特表 2022-547949 シーケンシングのためのＲＮＡ試料を調製する方法およびそのキット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-11-16

(54)【発明の名称】シーケンシングのためのＲＮＡ試料を調製する方法およびそのキット

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/10 20060101AFI20221109BHJP

   C12Q 1/6844 20180101ALI20221109BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20221109BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALI20221109BHJP

   C40B 40/08 20060101ALI20221109BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20221109BHJP

   C12Q 1/6855 20180101ALI20221109BHJP

【ＦＩ】

C12N15/10 100Z

C12Q1/6844 Z ZNA

C12Q1/686 Z

C12Q1/6869 Z

C40B40/08

C12N15/11 Z

C12Q1/6855 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022515626

(86)(22)【出願日】2020-09-04

(85)【翻訳文提出日】2022-04-28

(86)【国際出願番号】 IB2020058259

(87)【国際公開番号】W WO2021048720

(87)【国際公開日】2021-03-18

(31)【優先権主張番号】102019000015914

(32)【優先日】2019-09-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】IT

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522091221

【氏名又は名称】イマジナ バイオテクノロジー ソシエタ レスポンサビリタ リミタータ

(74)【代理人】

【識別番号】100113376

【弁理士】

【氏名又は名称】南条 雅裕

(74)【代理人】

【識別番号】100179394

【弁理士】

【氏名又は名称】瀬田 あや子

(74)【代理人】

【識別番号】100185384

【弁理士】

【氏名又は名称】伊波 興一朗

(74)【代理人】

【識別番号】100137811

【弁理士】

【氏名又は名称】原 秀貢人

(72)【発明者】

【氏名】デル ピアーノ アレッシア

(72)【発明者】

【氏名】フィッリート クラウディア

(72)【発明者】

【氏名】クラメール マッシミリアーノ

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA13

4B063QQ52

4B063QR08

4B063QR20

4B063QS25

4B063QS36

(57)【要約】

生物学的試料内に含まれる少なくとも１つのＲＮＡ分子をシーケンシングのために調製する方法であって、以下のステップ：
（ｉ）リン酸基または２’，３’－環状リン酸基を３’末端に有する少なくとも１つのＲＮＡ分子を含む生物学的試料を取得するステップ；
（ｉｉ）少なくとも１つのＲＮＡ分子の５’末端をリン酸化し、それにより、該少なくとも１つのＲＮＡ分子の５’末端にリン酸基を導入して、両末端がリン酸化された少なくとも１つのＲＮＡ分子を取得するステップ；
（ｉｉｉ）少なくとも１つのリン酸化ＲＮＡ分子の３’末端を、両末端に－ＯＨ基を有しているランダムＲＮＡリンカーの５’末端にライゲーションして、少なくとも１つの第１のライゲーション産物を取得するステップ；
（ｉｖ）少なくとも１つの第１のライゲーション産物を自己ライゲーションして、線状ＲＮＡ分子と混合されている少なくとも１つの環状ＲＮＡ分子を形成するステップ；
（ｖ）線状ＲＮＡ分子を消化するステップ；
（ｖｉ）少なくとも１つの環状ＲＮＡ分子を逆転写ローリング・サーキュラー増幅に供して、少なくとも１コピー、好ましくは２～５００コピーの少なくとも１つのＲＮＡ分子を有する少なくとも１つの一本鎖ｃＤＮＡ分子を取得するステップ；
を含み、
ここで上記少なくとも１つの一本鎖ｃＤＮＡ分子は、シーケンシングに適切である。
【選択図】図１Ｂ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

生物学的試料内に含まれる少なくとも１つのＲＮＡ分子をシーケンシングのために調製する方法であって、
以下のステップ：
（ｉ）リン酸基または２’，３’－環状リン酸基を３’末端に有する少なくとも１つのＲＮＡ分子を含む生物学的試料を取得するステップ；
（ｉｉ）前記少なくとも１つのＲＮＡ分子の５’末端をリン酸化し、それにより前記少なくとも１つのＲＮＡ分子の５’末端にリン酸基を導入して、両末端がリン酸化された少なくとも１つのＲＮＡ分子を取得するステップ；
（ｉｉｉ）前記少なくとも１つのリン酸化ＲＮＡ分子の３’末端を、両末端に－ＯＨ基を有しているランダムＲＮＡリンカーの５’末端にライゲーションして、少なくとも１つの第１のライゲーション産物を取得するステップ；
（ｉｖ）前記少なくとも１つの第１のライゲーション産物を自己ライゲーションして、線状ＲＮＡ分子と混合されている少なくとも１つの環状ＲＮＡ分子を形成するステップ；
（ｖ）前記線状ＲＮＡ分子を消化するステップ；
（ｖｉ）前記少なくとも１つの環状ＲＮＡ分子を逆転写ローリング・サーキュラー増幅に供して、少なくとも１コピー、好ましくは２～５００コピーの前記少なくとも１つのＲＮＡ分子を有する少なくとも１つの一本鎖ｃＤＮＡ分子を取得するステップ；
を含み、
ここで前記少なくとも１つの一本鎖ｃＤＮＡ分子は、シーケンシング、好ましくは単一分子のシーケンシングに適切である、
方法。

【請求項2】

請求項１に記載の方法であって、
前記方法は、前記少なくとも１つの一本鎖ｃＤＮＡ分子の相補ｃＤＮＡ鎖を生成して、少なくとも１つの二本鎖ｃＤＮＡ分子を取得する、さらなるステップ（ｖｉ）を含む、
方法。

【請求項3】

請求項１～３のいずれか一項に記載の方法であって、
リン酸化ステップ（ｉｉ）は、Ｔ４ ＰＮＫ ３’ｍｉｎｕｓ、Ｔ４ ＰＮＫおよびＴ４ ＰＮＫの組み換えバージョン（例えばＯｐｔｉｋｉｎａｓｅ（商標））から選択されるリン酸化酵素を用いて行なわれる、
方法。

【請求項4】

請求項１～３のいずれか一項に記載の方法であって、
ライゲーションステップ（ｉｉｉ）は、ＲｔｃＢ、Ａｒｃｈｅａｓｅ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｔｈａｌｉａｎａ ｔＲＮＡリガーゼ、および真核生物ｔＲＮＡリガーゼから選択される第１のリガーゼ酵素を用いて行なわれる、
方法。

【請求項5】

請求項１～４のいずれか一項に記載の方法であって、
自己ライゲーションステップ（ｉｖ）は、Ｔ４ Ｒｎｌ１、Ｔ４ Ｒｎｌ２、Ｔ４ Ｒｎｌ２ｔｒ、Ｔ４ Ｒｎｌ２ Ｋ２２７Ｑ、Ｍｔｈ Ｒｎｌおよび分子内ライゲーションを触媒するＡＴＰ非依存性リガーゼ（例えばｃｉｒｃｌｉｇａｓｅ（商標）、ｃｉｒｃｌｉｇａｓｅＩＩ（商標））から選択される第２のリガーゼ酵素を用いて行なわれる、
方法。

【請求項6】

請求項１～５のいずれか一項に記載の方法であって、
消化ステップ（ｉｖ）は、３’－５’エキソリボヌクレアーゼまたは５’－３’エキソリボヌクレアーゼを用いて行なわれる、
方法。

【請求項7】

請求項１～６のいずれか一項に記載の方法であって、
逆転写ローリング・サーキュラー増幅ステップ（ｖｉ）は、改変されたＭＭＬＶ－ＲＴ（Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ白血病ウイルス逆転写酵素）およびＡＭＶ－ＲＴ（Ａｖｉａｎ ｍｙｅｏｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓウイルス逆転写酵素）から選択される逆転写酵素を用いて行なわれる、
方法。

【請求項8】

請求項２～６のいずれか一項に記載の方法であって、
相補ｃＤＮＡ鎖の生成ステップ（ｖｉ）は、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＴａｑポリメラーゼおよびＧｕｂｌｅｒ－Ｈｏｆｆｍａｎ方法（例えば、Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＩＩ ＴａｑホットスタートＤＮＡポリメラーゼ（商標）、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標））から選択されるＤＮＡポリメラーゼ酵素を用いて行なわれる、
方法。

