▶ ザ・トラスティーズ・オブ・コランビア・ユニバーシティー・イン・ザ・シティー・オブ・ニューヨークの特許一覧
特表2022-547606ＴＩＡ１を標的としたストレス顆粒形成およびタウ凝集を抑制する化合物の同定
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-11-14
(54)【発明の名称】ＴＩＡ１を標的としたストレス顆粒形成およびタウ凝集を抑制する化合物の同定
(51)【国際特許分類】
A61K 45/00 20060101AFI20221107BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20221107BHJP
A61P 25/18 20060101ALI20221107BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20221107BHJP
A61K 31/5377 20060101ALI20221107BHJP
A61K 31/428 20060101ALI20221107BHJP
A61K 31/437 20060101ALI20221107BHJP
A61K 31/519 20060101ALI20221107BHJP
A61K 33/04 20060101ALI20221107BHJP
A61K 31/506 20060101ALI20221107BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20221107BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20221107BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20221107BHJP
A61P 25/22 20060101ALI20221107BHJP
A61K 45/06 20060101ALI20221107BHJP
A61K 31/44 20060101ALI20221107BHJP
A61K 31/69 20060101ALI20221107BHJP
【ＦＩ】
A61K45/00
A61P25/00
A61P25/18
A61P35/00
A61K31/5377
A61K31/428
A61K31/437
A61K31/519
A61K33/04
A61K31/506
A61P43/00 111
A61P43/00 105
A61P25/28
A61P21/00
A61P25/22
A61P43/00 121
A61K45/06
A61K31/44
A61K31/69
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022516273
(86)(22)【出願日】2020-09-16
(85)【翻訳文提出日】2022-04-21
(86)【国際出願番号】 US2020051107
(87)【国際公開番号】W WO2021055502
(87)【国際公開日】2021-03-25
(31)【優先権主張番号】62/900,784
(32)【優先日】2019-09-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】518360944
【氏名又は名称】ザ・トラスティーズ・オブ・コランビア・ユニバーシティー・イン・ザ・シティー・オブ・ニューヨーク
(74)【代理人】
【識別番号】100104411
【弁理士】
【氏名又は名称】矢口 太郎
(72)【発明者】
【氏名】レイマン、ジョセフ、ビー．
(72)【発明者】
【氏名】ランドリー、ドナルド
(72)【発明者】
【氏名】デン、シシエン
【テーマコード（参考）】
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C084AA17
4C084AA20
4C084MA02
4C084NA14
4C084ZA01
4C084ZA16
4C084ZA18
4C084ZB21
4C084ZB26
4C084ZC41
4C084ZC751
