特表 2022-548315 遺伝子編集された免疫細胞及び治療方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-11-17

(54)【発明の名称】遺伝子編集された免疫細胞及び治療方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/12 20060101AFI20221110BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20221110BHJP

   C12N 15/86 20060101ALI20221110BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20221110BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20221110BHJP

   C07K 14/47 20060101ALI20221110BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20221110BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20221110BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20221110BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20221110BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20221110BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20221110BHJP

   C12N 9/16 20060101ALN20221110BHJP

【ＦＩ】

C12N15/12

C12N5/10 ZNA

C12N15/86 Z

C12N15/13

C12N15/09 110

C07K14/47

C07K19/00

C07K16/28

C07K16/18

A61K35/12

A61P35/02

A61P35/00

C12N9/16 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022518248

(86)(22)【出願日】2020-09-23

(85)【翻訳文提出日】2022-05-20

(86)【国際出願番号】 US2020052295

(87)【国際公開番号】W WO2021061832

(87)【国際公開日】2021-04-01

(31)【優先権主張番号】62/904,299

(32)【優先日】2019-09-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/915,436

(32)【優先日】2019-10-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】305023366

【氏名又は名称】リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】ウェバー， ビュー

(72)【発明者】

【氏名】モリアリティ， ブランデン

【テーマコード（参考）】

4B050

4B065

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B050DD02

4B050DD11

4B050LL01

4B050LL10

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC20

4B065BA03

4B065CA23

4B065CA25

4B065CA44

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB64

4C087NA05

4C087ZB26

4C087ZB27

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045DA75

4H045DA76

4H045EA20

(57)【要約】

本開示は、遺伝子編集された免疫細胞、遺伝子編集された免疫細胞を生成する方法、及び治療方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、複数の哺乳動物細胞を、相同性アームと隣接する挿入配列を含むポリ核酸コンストラクトと接触させることであって、前記相同性アームが、前記複数の哺乳動物細胞のゲノム中の標的部位に隣接する配列の最大４００個の連続するヌクレオチドに相同な配列を含む、接触させることを含む。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

操作された哺乳動物細胞の集団を生成する方法であって、
（ａ）複数の哺乳動物細胞を、相同性アームと隣接する挿入配列を含むポリ核酸コンストラクトと接触させることであって、前記相同性アームのそれぞれが、前記複数の哺乳動物細胞における哺乳動物細胞のゲノム中の標的部位に隣接する配列の最大４００個の連続するヌクレオチドに相同な配列を含む、前記接触させることと；
（ｂ）前記ポリ核酸コンストラクトを切断することと；
（ｃ）前記挿入配列を前記標的部位に挿入し、それにより、操作された哺乳動物細胞の集団を生成することと、を含む、前記方法。

【請求項2】

操作された哺乳動物細胞の集団を生成する方法であって、
（ａ）複数の哺乳動物細胞を、相同性アームと隣接する挿入配列を含むポリ核酸コンストラクトと接触させることであって、前記相同性アームのそれぞれが、前記複数の哺乳動物細胞における哺乳動物細胞のゲノム中の標的部位に隣接する配列に相同な配列を含む、前記接触させることと；
（ｂ）前記ポリ核酸コンストラクトを切断することと；
（ｃ）前記挿入配列を前記標的部位に挿入することであって、前記挿入は、（ｂ）を含まない方法よりも少なくとも１０％効率的である、前記挿入することと、それにより、操作された哺乳動物細胞の集団を生成することと、を含む、前記方法。

【請求項3】

操作された哺乳動物細胞の集団を生成する方法であって、
（ａ）複数の哺乳動物細胞を、相同性アームと隣接する少なくとも１０００塩基対を含む挿入配列を含むポリ核酸コンストラクトと接触させることであって、前記相同性アームのそれぞれが、前記複数の哺乳動物細胞における哺乳動物細胞のゲノム中の標的部位に隣接する配列の最大４００個の連続するヌクレオチドに相同な配列を含む、前記接触させることと；
（ｂ）前記ポリ核酸コンストラクトを切断することと；
（ｃ）前記挿入配列を前記標的部位に挿入することであって、前記挿入は、前記複数の哺乳動物細胞を、前記標的部位に隣接する前記配列の少なくとも５００個の連続するヌクレオチドに相同な配列を含む相同性アームに隣接する挿入配列を含む別のポリ核酸コンストラクトと接触させることを含む方法よりも、少なくとも１０％効率的である、前記挿入することと、それにより、操作された哺乳動物細胞の集団を生成することと、を含む、前記方法。

【請求項4】

操作された哺乳動物細胞の集団を生成する方法であって、
（ａ）複数の哺乳動物細胞を、相同性アームと隣接する挿入配列を含むポリ核酸コンストラクトと接触させることであって、前記相同性アームのそれぞれが、前記複数の哺乳動物細胞の前記ゲノム中の標的部位に隣接する配列の最大４００個の連続するヌクレオチドに相同な配列を含む、前記接触させることと；
（ｂ）前記ポリ核酸コンストラクトを切断することと；
（ｃ）前記複数の哺乳動物細胞の前記ゲノム中の前記標的部位に第１の二本鎖切断を生成し、前記複数の哺乳動物細胞の前記ゲノム中の第２の部位に第２の二本鎖切断を生成することと；
（ｄ）前記挿入配列を前記標的部位に挿入し、それにより、操作された哺乳動物細胞の集団を生成することと、を含む、前記方法。

【請求項5】

操作された哺乳動物細胞の前記集団を増殖させることをさらに含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

前記複数の哺乳動物細胞をＤＮアーゼと接触させることをさらに含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

前記複数の哺乳動物細胞の前記ＤＮアーゼとの前記接触によって、前記接触が実行されない操作された哺乳動物細胞の同等の集団と比較して、前記挿入配列によってコードされる導入遺伝子を発現する操作された哺乳動物細胞の前記集団における細胞のパーセンテージの増加がもたらされる、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記複数の哺乳動物細胞の前記ＤＮアーゼとの前記接触によって、前記接触が実行されない操作された哺乳動物細胞の同等の集団と比較して、操作された哺乳動物細胞の前記集団における生存細胞のパーセンテージの増加がもたらされる、請求項６または７に記載の方法。

【請求項9】

前記複数の哺乳動物細胞の前記ＤＮアーゼとの前記接触によって、前記接触が実行されない操作された哺乳動物細胞の同等の集団と比較して、前記挿入配列によってコードされる導入遺伝子を発現する操作された哺乳動物細胞の前記集団における生存細胞のパーセンテージの増加がもたらされる、請求項６～８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

前記複数の哺乳動物細胞が前記ポリ核酸コンストラクトと接触してから７日後のフローサイトメトリーによる前記導入遺伝子の検出によって測定されるように、操作された哺乳動物細胞の前記集団における前記細胞の少なくとも５５％は、前記挿入配列によってコードされる導入遺伝子を発現する、請求項６～９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

前記複数の哺乳動物細胞が前記ポリ核酸コンストラクトと接触してから７日後のフローサイトメトリーによる前記導入遺伝子の検出によって測定されるように、操作された哺乳動物細胞の前記集団における細胞の少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、または９０％は、前記挿入配列によってコードされる前記導入遺伝子を発現する、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記ＤＮアーゼが、ＤＮアーゼＩ、ベンゾナーゼ、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、マングビーンヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＢＡＬ３１、ＲＮアーゼＩ、Ｓ１ヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＪ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、制限酵素、及びそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択される、請求項６～１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

前記ＤＮアーゼがＤＮアーゼＩである、請求項１１に記載の方法。

【請求項14】

前記ＤＮアーゼが、約５μｇ／ｍｌ～約１５μｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項６～１３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項15】

前記複数の哺乳動物細胞を外因性免疫刺激剤と接触させることをさらに含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項16】

前記複数の哺乳動物細胞の前記外因性免疫刺激剤との前記接触によって、前記接触が実行されない操作された哺乳動物細胞の同等の集団と比較して、前記挿入配列によってコードされる導入遺伝子を発現する操作された哺乳動物細胞の前記集団における細胞のパーセンテージの増加がもたらされる、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記複数の細胞の前記外因性免疫刺激剤との前記接触によって、前記接触が実行されない操作された哺乳動物細胞の同等の集団と比較して、操作された哺乳動物細胞の前記集団における生存細胞のパーセンテージの増加がもたらされる、請求項１５または１６に記載の方法。

【請求項18】

前記複数の細胞の前記外因性免疫刺激剤との前記接触によって、前記接触が実行されない操作された哺乳動物細胞の同等の集団と比較して、前記挿入配列によってコードされる導入遺伝子を発現する操作された哺乳動物細胞の前記集団における生存細胞のパーセンテージの増加がもたらされる、請求項１５～１７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項19】

前記複数の哺乳動物細胞が前記ポリ核酸コンストラクトと接触してから７日後のフローサイトメトリーによる前記導入遺伝子の検出によって測定されるように、操作された哺乳動物細胞の前記集団における前記細胞の少なくとも６０％は、前記挿入配列によってコードされる導入遺伝子を発現する、請求項１５～１８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項20】

前記外因性免疫刺激剤が、Ｂ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、４－１ＢＢＬ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ３ｍＡｂ、Ｓ－２－ヒドロキシグルタレート、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２８ｍＡｂ、ＣＤ１ｄ、抗ＣＤ２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－２１、ＩＬ－２、ＩＬ－７、または短縮型ＣＤ１９、である、請求項１５～１９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項21】

前記外因性免疫刺激剤が、前記複数の哺乳動物細胞の少なくとも一部の増殖を刺激するように構成される、請求項１５～２０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項22】

前記免疫刺激剤の濃度が、約５０ＩＵ／ｍｌ～約１０００ＩＵ／ｍｌである、請求項１５～２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項23】

（ａ）の前記接触が、前記外因性免疫刺激剤との前記接触の３０時間～３６時間後に起こる、請求項１５～２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項24】

（ａ）の前記接触が、前記外因性免疫刺激剤との前記接触の３６時間後に起こる、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記複数の哺乳動物細胞を、ＤＮＡ二本鎖切断修復を調節する外因性薬剤と接触させることをさらに含む、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項26】

前記複数の哺乳動物細胞の前記外因性免疫刺激剤との前記接触によって、前記接触が実行されない操作された哺乳動物細胞の同等の集団と比較して、前記挿入配列によってコードされる導入遺伝子を発現する操作された哺乳動物細胞の前記集団における細胞のパーセンテージの増加がもたらされる、請求項２３に記載の方法。

【請求項27】

前記複数の哺乳動物細胞の前記外因性免疫刺激剤との前記接触によって、前記接触が実行されない操作された哺乳動物細胞の同等の集団と比較して、操作された哺乳動物細胞の前記集団における生存細胞のパーセンテージの増加がもたらされる、請求項２３または２６に記載の方法。

【請求項28】

前記複数の細胞の前記前記外因性免疫刺激剤との前記接触によって、前記接触が実行されない操作された哺乳動物細胞の同等の集団と比較して、前記挿入配列によってコードされる導入遺伝子を発現する操作された哺乳動物細胞の前記集団における生存細胞のパーセンテージの増加がもたらされる、請求項２３～２７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項29】

前記複数の哺乳動物細胞が前記ポリ核酸コンストラクトと接触してから７日後のフローサイトメトリーによる前記導入遺伝子の検出によって測定されるように、操作された哺乳動物細胞の前記集団における前記細胞の少なくとも６０％は、前記挿入配列によってコードされる導入遺伝子を発現する、請求項２３～２８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項30】

前記薬剤が、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与するタンパク質を含む、請求項２３～２９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項31】

ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与する前記タンパク質が、Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＲＡＤ５１、ＲＳ－１、ＰＡＬＢ２、Ｎａｐ１、ｐ４００ ＡＴＰアーゼ、ＥＶＬ、ＮＡＣ、ＭＲＥ１１、ＲＡＤ５０、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５５、ＲＡＤ５７、ＲＡＤ５４、ＲＡＤ５４Ｂ、Ｓｒｓ２、ＮＢＳ１、Ｈ２ＡＸ、ＰＡＲＰ－１、ＲＡＤ１８、ＤＮＡ－ＰＫｃｓ、ＸＲＣＣ４、ＸＬＦ、Ａｒｔｅｍｉｓ、ＴｄＴ、ｐｏｌμ及びｐｏｌλ、ＡＴＭ、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ニブリン、ＣｔＩＰ、ＥＸＯ１、ＢＬＭ、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ１ｂ５５Ｋ、ならびにＳｃｒ７、からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記複数の哺乳動物細胞が、培養培地中でインビトロまたはエクスビボで培養され、前記培養培地が実質的に抗生物質を含まない、請求項１～３１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項33】

前記挿入配列が、プラスミド、ミニサークルベクター、線状化二本鎖ＤＮＡコンストラクト、またはウイルスベクターを使用して、前記複数の哺乳動物細胞に導入される、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項34】

前記導入遺伝子が、外因性受容体をコードする配列を含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項35】

前記外因性受容体が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）受容体、サイトカイン受容体、またはケモカイン受容体である、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記外因性受容体が、疾患関連抗原に対して特異性を有する免疫受容体である、請求項３４または３５に記載の方法。

【請求項37】

前記外因性受容体が、がん抗原に特異的に結合する免疫受容体である、請求項３４、３５、または３６に記載の方法。

【請求項38】

前記外因性受容体が、自己免疫抗原に特異的に結合する免疫受容体である、請求項３４または３５に記載の方法。

【請求項39】

前記外因性受容体がＴＣＲである、請求項３５～３８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項40】

前記外因性受容体がＣＡＲであり、前記ＣＡＲが、配列番号９１のポリペプチドと少なくとも６０％の同一性を含む配列によってコードされる、請求項３５～３８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項41】

前記ポリ核酸コンストラクトが、配列番号９０の少なくとも一部と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項42】

前記ポリ核酸コンストラクトが配列番号９０を含む、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

前記挿入配列が、プロモーター配列、エンハンサー配列、またはプロモーター配列とエンハンサー配列の両方を含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項44】

前記複数の哺乳動物細胞の前記ゲノム中の前記標的部位を切断することをさらに含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項45】

前記標的部位の前記切断が、エンドヌクレアーゼによる切断を含む、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

前記ポリ核酸コンストラクトの前記切断が、エンドヌクレアーゼによる切断を含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項47】

前記エンドヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼである、請求項４４または４６に記載の方法。

【請求項48】

前記エンドヌクレアーゼがＣａｓ９である、請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

（ａ）が、前記複数の哺乳動物細胞に、第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または前記第１のｇＲＮＡをコードするポリ核酸を導入することをさらに含む、請求項４５～４８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項50】

（ａ）が、前記複数の哺乳動物細胞に、第２のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または前記第２のｇＲＮＡをコードするポリ核酸を導入することをさらに含む、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

前記第１のガイドＲＮＡが前記エンドヌクレアーゼを標的にして、前記複数の哺乳動物細胞の前記ゲノムに少なくとも１つの二本鎖切断を生成する、請求項４９または５０に記載の方法。

【請求項52】

前記第１のガイドＲＮＡが、前記エンドヌクレアーゼを標的にして、前記ポリ核酸コンストラクトにおいて少なくとも１つの二本鎖切断を生成する、請求項４９～５１に記載の方法。

【請求項53】

前記第１のガイドＲＮＡが、前記エンドヌクレアーゼを標的にして、前記複数の哺乳動物細胞の前記ゲノムに少なくとも１つの二本鎖切断及び前記ポリ核酸コンストラクトに少なくとも１つの二本鎖切断を生成する、請求項４９～５２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項54】

前記複数の哺乳動物細胞の前記ゲノムにおける前記二本鎖切断が、セーフハーバー遺伝子座に導入される、請求項５１～５３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項55】

前記複数の哺乳動物細胞の前記ゲノムにおける前記二本鎖切断が、免疫調節遺伝子座に導入される、請求項５１～５３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項56】

前記複数の哺乳動物細胞の前記ゲノムにおける前記二本鎖切断が、免疫チェックポイント遺伝子座に導入される、請求項５１～５３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項57】

前記複数の哺乳動物細胞の前記ゲノムにおける前記二本鎖切断が、受容体をコードする遺伝子に導入される、請求項５１～５３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項58】

前記複数の哺乳動物細胞の前記ゲノムにおける前記二本鎖切断が、Ｔ細胞受容体成分をコードする遺伝子に導入される、請求項５１～５３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項59】

前記複数の哺乳動物細胞の前記ゲノムにおける前記二本鎖切断が、Ｔ細胞受容体アルファ定常部（ＴＲＡＣ）またはＴ細胞受容体ベータ遺伝子座（ＴＣＲＢ）遺伝子座に導入される、請求項５８に記載の方法。

【請求項60】

前記ＴＲＡＣまたは前記ＴＣＲＢ遺伝子座によってコードされる前記内因性タンパク質の発現が破壊される、請求項５９に記載の方法。

【請求項61】

前記複数の哺乳動物細胞の前記ゲノムにおける前記二本鎖切断が、前記ＴＲＡＣ遺伝子座に導入される、請求項５９～６０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項62】

前記複数の哺乳動物細胞の前記ゲノムにおける前記二本鎖切断が、前記ＴＲＡＣ遺伝子座のエクソン１に導入される、請求項５９～６１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項63】

前記複数の哺乳動物細胞の前記ゲノムにおける前記二本鎖切断が、前記エクソン１に導入され、配列番号８０の少なくとも一部を含む、請求項６２に記載の方法。

【請求項64】

前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項65】

前記哺乳動物細胞が初代細胞である、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項66】

前記哺乳動物細胞が免疫細胞である、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項67】

前記免疫細胞が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、または好中球である、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項68】

前記複数の哺乳動物細胞が、ヒトＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、または好中球を含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項69】

前記複数の哺乳動物細胞がヒトＴ細胞を含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項70】

（ｃ）が、前記ポリ核酸コンストラクトにおいて２つの二本鎖切断を生成することを含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項71】

（ｂ）が、前記複数の哺乳動物細胞の前記ゲノムに２つの二本鎖切断を生成することを含み、前記挿入配列が、前記複数の哺乳動物細胞の前記ゲノムに挿入され、前記複数の哺乳類細胞の前記ゲノムにおける前記２つの二本鎖切断を架橋する、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項72】

少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドを前記哺乳動物細胞ゲノムから欠失させる、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項73】

前記相同性アームのそれぞれが、３または４の倍数である複数のヌクレオチドを含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項74】

前記相同性アームのそれぞれが、５～１００塩基対を含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項75】

前記相同性アームが、挿入のための配列に隣接する、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項76】

前記相同性アームの少なくとも１つが、ガイドＲＮＡによって標的化される配列に隣接している、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項77】

前記相同性アームが同一の配列を含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項78】

前記相同性アームが異なる配列を含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項79】

前記相同性アームが挿入のための配列に隣接する、請求項７７に記載の方法。

【請求項80】

前記相同性アームが、ＴＲＡＣまたはＴＣＲＢ遺伝子座の配列に相同な配列を含む、請求項７７に記載の方法。

【請求項81】

前記相同性アームが、長さ３０～７０、３５～６５、４０～６０、４５～５５、４５～５０、６０～８０、６０～１００、５０～２００、１００～４００、２００～６００、または５００～１０００塩基に相同な配列を含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項82】

前記相同性アームが、長さ４８塩基に相同な配列を含む、請求項８０に記載の方法。

【請求項83】

前記哺乳動物細胞ゲノム中の１つ以上の追加の遺伝子を破壊することをさらに含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項84】

（ａ）において挿入するための配列を含む１つ以上の追加のポリ核酸コンストラクトを導入すること、（ｂ）において前記哺乳動物細胞ゲノムの追加の部位に二本鎖切断を生成すること、（ｃ）において前記１つ以上の追加のポリ核酸コンストラクトに二本鎖切断を生成すること、及び前記哺乳動物細胞ゲノムの前記追加の部位に挿入するための１つ以上の追加の配列を挿入することをさらに含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項85】

前記第１のｇＲＮＡ及び前記第２のガイドＲＮＡが、配列番号７９または配列番号８２の少なくとも一部と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を含む配列を含む、請求項５０～８４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項86】

操作されたＴ細胞を作製する方法であって、
（ａ）ヒト対象からの初代Ｔ細胞を提供することと；
（ｂ）エクスビボで、前記初代Ｔ細胞に、
（ｉ）ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリ核酸、であって、前記ヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼである、前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードする前記ポリ核酸と；
（ｉｉ）第１のガイドＲＮＡまたは前記第１のガイドＲＮＡをコードするポリ核酸、であって、前記第１のガイドＲＮＡは、前記初代Ｔ細胞のＴＲＡＣまたはＴＣＲＢ遺伝子座の配列を標的とする、前記第１のガイドＲＮＡまたは前記第１のガイドＲＮＡをコードする前記ポリ核酸と；
（ｉｉｉ）第２のガイドＲＮＡまたは前記第２のガイドＲＮＡをコードするポリ核酸と；
（ｉｖ）挿入のための配列を含むポリ核酸コンストラクトであって、挿入のための前記配列は、外因性Ｔ細胞受容体またはキメラ抗原受容体をコードする配列を含み、前記ポリ核酸コンストラクトは、挿入のための前記配列に隣接する第１の短い相同性アーム及び第２の短い相同性アームを含み、前記第１の短い相同性アーム及び前記第２の短い相同性アームは、前記初代Ｔ細胞の前記ＴＲＡＣまたは前記ＴＣＲＢ遺伝子座の配列に相同な配列を含み、前記第１の短い相同性アームは５０塩基対未満であり、前記第２の短い相同性アームは５０塩基対未満であり、前記第１の短い相同性アーム及び前記第２の短い相同性アームは、前記第２のガイドＲＮＡによって標的とされる配列に隣接している、前記ポリ核酸コンストラクトと、を導入することと；
（ｃ）前記初代Ｔ細胞の前記ゲノムの前記ＴＲＡＣまたは前記ＴＣＲＢ遺伝子座に二本鎖切断を生成することであって、前記ＴＲＡＣまたは前記ＴＣＲＢ遺伝子座の二本鎖切断が、前記ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ及び前記第１のガイドＲＮＡによって生成され、前記二本鎖切断は、前記第１の短い相同性アームに相同な第１の配列と、前記第２の短い相同性アームに相同な第２の配列との間にある、前記二本鎖切断を前記生成することと、
（ｄ）前記ポリ核酸コンストラクトに２つの二本鎖切断を生成し、それによって切断されたポリ核酸コンストラクトを生成することであって、前記切断されたポリ核酸コンストラクトは、第１の末端に前記第１の短い相同性アームを含み、第２の末端に前記第２の短い相同性アームを含み、前記２つの二本鎖切断は前記ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ及び前記第２のガイドＲＮＡによって生成される、前記２つの二本鎖切断を前記生成し、それによって切断された前記ポリ核酸コンストラクトを前記生成することと；
（ｅ）前記外因性Ｔ細胞受容体をコードする前記配列を、相同性媒介末端結合により、前記初代Ｔ細胞ゲノムの前記ＴＲＡＣまたは前記ＴＣＲＢ遺伝子座の前記二本鎖切断部位に挿入することと、を含む、前記方法。

【請求項87】

（ｂ）の前記導入が、外因性免疫刺激剤との接触から３０時間～３６時間後に起こる、請求項８６に記載の方法。

【請求項88】

（ｂ）の前記導入が、前記外因性免疫刺激剤との前記接触から３６時間後に起こる、請求項８７に記載の方法。

【請求項89】

前記外因性免疫刺激剤が、Ｂ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、４－１ＢＢＬ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ３ｍＡｂ、Ｓ－２－ヒドロキシグルタレート、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２８ｍＡｂ、ＣＤ１ｄ、抗ＣＤ２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－２１、ＩＬ－２、ＩＬ－７、または短縮型ＣＤ１９、である、請求項８７～８８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項90】

がんの治療を必要とする対象におけるがんを治療する方法であって、請求項１～８９のいずれか１項に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。

【請求項91】

前記がんが、膀胱癌、上皮癌、骨癌、脳腫瘍、乳癌、食道癌、胃腸癌、白血病、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、骨髄腫、卵巣癌、前立腺癌、肉腫、胃癌、甲状腺癌、急性リンパ球性癌、急性骨髄性白血病、胞巣状横紋筋肉腫、肛門管、直腸癌、眼癌、頸部癌、胆嚢癌、胸膜癌、口腔癌、外陰癌、結腸癌、子宮頸癌、線維肉腫、消化管カルチノイド腫瘍、ホジキンリンパ腫、腎臓癌、中皮腫、肥満細胞腫、黒色腫、多発性骨髄腫、鼻咽頭癌、非ホジキンリンパ腫、膵臓癌、腹膜癌、腎癌、皮膚癌、小腸癌、軟組織癌、固形腫瘍、胃癌、精巣癌、または甲状腺癌、である、請求項９０に記載の方法。

【請求項92】

前記がんが、胃腸癌、乳癌、リンパ腫、または前立腺癌である、請求項９１に記載の方法。

【請求項93】

請求項１～８８のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物細胞の前記集団が、前記対象に対して同種異系または自家である、請求項９０～９２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項94】

哺乳動物細胞であって、
（ａ）相同性アームに隣接する外因性配列を含むポリ核酸コンストラクトであって、前記相同性アームのそれぞれが、前記哺乳動物細胞のゲノム中の標的部位に隣接する配列の最大４００個の連続するヌクレオチドに相同な配列を含み、前記ポリ核酸は切断されており、切除された末端を含む、前記ポリ核酸コンストラクトと；
（ｂ）前記哺乳動物細胞の前記ゲノム中の二本鎖切断であって、前記二本鎖切断によって露出された少なくとも一方の末端が切除される、前記二本鎖切断と、を含む、前記哺乳動物細胞。

【請求項95】

哺乳動物細胞であって、
（ａ）相同性アームに隣接する少なくとも１０００塩基対の挿入配列を含むポリ核酸コンストラクトであって、前記相同性アームは、前記哺乳動物細胞のゲノム中の標的部位に隣接する配列の最大４００個の連続するヌクレオチドに相同な配列を含む、前記ポリ核酸コンストラクトと；
（ｂ）前記哺乳動物細胞の前記ゲノム中の二本鎖切断であって、前記二本鎖切断によって露出された少なくとも一方の末端が切除される、前記二本鎖切断と、を含む、前記哺乳動物細胞。

【請求項96】

前記相同性アームが、長さ３０～７０、３５～６５、４０～６０、４５～５５、または４５～５０塩基に相同な配列を含む、請求項９４または９５に記載の哺乳動物細胞。

【請求項97】

前記相同性アームが、長さ４８塩基に相同な配列を含む、請求項９６に記載の哺乳動物細胞。

【請求項98】

前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項９４～９７のいずれか１項に記載の哺乳動物細胞。

【請求項99】

前記哺乳動物細胞が初代細胞である、請求項９４～９８のいずれか１項に記載の哺乳動物細胞。

【請求項100】

前記哺乳動物細胞が免疫細胞である、請求項９４～９９のいずれか１項に記載の哺乳動物細胞。

【請求項101】

前記免疫細胞が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、マクロファージ、樹状細胞、または好中球である、請求項１００に記載の哺乳動物細胞。

【請求項102】

前記免疫細胞がＴ細胞である、請求項１０１に記載の細胞。

【請求項103】

請求項１～８９のいずれかに１項に記載の方法によって作製された哺乳動物細胞。

【請求項104】

請求項１～８９のいずれかに１項に記載の方法によって作製された哺乳動物細胞の集団。

【請求項105】

請求項１～８９のいずれか１項に記載の方法によって作製された哺乳動物細胞を含む医薬組成物。

【請求項106】

請求項１～８９のいずれかに１項に記載の方法によって作製された哺乳動物細胞の集団を含む医薬組成物。

【請求項107】

ＢＬＡＳＴによって決定される配列番号８１または配列番号８４の少なくとも一部と、少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を含む配列を含む操作されたポリヌクレオチド。

【請求項108】

ＢＬＡＳＴによって決定される配列番号７９または配列番号８２の少なくとも一部と、少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を含む操作されたポリヌクレオチド。

【請求項109】

請求項１０７～１０８のいずれか１項に記載の操作されたポリヌクレオチドを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）。

【請求項110】

エンドヌクレアーゼをさらに含み、前記エンドヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを含む、請求項１０９に記載のＲＮＰ。

【請求項111】

請求項１０７～１０８のいずれか１項に記載の操作されたポリヌクレオチドまたは請求項１０９～１１０に記載のＲＮＰを含む細胞。

【請求項112】

請求項１１１に記載の細胞を含む細胞の集団。

【請求項113】

請求項１０７～１０８のいずれか１項に記載の操作されたポリヌクレオチド、及び／または請求項１０９～１１０のいずれか１項に記載のリボヌクレオタンパク質を容器に含むキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

相互参照
本出願は、２０１９年９月２３日出願の米国特許仮出願第６２／９０４，２９９号及び２０１９年１０月１５日出願の６２／９１５，４３６に対する優先権の利益を主張し、これらのそれぞれは、あらゆる目的のために参照により本明細書に完全に組み込まれる。

【0002】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２０年９月２３日に作成の前記ＡＳＣＩＩコピーは、４７５３３７４８６０１＿ＳＬ．ｔｘｔと称され、サイズは５，３４１，５６４バイトである。

【背景技術】

【0003】

遺伝子編集された免疫細胞は、がん、自己免疫障害、炎症性障害、及び感染症など、さまざまな疾患の潜在的な治療法として大きな期待が寄せられている。この可能性を実現するには、細胞の生存能力を維持しながら、免疫細胞ゲノムに所望の改変を効率的に導入するための技術が必要である。
参照による組み込み

【0004】

本出願で引用された各特許、刊行物、及び非特許文献は、それぞれが参照により個別に組み込まれたかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

一態様では、本明細書で提供されるのは、操作された哺乳動物細胞の集団を生成する方法であって、（ａ）複数の哺乳動物細胞を、相同性アームと隣接する挿入配列を含むポリ核酸コンストラクトと接触させることであって、前記相同性アームのそれぞれが、前記複数の哺乳動物細胞のゲノム中の標的部位に隣接する配列の最大４００個の連続するヌクレオチドに相同な配列を含む、接触させることと；（ｂ）前記ポリ核酸コンストラクトを切断することと；（ｃ）前記挿入配列を前記標的部位に挿入し、それにより、操作された哺乳動物細胞の集団を生成することと、を含む、方法である。

【0006】

いくつかの実施形態では、この方法は、遺伝子操作された哺乳動物細胞の前記集団を増殖させることをさらに含む。

【0007】

いくつかの実施形態では、この方法は、前記複数の哺乳動物細胞をＤＮアーゼと接触させることをさらに含む。

【0008】

いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞の前記ＤＮアーゼとの前記接触によって、前記接触が実行されない操作された哺乳動物細胞の同等の集団と比較して、前記挿入配列によってコードされる導入遺伝子を発現する操作された哺乳動物細胞の前記集団における細胞のパーセンテージの増加がもたらされる。

【0009】

いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞の前記ＤＮアーゼとの前記接触によって、前記接触が実行されない操作された哺乳動物細胞の同等の集団と比較して、操作された哺乳動物細胞の前記集団における生存細胞のパーセンテージの増加がもたらされる。

【0010】

いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞の前記ＤＮアーゼとの前記接触によって、前記接触が実行されない操作された哺乳動物細胞の同等の集団と比較して、前記挿入配列によってコードされる導入遺伝子を発現する操作された哺乳動物細胞の前記集団における生存細胞のパーセンテージの増加がもたらされる。

【0011】

いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞が前記ポリ核酸コンストラクトと接触してから７日後のフローサイトメトリーによる前記導入遺伝子の検出によって測定されるように、操作された哺乳動物細胞の前記集団における細胞の少なくとも６０％は、前記挿入配列によってコードされる導入遺伝子を発現する。

【0012】

いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、ＤＮアーゼＩ、ベンゾナーゼ、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、マングビーンヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＢＡＬ３１、ＲＮアーゼＩ、Ｓ１ヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＪ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、制限酵素、及びそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼはＤＮアーゼＩである。いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、約５μｇ／ｍｌ～約１５μｇ／ｍｌの濃度で存在する。

【0013】

いくつかの実施形態では、この方法は、前記複数の哺乳動物細胞を外因性免疫刺激剤と接触させることをさらに含む。

【0014】

いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞の前記外因性免疫刺激剤との前記接触によって、前記接触が実行されない操作された哺乳動物細胞の同等の集団と比較して、前記挿入配列によってコードされる導入遺伝子を発現する操作された哺乳動物細胞の前記集団における細胞のパーセンテージの増加がもたらされる。

【0015】

いくつかの実施形態では、前記複数の細胞の前記外因性免疫刺激剤との前記接触によって、前記接触が実行されない操作された哺乳動物細胞の同等の集団と比較して、操作された哺乳動物細胞の前記集団における生存細胞のパーセンテージの増加がもたらされる。

【0016】

いくつかの実施形態では、前記複数の細胞の前記外因性免疫刺激剤との前記接触によって、前記接触が実行されない操作された哺乳動物細胞の同等の集団と比較して、前記挿入配列によってコードされる導入遺伝子を発現する操作された哺乳動物細胞の前記集団における生存細胞のパーセンテージの増加がもたらされる。

【0017】

いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞が前記ポリ核酸コンストラクトと接触してから７日後のフローサイトメトリーによる導入遺伝子の検出によって測定されるように、操作された哺乳動物細胞の前記集団における細胞の少なくとも６０％は、前記挿入配列によってコードされる前記導入遺伝子を発現する。

【0018】

いくつかの実施形態では、前記外因性免疫刺激剤は、Ｂ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、４－１ＢＢＬ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ３ｍＡｂ、Ｓ－２－ヒドロキシグルタレート、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２８ｍＡｂ、ＣＤ１ｄ、抗ＣＤ２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－２１、ＩＬ－２、ＩＬ－７、または短縮型ＣＤ１９、である。

【0019】

いくつかの実施形態では、前記外因性免疫刺激剤は、前記複数の哺乳動物細胞の少なくとも一部の増殖を刺激するように構成される。いくつかの実施形態では、前記免疫刺激剤の濃度は、約５０ＩＵ／ｍｌ～約１０００ＩＵ／ｍｌである。

【0020】

いくつかの実施形態では、この方法は、前記複数の哺乳動物細胞を、ＤＮＡ二本鎖切断修復を調節する外因性薬剤と接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞の前記外因性免疫刺激剤との前記接触によって、前記接触が実行されない操作された哺乳動物細胞の同等の集団と比較して、前記挿入配列によってコードされる導入遺伝子を発現する操作された哺乳動物細胞の前記集団における細胞のパーセンテージの増加がもたらされる。いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞の前記外因性免疫刺激剤との前記接触によって、前記接触が実行されない操作された哺乳動物細胞の同等の集団と比較して、操作された哺乳動物細胞の前記集団における生存細胞のパーセンテージの増加がもたらされる。いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞の前記外因性免疫刺激剤との前記接触によって、前記接触が実行されない操作された哺乳動物細胞の同等の集団と比較して、前記挿入配列によってコードされる導入遺伝子を発現する操作された哺乳動物細胞の前記集団における生存細胞のパーセンテージの増加がもたらされる。いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞が前記ポリ核酸コンストラクトと接触してから７日後のフローサイトメトリーによる前記導入遺伝子の検出によって測定されるように、操作された哺乳動物細胞の前記集団における細胞の少なくとも６０％は、前記挿入配列によってコードされる導入遺伝子を発現する。

【0021】

いくつかの実施形態では、前記薬剤は、ＮＡＣまたは抗ＩＦＮＡＲ２抗体を含む。いくつかの実施形態では、前記薬剤は、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与するタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与する前記タンパク質は、Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＲＡＤ５１、ＲＳ－１、ＰＡＬＢ２、Ｎａｐ１、ｐ４００ ＡＴＰアーゼ、ＥＶＬ、ＮＡＣ、ＭＲＥ１１、ＲＡＤ５０、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５５、ＲＡＤ５７、ＲＡＤ５４、ＲＡＤ５４Ｂ、Ｓｒｓ２、ＮＢＳ１、Ｈ２ＡＸ、ＰＡＲＰ－１、ＲＡＤ１８、ＤＮＡ－ＰＫｃｓ、ＸＲＣＣ４、ＸＬＦ、Ａｒｔｅｍｉｓ、ＴｄＴ、ｐｏｌμ及びｐｏｌλ、ＡＴＭ、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ニブリン、ＣｔＩＰ、ＥＸＯ１、ＢＬＭ、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ１ｂ５５Ｋ、ならびにＳｃｒ７、からなる群から選択される。

【0022】

いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞は、培養培地においてインビトロまたはエクスビボで培養され、ここで、前記培養培地は、実質的に抗生物質を含まない。

【0023】

いくつかの実施形態では、前記挿入配列は、プラスミド、ミニサークルベクター、線状化二本鎖ＤＮＡコンストラクト、またはウイルスベクターを使用して、前記複数の哺乳動物細胞に導入される。

【0024】

いくつかの実施形態では、前記挿入配列は、外因性受容体をコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、前記外因性受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）受容体、サイトカイン受容体、またはケモカイン受容体である。いくつかの実施形態では、前記外因性受容体は、疾患関連抗原に対して特異性を有する免疫受容体である。いくつかの実施形態では、前記外因性受容体は、がん抗原に特異的に結合する免疫受容体である。いくつかの実施形態では、前記外因性受容体は、自己免疫抗原に特異的に結合する免疫受容体である。

【0025】

いくつかの実施形態では、前記挿入配列は、プロモーター配列、エンハンサー配列、またはプロモーター配列とエンハンサー配列の両方を含む。

【0026】

いくつかの実施形態では、前記方法は、前記複数の哺乳動物細胞のゲノム中の前記標的部位を切断することをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記標的部位の前記切断は、エンドヌクレアーゼによる切断を含む。いくつかの実施形態では、前記ポリ核酸コンストラクトの前記切断は、エンドヌクレアーゼによる切断を含む。いくつかの実施形態では、前記エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、前記エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、（ａ）は、前記複数の哺乳動物細胞に、第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または前記第１のｇＲＮＡをコードするポリ核酸を導入することをさらに含む。いくつかの実施形態では、（ａ）は、前記複数の哺乳動物細胞に、第２のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または前記第２のｇＲＮＡをコードするポリ核酸を導入することをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記第１のガイドＲＮＡは、前記エンドヌクレアーゼを標的にして、前記複数の哺乳動物細胞のゲノムにおいて少なくとも１つの二本鎖切断を生成する。いくつかの実施形態では、前記第１のガイドＲＮＡは、前記エンドヌクレアーゼを標的にして、ポリ核酸コンストラクトにおいて少なくとも１つの二本鎖切断を生成する。

【0027】

いくつかの態様では、第１のｇＲＮＡ及び第２のガイドＲＮＡは、配列番号７９または配列番号８２の少なくとも一部と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を含む配列を含む。場合によっては、第１のｇＲＮＡは内因性遺伝子（表１から選択したもの、免疫チェックポイント、及び／またはセーフハーバー遺伝子など）に結合することができ、第２のｇＲＮＡは異種配列または合成配列に結合することができる（本明細書で提供されるユニバーサルｇＲＮＡの標的指向性配列など）。

【0028】

いくつかの実施形態では、前記第１のガイドＲＮＡは、前記エンドヌクレアーゼを標的にして、前記複数の哺乳動物細胞のゲノムに少なくとも１つの二本鎖切断及び前記ポリ核酸コンストラクトに少なくとも１つの二本鎖切断を生成する。いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞のゲノムにおける前記二本鎖切断は、セーフハーバー遺伝子座に導入される。いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞のゲノムにおける前記二本鎖切断は、免疫調節遺伝子座に導入される。いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞のゲノムにおける前記二本鎖切断は、免疫チェックポイント遺伝子座に導入される。いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞のゲノムにおける前記二本鎖切断は、受容体をコードする遺伝子に導入される。いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞のゲノムにおける前記二本鎖切断は、Ｔ細胞受容体成分をコードする遺伝子に導入される。いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞のゲノムにおける前記二本鎖切断は、ＴＲＡＣまたはＴＣＲＢ遺伝子座に導入される。

【0029】

いくつかの実施形態では、前記ＴＲＡＣまたはＴＣＲＢ遺伝子座によってコードされる前記内因性タンパク質の発現は破壊される。

【0030】

いくつかの実施形態では、前記哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、前記哺乳動物細胞は、初代細胞である。いくつかの実施形態では、前記哺乳動物細胞は、免疫細胞である。いくつかの実施形態では、前記免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、または好中球である。いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞は、ヒトＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、または好中球を含む。いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞は、ヒトＴ細胞を含む。

【0031】

いくつかの実施形態では、（ｃ）は、前記ポリ核酸コンストラクトにおいて２つの二本鎖切断を生成することを含む。

【0032】

いくつかの実施形態では、（ｂ）は、前記複数の哺乳動物細胞のゲノムに２つの二本鎖切断を生成することを含み、前記挿入配列は、前記複数の哺乳動物細胞のゲノムに挿入され、前記複数の哺乳類細胞のゲノムにおける前記２つの二本鎖切断を架橋する。

【0033】

いくつかの実施形態では、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドを、哺乳動物細胞ゲノムから欠失させる。

【0034】

いくつかの実施形態では、前記相同性アームは、３または４の倍数である複数のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、前記相同性アームは、最大５～１００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、前記相同性アームは、最大５０塩基対を含む。いくつかの実施形態では、前記相同性アームは、挿入のための配列に隣接する。いくつかの実施形態では、前記相同性アームは、ガイドＲＮＡによって標的化される配列に隣接している。いくつかの実施形態では、前記相同性アームは異なっているかまたは同一である。場合によっては、相同性アームは異なっている。場合によっては、相同性アームは同一である。場合によっては、前記相同性アームの少なくとも１つは、ガイドＲＮＡによって標的化される配列に隣接している。場合によっては、両方の相同性アームが、ガイドＲＮＡによって標的化される配列に隣接している。いくつかの実施形態では、前記相同性アームは、挿入のための配列に隣接する。いくつかの実施形態では、相同性アームは、ＴＲＡＣまたはＴＣＲＢ遺伝子座の配列に相同な配列を含む。

【0035】

場合によっては、相同性アームは、長さ３０～７０、３５～６５、４０～６０、４５～５５、４５～５０、６０～８０、６０～１００、５０～２００、１００～４００、２００～６００、または５００～１０００塩基に相同な配列を含むことができる。場合によっては、相同性アームは、長さ４８塩基に相同な配列を含む。場合によっては、配列は、例えば表１の内因性遺伝子配列、免疫チェックポイント配列、及び／またはセーフハーバー配列である。

【0036】

いくつかの実施形態では、この方法は、哺乳動物細胞ゲノム中の１つ以上の追加の遺伝子を破壊することをさらに含む。

【0037】

いくつかの実施形態では、この方法は、（ａ）に挿入するための配列を含む１つ以上の追加のポリ核酸コンストラクトを導入すること、（ｂ）の哺乳動物細胞ゲノムの追加の部位に二本鎖切断を生成すること、（ｃ）の１つ以上の追加のポリ核酸コンストラクトに二本鎖切断を生成すること、及び哺乳動物細胞ゲノムの追加の部位に挿入するための１つ以上の追加の配列を挿入することをさらに含む。

【0038】

一態様では、本明細書で提供されるのは、操作された哺乳動物細胞の集団を生成する方法であって、（ａ）複数の哺乳動物細胞を、相同性アームと隣接する挿入配列を含むポリ核酸コンストラクトと接触させることであって、前記相同性アームが、前記複数の哺乳動物細胞のゲノム中の標的部位に隣接する配列に相同な配列を含む、接触させることと；（ｂ）前記ポリ核酸コンストラクトを切断することと；（ｃ）前記挿入配列を前記標的部位に挿入することであって、前記挿入は、（ｂ）を含まない方法よりも少なくとも１０％効率的である、挿入することと、それにより、操作された哺乳動物細胞の集団を生成することと、を含む、方法である。

【0039】

いくつかの実施形態では、この方法は、遺伝子操作された哺乳動物細胞の前記集団を増殖させることをさらに含む。

【0040】

いくつかの実施形態では、この方法は、前記複数の哺乳動物細胞をＤＮアーゼと接触させることをさらに含む。

【0041】

いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞の前記ＤＮアーゼとの前記接触によって、前記接触が実行されない操作された哺乳動物細胞の同等の集団と比較して、前記挿入配列によってコードされる導入遺伝子を発現する操作された哺乳動物細胞の前記集団における細胞のパーセンテージの増加がもたらされる。

【0042】

いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞の前記ＤＮアーゼとの前記接触によって、前記接触が実行されない操作された哺乳動物細胞の同等の集団と比較して、操作された哺乳動物細胞の前記集団における生存細胞のパーセンテージの増加がもたらされる。

【0043】

いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞の前記ＤＮアーゼとの前記接触によって、前記接触が実行されない操作された哺乳動物細胞の同等の集団と比較して、前記挿入配列によってコードされる導入遺伝子を発現する操作された哺乳動物細胞の前記集団における生存細胞のパーセンテージの増加がもたらされる。

【0044】

いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞が前記ポリ核酸コンストラクトと接触してから７日後のフローサイトメトリーによる前記導入遺伝子の検出によって測定されるように、操作された哺乳動物細胞の前記集団における細胞の少なくとも６０％は、前記挿入配列によってコードされる導入遺伝子を発現する。

【0045】

いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞が前記ポリ核酸コンストラクトと接触してから７日後のフローサイトメトリーによる前記導入遺伝子の検出によって測定されるように、操作された哺乳動物細胞の前記集団における細胞の少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、または９０％は、前記挿入配列によってコードされる前記導入遺伝子を発現する。

【0046】

いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、ＤＮアーゼＩ、ベンゾナーゼ、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、マングビーンヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＢＡＬ３１、ＲＮアーゼＩ、Ｓ１ヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＪ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、制限酵素、及びそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼはＤＮアーゼＩである。いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、約５μｇ／ｍｌ～約１５μｇ／ｍｌの濃度で存在する。

【0047】

いくつかの実施形態では、この方法は、前記複数の哺乳動物細胞を外因性免疫刺激剤と接触させることをさらに含む。

【0048】

いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞の前記外因性免疫刺激剤との前記接触によって、前記接触が実行されない操作された哺乳動物細胞の同等の集団と比較して、前記挿入配列によってコードされる導入遺伝子を発現する操作された哺乳動物細胞の前記集団における細胞のパーセンテージの増加がもたらされる。

【0049】

いくつかの実施形態では、前記複数の細胞の前記外因性免疫刺激剤との前記接触によって、前記接触が実行されない操作された哺乳動物細胞の同等の集団と比較して、操作された哺乳動物細胞の前記集団における生存細胞のパーセンテージの増加がもたらされる。

【0050】

いくつかの実施形態では、前記複数の細胞の前記外因性免疫刺激剤との前記接触によって、前記接触が実行されない操作された哺乳動物細胞の同等の集団と比較して、前記挿入配列によってコードされる導入遺伝子を発現する操作された哺乳動物細胞の前記集団における生存細胞のパーセンテージの増加がもたらされる。

【0051】

いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞が前記ポリ核酸コンストラクトと接触してから７日後のフローサイトメトリーによる前記導入遺伝子の検出によって測定されるように、操作された哺乳動物細胞の前記集団における細胞の少なくとも６０％は、前記挿入配列によってコードされる導入遺伝子を発現する。

【0052】

いくつかの実施形態では、前記外因性免疫刺激剤は、Ｂ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、４－１ＢＢＬ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ３ｍＡｂ、Ｓ－２－ヒドロキシグルタレート、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２８ｍＡｂ、ＣＤ１ｄ、抗ＣＤ２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－２１、ＩＬ－２、ＩＬ－７、または短縮型ＣＤ１９、である。

【0053】

いくつかの実施形態では、前記外因性免疫刺激剤は、前記複数の哺乳動物細胞の少なくとも一部の増殖を刺激するように構成される。いくつかの実施形態では、前記免疫刺激剤の濃度は、約５０ＩＵ／ｍｌ～約１０００ＩＵ／ｍｌである。

【0054】

いくつかの実施形態では、相同性アームに隣接する挿入配列を含むポリ核酸コンストラクトとの複数の哺乳動物細胞の接触は、前記外因性免疫刺激剤との前記接触後３０時間～３６時間で起こる。いくつかの実施形態では、相同性アームに隣接する挿入配列を含むポリ核酸コンストラクトとの複数の哺乳動物細胞の接触は、前記外因性免疫刺激剤との前記接触後３６時間で起こる。

【0055】

いくつかの実施形態では、この方法は、前記複数の哺乳動物細胞を、ＤＮＡ二本鎖切断修復を調節する外因性薬剤と接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞の前記外因性免疫刺激剤との前記接触によって、前記接触が実行されない操作された哺乳動物細胞の同等の集団と比較して、前記挿入配列によってコードされる導入遺伝子を発現する操作された哺乳動物細胞の前記集団における細胞のパーセンテージの増加がもたらされる。いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞の前記外因性免疫刺激剤との前記接触によって、前記接触が実行されない操作された哺乳動物細胞の同等の集団と比較して、操作された哺乳動物細胞の前記集団における生存細胞のパーセンテージの増加がもたらされる。いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞の前記外因性免疫刺激剤との前記接触によって、前記接触が実行されない操作された哺乳動物細胞の同等の集団と比較して、前記挿入配列によってコードされる導入遺伝子を発現する操作された哺乳動物細胞の前記集団における生存細胞のパーセンテージの増加がもたらされる。いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞が前記ポリ核酸コンストラクトと接触してから７日後のフローサイトメトリーによる前記導入遺伝子の検出によって測定されるように、操作された哺乳動物細胞の前記集団における細胞の少なくとも６０％は、前記挿入配列によってコードされる導入遺伝子を発現する。

【0056】

いくつかの実施形態では、前記薬剤は、ＮＡＣまたは抗ＩＦＮＡＲ２抗体を含む。いくつかの実施形態では、前記薬剤は、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与するタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与する前記タンパク質は、Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＲＡＤ５１、ＲＳ－１、ＰＡＬＢ２、Ｎａｐ１、ｐ４００ ＡＴＰアーゼ、ＥＶＬ、ＮＡＣ、ＭＲＥ１１、ＲＡＤ５０、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５５、ＲＡＤ５７、ＲＡＤ５４、ＲＡＤ５４Ｂ、Ｓｒｓ２、ＮＢＳ１、Ｈ２ＡＸ、ＰＡＲＰ－１、ＲＡＤ１８、ＤＮＡ－ＰＫｃｓ、ＸＲＣＣ４、ＸＬＦ、Ａｒｔｅｍｉｓ、ＴｄＴ、ｐｏｌμ及びｐｏｌλ、ＡＴＭ、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ニブリン、ＣｔＩＰ、ＥＸＯ１、ＢＬＭ、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ１ｂ５５Ｋ、ならびにＳｃｒ７、からなる群から選択される。

【0057】

いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞は、培養培地においてインビトロまたはエクスビボで培養され、ここで、前記培養培地は、実質的に抗生物質を含まない。

【0058】

いくつかの実施形態では、前記挿入配列は、プラスミド、ミニサークルベクター、線状化二本鎖ＤＮＡコンストラクト、またはウイルスベクターを使用して、前記複数の哺乳動物細胞に導入される。

【0059】

いくつかの実施形態では、前記挿入配列または導入遺伝子は、外因性受容体をコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、前記外因性受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）受容体、サイトカイン受容体、またはケモカイン受容体である。いくつかの実施形態では、前記外因性受容体は、疾患関連抗原に対して特異性を有する免疫受容体である。いくつかの実施形態では、前記外因性受容体は、がん抗原に特異的に結合する免疫受容体である。いくつかの実施形態では、前記外因性受容体は、自己免疫抗原に特異的に結合する免疫受容体である。

【0060】

場合によっては、外因性受容体はＴＣＲであり得る。他の場合では、外因性受容体はＣＡＲであり得る。ＣＡＲは、配列番号９１のポリペプチドと少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または１００％の同一性を含むポリペプチド配列によってコードされ得る。場合によっては、ポリ核酸コンストラクトは、配列番号９０の少なくとも一部と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を含む。場合によっては、ポリ核酸コンストラクトは、配列番号９０、またはその改変バージョンを含む。

【0061】

いくつかの実施形態では、前記挿入配列は、プロモーター配列、エンハンサー配列、またはプロモーター配列とエンハンサー配列の両方を含む。

【0062】

いくつかの実施形態では、前記方法は、前記複数の哺乳動物細胞のゲノム中の前記標的部位を切断することをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記標的部位の前記切断は、エンドヌクレアーゼによる切断を含む。いくつかの実施形態では、前記ポリ核酸コンストラクトの前記切断は、エンドヌクレアーゼによる切断を含む。いくつかの実施形態では、前記エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、前記エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、（ａ）は、前記複数の哺乳動物細胞に、第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または前記第１のｇＲＮＡをコードするポリ核酸を導入することをさらに含む。いくつかの実施形態では、（ａ）は、前記複数の哺乳動物細胞に、第２のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または前記第２のｇＲＮＡをコードするポリ核酸を導入することをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記第１のガイドＲＮＡは、前記エンドヌクレアーゼを標的にして、前記複数の哺乳動物細胞のゲノムにおいて少なくとも１つの二本鎖切断を生成する。いくつかの実施形態では、前記第１のガイドＲＮＡは、前記エンドヌクレアーゼを標的にして、ポリ核酸コンストラクトにおいて少なくとも１つの二本鎖切断を生成する。

【0063】

いくつかの実施形態では、前記第１のガイドＲＮＡは、前記エンドヌクレアーゼを標的にして、前記複数の哺乳動物細胞のゲノムにおいて少なくとも１つの二本鎖切断及び前記ポリ核酸コンストラクトにおいて少なくとも１つの二本鎖切断を生成する。いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞のゲノムにおける前記二本鎖切断は、セーフハーバー遺伝子座に導入される。いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞のゲノムにおける前記二本鎖切断は、免疫調節遺伝子座に導入される。いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞のゲノムにおける前記二本鎖切断は、免疫チェックポイント遺伝子座に導入される。いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞のゲノムにおける前記二本鎖切断は、受容体をコードする遺伝子に導入される。いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞のゲノムにおける前記二本鎖切断は、Ｔ細胞受容体成分をコードする遺伝子に導入される。いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞のゲノムにおける前記二本鎖切断は、ＴＲＡＣまたはＴＣＲＢ遺伝子座に導入される。

【0064】

いくつかの実施形態では、前記ＴＲＡＣまたはＴＣＲＢ遺伝子座によってコードされる前記内因性タンパク質の発現は破壊される。場合によっては、複数の哺乳動物細胞のゲノムにおける二本鎖切断は、ＴＲＡＣ遺伝子座に導入される。場合によっては、複数の哺乳動物細胞のゲノムにおける二本鎖切断は、ＴＲＡＣ遺伝子座のエクソン１に導入される。場合によっては、複数の哺乳類細胞のゲノムにおける二本鎖切断は、ＴＲＡＣのエクソン１に導入され、配列番号８０の少なくとも一部、または配列番号８０の５’または３’のいずれかの側に少なくとも約１０００塩基の配列を含む。

【0065】

いくつかの実施形態では、前記哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、前記哺乳動物細胞は、初代細胞である。いくつかの実施形態では、前記哺乳動物細胞は、免疫細胞である。いくつかの実施形態では、前記免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、または好中球である。いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞は、ヒトＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、または好中球を含む。いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞は、ヒトＴ細胞を含む。

【0066】

いくつかの実施形態では、（ｃ）は、前記ポリ核酸コンストラクトにおいて２つの二本鎖切断を生成することを含む。

【0067】

いくつかの実施形態では、（ｂ）は、前記複数の哺乳動物細胞のゲノムにおいて２つの二本鎖切断を生成することを含み、前記挿入配列は、前記複数の哺乳動物細胞のゲノムに挿入され、前記複数の哺乳類細胞のゲノムにおける前記２つの二本鎖切断を架橋する。

【0068】

いくつかの実施形態では、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドを、哺乳動物細胞ゲノムから欠失させる。

【0069】

いくつかの実施形態では、前記相同性アームは、３または４の倍数である複数のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、前記相同性アームは、最大５～１００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、前記相同性アームは、最大５０塩基対を含む。いくつかの実施形態では、前記相同性アームは、最大７５塩基対を含む。いくつかの実施形態では、前記相同性アームは、挿入のための配列に隣接する。いくつかの実施形態では、前記相同性アームは、ガイドＲＮＡによって標的化される配列に隣接している。いくつかの実施形態では、前記ポリ核酸コンストラクトは、同一または異なる相同性アームを含む。いくつかの実施形態では、前記相同性アームは、挿入のための配列に隣接する。いくつかの実施形態では、相同性アームは、ＴＲＡＣまたはＴＣＲＢ遺伝子座の配列に相同な配列を含む。

【0070】

いくつかの実施形態では、この方法は、哺乳動物細胞ゲノム中の１つ以上の追加の遺伝子を破壊することをさらに含む。

【0071】

いくつかの実施形態では、この方法は、（ａ）において挿入するための配列を含む１つ以上の追加のポリ核酸コンストラクトを導入すること、（ｂ）において哺乳動物細胞ゲノムの追加の部位に二本鎖切断を生成すること、（ｃ）において１つ以上の追加のポリ核酸コンストラクトに二本鎖切断を生成すること、及び哺乳動物細胞ゲノムの追加の部位に挿入するための１つ以上の追加の配列を挿入することをさらに含む。

【0072】

一態様では、本明細書で提供されるのは、操作された哺乳動物細胞の集団を生成する方法であって、（ａ）複数の哺乳動物細胞を、相同性アームと隣接する少なくとも１０００塩基対の挿入配列を含むポリ核酸コンストラクトと接触させることであって、前記相同性アームが、前記複数の哺乳動物細胞のゲノム中の標的部位に隣接する配列の最大４００個の連続するヌクレオチドに相同な配列を含む、接触させることと；（ｂ）前記ポリ核酸コンストラクトを切断することと；（ｃ）前記挿入配列を前記標的部位に挿入することであって、前記挿入は、相同性アームが、前記標的部位に隣接する前記配列の少なくとも５００個の連続するヌクレオチドに相同な配列を含む方法よりも少なくとも１０％効率的である、挿入することと、それにより、操作された哺乳動物細胞の集団を生成することと、を含む、方法である。

【0073】

いくつかの実施形態では、この方法は、遺伝子操作された哺乳動物細胞の前記集団を増殖させることをさらに含む。

【0074】

いくつかの実施形態では、この方法は、前記複数の哺乳動物細胞をＤＮアーゼと接触させることをさらに含む。

【0075】

いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞の前記ＤＮアーゼとの前記接触によって、前記接触が実行されない操作された哺乳動物細胞の同等の集団と比較して、前記挿入配列によってコードされる導入遺伝子を発現する操作された哺乳動物細胞の前記集団における細胞のパーセンテージの増加がもたらされる。

【0076】

いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞の前記ＤＮアーゼとの前記接触によって、前記接触が実行されない操作された哺乳動物細胞の同等の集団と比較して、操作された哺乳動物細胞の前記集団における生存細胞のパーセンテージの増加がもたらされる。

【0077】

いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞の前記ＤＮアーゼとの前記接触によって、前記接触が実行されない操作された哺乳動物細胞の同等の集団と比較して、前記挿入配列によってコードされる導入遺伝子を発現する操作された哺乳動物細胞の前記集団における生存細胞のパーセンテージの増加がもたらされる。

【0078】

いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞が前記ポリ核酸コンストラクトと接触してから７日後のフローサイトメトリーによる前記導入遺伝子の検出によって測定されるように、操作された哺乳動物細胞の前記集団における細胞の少なくとも６０％は、前記挿入配列によってコードされる導入遺伝子を発現する。

【0079】

いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、ＤＮアーゼＩ、ベンゾナーゼ、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、マングビーンヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＢＡＬ３１、ＲＮアーゼＩ、Ｓ１ヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＪ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、制限酵素、及びそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼはＤＮアーゼＩである。いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、約５μｇ／ｍｌ～約１５μｇ／ｍｌの濃度で存在する。

【0080】

いくつかの実施形態では、この方法は、前記複数の哺乳動物細胞を外因性免疫刺激剤と接触させることをさらに含む。

【0081】

いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞の前記外因性免疫刺激剤との前記接触によって、前記接触が実行されない操作された哺乳動物細胞の同等の集団と比較して、前記挿入配列によってコードされる導入遺伝子を発現する操作された哺乳動物細胞の前記集団における細胞のパーセンテージの増加がもたらされる。

【0082】

いくつかの実施形態では、前記複数の細胞の前記外因性免疫刺激剤との前記接触によって、前記接触が実行されない操作された哺乳動物細胞の同等の集団と比較して、操作された哺乳動物細胞の前記集団における生存細胞のパーセンテージの増加がもたらされる。

