２（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号２５６９、１：１０００）、β－ｃａｔ（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号８４８０、１：１０００）、β－アクチン（Ａｂｃａｍ（アブカム）、カタログ番号ａｂ８２２６、１：３０００）であった。

【0098】

共免疫沈降法
ＨＣＴ１１６細胞を指示濃度の化合物で１８時間処理した。２０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１３７ｍＭＮａＣｌ、１．５ｍＭＭｇＣｌ_２、１ｍＭＥＧＴＡ、１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、１０％グリセロール、ｃＯｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１１６９７４９８００１）、及び１ｍＭＮａ_３ＶＯ_４を含む溶解バッファを用いて、氷上で細胞を溶解した。清澄にしたタンパク質ライセートの各試料を、４μｇの抗β－ｃａｔ抗体（Ｓｉｇｍａ（シグマ）、カタログ番号Ｃ７２０７）と４℃で一晩インキュベートし、続いて５０μＬのスラリー状のＤｙｎａｂｅａｄｓＰｒｏｔｅｉｎＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１０００４Ｄ）と４℃で１時間インキュベートした。その後、ビーズを４℃の溶解バッファで３回洗浄し、ビーズを３０μＬ（１試料あたり）のＳＤＳ試料バッファと一緒に９５℃で７分間加熱することにより、結合したタンパク質を溶出させた。タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＩＰＶＨ０００１０）にブロッティングした。一次抗体を４℃で一晩インキュベートし、ブロットをＩＲＤｙｅ８００ＣＷヤギ抗ウサギ抗体（ＬＩ－ＣＯＲ、カタログ番号９２６－３２２１１）又はＩＲＤｙｅ６８０ＲＤヤギ抗マウス抗体（ＬＩ－ＣＯＲ、カタログ番号９２６－６８０７０）のいずれかで１：５０００の希釈で検出した。シグナルはＬＩ－ＣＯＲＯｄｙｓｓｅｙＣＬｘイメージングシステムで可視化し、バンドはＬＩ－ＣＯＲＩｍａｇｅＳｔｕｄｉｏデータ解析ソフトウェアを用いて数値化した。使用した一次抗体は、Ｅ－カドヘリン（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ１５１４８、１：１０００）、ＴＣＦ４／ＴＣＦ７Ｌ２（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号２５６９、１：１０００）、β－ｃａｔ（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号８４８０、１：１０００）であった。

【0099】

タンパク質の発現及び精製
Ｈｉｓタグ付きヒトβ－ｃａｔ（１３４－６６８）のｐＥＴ－２８β－ｃａｔ発現ベクターを保有するＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を３７℃で、ＯＤ_６００＝０．６～０．８になるまで培養した。その後、この細胞を、５００μＭイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いて２３℃で６～８時間誘導した。細胞を、２０ｍＭＴｒｉｓ（トリス）（ｐＨ８．８）、２５０ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＤＴＴ、５％グリセロール、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、及びｃＯｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害剤カクテル（ＥＤＴＡなし、Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１１８７３５８０００１）を含む溶解バッファに、超音波処理によって溶解した。ライセートをＮｉ－ＮＴＡアガロースビーズ（Ｑｉａｇｅｎ（キアゲン）、カタログ番号３０２１０）と４℃で１時間インキュベートした後、ビーズを２０ｍＭイミダゾールを含む溶解バッファで洗浄した。結合したタンパク質は、２０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．８）、２５０ｍＭＮａＣｌ、０．５ｍＭトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、５％グリセロール、及び２５０ｍＭイミダゾールを含むバッファで溶出した。

【0100】

ＧＳＴタグ付きＴＣＦ４Ｎ末端ドメインを、ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞で同様に発現させ、ＩＰＴＧを用いて２３℃で２～４時間誘導した後、２０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．８）、２５０ｍＭＮａＣｌ、０．５ｍＭＴＣＥＰ、５％グリセロール、及び１０ｍＭ還元型グルタチオンを含むバッファを用いてグルタチオンアガロースビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ（ピアース）、カタログ番号１６１００）から精製した。

