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特表2022-547865培養液中における改善された残存率を有する遺伝子操作されたＴ細胞
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-11-16
(54)【発明の名称】培養液中における改善された残存率を有する遺伝子操作されたＴ細胞
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0783 20100101AFI20221109BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20221109BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20221109BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20221109BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20221109BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20221109BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20221109BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20221109BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20221109BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20221109BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0783 ZNA
C12N5/10
C12N15/09 110
C12N15/62 Z
C12N15/12
C12N15/13
A61K35/17 Z
A61P35/00
A61P37/04
C12N15/113 130Z
C12N15/113 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022514539
(86)(22)【出願日】2020-09-04
(85)【翻訳文提出日】2022-04-28
(86)【国際出願番号】 IB2020058280
(87)【国際公開番号】W WO2021044378
(87)【国際公開日】2021-03-11
(31)【優先権主張番号】62/897,016
(32)【優先日】2019-09-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/927,764
(32)【優先日】2019-10-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/034,646
(32)【優先日】2020-06-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】518370079
【氏名又は名称】クリスパー セラピューティクス アクチェンゲゼルシャフト
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(74)【代理人】
【識別番号】100203828
【弁理士】
【氏名又は名称】喜多村 久美
(72)【発明者】
【氏名】ジョナサン アレクサンダー テレット
(72)【発明者】
【氏名】デメトリオス カライツィディス
(72)【発明者】
【氏名】ハンスペーター ウォルドナー
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94X
4B065AA94Y
4B065AB01
4B065AC12
4B065AC20
4B065BA01
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB37
4C087BB65
4C087NA05
4C087NA06
4C087NA14
4C087ZB26
(57)【要約】
操作されていないＴ細胞対応物と比較して、以下の特徴：（ａ）培養液中における向上した拡大能力、（ｂ）向上した増殖能力、（ｃ）低減したアポトーシス、及び（ｄ）向上した活性化頻度の１つ以上を有する遺伝子操作されたＴ細胞を含むＴ細胞バンク。こうした遺伝子操作されたＴ細胞は、（ｉ）細胞の自己再生に関与する変異遺伝子、（ｉｉ）アポトーシスに関与する破壊された遺伝子、（ｉｉｉ）Ｔ細胞の疲弊の制御に関与する破壊された遺伝子、又は（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つの組み合わせを含み得る。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
遺伝子操作されたＴ細胞の集団であって、（ｉ）細胞の自己再生に関与する破壊された遺伝子、
（ｉｉ）アポトーシスに関与する破壊された遺伝子、
（ｉｉｉ）Ｔ細胞の疲弊の制御に関与する破壊された遺伝子、又は
（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つの組み合わせ
を含み、操作されていないＴ対応物と比較して、以下の特徴：（ａ）培養液中における向上した拡大能力、（ｂ）向上した増殖能力、（ｃ）低減したアポトーシスレベル、及び（ｄ）向上した活性化頻度の１つ以上を有する、遺伝子操作されたＴ細胞の集団。
【請求項2】
前記Ｔ細胞は、（ｉ）～（ｉｉｉ）の組み合わせを含む、請求項１に記載の遺伝子操作されたＴ細胞の集団。
【請求項3】
（ｉ）は、ＴＥＴ２を含み、任意選択的に、前記遺伝子操作されたＴ細胞は、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）又は両方を含まない、請求項１又は２に記載の遺伝子操作されたＴ細胞の集団。
【請求項4】
前記破壊されたＴＥＴ２は、エクソン１、エクソン３、エクソン４、エクソン５及びエクソン６又はこれらの組み合わせからなる群から選択されるエクソン中で遺伝子編集され、任意選択的に、前記変異したＴＥＴ２は、エクソン３、エクソン４、エクソン５又はエクソン６中で遺伝子編集される、請求項１～３のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたＴ細胞の集団。
【請求項5】
前記破壊されたＴＥＴ２遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介遺伝子編集によって遺伝子編集される、請求項１～４のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたＴ細胞の集団。
【請求項6】
前記破壊されたＴＥＴ２遺伝子は、配列番号１４、１８、２２、２６、１１２、１１６又は１２０のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を用いるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介遺伝子編集によって遺伝子編集される、請求項５に記載の遺伝子操作されたＴ細胞の集団。
【請求項7】
（ｉｉ）は、ＦＡＳを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたＴ細胞の集団。
【請求項8】
（ｉｉｉ）は、ＣＤ７０を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたＴ細胞の集団。
【請求項9】
前記破壊されたＦＡＳ及び／又はＣＤ７０遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介遺伝子編集によって遺伝子編集される、請求項７又は８に記載の遺伝子操作されたＴ細胞の集団。
【請求項10】
前記破壊されたＦＡＳ遺伝子は、配列番号６９、７３、７７、８１又は８５のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を用いるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介遺伝子編集によって遺伝子編集され、及び／又は前記破壊されたＣＤ７０遺伝子は、配列番号３４、３８、４２、４６、５０、５４又は５８のヌクレオチド配列を含むｇＲＮＡを用いるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介遺伝子編集によって遺伝子編集される、請求項９に記載の遺伝子操作されたＴ細胞の集団。
【請求項11】
前記Ｔ細胞は、破壊されたβ－２－ミクログロブリン（β２Ｍ）遺伝子を更に含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたＴ細胞の集団。
【請求項12】
前記Ｔ細胞は、破壊されたＴ細胞受容体α鎖定常領域（ＴＲＡＣ）遺伝子を更に含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたＴ細胞の集団。
【請求項13】
前記Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように更に操作される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたＴ細胞の集団。
【請求項14】
前記ＣＡＲは、腫瘍抗原を標的化する、請求項１３に記載の遺伝子操作されたＴ細胞の集団。
【請求項15】
前記腫瘍抗原は、ＣＤ１９、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）又はＣＤ７０である、請求項１４に記載の遺伝子操作されたＴ細胞の集団。
【請求項16】
前記Ｔ細胞は、前記ＣＡＲをコードする核酸を含み、前記核酸は、前記Ｔ細胞のゲノムに挿入される、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたＴ細胞の集団。
【請求項17】
前記破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、前記キメラ抗原受容体をコードする前記ヌクレオチド酸の挿入を有する、請求項１６に記載の遺伝子操作されたＴ細胞の集団。
【請求項18】
前記Ｔ細胞は、１つ以上のヒトドナーの初代Ｔ細胞から誘導される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたＴ細胞の集団。
【請求項19】
前記Ｔ細胞は、サイトカイン依存性の成長を示す、請求項１～１８のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたＴ細胞の集団。
【請求項20】
請求項１～１０のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたＴ細胞の集団を調製するための方法であって、（ａ）Ｔ細胞又はその前駆細胞である複数の細胞を提供することと、
（ｂ）前記（ｉ）～（ｉｉｉ）の遺伝子の１つ以上を遺伝子編集することと、
（ｃ）前記遺伝子操作されたＴ細胞の集団を生成することと
を含む方法。
【請求項21】
工程（ｂ）は、前記複数の細胞に、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ及び前記（ｉ）～（ｉｉｉ）の遺伝子の１つ以上を標的化する１つ以上のｇＲＮＡを送達することによって実施される、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
（ｉ）は、ＴＥＴ２を含み、任意選択的に、ＴＥＴ２を標的化する前記ｇＲＮＡは、エクソン１、エクソン３、エクソン４、エクソン５及びエクソン６からなる群から選択される前記ＴＥＴ２遺伝子のエクソンに特異的である、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
ＴＥＴ２を標的化する前記ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、配列番号１４、１８、２２、２６、１１２、１１６又は１２０のヌクレオチド配列を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
（ｉｉ）は、ＦＡＳを含む、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
（ｉｉｉ）は、ＣＤ７０を含む、請求項２０～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
ＦＡＳを標的化する前記ｇＲＮＡは、配列番号６９、７３、７７、８１又は８５のヌクレオチド配列を含み、及び／又はＣＤ７０を標的化する前記ｇＲＮＡは、配列番号３４、３８、４２、４６、５０、５４又は５８のヌクレオチド配列を含む、請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項27】
工程（ａ）の前記細胞は、１つ以上のヒトドナーの初代Ｔ細胞である、請求項２０～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
工程（ｂ）において、（ｉ）～（ｉｉｉ）の組み合わせを標的化するｇＲＮＡは、前記細胞に送達される、請求項２０～２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
工程（ｂ）において、前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、請求項２０～２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ及び前記１つ以上のｇＲＮＡは、リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）中で複合体を形成する、請求項２０～３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
工程（ｂ）は、単一のエレクトロポレーションイベントによって実施される、請求項２０～３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項33】
工程（ｂ）は、２つの逐次的なエレクトロポレーションイベントによって実施される、請求項２０～３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項34】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する遺伝子操作されたＴ細胞を調製するための方法であって、（ａ）請求項１～１０のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたＴ細胞を含む細胞バンクから複数のＴ細胞を提供することと、
（ｂ）前記複数の前記Ｔ細胞に、ＣＡＲをコードする核酸を送達することと、
（ｃ）前記ＣＡＲを発現する遺伝子操作されたＴ細胞を生成することと
を含む方法。
【請求項35】
前記細胞バンク中の前記遺伝子操作されたＴ細胞は、破壊されたβ２Ｍ遺伝子を更に含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
β２Ｍ遺伝子を遺伝子編集することを更に含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項37】
前記遺伝子編集工程は、前記複数の前記Ｔ細胞に、β２Ｍ遺伝子を標的化するｇＲＮＡを送達することを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
前記細胞バンク中の前記遺伝子操作されたＴ細胞は、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子を更に含む、請求項３４～３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項39】
ＴＲＡＣ遺伝子を遺伝子編集することを更に含む、請求項３４～３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項40】
前記細胞バンク中の前記遺伝子操作されたＴ細胞は、１つ以上のヒトドナーの初代Ｔ細胞から誘導される、請求項３４～３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項41】
ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、前記Ｔ細胞に送達される、請求項３４～４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項42】
前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、請求項４２に記載の方法。
【請求項44】
前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ及び前記ｇＲＮＡは、リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）中で複合体を形成する、請求項４１～４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項45】
請求項２０～４４のいずれか一項に記載の方法によって調製される、遺伝子操作されたＴ細胞集団。
【請求項46】
対象中の望ましくない細胞を消失させるための方法であって、前記望ましくない細胞を標的化するキメラ抗原受容体を発現するＴ細胞を、それを必要とする対象に投与することを含み、前記Ｔ細胞は、請求項１～１９又は４５のいずれか一項に記載される、方法。
【請求項47】
前記望ましくない細胞は、癌細胞である、請求項４６に記載の方法。
【請求項48】
ＴＥＴ２遺伝子を標的化するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であって、前記ＴＥＴ２遺伝子のエクソン３又はエクソン５に特異的なヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）。
【請求項49】
エクソン５に特異的なヌクレオチド配列を含む、請求項４８に記載のｇＲＮＡ。
【請求項50】
前記ヌクレオチド配列は、前記ＴＥＴ２遺伝子のエクソン５中のＧＧＧＡＴＧＴＣＣＴＡＴＴＧＣＴＡＡＧＴ（配列番号１２５）又はＡＧＧＧＡＴＧＴＣＣＴＡＴＴＧＣＴＡＡＧ（配列番号１２６）の部位を標的化する、請求項４９に記載のｇＲＮＡ。
【請求項51】
前記ヌクレオチド配列は、配列番号１８又は２２を含む、請求項５０に記載のｇＲＮＡ。
【請求項52】
前記ＴＥＴ２遺伝子のエクソン３を標的化するヌクレオチド配列を含む、請求項４８に記載のｇＲＮＡ。
【請求項53】
前記ヌクレオチド配列は、前記ＴＥＴ２遺伝子のエクソン３中のＧＡＴＴＣＣＧＣＴＴＧＧＴＧＡＡＡＡＣＧ（配列番号１２９）、ＣＡＧＧＡＣＴＣＡＣＡＣＧＡＣＴＡＴＴＣ（配列番号１３１）又はＴＴＣＣＧＣＴＴＧＧＴＧＡＡＡＡＣＧＡＧ（配列番号１３３）を標的化する、請求項５２に記載のｇＲＮＡ。
【請求項54】
配列番号１１２、１１６又は１２０のヌクレオチド配列を含む、請求項５３に記載のｇＲＮＡ。
【請求項55】
前記ＴＥＴ２遺伝子のエクソン４を標的化するヌクレオチド配列を含む、請求項４８に記載のｇＲＮＡ。
【請求項56】
前記ヌクレオチド配列は、前記ＴＥＴ２遺伝子のエクソン４中のＣＡＴＴＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＣＴＡＧＡ（配列番号１２４）を標的化する、請求項５５に記載のｇＲＮＡ。
【請求項57】
配列番号１４のヌクレオチド配列を含む、請求項５６に記載のｇＲＮＡ。
【請求項58】
前記ＴＥＴ２遺伝子のエクソン６を標的化するヌクレオチド配列を含む、請求項４８に記載のｇＲＮＡ。
【請求項59】
前記ヌクレオチド配列は、前記ＴＥＴ２遺伝子のエクソン６中のＡＣＧＧＣＡＣＧＣＴＣＡＣＣＡＡＴＣＧＣ（配列番号１２７）を標的化する、請求項５８に記載のｇＲＮＡ。
【請求項60】
配列番号２６のヌクレオチド配列を含む、請求項５９に記載のｇＲＮＡ。
【請求項61】
足場配列を更に含む、請求項４８～６０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
【請求項62】
１つ以上の修飾されたヌクレオチドを含む、請求項４８～６１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
【請求項63】
前記ｇＲＮＡの５’及び／又は３’末端に１つ以上の２’－Ｏ－メチルホスホロチオエート残基を含む、請求項６２に記載のｇＲＮＡ。
【請求項64】
配列番号１２、１３、１６、１７、２０、２１、２４、２５、１１４、１１５、１１８、１１９、１２２又は１２３のヌクレオチド配列を含む、請求項６１～６３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年９月６日出願の米国仮特許出願第６２／８９７，０１６号明細書、２０１９年１０月３０日出願の米国仮特許出願第６２／９２７，７６４号明細書及び２０２０年６月４日出願の米国仮特許出願第６３／０３４，６４６号明細書に対する優先権の利益を主張する。先行出願の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年９月６日出願の米国仮特許出願第６２／８９７，０１６号明細書、２０１９年１０月３０日出願の米国仮特許出願第６２／９２７，７６４号明細書及び２０２０年６月４日出願の米国仮特許出願第６３／０３４，６４６号明細書に対する優先権の利益を主張する。先行出願の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法は、遺伝子修飾されたＴ細胞を使用して、癌細胞をより特異的且つ効率的に標的化して死滅させる。Ｔ細胞が血液から回収された後、この細胞は、その表面上にＣＡＲを含むように操作される。ＣＡＲは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術を使用してＴ細胞に導入され得る。これらの同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞が患者に注射されると、受容体は、Ｔ細胞が癌細胞を死滅させることを可能にする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
培養液中における改善された残存率を有するＴ細胞がＣＡＲ－Ｔ療法に望まれている。こうしたＴ細胞は、インビトロ及びインビボの両方でより長期間生存し、それによってＣＡＲ－Ｔ細胞の製造及び臨床応用における利益を付与する。しかしながら、培養液中のＴ細胞の残存率を改善することは、依然として困難である。
【課題を解決するための手段】
【0004】
本開示は、少なくとも部分的に、細胞培養中のＴ細胞の残存率を改善するために、特定の遺伝子（例えば、ＴＥＴ２などの細胞の自己再生、ＦＡＳなどのアポトーシス、ＣＤ７０などのＴ細胞の疲弊若しくは複製老化又はこれらの組み合わせに関与する遺伝子）の遺伝子編集を有するＴ細胞を含むＴ細胞バンクの開発に基づく。本明細書に開示される遺伝子編集されたＴ細胞は、培養液中における向上した細胞拡大及び増殖能力、低減したアポトーシス（例えば、ＦＡＳリガンドによって誘発される）、向上した活性化頻度（例えば、向上した細胞傷害性）並びに動物モデルにおける向上したＣＡＲ－Ｔ有効性（例えば、より長期の残存性を介して）を示した。例えば、破壊されたＴＥＴ２遺伝子を有するＣＡＲ－Ｔ細胞は、インビトロでの成長の優位性及びＣＡＲ－Ｔ濃縮効果の両方を示し、ＣＡＲ－Ｔ細胞が、液性腫瘍及び固形腫瘍の両方を有する動物モデル中でより長期間残存することを可能にする。更に、破壊されたＴＥＴ２遺伝子を有する遺伝子編集Ｔ細胞は、安全性を示唆するサイトカイン依存性の成長を示した。こうしたＴ細胞バンク（例えば、破壊されたＴＥＴ２遺伝子を有する）は、治療用Ｔ細胞、例えばＣＡＲ－Ｔ細胞を作製するために用いることができる。
【0005】
従って、本開示の１つの態様は、（ｉ）細胞の自己再生に関与する変異遺伝子、（ｉｉ）アポトーシスに関与する破壊された遺伝子、（ｉｉｉ）Ｔ細胞の疲弊の制御若しくは複製老化に関与する破壊された遺伝子、又は（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つの組み合わせを含む、遺伝子操作されたＴ細胞の集団（Ｔ細胞バンク）を提供する。遺伝子操作されたＴ細胞の集団は、操作されていないＴ対応物と比較して、以下の優れた特徴：（ａ）培養液中における向上した拡大能力、（ｂ）向上した増殖能力、（ｃ）低減したアポトーシスレベル、及び（ｄ）向上した活性化頻度の１つ以上を有する。本明細書に開示されるＴ細胞バンクは、１つ以上のドナー、例えば１つ以上のヒトドナーの初代Ｔ細胞から誘導され得る。
【0006】
いくつかの実施形態では、細胞の自己再生に関与する遺伝子は、ＴＥＴ２遺伝子を含み得る。変異ＴＥＴ２遺伝子は、官能性ＴＥＴ２タンパク質を発現しない破壊されたＴＥＴ２遺伝子であり得る。代わりに、変異ＴＥＴ２遺伝子は、ＴＥＴ２の切断型（例えば、１７０ｋＤａ前後の分子量を有する切断型）を発現する調節されたＴＥＴ２遺伝子であり得る。変異ＴＥＴ２遺伝子のいずれも、例えば、ＴＥＴ２遺伝子中の所望の部位（コード領域又は非コード領域のいずれか）を標的化するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を用いたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介遺伝子編集によって遺伝子編集され得る。いくつかの例では、変異ＴＥＴ２遺伝子は、エクソン１、エクソン３、エクソン４、エクソン５及びエクソン６の１つ以上で１つ以上の遺伝子編集イベントを有し得る。具体的な例では、変異ＴＥＴ２遺伝子は、配列番号１４、１８、２２、２６、１１２、１１６又は１２０を含むｇＲＮＡを用いて遺伝子編集される。
【0007】
いくつかの実施形態では、アポトーシスに関与する遺伝子は、ＦＡＳを含み得、及び／又はＴ細胞の疲弊に関与する遺伝子は、ＣＤ７０を含み得る。こうした遺伝子は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介遺伝子編集を介して破壊され得る。ＦＡＳを標的化する例示的なｇＲＮＡは、配列番号６９、７３、７７、８１又は８５を含み得る。ＣＤ７０を標的化する例示的なｇＲＮＡは、配列番号３４、３８、４２、４６、５０、５４又は５８を含み得る。
【0008】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される遺伝子操作されたＴ細胞の集団は、細胞の自己再生に関与する少なくとも１つの変異遺伝子（例えば、ＴＥＴ２）、アポトーシスに関与する少なくとも１つの遺伝子（例えば、ＦＡＳ）及び／又はＴ細胞の疲弊に関与する少なくとも１つの遺伝子（例えば、ＣＤ７０）の組み合わせを含み得る。
【0009】
本明細書に開示される遺伝子操作されたＴ細胞の集団のいずれも、破壊されたβ－２－ミクログロブリン（β２Ｍ）遺伝子、破壊されたＴ細胞受容体α鎖定常領域（ＴＲＡＣ）遺伝子又はこれらの組み合わせを更に含み得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、例えば、ＣＡＲをコードする核酸を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように更に操作され得る。いくつかの例では、核酸がＴ細胞のゲノムに挿入される。特定の例では、遺伝子操作されたＴ細胞は、キメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド酸が挿入され得る、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子を有し得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、腫瘍抗原を標的化し得る。例としては、ＣＤ１９、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）又はＣＤ７０が挙げられる。
【0010】
別の態様では、本開示は、本明細書に開示されるＴ細胞バンクを調製するための方法を提供する。こうした方法は、（ａ）Ｔ細胞又はその前駆細胞である複数の細胞を提供することと、（ｂ）細胞の自己再生に関与する少なくとも１つの遺伝子（例えば、ＴＥＴ２）、アポトーシスに関与する少なくとも１つの遺伝子（例えば、ＦＡＳ）及び／又はＴ細胞の疲弊の制御に関与する少なくとも１つの遺伝子（例えば、ＣＤ７０）を遺伝子編集することと、（ｃ）遺伝子操作されたＴ細胞の集団を生成することとを含み得る。
【0011】
いくつかの実施形態では、工程（ａ）のＴ細胞は、１つ以上の好適なドナー、例えば１つ以上のヒトドナーから誘導され得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、サイトカイン依存性の成長を示す。
【0012】
いくつかの実施形態では、工程（ｂ）は、（ａ）の細胞に、１つ以上のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ及び本明細書に開示される１つ以上の標的遺伝子に特異的な１つ以上のｇＲＮＡを送達することによって実施され得る。いくつかの例では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、例えばＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼであり得る。いくつかの例では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ及び１つ以上のｇＲＮＡは、リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）中で複合体を形成することができる。工程（ｂ）は、単一のエレクトロポレーションイベントによって実施され得る。代わりに、工程（ｂ）は、２つの逐次的なエレクトロポレーションイベントによって実施され得る。
【0013】
いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、ＴＥＴ２を含む。例示的なＴＥＴ２を標的化するｇＲＮＡは、ＴＥＴ２遺伝子のエクソン１、エクソン３、エクソン４、エクソン５及び／又はエクソン６に特異的であり得る。こうしたｇＲＮＡは、配列番号１４、１８、２２又は２６のヌクレオチド配列を含み得る。代わりに又は加えて、標的遺伝子は、ＦＡＳ及び／又はＣＤ７０を含み得る。ＦＡＳを標的化する例示的なｇＲＮＡは、配列番号６９、７３、７７、８１又は８５のヌクレオチド配列を含み得る。ＣＤ７０を標的化する例示的なｇＲＮＡは、配列番号３４、３８、４２、４６、５０、５４又は５８のヌクレオチド配列を含み得る。
【0014】
更に別の態様では、本開示は、本明細書に開示されるＴ細胞バンクのいずれかに由来する遺伝子操作されたＴ細胞を用いて、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する遺伝子操作されたＴ細胞を調製するための方法を提供する。こうした方法は、（ａ）細胞の自己再生に関与する少なくとも１つの遺伝子（例えば、ＴＥＴ２）、アポトーシスに関与する少なくとも１つの遺伝子（例えば、ＦＡＳ）及び／又はＴ細胞の疲弊の制御に関与する少なくとも１つの遺伝子（例えば、ＣＤ７０）を有する遺伝子操作されたＴ細胞を含み得る、Ｔ細胞バンクからの複数のＴ細胞を提供することと、（ｂ）複数のＴ細胞に、ＣＡＲをコードする核酸を送達することと、（ｃ）ＣＡＲを発現する遺伝子操作されたＴ細胞を生成することとを含み得る。
【0015】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞バンクからの複数のＴ細胞は、破壊されたβ２Ｍ遺伝子を更に含む。他の実施形態では、方法は、β２Ｍ遺伝子を遺伝子編集して、例えば複数のＴ細胞に、β２Ｍ遺伝子を標的化するｇＲＮＡを送達することを更に含み得る。
【0016】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞バンクからの複数のＴ細胞は、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子を更に含む。他の実施形態では、方法は、ＴＲＡＣ遺伝子を遺伝子編集して、例えば複数のＴ細胞に、ＴＲＡＣ遺伝子を標的化するｇＲＮＡを送達することを更に含み得る。
【0017】
本明細書に開示される方法のいずれにおいても、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、Ｔ細胞バンクから複数のＴ細胞に送達され得る。いくつかの例では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、例えばＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼであり得る。いくつかの例では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ及びｇＲＮＡは、リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）中で複合体を形成することができる。
【0018】
本明細書に開示される調製方法のいずれかによって調製される遺伝子編集されたＴ細胞も本開示の範囲に含まれる。
【0019】
本明細書に開示されるＣＡＲ－Ｔ細胞のいずれも、ＣＡＲ－Ｔ療法の標準用量よりも低い用量で治療目的（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞上のＣＡＲポリペプチドによって標的化された疾患細胞を消失させること）に使用することができ、ＣＡＲ－Ｔ療法の標準用量とは、同じＣＡＲポリペプチドを発現し、且つ本明細書に開示されるようなＴ細胞残存率を向上させるための遺伝子編集を含まない（例えば、ＴＥＴ２、ＦＡＳ及び／又はＣＤ７０に対する遺伝子編集のない）ＣＡＲ－Ｔ細胞の用量を指す。
【0020】
ＴＥＴ２遺伝子を標的化するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）も本開示の範囲に含まれる。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ＴＥＴ２遺伝子のエクソン５のエクソンに特異的なヌクレオチド配列を含む。いくつかの例では、ｇＲＮＡによって編集されたＴＥＴ２遺伝子は、ＴＥＴ２の切断型を発現し得る。こうしたｇＲＮＡは、ＴＥＴ２遺伝子のエクソン５中のＧＧＧＡＴＧＴＣＣＴＡＴＴＧＣＴＡＡＧＴ（配列番号１２５）の部位を標的化し得る。一例では、ｇＲＮＡは、配列番号１８のヌクレオチド配列を含み得る。代わりに、ｇＲＮＡは、ＴＥＴ２遺伝子のエクソン５中のＡＧＧＧＡＴＧＴＣＣＴＡＴＴＧＣＴＡＡＧ（配列番号１２６）の部位を標的化し得る。一例では、ｇＲＮＡは、配列番号２２のヌクレオチド配列を含み得る。
【0021】
他の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＴＥＴ２遺伝子のエクソン３を標的化するヌクレオチド配列を含み得る。例えば、ｇＲＮＡは、ＴＥＴ２遺伝子のエクソン３中のＧＡＴＴＣＣＧＣＴＴＧＧＴＧＡＡＡＡＣＧ（配列番号１２９）を標的化するヌクレオチド配列を含み得る。代わりに、ｇＲＮＡは、ＴＥＴ２遺伝子のエクソン３中のＣＡＧＧＡＣＴＣＡＣＡＣＧＡＣＴＡＴＴＣ（配列番号１３１）を標的化するヌクレオチド配列を含み得る。別の例では、ｇＲＮＡは、ＴＥＴ２遺伝子のエクソン３中のＴＴＣＣＧＣＴＴＧＧＴＧＡＡＡＡＣＧＡＧ（配列番号１３３）を標的化するヌクレオチド配列を含み得る。例示的なｇＲＮＡは、配列番号１１２、１１６又は１２０のヌクレオチド配列を含み得る。
【0022】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ＴＥＴ２遺伝子のエクソン４を標的化するヌクレオチド配列を含み得る。例えば、ｇＲＮＡは、ＴＥＴ２遺伝子のエクソン４中のＣＡＴＴＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＣＴＡＧＡ（配列番号１２４）を標的化するヌクレオチド配列を含み得る。一例では、ｇＲＮＡは、配列番号１４のヌクレオチド配列を含み得る。
【0023】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ＴＥＴ２遺伝子のエクソン６を標的化するヌクレオチド配列を含み得る。例えば、ｇＲＮＡは、ＴＥＴ２遺伝子のエクソン６中のＡＣＧＧＣＡＣＧＣＴＣＡＣＣＡＡＴＣＧＣ（配列番号１２７）を標的化するヌクレオチド配列を含み得る。一例では、ｇＲＮＡは、配列番号２６のヌクレオチド配列を含み得る。
【0024】
本明細書に開示されるｇＲＮＡのいずれも足場配列を更に含み得る。いくつかの場合、ｇＲＮＡは、１つ以上の修飾されたヌクレオチド、例えばｇＲＮＡの５’及び／又は３’末端に１つ以上の２’－Ｏ－メチルホスホロチオエート残基を含み得る。ＴＥＴ２を標的化する例示的なｇＲＮＡは、表３に示され（未修飾配列及び修飾配列を含む）、その全てが本開示の範囲に含まれ、またＴ細胞などの宿主細胞中でＴＥＴ２遺伝子を遺伝子編集するための本明細書に開示される方法のいずれかに用いることができる。