【0083】

いくつかの実施形態では、前記複数の細胞の前記外因性免疫刺激剤との前記接触によって、前記接触が実行されない操作された哺乳動物細胞の同等の集団と比較して、前記挿入配列によってコードされる導入遺伝子を発現する操作された哺乳動物細胞の前記集団における細胞のパーセンテージの増加がもたらされる。

【0084】

いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞が前記ポリ核酸コンストラクトと接触してから７日後のフローサイトメトリーによる前記導入遺伝子の検出によって測定されるように、操作された哺乳動物細胞の前記集団における細胞の少なくとも６０％は、前記挿入配列によってコードされる導入遺伝子を発現する。

【0085】

いくつかの実施形態では、前記外因性免疫刺激剤は、Ｂ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、４－１ＢＢＬ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ３ｍＡｂ、Ｓ－２－ヒドロキシグルタレート、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２８ｍＡｂ、ＣＤ１ｄ、抗ＣＤ２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－２１、ＩＬ－２、ＩＬ－７、または短縮型ＣＤ１９、である。

【0086】

いくつかの実施形態では、前記外因性免疫刺激剤は、前記複数の哺乳動物細胞の少なくとも一部の増殖を刺激するように構成される。いくつかの実施形態では、前記免疫刺激剤の濃度は、約５０ＩＵ／ｍｌ～約１０００ＩＵ／ｍｌである。

【0087】

いくつかの実施形態では、この方法は、前記複数の哺乳動物細胞を、ＤＮＡ二本鎖切断修復を調節する外因性薬剤と接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞の前記外因性免疫刺激剤との前記接触によって、前記接触が実行されない操作された哺乳動物細胞の同等の集団と比較して、前記挿入配列によってコードされる導入遺伝子を発現する操作された哺乳動物細胞の前記集団における細胞のパーセンテージの増加がもたらされる。いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞の前記外因性免疫刺激剤との前記接触によって、前記接触が実行されない操作された哺乳動物細胞の同等の集団と比較して、操作された哺乳動物細胞の前記集団における生存細胞のパーセンテージの増加がもたらされる。いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞の前記外因性免疫刺激剤との前記接触によって、前記接触が実行されない操作された哺乳動物細胞の同等の集団と比較して、前記挿入配列によってコードされる導入遺伝子を発現する操作された哺乳動物細胞の前記集団における生存細胞のパーセンテージの増加がもたらされる。いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞が前記ポリ核酸コンストラクトと接触してから７日後のフローサイトメトリーによる前記導入遺伝子の検出によって測定されるように、操作された哺乳動物細胞の前記集団における細胞の少なくとも６０％は、前記挿入配列によってコードされる導入遺伝子を発現する。

【0088】

いくつかの実施形態では、前記薬剤は、ＮＡＣまたは抗ＩＦＮＡＲ２抗体を含む。いくつかの実施形態では、前記薬剤は、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与するタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与する前記タンパク質は、Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＲＡＤ５１、ＲＳ－１、ＰＡＬＢ２、Ｎａｐ１、ｐ４００ ＡＴＰアーゼ、ＥＶＬ、ＮＡＣ、ＭＲＥ１１、ＲＡＤ５０、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５５、ＲＡＤ５７、ＲＡＤ５４、ＲＡＤ５４Ｂ、Ｓｒｓ２、ＮＢＳ１、Ｈ２ＡＸ、ＰＡＲＰ－１、ＲＡＤ１８、ＤＮＡ－ＰＫｃｓ、ＸＲＣＣ４、ＸＬＦ、Ａｒｔｅｍｉｓ、ＴｄＴ、ｐｏｌμ及びｐｏｌλ、ＡＴＭ、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ニブリン、ＣｔＩＰ、ＥＸＯ１、ＢＬＭ、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ１ｂ５５Ｋ、ならびにＳｃｒ７、からなる群から選択される。

【0089】

いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞は、培養培地においてインビトロまたはエクスビボで培養され、ここで、前記培養培地は、実質的に抗生物質を含まない。

【0090】

いくつかの実施形態では、前記挿入配列は、プラスミド、ミニサークルベクター、線状化二本鎖ＤＮＡコンストラクト、またはウイルスベクターを使用して、前記複数の哺乳動物細胞に導入される。

【0091】

いくつかの実施形態では、前記挿入配列は、外因性受容体をコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、前記外因性受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）受容体、サイトカイン受容体、またはケモカイン受容体である。いくつかの実施形態では、前記外因性受容体は、疾患関連抗原に対して特異性を有する免疫受容体である。いくつかの実施形態では、前記外因性受容体は、がん抗原に特異的に結合する免疫受容体である。いくつかの実施形態では、前記外因性受容体は、自己免疫抗原に特異的に結合する免疫受容体である。

【0092】

いくつかの実施形態では、前記挿入配列は、プロモーター配列、エンハンサー配列、またはプロモーター配列とエンハンサー配列の両方を含む。

【0093】

いくつかの実施形態では、前記方法は、前記複数の哺乳動物細胞のゲノム中の前記標的部位を切断することをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記標的部位の前記切断は、エンドヌクレアーゼによる切断を含む。いくつかの実施形態では、前記ポリ核酸コンストラクトの前記切断は、エンドヌクレアーゼによる切断を含む。いくつかの実施形態では、前記エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、前記エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、（ａ）は、前記複数の哺乳動物細胞に、第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または前記第１のｇＲＮＡをコードするポリ核酸を導入することをさらに含む。いくつかの実施形態では、（ａ）は、前記複数の哺乳動物細胞に、第２のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または前記第２のｇＲＮＡをコードするポリ核酸を導入することをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記第１のガイドＲＮＡは、前記エンドヌクレアーゼを標的にして、前記複数の哺乳動物細胞のゲノムにおいて少なくとも１つの二本鎖切断を生成する。いくつかの実施形態では、前記第１のガイドＲＮＡは、前記エンドヌクレアーゼを標的にして、ポリ核酸コンストラクトにおいて少なくとも１つの二本鎖切断を生成する。

【0094】

いくつかの実施形態では、前記第１のガイドＲＮＡは、前記エンドヌクレアーゼを標的にして、前記複数の哺乳動物細胞のゲノムに少なくとも１つの二本鎖切断及び前記ポリ核酸コンストラクトに少なくとも１つの二本鎖切断を生成する。いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞のゲノムにおける前記二本鎖切断は、セーフハーバー遺伝子座に導入される。いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞のゲノムにおける前記二本鎖切断は、免疫調節遺伝子座に導入される。いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞のゲノムにおける前記二本鎖切断は、免疫チェックポイント遺伝子座に導入される。いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞のゲノムにおける前記二本鎖切断は、受容体をコードする遺伝子に導入される。いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞のゲノムにおける前記二本鎖切断は、Ｔ細胞受容体成分をコードする遺伝子に導入される。いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞のゲノムにおける前記二本鎖切断は、ＴＲＡＣまたはＴＣＲＢ遺伝子座に導入される。

【0095】

いくつかの実施形態では、前記ＴＲＡＣまたはＴＣＲＢ遺伝子座によってコードされる前記内因性タンパク質の発現は破壊される。

【0096】

いくつかの実施形態では、前記哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、前記哺乳動物細胞は、初代細胞である。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、前記免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、または好中球である。いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞は、ヒトＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、または好中球を含む。いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞は、ヒトＴ細胞を含む。

【0097】

いくつかの実施形態では、（ｃ）は、前記ポリ核酸コンストラクトにおいて２つの二本鎖切断を生成することを含む。

【0098】

いくつかの実施形態では、（ｂ）は、前記複数の哺乳動物細胞のゲノムにおいて２つの二本鎖切断を生成することを含み、前記挿入配列は、前記複数の哺乳動物細胞のゲノムに挿入され、前記複数の哺乳類細胞のゲノムにおける前記２つの二本鎖切断を架橋する。

【0099】

いくつかの実施形態では、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドを、哺乳動物細胞ゲノムから欠失させる。

【0100】

いくつかの実施形態では、前記相同性アームは、３または４の倍数である複数のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、前記相同性アームは、最大５～１００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、前記相同性アームは、最大５０塩基対を含む。いくつかの実施形態では、前記相同性アームは、最大７５塩基対を含む。いくつかの実施形態では、前記相同性アームは、挿入のための配列に隣接する。いくつかの実施形態では、前記相同性アームは、ガイドＲＮＡによって標的化される配列に隣接している。いくつかの実施形態では、前記ポリ核酸コンストラクトは、同一または異なる相同性アームを含む。いくつかの実施形態では、前記相同性アームは、挿入のための配列に隣接する。いくつかの実施形態では、相同性アームは、ＴＲＡＣまたはＴＣＲＢ遺伝子座の配列に相同な配列を含む。

【0101】

いくつかの実施形態では、この方法は、哺乳動物細胞ゲノム中の１つ以上の追加の遺伝子を破壊することをさらに含む。

【0102】

いくつかの実施形態では、この方法は、（ａ）において挿入するための配列を含む１つ以上の追加のポリ核酸コンストラクトを導入すること、（ｂ）において哺乳動物細胞ゲノムの追加の部位に二本鎖切断を生成すること、（ｃ）において１つ以上の追加のポリ核酸コンストラクトに二本鎖切断を生成すること、及び哺乳動物細胞ゲノムの追加の部位に挿入するための１つ以上の追加の配列を挿入することをさらに含む。

【0103】

一態様では、本明細書で提供されるのは、操作された哺乳動物細胞の集団を生成する方法であって、（ａ）複数の哺乳動物細胞を、相同性アームと隣接する挿入配列を含むポリ核酸コンストラクトと接触させることであって、前記相同性アームが、前記複数の哺乳動物細胞のゲノム中の標的部位に隣接する配列の最大４００個の連続するヌクレオチドに相同な配列を含む、接触させることと；（ｂ）前記ポリ核酸コンストラクトを切断することと；（ｃ）前記複数の哺乳動物細胞のゲノムの前記標的部位に第１の二本鎖切断を生成し、前記複数の哺乳動物細胞のゲノムの第２の部位に第２の二本鎖切断を生成することと、（ｄ）前記挿入配列を前記標的部位に挿入し、それにより、操作された哺乳動物細胞の集団を生成することと、を含む、方法である。

【0104】

いくつかの実施形態では、この方法は、遺伝子操作された哺乳動物細胞の前記集団を増殖させることをさらに含む。

【0105】

いくつかの実施形態では、この方法は、前記複数の哺乳動物細胞をＤＮアーゼと接触させることをさらに含む。

【0106】

いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞の前記ＤＮアーゼとの前記接触によって、前記接触が実行されない操作された哺乳動物細胞の同等の集団と比較して、前記挿入配列によってコードされる導入遺伝子を発現する操作された哺乳動物細胞の前記集団における細胞のパーセンテージの増加がもたらされる。

【0107】

いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞の前記ＤＮアーゼとの前記接触によって、前記接触が実行されない操作された哺乳動物細胞の同等の集団と比較して、操作された哺乳動物細胞の前記集団における生存細胞のパーセンテージの増加がもたらされる。

【0108】

いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞の前記ＤＮアーゼとの前記接触によって、前記接触が実行されない操作された哺乳動物細胞の同等の集団と比較して、前記挿入配列によってコードされる導入遺伝子を発現する操作された哺乳動物細胞の前記集団における生存細胞のパーセンテージの増加がもたらされる。

【0109】

いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞が前記ポリ核酸コンストラクトと接触してから７日後のフローサイトメトリーによる前記導入遺伝子の検出によって測定されるように、操作された哺乳動物細胞の前記集団における細胞の少なくとも６０％は、前記挿入配列によってコードされる導入遺伝子を発現する。

【0110】

いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、ＤＮアーゼＩ、ベンゾナーゼ、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、マングビーンヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＢＡＬ３１、ＲＮアーゼＩ、Ｓ１ヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＪ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、制限酵素、及びそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼはＤＮアーゼＩである。いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、約５μｇ／ｍｌ～約１５μｇ／ｍｌの濃度で存在する。

【0111】

いくつかの実施形態では、この方法は、前記複数の哺乳動物細胞を外因性免疫刺激剤と接触させることをさらに含む。

【0112】

いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞の前記外因性免疫刺激剤との前記接触によって、前記接触が実行されない操作された哺乳動物細胞の同等の集団と比較して、前記挿入配列によってコードされる導入遺伝子を発現する操作された哺乳動物細胞の前記集団における細胞のパーセンテージの増加がもたらされる。

【0113】

いくつかの実施形態では、前記複数の細胞の前記外因性免疫刺激剤との前記接触によって、前記接触が実行されない操作された哺乳動物細胞の同等の集団と比較して、操作された哺乳動物細胞の前記集団における生存細胞のパーセンテージの増加がもたらされる。

【0114】

いくつかの実施形態では、前記複数の細胞の前記外因性免疫刺激剤との前記接触によって、前記接触が実行されない操作された哺乳動物細胞の同等の集団と比較して、前記挿入配列によってコードされる導入遺伝子を発現する操作された哺乳動物細胞の前記集団における生存細胞のパーセンテージの増加がもたらされる。

【0115】

いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞が前記ポリ核酸コンストラクトと接触してから７日後のフローサイトメトリーによる前記導入遺伝子の検出によって測定されるように、操作された哺乳動物細胞の前記集団における細胞の少なくとも６０％は、前記挿入配列によってコードされる導入遺伝子を発現する。

【0116】

いくつかの実施形態では、前記外因性免疫刺激剤は、Ｂ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、４－１ＢＢＬ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ３ｍＡｂ、Ｓ－２－ヒドロキシグルタレート、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２８ｍＡｂ、ＣＤ１ｄ、抗ＣＤ２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－２１、ＩＬ－２、ＩＬ－７、または短縮型ＣＤ１９、である。

【0117】

いくつかの実施形態では、前記外因性免疫刺激剤は、前記複数の哺乳動物細胞の少なくとも一部の増殖を刺激するように構成される。いくつかの実施形態では、前記免疫刺激剤の濃度は、約５０ＩＵ／ｍｌ～約１０００ＩＵ／ｍｌである。

【0118】

いくつかの実施形態では、この方法は、前記複数の哺乳動物細胞を、ＤＮＡ二本鎖切断修復を調節する外因性薬剤と接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞の前記外因性免疫刺激剤との前記接触によって、前記接触が実行されない操作された哺乳動物細胞の同等の集団と比較して、前記挿入配列によってコードされる導入遺伝子を発現する操作された哺乳動物細胞の前記集団における細胞のパーセンテージの増加がもたらされる。いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞の前記外因性免疫刺激剤との前記接触によって、前記接触が実行されない操作された哺乳動物細胞の同等の集団と比較して、操作された哺乳動物細胞の前記集団における生存細胞のパーセンテージの増加がもたらされる。いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞の前記外因性免疫刺激剤との前記接触によって、前記接触が実行されない操作された哺乳動物細胞の同等の集団と比較して、前記挿入配列によってコードされる導入遺伝子を発現する操作された哺乳動物細胞の前記集団における生存細胞のパーセンテージの増加がもたらされる。いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞が前記ポリ核酸コンストラクトと接触してから７日後のフローサイトメトリーによる前記導入遺伝子の検出によって測定されるように、操作された哺乳動物細胞の前記集団における細胞の少なくとも６０％は、前記挿入配列によってコードされる導入遺伝子を発現する。

【0119】

いくつかの実施形態では、前記薬剤は、ＮＡＣまたは抗ＩＦＮＡＲ２抗体を含む。いくつかの実施形態では、前記薬剤は、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与するタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与する前記タンパク質は、Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＲＡＤ５１、ＲＳ－１、ＰＡＬＢ２、Ｎａｐ１、ｐ４００ ＡＴＰアーゼ、ＥＶＬ、ＮＡＣ、ＭＲＥ１１、ＲＡＤ５０、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５５、ＲＡＤ５７、ＲＡＤ５４、ＲＡＤ５４Ｂ、Ｓｒｓ２、ＮＢＳ１、Ｈ２ＡＸ、ＰＡＲＰ－１、ＲＡＤ１８、ＤＮＡ－ＰＫｃｓ、ＸＲＣＣ４、ＸＬＦ、Ａｒｔｅｍｉｓ、ＴｄＴ、ｐｏｌμ及びｐｏｌλ、ＡＴＭ、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ニブリン、ＣｔＩＰ、ＥＸＯ１、ＢＬＭ、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ１ｂ５５Ｋ、ならびにＳｃｒ７、からなる群から選択される。

【0120】

いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞は、培養培地においてインビトロまたはエクスビボで培養され、ここで、前記培養培地は、実質的に抗生物質を含まない。

【0121】

いくつかの実施形態では、前記挿入配列は、プラスミド、ミニサークルベクター、線状化二本鎖ＤＮＡコンストラクト、またはウイルスベクターを使用して、前記複数の哺乳動物細胞に導入される。

【0122】

いくつかの実施形態では、前記挿入配列は、外因性受容体をコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、前記外因性受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）受容体、サイトカイン受容体、またはケモカイン受容体である。いくつかの実施形態では、前記外因性受容体は、疾患関連抗原に対して特異性を有する免疫受容体である。いくつかの実施形態では、前記外因性受容体は、がん抗原に特異的に結合する免疫受容体である。いくつかの実施形態では、前記外因性受容体は、自己免疫抗原に特異的に結合する免疫受容体である。

【0123】

いくつかの実施形態では、前記挿入配列は、プロモーター配列、エンハンサー配列、またはプロモーター配列とエンハンサー配列の両方を含む。

【0124】

いくつかの実施形態では、前記方法は、前記複数の哺乳動物細胞のゲノム中の前記標的部位を切断することをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記標的部位の前記切断は、エンドヌクレアーゼによる切断を含む。いくつかの実施形態では、前記ポリ核酸コンストラクトの前記切断は、エンドヌクレアーゼによる切断を含む。いくつかの実施形態では、前記エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、前記エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、（ａ）は、前記複数の哺乳動物細胞に、第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または前記第１のｇＲＮＡをコードするポリ核酸を導入することをさらに含む。いくつかの実施形態では、（ａ）は、前記複数の哺乳動物細胞に、第２のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または前記第２のｇＲＮＡをコードするポリ核酸を導入することをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記第１のガイドＲＮＡは、前記エンドヌクレアーゼを標的にして、前記複数の哺乳動物細胞のゲノムにおいて少なくとも１つの二本鎖切断を生成する。いくつかの実施形態では、前記第１のガイドＲＮＡは、前記エンドヌクレアーゼを標的にして、ポリ核酸コンストラクトにおいて少なくとも１つの二本鎖切断を生成する。

【0125】

いくつかの実施形態では、前記第１のガイドＲＮＡは、前記エンドヌクレアーゼを標的にして、前記複数の哺乳動物細胞のゲノムに少なくとも１つの二本鎖切断及び前記ポリ核酸コンストラクトに少なくとも１つの二本鎖切断を生成する。いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞のゲノムにおける前記二本鎖切断は、セーフハーバー遺伝子座に導入される。いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞のゲノムにおける前記二本鎖切断は、免疫調節遺伝子座に導入される。いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞のゲノムにおける前記二本鎖切断は、免疫チェックポイント遺伝子座に導入される。いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞のゲノムにおける前記二本鎖切断は、受容体をコードする遺伝子に導入される。いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞のゲノムにおける前記二本鎖切断は、Ｔ細胞受容体成分をコードする遺伝子に導入される。いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞のゲノムにおける前記二本鎖切断は、ＴＲＡＣまたはＴＣＲＢ遺伝子座に導入される。

【0126】

いくつかの実施形態では、前記ＴＲＡＣまたはＴＣＲＢ遺伝子座によってコードされる前記内因性タンパク質の発現は破壊される。

【0127】

いくつかの実施形態では、前記哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、前記哺乳動物細胞は、初代細胞である。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、前記免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、または好中球である。いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞は、ヒトＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、または好中球を含む。いくつかの実施形態では、前記複数の哺乳動物細胞は、ヒトＴ細胞を含む。

【0128】

いくつかの実施形態では、（ｃ）は、前記ポリ核酸コンストラクトにおいて２つの二本鎖切断を生成することを含む。

【0129】

いくつかの実施形態では、（ｂ）は、前記複数の哺乳動物細胞のゲノムにおいて２つの二本鎖切断を生成することを含み、前記挿入配列は、前記複数の哺乳動物細胞のゲノムに挿入され、前記複数の哺乳類細胞のゲノムにおける前記２つの二本鎖切断を架橋する。

【0130】

いくつかの実施形態では、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドを、哺乳動物細胞ゲノムから欠失させる。

【0131】

いくつかの実施形態では、前記相同性アームは、３または４の倍数である複数のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、前記相同性アームは、最大５～１００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、前記相同性アームは、最大５０塩基対を含む。いくつかの実施形態では、前記相同性アームは、最大７５塩基対を含む。いくつかの実施形態では、前記相同性アームは、挿入のための配列に隣接する。いくつかの実施形態では、前記相同性アームは、ガイドＲＮＡによって標的化される配列に隣接している。いくつかの実施形態では、前記ポリ核酸コンストラクトは、同一または異なる相同性アームを含む。いくつかの実施形態では、前記相同性アームは、挿入のための配列に隣接する。いくつかの実施形態では、相同性アームは、ＴＲＡＣまたはＴＣＲＢ遺伝子座の配列に相同な配列を含む。

【0132】

いくつかの実施形態では、この方法は、哺乳動物細胞ゲノム中の１つ以上の追加の遺伝子を破壊することをさらに含む。

【0133】

いくつかの実施形態では、この方法は、（ａ）において挿入するための配列を含む１つ以上の追加のポリ核酸コンストラクトを導入すること、（ｂ）において哺乳動物細胞ゲノムの追加の部位に二本鎖切断を生成すること、（ｃ）において１つ以上の追加のポリ核酸コンストラクトに二本鎖切断を生成すること、及び哺乳動物細胞ゲノムの追加の部位に挿入するための１つ以上の追加の配列を挿入することをさらに含む。

【0134】

一態様では、本明細書で提供されるのは、操作されたＴ細胞を作製する方法であって、（ａ）ヒト対象からの初代Ｔ細胞を提供することと；（ｂ）エクスビボで初代Ｔ細胞に、（ｉ）ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードするポリ核酸、であって、ここで、ヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼである、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードするポリ核酸と；（ｉｉ）第１のガイドＲＮＡまたは第１のガイドＲＮＡをコードするポリ核酸、であって、第１のガイドＲＮＡは、初代Ｔ細胞のＴＲＡＣまたはＴＣＲＢ遺伝子座の配列を標的とする、第１のガイドＲＮＡまたは第１のガイドＲＮＡをコードするポリ核酸と；（ｉｉｉ）第２のガイドＲＮＡまたは第２のガイドＲＮＡをコードするポリ核酸と；（ｉｖ）挿入のための配列を含むポリ核酸コンストラクトであって、挿入のための配列は、外因性Ｔ細胞受容体またはキメラ抗原受容体をコードする配列を含み、ポリ核酸コンストラクトは、挿入のための配列に隣接する第１の短い相同性アーム及び第２の短い相同性アームを含み、第１の短い相同性アーム及び第２の短い相同性アームは、初代Ｔ細胞のＴＲＡＣまたはＴＣＲＢ遺伝子座の配列に相同な配列を含み、第１の短い相同性アームは５０塩基対未満であり、第２の短い相同性アームは５０塩基対未満であり、第１の短い相同性アーム及び第２の短い相同性アームは、第２のガイドＲＮＡによって標的とされる配列に隣接している、ポリ核酸コンストラクトと、を導入することと；（ｃ）初代Ｔ細胞のゲノムのＴＲＡＣまたはＴＣＲＢ遺伝子座に二本鎖切断を生成することであって、ＴＲＡＣまたはＴＣＲＢ遺伝子座の二本鎖切断がＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ及び第１のガイドＲＮＡによって生成され、二本鎖切断は、第１の短い相同性アームに相同な第１の配列と、第２の短い相同性アームに相同な第２の配列との間にある、二本鎖切断を生成することと、（ｄ）ポリ核酸コンストラクトに２つの二本鎖切断を生成し、それによって切断されたポリ核酸コンストラクトを生成することであって、切断されたポリ核酸コンストラクトは、第１の末端に第１の短い相同性アームを含み、第２の末端に第２の短い相同性アームを含み、２つの二本鎖切断はＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ及び第２のガイドＲＮＡによって生成される、２つの二本鎖切断を生成し、それによって切断されたポリ核酸コンストラクトを生成することと；（ｅ）外因性Ｔ細胞受容体をコードする配列を、ホモロジー媒介末端結合により、初代Ｔ細胞ゲノムのＴＲＡＣまたはＴＣＲＢ遺伝子座の二本鎖切断部位に挿入することと、を含む方法、である。

【0135】

場合によっては、（ｂ）の導入は、外因性免疫刺激剤との接触から３０時間～３６時間後に起こる。その他の場合、（ｂ）の導入は、外因性免疫刺激剤との接触から３６時間後に起こる。場合によっては、外因性免疫刺激剤は、Ｂ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、４－１ＢＢＬ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ３ｍＡｂ、Ｓ－２－ヒドロキシグルタレート、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２８ｍＡｂ、ＣＤ１ｄ、抗ＣＤ２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－２１、ＩＬ－２、ＩＬ－７、または短縮型ＣＤ１９、である。

【0136】

一態様では、本明細書で提供されるのは、がんの治療を必要とする対象のがんを治療する方法であって、本明細書に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、方法である。いくつかの実施形態では、前記がんは、膀胱癌、上皮癌、骨癌、脳腫瘍、乳癌、食道癌、胃腸癌、白血病、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、骨髄腫、卵巣癌、前立腺癌、肉腫、胃癌、甲状腺癌、急性リンパ球性癌、急性骨髄性白血病、胞巣状横紋筋肉腫、肛門管、直腸癌、眼癌、頸部癌、胆嚢癌、胸膜癌、口腔癌、外陰癌、結腸癌、子宮頸癌、線維肉腫、消化管カルチノイド腫瘍、ホジキンリンパ腫、腎臓癌、中皮腫、肥満細胞腫、黒色腫、多発性骨髄腫、鼻咽頭癌、非ホジキンリンパ腫、膵臓癌、腹膜癌、腎癌、皮膚癌、小腸癌、軟組織癌、固形腫瘍、胃癌、精巣癌、または甲状腺癌、である。いくつかの実施形態では、前記癌は、胃腸癌、乳癌、リンパ腫、または前立腺癌である。いくつかの実施形態では、操作された哺乳動物細胞の前記集団は、前記対象に対して同種異系または自家である。

【0137】

一態様では、本明細書で提供されるのは、（ａ）相同性アームに隣接する外因性配列を含むポリ核酸コンストラクトであって、相同性アームのそれぞれが、哺乳動物細胞のゲノム中の標的部位に隣接する配列の最大４００個の連続するヌクレオチドに相同な配列を含み、ポリ核酸は切断されており、切除された末端を含む、ポリ核酸コンストラクトと；（ｂ）哺乳動物細胞のゲノム中の二本鎖切断であって、二本鎖切断によって露出された少なくとも一方の末端が切除される、二本鎖切断と、含む哺乳動物細胞である。

【0138】

いくつかの実施形態では、前記哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、前記哺乳動物細胞は、初代細胞である。いくつかの実施形態では、前記哺乳動物細胞は免疫細胞である。いくつかの実施形態では、前記免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、マクロファージ、樹状細胞、または好中球である。いくつかの実施形態では、前記免疫細胞は、Ｔ細胞である。

【0139】

一態様では、本明細書で提供されるのは、（ａ）相同性アームに隣接する少なくとも１０００塩基対の挿入配列を含むポリ核酸コンストラクトであって、相同性アームのそれぞれが、前記複数の哺乳動物細胞のゲノム中の標的部位に隣接する配列の最大４００個の連続するヌクレオチドに相同な配列を含む、ポリ核酸コンストラクトと；（ｂ）哺乳動物細胞のゲノム中の二本鎖切断であって、二本鎖切断によって露出された少なくとも一方の末端が切除される、二本鎖切断と、を含む哺乳動物細胞である。場合によっては、相同性アームは、長さ３０～７０、３５～６５、４０～６０、４５～５５、または４５～５０塩基に相同な配列を含む。場合によっては、相同性アームは、長さ４８塩基に相同な配列を含む。

【0140】

いくつかの実施形態では、前記哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、前記哺乳動物細胞は、初代細胞である。いくつかの実施形態では、前記哺乳動物細胞は免疫細胞である。いくつかの実施形態では、前記免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、マクロファージ、樹状細胞、または好中球である。いくつかの実施形態では、前記免疫細胞は、Ｔ細胞である。

【0141】

一態様では、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の方法によって作製された哺乳動物細胞である。

【0142】

一態様では、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の方法によって作製された哺乳動物細胞の集団である。

【0143】

一態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載の方法によって作製された哺乳動物細胞を含む医薬組成物である。

【0144】

一態様では、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の方法によって作製された哺乳動物細胞の集団を含む医薬組成物である。

【0145】

一態様では、本明細書で提供されるのは、導入遺伝子をコードするポリ核酸と接触した細胞集団と；約５μｇ／ｍｌ～約１５μｇ／ｍｌの濃度のＤＮアーゼと、を含む組成物であって、前記ＤＮアーゼの存在下で、前記細胞集団が前記ポリ核酸と接触してから７日後にフローサイトメトリーによる前記導入遺伝子の検出によって測定されるように、前記細胞集団の少なくとも６０％が前記導入遺伝子を発現する、組成物である。

【0146】

いくつかの実施形態では、前記細胞集団の少なくとも一部の核は、ＤＮＡ二本鎖切断修復の少なくとも１つの外因的に添加されたモジュレーターを含む。いくつかの実施形態では、組成物は実質的に抗生物質を含まない培地である。

【0147】

いくつかの実施形態では、前記細胞集団は、初代細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記細胞集団は、初代免疫細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記組成物は、少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤は、約５０ＩＵ／ｍｌ～約１０００ＩＵ／ｍｌの濃度で存在する。

【0148】

いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、約５μｇ／ｍｌ～約１５μｇ／ｍｌの濃度で存在する。いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、ＤＮアーゼＩ、ベンゾナーゼ、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、マングビーンヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＢＡＬ３１、ＲＮアーゼＩ、Ｓ１ヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＪ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、制限酵素、及びそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、ＤＮアーゼＩを含む。

【0149】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復の前記少なくとも１つの外因的に添加されたモジュレーターは、ＮＡＣ、抗ＩＦＮＡＲ２抗体、またはその両方を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復の前記少なくとも１つの外因的に添加されたモジュレーターは、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与するタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与するタンパク質は、Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＲＡＤ５１、ＲＳ－１、ＰＡＬＢ２、Ｎａｐ１、ｐ４００ ＡＴＰアーゼ、ＥＶＬ、ＮＡＣ、ＭＲＥ１１、ＲＡＤ５０、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５５、ＲＡＤ５７、ＲＡＤ５４、ＲＡＤ５４Ｂ、Ｓｒｓ２、ＮＢＳ１、Ｈ２ＡＸ、ＰＡＲＰ－１、ＲＡＤ１８、ＤＮＡ－ＰＫｃｓ、ＸＲＣＣ４、ＸＬＦ、Ａｒｔｅｍｉｓ、ＴｄＴ、ｐｏｌμ及びｐｏｌλ、ＡＴＭ、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ニブリン、ＣｔＩＰ、ＥＸＯ１、ＢＬＭ、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ１ｂ５５Ｋ、それらの相同体及び誘導体、Ｓｃｒ７、ならびにそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択されるタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与する前記少なくとも１つの外因的に添加されたタンパク質は、ＲＳ－１、ＲＡＤ５１、またはその両方を含む。

【0150】

いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤は、Ｂ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、４－１ＢＢＬ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ３ｍＡｂ、Ｓ－２－ヒドロキシグルタレート、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２８ｍＡｂ、ＣＤ１ｄ、抗ＣＤ２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－２１、ＩＬ－２、ＩＬ－７、短縮型ＣＤ１９、それらの誘導体、または任意の組み合わせ、を含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤は、前記細胞集団または前記細胞の少なくとも一部の増殖を刺激するように構成される。

【0151】

いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、Ｂ細胞、好塩基球、樹状細胞、好酸球、ガンマデルタＴ細胞、顆粒球、ヘルパーＴ細胞、ランゲルハンス細胞、リンパ球細胞、自然リンパ球（ＩＬＣ）、マクロファージ、マスト細胞、巨核球、メモリーＴ細胞、単球、骨髄細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、好中球、前駆体細胞、形質細胞、前駆細胞、制御性Ｔ細胞、Ｔ細胞、胸腺細胞、それらの分化もしくは脱分化細胞、またはそれらの細胞の任意の混合物もしくは組み合わせ、からなる群から選択される細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、初代Ｔ細胞を含む。

【0152】

いくつかの実施形態では、前記初代Ｔ細胞は、対象の血液試料から単離される。いくつかの実施形態では、前記対象はヒトである。いくつかの実施形態では、前記血液試料は、全血試料または分画血液試料である。いくつかの実施形態では、前記血液試料は、単離された末梢血単核細胞を含む。

【0153】

いくつかの実施形態では、前記初代Ｔ細胞は、ガンマデルタＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、メモリーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、エフェクターＴ細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0154】

いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、ＣＤ３＋細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、それらの分化もしくは脱分化細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0155】

いくつかの実施形態では、組成物は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記ＡＰＣは、前記ＴＩＬの増殖を刺激するように構成される。いくつかの実施形態では、前記ＡＰＣは、Ｂ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、４－１ＢＢＬ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ３ｍＡｂ、Ｓ－２－ヒドロキシグルタレート、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２８ｍＡｂ、ＣＤ１ｄ、抗－ＣＤ２、膜結合型ＩＬ－１５、膜結合型ＩＬ－１７、膜結合型ＩＬ－２１、膜結合型ＩＬ－２、短縮型ＣＤ１９、それらの誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを発現する。

【0156】

いくつかの実施形態では、前記遺伝子改変細胞は、１つ以上のゲノム部位の破壊を含む。いくつかの実施形態では、前記遺伝子改変細胞は、１つ以上の内因性遺伝子の改変または欠失を含む。いくつかの実施形態では、前記内因性遺伝子は、免疫チェックポイント遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、前記内因性遺伝子は、ＣＩＳＨ、ＰＤ－１、またはその両方を含む。

【0157】

いくつかの実施形態では、前記遺伝子改変細胞の核は、導入遺伝子を含む。

【0158】

いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子は、細胞受容体、免疫学的チェックポイントタンパク質、サイトカイン、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される細胞受容体をコードする。いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子は、Ｔ細胞受容体をコードする。

【0159】

一態様では、本明細書で提供されるのは、遺伝子改変細胞集団を含む組成物であって、前記細胞集団は、その核が、導入遺伝子をコードするポリ核酸；及び少なくとも１つの外因的に添加されたＤＮＡ二本鎖切断修復のモジュレーターを含む細胞を含む、組成物である。

【0160】

いくつかの実施形態では、組成物は、ＤＮアーゼをさらに含む。いくつかの実施形態では、組成物は実質的に抗生物質を含まない培地である。

【0161】

いくつかの実施形態では、前記細胞集団の少なくとも一部の核は、ＤＮＡ二本鎖切断修復の少なくとも１つの外因的に添加されたモジュレーターを含む。

【0162】

いくつかの実施形態では、前記細胞集団は、初代細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記細胞集団は、初代免疫細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記組成物は、少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤は、約５０ＩＵ／ｍｌ～約１０００ＩＵ／ｍｌの濃度で存在する。

【0163】

いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、約５μｇ／ｍｌ～約１５μｇ／ｍｌの濃度で存在する。いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、ＤＮアーゼＩ、ベンゾナーゼ、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、マングビーンヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＢＡＬ３１、ＲＮアーゼＩ、Ｓ１ヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＪ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、制限酵素、及びそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、ＤＮアーゼＩを含む。

【0164】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復の前記少なくとも１つの外因的に添加されたモジュレーターは、ＮＡＣ、抗ＩＦＮＡＲ２抗体、またはその両方を含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加されたＤＮＡ二本鎖切断修復のモジュレーターは、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与するタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与するタンパク質は、Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＲＡＤ５１、ＲＳ－１、ＰＡＬＢ２、Ｎａｐ１、ｐ４００ ＡＴＰアーゼ、ＥＶＬ、ＮＡＣ、ＭＲＥ１１、ＲＡＤ５０、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５５、ＲＡＤ５７、ＲＡＤ５４、ＲＡＤ５４Ｂ、Ｓｒｓ２、ＮＢＳ１、Ｈ２ＡＸ、ＰＡＲＰ－１、ＲＡＤ１８、ＤＮＡ－ＰＫｃｓ、ＸＲＣＣ４、ＸＬＦ、Ａｒｔｅｍｉｓ、ＴｄＴ、ｐｏｌμ及びｐｏｌλ、ＡＴＭ、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ニブリン、ＣｔＩＰ、ＥＸＯ１、ＢＬＭ、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ１ｂ５５Ｋ、それらの相同体及び誘導体、Ｓｃｒ７、ならびにそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択されるタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与する前記少なくとも１つの外因的に添加されたタンパク質は、ＲＳ－１、ＲＡＤ５１、またはその両方を含む。

【0165】

いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤は、Ｂ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、４－１ＢＢＬ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ３ｍＡｂ、Ｓ－２－ヒドロキシグルタレート、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２８ｍＡｂ、ＣＤ１ｄ、抗ＣＤ２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－２１、ＩＬ－２、ＩＬ－７、短縮型ＣＤ１９、それらの誘導体、または任意の組み合わせ、を含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤は、前記細胞集団または前記細胞の少なくとも一部の増殖を刺激するように構成される。

【0166】

いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、Ｂ細胞、好塩基球、樹状細胞、好酸球、ガンマデルタＴ細胞、顆粒球、ヘルパーＴ細胞、ランゲルハンス細胞、リンパ球細胞、自然リンパ球（ＩＬＣ）、マクロファージ、マスト細胞、巨核球、メモリーＴ細胞、単球、骨髄細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、好中球、前駆体細胞、形質細胞、前駆細胞、制御性Ｔ細胞、Ｔ細胞、胸腺細胞、それらの分化もしくは脱分化細胞、またはそれらの細胞の任意の混合物もしくは組み合わせ、からなる群から選択される細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、初代Ｔ細胞を含む。

【0167】

いくつかの実施形態では、前記初代Ｔ細胞は、対象の血液試料から単離される。いくつかの実施形態では、前記対象はヒトである。いくつかの実施形態では、前記血液試料は、全血試料または分画血液試料である。いくつかの実施形態では、前記血液試料は、単離された末梢血単核細胞を含む。

【0168】

いくつかの実施形態では、前記初代Ｔ細胞は、ガンマデルタＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、メモリーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、エフェクターＴ細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0169】

いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、ＣＤ３＋細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、それらの分化もしくは脱分化細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0170】

いくつかの実施形態では、組成物は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記ＡＰＣは、前記ＴＩＬの増殖を刺激するように構成される。いくつかの実施形態では、前記ＡＰＣは、Ｂ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、４－１ＢＢＬ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ３ｍＡｂ、Ｓ－２－ヒドロキシグルタレート、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２８ｍＡｂ、ＣＤ１ｄ、抗－ＣＤ２、膜結合型ＩＬ－１５、膜結合型ＩＬ－１７、膜結合型ＩＬ－２１、膜結合型ＩＬ－２、短縮型ＣＤ１９、それらの誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを発現する。

【0171】

いくつかの実施形態では、前記遺伝子改変細胞は、１つ以上のゲノム部位の破壊を含む。いくつかの実施形態では、前記遺伝子改変細胞は、１つ以上の内因性遺伝子の改変または欠失を含む。いくつかの実施形態では、前記内因性遺伝子は、免疫チェックポイント遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、前記内因性遺伝子は、ＣＩＳＨ、ＰＤ－１、またはその両方を含む。

【0172】

いくつかの実施形態では、前記遺伝子改変細胞の核は、導入遺伝子を含む。

【0173】

いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子は、細胞受容体、免疫学的チェックポイントタンパク質、サイトカイン、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される細胞受容体をコードする。いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子は、Ｔ細胞受容体をコードする。

【0174】

一態様では、本明細書で提供されるのは、遺伝子改変細胞；ＤＮアーゼ；及び実質的に抗生物質を含まない培地を含む組成物である。

【0175】

いくつかの実施形態では、前記遺伝子改変細胞の核は、ＤＮＡ二本鎖切断修復の少なくとも１つの外因的に添加されたモジュレーターを含む。いくつかの実施形態では、組成物は実質的に抗生物質を含まない培地である。

【0176】

いくつかの実施形態では、前記細胞集団は、初代細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記細胞集団は、初代免疫細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記組成物は、少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤は、約５０ＩＵ／ｍｌ～約１０００ＩＵ／ｍｌの濃度で存在する。

【0177】

いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、約５μｇ／ｍｌ～約１５μｇ／ｍｌの濃度で存在する。いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、ＤＮアーゼＩ、ベンゾナーゼ、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、マングビーンヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＢＡＬ３１、ＲＮアーゼＩ、Ｓ１ヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＪ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、制限酵素、及びそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、ＤＮアーゼＩを含む。

【0178】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復の前記少なくとも１つの外因的に添加されたモジュレーターは、ＮＡＣ、抗ＩＦＮＡＲ２抗体、またはその両方を含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加されたＤＮＡ二本鎖切断修復のモジュレーターは、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与するタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与するタンパク質は、Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＲＡＤ５１、ＲＳ－１、ＰＡＬＢ２、Ｎａｐ１、ｐ４００ ＡＴＰアーゼ、ＥＶＬ、ＮＡＣ、ＭＲＥ１１、ＲＡＤ５０、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５５、ＲＡＤ５７、ＲＡＤ５４、ＲＡＤ５４Ｂ、Ｓｒｓ２、ＮＢＳ１、Ｈ２ＡＸ、ＰＡＲＰ－１、ＲＡＤ１８、ＤＮＡ－ＰＫｃｓ、ＸＲＣＣ４、ＸＬＦ、Ａｒｔｅｍｉｓ、ＴｄＴ、ｐｏｌμ及びｐｏｌλ、ＡＴＭ、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ニブリン、ＣｔＩＰ、ＥＸＯ１、ＢＬＭ、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ１ｂ５５Ｋ、それらの相同体及び誘導体、Ｓｃｒ７、ならびにそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択されるタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与する前記少なくとも１つの外因的に添加されたタンパク質は、ＲＳ－１、ＲＡＤ５１、またはその両方を含む。

【0179】

いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤は、Ｂ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、４－１ＢＢＬ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ３ｍＡｂ、Ｓ－２－ヒドロキシグルタレート、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２８ｍＡｂ、ＣＤ１ｄ、抗ＣＤ２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－２１、ＩＬ－２、ＩＬ－７、短縮型ＣＤ１９、それらの誘導体、または任意の組み合わせ、を含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤は、前記細胞集団または前記細胞の少なくとも一部の増殖を刺激するように構成される。

【0180】

いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、Ｂ細胞、好塩基球、樹状細胞、好酸球、ガンマデルタＴ細胞、顆粒球、ヘルパーＴ細胞、ランゲルハンス細胞、リンパ球細胞、自然リンパ球（ＩＬＣ）、マクロファージ、マスト細胞、巨核球、メモリーＴ細胞、単球、骨髄細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、好中球、前駆体細胞、形質細胞、前駆細胞、制御性Ｔ細胞、Ｔ細胞、胸腺細胞、それらの分化もしくは脱分化細胞、またはそれらの細胞の任意の混合物もしくは組み合わせ、からなる群から選択される細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、初代Ｔ細胞を含む。

【0181】

いくつかの実施形態では、前記初代Ｔ細胞は、対象の血液試料から単離される。いくつかの実施形態では、前記対象はヒトである。いくつかの実施形態では、前記血液試料は、全血試料または分画血液試料である。いくつかの実施形態では、前記血液試料は、単離された末梢血単核細胞を含む。

【0182】

いくつかの実施形態では、前記初代Ｔ細胞は、ガンマデルタＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、メモリーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、エフェクターＴ細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0183】

いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、ＣＤ３＋細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、それらの分化もしくは脱分化細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0184】

いくつかの実施形態では、組成物は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記ＡＰＣは、前記ＴＩＬの増殖を刺激するように構成される。いくつかの実施形態では、前記ＡＰＣは、Ｂ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、４－１ＢＢＬ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ３ｍＡｂ、Ｓ－２－ヒドロキシグルタレート、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２８ｍＡｂ、ＣＤ１ｄ、抗－ＣＤ２、膜結合型ＩＬ－１５、膜結合型ＩＬ－１７、膜結合型ＩＬ－２１、膜結合型ＩＬ－２、短縮型ＣＤ１９、それらの誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを発現する。

【0185】

いくつかの実施形態では、前記遺伝子改変細胞は、１つ以上のゲノム部位の破壊を含む。いくつかの実施形態では、前記遺伝子改変細胞は、１つ以上の内因性遺伝子の改変または欠失を含む。いくつかの実施形態では、前記内因性遺伝子は、免疫チェックポイント遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、前記内因性遺伝子は、ＣＩＳＨ、ＰＤ－１、またはその両方を含む。

【0186】

いくつかの実施形態では、前記遺伝子改変細胞の核は、導入遺伝子を含む。

【0187】

いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子は、細胞受容体、免疫学的チェックポイントタンパク質、サイトカイン、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される細胞受容体をコードする。いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子は、Ｔ細胞受容体をコードする。

【0188】

一態様では、ここで提供されるのは、遺伝子改変初代免疫細胞；ＤＮアーゼ；及び少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤を含む組成物である。

【0189】

いくつかの実施形態では、前記細胞集団の少なくとも一部の核は、ＤＮＡ二本鎖切断修復の少なくとも１つの外因的に添加されたモジュレーターを含む。いくつかの実施形態では、組成物は実質的に抗生物質を含まない培地である。

【0190】

いくつかの実施形態では、前記細胞集団は、初代細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記細胞集団は、初代免疫細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記組成物は、少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤は、約５０ＩＵ／ｍｌ～約１０００ＩＵ／ｍｌの濃度で存在する。

【0191】

いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、約５μｇ／ｍｌ～約１５μｇ／ｍｌの濃度で存在する。いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、ＤＮアーゼＩ、ベンゾナーゼ、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、マングビーンヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＢＡＬ３１、ＲＮアーゼＩ、Ｓ１ヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＪ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、制限酵素、及びそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、ＤＮアーゼＩを含む。

【0192】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復の前記少なくとも１つの外因的に添加されたモジュレーターは、ＮＡＣ、抗ＩＦＮＡＲ２抗体、またはその両方を含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加されたＤＮＡ二本鎖切断修復のモジュレーターは、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与するタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与するタンパク質は、Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＲＡＤ５１、ＲＳ－１、ＰＡＬＢ２、Ｎａｐ１、ｐ４００ ＡＴＰアーゼ、ＥＶＬ、ＮＡＣ、ＭＲＥ１１、ＲＡＤ５０、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５５、ＲＡＤ５７、ＲＡＤ５４、ＲＡＤ５４Ｂ、Ｓｒｓ２、ＮＢＳ１、Ｈ２ＡＸ、ＰＡＲＰ－１、ＲＡＤ１８、ＤＮＡ－ＰＫｃｓ、ＸＲＣＣ４、ＸＬＦ、Ａｒｔｅｍｉｓ、ＴｄＴ、ｐｏｌμ及びｐｏｌλ、ＡＴＭ、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ニブリン、ＣｔＩＰ、ＥＸＯ１、ＢＬＭ、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ１ｂ５５Ｋ、それらの相同体及び誘導体、Ｓｃｒ７、ならびにそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択されるタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与する前記少なくとも１つの外因的に添加されたタンパク質は、ＲＳ－１、ＲＡＤ５１、またはその両方を含む。

【0193】

いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤は、Ｂ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、４－１ＢＢＬ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ３ｍＡｂ、Ｓ－２－ヒドロキシグルタレート、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２８ｍＡｂ、ＣＤ１ｄ、抗ＣＤ２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－２１、ＩＬ－２、ＩＬ－７、短縮型ＣＤ１９、それらの誘導体、または任意の組み合わせ、を含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤は、前記細胞集団または前記細胞の少なくとも一部の増殖を刺激するように構成される。

【0194】

いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、Ｂ細胞、好塩基球、樹状細胞、好酸球、ガンマデルタＴ細胞、顆粒球、ヘルパーＴ細胞、ランゲルハンス細胞、リンパ球細胞、自然リンパ球（ＩＬＣ）、マクロファージ、マスト細胞、巨核球、メモリーＴ細胞、単球、骨髄細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、好中球、前駆体細胞、形質細胞、前駆細胞、制御性Ｔ細胞、Ｔ細胞、胸腺細胞、それらの分化もしくは脱分化細胞、またはそれらの細胞の任意の混合物もしくは組み合わせ、からなる群から選択される細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、初代Ｔ細胞を含む。

【0195】

いくつかの実施形態では、前記初代Ｔ細胞は、対象の血液試料から単離される。いくつかの実施形態では、前記対象はヒトである。いくつかの実施形態では、前記血液試料は、全血試料または分画血液試料である。いくつかの実施形態では、前記血液試料は、単離された末梢血単核細胞を含む。

【0196】

いくつかの実施形態では、前記初代Ｔ細胞は、ガンマデルタＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、メモリーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、エフェクターＴ細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0197】

いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、ＣＤ３＋細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、それらの分化もしくは脱分化細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0198】

いくつかの実施形態では、組成物は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記ＡＰＣは、前記ＴＩＬの増殖を刺激するように構成される。いくつかの実施形態では、前記ＡＰＣは、Ｂ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、４－１ＢＢＬ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ３ｍＡｂ、Ｓ－２－ヒドロキシグルタレート、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２８ｍＡｂ、ＣＤ１ｄ、抗－ＣＤ２、膜結合型ＩＬ－１５、膜結合型ＩＬ－１７、膜結合型ＩＬ－２１、膜結合型ＩＬ－２、短縮型ＣＤ１９、それらの誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを発現する。

【0199】

いくつかの実施形態では、前記遺伝子改変細胞は、１つ以上のゲノム部位の破壊を含む。いくつかの実施形態では、前記遺伝子改変細胞は、１つ以上の内因性遺伝子の改変または欠失を含む。いくつかの実施形態では、前記内因性遺伝子は、免疫チェックポイント遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、前記内因性遺伝子は、ＣＩＳＨ、ＰＤ－１、またはその両方を含む。

【0200】

いくつかの実施形態では、前記遺伝子改変細胞の核は、導入遺伝子を含む。

【0201】

いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子は、細胞受容体、免疫学的チェックポイントタンパク質、サイトカイン、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される細胞受容体をコードする。いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子は、Ｔ細胞受容体をコードする。

【0202】

一態様では、本明細書で提供されるのは、遺伝子改変初代免疫細胞；ＤＮアーゼ；及び約５０ＩＵ／ｍｌ～約１０００ＩＵ／ｍｌの濃度の少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤を含む組成物である。

【0203】

いくつかの実施形態では、前記細胞集団の少なくとも一部の核は、ＤＮＡ二本鎖切断修復の少なくとも１つの外因的に添加されたモジュレーターを含む。いくつかの実施形態では、組成物は実質的に抗生物質を含まない培地である。

【0204】

いくつかの実施形態では、前記細胞集団は、初代細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記細胞集団は、初代免疫細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記組成物は、少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤は、約５０ＩＵ／ｍｌ～約１０００ＩＵ／ｍｌの濃度で存在する。

【0205】

いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、約５μｇ／ｍｌ～約１５μｇ／ｍｌの濃度で存在する。いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、ＤＮアーゼＩ、ベンゾナーゼ、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、マングビーンヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＢＡＬ３１、ＲＮアーゼＩ、Ｓ１ヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＪ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、制限酵素、及びそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、ＤＮアーゼＩを含む。

【0206】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復の前記少なくとも１つの外因的に添加されたモジュレーターは、ＮＡＣ、抗ＩＦＮＡＲ２抗体、またはその両方を含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加されたＤＮＡ二本鎖切断修復のモジュレーターは、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与するタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与するタンパク質は、Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＲＡＤ５１、ＲＳ－１、ＰＡＬＢ２、Ｎａｐ１、ｐ４００ ＡＴＰアーゼ、ＥＶＬ、ＮＡＣ、ＭＲＥ１１、ＲＡＤ５０、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５５、ＲＡＤ５７、ＲＡＤ５４、ＲＡＤ５４Ｂ、Ｓｒｓ２、ＮＢＳ１、Ｈ２ＡＸ、ＰＡＲＰ－１、ＲＡＤ１８、ＤＮＡ－ＰＫｃｓ、ＸＲＣＣ４、ＸＬＦ、Ａｒｔｅｍｉｓ、ＴｄＴ、ｐｏｌμ及びｐｏｌλ、ＡＴＭ、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ニブリン、ＣｔＩＰ、ＥＸＯ１、ＢＬＭ、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ１ｂ５５Ｋ、それらの相同体及び誘導体、Ｓｃｒ７、ならびにそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択されるタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与する前記少なくとも１つの外因的に添加されたタンパク質は、ＲＳ－１、ＲＡＤ５１、またはその両方を含む。

【0207】

いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤は、Ｂ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、４－１ＢＢＬ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ３ｍＡｂ、Ｓ－２－ヒドロキシグルタレート、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２８ｍＡｂ、ＣＤ１ｄ、抗ＣＤ２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－２１、ＩＬ－２、ＩＬ－７、短縮型ＣＤ１９、それらの誘導体、または任意の組み合わせ、を含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤は、前記細胞集団または前記細胞の少なくとも一部の増殖を刺激するように構成される。

【0208】

いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、Ｂ細胞、好塩基球、樹状細胞、好酸球、ガンマデルタＴ細胞、顆粒球、ヘルパーＴ細胞、ランゲルハンス細胞、リンパ球細胞、自然リンパ球（ＩＬＣ）、マクロファージ、マスト細胞、巨核球、メモリーＴ細胞、単球、骨髄細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、好中球、前駆体細胞、形質細胞、前駆細胞、制御性Ｔ細胞、Ｔ細胞、胸腺細胞、それらの分化もしくは脱分化細胞、またはそれらの細胞の任意の混合物もしくは組み合わせ、からなる群から選択される細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、初代Ｔ細胞を含む。

【0209】

いくつかの実施形態では、前記初代Ｔ細胞は、対象の血液試料から単離される。いくつかの実施形態では、前記対象はヒトである。いくつかの実施形態では、前記血液試料は、全血試料または分画血液試料である。いくつかの実施形態では、前記血液試料は、単離された末梢血単核細胞を含む。

【0210】

いくつかの実施形態では、前記初代Ｔ細胞は、ガンマデルタＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、メモリーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、エフェクターＴ細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0211】

いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、ＣＤ３＋細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、それらの分化もしくは脱分化細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0212】

いくつかの実施形態では、組成物は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記ＡＰＣは、前記ＴＩＬの増殖を刺激するように構成される。いくつかの実施形態では、前記ＡＰＣは、Ｂ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、４－１ＢＢＬ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ３ｍＡｂ、Ｓ－２－ヒドロキシグルタレート、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２８ｍＡｂ、ＣＤ１ｄ、抗－ＣＤ２、膜結合型ＩＬ－１５、膜結合型ＩＬ－１７、膜結合型ＩＬ－２１、膜結合型ＩＬ－２、短縮型ＣＤ１９、それらの誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを発現する。

【0213】

いくつかの実施形態では、前記遺伝子改変細胞は、１つ以上のゲノム部位の破壊を含む。いくつかの実施形態では、前記遺伝子改変細胞は、１つ以上の内因性遺伝子の改変または欠失を含む。いくつかの実施形態では、前記内因性遺伝子は、免疫チェックポイント遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、前記内因性遺伝子は、ＣＩＳＨ、ＰＤ－１、またはその両方を含む。

【0214】

いくつかの実施形態では、前記遺伝子改変細胞の核は、導入遺伝子を含む。

【0215】

いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子は、細胞受容体、免疫学的チェックポイントタンパク質、サイトカイン、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される細胞受容体をコードする。いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子は、Ｔ細胞受容体をコードする。

【0216】

一態様では、本明細書で提供されるのは、操作された細胞の導入遺伝子発現を増加させる方法であって、初代免疫細胞の集団に導入遺伝子をコードする外因性ポリ核酸を導入し、それによって改変初代免疫細胞の集団を生成することと；改変初代免疫細胞の前記集団をＤＮアーゼ及び免疫刺激剤と接触させることであって；前記接触によって、前記ＤＮアーゼまたは前記免疫刺激剤のうちの１つだけが接触する改変初代免疫細胞の同等の集団と比較して、前記外因性ポリ核酸によってコードされる前記導入遺伝子を発現する細胞のパーセンテージの増加がもたらされる、接触させることと、を含む、方法である。

【0217】

いくつかの実施形態では、前記細胞集団の少なくとも一部の核は、ＤＮＡ二本鎖切断修復の少なくとも１つの外因的に添加されたモジュレーターを含む。いくつかの実施形態では、組成物は実質的に抗生物質を含まない培地である。

【0218】

いくつかの実施形態では、前記細胞は、初代細胞である。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤は、約５０ＩＵ／ｍｌ～約１０００ＩＵ／ｍｌの濃度で存在する。

【0219】

いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、約５μｇ／ｍｌ～約１５μｇ／ｍｌの濃度で添加される。いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、ＤＮアーゼＩ、ベンゾナーゼ、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、マングビーンヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＢＡＬ３１、ＲＮアーゼＩ、Ｓ１ヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＪ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、制限酵素、及びそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、ＤＮアーゼＩを含む。

【0220】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復の前記少なくとも１つの外因的に添加されたモジュレーターは、ＮＡＣ、抗ＩＦＮＡＲ２抗体、またはその両方を含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加されたＤＮＡ二本鎖切断修復のモジュレーターは、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与するタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与するタンパク質は、Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＲＡＤ５１、ＲＳ－１、ＰＡＬＢ２、Ｎａｐ１、ｐ４００ ＡＴＰアーゼ、ＥＶＬ、ＮＡＣ、ＭＲＥ１１、ＲＡＤ５０、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５５、ＲＡＤ５７、ＲＡＤ５４、Ｓｒｓ２、ＮＢＳ１、Ｈ２ＡＸ、ＰＡＲＰ－１、ＲＡＤ１８、ＤＮＡ－ＰＫｃｓ、ＸＲＣＣ４、ＸＬＦ、Ａｒｔｅｍｉｓ、ＴｄＴ、ｐｏｌμ及びｐｏｌλ、ＡＴＭ、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ニブリン、ＣｔＩＰ、ＥＸＯ１、ＢＬＭ、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ１ｂ５５Ｋ、それらの相同体及び誘導体、Ｓｃｒ７、ならびにそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択されるタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与する前記少なくとも１つの外因的に添加されたタンパク質は、ＲＳ－１、ＲＡＤ５１、またはその両方を含む。

【0221】

いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤は、Ｂ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、４－１ＢＢＬ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ３ｍＡｂ、Ｓ－２－ヒドロキシグルタレート、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２８ｍＡｂ、ＣＤ１ｄ、抗ＣＤ２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－２１、ＩＬ－２、ＩＬ－７、短縮型ＣＤ１９、それらの誘導体、または任意の組み合わせ、を含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤は、前記細胞集団または前記細胞の少なくとも一部の増殖を刺激するように構成される。

【0222】

いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、Ｂ細胞、好塩基球、樹状細胞、好酸球、ガンマデルタＴ細胞、顆粒球、ヘルパーＴ細胞、ランゲルハンス細胞、リンパ球細胞、自然リンパ球（ＩＬＣ）マクロファージ、マスト細胞、巨核球、メモリーＴ細胞、単球、骨髄細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、好中球、前駆体細胞、形質細胞、前駆細胞、制御性Ｔ細胞、Ｔ細胞、胸腺細胞、それらの分化もしくは脱分化細胞、またはそれらの細胞の任意の混合物もしくは組み合わせ、からなる群から選択される細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、初代Ｔ細胞を含む。

【0223】

いくつかの実施形態では、前記初代Ｔ細胞は、対象の血液試料から単離される。いくつかの実施形態では、前記対象はヒトである。いくつかの実施形態では、前記血液試料は、全血試料または分画血液試料である。いくつかの実施形態では、前記血液試料は、単離された末梢血単核細胞を含む。

【0224】

いくつかの実施形態では、前記初代Ｔ細胞は、ガンマデルタＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、メモリーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、エフェクターＴ細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0225】

いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、ＣＤ３＋細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、それらの分化もしくは脱分化細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0226】

いくつかの実施形態では、組成物は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記ＡＰＣは、前記ＴＩＬの増殖を刺激するように構成される。いくつかの実施形態では、前記ＡＰＣは、Ｂ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、４－１ＢＢＬ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ３ｍＡｂ、Ｓ－２－ヒドロキシグルタレート、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２８ｍＡｂ、ＣＤ１ｄ、抗－ＣＤ２、膜結合型ＩＬ－１５、膜結合型ＩＬ－１７、膜結合型ＩＬ－２１、膜結合型ＩＬ－２、短縮型ＣＤ１９、それらの誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを発現する。

