特表 2022-548283 ヒト抗ＰＤ－Ｌ１ペプチドワクチン及びその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-11-17

(54)【発明の名称】ヒト抗ＰＤ－Ｌ１ペプチドワクチン及びその使用方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20221110BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20221110BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20221110BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20221110BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20221110BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20221110BHJP

   A61P 7/06 20060101ALI20221110BHJP

   A61P 17/02 20060101ALI20221110BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20221110BHJP

   A61P 17/14 20060101ALI20221110BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20221110BHJP

   A61P 21/02 20060101ALI20221110BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20221110BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20221110BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20221110BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20221110BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20221110BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20221110BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20221110BHJP

   A61K 47/64 20170101ALI20221110BHJP

   A61K 39/20 20060101ALI20221110BHJP

   C07K 14/705 20060101ALN20221110BHJP

【ＦＩ】

C07K19/00 ZNA

C07K16/28

A61K39/00 H

A61K39/39

A61K39/395 D

A61K39/395 E

A61K39/395 N

A61K39/395 U

A61K39/395 T

A61P1/16

A61P7/06

A61P17/02

A61P17/06

A61P17/14

A61P19/02

A61P21/02

A61P25/00

A61P25/28

A61P29/00

A61P35/00

A61P35/02

A61P37/02

A61P37/04

A61K47/64

A61K39/20

C07K14/705

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022517184

(86)(22)【出願日】2020-09-17

(85)【翻訳文提出日】2022-05-10

(86)【国際出願番号】 US2020051240

(87)【国際公開番号】W WO2021055583

(87)【国際公開日】2021-03-25

(31)【優先権主張番号】62/901,727

(32)【優先日】2019-09-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】514137997

【氏名又は名称】オハイオ・ステイト・イノベーション・ファウンデーション

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100157956

【弁理士】

【氏名又は名称】稲井 史生

(74)【代理人】

【識別番号】100170520

【弁理士】

【氏名又は名称】笹倉 真奈美

(74)【代理人】

【識別番号】100221545

【弁理士】

【氏名又は名称】白江 雄介

(72)【発明者】

【氏名】カウマヤ，プラビン ティ ピー

【テーマコード（参考）】

4C076

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076CC41

4C076EE59

4C085AA03

4C085AA13

4C085AA14

4C085AA38

4C085BA63

4C085BB01

4C085BB36

4C085BB50

4C085CC22

4C085CC23

4C085EE01

4C085EE06

4C085FF01

4C085FF02

4C085FF03

4C085FF18

4C085FF20

4C085GG02

4C085GG03

4C085GG04

4C085GG05

4C085GG06

4C085GG08

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA41

4H045DA76

4H045DA86

4H045EA22

4H045EA28

4H045EA31

(57)【要約】

合成ＰＤ－Ｌ１ペプチド、キメラＰＤ－Ｌ１のペプチド、抗ＰＤ－Ｌ１抗体に関連する組成物、ならびに該ペプチドまたは抗体を使用して、がん、自己免疫疾患、及びアルツハイマー病を治療する方法が開示される。
【選択図】図９

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＰＤ－Ｌ１タンパク質に対する免疫応答を刺激するためのプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）キメラペプチドであって、１つ以上のＰＤ－Ｌ１ Ｂ細胞エピトープ、Ｔヘルパー（Ｔｈ）エピトープ、及び前記Ｔｈエピトープに前記ＰＤ－Ｌ１ Ｂ細胞エピトープを連結するリンカーを含み、前記１つ以上のＰＤ－Ｌ１ Ｂ細胞エピトープが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５からなる群より選択される配列からなる、前記プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）キメラペプチド。

【請求項2】

前記Ｔｈエピトープが、麻疹ウイルス融合タンパク質ペプチドを含む、請求項１に記載のキメラペプチド。

【請求項3】

前記Ｔｈエピトープが、配列番号６を含む、請求項１または２に記載のプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）キメラペプチド。

【請求項4】

前記リンカーが、配列番号７を含む、請求項１～３のいずれかに記載のプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）キメラペプチド。

【請求項5】

前記ペプチドが、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれかに記載のプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）キメラペプチド。

【請求項6】

ＰＤ－Ｌ１タンパク質に対する免疫応答を刺激するための合成ＰＤ－Ｌ１ペプチドであって、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５に記載の配列のうちの１つ以上を含む、前記合成ＰＤ－Ｌ１ペプチド。

【請求項7】

前記合成ＰＤ－Ｌ１のペプチドが含む前記アミノ酸が、Ｄエナンチオマーである、請求項６に記載の合成ペプチド。

【請求項8】

前記ペプチドが、アセチル化される、請求項６または７に記載の合成ペプチド。

【請求項9】

さらに、Ｔｈエピトープ、及び前記Ｔｈエピトープに前記合成ＰＤ－Ｌ１ペプチドを連結するリンカーを含む、請求項６～８のいずれかに記載の１つ以上の合成ペプチドを含むキメラペプチド。

【請求項10】

前記Ｔｈエピトープが、麻疹ウイルス融合タンパク質ペプチドを含む、請求項９に記載のキメラペプチド。

【請求項11】

前記Ｔｈエピトープが、配列番号６を含む、請求項９または１０に記載のキメラペプチド。

【請求項12】

前記リンカーが、配列番号７を含む、請求項９～１１のいずれかに記載のキメラペプチド。

【請求項13】

前記ペプチドが、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９に記載のアミノ酸配列を含む、請求項９～１２のいずれかに記載のキメラペプチド。

【請求項14】

請求項１～１３のいずれかに記載の１つ以上のキメラペプチドまたは合成ペプチド及び薬学的に許容されるビヒクルを含む、医薬組成物。

【請求項15】

さらに、１つ以上のＨＥＲ－２ Ｂ細胞エピトープを含む、請求項１４に記載の医薬組成物。

【請求項16】

前記ＨＥＲ－２ Ｂ細胞エピトープが、配列番号２７または２９に記載の配列のうちの１つ以上を含む、請求項１５に記載の医薬組成物。

【請求項17】

前記ＨＥＲ－２ Ｂ細胞エピトープが、配列番号２８または３０に記載の１つ以上のキメラＨＥＲ－２ペプチドの構成要素である、請求項１６に記載の医薬組成物。

【請求項18】

前記ビヒクルが、薬学的に許容されるアジュバントである、請求項１４～１７のいずれかに記載の医薬組成物。

【請求項19】

前記アジュバントが、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム、リン酸カルシウム水酸化物、フロイント完全アジュバント、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）、フロイント不完全アジュバント、ｉｓｃｏｍ、ｉｓｃｏｍマトリックス、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）アジュバント、Ｍａｔｒｉｘ Ｍ（商標）アジュバント、Ｍａｔｒｉｘ Ｃ（商標）アジュバント、Ｍａｔｒｉｘ Ｑ（商標）アジュバント、ＡｂＩＳＣＯ（登録商標）－１００アジュバント、ＡｂＩＳＣＯ（登録商標）－３００アジュバント、ＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）、ＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）誘導体、ＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）またはＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）誘導体を含有するアジュバント、ＱＳ－２１、ＱＳ－２１誘導体、及びＱＳ－２１またはＱＳ２１誘導体を含有するアジュバントからなる群より選択される、請求項１８に記載の医薬組成物。

【請求項20】

前記アジュバントが、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）である、請求項１９に記載の医薬組成物。

【請求項21】

ＨＥＲ－２に対する免疫応答を刺激するためのＨＥＲ－２キメラペプチドであって、１つ以上のＨＥＲ－２ Ｂ細胞エピトープ、Ｔヘルパー（Ｔｈ）エピトープ、及び前記Ｔｈエピトープに前記ＨＥＲ－２ Ｂ細胞エピトープを連結するリンカーを含み、前記１つ以上のＨＥＲ－２ Ｂ細胞エピトープが、配列番号２７及び配列番号２９からなる群より選択される配列からなる、前記ＨＥＲ－２キメラペプチド。

【請求項22】

前記Ｔｈエピトープが、麻疹ウイルス融合タンパク質ペプチドを含む、請求項２１に記載のＨＥＲ－２キメラペプチド。

【請求項23】

前記Ｔｈエピトープが、配列番号６を含む、請求項２１または２２に記載のＨＥＲ－２キメラペプチド。

【請求項24】

前記リンカーが、配列番号７を含む、請求項２１～２３のいずれかに記載のＨＥＲ－２キメラペプチド。

【請求項25】

前記ペプチドが、配列番号２８または配列番号３０に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２１～２４のいずれかに記載のＨＥＲ－２キメラペプチド。

【請求項26】

請求項１～１３または２１～２５のいずれかに記載のキメラまたは合成ペプチドのいずれかに特異的に結合する、抗体。

【請求項27】

対象のがん、アルツハイマー病、または自己免疫疾患を治療する方法であって、請求項１～２４のいずれかに記載のペプチドもしくは組成物またはそれらの任意の組み合わせのいずれかを前記対象に投与することを含む、前記方法。

【請求項28】

対象のがん、アルツハイマー病、または自己免疫疾患を治療する方法であって、ＰＤ－Ｌ１キメラペプチドを対象に投与することを含み、前記キメラペプチドが、１つ以上のＰＤ－Ｌ１ Ｂ細胞エピトープ、Ｔヘルパー（Ｔｈ）エピトープ、及び前記Ｔｈエピトープに前記ＰＤ－１ Ｂ細胞エピトープを連結するリンカーを含み、前記１つ以上のＰＤ－Ｌ１ Ｂ細胞エピトープが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５からなる群より選択される配列からなる、前記方法。

【請求項29】

対象のがん、アルツハイマー病、または自己免疫疾患を治療する方法であって、ＰＤ－Ｌ１合成ペプチドを対象に投与することを含み、前記ＰＤ－Ｌ１合成ペプチドが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５に記載の配列のうちの１つ以上を含む、前記方法。

【請求項30】

前記がんが、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉腫、ホジキン病、骨髄性白血病、膀胱癌、脳癌、神経系癌、頭頸部癌、頭頸部の扁平上皮癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経芽細胞腫、神経膠芽腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、肝臓癌、メラノーマ、口、喉、喉頭、及び肺の扁平上皮細胞癌腫、結腸癌、子宮頸癌、子宮頸癌腫、乳癌、子宮体癌、上皮癌、腎臓癌、泌尿生殖器癌、肺癌、食道癌、頭頸部癌、大腸癌、造血癌、精巣癌、前立腺癌、または膵臓癌からなるがんの群より選択される、請求項２７～２９のいずれかに記載の方法。

【請求項31】

前記がんが、乳癌、卵巣癌、子宮体癌、結腸癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、または子宮頸癌である、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記方法が、さらに、１つ以上のＨＥＲ－２ Ｂ細胞エピトープを前記対象に投与することを含む、請求項２９または３１に記載の方法。

【請求項33】

前記ＨＥＲ－２ Ｂ細胞エピトープが、配列番号２７または２９に記載の配列のうちの１つ以上を含む、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

前記ＨＥＲ－２ Ｂ細胞エピトープが、配列番号２８または３０に記載の１つ以上のキメラＨＥＲ－２ペプチドに含まれる、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記ＨＥＲ－２ Ｂ細胞エピトープが、前記ＰＤ－Ｌ１エピトープと同じ組成物で投与される、請求項３２～３４のいずれかに記載の方法。

【請求項36】

前記自己免疫疾患が、乾癬、円形脱毛症、原発性胆汁性肝硬変、多腺性自己免疫症候群、１型真性糖尿病、自己免疫甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、ギランバレー症候群、グレーブス病、シェーグレン症候群、潰瘍性大腸炎、自己免疫性溶血性貧血、悪性貧血、乾癬性関節炎、関節リウマチ、再発性多発性軟骨炎、重症筋無力症、急性散在性脳脊髄炎、及び多発血管炎性肉芽腫症からなる群より選択される、請求項２７～２９のいずれかに記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

Ｉ．関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年９月１７日に出願された米国仮出願第６２／９０１，７２７号（全体が参照により本明細書に組み込まれる）の利益を主張する。

【背景技術】

【0002】

ＩＩ．背景

【0003】

がんは、現在、先進国において及び世界中で主要な死因である。この疾患の経済的負担、またより重要なことに、それが引き起こす苦痛は計り知れない。新しい、より効果的な抗がん療法の開発及び適用を加速する明白で緊急の必要性がある。腫瘍学の分野は巨大であり、いくつかの稀な／稀少な形態を含むいくつかの適応症を含む。腫瘍学は、医薬品開発に関して最も活発な領域の１つであり続けるが、依然として満たされていない重要なニーズがある。

【0004】

がん免疫学の最近の進歩は、ヒトがんに対するＴ細胞媒介性抗腫瘍免疫の重要性を記録しており、Ｔ細胞により発現される抑制性受容体は、がん免疫療法のための重要な標的となっている。免疫チェックポイントのプログラム細胞死タンパク質－１（ＰＤ－１）を介したシグナル伝達は、抗腫瘍免疫応答を減衰させることにより腫瘍の進行を可能にする。ＰＤ－１及びそのリガンドであるプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）間のシグナル伝達軸の、モノクローナル抗体を用いる治療的遮断は、がんの治療において顕著な臨床的成功が示されており、疾患の進行及び転移期であっても、一連の広範ながんサブタイプにわたる著しい活性を示している。この経路を標的とする治療薬は、現在、臨床試験中である。ペンブロリズマブ及びニボルマブは、イピリムマブ不応性メラノーマの治療のためにＵＳ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＦＤＡ）から加速承認を得たチェックポイント阻害薬のこの抗ＰＤ－１経路ファミリーの最初のものである。

【0005】

免疫チェックポイント、特に、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１軸、を標的とするモノクローナル抗体は、近年のがん治療において目覚ましい結果をもたらした。それらの証明された有用性にもかかわらず、抗体は、ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達経路を標的とする場合に特に関連し得る不十分な組織／腫瘍浸透度を含む、治療法としての特定の欠点を有する。例えば、ＰＤ－１発現エフェクターＴ細胞は、ＰＤ－Ｌ１発現腫瘍の固形組織内に浸潤していることが見出される。これは、抗体にとって問題となる。抗体は、サイズが大きいために腫瘍への侵入が抑制される。したがって、抗体は、腫瘍内の意図された治療部位で、ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達に完全に拮抗することができず、最適ではない有効性がもたらされ得る。

【0006】

チェックポイント遮断は、がんの免疫療法における新しいパラダイムシフトを引き起こす。しかし、多くのがん患者は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１チェックポイント遮断に応答しなかった。必要とされるのは、がん、ウイルス感染、自己免疫疾患、及びアルツハイマー病の治療のための新しいＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１チェックポイント阻害薬である。

【発明の概要】

【0007】

ＩＩＩ．概要
合成ＰＤ－Ｌ１ペプチドに関連する方法及び組成物が開示される。

【0008】

一態様では、１つ以上のＰＤ－Ｌ１ Ｂ細胞エピトープ、Ｔヘルパー（Ｔｈ）エピトープ（例えば、配列番号６などの麻疹ウイルス融合タンパク質のペプチド）、及びＴｈエピトープにＰＤ－Ｌ１ Ｂ細胞エピトープを連結するリンカー（例えば、配列番号７など）を含む、ＰＤ－Ｌ１タンパク質に対する免疫応答を刺激するためのＰＤ－Ｌ１キメラペプチドが本明細書で開示され、１つ以上のＰＤ－Ｌ１ Ｂ細胞エピトープは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５からなる群より選択される配列からなる。例えば、任意の上述の態様のキメラペプチドが本明細書に開示され、ペプチドは、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含む。

【0009】

開示の配列のＤエナンチオマーを含む、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５に記載の配列のうちの１つ以上を含むＰＤ－Ｌ１タンパク質に対する免疫応答を刺激するための合成ＰＤ－Ｌ１ペプチドもまた、本明細書で開示される。一態様では、合成ペプチドは、アセチル化することができる。

【0010】

一態様では、任意の上述の態様の合成ペプチドを含み、さらに、Ｔｈエピトープ（例えば、配列番号６などの麻疹ウイルス融合タンパク質のペプチド）、及びＴｈエピトープに合成ＰＤ－Ｌ１ペプチドを連結するリンカー（例えば、配列番号７など）を含む、キメラペプチドが本明細書に開示される。例えば、任意の上述の態様のキメラペプチドが本明細書に開示され、ペプチドは、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９に記載のアミノ酸配列を含む。

【0011】

任意の上述の１つ以上のキメラまたは合成ペプチド、及び薬学的に許容されるビヒクル（例えば、限定されないが、アジュバントを含む、生分解性のビヒクルなど（例えば、限定されないが、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅを含む油性アジュバント中の水など））を含む医薬組成物もまた、本明細書に開示される。

【0012】

一態様では、さらに、１つ以上のＨＥＲ－２Ｂ細胞エピトープ（例えば、配列番号２７もしくは配列番号２９など）、１つ以上のキメラＨＥＲ２ペプチド（例えば、配列番号２８もしくは配列番号３０など）、及び／または１つ以上の抗Ｈｅｒ－２抗体を含む、任意の上述の態様の医薬組成物が開示される。

【0013】

１つ以上のＨＥＲ－２ Ｂ細胞エピトープ、Ｔヘルパー（Ｔｈ）エピトープ（限定されないが、麻疹ウイルス融合タンパク質のペプチドを含む（例えば、配列番号６など））、及びＴｈエピトープにＨＥＲ－２ Ｂ細胞エピトープを連結するリンカー（例えば、配列番号７など）を含む、ＨＥＲ－２に対する免疫応答を刺激するためのＨＥＲ－２キメラペプチドもまた、本明細書で開示され、１つ以上のＨＥＲ－２ Ｂ細胞エピトープは、配列番号２７及び配列番号２９からなる群より選択される配列からなる。例えば、ＨＥＲ－２キメラペプチドは、配列番号２８または配列番号３０に記載のアミノ酸配列を含む。

【0014】

一態様では、任意の上述の態様のキメラペプチドまたは合成ペプチドに特異的に結合する抗体が本明細書に開示される。

【0015】

任意の先行する態様のペプチドまたは組成物のいずれかを対象に投与することを含む、対象のがん及び／または転移（例えば、乳癌、卵巣癌、子宮体癌、結腸癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、及び子宮頸癌など）、アルツハイマー病、または自己免疫疾患を治療、抑制、低減、減少、改善、及び／または予防する方法もまた、本明細書で開示される。

【0016】

ＩＶ．図面の簡単な説明
本明細書に組み込まれ且つその一部を構成する添付の図面は、いくつかの実施形態を示し、説明と共に、開示された組成物及び方法を示す。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】ｈＰＤ－１／ｈＰＤ－Ｌ１の界面の拡大図を示し、ｈＰＤ－１及びｈＰＤ－Ｌ１が、それぞれ、青及び緑のリボンで表される。相互作用に重要な全ての残基が、棒で強調される。疎水性コアを形成する残基が黄色に着色される。水分子が赤球として示される。水素結合が黒破線で示される。（Ａ）正面－側面図 Ｚａｋ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２３，２３４１－２３４８。（Ｂ）モデル化されたＰＤ－１ペプチド。

【図2】ヒトＰＤ－Ｌ１で予測されるＢ細胞エピトープ及びＨＥＲ－２ペプチドを示す。ヒトＰＤ－Ｌ１、ペプチド３６～５３、５０～６７、９５～１１２、及び１３０～１４７のアミノ酸配列を評価のために選択した。本明細書では、上述のＨＥＲ２（２６６～２９６）及びＨＥＲ２（５９７～６２６）を併用療法に使用した。

【図3】ＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１エピトープワクチンに対するウサギのＰＤ－Ｌ１エピトープの免疫原性を示す。ＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１ Ｂ細胞エピトープの免疫原性。ニュージーランド白ウサギを、Ｎ－アセチルグルコサミン－３イル－アセチル－ｌ－アラニル－ｄ－イソグルタミン３３３μｇを含むＭｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ７２０ビヒクル（Ｓｅｐｐｉｃ）で乳化した（１：１）、蒸留脱イオンＨ_２Ｏに溶解させた各ＭＶＦ－ペプチド免疫原１ｍｇで免疫した（ｎｏｒ－ＭＤＰ）。３週間隔で、ウサギを同じ用量で追加免疫した。ウサギの中央耳介の動脈から血液を採取した。血液を週１回採取し（１Ｙ＋３、２Ｙ＋１、２Ｙ＋２、２Ｙ＋３、３Ｙ＋１、３Ｙ＋２）、免疫原ＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１ペプチドを使用して、ＥＬＩＳＡにより抗体価について血清を試験した。ＭＶＦ－ＰＤ－１ペプチド免疫原で免疫されたウサギ（３Ｙ＋３）由来の血清（終点）を、ＥＬＩＳＡで免疫原に対して個別に試験した。２００ｎｇ／ウェルのペプチドを２連で使用して、ＥＬＩＳＡプレートをコーティングした。力価は、ブランクを差し引いた後の吸光度値０．２の血清の最も高い希釈度として定義される。

【図4】組み換えＰＤ－Ｌ１タンパク質に対するＰＤ－Ｌ１エピトープの抗原性を示す。ＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１ペプチド免疫原で免疫されたウサギ（３Ｙ＋３）の血清（終点）を、ＥＬＩＳＡにより免疫原ｒｈＰＤ－Ｌ１タンパク質に対して個別に試験した。５００ｎｇ／ウェルのｒｈＰＤ－Ｌ１タンパク質を２連で使用して、ＥＬＩＳＡプレートをコーティングした。

【図5A】Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＰＤ－Ｌ１による免疫化を試験する実験スキームを示す。実験１を示す：ＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１＋ＩＳＡ７２０で免疫されたＢａｌｂ／ｃマウスのＣＴ２６ＷＴ腫瘍モデル。

【図5B】Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＰＤ－Ｌ１による免疫化を試験する実験スキームを示す。スキーム１Ｂを示す：Ｂａｌｂ／ｃマウスのワクチン接種及び腫瘍移植のスキーム。６～８週齢のＢａｌｂ／ｃマウスを、ｎｏｒ－ＭＤＰを含むＩＳＡ７２０で乳化したＭＶＦ－ペプチド免疫原で、３週間隔で３回免疫した。腫瘍チャレンジ前に、マウスを、ＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１ワクチン構築物［ＰＤ－Ｌ１（３６－５３）、ＰＤ－Ｌ１（５０－６７）、ＰＤ－Ｌ１（９５－１１２）、ＰＤ－Ｌ１（１３０－１４７）］で免疫した。血液を週１回収集し、血清をＥＬＩＳＡにより抗体価について試験した。３回目の免疫（３Ｙ）の２週間後に、マウスにＣＴ２６ ＷＴ腫瘍細胞（マウス１匹当たり１０^５）を移植し、腫瘍チャレンジの２日後に開始して、対照マウスを陰性対照としてＰＢＳで週に２回、陽性対照として抗ｍＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂ（１０Ｆ．９Ｇ２）で週に２回処置した。腫瘍の成長を週に２回観察し、ノギスで測定した。

【図5C】Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＰＤ－Ｌ１による免疫化を試験する実験スキームを示す。抗体対照スキームであるスキーム１Ｃを示す。

【図5D】Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＰＤ－Ｌ１による免疫化を試験する実験スキームを示す。ＣＴ２６ ＷＴによる２回目の追加免疫の２週間後に、ＰＤ－Ｌ１ワクチンチャレンジで免疫されたマウスを示すスキーム１Ｄを示す。

【図6】Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１免疫原に対するＰＤ－Ｌ１エピトープの免疫原性を示す。様々なペプチド構築物で免疫化されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１ペプチドの免疫原性。週に１回収集された血清を、それぞれ個々のＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１ペプチド免疫原に対して力価測定した。ピンクのバーは、ＰＤ－Ｌ１ １３０に対する力価を意味し、赤いバーは、ＰＤ－１（９２－１１０）に対する力価を指す。

【図7-1】ＣＴ２６腫瘍モデルにおける組み換えヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質に対するＰＤ－Ｌ１エピトープの抗原性を示す。ＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１ペプチド免疫原で免疫されたマウスの血清を、ＥＬＩＳＡにより免疫原ｒｈＰＤ－Ｌ１タンパク質に対して個別に試験した。５００ｎｇ／ウェルのｒｈＰＤ－Ｌ１タンパク質を２連で使用して、ＥＬＩＳＡプレートをコーティングした。

【図7-2】同上

【図8】ＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１ワクチン構築物［ＰＤ－Ｌ１（３６－５３）、ＰＤ－Ｌ１（５０－６７）、ＰＤ－Ｌ１（９５－１１２）、ＰＤ－Ｌ１（１３０－１４７）］で免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＣＴ２６ ＷＴ腫瘍成長の個々のプロットを示す。ＰＢＳを陰性対照として使用し、抗ｍＰＤ－Ｌ１ｍＡｂ（１０Ｆ．９Ｇ２）を陽性対照として使用した。