【0025】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細を以下の説明に記載する。本発明の他の特徴又は利点は、以下の図面及びいくつかの実施形態の詳細な説明並びに添付の特許請求の範囲からも明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0026】
【図1A-1B】初代ヒトＴ細胞中において、ＴＥＴ２遺伝子ノックアウト（ＫＯ）又はタンパク質切断のいずれかをもたらす変異が増殖及び拡大を増加させたことを示す図面を含む。図１Ａ：ウェスタンブロットアッセイによって判定した、ＴＥＴ２遺伝子のエクソン５を標的化するｇＲＮＡによって編集された初代ヒトＴ細胞中のＴＥＴ２タンパク質の存在を示す絵図。ＴＥＴ２エクソン５＿Ｔ１及びＴＥＴ２エクソン５＿Ｔ２を含むｇＲＮＡの１つでトランスフェクトした細胞中において、タンパク質は、検出されなかった。ＴＥＴ２エクソン５＿Ｔ１ｇＲＮＡは、ＴＥＴ２タンパク質の切断型を生成した。図１Ｂ：ウェスタンブロットアッセイによって判定した、ＴＥＴ２遺伝子のエクソン４又はエクソン６を標的化するｇＲＮＡによって編集された初代ヒトＴ細胞中のＴＥＴ２タンパク質の存在を示す絵図。ＴＥＴ２エクソン４＿ＢＧ４及びＴＥＴ２エクソン６＿ＢＧ５でトランスフェクトした細胞中において、完全長のタンパク質は、検出されなかった。ＴＥＴ２エクソン６＿ＢＧ５処置は、切断型ＴＥＴ２タンパク質種も生成する。
【図1C-1D】図１Ｃ：ＴＥＴ２の調節が培養液中のＴ細胞の増殖及び拡大を著しく向上させることを示すグラフ。ＴＥＴ２エクソン５＿Ｔ１及びＴＥＴ２エクソン５＿Ｔ２によるＴＥＴ２の欠失は、モック群と比較してＴ細胞の増殖を増加させた。切断型ＴＥＴ２を含むＴ細胞（ＴＥＴ２エクソン５＿Ｔ１）は、他の全ての群と比較してより大量の増殖を有した。図１Ｄ：ＴＥＴ２の調節が培養液中のＴ細胞の増殖を著しく向上させることを示すグラフ。ＴＥＴ２エクソン４＿ＢＧ４（ＢＧ４）又はＴＥＴ２エクソン６＿ＢＧ５（ＢＧ５）のいずれかによるＴＥＴ２の欠失は、Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡ ＲＮＰを投与されていない細胞と比較してＴ細胞の増殖及び拡大を増加させた。
【図2A-2B】は、インビトロの抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞中において、ＦＡＳノックアウト（ＫＯ）が、サイトカインによって駆動される増殖を増加させ、アポトーシスを救助したことを示す図を含む。図２Ａ：初代ヒトＴ細胞中の高効率のＦＡＳ遺伝子編集を示すグラフ。ＦＭＯ－ＦＡＳ群は、ＦＡＳシグナルの陰性対照である蛍光マイナス１群を表す。図２Ｂ：ＦＡＳのノックアウトが、インビトロでＩＬ－２／ＩＬ－７によって駆動される抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の増殖を改善させたことを示すグラフ。
【図3A】三重ノックアウト（ＦＡＳ／ＴＥＴ２／ＣＤ７０ノックアウト）Ｔ細胞中で増加した殺細胞及び細胞増殖を示す図を含む。図３Ａ：ＦＡＳ／ＴＥＴ２／ＣＤ７０の三重ノックアウトが抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞殺細胞機能（４８時間）を増加させたことを示すグラフ。
【図4】急性リンパ芽球性白血病を患うマウス中のＣＡＲ－Ｔ細胞の拡大を示すグラフを含む。マウスを、破壊されたＴＲＡＣ及びＢ２Ｍ遺伝子を有する抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞で、且つ適応があれば任意選択的に破壊されたＴＥＴ２、ＣＤ７０及び／又はＦＡＳと組み合わせて処置した。
【図5A-5B】急性リンパ芽球性白血病を患うマウスにおける、ＣＡＲ－Ｔ細胞により増加した生残期間及び腫瘍阻害を示すグラフを含む。図５Ａ：ＣＡＲ Ｔ細胞にＴＥＴ２ ＫＯを添加すると生残期間が増加することを示すプロット。図５Ｂ：ＴＥＴ２ ＫＯの添加が、ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したマウス中の腫瘍負荷を更に低減することを示すグラフ。
【図6A-6B】腫瘍再チャレンジにさらされたときのＴＥＴ２ ＫＯ含有ＣＡＲ Ｔ細胞の保護効果を示すグラフを含む。図６Ａ：腫瘍再チャレンジを受けた抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞中のＴＥＴ２ ＫＯの保護効果を示すグラフ。図６Ｂ：抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞中のＴＥＴ２ ＫＯの保護効果を示すグラフ。
【図7】ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／ＴＥＴ２－ＣＡＲ Ｔ細胞のサイトカイン非依存性成長を示すグラフを含む。
【図8A-8B】抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞中のＴＥＴ ＫＯによって付与された、ＴＥＴ ＷＴ抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して有利な特徴を示すグラフを含む。図８Ａ：３ラウンドのＭＭ．１Ｓ標的細胞刺激後の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞＋／－ ＴＥＴ２ ＫＯの拡大成長曲線を示す図。図８Ｂ：３ラウンドのＭＭ．１Ｓ標的細胞刺激後の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞＋／－ ＴＥＴ２ ＫＯの生存度曲線を示す図。
【図8C-8D】図８Ｃ：３ラウンドのＭＭ．１Ｓ標的細胞刺激後の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞＋／－ ＴＥＴ２ ＫＯのＦＡＣＳ表面発現曲線を示す図。図８Ｄ：抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞＋／－ＴＥＴ２ ＫＯのＭＭ１Ｓ刺激後のサイトカイン分泌（ＩＦＮγ）応答を示すチャート。
【発明を実施するための形態】
【0027】
本開示は、ＣＡＲ－Ｔ療法において長年にわたる切実なニーズである、改善された残存率を有するＴ細胞を含むＴ細胞バンクを確立することを目的とする。こうしたＴ細胞バンクは、出発物質として真正のＴ細胞、例えば非形質転換Ｔ細胞、最終分化Ｔ細胞、安定なゲノムを有するＴ細胞並びに／又は増殖及び拡大についてサイトカイン及び成長因子に依存するＴ細胞を用いることができる。代わりに、こうしたＴ細胞バンクは、インビトロ培養中で造血幹細胞（例えば、ｉＰＳＣ）などの前駆細胞から生成されたＴ細胞を用いることができる。本明細書に開示されるＴ細胞バンクは、ＣＡＲ－Ｔ細胞の製造及び臨床応用の両方における１つ以上の利益を付与することができる。
【0028】
従来の同種ＣＡＲ Ｔ細胞が生成され、ここで、細胞が患者の免疫系の構成要素を回避することができ、従ってＧｖＨＤを生じさせないように、ほとんどの場合に単一ドナーのロイコパック（ｌｅｕｋｏｐａｋ）が編集される。これらのＣＡＲ Ｔ細胞を拡大させるプロセスは、数十～数百のバイアル入り製剤をもたらすことができる。患者は、単一用量又は複数用量を投与され得る。製造プロセス中、これらのＣＡＲ Ｔ細胞は、例えば、アポトーシス、疲弊、複製老化及び細胞の適合性が低下する他のプロセスなどの様々な機構が原因で潜在力を喪失する。
【0029】
本明細書に開示される編集されたＴ細胞バンクは、それによって単一のロイコパックが数十～数百の細胞の「バイアル」の細胞バンクを生成することができ、そのそれぞれが、同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞の複数のバイアル入り製剤を生成するために用いることができる、プロセスを提供し得る。バンクされた細胞及びそれらから生成されたＣＡＲ Ｔ細胞の両方は、標準の（非細胞バンク）プロセスによって生成された（本明細書に開示される１つ以上の遺伝子編集イベントなしで）ＣＡＲ Ｔ細胞よりも高い潜在力を保持していると予測される。
【0030】
本明細書で提供されるＴ細胞バンクの他の非限定的な有利な特徴としては、以下のものが挙げられる：
（ａ）ＣＡＲ－Ｔ産物などの製剤の改善された質及び一貫性。
（ｂ）ヒト患者中のＴ細胞バンク細胞から生成されたＣＡＲ－Ｔ細胞のより優れた効力及びより長寿命の効力。
（ｃ）低減された必要投薬量。本明細書に開示されるＴ細胞は、向上した増殖及び拡大能力を有するため、これらは、インビボでより長寿命であり得る。このため、標準のＣＡＲ－Ｔ療法と比較して低い用量で、本明細書に開示される遺伝子編集（例えば、ＴＥＴ２における破壊）を有さない従来のＣＡＲ－Ｔ細胞と実質的に同様の治療効果を達成することができる。
（ｄ）増加した安全性。本明細書に開示される遺伝子操作されたＴ細胞の成長は、サイトカインに依存することが発見され、これは、形質転換がないことを示唆する。更に、より低い用量で十分となり得るため、本明細書に開示されるＣＡＲ－Ｔ細胞の使用は、ＣＡＲＴ－Ｔ療法に一般的に伴う副作用、例えばサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、マクロファージ活性化症候群（ＭＡＳ）、腫瘍溶解症候群（ＴＬＳ）及び／又は神経毒性作用を低減することが期待される。
（ｅ）本明細書に開示されるＣＡＲ－Ｔ細胞の向上した増殖及び拡大、向上した細胞傷害性並びに長期のインビボ残存率から生じる増加した有効性。更に、Ｔ細胞バンクは、患者における滴定可能な投与の利益を提供して、上述した安全性及び有効性を最適化する。
（ｆ）インビトロ及びインビボの両方でのＴ細胞バンク中のＴ細胞の疲弊及び／又は複製老化の低減並びに長期間の残存率に起因する治療効果の延長。
（ｇ）単一のロイコパックなどの好適な天然源から生成され得る同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞産物などのバイアル入り製剤の数の増加。
（ａ）ＣＡＲ－Ｔ産物などの製剤の改善された質及び一貫性。
（ｂ）ヒト患者中のＴ細胞バンク細胞から生成されたＣＡＲ－Ｔ細胞のより優れた効力及びより長寿命の効力。
（ｃ）低減された必要投薬量。本明細書に開示されるＴ細胞は、向上した増殖及び拡大能力を有するため、これらは、インビボでより長寿命であり得る。このため、標準のＣＡＲ－Ｔ療法と比較して低い用量で、本明細書に開示される遺伝子編集（例えば、ＴＥＴ２における破壊）を有さない従来のＣＡＲ－Ｔ細胞と実質的に同様の治療効果を達成することができる。
（ｄ）増加した安全性。本明細書に開示される遺伝子操作されたＴ細胞の成長は、サイトカインに依存することが発見され、これは、形質転換がないことを示唆する。更に、より低い用量で十分となり得るため、本明細書に開示されるＣＡＲ－Ｔ細胞の使用は、ＣＡＲＴ－Ｔ療法に一般的に伴う副作用、例えばサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、マクロファージ活性化症候群（ＭＡＳ）、腫瘍溶解症候群（ＴＬＳ）及び／又は神経毒性作用を低減することが期待される。
（ｅ）本明細書に開示されるＣＡＲ－Ｔ細胞の向上した増殖及び拡大、向上した細胞傷害性並びに長期のインビボ残存率から生じる増加した有効性。更に、Ｔ細胞バンクは、患者における滴定可能な投与の利益を提供して、上述した安全性及び有効性を最適化する。
（ｆ）インビトロ及びインビボの両方でのＴ細胞バンク中のＴ細胞の疲弊及び／又は複製老化の低減並びに長期間の残存率に起因する治療効果の延長。
（ｇ）単一のロイコパックなどの好適な天然源から生成され得る同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞産物などのバイアル入り製剤の数の増加。
【0031】
従って、本明細書では、培養液中における改善された残存率を有するＴ細胞を含むＴ細胞バンク、こうしたＴ細胞バンクを生成する方法及びＣＡＲ－Ｔ細胞などの治療用Ｔ細胞を生成するためにこうしたＴ細胞バンクを使用する方法が提供される。本明細書に開示されるＴ細胞バンクを作製するための構成要素及びプロセス（例えば、遺伝子編集のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介アプローチ及びそこで使用される構成要素）も本開示の範囲内である。
【0032】
Ｉ．向上した残存率を有するＴ細胞バンク
本明細書に開示されるＴ細胞バンクは、培養液中における向上した残存率を有する遺伝子操作されたＴ細胞を含む。こうした遺伝子操作されたＴ細胞は、細胞の自己再生に関与する１つ以上の遺伝子、アポトーシスに関与する１つ以上の遺伝子及び／又はＴ細胞疲弊に関与する１つ以上の遺伝子の遺伝子編集を有し得る。本明細書に開示される研究によって示されるように、こうした遺伝子操作されたＴ細胞は、未編集のＴ対応物と比較して以下の優れた特徴の１つ以上を示す：培養液中における向上した拡大能力（例えば、未編集の対応物と比較して、培養液中で少なくとも４週間、例えば少なくとも６週間拡大可能であり、且つ／又は少なくとも１０倍拡大可能、例えば少なくとも１５倍拡大可能である）、向上した増殖能力、より優れたＴ細胞活性化及び低減したアポトーシスレベル。
本明細書に開示されるＴ細胞バンクは、培養液中における向上した残存率を有する遺伝子操作されたＴ細胞を含む。こうした遺伝子操作されたＴ細胞は、細胞の自己再生に関与する１つ以上の遺伝子、アポトーシスに関与する１つ以上の遺伝子及び／又はＴ細胞疲弊に関与する１つ以上の遺伝子の遺伝子編集を有し得る。本明細書に開示される研究によって示されるように、こうした遺伝子操作されたＴ細胞は、未編集のＴ対応物と比較して以下の優れた特徴の１つ以上を示す：培養液中における向上した拡大能力（例えば、未編集の対応物と比較して、培養液中で少なくとも４週間、例えば少なくとも６週間拡大可能であり、且つ／又は少なくとも１０倍拡大可能、例えば少なくとも１５倍拡大可能である）、向上した増殖能力、より優れたＴ細胞活性化及び低減したアポトーシスレベル。
【0033】
（ｉ）Ｔ細胞バンク中の遺伝子操作されたＴ細胞
本明細書に開示されるＴ細胞バンク中の遺伝子操作されたＴ細胞は、Ｔ細胞の培養液中における残存率に関連する１つ以上の遺伝子における遺伝子編集を含む。本明細書で使用するとき、「Ｔ細胞残存率」とは、培養液中でＴ細胞が成長し、増殖し、自己再生し、拡大し、且つ健全な活性を維持することを継続する傾向を指す。いくつかの場合、Ｔ細胞残存率は、Ｔ細胞がインビトロで成長及び拡大することのできる寿命によって表すことができ、これは、本明細書に記載される従来法及び／又はアッセイによって測定可能である。他の場合、Ｔ細胞残存率は、細胞死（例えば、アポトーシス）の低減又は疲弊若しくは複製老化を特徴とする細胞状態の低減によって表され得る。更に他の場合、Ｔ細胞の残存率は、培養液中のＴ細胞活性の維持によって表され得る。
本明細書に開示されるＴ細胞バンク中の遺伝子操作されたＴ細胞は、Ｔ細胞の培養液中における残存率に関連する１つ以上の遺伝子における遺伝子編集を含む。本明細書で使用するとき、「Ｔ細胞残存率」とは、培養液中でＴ細胞が成長し、増殖し、自己再生し、拡大し、且つ健全な活性を維持することを継続する傾向を指す。いくつかの場合、Ｔ細胞残存率は、Ｔ細胞がインビトロで成長及び拡大することのできる寿命によって表すことができ、これは、本明細書に記載される従来法及び／又はアッセイによって測定可能である。他の場合、Ｔ細胞残存率は、細胞死（例えば、アポトーシス）の低減又は疲弊若しくは複製老化を特徴とする細胞状態の低減によって表され得る。更に他の場合、Ｔ細胞の残存率は、培養液中のＴ細胞活性の維持によって表され得る。
【0034】
遺伝子操作されたＴ細胞のＴ細胞残存率は、様々な経路を介して細胞の残存率の制御、例えば細胞の自己再生、アポトーシス及び／又は細胞疲弊の調節において機能する１つ以上の遺伝子を遺伝子編集することによって達成され得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたＴ細胞は、細胞残存率を制御する複数の経路に関与する複数の遺伝子の遺伝子編集を含み得る。こうした遺伝子操作されたＴ細胞は、培養液中成長の期間が増加し得る。更に、こうした遺伝子操作されたＴ細胞から誘導されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、向上したインビボ治療有効性も有し得る。
【0035】
遺伝子操作されたＴ細胞は、好適な供給源、例えば１つ以上の哺乳動物ドナーから得られた親Ｔ細胞（例えば、未編集の野生型Ｔ細胞）から誘導され得る。いくつかの例では、親Ｔ細胞は、１つ以上のヒトドナーから得られた初代Ｔ細胞（例えば、形質転換及び最終分化されていないＴ細胞）である。代わりに、親Ｔ細胞は、インビトロで培養され得る、１つ以上の好適なドナー又は造血幹細胞若しくは人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などの幹細胞から得られた前駆Ｔ細胞から分化され得る。
【0036】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたＴ細胞は、細胞の自己再生に関与する１つ以上の変異遺伝子、アポトーシスに関与する１つ以上の破壊された遺伝子及び／又は細胞疲弊に関与する１つ以上の破壊された遺伝子を含む。こうしたＴ細胞は、ヌクレオチド／核酸が、標的化された細胞のゲノム中などのＤＮＡ配列中に挿入、欠失及び／又は置換される一種の遺伝子操作である遺伝子編集（ゲノム編集を含む）を介して生成され得る。標的化された遺伝子編集により、標的化された細胞のゲノム中（例えば、標的化された遺伝子中又は標的化されたＤＮＡ配列中）の予め選択された部位での挿入、欠失及び／又は置換が可能になる。内因性の遺伝子の配列が例えばヌクレオチド／核酸の欠失、挿入又は置換によって編集されるとき、影響を受けた配列を含む内因性の遺伝子は、配列変異のためにノックアウト又はノックダウンされ得る。従って、標的化された編集を使用して、内因性の遺伝子発現を破壊し得る。「標的化された組込み」は、挿入部位における内因性配列の欠失の有無に関わらず、１つ以上の外因性配列の挿入を含むプロセスを指す。標的化された組込みは、外因性配列を含むドナー鋳型が存在する場合、標的化された遺伝子編集から生じ得る。
【0037】
本明細書で使用するとき、「変異遺伝子」は、標的遺伝子に導入される任意のタイプの遺伝子変異を包含する。いくつかの場合、「変異遺伝子」は、変異遺伝子産物（例えば、切断型遺伝子産物）の発現をもたらす遺伝子変異を含み得る。他の場合、「変異遺伝子」は、遺伝子産物の発現を実質的に又は完全に無効化する遺伝子変異を含有し得る破壊された遺伝子であり得る。
【0038】
本明細書で使用するとき、「破壊された遺伝子」は、内因性の遺伝子と比較して、内因性の遺伝子から機能性タンパク質の発現が減少又は阻害されるような挿入、欠失又は置換を含む遺伝子を指す。本明細書で使用する場合、「遺伝子を破壊すること」は、内因性の遺伝子中において、内因性の遺伝子から機能性タンパク質の発現が減少又は阻害されるような少なくとも１つのヌクレオチド／核酸を挿入するか、欠失させるか又は置換する方法を指す。遺伝子を破壊する方法は、当業者に知られており、本明細書に記載される。
【0039】
いくつかの実施形態では、破壊された遺伝子を含む細胞は、この遺伝子によってコードされる検出可能なレベル（例えば、コードされたタンパク質に結合する抗体を用いた免疫アッセイで又はフローサイトメトリによって）のタンパク質を（例えば、細胞表面において）発現しない。検出可能なレベルのタンパク質を発現しない細胞は、ノックアウト細胞と称され得る。
【0040】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＴ細胞バンクの遺伝子操作されたＴ細胞は、変異ＴＥＴ２遺伝子、破壊されたＦＡＳ遺伝子、破壊されたＣＤ７０遺伝子又はこれらの組み合わせを含み得る。いくつかの場合、追加の遺伝子（例えば、β２Ｍ及び／又はＴＲＡＣ）の遺伝子編集も含まれ得る。
【0041】
Ｔｅｔメチルシトシンジオキシゲナーゼ２遺伝子（ＴＥＴ２）編集
自己再生は、細胞（例えば、Ｔ細胞）が分裂して、同じ細胞状態／同一性を維持するプロセスである。細胞の自己再生に関与する遺伝子とは、細胞の自己再生を正に制御するか又は負に制御するものを指す。本明細書に開示される遺伝子操作されたＴ細胞は、細胞の自己再生を正に制御して、その発現及び／又はコードされたタンパク質産物の生物活性を向上させる遺伝子の遺伝子編集を含み得る。代わりに又は加えて、遺伝子操作されたＴ細胞は、細胞の自己再生を負に制御して、その発現を破壊する遺伝子の遺伝子編集を含み得る。
自己再生は、細胞（例えば、Ｔ細胞）が分裂して、同じ細胞状態／同一性を維持するプロセスである。細胞の自己再生に関与する遺伝子とは、細胞の自己再生を正に制御するか又は負に制御するものを指す。本明細書に開示される遺伝子操作されたＴ細胞は、細胞の自己再生を正に制御して、その発現及び／又はコードされたタンパク質産物の生物活性を向上させる遺伝子の遺伝子編集を含み得る。代わりに又は加えて、遺伝子操作されたＴ細胞は、細胞の自己再生を負に制御して、その発現を破壊する遺伝子の遺伝子編集を含み得る。
【0042】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたＴ細胞は、細胞の自己再生に関与する変異遺伝子を含み得る。こうした遺伝子は、ＴＥＴ２（１０－１１転座－２）メチルシトシンジオキシゲナーゼであり得る。Ｔｅｔ２は、修飾ゲノム塩基であるメチルシトシンから５－ヒドロキシメチルシトシンへの且つシトシン脱メチル化をもたらす更なる中間体への変換を触媒するジオキシゲナーゼである。この酵素は、骨髄造血に関与しており、ＴＥＴ２の欠陥がいくつかの重篤な骨髄増殖症候群に関連していることが報告されている。ＴＥＴ２遺伝子の構造は、当技術分野で既知である。例えば、ヒトＴＥＴ２遺伝子は、染色体４ｑ２４上に位置する。更なる情報は、ＧｅｎＢａｎｋの遺伝子ＩＤ：５４７９０又はＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００１１２７２０８．２に見ることができる。
【0043】
いくつかの例では、遺伝子操作されたＴ細胞は、Ｔ細胞中のＴＥＴ２の発現が実質的に低減するか又は完全に消失するように、破壊されたＴＥＴ２遺伝子を含み得る。破壊されたＴＥＴ２遺伝子は、１つ以上の好適な標的部位（例えば、コード領域中又はプロモーター領域などの非コード制御領域中）において、ＴＥＴ２遺伝子の発現を破壊する１つ以上の遺伝子編集を含み得る。こうした標的部位は、遺伝子操作されたＴ細胞を作製するのに使用するための遺伝子編集アプローチに基づいて同定され得る。遺伝子編集のための例示的な標的部位としては、エクソン１、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６又はこれらの組み合わせが挙げられ得る。いくつかの例では、１つ以上の遺伝子編集は、エクソン３、エクソン４、エクソン５又はエクソン６で起こり得る。こうした遺伝子編集は、好適なガイドＲＮＡ、例えば表３に列挙するものを用いたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術によって誘導され得る。表３に列挙されるｇＲＮＡを用いて得られる編集されたＴＥＴ２遺伝子は、下記の表１５～２１に提供される１つ以上の編集された配列を含み得る。
【0044】
他の例では、遺伝子操作されたＴ細胞は、ＴＥＴ２の機能獲得型変異体であり得る、ＴＥＴ２タンパク質の切断型を発現する変異ＴＥＴ２遺伝子を含み得る。こうした変異ＴＥＴ２遺伝子は、エクソン５中に遺伝子編集を有し得、ＳＤＳ－ＰＡＧＥなどの従来法によって判定され得る約１７０ｋＤａの分子量を有する切断型ＴＥＴ２変異体を生成する。
【0045】
本明細書で使用するとき、用語「約」とは、当業者によって決定される特定の値の許容誤差範囲内を意味し、これは、その値が測定又は決定される方法、即ち測定系の限界に部分的に依存する。例えば、「約」は、当技術分野の慣習による許容標準偏差内にあることを意味し得る。代わりに、「約」は、所与の値の最大±２０％、好ましくは最大±１０％、より好ましくは最大±５％、更により好ましくは最大±１％の範囲を意味し得る。本出願及び特許請求の範囲に特定の値が記載されている場合、特に指示のない限り、用語「約」は、黙示的であり、これに関連して特定の値が許容誤差範囲内にあることを意味する。
【0046】
いくつかの例では、本明細書に開示されるＴ細胞バンクは、遺伝子操作されたＴ細胞を含み得、その少なくとも５０％は、破壊されたＴＥＴ２遺伝子を含む（例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又はそれを超える）。いくつかの例では、本明細書に開示されるＴ細胞バンクは、遺伝子操作されたＴ細胞を含み得、その少なくとも５０％は、上記で開示したものなどのＴＥＴ２の切断型を発現し得る変異ＴＥＴ２遺伝子を含む（例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又はそれを超える）。
【0047】
ＦＡＳ遺伝子編集
アポトーシスとは、多細胞生物内で起こるプログラム細胞死のプロセスである。アポトーシスに関与する遺伝子とは、この生物学的プロセスを正に制御するか又は負に制御するものを指す。本明細書に開示される遺伝子操作されたＴ細胞は、細胞アポトーシスを正に制御して、その発現を破壊する遺伝子の遺伝子編集を含み得る。代わりに又は加えて、遺伝子操作されたＴ細胞は、細胞アポトーシスを負に制御して、その発現及び／又は遺伝子産物の生物活性を向上させる、遺伝子の遺伝子編集を含み得る。
アポトーシスとは、多細胞生物内で起こるプログラム細胞死のプロセスである。アポトーシスに関与する遺伝子とは、この生物学的プロセスを正に制御するか又は負に制御するものを指す。本明細書に開示される遺伝子操作されたＴ細胞は、細胞アポトーシスを正に制御して、その発現を破壊する遺伝子の遺伝子編集を含み得る。代わりに又は加えて、遺伝子操作されたＴ細胞は、細胞アポトーシスを負に制御して、その発現及び／又は遺伝子産物の生物活性を向上させる、遺伝子の遺伝子編集を含み得る。
【0048】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたＴ細胞は、細胞アポトーシス、例えばアポトーシスを正に制御する遺伝子の破壊に関与する編集された遺伝子を含み得る。こうした遺伝子は、ＦＡＳ遺伝子、別名ＦＡＳ受容体、ＣＤ９５又はアポトーシス抗原１（ＡＰＯ－１）であり得る。ＦＡＳ遺伝子は、ＦＡＳリガンドによってトリガされるとアポトーシスをもたらす、細胞表面の死受容体をコードする。ＦＡＳＬ－ＦＡＳ誘導性アポトーシスは、細胞中の複数のアポトーシス経路の１つである（もう１つの主要な経路は、ミトコンドリア経路である）。ＦＡＳ遺伝子の構造は、当技術分野で既知である。例えば、ヒトＦＡＳ遺伝子は、染色体１０ｑ２４．１上に位置する。更なる情報は、ＧｅｎＢａｎｋの遺伝子ＩＤ：３５５に見ることができる。
【0049】
いくつかの例では、遺伝子操作されたＴ細胞は、Ｔ細胞中のＦＡＳの発現が実質的に低減するか又は完全に消失するように、破壊されたＦＡＳ遺伝子を含み得る。破壊されたＦＡＳ遺伝子は、１つ以上の好適な標的部位（例えば、コード領域中又はプロモーター領域などの非コード制御領域中）において、ＦＡＳ遺伝子の発現を破壊する１つ以上の遺伝子編集を含み得る。こうした標的部位は、遺伝子操作されたＴ細胞を作製するのに使用するための遺伝子編集アプローチに基づいて同定され得る。遺伝子編集のための例示的な標的部位としては、エクソン２、エクソン３又はこれらの組み合わせが挙げられ得る。
【0050】
いくつかの例では、本明細書に開示されるＴ細胞バンクは、遺伝子操作されたＴ細胞を含み得、その少なくとも５０％は、破壊されたＦＡＳ遺伝子を含む（例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又はそれを超える）。
【0051】
ＣＤ７０遺伝子編集
Ｔ細胞疲弊は、Ｔ細胞機能の段階的且つ漸進的な喪失のプロセスであり、これは、長期の抗原刺激又は他の因子によって誘導され得る。Ｔ細胞疲弊に関与する遺伝子とは、この生物学的プロセスを正に制御するか又は負に制御するものを指す。本明細書に開示される遺伝子操作されたＴ細胞は、Ｔ細胞疲弊を正に制御して、その発現を破壊する遺伝子の遺伝子編集を含み得る。代わりに又は加えて、遺伝子操作されたＴ細胞は、Ｔ細胞疲弊を負に制御して、その発現及び／又は遺伝子産物の生物活性を向上させる遺伝子の遺伝子編集を含み得る。
Ｔ細胞疲弊は、Ｔ細胞機能の段階的且つ漸進的な喪失のプロセスであり、これは、長期の抗原刺激又は他の因子によって誘導され得る。Ｔ細胞疲弊に関与する遺伝子とは、この生物学的プロセスを正に制御するか又は負に制御するものを指す。本明細書に開示される遺伝子操作されたＴ細胞は、Ｔ細胞疲弊を正に制御して、その発現を破壊する遺伝子の遺伝子編集を含み得る。代わりに又は加えて、遺伝子操作されたＴ細胞は、Ｔ細胞疲弊を負に制御して、その発現及び／又は遺伝子産物の生物活性を向上させる遺伝子の遺伝子編集を含み得る。
【0052】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたＴ細胞は、Ｔ細胞疲弊、例えばＴ細胞疲弊を正に制御する遺伝子の破壊に関与する編集された遺伝子を含み得る。こうした遺伝子は、分化抗原群７０（ＣＤ７０）遺伝子であり得る。ＣＤ７０は、腫瘍壊死因子スーパーファミリのメンバーであり、その発現は、活性化Ｔ及びＢリンパ球並びに成熟樹状細胞に限定される。ＣＤ７０は、そのリガンドであるＣＤ２７との相互作用を通して、腫瘍細胞及び制御性Ｔ細胞の生残に関与している。ＣＤ７０及びその受容体であるＣＤ２７は、Ｔ細胞（活性化及びＴreg細胞）及びＢ細胞を含む複数の細胞型における免疫機能において複数の役割を有する。
【0053】
抗原標的化部分を発現するように操作された免疫細胞においてＣＤ７０遺伝子を破壊することは、大型腫瘍に対する抗腫瘍効果を増強し、且つ耐久性のある抗癌記憶応答を誘導したことも見出された。特に、抗癌記憶応答は、再チャレンジ時に腫瘍増殖を防いだ。更に、ＣＤ７０遺伝子を破壊することは、操作された免疫細胞と標的細胞との比較的低い比で抗原標的化部分を発現するように操作された免疫細胞の細胞傷害性の増強をもたらし、低用量の操作された免疫細胞の潜在的な有効性を示すことが実証された。例えば、本明細書で言及される目的及び主題に対するその関連する開示が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１９／２１５５００号パンフレットを参照されたい。
【0054】
ＣＤ７０遺伝子の構造は、当技術分野で既知である。例えば、ヒトＣＤ７０遺伝子は、染色体１９ｐ１３．３上に位置する。この遺伝子は、エクソンをコードする４つのタンパク質を含有する。更なる情報は、ＧｅｎＢａｎｋの遺伝子ＩＤ：９７０に見ることができる。
【0055】
いくつかの例では、遺伝子操作されたＴ細胞は、Ｔ細胞中のＣＤ７０の発現が実質的に低減するか又は完全に消失するように、破壊されたＣＤ７０遺伝子を含み得る。破壊されたＣＤ７０遺伝子は、１つ以上の好適な標的部位（例えば、コード領域中又はプロモーター領域などの非コード制御領域中）において、ＣＤ７０遺伝子の発現を破壊する１つ以上の遺伝子編集を含み得る。こうした標的部位は、遺伝子操作されたＴ細胞を作製するのに使用するための遺伝子編集アプローチに基づいて同定され得る。遺伝子編集のための例示的な標的部位としては、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４又はこれらの組み合わせが挙げられ得る。本明細書で言及される目的及び主題に対するその関連する開示が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１９／２１５５００号パンフレットも参照されたい。
【0056】
いくつかの例では、本明細書に開示されるＴ細胞バンクは、遺伝子操作されたＴ細胞を含み得、その少なくとも５０％は、破壊されたＣＤ７０遺伝子を含む（例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又はそれを超える）。
【0057】
β２Ｍ遺伝子編集
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＴ細胞バンク中の遺伝子操作されたＴ細胞は、破壊されたβ２Ｍ遺伝子を更に含み得る。β２Ｍは、ＭＨＣ Ｉ複合体の共通の（不変の）構成要素である。遺伝子編集によりその発現が破壊されると、宿主対治療用同種異系Ｔ細胞反応が予防され、同種異系Ｔ細胞の残存率の増加がもたらされる。いくつかの実施形態では、内因性のβ２Ｍ遺伝子の発現は、宿主対移植片反応を予防するために消失される。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＴ細胞バンク中の遺伝子操作されたＴ細胞は、破壊されたβ２Ｍ遺伝子を更に含み得る。β２Ｍは、ＭＨＣ Ｉ複合体の共通の（不変の）構成要素である。遺伝子編集によりその発現が破壊されると、宿主対治療用同種異系Ｔ細胞反応が予防され、同種異系Ｔ細胞の残存率の増加がもたらされる。いくつかの実施形態では、内因性のβ２Ｍ遺伝子の発現は、宿主対移植片反応を予防するために消失される。
【0058】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞バンク中の遺伝子操作されたＴ細胞の少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又はそれを超える）は、検出可能なレベルのβ２Ｍ表面タンパク質を発現しない。
【0059】
いくつかの実施形態では、編集されたβ２Ｍ遺伝子は、以下の表１における配列から選択されるヌクレオチド配列を含み得る。編集されたβ２Ｍ遺伝子（例えば、表１にあるもの）などの編集された遺伝子中において、異なるヌクレオチド配列が単一のｇＲＮＡから生成され得ることは、当業者に既知である。本明細書で言及される主題及び目的に対するその関連する開示が参照により組み込まれる国際公開第２０１９０９７３０５号パンフレットも参照されたい。
【0060】
【表1】
【0061】
本明細書に開示されるＴ細胞バンク中の遺伝子操作されたＴ細胞は、Ｔ細胞の機能を改善するための１つ以上の追加の遺伝子編集（例えば、遺伝子ノックイン又はノックアウト）を更に含み得る。例としては、標的細胞溶解を改善するためのノックイン又はノックアウト遺伝子、Ｔ細胞バンクの細胞から調製されたＣＡＲ－Ｔ細胞などの治療用Ｔ細胞の性能を向上させるためのノックイン又はノックアウト遺伝子が挙げられる。例としては、ＰＤ－１などの免疫チェックポイント遺伝子のノックアウトが挙げられる。
【0062】
ＴＲＡＣ遺伝子編集
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＴ細胞バンク中の遺伝子操作されたＴ細胞は、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子を更に含み得る。この破壊は、ＴＣＲの機能喪失をもたらし、この操作されたＴ細胞を非同種異系反応性にし、且つ同種異系間移植に適したものにし、移植片対宿主疾患のリスクを最小化する。いくつかの実施形態では、内因性ＴＲＡＣ遺伝子の発現は、移植片対宿主反応を予防するために消失される。本明細書で言及される目的及び主題に対するその関連する開示が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１９０９７３０５号パンフレットも参照されたい。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＴ細胞バンク中の遺伝子操作されたＴ細胞は、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子を更に含み得る。この破壊は、ＴＣＲの機能喪失をもたらし、この操作されたＴ細胞を非同種異系反応性にし、且つ同種異系間移植に適したものにし、移植片対宿主疾患のリスクを最小化する。いくつかの実施形態では、内因性ＴＲＡＣ遺伝子の発現は、移植片対宿主反応を予防するために消失される。本明細書で言及される目的及び主題に対するその関連する開示が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１９０９７３０５号パンフレットも参照されたい。
【0063】
２つ以上の好適な標的部位／ｇＲＮＡは、本明細書に開示される各標的遺伝子、例えば当技術分野で既知の又は本明細書に開示されるものに対して使用され得ることを理解されたい。更なる例は、例えば、本明細書で言及される目的及び主題に対するその関連する開示が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１９０９７３０５号パンフレットに見ることができる。
【0064】
例示的なＴ細胞バンク中の遺伝子操作されたＴ細胞