【0227】

いくつかの実施形態では、前記遺伝子改変細胞は、１つ以上のゲノム部位の破壊を含む。いくつかの実施形態では、前記遺伝子改変細胞は、１つ以上の内因性遺伝子の改変または欠失を含む。いくつかの実施形態では、前記内因性遺伝子は、免疫チェックポイント遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、前記内因性遺伝子は、ＣＩＳＨ、ＰＤ－１、またはその両方を含む。いくつかの実施形態では、前記内因性遺伝子は、Ｔ細胞受容体遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、前記内因性遺伝子は、ＴＲＡＣ、ＴＣＲＢ、またはその両方を含む。いくつかの実施形態では、前記内因性遺伝子は、Ｔ細胞受容体遺伝子及び免疫チェックポイント遺伝子を含む。

【0228】

いくつかの実施形態では、前記遺伝子改変細胞の核は、導入遺伝子を含む。

【0229】

いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子は、細胞受容体、免疫学的チェックポイントタンパク質、サイトカイン、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される細胞受容体をコードする。いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子は、Ｔ細胞受容体をコードする。

【0230】

一態様では、本明細書で提供されるのは、操作された細胞の生存率を増加させる方法であって、初代免疫細胞の集団に導入遺伝子をコードする外因性ポリ核酸を導入し、それによって改変初代免疫細胞の集団を生成することと；改変初代免疫細胞の前記集団をＤＮアーゼ及び免疫刺激剤と接触させることであって；前記接触によって、前記ＤＮアーゼまたは前記免疫刺激剤のうちの１つだけが接触する改変初代免疫細胞の同等の集団と比較して、前記外因性ポリ核酸によってコードされる前記導入遺伝子を発現する生存細胞のパーセンテージの増加がもたらされる、接触させることと、を含む、方法である。

【0231】

いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼ及び前記免疫刺激剤との接触は、同時に起こる。

【0232】

いくつかの実施形態では、前記細胞集団の少なくとも一部の核は、ＤＮＡ二本鎖切断修復の少なくとも１つの外因的に添加されたモジュレーターを含む。いくつかの実施形態では、組成物は実質的に抗生物質を含まない培地である。

【0233】

いくつかの実施形態では、前記細胞は、初代細胞である。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤は、約５０ＩＵ／ｍｌ～約１０００ＩＵ／ｍｌの濃度で存在する。

【0234】

いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、約５μｇ／ｍｌ～約１５μｇ／ｍｌの濃度で添加される。いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、ＤＮアーゼＩ、ベンゾナーゼ、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、マングビーンヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＢＡＬ３１、ＲＮアーゼＩ、Ｓ１ヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＪ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、制限酵素、及びそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、ＤＮアーゼＩを含む。

【0235】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復の前記少なくとも１つの外因的に添加されたモジュレーターは、ＮＡＣ、抗ＩＦＮＡＲ２抗体、またはその両方を含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加されたＤＮＡ二本鎖切断修復のモジュレーターは、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与するタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与するタンパク質は、Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＲＡＤ５１、ＲＳ－１、ＰＡＬＢ２、Ｎａｐ１、ｐ４００ ＡＴＰアーゼ、ＥＶＬ、ＮＡＣ、ＭＲＥ１１、ＲＡＤ５０、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５５、ＲＡＤ５７、ＲＡＤ５４、ＲＡＤ５４Ｂ、Ｓｒｓ２、ＮＢＳ１、Ｈ２ＡＸ、ＰＡＲＰ－１、ＲＡＤ１８、ＤＮＡ－ＰＫｃｓ、ＸＲＣＣ４、ＸＬＦ、Ａｒｔｅｍｉｓ、ＴｄＴ、ｐｏｌμ及びｐｏｌλ、ＡＴＭ、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ニブリン、ＣｔＩＰ、ＥＸＯ１、ＢＬＭ、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ１ｂ５５Ｋ、それらの相同体及び誘導体、Ｓｃｒ７、ならびにそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択されるタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与する前記少なくとも１つの外因的に添加されたタンパク質は、ＲＳ－１、ＲＡＤ５１、またはその両方を含む。

【0236】

いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤は、Ｂ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、４－１ＢＢＬ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ３ｍＡｂ、Ｓ－２－ヒドロキシグルタレート、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２８ｍＡｂ、ＣＤ１ｄ、抗ＣＤ２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－２１、ＩＬ－２、ＩＬ－７、短縮型ＣＤ１９、それらの誘導体、または任意の組み合わせ、を含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤は、前記細胞集団または前記細胞の少なくとも一部の増殖を刺激するように構成される。

【0237】

いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、Ｂ細胞、好塩基球、樹状細胞、好酸球、ガンマデルタＴ細胞、顆粒球、ヘルパーＴ細胞、ランゲルハンス細胞、リンパ球細胞、自然リンパ球（ＩＬＣ）、マクロファージ、マスト細胞、巨核球、メモリーＴ細胞、単球、骨髄細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、好中球、前駆体細胞、形質細胞、前駆細胞、制御性Ｔ細胞、Ｔ細胞、胸腺細胞、それらの分化もしくは脱分化細胞、またはそれらの細胞の任意の混合物もしくは組み合わせ、からなる群から選択される細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、初代Ｔ細胞を含む。

【0238】

いくつかの実施形態では、前記初代Ｔ細胞は、対象の血液試料から単離される。いくつかの実施形態では、前記対象はヒトである。いくつかの実施形態では、前記血液試料は、全血試料または分画血液試料である。いくつかの実施形態では、前記血液試料は、単離された末梢血単核細胞を含む。

【0239】

いくつかの実施形態では、前記初代Ｔ細胞は、ガンマデルタＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、メモリーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、エフェクターＴ細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0240】

いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、ＣＤ３＋細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、それらの分化もしくは脱分化細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0241】

いくつかの実施形態では、組成物は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記ＡＰＣは、前記ＴＩＬの増殖を刺激するように構成される。いくつかの実施形態では、前記ＡＰＣは、Ｂ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、４－１ＢＢＬ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ３ｍＡｂ、Ｓ－２－ヒドロキシグルタレート、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２８ｍＡｂ、ＣＤ１ｄ、抗－ＣＤ２、膜結合型ＩＬ－１５、膜結合型ＩＬ－１７、膜結合型ＩＬ－２１、膜結合型ＩＬ－２、短縮型ＣＤ１９、それらの誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを発現する。

【0242】

いくつかの実施形態では、前記遺伝子改変細胞は、１つ以上のゲノム部位の破壊を含む。いくつかの実施形態では、前記遺伝子改変細胞は、１つ以上の内因性遺伝子の改変または欠失を含む。いくつかの実施形態では、前記内因性遺伝子は、免疫チェックポイント遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、前記内因性遺伝子は、ＣＩＳＨ、ＰＤ－１、ＴＲＡＣ、ＴＣＲＢ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0243】

いくつかの実施形態では、前記遺伝子改変細胞の核は、導入遺伝子を含む。

【0244】

いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子は、細胞受容体、免疫学的チェックポイントタンパク質、サイトカイン、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される細胞受容体をコードする。いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子は、Ｔ細胞受容体をコードする。

【0245】

一態様では、本明細書で提供されるのは、操作された細胞の細胞生存率を増加させる方法であって、初代免疫細胞の集団に導入遺伝子をコードする外因性ポリ核酸を導入し、それによって改変初代免疫細胞の集団を生成することと；改変初代免疫細胞の前記集団をＤＮアーゼと接触させることであって；前記接触によって、前記導入が行われるが、前記接触は行われない、改変初代免疫細胞の同等の集団と比較して、前記集団において前記外因性ポリ核酸によってコードされるような前記導入遺伝子を発現する生存細胞のパーセンテージの増加がもたらされる、接触させることと、を含む、方法である。

【0246】

いくつかの実施形態では、前記細胞集団の少なくとも一部の核は、ＤＮＡ二本鎖切断修復の少なくとも１つの外因的に添加されたモジュレーターを含む。いくつかの実施形態では、組成物は実質的に抗生物質を含まない培地である。

【0247】

いくつかの実施形態では、前記細胞は、初代細胞である。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤は、約５０ＩＵ／ｍｌ～約１０００ＩＵ／ｍｌの濃度で存在する。

【0248】

いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、約５μｇ／ｍｌ～約１５μｇ／ｍｌの濃度で添加される。いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、ＤＮアーゼＩ、ベンゾナーゼ、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、マングビーンヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＢＡＬ３１、ＲＮアーゼＩ、Ｓ１ヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＪ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、制限酵素、及びそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、ＤＮアーゼＩを含む。

【0249】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復の前記少なくとも１つの外因的に添加されたモジュレーターは、ＮＡＣ、抗ＩＦＮＡＲ２抗体、またはその両方を含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加されたＤＮＡ二本鎖切断修復のモジュレーターは、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与するタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与するタンパク質は、Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＲＡＤ５１、ＲＳ－１、ＰＡＬＢ２、Ｎａｐ１、ｐ４００ ＡＴＰアーゼ、ＥＶＬ、ＮＡＣ、ＭＲＥ１１、ＲＡＤ５０、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５５、ＲＡＤ５７、ＲＡＤ５４、ＲＡＤ５４Ｂ、Ｓｒｓ２、ＮＢＳ１、Ｈ２ＡＸ、ＰＡＲＰ－１、ＲＡＤ１８、ＤＮＡ－ＰＫｃｓ、ＸＲＣＣ４、ＸＬＦ、Ａｒｔｅｍｉｓ、ＴｄＴ、ｐｏｌμ及びｐｏｌλ、ＡＴＭ、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ニブリン、ＣｔＩＰ、ＥＸＯ１、ＢＬＭ、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ１ｂ５５Ｋ、それらの相同体及び誘導体、Ｓｃｒ７、ならびにそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択されるタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与する前記少なくとも１つの外因的に添加されたタンパク質は、ＲＳ－１、ＲＡＤ５１、またはその両方を含む。

【0250】

いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤は、Ｂ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、４－１ＢＢＬ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ３ｍＡｂ、Ｓ－２－ヒドロキシグルタレート、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２８ｍＡｂ、ＣＤ１ｄ、抗ＣＤ２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－２１、ＩＬ－２、ＩＬ－７、短縮型ＣＤ１９、それらの誘導体、または任意の組み合わせ、を含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤は、前記細胞集団または前記細胞の少なくとも一部の増殖を刺激するように構成される。

【0251】

いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、Ｂ細胞、好塩基球、樹状細胞、好酸球、ガンマデルタＴ細胞、顆粒球、ヘルパーＴ細胞、ランゲルハンス細胞、リンパ球細胞、自然リンパ球（ＩＬＣ）、マクロファージ、マスト細胞、巨核球、メモリーＴ細胞、単球、骨髄細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、好中球、前駆体細胞、形質細胞、前駆細胞、制御性Ｔ細胞、Ｔ細胞、胸腺細胞、それらの分化もしくは脱分化細胞、またはそれらの細胞の任意の混合物もしくは組み合わせ、からなる群から選択される細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、初代Ｔ細胞を含む。

【0252】

いくつかの実施形態では、前記初代Ｔ細胞は、対象の血液試料から単離される。いくつかの実施形態では、前記対象はヒトである。いくつかの実施形態では、前記血液試料は、全血試料または分画血液試料である。いくつかの実施形態では、前記血液試料は、単離された末梢血単核細胞を含む。

【0253】

いくつかの実施形態では、前記初代Ｔ細胞は、ガンマデルタＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、メモリーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、エフェクターＴ細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0254】

いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、ＣＤ３＋細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、それらの分化もしくは脱分化細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0255】

いくつかの実施形態では、組成物は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記ＡＰＣは、前記ＴＩＬの増殖を刺激するように構成される。いくつかの実施形態では、前記ＡＰＣは、Ｂ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、４－１ＢＢＬ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ３ｍＡｂ、Ｓ－２－ヒドロキシグルタレート、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２８ｍＡｂ、ＣＤ１ｄ、抗－ＣＤ２、膜結合型ＩＬ－１５、膜結合型ＩＬ－１７、膜結合型ＩＬ－２１、膜結合型ＩＬ－２、短縮型ＣＤ１９、それらの誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを発現する。

【0256】

いくつかの実施形態では、前記遺伝子改変細胞は、１つ以上のゲノム部位の破壊を含む。いくつかの実施形態では、前記遺伝子改変細胞は、１つ以上の内因性遺伝子の改変または欠失を含む。いくつかの実施形態では、前記内因性遺伝子は、免疫チェックポイント遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、前記内因性遺伝子は、ＣＩＳＨ、ＰＤ－１、ＴＲＡＣ、ＴＣＲＢ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0257】

いくつかの実施形態では、前記遺伝子改変細胞の核は、導入遺伝子を含む。

【0258】

いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子は、細胞受容体、免疫学的チェックポイントタンパク質、サイトカイン、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される細胞受容体をコードする。いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子は、Ｔ細胞受容体をコードする。

【0259】

一態様では、本明細書で提供されるのは、操作された細胞の導入遺伝子発現を増加させる方法であって、初代免疫細胞の集団に導入遺伝子をコードする外因性ポリ核酸を導入し、それによって改変初代免疫細胞の集団を生成することと；初代免疫細胞の前記集団をＤＮアーゼと接触させることであって；前記接触によって、前記導入が行われるが、前記接触は行われない、改変初代免疫細胞の同等の集団と比較して、前記外因性ポリ核酸によってコードされる前記導入遺伝子を発現する細胞のパーセンテージの増加がもたらされる、接触させることと、を含む、方法である。

【0260】

いくつかの実施形態では、前記細胞集団の少なくとも一部の核は、ＤＮＡ二本鎖切断修復の少なくとも１つの外因的に添加されたモジュレーターを含む。いくつかの実施形態では、組成物は実質的に抗生物質を含まない培地である。

【0261】

いくつかの実施形態では、前記細胞は、初代細胞である。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤は、約５０ＩＵ／ｍｌ～約１０００ＩＵ／ｍｌの濃度で存在する。

【0262】

いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、約５μｇ／ｍｌ～約１５μｇ／ｍｌの濃度で添加される。いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、ＤＮアーゼＩ、ベンゾナーゼ、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、マングビーンヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＢＡＬ３１、ＲＮアーゼＩ、Ｓ１ヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＪ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、制限酵素、及びそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、ＤＮアーゼＩを含む。

【0263】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復の前記少なくとも１つの外因的に添加されたモジュレーターは、ＮＡＣ、抗ＩＦＮＡＲ２抗体、またはその両方を含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加されたＤＮＡ二本鎖切断修復のモジュレーターは、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与するタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与するタンパク質は、Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＲＡＤ５１、ＲＳ－１、ＰＡＬＢ２、Ｎａｐ１、ｐ４００ ＡＴＰアーゼ、ＥＶＬ、ＮＡＣ、ＭＲＥ１１、ＲＡＤ５０、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５５、ＲＡＤ５７、ＲＡＤ５４、ＲＡＤ５４Ｂ、Ｓｒｓ２、ＮＢＳ１、Ｈ２ＡＸ、ＰＡＲＰ－１、ＲＡＤ１８、ＤＮＡ－ＰＫｃｓ、ＸＲＣＣ４、ＸＬＦ、Ａｒｔｅｍｉｓ、ＴｄＴ、ｐｏｌμ及びｐｏｌλ、ＡＴＭ、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ニブリン、ＣｔＩＰ、ＥＸＯ１、ＢＬＭ、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ１ｂ５５Ｋ、それらの相同体及び誘導体、Ｓｃｒ７、ならびにそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択されるタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与する前記少なくとも１つの外因的に添加されたタンパク質は、ＲＳ－１、ＲＡＤ５１、またはその両方を含む。

【0264】

いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤は、Ｂ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、４－１ＢＢＬ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ３ｍＡｂ、Ｓ－２－ヒドロキシグルタレート、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２８ｍＡｂ、ＣＤ１ｄ、抗ＣＤ２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－２１、ＩＬ－２、ＩＬ－７、短縮型ＣＤ１９、それらの誘導体、または任意の組み合わせ、を含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤は、前記細胞集団または前記細胞の少なくとも一部の増殖を刺激するように構成される。

【0265】

いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、Ｂ細胞、好塩基球、樹状細胞、好酸球、ガンマデルタＴ細胞、顆粒球、ヘルパーＴ細胞、ランゲルハンス細胞、リンパ球細胞、自然リンパ球（ＩＬＣ）、マクロファージ、マスト細胞、巨核球、メモリーＴ細胞、単球、骨髄細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、好中球、前駆体細胞、形質細胞、前駆細胞、制御性Ｔ細胞、Ｔ細胞、胸腺細胞、それらの分化もしくは脱分化細胞、またはそれらの細胞の任意の混合物もしくは組み合わせ、からなる群から選択される細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、初代Ｔ細胞を含む。

【0266】

いくつかの実施形態では、前記初代Ｔ細胞は、対象の血液試料から単離される。いくつかの実施形態では、前記対象はヒトである。いくつかの実施形態では、前記血液試料は、全血試料または分画血液試料である。いくつかの実施形態では、前記血液試料は、単離された末梢血単核細胞を含む。

【0267】

いくつかの実施形態では、前記初代Ｔ細胞は、ガンマデルタＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、メモリーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、エフェクターＴ細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0268】

いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、ＣＤ３＋細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、それらの分化もしくは脱分化細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0269】

いくつかの実施形態では、組成物は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記ＡＰＣは、前記ＴＩＬの増殖を刺激するように構成される。いくつかの実施形態では、前記ＡＰＣは、Ｂ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、４－１ＢＢＬ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ３ｍＡｂ、Ｓ－２－ヒドロキシグルタレート、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２８ｍＡｂ、ＣＤ１ｄ、抗－ＣＤ２、膜結合型ＩＬ－１５、膜結合型ＩＬ－１７、膜結合型ＩＬ－２１、膜結合型ＩＬ－２、短縮型ＣＤ１９、それらの誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを発現する。

【0270】

いくつかの実施形態では、前記遺伝子改変細胞は、１つ以上のゲノム部位の破壊を含む。いくつかの実施形態では、前記遺伝子改変細胞は、１つ以上の内因性遺伝子の改変または欠失を含む。いくつかの実施形態では、前記内因性遺伝子は、免疫チェックポイント遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、前記内因性遺伝子は、ＣＩＳＨ、ＰＤ－１、またはその両方を含む。いくつかの実施形態では、前記内因性遺伝子は、ＣＩＳＨ、ＰＤ－１、ＴＲＡＣ、ＴＣＲＢ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0271】

いくつかの実施形態では、前記遺伝子改変細胞の核は、導入遺伝子を含む。

【0272】

いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子は、細胞受容体、免疫学的チェックポイントタンパク質、サイトカイン、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される細胞受容体をコードする。いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子は、Ｔ細胞受容体をコードする。

【0273】

一態様では、本明細書で提供されるのは、操作された細胞の細胞生存率を増加させる方法であって、細胞の集団に、導入遺伝子をコードするミニサークルベクターまたは線形化二本鎖ＤＮＡコンストラクトを導入し、それによって改変細胞の集団を生成することと；改変細胞の前記集団をＤＮアーゼと接触させることであって；前記接触によって、前記導入が行われるが、前記接触は行われない、改変細胞の同等の集団と比較して、改変細胞の前記集団において生存細胞のパーセンテージの増加がもたらされる、接触させることと、を含む、方法である。

【0274】

いくつかの実施形態では、前記細胞集団の少なくとも一部の核は、ＤＮＡ二本鎖切断修復の少なくとも１つの外因的に添加されたモジュレーターを含む。いくつかの実施形態では、組成物は実質的に抗生物質を含まない培地である。

【0275】

いくつかの実施形態では、前記細胞は、初代細胞である。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤は、約５０ＩＵ／ｍｌ～約１０００ＩＵ／ｍｌの濃度で存在する。

【0276】

いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、約５μｇ／ｍｌ～約１５μｇ／ｍｌの濃度で添加される。いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、ＤＮアーゼＩ、ベンゾナーゼ、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、マングビーンヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＢＡＬ３１、ＲＮアーゼＩ、Ｓ１ヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＪ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、制限酵素、及びそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、ＤＮアーゼＩを含む。

【0277】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復の前記少なくとも１つの外因的に添加されたモジュレーターは、ＮＡＣ、抗ＩＦＮＡＲ２抗体、またはその両方を含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加されたＤＮＡ二本鎖切断修復のモジュレーターは、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与するタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与するタンパク質は、Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＲＡＤ５１、ＲＳ－１、ＰＡＬＢ２、Ｎａｐ１、ｐ４００ ＡＴＰアーゼ、ＥＶＬ、ＮＡＣ、ＭＲＥ１１、ＲＡＤ５０、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５５、ＲＡＤ５７、ＲＡＤ５４、ＲＡＤ５４Ｂ、Ｓｒｓ２、ＮＢＳ１、Ｈ２ＡＸ、ＰＡＲＰ－１、ＲＡＤ１８、ＤＮＡ－ＰＫｃｓ、ＸＲＣＣ４、ＸＬＦ、Ａｒｔｅｍｉｓ、ＴｄＴ、ｐｏｌμ及びｐｏｌλ、ＡＴＭ、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ニブリン、ＣｔＩＰ、ＥＸＯ１、ＢＬＭ、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ１ｂ５５Ｋ、それらの相同体及び誘導体、Ｓｃｒ７、ならびにそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択されるタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与する前記少なくとも１つの外因的に添加されたタンパク質は、ＲＳ－１、ＲＡＤ５１、またはその両方を含む。

【0278】

いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤は、Ｂ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、４－１ＢＢＬ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ３ｍＡｂ、Ｓ－２－ヒドロキシグルタレート、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２８ｍＡｂ、ＣＤ１ｄ、抗ＣＤ２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－２１、ＩＬ－２、ＩＬ－７、短縮型ＣＤ１９、それらの誘導体、または任意の組み合わせ、を含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤は、前記細胞集団または前記細胞の少なくとも一部の増殖を刺激するように構成される。

【0279】

いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、Ｂ細胞、好塩基球、樹状細胞、好酸球、ガンマデルタＴ細胞、顆粒球、ヘルパーＴ細胞、ランゲルハンス細胞、リンパ球細胞、自然リンパ球（ＩＬＣ）、マクロファージ、マスト細胞、巨核球、メモリーＴ細胞、単球、骨髄細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、好中球、前駆体細胞、形質細胞、前駆細胞、制御性Ｔ細胞、Ｔ細胞、胸腺細胞、それらの分化もしくは脱分化細胞、またはそれらの細胞の任意の混合物もしくは組み合わせ、からなる群から選択される細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、初代Ｔ細胞を含む。

【0280】

いくつかの実施形態では、前記初代Ｔ細胞は、対象の血液試料から単離される。いくつかの実施形態では、前記対象はヒトである。いくつかの実施形態では、前記血液試料は、全血試料または分画血液試料である。いくつかの実施形態では、前記血液試料は、単離された末梢血単核細胞を含む。

【0281】

いくつかの実施形態では、前記初代Ｔ細胞は、ガンマデルタＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、メモリーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、エフェクターＴ細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0282】

いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、ＣＤ３＋細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、それらの分化もしくは脱分化細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0283】

いくつかの実施形態では、組成物は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記ＡＰＣは、前記ＴＩＬの増殖を刺激するように構成される。いくつかの実施形態では、前記ＡＰＣは、Ｂ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、４－１ＢＢＬ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ３ｍＡｂ、Ｓ－２－ヒドロキシグルタレート、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２８ｍＡｂ、ＣＤ１ｄ、抗－ＣＤ２、膜結合型ＩＬ－１５、膜結合型ＩＬ－１７、膜結合型ＩＬ－２１、膜結合型ＩＬ－２、短縮型ＣＤ１９、それらの誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを発現する。

【0284】

いくつかの実施形態では、前記遺伝子改変細胞は、１つ以上のゲノム部位の破壊を含む。いくつかの実施形態では、前記遺伝子改変細胞は、１つ以上の内因性遺伝子の改変または欠失を含む。いくつかの実施形態では、前記内因性遺伝子は、免疫チェックポイント遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、前記内因性遺伝子は、ＣＩＳＨ、ＰＤ－１、またはその両方を含む。いくつかの実施形態では、前記内因性遺伝子は、ＣＩＳＨ、ＰＤ－１、ＴＲＡＣ、ＴＣＲＢ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0285】

いくつかの実施形態では、前記遺伝子改変細胞の核は、導入遺伝子を含む。

【0286】

いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子は、細胞受容体、免疫学的チェックポイントタンパク質、サイトカイン、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される細胞受容体をコードする。いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子は、Ｔ細胞受容体をコードする。

【0287】

一態様では、本明細書で提供されるのは、操作された細胞の組み込み効率を向上させる方法であって、細胞の集団に、導入遺伝子をコードするミニサークルベクターまたは線形化二本鎖ＤＮＡコンストラクトを導入し、それによって改変細胞の集団を生成することと；改変細胞の前記集団をＤＮアーゼと接触させることであって；前記接触によって、前記導入が行われるが、前記接触は行われない、改変細胞の同等の集団と比較して、前記ミニサークルベクターまたは前記線形化二本鎖ＤＮＡコンストラクトによってコードされる前記導入遺伝子を発現する細胞のパーセンテージの増加がもたらされる、接触させることと、を含む、方法である。

【0288】

いくつかの実施形態では、前記導入は、前記外因性ポリ核酸または前記ミニサークルベクターまたは前記線形化二本鎖ＤＮＡコンストラクトにより細胞の前記集団をエレクトロポレーションすることを含む。

【0289】

いくつかの実施形態では、前記細胞集団の少なくとも一部の核は、ＤＮＡ二本鎖切断修復の少なくとも１つの外因的に添加されたモジュレーターを含む。いくつかの実施形態では、組成物は実質的に抗生物質を含まない培地である。

【0290】

いくつかの実施形態では、前記細胞は、初代細胞である。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤は、約５０ＩＵ／ｍｌ～約１０００ＩＵ／ｍｌの濃度で存在する。

【0291】

いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、約５μｇ／ｍｌ～約１５μｇ／ｍｌの濃度で添加される。いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、ＤＮアーゼＩ、ベンゾナーゼ、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、マングビーンヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＢＡＬ３１、ＲＮアーゼＩ、Ｓ１ヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＪ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、制限酵素、及びそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、ＤＮアーゼＩを含む。

【0292】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復の前記少なくとも１つの外因的に添加されたモジュレーターは、ＮＡＣ、抗ＩＦＮＡＲ２抗体、またはその両方を含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加されたＤＮＡ二本鎖切断修復のモジュレーターは、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与するタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与するタンパク質は、Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＲＡＤ５１、ＲＳ－１、ＰＡＬＢ２、Ｎａｐ１、ｐ４００ ＡＴＰアーゼ、ＥＶＬ、ＮＡＣ、ＭＲＥ１１、ＲＡＤ５０、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５５、ＲＡＤ５７、ＲＡＤ５４、ＲＡＤ５４Ｂ、Ｓｒｓ２、ＮＢＳ１、Ｈ２ＡＸ、ＰＡＲＰ－１、ＲＡＤ１８、ＤＮＡ－ＰＫｃｓ、ＸＲＣＣ４、ＸＬＦ、Ａｒｔｅｍｉｓ、ＴｄＴ、ｐｏｌμ及びｐｏｌλ、ＡＴＭ、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ニブリン、ＣｔＩＰ、ＥＸＯ１、ＢＬＭ、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ１ｂ５５Ｋ、それらの相同体及び誘導体、Ｓｃｒ７、ならびにそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択されるタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与する前記少なくとも１つの外因的に添加されたタンパク質は、ＲＳ－１、ＲＡＤ５１、またはその両方を含む。

【0293】

いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤は、Ｂ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、４－１ＢＢＬ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ３ｍＡｂ、Ｓ－２－ヒドロキシグルタレート、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２８ｍＡｂ、ＣＤ１ｄ、抗ＣＤ２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－２１、ＩＬ－２、ＩＬ－７、短縮型ＣＤ１９、それらの誘導体、または任意の組み合わせ、を含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤は、前記細胞集団または前記細胞の少なくとも一部の増殖を刺激するように構成される。

【0294】

いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、Ｂ細胞、好塩基球、樹状細胞、好酸球、ガンマデルタＴ細胞、顆粒球、ヘルパーＴ細胞、ランゲルハンス細胞、リンパ球細胞、自然リンパ球（ＩＬＣ）、マクロファージ、マスト細胞、巨核球、メモリーＴ細胞、単球、骨髄細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、好中球、前駆体細胞、形質細胞、前駆細胞、制御性Ｔ細胞、Ｔ細胞、胸腺細胞、それらの分化もしくは脱分化細胞、またはそれらの細胞の任意の混合物もしくは組み合わせ、からなる群から選択される細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、初代Ｔ細胞を含む。

【0295】

いくつかの実施形態では、前記初代Ｔ細胞は、対象の血液試料から単離される。いくつかの実施形態では、前記対象はヒトである。いくつかの実施形態では、前記血液試料は、全血試料または分画血液試料である。いくつかの実施形態では、前記血液試料は、単離された末梢血単核細胞を含む。

【0296】

いくつかの実施形態では、前記初代Ｔ細胞は、ガンマデルタＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、メモリーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、エフェクターＴ細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0297】

いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、ＣＤ３＋細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、それらの分化もしくは脱分化細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0298】

いくつかの実施形態では、組成物は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記ＡＰＣは、前記ＴＩＬの増殖を刺激するように構成される。いくつかの実施形態では、前記ＡＰＣは、Ｂ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、４－１ＢＢＬ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ３ｍＡｂ、Ｓ－２－ヒドロキシグルタレート、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２８ｍＡｂ、ＣＤ１ｄ、抗－ＣＤ２、膜結合型ＩＬ－１５、膜結合型ＩＬ－１７、膜結合型ＩＬ－２１、膜結合型ＩＬ－２、短縮型ＣＤ１９、それらの誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを発現する。

【0299】

いくつかの実施形態では、前記遺伝子改変細胞は、１つ以上のゲノム部位の破壊を含む。いくつかの実施形態では、前記遺伝子改変細胞は、１つ以上の内因性遺伝子の改変または欠失を含む。いくつかの実施形態では、前記内因性遺伝子は、免疫チェックポイント遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、前記内因性遺伝子は、ＣＩＳＨ、ＰＤ－１、またはその両方を含む。いくつかの実施形態では、前記内因性遺伝子は、ＣＩＳＨ、ＰＤ－１、ＴＲＡＣ、ＴＣＲＢ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0300】

いくつかの実施形態では、前記遺伝子改変細胞の核は、導入遺伝子を含む。

【0301】

いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子は、細胞受容体、免疫学的チェックポイントタンパク質、サイトカイン、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される細胞受容体をコードする。いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子は、Ｔ細胞受容体をコードする。

【0302】

一態様では、本明細書で提供されるのは、初代細胞の集団をゲノム編集する方法であって、初代細胞の前記集団に、導入遺伝子をコードする外因性ポリ核酸を導入して二本鎖切断を生成し、それによって改変初代細胞の集団を生成することと；改変初代細胞の前記集団に、ＤＮＡ二本鎖切断修復のモジュレーターを導入することと；を含み、ここで、前記接触によって、前記導入が行われるが、前記接触は行われない、改変初代細胞の同等の集団と比較して、改変初代細胞の前記集団において、生存率のパーセント；または前記外因性ポリ核酸によってコードされる前記導入遺伝子の発現のパーセント、のうちの少なくとも１つが増加する、方法である。いくつかの実施形態では、前記細胞集団は、初代免疫細胞を含む。

【0303】

いくつかの実施形態では、前記細胞集団の少なくとも一部の核は、ＤＮＡ二本鎖切断修復の少なくとも１つの外因的に添加されたモジュレーターを含む。いくつかの実施形態では、組成物は実質的に抗生物質を含まない培地である。

【0304】

いくつかの実施形態では、前記細胞は、初代細胞である。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤は、約５０ＩＵ／ｍｌ～約１０００ＩＵ／ｍｌの濃度で存在する。

【0305】

いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、約５μｇ／ｍｌ～約１５μｇ／ｍｌの濃度で添加される。いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、ＤＮアーゼＩ、ベンゾナーゼ、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、マングビーンヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＢＡＬ３１、ＲＮアーゼＩ、Ｓ１ヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＪ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、制限酵素、及びそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、ＤＮアーゼＩを含む。

【0306】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復の前記少なくとも１つの外因的に添加されたモジュレーターは、ＮＡＣ、抗ＩＦＮＡＲ２抗体、またはその両方を含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加されたＤＮＡ二本鎖切断修復のモジュレーターは、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与するタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与するタンパク質は、Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＲＡＤ５１、ＲＳ－１、ＰＡＬＢ２、Ｎａｐ１、ｐ４００ ＡＴＰアーゼ、ＥＶＬ、ＮＡＣ、ＭＲＥ１１、ＲＡＤ５０、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５５、ＲＡＤ５７、ＲＡＤ５４、ＲＡＤ５４Ｂ、Ｓｒｓ２、ＮＢＳ１、Ｈ２ＡＸ、ＰＡＲＰ－１、ＲＡＤ１８、ＤＮＡ－ＰＫｃｓ、ＸＲＣＣ４、ＸＬＦ、Ａｒｔｅｍｉｓ、ＴｄＴ、ｐｏｌμ及びｐｏｌλ、ＡＴＭ、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ニブリン、ＣｔＩＰ、ＥＸＯ１、ＢＬＭ、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ１ｂ５５Ｋ、それらの相同体及び誘導体、Ｓｃｒ７、ならびにそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択されるタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与する前記少なくとも１つの外因的に添加されたタンパク質は、ＲＳ－１、ＲＡＤ５１、またはその両方を含む。

【0307】

いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤は、Ｂ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、４－１ＢＢＬ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ３ｍＡｂ、Ｓ－２－ヒドロキシグルタレート、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２８ｍＡｂ、ＣＤ１ｄ、抗ＣＤ２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－２１、ＩＬ－２、ＩＬ－７、短縮型ＣＤ１９、それらの誘導体、または任意の組み合わせ、を含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの外因的に添加された免疫刺激剤は、前記細胞集団または前記細胞の少なくとも一部の増殖を刺激するように構成される。

【0308】

いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、Ｂ細胞、好塩基球、樹状細胞、好酸球、ガンマデルタＴ細胞、顆粒球、ヘルパーＴ細胞、ランゲルハンス細胞、リンパ球細胞、自然リンパ球（ＩＬＣ）、マクロファージ、マスト細胞、巨核球、メモリーＴ細胞、単球、骨髄細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、好中球、前駆体細胞、形質細胞、前駆細胞、制御性Ｔ細胞、Ｔ細胞、胸腺細胞、それらの分化もしくは脱分化細胞、またはそれらの細胞の任意の混合物もしくは組み合わせ、からなる群から選択される細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、初代Ｔ細胞を含む。

【0309】

いくつかの実施形態では、前記初代Ｔ細胞は、対象の血液試料から単離される。いくつかの実施形態では、前記対象はヒトである。いくつかの実施形態では、前記血液試料は、全血試料または分画血液試料である。いくつかの実施形態では、前記血液試料は、単離された末梢血単核細胞を含む。

【0310】

いくつかの実施形態では、前記初代Ｔ細胞は、ガンマデルタＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、メモリーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、エフェクターＴ細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0311】

いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、ＣＤ３＋細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、それらの分化もしくは脱分化細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0312】

いくつかの実施形態では、組成物は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記ＡＰＣは、前記ＴＩＬの増殖を刺激するように構成される。いくつかの実施形態では、前記ＡＰＣは、Ｂ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、４－１ＢＢＬ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ３ｍＡｂ、Ｓ－２－ヒドロキシグルタレート、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２８ｍＡｂ、ＣＤ１ｄ、抗－ＣＤ２、膜結合型ＩＬ－１５、膜結合型ＩＬ－１７、膜結合型ＩＬ－２１、膜結合型ＩＬ－２、短縮型ＣＤ１９、それらの誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを発現する。

【0313】

いくつかの実施形態では、前記遺伝子改変細胞は、１つ以上のゲノム部位の破壊を含む。いくつかの実施形態では、前記遺伝子改変細胞は、１つ以上の内因性遺伝子の改変または欠失を含む。いくつかの実施形態では、前記内因性遺伝子は、免疫チェックポイント遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、前記内因性遺伝子は、ＣＩＳＨ、ＰＤ－１、ＴＲＡＣ、ＴＣＲＢ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0314】

いくつかの実施形態では、前記遺伝子改変細胞の核は、導入遺伝子を含む。

【0315】

いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子は、細胞受容体、免疫学的チェックポイントタンパク質、サイトカイン、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される細胞受容体をコードする。いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子は、Ｔ細胞受容体をコードする。

【0316】

一態様では、本明細書で提供されるのは、初代免疫細胞の集団をゲノム編集する方法であって、初代免疫細胞の前記集団をエレクトロポレーションして、ガイドポリ核酸；ガイド型ヌクレアーゼ；及び導入遺伝子をコードするミニサークルベクターまたは線形化二本鎖ＤＮＡコンストラクト、を導入して、それによって改変初代免疫細胞の集団を生成することと；改変初代免疫細胞の前記集団をＤＮアーゼ及び免疫刺激剤と接触させることであって；前記接触によって、前記エレクトロポレーションが行われるが、前記接触は行われない、改変初代免疫細胞の同等の集団と比較して、改変初代免疫細胞の前記集団において前記導入遺伝子を発現する生存細胞のパーセンテージの増加がもたらされる、接触させることと、を含む、方法である。

【0317】

いくつかの実施形態では、前記エレクトロポレーションは、前記細胞を、前記ガイド型ヌクレアーゼをコードするポリ核酸と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、前記ポリ核酸は、ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、前記ポリ核酸は、ｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、前記エレクトロポレーションは、前記細胞を前記ガイド型ヌクレアーゼと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、前記ガイド型ヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、それらの相同体、またはそれらの改変バージョン、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0318】

いくつかの実施形態では、前記ガイド型ヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質を含む。

【0319】

Ｃａｓタンパク質は、任意の好適な生物に由来し得る。非限定的な例としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅ ｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏ ｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、ＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃＨｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ種、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ種、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ種、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｃｓｃｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ種、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ種、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ種、Ｌｙｎｇｂｙａ種、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ種、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ、及びＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａが挙げられる。いくつかの態様では、生物は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）である。いくつかの態様では、生物は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）である。いくつかの態様では、生物は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）である。

【0320】

Ｃａｓタンパク質は、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ ａｔｙｐｉｃａｌ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ ａｌｏｃｉｓ、Ｓｏｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｏｏｒｅｉ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｔｕｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ ｄｕｅｒｄｅｎｉｉ、Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｔｓｕｏｋａｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ、Ｏｌｓｅｎｅｌｌａ ｕｌｉ、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ ｋｉｔａｈａｒａｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍｏｂｉｌｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｏｖｉｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃａｎｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｙｎｏｖｉａｅ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｃｔａｌｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｏｌｉｃｈｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ亜種Ｔｏｒｑｕｅｎｓ、Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｕｓ、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ、Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｎｔｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｍｉｎｕｔｕｍ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ ｇｌｏｂｕｓ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ亜種Ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｏｃｈｒａｃｅａ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｉｃａｎｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｏｌｕｍｎａｒｅ、Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ、Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｙｚｙｇｉｉ、Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｈｉｂａｅ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｈａｍｂｕｒｇｅｎｓｉｓ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ亜種Ｊｅｊｕｎｉ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｓｔｅｌａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ｅｂｒｅｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ亜種Ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ、ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｐａｒａｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｅｘｃｒｅｍｅｎｔｉｈｏｍｉｎｉｓ、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、及びＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ、を含むがこれらに限定されない様々な細菌種に由来し得る。

【0321】

本明細書で使用されるＣａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質の野生型または改変型であり得る。Ｃａｓタンパク質は、野生型もしくは改変Ｃａｓタンパク質の活性バリアント、不活性バリアント、または断片であり得る。Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質の野生型バージョンと比較して、欠失、挿入、置換、バリアント、変異、融合、キメラ、またはそれらの任意の組み合わせなどのアミノ酸変化を含むことができる。Ｃａｓタンパク質は、野生型の例示的なＣａｓタンパク質との少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性または配列類似性を有するポリペプチドであり得る。Ｃａｓタンパク質は、野生型の例示的なＣａｓタンパク質との最大約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％の配列同一性及び／または配列類似性を有するポリペプチドであり得る。バリアントまたは断片は、野生型もしくは改変Ｃａｓタンパク質またはその一部との少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性または配列類似性を含み得る。バリアントまたは断片は、核酸切断活性を欠いているが、ガイド核酸と複合体を形成して核酸遺伝子座を標的にすることができる。

【0322】

いくつかの実施形態では、前記Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１Ｓ、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、ＣｓＯ、Ｃｓｆ４、Ｃｐｆ１、ｃ２ｃ１、ｃ２ｃ３、Ｃａｓ９ＨｉＦｉ、それらの相同体、またはそれらの改変バージョンを含む。

【0323】

いくつかの実施形態では、前記ガイドポリ核酸は、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、前記ガイドポリ核酸は、ガイドＲＮＡを含む。

【0324】

いくつかの実施形態では、前記エレクトロポレーションは、前記集団初代ヒト細胞を、前記ガイドポリ核酸及び前記ガイド型ヌクレアーゼを含むガイド型リボ核タンパク質複合体と接触させることを含む。

【0325】

いくつかの実施形態では、前記ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。

【0326】

いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、約５μｇ／ｍｌ～約１５μｇ／ｍｌの濃度で存在する。

【0327】

いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、ＤＮアーゼＩ、ベンゾナーゼ、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、マングビーンヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＢＡＬ３１、ＲＮアーゼＩ、Ｓ１ヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＪ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、制限酵素、及びそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、ＤＮアーゼＩを含む。

【0328】

いくつかの実施形態では、前記接触は、改変初代細胞の前記集団を免疫刺激剤と接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記免疫刺激剤との前記接触によって、前記導入が行われるが、前記接触は行われない、改変初代細胞の同等の集団と比較して、改変初代細胞の前記集団において、生存率のパーセント；または前記外因性ポリ核酸によってコードされる前記導入遺伝子の発現のパーセント：のうちの少なくとも１つが増加する。いくつかの実施形態では、前記免疫刺激剤は、Ｂ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、４－１ＢＢＬ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ３ｍＡｂ、Ｓ－２－ヒドロキシグルタレート、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２８ｍＡｂ、ＣＤ１ｄ、抗ＣＤ２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－２１、ＩＬ－２、ＩＬ－７、短縮型ＣＤ１９、それらの誘導体、または任意の組み合わせ、を含む。いくつかの実施形態では、前記免疫刺激剤は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、前記免疫刺激剤は、約５０ＩＵ／ｍｌ～約１０００ＩＵ／ｍｌの濃度で存在する。いくつかの実施形態では、前記免疫刺激剤は、前記細胞集団または前記細胞の少なくとも一部の増殖を刺激するように構成される。いくつかの実施形態では、前記接触は、改変細胞の前記集団に、ＤＮＡ二本鎖切断修復のモジュレーターを導入することをさらに含む。

【0329】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復の前記モジュレーターの前記導入によって、前記導入が行われるが、前記接触は行われない、改変初代細胞の同等の集団と比較して、改変初代細胞の前記集団において、生存率のパーセント；または前記外因性ポリ核酸によってコードされる前記導入遺伝子の発現のパーセント：のうちの少なくとも１つが増加する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復の前記モジュレーターは、ＮＡＣ、抗ＩＦＮＡＲ２抗体、またはその両方を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復の前記モジュレーターは、ＤＮＡ二本鎖修復に関与するタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与する前記タンパク質は、Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＲＡＤ５１、ＲＳ－１、ＰＡＬＢ２、Ｎａｐ１、ｐ４００ ＡＴＰアーゼ、ＥＶＬ、ＮＡＣ、ＭＲＥ１１、ＲＡＤ５０、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５５、ＲＡＤ５７、ＲＡＤ５４、ＲＡＤ５４Ｂ、Ｓｒｓ２、ＮＢＳ１、Ｈ２ＡＸ、ＰＡＲＰ－１、ＲＡＤ１８、ＤＮＡ－ＰＫｃｓ、ＸＲＣＣ４、ＸＬＦ、Ａｒｔｅｍｉｓ、ＴｄＴ、ｐｏｌμ及びｐｏｌλ、ＡＴＭ、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ニブリン、ＣｔＩＰ、ＥＸＯ１、ＢＬＭ、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ１ｂ５５Ｋ、それらの相同体及び誘導体、Ｓｃｒ７、ならびにそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択されるタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡに関与する前記タンパク質は、ＲＳ－１、ＲＡＤ５１、またはその両方を含む。

【0330】

いくつかの実施形態では、前記接触は、実質的に抗生物質を含まない培地において、改変初代細胞の前記集団と接触することを含む。いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、Ｂ細胞、好塩基球、樹状細胞、好酸球、ガンマデルタＴ細胞、顆粒球、ヘルパーＴ細胞、ランゲルハンス細胞、リンパ球細胞、自然リンパ球（ＩＬＣ）、マクロファージ、マスト細胞、巨核球、メモリーＴ細胞、単球、骨髄細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、好中球、前駆体細胞、形質細胞、前駆細胞、制御性Ｔ細胞、Ｔ細胞、胸腺細胞、それらの分化もしくは脱分化細胞、またはそれらの細胞の任意の混合物もしくは組み合わせ、からなる群から選択される細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、初代Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記初代Ｔ細胞は、対象の血液試料から単離される。いくつかの実施形態では、前記対象はヒトである。いくつかの実施形態では、前記血液試料は、全血試料または分画血液試料である。いくつかの実施形態では、前記血液試料は、単離された末梢血単核細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記初代Ｔ細胞は、ガンマデルタＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、メモリーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、エフェクターＴ細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、ＣＤ３＋細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、それらの分化もしくは脱分化細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0331】

いくつかの実施形態では、前記接触は、共培養されたＡＰＣの存在下で前記ＴＩＬと接触することを含む。いくつかの実施形態では、前記ＡＰＣは、前記ＴＩＬの増殖を刺激するように構成される。いくつかの実施形態では、前記ＡＰＣは、Ｂ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、４－１ＢＢＬ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ３ｍＡｂ、Ｓ－２－ヒドロキシグルタレート、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２８ｍＡｂ、ＣＤ１ｄ、抗－ＣＤ２、膜結合型ＩＬ－１５、膜結合型ＩＬ－１７、膜結合型ＩＬ－２１、膜結合型ＩＬ－２、短縮型ＣＤ１９、それらの誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを発現する。いくつかの実施形態では、前記導入は、初代細胞の前記集団の少なくとも一部の１つ以上のゲノム部位を破壊することを含み、これにより改変初代細胞の前記集団がもたらされる。

【0332】

いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子は、細胞受容体、免疫学的チェックポイントタンパク質、サイトカイン、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子は、Ｔ細胞受容体をコードする。

【0333】

いくつかの実施形態では、前記導入は、初代細胞の前記集団の少なくとも一部の１つ以上の内因性遺伝子を改変するまたは欠失させることを含み、これにより改変初代細胞の前記集団がもたらされる。いくつかの実施形態では、前記内因性遺伝子は、免疫チェックポイント遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、前記内因性遺伝子は、ＰＤ－１を含む。

【0334】

一態様では、本明細書で提供されるのは、初代免疫細胞の集団をゲノム編集する方法であって、ａ）初代ヒト細胞の前記集団をエレクトロポレーションして、ガイドポリ核酸；ガイド型ヌクレアーゼ；及び導入遺伝子をコードするミニサークルベクターまたは線形化二本鎖ＤＮＡコンストラクト：を導入して、それによって改変初代免疫細胞の集団を生成することと；改変初代免疫細胞の前記集団をＤＮアーゼ及び免疫刺激剤と接触させることであって；前記接触によって、前記エレクトロポレーションが行われるが、前記接触は行われない、改変初代免疫細胞の同等の集団と比較して、前記ミニサークルベクターまたは前記線形化二本鎖ＤＮＡコンストラクトによってコードされる前記導入遺伝子を発現する細胞のパーセンテージの増加がもたらされる、接触させることと、を含む、方法である。

【0335】

いくつかの実施形態では、前記エレクトロポレーションは、前記細胞を、前記ガイド型ヌクレアーゼをコードするポリ核酸と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、前記ポリ核酸は、ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、前記ポリ核酸は、ｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、前記エレクトロポレーションは、前記細胞を前記ガイド型ヌクレアーゼと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、前記ガイド型ヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、それらの相同体、またはそれらの改変バージョン、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0336】

いくつかの実施形態では、前記ガイド型ヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、前記Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１Ｓ、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、ＣｓＯ、Ｃｓｆ４、Ｃｐｆ１、ｃ２ｃ１、ｃ２ｃ３、Ｃａｓ９ＨｉＦｉ、それらの相同体、またはそれらの改変バージョンを含む。

【0337】

いくつかの実施形態では、前記ガイドポリ核酸は、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、前記ガイドポリ核酸は、ガイドＲＮＡを含む。

【0338】

いくつかの実施形態では、前記エレクトロポレーションは、前記集団初代ヒト細胞を、前記ガイドポリ核酸及び前記ガイド型ヌクレアーゼを含むガイド型リボ核タンパク質複合体と接触させることを含む。

【0339】

いくつかの実施形態では、前記ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。

【0340】

いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、約５μｇ／ｍｌ～約１５μｇ／ｍｌの濃度で存在する。

【0341】

いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、ＤＮアーゼＩ、ベンゾナーゼ、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、マングビーンヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＢＡＬ３１、ＲＮアーゼＩ、Ｓ１ヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＪ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、制限酵素、及びそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、ＤＮアーゼＩを含む。

【0342】

いくつかの実施形態では、前記接触は、改変初代細胞の前記集団を免疫刺激剤と接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記免疫刺激剤との前記接触によって、前記導入が行われるが、前記接触は行われない、改変初代細胞の同等の集団と比較して、改変初代細胞の前記集団において、生存率のパーセント；または前記外因性ポリ核酸によってコードされる前記導入遺伝子の発現のパーセント：のうちの少なくとも１つが増加する。いくつかの実施形態では、前記免疫刺激剤は、Ｂ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、４－１ＢＢＬ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ３ｍＡｂ、Ｓ－２－ヒドロキシグルタレート、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２８ｍＡｂ、ＣＤ１ｄ、抗ＣＤ２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－２１、ＩＬ－２、ＩＬ－７、短縮型ＣＤ１９、それらの誘導体、または任意の組み合わせ、を含む。いくつかの実施形態では、前記免疫刺激剤は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、前記免疫刺激剤は、約５０ＩＵ／ｍｌ～約１０００ＩＵ／ｍｌの濃度で存在する。いくつかの実施形態では、前記免疫刺激剤は、前記細胞集団または前記細胞の少なくとも一部の増殖を刺激するように構成される。いくつかの実施形態では、前記接触は、改変細胞の前記集団に、ＤＮＡ二本鎖切断修復のモジュレーターを導入することをさらに含む。

【0343】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復の前記モジュレーターの前記導入によって、前記導入が行われるが、前記接触は行われない、改変初代細胞の同等の集団と比較して、改変初代細胞の前記集団において、生存率のパーセント；または前記外因性ポリ核酸によってコードされる前記導入遺伝子の発現のパーセント：のうちの少なくとも１つが増加する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復の前記モジュレーターは、ＮＡＣ、抗ＩＦＮＡＲ２抗体、またはその両方を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復のモジュレーターは、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与するタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与する前記タンパク質は、Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＲＡＤ５１、ＲＳ－１、ＰＡＬＢ２、Ｎａｐ１、ｐ４００ ＡＴＰアーゼ、ＥＶＬ、ＮＡＣ、ＭＲＥ１１、ＲＡＤ５０、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５５、ＲＡＤ５７、ＲＡＤ５４、ＲＡＤ５４Ｂ、Ｓｒｓ２、ＮＢＳ１、Ｈ２ＡＸ、ＰＡＲＰ－１、ＲＡＤ１８、ＤＮＡ－ＰＫｃｓ、ＸＲＣＣ４、ＸＬＦ、Ａｒｔｅｍｉｓ、ＴｄＴ、ｐｏｌμ及びｐｏｌλ、ＡＴＭ、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ニブリン、ＣｔＩＰ、ＥＸＯ１、ＢＬＭ、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ１ｂ５５Ｋ、それらの相同体及び誘導体、Ｓｃｒ７、ならびにそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択されるタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡに関与する前記タンパク質は、ＲＳ－１、ＲＡＤ５１、またはその両方を含む。

【0344】

いくつかの実施形態では、前記接触は、実質的に抗生物質を含まない培地において、改変初代細胞の前記集団を接触させることを含む。いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、Ｂ細胞、好塩基球、樹状細胞、好酸球、ガンマデルタＴ細胞、顆粒球、ヘルパーＴ細胞、ランゲルハンス細胞、リンパ球細胞、自然リンパ球（ＩＬＣ）、マクロファージ、マスト細胞、巨核球、メモリーＴ細胞、単球、骨髄細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、好中球、前駆体細胞、形質細胞、前駆細胞、制御性Ｔ細胞、Ｔ細胞、胸腺細胞、それらの分化もしくは脱分化細胞、またはそれらの細胞の任意の混合物もしくは組み合わせ、からなる群から選択される細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、初代Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記初代Ｔ細胞は、対象の血液試料から単離される。いくつかの実施形態では、前記対象はヒトである。いくつかの実施形態では、前記血液試料は、全血試料または分画血液試料である。いくつかの実施形態では、前記血液試料は、単離された末梢血単核細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記初代Ｔ細胞は、ガンマデルタＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、メモリーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、エフェクターＴ細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、ＣＤ３＋細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、それらの分化もしくは脱分化細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0345】

いくつかの実施形態では、前記接触は、共培養されたＡＰＣの存在下で前記ＴＩＬを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、前記ＡＰＣは、前記ＴＩＬの増殖を刺激するように構成される。いくつかの実施形態では、前記ＡＰＣは、Ｂ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、４－１ＢＢＬ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ３ｍＡｂ、Ｓ－２－ヒドロキシグルタレート、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２８ｍＡｂ、ＣＤ１ｄ、抗－ＣＤ２、膜結合型ＩＬ－１５、膜結合型ＩＬ－１７、膜結合型ＩＬ－２１、膜結合型ＩＬ－２、短縮型ＣＤ１９、それらの誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを発現する。いくつかの実施形態では、前記導入は、初代細胞の前記集団の少なくとも一部の１つ以上のゲノム部位を破壊することを含み、これにより改変初代細胞の前記集団がもたらされる。

【0346】

いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子は、細胞受容体、免疫学的チェックポイントタンパク質、サイトカイン、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子は、Ｔ細胞受容体をコードする。

【0347】

いくつかの実施形態では、前記導入は、初代細胞の前記集団の少なくとも一部の１つ以上の内因性遺伝子を改変するまたは欠失させることを含み、これにより改変初代細胞の前記集団がもたらされる。いくつかの実施形態では、前記内因性遺伝子は、免疫チェックポイント遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、前記内因性遺伝子は、ＰＤ－１を含む。

【0348】

一態様では、本明細書で提供されるのは、細胞をエレクトロポレーションする方法であって、ガイド型ヌクレアーゼを前記細胞に導入するための第１のエレクトロポレーションステップと；遺伝子の少なくとも一部に相補的な領域を含むガイドポリ核酸；及び細胞受容体配列を含む外因性ポリ核酸を導入し、それによって改変細胞を生成することを含む、第２のエレクトロポレーションステップと、を含み、前記改変細胞は、ａ）及びｂ）からなる単一のエレクトロポレーションを含む同等の細胞と比較して、細胞受容体配列を含む前記外因性ポリ核酸の組み込みのパーセンテージの増加；または生存率のパーセンテージの増加、のうちの少なくとも１つを有する、方法である。

【0349】

いくつかの実施形態では、前記第１のエレクトロポレーションステップは、前記細胞を、前記ガイド型ヌクレアーゼをコードするポリ核酸と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、前記ポリ核酸は、ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、前記ポリ核酸は、ｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、前記第１のエレクトロポレーションステップは、前記細胞を前記ガイド型ヌクレアーゼと接触させることを含む。

【0350】

いくつかの実施形態では、前記エレクトロポレーションは、前記細胞を、前記ガイド型ヌクレアーゼをコードするポリ核酸と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、前記ポリ核酸は、ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、前記ポリ核酸は、ｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、前記エレクトロポレーションは、前記細胞を前記ガイド型ヌクレアーゼと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、前記ガイド型ヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、それらの相同体、またはそれらの改変バージョン、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0351】

いくつかの実施形態では、前記ガイド型ヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、前記Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１Ｓ、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、ＣｓＯ、Ｃｓｆ４、Ｃｐｆ１、ｃ２ｃ１、ｃ２ｃ３、Ｃａｓ９ＨｉＦｉ、それらの相同体、またはそれらの改変バージョンを含む。

【0352】

いくつかの実施形態では、前記ガイドポリ核酸は、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、前記ガイドポリ核酸は、ガイドＲＮＡを含む。

【0353】

いくつかの実施形態では、前記エレクトロポレーションは、前記集団初代ヒト細胞を、前記ガイドポリ核酸及び前記ガイド型ヌクレアーゼを含むガイド型リボ核タンパク質複合体と接触させることを含む。

【0354】

いくつかの実施形態では、前記ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。

【0355】

いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、約５μｇ／ｍｌ～約１５μｇ／ｍｌの濃度で存在する。

【0356】

いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、ＤＮアーゼＩ、ベンゾナーゼ、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、マングビーンヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＢＡＬ３１、ＲＮアーゼＩ、Ｓ１ヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＪ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、制限酵素、及びそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、ＤＮアーゼＩを含む。

【0357】

いくつかの実施形態では、前記接触は、改変初代細胞の前記集団を免疫刺激剤と接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記免疫刺激剤との前記接触によって、前記導入が行われるが、前記接触は行われない、改変初代細胞の同等の集団と比較して、改変初代細胞の前記集団において、生存率のパーセント；または前記外因性ポリ核酸によってコードされる前記導入遺伝子の発現のパーセント：のうちの少なくとも１つが増加する。いくつかの実施形態では、前記免疫刺激剤は、Ｂ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、４－１ＢＢＬ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ３ｍＡｂ、Ｓ－２－ヒドロキシグルタレート、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２８ｍＡｂ、ＣＤ１ｄ、抗ＣＤ２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－２１、ＩＬ－２、ＩＬ－７、短縮型ＣＤ１９、それらの誘導体、または任意の組み合わせ、を含む。いくつかの実施形態では、前記免疫刺激剤は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、前記免疫刺激剤は、約５０ＩＵ／ｍｌ～約１０００ＩＵ／ｍｌの濃度で存在する。いくつかの実施形態では、前記免疫刺激剤は、前記細胞集団または前記細胞の少なくとも一部の増殖を刺激するように構成される。いくつかの実施形態では、前記接触は、改変細胞の前記集団に、ＤＮＡ二本鎖切断修復のモジュレーターを導入することをさらに含む。

【0358】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復の前記モジュレーターの前記導入によって、前記導入が行われるが、前記接触は行われない、改変初代細胞の同等の集団と比較して、改変初代細胞の前記集団において、生存率のパーセント；または前記外因性ポリ核酸によってコードされる前記導入遺伝子の発現のパーセント：のうちの少なくとも１つが増加する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復の前記モジュレーターは、ＮＡＣ、抗ＩＦＮＡＲ２抗体、またはその両方を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復のモジュレーターは、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与するタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与する前記タンパク質は、Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＲＡＤ５１、ＲＳ－１、ＰＡＬＢ２、Ｎａｐ１、ｐ４００ ＡＴＰアーゼ、ＥＶＬ、ＮＡＣ、ＭＲＥ１１、ＲＡＤ５０、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５５、ＲＡＤ５７、ＲＡＤ５４、ＲＡＤ５４Ｂ、Ｓｒｓ２、ＮＢＳ１、Ｈ２ＡＸ、ＰＡＲＰ－１、ＲＡＤ１８、ＤＮＡ－ＰＫｃｓ、ＸＲＣＣ４、ＸＬＦ、Ａｒｔｅｍｉｓ、ＴｄＴ、ｐｏｌμ及びｐｏｌλ、ＡＴＭ、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ニブリン、ＣｔＩＰ、ＥＸＯ１、ＢＬＭ、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ１ｂ５５Ｋ、それらの相同体及び誘導体、Ｓｃｒ７、ならびにそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択されるタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡに関与する前記タンパク質は、ＲＳ－１、ＲＡＤ５１、またはその両方を含む。

