▶ イマティクス バイオテクノロジーズ ゲーエムベーハーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-11-16
(54)【発明の名称】ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドの特性決定方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/68 20060101AFI20221109BHJP
C12Q 1/04 20060101ALI20221109BHJP
C07K 14/74 20060101ALN20221109BHJP
C07K 16/00 20060101ALN20221109BHJP
C07K 14/725 20060101ALN20221109BHJP
C07K 19/00 20060101ALN20221109BHJP
C07K 16/46 20060101ALN20221109BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20221109BHJP
C07K 17/12 20060101ALN20221109BHJP
【ＦＩ】
G01N33/68 ZNA
C12Q1/04
C07K14/74
C07K16/00
C07K14/725
C07K19/00
C07K16/46
C12N15/13
C07K17/12
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022508957
(86)(22)【出願日】2020-08-12
(85)【翻訳文提出日】2022-02-10
(86)【国際出願番号】 EP2020072674
(87)【国際公開番号】W WO2021028503
(87)【国際公開日】2021-02-18
(31)【優先権主張番号】102019121834.9
(32)【優先日】2019-08-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】DE
(31)【優先権主張番号】62/886,225
(32)【優先日】2019-08-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】506258073
【氏名又は名称】イマティクス バイオテクノロジーズ ゲーエムベーハー
(74)【代理人】
【識別番号】100174252
【弁理士】
【氏名又は名称】赤津 豪
(72)【発明者】
【氏名】シュスター，ハイコ
(72)【発明者】
【氏名】フット，マイケ
(72)【発明者】
【氏名】ヴァインシェンク，トニ
(72)【発明者】
【氏名】バンク，ゼバスティアン
(72)【発明者】
【氏名】スホール，オリバー
(72)【発明者】
【氏名】バッケルト，リーナス
(72)【発明者】
【氏名】ホフマン，マーティン
(72)【発明者】
【氏名】フリッチェ，イェンス
(72)【発明者】
【氏名】ウンバードルベン，フェリックス
(72)【発明者】
【氏名】シマック，ギーゼラ
(72)【発明者】
【氏名】シュヴォーア（サロピアタ）、フロリアン
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G045AA25
2G045CB01
2G045DA36
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ08
4B063QQ79
4B063QR48
4B063QR56
4B063QS32
4B063QS33
4H045AA30
4H045BA41
4H045BA61
4H045CA40
4H045DA50
4H045DA75
4H045DA76
4H045EA50
(57)【要約】
本発明は、例えば、質量分析、認識したペプチド空間の分析による、即ち、ＭＨＣによる提示の文脈において結合可能な、及び、結合不可能なペプチドを同定するための、ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドの特性決定方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも１つの規定のペプチド結合ドメインを含むポリペプチド分子（「ｐＭＨＣ結合ポリペプチド」）の、ペプチド：ＭＨＣ複合体のペプチド（「標的ペプチド」）への結合の特性決定方法であって、ａ）分析される少なくとも１つのペプチド：ＭＨＣ複合体を含むサンプルを提供するステップと、
ｂ）前記サンプルを前記ポリペプチド分子（「ｐＭＨＣ結合ポリペプチド」）と接触させ、前記ポリペプチド分子の少なくとも１つのペプチド結合ドメインを、前記少なくとも１つのペプチド：ＭＨＣ複合体に結合させるステップと、
ｃ）前記少なくとも１つのペプチド結合ドメインに結合した前記少なくとも１つのペプチド：ＭＨＣ複合体を単離するステップと、
ｄ）ステップｃ）で単離した、前記少なくとも１つのペプチド：ＭＨＣ複合体の前記ペプチドを同定することにより、前記ポリペプチド分子の、前記少なくとも１つのペプチド：ＭＨＣ複合体の前記ペプチドへの結合を同定するステップと、
を含む、方法。
【請求項2】
前記ポリペプチド分子が任意に、マトリックス物質に結合する、及び／又は、前記ポリペプチド分子が、マトリックス物質に結合している、若しくは付着している、少なくとも１つの結合部位を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ポリペプチド分子のペプチド：ＭＨＣ複合体のペプチドへの結合の特性決定方法が、前記ポリペプチド分子の、ペプチド：ＭＨＣ複合体の前記ペプチドへの前記結合を同定するステップを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記サンプルが、細胞溶解物などの、少なくとも１つのペプチド：ＭＨＣ複合体を含む天然若しくは人工のサンプル、又は精製若しくは濃縮されたペプチド：ＭＨＣ複合体を含むサンプルから選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記少なくとも１つのペプチド結合ドメインを含む前記ポリペプチド分子が、二重特異的、三重特異的、四重特異的、又は多重特異的分子から選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記少なくとも１つのペプチド結合ドメインを含む前記ポリペプチド分子が、抗体、同時多重相互作用Ｔ細胞エンゲージ(ＳＭＩＴＥ)との二重特異的性、二重特異的T細胞誘起（ＢｉＴＥ）、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、二重親和性再標的化抗体（ＤＡＲＴ）、タンデム抗体（ＴａｎｄＡｂ）、可溶性ＴＣＲ、ｓｃＴＣＲ、例えばＳブリッジを含む変異ＴＣＲ、切頭ＴＣＲ、及び、二重特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）－抗体融合分子から選択される分子である、又はこれらの分子に由来する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記ポリペプチド分子が、免疫細胞の活性化を誘発することが知られている細胞表面分子に結合するドメイン並びに、免疫応答関連分子、好ましくは、ＣＤ３、若しくは、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、及びＣＤ３ε鎖、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ４１、ＣＤ４１ｂ、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４４、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４９、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ９４、ＣＤ９０、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１２５、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１６３、ＣＤ１９３、ＣＤ２０３Ｃ、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９、ＣＤ２８７、Ｎｋｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＧＩＴＲ、ＦｃεＲＩ、ＴＣＲａ／β、ＴＣＲγ／δ、及び／又はＨＬＡ－ＤＲなどの、その鎖のうちの１つに結合する、第２の結合ドメインから選択される、少なくとも１つの第２の結合ドメインを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記少なくとも１つのペプチド結合ドメインを含む前記ポリペプチド分子が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に由来するペプチド結合ドメインを含む二重特異的分子である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記少なくとも１つのペプチド結合ドメインを含む前記ポリペプチド分子が、可溶性分子である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記結合部位が前記少なくとも１つの結合ドメイン中、前記少なくとも１つの第２ドメイン中に存在するか、又は個別の連結基であり、前記分子の前記結合と本質的に干渉しない、請求項２～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
ステップｄ）における前記同定するステップが、質量分析及びペプチド配列決定から選択される方法を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
ポリペプチド分子の、ペプチド：ＭＨＣ複合体のペプチドへの前記結合を特性決定方法が、前記ペプチド：ＭＨＣ結合ドメインに対する上位結合モチーフを同定するステップを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
ポリペプチド分子の、ペプチド：ＭＨＣ複合体のペプチドへの前記結合を特性決定方法が、ａ）前記ペプチド：ＭＨＣ結合ドメインに対するポリペプチド分子の、位置ベース、及び／若しくは上位結合モチーフを同定するステップ、並びに／又は、
ｂ）提示した適用により同定される前記ペプチドを用いて、ペプチド：ＭＨＣ結合ドメインに対する前記ポリペプチド分子の、オフターゲットペプチドを同定するステップ
を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
ポリペプチド分子の、ペプチド：ＭＨＣ複合体のペプチドへの前記結合を特性決定方法が、他のペプチド：ＭＨＣ結合ドメインに対する前記ペプチドの交差反応性を探索、及び／又は同定するステップを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
癌性、及び／又は非癌性の細胞又は組織における、１つ以上のペプチドモチーフの提示を同定するステップを更に含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記方法が、ステップａ）において、前記サンプルに、少なくとも、・既知の配列を有する１のペプチド、並びに／又は
・規定の、及び／若しくは事前に選択された１のペプチド：ＭＨＣ複合体であって、前記ペプチドが、既知の配列を有する、複合体
を、好ましくは所定の量で添加するステップ（「スパイキング」）を更に含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記ペプチドの前記配列が、少なくとも１の規定のペプチド結合ドメインを含むポリペプチド分子（「ｐＭＨＣ結合ポリペプチド」）が結合する、ペプチド：ＭＨＣ複合体の前記ペプチド（「標的ペプチド」）の配列に対して変化又は変異される、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
少なくとも１の規定のペプチド結合ドメインを含む前記ポリペプチド分子（「ｐＭＨＣ結合ポリペプチド」）が結合する、ペプチド：ＭＨＣ複合体の前記ペプチド（「標的ペプチド」）の一連の変異体が作製され、ステップａ）で前記サンプルに添加され、各変異体が、その長さ全体にわたって、又は、その長さの少なくとも細分画にわたって、ある位置のアミノ酸残基が代替のアミノ酸で置換された、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項19】
各変異体が、その長さ全体にわたって、又は、その長さの少なくとも細分画にわたって、ある位置のアミノ酸残基がアラニン又はグリシンで置換された、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
少なくとも１つの規定のペプチド結合ドメインを含む前記ポリペプチド分子（ｐＭＨＣ結合ポリペプチド」）に対する、ペプチド：ＭＨＣ複合体の前記ペプチド（「標的ペプチド」）のアンカリング位置が、変化／変異しない、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記マトリックス物質がＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）又はアガロースから選択される、請求項２～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記方法が、前記ステップｂ）及び／又はｃ）における前記サンプルを、例えば、広範な特異的ＴＣＲ及び／又は抗体などの、１又はそれ以上の他の結合ドメイン分子と接触させるステップを更に含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
少なくとも１つの広範な特異的結合ドメイン分子が、前記結合ドメイン分子に結合したペプチドに関係なく、１つ以上のＭＨＣ分子のみに対して結合特異性を有する、ＭＨＣ汎特異的結合分子である、請求項２２に記載の方法。（ｉ）前記サンプルの第１の画分がｐＭＨＣ結合ポリペプチドと接触し、（ｉｉ）前記サンプルの第２の画分が、別のｐＭＨＣ結合ポリペプチド又はＭＨＣ汎特異的結合分子と接触し、
更に、前記ｐＭＨＣ結合ポリペプチド、及び、前記別のｐＭＨＣ結合ポリペプチド又はＭＨＣ汎特異的結合分子に結合したペプチド：ＭＨＣ複合体を単離した後で、２つの画分で実現した単離効率を比較する、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項24】
前記ステップｂ）又はｃ）において、多量の過剰のｐＭＨＣ結合ポリペプチド、及び所望により、ＭＨＣ汎特異的結合分子がアプライされる、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
前記サンプル中の前記異なるペプチドに対する、前記第１及び第２の画分で使用した前記結合因子（結合ポリペプチド又は結合分子）の前記結合の親和性を、前記単離効率の比較に基づいて測定する、請求項２３～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
前記方法における少なくとも１つの分子が、検出可能なマーカー又はラベルを含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
前記同定及び／又はオフターゲット結合の演算分析を更に含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
前記ペプチド：ＭＨＣ結合ドメインの交差反応性を、少なくとも１つの細胞傷害性実験により更に探索する、請求項１４～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
例えば、ａ）マトリックス物質、及び、ｂ）少なくとも１つのペプチド：ＭＨＣ複合体に結合する前記少なくとも１つのペプチド結合ドメインを含むポリペプチド分子などの、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法を実施するための物質を含むキット。
【請求項30】
ペプチド：ＭＨＣ複合体のペプチド（「標的ペプチド」）への前記結合が、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法により特性決定された、少なくとも１つの規定のペプチド結合ドメインを含むポリペプチド分子（「ｐＭＨＣ結合ポリペプチド」）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、例えば、質量分析、認識したペプチド空間の分析による、即ち、ＭＨＣによる提示に関して、結合可能な、及び、結合不可能なペプチドを同定するための、ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドの特性決定方法に関する。
【背景技術】
【0002】
免疫療法は、腫瘍学の分野における顕著な役割を得、異なる種類の腫瘍の治療において価値があることが証明された。免疫療法の範囲は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）から、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）形質導入エフェクター細胞にまで広がって異なっている。様々な研究が、ＴＣＲ組換えＴ細胞を活用して、悪性腫瘍に対する患者の適応免疫応答を向上させることに成功しており、強力な抗腫瘍反応性を示している。癌に対する遺伝子組換えＴ細胞の有効性は、しかしながら、毒性の増加を犠牲にして大いに改善されている。
【0003】
形質導入したＴ細胞集団が予想外に、目的の抗原以外の抗原を攻撃する、又は、その特異性とは無関係に、目的の抗原自体を活性化するときに、オフターゲットの毒性が生じる。
【0004】
米国特許出願公開第２０１８／０１２５８８９号は、γδＴ細胞を組み換えると、阻害性ＣＡＲを発現し得、これは、オフターゲット細胞、例えば、細胞表面標的が腫瘍に関連しているが、腫瘍特異的ではない非腫瘍細胞における活性化を最小化することを示している。国際公開第２０１８／０５３３７４号は、組換え標的細胞、又は組換え標的細胞の集団を、Ｔ細胞、ＴＣＲ、又はＴＣＲ様分子と接触させることと、アッセイを行い、Ｔ細胞、ＴＣＲ、又はＴＣＲ様分子が組換え標的細胞又は組換え標的細胞の集団に結合するか否かを測定することと、及び／又は、任意のそのような結合の強度を測定することと、を含む、Ｔ細胞、ＴＣＲ、又はＴＣＲ様分子の毒性及び／又はオフターゲット効果を予想又は研究する、Ｔ細胞エピトープスクリーニング法について記載している。
【0005】
Ｂｉｊｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｊｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）は、ＨＡ－２抗原を発現しないヒト線維芽細胞及びケラチノサイトの７Ｂ５ Ｔ細胞クローンによる、オフターゲット認識を発見した。Ｂｉｊｅｎ ｅｔ ａｌ．は、オフターゲットペプチド、即ち、７Ｂ５ Ｔ細胞クローンにより認識される、ＣＤＨ１３由来のペプチドを同定するための、コンビナトリアルペプチドライブラリースキャンアプローチについて開示している。
【0006】
免疫療法において、オフターゲット毒性を低下させる必要性が依然として存在する。
【0007】
