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特表2022-548062亢進したＤＮＡ産生を有する修飾型細菌レトロエレメント
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-11-16
(54)【発明の名称】亢進したＤＮＡ産生を有する修飾型細菌レトロエレメント
(51)【国際特許分類】
C12N 15/87 20060101AFI20221109BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20221109BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20221109BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20221109BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20221109BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20221109BHJP
C12P 19/34 20060101ALI20221109BHJP
【ＦＩ】
C12N15/87 Z ZNA
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P19/34 A
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022516205
(86)(22)【出願日】2020-09-11
(85)【翻訳文提出日】2022-04-25
(86)【国際出願番号】 US2020050323
(87)【国際公開番号】W WO2021050822
(87)【国際公開日】2021-03-18
(31)【優先権主張番号】62/899,625
(32)【優先日】2019-09-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】517352418
【氏名又は名称】ザ ジェイ． デビッド グラッドストーン インスティテューツ、 ア テスタメンタリー トラスト エスタブリッシュド アンダー ザ ウィル オブ ジェイ． デビッド グラッドストーン
(71)【出願人】
【識別番号】507044516
【氏名又は名称】プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ
(74)【代理人】
【識別番号】100105957
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100068755
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 博宣
(74)【代理人】
【識別番号】100142907
【弁理士】
【氏名又は名称】本田 淳
(74)【代理人】
【識別番号】100152489
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 美樹
(72)【発明者】
【氏名】シップマン、セス
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AF27
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA20
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA90X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA23
4B065CA60
(57)【要約】
マルチコピー一本鎖ＤＮＡ（ｍｓＤＮＡ）の産生を亢進させるように修飾された改変レトロンが提供される。加えて、かかる改変レトロンをコードするベクターシステム並びにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介ゲノム編集、リコンビニアリング、細胞バーコーディング及び分子レコーディングなどの様々な適用において改変レトロン及びそれをコードするベクターシステムを使用する方法も開示される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
改変レトロンであって、ａ）ｍｓｒ前配列；
ｂ）マルチコピー一本鎖ＲＮＡ（ｍｓＲＮＡ）をコードするｍｓｒ遺伝子；
ｃ）マルチコピー一本鎖ＤＮＡ（ｍｓＤＮＡ）をコードするｍｓｄ遺伝子；
ｄ）前記ｍｓｒ前配列との配列相補性を有する自己相補性領域を含むｍｓｄ後配列であって、前記自己相補性領域は、野生型相補性領域よりも１～５０ヌクレオチド長い長さを有し、それにより、前記改変レトロンは、前記ｍｓＤＮＡの亢進した産生が可能である、ｍｓｄ後配列；及び
ｅ）逆転写酵素をコードするｒｅｔ遺伝子
を含む改変レトロン。
【請求項2】
目的の異種配列を更に含む、請求項１に記載の改変レトロン。
【請求項3】
前記異種配列は、前記ｍｓｒ遺伝子又は前記ｍｓｄ遺伝子に挿入される、請求項２に記載の改変レトロン。
【請求項4】
前記ｍｓｄ遺伝子によってコードされる前記一本鎖ＤＮＡ（ｍｓＤＮＡ）は、ｍｓｄステムループを含み、前記ループは、目的の異種配列を含む、請求項１に記載の改変レトロン。
【請求項5】
前記異種配列は、相同組換え修復（ＨＤＲ）又はリコンビニアリングによって標的遺伝子座に組み込まれる意図される編集を含むヌクレオチド配列に隣接している、５’標的配列にハイブリダイズする５’相同性アームと、３’標的配列にハイブリダイズする３’相同性アームとを含むドナーポリヌクレオチドをコードする、請求項２に記載の改変レトロン。
【請求項6】
前記異種配列は、ＣＲＩＳＰＲプロトスペーサＤＮＡ配列を含む、請求項２に記載の改変レトロン。
【請求項7】
前記ＣＲＩＳＰＲプロトスペーサＤＮＡ配列は、修飾されたＡＡＧプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む、請求項６に記載の改変レトロン。
【請求項8】
バーコード配列を更に含む、請求項１に記載の改変レトロン。
【請求項9】
前記バーコード配列は、前記ｍｓＤＮＡのヘアピンループに位置する、請求項８に記載の改変レトロン。
【請求項10】
前記ｍｓｄステムは、少なくとも１４ヌクレオチド（塩基対）長である、請求項４に記載の改変レトロン。
【請求項11】
前記ｍｓｄステムは、１つ以上のミスマッチヌクレオチドを含み得る、請求項４に記載の改変レトロン。
【請求項12】
前記ｍｓｄステムは、５又は６つ未満の連続するミスマッチヌクレオチドを有する、請求項４に記載の改変レトロン。
【請求項13】
前記ｍｓｄステムは、ｍｓｄステム基端に隣接する配列にいかなるミスマッチ又は挿入も有しない、請求項４に記載の改変レトロン。
【請求項14】
野生型ｍｓｄ配列に対する任意のｍｓｄステムミスマッチ又は配列変化は、前記ｍｓｄステムの中央内にある、請求項４に記載の改変レトロン。
【請求項15】
前記ｍｓｒ遺伝子及び前記ｍｓｄ遺伝子は、トランス構成又はシス構成で提供される、請求項１に記載の改変レトロン。
【請求項16】
前記ｒｅｔ遺伝子は、前記ｍｓｒ遺伝子及び前記ｍｓｄ遺伝子に対してトランス構成で提供される、請求項１に記載の改変レトロン。
【請求項17】
前記ｍｓｒ遺伝子、ｍｓｄ遺伝子及びｒｅｔ遺伝子は、修飾された細菌性レトロンｍｓｒ遺伝子、ｍｓｄ遺伝子及びｒｅｔ遺伝子である、請求項１に記載の改変レトロン。
【請求項18】
前記ｍｓｒ遺伝子、ｍｓｄ遺伝子及びｒｅｔ遺伝子は、独立に、修飾された粘液細菌レトロン、修飾された大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）レトロン、修飾されたサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）レトロン又は修飾されたコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）レトロンである、請求項１に記載の改変レトロン。
【請求項19】
前記修飾された大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）レトロンは、修飾されたＥＣ８３又は修飾されたＥＣ８６である、請求項１８に記載の改変レトロン。
【請求項20】
請求項１に記載の改変レトロンを含む１つ以上のベクターを含むベクターシステム。
【請求項21】
前記ｍｓｒ遺伝子及び前記ｍｓｄ遺伝子は、同じベクター又は異なるベクターによって提供される、請求項２０に記載のベクターシステム。
【請求項22】
前記ｍｓｒ遺伝子、前記ｍｓｄ遺伝子及び前記ｒｅｔ遺伝子は、同じベクターによって提供される、請求項２０に記載のベクターシステム。
【請求項23】
前記同じベクターは、前記ｍｓｒ遺伝子及び前記ｍｓｄ遺伝子に作動可能に連結されたプロモータを含む、請求項２２に記載のベクターシステム。
【請求項24】
前記プロモータは、前記ｒｅｔ遺伝子に更に作動可能に連結される、請求項２３に記載のベクターシステム。
【請求項25】
前記ｒｅｔ遺伝子に作動可能に連結された第２のプロモータを更に含む、請求項２３に記載のベクターシステム。
【請求項26】
前記ｍｓｒ遺伝子、前記ｍｓｄ遺伝子及び前記ｒｅｔ遺伝子は、異なるベクターによって提供される、請求項２０に記載のベクターシステム。
【請求項27】
前記１つ以上のベクターは、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターである、請求項２０に記載のベクターシステム。
【請求項28】
前記非ウイルスベクターは、プラスミドである、請求項２７に記載のベクターシステム。
【請求項29】
前記改変レトロンは、相同組換え修復（ＨＤＲ）又はリコンビニアリングによって標的遺伝子座に組み込まれる意図される編集を含むヌクレオチド配列に隣接している、５’標的配列にハイブリダイズする５’相同性アームと、３’標的配列にハイブリダイズする３’相同性アームとを含むドナーポリヌクレオチドを含む、請求項２０に記載のベクターシステム。
【請求項30】
ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼをコードするベクターを更に含む、請求項２９に記載のベクターシステム。
【請求項31】
前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓヌクレアーゼ又は改変されたＲＮＡ誘導型ＦｏｋＩヌクレアーゼである、請求項３０に記載のベクターシステム。
【請求項32】
前記Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９又はＣｐｆ１である、請求項３１に記載のベクターシステム。
【請求項33】
前記改変レトロンは、ＣＲＩＳＰＲプロトスペーサＤＮＡ配列を含む、請求項２０に記載のベクターシステム。
【請求項34】
Ｃａｓ１及び／又はＣａｓ２タンパク質をコードするベクターを更に含む、請求項３３に記載のベクターシステム。
【請求項35】
ＣＲＩＳＰＲアレイ配列を含むベクターを更に含む、請求項３４に記載のベクターシステム。
【請求項36】
バクテリオファージ相同組換えタンパク質をコードするベクターを更に含む、請求項２０に記載のベクターシステム。
【請求項37】
前記バクテリオファージ相同組換えタンパク質をコードする前記ベクターは、ｅｘｏ、ｂｅｔ及びｇａｍ遺伝子を含む複製欠損λプロファージである、請求項３６に記載のベクターシステム。
【請求項38】
請求項１に記載の改変レトロン又は請求項２０に記載のベクターシステムを含む単離宿主細胞。
【請求項39】
前記宿主細胞は、原核、古細菌又は真核宿主細胞である、請求項３８に記載の宿主細胞。
【請求項40】
前記真核宿主細胞は、哺乳類宿主細胞である、請求項３９に記載の宿主細胞。
【請求項41】
前記哺乳類宿主細胞は、ヒト宿主細胞である、請求項４０に記載の宿主細胞。
【請求項42】
前記宿主細胞は、人工細胞又は遺伝子修飾細胞である、請求項３８に記載の宿主細胞。
【請求項43】
請求項１に記載の改変レトロン、請求項２０に記載のベクターシステム又は請求項３８に記載の宿主細胞を含むキット。
【請求項44】
前記改変レトロンで細胞を遺伝子修飾するための説明書を更に含む、請求項４３に記載のキット。
【請求項45】
細胞を遺伝子修飾する方法であって、ａ）細胞に、請求項５に記載の改変レトロンをトランスフェクトすること；
ｂ）前記細胞にＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡを導入することであって、前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、前記ガイドＲＮＡと複合体を形成し、前記ガイドＲＮＡは、前記複合体を前記ゲノム標的遺伝子座に導き、前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、前記ゲノム標的遺伝子座においてゲノムＤＮＡに二本鎖切断を作り出し、及び前記改変レトロンによって生成される前記ドナーポリヌクレオチドは、その５’相同性アーム及び３’相同性アームによって認識される前記ゲノム標的遺伝子座に相同組換え修復（ＨＤＲ）によって組み込まれて、遺伝子修飾細胞を産生する、導入すること
を含む方法。
【請求項46】
前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓヌクレアーゼ又は改変されたＲＮＡ誘導型ＦｏｋＩヌクレアーゼである、請求項４５に記載の方法。
【請求項47】
Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９又はＣｐｆ１である、請求項４５に記載の方法。
【請求項48】
前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、前記細胞のゲノムに組み込まれたベクター又は組換えポリヌクレオチドによって提供される、請求項４５に記載の方法。
【請求項49】
前記改変レトロンは、ベクターによって提供される、請求項４５に記載の方法。
【請求項50】
前記ドナーポリヌクレオチドは、遺伝子置換、遺伝子ノックアウト、欠失、挿入、逆位又は点突然変異を作り出すために使用される、請求項４５に記載の方法。
【請求項51】
細胞をリコンビニアリングによって遺伝子修飾する方法であって、前記方法は、ａ）前記細胞に、請求項５に記載の改変レトロンをトランスフェクトすること；及び
ｂ）前記細胞にバクテリオファージ組換えタンパク質を導入することであって、前記バクテリオファージ組換えタンパク質は、標的遺伝子座における相同組換えを媒介し、それにより、前記改変レトロンによって生成される前記ドナーポリヌクレオチドは、その５’相同性アーム及び３’相同性アームによって認識される前記標的遺伝子座に組み込まれて、遺伝子修飾細胞を産生する、導入すること
を含む方法。
【請求項52】
前記ドナーポリヌクレオチドは、前記細菌細胞のプラスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）又は細菌染色体をリコンビニアリングによって修飾するために使用される、請求項５１に記載の方法。
【請求項53】
前記ドナーポリヌクレオチドは、遺伝子置換、遺伝子ノックアウト、欠失、挿入、逆位又は点突然変異を作り出すことができる、請求項５１に記載の方法。
【請求項54】
前記細胞にバクテリオファージ組換えタンパク質を前記導入することは、細菌ゲノムへの複製欠損λプロファージの挿入を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項55】
前記バクテリオファージは、ｅｘｏ、ｂｅｔ及びｇａｍ遺伝子を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項56】
細胞をバーコーディングする方法であって、細胞に、請求項８に記載の改変レトロンをトランスフェクトすることを含む方法。
【請求項57】
インビボ分子レコーディングシステムを作製する方法であって、ａ）ＣＲＩＳＰＲ適応システムのＣａｓｌタンパク質又はＣａｓ２タンパク質を宿主細胞に導入すること；
ｂ）リーダ配列及び少なくとも１つのリピート配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイ核酸配列を前記宿主細胞に導入することであって、前記ＣＲＩＳＰＲアレイ核酸配列は、前記宿主細胞内のゲノムＤＮＡ又はベクターに組み込まれる、導入すること；及び
ｃ）請求項１０又は１１に記載の複数の改変レトロンを前記宿主細胞に導入することであって、各レトロンは、プロセシングされ、且つ前記ＣＲＩＳＰＲアレイ核酸配列に挿入され得る異なるプロトスペーサＤＮＡ配列を含む、導入すること
を含む方法。
【請求項58】
前記Ｃａｓｌタンパク質又は前記Ｃａｓ２タンパク質は、ベクターによって提供される、請求項５７に記載の方法。
【請求項59】
前記改変レトロンは、ベクターによって提供される、請求項５７に記載の方法。
【請求項60】
前記複数の改変レトロンは、少なくとも３つの異なるプロトスペーサＤＮＡ配列を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項61】
インビボ分子レコーディングシステムを含む改変細胞であって、ａ）ＣＲＩＳＰＲ適応システムのＣａｓｌタンパク質又はＣａｓ２タンパク質；
ｂ）宿主細胞へのリーダ配列及び少なくとも１つのリピート配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイ核酸配列であって、前記改変細胞内のゲノムＤＮＡ又はベクターに組み込まれるＣＲＩＳＰＲアレイ核酸配列；及び
ｃ）請求項６に複数の記載の改変レトロンであって、各レトロンは、プロセシングされ、且つ前記ＣＲＩＳＰＲアレイ核酸配列に挿入され得る異なるプロトスペーサＤＮＡ配列を含む、複数の改変レトロン
を含む改変細胞。
【請求項62】
前記Ｃａｓｌタンパク質又は前記Ｃａｓ２タンパク質は、ベクターによって提供される、請求項６１に記載の改変細胞。
【請求項63】
前記改変レトロンは、ベクターによって提供される、請求項６１に記載の改変細胞。
【請求項64】
前記複数の改変レトロンは、少なくとも３つの異なるプロトスペーサＤＮＡ配列を含む、請求項６１に記載の改変細胞。
【請求項65】
請求項６１に記載の改変細胞と、インビボ分子レコーディングのための説明書とを含むキット。
【請求項66】
組換えｍｓＤＮＡを作製する方法であって、ａ）宿主細胞に、請求項１に記載の改変レトロン又は請求項２０に記載のベクターシステムをトランスフェクトすること；及び
ｂ）前記宿主細胞を好適な条件下で培養することであって、前記ｍｓＤＮＡは、産生される、培養すること
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、亢進したＤＮＡ産生を有する修飾型細菌レトロエレメントに関する。
【背景技術】
【0002】
レトロンは、逆転写を受けるエレメントであり、ほぼ全ての粘液細菌（非特許文献１）に見られると共に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（非特許文献２）、コレラ菌（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）（非特許文献３）及び他の細菌にも僅かに見られる。レトロンオペロンは、ＲＮＡプライマー（マルチコピー一本鎖ＲＮＡ、ｍｓｒ）、逆転写されるＲＮＡ配列（マルチコピー一本鎖ＤＮＡ、ｍｓｄ）及び逆転写酵素をこの順番にコードする。レトロン転写物は、それ自体が折り返されるように畳まれたものであり、一部が逆転写されることによって約８０塩基の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ：ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ）を生成する。レトロン由来のＤＮＡは、一本鎖であるが、これは、二本鎖ＤＮＡのヘアピンを含む。複数のレトロンｓｓＤＮＡが互いに相補体となって、大型の二本鎖エレメントも形成し得る。レトロン変異体は、ＤＮＡ長さ及び塩基含有量が異なるが、大まかにはこの全体的なフォーマットを共有している。
【0003】
レトロンによって生成されるｓｓＤＮＡは、２つのコンテクストでゲノム改変に用いられている。細菌のコンテクストでは、λ Ｒｅｄβリコンビナーゼによるリコンビニアリングに用いられ（非特許文献４）；及び真核生物のコンテクストでは、Ｃａｓ９編集の相同組換え修復（ＨＤＲ：ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｐａｉｒ）鋳型として（非特許文献５）酵母で用いられている。これらの適用は、極めて有望であるものの、予想を超える効率の悪さ及びコンテクスト上の制約に直面しており、これらは、内因性形態のレトロンにおける諸要因から生じると見られている。それらの要因には、（１）リン酸ジエステル結合がｓｓＤＮＡの５’末端をｍｓｒ ＲＮＡの２’ヒドロキシルに連結する分枝状の構造、（２）レトロン逆転写に必要であり得るが、修復鋳型の一部ではないインバリアントな隣接領域、（３）限られた全長、及び（４）Ｐｏｌ ＩＩＩ転写のターミネータとして機能する天然ポリＴストレッチがある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】ドゥンダール（Ｄｈｕｎｄａｌｅ）ら著、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、第１６４巻、ｐ．９１４～９１７、１９８５年
【非特許文献2】ランプソン（Ｌａｍｐｓｏｎ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２４３巻、ｐ．１０３３～１０３８、１９８９年
【非特許文献3】イノウエ（Ｉｎｏｕｙｅ）ら著、マイクロバイオロジー・アンド・イムノロジー（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、第５５巻、ｐ．５１０～５１３
【非特許文献4】ファルザドファルド（Ｆａｒｚａｄｆａｒｄ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第３４６巻、ｐ．１２５６２７２、２０１４年
【非特許文献5】シャロン（Ｓｈａｒｏｎ）ら著、セル（Ｃｅｌｌ）、第１７５巻、ｐ．５４４～５５７、ｅ５１６、２０１８年
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
マルチコピー一本鎖ＤＮＡ（ｍｓＤＮＡ：ｍｕｌｔｉｃｏｐｙ ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ）の産生を亢進させる（ｅｎｈａｎｃｅ）ように修飾された改変レトロンが提供され、これは、効率及び低コピー数に関連する既存の問題の多くを解決するものである。本明細書には、かかる改変レトロンをコードするベクターシステム並びにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介ゲノム編集、リコンビニアリング、細胞バーコーディング及び分子レコーディングなどの様々な適用において改変レトロン及びベクターシステムを使用する方法も記載される。
【0006】
一態様において、改変レトロンが提供され、この改変レトロンは、ａ）ｍｓｒ前配列（ｐｒｅ－ｍｓｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）；ｂ）マルチコピー一本鎖ＲＮＡ（ｍｓＲＮＡ：ｍｕｌｔｉｃｏｐｙ ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ）をコードするｍｓｒ遺伝子；ｃ）マルチコピー一本鎖ＤＮＡ（ｍｓＤＮＡ）をコードするｍｓｄ遺伝子；ｄ）ｍｓｒ前配列との配列相補性を有する自己相補性領域を含むｍｓｄ後配列（ｐｏｓｔ－ｍｓｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）であって、自己相補性領域は、野生型相補性領域よりも少なくとも１～５０ヌクレオチド長い長さを有し、それにより、改変レトロンは、ｍｓＤＮＡの亢進した産生が可能である、ｍｓｄ後配列；及びｅ）逆転写酵素をコードするｒｅｔ遺伝子を含む。
【0007】
自己相補性領域は、ｎｃＲＮＡの３’末端と５’末端との間の水素結合によって形成される。特定の実施形態において、相補性領域は、野生型相補性領域よりも少なくとも１、少なくとも２、少なくとも４、少なくとも６、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０又は少なくとも５０ヌクレオチド長い長さを有する。例えば、自己相補性領域は、野生型相補性領域よりも１～５０ヌクレオチドの範囲で長い長さ、例えばこの範囲内にある任意の長さを含めて、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０ヌクレオチド長い長さなどを有し得る。特定の実施形態において、自己相補性領域は、野生型相補性領域よりも１～１６ヌクレオチドの範囲で長い長さを有する。
【0008】
特定の実施形態において、ｍｓｒ遺伝子及びｍｓｄ遺伝子は、トランス構成又はシス構成で提供される。一部の実施形態において、ｒｅｔ遺伝子は、ｍｓｒ遺伝子及び／又はｍｓｄ遺伝子に対してトランス構成で提供される。
【0009】
特定の実施形態において、ｍｓｒ遺伝子、ｍｓｄ遺伝子及びｒｅｔ遺伝子は、限定なしに、粘液細菌レトロン（例えば、Ｍｘ６５、Ｍｘ１６２）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）レトロン（例えば、Ｅ６７、Ｅｃ７３、ＥＣ８３、ＥＣ８６、ＥＣ１０７）、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）レトロン（例えば、ｍｓＤＮＡ－Ｓｔ８５）及びコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）レトロン（例えば、Ｖｃ８１、Ｖｃ９５、Ｖｃ１３７）を含めた細菌性レトロンに由来する。
【0010】
特定の実施形態において、改変レトロンは、目的の異種配列を更に含む。異種配列は、例えば、ｍｓｒ遺伝子又はｍｓｄ遺伝子に挿入され得る。例えば、異種配列は、ｍｓｄステムループのループに挿入することができる。一部の実施形態において、異種配列は、ポリペプチド又はペプチドをコードする。他の実施形態において、異種配列は、相同組換え修復（ＨＤＲ）又はリコンビニアリングによってゲノム標的遺伝子座に組み込まれる意図される編集を含むヌクレオチド配列に隣接している、５’ゲノム標的配列にハイブリダイズする５’相同性アームと、３’ゲノム標的配列にハイブリダイズする３’相同性アームとを含むドナーポリヌクレオチドをコードする。更に他の実施形態において、異種配列は、ＣＲＩＳＰＲプロトスペーサＤＮＡ配列を含む。一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲプロトスペーサＤＮＡ配列は、修飾された「ＡＡＧ」プロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ：ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ ａｄｊａｃｅｎｔ ｍｏｔｉｆ）を含む。
【0011】
特定の実施形態において、改変レトロンは、バーコード配列を更に含む。バーコード配列は、例えば、ｍｓＤＮＡのヘアピンループに位置し得る。
別の態様において、ベクターシステムが提供され、このベクターシステムは、本明細書に記載される改変レトロンを含む１つ以上のベクターを含む。特定の実施形態において、ｍｓｒ遺伝子及びｍｓｄ遺伝子は、同じベクター又は異なるベクターによって提供される。一部の実施形態において、ｍｓｒ遺伝子、ｍｓｄ遺伝子及びｒｅｔ遺伝子は、同じベクターによって提供され、このベクターは、ｍｓｒ遺伝子及びｍｓｄ遺伝子に作動可能に連結されたプロモータを含む。一部の実施形態において、プロモータは、ｒｅｔ遺伝子に更に作動可能に連結される。他の実施形態において、ベクターは、ｒｅｔ遺伝子に作動可能に連結された第２のプロモータを更に含む。特定の実施形態において、ｍｓｒ遺伝子、ｍｓｄ遺伝子及びｒｅｔ遺伝子は、異なるベクターによって提供される。
別の態様において、ベクターシステムが提供され、このベクターシステムは、本明細書に記載される改変レトロンを含む１つ以上のベクターを含む。特定の実施形態において、ｍｓｒ遺伝子及びｍｓｄ遺伝子は、同じベクター又は異なるベクターによって提供される。一部の実施形態において、ｍｓｒ遺伝子、ｍｓｄ遺伝子及びｒｅｔ遺伝子は、同じベクターによって提供され、このベクターは、ｍｓｒ遺伝子及びｍｓｄ遺伝子に作動可能に連結されたプロモータを含む。一部の実施形態において、プロモータは、ｒｅｔ遺伝子に更に作動可能に連結される。他の実施形態において、ベクターは、ｒｅｔ遺伝子に作動可能に連結された第２のプロモータを更に含む。特定の実施形態において、ｍｓｒ遺伝子、ｍｓｄ遺伝子及びｒｅｔ遺伝子は、異なるベクターによって提供される。
【0012】
特定の実施形態において、ベクターシステムのベクターの１つ以上は、ウイルスベクター又は非ウイルスベクター（例えば、プラスミド）である。
特定の実施形態において、ベクターシステムは、ドナーポリヌクレオチド配列に隣接している、５’ゲノム標的配列にハイブリダイズする５’相同性アームと、３’ゲノム標的配列にハイブリダイズする３’相同性アームとを含むドナーポリヌクレオチドをコードする異種配列を含む改変レトロンを含む。ドナーポリヌクレオチド配列は、例えば、相同組換え修復（ＨＤＲ）又はリコンビニアリングにより、ゲノム標的遺伝子座を置換又は編集することができる。
特定の実施形態において、ベクターシステムは、ドナーポリヌクレオチド配列に隣接している、５’ゲノム標的配列にハイブリダイズする５’相同性アームと、３’ゲノム標的配列にハイブリダイズする３’相同性アームとを含むドナーポリヌクレオチドをコードする異種配列を含む改変レトロンを含む。ドナーポリヌクレオチド配列は、例えば、相同組換え修復（ＨＤＲ）又はリコンビニアリングにより、ゲノム標的遺伝子座を置換又は編集することができる。
【0013】
特定の実施形態において、ベクターシステムは、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼをコードするベクターを更に含む。例示的ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼとしては、限定なしに、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１）及び改変されたＲＮＡ誘導型ＦｏｋＩヌクレアーゼが挙げられる。
【0014】
特定の実施形態において、ベクターシステムは、リコンビニアリングのためのバクテリオファージ組換えタンパク質をコードするベクターを更に含む。一部の実施形態において、ベクターは、バクテリオファージ組換えタンパク質をコードする複製欠損プロファージである。
【0015】
特定の実施形態において、ベクターシステムは、ＣＲＩＳＰＲプロトスペーサＤＮＡ配列をコードする異種配列を含む改変レトロンを含む。一部の実施形態において、ベクターシステムは、Ｃａｓ１又はＣａｓ２タンパク質をコードするベクターを更に含む。一部の実施形態において、ベクターシステムは、ＣＲＩＳＰＲアレイ配列を含むベクターを更に含む。
【0016】
別の態様において、単離宿主細胞が提供され、この宿主細胞は、本明細書に記載される改変レトロン又はベクターシステムを含む。
特定の実施形態において、宿主細胞は、原核、古細菌又は真核宿主細胞である。例えば、宿主細胞は、細菌、原生生物、真菌、動物又は植物宿主細胞であり得る。一部の実施形態において、宿主細胞は、哺乳類宿主細胞である。宿主細胞は、ヒト又は非ヒト哺乳類宿主細胞であり得る。他の実施形態において、宿主細胞は、人工細胞又は遺伝子修飾細胞である。
特定の実施形態において、宿主細胞は、原核、古細菌又は真核宿主細胞である。例えば、宿主細胞は、細菌、原生生物、真菌、動物又は植物宿主細胞であり得る。一部の実施形態において、宿主細胞は、哺乳類宿主細胞である。宿主細胞は、ヒト又は非ヒト哺乳類宿主細胞であり得る。他の実施形態において、宿主細胞は、人工細胞又は遺伝子修飾細胞である。
【0017】
別の態様において、本明細書に記載される改変レトロン又はかかる改変レトロンを含むベクターシステム若しくは宿主細胞を含むキットが提供される。一部の実施形態において、キットは、改変レトロンの使用方法に関する説明書を更に含む。
【0018】
別の態様において、細胞を遺伝子修飾する方法が提供される。ある場合には、本方法は、細胞に改変レトロンをトランスフェクトすることを含む。例えば、本方法は、ａ）相同組換え修復（ＨＤＲ）によってゲノム標的遺伝子座に組み込まれる意図される編集を含むヌクレオチド配列に隣接している、５’ゲノム標的配列にハイブリダイズする５’相同性アームと、３’ゲノム標的配列にハイブリダイズする３’相同性アームとを含むドナーポリヌクレオチドをコードする異種配列を含む改変レトロンを細胞にトランスフェクトすること；及びｂ）細胞にＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡを導入することであって、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡと複合体を形成し、前記ガイドＲＮＡは、複合体をゲノム標的遺伝子座に導き、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、ゲノム標的遺伝子座においてゲノムＤＮＡに二本鎖切断を作り出し、及び改変レトロンによって生成されるドナーポリヌクレオチドは、その５’相同性アーム及び３’相同性アームによって認識されるゲノム標的遺伝子座に相同組換え修復（ＨＤＲ）によって組み込まれる、導入することを含み得る。ドナーポリヌクレオチドをコードする改変レトロンによるＨＤＲを用いて、例えば遺伝子置換、遺伝子ノックアウト、欠失、挿入、逆位又は点突然変異を作り出すことができる。ある場合には、ドナーポリヌクレオチドをコードする改変レトロンによるＨＤＲを用いて、例えば遺伝子、遺伝子ノックアウト、欠失、挿入、逆位又は点突然変異を修復することができる。従って、かかる方法は、遺伝子修飾細胞を作り出すことができる。一部の実施形態において、本方法は、遺伝子修飾細胞の表現型タイピングを行うこと又は遺伝子修飾細胞のゲノムをシーケンシングすることを更に含む。
【0019】
別の態様において、細胞をリコンビニアリングによって遺伝子修飾する方法が提供され、この方法は、ａ）リコンビニアリングによってゲノム標的遺伝子座に組み込まれる意図される編集を含むヌクレオチド配列に隣接している、５’ゲノム標的配列にハイブリダイズする５’相同性アームと、３’ゲノム標的配列にハイブリダイズする３’相同性アームとを含むドナーポリヌクレオチドをコードする異種配列を含む改変レトロンを細胞にトランスフェクトすること；及びｂ）細胞にバクテリオファージ組換えタンパク質を導入することであって、バクテリオファージ組換えタンパク質は、標的遺伝子座における相同組換えを媒介し、それにより、改変レトロンによって生成されるドナーポリヌクレオチドは、その５’相同性アーム及び３’相同性アームによって認識される標的遺伝子座に組み込まれて、遺伝子修飾細胞を産生する、導入することを含む。ドナーポリヌクレオチドをコードする改変レトロンによるリコンビニアリングを用いて、例えば遺伝子置換、遺伝子ノックアウト、欠失、挿入、逆位又は点突然変異を作り出すことができる。特定の実施形態において、ドナーポリヌクレオチドを使用して、細菌細胞のプラスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ：ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）又は細菌染色体がリコンビニアリングによって修飾される。一部の実施形態において、本方法は、遺伝子修飾細胞の表現型タイピングを行うこと又は遺伝子修飾細胞のゲノムをシーケンシングすることを更に含む。
