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特表2022-548024脂肪分解活性の検出のための組成物、方法、およびキット
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-11-16
(54)【発明の名称】脂肪分解活性の検出のための組成物、方法、およびキット
(51)【国際特許分類】
G01N 33/50 20060101AFI20221109BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20221109BHJP
C12Q 1/34 20060101ALI20221109BHJP
G01N 33/92 20060101ALI20221109BHJP
【ＦＩ】
G01N33/50 T
C12Q1/02
C12Q1/34
G01N33/92 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022516037
(86)(22)【出願日】2020-09-09
(85)【翻訳文提出日】2022-03-11
(86)【国際出願番号】 US2020049992
(87)【国際公開番号】W WO2021050585
(87)【国際公開日】2021-03-18
(31)【優先権主張番号】62/899,638
(32)【優先日】2019-09-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/905,926
(32)【優先日】2019-09-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/964,938
(32)【優先日】2020-01-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．ＰＬＵＲＯＮＩＣ
３．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】391003864
【氏名又は名称】ロンザ リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＬＯＮＺＡ ＬＩＭＩＴＥＤ
(74)【代理人】
【識別番号】100127926
【弁理士】
【氏名又は名称】結田 純次
(74)【代理人】
【識別番号】100140132
【弁理士】
【氏名又は名称】竹林 則幸
(72)【発明者】
【氏名】ハンス－クリスティアン・マーラー
(72)【発明者】
【氏名】フィリップ・フェドロヴィッチ
(72)【発明者】
【氏名】ミヒャエル・ヤーン
(72)【発明者】
【氏名】アンドレアス・ツェル
(72)【発明者】
【氏名】アタナス・コウロヴ
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
【Ｆターム（参考）】
2G045CB30
2G045DA20
2G045DA60
2G045FB12
4B063QA01
4B063QA05
4B063QQ02
4B063QQ08
4B063QQ30
4B063QQ79
4B063QR41
4B063QX02
(57)【要約】
本開示は、脂肪分解活性を検出するための組成物、方法、およびキットを提供する。一部の実施形態では、組成物は、水性アッセイ試料と有機溶媒とを含み、有機溶媒が、４－メチルウンベリフェリルオレエート（４ＭｕＯ）を含む。また、タンパク質調製物の安定性を決定するための方法も本明細書に提供される。
【選択図】図１Ａ
【選択図】図１Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
組成物であって、ａ．タンパク質調製物を含む水性アッセイ試料と、
ｂ．有機溶媒であって、４－メチルウンベリフェリルオレエート（４ＭｕＯ）をさらに含む、有機溶媒と、
を含み、
前記水性アッセイ試料が、５．０～７．０のｐＨを有し、
前記水性アッセイ試料が、前記組成物の約８０％～約９９．９％であり、前記有機溶媒が、前記組成物の約０．１％～約２０％である、組成物。
【請求項2】
前記タンパク質調製物が、細胞培養上清である、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記タンパク質調製物が、部分的に精製されたタンパク質調製物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項4】
前記タンパク質調製物が、精製されたタンパク質調製物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項5】
前記タンパク質調製物が、治療用タンパク質を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項6】
前記タンパク質調製物が、界面活性剤を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項7】
前記界面活性剤が、ポリソルベートである、請求項６に記載の組成物。
【請求項8】
前記ポリソルベートが、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、またはそれらの組み合わせである、請求項７に記載の組成物。
【請求項9】
前記タンパク質調製物が、追加の宿主細胞タンパク質をさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項10】
前記水性アッセイ試料が、緩衝剤、塩、またはそれらの両方をさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項11】
前記塩が、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、またはそれらの組み合わせである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項12】
前記塩が、塩化ナトリウムおよび塩化カルシウムである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項13】
前記塩化ナトリウムが、前記水性アッセイ試料中で、約５０ｍＭ～約４００ｍＭである、請求項１１または１２に記載の組成物。
【請求項14】
前記塩化ナトリウムが、前記水性アッセイ試料中で、約１００ｍＭ～約２００ｍＭである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項15】
前記塩化カルシウムが、前記水性アッセイ試料中で、約０．２ｍＭ～約１０ｍＭである、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項16】
前記塩化カルシウムが、前記水性アッセイ試料中で、約１．０ｍＭ～約２．０ｍＭである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項17】
前記緩衝剤が、約ｐＨ６．０で緩衝能を有する、請求項１０～１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項18】
前記緩衝剤が、Ｔｒｉｓである、請求項１０～１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項19】
前記緩衝剤が、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓである、請求項１０～１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項20】
前記緩衝剤が、前記水性アッセイ試料中で、約２ｍＭ～約２００ｍＭである、請求項１０～１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項21】
前記緩衝剤が、前記水性アッセイ試料中で、約１０ｍＭ～約１００ｍＭである、請求項２０に記載の組成物。
【請求項22】
前記緩衝剤が、前記水性アッセイ試料中で、約４０ｍＭ～約６０ｍＭである、請求項２１に記載の組成物。
【請求項23】
前記有機溶媒が、アルコール、スルホキシド、ニトリル、またはそれらの組み合わせである、請求項１～２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項24】
前記有機溶媒が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項25】
前記有機溶媒が、アセトニトリルを含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項26】
前記有機溶媒が、アルコールを含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項27】
前記有機溶媒が、アセトニトリルおよびイソプロパノールの混合物を含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項28】
前記有機溶媒が、Ｃ１－Ｃ６アルコールである、請求項２３に記載の組成物。
【請求項29】
前記有機溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ｓｅｃ－ブタノール、イソブタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール、またはそれらの組み合わせである、請求項２８に記載の組成物。
【請求項30】
前記組成物が、リパーゼ阻害剤をさらに含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項31】
前記リパーゼ阻害剤が、（Ｓ）－２－ホルミルアミノ－４－メチル－ペンタン酸（Ｓ）－１－［［（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヘキシル－４－オキソ－２－オキセタニル］メチル］－ドデシルエステル（オルリスタット）である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項32】
前記リパーゼ阻害剤が、前記有機溶媒中にある、請求項３０または３１に記載の組成物。
【請求項33】
前記リパーゼ阻害剤が、前記組成物中で、約１μＭ～約５０μＭである、請求項３０～３２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項34】
前記リパーゼ阻害剤が、前記組成物中で、約５μＭ～約２５μＭである、請求項３３に記載の組成物。
【請求項35】
組成物であって、ａ．水性アッセイ試料であって、
ｉ．精製されたタンパク質調製物、
ｉｉ．緩衝剤、および
ｉｉｉ．塩、
を含む、水性アッセイ試料と、
ｂ．有機溶媒であって、４－メチルウンベリフェリルオレエート（４ＭｕＯ）をさらに含む、有機溶媒と、
を含み、
前記水性アッセイ試料が、５．０～７．０のｐＨを有し、
前記水性アッセイ試料が、前記組成物の約８０％～約９９．９％であり、前記有機溶媒が、前記組成物の約０．１％～約２０％である、組成物。
【請求項36】
組成物であって、ａ．約９０％～約９９．９％（体積／体積）の水性アッセイ試料であって、
ｉ．タンパク質および脂質を含む精製されたタンパク質調製物、
ｉｉ．緩衝剤、
ｉｉｉ．約１．０ｍＭ～約２．０ｍＭの塩化カルシウム、および
ｉｖ．約１００ｍＭ～約２００ｍＭの塩化ナトリウム、
を含む、水性アッセイ試料と、
ｂ．メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ｓｅｃ－ブタノール、イソブタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトニトリル、またはそれらの組み合わせから選択される約１０％～約０．１％（体積／体積）の有機溶媒であって、４－メチルウンベリフェリルオレエート（４ＭｕＯ）をさらに含む、有機溶媒と、
を含み、
前記水性アッセイ試料が、５．０～７．０のｐＨを有する、組成物。
【請求項37】
水性アッセイ試料中の脂肪分解活性を検出する方法であって、前記方法が、ａ．タンパク質調製物を含む前記水性アッセイ試料を、４－メチルウンベリフェリルオレエート（４ＭｕＯ）を含む有機溶媒と組み合わせることと、
ｂ．蛍光によって、オレエートおよび４－メチルウンベリフェロン（４Ｍｕ）の形成を測定することと、
を含む、方法。
【請求項38】
水性アッセイ試料中の脂肪分解活性を検出する方法であって、前記方法が、ａ．タンパク質調製物を含む前記水性アッセイ試料を、４－メチルウンベリフェリルオレエート（４ＭｕＯ）を含む有機溶媒と組み合わせて、アッセイ組成物を形成することと、
ｂ．タンパク質調製物およびリパーゼ阻害剤を含む対照試料を、４－メチルウンベリフェリルオレエート（４ＭｕＯ）を含む有機溶媒と組み合わせて、対照組成物を形成することと、
ｃ．蛍光によって、前記アッセイ組成物中および前記対照組成物中のオレエートおよび４－メチルウンベリフェロン（４Ｍｕ）の形成を測定することと、
を含む、方法。
【請求項39】
タンパク質調製物の安定性を決定する方法であって、ａ．前記タンパク質調製物を含む水性アッセイ試料を、４－メチルウンベリフェリルオレエート（４ＭｕＯ）を含む有機溶媒と組み合わせることと、
ｂ．蛍光によって、オレエートおよび４－メチルウンベリフェロン（４Ｍｕ）の形成を測定することと、
ｃ．測定された前記蛍光に基づいて、前記タンパク質調製物の安定性を決定することと、
を含む、方法。
【請求項40】
前記水性アッセイ試料が、５．０～７．０のｐＨを有する、請求項３７～３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項41】
前記水性アッセイ試料および前記有機溶媒が、約８０：２０～約９９．９：０．１の比率で組み合わされる、請求項３７～４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項42】
前記水性アッセイ試料および前記有機溶媒が、約９０：１０～約９８：２の比率で組み合わされる、請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
前記蛍光が、３３０ｎｍでの蛍光励起および４９５ｎｍでの蛍光発光によって測定される、請求項３７～４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項44】
前記蛍光が、最大２４時間測定される、請求項３７～４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項45】
前記蛍光が、約２４時間～約４００時間測定される、請求項３７～４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項46】
前記蛍光が、約１００時間を超えて測定される、請求項３７～４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項47】
前記タンパク質調製物が、細胞培養上清である、請求項３７～４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項48】
前記タンパク質調製物が、部分的に精製されたタンパク質調製物である、請求項３７～４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項49】
前記タンパク質調製物が、精製されたタンパク質調製物である、請求項３７～４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項50】
前記タンパク質調製物が、治療用タンパク質を含む、請求項３７～４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項51】
前記タンパク質調製物が、界面活性剤を含む、請求項３７～５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項52】
前記界面活性剤が、ポリソルベートである、請求項５１に記載の方法。
【請求項53】
前記ポリソルベートが、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、またはそれらの組み合わせである、請求項５２に記載の方法。
【請求項54】
前記タンパク質調製物が、追加の宿主細胞タンパク質をさらに含む、請求項３７～５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項55】
前記水性アッセイ試料が、緩衝剤、塩、またはそれらの両方をさらに含む、請求項３７～５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項56】
前記塩が、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、またはそれらの組み合わせである、請求項５５に記載の方法。
【請求項57】
前記塩が、塩化ナトリウムおよび塩化カルシウムである、請求項５５に記載の方法。
【請求項58】
前記塩化ナトリウムが、前記水性アッセイ試料中で、約５０ｍＭ～約４００ｍＭである、請求項５６または５７に記載の方法。
【請求項59】
前記塩化ナトリウムが、前記水性アッセイ試料中で、約１００ｍＭ～約２００ｍＭである、請求項５８に記載の方法。
【請求項60】
前記塩化カルシウムが、前記水性アッセイ試料中で、約０．２ｍＭ～約１０ｍＭである、請求項５６～５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項61】
前記塩化カルシウムが、前記水性アッセイ試料中で、約１．０ｍＭ～約２．０ｍＭである、請求項６０に記載の方法。
【請求項62】
前記緩衝剤が、約ｐＨ６．０で緩衝能を有する、請求項５５～６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項63】
前記緩衝剤が、Ｔｒｉｓである、請求項５５～６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項64】
前記緩衝剤が、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓである、請求項５５～６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項65】
前記緩衝剤が、前記水性アッセイ試料中で、約２ｍＭ～約２００ｍＭである、請求項５５～６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項66】
前記緩衝剤は、前記水性アッセイ試料中で、約１０ｍＭ～約１００ｍＭである、請求項６５に記載の方法。
【請求項67】
前記緩衝剤が、前記水性アッセイ試料中で、約４０ｍＭ～約６０ｍＭである、請求項６６に記載の方法。
【請求項68】
前記有機溶媒が、アルコール、スルホキシド、ニトリル、またはそれらの組み合わせである、請求項３７～６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項69】
前記有機溶媒が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である、請求項６８に記載の方法。
【請求項70】
前記有機溶媒が、アセトニトリルを含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項71】
前記有機溶媒が、アルコールを含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項72】
前記有機溶媒が、アセトニトリルおよびイソプロパノールを含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項73】
前記有機溶媒が、Ｃ１－Ｃ６アルコールである、請求項６８に記載の方法。
【請求項74】
前記有機溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ｓｅｃ－ブタノール、イソブタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール、またはそれらの組み合わせである、請求項７３に記載の方法。
【請求項75】
前記水性アッセイ試料が、ステップ（ａ）の前に、リパーゼ阻害剤と、約１０分間～約１時間インキュベートされる、請求項３７または４０～７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項76】
前記水性アッセイ試料が、ステップ（ａ）の前に、前記リパーゼ阻害剤と、約３０分間インキュベートされる、請求項７５に記載の方法。
【請求項77】