２クラスのＭＨＣ分子が存在する。ＭＨＣ Ｉ又はＩＩは、大部分の有核細胞で観察され得る。ＭＨＣ分子は、それぞれ、α重鎖及びβ－２－マイクログロブリン（ＭＨＣクラスＩ受容体）、又は、α及びβ鎖（ＭＨＣクラスＩＩ受容体）で構成される。これらの３次元構造は結合の溝を作り出し、これにより、特異的ペプチドとの非共有相互作用が可能となる。
【0008】
ＭＨＣクラスＩ受容体は、主に内因性タンパク質、欠陥リボソーム粒子（ＤＲＩＰ）及びより大型のペプチドのタンパク質切断によりもたらされたペプチドを提示する。ＭＨＣクラスＩＩ受容体は、主にプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）において観察され、エンドサイトーシスの過程の間にＡＰＣにより取り込まれ、その後処理される、外因性又は膜貫通タンパク質のペプチドを主に提示する。
【0009】
ペプチドとＭＨＣクラスＩ分子との複合体は、適切なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有する、ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔリンパ球により認識される一方で、ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子との複合体は、適切なＴＣＲを有するＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞により認識される。この認識プロセスの間に、ＴＣＲ、ペプチド、及びＭＨＣが存在し、１：１：１の化学量論量で複合体を形成することがよく知られている。
【0010】
ペプチドが細胞免疫応答をトリガー（誘発）するためには、ペプチドがＭＨＣ分子に結合しなければならない。本プロセスは、ＭＨＣ分子のアレル、及びペプチドアミノ酸配列の特異的多型に依存する。ＭＨＣクラスＩ結合ペプチドは通常、８～１２アミノ酸長であり、通常、ＭＨＣ分子の対応する結合溝と相互作用する配列中に、少なくとも２つの保存残基（「アンカー残基」、ＡＲ）を含有する。この方法により、各ＭＨＣアレルが、ペプチドが結合溝に特異的に結合する能力を制御する結合モチーフを有する。しかし、上述したように、ＭＨＣクラスＩ依存性免疫反応において、ペプチドは、腫瘍細胞により発現されるある種のＭＨＣクラスＩ分子に結合可能である必要があるだけでなく、ペプチドは、特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＴ細胞によって認識される必要もある。腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球、により認識される抗原、即ち、そのエピトープは、発現され、同一種の未変化細胞と比較して、対応する腫瘍の細胞内で発現が促進される、全てのタンパク質クラス、例えば酵素、受容体、転写因子などに由来する分子（ペプチド）であることができる。
【0011】
現在開発中の多くの癌免疫療法は、ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドを、可溶性ポリペプチド分子の形態で、又はそのようなポリペプチドを膜結合分子として発現する細胞、好ましくはＴ細胞の輸送により対象に投与することによってなされる。
【0012】
そのようなペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドに対する実際の標的ペプチド配列は通常確立／定義されている一方で、これらの分子が結合可能な、未知数の更なるペプチドが存在し得る。これらのいわゆる「オフターゲットペプチド」は、潜在的で深刻な副作用により、インビボ適用に対して著しい安全リスクを構成する。これらの副作用の理由は通常、癌組織以外の健常組織で、そのようなオフターゲットペプチドが提示されることであり、対応する致死的な結果が以前に報告されている（例えば、（Ｌｉｎｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３）を参照されたい）。
【0013】
ある種の非最適化Ｔ細胞受容体（ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５）、並びに、Ｍａｇｅ－Ａ４及びＭａｇｅ－Ａ１０（Ａｄａｐｔｉｍｍｕｎｅ社の製品・ＡＤＰ－Ａ２Ｍ４及びＡＤＰ－Ａ２Ｍ１０）を形質導入したＴ細胞の投与の際に、更なる問題及び潜在的に致死性の深刻な有害事象の症例報告がある。
【0014】
結果的に、これらのオフターゲットペプチドの同定だけでなく加えて、これらの安全性についての正確な知識が、ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドを伴う癌免疫療法の適切な開発において、最も適切である。
【0015】
このようなペプチドを同定するための現在の方法は、タンパク質配列データベースで、標的ペプチドと類似性を有するペプチドを検索することを含む。これらのアプローチは通常、適用される検索パラメーターに応じて、多数の、場合によっては１万個のペプチドをもたらし、これら全てが、対応するペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドにより結合される可能性に関して、下流アッセイで試験される必要がある。ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドからの更なる特性、例えば変異スキャニングデータの組込みによる、これらの検索の修正は、下流アッセイで試験される必要があるペプチドの数を潜在的に低下させる可能性があるが、これらのペプチドが生理学的設定においてＭＨＣ分子によってもまた提示されるか否かについてのあらゆる情報を、依然として提示しないため、インビボでの適用に対して、依然として相当の安全性リスクを呈している。
【0016】
更に、これら全てのアプローチは、標的配列に対する類似性がどのように評価されるか、又は、どのアミノ酸が、変異スキャニングデータに基づいてペプチド配列の特定の位置で許容されるかについての、ある種の推定を必要とする。これらの推定を満たさないペプチドは、例えば、ＭＨＣ分子、又はペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドへの結合様式が、標的ペプチド配列の結合様式とは異なるが故に、これらのアプローチにより同定することができない。これは特に、標的ペプチドとは異なる長さを有するペプチド（例えば、十量体標的ペプチド由来の、九量体のオフターゲットペプチド）に関係があり、標的配列とは関係のない、完全に異なるアミノ酸配列を示し得る（Ｅｋｅｒｕｃｈｅ－Ｍａｋｉｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。
【発明の概要】
【0017】
上記の観点から、インビボでの状態にできる限り近づけるという目的を伴った、ＴＣＲの標的エピトープを同定する効率的な方法が、当該技術分野において求められている。これは更に、分析の元で、ＴＣＲ（又はＴＣＲ様分子）と交差反応性である「オフターゲット」エピトープの同定を必要とし、これにより、非常に特異的であるというだけでなく、通常の健常な組織を標的にしない治療薬が開発可能となる。
【0018】
それ故、不正確な予測アルゴリズムの使用、及び、潜在的な、数百～数千個のオフターゲットペプチドの厄介な試験を回避することによるペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドにより結合又は認識される、関連するＭＨＣ結合ペプチドを同定するための、代替かつより直接的な方法を提供することが非常に望ましい。故に、本発明の目的は、包括的及び直接的な方法で、これらの分子により結合可能なオフターゲットペプチド（即ち、ＭＨＣ提示リガンド）を同定するための、そのようなペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドの特性決定方法を提供することである。本発明の他の目的及び利点が、提供される以下の説明を検討する際に、当業者には速やかに明らかとなろう。
【0019】
本発明の第１の態様では、本発明の目的は、
ａ）分析される少なくとも１つのペプチド：ＭＨＣ複合体を含むサンプルを提供するステップと、
ｂ）上記サンプルを上記ポリペプチド分子（「ｐＭＨＣ結合ポリペプチド」）と接触させ、上記ポリペプチド分子の少なくとも１つのペプチド結合ドメインを、上記少なくとも１つのペプチド：ＭＨＣ複合体に結合させるステップと、
ｃ）上記少なくとも１つのペプチド結合ドメインに結合した上記少なくとも１つのペプチド：ＭＨＣ複合体を単離するステップと、
ｄ）ステップｃ）で単離した、上記少なくとも１つのペプチド：ＭＨＣ複合体の上記ペプチドを同定することにより、上記ポリペプチド分子の、上記少なくとも１つのペプチド：ＭＨＣ複合体の上記ペプチドへの結合を同定するステップと、
を含む、少なくとも１つの規定のペプチド結合ドメインを含むポリペプチド分子（「ｐＭＨＣ結合ポリペプチド」）の、ペプチド：ＭＨＣ複合体のペプチド（「標的ペプチド」）への結合の特性決定方法により解決される。
ａ）分析される少なくとも１つのペプチド：ＭＨＣ複合体を含むサンプルを提供するステップと、
ｂ）上記サンプルを上記ポリペプチド分子（「ｐＭＨＣ結合ポリペプチド」）と接触させ、上記ポリペプチド分子の少なくとも１つのペプチド結合ドメインを、上記少なくとも１つのペプチド：ＭＨＣ複合体に結合させるステップと、
ｃ）上記少なくとも１つのペプチド結合ドメインに結合した上記少なくとも１つのペプチド：ＭＨＣ複合体を単離するステップと、
ｄ）ステップｃ）で単離した、上記少なくとも１つのペプチド：ＭＨＣ複合体の上記ペプチドを同定することにより、上記ポリペプチド分子の、上記少なくとも１つのペプチド：ＭＨＣ複合体の上記ペプチドへの結合を同定するステップと、
を含む、少なくとも１つの規定のペプチド結合ドメインを含むポリペプチド分子（「ｐＭＨＣ結合ポリペプチド」）の、ペプチド：ＭＨＣ複合体のペプチド（「標的ペプチド」）への結合の特性決定方法により解決される。
【0020】
一実施形態では、上記ペプチド結合ドメインのアミノ酸配列は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｔ細胞受容体様ポリペプチド、及び／若しくは、抗体、又はその単なる結合ドメインであるか、又はこれに由来する。
【0021】
本明細書で使用する場合、用語「少なくとも１つの規定のペプチド結合ドメインを含むポリペプチド分子」は、用語「ｐＭＨＣ結合ポリペプチド」と同じ意味で用いられる。
【0022】
このようなｐＭＨＣ結合ポリペプチドは、例えば、本明細書の他の箇所で開示した抗体、若しくはその機能性断片若しくは誘導体、又は、本明細書の他の箇所で開示したＴ細胞受容体（本明細書では「ＴＣＲ」とも呼ばれる）、好ましくは可溶性Ｔ細胞受容体、若しくはその機能性断片若しくは誘導体である。
【0023】
結合ポリペプチド内の「規定のペプチド結合ドメイン」という用語は、例えば、抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン、又は、ＴＣＲのα及びβサブユニットの可変ドメインを意味する。
【0024】
結合ポリペプチド内の「規定のペプチド結合ドメイン」という用語は、抗体又はＴＣＲの少なくとも１つの可変ドメインの、少なくとも１つの相補性決定領域（本明細書では「ＣＤＲ」とも呼ばれる）もまた意味する場合がある。本明細書で使用する場合、ペプチド：ＭＨＣ複合体内での「ペプチド」という用語は、用語「標的ペプチド」と同じ意味で用いられる。
【0025】
用語「ペプチド：ＭＨＣ複合体」は、「ｐＭＨＣ複合体」、又は更に「ｐＭＨＣ」と略すことができる。
【0026】
一実施形態に従うと、特許請求した方法において、ポリペプチド分子は任意に、マトリックス物質に結合し、かつ／又は、上記ポリペプチド分子は、マトリックス物質に結合している、又は付着している、少なくとも１つの結合部位を更に含む。
【0027】
本実施形態は、ポリペプチド分子が、例えば反応交差性のために特性決定される、方法それ自体にのみ関係しているということに言及しておくことが重要である。本明細書の他の箇所で論じるように、ポリペプチド分子はそれ自体が可溶性であることができる。
【0028】
一実施形態に従うと、ポリペプチド分子の、ペプチド：ＭＨＣ複合体のペプチドへの結合を特性決定するステップは、ポリペプチド分子の、ペプチド：ＭＨＣ複合体の上記ペプチドへの結合を同定するステップを含む。
【0029】
別の好ましい実施形態では、本開示は、例えば、
ａ）オフターゲットペプチド複合体を含むサンプル、例えば細胞溶解物を提供するステップであって、上記サンプルが、上記ペプチド結合ドメインのペプチド結合特性を規定する標的ペプチド：ＭＨＣ複合体を必ずしも含有しない、ステップと、
ｂ）上記サンプルを、任意にマトリックス物質に結合又は付着したポリペプチドと接触させるステップを含む、上記サンプルをアフィニティ精製するステップであって、上記ポリペプチドが、上記標的ペプチド：ＭＨＣ複合体に結合する少なくとも１つのペプチド結合ドメインを含み、上記ポリペプチドが、上記標的ペプチド：ＭＨＣ複合体の標的ペプチドに結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）及び／又は抗体である、アフィニティ精製するステップと、
ｃ）上記少なくとも１つのペプチド結合ドメインに結合した、上記オフターゲットペプチド：ＭＨＣ複合体を単離するステップと、
ｄ）ステップｃ）で単離した、上記少なくとも１つのオフターゲットペプチド：ＭＨＣ複合体の上記オフターゲットペプチドを同定するステップと、を含む、規定のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）及び／又は抗体ペプチド結合ドメインに結合可能な、オフターゲットペプチド：ＭＨＣ複合体におけるオフターゲットペプチドの同定方法を提供する。
ａ）オフターゲットペプチド複合体を含むサンプル、例えば細胞溶解物を提供するステップであって、上記サンプルが、上記ペプチド結合ドメインのペプチド結合特性を規定する標的ペプチド：ＭＨＣ複合体を必ずしも含有しない、ステップと、
ｂ）上記サンプルを、任意にマトリックス物質に結合又は付着したポリペプチドと接触させるステップを含む、上記サンプルをアフィニティ精製するステップであって、上記ポリペプチドが、上記標的ペプチド：ＭＨＣ複合体に結合する少なくとも１つのペプチド結合ドメインを含み、上記ポリペプチドが、上記標的ペプチド：ＭＨＣ複合体の標的ペプチドに結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）及び／又は抗体である、アフィニティ精製するステップと、
ｃ）上記少なくとも１つのペプチド結合ドメインに結合した、上記オフターゲットペプチド：ＭＨＣ複合体を単離するステップと、
ｄ）ステップｃ）で単離した、上記少なくとも１つのオフターゲットペプチド：ＭＨＣ複合体の上記オフターゲットペプチドを同定するステップと、を含む、規定のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）及び／又は抗体ペプチド結合ドメインに結合可能な、オフターゲットペプチド：ＭＨＣ複合体におけるオフターゲットペプチドの同定方法を提供する。
【0030】
本発明の文脈では、上記サンプルは、分析される少なくとも１つのペプチド：ＭＨＣ複合体を含む、任意の好適な天然又は人工サンプル、例えば、細胞溶解物、又は、精製若しくは濃縮されたペプチド：ＭＨＣ複合体を含むサンプルから選択することができる。ペプチド：ＭＨＣ複合体の組成物／特性、加えて、分子の濃度／量は、既知であるか、又は未知であることができる。サンプルの一例は、ペプチド：ＭＨＣ複合体のライブラリーであり、結合したペプチドの配列は定義されている、かつ／又は、その長さ及びアミノ酸配列が類似している。
【0031】
一実施形態では、上記少なくとも１つのペプチド結合ドメインを含むポリペプチド分子は、更なる結合特異性を含まない、即ち、当該ポリペプチド分子は、ペプチド又はペプチド：ＭＨＣ複合体に対して単一特異的である。
【0032】
本発明に従った方法の異なる実施形態では、上記少なくとも１つのペプチド結合ドメインを含むポリペプチド分子は、二重特異的、三重特異的、四重特異的、又は多重特異的分子から選択される。
【0033】
本発明の方法の文脈における「二重特異的」という用語は、少なくとも２の価数、及び、２つの異なる抗原に対する結合特異性を有するポリペプチド分子を意味し、故に、２つの抗原結合部位を含む。本発明に従うと、これらの抗原結合部位のうちの１つは、規定のペプチド結合ドメインである。用語「価数」とは、ポリペプチド分子の結合部位の数を意味し、例えば、二価ポリペプチドとは、２つの結合部位を有するポリペプチドに関する。用語「価数」とは、結合部位の数を意味し、これらの結合部位は、同一の又は異なる標的に結合可能である、即ち、二価ポリペプチド分子は単一特異的、即ち１つの標的に結合可能であるか、又は二重特異的、即ち、２つの異なる標的に結合可能であることに留意すべきである。
【0034】
この場合、ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｔ細胞受容体様ポリペプチド、及び／若しくは抗体、又は、これらの分子の断片であって、上記分子が、特定の／規定のペプチド：ＭＨＣ複合体に結合可能である、又は、結合するのを媒介可能である、断片であるか、又はこれに由来する。
【0035】
少なくとも１つのペプチド結合ドメインは、分子であることができるか、抗体、同時多重相互作用Ｔ細胞エンゲージ（ＳＭＩＴＥ）との二重特異的性、二重特異的Ｔ細胞誘起（ＢｉＴＥ）、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、二重親和性再標的化抗体（ＤＡＲＴ）、タンデム抗体（ＴａｎｄＡｂ）、可溶性ＴＣＲ、ｓｃＴＣＲ、例えばＳブリッジを含む変異ＴＣＲ、切頭ＴＣＲ、及び、二重特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）－抗体融合分子から選択される分子に由来する。
【0036】
一例では、少なくとも１つのペプチド結合ドメインは抗体であることができるか、又は、抗体に由来する。
【0037】
本発明の文脈では、「規定された」ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチド、又は、ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチド「を規定する」とは、ＭＨＣの文脈で、選択された（「標的化された」）ＭＨＣペプチドに結合する、（結合ドメインを構成する、又は結合ドメインを含む）ポリペプチドを意味しなければならない。好ましい実施形態では、ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドの、選択されたＭＨＣペプチドへの上記結合は、他の（既知の）ＭＨＣペプチドと比較したときに、最も高い親和性及び／又は選択性を伴って生じる。
【0038】
本発明の文脈で使用する例は、ＰＲＡＭＥ－００４ペプチドＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号１）への親和性を示す、実施例１、３、４、及び５の規定のペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチド、並びに、本明細書ではＭＡＧＥＡ４／８ペプチドとも呼ばれる、配列ＫＶＬＥＨＶＶＲＶ（配列番号２４）を有する、ＭＡＧＥＡ４／Ａ８由来のペプチドへの向上した親和性を示す、実施例２の規定のペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドである。
