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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-11-14
(54)【発明の名称】肺がんリスクについて検査するためのキットおよび方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6886 20180101AFI20221107BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20221107BHJP
C12Q 1/6827 20180101ALI20221107BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6886 Z
C12Q1/686 Z
C12Q1/6827 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022515482
(86)(22)【出願日】2020-09-08
(85)【翻訳文提出日】2022-04-25
(86)【国際出願番号】 US2020049629
(87)【国際公開番号】W WO2021046502
(87)【国際公開日】2021-03-11
(31)【優先権主張番号】62/897,343
(32)【優先日】2019-09-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】502409721
【氏名又は名称】ザ・ユニバーシティ・オブ・トレド
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100135415
【弁理士】
【氏名又は名称】中濱 明子
(72)【発明者】
【氏名】ウィリー，ジェームズ・シー
(72)【発明者】
【氏名】クレイグ，ダニエル・ジェイ
(72)【発明者】
【氏名】ブロムクイスト，トーマス・エム
(72)【発明者】
【氏名】クロウフォード，エリン・エル
(72)【発明者】
【氏名】ヨー，ジ－ヨン
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA13
4B063QA17
4B063QA19
4B063QQ03
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS28
4B063QX02
(57)【要約】
肺がんを発症するリスクを診断するためのキットおよび方法、ならびにこれらの使用が記載される。
【選択図】図１Ａ
【選択図】図１Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
肺がんドライバー遺伝子のセットにおける複数の低バリアントアレル頻度（ＶＡＦ）突然変異を測定するための試薬、およびそのための指示
を含む肺がんリスク検査キット。
【請求項2】
ａ）各標的遺伝子のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー、ｂ）各標的遺伝子のための合成内部標準、および
ｃ）ＰＣＲ産物を次世代シーケンシングのためのライブラリーとして調製するための試薬
を含む、請求項１に記載のキット。
【請求項3】
肺がんドライバー遺伝子のセットが、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＢＲＡＦ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＮＯＴＣＨＩ、ＥＧＦＲ、およびＥＲＢＢ２の１つ以上を含む、請求項１に記載のキット。
【請求項4】
肺がんドライバー遺伝子のセットが、ＣＤＫＮ１Ａ、Ｅ２Ｆ１、ＥＲＣＣ１、ＥＲＣＣ４、ＥＲＣＣ５、ＧＰＸ１、ＧＳＴＰ１、ＫＥＡＰ１、ＲＢ１、ＴＰ６３、およびＸＲＣＣ１の１つ以上を含む、請求項１に記載のキット。
【請求項5】
複数のＶＡＦ突然変異体の測定に必要な試薬および指示を提供する、請求項１に記載のキット。
【請求項6】
複数の患者標本における検査を行うために必要な試薬および指示を提供する、請求項１に記載のキット。
【請求項7】
ａ）対象から生体サンプルを得るステップ、ｂ）生体サンプル中の、肺がんドライバー遺伝子のセットにおける複数の低バリアントアレル頻度（ＶＡＦ）突然変異を測定して、物理的データを得て、生体サンプルにおけるＶＡＦ突然変異のレベルがコントロールにおけるレベルよりも高いかどうかを決定するステップ、
ｃ）ステップｂ）で得られたレベルを、コントロールにおけるレベルと比較するステップ、
ｄ）不正確性の原因、偽陽性、および偽陰性についてコントロールすることによって、真の突然変異とアーチファクトとの間を区別するステップ、ならびに
ｅ）生体サンプルにおけるレベルがコントロールにおけるレベルと有意に異なることを物理的データが示す場合には、対象が肺がんを発症するリスクを有すると同定するステップ
を含む、対象が肺がんを発症するリスクを有するかどうかを診断する方法。
【請求項8】
肺がんドライバー遺伝子のセットが、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＢＲＡＦ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＮＯＴＣＨＩ、ＥＧＦＲ、およびＥＲＢＢ２の１つ以上を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
肺がんドライバー遺伝子のセットが、ＣＤＫＮ１Ａ、Ｅ２Ｆ１、ＥＲＣＣ１、ＥＲＣＣ４、ＥＲＣＣ５、ＧＰＸ１、ＧＳＴＰ１、ＫＥＡＰ１、ＲＢ１、ＴＰ６３、およびＸＲＣＣ１の１つ以上を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項10】
低ＶＡＦ突然変異の測定が、数が分かっている合成内部標準分子と比較した標本解析物の測定に基づいて、各標本における各解析物の測定の検出限界／定量限界を計算するステップ
を含む、請求項７、８、または９に記載の方法。
【請求項11】
方法が、１）様々な融解温度を有するプライマーによる特異的標的へのアニーリングを可能にするため、マルチプレックス勾配ＰＣＲを行うステップ、
２）シングルプレックスＰＣＲと、その後の、定量、およびシーケンサーへの等しいロードを可能にする等モルでの混合を行うステップ
を行うことを含み、ＰＣＲ標的が、肺がんおよび肺の前がん病変の発生率の高さに基づいて選択される、請求項７、８、または９に記載の方法。
【請求項12】
診断または評価が、肺がんの診断、
肺がんのステージの診断、
肺がんのタイプまたは分類の診断、
肺がんの再発の診断または検出、
肺がんの退縮の診断または検出、
肺がんの予後、および
外科的または非外科的療法に対する肺がんの応答の評価
の１つ以上を含む、請求項７、８、または９に記載の方法。
【請求項13】
肺がんが非小細胞肺がんである、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
対象が充実性腫瘍の切除のための外科手術および／または化学療法および／または放射線療法を受けている、請求項１２に記載の方法。
【請求項15】
対象に、継続中の短期的評価を行うステップをさらに含む、請求項７、８、または９に記載の方法。
【請求項16】
対象に抗がん剤での治療を行うステップをさらに含む、請求項７、８、または９に記載の方法。
【請求項17】
ＶＡＦが＜０．０１％である、請求項７、８、または９に記載の方法。
【請求項18】
ＶＡＦが約５×１０－４（０．０５％）である、請求項７、８、または９に記載の方法。
【請求項19】
内部標準を含めると、０．０５％という低さのバリアント頻度の突然変異が確実に測定され、内部標準を含めない場合には５％である、請求項７、８、または９に記載の方法。
【請求項20】
内部標準を含めると、固有分子インデックス（ＵＭＩ）を使用することなく、０．０１％という低さのＶＡＦを有する低バリアント頻度突然変異が確実に測定される、請求項７、８、または９に記載の方法。
【請求項21】
生体サンプルが、気道上皮細胞に由来するＲＮＡまたはＤＮＡを含む、請求項７、８、または９に記載の方法。
【請求項22】
生体サンプルが、呼気凝縮液および鼻ブラッシングによって得られた気道上皮細胞を含む、非侵襲的に得られた標本を含む、請求項７、８、または９に記載の方法。
【請求項23】
肺がんと診断された対象に対する実行可能な治療法の推奨を決定する方法であって、ａ）対象から生体サンプルを得るステップ、
ｂ）ＥＧＦＲ、ＡＬＫ、ＲＯＳ１、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＲＢＢ４、ＭＥＴ、ＲＥＴ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＤＤＲ２、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＴＰ５３、ＳＴＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＳＭＡＤ４、ＦＢＸＷ７、ＮＯＴＣＨ１、ＫＩＴ／ＰＧＤＦＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＡＫＴ１、およびＨＲＡＳ遺伝子にハイブリダイズし、これらを増幅するプローブのセットを使用して、正の値を有する少なくとも１つの特徴を検出することによって、正の値の閾値基準を満たす少なくとも１つの特徴を検出するステップ、ならびに
ｃ）正の値が検出された少なくとも１つの正の特徴に基づいて、対象に対する実行可能な処置の推奨を決定するステップ
を含む、方法。
【請求項24】
医療管理の前に、肺がんを発症するリスクが、請求項１に記載のキットを使用することによって見積もられる、肺がんを発症するリスクを有する患者を処置する方法であって、肺がんを発症するリスクが低い患者には通常の長期的評価が行われ、その後、医療処置が投与される、ならびに／または
肺がんを発症するリスクが高い患者もしくは肺がんに罹患している患者には、肺がんのスクリーニング、および／もしくは肺がんを予防するための医療処置、医療および／もしくは放射線照射、および／もしくは病変を除去するための外科手術が行われる、
方法。
【請求項25】
地域研究所でのキット形式または方法形式での肺がんリスク検査についてのＦＤＡおよび他の規制当局による承認を促進するための、ここに記載のキットおよび方法の使用。
【請求項26】
地域研究所でのキット形式または方法形式での、がんの標的療法を導くがん細胞における突然変異を測定するための検査についてのＦＤＡおよび他の規制当局による承認を促進するための、ここに記載のキットおよび方法の使用。
【請求項27】
地域研究所でのキット形式または方法形式での、がんの標的療法を導くがん細胞におけるＶＡＦが非常に低い（０．０１％という低さ）突然変異を固有分子インデックス（ＵＭＩ）を用いずに測定するための検査についてのＦＤＡおよび他の規制当局による承認を促進するための、ここに記載のキットおよび方法の使用。
【請求項28】
呼気凝縮液、気管支ブラッシング標本、および／または鼻ブラッシング標本などの非侵襲的に得られた標本における肺がんリスクの測定を可能にするための、ここに記載のキットおよび方法の使用。
【請求項29】
気道上皮細胞における、ＶＡＦが非常に低い突然変異の測定を可能にするための、ここに記載のキットおよび方法の使用。
【請求項30】
がんの標的療法を導く、がん細胞における突然変異を測定するための、ここに記載のキットおよび方法の使用。
【請求項31】
正常気道細胞における遺伝子セット内の突然変異を測定してがんのリスクを決定するための、ここに記載のキットおよび方法の使用。【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【0001】
関連出願の相互参照
[0001]本願は、その開示全体が参照によって本明細書に明確に組み込まれる、２０１９年９月８日に出願された米国仮特許出願番号第６２／８９７，３４３号の利益を主張する、２０２０年９月８日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／ｘｘｘｘｘｘの、３５ ＵＳＣ §３７１の下で出願された国内段階出願である。
[0001]本願は、その開示全体が参照によって本明細書に明確に組み込まれる、２０１９年９月８日に出願された米国仮特許出願番号第６２／８９７，３４３号の利益を主張する、２０２０年９月８日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／ｘｘｘｘｘｘの、３５ ＵＳＣ §３７１の下で出願された国内段階出願である。
【0002】
連邦政府資金による研究の記載
[0002]本発明は、米国国立衛生研究所によって付与された認可番号ＣＡ０８６３６８、および米国国立がん研究所によって付与されたＥａｒｌｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｓｕｂ－Ａｗａｒｄ ００００９２１３５６の下で、政府支援を伴ってなされた。政府は、本発明においてある一定の権利を有する。
[0002]本発明は、米国国立衛生研究所によって付与された認可番号ＣＡ０８６３６８、および米国国立がん研究所によって付与されたＥａｒｌｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｓｕｂ－Ａｗａｒｄ ００００９２１３５６の下で、政府支援を伴ってなされた。政府は、本発明においてある一定の権利を有する。
【技術分野】
【0003】
発明の分野
[0003]本発明は、肺がんリスクを検査するためのキットおよび方法に関する。
[0003]本発明は、肺がんリスクを検査するためのキットおよび方法に関する。
【背景技術】
【0004】
[0004]肺がんは、男性および女性におけるがん関連死の主因であり、喫煙は、最も重要な回避可能なリスク因子である。広く禁煙の取り組みがされているが、過去のおよび継続している煙草の使用に起因して、また進行した疾患の効果的な治療法がないことに起因して、肺がんは、今後数十年にわたり、最も致死的ながんであり続けるであろう。
【0005】
[0005]肺がん死を低減させるための第１の戦略は、タバコ製品への曝露の低減を介する、ならびに、それが早期ステージおよび治癒可能である場合には、肺がんを診断するための毎年の低線量ＣＴ（ＬＤＣＴ）スキャンによるハイリスク対象のスクリーニングによる予防である。毎年のＬＤＣＴスクリーニングは、肺がん死亡率を有意に低減させる。しかし、個体群統計学的基準に従うと、スクリーニングが現在推奨されている人の間で、肺がんリスクに大きな個体間の変動がある。全体として、スクリーニング基準を現在満たしている人の間で肺がんの発生率は低く（すなわち＜１０％）、これは、陽性適中率および特異性が低いことと関連している。
【0006】
[0006]しかし、１つの課題は、がんが多くの固有の集団サブクローンを有していることである。感受性クローンを死滅させると、生存のために、耐性をもたらす突然変異が選択される。
【0007】
[0007]現在の戦略は、耐性が発現した場合に再びサンプリングすること、および新たな優勢クローンを同定することである。しかし、耐性サブクローンおよび潜在的ドライバーの同定は、アッセイの詳細さのレベルに依存する。また、従来のＮＧＳ法は、複数の不正確性の原因に起因して、シグナルのアーチファクトを生じさせ、これは、＜２．５％のバリアントアレル頻度（ＶＡＦ）を有する突然変異の同定を困難にしている。
【0008】
[0008]加えて、臨床的ＮＧＳにおける不正確性の原因の一部の非限定的な例には、ＰＣＲ増幅を伴うライブラリー調製（アンプリコンおよびハイブリッドキャプチャー）に起因する、およびシーケンシングに起因する技術的エラーが含まれ、ライブラリー調製は、ポリメラーゼの非忠実性に対応する割合でエラーを導入し（約１０－４）、シーケンシングでは、各次世代シーケンシング（ＮＧＳ）プラットフォームは、ＤＮＡ鎖を正確にシーケンシングするその能力を制限している、それに付随するヌクレオチド置換エラー率を有している。
【0009】
[0009]臨床的ＮＧＳにおける他の不正確性の原因には、確率論的なサンプリングエラーを生じさせる、サンプル量の変動が含まれる。診断用サンプルは限定的であり得、それは、例えば微細針吸引（ＦＮＡ）では細胞学的分析に必要な量を超えるわずかな材料が得られ、および／またはコア生検では、組織学的分析に必要な量をわずかに超える量が得られるためである。加えて、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）は非常に変動性が高く、かつ疾患の進行に依存し、そのため、測定可能なゲノムコピーは、血漿サンプルにおいて限定的であることが多い。
【0010】
[0010]臨床的ＮＧＳにおける他の不正確性の原因には、ＤＮＡが処理の際に損傷を受け得、より高い割合の、真の生物学的変動の典型ではない技術的エラーを生じさせる、サンプルクオリティーエラーが含まれる。例えば、ＤＮＡ損傷の原因は、細胞組織の保存のためのホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）法を含む処理の際、ならびに、ＤＮＡ抽出およびシーケンシングプロトコルの際に生じる。多くのエビデンスが、ＦＦＰＥ損傷が系統的かつ時間依存的であることを示している。
