▶ ミガル ガリラヤ リサーチ インスティテュート リミテッドの特許一覧
特表2022-547967ＣＤ４０細胞質ドメインを含むキメラ抗原レセプター及びその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-11-16
(54)【発明の名称】ＣＤ４０細胞質ドメインを含むキメラ抗原レセプター及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20221109BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20221109BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20221109BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z ZNA
C12N15/63 Z
C12N5/10
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022515811
(86)(22)【出願日】2020-09-10
(85)【翻訳文提出日】2022-04-11
(86)【国際出願番号】 IL2020050991
(87)【国際公開番号】W WO2021048850
(87)【国際公開日】2021-03-18
(31)【優先権主張番号】62/898,704
(32)【優先日】2019-09-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521550714
【氏名又は名称】ミガル ガリラヤ リサーチ インスティテュート リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000729
【氏名又は名称】特許業務法人 ユニアス国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】グロス、ギデオン
(72)【発明者】
【氏名】ワインスタイン－マロム、ハダス
(72)【発明者】
【氏名】レビン－ピアエダ、オフィル
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
(57)【要約】
ＣＤ４０に由来する少なくとも１つのシグナル伝達エレメントを含む活性化キメラ抗原レセプター（ａＣＡＲ）をコードする核酸分子が提供される。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ｉ）細胞外結合ドメイン；（ｉｉ）膜貫通ドメイン；
（ｉｉｉ）細胞内ドメイン；及び
（ｉｖ）前記細胞外結合ドメインと前記膜貫通ドメインとを連結する可動性ヒンジドメインであって、前記可動性ヒンジドメインは、システイン架橋を形成できるシステイン残基を含む、可動性ヒンジドメイン
を含む活性化キメラ抗原レセプター（ａＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、
ここで、前記細胞内ドメインは、
（ａ）ＣＤ４０に由来する少なくとも１つのシグナル伝達エレメントを含む第１のアミノ酸配列、及びＦｃＲガンマ（γ）鎖、ＣＤ３ゼータ（ζ）鎖又はＣＤ３エータ（η）鎖に由来する少なくとも１つのシグナル伝達エレメントを含む第２のアミノ酸配列を含み、ＭｙＤ８８ポリペプチド、２Ａ自己切断ペプチド又は二量体化ドメインを欠く、細胞内ドメイン；
（ｂ）ＣＤ４０に由来する少なくとも１つのシグナル伝達エレメントを含む第１のアミノ酸配列、及びＣＤ２８又は４－１ＢＢに由来する少なくとも１つのシグナル伝達エレメントを含む第３のアミノ酸配列を含む、細胞内ドメイン；及び
（ｃ）ＣＤ４０に由来する少なくとも１つのシグナル伝達エレメントを含む第１のアミノ酸配列、ＦｃＲガンマ（γ）鎖、ＣＤ３ゼータ（ζ）鎖又はＣＤ３エータ（η）鎖に由来する少なくとも１つのシグナル伝達エレメントを含む第２のアミノ酸配列、及びＣＤ２８に由来する少なくとも１つのシグナル伝達エレメントを含む第３のアミノ酸配列を含む、細胞内ドメイン；及び
（ｄ）ＣＤ４０に由来する少なくとも１つのシグナル伝達エレメントを含む第１のアミノ酸配列を含み、ＭｙＤ８８ポリペプチド又は二量体化ドメインを欠く、細胞内ドメイン
から選択される、核酸分子。
【請求項2】
前記細胞外結合ドメインが、（ｉ）抗体、その誘導体又はフラグメント、例えば、ヒト化抗体；ヒト抗体；抗体の機能的フラグメント；単一ドメイン抗体、例えば、ナノボディ；組換え抗体；及び一本鎖可変フラグメント（ＳｃＦｖ）；（ｉｉ）抗体模倣物、例えば、アフィボディ分子；アフィリン；アフィマー；アフィチン；アルファボディ；アンチカリン；アビマー；ＤＡＲＰｉｎ；フィノマー；Ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド；及びモノボディ；又は（ｉｉｉ）アプタマーを含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項3】
前記細胞外結合ドメインが、ＳｃＦｖを含む、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項4】
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ３－ζ、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ９及びＦｃレセプターの膜貫通ドメインから選択される、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項5】
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ２８の膜貫通ドメインである、請求項４に記載の核酸分子。
【請求項6】
前記第１のアミノ酸配列が、ＣＤ４０の完全な細胞内ドメインである、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項7】
前記第２のアミノ酸配列の前記少なくとも１つのシグナル伝達エレメントが、ＦｃＲγ鎖に由来する、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項8】
前記第２のアミノ酸配列が、ＦｃＲγ鎖の完全な細胞内ドメインである、請求項７に記載の核酸分子。
【請求項9】
前記第３のアミノ酸配列が、ＣＤ２８の完全な細胞内ドメインである、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項10】
前記可動性ヒンジが、ＣＤ８α、ＣＤ８βのヒンジ領域、ＩｇＧの重鎖のヒンジ領域及びＩｇＤの重鎖のヒンジ領域から選択されるポリペプチドを含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項11】
前記可動性ヒンジドメインが、ＣＤ８αのヒンジドメインである、請求項１０に記載の核酸分子。
【請求項12】
前記細胞外結合ドメインが、（ｉ）抗体、その誘導体又はフラグメント、例えば、ヒト化抗体；ヒト抗体；抗体の機能的フラグメント；単一ドメイン抗体、例えば、ナノボディ；組換え抗体；及び一本鎖可変フラグメント（ＳｃＦｖ）；（ｉｉ）抗体模倣物、例えば、アフィボディ分子；アフィリン；アフィマー；アフィチン；アルファボディ；アンチカリン；アビマー；ＤＡＲＰｉｎ；フィノマー；Ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド；及びモノボディ；又は（ｉｉｉ）アプタマーを含み；前記膜貫通ドメインが、ＣＤ２８、ＣＤ３－ζ、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ９及びＦｃレセプターの膜貫通ドメインから選択され；前記第１のアミノ酸配列が、ＣＤ４０の完全な細胞内ドメインであり；前記第２のアミノ酸配列の前記少なくとも１つのシグナル伝達エレメントが、ＦｃＲγ鎖に由来し；前記第３のアミノ酸配列が、ＣＤ２８の完全な細胞内ドメインであり；前記可動性ヒンジが、ＣＤ８α、ＣＤ８βのヒンジ領域、ＩｇＧの重鎖のヒンジ領域及びＩｇＤの重鎖のヒンジ領域から選択されるポリペプチドを含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項13】
前記細胞外結合ドメインが、ＳｃＦｖを含み；前記膜貫通ドメインが、ＣＤ２８の膜貫通ドメインであり；前記第２のアミノ酸配列が、ＦｃＲγ鎖の完全な細胞内ドメインであり；前記可動性ヒンジドメインが、ＣＤ８αの可動性ヒンジドメインである、請求項１２に記載の核酸分子。
【請求項14】
前記細胞内ドメインが、ＣＤ４０－ＦｃＲγの完全な細胞内ドメインのタンデム配置を含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項15】
前記ａＣＡＲが、ＳｃＦｖ－ＣＤ８αのヒンジ領域－ＣＤ２８膜貫通ドメイン－ＣＤ４０－ＦｃＲγの完全な細胞内ドメインのタンデム配置から本質的になる細胞内ドメインのタンデム配置を含む、請求項１４に記載の核酸分子。
【請求項16】
前記細胞内ドメインが、ＣＤ２８－ＣＤ４０－ＦｃＲγの完全な細胞内ドメインのタンデム配置を含み、前記ＣＤ２８の細胞内ドメインは、任意選択で、リンカーを介してＣＤ４０の細胞内ドメインに連結される、請求項１～１３のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項17】
前記細胞内ドメインが、ＣＤ２８－リンカー－ＣＤ４０－ＦｃＲγの完全な細胞内ドメインのタンデム配置を含む、請求項１６に記載の核酸分子。
【請求項18】
前記ａＣＡＲが、ＳｃＦｖ－ＣＤ８αのヒンジ領域－ＣＤ２８膜貫通ドメイン－ＣＤ２８の完全な細胞内ドメインのタンデム配置から本質的になる細胞内ドメイン－ＣＤ４０－ＦｃＲγのタンデム配置を含み、前記ＣＤ２８の細胞内ドメインは、任意選択で、リンカーを介してＣＤ４０の細胞内ドメインに連結される、請求項１６又は１７に記載の核酸分子。
【請求項19】
請求項１～１８のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、組成物。
【請求項20】
請求項１～１８のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項21】
請求項１～１８のいずれか１項に記載の核酸分子又は請求項２０に記載のＤＮＡベクターを含む、哺乳動物Ｔ細胞。
【請求項22】
ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞又は制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である、請求項２１に記載の哺乳動物Ｔ細胞。
【請求項23】
ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞である、請求項２１に記載の哺乳動物Ｔ細胞。
【請求項24】