前記リパーゼ阻害剤が、（Ｓ）－２－ホルミルアミノ－４－メチル－ペンタン酸（Ｓ）－１－［［（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヘキシル－４－オキソ－２－オキセタニル］メチル］－ドデシルエステル（オルリスタット）である、請求項３７、３８、または４０～７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項78】
前記リパーゼ阻害剤が、約１μＭ～約５０μＭで添加される、請求項３８または４０～７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項79】
前記リパーゼ阻害剤が、約５μＭ～約２５μＭで添加される、請求項７８に記載の方法。
【請求項80】
キットであって、２つ以上の容器内に、ａ．有機溶媒と、
ｂ．４－メチルウンベリフェリルオレエート（４ＭｕＯ）と、
ｃ．リパーゼ阻害剤と、
を含む、キット。
【請求項81】
緩衝剤、塩、またはそれらの両方をさらに含む、請求項８０に記載のキット。
【請求項82】
緩衝液交換カラムをさらに含む、請求項８０または８１に記載のキット。
【請求項83】
キットであって、ａ．４－メチルウンベリフェリルオレエート（４ＭｕＯ）を含む有機溶媒と、
ｂ．タンパク質調製物の緩衝液を交換するのに好適なカラムと、
ｃ．リパーゼ阻害剤と、
を含む、キット。
【請求項84】
前記有機溶媒が、アルコール、スルホキシド、ニトリル、またはそれらの組み合わせである、請求項８０～８３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項85】
前記有機溶媒が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である、請求項８４に記載のキット。
【請求項86】
前記有機溶媒が、アセトニトリルを含む、請求項８４に記載のキット。
【請求項87】
前記有機溶媒が、アルコールを含む、請求項８４に記載のキット。
【請求項88】
前記有機溶媒が、アセトニトリルおよびイソプロピルアルコールの混合物を含む、請求項８４に記載のキット。
【請求項89】
前記有機溶媒が、Ｃ１－Ｃ６アルコールである、請求項８４に記載のキット。
【請求項90】
前記有機溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ｓｅｃ－ブタノール、イソブタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール、またはそれらの組み合わせである、請求項８９に記載のキット。
【請求項91】
前記リパーゼ阻害剤が、（Ｓ）－２－ホルミルアミノ－４－メチル－ペンタン酸（Ｓ）－１－［［（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヘキシル－４－オキソ－２－オキセタニル］メチル］－ドデシルエステルである、請求項８０～９０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項92】
前記塩が、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、またはそれらの組み合わせである、請求項８１に記載のキット。
【請求項93】
前記塩が、塩化ナトリウムおよび塩化カルシウムである、請求項８１に記載のキット。
【請求項94】
前記緩衝剤が、Ｔｒｉｓである、請求項８１、９２、または９３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項95】
前記緩衝剤が、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓである、請求項８１、９２、または９３のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、脂肪分解活性を検出および／または定量化するための組成物、方法、およびキットを提供する。また、タンパク質調製物の安定性を決定するための方法も本明細書に提供される。一部の実施形態では、脂肪分解活性を検出するための組成物は、水性アッセイ試料と、有機溶媒と、を含み、有機溶媒は、４－メチルウンベリフェリルオレエート（４ＭｕＯ）を含む。
【背景技術】
【0002】
細胞培養は、治療用タンパク質などの商業的に重要なタンパク質の生成に使用され得る。標的タンパク質の他に、細胞は、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）（例えば、リパーゼ）を産生し、これは、標的タンパク質（例えば、細胞培養上清または細胞溶解物）の産生プール中に見出すことができる。様々なクロマトグラフィーステップ（例えば、モノクローナル抗体の産生の場合、親和性クロマトグラフィー）を含み得る下流の精製プロセスは、一般に、ＨＣＰの大部分を枯渇させることができる。しかしながら、平衡に基づく分離方法および精製方法の自然原理により、ＨＣＰの１００％の枯渇は不可能である場合がある。業界および保健当局によって許容されるＨＣＰ制限は、活性タンパク質の量に対して、約１～１００ｐｐｍである。ＨＣＰは、典型的には、例えば、ＵＳＰ＜１１３２＞に概説されているように、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて総和パラメータ（ｓｕｍ ｐａｒａｍｅｔｅｒ）として測定および報告される。したがって、これらは、典型的には、様々な濃度の異なる宿主由来タンパク質の範囲を含む。ＥＬＩＳＡによって定量化されたのと同じ総ＨＣＰ含有量の薬物は、異なるＨＣＰプロファイルを有する可能性がある。これは、わずかなプロセスの変動が、低濃度の特異的ＨＣＰ（例えば、リパーゼ）の増加を引き起こすという状況につながり得るが、全ＨＣＰアッセイの適用によって検出されない場合がある。したがって、わずかな割合のＨＣＰは、最終タンパク質生成物中に存在し得、触媒活性を有し得る。残留触媒活性は、賦形剤（例えば、ポリソルベートなどの界面活性剤）の安定性、ならびに、最終的には、タンパク質生成物の安定性、品質、および安全性などの生成物の品質に対して悪影響を及ぼし得る。タンパク質が治療用タンパク質（特に、ヒトにおいて使用される治療用タンパク質）である場合、これらの悪影響を最小化するか、または排除することが最も重要であり得る。
【0003】
タンパク質の調製における残留リパーゼ活性（例えば、標的タンパク質の下流精製プロセス中の最適でない枯渇に起因する残留リパーゼ活性）は、一部の賦形剤（例えば、界面活性剤）の加水分解をもたらし得る。結果としては、例えば、界面活性剤からの非極性（したがって、不溶性）長鎖脂肪酸および他の分解物の遊離、ならびに界面活性剤によってもたらされる安定化の喪失に起因する、不可視粒子および可視粒子の形成が含まれ得る。界面活性剤の分解はまた、例えば、タンパク質の分解につながるペルオキシドの生成、またはラウリン酸に誘導されるタンパク質凝集の生成など、タンパク質品質に悪影響を及ぼし得る。界面活性剤の分解はまた、製剤中のそれらの濃度を低下させ、例えば、界面応力（例えば、振盪、凍結／解凍等）に対するタンパク質の不十分な保護を潜在的に引き起こし、また、例えば、分解された界面活性剤に起因する異なるインビボ傾向の生成物の安全性考慮事項の潜在的な差異をもたらす。したがって、残留リパーゼ活性は、賦形剤の加水分解による最終的なタンパク質調製物の品質を損なう可能性がある。例えば、ポリソルベートなどの賦形剤の分解生成物は、注射部位の反応など、患者における安全性の問題を引き起こす可能性もある（例えば、非特許文献１を参照されたい）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ １０７（１１）：２７３５－２７４１（２０１８）
【発明の概要】
【0005】
一部の実施形態では、本開示は、組成物を提供し、（ａ）タンパク質調製物を含む水性アッセイ試料と、（ｂ）有機溶媒と、を含み、有機溶媒が、４－メチルウンベリフェリルオレエート（４ＭｕＯ）をさらに含み、水性アッセイ試料が、５．０～７．０のｐＨを有し、水性アッセイ試料が、組成物の約８０％～約９９．９％であり、有機溶媒が、組成物の約０．１％～約２０％である。
【0006】
一部の実施形態では、タンパク質調製物は、細胞培養上清である。一部の実施形態では、タンパク質調製物は、部分的に精製されたタンパク質調製物である。一部の実施形態では、タンパク質調製物は、精製されたタンパク質調製物である。
【0007】
一部の実施形態では、タンパク質調製物は、治療用タンパク質を含む。
【0008】
一部の実施形態では、タンパク質調製物は、界面活性剤を含む。一部の実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベートである。一部の実施形態では、ポリソルベートは、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、またはそれらの組み合わせである。
【0009】
一部の実施形態では、タンパク質調製物は、追加の宿主細胞タンパク質をさらに含む。
【0010】
一部の実施形態では、水性アッセイ試料は、緩衝剤、塩、またはそれらの両方をさらに含む。
【0011】
一部の実施形態では、塩は、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、またはそれらの組み合わせである。一部の実施形態では、塩は、塩化ナトリウムおよび塩化カルシウムである。一部の実施形態では、塩化ナトリウムは、水性アッセイ試料中で、約５０ｍＭ～約４００ｍＭである。一部の実施形態では、塩化ナトリウムは、水性アッセイ試料中で、約１００ｍＭ～約２００ｍＭである。一部の実施形態では、塩化カルシウムは、水性アッセイ試料中で、約０．２ｍＭ～約１０ｍＭである。一部の実施形態では、塩化カルシウムは、水性アッセイ試料中で、約１．０ｍＭ～約２．０ｍＭである。
【0012】
一部の実施形態では、緩衝剤は、約ｐＨ６．０で緩衝能を有する。一部の実施形態では、緩衝剤は、Ｔｒｉｓである。一部の実施形態では、緩衝剤は、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓである。一部の実施形態では、緩衝剤は、水性アッセイ試料中で、約２ｍＭ～約２００ｍＭである。一部の実施形態では、緩衝剤は、水性アッセイ試料中で、約１０ｍＭ～約１００ｍＭである。一部の実施形態では、緩衝剤は、水性アッセイ試料中で、約４０ｍＭ～約６０ｍＭである。一部の実施形態では、緩衝剤は、水性アッセイ試料中で、約４５ｍＭ～約５５ｍＭである。
【0013】
一部の実施形態では、有機溶媒は、アルコール、スルホキシド、ニトリル、またはそれらの組み合わせである。一部の実施形態では、有機溶媒は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である。一部の実施形態では、有機溶媒は、アセトニトリルを含む。
【0014】
一部の実施形態では、有機溶媒は、アルコールを含む。一部の実施形態では、有機溶媒は、アセトニトリルおよびイソプロパノールの混合物を含む。一部の実施形態では、有機溶媒は、Ｃ１－Ｃ６アルコールである。一部の実施形態では、有機溶媒は、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ｓｅｃ－ブタノール、イソブタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール、またはそれらの組み合わせである。
【0015】
一部の実施形態では、組成物は、リパーゼ阻害剤をさらに含む。一部の実施形態では、リパーゼ阻害剤は、（Ｓ）－２－ホルミルアミノ－４－メチル－ペンタン酸（Ｓ）－１－［［（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヘキシル－４－オキソ－２－オキセタニル］メチル］－ドデシルエステル（オルリスタット）である。
【0016】
一部の実施形態では、リパーゼ阻害剤は、有機溶媒中にある。一部の実施形態では、リパーゼ阻害剤は、組成物中で、約１μＭ～約５０μＭである。一部の実施形態では、リパーゼ阻害剤は、組成物中で、約５μＭ～約２５μＭである。
【0017】
一部の実施形態では、本開示は、組成物を提供し、（ａ）（ｉ）精製されたタンパク質調製物、（ｉｉ）緩衝剤、および（ｉｉｉ）塩を含む水性アッセイ試料と、（ｂ）有機溶媒と、を含み、有機溶媒が、４－メチルウンベリフェリルオレエート（４ＭｕＯ）をさらに含み、水性アッセイ試料が、５．０～７．０のｐＨを有し、水性アッセイ試料が、組成物の約８０％～約９９．９％であり、有機溶媒が、組成物の約０．１％～約２０％である。
【0018】
一部の実施形態では、本開示は、組成物を提供し、（ａ）（ｉ）タンパク質および脂質を含む精製されたタンパク質調製物、（ｉｉ）緩衝剤、（ｉｉｉ）約１．０ｍＭ～約２．０ｍＭの塩化カルシウム、および（ｉｖ）約１００ｍＭ～約２００ｍＭの塩化ナトリウムを含む、約９０％～約９９．９％（体積／体積）の水性アッセイ試料と、（ｂ）メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ｓｅｃ－ブタノール、イソブタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトニトリル、またはそれらの組み合わせから選択される約１０％～約０．１％（体積／体積）の有機溶媒であって、４－メチルウンベリフェリルオレエート（４ＭｕＯ）をさらに含む、有機溶媒と、を含み、水性アッセイ試料が、５．０～７．０のｐＨを有する。
【0019】
一部の実施形態では、本開示は、水性アッセイ試料中の脂肪分解活性を検出する方法を提供し、当該方法は、（ａ）タンパク質調製物を含む水性アッセイ試料を、４－メチルウンベリフェリルオレエート（４ＭｕＯ）を含む有機溶媒と組み合わせることと、（ｂ）蛍光によって、オレエートおよび４－メチルウンベリフェロン（４Ｍｕ）の形成を測定することと、を含む。
【0020】
一部の実施形態では、本開示は、水性アッセイ試料中の脂肪分解活性を検出する方法を提供し、当該方法は、（ａ）タンパク質調製物を含む水性アッセイ試料を、４－メチルウンベリフェリルオレエート（４ＭｕＯ）を含む有機溶媒と組み合わせて、アッセイ組成物を形成することと、（ｂ）タンパク質調製物およびリパーゼ阻害剤を含む対照試料を、４－メチルウンベリフェリルオレエート（４ＭｕＯ）を含む有機溶媒と組み合わせて、対照組成物を形成することと、（ｃ）アッセイ組成物および対照組成物中の蛍光によって、オレエートおよび４－メチルウンベリフェロン（４Ｍｕ）の形成を測定することと、を含む。
【0021】
一部の実施形態では、本開示は、タンパク質調製物の安定性を決定する方法を提供し、（ａ）タンパク質調製物を含む水性アッセイ試料を、４－メチルウンベリフェリルオレエート（４ＭｕＯ）を含む有機溶媒と組み合わせることと、（ｂ）蛍光によって、オレエートおよび４－メチルウンベリフェロン（４Ｍｕ）の形成を測定することと、（ｃ）測定された蛍光に基づいて、タンパク質調製物の安定性を決定することと、を含む。
【0022】
一部の実施形態では、水性アッセイ試料は、５．０～７．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、水性アッセイ試料および有機溶媒は、約８０：２０～約９８：２の比率で組み合わされる。一部の実施形態では、水性アッセイ試料および有機溶媒は、約９０：１０～約９９．９：０．１の比率で組み合わされる。
【0023】
一部の実施形態では、蛍光は、３３０ｎｍでの蛍光励起および４９５ｎｍでの蛍光発光によって測定される。一部の実施形態では、蛍光は、最大２４時間測定される。一部の実施形態では、蛍光は、約２４時間～約４００時間測定される。一部の実施形態では、蛍光は、約１００時間を超えて測定される。
【0024】
一部の実施形態では、水性アッセイ試料は、ステップ（ａ）の前に、約１０分～約１時間リパーゼ阻害剤とインキュベートされる。一部の実施形態では、水性アッセイ試料は、ステップ（ａ）の前に、リパーゼ阻害剤と約３０分間インキュベートされる。一部の実施形態では、リパーゼ阻害剤は、（Ｓ）－２－ホルミルアミノ－４－メチル－ペンタン酸（Ｓ）－１－［［（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヘキシル－４－オキソ－２－オキセタニル］メチル］－ドデシルエステル（オルリスタット）である。一部の実施形態では、リパーゼ阻害剤は、約１μＭ～約５０μＭで添加される。一部の実施形態では、リパーゼ阻害剤は、約５μＭ～約２５μＭで添加される。
【0025】
一部の実施形態では、本開示は、キットを提供し、２つ以上の容器内に、（ａ）有機溶媒と、（ｂ）４－メチルウンベリフェリルオレエート（４ＭｕＯ）と、（ｃ）リパーゼ阻害剤と、を含む。
【0026】
一部の実施形態では、キットは、緩衝剤、塩、またはそれらの両方をさらに含む。一部の実施形態では、キットは、緩衝液交換カラムをさらに含む。
【0027】
一部の実施形態では、本開示は、キットを提供し、当該キットは、（ａ）４－メチルウンベリフェリルオレエート（４ＭｕＯ）を含む有機溶媒と、（ｂ）タンパク質調製物の緩衝液を交換するのに好適なカラムと、（ｃ）リパーゼ阻害剤と、を含む。
【図面の簡単な説明】
【0028】
【図1A】実施例１Ａに関する。図１Ａおよび１Ｂは、それぞれ、ブタ膵臓リパーゼ（ＰＰＬ）活性および４－メチルウンベリフェロン（４Ｍｕ）蛍光クエンチに対する、ＴｒｉｓおよびＢｉｓ－Ｔｒｉｓ緩衝液の緩衝液濃度およびｐＨの影響をそれぞれ示す。
【図1B】実施例１Ａに関する。図１Ａおよび１Ｂは、それぞれ、ブタ膵臓リパーゼ（ＰＰＬ）活性および４－メチルウンベリフェロン（４Ｍｕ）蛍光クエンチに対する、ＴｒｉｓおよびＢｉｓ－Ｔｒｉｓ緩衝液の緩衝液濃度およびｐＨの影響をそれぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【0029】
本開示は、脂肪分解活性を検出するための組成物、方法、およびキットに関する。
【0030】
本明細書で使用される場合、「ａ」または「ａｎ」は、１つ以上を意味し得る。本明細書で使用される場合、単語「ａ」または「ａｎ」は、単語「含む」と併せて使用される場合、１つ以上を意味し得る。本明細書で使用される場合、「別の」または「さらに」は、少なくとも第２またはそれ以上を意味し得る。
【0031】
本出願全体を通して、「約」という用語は、値が、値を決定するために用いられる方法／デバイスの誤差の固有の変動、または研究対象の間に存在する変動を含むことを示すために使用される。典型的には、「約」という用語は、状況に応じて、およそ１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、もしくは２０％以上、またはそれ未満の変動を包含することを意味する。一部の実施形態では、当業者は、「約」という用語によって示される可変性のレベルを、本明細書で使用される文脈から理解するであろう。「約」という用語の使用は、具体的に列挙される値も含むことも理解されるべきである。
【0032】
特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、代替物のみを指すことが明示的に示されない限り、「および／または」を意味するように使用されるか、または代替物は互いに排他的であるが、本開示は、代替物および「および／または」のみを指す定義を支持する。
【0033】
本明細書で使用する場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（ならびに「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」などの「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」の任意の変形もしくは形態）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（ならびに「ｈａｖｅ」および「ｈａｓ」などの「ｈａｖｉｎｇ」の任意の変形もしくは形態）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（ならびに「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」および「ｉｎｃｌｕｄｅ」などの「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」の任意の変形もしくは形態）、または用語「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（ならびに「ｃｏｎｔａｉｎｓ」および「ｃｏｎｔａｉｎ」などの「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ」の任意の変形もしくは形態）という用語は、包含的またはオープンエンドであり、追加の、列挙されていない要素または方法ステップを除外しない。本明細書で論じられる任意の実施形態は、本開示の任意の方法、組成物、および／またはキットに関して実施され得ることが企図される。さらに、本開示の組成物は、本開示の方法およびキットを達成するために使用することができる。