【0011】
[0011]したがって、標準化および品質コントロールの両方が、低頻度バリアントコールに実験室間での整合性をもたらすために必要である。
[0012]例えば、最近の研究において、バリアントアレル頻度（ＶＡＦ）が＞１．０％の突然変異を測定し得るターゲットＮＧＳが、対象群から得た肺がん組織および隣接した適合正常組織におけるドライバー遺伝子体細胞突然変異を見積もるために使用された。肺がんのドライバーであることが分かっている多くの突然変異が、各がんに非常に近接する非がん肺組織において同定された。したがって、ＶＡＦが＞１％の突然変異の測定は、広く認められる肺がんの容易な診断および／または遺伝的特徴付けのためのバイオマーカーの開発をサポートし得る。しかし、クローンの出現率は、がん部位からの距離に比例して減少し、がんに罹患していない肺の正常気道または鼻上皮では非常にわずかな突然変異体があるのみである。したがって、このアプローチは、将来的に付随する肺がんリスクについての非侵襲的な検査の開発をサポートするものではなかった。（Ｋａｄａｒａ Ｈ、Ｓｉｖａｋｕｍａｒ Ｓ、Ｊａｋｕｂｅｋ Ｙ、Ｓａｎ Ｌｕｃａｓ ＦＡ、Ｌａｎｇ Ｗ、ＭｃＤｏｗｅｌｌ Ｔら、Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｎｏｒｍａｌ Ａｉｒｗａｙ Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ Ｅｌｕｃｉｄａｔｅ Ｓｐａｔｉｏｔｅｍｐｏｒａｌ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．、２０１９）。
[0012]例えば、最近の研究において、バリアントアレル頻度（ＶＡＦ）が＞１．０％の突然変異を測定し得るターゲットＮＧＳが、対象群から得た肺がん組織および隣接した適合正常組織におけるドライバー遺伝子体細胞突然変異を見積もるために使用された。肺がんのドライバーであることが分かっている多くの突然変異が、各がんに非常に近接する非がん肺組織において同定された。したがって、ＶＡＦが＞１％の突然変異の測定は、広く認められる肺がんの容易な診断および／または遺伝的特徴付けのためのバイオマーカーの開発をサポートし得る。しかし、クローンの出現率は、がん部位からの距離に比例して減少し、がんに罹患していない肺の正常気道または鼻上皮では非常にわずかな突然変異体があるのみである。したがって、このアプローチは、将来的に付随する肺がんリスクについての非侵襲的な検査の開発をサポートするものではなかった。（Ｋａｄａｒａ Ｈ、Ｓｉｖａｋｕｍａｒ Ｓ、Ｊａｋｕｂｅｋ Ｙ、Ｓａｎ Ｌｕｃａｓ ＦＡ、Ｌａｎｇ Ｗ、ＭｃＤｏｗｅｌｌ Ｔら、Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｎｏｒｍａｌ Ａｉｒｗａｙ Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ Ｅｌｕｃｉｄａｔｅ Ｓｐａｔｉｏｔｅｍｐｏｒａｌ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．、２０１９）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0012】
[0013]したがって、肺がんリスクに非常に関連する検査特徴の組み合わせのＮＧＳ測定、ならびにまた、ＮＧＳに伴う量的および質的な技術的エラーのより良好なコントロールを可能にする方法およびキットが必要である。これらの要求を満たすことで、肺がんリスクに従った、個体のより正確な層別化が可能となり、これによって、ＬＣＤＴスクリーニングに関連するコストおよび害が低減する。
【課題を解決するための手段】
【0013】
[0014]第１の態様において、肺がんドライバー遺伝子のセットにおける複数の低ＶＡＦ（ＶＡＦ＜１％として定義される）突然変異体を測定するための試薬、およびそのための指示を含む肺がんリスク検査キットが、本明細書において記載される。
【0014】
[0015]ある特定の実施形態において、キットは、次世代シーケンシングによって正常気道上皮細胞における複数の遺伝子の発現および／または体細胞突然変異を測定するための試薬を含み、当該キットは、各標的遺伝子のためのＰＣＲプライマー、各標的遺伝子のための合成内部標準、およびＰＣＲ産物を次世代シーケンシングのためのライブラリーとして調製するための試薬を含む。
【0015】
[0016]ある特定の実施形態において、キットは、次世代シーケンシングによって正常気道上皮細胞における複数の遺伝子の発現および／または体細胞突然変異を測定するための試薬を含み、当該キットは、各標的遺伝子のためのＤＮＡキャプチャープローブ、各標的遺伝子のための合成内部標準、およびｂａｉｔ－キャプチャー産物を次世代シーケンシングのためのライブラリーとして調製するための試薬を含む。
【0016】
[0017]ある特定の実施形態において、ＶＡＦは＜０．０１％である。
[0018]ある特定の実施形態において、ＶＡＦは、約５×１０－４（０．０５％）である。
[0018]ある特定の実施形態において、ＶＡＦは、約５×１０－４（０．０５％）である。
【0017】
[0019]ある特定の実施形態において、内部標準を含めると、０．０５％という低さのバリアント頻度の突然変異が確実に測定され、内部標準を含めない場合には５％である。
[0020]ある特定の実施形態において、内部標準を含めると、０．０５％という低さのバリアント頻度の突然変異が確実に測定される。
[0020]ある特定の実施形態において、内部標準を含めると、０．０５％という低さのバリアント頻度の突然変異が確実に測定される。
【0018】
[0021]ある特定の実施形態において、本キットまたは本方法は、無条件で、０．０５％という低さのＶＡＦの測定を可能にする（すなわち、含めない場合には５％）。
[0022]ある特定の実施形態において、合成内部標準が含まれる。
[0022]ある特定の実施形態において、合成内部標準が含まれる。
【0019】
[0023]ある特定の実施形態において、肺がんリスクに関連するドライバー遺伝子は、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＢＲＡＦ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＮＯＴＣＨＩ、ＥＧＦＲ、およびＥＲＢＢ２の１つまたは複数を含む。
【0020】
[0024]ある特定の実施形態において、肺がんドライバーリスクに関連する遺伝子は、ＣＤＫＮ１Ａ、Ｅ２Ｆ１、ＥＲＣＣ１、ＥＲＣＣ４、ＥＲＣＣ５、ＧＰＸ１、ＧＳＴＰ１、ＫＥＡＰ１、ＲＢ１、ＴＰ６３、およびＸＲＣＣ１の１つまたは複数を含む。
【0021】
[0025]ある特定の実施形態において、解析物は、気道上皮細胞のＲＮＡまたはＤＮＡにおいて測定される。
[0026]ある特定の実施形態において、解析物は、呼気凝縮液および／または鼻ブラッシングによって得られた気道上皮細胞を含む、非侵襲的に得られた標本において測定される。
[0026]ある特定の実施形態において、解析物は、呼気凝縮液および／または鼻ブラッシングによって得られた気道上皮細胞を含む、非侵襲的に得られた標本において測定される。
【0022】
[0027]ある特定の実施形態において、各キットまたは方法は、１つまたは複数の肺がんリスク検査に含まれる複数の解析物の測定に必要な試薬および指示を提供する。
[0028]ある特定の実施形態において、各キットまたは方法は、複数の患者標本の各検査に含まれる各解析物を測定するために使用される。
[0028]ある特定の実施形態において、各キットまたは方法は、複数の患者標本の各検査に含まれる各解析物を測定するために使用される。
【0023】
[0029]別の態様において、対象が肺がんを発症するリスクを有するかどうかを診断する方法が、本明細書において記載される。一実施形態において、本方法は、以下を含む：
[0030]対象から生体サンプルを得るステップ、
[0031]生体サンプルにおける肺がんドライバー遺伝子セットのレベルを、本明細書における請求項のいずれか一つに記載のキットのいずれか一つを使用して測定して、物理的データを得て、生体サンプルにおけるレベルがコントロールにおけるレベルよりも高いかどうかを決定するステップ、
[0032]生体サンプルにおけるレベルを、コントロールにおけるレベルと比較するステップ、
[0033]不正確性の原因、偽陽性、および偽陰性についてコントロールすることによって、真の突然変異とアーチファクトとの間を区別するステップ、ならびに
[0034]生体サンプルにおけるレベルがコントロールにおけるレベルと有意に異なることを物理的データが示す場合には、対象が肺がんを発症するリスクを有すると同定するステップ。
[0030]対象から生体サンプルを得るステップ、
[0031]生体サンプルにおける肺がんドライバー遺伝子セットのレベルを、本明細書における請求項のいずれか一つに記載のキットのいずれか一つを使用して測定して、物理的データを得て、生体サンプルにおけるレベルがコントロールにおけるレベルよりも高いかどうかを決定するステップ、
[0032]生体サンプルにおけるレベルを、コントロールにおけるレベルと比較するステップ、
[0033]不正確性の原因、偽陽性、および偽陰性についてコントロールすることによって、真の突然変異とアーチファクトとの間を区別するステップ、ならびに
[0034]生体サンプルにおけるレベルがコントロールにおけるレベルと有意に異なることを物理的データが示す場合には、対象が肺がんを発症するリスクを有すると同定するステップ。
【0024】
[0035]別の態様において、以下を含む、肺がんと診断された対象に対する実行可能な処置の推奨を決定する方法が、本明細書において記載される：
[0036]対象から生体サンプルを得、ＥＧＦＲ、ＡＬＫ、ＲＯＳ１、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＲＢＢ４、ＭＥＴ、ＲＥＴ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＤＤＲ２、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＴＰ５３、ＳＴＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＳＭＡＤ４、ＦＢＸＷ７、ＮＯＴＣＨ１、ＫＩＴ／ＰＧＤＦＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＡＫＴ１、およびＨＲＡＳ遺伝子にハイブリダイズし、これらを増幅するプローブのセットを使用して、正の値の閾値基準を満たす少なくとも１つの特徴を検出することによって、正の値の閾値基準を満たす少なくとも１つの特徴を検出するステップ、ならびに
[0037]陽性値が検出された少なくとも１つの特徴に基づいて、対象に対する実行可能な処置の推奨を決定するステップ。
[0036]対象から生体サンプルを得、ＥＧＦＲ、ＡＬＫ、ＲＯＳ１、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＲＢＢ４、ＭＥＴ、ＲＥＴ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＤＤＲ２、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＴＰ５３、ＳＴＫ１、ＣＴＮＮＢ１、ＳＭＡＤ４、ＦＢＸＷ７、ＮＯＴＣＨ１、ＫＩＴ／ＰＧＤＦＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＡＫＴ１、およびＨＲＡＳ遺伝子にハイブリダイズし、これらを増幅するプローブのセットを使用して、正の値の閾値基準を満たす少なくとも１つの特徴を検出することによって、正の値の閾値基準を満たす少なくとも１つの特徴を検出するステップ、ならびに
[0037]陽性値が検出された少なくとも１つの特徴に基づいて、対象に対する実行可能な処置の推奨を決定するステップ。
【0025】
[0038]別の態様において、肺がんを発症するリスクを有する患者を処置する方法が本明細書において記載され、当該方法において、医療管理（例えば、肺がんのスクリーニングおよび／または予防的処置）の前に、肺がんを発症するリスクが、本明細書における請求項に記載されるキットのいずれか一つを使用することによって見積もられ、そして
[0039]肺がんを発症するリスクが低い患者には通常の長期的評価が行われ、その後、医療処置が投与される、および
[0040]肺がんを発症するリスクが高い患者または肺がんに罹患している患者には、予防的医療管理または病変を除去するための外科手術が行われ、その後、医療処置が投与される。
[0039]肺がんを発症するリスクが低い患者には通常の長期的評価が行われ、その後、医療処置が投与される、および
[0040]肺がんを発症するリスクが高い患者または肺がんに罹患している患者には、予防的医療管理または病変を除去するための外科手術が行われ、その後、医療処置が投与される。
【0026】
[0041]ある特定の実施形態において、低ＶＡＦ突然変異体の測定は、以下を含む：
[0042]数が分かっている合成内部標準分子と比較した標本解析物の測定に基づく、各標本における各解析物の測定の検出限界／定量限界の計算。
[0042]数が分かっている合成内部標準分子と比較した標本解析物の測定に基づく、各標本における各解析物の測定の検出限界／定量限界の計算。
【0027】
[0043]ある特定の実施形態において、本方法は、以下のステップを行うことを含む：
[0044]ステップ１）様々な融解温度を有するプライマーによる特異的標的へのアニーリングを可能にするための、マルチプレックス勾配ＰＣＲ、
[0045]ステップ２）シングルプレックスＰＣＲと、その後の、定量、およびシーケンサーへの等しいロードを可能にする等モルでの混合、ならびに、
[0046]ステップ３）肺がんおよび肺の前がん病変の発生率の高さに基づいて選択されたＰＣＲ標的。
[0044]ステップ１）様々な融解温度を有するプライマーによる特異的標的へのアニーリングを可能にするための、マルチプレックス勾配ＰＣＲ、
[0045]ステップ２）シングルプレックスＰＣＲと、その後の、定量、およびシーケンサーへの等しいロードを可能にする等モルでの混合、ならびに、
[0046]ステップ３）肺がんおよび肺の前がん病変の発生率の高さに基づいて選択されたＰＣＲ標的。
【0028】
[0047]ある特定の実施形態において、診断または評価は、肺がんの診断、肺がんのステージの診断、肺がんのタイプもしくは分類の診断、肺がんの再発の診断もしくは検出、肺がんの退縮の診断もしくは検出、肺がんの予後、または外科的もしくは非外科的療法に対する肺がんの応答の評価の１つまたは複数を含む。
【0029】
[0048]ある特定の実施形態において、肺がんは、非小細胞肺がんである。
[0049]ある特定の実施形態において、検査対象は、充実性腫瘍の切除のための外科手術および／または化学療法および／または放射線療法を受けている。
[0049]ある特定の実施形態において、検査対象は、充実性腫瘍の切除のための外科手術および／または化学療法および／または放射線療法を受けている。
【0030】
[0050]ある特定の実施形態において、本方法は、患者に、継続中の短期的評価を行うステップをさらに含む。
[0051]ある特定の実施形態において、本方法は、患者に抗がん剤での治療を行うステップをさらに含む。
[0051]ある特定の実施形態において、本方法は、患者に抗がん剤での治療を行うステップをさらに含む。
【0031】
[0052]別の態様において、地域研究所でのキット形式または方法形式での肺がんリスク検査についてのＦＤＡおよび他の規制当局による承認を促進するためのキットおよび方法の使用が、本明細書において記載される。
【0032】
[0053]別の態様において、地域研究所でのキット形式または方法形式での、がんの標的療法を導くがん細胞における突然変異を測定するための検査についてのＦＤＡおよび他の規制当局による承認を促進するためのキットおよび方法の使用が、本明細書において記載される。
【0033】
[0054]別の態様において、地域研究所でのキット形式または方法形式での、がんの標的療法を導くがん細胞におけるＶＡＦが非常に低い（０．０１％という低さ）突然変異を固有分子インデックス（ｕｎｉｑｕｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｄｉｃｅｓ）（ＵＭＩ）を用いずに測定するための検査についてのＦＤＡおよび他の規制当局による承認を促進するためのキットおよび方法の使用が、本明細書において記載される。
【0034】
[0055]別の態様において、呼気凝縮液、気管支ブラッシング標本、および／または鼻ブラッシング標本などの非侵襲的に得られた標本における肺がんリスクの測定を可能にするためのキットおよび方法の使用が、本明細書において記載される。
【0035】
[0056]別の態様において、気道上皮細胞における、ＶＡＦが非常に低い突然変異の測定を可能にするためのキットおよび方法の使用が、本明細書において記載される。
[0057]別の態様において、がんの標的療法を導く、がん細胞における突然変異を測定するためのキットおよび方法の使用が、本明細書において記載される。