【0359】

いくつかの実施形態では、前記接触は、実質的に抗生物質を含まない培地において、改変初代細胞の前記集団を接触させることを含む。いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、Ｂ細胞、好塩基球、樹状細胞、好酸球、ガンマデルタＴ細胞、顆粒球、ヘルパーＴ細胞、ランゲルハンス細胞、リンパ球細胞、自然リンパ球（ＩＬＣ）、マクロファージ、マスト細胞、巨核球、メモリーＴ細胞、単球、骨髄細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、好中球、前駆体細胞、形質細胞、前駆細胞、制御性Ｔ細胞、Ｔ細胞、胸腺細胞、それらの分化もしくは脱分化細胞、またはそれらの細胞の任意の混合物もしくは組み合わせ、からなる群から選択される細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、初代Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記初代Ｔ細胞は、対象の血液試料から単離される。いくつかの実施形態では、前記対象はヒトである。いくつかの実施形態では、前記血液試料は、全血試料または分画血液試料である。いくつかの実施形態では、前記血液試料は、単離された末梢血単核細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記初代Ｔ細胞は、ガンマデルタＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、メモリーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、エフェクターＴ細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、ＣＤ３＋細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、それらの分化もしくは脱分化細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0360】

いくつかの実施形態では、前記接触は、共培養されたＡＰＣの存在下で前記ＴＩＬを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、前記ＡＰＣは、前記ＴＩＬの増殖を刺激するように構成される。いくつかの実施形態では、前記ＡＰＣは、Ｂ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、４－１ＢＢＬ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ３ｍＡｂ、Ｓ－２－ヒドロキシグルタレート、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２８ｍＡｂ、ＣＤ１ｄ、抗－ＣＤ２、膜結合型ＩＬ－１５、膜結合型ＩＬ－１７、膜結合型ＩＬ－２１、膜結合型ＩＬ－２、短縮型ＣＤ１９、それらの誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを発現する。いくつかの実施形態では、前記導入は、初代細胞の前記集団の少なくとも一部の１つ以上のゲノム部位を破壊することを含み、これにより改変初代細胞の前記集団がもたらされる。

【0361】

いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子は、細胞受容体、免疫学的チェックポイントタンパク質、サイトカイン、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子は、Ｔ細胞受容体をコードする。

【0362】

いくつかの実施形態では、前記導入は、初代細胞の前記集団の少なくとも一部の１つ以上の内因性遺伝子を改変するまたは欠失させることを含み、これにより改変初代細胞の前記集団がもたらされる。いくつかの実施形態では、前記内因性遺伝子は、免疫チェックポイント遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、前記内因性遺伝子は、ＰＤ－１を含む。

【0363】

一態様では、本明細書で提供されるのは、細胞をエレクトロポレーションする方法であって、ガイド型リボ核タンパク質複合体を前記細胞に導入するための第１のエレクトロポレーションステップと；外因性ポリ核酸を導入し、それによって改変細胞を生成することを含む第２のエレクトロポレーションステップと；を含み、前記改変された細胞は、ａ）及びｂ）からなる単一のエレクトロポレーションを含む同等の細胞と比較して、細胞受容体配列を含む前記外因性ポリ核酸の組み込みのパーセンテージの増加；または生存率のパーセンテージの増加：のうちの少なくとも１つを有する、方法である。

【0364】

いくつかの実施形態では、前記外因性ポリ核酸は、線状化二本鎖ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、前記エレクトロポレーションは、前記細胞を、前記ガイド型ヌクレアーゼをコードするポリ核酸と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、前記ポリ核酸は、ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、前記ポリ核酸は、ｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、前記エレクトロポレーションは、前記細胞を前記ガイド型ヌクレアーゼと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、前記ガイド型ヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、それらの相同体、またはそれらの改変バージョン、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0365】

いくつかの実施形態では、前記ガイド型ヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、前記Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１Ｓ、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、ＣｓＯ、Ｃｓｆ４、Ｃｐｆ１、ｃ２ｃ１、ｃ２ｃ３、Ｃａｓ９ＨｉＦｉ、それらの相同体、またはそれらの改変バージョンを含む。

【0366】

いくつかの実施形態では、前記ガイドポリ核酸は、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、前記ガイドポリ核酸は、ガイドＲＮＡを含む。

【0367】

いくつかの実施形態では、前記エレクトロポレーションは、前記集団初代ヒト細胞を、前記ガイドポリ核酸及び前記ガイド型ヌクレアーゼを含むガイド型リボ核タンパク質複合体と接触させることを含む。

【0368】

いくつかの実施形態では、前記ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。

【0369】

いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、約５μｇ／ｍｌ～約１５μｇ／ｍｌの濃度で存在する。

【0370】

いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、ＤＮアーゼＩ、ベンゾナーゼ、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、マングビーンヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＢＡＬ３１、ＲＮアーゼＩ、Ｓ１ヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＪ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、制限酵素、及びそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記ＤＮアーゼは、ＤＮアーゼＩを含む。

【0371】

いくつかの実施形態では、前記接触は、改変初代細胞の前記集団を免疫刺激剤と接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記免疫刺激剤との前記接触によって、前記導入が行われるが、前記接触は行われない、改変初代細胞の同等の集団と比較して、改変初代細胞の前記集団において、生存率のパーセント；または前記外因性ポリ核酸によってコードされる前記導入遺伝子の発現のパーセント：のうちの少なくとも１つが増加する。いくつかの実施形態では、前記免疫刺激剤は、Ｂ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、４－１ＢＢＬ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ３ｍＡｂ、Ｓ－２－ヒドロキシグルタレート、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２８ｍＡｂ、ＣＤ１ｄ、抗ＣＤ２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－２１、ＩＬ－２、ＩＬ－７、短縮型ＣＤ１９、それらの誘導体、または任意の組み合わせ、を含む。いくつかの実施形態では、前記免疫刺激剤は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、前記免疫刺激剤は、約５０ＩＵ／ｍｌ～約１０００ＩＵ／ｍｌの濃度で存在する。いくつかの実施形態では、前記免疫刺激剤は、前記細胞集団または前記細胞の少なくとも一部の増殖を刺激するように構成される。いくつかの実施形態では、前記接触は、改変細胞の前記集団に、ＤＮＡ二本鎖切断修復のモジュレーターを導入することをさらに含む。

【0372】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復の前記モジュレーターの前記導入によって、前記導入が行われるが、前記接触は行われない、改変初代細胞の同等の集団と比較して、改変初代細胞の前記集団において、生存率のパーセント；または前記外因性ポリ核酸によってコードされる前記導入遺伝子の発現のパーセント：のうちの少なくとも１つが増加する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復の前記モジュレーターは、ＮＡＣ、抗ＩＦＮＡＲ２抗体、またはその両方を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復のモジュレーターは、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与するタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与する前記タンパク質は、Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＲＡＤ５１、ＲＳ－１、ＰＡＬＢ２、Ｎａｐ１、ｐ４００ ＡＴＰアーゼ、ＥＶＬ、ＮＡＣ、ＭＲＥ１１、ＲＡＤ５０、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５５、ＲＡＤ５７、ＲＡＤ５４、ＲＡＤ５４Ｂ、Ｓｒｓ２、ＮＢＳ１、Ｈ２ＡＸ、ＰＡＲＰ－１、ＲＡＤ１８、ＤＮＡ－ＰＫｃｓ、ＸＲＣＣ４、ＸＬＦ、Ａｒｔｅｍｉｓ、ＴｄＴ、ｐｏｌμ及びｐｏｌλ、ＡＴＭ、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ニブリン、ＣｔＩＰ、ＥＸＯ１、ＢＬＭ、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ１ｂ５５Ｋ、それらの相同体及び誘導体、Ｓｃｒ７、ならびにそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択されるタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡに関与する前記タンパク質は、ＲＳ－１、ＲＡＤ５１、またはその両方を含む。

【0373】

いくつかの実施形態では、前記接触は、実質的に抗生物質を含まない培地において、改変初代細胞の前記集団を接触させることを含む。いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、Ｂ細胞、好塩基球、樹状細胞、好酸球、ガンマデルタＴ細胞、顆粒球、ヘルパーＴ細胞、ランゲルハンス細胞、リンパ球細胞、自然リンパ球（ＩＬＣ）、マクロファージ、マスト細胞、巨核球、メモリーＴ細胞、単球、骨髄細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、好中球、前駆体細胞、形質細胞、前駆細胞、制御性Ｔ細胞、Ｔ細胞、胸腺細胞、それらの分化もしくは脱分化細胞、またはそれらの細胞の任意の混合物もしくは組み合わせ、からなる群から選択される細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、初代Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記初代Ｔ細胞は、対象の血液試料から単離される。いくつかの実施形態では、前記対象はヒトである。いくつかの実施形態では、前記血液試料は、全血試料または分画血液試料である。いくつかの実施形態では、前記血液試料は、単離された末梢血単核細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記初代Ｔ細胞は、ガンマデルタＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、メモリーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、エフェクターＴ細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、ＣＤ３＋細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記初代免疫細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、それらの分化もしくは脱分化細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0374】

いくつかの実施形態では、前記接触は、共培養されたＡＰＣの存在下で前記ＴＩＬを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、前記ＡＰＣは、前記ＴＩＬの増殖を刺激するように構成される。いくつかの実施形態では、前記ＡＰＣは、Ｂ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、４－１ＢＢＬ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ３ｍＡｂ、Ｓ－２－ヒドロキシグルタレート、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２８ｍＡｂ、ＣＤ１ｄ、抗－ＣＤ２、膜結合型ＩＬ－１５、膜結合型ＩＬ－１７、膜結合型ＩＬ－２１、膜結合型ＩＬ－２、短縮型ＣＤ１９、それらの誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを発現する。いくつかの実施形態では、前記導入は、初代細胞の前記集団の少なくとも一部の１つ以上のゲノム部位を破壊することを含み、これにより改変初代細胞の前記集団がもたらされる。

【0375】

いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子は、細胞受容体、免疫学的チェックポイントタンパク質、サイトカイン、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子は、Ｔ細胞受容体をコードする。

【0376】

いくつかの実施形態では、前記導入は、初代細胞の前記集団の少なくとも一部の１つ以上の内因性遺伝子を改変するまたは欠失させることを含み、これにより改変初代細胞の前記集団がもたらされる。いくつかの実施形態では、前記内因性遺伝子は、免疫チェックポイント遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、前記内因性遺伝子は、ＰＤ－１を含む。

【0377】

一態様では、本明細書で提供されるのは、がんを治療する方法であって、本明細書に記載の組成物または本明細書に記載の方法によって生成された改変細胞の集団を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法である。いくつかの実施形態では、前記対象は、前記治療を必要としている。いくつかの実施形態では、前記対象は、がんまたは腫瘍と診断されている。いくつかの実施形態では、前記対象はヒトである。いくつかの実施形態では、前記投与は、前記組成物または改変細胞の前記集団を前記対象の血管に注入することを含む。

【0378】

本明細書で提供されるのは、ＢＬＡＳＴによって決定される配列番号８１または配列番号８４の少なくとも一部と、少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を含む配列を含む操作されたポリヌクレオチドである。

【0379】

本明細書で提供されるのはまた、ＢＬＡＳＴによって決定される配列番号７９または配列番号８２の少なくとも一部と、少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を含む操作されたポリヌクレオチドである。

【0380】

本明細書で提供されるのは、操作されたポリヌクレオチドを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）である。ＲＮＰは、エンドヌクレアーゼをさらに含むことができる。いくつかの態様において、エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを含む。

【0381】

本明細書で提供されるのは、操作されたポリヌクレオチド及び／またはＲＮＰを含む細胞である。

【0382】

本明細書で提供されるのは、操作された細胞を含む細胞の集団である。

【0383】

本明細書で提供されるのはまた、容器内に操作されたポリヌクレオチド及び／またはリボヌクレオタンパク質を含むキットである。

【図面の簡単な説明】

【0384】

【図1】Ａ～Ｃは、免疫細胞ゲノムに挿入配列を導入するための概略図を提供する。Ａは、ポリヌクレオチドコンストラクトを示す。Ｃ１及びＣ２は、ヌクレアーゼによる切断の標的となる配列、例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼによる切断のためのガイドＲＮＡによって標的とされる配列を表す。Ｃ１及びＣ２は、同じ配列であっても異なる配列であってもよい。Ｈ１及びＨ２は相同性アーム配列を表す。「挿入」は、ゲノムに挿入される配列を表す。コンストラクトは、図１Ｂに示されるゲノムの標的部位に挿入されるように設計されている。Ｃ３は、ヌクレアーゼによる切断の標的となる配列を表し、これは、Ｃ１及び／またはＣ２と同じ配列であっても異なる配列であってもよい。ＢにおけるＨ１及びＨ２は、ポリヌクレオチドコンストラクトにおけるＨ１及びＨ２に相同なゲノムの配列を表す。Ｃは、本開示の方法による挿入配列の導入後のゲノムを示している。

【0385】

【図2】ヌクレアーゼまたはガイドＲＮＡを用いない実験条件において、挿入ＴＣＲ配列がゲノムに組み込まれていないこと、または細胞によって発現されていないことを示す実験結果を提供する。各列は条件を表す。各行は、異なるドナーから得られた試料を表す。ｙ軸はＣＤ３染色からの蛍光を表し、Ｘ軸は挿入ＴＣＲの染色からの蛍光を表す。数値は、象限内にある生細胞のパーセンテージを表す。条件１は、モック処理細胞である。条件２は、１０００ｂｐの相同性アームを有するＤＮＡミニサークルベクターを受ける細胞である。条件３は、４８ｂｐの相同性アームを有するＤＮＡミニサークルベクターを受ける細胞である。

【0386】

【図3】１０００塩基対の相同性アーム（条件４及び５）を使用した実験条件と比較して、４８塩基対の相同性アーム及びミニサークル標的指向性ガイドＲＮＡ（条件６及び７）を使用した実験条件では、より高い割合及び数の細胞が挿入ＴＣＲを発現することを示す。各列は条件を表す。各行は、異なるドナー由来の試料を表す。ｙ軸はＣＤ３染色からの蛍光を表し、Ｘ軸は挿入ＴＣＲの染色からの蛍光を表す。数値は、象限内にある生細胞のパーセンテージを表す。

【0387】

【図4】種々の実験条件から挿入ＴＣＲを発現する生細胞のパーセンテージを示す。２つのドナーから処理された試料についてのデータが提示され、ドナーごとに２つの技術的複製がある。結果は、１０００塩基対の相同性アーム（条件４及び５）を使用した実験条件と比較して、４８塩基対の相同性アーム及びミニサークル標的指向性ガイドＲＮＡ（条件６及び７）を使用した実験条件では、より高い割合及び数の細胞が挿入ＴＣＲを発現することを示す。条件１は、モック処理細胞である。条件２は、１０００ｂｐの相同性アームを有するＤＮＡミニサークルベクターを受けているが、ガイドＲＮＡもヌクレアーゼも受けていない細胞である。条件３は、４８ｂｐの相同性アームを有するＤＮＡミニサークルベクターを受けているが、ガイドＲＮＡもヌクレアーゼも受けていない細胞である。

【0388】

【図5】種々の実験条件からＧＦＰレポーターを発現する生細胞のパーセンテージを示す。２つのドナーから処理された試料についてのデータが提示され、ドナーごとに３つの技術的複製がある。条件１は、モック処理細胞である。条件２は、１０００ｂｐの相同性アームを有するＤＮＡミニサークルベクターを受けているが、ガイドＲＮＡもヌクレアーゼも受けていない細胞である。条件３は、４８ｂｐの相同性アームを有するＤＮＡミニサークルベクターを受けているが、ガイドＲＮＡもヌクレアーゼも受けていない細胞である。条件４及び５は、１０００ｂｐの相同性アームを有するＤＮＡミニサークルベクター、ミニサークル標的指向性ガイドＲＮＡ、及びヌクレアーゼを受けた細胞である。条件６及び７は、４８ｂｐの相同性アームを有するＤＮＡミニサークルベクター、ミニサークル標的指向性ガイドＲＮＡ、及びヌクレアーゼを受けた細胞である。結果は、一本鎖アニーリングを含む方法を使用した効率的な免疫細胞ゲノム編集を示す。

【0389】

【図6】Ａ～Ｅは、２つの相同性アーム及び２つの切断部位を有するポリヌクレオチドコンストラクトを含む本開示の方法で免疫細胞ゲノムを編集するための概略図を提供する。Ａは、ポリヌクレオチドコンストラクトを示す。Ｃ１及びＣ２は、ヌクレアーゼによる切断の標的となる配列、例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼによる切断のためのガイドＲＮＡによって標的とされる配列を表す。Ｃ１及びＣ２は、同じ配列であっても異なる配列であってもよい。Ｈ１及びＨ２は相同性アーム配列を表す。「（挿入）」は、２つの相同性アームの間の介在配列を表し、これは存在していても不存在であってもよい。コンストラクトは、Ｂに示されるゲノムの標的部位に挿入するように設計されている。Ｂは、免疫細胞ゲノムにおける標的部位を示している。Ｃ３は、ヌクレアーゼによる切断の標的となる配列を表し、これは、Ｃ１及び／またはＣ２と同じ配列であっても異なる配列であってもよい。ＢのＨ１及びＨ２は、ポリヌクレオチドコンストラクト中のＨ１及びＨ２に相同なゲノム内の配列を表す。Ｃは、Ｃ１及びＣ２で切断され、二本鎖切断の部位から５’切除を受け、Ｈ１及びＨ２相同性アームの一本鎖配列を露出させたＡのポリヌクレオチドコンストラクトを表す。Ｄは、Ｃ３で切断されたＡからの免疫細胞ゲノム中の部位を表す。二本鎖切断によって露出された各末端は、５’切除を受け、Ｈ１及びＨ２相同性アームの配列に相同な一本鎖配列を露出させている。Ｅは、ポリ核酸コンストラクトまたはその一部を修復鋳型として使用してゲノムを修復した（例えば、一本鎖アニーリング、相同性媒介末端結合、マイクロホモロジー媒介末端結合、代替末端結合、相同性組換え修復（ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｐａｉｒ）、相同組換え、またはそれらの組み合わせを含む経路を介した修復）後のゲノムを表す。

【0390】

【図7】Ａ～Ｅは、１つの相同性アーム及び１つの切断部位を有するポリヌクレオチドコンストラクトを含む本開示の方法で免疫細胞ゲノムを編集するための概略図を提供する。Ａは、ポリヌクレオチドコンストラクトを示す。Ｃ１は、ヌクレアーゼによる切断の標的となる配列、例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼによる切断のためのガイドＲＮＡによって標的とされる配列を表す。Ｈ１は相同性アーム配列を表す。「（挿入）」は、２つの相同性アームの間に介在配列を表し、これは存在していても不存在であってもよい。コンストラクトは、Ｂに示されるゲノムの標的部位に挿入するように設計されている。Ｂは、免疫細胞ゲノムにおける標的部位を示している。Ｃ２は、ヌクレアーゼによる切断の標的となる配列を表し、これは、Ｃ１と同じ配列であっても異なる配列であってもよい。ＢのＨ１は、ポリヌクレオチドコンストラクト中のＨ１に相同なゲノム内の配列を表す。Ｃは、Ｃ１で切断され、二本鎖切断の部位から５’切除を受け、Ｈ１相同性アームの一本鎖配列を露出させたＡのポリヌクレオチドコンストラクトを表す。Ｄは、Ｃ２で切断された図７Ａからの免疫細胞ゲノム中の部位を表す。二本鎖切断によって露出された末端は、５’切除を受け、Ｈ１相同性アームの配列に相同な一本鎖配列を露出させている。Ｅは、ポリ核酸コンストラクトまたはその一部を修復鋳型として使用してゲノムを修復した（例えば、一本鎖アニーリング、相同性媒介末端結合、マイクロホモロジー媒介末端結合、代替末端結合、相同組換え修復、相同組換え、またはそれらの組み合わせを含む経路を介した修復）後のゲノムを表す。

【0391】

【図8】Ａ～Ｅは、２つの相同性アーム及び２つの切断部位を有するポリヌクレオチドコンストラクトを含み、免疫細胞ゲノムに２つの二本鎖切断を導入する（例えば、大きな欠失を促進するための）本開示の方法で免疫細胞ゲノムを編集するための概略図を提供する。図８Ａは、ポリヌクレオチドコンストラクトを示す。Ｃ１及びＣ２は、ヌクレアーゼによる切断の標的となる配列、例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼによる切断のためのガイドＲＮＡによって標的とされる配列を表す。Ｃ１及びＣ２は、同じ配列であっても異なる配列であってもよい。Ｈ１及びＨ２は相同性アーム配列を表す。「（ｉ）」は、２つの相同性アームの間に介在配列を表し、これは存在していても不存在であってもよい。コンストラクトは、挿入されたときに免疫細胞の２つの標的部位を架橋し、それによって、挿入がある場合またはない場合において、免疫細胞ゲノムに欠失を生成するためのものである。図８Ｂは、免疫細胞ゲノムにおける２つの標的部位を示している。Ｃ３及びＣ３は、ヌクレアーゼによる切断の標的となる配列を表し、これらのそれぞれは、Ｃ１及び／またはＣ２と同じ配列であっても異なる配列（複数可）であってもよい。ＢのＨ１及びＨ２は、ポリヌクレオチドコンストラクト中のＨ１及びＨ２に相同なゲノム内の配列を表す。Ｃは、Ｃ１及びＣ２で切断され、二本鎖切断の部位から５’切除を受け、Ｈ１及びＨ２相同性アームの一本鎖配列を露出させたＡのポリヌクレオチドコンストラクトを表す。Ｄは、Ｃ３及びＣ４で切断された図８Ａからの免疫細胞ゲノム中の部位を表す。二本鎖切断によって露出された各末端は、５’切除を受け、Ｈ１及びＨ２相同性アームの配列に相同な一本鎖配列を露出している。図８Ｅは、ポリ核酸コンストラクトまたはその一部を修復鋳型として使用してゲノムを修復した（例えば、一本鎖アニーリング、相同性媒介末端結合、マイクロホモロジー媒介末端結合、代替末端結合、相同組換え修復、相同組換え、またはそれらの組み合わせを含む経路を介した修復）後のゲノムを表す。

【0392】

【図9】Ａ～Ｃは、１つの相同性アーム及び１つの切断部位を含むポリヌクレオチドコンストラクトを使用して、免疫細胞ゲノムに挿入配列を導入するための概略図を提供する。Ａは、ポリヌクレオチドコンストラクトを示す。Ｃ１は、ヌクレアーゼによる切断の標的となる配列、例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼによる切断のためのガイドＲＮＡによって標的とされる配列を表す。Ｈ１は相同性アーム配列を表す。「挿入」は、ゲノムに挿入される配列を表す。コンストラクトは、Ｂに示されるゲノムの標的部位に挿入するように設計されている。Ｃ２は、ヌクレアーゼによる切断の標的となる配列を表し、これは、Ｃ１と同じ配列であっても異なる配列であってもよい。ＢにおけるＨ１は、ポリヌクレオチドコンストラクトにおけるＨ１に相同なゲノムの配列を表す。Ｃは、本開示の方法による挿入配列の導入後のゲノムを示している。

【0393】

【図10】Ａ～Ｃは、本開示の免疫細胞ゲノムを編集するための概略図を提供する（例えば、小さなインデルを導入する）。Ａは、ポリヌクレオチドコンストラクトを示す。Ｃ１及びＣ２は、ヌクレアーゼによる切断の標的となる配列、例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼによる切断のためのガイドＲＮＡによって標的とされる配列を表す。Ｃ１及びＣ２は、同じ配列であっても異なる配列であってもよい。Ｈ１及びＨ２は相同性アーム配列を表す。コンストラクトは、Ｂに表されるゲノム内の標的部位の修復鋳型として機能するように設計されている。Ｃ３は、ヌクレアーゼによる切断の標的となる配列を表し、これは、Ｃ１及び／またはＣ２と同じ配列であっても異なる配列であってもよい。ＢにおけるＨ１及びＨ２は、ポリヌクレオチドコンストラクトにおけるＨ１及びＨ２に相同なゲノムの配列を表す。は、本開示の方法による挿入配列の導入後のゲノムを示している。

【0394】

【図11】Ａ～Ｃは、１つの相同性アーム及び１つの切断部位を含むポリヌクレオチドコンストラクトを使用して、本開示の免疫細胞ゲノムを編集するための概略図を提供する（例えば、小さなインデルを導入する）。Ａは、ポリヌクレオチドコンストラクトを示す。Ｃ１は、ヌクレアーゼによる切断の標的となる配列、例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼによる切断のためのガイドＲＮＡによって標的とされる配列を表す。Ｈ１は相同性アーム配列を表す。コンストラクトは、Ｂに表される免疫細胞ゲノム内の標的部位の修復鋳型として機能するように設計されている。Ｃ２は、ヌクレアーゼによる切断の標的となる配列を表し、これは、Ｃ１と同じ配列であっても異なる配列であってもよい。ＢにおけるＨ１は、ポリヌクレオチドコンストラクトにおけるＨ１に相同なゲノムの配列を表す。Ｃは、本開示の方法による挿入配列の導入後のゲノムを示している。

【0395】

【図12】Ａ～Ｃは、２つの相同性アーム及び２つの切断部位を有するポリヌクレオチドコンストラクトを含み、免疫細胞ゲノムに２つの二本鎖切断を導入する（例えば、欠失を促進するための）、本開示の方法で免疫細胞ゲノムに挿入配列を導入するための概略図を提供する。Ａは、ポリヌクレオチドコンストラクトを示す。Ｃ１及びＣ２は、ヌクレアーゼによる切断の標的となる配列、例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼによる切断のためのガイドＲＮＡによって標的とされる配列を表す。Ｃ１及びＣ２は、同じ配列であっても異なる配列であってもよい。Ｈ１及びＨ２は相同性アーム配列を表す。「挿入」は、ゲノムに挿入される配列を表す。コンストラクトは、Ｂに示されるゲノムの標的部位に挿入するように設計されている。Ｃ３及びＣ４は、ヌクレアーゼによる切断の標的となる配列を表し、これらのそれぞれは、Ｃ１及び／またはＣ２と同じ配列であっても異なる配列であってもよい。ＢにおけるＨ１及びＨ２は、ポリヌクレオチドコンストラクトにおけるＨ１及びＨ２に相同なゲノムの配列を表す。Ｃは、本開示の方法による挿入配列の導入後のゲノムを示している。

【0396】

【図13】Ａ～Ｃは、２つの相同性アーム及び２つの切断部位を有するポリヌクレオチドコンストラクトを含み、免疫細胞ゲノムに２つの二本鎖切断を導入する（例えば、欠失を促進するための）本開示の方法で免疫細胞ゲノムに欠失を生成するための概略図を提供する。Ａは、ポリヌクレオチドコンストラクトを示す。Ｃ１及びＣ２は、ヌクレアーゼによる切断の標的となる配列、例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼによる切断のためのガイドＲＮＡによって標的とされる配列を表す。Ｃ１及びＣ２は、同じ配列であっても異なる配列であってもよい。Ｈ１及びＨ２は相同性アーム配列を表す。コンストラクトは、Ｂに表される免疫細胞内の標的部位の修復鋳型として機能するように設計されている。Ｃ３及びＣ４は、ヌクレアーゼによる切断の標的となる配列を表し、これらのそれぞれは、Ｃ１及び／またはＣ２と同じ配列であっても異なる配列であってもよい。ＢのＨ１及びＨ２は、ポリヌクレオチドコンストラクト中のＨ１及びＨ２に相同なゲノム内の配列を表す。Ｃは、本開示の方法によって免疫細胞ゲノム中のＨ１及びＨ２にまたがる配列の欠失を生成するための修復鋳型としてのポリヌクレオチドコンストラクトの使用後のゲノムを示している。

【0397】

【図14】培養培地中のＤＮアーゼの存在下または非存在下での、６ウェルディッシュ中のプラスミドドナーベクターを用いた活性化Ｔ細胞培養物のエレクトロポレーションの２４時間後に撮影された画像を示す。この図は、ＤＮアーゼの非存在下で細胞の凝集を明確に示しているが、ＤＮアーゼを含む培養物では細胞の凝集は見られなかった。

【0398】

【図15A】培養培地中のＤＮアーゼの存在下または非存在下でのプラスミドのエレクトロポレーションの２４時間後のトランスフェクトされた細胞の回復パーセントを示す。図２Ｂは、各条件における回復パーセントを定量化するグラフである。両方の図は、ＤＮアーゼを含まない培養と比較して、ＤＮアーゼを含む培養においてトランスフェクションが増加した後のリンパ球の生存率を示す。

【図15B】ＤＮアーゼ処理を用いる場合または用いない場合における、０日目または１日目のプラスミドドナーのエレクトロポレーション後１４日目のＧＦＰ＋細胞の発現パーセントを示す。ＤＮアーゼを含まない培養と比較して、ＤＮアーゼを含む培養において導入遺伝子の組み込みが増加したことを示す。

【図15C】ＤＮアーゼ処理を用いる場合または用いない場合における、０日目または１日目のプラスミドドナーのエレクトロポレーション後１４日目のＧＦＰ＋細胞の発現パーセントを示す。

【図15D】ＤＮアーゼ処理を用いる場合または用いない場合における、０日目または１日目のプラスミドドナーのエレクトロポレーション後１４日目のｍＴＣＲ＋細胞の発現率を示す。ＤＮアーゼを含まない培養と比較して、ＤＮアーゼを含む培養において導入遺伝子の組み込みが増加したことを示す。

【0399】

【図16】Ａは、ＲＳ１、ＤＮアーゼ、またはＲＳ１及びＤＮアーゼの存在下または非存在下での、０日目または１日目のプラスミドドナー、Ｃａｓ９、ｇＲＮＡのエレクトロポレーション後１４日目のＧＦＰ＋細胞の発現パーセントを示す。Ｂは、ＲＳ１、ＤＮアーゼ、またはＲＳ１及びＤＮアーゼの存在下または非存在下での、０日目または１日目のプラスミドドナー、Ｃａｓ９、ｇＲＮＡのエレクトロポレーション後１４日目のｍＴＣＲ＋細胞の発現パーセントを示す。結果は、ＲＳ１、及び／またはＤｎアーゼ処理による導入遺伝子発現の増加を示す。

【0400】

【図17】Ａは、パルス（対照）、Ｃａｓ９及びｇＲＮＡ、ドナー（ＧＦＰ）、ドナー及びＤＮアーゼ、またはドナー、ＤＮアーゼ、及びＲＳ－１による刺激後０日目にエレクトロポレーションされたＴ細胞の７日目のＧＦＰ発現パーセントを示す。Ｂは、パルス（対照）、Ｃａｓ９及びｇＲＮＡ、ドナー（ＧＦＰ）、ドナー及びＤＮアーゼ、またはドナー、ＤＮアーゼ、及びＲＳ－１（トランスフェクション後のみ）による刺激後０日目にエレクトロポレーションされたＴ細胞の７日目のｍＴＣＲ発現パーセントを示す。Ｃは、パルス（対照）、Ｃａｓ９及びｇＲＮＡ、ドナー（ＧＦＰ）、ドナー及びＤＮアーゼ、またはドナー、ＤＮアーゼ、及びＲＳ－１（トランスフェクション後またはトランスフェクション前とトランスフェクション後の両方）による刺激後１日目にエレクトロポレーションされたＴ細胞の７日目のＧＦＰ発現を示す。Ｄは、パルス（対照）、Ｃａｓ９及びｇＲＮＡ、ドナー（ＧＦＰ）、ドナー及びＤＮアーゼ、またはドナー、ＤＮアーゼ、及びＲＳ－１（トランスフェクション後またはトランスフェクション前とトランスフェクション後の両方）による刺激後１日目にエレクトロポレーションされたＴ細胞の７日目のｍＴＣＲ発現を示す。結果は、ＲＳ１、及び／またはＤＮアーゼ処理による導入遺伝子発現の増加を示す。

【0401】

【図18】Ａは、パルス（対照）、Ｃａｓ９及びｇＲＮＡ、ドナー（ＧＦＰまたはｍＴＣＲ）、ドナー及びＤＮアーゼ、またはドナー、ＤＮアーゼ、及びＲＳ－１（トランスフェクション後のみ）による刺激後０日目にエレクトロポレーションされたＴ細胞の１４日目のＧＦＰまたはｍＴＣＲ発現パーセントを示す。Ｂは、パルス（対照）、Ｃａｓ９及びｇＲＮＡ、ドナー（ＧＦＰまたはｍＴＣＲ）、ドナー及びＤＮアーゼ、またはドナー、ＤＮアーゼ、及びＲＳ－１（トランスフェクション後またはトランスフェクション前とトランスフェクション後の両方）による刺激後１日目にエレクトロポレーションされたＴ細胞の１４日目のＧＦＰまたはｍＴＣＲ発現パーセントを示す。結果は、ＲＳ１及び／またはＤＮアーゼ処理によるトランスフェクションの１４日後に安定な導入遺伝子発現の増加を示す。

【0402】

【図19】刺激の３６時間後または刺激の３６時間後及び最初のエレクトロポレーションの６時間後の、ｍＴＣＲについて、ＲＳ－１、またはＤＮアーゼを用いてまたは用いないでエレクトロポレーションされたドナー０５５３３０のエレクトロポレーション効率のＦＡＣ分析を示す。結果は、両方の時点でＲＳ１及び／またはＤＮアーゼ処理による導入遺伝子発現の増加を示しており、処理の持続的な効果を示唆している。

【0403】

【図20】刺激の３６時間後または刺激の３６時間後及び最初のエレクトロポレーションの６時間後の、ｍＴＣＲについて、ＲＳ－１、またはＤＮアーゼを用いてまたは用いないでエレクトロポレーションされたドナー１１９８６６のエレクトロポレーション効率のＦＡＣ分析を示す。結果は、両方の時点でＲＳ１及び／またはＤＮアーゼ処理による導入遺伝子発現の増加を示しており、処理の持続的な効果を示唆している。

【0404】

【図21】Ａは、刺激の３６時間後及び最初のエレクトロポレーションの２４時間後の、ｍＴＣＲについて、ＲＳ－１、またはＤＮアーゼを用いてまたは用いないでエレクトロポレーションされたドナー０５５３３０及び１１９８６６のエレクトロポレーション効率のＦＡＣ分析を示す。Ｂは、刺激の３６時間後または刺激の３６時間後及び最初のエレクトロポレーションの６時間後の、ｍＴＣＲについて、ＲＳ－１、またはＤＮアーゼを用いてまたは用いないでエレクトロポレーションされたドナー１２０５３４のエレクトロポレーション効率のＦＡＣ分析を示す。結果は、両方の時点でＲＳ１及び／またはＤＮアーゼ処理による導入遺伝子発現の増加を示しており、処理の持続的な効果を示唆している。

【0405】

【図22】Ａは、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）、Ａｋｔ ＶＩＩＩ阻害剤（Ａｋｔ Ｉｎｈ）、または抗ＩＦＮＡＲ２抗体（ＩＦＮ Ａｂ）を用いる場合または用いない場合の、エレクトロポレーション後２日目の生存細胞計数（生存細胞の数）のグラフを示す。Ｂは、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）、Ａｋｔ ＶＩＩＩ阻害剤（Ａｋｔ Ｉｎｈ）、または抗ＩＦＮＡＲ２抗体（ＩＦＮ Ａｂ）を用いる場合または用いない場合の、エレクトロポレーション後５日目の生存細胞計数（生存細胞の数）のグラフを示す。Ｃは、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）、Ａｋｔ ＶＩＩＩ阻害剤（Ａｋｔ Ｉｎｈ）、または抗ＩＦＮＡＲ２抗体（ＩＦＮ Ａｂ）を用いる場合または用いない場合の、エレクトロポレーション後７日目の生存細胞計数（生存細胞の数）のグラフを示す。

【0406】

【図23】Ａは、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）、Ａｋｔ ＶＩＩＩ阻害剤（Ａｋｔ Ｉｎｈ）、または抗ＩＦＮＡＲ２抗体（ＩＦＮ Ａｂ）を用いる場合または用いない場合の、エレクトロポレーション後２日目の生存細胞計数（生存細胞のパーセンテージ）のグラフを示す。Ｂは、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）、Ａｋｔ ＶＩＩＩ阻害剤（Ａｋｔ Ｉｎｈ）、または抗ＩＦＮＡＲ２抗体（ＩＦＮ Ａｂ）を用いる場合または用いない場合の、エレクトロポレーション後５日目の生存細胞計数（生存細胞のパーセンテージ）のグラフを示す。Ｃは、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）、Ａｋｔ ＶＩＩＩ阻害剤（Ａｋｔ Ｉｎｈ）、または抗ＩＦＮＡＲ２抗体（ＩＦＮ Ａｂ）を用いる場合または用いない場合の、エレクトロポレーション後７日目の生存細胞計数（生存細胞のパーセンテージ）のグラフを示す。

【0407】

【図24】Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）、Ａｋｔ ＶＩＩＩ阻害剤（Ａｋｔ Ｉｎｈ）、または抗ＩＦＮＡＲ２抗体（ＩＦＮ Ａｂ）を用いる場合または用いない場合の、エレクトロポレーション後７日目のｍＴＣＲ陽性細胞のパーセンテージのグラフを示す。図は、３０または５０μｇの外因性ドナーＤＮＡを使用した場合、対照培養と比較して、ＩＦＮＡｂを含有する培養で導入遺伝子の発現が増加したことを示している。

【0408】

【図25】Ａは、ＡＡＶＳ１を標的とする相同性アーム（ＨＲ）または一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）を含むＡＡＶＳ１－ＧＦＰドナーを利用するエレクトロポレーション後に第２の刺激を受けた全生細胞のｃｙｔｏｆｌｅｘ結果を示す。Ｂは、エレクトロポレーション及びＡＡＶＳ１－ＧＦＰドナーを用いてエレクトロポレーションした同じ細胞の二次刺激後のＧＦＰのパーセントを示す。ＧＦＰを、エレクトロポレーション後７日目に測定した。エレクトロポレーションの約３０分後に第２の刺激を加えた。

【0409】

【図26A-1】ＲＡＤ５２、Ｅｘｏ１、ＲＡＤ５４Ｂ、Ｌｉｇ３、ＢＲＤ、またはＰｏｌＱのノックアウトを含むＨＣＴ１１１６細胞のフローサイトメトリープロットを示す。ノックアウトＨＣＴ１１１６細胞を、ＳＳＡまたはＨＲを介するＡＡＶＳ１ ＳＡ－ＧＦＰドナーを用いてエレクトロポレーションし、エレクトロポレーション後１０日目に結果が取得され、対象に対して正規化した。

【図26A-2】同上。

【図26A-3】同上。

【図26B】野生型（ＷＴ）に正規化されたＨＲドナー鋳型のＧＦＰ発現の変化パーセントを示す。

【図26C】野生型（ＷＴ）に正規化されたＳＳＡドナー鋳型のＧＦＰ発現の変化パーセントを示す。

【0410】

【図27】ＣＡＲまたはＴＣＲなどの細胞受容体を含む導入遺伝子などの導入遺伝子を、表１に提供される、免疫チェックポイント及び／またはＴＣＲなどの例示的な遺伝子にノックインするための例示的な戦略の概略図である。

【0411】

【図28】Ａは、対照（パルスのみ）またはＨＲ導入遺伝子ドナーのいずれかによるエレクトロポレーションの２４時間、３６時間、４８時間、または７２時間後の細胞周期のＳ期におけるＴ細胞のパーセントを示す。Ｂは、対照（パルスのみ）、ＨＲ ＳＡ－ＧＦＰドナー、またはＳＳＡ ＳＡ ＧＦＰミニサークル（ＭＣ）を用いたエレクトロポレーション後７日目のＧＦＰパーセントを示す。Ｃは、対照（パルスのみ）またはＳＳＡ抗メソテリンＣＡＲミニサークル（ＭＣ）を用いたエレクトロポレーション後７日目のＣＡＲ（ＣＤ３４＋）パーセントを示す。ＧＦＰ及びＣＡＲパーセントを、２４時間、３６時間、４８時間、または７２時間において、エレクトロポレーションした細胞と比較した。

【0412】

【図29A】ＤＮＡセンサーのベースラインを超える倍率変化、それらのタイミング、及び３６時間後の発現を示す。これは、Ｘ軸にマッピングされた細胞周期と合致する。約３６時間のトランスフェクションゾーンは、影付きのボックスとして示される。

【図29B】刺激後２４、３６、４８、及び７２時間での２つのＴ細胞ドナーのＳ期におけるＴ細胞のパーセントを示す。

【図29C】抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８を含む抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８コーティングビーズを使用して刺激され、ＳＡ－ＧＦＰプラスミド単独（プラスミド対照）によりまたはＣａｓ９及びＡＡＶＳ１ ｇＲＮＡ（ＨＲ）と組み合わせたＳＡドナーによりエレクトロポレーションされたＴ細胞の、刺激後２４時間、３６時間、４８時間、または７２時間でのＧＦＰパーセントを示す。

【0413】

【図30】Ａは、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８コーティングビーズで３６時間刺激し、ドナープラスミド単独によりまたはＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９試薬と組み合わせてエレクトロポレーションされたＴ細胞における完全なＧＦＰ発現を示す。ＨＲカーゴとＨＭＥＪカーゴはどちらも、ＡＡＶＳ１に組み込まれたＳＡ－ＧＦＰコンストラクトである。プラスミドは、単独で、またはＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びＡＡＶＳ１ ｇＲＮＡ（ＨＲ）と組み合わせて、またはＨＭＥＪの場合、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びＡＡＶＳ１ ｇＲＮＡ及びユニバーサルｇＲＮＡと組み合わせて、提供された。コンストラクトには１ｋｂの挿入カーゴが含まれている。図３０Ｂは、プラスミド対象と比較した、ＨＲ－ｍＴＣＲまたはＳＳＡ－ｍＴＣＲ（ＨＭＥＪ）を介してトランスフェクトされたマウスＴＣＲ（ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲ）挿入の発現パーセントを示す。簡単に説明すると、Ｔ細胞を、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８コーティングビーズで３６時間刺激し、ドナープラスミド単独によりまたはＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９試薬と組み合わせてエレクトロポレーションした。ＨＲとＨＭＥＪカーゴはどちらも、１ｋｂの相同性（ＨＲの場合）と４８ｂｐの相同性（ＨＭＥＪ）を有するＭＮＤ－抗ＫＲＡＳ ＴＣＲである。プラスミドは、単独で、またはＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びＡＡＶＳ１ ｇＲＮＡ（ＨＲ）と組み合わせて、またはＨＭＥＪの場合、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、ＡＡＶＳ１ ｇＲＮＡ及びユニバーサルｇＲＮＡと組み合わせて、提供された。

【0414】

【図31A】非ウイルス性細胞製造の例示的なワークフローを示す。（１）Ｔ細胞を単離及び精製する（２）ビーズ及び／または好適な刺激抗体の添加によりＴ細胞を活性化させる（３）活性化ビーズを除去する（４）活性化Ｔ細胞をエレクトロポレーションする（５）改変細胞を増殖させる。

【図31B】図３１Ａの例示的なワークフローを使用して製造され、プラスミド対照、ＨＲ、またはＨＭＥＪコンストラクトでエレクトロポレーションされた細胞の増殖倍率を示す。

【図31C】エレクトロポレーション後の第２のビーズ添加によって示されるような、追加の刺激を含む例示的な任意のワークフローを示す。

【0415】

【図32A】プラスミド対象と比較した、ＨＲ－ｍＴＣＲまたはＳＳＡ－ｍＴＣＲ（ＨＭＥＪ）導入遺伝子を介して送達されたマウスＴＣＲ（ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ＴＣＲ）挿入でエレクトロポレーションされたＴ細胞の増殖倍率を示す。再刺激されたＳＳＡ－ｍＴＣＲ（ＨＭＥＪ）細胞も示されている。

【図32B】ＳＳＡ－ｍＴＣＲ（ＨＭＥＪ）導入遺伝子またはＳＳＡ－ｍＴＣＲ（ＨＭＥＪ）導入遺伝子でトランスフェクトされ、対象（パルスのみ）と比較して再刺激された細胞の抗メソテリンＣＡＲ発現（ＣＤ３４発現）のパーセントを示す。

【図32C】同じ細胞の発光データを示す。

【0416】

【図33】プラスミドのみ、プラスミド、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、及びＡＡＶＳ１ ｇＲＮＡ（ＨＲ）、またはＨＭＥＪの場合プラスミド、ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、ＡＡＶＳ１ ｇＲＮＡ、及びユニバーサルｇＲＮＡでエレクトロポレーションされたＣＤ４及びＣＤ８細胞のＧＦＰ発現を示す。

【0417】

【図34】Ａは、ドナーのみ（対照）、長さ４８から、１００、２５０、５００、７５０、または１０００塩基対の相同性アームを含むＳＡ－ｅＧＦＰ－ｐＡ（ＨＲ）、またはＳＡ－ｅＧＦＰ－ｐＡ（ＨＭＥＪ）コンストラクトでエレクトロポレーションされたＴ細胞のノックインパーセントを示す。Ｂは、Ａに記載されるように、相同性アーム長を増加させて、ＳＡ－ｅＧＦＰ－ｐＡ（ＨＲ）またはＳＡ－ｅＧＦＰ－ｐＡ（ＨＭＥＪ）コンストラクトを使用する標的化組み込み率を示す棒グラフを示す。

【0418】

【図35A】追加の刺激がある場合及びない場合で、相同性アームの長さを増加させて、ドナーのみ（対照）、ＳＡ－ｅＧＦＰ－ｐＡ（ＨＲ）、またはＳＡ－ｅＧＦＰ－ｐＡ（ＨＭＥＪ）コンストラクトを使用した標的化組み込み後の細胞増殖を示す。

【図35B】図３５Ａに記載されたものと同じデータの棒グラフを示す。

【0419】

【図36】例示的な臨床ワークフローを示している。提供されるワークフローは、本明細書に記載されるように、Ｔ細胞の追加の刺激を含むように修正することができる。

【発明を実施するための形態】

【0420】

序文
遺伝子編集された免疫細胞は、がん、自己免疫障害、炎症性障害、及び感染症など、さまざまな疾患の潜在的な治療法として大きな期待が寄せられている。この可能性を実現するには、細胞の生存能力を維持しながら、免疫細胞ゲノムに所望の改変を効率的に導入するための技術が必要である。本明細書に開示されるのは、いくつかの実施形態では、遺伝子編集された免疫細胞、免疫細胞を遺伝子編集する改良された方法、及び治療の方法である。免疫細胞ゲノムに導入することができる改変には、例えば、挿入、欠失、配列置換（例えば、置換）、及びそれらの組み合わせが含まれる。

【0421】

免疫細胞を遺伝子編集する多くの既存の方法は、相同組換え経路に依存している。例えば、二本鎖切断をゲノムに導入することができ、相同組換えを介して二本鎖切断を直接修復するために修復鋳型が提供される。相同組換えを介して直接修復するために、修復鋳型は長い相同性アーム（例えば、約５００～１５００塩基対の相同性アーム）を必要とし得る。相同組換えによる修復に依存する方法は、例えば、必要な相同性アームのサイズ、修復の効率、またはそれらの組み合わせのために、制限を有する可能性がある。本明細書に開示される方法において、二本鎖切断は、修復鋳型ならびにゲノムの標的部位に導入することができる。これにより、代替または追加の修復経路、例えば、末端切除を含む経路、修復鋳型に短い相同性アームのみを必要とする経路、またはそれらの組み合わせを介して修復鋳型を組み込むことができる。利用することができる代替または追加の修復経路の非限定的な例としては、一本鎖アニーリング、相同性媒介末端結合、マイクロホモロジー媒介末端結合、代替末端結合、及びそれらの組み合わせを含む経路が含まれる。

【0422】

本明細書に開示される方法には、免疫細胞を編集する既存の方法に勝る利点、例えば、より高い編集効率、編集細胞のより高い生存率、編集細胞のより大きな集団を生成する能力、増強された増殖能力を有する編集細胞を生成する能力、及び／またはエフェクター機能、より小さな修復鋳型コンストラクトを使用する能力（例えば、より短い相同性アームを含む）、より大きな配列を免疫細胞ゲノムに導入する能力（例えば、より高い効率で）、免疫細胞ゲノムに複数の改変（例えば、挿入、欠失、置換、及び／または他の改変）を導入する能力、及びそれらの組み合わせ、があり得る。

【0423】

遺伝子改変細胞
本明細書に開示されるのは、いくつかの実施形態では、遺伝子編集された細胞、及び細胞を編集する方法である。いくつかの実施形態では、細胞は、腎臓細胞、肝細胞、膵臓細胞、血液細胞、免疫細胞、リンパ球、心臓細胞、肺細胞、幹細胞、卵巣細胞、前立腺細胞、筋肉細胞、腱細胞、靭帯細胞、心臓細胞、骨細胞、骨髄細胞、角膜細胞、網膜細胞、軟骨細胞、内皮細胞、子宮頸部細胞、乳房細胞、神経系細胞、脊髄細胞、脳細胞、ニューロン、皮膚細胞、上皮細胞、胃腸細胞、ホルモン分泌細胞、膵臓β細胞、甲状腺細胞、胸腺細胞、外分泌細胞、及び副甲状腺細胞を含む。

【0424】

本明細書に開示されるのは、いくつかの実施形態では、遺伝子編集された免疫細胞、及び免疫細胞を編集する方法である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、リンパ球、Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、アルファ－ベータＴ細胞、ガンマ－デルタＴ細胞、Ｔ制御性細胞（Ｔｒｅｇ）、細胞傷害性Ｔリンパ球、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ９細胞、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、エフェクターＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞（Ｔ_ＥＭ）、セントラルメモリーＴ細胞（Ｔ_ＣＭ）、レジデントメモリーＴ細胞（Ｔ_ＲＭ）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、自然リンパ球（ＩＬＣ）、Ｂ細胞、Ｂ１細胞、Ｂ１ａ細胞、Ｂ１ｂ細胞、Ｂ２細胞、形質細胞、制御性Ｂ細胞、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、単球、マクロファージ、Ｍ１マクロファージ、Ｍ２マクロファージ、樹状細胞、形質細胞様樹状細胞、好中球、肥満細胞、またはそれらの組み合わせ、を含む。

【0425】

いくつかの実施形態では、免疫細胞は、細胞株である。例えば、細胞株は、変異を受け、培養で広範囲に増殖する能力を獲得した細胞の集団であり得る。

【0426】

本開示の免疫細胞は、ヒト哺乳動物細胞であり得る。本開示の免疫細胞は、ヒト免疫細胞であり得る。本開示の免疫細胞は、マウス免疫細胞であり得る。本開示の免疫細胞は、ラット免疫細胞であり得る。本開示の免疫細胞は、ウサギ免疫細胞であり得る。本開示の免疫細胞は、ヤギ免疫細胞であり得る。本開示の免疫細胞は、非ヒト霊長類免疫細胞であり得る。本開示の免疫細胞は、ブタ免疫細胞であり得る。本開示の免疫細胞は、ラマ免疫細胞であり得る。本開示の免疫細胞は、ヤギ免疫細胞であり得る。本開示の免疫細胞は、遺伝子改変動物からの免疫細胞であり得る。

【0427】

いくつかの実施形態では、免疫細胞は、初代細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞の遺伝子編集は、エクスビボまたはインビトロで実施することができる。例えば、初代細胞は、ドナー生物から採取され、遺伝子編集され、レシピエント生物に注入されるか、またはドナー生物に戻され得る。いくつかの実施形態では、初代細胞の遺伝子編集は、生物内で（例えば、インビボで）実施することができる。

【0428】

ポリ核酸コンストラクト
本明細書に開示されるのは、いくつかの実施形態では、免疫細胞を遺伝子編集する方法、例えば、免疫細胞に挿入、欠失、配列置換、及びそれらの組み合わせを導入する方法である。ポリ核酸コンストラクトは、本開示の方法において使用され得る、例えば、免疫細胞ゲノムにおける二本鎖切断の修復を誘導するための修復鋳型を提供するために使用され得る。修復鋳型は、修復プロセスのある特定のアウトカム、例えば、挿入、欠失、置換配列、またはそれらの任意の組み合わせを含む修復されたゲノムに有利になり得る。

【0429】

ポリ核酸コンストラクトは、例えば、ヌクレアーゼによる切断の標的となり得る（例えば、ガイドＲＮＡ及びＣａｓ９によって標的とされ得る）１つ以上の相同性アーム及び１つ以上の切断部位を含み得る。いくつかの実施形態では、ポリ核酸コンストラクトは、挿入配列を含む。

【0430】

本明細書に開示される方法において、二本鎖切断は、修復鋳型ならびにゲノムの標的部位に導入することができる。これにより、代替または追加の修復経路、例えば、末端切除を含む経路、修復鋳型に短い相同性アームのみを必要とする経路、またはそれらの組み合わせを介して修復鋳型を組み込むことができる。利用することができる代替または追加の修復経路の非限定的な例としては、一本鎖アニーリング、相同性媒介末端結合、マイクロホモロジー媒介末端結合、代替末端結合、及びそれらの組み合わせを含む経路が含まれる。

【0431】

ポリ核酸コンストラクトは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、化学改変されたヌクレオチド、またはそれらの組み合わせを含むことができる。いくつかの実施形態では、ポリ核酸コンストラクトは、ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸はＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリ核酸はＲＮＡを含み、相補的ＤＮＡに逆転写することができる。いくつかの実施形態では、ポリ核酸は、ＤＮＡミニサークルを含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸コンストラクトは、プラスミドを含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸は、線状ＤＮＡ、例えば、ＰＣＲ産物、ＤＮＡミニサークルまたはプラスミドから遊離した線状ＤＮＡ、または合成的に生成されたＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸コンストラクトは、環状ＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸コンストラクトは、化学的改変を含む（例えば、本明細書に開示されるような）。

【0432】

いくつかの実施形態では、ポリ核酸コンストラクトは、ウイルスベクターに含まれる。例示的なウイルスベクターには、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、フラビウイルスベクター、ラブドウイルスベクター、はしかウイルスベクター、ニューカッスル病ウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、及びピコルナウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ポリ核酸コンストラクトは、ＡＡＶウイルスベクターに含まれる。

【0433】

本明細書に開示されるのは、いくつかの実施形態では、免疫細胞ゲノムに複数の改変（例えば、挿入及び欠失、複数の挿入、複数の欠失、挿入及び複数の欠失、複数の挿入及び欠失、または複数の挿入及び複数の欠失）を導入する方法である。

【0434】

挿入配列
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、免疫細胞のゲノムへの挿入配列の挿入を可能にするか、または免疫細胞のゲノムへの挿入配列の挿入を含む。いくつかの実施形態では、挿入配列は、ポリ核酸、例えば、ＤＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、ポリ核酸コンストラクトは、挿入配列を含む。

【0435】

いくつかの実施形態では、挿入配列は、少なくとも１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、１５０ｂｐ、２００ｂｐ、２５０ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、５０ｋｂ、１００ｋｂ、２００ｋｂ、３００ｋｂ、４００ｋｂ、５００ｋｂ、６００ｋｂ、７００ｋｂ、８００ｋｂ、９００ｋｂ、１０００ｋｂ、またはそれ以上である。いくつかの実施形態では、挿入配列は、０．５ｋｂ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、５０ｋｂ、１００ｋｂ、２００ｋｂ、３００ｋｂ、４００ｋｂ、５００ｋｂ、６００ｋｂ、７００ｋｂ、８００ｋｂ、９００ｋｂ、または１０００ｋｂよりも大きい。

【0436】

いくつかの実施形態では、挿入配列は、約５００ｂｐ～５００ｋｂ、５００ｂｐ～４００ｋｂ、５００ｂｐ～３００ｋｂ、５００ｂｐ～２００ｋｂ、５００ｂｐ～１００ｋｂ、５００ｂｐ～５０ｋｂ、５００ｂｐ～４０ｋｂ、５００ｂｐ～３０ｋｂ、５００ｂｐ～２０ｋｂ、５００ｂｐ～１０ｋｂ、５００ｂｐ～９ｋｂ、５００ｂｐ～８ｋｂ、５００ｂｐ～７ｋｂ、５００ｂｐ～６ｋｂ、５００ｂｐ～５ｋｂ、５００ｂｐ～４ｋｂ、５００ｂｐ～３ｋｂ、５００ｂｐ～２ｋｂ、または５００ｂｐ～１ｋｂである。いくつかの実施形態では、挿入配列は、約１ｋｂ～５００ｋｂ、１ｋｂ～４００ｋｂ、１ｋｂ～３００ｋｂ、１ｋｂ～２００ｋｂ、１ｋｂ～２００ｋｂ、１ｋｂ～１００ｋｂ、１ｋｂ～９０ｋｂ、１ｋｂ～８０ｋｂ、１ｋｂ～７０ｋｂ、１ｋｂ～６０ｋｂ、１ｋｂ～５０ｋｂ、１ｋｂ～４０ｋｂ、１ｋｂ～３０ｋｂ、１ｋｂ～２０ｋｂ、１ｋｂ～１０ｋｂ、１ｋｂ～９ｋｂ、１ｋｂ～８ｋｂ、１ｋｂ～７ｋｂ、１ｋｂ～６ｋｂ、１ｋｂ～５ｋｂ、１ｋｂ～４ｋｂ、１ｋｂ～３ｋｂ、また１ｋｂ～２ｋｂである。いくつかの実施形態では、挿入配列は、約２ｋｂ～５００ｋｂ、２ｋｂ～４００ｋｂ、２ｋｂ～３００ｋｂ、２ｋｂ～２００ｋｂ、２ｋｂ～２００ｋｂ、２ｋｂ～１００ｋｂ、２ｋｂ～９０ｋｂ、２ｋｂ～８０ｋｂ、２ｋｂ～７０ｋｂ、２ｋｂ～６０ｋｂ、２ｋｂ～５０ｋｂ、２ｋｂ～４０ｋｂ、２ｋｂ～３０ｋｂ、２ｋｂ～２０ｋｂ、１ｋｂ～１０ｋｂ、２ｋｂ～９ｋｂ、２ｋｂ～８ｋｂ、２ｋｂ～７ｋｂ、２ｋｂ～６ｋｂ、２ｋｂ～５ｋｂ、２ｋｂ～４ｋｂ、または２ｋｂ～３ｋｂである。いくつかの実施形態では、挿入配列は、約３ｋｂ～５００ｋｂ、３ｋｂ～４００ｋｂ、３ｋｂ～３００ｋｂ、３ｋｂ～２００ｋｂ、３ｋｂ～２００ｋｂ、３ｋｂ～１００ｋｂ、３ｋｂ～９０ｋｂ、３ｋｂ～８０ｋｂ、３ｋｂ～７０ｋｂ、３ｋｂ～６０ｋｂ、３ｋｂ～５０ｋｂ、３ｋｂ～４０ｋｂ、３ｋｂ～３０ｋｂ、３ｋｂ～２０ｋｂ、１ｋｂ～１０ｋｂ、３ｋｂ～９ｋｂ、３ｋｂ～８ｋｂ、３ｋｂ～７ｋｂ、３ｋｂ～６ｋｂ、３ｋｂ～５ｋｂ、または３ｋｂ～４ｋｂである。いくつかの実施形態では、挿入配列は、約４ｋｂ～５００ｋｂ、４ｋｂ～４００ｋｂ、４ｋｂ～３００ｋｂ、４ｋｂ～２００ｋｂ、４ｋｂ～２００ｋｂ、４ｋｂ～１００ｋｂ、４ｋｂ～９０ｋｂ、４ｋｂ～８０ｋｂ、４ｋｂ～７０ｋｂ、４ｋｂ～６０ｋｂ、４ｋｂ～５０ｋｂ、４ｋｂ～４０ｋｂ、４ｋｂ～３０ｋｂ、４ｋｂ～２０ｋｂ、１ｋｂ～１０ｋｂ、４ｋｂ～９ｋｂ、４ｋｂ～８ｋｂ、４ｋｂ～７ｋｂ、４ｋｂ～６ｋｂ、または４ｋｂ～５ｋｂである。いくつかの実施形態では、挿入配列は、約５ｋｂ～５００ｋｂ、５ｋｂ～４００ｋｂ、５ｋｂ～３００ｋｂ、５ｋｂ～２００ｋｂ、５ｋｂ～２００ｋｂ、５ｋｂ～１００ｋｂ、５ｋｂ～９０ｋｂ、５ｋｂ～８０ｋｂ、５ｋｂ～７０ｋｂ、５ｋｂ～６０ｋｂ、５ｋｂ～５０ｋｂ、５ｋｂ～４０ｋｂ、５ｋｂ～３０ｋｂ、５ｋｂ～２０ｋｂ、１ｋｂ～１０ｋｂ、５ｋｂ～９ｋｂ、５ｋｂ～８ｋｂ、５ｋｂ～７ｋｂ、または５ｋｂ～６ｋｂである。いくつかの実施形態では、挿入配列は、約１０ｋｂ～５００ｋｂ、１０ｋｂ～４００ｋｂ、１０ｋｂ～３００ｋｂ、１０ｋｂ～２００ｋｂ、１０ｋｂ～２００ｋｂ、１０ｋｂ～１００ｋｂ、１０ｋｂ～９０ｋｂ、１０ｋｂ～８０ｋｂ、１０ｋｂ～７０ｋｂ、１０ｋｂ～６０ｋｂ、１０ｋｂ～５０ｋｂ、１０ｋｂ～４０ｋｂ、１０ｋｂ～３０ｋｂ、または１０ｋｂ～２０ｋｂである。いくつかの実施形態では、挿入配列は、約３０ｋｂ～５００ｋｂ、３０ｋｂ～４００ｋｂ、３０ｋｂ～３００ｋｂ、３０ｋｂ～２００ｋｂ、３０ｋｂ～２００ｋｂ、３０ｋｂ～１００ｋｂ、３０ｋｂ～９０ｋｂ、３０ｋｂ～８０ｋｂ、３０ｋｂ～７０ｋｂ、３０ｋｂ～６０ｋｂ、３０ｋｂ～５０ｋｂ、または３０ｋｂ～４０ｋｂである。