【0034】
用語「例えば（ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ）」およびその対応する略語「例えば（ｅ．ｇ．）」（斜体であるかどうかにかかわらず）の使用は、列挙された特定の用語が、本開示の代表的な実施例および実施形態であることを意味し、別途明示的に記載されない限り、参照または引用される特定の実施例に限定されることを意図しない。
【0035】
本明細書で使用される場合、「間（ｂｅｔｗｅｅｎ）」は、範囲の末端を含む範囲である。例えば、ｘとｙの間の数字には、ｘとｙの数字、ならびにｘとｙの内にある任意の数字が明示的に含まれる。
【0036】
本明細書で使用される場合、「タンパク質」、「ペプチド」、または「ポリペプチド」は、アミノ酸のポリマー形態を指し、任意の長さであり得る。タンパク質には、例えば、抗体、構造タンパク質、酵素、膜タンパク質、膜関連タンパク質、および／または膜貫通タンパク質、トランスポーター、受容体、シグナル伝達タンパク質などが含まれ得る。また、本開示のタンパク質および／またはペプチドは、例えば、例えば、薬物、標的部分、タグ（例えば、可視化タグ）などの１つ以上の非ペプチド物質にコンジュゲートされた修飾タンパク質も包含する。本開示のタンパク質は、例えば、疾患もしくは障害の診断、治療、および／または予防に使用される治療用タンパク質であり得る。一部の実施形態では、本明細書に記載のポリソルベートは、薬学的製剤中のタンパク質の安定性を改善することができる。一部の実施形態では、治療用タンパク質は、抗体である。一部の実施形態では、治療用タンパク質は、抗体－薬物コンジュゲートである。一部の実施形態では、本明細書に記載のタンパク質調製物は、タンパク質（例えば、治療用タンパク質）を含む。
【0037】
タンパク質調製物の文脈で本明細書で使用される場合、「精製」は、１つ以上の物質（例えば、タンパク質）が複雑な混合物、典型的には、細胞、組織、または生物から単離されるプロセスを指す。「精製された」タンパク質試料またはタンパク質調製物は、細胞、組織、または生物の１つ以上の非水溶性成分（例えば、細胞膜、脂質、凝集タンパク質もしくは核酸、および他の疎水性物質など）が低減もしくは除去され、可溶性成分（例えば、可溶性タンパク質など）のみが残された試料を指し得る。本明細書で使用される場合、「可溶性」は、物質が、特定の溶媒（例えば、細胞培養培地、緩衝液、水、または有機溶媒）に溶解する能力を指し得る。タンパク質の文脈において、「可溶性」とは、特定の溶媒（例えば、細胞培養培地、緩衝液、水、または有機媒）中で、沈殿および／または凝集しないタンパク質も指し得る。
【0038】
例示的な精製プロセスは、目的のタンパク質（例えば、治療用タンパク質）を含む細胞培養物を増殖することと、細胞を培養培地から分離することと、細胞を溶解させ、溶解した細胞を分離して、可溶性成分を含む細胞培養上清および本明細書に記載の不溶性成分を含むペレットを生成することと、細胞培養上清を、緩衝液交換、ｐＨ調整、遠心分離、濾過（例えば、限外濾過および／もしくは透析濾過を含む）、クロマトグラフィー、またはそれらの任意の組み合わせに供して、精製したタンパク質調製物を生成することと、を含み得る。一部の実施形態では、本開示の精製されたタンパク質調製物は、本明細書に記載のプロセスによって精製される。一部の実施形態では、本開示の部分的に精製されたタンパク質調製物は、本明細書に記載の精製プロセスの一部に供されている。例えば、部分的に精製されたタンパク質調製物は、精製されたタンパク質調製物を生成するために使用される緩衝液交換、ｐＨ調整、遠心分離、濾過、および／またはクロマトグラフィーのステップの全てに供されていない場合がある。一部の実施形態では、本明細書に記載の細胞培養上清は、本開示の治療用タンパク質を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の部分的に精製されたタンパク質調製物は、本開示の治療用タンパク質を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の精製されたタンパク質調製物は、本開示の治療用タンパク質を含む。
【0039】
一部の実施形態では、本開示は、脂肪分解活性の検出のための組成物および方法に関する。脂肪分解活性、すなわち、脂肪分解は、一般に、脂質の加水分解を指す。脂肪分解反応は、エステラーゼ酵素のサブクラスであるリパーゼ酵素によって触媒することができる。したがって、「リパーゼ」は、脂質（例えば、トリグリセリド、リン脂質、コレステリルエステルなど）のエステル結合を加水分解する酵素を指す。リパーゼとしては、例えば、トリグリセリドリパーゼ、リポタンパク質リパーゼ、膵臓リパーゼ、肝臓リパーゼ、胃リパーゼ、舌リパーゼ、内皮リパーゼ、およびホスファチジルセリンホスホリパーゼが挙げられる。リパーゼは、例えば、哺乳動物の膵臓、肝臓、舌腺、胃、甲状腺、および／もしくは粘膜によって天然に産生される、特定の細菌および真菌によって分泌される、かつ／またはリソソームに見出される。一部の実施形態では、リパーゼは、タンパク質精製におけるタンパク質が由来した細胞に対して内因性である。一部の実施形態では、リパーゼは、タンパク質調製物中の別の生物学的成分（例えば、タンパク質調製物に添加される安定化タンパク質を含む生物学的成分）に対して内因性である。
【0040】
一部の実施形態では、リパーゼは、細胞培養の細胞によって産生される。一部の実施形態では、リパーゼは、目的のタンパク質の産生のための細胞培養の細胞によって産生される。目的のタンパク質の産生に好適な細胞の非限定的な例としては、細菌、昆虫、酵母、哺乳動物、および／もしくはトランスジェニック細胞が挙げられる。細胞株の非限定的な例としては、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＨＴ－１０８０、ＰＥＲ．Ｃ６、ＣＡＰ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＶ１、Ｃｏｓ、ＭＤＣＫ、３Ｔ３、ＮＳ０、ＮＳ１、ＰＣ１２、Ｗ１３８、Ｓｐ２／０、ＨＫＢ－１１、ＴＭ４、ＭＭＴ０６０５６２、ＴＲ１、ＭＲＣ５、ＦＳ４、骨髄腫細胞株、ハイブリドーマ細胞株、および肝癌細胞株が挙げられる。一部の実施形態では、目的のタンパク質を産生するための細胞株は、安定した細胞株であり、例えば、目的のタンパク質の遺伝子が、細胞のゲノムに安定して組み込まれている。一部の実施形態では、目的のタンパク質を産生するための細胞株は、一過性の細胞株であり、例えば、細胞が遺伝子を発現するが、遺伝子はゲノムに組み込まれない。
【0041】
一部の実施形態では、目的のタンパク質は、治療用タンパク質である。一部の実施形態では、目的のタンパク質は、細胞培養物から精製されて、精製されたタンパク質調製物を生成する。一部の実施形態では、細胞培養物中のリパーゼは、精製プロセス中にタンパク質調製物から完全に除去されない。したがって、一部の実施形態では、リパーゼは、精製されたタンパク質調製物中に存在する。
【0042】
本明細書で言及されるように、「活性」リパーゼは、脂肪分解を行うことができるリパーゼである（本明細書では「脂肪分解活性」を有するとも呼ばれる）。タンパク質調製物中に存在する活性リパーゼは、目的のタンパク質（例えば、治療用タンパク質）を伴う下流プロセスを妨げ得る。一部の実施形態では、目的のタンパク質（例えば、治療用タンパク質）、およびリパーゼを含むタンパク質調製物は、薬学的製剤に含まれる。一部の実施形態では、賦形剤は、タンパク質調製物に添加される。一部の実施形態では、賦形剤は、例えば、界面応力を最小化すること、タンパク質凝集を低減すること、および／またはタンパク質溶解性を改善することによって、タンパク質調製物を安定化する。一部の実施形態では、賦形剤は、界面活性剤である。一部の実施形態では、賦形剤は、脂肪酸、エステル、またはそれらの両方を含む。一部の実施形態では、賦形剤は、活性リパーゼによる加水分解を受けやすい。一部の実施形態では、目的のタンパク質および賦形剤を含むタンパク質調製物中の活性リパーゼの存在は、調製物の安定性を低下させる。したがって、賦形剤のリパーゼ加水分解によって引き起こされる、粒子の増加、安全性の懸念（例えば、注射部位の反応の増加に起因する）、および品質の低下などの負の影響を最小化するために、タンパク質調製物中の脂肪分解活性を確実に検出することが有利である。
【0043】
一部の実施形態では、本開示は、タンパク質調製物中の脂肪分解活性を検出することができる組成物を提供する。
【0044】
一部の実施形態では、本開示は、組成物を提供し、（ａ）タンパク質調製物を含む水性アッセイ試料と、（ｂ）有機溶媒と、を含み、有機溶媒が、４－メチルウンベリフェリルオレエート（４ＭｕＯ）をさらに含み、水性アッセイ試料が、５．０～７．０のｐＨを有し、水性アッセイ試料が、組成物の約８０％～約９８％であり、有機溶媒が、組成物の約２％～約２０％である。
【0045】
さらなる実施形態では、本開示は、組成物を提供し、（ａ）（ｉ）精製されたタンパク質調製物、（ｉｉ）緩衝剤、および（ｉｉｉ）塩を含む水性アッセイ試料と、（ｂ）有機溶媒と、を含み、有機溶媒が、４－メチルウンベリフェリルオレエート（４ＭｕＯ）をさらに含み、水性アッセイ試料が、５．０～７．０のｐＨを有し、水性アッセイ試料が、組成物の約８０％～約９８％（体積／体積）であり、有機溶媒が、組成物の約２％～約２０％（体積／体積）である。
【0046】
なおさらなる実施形態では、本開示は、組成物を提供し、（ａ）（ｉ）タンパク質および脂質を含む精製されたタンパク質調製物、（ｉｉ）緩衝剤、（ｉｉｉ）約１．０ｍＭ～約２０ｍＭの塩化カルシウム、および（ｉｖ）約１００ｍＭ～約２００ｍＭの塩化ナトリウムを含む、約９０％～約９８％（体積／体積）の水性アッセイ試料と、（ｂ）メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ｓｅｃ－ブタノール、イソブタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトニトリル、またはそれらの組み合わせから選択される約２％～約１０％（体積／体積）の有機溶媒であって、４－メチルウンベリフェリルオレエート（４ＭｕＯ）をさらに含む、有機溶媒と、を含み、水性アッセイ試料が、５．０～７．０のｐＨを有する。
【0047】
本明細書で使用される場合、「水性」（例えば、水性アッセイ試料）は、水が溶媒である溶液または試料を指す。したがって、本開示の水性アッセイ試料は、例えば、細胞培養培地、緩衝液、タンパク質試料などを含み得る。一部の実施形態では、本開示の水性アッセイ試料は、タンパク質調製物を含む。
【0048】
一部の実施形態では、タンパク質調製物は、細胞培養上清である。細胞培養上清は、本明細書に記載されており、例えば、目的のタンパク質を産生するための細胞培養から得ることができる。一部の実施形態では、タンパク質は、治療用タンパク質である。一部の実施形態では、細胞培養上清は、培養細胞を溶解し、可溶性および不溶性の成分を（例えば、遠心分離によって）分離した後に生成される。培養およびタンパク質産生に好適な細胞および細胞株の例が、本明細書に提供される。一部の実施形態では、細胞培養上清は、目的のタンパク質（例えば、治療用タンパク質）および追加の宿主細胞成分を含む。一部の実施形態では、追加の宿主細胞成分は、追加の宿主細胞タンパク質を含む。一部の実施形態では、追加の宿主細胞タンパク質は、リパーゼを含む。一部の実施形態では、リパーゼは、脂肪分解活性を有する。
【0049】
一部の実施形態では、タンパク質調製物は、部分的に精製されたタンパク質調製物である。部分的に精製されたタンパク質調製物は、本明細書に記載されており、例えば、細胞培養物からの目的のタンパク質の部分精製手順（例えば、本明細書に記載の精製プロセス）を行った後に得ることができる。一部の実施形態では、タンパク質は、治療用タンパク質である。一部の実施形態では、部分的に精製されたタンパク質調製物は、細胞培養上清と比較して、さらなる精製ステップを経た。一部の実施形態では、部分的に精製されたタンパク質調製物は、治療用タンパク質および宿主細胞の追加の成分を含む。一部の実施形態では、宿主細胞成分は、宿主細胞タンパク質を含む。一部の実施形態では、宿主細胞タンパク質は、リパーゼを含む。一部の実施形態では、リパーゼは、脂肪分解活性を有する。一部の実施形態では、治療用タンパク質は、部分的に精製されたタンパク質調製物中の全てのタンパク質の２０％～９５％（ｗ／ｗ）、３０％～９０％（ｗ／ｗ）、または４０％～８０％（ｗ／ｗ）である。
【0050】
一部の実施形態では、タンパク質調製物は、精製されたタンパク質調製物である。精製されたタンパク質調製物は、本明細書に記載されており、例えば、細胞培養物からの目的のタンパク質の精製手順（例えば、本明細書に記載の精製プロセス）を行った後に得ることができる。一部の実施形態では、目的のタンパク質は、治療用タンパク質である。一部の実施形態では、精製されたタンパク質調製物は、治療用タンパク質および宿主細胞の追加の成分である。一部の実施形態では、宿主細胞成分は、宿主細胞タンパク質を含む。一部の実施形態では、宿主細胞タンパク質は、リパーゼを含む。一部の実施形態では、リパーゼは、脂肪分解活性を有する。一部の実施形態では、治療用タンパク質は、精製されたタンパク質調製物中の全てのタンパク質の７０％（ｗ／ｗ）超、８０％（ｗ／ｗ）超、８５％（ｗ／ｗ）超、９０％（ｗ／ｗ）超、９５％（ｗ／ｗ）超、または９９％（ｗ／ｗ）超である。
【0051】
一部の実施形態では、タンパク質調製物は、治療用タンパク質を含む。治療用タンパク質の非限定的な例としては、抗体（モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体など）および抗体断片、タンパク質ベースのワクチン（例えば、Ｂ型肝炎表面抗原など）、血液因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子など）、血栓溶解剤（例えば、組織プラスミノーゲンアクチベーターなど）、ホルモン（例えば、インスリン、グルカゴン、成長ホルモン、およびゴナドトロピンなど）、造血成長因子（例えば、エリスロポエチンおよびコロニー刺激因子など）、インターフェロン（例えば、インターフェロンα、インターフェロンβ、およびインターフェロンγなど）、インターロイキンベースのタンパク質（例えば、インターロイキン－１２など）、ならびに腫瘍壊死因子および治療用酵素などの他のタンパク質が挙げられる。タンパク質ベースの治療薬のさらなる例としては、ベリムマブ、イピリムマブ、ベラタセプト、ブレンツキシマブベドチン、アフリベルセプト、ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉアスパラギナーゼ、グルカルピダーゼ、オビヌツズマブ、ペムブロリズマブ、ブリナツモマブ、ニボルマブ、イダルシズマブ、アソファターゼ－アルファ、ダラツムマブ、エロツズマブ、セベリパーゼアルファーゼ、アテゾリズマブ、タリグルセラーゼアルファ、ラキシバクマブ、エロスルファーゼアルファ、メトレレプチン、ラムシルマブ、シルツキシマブ、ペムブロリズマブ、ジヌツキシマブ、エボロクマブ、ネシツムマブ、オビルトキサキシマブ、アバタセプト、アダリムマブ、アレファセプト、エタネルセプト、インフリキシマブ、トラスツズマブ、ウステキヌマブ、デニロイキンジフチトクス、およびゴリムマブが挙げられる。タンパク質治療薬のさらなる例は、例えば、Ｄｉｍｉｔｒｏｖ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ８９９：１－２６（２０１２），Ｌａｇａｓｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｆ１０００Ｒｅｓ ６：１１３（２０１７）、およびＰｒｏｔｅｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｅｄｓ：Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７：Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇに記載されている。治療用タンパク質としては、組換えタンパク質、修飾タンパク質、および融合タンパク質、例えば、抗体－薬物コンジュゲート、抗体－サイトカイン融合物、Ｆｃ融合物、二重特異性抗体、多重特異性抗体、アフィボディ融合物、グリコシル化タンパク質およびペプチド、ならびに操作された受容体アンタゴニストが挙げられ得る。一部の実施形態では、治療用タンパク質を含むタンパク質調製物は、薬学的製剤で使用される。
【0052】
一部の実施形態では、タンパク質調製物は、商業的に重要なタンパク質、例えば、工業用酵素を含む。商業的に重要なタンパク質は、医薬品、化学生産、バイオ燃料、食品および飲料、ならびに消費者製品などの様々な産業で使用され得る。例えば、一部の実施形態では、タンパク質調製物は、所望の生成物を生成するためにプロセス内で使用される酵素であるか、または目的の生成物であり得る。一部の実施形態では、商業的に重要なタンパク質は、食品、医薬品合成、バイオ燃料、化学、または製造の業界で使用されている。一部の実施形態では、工業用酵素には、パラターゼリポザイム、リポパン、キシロースイソメラーゼ、ブロメラインおよびノーパザイム（食品業界で使用）、セルラーゼおよびアミラーゼ（バイオ燃料業界で使用）、レジナーゼ（紙加工業界で使用）、アミダーゼ（化学業界で使用）、ノボザイム－４３５（ミリスチン酸イソプロピルの化粧品製造で使用）、またはスブチリシン（洗剤で使用）が含まれるが、これらに限定されない。
【0053】
一部の実施形態では、タンパク質調製物は、薬学的賦形剤を含む。薬学的賦形剤は、例えば、製造前、製造中、もしくは製造後の薬物送達システムの処理を助けるために、安定性、生物学的利用能、もしくは患者の受容性を保護、支持、もしくは強化するために、製品の識別を補助し、全体的な安全性を高めるために、使用中の薬物の有効性および／もしくは送達を補助するために、ならびに／または保存中の医薬品の完全性の維持を補助するために、含まれる。薬学的賦形剤の非限定的な例としては、界面活性剤、充填剤、希釈剤、結合剤、懸濁剤、増粘剤、コーティング剤、香味剤、崩壊剤、着色剤、潤滑剤、流動促進剤、防腐剤、甘味料などが挙げられる。一部の実施形態では、薬学的賦形剤は、タンパク質調製物に添加される。一部の実施形態では、薬学的賦形剤は、精製前、精製後、または精製中にタンパク質調製物に添加される。
【0054】
一部の実施形態では、薬学的賦形剤は、界面活性剤である。本明細書で使用される場合、「界面活性剤」は、２つの液体間の表面張力または界面張力を低下させる薬剤を指す。一部の実施形態では、界面活性剤は、組成物の１つ以上の成分の、凝集および／もしくは沈殿を最小化することによって、かつ／または溶解性を改善することによって（例えば、表面張力を低下させ、タンパク質の表面吸着を阻害することによって；例えば、Ａｇａｒｋｈｅｄ ｅｔ ａｌ．，ＡＡＰＳ ＰｈａｒｍＳｃｉＴｅｃｈ １４：１－９（２０１３）を参照されたい）、組成物（例えば、本明細書に記載のタンパク質調製物）を安定化することができる。また、薬学的組成物中の界面活性剤は、活性医薬成分（ＡＰＩ）の生物学的利用能を調節し、ＡＰＩを好ましい多形形態で維持するのを補助し、凝集もしくは解離を防止し、かつ／または活性成分の免疫原性応答を調節することもできる。界面活性剤としては、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、双性イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、および／または両性電解性界面活性剤を挙げることができる。界面活性剤の非限定的な例としては、脂肪酸（例えば、ポリソルベート２０中のラウリン酸およびポリソルベート８０中のオレイン酸）でエステル化されたエトキシル化ソルビタンに由来するポリソルベート（例えば、ＴＷＥＥＮ２０およびＴＷＥＥＮ８０などのＴＷＥＥＮ界面活性剤、それぞれポリソルベート２０、ポリソルベート８０としても知られている）、チロキサポール、ポロキサマー（例えば、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ６８ＬＦ、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｌ－Ｇ２ＬＦ、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｌ６２Ｄ、ＬＵＴＲＯＬ Ｆ６８、およびＫＯＬＬＩＰＨＯＲ Ｐ１８８）、ポリオキシエチレンヒマシ油（例えば、ＫＯＬＬＩＰＨＯＲ ＥＬ）およびその誘導体、ソルビタンエステル（Ｓｐａｎとしても知られている）、ステアリン酸ポリオキシル、レシチン、リン脂質、ポリオキシエチレン界面活性剤（ＴＲＩＴＯＮ（例えば、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ－１００）およびＢＲＩＪ（例えば、ＢＲＩＪ ３５）など）、ならびにポリエトキシル化脂肪酸（例えば、ＭＹＲＪ Ｓ４０、ＭＹＲＪ Ｓ１００、およびＭＹＲＪ ５２）が挙げられる。