[0057]別の態様において、がんの標的療法を導く、がん細胞における突然変異を測定するためのキットおよび方法の使用が、本明細書において記載される。
【0036】
[0058]別の態様において、正常気道細胞におけるこれらの遺伝子内の突然変異を測定してがんのリスクを決定するためのキットおよび方法の使用が、本明細書において記載される。
【0037】
[0059]本発明の他のシステム、方法、特徴、および利点は、以下の図面および詳細な説明を調べることで、当業者に自明であるか、または自明となる。全てのこれらのさらなるシステム、方法、特徴、および利点は、本明細書に含まれ、本発明の範囲内であり、そして、添付の特許請求の範囲によって保護されるものである。
【0038】
[0060]特許書類または出願書類は、カラーで作成された１つもしくは複数の図面および／または１つもしくは複数の写真を有し得る。カラーの図面および／または写真を伴うこの特許公報または特許出願公開公報のコピーは、請求および手数料の支払をすれば、特許庁によって提供される。
【図面の簡単な説明】
【0039】
【図1A】[0061]患者の標本において同定された突然変異を示す図である。ＩＳシーケンシングエラーに対するサンプル突然変異シグナル。１９回のＩＳ反復における対応するヌクレオチド特異的エラーバリアントのＶＡＦ（黒い丸）と比較した、サンプルの突然変異のバリアントアレル頻度（ＶＡＦ）（赤い三角）。ＶＡＦ＝部位特異的バリアントアレルのリード数／全アレルのリード数。
【図1B】[0062]ＶＡＦ％が上昇すると、ＣＡ対象とＮＣ対象との間の差がいかに弱まるかを示す図であり、これは、ＶＡＦが極度に低いバリアントを検出する重要性を強調している。クローンがそのＶＡＦを有意なサイズまで上昇させると、免疫系はそれを排除する可能性が高い。したがって、低ＶＡＦクローンを同定することができるようになると、肺がんのリスクが高い人とリスクが低い人との間の区別が可能となる。
【図2A】[0063]ＴＰ５３突然変異の平均出現率のコホート間比較を示す図である。図２Ａ－それぞれの別個のＴＰ５３エキソン５、６、または７における各コホート内の対象での平均突然変異出現率（突然変異／標的塩基／対象）。図２Ｂ－組み合わされた３つのＴＰ５３エキソン標的についての、コホート特異的および置換特異的な平均突然変異出現率。図２Ｃ－ＴＰ５３ホットスポット部位での突然変異の数。挿入図：突然変異のタイプに従った突然変異の数。突然変異は、ＶＡＦ（バリアントアレルのリード数／全アレルのリード数）が＞０．０５％であり、分割表の解析に基づいてＩＳバックグラウンドＶＡＦを有意に上回るものと定義された。ＣＡ－ＳＭＫ対象におけるＴＰ５３突然変異は、「ホットスポット」肺がんドライバー突然変異部位で有意に多かった。（ｐ＝０．００２）。
【図3】[0064]対象特異的な突然変異出現率のコホート間比較を示す図である。（図３Ａ）ＴＰ５３エキソンのみにおける、または（図３Ｂ）ＴＰ５３エキソン、ＰＩＫ３ＣＡ、およびＢＲＡＦにおける、対象特異的な突然変異出現率のコホート間比較。
【図4A】[0065]ＥＧＦＲ突然変異の平均出現率のコホート間比較を示す図である。図４Ａ－各ＥＧＦＲエキソン（１８、１９、２０、または２１）における各コホート内の対象での平均突然変異出現率（突然変異／標的塩基／対象）。図４Ｂ－組み合わされた４つのＥＧＦＲエキソン標的についての、コホート特異的および置換特異的な平均突然変異出現率。図４Ｃ－ＥＧＦＲホットスポット部位での突然変異の数。挿入図：突然変異のタイプに従った突然変異の数。突然変異は、ＶＡＦ（バリアントアレルのリード数／全アレルのリード数）が＞５×１０－４（０．０５％）であり、分割表の解析に基づいてＩＳバックグラウンドＶＡＦを有意に上回るものと定義された。
【図5-1】[0066]Ｑｉａｇｅｎ ＣＬＣゲノミクスワークベンチの設定を示す図である。
【図6】[0067]ＮＧＳのための内部標準（ＩＳ）スパイク・イン分子の設計方法を示す略図である。
【図7-1】[0068]異なるタイプの配列バリエーションについての、ネイティブ鋳型群および内部標準群での観察された配列バリエーションの頻度を示す図である。
【図8】[0069]個々の反復のエラーおよび平均エラーを示す、４回の反復についての内部標準エラーを示す図である。
【図9A】[0070]ＩＳ頻度（％）を示す、エキソンＥＧＦＲ＿１８（赤）、ＥＧＦＲ＿２０（青）、およびＥＧＦＲ＿２１（緑）についてのハイブリッドキャプチャーパネルを示す図である。
【図9B】[0071]エキソンＥＧＦＲ＿１８（赤）、ＥＧＦＲ＿２０（青）、およびＥＧＦＲ＿２１（緑）についての、反復測定値を示すＮＴ頻度（％）、ブランク限界（ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｂｌａｎｋ）（ＬＯＢ）、およびバリアントアレル頻度を示す図である。内部標準がない場合、ブランク限界（ＬＯＢ）の計算は、全ヌクレオチド位置での全バリアントタイプにわたる平均エラー頻度に基づく。これは、検出限界（ＬＯＤ）を効果的に上昇させ、ＶＡＦが＜５％のバリアントの統計的決定を防ぐ。
【図9C】[0072]内部標準は、検出限界（ＬＯＤ）の部位特異的な決定を提供する、各ヌクレオチド位置での各バリアントタイプのブランク限界（ＬＯＢ）の計算を可能にする。これによって、ＬＯＢが十分に低い場所での、ＶＡＦが＜１％のバリアントの同定が可能となる。
【図9D】[0073]エキソンＥＧＦＲ＿１８（赤）、ＥＧＦＲ＿２０（青）、およびＥＧＦＲ＿２１（緑）についての、予想されたＮＴ、報告されたＮＴ、および報告されたＩＳの比較を示す図である。
【図10】[0074]断片化されたＦＤＡサンプルへの内部標準の適用を示す図である。
【図11】[0075]ＴＰ５３のトランス活性化ドメイン、ＴＰ５３のＤＮＡ結合ドメイン、およびＴＰ５３の四量体化ドメインでのバリアントアレル頻度を示す、１９回の内部標準反復にわたるＴＰ５３（エキソン６）でのトランジションシーケンシングエラーを示す図である。
【図12】[0076]サンプル７におけるＴＰ５３（エキソン６）のトランジションバリアントを示す図である。
【図13】[0077]ＩＳと比較した１９の患者標本における突然変異を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0040】
[0078]本開示の全体を通して、様々な刊行物、特許、および公開された特許明細書が、特定的な引用によって参照される。これら刊行物、特許、および公開された特許明細書の開示はこれによって、本発明が関連する技術水準をより完全に説明するために、参照によって本開示に組み込まれる。
【0041】
定義および略記
[0079]ＡＥＣ － 気道上皮細胞
[0080]ＣＡ－ＳＭＫ － がん対象、喫煙者
[0081]ＣＯＳＭＩＣ － がんにおける体細胞突然変異の一覧（Ｃａｔａｌｏｇ ｏｆ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ）
[0082]ＦＡＳＭＩＣ － がんにおける体細胞突然変異の機能的アノテーション（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ）
[0083]ＦＤＡ － 食品医薬品局
[0084]ＨＵＧＯ － ヒト遺伝子解析機構
[0085]ＩＳ － 内部標準、合成ＤＮＡ
[0086]ＩＳＭ － 内部標準混合物
[0087]ＬＣＲＴ － 肺がんリスク検査
[0088]ＬＤＣＴ － 低線量コンピュータ断層撮影
[0089]ＮＣ－ＮＯＮ － 非がん対象、非喫煙者
[0090]ＮＣ－ＳＭＫ － 非がん対象、喫煙者
[0091]ＮＣ－ＴＯＴ － 非がん対象、非喫煙者＋喫煙者（全ての非がん対象）
[0092]ＮＧＳ － 次世代シーケンシング
[0093]ＮＴ － ネイティブ鋳型、標的化された標本ＤＮＡ領域に由来する
[0094]ＰＣＲ － ポリメラーゼ連鎖反応
[0095]ＳＮＰ － 一塩基多型
[0096]ＶＡＦ － バリアントアレル頻度
[0097]ＴＣＧＡ － がんゲノムアトラス
[0079]ＡＥＣ － 気道上皮細胞
[0080]ＣＡ－ＳＭＫ － がん対象、喫煙者
[0081]ＣＯＳＭＩＣ － がんにおける体細胞突然変異の一覧（Ｃａｔａｌｏｇ ｏｆ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ）
[0082]ＦＡＳＭＩＣ － がんにおける体細胞突然変異の機能的アノテーション（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ）
[0083]ＦＤＡ － 食品医薬品局
[0084]ＨＵＧＯ － ヒト遺伝子解析機構
[0085]ＩＳ － 内部標準、合成ＤＮＡ
[0086]ＩＳＭ － 内部標準混合物
[0087]ＬＣＲＴ － 肺がんリスク検査
[0088]ＬＤＣＴ － 低線量コンピュータ断層撮影
[0089]ＮＣ－ＮＯＮ － 非がん対象、非喫煙者
[0090]ＮＣ－ＳＭＫ － 非がん対象、喫煙者
[0091]ＮＣ－ＴＯＴ － 非がん対象、非喫煙者＋喫煙者（全ての非がん対象）
[0092]ＮＧＳ － 次世代シーケンシング
[0093]ＮＴ － ネイティブ鋳型、標的化された標本ＤＮＡ領域に由来する
[0094]ＰＣＲ － ポリメラーゼ連鎖反応
[0095]ＳＮＰ － 一塩基多型
[0096]ＶＡＦ － バリアントアレル頻度
[0097]ＴＣＧＡ － がんゲノムアトラス
【0042】
[0098]「遺伝子」は、１つまたは複数の発現分子、例えばＲＮＡまたはポリペプチドを共にコードする、ゲノム内の１つまたは複数のヌクレオチド配列である。遺伝子は、ＲＮＡに転写されるコード配列を含み得、当該ＲＮＡは次いでポリペプチド配列に翻訳され得、また、遺伝子は、付随する、構造配列または遺伝子の複製もしくは発現において機能する調節配列を含み得る。
【0043】
[0099]マーカー、プローブ、またはプライマーの「セット」は、共通の目的（例えば、個体のがんを発症するリスクの見積もり）に使用される、マーカー、プローブ、プライマーのコレクションもしくは群、またはこれらに由来するデータを指す。多くは、マーカー、プローブ、もしくはプライマーに対応する、またはこれらの使用に由来するデータは、電子メディアに保存される。セットの構成員の各々は特定の目的に関して有用性を有するが、セットから、および一部のマーカーを含むが全てのマーカーは含まないサブセットから選択された個々のマーカーもまた、特定の目的の達成において効果的である。
【0044】
[00100]本明細書において使用される「標本」は、解析のために回収された材料、例えば、調査、診断、または他の目的のために任意の生物学的実体から例えば採取された、培養物のスワブ、つまみ取った組織、生検抽出物、一瓶の体液、例えば、唾液、血液、および／または尿などを指し得る。
【0045】
[00101]標本はまた、生検、例えば、内視鏡生検（ブラシおよび／または鉗子を使用する）、針吸引生検（微細針吸引生検を含む）で典型的に回収された量、ならびに、選別された細胞集団（例えば、流動選別された細胞集団）および／またはマイクロダイセクションされた材料（例えば、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションされた組織）で提供される量も指し得る。例えば、疑わしいがん性病変の生検は、一般に、微細針吸引（ＦＮＡ）生検によって行われ、骨髄もまた生検によって得られ、また、脳の組織、発生中の胚、および動物モデルは、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションされたサンプルによって得られ得る。
【0046】
[00102]本明細書において使用される「生物学的実体」は、あらゆる種を含む、核酸を有し得るあらゆる実体、例えば、ウイルス、細胞、組織、インビトロ培養物、植物、動物、臨床試験に参加している対象、および／または、疾患もしくは状態について診断もしくは処置されている対象を指し得る。
【0047】
[00103]本明細書において使用される「サンプル」は、所与のアッセイ、反応、ラン、試験、および／または実験に使用される標本材料を指し得る。例えば、サンプルは、標本の全てまたは一部を含む、回収された標本材料のアリコートを含み得る。本明細書において使用される場合、アッセイ、反応、ラン、試験、および／または実験という用語は、区別せずに使用され得る。
【0048】
[00104]一部の実施形態において、回収された標本は、約１０万個未満の細胞、約１万個未満の細胞、約５０００個未満の細胞、約１０００個未満の細胞、約５００個未満の細胞、約１００個未満の細胞、約５０個未満の細胞、または約１０個未満の細胞を含み得る。
【0049】
[00105]一部の実施形態において、核酸の見積もり、評価、および／または測定は、遺伝子の発現レベルを例えば決定するために、標本および／またはサンプルにおける核酸量の測定を提供することを指し得る。一部の実施形態において、量の測定の提供は、目的の核酸の存在または不存在を検出することを指す。一部の実施形態において、量の測定の提供は、例えば、核酸の量を定量すること、例えば、存在する核酸の濃度または量の程度の測定を提供することを指し得る。一部の実施形態において、核酸量の測定の提供は、核酸量を計数すること、例えば、サンプル中に存在する核酸分子の数を示すことを指す。「目的の核酸」は、「標的」核酸および／または「目的の遺伝子」と呼ばれ得、例えば、評価対象の遺伝子は、標的遺伝子と呼ばれ得る。核酸分子の数はまた、サンプルおよび／または標本中で見られる核酸コピーの数とも呼ばれ得る。
【0050】
[00106]本明細書において使用される場合、「核酸」は、あらゆる長さのポリマー形態のヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド様分子を指し得る。ある特定の実施形態において、核酸は、例えばヌクレオチド単位の塩基相補的組み込みによる、相補的核酸の合成のための鋳型として役立ち得る。例えば、核酸は、天然のＤＮＡ、例えばゲノムＤＮＡ；ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡを含み得、かつ／または、限定はしないが任意の様式で生成されたｃＤＮＡおよび組換え分子を含む、合成分子を含み得る。例えば、核酸は、化学合成、逆転写、ＤＮＡ複製、またはこれらの生成方法の組み合わせから生成され得る。サブユニット間の結合は、ホスフェート、ホスホネート、ホスホロアミデート、ホスホロチオエート、もしくはそれに類するものによって、または、限定はしないが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）において利用されるペプチドタイプの結合などの、非リン酸基によって、提供され得る。結合基は、キラルまたはアキラルであり得る。ポリヌクレオチドは、例えばＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、またはハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ分子であり得る、一本鎖分子、二本鎖分子、および三重らせん分子を包含する、あらゆる三次元構造を有し得る。
【0051】
[00107]ヌクレオチド様分子は、ヌクレオチドとほぼ類似の作用をし得る、例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡで生じる塩基の１つもしくは複数との塩基相補性を示す、および／または塩基相補的組み込みをし得る、構造部分を指し得る。用語「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド分子」、「核酸分子」、「ポリヌクレオチド配列」、および「核酸配列」は、本明細書において「核酸」と区別せずに使用され得る。一部の具体的な実施形態において、測定対象の核酸は、特異的遺伝子に対応する配列を含み得る。
【0052】
[00108]一部の実施形態において、回収された標本は、測定対象のＲＮＡ、例えば、組織培養物において発現しているｍＲＮＡを含む。一部の実施形態において、回収された標本は、測定対象のＤＮＡ、例えば、転写産物から逆転写されたｃＤＮＡを含む。一部の実施形態において、測定対象の核酸は、他の核酸分子の異種混合物中で提供される。
【0053】
[00109]本明細書において使用される用語「ネイティブ鋳型」は、増幅のための鋳型として機能し得る、標本から直接または間接得られる核酸を指し得る。例えば、ネイティブ鋳型は、その発現が測定対象である遺伝子に対応するｃＤＮＡ分子を指し得、この場合、ｃＤＮＡが増幅および定量される。
【0054】
[00110]用語「プライマー」は一般に、条件がプライマー伸長産物の合成に適切である場合に相補鎖に沿った合成の開始点として作用し得る、核酸を指す。
全体的な説明
[00111]サンプル中の核酸量を見積もるためのキットおよび方法が、本明細書において記載される。一部の実施形態において、本方法は、例えば、核酸が標本において少量で発現している場合、少量の核酸が無傷のままである場合、および／または少量の標本が提供される場合の、少量の核酸の測定を可能にする。
全体的な説明