【0101】

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による研究
β－ｃａｔへの結合
表面プラズモン共鳴実験は、ＢＩＡＣＯＲＥＴ１００（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ（ジーイー・ヘルスケア））を用いてＣＭ５シリーズＳセンサチップ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ－１００５－３０）上で行った。ヒスタグ付きのβ－ｃａｔ（６０ｋＤａ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる純度９０％超）をアミンカップリング化学で固定化した。フローセル１及び２の表面を、０．１ＭＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド）及び０．１ＭＥＤＣ（３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）プロピル－Ｎ－エチルカルボジイミド）の１：１混合物で５μＬ／分の流量で活性化した。フローセル２には、ＰＢＳ、ｐＨ６．０中の１μＭの濃度のリガンドを８０００ＲＵの密度で固定化し、フローセル１は基準面として機能するようにブランクのままとした。どちらの表面も１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８．０）でブロッキングした。結合データを収集するために、５％のＤＭＳＯを含むＰＢＳ（ｐＨ７．５）中の化合物ＧＢ１８７４を、１２５μＭ、１００μＭ、８０μＭ、６０μＭ、４０μＭ及び２０μＭの濃度で、３０μＬ／分の流量及び２５℃の温度で２つのフローセル上に注入した。複合体はそれぞれ１２０秒及び６００秒の間、会合及び解離をさせた。５０ｍＭのＮａＯＨを３０秒間注入して表面を再生した。ＲＵ反応を収集し、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５を用いて、試験したＧＢ１８７４の濃度に対してプロットした。解離定数Ｋ_Ｄは、Ｈｉｌｌスロープカーブフィッティング機能を用いた非線形特異的結合により得た。

【0102】

β－ｃａｔ－ＴＣＦ４相互作用の阻害
ＧＳＴタグＴＣＦ４Ｎ末端ドメイン（３１ｋＤａ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる純度９０％超）をアミンカップリング化学を用いてＣＭ５シリーズＳセンサチップに固定化した。１０ｍｍクエン酸バッファ、ｐＨ４．０、中の０．５μＭの濃度のリガンドを４００ＲＵの密度でフローセル４に固定し、フローセル３は基準面として機能するようにブランクのままとした。阻害試験では、５０ｎＭのＨｉｓタグ付きβ－ｃａｔを、５％ＤＭＳＯを含むＰＢＳ中で異なる濃度の化合物ＧＢ１８７４と室温で１５分間プレインキュベートした。この混合物を３０μＬ／分の流量で、２５℃の温度で上記２つのフローセル上に注入した。複合体をそれぞれ６０秒間、会合及び解離をさせ、５０ｍＭのＮａＯＨを３０秒間注入して表面を再生した。ＲＵ反応を収集し、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５を用いて、試験したＧＢ１８７４の濃度に対してプロットした。化合物ＧＢ１８７４の阻害性ＩＣ_５０値は、４パラメータの非線形回帰により得た。

【0103】

マウス異種移植及び化合物処理
ＨＣＴ１１６細胞（１部位あたり１×１０^６細胞）を、５～７週齢のＮＳＧ（ＮＯＤｓｃｉｄｇａｍｍａ）マウス（ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（ジャクソン・ラボラトリー）、ストック番号００５５５７）の右脇腹に皮下移植した。腫瘍体積が６０～１００ｍｍ^３に達した時点で、動物を処置群又は対照群のいずれかに無作為に割り付けた。処置群のマウスには、５０ｍｇ／ｋｇの化合物ＧＢ１８７４を１日おきに腹腔内注射で投与した。同時に、対照群のマウスには、化合物を含まない希釈液を投与した。化合物ＧＢ１８７４は、６０ｍｇ／ｍＬの濃度になるようにＤＭＳＯに溶解し、最終濃度が３ｍｇ／ｍＬ、５％ＤＭＳＯになるように生理食塩水中の５％ＰＥＧ３００、５％Ｔｗｅｅｎ－８０で希釈して調製した。２日に１回、ノギスを用いて腫瘍の長さと幅を測定した。腫瘍体積は、以下の修正楕円体式を用いて推定した：腫瘍体積＝１／２（長さ×幅^２）。対照群の腫瘍が２０００ｍｍ^３に達した時点でマウスを安楽死させた。