【0055】
一部の実施形態では、界面活性剤は、脂肪酸を含む。一部の実施形態では、界面活性剤は、エステルを含む。一部の実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベートである。ポリソルベートは、脂肪酸でエステル化されたエトキシル化ソルビタンに由来する化合物のクラスであり、例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、ポリソルベート２１、ポリソルベート６１、ポリソルベート６５、ポリソルベート８１、およびポリソルベート８１が挙げられる。一部の実施形態では、本明細書に提供されるタンパク質調製物は、ポリソルベートを含む。一部の実施形態では、タンパク質調製物中のポリソルベートは、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、またはそれらの組み合わせである。
【0056】
一部の実施形態では、界面活性剤は、水性アッセイ試料の約０．００１％（ｗ／ｖ）～約２％（ｗ／ｖ）である。一部の実施形態では、界面活性剤は、水性アッセイ試料の約０．００５％（ｗ／ｖ）～約２％（ｗ／ｖ）である。一部の実施形態では、界面活性剤は、水性アッセイ試料の約０．０１％（ｗ／ｖ）～約２％（ｗ／ｖ）である。一部の実施形態では、界面活性剤は、水性アッセイ試料の約０．０２％～約１．５％（ｗ／ｖ）である。一部の実施形態では、界面活性剤は、水性アッセイ試料の約０．０３％～約１．０％（ｗ／ｖ）である。一部の実施形態では、界面活性剤は、水性アッセイ試料の約０．０４％～約０．８％（ｗ／ｖ）である。一部の実施形態では、界面活性剤は、水性アッセイ試料の約０．０５％～約０．６％（ｗ／ｖ）である。一部の実施形態では、界面活性剤は、水性アッセイ試料の約０．０６％～約０．４％（ｗ／ｖ）である。一部の実施形態では、界面活性剤は、水性アッセイ試料の約０．０７％～約０．２％（ｗ／ｖ）である。一部の実施形態では、界面活性剤は、水性アッセイ試料の約０．０８％～約０．１５％（ｗ／ｖ）である。一部の実施形態では、界面活性剤は、水性アッセイ試料の約０．０９％～約０．１０％（ｗ／ｖ）である。一部の実施形態では、界面活性剤は、水性アッセイ試料の約０．０１％～約０．０４％（ｗ／ｖ）である。一部の実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベートである。一部の実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、またはそれらの組み合わせである。
【0057】
一部の実施形態では、タンパク質調製物は、１つ以上の追加の宿主細胞タンパク質をさらに含む。本明細書に記載されるように、タンパク質調製物は、細胞培養物、すなわち、目的のタンパク質（例えば、治療用タンパク質）の宿主細胞を含む細胞培養物から調製される。一部の実施形態では、タンパク質調製物は、１つ以上の追加の宿主細胞タンパク質を含む。一部の実施形態では、追加の宿主細胞タンパク質は、目的のタンパク質（例えば、治療用タンパク質）と実質的に同じ条件で可溶性である。一部の実施形態では、追加の宿主細胞タンパク質は、目的のタンパク質（例えば、治療用タンパク質）から容易に分離することができない。一部の実施形態では、追加の宿主細胞タンパク質は、リパーゼを含む。一部の実施形態では、追加の宿主細胞タンパク質のうちの１つ以上は、脂肪分解活性を有する。
【0058】
一部の実施形態では、タンパク質調製物を含む水性アッセイ試料は、緩衝剤、塩、またはその両方をさらに含む。一般に、本開示の塩は、アニオンがＯＨ－およびＯ２－でないイオン性化合物を指す。一部の実施形態では、塩は、組成物中の１つ以上の成分の分解を低減および／または防止する。水性アッセイ試料中に含まれ得る好適な塩は、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩などを含み、当業者によって選択することができる。一部の実施形態では、塩は、塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３）、硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）、酢酸アンモニウム（ＮＨ４ＣＨ３ＣＯＯ）、硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）、またはそれらの組み合わせである。一部の実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ２、またはそれらの組み合わせである。一部の実施形態では、塩は、ＮａＣｌおよびＣａＣｌ２の両方である。
【0059】
一部の実施形態では、水性アッセイ試料中のＮａＣｌの濃度は、試料中の脂肪分解活性の正確かつ／または効率的な検出を促進する。一部の実施形態では、ＮａＣｌは、水性アッセイ試料中で、約１０ｍＭ～約５００ｍＭである。一部の実施形態では、ＮａＣｌは、水性アッセイ試料中で、約２５ｍＭ～約４００ｍＭである。一部の実施形態では、ＮａＣｌは、水性アッセイ試料中で、約５０ｍＭ～約３００ｍＭである。一部の実施形態では、ＮａＣｌは、水性アッセイ試料中で、約７５ｍＭ～約２５０ｍＭである。一部の実施形態では、ＮａＣｌは、水性アッセイ試料中で、約１００ｍＭ～約２００ｍＭである。一部の実施形態では、ＮａＣｌは、水性アッセイ緩衝液中で、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１３０ｍＭ、１４０ｍＭ、１５０ｍＭ、１６０ｍＭ、１７０ｍＭ、１８０ｍＭ、１９０ｍＭ、または２００ｍＭである。
【0060】
一部の実施形態では、ＮａＣｌは、最終組成物（水性アッセイ試料および有機溶媒）中で、約１０ｍＭ～約５００ｍＭである。一部の実施形態では、ＮａＣｌは、最終組成物中で、約２５ｍＭ～約４００ｍＭである。一部の実施形態では、ＮａＣｌは、最終組成物中で、約５０ｍＭ～約３００ｍＭである。一部の実施形態では、ＮａＣｌは、最終組成物中で、約７５ｍＭ～約２５０ｍＭである。一部の実施形態では、ＮａＣｌは、最終組成物中で、約１００ｍＭ～約２００ｍＭである。一部の実施形態では、ＮａＣｌは、最終組成物中で、約１００ｍＭ～約１４０ｍＭ例えば１２０ｍＭである。一部の実施形態では、ＮａＣｌは、最終組成物中、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１３０ｍＭ、１４０ｍＭ、１５０ｍＭ、１６０ｍＭ、１７０ｍＭ、１８０ｍＭ、１９０ｍＭ、または２００ｍＭである。
【0061】
一部の実施形態では、水性アッセイ試料中のＣａＣｌ２の濃度は、試料中の脂肪分解活性の正確かつ／または効率的な検出を促進する。一部の実施形態では、ＣａＣｌ２は、水性アッセイ試料中で、約０．１ｍＭ～約２０ｍＭである。一部の実施形態では、ＣａＣｌ２は、水性アッセイ試料中で、約０．２ｍＭ～約１０ｍＭである。一部の実施形態では、ＣａＣｌ２は、水性アッセイ試料中で、約０．５ｍＭ～約５．０ｍＭである。一部の実施形態では、ＣａＣｌ２は、水性アッセイ試料中で、約０．７ｍＭ～約３．０ｍＭである。一部の実施形態では、ＣａＣｌ２は、水性アッセイ試料中で、約１．０ｍＭ～約２．０ｍＭである。一部の実施形態では、ＣａＣｌ２は、水性アッセイ試料中で、約０．５ｍＭ、約０．６ｍＭ、約０．７ｍＭ、約０．８ｍＭ、約０．９ｍＭ、約１．０ｍＭ、約１．１ｍＭ、約１．２ｍＭ、約１．３ｍＭ、約１．５ｍＭ、約１．６ｍＭ、約１．７ｍＭ、約１．８ｍＭ、約１．９ｍＭ、約２．０ｍＭ、約２．５ｍＭ、約３．０ｍＭ、約３．５ｍＭ、約４．０ｍＭ、約４．５ｍＭ、または約５．０ｍＭである。
【0062】
一部の実施形態では、ＣａＣｌ２は、最終組成物（水性アッセイ試料および有機溶媒）中で、約０．１ｍＭ～約２０ｍＭである。一部の実施形態では、ＣａＣｌ２は、最終組成物中で、約０．２ｍＭ～約１０ｍＭである。一部の実施形態では、ＣａＣｌ２は、最終組成物中で、約０．５ｍＭ～約５．０ｍＭである。一部の実施形態では、ＣａＣｌ２は、最終組成物中で、約０．７ｍＭ～約３．０ｍＭである。一部の実施形態では、ＣａＣｌ２は、最終組成物中で、約１．０ｍＭ～約２．０ｍＭである。一部の実施形態では、ＣａＣｌ２は、最終組成物中で、約０．５ｍＭ、約０．６ｍＭ、約０．７ｍＭ、約０．８ｍＭ、約０．９ｍＭ、約１．０ｍＭ、約１．１ｍＭ、約１．２ｍＭ、約１．３ｍＭ、約１．５ｍＭ、約１．６ｍＭ、約１．７ｍＭ、約１．８ｍＭ、約１．９ｍＭ、約２．０ｍＭ、約２．５ｍＭ、約３．０ｍＭ、約３．５ｍＭ、約４．０ｍＭ、約４．５ｍＭ、または約５．０ｍＭである。
【0063】
一部の実施形態では、ＮａＣｌおよびＣａＣｌ２は、水性アッセイ試料中の１つ以上の成分の分解を、低減および／または防止する。一部の実施形態では、ＮａＣｌおよびＣａＣｌ２は、タンパク質（例えば、治療用タンパク質）の凝集および／または沈殿を、低減および／または防止する。一部の実施形態では、ＮａＣｌおよびＣａＣｌ２は、水性アッセイ試料中に存在しない組成物中（例えば、有機溶媒中）の１つ以上の成分の分解を、低減および／または防止する。一部の実施形態では、ＮａＣｌおよびＣａＣｌ２は、４－メチルウンベリフェリルオレエート（４ＭｕＯ）の自己加水分解を、低減および／または防止する。一部の実施形態では、水性アッセイ試料中で、ＮａＣｌは、約１０ｍＭ～約５００ｍＭであり、ＣａＣｌ２は、約０．１ｍＭ～約２０ｍＭである。一部の実施形態では、水性アッセイ試料中で、ＮａＣｌは、約２５ｍＭ～約４００ｍＭであり、ＣａＣｌ２は、約０．２ｍＭ～約１０ｍＭである。一部の実施形態では、水性アッセイ試料中で、ＮａＣｌは、約５０ｍＭ～約３００ｍＭであり、ＣａＣｌ２は、約０．５ｍＭ～約５．０ｍＭである。一部の実施形態では、水性アッセイ試料中で、ＮａＣｌは、約７５ｍＭ～約２５０ｍＭであり、ＣａＣｌ２は、約０．７～約３．０ｍＭである。一部の実施形態では、水性アッセイ試料中で、ＮａＣｌは、約１００ｍＭ～約２００ｍＭであり、ＣａＣｌ２は、約１．０～約２．０ｍＭである。一部の実施形態では、水性アッセイ試料中で、ＮａＣｌは、約１５０ｍＭであり、ＣａＣｌ２は、約０．３ｍＭである。
【0064】
本明細書で使用される場合、「緩衝剤」は、溶液のｐＨを維持するために溶液中で使用される物質を指す。緩衝剤は、溶液を特定のｐＨ範囲に維持し（すなわち、所与の範囲における緩衝能）、追加の成分が溶液に添加されたときのｐＨの急激な変化を防止することができる。一般に、緩衝剤は、弱酸または弱塩基であり得る。一部の実施形態では、緩衝剤は、約ｐＨ５．０、約ｐＨ５．５、約ｐＨ６．０、約ｐＨ６．５、または約ｐＨ７．０での緩衝能を有する。約ｐＨ５．０～約ｐＨ７．０の緩衝能を有する緩衝剤としては、例えば、クエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩、ＭＥＳ、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓプロパン、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＯＢＳ、ＴＡＰＳＯ、およびＴｒｉｓが挙げられる。緩衝剤の緩衝能は、当業者によって決定され得る。一部の実施形態では、水性アッセイ試料中の緩衝剤は、試料中の脂肪分解活性の正確かつ／または効率的な検出を促進する。一部の実施形態では、緩衝剤は、水性アッセイ試料中の１つ以上の成分の分解を、低減および／または防止する。一部の実施形態では、緩衝剤は、タンパク質（例えば、治療用タンパク質）の凝集を、低減および／または防止する。一部の実施形態では、緩衝剤は、水性アッセイ試料中に存在しない組成物中（例えば、組成物の有機溶媒中）の１つ以上の成分の分解を、低減および／または防止する。一部の実施形態では、緩衝剤は、４－メチルウンベリフェリルオレエート（４ＭｕＯ）の自己加水分解を、低減および／または防止する。一部の実施形態では、緩衝剤は、水性緩衝液として水性アッセイ試料中に提供される。
【0065】
一部の実施形態では、緩衝剤は、水性アッセイ試料中で、約５ｍＭ～約２００ｍＭである。一部の実施形態では、緩衝剤は、水性アッセイ試料中で、約１０ｍＭ～約１００ｍＭである。一部の実施形態では、緩衝剤は、水性アッセイ試料中で、約２０ｍＭ～約８０ｍＭである。一部の実施形態では、緩衝剤は、水性アッセイ試料中で、約３０ｍＭ～約７０ｍＭである。一部の実施形態では、緩衝剤は、水性アッセイ試料中で、約４０ｍＭ～約６０ｍＭである。一部の実施形態では、緩衝剤は、水性アッセイ試料中で、約１０ｍＭ、約１２ｍＭ、約１５ｍＭ、約１８ｍＭ、約２０ｍＭ、約２２ｍＭ、約２５ｍＭ、約２８ｍＭ、約３０ｍＭ、約３２ｍＭ、約３５ｍＭ、約３８ｍＭ、約４０ｍＭ、約４２ｍＭ、約４５ｍＭ、約４８ｍＭ、約５０ｍＭ、約５２ｍＭ、約５５ｍＭ、約５８ｍＭ、約６０ｍＭ、約６２ｍＭ、約６５ｍＭ、約６８ｍＭ、約７０ｍＭ、約７２ｍＭ、約７５ｍＭ、約７８ｍＭ、約８０ｍＭ、約８２ｍＭ、約８５ｍＭ、約８８ｍＭ、約９０ｍＭ、約９２ｍＭ、約９５ｍＭ、約９８ｍＭ、または約１００ｍＭである。一部の実施形態では、緩衝剤は、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓである。一部の実施形態では、緩衝剤は、Ｔｒｉｓである。
【0066】
一部の実施形態では、緩衝剤は、最終組成物（水性アッセイ試料および有機溶媒）中で、約５ｍＭ～約２００ｍＭである。一部の実施形態では、緩衝剤は、最終組成物（水性アッセイ試料および有機溶媒）中で、約１０ｍＭ～約１００ｍＭである。一部の実施形態では、緩衝剤は、最終組成物中で、約２０ｍＭ～約８０ｍＭである。一部の実施形態では、緩衝剤は、最終組成物中で、約３０ｍＭ～約７０ｍＭである。一部の実施形態では、緩衝剤は、最終組成物中で、約４０ｍＭ～約６０ｍＭである。一部の実施形態では、緩衝剤は、最終組成物中で、約１０ｍＭ、約１２ｍＭ、約１５ｍＭ、約１８ｍＭ、約２０ｍＭ、約２２ｍＭ、約２５ｍＭ、約２８ｍＭ、約３０ｍＭ、約３２ｍＭ、約３５ｍＭ、約３８ｍＭ、約４０ｍＭ、約４２ｍＭ、約４５ｍＭ、約４８ｍＭ、約５０ｍＭ、約５２ｍＭ、約５５ｍＭ、約５８ｍＭ、約６０ｍＭ、約６２ｍＭ、約６５ｍＭ、約６８ｍＭ、約７０ｍＭ、約７２ｍＭ、約７５ｍＭ、約７８ｍＭ、約８０ｍＭ、約８２ｍＭ、約８５ｍＭ、約８８ｍＭ、約９０ｍＭ、約９２ｍＭ、約９５ｍＭ、約９８ｍＭ、または約１００ｍＭである。
【0067】
一部の実施形態では、水性アッセイ試料は、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ２、および緩衝剤を含む。一部の実施形態では、水性アッセイ試料中で、ＮａＣｌは、約１０ｍＭ～約５００ｍＭであり、ＣａＣｌ２は、約０．１ｍＭ～約２０ｍＭであり、緩衝剤は、約５ｍＭ～約２００ｍＭである。一部の実施形態では、水性アッセイ試料中で、ＮａＣｌは、約２５ｍＭ～約４００ｍＭであり、ＣａＣｌ２は、約０．２ｍＭ～約１０ｍＭであり、緩衝剤は、約１０ｍＭ～約１００ｍＭである。一部の実施形態では、水性アッセイ試料中で、ＮａＣｌは、約５０ｍＭ～約３００ｍＭであり、ＣａＣｌ２は、約０．５ｍＭ～約５．０ｍＭであり、緩衝剤は、約２０ｍＭ～約８ｍＭである。一部の実施形態では、水性アッセイ試料中で、ＮａＣｌは、約７５ｍＭ～約２５０ｍＭであり、ＣａＣｌ２は、約０．７～約３．０ｍＭであり、緩衝剤は、約３０ｍＭ～約７０ｍＭである。一部の実施形態では、水性アッセイ試料中で、ＮａＣｌは、約１００ｍＭ～約２００ｍＭであり、ＣａＣｌ２は、約１．０～約２．０ｍＭであり、緩衝剤は、約４０ｍＭ～約６０ｍＭである。一部の実施形態では、水性アッセイ試料中で、ＮａＣｌは、約１５０ｍＭであり、ＣａＣｌ２は、約０．３ｍＭであり、緩衝剤は、約４５ｍＭ～約５５ｍＭである。一部の実施形態では、緩衝剤は、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓである。一部の実施形態では、緩衝剤は、Ｔｒｉｓである。当業者は、塩および緩衝液がタンパク質調製物に一般的に見出され、したがって、上記のパーセンテージは例のみによって提供されることを認識するであろう。
【0068】
一部の実施形態では、水性アッセイ試料のｐＨは、４Ｍｕの蛍光強度を最大化するように調整される。一部の実施形態では、水性アッセイ試料のｐＨは、水性アッセイ試料および／または有機溶媒の１つ以上の成分を安定化するように調整される。一部の実施形態では、わずかに酸性～中性のｐＨ（例えば、約５．０～約７．０）は、水性アッセイ試料中の成分の分解を最小化する。一部の実施形態では、わずかに酸性～中性のｐＨ（例えば、約５．０～約７．０）は、治療用タンパク質の凝集を最小化する。一部の実施形態では、わずかに酸性～中性のｐＨ（例えば、約５．０～約７．０）は、４－メチルウンベリフェリルオレエート（４ＭｕＯ）の自己加水分解を最小化する。
【0069】
一部の実施形態では、水性アッセイ試料は、酸性ｐＨを有する。一部の実施形態では、水性アッセイ試料は、５．０～７．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、水性アッセイ試料は、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、または約７．０のｐＨを有する。
【0070】
一部の実施形態では、本開示の組成物は、本明細書に記載される水性アッセイ試料と、有機溶媒と、を含む。本明細書で使用される場合、「有機溶媒」とは、１つ以上の溶質を溶解するために使用することができる炭素系物質を指す。有機溶媒の例としては、例えば、脂肪族炭化水素、環状炭化水素、芳香族炭化水素、およびハロゲン化炭化水素を含む炭化水素、ケトン、アミン、エステル、アルコール、アルデヒド、エーテル、ニトリル、スルホキシドなどが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、有機溶媒は、４－メチルウンベリフェリルオレエート（４ＭｕＯ）を可溶化することができる。
【0071】
一部の実施形態では、有機溶媒は、アルコール、スルホキシド、ニトリル、またはそれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、有機溶媒は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である。一部の実施形態では、有機溶媒は、アセトニトリル（ＡＣＮ）を含む。一部の実施形態では、有機溶媒は、アルコールを含む。一部の実施形態では、有機溶媒は、Ｃ１－Ｃ６アルコールである。一部の実施形態では、Ｃ１－Ｃ６アルコールは、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ｓｅｃ－ブタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール、ペンタノール、またはヘキサノールである。一部の実施形態では、有機溶媒は、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ｓｅｃ－ブタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール、またはそれらの組み合わせである。一部の実施形態では、有機溶媒は、アセトニトリルおよびアルコールの混合物を含む。一部の実施形態では、有機溶媒は、アセトニトリルおよびイソプロパノールの混合物を含む。一部の実施形態では、アセトニトリルおよびイソプロパノールは、約５：１、約４：１、約３：１、約２：１、または約１：１の比率で混合される。
【0072】
一部の実施形態では、４－メチルウンベリフェリルオレエート（４ＭｕＯ）は、有機溶媒中に存在する。４ＭｕＯは、以下の構造を含む。
【化1】
【0073】
一部の実施形態では、４ＭｕＯは、加水分解して、オレイン酸および４－メチルウンベリフェロン（４Ｍｕ）を形成する（スキームＩ）。
【化2】
【0074】