表面上に前記ａＣＡＲを発現している、請求項２１～２３のいずれか１項に記載の哺乳動物Ｔ細胞。
【請求項25】
ヒトＴ細胞である、請求項２１～２４のいずれか１項に記載の哺乳動物Ｔｒｅｇ。
【請求項26】
同種異系又は自己のａＣＡＲ Ｔ細胞を調製する方法であって、請求項１～１８のいずれか１項に記載の核酸分子；又は請求項２０に記載のベクターとＴ細胞を接触させ、それにより、同種異系又は自己のａＣＡＲ Ｔ細胞を調製する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
［関連出願の相互参照］
本願は、２０１９年９月１１日出願の米国特許仮出願第６２／８９８，７０４号に対する優先権の利益を主張する。この仮出願の内容は、その全体が参照により本明細書中に援用される。
本願は、２０１９年９月１１日出願の米国特許仮出願第６２／８９８，７０４号に対する優先権の利益を主張する。この仮出願の内容は、その全体が参照により本明細書中に援用される。
【0002】
本発明は概して、活性化キメラ抗原レセプター（ａＣＡＲ）及び癌の免疫療法におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【0003】
１９８０年代後半から１９９０年代前半にかけて、Ｔ細胞を自在にリダイレクトする新しい遺伝的手段として二本鎖及び一本鎖のＣＡＲが登場し、癌のＣＡＲ－Ｔ細胞療法という分野全体への道が開かれた［１，２］。２０１７年には、最初のＣＡＲ－Ｔ製品が、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病及び非ホジキンリンパ腫の処置に対してＦＤＡから承認され、現在およそ４００の臨床試験で広範囲の血液悪性腫瘍及び固形腫瘍のＣＡＲ療法が検討されている（本発明者らの概説［３］、［４，５］及びhttps://clinicaltrials.gov/を参照のこと）。
【0004】
固形腫瘍において観察された奏効率の低さは、ＣＡＲ－Ｔ細胞の治療効果を改善するために、その殺腫瘍活性を増強することが必要であることを浮き彫りにしている。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、好適な腫瘍抗原が明らかに不足していることに加え、外因子と内因子の両方がもたらす大きな障害に直面している。外因的には、移入されたＴ細胞は、回復力に富む腫瘍微小環境に直面するが、その腫瘍微小環境は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、骨髄由来抑制細胞及び腫瘍関連マクロファージをはじめとした免疫抑制細胞をリクルートすることが多く、多様な回避機構を利用して、Ｔ細胞のアクセスを阻止して免疫学的攻撃を回避する［６］。内因性の障害として顕著なのは、注入されたＴ細胞の持続性及び増殖能が限定的であること、長期のエキソビボ増殖後に機能的に疲弊すること（ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ）、ターミナルエフェクターＴ細胞が好ましくない分化状態を獲得すること、抗原への長期曝露の結果として抗原誘発細胞死（ＡＩＣＤ）が起きること、並びにＴ細胞の反応性及び生存を妨げ得る制御されない持続性シグナルが生成されることである［７，８］。
【0005】
これらの限界を克服しようとして、近年、第２及び第３世代ＣＡＲの細胞内部分に組み込まれるシグナル伝達部分の最適化に多大な努力が注がれており、このシグナル伝達部分は、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の臨床成績を大きく左右する。Ｔ細胞の機能及び寿命の多様な側面を増強できる種々の共刺激シグナル伝達エレメント（ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＣＤ２４４、ＣＤ８０及び４－１ＢＢＬを含む）及びそれらの組み合わせがこのルートで探索されてきた［８－１０］。これらの中で最も広く探索されているのは、間違いなくＣＤ２８及び４－１ＢＢである。
【0006】
重要な共刺激レセプターであるＣＤ２８とＢ７タンパク質とが抗原提示細胞（ＡＰＣ）上で結合することが、ナイーブＴ細胞のプライミングに必須であり、それにより、ＴＣＲによって誘導される増殖、分化及び多様なエフェクター機能の獲得の増強がシグナル伝達される［１１－１３］。腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦＲ）ファミリーのメンバーである４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）は、活性化されたヒトＴ細胞上で発現される。ＴＮＦＲファミリーには、ＯＸ４０及びＣＤ２７も含まれ、これらのシグナル伝達エレメントも同様に、先進のＣＡＲデザインにおいて評価されてきた。これらのＴＮＦＲのサイトゾル部分は、構造的に類似しており、それらはすべて、ＮＦκＢ、ｐ３８ＭＡＰＫ又はＪＮＫ／ＳＡＰＫ経路を介してアダプターＴＮＦＲ関連因子（ＴＲＡＦ）タンパク質を通じてシグナル伝達する［１４］。
【0007】
対応するリガンド又は可溶性アゴニストによる４－１ＢＢのライゲーションは、アポトーシスを相殺することによってＴ細胞の生存を高め、細胞分裂を誘導し、Ｔｈ１サイトカイン産生を増強し、ＡＩＣＤからＴ細胞を守り、記憶形成を推進し、Ｔｒｅｇ抑制に対する抵抗性を与える［１１，１５］。驚くことではないが、ＣＤ２８及び４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、第２及び第３世代のＣＡＲの共刺激成分として広く探索された。
【0008】
第２世代のＣＡＲに関する数多くの研究が、ＣＤ２８及び４－１ＢＢシグナル伝達ドメインが発揮する効果に著明な違いがあることを明らかにしており、その違いは、それらの別個の生理学的役割を反映している［８，１１］。例えば、ＣＤ２８は、４－１ＢＢとは明らかに異なって、エフェクター機能及び腫瘍根絶能力の迅速な獲得をサポートするが、持続性は限定的でしかないことが示された（例えば、［１０，１６，１７］）。ＣＤ２８は大部分が、ＣＡＲ－Ｔ細胞がエフェクター－メモリータイプに分化するのを誘導するが、４－１ＢＢは、セントラルメモリーの形成を優先的に推進する［１８］。驚くべきことに、これらの２つの共刺激ドメインをタンデムにつないで第３世代のＣＡＲを作製しても、必ずしもインビボにおいて治療活性は改善されない（最近の概説については［８］を参照のこと）。さらに、天然のＣＤ２８及び４－１ＢＢの生理学的機能がすべてＣＡＲにおいて保存されるわけではないことが明らかになりつつある［１１］。極めて重要なことに、機能的帰結に関して矛盾した報告は、単に実験の状況が異なることを反映しているに過ぎないかもしれない。例えば、４－１ＢＢによって媒介される持続的なシグナル伝達は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の生存及び機能に対して正［９］又は負［１９］の作用を発揮すると報告された。
【0009】
このように、癌の免疫療法に使用するための改善されたａＣＡＲには、満たされていないニーズがまだ残っている。
【発明の概要】
【0010】
１つの態様において、本発明は、（ｉ）抗原に結合できる細胞外結合ドメイン；（ｉｉ）膜貫通ドメイン；（ｉｉｉ）細胞内ドメイン；及び（ｉｖ）細胞外結合ドメインと膜貫通ドメインとを連結する可動性ヒンジドメイン又は可動性ストークドメインであって、前記可動性ヒンジドメイン又は可動性ストークドメインは、システイン架橋を形成できるシステイン残基を含むことによりａＣＡＲホモ二量体を形成する、可動性ヒンジドメイン又は可動性ストークドメインを含む、活性化キメラ抗原レセプター（ａＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供し、
ここで、前記細胞内ドメインは、
（ａ）ＣＤ４０に由来する少なくとも１つのシグナル伝達エレメント、及びＦｃＲガンマ（γ）鎖、ＣＤ３ゼータ（ζ）鎖又はＣＤ３エータ（η）鎖に由来する少なくとも１つのシグナル伝達エレメントを含み、ＭｙＤ８８ポリペプチド、２Ａ自己切断ペプチド又は二量体化ドメインを欠く、第２のアミノ酸配列を含む、細胞内ドメイン；
（ｂ）ＣＤ４０に由来する少なくとも１つのシグナル伝達エレメント、及びＣＤ２８又は４－１ＢＢに由来する少なくとも１つのシグナル伝達エレメントを含む第３のアミノ酸配列を含む、細胞内ドメイン；及び
（ｃ）ＣＤ４０に由来する少なくとも１つのシグナル伝達エレメントを含む第１のアミノ酸配列、ＦｃＲガンマ（γ）鎖、ＣＤ３ゼータ（ζ）鎖又はＣＤ３エータ（η）鎖に由来する少なくとも１つのシグナル伝達エレメントを含む第２のアミノ酸配列、及びＣＤ２８に由来する少なくとも１つのシグナル伝達エレメントを含む第３のアミノ酸配列を含む、細胞内ドメイン；及び
（ｄ）ＣＤ４０に由来する少なくとも１つのシグナル伝達エレメントを含む第１のアミノ酸配列を含み、ＭｙＤ８８ポリペプチド又はＴｏｌｌ／ＩＬ－１レセプタードメイン（ＴＩＲ）ドメインを欠く切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドを欠き、代替的又は追加的に、ミリストイル化標的化配列又は二量体化ドメイン（例えば、ＦＫＢＰ１２ｖ３６ドメイン）を欠き得る、細胞内ドメイン
から選択される。
ここで、前記細胞内ドメインは、
（ａ）ＣＤ４０に由来する少なくとも１つのシグナル伝達エレメント、及びＦｃＲガンマ（γ）鎖、ＣＤ３ゼータ（ζ）鎖又はＣＤ３エータ（η）鎖に由来する少なくとも１つのシグナル伝達エレメントを含み、ＭｙＤ８８ポリペプチド、２Ａ自己切断ペプチド又は二量体化ドメインを欠く、第２のアミノ酸配列を含む、細胞内ドメイン；
（ｂ）ＣＤ４０に由来する少なくとも１つのシグナル伝達エレメント、及びＣＤ２８又は４－１ＢＢに由来する少なくとも１つのシグナル伝達エレメントを含む第３のアミノ酸配列を含む、細胞内ドメイン；及び
（ｃ）ＣＤ４０に由来する少なくとも１つのシグナル伝達エレメントを含む第１のアミノ酸配列、ＦｃＲガンマ（γ）鎖、ＣＤ３ゼータ（ζ）鎖又はＣＤ３エータ（η）鎖に由来する少なくとも１つのシグナル伝達エレメントを含む第２のアミノ酸配列、及びＣＤ２８に由来する少なくとも１つのシグナル伝達エレメントを含む第３のアミノ酸配列を含む、細胞内ドメイン；及び
（ｄ）ＣＤ４０に由来する少なくとも１つのシグナル伝達エレメントを含む第１のアミノ酸配列を含み、ＭｙＤ８８ポリペプチド又はＴｏｌｌ／ＩＬ－１レセプタードメイン（ＴＩＲ）ドメインを欠く切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドを欠き、代替的又は追加的に、ミリストイル化標的化配列又は二量体化ドメイン（例えば、ＦＫＢＰ１２ｖ３６ドメイン）を欠き得る、細胞内ドメイン
から選択される。
【0011】
別の態様において、本発明は、上記実施形態のうちのいずれか１つのいずれか１つの核酸分子を含む組成物を提供する。
【0012】