【図9】ＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１ワクチン構築物［ＰＤ－Ｌ１（３６－５３）、ＰＤ－Ｌ１（５０－６７）、ＰＤ－Ｌ１（９５－１１２）、ＰＤ－Ｌ１（１３０－１４７）］、陰性対照としてのＰＢＳ、及び陽性対照としての抗ｍＰＤ－Ｌ１ｍＡｂ（１０Ｆ．９Ｇ２）で免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスの腫瘍成長の平均値を示す。二元配置ＡＮＯＶＡを使用して、腫瘍成長の曲線全体を分析し、これは、ｐ＜０．０１の有意差を示す。

【図10】４つの処置群のそれぞれに対する１４日目及び１６日目の腫瘍体積ＬＷＷのプロットを示し、一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、複数の群比較を分析し、これは、ともにｐ＜０．０１を示した。

【図11】ＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１ワクチン構築物［ＰＤ－Ｌ１（３６－５３）、ＰＤ－Ｌ１（５０－６７）、ＰＤ－Ｌ１（９５－１１２）、ＰＤ－Ｌ１（１３０－１４７）］、ｎｏｒ－ＭＤＰ、及びＩＳＡ７２０で免疫された後のＢａｌｂ／ｃマウスにおける抗体アイソタイプを示す。

【図12】ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１バイオアッセイを示す。アッセイは、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断バイオアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の製造元のプロトコールにしたがって実施した。ニボルマブ及びアテゾリズマブと比較して、ＰＤ－Ｌ１（１３０－１４７）エピトープのみがＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１を阻害することができた。エピトープＰＤ－Ｌ１－（５０、９５、及びＰＤ－Ｌ１－９２）は、ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１を遮断することができなかった。

【図13】アポトーシスを示す（カスパーゼ９アッセイ）。ｉｎ ｖｉｔｒｏで処理された細胞のカスパーゼ検出のために、カスパーゼ－Ｇｌｏ９アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）を使用した。

【図14】ＡＤＣＣ活性を示す。抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、抗がんｍＡｂの重要な作用機序である。

【図15A】実験２のスキーム：ＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１＋ＩＳＡ７２０で免疫されたＢａｌｂ／ｃマウスのＣＴ２６ ＨＥＲ－２腫瘍モデルを示す。スキーム２Ａ、研究期間中３日毎に１００μｇ／マウス（＝各マウスの体重２０ｇに基づいて５ｍｇ／ｋｇ）を示す。（ＰＭＩＤ：２９３３７３０５）。

【図15B】実験２のスキーム：ＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１＋ＩＳＡ７２０で免疫されたＢａｌｂ／ｃマウスのＣＴ２６ ＨＥＲ－２腫瘍モデルを示す。Ｂａｌｂ／ｃマウスのワクチン接種及びＣＴ２６ ＨＥＲ－２腫瘍移植を示す。６～８週齢のＢａｌｂ／ｃマウスを、ｎｏｒ－ＭＤＰを含むＩＳＡ７２０で乳化したＭＶＦ－ペプチド免疫原で、３週間隔で３回免疫した。腫瘍チャレンジ前に、マウスを、ＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１ワクチン構築物［ＰＤ－Ｌ１（３６－５３）、ＰＤ－Ｌ１（５０－６７）、ＰＤ－Ｌ１（９５－１１２）、ＰＤ－Ｌ１（１３０－１４７）］で免疫した。血液を週１回収集し、血清をＥＬＩＳＡにより抗体価について試験した。３回目の免疫（３Ｙ）の２週間後に、マウスにＣＴ２６ ＷＴ腫瘍細胞（マウス１匹当たり１０^５）を移植し、腫瘍チャレンジの２日後に開始して、対照マウスを陰性対照としてＰＢＳで週に２回、陽性対照として抗ｍＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂ（１０Ｆ．９Ｇ２）で週に２回処置した。腫瘍の成長を週に２回観察し、ノギスで測定した。

【図15C】実験２のスキーム：ＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１＋ＩＳＡ７２０で免疫されたＢａｌｂ／ｃマウスのＣＴ２６ ＨＥＲ－２腫瘍モデルを示す。抗体対照のスキーム（スキーム２Ｃ）を示す。

【図15D】実験２のスキーム：ＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１＋ＩＳＡ７２０で免疫されたＢａｌｂ／ｃマウスのＣＴ２６ ＨＥＲ－２腫瘍モデルを示す。ＣＴ２６／ＨＥＲ－２を用いる２回目の追加免疫の２週間後に、ＰＤ－Ｌ１ワクチンチャレンジで免疫されたマウスを示す。

【図16】様々なペプチド構築物で免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１ペプチド及びコンボ（ＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１－（９５）＋ＭＶＦ－ＰＤ－１（９２－１１０））の免疫原性を示す。週に１回収集された血清を、それぞれ個々のＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１またはＭＶＦ－ＰＤ－１ペプチド免疫原に対して力価測定した。ピンクのバーは、ＰＤ－Ｌ１－９５に対する力価を意味し、赤いバーは、ＰＤ－１（９２）に対する力価を指す。

【図17-1】ＣＴ２６－ＨＥＲ２腫瘍モデルにおける組み換えヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質に対するＰＤ－Ｌ１エピトープの抗原性を示す。ＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１ペプチド免疫原で免疫されたマウスの血清を、ＥＬＩＳＡにより免疫原ｒｈＰＤ－Ｌ１タンパク質に対して個別に試験した。５００ｎｇ／ウェルのｒｈＰＤ－Ｌ１タンパク質を２連で使用して、ＥＬＩＳＡプレートをコーティングした。

【図17-2】同上

【図18】ＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１ワクチン構築物［ＰＤ－Ｌ１（３６－５３）、ＰＤ－Ｌ１（５０－６７）、ＰＤ－Ｌ１（９５－１１２）、ＰＤ－Ｌ１（１３０－１４７）］、陰性対照としてのＰＢＳ、及び陽性対照としての抗ｍＰＤ－Ｌ１ｍＡｂ（１０Ｆ．９Ｇ２）で免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスのＣＴ２６ ＨＥＲ２腫瘍成長の個々のプロットを示す。

【図19】ＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１ワクチン構築物［ＰＤ－Ｌ１（３６－５３）、ＰＤ－Ｌ１（５０－６７）、ＰＤ－Ｌ１（９５－１１２）、ＰＤ－Ｌ１（１３０－１４７）］、及びＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１－（９５）＋ＭＶＦ－ＰＤ－１（９２－１１０）の組み合わせ、陰性対照としてのＰＢＳ、及び陽性対照としての抗ｍＰＤ－Ｌ１ｍＡｂ（１０Ｆ．９Ｇ２）で免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスのＣＴ２６ ＨＥＲ２腫瘍成長の平均値を示す。二元配置ＡＮＯＶＡを使用して、腫瘍成長の曲線全体を分析し、これは、ｐ＜０．０１の有意差を示す。

【図20】４つの処置群のそれぞれに対する１４日目及び１６日目の腫瘍体積ＬＷＷのプロットを示し、一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、複数の群比較を分析し、これは、それぞれ、１４日目にｐ＜０．０５、１６日目にｐ＜０．０１を示した。

【図21】ＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１ワクチン構築物［ＰＤ－Ｌ１（３６－５３）、ＰＤ－Ｌ１（５０－６７）、ＰＤ－Ｌ１（９５－１１２）、ＰＤ－Ｌ１（１３０－１４７）］、ｎｏｒ－ＭＤＰ、及びＩＳＡ７２０で免疫された後のＢａｌｂ／ｃマウスにおける抗体アイソタイプを示す。

【図22】５０％マウス生存時間の比較を示す。ＭＶＦ－ＰＤ－１（９２）を用いるまたは用いない、ＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１ワクチン構築物［ＰＤ－Ｌ１（３６－５３）、ＰＤ－Ｌ１（５０－６７）、ＰＤ－Ｌ１（９５－１１２）、ＰＤ－Ｌ１（１３０－１４７）］、ｎｏｒ－ＭＤＰ、及びＩＳＡ７２０によるＢａｌｂ／ｃマウスの免疫である。１群当たり９～１０匹のマウス、マウスがＣＴ２６ ＨＥＲ２腫瘍細胞でチャレンジされた後、本明細書では、１群当たり４～５匹のマウスのマウス生存時間を使用して、５０％マウス生存時間を分析した。

【図23A】実験３のスキーム：コンボまたはトリプル＋ＩＳＡ７２０で免疫されたＢａｌｂ／ｃマウスのＣＴ２６ ＨＥＲ－２腫瘍モデルを示す。スキーム３Ａ、コンボまたはトリプル＋ＩＳＡ７２０で免疫されたＢａｌｂ／ｃマウスのＣＴ２６／ＨＥＲ－２腫瘍モデルを示す。

【図23B】実験３のスキーム：コンボまたはトリプル＋ＩＳＡ７２０で免疫されたＢａｌｂ／ｃマウスのＣＴ２６ ＨＥＲ－２腫瘍モデルを示す。Ｂａｌｂ／ｃ ＣＴ２６／ＨＥＲ－２マウスにおけるＰＤ－Ｌ１及びＨＥＲ－２による免疫化を試験する実験のスキーム３Ｂを示す。

【図23C】実験３のスキーム：コンボまたはトリプル＋ＩＳＡ７２０で免疫されたＢａｌｂ／ｃマウスのＣＴ２６ ＨＥＲ－２腫瘍モデルを示す。スキーム３Ｃ、Ｂａｌｂ／ｃマウスのワクチン接種及びＣＴ２６ ＨＥＲ２腫瘍の移植を示す。６～８週齢のＢａｌｂ／ｃマウスを、ｎｏｒ－ＭＤＰを含むＩＳＡ７２０で乳化したＭＶＦ－ペプチド免疫原で、３週間隔で３回免疫した。腫瘍チャレンジ前に、マウスを、コンボＨＥＲ２と組み合わせたＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１ワクチン構築物［ＰＤ－Ｌ１（３６－５３）、ＰＤ－Ｌ１（５０－６７）、ＰＤ－Ｌ１（９５－１１２）、ＰＤ－Ｌ１（１３０－１４７）］で免疫した。血液を週１回収集し、血清をＥＬＩＳＡにより抗体価について試験した。３回目の免疫（３Ｙ）の２週間後に、マウスにＣＴ２６ ＷＴ腫瘍細胞（マウス１匹当たり１０^５）を移植し、腫瘍チャレンジの２日後に開始して、対照マウスを陰性対照としてＰＢＳで週に２回、陽性対照として抗ｍＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂ（１０Ｆ．９Ｇ２）で週に２回処置した。腫瘍の成長を週に２回観察し、ノギスで測定した。

【図24】様々なペプチド構築物で免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるコンボＨＥＲ－２によるＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１ペプチドの免疫原性を示す。週に１回収集された血清は、それぞれ個々のＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１、各ＨＥＲ２ペプチド免疫原に対して力価測定した。

【図25】様々なペプチド構築物で免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるコンボＨＥＲ－２によるＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１ペプチドの免疫原性を示す。週に１回収集された血清は、それぞれ個々のＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１、各ＨＥＲ２ペプチド免疫原に対して力価測定した。

【図26】Ｄ２Ｆ２がん細胞チャレンジの実験計画を示す。６～８週齢のＢａｌｂ／ｃマウスを免疫し、腫瘍チャレンジ前に、Ｇ１及びＧ２マウスを、抗ＰＤ－１ ｍＡｂ（２９Ｆ．１Ａ１２）（Ｇ１）または抗ＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂ（１０Ｆ．９Ｇ２）（Ｇ２またはＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１ワクチン構築物［ＰＤ－Ｌ１（９２－１１０）（Ｇ３）ＰＤ－Ｌ１（１３０－１４７）（Ｇ４）］で処置した。同様に、Ｇ１０、Ｇ１１、及びＧ１２は、対照群であり、腫瘍細胞チャレンジの前に処置されなかった。Ｇ１３、Ｇ１４、及びＧ１５マウスを、Ｇ１３の場合、マウス１匹当たり１００μｇのＭＶＦ－ＨＥＲ－２（２６６－２９６）＋１００μｇのＭＶＦ－ＨＥＲ－２（５９７－６２６）＋ＩＳＡ７２０、Ｇ１４の場合、マウス１匹当たり１００μｇのＭＶＦ－ＰＤ－１（９２－１１０）＋１００μｇのＭＶＦ－ＨＥＲ－２（２６６－２９６）＋１００μｇのＭＶＦ－ＨＥＲ－２（５９７－６２６）＋ＩＳＡ７２０、Ｇ１５の場合、マウス１匹当たり１００μｇのＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１（１３０－１４７）＋１００μｇのＭＶＦ－ＨＥＲ－２（２６６－２９６）＋１００ｕｇのＭＶＦ－ＨＥＲ－２（５９７－６２６）＋ＩＳＡ７２０で免疫した。腫瘍チャレンジの前に、マウスを最大４回免疫した。Ｄ２Ｆ２／Ｅ２腫瘍細胞でチャレンジされた後、マウスは、さらなる処置を受けなかった。全てのマウスを、週に少なくとも２回監視しており、データに示されるように、腫瘍をノギスで測定した。

【図27】図２６に記載されるようなＤ２Ｆ２チャレンジのスキームを示す。

【図28】マウス１匹当たり１００μｇのＭＶＦ－ＰＤ－１（９２－１１０）＋ＩＳＡ７２０で免疫されたＧ３マウスの免疫原性（ＥＬＩＳＡで測定）を示す。

【図29】マウス１匹当たり１００μｇのＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１（１３０－１４７）＋ＩＳＡ７２０で免疫されたＧ４マウスの免疫原性（ＥＬＩＳＡで測定）を示す。

【図30】マウス１匹当たり１００μｇのＭＶＦ－ＨＥＲ－２（２６６－２９６）＋１００μｇのＭＶＦ－ＨＥＲ－２（５９７－６２６）＋ＩＳＡ７２０で免疫されたＧ１３マウスの免疫原性（ＥＬＩＳＡで測定）を示す。

【図31】マウス１匹当たり１００μｇのＭＶＦ－ＰＤ－１（９２－１１０）＋１００μｇのＭＶＦ－ＨＥＲ－２（２６６－２９６）＋１００μｇのＭＶＦ－ＨＥＲ－２（５９７－６２６）＋ＩＳＡ７２０で免疫されたＧ１４マウスの免疫原性（ＥＬＩＳＡで測定）を示す。

【図32】マウス１匹当たり１００μｇのＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１（１３０－１４７）＋１００μｇのＭＶＦ－ＨＥＲ－２（２６６－２９６）＋１００μｇのＭＶＦ－ＨＥＲ－２（５９７－６２６）＋ＩＳＡ７２０で免疫されたＧ１５マウスの免疫原性（ＥＬＩＳＡで測定）を示す。

【図33】示された処置群のマウス群であるＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＤ２Ｆ２ ＷＴ腫瘍細胞の成長を示す。腫瘍体積をノギスで測定し、式：（長さ×幅２）／２で計算した。全体的な二元配置ＡＮＯＶＡを使用して、腫瘍成長の曲線全体を分析し、これは、ｐ＜０．０１の有意差を示す。同様に、マウスの全てのペプチド免疫化群は、ＰＢＳ群及びｍＡｂ処置群よりも腫瘍負荷が少ないことが示される。

【図34】設計された群で処置されたマウスの生存率のログランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定を示す。

【図35】グラフに示されるマウス群であるＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＤ２Ｆ２／Ｅ２腫瘍細胞の成長を示す線図を示す。腫瘍体積をノギスで測定し、式：（長さ×幅２）／２で計算した。全体的な二元配置ＡＮＯＶＡを使用して、腫瘍成長の曲線全体を分析し、これは、ｐ＜０．０１の有意差を示す。全てのペプチド免疫化群及びｍＡｂで処置されたマウスは、ＰＢＳ群よりも腫瘍負荷が少ないことが示される。最も重要なのは、ＭＶＦ－ＨＥＲ－２（２６６－２９６）＋ＭＶＦ－ＨＥＲ－２（５９７－６２６）；ＭＶＦ－ＰＤ－１（９２－１１０）＋ＭＶＦ－ＨＥＲ－２（２６６－２９６）＋ＭＶＦ－ＨＥＲ－２（５９７－６２６）、及びＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１（１３０－１４７）＋ＭＶＦ－ＨＥＲ－２（２６６－２９６）＋ＭＶＦ－ＨＥＲ－２（５９７－６２６）として、２×ＨＥＲ２で免疫されたマウスは、著しい腫瘍抑制が示され、マウスのほとんどが、腫瘍チャレンジ後２８日目の最後まで腫瘍がない。

【図36】設計された各群で治療されたマウスの生存率を示すログランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定を示す。

【発明を実施するための形態】

【0018】

Ｖ．詳細な説明
本化合物、組成物、物品、デバイス、及び／または方法が開示及び記載される前に、それらは、別途明記のない限り、特定の合成方法もしくは特定の組み換えバイオテクノロジー方法に、または、別途明記のない限り、特定の試薬に、限定されないことを理解すべきであり、したがって、当然、異なる場合がある。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、限定することを意図するものではないことも理解すべきである。

【0019】

Ａ．定義
明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈に別途明示のない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「薬学的担体」への言及は、２つ以上のそのような担体の混合物などを含む。

【0020】

範囲は、本明細書では、「約」ある特定値から、及び／または「約」別の特定値までとして表すことができる。そのような範囲が表現される場合、別の実施形態は、１つの特定値から及び／または他の特定値までを含む。同様に、値が近似値として表される場合、先行詞「約」を使用することにより、特定値が別の実施形態を形成することが理解されるであろう。さらに、範囲のそれぞれの端点は、他の端点に関して且つ他の端点とは独立して、有意であることが理解されるであろう。本明細書にいくつかの数値が開示されており、各数値はまた、その数値自体に加えて、「約」その特定値として本明細書で開示されることも理解される。例えば、「１０」という数値が開示される場合、「約１０」も開示される。数値が開示される場合、当業者により適切に理解されるように、値「以下」、「その数値以上」、及び数値間の可能な範囲も開示されることも理解される。例えば、「１０」という数値が開示されている場合、「１０以下」ならびに「１０以上」も開示される。本出願の全体にわたって、データは、いくつかの異なる形式で提供され、このデータは、終点及び開始点、ならびにデータ点の任意の組み合わせに対する範囲を表すことも理解される。例えば、特定のデータ点「１０」及び特定のデータ点１５が開示される場合、１０及び１５超、以上、未満、以下、及び等しい、ならびに１０～１５が開示されたとみなされると理解される。２つの特定の単位間の各単位も開示されていることも理解される。例えば、１０及び１５が開示される場合、１１、１２、１３、及び１４も開示される。

【0021】

本明細書及びそれに続く特許請求の範囲では、いくつかの用語への言及がなされ、それらは以下の意味を有するように定義されるものとする。

【0022】

「任意」または「任意に」は、その後に記載される事象または状況が生じても生じなくてもよいこと、及び、記載が該事象または状況が生じる場合及び生じない場合を含むことを意味する。

【0023】

「投与すること」という用語は、経口、局所、静脈内、皮下、経皮、経皮、筋肉内、関節内、非経口、細動脈内、皮内、脳室内、頭蓋内、腹腔内、病巣内、鼻腔内、経直腸、膣内、吸入による、または埋め込みリザーバーを介する投与を指す。「非経口」という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、髄腔内、肝内、病巣内、及び頭蓋内注射または注入手法を含む。

【0024】

本明細書で使用される場合、「含む」という用語は、組成物及び方法が列挙された要素を含むが、他のものを除外しないことを意味することが意図される。組成物及び方法を定義するために使用される場合、「本質的に～からなる」は、組み合わせにとって本質的に重要な他の要素を除外することを意味するものとする。したがって、本明細書で定義される要素から本質的になる組成物は、単離及び精製方法からの微量汚染物質、ならびに薬学的に許容される担体、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、防腐剤などを除外しない。これらの転換用語のそれぞれにより定義される実施形態は、本発明の範囲内である。

【0025】

「有効量」は、有益なまたは望ましい結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、１つ以上の投与、適用、または投薬量で投与することができる。

【0026】

本明細書で使用される「治療する」、「治療すること」、「治療」という用語、及びそれらの文法的変形は、障害もしくは状態の１つ以上の付随する症状の強度を部分的もしくは完全に遅延、緩和、軽減、もしくは低減すること、及び／または、障害もしくは状態の１つ以上の原因を緩和、軽減、もしくは抑制すること、を含む。本発明による治療は、予防的、予防的、緩和的、または治療的に適用されてもよい。一部の場合では、「治療する」、「治療すること」、「治療」という用語、及びそれらの文法的変形は、対象の治療前と比較して、または一般的もしくは試験集団におけるそのような症状の発生率に比べてと比較して、腫瘍のサイズを部分的または完全に低減させること、腫瘍の数を低減させること、及び腫瘍の重症度／転移能力を低減させることを含む。

【0027】

本明細書及び結びの特許請求の範囲では、組成物中の特定の要素または構成成分の重量部への言及は、要素または構成成分と、重量部が表現される組成物または物品中の他の任意の要素または構成成分との間の重量関係を意味する。したがって、２重量部の構成成分Ｘならびに５重量部の構成成分Ｙを含有する化合物中には、Ｘ及びＹは、重量比２：５で存在し、さらなる構成成分が化合物に含有されるかどうかに関わらず、そのような比で存在する。本明細書で使用される場合、構成成分の「ｗｔ．％」または「重量パーセント（ｗｅｉｇｈｔ ｐｅｒｃｅｎｔ）」または「重量パーセント（ｐｅｒｃｅｎｔ ｂｙ ｗｅｉｇｈｔ）」は、特に相反する記載がない限り、パーセンテージとして表される、構成成分の重量の構成成分が含まれる組成物の総重量に対する比を指す。

【0028】

本出願全体を通して、様々な出版物が参照される。それらの刊行物全体の開示は、本出願が属する現況技術をより完全に説明するために、本明細書により、本出願に参照により組み込まれる。開示された参考文献は、また、参考文献が依拠している文で考察される、それらに含有される資料について、本明細書に参照により個別且つ具体的に組み込まれる。

【0029】

Ｂ．組成物
開示の組成物及び本明細書に開示の方法で使用される組成物自体を調製するために使用される構成成分が開示される。これら及び他の材料が本明細書に開示され、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、グループなどが開示される場合、これらの化合物のそれぞれ様々な個別及び集合的組み合わせ及び順列の具体的な言及が明確に開示されないことがあるが、それぞれは、本明細書で具体的に企図及び記載されると理解される。例えば、特定の合成またはキメラＰＤ－Ｌ１ペプチドが開示及び考察され、且つ合成またはキメラＰＤ－Ｌ１ペプチドを含むいくつかの分子になすことができるいくつかの修飾が開示される場合、合成またはキメラＰＤ－Ｌ１ペプチドのありとあらゆる組み合わせ及び順列ならびに特に反対の指示がない限り可能な修正が具体的に考察される。したがって、分子Ａ、Ｂ、及びＣのクラスならびに分子Ｄ、Ｅ、及びＦのクラスが開示され、且つ組み合わせ分子Ａ～Ｄの例が開示されるならば、たとえそれぞれが個別に列挙されないとしても、それぞれは、組み合わせを意味するように個別に及び集合的に企図され、Ａ～Ｅ、Ａ～Ｆ、Ｂ～Ｄ、Ｂ～Ｅ、Ｂ～Ｆ、Ｃ～Ｄ、Ｃ～Ｅ、及びＣ～Ｆが開示されているとみなされることを意味する。同様に、これらのサブセットまたは組み合わせも開示される。したがって、例えば、サブグループＡ～Ｅ、Ｂ～Ｆ、及びＣ～Ｅは開示されているとみなされるであろう。本概念は、限定されないが、開示の組成物を作成及び使用する方法のステップを含む本出願の全ての態様に適用される。したがって、実施することできる様々な追加のステップがある場合、これらの追加のステップのそれぞれは、開示の方法の任意の特定の実施形態または実施形態の組み合わせで実施することができると理解される。

【0030】

免疫グロブリンスーパーファミリーに属するＰＤ－１遺伝子は、５５ｋＤａのＩ型膜貫通タンパク質をコードする。マウスＰＤ－１及びヒトＰＤ－１の両方は、２８８アミノ酸から成り、Ｎ末端（２０アミノ酸）にシグナルペプチド、及び中央部に疎水性領域を有し、疎水性領域は膜貫通領域である。ヒト及びマウスのＰＤ－１タンパク質は、約６０％～８０％のアミノ酸同一性を共有し、４つの潜在的なＮ－グリコシル化部位、及びＩｇ－Ｖドメインを定義する残基が保存されている。ＰＤ－１は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及びマクロファージ上に発現される。ＰＤ－１のリガンドは、Ｂ７ファミリーメンバーのＰＤ－Ｌ１（Ｂ７－Ｈ１）及びＰＤ－Ｌ２（Ｂ７－ＤＣ）である。免疫チェックポイントのプログラム細胞死タンパク質－１（ＰＤ－１）を介したシグナル伝達は、抗腫瘍免疫応答を減衰させることにより腫瘍の進行を可能にする。ＰＤ－１及びそのリガンドであるプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）間のシグナル伝達軸の、モノクローナル抗体を用いる治療的遮断は、がんの治療において顕著な臨床的成功が示されており、一連の広範ながんサブタイプにわたる目覚ましい活性を示している。ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１の相互作用を直接遮断するか、またはＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１の相互作用を遮断するＰＤ－Ｌ１に対する抗体を生成するために宿主の免疫応答を刺激することができる、より小さな非抗体ペプチド治療薬及びペプチドワクチンを使用した従来のＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断の改善が本明細書に開示される。