一部の実施形態では、４ＭｕＯは、蛍光性ではない。一部の実施形態では、４Ｍｕは、蛍光性である。一部の実施形態では、４Ｍｕの蛍光は、リパーゼによる４ＭｕＯの加水分解を検出するために使用され、したがって、脂肪分解活性の指標である。当業者であれば、４ＭｕＯの加水分解（４Ｍｕの蛍光によって測定される）は、タンパク質調製物中で脂肪分解活性が生じた（すなわち、界面活性剤が加水分解された）ことを示し、おそらく、タンパク質調製物が不安定化されている可能性が高いことを理解するであろう。一部の実施形態では、４Ｍｕの蛍光は、約３３０ｎｍの励起波長および約４９５ｎｍの発光波長で測定され得る。一部の実施形態では、４Ｍｕの蛍光は、約３２７ｎｍの励起波長および約４４９ｎｍの発光波長で測定され得る。一部の実施形態では、４Ｍｕの蛍光は、約３００ｎｍ～約３５０ｎｍの励起波長および約４２０ｎｍ～約５００ｎｍの発光波長で測定され得る。一部の実施形態では、４Ｍｕの蛍光測定パラメータ（例えば、励起波長および発光波長）は、ｐＨが変化するときに変化する。一部の実施形態では、４Ｍｕの蛍光測定パラメータは、塩および／または緩衝剤の濃度が変化するときに変化する。一部の実施形態では、４ＭｕＯは、リパーゼの基質である。一部の実施形態では、４ＭｕＯは、本明細書に記載のタンパク質調製物中のリパーゼによって加水分解される。一部の実施形態では、４Ｍｕの形成は、蛍光によって測定される。一部の実施形態では、本明細書に記載のタンパク質調製物を含むアッセイ試料の脂肪分解活性は、４Ｍｕの蛍光によって測定される。
【0075】
様々な濃度の４ＭｕＯを、本明細書に記載される組成物および方法に使用することができる。一般に、４ＭｕＯの量は、自己加水分解の影響を最小化するために，最小限に抑える必要がある。一部の実施形態では、有機溶媒中の４ＭｕＯは、約１μＭ～約１ｍＭ、または約１０μＭ～約５００μＭ、または約２０μＭ～約２００μＭ、または約５０μＭ～約１５０μＭ、または約７５μＭ～約１２５μＭ、または約１００μＭである。
【0076】
一部の実施形態では、組成物は、本明細書に記載されるタンパク質調製物を含む水性アッセイ試料と、本明細書に記載される４ＭｕＯを含む有機溶媒と、を含む。一部の実施形態では、組成物は、等量の水性アッセイ試料および有機溶媒を含まない。一部の実施形態では、組成物中の有機溶媒の量は、タンパク質調製物（特に、治療用タンパク質）に対する有機溶媒の潜在的な悪影響を最小化するために、組成物中の水性アッセイ緩衝液の量よりも少ない。例えば、有機溶媒の量が多すぎる場合、治療用タンパク質が凝集する可能性がある。一部の実施形態では、水性アッセイ試料は、組成物の約７０％～約９９．９体積％であり、有機溶媒は、組成物の約０．１％～約３０体積％である。一部の実施形態では、水性アッセイ試料は、組成物の約７０％～約９９．５体積％であり、有機溶媒は、組成物の約０．５％～約３０体積％である。一部の実施形態では、水性アッセイ試料は、組成物の約７０％～約９９体積％であり、有機溶媒は、組成物の約１％～約３０体積％である。一部の実施形態では、水性アッセイ試料は、組成物の約７５％～約９９体積％であり、有機溶媒は、組成物の約１％～約２５体積％である。一部の実施形態では、水性アッセイ試料は、組成物の約８０％～約９８体積％であり、有機溶媒は、組成物の約２％～約２０体積％である。一部の実施形態では、水性アッセイ試料は、組成物の約９０％～約９８体積％であり、有機溶媒は、組成物の約２％～約１０体積％である。一部の実施形態では、水性アッセイ試料は、組成物の約９５％～約９８体積％であり、有機溶媒は、組成物の約２体積％～約５体積％である。
【0077】
一部の実施形態では、水性アッセイ試料は、組成物の約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．１％、約９９．２％、約９９．３％、約９９．４％、約９９．５％、約９９．６％、約９９．７％、約９９．８％、または約９９．９体積％である。一部の実施形態では、タンパク質調製物は、組成物の約７０％～約８５体積％、約７５％～約８５体積％、または約８０％～約８５体積％であり、水性アッセイ試料の非タンパク質調製物成分（例えば、緩衝剤および／または塩）は、組成物の約１５％～約３０％、約１５％～約２５％、約１５％～約２０体積％を含む。一部の実施形態では、有機溶媒は、組成物の約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または約５０体積％である。当業者は、塩および緩衝液がタンパク質調製物に一般的に見出され、したがって、上記のパーセンテージは例のみによって使用されることを認識するであろう。
【0078】
一部の実施形態では、組成物は、リパーゼ阻害剤をさらに含む。一部の実施形態では、リパーゼ阻害剤は、リパーゼを不活性化することによって、組成物中の脂肪分解活性を低減または消失する。一部の実施形態では、リパーゼ阻害剤は、脂肪分解活性の検出のための陰性対照を提供するために組成物に含まれ、すなわち、リパーゼ阻害剤を含む組成物は、脂肪分解活性を有することが予想されない。一部の実施形態では、リパーゼ阻害剤は、例えば、４Ｍｕの蛍光を測定することによって、脂肪分解活性が検出された後に、組成物に添加される。一部の実施形態では、リパーゼ阻害剤は、水性アッセイ試料中にある。一部の実施形態では、リパーゼ阻害剤は、水溶性である。一部の実施形態では、リパーゼ阻害剤は、有機溶媒中にある。一部の実施形態では、リパーゼ阻害剤は、水溶性ではない。
【0079】
一部の実施形態では、リパーゼ阻害剤は、組成物中の脂肪分解活性を低減または消失するのに十分な濃度である。一部の実施形態では、リパーゼ阻害剤は、組成物中の脂肪分解活性を、組成物中で、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％、または約１００％減少させるのに十分な濃度である。一部の実施形態では、リパーゼ阻害剤は、組成物中で、約１μＭ～約５０μＭである。一部の実施形態では、リパーゼ阻害剤は、組成物中で、約２μＭ～約４０μＭである。一部の実施形態では、リパーゼ阻害剤は、組成物中で、約３μＭ～約３５μＭである。一部の実施形態では、リパーゼ阻害剤は、組成物中で、約４μＭ～約３０μＭである。一部の実施形態では、リパーゼ阻害剤は、組成物中で、約５μＭ～約２５μＭである。一部の実施形態では、リパーゼ阻害剤は、組成物中で、約１μＭ、約２μＭ、約３μＭ、約４μＭ、約５μＭ、約６μＭ、約７μＭ、約８μＭ、約９μＭ、約１０μＭ、約１１μＭ、約１２μＭ、約１３μＭ、約１４μＭ、約１５μＭ、約１６μＭ、約１７μＭ、約１７μＭ、約１８μＭ、約１９μＭ、約２０μＭ、約２１μＭ、約２２μＭ、約２３μＭ、約２４μＭ、約２５μＭ、約３０μＭ、約３５μＭ、約４０μＭ、約４５μＭ、または約５０μＭである。
【0080】
一部の実施形態では、リパーゼ阻害剤は、（Ｓ）－２－ホルミルアミノ－４－メチル－ペンタン酸（Ｓ）－１－［［（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヘキシル－４－オキソ－２－オキセタニル］メチル］－ドデシルエステル（オルリスタット）である。一部の実施形態では、リパーゼ阻害剤は、アルカロイドであり、例えば、カフェイン、テオフィリン、およびテオブロミンである。一部の実施形態では、リパーゼ阻害剤は、カロテノイドであり、例えば、フコキサンチンなどである。一部の実施形態では、リパーゼ阻害剤は、グリコシドであり、例えば、アクテオシド、ケンフェロール－３－Ｏ－ルチノシド、ルチン、ケンフェロール、ケルセチン、およびルテオリンである。一部の実施形態では、リパーゼ阻害剤は、ポリフェノールであり、例えば、ガランギン、ヘスペリジン、リコカルコンＡ、ＣＴ－ＩＩ、７－フロロエコール、およびイソリキリチゲニンである。一部の実施形態では、リパーゼ阻害剤は、サポニンであり、例えば、セシロシドおよびチイアノシドである。一部の実施形態では、リパーゼ阻害剤は、テルペンであり、例えば、クロシンおよびクロセチンである。一部の実施形態では、リパーゼ阻害剤は、細菌に由来し、例えば、リプスタチン、バリラクトン、ペルシキニン、パンクリシン、エベラクトン、ビブララクトン、およびエステラスチンである。一部の実施形態では、リパーゼ阻害剤は、合成リパーゼ阻害剤、例えば、天然脂肪の合成類似体である。リパーゼ阻害剤は、Ｌｕｎａｇａｒｉｙａ ｙｅｔ ａｌ．，ＥＸＣＬＩ Ｊ １３：８９７－９２１（２０１４）に概説されている。
【0081】
一部の実施形態では、本開示は、組成物を提供し、（ａ）（ｉ）タンパク質および脂質を含む精製されたタンパク質調製物、（ｉｉ）緩衝剤、（ｉｉｉ）約１．０ｍＭ～約２．０ｍＭの塩化カルシウム、および（ｉｖ）約１００ｍＭ～約２００ｍＭの塩化ナトリウムを含む、約９０％～約９９．９％（体積／体積）の水性アッセイ試料と、（ｂ）メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ｓｅｃ－ブタノール、イソブタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトニトリル、またはそれらの組み合わせから選択される約１０％～約０．１％（体積／体積）の有機溶媒であって、４－メチルウンベリフェリルオレエート（４ＭｕＯ）をさらに含む、有機溶媒と、を含み、水性アッセイ試料が、５．０～７．０のｐＨを有する。
【0082】
一部の実施形態では、本開示は、組成物を提供し、（ａ）（ｉ）タンパク質およびポリソルベート界面活性剤を含む精製されたタンパク質調製物、（ｉｉ）緩衝剤、（ｉｉｉ）約１．０ｍＭ～約２．０ｍＭの塩化カルシウム、および（ｉｖ）約１００ｍＭ～約２００ｍＭの塩化ナトリウムを含む、約９０％～約９９．９％（体積／体積）の水性アッセイ試料と、（ｂ）メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ｓｅｃ－ブタノール、イソブタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトニトリル、またはそれらの組み合わせから選択される約１０％～約０．１％（体積／体積）の有機溶媒であって、４－メチルウンベリフェリルオレエート（４ＭｕＯ）をさらに含む、有機溶媒と、を含み、水性アッセイ試料が、５．０～７．０のｐＨを有する。
【0083】
一部の実施形態では、本開示は、組成物を提供し、（ａ）（ｉ）タンパク質および脂質を含む部分的に精製されたタンパク質調製物と、（ｉｉ）緩衝剤と、（ｉｉｉ）約１．０ｍＭ～約２．０ｍＭの塩化カルシウムと、（ｉｖ）約１００ｍＭ～約２００ｍＭの塩化ナトリウムとを含む、約９０％～約９９．９％（体積／体積）の水性アッセイ試料と、（ｂ）メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ｓｅｃ－ブタノール、イソブタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトニトリル、またはこれらの組み合わせから選択される約１０％～約０．１％（体積／体積）の有機溶媒であって、さらに４－メチルウンベリフェリルオレエート（４ＭｕＯ）を含む、有機溶媒と、を含み、水性アッセイ試料が、５．０～７．０のｐＨを有する水性溶媒。
【0084】
一部の実施形態では、本開示は、組成物を提供し、（ａ）（ｉ）タンパク質および脂質を含む細胞培養上清、（ｉｉ）緩衝剤、（ｉｉｉ）約１．０ｍＭ～約２．０ｍＭの塩化カルシウム、および（ｉｖ）約１００ｍＭ～約２００ｍＭの塩化ナトリウムを含む、約９０％～約９９．９％（体積／体積）の水性アッセイ試料と、（ｂ）メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ｓｅｃ－ブタノール、イソブタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトニトリル、またはそれらの組み合わせから選択される約１０％～約０．１％（体積／体積）の有機溶媒であって、４－メチルウンベリフェリルオレエート（４ＭｕＯ）をさらに含む、有機溶媒と、を含み、水性アッセイ試料が、５．０～７．０のｐＨを有する。
【0085】
さらなる実施形態では、本明細書に提供される組成物は、タンパク質調製物中の脂肪分解活性を検出するための方法で使用されるのに好適である。一部の実施形態では、本開示は、水性アッセイ試料中の脂肪分解活性を検出する方法をさらに提供する。
【0086】
一部の実施形態では、本開示は、水性アッセイ試料中の脂肪分解活性を検出する方法を提供し、当該方法は、（ａ）タンパク質調製物を含む水性アッセイ試料を、４－メチルウンベリフェリルオレエート（４ＭｕＯ）を含む有機溶媒と組み合わせることと、（ｂ）蛍光によって、オレエートおよび４－メチルウンベリフェロン（４Ｍｕ）の形成を測定することと、を含む。
【0087】
一部の実施形態では、水性アッセイ試料は、本明細書に記載の水性アッセイ試料である。一部の実施形態では、水性アッセイ試料は、５．０～７．０のｐＨを有する。
【0088】
一部の実施形態では、水性アッセイ試料は、本明細書に記載の緩衝剤、塩、またはその両方をさらに含む。また、本方法に好適な緩衝剤および塩ならびにそれらの濃度の例も、本明細書に提供される。一部の実施形態では、塩は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、またはそれらの組み合わせである。一部の実施形態では、塩は、塩化ナトリウムおよび塩化カルシウムである。一部の実施形態では、塩化ナトリウムは、水性アッセイ試料中で、約５０ｍＭ～約４００ｍＭである。一部の実施形態では、塩化ナトリウムは、水性アッセイ試料中で、約１００ｍＭ～約２００ｍＭである。一部の実施形態では、塩化カルシウムは、水性アッセイ試料中で、約０．２ｍＭ～約１０ｍＭである。一部の実施形態では、塩化カルシウムは、水性アッセイ試料中で、約１．０ｍＭ～約２．０ｍＭである。
【0089】
一部の実施形態では、緩衝剤は、約ｐＨ６．０で緩衝能を有する。一部の実施形態では、緩衝剤は、Ｔｒｉｓである。一部の実施形態では、緩衝剤は、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓである。一部の実施形態では、緩衝剤は、水性アッセイ試料中で、約２ｍＭ～約２００ｍＭである。一部の実施形態では、緩衝剤は、水性アッセイ試料中で、約１０ｍＭ～約１００ｍＭである。一部の実施形態では、緩衝剤は、水性アッセイ試料中で、約４０ｍＭ～約６０ｍＭである。一部の実施形態では、緩衝剤は、水性アッセイ試料中で、約４５ｍＭ～約５５ｍＭである。
【0090】
一部の実施形態では、タンパク質調製物は、本明細書に記載のタンパク質調製物である。一部の実施形態では、タンパク質調製物は、細胞培養上清である。一部の実施形態では、タンパク質調製物は、部分的に精製されたタンパク質調製物である。一部の実施形態では、タンパク質調製物は、精製されたタンパク質調製物である。様々な程度に精製されたタンパク質調製物、例えば、細胞培養上清、部分的に精製されたタンパク質調製物、および精製されたタンパク質調製物が本明細書に記載される。一部の実施形態では、タンパク質調製物は、治療用タンパク質（例えば、本明細書に記載の治療用タンパク質）を含む。本開示の方法は、タンパク質調製物の精製プロセス全体を通して、タンパク質調製物中の脂肪分解活性の単純かつ効率的な決定を有利に可能にする。例えば、細胞培養上清（またはその後の精製プロセスの生成物）の脂肪分解活性を、本方法を使用して測定して、その後の精製ステップの間にリパーゼを除去する必要があるかどうかを判定することができる。有利には、本方法は、タンパク質調製物中の脂肪分解活性が適切に消失しているかどうかを判定するために、精製プロセス全体を通して生成物に対して使用することができる。
【0091】
一部の実施形態では、タンパク質調製物は、追加の宿主細胞タンパク質を含む。一部の実施形態では、追加の宿主細胞タンパク質は、リパーゼを含む。リパーゼは、本明細書に記載される。
【0092】
一部の実施形態では、タンパク質調製物は、界面活性剤（例えば、本明細書に記載の界面活性剤）を含む。一部の実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベートである。一部の実施形態では、ポリソルベートは、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、またはそれらの組み合わせである。
【0093】
一部の実施形態では、有機溶媒は、本明細書に記載の有機溶媒である。一部の実施形態では、有機溶媒は、アルコール、スルホキシド、ニトリル、またはそれらの組み合わせである。一部の実施形態では、有機溶媒は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である。一部の実施形態では、有機溶媒は、アセトニトリルを含む。一部の実施形態では、有機溶媒は、アルコールを含む。一部の実施形態では、有機溶媒は、Ｃ１－Ｃ６アルコールである。一部の実施形態では、有機溶媒は、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ｓｅｃ－ブタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール、またはそれらの組み合わせである。一部の実施形態では、有機溶媒は、アセトニトリルおよびイソプロパノールの混合物を含む。一部の実施形態では、アセトニトリルおよびイソプロパノールは、約３：１の比率で混合される。
【0094】
一部の実施形態では、有機溶媒は、４－メチルウンベリフェリルオレエート（４ＭｕＯ）を含む。４ＭｕＯの構造は、本明細書に提供される。一部の実施形態では、４ＭｕＯは、例えば、スキームＩに記載されるように加水分解されて、オレイン酸および４－メチルウンベリフェロン（４Ｍｕ）を形成する。４Ｍｕの構造は、本明細書に提供される。一部の実施形態では、４Ｍｕは、蛍光性である。一部の実施形態では、４Ｍｕの蛍光は、約３３０ｎｍの励起および４９５ｍｍの発光で測定される。
【0095】
一部の実施形態では、本方法は、蛍光を、最大２４時間測定することを含む。一部の実施形態では、蛍光は、約２４時間～約４００時間測定される。一部の実施形態では、蛍光は、約２４時間を超えて測定される。一部の実施形態では、蛍光は、約１００時間を超えて測定される。一部の実施形態では、蛍光は、約３００時間を超えて測定される。蛍光測定は、必ずしも連続測定である必要はなく、所定の時点で蛍光が測定され得ることを理解されたい。一部の実施形態では、蛍光は、約１２時間～約４００時間の選択された時点で測定される。一部の実施形態では、蛍光は、約２４時間、約４８時間、約７２時間、約９６時間、約１２０時間、約１４４時間、約１６８時間、約１９２時間、約２１６時間、約２４０時間、約２６４時間、約２８８時間、約３１２時間、約３３６時間、約３６０時間、約３８４時間、または約４００時間の時点で測定される。蛍光が測定される期間は、タンパク質調製物中のリパーゼ活性のレベルに応じて選択され得る。例えば、低レベルの脂肪分解活性は、４ＭｕＯのより遅い加水分解に起因して、より長い検出期間を必要とし得る。
【0096】
一部の実施形態では、治療用タンパク質を含むタンパク質調製物は、精製され、次いで、一定期間（例えば、４時間未満、８時間未満、１日未満、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約１週間、１週間超、約２週間、２週間超、約３週間、３週間超、約１ヶ月間、１ヶ月間超、約２ヶ月間、２ヶ月間超、約３ヶ月間、または３ヶ月間超）保存される。次いで、タンパク質調製物を本方法に供して、脂肪分解活性を検出する。
【0097】
一部の実施形態では、水性アッセイ試料および有機溶媒は、約７０：３０～約９９：１の比率で組み合わされる。一部の実施形態では、水性アッセイ試料および有機溶媒は、約７５：２５～約９９：１の比率で組み合わされる。一部の実施形態では、水性アッセイ試料および有機溶媒は、約８０：２０～約９８：２の比率で組み合わされる。一部の実施形態では、水性アッセイ試料および有機溶媒は、約８５：１５～約９８：２の比率で組み合わされる。一部の実施形態では、水性アッセイ試料および有機溶媒は、約９０：１０～約９８：２の比率で組み合わされる。一部の実施形態では、水性アッセイ試料および有機溶媒は、約９５：５～約９８：２の比率で組み合わされる。
【0098】
一部の実施形態では、水性アッセイ試料は、ステップ（ａ）の前に、リパーゼ阻害剤と約１０分間～約１時間インキュベートされ、タンパク質調製物を含む水性アッセイ試料と有機溶媒が組み合わされる。一部の実施形態では、水性アッセイ試料は、ステップ（ａ）の前に、リパーゼ阻害剤と約１５分間～約４５分間、約２０分間～約４０分間、または約３０分間インキュベートされる。一部の実施形態では、水性アッセイ試料をリパーゼ阻害剤とインキュベートすると、脂肪分解活性が低減または消失する。一部の実施形態では、水性アッセイ試料をリパーゼ阻害剤とインキュベートすることは、脂肪分解活性の検出のための陰性対照を提供する。実施形態では、水性アッセイ試料が、ステップ（ａ）の前に、リパーゼ阻害剤とインキュベートされ、測定された蛍光は、脂肪分解活性が低い（すなわち、低い脂肪分解活性または脂肪分解活性の欠如を示す）と予想される。リパーゼ阻害剤は、本明細書に記載される。一部の実施形態では、リパーゼ阻害剤は、（Ｓ）－２－ホルミルアミノ－４－メチル－ペンタン酸（Ｓ）－１－［［（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヘキシル－４－オキソ－２－オキセタニル］メチル］－ドデシルエステル（オルリスタット）である。一部の実施形態では、リパーゼ阻害剤は、組成物中で、約１μＭ～約５０μＭである。一部の実施形態では、リパーゼ阻害剤は、組成物中で、約５μＭ～約２５μＭである。