いくつかの実施形態では、破壊されたＴＥＴ２遺伝子を含む遺伝子操作されたＴ細胞の集団を含む、本明細書に開示されるＴ細胞バンクである。こうした遺伝子操作されたＴ細胞は、破壊されたＦＡＳ遺伝子、破壊されたＣＤ７０遺伝子又はその両方を更に含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＴ細胞バンクは、変異ＴＥＴ２遺伝子、破壊されたＦＡＳ遺伝子及び破壊されたＣＤ７０遺伝子から選択される遺伝子編集された遺伝子の少なくとも２つの組み合わせを含む遺伝子操作されたＴ細胞の集団を含み得る。こうした遺伝子操作されたＴ細胞は、任意選択的に、破壊されたβ２Ｍ遺伝子、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子又はその両方を更に含み得る。
いくつかの実施形態では、破壊されたＴＥＴ２遺伝子を含む遺伝子操作されたＴ細胞の集団を含む、本明細書に開示されるＴ細胞バンクである。こうした遺伝子操作されたＴ細胞は、破壊されたＦＡＳ遺伝子、破壊されたＣＤ７０遺伝子又はその両方を更に含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＴ細胞バンクは、変異ＴＥＴ２遺伝子、破壊されたＦＡＳ遺伝子及び破壊されたＣＤ７０遺伝子から選択される遺伝子編集された遺伝子の少なくとも２つの組み合わせを含む遺伝子操作されたＴ細胞の集団を含み得る。こうした遺伝子操作されたＴ細胞は、任意選択的に、破壊されたβ２Ｍ遺伝子、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子又はその両方を更に含み得る。
【0065】
いくつかの例では、本明細書に開示される破壊されたＴＥＴ２遺伝子を含む遺伝子操作されたＴ細胞の集団を含む本明細書に開示されるＴ細胞バンクである。いくつかの場合、Ｔ細胞バンク中の遺伝子操作されたＴ細胞の少なくとも５０％（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％）は、従来のアッセイで測定して検出可能なレベルの表面ＴＥＴ２を発現しない。
【0066】
いくつかの例では、破壊されたＴＥＴ２遺伝子及び破壊されたＦＡＳ遺伝子を含む遺伝子操作されたＴ細胞の集団を含む本明細書に開示されるＴ細胞バンクである。いくつかの場合、Ｔ細胞バンク中の遺伝子操作されたＴ細胞の少なくとも５０％（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％）は、破壊されたＴＥＴ２遺伝子及び破壊されたＦＡＳ遺伝子を含む。
【0067】
いくつかの例では、破壊されたＴＥＴ２遺伝子及び破壊されたＣＤ７０遺伝子を含む遺伝子操作されたＴ細胞の集団を含む本明細書に開示されるＴ細胞バンクである。いくつかの場合、Ｔ細胞バンク中の遺伝子操作されたＴ細胞の少なくとも５０％（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％）は、変異した又は破壊されたＴＥＴ２遺伝子及び破壊されたＣＤ７０遺伝子を含む。
【0068】
特定の例では、破壊されたＴＥＴ２遺伝子、破壊されたＦＡＳ遺伝子及び破壊されたＣＤ７０遺伝子を含む遺伝子操作されたＴ細胞の集団を含む本明細書に開示されるＴ細胞バンクである。いくつかの場合、Ｔ細胞バンク中の遺伝子操作されたＴ細胞の少なくとも５０％（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％）は、変異した又は破壊されたＴＥＴ２遺伝子、破壊されたＦＡＳ遺伝子及び破壊されたＣＤ７０遺伝子を含む。
【0069】
いくつかの例では、本明細書に開示される切断型ＴＥＴ２ポリペプチドのいずれかを発現する変異ＴＥＴ２遺伝子及び破壊されたＦＡＳ遺伝子を含む遺伝子操作されたＴ細胞の集団を含む本明細書に開示されるＴ細胞バンクである。いくつかの場合、Ｔ細胞バンク中の遺伝子操作されたＴ細胞の少なくとも５０％（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％）は、変異ＴＥＴ２遺伝子及び破壊されたＦＡＳ遺伝子を含む。
【0070】
いくつかの例では、本明細書に開示される切断型ＴＥＴ２ポリペプチドを発現する変異ＴＥＴ２遺伝子及び破壊されたＣＤ７０遺伝子を含む遺伝子操作されたＴ細胞の集団を含む本明細書に開示されるＴ細胞バンクである。いくつかの場合、Ｔ細胞バンク中の遺伝子操作されたＴ細胞の少なくとも５０％（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％）は、変異ＴＥＴ２遺伝子及び破壊されたＣＤ７０遺伝子を含む。
【0071】
特定の例では、破壊されたＴＥＴ２遺伝子、破壊されたＦＡＳ遺伝子及び破壊されたＣＤ７０遺伝子を含む遺伝子操作されたＴ細胞の集団を含む本明細書に開示されるＴ細胞バンクである。いくつかの場合、Ｔ細胞バンク中の遺伝子操作されたＴ細胞の少なくとも５０％（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％）は、破壊されたＴＥＴ２遺伝子、破壊されたＦＡＳ遺伝子及び破壊されたＣＤ７０遺伝子を含む。
【0072】
特定の例では、本明細書に開示される切断型ＴＥＴ２ポリペプチドのいずれかを発現する変異ＴＥＴ２遺伝子、破壊されたＦＡＳ遺伝子及び破壊されたＣＤ７０遺伝子を含む遺伝子操作されたＴ細胞の集団を含む本明細書に開示されるＴ細胞バンクである。いくつかの場合、Ｔ細胞バンク中の遺伝子操作されたＴ細胞の少なくとも５０％（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％）は、変異ＴＥＴ２遺伝子、破壊されたＦＡＳ遺伝子及び破壊されたＣＤ７０遺伝子を含む。
【0073】
いくつかの実施形態では、変異ＴＥＴ２遺伝子（例えば、破壊又は変異されて本明細書に開示されるＴＥＴ２の切断型を発現する）、破壊されたＦＡＳ遺伝子及び破壊されたＣＤ７０の１つ以上を含み得るＴ細胞バンク中の遺伝子操作されたＴ細胞は、４週間超、例えば５週間超、６週間超、８週間超及び１０週間超にわたり、培養液中で拡大可能であり得る。いくつかの例では、Ｔ細胞バンク中の遺伝子操作されたＴ細胞は、本明細書に開示される切断型ＴＥＴ２ポリペプチドを発現する変異ＴＥＴ２遺伝子を含み（任意選択的にＦＡＳ及び／又はＣＤ７０の破壊）、培養液中で６週間後（例えば、７週間後、８週間後、９週間後又は１０週間後）に拡大可能である。こうした遺伝子操作されたＴ細胞は、培養液中で６週間後（例えば、７週間後、８週間後、９週間後又は１０週間後）に活性化される能力を維持することができる。更に、こうした遺伝子操作されたＴ細胞は、操作されていない対応物よりも少なくとも１０倍（例えば、少なくとも１５倍）高くなり得る、増加した拡大能力を有する。操作されていない対応物とは、本明細書に開示される細胞の自己再生（例えば、ＴＥＴ２）、アポトーシス（例えば、ＦＡＳ）及び／又はＴ細胞の疲弊（例えば、ＣＤ７０）に関与する遺伝子を除いて同じ遺伝的背景を有する、即ち野生型に対する破壊／変異されているＴ細胞を指す。
【0074】
いくつかの実施形態では、破壊されたＦＡＳ遺伝子（任意選択的に例えば破壊されているか、若しくは本明細書に開示される切断型ＴＥＴ２ポリペプチドを発現する変異ＴＥＴ２遺伝子及び／又は破壊されたＣＤ７０遺伝子）を含み得るＴ細胞バンク中の遺伝子操作されたＴ細胞は、操作されていない対応物と比較して低減したアポトーシス傾向を有し得る。例えば、培養液中の遺伝子操作されたＴ細胞のＦＡＳ／ＦＡＳリガンド誘導アポトーシスのレベルは、操作されていない対応物中のＦＡＳ／ＦＡＳリガンド誘導アポトーシスの５０％未満（例えば、４０％未満、３０％未満、２０％未満又はより低い）であり得る。
【0075】
いくつかの実施形態では、破壊されたＣＤ７０遺伝子（任意選択的に例えば破壊されているか、若しくは本明細書に開示される切断型ＴＥＴ２ポリペプチドを発現する変異ＴＥＴ２遺伝子及び／又は破壊されたＦＡＳ遺伝子）を含む、Ｔ細胞バンク中の遺伝子操作されたＴ細胞を用いて生成されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、操作されていない対応物と比較して、インビトロ及びインビボの両方で改善された効力（例えば、少なくとも５０％高い、少なくとも１倍高い、少なくとも２倍高い、少なくとも５倍高い又は少なくとも１０倍高い）を有し得る。
【0076】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞バンク中のＴ細胞は、下記でより詳細に説明されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように更に操作され得る。
【0077】
（ｉｉ）Ｔ細胞バンクを作製する方法
本明細書に開示されるＴ細胞バンクの遺伝子操作されたＴ細胞は、従来の遺伝子編集法又は本明細書で説明されるものを介して親Ｔ細胞又はその前駆細胞を遺伝子編集することによって調製され得る。
本明細書に開示されるＴ細胞バンクの遺伝子操作されたＴ細胞は、従来の遺伝子編集法又は本明細書で説明されるものを介して親Ｔ細胞又はその前駆細胞を遺伝子編集することによって調製され得る。
【0078】
（ａ）Ｔ細胞
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞バンクを作製するのに使用するためのＴ細胞は、１つ以上の好適な哺乳動物、例えば１つ以上のヒトドナーから誘導され得る。Ｔ細胞は、多くの供給源から得ることができ、この供給源としては、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織及び腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、遠心沈降、例えばＦＩＣＯＬＬ（商標）分離などの当業者に既知の任意の数の技術を使用して、対象から回収される血液の単位から得ることができる。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞バンクを作製するのに使用するためのＴ細胞は、１つ以上の好適な哺乳動物、例えば１つ以上のヒトドナーから誘導され得る。Ｔ細胞は、多くの供給源から得ることができ、この供給源としては、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織及び腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、遠心沈降、例えばＦＩＣＯＬＬ（商標）分離などの当業者に既知の任意の数の技術を使用して、対象から回収される血液の単位から得ることができる。
【0079】
いくつかの例では、Ｔ細胞を免疫細胞（例えば、本明細書に記載されるもの）の混合物から単離して、単離されたＴ細胞集団を生成することができ、これは、本明細書に開示されるＴ細胞バンクの作製に使用することができる。例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離後、細胞傷害性及びヘルパーＴリンパ球の両方は、活性化、拡大及び／又は遺伝子修飾前又は後のいずれかでナイーブ、メモリー及びエフェクターＴ細胞亜集団に分別され得る。
【0080】
下記の細胞表面マーカー：ＴＣＲａｂ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１２２、ＣＤ９５、ＣＤ１９７、ＣＣＲ７、ＫＬＲＧ１、ＭＣＨ－Ｉタンパク質及び／又はＭＣＨ－ＩＩタンパク質の１つ以上を発現するＴ細胞の特定の亜集団が陽性又は陰性選択手法によって更に単離され得る。いくつかの実施形態では、ＴＣＲａｂ、ＣＤ４及び／又はＣＤ８からなる群から選択されるマーカーの１つ以上を発現するＴ細胞の特定の亜集団は、陽性又は陰性選択手法により更に単離される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の亜集団は、遺伝子改変前及び／又は遺伝子改変後に陽性又は陰性選択により単離され得る。
【0081】
Ｔ細胞バンクの製造に用いるためのＴ細胞の単離された集団は、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋又はこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されないＴ細胞マーカーの１つ以上を発現し得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ドナー又は対象から単離され、遺伝子編集を受ける前に最初に活性化され、インビトロで増殖するように刺激される。
【0082】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞バンクの作製に使用するためのＴ細胞集団は、１つ以上のヒトドナーから単離した初代Ｔ細胞を含む。こうしたＴ細胞は、最終分化され、形質転換されず、成長についてサイトカイン及び／若しくは成長因子に依存し、且つ／又は安定したゲノムを有する。
【0083】
代わりに、Ｔ細胞バンクの作製に使用するためのＴ細胞は、インビトロ分化を介して幹細胞（例えば、ＨＳＣ又はｉＰＳＣ）から誘導され得る。
【0084】
Ｔ細胞バンクを作製するのに十分な量のＴ細胞を達成するために、好適な供給源由来のＴ細胞を刺激、活性化及び／又は拡大の１つ以上のラウンドに供し得る。Ｔ細胞は、一般に、例えば米国特許第６，３５２，６９４号明細書；同第６，５３４，０５５号明細書；同第６，９０５，６８０号明細書；同第６，６９２，９６４号明細書；同第５，８５８，３５８号明細書；同第６，８８７，４６６号明細書；同第６，９０５，６８１号明細書；同第７，１４４，５７５号明細書；同第７，０６７，３１８号明細書；同第７，１７２，８６９号明細書；同第７，２３２，５６６号明細書；同第７，１７５，８４３号明細書；同第５，８８３，２２３号明細書；同第６，９０５，８７４号明細書；同第６，７９７，５１４号明細書；及び同第６，８６７，０４１号明細書に説明される方法を使用して活性化及び拡大され得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、Ｔ細胞へのゲノム編集組成物の導入前に約１日～約４日、約１日～約３日、約１日～約２日、約２日～約３日、約２日～約４日、約３日～約４日又は約１日、約２日、約３日若しくは約４日にわたり活性化及び拡大され得る。
【0085】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、Ｔ細胞への遺伝子編集組成物の導入前に約４時間、約６時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約６０時間又は約７２時間にわたり活性化及び拡大される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ゲノム編集組成物がＴ細胞に導入されるのと同時に活性化される。いくつかの実施例では、Ｔ細胞集団は、本明細書に開示される遺伝子編集後に拡大及び／又は活性化され得る。本明細書に記載される遺伝子編集方法のいずれかによって生成されるＴ細胞集団又は単離されたＴ細胞も本開示の範囲内である。
【0086】
（ｂ）遺伝子編集方法
遺伝子操作されたＴ細胞のいずれも、本明細書に開示される標的遺伝子の１つ以上を編集するための従来の遺伝子編集法又は本明細書に記載されるものを用いて調製することができる（標的化された編集）。標的化された編集は、ヌクレアーゼ非依存的アプローチ又はヌクレアーゼ依存的アプローチのいずれかを介して達成され得る。ヌクレアーゼ非依存的な標的化された編集アプローチにおいて、相同組み換えは、宿主細胞の酵素機構を介して内因性配列に導入される外因性ポリヌクレオチドに隣接する相同配列によって誘導される。この外因性ポリヌクレオチドは、この内因性配列中においてヌクレオチドの欠失、挿入又は置換を導入し得る。
遺伝子操作されたＴ細胞のいずれも、本明細書に開示される標的遺伝子の１つ以上を編集するための従来の遺伝子編集法又は本明細書に記載されるものを用いて調製することができる（標的化された編集）。標的化された編集は、ヌクレアーゼ非依存的アプローチ又はヌクレアーゼ依存的アプローチのいずれかを介して達成され得る。ヌクレアーゼ非依存的な標的化された編集アプローチにおいて、相同組み換えは、宿主細胞の酵素機構を介して内因性配列に導入される外因性ポリヌクレオチドに隣接する相同配列によって誘導される。この外因性ポリヌクレオチドは、この内因性配列中においてヌクレオチドの欠失、挿入又は置換を導入し得る。
【0087】
代わりに、ヌクレアーゼ依存的アプローチは、特異的レアカッティングヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼ）による二本鎖切断（ＤＳＢ）の特異的導入を介して比較的高い頻度で標的化された編集を達成できる。こうしたヌクレアーゼ依存的な標的化された編集は、ＤＮＡ修復機構、例えばＤＳＢに応答して生じる非相同末端連結（ＮＨＥＪ）も利用する。ＮＨＥＪによるＤＮＡ修復は、少数の内因性ヌクレオチドのランダムな挿入又は欠失（インデル）を引き起こす場合が多い。ＮＨＥＪに媒介される修復とは対照的に、修復は、相同組み換え修復（ＨＤＲ）によっても生じ得る。相同性アームの対に隣接する外因性の遺伝子材料を含むドナー鋳型が存在する場合、この外因性の遺伝子材料を、この外因性の遺伝子材料の標的化された組込みをもたらすＨＤＲによりゲノムに導入し得る。
【0088】
いくつかの実施形態では、遺伝子破壊は、２つのガイドＲＮＡを使用するゲノム配列の欠失によって発生し得る。細胞においてゲノム欠失をもたらす（例えば、細胞において遺伝子をノックアウトする）ためにＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子編集技術を使用する方法は、既知である（Ｂａｕｅｒ ＤＥ ｅｔ ａｌ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．２０１５；９５；ｅ５２１１８）。
【0089】
特異的且つ標的化されたＤＳＢを導入できる利用可能なエンドヌクレアーゼとしては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）及びＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓなどのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例えば、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート関連タンパク質９又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、ｐｈｉＣ３１インテグラーゼ及びＢｘｂ１インテグラーゼを利用するＤＩＣＥ（二重インテグラーゼカセット交換）システムも、標的化された組込みのために使用され得る。いくつかの例示的なアプローチを下記で詳細に開示する。
【0090】
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集システム
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、遺伝子編集のために使用されるＲＮＡ誘導型ＤＮＡ標的化プラットフォームとして転用されている、原核生物に天然に存在する防御機構である。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、ＤＮＡヌクレアーゼであるＣａｓ９と、２つの非コードＲＮＡであるｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化型ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とに依拠するものであり、ＤＮＡを切断することを目的としている。ＣＲＩＳＰＲは、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピートの略称であり、例えば原核生物を感染又は攻撃したウイルスによって細胞に以前暴露された外来ＤＮＡと類似性を有するＤＮＡのフラグメント（スペーサーＤＮＡ）を含有する細菌及び古細菌のゲノムに見られるＤＮＡ配列のファミリーである。例えば、同様のウイルスがその後の攻撃時に再導入すると、類似した外来ＤＮＡを検出及び破壊するために、これらのＤＮＡのフラグメントが原核生物によって使用される。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の転写によってスペーサー配列を含むＲＮＡ分子の形成がもたらされるが、このＲＮＡ分子は、外来の外因性ＤＮＡを認識して切断することができるＣａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）タンパク質と結合し、標的となる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの多数の種類及びクラスが記載されている（例えば、Ｋｏｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３７：６７－７８を参照されたい）。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、遺伝子編集のために使用されるＲＮＡ誘導型ＤＮＡ標的化プラットフォームとして転用されている、原核生物に天然に存在する防御機構である。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、ＤＮＡヌクレアーゼであるＣａｓ９と、２つの非コードＲＮＡであるｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化型ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とに依拠するものであり、ＤＮＡを切断することを目的としている。ＣＲＩＳＰＲは、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピートの略称であり、例えば原核生物を感染又は攻撃したウイルスによって細胞に以前暴露された外来ＤＮＡと類似性を有するＤＮＡのフラグメント（スペーサーＤＮＡ）を含有する細菌及び古細菌のゲノムに見られるＤＮＡ配列のファミリーである。例えば、同様のウイルスがその後の攻撃時に再導入すると、類似した外来ＤＮＡを検出及び破壊するために、これらのＤＮＡのフラグメントが原核生物によって使用される。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の転写によってスペーサー配列を含むＲＮＡ分子の形成がもたらされるが、このＲＮＡ分子は、外来の外因性ＤＮＡを認識して切断することができるＣａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）タンパク質と結合し、標的となる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの多数の種類及びクラスが記載されている（例えば、Ｋｏｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３７：６７－７８を参照されたい）。
【0091】
ｃｒＲＮＡは、典型的には、標的ＤＮＡ内の２０個のヌクレオチド（ｎｔ）の配列とのワトソン－クリック塩基対形成を介して、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体の配列認識及び特異性を促進する。ｃｒＲＮＡ内の５’ ２０ｎｔの配列を変更することにより、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体を特定の遺伝子座に標的化させることが可能になる。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体は、標的配列がプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる特定の短いＤＮＡモチーフ（配列ＮＧＧを有する）の後にある場合、ｃｒＲＮＡの最初の２０ｎｔと一致する配列を含むＤＮＡ配列のみに結合する。
【0092】
ＴｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの３’末端とハイブリダイズしてＲＮＡ二重鎖構造を形成し、このＲＮＡ二重鎖構造にＣａｓ９エンドヌクレアーゼが結合して、触媒活性のあるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体が形成され、次いでこのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体によって標的ＤＮＡを切断することができる。
【0093】
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体が標的部位でＤＮＡに結合すると、Ｃａｓ９酵素内の２つの独立したヌクレアーゼドメインがそれぞれＰＡＭ部位の上流でＤＮＡ鎖の一方を切断し、ＤＮＡの両鎖が塩基対で終端する（平滑末端）二本鎖切断（ＤＳＢ）を残す。
【0094】
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体が特定の標的部位でＤＮＡに結合し、部位特異的なＤＳＢが形成された後、次の重要な工程は、ＤＳＢの修復である。細胞は、ＤＳＢを修復するために、２つの主要なＤＮＡ修復経路、非相同末端連結（ＮＨＥＪ）及び相同組み換え修復（ＨＤＲ）を使用する。
【0095】
ＮＨＥＪは、非分裂細胞を含む大部分の細胞型において高度に活性であるように見える頑健な修復機構である。ＮＨＥＪは、誤りがちであり、多くの場合、ＤＳＢの部位において１～数百のヌクレオチド間で除去又は付加をもたらす可能性があるが、そのような修飾は、典型的には、＜２０ｎｔである。得られた挿入及び欠失（インデル）は、遺伝子のコード領域又は非コード領域を破壊する可能性がある。代わりに、ＨＤＲは、内因的又は外因的に提供される長い一続きの相同性ドナーＤＮＡを使用して、高い忠実度でＤＳＢを修復する。ＨＤＲは、分裂細胞においてのみ活性であり、大部分の細胞型において相対的に低い頻度で生じる。本開示の多くの実施形態では、修復オペラントとしてＮＨＥＪを利用する。
【0096】
ＣＲＩＳＰＲに使用するためのエンドヌクレアーゼ
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）エンドヌクレアーゼは、本明細書に開示されるような遺伝子操作されたＴ細胞を製作するためのＣＲＩＳＰＲ法において使用される。Ｃａｓ９酵素は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するものであり得るが、他のＣａｓ９相同体も使用することができる。本明細書で提供されるように、野生型Ｃａｓ９を使用し得るか、又はＣａｓ９の修飾されたバージョン（例えば、Ｃａｓ９の進化させたバージョン又はＣａｓ９オルソログ若しくは変異体）を使用し得ることが理解されるであろう。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、（クラスＩＩ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの）Ｃｐｆ１などの別のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼと置換され得る。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）エンドヌクレアーゼは、本明細書に開示されるような遺伝子操作されたＴ細胞を製作するためのＣＲＩＳＰＲ法において使用される。Ｃａｓ９酵素は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するものであり得るが、他のＣａｓ９相同体も使用することができる。本明細書で提供されるように、野生型Ｃａｓ９を使用し得るか、又はＣａｓ９の修飾されたバージョン（例えば、Ｃａｓ９の進化させたバージョン又はＣａｓ９オルソログ若しくは変異体）を使用し得ることが理解されるであろう。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、（クラスＩＩ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの）Ｃｐｆ１などの別のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼと置換され得る。
【0097】
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｉ型、ＩＩ型又はＩＩＩ型のシステムに由来する構成要素を含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子座に関する最新の分類スキームは、Ｉ～Ｖ又はＶＩ型を有するクラス１及びクラス２ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを定義する（Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１３（１１）：７２２－３６；Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ，６０：３８５－３９７）。クラス２ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、単一のタンパク質エフェクターを有する。ＩＩ型、Ｖ型及びＶＩ型のＣａｓタンパク質は、「クラス２Ｃａｓヌクレアーゼ」と本明細書で呼ばれる単一タンパク質のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼである。クラス２Ｃａｓヌクレアーゼとしては、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２及びＣ２ｃ３タンパク質が挙げられる。Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ（Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｃｅｌｌ １６３：１－１３）は、Ｃａｓ９に相同であり、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含有する。
【0098】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに由来する（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムに由来するＣａｓ９タンパク質）。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに由来する（Ｃａｓ９タンパク質又はＣｐｆ１タンパク質などの単一タンパク質Ｃａｓヌクレアーゼ）。タンパク質のＣａｓ９及びＣｐｆ１ファミリーは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素であり、それらは、本明細書に更に記載されるとおり、適切なガイドＲＮＡを設計することによって所望の核酸標的を切断するように誘導され得る。
【0099】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、２つ以上のヌクレアーゼドメインを含み得る。例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、少なくとも１つのＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン（例えば、Ｃｐｆ１）及び少なくとも１つのＨＮＨ様ヌクレアーゼドメイン（例えば、Ｃａｓ９）を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、標的配列においてＤＳＢを導入する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、１つのみの機能性ヌクレアーゼドメインを含有するように修飾される。例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼドメインの１つが、変異されるか又は完全に若しくは部分的に欠失されて、その核酸切断活性が低減するように修飾される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、機能性ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含有しないように修飾される。他の実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、機能性ＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを含有しないように修飾される。ヌクレアーゼドメインの１つのみが機能的であるいくつかの実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、一本鎖切断（「ニック」）を標的配列に導入できるニッカーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼのヌクレアーゼドメイン内の保存されたアミノ酸は、ヌクレアーゼ活性を低減又は改変するために置換される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼニッカーゼは、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン中においてアミノ酸置換を含む。ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン中における例示的なアミノ酸置換は、Ｄ１０Ａを含む（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼに基づく）。いくつかの実施形態では、ニッカーゼは、ＨＮＨ様ヌクレアーゼドメイン中においてアミノ酸置換を含む。ＨＮＨ様ヌクレアーゼドメイン中における例示的なアミノ酸置換は、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｈ９８３Ａ及びＤ９８６Ａを含む（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼに基づく）。
【0100】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに由来する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのカスケード複合体の構成要素である。例えば、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ３ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに由来する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに由来する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに由来する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに由来する。
【0101】
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
ＣＲＩＳＰＲ技術は、特定の標的配列において遺伝子を編集するために、エンドヌクレアーゼを標的遺伝子内の特定の標的配列に誘導することができるゲノム標的化核酸の使用を伴う。このゲノム標的化核酸は、ＲＮＡであり得る。ゲノム標的化ＲＮＡは、本明細書では「ガイドＲＮＡ」又は「ｇＲＮＡ」と呼ばれる。ガイドＲＮＡは、編集のための標的遺伝子内の標的核酸配列とＣＲＩＳＰＲ反復配列とにハイブリダイズする少なくとも１つのスペーサー配列を含む。
ＣＲＩＳＰＲ技術は、特定の標的配列において遺伝子を編集するために、エンドヌクレアーゼを標的遺伝子内の特定の標的配列に誘導することができるゲノム標的化核酸の使用を伴う。このゲノム標的化核酸は、ＲＮＡであり得る。ゲノム標的化ＲＮＡは、本明細書では「ガイドＲＮＡ」又は「ｇＲＮＡ」と呼ばれる。ガイドＲＮＡは、編集のための標的遺伝子内の標的核酸配列とＣＲＩＳＰＲ反復配列とにハイブリダイズする少なくとも１つのスペーサー配列を含む。
【0102】
ＩＩ型システムでは、ｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と呼ばれる第２のＲＮＡも含む。ＩＩ型のｇＲＮＡでは、ＣＲＩＳＰＲ反復配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列が互いにハイブリダイズして二重鎖を形成する。Ｖ型のｇＲＮＡでは、ｃｒＲＮＡが二重鎖を形成する。両方のシステムにおいて、二重鎖は、部位特異的ポリペプチドに結合し、その結果、ガイドＲＮＡと部位特異的ポリペプチドとが複合体を形成する。いくつかの実施形態では、ゲノム標的化核酸は、この部位特異的ポリペプチドとの会合による複合体に標的特異性をもたらす。そのため、ゲノム標的化核酸は、部位特異的ポリペプチドの活性を誘導する。
【0103】