追加の態様において、本発明は、上記実施形態のうちのいずれか１つの核酸分子を含むベクターを提供する。
【0013】
なおも別の態様において、本発明は、上記実施形態のうちのいずれか１つの核酸分子又は上記実施形態のうちのいずれか１つのＤＮＡベクターを含む哺乳動物Ｔ細胞を提供する。
【0014】
なおも追加の態様において、本発明は、同種異系又は自己のａＣＡＲ Ｔ細胞を調製する方法を提供し、その方法は、上記実施形態のうちのいずれか１つのいずれか１つの核酸分子；又は上で定義されたようなＤＮＡベクターとＴ細胞を接触させ、それにより、同種異系ａＣＡＲ Ｔ細胞又は自己ａＣＡＲ Ｔ細胞を調製する工程を含む。
【0015】
さらなる態様において、本発明は、対象における疾患、障害又は状態を処置又は予防する方法を提供し、その方法は、前記対象に上記実施形態のうちのいずれか１つの哺乳動物Ｔ細胞を投与する工程を含み、ここで、前記Ｔ細胞は、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞であり、前記疾患、障害又は状態は、固形腫瘍、血液悪性腫瘍、メラノーマ、ウイルスによる感染から選択されるか；又は前記Ｔ細胞は、ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）であり、前記疾患、障害又は状態は、自己免疫疾患、アレルギー、喘息、並びに臓器移植及び骨髄移植などの免疫系が過剰に活動している状態として現れている。
【図面の簡単な説明】
【0016】
特許ファイル又は出願ファイルは、カラー又はグレースケールで実行される少なくとも１つの図面を含んでいる。カラー又はグレースケールの図面を含むこの特許公報又は特許出願公報の写しは、請求し、必要な手数料を支払うと特許庁から提供される。
【0017】
【0018】
【0019】
【図3A-B】図３Ａ～Ｂは、ＣＡＲの機能を示している。（Ａ）新規ＣＡＲの抗原特異的活性（ＣＡＲの名称の凡例については図１を参照のこと）。レポーターＮＦＡＴ－ＬａｃＺ遺伝子を有するＢ３Ｚ Ｔ細胞に、記載の各ｍＲＮＡをエレクトロポレートした。エレクトロポレーションの７時間後、細胞を５７９メラノーマ細胞（格子縞）、５７９－Ａ２メラノーマ細胞（黒色）又は細胞なし（白色）と１：１の比でインキュベートし、２４時間後、細胞溶解産物を比色ＣＰＲＧアッセイに供した。（Ｂ）ＮＦ－κＢシグナル伝達経路の活性化。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼレポータープラスミドをトランスフェクトし、２４時間後、記載の各コンストラクトをコードするｍＲＮＡをトランスフェクトした。ヒストグラムは、細胞溶解産物における相対ルミネセンス単位（ＲＬＵ）を示している。Ｉｒｒ．、無関係のｍＲＮＡ；Ｐ．Ｃ．、ポジティブコントロール、恒常的に活性なＣＤ４０（ｃａＣＤ４０、（７））。結果は、３回の独立した実験の代表である。
【0020】
【0021】
【発明を実施するための形態】
【0022】
［発明の詳細な説明］
ＣＤ４０は、ＴＮＦＲファミリーのメンバーであり、主にプロフェッショナルＡＰＣによって発現される。いくつかの研究から、ＣＤ４０はＴ細胞によっても機能的に発現されることが示唆されている。ＣＤ４０の直接的なＴ細胞刺激能は、分化、記憶の形成、機能的アビディティーの改善、抗アポトーシスシグナルのアップレギュレーション及びアポトーシス促進性シグナルの低減、疲弊からのレスキュー、並びにＴｒｅｇ媒介性抑制に対する抵抗性の獲得をはじめとした広範囲の効果として現れた［２０－２２］。しかし、他の研究は、これらの観察結果を確認できず、Ｔ細胞によって発現されたＣＤ４０が生理学的条件下で果たす免疫学的役割は謎のままである。それにもかかわらず、最近になって、ＣＤ４０シグナル伝達ドメインの強力な共刺激能を天然の未改変Ｔ細胞に補充することに成功した［２３－２５］。対照的に、他の研究者は、ＣＤ４０シグナル伝達ドメインが、自己集合ドメイン及びｍｙＤ８８ドメインに結合体化されない限り、ａＣＡＲの状況においては不活性であることを見出した［２６－２８］。
ＣＤ４０は、ＴＮＦＲファミリーのメンバーであり、主にプロフェッショナルＡＰＣによって発現される。いくつかの研究から、ＣＤ４０はＴ細胞によっても機能的に発現されることが示唆されている。ＣＤ４０の直接的なＴ細胞刺激能は、分化、記憶の形成、機能的アビディティーの改善、抗アポトーシスシグナルのアップレギュレーション及びアポトーシス促進性シグナルの低減、疲弊からのレスキュー、並びにＴｒｅｇ媒介性抑制に対する抵抗性の獲得をはじめとした広範囲の効果として現れた［２０－２２］。しかし、他の研究は、これらの観察結果を確認できず、Ｔ細胞によって発現されたＣＤ４０が生理学的条件下で果たす免疫学的役割は謎のままである。それにもかかわらず、最近になって、ＣＤ４０シグナル伝達ドメインの強力な共刺激能を天然の未改変Ｔ細胞に補充することに成功した［２３－２５］。対照的に、他の研究者は、ＣＤ４０シグナル伝達ドメインが、自己集合ドメイン及びｍｙＤ８８ドメインに結合体化されない限り、ａＣＡＲの状況においては不活性であることを見出した［２６－２８］。
【0023】
本発明者らは、ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインあり又はなしで、ＣＤ４０又は４－１ＢＢの細胞内シグナル伝達ドメインを有する一連の新しい抗ＨＬＡ－Ａ２ ＣＡＲを構築し、ｍＲＮＡをエレクトロポレートされたヒトＣＤ８Ｔ細胞においてこれらのＣＡＲを調べた。調べた一連のコンストラクトの模式図は、図１に示されており、表１に詳述されている。単にＣＤ４０シグナル伝達ドメインを種々のＣＡＲの細胞内部分に組み込むことによって、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路が自発的に活性化されることが予想外にも見出され、この自発的な活性化は、一貫して、４－１ＢＢシグナル伝達ドメインを有する対応するＣＡＲによって誘導される活性化よりも高かった（図２Ｂ）。さらに、本発明者らが以前に試験したいずれのヒトＴ細胞においても、ＣＤ４０の発現はその痕跡すら検出できなかったが、ＣＤ４０シグナル伝達ドメインは、ｃａＣＤ４０又は天然のＣＤ４０を導入した後のＣＤ４０Ｌ刺激によって明らかにされたように、これらのＴ細胞において十分に強力だった［２４］。
【0024】
１つの態様において、本発明は、（ｉ）抗原に結合できる細胞外結合ドメイン；（ｉｉ）膜貫通ドメイン；（ｉｉｉ）細胞内ドメイン；及び（ｉｖ）細胞外結合ドメインと膜貫通ドメインとを連結する可動性ヒンジドメイン又は可動性ストークドメインであって、前記可動性ヒンジドメイン又は可動性ストークドメインは、システイン架橋を形成できるシステイン残基を含むことによりａＣＡＲホモ二量体を形成する、可動性ヒンジドメイン又は可動性ストークドメインを含む活性化キメラ抗原レセプター（ａＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供し、
ここで前記細胞内ドメインは、
（ａ）ＣＤ４０に由来する少なくとも１つのシグナル伝達エレメント、及びＦｃＲガンマ（γ）鎖、ＣＤ３ゼータ（ζ）鎖又はＣＤ３エータ（η）鎖に由来する少なくとも１つのシグナル伝達エレメントを含み、ＭｙＤ８８ポリペプチド、２Ａ自己切断ペプチド又は二量体化ドメインを欠く、第２のアミノ酸配列を含む、細胞内ドメイン；
（ｂ）ＣＤ４０に由来する少なくとも１つのシグナル伝達エレメント、及びＣＤ２８又は４－１ＢＢに由来する少なくとも１つのシグナル伝達エレメントを含む第３のアミノ酸配列を含む、細胞内ドメイン；及び
（ｃ）ＣＤ４０に由来する少なくとも１つのシグナル伝達エレメントを含む第１のアミノ酸配列、ＦｃＲガンマ（γ）鎖、ＣＤ３ゼータ（ζ）鎖又はＣＤ３エータ（η）鎖に由来する少なくとも１つのシグナル伝達エレメントを含む第２のアミノ酸配列、及びＣＤ２８に由来する少なくとも１つのシグナル伝達エレメントを含む第３のアミノ酸配列を含む、細胞内ドメイン；及び
（ｄ）ＣＤ４０に由来する少なくとも１つのシグナル伝達エレメントを含む第１のアミノ酸配列を含み、ＭｙＤ８８ポリペプチド、又はＴｏｌｌ／ＩＬ－１レセプタードメイン（ＴＩＲ）ドメインを欠く切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドを欠き、代替的又は追加的に、ミリストイル化標的化配列又は二量体化ドメイン（例えば、ＦＫＢＰ１２ｖ３６ドメイン［２９］）を欠き得る、細胞内ドメイン
から選択される。
ここで前記細胞内ドメインは、
（ａ）ＣＤ４０に由来する少なくとも１つのシグナル伝達エレメント、及びＦｃＲガンマ（γ）鎖、ＣＤ３ゼータ（ζ）鎖又はＣＤ３エータ（η）鎖に由来する少なくとも１つのシグナル伝達エレメントを含み、ＭｙＤ８８ポリペプチド、２Ａ自己切断ペプチド又は二量体化ドメインを欠く、第２のアミノ酸配列を含む、細胞内ドメイン；
（ｂ）ＣＤ４０に由来する少なくとも１つのシグナル伝達エレメント、及びＣＤ２８又は４－１ＢＢに由来する少なくとも１つのシグナル伝達エレメントを含む第３のアミノ酸配列を含む、細胞内ドメイン；及び
（ｃ）ＣＤ４０に由来する少なくとも１つのシグナル伝達エレメントを含む第１のアミノ酸配列、ＦｃＲガンマ（γ）鎖、ＣＤ３ゼータ（ζ）鎖又はＣＤ３エータ（η）鎖に由来する少なくとも１つのシグナル伝達エレメントを含む第２のアミノ酸配列、及びＣＤ２８に由来する少なくとも１つのシグナル伝達エレメントを含む第３のアミノ酸配列を含む、細胞内ドメイン；及び
（ｄ）ＣＤ４０に由来する少なくとも１つのシグナル伝達エレメントを含む第１のアミノ酸配列を含み、ＭｙＤ８８ポリペプチド、又はＴｏｌｌ／ＩＬ－１レセプタードメイン（ＴＩＲ）ドメインを欠く切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドを欠き、代替的又は追加的に、ミリストイル化標的化配列又は二量体化ドメイン（例えば、ＦＫＢＰ１２ｖ３６ドメイン［２９］）を欠き得る、細胞内ドメイン
から選択される。
【0025】
ＣＤ４０に由来するシグナル伝達エレメントは、腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦＲ）関連因子（ＴＲＡＦ）結合ドメイン、例えば、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ５及びＴＲＡＦ６結合ドメインであり得る。ＴＲＡＦ２、３及び５は通常、重複する結合モチーフを有するのに対して、ＴＲＡＦ６は、これらのレセプター上で別個の相互作用モチーフを有し、ＴＲＡＦ１はＴＲＡＦ２を介してＣＤ４０シグナル伝達エレメントに結合する［３０］。
【0026】
ある特定の実施形態において、ＦｃＲガンマ（γ）鎖、ＣＤ３ゼータ（ζ）鎖又はＣＤ３エータ（η）鎖に由来するシグナル伝達エレメントは、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ）（ＩＴＡＭ）である。このモチーフでは、チロシンがロイシン又はイソロイシンから任意の他の２つのアミノ酸だけ隔てられており、ＹｘｘＬ／Ｉのシグネチャをもたらす。このシグネチャのうちの２つは、通常、当該分子の細胞質テールにおいて６～８アミノ酸隔てられている（ＹｘｘＬ／Ｉｘ（６－８）ＹｘｘＬ／Ｉ）。