【0437】

いくつかの実施形態では、挿入配列はタンパク質をコードしない。いくつかの実施形態では、挿入配列は、５００ｂｐ、４００ｂｐ、３００ｂｐ、２００ｂｐ、１００ｂｐ、５０ｂｐ、４０ｂｐ、３０ｂｐ、２０ｂｐ、１０ｂｐ ５ｂｐ、４ｂｐ、３ｂｐ、または２ｂｐ未満である。

【0438】

挿入配列は、例えば、非コード配列、ＲＮＡをコードする配列、タンパク質をコードする配列、またはそれらの組み合わせを含むことができる。いくつかの実施形態では、挿入配列は機能性タンパク質をコードしない。いくつかの実施形態では、挿入配列はタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、挿入配列は機能性タンパク質をコードする。

【0439】

いくつかの実施形態では、挿入配列は、少なくとも１つのタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、挿入配列は、膜タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、挿入配列は、膜貫通タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、挿入配列は、膜貫通型受容体タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、挿入配列は、細胞内タンパク質（例えば、細胞質または核タンパク質）をコードする。いくつかの実施形態では、挿入配列は、分泌タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、挿入配列は、キメラタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、挿入配列は、融合タンパク質をコードする。

【0440】

いくつかの実施形態では、挿入配列は、免疫細胞の表面上に発現する受容体（例えば、Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、アルファ－ベータＴ細胞、ガンマ－デルタＴ細胞、Ｔ制御性細胞（Ｔｒｅｇ）、細胞傷害性Ｔリンパ球、メモリーＴ細胞、エフェクターＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞（Ｔ_ＥＭ）、セントラルメモリーＴ細胞（Ｔ_ＣＭ）、レジデントメモリーＴ細胞（Ｔ_ＲＭ）、ナイーブＴ細胞、Ｂ細胞、形質細胞、ＮＫ細胞、ＮＫ Ｔ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、抗原提示細胞、好中球、または腫瘍浸潤リンパ球、の表面に発現する受容体）をコードする。

【0441】

いくつかの実施形態では、挿入配列は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはその機能的部分をコードする。いくつかの実施形態では、挿入配列は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはその機能的部分をコードする。いくつかの実施形態では、挿入配列は、Ｂ細胞受容体またはその機能的部分をコードする。いくつかの実施形態では、挿入配列は、ケモカイン受容体をコードする。いくつかの実施形態では、挿入配列は、サイトカイン受容体をコードする。いくつかの実施形態では、挿入配列は、１つ以上の抗原認識ドメイン（例えば、ＴＣＲ、ＢＣＲ、抗体またはその抗原結合断片、ＤＡＲＰｉｎなどの抗原認識ドメイン）、１つ以上の膜貫通ドメイン、及び１つ以上のシグナル伝達ドメイン（例えば、ＴＣＲ、ＢＣＲ、免疫共受容体、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、免疫受容体チロシンベースの阻害ドメイン（ＩＴＩＭ）、免疫受容体チロシンベースの活性化ドメイン（ＩＴＡＭ）、免疫チェックポイント遺伝子、またはそれらの組み合わせからのシグナル伝達ドメイン）、を含む融合タンパク質をコードする。

【0442】

いくつかの実施形態では、挿入配列は、がん細胞によって発現する抗原またはネオ抗原に特異的に結合する受容体をコードする。いくつかの実施形態では、挿入配列は、がん細胞によって発現する抗原またはネオ抗原に特異的に結合する受容体をコードする。いくつかの実施形態では、抗原またはネオ抗原は、がん遺伝子または腫瘍抑制遺伝子（例えば、変異腫瘍抑制遺伝子）に由来する。いくつかの実施形態では、抗原は、Ｔ細胞エピトープを含む。いくつかの実施形態では、がんは、固形腫瘍、血液癌、または軟組織癌である。いくつかの実施形態では、がん細胞は、膀胱癌、上皮癌、骨癌、脳腫瘍、乳癌、結腸直腸癌、食道癌、胃腸癌、白血病、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、骨髄腫、卵巣癌、前立腺癌、肉腫、胃癌、甲状腺癌、急性リンパ球性癌、急性骨髄性白血病、胞巣状横紋筋肉腫、肛門管、直腸癌、眼癌、頸部癌、胆嚢癌、胸膜癌、口腔癌、外陰癌、結腸癌、子宮頸癌、線維肉腫、消化管カルチノイド腫瘍、ホジキンリンパ腫、腎臓癌、中皮腫、肥満細胞腫、黒色腫、多発性骨髄腫、骨髄腫、鼻咽頭癌、非ホジキンリンパ腫、膵臓癌、腹膜癌、腎癌、皮膚癌、小腸癌、胃癌、精巣癌、及び甲状腺癌、からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、がん細胞は、胃腸癌、乳癌、リンパ腫、及び前立腺癌からなる群から選択される。

【0443】

いくつかの実施形態では、挿入配列は、病原体によって発現する抗原に特異的に結合するタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、挿入配列は、病原体によって発現する抗原に特異的に結合する受容体（例えば、免疫受容体）をコードする。いくつかの実施形態では、抗原は、Ｔ細胞エピトープを含む。いくつかの実施形態では、病原体は、細菌、ウイルス、真菌、酵母、寄生虫（例えば、単細胞もしくは多細胞の真核生物の寄生虫）、または他の微生物である。

【0444】

いくつかの実施形態では、挿入配列は、疾患（例えば、炎症性または自己免疫疾患）に関連する抗原に特異的に結合するタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、挿入配列は、疾患に関連する抗原に特異的に結合する受容体（例えば、免疫受容体）をコードする。いくつかの実施形態では、抗原は、Ｔ細胞エピトープを含む。いくつかの実施形態では、疾患は、急性散在性脳脊髄炎、急性運動性軸索ニューロパチー、アジソン病、ドロローサ脂肪症、成人発症スティル病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗糸球体基底膜腎炎、抗好中球細胞質抗体関連血管炎、抗ｎ－メチル－ｄ－アスパラギン酸受容体脳炎、抗リン脂質抗体症候群、抗合成酵素症候群、再生不良性貧血、自己免疫性血管浮腫、自己免疫性脳炎、自己免疫性腸症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖症候群、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性卵胞炎、自己免疫性精巣炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性ポリエンドクリン症候群、自己免疫性ポリエンドクリン症候群２型、自己免疫性ポリエンドクリン症候群３型、自己免疫性プロゲステロン皮膚炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性蕁麻疹、自己免疫性ブドウ膜炎、バロ同心性硬化症、ベーチェット病、ビッカースタフ脳炎、水疱性類天疱瘡、セリアック病、慢性疲労症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、チャーグ・シュトラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、コーガン症候群、寒冷凝集素症、複合性局所疼痛症候群、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、真性糖尿病１型、円板状エリテマトーデス、子宮内膜症、腱付着部炎、腱付着部炎関連関節炎、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、後天性表皮水疱症、結節性紅斑、必須混合クリオグロブリン血症、エヴァンス症候群、フェルティ症候群、線維筋痛症、胃炎、妊娠性類天疱瘡、巨細胞性動脈炎、グッドパスチャー症候群、バセドウ病、グレーブス眼症、ギランバレー症候群、橋本脳症、橋本甲状腺炎、ヘノッホシェーンライン紫斑病、化膿性汗腺炎、特発性増殖型心筋症、特発性炎症性脱髄性疾患、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連全身性疾患、封入体筋炎、炎症性腸疾患、中間部ぶどう膜炎、間質性膀胱炎、若年性関節炎、川崎病、ランバート・イートン筋無力症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質結膜炎、線状ＩｇＡ病、ループス腎炎、ループス血管炎、ライム病（慢性）、メニエール病、顕微鏡的大腸炎、顕微鏡的多発血管炎、混合性結合組織病、モーレン潰瘍、限局性強皮症、ミュシャ・ハーバーマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋炎、筋炎、視神経脊髄炎、神経性筋硬直症、オプソクローヌスミオクローヌス症候群、視神経炎、オード甲状腺炎、パリンドロームリウマチ、傍腫瘍性小脳変性症、パリーロンバーグ病症候群、パーソネイジ・ターナー症候群、連鎖球菌に関連する小児自己免疫性神経精神障害、尋常性天疱瘡、悪性貧血、急性苔癬状痘瘡状粃糠疹、ｐｏｅｍｓ症候群、結節性多発動脈炎、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、原発性胆汁性肝硬変、原発性免疫不全症、原発性硬化性胆管炎、進行性炎症性ニューロパチー、乾癬、乾癬性関節炎、赤芽球癆、壊疽性膿皮症、レイノー現象、反応性関節炎、再発性多発性軟骨炎、むずむず脚症候群、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、リウマチ性血管炎、サルコイドーシス、シュニッツラー症候群、強皮症、シェーグレン症候群、スティッフパーソン症候群、亜急性細菌性心内膜炎、スザック症候群、シデナム舞踏病、交感神経性眼炎、全身性エリテマトーデス、全身性強皮症、血小板減少症、トロサハント症候群、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織病、蕁麻疹、蕁麻疹性血管炎、血管炎、または白斑、である。

【0445】

いくつかの実施形態では、挿入配列は、サイトカイン受容体またはその機能的部分（例えば、サイトカイン認識ドメインまたはシグナル伝達ドメイン）をコードする。いくつかの実施形態では、挿入配列は、４－１ＢＢＬ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１７８、ＣＤ７０、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＩＴＲＬ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１ＲＡ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２０、ＩＬ－２３、ＬＩＦ、ＬＩＧＨＴ、ＬＴ－β、Ｍ－ＣＳＦ、ＭＳＰ、ＯＳＭ、ＯＸ４０Ｌ、ＳＣＦ、ＴＡＬＬ－１、ＴＧＦ－β、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＮＣＥ、ＴＷＥＡＫの受容体、それらの機能的部分、またはそれらの組み合わせをコードする。いくつかの実施形態では、挿入配列は、共通ガンマ鎖受容体、共通ベータ鎖受容体、インターフェロン受容体、ＴＮＦファミリー受容体、ＴＧＦ－Ｂ受容体、それらの機能的部分、またはそれらの組み合わせをコードする。いくつかの実施形態では、挿入配列は、Ａｐｏ３、ＢＣＭＡ、ＣＤ１１４、ＣＤ１１５、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ１１８、ＣＤ１２０、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１２１、ＣＤ１２１ａ、ＣＤ１２１ｂ、ＣＤ１２２、ＣＤ１２３、ＣＤ１２４、ＣＤ１２６、ＣＤ１２７、ＣＤ１３０、ＣＤ１３１、ＣＤ１３２、ＣＤ２１２、ＣＤ２１３、ＣＤ２１３ａ１、ＣＤ２１３ａ１３、ＣＤ２１３ａ２、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ９５（Ｆａｓ）、ＣＤｗ１１９、ＣＤｗ１２１ｂ、ＣＤｗ１２５、ＣＤｗ１３１、ＣＤｗ１３６、ＣＤｗ１３７（４１ＢＢ）、ＣＤｗ２１０、ＣＤｗ２１７、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＬ－１１Ｒ、ＩＬ－１１Ｒａ、ＩＬ－１４Ｒ、ＩＬ－１５Ｒ、ＩＬ－１５Ｒａ、ＩＬ－１８Ｒ、ＩＬ－１８Ｒα、ＩＬ－１８Ｒβ、ＩＬ－２０Ｒ、ＩＬ－２０Ｒα、ＩＬ－２０Ｒβ、ＩＬ－９Ｒ、ＬＩＦＲ、ＬＴβＲ、ＯＰＧ、ＯＳＭＲ、ＯＸ４０、ＲＡＮＫ、ＴＡＣＩ、ＴＧＦ－βＲ１、ＴＧＦ－βＲ２、ＴＧＦ－βＲ３、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＴＲＡＩＬＲ３、ＴＲＡＩＬＲ４、それらの機能的部分、またはそれらの組み合わせ、をコードする。

【0446】

いくつかの実施形態では、挿入配列は、ケモカインまたはその機能的部分（例えば、ケモカイン受容体に結合する部分）をコードする。いくつかの実施形態では、挿入配列は、ＡＣＴ－２、ＡＭＡＣ－ａ、ＡＴＡＣ、ＡＴＡＣ、ＢＬＣ、ＢＣＡ－１、ＢＲＡＫ－、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＫｂ－６、ＣＫｂ－８、ＣＴＡＣＫ、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＤＣ－ＣＫ１、ＥＬＣ、ＥＮＡ－７８＋、エオタキシン、エオタキシン－２、エオタキシン－３、エスキン、エクソダス－１、エクソダス－２、エクソダス－３、フラクタルカイン、ＧＣＰ－２＋、ＧＲＯａ、ＧＲＯｂ、ＧＲＯｇ、ＨＣＣ－１、ＨＣＣ－２、ＨＣＣ－４、Ｉ－３０９、ＩＬ－８、ＩＬＣ、ＩＰ－１０－、Ｉ－ＴＡＣ－、ＬＡＧ－１、ＬＡＲＣ、ＬＣＣ－１、ＬＤ７８α、ＬＥＣ、Ｌｋｎ－１、ＬＭＣ、リンフォアクチン、リンフォアクチンｂ、ＭＣＡＦ、ＭＣＰ－１、ＭＣＰ－２、ＭＣＰ－３、ＭＣＰ－４、ＭＤＣ、ＭＤＮＣＦ＋、ＭＧＳＡ－ａ、ＭＧＳＡ－ｂ、ＭＧＳＡ－ｇ、Ｍｉｇ－、ＭＩＰ－１ｄ、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、ＭＩＰ－２ａ＋、ＭＩＰ－２ｂ＋、ＭＩＰ－３、ＭＩＰ－３α、ＭＩＰ－３β、ＭＩＰ－４、ＭＩＰ－４ａ、ＭＩＰ－５、ＭＰＩＦ－１、ＭＰＩＦ－２、ＮＡＦ、ＮＡＰ－１、ＮＡＰ－２、オンコスタチンＡ－、ＰＡＲＣ、ＰＦ４、ＰＰＢＰ＋、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＣＭ－１ａ、ＳＣＭ－１ｂ、ＳＤＦ－１α／β－、ＳＬＣ、ＳＴＣＰ－１、ＴＡＲＣ、ＴＥＣＫ、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、それらの機能的部分、またはそれらの組み合わせ、をコードする。いくつかの実施形態では、挿入配列は、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＸＣＲ１、ＸＣＲ１、それらの機能的部分、またはそれらの組み合わせ、をコードする。

【0447】

いくつかの実施形態では、挿入配列は、転写因子（例えば、免疫遺伝子の発現、免疫細胞機能、免疫細胞分化、またはそれらの組み合わせに影響を与える転写因子）をコードする。本開示の挿入配列によってコードされ得る転写因子の例には、ＡＰ－１、Ｂｃｌ６、Ｅ２Ａ、ＥＢＦ、Ｅｏｍｅｓ、ＦｏｘＰ３、ＧＡＴＡ３、Ｉｄ２、Ｉｋａｒｏｓ、ＩＲＦ、ＩＲＦ１、ＩＲＦ２、ＩＲＦ３、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ＮＦＡＴ、ＮＦｋＢ、Ｐａｘ５、ＰＬＺＦ、ＰＵ．１、ＲＯＲ－ガンマ－Ｔ、ＳＴＡＴ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ５Ａ、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＳＴＡＴ６、Ｔ－ｂｅｔ、ＴＣＦ７、及びＴｈＰＯＫが含まれるが、これらに限定されない。

【0448】

いくつかの実施形態では、挿入配列は、転写因子をコードし、薬物応答性ドメインを含む融合タンパク質（例えば、薬物によって活性化または不活性化され得るタンパク質）をコードする。いくつかの実施形態では、挿入配列は酵素をコードする。

【0449】

いくつかの実施形態では、挿入配列は、抗体、抗原結合タンパク質、またはそれらの機能的部分をコードする。例えば、挿入配列は、抗体重鎖、軽鎖、またはそれらの組み合わせ（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２からの重鎖または軽鎖）をコードすることができる。挿入配列は、好適な抗体特性、例えば、本明細書に開示されるような疾患または状態を治療するための好適な特性を提供するために選択または改変される定常領域またはＦｃ領域を有する抗体をコードし得る。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１は、例えば、免疫活性化エフェクター機能（例えば、がんの治療のためのＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣ、ＩＴＡＭシグナル伝達、サイトカイン誘導、またはそれらの組み合わせ）を促進するために使用することができる。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ４は、例えば、免疫エフェクター機能の非存在下で抗体の拮抗的特性が望ましい場合に使用することができる。

【0450】

挿入配列は、標的抗原、例えば、設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）またはアプタマーに結合することができる非抗体産物をコードすることができる。

【0451】

いくつかの実施形態では、挿入配列は、抗体または抗体由来タンパク質の機能的部分をコードすることができる。例えば、挿入配列は、１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むタンパク質をコードすることができる。挿入配列は、抗体に由来する１つ以上の可変領域を含むタンパク質をコードすることができる。抗体及び抗体由来タンパク質の機能的部分の非限定的な例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂコンジュゲートの二量体及び三量体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、及びテトラボディ、線状抗体が含まれる。Ｆａｂ及びＦａｂ’は、ジスルフィド結合を介して軽鎖のＶＬ及びＣＬドメインに連結された重鎖のＶＨ及びＣＨ１ドメインを含むことができる抗原結合断片である。ＡＦ（ａｂ’）２は、ジスルフィド結合によって結合された２つのＦａｂまたはＦａｂ’を含むことができる。Ｆｖは、非共有相互作用によって結合されたＶＨドメイン及びＶＬドメインを含むことができる。ｓｃＦｖ（単鎖可変断片）は、ペプチドリンカーによって接続されたＶＨドメイン及びＶＬドメインを含むことができる融合タンパク質である。ＶＨ及びＶＬドメインの配向及びリンカー長さの操作を使用して、単量体、二量体（ダイアボディ）、三量体（トリアボディ）、または四量体（テトラボディ）であり得るさまざまな形態の分子を作成することができる。

【0452】

挿入配列は、１つ以上の抗原結合領域を含む融合タンパク質をコードすることができる。挿入配列は、２つ以上の抗原結合領域を含む融合タンパク質をコードすることができる。例えば、挿入配列は、多重特異性抗原結合タンパク質をコードすることができる。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合タンパク質は、がん抗原及び免疫細胞抗原に結合することができ、それにより、免疫細胞をがん細胞に誘導することができる。免疫細胞抗原は、例えば、Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、アルファ－ベータＴ細胞、ガンマ－デルタＴ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、細胞傷害性Ｔリンパ球、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ９細胞、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、エフェクターＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞（Ｔ_ＥＭ）、セントラルメモリーＴ細胞（Ｔ_ＣＭ）、レジデントメモリーＴ細胞（Ｔ_ＲＭ）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、自然リンパ球（ＩＬＣ）、Ｂ細胞、Ｂ１細胞、Ｂ１ａ細胞、Ｂ１ｂ細胞、Ｂ２細胞、形質細胞、制御性Ｂ細胞、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、単球、マクロファージ、Ｍ１マクロファージ、Ｍ２マクロファージ、樹状細胞、形質細胞様樹状細胞、好中球、肥満細胞、またはそれらの組み合わせ、に存在することができる。多重特異性抗原結合タンパク質は、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個以上の抗原結合部位を含む。多重特異性抗原結合タンパク質は、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の異なる標的抗原に対する結合特異性を含むことができる。

【0453】

いくつかの実施形態では、挿入配列は、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、ＮＫ細胞受容体、ＮＫ Ｔ細胞受容体、樹状細胞受容体、マクロファージ受容体、または単球受容体をコードする。いくつかの実施形態では、挿入配列は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする。いくつかの実施形態では、挿入配列は、ＴＣＲまたはＣＡＲをコードする。

【0454】

場合によっては、挿入配列はＣＡＲをコードする。一態様では、ＣＡＲは、ＣＤ３ゼータ鎖（第１世代ＣＡＲと呼ばれることもある）を含む。別の態様では、ＣＡＲは、ＣＤ－３ゼータ鎖及び単一の共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２８または４－１ＢＢ）（第２世代ＣＡＲと呼ばれることもある）を含む。別の態様では、ＣＡＲは、ＣＤ－３ゼータ鎖及び２つの共刺激ドメイン（ＣＤ２８／ＯＸ４０またはＣＤ２８／４－１ＢＢ）（第３世代ＣＡＲと呼ばれることもある）を含む。ＣＤ８などの補助受容体とともに、これらの種々のシグナル伝達鎖は、遺伝子転写及び機能的細胞応答を支持するするキナーゼ経路の下流の活性化を生み出すことができる。

【0455】

ＣＡＲは、細胞外標的指向性ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。ＣＡＲは、少なくとも第１の結合部分を含むことができる。結合部分の非限定的な例としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはそれらの機能的誘導体、バリアントまたは断片が挙げられるが、これらに限定されず、例えば、限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ミニボディ、ダイアボディ、及び単一ドメイン抗体、例として重鎖可変ドメインなどの（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。ＣＡＲは一般に、単鎖抗体に由来する標的指向性ドメイン、ヒンジドメイン（Ｈ）またはスペーサー、原形質膜への足場を提供する膜貫通ドメイン（ＴＭ）、及びＴ細胞活性化に関与するシグナル伝達ドメインを含む。

【0456】

一態様では、ＣＡＲなどの本明細書で提供される受容体は、ヒンジをさらに含む。ヒンジは、ＣＡＲの任意の領域に位置することができる。一態様では、ヒンジは、結合部分と膜貫通領域との間に位置する。別の態様では、対象のＣＡＲは、ヒンジまたはスペーサーを含む。ヒンジまたはスペーサーは、結合部分と膜貫通ドメインとの間のセグメントを指すことができる。いくつかの実施形態では、ヒンジを使用して、標的指向性部分、例えば、ｓｃＦｖに柔軟性を提供することができる。いくつかの実施形態では、例えば、ｓｃＦｖを検出するための抗体が機能的でないかまたは利用可能でない場合、ヒンジを使用して、細胞の表面上のＣＡＲの発現を検出することができる。場合によっては、ヒンジは免疫グロブリン分子に由来し、標的上の最初のエピトープまたは２番目のエピトープの位置に応じて最適化が必要になることがある。場合によっては、ヒンジは免疫グロブリン分子ではなく、ＣＤ８アルファ分子のネイティブヒンジなどの別の分子に属していることがある。ＣＤ８アルファヒンジは、ＣＤ８補助受容体とＭＨＣ分子の相互作用において多くの役割を果たすシステイン及びプロリン残基を含有し得る。いくつかの実施形態では、システイン及びプロリン残基は、ＣＡＲの性能に影響を与える可能性があり、したがって、ＣＡＲの性能に影響を与えるように操作され得る。Ｉ、

【0457】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるヒンジは、任意の好適な長さであり得る。いくつかの実施形態では、例えばＣＡＲで使用されるヒンジは、サイズ調整可能であり得、ＣＡＲ発現細胞と標的細胞との間の直交シナプス距離を正規化する際にある程度補償することができる。ＣＡＲ発現細胞と標的細胞の間の免疫シナプスのこのトポグラフィーは、ヒンジＣＡＲが短く、シナプス距離をシグナル伝達の近似値にすることができない、細胞表面標的分子上の膜遠位エピトープのために、ＣＡＲによって機能的に架橋できない距離を定義することもできる。同様に、シグナル伝達出力が長いヒンジＣＡＲの状況でのみ観察される膜近位ＣＡＲ標的抗原エピトープが記述されている。本明細書に開示されるヒンジは、使用することができる一本鎖可変断片領域に従って調整することができる。いくつかの実施形態では、ヒンジは、ＣＤ２８、ＩｇＧ１、及び／またはＣＤ８αからのものである。

【0458】

場合によっては、ＣＡＲの結合部分は、膜貫通ドメインを介して細胞内シグナル伝達ドメインに連結することができる。膜貫通ドメインは、膜貫通セグメントであり得る。ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＡＲを細胞、例えば免疫細胞の原形質膜に固定することができる。いくつかの実施形態では、膜貫通セグメントは、ポリペプチドを含む。ＣＡＲの標的指向性部分と細胞内シグナル伝達ドメインを連結する膜貫通ポリペプチドは、任意の好適なポリペプチド配列を有することができる。場合によっては、膜貫通ポリペプチドは、内因性または野生型の膜貫通タンパク質の膜貫通部分のポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ポリペプチドは、内因性または野生型の膜貫通タンパク質の膜貫通部分と比較して、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のアミノ酸置換、欠失、及び挿入を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ポリペプチドは、ポリペプチドリンカーの配列などの非天然ポリペプチド配列を含む。ポリペプチドリンカーは、柔軟であっても剛性であってもよい。ポリペプチドリンカーは、構造化されていても構造化されていなくてもよい。いくつかの実施形態では、膜貫通ポリペプチドは、細胞外標的指向性部分から細胞内領域にシグナルを伝達する。一態様では、対象ＣＡＲは、標的指向性部分を細胞内領域に接続する膜貫通領域を含むことができる。膜貫通領域は、外因性細胞膜貫通領域からのものであるか、またはそれに由来する可能性がある。種々の膜貫通領域が当技術分野で知られており、免疫細胞受容体からのものであり得る。一態様では、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ鎖、ＴＣＲのベータ鎖、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＰＤ－１、及び／またはＣＤ１５２からのものである。場合によっては、ヒトＩｇ（免疫グロブリン）ヒンジを含む様々なヒトヒンジを使用することもできる。ＣＤ２８のネイティブ膜貫通部分を、ＣＡＲで使用することができる。他の場合には、ＣＤ８アルファのネイティブ膜貫通部分も対象のＣＡＲで使用することができる。一態様では、膜貫通ドメインは、ＴＣＲのアルファ鎖からのものである。一態様では、膜貫通ドメインはＣＤ８からのものであり、ＣＤ８αである。一実施形態では、膜貫通ドメインは合成であり得、その場合、それは、ロイシン及びバリンなどの主に疎水性の残基を含む。好ましくは、フェニルアラニン、トリプトファン、及びバリンのトリプレットが、合成膜貫通ドメインの各末端に見出される。

【0459】

対象の融合タンパク質のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫細胞シグナル伝達に関与するシグナル伝達ドメイン、またはその任意の誘導体、バリアント、または断片を含むことができる。ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲを構成する免疫細胞の活性を誘導することができる。細胞内シグナル伝達ドメインは、エフェクター機能シグナルを伝達し、特殊な機能を実行するように細胞を誘導することができる。シグナル伝達ドメインは、他の分子のシグナル伝達ドメインを含むことができる。通常、別の分子のシグナル伝達ドメインをＣＡＲで使用することができるが、多くの場合、全鎖を使用する必要はない。場合によっては、シグナル伝達ドメインの短縮部分が、対象の融合タンパク質のＣＡＲで使用される。

【0460】

いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫細胞シグナル伝達に関与する複数のシグナル伝達ドメイン、またはそれらの任意の誘導体、バリアント、または断片を含む。例えば、細胞内シグナル伝達ドメインは、少なくとも２つの免疫細胞シグナル伝達ドメイン、例えば、少なくとも２、３、４、５、７、８、９、または１０の免疫細胞シグナル伝達ドメインを含み得る。免疫細胞シグナル伝達ドメインは、刺激的な方法または阻害的な方法のいずれかで、ＴＣＲ複合体の一次活性化の調節に関与することができる。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲ複合体のシグナル伝達ドメインであり得る。対象融合タンパク質における対象ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）、Ｆｃε受容体（ＦｃεＲ）、Ｆｃα受容体（ＦｃαＲ）、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）、ＣＤ３、ＣＤ３ζ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）、ＣＤ４５、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳとも呼ばれる）、ＣＤ２４７ζ、ＣＤ２４７η、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＦＹＮ、ＬＡＴ、Ｌｃｋ、ＭＡＰＫ、ＭＨＣ複合体、ＮＦＡＴ、ＮＦ－κＢ、ＰＬＣ－γ、ｉＣ３ｂ、Ｃ３ｄｇ、Ｃ３ｄ、及びＺａｐ７０、のシグナル伝達ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭを含む。ＩＴＡＭを含むシグナル伝達ドメインは、６～８個のアミノ酸によって分離されたアミノ酸配列ＹｘｘＬ／Ｉの２つのリピートを含むことができ、各ｘは独立して任意のアミノ酸であり、保存モチーフＹｘｘＬ／Ｉｘ_{（６～８）}ＹｘｘＬ／Ｉを生成する。ＩＴＡＭを含むシグナル伝達ドメインは、例えば、標的指向性部分がエピトープに結合している場合、リン酸化によって改変することができる。リン酸化ＩＴＡＭは、他のタンパク質、例えば種々のシグナル伝達経路に関与するタンパク質のドッキング部位として機能することができる。いくつかの実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、改変ＩＴＡＭドメイン、例えば、変異、短縮、及び／または最適化ＩＴＡＭドメインを含み、これは、ネイティブＩＴＡＭドメインと比較して変化した（例えば、増加または減少した）活性を有する。

【0461】

いくつかの実施形態では、対象融合タンパク質におけるＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＦｃγＲシグナル伝達ドメイン（例えば、ＴＡＭ）を含む。ＦｃγＲシグナル伝達ドメインは、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）、及びＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）から選択することができる。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＦｃεＲシグナル伝達ドメイン（例えば、ＩＴＡＭ）を含む。ＦｃεＲシグナル伝達ドメインは、ＦｃεＲＩ及びＦｃεＲＩＩ（ＣＤ２３）から選択することができる。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＦｃαＲシグナル伝達ドメイン（例えば、ＩＴＡＭ）を含む。ＦｃαＲシグナル伝達ドメインは、ＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）及びＦｃα／μＲから選択することができる。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζのＩＴＡＭを含む。

【0462】

いくつかの実施形態では、対象ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフまたはＩＴＩＭを含む。ＩＴＩＭを含むシグナル伝達ドメインは、免疫系のいくつかの阻害性受容体の細胞質尾部に見られるアミノ酸の保存配列（Ｓ／Ｉ／Ｖ／ＬｘＹｘｘＩ／Ｖ／Ｌ）を含むことができる。ＩＴＩＭを含む一次シグナル伝達ドメインは、Ｓｒｃキナーゼファミリーメンバー（例えば、Ｌｃｋ）などの酵素によって改変、例えばリン酸化することができる。リン酸化に続いて、酵素を含む他のタンパク質をＩＴＩＭに補充することができる。これらの他のタンパク質には、ホスホチロシンホスファターゼＳＨＰ－１及びＳＨＰ－２などの酵素、ＳＨＩＰと呼ばれるイノシトールホスファターゼ、及び１つ以上のＳＨ２ドメインを有するタンパク質（例えば、ＺＡＰ７０）が含まれるが、これらに限定されない。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＢＴＬＡ、ＣＤ５、ＣＤ３１、ＣＤ６６ａ、ＣＤ７２、ＣＭＲＦ３５Ｈ、ＤＣＩＲ、ＥＰＯ－Ｒ、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２）、Ｆｃ受容体様タンパク質２（ＦＣＲＬ２）、Ｆｃ受容体様タンパク質３（ＦＣＲＬ３）、Ｆｃ受容体様タンパク質４（ＦＣＲＬ４）、Ｆｃ受容体様タンパク質５（ＦＣＲＬ５）、Ｆｃ受容体様タンパク質６（ＦＣＲＬ６）、タンパク質Ｇ６ｂ（Ｇ６Ｂ）、インターロイキン４受容体（ＩＬ４Ｒ）、免疫グロブリンスーパーファミリー受容体転座関連１（ＩＲＴＡ１）、免疫グロブリンスーパーファミリー受容体転座関連２（ＩＲＴＡ２）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体２ＤＬ１（ＫＩＲ２ＤＬ１）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体２ＤＬ２（ＫＩＲ２ＤＬ２）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体２ＤＬ３（ＫＩＲ２ＤＬ３）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体２ＤＬ４（ＫＩＲ２ＤＬ４）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体２ＤＬ５（ＫＩＲ２ＤＬ５）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体３ＤＬ１（ＫＩＲ３ＤＬ１）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体３ＤＬ２（ＫＩＲ３ＤＬ２）、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー１（ＬＩＲ１）、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー２（ＬＩＲ２）、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー３（ＬＩＲ３）、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー５（ＬＩＲ５）、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー８（ＬＩＲ８）、白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ－１）、マスト細胞機能関連抗原（ＭＡＦＡ）、ＮＫＧ２Ａ、天然細胞傷害誘発受容体２（ＮＫｐ４４）、ＮＴＢ－Ａ、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、ＰＩＬＲ、ＳＩＧＬＥＣＬ１、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン２（ＳＩＧＬＥＣ２またはＣＤ２２）、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン３（ＳＩＧＬＥＣ３またはＣＤ３３）、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン５（ＳＩＧＬＥＣ５またはＣＤ１７０）、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン６（ＳＩＧＬＥＣ６）、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン７（ＳＩＧＬＥＣ７）、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン１０（ＳＩＧＬＥＣ１０）、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン１１（ＳＩＧＬＥＣ１１）、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン４（ＳＩＧＬＥＣ４）シアル酸結合Ｉｇ様レクチン８（ＳＩＧＬＥＣ８）、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン９（ＳＩＧＬＥＣ９）、血小板及び内皮細胞接着分子１（ＰＥＣＡＭ－１）、シグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ２）、及びシグナル伝達閾値調節膜貫通アダプター１（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ａｄａｐｔｏｒ １）（ＳＩＴ）、のシグナル伝達ドメイン（例えば、ＩＴＩＭ）を含むことができる。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは改変ＩＴＩＭドメイン、例えば、変異、短縮、及び／または最適化されたＩＴＩＭドメインを含み、これは、ネイティブＩＴＩＭドメインと比較して変化した（例えば、増加または減少した）活性を有する。

【0463】

いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、少なくとも２つのＩＴＡＭドメイン（例えば、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、または１０個のＩＴＡＭドメイン）を含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、少なくとも２つのＩＴＩＭドメイン（例えば、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、または１０のＩＴＩＭドメイン）（例えば、少なくとも２つの一次シグナル伝達ドメイン）を含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＴＡＭドメインとＩＴＩＭドメインの両方を含む。一態様では、対象ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）、Ｆｃε受容体（ＦｃεＲ）、Ｆｃα受容体（ＦｃαＲ）、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）、ＣＤ３、ＣＤ３ζ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）、ＣＤ４５、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳとも呼ばれる）、ＣＤ２４７ζ、ＣＤ２４７η、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＦＹＮ、ＬＡＴ、Ｌｃｋ、ＭＡＰＫ、ＭＨＣ複合体、ＮＦＡＴ、ＮＦ－κＢ、ＰＬＣ－γ、ｉＣ３ｂ、Ｃ３ｄｇ、Ｃ３ｄ、及びＺａｐ７０、のシグナル伝達ドメインからのものである。別の態様では、対象ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３、ＣＤ３ζ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、及び／またはＣＤ３εからのものである。

【0464】

場合によっては、本明細書で提供される融合タンパク質は、共刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一態様では、共刺激ドメインは、本明細書で提供される融合タンパク質の対象ＣＡＲの一部であり得る。いくつかの実施形態では、例えば細胞共刺激分子からの共刺激ドメインは、例えば、免疫細胞活性の活性化及び／または不活性化のための、免疫細胞シグナル伝達、例としてＩＴＡＭ及び／またはＩＴＩＭドメインからのシグナル伝達のための共刺激シグナルを提供する。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、免疫細胞における増殖及び／または生存シグナルを調節するように作動可能である。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＭＨＣクラスＩタンパク質、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、またはＴｏｌｌリガンド受容体を含む。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４、４－１ＢＢ／ＴＮＦＳＦ９／ＣＤ１３７、Ｂ７－１／ＣＤ８０、Ｂ７－２／ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ１／ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、Ｂ７－Ｈ７、ＢＡＦＦＲ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＢＬＡＭＥ／ＳＬＡＭＦ８、ＢＴＬＡ／ＣＤ２７２、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ１０３、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、ＣＤ１５０、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２、ＣＤ２００、ＣＤ２２９／ＳＬＡＭＦ３、ＣＤ２７リガンド／ＴＮＦＳＦ７、ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ２Ｆ－１０／ＳＬＡＭＦ９、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＣＤ３００ａ／ＬＭＩＲ１、ＣＤ４、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＣＤ４８／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９Ｄ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５、ＣＤ５３、ＣＤ５８／ＬＦＡ－３、ＣＤ６９、ＣＤ７、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ８２／Ｋａｉ－１、ＣＤ８４／ＳＬＡＭＦ５、ＣＤ９０／Ｔｈｙ１、ＣＤ９６、ＣＤＳ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＡＣＣ／ＳＬＡＭＦ７、ＣＲＴＡＭ、ＣＴＬＡ－４、ＤＡＰ１２、デクチン－１／ＣＬＥＣ７Ａ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６、ＤＲ３／ＴＮＦＲＳＦ２５、ＥｐｈＢ６、ＧＡＤＳ、Ｇｉ２４／ＶＩＳＴＡ／Ｂ７－Ｈ５、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８、ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８、ＨＬＡクラスＩ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４、ＩＡ４、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、Ｉｋａｒｏｓ、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、インテグリンα４／ＣＤ４９ｄ、インテグリンα４β１、インテグリンα４β７／ＬＰＡＭ－１、ＩＰＯ－３、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＡＤ、ＩＴＧＡＥ、ＩＴＧＡＬ、ＩＴＧＡＭ、ＩＴＧＡＸ、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＢ２、ＩＴＧＢ７、ＫＩＲＤＳ２、ＬＡＧ－３、ＬＡＴ、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、ＬＴＢＲ、Ｌｙ１０８、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、リンホトキシン－α／ＴＮＦ－β、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＴＢ－Ａ／ＳＬＡＭＦ６、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＰＤ－１、ＰＤＣＤ６、ＰＤ－Ｌ２／Ｂ７－ＤＣ、ＰＳＧＬ１、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１）、ＳＬＡＭ／ＣＤ１５０、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ）、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＰ－７６、ＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＣＬ１Ａ、ＴＣＬ１Ｂ、ＴＩＭ－１／ＫＩＭ－１／ＨＡＶＣＲ、ＴＩＭ－４、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦ ＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＮＦ－α、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＴＳＬＰ、ＴＳＬＰ Ｒ、ＶＬＡ１、及びＶＬＡ－６からなる群から選択される分子のシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、複数の共刺激ドメイン、例えば、少なくとも２つ、例えば、少なくとも３、４、または５つの共刺激ドメインを含む。一態様では、ＣＡＲなどの本明細書で提供される受容体は、少なくとも２つまたは３つの共刺激ドメインを含む。一態様では、受容体は、少なくとも２つの共刺激ドメインを含み、少なくとも２つの共刺激ドメインは、ＣＤ２８及びＣＤ１３７である。一態様では、受容体は、少なくとも３つの共刺激ドメインを含み、少なくとも３つの共刺激ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、及びＯＸ４０Ｌである。共刺激シグナル伝達領域は、一次エフェクター活性化シグナルと相乗的なシグナルを提供する場合があり、Ｔ細胞の活性化の要件を満たすことができる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲへの共刺激ドメインの付加により、本明細書で提供される免疫細胞の有効性及び持続性を増強することができる。

【0465】

場合によっては、挿入配列はＴＣＲまたはその機能的断片をコードする。ＴＣＲとは、抗原の認識に関与するＴ細胞またはＴリンパ球の表面にある分子を指す。ＴＣＲは、２つの異なるタンパク質鎖で構成することができるヘテロダイマーである。いくつかの実施形態では、本開示のＴＣＲは、アルファ（α）鎖及びベータ（β）鎖からなり、αβＴＣＲと呼ばれる。αβＴＣＲは、細胞表面で主要組織適合遺伝子複合体分子（ＭＨＣ）に結合したタンパク質から分解された抗原ペプチドを認識する。いくつかの実施形態では、本開示のＴＣＲは、ガンマ（γ）及びデルタ（δ）鎖からなり、γδＴＣＲと呼ばれる。γδＴＣＲは、ＭＨＣに依存しない方法でペプチド及び非ペプチド抗原を認識する。γδＴ細胞は脂質抗原の認識に重要な役割を果たすことが示されている。特に、ＴＣＲのγ鎖には、Ｖγ２、Ｖγ３、Ｖγ４、Ｖγ５、Ｖγ８、Ｖγ９、Ｖγ１０、それらの機能的バリアント、及びそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない；ＴＣＲのδ鎖には、δ１、δ２、δ３、それらの機能的バリアント、及びそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、γδＴＣＲは、Ｖγ２／Ｖδ１ＴＣＲ、Ｖγ２／Ｖδ２ ＴＣＲ、Ｖγ２／Ｖδ３ ＴＣＲ、Ｖγ３／Ｖδ１ ＴＣＲ、Ｖγ３／Ｖδ２ ＴＣＲ、Ｖγ３／Ｖδ３ ＴＣＲ、Ｖγ４／Ｖδ１ ＴＣＲ、Ｖγ４／Ｖδ２ ＴＣＲ、Ｖγ４／Ｖδ３ ＴＣＲ、Ｖγ５／Ｖδ１ ＴＣＲ、Ｖγ５／Ｖδ２ ＴＣＲ、Ｖγ５／Ｖδ３ ＴＣＲ、Ｖγ８／Ｖδ１ ＴＣＲ、Ｖγ８／Ｖδ２ ＴＣＲ、Ｖγ８／Ｖδ３ ＴＣＲ、Ｖγ９／Ｖδ１ ＴＣＲ、Ｖγ９／Ｖδ２ ＴＣＲ、Ｖγ９／Ｖδ３ ＴＣＲ、Ｖγ１０／Ｖδ１ ＴＣＲ、Ｖγ１０／Ｖδ２ ＴＣＲ、及び／またはＶγ１０／Ｖδ３ＴＣＲであり得る。いくつかの例において、γδＴＣＲは、Ｖγ９／Ｖδ２ ＴＣＲ、Ｖγ１０／Ｖδ２ ＴＣＲ、及び／またはＶγ２／Ｖδ２ ＴＣＲであり得る。

【0466】

場合によっては、挿入配列は、以前に同定されたＴＣＲを含むＴＣＲをコードする。場合によっては、ＴＣＲは、全エクソームシーケンシングを使用して同定することができる。例えば、ＴＣＲは、標的細胞の全エクソームシーケンシングによって同定されたネオ抗原またはネオエピトープを標的にすることができる。あるいは、ＴＣＲは、自家、同種異系、または異種のレパートリーから同定することができる。自家及び同種異系の同定は、多段階プロセスを伴う場合がある。自家及び同種異系の同定の両方で、樹状細胞（ＤＣ）は、ＣＤ１４選択単球から生成され、成熟後、特定のペプチドでパルスまたはトランスフェクトされる。ペプチドパルスＤＣを使用して、Ｔ細胞などの自家免疫細胞または同種異系免疫細胞を刺激することができる。単一細胞ペプチド特異的Ｔ細胞クローンは、限界希釈によってこれらのペプチドパルスＴ細胞株から単離することができる。目的の対象ＴＣＲを同定し、単離することができる。目的のＴＣＲのアルファ、ベータ、ガンマ、及びデルタ鎖を、クローン化し、コドン最適化し、ベクター、例えばレンチウイルスベクターにコードする。いくつかの実施形態では、ＴＣＲの一部を置き換えることができる。例えば、ヒトＴＣＲの定常領域を、対応するマウス領域に置き換えることができる。ＴＣＲの安定性を向上させるために、ヒトの定常領域を対応するマウス領域に置き換えることができる。ＴＣＲは、エクスビボで高いまたは超生理学的アビディティにより同定することもできる。場合によっては、ＴＣＲを同定する方法は、ヒト腫瘍タンパク質でヒト白血球抗原（ＨＬＡ）システムを発現するトランスジェニックマウスを免疫して、ヒト抗原に対するＴＣＲを発現するＴ細胞を生成することを含み得る（例えば、Ｓｔａｎｉｓｌａｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｉｒｃｕｍｖｅｎｔｉｎｇ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ ａ ｈｕｍａｎ ＭＤＭ２－ｄｅｒｉｖｅｄ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｙ ＴＣＲ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２， ９６２ －９７０ （２００１））。代替的アプローチは、同種異系ＴＣＲ遺伝子移入であり得、腫瘍寛解を経験している対象から腫瘍特異的Ｔ細胞を単離し、疾患を共有しているが非応答性であり得る別の対象からのＴ細胞に応答性ＴＣＲ配列を移入することができる（ｄｅ Ｗｉｔｔｅ， Ｍ． Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｅｌｆ－ａｎｔｉｇｅｎｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ＴＣＲ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ， Ｂｌｏｏｄ １０８， ８７０－８７７ （２００６））。場合によっては、インビトロ技術を使用して、ＴＣＲの配列を変更し、応答性の弱い腫瘍特異的ＴＣＲと標的抗原との相互作用（アビディティ）の強さを向上させることにより、腫瘍殺傷活性を増強することができる （Ｓｃｈｍｉｄ， Ｄ． Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ＴＣＲ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｄｅｌｉｍｉｔｉｎｇ ｍａｘｉｍａｌ ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８４， ４９３６－４９４６ （２０１０） ）。

【0467】

いくつかの実施形態では、挿入配列は、がん細胞上で発現する抗原に特異的に結合する免疫細胞上で発現するタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、挿入配列は、がん細胞上で発現するネオ抗原に特異的に結合する免疫細胞上で発現するタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、挿入配列は、がん関連抗原に特異的に結合する免疫細胞上で発現するタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、挿入配列は、がん細胞上で発現する抗原に特異的に結合する免疫細胞上で発現するタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、挿入配列は、自己免疫疾患に関連する抗原に特異的に結合する免疫細胞上で発現するタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、挿入配列は、病原体（例えば、微生物、例えば、ウイルス、細菌、寄生虫、真菌、または酵母）上で発現する抗原に特異的に結合する免疫細胞上で発現するタンパク質をコードする。

【0468】

いくつかの実施形態では、挿入配列は、免疫細胞上で発現するタンパク質をコードし、癌胎児性抗原、アルファフェトタンパク質、ＣＡ－１２５、ＭＵＣ－１、上皮腫瘍抗原、メラノーマ関連抗原、変異ｐ５３、変異ｒａｓ、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、ＥＲＢＢ２、葉酸結合タンパク質、ＨＩＶ－１外被糖タンパク質ｇｐ１２０、ＨＩＶ－１外被糖タンパク質ｇｐ４１、ＧＤ２、ｃ－Ｍｅｔ、メソセリン、ＧＤ３、ＨＥＲＶ－Ｋ、ＩＬ－１１Ｒａｌｐｈａ、カッパ鎖、ラムダ鎖、ＣＳＰＧ４、ＥＲＢＢ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＶＥＧＦＲ２、炭酸アンヒドラーゼＩＸ、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、α－アクチニン－４、ＡＲＴ－４、Ａ１８４７、Ｂａ ７３３、ＢＡＧＥ、ＢＣＭＡ、ＢｒＥ３－抗原、ＣＡ１２５、ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ－１、ＣＡＳＰ－８／ｍ、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ－ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７ＯＬ、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１２３、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ－４／ｍ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＴＬＡ－４、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７、ＣＸＣＬ１２、ＨＩＦ－１α、結腸特異的抗原－ｐ（ＣＳＡｐ）、ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ５）、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ－Ｍｅｔ、ＤＡＭ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ－１（ＴＲＯＰ－２）、ＥＧＰ－２、ＥＬＦ２－Ｍ、Ｅｐ－ＣＡＭ、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、Ｆｌｔ－１、Ｆｌｔ－３、葉酸受容体、Ｇ２５０抗原、ＧＡＧＥ、ｇｐ１００、ＧＲＯ－β、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＭ１．２４、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＭＧＢ－１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ－１）、ＨＳＰ７０－２Ｍ、ＨＳＴ－２、Ｉａ、ＩＧＦ－１Ｒ、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－λ、ＩＬ－４Ｒ、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－１３Ｒ、ＩＬ－１５Ｒ、ＩＬ－１７Ｒ、ＩＬ－１８Ｒ、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２３、ＩＬ－２５、インスリン様成長因子－１（ＩＧＦ－１）、ＫＳ１－４、Ｌｅ－Ｙ、ＬＤＲ／ＦＵＴ、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ－３、ＭＡＲＴ－１、ＭＡＲＴ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＴＲＡＧ－３、ＣＲＰ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１Ａ、ＭＩＰ－１Ｂ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ａｃ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ１６、ＭＵＭ－１／２、ＭＵＭ－３、メソテリン、ＮＣＡ６６、ＮＣＡ９５、ＮＣＡ９０、膵臓癌ムチン、ＰＤ１、ＰＤ－１受容体、胎盤成長因子、ｐ５３、ＰＬＡＧＬ２、前立腺酸性ホスファターゼ、ＰＳＡ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、Ｐ１ＧＦ、ＩＬＧＦ、ＩＬＧＦ－１Ｒ、ＩＬ－６、ＩＬ－２５、ＲＳ５、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、ＳＡＧＥ、５１００、サバイビン、サバイビン－２Ｂ、ＴＡＣ、ＴＡＧ－７２、テネイシン、ＴＲＡＩＬ受容体、ＴＮＦ－α、Ｔｎ抗原、トムソン－フリーデンライヒ（Ｔｈｏｍｓｏｎ－Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ）抗原、腫瘍壊死抗原、ＶＥＧＦＲ、ＥＤ－Ｂフィブロネクチン、ＷＴ－１、１７－１Ａ－抗原、補体因子Ｃ３、補体因子Ｃ３ａ、補体因子Ｃ３ｂ、補体因子Ｃ５ａ、補体因子Ｃ５、７０７－ＡＰ、ビオチン化分子、ａ－アクチニン－４、ａｂｌ－ｂｃｒ ａｌｂ－ｂ３（ｂ２ａ２）、ａｂｌ－ｂｃｒ ａｌｂ－ｂ４（ｂ３ａ２）、アディポフィリン、ＡＦＰ、ＡＩＭ－２、アネキシンＩＩ、ＡＲＴ－４、ＢＡＧＥ、ｂ－カテニン、ｂｃｒ－ａｂｌ、ｂｃｒ－ａｂｌ ｐ１９０（ｅ１ａ２）、ｂｃｒ－ａｂｌ ｐ２１０ （ｂ２ａ２）、ｂｃｒ－ａｂｌ ｐ２１０ （ｂ３ａ２）、ＢＩＮＧ－４、ＣＡＧ－３、ＣＡＩＸ、ＣＡＭＥＬ、カスパーゼ－８、ＣＤ１７１、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ－４、ＣＥＡ、ＣＬＣＡ２、Ｃｙｐ－Ｂ、ＤＡＭ－１０、ＤＡＭ－６、ＤＥＫ－ＣＡＮ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ－２、ＥＧＰ－４０、ＥＬＦ２、Ｅｐ－ＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ｅｒｂ－Ｂ２、ｅｒｂ－Ｂ３、ｅｒｂ－Ｂ４、ＥＳ－ＥＳＯ－１ａ、ＥＴＶ６／ＡＭＬ、ＦＢＰ、胎児アセチルコリン受容体、ＦＧＦ－５、ＦＮ、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ＧＡＧＥ－３、ＧＡＧＥ－４、ＧＡＧＥ－５、ＧＡＧＥ－６、ＧＡＧＥ－７Ｂ、ＧＡＧＥ－８、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧｎＴ－Ｖ、Ｇｐ１００、ｇｐ７５、Ｈｅｒ－２、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１－Ｒ１７０Ｉ、ＨＭＷ－ＭＡＡ、ＨＳＰ７０－２ Ｍ、ＨＳＴ－２（ＦＧＦ６）、ＨＳＴ－２／ｎｅｕ、ｈＴＥＲＴ、ｉＣＥ、ＩＬ－１１Ｒα、ＩＬ－１３Ｒα２、ＫＤＲ、ＫＩＡＡ０２０５、Ｋ－ＲＡＳ、Ｌ１細胞接着分子、ＬＡＧＥ－１、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、ルイスＹ、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－１０、ＭＡＧＥ－１２、ＭＡＧＥ－２、ＭＡＧＥ－３、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－６、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ｂ１、ＭＡＧＥ－Ｂ２、リンゴ酸酵素、マンマグロビン－Ａ、ＭＡＲＴ－１／Ｍｅｌａｎ－Ａ、ＭＡＲＴ－２、ＭＣ１Ｒ、Ｍ－ＣＳＦ、ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ２、ＭＵＭ－１、ＭＵＭ－２、ＭＵＭ－３、Ｍｙｏｓｉｎ、ＮＡ８８－Ａ、Ｎｅｏ－ＰＡＰ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＰＭ／ＡＬＫ、Ｎ－ＲＡＳ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＯＡ１、ＯＧＴ、腫瘍胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＯＳ－９、Ｐポリペプチド、Ｐ１５、Ｐ５３、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＡ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＰＴＰＲＫ、ＲＡＧＥ、ＲＯＲ１、ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＲＴ－１、ＳＡＲＴ－２、ＳＡＲＴ－３、ＳＯＸ１０、ＳＳＸ－２、サバイビン、サバイビン－２Ｂ、ＳＹＴ／ＳＳＸ、ＴＡＧ－７２、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＴＧＦａＲＩＩ、ＴＧＦｂＲＩＩ、ＴＰ１、ＴＲＡＧ－３、ＴＲＧ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＴＲＰ－２／ＩＮＴ２、ＴＲＰ－２－６ｂ、チロシナーゼ、ＶＥＧＦ－Ｒ２、ＷＴ１、α－葉酸受容体、及びκ軽鎖、に特異的に結合する。

【0469】

場合によっては、挿入物に提供される細胞受容体は、ネオ抗原及び／またはネオエピトープに結合することができる可能性がある。ネオ抗原及びネオエピトープは、一般に、場合によっては抗腫瘍Ｔ細胞応答を誘発する腫瘍特異的変異を指す。例えば、これらの内因性変異は、全エクソームシーケンシングアプローチを使用して同定することができる。Ｔｒａｎ Ｅ， ｅｔ ａｌ．， “Ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ４＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａ ｐａｔｉｅｎｔ ｗｉｔｈ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃａｎｃｅｒ， ” Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４４： ６４１－６４４ （２０１４） 。抗原結合ドメイン、例えば、対象ＣＡＲまたは改変ＴＣＲ複合体の抗原結合ドメインは、腫瘍特異的ネオ抗原への特異的結合を示すことができる。改変ＴＣＲ複合体の抗原結合ドメインによって結合されるネオ抗原は、標的細胞上で発現することができ、例えば、任意の内因性遺伝子の変異によってコードされるネオ抗原及びネオペプチドである。場合によっては、２つ以上の抗原結合ドメインが、変異遺伝子によってコードされるネオ抗原またはネオエピトープに結合する。遺伝子は、ＡＢＬ１、ＡＣＯｌ １９９７、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＦＰ、ＡＫＴ１、ＡＬＫ、ＡＬＰＰＬ２、ＡＮＡＰＣ１、ＡＰＣ、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＲ、ＡＲ－ｖ７、ＡＳＣＬ２、β２Μ、ＢＲＡＦ、ＢＴＫ、Ｃ１５ＯＲＦ４０、ＣＤＨ１、ＣＬＤＮ６、ＣＮＯＴ１、ＣＴ４５Ａ５、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＤＣＴ、ＤＫＫ４、ＥＥＦ１Ｂ２、ＥＥＦ１ＤＰ３、ＥＧＦＲ、ＥＩＦ２Ｂ３、ｅｎｖ、ＥＰＨＢ２、ＥＲＢＢ３、ＥＳＲ１、ＥＳＲＰ１、ＦＡＭ１１ ＩＢ、ＦＧＦＲ３、ＦＲＧ１Ｂ、ＧＡＧＥ１、ＧＡＧＥ１０、ＧＡＴＡ３、ＧＢＰ３、ＨＥＲ２、ＩＤＨ１、ＪＡＫ１、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＬＭＡＮ１、ＭＡＢＥＢ１６、ＭＡＧＥＡ１、ＭＡＧＥＡ１０、ＭＡＧＥＡ４、ＭＡＧＥＡ８、ＭＡＧＥＢ１７、ＭＡＧＥＢ４、ＭＡＧＥＣ１、ＭＥＫ、ＭＬＡＮＡ、ＭＬＬ２、ＭＭＰ１３、ＭＳＨ３、ＭＳＨ６、ＭＹＣ、ＮＤＵＦＣ２、ＮＲＡＳ、ＮＹ－ＥＳＯ、ＰＡＧＥ２、ＰＡＧＥ５、ＰＤＧＦＲａ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＭＥＬ、ｐｏｌタンパク質、ＰＯＬＥ、ＰＴＥＮ、ＲＡＣ１、ＲＢＭ２７、ＲＮＦ４３、ＲＰＬ２２、ＲＵＮＸ１、ＳＥＣ３１Ａ、ＳＥＣ６３、ＳＦ３Ｂ １、ＳＬＣ３５Ｆ５、ＳＬＣ４５Ａ２、ＳＭＡＰ１、ＳＭＡＰ１、ＳＰＯＰ、ＴＦＡＭ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＨＡＰ５、ＴＰ５３、ＴＴＫ、ＴＹＲ、ＵＢＲ５、ＶＨＬ、及びＸＰＯＴからなる群から選択することができる。

【0470】

いくつかの実施形態では、挿入物において提供される細胞受容体は、間質上に存在し得る抗原またはエピトープに結合することができる。間質は一般に、とりわけ、生物学的細胞、組織、または器官の結合的及び機能的支持を提供する組織を指す。間質は、腫瘍微小環境のものであり得る。エピトープは、間質抗原に存在し得る。このような抗原は、腫瘍微小環境の間質に存在し得る。例えば、ネオ抗原及びネオエピトープは、腫瘍内皮細胞、腫瘍血管系、腫瘍線維芽細胞、腫瘍周皮細胞、腫瘍間質、及び／または腫瘍間葉細胞に存在し得る。抗原の例には、ＣＤ３４、ＭＣＳＰ、ＦＡＰ、ＣＤ３１、ＰＣＮＡ、ＣＤ１１７、ＣＤ４０、ＭＭＰ４、及びテネイシンが含まれるが、これらに限定されない。

【0471】

相同性アーム
ポリ核酸コンストラクトは、１つまたは複数の相同性アームを含むことができる。相同性アームは、編集される免疫細胞のゲノム内の配列とある程度の相同性を有する配列を含むことができ、それにより例えば、ポリ核酸コンストラクトまたはその一部を修復鋳型として使用して、免疫細胞ゲノムの二本鎖切断の修復（例えば、一本鎖アニーリング、相同性媒介末端結合、マイクロホモロジー媒介末端結合、代替末端結合、相同組換え修復、相同組換え、またはそれらの組み合わせを含む経路を介した修復）を誘導することができる。相同性アームは、ポリ核酸コンストラクトまたはその一部を、免疫細胞ゲノムの所望の部位、例えば、二本鎖切断に隣接する部位に標的化することができる。ポリ核酸コンストラクトは、１つの相同性アームを含むことができる。本開示のポリ核酸コンストラクトは、２つの相同性アームを含むことができる。ポリ核酸コンストラクトの２つの相同性アームは、免疫細胞ゲノムに挿入される配列（例えば、導入遺伝子）に隣接し得る。多核酸コンストラクト中の２つの相同性アームは、互いに直接隣接することができる（例えば、免疫細胞ゲノムに欠失を生成するために）。本開示のポリ核酸コンストラクトは、３つ以上の相同性アームを含むことができる。

【0472】

本開示の相同性アームは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）であり得る。他の態様において、相同性アームは二本鎖（ｄｓＤＮＡ）である。いくつかの態様において、１つまたは複数の相同性アームは１００ｎｔであり、ドナー挿入配列の各側に隣接することができる。いくつかの態様において、相同性アームまたは相同性アームは、約５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、または２００ｎｔのｓｓＤＮＡであり、ドナー挿入配列の各側に隣接することができる。いくつかの態様において、１つ以上の相同性アームは約１００ｎｔであり、ドナー挿入配列の各側に隣接することができる。