4C086AA01
4C086AA02
4C086BC17
4C086BC69
4C086BC70
4C086CB27
4C086DA43
4C086GA10
4C086GA12
4C086HA08
4C086MA01
4C086MA02
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA01
4C086ZA16
4C086ZA94
4C086ZB21
4C086ZB26
4C086ZC41
(57)【要約】
【要約】
【解決手段】 本発明は、哺乳動物における神経変性疾患、ウェランダー遠位型ミオパチー、精神疾患、または癌の症状を改善する、または治療する方法であって、ＴＩＡ１依存性ストレス顆粒形成を減少させる化合物の有効量を哺乳動物に投与することを含む、方法を提供するものである。
【選択図】 １Ａ
【解決手段】 本発明は、哺乳動物における神経変性疾患、ウェランダー遠位型ミオパチー、精神疾患、または癌の症状を改善する、または治療する方法であって、ＴＩＡ１依存性ストレス顆粒形成を減少させる化合物の有効量を哺乳動物に投与することを含む、方法を提供するものである。
【選択図】 １Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
哺乳動物における神経変性疾患、ウェランダー遠位型ミオパチー、精神疾患、または癌の症状を改善する、または治療する方法であって、前記方法は、ＴＩＡ１依存性ストレス顆粒形成を減少させる化合物の有効量を前記哺乳動物に投与する工程を含む、方法。
【請求項2】
請求項１記載の方法において、前記化合物が、【化1】
【請求項3】
請求項１～２のいずれか１項に記載の方法において、前記化合物が薬学的に許容される塩である、方法。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか１項に記載の方法において、前記化合物が、ＴＩＡ１多量体化を阻害するのに有効な量で投与される、方法。
【請求項5】
請求項１～３のいずれか１項に記載の方法において、前記化合物が、ＴＩＡ１、タウ、またはＴＤＰ－４３タンパク質の凝集を減少させる有効量で投与される、方法。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか１項に記載の方法において、前記神経変性疾患が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、及びタウオパチーのいずれか１つである、方法。
【請求項7】
請求項１～５のいずれか１項に記載の方法において、前記精神疾患が心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）または不安症である、方法。
【請求項8】
請求項１～５のいずれか１項に記載の方法において、前記癌がＫＲＡＳ変異に関連している、方法。
【請求項9】
請求項１～５のいずれか１項に記載の方法において、前記哺乳動物に化学療法剤をさらに投与する、方法。
【請求項10】
請求項９記載の方法において、前記化学療法剤が、ソラフェニブまたはボルテゾミブである、方法。
【請求項11】
請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法において、前記化合物が、神経細胞に送達される、方法。
【請求項12】
【化2】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０１９年９月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／９００，７８４号の優先権を主張し、その内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本出願において、様々な出版物は著者と出版日を括弧内に記載する。これらの出版物の完全な引用は、本明細書の末尾または各実験セクションの末尾に参照される。これらの出版物の開示は、本発明が関連する技術をより完全に説明するために、参照により本願に組み込まれる。
【背景技術】
【0003】