【0020】
特定の実施形態において、バクテリオファージ組換えタンパク質は、細菌ゲノムへの複製欠損λプロファージの挿入によって細菌細胞に導入される。一実施形態において、バクテリオファージは、ｅｘｏ、ｂｅｔ及びｇａｍ遺伝子を含む。
【0021】
別の態様において、細胞をバーコーディングする方法が提供され、この方法は、本明細書に記載されるとおりのバーコードを含む改変レトロンを細胞にトランスフェクトすることを含む。
【0022】
別の態様において、インビボ分子レコーディングシステムを作製する方法が提供され、この方法は、ａ）ＣＲＩＳＰＲ適応システムのＣａｓｌタンパク質又はＣａｓ２タンパク質を宿主細胞に導入すること；ｂ）リーダ配列及び少なくとも１つのリピート配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイ核酸配列を宿主細胞に導入することであって、ＣＲＩＳＰＲアレイ核酸配列は、宿主細胞内のゲノムＤＮＡ又はベクターに組み込まれる、導入すること；及びｃ）ＣＲＩＳＰＲプロトスペーサＤＮＡ配列を含む複数の改変レトロンを宿主細胞に導入することであって、各レトロンは、プロセシングされ、且つＣＲＩＳＰＲアレイ核酸配列に挿入され得る異なるプロトスペーサＤＮＡ配列を含む、導入することを含む。特定の実施形態において、Ｃａｓｌタンパク質又はＣａｓ２タンパク質は、ベクターによって提供される。特定の実施形態において、改変レトロンは、ベクターによって提供される。特定の実施形態において、複数の改変レトロンは、少なくとも３つの異なるプロトスペーサＤＮＡ配列を含む。
【0023】
別の態様において、インビボ分子レコーディングシステムを含む改変細胞が提供され、この改変細胞は、ａ）ＣＲＩＳＰＲ適応システムのＣａｓｌタンパク質又はＣａｓ２タンパク質；ｂ）宿主細胞へのリーダ配列及び少なくとも１つのリピート配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイ核酸配列であって、改変細胞内のゲノムＤＮＡ又はベクターに組み込まれるＣＲＩＳＰＲアレイ核酸配列；及びｃ）複数の改変レトロンであって、それぞれＣＲＩＳＰＲプロトスペーサＤＮＡ配列を含み、各レトロンは、プロセシングされ、且つＣＲＩＳＰＲアレイ核酸配列に挿入され得る異なるプロトスペーサＤＮＡ配列を含む、改変レトロンを含む。特定の実施形態において、Ｃａｓｌタンパク質又はＣａｓ２タンパク質は、ベクターによって提供される。特定の実施形態において、改変レトロンは、ベクターによって提供される。特定の実施形態において、複数の改変レトロンは、少なくとも３つの異なるプロトスペーサＤＮＡ配列を含む。
【0024】
別の態様において、本明細書に記載されるとおりのインビボ分子レコーディングシステムを含む改変細胞を含むキットが提供される。一部の実施形態において、キットは、インビボ分子レコーディングのための説明書を更に含む。
【0025】
別の態様において、組換えｍｓＤＮＡを作製する方法が提供され、この方法は、ａ）本明細書に記載される改変レトロン又はベクターシステムを宿主細胞にトランスフェクトすること；及びｂ）宿主細胞を好適な条件下で培養することであって、ｍｓＤＮＡは、産生される、培養することを含む。
【図面の簡単な説明】
【0026】
【図1A】レトロンオペロンの概略図及びレトロンの潜在的用途を示す。図１Ａは、ｍｓｒ、ｍｓｄ及び逆転写酵素をコードするレトロンオペロンの概略図を示し、逆転写酵素は、マルチコピー一本鎖ＤＮＡをコードするｍｓｄ遺伝子の一部分のＤＮＡコピーを合成することができる。
【図1B】レトロンオペロンの概略図及びレトロンの潜在的用途を示す。図１Ｂは、リコンビニアリングがレトロンの潜在的用途であることを図示し、Ｂｅｔａは、ｓｓＤＮＡを保護することができ、及びｓｓＤＮＡが相補ｓｓＤＮＡ標的、例えば細胞内のＤＮＡ標的にアニーリングすることを促進し得る。
【図1C】レトロンオペロンの概略図及びレトロンの潜在的用途を示す。図１Ｃは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集がレトロンの潜在的用途であることを図示し、レトロンは、変異体又は突然変異体標的部位を修復し得るｓｓＤＮＡ鋳型を提供することができる。
【図1D】レトロンオペロンの概略図及びレトロンの潜在的用途を示す。図１Ｄは、分子レコーディングがレトロンの潜在的用途であることを図示する（例えば、国際公開第２０１８１９１５２５ Ａ１号パンフレット（これは、全体として参照により本明細書に具体的に援用される）に提供されるとおり）。
【図2A】レトロン要因（ｒｅｔｒｏｎ ｅｌｅｍｅｎｔｓ）及びそのアセンブリを示す。図２Ａは、レトロン要因を示す：（１）ｍｓｒ及び逆転写されるｍｓｄの５’末端が２’－５’連結でプライミンググアノシンに共有結合的に結合しており、この分枝状の構造がゲノム改変における使用の妨げとなり、（２）レトロン逆転写に必要であり得るインバリアントな隣接領域、そのため、これは、容易に修復鋳型の一部となり得ず、（３）現在のところ全長が限られていると考えられているステム。ゲノム改変上の別の問題は、Ｐｏｌ ＩＩＩ転写のターミネータとして機能する天然レトロンポリＴストレッチである。
【図2B】レトロン要因及びそのアセンブリを示す。図２Ｂは、レトロンオペロンの非タンパク質コード（ｍｓｒ－ｍｓｄ）部分が、顕著な二次構造を有する転写物を産生すること、及び逆転写酵素（ＲＴ：ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）がこの転写物中の特定の開始部位を認識し、次に転写物をＲＴ－ＤＮＡ（ｍｓｄ）に部分的に逆転写することを図示する。
【図3A】図３Ａは、野生型ｅｃ８６（レトロン－Ｅｃｏ１ ｎｃＲＮＡとも称される）の塩基構造を示し、逆転写後、一番上のｍｓｄ ＤＮＡ（配列番号１、ＧＴＣＡＧＡＡＡＡＡＡＣＧＧＧＴＴＴＣＣＴＧＧＴＴＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＧＣＡＴＣＡＧＧＣＧＡＴＧＣＴＣＴＣＣＧＴＴＣＣＡＡＣＡＡＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＣＡＧＴＡＡＣＴＣＡＧＡ）及びｍｓｒ ＲＮＡが下の方の配列である（配列番号２ － ＡＵＧＣＧＣＡＣＣＣＵＵＡＧＣＧＡＧＡＧＧＵＵＵＡＵＣＡＵＵＡＡＧＧＵＣＡＡＣＣＵＣＵＧＧＡＵＧＵＵＧＵＵＵＣＧＧＣＡＵＣＣＵＧＣＡＵＵＧＡＡＵＣＵＧＡＧＵＵＡＣＵ）。
【図3D】図３Ｄは、２つの変異体ｍｓｄ、ｅｃ８６野生型から変化させたレトロン－Ｅｃｏ１ ｖ３２ ｎｃＲＮＡ（ＧＴＣＡＧＡＡＡＡＡＡＣＧＧＧＴＴＧＴＣＧＣＣＡＧＴＣＴＧＡＣＴＧＧＣＧＡＣＡＡＡＣＡＧＣＴＴＧＴＡＡＣＴＣＡＧＡ、配列番号３）及びｖ３２ ｎｃＲＮＡから変化させたレトロン－Ｅｃｏ１ ｖ３５ ｎｃＲＮＡ（ＧＴＣＡＧＡＡＡＡＡＡＣＧＧＧＴＧＧＡＧＡＧＧＴＴＧＣＴＧＣＡＡＣＣＴＣＴＣＣＡＴＴＴＴＣＴＴＧＴＡＡＣＴＣＡＧＡ、配列番号４）の塩基構造を示す。
【図4A】伸長型ｍｓｄ ｓｓＤＮＡを産生するための発現システムを図示する。図４Ａは、ｍｓｒ／ｍｓｄをレトロン逆転写酵素（ＲＴ）と分ける発現コンストラクトを示し、これにより、より長い（修飾された）逆転写ｍｓｄ ｓｓＤＮＡの産生が可能となる。
【図4C】伸長型ｍｓｄ ｓｓＤＮＡを産生するための発現システムを図示する。図４Ｃは、逆転写酵素コード領域と離れている（それに対してトランスの）ｍｓｒ／ｍｓｄ発現カセットにおけるｍｓｄ ｓｓＤＮＡの幾つかの伸長を図示し、異種配列を取り入れるため、ｍｓｄ領域を大きく拡張し得ることを示している。
【図5】修飾することができるレトロンパラメータを示す。
【図6A】図６Ａは、カスタマイズしたシーケンシングプレップパイプラインを概略的に図示する。ｓｓＤＮＡをＲＮアーゼの存在下でＲＮＡラリアット枝切り１（ＤＢＲ１：ｄｅｂｒａｎｃｈｉｎｇ ＲＮＡ ｌａｒｉａｔ １）によって処理し、次に鋳型非依存的ポリメラーゼ（ＴｄＴ：ｔｅｍｐｌａｔｅ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を使用して一続きの単一種のポリヌクレオチドを付加し、アダプターを含有する逆アンカー型プライマーを使用して相補鎖を生成し、第２のアダプターをライゲートし、次にこのアダプターを連結した二本鎖ＤＮＡにインデックスを付加してマルチプレックスシーケンシングに供する（配列番号２９）。
【図6C】図６Ｃは、注文した（ｏｒｄｅｒｅｄ）ｍｓｄ ｓｓＤＮＡ ｅｃ８６ ｖ３２配列を示し（ＧＴＣＡＧＡＡＡＡＡＡＣＧＧＧＴＴＧＴＣＧＣＣＡＧＴＣＴＧＡＣＴＧＧＣＧＡＣＡＡＡＣＡＧＣＴＴＧＴＡＡＣＴＣＡＧＡ、配列番号５）、シーケンシングによる確認を図示している。
【図6D】図６Ｄは、予想されるｍｓｄ ｓｓＤＮＡ ｅｃ８６ ｖ ３２配列を示し（ＧＴＣＡＧＡＡＡＡＡＡＣＧＧＧＴＴ ＧＴＣＧＣＣＡＧＴＣＴＧＡＣＴＧＧＣＧＡＣＡＡＡＣＡＧＣＴＴＧＴＡＡＣＴＣＡＧＡ、配列番号６）、シーケンシングの結果を図示している（ＧＴＣＡＧＡＡＡＡＡＡＣＧＧＧＴＴＧＴＣＧＣＣＡＧＴＣＴＧＡＣＴＧＧＣＧＡＣＡＡＡＣＡＧＣＴＴＧＴＡＡＣＴＣＡＧ、配列番号７）。
【図6E】図６Ｅは、文献の野生型ｍｓｄ ｓｓＤＮＡ ｅｃ８６配列を示し（ＧＴＣＡＧＡＡＡＡＡＡＣＧＧＧＴＴＴＣＣＴＧＧＴＴＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＧＣＡＴＣＡＧＧＣＧＡＴＧＣＴＣＴＣＴＣＣＧＴＴＣＣＡＡＣＡＡＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＣＡＧＴＡＡＣＴＣＡＧＡ、配列番号８）、シーケンシングの結果を図示している（ＧＴＣＡＧＡＡＡＡＡＡＣＧＧＧＴＴＴＣＣＴＧＧＴＴＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＧＣＡＴＣＡＧＧＣＧＡＴＧＣＴＣＴＣＴＣＣＧＴＴＣＣＡＡＣＡＡＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＣＡＧＴＡＡＣＴＣＡＧ、配列番号９）。
【図6F】図６Ｆは、文献の野生型ｍｓｄ ｓｓＤＮＡ ｅｃ８３配列を示し（ＴＴＧＡＡＧＣＣＧＣＧＧＡＡＣＡＡＡＣＴＴＴＴＴＧＡＴＣＣＧＣＡＡＣＣＴＡＣＴＧＧＡＴＴＧＣＧＧＣＴＣＡＡＡＡＡＧＴＴＴＧＴＴＣＣＧＣＡＡＣＴＧＴＡＡＡＴＧＴＡＡＴＣ、配列番号１０）、シーケンシングの結果を図示している（ＡＧＣＣＧＣＧＧＡＡＣＡＡＡＣＴＴＴＴＴＧＡＴＣＣＧＣＡＡＣＣＴＡＣＴＧＧＡＴＴＧＣＧＧＣＴＣＡＡＡＡＡＧＴＴＴＧＴＴＣＣＧＣＡＡＣＴＧＴＡＡＡＴＧＴＡＡＴＣ、配列番号１１）。
【図7C-1】ｍｓｄ ＤＮＡの修飾を図示する。図７Ｃ－１及び図７Ｃ－２は、レトロン非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ：ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ）の５’末端及び３’末端における領域の伸長及び短縮を図示する。図７Ｃ－１は、使用した基本的なレトロン構造を概略的に図示し、ｎｃＲＮＡ中の伸長した相補性領域は、黒色の実線で示される一方、残りのｎｃＲＮＡは、破線である。
【図7C-2】ｍｓｄ ＤＮＡの修飾を図示する。図７Ｃ－１及び図７Ｃ－２は、レトロン非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ：ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ）の５’末端及び３’末端における領域の伸長及び短縮を図示する。図７Ｃ－２は、ｎｃＲＮＡ相補性領域の伸長によって野生型配列と比べたＲＴ－ＤＮＡの存在量が増加し（ここで、野生型の存在量は、１００％である）、しかし、ｎｃＲＮＡ相補性領域の短縮によってＲＴ－ＤＮＡの存在量が減少することをグラフで図示する。示されるデータは、変異体毎にプールした実験からのものである（ｎ＝３、レプリケートを示す）。
【図8A】ｎｃＲＮＡの逆転写されるステムが短くなることによってｓｓＤＮＡの量が減少し得るが、ステムの伸長がｓｓＤＮＡ産生に負の影響を及ぼさないことをグラフで図示する。図８Ａは、修飾されるｎｃＲＮＡ構造の一部分を概略的に図示し、ステム領域を黒色の実線で示す一方、残りのｎｃＲＮＡを破線で示す。
【図8B】ｎｃＲＮＡの逆転写されるステムが短くなることによってｓｓＤＮＡの量が減少し得るが、ステムの伸長がｓｓＤＮＡ産生に負の影響を及ぼさないことをグラフで図示する。図８Ｂは、ｎｃＲＮＡ領域を約１５～３０ヌクレオチド伸長させると、伸長されていない野生型ｎｃＲＮＡ配列に観察されるのとほぼ同じレベルのＲＴ－ＤＮＡの存在量が維持され、しかしながら、ｎｃＲＮＡ領域の長さが約１４ヌクレオチド未満まで減少すると、伸長されていない野生型ｎｃＲＮＡ配列と比較して、逆転写によって生成されるｓｓＤＮＡの量が減少することをグラフで図示する。
【図9A】ｎｃＲＮＡの逆転写されたステム領域の破綻（ｂｒｅａｋｉｎｇ）及び修理（ｆｉｘｉｎｇ）の効果を図示する。図９Ａは、ｎｃＲＮＡの概略図であり、ｎｃＲＮＡの逆転写されたステム領域を黒色の実線で示す。
【図9B】ｎｃＲＮＡの逆転写されたステム領域の破綻（ｂｒｅａｋｉｎｇ）及び修理（ｆｉｘｉｎｇ）の効果を図示する。図９Ｂは、野生型配列と比べたｎｃＲＮＡ構造変異体の逆転写されたＤＮＡの存在量をグラフで図示する。データは、変異体毎にプールした実験からのものである。破綻したステム、修理されたステム及び許容できる破綻したステムのｎｃＲＮＡ構造変異体についての配列は、実施例に提供する。
【図10A】ｎｃＲＮＡの逆転写領域における挿入及び欠失が、ｎｃＲＮＡから逆転写されるＤＮＡの存在量に及ぼす効果を図示する。図１０Ａは、ｎｃＲＮＡを概略的に図示し、ｎｃＲＮＡの逆転写領域を黒色の破線及び実線で示す。破線は、ｍｓｄステムに隣接する領域を特定する。
【図10B】ｎｃＲＮＡの逆転写領域における挿入及び欠失が、ｎｃＲＮＡから逆転写されるＤＮＡの存在量に及ぼす効果を図示する。図１０Ｂは、各々がｍｓｄステムループに沿った個別の位置に３塩基の欠失を有する一連のｎｃＲＮＡ変異体について、その逆転写によって産生されたＲＴ－ＤＮＡ存在量を野生型配列と比べてグラフで図示する。欠失の位置は、ｘ軸に沿ってプロットする。
【図10C】ｎｃＲＮＡの逆転写領域における挿入及び欠失が、ｎｃＲＮＡから逆転写されるＤＮＡの存在量に及ぼす効果を図示する。図１０Ｃは、各々がｍｓｄステムループに沿った個別の位置に３塩基の挿入を有する一連のｎｃＲＮＡ変異体について、その逆転写によって産生されるＲＴ－ＤＮＡ存在量を野生型配列と比べてグラフで図示する。挿入の位置は、ｘ軸に沿ってプロットする。
【図10D】ｎｃＲＮＡの逆転写領域における挿入及び欠失が、ｎｃＲＮＡから逆転写されるＤＮＡの存在量に及ぼす効果を図示する。図１０Ｄは、各々がｍｓｄステムループに沿った個別の位置に一塩基変化を有する一連のｎｃＲＮＡ変異体について、その逆転写によって産生されるＲＴ－ＤＮＡ存在量を野生型配列と比べてグラフで図示する。挿入の位置は、ｘ軸に沿ってプロットする。
【図10E】ｎｃＲＮＡの逆転写領域における挿入及び欠失が、ｎｃＲＮＡから逆転写されるＤＮＡの存在量に及ぼす効果を図示する。図１０Ｅは、構造変化及び図１０Ｂ～図１０Ｄについて観察される結果に鑑みたｍｓｄループ位置の修飾適合性スコアをグラフで図示する。修飾適合性スコアは、これらの変化の平均的な影響に基づいており、データは、変異体毎にプールした実験からのものであった。折り畳まれたｎｃＲＮＡについて、ステム、ループ及び隣接領域の概略図は、図１０Ｂ～図１０Ｃに示される。
【発明を実施するための形態】
【0027】
定義
本明細書において、量、長さなどの測定可能な値を指すときに使用されるとおりの用語「約」は、指定される値から±２０％又は±１０％、より好ましくは±５％、更により好ましくは±１％及び更により好ましくは±０．１％の変動を包含することが意図される。
本明細書において、量、長さなどの測定可能な値を指すときに使用されるとおりの用語「約」は、指定される値から±２０％又は±１０％、より好ましくは±５％、更により好ましくは±１％及び更により好ましくは±０．１％の変動を包含することが意図される。
【0028】
「組換え体（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）」は、本明細書で核酸分子について記載するために使用されるとき、ゲノム、ｃＤＮＡ、細菌、半合成又は合成起源のポリヌクレオチドが、その起源又は操作のため、自然中でそれが結び付いている（ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ポリヌクレオチドの全て又は一部分に結び付いていないことを意味する。
【0029】
用語「組換え体」は、タンパク質又はポリペプチドに関連して使用されるとき、組換えポリヌクレオチドの発現によって産生されるポリペプチドを意味する。一般に、以下に詳述するとおり、目的の遺伝子をクローニングし、次に形質転換された生物において発現させる。宿主生物は、発現条件下で外来性遺伝子を発現してタンパク質を産生する。
【0030】
本明細書で使用されるとき、「細胞」は、組織、臓器及び生検からの細胞並びに組換え細胞、インビトロで培養した細胞株からの細胞及び細胞断片、細胞成分又は核酸を含む細胞小器官を含め、細菌、古細菌、真菌、原生生物、植物及び動物を含めた、原核生物、真核生物又は古細菌生物から単離された任意の種類の細胞を指す。この用語は、核酸を封入するナノ粒子、リポソーム、ポリマーソーム又はマイクロカプセルなど、人工細胞も包含する。本明細書に記載される方法は、例えば、単一細胞又は細胞集団を含む試料に対して実施することができる。この用語には、遺伝子修飾細胞も含まれる。
【0031】
用語「形質転換」は、挿入に用いられる方法に関わらず、宿主細胞への外因性ポリヌクレオチド（例えば、改変レトロン）の挿入を指す。例えば、直接的な取込み、形質導入又はＦ接合が挙げられる。外因性ポリヌクレオチドは、非組込み型ベクター、例えばプラスミドとして維持され得るか、又は代わりに宿主ゲノムに組み込まれ得る。
【0032】
「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞株」、「細胞培養物」及び単細胞実体として培養される微生物又は高等真核細胞株を指示する他のかかる用語は、組換えベクター又は他の移入されるＤＮＡのレシピエントとして使用され得るか又はそのように使用された細胞を指し、トランスフェクトされた元の細胞の元の子孫が含まれる。
【0033】
「コード配列」又は選択のポリペプチドを「コードする」配列は、適切な調節配列（即ち「制御エレメント」）の制御下にあるとき、インビボで転写（ＤＮＡの場合）及び翻訳されて（ｍＲＮＡの場合）ポリペプチドになる核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドン及び３’（カルボキシ）末端の翻訳終結コドンによって決まり得る。コード配列には、限定はされないが、ウイルス、原核生物又は真核生物ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、ウイルス又は原核生物ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、更に合成ＤＮＡ配列が含まれ得る。コード配列の３’側に転写終結配列が位置し得る。
【0034】
典型的な「制御エレメント」としては、限定はされないが、転写プロモータ、転写エンハンサーエレメント、転写終結シグナル、ポリアデニル化配列（翻訳終結コドンの３’側に位置する）、翻訳の開始を最適化するための配列（コード配列の５’側に位置する）及び翻訳終結配列が挙げられる。
【0035】
「作動可能に連結されている（Ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」は、そのように記載される成分がその通常の機能を果たすように構成されているエレメントの配列を指す。従って、コード配列に作動可能に連結されている所与のプロモータは、適切な酵素が存在するとき、そのコード配列の発現を生じさせる能力を有する。プロモータがその発現を導くように機能する限り、プロモータがコード配列と連続している必要はない。従って、例えば、プロモータ配列とコード配列との間には、依然として翻訳されていないが、転写されている介在配列が存在し得、それでもなお、プロモータ配列は、コード配列に「作動可能に連結されている」と見なすことができる。
【0036】
「～によってコードされる」は、ポリペプチド又はＲＮＡ配列をコードする核酸配列を指す。例えば、ポリペプチド配列又はその一部分は、その核酸配列によってコードされるポリペプチドからの少なくとも３～５アミノ酸、より好ましくは少なくとも８～１０アミノ酸及び更により好ましくは少なくとも１５～２０アミノ酸のアミノ酸配列を含有する。ＲＮＡ配列又はその一部分は、少なくとも３～５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも８～１０ヌクレオチド及び更により好ましくは少なくとも１５～２０ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含有する。
【0037】
用語「単離されている」、「精製されている」又は「生物学的に純粋な」は、程度の差はあるにしろ、その天然状態で見られるときに通常それに付随する成分を含まない材料を指す。「単離する」は、元の供給源又は周囲環境からのある程度の分離を意味する。「精製する」は、単離よりも高い程度の分離を意味する。「精製されている」又は「生物学的に純粋な」タンパク質は、任意の不純物がタンパク質の生物学的特性に実質的に影響を及ぼさないか、又は他の有害な帰結を引き起こさないように十分に他の材料を欠いている。即ち、本発明の核酸又はペプチドは、それが組換えＤＮＡ技法によって産生されるとき、細胞材料、ウイルス材料若しくは培養培地を実質的に含まないか、又は化学的に合成されるとき、化学的前駆体若しくは他の化学物質を実質的に含まない場合に精製されている。純度及び均一性は、典型的には、分析化学技法、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィーを用いて決定される。用語「精製されている」は、核酸又はタンパク質が電気泳動ゲルに本質的に１つのバンドを生じさせることを意味し得る。修飾、例えばリン酸化又はグリコシル化に供され得るタンパク質について、修飾が異なれば、異なる単離タンパク質が生じ得ると共に、これらは、別々に精製することができる。
【0038】
「実質的に精製されている」は、概して、物質が存在する試料の大多数の割合をその物質が占めるような物質（化合物、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド組成物）の単離を指す。典型的には、試料中において、実質的に精製されている成分は、試料の５０％、好ましくは８０％～８５％、より好ましくは９０～９５％を占める。目的のポリヌクレオチド及びポリペプチドの精製技法は、当技術分野において周知であり、例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー及び密度に基づく沈降が挙げられる。
【0039】
「発現」は、細胞による遺伝子産物の検出可能な産生を指す。遺伝子産物は、転写産物（即ちＲＮＡ）であり得る（これは、「遺伝子発現」と称され得る）か、又は遺伝子産物は、転写産物の翻訳産物（即ちタンパク質）であり得、文脈による。「精製されているポリヌクレオチド」は、そのポリヌクレオチドが天然で結び付いているタンパク質及び／又は核酸を本質的に含まない、例えばその約５０％未満、好ましくは約７０％未満及びより好ましくは約少なくとも９０％未満を含有する目的のポリヌクレオチド又はその断片を指す。目的のポリヌクレオチドの精製技法は、当技術分野で利用可能であり、例えばポリヌクレオチドを含有する細胞のカオトロピック剤による破壊並びにイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー及び密度に基づく沈降による１つ又は複数のポリヌクレオチド及びタンパク質の分離が挙げられる。
【0040】
用語「トランスフェクション」は、細胞による外来ＤＮＡの取込みを指して用いられる。細胞は、外因性ＤＮＡが細胞膜の内側に導入されているとき、「トランスフェクト」されている。当技術分野では、幾つものトランスフェクション技法が概して公知である。例えば、グラハム（Ｇｒａｈａｍ）ら著、１９７３年、ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、第５２巻、ｐ．４５６、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら著、２００１年、「分子クローニング、実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）」、第３版、コールド・スプリング・ハーバ研究所（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ニューヨーク州（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、デイビス（Ｄａｖｉｓ）ら著、１９９５年、「分子生物学の基本的方法（Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、第２版、マグローヒル（ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ）及びチュー（Ｃｈｕ）ら著、１９８１年、ジーン（Ｇｅｎｅ）、第１３巻、ｐ．１９７を参照されたい。かかる技法を用いて、好適な宿主細胞に１つ以上の外因性ＤＮＡ部分を導入することができる。この用語は、遺伝子材料の安定な取込み及び一過性の取込みの両方を指し、ペプチドに連結された又は抗体に連結されたＤＮＡの取込みを含む。
【0041】
「ベクター」は、核酸配列を標的細胞に移入させる能力を有する（例えば、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、粒子状担体及びリポソーム）。典型的には、「ベクターコンストラクト」、「発現ベクター」及び「遺伝子移入ベクター」は、目的の核酸の発現を導く能力を有する任意の核酸コンストラクトであって、核酸配列を標的細胞に移入させることのできるものを意味する。従って、この用語には、クローニング及び発現媒体並びにウイルスベクターが含まれる。
【0042】
「哺乳類細胞」は、本明細書に記載されるとおりの改変レトロン又は改変レトロンを含むベクターシステムのトランスフェクションに好適な哺乳類対象に由来する任意の細胞を指す。細胞は、異種細胞、自家細胞又は同種異系細胞であり得る。細胞は、哺乳類対象から直接入手された初代細胞であり得る。細胞は、哺乳類対象から入手された細胞を培養及び拡大したものに由来する細胞でもあり得る。不死化細胞もこの定義内に含まれる。一部の実施形態において、細胞は、組換えタンパク質及び／又は核酸を発現するように遺伝子改変されている。
【0043】
用語「対象」には、限定なしに、節足動物、軟体動物、環形動物及び刺胞動物などの無脊椎動物；並びにカエル、サンショウウオ及びアシナシイモリを含めた両生類；トカゲ、ヘビ、カメ、クロコダイル及びアリゲータを含めた爬虫類；魚類；ヒト並びにチンパンジー及び他の類人猿及びサル種を含めた非ヒト霊長類などの非ヒト哺乳類を含めた哺乳類；マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット及びチンチラなどの実験動物；イヌ及びネコなどの家庭動物；ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ及び雌ウシなどの農場動物；及びニワトリ、シチメンチョウ及び他のキジ類の鶏、アヒル、ガチョウなどを含めた、家禽、野鳥及び狩猟鳥などの鳥類などの脊椎動物を含め、脊椎動物及び無脊椎動物の両方を含めた動物が含まれる。ある場合には、本開示の方法は、限定はされないが、マウス、ラット及びハムスターを含めたげっ歯類；霊長類及びトランスジェニック動物を含め、実験動物、獣医学的適用及び疾患用動物モデルの開発に用途が見出される。
【0044】
「遺伝子移入」又は「遺伝子送達」は、目的のＤＮＡ又はＲＮＡを宿主細胞に確実に挿入するための方法又はシステムを指す。かかる方法は、組み込まれていないトランスフェクトされたＤＮＡの一過性発現、移入されたレプリコン（例えば、エピソーム）の染色体外複製及び発現又は宿主細胞のゲノムＤＮＡへの移入された遺伝子材料の組込みをもたらし得る。遺伝子送達発現ベクターとしては、限定はされないが、細菌プラスミドベクター、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、アルファウイルス、ポックスウイルス及びワクシニアウイルスに由来するベクターが挙げられる。
【0045】
用語「～に由来する」は、本明細書では、分子の元の供給源を特定するために用いられるが、例えば化学合成又は組換え手段によるものであり得る、その分子が作られる方法を限定する意図はない。
【0046】
指定される配列「に由来する」ポリヌクレオチドとは、指定されるヌクレオチド配列の一領域に対応する、即ちそれと同一の又は相補的なおよそ少なくとも約６ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約８ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１０～１２ヌクレオチド及び更により好ましくは少なくとも約１５～２０ヌクレオチドの連続した配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。由来したポリヌクレオチドは、必ずしも物理的に目的のヌクレオチド配列に由来するとは限らず、限定はされないが、化学合成、複製、逆転写又は転写を含め、ポリヌクレオチドの由来である元のその１つ又は複数の領域中の塩基配列によって提供される情報に基づく任意の方法によって生成され得る。そのため、これは、元のポリヌクレオチドのセンス又はアンチセンスのいずれの向きにも相当し得る。
【0047】
「バーコード」は、そのバーコードが結び付けられている核酸又は細胞を同定するために使用される１つ以上のヌクレオチド配列を指す。バーコードは、３～１０００ヌクレオチド長以上、好ましくは１０～２５０ヌクレオチド長及びより好ましくは１０～３０ヌクレオチド長、例えばこれらの範囲内にある任意の長さを含めて、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００又は１０００ヌクレオチド長などであり得る。バーコードは、例えば、核酸の起源である単一細胞、細胞のサブ集団、コロニー又は試料を同定するために使用され得る。バーコードは、核酸の起源である細胞、コロニー又は試料の位置、例えば細胞アレイ内におけるコロニーの位置、マルチウェルプレート内におけるウェルの位置又はラック内におけるチューブ、フラスコ若しくは他の容器の位置などを同定するためにも使用され得る（即ち位置的バーコード）。例えば、バーコードは、核酸の起源である遺伝子修飾細胞を同定するために使用され得る。一部の実施形態において、バーコードは、特定の種類のゲノム編集又は特定の種類のドナー核酸を同定するために使用される。
【0048】
用語「ハイブリダイズする」及び「ハイブリダイゼーション」は、ワトソン・クリック塩基対合で複合体を形成するのに十分に相補的なヌクレオチド配列間での複合体の形成を指す。
【0049】
用語「相同領域」は、別の核酸領域と相同性がある核酸の領域を指す。従って、核酸分子に「相同領域」が存在するかどうかは、同じ又は異なる分子の別の核酸領域に照らして決まる。更に、核酸は、多くの場合、二本鎖であるため、用語「相同領域」とは、本明細書で使用されるとき、核酸分子が互いにハイブリダイズする能力を指す。例えば、一本鎖核酸分子は、互いとのハイブリダイズ能を有する２つの相同領域を有し得る。従って、用語「相同領域」には、相補配列を有する核酸セグメントが含まれる。相同領域の長さは、様々であり得るが、典型的には４～５００ヌクレオチド（例えば、約４～約４０、約４０～約８０、約８０～約１２０、約１２０～約１６０、約１６０～約２００、約２００～約２４０、約２４０～約２８０、約２８０～約３２０、約３２０～約３６０、約３６０～約４００、約４００～約４４０等）となり得る。
【0050】
本明細書で使用されるとき、用語「相補的」又は「相補性」は、互いと塩基対を形成することが可能なポリヌクレオチドを指す。塩基対は、典型的には、ポリヌクレオチド鎖間で逆平行の向きにあるヌクレオチド単位間の水素結合によって形成される。相補的なポリヌクレオチド鎖は、ワトソン・クリック方式（例えば、ＡがＴに、ＡがＵに、ＣがＧに）又は二重鎖の形成を可能にする任意の他の方式で塩基対合することができる。当業者が認識するとおり、ＤＮＡと対照的にＲＮＡを使用するとき、チミン（Ｔ）でなく、むしろウラシル（Ｕ）が、アデノシンに相補的であると見なされる塩基である。しかしながら、本発明に関連してウラシルが表示されているとき、特に指定されない限り、チミンで代替可能であることが含意される。「相補性」は、２つのＲＮＡ鎖間、２つのＤＮＡ鎖間又はＲＮＡ鎖とＤＮＡ鎖との間に存在し得る。概して、２つ以上のポリヌクレオチドは、相補性が完全でないか又は１００％に満たなくても「相補的」であり、二重鎖を形成可能であり得ることが理解される。２つの配列は、各ポリヌクレオチド配列の相補性領域を含む少なくとも連続した一部分が、かかる領域内にいかなるミスマッチ又は中断もなく他方のポリヌクレオチドと完全に塩基対合する場合、「完全に相補的」又は「１００％相補的」である。２つ以上の配列は、いずれか一方又は両方のポリヌクレオチドが追加的な非相補配列を含んでいたとしても、各ポリヌクレオチド内の連続した相補性領域が他方と完全にハイブリダイズ可能である限り、「完全に相補的」又は「１００％相補的」と見なされる。「完全でない」相補性とは、かかる相補性領域内にある連続したヌクレオチドのうち、互いに塩基対合可能であるのが全てではない状況を指す。２つのポリヌクレオチド配列間の相補性パーセンテージの決定は、当技術分野の通常の技術程度の事項である。
【0051】
用語「Ｃａｓ９」は、本明細書で使用されるとき、任意の種由来のＩＩ型のクラスター化して規則的に散在する短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ：ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ）システムＣａｓ９エンドヌクレアーゼを包含し、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ活性（即ちＤＮＡの部位特異的切断を触媒して二本鎖切断を生じさせる）を保持しているその生物学的に活性な断片、変異体、類似体及び誘導体も含む。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、その結合したガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ：ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）に相補的な配列を含む部位のＤＮＡに結合し、それを切断する。Ｃａｓ９ターゲティングの目的上、ｇＲＮＡは、標的配列（例えば、メジャー又はマイナーアレル）に「相補的」である、二重鎖を形成する（即ちｇＲＮＡが標的配列とハイブリダイズする）のに十分な塩基対合能のある配列を含み得る。加えて、ｇＲＮＡは、ＰＡＭ配列に相補的な配列を含み得、ここで、ｇＲＮＡは、標的ＤＮＡのＰＡＭ配列ともハイブリダイズする。
【0052】
用語「ドナーポリヌクレオチド」は、標的遺伝子座のゲノムにＨＤＲ又はリコンビニアリングによって組み込まれる意図される編集の配列を提供するポリヌクレオチドを指す。
「標的部位」又は「標的配列」は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）又はドナーポリヌクレオチドの相同性アームによって認識される（即ちハイブリダイゼーションに十分に相補的な）核酸配列である。標的部位は、アレル（例えば、メジャー又はマイナーアレル）に特異的であり得る。例えば、標的部位は、１つ以上のヌクレオチドの挿入、１つ以上のヌクレオチドの置換、１つ以上のヌクレオチドの欠失又はこれらの組み合わせによるなど、修飾されることが意図されるゲノム部位であり得る。