【0031】

ＰＤ－Ｌ１ Ｂ細胞エピトープのコンピューター支援分析を使用して、ＰＤ－Ｌ１（配列番号１）残基３６～５３、５０～６７、９５～１１２、及び１３０～１４７に対応する配列を導出した。したがって、一態様では、ＰＤ－Ｌ１の残基３６～５３、５０～６７、９５～１１２、及び／または１３０～１４７を含むＰＤ－Ｌ１タンパク質に対する免疫応答を刺激するための合成ＰＤ－Ｌ１ペプチドが本明細書に開示される。例えば、ＬＩＶＹＷＥＭＥＤＫＮＩＩＱＦＶＨＧ（配列番号２）、ＦＶＨＧＥＥＤＬＫＶＱＨＳＳＹＲＱＲ（配列番号３）、ＹＲＣＭＩＳＹＧＧＡＤＹＫＲＩＴＶＫ（配列番号４）、及び／またはＶＴＳＥＨＥＬＴＣＱＡＥＧＹＰＫＡＥ（配列番号５）を含む、ＰＤ－Ｌ１タンパク質に対する免疫応答を刺激するための合成ＰＤ－Ｌ１ペプチドが本明細書に開示される。一態様では、ペプチドは、アシル化及び／またはアミド化することができる。したがって、（配列番号２）、（配列番号３）、（配列番号４）、及び／または（配列番号５）を含むＰＤ－Ｌ１タンパク質に対する免疫応答を刺激するための合成ＰＤ－Ｌ１ペプチドが本明細書で開示され、合成ペプチドは、アシル化及び／またはアミド化される。

【0032】

いくつかの例では、Ｌ－アミノ配列のアナログを使用すると、分解に対する耐性、安定性、合成の容易さ、またはより大きな有効性などの、元の配列に対する利点がもたらされ得る。一態様では、開示の合成配列は、アミノ末端からカルボキシ末端への逆の順序でＬ－アミノ配列を含み得ることが理解され、本明細書で企図される。例えば、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５のレトロ配列は、それぞれ、ＧＨＶＦＱＩＩＮＫＤＥＭＥＷＹＶＩＬ（配列番号１２）、ＲＱＲＹＳＨＳＱＶＫＬＤＥＥＧＨＶＦ（配列番号１３）、ＫＶＴＩＲＫＹＤＡＧＧＹＳＩＭＣＲＹ（配列番号１４）、及びＥＡＫＰＹＧＥＡＱＣＴＬＥＨＥＳＴＶ（配列番号１５）である。これらのレトロ配列は、基本配列のミラーコンフォメーションも有し得る。したがって、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、及び／または配列番号１５に記載の配列のうちの１つ以上を含む合成ＰＤ－Ｌ１ペプチドが本明細書に開示される。配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５と同様に、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、及び／または配列番号１５を含む合成ペプチドは、アセチル化及び／またはアミド化することができる。

【0033】

配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５で記載されるＬ－アミノ酸配列のレトロアナログ（配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５に記載）に加えて、より良い経口投与、有効性の拡大、及び合成の容易さの増加を可能にする分解及びタンパク質分解に対する耐性の増加を有し得る、フォワードＬ－アミノ（配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５）ならびにレトロＬ－アミノ配列（配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５）のＤエナンチオマーアナログがある。したがって、一態様では、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、及び／または配列番号１５のうちの１つ以上を含む合成ＰＤ－Ｌ１ペプチドが本明細書に開示され、配列を構成するアミノ酸はＤアミノ酸である。

【0034】

一態様では、開示の合成ＰＤ－Ｌ１のペプチドは、キメラＰＤ－Ｌ１ペプチドを形成するために、ＭＨＣ制限（すなわち、無差別Ｔｈ細胞エピトープ）をバイパスすることを支援するサイトカインの放出を促進するヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞エピトープに合成ＰＤ－Ｌ１ペプチドを連結することにより、Ｂ細胞の刺激を増加させ得ることが理解され、本明細書で企図される。例えば、一態様では、さらに、Ｔヘルパー（Ｔｈ）エピトープ（例えば、配列番号６などの麻疹ウイルス融合タンパク質ペプチド）を含む１つ以上のＰＤ－Ｌ１ Ｂ細胞エピトープを含む、ＰＤ－Ｌ１タンパク質に対する免疫応答を刺激するためのＰＤ－Ｌ１キメラペプチドが本明細書に開示され、１つ以上のＰＤ－Ｌ１ Ｂ細胞エピトープが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、及び／または配列番号１５からなる群より選択される配列からなる。Ｂ細胞エピトープ（すなわち、ＰＤ－Ｌ１合成ペプチド）がＤアミノ酸を含み得ることが理解され、本明細書で企図される。

【0035】

Ｔｈエピトープは、約１４～約２２アミノ酸長、より好ましくは、約１５～２１アミノ酸長、最も好ましくは、１６アミノ酸長であり得る。好ましくは、Ｔｈ細胞エピトープは、表１に提供される以下のアミノ酸配列のうちの１つを有する。

【表1】

【0036】

合成ＰＤ－Ｌ１ペプチド及びＴｈ細胞エピトープを連結するために、アミノ酸リンカーを使用することができる。好ましくは、リンカーは、約２～約１５アミノ酸長、より好ましくは、約２～約１０アミノ酸長、最も好ましくは、約２～約６アミノ酸長のペプチドである。最も好ましいリンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ（配列番号７）を含む。したがって、一態様では、任意の先行する態様の合成ペプチドを含み、さらに、Ｔｈエピトープ（例えば、配列番号６などの麻疹ウイルス融合タンパク質ペプチド）及びＴｈエピトープに合成ＰＤ－Ｌ１ペプチドを連結するリンカー（例えば、配列番号７など）を含む、キメラペプチドも本明細書で開示される。例えば、一態様では、１つ以上のＰＤ－Ｌ１ Ｂ細胞エピトープ、Ｔヘルパー（Ｔｈ）エピトープ（例えば、配列番号６などの麻疹ウイルス融合タンパク質ペプチド）、及びＴｈエピトープにＰＤ－Ｌ１ Ｂ細胞エピトープを連結するリンカー（例えば、配列番号７など）を含む、ＰＤ－Ｌ１タンパク質に対する免疫応答を刺激するためのキメラＰＤ－Ｌ１ペプチドが本明細書で開示され、キメラＰＤ－Ｌ１ペプチドは、ＫＬＬＳＬＩＫＧＶＩＶＨＲＬＥＧＶＥＧＰＳＬＬＩＶＹＷＥＭＥＤＫＮＩＩＱＦＶＨＧ（配列番号８）、ＫＬＬＳＬＩＫＧＶＩＶＨＲＬＥＧＶＥＧＰＳＬＦＶＨＧＥＥＤＬＫＶＱＨＳＳＹＲＱＲ（配列番号９）、ＫＬＬＳＬＩＫＧＶＩＶＨＲＬＥＧＶＥＧＰＳＬＹＲＣＭＩＳＹＧＧＡＤＹＫＲＩＴＶＫ（配列番号１０）、ＫＬＬＳＬＩＫＧＶＩＶＨＲＬＥＧＶＥＧＰＳＬＶＴＳＥＨＥＬＴＣＱＡＥＧＹＰＫＡＥ（配列番号１１）、ＫＬＬＳＬＩＫＧＶＩＶＨＲＬＥＧＶＥＧＰＳＬＧＨＶＦＱＩＩＮＫＤＥＭＥＷＹＶＩＬ（配列番号１６）、ＫＬＬＳＬＩＫＧＶＩＶＨＲＬＥＧＶＥＧＰＳＬＲＱＲＹＳＳＨＱＶＫＬＤＥＥＧＨＶＦ（配列番号１７）、ＫＬＬＳＬＩＫＧＶＩＶＨＲＬＥＧＶＥＧＰＳＬＫＶＴＩＲＫＹＤＡＧＧＹＳＩＭＣＲＹ（配列番号１８）、及び／またはＫＬＬＳＬＩＫＧＶＩＶＨＲＬＥＧＶＥＧＰＳＬＥＡＫＰＹＧＥＡＱＣＴＬＥＨＥＳＴＶ（配列番号１９）に記載のアミノ酸配列を含む。

【0037】

合成ペプチドと同様に、キメラＰＤ－Ｌ１ペプチド内に含まれる合成ＰＤ－Ｌ１ペプチドのアミノ酸は、配列中のＬ－アミノ酸のＤアミノ酸アナログであり得ることが理解され、本明細書で企図される。したがって、一態様では、本明細書に開示の合成ＰＤ－Ｌ１ペプチドのいずれかを含み、さらに、Ｔｈエピトープ（例えば、配列番号６などの麻疹ウイルス融合タンパク質ペプチド）、及びＴｈエピトープに合成ＰＤ－Ｌ１ペプチドを連結するリンカー（例えば、配列番号７など）を含む、キメラペプチドが本明細書に開示される。例えば、一態様では、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、及び／または配列番号１９に記載のアミノ酸配列を含むキメラＰＤ－Ｌ１ペプチドが本明細書に開示され、合成ＰＤ－Ｌ１ペプチド配列（すなわち、Ｂ細胞エピトープ）は、Ｄアミノ酸を含む。

【0038】

本明細書に開示される、開示の合成及びキメラＰＤ－Ｌ１ペプチドは、ペプチドベースのＢ細胞エピトープを使用する標的療法ならびにＨＥＲ－２などの発がん性シグナル伝達経路を阻害することにより、がんの成長及び拡散を阻止する標ペプチド免疫療法と組み合わせることができる。ＨＥＲ２、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ｐ１８５ｎｅｕ、ＥＲＢＢ２、またはＣＤ３４０ファミリーの受容体としても知られるヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ－２）は、乳癌、卵巣癌、腎臓癌、結腸癌、及び肺癌腫癌を含むいくつかのヒトがんの病因において中心的な役割を果たし、より侵襲型のがん、転移リスクの増加、腫瘍浸潤の増加、及び全生存期間の減少と関連する。それ故、ＨＥＲ－２は、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））及びペルツズマブ（ＰＥＲＪＥＣＴＡ（登録商標））の結合部位であるいくつかのがんの重要な治療標的である。トラスツズマブは、化学療法と組み合わせた、転移性ＨＥＲ－２陽性乳癌患者の臨床使用が承認されたＨＥＲ－２を標的とする最初のヒト化ｍＡｂである。未治療ＨＥＲ－２陽性乳癌患者において、他のＨＥＲファミリーメンバーとのＨＥＲ－２の二量体化を阻止するヒト化ｍＡｂであるペルツズマブを、ドセタキセル及びトラスツズマブに追加すると、無増悪生存期間が１２．４か月から１８．５か月に改善され、全生存期間が４０．８か月から５６．５か月に改善された。転移性患者の約３分の１においてトラスツズマブからの効果が観察されたにもかかわらず、ＨＥＲ－２陽性乳癌は、最初に応答し、応答する患者の大多数は、最終的に、治療の１年以内に後天性耐性を高めた。ＨＥＲ－２に対するヒト化ｍＡｂ（トラスツズマブ、ペルツズマブ）またはＥＧＦＲを特異的に標的とするキメラｍＡｂ（セツキシマブ、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標））による標的療法は、アジュバント設定で生存率を著しく改善したが、依然として、毒性、内因性、または後天性耐性を示し、進行癌患者の大多数は、最終的に疾患により死亡する。

【0039】

１つ以上のＨＥＲ－２ Ｂ細胞エピトープ、Ｔヘルパー（Ｔｈ）エピトープ（限定されないが、麻疹ウイルス融合タンパク質のペプチドを含む（例えば、配列番号６など））、及びＴｈエピトープにＨＥＲ－２ Ｂ細胞エピトープを連結するリンカー（例えば、配列番号７など）を含む、ＨＥＲ－２に対する免疫応答を刺激するためのＨＥＲ－２キメラペプチドもまた、本明細書で開示され、１つ以上のＨＥＲ－２ Ｂ細胞エピトープが、配列番号２７及び配列番号２９からなる群より選択される配列からなる。例えば、ＨＥＲ－２キメラペプチドが配列番号２８または配列番号３０に記載のアミノ酸配列を含む。

【0040】

ＰＤ－Ｌ１ペプチド、合成ＰＤ－Ｌ１ペプチド、キメラＰＤ－Ｌ１ペプチド（例えば、配列番号２、３、４、５、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、及び／もしくは１９に記載のペプチドのいずれか）のうちのいずれも、ならびに／またはＨＥＲ－２ペプチドまたはキメラＨＥＲ－２ペプチドのうちのいずれも（例えば、配列番号２７、２８、２９、または３０に記載のペプチドのいずれも）が、ワクチンまたは医薬組成物として製剤化することができ、これは、がん（例えば、乳癌、卵巣癌、子宮体癌、結腸癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、及び子宮頸癌など）、自己免疫疾患、ならびに／またはアルツハイマー病を有するか、またはそれを発症するリスクのある対象に治療的または予防的に投与することができることが理解され、本明細書に企図される。一態様では、ワクチンまたは医薬組成物は、任意の上述の１つ以上のキメラまたは合成ペプチド及び薬学的に許容されるビヒクル（例えば、限定されないが、薬学的に許容されるアジュバントを含むエマルションを含む生分解性のビヒクルなど）を含み得る。本明細書で使用される場合、「アジュバント」という用語は、通常、キメラペプチド単独、またはアジュバントの非存在下の本明細書に記載のキメラペプチドのいずれかから予想されるものを超えて、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）キメラペプチドにより誘発された免疫応答の大きさを増加させ得る物質のクラスを指す。

【0041】

好適なアジュバントは、当業者に既知であろう。好適なアジュバントの非限定例は、アルミニウム塩（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、及び硫酸アルミニウムカリウム（ミョウバンとも呼ばれる））、リポソーム、ビロソーム、油中水型または水中油型エマルション（例えば、フロイントアジュバント、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）、ＭＦ５９（登録商標）、及びＡＳ０３）、３－Ｏ－デサシル－４’－モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、ならびにＭＰＬを含有するアジュバント（例えば、ＡＳ０１、ＡＳ０２、及びＡＳ０４）、ならびにサポニンベースのアジュバントを含む。サポニンベースのアジュバントは、例えば、Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ、Ｐａｎａｘ ｇｉｎｓｅｎｇ、Ｐａｎａｘ ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ、Ｐａｎａｘ ｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌｉｕｍ、Ｐｌａｔｙｃｏｄｏｎ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ、Ｐｏｌｙｇａｌａ ｓｅｎｅｇａ、Ｐｏｌｙｇａｌａ ｔｅｎｕｉｆｏｌｉａ、Ｑｕｉｌｌａｊａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ、及びＡｃｈｙｒａｎｔｈｅｓ ｂｉｄｅｎｔａｔａ由来のサポニンまたはサポニン誘導体を含む。例示的なサポニンベースのアジュバントとしては、ｉｓｃｏｍ、ｉｓｃｏｍマトリックス、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）アジュバント、ＭａｔｒｉｘＭ（商標）アジュバント、Ｍａｔｒｉｘ Ｃ（商標）アジュバント、Ｍａｔｒｉｘ Ｑ（商標）アジュバント、ＡｂＩＳＣＯ（登録商標）－１００アジュバント、ＡｂＩＳＣＯ（登録商標）－３００アジュバント、ＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）、ＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）誘導体、ＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）またはＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）誘導体を含有するアジュバント、ＱＳ－２１、ＱＳ－２１誘導体、及びＱＳ－２１またはＱＳ２１誘導体を含有するアジュバントが挙げられる。本明細書に記載のワクチン組成物は、例えば、サイトカイン、ケモカイン、及び成長因子を含む免疫調節物質と会合することもできる。同じワクチン組成物内の２つ以上のアジュバントの混合物もまた、本明細書で企図される。一実施形態では、アジュバントは、油中水型アジュバントであるＭｏｎｔａｎｉｄｅである。例えば、医薬組成物を含み、さらに、１つ以上のＨＥＲ－２ Ｂ細胞エピトープ（例えば、配列番号２７もしくは配列番号２９など）、１つ以上のキメラＨＥＲ ２ペプチド（例えば、配列番号２８もしくは配列番号３０など）、及び／または１つ以上の抗Ｈｅｒ－２抗体を含む、ＰＤ－Ｌ１ペプチド、合成ＰＤ－Ｌ１ペプチド、及び／またはキメラＰＤ－Ｌ１ペプチド（例えば、配列番号２、３、４、５、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、及び／または１９に記載のペプチドのいずれか）が本明細書に開示される。一態様では、ＨＥＲ－２ Ｂ細胞エピトープを伴い、または伴わず、ＰＤ－Ｌ１ペプチド、合成ＰＤ－Ｌ１ペプチド、及び／またはキメラＰＤ－Ｌ１ペプチド（例えば、配列番号２、３、４、５、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、及び／または１９に記載のペプチドのいずれか）のうちのいずれかを含み、さらに、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム、水酸化リン酸カルシウム、フロイントの完全アジュバント、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）、フロイント不完全アジュバント、ｉｓｃｏｍ、ｉｓｃｏｍマトリックス、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）アジュバント、Ｍａｔｒｉｘ Ｍ（商標）アジュバント、Ｍａｔｒｉｘ Ｃ（商標）アジュバント、Ｍａｔｒｉｘ Ｑ（商標）アジュバント、ＡｂＩＳＣＯ（登録商標）－１００アジュバント、ＡｂＩＳＣＯ（登録商標）－３００アジュバント、ＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）、ＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）誘導体、ＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）またはＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）誘導体を含有するジュバント、ＱＳ－２１、ＱＳ－２１誘導体、及びＱＳ－２１またはＱＳ２１誘導体を含むアジュバントからなる群より選択されるアジュバントを含む医薬組成物が本明細書に開示される。

【0042】

一態様では、本明細書に開示のＰＤ－Ｌ１キメラペプチド、ＰＤ－Ｌ１合成ペプチド、ＨＥＲ－２キメラペプチド、ＨＥＲ－２合成ペプチドのいずれかに特異的に結合する抗体が本明細書に開示される。

【0043】

１．配列類似性
本明細書で考察されるように、相同性及び同一性という用語の使用は、類似性と同じことを意味することが理解される。したがって、例えば、相同性という単語の使用が２つの非天然配列間で使用される場合、これは、必ずしもこれらの２つの配列間の進化的関係を示すのではなく、むしろ、それらの核酸配列間の類似性または関連性を検討していることが理解される。２つの進化的に関連する分子間の相同性を決定するための方法の多くが、それらが進化的に関連するか否かに関わらず、配列類似性を測定するために、日常的に、任意の２つ以上の核酸またはタンパク質に適用される。

【0044】

一般に、任意の既知のバリアント及び誘導体または本明細書に開示の遺伝子及びタンパク質から生じる得るものを定義する１つの仕方は、特定の既知の配列に対する相同性に関して、バリアント及び誘導体を定義することによるものであると理解される。本明細書に開示の特定の配列のこの同一性は、また、本明細書の他の箇所に論じられる。一般に、本明細書に開示の遺伝子及びタンパク質のバリアントは、通常、所定の配列または天然配列と、少なくとも、約７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９パーセントの相同性を有する。当業者は、２つのタンパク質または核酸、例えば、遺伝子、の相同性を決定する方法を容易に理解する。例えば、相同性は、相同性が最高レベルになるように、２つの配列をアラインさせた後に、計算することができる。

【0045】

相同性を計算する別の方法は、公開されたアルゴリズムにより実施することができる。比較のための配列の最適なアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局地的相同性アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．ＭｏＬ Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４（１９８８）の類似性の方法の検索により、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実装形態（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、ウィスコンシン州マディソンのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）により、または検査により、実行されてもよい。

【0046】

方法のうちのいずれも通常使用することができ、ある特定の場合では、これらの様々な方法の結果が異なってもよいことが理解されるが、これらの方法のうちの少なくとも１つにより同一性が判明した場合、配列は、所定の同一性を有すると言われ、本明細書に開示されると、当業者は理解する。

【0047】

例えば、本明細書で使用される場合、別の配列に対して特定のパーセント相同性を有すると記載される配列は、記載の相同性（上記の計算方法のいずれか１つ以上により計算）を有する配列を指す。例えば、第１の配列が、Ｚｕｋｅｒ計算法を使用して、第２の配列にと８０パーセントの相同性を有するように計算される場合、第１の配列が第２の配列と、他の計算法のいずれかにより計算して８０パーセントの相同性を有さない場合でも、第１の配列は、本明細書で定義されるように、第２の配列と８０パーセントの相同性を有する。別の例として、第１の配列が、Ｚｕｋｅｒ計算方法ならびにＰｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ計算方法の両方を使用して、第２の配列と８０パーセントの相同性を有するように計算される場合、たとえ、第１の配列が、第２の配列と、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ計算方法、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ計算方法、Ｊａｅｇｅｒ計算方法、または他の計算方法のいずれかにより計算して、８０パーセントの相同性を有さないとしても、第１の配列は、本明細書で定義されるように、第２の配列と８０パーセントの相同性を有する。さらに別の例として、第１の配列が、計算法のそれぞれを使用して、第２の配列と８０パーセントの相同性を有するように計算される場合（但し、実際には、異なる計算法が、多くの場合、異なる計算された相同性パーセンテージをもたらすであろう）、第１の配列は、本明細書で定義されるように、第２の配列と８０パーセントの相同性を有する。

【0048】

２．ペプチド
ａ）タンパク質及びペプチドバリアント
本明細書で考察されるように、既知であり、本明細書で企図される合成ＰＤ－Ｌ１ペプチド及びキメラＰＤ－Ｌ１ペプチドの多数のバリアントがある。さらに、既知の機能的ＰＤ－Ｌ１株バリアントには、合成ＰＤ－Ｌ１ペプチド及びキメラＰＤ－Ｌ１ペプチドの誘導体があり、これらも、開示の方法及び組成物で機能する。タンパク質バリアント及び誘導体は、当業者に十分に理解され、アミノ酸配列の修飾を伴い得る。例えば、アミノ酸配列修飾は、通常、３つのクラス、すなわち置換バリアント、挿入バリアント、または欠失バリアントのうちの１つ以上に分類される。挿入は、アミノ及び／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。挿入は、通常、アミノまたはカルボキシル末端融合の挿入よりも小さい挿入であり、例えば、１～４残基程度である。実施例に記載されるような免疫原性融合タンパク質誘導体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの架橋により標的配列に免疫原性を付与するのに十分な大きさのポリペプチドを融合することにより、または融合をコードするＤＮＡで形質転換された組み換え細胞培養により、作成される。欠失は、タンパク質配列からの１つ以上のアミノ酸残基の除去を特徴とする。通常、約２～６つ以下残基が、タンパク質分子内の任意の１つの部位で欠失する。これらのバリアントは、通常、タンパク質をコードするＤＮＡのヌクレオチドの部位特異的変異導入により調製され、それにより、バリアントをコードするＤＮＡを生成し、その後、組み換え細胞培養でＤＮＡを発現する。既知の配列を有するＤＮＡの所定の部位で置換変異を作成するための手法、例えば、Ｍ１３プライマー変異導入及びＰＣＲ変異導入はよく知られている。アミノ酸置換は、通常、単一の残基のものであるが、一度に、いくつかの異なる場所で生じ得、挿入は、通常、約１～１０アミノ酸残基程度となり、欠失は、約１～３０残基の範囲に及ぶであろう。欠失または挿入は、好ましくは、隣接する対で行われ、すなわち、２残基の欠失または２残基の挿入である。置換、欠失、挿入、またはそれらの任意の組み合わせを、最終構築物に到達するように組み合せてもよい。変異は、配列をリーディングフレームの外に配置してはならず、２次ｍＲＮＡ構造を生成し得る相補的領域を生じさせないことが好ましい。置換バリアントは、少なくとも１つの残基が除去されており、異なる残基がその場所に挿入されている。そのような置換は、一般に、以下の表２及び３に従って行われ、保存的置換と呼ばれる。

【表2】

【表3】

【0049】

機能または免疫学的識別の実質的な変更が、表３のものよりも保存的でない置換を選択することにより、すなわち、（ａ）例えば、シートまたはらせん構造として、置換の領域のポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の大部分、を維持することにおける影響がより大きく異なる残基を選択することにより、行われる。一般にタンパク質特性に最大の変化を生じると予想される置換は、（ａ）親水性残基、例えば、セリルもしくはスレオニンが、疎水性残基、例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル、もしくはアラニルと（もしくはそれにより）置換されるもの、（ｂ）システインもしくはプロリンが、他の任意の残基と（もしくはそれにより）置換されるもの、（ｃ）正荷電側鎖を有する残基、例えば、リシル、アルギニル、もしくはヒスチジルが、負荷電残基、例えば、グルタミルもしくはアスパルチルと（もしくはそれにより）置換されるもの、または、（ｄ）嵩高な側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンが、この場合は、側鎖を有さないもの、例えば、グリシン、と（もしくはそれにより）置換されるもの、（ｅ）硫酸化及び／もしくはグリコシル化の部位数を増加させることによるもの、となる。