【0039】
規定のペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドへの結合は、ＭＨＣに関して標的化されたペプチドへの結合、又は、標的化されたペプチド及びＭＨＣポリペプチドの両方への結合を含み得る。
【0040】
近年では、ペプチドリガンドに対するＴＣＲ及びＴＣＲ様分子の、いくつかのスクリーニング法が記載されているものの、現在まで、このような方法は限定的な成功しか成し遂げていない。例えば、Ｂｉｒｎｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．は、約２．１×１０８個の抗原ミニジーンのペプチド：ＭＨＣ（「ｐＭＨＣ」）酵母ディスプレイライブラリーを開発した（Ｂｉｒｎｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。Ｂｉｒｎｂａｕｍのシステムを用い、可溶性ＴＣＲに結合した細胞を磁気ビーズで精製し、その後、ハイスループット配列決定に供した。４ラウンドの選択の後、５つの異なるマウスＴＣＲと交差反応性である数百個のペプチドを同定した。しかし、ＴＣＲが結合することが知られている元のエピトープは、検出されなかった。
【0041】
本発明は、好ましくはペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドを用いて、ペプチド及びタンパク質（例えば、組換え作製したペプチド：ＭＨＣ分子の組織又は細胞株、ライブラリーから作製したタンパク質溶解物）などの、有機分子の混合物から、特異的ペプチド：ＭＨＣ分子を単離又は濃縮し、例えばその後の質量分析により、単離したペプチド：ＭＨＣ分子を分析し、結合したペプチドの配列を同定する。
【0042】
本発明の方法は、現況技術の方法と比較して多数の利点を有し、これらは「オフターゲット予測アプローチ」として示すことができる。
【0043】
オフターゲット結合因子の実際の同定のために、予測アプローチにおいては、結合因子モチーフを用いてペプチドの広範な一覧を予想し、次いで手のかかるインビトロ試験に入る。本発明では、細胞溶解物などのサンプルからの直接同定が可能である。これには、インビトロアッセイでの、予想したペプチドの厄介な試験を必要としない。更に、本方法は非常に感度が高いため、弱く交差識別されたペプチドでさえも同定可能であることが発見された。
【0044】
予測アプローチでは、未知のオフターゲット認識源の同定は不可能である。対照的に、本発明を用いると、サンプル、例えば溶解物を作製して、ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドによるアフィニティクロマトグラフィー実験において、上記溶解物を用いることにより、このことが可能となる。
【0045】
予測アプローチでは、結合因子モチーフの生成が位置スキャニングデータから推測されるが、本発明では、結合因子モチーフの生成は、同定したオフターゲットから推測され、必要な以前のインビトロ試験を用いることなく、ペプチドアミノ酸配列中での異なる位置において、複数の置換が存在すると更にみなされる。
【0046】
更に、提示された方法は、特異的ＨＬＡアロタイプ（例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１）の分析に限定されず、異なるＨＬＡアロタイプにより提示されるオフターゲットを同定するためにも使用可能である。これらのアロ反応性は、現在利用可能な標準的なアプローチでは評価するのが困難であり、予測方法では対応できない。
【0047】
最終的に、ペプチド配列の長さのバリアント及び修飾に関して、予測アッセイでは、長さバリアント又は天然に存在するペプチド修飾の予測は不可能であり、本アッセイは、あらゆる長さバリアント、並びに、自然に存在するペプチド修飾、例えばリン酸化及びグリコシル化などの、直接同定を可能にする。
【0048】
一実施形態では、生体サンプル又は生物工学的生産に由来するペプチド：ＭＨＣ分子の混合物由来の上記ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドにより認識される、ペプチド：ＭＨＣ分子の濃縮又は単離、及び、例えば質量分析による、濃縮／単離ペプチド：ＭＨＣ分子の同定、及び、その後の、同定した分子の、インビトロでの同一ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドにより結合する能力の試験を含む本方法は、ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドにより結合したペプチドを特異的かつ確実に同定する。
【0049】
ペプチド：ＭＨＣ複合体に結合する上記少なくとも１つのペプチド結合ドメインを含む上記ポリペプチド分子が、二重特異的、三重特異的、四重特異的、又は多重特異的分子から選択される、本発明に従った方法が好ましい。
【0050】
上記少なくとも１つのペプチド結合ドメインを含む上記ポリペプチド分子が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に由来するペプチド結合ドメインを含む二重特異的分子である、本発明に従った方法が更に好ましい。
【0051】
別の態様では、標的ペプチド：ＭＨＣ複合体に結合する上記少なくとも１つのペプチド結合ドメインを含有するポリペプチドは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に由来する結合ドメインを含む二重特異的分子であってよい。
【0052】
他の態様では、本明細書に記載する方法は、結合特性が異なる一連のポリペプチドを選択するステップを更に含むことができる。
【0053】
有利には、独立した特許請求の範囲で説明される、提示された方法は、上で説明した、標的ペプチドの個別の位置における、単一のアミノ酸の置換による、結合モチーフの決定、その後の機能アッセイにおける、これらのバリアントの認識試験、次いでの、ヒトプロテオームデータベースを用いる上記結合モチーフに基づく、潜在的なオフターゲットの予測、及びその後の、インビトロアッセイでのこれらの（潜在的に）多数のペプチドの試験を必ずしも必要としない。
【0054】
別の態様では、本明細書に記載する方法は、上、及び、本明細書における比較例で説明した、適切なＨＬＡアロタイプにより生体サンプル上に提示される関連ペプチド上に焦点を当てることによる、予測ベースのアプローチと比較して、好ましくは、同定したオフターゲットペプチドの数を、少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍、及び最も好ましくは少なくとも１０倍、低下させる。
【0055】
別の態様では、少なくとも１つの結合ドメインは、検出可能なマーカー又はラベルを含有し得る。
【0056】
本発明の一実施形態に従うと、上記ペプチド：ＭＨＣ結合ドメインの交差反応性を、少なくとも１つの細胞傷害性実験により更に探索する。これは、例えば、示した濃度のＰＲＡＭＥ－００４特異的ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドの存在下で、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞（５０，０００ｃｅｌｌｓ／ウェル）で同時インキュベートした、対応するペプチドを負荷したＴ２細胞により行うことができる（図４、及び本明細書の他の箇所での対応する説明を参照されたい）。
【0057】
本発明は、ａ）物質、例えば、本明細書に記載するマトリックス物質、及び、ｂ）標的ペプチド：ＭＨＣ複合体に結合する少なくとも１つの結合ドメインを含有するポリペプチドを含む方法を行うための物質を含有するキットにもまた関係し得る。
【0058】
本発明は更に、少なくとも１つの規定のペプチド結合ドメインを含むポリペプチド分子（「ｐＭＨＣ結合ポリペプチド」）であって、当該ポリペプチド分子の、ペプチド：ＭＨＣ複合体のペプチド（「標的ペプチド」）への結合が、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法により特性決定された、ポリペプチド分子に関する。
【0059】
このようなポリペプチド分子は、本明細書の他の箇所における方法の文脈で論じたように、抗体若しくはＴ細胞受容体、又は修飾フォーマットであることができる。
【0060】
このようなポリペプチド分子は、本明細書の他の箇所における方法の文脈で論じたように、単一特異的、二重特異的、又は多重特異的であることができる。
【0061】
このようなポリペプチド分子は、本明細書の他の箇所における方法の文脈で論じたように、可溶性であることができる。
【0062】
このようなポリペプチド分子は、ペプチド：ＭＨＣ複合体のペプチド（「標的ペプチド」）、又は、ペプチド：ＭＨＣ複合体に対して、ＫＤ＜５００ｎＭの親和性を有することができる。
【0063】
本方法の文脈で論じたポリペプチド分子の、好ましい全ての実施形態はここでも同様に適用され、経済性のために、繰り返しはしない。
【0064】
本発明は更に、宿主細胞を提供するステップと、第２のポリペプチドをコードするコード配列を含む、標的特異的抗原を認識する構築物を提供するステップと、上記宿主細胞に、上記標的特異的抗原を認識する構築物を導入するステップと、上記標的特異的抗原を認識する構築物を宿主細胞により発現するステップと、を含む、標的特異的抗原を認識する構築物を発現する細胞集団の製造方法に関する。別の態様では、発現することは、抗原を認識する構築物を細胞表面上に提示することを含み得る。
【0065】
別の態様では、標的特異的抗原を認識する構築物は、上記コード配列に作動可能に結合したプロモーター配列を含有する発現構築物であってよい。更に別の態様では、標的特異的抗原を認識する構築物は、哺乳類由来、所望によりヒト由来のものであってよい。標的特異的抗原を認識する構築物は更に、修飾ＴＣＲであってよく、上記修飾は、ラベルを含む機能的ドメイン、又は、膜アンカードメインを含む代替ドメインを付加することを含む。
【0066】
別の態様では、標的特異的抗原を認識する構築物は、α／βＴＣＲ、γ／δＴＣＲ、又は一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）であってよい。別の態様では、標的特異的抗原を認識する構築物は、レトロウイルス形質導入により、上記好適な宿主細胞に導入することができる。更に別の態様では、本明細書に記載の方法は、標的特異的抗原を認識する構築物を宿主細胞から単離して精製するステップと、及び所望により、標的特異的抗原を認識する構築物をＴ細胞中で再構築するステップと、を更に含んでよい。
【0067】
一態様では、本発明は、本発明の方法により作製される細胞集団、特に、Ｔ細胞集団に関する。
【0068】
本発明の方法により作製される標的特異的抗原を認識する構築物及び細胞、特にＴ細胞は、疾患に対する治療において改善された特性を示すことが予想され、上記治療は免疫療法を含む。本方法が、インビボでの状況に近い／より類似する状況に似ているという事実によって、遭遇するオフターゲットへの影響、及び副作用が少なくなる。これは、医学的及び臨床的用途に利点を有する。ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１トランスジェニックマウスの免疫付与に由来する、修飾抗ＭＡＧＥ－Ａ３ ＴＣＲを試験する臨床治験において、脳で発現した同一遺伝子ファミリーに由来するペプチドの認識により、９名の癌患者のうち２名で、致死的な標的神経系毒性が進行した（Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。
【0069】
親和性が向上した抗ＭＡＧＥ－Ａ３ ＴＣＲを骨髄腫及び黒色腫患者で試験した別の治験において、完全に異なるペプチドの認識により引き起こされた、オフターゲット毒性の患者２名が死亡し、深刻な心筋障害をもたらした（Ｌｉｎｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。これらの臨床症例は、最適な胸腺選択を受けなかったＴＣＲの正確な特異性及び得られた効果を予想することが、どれだけ困難であるかを示す。特に、ＴＣＲ組換えＴ細胞は非常に感度が高いために、ＴＣＲの正確な特異性を広範にわたり確認するための方法を開発することが重要である（Ｊａｈｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｓｔｏｎｅ ａｎｄ Ｋｒａｎｚ，２０１３）。
【0070】
別の態様では、本発明は、上述の細胞集団を含む組成物を患者に投与することを含む、癌を有する患者の治療方法であって、癌が、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、腎細胞癌、脳腫瘍、胃癌、結腸直腸癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）、膵臓癌、前立腺癌、白血病、乳癌、メルケル細胞癌、黒色腫、卵巣癌（ＯＣ）、泌尿器膀胱癌、子宮癌、胆嚢及び胆管癌、食道癌（ＯＳＣＡＲ）急性骨髄性白血病、胆管細胞癌、慢性リンパ性白血病、グリア芽腫、頭頸部の扁平上皮細胞癌、非ホジキンリンパ腫、並びに子宮体癌から選択される、方法に関する。
【0071】
別の態様では、宿主細胞は患者から入手することができる。別の態様では、宿主細胞は健常なドナーから入手することができる。別の態様では、宿主細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞であってよい。
【0072】
別の態様では、ＭＨＣ分子はＭＨＣクラスＩ分子であってよい。別の態様では、ＭＨＣ分子はＨＬＡ－Ａ＊０２分子であってよい。
【0073】
上記ポリペプチド分子が、免疫細胞の活性化を誘発することが知られている細胞表面分子に結合するドメインから選択される、少なくとも１つの第２の結合ドメインを含むか、又は、免疫応答関連分子、好ましくは、ＣＤ３、若しくは、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、及びＣＤ３ε鎖、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ４１、ＣＤ４１ｂ、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４４、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４９、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ９４、ＣＤ９０、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１２５、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１６３、ＣＤ１９３、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９、ＣＤ２８７、Ｎｋｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＧＩＴＲ、ＦｃεＲＩ、ＴＣＲα／β、ＴＣＲγ／δ、及びＨＬＡ－ＤＲなどの、その鎖のうちの１つに結合する、第２の結合ドメインからなる群から選択される、本発明に従った方法が好ましい。
【0074】
一実施形態に従うと、上記少なくとも１つのペプチド結合ドメインを含むポリペプチド分子は、可溶性分子である。本明細書の他の箇所で論じる、このような可溶性ポリペプチド分子、例えば抗体、Ｔ細胞受容体、又はその誘導体は、好ましい治療様式である。
【0075】
一実施形態に従うと、ポリペプチド分子は、ペプチド：ＭＨＣ複合体のペプチド（「標的ペプチド」）、又は、ペプチド：ＭＨＣ複合体に対して、ＫＤ＜１００ｎＭの親和性を有する。
【0076】
ＫＤは解離定数、即ち、標的－結合因子複合体が可逆的に分離（解離）する性質を測定する、平衡定数である。ＫＤを測定する一方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
【0077】
好ましくは、ポリペプチド分子は、ペプチド：ＭＨＣ複合体のペプチド（「標的ペプチド」）、又はペプチド：ＭＨＣ複合体に対して、ＫＤ＜１００ｎＭ；＜５０ｎＭ；＜２０ｎＭ；＜１０ｎＭ；＜５ｎＭ；＜２ｎＭ；＜１ｎＭ；＜５００ｐＭ；＜４００ｐＭ；＜３００ｐＭ；＜２００ｐＭ；＜１００ｐＭ；＜５０ｐＭ；＜２０ｐＭ；＜１０ｐＭ；又は＜１ｐＭの親和性を有する。１０ｎＭ～５００ｐＭの範囲が最も好ましい。
【0078】
本発明に従った方法の別の態様では、上記マトリックス物質に結合しているか又は付着している、上記付着部位は、少なくとも１つの結合ドメイン、少なくとも１つの第２ドメイン中に存在するか、又は、個別の連結基であり、上記分子の結合と本質的に干渉しない。
【0079】
ペプチド：ＭＨＣ分子の単離が、上記ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドの、固体マトリックスへのカップリングの後に、アフィニティクロマトグラフィー又は免疫沈降により実施される、本発明に従った方法が好ましい。
【0080】
上記マトリックス物質がＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）又はアガロースから選択される、本発明に従った方法が好ましい。にもかかわらず、結合は、固体マトリックスを用いずに溶液中で（バッチとして）実施することもまた可能であり、複合体は、例えば抗体、沈殿、濾過などを用いて、好適に単離することができる。
【0081】
別の態様では、上記方法は、ステップｂ）及び／又はｃ）における上記サンプルを、例えば、広範な特異的ＴＣＲ及び／又は抗体などの、１つ以上の他の結合ドメイン分子と接触させるステップを更に含むことができる。
【0082】
このような広範な特異的結合ドメイン分子は、それに結合したペプチドに関係なく、１つ以上のＭＨＣ分子のみに対して結合特異性を有する、結合ドメイン分子であるのが好ましい。このような結合分子は、本明細書では、ＭＨＣ汎特異的と呼ばれる。
【0083】
本方法の一実施形態では、
（ｉ）サンプルの第１の画分がｐＭＨＣ結合ポリペプチドと接触し、
（ｉｉ）サンプルの第２の画分が、別のｐＭＨＣ結合ポリペプチド又はＭＨＣ汎特異的結合分子と接触し、
更に、ｐＭＨＣ結合ポリペプチド、及び、他のｐＭＨＣ結合ポリペプチド又はＭＨＣ汎特異的結合分子に結合したペプチド：ＭＨＣ複合体を単離した後で、２つの画分で実現した単離効率を比較する。
（ｉ）サンプルの第１の画分がｐＭＨＣ結合ポリペプチドと接触し、
（ｉｉ）サンプルの第２の画分が、別のｐＭＨＣ結合ポリペプチド又はＭＨＣ汎特異的結合分子と接触し、
更に、ｐＭＨＣ結合ポリペプチド、及び、他のｐＭＨＣ結合ポリペプチド又はＭＨＣ汎特異的結合分子に結合したペプチド：ＭＨＣ複合体を単離した後で、２つの画分で実現した単離効率を比較する。
【0084】
これは例えば、並行して行った対応する単離の質量分析データセットを、異なる結合分子と組み合わせることにより実現することができる。実施例２に示すように、同定した各ペプチドの定量データにより、異なるｐＭＨＣ結合ポリペプチド又はｐＭＨＣ結合ポリペプチドと、ＭＨＣ汎特異的結合分子との間での、ペプチドの単離効率の比較が可能となる。
【0085】
これにより、ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチド、及び広範な特異的ＴＣＲ又は抗体の、倍率変化／濃縮因子の計算により分析した生体サンプルにおける、各ペプチドの自然存在比及び任意の非特異的結合の補正が可能となる。
【0086】