「標的部位」又は「標的配列」は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）又はドナーポリヌクレオチドの相同性アームによって認識される（即ちハイブリダイゼーションに十分に相補的な）核酸配列である。標的部位は、アレル（例えば、メジャー又はマイナーアレル）に特異的であり得る。例えば、標的部位は、１つ以上のヌクレオチドの挿入、１つ以上のヌクレオチドの置換、１つ以上のヌクレオチドの欠失又はこれらの組み合わせによるなど、修飾されることが意図されるゲノム部位であり得る。
【0053】
「相同性アーム（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｒｍ）」とは、ドナーポリヌクレオチドの中で、細胞内の編集されるゲノム配列へのドナーポリヌクレオチドのターゲティングに関与する一部分が意味される。ドナーポリヌクレオチドは、典型的には、ゲノムＤＮＡに対する意図される編集を含むヌクレオチド配列に隣接している、５’ゲノム標的配列にハイブリダイズする５’相同性アームと、３’ゲノム標的配列にハイブリダイズする３’相同性アームとを含む。相同性アームは、本明細書では５’及び３’（即ち上流及び下流）相同性アームと称され、これは、ドナーポリヌクレオチド内の意図される編集を含むヌクレオチド配列に対する相同性アームの相対的な位置に関する。５’及び３’相同性アームは、修飾されるゲノムＤＮＡの標的遺伝子座内にある、本明細書でそれぞれ「５’標的配列」及び「３’標的配列」と称される領域にハイブリダイズする。例えば、意図される編集を含むヌクレオチド配列は、５’及び３’相同性アームによって認識される（即ちハイブリダイゼーションに十分に相補的な）ゲノム標的遺伝子座において、ＨＤＲ又はリコンビニアリングによってゲノムＤＮＡに組み込まれ得る。
【0054】
一般に、「ＣＲＩＳＰＲ適応システム（ＣＲＩＳＰＲ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）」は、まとめて、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列及びリーダ配列と少なくとも１つのリピート配列とを含むＣＲＩＳＰＲアレイ核酸配列を含む、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現又はその活性を導くことに関わる転写物及び他のエレメントを指す。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ適応システムの１つ以上のエレメントは、Ｉ型、ＩＩ型又はＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムに由来する。Ｃａｓｌ及びＣａｓ２は、３つ全ての型のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに見出され、これらは、スペーサ獲得に関わる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＩ－Ｅシステムでは、ＣａｓｌとＣａｓ２とは、Ｃａｓ２二量体によって２つのＣａｓｌ二量体が架橋される複合体を形成する。この複合体では、Ｃａｓ２が非酵素的足場の役割を果たし、侵入してくるＤＮＡの二本鎖断片を結合する一方、ＣａｓｌがそのＤＮＡの一本鎖隣接部を結合し、ＣＲＩＳＰＲアレイへのその組込みを触媒する。
【0055】
一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ以上のエレメントは、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）など、内因性ＣＲＩＳＰＲシステムを含む特定の生物に由来する。一般に、ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムに関連してプロトスペーサとも称される）の部位におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメントによって特徴付けられる。
【0056】
一部の実施形態において、ベクターは、Ｃａｓタンパク質などのＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に連結された調節エレメントを含む。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓｌ、ＣａｓｌＢ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎｌ及びＣｓｘｌ２としても知られる）、ＣａｓｌＯ、Ｃｓｙｌ、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅｌ、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃｌ、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒｌ、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂｌ、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘｌ７、Ｃｓｘｌ４、ＣｓｘｌＯ、Ｃｓｘｌ６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘｌ、Ｃｓｘｌ５、Ｃｓｆｌ、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、その相同体又はその修飾されたバージョンが挙げられる。
【0057】
特定の実施形態において、本開示は、プロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる短い（３～５ｂｐ）ＤＮＡ配列に隣接するプロトスペーサを提供する。ＰＡＭは、Ｉ型及びＩＩ型システムにとって獲得において重要である。Ｉ型及びＩＩ型システムでは、プロトスペーサがＰＡＭ配列に隣接する位置で切り出され、スペーサの他端がルーラー機構を用いて切断されるため、ＣＲＩＳＰＲアレイにおけるスペーササイズの規則性が維持されている。ＰＡＭ配列の保存は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム間で異なり、Ｃａｓｌ及びリーダ配列に進化的に連結されていることもある。
【0058】
一部の実施形態において、本開示は、細胞内で改変レトロンシステムの使用によるなどして細胞内で産生される定義付けられた合成ＤＮＡを、限定はされないが、優先的にはリーダ配列に隣接して存在するＣＲＩＳＰＲアレイに決まった向きで組み込むことを提供する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のＩ－Ｅ型システムでは、リーダ配列に隣接する１番目のダイレクトリピートがコピーされ、新規に獲得されたスペーサが１番目のダイレクトリピートと２番目のダイレクトリピートとの間に挿入されることが実証された。
【0059】
一実施形態において、プロトスペーサは、定義付けられた合成ＤＮＡである。一部の実施形態において、定義付けられた合成ＤＮＡは、少なくとも３、５、１０、２０、３０、４０、又は５０ヌクレオチド、又は３～５０、又は１０～１００、又は２０～９０、又は３０～８０、又は４０～７０、又は５０～６０ヌクレオチド長である。一実施形態において、オリゴヌクレオチド配列又は定義付けられた合成ＤＮＡは、修飾された「ＡＡＧ」プロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む。
【0060】
一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ以上のエレメントの発現をドライブするため、ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ以上のエレメントに調節エレメントが作動可能に連結されている。一般に、ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ：クラスター化して規則的に散在する短い回文配列リピート）、別名ＳＰＩＤＲ（ＳＰａｃｅｒ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｄｉｒｅｃｔ Ｒｅｐｅａｔ：スペーサが散在するダイレクトリピート）は、特定の細菌種に特異的であることが通例であるＤＮＡ遺伝子座のファミリーを成す。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に認められた特徴的なクラスの散在する短い配列リピート（ＳＳＲ：ｓｈｏｒｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔ）（イシノ（Ｉｓｈｉｎｏ）ら著、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．ＢａｃｔｅｒｉｏＬ）、第１６９巻、ｐ．５４２９～５４３３、１９８７年；及びナカタ（Ｎａｋａｔａ）ら著、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．ＢａｃｔｅｒｉｏＬ）、第１７１巻、ｐ．３５５３～３５５６、１９８９年）及び関連する遺伝子を含む。同様の散在するＳＳＲは、ハロフェラックス・メディテラネイ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ）、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）及び結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）で同定されている（グローネン（Ｇｒｏｅｎｅｎ）ら著、モレキュラー・マイクロバイオロジー（Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）、第１０巻、ｐ．１０５７～１０６５、１９９３年；ホー（Ｈｏｅ）ら著、エマージング・インフェクシャス・ディジーズ（Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．）、第５巻、ｐ．２５４～２６３、１９９９年；マスポール（Ｍａｓｅｐｏｈｌ）ら著、バイオキミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ）、第１３０７巻、ｐ．２６～３０、１９９６年；及びモヒカ（Ｍｏｊｉｃａ）ら著、モレキュラー・マイクロバイオロジー（Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ）、第１７巻、ｐ．８５～９３、１９９５年を参照されたい）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、典型的には、他のＳＳＲとリピートの構造が異なり、これは、短い規則的に散在するリピート（ＳＲＳＲ：ｓｈｏｒｔ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｓｐａｃｅｄ ｒｅｐｅａｔ）と呼ばれている（ジャンセン（Ｊａｎｓｓｅｎ）ら著、ＯＭＩＣＳジャーナル・オブ・インテグレイティブ・バイオロジー（ＯＭＩＣＳ Ｊ．Ｉｎｔｅｇ．Ｂｉｏｌ．）、第６巻、ｐ．２３～３３、２００２年；及びモヒカ（Ｍｏｊｉｃａ）ら著、モレキュラー・マイクロバイオロジー（Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）、第３６巻、ｐ．２４４～２４６、２０００年）。一般に、リピートは、実質的に一定の長さのユニークな介在配列によって規則的な間隔が空いたクラスター化して存在する短いエレメントである（モヒカ（Ｍｏｊｉｃａ）ら著、２０００年、前掲）。リピート配列は、株間で高度に保存されているが、散在するリピートの数及びスペーサ領域の配列は、典型的には、株毎に異なる（ヴァン・エムデン（ｖａｎ Ｅｍｂｄｅｎ）ら著、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）、第１８２巻、ｐ．２３９３～２４０１、２０００年）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、４０種を超える原核生物で同定されており（例えば、ジャンセン（Ｊａｎｓｅｎ）ら著、モレキュラー・マイクロバイオロジー（Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）、第４３巻、ｐ．１５６５～１５７５、２００２年；及びモヒカ（Ｍｏｊｉｃａ）ら著、２００５年を参照されたい）、限定はされないが、アエロピルム属（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ）、ピロバキュラム属（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）、スルホロブス属（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）、アーケオグロブス属（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ハロアーキュラ属（Ｈａｌｏｃａｒｃｕｌａ）、メタノバクテリウム属（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎ）、メタノコッカス属（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）、メタノサルシナ属（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）、メタノピュルス属（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ）、パイロコッカス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ピクロフィルス属（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ）、サーモプラズマ属（Ｔｈｅｒｎｉｏｐｌａｓｎｉａ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アクイフェックス属（Ａｑｕｉｆｒｘ）、ポルフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｖｒｏｍｏｎａｓ）、クロロビウム属（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、サーマス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、サーモアナエロバクター属（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、フゾバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アゾアルカス属（Ａｚａｒｃｕｓ）、クロモバクテリウム属（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）、デスルホビブリオ属（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）、ジオバクター属（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ）、ミクロコッカス属（Ｍｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ウォリネラ属（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、メチロコッカス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、フォトバクテリウム属（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）及びサーモトガ属（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）が挙げられる。
【0061】
一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列は、真核細胞など、特定の細胞における発現のためにコドン最適化される。真核細胞は、限定はされないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ又は非ヒト霊長類を含めた、哺乳類などの特定の生物のもの又はそれに由来するものであり得る。一般に、コドン最適化とは、目的の宿主細胞における発現を亢進させるため、天然アミノ酸配列を維持しつつ、天然配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約１又は約１より多い、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０又はそれを超えるコドン）をその宿主細胞の遺伝子でより使用頻度の高い又は最も使用頻度の高いコドンに置き換えることにより核酸配列を修飾する処理を指す。様々な種が特定のアミノ酸のある種のコドンに特定の偏りを呈する。コドンバイアス（生物間のコドン使用の違い）は、多くの場合、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ：ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ）の翻訳効率と相関があり、従って、それは、とりわけ翻訳されるコドンの特性及び特定の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ：ｔｒａｎｓｆｅｒ ＲＮＡ）分子が利用可能であるかどうかに依存すると考えられている。細胞において選択したｔＲＮＡが優勢であることは、概して、ペプチド合成において最も使用頻度の高いコドンを反映するものである。従って、コドン最適化に基づいて、所与の生物で最適な遺伝子発現となるように遺伝子を調整することができる。コドン使用表は、例えば、「コドン使用データベース（Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ）」で容易に利用可能であり、こうした表を幾つもの方法で応用することができる。ナカムラ，Ｙ．（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．）ら著、「国際ＤＮＡ配列データベースから一覧表にしたコドン使用：２０００年の状況（Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｔａｂｕｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｙｅａｒ ２０００）」、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）、第２８巻、ｐ．２９２、２０００年を参照されたい。特定の配列を特定の宿主細胞での発現のためにコドン最適化するコンピュータアルゴリズムも利用可能であり、ジーン・フォージ（Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ）（アプタジェン（Ａｐｔａｇｅｎ）；ペンシルベニア州ジャコバス（Ｊａｃｏｂｕｓ，Ｐａ．））なども利用可能である。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列中の１つ以上のコドン（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０若しくはそれを超える又は全てのコドン）は、特定のアミノ酸についての最も使用頻度の高いコドンに対応する。
【0062】
改変レトロンコンストラクト又は改変レトロンコンストラクトを含むベクターなど、核酸を細胞に「投与すること」は、形質導入、トランスフェクション、電気穿孔、転位置、融合、貪食、銃又はバリスティック法等、即ち細胞膜を越えて核酸を輸送することのできる任意の手段を含む。
【0063】
本開示を更に説明する前に、開示される主題は、当然のことながら、異なり得るため、説明される詳細な実施形態に限定されないことが理解されるべきである。本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることになるため、本明細書で使用される用語法は、詳細な実施形態を説明するためのものに過ぎず、限定する意図がないことも理解されるべきである。
【0064】
値の範囲が提供される場合、文脈上特に明確に指示されない限り、下限の単位の１０分の１に至るまでの、その範囲の上限と下限との間にある各中間値及びその記載される範囲にある任意の他の記載される値又は中間値は、開示される主題の範囲内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立に、そのより小さい範囲に含まれ得、それらも、記載される範囲における任意の具体的に除外される限界値を条件として、開示される主題の範囲内に包含される。記載される範囲が限界値の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる限界値の一方又は両方を除外する範囲も、開示される主題に含まれる。
【0065】
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、開示される主題が属する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。開示される主題の実施又は試験では、本明細書に記載されるものと同様の又は均等な任意の方法及び材料も使用し得るが、ここに好ましい方法及び材料を記載する。本明細書において言及される全ての刊行物は、それらの刊行物を引用するのに関連する方法及び／又は材料を開示及び説明するため、参照により本明細書に援用される。
【0066】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」及び「その」には、文脈上特に明確に指示されない限り複数の指示対象が含まれることに留意しなければならない。従って、例えば「細胞」と言うとき、それには、複数のかかる細胞が含まれ、「その核酸」と言うとき、それには、１つ以上の核酸及び当業者に公知のその均等物への言及が含まれるなどである。更に、特許請求の範囲は、いかなる任意選択の要素も除外するように記述され得ることが留意される。そのため、この記載事項が、「否定的な」限定の使用を含む、本明細書に記載される任意の特徴又は要素の列挙に関連した「もっぱら」、「のみ」などのような除外の文言の使用に際して先行的限定の根拠となることが意図される。
【0067】
明確にするため、個別の実施形態に関連して記載される開示される主題の特定の特徴は、単一の実施形態として組み合わせても提供され得ることが理解される。逆に、簡潔にするため、単一の実施形態に関連して記載される開示される主題の様々な特徴は、個別に又は任意の好適な部分的組み合わせでも提供され得る。本開示に関する実施形態の全ての組み合わせは、開示される主題に具体的に包含され、あたかもあらゆる組み合わせが個々に且つ明示的に開示されたかのように本明細書に開示される。加えて、様々な実施形態及びその要素のあらゆる部分的組み合わせも本開示に具体的に包含され、あたかもあらゆるかかる部分的組み合わせが個々に且つ明示的に本明細書に開示されたかのように本明細書に開示される。
【0068】
本明細書で考察される刊行物は、本願の出願日より前のそれらの開示についてのみ提供される。本明細書のいかなる事項も、開示される主題にかかる刊行物に先行する権利がないことを認めるものとして解釈されてはならない。更に、提供される刊行日は、実際の刊行日と異なり得るため、実際の刊行日を別途確認する必要があり得る。
【0069】
マルチコピー一本鎖ＤＮＡ（ｍｓＤＮＡ）の産生を亢進させるように修飾された改変レトロンが提供される。加えて、かかる改変レトロンをコードするベクターシステム並びにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介ゲノム編集、リコンビニアリング、細胞バーコーディング及び分子レコーディングなどの様々な適用において改変レトロン及びそれをコードするベクターシステムを使用する方法も提供される。
【0070】
改変レトロン
本開示は、細胞におけるｍｓＤＮＡの産生を亢進させるように修飾されている改変レトロンを提供する。改変レトロンは、ｍｓｒ前配列、マルチコピー一本鎖ＲＮＡ（ｍｓＲＮＡ）をコードするｍｓｒ遺伝子；マルチコピー一本鎖ＤＮＡ（ｍｓＤＮＡ）をコードするｍｓｄ遺伝子；ｍｓｄ後配列及び逆転写酵素をコードするｒｅｔ遺伝子を含む。このレトロンによってコードされる逆転写酵素によるＤＮＡ合成の結果、ｍｓｒ遺伝子によってコードされる一本鎖ＲＮＡに連結したｍｓｄ遺伝子によってコードされる一本鎖ＤＮＡで構成されるＤＮＡ／ＲＮＡキメラ産物が提供され得る。レトロンｍｓｒ ＲＮＡは、ステムループ構造の末端において、保存されたグアノシン残基を含有する。ｍｓｒ ＲＮＡの鎖は、この保存されたグアノシン残基の２’位における２’－５’リン酸ジエステル結合によってｍｓｄ一本鎖ＤＮＡの５’末端につなぎ合わされる。
本開示は、細胞におけるｍｓＤＮＡの産生を亢進させるように修飾されている改変レトロンを提供する。改変レトロンは、ｍｓｒ前配列、マルチコピー一本鎖ＲＮＡ（ｍｓＲＮＡ）をコードするｍｓｒ遺伝子；マルチコピー一本鎖ＤＮＡ（ｍｓＤＮＡ）をコードするｍｓｄ遺伝子；ｍｓｄ後配列及び逆転写酵素をコードするｒｅｔ遺伝子を含む。このレトロンによってコードされる逆転写酵素によるＤＮＡ合成の結果、ｍｓｒ遺伝子によってコードされる一本鎖ＲＮＡに連結したｍｓｄ遺伝子によってコードされる一本鎖ＤＮＡで構成されるＤＮＡ／ＲＮＡキメラ産物が提供され得る。レトロンｍｓｒ ＲＮＡは、ステムループ構造の末端において、保存されたグアノシン残基を含有する。ｍｓｒ ＲＮＡの鎖は、この保存されたグアノシン残基の２’位における２’－５’リン酸ジエステル結合によってｍｓｄ一本鎖ＤＮＡの５’末端につなぎ合わされる。
【0071】
改変レトロンでは、ｍｓｄ後配列は、例えば、その自己相補性領域（これは、ｍｓｒ前配列との配列相補性を有する）の範囲内で修飾され、ここで、自己相補性領域の長さは、天然レトロンの対応する領域に対して長くなっている。かかる修飾により、改変レトロンがｍｓＤＮＡ産生の亢進をもたらすことになる。特定の実施形態において、相補性領域は、野生型自己相補性領域よりも少なくとも１、少なくとも２、少なくとも４、少なくとも６、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０又は少なくとも５０ヌクレオチド長い長さを有する。例えば、自己相補性領域は、天然又は野生型相補性領域よりも１～５０ヌクレオチドの範囲で長い長さ、例えばこの範囲内にある任意の長さを含めて、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０ヌクレオチド長い長さなどを有し得る。特定の実施形態において、自己相補性領域は、野生型相補性領域よりも１～１６ヌクレオチドの範囲で長い長さを有する。改変レトロンによって生成される一本鎖ＤＮＡは、様々な適用に使用することができる。
【0072】
より多量のｓｓＤＮＡが作り出されるように、例えば、以下に示すｎｃＲＮＡ配列番号１２の配列（天然自己相補性３’及び５’末端（１～１２位及び１５８～１６９位にある）を太字で強調表示した）を１位及び１６９位で伸長させることができる。
【0073】
【化1】
【0074】
例えば、下記の改変された「ｎｃＲＮＡ伸長型」（配列番号１３）について以下に示すとおりである（ここで、自己相補性領域を伸長する追加のヌクレオチドは、下線付きの斜体で示されている）。
【0075】
【化2】
【0076】
場合により、追加のヌクレオチドは、自己相補性領域内の任意の位置、例えば配列番号１２の配列の１～１２位及び１５８～１６９位内のいずれにも付加することができる。
特定の実施形態において、改変レトロンに使用されるｍｓｒ遺伝子、ｍｓｄ遺伝子及びｒｅｔ遺伝子の配列は、細菌性レトロンオペロンに由来し得る。代表的なレトロン、例えば、限定なしに、ミキソコッカス・ザンサス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ ｘａｎｔｈｕｓ）レトロン（例えば、Ｍｘ６５、Ｍｘ１６２）及びスチグマテラ・オーランチアカ（Ｓｔｉｇｍａｔｅｌｌａ ａｕｒａｎｔｉａｃａ）レトロン（例えば、Ｓａ１６３）などの粘液細菌レトロン；大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）レトロン（例えば、Ｅｃ４８、Ｅ６７、Ｅｃ７３、Ｅｃ７８、ＥＣ８３、ＥＣ８６、ＥＣ１０７及びＥｃ１０７）；サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）；コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）レトロン（例えば、Ｖｃ８１、Ｖｃ９５、Ｖｃ１３７）；腸炎ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）（例えば、Ｖｃ９６）；及びナンノキスチス・エクセデンス（Ｎａｎｎｏｃｙｓｔｉｓ ｅｘｅｄｅｎｓ）レトロン（例えば、Ｎｅ１４４）を含めたグラム陰性菌のものなどが利用可能である。レトロンｍｓｒ遺伝子、ｍｓｄ遺伝子及びｒｅｔ遺伝子核酸配列並びにレトロン逆転写酵素タンパク質配列は、任意の供給源に由来し得る。代表的なレトロン配列は、ｍｓｒ遺伝子、ｍｓｄ遺伝子及びｒｅｔ遺伝子核酸配列及び逆転写酵素タンパク質配列を含め、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のデータベースに掲載されている。例えば、ＮＣＢＩエントリ：アクセッション番号ＥＦ４２８９８３、Ｍ５５２４９、ＥＵ２５００３０、Ｘ６０２０６、Ｘ６２５８３、ＡＢ２９９４４５、ＡＢ４３６６９６、ＡＢ４３６６９５、Ｍ８６３５２、Ｍ３０６０９、Ｍ２４３９２、ＡＦ４２７７９３、ＡＱ３３５４及びＡＢ０７９１３４を参照されたく；これらの配列は、全て（本願の出願日までに登録されているとおり）全体として参照により本明細書に援用される。これらのレトロン配列又はある配列を含むその変異体のいずれも変異体ヌクレオチド、付加されたヌクレオチド又はより少数のヌクレオチドを含み得る。例えば、レトロンは、それと少なくとも約８０～１００％の配列同一性、例えばこの範囲内にある任意のパーセント同一性を含めて、例えば本明細書に記載されるレトロン配列のいずれか（アクセッション番号によって定義されるものを含む）と８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％の配列同一性などを有し得、本明細書に記載されるとおりの改変レトロン又は改変レトロンを含むベクターシステムの構築に使用することができる。
特定の実施形態において、改変レトロンに使用されるｍｓｒ遺伝子、ｍｓｄ遺伝子及びｒｅｔ遺伝子の配列は、細菌性レトロンオペロンに由来し得る。代表的なレトロン、例えば、限定なしに、ミキソコッカス・ザンサス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ ｘａｎｔｈｕｓ）レトロン（例えば、Ｍｘ６５、Ｍｘ１６２）及びスチグマテラ・オーランチアカ（Ｓｔｉｇｍａｔｅｌｌａ ａｕｒａｎｔｉａｃａ）レトロン（例えば、Ｓａ１６３）などの粘液細菌レトロン；大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）レトロン（例えば、Ｅｃ４８、Ｅ６７、Ｅｃ７３、Ｅｃ７８、ＥＣ８３、ＥＣ８６、ＥＣ１０７及びＥｃ１０７）；サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）；コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）レトロン（例えば、Ｖｃ８１、Ｖｃ９５、Ｖｃ１３７）；腸炎ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）（例えば、Ｖｃ９６）；及びナンノキスチス・エクセデンス（Ｎａｎｎｏｃｙｓｔｉｓ ｅｘｅｄｅｎｓ）レトロン（例えば、Ｎｅ１４４）を含めたグラム陰性菌のものなどが利用可能である。レトロンｍｓｒ遺伝子、ｍｓｄ遺伝子及びｒｅｔ遺伝子核酸配列並びにレトロン逆転写酵素タンパク質配列は、任意の供給源に由来し得る。代表的なレトロン配列は、ｍｓｒ遺伝子、ｍｓｄ遺伝子及びｒｅｔ遺伝子核酸配列及び逆転写酵素タンパク質配列を含め、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のデータベースに掲載されている。例えば、ＮＣＢＩエントリ：アクセッション番号ＥＦ４２８９８３、Ｍ５５２４９、ＥＵ２５００３０、Ｘ６０２０６、Ｘ６２５８３、ＡＢ２９９４４５、ＡＢ４３６６９６、ＡＢ４３６６９５、Ｍ８６３５２、Ｍ３０６０９、Ｍ２４３９２、ＡＦ４２７７９３、ＡＱ３３５４及びＡＢ０７９１３４を参照されたく；これらの配列は、全て（本願の出願日までに登録されているとおり）全体として参照により本明細書に援用される。これらのレトロン配列又はある配列を含むその変異体のいずれも変異体ヌクレオチド、付加されたヌクレオチド又はより少数のヌクレオチドを含み得る。例えば、レトロンは、それと少なくとも約８０～１００％の配列同一性、例えばこの範囲内にある任意のパーセント同一性を含めて、例えば本明細書に記載されるレトロン配列のいずれか（アクセッション番号によって定義されるものを含む）と８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％の配列同一性などを有し得、本明細書に記載されるとおりの改変レトロン又は改変レトロンを含むベクターシステムの構築に使用することができる。
【0077】
一部の実施形態において、組換えレトロンコンストラクトは、ｍｓｒ遺伝子、ｍｓｄ遺伝子及びｒｅｔ遺伝子間の間隔が非天然である非天然立体配置（ｎｏｎ－ｎａｔｉｖｅ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）を有する。ｍｓｒ遺伝子及びｍｓｄ遺伝子は、内因性のシス構成で提供されるのでなく、むしろトランス構成で離れていることができる。加えて、ｒｅｔ遺伝子は、ｍｓｒ遺伝子又はｍｓｄ遺伝子のいずれに対してもトランス構成で提供され得る。一部の実施形態において、ｒｅｔ遺伝子がトランス構成で提供されると逆転写酵素の潜在終結シグナル（ｃｒｙｐｔｉｃ ｓｔｏｐ ｓｉｇｎａｌ）がなくなり、そのため、改変レトロンコンストラクトからの一層長い一本鎖ＤＮＡの生成が可能となる。
【0078】
一部の実施形態において、レトロンコンストラクトは、天然レトロンに対して目的の異種配列を含むように修飾される。これに関連して、レトロンは、種々の適用で用いるために異種配列で改変され得る。例えば、レトロンコンストラクトに異種配列を付加することにより、以下で更に考察するとおりの、目的のタンパク質又は調節性ＲＮＡをコードする核酸、例えば相同組換え修復（ＨＤＲ）又は組換えによって媒介される遺伝子改変（リコンビニアリング）による遺伝子編集での使用に好適なドナーポリヌクレオチド又は分子レコーディングに用いられるＣＲＩＳＰＲプロトスペーサＤＮＡ配列を細胞に提供することができる。かかる異種配列は、例えば、異種配列がレトロン逆転写酵素によってｍｓＤＮＡ産物の一部として転写されるようにｍｓｒ遺伝子又はｍｓｄ遺伝子に挿入され得る。
【0079】
ある場合には、目的の異種配列は、ｍｓｄステムループのループに挿入することができる。