【0050】

例えば、あるアミノ酸残基を、生物学的及び／または化学的に類似している別のアミノ酸残基と置換することは、保存的置換として当業者には知られている。例えば、保存的置換は、ある疎水性残基を別の疎水性残基に、またはある極性残基を別の極性残基に置換するであろう。置換は、例えば、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；及びＰｈｅ、Ｔｙｒなどの組み合わせを含む。明示的に開示された各配列のそのような保存的に置換された変形が、本明細書で提供されるモザイクポリペプチド内に含まれる。

【0051】

Ｎ－グリコシル化（Ａｓｎ－Ｘ－Ｔｈｒ／Ｓｅｒ）またはＯ－グリコシル化（ＳｅｒまたはＴｈｒ）の部位を挿入するために、置換または欠失変異導入を用いることができる。システインまたは他の不安定な残基の欠失も望ましいことがある。潜在的なタンパク質分解部位、例えば、Ａｒｇ、の欠失または置換は、例えば、塩基性残基の１つを欠失するか、または１つをグルタミニルもしくはヒスチジル残基で置換することにより行われる。

【0052】

ある特定の翻訳後誘導体化は、発現されたポリペプチドに対する組み換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミニル及びアスパラギニル残基は、多くの場合、翻訳後脱アミド化されて、対応するグルタミル及びアスパリル残基になる。あるいは、これらの残基は、弱酸性条件下で脱アミド化される。他の翻訳後修飾としては、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のｏ－アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ｐｐ ７９－８６［１９８３］）、Ｎ末端アミンのアセチル化、及びいくつかの場合では、Ｃ末端カルボキシルのアミド化、が挙げられる。

【0053】

本明細書に開示のタンパク質のバリアント及び誘導体を定義する１つの方法は、特定の既知の配列に対する相同性／同一性に関してバリアント及び誘導体を定義することによるものであると理解される。所定の配列と、少なくとも７０％または７５％または８０％または８５％または９０％または９５％の同一性を有する、本明細書に開示のこれらの及び他のタンパク質のバリアントが具体的に開示される。当業者は、２つのタンパク質の相同性を決定する方法を容易に理解する。例えば、相同性は、相同性が最高レベルになるように、２つの配列をアラインさせた後に、計算することができる。

【0054】

相同性を計算する別の方法は、公開されたアルゴリズムにより実施することができる。比較のための配列の最適なアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．ＭｏＬ Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４（１９８８）の類似性の方法の検索により、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実装形態（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、ウィスコンシン州マディソンのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）により、または検査により、実行されてもよい。

【0055】

同じタイプの相同性を、例えば、Ｚｕｋｅｒ，Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：４８－５２，１９８９，Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：７７０６－７７１０，１９８９，Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１－３０６，１９８９に開示されたアルゴリズムにより核酸について得ることができる。

【0056】

保存的変異及び相同性の説明は、例えば、特定の配列と少なくとも７０％の相同性を有する実施形態の任意の組み合わせで一緒に組み合わせることができ、バリアントは、保存的変異であると理解される。

【0057】

本明細書が様々なタンパク質及びタンパク質配列を考察する場合、それらのタンパク質配列をコードし得る核酸も開示されると理解される。これは、特定のタンパク質配列に関連する全ての縮重配列、すなわち、１つの特定のタンパク質配列をコードする配列を有する全ての核酸、ならびにタンパク質配列の開示のバリアント及び誘導体をコードする縮重核酸を含む全ての核酸、を含むであろう。各特定の核酸配列は、本明細書に書き出されないこともあるが、ありとあらゆる配列が、実際に、開示のタンパク質配列を通して、本明細書に開示され、記載されると理解される。アミノ酸配列は、特定のＤＮＡ配列が生物内のそのタンパク質コードするものを示さず、開示のタンパク質の特定のバリアントが本明細書で開示されるが、そのペプチドまたはタンパク質をコードする既知の核酸配列もまた既知であり、本明細書で開示及び記載されることが理解される。

【0058】

開示の組成物に組み込むことができる多くのアミノ酸及びペプチド類似体があることが理解される。例えば、多数のＤアミノ酸、または表２及び表３に示されるアミノ酸とは異なる官能的置換基を有するアミノ酸がある。天然に存在するペプチドの反対の立体異性体、ならびにペプチドアナログの立体異性体が開示される。これらのアミノ酸は、部位に特異的な仕方で、ペプチド鎖にアナログアミノ酸を挿入するために、ｔＲＮＡ分子を選択のアミノ酸で荷電させることにより、及び、例えば、ａｍｂｅｒコドン、を利用する遺伝子構築物を操作することにより、ポリペプチド鎖に容易に組み込むことができる。

【0059】

ペプチドに似ているが、天然のペプチド結合を介して連結されていない分子を生成することができる。例えば、アミノ酸またはアミノ酸アナログのための結合は、ＣＨ_２ＮＨ－－、－－ＣＨ_２Ｓ－－、－－ＣＨ_２－－ＣＨ_２－－、－－ＣＨ＝ＣＨ－－（シス及びトランス）、－－ＣＯＣＨ_２－－、－－ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２－－、ならびに－－ＣＨＨ_２ＳＯ－を含み得る（これら及び他は、Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，ｅｄｓ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐ．２６７（１９８３）、Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．，Ｖｅｇａ Ｄａｔａ（Ｍａｒｃｈ １９８３），Ｖｏｌ．１，Ｉｓｓｕｅ ３，Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ（ｇｅｎｅｒａｌ ｒｅｖｉｅｗ）、Ｍｏｒｌｅｙ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ（１９８０）ｐｐ．４６３－４６８、Ｈｕｄｓｏｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｐｔ Ｐｒｏｔ Ｒｅｓ １４：１７７－１８５（１９７９）（－－ＣＨ_２ＮＨ－－、ＣＨ_２ＣＨ_２－－）、Ｓｐａｔｏｌａ ｅｔ ａｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ３８：１２４３－１２４９（１９８６）（－－ＣＨＨ_２－－Ｓ）、Ｈａｎｎ Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．Ｉ ３０７－３１４（１９８２）（－－ＣＨ－－ＣＨ－－、シス及びトランス）；Ａｌｍｑｕｉｓｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３：１３９２－１３９８（１９８０）（－－ＣＯＣＨ_２－－）、Ｊｅｎｎｉｎｇｓ－Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ ２３：２５３３（１９８２）（－－ＣＯＣＨ_２－－）、Ｓｚｅｌｋｅ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ａｐｐｌｎ，ＥＰ ４５６６５ ＣＡ（１９８２）：９７：３９４０５（１９８２）（－－ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２－－）、Ｈｏｌｌａｄａｙ ｅｔ ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．Ｌｅｔｔ ２４：４４０１－４４０４（１９８３）（－－Ｃ（ＯＨ）ＣＨ_２－－）、ならびにＨｒｕｂｙ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ３１：１８９－１９９（１９８２）（－－ＣＨ_２－－Ｓ－－）に見出すことができ、これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。特に好ましくは、非ペプチド結合は、－ＣＨ_２ＮＨ－である。ペプチドアナログは、ｂアラニン、ｇアミノ酪酸などの、結合原子間に複数の原子を有し得ると理解される。

【0060】

アミノ酸アナログ及びアナログ及びペプチドアナログは、多くの場合、強化されたまたは望ましい特性、例えば、より経済的な生産、より高い化学的安定性、強化された薬理学的特性（半減期、吸収、効力、有効性など）、特異性の変化（例えば、広域スペクトルの生物学的活性）、抗原性の低減などを有する。

【0061】

Ｄアミノ酸はペプチダーゼなどにより認識されないので、Ｄ－アミノ酸を、より安定なペプチドを生成するために使用することができる。コンセンサス配列の１つ以上のアミノ酸を、同じタイプのＤ－アミノ酸（例えば、Ｌリジンの代わりにＤリジン）で系統的置換することにより、より安定したペプチドを生成するために使用することができる。換言すれば、任意の開示の配列のインベルソ（すなわち、Ｄアミノ酸置換）が本明細書で企図される。システイン残基を、２つ以上のペプチドを一緒に環化または結合させるために使用することができる。これは、ペプチドを特定の立体配座に拘束するのに有益であり得る。一態様では、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５に記載の配列のうちの１つ以上を含む合成ＰＤ－Ｌ１ペプチドが本明細書に開示され、ペプチドのアミノ酸が、Ｄエナンチオマーである。

【0062】

一態様では、開示の合成ペプチドは、ペプチドのアミノ末端からカルボキシ末端が逆になるように、逆の順序であり得る（すなわち、レトロ配列）。一態様では、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５のレトロ配列が本明細書に開示され、これは、それぞれ、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５を含む。これらのレトロ配列は、基本配列のミラーコンフォメーションも有し得る。一態様では、レトロ配列は、Ｄアミノ酸置換（すなわち、レトロインベルソ）配列も含み得る。したがって、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５に記載の配列のうちの１つ以上を含む合成ＰＤ－Ｌ１ペプチドが本明細書に開示され、ペプチドのアミノ酸が、Ｄエナンチオマーである。

【0063】

本明細書に開示のＤアミノ酸置換合成ペプチドのいずれも、開示のＰＤ－Ｌ１キメラペプチドのＰＤ－Ｌ１エピトープとして使用することができると理解される。例えば、１つ以上のＰＤ－Ｌ１ Ｂ細胞エピトープ、Ｔヘルパー（Ｔｈ）エピトープ、及びＴｈエピトープにＰＤ－Ｌ１ Ｂ細胞エピトープを連結するリンカーを含む、キメラＰＤ－Ｌ１ペプチドが本明細書に開示され、１つ以上のＰＤ－Ｌ１ Ｂ細胞エピトープが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５からなる群より選択される配列からなり、ペプチドのアミノ酸は、Ｄエナンチオマーである。一態様では、キメラＰＤ－Ｌ１ペプチドが本明細書に開示され、ペプチドは、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９に記載のアミノ酸配列を含み、合成ＰＤ－Ｌ１のペプチドのアミノ酸が、Ｄエナンチオマーである。

【0064】

３．薬学的担体／医薬品の送達
上記のように、本明細書に開示の合成ＰＤ－Ｌ１ペプチド、キメラＰＤ－Ｌ１ペプチド、合成ＨＥＲ－２ペプチド、及び／またはキメラＨＥＲ－２ペプチドは、薬学的に許容される担体中、ｉｎ ｖｉｖｏで投与することもできる。したがって、一態様では、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、及び／または配列番号３０に記載のＰＤ－Ｌ１ペプチドのうちのいずれか１つ以上を含む医薬組成物が本明細書に開示される。

【0065】

「薬学的に許容される」とは、生物学的または他の点で望ましくないものではない材料を意味し、すなわち、その材料は、いかなる望ましくない生物学的効果も引き起こすことなく、またはその材料が含有される医薬組成物の他の構成要素と有害な様式で、いかなる相互作用も生じさせずに、核酸またはベクターと共に対象に投与されてもよい。担体は、当然、当業者に周知のように、活性成分の任意の分解を最小限にし、対象における任意の有害な副作用を最小化するように、選択されるであろう。

【0066】

医薬組成物を含む開示のＰＤ－Ｌ１ペプチドは、ＰＤ－Ｌ１媒介性免疫抑制が生じる疾患または状態の治療、抑制、低減、減少、改善、及び／または予防において特に有用であることが理解され、本明細書で企図される。過去２０年間で、別のがん治療パラダイムが進化している。発がん性シグナル伝達経路を阻害することにより、がんの成長及び拡大を阻止するペプチドベースのＢ細胞エピトープ及びペプチド免疫療法を使用した選択的な作用機序に基づいた標的療法である。これらの標的療法は、非特異的化学療法よりも副作用が少ない傾向にある。したがって、ペプチドベースの小分子阻害薬は、薬物開発方策において近年注目を受けている。しかし、モノクローナル抗体と比較して、小分子免疫チェックポイント阻害薬は、大幅な改善が必要である。したがって、一態様では、本明細書に開示のＰＤ－Ｌ１ペプチドのうちの１つ以上を含む開示の医薬組成物は、さらに、ＰＤ－Ｌ１ペプチドの有効性を増加させるために、疾患特異的治療またはワクチンと組み合わせることができる。例えば、ＰＤ－Ｌ１ペプチドのうちの１つ以上を含む医薬組成物は、がん及び／または転移（例えば、乳癌、卵巣癌、子宮体癌、結腸癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、及び子宮頸癌など）を治療、抑制、低減、減少、改善、及び／または予防に使用される抗ＨＥＲ２抗体、ＨＥＲ－２キメラペプチド、及び／またはＨＥＲ－２ Ｂ細胞エピトープと組み合わせることができる。

【0067】

一態様では、本明細書に開示のＰＤ－Ｌ１ペプチド、合成ペプチド、またはキメラペプチド（例えば、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、及び／または配列番号１９）のうちの１つ以上を含み、さらに、１つ以上のＨＥＲ－２ Ｂ細胞エピトープ（例えば、配列番号２７もしくは２９、またはキメラエピトープ配列番号２８もしくは３０）及び／あるいは抗Ｈｅｒ－２抗体を含む、医薬組成物が本明細書に開示される。一態様では、配列番号８に記載のＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１（３６－５３）、配列番号９に記載のＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１（５０－６７）、配列番号１０に記載のＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１（９５－１１２）、及び／または配列番号１１に記載のＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１（１３０－１４７）；ＭＶＦ－ＨＥＲ－２（２６６－２９６）ペプチド（例えば、配列番号２８に記載）、及びＭＶＦ－ＨＥＲ－２（５９７－６２６）ペプチド（例えば、配列番号３０に記載）を含む医薬組成物が本明細書に具体的に開示される。

【0068】

組成物は、局所鼻腔内投与または吸入剤による投与を含め、経口、非経口（例えば、静脈内）、筋肉内注射による、腹腔内注射による、経皮、体外、局所などで投与されてもよい。本明細書で使用される場合、「局所鼻腔内投与」は、外鼻孔の一方または両方を介して鼻及び鼻腔に組成物を送達することを意味し、噴霧機構もしくは液滴機構による、または核酸もしくはベクターのエアロゾル化による送達を含み得る。吸入剤による組成物の投与は、噴霧または液滴機構による送達により鼻または口を介するものであり得る。挿管による呼吸器系の任意の領域（例えば、肺）に直接送達することもできる。必要な組成物の正確な量は、対象の種、年齢、体重、及び全身状態、治療されるアレルギー性障害の重症度、使用される特定の核酸またはベクター、投与様式などに応じて、対象間で変動するであろう。このように、全ての組成物について正確な量を特定することは可能ではない。しかし、適切な量は、本明細書の教示される日常的な実験のみを使用して、当業者が決定することができる。

【0069】

組成物の非経口投与は、使用される場合、一般に注射を特徴とする。注射可能薬剤は、液体溶液もしくは懸濁液、注射前の液体中の懸濁液の溶液に適する固体形態、またはエマルションのいずれかとして、従来の形態で調製することができる。非経口投与のためのより最近改訂されたアプローチは、一定の投薬量が維持されるように、持続放出または徐放性システムの使用を含む。例えば、米国特許第３，６１０，７９５号（参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。

【0070】

材料は、溶液、懸濁液であってよい（例えば、微粒子、リポソーム、または細胞に組み込まれる）。これらは、抗体、受容体、または受容体リガンドを介して特定の細胞型を標的とされてもよい。以下の参考文献は、特定のタンパク質を腫瘍組織に標的とするこの技術の使用の例である（Ｓｅｎｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，２：４４７－４５１，（１９９１）、Ｂａｇｓｈａｗｅ，Ｋ．Ｄ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６０：２７５－２８１，（１９８９）、Ｂａｇｓｈａｗｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８：７００－７０３，（１９８８）、Ｓｅｎｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，４：３－９，（１９９３）、Ｂａｔｔｅｌｌｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３５：４２１－４２５，（１９９２）、Ｐｉｅｔｅｒｓｚ ａｎｄ ＭｃＫｅｎｚｉｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｒｅｖｉｅｗｓ，１２９：５７－８０，（１９９２）、及びＲｏｆｆｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，４２：２０６２－２０６５，（１９９１））。「ステルス」などのビヒクル及び他の抗体コンジュゲートリポソーム（結腸癌への脂質媒介薬物標的化を含む）、細胞特異的リガンドを介したＤＮＡの受容体媒介標的化、リンパ球指向性腫瘍標的化、及びｉｎ ｖｉｖｏでのマウス神経膠腫細胞の高度に特異的な治療レトロウイルス標的化。以下の参考文献は、特定のタンパク質を腫瘍組織に標的とするこの技術の使用の例である（Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４９：６２１４－６２２０，（１９８９）、及びＬｉｔｚｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１１０４：１７９－１８７，（１９９２））。一般に、受容体が、構成的またはリガンド誘導のいずれかの、エンドサイトーシスの経路に関与する。クラスリン被覆ピット中のこれらの受容体クラスターは、クラスリン被覆小胞を介して細胞に入り、酸性化エンドソームを通過し、この中で、受容体が選別され、その後、細胞表面に再循環するか、細胞内に保存されるか、またはリソソーム中で分解される。内在化経路は、様々な機能、例えば、栄養素の取り込み、活性化タンパク質の除去、高分子のクリアランス、ウイルス及び毒素の日和見侵入、リガンドの解離及び分解、ならびに受容体レベルの制御、を果たす。多くの受容体は、細胞の種類、受容体の濃度、リガンドの種類、リガンド価数、及びリガンド濃度に応じて、複数の細胞内経路をたどる。受容体媒介性エンドサイトーシスの分子及び細胞機序が概説されている（Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｅ、ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：６、３９９－４０９（１９９１））。

【0071】

ａ）薬学的に許容される担体
抗体を含む組成物は、薬学的に許容される担体と組み合わせて治療的に使用することができる。

【0072】

好適な担体及びそれらの製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（１９ｔｈ ｅｄ．）ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １９９５に記載される。通常は、適切な量の薬学的に許容される塩が、製剤を等張にするために製剤に使用される。薬学的に許容される担体の例としては、生理食塩水、リンゲル液、及びデキストロース溶液が含まれるが、これらに限定されない。溶液のｐＨは、好ましくは、約５～約８であり、より好ましくは、約７～約７．５である。さらなる担体は、徐放性調製物、例えば、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスを含み、このマトリックスは、成形品、例えば、フィルム、リポソーム、または微粒子の形態である。これは、例えば、投与経路及び投与される組成物の濃度に応じて、ある特定の担体が好ましくあり得ることが当業者には明らかであろう。

【0073】

医薬担体は、当業者に既知である。これらは、最も一般には、滅菌水、生理食塩水、及び生理学的ｐＨの緩衝液などの溶液を含む、ヒトに薬物を投与するための標準的な担体である。組成物は、筋肉内投与または皮下投与することができる。他の化合物は、当業者により使用される標準的な手順に従って投与されるであろう。

【0074】

医薬組成物は、選択された分子に加えて、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、防腐剤、界面活性剤などを含んでもよい。医薬組成物は、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔薬などのような１つ以上の有効成分も含んでもよい。

【0075】

医薬組成物は、局所的または全身的治療が望まれるかどうか、及び治療されるべき領域に応じて、いくつかの方法で投与されてもよい。投与は、局所的（眼科的、経膣的、直腸的、鼻腔内を含む）、経口的、吸入による、または非経口的、例えば、静脈内点滴、皮下、腹腔内、または筋肉内注射であってよい。開示の抗体は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、または経皮投与することができる。

【0076】

非経口投与の調製は、滅菌水溶液または非水溶液、懸濁液、及び乳濁液を含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えば、オリーブ油、及び注射可能な有機エステル、例えば、エチルオレアートである。水性担体は、水、アルコール／水溶液、乳濁液、または生理食塩水及び緩衝培地を含む懸濁液を含む。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、または固定油を含む。静脈内ビヒクルは、液体及び栄養素補充剤、電解質補充剤（リンゲルのデキストロースに基づくような）などを含む。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガスなどの防腐剤及び他の添加剤も存在してもよい。

【0077】

局所投与用の製剤は、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、ドロップ剤、坐剤、スプレー剤、液剤、及び散剤を含んでもよい。従来の薬学的担体、水溶液、粉末、または油性基剤、増粘剤などが、必要または望ましいことがある。

【0078】

経口投与用の組成物は、散剤もしくは顆粒剤、水もしくは非水性媒体中の懸濁剤もしくは液剤、カプセル剤、サシェ、または錠剤を含む。増粘剤、着香剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤、または結合剤が望ましいことがある。

【0079】

組成物のいくつかは、場合により、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、及びリン酸、ならびに有機酸、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、及びフマル酸との反応により、または無機塩基、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、ならびに有機塩基、例えば、モノ、ジ、トリアルキル及びアリールアミン、ならびに置換エタノールアミンとの反応により形成された、薬学的に許容される酸付加塩または塩基付加塩として投与されてもよい。

【0080】

ｂ）治療的使用
組成物を投与するための有効な投薬量及びスケジュールは、経験的に決定されてもよく、そのような決定を行うことは、当該技術分野の技術の範囲内である。組成物の投与のための投薬量の範囲は、障害の症状がもたらされる所望の効果を生じさせるのに十分なものである。投薬量は、望ましくない交差反応、アナフィラキシー反応などの有害な副作用を引き起こすほど多くてはならない。一般に、投薬量は、患者の年齢、状態、性別、及び疾患の程度、投与経路、または他の薬物が投薬計画に含まれるかどうか、により変動することになり、当業者が決定することができる。投薬量は、反対の兆候が少しでもある場合には、個々の医師が調整することができる。投薬量は、変動し得、１日または数日間、１日に１回以上の用量の投与で投与することができる。所与のクラスの医薬品の適切な投薬量に関するガイダンスは、文献に見出すことができる。例えば、抗体の適切な用量を選択する際のガイダンスは、抗体の治療的使用に関する以下の文献に見出すことができる、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｆｅｒｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｎｏｇｅｓ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐａｒｋ Ｒｉｄｇｅ，Ｎ．Ｊ．，（１９８５）ｃｈ．２２ ａｎｄ ｐｐ．３０３－３５７、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｈａｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７７）ｐｐ．３６５－３８９。単独で使用される抗体の代表的な１日投薬量は、上記の要因に応じて、１日当たり約１μｇ／ｋｇ体重～最大１００ｍｇ／ｋｇ体重以上の範囲であってよい。

【0081】

ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１の相互作用を阻害する本明細書に開示の合成ＰＤ－Ｌ１ペプチド、キメラ、及び抗体を、がん、自己免疫疾患、アルツハイマー病を進行させるリスクがある患者もしくは対象に予防的に投与するか、またはがん（例えば、乳癌、卵巣癌、子宮体癌、結腸癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、及び子宮頸癌など）、自己免疫疾患、アルツハイマー病の治療、抑制、低減、改善、及び／または予防のために治療的に（すなわち、疾患の診断後または症状の発症後に）投与することができる。

【0082】

ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１と相互作用してＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を阻害する他の分子または抗体（例えば、ペンブロリクスマブ及びニボルマブ）は、対象のがん、自己免疫疾患、またはアルツハイマー病を治療、抑制、低減、減少、改善、及び／または予防するために、開示の合成ＰＤ－Ｌ１ペプチド、キメラＰＤ－Ｌ１ペプチド、または抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせて使用することができる。

【0083】

４．抗体
（１）抗体一般
「抗体」という用語は、本明細書では広い意味で使用され、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方を含む。インタクトな免疫グロブリン分子に加えて、ＰＤ－１がＰＤ－Ｌ１との相互作用を阻害されるか、またはＨＥＲ－２受容体が阻害されるように、ＰＤ－Ｌ１と相互作用する能力について選択される限り、それらの免疫グロブリン分子のフラグメントまたはポリマー、及びその免疫グロブリン分子またはフラグメントのヒトまたはヒト化バージョンもまた、「抗体」という用語に含まれる。ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１間の相互作用に関与する配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、及び／または配列番号１９と結合する抗体も開示されている。また本明細書では、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、及び／または配列番号３０のＨＥＲ－２と結合する抗体も開示される。抗体は、本明細書に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを使用して、または類似の方法により、所望の活性について試験することができ、その後、ｉｎ ｖｉｖｏ治療及び／または予防活性は、既知の臨床試験方法に従って試験される。ヒト免疫グロブリンの５つの主要なクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ－１、ＩｇＧ－２、ＩｇＧ－３、及びＩｇＧ－４；ＩｇＡ－１及びＩｇＡ－２に分けられ得る。当業者は、マウスの同等のクラスを認識するであろう。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、及びミューと呼ばれる。

【0084】

本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、抗体の実質的に均質な集団から得られた抗体を指し、すなわち、集団内の個々の抗体は、抗体分子の小さなサブセットに存在し得る可能な天然に存在する変異を除いて同一である。本明細書でのモノクローナル抗体は、所望のアンタゴニスト活性を示す限り、重鎖及び／または軽鎖の一部が特定の種に由来する、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であるが、鎖（複数可）の残りが、別の種に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列、及びそのような抗体のフラグメントと同一または相同である、「キメラ」抗体を具体的に含む。