ＴＩＡ１は、細胞のストレス応答において重要な役割を果たすＲＮＡ結合タンパク質である。ＴＩＡ１は、細胞が様々な環境刺激（酸化ストレス、ウイルス感染など）にさらされると、ストレス顆粒（ＳＧ）の形成を促進する。ＳＧは、ストレス応答中に必要とされないＲＮＡの一時貯蔵所として機能する細胞質の病巣である。これらのＲＮＡは、ＳＧに局在している間は翻訳が停止した状態に保たれるが、環境ストレスが解消され、ＳＧが分解されるとポリソームプールに戻されることが可能である。このように、ＳＧはストレス時に重要なＲＮＡの優先的な翻訳を促進し、また、正常な細胞機能の回復時にはｄｅ ｎｏｖｏ転写の必要性を低減する。さらに、ＳＧは、スプライシング因子など、通常は核内で機能する多くの重要なＲＮＡ結合タンパク質をリクルートしている。主要なスプライシング因子の化学量論を変化させることによって、ＳＧは世界規模の代替的なスプライシングパターンを調節している。最後に、シグナル伝達タンパク質がＳＧＳに取り込まれると、細胞シグナル伝達、特にアポトーシスと細胞生存が変化する。以上のことから、ＳＧＳは細胞ストレス時のプロテオームの適応的な再プログラミングを促進することが明らかとなった。
【0004】
ＴＩＡ１のようなＳＧ成分の機能的活性は、生理的条件下で凝集構造を形成する固有の性質に由来しており、ＴＩＡ１の場合、そのＣ末端プリオン関連ドメインが一部介在している。発明者はまた、最近、ＴＩＡ１の多量体化およびＳＧへのそのリクルートが、ストレス依存性の細胞内亜鉛の放出によって引き起こされ、それが生理的セカンドメッセンジャーとして作用してＴＩＡ１の可逆的相分離を促進し、ＳＧ形成を駆動することを立証した（Ｒａｙｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８）
【0005】
相分離は、適切な生理的条件下で膜なし小器官を生じさせる一般的な生物物理学的メカニズムである。しかしながら、ＴＩＡ１や他のＳＧ構成タンパク質がこのような生理的凝集を起こす性質は、多くの病態生理学的過程によって利用される可能性がある。したがって、ＳＧは細胞毒性を持つ持続的な凝集体に進化する、あるいはその播種を促進するという仮説が立てられてきた。例えば、ＴＩＡ１およびＳＧは、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、およびタウオパチーを含むいくつかの神経変性状態に関与する（Ｍａｚｉｕｋ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｖａｎｄｅｒｗｅｙｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｖａｎｄｅｒｗｅｙｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２）．さらに、ＴＩＡ１自体の変異はＷｅｌａｎｄａｒ ｄｉｓｔａｌ ｍｙｏｐａｔｈｙ（ＷＤＭ）に関連する（Ｈａｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｋｌａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。これらの疾患の特徴は、ＴＩＡ１、ＴＤＰ－４３、およびタウなどのＳＧ成分に対してしばしば陽性である病的タンパク質封入体の存在である。これらの結果および他の研究の結果を合わせると、ＴＩＡ１活性および／またはＳＧ形成の阻害は、持続的なタンパク質凝集に関連するタウ障害および他の神経変性状態の治療のための有用な治療アプローチとなり得ることが示唆される（Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ，２０１９；Ａｐｉｃｃｏ ｅｔ ａｌ．