例えば、改変レトロンは、マルチプレックス化を容易にするユニークなバーコードを含み得る。バーコードは、そのバーコードが結び付けられている核酸又は細胞の同定に用いられる１つ以上のヌクレオチド配列を含み得る。かかるバーコードは、例えば、ｍｓｄコードＤＮＡのループ領域内に挿入され得る。バーコードは、３～１０００ヌクレオチド長以上、好ましくは１０～２５０ヌクレオチド長及びより好ましくは１０～３０ヌクレオチド長、例えばこれらの範囲内にある任意の長さを含めて、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００又は１０００ヌクレオチド長などであり得る。一部の実施形態において、バーコードは、レトロンの起源である細胞、コロニー又は試料の位置、例えば細胞アレイ内におけるコロニーの位置、マルチウェルプレート内におけるウェルの位置、ラック内におけるチューブの位置又は研究室内における試料の場所などを同定するためにも使用される（即ち位置的バーコード）。詳細には、バーコードは、レトロンを含有する遺伝子修飾細胞の位置を同定するために使用され得る。バーコードを使用すると、特定のレトロンをその起源であるコロニーに遡ることがなおも可能でありながら、異なる細胞からのレトロンをシーケンシングのための単一の反応混合物中にプールすることが可能となる。
例えば、改変レトロンは、マルチプレックス化を容易にするユニークなバーコードを含み得る。バーコードは、そのバーコードが結び付けられている核酸又は細胞の同定に用いられる１つ以上のヌクレオチド配列を含み得る。かかるバーコードは、例えば、ｍｓｄコードＤＮＡのループ領域内に挿入され得る。バーコードは、３～１０００ヌクレオチド長以上、好ましくは１０～２５０ヌクレオチド長及びより好ましくは１０～３０ヌクレオチド長、例えばこれらの範囲内にある任意の長さを含めて、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００又は１０００ヌクレオチド長などであり得る。一部の実施形態において、バーコードは、レトロンの起源である細胞、コロニー又は試料の位置、例えば細胞アレイ内におけるコロニーの位置、マルチウェルプレート内におけるウェルの位置、ラック内におけるチューブの位置又は研究室内における試料の場所などを同定するためにも使用される（即ち位置的バーコード）。詳細には、バーコードは、レトロンを含有する遺伝子修飾細胞の位置を同定するために使用され得る。バーコードを使用すると、特定のレトロンをその起源であるコロニーに遡ることがなおも可能でありながら、異なる細胞からのレトロンをシーケンシングのための単一の反応混合物中にプールすることが可能となる。
【0080】
加えて、レトロンコンストラクトにアダプター配列を付加すると、ハイスループット増幅又はシーケンシングが容易となり得る。例えば、アダプター配列の対をレトロンコンストラクトの５’末端及び３’末端に付加すると、複数のレトロンコンストラクトを同じ組のプライマーによって同時に増幅又はシーケンシングすることが可能となり得る。レトロンコンストラクトの増幅は、例えば、細胞のトランスフェクション前又はベクターへのライゲーション前に実施され得る。レトロンコンストラクトの増幅には、限定はされないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、等温増幅（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ：ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、転写媒介性増幅（ＴＭＡ：ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ストランド置換増幅（ＳＤＡ：ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）及びリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ：ｌｉｇａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を含めた任意の方法を用いることができる。一実施形態では、レトロンコンストラクトは、共通の５’及び３’プライミング部位を含むため、レトロン配列をユニバーサルプライマーの組で並行して増幅することが可能である。別の実施形態では、選択的プライマーの組を使用して、プールされた混合物から一部のレトロン配列が選択的に増幅される。
【0081】
細胞への改変レトロンの送達は、概して、ベクターを用いて又はベクターなしで達成されることになる。改変レトロン（又はそれを含むベクター）は、細菌、古細菌、真菌、原生生物、植物（例えば、単子葉及び双子葉植物）を含めた原核生物、真核生物又は古細菌生物；及び動物（例えば、脊椎動物及び無脊椎動物）からの任意の細胞を含めた任意の種類の細胞に導入することができる。改変レトロンをトランスフェクトし得る動物の例としては、限定なしに、魚類、鳥類、哺乳類（例えば、ヒト及び非ヒト霊長類、農場動物、ペット及び実験動物）、爬虫類及び両生類などの脊椎動物が挙げられる。改変レトロンをトランスフェクトし得る植物の例としては、限定なしに、コムギ、オートムギ及びコメなどの穀類、ダイズ及びエンドウマメなどのマメ科植物、トウモロコシ、アルファルファなどの草及び綿を含めた作物が挙げられる。改変レトロンは、目的の単一細胞又は細胞集団に導入され得る。組織、臓器及び生検からの細胞並びに組換え細胞、遺伝子修飾細胞、インビトロ培養された細胞株からの細胞及び人工細胞（例えば、核酸を封入するナノ粒子、リポソーム、ポリマーソーム又はマイクロカプセル）は全て、改変レトロンをトランスフェクトし得る。主題の方法は、細胞断片、細胞成分又は細胞小器官（例えば、動物及び植物細胞のミトコンドリア、植物細胞及び藻類のプラスチド（例えば、葉緑体））にも適用可能である。細胞は、改変レトロンコンストラクトのトランスフェクション後に培養又は拡大され（ｅｘｐａｎｄｅｄ）得る。
【0082】
核酸を宿主細胞に導入する方法は、当技術分野において周知である。一般的に用いられる方法としては、典型的には、二価カチオン（例えば、ＣａＣｌ２）を用いた、化学的に誘発される形質転換、デキストラン媒介性トランスフェクション、ポリブレン媒介性トランスフェクション、リポフェクタミン及びＬＴ－１媒介性トランスフェクション、電気穿孔、プロトプラスト融合、リポソームへの核酸の封入及び核内への改変レトロンを含む核酸の直接的なマイクロインジェクションが挙げられる。例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら著、２００１年、「分子クローニング、実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）」、第３版、コールド・スプリング・ハーバ研究所（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ニューヨーク州（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、デイビス（Ｄａｖｉｓ）ら著、１９９５年、「分子生物学の基本的方法（Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、第２版、マグローヒル（ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ）及びチュー（Ｃｈｕ）ら著、１９８１年、ジーン（Ｇｅｎｅ）、第１３巻、ｐ．１９７（全体として参照により本明細書に援用される）を参照されたい。
【0083】
改変レトロンを含むベクターシステム
特定の実施形態において、レトロンｍｓｒ遺伝子、ｍｓｄ遺伝子及びｒｅｔ遺伝子は、細胞内でベクターからインビボで発現させる。「ベクター」は、細胞の内部への目的の核酸の送達に使用することのできる組成物である。レトロンｍｓｒ遺伝子、ｍｓｄ遺伝子及びｒｅｔ遺伝子は、宿主対象においてｍｓＤＮＡを産生させるため、単一のベクター又は複数の別個のベクターで細胞内に導入することができる。ベクターは、典型的には、レトロン配列に作動可能に連結された制御エレメントを含み、これにより対象種におけるインビボでのｍｓＤＮＡの産生が可能となる。例えば、レトロンｍｓｒ遺伝子、ｍｓｄ遺伝子及びｒｅｔ遺伝子は、レトロン逆転写酵素及びｍｓＤＮＡ産物の発現を可能にするため、プロモータに作動可能に連結され得る。一部の実施形態において、所望の目的産物をコードする異種配列（例えば、ポリペプチド又は調節性ＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、遺伝子編集のためのドナーポリヌクレオチド又は分子レコーディングのためのプロトスペーサＤＮＡ）は、ｍｓｒ遺伝子又はｍｓｄ遺伝子に挿入され得る。ｍｓＤＮＡの産生には、改変レトロン配列を含むベクターのトランスフェクト能を有する任意の真核、古細菌又は原核細胞を使用することができる。他のレトロンがコードされた産物と共にｍｓＤＮＡを産生するコンストラクトの能力は、実験的に決定することができる。
特定の実施形態において、レトロンｍｓｒ遺伝子、ｍｓｄ遺伝子及びｒｅｔ遺伝子は、細胞内でベクターからインビボで発現させる。「ベクター」は、細胞の内部への目的の核酸の送達に使用することのできる組成物である。レトロンｍｓｒ遺伝子、ｍｓｄ遺伝子及びｒｅｔ遺伝子は、宿主対象においてｍｓＤＮＡを産生させるため、単一のベクター又は複数の別個のベクターで細胞内に導入することができる。ベクターは、典型的には、レトロン配列に作動可能に連結された制御エレメントを含み、これにより対象種におけるインビボでのｍｓＤＮＡの産生が可能となる。例えば、レトロンｍｓｒ遺伝子、ｍｓｄ遺伝子及びｒｅｔ遺伝子は、レトロン逆転写酵素及びｍｓＤＮＡ産物の発現を可能にするため、プロモータに作動可能に連結され得る。一部の実施形態において、所望の目的産物をコードする異種配列（例えば、ポリペプチド又は調節性ＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、遺伝子編集のためのドナーポリヌクレオチド又は分子レコーディングのためのプロトスペーサＤＮＡ）は、ｍｓｒ遺伝子又はｍｓｄ遺伝子に挿入され得る。ｍｓＤＮＡの産生には、改変レトロン配列を含むベクターのトランスフェクト能を有する任意の真核、古細菌又は原核細胞を使用することができる。他のレトロンがコードされた産物と共にｍｓＤＮＡを産生するコンストラクトの能力は、実験的に決定することができる。
【0084】
一部の実施形態において、改変レトロンは、１つ以上のベクターを含むベクターシステムによって産生される。ベクターシステムでは、ｍｓｒ遺伝子、ｍｓｄ遺伝子及びｒｅｔ遺伝子が同じベクターによって提供され得（即ち全てのかかるレトロンエレメントがシス構成である）、ベクターは、ｍｓｒ遺伝子及びｍｓｄ遺伝子に作動可能に連結されたプロモータを含む。一部の実施形態において、このプロモータは、ｒｅｔ遺伝子に更に作動可能に連結される。他の実施形態において、ベクターは、ｒｅｔ遺伝子に作動可能に連結された第２のプロモータを更に含む。代わりに、ｒｅｔ遺伝子は、ｍｓｒ遺伝子及びｍｓｄ遺伝子を含まない第２のベクターによって提供され得る（即ちｍｓｒ－ｍｓｄ及びｒｅｔがトランス構成である）。更に他の実施形態において、ｍｓｒ遺伝子、ｍｓｄ遺伝子及びｒｅｔ遺伝子は、各々が異なるベクターによって提供される（即ち全てのレトロンエレメントがトランス構成である）。限定はされないが、線状ポリヌクレオチド、イオン化合物又は両親媒性化合物に関連するポリヌクレオチド、プラスミド及びウイルスを含めて、多くのベクターが利用可能である。従って、用語「ベクター」には、自己複製プラスミド又はウイルスが含まれる。ウイルスベクターの例としては、限定はされないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられる。発現コンストラクトは、生細胞内で複製することができるか、又はそれは、合成的に作成することができる。本願の目的上、用語「発現コンストラクト（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）」、「発現ベクター」及び「ベクター」は、一般化した例示的な意味で本発明の適用を実証するために同義的に使用され、本発明を限定することを意図されない。
【0085】
特定の実施形態において、改変レトロン配列を含む核酸は、プロモータの転写制御下にある。「プロモータ」は、遺伝子の特異的転写の開始に必要である、細胞の合成機構又は導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列を指す。用語のプロモータは、ここで、ＲＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩ又はＩＩＩの開始部位の周りにクラスター化する一群の転写制御モジュールを指して使用されることになる。哺乳類細胞発現に典型的なプロモータとしては、とりわけ、ＳＶ４０初期プロモータ、ＣＭＶ前初期プロモータなどのＣＭＶプロモータ（米国特許第５，１６８，０６２号明細書及び同第５，３８５，８３９号明細書（全体として参照により本明細書に援用される）を参照されたい）、マウス乳癌ウイルスＬＴＲプロモータ、アデノウイルス主要後期プロモータ（Ａｄ ＭＬＰ）及び単純ヘルペスウイルスプロモータが挙げられる。マウスメタロチオネイン遺伝子に由来するプロモータなど、他の非ウイルスプロモータも哺乳類発現への用途が見出されることになる。これらのプロモータ及び他のプロモータは、市販のプラスミドから、当技術分野において周知の技法を用いて入手することができる。例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら著、前掲を参照されたい。プロモータに関連してエンハンサーエレメントを使用すると、コンストラクトの発現レベルが増加し得る。例としては、ダイケマ（Ｄｉｊｋｅｍａ）ら著、欧州分子生物学機構ジャーナル（ＥＭＢＯ Ｊ．）、１９８５年、第４巻、ｐ．７６１に記載されるとおりのＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー、ゴーマン（Ｇｏｒｍａｎ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、１９８２ｂ年、第７９巻、ｐ．６７７７に記載されるとおりのラウス肉腫ウイルスの長末端反復配列（ＬＴＲ）に由来するエンハンサー／プロモータ及びＣＭＶイントロンＡ配列に含まれるエレメントなど、ボシャート（Ｂｏｓｈａｒｔ）ら著、セル（Ｃｅｌｌ）、１９８５年、第４１巻、ｐ．５２１に記載されるとおりのヒトＣＭＶに由来するエレメントが挙げられる。
【0086】
一実施形態において、ｍｓｒ遺伝子、ｍｓｄ遺伝子及びｒｅｔ遺伝子を含む改変レトロンを発現させるための発現ベクターは、ｍｓｒ遺伝子、ｍｓｄ遺伝子及びｒｅｔ遺伝子をコードするポリヌクレオチドに「作動可能に連結されている」プロモータを含む。語句「作動可能に連結されている」又は「転写制御下にある」は、本明細書で使用されるとき、プロモータがポリヌクレオチドに対して、ＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始並びにｍｓｒ遺伝子、ｍｓｄ遺伝子及びｒｅｔ遺伝子の発現を制御するのに正しい位置及び向きにあることを意味する。
【0087】
典型的には、発現コンストラクトには、転写ターミネータ／ポリアデニル化シグナルも存在することになる。かかる配列の例としては、限定はされないが、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら著、前掲に記載されるとおりのＳＶ４０に由来するもの並びにウシ成長ホルモンターミネータ配列が挙げられる（例えば、米国特許第５，１２２，４５８号明細書を参照されたい）。加えて、コード配列に隣接して、その発現を亢進させるために５’－ＵＴＲ配列が置かれ得る。かかる配列には、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ：ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）を含むＵＴＲが含まれ得る。
【0088】
ＩＲＥＳを含めると、ベクターからの１つ以上のオープンリーディングフレームの翻訳が可能となる。ＩＲＥＳエレメントは、真核生物リボソーム翻訳開始複合体を引き付けて翻訳開始を促進する。例えば、カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎ）ら著、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）、１９９１年、第１９巻、ｐ．４４８５～４４９０；グルトゥ（Ｇｕｒｔｕ）ら著、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．）、１９９６年、第２２９巻、ｐ．２９５～２９８；リース（Ｒｅｅｓ）ら著、バイオテクニクス（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、１９９６年、第２０巻、ｐ．１０２～１１０；コバヤシ（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ）ら著、バイオテクニクス（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、１９９６年、第２１巻、ｐ．３９９～４０２；及びモッサー（Ｍｏｓｓｅｒ）ら著、バイオテクニクス（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）（１９９７年、第２２巻、ｐ．１５０～１６１を参照されたい。多数のＩＲＥＳ配列が公知であり、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）ＵＴＲなどのピコルナウイルスのリーダ配列からのもの（ジャン（Ｊａｎｇ）ら著、ジャーナル・オブ・ヴィロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）、１９８９年、第６３巻、ｐ．１６５１～１６６０）、ポリオリーダ配列、Ａ型肝炎ウイルスリーダ、Ｃ型肝炎ウイルスＩＲＥＳ、ヒトライノウイルス２型ＩＲＥＳ（ドブリコバ（Ｄｏｂｒｉｋｏｖａ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、２００３年、第１００巻、第２５号、ｐ．１５１２５～１５１３０）、口蹄疫ウイルスからのＩＲＥＳエレメント（ラメッシュ（Ｒａｍｅｓｈ）ら著、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．）、１９９６年、第２４巻、ｐ．２６９７～２７００）、ジアルジアウイルスＩＲＥＳ（ガルラパティ（Ｇａｒｌａｐａｔｉ）ら著、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２００４年、第２７９巻、第５号、ｐ．３３８９～３３９７）など、幅広い種類のウイルスに由来する配列が挙げられる。種々の非ウイルス性ＩＲＥＳ配列も、限定はされないが、酵母のＩＲＥＳ配列並びにヒトアンジオテンシンＩＩ １型受容体ＩＲＥＳ（マーティン（Ｍａｒｔｉｎ）ら著、モレキュラー・アンド・セルラー・エンドクリノロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．）、２００３年、第２１２巻、ｐ．５１～６１）、線維芽細胞成長因子ＩＲＥＳ（ＦＧＦ－１ ＩＲＥＳ及びＦＧＦ－２ ＩＲＥＳ、マーティノ（Ｍａｒｔｉｎｅａｕ）ら著、２００４年、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）、第２４巻、第１７号、ｐ．７６２２～７６３５）、血管内皮成長因子ＩＲＥＳ（バラニック（Ｂａｒａｎｉｃｋ）ら著、２００８年、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）、第１０５巻、第１２号、ｐ．４７３３～４７３８、スタイン（Ｓｔｅｉｎ）ら著、１９９８年、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）、第１８巻、第６号、ｐ．３１１２～３１１９、バート（Ｂｅｒｔ）ら著、２００６年、ＲＮＡ、第１２巻、第６号、ｐ．１０７４～１０８３）及びインスリン様成長因子２ ＩＲＥＳ（ペダーセン（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ）ら著、２００２年、バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．）、第３６３巻、第１部、ｐ．３７～４４）を含め、本明細書での用途が見出され得る。これらのエレメントは、例えば、クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（カリフォルニア州マウンテンビュー（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ））、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）（カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））、アドジェン（Ａｄｄｇｅｎｅ）（マサチューセッツ州ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ））及びジェンコピア（ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ）（メリーランド州ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ））によって販売されているプラスミド中に容易に商業的に入手可能である。ＩＲＥＳｉｔｅ：実験的に検証されたＩＲＥＳ構造のデータベース（ｉｒｅｓｉｔｅ．ｏｒｇ）も参照されたい。ベクターにＩＲＥＳ配列を含めることにより、発現カセットからレトロン逆転写酵素と組み合わせて、例えばリコンビニアリングのための複数のバクテリオファージ組換えタンパク質又はＨＤＲのためのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）を発現させることができる。
【0089】
代わりに、ウイルスＴ２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用すると、単一のベクターから複数のタンパク質産物（例えば、Ｃａｓ９、バクテリオファージ組換えタンパク質、レトロン逆転写酵素）を産生することが可能となる。多シストロン性コンストラクトのコード配列間に１つ以上の２Ａリンカーペプチドを挿入することができる。自己切断性である２Ａペプチドは、多シストロン性コンストラクトからの共発現するタンパク質の等モルレベルでの産生を可能にする。様々なウイルスからの２Ａペプチドを使用することができ、限定はされないが、口蹄疫ウイルス、ウマ鼻炎Ａウイルス、トセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）ウイルス及びブタテッショウウイルス－１に由来する２Ａペプチドが挙げられる。例えば、キム（Ｋｉｍ）ら著、２０１１年、プロス・ワン（ＰＬｏＳ Ｏｎｅ）、第６巻、第４号、ｐ．ｅ１８５５６、トリチャス（Ｔｒｉｃｈａｓ）ら著、２００８年、ＢＭＣバイオロジー（ＢＭＣ Ｂｉｏｌ．）、第６巻、ｐ．４０、プロボスト（Ｐｒｏｖｏｓｔ）ら著、２００７年、ジェネシス（Ｇｅｎｅｓｉｓ）、第４５巻、第１０号、ｐ．６２５～６２９、ファーラ（Ｆｕｒｌｅｒ）ら著、２００１年、ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．）、第８巻、第１１号、ｐ．８６４～８７３（全体として参照により本明細書に援用される）を参照されたい。
【0090】
特定の実施形態において、発現コンストラクトは、細菌宿主の形質転換に好適なプラスミドを含む。多くの細菌発現ベクターが当業者に公知であり、適切なベクターの選択は、好みの問題である。細菌発現ベクターとしては、限定はされないが、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＳＫ７５、ｐＢＡＤ、ｐＢＡＤＭ、ｐＢＡＴ、ｐＣａｌ、ｐＥＴ、ｐＥＴＭ、ｐＧＡＴ、ｐＧＥＸ、ｐＨＡＴ、ｐＫＫ２２３、ｐＭａｌ、ｐＰｒｏＥｘ、ｐＱＥ及びｐＺＡ３１が挙げられる。細菌プラスミドは、抗生物質選択マーカ（例えば、アンピシリン、カナマイシン、エリスロマイシン、カルベニシリン、ストレプトマイシン又はテトラサイクリン耐性）、ｌａｃＺ遺伝子（β－ガラクトシダーゼはｘ－ｇａｌ基質から青色色素を発する）、蛍光マーカ（例えば、ＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ）又は形質転換された細菌を選択するための他のマーカを含有し得る。例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら著、前掲を参照されたい。
【0091】
他の実施形態において、発現コンストラクトは、酵母細胞の形質転換に好適なプラスミドを含む。酵母発現プラスミドは、典型的には、酵母特異的複製起点（ＯＲＩ：ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）及び栄養選択マーカ（例えば、ＨＩＳ３、ＵＲＡ３、ＬＹＳ２、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＭＥＴ１５、ｕｒａ４＋、ｌｅｕ１＋、ａｄｅ６＋）、抗生物質選択マーカ（例えば、カナマイシン耐性）、蛍光マーカ（例えば、ｍＣｈｅｒｒｙ）又は形質転換された酵母細胞を選択するための他のマーカを含有し得る。酵母プラスミドは、細菌宿主（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））と酵母細胞との間のシャトル輸送を可能にする成分を更に含有し得る。ＯＲＩを欠いた、相同組換えによって宿主染色体に組み込まれる酵母組込みプラスミド（ＹＩｐ：ｙｅａｓｔ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄ）；自己複製配列（ＡＲＳ：ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｌｙ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含有し、独立して複製することができる酵母複製プラスミド（ＹＲｐ：ｙｅａｓｔ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄ）；ＡＲＳの一部とセントロメア配列（ＣＥＮ：ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の一部とを含有する低コピーベクターである酵母セントロメアプラスミド（ＹＣｐ：ｙｅａｓｔ ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅ ｐｌａｓｍｉｄ）；及び１細胞当たり５０コピー以上の安定した増殖を可能にする２ミクロン環（天然酵母プラスミド）からの断片を含む高コピー数プラスミドである酵母エピソームプラスミド（ＹＥｐ：ｙｅａｓｔ ｅｐｉｓｏｍａｌ ｐｌａｓｍｉｄ）を含め、多くの異なる種類の酵母プラスミドが利用可能である。
【0092】
他の実施形態において、発現コンストラクトは、ウイルスコンストラクト又はウイルスゲノムに由来する改変コンストラクトを含む。哺乳類細胞への遺伝子移入のために、幾つものウイルスベースのシステムが開発されている。それらとしては、アデノウイルス、レトロウイルス（γ－レトロウイルス及びレンチウイルス）、ポックスウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウイルス及び単純ヘルペスウイルスが挙げられる（例えば、ウォーノック（Ｗａｒｎｏｃｋ）ら著、２０１１年、メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、第７３７巻、ｐ．１～２５；ワルサー（Ｗａｌｔｈｅｒ）ら著、２０００年、ドラッグズ（Ｄｒｕｇｓ）、第６０巻、第２号、ｐ．２４９～２７１；及びランドストローム（Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ）著、２００３年、トレンズ・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、第２１巻、第３号、ｐ．１１７～１２２（全体として参照により本明細書に援用される）を参照されたい）。特定のウイルスは、その受容体介在性エンドサイトーシスによって細胞に侵入する能力、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、ウイルス遺伝子を安定且つ効率的に発現する能力により、外来性遺伝子を哺乳類細胞に移入させるための魅力的な候補となっている。
【0093】
例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達システムに好都合なプラットフォームを提供する。当技術分野において公知の技法を用いて選択の配列をベクターに挿入し、レトロウイルス粒子にパッケージングすることができる。次に、この組換えウイルスを単離し、対象の細胞にインビボ又はエキソビボのいずれでも送達することができる。幾つものレトロウイルスシステムが記載されている（米国特許第５，２１９，７４０号明細書；ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）及びロズマン（Ｒｏｓｍａｎ）著、１９８９年、バイオテクニクス（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、第７巻、ｐ．９８０～９９０；ミラー，Ａ．Ｄ．（Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．）著、１９９０年、ヒューマン・ジーン・セラピー（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ）、第１巻、ｐ．５～１４；スカルパ（Ｓｃａｒｐａ）ら著、１９９１年、ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、第１８０巻、ｐ．８４９～８５２；バーンズ（Ｂｕｒｎｓ）ら著、１９９３年、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第９０巻、ｐ．８０３３～８０３７；ボリス・ローリ（Ｂｏｒｉｓ－Ｌａｗｒｉｅ）及びテミン（Ｔｅｍｉｎ）著、１９９３年、カレント・オピニオン・イン・ジェネティクス・アンド・デベロップメント（Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．）、第３巻、ｐ．１０２～１０９；及びフェリー（Ｆｅｒｒｙ）ら著、２０１１年、カレント・ファーマシューティカル・デザイン（Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．）、第１７巻、第２４号、ｐ．２５１６～２５２７）。レンチウイルスは、分裂細胞及び非分裂細胞の両方に感染可能であるため、ポリヌクレオチドを哺乳類細胞に送達するのに特に有用なクラスのレトロウイルスである（例えば、ロイス（Ｌｏｉｓ）ら著、２００２年、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２９５巻、ｐ．８６８～８７２；デュランド（Ｄｕｒａｎｄ）ら著、２０１１年、ウイルスィーズ（Ｖｉｒｕｓｅｓ）、第３巻、第２号、ｐ．１３２～１５９（本明細書において参照により援用される）を参照されたい）。
【0094】
幾つものアデノウイルスベクターも記載されている。宿主ゲノムに組み込まれるレトロウイルスと異なり、アデノウイルスは、染色体外に残り続けるため、挿入突然変異誘発に関連するリスクが最小限となる（ハジ－アフマッド（Ｈａｊ－Ａｈｍａｄ）及びグラハム（Ｇｒａｈａｍ）、ジャーナル・オブ・ヴィロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）、１９８６年、第５７巻、ｐ．２６７～２７４；ベット（Ｂｅｔｔ）ら著、ジャーナル・オブ・ヴィロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）、１９９３年、第６７巻、ｐ．５９１１～５９２１；ミッテレーダ（Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒ）ら著、ヒューマン・ジーン・セラピー（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ）、１９９４年、第５巻、ｐ．７１７～７２９；セス（Ｓｅｔｈ）ら著、ジャーナル・オブ・ヴィロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）、１９９４年、第６８巻、ｐ．９３３～９４０；バー（Ｂａｒｒ）ら著、ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ）、１９９４年、第１巻、ｐ．５１～５８；ベルクネル，Ｋ．Ｌ．（Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．）著、バイオテクニクス（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、１９８８年、第６巻、ｐ．６１６～６２９；及びリッチ（Ｒｉｃｈ）ら著、ヒューマン・ジーン・セラピー（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ）、１９９３年、第４巻、ｐ．４６１～４７６）。加えて、遺伝子送達のために、様々なアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ：ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）ベクターシステムが開発されている。ＡＡＶベクターは、当技術分野において周知の技法を用いて容易に構築することができる。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号明細書及び同第５，１３９，９４１号明細書；国際公開第９２／０１０７０号パンフレット（１９９２年１月２３日公開）及び同第９３／０３７６９号パンフレット（１９９３年３月４日公開）；レブコフスキー（Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ）ら著、モレキュラー・アンド：セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）、１９８８年、第８巻、ｐ．３９８８～３９９６；ビンセント（Ｖｉｎｃｅｎｔ）ら著、ワクシーンズ９０（Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９０）、１９９０年、コールド・スプリング・ハーバ研究所出版局（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；カータ，Ｂ．Ｊ．（Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．）著、カレント・オピニオン・イン・バイオテクノロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１９９２年、第３巻、ｐ．５３３～５３９；ムジツカ，Ｎ．（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．）著、カレント・トピックス・イン・マイクロバイオロジー・アンド・イムノロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、１９９２年、第１５８巻、ｐ．９７～１２９；コチン，Ｒ．Ｍ．（Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．）著、ヒューマン・ジーン・セラピー（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ）、１９９４年、第５巻、ｐ．７９３～８０１；シェリング（Ｓｈｅｌｌｉｎｇ）及びスミス（Ｓｍｉｔｈ）著、ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ）、１９９４年、第１巻、ｐ．１６５～１６９；及びチョウ（Ｚｈｏｕ）ら著、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．）、１９９４年、第１７９巻、ｐ．１８６７～１８７５を参照されたい。