【0104】

結果
β－ｃａｔ構造モデルの生成
将来のリガンド予測に用いるβ－ｃａｔの最終的な構造モデルは、β－ｃａｔ－Ｔｃｆ３複合体、β－ｃａｔ－ＴＣＦ４複合体、及びβ－ｃａｔ－ＢＣＬ９－ＴＣＦ４複合体（ＰＤＢコード：それぞれ、１Ｇ３Ｊ^１８、１ＪＰＷ^１９、及び２ＧＬ７^２０）を含めた３つのβ－ｃａｔ結晶構造から、１）最適化（訓練）、２）ＥＦ１及びｌｏｇＡＵＣで測定したリガンドの改善度に基づくブラインドテスト（検証）の２つの段階を経て得た。最適化は、組織内の自動モデリング・ドッキングプラットフォーム（図１）によって達成した。第一に、ＭｅｔａＰｏｃｋｅｔ^２１によりβ－ｃａｔの結晶構造（ＰＤＢコード：１ＪＰＷ）において推定リガンド結合部位を予測した。この部位は、β－ｃａｔのアルマジロリピート４－９によって形成される荷電溝と重なっており、この荷電溝はβ－ｃａｔ－ＴＣＦ４相互作用界面と重なっている。それゆえ、今回の研究では、この部位に注目した。第二に、β－ｃａｔの３つの結晶構造にＳＣＷＲＬ^２２による側鎖サンプリングを行い、別の３つの構造を導入した。この６つのβ－ｃａｔ構造のセットが、訓練の出発点となった。第三に、β－ｃａｔのコンフォメーション空間をより広く探索するために、訓練ライブラリ（１５３種の化合物）を上記６つのβ－ｃａｔ構造すべてにドッキングし、リガンドの改善度でドッキング性能を評価し、ドッキングした各リガンド（ｉＣＲＴ３、ｉＣＲＴ５、ｉＣＲＴ１４）の存在下でＰＬＯＰ（ＰｒｏｔｅｉｎＬｏｃａｌＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎＰｒｏｇｒａｍ）^２３を用いて結合部位の側鎖を最適化した。この工程は、いくつかの最適化された構造が、任意の閾値（ｌｏｇＡＵＣ≧４０及びＥＦ１≧３０）よりも優れたリガンド改善性能を示すまで繰り返し行った。

【0105】

β－ｃａｔ－ＴＣＦ４相互作用の低分子阻害剤の予測
訓練段階での最良のβ－ｃａｔ構造は、訓練ライブラリの総合的なリガンド改善度ｌｏｇＡＵＣ＝４４．２、及び初期リガンド改善度ＥＦ１＝３３．３を示した。訓練ライブラリの１５３種の化合物の中では、最も強力な公知の阻害剤であるｉＣＲＴ３が最も優れていると評価された。ドッキングで生成した複合体構造におけるβ－ｃａｔとｉＣＲＴ３との相互作用を解析した。ｉＣＲＴ３のオキサゾール基は、Ｒ４６９と水素結合を、β－ｃａｔ－ＴＣＦ４結晶構造においてＴＣＦ４のＥ１７と塩橋を形成するＫ５０８とカチオン－π相互作用を形成していた（図２Ｄ）。一方、ｉＣＲＴ３のフェニル基は、ＴＣＦ４のＩ１９及びＦ２１と相互作用することが示されているＲ３８６、Ｎ４２６及びＰ４６３が囲むポケットに詰め込まれている。加えて、オキサゾール基及びフェニル基をつなぐｉＣＲＴ３のアミド基は、β－ｃａｔのＥ４６２との別の水素結合によって安定化されており、ｉＣＲＴ３のエチルフェニル基は、Ｋ５０８、Ｖ５１１及びＲ５１５が囲むポケットを満たしていた。

【0106】

この最も改善（充実）したβ－ｃａｔ構造を、６３種のｉＣＲＴ３類似化合物を含む検証用ライブラリを用いてブラインドテストに供した（図５）。ＤＯＣＫエネルギースコアによるドッキングランクと、人間の介入によるドッキングポーズの両方を考慮して、バーチャルスクリーニングから１９種のリガンド候補を選択した（図５）。一方、６３種の化合物すべてを、ＨＥＫ２９３細胞にＴＯＰＦｌａｓｈレポーター（ＳＴＦ細胞）を安定的にトランスフェクトしたＷｎｔレポーターアッセイで、単濃度で試験したところ、１２種の化合物が活性を示した（データは示さず）。これらの１２種の化合物をさらにＳＴＦ細胞に対して様々な濃度で試験したところ、５種の化合物が公知の阻害剤であるｉＣＲＴ３と同等かそれ以下のＩＣ_５０値を示した（図５）。実際、これら５つの強力な阻害剤はすべて、ドッキングによって最上位のリガンド候補として優先的に順位付けされた。これは、訓練によって生成された最も改善された構造が、新規リガンドを予測できることを示唆している。