[00111]サンプル中の核酸量を見積もるためのキットおよび方法が、本明細書において記載される。一部の実施形態において、本方法は、例えば、核酸が標本において少量で発現している場合、少量の核酸が無傷のままである場合、および／または少量の標本が提供される場合の、少量の核酸の測定を可能にする。
【0055】
ＮＧＳのための内部標準（ＩＳ）スパイク・イン分子の設計
[00112]まず図６を参照すると、ＮＧＳのための内部標準（ＩＳ）スパイク・イン分子の設計方法の略図が示されている。
[00112]まず図６を参照すると、ＮＧＳのための内部標準（ＩＳ）スパイク・イン分子の設計方法の略図が示されている。
【0056】
[00113]ＩＳは、既知の１つまたは複数のヌクレオチドの変化を除いて標的解析物と相同な、合成ＤＮＡ分子である。
[00114]ＩＳ設計の目的：標的解析物ＤＮＡのネイティブ鋳型（ＮＴ）と同一であるが区別可能な形態で挙動すること
[00115]ＩＳは以下を使用する：１）ライブラリープレップにおける各標的解析物ＮＴの測定可能なゲノムコピーを定量する、および、２）定量し、ヌクレオチド部位特異的な技術的エラーを特徴付けする
[00116]ＩＳの実装：１）サンプルＤＮＡを数が分かっているＩＳ分子と１：１のゲノムコピー比で混合し、その後、ＮＧＳライブラリーを調製する、２）ＩＳ＋ＮＴ混合物を共増幅する、３）シーケンシングライブラリーを調製する、および４）サンプルをシーケンシングする。
[00114]ＩＳ設計の目的：標的解析物ＤＮＡのネイティブ鋳型（ＮＴ）と同一であるが区別可能な形態で挙動すること
[00115]ＩＳは以下を使用する：１）ライブラリープレップにおける各標的解析物ＮＴの測定可能なゲノムコピーを定量する、および、２）定量し、ヌクレオチド部位特異的な技術的エラーを特徴付けする
[00116]ＩＳの実装：１）サンプルＤＮＡを数が分かっているＩＳ分子と１：１のゲノムコピー比で混合し、その後、ＮＧＳライブラリーを調製する、２）ＩＳ＋ＮＴ混合物を共増幅する、３）シーケンシングライブラリーを調製する、および４）サンプルをシーケンシングする。
【0057】
[00117]内部標準「スパイク・イン分子」は、１つまたは複数のヌクレオチド変化を使用してＩＳリードをサンプルリードから分離する、カスタムｐｅｒｌスクリプトである。ネイティブ鋳型（ＮＴ）におけるエラープロファイルは、内部標準（ＩＳ）においてほとんど同一である。
【0058】
[00118]したがって、ＩＳコントロールは、異なるタイプの配列バリエーションについての、ネイティブ鋳型群および内部標準群での観察された配列バリエーションの頻度を示す図７に示すように、ライブラリー特異的なエラープロファイルについてコントロールする。
【0059】
[00119]さらに、図８に示すように、ヌクレオチド特異的な技術的エラーは再現可能である。図８は、個々の反復のエラーおよび平均エラーを示す、４回の反復についての内部標準エラーを示す。各ＮＴ塩基位置でのヌクレオチド特異的な技術的エラーは、対応するＩＳ位置に適合する。また、ＤＮＡのランドスケープは、領域間でのおよびヌクレオチド間でのシーケンシングエラーに影響を及ぼすことが多く、つまり、ＩＳおよびＮＴは同様の挙動をする。
【0060】
[00120]各反応へのＩＳのスパイクは、したがって、ライブラリープレップ内の変動（例えば、干渉物質、パネル内およびパネル間のハイブリダイゼーション効率、ライゲーション効率、増幅）についてコントロールする。
【0061】
[00121]内部標準はまた不正確性の原因についてもコントロールし、各ヌクレオチドでの信頼区間：ヌクレオチド特異的エラーの頻度、プラットフォーム特異的エラー、およびポリメラーゼ特異的エラーを狭くすることを可能にする。
【0062】
[00122]図９Ａ～図９Ｄは、内部標準が部位特異的なＬＯＤ（対数オッズ）を可能にすることを示している。図９Ａは、ＩＳ頻度（％）を示す、エキソンＥＧＦＲ＿１８（赤）、ＥＧＦＲ＿２０（青）、およびＥＧＦＲ＿２１（緑）についてのハイブリッドキャプチャーパネルを示している。図９Ｂ～図９Ｃは、エキソンＥＧＦＲ＿１８（赤）、ＥＧＦＲ＿２０（青）、およびＥＧＦＲ＿２１（緑）についての、反復測定値を示すＮＴ頻度（％）、ＬＯＢ、およびバリアントアレル頻度を示している。図９Ｄは、エキソンＥＧＦＲ＿１８（赤）、ＥＧＦＲ＿２０（青）、およびＥＧＦＲ＿２１（緑）についての、予想されたＮＴ、報告されたＮＴ、および報告されたＩＳの比較を示す。したがって、図９Ａ～図９Ｄは、外部プロセス性能推定に基づく従来の方法が＜５％のＶＡＦ測定をサポートしないことを示す。また、代替的な補正方法は複雑であり、１０倍から２０倍多くのシーケンシングリードを必要とする。
【0063】
[00123]図１０は、断片化されたＦＤＡサンプルへの内部標準（ＩＳ）の適用を示す。既知の突然変異が、内部標準（ＩＳ）によって決定された部位特異的ＬＯＢに基づいてＬＯＤで同定されている。
【0064】
[00124]マルチプレックス勾配ＰＣＲは、様々な融解温度を有するプライマーによる特異的標的へのアニーリングを可能にする。シングルプレックスＰＣＲと、その後の定量等モルでの混合は、シーケンサーへの等しいロードを可能にする。ＰＣＲ標的は、肺がんおよび肺の前がん病変における発生率の高さに基づいて選択される。
【0065】
[00125]合成ＤＮＡ内部標準（ＩＳ）を様々な肺がんドライバー遺伝子の各々について調製し、各ＡＥＣゲノム（ｇＤＮＡ）標本と混合し、その後、競合マルチプレックスＰＣＲアンプリコンＮＧＳライブラリーを調製した。カスタムＰｅｒｌスクリプトを作製して、ＩＳリードおよび各標的のそれぞれの標本ｇＤＮＡリードを、並行したバリアント頻度解析のための別個のファイルに分けた。このアプローチは、ＶＡＦが５×１０－４（０．０５％）と低い突然変異の信頼性の高い検出を可能にした。この方法を次いで、レトロスペクティブなケースコントロール研究に適用した。具体的には、ＡＥＣ標本を１１の肺がんケースおよび８の非がんコントロールを含む１９の対象の正常な気道から気管支鏡ブラシ生検によって回収し、肺がんリスクとＡＥＣドライバー遺伝子突然変異との関係を試験した。
【0066】
[00126]図１１は、ＴＰ５３のトランス活性化ドメイン、ＴＰ５３のＤＮＡ結合ドメイン、およびＴＰ５３の四量体化ドメインでのバリアントアレル頻度（ＶＡＦ）を示す、１９回の内部標準（Ｓ）反復にわたるＴＰ５３（エキソン６）でのトランジションシーケンシングエラーの例である。
【0067】
[00127]図１２は、ＴＰ５３のトランス活性化ドメイン、ＴＰ５３のＤＮＡ結合ドメイン、およびＴＰ５３の四量体化ドメインでのバリアントアレル頻度（ＶＡＦ）を示す、ＴＰ５３（エキソン６）でのサンプルにおけるトランジションバリアントの例である。
【0068】
[00128]図１３は、ＩＳと比較した１９の患者標本における突然変異を示す。１９の患者標本において、１２９の有意なバリアントが同定された。これらバリアントのＶＡＦは、０．０５％から０．４６％の範囲である。９９のバリアントが１１のがん標本において見られた。３０のバリアントが８の非がん標本においてみられた。また、がんを有する喫煙者のバリアントは、がんを有さない喫煙者と比較して有意に増大した。
【0069】
[00129]肺がんリスク検査において解析物を測定するための試薬および指示を含むキットまたは方法が、本明細書において記載される。
[00130]このキットまたは方法は、肺がんリスクについての検査に含めるために、これまでに記載されていない解析物を測定するための試薬を組み込む。
[00130]このキットまたは方法は、肺がんリスクについての検査に含めるために、これまでに記載されていない解析物を測定するための試薬を組み込む。
【0070】
[00131]具体的には、肺がんリスク検査（ＬＣＲＴ）キットまたは方法は、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＢＲＡＦ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＮＯＴＣＨＩ、ＥＧＦＲ、およびＥＲＢＢ２を含む、肺がんドライバー遺伝子における複数の低バリアントアレル頻度（ＶＡＦ）（すなわち、ＶＡＦ＜０．０１ １１－．０％１）突然変異体を測定するための試薬を含む。
【0071】
[00132]他の試薬が、ＣＤＫＮ１Ａ、Ｅ２Ｆ１、ＥＲＣＣ１、ＥＲＣＣ４、ＥＲＣＣ５、ＧＰＸ１、ＧＳＴＰ１、ＫＥＡＰ１、ＲＢ１、ＴＰ５３、ＴＰ６３、およびＸＲＣＣ１などの遺伝子のために含まれ得る。
【0072】
[00133]これら解析物は、気道上皮細胞のＲＮＡまたはＤＮＡにおいて測定され得、また、呼気凝縮液および鼻ブラッシングによって得られた気道上皮細胞を含む、非侵襲的に得られた標本において測定され得る。
【0073】
[00134]また、数が分かっている合成内部標準分子と比較した標本解析物の測定に基づく、各標本における各解析物の測定の検出限界／定量限界の計算を伴う、低ＶＡＦ突然変異体を測定するための方法が、本明細書において記載される。
【0074】
[00135]ある特定の実施形態において、これらのキットおよび方法は、地域研究所でのキット形式または方法形式での肺がんリスク検査についてのＦＤＡおよび他の規制当局による承認を促進するために有用である。
【0075】
[00136]ある特定の実施形態において、これらのキットおよび方法は、呼気凝縮液、鼻ブラッシング標本、喀痰、口腔上皮、血液、およびそれに類するものなどの非侵襲的に得られた標本における肺がんリスクの測定を可能にするために有用である。
【0076】
[00137]ある特定の実施形態において、これらのキットおよび方法は、気道上皮細胞における、ＶＡＦが非常に低い突然変異の測定を可能にするために有用である。
【実施例】
【0077】
[00138]本明細書において記載される方法および実施形態は、以下の実施例においてさらに規定され、これら実施例において、別段の記載がない限り、全ての部およびパーセンテージは重量当たりであり、温度は摂氏である。本発明のある特定の実施形態が、本明細書の実施例において規定される。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、説明のためだけに提供されていることが理解されるべきである。本明細書における議論およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の必須の特徴を確認し得、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な使用および条件に本発明を適合させるための本発明の様々な変更および修正を行うことができる。
【0078】
[00139]ＶＡＦ範囲が０．０５～１．０％の突然変異の測定は、がんリスクに関連するＡＥＣ体細胞突然変異のより有益な解析を可能にする。肺がん対象の間では、喫煙および年齢について適合させた非がん対象と比較して、ＴＰ５３突然変異はより多く出現しており（ｐ＜０．０５）、タバコ煙および年齢のシグネチャーに富んでいた。
【0079】
方法
研究コホートの登録および特徴付け。
[00140]このレトロスペクティブなケースコントロール研究では、１１人の肺がんを有する喫煙者（ＣＡ－ＳＭＫ）、年齢および喫煙歴について適合させた５人のがんを有さない喫煙者（ＮＣ－ＳＭＫ）、および３人のがんを有さない非喫煙者（ＮＣ－ＮＯＮ）を含む、１９人の対象から回収されたＡＥＣ標本が使用された（表１）。
研究コホートの登録および特徴付け。
[00140]このレトロスペクティブなケースコントロール研究では、１１人の肺がんを有する喫煙者（ＣＡ－ＳＭＫ）、年齢および喫煙歴について適合させた５人のがんを有さない喫煙者（ＮＣ－ＳＭＫ）、および３人のがんを有さない非喫煙者（ＮＣ－ＮＯＮ）を含む、１９人の対象から回収されたＡＥＣ標本が使用された（表１）。
【0080】
[00141]対象は、２０００年から２０１８年の間のＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｏｌｅｄｏ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（ＵＴＭＣ）での調査試験に登録された。この調査研究に含まれた各対象は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｏｌｅｄｏ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄによって承認されたプロトコルの下で、文書のインフォームドコンセントを提出した。肺がん診断、喫煙歴、および個体群統計情報を含む臨床的特徴を、診療記録から得た。肺がん歴は再調査され、解剖学的および臨床的病理の資格を有する独立した病理学者によって確認された。
【0081】
【表1】
【0082】
標本の取得
[00143]ＡＥＣは、診断手順が標準治療の指示に従って行われたときの、正常に見える気道上皮の気管支鏡ブラシ生検を介して得られた。肺がんと診断された患者では、ＡＥＣのサンプリングは、がんを伴わない肺の主気管支から行われた。標本はすぐに冷たい生理食塩水中に置かれ、回収の１時間以内に処理された。
[00143]ＡＥＣは、診断手順が標準治療の指示に従って行われたときの、正常に見える気道上皮の気管支鏡ブラシ生検を介して得られた。肺がんと診断された患者では、ＡＥＣのサンプリングは、がんを伴わない肺の主気管支から行われた。標本はすぐに冷たい生理食塩水中に置かれ、回収の１時間以内に処理された。
【0083】
ＤＮＡの抽出および定量
[00144]ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、ＦｌｅｘｉＧｅｎｅ ＤＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造者のプロトコルに従って使用して、対象当たりおよそ５０万のＡＥＣから抽出し、セクレトグロビン、ファミリー１Ａ、メンバー１遺伝子における、良く特徴付けされたゲノム位置の競合ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を使用して定量した。
[00144]ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、ＦｌｅｘｉＧｅｎｅ ＤＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造者のプロトコルに従って使用して、対象当たりおよそ５０万のＡＥＣから抽出し、セクレトグロビン、ファミリー１Ａ、メンバー１遺伝子における、良く特徴付けされたゲノム位置の競合ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を使用して定量した。
【0084】
標的の選択
[00145]Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）プロジェクトによって非小細胞肺がんにおいて最も共通して突然変異していると最近報告された７つの遺伝子領域における１２の遺伝子座を、標的として選択した。エキソン番号および括弧書きで示されている略記を用いてヒト遺伝子解析機構（ＨＵＧＯ）に従って特定された標的領域は、Ｂ－Ｒａｆがん原遺伝子エキソン１５（ＢＲＡＦ＿１５）、上皮成長因子受容体エキソン１８～２１（ＥＧＦＲ＿１８、ＥＧＦＲ＿１９、ＥＧＦＲ＿２０、ＥＧＦＲ＿２１）、ｅｒｂ－ｂ２受容体チロシンキナーゼ２（ＥＲＢＢ２）、ＫＲＡＳがん原遺伝子エキソン２（ＫＲＡＳ＿２）、ノッチ受容体１エキソン２６（ＮＯＴＣＨ１＿２６）、ホスファチジルイノシトール－４，５－ビスリン酸３－キナーゼ触媒性サブユニットアルファエキソン１０（ＰＩＫ３ＣＡ＿１０）、および腫瘍タンパク質ｐ５３エキソン５～７（ＴＰ５３＿５、ＴＰ５３＿６、ＴＰ５３＿７）を含んでいた。プライマーをこれらの標的の各々について作製した。
[00145]Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）プロジェクトによって非小細胞肺がんにおいて最も共通して突然変異していると最近報告された７つの遺伝子領域における１２の遺伝子座を、標的として選択した。エキソン番号および括弧書きで示されている略記を用いてヒト遺伝子解析機構（ＨＵＧＯ）に従って特定された標的領域は、Ｂ－Ｒａｆがん原遺伝子エキソン１５（ＢＲＡＦ＿１５）、上皮成長因子受容体エキソン１８～２１（ＥＧＦＲ＿１８、ＥＧＦＲ＿１９、ＥＧＦＲ＿２０、ＥＧＦＲ＿２１）、ｅｒｂ－ｂ２受容体チロシンキナーゼ２（ＥＲＢＢ２）、ＫＲＡＳがん原遺伝子エキソン２（ＫＲＡＳ＿２）、ノッチ受容体１エキソン２６（ＮＯＴＣＨ１＿２６）、ホスファチジルイノシトール－４，５－ビスリン酸３－キナーゼ触媒性サブユニットアルファエキソン１０（ＰＩＫ３ＣＡ＿１０）、および腫瘍タンパク質ｐ５３エキソン５～７（ＴＰ５３＿５、ＴＰ５３＿６、ＴＰ５３＿７）を含んでいた。プライマーをこれらの標的の各々について作製した。
【0085】
[00146]ＮＯＴＣＨ１＿２６を除く全ての標的のためのプライマーは、マルチプレックスライブラリーおよび下流ライブラリーの調製において効率的に機能した。したがって、データは、残りの１１の標的いついて報告される。
【0086】
合成内部標準混合物の調製