【0473】

相同性アームは、編集される免疫細胞のゲノム中の配列と約または少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．１％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含むことができる。相同性アームは、ポリ核酸コンストラクトまたはその一部を免疫細胞ゲノムにおける二本鎖切断のための修復鋳型として使用することが可能となるのに十分な程度の相同性を有する配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、相同性アームは、免疫細胞ゲノムにおける相同配列と一致しない１つ以上のヌクレオチドを含有することができる（例えば、１つ以上の一塩基多型（ＳＮＰ）の修正のため、または１つ以上のＳＮＰの導入のため）。いくつかの実施形態では、多核酸コンストラクト中の２つ以上の相同性アームは、免疫細胞ゲノム中の対応する部位に対して同程度の相同性を含む。いくつかの実施形態では、多核酸コンストラクト中の２つ以上の相同性アームは、免疫細胞ゲノム中の対応する部位に対して異なる程度の相同性を含む。相同性アームは、遺伝子のヌクレオチド、オープンリーディングフレームのヌクレオチド、非コード領域のヌクレオチド、またはそれらの組み合わせに相同である核酸配列を含むことができる。

【0474】

いくつかの実施形態では、相同性アームは、長さ約２４ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、相同性アームは、長さ約４８ヌクレオチドである。相同性アームは、例えば、長さ約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５２０、５４０、５６０、５８０、６００、６２０、６４０、６６０、６８０、７００、７２０、７４０、７６０、７８０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１５５０、１６００、１６５０、１７００、１７５０、１８００、１８５０、１９００、１９５０、または２０００ヌクレオチドであり得る。

【0475】

いくつかの実施形態では、本開示の相同性アームは、長さが最長３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５２０、５４０、５６０、５８０、６００、６２０、６４０、６６０、６８０、７００、７２０、７４０、７６０、７８０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１５５０、１６００、１６５０、１７００、１７５０、１８００、１８５０、１９００、１９５０、または２０００ヌクレオチドであり得る。

【0476】

いくつかの実施形態では、本開示の相同性アームは、長さが少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５２０、５４０、５６０、５８０、６００、６２０、６４０、６６０、６８０、７００、７２０、７４０、７６０、７８０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１５５０、１６００、１６５０、１７００、１７５０、１８００、１８５０、１９００、１９５０、または２０００ヌクレオチドであり得る。

【0477】

相同性アームは、短い相同性アームであり得る。短い相同性アームは、例えば、長さが最長３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、または４００ヌクレオチドであり得る。

【0478】

短い相同性アームは、例えば、長さが約３～４００、５～３００、５～２００、５～１００、５～９０、５～８０、５～７０、５～６０、５～５０、５～４９、５～４８、５～４７、５～４６、５～４５、５～４４、５～４３、５～４２、５～４１、５～４０、５～３９、５～３８、５～３７、５～３６、５～３５、５～３４、５～３３、５～３２、５～３１、５～３０、５～２９、５～２８、５～２７、５～２６、５～２５、５～２４、５～２３、５～２２、５～２１、５～２０、５～１９、５～１８、５～７、５～１６、５～１５、５～１４、５～１３、５～１２、５～１１、５～１０、１０～５０、１０～４９、１０～４８、１０～４７、１０～４６、１０～４５、１０～４４、１０～４３、１０～４２、１０～４１、１０～４０、１０～３９、１０～３８、１０～３７、１０～３６、１０～３５、１０～３４、１０～３３、１０～３２、１０～３１、１０～３０、１０～２９、１０～２８、１０～２７、１０～２６、１０～２５、１０～２４、１０～２３、１０～２２、１０～２１、１０～２０、１０～１９、１０～１８、１０～１７、１０～１６、１０～１５、１５～５０、１５～４９、１５～４８、１５～４７、１５～４６、１５～４５、１５～４４、１５～４３、１５～４２、１５～４１、１５～４０、１５～３９、１５～３８、１５～３７、１５～３６、１５～３５、１５～３４、１５～３３、１５～３２、１５～３１、１５～３０、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、２０～５０、２０～４９、２０～４８、２０～４７、２０～４６、２０～４５、２０～４４、２０～４３、２０～４２、２０～４１、２０～４０、２０～３９、２０～３８、２０～３７、２０～３６、２０～３５、２０～３４、２０～３３、２０～３２、２０～３１、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２４～５０、２４～４９、２４～４８、２４～４７、２４～４６、２４～４５、２４～４４、２４～４３、２４～４２、２４～４１、２４～４０、２４～３９、２４～３８、２４～３７、２４～３６、２４～３５、２４～３４、２４～３３、２４～３２、２４～３１、２４～３０、２４～２９、または２４～２８ヌクレオチドであり得る。

【0479】

相同性アームは、長い相同性アームであり得る。長い相同性アームは、例えば、長さが少なくとも４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５２０、５４０、５６０、５８０、６００、６２０、６４０、６６０、６８０、７００、７２０、７４０、７６０、７８０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、または１５００ヌクレオチドであり得る。

【0480】

いくつかの実施形態では、相同性アームは、３の倍数である複数のヌクレオチドを含有する。いくつかの実施形態では、相同性アームは、３の倍数ではない複数のヌクレオチドを含有する。いくつかの実施形態では、相同性アームは、４の倍数である複数のヌクレオチドを含有する。いくつかの実施形態では、相同性アームは、４の倍数ではない複数のヌクレオチドを含有する。

【0481】

本開示のポリ核酸コンストラクトは、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上の相同性アームを含むことができる。いくつかの実施形態では、多核酸コンストラクト中の２つ以上の相同性アームは、同じ長さである。いくつかの実施形態では、多核酸コンストラクト中の２つ以上の相同性アームは、異なる長さである。

【0482】

いくつかの実施形態では、相同性アームは、標的部位に隣接するゲノム遺伝子座に少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％相補的であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、相同性アームは、標的部位に隣接するゲノム遺伝子座に約７０％～１００％、８０％～１００％、９０％～１００、９５％～１００％、９６％～１００％、９７％～１００％、９８％～１００％、９９％～１００％相補的であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、相同性アームは、標的部位に隣接するゲノム遺伝子座に約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％相補的であるヌクレオチド配列を含む。

【0483】

いくつかの実施形態では、相同性アームは、表１からの遺伝子、免疫チェックポイント遺伝子、セーフハーバー遺伝子、またはそれらの任意の組み合わせに約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％相補的である配列を含み得る。

【0484】

切断部位
いくつかの実施形態では、挿入配列に隣接する多核酸コンストラクト中の１つ以上（例えば、２つ）の相同性アームは、切断部位に隣接している。例えば、いくつかの実施形態では、ポリ核酸コンストラクトは、２つの相同性アームを含み、挿入配列（例えば、導入遺伝子）の各末端に１つあり、各相同性アームは、切断部位に隣接している。例えば、５’から３’までのポリ核酸は、第１の切断部位、第１の相同性アーム、挿入配列（例えば、導入遺伝子）、第２の相同性アーム、及び第２の切断部位を含み得る。いくつかの実施形態では、ポリ核酸コンストラクトは、１つの相同性アームを含有する。例えば、ポリ核酸は、５’から３’までの切断部位、相同性アーム、挿入配列（例えば、導入遺伝子）；または、挿入配列、相同性アーム、及び切断部位；または、切断部位、挿入配列、相同性アーム、及び切断部位；または、切断部位、相同性アーム、挿入配列、及び切断部位、を含み得る。

【0485】

いくつかの実施形態では、前記切断部位は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）によって認識される標的化配列に隣接している。いくつかの実施形態では、標的化配列は、エンドヌクレアーゼを切断部位に誘導するｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）によって認識される。いくつかの実施形態では、前記エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲシステムエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ）、ＴＡＬＥＮエンドヌクレアーゼ、またはジンクフィンガーエンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、前記エンドヌクレアーゼは、本明細書に記載されたエンドヌクレアーゼである。

【0486】

いくつかの実施形態では、切断部位は、ＣＲＩＳＰＲシステム切断部位である。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステム切断部位は、ＰＡＭモチーフ及びｇＲＮＡに少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ｇＲＮＡは、前記配列に結合する。

【0487】

いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステム切断部位は、ＰＡＭモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸コンストラクトは、ＰＡＭモチーフと相同性アームとの間にスペーサーを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｂｐである。いくつかの実施形態では、スペーサーは、約１～１０ｂｐ、１～９ｂｐ、１～８ｂｐ、１～７ｂｐ、１～６ｂｐ、１～５ｂｐ、１～４ｂｐ、１～３ｂｐ、または１～２ｂｐである。いくつかの実施形態では、スペーサーは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｂｐである。いくつかの実施形態では、スペーサーは約３ｂｐである。いくつかの実施形態では、スペーサーは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、スペーサーは、約１～１０ヌクレオチド、１～９ヌクレオチド、１～８ヌクレオチド、１～７ヌクレオチド、１～６ヌクレオチド、１～５ヌクレオチド、１～４ヌクレオチド、１～３ヌクレオチド、または１～２ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、スペーサーは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、スペーサーは約３ヌクレオチドである。

【0488】

プロモーター及びエンハンサー
いくつかの実施形態では、前記ポリ核酸コンストラクトは、プロモーターを含む。好適なプロモーターは、当業者によって選択され得る。導入遺伝子の発現は、少なくとも１つのプロモーターによって制御することができる。例示的なプロモーターには、ＣＭＶ、Ｕ６、ＭＮＤ、ＰＫＧ、ＭＮＤ、またはＥＦ１ａが含まれるが、これらに限定されない。

【0489】

プロモーターは、遍在性、構成的（関連する遺伝子の継続的な転写を可能にする非制御プロモーター）、組織特異的プロモーター、または誘導性プロモーターであり得る。例示的な遍在性プロモーターには、ＣＡＧＧＳプロモーター、ｈＣＭＶプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、またはＲＯＳＡ２６プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。

【0490】

プロモーターは内因性または外因性であり得る。例えば、１つ以上の導入遺伝子は、内因性または外因性ＲＯＳＡ２６プロモーターに隣接してまたはその近くに挿入することができる。さらに、プロモーターはＴ細胞に特異的であり得る。例えば、１つ以上の導入遺伝子は、ブタのＲＯＳＡ２６プロモーターに隣接してまたはその近くに挿入することができる。

【0491】

組織特異的プロモーターまたは細胞特異的プロモーターを使用して、発現の位置を制御することができる。例えば、１つ以上の導入遺伝子は、組織特異的プロモーターに隣接して、またはその近くに挿入することができる。組織特異的プロモーターは、ＦＡＢＰプロモーター、Ｌｃｋプロモーター、ＣａｍＫＩＩプロモーター、ＣＤ１９プロモーター、ケラチンプロモーター、アルブミンプロモーター、ａＰ２プロモーター、インスリンプロモーター、ＭＣＫプロモーター、ＭｙＨＣプロモーター、ＷＡＰプロモーター、またはＣｏｌ２Ａプロモーターであり得る。

【0492】

誘導性プロモーターも使用することができる。これらの誘導性プロモーターは、誘導剤を添加または除去することにより、必要に応じてオン及びオフにすることができる。誘導性プロモーターは、Ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ａｒａＢＡＤ、ｐｈｏＡ、ｒｅｃＡ、ｐｒｏＵ、ｃｓｔ－１、ｔｅｔＡ、ｃａｄＡ、ｎａｒ、ＰＬ、ｃｓｐＡ、Ｔ７、ＶＨＢ、Ｍｘ、及び／またはＴｒｅｘであり得るが、これらに限定されないことが企図される。

【0493】

いくつかの実施形態では、挿入配列は、エンハンサーを含む。いくつかの実施形態では、エンハンサーは組織特異的である。いくつかの実施形態では、挿入配列は、複数のエンハンサー（例えば、少なくとも２つ）を含む。

【0494】

細胞を遺伝子改変する方法
本明細書で提供されるのは、ゲノム改変細胞、例えば、免疫細胞、例えば、本明細書に記載の免疫細胞を作製する方法である。いくつかの実施形態では、方法は、標的化遺伝子配列にゲノム破壊を導入するエンドヌクレアーゼシステム（例えば、ｇＲＮＡ及びＣａｓヌクレアーゼを含むＣＲＩＳＰＲシステム）を細胞（例えば、免疫細胞）に導入する（例えば、エクスビボ）こと、及び少なくとも１つ（例えば、２つ）の切断配列、少なくとも１つ（例えば、２つの相同性アーム）及び挿入配列（例えば、導入遺伝子）を含むポリ核酸コンストラクト（例えば、本明細書に記載の）を細胞に導入することであって、導入遺伝子はゲノム破壊に挿入される、導入することを含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、少なくとも１つの切断部位に二本鎖切断を導入する。いくつかの実施形態では、単一のエンドヌクレアーゼが導入される。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのエンドヌクレアーゼが使用される。いくつかの実施形態では、挿入配列は、マイクロホモロジー媒介末端結合を介してゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態では、挿入配列は、一本鎖アニーリングを介してゲノムに組み込まれる。挿入配列は、相同性媒介末端結合を介してゲノムに組み込まれる。

【0495】

ポリ核酸コンストラクトの切断
いくつかの実施形態では、挿入配列に隣接する多核酸コンストラクト中の１つ以上（例えば、２つ）の相同性アームは、切断部位に隣接している。例えば、いくつかの実施形態では、ポリ核酸コンストラクトは、２つの相同性アームを含み、挿入配列（例えば、導入遺伝子）の各末端に１つあり、各相同性アームは、切断部位に隣接している。例えば、５’から３’までのポリ核酸は、第１の切断部位、第１の相同性アーム、挿入配列（例えば、導入遺伝子）、第２の相同性アーム、及び第２の切断部位を含み得る。いくつかの実施形態では、ポリ核酸コンストラクトは、１つの相同性アームを含有する。例えば、ポリ核酸は、５’から３’までの切断部位、相同性アーム、挿入配列（例えば、導入遺伝子）；または、挿入配列、相同性アーム、及び切断部位；または、切断部位、挿入配列、相同性アーム、及び切断部位；または、切断部位、相同性アーム、挿入配列、及び切断部位、を含み得る。

【0496】

いくつかの実施形態では、切断部位は、エンドヌクレアーゼによって認識される。いくつかの実施形態では、切断部位は、本明細書に記載されるように、ＣＲＩＳＰＲ、ジンクフィンガー、またはＴＡＬＥＮシステム切断部位を含む。いくつかの実施形態では、切断部位は、ＣＲＩＳＰＲシステム切断部位を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステム切断部位は、ＰＡＭ配列（例えば、本明細書に記載されるような）及びｇＲＮＡによって認識される標的指向性核酸配列（例えば、本明細書に記載されるような）を含む。

【0497】

いくつかの実施形態では、切断部位での切断は、エンドヌクレアーゼを細胞に導入することによって媒介される。いくつかの実施形態では、切断部位での切断は、ＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本明細書に記載されるような）を細胞に導入することによって媒介される。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムは、エンドヌクレアーゼ（例えば、本明細書に記載されるような）及びｇＲＮＡ（例えば、本明細書に記載されるような）を含む。

【0498】

ゲノム標的部位
いくつかの実施形態では、挿入配列は、細胞のゲノム中の内因性遺伝子に挿入される。いくつかの実施形態では、遺伝子は、セーフハーバー遺伝子座、例えば、ＡＡＶＳ（例えば、ＡＡＶＳ１、ＡＡＶＳ２）、ＣＣＲ５、ｈＲＯＳＡ２６、アルブミン。またはＨＰＲＴである。

【0499】

いくつかの実施形態では、遺伝子は、細胞表面受容体（例えば、ＴＣＲ、ＢＣＲ）をコードする。

【0500】

いくつかの実施形態では、遺伝子は、阻害性免疫チェックポイントタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、阻害性免疫チェックポイントタンパク質は、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＶＩＳＴＡまたはＣＩＳＨである。いくつかの実施形態では、遺伝子は、表１の遺伝子をコードする。

【0501】

場合によっては、本明細書で提供されるコンストラクトは、表１からの例示的な内因性遺伝子のいずれか１つ及び／または他の同等の遺伝子を標的とする相同性アームを含むことができる。例えば、コンストラクトは、表１の遺伝子の領域に特異的な相同性アームを含むことができる。いくつかの態様において、例示的な内因性遺伝子は、本明細書で提供される導入遺伝子挿入配列で破壊され得る。破壊は、内因性遺伝子によってコードされるＲＮＡまたはタンパク質の発現を減少及び／または排除するのに十分であり得る。

【0502】

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表1-4】

【表1-5】

【表1-6】

【表1-7】

【表1-8】

【表1-9】

【表1-10】

【表1-11】

【表1-12】

【表1-13】

【表1-14】

【表1-15】

【0503】

いくつかの実施形態では、遺伝子は、ＩＴＩＭを含む細胞表面受容体をコードする。いくつかの実施形態では、内因性遺伝子はＴＲＡＣ、ＴＣＲＢ、アデノシンＡ２ａ受容体（ＡＤＯＲＡ）、ＣＤ２７６、Ｖセットドメイン含有Ｔ細胞活性化阻害剤１（ＶＴＣＮ１）、Ｂ及びＴリンパ球関連（ＢＴＬＡ）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ１（ＩＤＯ１）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体、３つのドメイン、長い細胞質側末端、１（ＫＩＲ３ＤＬ１）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、プログラム細胞死１（ＰＤ－１）、Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体２（ＨＡＶＣＲ２）、Ｔ細胞活性化のＶドメイン免疫グロブリンサプレッサー（ＶＩＳＴＡ）、ナチュラルキラー細胞受容体２Ｂ４（ＣＤ２４４）、サイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ）、アデノ随伴ウイルス組み込み部位（ＡＡＶＳ（例：ＡＡＶＳ１、ＡＡＶＳ２））、またはケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）受容体５（遺伝子／偽遺伝子）（ＣＣＲ５）、ＣＤ１６０分子（ＣＤ１６０）、Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、ＣＤ９６分子（ＣＤ９６）、細胞傷害性及び制御性Ｔ細胞分子（ＣＲＴＡＭ）、白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン７（ＳＩＧＬＥＣ７）、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン９（ＳＩＧＬＥＣ９）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０ａ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ）、カスパーゼ８（ＣＡＳＰ８）、カスパーゼ１０（ＣＡＳＰ１０）、カスパーゼ３（ＣＡＳＰ３）、カスパーゼ６（ＣＡＳＰ６）、カスパーゼ７（ＣＡＳＰ７）、Ｆａｓ関連デスドメイン（ＦＡＤＤ）、Ｆａｓ細胞表面死受容体（ＦＡＳ）、トランスフォーミング成長因子ベータ受容体ＩＩ（ＴＧＦＢＲＩＩ）、トランスフォーミング成長因子ベータ受容体Ｉ（ＴＧＦＢＲ１）、ＳＭＡＤファミリーメンバー２（ＳＭＡＤ２）、ＳＭＡＤファミリーメンバー３（ＳＭＡＤ３）、ＳＭＡＤファミリーメンバー４（ＳＭＡＤ４）、ＳＫＩプロトオンコジーン（ＳＫＩ）、ＳＫＩ様プロトオンコジーン（ＳＫＩＬ）、ＴＧＦＢ誘導因子ホメオボックス１（ＴＧＩＦ１）、インターロイキン１０受容体サブユニットアルファ（ＩＬ１０ＲＡ）、インターロイキン１０受容体サブユニットベータ（ＩＬ１０ＲＢ）、ヘムオキシゲナーゼ２（ＨＭＯＸ２）、インターロイキン６受容体（ＩＬ６Ｒ）、インターロイキン６シグナルトランスデューサー（ＩＬ６ＳＴ）、ｃ－ｓｒｃチロシンキナーゼ（ＣＳＫ）、スフィンゴ糖脂質マイクロドメイン１（ＰＡＧ１）を有するリンタンパク質膜アンカー、シグナル伝達閾値調節膜貫通アダプター１（ＳＩＴ１）、フォークヘッドボックスＰ３（ＦＯＸＰ３）、ＰＲドメイン１（ＰＲＤＭ１）、塩基性ロイシンジッパー転写因子、ＡＴＦ様（ＢＡＴＦ）、グアニル酸シクラーゼ１、可溶性、アルファ２（ＧＵＣＹ１Ａ２）、グアニル酸シクラーゼ１、可溶性、アルファ３（ＧＵＣＹ１Ａ３）、グアニル酸シクラーゼ１、可溶性、ベータ２（ＧＵＣＹ１Ｂ２）、グアニル酸シクラーゼ１、可溶性、ベータ３（ＧＵＣＹ１Ｂ３）、プロリルヒドロキシラーゼドメイン（ＰＨＤ１、ＰＨＤ２、ＰＨＤ３）タンパク質ファミリー、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ－３、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＤ１２２、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、またはＰＰＰ１Ｒ１２Ｃである。

【0504】

いくつかの実施形態では、複数の（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、またはそれ以上の）標的遺伝子が、宿主ゲノムにおいて破壊される。いくつかの実施形態では、ゲノム破壊は二本鎖ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、１つの二本鎖切断が、宿主ゲノムの標的部位に導入される。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの二本鎖切断が、宿主ゲノムの２つの異なる標的部位に導入される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡの大部分の欠失を媒介するために、２つの二本鎖切断が宿主ゲノム中の２つの異なる標的部位に導入される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡの大部分の欠失を媒介するために、２つの二本鎖切断が宿主ゲノム中の単一の遺伝子に導入される。いくつかの実施形態では、ゲノム破壊は、ゲノム破壊を含む遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を抑制する。いくつかの実施形態では、ゲノム破壊は、ゲノム破壊を含む遺伝子によってコードされる機能性タンパク質の発現を抑制する。

【0505】

ＤＮＡ修復経路
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、少なくとも１つの二本鎖切断が導入された修復鋳型を使用して、細胞（ｃａｌｌ）のゲノムに導入された二本鎖切断を解決する方法である。修復鋳型に少なくとも１つの二本鎖（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔａｎｄ）切断を導入すると、ゲノムへ挿入配列を挿入するために、代替または追加の修復経路、例えば、末端切除を含む経路、修復鋳型に短い相同性アームのみを必要とする経路、またはそれらの組み合わせの使用が可能になる。利用することができる代替または追加の修復経路の非限定的な例としては、一本鎖アニーリング、相同性媒介末端結合、マイクロホモロジー媒介末端結合、代替末端結合、及びそれらの組み合わせを含む経路が含まれる。

【0506】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法では、少なくとも１つの二本鎖切断を有さない修復鋳型を使用する同等の方法と比較して、組み込み効率の向上が示される。

【0507】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法により、少なくとも１つの二本鎖切断を有さない修復鋳型を使用する同等の集団と比較して、挿入配列を組み込む細胞のパーセンテージが増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞集団中の細胞の少なくとも３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％が挿入配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞集団中の細胞の少なくとも１０％が挿入配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞集団中の細胞の少なくとも２０％が挿入配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞集団中の細胞の少なくとも３０％が挿入配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞集団中の細胞の少なくとも４０％が挿入配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞集団中の細胞の少なくとも５０％が挿入配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞集団中の細胞の少なくとも６０％が挿入配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞集団中の細胞の少なくとも７０％が挿入配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞集団中の細胞の少なくとも８０％が挿入配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞集団中の細胞の少なくとも９０％が挿入配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞集団中の細胞の少なくとも３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％が挿入配列を含み、生存可能である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞集団中の細胞の少なくとも１０％が挿入配列を含み、生存可能である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞集団中の細胞の少なくとも２０％が挿入配列を含み、生存可能である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞集団中の細胞の少なくとも３０％が挿入配列を含み、生存可能である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞集団中の細胞の少なくとも４０％が挿入配列を含み、生存可能である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞集団中の細胞の少なくとも５０％が挿入配列を含み、生存可能である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞集団中の細胞の少なくとも６０％が挿入配列を含み、生存可能である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞集団中の細胞の少なくとも７０％が挿入配列を含み、生存可能である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞集団中の細胞の少なくとも８０％が挿入配列を含み、生存可能である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞集団中の細胞の少なくとも９０％が挿入配列を含み、生存可能である。いくつかの実施形態では、導入遺伝子の組み込みは、前記導入遺伝子の導入後、１～３０、１～２１、１～１４、１～７、１～５、１～４、１～３、１～２日目に測定される。いくつかの実施形態では、細胞生存率は、前記導入遺伝子の導入後、１～３０、１～２１、１～１４、１～７、１～５、１～４、１～３、１～２日目に測定される。

【0508】

いくつかの実施形態では、挿入配列組み込みの効率は、挿入配列を含む多核酸コンストラクトにおける少なくとも１つの二本鎖切断の導入効率の関数である。いくつかの実施形態では、挿入配列組み込みの効率は、挿入配列を含む多核酸コンストラクトからの導入遺伝子の切除効率の関数である。

【0509】

いくつかの実施形態では、組み込まれた導入遺伝子を含む細胞は増殖される。いくつかの実施形態では、組み込まれた導入遺伝子を含む細胞は、選択的に増殖される。いくつかの実施形態では、組み込まれた導入遺伝子を含む細胞は、インビトロで増殖される。

【0510】

細胞の生存率及び組み込み効率
本明細書で提供されるのは、ゲノム移植を増強する方法である。場合によっては、本明細書で提供される方法により、細胞生存率が向上する。場合によっては、本明細書で提供される方法により、導入遺伝子の組み込み効率（「トランスフェクション効率」とも呼ばれる）が向上する。場合によっては、本明細書で提供される方法により、細胞生存率及び導入遺伝子の組み込み効率の両方が向上する。

【0511】

場合によっては、細胞生存率は、種々のアプローチによる細胞計数によって測定される。場合によっては、生細胞を染色することにより細胞計数を支援することができる。場合によっては、細胞計数は、例えば、フローサイトメトリーまたはオブジェクト認識アルゴリズムによって自動化することができる。場合によっては、細胞計数を手動で実行することができる。場合によっては、細胞の生存率を直接観察することができ、例えば、培養皿内の細胞は、死滅するときに凝集する傾向がある。場合によっては、細胞生存率は、例えば、限定されるものではないが、細胞溶解、膜漏出、ミトコンドリア活性またはカスパーゼ発現、ある特定の細胞機能、ある特定の遺伝子の発現、ゲノムの完全性を測定することができる生存率アッセイによって測定することができる。場合によっては、細胞生存率は生存率色素染色によって測定することができる。場合によっては、生存率色素染色の後にフローサイトメトリーを行うことができる。生存率色素は、生細胞または死細胞または死滅しつつある細胞を区別することができる。細胞の示差染色は、例えば、フローサイトメトリーまたは顕微鏡検査によって検出することができる。

【0512】

組み込み効率は、細胞内への導入遺伝子のゲノム挿入を検出することによって測定することができる。場合によっては、導入遺伝子産物を検出することによって組み込み効率を測定することができる。例えば、外因性ポリ核酸は、レポーター遺伝子、例えば、蛍光タンパク質、例えば、ＧＦＰ、ＹＦＰ、またはｍＣｈｅｒｒｙを含むことができる。場合によっては、組み込み効率は、レポーター遺伝子の発現を調べることによって、例えば、蛍光タンパク質を発現している細胞を計数することができるフローサイトメトリーによって測定することができる。場合によっては、エレクトロポレーションされた細胞のゲノム配列を直接評価することによって、例えば、シーケンシングを介して導入遺伝子の挿入を調査することによって、組み込み効率を測定することができる。

【0513】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法では、少なくとも１つの二本鎖切断を有さない修復鋳型を使用する同等の方法と比較して、組み込み効率の向上が示される。

【0514】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法により、少なくとも１つの二本鎖切断を有さない修復鋳型を使用する同等の集団と比較して、挿入配列を組み込む細胞のパーセンテージが増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞集団中の細胞の少なくとも３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％が挿入配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞集団中の細胞の少なくとも１０％が挿入配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞集団中の細胞の少なくとも２０％が挿入配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞集団中の細胞の少なくとも３０％が挿入配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞集団中の細胞の少なくとも４０％が挿入配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞集団中の細胞の少なくとも５０％が挿入配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞集団中の細胞の少なくとも６０％が挿入配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞集団中の細胞の少なくとも７０％が挿入配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞集団中の細胞の少なくとも８０％が挿入配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞集団中の細胞の少なくとも９０％が挿入配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞集団中の細胞の少なくとも３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％が挿入配列を含み、生存可能である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞集団中の細胞の少なくとも１０％が挿入配列を含み、生存可能である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞集団中の細胞の少なくとも２０％が挿入配列を含み、生存可能である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞集団中の細胞の少なくとも３０％が挿入配列を含み、生存可能である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞集団中の細胞の少なくとも４０％が挿入配列を含み、生存可能である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞集団中の細胞の少なくとも５０％が挿入配列を含み、生存可能である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞集団中の細胞の少なくとも６０％が挿入配列を含み、生存可能である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞集団中の細胞の少なくとも７０％が挿入配列を含み、生存可能である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞集団中の細胞の少なくとも８０％が挿入配列を含み、生存可能である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞集団中の細胞の少なくとも９０％が挿入配列を含み、生存可能である。いくつかの実施形態では、導入遺伝子の組み込みは、前記導入遺伝子の導入後、１～３０、１～２１、１～１４、１～７、１～５、１～４、１～３、１～２日目に測定される。いくつかの実施形態では、細胞生存率は、前記導入遺伝子の導入後、１～３０、１～２１、１～１４、１～７、１～５、１～４、１～３、１～２日目に測定される。

【0515】

いくつかの実施形態では、挿入配列組み込みの効率は、挿入配列を含む多核酸コンストラクトにおける少なくとも１つの二本鎖切断の導入効率の関数である。いくつかの実施形態では、挿入配列組み込みの効率は、挿入配列を含む多核酸コンストラクトからの導入遺伝子の切除効率の関数である。

【0516】

いくつかの実施形態では、組み込まれた導入遺伝子を含む細胞は増殖される。いくつかの実施形態では、組み込まれた導入遺伝子を含む細胞は、選択的に増殖される。いくつかの実施形態では、組み込まれた導入遺伝子を含む細胞は、インビトロで増殖される。

【0517】

ヌクレアーゼ処理
本明細書で提供されるのは、細胞操作からの全体的な収量を改善する方法であって、例えば、細胞操作後の細胞生存率を改善すること、及び／またはトランスフェクション効率を改善することを含み、遺伝子改変細胞を十分な量の少なくとも１つのヌクレアーゼと接触させることを含む、方法、である。場合によっては、十分な量の少なくとも１つのヌクレアーゼと十分な時間接触させると、細胞の生存率を向上させることができる。場合によっては、十分な量の少なくとも１つのヌクレアーゼと一定期間接触させると、トランスフェクション効率を向上させることができる。場合によっては、十分な量の少なくとも１つのヌクレアーゼと十分な時間接触させると、細胞の生存率とトランスフェクション効率の両方を向上させることができる。

【0518】

特定の理論に拘束されることを望むものではないが、当技術分野の技術の１つにおいて理解されるように、トランスフェクション中に、細胞膜の少なくとも１つの点が破壊されて、外因性核酸及び／または他の薬剤が細胞に入り、細胞の完全性への侵襲的な損傷がもたらされ、及び開いた膜の可逆的な性質にもかかわらず、潜在的に持続的な効果を伴う。さらに、外因性薬剤が細胞内環境に導入されるため、細胞は必ずしもそれらの細胞内存在に対して耐性があるとは限らない。別の潜在的な悪影響は、細胞膜が一時的に開いた後に再封鎖されるときに、細胞膜の脂質二重層の間に閉じ込められる可能性のある外因性物質に起因し得る。

【0519】

場合によっては、細胞生存率を促進する方法は、細胞をヌクレアーゼと接触させることを含み得、これは、定義により、選択性を有するポリ核酸におけるホスホジエステル連結の加水分解切断（加水分解または消化）を触媒することができる。ヌクレアーゼは、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮアーゼ）、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、またはその両方を含むことができる。ＤＮアーゼはＤＮＡを特異的に消化することができるが、ＲＮアーゼはＲＮＡを特異的に消化することができる。ヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼとして分類することもできる。エキソヌクレアーゼは、５’、３’、両端からポリ核酸分子の加水分解を触媒する一群の酵素のいずれかを指し得る。エンドヌクレアーゼは、ポリ核酸分子の内部における核酸間のポリ核酸分子の加水分解を触媒する一群の酵素のいずれかを指し得る。一部の酵素は、エキソヌクレアーゼとエンドヌクレアーゼの両方の特性を有することができる。さらに、一部の酵素はＤＮＡ配列とＲＮＡ配列の両方を消化することができる。

【0520】

ヌクレアーゼとの接触により、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約９０％、約１００％、約１２５％、約１５０％、約１７５％、約２００％、約２５０％、約３００％、またはそれ以上の生存パーセンテージの増加がもたらされる可能性がある。場合によっては、生存パーセンテージの増加は、約５０％から約２００％になる可能性がある。ヌクレアーゼとの接触により、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約９０％、約１００％、約１２５％、約１５０％、約１７５％、約２００％、約２５０％、約３００％、またはそれ以上であり得る組み込み効率の向上がもたらされる可能性がある。場合によっては、組み込み効率の向上は約５０％～約２００％であり得る。

【0521】

本明細書に記載の主題に関連するＤＮアーゼの非限定的な例には、ＤＮアーゼＩ、ベンゾナーゼ、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、マングビーンヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＢＡＬ３１、ＲＮアーゼＩ、Ｓ１ヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＪ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、及びそれぞれの認識配列におけるホスホジエステル（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅａｓｔｅｒ）連結の切断に特化した種々の制限酵素が含まれる。本明細書に開示される主題に関連するＲＮアーゼの非限定的な例には、ＲＮアーゼＡ、ＲＮアーゼＨ、ＲＮアーゼＩＩＩ、ＲＮアーゼＬ、ＲＮアーゼＰ、ＲＮアーゼＰｈｙＭ、ＲＮアーゼＴ１、ＲＮアーゼＴ１、ＲＮアーゼＵ２、ＲＮアーゼＶ、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ、ＲＮアーゼＰＨ、ＲＮアーゼＲ、ＲＮアーゼＤ、ＲＮアーゼＩ、ＲＮアーゼＩＩ、ＲＮアーゼＴ、オリゴリボヌクレアーゼ、エキソリボヌクレアーゼＩ、及びエキソリボヌクレアーゼＩＩが含まれる。細胞に導入されるポリ核酸の特性及びトランスフェクトされる細胞のタイプに応じて、適切なヌクレアーゼを選択することができる。

【0522】

場合によっては、細胞トランスフェクション後にヌクレアーゼを適用することができる。場合によっては、細胞のトランスフェクションが完了した直後にヌクレアーゼを導入することができる。場合によっては、ヌクレアーゼは、細胞トランスフェクションが実施されている間に導入することができ、例えば、エレクトロポレーションが行われている間に適用することができ、または細胞がまだトランスフェクション試薬に曝露されている間に適用することができる。場合によっては、トランスフェクション後数分から数時間まででヌクレアーゼを導入することができる。細胞トランスフェクションの完了とヌクレアーゼの適用との間の時間遅延は、約３０秒、約１分、約２分、約３分、約４分、約５分、約６分、約７分、約８分、約９分、約１０分、約１５分、約３０分、約４５分、約６０分、約１．５時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約７．５時間、約８時間、約１０時間、約１２時間、約２０時間、約３０時間、約４０時間、約５０時間、約６０時間、約７０時間、約８０時間、約９０時間、または約１週間であり得る。場合によっては、時間遅延がさらに長くなる可能性がある。

【0523】

場合によっては、細胞トランスフェクション前にヌクレアーゼを適用することができる。ヌクレアーゼは、トランスフェクション前の一定期間にわたって、細胞培養に存在し得る。場合によっては、ヌクレアーゼの「前処理」により、標的細胞の全体的な健康状態を促進することができる。例えば、多くの場合、前処理により、生物の生体器官から単離された後の細胞の生存を促進することができる。ヌクレアーゼは、細胞トランスフェクションの前と後の両方に存在し得る。

【0524】

ヌクレアーゼは、約１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌ、９００μｇ／ｍｌ、９５０μｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、７ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、９ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、２００ｍｇ／ｍｌ、５００ｍｇ／ｍｌ、またはこれらの値のいずれか２つの間のおよその値の濃度で培養培地に供給することができる。ヌクレアーゼは、約１ｍｇ／ｍＬの濃度で培養培地に供給することができる。ヌクレアーゼは培養培地に供給することができ、ヌクレアーゼを含有する培養培地は、約３時間、６時間、１２時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、２６時間、２８時間、３０時間、３２時間、３４時間、３６時間、４０時間、４４時間、４８時間、５０時間、６０時間ごとに１回交換することができる。培地を頻繁に交換することで、ヌクレアーゼの濃度をある一定のレベルに維持することができる。

【0525】

当業者が理解するように、ヌクレアーゼの選択、ヌクレアーゼの濃度、及びヌクレアーゼのインキュベーションのタイミング及び期間は、本明細書に記載の主題の特定の用途の多くのパラメーターに応じて変化し得る。種々のパラメーターには、細胞のタイプ、移入されるポリ核酸の特性、細胞の全体的な健康状態、達成することが予測される生存率、及びトランスフェクトされた細胞の使用目的が含まれるが、これらに限定されない。

【0526】

場合によっては、細胞を、一定期間ヌクレアーゼで処理／インキュベートすることができる。インキュベーション時間は、少なくとも約１分、少なくとも約２分、少なくとも約３分、少なくとも約４分、少なくとも約５分、少なくとも約１０分、少なくとも約２０分、少なくとも約３０分、少なくとも約４５分、または少なくとも約６０分であり得る。インキュベーション時間は、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、少なくとも約４時間、少なくとも約５時間、少なくとも約７．５時間、少なくとも約８時間、少なくとも約１０時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約４０時間、少なくとも約５０時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７０時間、少なくとも約８０時間、少なくとも約９０時間、または少なくとも約１週間であり得る。場合によっては、インキュベーションは、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、またはそれ以上になる可能性がある。

【0527】

場合によっては、細胞を混合物中で１８～２５℃にて１～３０分間ヌクレアーゼに曝露することができる。いくつかの例では、混合物は、ＰＢＳ、ＦＢＳ、マグネシウム、及びＤＮアーゼを含むことができる。

【0528】

免疫刺激剤
本明細書で提供されるのは、細胞操作からの全体的な収量を改善する方法であって、例えば、細胞操作後の細胞生存率を改善すること、及び／またはトランスフェクション効率を改善することを含み、遺伝子改変細胞を十分な量の少なくとも１つの免疫刺激剤と接触させることを含む、方法、である。場合によっては、十分な量の少なくとも１つの免疫刺激剤と十分な時間接触させると、細胞の生存率を向上させることができる。場合によっては、十分な量の少なくとも１つの免疫刺激剤と一定期間接触させると、トランスフェクション効率を向上させることができる。場合によっては、十分な量の少なくとも１つの免疫刺激剤と十分な時間接触させると、細胞の生存率とトランスフェクション効率の両方を向上させることができる。

【0529】

免疫刺激剤には、免疫細胞を刺激することができる任意のタイプの試薬を含めることができる。例えば、免疫刺激剤はサイトカインを含むことができる。場合によっては、免疫刺激剤は、免疫細胞受容体に対する抗体または免疫細胞受容体のリガンドを含むことができる。

【0530】

サイトカインは、細胞の挙動に影響を与える可能性がある、細胞から放出されるタンパク質（ケモカイン、インターフェロン、リンホカイン、インターロイキン、腫瘍壊死因子など）を指す。サイトカインは、マクロファージ、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、及び肥満細胞などの免疫細胞、ならびに内皮細胞、線維芽細胞、及び種々の間質細胞を含む、広範囲の細胞によって産生される。特定のサイトカインは、複数のタイプの細胞によって産生され得る。サイトカインは、全身的または局所的な免疫調節効果の生成に関与し得る。例示的なサイトカインには、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、またはそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。

【0531】

場合によっては、ａＡＰＣは同種特異性を誘発しないことがある。場合によっては、ａＡＰＣはＨＬＡを発現しないことがある。ａＡＰＣは、活性化及び／または刺激に使用することができる遺伝子を安定して発現するように遺伝子改変され得る。場合によっては、Ｋ５６２細胞を活性化に使用することができる。Ｋ５６２細胞を増殖に使用することもできる。Ｋ５６２細胞は、ヒト赤白血病細胞株であり得る。Ｋ５６２細胞を、目的の遺伝子を発現するように操作することができる。Ｋ５６２細胞は、ＨＬＡクラスＩ、ＩＩ、またはＣＤ１ｄ分子を内因的に発現しない場合があるが、ＩＣＡＭ－１（ＣＤ５４）及びＬＦＡ－３（ＣＤ５８）を発現する場合がある。Ｋ５６２を、Ｔ細胞にシグナル１を送達するように設計することができる。たとえば、Ｋ５６２細胞を、ＨＬＡクラスＩを発現するように操作することができる。場合によっては、Ｋ５６２細胞は、Ｂ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、４－１ＢＢＬ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ３ｍＡｂ、Ｓ－２－ヒドロキシグルタレート、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２８ｍＡｂ、ＣＤ１ｄ、抗ＣＤ２、膜結合ＩＬ－１５、膜結合ＩＬ－１７、膜結合ＩＬ－２１、膜結合ＩＬ－２、短縮型ＣＤ１９、または任意の組み合わせ、などの追加の分子を発現するように操作することができる。場合によっては、操作されたＫ５６２細胞は、ＣＤ８０及びＣＤ８３に加えて、膜型の抗ＣＤ３ｍＡｂ、クローンＯＫＴ３を発現し得る。場合によっては、操作されたＫ５６２細胞は、ＣＤ８０及びＣＤ８３に加えて、膜型の抗ＣＤ３ｍＡｂ、クローンＯＫＴ３、膜型の抗ＣＤ２８ｍＡｂを発現し得る。場合によっては、本開示の改変標的細胞は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞またはＢ細胞を含むことができる。免疫細胞は、免疫刺激剤によって刺激されて増殖させることができる。一般に、Ｔ細胞は、ＣＤ３ ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激することができる薬剤及びＴ細胞の表面上の共刺激分子を刺激することができるリガンドに結合した表面との接触によって増殖させることができる。特に、Ｔ細胞集団は、例えば、抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合断片、または表面上に固定化された抗ＣＤ２抗体との接触によって、または場合によりカルシウムイオノフォアと併せたタンパク質キナーゼＣ活性化因子（例えば、ブリオスタチン）との接触によって刺激され得る。Ｔ細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激のために、アクセサリー分子に結合するリガンドを使用することができる。例えば、Ｔ細胞集団は、Ｔ細胞の増殖を刺激することができる条件下で抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体と接触することができる。場合によっては、４－１ＢＢを使用して細胞を刺激することができる。たとえば、細胞を、４－１ＢＢ及びＩＬ－２１または別のサイトカインで刺激することができる。

【0532】

ＣＤ４Ｔ細胞またはＣＤ８Ｔ細胞のいずれかの増殖を刺激するために、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を使用することができる。例えば、シグナルを提供する薬剤は、溶液中に存在し得るか、または表面にカップリングし得る。場合によっては、Ｔ細胞などの細胞を薬剤コーティングビーズと組み合わせることができる。各ビーズを、抗ＣＤ３抗体もしくは抗ＣＤ２８抗体のいずれか、または場合によっては２つの組み合わせでコーティングすることができる。ビーズ対細胞の任意の比率を利用することができる。場合によっては、ビーズ：細胞の比率は５：１；２．５：１；１：１；１：２；１：５；１：２．５；または２：１である。改変されたＴ細胞の増殖及び生存率に適切な免疫刺激剤には、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、ＩＦＮ－ｇ、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－２１、ＩＬ－１５、ＴＧＦベータ、及びＴＮＦアルファまたはそれらの任意の誘導体が含まれるが、これらに限定されない。

【0533】

場合によっては、改変細胞の調製の際に追加の刺激プロトコルを利用することができる。追加の刺激は、本明細書で提供される免疫刺激剤を利用する初期刺激を含むことができる。刺激は、エレクトロポレーションの前、エレクトロポレーションと同時、及び／またはエレクトロポレーションの後に細胞が刺激されるようにタイミングを合わせることができる。場合によっては、細胞は１つ以上の刺激を受けることができる。場合によっては、細胞は、抗体、その抗体断片、及び／または刺激性抗体もしくはその断片を表示する任意のビーズのいずれかを利用して、１、２、３、４、５、または最大約６回の刺激を受けることができる。場合によっては、追加の刺激は継続的な刺激を含む。例えば、エレクトロポレーション後、細胞を、その後、本明細書で提供される組成物及び方法のいずれか、例えば、抗ＣＤ３及び／または抗ＣＤ２８を使用して、継続的に刺激することができる。追加の刺激により、追加の刺激を欠く同等の方法と比較して、細胞の増殖が増加し得る。場合によっては、２回目の刺激などの追加の刺激を、細胞のエレクトロポレーションの後に実行する。場合によっては、エレクトロポレーションの直後に２回目の刺激を実行する。他の場合では、２回目の刺激を、エレクトロポレーション後約５分から、１０分、２０分、３０分、４０分、５０分、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、または最長約２０時間実行する。追加の刺激は、任意の長さの時間実行することができる。例えば、追加の刺激は、約２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２２時間、２４時間、２６時間、２８時間、３０時間、３２時間、３４時間、３６時間、３８時間、４０時間、４２時間、４４時間、４６時間、４８時間、または最長約５０時間実行することができる。場合によっては、追加の刺激は、約２４～４８時間、または約３０～４０時間である。場合によっては、刺激は、エレクトロポレーション前の最初の刺激と、それに続くエレクトロポレーション後の２回目の刺激とを含む。エレクトロポレーションされた細胞は、前述の比率、例えば２：１または１：２．５のビーズ（細胞あたりのビーズ）で刺激することができる。

【0534】

場合によっては、標的細胞または改変標的細胞は、組織または細胞と共培養することによって活性化または増殖させることができる。細胞は、抗原提示細胞または人工抗原提示細胞であり得る。抗原提示細胞（ＡＰＣ）には、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、及びその他の非プロフェッショナルＡＰＣが含まれるが、これらに限定されない。ＡＰＣは、限定されるものではないが、Ｂ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、４－１ＢＢＬ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ３ｍＡｂ、Ｓ－２－ヒドロキシグルタレート、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２８ｍＡｂ、ＣＤ１ｄ、抗－ＣＤ２、膜結合型ＩＬ－１５、膜結合型ＩＬ－１７、膜結合型ＩＬ－２１、膜結合型ＩＬ－２、短縮型ＣＤ１９、それらの誘導体、またはそれらの任意の組み合わせなど、その表面上に複数の免疫刺激分子を発現させることができる。

【0535】

人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、Ｔ細胞受容体及び共刺激分子のリガンドを発現し、Ｔ細胞を活性化及び増殖して移入させることができ、場合によってはその効力及び機能を改善する。ａＡＰＣは、Ｔ細胞活性化のための任意の遺伝子を発現するように設計することができる。ａＡＰＣは、Ｔ細胞増殖のための任意の遺伝子を発現するように設計することができる。ａＡＰＣは、ビーズ、細胞、タンパク質、抗体、サイトカイン、または任意の組み合わせであり得る。ａＡＰＣは、ゲノム移植を受ける可能性のある細胞集団にシグナルを送達することができる。たとえば、ａＡＰＣは、シグナル１、シグナル２、シグナル３、または任意の組み合わせを送達することができる。シグナル１は、抗原認識シグナルであり得る。たとえば、シグナル１は、ペプチド－ＭＨＣ複合体によるＴＣＲのライゲーション、またはＣＤ３シグナル伝達複合体の活性化につながる可能性のあるＣＤ３に誘導されたアゴニスト抗体の結合であり得る。シグナル２は共刺激シグナルであり得る。たとえば、共刺激シグナルは、抗ＣＤ２８、誘導性共刺激（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７、及び４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）であり得、それぞれＩＣＯＳ－Ｌ、ＣＤ７０、及び４－１ＢＢＬに結合する。シグナル３はサイトカインシグナルであり得る。

【0536】

ａＡＰＣはビーズであり得る。球状のポリスチレンビーズは、ＣＤ３及びＣＤ２８に対する抗体でコーティングすることができ、Ｔ細胞の活性化に使用することができる。ビーズは任意のサイズであり得る。場合によっては、ビーズは３及び６マイクロメートルであり得るかまたは約３及び６マイクロメートルであり得る。ビーズは、サイズが４．５マイクロメートルであるかまたは約４．５マイクロメートルであり得る。ビーズは、任意の細胞対ビーズ比で利用することができる。たとえば、１ミリリットルあたり１００万細胞で、３対１のビーズ対細胞比を使用することができる。ａＡＰＣはまた、剛性の球状粒子、ポリスチレンラテックスマイクロビーズ、磁性ナノ粒子またはマイクロ粒子、ナノサイズの量子ドット、４、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ミクロスフェア、非球状粒子、５、カーボンナノチューブバンドル、６、楕円形ＰＬＧＡ微粒子、７、ナノワーム（ｎａｎｏｗｏｒｍ）、流体脂質二重層含有システム、８、２Ｄ支持脂質二重層（２Ｄ－ＳＬＢ）、９、リポソーム、１０、ＲＡＦＴｓｏｍｅｓ／マイクロドメインリポソーム、１１、ＳＬＢ粒子、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。

【0537】

場合によっては、ａＡＰＣはＣＤ４ Ｔ細胞を増殖させることができる。たとえば、ａＡＰＣは、ＨＬＡクラスＩＩ拘束性ＣＤ４ Ｔ細胞の抗原処理及び提示経路を模倣するように設計することができる。Ｋ５６２は、ＨＬＡ－Ｄ、ＤＰα、ＤＰβ鎖、Ｉｉ、ＤＭα、ＤＭβ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、またはそれらの任意の組み合わせを発現するように設計することができる。たとえば、ＨＬＡ拘束性抗原特異的ＣＤ４ Ｔ細胞を増殖させるために、操作されたＫ５６２細胞にＨＬＡ拘束性ペプチドをパルスすることができる。場合によっては、ａＡＰＣの使用は、Ｔ細胞の活性化、増殖、または任意の組み合わせのために外因的に導入されたサイトカインと組み合わせることができる。細胞はまた、例えば、改変された細胞を対象に投与した後、対象の血液中でインビボにて増殖させることができる。

【0538】

場合によっては、本明細書で提供される方法及び組成物は、実質的に抗生物質を含まない細胞培養培地を含み得る。抗生物質、例えば、ペニシリン及びストレプトマイシンは、実験培養物にのみ含めることができ、対象に注入される細胞の培養物には含まれない可能性がある。「実質的に抗生物質を含まない培地」という用語は、抗生物質を全くまたはほとんど含まない培地、例えば、０ｇ／ｍｌの抗生物質を含む培地、または最大１μｇ／ｍｌ、最大０．５μｇ／ｍｌ、最大０．２μｇ／ｍｌ、最大１００ｎｇ／ｍｌ、最大５０ｎｇ／ｍｌ、最大２０ｎｇ／ｍｌ、最大１０ｎｇ／ｍｌ、最大５ｎｇ／ｍｌ、最大２ｎｇ／ｍｌ、最大１ｎｇ／ｍｌ、最大５００ｐｇ／ｍｌ、最大２００ｐｇ／ｍｌ、最大１００ｐｇ／ｍｌ、最大５０ｐｇ／ｍｌ、最大２０ｐｇ／ｍｌ、最大１０ｐｇ／ｍｌ、最大５ｐｇ／ｍｌ、最大２ｐｇ／ｍｌ、最大１ｐｇ／ｍｌ、最大５００ｆｇ／ｍｌ、最大２００ｆｇ／ｍｌ、最大１００ｆｇ／ｍｌ、最大５０ｆｇ／ｍｌ、最大２０ｆｇ／ｍｌ、最大１０ｆｇ／ｍｌ、または最大１ｆｇ／ｍｌの抗生物質を含む培地を指すことができる。

【0539】

場合によっては、免疫刺激剤は細胞トランスフェクション後に適用することができる。場合によっては、細胞トランスフェクションが完了した直後に免疫刺激剤を導入することができる。場合によっては、免疫刺激剤は、細胞トランスフェクションが実施されている間に導入され得、例えば、エレクトロポレーションが行われている間に適用され、または細胞がまだトランスフェクション試薬に曝露されている間に適用され得る。場合によっては、トランスフェクション後数分から数時間までで免疫刺激剤を導入することができる。細胞トランスフェクションの完了と免疫刺激剤の適用との間の時間遅延は、約３０秒、約１分、約２分、約３分、約４分、約５分、約６分、約７分、約８分、約９分、約１０分、約１５分、約３０分、約４５分、約６０分、約１．５時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約７．５時間、約８時間、約１０時間、約１２時間、約２０時間、約３０時間、約４０時間、約５０時間、約６０時間、約７０時間、約８０時間、約９０時間、または約１週間であり得る。場合によっては、時間遅延がさらに長くなる可能性がある。

【0540】

場合によっては、免疫刺激剤は細胞トランスフェクション前に適用することができる。場合によっては、免疫刺激剤は、トランスフェクション前の一定期間にわたって、細胞培養に存在し得る。免疫刺激剤は、細胞トランスフェクションの前と後の両方に存在し得る。

【0541】

免疫刺激剤は、約２０ｐｇ／ｍｌ、５０ｐｇ／ｍｌ、１００ｐｇ／ｍｌ、２００ｐｇ／ｍｌ、３００ｐｇ／ｍｌ、４００ｐｇ／ｍｌ、５００ｐｇ／ｍｌ、６００ｐｇ／ｍｌ、７００ｐｇ／ｍｌ、８００ｐｇ／ｍｌ、９００ｐｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、６ｎｇ／ｍｌ、７ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、９ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１２ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、４５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、７５ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、７５０ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、またはこれらの値のいずれか２つの間のおよそ値の濃度で培養培地に供給することができる。免疫刺激剤は、約５ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に供給することができる。免疫刺激剤は培養培地に供給することができ、免疫刺激剤を含有する培養培地は、約、６時間、１２時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、２６時間、２８時間、３０時間、３２時間、３４時間、３６時間、４０時間、４４時間、４８時間、５０時間、６０時間ごとに１回交換することができる。培養培地を頻繁に交換することで、免疫刺激剤の濃度をある一定のレベルに維持することができる。

【0542】

当業者が理解するように、免疫刺激剤の選択、免疫刺激剤の濃度、及び免疫刺激剤のインキュベーションのタイミング及び期間は、上記のように多くのパラメーターに応じて変化し得る。

【0543】

場合によっては、細胞を、一定期間免疫刺激剤で処理／インキュベートすることができる。インキュベーション時間は、少なくとも約１分、少なくとも約２分、少なくとも約３分、少なくとも約４分、少なくとも約５分、少なくとも約１０分、少なくとも約２０分、少なくとも約３０分、少なくとも約４５分、または少なくとも約６０分であり得る。インキュベーション時間は、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、少なくとも約４時間、少なくとも約５時間、少なくとも約７．５時間、少なくとも約８時間、少なくとも約１０時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約４０時間、少なくとも約５０時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７０時間、少なくとも約８０時間、少なくとも約９０時間、または少なくとも約１週間であり得る。場合によっては、インキュベーションは、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、またはそれ以上であり得る。

【0544】

二本鎖切断修復のモジュレーター
本明細書で提供されるのは、細胞操作からの全体的な収量を改善する方法であって、例えば、細胞操作後の細胞生存率を改善すること、及び／またはトランスフェクション効率を改善することを含み、遺伝子改変細胞を十分な量の少なくとも１つのＤＮＡ二本鎖切断修復のモジュレーターと接触させることを含む、方法、である。いくつかの例では、十分な量のＤＮＡ二本鎖切断修復の少なくとも１つのモジュレーターと十分な期間接触させると、細胞の生存率を向上させることができる。場合によっては、十分な量のＤＮＡ二本鎖切断修復の少なくとも１つのモジュレーターと一定期間接触させると、トランスフェクション効率を向上させることができる。いくつかの例では、十分な量のＤＮＡ二本鎖切断修復の少なくとも１つのモジュレーターと十分な期間接触させると、細胞の生存率とトランスフェクション効率の両方を向上させることができる。

【0545】

場合によっては、ＤＮＡ二本鎖切断修復のモジュレーターは、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与するタンパク質を含み得る。場合によっては、ＤＮＡ二本鎖切断修復のモジュレーターは化合物を含むことができる。二本鎖切断修復のモジュレーターは、ヒト、非ヒト、及び／または合成であり得る。場合によっては、二本鎖切断修復のモジュレーターはヒトである。場合によっては、二本鎖切断修復のモジュレーターは非ヒトである。好適な非ヒト供給源には、以下の非限定的な種：ラット、マウス、ロバ、ブタ、ウシ、イヌ、ネコ、フェレット、サル、ヤギ、ヒツジ、魚、またはそれらの任意の組み合わせ、のいずれかのものが含まれる。

【0546】

いくつかの実施形態では、ゲノム編集を改善するために使用することができるＤＮＡ二本鎖切断修復に関与するタンパク質の非限定的な例としては、Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＲＡＤ５１、ＲＳ－１、ＰＡＬＢ２、Ｎａｐ１、ｐ４００ ＡＴＰアーゼ、ＥＶＬ、ＮＡＣ、ＭＲＥ１１、ＲＡＤ５０、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５５、ＲＡＤ５７、ＲＡＤ５４、ＲＡＤ５４Ｂ、Ｓｒｓ２、ＮＢＳ１、Ｈ２ＡＸ、ＰＡＲＰ－１、ＲＡＤ１８、ＤＮＡ－ＰＫｃｓ、ＸＲＣＣ４、ＸＬＦ、Ａｒｔｅｍｉｓ、ＴｄＴ、ｐｏｌμ及びｐｏｌλ、ＡＴＭ、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ニブリン、ＣｔＩＰ、ＥＸＯ１、ＢＬＭ、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ１ｂ５５Ｋ、それらの相同体及び誘導体、Ｓｃｒ７、ならびにそれらの任意の組み合わせ、を挙げることができる。場合によっては、ゲノム編集の改善に使用することができるＤＮＡ二本鎖切断修復に関与するタンパク質としては、ＲＡＤ５１を挙げることができる。場合によっては、ゲノム編集の改善に使用することができるＤＮＡ二本鎖切断修復に関与するタンパク質としては、ＲＳ－１を挙げることができる。ＲＳ－１またはＲＡＤ５１のタンパク質を使用することができる。ＲＳ－１またはＲＡＤ－５１をコードするポリヌクレオチドを使用することもできる。ＲＳ－１またはＲＡＤ－５１のｍＲＮＡを使用することもできる。

【0547】

場合によっては、本明細書に記載のゲノム編集は、導入遺伝子の挿入を含み得る。導入遺伝子は通常、それが配置されているゲノム配列と同一ではない。導入遺伝子の挿入は、通常、標的ゲノム配列の切除を伴い、それによりＤＮＡ二本鎖切断を伴う。場合によっては、Ｋｕ７０及びＫｕ８０などのタンパク質が関与する非相同末端結合（ＮＨＥＪ経路）、ならびにＢＲＣＡ、ＢＲＣＡ２、及びＲａｄ５１などのタンパク質が関与する相同組換え経路（ＨＲ経路）は、細胞内の二本鎖切断イベント中に活性化される。場合によっては、本明細書に記載のＤＮＡ二本鎖切断修復のモジュレーターは、ＨＲエンハンサーを含むことができる。ＨＲエンハンサーは、相同組換え媒介ＤＮＡ二本鎖切断修復を促進することができる。場合によっては、ＨＲエンハンサーはＮＨＥＪ媒介ＤＮＡ二本鎖切断修復を阻害し得る。場合によっては、本明細書に記載のＤＮＡ二本鎖切断修復のモジュレーターは、ＮＨＥＪエンハンサーを含むことができる。ＮＨＥＪエンハンサーは、ＮＨＥＪ媒介ＤＮＡ二本鎖切断修復を促進することができる。場合によっては、ＮＨＥＪエンハンサーは、ＨＲ媒介ＤＮＡ二本鎖切断修復を阻害し得る。

【0548】

本明細書に記載の導入遺伝子は、相同組換えによってゲノムに導入することができる。場合によっては、導入遺伝子は相同性アームに隣接し得る。場合によっては、相同性アームは、導入遺伝子を所望の組み込み部位に標的化する相補的領域を含むことができる。場合によっては、ドナー導入遺伝子は、目的の位置で効率的なＨＤＲが可能となるように、相同性の２つの領域に隣接する非相同配列を含有することができる。さらに、導入遺伝子配列は、細胞クロマチンの目的領域に相同ではない配列を含有するベクター分子を含むことができる。導入遺伝子は、細胞クロマチンと相同性のあるいくつかの不連続な領域を含むことができる。例えば、通常は目的の領域に存在しない配列の標的化挿入の場合、配列はドナー核酸分子に存在し、目的の領域の配列と相同性のある領域に隣接することができる。