【0095】
改変レトロンをコードする核酸の送達に有用な別のベクターシステムは、スモール・ジュニア，Ｐ．Ａ．（Ｓｍａｌｌ，Ｊｒ．，Ｐ．Ａ．）ら（米国特許第５，６７６，９５０号明細書、１９９７年１０月１４日発行、本明細書において参照により援用される）によって記載される経腸的に投与される組換えポックスウイルスワクチンである。
【0096】
目的の核酸分子の送達に用途が見出されるであろう別のウイルスベクターとしては、ワクシニアウイルス及びトリポックスウイルスを含めた、ポックスウイルスファミリーに由来するものが挙げられる。例として、目的の核酸分子（例えば、改変レトロン）を発現するワクシニアウイルス組換え体は、以下のとおり構築することができる。初めに、特定の核酸配列をコードするＤＮＡを、それがワクシニアプロモータ及びチミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードする配列などのフランキングワクシニアＤＮＡ配列に隣接するように適切なベクターに挿入する。次に、このベクターを使用して細胞をトランスフェクトし、同時に細胞をワクシニアに感染させる。相同組換えは、ワクシニアプロモータ＋目的の配列をコードする遺伝子をウイルスゲノムに挿入する役割を果たす。得られたＴＫ組換え体は、５－ブロモデオキシウリジンの存在下で細胞を培養し、それに耐性のあるウイルスプラークをピッキングすることによって選択できる。
【0097】
代わりに、鶏痘及びカナリア痘ウイルスなどのアビポックスウイルスも目的の核酸分子の送達に使用することができる。アビポックス属のメンバーは、感受性のある鳥類種においてのみ増殖的に複製することができ、従って哺乳類細胞では感染性を有しないため、アビポックスベクターの使用は、ヒト及び他の哺乳類種において特に望ましい。組換えアビポックスウイルスの作製方法は、当技術分野において公知であり、上記にワクシニアウイルスの作製に関して記載されるとおり、遺伝子組換えを用いる。例えば、国際公開第９１／１２８８２号パンフレット；国際公開第８９／０３４２９号パンフレット；及び国際公開第９２／０３５４５号パンフレットを参照されたい。
【0098】
マイケル（Ｍｉｃｈａｅｌ）ら著、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、１９９３年、第２６８巻、ｐ．６８６６～６８６９及びワグナー（Ｗａｇｎｅｒ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、１９９２年、第８９巻、ｐ．６０９９～６１０３に記載されるアデノウイルスキメラベクターなど、分子コンジュゲートベクターも遺伝子送達に使用することができる。
【0099】
限定はされないが、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）及びベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）に由来するベクターなど、アルファウイルス属のメンバーも本発明のポリヌクレオチドを送達するためのウイルスベクターとしての用途が見出されるであろう。本方法の実施に有用なシンドビスウイルス由来のベクターの説明については、ドゥベンスキー（Ｄｕｂｅｎｓｋｙ）ら著、１９９６年、ジャーナル・オブ・ヴィロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）、第７０巻、ｐ．５０８～５１９；及び国際公開第９５／０７９９５号パンフレット、同第９６／１７０７２号パンフレット；並びにドゥベンスキー・ジュニア，Ｔ．Ｗ．（Ｄｕｂｅｎｓｋｙ，Ｊｒ．，Ｔ．Ｗ．）ら著、米国特許第５，８４３，７２３号明細書、１９９８年１２月１日発行及びドゥベンスキー・ジュニア，Ｔ．Ｗ．（Ｄｕｂｅｎｓｋｙ，Ｊｒ．，Ｔ．Ｗ．）著、米国特許第５，７８９，２４５号明細書、１９９８年８月４日発行（両方とも本明細書において参照により援用される）を参照されたい。特に好ましいのは、シンドビスウイルス及びベネズエラウマ脳炎ウイルスに由来する配列を含むキメラアルファウイルスベクターである。例えば、ペリー（Ｐｅｒｒｉ）ら著、２００３年、ジャーナル・オブ・ヴィロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）、第７７巻、ｐ．１０３９４～１０４０３並びに国際公開第０２／０９９０３５号パンフレット、同第０２／０８０９８２号パンフレット、同第０１／８１６０９号パンフレット及び同第００／６１７７２号パンフレット（全体として参照により本明細書に援用される）を参照されたい。
【0100】
好都合には、ワクシニアベースの感染／トランスフェクションシステムを使用して、宿主細胞における目的の核酸（例えば、改変レトロン）の誘導性の一過性発現をもたらすことができる。このシステムでは、初めにバクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードするワクシニアウイルス組換え体にインビトロで細胞を感染させる。このポリメラーゼは、Ｔ７プロモータを担持する鋳型のみを転写する点で精巧な特異性を呈する。感染後、Ｔ７プロモータによってドライブされる目的の核酸を細胞にトランスフェクトする。細胞質においてワクシニアウイルス組換え体から発現したポリメラーゼがトランスフェクトＤＮＡをＲＮＡに転写する。この方法は、細胞質における高度な一過性の多量のＲＮＡ産生をもたらす。例えば、エルロイ・スタイン（Ｅｌｒｏｙ－Ｓｔｅｉｎ）及びモス（Ｍｏｓｓ）著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、１９９０年、第８７巻、ｐ．６７４３～６７４７；フュアースト（Ｆｕｅｒｓｔ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、１９８６年、第８３巻、ｐ．８１２２～８１２６を参照されたい。
【0101】
ワクシニア若しくはアビポックスウイルス組換え体を感染させる代替的な手法又は他のウイルスベクターを用いて核酸を送達する代替的な手法として、宿主細胞への導入後に高度な発現につながるであろう増幅システムを使用することができる。具体的には、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのコード領域の前にあるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモータを改変することができる。この鋳型に由来するＲＮＡが翻訳されると、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼが生じることになり、次にそれがより多くの鋳型を転写することになる。付随して、発現がＴ７プロモータの制御下にあるｃＤＮＡがあることになる。従って、増幅鋳型ＲＮＡの翻訳によって生じたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの一部が所望の遺伝子の転写につながることになる。一部のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼは、増幅の開始に必要であるため、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、転写反応をプライミングする１つ又は複数の鋳型と共に細胞に導入することができる。ポリメラーゼは、タンパク質として又はＲＮＡポリメラーゼをコードするプラスミド上に導入することができる。Ｔ７システム及び細胞の形質転換へのその使用の更なる考察については、例えば、国際公開第９４／２６９１１号パンフレット；スチュディアー（Ｓｔｕｄｉｅｒ）及びモファット（Ｍｏｆｆａｔｔ）著、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、１９８６年、第１８９巻、ｐ．１１３～１３０；デング（Ｄｅｎｇ）及びウォルフ（Ｗｏｌｆｆ）著、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１９９４年、第１４３巻、ｐ．２４５～２４９；ガオ（Ｇａｏ）ら著、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．）、１９９４年、第２００巻、ｐ．１２０１～１２０６；ガオ（Ｇａｏ）及びファン（Ｈｕａｎｇ）著、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）、１９９３年、第２１巻、ｐ．２８６７～２８７２；チェン（Ｃｈｅｎ）ら著、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）、１９９４年、第２２巻、ｐ．２１１４～２１２０；及び米国特許第５，１３５，８５５号明細書を参照されたい。
【0102】
バキュロウイルスシステムなどの昆虫細胞発現システムも使用することができ、当業者に公知であり、例えば「バキュロウイルス及び昆虫細胞発現プロトコル（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）」（メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｄ．Ｗ．ムーハンマ（Ｄ．Ｗ．Ｍｕｒｈａｍｍｅｒ）編、ヒューマナ・プレス（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）、第２版、２００７年）及びＬ．キング（Ｌ．Ｋｉｎｇ）著、「バキュロウイルス発現システム：実験室ガイド（Ｔｈｅ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｇｕｉｄｅ）」（シュプリンガー（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）、１９９２年）に記載されている。バキュロウイルス／昆虫細胞発現システムのための材料及び方法は、とりわけ、サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（マサチューセッツ州ウォルサム（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））及びクロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（カリフォルニア州マウンテンビュー（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ））からキット形態で市販されている。
【0103】
植物発現システムも植物細胞の形質転換に使用することができる。概して、かかるシステムは、ウイルスベースのベクターを使用して植物細胞に異種遺伝子をトランスフェクトする。かかるシステムの説明については、例えば、ポルタ（Ｐｏｒｔａ）ら著、モレキュラー・バイオテクノロジー（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．）、１９９６年、第５巻、ｐ．２０９～２２１；及びハックランド（Ｈａｃｋｌａｎｄ）ら著、アーカイブズ・オブ・ヴィロロジー（Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．）、１９９４年、第１３９巻、ｐ．１～２２を参照されたい。
【0104】
改変レトロンコンストラクトの発現を生じさせるために、発現コンストラクトを細胞内に送達しなければならない。この送達は、細胞株を形質転換する際の実験室手順において見られるように、インビトロで達成され得るか、又はある種の疾患状態の治療において見られるように、インビボ又はエキソビボで達成され得る。１つの送達機構は、ウイルス感染によるものであり、ここで、発現コンストラクトは、感染性ウイルス粒子に封入される。
【0105】
発現コンストラクトを培養細胞に移入させるための幾つかの非ウイルス方法も企図される。それらとしては、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラン、電気穿孔、ダイレクトマイクロインジェクション、ＤＮＡ負荷リポソーム、リポフェクタミン－ＤＮＡ複合体、細胞超音波処理、高速マイクロプロジェクタイルを用いる遺伝子銃及び受容体介在性トランスフェクションの使用が挙げられる（例えば、グラハム（Ｇｒａｈａｍ）及びファン・デル・エブ（Ｖａｎ Ｄｅｒ Ｅｂ）著、１９７３年、ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、第５２巻、ｐ．４５６～４６７；チェン（Ｃｈｅｎ）及びオカヤマ（Ｏｋａｙａｍａ）著、１９８７年、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．）、第７巻、ｐ．２７４５～２７５２；リップ（Ｒｉｐｐｅ）ら著、１９９０年、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．）、第１０巻、ｐ．６８９～６９５；ゴパール（Ｇｏｐａｌ）著、１９８５年、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．）、第５巻、ｐ．１１８８～１１９０；ターカスパ（Ｔｕｒ－Ｋａｓｐａ）ら著、１９８６年、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）、第６巻、ｐ．７１６～７１８；ポッター（Ｐｏｔｔｅｒ）ら著、１９８４年、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第８１巻、ｐ．７１６１～７１６５）；ハーランド（Ｈａｒｌａｎｄ）及びワイントラウブ（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ）著、１９８５年、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．）、第１０１巻、ｐ．１０９４～１０９９）；ニコラウ（Ｎｉｃｏｌａｕ）及びセネ（Ｓｅｎｅ）著、１９８２年、バイオキミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ）、第７２１巻、ｐ．１８５～１９０；フレーリ（Ｆｒａｌｅｙ）ら著、１９７９年、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第７６巻、ｐ．３３４８～３３５２；フェヒヘイマー（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒ）ら著、１９８７年、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第８４巻、ｐ．８４６３～８４６７；ヤン（Ｙａｎｇ）ら著、１９９０年、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第８７巻、ｐ．９５６８～９５７２；ウー（Ｗｕ）及びウー（Ｗｕ）著、１９８７年、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、第２６２巻、ｐ．４４２９～４４３２；ウー（Ｗｕ）及びウー（Ｗｕ）著、１９８８年、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２７巻、ｐ．８８７～８９２（本明細書において参照により援用される）を参照されたい）。これらの技法の一部は、インビボ又はエキソビボ用途に問題なく適合させることができる。
【0106】
発現コンストラクトが細胞内に送達されると、改変レトロン配列を含む核酸が種々の部位に置かれ、発現し得る。特定の実施形態において、改変レトロン配列を含む核酸は、細胞のゲノムに安定に組み込まれ得る。この組込みは、相同組換え（遺伝子置換）でコグネイトな（ｃｏｇｎａｔｅ）位置及び向きであり得るか、又はこれは、ランダムな非特異的な位置に組み込まれ得る（遺伝子の増大）。更に別の実施形態において、核酸は、ＤＮＡの別個のエピソームセグメントとして細胞に安定に維持され得る。かかる核酸セグメント又は「エピソーム」は、宿主細胞周期と独立して又はそれと同期して維持及び複製を可能にするのに十分な配列をコードする。発現コンストラクトがどのように細胞に送達されるか及び細胞のいずれの箇所に核酸が残るかは、利用される発現コンストラクトの種類に依存する。
【0107】
更に別の実施形態において、発現コンストラクトは、単純に、改変レトロンを含むネイキッドの組換えＤＮＡ又はプラスミドからなり得る。コンストラクトの移入は、細胞膜を物理的又は化学的に透過処理する上述の方法のいずれかによって実施され得る。これは、特にインビトロでの移入に適用可能であるが、これは、インビボ使用にも同様に適用され得る。ドゥベンスキー（Ｄｕｂｅｎｓｋｙ）ら（米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、１９８４年、第８１巻、ｐ．７５２９～７５３３）は、活動性のウイルス複製及び急性感染症を示す成体及び新生児マウスの肝臓及び脾臓にポリオーマウイルスＤＮＡをリン酸カルシウム沈殿物の形態で注入することに成功した。ベンベニスティー（Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ）及びネシフ（Ｎｅｓｈｉｆ）（米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、１９８６年、第８３巻、ｐ．９５５１～９５５５）も、リン酸カルシウム沈殿させたプラスミドの直接的な腹腔内注射により、トランスフェクトした遺伝子の発現が得られることを実証した。目的の改変レトロンをコードするＤＮＡも同様の方法においてインビボで移入し、レトロン産物を発現させ得ることが想定される。
【0108】
なおも別の実施形態では、ネイキッドＤＮＡ発現コンストラクトをパーティクルボンバードメントによって細胞に移入し得る。この方法は、ＤＮＡをコートしたマイクロプロジェクタイルを高速に加速させることにより、それを細胞膜に貫通させて、細胞を殺傷することなく細胞に侵入させる能力に依存する（クライン（Ｋｌｅｉｎ）ら著、１９８７年、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３２７巻、ｐ．７０～７３）。小粒子を加速させるための幾つかの装置が開発されている。１つのかかる装置は、高電圧放電によって電流を生じさせ、それが次に原動力をもたらすことに依存する（ヤン（Ｙａｎｇ）ら著、１９９０年、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第８７巻、ｐ．９５６８～９５７２）。マイクロプロジェクタイルは、タングステン又は金ビーズなど、生物学的に不活性な物質からなり得る。
【0109】
更なる実施形態では、リポソームを使用して発現コンストラクトを送達し得る。リポソームは、リン脂質二分子膜及び内部の水性媒体を特徴とする小胞構造である。多重膜リポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。これは、過剰量の水溶液にリン脂質を懸濁すると、自然発生的に形成される。脂質成分は、自己再構成を起こした後に閉じた構造を形成し、脂質二重層間に水及び溶解した溶質を封入する（ゴーシュ（Ｇｈｏｓｈ）及びバッチャワット（Ｂａｃｈｈａｗａｔ）著、１９９１年、「特異的受容体及びリガンドを使用した肝疾患、標的診断及び治療（Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｕｓｉｎｇ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ Ｌｉｇａｎｄｓ）」、ウー（Ｗｕ）ら編、マルセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ）、ニューヨーク州、ｐ．８７～１０４）。リポフェクタミン－ＤＮＡ複合体の使用も企図される。
【0110】
特定の実施形態において、リポソームは、センダイウイルス（ＨＶＪ）と複合体化され得る。これにより、細胞膜との融合が容易になり、リポソームに封入されたＤＮＡの細胞への侵入が促進されることが示されている（カネダ（Ｋａｎｅｄａ）ら著、１９８９年、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２４３巻、ｐ．３７５～３７８）。他の実施形態において、リポソームは、核内非ヒストン染色体タンパク質（ＨＭＧ－Ｉ）と複合体化されるか又はそれと併せて利用され得る（カトウ（Ｋａｔｏ）ら著、１９９１年、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、第２６６巻、第６号、ｐ．３３６１～３３６４）。更に別の実施形態において、リポソームは、ＨＶＪ及びＨＭＧ－Ｉの両方と複合体化されるか又はそれと併せて利用され得る。かかる発現コンストラクトがインビトロ及びインビボでの核酸の移入及び発現に利用され、成功している点において、従ってそれを本発明に適用可能である。ＤＮＡコンストラクトに細菌プロモータが利用される場合、リポソーム内に適切な細菌ポリメラーゼを含めることも望ましいであろう。
【0111】
細胞への核酸の送達に利用することのできる他の発現コンストラクトは、受容体介在性送達媒体（ｖｅｈｉｃｌｅｓ）である。これは、ほぼ全ての真核細胞における受容体介在性エンドサイトーシスによる高分子の選択的取込みを利用する。様々な受容体の細胞型特異的分布のため、送達は、高度に特異的であり得る（ウー（Ｗｕ）及びウー（Ｗｕ）著、１９９３年、アドバンスド・ドラッグ・デリバリー・レビューズ（Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．）、第１２巻、ｐ．１５９～１６７）。
【0112】
受容体介在性遺伝子ターゲティング媒体は、概して、２つの成分、即ち細胞受容体特異的リガンド及びＤＮＡ結合体からなる。受容体介在性遺伝子移入には、幾つかのリガンドが使用されている。最も十分に特徴付けられているリガンドは、アシアロオロソムコイド（ＡＳＯＲ）及びトランスフェリンである（例えば、ウー（Ｗｕ）及びウー（Ｗｕ）著、１９８７年、前掲；ワグナー（Ｗａｇｎｅｒ）ら著、１９９０年、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第８７巻、第９号、ｐ．３４１０～３４１４を参照されたい）。ＡＳＯＲと同じ受容体を認識する合成ネオ糖タンパク質が遺伝子送達媒体として使用されており（フェルコル（Ｆｅｒｋｏｌ）ら著、１９９３年、ＦＡＳＥＢジャーナル（ＦＡＳＥＢ Ｊ．）、第７巻、ｐ．１０８１～１０９１；ペラレス（Ｐｅｒａｌｅｓ）ら著、１９９４年、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第９１巻、第９号、ｐ．４０８６～４０９０）、上皮成長因子（ＥＧＦ：ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）も、遺伝子を扁平上皮癌細胞に送達するために使用されている（マイヤーズ（Ｍｙｅｒｓ）著、欧州特許第０２７３０８５号明細書）。
【0113】
他の実施形態において、送達媒体は、リガンド及びリポソームを含み得る。例えば、ニコラウ（Ｎｉｃｏｌａｕ）ら（メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．）、１９８７年、第１４９巻、ｐ．１５７～１７６）は、ガラクトース末端アシアロガングリオシドであるラクトシルセラミドをリポソームに取り込んだものを利用して、ヘパトサイトによるインスリン遺伝子の取込みの増加を観察した。従って、特定の遺伝子をコードする核酸も、幾つもの受容体－リガンドシステムによってリポソームあり又はなしで細胞に特異的に送達し得ることが実現可能である。細胞上の表面抗原に対する抗体も同様にターゲティング部分として使用することができる。
【0114】
詳細な例において、改変レトロンを含む組換えポリヌクレオチドをカチオン性脂質と組み合わせて投与し得る。カチオン性脂質の例としては、限定はされないが、リポフェクチン、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ及びＤＯＴＡＰが挙げられる。国際公開第００／７１０９６号パンフレット（これは、参照により具体的に援用される）は、遺伝子療法に有効に使用し得るＤＯＴＡＰ：コレステロール又はコレステロール誘導体製剤など、種々の製剤について記載している。他の開示も、ナノ粒子及び投与方法を含め、種々の脂質又はリポソーム製剤について考察しており；それらとしては、限定はされないが、米国特許出願公開第２００３０２０３８６５号明細書、同第２００２０１５０６２６号明細書、同第２００３００３２６１５号明細書及び同第２００４００４８７８７号明細書（これらは、製剤及び他の関連する核酸の投与及び送達の態様を開示する範囲で参照により具体的に援用される）が挙げられる。粒子の形成に用いられる方法は、米国特許第５，８４４，１０７号明細書、同第５，８７７，３０２号明細書、同第６，００８，３３６号明細書、同第６，０７７，８３５号明細書、同第５，９７２，９０１号明細書、同第６，２００，８０１号明細書及び同第５，９７２，９００号明細書（これらは、その態様について参照により援用される）にも開示されている。
【0115】
特定の実施形態では、エキソビボ条件下で遺伝子移入を実施することがより容易であり得る。エキソビボ遺伝子療法とは、対象から細胞を単離し、インビトロで細胞に核酸を送達し、次に修飾された細胞を対象に戻すことを指す。これには、対象からの細胞を含む生体試料の採取が関わり得る。例えば、当技術分野において周知の方法によれば、血液は、静脈穿刺によって入手することができ、固形組織試料は、外科的技法によって入手することができる。
【0116】
常にそうであるとは限らないが、通常、細胞を受け取る対象（即ちレシピエント）は、細胞を回収又は入手する対象でもあり、これは、供与される細胞が自家性であるという利点をもたらす。しかしながら、細胞は、別の対象（即ちドナー）、ドナーからの細胞の培養物又は樹立された細胞培養株から入手することもできる。細胞は、治療される対象と同じ又は異なる種から入手され得るが、好ましくは対象と同じ種、より好ましくは同じ免疫学的プロファイルの細胞である。かかる細胞は、例えば、近親血縁者又は適合ドナーからの細胞を含む生体試料から入手することができ、次に核酸（例えば、改変レトロンを含む）がトランスフェクトされて、ゲノム修飾を必要としている対象に例えば疾患又は病態の治療のために投与され得る。
【0117】
キット
本明細書に記載されるとおりの改変レトロンコンストラクトを含むキットも提供される。一部の実施形態において、キットは、改変レトロンコンストラクト又はかかるレトロンコンストラクトを含むベクターシステムを提供する。一部の実施形態において、キットに含まれる改変レトロンコンストラクトは、目的のタンパク質又は調節性ＲＮＡをコードする核酸、細胞性バーコード、例えば相同組換え修復（ＨＤＲ）又は組換えによって媒介される遺伝子改変（リコンビニアリング）による遺伝子編集における使用に好適なドナーポリヌクレオチド又は分子レコーディングに用いられるＣＲＩＳＰＲプロトスペーサＤＮＡ配列を細胞に提供する能力のある異種配列を含む。キットには、トランスフェクション剤、宿主細胞、細胞の培養に好適な培地、緩衝液などの他の薬剤も含まれ得る。
本明細書に記載されるとおりの改変レトロンコンストラクトを含むキットも提供される。一部の実施形態において、キットは、改変レトロンコンストラクト又はかかるレトロンコンストラクトを含むベクターシステムを提供する。一部の実施形態において、キットに含まれる改変レトロンコンストラクトは、目的のタンパク質又は調節性ＲＮＡをコードする核酸、細胞性バーコード、例えば相同組換え修復（ＨＤＲ）又は組換えによって媒介される遺伝子改変（リコンビニアリング）による遺伝子編集における使用に好適なドナーポリヌクレオチド又は分子レコーディングに用いられるＣＲＩＳＰＲプロトスペーサＤＮＡ配列を細胞に提供する能力のある異種配列を含む。キットには、トランスフェクション剤、宿主細胞、細胞の培養に好適な培地、緩衝液などの他の薬剤も含まれ得る。
【0118】
キットに関連して、薬剤は、任意の好都合な包装（例えば、スティックパック、用量パック等）に液体又は固体形態で提供され得る。キットの薬剤は、同じ又は別個の容器に存在し得る。薬剤は、同じ容器にも存在し得る。上記の構成要素に加えて、主題のキットは、（特定の実施形態では）主題の方法の実施に関する説明書を更に含み得る。これらの説明書は、主題のキットに種々の形態で存在し得、その１つ以上がキットに存在し得る。それらの説明書が存在し得る１つの形態は、キットの包装、添付文書などにある、好適な媒体又は基材に印刷された情報としての形態、例えば情報が印刷されている１枚又は複数枚の紙である。これらの説明書の更に別の形態は、コンピュータ可読媒体、例えばディスケット、コンパクトディスク（ＣＤ：ｃｏｍｐａｃｔ ｄｉｓｋ）、フラッシュドライブなどであり、それに情報が記録されている。存在し得るこれらの説明書の更に別の形態は、離れた場所から情報にアクセスするためにインターネット経由で用いられ得るウェブサイトアドレスである。
【0119】
有用性
レトロンは、種々の適用での使用のために異種配列で改変することができる。例えば、レトロンコンストラクトに異種配列を付加することにより、以下で更に考察するとおりの、目的のタンパク質又は調節性ＲＮＡをコードする異種核酸、細胞性バーコード、例えば相同組換え修復（ＨＤＲ）又は組換えによって媒介される遺伝子改変（リコンビニアリング）による遺伝子編集における使用に好適なドナーポリヌクレオチド又は分子レコーディングに用いられるＣＲＩＳＰＲプロトスペーサＤＮＡ配列を細胞に提供することができる。かかる異種配列は、例えば、異種配列がレトロン逆転写酵素によってｍｓＤＮＡ産物の一部として転写されるようにｍｓｒ遺伝子又はｍｓｄ遺伝子に挿入され得る。
レトロンは、種々の適用での使用のために異種配列で改変することができる。例えば、レトロンコンストラクトに異種配列を付加することにより、以下で更に考察するとおりの、目的のタンパク質又は調節性ＲＮＡをコードする異種核酸、細胞性バーコード、例えば相同組換え修復（ＨＤＲ）又は組換えによって媒介される遺伝子改変（リコンビニアリング）による遺伝子編集における使用に好適なドナーポリヌクレオチド又は分子レコーディングに用いられるＣＲＩＳＰＲプロトスペーサＤＮＡ配列を細胞に提供することができる。かかる異種配列は、例えば、異種配列がレトロン逆転写酵素によってｍｓＤＮＡ産物の一部として転写されるようにｍｓｒ遺伝子又はｍｓｄ遺伝子に挿入され得る。
【0120】
タンパク質又はＲＮＡの産生
例えば、改変レトロンによって生成される一本鎖ＤＮＡを使用して、細胞において所望の目的産物を産生させることができる。一部の実施形態では、レトロンは、細胞において生成されるレトロンｍｓＤＮＡからのポリペプチドの産生が可能となるように、目的のポリペプチドをコードする異種配列で改変される。目的のポリペプチドは、いかなる種類のタンパク質／ペプチドでもあり得、限定なしに、酵素、細胞外マトリックスタンパク質、受容体、トランスポータ、イオンチャネル又は他の膜タンパク質、ホルモン、神経ペプチド、抗体若しくは細胞骨格タンパク質；又はその断片若しくは目的の生物学的に活性なドメインが挙げられる。一部の実施形態において、タンパク質は、疾患の治療に用いられる治療用タンパク質又は治療用抗体である。
例えば、改変レトロンによって生成される一本鎖ＤＮＡを使用して、細胞において所望の目的産物を産生させることができる。一部の実施形態では、レトロンは、細胞において生成されるレトロンｍｓＤＮＡからのポリペプチドの産生が可能となるように、目的のポリペプチドをコードする異種配列で改変される。目的のポリペプチドは、いかなる種類のタンパク質／ペプチドでもあり得、限定なしに、酵素、細胞外マトリックスタンパク質、受容体、トランスポータ、イオンチャネル又は他の膜タンパク質、ホルモン、神経ペプチド、抗体若しくは細胞骨格タンパク質；又はその断片若しくは目的の生物学的に活性なドメインが挙げられる。一部の実施形態において、タンパク質は、疾患の治療に用いられる治療用タンパク質又は治療用抗体である。
【0121】
他の実施形態において、レトロンは、細胞におけるレトロンからのＲＮＡの産生が可能となるように、目的のＲＮＡをコードする異種配列で改変される。目的のＲＮＡは、いかなる種類のＲＮＡでもあり得、限定なしに、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ：ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）核酸又は調節性ＲＮＡ、例えば、限定はされないが、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ：ｍｉｃｒｏＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ：ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ：ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）、低分子核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ：ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ＲＮＡ）、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ：ｌｏｎｇ ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ）、アンチセンス核酸などが挙げられる。
【0122】
遺伝子編集
一部の実施形態において、レトロンは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓゲノム編集システムで使用するのに好適なドナーポリヌクレオチドをコードする異種配列で改変される。ドナーポリヌクレオチドは、細胞内の編集される標的遺伝子座へのドナーポリヌクレオチドのターゲティングに関与する相同性アームの対が隣接する意図されるゲノム編集を含む配列を含む。ドナーポリヌクレオチドは、典型的には、５’ゲノム標的配列にハイブリダイズする５’相同性アームと、３’ゲノム標的配列にハイブリダイズする３’相同性アームとを含む。相同性アームは、本明細書では５’及び３’（即ち上流及び下流）相同性アームと称され、これは、ドナーポリヌクレオチド内の意図される編集を含むヌクレオチド配列に対する相同性アームの相対的な位置に関する。５’及び３’相同性アームは、修飾されるゲノムＤＮＡの標的遺伝子座内にある、本明細書でそれぞれ「５’標的配列」及び「３’標的配列」と称される領域にハイブリダイズする。
一部の実施形態において、レトロンは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓゲノム編集システムで使用するのに好適なドナーポリヌクレオチドをコードする異種配列で改変される。ドナーポリヌクレオチドは、細胞内の編集される標的遺伝子座へのドナーポリヌクレオチドのターゲティングに関与する相同性アームの対が隣接する意図されるゲノム編集を含む配列を含む。ドナーポリヌクレオチドは、典型的には、５’ゲノム標的配列にハイブリダイズする５’相同性アームと、３’ゲノム標的配列にハイブリダイズする３’相同性アームとを含む。相同性アームは、本明細書では５’及び３’（即ち上流及び下流）相同性アームと称され、これは、ドナーポリヌクレオチド内の意図される編集を含むヌクレオチド配列に対する相同性アームの相対的な位置に関する。５’及び３’相同性アームは、修飾されるゲノムＤＮＡの標的遺伝子座内にある、本明細書でそれぞれ「５’標的配列」及び「３’標的配列」と称される領域にハイブリダイズする。