【0027】
本発明のａＣＡＲを発現しているＴ細胞又はそのＴ細胞を含む細胞集団は、細胞内ドメインがＣＤ２８及びＣＤ３ζ、４－１ＢＢ及びＣＤ３ζ、又はＣＤ２８及び４－１ＢＢの細胞内ドメインからなるａＣＡＲを発現するＴ細胞又はそのＴ細胞を含む細胞集団と比べて、表面上に標的抗原を有する細胞に対して高い細胞傷害活性を有する。
【0028】
ある特定の実施形態において、細胞外結合ドメインは、（ｉ）抗体、その誘導体又はフラグメント、例えば、ヒト化抗体；ヒト抗体；抗体の機能的フラグメント；単一ドメイン抗体、例えば、ナノボディ（Ｎａｎｏｂｏｄｙ）；組換え抗体；及び一本鎖可変フラグメント（ＳｃＦｖ）；（ｉｉ）抗体模倣物、例えば、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）分子；アフィリン（ａｆｆｉｌｉｎ）；アフィマー（ａｆｆｉｍｅｒ）；アフィチン（ａｆｆｉｔｉｎ）；アルファボディ；アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）；アビマー（ａｖｉｍｅｒ）；ＤＡＲＰｉｎ；フィノマー（ｆｙｎｏｍｅｒ）；Ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド；及びモノボディ；又は（ｉｉｉ）アプタマーを含む。
【0029】
特定の実施形態において、細胞外結合ドメインは、ＳｃＦｖを含む。ある特定の実施形態において、ＳｃＦｖは、第１の可動性ペプチドリンカー、例えば、配列番号１２の可動性ペプチドリンカーによって連結された、可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）を含む。
【0030】
ある特定の実施形態において、ａＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ３－ζ、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ９及びＦｃレセプターの膜貫通ドメインから選択される。
【0031】
ある特定の実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメイン（例えば配列番号１６）である。
【0032】
ある特定の実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＤ４０膜貫通ドメイン（例えば配列番号２２）である。
【0033】
ある特定の実施形態において、第１のアミノ酸配列は、ＣＤ４０の完全な細胞内ドメイン（例えば配列番号１７）である。
【0034】
ある特定の実施形態において、第２のアミノ酸配列の少なくとも１つのシグナル伝達エレメントは、ＦｃＲγ鎖に由来する。
【0035】
ある特定の実施形態において、第２のアミノ酸配列は、ＦｃＲγ鎖の完全な細胞内ドメイン（例えば配列番号１８）である。
【0036】
ある特定の実施形態において、第３のアミノ酸配列は、ＣＤ２８の完全な細胞内ドメイン（例えば配列番号２０）である。
【0037】
ある特定の実施形態において、可動性ヒンジ又は可動性ストークは、ＣＤ８α又はＣＤ８βのヒンジ領域から選択されるポリペプチドを含む。これらのヒンジドメインの配列及び構造は、十分に特徴づけられている（例えば、Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．［３１］）。可動性ヒンジ又は可動性ストークはさらに、ＩｇＧの重鎖のヒンジ領域及びＩｇＤの重鎖のヒンジ領域から選択され得る。
【0038】
ある特定の実施形態において、可動性ヒンジドメインは、ＣＤ８αのヒンジドメイン（例えば、完全に可動性のヒンジドメインであり、任意で、配列番号１５の配列におけるように、２つのＳｅｒ残基をＣ末端に付加する（それによりＸｈｏＩ制限酵素認識部位を形成する）ことによって変更される、完全に可動性のヒンジドメインである。
【0039】
特定の実施形態において、上記実施形態のうちのいずれか１つの核酸分子は、（ｉ）抗体、その誘導体又はフラグメント、例えば、ヒト化抗体；ヒト抗体；抗体の機能的フラグメント；ナノボディなどの単一ドメイン抗体；組換え抗体；及び一本鎖可変フラグメント（ＳｃＦｖ）；（ｉｉ）抗体模倣物、例えば、アフィボディ分子；アフィリン；アフィマー；アフィチン；アルファボディ；アンチカリン；アビマー；ＤＡＲＰｉｎ；フィノマー；Ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド；及びモノボディ；又は（ｉｉｉ）アプタマーを含む細胞外結合ドメインを含むａＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含み；前記膜貫通ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ３－ζ、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ９及びＦｃレセプターの膜貫通ドメインから選択され；第１のアミノ酸配列は、ＣＤ４０の完全な細胞内ドメイン（例えば配列番号１７）であり；第２のアミノ酸配列の少なくとも１つのシグナル伝達エレメントは、ＦｃＲγ鎖に由来し；第３のアミノ酸配列は、存在する場合、ＣＤ２８の完全な細胞内ドメイン（例えば配列番号２０）であり；可動性ヒンジは、ＣＤ８α、ＣＤ８βのヒンジ領域、ＩｇＧの重鎖のヒンジ領域及びＩｇＤの重鎖のヒンジ領域から選択されるポリペプチドを含む。
【0040】
ある特定の実施形態において、先の実施形態のａＣＡＲは、ＳｃＦｖを含む細胞外結合ドメインを含み；膜貫通ドメインは、ＣＤ２８の膜貫通ドメイン（例えば配列番号１６）であり；第２のアミノ酸配列は、ＦｃＲγ鎖の完全な細胞内ドメイン（例えば配列番号１８）であり；可動性ヒンジドメインは、ＣＤ８αの可動性ヒンジドメインである。
【0041】
ある特定の実施形態において、上記ａＣＡＲのうちのいずれか１つの細胞内ドメインは、ＣＤ４０の完全な細胞内ドメインのタンデム配置－ＦｃＲγを含むか又はそのタンデム配置から本質的になる。
【0042】
ある特定の実施形態において、上記ａＣＡＲのうちのいずれか１つの細胞内ドメインは、ＣＤ２８の完全な細胞内ドメインのタンデム配置－ＣＤ４０－ＦｃＲγを含むか又はそのタンデム配置から本質的になり、ここで、そのＣＤ２８の細胞内ドメインは、任意選択で、短オリゴペプチドリンカーを介してＣＤ４０の細胞内ドメインに連結される。
【0043】
換言すれば、上記タンデム配置は、［Ｎ末端－ＣＤ２８］－［任意選択の短オリゴペプチドリンカー］－［ＣＤ４０－ＦｃＲγ－Ｃ末端］；及び［Ｎ末端－ＣＤ４０］－［ＦｃＲγ－Ｃ末端］の完全な細胞内ドメインを含むポリペプチドから選択される。Ｎ末端からＣ末端までの種々のドメインの出現順は、異なることがあり、例えば、［Ｎ末端－ＣＤ４０］－［任意選択の短オリゴペプチドリンカー］－［ＣＤ２８－ＦｃＲγ－Ｃ末端］である場合もある。
【0044】
ある特定の実施形態において、上記ａＣＡＲのうちのいずれか１つの細胞内ドメインは、４－１ＢＢ、ＣＤ４０及びＦｃＲγの完全な細胞内ドメインを含むか又はその完全な細胞内ドメインから本質的になる。例えば、ａＣＡＲは、ＳｃＦｖ；ＣＤ２８の膜貫通ドメイン；ＣＤ４０の完全な細胞内ドメイン、４－１ＢＢの完全な細胞内ドメイン、ＦｃＲγ鎖の完全な細胞内ドメイン；及びＣＤ８αの可動性ヒンジドメインを含み得る。
【0045】
可動性ペプチドリンカーは、当該分野で周知である。研究者らがデザインした経験上のリンカーは、一般に、その構造に従って、例えば、［３２－３４］（それらの各々が、本明細書中に完全に開示されたように参照により援用される）に定義されているような、３つのカテゴリー：可動性リンカー、剛性リンカー及びインビボで切断可能なリンカー、に分類される。
【0046】
可動性の短オリゴペプチドリンカーの構造は、［３２－３４］に開示されているリンカーのうちのいずれか１つから選択される。原則として、可動性を提供するために、リンカーは一般に、小さな非極性（例えば、Ｇｌｙ）又は極性（例えば、Ｓｅｒ又はＴｈｒ）のアミノ酸から構成される（例えば、Ｇｌｙ残基とＳｅｒ残基が交互になっている基礎的な配列）。リンカー及び関連するシグナル伝達エレメントの溶解度は、荷電残基；例えば、２つの正に帯電した残基（Ｌｙｓ）及び１つの負に帯電した残基（Ｇｌｕ）を含めることによって、高めることができる。リンカーは、２～３１アミノ酸で変動してよく、そのリンカーが連結パートナーの立体配座又は相互作用に対して長さの制約を課さないように、各条件に対して最適化される。
【0047】
ある特定の実施形態において、可動性の短オリゴペプチドリンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙを有する。
【0048】
ある特定の実施形態において、細胞内ドメインは、（Ｎ末端からＣ末端に向かって）［ＣＤ２８］－［短オリゴペプチドリンカー］－［ＣＤ４０］－［ＦｃＲγ］の完全な細胞内ドメインのタンデム配置を含むか又はそのタンデム配置から本質的になる（２８－４０－γ）。
【0049】
ある特定の実施形態において、ａＣＡＲは、（Ｎ末端からＣ末端に向かって）［ＳｃＦｖ］－［ＣＤ８αのヒンジ領域－ＣＤ２８膜貫通ドメイン］－［ＣＤ４０－ＦｃＲγの完全な細胞内ドメインのタンデム配置から本質的になる細胞内ドメイン］のタンデム配置を含む（４０－γ）。
【0050】
ある特定の実施形態において、ａＣＡＲは、（Ｎ末端からＣ末端に向かって）［ＳｃＦｖ］－［ＣＤ８αのヒンジ領域－ＣＤ２８膜貫通ドメイン］－［ＣＤ２８の完全な細胞内ドメインのタンデム配置から本質的になる細胞内ドメイン－ＣＤ４０－ＦｃＲγ］のタンデム配置を含み、ここで、ＣＤ２８の細胞内ドメインは、任意選択で、リンカーを介してＣＤ４０の細胞内ドメインに連結される。
【0051】
ある特定の実施形態において、ａＣＡＲの種々のドメインのそれぞれのＤＮＡ配列又はアミノ酸配列は、ヒト配列である。
【0052】
ある特定の実施形態において、細胞外結合ドメインを除くａＣＡＲは、配列番号１５＋１６＋２０＋Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ＋１７＋１８；又は１５＋１６＋１７＋１８の組み合わせのアミノ酸配列を含む。
【0053】
本発明のａＣＡＲをコードするＤＮＡの完全な配列の非限定的な例は、配列番号２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７及び３９に示されており；本発明のａＣＡＲの完全なアミノ酸配列の非限定的な例は、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８及び４０に示されている。これらは、本発明を行う１つの具体的な方法を教示することだけを目的として開示された例であって、これは、例えば、必要に応じ、制限酵素認識部位若しくは短い可動性オリゴペプチドリンカーを導入するか若しくは無くすことにより、又は発現を改善するためにＤＮＡ配列の同義的な変更によって、種々の実験の要求を満たすために当業者が容易に適応させることができることは明らかであるはずである。