【0549】

導入遺伝子は、アームとその相補的配列との間の相同性の程度が２つの間の相同組換えを可能にするのに十分である場合、相同性アームに隣接することができる。例えば、アームとその相補的配列との間の相同性の程度は、５０％以上であり得る。２つの相同非同一配列は、任意の長さであり得、それらの非相同性の程度は、（例えば、標的化相同組換えによるゲノム点変異の修正のために）単一のヌクレオチドと同程度に小さくてもよく、または（例えば、染色体における所定の異所部位での遺伝子の挿入のために）１０キロベース以上と同程度に大きくてもよい。相同非同一配列を含む２つのポリヌクレオチドは、同一の長さである必要はない。他の任意の遺伝子、例えば、本明細書に記載の遺伝子を使用して、組換えアームを生成することができる。

【0550】

導入遺伝子はまた、ゲノム内の標的化二本鎖切断領域に相補的な操作された部位に隣接することができる。場合によっては、操作された部位は、相同性アームではない。操作された部位は、二本鎖切断領域と相同性を有する可能性がある。操作された部位は、遺伝子と相同性を有する可能性がある。操作された部位は、コーディングゲノム領域と相同性を有することができる。操作された部位は、非コーディングゲノム領域と相同性を有することができる。場合によっては、導入遺伝子をポリ核酸から切り出すことができるので、これを相同組換えなしに二本鎖切断領域に挿入することができる。導入遺伝子は、相同組換えなしに二本鎖切断に組み込むことができる。

【0551】

場合によっては、相同組換えＨＲエンハンサーを使用して、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を抑制することができる。非相同末端結合は、二本鎖切断の末端でヌクレオチドの喪失をもたらす可能性があり；非相同末端結合もフレームシフトをもたらす可能性がある。場合によっては、相同組換え修復は、遺伝子をノックインするときに使用するより魅力的な機序であり得る。非相同末端結合を抑制するために、ＨＲエンハンサーを送達することができる。場合によっては、複数のＨＲエンハンサーを送達することができる。ＨＲエンハンサーは、非相同末端結合に関与するタンパク質、たとえばＫＵ７０、ＫＵ８０、及び／またはＤＮＡリガーゼＩＶを阻害することができる。場合によっては、Ｓｃｒ７などのリガーゼＩＶ阻害剤を送達することができる。場合によっては、ＨＲエンハンサーはＬ７５５５０７であり得る。場合によっては、別のリガーゼＩＶ阻害剤を使用することができる。場合によっては、ＨＲエンハンサーはアデノウイルス４タンパク質、例えばＥ１Ｂ５５Ｋ及び／またはＥ４ｏｒｆ６であり得る。場合によっては、化学的阻害剤を使用することができる。

【0552】

ＫＵ７０、ＫＵ８０、及び／またはＤＮＡリガーゼＩＶなどの非相同末端結合分子は、さまざまな方法を使用して抑制することができる。たとえば、ＫＵ７０、ＫＵ８０、及び／またはＤＮＡリガーゼＩＶなどの非相同末端結合分子は、遺伝子サイレンシングによって抑制することができる。たとえば、非相同末端結合分子ＫＵ７０、ＫＵ８０、及び／またはＤＮＡリガーゼＩＶは、因子の転写または翻訳中に、遺伝子サイレンシングによって抑制することができる。非相同末端結合分子ＫＵ７０、ＫＵ８０、及び／またはＤＮＡリガーゼＩＶはまた、因子の分解によって抑制することができる。非相同末端結合分子ＫＵ７０、ＫＵ８０、及び／またはＤＮＡリガーゼＩＶはまた、阻害することができる。ＫＵ７０、ＫＵ８０、及び／またはＤＮＡリガーゼＩＶの阻害剤は、Ｅ１Ｂ５５Ｋ及び／またはＥ４ｏｒｆ６を含むことができる。非相同末端結合分子ＫＵ７０、ＫＵ８０、及び／またはＤＮＡリガーゼＩＶはまた、隔離によって阻害することができる。遺伝子発現は、ノックアウト、遺伝子のプロモーターの変更、及び／または因子に向けられた干渉ＲＮＡの投与によって抑制することができる。

【0553】

場合によっては、挿入は相同組換え修復を含むことができる。場合によっては、ＲＳ－１などのＨＲのエンハンサーを使用することができる。ＲＳ－１を、細胞培養の培地に加えることができる。ＲＳ－１は、外因性ポリ核酸をヌクレアーゼ媒介によりゲノムに組み込む効率を向上させることができる。たとえば、ＲＳ－１は、相同組換えによってＴＣＲ配列を細胞のゲノムに組み込む効率を改善することができる。ＲＳ－１はまた、細胞操作後の細胞の生存率を向上させることもできる。ＲＳ－１タンパク質またはその一部を、約３μＭから約１２μＭの濃度で細胞集団に導入することができる。ＲＳ－１タンパク質またはその一部を、約７μＭから約８μＭの濃度で細胞集団に導入することができる。場合によっては、ＲＳ－１タンパク質またはその一部を、約３μＭから、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭまたは最大約１２μＭの濃度で細胞集団に導入することができる。場合によっては、ＲＳ－１経路における下流因子を利用することができる。ＲＳ－１（３－（（ベンジルアミノ）スルホニル）－４－ブロモ－Ｎ－（４－ブロモフェニル）ベンズアミド）は、ＨＲ複合体のプレーヤーであるＲＡＤ５１を刺激することができる。場合によっては、ＰＡＬＢ２（ＢＲＣＡ２のパートナー及びローカライザー）、Ｎａｐ１（ヌクレオソーム集合タンパク質１）、ｐ４００ ＡＴＰａｓｅ、ＥＶＬ（Ｅｎａ／Ｖａｓｐ様）などのＲＡＤ５１相互作用因子を調節すると、ヌクレアーゼ媒介遺伝子ターゲティングにおいて組み込み頻度が向上することもある。例えば、ＲＡＤ５１を細胞培養に導入して、外因性配列の細胞ゲノムへの組み込みを改善することができる。

【0554】

Ｒａｄ５１は、さまざまな方法でＨＲを支援することができる。たとえば、ＨＲは、細胞周期のＳ期に合成された鋳型の可用性に依存し得る。乳癌感受性遺伝子（ＢＲＣＡ２）及び細菌のＲｅｃＡリコンビナーゼの構造的及び機能的相同体であるＲａｄ５１は、ＨＲによるＤＳＢのエラーのない修復に使用することができる。ＤＳＢの検出に続いて、ＢＲＣＡ２は、Ｒａｄ５１をＤＳＢのジャンクションに動員する。Ｒａｄ５１タンパク質またはその一部は、場合によっては約１００ｎｇから約２０μｇの濃度で細胞集団に導入することができる。たとえば、Ｒａｄ５１を、約１００ｎｇから、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、５００ｎｇ、６００ｎｇ、７００ｎｇ、８００ｎｇ、９００ｎｇ、１μｇ、２μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、６μｇ、７μｇ、８μｇ、９μｇ、１０μｇ、１１μｇ、１２μｇ、１３μｇ、１４μｇ、１５μｇ、１６μｇ、１７μｇ、１８μｇ、１９μｇ、または最大約２０μｇの細胞集団に導入することができる。

【0555】

場合によっては、相同組換えのエンハンサーは、ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）であり得る。ＮＡＣは、反応性求電子試薬及びフリーラジカルと非酵素的に相互作用してこれらを解毒するチオール含有化合物であり得る。ＮＡＣは、場合によっては細胞培養に導入することができる。例えば、ＮＡＣは、エレクトロポレーション前、エレクトロポレーション中、またはエレクトロポレーション後に導入され得る。他の場合には、ＮＡＣは増殖段階の間に細胞と共に培養され得る。場合によっては、ＮＡＣをコードするベクターを、細胞に導入することができる。ＮＡＣを、培養培地に約１μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ、５０μＭ、７５μＭ、１００μＭ、２００μＭ、３００μＭ、４００μＭ、５００μＭ、６００μＭ、７００μＭ、８００μＭ、９００μＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１２ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１８ｍＭ、２０ｍＭ、２２ｍＭ、２４ｍＭ、２５ｍＭ、２６ｍＭ、２８ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、７５ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、５００ｍＭ、７５０ｍＭ、１Ｍ、１０Ｍ、１００Ｍ、またはこれらの値のいずれか２つの間のおよその値の濃度で供給することができる。ＮＡＣは約１０ｍＭの濃度で培養培地に供給することができる。

【0556】

エンハンサーは、二本鎖切断修復に関与するタンパク質であり得る。二本鎖切断修復に関与するタンパク質は、ＭＲＥ１１、ＲＡＤ５０、ＮＢＳ１（ＸＲＳ２）複合体、ＢＲＣＡ１、ヒストンＨ２ＡＸ、ＰＡＲＰ－１、ＲＡＤ１８、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニット（ＤＮＡ－ＰＫｃｓ）、及びＡＴＭであり得る。場合によっては、エンハンサーはＡＫＴであり得るか、またはＡＫＴ経路に関与している可能性がある。ＡＫＴは、ＮＨＥＪ媒介二本鎖切断修復に関与し得る。場合によっては、ＡＫＴ１はＢｒｃａ１とＲａｄ５１の細胞質移行を誘導することによってＨＲを阻害することができる。プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）としても知られるＡＫＴは、ｃＡＭＰ依存性、ｃＧＭＰ依存性、プロテインキナーゼＣキナーゼファミリーに属している。ＡＫＴファミリーは、３つの進化的に保存されたアイソフォーム：ＡＫＴ１（ＰＫＢα）（３つのスプライスバリアントを含む）、ＡＫＴ２（ＰＫＢβ）、及びＡＫＴ３（ＰＫＢγ）（２つのスプライスバリアントを含む）、を有し得る。成長因子及びサイトカイン、例としてＩＬ－２は、膜貫通受容体に結合し、ホスファチジルイノシトール二リン酸（ＰＩＰ２）をリン酸化して原形質膜でＰＩＰ３を生成する脂質酵素ホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）ファミリーメンバーの活性を刺激することができる。ＰＩＰ３は、ＡＫＴ及びＰＤＫ１などのプレクストリン相同（ＰＨ）ドメインを含有するタンパク質の結合部位を構成し、それらを膜に動員することができる。場合によっては、ＰＩ３Ｋファミリーのメンバーを細胞に導入して、外因性配列の組み込みを強化することができる。

【0557】

場合によっては、ＡＫＴを阻害することができる。選択的化学阻害剤またはＡＫＴ ｓｉＲＮＡによるＡＫＴの阻害により、ＲＰＡ、ＣｔＩＰ、Ｒａｄ５１、及びＣｈｋ１活性化のＤＮＡ損傷誘導型動員を回復させることができる。場合によっては、成長因子、サイトカイン、またはその両方の遮断によりＡＫＴ経路を阻害することができる。場合によっては、成長因子、サイトカイン、またはその両方、例えば抗ＩＦＮＡＲ２抗体（ヒトインターフェロン（アルファ、ベータ、及びオメガ）受容体２に対する抗体）の遮断により、ＨＲ媒介ＤＮＡ二本鎖切断修復を促進することができる。ＩＦＮＡＲ２抗体は、約１００ｐｇ／ｍｌ、５００ｐｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、７５ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、７５０ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、６μｇ／ｍｌ、７μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌ、９μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１２μｇ／ｍｌ、１４μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、１６μｇ／ｍｌ、１８μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、２２μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、６０μｇ／ｍｌ、７０μｇ／ｍｌ、８０μｇ／ｍｌ、９０μｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、２００ｍｇ／ｍｌ、５００ｍｇ／ｍｌ、１ｇ／ｍｌ、またはこれらの値のいずれか２つの間のおよその値の濃度で培養培地に供給することができる。ＩＦＮＡＲ２抗体は、約１０μｇ／ｍｌの濃度で培養培地に供給することができる。

【0558】

非相同末端結合を抑制するＨＲエンハンサーを、プラスミドＤＮＡとともに送達することができる。場合により、プラスミドは二本鎖ＤＮＡ分子であり得る。プラスミド分子は一本鎖ＤＮＡであってもよい。プラスミドはまた、少なくとも１つの遺伝子を有することができる。プラスミドはまた、複数の遺伝子を有することができる。少なくとも１つのプラスミドを使用することもできる。複数のプラスミドを使用することもできる。非相同末端結合を抑制するＨＲエンハンサーを、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ、プライマー、及び／または改変化合物と組み合わせたプラスミドＤＮＡとともに送達することができる。改変化合物は、プラスミドＤＮＡの細胞毒性を低減し、細胞の生存率を改善することができる。ＨＲエンハンサー及び改変化合物は、ゲノム操作の前に細胞に導入することができる。ＨＲエンハンサーは、小分子であり得る。場合によっては、ＨＲエンハンサーをＴ細胞懸濁液に送達することができる。ＨＲエンハンサーは、二本鎖ＤＮＡでトランスフェクトされた細胞の生存率を改善することができる。

【0559】

非相同末端結合を抑制するＨＲエンハンサーを、組み込まれるＨＲ基質とともに送達することができる。基質はポリ核酸であり得る。ポリ核酸は、ＴＣＲ導入遺伝子を含むことができる。ポリ核酸は、ｍＲＮＡとして送達することができる。ポリ核酸は、ＴＣＲ導入遺伝子を組み込むためにゲノムの内因性領域へ相同性アームを含むことができる。ポリ核酸はベクターであり得る。ベクターは、センスまたはアンチセンスのいずれかの方向で別のベクター（例えば、ウイルスベクター）に挿入することができる。ウイルスゲノムの５’ＬＴＲ領域の上流に、Ｔ７、Ｔ３、または他の転写開始配列を配置して、ウイルスカセットのインビトロ転写を行うことができる。次に、このベクターカセットを、ｍＲＮＡのインビトロ転写の鋳型として使用することができる。たとえば、このｍＲＮＡが同族の逆転写酵素とともに任意の細胞に送達され、またｍＲＮＡまたはタンパク質として送達される場合、一本鎖ｍＲＮＡカセットを鋳型として使用して、ゲノム内の目的の標的部位に導入遺伝子カセットを組み込むための所望の相同組換えイベントのＨＲ基質として使用することができる二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の形態で、数百～数千のコピーを生成することができる。この方法により、ＣＲＩＳＰＲ媒介相同組換えのための毒性プラスミドＤＮＡの送達の必要性を回避することができる。さらに、各ｍＲＮＡ鋳型を、ｄｓＤＮＡの数百または数千のコピーに作製することができるため、細胞内で利用可能な相同組換え鋳型の量は非常に多くなり得る。大量の相同組換え鋳型は、所望の相同組換えイベントを促進することができる。さらに、ｍＲＮＡは、一本鎖ＤＮＡを生成することもできる。一本鎖ＤＮＡは、例えば組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）遺伝子ターゲティングを用いた相同組換えの鋳型としても使用することができる。ｍＲＮＡは、インサイチュでＤＮＡ相同組換えＨＲエンハンサーに逆転写することができる。この戦略により、プラスミドＤＮＡの毒性送達を回避することができる。さらに、ｍＲＮＡは、相同組換え基質をプラスミドＤＮＡよりも高いレベルに増幅することができ、及び／または相同組換えの効率を改善することができる。一本鎖ＤＮＡのロバストな逆転写のみが細胞内で発生する場合、ウイルスベクターのセンス鎖とアンチセンス鎖の両方をコードするｍＲＮＡを導入することができる。この場合、両方のｍＲＮＡ鎖を細胞内で逆転写する、及び／または自然にアニーリングしてｄｓＤＮＡを生成することができる。

【0560】

非相同末端結合を抑制するＨＲエンハンサーは、化学的阻害剤として送達することができる。たとえば、ＨＲエンハンサーはリガーゼＩＶ－ＤＮＡ結合を妨害することによって作用することができる。ＨＲエンハンサーは、内因性アポトーシス経路を活性化することもできる。ＨＲエンハンサーは、リガーゼＩＶ阻害剤のペプチド模倣体でもあり得る。ＨＲエンハンサーは、Ｃａｓ９システムと共発現させることもできる。ＨＲエンハンサーは、Ｅ１Ｂ５５Ｋ及び／またはＥ４ｏｒｆ６などのウイルスタンパク質と共発現させることもできる。ＨＲエンハンサーは、ＳＣＲ７、Ｌ７５５５０７、またはそれらの任意の誘導体でもあり得る。ＨＲエンハンサーは、外因性ＤＮＡ挿入物の毒性を低減する化合物とともに送達することができる。

【0561】

場合によっては、相同組換えＨＲエンハンサーを使用して、非相同末端結合を抑制することができる。場合によっては、相同組換えＨＲエンハンサーを使用して、相同組換え修復（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｐａｉｒ）を促進することができる。場合によっては、相同組換えＨＲエンハンサーを使用して、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ二本鎖切断後の相同組換え修復を促進することができる。場合によっては、相同組換えＨＲエンハンサーを使用して、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ二本鎖切断及び１つ以上の遺伝子（ｏｎｅ ｏｆ ｍｏｒｅ ｇｅｎｅｓ）のノックイン及びノックアウト後の相同組換え修復を促進することができる。

【0562】

ＨＲエンハンサーによるＨＲ効率の向上は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％であり得るかまたは約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％であり得る。ＨＲエンハンサーによるＮＨＥＪの減少は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％であり得るかまたは約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％であり得る。

【0563】

ＤＮＡ二本鎖切断修復のモジュレーターとの接触により、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約９０％、約１００％、約１２５％、約１５０％、約１７５％、約２００％、約２５０％、約３００％、またはさらにそれ以上の細胞生存率の向上がもたらされる可能性がある。場合によっては、細胞生存率の向上は、約５０％～約２００％であり得る。ヌクレアーゼとの接触により、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約９０％、約１００％、約１２５％、約１５０％、約１７５％、約２００％、約２５０％、約３００％、またはさらにそれ以上の組み込み効率の向上がもたらされる可能性がある。場合によっては、組み込み効率の向上は約５０％～約２００％であり得る。

【0564】

場合によっては、ＤＮＡ二本鎖切断修復のモジュレーターを、細胞トランスフェクション後に適用することができる。場合によっては、細胞トランスフェクションが完了した直後に、ＤＮＡ二本鎖切断修復のモジュレーターを導入することができる。場合によっては、ＤＮＡ二本鎖切断修復のモジュレーターを、細胞トランスフェクションが実施されている間に導入することができ、例えば、エレクトロポレーションが行われている間に適用することができ、または細胞がまだトランスフェクション試薬に曝露されている間に適用することができる。場合によっては、トランスフェクション後数分から数時間まででＤＮＡ二本鎖切断修復のモジュレーターを導入することができる。細胞トランスフェクションの完了とＤＮＡ二本鎖切断修復のモジュレーターの適用との間の時間遅延は、約３０秒、約１分、約２分、約３分、約４分、約５分、約６分、約７分、約８分、約９分、約１０分、約１５分、約３０分、約４５分、約６０分、約１．５時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約７．５時間、約８時間、約１０時間、約１２時間、約２０時間、約３０時間、約４０時間、約５０時間、約６０時間、約７０時間、約８０時間、約９０時間、または約１週間であり得る。場合によっては、時間遅延がさらに長くなる可能性がある。

【0565】

場合によっては、ＤＮＡ二本鎖切断修復のモジュレーターを、細胞トランスフェクション前に適用することができる。ある特定の場合には、ＤＮＡ二本鎖切断修復のモジュレーターは、トランスフェクション前の一定期間にわたって、細胞培養に存在し得る。ＤＮＡ二本鎖切断修復のモジュレーターは、細胞トランスフェクション前及び後の両方に存在し得る。

【0566】

ＤＮＡ二本鎖切断修復のモジュレーターは培養培地に供給することができ、ＤＮＡ二本鎖切断修復のモジュレーターを含有する培養培地は、約６時間、１２時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、２６時間、２８時間、３０時間、３２時間、３４時間、３６時間、４０時間、４４時間、４８時間、５０時間、６０時間ごとに１回交換することができる。培養培地を頻繁に交換することで、ＤＮＡ二本鎖切断修復のモジュレーターの濃度をある一定のレベルに維持することができる。

【0567】

当業者が理解するように、ＤＮＡ二本鎖切断修復のモジュレーターの選択、ＤＮＡ二本鎖切断修復のモジュレーターの濃度、及びＤＮＡ二本鎖切断修復のモジュレーターのインキュベーションのタイミング及び期間は、上記のように多くのパラメーターに応じて変化し得る。

【0568】

場合によっては、細胞を、一定期間ＤＮＡ二本鎖切断修復のモジュレーターで処理／インキュベートすることができる。インキュベーション時間は、少なくとも約１分、少なくとも約２分、少なくとも約３分、少なくとも約４分、少なくとも約５分、少なくとも約１０分、少なくとも約２０分、少なくとも約３０分、少なくとも約４５分、または少なくとも約６０分であり得る。インキュベーション時間は、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、少なくとも約４時間、少なくとも約５時間、少なくとも約７．５時間、少なくとも約８時間、少なくとも約１０時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約４０時間、少なくとも約５０時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７０時間、少なくとも約８０時間、少なくとも約９０時間、または少なくとも約１週間であり得る。場合によっては、インキュベーション時間は少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、またはそれ以上になる可能性がある。

【0569】

ミニサークル及び線形化二本鎖ＤＮＡコンストラクト
本明細書で提供されるのは、細胞操作からの全体的な収量を改善する方法であって、例えば、細胞操作後の細胞生存率を改善すること、及び／またはトランスフェクション効率を改善することを含み、導入遺伝子をコードするミニサークルベクターを細胞集団に接触させ、それによって改変細胞の集団を生成することを含む、方法である。

【0570】

また、本明細書で提供されるのは、細胞操作からの全体的な収量を改善する方法であって、例えば、細胞操作後の細胞生存率を改善することを含み、導入遺伝子をコードする線形化二本鎖ＤＮＡコンストラクトを細胞集団に接触させ、それによって改変細胞の集団を生成することを含む、方法である。

【0571】

本開示の一態様は、導入遺伝子をコードするミニサークルベクターを細胞の集団に導入し、それによって改変細胞の集団を生成することを含む、ゲノム編集の方法を提供する。本開示の一態様は、導入遺伝子をコードする線形化二本鎖ＤＮＡコンストラクトを細胞の集団に導入し、それによって改変細胞の集団を生成することを含む、ゲノム編集の方法を提供する。

【0572】

場合によっては、外因性ポリ核酸、例えば導入遺伝子を、ミニサークルベクターにおいて細胞に導入することができる。本明細書で使用される「ミニサークル」という用語は、すべてではないにしてもほとんどの原核生物ベクター部分（例えば、原核生物起源の制御配列及び他の非機能的配列）を含まない小さな環状プラスミド誘導体を指すことができる。ある特定の理論に拘束されることを望むと（Ｗｉｔｈ ｗｉｓｈｉｎｇ ｔｏ ｂｅ ｂｏｕｎｄ ｂｙ ａ ｃｅｒｔａｉｎ ｔｈｅｏｒｙ）、外因性核酸のサイズを最小化することによって、細胞毒性を低減し、組み込み効率を場合により促進することができる。場合によっては、導入遺伝子をコードするミニサークルベクターを細胞に導入することを含む本明細書で提供される方法は、細胞生存率を増加させることができる。場合によっては、導入遺伝子をコードするミニサークルベクターを細胞に導入することを含む本明細書で提供される方法は、組み込み効率を向上させることができる。

【0573】

ミニサークルベクターは、約１．５ｋｂ、約２ｋｂ、約２．２ｋｂ、約２．４ｋｂ、約２．６ｋｂ、約２．８ｋｂ、約３ｋｂ、約３．２ｋｂ、約３．４ｋｂ、約３．６ｋｂ、約３．８ｋｂ、約４ｋｂ、約４．２ｋｂ、約４．４ｋｂ、約４．６ｋｂ、約４．８ｋｂ、約５ｋｂ、約５．２ｋｂ、約５．４ｋｂ、約５．６ｋｂ、約５．８ｋｂ、約６ｋｂ、約６．５ｋｂ、約７ｋｂ、約８ｋｂ、約９ｋｂ、約１０ｋｂ、約１２ｋｂ、約２５ｋｂ、約５０ｋｂ、またはこれらの数のいずれか２つの間の値のサイズを有することができる。場合によっては、本明細書で提供されるミニサークルは、最大２．１ｋｂ、最大３．１ｋｂ、最大４．１ｋｂ、最大４．５ｋｂ、最大５．１ｋｂ、最大５．５ｋｂ、最大６．５ｋｂ、最大７．５ｋｂ、最大８．５ｋｂ、最大９．５ｋｂ、最大１１ｋｂ、最大１３ｋｂ、最大１５ｋｂ、最大３０ｋｂ、または最大６０ｋｂのサイズを有することができる。

【0574】

ミニサークルベクター濃度は、約０．５ナノグラム（ｎｇ）～約５０μｇであり得る。ミニサークルベクター濃度は、約０．５ｎｇ～約５０μｇ、約１ｎｇ～約２５μｇ、約５ｎｇ～約１０μｇ、約１０ｎｇ～約５μｇ、約２０ｎｇ～約１μｇ、約５０ｎｇ～５００ｎｇ、または約１００ｎｇ～２５０ｎｇ、であり得る。

【0575】

場合によっては、外因性ポリ核酸、例えば導入遺伝子を、線形化二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）コンストラクトにおいて細胞に導入することができる。場合によっては、導入遺伝子をコードする線形化ｄｓＤＮＡコンストラクトを細胞に導入することを含む本明細書で提供される方法は、細胞生存率を増加させることができる。場合によっては、導入遺伝子をコードする線形化ｄｓＤＮＡコンストラクトを細胞に導入することを含む本明細書で提供される方法は、組み込み効率を向上させることができる。

【0576】

線形化ｄｓＤＮＡコンストラクトは、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも７５０ｂｐ、少なくとも１ｋｂ、少なくとも１．１ｋｂ、少なくとも１．２ｋｂ、少なくとも１．３ｋｂ、少なくとも１．４ｋｂ、少なくとも１．５ｋｂ、少なくとも１．６ｋｂ、少なくとも１．７ｋｂ、少なくとも１．８ｋｂ、少なくとも１．９ｋｂ、少なくとも２ｋｂのサイズ、またはさらにそれ以上のサイズを有することができる。線形化ｄｓＤＮＡコンストラクトは、約５００ｂｐ、約７５０ｂｐ、約１ｋｂ、約１．１ｋｂ、約１．２ｋｂ、約１．３ｋｂ、約１．４ｋｂ、約１．５ｋｂ、約１．６ｋｂ、約１．７ｋｂ、約１．８ｋｂ、約１．９ｋｂ、または約２ｋｂのサイズを有することができる。

【0577】

線形化ｄｓＤＮＡコンストラクト濃度は、約０．５ナノグラム（ｎｇ）～約５０μｇであり得る。線形化ｄｓＤＮＡコンストラクト濃度は、約０．５ｎｇ～約５０μｇ、約１ｎｇ～約２５μｇ、約５ｎｇ～約１０μｇ、約１０ｎｇ～約５μｇ、約２０ｎｇ～約１μｇ、約５０ｎｇ～５００ｎｇ、または約１００ｎｇ～２５０ｎｇ、であり得る。

【0578】

ミニサークルベクターまたは二本鎖線形化コンストラクトは、上記のように導入遺伝子を含有することができる。ミニサークルまたは二本鎖線形化コンストラクトは、任意のヌクレオチド配列、例えば、任意の目的の遺伝子を含むことができる。ミニサークルまたは二本鎖線形化コンストラクトは、細胞受容体をコードする導入遺伝子を含むことができる。細胞受容体としては、ＴＣＲ、ＢＣＲ、ＣＡＲ、及びそれらの任意の組み合わせを挙げることができるが、これらに限定されない。ミニサークルまたは二本鎖線形化コンストラクトは、上記のようにＴＣＲをコードする導入遺伝子を含むことができる。

【0579】

ヌクレアーゼシステム
遺伝子編集は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓタンパク質、例えばＣａｓ９）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはメガヌクレアーゼを含むヌクレアーゼを使用して実行することができる。ヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼ）は、天然に存在するヌクレアーゼであり得、遺伝子改変され、及び／または組換えであり得る。遺伝子編集はまた、トランスポゾンベースのシステム（ＰｉｇｇｙＢａｃ、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙなど）を使用して実行することもできる。たとえば、遺伝子編集はトランスポザーゼを使用して実行することができる。

【0580】

ＣＲＩＳＰＲシステム
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法では、ＣＲＩＳＰＲシステムを使用する。ＲＮＡ及びＣａｓタンパク質をすべて組み込んだＣＲＩＳＰＲシステムには少なくとも５つのタイプがある。タイプＩ、ＩＩＩ、及びＩＶは、ｃｒＲＮＡに相補的な核酸を切断することができるマルチＣａｓタンパク質複合体を集合化する。タイプＩ及びＩＩＩはどちらも、処理済みｃｒＲＮＡをマルチＣａｓタンパク質複合体に集合体化する前にｃｒＲＮＡ前処理を必要とする。タイプＩＩ及びＶのＣＲＩＳＰＲシステムは、少なくとも１つのガイドＲＮＡと複合体を形成した単一のＣａｓタンパク質を含む。好適なヌクレアーゼには、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質またはＣａｓヌクレアーゼ、例えばＩ型ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチド、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチド、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチド、ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチド、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチド、及びＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチド；ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）；転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）；メガヌクレアーゼ；ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）；ＣＲＩＳＰＲ関連ＲＮＡ結合タンパク質；リコンビナーゼ；フリッパーゼ；トランスポザーゼ；アルゴノートタンパク質；それらの任意の誘導体；それらの任意のバリアント；及びそれらの任意の断片、が含まれるが、これらに限定されない。

【0581】

ＣＲＩＳＰＲシステムの一般的な機序及び最近の進歩については、Ｃｏｎｇ， Ｌ． ｅｔ ａｌ．， “Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ｓｙｓｔｅｍｓ，” Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３３９（６１２１）： ８１９－８２３ （２０１３）；Ｆｕ， Ｙ． ｅｔ ａｌ．， “Ｈｉｇｈ－ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ，” Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ３１， ８２２－８２６ （２０１３）；Ｃｈｕ， ＶＴ ｅｔ ａｌ． “Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｐａｉｒ ｆｏｒ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９－ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｅｃｉｓｅ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ，” Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３３， ５４３－５４８ （２０１５）；Ｓｈｍａｋｏｖ， Ｓ． ｅｔ ａｌ．， “Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｖｅｒｓｅ Ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ，” Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ， ６０， １－１３ （２０１５）；Ｍａｋａｒｏｖａ， ＫＳ ｅｔ ａｌ．， “Ａｎ ｕｐｄａｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ，”， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， １３， １－１５ （２０１５）、において考察されている。標的ＤＮＡの部位特異的切断は、１）ガイドＲＮＡと標的ＤＮＡ（プロトスペーサーとも呼ばれる）との間の塩基対相補性及びｉｉ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる標的ＤＮＡ内の短いモチーフの両方によって決定される位置で起こり得る。例えば、操作された細胞は、ＣＲＩＳＰＲシステム、例えば、タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲシステムを使用して生成することができる。本明細書に開示される方法において使用されるＣａｓ酵素は、ＤＮＡ切断を触媒するＣａｓ９であり得る。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９または密接に関連する任意のＣａｓ９による酵素作用によって、ガイド配列の２０ヌクレオチドにハイブリダイズし、標的配列の２０ヌクレオチドに続くプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を有する標的部位配列で二本鎖切断を生成することができる。

【0582】

Ｃａｓタンパク質
ベクターは、Ｃａｓタンパク質（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質としての）などのＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に連結することができる。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１またはＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１Ｓ、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、ＣｓＯ、Ｃｓｆ４、Ｃｐｆ１、ｃ２ｃ１、ｃ２ｃ３、Ｃａｓ９ＨｉＦｉ、それらの相同体、またはそれらの改変バージョンが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ酵素は改変されていない。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列で、例として標的配列内及び／または標的配列の補体内で一方または両方の鎖の切断を誘導する。たとえば、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の最初または最後のヌクレオチドからの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００またはそれ以上の塩基対内または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００またはそれ以上の塩基対内の一方または両方の鎖の切断を誘導することができる。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、対応する野生型酵素に関して変異し、その結果、変異ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列を含有する標的ポリヌクレオチドの一方または両方の鎖を切断する能力を欠く。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９ＨｉＦｉなどの忠実度の高いｃａｓタンパク質である。

【0583】

Ｃａｓ９は、Ｃａｓ９タンパク質の野生型または改変型を指し、欠失、挿入、置換、バリアント、変異、融合、キメラ、またはそれらの任意の組み合わせなどのアミノ酸変化を含むことができる。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド（例えば、Ｃａｓ９などのＣａｓタンパク質）は、真核細胞などの特定の細胞における発現のためにコドン最適化されている。このタイプの最適化は、同じタンパク質をコードしながら、目的の宿主生物または細胞のコドン選好を模倣するために、外来性（例えば、組換え）ＤＮＡの変異を伴う可能性がある。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、野生型の例示的な部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｓ． ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９）のヌクレアーゼドメインに対する少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、もしくは１００％または少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、もしくは１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0584】

任意の機能的濃度のＣａｓタンパク質を細胞に導入することができる。たとえば、１５マイクログラムのＣａｓ ｍＲＮＡを細胞に導入することができる。他の場合には、Ｃａｓ ｍＲＮＡは０．５マイクログラムから１００マイクログラムまで導入することができる。Ｃａｓ ｍＲＮＡは、０．５から、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００マイクログラム導入することができる。

【0585】

いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするベクターは、１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）を含み、例として１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０を超えるまたは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０を超えるＮＬＳを使用することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、アミノ末端またはその近くに１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０を超えるまたは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０を超えるＮＬＳ、カルボキシル末端またはその近くに１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０を超えるまたは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０を超えるＮＬＳ、またはこれらの任意の組み合わせ（例えば、アミノ末端に１つ以上のＮＬＳ、及びカルボキシル末端に１つ以上のＮＬＳ）を含むことができる。複数のＮＬＳが存在する場合、それぞれを他とは独立して選択することができ、その結果、単一のＮＬＳが複数のコピーに存在し得、及び／または１つ以上のコピーに存在する１つ以上の他のＮＬＳと組み合わせて存在し得る。いくつかの実施形態では、方法で使用されるＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＮＬＳを含む。ＮＬＳは、ポリペプチド鎖内のどこにでも、例えば、Ｎ末端またはＣ末端の近くに位置することができる。例えば、ＮＬＳは、Ｎ末端またはＣ末端からポリペプチド鎖に沿って１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０アミノ酸内または約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０アミノ酸内に存在し得る。ＮＬＳは、Ｎ末端またはＣ末端から５０アミノ酸以上内、例えば、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、もしくは１０００アミノ酸以内または約５０アミノ酸以上内、例えば、約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、もしくは１０００アミノ酸以内に存在し得る。

【0586】

ＮＬＳの非限定的な例には、以下に由来するＮＬＳ配列が含まれる：アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２）を有するＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原のＮＬＳ；ヌクレオプラスミンからのＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号６３）を有するヌクレオプラスミン双節型ＮＬＳ）；アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号６４）またはＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号６５）を有するｃ－ｍｙｃ ＮＬＳ；配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号６６）を有するｈＲＮＰＡ１ Ｍ９ ＮＬＳ；インポーチンアルファからのＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号６７）；筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号６８）及びＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号６９）；ヒトｐ５３の配列ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号７０）；マウスｃ－ａｂｌＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号７１）；インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ（配列番号７２）及びＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号７３）；肝炎ウイルスデルタ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号７４）；マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号７５）；ヒトポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号７６）；及びステロイドホルモン受容体（ヒト）糖質コルチコイドの配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号７７）。
ガイドＲＮＡ

【0587】

本明細書で使用される場合、「ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）」という用語、及びその文法上の同等物は、標的ＤＮＡに特異的であり得、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し得るＲＮＡを指す。ガイドＲＮＡは、標的部位を特定し、切断のためにＲＮＡ／Ｃａｓ複合体を特定の標的ＤＮＡに案内するガイド配列またはスペーサー配列を含むことができる。標的ＤＮＡの部位特異的切断は、１）ガイドＲＮＡと標的ＤＮＡ（プロトスペーサーとも呼ばれる）との間の塩基対相補性及びｉｉ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる標的ＤＮＡ内の短いモチーフの両方によって決定される位置で起こる。

【0588】

本明細書に開示される方法は、細胞または胚に、少なくとも１つのガイドＲＮＡまたは核酸、例えば、少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを導入することを含み得る。ガイドＲＮＡは、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼと相互作用してエンドヌクレアーゼを特定の標的部位に誘導することができ、その部位でガイドＲＮＡの５’末端が染色体配列の特定のプロトスペーサー配列と対になる。

【0589】

いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの一部（例えば、機能的部分）とｔｒａｃｒＲＮＡとの融合によって形成される単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む。ガイドＲＮＡはまた、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含むデュアルＲＮＡであり得る。ガイドＲＮＡはｃｒＲＮＡを含み、ｔｒａｃｒＲＮＡを欠いていてもよい。さらに、ｃｒＲＮＡは標的ＤＮＡまたはプロトスペーサー配列とハイブリダイズすることができる。

【0590】

上記のように、ガイドＲＮＡは発現産物であり得る。例えば、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、ガイドＲＮＡをコードする配列を含むベクターであり得る。ガイドＲＮＡを、単離されたガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡ及びプロモーターをコードする配列を含むプラスミドＤＮＡで細胞または生物をトランスフェクトすることによって、細胞または生物に移入することができる。ガイドＲＮＡを、ウイルス媒介遺伝子送達など、他の方法で細胞または生物に移入することもできる。

【0591】

ガイドＲＮＡを単離することができる。例えば、ガイドＲＮＡを、単離されたＲＮＡの形態で細胞または生物にトランスフェクトすることができる。ガイドＲＮＡは、任意のインビトロ転写システムを使用したインビトロ転写によって調製することができる。ガイドＲＮＡを、ガイドＲＮＡのコード配列を含むプラスミドの形態ではなく、単離されたＲＮＡの形態で細胞に移入することができる。

【0592】

いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＤＮＡ標的指向性セグメント及びタンパク質結合セグメントを含む。ＤＮＡ標的指向性セグメント（またはＤＮＡ標的指向性配列、またはスペーサー配列）は、標的ＤＮＡ（例えば、プロトスペーサー）内の特定の配列に相補的であり得るヌクレオチド配列を含む。タンパク質結合セグメント（またはタンパク質結合配列）は、部位特異的改変ポリペプチド、例えば、Ｃａｓタンパク質などのＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼと相互作用することができる。「セグメント」とは、分子のセグメント／セクション／領域、例えば、ＲＮＡ内のヌクレオチドの連続したストレッチを意味する。セグメントはまた、セグメントが２つ以上の分子の領域を含み得るような複合体の領域／セクションを意味し得る。例えば、場合によっては、ＤＮＡ標的指向性ＲＮＡのタンパク質結合セグメントは１つのＲＮＡ分子であり、したがってタンパク質結合セグメントはそのＲＮＡ分子の領域を含む。他の場合では、ＤＮＡ標的指向性ＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、相補性の領域に沿ってハイブリダイズする２つの別々の分子を含む。

【0593】

いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、２つの別々のＲＮＡ分子または単一のＲＮＡ分子を含む。例示的な単一分子ガイドＲＮＡは、ＤＮＡ標的指向性セグメント及びタンパク質結合セグメントの両方を含む。

【0594】

例示的な２分子ＤＮＡ標的指向性ＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ様（「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」または「ターゲッターＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡリピート」）分子及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様（「トランス作用性ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」または「アクチベーターＲＮＡ」または「ｔｒａｃｒＲＮＡ」）分子）を含み得る。第１のＲＮＡ分子は、ｃｒＲＮＡ様分子（ターゲッターＲＮＡ）であり得、ＤＮＡ標的指向性セグメント（例えばスペーサー）及びガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントを含む二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）デュプレックスの半分を形成し得るヌクレオチドのストレッチを含み得る。第２のＲＮＡ分子は、対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様分子（アクチベーターＲＮＡ）であり得、ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡデュプレックスの残り半分を形成し得るヌクレオチドのストレッチを含み得る。言い換えれば、ｃｒＲＮＡ様分子のヌクレオチドのストレッチは、ｔｒａｃｒＲＮＡ様分子のヌクレオチドのストレッチと相補的であり得、ハイブリダイズして、ガイドＲＮＡのタンパク質結合ドメインのｄｓＲＮＡデュプレックスを形成することができる。このように、各ｃｒＲＮＡ様分子は対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様分子を有すると言うことができる。さらに、ｃｒＲＮＡ様分子は、一本鎖ＤＮＡ標的指向性セグメントまたはスペーサー配列を提供することができる。したがって、ｃｒＲＮＡ様分子及びｔｒａｃｒＲＮＡ様分子（対応する対として）はハイブリダイズしてガイドＲＮＡを形成することができる。対象の２分子ガイドＲＮＡは、任意の対応するｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの対を含み得る。

【0595】

いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的指向性セグメントまたはスペーサー配列は、染色体配列（例えば、プロトスペーサー配列）における標的部位の配列に相補的であり、したがってガイドＲＮＡのＤＮＡ標的指向性セグメントは、標的部位またはプロトスペーサーと塩基対を形成することができる。場合によっては、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的指向性セグメントは、１０ヌクレオチド～２５ヌクレオチド以上または約１０ヌクレオチド～約２５ヌクレオチド以上を含む。例えば、ガイドＲＮＡの第１の領域と染色体配列中の標的部位との間の塩基対形成の領域は、長さ１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５ヌクレオチド、もしくは２５ヌクレオチド以上または約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５ヌクレオチド、もしくは２５ヌクレオチド以上であり得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの第１の領域は、長さ約１９、２０、または２１ヌクレオチドである。

【0596】

いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、２０ヌクレオチドまたは約２０ヌクレオチドの核酸配列を標的とする。標的核酸は、２０ヌクレオチド未満または約２０ヌクレオチド未満であり得る。標的核酸は、少なくとも５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０もしくはそれ以上のヌクレオチドまたは少なくとも約５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０もしくはそれ以上のヌクレオチドであり得る。標的核酸は、最長５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０もしくはそれ以上のヌクレオチドまたは最長約５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０もしくはそれ以上のヌクレオチドであり得る。標的核酸配列は、ＰＡＭにおける第１のヌクレオチドの５’のすぐ近くの約２０塩基であり得る。ガイドＲＮＡは、核酸配列を標的にすることができる。

【0597】

ガイド核酸、例えば、ガイドＲＮＡは、別の核酸、例えば、細胞のゲノム中の標的核酸またはプロトスペーサーにハイブリダイズすることができる核酸を指すことができる。ガイド核酸はＲＮＡであり得る。ガイド核酸はＤＮＡであり得る。ガイド核酸は、部位特異的に核酸の配列に結合するようにプログラムまたは設計することができる。ガイド核酸は、ポリヌクレオチド鎖を含むことができ、単一ガイド核酸と呼ぶことができる。ガイド核酸は、２つのポリヌクレオチド鎖を含むことができ、ダブルガイド核酸と呼ぶことができる。

【0598】

ガイド核酸は、表１に示されている内因性遺伝子などのゲノム部位にハイブリダイズすることができる。他の場合において、ガイド核酸は、例えば、図１Ａ～図１Ｃに例示されるように、挿入導入遺伝子を含むコンストラクトにハイブリダイズすることができる。いくつかの態様において、ガイド核酸は、非ヒトである配列にハイブリダイズする。例えば、ガイド核酸が挿入を含むコンストラクトにハイブリダイズする場合、それは、異種配列または合成配列などの非ヒト配列に特異的であり得る。場合によっては、非ヒト配列は異種（ｚｅｎｏｇｅｎｅｉｃ）である。異種配列は、魚、ウシ、ネコ、ヤギ、サル、ブタ、イヌ、ウマ、ヒツジ、鳥、フェレット、ハムスター、ウサギ、ヘビ、またはそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない、任意の非ヒト供給源から得ることができる。場合によっては、異種配列は魚からのものであり、魚はゼブラフィッシュである。

【0599】

他の場合では、標的指向性コンストラクトの設計を簡素化するため、及び／または一貫性を持たせるために、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９、ユニバーサルガイドＲＮＡ配列、ＵｇＲＮＡによるインビボでのドナー導入遺伝子カーゴの再現可能な遊離を利用することができ、Ｗｉｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１９に記載されている。場合によっては、ユニバーサルガイドは、たとえばＭｏｒｅｎｏ－Ｍａｔｅｏｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１５で提供されているように、ＣＲＩＳＰＲＳｃａｎを使用して最適な塩基組成を含むことができる。例示的なユニバーサルＵｇＲＮＡは、ゼブラフィッシュ、ブタ、またはヒトゲノムなどの異種ゲノム中に予測される標的を含まない場合がある。ユニバーサルガイドを利用すると、例えばガイドポリ核酸の標的部位で、及び／またはゼブラフィッシュｎｏｔｏ遺伝子に組み込まれた蛍光レポーターで効率的な二本鎖切断誘導及び相同性媒介修復を示すことができる（Ｗｉｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１９ａ）。

【0600】

ガイド核酸は、核酸に新しいまたは強化された特徴を提供するための１つ以上の改変を含むことができる。ガイド核酸は、核酸アフィニティータグを含むことができる。ガイド核酸は、合成ヌクレオチド、合成ヌクレオチドアナログ、ヌクレオチド誘導体、及び／または改変ヌクレオチドを含むことができる。

【0601】

ガイド核酸は、例えば、５’末端もしくは３’末端のまたはその近くの、ヌクレオチド配列（例えば、スペーサー）を含むことができ、これにより標的核酸の配列（例えば、プロトスペーサー）にハイブリダイズすることができる。ガイド核酸のスペーサーは、ハイブリダイゼーションによる配列特異的な方法（すなわち、塩基対形成）で、標的核酸と相互作用することができる。スペーサー配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’または３’に位置する標的核酸にハイブリダイズすることができる。スペーサー配列の長さは、少なくとも５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０もしくはそれ以上のヌクレオチドまたは少なくとも約５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０もしくはそれ以上のヌクレオチドであり得る。スペーサー配列の長さは、最長５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０もしくはそれ以上のヌクレオチドまたは最長約５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０もしくはそれ以上のヌクレオチドであり得る。

【0602】

ガイドＲＮＡは、二次構造を形成するｄｓＲＮＡデュプレックス領域を含むこともできる。例えば、ガイドＲＮＡによって形成される二次構造は、ステム（またはヘアピン）及びループを含むことができる。ループ及びステムの長さは可変であり得る。例えば、ループは長さ約３～約１０ヌクレオチドの範囲であり得、ステムは長さ約６～約２０塩基対の範囲であり得る。ステムは、１～約１０ヌクレオチドの１つ以上のバルジ（ｂｕｌｇｅ）を含むことができる。第２の領域の全長は、長さ約１６～約６０ヌクレオチドの範囲であり得る。例えば、ループは長さ４ヌクレオチドであり得るかまたは約４ヌクレオチドであり得、ステムは１２塩基対であり得るかまたは約１２塩基対であり得る。ｄｓＲＮＡデュプレックス領域は、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓタンパク質などのＲＮＡ結合タンパク質と複合体を形成することができるタンパク質結合セグメントを含むことができる。

【0603】

ガイドＲＮＡはまた、本質的に一本鎖であり得る５’または３’末端にテール領域を含むこともできる。たとえば、テール領域は、目的の細胞内の染色体配列に対して相補性ではない場合があり、ガイドＲＮＡの残りの部分に対して相補性ではない場合がある。さらに、テール領域の長さは可変であり得る。テール領域は、長さが４ヌクレオチドより長いかまたは約４ヌクレオチドより長い場合がある。例えば、テール領域の長さは、長さ５～６０ヌクレオチドまたは約５～約６０ヌクレオチドの範囲であり得る。

【0604】

ガイドＲＮＡは、ＲＮＡ分子として細胞または胚に導入することができる。例えば、ＲＮＡ分子は、インビトロで転写することができ、及び／または化学合成することができる。次に、ガイドＲＮＡは、ＲＮＡ分子として細胞または胚に導入することができる。ガイドＲＮＡはまた、非ＲＮＡ核酸分子、例えば、ＤＮＡ分子の形態で細胞または胚に導入することができる。例えば、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、目的の細胞または胚におけるガイドＲＮＡの発現のためにプロモーター制御配列に作動可能に連結することができる。ＲＮＡコード配列は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）によって認識されるプロモーター配列に作動可能に連結することができる。

【0605】

ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ分子はまた、線形であり得る。ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ分子はまた、環状であり得る。ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列はまた、ベクターの一部であり得る。ベクターのいくつかの例としては、プラスミドベクター、ファージミド、コスミド、人工／ミニ染色体、トランスポゾン、及びウイルスベクターを挙げることができる。たとえば、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡはプラスミドベクターに存在する。好適なプラスミドベクターの他の非限定的な例としては、ｐＵＣ、ｐＢＲ３２２、ｐＥＴ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、及びそれらのバリアントが挙げられる。さらに、ベクターは、追加の発現制御配列（例えば、エンハンサー配列、コザック配列、ポリアデニル化配列、転写終結配列など）、選択可能なマーカー配列（例えば、抗生物質耐性遺伝子）、複製起点などを含むことができる。

【0606】

ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼとガイドＲＮＡの両方がＤＮＡ分子として細胞に導入される場合、それぞれが別々の分子の一部であり得る（たとえば、融合タンパク質コード配列を含有する１つのベクター及びガイドＲＮＡコード配列を含有する第２のベクター）か、または両方同じ分子の一部であり得る（たとえば、融合タンパク質とガイドＲＮＡの両方のコード（及び制御）配列を含有する１つのベクター）。

【0607】

Ｃａｓタンパク質、例としてＣａｓ９タンパク質またはその任意の誘導体は、ガイドＲＮＡと事前複合体化されて、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成することができる。ＲＮＰ複合体を、初代免疫細胞に導入することができる。ＲＮＰ複合体の導入はタイミングを合わせることができる。細胞は、細胞周期のＧ１、Ｓ、及び／またはＭ期で他の細胞と同期させることができる。ＲＮＰ複合体は、ＨＤＲが強化されるような細胞周期の期で送達することができる。ＲＮＰ複合体は、相同組換え修復を促進することができる。

【0608】

ガイドＲＮＡはまた、改変することができる。改変は、化学的変化、合成改変、ヌクレオチド付加、及び／またはヌクレオチド減算を含み得る。改変はまた、ＣＲＩＳＰＲゲノム操作を強化することができる。改変により、ｇＲＮＡのキラリティーが変化することがある。場合によっては、キラリティーは、改変後に均一または立体化学的に純粋になり得る。ガイドＲＮＡを合成することができる。合成されたガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲゲノム操作を強化することができる。ガイドＲＮＡはまた、短縮化することができる。短縮化を使用して、望ましくないオフターゲット変異誘発を低減することができる。短縮化は、任意の数のヌクレオチド欠失を含むことができる。例えば、短縮化は、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０またはそれ以上のヌクレオチドを含むことができる。ガイドＲＮＡは、任意の長さの標的相補性の領域を含むことができる。例えば、標的相補性の領域は、長さ２０ヌクレオチド未満であり得る。標的相補性の領域は、長さ２０ヌクレオチド超であり得る。

【0609】

場合によっては、改変は、５’末端、３’末端、５’末端から３’末端まで、単一塩基改変、２’－リボース改変、またはそれらの任意の組み合わせである。改変は、塩基置換、挿入、欠失、化学的改変、物理的改変、安定化、精製、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択することができる。

【0610】

場合によっては、改変は化学的改変である。改変は、５’アデニル酸、５’グアノシン三リン酸キャップ、５’Ｎ７－メチルグアノシン三リン酸キャップ、５’三リン酸キャップ、３’ホスフェート、３’チオホスフェート、５’ホスフェート、５’チオホスフェート、Ｃｉｓ－Ｓｙｎチミジン二量体、三量体、Ｃ１２スペーサー、Ｃ３スペーサー、Ｃ６スペーサー、ｄＳｐａｃｅｒ、ＰＣスペーサー、ｒＳｐａｃｅｒ、スペーサー１８、スペーサー９、３’－３’改変、５’－５’改変、脱塩基、アクリジン、アゾベンゼン、ビオチン、ビオチンＢＢ、ビオチンＴＥＧ、コレステリルＴＥＧ、デスチオビオチンＴＥＧ、ＤＮＰ ＴＥＧ、ＤＮＰ－Ｘ、ＤＯＴＡ、ｄＴ－ビオチン、デュアルビオチン、ＰＣビオチン、ソラレンＣ２、ソラレンＣ６、ＴＩＮＡ、３’ＤＡＢＣＹＬ、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ１、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ２、ＤＡＢＣＹＬ ＳＥ、ｄＴ－ＤＡＢＣＹＬ、ＩＲＤｙｅ ＱＣ－１、ＱＳＹ－２１、ＱＳＹ－３５、ＱＳＹ－７、ＱＳＹ－９、カルボキシルリンカー、チオールリンカー、２’デオキシリボヌクレオシドアナログプリン、２’デオキシリボヌクレオシドアナログピリミジン、リボヌクレオシドアナログ、２’－０－メチルリボヌクレオシドアナログ、糖修飾アナログ、ゆらぎ／ユニバーサル塩基、蛍光色素標識、２’フルオロＲＮＡ、２’Ｏ－メチルＲＮＡ、メチルホスホネート、ホスホジエステルＤＮＡ、ホスホジエステルＲＮＡ、ホスホチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏａｔｅ）ＤＮＡ、ホスホロチオエートＲＮＡ、ＵＮＡ、シュードウリジン－５’－三リン酸、５－メチルシチジン－５’－三リン酸、２－Ｏ－メチル３ホスホロチオエートまたはこれらの任意の組み合わせから選択され得る。

【0611】

場合によっては、改変は、２－Ｏ－メチル３ホスホロチオエート付加である。２－Ｏ－メチル３ホスホロチオエート付加は、１塩基から１５０塩基まで行うことができる。２－Ｏ－メチル３ホスホロチオエート付加は、１塩基から４塩基まで行うことができる。２－Ｏ－メチル３ホスホロチオエート付加は、２塩基で行うことができる。２－Ｏ－メチル３ホスホロチオエート付加は、４塩基で行うことができる。改変は、短縮化であり得る。短縮化は、５塩基短縮化であり得る。

【0612】

場合によっては、デュアルニッカーゼアプローチを使用して、二本鎖切断を導入してもよい。Ｃａｓタンパク質は、いずれかのヌクレアーゼドメイン内の既知のアミノ酸で変異させることができ、これにより１つのヌクレアーゼドメインの活性が削除され、一本鎖切断を生成することができるニッカーゼＣａｓタンパク質が生成される。反対側の鎖を標的とする２つの異なるガイドＲＮＡとともにニッカーゼを利用して、標的部位内にＤＳＢを生成することができる（多くの場合、「ダブルニック」または「デュアルニッカーゼ」ＣＲＩＳＰＲシステムと呼ばれる）。このアプローチにより、ＤＳＢを引き起こすのに十分な近接距離内に２つのオフターゲットニックが生成される可能性が低いため、標的特異性が劇的に向上する場合がある。

【0613】

ｇＲＮＡは、任意の機能的濃度で導入することができる。たとえば、ｇＲＮＡを、１０マイクログラムで細胞に導入することができる。他の場合には、ｇＲＮＡは０．５マイクログラムから１００マイクログラムまで導入することができる。ｇＲＮＡは、０．５から、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００マイクログラムで導入することができる。

【0614】

場合によっては、ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ分析を実行して、操作されたガイドＲＮＡの特異性を決定することができる。ＣＲＩＳＰＲシステムヌクレアーゼによるオフターゲット切断のＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑプロファイリングの一般的な機序及びプロトコルについては、Ｔｓａｉ， Ｓ． ｅｔ ａｌ．， “ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ ｅｎａｂｌｅｓ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ ｓｙｓｔｅｍ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，” Ｎａｔｕｒｅ， ３３： １８７－１９７ （２０１５）において考察されている。

【0615】

場合によっては、１つ以上のガイドを、細胞に導入する。その他の場合、２つ以上のガイドを、細胞に導入する。２つ以上のガイド核酸は、同じ発現ベクター上に同時に存在することができ、またはネイキッドガイドとして導入することもできる。２つ以上のガイド核酸は、同じ転写制御下にあり得る。いくつかの実施形態では、２つ以上（例えば、３以上、４以上、５以上、１０以上、１５以上、２０以上、２５以上、３０以上、３５以上、４０以上、４５以上、または５０以上）のガイド核酸は、（同じまたは異なるベクターからの）標的細胞において同時に発現する。場合によっては、ガイド核酸は、死滅したＣａｓタンパク質によって異なって認識される可能性がある（たとえば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ、及びＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓなどのさまざまな細菌由来のｄＣａｓ９タンパク質）。

【0616】

非相同組換えの阻害
ＫＵ７０、ＫＵ８０、及び／またはＤＮＡリガーゼＩＶなどの非相同末端結合分子は、さまざまな方法を使用して抑制することができる。たとえば、非相同末端結合分子、例としてＫＵ７０、ＫＵ８０、及び／またはＤＮＡリガーゼＩＶは、（例えば、因子の転写または翻訳中に）遺伝子サイレンシングによって抑制することができる。非相同末端結合分子ＫＵ７０、ＫＵ８０、及び／またはＤＮＡリガーゼＩＶはまた、タンパク質の分解によって抑制することができる。非相同末端結合分子ＫＵ７０、ＫＵ８０、及び／またはＤＮＡリガーゼＩＶはまた、阻害することができる。ＫＵ７０、ＫＵ８０、及び／またはＤＮＡリガーゼＩＶの阻害剤は、Ｅ１Ｂ５５Ｋ及び／またはＥ４ｏｒｆ６を含むことができる。非相同末端結合分子ＫＵ７０、ＫＵ８０、及び／またはＤＮＡリガーゼＩＶはまた、隔離によって阻害することができる。非相同末端結合を抑制する薬剤は、小分子であり得る。

【0617】

送達システム
従来のウイルス及び非ウイルスベースの遺伝子移入法を使用して、エンドヌクレアーゼをコードする核酸（例えば、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、トランスポゾンベース、ＺＥＮ、メガヌクレアーゼ、またはＭｅｇａ－ＴＡＬ分子）、ポリ核酸コンストラクト（例えば、挿入配列）、及びｇＲＮＡを、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで細胞に導入することができる。

【0618】

例示的なウイルスベクター送達システムは、細胞への送達後にエピソームゲノムまたは組み込まれたゲノムのいずれかを有するＤＮＡ及びＲＮＡウイルスを含む。当業者に知られている形質導入法を使用して、ウイルスベクターを細胞に導入することができる。例示的な非ウイルスベクター送達システムとしては、ＤＮＡプラスミド、ミニサークルＤＮＡ、ネイキッド核酸、ｍＲＮＡ、及びリポソームまたはポロキサマーなどの送達ビヒクルと複合体を形成した核酸が挙げられる。

【0619】

核酸の非ウイルス送達の方法には、エレクトロポレーション、リポフェクション、ヌクレオフェクション、金ナノ粒子送達、マイクロインジェクション、バイオリスティクス（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、ｍＲＮＡ、人工ビリオン、及び薬剤で強化されたＤＮＡの取り込みが含まれる。追加の例示的な核酸送達システムとしては、ＡＭＡＸＡ（登録商標）Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ （Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ， Ｍｄ．）、ＭＡＸＣＹＴＥ， Ｉｎｃ． （Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍｄ．）、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ （Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ， Ｍａｓｓ．）及びＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ． （例えば、米国特許第６，００８，３３６号を参照）によって提供されるものが挙げられる。リポフェクション試薬は市販されており（例えば、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（登録商標）及びＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標））、ソノポレーションは、例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ２０００システム（Ｒｉｃｈ－Ｍａｒ）を使用している。

【0620】

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼを、前記エンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ分子を使用して細胞に導入する。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼを、ウイルスベクターを使用して細胞に導入する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡを、合成ＲＮＡ分子を使用して細胞に導入する。いくつかの実施形態では、ポリ核酸コンストラクトを、ＤＮＡプラスミドを使用して細胞に導入する。いくつかの実施形態では、ポリ核酸コンストラクトを、ミニサークルＤＮＡプラスミドを使用して細胞に導入する。いくつかの実施形態では、ポリ核酸コンストラクトを、ウイルスベクターを使用して細胞に導入する。いくつかの実施形態では、ポリ核酸コンストラクトを、ＡＡＶベクターを使用して細胞に導入する。

【0621】

場合によっては、本明細書に記載のポリ核酸コンストラクトを、ＲＮＡ、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を介して細胞に導入する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡポリ核酸を、逆転写酵素（ＲＴ）（タンパク質形態またはＲＴをコードするポリ核酸のいずれか）を用いて細胞に導入することができる。例示的なＲＴとしては、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ ＲＴ）、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）逆転写酵素（ＲＴ）、それらの誘導体またはそれらの組み合わせに由来するものが含まれるが、これらに限定されない。トランスフェクトされると、逆転写酵素は、操作されたｍＲＮＡポリ核酸を、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＮＤＡ）に転写し得る。逆転写酵素（ＲＴ）は、ＲＮＡ鋳型から相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生成するために使用される酵素であり得る。場合によっては、ＲＴ酵素は、ＲＮＡ（ｃＤＮＡ合成）または一本鎖ＤＮＡを鋳型として使用して、プライマーから開始する相補的ＤＮＡ鎖を合成することができる。