【0123】
相同性アームは、ドナーポリヌクレオチドと標的遺伝子座のゲノムＤＮＡとの間の相同組換えを媒介するため標的配列にハイブリダイズするのに十分な相補性がなければならない。例えば、相同性アームは、対応するゲノム標的配列と少なくとも約８０～１００％の配列同一性、例えばこの範囲内にある任意のパーセント同一性を含めて、例えばそれと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性などを有するヌクレオチド配列を含むことができ、ここで意図される編集を含むヌクレオチド配列は、５’及び３’相同性アームによって認識される（即ちハイブリダイゼーションに十分な相補性を有する）ゲノム標的遺伝子座においてＨＤＲによってゲノムＤＮＡに組み込まれ得る。
【0124】
特定の実施形態において、ゲノム標的配列中の対応する相同ヌクレオチド配列（即ち「５’標的配列」及び「３’標的配列」）は、切断のための特異的部位に隣接し、且つ／又は意図される編集の導入のための特異的部位に隣接する。特異的な切断部位と相同ヌクレオチド配列（例えば、各相同性アーム）との間の距離は、数百ヌクレオチドであり得る。一部の実施形態において、相同性アームと切断部位との間の距離は、２００ヌクレオチド以下（例えば、０、１０、２０、３０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５及び２００ヌクレオチド）である。ほとんどの場合、距離が短いほど、高い遺伝子ターゲティング率が生じ得る。好ましい実施形態において、ドナーポリヌクレオチドは、特異的切断部位及び変化されるゲノム標的配列の一部分の両方を包含するゲノムの一部分に導入される配列変化を除いて、その全長にわたって標的ゲノム配列と実質的に同一である。
【0125】
相同性アームは、任意の長さ、例えば１０ヌクレオチド以上、１５ヌクレオチド以上、２０ヌクレオチド以上、５０ヌクレオチド以上、１００ヌクレオチド以上、２５０ヌクレオチド以上、３００ヌクレオチド以上、３５０ヌクレオチド以上、４００ヌクレオチド以上、４５０ヌクレオチド以上、５００ヌクレオチド以上、１０００ヌクレオチド（１ｋｂ）以上、５０００ヌクレオチド（５ｋｂ）以上、１００００ヌクレオチド（１０ｋｂ）以上等であり得る。一部の例では、５’及び３’相同性アームは、互いに実質的に等しい長さである。しかしながら、一部の例では、５’及び３’相同性アームは、必ずしも互いに等しい長さというわけではない。例えば、一方の相同性アームが他方の相同性アームよりも３０％以下短いか、他方の相同性アームよりも２０％以下短いか、他方の相同性アームよりも１０％以下短いか、他方の相同性アームよりも５％以下短いか、他方の相同性アームよりも２％以下短いか、又は他方の相同性アームよりも僅か数ヌクレオチドだけ短くてもよい。他の場合、５’及び３’相同性アームは、互いに実質的に異なる長さであり、例えば一方が他方の相同性アームよりも４０％以上短いか、５０％以上短いか、時に６０％以上短いか、７０％以上短いか、８０％以上短いか、９０％以上短いか、又は９５％以上短くてもよい。
【0126】
ドナーポリヌクレオチドは、ガイドＲＮＡによって特定のゲノム配列（即ち修飾されるゲノム標的配列）に標的化されるＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと組み合わせて使用される。標的特異的ガイドＲＮＡは、ゲノム標的配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、従って標的部位におけるヌクレアーゼ－ｇＲＮＡ複合体のハイブリダイゼーションによる結合を媒介する。例えば、ｇＲＮＡは、ヌクレアーゼ－ｇＲＮＡ複合体を突然変異部位に標的化するため、マイナーアレルの配列に相補的な配列を含んで設計することができる。突然変異は、挿入、欠失又は置換を含み得る。例えば、突然変異には、一塩基変化、遺伝子融合、転座、逆位、重複、フレームシフト、ミスセンス、ナンセンス又は目的の表現型若しくは疾患に関連する他の突然変異が含まれ得る。標的化されるマイナーアレルは、共通の遺伝的変異又はまれな遺伝的変異であり得る。特定の実施形態において、ｇＲＮＡは、一塩基対を識別してマイナーアレルに選択的に結合するように設計され、例えばヌクレアーゼ－ｇＲＮＡ複合体が一塩基変異多型（ＳＮＰ：ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）に結合することを可能にする。詳細には、ｇＲＮＡは、遺伝子から突然変異を取り除くためのゲノム編集を目的として、目的の疾患関連突然変異を標的化するように設計され得る。代わりに、ｇＲＮＡは、細胞のゲノムＤＮＡの遺伝子に挿入、欠失又は置換などの突然変異を導入するためのゲノム編集を目的として、メジャー又は野生型アレルの配列に相補的な配列を含んで、ヌクレアーゼ－ｇＲＮＡ複合体がそのアレルに標的化されるように設計することができる。かかる遺伝子修飾細胞は、例えば、表現型を変化させるため、新規特性を付与するため又は薬物スクリーニングのための疾患モデルを作製するために使用することができる。
【0127】
特定の実施形態において、ゲノム修飾に使用されるＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）システムＣａｓヌクレアーゼである。ゲノム編集では、ＣＲＩＳＰＲシステムＩ型、ＩＩ型又はＩＩＩ型Ｃａｓヌクレアーゼを含め、ＨＤＲ機構によるドナーポリヌクレオチドの組込みを可能にするＤＮＡの部位特異的切断の触媒能を有する任意のＲＮＡ誘導型Ｃａｓヌクレアーゼを使用することができる。Ｃａｓタンパク質の例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（ＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１又はＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（ＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（ＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（ＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４及びＣｕ１９６６並びにその相同体又は修飾されたバージョンが挙げられる。
【0128】
特定の実施形態では、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムＣａｓ９エンドヌクレアーゼが使用される。本明細書に記載されるとおりのゲノム修飾の実施には、任意の種のＣａｓ９ヌクレアーゼ又はＣａｓ９エンドヌクレアーゼ活性（即ちＤＮＡの部位特異的切断を触媒して二本鎖切断を生じさせる）を保持しているその生物学的に活性な断片、変異体類似体若しくは誘導体を使用し得る。Ｃａｓ９は、物理的に生物に由来しなくてもよく、合成的に又は組換えで作製され得る。幾つもの細菌種のＣａｓ９配列が当技術分野において周知であり、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）データベースに掲載されている。例えば、以下のＣａｓ９についてのＮＣＢＩエントリを参照されたい：化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（ＷＰ＿００２９８９９５５、ＷＰ＿０３８４３４０６２、ＷＰ＿０１１５２８５８３）；カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）（ＷＰ＿０２２５５２４３５、ＹＰ＿００２３４４９００）、カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ）（ＷＰ＿０６０７８６１１６）；カンピロバクター・フィタス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｔｕｓ）（ＷＰ＿０５９４３４６３３）；コリネバクテリウム・ウルセランス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ）（ＮＣ＿０１５６８３、ＮＣ＿０１７３１７）；ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）（ＮＣ＿０１６７８２、ＮＣ＿０１６７８６）；フェカリス菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）（ＷＰ＿０３３９１９３０８）；スピロプラズマ・シルフィディコーラ（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｓｙｒｐｈｉｄｉｃｏｌａ）（ＮＣ＿０２１２８４）；プレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）（ＮＣ＿０１７８６１）；スピロプラズマ・タイワネンス（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｔａｉｗａｎｅｎｓｅ）（ＮＣ＿０２１８４６）；ストレプトコッカス・イニアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅ）（ＮＣ＿０２１３１４）；ベルリエラ・バルティカ（Ｂｅｌｌｉｅｌｌａ ｂａｌｔｉｃａ）（ＮＣ＿０１８０１０）；サイクロフレクサス・トークイス（Ｐｓｙｃｈｒｏｆｌｅｘｕｓ ｔｏｒｑｕｉｓ ）Ｉ（ＮＣ＿０１８７２１）；ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（ＹＰ＿８２０８３２）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）（ＷＰ＿０６１０４６３７４、ＷＰ＿０２４７８６４３３）；リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）（ＮＰ＿４７２０７３）；リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）（ＷＰ＿０６１６６５４７２）；レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）（ＷＰ＿０６２７２６６５６）；黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（ＷＰ＿００１５７３６３４）；野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）（ＷＰ＿０３２７２９８９２、ＷＰ＿０１４５４８４２０）、フェカリス菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）（ＷＰ＿０３３９１９３０８）；ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）（ＷＰ＿０４８４８２５９５、ＷＰ＿０３２９６５１７７）；及び髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（ＷＰ＿０６１７０４９４９、ＹＰ＿００２３４２１００）。これらの配列は、全て（本願の出願日までに登録されているとおり）全体として参照により本明細書に援用される。本明細書に記載されるとおりのゲノム編集には、これらの配列のいずれも又はそれと少なくとも約７０～１００％の配列同一性、例えばこの範囲内にある任意のパーセント同一性を含めて、例えばそれと７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％の配列同一性などを有する配列を含むその変異体を使用することができる。Ｃａｓ９の配列比較並びに遺伝的多様性及び系統発生解析の考察については、フォンファラ（Ｆｏｎｆａｒａ）ら著、２０１４年、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）、第４２巻、第４号、ｐ．２５７７～９０；カピトノフ（Ｋａｐｉｔｏｎｏｖ）ら著、２０１５年、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）、第１９８巻、第５号、ｐ．７９７～８０７、シュマコフ（Ｓｈｍａｋｏｖ）ら著、２０１５年、モレキュラー・セル（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．）、第６０巻、第３号、ｐ．３８５～３９７及びチリンスキー（Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ）ら著、２０１４年、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）、第４２巻、第１０号、ｐ．６０９１～６１０５）も参照されたい。
【0129】
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、細菌及び古細菌中に天然に存在し、そこでは、それは、外来ＤＮＡに対するＲＮＡ媒介性適応免疫において役割を果たしている。細菌ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と複合体を形成するエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ９を用いるものであり、ｇＲＮＡが相補的なゲノム標的配列に特異的にハイブリダイズし、そこでＣａｓ９エンドヌクレアーゼが切断を触媒して二本鎖切断を生じさせる。Ｃａｓ９のターゲティングは、典型的には、ｇＲＮＡ結合部位又はその近傍にあるＤＮＡ中の５’プロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）の存在に更に依存する。
【0130】
ゲノム標的部位は、典型的には、ｇＲＮＡに相補的なヌクレオチド配列を含むことになり、更にプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含み得る。特定の実施形態において、標的部位は、３塩基対のＰＡＭに加えて２０～３０塩基対を含む。典型的には、ＰＡＭの１番目のヌクレオチドは、任意のヌクレオチドであり得る一方、他の２つのヌクレオチドは、選択された特異的なＣａｓ９タンパク質に依存することになる。例示的ＰＡＭ配列は、当業者に公知であり、限定なしに、ＮＮＧ、ＮＧＮ、ＮＡＧ及びＮＧＧ（式中、Ｎは、任意のヌクレオチドを表す）が挙げられる。特定の実施形態において、ｇＲＮＡによって標的化されるアレルは、アレル内にＰＡＭを作り出す突然変異を含み、ここで、ＰＡＭは、Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ複合体によるアレルへの結合を促進する。
【0131】
特定の実施形態において、ｇＲＮＡは、５～５０ヌクレオチド長、１０～３０ヌクレオチド長、１５～２５ヌクレオチド長、１８～２２ヌクレオチド長若しくは１９～２１ヌクレオチド長又は記載される範囲間にある任意の長さ、例えば１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４又は３５ヌクレオチド長を含めた長さである。ガイドＲＮＡは、単一のＲＮＡ分子にｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡ配列とを含むシングルガイドＲＮＡであり得るか、又はガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列が別個のＲＮＡ分子に存在する２つのＲＮＡ分子を含み得る。
【0132】
別の実施形態において、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）及びフランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）由来のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ１（Ｃｐｆ１）が使用される。Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９と類似性があり、同様に使用され得る別のクラスＩＩ ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼである。Ｃａｓ９と異なり、Ｃｐｆ１は、ｔｒａｃｒＲＮＡの必要がなく、そのガイドＲＮＡ中のｃｒＲＮＡのみに依存し、これは、Ｃｐｆ１ではターゲティングにＣａｓ９よりも短いガイドＲＮＡを使用し得るという利点を提供する。Ｃｐｆ１は、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれの切断能も有する。Ｃｐｆ１によって認識されるＰＡＭ部位は、配列５’－ＹＴＮ－３’（式中、「Ｙ」は、ピリミジンであり、「Ｎ」は、任意の核酸塩基である）又は５’－ＴＴＮ－３’を有し、Ｃａｓ９によって認識されるＧリッチＰＡＭ部位とは対照的である。Ｃｐｆ１によってＤＮＡが切断されると、４又は５ヌクレオチドオーバーハングを有する付着末端（ｓｔｉｃｋｙ－ｅｎｄｓ）の二本鎖切断が生じる。Ｃｐｆ１の考察については、例えば、レドフォード（Ｌｅｄｆｏｒｄ）ら著、２０１５年、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第５２６巻、第７５７１号、ｐ．１７～１７、ツェッチェ（Ｚｅｔｓｃｈｅ）ら著、２０１５年、セル（Ｃｅｌｌ）、第１６３巻、第３号、ｐ．７５９～７７１、ムロヴェク（Ｍｕｒｏｖｅｃ）ら著、２０１７年、ジャーナル・オブ・プラント・バイオテクノロジー（Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．）、第１５巻、第８号、ｐ．９１７～９２６、チャン（Ｚｈａｎｇ）ら著、２０１７年、フロンティアズ・イン・プラント・サイエンス（Ｆｒｏｎｔ．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．）、第８巻、ｐ．１７７、フェルナンデス（Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ）ら著、２０１６年、ポステピー・バイオケミイ（Ｐｏｓｔｅｐｙ Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、第６２巻、第３号、ｐ．３１５～３２６（本明細書において参照により援用される）を参照されたい。
【0133】
Ｃ２ｃ１は、使用し得る別のクラスＩＩ ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼである。Ｃ２ｃ１は、Ｃａｓ９と同様に、標的部位への誘導についてｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの両方に依存する。Ｃ２ｃ１の説明については、例えば、シュマコフ（Ｓｈｍａｋｏｖ）ら著、２０１５年、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．）、第６０巻、第３号、ｐ．３８５～３９７、チャン（Ｚｈａｎｇ）ら著、２０１７年、フロンティアズ・イン・プラント・サイエンス（Ｆｒｏｎｔ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．）、第８巻、ｐ．１７７（本明細書において参照により援用される）を参照されたい。
【0134】
更に別の実施形態において、改変されたＲＮＡ誘導型ＦｏｋＩヌクレアーゼが使用され得る。ＲＮＡ誘導型ＦｏｋＩヌクレアーゼは、不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）とＦｏｋＩエンドヌクレアーゼとの融合体（ＦｏｋＩ－ｄＣａｓ９）を含み、ここで、ｄＣａｓ９部分は、ＦｏｋＩにガイドＲＮＡ依存的ターゲティングを付与する。改変されたＲＮＡ誘導型ＦｏｋＩヌクレアーゼの説明については、例えば、ハブリチェク（Ｈａｖｌｉｃｅｋ）ら著、２０１７年、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．）、第２５巻、第２号、ｐ．３４２～３５５、パン（Ｐａｎ）ら著、２０１６年、サイエンティフィック・リポーツ（Ｓｃｉ Ｒｅｐ．）、第６巻、ｐ．３５７９４、ツァイ（Ｔｓａｉ）ら著、２０１４年、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、第３２巻、第６号、ｐ．５６９～５７６（本明細書において参照により援用される）を参照されたい。
【0135】
ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、タンパク質の形態で提供され得、任意選択で、ヌクレアーゼは、ｇＲＮＡと複合体化されるか、又はＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ）若しくはＤＮＡ（発現ベクター）など、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸によって提供される。一部の実施形態において、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ及びｇＲＮＡは、両方ともベクターによって提供される。両方を単一のベクターによって発現させ得るか、又は異なるベクター上で別個に発現させ得る。ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ及びｇＲＮＡをコードする１つ又は複数のベクターは、改変レトロンｍｓｒ遺伝子、ｍｓｄ遺伝子及びｒｅｔ遺伝子配列を含むベクターシステムに含まれ得る。
【0136】
特定の細胞又は生物におけるＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ及び／又はレトロン逆転写酵素の産生を向上させるため、コドン使用が最適化され得る。例えば、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ又は逆転写酵素をコードする核酸は、天然に存在するポリヌクレオチド配列と比較したとき、酵母細胞、細菌細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳類細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞又は任意の他の目的の宿主細胞における使用頻度がより高いコドンを代用するように修飾することができる。ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ又は逆転写酵素をコードする核酸が細胞に導入されると、タンパク質は、細胞において一過性に、条件的に又は構成的に発現することができる。
【0137】
リコンビニアリング
例えば、遺伝子置換、遺伝子ノックアウト、欠失、挿入、逆位又は点突然変異を作り出すための、細胞における染色体並びにエピソームレプリコンの修飾には、リコンビニアリング（組換えによって媒介される遺伝子改変）を用いることができる。リコンビニアリングは、例えば、遺伝子をクローニングする又はマーカ若しくはタグを挿入するためのプラスミド又は細菌人工染色体（ＢＡＣ）の修飾にも用いることができる。本明細書に記載される改変レトロンをリコンビニアリング適用において使用すると、組換えのための線状一本鎖又は二本鎖ＤＮＡを提供することができる。相同組換えは、ＲａｃプロファージのＲｅｃＥ／ＲｅｃＴ又はバクテリオファージλのＲｅｄαβδなど、バクテリオファージタンパク質によって媒介される。線状ＤＮＡは、細胞（例えば、プラスミド、ＢＡＣ又は染色体）に存在する標的ＤＮＡ分子との５’末端及び３’末端における相同性が、組換えが可能となるのに十分でなければならない。
例えば、遺伝子置換、遺伝子ノックアウト、欠失、挿入、逆位又は点突然変異を作り出すための、細胞における染色体並びにエピソームレプリコンの修飾には、リコンビニアリング（組換えによって媒介される遺伝子改変）を用いることができる。リコンビニアリングは、例えば、遺伝子をクローニングする又はマーカ若しくはタグを挿入するためのプラスミド又は細菌人工染色体（ＢＡＣ）の修飾にも用いることができる。本明細書に記載される改変レトロンをリコンビニアリング適用において使用すると、組換えのための線状一本鎖又は二本鎖ＤＮＡを提供することができる。相同組換えは、ＲａｃプロファージのＲｅｃＥ／ＲｅｃＴ又はバクテリオファージλのＲｅｄαβδなど、バクテリオファージタンパク質によって媒介される。線状ＤＮＡは、細胞（例えば、プラスミド、ＢＡＣ又は染色体）に存在する標的ＤＮＡ分子との５’末端及び３’末端における相同性が、組換えが可能となるのに十分でなければならない。
【0138】
リコンビニアリングに使用される線状二本鎖又は一本鎖ＤＮＡ分子（即ちドナーポリヌクレオチド）は、線状ＤＮＡ分子を相同組換えの標的部位に標的化させる２つの相同性アームが隣接している、挿入される意図される編集を有する配列を含む。リコンビニアリングの相同性アームは、典型的には、長さが１３～３００ヌクレオチド又は２０～２００ヌクレオチドの範囲、例えばこの範囲内にある任意の長さを含めて、例えば１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５又は２００ヌクレオチド長などである。一部の実施形態において、相同性アームは、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０又は少なくとも５０ヌクレオチド長又はそれを超える。４０～５０ヌクレオチド長の範囲の相同性アームが概して組換えに十分なターゲティング効率を呈する。しかしながら、１５０～２００塩基又はそれを超える範囲のより長い相同性アームは、ターゲティング効率を更に改善し得る。一部の実施形態において、５’相同性アームと３’相同性アームとは、長さが異なる。例えば、線状ＤＮＡは、標的化する領域と相同性のある約５０塩基を５’末端に有し、約２０塩基を３’末端に有し得る。
【0139】
バクテリオファージ相同組換えタンパク質は、タンパク質として又は組換えタンパク質をコードする１つ以上のベクターによって細胞に提供することができる。一部の実施形態において、バクテリオファージ組換えタンパク質をコードする１つ以上のベクターは、改変レトロンｍｓｒ遺伝子、ｍｓｄ遺伝子及びｒｅｔ遺伝子配列を含むベクターシステムに含まれる。
【0140】
加えて、リコンビニアリングには、限定なしに、組換えタンパク質ｅｘｏ、ｂｅｔ及びｇａｍを有する欠損λプロファージを含有するＤＹ３８０；ＤＹ３８０に由来するものであり、ＤＹ３８０に見られる組換え遺伝子に加えて、厳密に制御されるアラビノース誘導性ｆｌｐｅ遺伝子（ｆｌｐｅは、２つの同一のｆｒｔ部位間での組換えを媒介する）も含有するＥＬ２５０；同様にＤＹ３８０に由来するものであり、ＤＹ３８０に見られる組換え遺伝子に加えて、厳密に制御されるアラビノース誘導性ｃｒｅ遺伝子（ｃｒｅは、２つの同一のｌｏｘＰ部位間での組換えを媒介する）も含有するＥＬ３５０；ＤＹ３８０に由来するものであり、ｇａｌＫポジティブ／ネガティブ選択を用いたＢＡＣリコンビニアリングのために設計されるＳＷ１０２；ＥＬ２５０に由来するものであり、ｇａｌＫポジティブ／ネガティブ選択にも使用することができるが、ＥＬ２５０と同様に、ａｒａ誘導性Ｆｌｐｅ遺伝子を含有するＳＷ１０５；及びＥＬ３５０に由来するものであり、ｇａｌＫポジティブ／ネガティブ選択に使用することができるが、ＥＬ３５０と同様に、ａｒａ誘導性Ｃｒｅ遺伝子を含有するＳＷ１０６を含め、プロファージ組換えシステムを含有する幾つもの細菌株が利用可能である。リコンビニアリングは、かかる株の細菌細胞に対して、リコンビニアリングに好適な線状ＤＮＡをコードする異種配列を含む改変レトロンをトランスフェクトすることにより行うことができる。リコンビニアリングシステム及びプロトコルの考察については、例えば、シャラン（Ｓｈａｒａｎ）ら著、２００９年、ネイチャー・プロトコルズ（Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．）、第４巻、第２号、ｐ．２０６～２２３、チャン（Ｚｈａｎｇ）ら著、１９９８年、ネイチャー・ジェネティクス（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、第２０巻、ｐ．１２３～１２８、マイラーズ（Ｍｕｙｒｅｒｓ）ら著、１９９９年、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）、第２７巻、ｐ．１５５５～１５５７、ユー（Ｙｕ）ら著、２０００年、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．）、第９７巻、第１１号、ｐ．５９７８～５９８３（本明細書において参照により援用される）を参照されたい。
【0141】
分子レコーディング
一部の実施形態において、改変レトロンコンストラクト中の異種配列は、分子レコーディングを可能にする合成ＣＲＩＳＰＲプロトスペーサＤＮＡ配列を含む。内因性ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓｌ－Ｃａｓ２システムは、通常、細菌及び古細菌が、侵入するウイルス核酸に対する配列特異的抵抗性を付与する短い配列（即ちプロトスペーサ）をゲノムベースのアレイ内に蓄えることにより、ウイルス感染に由来する外来性ＤＮＡ配列を追跡するために利用される。これらのアレイは、スペーサ配列を維持するのみならず、配列が獲得される順番も記録して、獲得イベントの時間的な記録を作成する。
一部の実施形態において、改変レトロンコンストラクト中の異種配列は、分子レコーディングを可能にする合成ＣＲＩＳＰＲプロトスペーサＤＮＡ配列を含む。内因性ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓｌ－Ｃａｓ２システムは、通常、細菌及び古細菌が、侵入するウイルス核酸に対する配列特異的抵抗性を付与する短い配列（即ちプロトスペーサ）をゲノムベースのアレイ内に蓄えることにより、ウイルス感染に由来する外来性ＤＮＡ配列を追跡するために利用される。これらのアレイは、スペーサ配列を維持するのみならず、配列が獲得される順番も記録して、獲得イベントの時間的な記録を作成する。
【0142】
このシステムを応用することにより、改変レトロンを使用して細胞に導入される「合成プロトスペーサ」の形態でゲノムＣＲＩＳＰＲアレイに任意のＤＮＡ配列を記録することができる。プロトスペーサ配列を担持する改変レトロンを使用して、ＣＲＩＳＰＲシステムＣａｓｌ－Ｃａｓ２複合体を利用することにより、特異的ゲノム遺伝子座に合成ＣＲＩＳＰＲプロトスペーサ配列を組み込むことができる。分子レコーディングを用いると、安定した遺伝記憶追跡コードの産生により、ある種の生物学的イベントを追跡することができる。例えば、シップマン（Ｓｈｉｐｍａｎ）ら著、２０１６年、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第３５３巻、第６２９８号、ａａｆ１１７５及び国際公開第２０１８／１９１５２５号パンフレット（全体として参照により本明細書に援用される）を参照されたい。
【0143】
一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、特異的な及び任意のＤＮＡ配列を細菌ゲノムに記録するために利用される。ＤＮＡ配列は、細胞内で改変レトロンによって産生され得る。例えば、改変レトロンを使用して細胞内でプロトスペーサを産生することができ、これは、細胞内でＣＲＩＳＰＲアレイに挿入される。細胞は、細胞において１つ以上の合成プロトスペーサを産生することができる１つ以上の改変レトロン（又はそれをコードするベクターシステム）を含むように修飾され得、ここで、合成プロトスペーサは、ＣＲＩＳＰＲアレイに付加される。何日にもわたって複数のモダリティで記録される定義された配列の記録が生成され得る。
【0144】
一部の実施形態において、改変レトロンは、ｍｓｄプロトスペーサ核酸領域又はｍｓｒプロトスペーサ核酸領域を含む。ｍｓｒプロトスペーサ核酸領域の場合、初めにｍｓｒ ＲＮＡにプロトスペーサ配列が取り込まれ、それが逆転写されてプロトスペーサＤＮＡになる。相補配列を有する２つの相補的なプロトスペーサＤＮＡ配列がハイブリダイズするか、又は一本鎖プロトスペーサＤＮＡに二本鎖構造（ヘアピンなど）が形成されると（例えば、単一のｍｓＤＮＡが適切なヘアピン構造を形成して二本鎖ＤＮＡプロトスペーサを提供することができる）、二本鎖プロトスペーサＤＮＡが産生される。
【0145】
一部の実施形態では、インビボで第１の改変レトロンから産生される一本鎖ＤＮＡは、インビボで同じレトロン又は第２の改変レトロンから産生される相補的な一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズし得るか、又はヘアピン構造を形成し得、それが次にプロトスペーサ配列として使用され、ＣＲＩＳＰＲアレイにスペーサ配列として挿入され得る。１つ又は複数の改変レトロンは、細胞内において、ＣＲＩＳＰＲアレイへの取込みに十分なレベルのプロトスペーサ配列を提供しなければならない。細胞内で生成されるプロトスペーサを使用すると、インビボ分子レコーディングシステムは、使用者に既知の情報を捕捉するのみのものから、使用者にとってそれまで未知であり得る生物学的又は環境的情報を捕捉するまで拡張される。例えば、改変レトロンコンストラクト中のｍｓＤＮＡプロトスペーサ配列は、生物学的現象又は環境毒素に関するセンサー経路の下流にあるプロモータによってドライブされ得る。ＣＲＩＳＰＲアレイにおけるプロトスペーサ配列の捕捉及び保存がイベントを記録する。複数のｍｓＤＮＡプロトスペーサが異なるプロモータによってドライブされる場合、それらのプロモータの活性（プロモータの上流にあり得る何らかのものと共に）並びにまたプロモータ活性の相対的順序（ＣＲＩＳＰＲアレイにおけるスペーサ配列の相対的位置に基づく）が記録される。記録が行われた後の任意の時点において、ＣＲＩＳＰＲアレイがシーケンシングされ、所与の生物学的又は環境的イベントが起こったかどうか、並びにＣＲＩＳＰＲアレイにおけるｍｓＤＮＡ由来のスペーサの存在及び相対位置によって与えられる複数のイベントの順序が決定され得る。
【0146】
一部の実施形態において、合成プロトスペーサは、その５’末端にＡＡＧ ＰＡＭ配列を更に含む。５’ＡＡＧ ＰＡＭを含むプロトスペーサは、ＰＡＭ配列を含まないものよりも高い効率でＣＲＩＳＰＲアレイによって獲得される。
【0147】
一部の実施形態において、Ｃａｓ１及びＣａｓ２は、改変レトロンによって産生される合成プロトスペーサ配列が細胞においてＣＲＩＳＰＲアレイによって獲得されることが可能となるのに十分なレベルでＣａｓ１及びＣａｓ２を発現するベクターによって提供される。かかるベクターシステムを使用すると、内因性Ｃａｓタンパク質を欠く細胞における分子レコーディングが可能となり得る。
【0148】
本開示の例示的な非限定的態様
上記に記載される本主題の実施形態を含めた態様は、単独で又は１つ以上の他の態様若しくは実施形態との組み合わせで有益であり得る。前述の説明を限定することなく、１～６０の番号を付した本開示の特定の非限定的な態様を以下に提供する。本開示を読めば当業者に明らかであろうとおり、個々の番号付けされた態様の各々は、先行する又は後続の個々の番号付けされた態様のいずれかと共に使用され得るか又はそれと組み合わされ得る。これは、態様のかかる組み合わせの全てに裏付けを提供することが意図され、以下に明示的に提供される態様の組み合わせに限定されない。
上記に記載される本主題の実施形態を含めた態様は、単独で又は１つ以上の他の態様若しくは実施形態との組み合わせで有益であり得る。前述の説明を限定することなく、１～６０の番号を付した本開示の特定の非限定的な態様を以下に提供する。本開示を読めば当業者に明らかであろうとおり、個々の番号付けされた態様の各々は、先行する又は後続の個々の番号付けされた態様のいずれかと共に使用され得るか又はそれと組み合わされ得る。これは、態様のかかる組み合わせの全てに裏付けを提供することが意図され、以下に明示的に提供される態様の組み合わせに限定されない。