【0054】
上記で定義されたａＣＡＲの種々のドメイン及び完全配列は、そのａＣＡＲが活性である限り、すなわち、抗原依存的様式でＴ細胞を活性化できる限り、それぞれ、配列番号１５、１６、１７、１８、２０、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８及び４０において定義される配列並びに上に列挙された他の組み合わせ配列と、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５、９６、９７、９８若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有してよい。
【0055】
上記で定義されたａＣＡＲの様々なドメインをコードするヌクレオチド配列は、これらのドメインのアミノ酸配列をコードするすべての冗長なヌクレオチド配列並びに活性なａＣＡＲをコードする類似の配列を含む。したがって、配列番号１５、１６、１７、１８、２０、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８及び４０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号６、７、８、９、２０、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７及び３９に示されているとおりであるか；又は同一のアミノ酸配列をコードする他の任意の冗長な配列である。さらに、ヌクレオチド配列は、コードされるａＣＡＲが活性である限り、すなわち、抗原依存的様式でＴ細胞を活性化できる限り、それぞれ、配列番号６、７、８、９、１９、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７及び３９において定義された配列、並びに上に列挙された他の組み合わせアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５、９６、９７、９８若しくは９９％の同一性を有してよい。
【0056】
ある特定の実施形態において、上記実施形態のうちのいずれか１つの（ｃ）又は（ｄ）の細胞内ドメインは、ＭｙＤ８８ポリペプチド、又はＴｏｌｌ／ＩＬ－１レセプタードメイン（ＴＩＲ）ドメインを欠く切断型ＭｙＤ８８ポリペプチドを欠き、代替的又は追加的に、ミリストイル化標的化配列又は二量体化ドメイン（例えば、ＦＫＢＰ１２ｖ３６ドメイン）を欠き得る。
【0057】
ある特定の実施形態において、上記実施形態のうちのいずれか１つの（ａ）（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）の細胞内ドメインは、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａ及びＴ２Ａのうちのいずれか１つを含む２Ａ自己切断ペプチドなどの自己切断ペプチドを欠く。
【0058】
別の態様において、本発明は、上記実施形態のうちのいずれか１つのいずれか１つの核酸分子を含む組成物を提供する。
【0059】
Ｍａｔｕｓｋｏｖａ及びＤｕｒｉｎｉｋｏｖａ［３５］は、導入遺伝子を細胞に送達するための系には、ウイルスによる系とウイルスによらない系の２つがあると教示している。非ウイルスアプローチは、ＤＮＡでコーティングされた微小粒子又はｍＲＮＡの、ポリマーナノ粒子、脂質、リン酸カルシウム、エレクトロポレーション／ヌクレオフェクション又はパーティクルガンによる送達によって代表される。非ウイルスアプローチは、「Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ」（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンを使用するプロトコルについては、例えば［３６］を参照のこと）として一般に知られているトランスポゾンシステムなどのトランスポゾンシステムも提供する。
【0060】
ウイルスアプローチは、ＤＮＡが宿主細胞のクロマチンにインテグレートされるか否かに応じて、本発明に従って使用され得る主要な２つのタイプのベクターを提供する。レトロウイルスベクター（例えば、ガンマレトロウイルス又はレンチウイルスに由来するベクター）は、インテグレートされたプロウイルスとして核内に残り、細胞分裂によって複製される。他のタイプのベクター（例えば、ヘルペスウイルス又はアデノウイルスに由来するベクター）は、エピソームの形態で細胞内に残る。
【0061】
追加の態様において、本発明は、上記実施形態のうちのいずれか１つの核酸分子を含むベクターを提供する。
【0062】
ある特定の実施形態において、上記実施形態のうちのいずれか１つのベクターは、プラスミド又はウイルスベクターなどのＤＮＡベクター；又はポリマーナノ粒子、脂質、リン酸カルシウム、ＤＮＡでコーティングされた微小粒子若しくはトランスポゾンなどの非ウイルスベクターである。
【0063】
ある特定の実施形態において、ＤＮＡベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、ガンマウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス及びヘルペスウイルスからなる群より選択されるウイルスに由来する改変ウイルスから選択されるウイルスベクターである。
【0064】
なおも別の態様において、本発明は、上記実施形態のうちのいずれか１つの核酸分子又は上記実施形態のうちのいずれか１つのＤＮＡベクターを含む哺乳動物Ｔ細胞を提供する。
【0065】
ある特定の実施形態において、上記で定義された哺乳動物Ｔ細胞は、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞又は制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）であるか；又はＣＤ８＋エフェクターＴ細胞であり得る。
【0066】
ある特定の実施形態において、上記で定義された哺乳動物Ｔ細胞は、その表面上に前記ａＣＡＲを発現している。
【0067】
ある特定の実施形態において、上記で定義された哺乳動物Ｔ細胞は、ヒトＴ細胞である。
【0068】
さらに追加の態様において、本発明は、同種異系又は自己のａＣＡＲ Ｔ細胞を調製する方法を提供し、その方法は、上記実施形態のうちのいずれか１つのいずれか１つの核酸分子；又は上で定義されたようなベクターとＴ細胞を接触させ、それにより、同種異系又は自己のａＣＡＲ Ｔ細胞を調製する工程を含む。
【0069】
上記免疫細胞は、例えば、ＲＮＡトランスフェクション、あるいは真核細胞における複製及び／若しくは転写に適したプラスミド又はウイルスベクターの取り込みによって、本明細書中に記載される適切な核酸分子でトランスフェクトされ得る。ある特定の実施形態において、そのベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、ガンマウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス及びヘルペスウイルスからなる群より選択されるウイルスに由来する改変ウイルスから選択されるウイルスベクターである。
【0070】
レトロウイルスベクターと適切なパッケージング株との組み合わせも使用することでき、その場合、それらのカプシドタンパク質は、ヒト細胞への感染において機能的である。ＰＡ１２［３７］、ＰＡ３１７［３８］及びＣＲＩＰ［３９］などのいくつかの両種性（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）ウイルス産生細胞株が知られている。あるいは、ＶＳＶＧ、ＲＤ１１４又はＧＡＬ Ｖエンベロープでシュードタイプ化された粒子などの非両種性粒子を使用することができる。細胞はさらに、例えば、Ｂｒｅｇｎｉらの方法［４０］によって、産生細胞と直接共培養するか、又は例えば、Ｘｕらの方法［４１］；及びＨｕｇｈｅｓらの方法［４２］によって、ウイルス上清のみ若しくは濃縮ベクターストックと培養することによって、形質導入され得る。
【0071】
さらなる態様において、本発明は、Ｔ細胞のシグナル伝達経路、並びに活性化及びリガンド依存性細胞殺傷能力に対する細胞内シグナル伝達ドメインの影響を調べる方法を提供し、その方法は、例えば、細胞内の部分における種々のシグナル伝達ドメイン及び活性化ドメインの相対的な物理的位置を評価することによる。
【0072】
さらなる態様において、本発明は、対象における疾患、障害又は状態を処置又は予防する方法を提供し、その方法は、前記対象に上記実施形態のうちのいずれか１つの哺乳動物Ｔ細胞を投与する工程を含み、ここで、前記Ｔ細胞は、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞であり、前記疾患、障害又は状態は、固形腫瘍、血液悪性腫瘍、メラノーマ、ウイルスによる感染から選択されるか；又は前記Ｔ細胞は、ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）であり、前記疾患、障害又は状態は、自己免疫疾患、アレルギー、喘息、並びに臓器移植及び骨髄移植などの免疫系が過剰に活動している状態として現れている。
【0073】
例えば、自己免疫疾患は、１型糖尿病；関節リウマチ；乾癬；乾癬性関節炎；多発性硬化症；全身性エリテマトーデス；クローン病及び潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；アジソン病；グレーヴズ病；シェーグレン症候群；橋本甲状腺炎；重症筋無力症；脈管炎；悪性貧血；セリアック病；並びにアテローム性動脈硬化症から選択され得る。
【0074】
ある特定の実施形態において、対象は、好ましくはヒトであり、前記哺乳動物Ｔｒｅｇは、同種異系ヒトＴ細胞又は自己ヒトＴ細胞である。
【0075】
［定義］
本明細書中で使用される用語「同種異系」とは、同じ種の個体由来であるが、組織、器官又は細胞を受け取る宿主と遺伝的に異なり、その宿主とは免疫学的に適合しない、組織、器官又は細胞のことを指す。
本明細書中で使用される用語「同種異系」とは、同じ種の個体由来であるが、組織、器官又は細胞を受け取る宿主と遺伝的に異なり、その宿主とは免疫学的に適合しない、組織、器官又は細胞のことを指す。
【0076】
本明細書中で使用される用語「自己」とは、組織、器官又は細胞を受け取る個体と同じ個体から得られた組織、器官又は細胞のことを指す。
【0077】
本明細書中で使用されるとき、用語「対象」又は「個体」又は「動物」又は「患者」又は「哺乳動物」とは、任意の対象、特に、診断、予後又は治療が望まれる哺乳動物対象、例えばヒトのことを指す。