【0085】

開示のモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体を産生する任意の手順を使用して作製することができる。例えば、開示のモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）に記載されるようなハイブリドーマ法を使用して調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウスまたは他の適切な宿主動物は、通常、免疫剤に特異的に結合する抗体を産生するか、または産生することが可能なリンパ球を誘発するために免疫剤で免疫される。あるいは、リンパ球は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫化されてもよい。

【0086】

モノクローナル抗体はまた、組み換えＤＮＡ法により作製されてもよい。開示のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）容易に単離及びシーケンシングすることができる。抗体または活性抗体フラグメントのライブラリーは、例えば、米国特許第５，８０４，４４０号（Ｂｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）及び米国特許第６，０９６，４４１号（Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．）に記載されているように、ファージディスプレイ手法を使用して生成及びスクリーニングすることもできる。

【0087】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ法は、一価抗体の調製にも適する。抗体を消化して、そのフラグメント、特に、Ｆａｂフラグメントを生成することは、当該技術分野で既知の所定の手法を使用して実施することができる。例えば、消化は、パパインを使用して実施することができる。パパイン消化の例は、１９９４年１２月２２日に公開されたＷＯ９４／２９３４８、及び米国特許第４，３４２，５６６号に記載される。抗体のパパイン消化は、通常、Ｆａｂフラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメントを生成し、それぞれは、単一の抗原結合部位及び残存するＦｃフラグメントを有する。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し且つさらに抗原を架橋結合することが可能であるフラグメントが生成される。

【0088】

本明細書で使用される場合、「抗体またはそのフラグメント」という用語は、二重または複数の抗原またはエピトープ特異性を有するキメラ抗体及びハイブリッド抗体、ならびにハイブリッドフラグメントを含む、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖなどのフラグメントを包含する。したがって、特定の抗原に結合する能力を保持する抗体のフラグメントが提供される。例えば、ＰＤ－Ｌ１結合活性を維持するか、または配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、及び／または配列番号１９と結合する抗体のフラグメントは、「抗体またはそのフラグメント」という用語の意味の中に含まれる。そのような抗体及びフラグメントは、実施例に記載の方法及び抗体を産生するための、及び特異性及び活性について抗体をスクリーニングするための一般的な方法に従って、当該技術分野で既知の手法により作成することができ、特異性及び活性についてスクリーニングすることができる（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８８）を参照）。

【0089】

抗体フラグメント及び抗原結合タンパク質（一本鎖抗体）のコンジュゲートも「抗体またはそのフラグメント」の意味に含まれる。

【0090】

フラグメントは、他の配列に結合しているか否かに関わらず、特定の領域または特定のアミノ酸残基の挿入、欠失、置換、または他の選択された修飾も含み得る。但し、それは、抗体または抗体フラグメントの活性が、未修飾抗体もしくは抗体フラグメントと比較して大幅に改変されないか、または損なわれないことを条件とする。これらの修飾は、ジスルフィド結合が可能なアミノ酸を除去／追加するための、生体寿命を延長するための、分泌特性を変更するためなどの、いくつかの追加の特性を提供し得る。いずれの場合も、抗体または抗体フラグメントは、同族の抗原への特異的結合などの、生物活性特性を有しなければならない。抗体または抗体フラグメントの機能的または活性な領域は、タンパク質の特定の領域の変異導入、それに続く、発現、及び発現されたポリペプチドの試験により同定され得る。そのような方法は、当業者には容易に明らかであり、抗体または抗体フラグメントをコードする核酸の部位特異的変異導入を含み得る。（Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：３４８－３５４，１９９２）。

【0091】

本明細書で使用される場合、「抗体」（複数可）という用語は、ヒト抗体及び／またはヒト化抗体も指し得る。多くの非ヒト抗体（例えば、マウス、ラット、またはウサギに由来するもの）は、ヒトにおいて自然に抗原性であり、したがって、ヒトに投与された場合、望ましくない免疫応答を引き起こし得る。それ故、方法におけるヒトまたはヒト化抗体の使用は、ヒトに投与された抗体が望ましくない免疫応答を引き起こす可能性を減らすのに役立つ。

【0092】

（２）ヒト抗体
開示のヒト抗体は、任意の手法を使用して調製することができる。開示のヒト抗体は、トランスジェニック動物から得ることもできる。例えば、免疫化に応答して、ヒト抗体の完全なレパートリーを産生することが可能なトランスジェニック変異型マウスが記載されている（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１－２５５（１９９３）、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５－２５８（１９９３）、Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７：３３（１９９３）を参照）。具体的には、これらのキメラ及び生殖細胞系列変異型マウスの領域（Ｊ（Ｈ））遺伝子を連結する抗体重鎖のホモ接合型欠失は、内因性抗体産生の完全な抑制をもたらし、ヒト生殖細胞系列抗体遺伝子アレイのそのような生殖細胞系列変異型マウスへの良好な導入は、抗原チャレンジ時にヒト抗体の産生をもたらす。所望の活性を有する抗体は、本明細書に記載されるＥｎｖ－ＣＤ４－共受容体複合体を使用して選択される。

【0093】

（３）ヒト化抗体
抗体ヒト化手法は、一般に、抗体分子の１つ以上のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ配列を操作するための組み換えＤＮＡ技術の使用を伴う。したがって、非ヒト抗体（またはそのフラグメント）のヒト化形態は、キメラ抗体または抗体鎖（またはそのフラグメント、例えば、ｓＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体の他の抗原結合部分）であり、これは、ヒト（レシピエント）抗体のフレームワークに組み込まれた非ヒト（ドナー）抗体由来の抗原結合部位の一部を含有する）。

【0094】

ヒト化抗体を生成するために、レシピエント（ヒト）抗体分子の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の抗原結合特性（例えば、標的抗原に対する特定のレベルの特異性及び親和性）を有することが既知のドナー（非ヒト）抗体分子の１つ以上のＣＤＲ由来の残基により置換される。いくつかの場合では、ヒト抗体のＦｖフレームワーク（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基により置換される。ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、取り込まれたＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見られない残基も含有してもよい。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。実際には、ヒト化抗体は、通常、いくつかのＣＤＲ残基、及び場合により、いくつかのＦＲ残基が齧歯動物抗体の類似部位由来の残基により置換されているヒト抗体である。ヒト化抗体は、一般に、抗体定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、通常は、ヒト抗体のものを含有する。

【0095】

（４）抗体の投与
抗体の投与は、本明細書に開示されるように行うことができる。抗体送達のための核酸アプローチも存在する。広域中和抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び抗体フラグメント（配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、及び／または配列番号１９に結合する任意の抗体を含む）を、抗体または抗体フラグメントをコードする核酸調製物（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）として患者または対象に投与することもでき、その結果、患者または対象自身の細胞が、核酸を取り込み、コードされた抗体または抗体フラグメントを産生及び分泌する。核酸の送達は、例えば、本明細書に開示されるように、任意の手段によるものであり得る。

【0096】

Ｃ．疾患の治療方法
開示の組成物、合成ＰＤ－Ｌ１ペプチド、及びキメラＰＤ－Ｌ１ペプチドは、本明細書で企図され、免疫抑制及びプログラム細胞死の予防が、疾患、例えば、アルツハイマー病、自己免疫疾患、または制御不能な細胞増殖が生じる疾患、例えば、がん、に有利である、任意の疾患を治療、抑制、低減、減少、改善、及び／または予防するために使用することができることが理解される。

【0097】

本明細書に開示のキメラまたは合成ペプチドまたは医薬組成物を使用して、治療、抑制、低減、減少、改善、及び／または予防することができる異なるタイプの自己免疫疾患の非限定的なリストとしては、乾癬、円形脱毛症、原発性胆汁性肝硬変、多腺性自己免疫症候群、１型真性糖尿病、自己免疫甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、ギランバレー症候群、グレーブス病、シェーグレン症候群、潰瘍性大腸炎、自己免疫性溶血性貧血、悪性貧血、乾癬性関節炎、関節リウマチ、再発性多発性軟骨炎、重症筋無力症、急性散在性脳脊髄炎、及び多発血管炎性肉芽腫症が挙げられるが、これらに限定されない。

【0098】

本明細書に開示のキメラもしくは合成ペプチドまたは医薬組成物を使用して、治療、抑制、低減、減少、改善、及び／または予防することができる様々な種類のがんの非限定的なリストとしては、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉腫、ホジキン病、骨髄性白血病、膀胱癌、脳癌、神経系癌、頭頸部癌、頭頸部の扁平上皮癌、腎臓癌、肺癌、例えば、小細胞肺癌及び非小細胞肺癌、子宮体癌、神経芽細胞腫／神経膠芽腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、肝臓癌、メラノーマ、口、喉、喉頭、及び肺の扁平上皮癌、結腸癌、子宮頸癌、子宮頸癌腫、乳癌、及び上皮癌、腎臓癌、泌尿生殖器癌、肺癌、食道癌、頭頸部癌、大腸癌、造血癌；精巣腫瘍；結腸及び直腸癌、前立腺癌、イピリムマブ不応性メラノーマ、または膵臓癌が挙げられるが、これらに限定されない。

【0099】

したがって、一態様では、対象のがん、アルツハイマー病、または自己免疫疾患を治療、抑制、低減、減少、改善、及び／または予防する方法が本明細書に開示され、方法は、ＰＤ－Ｌ１合成ペプチドを対象に投与することを含み、ＰＤ－Ｌ１合成ペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５に記載の配列のうちの１つ以上を含む。合成ペプチドは、アセチル化、アミド化、及び／またはＤエナンチオマーを含み得ることが理解され、本明細書で企図される。したがって、一態様では、対象のがん（例えば、乳癌、卵巣癌、子宮体癌、結腸癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、及び子宮頸癌など）、アルツハイマー病、または自己免疫疾患を治療、抑制、低減、減少、改善、及び／または予防する方法が本明細書に開示され、方法は、ＰＤ－Ｌ１合成ペプチドを対象に投与することを含み、ＰＤ－Ｌ１合成ペプチドは、それぞれ、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、及び配列番号１９に記載されるように、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１のＤエナンチオマー及び／またはＤエナンチオマーレトロインバーソを含む。

【0100】

一態様では、開示の組成物は、所与の疾患または状態に対する他の治療と組み合わせることができることが理解される。例えば、一の態様では、がん及び／または転移を治療、抑制、低減、減少、改善、及び／または予防する方法が本明細書に開示され、方法は、ＰＤ－Ｌ１のペプチド、ＰＤ－Ｌ１合成ペプチド、またはＰＤ－Ｌ１キメラペプチドを対象に投与することを含む、疾患または状態が、がん（例えば、乳癌、卵巣癌、子宮体癌、結腸癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、及び子宮頸癌など）であり、方法は、さらに、１つ以上のＨＥＲ－２ Ｂ細胞エピトープ（例えば、配列番号２７もしくは２９に記載のＨＥＲ－２ペプチドのうちの１つ以上または配列番号２８もしくは３０に記載のキメラＭＶＦ－ＨＥＲ－２ペプチド）及び／あるいは１つ以上の抗ＨＥＲ－２抗体を対象に投与することを含む。ＨＥＲ－２ Ｂ細胞エピトープまたは抗ＨＥＲ－２抗体が対象に投与される場合、投与は、別個の同時投与、ＨＥＲ－２ Ｂ細胞エピトープもしくは抗ＨＥＲ－２抗体の先行投与、ＨＥＲ－２ Ｂ細胞エピトープもしくは抗ＨＥＲ－２抗体の後続投与、またはＰＤ－Ｌ１ペプチド、ＰＤ－Ｌ１合成ペプチド、もしくはＰＤ－Ｌ１キメラペプチドと同じ医薬製剤の構成成分であるＨＥＲ－２ Ｂ細胞エピトープもしくは抗ＨＥＲ－２抗体、となり得ると理解される。例えば、がん及び／または転移（例えば、乳癌、卵巣癌、子宮体癌、結腸癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、及び子宮頸癌など）を治療、抑制、低減、減少、改善、及び／または予防する方法は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５に記載のＰＤ－Ｌ１ペプチド；配列番号８、配列番号９、配列番号１０、及び配列番号１１に記載のキメラＰＤ－Ｌ１ペプチド；ならびに／または配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、及び配列番号１９に記載のレトロインベルソＰＤ－Ｌ１ペプチドのうちの１つ以上を含む医薬組成物を対象に投与することを含み得、方法が、さらに、配列番号２７に記載の１つ以上のＨＥＲ－２ Ｂ細胞エピトープＨＥＲ－２（２６６－２９６）及び／または配列番号２９に記載のＨＥＲ－２（５９７－６２６）及び／またはキメラエピトープＭＶＦ－ＨＥＲ－２（２６６－２９６）ペプチド（例えば、配列番号２８に記載）、ならびにＭＶＦ－ＨＥＲ－２（５９７－６２６）ペプチド（例えば、配列番号３０に記載）を対象に投与することを含む。したがって、一態様では、がん及び／または転移（例えば、乳癌、卵巣癌、子宮体癌、結腸癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、及び子宮頸癌など）を治療、抑制、低減、減少、改善、及び／または予防する方法が本明細書に開示され、方法は、配列番号８に記載のＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１（３６－５３）、配列番号９に記載のＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１（５０－６７）、配列番号１０に記載のＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１（９５－１１２）、及び／または配列番号１１に記載のＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１（１３０－１４７）；ＭＶＦ－ＨＥＲ－２（２６６－２９６）ペプチド（例えば、配列番号２８に記載）、ならびにＭＶＦ－ＨＥＲ－２（５９７－６２６）ペプチド（例えば、配列番号３０に記載）を含む医薬組成物をがん対象に投与することを含む。

【0101】

さらに、がん、自己免疫疾患、またはアルツハイマー病の治療、抑制、低減、減少、改善、及び／または予防における使用される合成ペプチドは、キメラペプチドの構成要素であり得ることが理解され、本明細書で企図される。したがって、一態様では、対象のがん、アルツハイマー病、または自己免疫疾患を治療、抑制、低減、減少、改善、及び／または予防する方法が本明細書に開示され、方法は、ＰＤ－Ｌ１キメラペプチドを対象に投与することを含み、キメラペプチドは、１つ以上のＰＤ－Ｌ１ Ｂ細胞エピトープ、Ｔヘルパー（Ｔｈ）エピトープ、及びＴｈエピトープにＰＤ－Ｌ１ Ｂ細胞エピトープを連結するリンカーを含み、１つ以上のＰＤ－Ｌ１ Ｂ細胞エピトープが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５からなる群より選択される配列からなる。キメラペプチドで使用される合成ＰＤ－Ｌ１ペプチド（すなわち、ＰＤ－Ｌ１ Ｂ細胞エピトープ）は、アセチル化、アミド化、及び／またはＤエナンチオマーを含み得ると理解され、本明細書で企図される。一態様では、例えば、対象のがん（例えば、乳癌、卵巣癌、子宮体癌、結腸癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、及び子宮頸癌など）、アルツハイマー病、または自己免疫疾患を治療、抑制、低減、減少、改善、及び／または予防する方法が本明細書に開示され、方法は、ＰＤ－Ｌ１キメラペプチドを対象に投与することを含み、キメラペプチドは、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９を含む。

【0102】

Ｄ．実施例
以下の実施例は、本明細書で特許請求される化合物、組成物、物品、デバイス、及び／または方法の作成及び評価の仕方の完全な開示及び説明を当業者に提供するために記載され、純粋に例示であることが意図され、本開示を制限することが意図されない。数値（例えば、量、温度など）に関する精度を確保する努力がなされているが、いくつかの誤差及び偏差を考慮すべきである。別途指示のない限り、部は、重量部であり、温度は、℃であるか、または周囲温度であり、圧力は、大気圧または大気圧付近である。

【0103】

１．実施例１：ｈｕＰＤ－Ｌ１のペプチドエピトープの同定
ＰＤ－Ｌ１の表面に発現された候補Ｂ細胞エピトープの選択は、以下のように記載される抗原性の６つの相関関係を使用した、社内（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（商標）、５ｘ．ｃｏｍ）のコンピューター支援分析で行った。（ａ）個々の配列の鎖の柔軟性及び可動性のプロファイルを計算した。（ｂ）疎水性プロファイルを７残基スパン設定により生成し、次に、Ｋｙｔｅ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅのスケールを使用して３残基スパンで平滑化した。（ｃ）Ｈｏｐｐ及びＷｏｏｄｓのプログラムを使用して、６残基ウィンドウによる親水性プロファイルを生成した。（ｄ）アミノ酸残基の水への曝露の分析（１．４Ａプローブ）を溶媒曝露アルゴリズムで実施した。（ｅ）アクセス可能で溶媒中に突出するタンパク質の部分を予測する突出指数を計算した。（ｆ）５残基配列が抗原性である確率を、Ｗｅｌｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．の方法で決定した。配列は、それぞれのインデックス値に基づいて、１～６のスコアを与え、ランク付けした。最高ランクの配列は、試験された分析について個々のスコアで最高であり、一連の候補は、次の最高スコアなどを有していた。

【0104】

さらに、最高スコアのエピトープを２次構造属性との相関によりランク付けした。例えば、両親媒性のα－ヘリックス配列またはβターンループ領域は、ランダムコイルフラグメントよりも好ましい。Ｃｈｏｕ ａｎｄ Ｆａｓｍａｎ及びＮｏｖｏｔｎｙ ｅｔ ａｌ．によるコンピュータープログラムを使用して、２次構造（αヘリックス、βストランド／シート、βターン／ループ、ランダムコイル）及びαヘリックス両親媒性モーメントを予測した。最後に、個々のアミノ酸配列を考慮した。らせんセグメントにおける静電イオン対及びらせん双極子相互作用も考慮した（例えば、疎水性／親水性バランス）。

【0105】

免疫原性／抗原性のアルゴリズムを使用したペプチドエピトープマッピングを使用して、ＰＤ－Ｌ１の４つのエピトープを同定し、これらのエピトープの分析を、２０１５年のＺａｋ ｅｔ ａｌ．（ＰＤＢ ＩＤ：４ＺＱＫ）により開示されたヒトＰＤ－１／ヒトＰＤ－Ｌ１（ｈＰＤ－１／ｈＰＤ－Ｌ１）の結晶構造複合体と組み合わせて、ＰＤ－１の細胞外ドメインに基づいてキメラＢ細胞ワクチンを設計した。ＰＤ－１の３Ｄ構造（ＰＤＢ ＩＤコード：４Ｚ１８、４ＺＱＫ、３ＢＩＫ）を試験することにより、選択がさらに強化された。ＰｙＭＯＬ ３ＤモデリングソフトウェアＤｅＬａｎｏ ＷＬ（２００２）ＰｙＭＯＬユーザーズマニュアルを使用して、４つのエピトープ全てをモデリングした。最高スコアを得る配列が表４に示される。本方法を用いて、ＰＤ－１：ＰＤＬ１の結晶構造の情報と組み合わせて、ヒトＰＤ－Ｌ１、アミノ酸３６～５３、５０～６７、９５～１１２、及び１３０～１４７の１２の最高スコアのＢ細胞エピトープ配列のうち４つを評価するために選択した。

【表4】

【0106】

ヒトＰＤ－１（ＰＤＢ ３ＲＲＱ）及びヒトＰＤ－Ｌ１（ＰＤＢ ３ＢＩＳ、３ＦＮ３、４Ｚ１８、５Ｃ３Ｔ）の構造が決定されているが、それらは、そこでは完全ヒトＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１複合体の構造により、ごく最近に実証された、複合体形成時のヒトＰＤ－１内の有意な可塑性を説明していなかった。上記の構造は相互作用の完全な説明を提供したが、タンパク質－タンパク質界面の平らな表面は、さらに合理的な医薬品開発を導くために、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１のいずれかと複合体を形成した小分子阻害薬に関する構造情報がない状態での薬物設計の取り組みをさらに複雑化する。結晶構造は、受容体－リガンドの相互作用の大部分が、ＰＤ－１及びＰＤＬ１の両方のＣ０ＣＦＧ鎖の残基により媒介されることを示す（図１）。タンパク質とタンパク質の接触は、疎水性相互作用及び極性相互作用の両方が関わり、１，９７０Å^２の総表面積を覆う。相互作用は、両方のパートナーが寄与する中央疎水性コアの周りに構築され、Ｉｌｅ１３４及びＬＴｙｒ１２３の側鎖の特徴的なアルキル－ｐ相互作用を含む、ＰＤ－１の前部シートにある非極性残基（Ｖａｌ６４、Ｉｌｅ１２６、Ｌｅｕ１２８、Ａｌａ１３２、Ｉｌｅ１３４）及びＰＤ－Ｌ１の前部シートにあるもの（ＬＩｌｅ５４、ＬＴｙｒ５６、ＬＭｅｔ１１５、ＬＡｌａ１２１、ＬＴｙｒ１２３）で構成される。この疎水性領域は、抗原結合となる部位で溶媒に開放され、分子の反対側に混合極性／非極性相互作用の埋没領域に隣接している。これらの領域は両方とも、極性残基の周辺ネットワーク（ＣＤＲループ側で安定）に囲まれており、受容体及びリガンド間の水素結合を介した追加の相互作用を提供する。

【0107】

２．実施例２：ｈｕＰＤ－Ｌ１のペプチドエピトープの合成
次に、Ｆｍｏｃ／ｔ－ブチル化学及びＣＬＥＡＲアミド樹脂上のＰｙＢＯＰ／６Ｃｌ－ＨＯＢＴカップリング試薬（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、米国ケンタッキー州ルイビル）を用いる９６００ Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ固相ペプチド合成装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国マサチューセッツ州ベッドフォード）を使用して、ヒトＰＤ－Ｌ１を標的とすることが同定された４つの新規ペプチド配列を合成した。切断前に１－アセチルイミダゾール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州セントルイス）を使用して、いくつかのペプチド試料をアセチル化した。４残基リンカー（ＧＰＳＬ）を使用して、麻疹ウイルス融合タンパク質（ＭＶＦ、アミノ酸２８８－３０２）に由来する無差別Ｔヘルパーエピトープを有するキメラ構築物として全てのペプチドを合成した。切断試薬Ｒ（ＴＦＡ）／チオアニソール／ＥＤＴ／アニソール（９０／５／３／２）を使用して、ペプチドを樹脂から切断し、粗製ペプチドをセミ分取（Ｃ－４ Ｖｙｄａｃカラム）逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ；Ｗａｔｅｒｓ、米国マサチューセッツ州ベッドフォード）で精製した。同じ保持時間を示すＲＰ－ＨＰＬＣ画分を一緒にプールし、凍結乾燥した。全てのペプチドは、９５％を超える純度を示した。次に、試料をＭＡＬＤＩ（ＣＣＩＣ（Ｃａｍｐｕｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｔｈｅ Ｏｈｉｏ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、米国オハイオ州コロンバス））でのマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析）で特性評価し、分析ＲＰ－ＨＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ、米国マサチューセッツ州ベッドフォード）で分析した。全てのペプチドは、適切な分子量を有していた。

【0108】

３．実施例３：ｈｕＰＤ－Ｌ１のペプチドエピトープによる免疫化
各ペプチドについて、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（米国マサチューセッツ州ウィルミントン）から購入したニュージーランド白ウサギを使用して、ワクチン抗体を作成した。Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ７２０（Ｓｅｐｐｉｃ、仏国パリ）及びｎｏｒ－ＭＤＰアジュバント（Ｎ－アセチルグルコサミン－３－イル－アセチル－ｌ－アラニル－ｄ－イソグルタミン）で乳化したＭＶＦキメラペプチド１ｍｇで、ウサギを免疫化し、３週間隔で２回追加免疫した。抗体価を、ペプチド免疫原、ペプチドＢ細胞エピトープ、及びＢ細胞エピトープのアセチル化バージョンに対する直接ＥＬＩＳＡにより監視した。血清を週１回収集し、動物を９週間で死亡させた。プロテインＡ／Ｇカラムを使用したアフィニティークロマトグラフィーによりペプチドワクチン抗体を精製し、濃度をクマシータンパク質アッセイで測定した。全ての実験は、Ｕ．Ｓ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｐｏｌｉｃｙ ｏｎ Ｈｕｍａｎｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓにしたがって実施され、Ｏｈｉｏ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌｓ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認され、認められたプロトコールに詳述された。

【0109】

４．実施例４：ペプチドワクチンＰＤ－Ｌ１エピトープのｉｎ ｖｉｖｏ試験：マウスのＣＴ－２６腫瘍モデル
ペプチドワクチンを水に溶解させ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ７２０（１：１）及びｎｏｒ－ＭＤＰ（Ｎ－アセチルグルコサミン－３イル－アセチル－ｌ－アラニル－ｄ－イソグルタミン）１００μｇ中で乳化した。５～６週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をペプチドワクチン１００μｇで、３週間隔で３回免疫し、３回目の免疫の１５日後、マウスをＣＴ－２６腫瘍細胞（マウス１匹当たり１００，０００）で皮下チャレンジした。無関係なＭＶＦペプチドキメラで免疫化されたマウスを、陰性対照として使用した。