【0099】
一部の実施形態では、対照試料は、脂肪分解活性のための水性アッセイ試料と並行して測定される。一部の実施形態では、本開示は、水性アッセイ試料中の脂肪分解活性を検出する方法を提供し、当該方法は、（ａ）タンパク質調製物を含む水性アッセイ試料を、４－メチルウンベリフェリルオレエート（４ＭｕＯ）を含む有機溶媒と組み合わせて、アッセイ組成物を形成することと、（ｂ）タンパク質調製物およびリパーゼ阻害剤を含む対照試料を、４－メチルウンベリフェリルオレエート（４ＭｕＯ）を含む有機溶媒と組み合わせて、対照組成物を形成することと、（ｃ）アッセイ組成物および対照組成物中の蛍光によって、オレエートおよび４－メチルウンベリフェロン（４Ｍｕ）の形成を測定することと、を含む。一部の実施形態では、（ａ）のタンパク質調製物および（ｂ）のタンパク質調製物は、同じタンパク質調製物から提供される。例えば、細胞培養物からタンパク質調製物を得て、それから２つのアリコートを取り出すことができる。一方のアリコートは、水性アッセイ試料のタンパク質調製物であり得、他方のアリコートは、対照試料のタンパク質調製物であり得る。一部の実施形態では、（ａ）のタンパク質調製物および（ｂ）のタンパク質調製物は、実質的に同じ成分を含む。一部の実施形態では、（ａ）のタンパク質調製物および（ｂ）のタンパク質調製物は、同じレベルの脂肪分解活性を有すると予想される。一部の実施形態では、水性アッセイ試料および対照試料は、対照試料中のリパーゼ阻害剤を除いて、実質的に同じ成分を有する。一部の実施形態では、リパーゼ阻害剤を含む対照試料は、陰性対照試料であり、すなわち、蛍光が検出されないと予想される。一部の実施形態では、本方法は、陽性対照試料（すなわち、蛍光が予想される試料）をさらに利用する。一部の実施形態では、陽性対照試料は、既知の量の４Ｍｕを含む。一部の実施形態では、陽性対照試料は、既知の量の４ＭｕＯおよび既知の量の活性リパーゼを含む。
【0100】
本明細書で考察されるように、脂肪分解活性を有するリパーゼは、タンパク質調製物の成分を妨害し得る。一部の実施形態では、脂肪分解活性を有するリパーゼは、タンパク質調製物中に存在する脂肪酸および／またはエステルを加水分解する。一部の実施形態では、脂肪分解活性を有するリパーゼは、タンパク質調製物中に存在する界面活性剤を加水分解する。一部の実施形態では、界面活性剤の加水分解は、タンパク質調製物の安定性を低下させる。本明細書で提供される方法を使用して脂肪分解活性の量を測定することによって、タンパク質調製物中で生じた加水分解のレベルは、その後、脂肪分解活性の測定量に基づいて決定され得、それによって、タンパク質調製物の安定性が決定される。一部の実施形態では、本開示は、タンパク質調製物の安定性を決定する方法を提供し、（ａ）タンパク質調製物を含む水性アッセイ試料を、４－メチルウンベリフェリルオレエート（４ＭｕＯ）を含む有機溶媒と組み合わせることと、（ｂ）蛍光によって、オレエートおよび４－メチルウンベリフェロン（４Ｍｕ）の形成を測定することと、（ｃ）測定された蛍光に基づいて、タンパク質調製物の安定性を決定することと、を含む。例えば、対照と比較して増加した蛍光は、リパーゼの存在を示し、賦形剤（例えば、ポリソルベートなどの界面活性剤）が加水分解され、それによって、非極性の、したがって不溶性の、長鎖脂肪酸を形成し、これが、タンパク質調製物中のタンパク質を不安定化させ得ることを示す。一部の実施形態では、本方法は、薬学的製剤のタンパク質調製物の安定性を決定するために使用される。
【0101】
一部の実施形態では、本開示は、本発明の組成物を提供するのに好適なキットを提供する。一部の実施形態では、本開示は、本発明の方法を達成するために使用され得るキットを提供する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、キットをさらに提供し、２つ以上の容器内に、（ａ）有機溶媒と、（ｂ）４－メチルウンベリフェリルオレエート（４ＭｕＯ）と、（ｃ）リパーゼ阻害剤と、を含む。
【0102】
任意の好適な容器は、本明細書に記載のキットに使用され得る。一部の実施形態では、容器は、バイアルである。一部の実施形態では、容器は、ボトルである。一部の実施形態では、各容器は、多区画（ｍｕｌｔｉ－ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）容器の区画である。一部の実施形態では、有機溶媒および４ＭｕＯは、第１の容器内にあり、リパーゼ阻害剤は、第２の容器内にある。一部の実施形態では、有機溶媒およびリパーゼ阻害剤は、第１の容器内にあり、４ＭｕＯは、第２の容器内にある。一部の実施形態では、リパーゼ阻害剤および４ＭｕＯは、第１の容器内にあり、有機溶媒は、第２の容器内にある。一部の実施形態では、リパーゼ阻害剤および有機溶媒は、第１の容器内にあり、４ＭｕＯおよび有機溶媒は、第２の容器内にある。一部の実施形態では、４ＭｕＯは、固体（例えば、粉末）として提供される。一部の実施形態では、４ＭｕＯは、溶液（例えば、有機溶媒）中に提供される。一部の実施形態では、リパーゼ阻害剤は、固体（例えば、凍結乾燥粉末などの粉末）として提供される。一部の実施形態では、リパーゼ阻害剤は、溶液（例えば、有機溶媒）中に提供される。上記実施形態のいずれかにおいて、（ａ）有機溶媒、（ｂ）４－メチルウンベリフェリルオレエート（４ＭｕＯ）、および／または（ｃ）リパーゼ阻害剤は、所定の特定の量のタンパク質調製物を受容するために、それぞれの容器に含まれ得、各成分の量は、本明細書に記載の脂肪分解活性を決定する方法を実施するのに十分である。一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載の方法のように、脂肪分解活性を決定するためにキットを利用するための説明書をさらに含む。
【0103】
一部の実施形態では、キットは、緩衝剤、塩、またはそれらの両方をさらに含む。好適な緩衝剤および塩は、本明細書に記載される。一部の実施形態では、キットのユーザーは、キットと共に使用するためのタンパク質調製物を提供する。一部の実施形態では、ユーザーのタンパク質調製物は、キットとの使用に好適でない緩衝液（例えば、４ＭｕＯの自己加水分解および／またはリパーゼ阻害剤の分解を促進する緩衝液）中にある。一部の実施形態では、キットは、緩衝液交換カラムを提供する。一部の実施形態では、緩衝液交換カラムは、ユーザーのタンパク質調製物の緩衝液を、本明細書で提供されるキットとの使用に好適な緩衝液に交換する。緩衝液交換カラムの例としては、ＴＨＥＲＭＯ ＦＩＳＨＥＲからのＺＥＢＡカラム、ＧＥ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥからのＰＤ－１０、ＳＥＰＨＡＤＥＸ、ＨＩＰＲＥＰ、およびＨＩＴＲＡＰカラム、ＳＡＲＴＯＲＩＵＳからのＶＩＶＡＦＬＯＷおよびＶＩＶＡＳＰＩＮ濃縮器、ＢＩＯ－ＲＡＤからのＢＩＯ－ＳＰＩＮおよびＥＣＯＮＯカラム、ならびにＧ－ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳからのＳＰＩＮＯＵＴカラムが挙げられるが、これらに限定されない。
【0104】
本明細書に記載のキットのカラムは、緩衝系を交換するために使用され得る。この目的のために使用されるカラムは、当業者に既知である。例えば、カラムを使用して、タンパク質調製物中の緩衝液を、本明細書に記載される脂肪分解活性を決定する方法を実施するのにより好適な緩衝液に交換することができる。
【0105】
一部の実施形態では、本開示は、キットを提供し、当該キットは、（ａ）４－メチルウンベリフェリルオレエート（４ＭｕＯ）を含む有機溶媒と、（ｂ）タンパク質調製物の緩衝液を交換するのに好適なカラムと、（ｃ）リパーゼ阻害剤と、を含む。
【0106】
本開示のキットに好適な有機溶媒には、本明細書に記載の有機溶媒が含まれる。一部の実施形態では、有機溶媒は、アルコール、スルホキシド、ニトリル、またはそれらの組み合わせである。一部の実施形態では、有機溶媒は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である。一部の実施形態では、有機溶媒は、アセトニトリルを含む。一部の実施形態では、有機溶媒は、アルコールを含む。一部の実施形態では、有機溶媒は、Ｃ１－Ｃ６アルコールである。一部の実施形態では、有機溶媒は、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ｓｅｃ－ブタノール、イソブタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール、またはそれらの組み合わせである。一部の実施形態では、有機溶媒は、アセトニトリルおよびイソプロピルアルコールの混合物を含む。
【0107】
本開示のキットに好適なリパーゼ阻害剤には、本明細書に記載のリパーゼ阻害剤が含まれる。一部の実施形態では、リパーゼ阻害剤は、（Ｓ）－２－ホルミルアミノ－４－メチル－ペンタン酸（Ｓ）－１－［［（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヘキシル－４－オキソ－２－オキセタニル］メチル］－ドデシルエステル（オルリスタット）である。一部の実施形態では、リパーゼ阻害剤は、本明細書に記載される脂肪分解活性を決定する方法を実施するときに、対照として使用される。
【0108】
本開示のキットに好適な塩には、本明細書に記載される塩が含まれる。一部の実施形態では、塩は、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、またはそれらの組み合わせである。一部の実施形態では、塩は、塩化ナトリウムおよび塩化カルシウムである。
【0109】
本開示のキットに好適な緩衝剤には、本明細書に記載の緩衝剤が含まれる。一部の実施形態では、緩衝剤は、Ｔｒｉｓである。一部の実施形態では、緩衝剤は、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓである。
【0110】
一部の実施形態では、キットは、脂肪分解活性を決定するためのアッセイを実施するための説明書をさらに含む。一部の実施形態では、アッセイは、本明細書に記載の方法を含む。
【0111】
特許、特許出願、論文、教科書などを含む本明細書に引用される全ての参考文献、およびそれらに引用される参考文献（それらがまだ引用されていない範囲まで）は、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
【実施例】
【0112】
本明細書に記載の実験のための化学物質および試薬は、以下の通りである。
【0113】
２－プロパノール（ＩＰＡ、９９．９％）、アセトニトリル（ＡＣＮ、ＨＰＬＣ Ｐｌｕｓ、≧９９．９％）、塩化カルシウム（≧９７％）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（実験室グレード）、リン酸ナトリウム一塩基性一水和物（ＡＣＳ試薬、≧９５％）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｌｕｓ、≧９９．５％）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（現Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ）から入手した。４－メチルウンベリフェロン（４Ｍｕ、≧９８％）およびＮ－フェニル－１－ナフチルアミン（ＮＰＮ、試薬グレード、９８％）は、Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。塩化ナトリウム（バイオ試薬、≧９９％）、ＴＲＩＺＭＡ（登録商標）塩酸塩（試薬グレード、９９．０％）、ＴＲＩＺＭＡ（登録商標）塩基（一次標準および緩衝液、≧９９．９％）、ブタ膵臓由来リパーゼ（ＰＰＬ、ＩＩ型、１００～５００Ｕ／ｍｇ）、ＢＩＳ－ＴＲＩＳ塩酸塩（≧９９．０％（滴定））、４－メチルウンベリフェリルオレエート（４ＭｕＯ、蛍光用に好適、≧９５％（ＨＰＣＥ））およびＫＯＬＬＩＰＨＯＲ（登録商標）Ｐ１８８（細胞培養用に好適）は、Ｓｉｇｍａから入手した。アセトニトリル（ＬＣ－ＭＳグレード）は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから入手した。エタノール（ＥｔＯＨ、液体クロマトグラフィーの勾配グレード）および塩酸２５％（ｖ／ｖ）は、Ｍｅｒｃｋから入手した。スクロース（ＵＳＰ／ＮＦ、ＥＰ、ＪＰ、高純度）は、Ｐｆａｎｓｔｉｅｈｌから入手した。水酸化ナトリウムの１Ｍ溶液は、Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ ＦｌｕｋａＴＭから入手した。塩化ナトリウム（ＵＳＰ、マルチコンペンディアル）、Ｌ－ヒスチジン（ＵＳＰ、マルチコンペンディアル）、Ｌ－ヒスチジン一塩酸塩（ＦＣＣ、マルチコンペンディアル）、ＰＳ２０（ＮＦ）、およびＰＳ８０（ＮＦ）は、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ．から入手した。高度に精製された水（以下、「水」と呼ばれる）は、水浄化システム（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ（商標）ＧｅｎＰｕｒｅ（商標）Ｐｒｏ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用することによって調製した。ｐＨは、ｐＨメーター（７８０ ｐＨメーター、Ｍｅｔｒｏｈｍ）および白金ｐＨ電極（Ｕｎｉｔｒｏｄｅ Ｐｔ１０００、Ｍｅｔｒｏｈｍ）を使用して測定した。非治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ１）を発現する独自のＣＨＯ細胞株から産生されたＨＣＰの一部としてリパーゼの混合物を含む細胞培養回収液（ＣＣＨＦ）、ならびにｍＡｂ１は、Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｓｌｏｕｇｈ，ＵＫから入手した。
【0114】
実施例１Ａ．リパーゼアッセイの開発Ｉ：ｐＨ
Ｋｕｒｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ ２６：３８３－３８５（２００３）に記載されている方法に基づいて、リパーゼアッセイを開発した。これは、リパーゼ酵素の基質として、４－メチルウンベリフェリルオレエート（４ＭｕＯ）を利用する。
Ｋｕｒｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ ２６：３８３－３８５（２００３）に記載されている方法に基づいて、リパーゼアッセイを開発した。これは、リパーゼ酵素の基質として、４－メチルウンベリフェリルオレエート（４ＭｕＯ）を利用する。
【0115】
ブタ膵臓リパーゼ（ＰＰＬ）を、アッセイの開発に使用した。この実験では、５００ｎＭのＰＰＬおよび４ＭｕＯを、４つの異なる緩衝系のうちの１つで２２時間インキュベートし、４ＭｕＯの蛍光クエンチおよび自己加水分解について試験した：（ａ）１０．４ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．１、（ｂ）１０．４ｍＭのＢｉｓ－Ｔｒｉｓ ｐＨ６、（ｃ）４１．６ｍＭのＢｉｓ－Ｔｒｉｓ ｐＨ６、（ｄ）１０４ｍＭのＢｉｓ－Ｔｒｉｓ ｐＨ６。
【0116】
図１Ａ～１Ｂおよび表１の結果は、ｐＨ８と比較して、ｐＨ６で、４ＭｕＯの自己加水分解が減少したことを示す。図１Ｃは、ｐＨ８における自己加水分解速度が、ｐＨ６における速度のほぼ２倍であったことを示す。リパーゼは、ｐＨ６と比較して、ｐＨ８で、わずかに活性が高かった（２０％未満）。緩衝液の濃度は、自己加水分解およびリパーゼ活性に対して強い影響を有していないようであった。脂肪分解活性は、４１．６ｍＭのＢｉｓ－Ｔｒｉｓ緩衝液において最も高いようであった。蛍光クエンチは、１０４ｍＭのＢｉｓ－Ｔｒｉｓ緩衝液中で観察された。
【表1】
【0117】
４ＭｕＯの自己加水分解をさらに検討した。４ＭｕのｐＫａは、約７．７である。図１Ｄは、４Ｍｕを測定したｐＨ範囲を示す（Ｚｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃ １（２０１３）ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１３／１４７１２８から転載されたグラフ）。図１Ｅは、様々なｐＨ範囲にわたる４Ｍｕの４つの形態を示す（Ｚｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３から転載）。形態ＩＩが優勢であり、３２０ｎｍのλｅｘおよび４４５ｎｍのλｅｍで、その励起および発光を示す。
【0118】
実施例１Ｂ．リパーゼアッセイの開発Ｉ：ｐＨ
リパーゼアッセイ緩衝液の様々な緩衝剤およびｐＨを評価するために、さらなる試験を行った。以下の体積比を適用した（全てｖ／ｖ）：試料（７５％）、高濃度マトリックス緩衝液（ＨＣＭＢ）（２０％）、有機溶媒（５％）。混合物を、約２４時間～約３００時間の時間枠でインキュベートした。アッセイの成分を、９６ウェルプレートに移し、蛍光強度について分析した。４μＭの検量線について、基準標準物質である４μＭを、有機溶媒中で、０μＭ、０．２μＭ、１μＭ、２μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ、５０μＭ、および１００μＭの濃度で調製し、他のアッセイ成分に、０μＭ、０．１μＭ、０．０５μＭ、０．１μＭ、０．２５μＭ、０．５μＭ、１μＭ、２．５μＭ、および５μＭの最終濃度まで、５％（ｖ／ｖ）でスパイク（ｓｐｉｋｅ）した。検量線の傾きは、低検量範囲（０．０１～０．５μＭ）から最大５μＭの高検量範囲まで、わずかにずれていることが分かった。したがって、４Ｍｕの定量結果は、最大０．５μＭの濃度範囲で、０．０１～０．５μＭに限定された検量線を用いて計算された。図１９Ａおよび１９Ｂに、４Ｍｕの検量線が示されている。
リパーゼアッセイ緩衝液の様々な緩衝剤およびｐＨを評価するために、さらなる試験を行った。以下の体積比を適用した（全てｖ／ｖ）：試料（７５％）、高濃度マトリックス緩衝液（ＨＣＭＢ）（２０％）、有機溶媒（５％）。混合物を、約２４時間～約３００時間の時間枠でインキュベートした。アッセイの成分を、９６ウェルプレートに移し、蛍光強度について分析した。４μＭの検量線について、基準標準物質である４μＭを、有機溶媒中で、０μＭ、０．２μＭ、１μＭ、２μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ、５０μＭ、および１００μＭの濃度で調製し、他のアッセイ成分に、０μＭ、０．１μＭ、０．０５μＭ、０．１μＭ、０．２５μＭ、０．５μＭ、１μＭ、２．５μＭ、および５μＭの最終濃度まで、５％（ｖ／ｖ）でスパイク（ｓｐｉｋｅ）した。検量線の傾きは、低検量範囲（０．０１～０．５μＭ）から最大５μＭの高検量範囲まで、わずかにずれていることが分かった。したがって、４Ｍｕの定量結果は、最大０．５μＭの濃度範囲で、０．０１～０．５μＭに限定された検量線を用いて計算された。図１９Ａおよび１９Ｂに、４Ｍｕの検量線が示されている。
【0119】
この試験では、「試料」は、プラセボ組成の緩衝液であり、２０ｍＭのＬ－ヒスチジン、ｐＨ６（ｐＨ調整は、２５％（ｗ／ｖ）のＨＣｌもしくは１ＭのＮａＯＨを添加することによって行った）、２５０ｍＭのスクロース、０．５％の細胞培養回収液（ＣＣＨＦ）、または約０．００２５ｍｇ／ｍＬのブタ膵臓リパーゼ（ＰＰＬ）を含んだ。ＨＣＭＢは、ｐＨ７およびｐＨ８のＴＲＩＳ（２０８ｍＭ）、またはｐＨ６のＢＩＳ－ＴＲＩＳ（２０８ｍＭ）（ｐＨ調整は、２５％（ｗ／ｖ）のＨＣｌもしくは１ＭのＮａＯＨを添加することによって行った）、ＮａＣｌ（２００ｍＭ、６００ｍＭ、もしくは１８００ｍＭ）、ＣａＣｌ２（０．５２ｍＭ、５．２ｍＭ、もしくは５２ｍＭ）を含んだ。有機溶媒は、１００μＭの４ＭｕＯを含む、メタノール（ＭｅＯＨ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、またはイソプロパノール（ＩＰＡ）のいずれかであり、５％（ｖ／ｖ）の有機溶媒／基質が添加された。アッセイの成分を、９６ウェルプレートに移し、蛍光強度について分析した。
【0120】
蛍光分析用に、試料を、９６ウェルのマイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）Ｎｕｎｃ（商標）Ｆ９６マイクロウェル（商標）黒色ポリスチレンプレート）に移した。蛍光測定は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉＤ３マイクロプレートリーダーおよびＳＭＰ７．１ソフトウェアで実施した。最大励起（λｅｘ）および発光波長（λｅｍ）は、それぞれ、３３０ｎｍおよび４９５ｎｍであり、最適化後、４Ｍｕの中間濃度について、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ７．１（ＳＭＰ７．１）波長最適化モードを使用した。蛍光シグナルを約２４時間～約３００時間のインキュベーション時間で読み取り、各読み取りのために、２００μＬの液体（試料、ＨＣＭＢ、および有機溶媒を含む）を各ウェルに移すことによって、新しい９６ウェルマイクロプレートを調製した。周囲温度で蛍光測定を実施した。