[00147]上記のＴＣＧＡ標的のための競合合成ＤＮＡ内部標準（ＩＳ）分子を、標的解析物のネイティブ鋳型（ＮＴ）に対する５０塩基ごとの既知のジヌクレオチド置換突然変異で設計した。これによって、この研究において使用されたＰＣＲアンプリコンライブラリーまたは本明細書において報告されていない他の継続中の研究におけるランダム断片ハイブリッドキャプチャーライブラリーの、シーケンシング後のデータ処理の際の、ＮＴリードおよびＩＳリードの分離が可能となった。ＩＳをプラスミドにクローニングし、Ｓａｎｇｅｒシーケンシング確認法を使用して純粋なクローン単離物として選択して、最終配列を確認した。このさらなる精製ステップは、合成によって導入される可能性があるエラーを全く有さないクローンを選択するために行われた。内因性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリメラーゼの忠実性が高いことに起因して、クローニングされたＩＳにおけるバリアントの頻度は１０－７から１０－８の間であると予想され得、これは、この研究の所望の検出限界よりもかなり低い。各クローニングされたプラスミドを線状化し、デジタルドロップレットＰＣＲによって定量し、次いで、等しいゲノムコピーバランスで組み合わせた。等濃度（ゲノムコピー当たり）の各線状化された標的解析物のＩＳ分子を含有する内部標準混合物（ＩＳＭ）は、Ａｃｃｕｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＮＣ）によって調製された。
[00147]上記のＴＣＧＡ標的のための競合合成ＤＮＡ内部標準（ＩＳ）分子を、標的解析物のネイティブ鋳型（ＮＴ）に対する５０塩基ごとの既知のジヌクレオチド置換突然変異で設計した。これによって、この研究において使用されたＰＣＲアンプリコンライブラリーまたは本明細書において報告されていない他の継続中の研究におけるランダム断片ハイブリッドキャプチャーライブラリーの、シーケンシング後のデータ処理の際の、ＮＴリードおよびＩＳリードの分離が可能となった。ＩＳをプラスミドにクローニングし、Ｓａｎｇｅｒシーケンシング確認法を使用して純粋なクローン単離物として選択して、最終配列を確認した。このさらなる精製ステップは、合成によって導入される可能性があるエラーを全く有さないクローンを選択するために行われた。内因性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリメラーゼの忠実性が高いことに起因して、クローニングされたＩＳにおけるバリアントの頻度は１０－７から１０－８の間であると予想され得、これは、この研究の所望の検出限界よりもかなり低い。各クローニングされたプラスミドを線状化し、デジタルドロップレットＰＣＲによって定量し、次いで、等しいゲノムコピーバランスで組み合わせた。等濃度（ゲノムコピー当たり）の各線状化された標的解析物のＩＳ分子を含有する内部標準混合物（ＩＳＭ）は、Ａｃｃｕｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＮＣ）によって調製された。
【0087】
[00148]技術的に誘導された塩基置換エラーは、組み合わせライブラリー調製ステップおよびシーケンシングステップの際に、ｇＤＮＡ試験サンプル内で、合成ＩＳとそれぞれの標的配列とで同率で生じる。したがって、各ＩＳは、塩基置換エラー率における標的特異的部位および領域の差についてコントロールする。
【0088】
マルチプレックス競合ＰＣＲアンプリコンライブラリー
[00149]サンプル中の各標的を増幅し、低頻度バリアントを検出する機会を最大にするために、マルチプレックス競合ＰＣＲアンプリコンライブラリーをＡＥＣのＤＮＡサンプルの各々について調製した。ＰＣＲの際の技術的エラーを最小にするために条件を最適化し、これには、報告されるエラー頻度が１０－６のＱ５ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）の使用、および各ラウンドでのＰＣＲサイクルの最少化が含まれる。
[00149]サンプル中の各標的を増幅し、低頻度バリアントを検出する機会を最大にするために、マルチプレックス競合ＰＣＲアンプリコンライブラリーをＡＥＣのＤＮＡサンプルの各々について調製した。ＰＣＲの際の技術的エラーを最小にするために条件を最適化し、これには、報告されるエラー頻度が１０－６のＱ５ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）の使用、および各ラウンドでのＰＣＲサイクルの最少化が含まれる。
【0089】
ラウンド１：競合マルチプレックスＰＣＲ
[00150]ユニバーサルテールを有する１２の標的特異的プライマーが、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によって合成された。ＴＥバッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ７．４、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）を凍結乾燥プライマーに添加することによって、各標的のための個々のプライマー溶液を作製して、１００μＭのストックとした。それぞれ１００μＭのフォワードプライマーおよびリバースプライマーストック溶液５μＬを混合し、ＴＥバッファーを添加して最終容積を２００μＬにすることによって、２．５μＭのマルチプレックスプライマー混合物を調製した。
[00150]ユニバーサルテールを有する１２の標的特異的プライマーが、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によって合成された。ＴＥバッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ７．４、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）を凍結乾燥プライマーに添加することによって、各標的のための個々のプライマー溶液を作製して、１００μＭのストックとした。それぞれ１００μＭのフォワードプライマーおよびリバースプライマーストック溶液５μＬを混合し、ＴＥバッファーを添加して最終容積を２００μＬにすることによって、２．５μＭのマルチプレックスプライマー混合物を調製した。
【0090】
[00151]各対象について、ライブラリー調製および／またはシーケンシングの際に生じるヌクレオチド特異的な置換エラーについてコントロールするために、ＡＥＣ ＤＮＡのアリコートを等しいゲノムコピーのＩＳＭと組み合わせた。混合物中の少なくとも５万ゲノム当量のサンプルおよびＩＳの両方、６μＬの５Ｘ Ｑ５バッファー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）、１０ｍＭのｄＮＴＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）０．６μＬ、２．５μＭのマルチプレックスプライマー混合物３μＬ、２％ｗ／ｖのウシ血清アルブミン（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）１．５μＬ、Ｑ５ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）０．３μＬ、ならびに最終反応容積３０μＬになるまでの分子グレードの水を含有する反応物を調製した。
【0091】
[00152]各競合マルチプレックス反応混合物を、７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）において、以下の修正された勾配ＰＣＲ条件下で、全部で２０サイクル増幅した：９５℃／２分（Ｑ５ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼの活性化）；９４℃／１０秒（変性）、７０℃／１０秒、６８℃／１０秒、６６℃／１０秒、６４℃／１０秒、６２℃／１０秒（アニーリング）、および７２℃／３０秒（伸長）を２０サイクル；全ての産物の完全な伸長を確実にするための、７２℃／２分の最終伸長。ＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造者のプロトコルに従って使用してカラム精製した。
【0092】
ラウンド２：シングルプレックスＰＣＲ
[00153]マルチプレックス増幅の後、最終濃度５００ｎＭのそれぞれの個々の標的に対するプライマーを使用する、第２ラウンドの１２の並行したシングルプレックスＰＣＲ反応を行って、マルチプレックスでの効率が低いプライマーの産物を確実にロバストに増幅させた。Ｈｉｇｈ ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｑ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔポリメラーゼおよび他のＰＣＲ試薬を上記のように使用した。
[00153]マルチプレックス増幅の後、最終濃度５００ｎＭのそれぞれの個々の標的に対するプライマーを使用する、第２ラウンドの１２の並行したシングルプレックスＰＣＲ反応を行って、マルチプレックスでの効率が低いプライマーの産物を確実にロバストに増幅させた。Ｈｉｇｈ ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｑ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔポリメラーゼおよび他のＰＣＲ試薬を上記のように使用した。
【0093】
[00154]シングルプレックス反応物を、７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）において、以下の条件を使用して、１５サイクル増幅した：９５℃／２分（Ｑ５ポリメラーゼの活性化）；９４℃／１０秒（変性）、６５℃／２０秒（アニーリング）、および７２℃／３０秒（伸長）を１５サイクル；７２℃／２分間の最終伸長を行って、全ての産物を確実に完全に伸長させた。各シングルプレックスＰＣＲ産物を、ＤＮＡチップとＤＮＡ １０００ Ｋｉｔ試薬とを製造者のプロトコルに従って使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで質および量についてチェックした（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ、Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。サンプル特異的シングルプレックス反応物を次いで、（ａ）シーケンシングリード数の間の標的リードのバランスを確実に等しくするために等モル量で混合し、そして（ｂ）ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造者のプロトコルに従って使用してカラム精製した。
【0094】
ラウンド３：サンプル特異的バーコードの付加
[00155]シーケンシングリードを偽インデックス／バーコードする可能性を低減させるために、各患者サンプルに由来する、カラム精製されたシングルプレックス反応混合物を、固有のセットのデュアルインデックスバーコードプライマーを使用して標識した。バーコード配列およびＩｌｌｕｍｉｎａプライミング部位を有する一対の融合プライマーを、以下を用いて設計した：１）最初のマルチプレックス反応およびシングルプレックス反応の際に付加されたユニバーサル配列テールに相補的なそれらの３’末端、２）５’からその１０ヌクレオチドのインデックス／バーコード配列、および（３）５’からそのＩｌｌｕｍｉｎａリード１またはリード２プライミング部位。各反応におけるバーコードプライマーの最終濃度は、５００ｎＭであった。ＰＣＲ条件は、サイクル数が１０に減ったことを除いて、シングルプレックス反応について記載されたものと同一であった。
[00155]シーケンシングリードを偽インデックス／バーコードする可能性を低減させるために、各患者サンプルに由来する、カラム精製されたシングルプレックス反応混合物を、固有のセットのデュアルインデックスバーコードプライマーを使用して標識した。バーコード配列およびＩｌｌｕｍｉｎａプライミング部位を有する一対の融合プライマーを、以下を用いて設計した：１）最初のマルチプレックス反応およびシングルプレックス反応の際に付加されたユニバーサル配列テールに相補的なそれらの３’末端、２）５’からその１０ヌクレオチドのインデックス／バーコード配列、および（３）５’からそのＩｌｌｕｍｉｎａリード１またはリード２プライミング部位。各反応におけるバーコードプライマーの最終濃度は、５００ｎＭであった。ＰＣＲ条件は、サイクル数が１０に減ったことを除いて、シングルプレックス反応について記載されたものと同一であった。
【0095】
[00156]ＰＣＲ産物を、ＤＮＡチップとＤＮＡ １０００ Ｋｉｔ試薬とを製造者のプロトコルに従って使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで質および量についてチェックし、分子グレードの水で１００倍希釈し、最終シーケンシングアダプターＰＣＲに入れた。
【0096】
ラウンド４：シーケンシングアダプターの付加
[00157]ラウンド３で使用したものと同一のＰＣＲ条件を使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａリード１またはリード２プライミング部位に相補的なこれらの３’末端、ならびに５’Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングアダプターを用いて設計された第２の融合プライマーセットを使用して、個々の希釈されたバーコードサンプルをＩｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム特異的アダプターで標識した。
[00157]ラウンド３で使用したものと同一のＰＣＲ条件を使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａリード１またはリード２プライミング部位に相補的なこれらの３’末端、ならびに５’Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングアダプターを用いて設計された第２の融合プライマーセットを使用して、個々の希釈されたバーコードサンプルをＩｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム特異的アダプターで標識した。
【0097】
サンプルのプール
[00158]ラウンド４の後、固有にバーコードされたサンプルのそれぞれを、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで上記のように定量した。サンプルを次いで、各ライブラリーが最終的に受け取るシーケンシングリードのパーセンテージを最適化するように、等モル比で混合した。ほとんどのケースにおいて、１：１が使用された。
[00158]ラウンド４の後、固有にバーコードされたサンプルのそれぞれを、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで上記のように定量した。サンプルを次いで、各ライブラリーが最終的に受け取るシーケンシングリードのパーセンテージを最適化するように、等モル比で混合した。ほとんどのケースにおいて、１：１が使用された。
【0098】
産物の精製およびシーケンシング
[00159]組み合わされたシーケンシングライブラリーを、２％ｗ／ｖのアガロースゲル上でのゲル電気泳動を使用して精製した。得られた産物バンドを次いで切り出し、これを望ましくないヘテロ二量体から分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して抽出し、そして５０μＬの溶出バッファー中で溶出した。精製されたシーケンシングライブラリーを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ ５５０シーケンシングでの次世代シーケンシングのために、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｈｉｇａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃｓコアファシリティーに送った。
[00159]組み合わされたシーケンシングライブラリーを、２％ｗ／ｖのアガロースゲル上でのゲル電気泳動を使用して精製した。得られた産物バンドを次いで切り出し、これを望ましくないヘテロ二量体から分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して抽出し、そして５０μＬの溶出バッファー中で溶出した。精製されたシーケンシングライブラリーを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ ５５０シーケンシングでの次世代シーケンシングのために、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｈｉｇａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃｓコアファシリティーに送った。
【0099】
ＮＧＳデータの解析