【請求項9】

請求項１～８のいずれか一項に記載の方法であって、
前記ランダムＲＮＡリンカーが、５０～５００ヌクレオチドの間に含まれる長さを有する、
方法。

【請求項10】

請求項１～９のいずれか一項に記載の方法であって、
前記ランダムＲＮＡリンカーが、－３～－１５０ｋｃａｌ／ｍｏｌの間に含まれる最小自由エネルギーを有する、
方法。

【請求項11】

請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法であって、
リン酸基または２’，３’－環状リン酸基を３’末端に有する前記少なくとも１つのＲＮＡ分子は、エンドリボヌクレアーゼ、エキソリボヌクレアーゼ、リボザイム、または、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、Ｙ ＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ウイルスＲＮＡもしくはｒＲＮＡを切断することが可能な毒素を用いて前記生物学的試料を処理することによって生産される、
方法。

【請求項12】

ランダムＲＮＡリンカー、および第１のリガーゼ酵素、エキソリボヌクレアーゼを含み、第２のリガーゼ酵素を含んでもよいキットであって、
（ｉ）前記ランダムＲＮＡリンカーは－ＯＨ基を両末端に有しており；
（ｉｉ）前記リガーゼ酵素は、リン酸基または２’，３’－環状リン酸基を３’末端に有しておりリン酸基を５’末端に有しているＲＮＡ分子の３’末端を、前記ランダムＲＮＡリンカーの５’末端にライゲーションするのに適切であり；
（ｉｉｉ）前記エキソリボヌクレアーゼは、線状ＲＮＡ分子を酵素的に消化するのに適切であり；および
（ｉｖ）前記第２のリガーゼ酵素は、前記ＲＮＡ分子への前記ランダムＲＮＡリンカーのライゲーションによって得られたライゲーション産物を環状化するのに適切である、
キット。

【請求項13】

請求項１２に記載のキットであって、
前記第１のリガーゼ酵素は、ＲｔｃＢ、Ａｒｃｈｅａｓｅ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｔｈａｌｉａｎａ ｔＲＮＡリガーゼ、および真核生物ｔＲＮＡリガーゼから選択される、
キット。

【請求項14】

請求項１２または１３に記載のキットであって、
前記第２のリガーゼ酵素は、Ｔ４ Ｒｎｌ１、Ｔ４ Ｒｎｌ２、Ｔ４ Ｒｎｌ２ｔｒ、Ｔ４ Ｒｎｌ２ Ｋ２２７Ｑ、Ｍｔｈ Ｒｎｌおよび分子内ライゲーションを触媒するＡＴＰ非依存性リガーゼ（例えばｃｉｒｃｌｉｇａｓｅ（商標）、ｃｉｒｃｌｉｇａｓｅＩＩ（商標））から選択される、
キット。

【請求項15】

請求項１２～１４のいずれか一項に記載のキットであって、
前記ランダムＲＮＡリンカーは、５０～５００ヌクレオチドの間に含まれる長さを有する、
キット。

【請求項16】

請求項１２～１５のいずれか一項に記載のキットであって、
前記ランダムＲＮＡリンカーは、－３～－１５０ｋｃａｌ／ｍｏｌの間に含まれる最小自由エネルギーを有する、
キット。

【請求項17】

請求項１２～１６のいずれか一項に記載のキットであって、
（ｉ）リン酸化酵素、および／または（ｉｉ）エンドリボヌクレアーゼ、リボザイム、または、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、Ｙ ＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ウイルスＲＮＡもしくはｒＲＮＡを切断することが可能な毒素をさらに含む、
キット。

【請求項18】

請求項１２～１７のいずれか一項に記載のキットであって、
前記ランダムＲＮＡリンカーは、配列番号３に記載のヌクレオチド配列を有する、
キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本明細書は、シーケンシングのためのＲＮＡ試料を調製する新規の方法およびかかる方法を実施するためのキットに関する。

【背景技術】

【0002】

ＲＮＡ－タンパク質相互作用は、ｍＲＮＡ転写、ｐｒｅ－ｍＲＮＡスプライシングおよびＲＮＡシグナリング機能から、翻訳およびタンパク質局在化までの、細胞生物学の極めて重要な態様を制御する根本的な役割を果たしている^１。そのような生物学的プロセスを理解する重要性を考慮して、ＲＮＡおよびタンパク質の化学標識化^２からＲＮＡフットプリントの全ゲノムハイスループットのシーケンシング^３－６まで、これらの相互作用を研究し特徴付けるための方法を開発すべく、様々な努力がなされてきた。しかしながら、シーケンシング手法は一般に、試料調製中の様々な制約、例えば、広範囲の操作ステップ、ＰＣＲ増幅および３’末端にリン酸基または２’，３’－環状リン酸基（３’－Ｐ／ｃＰ）を有するＲＮＡ配列を選択的に捕捉する不可能性の影響を受け、したがって、結果の正確性の低下をもたらす^７。このことは、望ましくないＲＮＡ標的とのライブラリー交差反応性、高いバックグラウンドノイズおよび低いライブラリー質をもたらし、３’－Ｐ／ｃＰ末端化ＲＮＡ産物の重要な生物学的情報を妨げる。３’－Ｐ／ｃＰは酵素的切断によって生産され、３’－Ｐ／ｃＰ ＲＮＡは、多くの病状（例えば、癌および筋萎縮性側索硬化症^８，９）、生物学的プロセス（例えば、タンパク質アンフォールディング応答（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）^１０、ストレス顆粒の産生^８、ＲＮＡ代謝^１１、ｒＲＮＡおよびｔＲＮＡ生合成^１２ならびにｍＲＮＡスプライシング^１３）、および生物学的機能（例えば、神経生存^１４および炎症性応答^１５）における重要な役割を有している。３’末端のリン酸シグネチャは重要な機能性マーカーであるが、大部分のシーケンシングパイプラインは、ライブラリー調製中、この化学的特徴を保存しない。ほんの少数の方法が３’－Ｐまたは３’－ｃＰの検出に利用可能であるが、それらは３’－Ｐの間接的な検出を可能にするだけであり^１６、または、もっぱら３’－ｃＰに選択的である^{１６，１７}。さらに、これらのプロトコルは、労力と時間がかかり、ＰＣＲ増幅ステップを伴い、したがって、不均一な配列カバレッジまたはシーケンシングエラーを生じさせ得る（例えば内側反復領域）。

【0003】

技術的観点から、多くのＲＮＡフットプリント技術は、ＲＮＡ－タンパク質相互作用（大きなＲＮＡ－タンパク質複合体^１８またはＲＮＡの小分子の相互作用^１９）を特徴付けるためにエンドリボヌクレアーゼを用いる。３’－Ｐ末端を選択的に捕捉することが可能である利用可能なライブラリー調製プロトコルがないことにより非常に影響を受ける実験的設定は、リボソームプロファイリング（Ｒｉｂｏ－ｓｅｑ）、２５～３５ｎｔ長のリボソームで保護されたフラグメント（ＲＰＦ）のディープシーケンシングに基づくＲＮＡフットプリント法、すなわち、保護されていない一本鎖ＲＮＡのヌクレアーゼ消化後に生産されるｍＲＮＡフラグメントである。特定の瞬間に捕捉された転写産物に沿ったリボソームの位置情報を提供するので、この技術は、タンパク質合成の生物学を研究するための有力な手法を代表する^２０。リボソームプロファイリングのための現在のプロトコルは、多くの連続的ステップを伴い、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングプラットフォームに基づく。特に、ＲＰＦの分離後、２つの代替ライブラリー調製のワークフロー：（ｉ）ＲＰＦの３’末端におけるアダプターライゲーション、ｃＤＮＡ合成、環状化およびＰＣＲ増幅の連続ステップと、合計４回のゲル抽出ステップに基づくワークフロー^２１；（ｉｉ）市販製品が利用可能であり、ＲＮＡ３’ポリアデニル化、テンプレートスイッチとＰＣＲ増幅によるｃＤＮＡ合成の連続ステップ^２２を伴い、ゲル抽出ステップを必要とする、低インプット材料に関するライゲーション非依存性ワークフローが現在までに利用可能である。利用可能なプロトコルの主な欠点は、（ｉ）ＰＣＲ増幅のバイアス、および（ｉｉ）３’－Ｐ／ｃＰ末端（効果的な消化のシグネチャを提供する）の保存の欠如と、その後の、シーケンシングデータセットにおける、３’－Ｐ／ｃＰを有するＲＮＡ種（実際のＲＰＦを表わす）の再現不足（ｕｎｄｅｒ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）によって示される。実際に、両方のワークフローは、アダプターライゲーション^３またはポリアデニル化の前に脱リン酸化ステップを必要とする。この操作ステップは、ライゲーション反応における特定化レベルを低下させ、３’末端に－ＯＨ基が付与された任意の短いＲＮＡ分子の捕捉をもたらす。