【0107】

新規リガンド予測のための方法論を機能的に検証した後、１０２４０種の小分子のライブラリ（Ｅｎａｍｉｎｅから購入）を、最も改善されたβ－ｃａｔの構造に対して計算によりスクリーニングした。スクリーニングしたライブラリの４．０％にあたる５００種の上位スコアのヒット化合物を手動で分析した。２７種の化合物（図６）を、（１）β－ｃａｔ－ＴＣＦ４相互作用の妨害、（２）水素結合等のβ－ｃａｔ残基との好ましい相互作用の形成、及び（３）足場（スカフォールド）の化学的新規性、という３つの基準に基づいて実験的なテストのために選択した。

【0108】

ＴＯＰＦｌａｓｈ／Ｗｎｔ－レポーターアッセイを用いた予測阻害剤の機能検証
ドッキング研究から特定された２７種の化合物を、まず、ＳＴＦ－レポーター細胞におけるＷｎｔシグナルを阻害する能力について、１０μＭでスクリーニングした（図２Ａ）。このスクリーニングから、３つの化合物を特定した。これらの化合物は、Ｗｎｔシグナル伝達を、ＤＭＳＯ対照と比較して平均して５０％を超えて阻害する一方で、細胞に対する毒性は２５％未満であった（図７Ａ）。ＳＴＦレポーターに対する３種のヒット化合物の用量反応研究では、これらの化合物がマイクロモルの低いＩＣ_５０値でＷｎｔシグナル伝達経路を阻害することが明らかになった（図２Ｂ）。これらの化合物はレポーター細胞の生存率にも影響を与えるが、細胞生存率のＥＣ_５０値はレポーターのＩＣ_５０値よりも少なくとも４倍大きかった（図７Ｂ）。心強いことに、３種のヒット化合物は、本発明者らが以前に報告した化合物であるｉＣＲＴ３と比較して、約２～５倍強力なＷｎｔ経路の阻害剤であった。興味深いことに、３種のヒット化合物の化学構造は異なっていた（図２Ｃ）。

【0109】

阻害剤候補の特異性
ヒット候補化合物の作用機序をさらに理解するために、レポーター細胞株を用いて、他のシグナル伝達経路活性に対するこれらの低分子の効果を検討した。最初のスクリーニング及び用量反応試験は、外因性のＷｎｔ３Ａを加えてＷｎｔシグナルを活性化しなければならないＳＴＦレポーター株で実施した。内因的にＷｎｔ３Ａを発現しているＳＴＦレポーター細胞株であるＳＴＦ３Ａレポーター細胞株への影響も調べた。その結果、ＳＴＦ３Ａレポーター細胞株ではＷｎｔシグナルが構成的に活性化される。得られたＩＣ_５０値に基づき、ｉＣＲＴ３及び化合物ＧＢ１８７４はともに、初期の活性化状態にかかわらず、Ｗｎｔ経路の強力な阻害剤であると判定した（表１）。しかしながら、化合物ＧＢ６８５３及びＧＢ８６７９は、Ｗｎｔ経路の活性化を強力に阻害できるが（ＳＴＦＩＣ_５０値はそれぞれ４．８μＭ及び７．０μＭ）、それらは、Ｗｎｔ経路がすでに活性化されている場合には効果がない（１００μＭを超えるＳＴＦ３ＡＩＣ_５０値）。これは、これらの化合物が、既存の（例えばＳＴＦ３Ａ細胞）β－ｃａｔ－ＴＣＦ４複合体と、新たに形成された（例えばＳＴＦ細胞）β－ｃａｔ－ＴＣＦ４複合体とに対して、それらを破壊する能力が異なることに起因すると考えられる。

【0110】

ルシフェラーゼ遺伝子の発現がＭｙｃ応答配列の制御下にあるＭｙｃレポーター細胞株に対する上記化合物の効果も調べた。Ｗｎｔ標的遺伝子の１つがＭｙｃであることから、Ｗｎｔシグナルを阻害すれば、Ｍｙｃシグナル伝達も阻害されることになる。Ｍｙｃレポーターに対する化合物の有効性は、ＳＴＦ３Ａレポーターの有効性を反映しており、ＳＴＦ３ＡレポーターにおけるＷｎｔ経路の強力な阻害剤は、Ｍｙｃレポーターの強力な阻害剤でもあった（表１）。