本方法の一実施形態では、ステップｂ）又はｃ）において、多量の過剰のｐＭＨＣ結合ポリペプチド、及び所望により、ＭＨＣ汎特異的結合分子がアプライされる。このような方法において、各ペプチドの回収は、利用可能な結合部位の数により限定されない。
【0087】
本方法の更なる一実施形態では、サンプル中の異なるペプチドに対する、第１及び第２の画分で使用した結合因子（結合ポリペプチド又は結合分子）の結合親和性を、例えば、実施例３に示すように、単離効率の比較に基づいて測定する。
【0088】
本発明者らは、驚くべきことに、バイオ層干渉法により行われる比較実験により確認されるように、ＭＨＣ汎特異的結合分子（例えば、抗体ＢＢ７．２及びｐＭＨＣ結合ポリペプチド）間の、個別のペプチドの回収（＝接触及び単離）率が、これらのペプチド（標的及びオフターゲット）に対する、ｐＭＨＣ結合ポリペプチドの結合親和性と相関することを示した（この場合、Ｏｃｔｅｔ測定；図１２（後者はグレースケールの着色として表現）、及び図１３を参照されたい）。
【0089】
故に、単離は、ペプチド：ＭＨＣ複合体を、ＭＨＣ分子に対する汎特異的抗体と接触させることを含み得るのが好ましい。別の態様では、抗体は、Ｗ６／３２、Ｂ１．２３．２、ＢＢ７．２、ＧＡＰ－Ａ３、Ｓｐｖ－Ｌ３、Ｔｕ３９、Ｌ２４３、又はＩＶＤ－１２から選択される少なくとも１つであることができる。ペプチド：ＭＨＣ分子のＭＨＣ構成成分に向けられ、故に、ペプチドに結合したペプチド配列の性質に関係なく、ある種のＭＨＣアロタイプに結合したペプチド全ての単離を可能にする、広範な特異的（又は多重特異的、又は単一特異的）ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドと並行しての、上記ペプチド：ＭＨＣ分子の単離を含む方法（図１）が、更に好ましい。述べたように、このような広範な特異的ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドは、抗体、例えばＨＬＡ－Ａ＊０２汎特異的抗体ＢＢ７．２、又は、汎ＨＬＡ－Ａ，Ｂ，Ｃ特異的抗体Ｗ６／３２であることができるが、これらに限定されない。更なる、マウスハイブリドーマ由来の抗体、及び関連する、ヒトＭＨＣ分子に対する汎特異性を、表１に列挙する。
【0090】
【表1】
【0091】
並行して行った、対応する単離の質量分析データセットを組み合わせることにより、同定した各ペプチドの定量データが得られ、実施例２に示すように、異なるペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチド又はペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドと、広範な特異的ＴＣＲ又は抗体との間での、ペプチドの単離効率の比較が可能となる。これにより、ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチド、及び広範な特異的ＴＣＲ又は抗体の、倍率変化／濃縮因子の計算により分析した生体サンプルにおける、各ペプチドの自然存在比及び任意の非特異的結合の補正が可能となる。
【0092】
例えば、単離手順で利用する物質の表面に結合するペプチド：ＭＨＣ分子の混合物から、非特異的な結合ペプチドを単離し枯渇させるための、更なるステップを含有する方法での、ペプチドの単離を含む方法が、更に好ましい。このようなステップは、固体マトリックス（例えば、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）、アガロース）を含有するが、ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドを含有せず、ペプチド：ＭＨＣ分子の混合物が、対応するペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドを用いる単離ステップの前にアプライされる、別のアフィニティクロマトグラフィーカラムで構成されてよい（図１を参照されたい）。これらの、非特異的に結合したペプチドのその後の抽出（溶出）、及び、質量分析により同定により、それらの同定が可能となり、これらのペプチドを更なる分析から排除することができる。
【0093】
ステップｄ）における上記同定するステップが、質量分析及びペプチド配列決定から選択される方法を含む、本発明に従った方法が好ましい。
【0094】
本発明の方法の一実施形態に従うと、ポリペプチド分子の、ペプチド：ＭＨＣ複合体のペプチドへの結合を特性決定するステップは、上記ペプチド：ＭＨＣ結合ドメインに対する上位結合モチーフを同定するステップを含む。
【0095】
この実現方法の詳細は図７、及び対応する説明、並びに、実施例１に示される。
【0096】
本発明の方法の一実施形態に従うと、ポリペプチド分子の、ペプチド：ＭＨＣ複合体のペプチドへの結合を特性決定するステップは、
ａ）上記ペプチド：ＭＨＣ結合ドメインに対するポリペプチド分子の、位置ベース、及び／若しくは上位結合モチーフを同定するステップ、並びに／又は、
ｂ）提示した適用により同定されるペプチドを用いて、ペプチド：ＭＨＣ結合ドメインに対するポリペプチド分子の、オフターゲットペプチドを同定するステップを含む。
ａ）上記ペプチド：ＭＨＣ結合ドメインに対するポリペプチド分子の、位置ベース、及び／若しくは上位結合モチーフを同定するステップ、並びに／又は、
ｂ）提示した適用により同定されるペプチドを用いて、ペプチド：ＭＨＣ結合ドメインに対するポリペプチド分子の、オフターゲットペプチドを同定するステップを含む。
【0097】
この実現方法の詳細は図７、及び対応する説明、並びに、実施例１に示される。
【0098】
本発明の方法の一実施形態に従うと、ポリペプチド分子の、ペプチド：ＭＨＣ複合体のペプチドへの結合を特性決定するステップは、別のペプチド：ＭＨＣ結合ドメインに対する上記ペプチドの交差反応性を探索、及び／又は同定するステップを含む。
【0099】
本明細書で使用する場合、用語「上位結合モチーフ」とは、どのアミノ酸が、ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドの結合を依然として維持しながら、ペプチド配列のどの位置で許容されるかを説明するために用いられる。
【0100】
本明細書で使用する場合、用語「位置ベースの結合モチーフ」とは、結合したペプチドのアミノ酸配列中のどの位置が、ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドとの相互作用と関連があるかを説明するために用いられる。
【0101】
本明細書で使用する場合、用語「オフターゲットペプチド配列」とは、所与のペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドに結合可能ではあるが、その配列が、ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドが元々設計された、又は選択されたペプチドの配列とはずれている、ペプチド配列に関する。したがって、このようなオフターゲットペプチド配列が、例えば、健常な非癌性組織で示される場合、ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドが、健常な組織に対して細胞傷害性活性（「別の腫瘍／オフターゲット」毒性）を示すというリスクが存在する。
【0102】
この実現方法の詳細は、図７、及び図１２～１５、並びに対応する説明、並びに提示する実施例にて示される。同定したペプチド配列を使用して、ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドの結合特性についての情報を推測する、本発明に従った方法が、更に好ましい。このような情報を使用して、例えば、ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドの結合モチーフを生成することができる。これらの結合モチーフは一般に、結合したペプチドのアミノ酸配列中のどの位置が、ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドとの相互作用と関連があるか（「位置ベースの結合モチーフ」）、及び更に、どのアミノ酸が、ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドの結合を依然として維持しながら、ペプチド配列のどの位置で許容されるか（「上位結合モチーフ」）を説明するために使用される。同定したペプチドのアミノ酸配列、及び、選択した位置におけるペプチド配列の存在を分析することにより、これらの結合モチーフの生成が容易になる。後者を更に使用して、検索基準として結合モチーフ内に含有される情報を用いて、例えばタンパク質配列データベースから、安全性に関連するオフターゲットを予測することを実施することができる。
【0103】
単離ステップの後で、含有されるペプチド配列全てが、同定される配列一致において最大感度、及び、高い信頼にて包括的、定量的に同定されるという方法で、配列同定が質量分析により達成される、本発明に従った方法が好ましい。
【0104】
本発明の文脈では、以下に列挙する技術及び方法のうちの１つを適用するのが、好ましい場合がある：
ａ）任意数の、異なる質量分析機械及び質量分析断片化技術の、特定の使用又は組合せ（例えば、衝突誘起解離（ＣＩＤ）、表面誘起解離（ＳＩＤ）、電子捕獲解離（ＥＣＤ）、高エネルギーＣトラップ解離（ＨＣＤ）、電子移動解離（ＥＴＤ）、陰電子移動解離（ＮＥＴＤ）、電子脱離解離（ＥＤＤ）、赤外線多光子解離（ＩＲＭＰＤ）、黒体赤外放射解離（ＢＩＲＤ）、電子移動／高エネルギー衝突解離（ＥＴＨＣＤ）、紫外光解離（ＵＶＰＤ）、電子移動及び衝突誘起解離（ＥＴＣＩＤ））、又は、ペプチドタンデムＭＳシグナル（ＭＳ／ＭＳ）スペクトルの良好な配列カバレッジを可能にする、活性化エネルギー、
ｂ）データ依存性（ＤＤＡ）、加えて、データ独立性獲得モード（ＤＩＡ）での質量分析実験。これは、予め規定されたペプチド配列の一覧を用いる、特定の獲得方法（標的化分析）、又は、理論上の全ての質量スペクトルの連続ウィンドウ獲得（ＳＷＡＴＨ）分析といった他の方法を更に含むことができる。
ｃ）例えば、質量分析の前に、又はこれに直接連結した、ＨＰＬＣ（例えば、水中でのアセトニトリル勾配による、ナノＵＨＰＬＣの実行）により、ペプチド混合物の事前分離。
ｄ）よりロバストな統計評価を可能にするための、同一ペプチド混合物の複製測定。
ｅ）これらの検索エンジン、加えて、新規の配列同定アルゴリズムのうちの１つを用いる、異なる検索エンジン（例えば、ＭＡＳＣＯＴ、Ｓｅｑｕｅｓｔ、Ａｎｄｒｏｍｅｄａ、Ｃｏｍｅｔ、ＸＴａｎｄｅｍ、ＭＳ－ＧＦ＋）、又はソフトウェアツールを用いる、ＭＳ／ＭＳスペクトルの検索。
ｆ）例えば、ｐＤｅｅｐ（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｔ．， ２０１７）として、ＭＳ／ＭＳスペクトル予測のために演算ツールを更に用いる検索。
ｇ）異なるタンパク質配列データベース（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ、ＩＰＩ）に対するＭＳ／ＭＳスペクトル、加えて、特定の目的のために生成したカスタム配列データベース（例えば、ｍＲＮＡ配列から翻訳したタンパク質配列）の検索。
ｈ）問題のペプチドの合成バージョンを質量分析測定し、例えば、ＨＰＬＣカラム上での、それらのＭＳ／ＭＳスペクトル、及びそれらの保持時間といった、ペプチド特有の特徴を比較することにより、それらの同一性を確認すること。
ｉ）以前に同定したＭＳ／ＭＳスペクトルのデータベース（例えば、スペクトルライブラリー、又はスペクトルアーカイブ）を伴う、ＭＳ／ＭＳスペクトルの検索。このデータベースは、新しく記録したＭＳ／ＭＳスペクトルを、既に同定したペプチド配列の対応するＭＳ／ＭＳスペクトルと比較することによる、ペプチド同定プロセスのために用いることができる。
ｊ）同定プロセスを補助するための、既に同定したペプチドの、実験又は予測保持時間（ＲＴ）の情報を更に記憶する、ｉ）で記載した任意のデータベース。
ｊ）例えば、適切なアルゴリズム（例えばＳｕｐｅｒＨｉｒｎ）（Ｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００７）を用いる、ＭＳの特徴の抽出及び一体化による、ＭＳ、又はＭＳ／ＭＳレベルにおけるペプチドシグナル面積の定量的評価。
ａ）任意数の、異なる質量分析機械及び質量分析断片化技術の、特定の使用又は組合せ（例えば、衝突誘起解離（ＣＩＤ）、表面誘起解離（ＳＩＤ）、電子捕獲解離（ＥＣＤ）、高エネルギーＣトラップ解離（ＨＣＤ）、電子移動解離（ＥＴＤ）、陰電子移動解離（ＮＥＴＤ）、電子脱離解離（ＥＤＤ）、赤外線多光子解離（ＩＲＭＰＤ）、黒体赤外放射解離（ＢＩＲＤ）、電子移動／高エネルギー衝突解離（ＥＴＨＣＤ）、紫外光解離（ＵＶＰＤ）、電子移動及び衝突誘起解離（ＥＴＣＩＤ））、又は、ペプチドタンデムＭＳシグナル（ＭＳ／ＭＳ）スペクトルの良好な配列カバレッジを可能にする、活性化エネルギー、
ｂ）データ依存性（ＤＤＡ）、加えて、データ独立性獲得モード（ＤＩＡ）での質量分析実験。これは、予め規定されたペプチド配列の一覧を用いる、特定の獲得方法（標的化分析）、又は、理論上の全ての質量スペクトルの連続ウィンドウ獲得（ＳＷＡＴＨ）分析といった他の方法を更に含むことができる。
ｃ）例えば、質量分析の前に、又はこれに直接連結した、ＨＰＬＣ（例えば、水中でのアセトニトリル勾配による、ナノＵＨＰＬＣの実行）により、ペプチド混合物の事前分離。
ｄ）よりロバストな統計評価を可能にするための、同一ペプチド混合物の複製測定。
ｅ）これらの検索エンジン、加えて、新規の配列同定アルゴリズムのうちの１つを用いる、異なる検索エンジン（例えば、ＭＡＳＣＯＴ、Ｓｅｑｕｅｓｔ、Ａｎｄｒｏｍｅｄａ、Ｃｏｍｅｔ、ＸＴａｎｄｅｍ、ＭＳ－ＧＦ＋）、又はソフトウェアツールを用いる、ＭＳ／ＭＳスペクトルの検索。
ｆ）例えば、ｐＤｅｅｐ（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｔ．， ２０１７）として、ＭＳ／ＭＳスペクトル予測のために演算ツールを更に用いる検索。
ｇ）異なるタンパク質配列データベース（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ、ＩＰＩ）に対するＭＳ／ＭＳスペクトル、加えて、特定の目的のために生成したカスタム配列データベース（例えば、ｍＲＮＡ配列から翻訳したタンパク質配列）の検索。
ｈ）問題のペプチドの合成バージョンを質量分析測定し、例えば、ＨＰＬＣカラム上での、それらのＭＳ／ＭＳスペクトル、及びそれらの保持時間といった、ペプチド特有の特徴を比較することにより、それらの同一性を確認すること。
ｉ）以前に同定したＭＳ／ＭＳスペクトルのデータベース（例えば、スペクトルライブラリー、又はスペクトルアーカイブ）を伴う、ＭＳ／ＭＳスペクトルの検索。このデータベースは、新しく記録したＭＳ／ＭＳスペクトルを、既に同定したペプチド配列の対応するＭＳ／ＭＳスペクトルと比較することによる、ペプチド同定プロセスのために用いることができる。
ｊ）同定プロセスを補助するための、既に同定したペプチドの、実験又は予測保持時間（ＲＴ）の情報を更に記憶する、ｉ）で記載した任意のデータベース。
ｊ）例えば、適切なアルゴリズム（例えばＳｕｐｅｒＨｉｒｎ）（Ｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００７）を用いる、ＭＳの特徴の抽出及び一体化による、ＭＳ、又はＭＳ／ＭＳレベルにおけるペプチドシグナル面積の定量的評価。
【0105】
癌性、及び／又は非癌性細胞又は組織における、上記１つ又は複数のペプチドの提示を同定するステップを更に含む、本発明に従った方法が好ましい。
【0106】
このような同定方法は、癌性、又は非癌性組織における、本明細書の他の箇所で開示したように同定される、結合モチーフの同定、加えて、オフターゲットペプチド配列の同定の両方を含む。
【0107】
この目的のために、癌性、及び非癌性組織のサンプル由来の細胞で示されるペプチド：ＭＨＣ複合体を分析することができる。
【0108】
これを行う一方法は、例えば、免疫親和性捕捉による、ペプチド：ＭＨＣ複合体（「イムノペプチド－ム」）全体を単離することである。次いで、示されたペプチドを、例えば酸変性により、ＭＨＣから解離することができる。次いで、ペプチドカーゴをＨＰＬＣにより抽出して画分に分離し、これらの画分中のペプチド配列を、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより同定する。このようにして、癌性細胞及び感染細胞、並びに、組織由来の細胞を含む、多種多様の細胞型から、数千ものペプチドを同定することができる。
【0109】
このように入手したペプチド配列を次いで、対応するペプチドが、癌性及び／又は非癌性細胞又は組織で発見されたか否かについての注釈と共に、データベースに入れる。次いで、このようなデータベースを、本明細書の他の箇所に記載されているように同定した結合モチーフ又は上位モチーフに対応するペプチドの提示により、スキャンすることができる。
【0110】
これを実現するための方法及び手順はとりわけ、国際公開第２００５０７６００９号、国際公開第２０１１１２８４４８号、及び国際公開第２０１６１０７７４０号に開示されており、これらの内容全体が参照により本明細書に組み込まれており、これら全てが、本出願人に割り当てられる。
【0111】
したがって、本発明の方法は、以下に挙げるが、これらに限定されない技術：
ｉ）異なる正常又は癌性組織、加えて細胞株における、上記オフターゲットペプチドの源遺伝子の遺伝子発現プロファイルの分析、
ｉｉ）異なる正常又は癌性組織、加えて細胞株における、上記オフターゲットのペプチド提示プロファイルの分析、及び、
ｉｉｉ）異なる正常又は癌性組織、加えて細胞株における、上記オフターゲットの細胞当たりのペプチドコピー数の分析のいずれかを適用することによる更なる調査による、オフターゲット毒性を引き起こす、関係のある同定されたペプチドを評価することを更に含むことができる。
ｉ）異なる正常又は癌性組織、加えて細胞株における、上記オフターゲットペプチドの源遺伝子の遺伝子発現プロファイルの分析、
ｉｉ）異なる正常又は癌性組織、加えて細胞株における、上記オフターゲットのペプチド提示プロファイルの分析、及び、
ｉｉｉ）異なる正常又は癌性組織、加えて細胞株における、上記オフターゲットの細胞当たりのペプチドコピー数の分析のいずれかを適用することによる更なる調査による、オフターゲット毒性を引き起こす、関係のある同定されたペプチドを評価することを更に含むことができる。
【0112】
本発明に従った方法の、別の重要な態様では、上記方法は、特に、本明細書で開示するペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドの更なる修飾のための準備における、上記同定、及び／又はオフターゲット結合の演算分析ステップを更に含む。対応するプログラムは、当業者に周知である。
【0113】