[00160]Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｈｉｇａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃｓコアファシリティーによって作成されたＦＡＳＴＱデータファイルを、カスタムＰｅｒｌスクリプトを使用して処理して、内部標準（ＩＳ）およびネイティブ鋳型（ＮＴ）のリードを別個のＮＴファイルおよびＩＳファイルに分け、その後、図５に示すように、クオリティトリミング、アラインメント、およびバリアントコーリングのために、Ｑｉａｇｅｎ ＣＬＣゲノミクスワークベンチ１２ソフトウェアスイートを使用した並行解析を行った。
[00160]Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｈｉｇａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃｓコアファシリティーによって作成されたＦＡＳＴＱデータファイルを、カスタムＰｅｒｌスクリプトを使用して処理して、内部標準（ＩＳ）およびネイティブ鋳型（ＮＴ）のリードを別個のＮＴファイルおよびＩＳファイルに分け、その後、図５に示すように、クオリティトリミング、アラインメント、およびバリアントコーリングのために、Ｑｉａｇｅｎ ＣＬＣゲノミクスワークベンチ１２ソフトウェアスイートを使用した並行解析を行った。
【0100】
[00161]プライマー配列、内部標準ジヌクレオチド位置とこれらの５’および３’塩基、ならびに既知の一塩基多型（ＳＮＰ）位置を、バリアント解析から排除した。
[00162]バリアントコーリング
[00163]バリアントが、各々それぞれの位置のそれぞれの突然変異タイプについて、ＩＳで測定されたバックグラウンドエラーを有意に上回るＮＴシグナルに基づいてコールされた。有意性は、プールされたサンプル中の稀なバリアントを同定するために、各ヌクレオチド位置でのそれぞれの個々のバリアントタイプの分割表のカイ二乗解析を使用して決定された。ノイズを上回るシグナルについての試験のストリンジェンシーを最大にするために、標本中の野生型リードに対するバリアントリードの割合が、それぞれの標本と混合したＩＳにおける同一の部位での野生型リードに対するバリアントリードの割合よりも有意に高く、また、他の１８の標本の各々と混合したＩＳにおいて見られる割合よりも高い場合に、バリアントがコールされた。したがって、標本中の各バリアントは、標本中での野生型リードに対するバリアントリードの割合が１９のＩＳ反復の各々よりも有意に高い場合にのみ、真陽性（ｐ＜０．０５）であるとみなされた。偽検出（ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）についてのボンフェローニ補正を、見積もられたヌクレオチドの数（７６０ｂｐ）および各ヌクレオチド位置で考えられる置換突然変異の数に基づいて使用した。さらに、確率論的サンプリングからの潜在的な解析の変動を避けるために、ＩＳノイズを上回る有意なシグナルを有し、かつＶＡＦが＞０．０５％の突然変異のみがコールされた。
[00162]バリアントコーリング
[00163]バリアントが、各々それぞれの位置のそれぞれの突然変異タイプについて、ＩＳで測定されたバックグラウンドエラーを有意に上回るＮＴシグナルに基づいてコールされた。有意性は、プールされたサンプル中の稀なバリアントを同定するために、各ヌクレオチド位置でのそれぞれの個々のバリアントタイプの分割表のカイ二乗解析を使用して決定された。ノイズを上回るシグナルについての試験のストリンジェンシーを最大にするために、標本中の野生型リードに対するバリアントリードの割合が、それぞれの標本と混合したＩＳにおける同一の部位での野生型リードに対するバリアントリードの割合よりも有意に高く、また、他の１８の標本の各々と混合したＩＳにおいて見られる割合よりも高い場合に、バリアントがコールされた。したがって、標本中の各バリアントは、標本中での野生型リードに対するバリアントリードの割合が１９のＩＳ反復の各々よりも有意に高い場合にのみ、真陽性（ｐ＜０．０５）であるとみなされた。偽検出（ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）についてのボンフェローニ補正を、見積もられたヌクレオチドの数（７６０ｂｐ）および各ヌクレオチド位置で考えられる置換突然変異の数に基づいて使用した。さらに、確率論的サンプリングからの潜在的な解析の変動を避けるために、ＩＳノイズを上回る有意なシグナルを有し、かつＶＡＦが＞０．０５％の突然変異のみがコールされた。
【0101】
バリアントアノテーションおよびホットスポット解析
[00164]ｄｂＳＮＰ、ＣＯＳＭＩＣ、およびＦＡＳＭＩＣを含む、公開されているデータベースを使用して、コールされたバリアントを病原性について特徴付けした。Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｎ Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ（ＭＳＫ）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒで開発されたｃＢｉｏＰｏｒｔａｌ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓを使用して、既知の発がん性ホットスポットの同定および対応する図の作製を評価した。
[00164]ｄｂＳＮＰ、ＣＯＳＭＩＣ、およびＦＡＳＭＩＣを含む、公開されているデータベースを使用して、コールされたバリアントを病原性について特徴付けした。Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｎ Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ（ＭＳＫ）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒで開発されたｃＢｉｏＰｏｒｔａｌ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓを使用して、既知の発がん性ホットスポットの同定および対応する図の作製を評価した。
【0102】
統計解析
[00165]各ヌクレオチド位置でのそれぞれの個々のバリアントタイプの分割表のカイ二乗解析に基づくバリアントのコールを、Ｒ：Ａ Ｌａｎｇｕａｇｅ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ（ｗｗｗ．Ｒ－ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／）を使用して行った。バリアントが多くコールされたホットスポットの評価を、カイ二乗分布を使用するクラスカル・ウォリス検定を使用して行った。突然変異および標的のタイプに基づく突然変異出現率を、複数の比較のために、クラスカル・ウォリス検定とネメニー検定とを用いて評価した。
[00165]各ヌクレオチド位置でのそれぞれの個々のバリアントタイプの分割表のカイ二乗解析に基づくバリアントのコールを、Ｒ：Ａ Ｌａｎｇｕａｇｅ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ（ｗｗｗ．Ｒ－ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／）を使用して行った。バリアントが多くコールされたホットスポットの評価を、カイ二乗分布を使用するクラスカル・ウォリス検定を使用して行った。突然変異および標的のタイプに基づく突然変異出現率を、複数の比較のために、クラスカル・ウォリス検定とネメニー検定とを用いて評価した。
【0103】
結果
非がん気道上皮における低頻度突然変異の測定
[00166]１９の対象の正常な気道から得たＡＥＣ標本における１１のドライバー遺伝子標的領域のこの研究において、ＶＡＦの範囲が５×１０－４（０．０５％）から４．６×１０－３（０．４６％）の１２９のバリアントがコールされた。方法の節において記載されているように、確率論的サンプリングに起因する偽検出のリスクを最小化するために、ＶＡＦの最小閾値０．０５％を使用した。１２９のコールされたバリアントでの、同一部位でのそれぞれのバリアントについてのサンプル突然変異シグナル（突然変異ＶＡＦ）とバックグラウンドの技術的エラー（ノイズ）（ＩＳ ＶＡＦ）との間の関係を、図１Ａに示す。
非がん気道上皮における低頻度突然変異の測定
[00166]１９の対象の正常な気道から得たＡＥＣ標本における１１のドライバー遺伝子標的領域のこの研究において、ＶＡＦの範囲が５×１０－４（０．０５％）から４．６×１０－３（０．４６％）の１２９のバリアントがコールされた。方法の節において記載されているように、確率論的サンプリングに起因する偽検出のリスクを最小化するために、ＶＡＦの最小閾値０．０５％を使用した。１２９のコールされたバリアントでの、同一部位でのそれぞれのバリアントについてのサンプル突然変異シグナル（突然変異ＶＡＦ）とバックグラウンドの技術的エラー（ノイズ）（ＩＳ ＶＡＦ）との間の関係を、図１Ａに示す。
【0104】
[00167]各サンプル突然変異ＶＡＦでは、１９のＩＳについてＩＳ ＶＡＦが示されている。これらは、突然変異を有していたサンプルと混合したＩＳでのＶＡＦ、および他の１８のサンプルと混合したＩＳの各々についてのＶＡＦを表している。これらの１９の独立したＩＳ反復の値は、実験内のＩＳ ＶＡＦ（エラー）測定値の周辺での変動を示す。ＩＳ ＶＡＦ値における反復間の変動はＩＳ ＶＡＦの減少と共に増大し、これは、確率論的サンプリングに対するポアソン分布の効果と一致している。
【0105】
[00168]さらに、これらの部位の一部では技術的エラーが非常に低いことに起因して、ＩＳ ＶＡＦ値は存在しなかった（図１Ａ）。
[00169]ポアソン分布のこれらの効果は、観察されたサンプル突然変異の有意性の統計解析の課題である。サンプルのリファレンスおよびバリアントアレルならびにＩＳのリファレンスおよびバリアント（エラー）アレルという全部で４つの成分について少なくとも１０のシーケンシングリードが存在する場合、簡単なＺスコア解析が適切である。０．０５％という最小のサンプル突然変異ＶＡＦを使用すると、各々のコールされたサンプル突然変異について少なくとも１０のバリアントアレルリードが確実となった。しかし、対応するＩＳエラーが非常に低い場合は、ＩＳバリアントアレルリード数は１０を下回り、場合によってはゼロであった。
[00169]ポアソン分布のこれらの効果は、観察されたサンプル突然変異の有意性の統計解析の課題である。サンプルのリファレンスおよびバリアントアレルならびにＩＳのリファレンスおよびバリアント（エラー）アレルという全部で４つの成分について少なくとも１０のシーケンシングリードが存在する場合、簡単なＺスコア解析が適切である。０．０５％という最小のサンプル突然変異ＶＡＦを使用すると、各々のコールされたサンプル突然変異について少なくとも１０のバリアントアレルリードが確実となった。しかし、対応するＩＳエラーが非常に低い場合は、ＩＳバリアントアレルリード数は１０を下回り、場合によってはゼロであった。
【0106】
[00170]各ＩＳ反復について少なくとも１つのバリアントアレルリードがあった場合、ポアソンの直接検定の使用が適している。この研究において、標的ホットスポット領域内のＩＳエラーが非常に低く、そのため、一部の測定では、観察されたサンプルバリアントに対応するＩＳバリアントリードがゼロであったため、ディープシーケンシングを利用した場合でも、この研究における各サンプル突然変異の有意性を決定するために分割表アプローチを使用することが有利であった。
【0107】
[00171]図１Ｂは、ＶＡＦ（％）検出の検出下限に依存する、ＡＥＣにおいて検出可能なＴＰ５３突然変異を示す。
[00172]気道上皮細胞において測定された肺がんリスクについてのＴＰ５３突然変異検査が、その試みにもかかわらずこれまでに開発されなかった重要な理由は、一般的に使用される方法がＶＡＦ＜１％の突然変異を容易に測定できないためである。
[00172]気道上皮細胞において測定された肺がんリスクについてのＴＰ５３突然変異検査が、その試みにもかかわらずこれまでに開発されなかった重要な理由は、一般的に使用される方法がＶＡＦ＜１％の突然変異を容易に測定できないためである。
【0108】
標的領域におけるシーケンシングエラーの特徴
[00173]図１Ａに示すように、サンプルバリアントをコールする標的領域内部位での最大シーケンシングエラー（反復間でのＩＳ ＶＡＦの中央値）は、０．０６％であった。このエラー率は、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームでの全エキソームシーケンシングで見られたものよりもはるかに低い。加えて、他者によって報告されているように、これは、コストを伴い計算が必要な固有分子インデックス（ＵＭＩ）を利用する方法を必要とせずに低頻度バリアントの有意義なコーリングを可能にする重要な因子である。
[00173]図１Ａに示すように、サンプルバリアントをコールする標的領域内部位での最大シーケンシングエラー（反復間でのＩＳ ＶＡＦの中央値）は、０．０６％であった。このエラー率は、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームでの全エキソームシーケンシングで見られたものよりもはるかに低い。加えて、他者によって報告されているように、これは、コストを伴い計算が必要な固有分子インデックス（ＵＭＩ）を利用する方法を必要とせずに低頻度バリアントの有意義なコーリングを可能にする重要な因子である。
【0109】
ＡＥＣにおける低頻度突然変異の出現率
[00174]突然変異出現率を、各標的で見積もられたヌクレオチド位置当たりのコールされた突然変異として計算した。各標的で見積もられたヌクレオチドの数は、プライマーがスパンする領域と、ＮＴリードからのＩＳリードの分離を可能にするためのＩＳ内の修飾に起因して解析からブロックされたジヌクレオチド部位の数とにある程度基づいて変化した。１９の対象全ての間で、各対象における標的ＤＮＡ領域（７６０ｂｐ）にわたる平均突然変異出現率（突然変異／ｂｐ／対象）は、８．９×１０－３であった。（表２）。
[00174]突然変異出現率を、各標的で見積もられたヌクレオチド位置当たりのコールされた突然変異として計算した。各標的で見積もられたヌクレオチドの数は、プライマーがスパンする領域と、ＮＴリードからのＩＳリードの分離を可能にするためのＩＳ内の修飾に起因して解析からブロックされたジヌクレオチド部位の数とにある程度基づいて変化した。１９の対象全ての間で、各対象における標的ＤＮＡ領域（７６０ｂｐ）にわたる平均突然変異出現率（突然変異／ｂｐ／対象）は、８．９×１０－３であった。（表２）。
【0110】
【表2】
【0111】
[00175]このＡＥＣの突然変異出現率の値は、比較的高いバリアント頻度（ＶＡＦ＞１％）の突然変異体を検出するだけの方法（１４）、またはより感度が高いが標的化されていない方法で報告されているものよりもはるかに高い。しかし、これは、非常に感度の高いＰＣＲベースの方法を使用する他のＡＥＣ解析に一致している。
【0112】
ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、およびＢＲＡＦにおける低頻度置換突然変異と肺がんとの関連
[00176]ＴＰ５３の３つの測定されたエキソンの間で、置換突然変異の出現率（突然変異／ｂｐ／対象）は、ＣＡ－ＳＭＫ対象に由来するＡＥＣにおいて、喫煙および年齢について適合させたＮＣ－ＳＭＫ対象と比較して１０．４倍高かった（ｐ＜０．０５）（図２Ａ、表３）。
[00176]ＴＰ５３の３つの測定されたエキソンの間で、置換突然変異の出現率（突然変異／ｂｐ／対象）は、ＣＡ－ＳＭＫ対象に由来するＡＥＣにおいて、喫煙および年齢について適合させたＮＣ－ＳＭＫ対象と比較して１０．４倍高かった（ｐ＜０．０５）（図２Ａ、表３）。
【0113】
【表3】
【0114】
[00177]加えて、ＰＩＫ３ＣＡまたはＢＲＡＦ突然変異は、７人のがん対象で見られ、非がん対象では見られなかった（表３）。
[00178]特に、ＴＰ５３における突然変異の大部分（図２Ｃ）、ＰＩＫ３ＣＡにおける突然変異の全て、およびＢＲＡＦにおける３つの突然変異のうちの１つは、発がんを進める生物学的変化を伴って、これまでに同定された「ホットスポット」で生じた。
[00178]特に、ＴＰ５３における突然変異の大部分（図２Ｃ）、ＰＩＫ３ＣＡにおける突然変異の全て、およびＢＲＡＦにおける３つの突然変異のうちの１つは、発がんを進める生物学的変化を伴って、これまでに同定された「ホットスポット」で生じた。
【0115】
[00179]肺がんリスクの決定の向上に寄与し得るバイオマーカーを開発するという目的のために、本発明らは、これらの低頻度突然変異の出現率における対象特異的なコホート間の差を評価した。この小さなレトロスペクティブなケースコントロール研究で得られたデータに基づいて、０．０２突然変異／ｂｐのＴＰ５３エキソン突然変異出現率カットオフは、１００％の特異性および５５％の感度を有する（図３Ａ）。ＴＰ５３エキソン突然変異がＰＩＫ３ＣＡおよびＢＲＡＦ突然変異と組み合わされた場合、類似の区別が観察された（図３Ｂ）。
【0116】