【0111】

最後に、候補となったヒット化合物をＨｉｐｐｏ経路レポーターに対して試験した。Ｈｉｐｐｏ経路レポーターでは、ＴＥＡＤ応答配列がルシフェラーゼの発現を促す。Ｈｉｐｐｏ経路が活性化されると、ＴＥＡＤの転写活性化が低下するため、レポーターのシグナルを低下させる化合物は、Ｈｉｐｐｏ経路を活性化させ、その逆もまた同様である。興味深いことに、ｉＣＲＴ３によってＨｉｐｐｏ経路が活性化できること、及び化合物ＧＢ８６７９がＨｉｐｐｏ経路の強力な阻害剤であることが見出された（表１）。Ｗｎｔ経路はＨｉｐｐｏ経路とクロストークを起こす可能性があるため^２４、ＧＢ８６７９によるＨｉｐｐｏシグナル伝達の阻害は、Ｗｎｔ標的遺伝子の発現を低下させることにおけるその有効性に間接的に影響を与えるのではないかと考えられた。

【0112】

β－ｃａｔの３つの候補低分子結合剤のインシリコで予測された異なる結合様式
２つのヒット化合物ＧＢ８６７９及びＧＢ６８５３のβ－ｃａｔに対する結合様式は、ｉＣＲＴ３と類似している。例えば、両化合物は、Ｒ３８６、Ｎ４２６、Ｐ４６３及びＫ５０８、Ｖ５１１、Ｒ５１５によってそれぞれ囲まれた２つのポケットを、その巨大な疎水性基で占めていた。一方、Ｋ５０８とＲ４６９との間の裂け目も、両化合物のチアゾール基が水素結合及び塩橋を形成して埋めていた（図２Ｄ）。しかしながら、第３のヒット化合物ＧＢ１８７４は、ｉＣＲＴ３及び他の２つのヒット化合物とは異なる結合様式を示した。ＧＢ１８７４は、Ｋ５０８とＲ４６９の間の裂け目にトリアゾール基を、Ｒ３８６、Ｎ４２６、Ｐ４６３及びＫ５０８、Ｖ５１１、Ｒ５１５で囲まれた２つのポケットに疎水基を詰め込んでいた。加えて、ＧＢ１８７４のエチルフェニル基は、Ｈ４７０、Ｒ４７４及びＫ４３５で囲まれたポケットに詰まっていた。際だったことは、β－ｃａｔ－ＴＣＦ４複合体の結晶構造におけるこのポケットはＴＣＦ４のＤ１６残基によって占有されていることであり、このＤ１６残基は、β－ｃａｔのＫ４３５と塩橋を形成し、β－ｃａｔ－ＴＣＦ４間の重要な相互作用を担っている^２５。ＴＣＦ４のＤ１６又はβ－ｃａｔのＫ４３５の一アミノ酸置換が、これらの相互作用を妨害し、下流の転写活性を著しく低下させるためには十分である^{２５、２６}。総合して、ＧＢ１８７４のこの独特の結合様式のために、ＧＢ１８７４がｉＣＲＴ３及び他の２つのヒット化合物と比較して、より強力にβ－ｃａｔ－ＴＣＦ４相互作用を妨害できるとの仮説が立てられた。

【0113】

ヒット化合物は、β－ｃａｔ－ＴＣＦ４相互作用を妨害し、Ｗｎｔ標的遺伝子の発現を低下させる
上記化合物はβ－ｃａｔタンパク質に対するインシリコでのドッキング研究によって特定されたので、生物学的に関連する細胞株において、β－ｃａｔ－ＴＣＦ４相互作用を妨害する他の化合物の能力を調べた。その結果、ＨＣＴ１１６ＣＲＣ細胞において、β－ｃａｔとその相互作用するパートナーの共免疫沈降（ｃｏ－ＩＰ）を行った。化合物処理によってβ－ｃａｔに結合したタンパク質をウエスタンブロットで分析したところ、３つのヒット化合物のうち、化合物ＧＢ１８７４だけがｉＣＲＴ３と同程度にβ－ｃａｔ－ＴＣＦ４相互作用を低下させることができることが明らかになった（図３Ａ）。興味深いことに、化合物ＧＢ１８７４は、β－ｃａｔ－ＴＣＦ４相互作用に影響を与えるものの、β－ｃａｔ－ＥＣＡＤ相互作用にはほとんど影響を与えないことが認められた（図３Ａ）。