本発明によれば、オフターゲットペプチドが本方法により同定される場合、ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドは次いで、これらのオフターゲットペプチドへの結合を低下させるために、好適に改変されることができる。このような改変は、ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドの特異性を改善するために、特に、成熟のラウンドにおいて、ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドのアミノ酸配列を修飾することを含む。新しく生成される分子の特異性はこれにより、図２の標的陰性細胞株Ｔ９８Ｇの殺傷の低下により例示的に示されるように、大幅に改善されることができる。ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドの対応する成熟方法は当業者に既知であり、具体的には、ＴＣＲの６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）といった、ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチド内での変化を含む。同様に、抗体のＣＤＲは、適宜修飾することができる（例えば、（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ，２０１４；Ｓｔｅｗａｒｔ－Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ， ２００９）；米国特許出願公開第２０１４－００６５１１１Ａ１号；国際公開第２０１７／１７４８２３Ａ１号；国際公開第２０１６／１９９１４１号；及び国際公開第２０１２／０１３９１３号）を参照されたい）。
【0114】
次いで、ペプチド：ＭＨＣ混合物が由来する上記生体サンプルが、上記方法の単離ステップにて個別に分析可能であるか、又は組み合わせることができる、複数の癌細胞株のうちの１つから選択される、本発明に従った方法が好ましい。図３は、ＸＰＲＥＳＩＤＥＮＴ（登録商標）に基づき、複数の細胞株の組み合わせが、正常な組織ペプチド空間のカバレッジをどのように増加させるかを示し、これは、サンプル生成のために複数の細胞株を選択することによる本方法を用いて直接対応可能である。当業者は更に、強力なＭＨＣ発現を伴う複数の細胞株と組み合わせるか、又は、例えば、対象の遺伝子のトランスフェクション若しくはウイルス性形質導入、若しくは、物質若しくは化学化合物（例えば、インターフェロンγ）による処理による方法により、このような細胞株を修飾し、このような細胞株内で、ＭＨＣ分子により提示される異なるペプチドの数を増加させる、又は修正するような方法で、ＭＨＣ発現を増加又は修正することを欲する場合がある。これらの遺伝子は、特異的ＭＨＣクラスＩ若しくはクラスＩＩ遺伝子（例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－ＤＲＢ３）、ＭＨＣペプチド処理及び提示に関与する遺伝子（例えばＴＡＰ１／２、ＬＭＰ７）、又は、細胞の遺伝子発現を誘発若しくは修正可能な転写因子（例えばＡＩＲＥ）であることができるが、これらに限定されない。
【0115】
ペプチド：ＭＨＣ混合物が由来する上記生体サンプルが、１つから複数個の一次的な正常組織サンプル、又は健常なドナーの血液、加えて、癌患者又は感染組織由来の腫瘍組織から選択される、本発明に従った方法が更に好ましい。これらの組織上でのペプチドの交差認識の場合に、高リスクの致死性の有害事象を有するこれらの組織又は特定の身体区画に由来する、正常組織又は単離細胞が、特に関連する。このような正常組織、又は正常組織から単離した細胞は、脳組織、心臓組織、血液、肺組織、脊髄、神経組織、又は肝臓組織であり得るが、これらに限定されない。
【0116】
生体サンプルは全て、本発明に従った方法に依然として好適であれば、新たなものであるか、又は処理されている（例えば凍結若しくは調製されている）ことができる。一態様では、生体サンプルは、組織、器官、細胞、タンパク質、又は、細胞、血液、若しくは生物学的流体の膜抽出物、例えば、対象から入手した血清、粘液、尿、腹水流体、若しくは脳流体を含むことができる。
【0117】
本発明の方法の一実施形態に従うと、上記方法は、ステップａ）において、上記サンプルに、少なくとも、
・既知の配列を有する１のペプチド、並びに／又は
・ある規定の、及び／若しくは事前に選択された１のペプチド：ＭＨＣ複合体であって、このペプチドが、既知の配列を有する、複合体
を、好ましくは所定の量で添加するステップ（「スパイキング」）を更に含む。
・既知の配列を有する１のペプチド、並びに／又は
・ある規定の、及び／若しくは事前に選択された１のペプチド：ＭＨＣ複合体であって、このペプチドが、既知の配列を有する、複合体
を、好ましくは所定の量で添加するステップ（「スパイキング」）を更に含む。
【0118】
一実施形態に従うと、上記ペプチドの配列は、少なくとも１つの規定のペプチド結合ドメインを含むポリペプチド分子（「ｐＭＨＣ結合ポリペプチド」）が結合する、ペプチド：ＭＨＣ複合体のペプチド（「標的ペプチド」）の配列に対して変化又は変異される。
【0119】
一実施形態に従うと、少なくとも１つの規定のペプチド結合ドメインを含むポリペプチド分子（「ｐＭＨＣ結合ポリペプチド」）が結合する、ペプチド：ＭＨＣ複合体のペプチド（「標的ペプチド」）の一連の変異体が作製され、ステップａ）でサンプルに添加される。この中で、各変異体は、その長さ全体にわたって、又は、その長さの少なくとも細分画にわたって、代替のアミノ酸で置換されたある位置において、アミノ酸残基を有する。
【0120】
一実施形態に従うと、各変異体は、その長さ全体にわたって、又は、その長さの少なくとも細分画にわたって、例えば、実施例５で示すような、アラニン又はグリシンで置換されたある位置において、アミノ酸残基を有する。
【0121】
述べたように、このようにして入手した変異体ペプチドを、提示した方法のステップａ）において、サンプル（例えば、ｐＨＬＡライブラリー又は細胞溶解物）にスパイクすることができる。本アプローチにより、上位結合モチーフをよりよく特性決定することも、潜在的なオフターゲットを同定することをもが可能になる。
【0122】
一実施形態に従うと、スパイキングのために利用した合成ペプチドは、例えば、質量分析データ又はゲノムデータに基づく、天然に存在するペプチドに由来し、例えば、実施例４に示すように、標的ペプチドに対する化学的類似性といった規定された基準に基づき選択される。
【0123】
一実施形態では、本明細書で論じる方法を用いると、標的ペプチド配列を必ずしも、これらのペプチドの評価のためにサンプルに組み込む必要はない。更に、上記実施形態では、標的ペプチド配列又は他のペプチド配列を参照して、任意の比率を計算する必要はない。変異ペプチドの結合強度は、結合因子とＢＢ７．２調製物におけるその回収によってのみ測定される。
【0124】
一実施形態に従うと、少なくとも１つの規定のペプチド結合ドメインを含むポリペプチド分子（ｐＭＨＣ結合ポリペプチド」）に対する、ペプチド：ＭＨＣ複合体のペプチド（「標的ペプチド」）のアンカリング位置は、変化／変異しない。
【0125】
本文脈では、いわゆる「アンカー残基」（本明細書では「ＡＲ」と略される）は、ペプチドの、ＭＨＣ中のペプチド結合溝への結合を媒介することに留意されたい。ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１では、これらのアンカー残基の大部分は、Ｐ２のロイシン、及び、Ｐ９のロイシン又はバリンであり、結合ポリペプチドとペプチド：ＭＨＣ複合体との間での結合反応において、微小な役割を果たすのみである。
【0126】
本発明に従った方法の更に好ましい態様では、ペプチド：ＭＨＣ分子の混合物を、生物工学的生産により人工的に生成することができる。後者は、ＭＨＣ分子の、原核細胞（例えばＥ．ｃｏｌｉ）系内での形質転換及び発現により達成可能であり得るが、これらに限定されない。このようなＭＨＣ分子を更に、例えば、このような分子の膜貫通部分を置換又は変更することにより修飾して、その可溶性を増加させることができる。このような分子のペプチド負荷及び再構築は、対象のペプチド、加えて、所望の分子の再構築を促進する、更なる化学物質（グルタチオン、アルギニンなど）の存在下において、ＭＨＣ構成成分（例えば、タンパク質重鎖及びβ－２マイクログロブリン）の封入体のリフォールディングにより達成可能であるが、これらに限定されない。
【0127】
当業者は、異なるペプチドを負荷した、これらの人工的に作製したペプチド：ＭＨＣ分子のいくつかを組み合わせて、提示した方法に従い、ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドを用いて試験可能な、数十から数百、数千、数万、又は数十万の異なるペプチド：ＭＨＣ分子のライブラリーを生成することを欲する場合がある。当業者は更に、人工的に生成したペプチド：ＭＨＣのこれらの混合物を、生物源由来のペプチド：ＭＨＣ分子の別の混合物にスパイクすることを欲する場合がある。別の態様では、当業者は、これらの人工的に生成したペプチド：ＭＨＣ分子を、１３Ｃ、１５Ｎ、又は２Ｈなどに限定されない、１つ、又は複数の重くて安定した同位体標識を含有するペプチドを用いて再構築することができる。これらのペプチド：ＭＨＣ分子を次いで、例えば、生物学的サンプル由来のペプチド：ＭＨＣ分子の別の混合物にスパイクして、重い標識を含有する対象となるペプチドの更なる情報を得、提示した方法を用いて、ペプチド単離効率についての定量的質量分析データを提供することができる。
【0128】
本発明に従った方法の更に好ましい態様では、本方法を、上記同定及び／又はオフターゲット結合の演算分析と組み合わせる。
【0129】
この更なる情報は、ＰＭＢＥＣ、Ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｐａｍ２５０、ＮｅｔＭＨＣ、ＮｅｔＭＨＣｐａｎ、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩなどのＭＨＣ分子に対する、ペプチド類似性及びペプチド結合のスコア計算により構成され得るが、これらに限定されない。
【0130】
２つのペプチドの「類似性」という用語は、所与の位置における２つのアミノ酸の関連性を考慮に入れる（例えば、下表１ａを参照されたい）。類似のアミノ酸配列、例えば、標的ペプチド配列に類似するオフターゲットペプチド配列は、２つの配列間での類似性の統計分析を行うＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて、タンパク質データベースから読み込むことができる（例えば、（Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９３）を参照されたい）。このようなアラインメントのための好ましい設定は、ワード長さ・３、予想（Ｅ）・１０、及び、ＢＬＯＳＵＭ６２又はＰＭＢＥＣスコアリングマトリックスの使用であり（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．２００９）、好ましくは、ＰＭＢＥＣスコアリングマトリックスを、類似性の測定で使用する。これらのマトリックスは例えば、複数のアミノ酸間の進化上の、又は機能的な類似性に基づきアミノ酸の類似性を定量化し、これは、物理化学的パラメーターに従った類似性に十分相関する。所与の標的ペプチド配列におけるアミノ酸の各置換に対して、スコア（１０進値）を、これらのマトリックスを使用することにより計算することができ、このスコアは、標的ペプチド配列中のアミノ酸の、オフターゲットペプチド配列中の置換アミノ酸との類似性を示す。複数の置換は、標的ペプチド配列中での個別の置換の効果（スコア）を合計することにより考慮することができる。定義上、オフターゲットペプチドのために提供可能な最大スコアは、非置換の標的ペプチド配列によりもたらされる一方で、オフターゲットペプチドを導く任意の置換は、スコアリングマトリックスによりペナルティを受け、最終的には、よりスコアの低いオフターゲットペプチドがもたらされる。しかし、この最大スコアは、標的ペプチドの長さ及びアミノ酸配列に依存する（即ち、異なる標的ペプチド配列が異なる最大スコアを有する）。典型的には、より長いアミノ酸配列は、より高いスコアをもたらす。しかし、標的ペプチドのスコアは、それを構成するアミノ酸に割り当てられるスコアに左右される。異なる標的ペプチド配列の最大スコアの差を考慮することなく、標的ペプチドに対する、オフターゲットペプチドの類似性を計算して比較することを可能にするために、対応する１０進値が変換され、これは、標的ペプチドに対する、オフターゲットペプチドの類似性を、百分率スコアに計算した結果であり、標的ペプチド配列の最大スコアはそれ故、常に１００％である。
【0131】
表１ａ：それぞれ、アミノ酸、並びに、保存的及び半保存的置換。新しいシステインが遊離チオールとして残ったままである場合、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、又はＹからＣへの変化は、半保存的である。更に、立体障害を受ける位置にあるグリシンは置換されるはずがないことを当業者は理解するであろう。
【0132】
【表1a】
【0133】
本発明はここで、以下の実施例を参照して説明されるが、これらに限定されない。本発明の目的のために、本明細書で引用される参考文献は全て、それら全体が参照により組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【0134】
【図1】本発明に従った実験アプローチの概略図である。ペプチド：ＭＨＣ分子を含有するサンプルを、例えば、組織又は細胞株に由来する、ペプチド：ＭＨＣを発現する細胞の溶解物を生成することにより提供する。あるいは、サンプルは、人工的に作製したペプチド：ＭＨＣ分子の混合物を添加することにより修飾することができるか、又は、当該混合物で構成されることができる。特定のペプチド：ＭＨＣ分子は、例えば、ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドが付着しているマトリックスに、当該特定のペプチド：ＭＨＣ分子を接触させることにより、本サンプルから単離される。付着したポリペプチドを含有しないグリシンカラムを使用して、マトリックスと非特異的に相互作用する、非特異的な単離ペプチド：ＭＨＣ分子から、サンプルを除外することができる。質量分析を使用して、サンプルから単離され、ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドにより認識されたペプチド空間の配列を同定することで、ＭＨＣ結合ペプチドを同定することができる。それにより、以前には未知だったオフターゲットリスクが、予測ツールを必要とせずに明らかとなることができる。本アプローチの変形においては、同一のペプチド：ＭＨＣ分子を含有するサンプルを分割し、並行して、結合したペプチド種に関係なく、これらの分子に結合した、ＨＬＡの広範な特異的抗体又はＴＣＲを用いる第２のアフィニティクロマトグラフィーに供することができる。図示した実施例では、ＨＬＡ－Ａ＊０２汎特異的抗体ＢＢ７．２を用いて、本明細書ではＨＬＡ－Ａ＊０２イムノペプチド－ムと呼ばれる、ペプチド配列に関係なくＨＬＡ－Ａ＊０２により提示されるペプチド全てを単離する。両方の単離物中にある、十分な量の、対象となる（例えば、オフターゲット）ペプチドを使用して、用いる広範な特異的抗体又はＴＣＲ、この例ではＢＢ７．２と比較して、上記ペプチドに対するペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドの結合親和性を評価することができる。
【図2】ＰＲＡＭＥ－００４ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドの２つのバリアントを含む、標的陽性（Ｕ２OＳ）及び標的陰性（Ｔ９８Ｇ）細胞株の殺傷を示す細胞傷害性実験（黒の長方形：元のバリアント、白の点：同定したオフターゲットペプチドを選択決定基として用いるＰＲＡＭＥ－００４に対して向けられる、ペプチド：ＭＨＣ特異的結合因子の更なる成熟の結果、特異性が改善したバリアント）。標的の陰性細胞株Ｔ９８Ｇの殺傷は、ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドの特異性が改善したバリアントを用いる際に強力に低下する一方で、標的の陽性細胞株Ｕ２OＳの殺傷は、わずかに影響を受けるのみである。
【図3】サンプル生成のための複数の細胞株の組合せを使用して、ＨＬＡ－Ａ＊０２を提示するイムノペプチド－ムの高いカバレッジを達成することができる。６０個の細胞株に対するＸＰＲＥＳＩＤＥＮＴ（登録商標）イムノペプチド－ムに基づくと、正常組織において以前に検出されている少なくとも１０個のペプチド同定がペプチドが考慮される場合、これらの細胞株のうちの１０個の組合せは既に、ＨＬＡ－Ａ＊０２イムノペプチド－ムの６０％超のカバレッジを可能にすることが示されている。
【図4】実施例１のＰＲＡＭＥ－００４特異的ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドを用いる分析で同定したペプチド全ての、細胞傷害性分析。簡潔に述べると、対応するペプチド１０ｎＭを負荷したＴ２細胞を、示した濃度を有するＰＲＡＭＥ－００４特異的ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドの存在下において、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞と同時にインキュベートした。４８時間後に、ＬＤＨ放出を測定することにより、細胞傷害性を定量化した。
【図5】異なる正常組織、加えて腫瘍組織における、ＩＦＴ１７－００３の源となるエクソンをコードするペプチドの発現プロファイルの分析。腫瘍（黒の点）サンプル、及び正常（灰色の点）サンプルを、元の器官に従ってグルーピングする。箱ひげ図は、下部四分位数の１．５四分位数間領域（ＩＱＲ）内に依然として存在する最低データポイント、及び、上部四分位数の１．５ＩＱＲ内に依然として存在する最高データポイントまで延ばした、中央ＦＰＫＭ値、２５及び７５パーセンタイル（箱）＋ひげを表す。正常な器官を、アルファベット順に並べる。ＦＰＫＭ：マップされたリード１００万に対するのキロベース当たりのフラグメント数。組織（左から右に向かって）：正常なサンプル：脂肪（脂肪組織）；副腎（副腎）；胆管；膀胱；血液細胞；血管（血管）；骨髄；脳；乳；食道（食道）；目；胆嚢（胆嚢）；頭頸；心臓；大腸（大腸）；小腸（小腸）；腎臓；肝臓；肺；リンパ節；末梢神経（末梢神経）；卵巣；膵臓；副甲状腺（副甲状腺）；腹膜（腹膜）；下垂体（下垂体）；胎盤；胸膜；前立腺；骨格筋（骨格筋）；皮膚；脊髄；脾臓；胃；精巣；胸腺；甲状腺；気管；尿管；子宮。腫瘍サンプル：ＡＭＬ（急性骨髄性白血病）；ＢＲＣＡ（乳癌）；ＣＣＣ（胆管細胞癌）；ＣＬＬ（慢性リンパ性白血病）；ＣＲＣ（結腸直腸癌）；ＧＢＣ（胆嚢癌）；ＧＢＭ（グリア芽腫）；ＧＣ（胃癌）；ＨＣＣ（肝細胞癌）；ＨＮＳＣＣ（頭頸扁平上皮細胞癌）；ＭＥＬ（黒色腫）；ＮＨＬ（非ホジキン・ホジキンリンパ腫）；ＮＳＣＬＣａｄｅｎｏ（非小細胞肺癌腺癌）；ＮＳＣＬＣｏｔｈｅｒ（ＮＳＣＬＣａｄｅｎｏ又はＮＳＣＬＣｓｑｕａｍには明確に割り当てられないＮＳＣＬＣサンプル）；ＮＳＣＬＣｓｑｕａｍ（扁平細胞非小細胞肺癌）；ＯＣ（卵巣癌）；ＯＳＣＡＲ（食道癌）；ＰＡＣＡ（膵癌）；ＰＲＣＡ（前立腺癌）；ＲＣＣ（腎細胞癌）；ＳＣＬＣ（小細胞肺癌）；ＵＢＣ（泌尿器膀胱癌）；ＵＥＣ（子宮体癌）。