【0149】
１．改変レトロンであって、
ａ）ｍｓｒ前配列；
ｂ）マルチコピー一本鎖ＲＮＡ（ｍｓＲＮＡ）をコードするｍｓｒ遺伝子；
ｃ）マルチコピー一本鎖ＤＮＡ（ｍｓＤＮＡ）をコードするｍｓｄ遺伝子；
ｄ）ｍｓｒ前配列との配列相補性を有する自己相補性領域を含むｍｓｄ後配列であって、自己相補性領域は、野生型自己相補性領域よりも少なくとも１～５０ヌクレオチド長い長さを有し、それにより、改変レトロンは、ｍｓＤＮＡの亢進した産生が可能である、ｍｓｄ後配列；及び
ｅ）逆転写酵素をコードするｒｅｔ遺伝子
を含む改変レトロン。
ａ）ｍｓｒ前配列；
ｂ）マルチコピー一本鎖ＲＮＡ（ｍｓＲＮＡ）をコードするｍｓｒ遺伝子；
ｃ）マルチコピー一本鎖ＤＮＡ（ｍｓＤＮＡ）をコードするｍｓｄ遺伝子；
ｄ）ｍｓｒ前配列との配列相補性を有する自己相補性領域を含むｍｓｄ後配列であって、自己相補性領域は、野生型自己相補性領域よりも少なくとも１～５０ヌクレオチド長い長さを有し、それにより、改変レトロンは、ｍｓＤＮＡの亢進した産生が可能である、ｍｓｄ後配列；及び
ｅ）逆転写酵素をコードするｒｅｔ遺伝子
を含む改変レトロン。
【0150】
２．自己相補性領域は、野生型自己相補性領域よりも少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５又は少なくとも３０ヌクレオチド長い長さを有する、改変レトロン。
【0151】
３．ｍｓｒ遺伝子及びｍｓｄ遺伝子は、トランス構成又はシス構成で提供される、態様１又は２の改変レトロン。
４．ｒｅｔ遺伝子は、ｍｓｒ遺伝子及びｍｓｄ遺伝子に対してトランス構成で提供される、態様３の改変レトロン。
４．ｒｅｔ遺伝子は、ｍｓｒ遺伝子及びｍｓｄ遺伝子に対してトランス構成で提供される、態様３の改変レトロン。
【0152】
５．ｍｓｒ遺伝子、ｍｓｄ遺伝子及びｒｅｔ遺伝子は、粘液細菌レトロン、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）レトロン又はコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）レトロンに由来する、態様１～４のいずれかの改変レトロン。
【0153】
６．大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）レトロンは、ＥＣ８３又はＥＣ８６である、態様５に記載の改変レトロン。
７．目的の異種配列を更に含む、態様１～６のいずれかの改変レトロン。
７．目的の異種配列を更に含む、態様１～６のいずれかの改変レトロン。
【0154】
８．異種配列は、ｍｓｒ遺伝子又はｍｓｄ遺伝子に挿入される、態様７に記載の改変レトロン。
９．異種核酸セグメントは、相補性領域の基端（ｂａｓｅ）から９～２０塩基に挿入される、態様１～７又は８の改変レトロン。
９．異種核酸セグメントは、相補性領域の基端（ｂａｓｅ）から９～２０塩基に挿入される、態様１～７又は８の改変レトロン。
【0155】
１０．異種配列は、ｍｓｄ、ｍｓｄ後又はｍｓＤＮＡのヘアピンループ内にある、態様７、８又は９の改変レトロン。
１１．異種核酸セグメントは、ｍｓｄ又はｍｓｄ後の２０～６０位に挿入される、態様１～８又は９のいずれかの改変レトロン。
１１．異種核酸セグメントは、ｍｓｄ又はｍｓｄ後の２０～６０位に挿入される、態様１～８又は９のいずれかの改変レトロン。
【0156】
１２．異種配列は、相同組換え修復（ＨＤＲ）又はリコンビニアリングによって標的遺伝子座に組み込まれる意図される編集を含むヌクレオチド配列に隣接している、５’標的配列にハイブリダイズする５’相同性アームと、３’標的配列にハイブリダイズする３’相同性アームとを含むドナーポリヌクレオチドをコードする、態様７～１０又は１１のいずれかの改変レトロン。
【0157】
１３．異種配列は、ＣＲＩＳＰＲプロトスペーサＤＮＡ配列を含む、態様７～１１又は１２のいずれかの改変レトロン。
１４．ＣＲＩＳＰＲプロトスペーサＤＮＡ配列は、修飾されたＡＡＧプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む、態様１３に記載の改変レトロン。
１４．ＣＲＩＳＰＲプロトスペーサＤＮＡ配列は、修飾されたＡＡＧプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む、態様１３に記載の改変レトロン。
【0158】
１５．バーコード配列を更に含む、態様１～１４のいずれかの改変レトロン。
１６．バーコード配列は、ｍｓＤＮＡのヘアピンループに位置する、態様１５に記載の改変レトロン。
１６．バーコード配列は、ｍｓＤＮＡのヘアピンループに位置する、態様１５に記載の改変レトロン。
【0159】
１７．態様１～１６のいずれかの改変レトロンを含む１つ以上のベクターを含むベクターシステム。
１８．ｍｓｒ遺伝子及びｍｓｄ遺伝子は、同じベクター又は異なるベクターによって提供される、態様１７のベクターシステム。
１８．ｍｓｒ遺伝子及びｍｓｄ遺伝子は、同じベクター又は異なるベクターによって提供される、態様１７のベクターシステム。
【0160】
１９．ｍｓｒ遺伝子、ｍｓｄ遺伝子及びｒｅｔ遺伝子は、同じベクターによって提供される、態様１７又は１８のベクターシステム。
２０．ベクターは、ｍｓｒ遺伝子及びｍｓｄ遺伝子に作動可能に連結されたプロモータを含む、態様１７、１８又は１９のベクターシステム。
２０．ベクターは、ｍｓｒ遺伝子及びｍｓｄ遺伝子に作動可能に連結されたプロモータを含む、態様１７、１８又は１９のベクターシステム。
【0161】
２１．プロモータは、ｒｅｔ遺伝子に更に作動可能に連結される、態様２０のベクターシステム。
２２．ｒｅｔ遺伝子に作動可能に連結された第２のプロモータを更に含む、態様２０又は２１のベクターシステム。
２２．ｒｅｔ遺伝子に作動可能に連結された第２のプロモータを更に含む、態様２０又は２１のベクターシステム。
【0162】
２３．ｍｓｒ遺伝子、ｍｓｄ遺伝子及びｒｅｔ遺伝子は、異なるベクターによって提供される、態様１７～２１又は２２のベクターシステム。
２４．１つ以上のベクターは、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターである、態様１７～２２又は２３のいずれかのベクターシステム。
２４．１つ以上のベクターは、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターである、態様１７～２２又は２３のいずれかのベクターシステム。
【0163】
２５．非ウイルスベクターは、プラスミドである、態様２４のベクターシステム。
２６．改変レトロンは、相同組換え修復（ＨＤＲ）又はリコンビニアリングによって標的遺伝子座に組み込まれる意図される編集を含むヌクレオチド配列に隣接している、５’標的配列にハイブリダイズする５’相同性アームと、３’標的配列にハイブリダイズする３’相同性アームとを含むドナーポリヌクレオチドを含む、態様１７～２５のいずれかのベクターシステム。
２６．改変レトロンは、相同組換え修復（ＨＤＲ）又はリコンビニアリングによって標的遺伝子座に組み込まれる意図される編集を含むヌクレオチド配列に隣接している、５’標的配列にハイブリダイズする５’相同性アームと、３’標的配列にハイブリダイズする３’相同性アームとを含むドナーポリヌクレオチドを含む、態様１７～２５のいずれかのベクターシステム。
【0164】
２７．ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼをコードするベクターを更に含む、態様２６のベクターシステム。
２８．ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓヌクレアーゼ又は改変されたＲＮＡ誘導型ＦｏｋＩヌクレアーゼである、態様２７のベクターシステム。
２８．ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓヌクレアーゼ又は改変されたＲＮＡ誘導型ＦｏｋＩヌクレアーゼである、態様２７のベクターシステム。
【0165】
２９．Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９又はＣｐｆ１である、態様２８の方法。
３０．改変レトロンは、ＣＲＩＳＰＲプロトスペーサＤＮＡ配列を含む、態様１７～２９のいずれかのベクターシステム。
３０．改変レトロンは、ＣＲＩＳＰＲプロトスペーサＤＮＡ配列を含む、態様１７～２９のいずれかのベクターシステム。
【0166】
３１．Ｃａｓ１又はＣａｓ２タンパク質をコードするベクターを更に含む、態様３０のベクターシステム。
３２．ＣＲＩＳＰＲアレイ配列を含むベクターを更に含む、態様３０又は３１のベクターシステム。
３２．ＣＲＩＳＰＲアレイ配列を含むベクターを更に含む、態様３０又は３１のベクターシステム。
【0167】
３３．バクテリオファージ相同組換えタンパク質をコードするベクターを更に含む、態様２９～３１のいずれかのベクターシステム。
３４．バクテリオファージ相同組換えタンパク質をコードするベクターは、ｅｘｏ、ｂｅｔ及びｇａｍ遺伝子を含む複製欠損λプロファージである、態様３３のベクターシステム。
３４．バクテリオファージ相同組換えタンパク質をコードするベクターは、ｅｘｏ、ｂｅｔ及びｇａｍ遺伝子を含む複製欠損λプロファージである、態様３３のベクターシステム。
【0168】
３５．態様１～１６のいずれかの改変レトロン又は態様１７～３４のいずれかのベクターシステムを含む単離宿主細胞。
３６．原核、古細菌又は真核宿主細胞である、態様３５の宿主細胞。
３６．原核、古細菌又は真核宿主細胞である、態様３５の宿主細胞。
【0169】
３７．真核宿主細胞は、哺乳類宿主細胞である、態様３６の宿主細胞。
３８．哺乳類宿主細胞は、ヒト宿主細胞である、態様３７の宿主細胞。
３９．宿主細胞は、人工細胞又は遺伝子修飾細胞である、態様３５の宿主細胞。
３８．哺乳類宿主細胞は、ヒト宿主細胞である、態様３７の宿主細胞。
３９．宿主細胞は、人工細胞又は遺伝子修飾細胞である、態様３５の宿主細胞。
【0170】
４０．態様１～１６のいずれかの改変レトロン、態様１７～３４のいずれかのベクターシステム又は態様３５～３９のいずれかの宿主細胞を含むキット。
４１．改変レトロンで細胞を遺伝子修飾するための説明書を更に含む、態様４０のキット。
４１．改変レトロンで細胞を遺伝子修飾するための説明書を更に含む、態様４０のキット。
【0171】
４２．細胞を遺伝子修飾する方法であって、
ａ）細胞に、態様１～１５又は１６（例えば、態様１２）の改変レトロンをトランスフェクトすること；
ｂ）細胞にＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡを導入すること又は発現させることであって、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡと複合体を形成し、前記ガイドＲＮＡは、複合体をゲノム標的遺伝子座に導き、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、ゲノム標的遺伝子座においてゲノムＤＮＡに二本鎖切断を作り出し、及び改変レトロンによって生成されるドナーポリヌクレオチドは、その５’相同性アーム及び３’相同性アームによって認識されるゲノム標的遺伝子座に相同組換え修復（ＨＤＲ）によって組み込まれて、遺伝子修飾細胞を産生する、導入すること
を含む方法。
ａ）細胞に、態様１～１５又は１６（例えば、態様１２）の改変レトロンをトランスフェクトすること；
ｂ）細胞にＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡを導入すること又は発現させることであって、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡと複合体を形成し、前記ガイドＲＮＡは、複合体をゲノム標的遺伝子座に導き、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、ゲノム標的遺伝子座においてゲノムＤＮＡに二本鎖切断を作り出し、及び改変レトロンによって生成されるドナーポリヌクレオチドは、その５’相同性アーム及び３’相同性アームによって認識されるゲノム標的遺伝子座に相同組換え修復（ＨＤＲ）によって組み込まれて、遺伝子修飾細胞を産生する、導入すること
を含む方法。
【0172】
４３．ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓヌクレアーゼ又は改変されたＲＮＡ誘導型ＦｏｋＩヌクレアーゼである、態様４２の方法。
４４．Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９又はＣｐｆ１である、態様４３の方法。
４４．Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９又はＣｐｆ１である、態様４３の方法。
【0173】
４５．ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、細胞のゲノムに組み込まれたベクター又は組換えポリヌクレオチドによって提供される、態様４２～４４の方法。
４６．改変レトロンは、ベクターによって提供される、態様４２～４５の方法。
４６．改変レトロンは、ベクターによって提供される、態様４２～４５の方法。
【0174】
４７．ドナーポリヌクレオチドは、遺伝子置換、遺伝子ノックアウト、欠失、挿入、逆位又は点突然変異を作り出すために使用される、態様４２～４５又は４６の方法。
４８．細胞をリコンビニアリングによって遺伝子修飾する方法であって、前記方法は、
ａ）態様１～１６（例えば、態様１２）の改変レトロンを細胞にトランスフェクトすること；及び
ｂ）細胞にバクテリオファージ組換えタンパク質を導入することであって、バクテリオファージ組換えタンパク質は、標的遺伝子座における相同組換えを媒介し、それにより、改変レトロンによって生成されるドナーポリヌクレオチドは、その５’相同性アーム及び３’相同性アームによって認識される標的遺伝子座に組み込まれて、遺伝子修飾細胞を産生する、導入すること
を含む方法。
４８．細胞をリコンビニアリングによって遺伝子修飾する方法であって、前記方法は、
ａ）態様１～１６（例えば、態様１２）の改変レトロンを細胞にトランスフェクトすること；及び
ｂ）細胞にバクテリオファージ組換えタンパク質を導入することであって、バクテリオファージ組換えタンパク質は、標的遺伝子座における相同組換えを媒介し、それにより、改変レトロンによって生成されるドナーポリヌクレオチドは、その５’相同性アーム及び３’相同性アームによって認識される標的遺伝子座に組み込まれて、遺伝子修飾細胞を産生する、導入すること
を含む方法。
【0175】
４９．ドナーポリヌクレオチドは、細菌細胞のプラスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）又は細菌染色体をリコンビニアリングによって修飾するために使用される、態様４８の方法。
【0176】
５０．ドナーポリヌクレオチドは、遺伝子置換、遺伝子ノックアウト、欠失、挿入、逆位又は点突然変異を作り出すために使用される、態様４８又は４９の方法。
５１．前記細胞にバクテリオファージ組換えタンパク質を導入することは、細菌ゲノムへの複製欠損λプロファージの挿入を含む、態様４８～５０のいずれかの方法。
５１．前記細胞にバクテリオファージ組換えタンパク質を導入することは、細菌ゲノムへの複製欠損λプロファージの挿入を含む、態様４８～５０のいずれかの方法。
【0177】
５２．バクテリオファージは、ｅｘｏ、ｂｅｔ及びｇａｍ遺伝子を含む、態様５１の方法。
５３．細胞をバーコーディングする方法であって、細胞に、態様１～１５又は１６（例えば、態様１５又は１６）の改変レトロンをトランスフェクトすることを含む方法。
５３．細胞をバーコーディングする方法であって、細胞に、態様１～１５又は１６（例えば、態様１５又は１６）の改変レトロンをトランスフェクトすることを含む方法。
【0178】
５４．インビボ分子レコーディングシステムを作製する方法であって、
ａ）ＣＲＩＳＰＲ適応システムのＣａｓｌタンパク質又はＣａｓ２タンパク質を宿主細胞に導入すること；
ｂ）リーダ配列及び少なくとも１つのリピート配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイ核酸配列を宿主細胞に導入することであって、ＣＲＩＳＰＲアレイ核酸配列は、宿主細胞内のゲノムＤＮＡ又はベクターに組み込まれる、導入すること；及び
ｃ）態様１～１６（例えば、態様１３又は１４）に係る複数の改変レトロンを宿主細胞に導入することであって、各レトロンは、プロセシングされ、且つＣＲＩＳＰＲアレイ核酸配列に挿入され得る異なるプロトスペーサＤＮＡ配列を含む、導入すること
を含む方法。
ａ）ＣＲＩＳＰＲ適応システムのＣａｓｌタンパク質又はＣａｓ２タンパク質を宿主細胞に導入すること；
ｂ）リーダ配列及び少なくとも１つのリピート配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイ核酸配列を宿主細胞に導入することであって、ＣＲＩＳＰＲアレイ核酸配列は、宿主細胞内のゲノムＤＮＡ又はベクターに組み込まれる、導入すること；及び
ｃ）態様１～１６（例えば、態様１３又は１４）に係る複数の改変レトロンを宿主細胞に導入することであって、各レトロンは、プロセシングされ、且つＣＲＩＳＰＲアレイ核酸配列に挿入され得る異なるプロトスペーサＤＮＡ配列を含む、導入すること
を含む方法。
【0179】
５５．Ｃａｓｌタンパク質又はＣａｓ２タンパク質は、ベクターによって提供される、態様５４の方法。
５６．改変レトロンは、ベクターによって提供される、態様５４又は５５の方法。
５６．改変レトロンは、ベクターによって提供される、態様５４又は５５の方法。
【0180】
５７．複数の改変レトロンは、少なくとも３つの異なるプロトスペーサＤＮＡ配列を含む、態様５４～５６のいずれかの方法。
５８．インビボ分子レコーディングシステムを含む改変細胞であって、
ａ）ＣＲＩＳＰＲ適応システムのＣａｓｌタンパク質又はＣａｓ２タンパク質；
ｂ）宿主細胞へのリーダ配列及び少なくとも１つのリピート配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイ核酸配列であって、改変細胞内のゲノムＤＮＡ又はベクターに組み込まれるＣＲＩＳＰＲアレイ核酸配列；及び
ｃ）態様１～１６（又は態様１３又は１４）に係る複数の改変レトロンであって、各レトロンは、プロセシングされ、且つＣＲＩＳＰＲアレイ核酸配列に挿入され得る異なるプロトスペーサＤＮＡ配列を含む、複数の改変レトロン
を含む改変細胞。
５８．インビボ分子レコーディングシステムを含む改変細胞であって、
ａ）ＣＲＩＳＰＲ適応システムのＣａｓｌタンパク質又はＣａｓ２タンパク質；
ｂ）宿主細胞へのリーダ配列及び少なくとも１つのリピート配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイ核酸配列であって、改変細胞内のゲノムＤＮＡ又はベクターに組み込まれるＣＲＩＳＰＲアレイ核酸配列；及び
ｃ）態様１～１６（又は態様１３又は１４）に係る複数の改変レトロンであって、各レトロンは、プロセシングされ、且つＣＲＩＳＰＲアレイ核酸配列に挿入され得る異なるプロトスペーサＤＮＡ配列を含む、複数の改変レトロン
を含む改変細胞。
【0181】
５９．Ｃａｓｌタンパク質又はＣａｓ２タンパク質は、ベクターによって提供される、態様５８の改変細胞。
６０．改変レトロンは、ベクターによって提供される、態様５８又は５９の改変細胞。
６０．改変レトロンは、ベクターによって提供される、態様５８又は５９の改変細胞。
【0182】
６１．複数の改変レトロンは、少なくとも３つの異なるプロトスペーサＤＮＡ配列を含む、態様５８～６０のいずれかの改変細胞。
６２．態様５８～６１のいずれかの改変細胞と、インビボ分子レコーディングのための説明書とを含むキット。
６２．態様５８～６１のいずれかの改変細胞と、インビボ分子レコーディングのための説明書とを含むキット。
【0183】
６０．組換えｍｓＤＮＡを作製する方法であって、
ａ）宿主細胞に、態様１～１６のいずれかの改変レトロン又は態様１７～３４のいずれかのベクターシステムをトランスフェクトすること；及び
ｂ）宿主細胞を好適な条件下で培養することであって、ｍｓＤＮＡは、産生される、培養すること
を含む方法。
ａ）宿主細胞に、態様１～１６のいずれかの改変レトロン又は態様１７～３４のいずれかのベクターシステムをトランスフェクトすること；及び
ｂ）宿主細胞を好適な条件下で培養することであって、ｍｓＤＮＡは、産生される、培養すること
を含む方法。
【実施例】
【0184】
以下の例は、開示される主題をどのように作製及び使用するかについて当業者に開示及び説明を与えるために提示されるものであり、本発明者らがその発明と考えるものの範囲を限定する意図はなく、以下の実験が、実施される全ての又は唯一の実験であることを表明する意図もない。使用する数値（例えば、量、温度等）に関して正確を期すように努力しているが、幾らかの実験誤差及び偏差が考慮されなければならない。特に指示がない限り、部数（ｐａｒｔｓ）は、重量部数であり、分子量は、重量平均分子量であり、温度は、セルシウス度であり、及び圧力は、大気圧又はその近傍である。標準的な略称、例えばｂｐ、塩基対；ｋｂ、キロベース；ｐｌ、ピコリットル；ｓ又はｓｅｃ、秒；ｍｉｎ、分；ｈ又はｈｒ、時間；ａａ、アミノ酸；ｋｂ、キロベース；ｂｐ、塩基対；ｎｔ、ヌクレオチド；ｉ．ｍ．、筋肉内；ｉ．ｐ．、腹腔内；ｓ．ｃ．、皮下などが用いられ得る。
【0185】
実施例１：材料及び方法
本実施例では、本発明の開発に使用した材料、方法の一部を例示する。
細菌株、プラスミド及び培養条件
実験は、組み込まれたアラビノース誘導性Ｔ７ポリメラーゼ、内因性ＣＲＩＳＰＲアレイ、内因性レトロンを含有するが、内因性Ｃａｓ１＋２を含有しないＢＬ２１－ＡＩ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（サーモ・フィッシャー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ））又は組み込まれたアラビノース誘導性Ｔ７ポリメラーゼを含有し、内因性レトロンを含有しない、ＭＧ１６５５の変異株であるｂＭＳ．３４６で行った。
本実施例では、本発明の開発に使用した材料、方法の一部を例示する。
細菌株、プラスミド及び培養条件
実験は、組み込まれたアラビノース誘導性Ｔ７ポリメラーゼ、内因性ＣＲＩＳＰＲアレイ、内因性レトロンを含有するが、内因性Ｃａｓ１＋２を含有しないＢＬ２１－ＡＩ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（サーモ・フィッシャー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ））又は組み込まれたアラビノース誘導性Ｔ７ポリメラーゼを含有し、内因性レトロンを含有しない、ＭＧ１６５５の変異株であるｂＭＳ．３４６で行った。
【0186】
図３Ｂ、図３Ｃ、図４Ｄ、図７Ｂ、図７Ｃ－２、図８Ｂ、図９Ｂ及び図１０Ｂ～図１０Ｄに示すレトロンベースの実験では、プラスミドからエリスロマイシン誘導性プロモータ（ｍｐｈＲ－ｅｃ８６ＲＴ）で逆転写酵素を発現させた（ロジャーズ（Ｒｏｇｅｒｓ）ら著、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）、２０１５年９月３日、第４３巻、第１５号、ｐ．７６４８～６０、ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｖ６１６、電子版、２０１５年７月７日（本明細書によって全体として参照により援用される）を参照されたい）。ｍｓｄ及びｍｓｒエレメントは、誘導性Ｔ７プロモータから一緒に（ＤＵＥＴ－Ｔ７－ｍｓｒ／ｍｓｄ）又は別々に（ＤＵＥＴ－Ｔ７－ｍｓｒ－Ｔ７－ｍｓｄ）発現させた。
【0187】
図１１Ａ～図１１Ｂに関連して説明されるレトロン生成プロトスペーサ実験について、各実験前に、いずれも誘導性（Ｔ７／ｌａｃ）プロモータによって発現させた、Ｃａｓ１＋２及び修飾されたｅｃ８６ ｍｓｒ／ｍｓｄをコードするプラスミド（ＤＵＥＴ－ｍｓｒ／ｍｓｄ－Ｃａｓ１＋２）を細胞に形質転換した。プラスミドを含有する細胞は、プレート上に４℃で最長３週間、コロニーで維持した。細胞は、ＬＢ培地において３４℃で成長させて、ＩＰＴＧ、Ｌ－アラビノース及び／又はエリスロマイシンを使用して、指示される期間にわたって誘導した。
【0188】
ｍｓｄの電気泳動分析
修飾レトロンから産生されたｍｓｄを視覚化するため、ｍｓｒ含有、ｍｓｄ含有及び逆転写酵素含有転写物を発現させるのに必要なあらゆる誘導物質を含むＬＢで細菌を４～１６時間培養した。５～２５ｍｌの容積の培養物を４℃でペレット化し、次にプラスミド・プラス・ミディ・キット（Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｌｕｓ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ）（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）））又はミニ・キット（Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ）を使用して調製した。次に、ＲＮアーゼＡとＲＮアーゼＴ１との組み合わせを用いてＲＮＡを消化し、得られたｍｓｄを、ｓｓＤＮＡ／ＲＮＡ精製及び濃縮キット（ｓｓＤＮＡ／ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ ｋｉｔ）（ザイモ・リサーチ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ））を使用して精製した。Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＴＢＥ－尿素ゲル（サーモ・フィッシャー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ））に流し、サイバー・ゴールド（ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｏｌｄ）（サーモ・フィッシャー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ））で後染色することにより、ｍｓｄを視覚化した。
修飾レトロンから産生されたｍｓｄを視覚化するため、ｍｓｒ含有、ｍｓｄ含有及び逆転写酵素含有転写物を発現させるのに必要なあらゆる誘導物質を含むＬＢで細菌を４～１６時間培養した。５～２５ｍｌの容積の培養物を４℃でペレット化し、次にプラスミド・プラス・ミディ・キット（Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｌｕｓ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ）（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）））又はミニ・キット（Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ）を使用して調製した。次に、ＲＮアーゼＡとＲＮアーゼＴ１との組み合わせを用いてＲＮＡを消化し、得られたｍｓｄを、ｓｓＤＮＡ／ＲＮＡ精製及び濃縮キット（ｓｓＤＮＡ／ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ ｋｉｔ）（ザイモ・リサーチ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ））を使用して精製した。Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＴＢＥ－尿素ゲル（サーモ・フィッシャー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ））に流し、サイバー・ゴールド（ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｏｌｄ）（サーモ・フィッシャー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ））で後染色することにより、ｍｓｄを視覚化した。
【0189】
変異体ライブラリ構築
アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）又はツイスト（Ｔｗｉｓｔ）により、レトロンｎｃＲＮＡ変異体ライブラリが１回の合成ラン当たり複数のライブラリでオリゴプールとして合成された。これらのオリゴプールから単一のライブラリを増幅し、ＮＥＢ５ａ細胞をクローニング株として使用して、ゴールデンゲート手法を用いて発現ベクターにクローニングした。これらのクローニングしたライブラリをクローニング株から精製し、発現株（ＢＬ２１－ＡＩ又はｂＭＳ．３４６）に移入した。ライブラリは、全てイルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）シーケンシングによって定量化した。
アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）又はツイスト（Ｔｗｉｓｔ）により、レトロンｎｃＲＮＡ変異体ライブラリが１回の合成ラン当たり複数のライブラリでオリゴプールとして合成された。これらのオリゴプールから単一のライブラリを増幅し、ＮＥＢ５ａ細胞をクローニング株として使用して、ゴールデンゲート手法を用いて発現ベクターにクローニングした。これらのクローニングしたライブラリをクローニング株から精製し、発現株（ＢＬ２１－ＡＩ又はｂＭＳ．３４６）に移入した。ライブラリは、全てイルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）シーケンシングによって定量化した。
【0190】
シーケンシング及び分析
ライブラリ実験におけるＲＴ－ＤＮＡ存在量を分析するため、レトロン変異体のライブラリを含有する細胞における発現後、逆転写されたＤＮＡを上記に記載したとおり精製した。５～２５ｍｌの容積の培養物を４℃でペレット化し、次にプラスミド・プラス・ミディ・キット（Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｌｕｓ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ）（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）））又はミニ・キット（Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ）を使用して調製した。次に、ＲＮアーゼＡとＲＮアーゼＴ１との組み合わせを用いてＲＮＡを消化し、得られたｍｓｄを、ｓｓＤＮＡ／ＲＮＡ精製及び濃縮キット（ｓｓＤＮＡ／ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ ｋｉｔ）（ザイモ・リサーチ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ））を使用して精製した。修飾が逆転写エレメントの外側にある変異体ライブラリでは（例えば、図７Ｃ－２）、逆転写されたＤＮＡのループにあるバーコード付加領域を発現後に増幅し、イルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）シーケンシングのために調製した。修飾が逆転写エレメントの内側にある変異体ライブラリでは（例えば、図８Ｂ）、末端デオキシヌクレオチド転換酵素（ＴｄＴ：Ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を使用して、追加のヌクレオチドの長さをＴｄＴインキュベーションの時間によって制御しながら（図６Ｂ）、精製した逆転写ＤＮＡのプールを３’末端で単一ヌクレオチドによって伸長させた。次に、アダプター配列、伸長に使用されるヌクレオチドに相補的な一続きのヌクレオチド及びアンカリング用ヌクレオチド（伸長に使用されるヌクレオチドに相補的でないあらゆる塩基のもの）で構成されるリバースプライマーを使用して、第２鎖を、クレノウ断片（３’→５’エキソ－）を用いて作り出し、これにより５’末端にＡオーバーハングが残った。このオーバーハングを成すＡをＴＡライゲーションに使用して、反対側の５’末端がアミノ修飾された二本鎖アダプターを取り付けた（図６Ａ）。次に、両端にアダプターを付加したヌクレオチドのこのプールをインデックス化し、イルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）シーケンシングのために調製した。全ての変異体ライブラリにおいて、可変領域を増幅し、その領域をイルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）シーケンシングに供することにより、細胞に存在するプラスミドのプールを定量化した。次に、共発現した野生型レトロンで正規化した変異体プラスミドの比率と逆転写ＤＮＡ中の変異体の比率を比較することにより、種々の逆転写ＤＮＡの相対的存在量を計算した。
ライブラリ実験におけるＲＴ－ＤＮＡ存在量を分析するため、レトロン変異体のライブラリを含有する細胞における発現後、逆転写されたＤＮＡを上記に記載したとおり精製した。５～２５ｍｌの容積の培養物を４℃でペレット化し、次にプラスミド・プラス・ミディ・キット（Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｌｕｓ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ）（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）））又はミニ・キット（Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ）を使用して調製した。次に、ＲＮアーゼＡとＲＮアーゼＴ１との組み合わせを用いてＲＮＡを消化し、得られたｍｓｄを、ｓｓＤＮＡ／ＲＮＡ精製及び濃縮キット（ｓｓＤＮＡ／ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ ｋｉｔ）（ザイモ・リサーチ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ））を使用して精製した。修飾が逆転写エレメントの外側にある変異体ライブラリでは（例えば、図７Ｃ－２）、逆転写されたＤＮＡのループにあるバーコード付加領域を発現後に増幅し、イルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）シーケンシングのために調製した。修飾が逆転写エレメントの内側にある変異体ライブラリでは（例えば、図８Ｂ）、末端デオキシヌクレオチド転換酵素（ＴｄＴ：Ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を使用して、追加のヌクレオチドの長さをＴｄＴインキュベーションの時間によって制御しながら（図６Ｂ）、精製した逆転写ＤＮＡのプールを３’末端で単一ヌクレオチドによって伸長させた。次に、アダプター配列、伸長に使用されるヌクレオチドに相補的な一続きのヌクレオチド及びアンカリング用ヌクレオチド（伸長に使用されるヌクレオチドに相補的でないあらゆる塩基のもの）で構成されるリバースプライマーを使用して、第２鎖を、クレノウ断片（３’→５’エキソ－）を用いて作り出し、これにより５’末端にＡオーバーハングが残った。このオーバーハングを成すＡをＴＡライゲーションに使用して、反対側の５’末端がアミノ修飾された二本鎖アダプターを取り付けた（図６Ａ）。次に、両端にアダプターを付加したヌクレオチドのこのプールをインデックス化し、イルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）シーケンシングのために調製した。全ての変異体ライブラリにおいて、可変領域を増幅し、その領域をイルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）シーケンシングに供することにより、細胞に存在するプラスミドのプールを定量化した。次に、共発現した野生型レトロンで正規化した変異体プラスミドの比率と逆転写ＤＮＡ中の変異体の比率を比較することにより、種々の逆転写ＤＮＡの相対的存在量を計算した。