【0114】

続いて、Ｗｎｔ標的遺伝子の発現に対するヒット化合物の影響を検討した。ＨＣＴ１１６細胞を５０μＭの化合物で処理し、ｃ－Ｍｅｔ、サイクリンＤ１及びサバイビンを含めたＷｎｔ標的遺伝子の発現をウエスタンブロット法で分析した。化合物ＧＢ１８７４は、これらのタンパク質の発現を低下させるのに最も効果的であった（図３Ｂ）。実際、化合物ＧＢ１８７４によるＷｎｔ標的タンパク質の発現低下は、ｉＣＲＴ３の場合と同程度であった。加えて、化合物ＧＢ１８７４は、Ｗｎｔ標的遺伝子の発現を低下させる一方で、β－ｃａｔ自体の発現、又はＥＣＡＤ及びＴＣＦ４等のβ－ｃａｔのパートナータンパク質の発現にはほとんど影響を与えなかった（図３Ｃ）。これらの結果は、ＧＢ１８７４は、β－ｃａｔ－ＴＣＦ４相互作用を特異的に妨害することにより、β－ｃａｔの核内転写機能を調節することができるが、Ｅ－ｃａｄを介した接着結合での膜機能には影響を与えないことを示唆する。

【0115】

一方、化合物ＧＢ６８５３及びＧＢ８６７９は、検討したＷｎｔ標的遺伝子の発現にほとんど影響を与えなかった（図３Ｂ）。これらの化合物は、β－ｃａｔ－ＴＣＦ４の相互作用を妨害する上で、化合物ＧＢ１８７４ほどの効果もなかった（図３Ａ）。これらの結果は、ＳＴＦ３Ａレポート細胞株における阻害活性の欠如（表１）と合わせて、Ｗｎｔシグナルがすでに活性化している細胞では、化合物ＧＢ６８５３及びＧＢ８６７９はＷｎｔ経路を阻害できないことを示唆する。

【0116】

化合物ＧＢ１８７４はインビトロでβ－ｃａｔ－ＴＣＦ４相互作用を妨害する
ＧＢ１８７４化合物は、インシリコでのドッキング研究によりβ－ｃａｔに結合することが予測されたため、ＧＢ１８７４化合物が、精製したβ－ｃａｔとインビトロで相互作用し、β－ｃａｔとＴＣＦ４との相互作用を阻害できるかどうかを調べる実験を行った。精製したβ－ｃａｔ（ＡＲＭドメインリピート領域）及びβ－ｃａｔと相互作用することが公知であるＴＣＦ４Ｎ末端ドメインをコードするタンパク質を用いて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法を採用した。まず、精製したβ－ｃａｔタンパク質をＳＰＲセンサチップに固定化し、β－ｃａｔ上に異なる濃度の化合物ＧＢ１８７４を注入した。センサグラム（図８Ａ）から、β－ｃａｔに対する化合物ＧＢ１８７４の用量依存的な結合が観察された。化合物ＧＢ１８７４の濃度に対する定常応答値をプロットすると、この化合物は７６±１３μＭのＫ_Ｄでβ－ｃａｔに結合することが示された（ｎ＝３、図３Ｄ）。しかしながら、ベストフィット曲線のＨｉｌｌスロープは１よりも大きく、これは、化合物ＧＢ１８７４がβ－ｃａｔ上の複数の部位に正の協同性をもって結合することを示唆した。

【0117】

化合物ＧＢ１８７４がインビトロでβ－ｃａｔとＴＣＦ４との相互作用を直接阻害できるかどうかを確認するために、ＳＰＲ競合実験を開発した。β－ｃａｔの代わりに、ＴＣＦ４Ｎ末端ドメインをＳＰＲセンサチップに固定化した。５０ｎＭのβ－ｃａｔを、異なる濃度の化合物ＧＢ１８７４でプレインキュベートした後、ＴＣＦ４Ｎ末端ドメイン上に注入した。センサグラム（図８Ｂ）から明らかなように、化合物ＧＢ１８７４は２５±８μＭ（ｎ＝２）のＩＣ_５０値でβ－ｃａｔとＴＣＦ４との相互作用を阻害することがわかった（図３Ｅ）。