【0004】

さらに、最近の研究は、生物学的流体（臍帯血漿、気管支肺胞洗浄液、成人血漿、耳下腺唾液、卵胞流体、血清、羊水、精漿、尿、胆汁、顎下／舌下唾液、脳脊髄液）における、小ＲＮＡ集団、例えば、ｔＲＮＡ由来ＲＮＡ、ｐｉｗｉ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ＲＮＡ、Ｙ ＲＮＡにおける相対的な量および種類の重要な違いを明らかにした。重要なことに、それらのうちのいくつかは、３’Ｐまたは２’，３’－ｃＰを有することが知られており、癌、神経障害および免疫学的障害と関連付けられている^２３。この臨床シナリオにおいて、これらのＲＮＡ種は、バイオマーカーとしての潜在的役割と、患者階層化における予想的および／または予後的重要性を有し得る^{２４，２５}。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

したがって、公知の方法の欠点がない、シーケンシングのためのＲＮＡ試料を調製する新規の方法が必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本開示の目的は、シーケンシングのためのＲＮＡ試料を調製する新規の方法およびかかる方法を実施するためのキットを提供することである。

【0007】

本発明によれば、上記目的は、本開示の不可欠な部分を形成するものとして理解される次のクレームにおいて明確に再現される（ｒｅｃａｌｌｅｄ）主題により達成される。

【0008】

本発明は、生物学的試料内に含まれる少なくとも１つのＲＮＡ分子をシーケンシングのために調製する方法に関するものであり、以下のステップ：
（ｉ）リン酸基または２’，３’－環状リン酸基を３’末端に有する少なくとも１つのＲＮＡ分子を含む生物学的試料を取得するステップ；
（ｉｉ）少なくとも１つのＲＮＡ分子の５’末端をリン酸化し、それにより、該少なくとも１つのＲＮＡ分子の５’末端にリン酸基を導入して、両末端がリン酸化された少なくとも１つのＲＮＡ分子を取得するステップ；
（ｉｉｉ）少なくとも１つのリン酸化ＲＮＡ分子の３’末端を、両末端に－ＯＨ基を有しているランダムＲＮＡリンカーの５’末端にライゲーションして、少なくとも１つの第１のライゲーション産物を取得するステップ；
（ｉｖ）少なくとも１つの第１のライゲーション産物を自己ライゲーションして、線状ＲＮＡ分子と混合されている少なくとも１つの環状ＲＮＡ分子を形成するステップ；
（ｖ）線状ＲＮＡ分子を消化するステップ；および
（ｖｉ）少なくとも１つの環状ＲＮＡ分子を逆転写ローリング・サーキュラー増幅に供して、少なくとも１コピー、好ましくは２～５００コピーの少なくとも１つのＲＮＡ分子を有する少なくとも１つの一本鎖ｃＤＮＡ分子を取得するステップ；
を含み、
ここで上記少なくとも１つの一本鎖ｃＤＮＡ分子は、シーケンシング、好ましくは単一分子のシーケンシングに適切である。

【0009】

本方法はＰＣＲが不要であり、任意の３’－Ｐ／ｃＰ末端化ＲＮＡフットプリントに適用することができる。本出願の方法の目的（ＣｉｒｃＡＩＤ－ｐ－ｓｅｑと呼ぶ）は、ナノポアシーケンシングのために最適化された低インプット生物学的試料のための迅速なｃＤＮＡシーケンシングプロトコルである。本方法は、時間のかかるプロトコルおよびＰＣＲバイアスなどの伝統的にＲＮＡフットプリントを悩ませてきた制約のいくつかを克服し、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅプラットフォームによる３’－Ｐ／ｃＰを有するＲＮＡフラグメントのディープシーケンシングのための有力なパイプラインを提供し、したがって、生物学的に関連のあるＲＮＡ種のリアルタイムの単一分子検出を可能にする。

【0010】

さらなる一実施態様では、本発明は、生物学的試料内に含まれる少なくとも１つのＲＮＡ分子をシーケンシングのために調製する方法（本明細書中に開示される）を実施するためのキットに関するものであり、ここでキットは、ランダムＲＮＡリンカー、および第１のリガーゼ酵素、エキソリボヌクレアーゼを含み、第２のリガーゼ酵素を含んでもよく、ここで：
（ｉ）ランダムＲＮＡリンカーは、－ＯＨ基を両末端に有しており；
（ｉｉ）リガーゼ酵素は、リン酸基または２’，３’－環状リン酸基を３’末端に有しておりリン酸基を５’末端に有しているＲＮＡ分子の３’末端を、ヒドロキシル基を３’末端に有するランダムＲＮＡリンカーの５’末端にライゲーションするのに適切であり；
（ｉｉｉ）エキソリボヌクレアーゼは、線状ＲＮＡ分子を酵素的に消化するのに適切であり；および
（ｉｖ）第２のリガーゼ酵素は、ＲＮＡ分子へのランダムＲＮＡリンカーのライゲーションによって得られたライゲーション産物を環状化するのに適切である。

【0011】

本発明は、純粋に説明および非限定的な例示のために、付随する図面に関して、詳細にここに説明される。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】Ａ）ポリアデニル化処理を伴う、または伴わない、ＲＮＡｓｅＩ消化によって生じたフラグメントのＴＢＥ－尿素ＰＡＧＥ分析。Ｂ）ＣｉｒｃＡＩＤ－ｐ－ｓｅｑワークフローの略図。Ｃ）全てのＣｉｒｃＡＩＤ－ｐ－ｓｅｑステップのＴＢＥ－尿素ＰＡＧＥ分析。

【図2】ｃｉｒｃＧＦＰ－リンカーＲライブラリーのダイレクトｃＤＮＡシーケンシング。Ａ）シーケンシングリードの長さ分布；Ｂ）代表的なコンセンサス配列。単一の塩基呼出し（ｂａｓｅ－ｃａｌｌｅｄ）リードを、その個々のリピートに分割し、それから、互いに対してアライメントして、コンセンサス配列を生成した。

【図3】Ａ）ＧＦＰトランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞の代表的な写真。Ｂ）ＢＬＡＳＴｎによって検出されたＧＦＰフラグメントの長さ分布。Ｃ）参照ＧＦＰ配列に対するシーケンシングリードのＢＬＡＳＴｎアライメント。

【図4】２つの異なるリードから得られた、２リピート（上）および３リピート（下）によって生産された代表的なコンセンサス配列。

【図5】ヌクレオチド配列。

【発明を実施するための形態】

【0013】

以下の説明では、非常に多くの具体的な詳細が、実施態様の徹底的な理解を提供するために与えられる。実施態様は、具体的な詳細の１つまたは複数を用いずに、または他の方法、構成要素、材料などを用いて、実施することができる。他の例では、良く知られた構造、材料、または操作は、実施態様の態様を不明瞭にするのを避けるために、詳細に示されず、または説明されない。

【0014】

この明細書全体で「１つの実施態様」または「一実施態様」との言及は、実施態様との関連で記載される特定の特性、構造、または特徴が、少なくとも１つの実施態様に含まれることを意味する。したがって、「１つの実施態様では」または「一実施態様では」という語句が本明細書全体にわたり様々な場所において現れることは、必ずしもすべてが同じ実施態様を言及しているわけではない。さらに、特定の特性、構造、または特徴は、任意の適切な様式で１つまたは複数の実施態様において組み合わせられ得る。