【図6】異なる正常組織、加えて腫瘍組織における、ＩＦＴ１７－００３のペプチド提示の分析。上部：技術的複製測定からの、中央ＭＳシグナル強度を、ペプチドが検出された単一のＨＬＡ－Ａ＊０２陽性正常（灰色の点、図の左部分）及び腫瘍サンプル（黒の点、図の右部分）に対する点としてプロットする。箱は、正規化したシグナル強度の、中央値、２５及び７５パーセンタイルを示す一方で、ひげは、下部四分位数の１．５四分位数間領域（ＩＱＲ）内に依然として存在する最低データポイント、及び、上部四分位数の１．５ＩＱＲ内に依然として存在する最高データポイントまで延びた。正常な器官を、アルファベット順に並べる。下部：各器官における、相対的なペプチド検出頻度を、スパインプロットとして示す。パネル下部の数は、ペプチドが各器官に対して分析されたサンプルの総数から検出されたサンプルの数を示す（正常組織に対してはＮ＝５９２、腫瘍サンプルに対してはＮ＝７１０）。ペプチドがサンプルで検出されているものの、技術的な理由により定量化不可能な場合、サンプルは、検出頻度のこの表示に含まれるが、図の上部には示されない。組織（左から右に向かって）：正常なサンプル：脂肪（脂肪組織）；副腎（副腎）；胆管；膀胱；血液細胞；血管（血管）；骨髄；脳；乳；食道（食道）；目；胆嚢（胆嚢）；頭頸；心臓；大腸（大腸）；小腸（小腸）；腎臓；肝臓；肺；リンパ節；中枢神経（中枢神経）；末梢神経（末梢神経）；卵巣；膵臓；副甲状腺（副甲状腺）；腹膜（腹膜）；下垂体（下垂体）；胎盤；胸膜；前立腺；骨格筋（骨格筋）；皮膚；脊髄；脾臓；胃；精巣；胸腺；甲状腺；気管；尿管；子宮。腫瘍サンプル：ＡＭＬ（急性骨髄性白血病）；ＢＲＣＡ（乳癌）；ＣＣＣ（胆管細胞癌）；ＣＬＬ（慢性リンパ性白血病）；ＣＲＣ（結腸直腸癌）；ＧＢＣ（胆嚢癌）；ＧＢＭ（グリア芽腫）；ＧＣ（胃癌）；ＧＥＪＣ（胃食道接合部癌）；ＨＣＣ（肝細胞癌）；ＨＮＳＣＣ（頭頸扁平上皮細胞癌）；ＭＥＬ（黒色腫）；ＮＨＬ（非ホジキン・ホジキンリンパ腫）；ＮＳＣＬＣａｄｅｎｏ（非小細胞肺癌腺癌）；ＮＳＣＬＣｏｔｈｅｒ（ＮＳＣＬＣａｄｅｎｏ又はＮＳＣＬＣｓｑｕａｍには明確に割り当てられないＮＳＣＬＣサンプル）；ＮＳＣＬＣｓｑｕａｍ（扁平細胞非小細胞肺癌）；ＯＣ（卵巣癌）；ＯＳＣＡＲ（食道癌）；ＰＡＣＡ（膵癌）；ＰＲＣＡ（前立腺癌）；ＲＣＣ（腎細胞癌）；ＳＣＬＣ（小細胞肺癌）；ＵＢＣ（泌尿器膀胱癌）；ＵＥＣ（子宮体癌）。
【図7】記載の方法を用いて測定し、配列ロゴのフォーマットで表示した、ＰＲＡＭＥ－００４に向けられるペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドの上位結合モチーフ。選択した位置における個別のアミノ酸のサイズは、同定したオフターゲット間での豊富さを反映する。本アプローチはそれ故、ＰＲＡＭＥ－００４に向けられるペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドの結合モチーフの正確な情報を伝達する。 例えば、同定したオフターゲットの中で、ペプチド配列の位置５におけるヒスチジン（Ｈ）は、リジン（Ｋ）と比較してより頻出しており、これは、上記位置において、ヒスチジンが、ＰＲＡＭＥ－００４結合ポリペプチドにより好まれていることを意味する。言い換えれば、位置５においてヒスチジン残基を有するペプチドは、位置５においてリジン残基を有するペプチドよりも高い親和性で、対応するＰＲＡＭＥ－００４結合ポリペプチドにより結合される。位置５において、ヒスチジン又はリジン以外の任意の他のアミノ酸は、更に一層、対応するペプチドの親和性を低下させる。 確認することができるように、対応するＰＲＡＭＥ－００４結合ポリペプチドにより受け入れられる結合モチーフは、位置１、３、及び４において極めて柔軟である一方で、位置５～８においては、表１ｂに示す以下の階層を伴って、選択したアミノ酸残基に対しての明確な好ましさを測定することができる。
【表1b】
以下において、ＰＲＡＭＥ（腫瘍で優先的に発現する黒色腫抗原；ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ７８３９５）の完全長配列を示し、ＰＲＡＭＥ－００４標的ペプチド（ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ、配列番号１）の配列を太い下線で示す：＞腫瘍で優先的に発現する、ｓｐ｜Ｐ７８３９５｜ＰＲＡＭＥヒト黒色腫抗原ＯＳ＝ホモサピエンス ＯＸ＝９６０６ ＧＮ＝ＰＲＡＭＥ ＰＥ＝１ ＳＶ＝１
【表1c】
次のステップとして、次いで、本明細書の他の箇所に記載するように、このような結合モチーフを含むペプチドに対して、ペプチド：ＭＨＣ複合体に示されるペプチドがアーカイブされる、対応するデータベースにおいて検索をすることができる。
【表1d】
【図8】位置スキャンを用いて、アンカー残基を除く、ペプチド配列の位置１～９の各アミノ酸をアラニンで置換することによる、ＰＲＡＭＥ－００４に対して向けられる、ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドの位置ベースの結合モチーフの同定。ペプチド配列のアラニン置換バリアントに対する、標的ペプチドＰＲＡＭＥ－００４のＫＤの比率を、各ペプチドに対して提示する。ＫＤ比率の５０％（破線）の閾値を適用し、結合因子により認識された位置を測定する。バイオ層干渉法により、ＫＤ値を測定した。 上位結合モチーフ、加えて、オフターゲットペプチド配列に、詳細情報を送達し、故に、上記ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドに対する交差反応性を探索及び／又は同定することを可能にする、本発明に従った方法と比較して、各アミノ酸をアラニンで単に置換することでは、非常に限定された情報、即ち、所与のアミノ酸残基が、結合因子による認識に必要である位置の単なる同定がもたらされるのみである。
【図9】位置ごとで、全てのタンパク質構成アミノ酸によるアミノ酸置換（システインを除く）を用いることによる、複合体の結合モチーフ測定。対応する位置スキャンバリアントに対する、標的ペプチドＰＲＡＭＥ－００４のＫＤの比率を表し、グレースケールでコードする（低い値から高い値で、白色～ダークグレーで着色して示す）。バイオ層干渉法により、ＫＤ値を測定した。
【図12】提示した方法により同定される、ＰＲＡＭＥ－００４に向けられるペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドに対する潜在的なオフターゲットペプチド。ＨＬＡ－Ａ＊０２特異的（「ＭＨＣ汎特異的」）抗体ＢＢ７．２を用いるアフィニティクロマトグラフィーの後で得られたＭＳシグナル強度に対して、ＰＲＡＭＥ－００４に向けられるペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドを用いるアフィニティクロマトグラフィーの後で得られる、ＭＳシグナル強度を表す。例えば、表１に示すものなどの、他の汎ＨＬＡ特異的結合因子も同様に使用することができる。ＢＢ７．２と結合因子との間の、個別のペプチドの回収比率は、これらのペプチド（標的及びオフターゲット）に対する、結合因子の結合親和性に相関する。 シグナル強度の比率は、左上部分に位置する、弱い結合ペプチド、及び、右下部分に位置する強力な結合ペプチドと対角線上（破線）の距離に対応する。矢印は、ＰＲＡＭＥ－００４を示す。全結合因子に対するアフィニティクロマトグラフィーは、多量の過剰の全ての結合因子が使用されるように行う。各ペプチドの回収はそれ故、利用可能な結合部位の数によって限定されない。ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチド及びＨＬＡ－Ａ＊０２特異的抗体ＢＢ７．２に対する、ほぼ定量的な沈殿により、約１の最大値が引き起こされ、このことは、結合因子により強力に認識されるペプチドが、略対角線上に現れることを意味する。グレースケールは、本明細書の他の箇所に記載するＨＩＳ１Ｋバイオセンサーを用いるバイオ層干渉法により測定した、標的に対する結合親和性倍数の低下を表す。バイオ層干渉計の検出限界を下回る結合を伴うペプチドに関しては、結合親和性倍数の低下を、１０００／０．１％に設定した。 両方のアプローチ（（ｉ）ｐＭＨＣ結合ポリペプチドとＭＨＣ汎特異的結合分子による並行した結合実験、及び、（ｉｉ）バイオ層干渉法）が、オフターゲットペプチドの親和性に関して類似の結果をもたらすことが確認可能である。ＭＨＣ汎特異的抗体のＭＳシグナル強度は、非常に低いシグナル強度における質量分析測定の確率過程性が原因で、３つのペプチド（例えば、ＩＦＩＴ１－００１）に対して定量不可能であり、それ故、図では「ＮＡ」として示した。故に、これらのオフターゲットに対しては、比率を計算することができなかった。しかし、アフィニティクロマトグラフィー後に独自に同定した、これらのペプチドもまた、バイオ層干渉法測定により確認した、非常に関連性のあるオフターゲットを示す。 次いで、閾値を結合親和性倍数の低下に基づいて設定し、交差反応性がもはや弱すぎるとは考えられず、故に無関係ないとは考えられないペプチドと、ＰＲＡＭＥ－００４に向けられるペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドが交差反応性であるペプチドを区別することができる。一般に、同定したペプチドは、強力な結合ペプチド（結合親和性倍数の低下が≧０．１）、中程度の結合ペプチド（０．０１≧結合親和性倍数の低下＞０．１）、及び、中程度の結合ペプチド（０．００１≧結合親和性倍数の低下＞０．０１）に分類することができる。
【図13】提示した方法により測定した、シグナル面積［ｐＭＨＣ結合ポリペプチド／ＢＢ７．２］の比率を用いるバイオ層干渉法により測定した、標的に対する、結合親和性倍数の低下の相関。相関分析（スピアマンの順位相関）により、０．８４のｒｈｏ値が得られた。関数ｆ（ｘ） ＝ ａ － ｅｘｐ（ｂ＊ｘ－ｃ）を用いて、指数回帰を行った。９５％確率予測バンドを、破線で示す。３つのペプチドを、ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドに結合したマトリックス上で排他的に検出した。故に、シグナル強度の比率を検出することはできなかった。値を、最大検出値に設定した。検出限界を下回る結合を伴うペプチドに関しては、結合親和性倍数の低下を、指数回帰のために１０００に設定した。
【図14】関連するオフターゲットを同定するために使用した、合成ペプチド：ＭＨＣライブラリーの立証。ＨＬＡ－Ａ＊０２特異的抗体ＢＢ７．２を用いるアフィニティクロマトグラフィーの後で得られたＭＳシグナル強度に対して、ＰＲＡＭＥ－００４に向けられるペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドを用いるアフィニティクロマトグラフィーの後で得られる、ＭＳシグナル強度を表す。シグナル強度の比率は、左上部分に位置する、弱い結合ペプチド、及び、右下部分に位置する強力な結合ペプチドと対角線上（破線）の距離に対応する。ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチド及びＨＬＡ－Ａ＊０２特異的抗体ＢＢ７．２に対する、ほぼ定量的な沈殿により、約１の最大値が引き起こされた。立証のために、以前に同定した５つのオフターゲット、標的、及び２つの非結合ペプチドを同位体標識し、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１アロタイプの、組換え作製しリフォールドしたＭＨＣモノマー上にロードし、合成スパイクインとして使用した。
【図15】標的ペプチドの個別のアミノ酸の位置変異に基づき、合成ペプチドライブラリーによる、提示した方法を用いる、ＰＲＡＭＥ－００４に向けられるペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドの位置ベースの結合モチーフの測定。この場合、アンカー残基（ＡＲ）を除く全ての位置１～９を、アラニンで交換した。合成ペプチドをｐＭＨＣ複合体に組み込み、細胞可溶化物マトリックスに添加した。各アミノ酸の交換位置に対して、他の箇所で説明するように測定した、結合親和性倍数の低下を表す。最大値を１に正規化した。エラーバーは、２つの技術的反復データの標準偏差を表す。得られた、位置ベースの結合モチーフは、バイオ層干渉法（図８）を用いる比較例で測定した、位置ベースのモチーフ内で全て一致している。提示した方法は、より高い感度を有するようであり、弱い結合変異体ペプチドもまた認識し、これは、位置８における比較的高い比率からも確認可能である。ダイナミックレンジは両方の方法の間で異なってはいるものの、個別の弱い結合ペプチドの順序は、最も強力な認識位置である位置５、続いて位置７、６、及び８に一致している。これは、位置５に対して群を抜いて最も高く、続いて位置７、６、及び８に対する選択性を示す、測定した上位結合モチーフ（図７）にもまた一致している。位置スキャンアプローチと共に、図７は、位置８、加えて、グリシン、及び、種々の許容されたアミノ酸に対する低下した選択性を示す。
【実施例】
【0135】
実施例１：
ＨＬＡ－Ａ＊０２の文脈で提示した本実施例で使用する、標的化ＭＨＣペプチドは、腫瘍（ＰＲＡＭＥ）で優先的に発現する黒色腫抗原に由来し、配列ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（（配列番号１）、本明細書ではＰＲＡＭＥ－００４とも呼ばれる）を示す。
ＨＬＡ－Ａ＊０２の文脈で提示した本実施例で使用する、標的化ＭＨＣペプチドは、腫瘍（ＰＲＡＭＥ）で優先的に発現する黒色腫抗原に由来し、配列ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（（配列番号１）、本明細書ではＰＲＡＭＥ－００４とも呼ばれる）を示す。
【0136】
これらの実験で使用したペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドは、可溶性となるために操作され、ＰＲＡＭＥ－００４ペプチドに対する向上した親和性を示し、更に、ＣＤ３結合抗体部分を含む、修飾Ｔ細胞受容体分子により例示した。
【0137】
これらの実験で使用したペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチド、その入手方法、及びその技術的特徴は、ＰＣＴ／欧州特許出願公開第２０２０／０５０９３６号に開示されており、参照により本明細書に組み込まれている。
【0138】
ペプチド：ＭＨＣ混合物の生物源として、細胞株Ｔ９８Ｇに由来するグリア芽腫を非常に発現するヒトＨＬＡ－Ａ＊０２を使用した。この細胞株は、ＰＲＡＭＥ－００４に対して向けられる、記載したペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドを用いる細胞傷害性実験で、以前に試験されており、正の殺傷を示した。
【0139】
５億個のＴ９８Ｇ細胞を、緩衝液を含有するＣＨＡＰＳ洗剤中での細胞溶解に供し、ソニフィケーションにより補助して均質化した。
【0140】
ＢｒＣＮ活性化後の化学的カップリングを用いて、ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドを個体Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）マトリックスに、所定の比率で結合した。並行して、同量のＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）も、同じ方法を用いて、ただし、ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドを添加することなく、カップリングのために活性化した。代わりに、０．１Ｍのアミノ酸グリシン溶液をＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）に添加した。これは代わりに、化学的に活性化された基に結合した。次に、ペプチド：ＭＨＣ分子の混合物を含有する、Ｔ９８Ｇ溶解物を、２００μLのグリシン結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）マトリックス、又は、ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドと結合した、２００μＬのＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）マトリックスを装填した、２つのアフィニティクロマトグラフィーカラムにアプライした。Ｔ９８Ｇ由来の溶解物はそれ故に、まず、グリシン結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）（本明細書においては、グリシンカラムと呼ばれる）上で実施され、あらゆるペプチドを除去又は枯渇させる方法でアプライされ、これは、ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドに結合するペプチドの単離前に、カラム又はＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）マトリックスに非特異的に結合する（図１）。ＰＢＳと二回蒸留水とで親和性カラムを洗浄し、添加した後、結合したペプチド：ＭＨＣ複合体を、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いてカラムから溶出させた。
【0141】
本ステップの間、ＭＨＣ結合ペプチドは、ＭＨＣ部分からも放出され、１０ｋＤａ未満の分子量カットオフにて、特定の装置を用いる限外濾過により、高分子量分子から分離することができる。
【0142】
次いで、単離したペプチド混合物を最終的に、ｎａｎｏＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ）、続いて、Ｏｒｂｉｔｒａｐ ｆｕｓｉｏｎ（商標）Ｔｒｉｂｒｉｄ（商標）質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、液体クロマトグラフィー連結質量分析（ＬＣ－ＭＳ）に供した。
【0143】
質量分析機器を、異なる断片化技術（本実施例では、ＣＩＤ及びＨＣＤ断片化）、加えて、２つの異なる分析器（本実施例では、ｌｏｎＴｒａｐ及びＯｒｂｉｔｒａｐ）における、ＭＳ／ＭＳスペクトル読出しを利用する、データ依存性モード（ＤＤＡ）で操作した。
【0144】
変形バージョンのＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌプロテインインデックス（ＩＰＩ ｖ．３７８）、及び、ＳＥＱＵＥＳＴの検索エンジンと繋げた、ユニバーサルプロテインリソース（Ｕｎｉｐｒｏｔ）配列データベースを用いて、ヒトプロテオームに対して、ペプチド断片スペクトルを検索した。グリシンカラムから溶出及び同定したペプチドは全て、これらが非特異的結合ペプチドを表すため、更なる分析から除外した。更に、同定のために、インハウスデータベース及びアルゴリズムに従い、既知の汚染物質を分析から取り除いた。
【0145】
合計で、２０個のペプチドを単離及び処理後に同定し、これらを表２に示す。参照として、標的ペプチドであるＰＲＡＭＥ－００４も同様に示すが、これは、単離したペプチドの間では同定されず、同定されることが予想されなかった。
【0146】
標的ペプチドと比較して、関連性を確認し、結合強度を分析するために、全てのペプチドを、バイオ層干渉法に供した。バイオ層干渉法（この場合、メーカーにより推奨される設定を用いる、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ３８４システム）により、測定を行った。簡潔に述べると、ＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０、０．１％のＢＳＡを緩衝液として使用し、３０℃及び１０００ｒｐｍにて、結合反応速度を測定した。ペプチド：ＭＨＣ特異的結合因子の連続希釈を分析する前に、ペプチド：ＭＨＣ複合体をバイオセンサー（ＨＩＳ１ Ｋ）にロードした。ＰＲＡＭＥ－００４と比較しての、平衡解離定数（ＫＤ）の比率を、表２の最後の縦列に示す。
【0147】