[00180]ＣＡ－ＳＭＫ対象におけるほぼ全てのＴＰ５３突然変異は、タバコシグネチャー突然変異または加齢性の突然変異（Ｃ＞Ａ、Ｃ＞Ｔ、およびＴ＞Ｃの置換）であり（図２Ｂ、表４）、肺がん組織で報告されたＴＰ５３突然変異のスペクトルとほぼ同様である。Ｃ＞Ａ（ｐ＝０．００２）、Ｃ＞Ｔ（ｐ＝０．００３）、およびＴ＞Ｃ（ｐ＝０．００１）を含む、各タイプのタバコシグネチャーまたは年齢シグネチャーＴＰ５３突然変異の出現率は、非がん対象よりもがん対象で有意に高かった（表４）。
【0117】
[00181]例えば、ＣからＡの突然変異は、ＣＡ－ＳＭＫ対象に由来するＡＥＣにおいて見られたＴＰ５３突然変異の２９．８％（１７／５７）を占めていたが、全ての非がん対象（ＮＣ－ＴＯＴ）で見られたＣからＡのＴＰ５３突然変異は１つのみであった（表４）。Ｃ＞Ｔのトランジションは、この研究の肺がん対象におけるＴＰ５３突然変異の４７％を占めていた。さらに、ＣＡ－ＳＭＫ対象におけるＴＰ５３突然変異は、「ホットスポット」肺がんドライバー突然変異部位で有意に多かった（ｐ＝０．００２）（図２Ｃ）。
【0118】
【表4】
【0119】
ＴＰ５３突然変異と喫煙歴との関連の欠如
[00183]特に、非がん対象の間で、喫煙はより高いＴＰ５３突然変異出現率と関連していなかった（表３）。具体的には、ＮＣ－ＳＭＫ対象の半数のみが、ＶＡＦ＞０．０５％のＴＰ５３突然変異を有しており、各ケースで、１つのバリアントのみが観察された（表３）。ＰＩＫ３ＣＡおよびＢＲＡＦ突然変異の数は小さいため、喫煙の関連について取り組むことはできなかった。
[00183]特に、非がん対象の間で、喫煙はより高いＴＰ５３突然変異出現率と関連していなかった（表３）。具体的には、ＮＣ－ＳＭＫ対象の半数のみが、ＶＡＦ＞０．０５％のＴＰ５３突然変異を有しており、各ケースで、１つのバリアントのみが観察された（表３）。ＰＩＫ３ＣＡおよびＢＲＡＦ突然変異の数は小さいため、喫煙の関連について取り組むことはできなかった。
【0120】
肺がんと関連しない低頻度ＡＥＣ突然変異の特徴
[00184]ＴＰ５３とは対照的に、非ＴＰ５３標的で、がんにおける突然変異出現率は、非がん対象と比較して有意に異ならなかった（表３）。測定された１１の標的の間で、突然変異数はＥＧＦＲ＿２０標的領域で最も高く、全部で４３の突然変異が全対象で見られた（表３）。がんと非がんとの間でＥＧＦＲ＿２０突然変異の出現率に差はなく（それぞれ３．９×１０－２と３．８×１０－２、ｐ＝０．７２）（図４Ａ、表３）、喫煙と非喫煙との間で関連はなかった（それぞれ３．４×１０－２と４．５×１０－２、ｐ＝０．７４）。ＥＲＢＢ２突然変異（Ｎ＝１７）はＥＧＦＲ＿２０のスペクトルと類似のスペクトルを示し、年齢シグネチャーまたはタバコシグネチャー突然変異パターンはなく、コホート間の差もなかった。特に、ＴＰ５３の間でＣ＞Ｔトランジションの割合が大きい（２９／６１、４８％）こととは対照的に、わずか１／４３（２．３％）のＥＧＦＲ＿２０突然変異および１つのＥＲＢＢ２突然変異がＣ＞Ｔであった（図３Ｂ）。さらに、ＥＧＦＲ＿２０突然変異の大部分は同義であり、病原性であるとは予測されなかった（図３Ｃ）。
[00184]ＴＰ５３とは対照的に、非ＴＰ５３標的で、がんにおける突然変異出現率は、非がん対象と比較して有意に異ならなかった（表３）。測定された１１の標的の間で、突然変異数はＥＧＦＲ＿２０標的領域で最も高く、全部で４３の突然変異が全対象で見られた（表３）。がんと非がんとの間でＥＧＦＲ＿２０突然変異の出現率に差はなく（それぞれ３．９×１０－２と３．８×１０－２、ｐ＝０．７２）（図４Ａ、表３）、喫煙と非喫煙との間で関連はなかった（それぞれ３．４×１０－２と４．５×１０－２、ｐ＝０．７４）。ＥＲＢＢ２突然変異（Ｎ＝１７）はＥＧＦＲ＿２０のスペクトルと類似のスペクトルを示し、年齢シグネチャーまたはタバコシグネチャー突然変異パターンはなく、コホート間の差もなかった。特に、ＴＰ５３の間でＣ＞Ｔトランジションの割合が大きい（２９／６１、４８％）こととは対照的に、わずか１／４３（２．３％）のＥＧＦＲ＿２０突然変異および１つのＥＲＢＢ２突然変異がＣ＞Ｔであった（図３Ｂ）。さらに、ＥＧＦＲ＿２０突然変異の大部分は同義であり、病原性であるとは予測されなかった（図３Ｃ）。
【0121】
考察
ＡＥＣにおける低頻度突然変異の測定
[00185]この研究でのＡＥＣにおける低頻度突然変異を測定する能力は、標的領域における少ない技術的エラーの組み合わせ（図１）、ならびに部位特異的およびバリアント特異的ベーシスで技術的エラーについてコントロールするための合成内部標準の使用によるものであった（図１）。この研究における対象の間でのＡＥＣにおける低頻度ＴＰ５３突然変異の出現率の範囲は、これまでに報告されていたものと類似していた。ドライバー突然変異部位におけるＴＰ５３突然変異、およびタバコ煙シグネチャーが多いことで、観察された突然変異が真陽性であることが確認される別の理由が提供される。
ＡＥＣにおける低頻度突然変異の測定
[00185]この研究でのＡＥＣにおける低頻度突然変異を測定する能力は、標的領域における少ない技術的エラーの組み合わせ（図１）、ならびに部位特異的およびバリアント特異的ベーシスで技術的エラーについてコントロールするための合成内部標準の使用によるものであった（図１）。この研究における対象の間でのＡＥＣにおける低頻度ＴＰ５３突然変異の出現率の範囲は、これまでに報告されていたものと類似していた。ドライバー突然変異部位におけるＴＰ５３突然変異、およびタバコ煙シグネチャーが多いことで、観察された突然変異が真陽性であることが確認される別の理由が提供される。
【0122】
肺がんリスクと関連するＴＰ５３突然変異フィールド効果の同定
[00186]喫煙および年齢について適合させたＮＣ対象と比較して、ＣＡ対象のＡＥＣにおいて、ＴＰ５３ホットスポットの病原性のタバコ煙シグネチャーおよび年齢シグネチャー低頻度突然変異の出現率が高いことは、損傷フィールドが肺がんリスクと強力に関連していることを表す（図２Ａ、図２Ｂ、図３Ａ、表３、表４）。
[00186]喫煙および年齢について適合させたＮＣ対象と比較して、ＣＡ対象のＡＥＣにおいて、ＴＰ５３ホットスポットの病原性のタバコ煙シグネチャーおよび年齢シグネチャー低頻度突然変異の出現率が高いことは、損傷フィールドが肺がんリスクと強力に関連していることを表す（図２Ａ、図２Ｂ、図３Ａ、表３、表４）。
【0123】
[00187]したがって、低頻度（すなわちＶＡＦ＜１％）の結果は、ＡＥＣにおけるＴＰ５３ホットスポット突然変異が肺がんリスクバイオマーカーであることを示す。さらに、ＢＲＡＦおよびＰＩＫ３ＣＡに低頻度の機能可能な突然変異を含めることは、このバイオマーカーの精度をさらに増強させ得る（図３Ｂ）。
【0124】
[00188]肺がん傾向は、一部には、喫煙に関連するおよび加齢性のＤＮＡ複製エラーに伴うＤＮＡ損傷からの最適ではない保護に起因する。ＤＮＡ損傷からの最適ではないＡＥＣ保護の遺伝的原因および後天的原因の両方について、エビデンスがある。例えば、重要なＤＮＡ修復の調節、抗酸化物質、およびＡＥＣにおける細胞サイクル制御遺伝子において大きな個体間の変動があり、この変動に基づく肺がんリスク検査（ＬＣＲＴ）は、肺がん対象を同定するための高い精度を有する。
【0125】
[00189]ＬＣＲＴバイオマーカーにおける変数の１つは、ＴＰ５３転写産物の量であり、ＡＥＣにおけるＴＰ５３発現には１００倍の変動がある。ＴＰ５３は、ＤＮＡ損傷に応答したＤＮＡ修復遺伝子の上方調節において重要な役割を有し、ＴＰ５３タンパク質は、ＡＥＣにおける重要なヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）遺伝子であるＥＲＣＣ５を直接調節する。
【0126】
[00190]ＥＲＣＣ５の５’調節領域におけるＴＰ５３認識部位であるｒｓ２２９６１４７での生殖細胞系アレル変異は、ＡＥＣにおけるＥＲＣＣ５のアレル特異的な発現における変動と関連する。ＴＰ５３によるＥＲＣＣ５転写調節における遺伝性の個体間変動は大きく、その理由は、ＥＲＣＣ５が転写共役ＮＥＲにおける律速酵素であり、タバコ煙に関連する突然変異が、転写される鎖上のグアニンの環外Ｎ２位置への煙草煙発がん物質代謝産物の結合によって生じるＤＮＡ付加体の非効率的なＮＥＲの結果生じるためである。
【0127】
[00191]したがって、遺伝性の生殖細胞系バリアントによって決定される、ＴＰ５３による最適ではないＥＲＣＣ５調節は、がん対象の間で、転写されるＴＰ５３鎖における、タバコ煙によって誘導されるホットスポット突然変異のより高い出現率に関与する、重要な因子である。
【0128】
非病原性ＥＧＦＲ突然変異の解釈
[00192]ＥＧＦＲの総突然変異、または煙草シグネチャーもしくは年齢シグネチャー突然変異について、がん対象と非がん対象との間または喫煙者と非喫煙者と間で出現率に差はなかった（図４Ａ、図４Ｂ、表２、表３）。置換パターン（Ｃ＞ＡとＣ＞Ｇとの間で等しく分布している）は、最適ではない相同組換えＤＮＡ二本鎖切断修復に関連する先に記載されたシグネチャー３と最も一致している。加えて、本明細書において提示されるエビデンスは、観察されたＥＧＦＲエキソン２０の突然変異が成長優位性を与えないという結論をサポートする。
[00192]ＥＧＦＲの総突然変異、または煙草シグネチャーもしくは年齢シグネチャー突然変異について、がん対象と非がん対象との間または喫煙者と非喫煙者と間で出現率に差はなかった（図４Ａ、図４Ｂ、表２、表３）。置換パターン（Ｃ＞ＡとＣ＞Ｇとの間で等しく分布している）は、最適ではない相同組換えＤＮＡ二本鎖切断修復に関連する先に記載されたシグネチャー３と最も一致している。加えて、本明細書において提示されるエビデンスは、観察されたＥＧＦＲエキソン２０の突然変異が成長優位性を与えないという結論をサポートする。
【0129】
[00193]具体的には、観察された、ＴＰ５３の煙に関連するおよび加齢性の非同義の病原性突然変異とは対照的に、わずか１／４３のＥＧＦＲ＿２０突然変異が同義であり、既知の病原性ホットスポットに存在している（図４Ｃ）。
【0130】
[00194]したがって、このタイプの突然変異を有するクローン集団は、胎児～若年の期間の気道上皮を生成するための幹細胞増殖において、確率論的ＤＮＡ複製エラーとして生じる可能性が高いと考えられる。
【0131】
[00195]５×１０－５（０．００５％）と低いＶＡＦを検出し得る感度が非常に高いミスマッチＰＣＲアッセイを使用して、ＴＰ５３、ＫＲＡＳ、およびＨＰＲＴ１遺伝子における突然変異を含む、非がん患者のＡＥＣにおける低ＶＡＦ体細胞突然変異の出現率に対する煙草の影響について試験した。驚くべきことに、これらの非がん対象の間で、ＡＥＣにおけるＴＰ５３またはＫＲＡＳ突然変異の出現率に対する喫煙の影響はなかった。
【0132】
[00196]したがって、喫煙者および非喫煙者の両方の肺がんを有さない個体において、気道上皮におけるほとんどの低頻度突然変異は、胎児／新生児期の組織発生の際に生じる細胞複製に関連する確率論的突然変異事象の結果であると考えられる。
【0133】
標的化学的予防のためのバイオマーカー
[00197]現在、肺がんに関連するＴＰ５３突然変異のための標的療法は存在していない。しかし、肺がんに関連するＰＩＫ３ＣＡまたはＢＲＡＦホットスポットでの突然変異は、１１人の肺がん対象のうちの６人のＡＥＣで検出され、非がん対象では検出されなかった（表３）。この研究における各対象で、ＤＮＡをおよそ５０万のＡＥＣから抽出し、ＰＩＫ３ＣＡまたはＢＲＡＦ突然変異が陽性の６人の対象の各々で、突然変異ＶＡＦの平均は約１０－３であった。したがって、両肺の気管支樹全体で５×１０８ＡＥＣという以前の推定を使用して、クローンが類似の出現率で等しく分布していれば、対象当たり１０００のコロニーにおいて全部で１０５の突然変異があると予想される。ＰＩＫ３ＣＡおよびＢＲＡＦのための比較的無毒の遺伝子標的療法は、ＦＤＡによって承認されているか、または一部のがんでは治験が進んでいる。例えば、アルペリシブは現在、肺および他の組織のがんにおけるＰＩＫ３ＣＡドライバー突然変異の処置のための第ＩＩＩ相治験中であり、また、ダブラフェニブおよびトラメチニブの組み合わせは、ＢＲＡＦ：Ｖ６００Ｅ突然変異型の非小細胞肺がんの処置において明らかな有効性を有する。
[00197]現在、肺がんに関連するＴＰ５３突然変異のための標的療法は存在していない。しかし、肺がんに関連するＰＩＫ３ＣＡまたはＢＲＡＦホットスポットでの突然変異は、１１人の肺がん対象のうちの６人のＡＥＣで検出され、非がん対象では検出されなかった（表３）。この研究における各対象で、ＤＮＡをおよそ５０万のＡＥＣから抽出し、ＰＩＫ３ＣＡまたはＢＲＡＦ突然変異が陽性の６人の対象の各々で、突然変異ＶＡＦの平均は約１０－３であった。したがって、両肺の気管支樹全体で５×１０８ＡＥＣという以前の推定を使用して、クローンが類似の出現率で等しく分布していれば、対象当たり１０００のコロニーにおいて全部で１０５の突然変異があると予想される。ＰＩＫ３ＣＡおよびＢＲＡＦのための比較的無毒の遺伝子標的療法は、ＦＤＡによって承認されているか、または一部のがんでは治験が進んでいる。例えば、アルペリシブは現在、肺および他の組織のがんにおけるＰＩＫ３ＣＡドライバー突然変異の処置のための第ＩＩＩ相治験中であり、また、ダブラフェニブおよびトラメチニブの組み合わせは、ＢＲＡＦ：Ｖ６００Ｅ突然変異型の非小細胞肺がんの処置において明らかな有効性を有する。
【0134】
[00198]したがって、本明細書に記載される、ＡＥＣにおけるＰＩＫ３ＣＡ／ＢＲＡＦの出現率の検査は、ＡＥＣ突然変異スペクトルががんを有する対象の肺がん処置の前および後に測定される場合に有用である。したがって、忍容性が良好な遺伝子標的療法は、ＡＥＣ野の、肺がんの発生に関与する損傷突然変異量を低減させ得る。そのため、ＡＥＣにおけるＰＩＫ３ＣＡ／ＢＲＡＦ突然変異の出現率が上昇した個体は、化学的予防の治験に考慮され得る。
【0135】
ヌクレオチド部位特異的およびバリアント特異的エラーの特徴付けのための内部標準の使用、ならびにがんドライバー突然変異の標的ＮＧＳ解析におけるコントロール
[00199]図１に示すように、この研究でスパンされる標的ドライバー遺伝子領域について、対応する真陽性サンプルバリアントについてＩＳで測定された技術的エラーＶＡＦの中央値は、０．０１４％であった。このエラー率は、標的ＮＧＳをＩｌｌｕｍｉｎａプラットフォームで利用してがんドライバー遺伝子のホットスポット領域を見積もった他の研究から報告されたものに類似している。
[00199]図１に示すように、この研究でスパンされる標的ドライバー遺伝子領域について、対応する真陽性サンプルバリアントについてＩＳで測定された技術的エラーＶＡＦの中央値は、０．０１４％であった。このエラー率は、標的ＮＧＳをＩｌｌｕｍｉｎａプラットフォームで利用してがんドライバー遺伝子のホットスポット領域を見積もった他の研究から報告されたものに類似している。
【0136】
[00200]本明細書において記載されるアプローチの重要な利点は、参照配列が確認された合成内部標準を各ライブラリーサンプル調製物に含めることで、各ライブラリーにおける各ヌクレオチド部位での各バリアントの技術的エラーの定性的および定量的特徴付けが可能となることである。このアプローチは、ＮＧＳを利用するものを含む全ての診断用途に望ましい、各測定における各々の検出されたバリアントについての、バックグラウンドエラーと比較した有意性の決定を可能にした。
【0137】
[00201]標的ＮＧＳの診断法のための本明細書において記載される合成ＩＳの使用は、液体およびガスクロマトグラフィーならびに質量解析診断用途において現在標準となっているＩＳの利用に類似している。
【0138】
[00202]したがって、エラーコントロールのための本明細書において提示される、コストが低くあまり複雑ではないアプローチの使用は、ドライバー遺伝子領域におけるＶＡＦ＞０．０５％の体細胞突然変異の解析に非常に適している。ＮＧＳ解析に利用可能な臨床的標本のサイズの実際の限界を理由に、突然変異ＶＡＦの、標本によって決定される下限は、＞０．０５％であると考えることが妥当である。
【0139】
適用の非限定的な例
[00203]一部の実施形態において、生物学的状態を示す数値的指標を得るための方法は、第１の生物学的状態および第２の生物学的状態の各々に対応する２つのサンプルを提供するステップ、２つのサンプルの各々における２つの核酸の各々の量を測定および／または計数するステップ、当該量を、多くのサンプル間で直接比較可能な数値として提供するステップ、第１および第２の生物学的状態の各々に対応する数値を数学的に計算するステップ、ならびに２つの生物学的状態を区別する数学的計算を決定するステップを含む。本明細書において使用される第１および第２の生物学的状態は、区別対象の２つの表現型状態などの、比較対象の２つの生物学的状態に対応する。非限定的な例としては、例えば、非疾患（正常）組織と疾患組織、治療薬応答を示す培養物と治療薬応答をあまり示さない培養物、有害薬剤応答を示す対象と有害応答をあまり示さない対象、処置対象群と非処置対象群などが含まれる。