【0015】

本明細書中に提供される見出しは便宜上のためのみであり、本実施態様の範囲または意味と解釈しない。

【0016】

本発明は、生物学的試料内に含まれる少なくとも１つのＲＮＡ分子をシーケンシングのために調製するための新規の方法に関するものであり、以下のステップ：
（ｉ）リン酸基または２’，３’－環状リン酸基を３’末端に有する少なくとも１つのＲＮＡ分子を含む生物学的試料を取得するステップ；
（ｉｉ）少なくとも１つのＲＮＡ分子の５’末端をリン酸化し、それにより、該少なくとも１つのＲＮＡ分子の５’末端にリン酸基を導入して、両末端がリン酸化された少なくとも１つのＲＮＡ分子を取得するステップ；
（ｉｉｉ）少なくとも１つのリン酸化ＲＮＡ分子の３’末端を、両末端に－ＯＨ基を有しているランダムＲＮＡリンカーの５’末端にライゲーションして、少なくとも１つの第１のライゲーション産物を取得するステップ；
（ｉｖ）少なくとも１つの第１のライゲーション産物を自己ライゲーションして、線状ＲＮＡ分子と混合されている少なくとも１つの環状ＲＮＡ分子を形成するステップ；
（ｖ）線状ＲＮＡ分子を消化するステップ；および
（ｖｉ）少なくとも１つの環状ＲＮＡ分子を逆転写ローリング・サーキュラー増幅に供して、少なくとも１コピー、好ましくは２～５００コピーの少なくとも１つのＲＮＡ分子を有する少なくとも１つの一本鎖ｃＤＮＡ分子を取得するステップ；
を含み、
ここで少なくとも１つの一本鎖ｃＤＮＡ分子は、シーケンシング、好ましくは単一分子のシーケンシングに適切である。より好ましくは、シーケンシングは、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇプラットフォーム（ナノポアシーケンシング）によって行なわれる。

【0017】

一実施態様では、生物学的試料は、真核生物（植物、動物、菌類および原生生物のような単細胞生物）、ウイルスまたは原核細胞溶解物、組織（血液および生検、インビトロおよびエクスビボの細胞を含む）、生物学的流体（臍帯血漿、気管支肺胞洗浄液、成人血漿、耳下腺唾液、卵胞流体、血清、羊水、精漿、尿、胆汁、顎下／舌下唾液、脳脊髄液）、３Ｄ細胞培養物から選択することができる。

【0018】

一実施態様では、リン酸基または２’，３’－環状リン酸基を３’末端に有する少なくとも１つのＲＮＡ分子は、エンドリボヌクレアーゼ、エキソリボヌクレアーゼ、リボザイム、または、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、Ｙ ＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ（正センスＲＮＡウイルス、負センスＲＮＡウイルス、逆転写ウイルス由来、およびウイルスによって生産される他のＲＮＡ種）もしくはｒＲＮＡを切断することが可能な毒素を用いて生物学的試料を処理することによって生産される。

【0019】

一実施態様では、リン酸基または２’，３’－環状リン酸基を３’末端に有する少なくとも１つのＲＮＡ分子は、エンドリボヌクレアーゼ、エキソリボヌクレアーゼ、リボザイム、または、生物学的試料中に存在するｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、Ｙ ＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ（正センスＲＮＡウイルス、負センスＲＮＡウイルス、逆転写ウイルス由来、およびウイルスによって生産される他のＲＮＡ種）もしくはｒＲＮＡを切断することが可能な毒素の作用の結果として、生物学的試料中に生理的または病理学的に存在する。

【0020】

一実施態様では、エンドリボヌクレアーゼは、好ましくは、ＲＮａｓｅＡ；ＲＮａｓｅＴ１；ＲＮａｓｅＴ２；ＲＮａｓｅＩ；Ｓ７小球菌ヌクレアーゼ；ブドウ球菌ヌクレアーゼ；ＲＮＡｓｅＬ；アンギオジェニン；コリシンＥ５；ｔＲＮＡ－スプライシングエンドヌクレアーゼ（ＳＥ２、ＳＥＮ３４）；フェレドキシン様Ｃａｓ６およびフェレドキシン様ＣａｓＥ；ＩＲＥ１；ポリ（Ｕ）特異的エンドリボヌクレアーゼ（ＰＰ１１）；Ｌａｓ１；ＲｔｃＡ；ＩＢ型トポイソメラーゼ；Ｃｕｅ２エンドヌクレアーゼ^２６およびＣａｓタンパク質の中から選択される。

【0021】

一実施態様では、エキソリボヌクレアーゼは、好ましくはＵＳＢ１によって代表される。

【0022】

一実施態様では、リボザイムは、好ましくは、シュモクザメリボザイム、ヘアピンリボザイム、肝炎δリボザイム、Ｖａｒｋｕｄサテライト（ＶＳ）リボザイムから選択される。

【0023】

一実施態様では、毒素は、好ましくは、コリシンＤおよびコリシンＥ５、α－サルシン、ジモシン、ＰａＴ、ＭａｚＦ、ＣｈｐＢＫ、ｐｒｒＣから選択される。

【0024】

一実施態様では、シーケンスされる少なくとも１つのＲＮＡ分子は一本鎖である。

【0025】

一実施態様では、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、１０ｐＭ～１００μＭ、好ましくは１ｎＭ～１０μＭの間に含まれる濃度内で生物学的試料中に含まれる。

【0026】

一実施態様では、本方法は、少なくとも１つの一本鎖ｃＤＮＡ分子の相補ｃＤＮＡ鎖を生成して、少なくとも１つの二本鎖ｃＤＮＡ分子を取得する、さらなるステップ（ｖｉ）を含む。

【0027】

一実施態様では、リン酸化ステップ（ｉｉ）は、Ｔ４ ＰＮＫ ３’ｍｉｎｕｓ、Ｔ４ ＰＮＫおよびＴ４ ＰＮＫの組み換えバージョン（例えばＯｐｔｉｋｉｎａｓｅ（商標））から選択されるリン酸化酵素を用いて行なわれる。

【0028】

一実施態様では、ライゲーションステップ（ｉｉｉ）は、ＲｔｃＢ、Ａｒｃｈｅａｓｅ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｔｈａｌｉａｎａ ｔＲＮＡリガーゼ、および真核生物ｔＲＮＡリガーゼから選択される第１のリガーゼ酵素を用いて行なわれる。

【0029】

一実施態様では、自己ライゲーションステップ（ｉｖ）は、Ｔ４ Ｒｎｌ１、Ｔ４ Ｒｎｌ２、Ｔ４ Ｒｎｌ２ｔｒ、Ｔ４ Ｒｎｌ２ Ｋ２２７Ｑ、Ｍｔｈ Ｒｎｌ、および分子内ライゲーションを触媒するＡＴＰ非依存性リガーゼ（例えばｃｉｒｃｌｉｇａｓｅ（商標）、ｃｉｒｃｌｉｇａｓｅＩＩ（商標））から選択される第２のリガーゼ酵素を用いて行なわれる。

【0030】

一実施態様では、消化ステップ（ｖ）は、５’－３’エキソリボヌクレアーゼまたは３’－５’エキソリボヌクレアーゼを用いて、好ましくはＲＮＡｓｅＲを用いて行なわれる。

【0031】

一実施態様では、逆転写ローリング・サーキュラー増幅ステップ（ｖｉ）は、改変されたＭ ＭＬＶ－ＲＴ（Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ白血病ウイルス逆転写酵素）およびＡＭＶ－ＲＴ（Ａｖｉａｎ ｍｙｅｏｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓウイルス逆転写酵素）（好ましくはＭａｘｉｍａ Ｈ ｍｉｎｕｓ（商標）Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｉ－ＩＩ－ＩＩＩ－ＩＶ、Ｓｕｎｓｃｒｉｐｔ（商標）から選択される）を用いて行なわれる。

【0032】

一実施態様では、相補ｃＤＮＡ鎖の生成ステップ（ｖｉ）は、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＴａｑポリメラーゼおよびＧｕｂｌｅｒ－Ｈｏｆｆｍａｎ方法（例えばＰｌａｔｉｎｕｍ ＩＩ ＴａｑホットスタートＤＮＡポリメラーゼ（商標）、ＡＢ Ｔａｑ（商標）ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）、ＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）Ｕｌｔｒａ（商標）ＩＩ Ｎｏｎ－Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＲＮＡ Ｓｅｃｏｎｄ Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）から選択されるＤＮＡポリメラーゼ酵素を用いて行なわれる。