【0118】

候補ヒット化合物は、「Ｗｎｔ依存症」の癌細胞の増殖及び幹細胞性に影響を与える
β－ｃａｔ－ＴＣＦ４相互作用の妨害及びＷｎｔ標的遺伝子の発現の低下とは別に、ヒット化合物が生物学的に関連する癌細胞株においてＷｎｔ活性の低下を連想させる表現型を誘発するかどうかを調べるために実験を行った。まず、候補化合物ＧＢ６８５３、ＧＢ８６７９及びＧＢ１８７４のＨＣＴ１１６結直腸癌（ＣＲＣ）細胞への影響を検討した。ＨＣＴ１１６細胞は、β－ｃａｔ遺伝子にヘテロ変異があり、このため、そのタンパク質のＳｅｒ４５残基の欠失を生じる。Ｓｅｒ４５は、分解複合体の主要メンバーであるＣＫ１αによるリン酸化の起点となる部位であり、ＣＫ１αは続いてプロテアソームによる分解のためにβ－ｃａｔを標的にする。それゆえ、Ｓｅｒ４５に変異があると、変異型β－ｃａｔが分解されず、Ｗｎｔシグナル伝達が恒常的に活性化する。ＨＣＴ１１６細胞でβ－ｃａｔの下流にあるＷｎｔシグナル伝達を阻害すると、細胞の成長に大きな効果があるという仮説が立てられた。

【0119】

ＨＣＴ１１６細胞を１０μＭの各化合物で毎日処理し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ生存率アッセイを用いて成長を追跡した。比較のために、Ｗｎｔシグナル伝達カスケードに沿って異なる構成要素を標的にするＩＷＰ－２、ＸＡＶ９３９、及びｉＣＲＴ３等の化合物を含めた^２７。図４Ａに示すように、３つのヒット化合物（ＧＢ１８７４、ＧＢ６８５３及びＧＢ８６７９）のいずれかで処理すると、ＨＣＴ１１６細胞の成長が効果的に抑制された。注目すべきは、これらの化合物はすべて、成長阻害アッセイにおいてｉＣＲＴ３よりも効果的であったことである。化合物ＩＷＰ－２及びＸＡＶ９３９（それぞれＰｏｒｃｕｐｉｎｅ及びタンキラーゼ（Ｔａｎｋｙｒａｓｅ）の阻害剤）は、β－ｃａｔ－ＴＣＦ４相互作用の上流でＷｎｔシグナル伝達を阻害するが、ＨＣＴ１１６細胞の成長を阻害する効果は低かった。３０μＭの化合物ＧＢ８６７９、ＧＢ６８５３及びＧＢ１８７４は、コロニー形成効率（図４Ｂ）、及びスフェロイド形成アッセイ（図４Ｃ）への効果からも明らかなように、ＨＣＴ１１６集団内の癌幹様細胞の生存率を著しく低下させることができた。加えて、上記ヒット化合物は、ＡＰＣ変異型ＣＲＣ細胞株であるＤＬＤ－１及びＳＷ４８０のスフェロイド形成にも、程度の差はあるものの、影響を与えた（図９Ａ及び図９Ｂ）。続いて、ＣＲＣ細胞の生存率に対する上記化合物の効果を検討した。ＨＣＴ１１６細胞株、ＤＬＤ－１細胞株、及びＳＷ４８０細胞株に対するＥＣ_５０値（表２）から、化合物ＧＢ１８７４がＣＲＣ細胞株に対して最も強い作用を示し、次いで化合物ＧＢ８６７９であった。

【0120】

ＧＢ１８７４はマウス腫瘍異種移植片の成長を阻害する
上記の研究に基づき、化合物ＧＢ１８７４は、Ｗｎｔ駆動のＣＲＣ細胞に対して最も強力な化合物であることが確認された。インビボでの有効性を調べるため、ＮＳＧマウスの脇腹にＨＣＴ１１６細胞を接種した。続いて、腫瘍保有マウスを、ビヒクル対照又は５０ｍｇ／ｋｇの化合物ＧＢ１８７４のいずれかで一日おきに（ｑ．ａ．ｄ．）ｉ．ｐ注射により処置した。化合物ＧＢ１８７４は、ＨＣＴ１１６異種移植片の成長をインビボで効果的に阻害し（図４Ｄ）たが、同時にマウスに最小限の全身毒性しかもたらさなかった（図９Ｃ）。

【0121】

【表1】

【0122】

【表2】

【0123】

ＧＢ１８７４の構造を足場として用いて、ＧＢ１８７４の類似体について化学データベースを検索した。次に、これらの化合物を本発明者らのβ－カテニンのインシリコモデルにドッキングし、β－カテニンの強力な結合剤候補を予測した。この予測から、８種のＧＢ１８７４の構造類似体が特定されたので、これらを試験した。