，２０１８；Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｃｏｗａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｊｏｕａｎｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１９；Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１８；Ｂｒｅｔｔｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｈｅｒｇｅｓｈｅｉｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１９；Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｐｒｏｔｔｅｒ&Ｐａｒｋｅｒ，２０１６；Ｗｏｌｏｚｉｎ&Ｉｖａｎｏｖ，２０１９）。
【0006】
ＴＩＡ１と神経変性との機能的な関連は、ＴＩＡ１がタンパク質凝集体を形成する傾向から生じると考えられており、この凝集体は、これらの神経変性プロセスに関与する他の凝集しやすいタンパク質と相互作用する可能性がある。特にＡＤやＦＴＤに関連するタウ（ｔａｕ）を介した神経変性に関しては、ＴＩＡ１、ＳＧ形成、タウ（ｔａｕ）病理を関連づける説得力のある研究が数多くなされる。例えば、ＴＩＡ１とタウの相互作用は、毒性タウオリゴマーの生成を調節することにより、タウ病態を制御する（Ｖａｎｄｅｒｗｅｙｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。重要なことに、マウスにおけるヒト化タウの過剰発現に関連する認知障害は、マウスをＴＩＡ１欠損バックグラウンドに交配すると逆転する（Ａｐｉｃｃｏ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。さらに、ＴＩＡ１依存性のＳＧ形成の上流に作用するキナーゼ阻害剤は、神経変性を改善する（Ｖａｎｄｅｒｗｅｙｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。同様に、ＴＩＡ１は、ＡＬＳ／ＦＴＤにおいてＳＧ様凝集体に病的に局在するようになる重要なスプライシング因子であるＴＤＰ－４３と機能的に相互作用し、ＴＤＰ－４３＋ＳＧ形成を損なう薬理操作は細胞の病的変化を改善すると考えられる（Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明は、哺乳動物における神経変性疾患、ウェランダー遠位型ミオパチー、精神疾患、または癌の症状を改善する、または治療する方法であって、前記方法は、ＴＩＡ１依存性ストレス顆粒形成を減少させる化合物の有効量を哺乳動物に投与する工程を含む、方法を提供するものである。
【0008】
また、本発明は、
のいずれか１つの化合物、その構造類似体、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【化1】
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1A】図１Ａ－１Ｂは、ヒ素によるストレス顆粒形成に対するＴＩＡ１化合物の用量反応を示す。ＨＴ２２細胞（マウス脳由来細胞株）を亜ヒ酸ナトリウム（．５ｍＭ）＋標記化合物で３０分間同時処理し、固定後、内因性ＴＩＡ１について染色した。ストレス顆粒（ＳＧ）形成の程度は、処理細胞と対照細胞（亜ヒ酸塩のみ、薬剤なし）を比較し、各条件につき１００細胞以上の視覚的スコアリングにより決定された。図１Ａ：ＳＧ形成の定性的評価は、０－３のスケールで採点した。ここで、０＝ＳＧの完全な阻害、３＝亜ヒ酸／薬剤で処理した対照細胞と同レベルのＳＧ形成であった。データは、最低（上段）から最高（下段）の阻害効力からランクソートされる。
【図2A】図２Ａ－２Ｂは、細胞アッセイ（ストレスグラニュール形成）とｉｎ ｖｉｔｒｏ ＦＲＥＴデータとの相関を示す。図２Ａ：化合物は、ストレス顆粒アッセイにおける性能に基づいて４つのグループに分けた。
【発明を実施するための形態】
【0010】
本発明は、哺乳動物における神経変性疾患、ウェランダー遠位型ミオパチー、精神疾患、または癌の症状を改善する、または治療する方法であって、ＴＩＡ１依存性ストレス顆粒形成を減少させる化合物の有効量を哺乳動物に投与する工程を含む、方法を提供するものである。