【0033】

さらなる一実施態様では、本発明は、生物学的試料中に含まれる少なくとも１つのＲＮＡ分子をシーケンシングのために調製する方法（本明細書中に開示される）を実施するためのキットに関するものであり、該キットは、ランダムＲＮＡリンカー、および第１のリガーゼ酵素、エキソリボヌクレアーゼを含み、第２のリガーゼ酵素を含んでもよく、
（ｉ）ランダムＲＮＡリンカーは、－ＯＨ基を両末端に有しており；
（ｉｉ）リガーゼ酵素は、リン酸基または２’，３’－環状リン酸基を３’末端に有しておりリン酸基を５’末端に有しているＲＮＡ分子の３’末端を、ランダムＲＮＡリンカーの５’末端にライゲーションするのに適切であり；
（ｉｉｉ）エキソリボヌクレアーゼは、線状ＲＮＡ分子を酵素的に消化するのに適切であり；および
ｉｖ）第２のリガーゼ酵素は、ＲＮＡ分子へのランダムＲＮＡリンカーのライゲーションによって得られるライゲーション産物を環状化するのに適切である（すなわち、リン酸を５’末端に有するライゲーション産物の５’末端を、－ＯＨ基を３’末端に有するライゲーション産物の３’末端にライゲーションする）。

【0034】

一実施態様では、第１のリガーゼ酵素は、ＲｔｃＢ、Ａｒｃｈｅａｓｅ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｔｈａｌｉａｎａ ｔＲＮＡリガーゼ、および真核生物ｔＲＮＡリガーゼから選択される。

【0035】

一実施態様では、第２のリガーゼ酵素は、Ｔ４ Ｒｎｌ１ Ｔ４ Ｒｎｌ１、Ｔ４ Ｒｎｌ２、Ｔ４ Ｒｎｌ２ｔｒ、Ｔ４ Ｒｎｌ２ Ｋ２２７Ｑ、Ｍｔｈ Ｒｎｌ、および分子内ライゲーションを触媒するＡＴＰ非依存性リガーゼ（例えばｃｉｒｃｌｉｇａｓｅ（商標）、ｃｉｒｃｌｉｇａｓｅＩＩ（商標））から選択される。

【0036】

一実施態様では、エキソリボヌクレアーゼはＲＮａｓｅＲである。

【0037】

一実施態様では、キットは、（ａ）リン酸化酵素、および／または（ｂ）エンドリボヌクレアーゼ、リボザイム、または、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、Ｙ ＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ（正センスＲＮＡウイルス、負センスＲＮＡウイルス、逆転写ウイルス由来、およびウイルスによって生産される他のＲＮＡ種）もしくはｒＲＮＡを切断することが可能な毒素をさらに含む。好ましくは、キットは、エンドリボヌクレアーゼをさらに含み、ここでエンドリボヌクレアーゼはＲＮＡｓｅＩである。

【0038】

１つまたは複数の実施態様では、ランダムＲＮＡリンカーは、５０～５００ヌクレオチドの間に含まれる長さを有する。

【0039】

１つまたは複数の実施態様では、ランダムＲＮＡリンカーは、－３～－１５０ｋｃａｌ／ｍｏｌの間に含まれる最小自由エネルギーを有する。好ましくは、各ランダムＲＮＡリンカーは、好ましくは、－６ｋｃａｌ／ｍｏｌ～－２４ｋｃａｌ／ｍｏｌの間に含まれる最小自由エネルギーを有し、目立った二次構造がないように設計される。いくつかの二次構造は配列の内側部分において許容されるが、５’／３’末端では許容されない。最小自由エネルギーは、当業者が利用可能なソフトウェアを用いて計算することができる。

【0040】

１つまたは複数の実施態様では、ランダムＲＮＡリンカーは、配列番号３に記載のヌクレオチド配列を有する。

【0041】

ランダムＲＮＡリンカーは、当該分野の専門家の共通の一般知識に従って、化学合成することができ、またはインビトロで転写および精製することができる。

【0042】

ランダムリンカーの５’－ＯＨ基は、化学的または酵素的に生産することができる。酵素的に生産される場合は、５’－ＯＨは、（ｉ）シス（インビトロで転写される配列によってコードされる）またはトランス（インビトロで転写される配列に対して作用する）で作用するリボザイム、ｉｉ）５’－ＯＨ基を放出する酵素、例えば子牛の腸ホスファターゼ、または（ｉｉｉ）コリシンＤおよびコリシンＥ５、α－サルシン、ジモシン、Ｐｉｃｈｉａ ａｃａｃｉａｅキラー毒素（ＰａＴ）、ＭａｚＦ、ＣｈｐＢＫ、ｐｒｒＣから選択される毒素の触媒活性によって得ることができる。

【0043】

ランダムＲＮＡリンカーは、以下の改変の少なくとも１つによって改変された少なくとも１個、好ましくは１～１０９個のヌクレオチドを含むことができる：ＬＮＡ、ＰＮＡ、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン（２－アミノ－ｄＡ）、６ｍＡ、５－ブロモｄＵ、逆位（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ）ｄＴ、５－メチルｄＣ、８－アザ－７－デアザグアノシン、５－ヒドロキシブチニル－２’－デオキシウリジン、５－ニトロインドール、２’－Ｏ－メチルＡ、２’－Ｏ－メチルＧ、２’－Ｏ－メチルＣ、２’－Ｏ－メチルＵ、２’フッ素Ａ、２’フッ素Ｃ、２’フッ素Ｇ、２’フッ素Ｕ、２－メトキシエトキシＡ、２－メトキシエトキシＭｅＣ、２－メトキシエトキシＧ、２－メトキシエトキシＴ、５－ブロモｄＵ、２－アミノプリン、逆位ｄＴ、２，６－ジアミノプリン、デオキシウリジン、逆位ジデオキシ－Ｔ、５－メチルｄＣ、ジデオキシ－Ｃ、デオキシイノシン（ｄｅｏｘｙｌｎｏｓｉｎｅ）、以下を含むユニバーサル塩基：５－ニトロインドール、モルホリノ、２’－０－メチルＲＡ塩基、イソｄＣ、イソ－ｄＧ、リボヌクレオチド、トレオースヌクレオチド類似体、タンパク質ヌクレオチド類似体、グリコイック（ｇｌｙｃｏｉｃ）ヌクレオチド類似体、ロックド（ｌｏｃｋｅｄ）ヌクレオチド類似体、鎖終結（ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ）ヌクレオチド類似体、ジヒドロウリジン、チオウリジン、プソイドウリジン、キューオシン、およびワイオシンリン酸化リボヌクレオチド、改変された糖、非天然の結合、脱塩基部位、ジデオキシ基、５－メチル基、または以下から選択されるスペーサー：炭素スペーサー（ＲＮＡ５’－０－（ＣＨ_２）_３－ＰＯ_４－３’ＲＮＡ）、光切断可能スペーサー、ＲＮＡ５’Ｏ－トリエチレングリコール－ＰＯ_４－３’ＲＮＡ、１８原子ヘキサエチレングリコールおよび１’，２’－ジデオキシリボース。好ましくは、ランダムＲＮＡリンカーは、５’末端から最初の２５塩基内および３’末端から最後の２５塩基内に、１～２５個の改変ヌクレオチドを含む。

【0044】

本発明者らは、３’－Ｐシグネチャを有する短いＲＮＡ分子のナノポアシーケンシングのためのライブラリー調製方法を開発し、リボソーム－プロファイリング（Ｒｉｂｏ－ｓｅｑ）の設定において確証された。特に、ＣｉｒｃＡＩＤ－ｐ－ｓｅｑは、低含量の短いＲＮＡ分子の検出を可能にする非常に高感度なＲＴ－ＲＣＡに基づく方法であり、したがって、単一細胞の技術に潜在的に適用可能である。

【0045】

この方法は、標準的なプロトコル^３に現在のところ必要とされる１週間よりも長くかかるＲｉｂｏ－ｓｅｑライブラリー調製に必要な時間を非常に短縮させることができ、技術的ステップ（脱リン酸化、ゲル抽出、精製）を著しく減少させ、したがって、バイアスの導入の可能性を下げる。本方法は、３’－Ｐ／ｃＰ末端を放出する酵素的切断を用いる任意のＲＮＡフットプリント研究を可能にする。さらに、癌および神経変性、自己免疫性および感染性障害、ならびに、３’－Ｐ／ｃＰ末端化ＲＮＡ分子が関与すると報告されている複数の細胞機能に関する研究は、本方法によって特に有利である。特に、この方法は、特定の酵素、リボザイムまたは毒素のヌクレオチド鎖切断活性の特性化に適切であり^２７、ＲＮＡ編集ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ^２８システムを含む。最後に、本明細書中に開示される方法は、資源が制限された状況でさえ、高価な実験装置を必要とすることなく迅速なシーケンシングのパイプラインを可能にする。