【0110】

抗マウスＰＤ－Ｌ１ＭＡｂ（Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌ、ニューハンプシャー州ウェストレバノン）２００ｕｇ／用量で週に２回処置されたマウスを、陽性対照として使用した。腫瘍の成長をチャレンジの１８日後まで監視した。免疫化の間、血液を隔週で採取し、Ａｂ力価を監視するためにＥＬＩＳＡで使用した。処置の最後にマウスを安楽死させ、腫瘍を抽出及び計量し、腫瘍の試料を、さらなる試験及び組織学的検査のために保存した。さらなる検査のために、脾臓も収集した。

【0111】

５．実施例５：ペプチドワクチンＰＤ－Ｌ１エピトープのｉｎ ｖｉｖｏ試験：マウスにおけるＣＴ－２６－ＨＥＲ２ ｎｅｕ腫瘍モデル。
ワクチンを水に溶解させ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ７２０（１：１）及びｎｏｒ－ＭＤＰ（Ｎ－アセチルグルコサミン－３イル－アセチル－ｌ－アラニル－ｄ－イソグルタミン）５０μｇで乳化した。５～６週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をペプチドワクチン１００μｇで、３週間隔で３回免疫し、３回目の免疫の２週間後、マウスをＣＴ－２６－ＨＥＲ２ ｎｅｕ腫瘍細胞（マウス１匹当たり１００，０００）で皮下チャレンジした。

【0112】

抗マウスＰＤ－Ｌ１ ＭＡｂ １０Ｆ．９Ｇ２（Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌ、ニューハンプシャー州ウェストレバノン）２００μｇ／用量で週２回処置されたマウスを陽性対照として使用するか、またはマウス血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）から精製したマウスＩｇＧを陰性対照として使用した。腫瘍の成長をチャレンジの２１日後まで監視した。免疫化の間、血液を隔週で採取し、Ａｂ力価を監視するためにＥＬＩＳＡで使用した。処置の最後にマウスを安楽死させ、腫瘍を抽出及び計量し、腫瘍の試料を、さらなる試験及び組織学的検査のために保存した。

【0113】

組み合わせペプチド（ＨＥＲ－２、ＰＤ－１、及びＰＤ－Ｌ１）をワクチン接種したＢａｌｂ／ｃマウス由来の臓器（脾臓、肝臓、心臓、肺、リンパ節、褐色脂肪組織、腎臓、及び腫瘍）をマウスから収集し、分析のために、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｎｔｅｒ ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ＆ Ｍｏｕｓｅ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ｃｏｒｅ施設に提出した（病理医：Ｋｒｉｓｔａ Ｍ．Ｄ．Ｌａ Ｐｅｒｌｅ、ＤＶＭ、ＰｈＤ、Ｄｉｐｌ．ＡＣＶＰ）。

【0114】

全ての実験は、Ｕ．Ｓ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｐｏｌｉｃｙ ｏｎ Ｈｕｍａｎｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓに従って実施され、Ｏｈｉｏ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌｓ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認され、認められたプロトコールに詳述された。

【0115】

６．実施例６：ＰＤ－Ｌ１抗体依存性細胞傷害：
ヒトの免疫系は、免疫チェックポイント分子の複雑なネットワークからなり、これは、自己抗原に対する耐性を維持しながら、外来抗原を発現する細胞の排除を促進する。免疫チェックポイント受容体は、がん及び自己免疫媒介性障害を含む様々な疾患の治療のための新しい免疫療法の標的として有望である。ＰＤ－１（ＣＤ２７９）としても知られるプログラム細胞死タンパク質１は、活性化Ｔ細胞及びＢ細胞上で発現される免疫抑制性受容体であり、腫瘍抗原に対する免疫応答の制御に重要な役割を果たす。隣接する細胞におけるリガンド、ＰＤ－Ｌ１（Ｂ７－Ｈ１）、またはＰＤ－Ｌ２（Ｂ７－ＤＣ）のいずれかによるＰＤ－１の結合は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達及びＴＣＲを介した増殖、転写活性化、及びサイトカイン産生を抑制する。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を遮断するように設計された治療用抗体及びＦｃ融合タンパク質は、様々ながんの治療のための臨床試験で有望な結果を示す。

【0116】

抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、ウイルス感染細胞または他の疾患細胞が細胞媒介性免疫系の構成要素による破壊の標的となる抗体の作用機序である。ＡＤＣＣは、抗体ベースの薬剤を使用して、標的がん細胞を殺傷するための望ましい機序である。抗体は、細胞表面の標的抗原に結合する。標的結合抗体のＦｃエフェクター部分が、エフェクター細胞（主に、ナチュラルキラー細胞）の細胞表面のＦｃγＲＩＩＩａ受容体にも結合する場合、２つの細胞型の複数の架橋が生じ、ＡＤＣＣの経路活性化につながる。標的細胞の殺傷は、この経路の活性化の終点であり、ＡＤＣＣバイオアッセイに使用される。

【0117】

７．実施例７：結腸癌の同系腫瘍モデルにおけるＰＤ－Ｌ１ワクチンの免疫原性及び抗腫瘍有効性
持続的治療の可能性を提供しながら、内因性の薬剤耐性を回避する目的を有する、立体配座的にＢ細胞エピトープワクチンに基づく体液性応答に焦点を当てる免疫療法の新しいパラダイムが、本明細書で提案される。具体的には、２つの新規Ｂ細胞エピトープ特異的ワクチン（Ｂ－Ｖａｘｘ）が開発された。すなわちＨＥＲ－２－トラスツズマブ及びＨＥＲ－２－ペルツズマブ結合複合体のＸ線構造を使用して特定的に設計されたトラスツズマブ結合エピトープ及びペルツズマブ結合エピトープである。ヒト初の、Ｂ－Ｖａｘｘを用いる第Ｉ相試験の用量漸増部分の臨床結果が最近報告された。試験ワクチンは、安全で、忍容性が高く、抗腫瘍活性を示し、ペプチドワクチン接種が治療耐性を回避し、ｍＡｂ療法の有望な代替法を提供し得る予備的な兆候を示した。

【0118】

本明細書では、ヒトＰＤ－Ｌ１を標的とする新しいＢ細胞ペプチドエピトープの特性評価及び開発が提示され、これは、アテゾリズマブの効果を潜在的に模倣するＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を遮断し得るｉｎ ｖｉｖｏでポリクローナル抗体を誘発する。ＰＤ－Ｌ１の３Ｄ構造に基づくペプチドマッピング及び予測抗原性アルゴリズムの洗練された方法を使用して、本発明者らは、ＰＤ－Ｌ１の細胞外ドメインに基づくキメラＢ細胞ワクチンを設計するためのＰＤ－Ｌ１ワクチンの前臨床開発を示し、本発明者らは、これを、無差別Ｔヘルパー細胞麻疹ウイルス融合タンパク質（ＭＶＦ）に連結した。

【0119】

各ペプチドエピトープの免疫原性を、最初にウサギ及びＢａｌｂ／ｃマウスで評価し、これは、免疫原性合成ペプチド及び組み換えヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質を認識する抗体を誘発した。同系大腸ＣＴ－２６ｗｔ Ｂａｌｂ／ｃマウス腫瘍モデルを使用して、ＣＴ－２６腫瘍細胞の成長抑制薬としての４つのＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１ペプチドによるワクチン接種の有効性を評価した。ＰＤ－Ｌ１（１３０－１４７）、ＰＤ－Ｌ１（５０－６７）、及びＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂエピトープは、ＰＢＳと比較して腫瘍成長の有意な抑制を示した。次に、本発明者らは、別の同系ＣＴ２６／ＨＥＲ－２ Ｂａｌｂ／ｃ癌腫モデルの実験を拡張した。４つＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１エピトープワクチン接種全ての抗腫瘍効果を、ＣＴ２６／ＨＥＲ－２細胞株でチャレンジされた同系のＢａｌｂ／ｃ結腸癌マウスモデルで試験した。興味深いことに、ＰＤ－Ｌ１（１３０－１４７）を用いる処置により、腫瘍成長のより大きい抑制が、ＰＢＳ及び市販の標準的なマウス抗ＰＤ－Ｌ１抗体と比較して示された。

【0120】

ａ）結果
（１）４つの新規ヒトＰＤ－Ｌ１（ｈＰＤ－Ｌ１）ペプチドエピトープの設計及び精製
ＰＤ－Ｌ１の３次構造は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内領域で構成されている。細胞外ドメインが、ＰＤ－１の結合、及び抗ペプチド抗体がアクセス可能であることに関与しているので、本発明者らは、免疫原性領域として、このドメインを選択した。Ｂ細胞エピトープは、抗原性の６つの相関関係に基づいてランク付けされ、２次構造と相関し、ヒトＰＤ－１／ヒトＰＤ－Ｌ１（ｈＰＤ－１／ｈＰＤ－Ｌ１）の結晶構造複合体を有するこれらのエピトープの複合分析であった。この分析から、さらなる調査のために、ヒトＰＤ－Ｌ１の４つのＢ細胞エピトープ配列を同定した。すなわちアミノ酸３６～５３、５０～６７、９５～１１２、及び１３０～１４７である（図２）。ＧＰＳＬからなる４残基リンカーを使用して、麻疹ウイルス融合タンパク質（ＭＶＦ、アミノ酸２８８～３０２；ＫＬＬＳＬＩＫＧＶＩＶＨＲＬＥＧＶＥ）（配列番号６）に由来する「無差別」Ｔヘルパーエピトープを有するキメラ構築物として、４つのペプチド配列を合成した。

【0121】

（２）ＰＤ－Ｌ１エピトープによるｉｎ ｖｉｖｏ免疫は、ウサギにおいて強力な抗体応答をもたらす。
４つのペプチド全ての免疫原性を非近交系ウサギで評価した（図３）。抗体応答を週１回監視した。最初の追加免疫の力価が増加した後、及び２回目の追加免疫後に、高い力価が、ＰＤ－Ｌ１ ３６－５３及び５０－６７の場合、３２，０００を超過したが、ＰＤ－Ｌ１ ９５及び１３０の場合、６４，０００であった。さらに、抗体は、ヒト組み換えＰＤ－Ｌ１タンパク質を認識することが可能でき（図４）、それにより、ペプチドエピトープの選択が正当化された。

【0122】

（３）ＣＴ２６結腸癌細胞株でチャレンジした同系Ｂａｌｂ／ｃモデルにおける、腫瘍成長の抑制における、抗マウスＰＤ－Ｌ１（Ｂ７－Ｈ１）ｍＡｂクローン１０Ｆ．９Ｇ２に対するＰＤ－Ｌ１ワクチンエピトープの有効性。
ＣＴ２６がん細胞株におけるｉｎ ｖｉｖｏでのＰＤ－Ｌ１エピトープワクチンの有効性を検証するために、Ｂａｌｂ／ｃマウス（１０匹のマウス／群）を、ｎｏｒ－ＭＤＰ及びＭｏｎｔａｎｉｄｅ ７２０（１：１の比）で乳化されたＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１（３６－５３）、ＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１（５０－６７）、ＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１（９５－１１２）、及びＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１（１３０－１４７）のそれぞれ１００μｇで免疫した（図５Ａ、スキーム１Ａ）。スキーム１Ａ～Ｄ（図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、及び５Ｄ）に詳述されるように、マウスを３週間隔で３回免疫した。各ワクチン接種の１、２、及び３週間後に、血液を収集した。これは、１Ｙ＋３、２Ｙ＋１、２Ｙ＋２、２Ｙ＋３、３Ｙ＋１、３Ｙ＋２、３Ｙ＋３（式中、Ｙが、表５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｄ、及び５Ｅに示される免疫化の数を示す）として示される。全てのＰＤ－Ｌ１エピトープは、高力価のＰＤ－Ｌ１抗ペプチド抗体を誘発した（ＥＬＩＳＡによる）。データは、図６に要約され、全ワクチンは、組み換えＰＤ－Ｌ１－タンパク質に対する反応性を示した（図７）。本発明者らは、ＰＤ－Ｌ１－１３０－１４７とのＰＤ－１（９２－１１０）の組み合わせも調査した。

【表5】

【表6】

【表7】

【表8】

【表9】

【0123】

３回目の免疫（３Ｙ）の２週間後に、マウスをＣＴ２６がん細胞（マウス１匹当たり１×１０^５細胞）で皮下（ｓ．ｃ）接種し、その後、腫瘍形成を毎日観察した。ＰＢＳで処置されたマウスを陰性対照として用い、抗マウスＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体（ｍＡｂクローン１０Ｆ．９Ｇ２）の２００μｇ／用量の注射で週２回処置されたマウスを陽性対照として用いた。腫瘍成長を週１回監視し、ノギスで測定した。個々のマウスそれぞれの腫瘍成長（腫瘍体積；ＬＷＷ ｍｍ^３）パターンを図８に示す。４つのＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１キメラペプチドワクチンでワクチン接種されたマウスは、抗マウスＰＤ－Ｌ１（１０Ｆ．９Ｇ２）ｍＡｂモノクローナル抗体（＋ｖｅ対照）による処置と同様に、ＰＢＳ処置（－ｖｅ対照）と比較して大幅な腫瘍抑制を示した。ＰＤ－Ｌ１ Ｂ細胞エピトープワクチン処置は、ＰＢＳによる陰性対照処置と比較して、チャレンジ後１６日目で腫瘍成長が同様に有意に低減した（図９）。しかし、最も注目すべきは、１０Ｆ．９Ｇ２ ＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂと共に、ＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１（１３０－１４７）ＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１（５０－６７）及びＰＤ－Ｌ１（３６－５３）は、１４及び１６日目に最高平均腫瘍成長抑制を示したが、ＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１（３６－５３）またはＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１（９５－１１２）またはＭＶＦ－（ＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１－（９５）＋ＭＶＦ－ＰＤ－１（９２－１１０）の組み合わせよりも有意に良好ではなかった。これらの結果は、有用な抑制性ワクチンとしてのワクチンの潜在的な治療用途を示す。様々な時点で腫瘍のサイズはまた、図１０に示され、複数群のデータまたは群間のデータを比較するために、一元配置分散分析（一元配置ＡＮＯＶＡ）とそれに続くＴｕｋｅｙの多重比較検定を使用した。カプラン・マイヤー法により分析し、陰性対照と比較して、大幅に高いパーセンテージの腫瘍成長抑制ならびに最高の生存率及び最低レベルの病変が、ワクチン接種されたＰＤ－Ｌ１（１３０－１４７）で観察された。

【0124】

（ａ）抗体アイソタイプ。
本発明者らは、また、ワクチン接種により生成される抗体の様々なアイソタイプを分析した。マウスで誘発された抗体のアイソタイプは、ＰＤ－Ｌ１ １３０－１４７の場合、主にＩｇＧ１クラス（データは図１１に示される）であると決定され、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂが、他のエピトープで優勢であった。

【0125】

（ｂ）抗ＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１ １３０抗体は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を遮断することができる。
生体発光細胞ベースのＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断バイオアッセイは、ＰＤ－１シグナル伝達相互作用を妨害するために開発された治療用抗体または他の化合物の迅速なスクリーニングのための優れた選択肢を提供する。ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１遮断アッセイを使用して、３つの抗ＰＤ－Ｌ１抗体の機能を試験した。ウサギ由来の精製ポリクローナル抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、市販の抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体と同様にＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を遮断することが可能であったことが観察された（図１２）。これらの結果は、機能的な抗ＰＤ－Ｌ１が、Ｂ細胞エピトープペプチドで免疫されたウサギで産生されることを示す。図１２では、本発明者らは、ニボルマブ及びアテゾリズマブと比較して、各ＰＤ－Ｌ１ワクチンがＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１相互作用を遮断する能力を示す。驚くべきことに、ＰＤ－Ｌ１ １３０－１４７抗体のみが有効であった。

【0126】

（ｃ）カスパーゼ活性アッセイによるアポトーシスの決定。
疾患特異的な標的化及び低毒性プロファイルの可能性により、モノクローナル抗体が魅力的な治療薬候補となっている。抗体媒介性標的細胞の殺傷は、多くの場合、抗体依存性細胞傷害などの免疫エフェクター機序と関連するが、アポトーシスプロセスによりも誘発することもできる。抗原架橋、細胞死受容体の活性化、及びリガンド－受容体の成長または生存経路の遮断を含む抗体指向の機序は、標的細胞におけるアポトーシスの誘導を誘発し得る。作用機序に応じて、モノクローナル抗体が、標的化細胞特異的殺傷のみを誘導し得るか、または抗アポトーシス経路の調節を行うことにより、化学療法もしくは放射療法に対する標的細胞を増強し得る。これをさらに検査するために、本発明者らは、抗ＰＤ－Ｌ１ペプチドワクチン抗体がカスパーゼ活性化アッセイを介してがん細胞のアポトーシスを誘導することができるかどうかを評価した。ＭＣ３８（ＰＤ－Ｌ１発現細胞）及びＣＴ２６ＷＴがん細胞を、９６ウェルプレートに播種し、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、ペプチドワクチン抗体ならびに参照抗体アテゾリズマブ及びアポトーシス誘導因子としてのβラパコンを含有する低血清成長培地をウェルに添加した。次に、プレートを３７℃でさらに２４時間インキュベートした。次に、カスパーゼＧｌｏ試薬を添加し、アポトーシス誘導の尺度として、照度計を使用して、カスパーゼ９放出を決定した。カスパーゼ９は、システインアスパラギン酸特異的プロテアーゼ（カスパーゼ）ファミリーのメンバーであり、これは、哺乳動物細胞の内因性アポトーシス経路において重要な開始因子の役割を果たす。ＰＤ－Ｌ１抗体は、陰性対照（ＰＢＳ）と比較して、処理細胞のカスパーゼ活性の量の大幅な増加を引き起こし、ｍＡｂアテゾリズマブに匹敵することを、本発明者らは見出した。カスパーゼ放出の増加は、３倍超であり（図１３）、アポトーシスの増加を明確に示す。ＰＤ－Ｌ１抗体は、陰性対照（ＰＢＳ）と比較して、処理細胞のカスパーゼ活性の量の大幅な増加を引き起こし、ｍＡｂアテゾリズマブに匹敵することを、本発明者らは見出した。カスパーゼ放出の増加は、３倍超であり（図１３）、アポトーシスの増加を明確に示す。

【0127】

（ｄ）ＡＤＣＣ活性。
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、抗がんｍＡｂの重要な作用機序であり、これを通して、抗体は、ＦｃγＲ保有エフェクター細胞を動員して、ナチュラルキラー細胞などの細胞媒介性免疫系の構成要素による破壊のために「疾患」細胞を標的とする。しかし、臨床開発中のＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１抗体のほとんどは、ＡＤＣＣ活性を除去するように操作されたＦｃγＲ結合欠損ＩｇＧ１アイソタイプヒト化モノクローナル抗体である、アテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）のように、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性を媒介しないことが知られる。ＡＤＣＣ誘導は、アポトーシスを誘導することにより腫瘍死を潜在的に増強し得るが、それは、また、ＰＤ－Ｌ１発現Ｔ細胞の枯渇もたらし、それにより、免疫応答を鈍化させ得る。臨床的に適切な用量でＡＤＣＣ及びＣＤＣを排除するために、アテゾリズマブのＦｃ（フラグメント結晶化可能）ドメインが、ＦｃｙＲとの相互作用を低減させるように設計される。

【0128】

精製ポリクローナル抗体のＡＤＣＣ活性を評価するために、本発明者らは、２５ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ－γで１６時間処理されたＭＣ３８細胞、及びＪｕｒｋａｔエフェクター細胞と一緒にＷＩＬ２－Ｓ標的細胞を使用した。アッセイの性能を評価するために、図１４に示されるように、様々な濃度の抗体で、ＡＤＣＣ応答の直線性試験を実施した。ペプチドワクチンにより誘発された抗体は、ｍＡｂアテゾリズマブと同様の効果があり、抗体依存性細胞傷害を媒介することはできなかった（図１４）。

【0129】

（４）ＨＥＲ－２を発現するＣＴ２６結腸癌細胞株をチャレンジされた同系Ｂａｌｂ／ｃモデルの腫瘍成長の抑制における抗マウスＰＤ－Ｌ１（Ｂ７－Ｈ１）ｍＡｂクローン１０Ｆ．９Ｇ２に対するＰＤ－Ｌ１ワクチンエピトープの有効性
ＣＴ２６／ＨＥＲ－２がん細胞株におけるｉｎ ｖｉｖｏでのＰＤ－Ｌ１エピトープワクチンの有効性を検証するために、Ｂａｌｂ／ｃマウス（１０匹のマウス／群）を、ｎｏｒ－ＭＤＰ及びＭｏｎｔａｎｉｄｅ ７２０（１：１の比）で乳化されたＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１（３６－５３）、ＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１（５０－６７）、ＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１（９５－１１２）、及びＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１（１３０－１４７）のそれぞれ１００μｇで免疫した（図１５Ａ、スキーム２Ａ）。スキーム２Ａ～Ｄ（図１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、及び１５Ｄ）に詳述されているように、マウスを３週間隔で３回免疫した。各ワクチン接種の１、２、及び３週間後に、血液を収集した。これは、１Ｙ＋３、２Ｙ＋１、２Ｙ＋２、２Ｙ＋３、３Ｙ＋１、３Ｙ＋２、３Ｙ＋３（式中、Ｙが、表６Ａ、２６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、及び６Ｅに示される免疫化の数を示す）として示される。全てのＰＤ－Ｌ１エピトープは、高力価のＰＤ－Ｌ１抗ペプチド抗体を誘発した（ＥＬＩＳＡによる）。データは、図１６に要約され、全ワクチンは、組み換えＰＤ－Ｌ１－タンパク質に対する反応性を示した（図１７）。本発明者らは、ＰＤ－Ｌ１－９５とのＰＤ－１（９２－１１０）の組み合わせも調査した。

【表10】

【表11】

【表12】

【表13】

【表14】

【0130】

３回目の免疫（３Ｙ）の２週間後に、マウスをＣＴ２６がん細胞（マウス１匹当たり１×１０^５細胞）で皮下（ｓ．ｃ）接種し、その後、腫瘍形成を毎日観察した。ＰＢＳで処置されたマウスを陰性対照として用い、抗マウスＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体（ｍＡｂクローン１０Ｆ．９Ｇ２）の２００μｇ／用量の注射で週２回処置されたマウスを陽性対照として用いた。腫瘍成長を週１回監視し、ノギスで測定した。個々のマウスそれぞれの腫瘍成長（腫瘍体積；ＬＷＷ ｍｍ^３）パターンを図１８に示す。４つのＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１キメラペプチドワクチンでワクチン接種されたマウスは全て、対ＰＢＳ処理（－ｖｅ対照）による処置と比較して、抗マウスＰＤ－Ｌ１（１０Ｆ．９Ｇ２）ｍＡｂモノクローナル抗体（＋ｖｅ対照）と同様に、大幅な腫瘍抑制を示した。ＰＤ－Ｌ１ Ｂ細胞エピトープワクチン処置は、ＰＢＳによる陰性対照処置と比較して、チャレンジ後１６日目で腫瘍成長が同様に有意に低減した（図１９）。但し、特に、ＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１（１３０－１４７）、ＰＤ－Ｌ１（３６－５３）、ＰＤ－Ｌ１（９５－１１２）、及びＰＤ－Ｌ１（５０－６７）、ならびにＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１－（９５）＋ＭＶＦ－ＰＤ－１（９２－１１０）は、１６日目に最も強い腫瘍成長抑制を示し、これは、有用な抑制性ワクチンとしての潜在的な治療用途を示す。様々な時点で腫瘍のサイズはまた、図２０に示され、複数群のデータまたは群間のデータを比較するために、及び一元配置分散分析（一元配置ＡＮＯＶＡ）とそれに続くＴｕｋｅｙの多重比較検定を使用した。カプラン・マイヤー法により分析し、陰性対照と比較して、大幅に高いパーセンテージの腫瘍成長抑制ならびに最高の生存率及び最低レベルの病変が、ワクチン接種されたＰＤ－Ｌ１（１３０－１４７）で観察された。

【0131】

本発明者らは、また、ワクチン接種により生成される抗体の様々なアイソタイプを分析した。マウスで誘発された抗体のアイソタイプは、ＰＤ－Ｌ１ １３０－１４７の場合、主にＩｇＧ１クラス（データは図２１に示される）であると決定され、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂが、他のエピトープで優勢であった。最後に、本発明者らは、ＰＤ－Ｌ１エピトープのそれぞれに対する５０％のマウスの生存時間を分析し、本発明者らは、ＰＤ－Ｌ１ １３０－１４７は、他のＰＤ－Ｌ１エピトープと比較してより良好な生存率を有していたことを示す（図２２）。