【0078】
本明細書中で使用される用語「処置する」とは、所望の生理学的効果を得る手段のことを指す。その効果は、疾患及び／又はその疾患によって生じる症状を部分的又は完全に治癒するということに関して治療的であり得る。この用語は、疾患を阻害すること、すなわち、その進展を停止すること；又は疾患を改善させること、すなわち、疾患を後退させることを指す。
【0079】
本発明に従って使用するための薬学的組成物は、１つ以上の生理的に許容され得る担体又は賦形剤を用いて従来の様式で製剤化され得る。担体は、その組成物の他の成分と適合し、そのレシピエントにとって有害でない、という意味において「許容され得る」ものでなければならない。
【0080】
投与方法としては、非経口、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、粘膜（例えば、経口、鼻腔内、頬側、膣、直腸、眼内）、髄腔内、外用及び皮内経路が挙げられるが、これらに限定されない。投与は、全身投与又は局所投与であり得る。ある特定の実施形態において、薬学的組成物は、経口投与に適合されている。
【0081】
用語「担体」とは、活性な作用物質とともに投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤又はビヒクルのことを指す。薬学的組成物中の担体には、結合剤、例えば、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン（ポリビドン又はポビドン）、トラガカントゴム、ゼラチン、デンプン、ラクトース又はラクトース一水和物；崩壊剤、例えば、アルギン酸、トウモロコシデンプンなど；潤滑剤又は界面活性剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム又はラウリル硫酸ナトリウム；及び滑剤、例えば、コロイド状二酸化ケイ素が含まれ得る。
【0082】
担体、投与様式、剤形などの以下の例証は、見込みのある公知のものとして列挙され、その中から、担体、投与様式、剤形などが本発明で使用するために選択され得る。しかしながら、当業者は、選択された任意の所与の製剤及び投与様式をまず初めに試験して、所望の結果を達成することを明らかにするべきであることを理解するだろう。
【0083】
本明細書中で使用される用語「治療有効量」は、探し求められている、組織、系、動物又はヒトの生物学的応答又は医学的応答、すなわち、癌などの細胞状態に関連する又はそれによって引き起こされる疾患の処置を誘発する核酸配列／分子又はベクターの量を意味する。その量は、とりわけ、処置される状態のタイプ及び重症度並びに処置レジメンに応じて、上に記載されたような所望の治療効果を達成するのに有効な量でなければならない。治療有効量は、通常、適切にデザインされた臨床試験（用量設定研究）において決定され、当業者は、有効量を決定するためにそのような試験を適切に行う方法を承知している。一般に知られているように、有効量は、レセプターへのリガンドの親和性、体内の分布プロファイル、体内での半減期などの種々の薬理学的パラメータをはじめとした種々の因子、もしあれば、望まれない副作用、並びに年齢及び性別などの因子に依存する。
【0084】
移行句「～から本質的になる」又は「本質的に～からなる」は、アミノ酸配列又は核酸配列に言及しているとき、列挙された配列を含む配列のことを指し、タンパク質自体の基本的な特性及び新規特性又はその核酸配列によってコードされるタンパク質に実質的に影響しない、存在する又は存在しない非列挙配列に対してオープンである。
【0085】
別段示されない限り、本明細書において使用されるすべての数字は、すべての場合において用語「約」によって修飾されていると理解されるべきである。したがって、反対のことが示されない限り、本明細書に示されている数値パラメータは、本発明によって得られる所望の特性に応じて最大プラス又はマイナス１０％変動し得る近似値である。
【0086】
等価物及び範囲
当業者は、本明細書中に記載される開示に従ったある特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、又は日常的な実験以上のものを用いずに確認することができるだろう。本開示の範囲は、上記の説明に限定されると意図されておらず、むしろ添付の請求項に示されているとおりである。
当業者は、本明細書中に記載される開示に従ったある特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、又は日常的な実験以上のものを用いずに確認することができるだろう。本開示の範囲は、上記の説明に限定されると意図されておらず、むしろ添付の請求項に示されているとおりである。
【0087】
請求項において、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」などの冠詞は、反対のことが示されない限り、又は文脈から明らかでない限り、１つ又は１つより多い、を意味し得る。ある群の１つ以上のメンバーの間に「又は」を含む請求項又は説明は、反対のことが示されない限り、又は文脈から明らかでない限り、１つ、１つより多い、又はすべての群メンバーが、所与の製品若しくはプロセスに存在するか、所与の製品若しくはプロセスにおいて使用されるか、又は所与の製品若しくはプロセスに関連する場合に満たされると見なされる。本開示は、その群の厳密に１つのメンバーが、所与の製品若しくはプロセスに存在するか、所与の製品若しくはプロセスにおいて使用されるか、又は所与の製品若しくはプロセスに関連する、いくつかの実施形態を含む。本開示は、１つより多い群メンバー又は群メンバー全体が、所与の製品若しくはプロセスに存在するか、所与の製品若しくはプロセスにおいて使用されるか、又は所与の製品若しくはプロセスに関連する、いくつかの実施形態を含む。
【0088】
用語「～を含む」は、オープンであることを意図しており、追加のエレメント又は工程の包含を許容するが要求しないことにも注意されたい。ゆえに、用語「～を含む」が本明細書中で使用されるとき、用語「～からなる」も包含され、開示される。
【0089】
範囲が与えられる場合、終点は含まれる。さらに、別段示されない限り、又は文脈及び当業者の理解から明らかでない限り、範囲として表現される値は、文脈が明らかに他のことを指示しない限り、本開示の種々の実施形態における記載の範囲内の任意の具体的な値又は部分的な範囲を、その範囲の下限の単位の１０分の１まで想定できると理解されるべきである。
【0090】
さらに、従来技術の範囲に含まれる本開示の任意の特定の実施形態は、請求項のいずれか１つ以上から明示的に除外され得ると理解されるべきである。そのような実施形態は、当業者に公知であるとみなされるので、除外が本明細書中に明示的に示されていなかったとしても除外され得る。本開示の組成物の任意の特定の実施形態（例えば、任意の抗生物質、治療成分又は活性成分；任意の生成方法；任意の使用方法など）は、従来技術の存在に関係するか否かを問わず、何らかの理由でいずれか１つ以上の請求項から除外されることがある。
【0091】
使用されてきた単語は、限定ではなく説明の単語であり、その広い態様における本開示の真の範囲及び趣旨から逸脱することなく、添付の請求項の範囲内で変更がなされ得ることが理解されるべきである。
【0092】
本開示は、記載されたいくつかの実施形態に関して、かなり長く、いくらか詳細に説明されてきたが、そのような任意の詳細若しくは実施形態又は任意の特定の実施形態に限定されるべきであるとは意図されておらず、従来技術を考慮してそのような請求項の考えられる最も広い解釈を提供するように、ゆえに、本開示の意図される範囲を有効に包含するように、添付の請求項に関して解釈されるべきである。
【0093】
ここから、本発明を以下の非限定的な実施例によって例証していく。
【実施例】
【0094】
［材料及び方法］
（細胞株）
Ｂ３Ｚは、活性化Ｔ細胞核内因子（ＮＦＡＴ）－ｌａｃＺ誘導性レポーター遺伝子を有する、ＯＶＡ２５７－２６４特異的Ｈ－２Ｋｂ制限（ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ）ＣＴＬハイブリドーマである。ＨＥＫ－２９３Ｔは、Ｔ抗原を発現するヒト胎児腎細胞株である。
（細胞株）
Ｂ３Ｚは、活性化Ｔ細胞核内因子（ＮＦＡＴ）－ｌａｃＺ誘導性レポーター遺伝子を有する、ＯＶＡ２５７－２６４特異的Ｈ－２Ｋｂ制限（ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ）ＣＴＬハイブリドーマである。ＨＥＫ－２９３Ｔは、Ｔ抗原を発現するヒト胎児腎細胞株である。
【0095】
Ｍ５７９（５７９）は、ＨＬＡ－Ａ２陰性メラノーマ細胞株であり、５７９－Ａ２は、ＨＬＡ－Ａ２を発現する５７９トランスフェクタントである。Ｂ３Ｚは、活性化Ｔ細胞核内因子（ＮＦＡＴ）－ｌａｃＺ誘導性レポーター遺伝子を有する、ＯＶＡ２５７－２６４－Ｈ－２Ｋｂ特異的マウスＴ細胞ハイブリドーマである。
【0096】
（ヒトＴ細胞の培養）
ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をＭＤＡ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｔｅｌ－Ｈａｓｈｏｍｅｒ，Ｉｓｒａｅｌ）から入手した。
ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をＭＤＡ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｔｅｌ－Ｈａｓｈｏｍｅｒ，Ｉｓｒａｅｌ）から入手した。
【0097】
ヒトリンパ球を、１０％熱失活ヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）又はＦＣＳ、ＰＢＭＣ培養用及び腫瘍浸潤白血球（ＴＩＬ）培養物用にそれぞれ３００及び６，０００ＩＵ／ｍｌの組換えヒトＩＬ－２（ｒｈＩＬ－２；Ｃｈｉｒｏｎ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、２ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ－グルタミン、１ｍｍｏｌ／Ｌピルビン酸ナトリウム、１％非必須アミノ酸、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０μＭ ２－メルカプトエタノール、並びに抗生物質の組み合わせが補充されたＲＰＭＩ１６４０完全培地中で培養した。
【0098】
ＣＤ８Ｔ細胞を、磁気ビーズ（ＢＤ）を用いたポジティブセレクションによって分離し、可溶性ＯＫＴ３ ｍＡｂ及び抗ＣＤ２８ ｍＡｂ並びに１０００Ｕ／ｍｌ組換えヒトＩＬ－２（ｒｈＩＬ－２，Ｃｈｉｒｏｎ）の存在下において３～４日間生育した。
【0099】
（プラスミド及び遺伝子クローニング）