【0011】
いくつかの実施形態では、化合物は、
のいずれか１つ、またはその構造類似体である。
【化2】
【0012】
いくつかの実施形態では、本化合物は、薬学的に許容される塩である。
【0013】
いくつかの実施形態では、化合物は、ＴＩＡ１多量体化を阻害するのに有効な量で投与される。
【0014】
いくつかの実施形態では、化合物は、ＴＩＡ１、タウ、またはＴＤＰ－４３タンパク質凝集を減少させるのに有効な量で投与される。
【0015】
いくつかの実施形態では、神経変性障害は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、及びタウオパチーのうちのいずれか１つである。
【0016】
いくつかの実施形態では、精神疾患は、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）又は不安症である。
【0017】
いくつかの実施形態では、癌はＫＲＡＳ変異に関連する。
【0018】
いくつかの実施形態では、哺乳類は、さらに化学療法剤を投与される。
【0019】
いくつかの実施形態では、化学療法薬は、ソラフェニブ又はボルテゾミブである。
【0020】
いくつかの実施形態では、化合物は神経細胞に送達される。
【0021】
本発明は、
のいずれか１つの化合物、その構造類似体、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【化3】
【実施例1】
【0022】
ＴＩＡ１は、プリオン関連ＲＮＡ結合タンパク質であり、疾患関連タンパク質の凝集を促進する能力から、神経変性疾患への関与が強く示唆されている。本開示の発明者らは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび細胞培養モデルの両方において、ＴＩＡ１が高分子凝集体を形成する能力を標的とするいくつかの化合物を同定する。ＴＩＡ１活性の上流のシグナル伝達事象の阻害は、動物試験において神経変性をブロックすることが示されるが、そのような戦略は、著しい毒性および非特異的な効果に関連する（Ｍａｚｉｕｋ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。対照的に、本明細書で同定された化合物は、ＴＩＡ１に対してより特異的であり、動物研究において最小限の毒性を示す。したがって、これらの化合物は、治療薬として、また、高齢化社会の中でますます一般的になり、大きな健康上の懸念を表す、ヒトにおける様々な神経変性プロセスを阻害する追加の新規治療薬の開発において、貴重なものである。
【0023】
より具体的には、ＴＩＡ１を標的とする化合物は、アルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）等を含むがこれらに限定されない神経変性疾患の治療に有用な新規クラスの薬剤であり、これらはそれぞれ、有効かつ長期間の改善をもたらす治療オプションが現在存在しないものである。
【0024】
本開示は、ＴＩＡ１を新規治療標的として同定し、ＴＩＡ１を標的とする化合物が、現在利用可能な薬剤とは全く異なる作用機序を有する新規クラスの化合物であることを示すものである。タウ自体、タウに作用する上流酵素、微小管などを標的とする技術とは対照的に、ＴＩＡ１は、ＳＧ形成に近接していることから、説得力のある治療標的であるといえる。実際、ＴＩＡ１の上流のＳＧ形成を標的とした操作（例えば、ＰＥＲＫ阻害剤、ｅＩＦ２αリン酸化阻害剤など）は、ＴＩＡ１のような近接した構成要素を標的とするより毒性が強く、非特異的な効果を生む。また、マウスにおけるＴＩＡ１の欠失が比較的軽度の表現型の変化を伴うことを考慮すると、欠失が致死と関連する遺伝子産物（例えばＴＤＰ－４３）よりも有効な治療標的であると言える。したがって、本明細書に記載の化合物は、ＴＩＡ１／タウ／ストレス顆粒経路を標的とする他の化合物よりも、毒性および非特異的効果を示さない。
【0025】