【0121】
図１１に、ｐＨ６、ｐＨ７、またはｐＨ８における２つの異なる緩衝液（ＴＲＩＳまたはＢＩＳ－ＴＲＩＳ）の評価の結果を示す。４ＭｕＯから４Ｍｕへの変換は、４Ｍｕの蛍光強度をモニタリングすることによって測定した。ＰＰＬまたはＣＣＨＦのいずれか、および４ＭｕＯ自己加水分解を含む試料を評価した。ｐＨ変更の最も顕著な影響は、自己加水分解（ＡＨ）について観察され、ｐＨを８から６に下げると、約５倍減少した。異なるｐＨの試料中の４Ｍｕ濃度を、同じｐＨでの参照試料中の４Ｍｕの検量線に対して測定した。すなわち、観察された傾向は、異なるｐＨにおける４Ｍｕ蛍光の異なる応答に起因するのではなく、異なる反応速度に起因する。ＰＰＬ活性は、ｐＨを８から６に下げると、ほぼ２倍増加したが、ＣＣＨＦ脂肪分解活性は影響を受けなかった。ＰＰＬのｐＨ依存性は、以前に、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，“Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｐｏｒｃｉｎｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｌｉｐａｓｅ ｏｎ ｒｏｄ－ｌｉｋｅ ＳＢＡ－１５ ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ ｍａｔｅｒｉａｌ，”Ｃｏｌｌｏｉｄｓ ａｎｄ Ｓｕｒｆａｃｅｓ Ａ：Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍ Ｅｎｇ Ａｓｐｅｃｔｓ ２００９；３４１：７９－８５に記載されている。しかしながら、このｐＨ依存性は、ＤＳプールに含まれるＨＣＰに存在する可能性のある任意の他の種類のリパーゼに関して同一ではない場合がある。ｐＨ６は、ポリソルベートの分解が観察および報告された多くの治療用タンパク質製剤が、典型的には、わずかに酸性のｐＨで維持され、したがって、アッセイのｐＨを約６に適応させることは、リパーゼ媒介性の加水分解性ポリソルベートの分解を引き起こす原因となる元凶（例えば、リパーゼ）を包含するものと想定されるという観点からも、最も好適であると考えられた。したがって、２００ｍＭの濃度のＢＩＳ－ＴＲＩＳを選択して、ＨＣＭＢに添加して、ｐＨ６での４０ｍＭの最終アッセイ濃度を得た。
【0122】
実施例２Ａ．リパーゼアッセイの開発ＩＩ：ＣａＣｌ２
リパーゼアッセイ緩衝液中の塩化カルシウム濃度を調べた。５００ｎＭのＰＰＬおよび４ＭｕＯを使用したリパーゼアッセイを、３つの異なるＣａＣｌ２濃度で実施し、４ＭｕＯの蛍光クエンチおよび自己加水分解を調べた：（ａ）０．１０４ｍＭのＣａＣｌ２、（ｂ）１．０４ｍＭのＣａＣｌ２、および（ｃ）１０．４ｍＭのＣａＣｌ２。
リパーゼアッセイ緩衝液中の塩化カルシウム濃度を調べた。５００ｎＭのＰＰＬおよび４ＭｕＯを使用したリパーゼアッセイを、３つの異なるＣａＣｌ２濃度で実施し、４ＭｕＯの蛍光クエンチおよび自己加水分解を調べた：（ａ）０．１０４ｍＭのＣａＣｌ２、（ｂ）１．０４ｍＭのＣａＣｌ２、および（ｃ）１０．４ｍＭのＣａＣｌ２。
【0123】
【0124】
実施例２Ｂ．リパーゼアッセイの開発ＩＩ：ＣａＣｌ２
リパーゼアッセイ緩衝液中の塩化カルシウム濃度を、さらなる実験で調べた。試料、ＨＣＢＭ組成物、および実験手順は、実施例１Ｂに記載される通りであり、ＣａＣｌ２は、実施例１Ｂに記載されるように、０．５２ｍＭ、５．２ｍＭ、または５２ｍＭでＨＣＭＢに含まれた。
リパーゼアッセイ緩衝液中の塩化カルシウム濃度を、さらなる実験で調べた。試料、ＨＣＢＭ組成物、および実験手順は、実施例１Ｂに記載される通りであり、ＣａＣｌ２は、実施例１Ｂに記載されるように、０．５２ｍＭ、５．２ｍＭ、または５２ｍＭでＨＣＭＢに含まれた。
【0125】
ＰＰＬまたはＣＣＨＦのいずれかを含む試料を用いた、ＨＣＭＢ中の異なるＣａＣｌ２濃度の評価の結果を、図１２に示す。最高濃度のＣａＣｌ２では、ＰＰＬ活性がわずかに減少することが観察された。様々な原薬／医薬品マトリックスについて同様のアッセイ条件を確立するためのＨＣＭＢの要件を考慮して、５ｍＭのＣａＣｌ２を選択し、ＨＣＭＢに添加して、１ｍＭのＣａＣｌ２の最終アッセイ濃度を得た。
【0126】
実施例３Ａ．リパーゼアッセイの開発ＩＩＩ：ＮａＣｌ
リパーゼアッセイ緩衝液中の塩化ナトリウム濃度を調べた。５００ｎＭのＰＰＬおよび４ＭｕＯを使用したリパーゼアッセイを、３つの異なるＮａＣｌ濃度で実施し、４ＭｕＯの蛍光クエンチおよび自己加水分解を調べた：（ａ）４０ｍＭのＮａＣｌ、（ｂ）１２０ｍＭのＮａＣｌ、および（ｃ）３６０ｍＭのＮａＣｌ。
リパーゼアッセイ緩衝液中の塩化ナトリウム濃度を調べた。５００ｎＭのＰＰＬおよび４ＭｕＯを使用したリパーゼアッセイを、３つの異なるＮａＣｌ濃度で実施し、４ＭｕＯの蛍光クエンチおよび自己加水分解を調べた：（ａ）４０ｍＭのＮａＣｌ、（ｂ）１２０ｍＭのＮａＣｌ、および（ｃ）３６０ｍＭのＮａＣｌ。
【0127】
【0128】
実施例３Ｂ．リパーゼアッセイの開発ＩＩＩ：ＮａＣｌ
リパーゼアッセイ緩衝液中の塩化ナトリウム濃度を、さらなる実験で調べた。試料、ＨＣＢＭ組成物、および実験手順は、実施例１Ｂに記載される通りであった。実施例１Ｂに記載されるように、ＮａＣｌは、２００ｍＭ、６００ｍＭ、または１８００ｍＭでＨＣＭＢに含まれた。
リパーゼアッセイ緩衝液中の塩化ナトリウム濃度を、さらなる実験で調べた。試料、ＨＣＢＭ組成物、および実験手順は、実施例１Ｂに記載される通りであった。実施例１Ｂに記載されるように、ＮａＣｌは、２００ｍＭ、６００ｍＭ、または１８００ｍＭでＨＣＭＢに含まれた。
【0129】
ＰＰＬまたはＣＣＨＦのいずれかを含む試料を用いたＨＣＭＢ中の異なるＮａＣｌ濃度の評価の結果を、図１３に示す。最高濃度のＮａＣｌでは、ＰＰＬ活性がわずかに減少することが観察された。様々な原薬／医薬品マトリックスについて同様のアッセイ条件を確立するためのＨＣＭＢの要件を考慮して、６００ｍＭのＮａＣｌを選択し、ＨＣＭＢに添加して、１２０ｍＭのＮａＣｌの最終アッセイ濃度を得た。
【0130】
実施例４Ａ．リパーゼアッセイの開発ＩＶ：有機溶媒
リパーゼアッセイ緩衝液中の有機溶媒を調べた。５００ｎＭのＰＰＬおよび４ＭｕＯを使用したリパーゼアッセイを、３つの異なる有機溶媒を使用して実施し、４ＭｕＯの蛍光クエンチおよび自己加水分解を調べた：（ａ）ＤＭＳＯ、（ｂ）イソプロパノール（ＩＰＡ）、および（ｃ）メタノール（ＭｅＯＨ）。
リパーゼアッセイ緩衝液中の有機溶媒を調べた。５００ｎＭのＰＰＬおよび４ＭｕＯを使用したリパーゼアッセイを、３つの異なる有機溶媒を使用して実施し、４ＭｕＯの蛍光クエンチおよび自己加水分解を調べた：（ａ）ＤＭＳＯ、（ｂ）イソプロパノール（ＩＰＡ）、および（ｃ）メタノール（ＭｅＯＨ）。
【0131】
図４Ａ～４Ｃおよび表４の結果は、３つの溶媒のうち、イソプロパノールで、わずかな蛍光クエンチがあるものの、最低の自己加水分解が観察されたことを示す。しかしながら、メタノールも同等の結果をもたらした。さらに、Ｇｌｏｇａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ １０：５４（２０１１）は、メタノールが活性を向上させる能力を有し得ることを示す。
【表4】
【0132】
実施例４Ｂ．リパーゼアッセイの開発ＩＶ：有機溶媒
リパーゼアッセイ緩衝液中の有機溶媒を、さらなる実験で調べた。試料、ＨＣＢＭ組成物、および実験手順は、実施例１Ｂに記載される通りであった。実施例１Ｂに記載されるように、１００μＭの４ＭｕＯを含む有機溶媒のメタノール（ＭｅＯＨ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、またはイソプロパノール（ＩＰＡ）が、アッセイ反応に含まれた。
リパーゼアッセイ緩衝液中の有機溶媒を、さらなる実験で調べた。試料、ＨＣＢＭ組成物、および実験手順は、実施例１Ｂに記載される通りであった。実施例１Ｂに記載されるように、１００μＭの４ＭｕＯを含む有機溶媒のメタノール（ＭｅＯＨ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、またはイソプロパノール（ＩＰＡ）が、アッセイ反応に含まれた。
【0133】
図１４に、ＰＰＬまたはＣＣＨＦのいずれかを含む試料を用いた異なる有機溶媒の評価結果を示す。Ｇｌｏｇａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｔｒｕｅ ｌｉｐａｓｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈ，”Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ ２０１１；１０：５４に報告されている（Ｅ．ｃｏｌｉからメタゲノムアプローチによって単離されたＬｉｐＣ１２リパーゼに対して、異なる溶媒による強い影響が報告されている）以前の結果とは異なる。Ｇｌｏｇａｕｅｒらによると、ＭｅＯＨ－および（より低い程度で）ＩＰＡ－は、活性化効果を示し、ＬｉｐＣ１２リパーゼ活性を１０倍超増加させた。しかしながら、研究した細菌酵素は、例えば、実施例１Ｂの結果と比較して、活性のための異なる最適ｐＨによって証明されるように、非常に異なる特性を有している可能性が高い。図１４の結果に基づいて、ＨＣＭＢに添加するために、ＭｅＯＨを選択した。
【0134】
実施例５Ａ．リパーゼアッセイの開発Ｖ：界面活性剤
界面活性剤の存在下で、リパーゼアッセイ緩衝液の性能を調べた。５００ｎＭのＰＰＬおよび４ＭｕＯを使用したリパーゼアッセイを、２つの異なる濃度の２つの界面活性剤を使用して実施し、４ＭｕＯの蛍光クエンチおよび自己加水分解を調べた：（ａ）０．０１２％（ｗ／ｖ）のＴＲＩＴＯＮ Ｘ－１００、（ｂ）０．０６％（ｗ／ｖ）のＴＲＩＴＯＮ Ｘ－１００、（ｃ）０．０３２％（ｗ／ｖ）のＫＯＬＬＩＰＨＯＲ Ｐ１８８、および（ｄ）０．１６％（ｗ／ｖ）のＫＯＬＬＩＰＨＯＲ Ｐ１８８。界面活性剤を含まない対照も試験した。
界面活性剤の存在下で、リパーゼアッセイ緩衝液の性能を調べた。５００ｎＭのＰＰＬおよび４ＭｕＯを使用したリパーゼアッセイを、２つの異なる濃度の２つの界面活性剤を使用して実施し、４ＭｕＯの蛍光クエンチおよび自己加水分解を調べた：（ａ）０．０１２％（ｗ／ｖ）のＴＲＩＴＯＮ Ｘ－１００、（ｂ）０．０６％（ｗ／ｖ）のＴＲＩＴＯＮ Ｘ－１００、（ｃ）０．０３２％（ｗ／ｖ）のＫＯＬＬＩＰＨＯＲ Ｐ１８８、および（ｄ）０．１６％（ｗ／ｖ）のＫＯＬＬＩＰＨＯＲ Ｐ１８８。界面活性剤を含まない対照も試験した。
【0135】
【0136】
実施例５Ｂ．リパーゼアッセイの開発Ｖ：界面活性剤
ＰＰＬおよびＣＣＨＦの脂肪分解活性に対する界面活性剤の影響を評価するために、さらなる試験を行った。バイオ医薬品製剤に含まれる界面活性剤ポリソルベート２０（ＰＳ２０）およびポリソルベート８０（ＰＳ８０）を評価した。また、ポロキサマーも試験した。以前の研究では（Ｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐａｒａ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｐａｌｍｉｔａｔｅ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｌｉｐａｓｅｓ ａｎｄ ｅｓｔｅｒａｓｅｓ，”Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２００２；３１１：９８－９９）、界面活性剤が、ｐ－ニトロフェニルパルミテートなどの難溶性基質を可溶化することが示唆された。
ＰＰＬおよびＣＣＨＦの脂肪分解活性に対する界面活性剤の影響を評価するために、さらなる試験を行った。バイオ医薬品製剤に含まれる界面活性剤ポリソルベート２０（ＰＳ２０）およびポリソルベート８０（ＰＳ８０）を評価した。また、ポロキサマーも試験した。以前の研究では（Ｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐａｒａ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｐａｌｍｉｔａｔｅ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｌｉｐａｓｅｓ ａｎｄ ｅｓｔｅｒａｓｅｓ，”Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２００２；３１１：９８－９９）、界面活性剤が、ｐ－ニトロフェニルパルミテートなどの難溶性基質を可溶化することが示唆された。
【0137】
試料は、ｐＨ６で２０ｍＭのＬ－ヒスチジン、２５０ｍＭのスクロース、界面活性剤（０．０２％もしくは０．０６％（全てｗ／ｖ）のポリソルベート２０（ＰＳ２０）、ポリソベート－８０（ＰＳ８０）、またはポロキサマーのいずれか、あるいは界面活性剤を含まない対照として）、０．５％のＣＣＨＦまたは０．００２５ｍｇ／ｍＬのＰＰＬを含んだ。ＨＣＭＢは、ｐＨ６で２０８ｍＭのＢＩＳ－ＴＲＩＳ、６００ｍＭのＮａＣｌ、５．２ｍＭのＣａＣｌ２を含んだ。１００μＭの４ＭｅＯを含む５％（ｖ／ｖ）の有機溶媒ＭｅＯＨを、アッセイに添加した。アッセイ成分を、９６ウェルプレートに移し、実施例１Ｂに関して上に記載のように、蛍光強度について分析した。
【0138】
図１５に、脂肪分解活性に対する界面活性剤の影響の結果を示す。界面活性剤の存在は、脂肪分解活性に顕著な影響を及ぼした。ポリソルベートは、４Ｍｕの形成を、ＰＰＬでは＞９０％、ＣＣＨＦでは約８０％大幅に減少させた。ＰＳ８０は、ＰＳ２０と比較して、４Ｍｕの形成がやや顕著に減少させた。
【0139】
これらの観察に関して、いくつかの理由が考えられる：（１）脂肪酸エステルからなるポリソルベートは、リパーゼの競合基質／阻害剤である、かつ／または（２）非極性基質である４ＭｕＯがポリソルベートのミセル構造に組み込まれるため、水性媒体中の濃度が低下し、したがって、これが基質濃度と相関して、酵素速度定数に悪影響を及ぼす（例えば、ミカエリス・メンテン反応速度論の概念による）、かつ／または（３）リパーゼ酵素が構造的に影響を受けて、アンフォールディングをもたらす可能性があり、それによって、活性が低下する。
【0140】
興味深いことに、ポリソルベートの濃度は、ＣＣＨＦの脂肪分解活性に影響を及ぼしたように見えた。ＰＰＬは、２つの異なる選択された濃度の両方のポリソルベートで、同様に活性であったが、ポリソルベートの濃度がより高いと、活性がより低くなった。一方、ポロキサマーは、非常に異なる方法で、ＰＰＬおよびＣＣＨＦの脂肪分解活性に影響を与えた。ＰＰＬの活性は、対照と比較して約５０％に低下し、ポリソルベートで既に見られたように、選択された濃度の界面活性剤は、酵素活性に明らかな変動を示さなかった。ＣＣＨＦの脂肪分解活性は、少なくとも０．０２％の界面活性剤濃度でポロキサマーによって正の影響を受け、０．０６％の濃度では明らかに影響を受けなかった。いずれの特定の理論に拘束されるものではないが、界面活性剤の存在下での酵素的挙動ならびに濃度依存性についての１つの理由は、２つ以上の原因の組み合わせであり得る。例えば、リパーゼの動態および機構的な調査は、酵素が、水に難溶性である基質（例えば、トリグリセリドおよび他の脂肪）に対して反応を触媒するという事実に起因して、困難である。水／脂肪界面では、酵素は、蓋ドメインの動きによって活性化され、閉じた形態では、活性部位が保護されており、一方、開いた形態では、基質が活性部位にアクセスできるようになる。例えば、Ｌｏｗｅ，“Ｔｈｅ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｌｉｐａｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｎｃｒｅａｓ，”Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ ２００２；４３（１２）：２００７－２０１６を参照されたい。
【0141】
特に、ポリソルベートは、モデルリパーゼであるＰＰＬおよびＣＣＨＦの脂肪分解活性に悪影響を及ぼす。図１５Ａに示されるように、４Ｍｕ加水分解生成物の蛍光強度も、界面活性剤の存在下（図１５Ｂを参照されたい）で影響を受ける（約２０％の減少）。これは、４Ｍｕ生成物のシグナル強度の低下にも寄与する。
【0142】
実施例６Ａ．リパーゼアッセイの開発ＶＩ：リパーゼ阻害剤
リパーゼ阻害剤であるオルリスタットを、リパーゼアッセイの対照実験に選択し、異なる濃度の阻害剤を用いてアッセイの性能を評価した。オルリスタットは、膵リパーゼの活性部位のセリンに共有結合することによって酵素を阻害するメカニズムに基づく阻害剤として開発された。この作用様式により、消化管の脂肪加水分解に基づく肥満および関連症状を治療するための経口投与薬となった。どのリパーゼのクラスがオルリスタットによって阻害され得るかを体系的に調査した研究は発表されていない。しかしながら、以前に、哺乳類のリパーゼとは別に、細菌のリパーゼ（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｉｍｏｓｕｓ由来のもの）は、ミリモル濃度のオリスタットで阻害され得、阻害が、活性部位のセリンの共有結合性修飾によって生じることが報告されていた。例えば、Ｈａｄｖａｒｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ ｌｉｐａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｌｉｐｓｔａｔｉｎ ｂｉｎｄｓ ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ｔｏ ｔｈｅ ｐｕｔａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ ｓｅｒｉｎｅ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｌｉｐａｓｅ，”Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９１；２６６（４）：２０２１－２０２７、Ｈｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｏｒｌｉｓｔａｔ，ａ ｎｅｗ ｌｉｐａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｏｂｅｓｉｔｙ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ ２０００；２０（３）：２７０－２７９、Ａｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ－ｂｏｕｎｄ ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｌｉｐｓｔａｔｉｎ ａｔ ｔｈｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｓｅｒｉｎｅ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｉｍｏｓｕｓ ｌｉｐａｓｅ，”Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．２００７；１７７０：１６３－１７０を参照されたい。このような以前の研究では、この高濃度で疎水性阻害剤を導入するために、最終アッセイで、５０％（ｖ／ｖ）の有機溶媒の大きな体積比が必要であった。このような高い濃度の有機溶媒は、他のアッセイ成分との潜在的な障害のために（例えば、薬学的に活性なタンパク質の沈殿）、現在のリパーゼアッセイでは予測されなかったため、より低い溶媒濃度および阻害剤濃度も使用することを選択した。これは、哺乳類のリパーゼがはるかに低い濃度（すなわち、ナノモル濃度）のオルリスタットで阻害されることが見出されたため、必ずしもアッセイ読み出し（ｒｅａｄｏｕｔ）に悪影響を及ぼすとは限らない。例えば、Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｉｒｅｃｔ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｌｉｐａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｂｙ Ｏｒｌｉｓｔａｔ ｕｓｉｎｇ ａ ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ ｌｉｎｋｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｓｓａｙ，”Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｂｉｏｐｈａｒｍ ２０１２；１（３）：１－３を参照されたい。