【実施例】

【0046】

結果
細胞ＲＮＡは、ヒドロキシル基（－ＯＨ）、リン酸基（－Ｐ）、または２’，３’－環状リン酸基（－ｃＰ）をその末端に有し得る。多くのエンドリボヌクレアーゼによるＲＮＡ切断はしばしば、３’－Ｐまたは３’－ｃＰ末端を放出し、それらはＡＴＰ依存性リガーゼ（例えばＴ４ ＲＮＡリガーゼ）にとって適合性の基質ではない。ＲＮＡ鎖を切断するためのエンドリボヌクレアーゼおよびその後のライゲーションイベントの使用を含む方法論的に関連のある状況は、ＲＮＡフットプリントのためのＲｉｂｏ－ｓｅｑによって代表され、それは、以下のステップ：（ｉ）細胞溶解、（ｉｉ）ｓｓＲＮＡのエンドヌクレアーゼ（例えばＲＮａｓｅＩ）消化、（ｉｉｉ）２５～３５ｎｔ長フラグメント（真正（ｂｏｎａ ｆｉｄｅ）ＲＰＦ）の回収、（ｉｖ）ライブラリー調製、（ｖ）ディープシーケンシング、および（ｖｉ）参照タンパク質をコードするトランスクリプトームに対する最終的なアライメントに基づく。

【0047】

ＲＮａｓｅＩ切断によって生じるフラグメントの全集団の中から実際のＲＰＦの画分を明らかにするために、本発明者らは３’ポリアデニル化処理を利用した。結果は、培養細胞（ＭＣＦ７）から得られた２５～３５ｎｔ長フラグメントの約５０％がポリアデニル化反応において反応したことを示す（図１Ａ）。このことは、サイズ選択されたＲＰＦに、３’－ＯＨ末端を有するＲＮＡ種（標準的なライゲーションプロセスによって捕捉され得て、より高いバックグラウンドノイズを生じる）が混入していることを示す。

【0048】

現在利用可能なＲｉｂｏ－ｓｅｑライブラリー調製ストラテジーの制約を克服するために、本発明者らは、（ｉ）３’－Ｐ／ｃＰシグネチャの保存および（ｉｉ）ＰＣＲ増幅ステップ非依存性を可能にする方法の開発を試みた。そのような目標を成し遂げるために、発明者らは、（ｉ）５’－ＯＨを３’－Ｐ／ｃＰ末端にライゲーションすることが可能な酵素（ＲｔｃＢリガーゼ）^{２９，３０}、および（ｉｉ）ＰＣＲを用いないナノポアシーケンシングに適切なリンカーを用いた。特に、本発明者らは、ダイレクトｃＤＮＡナノポアシーケンシングに注力した方法を設計した。この方法の実施可能性の概念の証拠を提供するために、本発明者らは最初に、５’末端および３’末端の両方に－Ｐ基を有する３０ｎｔ長の合成ＲＮＡフラグメント（５’Ｐ－ＧＦＰ－３’Ｐ）を、細胞由来および５’リン酸化ＲＰＦの代用として用いた。ＧＦＰフラグメントは、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有する。

【0049】

ｃｉｒＡＩＤ－ｐ－Ｓｅｑ手法において（図１Ｂ）、本発明者らは最初に、ランダムＲＮＡリンカーの５’－ＯＨ末端を５’Ｐ－ＧＦＰ－３’Ｐフラグメントの３’－Ｐ末端に、ＲｔｃＢリガーゼを用いてライゲーションした。それから、ライゲーション産物をＴＢＥ－尿素ＰＡＧＥによって分離し、サイズ選択し、その後の反応のためにゲル精製した（図１Ｃ）。次に、本発明者らは、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼＩを用いて５’Ｐ－ＧＦＰ－リンカーＲ－３’ＯＨ産物を環状化させた。環状ＲＮＡ構造の存在を確認するために、ＲＮａｓｅＲ（環状ＲＮＡを保存する代わりに全ての線状ＲＮＡを消化するエキソリボヌクレアーゼ）を用いて環状化産物を処理した。ＲＮＡｓｅＲ反応のＴＢＥ－尿素ＰＡＧＥ分離後（図１Ｃ）、予期される分子量において環状化産物（ｃｉｒｃＧＦＰ－リンカーＲ）が検出され、したがって、構築物の安定性および正しい環状化が確認された。それから、ｃｉｒｃＧＦＰ－リンカーＲ産物をゲル精製して、逆転写ローリング・サーキュラー増幅（ＲＴ－ＲＣＡ）^{３１，３２}に供して、多コピーの挿入フラグメントを有する長い多量体一本鎖ｃＤＮＡ分子（１４０～１５０００ｎｔ）を得た。シーケンシング前の最終チェックポイントとして、ＲＴ－ＲＣＡ産物をＴＢＥ－尿素ＰＡＧＥによって分離して、それにより、予期されるサイズ範囲内の多量体ｃＤＮＡ産物の存在を確認した（図１Ｃ）。

【0050】

本方法は、３’－Ｐ／ｃＰ－付与（ｅｎｄｏｗｅｄ）ＲＮＡフラグメントの富化を可能にする。なぜならば、このシグネチャは、プロトコル全体の効率に必須だからである。この手法は、下流のＰＣＲを用いないダイレクトｃＤＮＡナノポアシーケンシングと適合し、バーコード化リンカーと組み合わせた場合、多重アッセイを可能にする。

【0051】

本開示のライブラリー調製方法の目的は、３’－Ｐ／ｃＰ末端化ＲＮＡフラグメントの選択的取り込みのための最初のＰＣＲを用いないプロトコルを代表し、ナノポアシーケンシングに適切である。

【0052】

短い３’－Ｐ末端化ＲＮＡフラグメントのナノポアシーケンシング
上述のＧＦＰに基づくライブラリーの両方を、Ｒ９．４フローセルおよび１ＤケミストリをダイレクトｃＤＮＡシーケンシングに用いることによって、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＯＮＴ）のＭｉｎＩＯＮでシーケンシングした。

【0053】

本発明者らは、第２の（相補）ｃＤＮＡ鎖の合成を行ない、その後に末端修復およびｄＡテール化を行なって、ＯＮＴプロトコルをｃＤＮＡシーケンシングに適合させた。６０ｎｇのライブラリーインプットのシーケンシングから、本発明者らは、２時間で約１５０万の「合格（ｐａｓｓｅｄ）」リードを得て（ＭｉｎＫＮＯＷＮベースコール）、平均ベースコール品質スコアは１０．５であり、失敗したリードは５％未満であった。

【0054】

リードの長さ分布は約３００ｎｔに主要ピークを示し、リードの約１０％は１ＫＢから５０ＫＢ超までのより一層広い分布にわたっていた（図２Ａ）。このことは、ＲＴ－ＲＣＡ反応が２～３ラウンドの逆転写で最大効率を示すが、元のテンプレートの最大で５００コピーまでを産生することができることを示す。参照ＧＦＰ配列に対する「合格」リードのＢＬＡＳＴｎアライメント後、リードの１００％が少なくとも１つの３０マーＧＦＰフラグメントを有するようであった。サンプリングされた２．５ＫＢのリード内で繰り返される１７個のＧＦＰフラグメントの代表的なアライメントは、コンセンサス配列を計算的に生成するためのリピートの重要性を強調しており、その精度（元の配列に対する同一性％）はリピート回数に比例し（図２Ｂ）、リピート回数はＲＴ－ＲＣＡ反応の効率に依存する。

【0055】

概して、これらの結果は、ライブラリー調製方法が、（ｉ）３’－Ｐシグネチャを有する内因性切断ＲＮＡに似ている短い合成ＲＮＡ分子を組み込むことができること、および（ｉｉ）ＯＮＴシーケンシングプラットフォームに効果的に適用可能であることの証拠を提供する。