これらのペプチドを選択して、更に細胞傷害性実験で試験した。簡潔に述べると、対応するペプチド１０ｎＭを負荷したＴ２細胞（１０，０００ｃｅｌｌｓ／ウェル）を、示した濃度を有するＰＲＡＭＥ－００４特異的ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドの存在下において、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞（５０，０００ｃｅｌｌｓ／ウェル）と同時にインキュベートした（図４）。４８時間後に、ＣｙｔｏＴｏｘ ９６非放射性細胞傷害性アッセイキット（ＰＲＯＭＥＧＡ）を使用してＬＤＨ放出を測定することにより、細胞傷害性を定量化した。試験したペプチドの対応するＥＣ５０値もまた、表２に記載する。本分析から出てくる主たるオフターゲットはＩＦＴ１７－００３であり、これは、標的ペプチドＰＲＡＭＥ－００４と比較して、ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドに対して同様のＫＤ及びＥＣ５０値を示した。
【0148】
ＸＰＲＥＳＩＤＥＮＴ（登録商標）ペプチド提示及び遺伝子発現データを使用して、さほど関連しないオフターゲットから、関連するオフターゲットを区別することで、オフターゲットペプチドの潜在的な安全性リスクを評価することができ、これは、他の腫瘍組織の文脈でのみ提示／表現される。本実施例では、異なる正常組織における、ペプチドの遍在する発現（図５）及び提示（図６）によって、ＩＦＴ１７－００３は、非常に関連のあるオフターゲットと考えられる。本実施例から提示されるデータを、更なる大規模なペプチド提示又は発現データと組み合わせることはそれ故、オフターゲットのリスク評価に対する、更なる価値のあるものである。
【0149】
ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドの特異性と改善するために、更なる成熟ラウンドを、選択決定因子として、同定したペプチドを用いて実施した。新しく生成される分子の特異性はこれにより、図２の標的陰性細胞株Ｔ９８Ｇの殺傷の低下により示されるように、大幅に改善されることができた。
【0150】
標的陽性又は標的陰性細胞（１０，０００ｃｅｌｌｓ／ウェル）のＬＤＨ放出を、ヒトＰＢＭＣ（１０，０００ｃｅｌｌｓ／ウェル）との同時インキュベーションの後に定量化し、４８時間、ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドの濃度を示した。ペプチド単離に使用した、元のペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチド分子を黒四角として示す一方で、特異性が改善したバリアントを、白丸で示す。対照のペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチド分子（アスタリスク付きの正方形）、及び、二重特異的分子を含まない対照（アスタリスク付きの丸）は、標的細胞の殺傷を誘発しない。
【0151】
表２：同定したペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチド特異的ペプチドの概観。標的ＰＲＡＭＥ－００４を上部に示す。ペプチドをロードしたＴ２細胞を用いる、細胞傷害性実験のＥＣ５０値を明記し、加えて、ＨＩＳ １Ｋバイオセンサーを使用して、バイオ層干渉法により結合親和性を測定した。
【0152】
【表2】
【0153】
結合モチーフの同定
同定したペプチドを更に使用して、ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドに対する結合モチーフを推定することができ、これは、ペプチド配列内のどのアミノ酸が、上記ポリペプチドの結合に関連しているかの情報をもたらす。
同定したペプチドを更に使用して、ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドに対する結合モチーフを推定することができ、これは、ペプチド配列内のどのアミノ酸が、上記ポリペプチドの結合に関連しているかの情報をもたらす。
【0154】
更に、結合モチーフ上の更なる情報を、関連する位置の中のアミノ酸から推論することができる。同定した一連のペプチドに基づくと、アミノ酸配列の位置１～９の中のアミノ酸のサブセットのみが許容される（図７及び表３を参照されたい）。
【0155】
表３：提示した方法により同定した各位置に対する、許容されるアミノ酸の概観。
【0156】
【表3】
【0157】
アミノ酸が、変異により個別の位置で置き換えられ、その後インビトロアッセイで試験される、一般的なアミノ酸スキャンアプローチとは対称的に、結合強度全体に、場合によっては異なる反対の効果を伴う複数の置換もまた、解明することができる。例えば、天然アミノ酸配列の位置６における置換が、結合親和性全体の低下をもたらす場合、これは、位置８における類似の置換により救出可能であり、これにより、ペプチド：ＭＨＣ分子に対する、ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドの結合親和性の強力な増加をもたらすことができる。
【0158】
このように生成した結合モチーフを使用して、異なるタンパク質配列データベース（例えばＵｎｉＰｒｏｔ、ＩＰＩ）を検索し、結合モチーフにより課される制限を反映し、これに適合する、更なるオフターゲットペプチド（即ち、結合モチーフの関連する位置にて許容される、規定のアミノ酸のセット）を発見した。
【0159】
比較例１
以下の実験は、当該技術分野において現在利用可能な方法がなぜ、実施例１で同定した、最も関連のあるオフターゲットペプチドを同定せず、故になぜ、インビボ投与を意図するペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドの不必要な副作用もまた予測できないかを示す。
以下の実験は、当該技術分野において現在利用可能な方法がなぜ、実施例１で同定した、最も関連のあるオフターゲットペプチドを同定せず、故になぜ、インビボ投与を意図するペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドの不必要な副作用もまた予測できないかを示す。
【0160】
位置スキャンを用いる、結合モチーフの同定：
各アミノ酸が後で、アミノ酸のアラニンで置き換えられた、ネイティブＰＲＡＭＥ－００４配列の多様体の、ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドに結合する能力について、バイオ層干渉法を用いて試験した。
ＡＬＬＱＨＬＩＧＬ （配列番号３８）
ＳＡＬＱＨＬＩＧＬ （配列番号３９）
ＳＬＡＱＨＬＩＧＬ （配列番号４０）
ＳＬＬＡＨＬＩＧＬ （配列番号４１）
ＳＬＬＱＡＬＩＧＬ （配列番号４２）
ＳＬＬＱＨＡＩＧＬ （配列番号４３）
ＳＬＬＱＨＬＡＧＬ （配列番号４４）
ＳＬＬＱＨＬＩＡＬ （配列番号４５）
ＳＬＬＱＨＬＩＧＡ （配列番号４６）
各アミノ酸が後で、アミノ酸のアラニンで置き換えられた、ネイティブＰＲＡＭＥ－００４配列の多様体の、ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドに結合する能力について、バイオ層干渉法を用いて試験した。
ＡＬＬＱＨＬＩＧＬ （配列番号３８）
ＳＡＬＱＨＬＩＧＬ （配列番号３９）
ＳＬＡＱＨＬＩＧＬ （配列番号４０）
ＳＬＬＡＨＬＩＧＬ （配列番号４１）
ＳＬＬＱＡＬＩＧＬ （配列番号４２）
ＳＬＬＱＨＡＩＧＬ （配列番号４３）
ＳＬＬＱＨＬＡＧＬ （配列番号４４）
ＳＬＬＱＨＬＩＡＬ （配列番号４５）
ＳＬＬＱＨＬＩＧＡ （配列番号４６）
【0161】
図８は、これらの実験結果を示す。５つのアラニン置換ペプチドが、野生型配列と比較して、結合親和性の５０％以上の低下（又はそれぞれ、２倍以上のＫＤの増加）をもたらし、それ故、結合に不可欠であると考えた。これらの結果に基づくと、結合モチーフは、ＸＸＸＸＨＬＩＧＬ（配列番号２２）［式中、Ｘは任意のアミノ酸を表す。］をもたらすであろう。
【0162】
位置スキャンアプローチの意図する変形において、ＰＲＡＭＥ－００４配列は各位置において、上述したものと類似の方法で、自然に存在するアミノ酸のいずれかにより置換された。ＰＲＡＭＥ－００４の置換に用いられなかった唯一のタンパク質新生アミノ酸は、システインであった。これは、本アミノ酸が、複数の化学修飾を急速に受け、試験中に、ペプチドの認識に関する誤った解釈をもたらし得ることが知られているためである。故に、合計で９＊１８＝１６２個のペプチドを調査した。
【0163】
各ペプチドを再び、バイオ層干渉法を用いて、結合親和性について試験をした（図９）。野生型配列と比較して、結合親和性の５０％以上の低下（又は、それぞれ、ＫＤの２倍以上の増加）をもたらしたペプチドは、ペプチド結合に許容されない、又は有害であるとみなされた。これにより、アミノ酸配列：
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＨＸ５ＩＸ６Ｘ７
［式中、Ｘ１は、ＡＤＥＦＧHＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷＹのいずれかから選択され、Ｘ２は、ＡＦＧＩＬＭＱＳＴＶＹのいずれかから選択され、Ｘ３は、ＡＤＧＩＫＬＭＮＱＳＴＶＷのいずれかから選択され、Ｘ４は、ＡＦＧHＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷＹのいずれかから選択され、Ｘ５は、ＩＬＭのいずれかから選択され、Ｘ６は、ＧＳＴのいずれかから選択され、Ｘ７は、ＥＦHＩＫＬＭＰＱＴＶＹのいずれかから選択される。］の、位置１～９において許容又は認可されている、一連の異なるアミノ酸を有する複合結合モチーフがもたらされた。
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＨＸ５ＩＸ６Ｘ７
［式中、Ｘ１は、ＡＤＥＦＧHＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷＹのいずれかから選択され、Ｘ２は、ＡＦＧＩＬＭＱＳＴＶＹのいずれかから選択され、Ｘ３は、ＡＤＧＩＫＬＭＮＱＳＴＶＷのいずれかから選択され、Ｘ４は、ＡＦＧHＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷＹのいずれかから選択され、Ｘ５は、ＩＬＭのいずれかから選択され、Ｘ６は、ＧＳＴのいずれかから選択され、Ｘ７は、ＥＦHＩＫＬＭＰＱＴＶＹのいずれかから選択される。］の、位置１～９において許容又は認可されている、一連の異なるアミノ酸を有する複合結合モチーフがもたらされた。
【0164】
アラニンスキャン由来の結合モチーフに基づく類似性検索。
インハウスソフトウェアツールを使用して、同定したモチーフ配列（Ｘ－Ｘ－Ｘ－Ｘ－Ｘ－Ｈ－Ｌ－Ｉ－Ｇ－Ｌ）（配列番号２２）［式中、Ｘは任意のアミノ酸により構成可能である。］を含有するヒトタンパク質に対する異なるタンパク質配列データベース（ＳＮＶを含ＩＰＩ ｖ． ３．７８、Ｅｎｓｅｍｂｌ Ｖｅｒｓｉｏｎ ７７ ＧｒＣＨ３８、ＮＣＢＩ非重複タンパク質データベース）を検索した。８つの固有のペプチドを同定した：標的そのものであるＰＲＡＭＥ－００４、及び、異なるヒトタンパク質：ＶＥＺＴ（Ｖｅｚａｔｉｎ）、ＨＴＲ２Ｃ（５－ヒドロキシトリプタミン受容体２Ｃ）、ＨＥＰＨＬ１（Ｈｅｐｈａｅｓｔｉｎ様タンパク質１）、ＣＯＬ２８Ａ１（コラーゲンα－１（ＸＸＶＩＩＩ）鎖）、ＳＬＣ２Ａ１（溶質キャリアファミリー２、グルコース促進輸送体メンバー１）、ＳＬＣ４４Ａ３（コリントランスポーター様タンパク質３）、ＰＩＥＺＯ２（ピエゾ型機械受容性イオンチャネル成分２）に由来する、７つのペプチド。
インハウスソフトウェアツールを使用して、同定したモチーフ配列（Ｘ－Ｘ－Ｘ－Ｘ－Ｘ－Ｈ－Ｌ－Ｉ－Ｇ－Ｌ）（配列番号２２）［式中、Ｘは任意のアミノ酸により構成可能である。］を含有するヒトタンパク質に対する異なるタンパク質配列データベース（ＳＮＶを含ＩＰＩ ｖ． ３．７８、Ｅｎｓｅｍｂｌ Ｖｅｒｓｉｏｎ ７７ ＧｒＣＨ３８、ＮＣＢＩ非重複タンパク質データベース）を検索した。８つの固有のペプチドを同定した：標的そのものであるＰＲＡＭＥ－００４、及び、異なるヒトタンパク質：ＶＥＺＴ（Ｖｅｚａｔｉｎ）、ＨＴＲ２Ｃ（５－ヒドロキシトリプタミン受容体２Ｃ）、ＨＥＰＨＬ１（Ｈｅｐｈａｅｓｔｉｎ様タンパク質１）、ＣＯＬ２８Ａ１（コラーゲンα－１（ＸＸＶＩＩＩ）鎖）、ＳＬＣ２Ａ１（溶質キャリアファミリー２、グルコース促進輸送体メンバー１）、ＳＬＣ４４Ａ３（コリントランスポーター様タンパク質３）、ＰＩＥＺＯ２（ピエゾ型機械受容性イオンチャネル成分２）に由来する、７つのペプチド。
【0165】
これらのペプチドのアミノ酸配列を以下に示す。
【0166】
【表20】
【0167】
全て、ＨＬＡ－Ａ＊０２型の個体に由来する、５９２個の正常組織サンプル、及び７１０個の腫瘍組織サンプルの、インハウスＸＰＲＥＳＩＤＥＮＴ（登録商標）イムノペプチド－ムデータは、予測された７つの、オフターゲットペプチドのいずれもが、分析したサンプルのいずれかにおいて、ＨＬＡ－Ａ＊０２の文脈で提示されることが同定されなかったことを示した。特に、ＶＥＺＴ及びＳＬＣ２Ａ１由来のペプチドは、非Ａ＊０２陽性個体の組織サンプルにおいて、ＸＰＲＥＳＩＤＥＮＴ（登録商標）により以前に同定されており、このことは、これらが、異なるＨＬＡアロタイプ（ＶＥＺＴ由来のペプチドの場合はＨＬＡ－Ｂ＊０７、及び、ＳＬＣ２Ａ１由来のペプチドの場合はＨＬＡ－Ｂ＊２７）により提示され、故に、ＨＬＡ－Ａ＊０２制限ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドの文脈において、オフターゲットリスクを生み出す可能性が低いことを示唆している。しかし、位置スキャン及び予測アプローチは、本出願に記載の優れた方法を用いて同定可能な、関連するオフターゲットペプチドのいずれも同定することができなかった。
【0168】
上位結合モチーフに基づく類似性検索。同一のインハウスソフトウェアツールを使用して、複雑な結合モチーフの基準を満たすヒトプロテオームに由来するペプチドもまた予測した。この置換ではシステインを除外したため、本アミノ酸が更に、以下のモチーフ：
Χ８Χ９Χ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６
［式中、Ｘ８は、ＡＣＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷＹのいずれかから選択され、Ｘ９は、ＡＣＦＧＩＬＭＱＳＴＶＹのいずれかから選択され、Ｘ１０は、ＡＣＤＧＩＫＬＭＮＱＳＴＶＷのいずれかから選択され、Ｘ１１は、ＡＣＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷＹのいずれかから選択され、Ｘ１２は、ＣＨのいずれかから選択され、Ｘ１３は、ＣＩＬＭのいずれかから選択され、Ｘ１４は、ＣＩのいずれかから選択され、Ｘ１５は、ＣＧＳＴのいずれかから選択され、Ｘ１６は、ＣＥＦＨＩＫＬＭＰＱＴＶＹのいずれかから選択される。］をもたらすアミノ酸配列における各位置で許容された。
Χ８Χ９Χ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６
［式中、Ｘ８は、ＡＣＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷＹのいずれかから選択され、Ｘ９は、ＡＣＦＧＩＬＭＱＳＴＶＹのいずれかから選択され、Ｘ１０は、ＡＣＤＧＩＫＬＭＮＱＳＴＶＷのいずれかから選択され、Ｘ１１は、ＡＣＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷＹのいずれかから選択され、Ｘ１２は、ＣＨのいずれかから選択され、Ｘ１３は、ＣＩＬＭのいずれかから選択され、Ｘ１４は、ＣＩのいずれかから選択され、Ｘ１５は、ＣＧＳＴのいずれかから選択され、Ｘ１６は、ＣＥＦＨＩＫＬＭＰＱＴＶＹのいずれかから選択される。］をもたらすアミノ酸配列における各位置で許容された。
【0169】
検索により、結合モチーフの基準を満たす、８８８個の異なるペプチドの全リストが得られた。わずかに２つのペプチド（ＩＦＴ１７－００３及びＡＴＰ１Ａ１－００１）が、実施例１における、本出願で記載した優れた方法により同定した、関連するオフターゲットの一覧と重複した一方で、残りは、８８８個のペプチド全てが、下流インビトロ分析においてその後試験された場合であっても、予測ベースのアプローチでは同定されなかった。
【0170】
実施例２：
ＨＬＡ－Ａ＊０２の文脈で提示された、本実施例で使用した、標的化ＭＨＣペプチドは、黒色腫関連抗原Ａ４及びＡ８（ＭＡＧＥＡ４／Ａ８）に由来し、本明細書ではＭＡＧＥＡ４／８とも呼ばれる、配列ＫＶＬＥＨＶＶＲＶ（配列番号２４）を示す。
ＨＬＡ－Ａ＊０２の文脈で提示された、本実施例で使用した、標的化ＭＨＣペプチドは、黒色腫関連抗原Ａ４及びＡ８（ＭＡＧＥＡ４／Ａ８）に由来し、本明細書ではＭＡＧＥＡ４／８とも呼ばれる、配列ＫＶＬＥＨＶＶＲＶ（配列番号２４）を示す。
【0171】
ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドは、可溶性となるように操作され、ＭＡＧＥＡ４／Ａ８由来のペプチドに対する向上した親和性を示し、更に、ＣＤ３結合抗体部分を含む、修飾Ｔ細胞受容体分子で構成される。ペプチド：ＭＨＣ混合物の生物源として、ヒトＨＬＡ－Ａ＊０２の高発現、及び、ＭＡＧＥＡ４／８陽性肺腺癌由来の細胞株ＮＣＩ－Ｈ１７５５を用いた。本細胞株の、５億個の細胞を、ＣＨＡＰＳ洗剤含有緩衝液中での細胞溶解に供し、ソニフィケーションにより補助して均質化した。ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドとアフィニティクロマトグラフィーとのカップリングを、実施例１に記載のとおりに実施した。
【0172】
ペプチド：ＭＨＣ分子の混合物を含有するＮＣＩ－Ｈ１７５５溶解物を、グリシン結合及びペプチド：ＭＨＣ結合因子結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）に適用する前に、体積を半分ずつに分けた。体積の第２の半分を、異なるグリシン結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）マトリックス、続いて、ＨＬＡ－Ａ＊０２特異的抗体ＢＢ７．２と結合したＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）マトリックスの上で並行して実施した。後者は、本細胞株中で、ＨＬＡ－Ａ＊０２により提示されるペプチドの完全なスペクトルを分離することを目的とする（図１もまた参照されたい）。
【0173】
ペプチドを全てのカラムから溶出し、実施例１に概略する質量分析に供した。グリシンカラムから溶出したペプチド、及び既知の汚染物質を再び、更なる分析から除外した。更に、ＳｕｐｅｒＨｉｒｎアルゴリズム（Ｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７）を用いて、全ての異なる実施にて、ペプチド前駆体シグナル全てを定量化した。±３分の固定保持時間ウィンドウ、及び±５ｐｐｍの質量精度を用いて、質量分析実験全てにおいて、特徴を抽出して定量化した。
【0174】