当業者に理解されているように、各ガイドＲＮＡは、そのゲノム標的配列に相補的なスペーサー配列を含むように設計されている。Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７，８１６－８２１（２０１２）及びＤｅｌｔｃｈｅｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４７１，６０２－６０７（２０１１）を参照されたい。
【0104】
いくつかの実施形態では、ゲノム標的化核酸（例えば、ｇＲＮＡ）は、二重分子ガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ゲノム標的化核酸（例えば、ｇＲＮＡ）は、単一分子ガイドＲＮＡである。
【0105】
二重分子ガイドＲＮＡは、２つの鎖のＲＮＡ分子を含む。第１の鎖は、５’から３’の方向において、任意選択のスペーサー延長配列、スペーサー配列及び最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列を含む。第２の鎖は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列に相補的）、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列及び任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列を含む。
【0106】
ＩＩ型システムにおける単一分子ガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」と呼ばれる）は、５’から３’方向において、任意選択のスペーサー延長配列、スペーサー配列、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列、単一分子ガイドリンカー、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列及び任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列を含む。任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ延長は、ガイドＲＮＡに追加の機能性（例えば、安定性）を付与する要素を含み得る。単一分子ガイドリンカーは、最小ＣＲＩＳＰＲ反復と最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とを連結して、ヘアピン構造を形成する。任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ延長は、１つ以上のヘアピンを含む。Ｖ型システムにおける単一分子ガイドＲＮＡは、５’から３’方向において、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列及びスペーサー配列を含む。
【0107】
ｇＲＮＡ中のスペーサー配列は、目的の標的遺伝子の標的配列（例えば、ゲノム標的配列などのＤＮＡ標的配列）を定義する配列（例えば、２０個のヌクレオチド配列）である。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、１５～３０個のヌクレオチドの範囲内である。例えば、スペーサー配列は、１５、１６、１７、１８、１９、２９、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０個のヌクレオチドを含有し得る。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、２０個のヌクレオチドを含有する。
【0108】
「標的配列」は、ＰＡＭ配列に隣接している標的遺伝子中にあり、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）によって修飾される配列である。「標的配列」は、ＰＡＭ鎖及び相補的な非ＰＡＭ鎖を含有する二本鎖分子である「標的核酸」内のいわゆるＰＡＭ鎖上にある。当業者は、ｇＲＮＡスペーサー配列が、目的の標的核酸の非ＰＡＭ鎖に位置する相補的配列にハイブリダイズすることを認識している。そのため、ｇＲＮＡスペーサー配列は、標的配列のＲＮＡ均等物である。例えば、標的配列が５’－ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣ－３’（配列番号７）である場合、ｇＲＮＡスペーサー配列は、５’－ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＵＧＣＵＧＵＧＧＣＣ－３’（配列番号８）である。ｇＲＮＡのスペーサーは、ハイブリダイゼーション（即ち塩基対形成）を介して配列特異的な様式で目的の標的核酸と相互作用する。そのため、スペーサーのヌクレオチド配列は、目的の標的核酸の標的配列に応じて変化する。
【0109】
本明細書のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムでは、スペーサー配列は、このシステムで使用されるＣａｓ９酵素によって認識可能なＰＡＭの５’に位置する標的核酸の領域にハイブリダイズするように設計されている。スペーサーは、標的配列と完全に一致し得るか、又はミスマッチを有し得る。各Ｃａｓ９酵素は、標的ＤＮＡにおいて認識する特定のＰＡＭ配列を有する。例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）は、標的核酸において、配列５’－ＮＲＧ－３’（ここで、Ｒは、Ａ又はＧのいずれかを含み、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、Ｎは、スペーサー配列により標的化される標的核酸配列の３’の直近にある）を含むＰＡＭを認識する。
【0110】
いくつかの実施形態では、標的核酸配列は、２０個の長さのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、２０個未満の長さのヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的核酸は、２０個超の長さのヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的核酸は、少なくとも５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０個又はそれを超える長さのヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的核酸は、最大で５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０個又はそれを超える長さのヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的核酸配列は、ＰＡＭの最初のヌクレオチドの５’の直近に２０個の塩基を有する。例えば、
を含む配列では、標的核酸は、Ｎに対応する配列であり得、ここで、Ｎは、任意のヌクレオチドであり得、下線が引かれたＮＲＧ配列は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＰＡＭである。
【化1】
【0111】
本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ内のスペーサー配列によって目的の任意の配列を標的化することができる。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡのスペーサー配列と標的遺伝子内の標的配列との間の相補性の程度は、約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％であり得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡのスペーサー配列及び標的遺伝子内の標的配列は、１００％相補的である。他の実施形態では、ガイドＲＮＡのスペーサー配列と標的遺伝子内の標的配列は、最大で１０個のミスマッチ、例えば最大で９個、最大で８個、最大で７個、最大で６個、最大で５個、最大で４個、最大で３個、最大で２個又は最大で１個のミスマッチを含み得る。
【0112】
本明細書で提供されるとおりに使用され得るｇＲＮＡの非限定例は、本明細書で言及される目的及び主題に対してその関連する開示が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１９０９７３０５号パンフレットに示される。本明細書で提供されるｇＲＮＡ配列のいずれに対しても、明示的に修飾を示さないものは、未修飾配列及び任意の好適な修飾を有する配列の両方を包含することが意図される。
【0113】
本明細書に開示されるｇＲＮＡのいずれかにおけるスペーサー配列の長さは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム及び更に本明細書に開示される標的遺伝子のいずれかを編集するために使用される構成要素に依存し得る。例えば、異なる細菌種に由来する異なるＣａｓ９タンパク質は、様々な最適なスペーサー配列長を有する。従って、スペーサー配列は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０又は５０個超の長さのヌクレオチドを有し得る。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、１８～２４個の長さのヌクレオチドを有し得る。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１９～２１個の長さのヌクレオチドを有し得る。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、２０個の長さのヌクレオチドを含み得る。
【0114】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡであり得、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２０個のヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２０個未満のヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２０超のヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に１７～３０個のヌクレオチドを有する可変長のスペーサー配列を含む。例を以下の表２に提供する。これらの例示的な配列では、「ｎ」のフラグメントは、５’末端におけるスペーサー配列を指す。
【0115】
【表2】
【0116】
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端にウラシルを含まない。他の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に１つ以上のウラシルを含み得る。例えば、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に１～８個のウラシル残基、例えばｓｇＲＮＡ配列の３’末端に１、２、３、４、５、６、７又は８個のウラシル残基を含むことができる。
【0117】
ｓｇＲＮＡのいずれかを含む、本明細書に開示されるｇＲＮＡのいずれも未修飾であり得る。代わりに、１つ以上の修飾されたヌクレオチド及び／又は修飾された主鎖を含み得る。例えば、ｓｇＲＮＡなどの修飾ｇＲＮＡは、５’末端、３’末端のいずれか又は両方に位置し得る１つ以上の２’－Ｏ－メチルホスホロチオエートヌクレオチドを含むことができる。
【0118】
ある実施形態では、２つ以上のガイドＲＮＡをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムと共に使用することができる。各ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが２つ以上の標的核酸を切断するように、異なる標的化配列を含有し得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９ ＲＮＰ複合体内での活性又は安定性などの同じ又は異なる特性を有し得る。２つ以上のガイドＲＮＡが使用される場合、各ガイドＲＮＡは、同じ又は異なるベクター上にコードされ得る。２つ以上のガイドＲＮＡの発現を駆動するために使用されるプロモーターは、同じであるか又は異なる。
【0119】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｇＲＮＡは、ＴＥＴ２遺伝子を標的化し、例えばＴＥＴ２遺伝子のエクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５又はエクソン６内の部位を標的化する。こうしたｇＲＮＡは、ＴＥＴ２遺伝子のエクソン３又はエクソン５中の標的配列又はそのフラグメントに（完全に又は部分的に）相補的なスペーサー配列を含み得る。ＴＥＴ２の例示的な標的配列及び例示的なｇＲＮＡ配列を以下の表３に示す。
【0120】
【表3】
【0121】
【表4】
【0122】
いくつかの実施形態では、ＴＥＴ２のエクソン３中の部位（例えば上記の表３に列挙されるもの）を標的化するｇＲＮＡは、ＴＥＴ２遺伝子を編集するために用いることができる。例えば、ＧＡＴＴＣＣＧＣＴＴＧＧＴＧＡＡＡＡＣＧ（配列番号１２９）の部位を標的化するｇＲＮＡ、例えば配列番号１１２（未修飾）又は配列番号１１３（修飾）のスペーサーを含むｇＲＮＡが用いられ得る。こうしたｇＲＮＡは、配列番号１１４（未修飾）又は配列番号１１５（修飾）のヌクレオチド配列を含み得る（例えば、それからなり得る）。配列番号１２９の部位を標的化するｇＲＮＡによって編集されたＴ細胞は、以下の表１５に列挙される修飾の少なくとも１つを有する修飾ＴＥＴ２遺伝子を含み得る。
【0123】
別の特定の例では、ＣＡＧＧＡＣＴＣＡＣＡＣＧＡＣＴＡＴＴＣ（配列番号１３１）の部位を標的化するｇＲＮＡ、例えば配列番号１１６（未修飾）又は配列番号１１７（修飾）のスペーサーを含むｇＲＮＡが用いられ得る。こうしたｇＲＮＡは、配列番号１１８（未修飾）又は配列番号１１９（修飾）のヌクレオチド配列を含み得る（例えば、それからなり得る）。配列番号１３１の部位を標的化するｇＲＮＡによって編集されたＴ細胞は、以下の表１６に列挙される修飾の少なくとも１つを有する修飾ＴＥＴ２遺伝子を含み得る。
【0124】
別の特定の例では、ＴＴＣＣＧＣＴＴＧＧＴＧＡＡＡＡＣＧＡＧ（配列番号１３３）の部位を標的化するｇＲＮＡ、例えば配列番号１２０（未修飾）又は配列番号１２１（修飾）のスペーサーを含むｇＲＮＡが用いられ得る。こうしたｇＲＮＡは、配列番号１２２（未修飾）又は配列番号１２３（修飾）のヌクレオチド配列を含み得る（例えば、それからなり得る）。配列番号１３３の部位を標的化するｇＲＮＡによって編集されたＴ細胞は、以下の表１７に列挙される修飾の少なくとも１つを有する修飾ＴＥＴ２遺伝子を含み得る。
【0125】
他の実施形態では、ＴＥＴ２遺伝子に特異的なｇＲＮＡは、エクソン５内の部位を標的化し得る。例えば、エクソン５中のＧＧＧＡＴＧＴＣＣＴＡＴＴＧＣＴＡＡＧＴ（配列番号１２５）の部位を標的化するｇＲＮＡ、例えば配列番号１８（未修飾）又は配列番号１９（修飾）のスペーサーを含むｇＲＮＡが用いられ得る。こうしたｇＲＮＡは、配列番号１６（未修飾）又は配列番号１７（修飾）のヌクレオチド配列を含み得る（例えば、それからなり得る）。配列番号１２５の部位を標的化するｇＲＮＡによって編集されたＴ細胞は、以下の表１９に列挙される修飾の少なくとも１つを有する修飾ＴＥＴ２遺伝子を含み得る。いくつかの場合、こうしたｇＲＮＡを用いるＴＥＴ２遺伝子の遺伝子編集は、約１７０ｋＤａの分子量を有し得るＴＥＴ２タンパク質の切断型の発現をもたらし得る。
【0126】
他の例では、エクソン５中のＡＧＧＧＡＴＧＴＣＣＴＡＴＴＧＣＴＡＡＧ（配列番号１２６）の部位を標的化するｇＲＮＡ、例えば配列番号２２（未修飾）又は配列番号２３（修飾）のスペーサーを含むｇＲＮＡが用いられ得る。こうしたｇＲＮＡは、配列番号２０（未修飾）又は配列番号２１（修飾）のヌクレオチド配列を含み得る（例えば、それからなり得る）。配列番号１２６の部位を標的化するｇＲＮＡによって編集されたＴ細胞は、以下の表２０に列挙される修飾の少なくとも１つを有する修飾ＴＥＴ２遺伝子を含み得る。
【0127】
他の実施形態では、ＴＥＴ２遺伝子に特異的なｇＲＮＡは、エクソン４内の部位を標的化し得る。例えば、エクソン４中のＣＡＴＴＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＣＴＡＧＡ（配列番号１２４）の部位を標的化するｇＲＮＡ、例えば配列番号１４（未修飾）又は配列番号１５（修飾）のスペーサーを含むｇＲＮＡが用いられ得る。こうしたｇＲＮＡは、配列番号１２（未修飾）又は配列番号１３（修飾）のヌクレオチド配列を含み得る（例えば、それからなり得る）。配列番号１２４の部位を標的化するｇＲＮＡによって編集されたＴ細胞は、以下の表２１に列挙される修飾の少なくとも１つを有する修飾ＴＥＴ２遺伝子を含み得る。
【0128】
他の実施形態では、ＴＥＴ２遺伝子に特異的なｇＲＮＡは、エクソン６内の部位を標的化し得る。例えば、エクソン６中のＡＣＧＧＣＡＣＧＣＴＣＡＣＣＡＡＴＣＧＣ（配列番号１２７）の部位を標的化するｇＲＮＡ、例えば配列番号２６（未修飾）又は配列番号２７（修飾）のスペーサーを含むｇＲＮＡが用いられ得る。こうしたｇＲＮＡは、配列番号２４（未修飾）又は配列番号２５（修飾）のヌクレオチド配列を含み得る（例えば、それからなり得る）。配列番号１２７の部位を標的化するｇＲＮＡによって編集されたＴ細胞は、以下の表１８に列挙される修飾の少なくとも１つを有する修飾ＴＥＴ２遺伝子を含み得る。
【0129】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｇＲＮＡは、ＣＤ７０遺伝子を標的化し、例えばＣＤ７０遺伝子のエクソン１又はエクソン３内の部位を標的化する。こうしたｇＲＮＡは、ＣＤ７０遺伝子のエクソン１又はエクソン３中の標的配列又はそのフラグメントに（完全に又は部分的に）相補的なスペーサー配列を含み得る。ＣＤ７０遺伝子中の例示的な標的配列及びＣＤ７０遺伝子に特異的な例示的なｇＲＮＡを以下の表４に示す。
【0130】
【表5】
【0131】
【表6】
【0132】
【表7】
【0133】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｇＲＮＡは、ＦＡＳ遺伝子を標的化し、例えばＦＡＳ遺伝子のエクソン１、エクソン２又はエクソン３内の部位を標的化する。こうしたｇＲＮＡは、ＦＡＳ遺伝子のエクソン１、エクソン２又はエクソン３中の標的配列又はそのフラグメントに（完全に又は部分的に）相補的なスペーサー配列を含み得る。ＦＡＳ遺伝子中の例示的な標的配列及びＦＡＳ遺伝子に特異的な例示的なｇＲＮＡを以下の表５に示す。
【0134】
【表8】
【0135】
【表9】
【0136】
他の実施形態では、ＦＡＳ遺伝子に特異的なｇＲＮＡは、エクソン２内の部位を標的化し得る。例えば、ＦＡＳ遺伝子のエクソン２中の配列番号１４２の部位を標的化するｇＲＮＡ、例えば配列番号７３（未修飾）又は配列番号７４（修飾）のスペーサーを含むｇＲＮＡが用いられ得る。こうしたｇＲＮＡは、配列番号７１（未修飾）又は配列番号７２（修飾）のヌクレオチド配列（例えば、ＦＡＳ－エクソン２－Ｔ２ｇＲＮＡ）を含み得る（例えば、それからなり得る）。配列番号１４２の部位を標的化するｇＲＮＡによって編集されたＴ細胞は、以下の表２６に列挙される修飾の少なくとも１つを有する修飾ＦＡＳ遺伝子を含み得る。
【0137】
他の実施形態では、ＦＡＳ遺伝子に特異的なｇＲＮＡは、エクソン３内の部位を標的化し得る。例えば、ＦＡＳ遺伝子のエクソン３中の配列番号１４４の部位を標的化するｇＲＮＡ、例えば配列番号８１（未修飾）又は配列番号８２（修飾）のスペーサーを含むｇＲＮＡが用いられ得る。こうしたｇＲＮＡは、配列番号７９（未修飾）又は配列番号８０（修飾）のヌクレオチド配列（例えば、ＦＡＳ－エクソン３－Ｔ１ｇＲＮＡ）を含み得る（例えば、それからなり得る）。配列番号１４４の部位を標的化するｇＲＮＡによって編集されたＴ細胞は、以下の表２７に列挙される修飾の少なくとも１つを有する修飾ＦＡＳ遺伝子を含み得る。
【0138】
他の実施形態では、ＦＡＳ遺伝子に特異的なｇＲＮＡは、エクソン３内の部位を標的化し得る。例えば、ＦＡＳ遺伝子のエクソン３中の配列番号１４５の部位を標的化するｇＲＮＡ、例えば配列番号８５（未修飾）又は配列番号８６（修飾）のスペーサーを含むｇＲＮＡが用いられ得る。こうしたｇＲＮＡは、配列番号８３（未修飾）又は配列番号８４（修飾）のヌクレオチド配列（例えば、ＦＡＳ－エクソン３－Ｔ２ｇＲＮＡ）を含み得る（例えば、それからなり得る）。配列番号１４５の部位を標的化するｇＲＮＡによって編集されたＴ細胞は、以下の表２８に列挙される修飾の少なくとも１つを有する修飾ＦＡＳ遺伝子を含み得る。
【0139】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｇＲＮＡは、β２Ｍ遺伝子を標的化し、例えばβ２Ｍ遺伝子内の好適な部位を標的化する。本明細書で言及される目的及び主題に対するその関連する開示が参照により本明細書に組み込まれる２０１８年５月１１日出願の国際出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１８／０３２３３４号明細書も参照されたい。他のｇＲＮＡ配列は、１５番染色体上に位置するβ２Ｍ遺伝子配列を使用して設計することができる（ＧＲＣｈ３８の座標：１５番染色体：４４，７１１，４７７～４４，７１８，８７７；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１６６７１０）。いくつかの実施形態では、β２Ｍゲノム領域を標的化するｇＲＮＡ及びＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、β２Ｍゲノム領域に切断を生じさせてβ２Ｍ遺伝子にインデルをもたらし、ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を阻害する。
【0140】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｇＲＮＡは、ＴＲＡＣ遺伝子を標的化する。本明細書で言及される目的及び主題に対するその関連する開示が参照により本明細書に組み込まれる２０１８年５月１１日出願の国際出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１８／０３２３３４号明細書も参照されたい。他のｇＲＮＡ配列は、１４番染色体上に位置するＴＲＡＣ遺伝子配列を使用して設計され得る（ＧＲＣｈ３８：１４番染色体：２２，５４７，５０６～２２，５５２，１５４；アンサンブル；ＥＮＳＧ０００００２７７７３４）。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣゲノム領域を標的化するｇＲＮＡ及びＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を破壊するＴＲＡＣ遺伝子におけるインデルをもたらすＴＲＡＣゲノム領域における切断をもたらす。
【0141】
β２Ｍ遺伝子又はＴＲＡＣ遺伝子を標的化する例示的なスペーサー配列及びｇＲＮＡを以下の表６に示す。
【0142】
【表10】
【0143】
例として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ／Ｃｐｆ１システムで使用されるガイドＲＮＡ又は他のより小さいＲＮＡは、下記で説明され、且つ当技術分野で説明されているように、化学的手段により容易に合成され得る。化学合成方法が拡大し続けている一方、ポリヌクレオチドの長さが１００ヌクレオチドあたりを大幅に超えて増加するため、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、ＰＡＧＥなどのゲルの使用を回避する）などの方法によるこうしたＲＮＡの精製は、より困難になる傾向がある。比較的長いＲＮＡを生成するために使用される１つの手法は、一緒に連結される２つ以上の分子を生成することである。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ又はＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするものなどのはるかに長いＲＮＡは、より容易に酵素的に生成される。当技術分野で説明されているように、様々な種類のＲＮＡ修飾（例えば、安定性を増強し、自然免疫応答の可能性若しくは程度を減少させ、且つ／又は他の特質を増強する修飾）がＲＮＡの化学合成及び／又は酵素的生成中又は後に導入され得る。
【0144】
いくつかの例では、本開示のｇＲＮＡはインビトロ転写（ＩＶＴ）、合成及び／若しくは化学合成法又はこれらの組み合わせで生成され得る。酵素的（ＩＶＴ）、固相、液相、複合型の合成法、小領域合成及びライゲーション法が利用される。一実施形態では、ｇＲＮＡは、ＩＶＴ酵素的合成法を使用して作製される。ＩＶＴによりポリヌクレオチドを作製する方法は、当技術分野で既知であり、国際公開第２０１３／１５１６６６号パンフレットに記載されている。従って、本開示は、ポリヌクレオチド、例えばＤＮＡコンストラクトも含み、ベクターは、本明細書に記載されるｇＲＮＡをインビトロ転写するために使用される。
【0145】
当技術分野で説明されているように、様々な種類のＲＮＡ修飾（例えば、安定性を増強し、自然免疫応答の可能性若しくは程度を減少させ、且つ／又は他の特質を増強する修飾）がＲＮＡの化学合成及び／又は酵素的生成中又は後に導入され得る。いくつかの実施形態では、非天然の修飾核酸塩基は、合成中又は合成後、本明細書に開示されるｇＲＮＡのいずれかに導入され得る。ある種の実施形態では、修飾は、ヌクレオシド間結合、プリン若しくはピリミジン塩基又は糖におけるものである。いくつかの実施形態では、修飾は、化学合成又はポリメラーゼ酵素を用いてｇＲＮＡの末端で導入される。修飾核酸及びこれらの合成の例は、国際公開第２０１３／０５２５２３号パンフレットに開示される。修飾ポリヌクレオチドの合成は、Ｖｅｒｍａ ａｎｄ Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．７６，９９－１３４（１９９８）にも記載されている。
【0146】
いくつかの実施形態では、酵素的又は化学的ライゲーション法を使用して、ポリヌクレオチド又はそれらの領域を、標的化又は送達薬剤、蛍光標識、液体、ナノ粒子などの様々な機能性部分とコンジュゲートすることができる。ポリヌクレオチド及び修飾ポリヌクレオチドのコンジュゲートは、Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．１（３），１６５－１８７（１９９０）で概説されている。
【0147】
本開示のいくつかの実施形態では、本明細書に開示される標的遺伝子のいずれかを遺伝子編集するのに用いるためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムは、少なくとも１個のガイドＲＮＡを含み得る。いくつかの例では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムは、複数のｇＲＮＡ、例えば２、３又は４のｇＲＮＡを含有し得る。こうした複数のｇＲＮＡは、同じ標的遺伝子内の異なる部位を標的化することができる。代わりに、複数のｇＲＮＡは、異なる遺伝子を標的化し得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ及びＣａｓタンパク質は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を形成し得る。ガイドＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質を、本明細書に開示されるものなどの１つ以上の標的遺伝子上の標的配列に誘導し得、ここで、Ｃａｓタンパク質が標的部位で標的遺伝子を切断する。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は、Ｃｐｆ１／ガイドＲＮＡ複合体である。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体は、Ｃａｓ９／ガイドＲＮＡ複合体である。
【0148】
いくつかの実施形態では、１つ以上の特定のｇＲＮＡを含む特定のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムのインデル頻度（編集頻度）は、標的遺伝子を編集するのに非常に効率的なｇＲＮＡ分子を同定するために使用され得るＴＩＤＥ分析を使用して決定され得る。いくつかの実施形態では、非常に効率的なｇＲＮＡは、８０％より高い遺伝子編集頻度をもたらす。例えば、ｇＲＮＡは、それが少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は１００％の遺伝子編集頻度をもたらす場合、非常に効率的であると見なされる。
【0149】
Ｔ細胞へのガイドＲＮＡ及びヌクレアーゼの送達
下記で開示する１つ以上のｇＲＮＡ、少なくとも１つのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ及び任意選択的にドナー鋳型を含む、本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムは、標的遺伝子の遺伝子編集のために従来法を介して標的細胞（例えばＴ細胞）に送達され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムの構成要素は、同時又は逐次的のいずれかで個別に標的細胞に送達され得る。他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムの構成要素は、例えば、複合体として共に標的内に送達され得る。いくつかの場合、ｇＲＮＡ及びＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、共に予め複合体を形成して、標的細胞内に送達され得るリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を形成することができる。
下記で開示する１つ以上のｇＲＮＡ、少なくとも１つのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ及び任意選択的にドナー鋳型を含む、本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムは、標的遺伝子の遺伝子編集のために従来法を介して標的細胞（例えばＴ細胞）に送達され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムの構成要素は、同時又は逐次的のいずれかで個別に標的細胞に送達され得る。他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムの構成要素は、例えば、複合体として共に標的内に送達され得る。いくつかの場合、ｇＲＮＡ及びＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、共に予め複合体を形成して、標的細胞内に送達され得るリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を形成することができる。
【0150】
ＲＮＰは、少なくともそれらが、核酸が豊富な細胞環境中での乱雑な相互作用のリスクを最小化し、且つＲＮＡを分解から保護するため、遺伝子編集に有用である。ＲＮＰを形成するための方法は、当技術分野で既知である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼなどのＣａｓヌクレアーゼ）及び目的の１つ以上の遺伝子を標的化する１つ以上のｇＲＮＡを含有するＲＮＰが細胞（例えば、Ｔ細胞）に送達され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＰは、エレクトロポレーションによってＴ細胞に送達され得る。
【0151】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、細胞内でＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを発現するＤＮＡベクター中で細胞に送達され得る。他の例では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼをコードし、細胞内でヌクレアーゼを発現させるＲＮＡ中で細胞に送達され得る。代わりに又は加えて、遺伝子を標的化するｇＲＮＡは、ＲＮＡとして又は細胞中でｇＲＮＡを発現するＤＮＡベクターとして細胞に送達され得る。
【0152】
ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、ｇＲＮＡ及び／又はＲＮＰの送達は、直接的な注射又は既知の方法、例えばエレクトロポレーション又は化学的トランスフェクションを使用する細胞トランスフェクションを介するものであり得る。他の細胞トランスフェクション法が使用され得る。
【0153】
他の遺伝子編集方法
本明細書に開示される遺伝子操作されたＴ細胞の作製には、本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ法の他に、当技術分野で既知の追加の遺伝子編集法も使用することができる。いくつかの例としては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、制限エンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼホーミングエンドヌクレアーゼなどを伴う遺伝子編集アプローチングが挙げられる。
本明細書に開示される遺伝子操作されたＴ細胞の作製には、本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ法の他に、当技術分野で既知の追加の遺伝子編集法も使用することができる。いくつかの例としては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、制限エンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼホーミングエンドヌクレアーゼなどを伴う遺伝子編集アプローチングが挙げられる。
【0154】
ＺＦＮは、１つ以上のジンクフィンガーを介して配列特異的な様式でＤＮＡに結合するポリペプチドドメインであるジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン（ＺＦＢＤ）に融合したヌクレアーゼを含む標的化ヌクレアーゼである。ジンクフィンガーは、構造が亜鉛イオンの配位を介して安定化されているジンクフィンガー結合ドメイン内の約３０個のアミノ酸のドメインである。ジンクフィンガーの例として、Ｃ２Ｈ２ジンクフィンガー、Ｃ３Ｈジンクフィンガー及びＣ４ジンクフィンガーが挙げられるが、これらに限定されない。設計されたジンクフィンガードメインは、設計／組成が合理的な基準（例えば、既存のＺＦＰ設計及び結合データの情報を保管するデータベース中の情報を処理するための置換規則及びコンピュータ処理されたアルゴリズムの適用）から主にもたらされる、天然に存在しないドメインである。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号明細書；同第６，４５３，２４２号明細書；及び同第６，５３４，２６１号明細書を参照されたく；国際公開第９８／５３０５８号パンフレット；同第９８／５３０５９号パンフレット；同第９８／５３０６０号パンフレット；同第０２／０１６５３６号パンフレット；及び同第０３／０１６４９６号パンフレットも参照されたい。選択されたジンクフィンガードメインは、ファージディスプレイ、相互作用トラップ又はハイブリッド選択などの実験的なプロセスから主にもたらされる、天然に存在しないドメインである。ＺＦＮは、米国特許第７，８８８，１２１号明細書及び同第７，９７２，８５４号明細書でより詳細に説明される。ＺＦＮの最も認知されている例は、ＦｏｋＩヌクレアーゼとジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインとの融合物である。
【0155】
ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインに融合したヌクレアーゼを含む標的化ヌクレアーゼである。「転写活性化因子様エフェクターＤＮＡ結合ドメイン」、「ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメイン」又は「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」は、ＤＮＡへのＴＡＬエフェクタータンパク質の結合に関与するＴＡＬエフェクタータンパク質のポリペプチドドメインである。ＴＡＬエフェクタータンパク質は、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属の植物病原体により、感染中に分泌される。これらのタンパク質は、植物細胞の核に入り、これらのＤＮＡ結合ドメインを介してエフェクター特異的なＤＮＡ配列に結合し、且つこれらの転写活性化ドメインを介してこれらの配列で遺伝子転写を活性化する。ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインの特異性は、反復可変二残基（ＲＶＤ）と呼ばれる選択反復位置で多型を含む、エフェクターにより可変の数の不完全な３４個のアミノ酸の反復に依存する。ＴＡＬＥＮは、米国特許出願第２０１１／０１４５９４０号明細書でより詳細に説明されている。当技術分野におけるＴＡＬＥＮの最も認知された例は、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインに対するＦｏｋＩヌクレアーゼの融合ポリペプチドである。
【0156】
本明細書に提供される使用に好適な標的化ヌクレアーゼの更なる例としては、個別での使用又は組み合わせでの使用に関わらず、Ｂｘｂ１、ｐｈｉＣ３１、Ｒ４、ＰｈｉＢＴ１及びＷβ／ＳＰＢｃ／ＴＰ９０１－１が挙げられるが、これらに限定されない。
【0157】
本明細書に開示されるヌクレアーゼのいずれも、プラスミドベクター、ＤＮＡ小環、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター；ヘルペスウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクター並びにこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されないベクター系を使用して送達され得る。
【0158】
従来のウイルス及び非ウイルス系遺伝子導入方法を使用して、細胞（例えば、Ｔ細胞）においてヌクレアーゼをコードする核酸及びドナー鋳型を導入し得る。非ウイルスベクター送達系として、ＤＮＡプラスミド、ＤＮＡ小環、裸の核酸及びリポソーム又はポロキサマーなどの送達媒体と複合体を形成した核酸が挙げられる。ウイルスベクター送達系として、細胞に送達された後にエピソーム又は組込みゲノムのいずれかを有するＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスが挙げられる。
【0159】
核酸の非ウイルス系送達の方法として、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン又は脂質：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡ、キャップ付きＲＮＡ、人工ビリオン及び薬剤で増強されたＤＮＡの取込みが挙げられる。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ２０００システム（Ｒｉｃｈ－Ｍａｒ）を使用するソノポレーションも核酸の送達に使用され得る。いくつかの具体例を下記で提供する。
【0160】
ＩＩ．治療用Ｔ細胞を生成するためのＴ細胞バンクの使用
本明細書に開示されるＴ細胞バンクからの遺伝子操作されたＴ細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞などの治療用Ｔ細胞を生成するために使用することができる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲなどの治療剤をコードする核酸をＴ細胞バンクからの細胞内に導入して、治療用Ｔ細胞を生成することができる。他の実施形態では、Ｔ細胞バンク中のＴ細胞は、ＣＡＲなどの治療剤を発現するように操作されている。こうしたＴ細胞は、Ｔ細胞バンクから得て、任意選択的にインビトロで拡大して、処置が必要な対象において使用するための治療用Ｔ細胞を生成することができる。Ｔ細胞バンクから生成された治療用Ｔ細胞は、インビボでより長く生き、且つより効力が強い。このため、低用量のこうした治療用Ｔ細胞は、結果として生じる副作用がより少ない治療で必要となる。更に、Ｔ細胞を用いた従来のアプローチ（例えば、野生型ＴＥＴ２遺伝子、野生型ＦＡＳ遺伝子及び／又は野生型ＣＤ７０遺伝子）と比較して、より多くのＣＡＲ－Ｔ細胞が、単一のロイコパックなどの好適な天然源から単離されたＴ細胞から生成され得る。
本明細書に開示されるＴ細胞バンクからの遺伝子操作されたＴ細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞などの治療用Ｔ細胞を生成するために使用することができる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲなどの治療剤をコードする核酸をＴ細胞バンクからの細胞内に導入して、治療用Ｔ細胞を生成することができる。他の実施形態では、Ｔ細胞バンク中のＴ細胞は、ＣＡＲなどの治療剤を発現するように操作されている。こうしたＴ細胞は、Ｔ細胞バンクから得て、任意選択的にインビトロで拡大して、処置が必要な対象において使用するための治療用Ｔ細胞を生成することができる。Ｔ細胞バンクから生成された治療用Ｔ細胞は、インビボでより長く生き、且つより効力が強い。このため、低用量のこうした治療用Ｔ細胞は、結果として生じる副作用がより少ない治療で必要となる。更に、Ｔ細胞を用いた従来のアプローチ（例えば、野生型ＴＥＴ２遺伝子、野生型ＦＡＳ遺伝子及び／又は野生型ＣＤ７０遺伝子）と比較して、より多くのＣＡＲ－Ｔ細胞が、単一のロイコパックなどの好適な天然源から単離されたＴ細胞から生成され得る。
【0161】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）とは、望ましくない細胞、例えば癌細胞などの疾患細胞で発現した抗原を認識して結合するように操作されている人工の免疫細胞受容体を意味する。ＣＡＲポリペプチドを発現するＴ細胞は、ＣＡＲ Ｔ細胞と呼ばれる。ＣＡＲは、ＭＨＣに制限されない様式において、選択された標的に対するＴ細胞の特異性及び反応性を再誘導する能力を有する。ＭＨＣに制限されない抗原認識は、抗原プロセシングに非依存的な抗原を認識する能力をＣＡＲ Ｔ細胞に与え、それにより腫瘍エスケープの主要な機構をバイパスする。更に、ＣＡＲは、Ｔ細胞上で発現する場合、有利には、内因性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ鎖及びベータ鎖と二量体化しない。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）とは、望ましくない細胞、例えば癌細胞などの疾患細胞で発現した抗原を認識して結合するように操作されている人工の免疫細胞受容体を意味する。ＣＡＲポリペプチドを発現するＴ細胞は、ＣＡＲ Ｔ細胞と呼ばれる。ＣＡＲは、ＭＨＣに制限されない様式において、選択された標的に対するＴ細胞の特異性及び反応性を再誘導する能力を有する。ＭＨＣに制限されない抗原認識は、抗原プロセシングに非依存的な抗原を認識する能力をＣＡＲ Ｔ細胞に与え、それにより腫瘍エスケープの主要な機構をバイパスする。更に、ＣＡＲは、Ｔ細胞上で発現する場合、有利には、内因性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ鎖及びベータ鎖と二量体化しない。
【0162】
様々な世代のＣＡＲが存在し、その各々が異なる構成要素を含む。第一世代のＣＡＲは、ヒンジ及び膜貫通ドメインを介して抗体に由来するｓｃＦｖをＴ細胞受容体のＣＤ３ゼータ（ζ又はｚ）細胞内シグナル伝達ドメインに連結する。第二世代のＣＡＲは、共刺激シグナルを供給するための追加の共刺激ドメイン、例えばＣＤ２８、４－１ＢＢ（４１ＢＢ）又はＩＣＯＳを組み込んでいる。第三世代のＣＡＲは、ＴＣＲのＣＤ３ζ鎖と融合した２つの共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ又はＯＸ４０の組み合わせ）を含有する。（Ｍａｕｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１５；１２５（２６）：４０１７－４０２３；Ｋａｋａｒｌａ ａｎｄ Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ，Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．２０１４；２０（２）：１５１－１５５）。様々な世代のＣＡＲ構築物は、いずれも本開示の範囲内である。
【0163】
一般に、ＣＡＲは、標的抗原（例えば、抗体の単鎖フラグメント（ｓｃＦｖ）又は他の抗体フラグメント）を認識する細胞外ドメインを含む融合ポリペプチドであり、細胞内ドメインは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体（例えば、ＣＤ３ζ）のシグナル伝達ドメインを含み、これは、ほとんどの場合に共刺激ドメインである。（Ｅｎｂｌａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１５；２６（８）：４９８－５０５）。ＣＡＲ構築物は、細胞外ドメインと細胞内ドメインとの間にヒンジ及び膜貫通ドメインを更に含み得、且つ表面に発現するためにＮ末端にシグナルペプチドを含み得る。シグナルペプチドの例としては、ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰ（配列番号１０２）及びＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号１０３）が挙げられる。他のシグナルペプチドを使用し得る。
【0164】
（ｉ）抗原結合細胞外ドメイン
抗原結合細胞外ドメインとは、ＣＡＲが細胞表面に発現すると、細胞外液にさらされるＣＡＲポリペプチドの領域のことである。場合により、細胞表面発現を促進するために、シグナルペプチドがＮ末端に位置し得る。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖであり、抗体重鎖可変領域（ＶH）と抗体軽鎖可変領域（ＶL）とを（いずれかの方向に）含み得る）であり得る。場合により、ＶHフラグメント及びＶLフラグメントは、ペプチドリンカーを介して連結され得る。リンカーは、いくつかの実施形態では、可動性のために一続きのグリシン及びセリン並びに可溶性を付与するために一続きのグルタミン酸塩及びリシンを含んだ親水性残基を含む。ｓｃＦｖフラグメントは、親抗体の抗原結合特異性を保持しており、そこからｓｃＦｖフラグメントが誘導される。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、ヒト化ＶHドメイン及び／又はＶLドメインを含み得る。他の実施形態では、ｓｃＦｖのＶHドメイン及び／又はＶLドメインは、完全ヒト型である。
抗原結合細胞外ドメインとは、ＣＡＲが細胞表面に発現すると、細胞外液にさらされるＣＡＲポリペプチドの領域のことである。場合により、細胞表面発現を促進するために、シグナルペプチドがＮ末端に位置し得る。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖであり、抗体重鎖可変領域（ＶH）と抗体軽鎖可変領域（ＶL）とを（いずれかの方向に）含み得る）であり得る。場合により、ＶHフラグメント及びＶLフラグメントは、ペプチドリンカーを介して連結され得る。リンカーは、いくつかの実施形態では、可動性のために一続きのグリシン及びセリン並びに可溶性を付与するために一続きのグルタミン酸塩及びリシンを含んだ親水性残基を含む。ｓｃＦｖフラグメントは、親抗体の抗原結合特異性を保持しており、そこからｓｃＦｖフラグメントが誘導される。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、ヒト化ＶHドメイン及び／又はＶLドメインを含み得る。他の実施形態では、ｓｃＦｖのＶHドメイン及び／又はＶLドメインは、完全ヒト型である。
【0165】
抗原結合細胞外ドメインは、目的の標的抗原、例えば腫瘍抗原などの病的抗原に特異的であり得る。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、通常、全く発現されない場合があるか、又は低レベルでのみ発現される場合がある非腫瘍細胞よりも腫瘍細胞中において高レベルで発現されるタンパク質などの免疫原性分子を指す「腫瘍関連抗原」である。いくつかの実施形態では、腫瘍を内部に持つ宿主の免疫系によって認識される腫瘍関連構造は、腫瘍関連抗原と称される。いくつかの実施形態では、腫瘍関連抗原は、ほとんどの種類の腫瘍によって広範に発現される場合、普遍的な腫瘍抗原である。いくつかの実施形態では、腫瘍関連抗原は、分化抗原、変異性抗原、過剰発現細胞抗原又はウイルス抗原である。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、腫瘍細胞に固有のタンパク質などの免疫原性分子を指す「腫瘍特異抗原」又は「ＴＳＡ」である。腫瘍特異抗原は、腫瘍細胞中、例えば特定の種類の癌細胞中のみで発現される。
【0166】
例示的な腫瘍抗原としては、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ及びＣＤ７０が挙げられるが、これらに限定されない。こうした腫瘍抗原に特異的な任意の既知の抗体、例えば市場売買が認可されたもの及び臨床実験中のものは、本明細書に開示されるＣＡＲ構築物の作製に使用され得る。
【0167】
（ｉｉ）膜貫通ドメイン
本明細書に開示されるＣＡＲポリペプチドは、膜にまたがる疎水性αヘリックスであり得る膜貫通ドメインを含有し得る。本明細書で使用する場合、「膜貫通ドメイン」とは、好ましくは、真核細胞膜である細胞膜内で熱力学的に安定な任意のタンパク質構造体を指す。膜貫通ドメインは、それ自体を含有するＣＡＲの安定性をもたらし得る。
本明細書に開示されるＣＡＲポリペプチドは、膜にまたがる疎水性αヘリックスであり得る膜貫通ドメインを含有し得る。本明細書で使用する場合、「膜貫通ドメイン」とは、好ましくは、真核細胞膜である細胞膜内で熱力学的に安定な任意のタンパク質構造体を指す。膜貫通ドメインは、それ自体を含有するＣＡＲの安定性をもたらし得る。
【0168】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメインであり得る。他の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインであり得る。更に他の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８及びＣＤ２８膜貫通ドメインのキメラである。本明細書に提供される他の膜貫通ドメインを使用し得る。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧ ＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡ ＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮＲ（配列番号１０４）又はＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹ（配列番号１０５）の配列を含有するＣＤ８ａ膜貫通ドメインである。他の膜貫通ドメインを使用し得る。
【0169】
（ｉｉｉ）ヒンジドメイン
いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＡＲの細胞外ドメイン（抗原結合ドメインを含む）と膜貫通ドメインとの間に位置し得るか、又はＣＡＲの細胞質ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置し得る。ヒンジドメインは、ポリペプチド鎖において膜貫通ドメインを細胞外ドメイン及び／又は細胞質ドメインに連結するように機能する任意のオリゴペプチド又はポリペプチドであり得る。ヒンジドメインは、ＣＡＲ若しくはそのドメインに可動性をもたらすか、又はＣＡＲ若しくはそのドメインの立体障害を防ぐように機能し得る。
いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＡＲの細胞外ドメイン（抗原結合ドメインを含む）と膜貫通ドメインとの間に位置し得るか、又はＣＡＲの細胞質ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置し得る。ヒンジドメインは、ポリペプチド鎖において膜貫通ドメインを細胞外ドメイン及び／又は細胞質ドメインに連結するように機能する任意のオリゴペプチド又はポリペプチドであり得る。ヒンジドメインは、ＣＡＲ若しくはそのドメインに可動性をもたらすか、又はＣＡＲ若しくはそのドメインの立体障害を防ぐように機能し得る。
【0170】
いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、最大で３００個のアミノ酸（例えば、１０～１００個のアミノ酸又は５～２０個のアミノ酸）を含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの他の領域に１つ以上のヒンジドメインが含まれ得る。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８ヒンジドメインであり得る。他のヒンジドメインを使用し得る。
【0171】
（ｉｖ）細胞内シグナル伝達ドメイン
ＣＡＲ構築物のいずれも、受容体の機能的末端である１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζ及び任意選択的に１つ以上の共刺激ドメイン）を含む。抗原認識後、受容体がクラスター化し、シグナルが細胞に伝達される。
ＣＡＲ構築物のいずれも、受容体の機能的末端である１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζ及び任意選択的に１つ以上の共刺激ドメイン）を含む。抗原認識後、受容体がクラスター化し、シグナルが細胞に伝達される。
【0172】
ＣＤ３ζは、Ｔ細胞受容体複合体の細胞質シグナル伝達ドメインである。ＣＤ３ζは、Ｔ細胞が同種抗原と会合した後にＴ細胞に活性化シグナルを伝達する３つの免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。多くの場合、ＣＤ３ζは、初代Ｔ細胞の活性化シグナルを提供するが、十分に適格な活性化シグナルではなく、共刺激シグナル伝達を必要とする。
【0173】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲポリペプチドは、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを更に含み得る。例えば、ＣＤ３ζによって媒介される一次シグナル伝達と共にＣＤ２８及び／又は４－１ＢＢの共刺激ドメインを使用して、十分な増殖／生残シグナルを伝達し得る。いくつかの例では、本明細書に開示されるＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激分子を含む。他の例では、本明細書に開示されるＣＡＲは、４－１ＢＢ共刺激分子を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン及びＣＤ２８共刺激ドメインを含む。他の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン及び４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む。更に他の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン及び４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む。
【0174】
表７は、本明細書で使用され得る４－１ＢＢ、ＣＤ２８及びＣＤ３－ゼータに由来するシグナル伝達ドメインの例を提供する。
【0175】
【表11】
【0176】
ＣＡＲ構築物の非限定的な例は、その関連する開示が参照により本明細書で言及される目的及び主題に関して本明細書に組み込まれる国際公開第２０１９０９７３０５号パンフレット及び同第２０１９２１５５００号パンフレット並びに同第２０２０／０９５１０７号パンフレットに提供されている。いくつかの例を下記で提供する。
【0177】
抗ＣＤ１９ ＣＡＲ（配列番号１４８）：
【化2】
【0178】
抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ（配列番号１４９）：
【化3】
【0179】
抗ＣＤ７０ ＣＡＲ（配列番号１５０）：
【化4】
【0180】
例示的な抗ＣＤ３３ＣＡＲ構築物は、その関連する開示が参照により本明細書で言及される主題及び目的に関して組み込まれる国際公開第２０２００９５１０７号パンフレットに見出され得る。
【0181】
Ｔ細胞へのＣＡＲ構築物の送達
いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸は、当業者に既知の方法により、本明細書に開示されるＴ細胞バンクからの遺伝子操作されたＴ細胞のいずれかに導入され得る。例えば、ＣＡＲのコード配列は、ＣＡＲ発現のために遺伝子操作されたＴ細胞内に導入され得るベクター中にクローニングされ得る。当技術分野で既知の様々な異なる方法を使用して、本明細書に開示される核酸又は発現ベクターのいずれかを免疫エフェクター細胞に導入することができる。核酸を細胞に導入するための方法の非限定的な例としては、リポフェクション、トランスフェクション（例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、高度に分岐した有機化合物を使用するトランスフェクション、カチオン性ポリマーを使用するトランスフェクション、デンドリマー系トランスフェクション、光学的トランスフェクション、粒子系トランスフェクション（例えば、ナノ粒子トランスフェクション）又はリポソーム（例えば、カチオン性リポソーム）を使用するトランスフェクション）、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、セルスクイージング、ソノポレーション、プロトプラスト融合、インペールフェクション、水力学的送達、遺伝子銃、マグネトフェクション、ウイルストランスフェクション及びヌクレオフェクションが挙げられる。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸は、当業者に既知の方法により、本明細書に開示されるＴ細胞バンクからの遺伝子操作されたＴ細胞のいずれかに導入され得る。例えば、ＣＡＲのコード配列は、ＣＡＲ発現のために遺伝子操作されたＴ細胞内に導入され得るベクター中にクローニングされ得る。当技術分野で既知の様々な異なる方法を使用して、本明細書に開示される核酸又は発現ベクターのいずれかを免疫エフェクター細胞に導入することができる。核酸を細胞に導入するための方法の非限定的な例としては、リポフェクション、トランスフェクション（例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、高度に分岐した有機化合物を使用するトランスフェクション、カチオン性ポリマーを使用するトランスフェクション、デンドリマー系トランスフェクション、光学的トランスフェクション、粒子系トランスフェクション（例えば、ナノ粒子トランスフェクション）又はリポソーム（例えば、カチオン性リポソーム）を使用するトランスフェクション）、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、セルスクイージング、ソノポレーション、プロトプラスト融合、インペールフェクション、水力学的送達、遺伝子銃、マグネトフェクション、ウイルストランスフェクション及びヌクレオフェクションが挙げられる。
【0182】
特定の例では、ＣＡＲをコードする核酸は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用して細胞に送達され得る。ＡＡＶは、宿主ゲノムに部位特異的に組込み、従ってＣＡＲなどの導入遺伝子を送達し得る小型のウイルスである。逆方向末端反復（ＩＴＲ）は、ＡＡＶゲノム及び／又は目的の導入遺伝子に隣接して存在し、複製開始点として機能する。また、ＡＡＶゲノム中には、転写されるとＡＡＶゲノムをカプセル化して標的細胞に送達するためのカプシドを形成するｒｅｐタンパク質及びｃａｐタンパク質も存在する。これらのカプシド上の表面受容体によってＡＡＶの血清型が付与され、カプシドがどの標的臓器に最初に結合するか、従っていずれの細胞にＡＡＶが最も効率的に感染するかが決定される。現在知られているヒトＡＡＶの血清型は、１２種類である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸を送達するのに使用するためのＡＡＶは、ＡＡＶ血清型６（ＡＡＶ６）である。
【0183】
アデノ随伴ウイルスは、いくつかの理由のために遺伝子療法に最も頻繁に使用されるウイルスの１つである。第一に、ＡＡＶは、ヒトを含む哺乳動物に投与する際、免疫応答を誘発しない。第二に、ＡＡＶは、特に適切なＡＡＶ血清型の選択を考慮に入れると、標的細胞に効率的に送達される。最後に、ＡＡＶは、ゲノムが組み込むことなしに宿主細胞中で残存し得ることから、分裂細胞及び非分裂細胞の両方に感染する能力を有する。この特質により、ＡＡＶは、遺伝子療法の理想的な候補となる。
【0184】
ＣＡＲをコードする核酸は、宿主Ｔ細胞内の目的のゲノム部位に挿入するように設計され得る。いくつかの実施形態では、標的ゲノム部位は、セーフハーバー遺伝子座内にあり得る。
【0185】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸は、（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのウイルスベクターによって運ぶことが可能なドナー鋳型を介して）遺伝子操作されたＴ細胞内のＴＲＡＣ遺伝子を破壊してＣＡＲポリペプチドを発現させるために、ＴＲＡＣ遺伝子内の位置に挿入することができるように設計することができる。ＴＲＡＣの破壊は、内因性ＴＣＲの機能喪失をもたらす。例えば、本明細書に記載されるようなエンドヌクレアーゼ及び１つ以上のＴＲＡＣゲノム領域を標的化する１つ以上のｇＲＮＡにより、ＴＲＡＣ遺伝子の破壊を生じさせ得る。本明細書に開示されるＴＲＡＣ遺伝子及び標的領域に特異的なｇＲＮＡのいずれかをこの目的のために使用することができる。
【0186】
いくつかの例では、相同組み換え修復、即ちＨＤＲ（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのウイルスベクターの一部であり得るドナー鋳型を使用した）により、ＴＲＡＣ遺伝子内のゲノム欠失と、ＣＡＲをコードするセグメントによる置換とを生じさせることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるようなエンドヌクレアーゼ及び１つ以上のＴＲＡＣゲノム領域を標的化する１つ以上のｇＲＮＡにより、且つＣＡＲをコードするセグメントをＴＲＡＣ遺伝子に挿入することにより、ＴＲＡＣ遺伝子の破壊を生じさせることができる。
【0187】
本明細書に開示されるようなドナー鋳型は、ＣＡＲのコード配列を含有し得る。いくつかの例では、ＣＡＲコード配列は、当技術分野で既知の遺伝子編集法を使用して、目的の遺伝子位置、例えばＴＲＡＣ遺伝子において効率的なＨＤＲを行うことができるように、２つの相同性領域に隣接し得る。いくつかの例では、ＣＲＩＳＰＲベースの方法を使用することができる。この場合、標的遺伝子座に特異的なｇＲＮＡによって誘導されたＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９酵素により、ＤＮＡの両方の鎖を標的遺伝子座で切断することができる。続いて、ＨＤＲが発生して二本鎖切断（ＤＳＢ）を修復し、ＣＡＲをコードするドナーＤＮＡを挿入する。これを正しく発生させるために、ドナー配列は、ＴＲＡＣ遺伝子などの標的遺伝子のＤＳＢ部位を取り囲む配列に相補的な隣接残基（以下では「相同性アーム」）を有するように設計されている。これらの相同性アームは、ＤＳＢ修復のための鋳型として機能し、ＨＤＲを本質的に誤りのない機構とすることを可能にする。相同組み換え修復（ＨＤＲ）の割合は、変異部位と切断部位との間の距離の関数であり、そのため、重複しているか又は近傍の標的部位を選択することが重要である。鋳型は、相同領域に隣接した余分な配列を含むことができるか、又はゲノム配列と異なる配列を含むことができ、これによって配列編集が可能になる。
【0188】
代わりに、ドナー鋳型は、ＤＮＡの標的化された位置と相同性のある領域がなくてもよく、標的部位で切断された後にＮＨＥＪ依存的末端連結により組み込まれ得る。
【0189】
ドナー鋳型は、一本鎖及び／又は二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡであり得、直鎖状又は環状形態で細胞に導入することができる。直鎖状形態で導入される場合、ドナー配列の末端は、当業者に既知の方法により（例えば、エキソヌクレアーゼによる分解から）保護することができる。例えば、１つ以上のジデオキシヌクレオチド残基を直鎖状分子の３’末端に付加し、且つ／又は自己相補的オリゴヌクレオチドを一方若しくは両方の末端に連結する。例えば、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：４９５９－４９６３；Ｎｅｈｌｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：８８６－８８９を参照されたい。外因性ポリヌクレオチドを分解から保護するための追加の方法としては、末端アミノ基の付加並びに例えばホスホロチオエート、ホスホロアミデート及びＯ－メチルリボース又はデオキシリボース残基などの修飾されたヌクレオチド間結合の使用が挙げられるが、これらに限定されない。
【0190】
ドナー鋳型は、例えば、複製開始点、プロモーター及び抗生物質耐性コード遺伝子などの追加の配列を有するベクター分子の一部として細胞に導入され得る。更に、ドナー鋳型は、裸の核酸として、リポソーム若しくはポロキサマーなどの薬剤と複合体を形成した核酸として細胞に導入することができるか、又はウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス及びインテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ））により送達することができる。
【0191】
いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、その発現が内因性プロモーターによって駆動することができるように、内因性プロンプターの近傍の部位（例えば、下流又は上流）に挿入することができる。他の実施形態では、ドナー鋳型は、ＣＡＲ遺伝子の発現を制御するために、外因性プロモーター及び／又はエンハンサー、例えば構成的プロモーター、誘導性プロモーター又は組織特異的プロモーターを含み得る。いくつかの実施形態では、外因性プロモーターは、ＥＦ１αプロモーターである。他のプロモーターを使用し得る。
【0192】
更に、外因性配列は、転写又は翻訳制御配列、例えばプロモーター、エンハンサー、インスレーター、配列内リボソーム進入部位、２Ａペプチドをコードする配列及び／又はポリアデニル化シグナルも含み得る。
【0193】
必要に応じて、Ｔ細胞の機能及び治療有効性を改善するために、本明細書に開示されるＴ細胞バンクから生成された治療用Ｔ細胞に追加の遺伝子編集（例えば、遺伝子ノックイン又はノックアウト）を導入し得る。例えば、宿主対移植片応答のリスクを低減又は予防するためにβ２Ｍノックアウトを実施し得る。他の例としては、標的細胞溶解を改善するためのノックイン又はノックアウト遺伝子、Ｔ細胞バンクの細胞から調製されたＣＡＲ－Ｔ細胞などの治療用Ｔ細胞の性能を向上させるためのノックイン又はノックアウト遺伝子が挙げられる。例としては、ＰＤ－１などの免疫チェックポイント遺伝子のノックアウトが挙げられる。
【0194】
ＩＩＩ．治療的適応
Ｔ細胞バンクの遺伝子操作されたＴ細胞を用いて生成された治療用Ｔ細胞は、ＴＥＴ２遺伝子中の変異、ＦＡＳ遺伝子の破壊、ＣＤ７０遺伝子の破壊又はこれらの組み合わせによって可能となる、Ｔ細胞の健全性を維持することが期待される。例えば、Ｔ細胞の健全性を維持することで、製造中の拡大を延長し、それにより収率及び一貫性を向上させることができる。別の例では、Ｔ細胞の健全性を維持することで、疲弊した／不健全なＴ細胞を救助し、それにより患者における潜在的なより低い用量及びより頑健な応答を可能にすることができる。
Ｔ細胞バンクの遺伝子操作されたＴ細胞を用いて生成された治療用Ｔ細胞は、ＴＥＴ２遺伝子中の変異、ＦＡＳ遺伝子の破壊、ＣＤ７０遺伝子の破壊又はこれらの組み合わせによって可能となる、Ｔ細胞の健全性を維持することが期待される。例えば、Ｔ細胞の健全性を維持することで、製造中の拡大を延長し、それにより収率及び一貫性を向上させることができる。別の例では、Ｔ細胞の健全性を維持することで、疲弊した／不健全なＴ細胞を救助し、それにより患者における潜在的なより低い用量及びより頑健な応答を可能にすることができる。
【0195】
本明細書に開示されるＴ細胞バンクを用いて生成された治療用Ｔ細胞は、治療目的、例えば治療用Ｔ細胞によって発現したＣＡＲ構築物によって標的化される固形腫瘍の処置のため対象に投与され得る。
【0196】
投与する工程は、所望の効果がもたらされ得るように、腫瘍部位などの所望の部位での治療用Ｔ細胞の少なくとも部分的な局在をもたらす方法又は経路による、対象への治療用Ｔ細胞の配置（例えば、移植）を含み得る。治療用Ｔ細胞は、移植された細胞又はこの細胞の構成要素の少なくとも一部が生存したままである対象中の所望の位置への送達をもたらす任意の適切な経路により投与され得る。対象への投与後の細胞の生存期間は、数時間（例えば、２４時間）という短い期間から数日、数年又は更に対象の寿命（即ち長期の生着）までであり得る。例えば、本明細書に記載されるいくつかの態様では、有効量の治療用Ｔ細胞を、腹腔内又は静脈内経路などの全身性の投与経路を介して投与することができる。
【0197】
いくつかの実施形態では、治療用Ｔ細胞は全身的に投与され、これは、標的部位、組織又は臓器に直接ではなく、対象の循環系に入り、それにより代謝及び他の同様のプロセスにかけられるような細胞の集団の投与を指す。好適な投与の様式としては、注射、注入、点滴又は経口摂取が挙げられる。注射としては、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、脳室内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節腔内、被膜下、くも膜下、脊髄内、脳脊髄内及び胸骨内注射及び注入が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、経路は、静脈内である。
【0198】
対象は、診断、処置又は治療が望まれている任意の対象であり得る。いくつかの実施形態では、この対象は、哺乳動物である。いくつかの実施形態では、この対象は、ヒトである。
【0199】
いくつかの場合、治療用Ｔ細胞は、対象に対して自己由来（「自己」）であり、即ち、この細胞は、同じ対象からのものである。代わりに、治療用Ｔ細胞は、対象に対して非自己由来（「非自己」、例えば同種異系、同系又は異種）であり得る。「同種異系」とは、治療用Ｔ細胞が、処置を受ける対象からではなく、対象と同じ種の別の個体（ドナー）から誘導されることを意味する。ドナーは、処置されている対象ではない個体である。ドナーは、患者ではない個体である。いくつかの実施形態では、ドナーは、処置される癌を有しないか又は有すると疑われていない個体である。いくつかの実施形態では、複数のドナー（例えば、２例以上のドナー）が使用される。
【0200】
いくつかの実施形態では、本明細書で説明されている方法に従って投与される操作されたＴ細胞集団は、１つ又は複数のドナーから得られた同種異系Ｔ細胞を含む。同種異系とは、１つ以上の遺伝子座における遺伝子がレシピエント（例えば、対象）と同一ではない同じ種の１つ以上の異なるドナーから得られた細胞、細胞集団又は細胞を含む生体試料を指す。例えば、対象に投与される操作されたＴ細胞集団は、１つ以上の血縁ではないドナー又は１つ以上の同一ではない同胞から誘導され得る。いくつかの実施形態では、遺伝的に同一のドナー（例えば、同一の双子）から得られたものなどの同系細胞集団が使用され得る。いくつかの実施形態では、細胞は、自己細胞であり、即ち、操作されたＴ細胞は、対象から得られるか又は単離されて同じ対象に投与され、即ち、ドナー及びレシピエントは、同一である。
【0201】
有効量とは、医学的状態（例えば、癌）の少なくとも１つ以上の徴候又は症状を予防又は軽減するのに必要である、操作されたＴ細胞の集団の量を指し、所望の効果をもたらすのに（例えば、医学的状態を有する対象を処置するのに）十分な量の組成物に関する。有効量としては、疾患の症状の発症を予防するか若しくは遅らせるか、疾患の症状の経過を変える（例えば、限定されないが、疾患の症状の進行を遅らせる）か、又は疾患の症状を逆転させるのに十分な量も挙げられる。任意の所与の場合に関して、適切な有効量は、通常の実験を使用して当業者により決定できることが理解される。