ＣＡＲ遺伝子を、ｐＧＥＭ４Ｚ／ＥＧＦＰ／Ａ６４ベクター［４３］において、インビトロ転写用のＤＮＡテンプレートとしてモジュール方式の制限クローニングを介してアセンブルした。ＮＦ－κＢアッセイの場合には、ＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼレポータープラスミドを使用した。
ＣＡＲ遺伝子を、ｐＧＥＭ４Ｚ／ＥＧＦＰ／Ａ６４ベクター［４３］において、インビトロ転写用のＤＮＡテンプレートとしてモジュール方式の制限クローニングを介してアセンブルした。ＮＦ－κＢアッセイの場合には、ＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼレポータープラスミドを使用した。
【0100】
上記コンストラクトは、表１に詳述される配列を含む。
【0101】
【表1】
【0102】
（ｍＲＮＡのインビトロ転写）
鋳型プラスミドをＳｐｅＩで線状化した。転写及びキャッピング反応を、ＡｍｐｌｉＣａｐ－Ｍａｘ Ｔ７ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ Ｍｅｓｓａｇｅ Ｍａｋｅｒ Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて行った。製造者の指示書に従って、ｍＲＮＡ産物をＤＮａｓｅ－Ｉ消化によって精製した後、ＬｉＣｌ沈殿を行った。ｍＲＮＡ産物の品質をアガロースゲル電気泳動によって評価し、分光光度的解析によって濃度を測定した。精製されたｍＲＮＡを少量のアリコートとして－８０℃で保存した。
鋳型プラスミドをＳｐｅＩで線状化した。転写及びキャッピング反応を、ＡｍｐｌｉＣａｐ－Ｍａｘ Ｔ７ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ Ｍｅｓｓａｇｅ Ｍａｋｅｒ Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて行った。製造者の指示書に従って、ｍＲＮＡ産物をＤＮａｓｅ－Ｉ消化によって精製した後、ＬｉＣｌ沈殿を行った。ｍＲＮＡ産物の品質をアガロースゲル電気泳動によって評価し、分光光度的解析によって濃度を測定した。精製されたｍＲＮＡを少量のアリコートとして－８０℃で保存した。
【0103】
（ヒトＴ細胞のｍＲＮＡエレクトロポレーション）
エレクトロポレーションを、ＥＣＭ８３０ Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｓｑｕａｒｅ Ｗａｖｅ Ｐｏｒａｔｏｒ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ＢＴＸ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）をＬＶモード、単一パルス、５００Ｖ、１ｍｓｅｃで用いて、又はＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を冷２ｍｍキュベットにおいて方形波パルス、５００Ｖ、１ｍｓｅｃで用いて、以下のように行った：刺激されたＣＤ８Ｔ細胞及びＴＩＬをＯｐｔｉＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）で２回洗浄し、３×１０７／ｍｌという最終濃度でＯｐｔｉＭＥＭに再懸濁した。エレクトロポレーションに向けて、予冷した０．１～０．４ｍｌの細胞（氷上で５分）を、インビトロで転写された必要量のｍＲＮＡと混合した。１つより多いｍＲＮＡ種が関わるトランスフェクション実験では、適切な量の無関係なｍＲＮＡをＴ細胞に同時に導入し、外来性ｍＲＮＡの総量を正規化した。
エレクトロポレーションを、ＥＣＭ８３０ Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｓｑｕａｒｅ Ｗａｖｅ Ｐｏｒａｔｏｒ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ＢＴＸ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）をＬＶモード、単一パルス、５００Ｖ、１ｍｓｅｃで用いて、又はＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を冷２ｍｍキュベットにおいて方形波パルス、５００Ｖ、１ｍｓｅｃで用いて、以下のように行った：刺激されたＣＤ８Ｔ細胞及びＴＩＬをＯｐｔｉＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）で２回洗浄し、３×１０７／ｍｌという最終濃度でＯｐｔｉＭＥＭに再懸濁した。エレクトロポレーションに向けて、予冷した０．１～０．４ｍｌの細胞（氷上で５分）を、インビトロで転写された必要量のｍＲＮＡと混合した。１つより多いｍＲＮＡ種が関わるトランスフェクション実験では、適切な量の無関係なｍＲＮＡをＴ細胞に同時に導入し、外来性ｍＲＮＡの総量を正規化した。
【0104】
（フローサイトメトリー解析）
細胞を収集し、冷ＦＡＣＳ緩衝液（１％ＦＣＳ及び０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）で１回洗浄し、製造者が推奨する濃度にてそれぞれのＡｂ－コンジュゲートとともに４℃の暗所で３０分間インキュベートした。細胞を再度、４ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、０．１％アジ化ナトリウムを含む０．３ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ又はＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いてフローサイトメトリーに供した。ＬＳＲＩＩ（ＢＤ）及びＦＣＳｅｘｐｒｅｓｓ（ＤｅＮｏｖｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）によって、データを解析した。
細胞を収集し、冷ＦＡＣＳ緩衝液（１％ＦＣＳ及び０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）で１回洗浄し、製造者が推奨する濃度にてそれぞれのＡｂ－コンジュゲートとともに４℃の暗所で３０分間インキュベートした。細胞を再度、４ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、０．１％アジ化ナトリウムを含む０．３ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ又はＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いてフローサイトメトリーに供した。ＬＳＲＩＩ（ＢＤ）及びＦＣＳｅｘｐｒｅｓｓ（ＤｅＮｏｖｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）によって、データを解析した。
【0105】
（Ｔ細胞活性化アッセイ）
Ｂ３Ｚ Ｔ細胞活性化に対するクロロフェノールレッドβ－Ｄガラクトピラノシド（ＣＰＲＧ）アッセイ：細胞媒介性又は抗体媒介性の活性化の後、増殖培地を除去し、１００μｌの溶解緩衝液（９ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１２５％ＮＰ４０、０．３ｍＭ ＣＰＲＧのＰＢＳ溶液）を各ウェルに加えた。溶解の１～２４時間後、ＥＬＩＳＡリーダー（５７０ｎｍ、参照として６３０ｎｍを用いる）を用いて各ウェルの光学濃度（Ｏ．Ｄ．）を確認した。抗原特異的ヒトＣＤ８Ｔ細胞応答をアッセイするために、細胞を洗浄し、それぞれのメラノーマ標的細胞と１：１というエフェクター対ターゲット比で２４時間、完全培地中で共培養した。増殖培地に分泌されたＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α及びＧＭ－ＣＳＦを、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いてモニターした。
Ｂ３Ｚ Ｔ細胞活性化に対するクロロフェノールレッドβ－Ｄガラクトピラノシド（ＣＰＲＧ）アッセイ：細胞媒介性又は抗体媒介性の活性化の後、増殖培地を除去し、１００μｌの溶解緩衝液（９ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１２５％ＮＰ４０、０．３ｍＭ ＣＰＲＧのＰＢＳ溶液）を各ウェルに加えた。溶解の１～２４時間後、ＥＬＩＳＡリーダー（５７０ｎｍ、参照として６３０ｎｍを用いる）を用いて各ウェルの光学濃度（Ｏ．Ｄ．）を確認した。抗原特異的ヒトＣＤ８Ｔ細胞応答をアッセイするために、細胞を洗浄し、それぞれのメラノーマ標的細胞と１：１というエフェクター対ターゲット比で２４時間、完全培地中で共培養した。増殖培地に分泌されたＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α及びＧＭ－ＣＳＦを、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いてモニターした。
【0106】
（ＮＦ－κＢ活性に対するルシフェラーゼレポーターアッセイ）
ＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼレポータープラスミドを、研究中の特定の遺伝子とともに様々な接着性細胞株に一過性にトランスフェクションすることによって、ＮＦ－κＢ活性を計測した。トランスフェクションの１２～４８時間後に、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ Ｐｒｏマイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ，Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって、細胞溶解産物中のルシフェラーゼ活性をモニターした。
ＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼレポータープラスミドを、研究中の特定の遺伝子とともに様々な接着性細胞株に一過性にトランスフェクションすることによって、ＮＦ－κＢ活性を計測した。トランスフェクションの１２～４８時間後に、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ Ｐｒｏマイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ，Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって、細胞溶解産物中のルシフェラーゼ活性をモニターした。
【0107】
（共培養実験）
エレクトロポレーションの７時間後に、Ｔ細胞及びメラノーマ標的細胞を、Ｂ３Ｚに対しては１：１というエフェクター対ターゲット比で、ヒトＣＤ８Ｔ細胞に対しては３：１というエフェクター対ターゲット比で、３つ組で１８時間、共培養した。細胞表面マーカーを解析するために、Ｔ細胞を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ）を用いるフローサイトメトリー解析に供した。サイトカインの分泌をモニターするために、市販のＥＬＩＳＡキットを用いて、増殖培地を解析した。