【0132】

（５）ペプチドワクチンＰＤ－Ｌ１及びＨＥＲ－２エピトープとの併用治療は、強力なＨＥＲ－２及びＰＤ－Ｌ１抗体応答ならびにＢａｌｂ／ｃ ＣＴ２６／ＨＥＲ－２モデルにおける腫瘍成長の抑制をもたらす。
次に、Ｂａｌｂ／ｃのＣＴ２６／ＨＥＲ－２腫瘍モデルを使用して、抗ＨＥＲ－２免疫療法と組み合わせた抗ＰＤ－Ｌ１免疫療法の相乗効果について試験し、この組み合わせが免疫原性を増加させ、抗腫瘍の応答を増強させ、腫瘍成長の抑制において相乗効果を提供し得るかどうかを判定した。Ｂａｌｂ／ｃマウス（１０匹／群）を、ＩＳＡ７２０（１：１の比率）で乳化されたＭＶＦ－ＨＥＲ－２（２６６－２９６）＋ＭＶＦ－ＨＥＲ－２（５９７－６２６）ペプチドワクチン構築物と組み合わせたＭＶＦ－ＨＥＲ－２（３６－５３、５０－６７、９５－１１２、１３０－１４７）で、３週間隔で３回免疫した。これは、スキーム３Ａ～３Ｃ（図２３Ａ、２３Ｂ、及び２３Ｃ）に要約される。時間（１Ｙ＋３、２Ｙ＋１、２Ｙ＋２、２Ｙ＋３、３Ｙ＋１、３Ｙ＋２、３Ｙ＋３、及び終点の採血）にわたって、ワクチン接種されたマウス群全てにおいて、強力なＨＥＲ－２及びＰＤ－Ｌ１抗体応答を誘発した（ＥＬＩＳＡで決定）（表７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｄ、及び７Ｅ）。これらの免疫原性データを図２４及び２５に要約する。最終追加免疫の２週間後、ＣＴ２６／ＨＥＲ－２腫瘍株由来の１×１０^５の腫瘍細胞をマウスに皮下移植した。対照マウスのみを、実験期間中、週に２回、陰性対照として機能するＰＢＳ、または陽性対照として２００μｇ／用量の抗マウスＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂ（１０Ｆ．９Ｇ２）のいずれかで処置した。

【表15】

【表16】

【表17】

【表18】

【表19】

【0133】

ｂ）考察
がん免疫療法に関する現在の熱意は、プログラム細胞死１（ＰＤ－１）及び細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）などの免疫チェックポイント分子を標的とするいくつかの薬剤の成功が原因である。現在、ＣＴＬＡ－４及びＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１を標的とする十数個の免疫チェックポイント抗体がＦＤＡ規制当局の承認を世界的に受けており、ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１を標的とするチェックポイント阻害薬のための多数の進行中の臨床試験がある。これらの治療法は、少数の患者にのみ例外的な成功をもたらしている。先天性及び後天性の耐性を支える機序が、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断に対する応答の欠如の部分的な原因となり、適切に設計された併用療法が使用及び臨床的影響を拡大し得る理論的根拠を強調している。例えば、イピリムマブ及びニボルマブの組み合わせは、切除不能メラノーマ及び有望な第Ｉ相及び第ＩＩ相の治験患者に対する肯定的な結果のために、ＦＤＡにより承認されたが、組み合わせは、単独療法と比較して増加した毒性も示した。

【0134】

ＰＤ－１阻害薬と比較して、ＰＤ－Ｌ１阻害薬は、免疫障害に起因する副作用の発生率を低減し得る。ＦＤＡは、ＰＤ－Ｌ１を標的とする１つのヒト化ｍＡｂ（アテゾリズマブ、ＴＥＣＥＮＴＲＩＣ（登録商標））及び２つの完全ヒトｍＡｂ（アベルマブ、ＢＡＶＥＮＣＩＯ（登録商標）及びデュルバルマブ、ＩＭＦＩＮＺＩ（登録商標））を承認している。最近報告されたアベルマブ／ｈＰＤ－Ｌ１複合体構造は、どのようにして治療用ｍＡｂがＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１の結合を無効にするかついての明確な構造情報を提供している。ＰＤ－Ｌ１標的抗体であるアベルマブは目下、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）（ＮＣＴ０２３９５１７２）、進行腎細胞癌（ＮＣＴ０２６８４００６）、及び胃癌（ＮＣＴ０２６２５６１０）に対する複数の第ＩＩＩ相臨床試験中である。

【0135】

最近、ジフテリア毒素（ＤＴＴ）の転座ドメインのＣ末端に融合したＰＤ－Ｌ１の細胞外ドメイン（ＰＤ－Ｌ１Ｅ）からなるＰＤ－Ｌ１を標的とするワクチンが報告された。ＤＰＤＬ１Ｅワクチンの治療有効性を、Ｂ１６－Ｆ１０担腫瘍Ｃ５７ＢＬ／６マウスで評価した。ＰＤ－Ｌ１を標的とするＤＰＤＬ１Ｅワクチンが、ＰＤ－Ｌ１特異的免疫応答を誘導し、ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍成長を遅延させると、著者らは結論付けた。これらの結果は、がんワクチン設計を探求する将来の研究のための有望な手段を示す。

【0136】

全体として、特定のがんを管理するための様々な免疫方策の合理的な開発には、治療環境を変化させ、ヒトの疾患管理を改善するための実質的な見込みがある。この研究は、マルチターゲットアプローチを使用することの利点にも注目を集め、それにより、複数のシグナル伝達モダリティに影響を与える薬物の使用のみが、強力な抗増殖効果をもたらし、薬剤耐性の発症を遅延させることがますます評価される。しかし、この現在の研究では、がん細胞における発がん性駆動因子を調べるための強力なツールとして役立ち得るワクチンの組み合わせを生成することが可能であることが実証された。現在、ヒトＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１軸を標的とする購入可能なＢ細胞エピトープワクチンはない。

【0137】

ｃ）材料及び方法
（１）ｈＰＤ－Ｌ１のペプチドエピトープの同定及び合成。
ＰＤ－Ｌ１の表面に発現された候補Ｂ細胞エピトープの選択は、以下のように記載される抗原性の６つの相関関係を使用した、社内のコンピューター支援分析（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（商標）、５ｚ．ｃｏｍ）で行った。（ａ）個々の配列の鎖の柔軟性及び可動性のプロファイルをＫａｒｐｌｕｓ及びＳｃｈｕｌｔｚにより計算した。（ｂ）疎水性プロファイルを７残基スパン設定により生成し、次に、Ｋｙｔｅ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅを使用して、３残基スパンで平滑化した。（ｃ）Ｈｏｐｐ及びＷｏｏｄｓのプログラムを使用して、６残基ウィンドウによる親水性プロファイルを生成した。（ｄ）アミノ酸残基の水への曝露の分析をＲｏｓｅ ｅｔ ａｌ．の溶媒曝露アルゴリズムで実施した。（ｅ）アクセス可能で溶媒中に突出するタンパク質の部分を予測するＴｈｏｒｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．の方法により突出指数を計算した。（ｆ）５残基配列が抗原性である確率を、Ｗｅｌｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．の方法で決定した。配列は、それぞれの指標値に基づいて、１～６のスコアを与え、ランク付けした。最高ランクの配列は、実験された分析に対して最高の個々のスコアを有し、それに続く候補は、次に高いスコアを有していた、などである。さらに、最高スコアのエピトープを２次構造属性との相関によりランク付けし、例えば、両親媒性のαヘリックス配列またはβターンループ領域が、ランダムコイルフラグメントよりも好ましい。Ｃｈｏｕ ａｎｄ Ｆａｓｍａｎ及びＮｏｖｏｔｎｙ ｅｔ ａｌ．によるコンピュータープログラムを使用して、２次構造（αヘリックス、βストランド／シート、βターン／ループ、ランダムコイル）及びαヘリックス両親媒性モーメントを予測した。最後に、個々のアミノ酸配列を考慮した。らせんセグメントにおける静電イオン対及びらせん双極子相互作用も考慮した（例えば、疎水性／親水性バランス）。本発明者らは、ＰＤ－Ｌ１の４つのエピトープを同定するために、免疫原性／抗原性のアルゴリズムを使用したペプチドエピトープマッピングを使用した。本発明者らは、ＰｙＭＯＬ ３－Ｄモデリングソフトウェア（ＤｅＬａｎｏ ＷＬ ２００２、ＰｙＭＯＬユーザーズマニュアル）を使用して、４つのエピトープ全てをモデリングしている。

【0138】

次に、Ｆｍｏｃ／ＢＯＰ化学及びＣＬＥＡＲアミド試薬（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、米国ケンタッキー州ルイビル）上のＰｙＢＯＰ／ＨＯＢＴカップリング試薬（ＰＢ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国ケンタッキー州ルイビル）を用いる９６００ Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ固相ペプチド合成装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国マサチューセッツ州ベッドフォード）を使用して、４つの新規ペプチド配列を合成した。切断前に１－アセチルイミダゾール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州セントルイス）を使用して、いくつかのペプチド試料をアセチル化した。４残基リンカー（ＧＰＳＬ）を使用して、麻疹ウイルス融合タンパク質（ＭＶＦ、アミノ酸２８８～３０２）に由来する無差別Ｔヘルパーエピトープを有するキメラ構築物として、全てのペプチドを合成した。切断試薬Ｒ（ＴＦＡ）／チオアニソール／ＥＤＴ／アニソール（９０／５／３／２）を使用して、ペプチドを樹脂から切断し、粗製ペプチドをセミ分取（Ｃ－４ Ｖｙｄａｃカラム）逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ；Ｗａｔｅｒｓ、米国マサチューセッツ州ベッドフォード）で精製した。同じ保持時間を示すＲＰＨＰＬＣ画分を一緒にプールし、凍結乾燥した。全てのペプチドは、９５％を超える純度を示した。次に、試料をＭＡＬＤＩ（ＣＣＩＣ（Ｃａｍｐｕｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｔｈｅ Ｏｈｉｏ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、米国オハイオ州コロンバス））でのマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析）で特性評価し、分析ＲＰ－ＨＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ、米国マサチューセッツ州ベッドフォード）で分析した。全てのペプチドは、適切な分子量を有していた。

【0139】

（２）ｈＰＤ－Ｌ１ペプチドエピトープによる免疫化。
各ペプチドについて、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（米国マサチューセッツ州ウィルミントン）から購入したニュージーランド白ウサギにおいて、ワクチン抗体を作成した。Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ７２０（Ｓｅｐｐｉｃ、仏国パリ）中で乳化したＭＶＦキメラペプチド１ｍｇで、ウサギを免疫化し、３週間隔で３回追加免疫した。マウス実験では、６～８週齢のマウスを、ＩＳＡ７２０で乳化した（１：１の比）ペプチド０．１ｍｇで免疫した。３週間隔でそれぞれの用量で、マウスを追加免疫した。次に、血液を収集し、血清を抗体価について試験した。血清を週１回収集し、プロテインＡ／Ｇカラムを使用したアフィニティークロマトグラフィーにより、ペプチドワクチンの抗体を精製し、分光光度計を使用して、濃度を測定した。全ての実験は、Ｕ．Ｓ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｐｏｌｉｃｙ ｏｎ Ｈｕｍａｎｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｉｍａｌｓに従って実施され、Ｏｈｉｏ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌｓ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認され、認められたプロトコールに詳述された。

【0140】

（３）４つのペプチドワクチンｈＰＤ－Ｌ１エピトープのｉｎ ｖｉｖｏ試験：マウスにおけるＣＴ２６及びＣＴ２６／ＨＥＲ－２腫瘍モデル
６～８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、マサチューセッツ州ウィルミントン）を標準動物モデルとして使用した。マウスＣＴ２６結腸癌細胞株をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｌｌｓから購入し、１０％のＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地で定期的に培養した。ＣＴ２６／ＨＥＲ２細胞は、Ｍ．Ｐｅｎｉｃｈｅｔの厚意により提供された。ワクチンを滅菌水に溶解させ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ７２０で乳化した（１：１）。６～８週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を各ペプチドワクチン１００μｇで、３週間隔で３回免疫し、３回目の免疫化の２週間後に、マウスをＣＴ２６及び／またはＣＴ２６／ＨＥＲ－２腫瘍細胞でチャレンジした（右脇腹に皮下（ｓ．ｃ）移植した（マウス１匹当たり１×１０^５））。２００μｇのラットαマウスＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂ １０Ｆ．９Ｇ２（Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌ、ニューハンプシャー州ウェストレバノン）を、対照群の腫瘍接種後に週２回腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。マウスを監視し、日常的に触知可能な腫瘍の形成に対しスコア化され、腫瘍が壊死になったか、または２，０００ｍｍ^３の所定のサイズを超えた場合、死亡させた。ノギスを用いて、腫瘍体積を立方ミリメートル単位で測定し、以下の式で計算した：Ａ×Ｂ^２×０．５（式中、Ａが、最大直径であり、Ｂが、長さに垂直で最も幅広い点である）。免疫化の間、血液を週１回採取し、抗体価を監視するためにＥＬＩＳＡで使用した。

【0141】

（４）抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）レポーターバイオアッセイ。
製造者の指示に従ってＡＤＣＣレポーターバイオアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ＡＤＣＣ活性を評価した。要約すると、１日前に、標的ＷＩＬ２－Ｓ及びＭＣ３８細胞を９６ウェルアッセイプレートの各ウェルに播種した。ＭＣ３８細胞をＩＦＮ－γ（２５ｎｇ／ｍｌ、３７℃で１６時間）で処理し、ＰＤ－Ｌ１発現を確実に誘導した。翌日、段階希釈された参照抗体（アテゾリズマブ）またはＣＤ２０対照抗体、及び段階希釈された精製ＰＤ－Ｌ１ １３０ポリクローナル抗体をアッセイプレートに添加した。次に、４：１のエフェクター細胞対標的細胞の比で、加湿された５％のＣＯ_２インキュベーター内で、Ｊｕｒｋａｔ細胞（エフェクター細胞としてＦｃγＲＩＩＩａ受容体を安定して発現するように設計された不死化Ｔリンパ球細胞）を抗体処理標的細胞と３７℃で６時間共培養した。抗体に結合すると、操作されたＪｕｒｋａｔ Ｔリンパ球細胞は、活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）経路を介して遺伝子転写を活性化し、ホタルルシフェラーゼの発現を誘導した。最後に、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ３プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）によるルシフェラーゼアッセイ試薬を使用して、ルシフェラーゼ活性を定量した。

【0142】

（５）アポトーシス（カスパーゼ９アッセイ）。
ｉｎ ｖｉｔｒｏで処理細胞のカスパーゼ検出のために、カスパーゼ－Ｇｌｏ９アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）を使用した。試薬は、ルシフェラーゼ及び細胞溶解剤と組み合わせて、プロルミネセントカスパーゼ－９基質を提供する。細胞を、１ウェル当たり１×１０^４細胞で９６ウェルプレートに播種し、完全培地で一晩培養した。次に、細胞を抗ＰＤ－Ｌ１抗体ならびに参照抗体アテゾリズマブ及びβラパコン（１０μＭ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で２４時間処理した。アッセイウェルに直接ＣＡＳＰＡＳＥ－ＧＬＯ（登録商標）９試薬５０μｌを添加することにより、カスパーゼ活性を測定した。これにより、細胞溶解とそれに続く、基質のカスパーゼ切断、及び発光の生成がもたらされる。マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、発光を検出した。読み出しに表示された量は、試料中のカスパーゼ活性の量に比例する。

【0143】

（６）ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１バイオアッセイ。
アッセイをＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断バイオアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の製造元のプロトコールに従って実施した。簡単に言うと、４×１０^５のａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１またはＰＤ－Ｌ１ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞を、９６ウェルプレートの１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０に播種した。一晩培養後、培地を吸引し、段階希釈された精製ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－１抗体、ならびにニボルマブ及びアテゾリズマブ抗体（基準抗体として）を添加した。次に、ＰＤ－１エフェクター細胞を共培養し、加湿された５％のＣＯ_２インキュベーター内で、プレートを３７℃で５時間維持した。Ｂｉｏ－Ｇｌｏ試薬と混合した後、発光プレートリーダーであるＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ３プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で、発光を測定した。

【0144】

（７）マウスアイソタイピングアッセイ。
Ｍｏｕｓｅ Ｔｙｐｅｒアイソタイピングキット（ＢＩＯ－ＲＡＤ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を使用して、抗体アイソタイプ（すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３）を決定した。要約すると、９６ウェルアッセイプレートのウェルを蒸留脱イオンＨ_２Ｏ中２００ｎｇのペプチド抗原でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ中の０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０及び１％のウマ血清）で洗浄した。次に、プレートを、ＰＢＳ中の１％のＢＳＡで、室温で１時間ブロッキングした。希釈されたマウス血清１００μｌを各ウェルに２時間添加し、ウェルを洗浄後、すぐに使えるウサギ抗マウスサブクラス抗体１００μｌをそれぞれ各ウェルに添加し、室温でさらに２時間インキュベートした。ウェルを再度洗浄し、ＨＲＰ抗体（ＢＩＯ－ＲＡＤ、カリフォルニア州ヘラクレス）にコンジュゲートされたヤギ抗ウサギの１／３０００希釈の１００μｌを各ウェルに添加し、暗所、室温で１時間インキュベートした。次に、プレートを洗浄し、５０μｌの調製された基質溶液を各ウェルに添加した。反応を、５％のＳＤＳ停止緩衝液２５μｌで停止させた。ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して、４１５ｎｍでの吸光度を決定した。バックグラウンドを差し引いた後、０．４以上の吸光度で示されたＥＬＩＳＡ力価により、各血清試料の希釈を決定した。

【0145】

（８）統計分析。
腫瘍サイズを１日１回観察し、ノギスで測定した。腫瘍体積を以下の式で計算した：体積＝（長さ＊幅＊幅）／２。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．１．２（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を使用して、データ統計分析を実施した。一元配置分散分析（一元配置ＡＮＯＶＡ）とそれに続くＴｕｋｅｙの多重比較検定を使用して、複数群のデータまたは複数群の群間のデータを比較した。０．０５未満のｐ値または調整済みｐ値を、統計的有意差として受け入れた。^＊は、ｐ＜０．０５を示し、^＊＊は、ｐ＜０．０１を示す。

【0146】

８．実施例８：Ｄ２Ｆ２及びＤ２Ｆ２Ｅ２腫瘍チャレンジ
ａ）実験設計：この実験には２つの部分がある（１０匹のマウス／群、６～８週齢）：
（１）パート１：Ｇ０～Ｇ４、これらの４群のマウスは、Ｄ２Ｆ２ ＷＴがん細胞でチャレンジされる。
Ｇ０、Ｇ１、及びＧ２は、対照群であり、これらの群のマウスは、腫瘍細胞チャレンジ前に処置されなかった。Ｄ２Ｆ２ ＷＴ腫瘍細胞でチャレンジした後、Ｇ０マウスを、ＰＢＳ（ｉ．ｐ．）でチャレンジ後２日目から週２回処置し、陰性対照として用いた。Ｇ１及びＧ２マウスを、それぞれ、抗ＰＤ－１ ｍＡｂ（２９Ｆ．１Ａ１２）または抗ＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂ（１０Ｆ．９Ｇ２）で処置した。Ｇ１及びＧ２マウス群の処置も、腫瘍チャレンジ後２日目から開始し、週２回、１００μｇ／マウスで投与した。Ｇ１及びＧ２は、陽性対照として用いた。対照的に、Ｇ３及びＧ４マウスを、マウス１匹当たり、それぞれ、１００μｇのＭＶＦ－ＰＤ－１（９２－１１０）＋ＩＳＡ７２０または１００μｇのＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１（１３０－１４７）＋ＩＳＡ７２０で免疫した。腫瘍チャレンジの前に、マウスを最大４回免疫した。Ｄ２Ｆ２ ＷＴ腫瘍細胞でチャレンジされた後、マウスは、さらなる処置を受けなかった。全てのマウスを、週に少なくとも２回監視しており、データに示されるように、腫瘍をノギスで測定した（図２６）。

【0147】

（２）Ｇパート２、１０～Ｇ１５。これらの５群のマウスは、Ｄ２Ｆ２／Ｅ２がん細胞でチャレンジされるように計画される。
Ｇ１０、Ｇ１１、及びＧ１２は、対照群であり、腫瘍細胞チャレンジ前に処置を受けていなかった。マウスをＤ２Ｆ２／Ｅ２腫瘍細胞でチャレンジした後、Ｇ１０マウスを、チャレンジ後ＰＢＳ（ｉ．ｐ．）で２日目から週２回処置し（陰性対照として用いた）、Ｇ１１及びＧ１２マウスを、それぞれ、抗ＰＤ－１ ｍＡｂ（２９Ｆ．１Ａ１２）または抗ＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂ（１０Ｆ．９Ｇ２）で処置した。Ｇ１及びＧ１２の場合、１００μｇ／マウスでの週２回の処置を、腫瘍チャレンジ後２日目から開始した。Ｇ１１及びＧ１２は、陽性対照として用いた。Ｇ１３、Ｇ１４、及びＧ１５マウスを、Ｇ１３の場合、マウス１匹当たり１００μｇのＭＶＦ－ＨＥＲ－２（２６６－２９６）＋１００ｕｇのＭＶＦ－ＨＥＲ－２（５９７－６２６）＋ＩＳＡ７２０、Ｇ１４の場合、マウス１匹当たり１００μｇのＭＶＦ－ＰＤ－１（９２－１１０）＋１００μｇのＭＶＦ－ＨＥＲ－２（２６６－２９６）＋１００μｇのＭＶＦ－ＨＥＲ－２（５９７－６２６）＋ＩＳＡ７２０、Ｇ１５の場合、マウス１匹当たり１００μｇのＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１（１３０－１４７）＋１００μｇのＭＶＦ－ＨＥＲ－２（２６６－２９６）＋１００μｇのＭＶＦ－ＨＥＲ－２（５９７－６２６）＋ＩＳＡ７２０で免疫した。腫瘍チャレンジの前に、マウスを最大４回免疫した。Ｄ２Ｆ２／Ｅ２腫瘍細胞でチャレンジされた後、マウスは、さらなる処置を受けなかった。全てのマウスを、週に少なくとも２回監視しており、データに示されるように、腫瘍をノギスで測定した（図２６）。

【0148】

ｂ）実験のスキーム：
図２６に記載されるように、マウスを設計されたペプチドワクチンで免疫化し、これは、本明細書で１Ｙ、２Ｙ、３Ｙ、及び４Ｙとして３週間隔で示した。スキームに示されているように、血液を収集した。数字は、免疫化後の週を意味する。例えば、２Ｙ＋２は、２次免疫を示し、この２週間後に、血液を収集していた（図２７）。図２６に示されるように、マウスは、４Ｙ＋５で、Ｄ２Ｆ２ ＷＴまたはＤ２Ｆ２／Ｅ２でチャレンジされている。マウスを少なくとも週２回監視し、データ図に示されるように、腫瘍を測定した。

【0149】

ｃ）結果
（１）マウス１匹当たり１００ｕｇのＭＶＦ－ＰＤ－１（９２－１１０）＋ＩＳＡ７２０で免疫されたＧ３マウスの免疫原性。
図２８に示されるように、血液を収集した。例えば、２Ｙ＋２は、２次免疫を示し、この２週間後に、血液を収集していた。ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、ＭＶＦ－ＰＤ－１（９２－１１０）に対する抗体価を測定した。

【0150】

マウス血清中のＭＶＦ－ＰＤ－１（９２－１１０）に対する抗体を検出するために、本発明者らは、９６ウェルアッセイプレート（ＣＯＳＴＡＲ）に、ＭＶＦ－ＰＤ－１（９２－１１０）ペプチドを、２μｇ／ｍｌの蒸留脱イオンＨ_２Ｏ中の抗原としてのペプチド１００μｌとともにコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ中の０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０及び１％のウマ血清）で洗浄した。その後、ＰＢＳ中１％のＢＳＡ ２００μｌで、プレートを室温で１時間ブロッキングした。インキュベーション後、２倍段階希釈された血清１００μｌを各ウェルに添加し、室温で２時間インキュベートした。ウェルを再度洗浄し、ＨＲＰ抗体（０．８ｍｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にコンジュゲートされたヤギ抗マウスの１／５００希釈液１００μｌを各ウェルに添加し、暗所、室温で１時間インキュベートした。プレートは最終洗浄され、調製されたＡＢＴＳ基質溶液５０μｌを各ウェルに添加した。蒸留脱イオン水中の１％のＳＤＳ ２５μｌで、反応を停止させた。ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して、４１５ｎｍでの吸光度を決定した。０．２を超える吸光度で示される最高の抗体ＥＬＩＳＡ力価により、各血清試料の希釈を決定した。

【0151】

（２）マウス１匹当たり１００μｇのＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１（１３０－１４７）＋ＩＳＡ７２０で免疫されたＧ４マウスの免疫原性。
図２９に示されるように、血液を収集した。２Ｙ＋２は、２次免疫を示し、この２週間後に、血液を収集していた。ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、ＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１（１３０－１４７）に対する抗体価を測定した。