【0124】

まず、これらの化合物を、ＳＴＦレポーター細胞及びＳＴＦ３Ａレポーター細胞を用いて、Ｗｎｔレポーター活性を阻害する能力について試験した（表３）。一般に、ＳＴＦ細胞に対する阻害ＩＣ_５０値は、ＳＴＦ３Ａ細胞に対する対応する値と比較して低く、これは、これらの化合物が、構成的なＷｎｔ活性化を有する生物系に対しては活性が低いことを示していた。例外はＧＢ１８７４Ａであり、これはＳＴＦ細胞に比べてＳＴＦ３Ａ細胞に対してより強力であった。

【0125】

ＧＢ１８７４のＩＣ_５０値（ＳＴＦＩＣ_５０＝６．８μＭ、ＳＴＦ３ＡＩＣ_５０＝２７μＭ）をＧＢ１８７４Ｆ（ＳＴＦＩＣ_５０＝５．４μＭ、ＳＴＦ３ＡＩＣ_５０＝１０μＭ）、ＧＢ１８７４Ｇ（ＳＴＦＩＣ_５０＝３．９μＭ、ＳＴＦ３ＡＩＣ_５０＝６．７μＭ）、及びＧＢ１８７４Ｈ（ＳＴＦＩＣ_５０＝５．０μＭ、ＳＴＦ３ＡＩＣ_５０＝１１μＭ）と比較すると、１，２，４－トリアゾールのＣ３置換基のサイズを大きくしても、ＳＴＦレポーター及びＳＴＦ３Ａレポーターに対する化合物の活性に影響を与えないことが認められた。ＧＢ１８７４の新しい類似体は、１，２，４－トリアゾールのＣ３置換基でほとんどが異なっていたため、他の位置の置換基を変更した場合の影響を導き出すことはできなかった。そのため、ＧＢ１８７４の構造活性相関をより深く理解するためには、より多くのＧＢ１８７４の類似体を購入又は合成する必要があると考えられた。

【0126】

【表3(1)】

【表3(2)】

【0127】

ＨＣＴ１１６ＣＲＣ細胞におけるＷｎｔ標的遺伝子の発現に対するＧＢ１８７４類似体の効果を検証した。得られた結果（図５）から、Ｗｎｔ標的遺伝子の下方制御の程度は、ＳＴＦレポーターを阻害する化合物の効力と相関していることが認められた。最も強力な化合物は、ｉＣＲＴ３、ＧＢ１８７４、ＧＢ１８７４Ｃ、ＧＢ１８７４Ｅ、ＧＢ１８７４Ｆ、ＧＢ１８７４Ｇ、及びＧＢ１８７４Ｈであった。これらの化合物は、ＡＸＩＮ２、ＢＩＲＣ５、ＢＭＰ４、及びＣＣＮＤ１等のＷｎｔ標的遺伝子を強力に阻害する一方で、β－カテニン（ＣＴＮＮＢ１）遺伝子の発現にはあまり影響を与えない。

【0128】

最上位のヒット化合物であるＧＢ１８７４を、原発性患者由来の結直腸癌（ＣＲＣ）細胞株でも試験した（表４）。ＧＢ１８７４は、タンキラーゼ阻害剤であるＸＡＶ９３９と比較して、原発性ＣＲＣ細胞株に対してより強力な作用を示すことがわかった。

【0129】

【表4】

【0130】

インビボ研究で得られたＨＣＴ１１６異種移植片の腫瘍を分析した。図４Ｄに示すように、また図１１Ａに示すように、ＨＣＴ１１６異種移植片を５０ｍｇ／ｋｇのＧＢ１８７４で１日おき（ｑ．ａ．ｄ．）にｉ．ｐ．を介して処置すると、ＨＣＴ１１６異種移植片の成長が阻害された。免疫組織化学染色及び数値化により、腫瘍成長の阻害は、Ｗｎｔ標的遺伝子であるサイクリンＤ１、及び増殖マーカーであるＫｉ６７の発現低下に関係していることが示された（図１１Ｂ）。

【産業上の利用可能性】

【0131】

本明細書に開示される化合物は、β－ｃａｔを阻害するため、又はβ－ｃａｔとＴＣＦ４との相互作用を妨害するために使用することができ、それゆえ、癌、神経変性疾患、代謝性疾患、心血管疾患、線維症、及び骨疾患からなる群から選択される疾患又は健康状態の治療に使用することができる。

【0132】

上述の開示を読んだ後に、本発明の様々な他の変更及び適合が、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく当業者に明らかになるであろう。そのようなすべての変更及び適合が添付の請求項の範囲内に入ることが意図される。

【0133】

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【図1】