エレクトロポレーションの７時間後に、Ｔ細胞及びメラノーマ標的細胞を、Ｂ３Ｚに対しては１：１というエフェクター対ターゲット比で、ヒトＣＤ８Ｔ細胞に対しては３：１というエフェクター対ターゲット比で、３つ組で１８時間、共培養した。細胞表面マーカーを解析するために、Ｔ細胞を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ）を用いるフローサイトメトリー解析に供した。サイトカインの分泌をモニターするために、市販のＥＬＩＳＡキットを用いて、増殖培地を解析した。
【0108】
（細胞傷害性アッセイ）
サイトカインＥＬＩＳＡに向けて、ＣＤ８Ｔ細胞とメラノーマ標的細胞とを、上に記載されたように共培養した。共培養の１８時間後、細胞を増殖培地とともにＦＡＣＳチューブに移し、１，５００ＲＰＭで７分間遠心し、上清を、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）細胞傷害性アッセイ用の市販のキット（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ，Ｍｉｌｐｉｔａｓ，ＣＡ）を用いて標的細胞の殺傷についてアッセイした。
サイトカインＥＬＩＳＡに向けて、ＣＤ８Ｔ細胞とメラノーマ標的細胞とを、上に記載されたように共培養した。共培養の１８時間後、細胞を増殖培地とともにＦＡＣＳチューブに移し、１，５００ＲＰＭで７分間遠心し、上清を、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）細胞傷害性アッセイ用の市販のキット（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ，Ｍｉｌｐｉｔａｓ，ＣＡ）を用いて標的細胞の殺傷についてアッセイした。
【0109】
（統計解析）
すべての結果を平均値±ＳＥＭとして示す。ＥＬＩＳＡの結果は、標準誤差（ＳＥＭ）を伴う３つ組の平均値として示す。ＳＰＳＳソフトウェア又はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアにおいて、ノンパラメトリック（ａ－ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ）検定である１元配置分散分析－Ｋｒｕｓｋａｌ Ｗａｌｌｉｓによる多重比較を用いて、統計的有意性を判断した。
すべての結果を平均値±ＳＥＭとして示す。ＥＬＩＳＡの結果は、標準誤差（ＳＥＭ）を伴う３つ組の平均値として示す。ＳＰＳＳソフトウェア又はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアにおいて、ノンパラメトリック（ａ－ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ）検定である１元配置分散分析－Ｋｒｕｓｋａｌ Ｗａｌｌｉｓによる多重比較を用いて、統計的有意性を判断した。
【0110】
［実施例１．ＣＤ４０－ＣＡＲは４－１ＢＢ－ＣＡＲより強いＮＦκＢ活性化を誘導する］
新しい一連のＣＡＲを作製するために、ｐＧＥＭ４Ｚ／ＥＧＦＰ／Ａ６４ベクターを使用して、外部ドメインに抗ＨＬＡ－Ａ２ ｍＡｂ ＢＢ７．２に由来するｓｃＦｖ、Ｍｙｃタグ及びＣＤ８αヒンジ、並びにＦｃＲγ細胞内Ｔ細胞活性化ドメインをコードするｍＲＮＡ合成用の鋳型ＤＮＡカセットを作製した（図１）。
新しい一連のＣＡＲを作製するために、ｐＧＥＭ４Ｚ／ＥＧＦＰ／Ａ６４ベクターを使用して、外部ドメインに抗ＨＬＡ－Ａ２ ｍＡｂ ＢＢ７．２に由来するｓｃＦｖ、Ｍｙｃタグ及びＣＤ８αヒンジ、並びにＦｃＲγ細胞内Ｔ細胞活性化ドメインをコードするｍＲＮＡ合成用の鋳型ＤＮＡカセットを作製した（図１）。
【0111】
ＣＤ２８膜貫通ドメインは、４－１ＢＢより良好な表面発現をサポートすることが報告されたので［４４］、本発明者らも同様に、ＣＤ４０、ＣＤ２８及び４－１ＢＢを評価することにした。この目的で、本発明者らは、４つの第２世代ＣＡＲを構築した：４０（＋）－γ及びＣＤ２８（＋）－γ（それぞれインタクトなヒトＣＤ４０又はＣＤ２８の膜貫通部分及び細胞内部分を有する）、並びに４０－γ及び４－１ＢＢ－γ（ＣＤ２８の膜貫通ドメイン及びＣＤ４０又は４－１ＢＢの細胞内ドメインを含む）（図１）。２つの第３世代ＣＡＲは、ＣＤ２８の膜貫通部分及び細胞内部分に続いて、ＣＤ４０又は４－１ＢＢの細胞内ドメインを含む。
【0112】
Ｍｙｃタグを使用して、これらのＣＡＲがすべて、インビトロで転写されたｍＲＮＡのエレクトロポレーション後に、Ｋ５６２細胞の細胞表面において適切に発現されることをフローサイトメトリーによって確認した（図２）。
【0113】
レポーターマウスＴ細胞ハイブリドーマＢ３Ｚを使用することによって、適切な細胞表面発現及び抗原媒介性のＴ細胞活性化を評価した。共培養実験を行い、６つの各ＣＡＲが、Ｂ３Ｚトランスフェクタントに対して５７９－Ａ２メラノーマ細胞上のＨＬＡ－Ａ２に応答する能力を付与する能力を、親５７９細胞と比較して評価した（図３Ａ）。４０（＋）－γを除くすべてのＣＡＲが、２Ｃ１１抗ＣＤ３ｍＡｂによって誘導された大きさに匹敵する予想された抗原特異性をＢ３Ｚ細胞に与えたが、親５７９細胞に対してもかなりのレベルの抗原非特異的応答が明白だった。興味深いことに、４０－γＣＡＲにおけるＣＤ２８膜貫通ドメインの組み込みは、４０（＋）－γと比べて、より高レベルの表面発現にならなかったのに対し、より頑健な応答をもたらした。
【0114】
本発明者らは、新しいＣＡＲがＮＦ－κＢシグナル伝達経路を活性化する能力（ＨＬＡ－Ａ２（＋）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼレポーターアッセイによって判断される）の評価に進んだ。図３Ｂに見られるように、第３世代ＣＡＲの２８－４０－γは、２８－４１ＢＢ－γ対応物よりもかなり強いシグナル伝達を誘導した。第２世代ＣＡＲの４０（＋）－γ及び４０－γが４１ＢＢ－γより優れていることも観察されたが、２８（＋）－γは、このアッセイにおいて完全に不活性だった。興味深いことに、Ｂ３Ｚ細胞ではＮＦＡＴ経路の活性化が弱かったこととは対照的に、４０（＋）－γコンストラクトの発現は、４０－γよりも強いＮＦ－κＢ活性化をもたらした。
【0115】
［実施例２．ヒトＣＤ８Ｔ細胞の抗原媒介性活性化］
ヒトＴ細胞に対して付与された機能特性を、抗原刺激後に、２対の第２及び第３世代ＣＡＲによって比較した。この目的を達成するために、２人のＨＬＡ－Ａ２（－）健康ドナーの末梢血サンプルからＣＤ８Ｔ細胞を精製した。これらの細胞に、４つの各ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ及び無関係のｍＲＮＡをトランスフェクトし、次いで、トランスフェクタントを５７９－Ａ２及び５７９メラノーマ細胞と共培養した。次の一連の実験のために合成された新しいｍＲＮＡの量及び完全性を確認した後（図示せず）、２人のドナーのＣＤ８Ｔ細胞のエレクトロポレーション後の表面発現は強くなかったことが示された（図示せず）。注目すべきことに、２８－４－１ＢＢ－γは、Ｋ５６２細胞では、２８－４－１ＢＢ－γの発現が試験された他のＣＡＲと同等だったが、それとは異なり、２つの無関係なＣＤ８Ｔ細胞サンプルにおいて比較的低いシグナルをもたらした。その後の共培養実験において、５７９細胞ではなく５７９－Ａ２が、ＣＤ２５及び４－１ＢＢ活性化マーカーのアップレギュレーションを誘導した（図示せず）。同様に、抗原陽性５７９－Ａ２細胞だけが、炎症促進性サイトカインであるＩＦＮ－γ（図４Ａ、Ｄ）、ＴＮＦ－α（図４Ｂ、Ｅ）及びＧＭ－ＣＳＦ（図４Ｃ、Ｆ）の分泌を誘導した。２人のドナーのＣＤ８Ｔ細胞の応答パターンに差があったが、すべてのＣＡＲが、抗原の非存在下での分泌は全くないか又は最小で、３つのサイトカインの明らかな抗原特異的誘導を増強した。そこで、本発明者らは、抗原媒介性の標的細胞殺傷を評価した（図５Ａ～Ｂ）。ここでもまた、いずれのＣＡＲ世代においてもＣＤ４０と４－１ＢＢとの間に識別可能な差は無く、２つのＣＤ８Ｔ細胞サンプルにおいて４つすべてのＣＡＲが、抗原特異的な標的細胞の殺傷を有意に媒介できた。２８－４－１ＢＢ－γの相対的に低レベルの発現に関して、それは、２人のドナーのＣＤ８Ｔ細胞において２８－４０－γのそれと同等の有効な細胞傷害性を媒介したことから、このｍＲＮＡの完全な適格性が証明された。
ヒトＴ細胞に対して付与された機能特性を、抗原刺激後に、２対の第２及び第３世代ＣＡＲによって比較した。この目的を達成するために、２人のＨＬＡ－Ａ２（－）健康ドナーの末梢血サンプルからＣＤ８Ｔ細胞を精製した。これらの細胞に、４つの各ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ及び無関係のｍＲＮＡをトランスフェクトし、次いで、トランスフェクタントを５７９－Ａ２及び５７９メラノーマ細胞と共培養した。次の一連の実験のために合成された新しいｍＲＮＡの量及び完全性を確認した後（図示せず）、２人のドナーのＣＤ８Ｔ細胞のエレクトロポレーション後の表面発現は強くなかったことが示された（図示せず）。注目すべきことに、２８－４－１ＢＢ－γは、Ｋ５６２細胞では、２８－４－１ＢＢ－γの発現が試験された他のＣＡＲと同等だったが、それとは異なり、２つの無関係なＣＤ８Ｔ細胞サンプルにおいて比較的低いシグナルをもたらした。その後の共培養実験において、５７９細胞ではなく５７９－Ａ２が、ＣＤ２５及び４－１ＢＢ活性化マーカーのアップレギュレーションを誘導した（図示せず）。同様に、抗原陽性５７９－Ａ２細胞だけが、炎症促進性サイトカインであるＩＦＮ－γ（図４Ａ、Ｄ）、ＴＮＦ－α（図４Ｂ、Ｅ）及びＧＭ－ＣＳＦ（図４Ｃ、Ｆ）の分泌を誘導した。２人のドナーのＣＤ８Ｔ細胞の応答パターンに差があったが、すべてのＣＡＲが、抗原の非存在下での分泌は全くないか又は最小で、３つのサイトカインの明らかな抗原特異的誘導を増強した。そこで、本発明者らは、抗原媒介性の標的細胞殺傷を評価した（図５Ａ～Ｂ）。ここでもまた、いずれのＣＡＲ世代においてもＣＤ４０と４－１ＢＢとの間に識別可能な差は無く、２つのＣＤ８Ｔ細胞サンプルにおいて４つすべてのＣＡＲが、抗原特異的な標的細胞の殺傷を有意に媒介できた。２８－４－１ＢＢ－γの相対的に低レベルの発現に関して、それは、２人のドナーのＣＤ８Ｔ細胞において２８－４０－γのそれと同等の有効な細胞傷害性を媒介したことから、このｍＲＮＡの完全な適格性が証明された。
【0116】
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【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図4F】
【図5A】
【図5B】
【配列表】
【国際調査報告】