【0056】

ｃｉｒｃＡＩＤ－ｐ－ｓｅｑは、ＲＮａｓｅＩ消化後にリボソームフットプリントの検出を可能にする
ｃｉｒｃＡＩＤ－ｐ－Ｓｅｑは、高いシーケンシング深度（リボソームプロファイリング実験に必要である）を提供し、合成３０マーＧＦＰフラグメントによるＯＮＴプラットフォームに対するこの方法の適用性が示されたので、本発明者らは、ＧＦＰがトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞からのリボソームフットプリントが本方法によって特定可能であるかどうかを調べようとした。

【0057】

本発明者らは、ＧＦＰ過剰発現プラスミドで一時的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔは、（ｉ）十分に規定されたオープンリーディングフレームを有するオルトゴナル参照配列のおかげでＲＰＦの迅速な同定を確実にし、（ｉｉ）ＧＦＰ ｍＲＮＡ上に高いフットプリント密度で大量の組み換えタンパク質を生産し得るという利点を有すると推論した。ＧＦＰタンパク質は、トランスフェクションから２４時間後に高レベルで発現されるようであった（図３Ａ）。細胞質細胞溶解物をＲＮａｓｅＩで処理して、リボソームによって保護されていない全てのＲＮＡ鎖を消化して３’－Ｐを有するＲＰＦを産生し、それをＩｎｇｏｌｉａら^３３に従って精製した。合計４５０ｎｇの精製されたＲＮＡをライブラリー調製のためのインプットとして使用し、生じたｃＤＮＡライブラリーをＭｉｎＩＯＮで６時間シーケンシングした。アウトプットは、品質スコアが約１０の配列を生産し、失敗したリードは１０％未満であった。ＭｉｎＫＮＯＷＮベースコールされたリードの、参照ＧＦＰ ｍＲＮＡに対するＢＬＡＳＴｎアライメントは、繰り返しＧＦＰ ｍＲＮＡフラグメントの検出を可能にした。ＧＦＰフラグメントの長さ分布は１８～６０ｎｔの間の範囲であり、リードの蓄積は約２５および３１ｎｔであり（図３Ｂ）、標準的なＲＰＦ長さ分布^３４から予想されるとおりであった。全てのＧＦＰフラグメントはコード配列にマッピングされ、３’および５’ＵＴＲのカバレッジは無く（図３Ｃ）、これらのＧＦＰフラグメントは、真正（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ）ＲＰＦであり、非リボソームのリボ核タンパク質複合体に由来するフットプリントではないことが示唆された^３５。

【0058】

さらに、本発明者らは、生じたコンセンサス配列が、２リピートによって優れた精度（９６．５％）を達成し、３リピートによって１００％コンセンサス精度が得られることを観察した。この結果は、本発明者らのライブラリー調製のストラテジーが、少なくとも３リピートを含むリード内に含まれるＲＮＡフラグメントの正しい同定を可能にすることを示す（表１；図４）。

【0059】

【0060】

これらの結果は、ＣｉｒｃＡＩＤ－ｐ－Ｓｅｑが、ＯＮＴプラットフォームに適切なリボソームプロファイリングライブラリーを生産することをさらに確認し、このプロトコル（ＣｉｒｃＡＩＤ－ｐ－Ｓｅｑ）が、転写産物に沿った実際のリボソームフットプリントの特異的な検出を可能にするという証拠を提供する。

【0061】

材料および方法
リボソームで保護されたフラグメントおよびリンカー
カスタムリンカー（配列番号３に記載のヌクレオチド配列を有する）を、ＩＭＭＡＧＩＮＡ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｓ．ｒ．ｌ（Ｔｒｅｎｔｏ）によって合成した。両末端に－ＯＨ基を有する１０９マーのオリゴヌクレオチドからなる。

【0062】

５’－Ｐおよび３’－Ｐを有する、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有する３０マーのオリゴヌクレオチドからなるリボソームで保護されたフラグメント（ＲＰＦ）を、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ）によって合成し、またはインビトロで生産した。

【0063】

インビトロで生産されるＲＰＦは、ＧＦＰ（ｐＭＡＸ＿ＧＦＰ（商標）、Ｌｏｎｚａカタログ番号Ｖ４ＸＰ－３０２４－配列番号２）をコードするプラスミドでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ（ヒト胚腎臓）細胞（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号１２０２２００１）から取得した。細胞を２４時間後に蛍光顕微鏡（Ｏｌｉｍｐｕｓ ＤＰ７０）によってＧＦＰ発現について監視した。トランスフェクトされた細胞を、ＣＨＸ（１０ｕｇ／ｍＬ、ＳＩＧＭＡカタログ番号０１８１０）で５分間３７℃にて処理して溶解させた。０．３ ＡＵ ２６０ｎｍのＣＨＸ処理した細胞溶解物をＷ－バッファー（Ｉｍｍａｇｉｎａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙカタログ番号＃ＲＬ００１－４）中の２．２５ＵのＲＮＡｓｅＩ（Ａｍｂｉｏｎ、カタログ番号ＡＭ２２９５）で室温にて４５分間処理することによってＲＰＦを生産した（Ｃｌａｍｅｒら、２０１８^３６に記載のとおり）。

【0064】

１０ＵのＳｕｐｅｒａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＡＭ２６９６）を１０分間、氷上で添加することによってＲＮＡｓｅＩ消化を止めた。消化後、溶解物を精製し（Ｉｎｇｏｌｉａら、２００９^３３に記載のとおり）、１％ＳＤＳ（Ｓｉｇｍａカタログ番号０５０３０）および０．１ｍｇプロテイナーゼＫ（Ｅｕｒｏｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＥＭＲ０２２００１）を用いて３７℃で７５分間処理した。全ＲＮＡを、酸－フェノール：クロロホルム、ｐｈ４．５（Ａｍｂｉｏｎ、カタログ番号ＡＭ９７２２）によって抽出した。ＲＮＡをイソプロパノールで沈殿させ、風乾し、１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）中に再懸濁して、１５％ＴＢＥ－尿素ポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＥＣ６８８５ＢＯＸ）上で分析した。３０マーＲＰＦをサイズ選択し、ゲルから抽出した（Ｒｉｂｏｌａｃｅプロトコル、Ｉｍｍａｇｉｎａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙに従った）（Ｃｌａｍｅｒら、２０１８）^３６。

【0065】

インビトロで生産されたＲＰＦフラグメントを精製の際に、リンカーＲによる捕捉の前にＴ４ ＰＮＫ ３’ｍｉｎｕｓ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ０２３６Ｓ）を用いて５’リン酸化に供した。

【0066】

ＲＰＦフラグメント－リンカーライゲーション
５’および３’末端の両方がリン酸化されたＲＰＦフラグメントを用いて、以下の反応条件：９０ｐｍｏｌのＲＰＦ、３０ｐｍｏｌのリンカーＲ、４５ｐｍｏｌ ＲｔｃＢリガーゼ、バッファーＲｔｃＢリガーゼ１Ｘ、１００μＭ ＧＴＰ、１ｍＭ ＭｎＣｌ_２（最終容量３０μＬ）に従って、ＲｔｃＢリガーゼ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ０４５８Ｓ）によってリンカーＲ、（Ｉｍｍａｇｉｎａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号＃ＲＬＰ００１－１）とライゲーションした。反応物を３７℃で２時間インキュベートし、それから、混合物を１５％アクリルアミド／８Ｍ尿素プレキャストゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＥＣ６８８５ＢＯＸ）中にローディングして、反応の効率を制御するために、目的産物（１４０ｎｔ長）をゲル抽出により精製した。ゲル精製ステップは、ワークフロー全体の利用にとって本質的ではない。

【0067】

環状化およびＲＮａｓｅＲ処理
ＲｔｃＢライゲーション産物の環状化を、１０ＵのＴ４ ＲＮＡリガーゼ１（ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ０２０４Ｌ）、１×バッファーＴ４ ＲＮＡリガーゼ、２０％ＰＥＧ８０００、５０μＭ ＡＴＰを含む合計容量２０μＬで、２５℃にて２時間行なった。環状化反応をその後、全ての望ましくない産物（すなわち線状ＲＮＡまたは混入産物）を除去するために、２０ＵのＲＮａｓｅＲ（Ｌｕｃｉｇｅｎ、カタログ番号ＲＮＲ０７２５０）とともに３７℃で１時間インキュベートした。環状ＲＮＡ産物を１５％アクリルアミド／８Ｍ尿素プレキャストゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＥＣ６８８５ＢＯＸ）上にローディングし、反応の効率を制御するためにゲル抽出により精製した。ゲル精製ステップは、ワークフロー全体の利用にとって本質的ではない。