[00203]一部の実施形態において、生物学的状態を示す数値的指標を得るための方法は、第１の生物学的状態および第２の生物学的状態の各々に対応する２つのサンプルを提供するステップ、２つのサンプルの各々における２つの核酸の各々の量を測定および／または計数するステップ、当該量を、多くのサンプル間で直接比較可能な数値として提供するステップ、第１および第２の生物学的状態の各々に対応する数値を数学的に計算するステップ、ならびに２つの生物学的状態を区別する数学的計算を決定するステップを含む。本明細書において使用される第１および第２の生物学的状態は、区別対象の２つの表現型状態などの、比較対象の２つの生物学的状態に対応する。非限定的な例としては、例えば、非疾患（正常）組織と疾患組織、治療薬応答を示す培養物と治療薬応答をあまり示さない培養物、有害薬剤応答を示す対象と有害応答をあまり示さない対象、処置対象群と非処置対象群などが含まれる。
【0140】
[00204]本明細書において使用される「生物学的状態」は、表現型状態、例えば、臨床的に関連する表現型または目的の他の代謝状態を指し得る。生物学的状態としては、例えば、疾患表現型、疾患状態または非疾患状態への傾向、治療薬応答またはこのような応答への傾向、有害薬剤応答（例えば薬剤毒性）またはこのような応答への傾向、薬剤への耐性またはこのような耐性を示す傾向などが含まれ得る。好ましい実施形態において、得られた数値的指標は、例えば目的の表現型と相関させることによって、バイオマーカーとして機能し得る。一部の実施形態において、薬剤は、抗腫瘍薬であり得る。ある特定の実施形態において、本明細書において記載される方法の使用は、個別化医療を提供し得る。
【0141】
[00205]ある特定の実施形態において、生物学的状態は、遺伝子の正常な発現レベルに対応する。生物学的状態が正常レベルに対応していない場合、例えば、所望の範囲の外側にある場合には、異常な状態、例えば疾患状態が示され得る。
【0142】
[00206]特定の生物学的状態、例えば疾患状態または代謝状態を区別する数値的指標は、それに関連する所与の１つおよび／または複数の状態についてのバイオマーカーとして使用され得る。
【0143】
[00207]一部の実施形態において、測定対象の核酸の１つまたは複数は、生物学的状態の１つと、他のものよりも格段に関連している。例えば、一部の実施形態において、評価対象の核酸の１つまたは複数は、第１の生物学的状態と関連しており、第２の生物学的状態とは関連していない。
【0144】
[00208]核酸は、核酸が特定の生物学的状態と正にまたは負に関連している場合、当該生物学的状態と「関連している」と言われ得る。例えば、核酸は、第２の生物学的状態よりも第１の生物学的状態で大量に存在する場合、第１の生物学的状態と「正に関連している」と言われ得る。例として、非がん細胞よりもがん細胞で多く発現している遺伝子は、がんと正に関連していると言われ得る。その一方で、第２の生物学的状態よりも第１の生物学的状態において少量で存在している核酸は、第１の生物学的状態と負に関連していると言われ得る。
【0145】
[00209]測定および／または計数対象の核酸は、特定の表現型と関連する遺伝子に対応し得る。核酸の配列は、遺伝子の転写領域、発現領域、および／または調節領域（例えば、転写因子、例えば共調節のための転写因子の調節領域）に対応し得る。
【0146】
[00210]一部の実施形態において、３つ以上の遺伝子の発現量が測定され、生物学的状態を示す数値的指標を提供するために使用される。例えば、一部のケースでは、複数の遺伝子の発現パターンが、所与の表現型状態、例えば、臨床的に関連する表現型を特徴付けするために使用される。一部の実施形態において、少なくとも約５の遺伝子、少なくとも約１０の遺伝子、少なくとも約２０の遺伝子、少なくとも約５０の遺伝子、または少なくとも約７０の遺伝子の発現量が測定され得、生物学的状態を示す数値的指標を提供するために使用される。本発明の一部の実施形態において、約９０未満の遺伝子、約１００未満の遺伝子、約１２０未満の遺伝子、約１５０未満の遺伝子、または約２００未満の遺伝子の発現量が測定され得、生物学的状態を示す数値的指標を提供するために使用される。
【0147】
[00211]生物学的状態を示す数値的指標を提供するためにどの数学的計算を使用するかの決定は、例えば数学分野、統計分野、および／または計算分野などの分野において公知のあらゆる方法によって行われ得る。一部の実施形態において、数学的計算の決定は、ソフトウェアの使用を伴う。例えば、一部の実施形態において、機械学習ソフトウェアが使用され得る。
【0148】
[00212]数値の数学的計算は、数値を相互作用させるためのあらゆる方程式、操作、式、および／または規則、例えば、合計、差、積、商、ｌｏｇ累乗、および／または他の数学的計算の使用を指し得る。一部の実施形態において、数値的指標は、分子を分母で割ることによって計算され、分子は１つの核酸の量に対応し、分母は別の核酸の量に対応する。ある特定の実施形態において、分子は所与の生物学的状態と正に関連する遺伝子に対応し、分母は当該生物学的状態と負に関連する遺伝子に対応する。一部の実施形態において、生物学的状態と正に関連する評価対象の２つ以上の遺伝子および生物学的状態と負に関連する評価対象の２つ以上の遺伝子が使用され得る。例えば、一部の実施形態において、分子の正に関連する遺伝子についての数値および分母の同数の負に関連する遺伝子についての数値を含む数値的指標が誘導され得る。このような平衡の取れた数値的指標において、参照核酸の数値は相殺されている。一部の実施形態において、平衡の取れた数値は、参照核酸を提供する遺伝子の発現における変動の影響を中和し得る。一部の実施形態において、数値的指標は、一連の１つまたは複数の数学関数によって計算される。
【0149】
[00213]一部の実施形態において、３つ以上の生物学的状態が比較され得、例えば区別され得る。例えば、一部の実施形態において、サンプルは、異なる疾患進行段階、例えば異なるがん段階に例えば対応する、様々な生物学的状態から提供され得る。異なるがん段階の細胞は、例えば、疾患の経過の様々な時点で所与の患者から得られる、非がん性細胞と、非転移性のがん性細胞と、転移性細胞とを含む。好ましい実施形態において、どの化学療法物質が例えば特定の患者における所与のタイプのがんに最もよく機能し得るかを予測するために、バイオマーカーが開発され得る。
【0150】
[00214]非がん性細胞は、非がん患者、例えば、血縁者にがん患者がいるまたはいない非がん患者に由来する、血腫および／または瘢痕組織の細胞ならびに形態学的に正常な実質を含み得る。非がん性細胞はまた、がん患者に由来する、例えば、同一組織および／もしくは同一器官内のがんの部位に近い部位に由来する；例えば同一器官系の異なる組織および／もしくは器官内のがんの部位からさらに離れた部位に由来する；または、例えば異なる器官および／もしくは異なる器官系における、さらに離れた部位に由来する、形態学的に正常な実質も含み得る。
【0151】
[00215]得られた数値的指標は、データベースとして提供され得る。数値的指標および／またはそのデータベースは、診断において、例えば臨床検査の開発および適用において使用され得る。
【0152】
診断用途
[00216]一部の実施形態において、生物学的状態を同定する方法が提供される。一部の実施形態において、本方法は、サンプル中の２つの核酸の各々の量を測定および／または計数するステップ、当該量を数値として提供するステップ、ならびに、当該数値を使用して、生物学的状態を示す数値的指標を提供するステップを含む。
[00216]一部の実施形態において、生物学的状態を同定する方法が提供される。一部の実施形態において、本方法は、サンプル中の２つの核酸の各々の量を測定および／または計数するステップ、当該量を数値として提供するステップ、ならびに、当該数値を使用して、生物学的状態を示す数値的指標を提供するステップを含む。
【0153】
[00217]生物学的状態を示す数値的指標は、様々な実施形態に従って上記のように決定され得る。サンプルは、標本、例えば、処置対象の対象から回収された標本から得られ得る。対象は、例えば、病院、医療供給者のオフィス、クリニック、および／または他の医療および／またはヘルスリサーチ施設を含む、臨床環境にいる場合がある。サンプル中の目的の核酸の量はこうして、測定および／または計数され得る。
【0154】
[00218]ある特定の実施形態において、所定の数の遺伝子を評価する場合、この所定の数の遺伝子についての発現データは同時に得られ得る。ある特定の遺伝子の発現パターンをデータベースにおける発現パターンと比較することによって、この遺伝子発現パターンを有する腫瘍が応答する可能性が最も高い化学療法剤が決定され得る。
【0155】
[00219]一部の実施形態において、本方法は、突然変異した内因性遺伝子の存在下で外因性の正常遺伝子を定量するために使用され得る。欠失した領域をスパンするプライマーを使用して、トランスフェクトされた正常遺伝子および／または構成的に異常な遺伝子からの発現を選択的に増幅および定量することができる。
【0156】
[00220]一部の実施形態において、本明細書において記載される方法は、正常な発現レベルを決定して、例えば、正常遺伝子転写産物の発現レベルに対応する数値を提供するために使用され得る。このような実施形態は、評価対象の遺伝子の発現に少なくとも関する、正常な生物学的状態を示すために使用され得る。
【0157】
[00221]正常な発現レベルは、疾患、外傷、および／または他の細胞傷害に通常は関連しない条件下での、転写産物の発現レベルを指し得る。一部の実施形態において、正常な発現レベルは、数として、または好ましくは特定の遺伝子の正常な発現の範囲に対応する数値範囲、例えば、実験誤差の＋／－１パーセント以内として、提供され得る。サンプル中の所与の核酸、例えば特定の遺伝子に対応する核酸について得られた数値の比較は、例えば、本明細書において提供されるデータベース内のデータと比較することによって、確立された正常な数値と比較され得る。数値はサンプル中の核酸の分子数を示し得、この比較は、遺伝子が正常なレベル内で発現しているか否かを示し得る。
【0158】
[00222]一部の実施形態において、本方法は、第１のサンプル中の核酸量を見積もるステップ、および前記量を、多くの他のサンプル間で直接比較可能な数値として提供するステップを含む、生物学的状態を同定するために使用され得る。一部の実施形態において、数値は、無制限の数の他のサンプルと潜在的に直接比較可能である。サンプルは、異なる時点で、例えば、異なる日に、同一の実験室における同一のもしくは異なる実験で、および／または異なる実験室における異なる実験で、評価され得る。
【0159】
治療用途
[00223]一部の実施形態は、薬剤の開発を改善する方法を提供する。例えば、標準内部標準混合物、数値のデータベース、および／または数値的指標のデータベースの使用が、薬剤の開発を改善するために使用され得る。
[00223]一部の実施形態は、薬剤の開発を改善する方法を提供する。例えば、標準内部標準混合物、数値のデータベース、および／または数値的指標のデータベースの使用が、薬剤の開発を改善するために使用され得る。
【0160】
[00224]一部の実施形態において、候補薬剤の効果を決定するために、遺伝子発現の調整が、これらの段階の１つまたは複数で測定および／または計数される。例えば、候補薬剤（例えば、所与の段階で同定される）が生物学的実体に投与され得る。生物学的実体は、上記のような、核酸を有し得るあらゆる実体であり得、また、薬剤開発の段階に基づいて適切に選択され得る。例えば、最初の同定段階では、生物学的実体はインビトロ培養物であり得る。臨床治験の段階では、生物学的実体はヒト患者であり得る。
【0161】
[00225]遺伝子発現に対する候補薬剤の影響は、こうして、例えば本発明の様々な実施形態を使用して評価され得る。例えば、核酸サンプルは生物学的実体から回収され得、目的の核酸の量が測定および／または計数され得る。例えば、量は、数値および／または数値的指標として提供され得る。量は次いで、薬剤開発の異なる段階の当該核酸の別の量と、ならびに／またはデータベース内の数値および／もしくは指標と比較され得る。この比較は、薬剤開発のプロセスを１つまたは複数の手段で改変するための情報を提供し得る。
【0162】
[00226]薬剤開発のステップの改変は、好ましくは薬剤開発のための時間および／または費用を低減させるために、薬剤開発のプロセスにおいて１つまたは複数の変更を行うことを指し得る。例えば、改変は、臨床治験の層別化を含み得る。臨床治験の層別化は、例えば、臨床治験内の患者集団を分けること、ならびに／または、特定の個体が臨床治験に参加し得るか否かおよび／もしくはその後の臨床治験相まで継続され得るか否かを決定することを指し得る。例えば、患者は、本発明の様々な実施形態を使用して決定されるそれらの遺伝子構造の１つまたは複数の特徴に基づいて分けられ得る。例えば、例えば候補薬剤に対する応答の欠如に対応することが分かっているインビトロ培養物から前臨床段階で得られた数値を、考慮する。臨床治験段階で、同一または類似の数値を示す対象は、治験への参加から外され得る。薬剤開発のプロセスは、したがって改変されており、時間およびコストが削減される。
【0163】
キット
[00227]本明細書において記載される内部増幅コントロール（ＩＡＣ）／競合内部標準（ＩＳ）は、キットの形態に組み合わされ、提供され得る。一部の実施形態において、キットは、マルチプレックスＰＣＲおよび次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を含むＰＣＲを行うために必要なＩＡＣおよび試薬を提供する。ＩＡＣは、濃度が分かっている単一の濃縮された形態で提供され得るか、またはいくつかの既知の作用濃度の少なくとも１つまで溶液中に連続希釈され得る。
[00227]本明細書において記載される内部増幅コントロール（ＩＡＣ）／競合内部標準（ＩＳ）は、キットの形態に組み合わされ、提供され得る。一部の実施形態において、キットは、マルチプレックスＰＣＲおよび次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を含むＰＣＲを行うために必要なＩＡＣおよび試薬を提供する。ＩＡＣは、濃度が分かっている単一の濃縮された形態で提供され得るか、またはいくつかの既知の作用濃度の少なくとも１つまで溶液中に連続希釈され得る。
【0164】
[00228]キットは、本明細書において記載される１５０の同定された内因性標的のＩＳ、または本明細書において記載される２８のＥＲＣＣ（外部ＲＮＡコントロールコンソーシアム）標的のＩＳ、またはその両方を含み得る。
【0165】
[00229]これらＩＳは、ＩＳを最大数年間わたり安定なまま維持することを可能にする溶液中で提供され得る。
[00230]キットはまた、１５０の内因性標的のＩＳ、２８のＥＲＣＣ標的のＩＳ、およびこれらの対応するネイティブな標的を増幅するように特異的に設計されたプライマーも提供し得る。
[00230]キットはまた、１５０の内因性標的のＩＳ、２８のＥＲＣＣ標的のＩＳ、およびこれらの対応するネイティブな標的を増幅するように特異的に設計されたプライマーも提供し得る。
【0166】
[00231]キットはまた、限定はしないがｄＮＴＰ、反応バッファー、Ｔａｑポリメラーゼ、およびＲＮＡｓｅを含有しない水を含む、１つまたは複数の必要なＰＣＲ試薬で満たされた、１つまたは複数の容器を提供し得る。場合によって、このような容器には、ＩＡＣの製造、使用、または販売を管理する政府機関によって規定された形態の通知および関連する試薬が付随しており、この通知は、製造、使用、または販売の機関による、調査使用についての承認を反映している。
【0167】
[00232]キットは、キットに含まれるＩＳを使用してマルチプレックスＰＣＲおよびＮＧＳを含むＰＣＲを準備、実行、および解析するための適切な指示を含み得る。指示は、限定はしないが、印刷物、ビデオテープ、コンピュータ読み取り可能ディスク、または光学ディスクを含む、あらゆる適切なフォーマットのものであり得る。
【0168】
[00233]本明細書において言及される特許文献および非特許文献を含む全ての刊行物は、参照によって本明細書に明確に組み込まれる。本明細書において引用される文献のいずれかの引用は、これら文献のいずれかが関連先行技術であるということの承認を、意図するものではない。これらの文献の日付についての全ての言及または内容についての記載は、出願人が入手可能な情報に基づくものであり、これら文献の日付または内容の正確さについての承認を構成するものでは全くない。
【0169】
[00234]本発明を様々なおよび好ましい実施形態に関して記載してきたが、当業者なら、本発明の必須の範囲から逸脱することなく様々な変更が行われ得ることおよび均等物がその要素の代わりとなり得ることを理解するはずである。加えて、多くの修正が、本発明の必須の範囲から逸脱することなく、特定の状況または材料を本発明の教示に適合させるために行われ得る。
【0170】
[00235]したがって、本発明は、本発明を実施するために検討される、本明細書において開示されている特定の実施形態に限定されないが、本発明は特許請求の範囲に含まれる全ての実施形態を含むものである。
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5-1】
【図5-2】
【図5-3】
【図5-4】
【図5-5】
【図6】
【図7-1】
【図7-2】
【図7-3】
【図7-4】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【国際調査報告】