本明細書に記載の化合物の追加的な用途としては、ヒトＴＩＡ１遺伝子のミスセンス変異によって引き起こされる稀な疾患であるウェランダー遠位型ミオパシーの治療が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。さらに、これらの化合物は、ＰＴＳＤおよび不安などの精神疾患に関連する恐怖記憶を調節するために使用され得る。さらに、これらの化合物は、腫瘍学的適応症に関連する可能性がある。例えば、ＫＲＡＳ変異を有するものなど、いくつかのタイプの癌は、化学療法剤に反応してＳＧを形成し、その細胞毒性効果を緩和する。発明者らは、ＴＩＡ１アンタゴニストが、ソラフェニブまたはボルテゾミブのような化学療法剤で処理した選択された癌細胞株におけるＳＧの形成をブロックすることを示す。これらの結果は、癌細胞におけるＳＧ形成の阻害が、化学療法剤の細胞毒性に対して癌細胞をより感受性にする可能性を示唆している。さらに、ＴＩＡ１アンタゴニストは、既存の化学療法アプローチのアジュバントとして使用するための治療上の有用性が期待される。
【0026】
Ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび細胞ベース研究
本発明者らが開発したハイスループット薬物スクリーニング（Ｒａｙｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８）に基づき、彼らは当初、ＴＩＡ１の多量体化およびＳＧ形成を促進するその能力を標的とするいくつかの市販の化合物を同定した。ヒトおよびマウスの両方の細胞株を用いた細胞培養実験において、これらの化合物の少なくとも２つ（以下に記載）は、１）ＴＩＡ１依存性ＳＧ形成、２）ＳＧへのタウ／ＴＤＰ－４３の動員、および３）ＴＩＡ１、タウ、およびＴＤＰ－４３の共局在化を完全に阻害した。これらの効果は、いくつかの異なる細胞株において、わずか１０μＭの薬剤で観察された。典型的なアッセイでは、細胞（例えば、ＨＴ２２またはＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞株）を亜ヒ酸ナトリウム（．５ｍＭ）で３０分間処理し、その後固定化し免疫細胞化学分析を行うことによりＳＧが誘導される。薬物は亜ヒ酸ナトリウムと同時に投与した。固定された細胞は、次に内因性ＴＩＡ１について染色され、次いで共焦点イメージングおよび分析が行われた。発明者らは、活性化合物が、ＡＬＳを研究するためのより翻訳的な関連システムを表す、ヒト運動ニューロンにおけるピューロマイシン誘発性ＳＧＳもブロックすることを確立した。興味深いことに、活性化合物のＩＣ５０値は、細胞株と比較して初代ニューロンでは５～１０倍低い。この知見は、異なるストレス要因（例えば、細胞株では亜砒酸、運動ニューロンではピューロマイシン）の使用によって部分的に説明されるかもしれない。発明者らはまた、これらの化合物が、様々な実験コンテキストにおいて、予め形成されたＳＧの解体を促進することができることを実証する。
本発明者らが開発したハイスループット薬物スクリーニング（Ｒａｙｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８）に基づき、彼らは当初、ＴＩＡ１の多量体化およびＳＧ形成を促進するその能力を標的とするいくつかの市販の化合物を同定した。ヒトおよびマウスの両方の細胞株を用いた細胞培養実験において、これらの化合物の少なくとも２つ（以下に記載）は、１）ＴＩＡ１依存性ＳＧ形成、２）ＳＧへのタウ／ＴＤＰ－４３の動員、および３）ＴＩＡ１、タウ、およびＴＤＰ－４３の共局在化を完全に阻害した。これらの効果は、いくつかの異なる細胞株において、わずか１０μＭの薬剤で観察された。典型的なアッセイでは、細胞（例えば、ＨＴ２２またはＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞株）を亜ヒ酸ナトリウム（．５ｍＭ）で３０分間処理し、その後固定化し免疫細胞化学分析を行うことによりＳＧが誘導される。薬物は亜ヒ酸ナトリウムと同時に投与した。固定された細胞は、次に内因性ＴＩＡ１について染色され、次いで共焦点イメージングおよび分析が行われた。発明者らは、活性化合物が、ＡＬＳを研究するためのより翻訳的な関連システムを表す、ヒト運動ニューロンにおけるピューロマイシン誘発性ＳＧＳもブロックすることを確立した。興味深いことに、活性化合物のＩＣ５０値は、細胞株と比較して初代ニューロンでは５～１０倍低い。この知見は、異なるストレス要因（例えば、細胞株では亜砒酸、運動ニューロンではピューロマイシン）の使用によって部分的に説明されるかもしれない。発明者らはまた、これらの化合物が、様々な実験コンテキストにおいて、予め形成されたＳＧの解体を促進することができることを実証する。