【0068】

逆転写－ローリング・サークル増幅（ＲＴ－ＲＣＡ）および第２の鎖の合成
ＲＴ－ＲＣＡを、以下：５０ｎｇの環状ＲＮＡ、２００Ｕの逆転写酵素、１×バッファーＲＴ、０．５ｍＭ ｄＮＴＰ、５０ｐｍｏｌ ＲＴ－ＲＣＡ Ｒｅｖプライマー（配列番号５に示すヌクレオチド配列を有する）、１０％グリセロールの条件下で、２０μＬ中、リンカーの３’領域にアニーリングするプライマーとＭａｘｉｍａ Ｈ Ｍｉｎｕｓ逆転写酵素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号ＥＰ０７５２）を用いて行なった。反応を４２℃で４時間行ない、それから、７０℃で１０分間止めた。ｃＤＮＡ合成後、０．１Ｎ ＮａＯＨを７０℃で１０分間添加することによって環状ＲＮＡテンプレートを加水分解した。

【0069】

一本鎖ｃＤＮＡ分子から第２の鎖を産生するために、１サイクルのＰＣＲを、Ｓｕｐｅｒ ＡＢ Ｔａｑポリメラーゼ（ＡＢ Ａｎａｌｉｔｉｃａカタログ番号０６－３６－０２０）によって、リンカーの５’領域にアニーリングするＲＴ－ＲＣＡ Ｆｗプライマー（配列番号４に示されるヌクレオチド配列を有する）を用いて行なった。反応は、ＲＴ反応由来の２０ｕｌ、１×バッファー、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１．２５Ｕ Ｔａｑポリメラーゼ、５０ｐｍｏｌ ＲＴ－ＲＣＡ Ｆｗプライマー（合計容量５０ｕｌ）を含んでおり、以下のプログラム：９５℃の最初の変性、９５℃３０秒、５１℃３０秒および７０℃２分の１サイクルに供した。二本鎖ｃＤＮＡを、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ、カタログ番号Ａ６３８８１）を製造元の説明に従って用いて精製した。

【0070】

ライブラリー調製およびナノポアシーケンシング
精製ｃＤＮＡを、ナノポアシーケンシングのために調製した。手短には、ＮＥＢＮｅｘｔ Ｅｎｄ修復／ｄＡテール化モジュール（ＮＥＢ、カタログ番号Ｅ７５４６Ｓ）を製造元の説明に従って用いて、ｃＤＮＡを末端修復およびｄＡテール化反応に供し、２０℃で５分、６５℃で５分インキュベートした。反応混合物を、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ）を用いて精製した。ＯＮＴアダプターミックスをダイレクトｃＤＮＡシーケンシングキットのプロトコル（ＳＱＫ－ＤＣＳ１０９、ＯＮＴ）に従って添加し、それから、Ｒ９．４フローセルにローディングし、ＭｉｎＩＯＮシーケンサーを用いてシーケンシングした。

【0071】

データ分析
ダイレクトｃＤＮＡシーケンシングに関する生物情報学分析において、参照配列に対する全てのアライメントを、ＢＬＡＳＴ－ｎまたはＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行なった。コンセンサス配列の生成のために、Ｍｅｓｑｕｉｔｅソフトウェアを用いて単一ＧＦＰリピートを並べて、ＷｅｂＬｏｇｏオンラインツールを最終的なコンセンサス配列の生成のために用いた。

【0072】

ｃｉｒｃＡＩＤ－ｐ－ｓｅｑ方法の概要説明
ステップ１．ＲＰＦリン酸化。
選択および精製の際に、３’Ｐまたは３’ｃＰを有するＲＰＦを、表２に示されるプロトコルに従ってＴ４ ＰＮＫ ３’Ｍｉｎｕｓによって５’リン酸化に供する。

【0073】

【0074】

反応物を３７℃で１時間インキュベートし、それから、Ｚｙｍｏカラム精製キットを通して精製する。

【0075】

ステップ２．ＲｔｃＢライゲーション。
５’および３’末端の両方がリン酸化された、ステップ１によるＲＰＦを、ＲｔｃＢリガーゼによって１０９ｎｔリンカーＲＮＡ分子（リンカーＲ）にライゲーションする。ＲｔｃＢリガーゼは、リンカーＲの５’ＯＨ末端をＲＰＦの３’Ｐ／３’ｃＰ末端に、表３に示されるプロトコルに従って結合させる。

【0076】

【0077】

３７℃で２時間インキュベートする。

【0078】

反応物を１５％Ｔｒｉｓ－ホウ酸－ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）－尿素アクリルアミドゲル上にローディングし、ライゲーション産物をサイズ選択し、ゲル抽出して、イソプロパノール中に沈殿させ、最後に８μＬの水中に再懸濁する。精製産物（ＲＰＦ－リンカーＲ）は約１４０ｎｔ長であり、５’Ｐおよび３’ＯＨ末端を有する。そのようなステップは本明細書中に開示される方法の実施にとって本質的でない。

【0079】

ステップ３．環状化５’Ｐ－ＲＰＦ－リンカーＲ－３’ＯＨ産物
５’Ｐ－ＲＰＦ－リンカーＲ－３’ＯＨ産物を、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１による５’Ｐ末端および３’ＯＨ末端のライゲーションによって環状化に供する。反応条件を表４に示す。

【0080】

【0081】

インキュベーション：２５℃で２時間。

【0082】

ステップ４．ＲＮａｓｅＲ
反応条件を表５に提供する。

【0083】

【0084】

３７℃で１時間インキュベートする。

【0085】

反応物を１５％Ｔｒｉｓ－ホウ酸－ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）－尿素アクリルアミドゲル上にローディングし、環状ＲＮＡ分子をゲル抽出する（ゲル抽出は本明細書中に開示される方法の実施にとって本質的なステップでない）。イソプロパノール沈殿後、環状ＲＮＡを８μＬ中に再懸濁して定量化する（ＱｕＢｉｔ定量化）。

【0086】

ステップ５．逆転写－ローリング・サークル増幅（ＲＴ－ＲＣＡ）。
多量体一本鎖ｃＤＮＡの生成のために、試薬を表６に示される量で混合する。

【0087】

【0088】

環状ＲＮＡプライマーミックスを６５℃で５分間加熱し、それから、少なくとも１分間氷上でインキュベートする。アニールしたＲＮＡに試薬を表７に示した量で添加する。

【0089】

【0090】

４２℃で４時間インキュベートし、それから０．１Ｎ ＮａＯＨを添加して、混合物を７０℃で２０分間加熱する。最後に、１５６μＬのヌクレアーゼフリーの水、２０μＬ酢酸ナトリウム（３Ｍ）、３００μＬイソプロパノールおよび２μＬのＧｌｙｃｏｂｌｕｅを添加して反応物を沈殿させる。沈殿後、２０μＬのヌクレアーゼフリーの水中に再懸濁する。

【0091】

ステップ６．第２の鎖の合成。
一本鎖ｃＤＮＡ分子（ステップ５で生産される）から第２の鎖を産生するために、１サイクルのＰＣＲを表８および表９に提供される反応条件下で行なう。

【0092】

【0093】

【0094】

４５μＬのＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（ａｇｅｎｃｏｕｒｔ）を添加することによって反応物を精製する。最終産物を合計容量２５μＬのヌクレアーゼフリーの水中に溶出する。

【0095】

ステップ７．ＯＮＴライブラリー調製。
精製した二本鎖ｃＤＮＡ（ステップ６参照）を、ダイレクト－ｃＤＮＡシーケンシングキット（ＳＱＫ－ＤＣＳ１０９）のプロトコルに従って、「Ｅｎｄ Ｐｒｅｐ Ｓｔｅｐ」から始めて、ＯＮＴライブラリー調製に用いる。

【0096】

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4】

【図5】

【配列表】

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【国際調査報告】