【0152】

マウス血清中のＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１（１３０－１４７）に対する抗体を検出するために、本発明者らは、９６ウェルアッセイプレート（ＣＯＳＴＡＲ）に、ＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１（１３０－１４７）ペプチドを、２μｇ／ｍｌの蒸留脱イオンＨ_２Ｏ中の抗原としてのペプチド１００μｌとともにコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ中の０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０及び１％のウマ血清）で洗浄した。その後、ＰＢＳ中１％のＢＳＡ ２００μｌで、プレートを室温で１時間ブロッキングした。インキュベーション後、２倍段階希釈された血清１００μｌを各ウェルに添加し、室温で２時間インキュベートした。ウェルを再度洗浄し、ＨＲＰ抗体（０．８ｍｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にコンジュゲートされたヤギ抗マウスの１／５００希釈液１００μｌを各ウェルに添加し、暗所、室温で１時間インキュベートした。プレートは最終洗浄され、調製されたＡＢＴＳ基質溶液５０μｌを各ウェルに添加した。蒸留脱イオン水中の１％のＳＤＳ ２５μｌで、反応を停止させた。ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して、４１５ｎｍでの吸光度を決定した。０．２を超える吸光度で示される最高の抗体ＥＬＩＳＡ力価により、各血清試料の希釈を決定した。

【0153】

（３）マウス１匹当たり１００μｇのＭＶＦ－ＨＥＲ－２（２６６－２９６）＋１００μｇのＭＶＦ－ＨＥＲ－２（５９７－６２６）＋ＩＳＡ７２０で免疫されたＧ１３マウスの免疫原性。
図３０に示されるように、血液を収集した。例えば、２Ｙ＋２は、２次免疫を示し、この２週間後に、血液を収集していた。ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、ＭＶＦ－ＨＥＲ－２（２６６－２９６）またはＭＶＦ－ＨＥＲ－２（５９７－６２６）に対する抗体価を別々に測定した。

【0154】

マウス血清中のＭＶＦ－ＨＥＲ－２（２６６－２９６）に対する抗体を検出するために、本発明者らは、９６ウェルアッセイプレート（ＣＯＳＴＡＲ）に、ＭＶＦ－ＨＥＲ－２（２６６－２９６）ペプチドを、２μｇ／ｍｌの蒸留脱イオンＨ_２Ｏ中の抗原としてのペプチド１００μｌとともにコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ中の０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０及び１％のウマ血清）で洗浄した。その後、ＰＢＳ中１％のＢＳＡ ２００μｌで、プレートを室温で１時間ブロッキングした。インキュベーション後、２倍段階希釈された血清１００μｌを各ウェルに添加し、室温で２時間インキュベートした。ウェルを再度洗浄し、ＨＲＰ抗体（０．８ｍｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にコンジュゲートされたヤギ抗マウスの１／５００希釈液１００μｌを各ウェルに添加し、暗所、室温で１時間インキュベートした。プレートは最終洗浄され、調製されたＡＢＴＳ基質溶液５０μｌを各ウェルに添加した。蒸留脱イオン水中の１％のＳＤＳ ２５μｌで、反応を停止させた。ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して、４１５ｎｍでの吸光度を決定した。０．２を超える吸光度で示される最高の抗体ＥＬＩＳＡ力価により、各血清試料の希釈を決定した。マウス血清中のＭＶＦ－ＨＥＲ－２（５９７－６２６）に対する抗体を検出するために、同じ手順を実施した。４Ｙ＋１３で、結果は、腫瘍のないマウスまたは非常に小さな腫瘍を有するマウスの抗体価は、大きな腫瘍を有するマウスよりも比較的高いＣＲマウスを示した。

【0155】

（４）マウス１匹当たり１００μｇのＭＶＦ－ＰＤ－１（９２－１１０）＋１００μｇのＭＶＦ－ＨＥＲ－２（２６６－２９６）＋１００μｇのＭＶＦ－ＨＥＲ－２（５９７－６２６）＋ＩＳＡ７２０で免疫されたＧ１４マウスの免疫原性。
図３１に示されるように、血液を収集した。例えば、２Ｙ＋２は、２次免疫を示し、この２週間後に、血液を収集していた。ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、ＭＶＦ－ＰＤ－１（９２－１１０）、ＭＶＦ－ＨＥＲ－２（２６６－２９６）、またはＭＶＦ－ＨＥＲ－２（５９７－６２６）に対する抗体価を別々に測定した。

【0156】

マウス血清中のＭＶＦ－ＰＤ－１（９２－１１０）に対する抗体を検出するために、本発明者らは、９６ウェルアッセイプレート（ＣＯＳＴＡＲ）に、ＭＶＦ－ＰＤ－１（９２－１１０）ペプチドを、２μｇ／ｍｌの蒸留脱イオンＨ_２Ｏ中の抗原としてのペプチド１００μｌとともにコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ中の０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０及び１％のウマ血清）で洗浄した。その後、ＰＢＳ中１％のＢＳＡ ２００μｌで、プレートを室温で１時間ブロッキングした。インキュベーション後、２倍段階希釈された血清１００μｌを各ウェルに添加し、室温で２時間インキュベートした。ウェルを再度洗浄し、ＨＲＰ抗体（０．８ｍｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にコンジュゲートされたヤギ抗マウスの１／５００希釈液１００μｌを各ウェルに添加し、暗所、室温で１時間インキュベートした。プレートは最終洗浄され、調製されたＡＢＴＳ基質溶液５０μｌを各ウェルに添加した。蒸留脱イオン水中の１％のＳＤＳ ２５μｌで、反応を停止させた。ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して、４１５ｎｍでの吸光度を決定した。０．２を超える吸光度で示される最高の抗体ＥＬＩＳＡ力価により、各血清試料の希釈を決定した。マウス血清中のＭＶＦ－ＨＥＲ－２（２６６－２９６）及びＭＶＦ－ＨＥＲ－２（５９７－６２６）に対する抗体を検出するために、同じ手順を実施した。４Ｙ＋１３で、結果は、腫瘍のないマウスまたは非常に小さな腫瘍を有するマウスの抗体価は、大きな腫瘍を有するマウスよりも比較的高いＣＲマウスを示した。

【0157】

（５）マウス１匹当たり１００μｇのＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１（１３０－１４７）＋１００μｇのＭＶＦ－ＨＥＲ－２（２６６－２９６）＋１００μｇのＭＶＦ－ＨＥＲ－２（５９７－６２６）＋ＩＳＡ７２０で免疫したＧ１５マウスの免疫原性。
図３２に示されるように、血液を収集した。例えば、２Ｙ＋２は、２次免疫を示し、この２週間後に、血液を収集していた。ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、ＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１（１３０－１４７）、ＭＶＦ－ＨＥＲ－２（２６６－２９６）、またはＭＶＦ－ＨＥＲ－２（５９７－６２６）に対する抗体価を別々に測定した。

【0158】

マウス血清中のＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１（１３０－１４７）に対する抗体を検出するために、本発明者らは、９６ウェルアッセイプレート（ＣＯＳＴＡＲ）に、ＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１（１３０－１４７）ペプチドを、２μｇ／ｍｌの蒸留脱イオンＨ_２Ｏ中の抗原としてのペプチド１００μｌとともにコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ中の０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０及び１％のウマ血清）で洗浄した。その後、ＰＢＳ中１％のＢＳＡ ２００μｌで、プレートを室温で１時間ブロッキングした。インキュベーション後、２倍段階希釈された血清１００μｌを各ウェルに添加し、室温で２時間インキュベートした。ウェルを再度洗浄し、ＨＲＰ抗体（０．８ｍｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にコンジュゲートされたヤギ抗マウスの１／５００希釈液１００μｌを各ウェルに添加し、暗所、室温で１時間インキュベートした。プレートは最終洗浄され、調製されたＡＢＴＳ基質溶液５０μｌを各ウェルに添加した。蒸留脱イオン水中の１％のＳＤＳ ２５μｌで、反応を停止させた。ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して、４１５ｎｍでの吸光度を決定した。０．２を超える吸光度で示される最高の抗体ＥＬＩＳＡ力価により、各血清試料の希釈を決定した。マウス血清中のＭＶＦ－ＨＥＲ－２（２６６－２９６）及びＭＶＦ－ＨＥＲ－２（５９７－６２６）に対する抗体を検出するために、同じ手順を実施した。４Ｙ＋１３で、結果は、腫瘍のないマウスまたは非常に小さな腫瘍を有するマウスの抗体価は、大きな腫瘍を有するマウスよりも比較的高いＣＲマウスを示した。

【0159】

（６）腫瘍の成長及び生存
図３３は、グラフに示されたマウス群のそれぞれについて、ＢＡＬＢ／ｃマウスで示されたＤ２Ｆ２ ＷＴ腫瘍細胞の成長を示す。腫瘍体積をノギスで測定し、式（長さ×幅^２）／２で計算した。全体的な二元配置ＡＮＯＶＡを使用して、腫瘍成長の曲線全体を分析し、これは、ｐ＜０．０１の有意差を示す。マウスのペプチド免疫化群全ては、ＰＢＳ群及びｍＡｂｓ処置群よりも、少ない腫瘍負荷を有するようにも示される。２１及び２８日目に、一元配置ＡＮＯＶＡで、５群全てを試験し、ｐ値全ては、０．０１未満である。同様に、全てのペプチド治療群ＭＶＦ－ＰＤ－１（９２－１１０）及びＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１（１３０－１４７）は、ＰＢＳ陰性対照群及び両方のｍＡｂ陽性対照群よりも小さな腫瘍体積を有した。

【0160】

マウスを設計群で処置した場合、ログランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定も使用して、生存率を分析した（図３４）。ｐ＜０．００１は、処置によりマウスの生存率が大幅に改善されたことを示した。特に、ＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１（１３０－１４７）ペプチド免疫化群では、腫瘍チャレンジの４５日後も、依然として、約６０％のマウス生存率があり、これは、全ての処置群で最高である。

【0161】

図３５は、グラフに示されているように、マウス群のＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＤ２Ｆ２／Ｅ２腫瘍細胞の成長を示す。腫瘍体積をノギスで測定し、式（長さ×幅^２）／２で計算した。全体的な二元配置ＡＮＯＶＡを使用して、腫瘍成長の曲線全体を分析し、これは、ｐ＜０．０１の有意差を示す。全てのペプチド免疫化群及びｍＡｂで処置されたマウスは、ＰＢＳ群よりも少ない腫瘍負荷を有するように示される。最も重要なことに、ＭＶＦ－ＨＥＲ－２（２６６－２９６）＋ＭＶＦ－ＨＥＲ－２（５９７－６２６）；ＭＶＦ－ＰＤ－１（９２－１１０）＋ＭＶＦ－ＨＥＲ－２（２６６－２９６）＋ＭＶＦ－ＨＥＲ－２（５９７－６２６）、及びＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１（１３０－１４７）＋ＭＶＦ－ＨＥＲ－２（２６６－２９６）＋ＭＶＦ－ＨＥＲ－２（５９７－６２６）としての２ＸＨＥＲ２で免疫されたマウスは大幅な腫瘍抑制を示し、ほとんどのマウスは、腫瘍チャレンジ後２８日目の最後までに、腫瘍がなかった。

【0162】

２１及び２８日目に、一元配置ＡＮＯＶＡで、６群全てを試験し、ｐ値全ては、０．０１未満である。全てのペプチド処置群ＭＶＦ－ＨＥＲ－２（２６６－２９６）＋ＭＶＦ－ＨＥＲ－２（５９７－６２６）；ＭＶＦ－ＰＤ－１（９２－１１０）＋ＭＶＦ－ＨＥＲ－２（２６６－２９６）＋ＭＶＦ－ＨＥＲ－２（５９７－６２６）、及びＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１（１３０－１４７）＋ＭＶＦ－ＨＥＲ－２（２６６－２９６）＋ＭＶＦ－ＨＥＲ－２（５９７－６２６）は、ＰＢＳ陰性対照群及び両方のｍＡｂ陽性対照群よりもはるかに小さい腫瘍体積を有していた。ペプチド免疫化群の全てのマウスが、２１日目及び２８日目に、それぞれ、小さな腫瘍を有しており、またはほとんどのマウスは全く腫瘍がなかった。

【0163】

さらに、ログランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定を使用して、マウスを設計群で処置した場合の生存率を分析した（図３６）。ｐ＜０．００１は、処置によりマウスの生存率が大幅に改善されたことを示した。特に、ＭＶＦ－ＨＥＲ－２（２６６－２９６）＋ＭＶＦ－ＨＥＲ－２（５９７－６２６）及びＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１（１３０－１４７）＋ＭＶＦ－ＨＥＲ－２（２６６－２９６）＋ＭＶＦ－ＨＥＲ－２（５９７－６２６）ペプチド免疫化群では、腫瘍チャレンジの４５日後も、依然として、１００％のマウス生存率があり、これは、全ての処置群で最高である。マウスをＭＶＦ－ＰＤ－１（９２－１１０）＋ＭＶＦ－ＨＥＲ－２（２６６－２９６）＋ＭＶＦ－ＨＥＲ－２（５９７－６２６）及びｍＡｂ（ＰＤ－１）（２９Ｆ．１Ａ１２）で処置し、生存率が約６０％である。

【0164】

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Ｍｏｒｒｉｓｏｎ Ｃ，Ｚａｎａｇｎｏｌｏ Ｖ，Ｒａｍｉｒｅｚ Ｎｅｔ ａｌ．ＨＥＲ－２ ｉｓ ａｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｃａｎｃｅｒ：ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｏｕｔｃｏｍｅ ｉｎ ａ ｌａｒｇｅ ｃｏｈｏｒｔ ｏｆ ｓｕｒｇｉｃａｌｌｙ ｓｔａｇｅｄ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，２４（１５），２３７６－２３８５（２００６）．
Ｎａｈｔａ Ｒ，Ｙｕ Ｄ，Ｈｕｎｇ ＭＣ，Ｈｏｒｔｏｂａｇｙｉ ＧＮ，Ｅｓｔｅｖａ ＦＪ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅ：ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ＨＥＲ２－ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ Ｃｌｉｎ Ｐｒａｃｔ Ｏｎｃｏｌ，３（５），２６９－２８０（２００６）．
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Ｎｏｖｏｔｎｙ Ｊ，Ｈａｎｄｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ Ｍ，Ｈａｂｅｒ Ｅ，Ｂｒｕｃｃｏｌｅｒｉ ＲＥ，Ｃａｒｌｓｏｎ ＷＢ，Ｆａｎｎｉｎｇ ＤＷ，Ｓｍｉｔｈ ＪＡ，Ｒｏｓｅ ＧＤ．１９８６．Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｃｏｉｎｃｉｄｅ ｗｉｔｈ ｓｕｒｆａｃｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ ｔｏ ｌａｒｇｅ ｐｒｏｂｅｓ（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｏｍａｉｎｓ）．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ８３：２２６－３０
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Ｓｌａｍｏｎ ＤＪ，Ｃｌａｒｋ ＧＭ，Ｗｏｎｇ ＳＧ，Ｌｅｖｉｎ ＷＪ，Ｕｌｌｒｉｃｈ Ａ，ＭｃＧｕｉｒｅ ＷＬ．Ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｌａｐｓｅ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｗｉｔｈ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＨＥＲ－２／ｎｅｕ ｏｎｃｏｇｅｎｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５（４７８５），１７７－１８２（１９８７）．
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Ｓｕｎ ＮＹ，Ｃｈｅｎ ＹＬ，Ｗｕ ＷＹｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｃｋａｄｅ ｏｆ ＰＤ－Ｌ１ Ｅｎｈａｎｃｅｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｂｙ Ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｉｎ：Ｃａｎｃｅｒｓ（Ｂａｓｅｌ）．（２０１９）
Ｓｗａｉｎ ＳＭ，Ｋｉｍ ＳＢ，Ｃｏｒｔｅｓ Ｊｅｔ ａｌ．Ｏｖｅｒａｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ（ＯＳ）ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ＣＬＥＯＰＡＴＲＡ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｆｉｒｓｔ－ｌｉｎｅ（１Ｌ）ｐｅｒｔｕｕｍａｂ（ＰＴＺ），ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（Ｔ）ａｎｄ ｄｏｃｅｔａｘｅｌ（Ｄ）ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＨＥＲ２－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ（ＭＢＣ）．Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２５（ｓｕｐｐ＿４）（２０１４）．
Ｓｗａｉｎ ＳＭ，Ｋｉｍ ＳＢ，Ｃｏｒｔｅｓ Ｊｅｔ ａｌ．Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ，ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ，ａｎｄ ｄｏｃｅｔａｘｅｌ ｆｏｒ ＨＥＲ２－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ（ＣＬＥＯＰＡＴＲＡ ｓｔｕｄｙ）：ｏｖｅｒａｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍ ａ ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ，ｄｏｕｂｌｅ－ｂｌｉｎｄ，ｐｌａｃｅｂｏ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ，ｐｈａｓｅ ３ ｓｔｕｄｙ．Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１４（６），４６１－４７１（２０１３）．
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Ｔｏｐａｌｉａｎ ＳＬ，Ｄｒａｋｅ ＣＧ，Ｐａｒｄｏｌｌ ＤＭ．Ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｂｌｏｃｋａｄｅ：ａ ｃｏｍｍｏｎ ｄｅｎｏｍｉｎａｔｏｒ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ，２７（４），４５０－４６１（２０１５）．
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Ｗｉｅｄｕｗｉｌｔ ＭＪ，Ｍｏａｓｓｅｒ ＭＭ．Ｔｈｅ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆａｍｉｌｙ：ｂｉｏｌｏｇｙ ｄｒｉｖｉｎｇ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ，６５（１０），１５６６－１５８４（２００８）．
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Ｙａｎｏ Ｔ，Ｄｏｉ Ｔ，Ｏｈｔｓｕ Ａｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ＨＥＲ２ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｓｓｅｓｓｅｄ ｂｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ＨＥＲ２ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｓｓｅｓｓｅｄ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｉｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ．Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｐ，１５（１），６５－７１（２００６）．
Ｚａｋ ＫＭ，Ｋｉｔｅｌ Ｒ，Ｐｒｚｅｔｏｃｋａ Ｓｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｘ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｄｅａｔｈ １，ＰＤ－１，ａｎｄ Ｉｔｓ Ｌｉｇａｎｄ ＰＤ－Ｌ１．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２３（１２），２３４１－２３４８（２０１５）．

【0165】

Ｆ．配列
配列番号１のヒトＰＤ－Ｌ１残基１～２７３
ＡＦＴＶＴＶＰＫＤＬＹＶＶＥＹＧＳＮＭＴＩＥＣＫＦＰＶＥＫＱＬＤＬＡＡＬＩＶＹＷＥＭＥＤＫＮＩＩＱＦＶＨＧＥＥＤＬＫＶＱＨＳＳＹＲＱＲＡＲＬＬＫＤＱＬＳＬＧＮＡＡＬＱＩＴＤＶＫＬＱＤＡＧＶＹＲＣＭＩＳＹＧＧＡＤＹＫＲＩＴＶＫＶＮＡＰＹＮＫＩＮＱＲＩＬＶＶＤＰＶＴＳＥＨＥＬＴＣＱＡＥＧＹＰＫＡＥＶＩＷＴＳＳＤＨＱＶＬＳＧＫＴＴＴＴＮＳＫＲＥＥＫＬＦＮＶＴＳＴＬＲＩＮＴＴＴＮＥＩＦＹＣＴＦＲＲＬＤＰＥＥＮＨＴＡＥＬＶＩＰＥＬＰＬＡＨＰＰＮＥＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧＲＭＭＤＶＫＫＣＧＩＱＤＴＮＳＫＫＱＳＤＴＨＬＥＥＴ
配列番号２のＰＤ－Ｌ１（３６～５３）
ＬＩＶＹＷＥＭＥＤＫＮＩＩＱＦＶＨＧ
配列番号３のＰＤ－Ｌ１（５０～６７）
ＦＶＨＧＥＥＤＬＫＶＱＨＳＳＹＲＱＲ
配列番号４のＰＤ－Ｌ１（９５～１１２）
ＹＲＣＭＩＳＹＧＧＡＤＹＫＲＩＴＶＫ
配列番号５のＰＤ－Ｌ１（１３０～１４７）
ＶＴＳＥＨＥＬＴＣＱＡＥＧＹＰＫＡＥ
配列番号６の麻疹ウイルス融合タンパク質（ＭＶＦ）
ＫＬＬＳＬＩＫＧＶＩＶＨＲＬＥＧＶＥ
配列番号７のリンカー
ＧＰＳＬ
配列番号８のＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１（３６～５３）
ＫＬＬＳＬＩＫＧＶＩＶＨＲＬＥＧＶＥＧＰＳＬＬＩＶＹＷＥＭＥＤＫＮＩＩＱＦＶＨＧ
配列番号９のＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１（５０～６７）
ＫＬＬＳＬＩＫＧＶＩＶＨＲＬＥＧＶＥＧＰＳＬＦＶＨＧＥＥＤＬＫＶＱＨＳＳＹＲＱＲ
配列番号１０のＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１（９５～１１２）
ＫＬＬＳＬＩＫＧＶＩＶＨＲＬＥＧＶＥＧＰＳＬＹＲＣＭＩＳＹＧＧＡＤＹＫＲＩＴＶＫ
配列番号１１のＭＶＦ－ＰＤ－Ｌ１（１３０～１４７）
ＫＬＬＳＬＩＫＧＶＩＶＨＲＬＥＧＶＥＧＰＳＬＶＴＳＥＨＥＬＴＣＱＡＥＧＹＰＫＡＥ
配列番号１２のＰＤ－Ｌ１（３６～５３）Ｄペプチドレトロインバーソ
ＧＨＶＦＱＩＩＮＫＤＥＭＥＷＹＶＩＬ
配列番号１３のＰＤ－Ｌ１（５０～６７）Ｄペプチドレトロインバーソ
ＲＱＲＹＳＳＨＱＶＫＬＤＥＥＧＨＶＦ
配列番号１４のＰＤ－Ｌ１（９５～１１２）Ｄペプチドレトロインバーソ
ＫＶＴＩＲＫＹＤＡＧＧＹＳＩＭＣＲＹ
配列番号１５のＰＤ－Ｌ１（１３０～１４７）Ｄペプチドレトロインバーソ
ＥＡＫＰＹＧＥＡＱＣＴＬＥＨＥＳＴＶ
配列番号１６のＭＶＦ ＰＤ－Ｌ１（３６～５３）Ｄペプチドレトロインバーソ
ＫＬＬＳＬＩＫＧＶＩＶＨＲＬＥＧＶＥＧＰＳＬＧＨＶＦＱＩＩＮＫＤＥＭＥＷＹＶＩＬ
配列番号１７のＭＶＦ ＰＤ－Ｌ１（５０～６７）Ｄペプチドレトロインバーソ
ＫＬＬＳＬＩＫＧＶＩＶＨＲＬＥＧＶＥＧＰＳＬＲＱＲＹＳＳＨＱＶＫＬＤＥＥＧＨＶＦ
配列番号１８のＭＶＦ ＰＤ－Ｌ１（９５～１１２）Ｄペプチドレトロインバーソ
ＫＬＬＳＬＩＫＧＶＩＶＨＲＬＥＧＶＥＧＰＳＬＫＶＴＩＲＫＹＤＡＧＧＹＳＩＭＣＲＹ
配列番号１９のＭＶＦ ＰＤ－Ｌ１（１３０～１４７）Ｄペプチドレトロインバーソ
ＫＬＬＳＬＩＫＧＶＩＶＨＲＬＥＧＶＥＧＰＳＬＥＡＫＰＹＧＥＡＱＣＴＬＥＨＥＳＴＶ
配列番号２０のＴＴ
ＮＳＶＤＤＡＬＩＮＳＴＩＹＳＹＦＰＳＶ
配列番号２１のＴＴ１
ＰＧＩＮＧＫＡＩＨＬＶＮＮＱＳＳＥ
配列番号２２のＰ２
ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ
配列番号２３のＰ３０
ＦＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ
配列番号２４のＭＶＦ（天然）
ＬＳＥＩＫＧＶＩＶＨＲＬＥＧＶ
配列番号２５のＨＢＶ
ＦＦＬＬＴＲＩＬＴＩＰＱＳＬＮ
配列番号２６のＣＳＰ
ＴＣＧＶＧＶＲＶＲＳＲＶＮＡＡＮＫＫＰＥ
配列番号２７のＨＥＲ－２（２６６～２９６）
ＬＨＣＰＡＬＶＴＹＮＴＤＴＦＥＳＭＰＮＰＥＧＲＹＴＦＧＡＳＣＶ
配列番号２８のＭＶＦ ＨＥＲ－２（２６６～２９６）
ＫＬＬＳＬＩＫＧＶＩＶＨＲＬＥＧＶＥＧＰＳＬＬＨＣＰＡＬＶＴＹＮＴＤＴＦＥＳＭＰＮＰＥＧＲＹＴＦＧＡＳＣＶ
配列番号２９のＨＥＲ－２（５９７～６２６）
ＶＡＲＣＰＳＧＶＫＰＤＬＳＹＭＰＩＷＫＦＰＤＥＥＧＡＣＱＰＬ
配列番号３０のＭＶＦ ＨＥＲ－２（５９７～６２６）
ＫＬＬＳＬＩＫＧＶＩＶＨＲＬＥＧＶＥＧＰＳＬＶＡＲＣＰＳＧＶＫＰＤＬＳＹＭＰＩＷＫＦＰＤＥＥＧＡＣＱＰＬ

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図6】

【図7-1】

【図7-2】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図15D】

【図16】

【図17-1】

【図17-2】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23A】

【図23B】

【図23C】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【配列表】

2022548283000001.app

【国際調査報告】