【0027】
さらに、本発明者らは、活性化合物が、疾患関連ＳＧ成分が関与するＳＧ形成を効果的に阻害することを確立している。例えば、トランスフェクション研究において、化合物は、Ｗｅｌａｎｄｅｒ遠位型ミオパシーの原因変異を有し、ヒト細胞において異常に持続するＳＧに関連するＷＤＭ－ＴＩＡ１によるＳＧアセンブリを完全に阻止する。さらに、本活性化合物は、定義されたＡＬＳ感受性遺伝子座の変異を有するヒト運動ニューロン（例えば、Ｃ９ｏｒｆ７２、ＳＯＤ１、またはＦＵＳ変異を有する運動ニューロン）においてプロマイシン誘発ＳＧ集合を効率的にブロックする。興味深いことに、本発明者らは、ヒトＦＵＳ変異ニューロンに形成された異常に持続的なＳＧが、我々の小分子によって分解され得ることも観察した。これらの結果は、本明細書に開示された化合物が、様々な異なる実験コンテキストにわたって普遍的にＳＧ形成および分解を標的とすることができることを示唆する。
【0028】
これまでのところ、入手可能な構造的アナログの一群がテストされてきた。さらに最近、本発明者らは、以前の化合物の構造に基づいて、いくつかの新規化学物質も開発し、試験してきた。さらなる新規アナログは、同定された構造活性相関に基づいて合成され得る。
【0029】
活性化合物の簡易分子入力システム（ＳＭＩＬＥＳ）フォーマット
Ｒｅｆ３５：Ｃ１＝ＣＣ＝ＣＣ２＝Ｃ１Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｓ２）Ｃ３＝ＣＣ（＝Ｃ（Ｃ＝Ｃ３）Ｃｌ）［Ｓ］（Ｎ４ＣＣＯＣＣ４）（＝Ｏ）＝Ｏ
Ｒｅｆ４９：ＣＣ１＝ＣＣ（＝Ｃ（Ｃ＝Ｃ１）Ｃ）Ｎ２Ｃ（＝Ｏ）Ｃ３＝Ｃ（Ｓ２）Ｃ＝Ｃ（Ｃ＝Ｃ３）Ｆ
ＯＴＸ１０００：Ｃ１＝ＣＣ＝ＣＣ２＝Ｃ１Ｃ（Ｎ（Ｓ２）Ｃ３＝ＣＣ（＝ＣＣ＝Ｃ３）Ｃ）＝Ｏ
ＯＴＸ１００８：Ｃ１＝ＣＣ＝ＣＣ２＝Ｃ１Ｃ（Ｎ（Ｓ２）Ｃ３＝ＣＣ（＝ＣＣ（＝Ｃ３）Ｃ）Ｃ）＝Ｏ
ＯＴＸ１０１３：Ｃ１＝ＣＮ＝ＣＣ２＝Ｃ１Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｓ２）Ｃ３＝ＣＣ（＝ＣＣ＝Ｃ３Ｃ）Ｃ
ＯＴＸ１０１４：Ｃ１＝ＮＣ２＝Ｃ（Ｃ＝Ｎ１）ＳＮ（Ｃ２＝Ｏ）Ｃ３＝Ｃ（Ｃ＝ＣＣ（＝Ｃ３）Ｃ）Ｃ
ＯＴＸ１０１５：Ｃ１＝ＣＣ２＝Ｃ（Ｃ＝Ｃ１Ｂｒ）ＳＮ（Ｃ２＝Ｏ）Ｃ３＝Ｃ（Ｃ＝ＣＣ（＝Ｃ３）Ｃ）Ｃ
ＯＴＸ１０１６：Ｃ１＝ＣＣ２＝Ｃ（Ｃ＝Ｃ１）［Ｓｅ］Ｎ（Ｃ２＝Ｏ）Ｃ３＝Ｃ（Ｃ＝ＣＣ（＝Ｃ３）Ｃ）Ｃ
ＯＴＸ１０１９：ＣＣ１＝ＣＣ（＝ＣＣ＝Ｃ１）Ｎ２Ｃ（＝Ｏ）Ｃ３＝ＣＣ＝ＣＣ＝Ｃ３［Ｓｅ］２
ＯＴＸ００Ｅ９：ＣＣ（Ｃ）Ｃ１＝ＮＯＣ（＝Ｃ１）ＣＮＣ２＝ＮＣ（＝ＣＣ（＝Ｎ２）Ｎ３ＣＣＮ（ＣＣ３）Ｃ）ＮＣ４＝ＮＮＣ（＝Ｃ４）Ｃ５ＣＣ５
Ｒｅｆ３５：Ｃ１＝ＣＣ＝ＣＣ２＝Ｃ１Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｓ２）Ｃ３＝ＣＣ（＝Ｃ（Ｃ＝Ｃ３）Ｃｌ）［Ｓ］（Ｎ４ＣＣＯＣＣ４）（＝Ｏ）＝Ｏ
Ｒｅｆ４９：ＣＣ１＝ＣＣ（＝Ｃ（Ｃ＝Ｃ１）Ｃ）Ｎ２Ｃ（＝Ｏ）Ｃ３＝Ｃ（Ｓ２）Ｃ＝Ｃ（Ｃ＝Ｃ３）Ｆ
ＯＴＸ１０００：Ｃ１＝ＣＣ＝ＣＣ２＝Ｃ１Ｃ（Ｎ（Ｓ２）Ｃ３＝ＣＣ（＝ＣＣ＝Ｃ３）Ｃ）＝Ｏ
ＯＴＸ１００８：Ｃ１＝ＣＣ＝ＣＣ２＝Ｃ１Ｃ（Ｎ（Ｓ２）Ｃ３＝ＣＣ（＝ＣＣ（＝Ｃ３）Ｃ）Ｃ）＝Ｏ
ＯＴＸ１０１３：Ｃ１＝ＣＮ＝ＣＣ２＝Ｃ１Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｓ２）Ｃ３＝ＣＣ（＝ＣＣ＝Ｃ３Ｃ）Ｃ
ＯＴＸ１０１４：Ｃ１＝ＮＣ２＝Ｃ（Ｃ＝Ｎ１）ＳＮ（Ｃ２＝Ｏ）Ｃ３＝Ｃ（Ｃ＝ＣＣ（＝Ｃ３）Ｃ）Ｃ