ＭＡＧＥＡ４／８特異的ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチド由来の、個別のペプチド前駆体シグナルの、ＢＢ７．２調製物由来の同一の前駆体シグナルに対する、得られる面積の比率を計算した。これらの比率は、ＨＬＡ－Ａ＊０２特異的抗体ＢＢ７．２と比較しての、ＭＡＧＥＡ４／８ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドの単離効率を反映している。標的に対する、加えて、ＨＬＡ－Ａ＊０２分子に結合した、潜在的なオフターゲットペプチドに対する、ＭＡＧＥＡ４／８特異的ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドの高親和性によって、これらのペプチドに対する単離効率は、結合したペプチド種とは大いに無関係なＨＬＡ－Ａ＊０２に向かう、より少ないナノモル範囲における親和性を有するＢＢ７．２と比較して、はるかに高い（Ｐａｒｈａｍ ａｎｄ Ｂｒｏｄｓｋｙ， １９８１）。質量分析データの分析により、標的ペプチドＭＡＧＥＡ４／８を含む、同定した１０個のペプチドが同定された（表４を参照されたい）。ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチド及びＢＢ７．２の面積比率に従い、これらのペプチドをランク付けすることにより、ＢＢ７．２と比較して、これらのペプチドの単離効率の測定が可能となり、これは、実施例１に記載するバイオ層干渉法を用いる結合親和性と相関する。これにより、標的ペプチドと、オフターゲットペプチドとの間での、オフターゲット毒性及び潜在的な治療ウィンドウのリスクを、質量分析実験の定量データから直接導き出すことができる。
【0175】
表４で提示する例において、ＭＡＧＥＡ１の面積比率は、標的ペプチドＭＡＧＥＡ４／８と比較して小さく（約１０．６と比較して、約１１）、これは、４．１の、非常に小さい結合親和性の低下に変換される。対照的に、ペプチドＨＥＡＴ５ＲＡに関しては、ＭＡＧＥＡ４／８と比較して、約８００倍小さい、面積比率の大幅な低下もまた、ＭＡＧＥＡ４／８と比較して、大きく低下した結合親和性（２３８）において反映される。
【0176】
ＸＰＲＥＳＩＤＥＮＴ（登録商標）における、ペプチド提示及び遺伝子発現データのより深い分析は、ＭＡＧＥＡ１が、癌組織で排他的に提示され（図１０）、癌となった精巣のような発現パターンを示す（図１１）ために、関連するオフターゲットリスクを提示しないことを示す。
【0177】
表４：同定したペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチド特異的ペプチドの概観。質量分析による、ＨＬＡ－Ａ＊０２特異的結合ペプチドＢＢ７．２に対する、ＭＡＧＥＡ４／８結合ポリペプチドから溶出したペプチドの比率を示す。上部の横列では、最も高い比率のシグナル面積を示す標的ペプチドＭＡＧＥＡ４／Ａ８が提示される。ＰＭＢＥＣスコアは、標的配列に対するペプチド類似性の測定値である。結合親和性は、ＨＩＳ１ Ｋバイオセンサーを用いるバイオ層干渉法により測定した。
【0178】
【表4】
【0179】
実施例３：
本実施例で使用する標的化ＭＨＣペプチドは、実施例１に記載したもの（ＰＲＡＭＥ－００４、配列番号１）と同一であった。ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドは同様に、可溶性となるために操作され、ＰＲＡＭＥ－００４ペプチドに対する向上した親和性を示し、更に、ＣＤ３結合抗体部分（ただし、オフターゲット認識における変化をもたらす、実施例１と比較して異なるバリアント）を含む、修飾Ｔ細胞受容体分子により例示した。
本実施例で使用する標的化ＭＨＣペプチドは、実施例１に記載したもの（ＰＲＡＭＥ－００４、配列番号１）と同一であった。ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドは同様に、可溶性となるために操作され、ＰＲＡＭＥ－００４ペプチドに対する向上した親和性を示し、更に、ＣＤ３結合抗体部分（ただし、オフターゲット認識における変化をもたらす、実施例１と比較して異なるバリアント）を含む、修飾Ｔ細胞受容体分子により例示した。
【0180】
ペプチド：ＭＨＣ混合物の生物源として、１０個の異なる細胞株のプールを利用した。ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ペプチドの量及び多様性を最大化するように、細胞株を選択した。細胞株当たり５億個の細胞を、ＣＨＡＰＳ洗剤含有緩衝液中での細胞溶解に供し、均質化してプールした。個別の分析に対して、５億の桁の細胞数となるアリコートを使用した。
【0181】
ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチド、及びＨＬＡ－Ａ＊０２特異的抗体ＢＢ７．２のカップリング及びアフィニティクロマトグラフィーを、実施例２に記載したとおりに実施したが、溶解物と、マトリックス結合ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドの溶解物の接触時間を増加させるために、インキュベーションを、１６時間の反応管での振盪にて実施した。
【0182】
合計で７９個のペプチドを、単離及び処理の後で同定した。標的ペプチドＰＲＡＭＥ－００４を含む、最も関連する１０個のオフターゲットを表５に示す。７９個のペプチドのうち、３２個が、低い比率のシグナル強度［ｐＭＨＣ結合ポリペプチド／ＢＢ７．２］（０．００５未満）を示し、故に、ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドに対しての結合が低い、又は全く結合しないことが予想された。これらのペプチドを、参照として更なる分析に含めた。ＨＬＡ－Ａ＊０２特異的抗体ＢＢ７．２を用いる精製後でのＭＳシグナル強度と比較して、ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドを用いる精製の後で入手したＭＳシグナル強度に従い、選択したペプチドを、図１２に表示する。対角への距離は、シグナル強度の比率を示す。標的、及び強力なオフターゲットに対して、約１のシグナル強度［ｐＭＨＣ結合ポリペプチド／ＢＢ７．２］の比率をもたらす、ほぼ定量的なアフィニティクロマトグラフィーが予想される（破線）。最も強力な１０個の、別の結合標的の名前をグラフに示す。全てが、予想した対角付近に存在する。非常に低い比率のシグナル強度［ｐＭＨＣ結合ポリペプチド／ＢＢ７．２］を有するペプチドは、参照としてのバイオ層干渉法を用いると、極めて大きな、又は定量不可能なほどの結合親和性倍数の低下を示した。
【0183】
表５ ：ＨＩＳ １Ｋバイオセンサーを用いるバイオ層干渉法により測定した、結合親和性倍数の低下に基づく、最も関連する上位１０個のオフターゲットの概観。質量分析による、ＦＩＬＡ－Ａ＊０２特異的結合ペプチドＢＢ７．２に対する、ＰＲＡＭＥ－００４結合ポリペプチドから溶出したペプチドの比率を示す。アスタリスクで標識した値については、ＨＬＡ－Ａ＊０２特異的結合ペプチドＢＢ７．２から溶出したペプチドでの不十分さにより、比率を計算することができなかったため、最大値を測定し、推定した。
【0184】
【表5】
【0185】
標的ペプチドと比較して、関連性を確認し、結合強度を分析するために、全てのペプチドを、実施例１に記載するバイオ層干渉法に供した。ＰＲＡＭＥ－００４と比較して、平衡解離定数（ＫＤ）の比率を計算すると、提示した方法により測定したシグナル強度［ｐＭＨＣ結合ポリペプチド／ＢＢ７．２］の比率と相関した。測定した結合親和性倍数の低下を、図１２においてグレースケールで示す。提示した方法により測定したシグナル強度［ｐＭＨＣ結合ポリペプチド／ＢＢ７．２］の比率との、結合親和性倍数の低下の相関を、図１３で示す。上述のように、ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドに強力に結合するペプチドは、高い比率のシグナル強度［ｐＭＨＣ結合ポリペプチド／ＢＢ７．２］により同定することができる一方で、非結合ペプチドは、０．００１を下回るシグナル強度［ｐＭＨＣ結合ポリペプチド／ＢＢ７．２］の比率を示した。本方法の最大感度を入手するために、ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチド、及びＨＬＡ－Ａ＊０２特異的抗体ＢＢ７．２を過剰にアプライし、両方の場合において、オフターゲットのほぼ定量的な抽出、及び、約１のシグナル面積［ｐＭＨＣ結合ポリペプチド／ＢＢ７．２］の最大比率を導く。この飽和効果を考慮に入れるために、指数回帰を行った（図１３）。
【0186】
提示した方法を適用する単一実験のシグナル強度の比率を用いて、結合親和性を推定することができることを、データは示す。
【0187】
実施例４：
本実施例で使用する標的化ＭＨＣペプチドは、実施例１に記載したもの（ＰＲＡＭＥ－００４、配列番号１）と同一であった。ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドは同様に、可溶性となるために操作され、ＰＲＡＭＥ－００４ペプチドに対する向上した親和性を示し、更に、ＣＤ３結合抗体部分（ただし、実施例１及び３と比較して異なるバリアント）を含む、修飾Ｔ細胞受容体分子により例示した。
本実施例で使用する標的化ＭＨＣペプチドは、実施例１に記載したもの（ＰＲＡＭＥ－００４、配列番号１）と同一であった。ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドは同様に、可溶性となるために操作され、ＰＲＡＭＥ－００４ペプチドに対する向上した親和性を示し、更に、ＣＤ３結合抗体部分（ただし、実施例１及び３と比較して異なるバリアント）を含む、修飾Ｔ細胞受容体分子により例示した。
【0188】
提示した方法が、合成ペプチドライブラリーから潜在的なオフターゲットを同定する能力を実証するために、同位体標識した８つのペプチド：ＭＨＣ複合体の混合物を、腎細胞癌組織サンプル由来の生物学的マトリックスでスパイクした。実験のために、０．３ｇの組織を上述のとおりに溶解し、２ｐｍｏｌのペプチド：ＭＨＣ複合体を添加した。溶解物を当量部に分け、ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチド、及びＨＬＡ－Ａ＊０２特異的抗体ＢＢ７．２を用いるアフィニティクロマトグラフィーに供した。同位体標識したペプチドは、標的、５つの既知の交差反応性ペプチド、及び、陰性対照としての２つの非結合ペプチドで構成された（表６）。
【0189】
ＰＲＡＭＥ結合ポリペプチドとＨＬＡ－Ａ＊０２特異的抗体ＢＢ７．２のシグナル面積を、図１４に示す。予想通り、標的、及び既知のオフターゲットは、約１桁で、高比率のシグナル面積［ｐＭＨＣ結合ポリペプチド／ＢＢ７．２］を示し、故に、提示した方法により、非常に関連があるものとして分類される。同様に、両方の陰性対照ペプチドが、非常に低い比率のシグナル面積［ｐＭＨＣ結合ポリペプチド／ＢＢ７．２］を示し、故に、提示した方法に基づき、さほど関連しないものと考えられる。
【0190】
表６：スパイクした、同位体標識したペプチド：ＭＨＣ複合体の概観。同位体標識したアミノ酸をアスタリスクで示す。質量分析による、ＨＬＡ－Ａ＊０２特異的結合ペプチドＢＢ７．２に対する、ＰＲＡＭＥ結合ポリペプチドから溶出したペプチドの比率を示す。上部の横列では、標的ペプチドのＰＲＡＭＥ－００４が提示され、続いて、５つの既知のオフターゲット、及び２つの非結合陰性対照ペプチドが提示される。ＰＭＢＥＣスコアは、標的配列に対するペプチド類似性の測定値である。結合親和性は、ＨＩＳ１ Ｋバイオセンサーを用いるバイオ層干渉法により測定した。
【0191】
【表6】
【0192】
実施例５：本実施例で使用する標的化ＭＨＣペプチドは、実施例４に記載したもの（ＰＲＡＭＥ－００４、配列番号１）と同一であった。ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドは同様に、可溶性となるために操作され、ＰＲＡＭＥ－００４ペプチドに対する向上した親和性を示し、更に、ＣＤ３結合抗体部分を含む、修飾Ｔ細胞受容体分子により例示した。
【0193】
ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドの結合モチーフにて情報を読み込む、提示した方法の更なるアプローチを示すために、標的ペプチドの合成ペプチドバリアントを、スパイクインライブラリーとして利用した。本アプローチにおいて、ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチドによる認識に関連する各アミノ酸位置を、個別にアラニンで交換（「スキャン」）した（配列番号３８～４６）。本実施例において、関連する位置は、ペプチド－ＭＨＣ結合に重要な位置２～９におけるアンカーアミノ酸を含まない、全ての位置（１～９）であった。合成ペプチドを組み換えにより作製し、リフォールディングしたＨＬＡ－Ａ＊０２アロタイプのＭＨＣ分子にロードし、腎細胞癌組織サンプル由来の生物学的マトリックスでスパイクした。実験のために、上述のとおりに０．１ｇの組織を溶解し、１４０ｆｍｏｌのペプチド：ＭＨＣ複合体を添加した。溶解物を当量部に分け、ペプチド：ＭＨＣ結合ポリペプチド、及びＨＬＡ－Ａ＊０２特異的抗体ＢＢ７．２を用いるアフィニティクロマトグラフィーに供した。標的化した質量分析測定を用いて、ペプチドの定量化を行った。
【0194】
先に記載したように、ＰＲＡＭＥを標的化するｐＭＨＣ結合ポリペプチドと、ＨＬＡ－Ａ＊０２特異的抗体ＢＢ７．２のシグナル強度の比率を、結合親和性に対する推定値として計算した。入手したＭＳシグナル強度の比率を図１５に示す。バイオ層干渉法測定を用いて、図８における比較実施例とのよりよい比較のために、比率を最大値に対して正規化した。位置ベースの結合モチーフ測定のための比較例を考慮すると（図８）、位置１、３、及び４は、ｐＭＨＣ複合体への結合に無関係である。提示した方法は、より高い感度を有し、弱い結合変異ペプチドもまた認識するようであり、これは、例えば、提示した方法の異なるダイナミックレンジを示す、位置８における比較的大きな比率から確認することができる。しかし、個別のペプチドの順序は、最も強力な認識位置である位置５、続いて位置７、６、及び８に一致する。データに従うと、位置８は、結合に関するとは考えられない一方で、ＭＳシグナル強度の比率は著しく低下する。これは、位置８において、グリシン、及び様々な他の許容されたアミノ酸に対する低下した選択性を示す、測定した上位結合モチーフ（図７）にもまた一致している。図７との比較は、位置５が結合に、はるかに最も関連する位置であることもまたを示し、このことは、提示した位置ベースの結合モチーフによってもまた、非常に十分に反映されている。
【0195】
スパイクインライブラリーを拡張して、アラニン以外の他の置換アミノ酸もまた含めるようにすることで、単一実験における、結合モチーフについて得られる情報を増加させることができる。更に、自然に存在する数百～数千個のペプチドの合成ライブラリーを、合成ライブラリーとして適用することができる。提示した方法の示した態様の、主たる１つの利点は、それぞれの結合親和性を並行して測定可能であることである。
【0196】
略称
ＡＲ アンカー残基
ＡＰＣ 抗原提示細胞
ＢＩＲＤ 黒体赤外放射解離
ＢｉＴＥ 特異的Ｔ細胞エンゲージャー
ＣＡＲ キメラ抗原受容体
ＣＤＲ 相補性決定領域
ＣＩＤ 衝突誘起解離
ＤＡＲＴ 二重特異性再標的化抗体
ＤＤＡ データ依存性獲得
ＤＩＡ データ独立性獲得
ＤＲＩＰ 欠陥性リボソーム粒子
ＥＣＤ 電子捕獲解離
ＥＤＤ 電子脱離解離
ＥＴＣＩＤ 電子移動及び衝突誘起解離
ＥＴＤ 電子移動解離
ＥＴＨＣＤ 電子移動／高エネルギー衝突解離
ＨＣＤ 高エネルギー衝突脱離
ＩＲＭＰＤ 赤外線多光子解離
ＩＱＲ 四分位数間領域
ＫＤ 解離定数
ＮＥＴＤ 陰電子移動解離
ＬＤＨ 乳酸脱水素酵素
ＰＢＭＣ 末梢血単核球
ＳＩＤ 表面誘起解離
ＳＭＩＴＥ 同時複数の相互作用Ｔ細胞関与
ＴａｎｄＡｂ タンデム抗体
ＴＣＲ Ｔ細胞受容体
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
ＴＩＬ 腫瘍浸潤リンパ球
参考文献
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Ｚｈｏｕ ＸＸ，Ｚｅｎｇ ＷＦ，Ｃｈｉ Ｈ，Ｌｕｏ Ｃ，Ｌｉｕ Ｃ，Ｚｈａｎ Ｊ，Ｈｅ ＳＭ，Ｚｈａｎｇ Ｚ（２０１７）．ｐＤｅｅｐ： Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ＭＳ／ＭＳ Ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ Ｄｅｅｐ Ｌｅａｒｎｉｎｇ．Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ８９，１２６９０－ １２６９７．
ＡＲ アンカー残基
ＡＰＣ 抗原提示細胞
ＢＩＲＤ 黒体赤外放射解離
ＢｉＴＥ 特異的Ｔ細胞エンゲージャー
ＣＡＲ キメラ抗原受容体
ＣＤＲ 相補性決定領域
ＣＩＤ 衝突誘起解離
ＤＡＲＴ 二重特異性再標的化抗体
ＤＤＡ データ依存性獲得
ＤＩＡ データ独立性獲得
ＤＲＩＰ 欠陥性リボソーム粒子
ＥＣＤ 電子捕獲解離
ＥＤＤ 電子脱離解離
ＥＴＣＩＤ 電子移動及び衝突誘起解離
ＥＴＤ 電子移動解離
ＥＴＨＣＤ 電子移動／高エネルギー衝突解離
ＨＣＤ 高エネルギー衝突脱離
ＩＲＭＰＤ 赤外線多光子解離
ＩＱＲ 四分位数間領域
ＫＤ 解離定数
ＮＥＴＤ 陰電子移動解離
ＬＤＨ 乳酸脱水素酵素
ＰＢＭＣ 末梢血単核球
ＳＩＤ 表面誘起解離
ＳＭＩＴＥ 同時複数の相互作用Ｔ細胞関与
ＴａｎｄＡｂ タンデム抗体
ＴＣＲ Ｔ細胞受容体
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
ＴＩＬ 腫瘍浸潤リンパ球
参考文献
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Ｓｔｏｎｅ ＪＤ，Ｋｒａｎｚ ＤＭ（２０１３）．Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４，２４４．ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ ＪＨ，Ｇｏｍｅｚ－Ｅｅｒｌａｎｄ Ｒ，ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｅｌ Ｂ，Ｈｕｌｓｈｏｆｆ Ｌ，ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｒｏｅｋ Ｄ，Ｂｉｎｓ Ａ，Ｔａｎ ＨＬ，Ｈａｒｐｅｒ ＪＶ，Ｈａｓｓａｎ ＮＪ，Ｊａｋｏｂｓｅｎ ＢＫ，ｅｔ ａｔ．（２０１５）．Ｃａｓｅ ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ａ ｆａｔａｌ Ｓｅｒｉｏｕｓ Ａｄｖｅｒｓｅ Ｅｖｅｎｔ ｕｐｏｎ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ ａ ＭＡＲＴ－１ ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．
Ｚｈｏｕ ＸＸ，Ｚｅｎｇ ＷＦ，Ｃｈｉ Ｈ，Ｌｕｏ Ｃ，Ｌｉｕ Ｃ，Ｚｈａｎ Ｊ，Ｈｅ ＳＭ，Ｚｈａｎｇ Ｚ（２０１７）．ｐＤｅｅｐ： Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ＭＳ／ＭＳ Ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ Ｄｅｅｐ Ｌｅａｒｎｉｎｇ．Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ８９，１２６９０－ １２６９７．
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【配列表】
【国際調査報告】