リパーゼ阻害剤であるオルリスタットを、リパーゼアッセイの対照実験に選択し、異なる濃度の阻害剤を用いてアッセイの性能を評価した。オルリスタットは、膵リパーゼの活性部位のセリンに共有結合することによって酵素を阻害するメカニズムに基づく阻害剤として開発された。この作用様式により、消化管の脂肪加水分解に基づく肥満および関連症状を治療するための経口投与薬となった。どのリパーゼのクラスがオルリスタットによって阻害され得るかを体系的に調査した研究は発表されていない。しかしながら、以前に、哺乳類のリパーゼとは別に、細菌のリパーゼ（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｉｍｏｓｕｓ由来のもの）は、ミリモル濃度のオリスタットで阻害され得、阻害が、活性部位のセリンの共有結合性修飾によって生じることが報告されていた。例えば、Ｈａｄｖａｒｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ ｌｉｐａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｌｉｐｓｔａｔｉｎ ｂｉｎｄｓ ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ｔｏ ｔｈｅ ｐｕｔａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ ｓｅｒｉｎｅ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｌｉｐａｓｅ，”Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９１；２６６（４）：２０２１－２０２７、Ｈｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｏｒｌｉｓｔａｔ，ａ ｎｅｗ ｌｉｐａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｏｂｅｓｉｔｙ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ ２０００；２０（３）：２７０－２７９、Ａｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ－ｂｏｕｎｄ ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｌｉｐｓｔａｔｉｎ ａｔ ｔｈｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｓｅｒｉｎｅ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｉｍｏｓｕｓ ｌｉｐａｓｅ，”Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．２００７；１７７０：１６３－１７０を参照されたい。このような以前の研究では、この高濃度で疎水性阻害剤を導入するために、最終アッセイで、５０％（ｖ／ｖ）の有機溶媒の大きな体積比が必要であった。このような高い濃度の有機溶媒は、他のアッセイ成分との潜在的な障害のために（例えば、薬学的に活性なタンパク質の沈殿）、現在のリパーゼアッセイでは予測されなかったため、より低い溶媒濃度および阻害剤濃度も使用することを選択した。これは、哺乳類のリパーゼがはるかに低い濃度（すなわち、ナノモル濃度）のオルリスタットで阻害されることが見出されたため、必ずしもアッセイ読み出し（ｒｅａｄｏｕｔ）に悪影響を及ぼすとは限らない。例えば、Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｉｒｅｃｔ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｌｉｐａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｂｙ Ｏｒｌｉｓｔａｔ ｕｓｉｎｇ ａ ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ ｌｉｎｋｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｓｓａｙ，”Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｂｉｏｐｈａｒｍ ２０１２；１（３）：１－３を参照されたい。
【0143】
５００ｎＭのＰＰＬを含む試料を、３濃度のオルリスタット（リパーゼ阻害剤）で共処理および前処理した後、リパーゼ活性を試験して、４ＭｕＯの蛍光クエンチおよび自己加水分解を調べた：（ａ）２５μＭのオルリスタットで共処理、（ｂ）１５μＭのオルリスタットで共処理、（ｃ）５μＭのオルリスタットで共処理、（ｄ）２５μＭのオルリスタットで前処理、（ｅ）１５μＭのオルリスタットで前処理、および（ｆ）５μＭのオルリスタットで前処理。オルリスタットを含まない対照試料も試験した。
【0144】
図６Ａ～６Ｂおよび表６の結果は、２５μＭのオルリスタットによる前処理（３０分）で、脂肪分解活性が完全に消失したことを示す。より低い濃度のオルリスタットで、残存活性が観察された。蛍光クエンチは観察されなかった。
【表6】
【0145】
実施例６Ｂ．リパーゼアッセイの開発ＶＩ：リパーゼ阻害剤
リパーゼ阻害剤オルリスタットの濃度を、さらなる実験で評価した。試料、ＨＣＭＢ組成物、および実験手順を、実施例１Ｂと同様に行った。阻害剤を、ＭｅＯＨ中で、２００、６００、および１０００μＭの濃度で調製した。プレインキュベーション実験のために、阻害剤溶液を２．５％（ｖ／ｖ）でアッセイに補充し、３０分間プレインキュベーションを行った。次いで、２００μＭの４ＭｕＯを含むＭｅＯＨを、２．５％（ｖ／ｖ）でアッセイに添加した。共インキュベーション実験のために、１００μＭの４ＭｕＯおよびオルリスタット（１００μＭ、３００μＭ、および５００μＭ）を含むＭｅＯＨを、５％（ｖ／ｖ）で添加した。０．０３３５ｍｇ／ｍＬの高濃度ＰＰＬを使用した。
リパーゼ阻害剤オルリスタットの濃度を、さらなる実験で評価した。試料、ＨＣＭＢ組成物、および実験手順を、実施例１Ｂと同様に行った。阻害剤を、ＭｅＯＨ中で、２００、６００、および１０００μＭの濃度で調製した。プレインキュベーション実験のために、阻害剤溶液を２．５％（ｖ／ｖ）でアッセイに補充し、３０分間プレインキュベーションを行った。次いで、２００μＭの４ＭｕＯを含むＭｅＯＨを、２．５％（ｖ／ｖ）でアッセイに添加した。共インキュベーション実験のために、１００μＭの４ＭｕＯおよびオルリスタット（１００μＭ、３００μＭ、および５００μＭ）を含むＭｅＯＨを、５％（ｖ／ｖ）で添加した。０．０３３５ｍｇ／ｍＬの高濃度ＰＰＬを使用した。
【0146】
３濃度のオルリスタット、すなわち、５μＭ、１５μＭ、および２５μＭ（最終アッセイ体積に対する）を、「最悪の場合」、すなわち、０．０３３５ｍｇ／ｍＬのＰＰＬの非常に高濃度のリパーゼを用いて試験した。これらの濃度では、最終アッセイ溶液は透明であり、潜在的に不溶性の阻害剤による濁りは示されなかった。さらに、オルリスタットを５％（ｖ／ｖ）のＭｅＯＨ中の基質を含むアッセイに直接供した場合のリパーゼ活性への影響を、オルリスタットを２．５％（ｖ／ｖ）のＭｅＯＨ中の酵素を含む試料に予め添加し、３０分間インキュベーションした後、別の２．５％（ｖ／ｖ）体積分率のＭｅＯＨ中の基質を添加した場合と比較して、試験した。
【0147】
図１６に、リパーゼ阻害剤の評価の結果を示す。上に記載のような高濃度のＰＰＬに起因して、オルリスタットの不在下では、４ＭｕＯが、２４時間以内にほぼ完全に加水分解された。オルリスタットはＰＰＬを阻害し、その阻害効果はオルリスタット濃度と相関し、すなわち、最も高い阻害効果が２５μＭのオルリスタットで観察されたことも分かる。阻害剤との酵素のプレインキュベーションは有益な効果を有した。すなわち、試験された２５μＭの最高オリスタット濃度では、酵素活性は、基質と阻害剤が同時に添加された試料と比較して、前処理された試料で約５０％減少した。したがって、オルリスタットは、高濃度（すなわち２５μＭ）で陰性対照に補充されるように選択され、陰性対照は、基質を添加する前に、阻害剤と約３０分間プレインキュベートされる。
【0148】
実施例７．リパーゼアッセイの開発ＶＩＩ：脂肪酸生成物阻害
リパーゼアッセイで、２濃度の理論的に分解されたＰＳ２０およびＰＳ８０であるオレイン酸およびラウリン酸を使用して、脂肪酸生成物阻害を試験した：（ａ）０．１％および（ｂ）０．００１％。この実験では、ＰＰＬの濃度は８００ｎＭであった。
リパーゼアッセイで、２濃度の理論的に分解されたＰＳ２０およびＰＳ８０であるオレイン酸およびラウリン酸を使用して、脂肪酸生成物阻害を試験した：（ａ）０．１％および（ｂ）０．００１％。この実験では、ＰＰＬの濃度は８００ｎＭであった。
【0149】
図７Ａ～７Ｄおよび表７の結果は、８．５μＭ超のラウリン酸がリパーゼ活性を阻害し、８．５μＭと８５０μＭの間に大差がないことを示す。オレイン酸の場合、７８０μＭで有意な生成物阻害が観察された。
【表7】
【0150】
実施例８．リパーゼアッセイの開発ＶＩＩＩ：クエンチ効果
ポリソルベート８０のクエンチ効果を調べた。８００ｎＭのＰＰＬおよび新鮮なＰＳ８０を含む試料を、８００ｎＭのＰＰＬを含む対照およびＰＳ８０なしの対照に対して試験した。図８の結果は、ＰＳ８０により、各標準のＲＦＵ値が減少することを示し、軽度のクエンチ効果を示唆している。
ポリソルベート８０のクエンチ効果を調べた。８００ｎＭのＰＰＬおよび新鮮なＰＳ８０を含む試料を、８００ｎＭのＰＰＬを含む対照およびＰＳ８０なしの対照に対して試験した。図８の結果は、ＰＳ８０により、各標準のＲＦＵ値が減少することを示し、軽度のクエンチ効果を示唆している。
【0151】
実施例９．リパーゼアッセイの評価：ＣＣＨＦ
原薬／医薬品における脂肪分解活性を試験するための実施例１～８で開発されたアッセイの適用可能性を評価するために、アッセイを、医薬品においてかかる分解が観察される時間枠内（例えば、１ヶ月以内）でポリソルベートの分解がもたらされ得るリパーゼの濃度で評価した。
原薬／医薬品における脂肪分解活性を試験するための実施例１～８で開発されたアッセイの適用可能性を評価するために、アッセイを、医薬品においてかかる分解が観察される時間枠内（例えば、１ヶ月以内）でポリソルベートの分解がもたらされ得るリパーゼの濃度で評価した。
【0152】
この試験用の試料は、ｐＨ６で２０ｍＭのＬ－ヒスチジン、２５０ｍＭのスクロース、０．０２％（ｗ／ｖ）の界面活性剤ＰＳ２０またはＰＳ８０、および様々な濃度のＣＣＨＦ（０％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、全てｖ／ｖ）を含んだ。試料を、室温および２～８℃で１ヶ月間保存した。試料を、以下に記載されるＨＰＬＣ－ＦＭＡおよび本明細書におけるリパーゼアッセイにより分析した。アッセイの陽性対照については、試料に０．０５５ｍｇ／ｍＬのＰＰＬを補充した。ＨＣＭＢは、ｐＨ６で２０８ｍＭのＢＩＳ－ＴＲＩＳ、６００ｍＭのＮａＣｌ、５．２ｍＭのＣａＣｌ２を含んだ。１００μＭの４ＭｕＯを含む５％（ｖ／ｖ）の有機溶媒ＭｅＯＨを、アッセイに添加した。オルリスタットを含む陰性対照については、阻害剤を、ＭｅＯＨ中で１０００μＭに調製し、２．５％（ｖ／ｖ）をアッセイに補充し、３０分間のプレインキュベーションを行った。次いで、２００μＭの４ＭｕＯを含むＭｅＯＨを、２．５％（ｖ／ｖ）でアッセイに添加した。アッセイ成分を９６ウェルプレートに移し、実施例１Ｂに関して記載されるように、蛍光強度について分析した。
【0153】
インタクトのＰＳ２０およびＰＳ８０の定量分析は、アイソクラティックポンプ、オートサンプラー、編み込み式リアクターコイル（１ｍＬ；Ｓｕｐｅｌｃｏ ＃５７４１０－Ｕ）、および蛍光検出器（Ｗａｔｅｒｓ２４７５ＦＬＲ検出器）を備えた高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システム（Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ｅ２６９５）を使用して実施した。試料を、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴＲＩＳ、５％（ｖ／ｖ）のＡＣＮのｐＨ８の溶液に溶解された５μＭのＮ－フェニル－１－ナプチルアミン（ＮＰＮ）、１５ｐｐｍ（ｗ／ｖ）のＢｒｉｊ（登録商標）３５を含む移動相に注入した。蛍光を、λｅｘ＝３５０ｎｍおよびλｅｍ＝４２０ｎｍで測定した。Ｅｍｐｏｗｅｒ３クロマトグラフィーデータシステム（ＣＤＳ）を、ピーク積分および分析に使用した。
【0154】
表９に、試験した試料を要約する。
【表8】
【0155】
図９Ａおよび９Ｂに、ＨＰＬＣ－ＦＭＡからの結果を示し、０．１０％以上のＣＣＨＦ濃度でポリソルベートの分解が観察されたことを示す。ＰＳ２０試料は、より分解されやすく、約０．１０％のＣＣＨＦで見られる効果を有した。より高い濃度は、見かけのポリソルベート濃度の低下を示した。２５℃では、２～８℃と比較して、その傾向がより顕著であった。ＰＳ２０含有試料は、明らかにＰＳ８０含有試料よりも分解されやすく、シグナル強度の減少は、０．５％のＣＣＨＦでのみ検出することができた。前述の界面活性剤の評価に関する実験では、ＰＳ８０は、ＰＳ２０と比較して、ＣＣＨＦ含有試料中の脂肪分解活性に対してわずかに増強された負の影響があることが分かった。したがって、最悪の場合として、ＨＰＬＣ－ＦＭＡアッセイからのＰＳ８０含有試料を、リパーゼアッセイに供した。
【0156】
図９Ｃに、本明細書で開発されたリパーゼアッセイの理論的な読み出し（ｒｅａｄｏｕｔ）を示し、図９Ｄに、実際の結果を示す。実際の結果は、予想される読み出しと同等である。異なる濃度のＣＣＨＦを含む試料は、ＣＣＨＦ濃度と相関する４Ｍｕの形成を示した。この酵素活性は、３つの陰性対照（すなわち、自己加水分解試料およびオルリスタットでスパイクされた２つのＣＣＨＦ試料）の酵素活性よりも高かった。アッセイは、ＨＰＬＣ－ＦＭＡ法では、まだポリソルベートの分解が検出されていない濃度で（すなわち、０．１％未満のＣＣＨＦ濃度で）、リパーゼ活性を検出するのに十分な感度があった。
【0157】
図１０Ａ～１０Ｈに、０．００１％～２％の範囲の異なる濃度のＣＣＨＦ中にＰＳ８０を含む、追加のリパーゼアッセイ測定値を示す。示された濃度のＣＣＨＦおよびポリソルベートは、４ＭｕＯおよび緩衝液の添加前であった。
【0158】
図１８に、リパーゼアッセイの結果を要約する。ＰＰＬでスパイクされた１％のＣＣＨＦ試料（アッセイの陽性対照）は、ＰＰＬでスパイクされていない同じＣＣＨＦ濃度の試料よりも、高い活性を示した。４Ｍｕの形成は、ＣＣＨＦの濃度と相関し、この脂肪分解活性は、オルリスタットでスパイクされた自己加水分解および他の陰性対照の脂肪分解活性よりも高かった。最も顕著なことに、このアッセイは、リパーゼ活性を、自己加水分解および０．１％未満のＣＣＨＦ濃度の陰性対照と区別するのに十分な感度があり、ＨＰＬＣ－ＦＭＡ法では、まだポリソルベートの分解が検出されていない濃度で（すなわち、０．０１％および０．０５％のＣＣＨＦ濃度で）、リパーゼアッセイにより脂肪分解活性を検出することができる。
【0159】
実施例１０．リパーゼアッセイの評価：タンパク質含有製剤
脂肪分解活性によって悪影響を受ける可能性のあるバイオ医薬品製剤は、バイオ医薬用タンパク質を含む。実施例１～８で開発されたリパーゼアッセイを、タンパク質含有製剤で試験した。
脂肪分解活性によって悪影響を受ける可能性のあるバイオ医薬品製剤は、バイオ医薬用タンパク質を含む。実施例１～８で開発されたリパーゼアッセイを、タンパク質含有製剤で試験した。
【0160】
試料は、ｐＨ６で２０ｍＭのＬ－ヒスチジン、２５０ｍＭのスクロース、０．０２％のＰＳ８０、１０ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ１（独自のＩｇＧ１）、０．５％のＣＣＨＦまたは０．０２５ｍｇ／ｍＬのＰＰＬを含んだ。ＨＣＭＢは、ｐＨ６の２０８ｍＭのＢＩＳ－ＴＲＩＳ、６００ｍＭのＮａＣｌ、５．２ｍＭのＣａＣｌ２から構成された。１００μＭの４ＭｕＯを含む５％（ｖ／ｖ）の有機溶媒ＭｅＯＨを、アッセイに添加した。オルリスタットを含む陰性対照については、阻害剤を、ＭｅＯＨ中で１０００μＭに調製し、２．５％（ｖ／ｖ）をアッセイに補充し、３０分間のプレインキュベーションを行った。次いで、２００μＭの４－ＭｕＯを含むＭｅＯＨを、２．５％（ｖ／ｖ）でアッセイに添加した。アッセイ成分を９６ウェルプレートに移し、実施例１Ｂに関して記載されるように、蛍光強度について分析した。表１０に、試験した試料を要約する。
【表9】
【0161】
図１７Ａに、異なる時点（１時間、２４時間、７２時間、１６８時間、および３３６時間）でのアッセイ結果を示す。予想通り、ＣＣＨＦおよびＰＰＬの両方を含むアッセイ陽性対照は、最も高い４Ｍｕの遊離を示した。アッセイ陰性対照は、強く低下した活性を示し、ＰＰＬおよびＣＣＨＦリパーゼの両方が、オルリスタットによって阻害されたことを示した。試料および製剤陽性対照（高活性）についても同様の傾向が見られるが、試料陰性対照および製剤陰性対照は、オルリスタット（低活性）によって阻害された。自己加水分解対照および製剤陰性対照は、全ての時点で、図１７Ａでは区別できない類似の読み出しを示す。図１７Ｂは、陰性対照の拡大図を示し、両方の陰性対照における活性が類似していることを示している。
【0162】
自己加水分解対照／製剤陰性対照と比較して、アッセイ陰性対照／試料陰性対照の明らかな活性において、オフセットが観察され得る。同じオフセットが、基質を含まないブランク試料（データ未掲載）で観察され、これは、タンパク質含有試料が、既に４Ｍｕとは非依存性の蛍光応答を有することを示した。脂肪分解活性が試験された時間枠内（すなわち、３３６時間以内）で、オフセットが増加し、最初阻害されていたＣＣＨＦおよびＰＰＬのリパーゼが、ゆっくりと再活性化され、しかし、製剤陰性には明らかに存在しないことが示された。
【0163】
Ｌｏｏｋｅｎｅらは、オルリスタットが、メカニズムに基づく阻害剤であるだけでなく、リポタンパク質リパーゼの真の基質であり、速い阻害（すなわち、活性部位のセリンにおける共有結合性の酵素－オルリスタット複合体の形成）を有し、複合体の遅い加水分解を有することを報告した（例えば、Ｌｏｏｋｅｎｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｐａｓｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ－ｓｉｔｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｌｉｐｓｔａｔｉｎ （Ｏｒｌｉｓｔａｔ）Ｒ，”Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９４；２２２：３９５－４０３を参照されたい）。本アッセイおよび原薬／医薬品における脂肪分解活性の評価への適用に関して、これは関連性がある：原薬／医薬品中のＨＣＰの残留画分の一部であり、ポリソルベートの分解を担う元凶（例えば、脂肪分解酵素）がオルリスタットによって阻害され得る場合、それらは再活性化され得る。試料と試料陰性対照との間の脂肪分解活性の区別が不可能な場合、これは、試料中の低い脂肪分解活性、またはオルリスタットによって阻害されない脂肪分解酵素の存在のいずれかを示している可能性がある。前者の場合、４Ｍｕの形成が自己加水分解対照と比較してあまり増加しない場合、これは、低い脂肪分解活性、および原薬／医薬品中のポリソルベートの分解のリスクが低いことを示す。自己加水分解と比較して、試料中で高い４Ｍｕの形成が見られる場合、これは、脂肪分解酵素が存在しているが、オルリスタットによって阻害され得ないことを示す。
【0164】
特許、特許出願、論文、教科書などを含む本明細書に引用される全ての参考文献、およびそれらに引用される参考文献（それらがまだ引用されていない範囲まで）は、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図10E】
【図10F】
【図10G】
【図10H】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15A】
【図15B】
【図16】
【図17A】
【図17B】
【図18】
【図19A】
【図19B】
【国際調査報告】