【0191】
スペーサ獲得を分析するため、細菌を９５℃に５分間加熱することにより溶解させ、次にリーダ－リピートジャンクションに隣接し、且つイルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）適合性アダプターを更に含有するプライマーを使用したそのゲノムアレイのＰＣＲに供した。隣接するリピート配列の存在に基づいてスペーサ配列をバイオインフォマティクス的に抽出し、既存のスペーサ配列と比較して、伸長されたアレイの割合並びに新規に獲得されたスペーサの位置及び配列を決定した。新規スペーサをゲノム及びプラスミド配列に対してブラスト（ＮＣＢＩ）し、意図されるプロトスペーサ配列と更に比較して、プロトスペーサの起源を決定した。この分析は、パイソン（Ｐｙｔｈｏｎ）においてカスタムで記述されたスクリプトを用いて実施した。
【0192】
実施例２：細胞でのＤＮＡ産生亢進のための細菌レトロエレメント（レトロン）
生細胞のゲノムを書き換えるには、新規ＤＮＡが必要である。現在、研究者らは、このＤＮＡを外因的に合成し、それを細胞に送達しており、それは、ゲノム改変の鋳型又は細胞若しくは細胞イベントに印を付けるバーコードとしての役割を果たす。しかしながら、特に複雑な組織内での相同組換え修復（ＨＤＲ）及び組込みの過程における効率の悪さを解消するのに十分な存在量で外因性ＤＮＡを送達することは、依然として非常に難題である。更に、特定のＤＮＡ配列を有する細胞のサブ集団のターゲティングが可能となるように送達を細胞型又は細胞状態別にゲート制御する手段はない。
生細胞のゲノムを書き換えるには、新規ＤＮＡが必要である。現在、研究者らは、このＤＮＡを外因的に合成し、それを細胞に送達しており、それは、ゲノム改変の鋳型又は細胞若しくは細胞イベントに印を付けるバーコードとしての役割を果たす。しかしながら、特に複雑な組織内での相同組換え修復（ＨＤＲ）及び組込みの過程における効率の悪さを解消するのに十分な存在量で外因性ＤＮＡを送達することは、依然として非常に難題である。更に、特定のＤＮＡ配列を有する細胞のサブ集団のターゲティングが可能となるように送達を細胞型又は細胞状態別にゲート制御する手段はない。
【0193】
設計したＤＮＡ配列を、自ら選択した細胞の内部においてオンデマンドで多量に作製することが － ＲＮＡ及びタンパク質に関して行っているように － 可能であれば、ＨＤＲにおける効率の悪さを解消し、種々の細胞に種々の鋳型を送達する能力を解放することが可能となるであろう。これらの局所的に産生されるＤＮＡ鋳型を使用すれば、ゲノムを編集することからゲノムを書き込むことにシフトすることが可能となるであろう。ＤＮＡオンデマンドは、細菌ゲノムをコードし直すλ Ｒｅｄβ、ヒトゲノムに治療用修飾を書き込むＣａｓ９及び生細胞内での分子イベントのタイミングのログを取る分子デバイスを作り出すＣＲＩＳＰＲインテグラーゼＣａｓ１＋２を含め、数々のＤＮＡ修飾用タンパク質を刺激する（ｆｕｅｌ）であろう。
【0194】
本明細書に記載されるとおり、逆転写酵素は、種々の配列を有する種々のＤＮＡを含め、豊富な量のＤＮＡを産生するための解決法である。逆転写酵素は、豊富なＤＮＡを生成することができるのみならず、現在ＲＮＡ及びタンパク質発現が制御されているのと同じ方法で時間的及び空間的にその活性を制御することができる。従って、逆転写酵素を広く送達することにより、標的化される一部の細胞集合において豊富な鋳型ＤＮＡを生成することができる。
【0195】
特に魅力的な逆転写酵素クラスは、細菌に由来するものであり、レトロンと呼ばれている（イノウエ（Ｉｎｏｕｙｅ）及びイノウエ（Ｉｎｏｕｙｅ）著、アニュアル・レビュー・オブ・マイクロバイオロジー（Ａｎｎｕａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、第４５巻、ｐ．１６３～１８６、１９９１年）（例えば、図１Ａを参照されたい）。レトロンは、コンパクトであり、モジュール式であり、真核細胞と直交性があり、他のタンパク質に接触可能なＤＮＡを産生することが示されており、及び原核細胞（ファルザドファルド（Ｆａｒｚａｄｆａｒｄ）及びルー（Ｌｕ）著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第３４６巻、ｐ．１２５６２７２、２０１４年）及び真核細胞（シャロン（Ｓｈａｒｏｎ）ら著、セル（Ｃｅｌｌ）、第１７５巻、ｐ．５４４～５５７、２０１８年）の両方でゲノム編集のための鋳型ＤＮＡとしての役割を果たしている（図１Ｂ、図１Ｃ）。しかし、レトロンの生物学に関してなおも未知の部分が多分にあり、この知識の欠落は、細胞内部での完全に設計されたＤＮＡ配列の生成に向けたレトロンの使用の妨げとなっている。
【0196】
ここで、本発明者らは、細胞内でＣＲＩＳＰＲ適合性の任意のＤＮＡ配列を多量に産生するようにレトロンを更に特徴付けて改変することにより、直接的にレトロンの限界に取り組む。大多数の改変は、ハイスループットを達成するために大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で実施したが、本明細書に記載される修飾されたレトロン及びシステムを真核細胞（ヒトを含む）で使用して、ゲノム書込みに関連して改善をもたらすことができる。
【0197】
例えば、ある場合にはレトロン－Ｅｃｏ１を例示的レトロンとして使用した。図２Ａに示されるとおり、この転写物は、逆転写酵素によって認識され、部分的にＲＴ－ＤＮＡに逆転写される。以下に、逆転写されたレトロン－Ｅｃｏ１ ＤＮＡ（ＲＴ－ＤＮＡ）の配列を配列番号１４として示す。
【0198】
【化3】
【0199】
実施例３：改変レトロン変異体のスクリーニング
本発明者らは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でレトロン－Ｅｃｏ１（ｅｃ８６又はレトロン－Ｅｃｏ１ ｎｃＲＮＡとも称される）を発現させた。以下に、この野生型レトロン－Ｅｃｏ１ ｎｃＲＮＡの配列を配列番号１５として示す。
本発明者らは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でレトロン－Ｅｃｏ１（ｅｃ８６又はレトロン－Ｅｃｏ１ ｎｃＲＮＡとも称される）を発現させた。以下に、この野生型レトロン－Ｅｃｏ１ ｎｃＲＮＡの配列を配列番号１５として示す。
【0200】
【化4】
【0201】
定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ：Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ）により、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現したレトロン－Ｅｃｏ１の発現により、１細胞当たり約８００～１，０００コピーのｓｓＤＮＡが生じたことが示された（図３Ｂ）。図３Ｃに図示されるとおり、このように産生されたｓｓＤＮＡは、変性ゲル上で視覚化、定量化及び精製することができる。
【0202】
本発明者らは、様々なレトロンエレメントをコードするコンストラクトも作成した。例えば、逆転写酵素をｍｓｒ／ｍｓｄ（プライマー－鋳型）と分離して、ｍｓｒ及びｍｓｄを（典型的なシス構成でなく）トランスで逆転写酵素に供給できるようにした（図４Ａ、図４Ｂ）。このトランス構成により、逆転写酵素の潜在的な終結シグナルがなくなる。以下に、レトロン－Ｅｃｏ１ ｍｓｒのみの領域の配列を配列番号１６として示す。
【0203】
【化5】
【0204】
以下に、レトロン－Ｅｃｏ１ ｍｓｄのみの領域の配列を配列番号１７として示す。
【0205】
【化6】
【0206】
ロースループット実験を用いて、逆転写酵素が許容する変更をｍｓｄエレメントに加えた。例えば、２つの変異体、レトロン－Ｅｃｏ１ ｖ３２ ｎｃＲＮＡ及びレトロン－Ｅｃｏ１ ｖ３５ ｎｃＲＮＡが産生された。以下に、レトロン－Ｅｃｏ１ ｖ３２ ｎｃＲＮＡの配列を配列番号１８として示す。
【0207】
【化7】
【0208】
以下に、レトロン－Ｅｃｏ１ ｖ３５ ｎｃＲＮＡの配列を配列番号１９として示す。
【0209】
【化8】
【0210】
レトロン－Ｅｃｏ１ ｖ３２ ｎｃＲＮＡ及びレトロン－Ｅｃｏ１ ｖ３５ ｎｃＲＮＡの鍵となる部分を図３Ｄに示す。
レトロン－Ｅｃｏ１ ｎｃＲＮＡに対して多くの修飾を行った。しかしながら、試みた修飾の全てが成功したわけではなかった。場合により、修飾したバージョンの大半は、細胞においてｓｓＤＮＡを産生しなかった。
レトロン－Ｅｃｏ１ ｎｃＲＮＡに対して多くの修飾を行った。しかしながら、試みた修飾の全てが成功したわけではなかった。場合により、修飾したバージョンの大半は、細胞においてｓｓＤＮＡを産生しなかった。
【0211】
レトロンからのｍｓｄ産生の決定因子を更によく理解するため、本発明者らは、ライブラリベースの手法を取った。数万個のレトロン変異体を合成し、レトロンの各構造パラメータについて系統的に試験した（図５）。ゴールデンゲートベースのクローニング戦略（エングラー（Ｅｎｇｌｅｒ）ら著、プロス・ワン（ＰＬＯＳ Ｏｎｅ）（２００８年１１月５日）を使用してこれらの変異体をクローニングし、次に修飾されたレトロンの大型プールをマルチプレックス実験で逆転写酵素と共に発現させた。これらの細胞によって産生された全てのｍｓｄを精製し、それらをシーケンシングし、発現株でその存在量をその元のレトロン／プラスミドと比較することにより、レトロンの特定のパラメータの影響を、それがｓｓＤＮＡ産生に関連するものとして定量化した。ｅｃ８６レトロンを使用したと共に、他のレトロンも、内部分枝構造を有するｅｃ８３レトロンを含めて使用した。
【0212】
レトロン逆転写酵素は、典型的には、標準外の方法でプライミングすることにより、ｍｓｒ ＲＮＡを２’位でリン酸ジエステル結合によってｍｓｄ ｓｓＤＮＡの５’末端に連結する分枝状ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッドを作り出す（イノウエ（Ｉｎｏｕｙｅ）及びイノウエ（Ｉｎｏｕｙｅ）著、アニュアル・レビュー・オブ・マイクロバイオロジー（Ａｎｎｕａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、第４５巻、ｐ．１６３～１８６、１９９１年）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、この結合を切断する酵素を有しない。従って、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内にあるとき、ｅｃ８６レトロンは、分枝状のままである。しかしながら、ｅｃ８３は、レトロンに固有の未知の機構を通してプロセシングされ、２’－５’連結を取り除いてｓｓＤＮＡを遊離させることも報告されている（リム（Ｌｉｍ）著、モレキュラー・バイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、第６巻、ｐ．３５３１～３５４２、１９９２年）。かかる分離は、ゲノム改変における様々な適用に有益であり得る。
【0213】
実施例４：改変レトロン変異体のシーケンシング
精製したｓｓＤＮＡのプールには、設計上、未知の部分（例えば、異なる末端）が含まれるため、実験のリードアウトとしてのレトロン由来のｓｓＤＮＡのシーケンシングに多大な複雑さが持ち込まれる。従来のパイプラインを用いて、これらのｓｓＤＮＡをマルチプレックスシーケンシングのために調製することはできない。この難題に取り組むため、本発明者らは、ｓｓＤＮＡの精製、ＲＮＡアーゼによるｓｓＤＮＡの処理及びレトロン由来のｓｓＤＮＡの脱分枝が関わるカスタムのシーケンシングパイプラインを開発した。次に、精製及び脱分枝したレトロンｓｓＤＮＡに対して、鋳型非依存的ポリメラーゼ（ＴｄＴ）を使用して一続きの単一種のポリヌクレオチドの尾部を付加した。次に、アダプターを含有する逆アンカー型プライマーを使用して、ｓｓＤＮＡの相補鎖を生成した（図６Ａ、図６Ｂ）。この二本鎖ＤＮＡに第２のアダプターをライゲートし、次にこのアダプターが連結した二本鎖ＤＮＡをインデックス化して、マルチプレックスシーケンシングに供した。
精製したｓｓＤＮＡのプールには、設計上、未知の部分（例えば、異なる末端）が含まれるため、実験のリードアウトとしてのレトロン由来のｓｓＤＮＡのシーケンシングに多大な複雑さが持ち込まれる。従来のパイプラインを用いて、これらのｓｓＤＮＡをマルチプレックスシーケンシングのために調製することはできない。この難題に取り組むため、本発明者らは、ｓｓＤＮＡの精製、ＲＮＡアーゼによるｓｓＤＮＡの処理及びレトロン由来のｓｓＤＮＡの脱分枝が関わるカスタムのシーケンシングパイプラインを開発した。次に、精製及び脱分枝したレトロンｓｓＤＮＡに対して、鋳型非依存的ポリメラーゼ（ＴｄＴ）を使用して一続きの単一種のポリヌクレオチドの尾部を付加した。次に、アダプターを含有する逆アンカー型プライマーを使用して、ｓｓＤＮＡの相補鎖を生成した（図６Ａ、図６Ｂ）。この二本鎖ＤＮＡに第２のアダプターをライゲートし、次にこのアダプターが連結した二本鎖ＤＮＡをインデックス化して、マルチプレックスシーケンシングに供した。
【0214】
合成したオリゴヌクレオチド、野生型及び修飾ｅｃ８６並びに野生型ｅｃ８３を使用して、このパイプラインを検証した。この方法は、合成オリゴヌクレオチドの正しい配列を確実に決定した。
【0215】
興味深いことに、このマルチプレックス化した単一分子方法を用いると、ｅｃ８６レトロン由来のｓｓＤＮＡは、典型的には、旧式のバルク方法論（例えば、マクサム・ギルバートシーケンシング）を用いる文献の報告と比べて１つ前の塩基で終結する。ｅｃ８３の切断及び予想される内因性エキソヌクレアーゼプロセシングも確認された（図６Ｃ～図６Ｆ）。レトロン由来のｓｓＤＮＡがシーケンシングされるため、レトロンのｍｓｄ（鋳型）部分の修飾を直接読み取ることができる。
【0216】
本発明者らは、逆転写されないｎｃＲＮＡのパラメータを理解することも目標とする。これらのパラメータを読み出すため、非逆転写領域の変異体を、ｍｓｄのループ領域に挿入したバーコードに連結した（図７Ａ）。この手法により、変異体を直接シーケンシングしなくても、配列変異が例えばｓｓＤＮＡ産生に及ぼす効果が明らかになった。
【0217】
実施例５：細胞におけるＤＮＡ産生を増加させる修飾
本実施例は、ｍｓｒ及びｍｓｄ転写物を分離すると、より長いＲＴ－ＤＮＡの産生が可能となり得ることと、レトロンの自己相補的非コードＲＮＡ領域の長さを修飾すると、レトロンによって生成される逆転写ＤＮＡの存在量が増加し得ることとを示す。
本実施例は、ｍｓｒ及びｍｓｄ転写物を分離すると、より長いＲＴ－ＤＮＡの産生が可能となり得ることと、レトロンの自己相補的非コードＲＮＡ領域の長さを修飾すると、レトロンによって生成される逆転写ＤＮＡの存在量が増加し得ることとを示す。
【0218】
実施例３に記載されるとおり、レトロン－Ｅｃｏ１ ｍｓｒ及びｍｓｄエレメントをコードするトランスコンストラクトの発現により、逆転写酵素の潜在的終結シグナルがなくなり、より長いｓｓＤＮＡの生成を生じさせることが可能となる（図４Ｃ、図４Ｄ）。
【0219】
伸長型トランスレトロン－Ｅｃｏ１ ｍｓｄ配列の一例は、レトロン－Ｅｃｏ１ ｍｓｄ ＋５０と称され、以下に配列番号２０として示す。
【0220】
【化9】
【0221】
図７に示されるとおり、レトロン－Ｅｃｏ１ ｎｃＲＮＡの５’末端及び３’末端で自己相補性領域を伸長させると、レトロンによって細胞で産生されるＲＴ－ＤＮＡの存在量の大幅な増加につながる。以下に、伸長型レトロン－Ｅｃｏ１ ｎｃＲＮＡの一例を配列番号２１として示す。
【0222】
【化10】
【0223】
以下に、配列がやや異なる伸長型レトロン－Ｅｃｏ１ ｖ３５ ｎｃＲＮＡの例を示す（配列番号２２）。
【0224】
【化11】
【0225】
図７Ｂ～図７Ｃに図示されるとおり、レトロン－Ｅｃｏ１ ｎｃＲＮＡの５’末端及び３’末端で自己相補性領域を伸長させると、レトロンによって細胞で産生されるＲＴ－ＤＮＡの存在量の大幅な増加につながる。例えば、ｍｓｄ配列自己相補性領域の長さを増加させることにより、ｓｓＤＮＡの相対量の１０倍の増加を生じさせることができる。
【0226】
逆に、ｎｃＲＮＡ自己相補性塩基が減少すると、ＲＴ－ＤＮＡの産生が大きく減少した。例えば、以下に、自己相補性配列が短いレトロン－Ｅｃｏ１ ｎｃＲＮＡの１つの配列を配列番号２３として示す。
【0227】
【化12】
【0228】
図７Ｃに示されるとおり、これらの相補性塩基の数が減少すると、ＲＴ－ＤＮＡの産生が大きく減少した。
従って、ｍｓｒ前／ｍｓｄ後自己相補性領域を伸長させると、ｓｓＤＮＡのプールを増加させることができる。遺伝子修飾に逆転写ｓｓＤＮＡのより大きいプールを利用可能であり、細菌（リコンビニアリング）、酵母（ＣＲＩＳＰＥＹ）及び哺乳類細胞におけるゲノム編集効率が高まり得る。生細胞において多量のＤＮＡを産生する目的上、伸長型自己相補性領域を有するこれらの変異体は、好ましい。
従って、ｍｓｒ前／ｍｓｄ後自己相補性領域を伸長させると、ｓｓＤＮＡのプールを増加させることができる。遺伝子修飾に逆転写ｓｓＤＮＡのより大きいプールを利用可能であり、細菌（リコンビニアリング）、酵母（ＣＲＩＳＰＥＹ）及び哺乳類細胞におけるゲノム編集効率が高まり得る。生細胞において多量のＤＮＡを産生する目的上、伸長型自己相補性領域を有するこれらの変異体は、好ましい。
【0229】
実施例６：ｍｓｄステム領域は、全てではないが、一部の修飾を許容する
レトロン－Ｅｃｏ１ ｎｃＲＮＡ領域のｍｓｄステム領域に対して、ステム二次構造（二本鎖結合）を破壊する修飾を加えた。本実施例は、レトロンによって産生される逆転写ｓｓＤＮＡの存在量に悪影響を及ぼすことなくｍｓｄステムのいずれの箇所に修飾を加え得るかを示す。
レトロン－Ｅｃｏ１ ｎｃＲＮＡ領域のｍｓｄステム領域に対して、ステム二次構造（二本鎖結合）を破壊する修飾を加えた。本実施例は、レトロンによって産生される逆転写ｓｓＤＮＡの存在量に悪影響を及ぼすことなくｍｓｄステムのいずれの箇所に修飾を加え得るかを示す。
【0230】
図８Ａ～図８Ｂ及び図９Ａ～図９Ｂにおいて、ｍｓｄステムに沿った修飾位置を示す。
ｍｓｄステム構造の長さを修飾すると、より短いＲＴ－ＤＮＡ配列を作り出すことができる。例えば、以下に、なおも野生型レベルのｓｓＤＮＡを提供する短さの短いステムのレトロン－Ｅｃｏ１ ｎｃＤＮＡについての１つの配列（レトロン－Ｅｃｏ１ステム短さＯＫ、図８Ｂを参照されたい）を配列番号２４として示す。
ｍｓｄステム構造の長さを修飾すると、より短いＲＴ－ＤＮＡ配列を作り出すことができる。例えば、以下に、なおも野生型レベルのｓｓＤＮＡを提供する短さの短いステムのレトロン－Ｅｃｏ１ ｎｃＤＮＡについての１つの配列（レトロン－Ｅｃｏ１ステム短さＯＫ、図８Ｂを参照されたい）を配列番号２４として示す。
【0231】
【化13】
【0232】
しかしながら、ｍｓｄステム長さが１４塩基を下回って減少すると、産生されるＲＴ－ＤＮＡの存在量が悪影響を受ける（図８Ｂ）。以下に、短か過ぎるステムの配列レトロン－Ｅｃｏ１ ｎｃＤＮＡの一例を配列番号２５として示す（図８Ｂ、ステム短か過ぎる）。
【0233】
【化14】
【0234】
対照的に、レトロンのステム領域を破綻させ、次に修復すると、生成されるｓｓＤＮＡの量は、野生型と同じであるか又はやや多い。「破綻した」とは、ステムの塩基対合が例えば非相補ヌクレオチドの導入によって損なわれることを意味する。図９Ｂによって示されるとおり、連続した５塩基の変化によってｎｃＲＮＡステムの基端が破綻すると、ＲＴ－ＤＮＡの存在量が劇的に減少する。以下に、５つのミスマッチ塩基を有するかかるレトロン－Ｅｃｏ１ ｎｃＲＮＡの配列（破綻したステム、図９Ｂ）を配列番号２６として示す。
【0235】
【化15】
【0236】
しかしながら、ステム二次構造が維持されるようなステムの他方の側の相補的な変化によってこれらの塩基が補償される場合、ＲＴ－ＤＮＡ存在量は、維持される（例えば、修理された（ｆｉｘｅｄ）ステム、図９Ｂを参照されたい）。以下に、図９Ｂに示される「修理されたステム」レトロン－Ｅｃｏ１ ｎｃＲＮＡの配列を配列番号２７として示す。
【0237】
【化16】
【0238】
ステムの基端から９～２０塩基の領域におけるステムに対する修飾は、それがステム構造を破綻させるものであっても許容される（図９Ｂ、許容できる破綻した（ｔｏｌｅｒａｂｌｅ ｂｒｏｋｅｎ）ステムを参照されたい）。かかる許容できる破綻したステムは、ステムの中央に修飾（ミスマッチ）を有する。以下に、図９Ｂの許容できる破綻したステムを有するレトロン－Ｅｃｏ１ ｎｃＲＮＡの配列の一例を配列番号２８として示す。
【0239】
【化17】
【0240】
従って、生細胞でＤＮＡを産生する目的上、ステム構造の基端が維持されている限り、ｎｃＲＮＡの配列を修飾することができる。ステムの基端から約９～２０塩基の、ｍｓｄステムの中央に対する修飾は、許容され、ｓｓＤＮＡの逆転写に悪影響を与えない。
【0241】
実施例７：ｎｃＲＮＡ ｍｓｄステム領域中心は、修飾の許容性がより高い
逆転写されるレトロン－Ｅｃｏ１ ｎｃＲＮＡ領域（ｍｓｄ）の領域内にある様々な位置に小さい修飾を加え、それらの修飾の影響を、種々のｎｃＲＮＡ変異体から逆転写されたｓｓＤＮＡの量で測定した。
逆転写されるレトロン－Ｅｃｏ１ ｎｃＲＮＡ領域（ｍｓｄ）の領域内にある様々な位置に小さい修飾を加え、それらの修飾の影響を、種々のｎｃＲＮＡ変異体から逆転写されたｓｓＤＮＡの量で測定した。
【0242】
ｎｃＲＮＡの逆転写領域全体にわたる小さい修飾に対する許容性は、図１０に図示されるとおり一定しない。図１０Ｂは、ｍｓｄ相補性（ステム）領域に沿った様々な位置から３塩基を欠失させる効果を示す。図示されるとおり、ｍｓｄステムの中央からの３塩基の欠失は、有害な効果を及ぼさず、なおも高レベルのｓｓＤＮＡ産生につながった（図１０Ｂ）。しかしながら、３塩基の欠失を相補性（ステム）領域の基端の近く又はステムに隣接する領域に作ると、ｓｓＤＮＡ産生レベルが低くなることが観察された（図１０Ｂ）。ｍｓｄ領域の中央及び隣接部における３塩基の挿入（図１０Ｃ）及び一塩基変化（図１０Ｄ）についても、同様の効果が観察された。ｍｓｄステム領域の中央は、数ヌクレオチドの（例えば、５ヌクレオチド未満の）挿入及び／又は欠失を許容し、ｓｓＤＮＡ産生の大きい減少は、観察されなかったが、ｍｓｄステムの基端における隣接配列に対するかかる修飾は、許容されなかった。ｍｓｄステムの基端及び隣接領域の修飾は、ｓｓＤＮＡの逆転写の減少につながった。
【0243】
図１０Ｅは、図１０Ｂ～図１０Ｄのデータに基づいて計算したｍｓｄステム領域内の位置に関する修飾適合性スコアをグラフで図示する。生細胞においてより高レベルのＤＮＡを産生する目的上、ｎｃＲＮＡの配列は、修飾適合性スコアが高い領域で修飾しなければならず、修飾適合性スコアが低い領域の修飾は避けなければならない。
【0244】
実施例８：改変レトロンの適用
改変レトロンで細胞においてＤＮＡをオンデマンドで作り出すことにより、生細胞でのゲノムの編集からゲノムの書込みへのシフトが可能となる。このシフトにより、それまで存在していた配列に制限されることなく、細胞を治療のために修飾することになる。現在、新規のＤＮＡ ＨＤＲ鋳型は、必ずボーラスとして送達されるが、ボーラスは、時間と共に減退する。このボーラス送達の効率の悪さは、それがインサイチューで記述され（ｗｒｉｔｔｅｎ）得ず、代わりにインビトロで記述されなければならない上、その後に選択及び拡大が続くことを意味する。この戦略に適合するのは、全ての実験とは限らず、僅かな治療法のみである。
改変レトロンで細胞においてＤＮＡをオンデマンドで作り出すことにより、生細胞でのゲノムの編集からゲノムの書込みへのシフトが可能となる。このシフトにより、それまで存在していた配列に制限されることなく、細胞を治療のために修飾することになる。現在、新規のＤＮＡ ＨＤＲ鋳型は、必ずボーラスとして送達されるが、ボーラスは、時間と共に減退する。このボーラス送達の効率の悪さは、それがインサイチューで記述され（ｗｒｉｔｔｅｎ）得ず、代わりにインビトロで記述されなければならない上、その後に選択及び拡大が続くことを意味する。この戦略に適合するのは、全ての実験とは限らず、僅かな治療法のみである。
【0245】
ＣＲＩＳＰＲベースの治療法の可能性を完全に実現するため、本発明者らは、厳密にそれが必要な時点及び場所でゲノムを書き換えるように設計されたＤＮＡ配列を提供する。この設計された配列は、図１１Ａに図示されるとおり提供され得る。修飾の効率は、ｎｃＲＮＡの５’末端及び３’末端における自己相補性領域を伸長させることによって増加し、レトロン逆転写酵素を動員して、それから所望のｓｓＤＮＡを多量に産生することができる。
【0246】
ＤＮＡがオンデマンドで産生されることにより、直接的に治療法を目指すのでない、むしろ疾患の生物学の理解を目指す新規のゲノム改変適用も可能となる。これは、分子レコーディングの分野であり、ここでは、細胞のゲノムに対する修飾を用いて、生物システム内でデータが書き込まれる。ＣＲＩＳＰＲインテグラーゼＣａｓ１＋２を使用してＣＲＩＳＰＲアレイに短いＤＮＡ配列を捕捉する、時間の経過に伴う順序のログを取ってイベントの記録が保存されるこの手法の説明については、例えば、シップマン（Ｓｈｉｐｍａｎ）ら著、２０１７年、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第５４７巻、７６６３年、ｐ．３４５～３４９及びシップマン（Ｓｈｉｐｍａｎ）ら著、２０１６年、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第３５３巻、６２９８年、ｐ．ａａｆ１１７５（全体として参照により本明細書に援用される）を参照されたい。この手法は、細胞におけるデータ収集デバイスの最終工程として用いることができる。しかしながら、これには、転写などの生物学的イベントによってドライブされる、細胞においてＤＮＡバーコードを生成する前工程が必要である。レトロン由来のＤＮＡは、こうした種類の技術を可能にし、複雑な生物学的過程に関して、これまで達成されたことのない水準の詳細さで理解を得ることが可能となる。
【0247】
最終的に、レトロンの実用化により、ゲノム改変を目指す分子バイオテクノロジーのレパートリーが拡大する。レトロンは、生細胞においてオンデマンドで任意のＤＮＡ配列を作るようにモジュール式構成要素で設計することができ、遺伝子療法、細胞制御及び細胞改変に興味がある科学者らに広く展開することが予想される。
【0248】
参考文献
１ イノウエ，Ｍ．（Ｉｎｏｕｙｅ，Ｍ．）及びイノウエ，Ｓ．（Ｉｎｏｕｙｅ，Ｓ．）著、「ｍｓＤＮＡ及び細菌逆転写酵素（ｍｓＤＮＡ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）」、アニュアル・レビュー・オブ・マイクロバイオロジー（Ａｎｎｕａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、第４５巻、ｐ．１６３～１８６、ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ．ｍｉ．４５．１００１９１．００１１１５、１９９１年。
１ イノウエ，Ｍ．（Ｉｎｏｕｙｅ，Ｍ．）及びイノウエ，Ｓ．（Ｉｎｏｕｙｅ，Ｓ．）著、「ｍｓＤＮＡ及び細菌逆転写酵素（ｍｓＤＮＡ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）」、アニュアル・レビュー・オブ・マイクロバイオロジー（Ａｎｎｕａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、第４５巻、ｐ．１６３～１８６、ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ．ｍｉ．４５．１００１９１．００１１１５、１９９１年。
【0249】
２ ファルザドファルド，Ｆ．（Ｆａｒｚａｄｆａｒｄ，Ｆ．）及びルー，Ｔ．Ｋ（Ｌｕ，Ｔ．Ｋ．）著、シンセティック・バイオロジー（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂｉｏｌｏｇｙ）、「生細胞集団における正確なインビボＤＮＡ書込みによるゲノムにコードされたアナログ記憶（Ｇｅｎｏｍｉｃａｌｌｙ ｅｎｃｏｄｅｄ ａｎａｌｏｇ ｍｅｍｏｒｙ ｗｉｔｈ ｐｒｅｃｉｓｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ＤＮＡ ｗｒｉｔｉｎｇ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ）」、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第３４６巻、ｐ．１２５６２７２、ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２５６２７２、２０１４年。
【0250】
３ シャロン，Ｅ．（Ｓｈａｒｏｎ，Ｅ．）ら著、「超並列精密ゲノム編集によって明らかになった機能的遺伝子変異体（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｒｉａｎｔｓ Ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｐｒｅｃｉｓｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ）」、セル（Ｃｅｌｌ）、第１７５巻、ｐ．５４４～５５７、ｅ５１６、ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１８．０８．０５７、２０１８年。
【0251】
４ ドゥンダール，Ａ．Ｒ．（Ｄｈｕｎｄａｌｅ，Ａ．Ｒ．）、フルイチ，Ｔ．（Ｆｕｒｕｉｃｈｉ，Ｔ．）、イノウエ，Ｓ．（Ｉｎｏｕｙｅ，Ｓ．）及びイノウエ，Ｍ．（Ｉｎｏｕｙｅ，Ｍ．）著、「粘液細菌及び近縁種間でのマルチコピー一本鎖ＤＮＡの分布（Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｃｏｐｙ ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ａｍｏｎｇ ｍｙｘｏｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｓｐｅｃｉｅｓ）」、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、第１６４巻、ｐ．９１４～９１７、１９８５年。
【0252】
５ ランプソン，Ｂ．Ｃ．（Ｌａｍｐｓｏｎ，Ｂ．Ｃ．）ら著、「大腸菌臨床株における逆転写酵素：分枝状のＲＮＡに連結したｍｓＤＮＡの産生（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｉｎ ａ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｒａｎｃｈｅｄ ＲＮＡ－ｌｉｎｋｅｄ ｍｓＤＮＡ）」、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２４３巻、ｐ．１０３３～１０３８、１９８９年。
【0253】
６ イノウエ，Ｋ．（Ｉｎｏｕｙｅ，Ｋ．）、タニモト，Ｓ．（Ｔａｎｉｍｏｔｏ，Ｓ．）、カミモト，Ｍ．（Ｋａｍｉｍｏｔｏ，Ｍ．）、シマモト，Ｔ．（Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ，Ｔ．）及びシマモト，Ｔ．（Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ，Ｔ．）著、「２つの新規レトロンエレメントをコレラ菌のレトロン－Ｖｃ９５に置き換える（Ｔｗｏ ｎｏｖｅｌ ｒｅｔｒｏｎ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ａｒｅ ｒｅｐｌａｃｅｄ ｗｉｔｈ ｒｅｔｒｏｎ－Ｖｃ９５ ｉｎ Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）」、マイクロバイオロジー・アンド・イムノロジー（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、第５５巻、ｐ．５１０～５１３、ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１３４８－０４２１．２０１１．００３４２．ｘ、２０１１年。
【0254】
７ リム，Ｄ．（Ｌｉｍ，Ｄ．）著、「臨床的大腸菌分離株における逆転写酵素による非分枝状マルチコピー一本鎖ＤＮＡの構造及び生合成（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｕｎｂｒａｎｃｈｅｄ ｍｕｌｔｉｃｏｐｙ ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｉｎ ａ ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｉｓｏｌａｔｅ）、第６巻、ｐ．３５３１～３５４２、１９９２年。
【0255】
８ シップマン，Ｓ．Ｌ．（Ｓｈｉｐｍａｎ，Ｓ．Ｌ．）、ニバラ，Ｊ．（Ｎｉｖａｌａ，Ｊ．）、マクリス，Ｊ．Ｄ．（Ｍａｃｋｌｉｓ，Ｊ．Ｄ．）及びチャーチ，Ｇ．（Ｃｈｕｒｃｈ，Ｇ．）著、「生細菌集団のゲノムへのデジタルムービのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓコーディング（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｏｆ ａ ｄｉｇｉｔａｌ ｍｏｖｉｅ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅｓ ｏｆ ａ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｖｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ）」、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ２３０１７、２０１７年。
【0256】
９ シップマン，Ｓ．Ｌ．（Ｓｈｉｐｍａｎ，Ｓ．Ｌ．）、ニバラ，Ｊ．（Ｎｉｖａｌａ，Ｊ．）、マクリス，Ｊ．Ｄ．（Ｍａｃｋｌｉｓ，Ｊ．Ｄ．）及びチャーチ，Ｇ．Ｍ．（Ｃｈｕｒｃｈ，Ｇ．Ｍ．）著、「指向性ＣＲＩＳＰＲスペーサ獲得による分子レコーディング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｃｏｒｄｉｎｇｓ ｂｙ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ＣＲＩＳＰＲ ｓｐａｃｅｒ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ）」、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｆ１１７５、２０１６年。
【0257】
本開示は、その具体的な実施形態に関連して記載されているが、本開示の真の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な変更形態がなされ得ること及び均等物に置き換えられ得ることが当業者によって理解されるべきである。加えて、特定の状況、材料、組成物、方法、１つ又は複数の方法ステップを本開示の目的、趣旨及び範囲に適合させるための多くの変形形態がなされ得る。全てのかかる変形形態は、ここに添付される特許請求の範囲内にあることが意図される。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図6F】
【図7A】
【図7B】
【図7C-1】
【図7C-2】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図10E】
【図11A】
【図11B】
【配列表】
【国際調査報告】