【0202】
本明細書に開示されるＴ細胞バンクから生成された治療用Ｔ細胞の向上した残存率及び有効性のために、本明細書で提供される治療用Ｔ細胞の用量は、従来のアプローチによって調製される（例えば、変異ＴＥＴ２遺伝子、破壊されたＦＡＳ遺伝子及び／又は破壊されたＣＤ７０遺伝子を含む、本明細書に開示される遺伝子編集イベントの１つ以上を有さないＴ細胞を使用した）ＣＡＲ－Ｔ細胞の標準用量よりも低くなり得る。いくつかの例では、本明細書に開示される治療用Ｔ細胞の有効量は、ＣＡＲ－Ｔ療法の標準用量よりも少なくとも２倍低い、少なくとも５倍低い、少なくとも１０倍低い、少なくとも２０倍低い、少なくとも５０倍低い又は少なくとも１００倍低いことができる。いくつかの例では、本明細書に開示される治療用Ｔ細胞の有効量は、１０6細胞未満、例えば１０5細胞、５×１０4細胞、１０4細胞、５×１０3細胞又は１０3細胞未満であり得る。本明細書で説明されるいくつかの例では、細胞は、それを必要とする対象への投与前に培養液中で拡大される。
【0203】
本明細書に開示される治療用Ｔ細胞を用いた処置の有効性は、熟練した臨床医によって決定され得る。処置は、任意の１つ又は全ての徴候又は症状の、一例では機能的標的のレベルが有利な様式で変えられる（例えば、少なくとも１０％増加する）か、又は疾患（例えば、癌）の他の臨床的に認められている症状又はマーカーが改善されるか又は緩和される場合、「有効」と見なされる。有効性は、入院又は医学的介入の必要性により評価して、対象が悪化しないことによっても測定され得る（例えば、疾患の進行が止まるか又は少なくとも遅くなる）。これらの指標を測定する方法は、当業者に既知であり、且つ／又は本明細書で説明されている。処置は、対象における疾患の任意の処置を含み、且つ（１）疾患を阻害すること、例えば症状の進行を止めるか若しくは遅くすること、又は（２）疾患を軽減すること、例えば症状の退行をもたらすこと、及び（３）症状の発症の可能性を予防するか若しくは減少させることを含む。
【0204】
併用療法も本開示により包含される。例えば、本明細書に開示される治療用Ｔ細胞は、同じ適応症を処置するか、又は治療用Ｔ細胞の有効性を向上させ、且つ／若しくは治療用Ｔ細胞の副作用を低減するために、他の治療剤と併用され得る。
【0205】
キット
本開示は、Ｔ細胞バンク、治療用Ｔ細胞を生成するのに使用するため且つ治療的使用のためのキットも提供する。
本開示は、Ｔ細胞バンク、治療用Ｔ細胞を生成するのに使用するため且つ治療的使用のためのキットも提供する。
【0206】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、ＴＥＴ２遺伝子、ＦＡＳ遺伝子及びＣＤ７０遺伝子の１つ以上の遺伝子編集を実施するための構成要素並びに任意選択的に遺伝子編集が実施される免疫細胞の集団（例えば、ロイコパック）を含み得る。ロイコパック試料は、末梢血から回収される濃縮白血球搬出生成物であり得る。これは、典型的には、単球、リンパ球、血小板、血漿及び赤血球を含む様々な血球を含有する。標的遺伝子の１つ以上を遺伝子編集するための構成要素は、ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼなどの好適なエンドヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼによる１つ以上の好適なゲノム部位の切断を誘導する１つ以上の核酸ガイドを含み得る。例えば、キットは、Ｃａｓ９などのＣａｓ酵素並びにＴＥＴ２遺伝子、ＦＡＳ遺伝子及び／又はＣＤ７０遺伝子を標的化する１つ以上のｇＲＮＡを含み得る。これらの標的遺伝子に特異的なｇＲＮＡのいずれかがキットに含まれ得る。こうしたキットは、更なる遺伝子編集のための構成要素、例えばｇＲＮＡ並びに任意選択的にβ２Ｍ及び／又はＴＲＡＣなどの他の標的遺伝子を編集するための追加のエンドヌクレアーゼを更に含み得る。
【0207】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、本明細書に開示されるＴ細胞バンクの遺伝子操作されたＴ細胞の集団及び同様に本明細書に開示される治療用Ｔ細胞を生成するための１つ以上の構成要素を含み得る。こうした構成要素は、目的のＣＡＲ構築物のための遺伝子編集及び核酸コード化に好適なエンドヌクレアーゼを含み得る。ＣＡＲをコードする核酸は、ＣＡＲコード配列に隣接する相同性アームを含有し得る、本明細書に開示されるドナー鋳型の一部であり得る。いくつかの場合、ドナー鋳型は、ＡＡＶベクターなどのウイルスベクターによって運ばれ得る。キットは、ＣＡＲコード配列をＴＲＡＣ遺伝子に挿入するためのＴＲＡＣ遺伝子に特異的なｇＲＮＡを更に含み得る。
【0208】
更に他の実施形態では、本明細書に開示されるキットは、意図される治療目的のための開示される治療用Ｔ細胞の集団を含み得る。
【0209】
本明細書に開示されるキットのいずれも、Ｔ細胞バンクの作製、治療用Ｔ細胞又は治療用Ｔ細胞の治療的適応に関する指示を更に含み得る。いくつかの例では、含まれる指示は、好適な供給源（例えば、本明細書に記載されるもの）の親Ｔ細胞からＴ細胞バンクを作製するための、標的遺伝子（例えば、ＴＥＴ２、ＦＡＳ、ＣＤ７０又はこれらの組み合わせ）の１つ以上を遺伝子操作するための遺伝子編集構成要素の使用の説明を含み得る。他の例では、含まれる指示は、治療用Ｔ細胞を作製するために、Ｔ細胞バンクのＴ細胞にＣＡＲ構築物をコードする核酸を導入する方法の説明を含み得る。
【0210】
代わりに、キットは、目的の活性、例えば治療用Ｔ細胞上で発現したＣＡＲによって標的化される疾患細胞の消失を達成するための本明細書に開示される治療用Ｔ細胞の投与に関する指示を更に含み得る。キットは、対象が処置を必要としているか否かを特定することに基づいて、処置に適した対象を選択することの説明を更に含み得る。本明細書に記載される治療用Ｔ細胞の使用に関する指示は、一般に、目的の処置に関する投薬量、投薬スケジュール及び投与経路に関する情報を含む。容器は、単位容量、バルクパッケージ（例えば、複数用量パッケージ）又は副単位用量であり得る。本開示のキット内で供給される指示は、典型的には、ラベル又は添付文書上の書面指示である。ラベル又は添付文書は、治療用Ｔ細胞が、対象における疾患又は障害を処置し、発病を遅らせ、且つ／又はそれを緩和するために用いられることを示す。
【0211】
本明細書で提供されるキットは、好適なパッケージング内にある。好適なパッケージングとしては、バイアル、瓶、ジャー、可撓性パッケージングなどが挙げられるが、これらに限定されない。治療用Ｔ細胞を投与するための注入装置などの特定の装置と組み合わせて使用するためのパッケージも検討される。キットは、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有する静脈注射用溶液袋又はバイアルであり得る）。容器は、滅菌アクセスポートも有し得る。
【0212】
キットは、任意選択的に、緩衝材及び解説情報などの追加の構成要素を提供し得る。通常、キットは、容器と、容器上の又は容器に付随したラベル又は添付文書とを含む。いくつかの実施形態では、本開示は、上記で説明されたキットの内容物を含む製造物品を提供する。
【0213】
一般的技術
本開示の実施では、別段の指摘がない限り、当技術分野の範囲内にある分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来技術が用いられる。こうした技術は、例えば下記の文献で十分に説明されている：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９８９）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．１９８７）；Ｉｎｔｒｏｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．１９９３－８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）：Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８８－１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）；Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）；Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．１９８５）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８５≫；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４≫；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６≫；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ｌＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６≫；及びＢ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）。
本開示の実施では、別段の指摘がない限り、当技術分野の範囲内にある分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来技術が用いられる。こうした技術は、例えば下記の文献で十分に説明されている：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９８９）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．１９８７）；Ｉｎｔｒｏｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．１９９３－８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）：Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８８－１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）；Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）；Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．１９８５）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８５≫；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４≫；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６≫；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ｌＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６≫；及びＢ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）。
【0214】
当業者であれば、更なる詳述なしに、上記の説明に基づいて本発明を最大限に利用することができると考えられる。従って、以下の特定の実施形態は、単なる例示として解釈すべきであり、決して以下の本開示を限定するものではない。本明細書で引用する全ての刊行物は、本明細書で言及される目的のために又は主題に対して参考として組み入れられる。
【実施例】
【0215】
実施例１：初代ヒトＴ細胞に対するＴＥＴ２ノックアウト（ＫＯ）又は変異の効果
（ｉ）Ｔ細胞中のＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ ＲＮＰによるＴＥＴ２の効率的ノックアウト又は変異
この実施例は、エクスビボでＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集を使用して初代ヒトＰＢＭＣ細胞から誘導されたＴ細胞中のＴＥＴ２遺伝子の効率的な編集を記載する。第４、第５及び第６つのタンパク質をコードするエクソンを含有するＴＥＴ２遺伝子のゲノムセグメントは、ｇＲＮＡ設計ソフトウェアにおける入力として使用された。所望のｇＲＮＡは、コード配列における欠失を引き起こし、ＴＥＴ２のアミノ酸配列を破壊し、アウトオブフレーム／機能喪失対立遺伝子（「ＴＥＴ２ノックアウト」対立遺伝子又はＴＥＴ２タンパク質の切断と呼ばれる）をもたらすものであった。ＴＥＴ２遺伝子を標的化するインシリコで同定されたｇＲＮＡスペーサー配列中の４つが合成され、ｇＲＮＡは、表１に示されるように特異的に修飾された。表１におけるｇＲＮＡは２’－Ｏ－メチルホスホロチオエート修飾で修飾されたが、未修飾ｇＲＮＡ又は他の修飾を有するｇＲＮＡが使用され得る。その関連する開示が参照により本明細書で言及される目的及び主題に関して組み込まれる国際公開第２０１９０９７３０５号パンフレットも参照されたい。
（ｉ）Ｔ細胞中のＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ ＲＮＰによるＴＥＴ２の効率的ノックアウト又は変異
この実施例は、エクスビボでＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集を使用して初代ヒトＰＢＭＣ細胞から誘導されたＴ細胞中のＴＥＴ２遺伝子の効率的な編集を記載する。第４、第５及び第６つのタンパク質をコードするエクソンを含有するＴＥＴ２遺伝子のゲノムセグメントは、ｇＲＮＡ設計ソフトウェアにおける入力として使用された。所望のｇＲＮＡは、コード配列における欠失を引き起こし、ＴＥＴ２のアミノ酸配列を破壊し、アウトオブフレーム／機能喪失対立遺伝子（「ＴＥＴ２ノックアウト」対立遺伝子又はＴＥＴ２タンパク質の切断と呼ばれる）をもたらすものであった。ＴＥＴ２遺伝子を標的化するインシリコで同定されたｇＲＮＡスペーサー配列中の４つが合成され、ｇＲＮＡは、表１に示されるように特異的に修飾された。表１におけるｇＲＮＡは２’－Ｏ－メチルホスホロチオエート修飾で修飾されたが、未修飾ｇＲＮＡ又は他の修飾を有するｇＲＮＡが使用され得る。その関連する開示が参照により本明細書で言及される目的及び主題に関して組み込まれる国際公開第２０１９０９７３０５号パンフレットも参照されたい。
【0216】
初代ヒトＰＢＭＣ細胞から誘導された活性化Ｔ細胞が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及びＴＥＴ２遺伝子（上記の表３の配列）を標的化する合成的に修飾されたｓｇＲＮＡを含有するリボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）又は対照（Ｃａｓ９なし、ｇＲＮＡなし）でトランスフェクト（エレクトロポレーション）された。トランスフェクションから６日後、細胞を免疫ブロットしてインデルの効率を評価した。
【0217】
図１Ａ～１Ｂに示すように、Ｓｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｉｍｐｌｅ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）と称するキャピラリベースのサイズ分離イムノアッセイによって判定して、ｇＲＮＡｓ ＴＥＴ２エクソン４＿ＢＧ４、ＴＥＴ２エクソン５＿Ｔ１、ＴＥＴ２エクソン５＿Ｔ２又はＴＥＴ２エクソン６＿ＢＧ５で処置した細胞中にＴＥＴ２タンパク質は検出されず、ＴＥＴ２エクソン５＿Ｔ１ ｇＲＮＡ又はエクソン６＿ＢＧ５ ｇＲＮＡのいずれかで処置した細胞中にＴＥＴ２タンパク質の切断型（野生型ＴＥＴ２よりも低い見かけ分子量を有する）が検出された。
【0218】
（ｉｉ）ＴＥＴ２ ＫＯ又は変異がＴ細胞の増殖及び拡大を増加させた
Ｔ細胞がサイトカイン含有培地（ＩＬ－２＋ＩＬ－７）中で拡大する能力に対するＴＥＴ２調節（破壊又は切断変異を含む）の効果を評価するために、破壊又は変異ＴＥＴ２遺伝子を含む細胞を上記のとおりに生成した。等しい数の細胞を１．５×１０6細胞／ｍｌのサイトカイン含有培地（ＩＬ－２＋ＩＬ－７）に播種し、２～３日ごとに細胞係数を記録し、新鮮なサイトカイン含有培地（ＩＬ－２＋ＩＬ－７）中で細胞密度を１．５×１０6細胞／ｍｌに調整した。ＴＥＴ２エクソン５＿Ｔ１又はＴＥＴ２エクソン５＿Ｔ２で誘導されたＴＥＴ２遺伝子中の破壊を含有するＴ細胞は、ＴＥＴ２遺伝子破壊を含まない対照細胞と比較してより高いレベルまで拡大した（図１Ｂ）。トランスフェクションから６週間超後、ＴＥＴ２エクソン５＿Ｔ１又はＴＥＴ２エクソン５＿Ｔ２ ｇＲＮＡによるＴＥＴ２編集細胞は増殖を続け、ＴＥＴ２エクソン５＿Ｔ１ ｇＲＮＡによるＴＥＴ２の調節（ＴＥＴ２の切断型をもたらす）は、他の群と比較して培養液中でより高い細胞収率をもたらし、非トランスフェクト細胞（ＷＴ）と比較して２５０倍超の細胞収率の増加を生じさせた。図１Ｂ。
Ｔ細胞がサイトカイン含有培地（ＩＬ－２＋ＩＬ－７）中で拡大する能力に対するＴＥＴ２調節（破壊又は切断変異を含む）の効果を評価するために、破壊又は変異ＴＥＴ２遺伝子を含む細胞を上記のとおりに生成した。等しい数の細胞を１．５×１０6細胞／ｍｌのサイトカイン含有培地（ＩＬ－２＋ＩＬ－７）に播種し、２～３日ごとに細胞係数を記録し、新鮮なサイトカイン含有培地（ＩＬ－２＋ＩＬ－７）中で細胞密度を１．５×１０6細胞／ｍｌに調整した。ＴＥＴ２エクソン５＿Ｔ１又はＴＥＴ２エクソン５＿Ｔ２で誘導されたＴＥＴ２遺伝子中の破壊を含有するＴ細胞は、ＴＥＴ２遺伝子破壊を含まない対照細胞と比較してより高いレベルまで拡大した（図１Ｂ）。トランスフェクションから６週間超後、ＴＥＴ２エクソン５＿Ｔ１又はＴＥＴ２エクソン５＿Ｔ２ ｇＲＮＡによるＴＥＴ２編集細胞は増殖を続け、ＴＥＴ２エクソン５＿Ｔ１ ｇＲＮＡによるＴＥＴ２の調節（ＴＥＴ２の切断型をもたらす）は、他の群と比較して培養液中でより高い細胞収率をもたらし、非トランスフェクト細胞（ＷＴ）と比較して２５０倍超の細胞収率の増加を生じさせた。図１Ｂ。
【0219】
他のＴＥＴ２コードエクソンの破壊がより大きいＴ細胞の拡大をもたらすか否かを評価するために、Ｔ細胞を、ＴＥＴ２エクソン４＿ＢＧ４及びＴＥＴ２エクソン６＿ＢＧ５ ｇＲＮＡで処置した後、ＴＥＴ２遺伝子中に破壊を含めて生成した。Ｔ細胞を編集した後、これらを、標準的Ｔ細胞培養条件下で４週間成長させた（５％ヒトＡＢ血清（ＨＰ１０２２，Ｖａｌｌｅｙ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）、５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－２（ｒｈＩＬ－２；１３０－０９７－７４５，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）及び１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７（ｒｈＩＬ－７；Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ ００１４１０－０５０）を添加したＸ－ｖｉｖｏ培地（０４－７４４，Ｌｏｎｚａ）。４週間後、３×１０6個の細胞をＧ－Ｒｅｘ（ガス透過性急速拡大（Ｇａｓ Ｐｅｒｍｅａｂｌｅ Ｒａｐｉｄ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ），Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ Ｐ／Ｎ８０６６０Ｍ）６ウェルプレートに播種した。細胞の拡大を、１０週間の間、週に１回生存細胞を計数することにより評価した。拡大を初期播種の３×１０6個の細胞の最新の細胞係数までの倍数変化として記録した（即ち最新細胞係数／３×１０6個の細胞）。細胞を、完全培地中で１ｍＬあたり１×１０6細胞に維持した。図１Ｄに示すように、ＴＥＴ２遺伝子のエクソン４又はエクソン６のいずれかを破壊することにより生成したＴＥＴ２ ＫＯは、１０週間の計数期間（培養液中には合計で１４週間）中、ＲＮＰ処置されていない対照Ｔ細胞の１５～１９倍の拡大をもたらした。
【0220】
要約すると、ＴＥＴ２修飾Ｔ細胞は、非修飾Ｔ細胞よりもはるかに長い４週間超も培養液中で拡大可能であることが判明した。
【0221】
（ｉｉｉ）ＴＥＴ２ ＫＯ又は切断型変異は、延長された細胞培養中でアポトーシス細胞数を減少させる。
延長された細胞培養中でアポトーシスを生じるＴＥＴ２欠損細胞の数を、エレクトロポレーション後３６日目に評価した。要約すると、一定分量の細胞を洗浄し、アネキシンＶ結合緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）中で７－ＡＡＤと共にＦＩＴＣコンジュゲートアネキシンＶにより室温で１５分間染色した。次に、細胞を洗浄し、フローサイトメトリによる分析のためにアネキシンＶ結合緩衝液中で再懸濁した。以下の表８に示すように、ＴＥＴ２エクソン５＿Ｔ１又はＴＥＴ２エクソン５＿Ｔ２ ｇＲＮＡで編集したＴ細胞は、アポトーシス細胞の減少と、未編集細胞と比較して７～８倍の健全細胞のパーセンテージの増加とを示した。
延長された細胞培養中でアポトーシスを生じるＴＥＴ２欠損細胞の数を、エレクトロポレーション後３６日目に評価した。要約すると、一定分量の細胞を洗浄し、アネキシンＶ結合緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）中で７－ＡＡＤと共にＦＩＴＣコンジュゲートアネキシンＶにより室温で１５分間染色した。次に、細胞を洗浄し、フローサイトメトリによる分析のためにアネキシンＶ結合緩衝液中で再懸濁した。以下の表８に示すように、ＴＥＴ２エクソン５＿Ｔ１又はＴＥＴ２エクソン５＿Ｔ２ ｇＲＮＡで編集したＴ細胞は、アポトーシス細胞の減少と、未編集細胞と比較して７～８倍の健全細胞のパーセンテージの増加とを示した。
【0222】
【表12】
【0223】
（ｉｖ）ＴＥＴ２ ＫＯ及び切断型変異は、延長された細胞培養中の活性化可能なＴ細胞の数を増加させた。
延長された細胞培養中で活性化されるＴＥＴ２修飾Ｔ細胞の能力を評価するために、破壊されたＴＥＴ２遺伝子を含む細胞を上記のとおり生成した。トランスフェクション後４５日目に、０．５×１０6個のＴ細胞をＢＤ Ｇｏｌｇｉｐｌｕｇで１時間処置し、続いてＧｏｌｇｉｐｌｕｇの存在下でＰＭＡ／イオノマイシンにより４時間活性化した。細胞を回収し、活性化マーカーについて表面染色し、ＩＦＮガンマ生成について細胞内染色した。ＴＥＴ２遺伝子中にそれぞれＴＥＴ２エクソン３＿Ｔ３及びＴＥＴ２エクソン５＿Ｔ１によって生じた破壊及び切断型変異を含有するＴ細胞は、ＴＥＴ２遺伝子の破壊又は他のｇＲＮＡでトランスフェクトされたＴ細胞を含まない対照細胞と比較して、より高い頻度の活性化且つＩＦＮ－γ－陽性細胞（ＣＤ２５+、ＩＦＮ－γ－+細胞）を示した。下記の表９を参照されたい。
延長された細胞培養中で活性化されるＴＥＴ２修飾Ｔ細胞の能力を評価するために、破壊されたＴＥＴ２遺伝子を含む細胞を上記のとおり生成した。トランスフェクション後４５日目に、０．５×１０6個のＴ細胞をＢＤ Ｇｏｌｇｉｐｌｕｇで１時間処置し、続いてＧｏｌｇｉｐｌｕｇの存在下でＰＭＡ／イオノマイシンにより４時間活性化した。細胞を回収し、活性化マーカーについて表面染色し、ＩＦＮガンマ生成について細胞内染色した。ＴＥＴ２遺伝子中にそれぞれＴＥＴ２エクソン３＿Ｔ３及びＴＥＴ２エクソン５＿Ｔ１によって生じた破壊及び切断型変異を含有するＴ細胞は、ＴＥＴ２遺伝子の破壊又は他のｇＲＮＡでトランスフェクトされたＴ細胞を含まない対照細胞と比較して、より高い頻度の活性化且つＩＦＮ－γ－陽性細胞（ＣＤ２５+、ＩＦＮ－γ－+細胞）を示した。下記の表９を参照されたい。
【0224】
【表13】
【0225】
実施例２：ＦＡＳノックアウト（ＫＯ）は増殖を増加させ、アポトーシスを低減させた
（ｉ）Ｔ細胞のＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ ＲＮＰによるＦＡＳのノックアウト
この実施例は、エクスビボでＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集アプローチを使用して初代ヒトＴ細胞におけるＦＡＳ遺伝子の効率的な編集を説明する。所望のｇＲＮＡは、コード配列における挿入又は欠失を引き起こして、ＦＡＳのアミノ酸配列を破壊し、アウトオブフレーム／機能喪失対立遺伝子（「ＦＡＳノックアウト」対立遺伝子と呼ばれる）をもたらすものであった。ＦＡＳ遺伝子を標的化する５つ全てのインシリコ同定されたｇＲＮＡスペーサー配列が合成された。
（ｉ）Ｔ細胞のＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ ＲＮＰによるＦＡＳのノックアウト
この実施例は、エクスビボでＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集アプローチを使用して初代ヒトＴ細胞におけるＦＡＳ遺伝子の効率的な編集を説明する。所望のｇＲＮＡは、コード配列における挿入又は欠失を引き起こして、ＦＡＳのアミノ酸配列を破壊し、アウトオブフレーム／機能喪失対立遺伝子（「ＦＡＳノックアウト」対立遺伝子と呼ばれる）をもたらすものであった。ＦＡＳ遺伝子を標的化する５つ全てのインシリコ同定されたｇＲＮＡスペーサー配列が合成された。
【0226】
２つの健全なドナー由来の初代ヒトＴ細胞を、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及びＦＡＳ遺伝子（上記の表５の配列）を標的化する合成的に修飾されたｓｇＲＮＡ（２’－Ｏ－メチルホスホロチオエート修飾で）を含有するリボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）又は対照（Ｃａｓ９なし、ｇＲＮＡなし）でトランスフェクト（エレクトロポレーション）した。トランスフェクションから６日後、細胞表面のＦＡＳ発現レベルを評価するために、細胞をフローサイトメトリ（一次抗体：ＰＥ Ｄａｚｚｌｅ ５９４抗ヒトＦＡＳ抗体、クローンＤＸ２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）によって処理した。
【0227】
図２Ａに示すように、上記の表５に列挙するｇＲＮＡは全て、最高の編集効率を有するｇＲＮＡ ＦＡＳ Ｅｘ３＿Ｔ２を用いて特定のレベルのＦＡＳノックアウトをもたらした。
【0228】
（ｉｉ）ＦＡＳ ＫＯは抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞のサイトカイン駆動増殖を増加させた
細胞増殖に対するＦＡＳ及び／又はＣＤ７０ノックアウトの効果を評価するため、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を用いた。以下の編集されたＴ ＢＣＭＡ－ＣＡＲ Ｔ細胞の群が生成された。
ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ＋（対照；２ＫＯ、ＢＣＭＡ ＣＡＲ＋）
ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／ＦＡＳ－／抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ＋（３ＫＯ（ＦＡＳ）、ＢＣＭＡ ＣＡＲ＋）
ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／ＣＤ７０－／抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ＋（３ＫＯ（ＣＤ７０）、ＢＣＭＡ ＣＡＲ＋）
ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／ＦＡＳ－／ＣＤ７０－／抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ＋（４ＫＯ、ＢＣＭＡ ＣＡＲ＋）
細胞増殖に対するＦＡＳ及び／又はＣＤ７０ノックアウトの効果を評価するため、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を用いた。以下の編集されたＴ ＢＣＭＡ－ＣＡＲ Ｔ細胞の群が生成された。
ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ＋（対照；２ＫＯ、ＢＣＭＡ ＣＡＲ＋）
ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／ＦＡＳ－／抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ＋（３ＫＯ（ＦＡＳ）、ＢＣＭＡ ＣＡＲ＋）
ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／ＣＤ７０－／抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ＋（３ＫＯ（ＣＤ７０）、ＢＣＭＡ ＣＡＲ＋）
ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／ＦＡＳ－／ＣＤ７０－／抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ＋（４ＫＯ、ＢＣＭＡ ＣＡＲ＋）
【0229】
ＣＤ３＋Ｂ２Ｍ＋細胞の磁性の枯渇により、編集された細胞をＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－細胞に関して濃縮した。要約すると、細胞を、抗ＣＤ３ビオチン（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ Ｃａｔ＃３００４０４）抗β２Ｍビオチン（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ Ｃａｔ＃３１６３０８）抗体で、それぞれ１００μｌ体積中１×１０6細胞あたり０．５μｇにて４℃で１５分間標識し、洗浄し、ストレプトアビジン標識磁性マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、１３０－０４８－１０１）と共に４℃で１５分間インキュベートした。細胞を緩衝液中に再懸濁し、製造者の手順に従ってＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１３０－０４２－４０１）に通した。
【0230】
ＩＬ－２／ＩＬ－７に駆動されるＴ細胞増殖に対するＦＡＳ又はＣＤ７０の効果を決定するために、編集されたＴ細胞（１×１０6細胞／ｍｌ）を増殖培地（５％ヒトＡＢ血清（ＨＰ１０２２，Ｖａｌｌｅｙ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）、５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－２（ｒｈＩＬ－２；１３０－０９７－７４５，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）及び１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７（ｒｈＩＬ－７；Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ ００１４１０－０５０）を添加したＸ－ｖｉｖｏ培地（０４－７４４，Ｌｏｎｚａ）中で最大４週間培養した。指定された日に、細胞を計数し、適切な培養皿中で１．５×１０6細胞／ｍｌで新鮮な培地に再播種した。
【0231】
図２Ｂに示すように、ＦＡＳ又はＣＤ７０のノックアウトは、対照（即ち内因性ＦＡＳ及びＣＤ７０を含む抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞）と比較して、インビトロで抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞のＩＬ－２／ＩＬ－７に駆動される増殖を改善した。ＦＡＳ及びＣＤ７０の両方のノックアウトは、ＦＡＳ又はＣＤ７０のみのノックアウトと比較して、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の増殖能力に対する相乗効果を示した。図２Ｂ。
【0232】
（ｉｉｉ）ＦＡＳ ＫＯは、抗ＦＡＳ抗体誘導性アポトーシスから抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を救助した
抗ＦＡＳ抗体に曝露した後の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ＋Ｔ細胞のアポトーシス細胞死に対するＦＡＳ ＫＯの効果を評価した。要約すると、ＦＡＳ－ＦＡＳＬシグナル伝達経路を活性化するために、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ＋Ｔ細胞を抗ＦＡＳ抗体（１μｇ／ｍｌ，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ Ｎｏ．３０５７０４）に４８時間曝露した。処置の最後に、一定分量の細胞を洗浄し、アネキシンＶ結合緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）中で７－ＡＡＤと共に蛍光色素でコンジュゲートされたアネキシンＶにより室温で１５分間染色した。次に、細胞を洗浄し、フローサイトメトリによる分析のためにアネキシンＶ結合緩衝液中で再懸濁した。
抗ＦＡＳ抗体に曝露した後の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ＋Ｔ細胞のアポトーシス細胞死に対するＦＡＳ ＫＯの効果を評価した。要約すると、ＦＡＳ－ＦＡＳＬシグナル伝達経路を活性化するために、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ＋Ｔ細胞を抗ＦＡＳ抗体（１μｇ／ｍｌ，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ Ｎｏ．３０５７０４）に４８時間曝露した。処置の最後に、一定分量の細胞を洗浄し、アネキシンＶ結合緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）中で７－ＡＡＤと共に蛍光色素でコンジュゲートされたアネキシンＶにより室温で１５分間染色した。次に、細胞を洗浄し、フローサイトメトリによる分析のためにアネキシンＶ結合緩衝液中で再懸濁した。
【0233】
図２Ｃに示すように、３ＫＯ（ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／ＦＡＳ－）及び４ＫＯ（ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／ＦＡＳ－／ＣＤ７０－）細胞の両方の中のアポトーシス細胞のパーセンテージの低下により実証されるように、ＦＡＳの欠失（ＦＡＳ ＫＯ）が、抗ＦＡＳ抗体により誘導されたアポトーシスから抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ＋Ｔ細胞を救助した。
【0234】
実施例３：ＣＤ７０、ＴＥＴ２及びＦＡＳの三重ノックアウトが、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞の細胞溶解活性を向上させた
編集された抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞を調製した後、ＣＡＲ Ｔ細胞の機能活性を、フローサイトメトリベースの細胞傷害性アッセイを使用して検証した。抗ＣＤ１９ ＣＡＲの開示は、その関連する開示が参照により本明細書で言及される目的及び主題に関して組み込まれる国際公開第２０１９／０９７３０５号パンフレットを参照されたい。抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞（ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／ＣＤ１９ ＣＡＲ＋及びＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／ＣＤ７０－／ＴＥＴ２－／ＦＡＳ－／ＣＤ１９ ＣＡＲ＋）を、ＣＤ１９発現癌細胞株（標的細胞）：Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ ｃｃｌ－８６）と共培養した。標的細胞は、５μＭ ｅｆｌｕｏｒ６７０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で標識され、洗浄され、ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／抗ＣＤ１９ ＣＡＲ＋又はＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／ＣＤ７０－／ＴＥＴ２－／ＦＡＳ－／抗ＣＤ１９ ＣＡＲ＋との様々な比（０．０１、０．０５、０．１、０．５、１：１ Ｔ細胞：標的細胞）での共培養物中でインキュベートされた。標的細胞は、９６ウェル、Ｕ底プレート中において１ウェルあたり１００，０００細胞で播種された。共培養物を４８時間インキュベートした。インキュベーション後、ウェルを洗浄し、培地を、５ｍｇ／ｍＬ ＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）の１：５００希釈物を含有する２００μＬの培地に置き換えた。次に、２５μＬのＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔビーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を各ウェルに加え、フローサイトメトリによって細胞培養物の細胞生存率を分析した（即ち、生存細胞は、ＤＡＰＩ染色が陰性である）。