ＯＴＸ１０１５：Ｃ１＝ＣＣ２＝Ｃ（Ｃ＝Ｃ１Ｂｒ）ＳＮ（Ｃ２＝Ｏ）Ｃ３＝Ｃ（Ｃ＝ＣＣ（＝Ｃ３）Ｃ）Ｃ
ＯＴＸ１０１６：Ｃ１＝ＣＣ２＝Ｃ（Ｃ＝Ｃ１）［Ｓｅ］Ｎ（Ｃ２＝Ｏ）Ｃ３＝Ｃ（Ｃ＝ＣＣ（＝Ｃ３）Ｃ）Ｃ
ＯＴＸ１０１９：ＣＣ１＝ＣＣ（＝ＣＣ＝Ｃ１）Ｎ２Ｃ（＝Ｏ）Ｃ３＝ＣＣ＝ＣＣ＝Ｃ３［Ｓｅ］２
ＯＴＸ００Ｅ９：ＣＣ（Ｃ）Ｃ１＝ＮＯＣ（＝Ｃ１）ＣＮＣ２＝ＮＣ（＝ＣＣ（＝Ｎ２）Ｎ３ＣＣＮ（ＣＣ３）Ｃ）ＮＣ４＝ＮＮＣ（＝Ｃ４）Ｃ５ＣＣ５
【0030】
ヒ素によるストレスグラニュール形成に対するＴＩＡ１化合物の用量応答性
プロトコールＨＴ２２細胞（マウス脳由来細胞株）を亜ヒ酸ナトリウム（．５ｍＭ）＋標記化合物で３０分間同時処理し、固定後、内在性ＴＩＡ１を染色した。ストレス顆粒（ＳＧ）形成の程度は、処理細胞と対照細胞（亜砒酸のみ、薬剤なし）を比較し、各条件につき１００個以上の細胞の視覚的スコアリングによって決定された。ＳＧ形成の定性的評価は０－３のスケールで採点し、０＝ＳＧの完全阻害、３＝亜砒酸／薬剤で処理した対照細胞と同レベルのＳＧ形成した（図１Ａ）。代表的な共焦点画像を示す（スケールバー、１０ｍｍ）（図１Ｂ）。データは、阻害力の低いもの（上段）から高いもの（下段）へとランク付けされる（図１Ａ）。Ｒｅｆ１６を除くすべての化合物は、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ／２０１７／２１８６９７に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ ＦＲＥＴアッセイで陽性であった。
プロトコールＨＴ２２細胞（マウス脳由来細胞株）を亜ヒ酸ナトリウム（．５ｍＭ）＋標記化合物で３０分間同時処理し、固定後、内在性ＴＩＡ１を染色した。ストレス顆粒（ＳＧ）形成の程度は、処理細胞と対照細胞（亜砒酸のみ、薬剤なし）を比較し、各条件につき１００個以上の細胞の視覚的スコアリングによって決定された。ＳＧ形成の定性的評価は０－３のスケールで採点し、０＝ＳＧの完全阻害、３＝亜砒酸／薬剤で処理した対照細胞と同レベルのＳＧ形成した（図１Ａ）。代表的な共焦点画像を示す（スケールバー、１０ｍｍ）（図１Ｂ）。データは、阻害力の低いもの（上段）から高いもの（下段）へとランク付けされる（図１Ａ）。Ｒｅｆ１６を除くすべての化合物は、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ／２０１７／２１８６９７に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ ＦＲＥＴアッセイで陽性であった。
【0031】
細胞アッセイ（ストレスグラニュール形成）とｉｎ ｖｉｔｒｏ ＦＲＥＴデータとの相関性
化合物は、ストレス顆粒アッセイでのパフォーマンスに基づいて、４つのグループに分けられた（図２Ａ）。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＦＲＥＴ データ（ベースライン ＦＲＥＴ からの最大変化率）は、各グループで平均化された（図２Ｂ）。全体として、グループ間で有意な統計的差異がある。しかし、少なくともＳＧ形成に最小限の影響を与える化合物（Ｂ、Ｃ、Ｄ群）については、ＳＧ阻害の大きさとＦＲＥＴ変化との間に相関は検出されない。
化合物は、ストレス顆粒アッセイでのパフォーマンスに基づいて、４つのグループに分けられた（図２Ａ）。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＦＲＥＴ データ（ベースライン ＦＲＥＴ からの最大変化率）は、各グループで平均化された（図２Ｂ）。全体として、グループ間で有意な統計的差異がある。しかし、少なくともＳＧ形成に最小限の影響を与える化合物（Ｂ、Ｃ、Ｄ群）については、ＳＧ阻害の大きさとＦＲＥＴ変化との間に相関は検出されない。
【0032】
参考文献
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【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【国際調査報告】