編集された抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞を調製した後、ＣＡＲ Ｔ細胞の機能活性を、フローサイトメトリベースの細胞傷害性アッセイを使用して検証した。抗ＣＤ１９ ＣＡＲの開示は、その関連する開示が参照により本明細書で言及される目的及び主題に関して組み込まれる国際公開第２０１９／０９７３０５号パンフレットを参照されたい。抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞（ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／ＣＤ１９ ＣＡＲ＋及びＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／ＣＤ７０－／ＴＥＴ２－／ＦＡＳ－／ＣＤ１９ ＣＡＲ＋）を、ＣＤ１９発現癌細胞株（標的細胞）：Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ ｃｃｌ－８６）と共培養した。標的細胞は、５μＭ ｅｆｌｕｏｒ６７０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で標識され、洗浄され、ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／抗ＣＤ１９ ＣＡＲ＋又はＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／ＣＤ７０－／ＴＥＴ２－／ＦＡＳ－／抗ＣＤ１９ ＣＡＲ＋との様々な比（０．０１、０．０５、０．１、０．５、１：１ Ｔ細胞：標的細胞）での共培養物中でインキュベートされた。標的細胞は、９６ウェル、Ｕ底プレート中において１ウェルあたり１００，０００細胞で播種された。共培養物を４８時間インキュベートした。インキュベーション後、ウェルを洗浄し、培地を、５ｍｇ／ｍＬ ＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）の１：５００希釈物を含有する２００μＬの培地に置き換えた。次に、２５μＬのＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔビーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を各ウェルに加え、フローサイトメトリによって細胞培養物の細胞生存率を分析した（即ち、生存細胞は、ＤＡＰＩ染色が陰性である）。
【0235】
次に、標的細胞（例えば、Ｎａｌｍ６又はＲａｊｉ細胞）の細胞溶解パーセントを、以下の式を使用して決定した：
細胞溶解パーセント＝（１－（（試験試料における標的細胞の総数）÷（対照試料における標的細胞の総数））×１００。
細胞溶解パーセント＝（１－（（試験試料における標的細胞の総数）÷（対照試料における標的細胞の総数））×１００。
【0236】
この式において、試験試料とは、（１）ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／ＣＤ１９ ＣＡＲ＋Ｔ細胞、又は（２）ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／ＣＤ７０－／ＴＥＴ２－／ＦＡＳ－／抗ＣＤ１９ ＣＡＲ＋細胞と共培養された標的細胞（例えばＲａｊｉ細胞）を指し、対照試料とは、ＣＡＲ－Ｔ細胞と共培養されていない標的細胞のみを指す。
【0237】
ＣＤ７０、ＴＥＴ２及びＦＡＳ遺伝子の破壊は、低いＣＡＲ－Ｔ対標的比率におけるＲａｊｉ細胞株に対する抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞溶解活性の向上をもたらした。図３Ａ。抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞（例えばＴＣ１細胞）の説明については国際公開第２０１９０９７３０５号パンフレットを参照されたい。このＰＣＴ国際公開特許の関連する開示は、参照により本明細書で言及される目的及び主題に関して本明細書に組み込まれる。Ｒａｊｉ細胞株に対してＣＤ７０、ＴＥＴ２及びＦＡＳの喪失により付与される活性の増加は、困難な腫瘍環境において、特に、ＣＡＲ－Ｔ対腫瘍比率が低い場合、ＣＤ７０、ＴＥＴ２及びＦＡＳの喪失が、腫瘍細胞の根絶におけるＣＡＲ－Ｔ細胞に対する実質的な利益を有し得ることを示す。
【0238】
Ｔ細胞バンクの生成及び細胞バンク拡大後の連続編集
更に、ＴＥＴ２遺伝子が最初にノックアウトされ、続いて培養液中で４週間後に更に編集されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術の使用を、ヒトＴ細胞バンクの生成に関して研究する。具体的には、４週間目に、追加のもう１つ又は２つの遺伝子を欠損したＴ細胞を生成するように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集によってＦＡＳ細胞表面死受容体（ＦＡＳ）遺伝子及び分化抗原群７０（ＣＤ７０）遺伝子を編集した。初期編集を活性化した初代ヒトＴ細胞中で実施し、これは対照Ｔ細胞（ＲＮＰなし）及びＴ細胞とＴＥＴ２ Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ ＲＮＰとの複合体のエレクトロポレーションを含んだ。ヌクレオフェクション混合物は、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）溶液、５×１０6細胞、１μＭのＣａｓ９及び５μＭのｇＲＮＡ（Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５；３３（９）：９８５－９８９，ＰＭＩＤ：２６１２１４１５に記載される）を含有した。
更に、ＴＥＴ２遺伝子が最初にノックアウトされ、続いて培養液中で４週間後に更に編集されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術の使用を、ヒトＴ細胞バンクの生成に関して研究する。具体的には、４週間目に、追加のもう１つ又は２つの遺伝子を欠損したＴ細胞を生成するように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集によってＦＡＳ細胞表面死受容体（ＦＡＳ）遺伝子及び分化抗原群７０（ＣＤ７０）遺伝子を編集した。初期編集を活性化した初代ヒトＴ細胞中で実施し、これは対照Ｔ細胞（ＲＮＰなし）及びＴ細胞とＴＥＴ２ Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ ＲＮＰとの複合体のエレクトロポレーションを含んだ。ヌクレオフェクション混合物は、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）溶液、５×１０6細胞、１μＭのＣａｓ９及び５μＭのｇＲＮＡ（Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５；３３（９）：９８５－９８９，ＰＭＩＤ：２６１２１４１５に記載される）を含有した。
【0239】
４週間後に実施した編集は、ＴＥＴ２ノックアウトＴ細胞及びＲＮＰなしの対照Ｔ細胞の再エレクトロポレーションを含んだ。二重ノックアウトＴ細胞を生成するため、ＴＥＴ２ノックアウト細胞を、Ｃａｓ９タンパク質及び以下のｓｇＲＮＡｓ：ＦＡＳ又はＣＤ７０の１つを含有するＲＮＰ複合体でエレクトロポレーションした。三重ノックアウトＴ細胞を生成するために、ＴＥＴ２ノックアウト細胞を、各ＲＮＰ複合体がＣａｓタンパク質及び以下のｓｇＲＮＡ：ＦＡＳ及びＣＤ７０の１つを含有する２つの異なるＲＮＰ複合体でエレクトロポレーションした。ＴＥＴ２、ＦＡＳ及びＣＤ７０遺伝子の遺伝子編集に使用するための例示的なｇＲＮＡを以下の表１０に示す。
【0240】
【表14】
【0241】
細胞バンクの更なる編集が細胞の拡大に影響を及ぼすか否かを評価するために、一重、二重、三重遺伝子編集されたＴ細胞（未編集のＴ細胞は対照として使用した）の間で細胞数を編集後の７週間にわたって数え上げた。１×１０6細胞が生成され、Ｔ細胞の各遺伝子型について播種された。エレクトロポレーション後、細胞の拡大を、７週間の間、週に１回生存細胞を計数することにより評価した。細胞を、完全培地中で１ｍＬあたり１×１０6細胞に維持した。
【0242】
図３Ｂに示されるように、増殖（拡大）は、編集された細胞バンク条件下の第２のエレクトロポレーション後に継続した。細胞増殖は、生存細胞の数によって示されるとおり、一重ＴＥＴ２（細胞バンク）、二重（ＴＥＴ２－／ＣＤ７０－）若しくは（ＴＥＴ２－／ＦＡＳ－）又は三重（ＴＥＴ２－／ＣＤ７０－／ＦＡＳ）ノックアウトＴ細胞の間で観察された。これらのデータは、回復期間後のＴ細胞の増殖によって測定して、ＴＥＴ２－Ｔ細胞バンクに対する一重遺伝子編集はＴ細胞の健全性に影響を及ぼさないことを示唆する。
【0243】
実施例４：静脈内播種性Ｎａｌｍ－６ヒト急性リンパ芽球性白血病腫瘍異種移植片モデル（Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ Ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ Ｎａｌｍ－６ Ｈｕｍａｎ Ａｃｕｔｅ Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｔｕｍｏｒ Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ Ｍｏｄｅｌ）における、同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞に対するＴＥＴ２、ＦＡＳ及びＣＤ７０ ＫＯのインビボ効果
播種マウスモデルを用いて、Ｂ２Ｍ及びＴＲＡＣ並びにＴＥＴ２、ＦＡＳ及び／又はＣＤ７０を含まない同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞のインビボ有効性を更に評価した。
播種マウスモデルを用いて、Ｂ２Ｍ及びＴＲＡＣ並びにＴＥＴ２、ＦＡＳ及び／又はＣＤ７０を含まない同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞のインビボ有効性を更に評価した。
【0244】
ＮＯＧマウス中でＣＤ１９＋ Ｂ－ＡＬＬ誘導Ｎａｌｍ－６ヒト急性リンパ芽球性白血病腫瘍細胞株を用いた静脈内播種性モデル（播種性モデル）を、本明細書に開示される追加の遺伝子編集（例えばＴＥＴ２、ＦＡＳ及び／又はＣＤ７０）を含む又は含まない抗ＣＤ１９／ＴＲＡＣ-／Ｂ２Ｍ-ＣＡＲ Ｔ細胞（抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞）の有効性を実証するために用いた。抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞は、実施例３に記載されるとおりに製造した。国際公開第２０１９／０９７３０５号パンフレットも参照されたい。
【0245】
Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ＬＬＣ（Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ、ＡＺ）で用いられる方法及び本明細書に記載される方法を使用した播種性モデルで抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞の有効性を評価した。要約すると、４０匹の５～８週齢雌性ＣＩＥＡ ＮＯＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃscidＩ１２ｒｇtm1Sug／ＪｉｃＴａｃ）マウスを、試験が開始する５～７日前に病原体を含まない条件下に維持された、換気されたマイクロアイソレーターケージ内で個別に飼育した。試験開始時、マウスを表１１に示す８つの処置群に分けた。マウスにＮａｌｍ６－Ｆｌｕｃ－ＧＦＰ（Ｎａｌｍ６－Ｆｌｕｃ－Ｎｅｏ／ｅＧＦＰ－－Ｐｕｒｏ）細胞を静脈内播種して、播種性疾患をモデリングした。１日目に、全てのマウスに０．５×１０6Ｎａｌｍ６細胞／マウスの静脈注射を投与した。４日目に、表１１に示すように、群２～８にＣＡＲ Ｔ細胞（４×１０6ＣＡＲ＋細胞／マウス）の静脈注射を投与した。
【0246】
【表15】
【0247】
研究の過程において、マウスを毎日監視し、体重を週２回測定した。２、７、１４、２１、４２及び５０日目に、顎下腺採血（ｓｕｂｍａｎｄｉｂｕｌａｒ ｂｌｅｅｄ）によって全てのマウスから血液試料（０．１ｍｌ／マウス）を回収して、研究の過程にわたるＣＡＲ Ｔ細胞の拡大を評価した。生物発光（ＢＬＩ；合計ＲＯＩ、光子／秒）を、研究の４日目から開始して週２回測定した。重要な評価項目は周囲罹患までの時間であり、Ｔ細胞の生着の効果も評価した。研究中、全ての群に対して動物死亡率のパーセンテージ及び死亡までの時間を記録した。マウスは、瀕死状態に達する前に安楽死させた。マウスは、以下の基準の１つ以上が満たされた場合、瀕死であると定義され、犠牲にされ得る：
・１週間を超える期間にわたり持続する２０％以上の体重の減少；
・摂食、飲水、運動性並びに排尿及び／若しくは排便能力などの正常な生理学的機能を阻害する腫瘍；
・過剰な体重減少（＞２０％）をもたらす長期の過剰な下痢；又は
・持続的な喘鳴及び呼吸困難。
・１週間を超える期間にわたり持続する２０％以上の体重の減少；
・摂食、飲水、運動性並びに排尿及び／若しくは排便能力などの正常な生理学的機能を阻害する腫瘍；
・過剰な体重減少（＞２０％）をもたらす長期の過剰な下痢；又は
・持続的な喘鳴及び呼吸困難。
【0248】
動物は、臨床的観察によって定義して、下記のものなどの長期の又は過剰な疼痛又は困難が存在する場合も瀕死であると見なされた：衰弱、猫背の姿勢、麻痺／不全麻痺、腹部膨張、潰瘍形成、膿瘍、痙攣及び／又は出血。
【0249】
（ｉ）インビボ生残率
単独で又はＣＤ７０及び／若しくはＦＡＳとの組み合わせでのいずれかで（群４、６及び８）追加のＴＥＴ２ノックアウトを含むＴＲＡＣ-／Ｂ２Ｍ-ＣＡＲ Ｔ細胞を投与された群のマウスは、未処置（群１）及び野生型ＴＥＴ２対立遺伝子を含むＴＲＡＣ-／Ｂ２Ｍ-同種異系抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したもの（群２）の両方のマウスと比較して生残期間の増加を示し、処置から１５３日後でもＮａｌｍ６白血病のために死ぬことはなかった。ＣＤ７０の喪失（群３；抗ＣＤ１９ ＣＡＲ／ＴＲＡＣ-／Ｂ２Ｍ-／ＣＤ７０-）は、群２のマウスと比較して生残期間を増加させなかったが、ＴＥＴ２ノックアウトの添加は、群２のマウスと比較して群６（抗ＣＤ１９ ＣＡＲ／ＴＲＡＣ-／Ｂ２Ｍ-／ＴＥＴ２-／ＣＤ７０-）及び群８（抗ＣＤ１９ ＣＡＲ／ＴＲＡＣ-／Ｂ２Ｍ-／ＦＡＳ-／ＴＥＴ２-／ＣＤ７０-）のマウスの生残期間を延長させた。下記の表１２を参照されたい。
単独で又はＣＤ７０及び／若しくはＦＡＳとの組み合わせでのいずれかで（群４、６及び８）追加のＴＥＴ２ノックアウトを含むＴＲＡＣ-／Ｂ２Ｍ-ＣＡＲ Ｔ細胞を投与された群のマウスは、未処置（群１）及び野生型ＴＥＴ２対立遺伝子を含むＴＲＡＣ-／Ｂ２Ｍ-同種異系抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したもの（群２）の両方のマウスと比較して生残期間の増加を示し、処置から１５３日後でもＮａｌｍ６白血病のために死ぬことはなかった。ＣＤ７０の喪失（群３；抗ＣＤ１９ ＣＡＲ／ＴＲＡＣ-／Ｂ２Ｍ-／ＣＤ７０-）は、群２のマウスと比較して生残期間を増加させなかったが、ＴＥＴ２ノックアウトの添加は、群２のマウスと比較して群６（抗ＣＤ１９ ＣＡＲ／ＴＲＡＣ-／Ｂ２Ｍ-／ＴＥＴ２-／ＣＤ７０-）及び群８（抗ＣＤ１９ ＣＡＲ／ＴＲＡＣ-／Ｂ２Ｍ-／ＦＡＳ-／ＴＥＴ２-／ＣＤ７０-）のマウスの生残期間を延長させた。下記の表１２を参照されたい。
【0250】
【表16】
【0251】
同種異系抗ＣＤ１９ ＣＡＲ＋／ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－Ｔ細胞で観察されたＴＥＴ２ ＫＯの効果が、ｓｇＲＮＡ ＴＥＴ２ エクソン４ ＢＧ４に特異的であるかどうかを評価するために、別の健全なドナーから別個の細胞のロットを調製し、上記のＮａｌｍ６／インビボモデル中で試験した。以下のｓｇＲＮＡ（ＴＥＴ２エクソン６＿ＢＧ５、ＴＥＴ２エクソン４＿ＢＧ４又はＴＥＴ２エクソン３＿Ｔ１）のいずれかを含むＴＥＴ２遺伝子座の破壊を有する４×１０6ＣＡＲ＋細胞で処置したマウスは、全て、ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／ＣＡＲ＋Ｔ細胞を投与されたマウスよりも長く生残期間を延長し（図５Ａ；全てのＴＥＴ２－群は、ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／ＣＡＲ＋Ｔ細胞（ｐ＝．００２１）に対して統計的に有意な生残期間を示した；ログランク検定）、経時的なＮａｌｍ６－ルシフェラーゼ活性の低減を示した（図５Ｂ）。従って、ＴＥＴ２は、Ｎａｌｍ６播種性マウスモデルにおけるＣＡＲ Ｔ有効性を改善した。
【0252】
まとめると、ＴＥＴ２ノックアウトは際立った細胞拡大をもたらして、ＣＤ１９+悪性腫瘍のインビボモデルにおけるＣＡＲ Ｔ細胞の機能の向上をもたらす。更に、ＴＥＴ２ ＫＯは、ＣＡＲ－Ｔ細胞が他の遺伝子中で細胞に対する追加の利益（例えば、抗アポトーシス／抗老化）を有し得る編集を担持することを可能にするが、それ自体でこの白血病モデルの生残期間を延長することはない。
【0253】
（ｉｉ）インビボでのＣＡＲ Ｔ細胞の拡大
上述した研究全体にわたって回収された血液試料から単離されたＤＮＡのｄｄＰＣＲによってＣＡＲのコピー数を測定することにより、ＣＡＲ Ｔ細胞の拡大を評価した。
上述した研究全体にわたって回収された血液試料から単離されたＤＮＡのｄｄＰＣＲによってＣＡＲのコピー数を測定することにより、ＣＡＲ Ｔ細胞の拡大を評価した。
【0254】
Ｑｉａｇｅｎ Ｄｎｅａｓｙ ｂｌｏｏｄ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖｅｎｌｏ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いてマウスの組織からＤＮＡを単離した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）又はＤｒｏｐＳｅｎｓｅ９６（ｔｒｉｎｅａｎ，Ｇｅｎｔｂｒｕｇｇｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）機のいずれかを用いて、ＲＢＣ溶解した試料からの核酸の全質量を定量化した。ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によってヒトＴＲＡＣ遺伝子座に組み込まれたＣＡＲ構築物のレベルを定量化するために、プライマー及び６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）で標識したプローブのセット（下記の表１２に示す）を設計した。ｄｄＰＣＲは、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｔ１００ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ及びＢｉｏ－Ｒａｄ ＱＸ２００ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｒｅａｄｅｒ機（Ｂｉｏ－ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して実施した。ＱｕａｎｔａＳｏｆｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ １．７．４．０９１７（Ｂｉｏ－ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）ソフトウェアを使用して、試料あたりの組み込まれたＣＡＲコピーの絶対数を計算した。最後に、検出されたＣＡＲ対立遺伝子の数を入力総ＤＮＡ量で割って、入力試料の質量あたりのＣＡＲコピーの絶対数を計算した。ｄｄＰＣＲアッセイは、内因性ＴＲＡＣ配列及びＣＡＲ発現カセットプロモーター（ＥＦ－１α）にわたる８６６ｂｐの単位複製配列を増幅することにより、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）の質量あたりの組み込まれたＣＡＲ導入遺伝子のコピー数を検出する。簡潔に言えば、アッセイの定性化により、試験された範囲（１μｇのｇＤＮＡあたり２～３００，０００コピー）内で線形データ（Ｒ2＞０．９５）がもたらされ、のみならず、条件≧ＬＬＯＱの正常範囲（％ＲＥ≦１００％及び％ＣＶ≦２０％）内の％相対誤差（％ＲＥ）及び変動係数（％ＣＶ）が生成された。ＬＬＯＤ及びＬＬＯＱは、利用可能なデータに基づいて計算し、ＬＬＯＤはｇＤＮＡ０．２μｇあたり５コピーに設定し、ＬＬＯＱは０．２μｇあたり４０コピーに設定した。
【0255】
【表17】
【0256】
これらの分析は、同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞（ＴＲＡＣ-／Ｂ２Ｍ-）にＴＥＴ２ ＫＯを添加することで、ＴＥＴ２ ＫＯなしの同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞で処置した群（例えば群２、３、５及び７）と比較して、処置したマウス（例えば群４、６及び８）の血液中でＴ細胞がより高いレベルに拡大することが可能となったことを実証する（図４）。この拡大は、研究の２１日目に明らかとなり、１００日目を超えた。ＦＡＳ ＫＯも、ＣＡＲ Ｔ細胞に、５０日目に明らかとなったより低度の拡大を与えたように見えた（例えば群５又は７対群２）（図４）。
【0257】
要約すると、ＴＥＴ２が喪失した全ての群は、末梢血中でＣＡＲ－Ｔ細胞が拡大し、ＦＡＳが喪失した群は、比較的後の時点でレベルの増加を示した。
【0258】
実施例５：ＴＥＴ２のノックアウトは、液性腫瘍及び固形腫瘍モデルにおける機能性ＣＡＲ－Ｔ細胞の残存率を増加させる
ＴＥＴ２ ＫＯがＣＡＲ－Ｔ効力を増加させる機序を評価するために、いくつかの再チャレンジモデルにおけるＣＡＲ Ｔ細胞の残存率に対するＴＥＴ２破壊の効果を調べた。ＣＤ１９＋悪性腫瘍の再チャレンジモデルにおいて、ＮＯＧマウスは、最初にＮａｌｍ６－ルシフェラーゼ細胞を投与され、上記のとおりのＣＡＲ－Ｔ細胞が投与された。マウスに、３つのｇＲＮＡ：ＴＥＴ２エクソン６＿ＢＧ５のＴＥＴ２エクソン４＿ＢＧ４、ＴＥＴ２エクソン３＿Ｔ１の１つを用いてＴＥＴ２の追加の破壊が誘導された群と共に全てＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－である８×１０6ＣＡＲ＋ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞を投与した。未処置のマウスは、白血病のために速やかに死んだが、全てのＣＡＲ－Ｔ細胞群は、３０日間以内に初期Ｎａｌｍ６－ルシフェラーゼ白血病から回復した（図６Ａ）。研究の３５日目に、全てのマウスがより攻撃性の強い癌細胞株を用いた癌細胞の第２の用量を投与された。マウスあたり０．５×１０6細胞のＣＤ１９＋バーキットリンパ腫誘導Ｒａｊｉ－ルシフェラーゼ細胞株をマウスに静脈注射（ｉ．ｖ．）した。未投薬マウス（Ｎａｌｍ－ｌｕｃ細胞を投与されていないマウス）はＲａｊｉリンパ腫のために死んだ。しかしながら、過去にＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／ＴＥＴ２－細胞を投与された後にＮａｌｍ６腫瘍から回復したマウスは、ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－ ＣＡＲ Ｔ細胞のみを投与されたマウスよりも良好に第２の腫瘍を抑制した（図６Ａ）。これらのデータは、ＴＥＴ２の破壊によって機能性ＣＡＲ－Ｔ細胞の継続した残存が可能となる証拠を提供する。いくつかの異なるｓｇＲＮＡで編集された細胞も同様の結果をもたらしたため、この効果は、破壊されたＴＥＴ２ゲノム分節に依存しない。
ＴＥＴ２ ＫＯがＣＡＲ－Ｔ効力を増加させる機序を評価するために、いくつかの再チャレンジモデルにおけるＣＡＲ Ｔ細胞の残存率に対するＴＥＴ２破壊の効果を調べた。ＣＤ１９＋悪性腫瘍の再チャレンジモデルにおいて、ＮＯＧマウスは、最初にＮａｌｍ６－ルシフェラーゼ細胞を投与され、上記のとおりのＣＡＲ－Ｔ細胞が投与された。マウスに、３つのｇＲＮＡ：ＴＥＴ２エクソン６＿ＢＧ５のＴＥＴ２エクソン４＿ＢＧ４、ＴＥＴ２エクソン３＿Ｔ１の１つを用いてＴＥＴ２の追加の破壊が誘導された群と共に全てＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－である８×１０6ＣＡＲ＋ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞を投与した。未処置のマウスは、白血病のために速やかに死んだが、全てのＣＡＲ－Ｔ細胞群は、３０日間以内に初期Ｎａｌｍ６－ルシフェラーゼ白血病から回復した（図６Ａ）。研究の３５日目に、全てのマウスがより攻撃性の強い癌細胞株を用いた癌細胞の第２の用量を投与された。マウスあたり０．５×１０6細胞のＣＤ１９＋バーキットリンパ腫誘導Ｒａｊｉ－ルシフェラーゼ細胞株をマウスに静脈注射（ｉ．ｖ．）した。未投薬マウス（Ｎａｌｍ－ｌｕｃ細胞を投与されていないマウス）はＲａｊｉリンパ腫のために死んだ。しかしながら、過去にＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／ＴＥＴ２－細胞を投与された後にＮａｌｍ６腫瘍から回復したマウスは、ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－ ＣＡＲ Ｔ細胞のみを投与されたマウスよりも良好に第２の腫瘍を抑制した（図６Ａ）。これらのデータは、ＴＥＴ２の破壊によって機能性ＣＡＲ－Ｔ細胞の継続した残存が可能となる証拠を提供する。いくつかの異なるｓｇＲＮＡで編集された細胞も同様の結果をもたらしたため、この効果は、破壊されたＴＥＴ２ゲノム分節に依存しない。
【0259】
異なるＣＡＲ構築物（抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ）に関連して、ＴＥＴ２ ＫＯが異なる液性腫瘍モデル（多発性骨髄腫）中のＣＡＲ－Ｔ細胞の残存率を増加させる能力を評価するために、ＣＡＲ－Ｔ細胞を標的化するＢＣＭＡを健全なドナーから製造した。抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞は、上述したとおりに製造した。ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－及びＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／ＴＥＴ２－であるＣＡＲ－Ｔ細胞の群を製造した（ＴＥＴ２エクソン４＿ＢＧ４、ＴＥＴ２エクソン６＿ＢＧ５又はＴＥＴ２エクソン５＿Ｔ１ ｓｇＲＮＡのいずれかを用いて）。最初に、ＮＯＧマウスの右脇腹に、１×１０7の多発性骨髄腫から誘導されたＲＰＭＩ－８２２６細胞を皮下播種した。９日後、腫瘍が触知可能となったときに、１×１０6のＣＡＲ＋細胞をｉ．ｖ．注射した。未処置のマウスは速やかに腫瘍エンドポイント（２０００ｍｍ3）のために死んだが、ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－及びＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／ＴＥＴ２－群の両方は、原発性ＲＰＭＩ－８２２６腫瘍から効率的に回復した（図６Ｂ）。研究の３２日目に、過去にＣＡＲ＋Ｔ細胞で処置したマウスを、１×１０7の新鮮なＲＰＭＩ－８２２６細胞をマウスの左脇腹に注射することによって腫瘍の再チャレンジに供した。未投薬マウスの新しい群は、１×１０7の新鮮なＲＰＭＩ－８２２６細胞を左脇腹に注射した（未処置群）。ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－Ｔ細胞は、再チャレンジをある程度抑制できたが、ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／ＴＥＴ２－ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－Ｔ細胞は、これらの新しい腫瘍細胞を速やかに消失させた（図６Ｃ）。まとめると、ＴＥＴ２の破壊により、ＣＡＲ－Ｔ細胞が複数の液性腫瘍モデル中の攻撃的な再チャレンジモデル中でより長期間残存することが可能となる。これは、異なる癌抗原を標的化する複数のＣＡＲ Ｔ細胞をもたらす。
【0260】
固形腫瘍中のＣＡＲ－Ｔ細胞の残存率を増加させるためのＴＥＴ２喪失の能力を評価するために、ＣＤ７０標的化ＣＡＲ Ｔ細胞（抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞）を健全なドナーから製造した。ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／ＣＤ７０－及びＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／ＣＤ７０－／ＴＥＴ２－（例えばＴＥＴ２エクソン４）ＢＧ４ ｓｇＲＮＡ）であるＣＡＲ－Ｔ細胞の群を製造した。最初に、ＮＯＧマウスの右脇腹に５×１０6の腎細胞癌（ＲＣＣ）から誘導されたＡ４９８細胞を皮下播種した。腫瘍が５００ｍｍ3に達したときに、１×１０7のＣＡＲ－Ｔ細胞をｉ．ｖ．注射した。未処置のマウスは速やかに腫瘍エンドポイント（２０００ｍｍ3）のために死んだが、ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／ＣＤ７０－及びＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／ＣＤ７０－／ＴＥＴ２－の両方は原発性Ａ４９８腫瘍から効率的に回復した（図６Ｄ）。研究の５４日目に、５×１０6のＲＣＣから誘導されたＣａｋｉ－１細胞をマウスの左脇腹に注射することにより、マウスを腫瘍再チャレンジに供した。未投薬マウスの新しい群は、１×１０7の新鮮なＲＰＭＩ－８２２６細胞を左脇腹に注射した（未処置群）。ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／ＣＤ７０－／ＣＤ７０－／ＣＡＲ－Ｔ細胞はＣａｋｉ－１腫瘍の低度の抑制を示したが、ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／ＣＤ７０－／ＴＥＴ２－／ＣＤ７０－／ＣＡＲ－Ｔ細胞は、これらの腫瘍細胞を速やかに消失させた（図６Ｅ）。まとめると、ＴＥＴ２の破壊により、ＣＡＲ－Ｔ細胞が液性腫瘍及び固形腫瘍の両方の攻撃的な再チャレンジモデル中でより長期間残存することが可能となる。
【0261】
実施例６．ＴＥＴ２欠損ＣＡＲ－Ｔ細胞の成長はサイトカインに依存する。
ＴＥＴ２を欠くＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍形成能を評価するために、ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－であり、ＴＥＴ２の野生型であるか又はＴＥＴ２の破壊を有するかのいずれかである抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞を生成した（ＴＥＴ２の破壊は、ＴＥＴ２エクソン４＿ＢＧ４、ＴＥＴ２エクソン６＿ＢＧ５、ＴＥＴ２－エクソン５＿Ｔ１のいずれかを用いて生成した）。続いて、細胞を、ゲノム編集細胞が培養液中の成長因子及び／又はサイトカイン非依存性成長を示す能力を評価するために用いた。２×１０6の細胞を、完全Ｔ細胞培地（５％ヒト血清＋ＩＬ－２及びＩＬ－７を含有する）又は血清を含有するがＩＬ－２及びＩＬ－７を含有しない培地のいずれかに置いた。続いて、トリパンブルー及びＣｏｕｎｔｅｓｓ自動細胞カウンタ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて細胞を毎週計数した。全ての細胞群が血清及びサイトカインを含有する培地中で成長することができたが、６週間にわたりこれらの群のいずれからも成長（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）は検出されなかった。図７。これらのデータは、ヒト末梢血から誘導されたＴ細胞はその成長をサイトカインに依存し続けているため、ＴＥＴ２の破壊は、直接的なこれらの細胞の発癌性形質転換をもたらさないことを実証する。
ＴＥＴ２を欠くＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍形成能を評価するために、ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－であり、ＴＥＴ２の野生型であるか又はＴＥＴ２の破壊を有するかのいずれかである抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞を生成した（ＴＥＴ２の破壊は、ＴＥＴ２エクソン４＿ＢＧ４、ＴＥＴ２エクソン６＿ＢＧ５、ＴＥＴ２－エクソン５＿Ｔ１のいずれかを用いて生成した）。続いて、細胞を、ゲノム編集細胞が培養液中の成長因子及び／又はサイトカイン非依存性成長を示す能力を評価するために用いた。２×１０6の細胞を、完全Ｔ細胞培地（５％ヒト血清＋ＩＬ－２及びＩＬ－７を含有する）又は血清を含有するがＩＬ－２及びＩＬ－７を含有しない培地のいずれかに置いた。続いて、トリパンブルー及びＣｏｕｎｔｅｓｓ自動細胞カウンタ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて細胞を毎週計数した。全ての細胞群が血清及びサイトカインを含有する培地中で成長することができたが、６週間にわたりこれらの群のいずれからも成長（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）は検出されなかった。図７。これらのデータは、ヒト末梢血から誘導されたＴ細胞はその成長をサイトカインに依存し続けているため、ＴＥＴ２の破壊は、直接的なこれらの細胞の発癌性形質転換をもたらさないことを実証する。
【0262】
実施例７．ＴＥＴ－２ガイドＲＮＡのオンターゲット及びオフターゲット編集
様々なＴＥＴ２標的化ｇＲＮＡのオンターゲット及びオフターゲット編集効率を、上記の実施例１で開示した方法に従って調べた。要約すると、初代ヒトＰＢＭＣ細胞から誘導された活性化Ｔ細胞が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及びＴＥＴ２遺伝子（上記の表３の配列）を標的化する合成的に修飾されたｓｇＲＮＡを含有するリボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）又は対照（Ｃａｓ９なし、ｇＲＮＡなし）でトランスフェクト（エレクトロポレーション）された。トランスフェクションから６日後、細胞を免疫ブロットして、タンパク質発現に対するオンターゲットＴＥＴ２編集の効果を評価した。
様々なＴＥＴ２標的化ｇＲＮＡのオンターゲット及びオフターゲット編集効率を、上記の実施例１で開示した方法に従って調べた。要約すると、初代ヒトＰＢＭＣ細胞から誘導された活性化Ｔ細胞が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及びＴＥＴ２遺伝子（上記の表３の配列）を標的化する合成的に修飾されたｓｇＲＮＡを含有するリボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）又は対照（Ｃａｓ９なし、ｇＲＮＡなし）でトランスフェクト（エレクトロポレーション）された。トランスフェクションから６日後、細胞を免疫ブロットして、タンパク質発現に対するオンターゲットＴＥＴ２編集の効果を評価した。
【0263】
ゲノムのオン及びオフターゲット評価のために、２つの異なるドナーＴ細胞（１及び２と称される）から２つの編集細胞の細胞集団を生成するために同じエレクトロポレーション法を用いた。表３及び１４に列挙される７つのガイドのそれぞれで細胞を遺伝子編集し、トランスフェクションから６日後に回収した。これらの試料を、次世代配列決定と組み合わせて、オン及びオフターゲット部位を濃縮するための相同性依存的な方法のハイブリッドキャプチャで分析した。要約すると、各ｇＲＮＡ標的部位との相同性を有するオン及びオフターゲット部位をコンピュータによって同定し、一本鎖ＲＮＡプローブを用いてバルクゲノムＤＮＡからこれらの部位を濃縮し、これらの濃縮された部位を次世代配列決定で配列決定し、このデータをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介遺伝子編集後の修復を示す挿入及び欠失に関して分析した。
【0264】
結果を下記の表１４に示す。
【0265】
【表18】
【0266】
Ｔ細胞におけるオンターゲットインデルプロファイルの分析
オフターゲット編集を定量化するために使用されるデータを、表１４に列挙される全てのＴＥＴ２ガイドに関して最も頻度の高いオンターゲットインデルを定量化し、要約するためにも使用した。このデータは、２つのドナー（ドナー１及びドナー２と称される）における次世代配列決定と組み合わせたＴＥＴ２遺伝子座のハイブリッドキャプチャから生成した。
オフターゲット編集を定量化するために使用されるデータを、表１４に列挙される全てのＴＥＴ２ガイドに関して最も頻度の高いオンターゲットインデルを定量化し、要約するためにも使用した。このデータは、２つのドナー（ドナー１及びドナー２と称される）における次世代配列決定と組み合わせたＴＥＴ２遺伝子座のハイブリッドキャプチャから生成した。
【0267】
遺伝子編集に続いて、ＴＥＴ２－Ｔ細胞を生成するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集後のＴ細胞集団におけるＴＥＴ２遺伝子座のハイブリッドキャプチャ分析は、ＴＥＴ２遺伝子座における特定のインデル頻度及び編集された遺伝子配列をもたらす（表１５～２１；ダッシュが欠失であり、及び太字が挿入である）。
【0268】
ハイブリッドキャプチャデータから個々の配列を定量化するために、切断部位の２０ｂｐ上流及び下流のＴＥＴ２オンターゲット部位にわたって整列する配列リードが、インデル配列定量化のために選択され、検討された。選択されたリードから、各推定上切断部位の１０ｂｐ上流及び下流以内にある配列（ＰＡＭの約３ｂｐ上流（Ｊｉｎｅｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１２）は、オンターゲット非相同末端連結（ＮＨＥＪ）編集の代表的な領域として定量化された。これらのオンターゲット遺伝子編集された配列のデータは、下の表に提示され、これらの配列の頻度は、各切断部位の２０ｂｐ上流及び下流以内のオンターゲット部位にわたる全ての配列のパーセントを表す。各ガイドのインデルは、表１５～２１におけるオンターゲット参照配列に対して示される。参照配列は、いずれかの方向において１０ｂｐを伴い、ＰＡＭの３’の４ｂｐで終わる切断部位の中央に置かれる。
【0269】
【表19】
【0270】
【表20】
【0271】
【表21】
【0272】
【表22】
【0273】
【表23】
【0274】
【表24】
【0275】
【表25】
【0276】
実施例８．抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞中のＴＥＴ２ノックアウトは、成長の優位性及びＣＡＲ－Ｔの濃縮をもたらす
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法は、遺伝子修飾されたＴ細胞を使用して、癌細胞をより特異的且つ効率的に標的化して死滅させる。Ｔ細胞が血液から回収された後、この細胞は、その表面上にＣＡＲを含むように操作される。ＣＡＲは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術を使用してＴ細胞に導入され得る。これらの同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞が患者に注射されると、受容体が、Ｔ細胞が癌細胞を死滅させることを可能にする。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法は、遺伝子修飾されたＴ細胞を使用して、癌細胞をより特異的且つ効率的に標的化して死滅させる。Ｔ細胞が血液から回収された後、この細胞は、その表面上にＣＡＲを含むように操作される。ＣＡＲは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術を使用してＴ細胞に導入され得る。これらの同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞が患者に注射されると、受容体が、Ｔ細胞が癌細胞を死滅させることを可能にする。
【0277】
この実施例は、例えば複数ラウンドの標的抗原刺激によるＣＡＲ－Ｔ細胞中の遺伝子編集を介するＴＥＴ２ノックアウトから生じる有利な特徴を更に研究する。
【0278】
（Ｉ）ＴＥＴ２ ＫＯ（ＴＥＴ２－）又はＴＥＴ２ ＷＴ（ＴＥＴ２＋）抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の生成
活性化された初代ヒトＴ細胞を、Ｃａｓ９：ＴＥＴ２ ｓｇＲＮＡ１ ＲＮＰ複合体でエレクトロポレーションし（ＥＰ１）、ポリクローナルＴＥＴ２ ＫＯ集団を生成した。７２時間後、これらの細胞又は野生型（ＷＴ）活性化初代Ｔ細胞を、Ｃａｓ９：ｇＲＮＡ ＲＮＰ複合体（ＲＮＰｓ）及びアデノ随伴アデノウイルスベクター（ＡＡＶ）で再度エレクトロポレーションして（ＥＰ２）、ＴＥＴ２－／ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ＋（ＴＥＴ２－／抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ）又はＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ＋Ｔ細胞（ＴＥＴ２＋／抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ）を生成した。２つの対照群を生成し、ここでＡＡＶ又はＲＮＰのいずれかがＥＰ２で除外された（それぞれＴＥＴ２－／ＡＡＶ－及びＴＥＴ２－／ＲＮＰ－）。活性化された同種異系ヒトＴ細胞に、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列（配列番号１４９）の１つを含む組み換えＡＡＶ血清型６（ＡＡＶ６）を、Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡ ＲＮＰ（１μＭのＣａｓ９、５μＭのｇＲＮＡ）と共に送達した。以下のｓｇＲＮＡを使用した：ＴＥＴ２（配列番号１３）、ＴＲＡＣ（配列番号９３）及びβ２Ｍ（配列番号９７）。
活性化された初代ヒトＴ細胞を、Ｃａｓ９：ＴＥＴ２ ｓｇＲＮＡ１ ＲＮＰ複合体でエレクトロポレーションし（ＥＰ１）、ポリクローナルＴＥＴ２ ＫＯ集団を生成した。７２時間後、これらの細胞又は野生型（ＷＴ）活性化初代Ｔ細胞を、Ｃａｓ９：ｇＲＮＡ ＲＮＰ複合体（ＲＮＰｓ）及びアデノ随伴アデノウイルスベクター（ＡＡＶ）で再度エレクトロポレーションして（ＥＰ２）、ＴＥＴ２－／ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ＋（ＴＥＴ２－／抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ）又はＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ＋Ｔ細胞（ＴＥＴ２＋／抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ）を生成した。２つの対照群を生成し、ここでＡＡＶ又はＲＮＰのいずれかがＥＰ２で除外された（それぞれＴＥＴ２－／ＡＡＶ－及びＴＥＴ２－／ＲＮＰ－）。活性化された同種異系ヒトＴ細胞に、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列（配列番号１４９）の１つを含む組み換えＡＡＶ血清型６（ＡＡＶ６）を、Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡ ＲＮＰ（１μＭのＣａｓ９、５μＭのｇＲＮＡ）と共に送達した。以下のｓｇＲＮＡを使用した：ＴＥＴ２（配列番号１３）、ＴＲＡＣ（配列番号９３）及びβ２Ｍ（配列番号９７）。
【0279】
エレクトロポレーション（ＥＰ１）から約１週間後、抗ＴＥＴ２ポリクローナル抗体（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ＃Ｃ１５４１０２５５－１００）を１：５００希釈度で用いる自動ウェスタンブロット（Ｗｅｓ（商標）、Ｐｒｏｔｅｉｎｓｉｍｐｌｅ）により、細胞のＴＥＴ２タンパク質ノックダウンを評価した。本アッセイから得られた結果は、ＴＥＴ２ ＫＯ（ＴＥＴ２－）抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞中ではＴＥＴ２の検出を確認せず、一方で対照細胞及びＴＥＴ２ ＷＴ（ＴＥＴ２＋）抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞中ではＴＥＴ２の発現を検出した。
【0280】
ＥＰ２後９日目に、細胞をフローサイトメトリのためにも処理して、編集された細胞集団の細胞表面におけるＴＲＡＣ及びβ２Ｍノックアウトレベル及び抗ＢＣＭＡ ＣＡＲの発現を評価した。細胞は、下記の表２２に示される抗体のパネルで染色した。
【0281】
【表26】
【0282】
結果を以下の表２３に示す。全ての抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＴＲＡＣ－／β２Ｍ－対照細胞（ＴＥＴ２－／ＡＡＶ－）に関して、生存細胞の＞８５％がＴＣＲの発現を欠いており、＞７４％がβ２Ｍの発現を欠いており、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞集団の＞７２％がＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－の両方であった。生ＣＡＲ－Ｔ細胞をその前方散乱（ＦＳＣ）及び側方散乱（ＳＳＣ）プロファイルにより且つ７－ＡＡＤ染料でゲートをかけた。
【0283】
【表27】
【0284】
（ＩＩ）．ＴＥＴ２ ＫＯ（ＴＥＴ２－）又はＴＥＴ２ ＷＴ（ＴＥＴ２＋）抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗原刺激
ＣＡＲ発現の判定後の１週間の間、異なる細胞集団を拡大した。各ＣＡＲ－Ｔ集団（ＴＥＴ２－／抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ、ＴＥＴ２＋／抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ、ＴＥＴ２－／ＡＡＶ－及びＴＥＴ２－／ＲＮＰ－）の１００万個の細胞を、続いて、完全Ｔ細胞培地中の１２ウェル組織培養プレート中で標的細胞株ＭＭ１Ｓと１：１のＥ：Ｔ比で三重に共培養し、３７℃で４８時間（刺激ラウンド１）又は７２時間（刺激ラウンド２及び３）（共培養されたＣＡＲ－Ｔ細胞が全ての標的細胞を死滅させることを確実にするために過去に確立された十分な期間）インキュベートした。合計で３ラウンドの刺激を実施し、各刺激後にＣＡＲ－Ｔ細胞を回収し、洗浄し、トリパンブルーを用いて計数し（生存評価のために）、新鮮な標的細胞を１００万細胞／ウェルで、１：１のＥ：Ｔで、三重に再播種した。更に、下記の表２４に示す抗体パネルを用いたＦＡＣＳにより、細胞の一部をＣＡＲ－Ｔ発現に関して評価した。３ラウンドの刺激後、ＣＡＲ－Ｔ細胞を回収し、拡大して、成長及び生存％並びに表２４に示す抗体パネルを用いた表面ＣＡＲ発現の周期的なＦＡＣＳ評価を監視した。
ＣＡＲ発現の判定後の１週間の間、異なる細胞集団を拡大した。各ＣＡＲ－Ｔ集団（ＴＥＴ２－／抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ、ＴＥＴ２＋／抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ、ＴＥＴ２－／ＡＡＶ－及びＴＥＴ２－／ＲＮＰ－）の１００万個の細胞を、続いて、完全Ｔ細胞培地中の１２ウェル組織培養プレート中で標的細胞株ＭＭ１Ｓと１：１のＥ：Ｔ比で三重に共培養し、３７℃で４８時間（刺激ラウンド１）又は７２時間（刺激ラウンド２及び３）（共培養されたＣＡＲ－Ｔ細胞が全ての標的細胞を死滅させることを確実にするために過去に確立された十分な期間）インキュベートした。合計で３ラウンドの刺激を実施し、各刺激後にＣＡＲ－Ｔ細胞を回収し、洗浄し、トリパンブルーを用いて計数し（生存評価のために）、新鮮な標的細胞を１００万細胞／ウェルで、１：１のＥ：Ｔで、三重に再播種した。更に、下記の表２４に示す抗体パネルを用いたＦＡＣＳにより、細胞の一部をＣＡＲ－Ｔ発現に関して評価した。３ラウンドの刺激後、ＣＡＲ－Ｔ細胞を回収し、拡大して、成長及び生存％並びに表２４に示す抗体パネルを用いた表面ＣＡＲ発現の周期的なＦＡＣＳ評価を監視した。
【0285】
【表28】
【0286】
これらの抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ集団の延長培養の結果は、Ｔ細胞中のＴＥＴ２のノックアウトは、全体的な生存に有意な差をもたらすことなく（図８Ｂ）、標的細胞株で刺激されたＣＡＲ－Ｔ細胞に増殖の有利性を与える（図８Ａ）ことを示す。更に、ＴＥＴ２＋／抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞又は刺激を受けていない細胞と比較してＴＥＴ２ ＫＯ細胞中のＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ陽性細胞の優先的な濃縮が観察された（図８Ｃ）。
【0287】
（ＩＩＩ）．ＴＥＴ２ ＫＯ抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＴＥＴ２－／抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ）とＴＥＴ２ ＷＴ抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＴＥＴ２＋／抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ）と間の機能的特徴の比較
標的細胞刺激の各ラウンド後、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の機能的活性（エフェクターサイトカイン分泌によって立証される）を、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）のサイトカイン放出アッセイを用いて評価した。上記の共培養期間後、共培養された細胞から上清培地を回収し、ＥＬＩＳＡ（ＲＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、製造業者の指示に従いＩＦＮγのレベルを測定した。磁気ミクロスフェアであるＨＣＹＩＦＮＧ－ＭＡＧ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ＃ＨＣＹＩＦＮＧ－ＭＡＧ）を用いるＭＩＬＬＩＰＬＥＸキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ＃ＨＣＹＴＯＭＡＧ－６０Ｋ）を用いて、共培養刺激アッセイからの試料中のＩＦＮγ分泌を定量化した。アッセイは、製造業者の指示に従い実施した。
標的細胞刺激の各ラウンド後、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の機能的活性（エフェクターサイトカイン分泌によって立証される）を、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）のサイトカイン放出アッセイを用いて評価した。上記の共培養期間後、共培養された細胞から上清培地を回収し、ＥＬＩＳＡ（ＲＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、製造業者の指示に従いＩＦＮγのレベルを測定した。磁気ミクロスフェアであるＨＣＹＩＦＮＧ－ＭＡＧ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ＃ＨＣＹＩＦＮＧ－ＭＡＧ）を用いるＭＩＬＬＩＰＬＥＸキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ＃ＨＣＹＴＯＭＡＧ－６０Ｋ）を用いて、共培養刺激アッセイからの試料中のＩＦＮγ分泌を定量化した。アッセイは、製造業者の指示に従い実施した。
【0288】
要約すると、ＭＩＬＬＩＰＬＥＸ（登録商標）標準及び品質管理（ＱＣ）試料を再構成し、１０，０００ｐｇ／ｍＬ～３．２ｐｇ／ｍＬの実用標準の連続希釈を調製した。ＭＩＬＬＩＰＬＥＸ（登録商標）標準、ＱＣ及び細胞上清を各プレートに添加し、アッセイ培地を用いて上清を希釈した。全ての試料を、ＨＣＹＩＦＮＧ－ＭＡＧビーズで２時間インキュベートした。インキュベート後、自動磁気プレート洗浄機を用いてプレートを洗浄した。ヒトサイトカイン／ケモカイン検出抗体溶液を各ウェルに添加して１時間インキュベートし、続いてストレプトアビジン－フィコエリトリンで３０分間インキュベートした。続いてプレートを洗浄し、試料を１５０μＬのシース液に再懸濁させ、プレート振とう器上で５分間攪拌した。ｘＰＯＮＥＮＴ（登録商標）ソフトウェアを備えたＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）１００／２００（商標）機器を用いて試料を読み取り、データの取得及び分析を、ＭＩＬＬＩＰＬＥＸ（登録商標）Ａｎａｌｙｓｔソフトウェアを用いて完了させた。未知の試料中で測定されたサイトカイン濃度を計算するために、中央蛍光強度（ＭＦＩ）データが、５パラメーターのロジスティック曲線適合法を用いて自動的に分析される。
【0289】
結果は、これらの条件下で複数ラウンドの標的細胞株の刺激後、ＴＥＴ２ ＫＯを含む又は含まない抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞中のＩＦＮγの分泌に有意差が存在しなかったことを示した（図８Ｄ）。対照細胞のＴＣＲ－／β２Ｍ－（ＡＡＶ陰性）及び非ＣＡＲ編集（ＲＮＰ陰性）は、ＭＭ１Ｓ細胞の存在下で有意な又は特定のＩＦＮγ分泌反応を示さなかった。
【0290】
要約すると、上記の研究は、以下を示す：（ａ）ＴＥＴ２ ＫＯ抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＴＥＴ２－／抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ）は、ＭＭ１Ｓ抗原刺激後、ＴＥＴ２ ＷＴ抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞（ＴＥＴ２＋／抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ）を上回る成長の優位性を示した；（ｂ）ＴＥＴ２ ＫＯ抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、抗原刺激後、ＴＥＴ２ ＷＴ抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を上回る抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ陽性細胞の濃縮を示した；及び（ｃ）ＴＥＴ２ ＫＯは、複数の抗原刺激を受けたＴＥＴ２ ＷＴ抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ機能活性（ＩＦＮγ分泌）を変化させなかった。これらの結果は、ＣＡＲ－Ｔ細胞中でＴＥＴ２ノックアウトを操作すること（本明細書では一例として抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞を用いる）は、成長の優位性及びＣＡＲ－Ｔ濃縮効果の両方を付与することを実証した。これは、遺伝子編集によってインビトロでのＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖をブーストすることは実現可能であり、機能を損なうことなしにより高いＣＡＲ－Ｔ収率が可能な細胞バンクを生成するために用いることができるという概念実証の証拠を提供する。
【0291】
実施例９．ＦＡＳガイドＲＮＡのオンターゲット及びオフターゲット編集
最高の遺伝子編集効率を示す３つのガイドであるＦＡＳ－ｅｘ２－Ｔ２、ＦＡＳ－ｅｘ３＿Ｔ１、ＦＡＳ－ｅｘ３＿Ｔ２に関して、様々なＦＡＳ標的化ｇＲＮＡのオンターゲット及びオフターゲット編集効率を調べた（図２Ａを参照）。要約すると、初代ヒトＰＢＭＣ細胞から誘導された活性化Ｔ細胞を、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及びＦＡＳ遺伝子（上記の表５の配列）を標的化する合成的に修飾されたｓｇＲＮＡを含有するリボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）でトランスフェクト（エレクトロポレーション）するか、又は未処置対照（エレクトロポレーションなし、Ｃａｓ９なし、ｇＲＮＡなし）として調製した。
最高の遺伝子編集効率を示す３つのガイドであるＦＡＳ－ｅｘ２－Ｔ２、ＦＡＳ－ｅｘ３＿Ｔ１、ＦＡＳ－ｅｘ３＿Ｔ２に関して、様々なＦＡＳ標的化ｇＲＮＡのオンターゲット及びオフターゲット編集効率を調べた（図２Ａを参照）。要約すると、初代ヒトＰＢＭＣ細胞から誘導された活性化Ｔ細胞を、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及びＦＡＳ遺伝子（上記の表５の配列）を標的化する合成的に修飾されたｓｇＲＮＡを含有するリボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）でトランスフェクト（エレクトロポレーション）するか、又は未処置対照（エレクトロポレーションなし、Ｃａｓ９なし、ｇＲＮＡなし）として調製した。
【0292】
ゲノムのオン及びオフターゲット評価の場合、２つの異なるドナーＴ細胞（１及び２と称される）から編集された細胞の２つの細胞集団を生成するために同じエレクトロポレーション法を用いた。表５に列挙される最上部のガイドの３つで細胞を遺伝子編集し、トランスフェクションから１０日後に回収した。これらの試料を、次世代配列決定と組み合わせて、オン及びオフターゲット部位を濃縮するための相同性依存的な方法のハイブリッドキャプチャで分析した。要約すると、各ｇＲＮＡ標的部位との相同性を有するオン及びオフターゲット部位をコンピュータによって同定し、一本鎖ＲＮＡプローブを用いてバルクゲノムＤＮＡからこれらの部位を濃縮し、これらの濃縮された部位を次世代配列決定で配列決定し、このデータをＣＲＩＳＰＲ編集後の修復を示す挿入及び欠失に関して分析した。
【0293】
結果を下記の表２５に示す。
【0294】
【表29】
【0295】
Ｔ細胞におけるオンターゲットインデルプロファイルの分析
オフターゲット編集を定量化するために使用されるデータを、表２５に列挙される全てのＦＡＳガイドに関して最も頻度の高いオンターゲットインデルを定量化し、要約するためにも使用した。このデータは、２つのドナー（ドナー１及びドナー２と称される）における次世代配列決定と組み合わせたＦＡＳ遺伝子座のハイブリッドキャプチャから生成した。
オフターゲット編集を定量化するために使用されるデータを、表２５に列挙される全てのＦＡＳガイドに関して最も頻度の高いオンターゲットインデルを定量化し、要約するためにも使用した。このデータは、２つのドナー（ドナー１及びドナー２と称される）における次世代配列決定と組み合わせたＦＡＳ遺伝子座のハイブリッドキャプチャから生成した。
【0296】
遺伝子編集に続いて、ＦＡＳ－Ｔ細胞を生成するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集後のＴ細胞集団におけるＦＡＳ遺伝子座のハイブリッドキャプチャ分析は、ＦＡＳ遺伝子座における特定のインデル頻度及び編集された遺伝子配列をもたらす（表２６～２８；ダッシュが欠失であり、及び太字が挿入である）。
【0297】
ハイブリッドキャプチャデータから個々の配列を定量化するために、切断部位の２０ｂｐ上流及び下流のＦＡＳオンターゲット部位にわたって整列する配列リードが、インデル配列定量化のために選択され、検討された。選択されたリードから、各推定上切断部位の１０ｂｐ上流及び下流以内にある配列（ＰＡＭの約３ｂｐ上流（Ｊｉｎｅｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１２）は、オンターゲット非相同末端連結（ＮＨＥＪ）編集の代表的な領域として定量化された。これらのオンターゲット遺伝子編集された配列のデータは、下の表に提示され、これらの配列の頻度は、各切断部位の２０ｂｐ上流及び下流以内のオンターゲット部位にわたる全ての配列のパーセントを表す。各ガイドのインデルは、表２２～２４におけるオンターゲット参照配列に対して示される。参照配列は、いずれかの方向において１０ｂｐを伴い、ＰＡＭの３’の４ｂｐで終わる切断部位の中央に置かれる。
【0298】
【表30】
【0299】
【表31】
【0300】
【表32】
【0301】
実施例１０．同種異系ヒトＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞株の誘導
ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／ＦＡＳ－／ＴＥＴ２－／ＣＤ７０－ＣＤ１９ ＣＡＲ発現Ｔ細胞（健全なヒトドナーの末梢血Ｔ細胞から生成した）を投与された３体のマウスから、脾細胞を単離した。これらのマウスは、注入後＞３ヶ月でＮａｌｍ６白血病を抑制した。単離された脾細胞を、ＩＬ－２／ＩＬ－７及びヒト血清を含有するヒトＴ細胞培地中で培養し、細胞の成長を監視した。マウス脾臓単離物の１つに由来する細胞は、経時的な成長を示した（これらの細胞を単離細胞と称する）。これらの単離細胞は、２ヶ月間の培養後、＞９９％ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／ＣＡＲ＋であり、且つＦＡＳ、ＣＤ７０、ＴＥＴ２において高頻度のインデルと共にＣＤ４表現型を有した。より具体的には、ＦＡＣＳ分析は、試験された細胞集団中で９７．８％が生細胞であり、９９．１％がＴＣＲ及びＢ２Ｍ陰性であり、９９．１％がＣＡＲ陽性であり、９９．８％がＣＤ４陽性であることを示した。
ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／ＦＡＳ－／ＴＥＴ２－／ＣＤ７０－ＣＤ１９ ＣＡＲ発現Ｔ細胞（健全なヒトドナーの末梢血Ｔ細胞から生成した）を投与された３体のマウスから、脾細胞を単離した。これらのマウスは、注入後＞３ヶ月でＮａｌｍ６白血病を抑制した。単離された脾細胞を、ＩＬ－２／ＩＬ－７及びヒト血清を含有するヒトＴ細胞培地中で培養し、細胞の成長を監視した。マウス脾臓単離物の１つに由来する細胞は、経時的な成長を示した（これらの細胞を単離細胞と称する）。これらの単離細胞は、２ヶ月間の培養後、＞９９％ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／ＣＡＲ＋であり、且つＦＡＳ、ＣＤ７０、ＴＥＴ２において高頻度のインデルと共にＣＤ４表現型を有した。より具体的には、ＦＡＣＳ分析は、試験された細胞集団中で９７．８％が生細胞であり、９９．１％がＴＣＲ及びＢ２Ｍ陰性であり、９９．１％がＣＡＲ陽性であり、９９．８％がＣＤ４陽性であることを示した。
【0302】
単離細胞は、ヒトサイトカインＩＬ－２及びＩＬ－７に対するその依存性を維持した（図９Ａ）。これらの細胞は、ＣＤ１９＋細胞を死滅させる能力も保持し（図９Ｂ）、インビトロの細胞毒性及びサイトカイン放出機能を更に維持した（それぞれ図９Ｃ及び９Ｄ）。単離細胞は、Ｎａｌｍ６白血病モデルに再度注入され、ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞の新鮮なロットと同等の有効性を示した。（図９Ｅ）。
【0303】
単離細胞を用いたこのインビボ試験の第２ラウンドに続いて、１体のマウスから細胞を再び単離し、サイトカイン含有培地中で数週間更に培養／拡大した。これらの再単離細胞は、初期のインビボ単離由来の細胞と同じ表現型を維持した。再単離細胞は、Ｎａｌｍ６白血病を制御するその能力を評価するための第２の実験に用いる。
【0304】
この実施例は、残存するＴ細胞株は、インビトロ及びインビボで機能性を維持し、細胞バンク及び／又は治療として機能する潜在力を有する正常な健全ドナー（例えばヒトドナー）から誘導された末梢血Ｔ細胞から生成され得ることを示唆する。
【0305】
他の実施形態
本明細書に開示される特徴は、全て任意の組み合わせで組み合わせが可能である。本明細書に開示される各特徴は、同じ、均等な又は同様の目的に役立つ代替的な特徴へと置き換えが可能である。即ち、明示的に別段の定めをした場合を除き、開示される各特徴は、一般的な一連の均等な又は同様の特徴の単なる一例である。
本明細書に開示される特徴は、全て任意の組み合わせで組み合わせが可能である。本明細書に開示される各特徴は、同じ、均等な又は同様の目的に役立つ代替的な特徴へと置き換えが可能である。即ち、明示的に別段の定めをした場合を除き、開示される各特徴は、一般的な一連の均等な又は同様の特徴の単なる一例である。
【0306】
上記の説明から、当業者は、本発明の本質的な特性を容易に把握することができ、その趣旨及び範囲から逸脱することなく、本発明を各種の用途及び条件に適合させるために本発明の種々の変更形態及び修正形態をなし得る。従って、他の実施形態も請求項の範囲に含まれるものとする。
【0307】
均等物
本明細書でいくつかの本発明の実施形態を説明及び図示してきたが、当業者であれば、本明細書で説明される機能を実施し、且つ／又は結果及び／若しくは１つ以上の利点を得るための様々な他の手段及び／又は構造を容易に想定し、こうした変形形態及び／又は修正形態のそれぞれは、本明細書で説明される本発明の実施形態の範囲内にあるものと見なされる。より一般的には、当業者であれば、本明細書で説明される全てのパラメーター、寸法、材料及び構成が例示的であることを意図し、実際のパラメーター、寸法、材料及び／又は構成が、本発明の教示が適用される特定の用途に依存することを容易に理解する。当業者は、本明細書に記載された特定の本発明の実施形態に対する多く均等物を、日常の実験のみを用いて認識するか又は確認することが可能である。従って、上述の実施形態は、単に例として提示されており、また添付の特許請求の範囲及びその均等物の範囲内において、本発明の実施形態は、具体的に説明及び特許請求される以外の別の方法で実践され得ることを理解されたい。本開示の本発明の実施形態は、本明細書で説明される各個別の特徴、システム、物品、材料、キット及び／又は方法を対象とする。加えて、２つ以上のこうした特徴、システム、物品、材料、キット及び／又は方法の任意の組み合わせは、こうした特徴、システム、物品、材料、キット及び／又は方法が相互に矛盾しない場合、本開示の本発明の範囲内に含まれる。
本明細書でいくつかの本発明の実施形態を説明及び図示してきたが、当業者であれば、本明細書で説明される機能を実施し、且つ／又は結果及び／若しくは１つ以上の利点を得るための様々な他の手段及び／又は構造を容易に想定し、こうした変形形態及び／又は修正形態のそれぞれは、本明細書で説明される本発明の実施形態の範囲内にあるものと見なされる。より一般的には、当業者であれば、本明細書で説明される全てのパラメーター、寸法、材料及び構成が例示的であることを意図し、実際のパラメーター、寸法、材料及び／又は構成が、本発明の教示が適用される特定の用途に依存することを容易に理解する。当業者は、本明細書に記載された特定の本発明の実施形態に対する多く均等物を、日常の実験のみを用いて認識するか又は確認することが可能である。従って、上述の実施形態は、単に例として提示されており、また添付の特許請求の範囲及びその均等物の範囲内において、本発明の実施形態は、具体的に説明及び特許請求される以外の別の方法で実践され得ることを理解されたい。本開示の本発明の実施形態は、本明細書で説明される各個別の特徴、システム、物品、材料、キット及び／又は方法を対象とする。加えて、２つ以上のこうした特徴、システム、物品、材料、キット及び／又は方法の任意の組み合わせは、こうした特徴、システム、物品、材料、キット及び／又は方法が相互に矛盾しない場合、本開示の本発明の範囲内に含まれる。
【0308】
本明細書中で定義され、用いられる全ての定義は、辞書の定義、参照により組み込まれる文献中の定義及び／又は定義される用語の普通の意味を超えて優先されるものと理解されたい。
【0309】
本明細書に開示されている全ての参考文献、特許及び特許出願は、それぞれ引用されている主題に関して参照により組み込まれており、場合により文献の全体を包含する場合がある。
【0310】
不定冠詞「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、本明細書及び特許請求の範囲において使用される場合、反対に明確に示されない限り、「少なくとも１つ」を意味するものと理解されるべきである。
【0311】
本明細書及び特許請求の範囲で使用するとき、「及び／又は」という表現は、等位結合される要素、即ち一部の場合に接続的に提示され、他の場合に離接的に提示される要素の「いずれか又は両方」を意味するものとして理解されたい。「及び／又は」と共に列挙される複数の要素は、同じように、即ちそのように結合された要素の「１つ以上」と解釈されるべきである。「及び／又は」の節によって具体的に特定される要素以外に、具体的に特定された要素に関連するか又は関連しないに関わらず、他の要素が任意選択的に提示され得る。従って、非限定的な例として、「Ａ及び／又はＢ」に対する参照は、「含む」などのオープンエンド用語と共に使用される場合、一実施形態ではＡのみ（任意選択的にＢ以外の要素を含む）、別の実施形態ではＢのみ（任意選択的にＡ以外の要素を含む）、更に別の実施形態ではＡ及びＢの両方（任意選択的に他の要素を含む）などを指し得る。
【0312】
本明細書及び特許請求の範囲で使用するとき、「又は」は、上記で定義される「及び／又は」と同じ意味を有するものと理解されるべきである。例えば、リスト中の項目を分離する際、「又は」又は「及び／又は」は、包括的であり、即ち要素のリストの少なくとも１つを含むが、２つ以上の数及び任意選択的に追加的な列挙されていない項目も含むものと解釈されるべきである。「～の１つのみ」若しくは「～の厳密に１つ」又は特許請求の範囲で使用されるときの「～からなる」などの反対を明らかに示す用語のみが、多数の要素又は要素のリストの厳密に１つの要素の包含を指す。一般に、本明細書で使用する場合、「又は」という用語は、「いずれか」、「～の１つ」、「～の１つのみ」又は「～の正確に１つ」などの排他的な用語の前に置かれた場合、排他的代替物を示すに過ぎない（即ち「一方又は他方、ただし両方ではない」）ものと解釈するべきである。特許請求の範囲で使用する場合、「～から本質的になる」とは、特許法の分野で使用されるような通常の意味を有するものとする。
【0313】
本明細書で使用する場合、本明細書及び特許請求の範囲における、１つ以上の要素の列挙に関する「少なくとも１つ」という語句は、要素の列挙内の要素の任意の１つ以上から選択される少なくとも１つの要素であるが、要素の列挙内に具体的に列挙されたあらゆる要素の少なくとも１つを必ずしも含まず、且つ要素の列挙内の要素の任意の組み合わせを必ずしも除外しないことを意味するものと理解すべきである。この定義により、具体的に特定されるそれらの要素に関係するか否かに関わらず、「少なくとも１つ」という語句が意味する要素の列挙内に具体的に特定される要素以外の要素が任意選択的に存在し得ることも可能になる。従って、非限定的な例として、「Ａ及びＢの少なくとも１つ」（換言すると「Ａ又はＢの少なくとも１つ」、換言すると「Ａ及び／又はＢの少なくとも１つ」は、一実施形態では、任意選択により２つ以上のＡを含み、Ｂが存在しない（及び任意選択によりＢ以外の要素を含む）少なくとも１つを指すことができ、別の実施形態では、任意選択により２つ以上のＢを含み、Ａが存在しない（及び任意選択によりＡ以外の要素を含む）少なくとも１つを指すことができ、更に別の実施形態では、任意選択により２つ以上のＡを含む少なくとも１つ、且つ任意選択により２つ以上のＢを含む少なくとも１つ（及び任意選択により他の要素を含む）を指すなどであり得る。
【0314】
同様に、反対に明確に示されない限り、２つ以上の工程又は行為を含む、本明細書で特許請求される任意の方法において、この方法の工程又は行為の順序は、必ずしもこの方法の工程又は行為が列挙される順序に限定されないことも理解されるべきである。
【図1A-1B】
【図1C-1D】
【図2A-2B】
【図2C】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5A-5B】
【図6A-6B】
【図6C-6D】
【図6E】
【図7】
【図8A-8B】
【図8C-8D】
【図9A-9B】
【図9C-9E】
【配列表】
【国際調査報告】