【0622】

エレクトロポレーションスキーム
本明細書で提供されるのは、細胞操作からの全体的な収量を改善する方法であって、例えば、細胞操作後の細胞生存率を改善すること、及び／またはトランスフェクション効率を改善することを含む、方法である。本開示の一態様は、ゲノム編集の方法であって、第１のエレクトロポレーションステップ及び第２のエレクトロポレーションステップを含む、方法を提供する。場合によっては、本明細書で提供される連続エレクトロポレーションスキームは、細胞生存率を向上させることができる。場合によっては、本明細書で提供される連続エレクトロポレーションスキームは、トランスフェクション効率を向上させることができる。場合によっては、本明細書で提供される連続エレクトロポレーションスキームは、細胞生存率及びトランスフェクション効率の両方を向上させることができる。

【0623】

場合によっては、第１のエレクトロポレーションステップは、ガイド型ヌクレアーゼを細胞に導入することを含み得る。第２のエレクトロポレーションステップは、遺伝子の少なくとも一部に相補的な領域を含むガイドポリ核酸を細胞に導入することを含むことができる。第２のエレクトロポレーションステップは、細胞に外因性ポリ核酸を導入することをさらに含むことができる。方法では、改変セルを生成することができる。第１のエレクトロポレーションはいつでも実行することができる。場合によっては、抗ＣＤ３及び／または抗ＣＤ２８などの刺激後にエレクトロポレーションを実行する。任意の数のサイトカインまたはインターロイキンを、刺激のために抗ＣＤ３または抗ＣＤ２８と組み合わせて使用することもできる。エレクトロポレーションは、エレクトロポレーション後、約０時間から、２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２２時間、２４時間、２６時間、２８時間、３０時間、３２時間、３４時間、３６時間、３８時間、４０時間、４２時間、４４時間、４６時間、４８時間、５０時間、５２時間、５４時間、５６時間、５８時間、６０時間、６２時間、６４時間、６６時間、６８時間、７０時間、７２時間、７４時間、７６時間、７８時間、８０時間、８２時間、８４時間、８６時間、８８時間、９０時間、９２時間、９４時間、９６時間、９８時間、または最長約１００時間実行することができる。場合によっては、エレクトロポレーションを、刺激後約３０時間～４０時間実行する。場合によっては、エレクトロポレーションを、刺激後３６時間で実行する。場合によっては、トランスフェクションは、細胞集団のＳ期に基づいてタイミングを合わせる、例えば、刺激後の時間の関数としての種々のＤＮＡセンサーの発現レベルを示す図２９Ａ及び図２９Ｂを参照されたい。

【0624】

場合によっては、第１のエレクトロポレーションステップは、ガイド型リボ核タンパク質複合体を細胞に導入することを含み得る。第２のエレクトロポレーションステップは、細胞に外因性ポリ核酸を導入することをさらに含むことができる。方法では、改変セルを生成することができる。

【0625】

本明細書で提供される方法は、改変される細胞の連続的エレクトロポレーションを含み得る。場合によっては、方法は、第１のエレクトロポレーションステップ及び第２のエレクトロポレーションステップを含むことができる。場合によっては、第１及び第２のエレクトロポレーションステップを、間隔を置いて実施する。第１及び第２のエレクトロポレーションステップ間の間隔は、約１０分～約４８時間、約３０分～約４４時間、約１時間～約４０時間、約２時間～約３６時間、３時間 ～約３２時間、約４時間～約３０時間、約５時間～約２８時間、約５．５時間～約２６時間、約６時間～約２４時間、約６．５時間～約２２時間、約７時間～約２０時間、約８時間～約１６時間、約９時間～約１２時間、または約１０～約１１時間であり得る。場合によっては、第１のエレクトロポレーションステップと第２のエレクトロポレーションステップとの間の間隔は、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、または約２４時間であり得る。

【0626】

第１のエレクトロポレーションステップと第２のエレクトロポレーションステップとの間の間隔は、細胞の生存率に有益であり得る。本明細書で提供される第１及び第２のエレクトロポレーションステップを含む方法は、第１及び第２のエレクトロポレーションステップの両方からなる単一のエレクトロポレーションを含む同等の細胞と比較して、生存率のパーセンテージの増加を促進することができる。生存パーセンテージの増加は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約９０％、約１００％、約１２５％、約１５０％、約１７５％、約２００％、約２５０％、約３００％、またはそれ以上であり得る。場合によっては、生存率の増加は約５０％～約２００％であり得る。

【0627】

第１のエレクトロポレーションステップと第２のエレクトロポレーションステップとの間の間隔は、導入遺伝子の組み込み効率に有益であり得る。本明細書で提供される第１及び第２のエレクトロポレーションステップを含む方法は、第１及び第２のエレクトロポレーションステップの両方からなる単一のエレクトロポレーションを含む同等の細胞と比較して、組み込み効率のパーセンテージの増加を促進することができる。組み込み効率の向上は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約９０％、約１００％、約１２５％、約１５０％、約１７５％、約２００％、約２５０％、約３００％、またはそれ以上であり得る。場合によっては、組み込み効率の向上は約５０％～約２００％であり得る。

【0628】

第１のエレクトロポレーションステップは、ガイド型ヌクレアーゼを細胞に導入することを含み得る。本明細書で提供されるように、ガイド型ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、トランスポサーゼ、及びメガヌクレアーゼを含むことができる。ヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼ）は、天然に存在するヌクレアーゼであり得、遺伝子改変され、及び／または組換えであり得る。ガイド型ヌクレアーゼは、細胞内にガイド型ヌクレアーゼの機能的存在をもたらすことができる任意の形態で標的細胞に導入することができる。場合によっては、ガイド型ヌクレアーゼをＤＮＡの形態で細胞にトランスフェクトすることができる。場合によっては、ガイド型ヌクレアーゼをｍＲＮＡの形態で細胞にトランスフェクトすることができる。場合によっては、ガイド型ヌクレアーゼは、タンパク質またはタンパク質複合体の形態で細胞に送達することができる。場合によっては、ガイド型ヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質を含み得る。本明細書で提供される方法に使用することができるＣａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１またはＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１Ｓ、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、ＣｓＯ、Ｃｓｆ４、Ｃｐｆ１、ｃ２ｃ１、ｃ２ｃ３、Ｃａｓ９ＨｉＦｉ、それらの相同体、またはそれらの改変バージョンが挙げられる。

【0629】

第２のエレクトロポレーションステップは、遺伝子の少なくとも一部に相補的領域を含むガイドポリ核酸を細胞に導入することを含むことができる。第２のエレクトロポレーションステップは、細胞に外因性ポリ核酸を導入することをさらに含むことができる。第２のエレクトロポレーションステップは、遺伝子の少なくとも一部に相補的な領域を含むガイドポリ核酸及び外因性ポリ核酸を細胞に導入することを含むことができる。場合によっては、遺伝子の少なくとも一部に相補的な領域を含むガイドポリ核酸は、ＣＲＩＳＰＲシステムで使用されるガイドＲＮＡを含むことができる。ガイドＲＮＡはｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含み得る。場合によっては、遺伝子の少なくとも一部に相補的な領域を含むガイドポリ核酸及び外因性ポリ核酸は、単一のポリヌクレオチド分子、例えば、単一のＤＮＡプラスミド上に存在し得る。

【0630】

本明細書で提供される方法に使用することができる外因性ポリ核酸は、任意のヌクレオチド配列を含むことができる。場合によっては、外因性ポリ核酸は、導入遺伝子を含み得る。導入遺伝子は、任意の遺伝子またはその誘導体であり得る。場合によっては、導入遺伝子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、またはそれらの組み合わせなどの細胞受容体を含み得る。

【0631】

治療への適用
本開示の遺伝子編集された免疫細胞は、治療方法、例えば、がん、炎症性障害、自己免疫障害、または感染症の治療に使用することができる。免疫細胞ゲノムに導入することができる改変には、例えば、挿入、欠失、配列置換（例えば、置換）、及びそれらの組み合わせが含まれる。１つ以上の配列をゲノムに挿入して、例えば、外因性遺伝子産物（例えば、既知の抗原特異性のＴ細胞受容体もしくはキメラ抗原受容体、既知の特異性の免疫グロブリン、サイトカインもしくはサイトカイン受容体、ケモカインもしくはケモカイン受容体、または薬物応答性ドメインを含むタンパク質）の発現が可能となり得る。プロモーター配列をゲノムに挿入して、例えば、内因性遺伝子産物または外因性（挿入）遺伝子産物の調節されたまたは構成的な発現が可能となり得る。１つ以上の遺伝子を破壊して、例えば、疾患の病因に寄与する産物（例えば、抗がんもしくは抗病原体免疫応答を低下させる免疫チェックポイント遺伝子、または炎症性疾患または自己免疫疾患に寄与する炎症誘発性遺伝子）の発現を破壊することができる。定義された配列を、例えば、遺伝子産物の機能を変更するために、ゲノムから欠失させることができる（例えば、エクソンの欠失またはタンパク質の１つ以上のドメインの欠失）。たとえば、疾患に関連する配列（ＳＮＰや突然変異など）を正常な配列に置き換えるために、または遺伝子産物の機能（例えば、抗原、リガンド、アゴニスト、アンタゴニストなどに対する結合親和性）を変更するために、ゲノム内の配列を別の配列に置き換えることができる。

【0632】

例示的ながんとしては、急性リンパ球性癌、急性骨髄性白血病、胞巣状横紋筋腫、膀胱癌、骨癌、脳腫瘍、乳癌、肛門癌、肛門管癌、直腸癌、眼癌、肝内胆管癌、関節癌、頸部癌、胆嚢癌、胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌、中耳癌、口腔癌、外陰癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性癌、結腸癌、食道癌、子宮頸癌、線維肉腫、胃腸癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、腎臓癌、喉頭癌、白血病、液体腫瘍、肝癌、肺癌、リンパ腫、悪性中皮腫、肥満細胞腫、黒色腫、多発性骨髄腫、鼻咽頭癌、非ホジキンリンパ腫、卵巣癌、膵臓癌、腹膜癌、子宮内膜癌、腸間膜癌、咽頭癌、前立腺癌、直腸癌、腎癌、皮膚癌、小腸癌、軟組織癌、固形癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、尿管癌、及び膀胱癌、が挙げられるが、これらに限定されない。

【0633】

いくつかの実施形態では、がんは、膀胱癌、上皮癌、骨癌、脳腫瘍、乳癌、食道癌、胃腸癌、白血病、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、骨髄腫、卵巣癌、前立腺癌、肉腫、胃癌、甲状腺癌、急性リンパ球性癌、急性骨髄性白血病、胞巣状横紋筋肉腫、肛門管、直腸癌、眼癌、頸部癌、胆嚢癌、胸膜癌、口腔癌、外陰癌、結腸癌、子宮頸癌、線維肉腫、消化管カルチノイド腫瘍、ホジキンリンパ腫、腎臓癌、中皮腫、肥満細胞腫、黒色腫、多発性骨髄腫、鼻咽頭癌、非ホジキンリンパ腫、膵臓癌、腹膜癌、腎癌、皮膚癌、小腸癌、軟組織癌、固形腫瘍、胃癌、精巣癌、または甲状腺癌、である。いくつかの実施形態では、前記がんは、胃腸癌、乳癌、リンパ腫、または前立腺癌である。

【0634】

例示的な自己免疫疾患としては、アカラシア、アジソン病、成人スティル病、無ガンマグロブリン血症、アレタ脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性血管浮腫、自己免疫性自律神経不全、自己免疫性脳脊髄炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性精巣炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性蕁麻疹、軸索及び神経ニューロパチー、バロ病、ベーチェット病、良性粘膜類天疱瘡、水疱性類天疱瘡、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、慢性再発性多発性骨髄炎、チャーグ・シュトラウス症候群、好酸球性肉芽腫症、瘢痕性類天疱瘡、コーガン症候群、寒冷凝集素症、先天性房室ブロック、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、円板状エリテマトーデス、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、必須混合クリオグロブリン血症、エヴァンス症候群、線維筋痛症 線維化肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発血管炎性肉芽腫症、バセドウ病、ギランバレー症候群、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホシェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹または妊娠性類天疱瘡、化膿性汗腺炎、低ガンマグロブリン血症、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫性血小板減少性紫斑病、封入体筋炎、間質性膀胱炎、若年性関節炎、若年性糖尿病、若年性筋炎、川崎病、ランバート・イートン症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬 硬化性苔癬、木質結膜炎、線状ＩｇＡ疾患、ループス、慢性ライム病、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎、混合性結合組織病、モーレン潰瘍、ミュシャ・ハーバーマン病、多発性運動神経障害 多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、新生児エリテマトーデス、視神経脊髄炎、好中球減少症、眼類天疱瘡、視神経炎、パリンドロームリウマチ、ＰＡＮＤＡＳ、傍腫瘍性小脳変性症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、パリーロンバーグ病症候群、扁平部炎、パーソネイジ・ターナー症候群、天疱瘡、末梢神経障害、静脈周囲脳脊髄炎、悪性貧血、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多動脈炎、多腺症候群Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ型、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、プロゲステロン皮膚炎、乾癬、乾癬性関節炎、赤芽球癆、壊疽性膿皮症、レイノー現象、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、再発性多発性軟骨炎、むずむず脚症候群、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子及び精巣の自己免疫、スティッフパーソン症候群、亜急性細菌性心内膜炎、スザック症候群、交感性眼炎、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、血小板減少性紫斑病、トロサハント症候群、横断性脊髄炎、１型糖尿病、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織病、ブドウ膜炎、血管炎、硝子体炎、及びフォークト・小柳・原田病、が挙げられるが、これらに限定されない。

【0635】

本明細書に記載の細胞は、それを必要とする対象に投与することができる。いくつかの実施形態では、細胞は、それらが投与される対象に対して同種異系または自家である。いくつかの実施形態では、細胞は、単回投与として投与される。いくつかの実施形態では、細胞は、複数回用量で投与される。いくつかの実施形態では、細胞は、静脈内注入によって投与される。

【0636】

いくつかの実施形態では、がん細胞などの標的細胞は、腫瘍を形成し得る。本明細書で提供される組成物及び方法により治療された腫瘍は、安定化した腫瘍増殖をもたらすことができる（例えば、１つ以上の腫瘍は、サイズが１％、５％、１０％、１５％、または２０％を超えて増加しない、及び／または転移しない）。いくつかの実施形態では、腫瘍は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはそれ以上の週の間安定化される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはそれ以上の月の間安定化される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の年の間安定化される。いくつかの実施形態では、腫瘍のサイズまたは腫瘍細胞の数は、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上減少する。いくつかの実施形態では、腫瘍は完全に排除されるか、または検出レベル未満に減少する。いくつかの実施形態では、対象は、治療後少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはそれ以上の週の間、腫瘍がない（例えば、寛解状態にある）ままである。いくつかの実施形態では、対象は、治療後少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはそれ以上の月の間、腫瘍がないままである。いくつかの実施形態では、対象は、治療後少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の年の間、腫瘍がないままである。

【0637】

がん細胞などの標的細胞の死は、治療前後の細胞の計数、または生細胞または死細胞（例えば、生標的細胞または死標的細胞）に関連するマーカーのレベルの測定を含むがこれらに限定されない任意の好適な方法によって決定することができる。）。細胞死の程度は、任意の好適な方法によって決定することができる。いくつかの実施形態では、細胞死の程度は、開始条件に関して決定される。例えば、個体は、既知のサイズの開始細胞塊または既知の濃度で循環する標的細胞などの、既知の開始量の標的細胞を有し得る。このような場合、細胞死の程度は、開始細胞集団に対する治療後の生存細胞の比率として表すことができる。いくつかの実施形態では、細胞死の程度は、好適な細胞死アッセイによって決定され得る。さまざまな細胞死アッセイが利用可能であり、さまざまな検出手法を利用することができる。検出手法の例としては、細胞染色、顕微鏡検査、フローサイトメトリー、細胞ソーティング、及びこれらの組み合わせの使用が挙げられるが、これらに限定されない。腫瘍が治療期間の完了後に外科的切除を受ける場合、腫瘍サイズを縮小する治療の有効性は、壊死している（すなわち、死滅している）切除された組織のパーセンテージを測定することによって決定することができる。いくつかの実施形態では、切除された組織の壊死パーセンテージが約２０％（例えば、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％）を超える場合、治療は治療上有効である。いくつかの実施形態では、切除された組織の壊死パーセンテージは１００％である、すなわち、生腫瘍組織が存在しないか、または検出可能ではない。

【0638】

本明細書に開示される免疫細胞または免疫細胞の集団へのがん細胞の曝露は、インビトロまたはインビボのいずれかで実施することができる。標的細胞の免疫細胞または免疫細胞の集団への曝露は、一般に、標的細胞を免疫細胞と接触させて、及び／または十分に近接させて、標的細胞の抗原（例えば、膜結合または非膜結合）が、免疫細胞で発現するキメラ膜貫通受容体ポリペプチドの抗原相互作用ドメインに結合できるようにすることを指す。標的細胞の免疫細胞または免疫細胞の集団へのインビトロでの曝露は、標的細胞と免疫細胞を共培養することによって達成することができる。標的細胞と免疫細胞は、例えば、付着細胞として、あるいは懸濁状態で共培養することができる。標的細胞及び免疫細胞は、例えばサプリメント、成長因子、イオンなどを含む種々の好適なタイプの細胞培養培地で共培養することができる。標的細胞を、免疫細胞または免疫細胞の集団にインビボで曝露することを、場合によっては、免疫細胞を対象、例えばヒト対象に投与し、免疫細胞が循環系を介して標的細胞に局在化することが可能になることによって、達成することができる。場合によっては、免疫細胞を、例えば直接注射によって、標的細胞が局在化するすぐ近くの領域に送達することができる。曝露は、任意の好適な時間、例えば、少なくとも１分、少なくとも５分、少なくとも１０分、少なくとも３０分、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも８時間、少なくとも１２時間、少なくとも１６時間、少なくとも２０時間、少なくとも２４時間、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも１か月以上実行することができる。

【0639】

キット
本明細書に記載の組成物のいずれも、キットに含めてもよい。非限定的な例では、導入遺伝子、ベクター、ポリヌクレオチド、ペプチド、本明細書で提供される組成物を生成するための試薬、及びそれらの任意の組み合わせを、キットに含めてもよい。場合によっては、キットの構成成分を、好適な容器手段で提供する。

【0640】

キットは、好適に等分された組成物を含み得る。キットの構成成分を、水性媒体または凍結乾燥形態のいずれかで包装することができる。キットの容器手段は、一般に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、注射器、または他の容器手段を含み、その中に構成成分を入れ、好ましくは好適に等分することができる。キットに複数の構成成分が存在している場合、キットには一般に、追加の構成成分を別々に配置することができる第２の、第の３、またはその他の追加の容器も含まれる。しかし、構成成分の種々の組み合わせをバイアルに含めることができる。キットには、通常、商業販売のために構成成分を緊密に閉じ込めて収容するための手段も含まれる。そのような容器は、所望のバイアルが保持される注射薬容器またはブロー成形プラスチック容器を含み得る。

【0641】

ただし、キットの成分を、乾燥粉末として提供してもよい。試薬及び／または成分が乾燥粉末として提供される場合、粉末は好適な溶媒の添加によって再構成することができる。溶媒はまた、別の容器手段で提供し得ることが想定される。

【0642】

いくつかの実施形態では、キットは、操作されたガイドＲＮＡ、操作されたガイドＲＮＡ前駆体、操作されたガイドＲＮＡもしくは操作されたガイドＲＮＡ前駆体を含むベクター、または操作されたガイドＲＮＡもしくは操作されたガイドＲＮＡ前駆体の核酸、操作された細胞受容体、操作された細胞受容体をコードするポリヌクレオチド、または上記のいずれかを含む医薬組成物及び容器を含むことができる。場合によっては、容器は、プラスチック、ガラス、金属、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。

【0643】

場合によっては、本明細書に記載の組成物を含む包装された製品は、適切に標識化することができる。場合によっては、本明細書に記載の医薬組成物は、適正製造基準（ｃＧＭＰ）及び表示規則に従って製造することができる。場合によっては、本明細書に開示される医薬組成物は無菌であり得る。

【0644】

好ましい実施形態が本明細書において示され、説明されてきたが、そのような実施形態が単に例として提供されることは当業者には明らかであろう。多数の変化、変更、及び代用が、ここで当業者に思い当たるであろう。本明細書に記載の実施形態の種々な代替手段が、用いられてもよいことを理解されたい。以下の特許請求の範囲が範囲を定義し、これらの特許請求の範囲の方法及び構造ならびにそれらの均等物が本明細書において包含されることが意図されている。

【実施例】

【0645】

実施例１：Ｔ細胞の単離
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、塩化アンモニウムベースのＲＢＣ溶解及び／または密度勾配遠心分離（例えば、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ）を使用して、全血またはアフェレーシスユニットから単離する。ＰＢＭＣを計数し、ＥａｓｙＳｅｐ緩衝液または２％ＦＢＳ及び１ｍＭ ＥＤＴＡ（カルシウム及びマグネシウム非含有）を含むＰＢＳで細胞密度を５×１０＾７細胞／ｍＬに調整し、８ｍＬまで丸底チューブに移す。ＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｔ－ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキット（カタログ番号１９０５１）からの単離カクテルを５０ｕＬ／ｍＬで細胞に加える。細胞を、ピペット操作により混合し、室温で５分間インキュベートする。ＲａｐｉｄＳｐｈｅｒｅｓを、３０秒間ボルテックスして混合し、４０ｕＬ／ｍＬで試料に加える。試料を５ｍＬまたは１０ｍＬまで補充し、ピペット操作により穏やかに混合する。チューブをＥａｓｙＳｅｐマグネットに入れ、室温で３分間インキュベートする。非Ｔ細胞は磁石に捕捉されるが、Ｔ細胞は結合されないままである。単離されたＴ細胞を、上澄みを１回の連続動作で注意深くピペット操作または注ぐことにより、新しいコニカルチューブに移す。Ｔ細胞を計数し、フローサイトメトリーによって純度を検証する（たとえば、＞９０％のＣＤ３＋細胞について検証する）。細胞は、培養、刺激、または分注して、将来の使用のために凍結することができる（たとえば、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ ＣＳ１０を用いる）。

【0646】

実施例２：Ｔ細胞の増殖
単離されたＴ細胞を、２４ウェルプレート中の、２．６％ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ細胞増殖サプリメント、２．５％ＣＴＳ（商標）免疫細胞血清置換、１％Ｌ－グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１０ｍＭ Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン、３００ ＩＵ／ｍＬ組換えヒトＩＬ－２、５ｎｇ／ｍＬ組換えヒトＩＬ－７、及び５ｎｇ／ｍＬ組換えヒトＩＬ－１５を含むＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ細胞増殖基礎培地に、１×１０＾６細胞／ｍＬの密度でプレーティングする。（凍結細胞）凍結単離Ｔ細胞（ｆｒｏｚｅｎ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｚｅｎ ｉｓｏｌａｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ）を使用する場合、細胞は刺激前に、解凍した後、少なくとも４～５時間静置させる。

【0647】

Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓを、培養培地で洗浄し、磁石を使用して収集し、細胞あたり２ビーズ、または２．５細胞あたり１ビーズの比率で単離されたＴ細胞に加える。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。１２～２４時間後、試料を穏やかにピペットで移し、ビーズを再分配する。合計３６時間のインキュベーション後、磁石を使用してビーズを除去する。

【0648】

実施例３：Ｔ細胞のヌクレオフェクション
単離されたＴ細胞を、実施例２に概説されているように刺激し、Ｌｏｎｚａ ４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）Ｘユニット及びＡｍａｘａ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｘキットを使用してエレクトロポレーションする。キットの説明書に従って、細胞をペレット化し、キット提供の緩衝液で１回洗浄し、キット提供の緩衝液に再懸濁し、キュベットに移す。

【0649】

１００ｕＬのキュベットの場合、キュベットごとに５～１５ｕｇのＣａｓ９ ｍＲＮＡ、及び５～２５ｕｇのｇＲＮＡ－ＲＮＡを加える。プラスミドＤＮＡを１００ｕＬキュベットに加える場合、５～１０ｕｇのプラスミドＤＮＡを加える。

【0650】

２０ｕＬのキュベットの場合、キュベットごとに１～３ｕｇのＣａｓ９ ｍＲＮＡ、及び１～５ｕｇのｇＲＮＡ－ＲＮＡを加える。プラスミドＤＮＡを２０ｕＬキュベットに加える場合、１～２ｕｇのプラスミドＤＮＡを加える。

【0651】

ヌクレオフェクションを、キットの説明書に従って実行する。細胞をキュベット内に１５分間静置した後、抗生物質を含まない培養培地を含有する回復プレートに移す。細胞を、最小限のピペット操作で穏やかに取り扱う。１００ｕＬキュベットの場合、内容物を、６ウェルプレートのウェルあたり１ｍＬに移す。２０ｕＬキュベットの場合、内容物を、２４ウェルプレートのウェルあたり３００ｕＬに移す。プラスミドＤＮＡを加えた場合、１ｕｇ ＤＮアーゼが回復ウェルに含まれる。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で３０分間インキュベートした後、追加の培養培地を加えて細胞濃度を１×１０＾６細胞／ｍＬにし、培養物を３７℃、５％ＣＯ２に維持する。成長及び生存率を、たとえば、自動セルカウンターを用いたトリパンブルー排除によって定期的に監視する。

【0652】

実施例４：一本鎖アニーリングを含むＴ細胞のゲノム編集
ＤＮＡミニサークルコンストラクトを、図１Ａに表される要素を含むように設計及び合成する。「挿入」ボックスは、プロモーター（ＭＮＤプロモーター）、及びＴ細胞受容体（特異的モノクローナル抗体によって認識可能なマウスＴＣＲｂ配列を含む外因性Ｇ１２Ｄ ＫＲＡＳ特異的ＴＣＲ）をコードするオープンリーディングフレームを含み、ポリＡテールを含む、ＤＮＡ配列を表す。Ｔ１は、ガイドＲＮＡ（たとえば、ゲノムを標的としないガイドＲＮＡ（たとえば、ゼブラフィッシュガイドＲＮＡまたはアルゴリズム設計ガイドＲＮＡ）、またはゲノム内の破壊標的部位を標的とするガイドＲＮＡ）による切断の標的となる配列を表す。Ｈ１及びＨ２は、ゲノム内の選択された部位に相同な配列を有する短い相同性アームを表す（ＴＲＡＣエクソン１内の４８塩基対配列）。対照として、４８塩基対の相同性アームの代わりに１０００塩基対の相同性アームとともに挿入を含むＤＮＡミニサークルコンストラクトを設計する。

【0653】

コンストラクトは、図１Ｂに示されるゲノム内のＴＲＡＣ標的部位に挿入されるように設計されている。Ｈ１及びＨ２は、ＤＮＡミニサークルコンストラクトのＨ１及びＨ２に相同なゲノムの配列を表す。Ｃ２は、ガイドＲＮＡ（例えば、Ｃ１を標的とする同じガイドＲＮＡまたは異なるガイドＲＮＡ）による切断の標的となる配列を表す。

【0654】

ヒトＴ細胞を実施例１のように単離し、実施例２のように増殖させ、Ｌｏｎｚａ ４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）Ｘ ユニット及びＡｍａｘａ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｘキットを使用してエレクトロポレーションする。キットの説明書に従って、細胞をペレット化し、キット提供の緩衝液で１回洗浄し、キット提供の緩衝液に再懸濁し、２０ｕＬキュベットに移す。

【0655】

ＤＮＡ及び／またはＲＮＡは、表２に示す量でキュベットに加える。

【表2】

【0656】

ヌクレオフェクションを、キットの説明書に従って実行する。細胞をキュベットで１５分間静置した後、ウェルあたり３００ｕＬの抗生物質を含まない培養培地を含有し、１ｕｇ ＤＮアーゼを含む２４ウェルプレートに移す。細胞を、最小限のピペット操作で穏やかに取り扱う。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で３０分間インキュベートした後、追加の培養培地を加えて細胞濃度を１×１０＾６細胞／ｍＬにする。培養物を、３７℃、５％ＣＯ２で７日間維持し、必要に応じて培養培地を交換し、培養物を分割する。

【0657】

ヌクレオフェクション後７日目に、細胞をフローサイトメトリーで分析し、ＤＮＡミニサークルコンストラクトによってコードされるＴＣＲを発現する細胞の頻度及び数を決定する。実験条件ごとに５×１０＾５の細胞を採取し、ペレット化し、ＣＤ３及び挿入ＴＣＲに特異的な蛍光色素コンジュゲートモノクローナル抗体で染色する。細胞はまた、生存率色素で染色する。染色後、細胞をフローサイトメトリーにかけ、生細胞についてＣＤ３及び挿入ＴＣＲの発現を分析する。

【0658】

図２は、実験条件１～３の結果を表し、ヌクレアーゼまたはガイドＲＮＡがない条件では、挿入ＴＣＲが発現しないことを示している。各列は条件を表す。各行は、異なるドナー由来の試料を表す。ｙ軸はＣＤ３染色からの蛍光を表し、Ｘ軸は挿入ＴＣＲの染色からの蛍光を表す。数値は、象限内にある生細胞のパーセンテージを表す。

【0659】

図３は、実験条件４～７からの結果を表し、１０００塩基対の相同性アーム（条件４及び５）を使用した実験条件と比較して、４８塩基対の相同性アーム及びミニサークル標的指向性ガイドＲＮＡ（条件６及び７）を使用した実験条件では、より高い割合及び数の細胞が挿入ＴＣＲを発現することを示す。各列は条件を表す。各行は、異なるドナー由来の試料を表す。ｙ軸はＣＤ３染色からの蛍光を表し、Ｘ軸は挿入ＴＣＲの染色からの蛍光を表す。数値は、象限内にある生細胞のパーセンテージを表す。これらの結果は、相同組換えと比較して一本鎖アニーリングを含む方法を使用した免疫細胞ゲノム編集の効率の改善を示す。

【0660】

図４は、実験条件１～７からの挿入ＴＣＲを発現する生細胞のパーセンテージを示す。２つのドナーから処理された試料についてのデータが提示され、ドナーごとに２つの技術的複製がある。結果は、１０００塩基対の相同性アーム（条件４及び５）を使用した実験条件と比較して、４８塩基対の相同性アーム及びミニサークル標的指向性ガイドＲＮＡ（条件６及び７）を使用した実験条件では、より高い割合及び数の細胞が挿入ＴＣＲを発現することを示す。これらの結果は、相同組換えと比較して一本鎖アニーリングを含む方法を使用した免疫細胞ゲノム編集の効率の改善を示す。

【表3】

【0661】

実施例５：一本鎖アニーリングを含むＴ細胞のゲノム編集
ＤＮＡミニサークルコンストラクトを、図１Ａに表される要素を含むように設計及び合成する。「挿入」ボックスは、プロモーター及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするオープンリーディングフレームを含むＤＮＡ配列を表す。Ｔ１は、ガイドＲＮＡ（たとえば、ゲノムを標的としないガイドＲＮＡ（たとえば、ゼブラフィッシュガイドＲＮＡまたはアルゴリズム設計ガイドＲＮＡ）、またはゲノム内の破壊標的部位を標的とするガイドＲＮＡ）による切断の標的となる配列を表す。Ｈ１及びＨ２は、ゲノム内の選択された部位に相同な配列を有する短い相同性アームを表す（ＡＡＶＳ１セーフハーバー遺伝子座内の４８塩基対配列）。対照として、４８塩基対の相同性アームの代わりに１０００塩基対の相同性アームとともに挿入物を含むＤＮＡミニサークルコンストラクトを設計する。
ユニバーサル配列などの異種配列を標的とする例示的なｇＲＮＡは、ＧＧＧＡＧＧＣＧＵＵＣＧＧＧＣＣＡＣＡＧＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号８２）と約５０％から、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含み得る。例示的な前述のｇＲＮＡはまた、ｍＧ＊ｍＧ＊ｍＧ＊ ｒＡｒＧｒＧ ｒＣｒＧｒＵ ｒＵｒＣｒＧ ｒＧｒＧｒＣ ｒＣｒＡｒＣ ｒＡｒＧｒＧ ｒＵｒＵｒＵ ｒＵｒＡｒＧ ｒＡｒＧｒＣ ｒＵｒＡｒＧ ｒＡｒＡｒＡ ｒＵｒＡｒＧ ｒＣｒＡｒＡ ｒＧｒＵｒＵ ｒＡｒＡｒＡ ｒＡｒＵｒＡ ｒＡｒＧｒＧ ｒＣｒＵｒＡ ｒＧｒＵｒＣ ｒＣｒＧｒＵ ｒＵｒＡｒＵ ｒＣｒＡｒＡ ｒＣｒＵｒＵ ｒＧｒＡｒＡ ｒＡｒＡｒＡ ｒＧｒＵｒＧ ｒＧｒＣｒＡ ｒＣｒＣｒＧ ｒＡｒＧｒＵ ｒＣｒＧｒＧ ｒＵｒＧｒＣ ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ ｒＵ（配列番号８３）に記述されるような改変を含むことができる。例示的なユニバーサルガイド（ゼブラフィッシュ）ｇＲＮＡのスペーサー配列は、ｇｇｇａｇｇｃｇｕｕｃｇｇｇｃｃａｃａｇ（配列番号８４）と約５０％から、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含み得る。前述のユニバーサルｇＲＮＡ（例示的なユニバーサル配列）によって結合され得る標的配列、Ｔ１は、ＣＴＧＴＧＧＣＣＣＧＡＡＣＧＣＣＴＣＣＣ（配列番号８５）を含む。

【0662】

ＡＡＶＳ１ ｇＲＮＡによって結合されるゲノム標的配列は、ＣＴＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＴＴＧＧＴＧＡＣ（配列番号８６）を含む。ＡＡＶＳ１ ｇＲＮＡは、配列番号７９または８２のいずれか１つの骨格、またはスペーサー配列を欠く領域を共有することができる。例えば、ＡＡＶＳ１ ｇＲＮＡは、残基２１～１００に対応する配列番号７９の骨格を含むことができる。

【0663】

コンストラクトは、図１Ｂに示されるゲノムのＡＡＶＳ１標的部位に挿入されるように設計されている。Ｈ１及びＨ２は、ＤＮＡミニサークルコンストラクトのＨ１及びＨ２に相同なゲノムの配列を表す。Ｔ２は、ガイドＲＮＡ（例えば、Ｃ１を標的とする同じガイドＲＮＡまたは異なるガイドＲＮＡ）による切断の標的となる配列を表す。

【0664】

ヒトＴ細胞を実施例１のように単離し、実施例２のように増殖させ、Ｌｏｎｚａ ４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）Ｘユニット及びＡｍａｘａ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｘキットを使用してエレクトロポレーションする。キットの説明書に従って、細胞をペレット化し、キット提供の緩衝液で１回洗浄し、キット提供の緩衝液に再懸濁し、２０ｕＬキュベットに移す。

【0665】

ＤＮＡ及び／またはＲＮＡは、表４に示す量でキュベットに加える。

【表4】

【0666】

ヌクレオフェクションを、キットの説明書に従って実行する。細胞をキュベットで１５分間静置した後、ウェルあたり３００ｕＬの抗生物質を含まない培養培地を含有し、１ｕｇ ＤＮアーゼを含む２４ウェルプレートに移す。細胞を、最小限のピペット操作で穏やかに取り扱う。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で３０分間インキュベートした後、追加の培養培地を加えて細胞濃度を１×１０＾６細胞／ｍＬにする。培養物を、３７℃、５％ＣＯ２で７日間維持し、必要に応じて培養培地を交換し、培養物を分割する。

【0667】

ヌクレオフェクション後７日目に、細胞をフローサイトメトリーで分析し、ＤＮＡミニサークルコンストラクトからＧＦＰレポーターを発現する細胞の頻度を決定する。実験条件ごとに５×１０＾５の細胞を採取し、ペレット化し、生存率色素で染色する。染色後、細胞をフローサイトメトリーにかけ、生細胞についてＧＦＰの発現を分析する。

【0668】

図５は、実験条件１～７からのＧＦＰレポーターを発現する生細胞のパーセンテージを示す。２つのドナーから処理された試料についてのデータが提示され、ドナーごとに３つの技術的複製がある。結果は、一本鎖アニーリングを含む方法を使用した効率的な免疫細胞ゲノム編集を示す。

【0669】

実施例６：Ｔ細胞改変のための材料及び方法
この実施例は、初代Ｔ細胞の単離、培養、トランスフェクション、及びエレクトロポレーション後のある特定のステップを伴う、実施例７～１１で使用される材料及び方法を提供する。

【0670】

例示的なプロトコル１
材料

【0671】

培養培地：
・Ｘ－ＶＩＶＯ １５ゲンタマイシン含有、Ｌ－グルタミン含有、トランスフェリン含有、フェノールレッド含有
・Ｘ－ＶＩＶＯ １５ゲンタマイシン非含有、フェノールレッド非含有、Ｌ－グルタミン含有、トランスフェリン含有（＊回復培地）
・１０％ＡＢヒト血清
・ＮアーゼＩ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）
・３００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２
・５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－７
・５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－１５

【0672】

凍結培地：
・Ｃｒｙｏｓｔｏｒ ＣＳ１０

【0673】

細胞分離試薬：
・ヒトＴ細胞単離キット
・塩化アンモニウムＲＢＣ溶解液

【0674】

その他の試薬：
・Ｄｙｎａｍａｇ－２
・Ｎｅｏｎキット

【0675】

抗体リスト：
・抗ヒトＣＴＬＡ４
・抗ヒトＰＤ－１
・抗ヒトＣＤ３
方法

【0676】

塩化アンモニウムベースのＲＢＣ溶解物を使用したアフェレーシスユニット（Ｌｅｕｋｏｐａｋ）からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の分離
（ａ）Ｌｅｕｋｏｐａｋの血液量を測定する
（ｂ）Ｌｅｕｋｏｐａｋを滅菌５００ｍｌボトルに分注し、等量の塩化アンモニウム溶液を加える
（ｃ）数回反転させて混合する
（ｄ）氷上で１５分間インキュベートする
（ｅ）試料を５０ｍｌのコニカルに均等に分配し、５００×ｇで１０分間遠心分離する。
（ｆ）注意深く上澄みを除去し、廃棄する。
（ｇ）チューブに１×ＰＢＳ＋２％ヒトＡＢ血清を補充し、ブレーキをオフにして１５０×ｇで１０分間遠心分離する。
（ｈ）この洗浄ステップを少なくとも１回繰り返して、血小板を除去する。
（ｉ）ＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｔ－ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキットを使用して、Ｔ細胞精製用の適切な培地に再懸濁する。
塩化アンモニウムベースのＲＢＣ溶解を使用したＴｒｉｍａコーンからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離
（ａ）コーン内の血液量を測定する（通常は約１０ｍｌ）
（ｂ）体積を２つの５０ｍｌコニカルに分割する
（ｃ）１５ｍｌの１×ＡＣＫ溶解液を加える
（ｄ）氷上で２０分間インキュベートし、２０ｍｌの１×ＰＢＳ＋２％ヒトＡＢ血清でクエンチする。
（ｅ）５００×ｇで１０分間遠心分離する。
（ｆ）注意深く上澄みを除去し、廃棄する。
（ｇ）チューブに１×ＰＢＳ＋２％ヒトＡＢ血清を補充し、ブレーキをオフにして１５０×ｇで１０分間遠心分離する。
（ｈ）この洗浄ステップを少なくとも１回繰り返して、血小板を除去する。
（ｉ）ＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｔ－ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキットを使用して、Ｔ細胞精製用の適切な培地に再懸濁する。
ＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｔ－ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキット（カタログ番号１９０５１）を使用したＣＤ３＋Ｔ細胞の単離
（ａ）フィコール分離ＰＢＭＣ（＊または洗浄アフェレーシスユニット／Ｌｅｕｋｏｐａｃ）を計数し、細胞密度を５×１０＾７細胞／ｍＬに調整する。
（ｂ）最大４５ｍＬを５０ｍｌコニカルチューブに移す（Ｅａｓｙ“５０”マグネットで使用するため）。
（ｃ）５０ｕＬ／ｍＬの単離カクテルを細胞に加える。
（ｄ）ピペット操作により混合し、室温で１０分間インキュベートする。
（ｅ）ＲａｐｉｄＳｐｈｅｒｅｓを３０秒間ボルテックスし、試料に５０ｕＬ／ｍＬを加える。上下にピペット操作して混合し、ＲＴで１０分間インキュベートする。
（ｆ）１０ｍＬを超える試料の場合は、５０ｍＬまで補充する。
（ｇ）コニカルチューブをＥａｓｙ“５０”マグネットに入れ、室温で１０分間インキュベートする。
（ｈ）マグネット内のコニカルから懸濁液を注意深くピペットで取り出し、新しい５０ｍＬコニカルに分注する。
（ｉ）２回目の単離のためにコニカルをマグネットに戻し、５分間インキュベートする。
（ｊ）５０ｍｌピペットを使用して１ラウンドのピペット操作で上澄みを注意深く除去して、非結合Ｔ細胞を除去し、新しい５０ｍｌコニカルに移す。
（ｋ）Ｔ細胞を計数し、％ＣＤ３＋（＞９０％）についてフローサイトメトリーによって純度を検証する
（ｌ） 将来の使用のために未使用の細胞を分注して凍結させる（Ｃｒｙｓｔｏｒまたは９０％ＦＢＳ：１０％ＤＭＳＯ）
ＣｒｙｏＳｔｏｒＣＳ１０で元々凍結されていた試料の解凍
（ａ）予熱した培養培地（３７℃）で細胞を解凍する。それらが培養されるのと同じタイプの培地を使用する。
（ｂ）滅菌１５ｍＬコニカルチューブに１ｍＬの培養培地を加える。
（ｃ）氷結晶が１つ残るまで、３７℃のウォーターバスで凍結バイアルを解凍する。すぐにバイアルを安全キャビネットに運び、７０％エタノールをスプレーして拭き取る。
（ｄ）バイアルを注意深く開ける。細胞懸濁液を、１つのバイアルから１５ｍｌコニカルチューブに穏やかにピペットで滴下する。
（ｅ）さらに１ｍｌの培養培地を滴下し、穏やかに回転させる。
（ｆ）もう１ｍｌの培養培地を滴下し、穏やかに回転させる。
（ｇ）さらに４ｍｌの培養培地を加え、穏やかに混合する。
（ｈ）１７５ｇで１０分間遠心分離する。より高い遠心力により細胞死がもたらされる。
（ｉ）上澄みを吸引し、細胞ペレットを培養培地に懸濁する。
（ｊ）細胞を計数し、試験するか、または培養する準備ができている。細胞を培養培地及びインキュベーターに遅れないで入れること。
ｄｙｎａｂｅａｄｓによるＣＤ３＋Ｔ細胞の刺激
（ａ）２４ウェルプレート中のＸ－ｖｉｖｏ培地＋１０％ヒトＡＢ血清＋３００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ、５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－７、及び５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５に、１×１０＾６細胞／ｍＬの密度で単離されたＴ細胞をプレーティングする。
（ｂ）２：１の比率（ビーズ：細胞）を得るために必要なＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の数を計算し、０．２％ＢＳＡを含む１×ＰＢＳで洗浄し、ｄｙｎａｍａｇｎｅｔ－２を使用してビーズを収集する。
（ｃ）洗浄したビーズを２：１の比率または１：２．５（ビーズ：細胞）で細胞に加える。
（ｄ）細胞を３７Ｃ及び５％ＣＯ２で２４～３６時間インキュベートする。
（ｅ）ｄｙｎａｍａｇｎｅｔ－２を使用してビーズを除去する。
（ｆ）エレクトロポレーションの前に、ビーズなしで細胞を少なくとも３０分間培養する。
ＣＤ３＋Ｔ細胞のＮｅｏｎトランスフェクション
（ａ）刺激されたＴ細胞を、Ｎｅｏｎトランスフェクションシステム（１００ｕＬまたは１０ｕｌキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してエレクトロポレーションする。
（ｂ）細胞をペレット化し、ＰＢＳまたはＴ緩衝液で１回洗浄する。
（ｃ）１０ｕｌチップの場合は１０ｕＬのＴ緩衝液に３×１０＾５細胞の密度で細胞を再懸濁し、１００ｕｌチップの場合は１００ｕｌ Ｔ緩衝液に３×１０＾６細胞を再懸濁する。
（ｄ）指定された質量のｍＲＮＡ／ＤＮＡを加え、１４００Ｖ、１０ミリ秒、３パルスでエレクトロポレーションする。
ａ．すべてのｍＲＮＡを使用したノックアウトの場合：
ｉ．１００ｕｌチップ：１５ｕｇ Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、１０ｕｇ ｇＲＮＡ－ＲＮＡ
ｉｉ．１０ｕｌチップ：１．５ｕｇ Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、１ｕｇ ｇＲＮＡ－ＲＮＡ
ｂ．ノックイン用のプラスミドドナーを含める場合：
ｉ．１００ｕｌチップ：５～２０ｕｇプラスミド
ｉｉ．１０ｕｌチップ：０．５～２ｕｇプラスミド
ｃ．順次エレクトロポレーションの場合：
－０時間の時点で、「ａ」で指定された量のＣａｓ９を送達する
ｉｉ．０時間及び６～２４時間の時点で、「ａ」及び「ｂ」で指定された量のｇＲＮＡとプラスミドを一緒に送達する。
（ｅ）トランスフェクション後、１０ｕｇ／ｍｌ ＤＮアーゼＩを含有する抗生物質を含まない培地に、３０００細胞／ｕｌで細胞をプレーティングし、５％ＣＯ２で３７℃にて約２０分間インキュベートする。
（ｆ）回復期間後、２倍量の抗生物質含有培地をウェルに加え、５％ＣＯ２で３７℃にて培養する。
ＣＤ３＋Ｔ細胞のｒＡＡＶ形質導入
（ａ）氷上でｒＡＡＶを解凍し、細胞に加える前によく混合する。
（ｂ）エレクトロポレーション後の次の時点で指定されたＭＯＩを加える
ａ．Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ編集細胞の場合：
ｉ．４～６時間後にウイルスを加える
ｂ．Ｃａｓ９タンパク質（ＲＮＰ）の場合：
ｉ．１５分後にウイルスを加える
初代Ｔ細胞のエレクトロポレーション後培養
１．培地添加の指標として、エレクトロポレーション後の培地の色を観察する。タイミングは、特定の実験／ドナー用の細胞の健康状態によって異なる。培地がオレンジ色に変わり始めたら（場合によっては４８時間という早い時期に）、２倍の濃度のサイトカインを含有する培養培地で培養培地の量を２倍にする（２×培地）。培養期間にわたって、必要に応じてこのプロセスを続ける。
２．場合によっては、細胞が非常に急速に成長し（特に７～９日目頃）、培地が急速に消費されると、細胞をスピンダウンして１×培地の２～３倍の量で再構成することができる。
３．細胞の成長が不十分で、培地を２倍にする必要がなく、３～４日が経過した場合は、フラスコの底に沈殿した細胞を乱さないように注意しながら、上部からピペット操作により培地の約５０％を注意深く除去し、等量の２×培地と交換する。
例示的なプロトコル２（追加の刺激）：例示的なプロトコル１に対する改変

【0677】

試薬及び材料
（Ａ）培養培地：２．６％ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ細胞増殖サプリメント（Ｇｉｂｃｏカタログ番号Ａ１０４８４－０２）を含む１Ｌ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ細胞増殖基礎培地（Ｇｉｂｃｏカタログ番号Ａ１０２２１－０１）、２．５％ＣＴＳ（商標）免疫細胞血清置換（Ｇｉｂｃｏカタログ番号Ａ２５９６１－０１）、１％Ｌ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏカタログ番号２５０３０－０８１）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅカタログ番号ＴＭＳ－ＡＢ２－Ｃ）、１０ｍＭ Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ａ９１６５－２５６）、３００ＩＵ／ｍｌ 組換えヒトＩＬ－６（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈカタログ番号２００－０２）、５ｎｇ／ｍｌ 組換えヒトＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈカタログ番号２００－０７）、５ｎｇ／ｍｌ 組換えヒトＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈカタログ番号２００－１５）。
（Ｂ）回復培地：ペニシリン／ストレプトマイシンを含まない培養培地。
（Ｃ）凍結培地：Ｃｒｙｏｓｔｏｒ ＣＳ１０（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ カタログ番号０７９３０）。
（Ｄ）分離緩衝液：０．２％ヒトＡＢ血清熱不活化（Ｖａｌｌｅｙ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌカタログ番号ＨＰ１０２２ＨＩ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅカタログ番号ＴＭＳ－ＡＢ２－Ｃ）及び０．１Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ ８．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号ＡＭ９２６１）を含む１Ｌリン酸緩衝生理食塩水１×（Ｈｙｃｌｏｎｅ カタログ番号ＳＨ３０２－５６－０１）
（Ｅ）ＦＡＣＳ緩衝液：０．５％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅカタログ番号ＴＭＳ－ＡＢ２－Ｃ）、０．１％ヒトＡＢ血清熱不活化（Ｖａｌｌｅｙ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌカタログ番号ＨＰ１０２２ＨＩ）、及び０．１Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ ８．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号ＡＭ９２６１）を含む５００ｍｌリン酸緩衝生理食塩水１×（Ｈｙｃｌｏｎｅカタログ番号ＳＨ３０２－５６－０１）
（Ｆ）細胞分離試薬：ヒトＴ細胞単離キット（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号１７９５１）及びＡＣＫ溶解緩衝液（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌカタログ番号１１８－１５６－１０１）。
（Ｇ）追加試薬：Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｇｉｂｃｏカタログ番号１１１３２Ｄ）、Ａｍａｘａ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｘキット（Ｌｏｎｚａカタログ番号Ｖ４ＸＰ－３０３２、Ｖ４ＸＰ－３０２４）、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ ＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｔ－ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキット（カタログ番号１９０５１）。
（Ｈ）抗体：ＡＰＣマウス抗ヒトＣＤ３（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎカタログ番号５５５３３５）、抗マウスＴＣＲｂ ＰＥ ＣＹ ７クローンＨ５７－５９７（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号２５－５９６１－８０）、抗マウスＴＣＲｂ ＰＥ ＣＹ ７クローンＳＫ７（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号３４０４４０）、及びＦｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ ７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号６５－０８６５－１４）。
（Ｉ）材料：ＤｙｎａＭａｇ（商標）－２マグネット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号１２３２１Ｄ）、Ｂｉｇ ＥａｓｙＥａｓｙＳｅｐ（商標）マグネット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌカタログ番号１８００１）、及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（商標）ＩＩ ＦＬ自動セルカウンター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号ＡＭＱＡＦ１０００）。

【0678】

塩化アンモニウムベースのＲＢＣ溶解物を使用したＴｒｉｍａコーンからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離を、前述のように実行する。

【0679】

ＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｔ－ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキット（カタログ番号１９０５１）を使用したＣＤ３＋Ｔ細胞の単離
（Ａ）フィコール分離ＰＢＭＣ（＊または洗浄アフェレーシスユニット／Ｌｅｕｋｏｐａｃ）を計数し、細胞密度を５×１０＾７細胞／ｍｌに調整する。
（Ｂ）８ｍＬ～１４ｍｌの丸底チューブに移す（「Ｔｈｅ Ｂｉｇ Ｅａｓｙ」ＥａｓｙＳｅｐマグネットで使用するため）。
（Ｃ）５０ｕＬ／ｍＬの単離カクテルを細胞に加える。
（Ｄ）ピペット操作により混合し、室温で５分間インキュベートする。
（Ｅ）ＲａｐｉｄＳｐｈｅｒｅｓを３０秒間ボルテックスし、試料に４０ｕＬ／ｍＬを加える。上下にピペット操作して混合し、ＲＴで３分間インキュベートする。
（Ｆ）４ｍＬ未満の試料の場合は５ｍＬまで補充し、４ｍｌを超える試料の場合は１０ｍｌまで補充する。
（Ｇ）滅菌ピペットを使用して１ラウンドのピペット操作で上澄みを注意深く除去し、新しいコニカルチューブに移して、非結合Ｔ細胞を除去する。
（Ｈ）Ｔ細胞を計数し、％ＣＤ３＋（＞９０％）についてフローサイトメトリーによって純度を検証する
（Ｉ）Ｃｒｙｏｓｔｏｒ ＣＳ１０（Ｓｔｅｍｃｅｌｌカタログ番号０７９３０）を用いて、将来使用するための未使用の細胞を分注して凍結する。

【0680】

ＣＤ３＋Ｔ細胞のＡｍａｘａヌクレオフェクション
刺激されたＴ細胞を、Ｐ３緩衝液（Ｖ４ＸＰ－３０３２、Ｖ４ＸＰ－３０２４）を使用し、Ｌｏｎｚａ ４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）Ｘユニット及びＡｍａｘａ４Ｄ －ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＸキットを使用してエレクトロポレーションする。
１）Ｐ３キットの場合、緩衝溶液マスターミックスを事前に調製し、ＲＴにする必要がある。一度混合すると、４℃で９０日間良好に保存できるので、特定の実験に必要な量よりわずかだけに多く作製する。
・１８ｕＬ サプリメント１＋８２ｕＬ Ｐ３ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ
－１００ｕｌキュベット：９０ｕＬＰ３緩衝液ミックス／反応
－２０ｕｌキュベット：１８ｕＬ Ｐ３緩衝液ミックス／反応
２）ピペットを使用して細胞をよく混合及び撹拌し、Ｄｙｎａｂｅａｄｓへの結合を破壊する。
３）ｄｙｎａｍａｇｎｅｔ－２を使用してビーズを除去する。
４）細胞をＰＢＳにより４００×ｇで５分間１回洗浄する。
５）細胞を再懸濁して計数する。
・１００ｕｌキュベットの場合、２～２０×１０＾６細胞／条件を使用することができる。
・２０ｕｌキュベットの場合、０．５～１×１０＾６細胞／条件を使用することができる。
６）より適切な数の細胞＋追加の１反応分を新しい５０ｍＬコニカルに移す（つまり、１０反応の場合、１１×１０＾６細胞で開始する）。
７）コニカルをＰＢＳで５０ｍＬまで充填し、２００×ｇで１０分間スピンさせる。
８）アスピレーターが液体を収集している間、コニカルをゆっくりとデカントすることにより、ＰＢＳを可能な限り注意深く吸引する。ペレットが緩むので、チューブの底にある角度の付いたリップより下にアスピレーターを動かさないこと。このやり方で１５～２０秒間単に保持するのが最適であることがわかった。
９）調製したＰ３マスターミックスに細胞を再懸濁する。
－１００ｕｌ キュベット：９０ｕＬ Ｐ３緩衝液ミックス／反応
－２０ｕｌ キュベット：１８ｕＬ Ｐ３緩衝液ミックス／反応
１０）滅菌環境において氷上で１００ｕＬのＰＣＲチューブに所望の量のｍＲＮＡ／ＤＮＡを加える
・すべてのｍＲＮＡを使用したノックアウトの場合：
－１００ｕｌ キュベット：５～１５ｕｇ Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、５～２５ｕｇ ｇＲＮＡ
－２０ｕｌ キュベット：１～３ｕｇ Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、１～５ｕｇ ｇＲＮＡ
・プラスミドドナー／ＤＮＡを含める場合：
－１００ｕｌ キュベット：５～１０ｕｇプラスミド
－２０ｕｌ キュベット：１～２ｕｇプラスミド
・核酸の量は、このシステムの細胞数ではなく反応量に基づいて調整するため、大きなキュベットには、２００万または２０００万の細胞を使用するかどうかにかかわらず、小さなキュベットの５倍の最適化された量のｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ／ＤＮＡが含まれている必要がある。
・緩衝液試薬を希釈しないように、このプロトコルには必ず濃縮核酸（１ｕｇ／ｕＬ以上）を使用すること。
１１）ステップ１０で調製した各チューブに細胞を含有するマスターミックスを加える。
１００ｕｌ キュベット：細胞を含む９０ｕＬ Ｐ３緩衝液ミックス／反応
２０ｕｌ キュベット：細胞を含む１８ｕＬ Ｐ３緩衝液ミックス／反応
１２）各チューブを、ピペットを用いて１回混合してすべての試薬を組み込み、反応混合物全体を適切なキュベットに移す。
・キュベットの最大充填量－ＰＣＲチューブに余剰分を残す
－１００ｕｌ キュベット：１２０ｕＬ
－２０ｕｌ キュベット：２４ｕＬ
１３）キャップをつける、たたく、ＺＡＰに組み込む
・キュベットにキャップを付ける
・平らな面を数回軽くたたいて、気泡が除去されていることを確認する
・Ａｍａｘａ Ｘモジュールにかけて、試料をエレクトロポレーションする
－すべてのｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ ｚａｐには、プログラムＥＯ－１１５を使用する
－ＤＮＡを含むすべてのＺＡＰには、プログラムＦＩ－１１５を使用する
１４）ヌクレオフェクション後、細胞をフード内のキュベット中で１０～１５分間静置する。
１５）このインキュベーションの際に、２０ｕｌキュベットを使用する場合は２４ウェルプレートのウェルあたり３００ｕｌ、１００ｕｌ キュベットを使用する場合は６ウェルプレートのウェルあたり１ｍｌを含有する回復プレートを準備する。このために必ず回復培地（抗生物質を含まない培地）を使用すること
＊プラスミドＤＮＡを使用する場合は、回復ウェルに１ｕｇＤＮアーゼを含める＊
１６）１５分後、セットアップしたプレートから８０ｕＬの回復培地を取り出し、キュベットに加えて、回復プレートに移す。
１７）３７Ｃ及び５％ＣＯ２で３０～６０分間インキュベートする。
１８）３０分間のインキュベーション後、抗生物質を含む追加の通常の培地を加え、細胞を１×１０＾６細胞／ｍｌにし、５％ＣＯ２で３７Ｃにて培養する。
・２４ウェルプレート中１×１０＾６細胞の場合は７００ｕＬ
・６ウェルプレート中２～２０×１０＾６細胞の場合は３ｍＬ
１９）細胞を培養し、ウェルの上部から古い培地を注意深く集め、細胞を新しい培地に戻すかまたは必要な場合はより大きなウェル／プレートに移すことによって補充する。

【0681】

Ｔ細胞の追加の「継続的な」刺激
（Ａ）１：２の比率（ビーズ：細胞）を得るために必要なＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズの数を計算し、Ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ Ｍｅｄｉａで洗浄し、ｄｙｎａｍａｇｎｅｔ－２を使用してビーズを収集する。最初のＴ細胞活性化に使用された量の１／４を利用する。
（Ｂ）Ａｍａｘａヌクレオフェクションプロトコルのステップ１８で培地を加える際、細胞に加える前に通常の培養培地にビーズを加える。
（Ｃ）ビーズ／培地混合物を細胞に加え、１回穏やかに混合する。
（Ｄ）通常通り細胞を培養する、ビーズ／細胞の塊を破壊するためにウェルをピペット操作しないこと。

【0682】

フローサイトメトリー
（Ａ）セル計数を使用して、試料ごとに０．５～１×１０＾６細胞を集め、ＦＡＣＳを実行する。
（Ｂ）細胞を、１×ＰＢＳを加えて洗浄し、１０００×ｇで３分間スピンし、上澄みをデカントしてから、各抗体に製造元の推奨に従って染色を加えて調製する。
（Ｃ）混合し、暗所で２０～３０分間インキュベートする。
（Ｄ）３０分間のインキュベーション後、１ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液を加えてクエンチし、再度スピンし、上澄みをデカントする。
（Ｅ）ＦＡＣＳ緩衝液を用いてさらに１回洗浄を繰り返す。
（Ｆ）ペレットを３００ｕｌ ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁して、ＦＡＣＳを実行する。

【0683】

実施例７：フローサイトメトリーによるトランスフェクション効率の検査
エレクトロポレーションされたＴ細胞を、トランスフェクションの約２４～４８時間後にフローサイトメトリーによって分析し、ＧＦＰまたは他の蛍光色素（導入遺伝子発現のマーカー）の発現について試験する。ノックアウト実験では、トランスフェクション後７～９日の間に標的タンパク質の喪失について分析を実施する。ノックイン実験では、７日目及び１４日目にマーカーの発現を測定する。細胞を、０．５％ＦＢＳを含む冷却した１×ＰＢＳで洗浄し、各抗体に製造元の推奨に従って染色を加えて細胞を調製する。

【0684】

実施例８：ＤＮアーゼ処理によるエレクトロポレーション後のＴ細胞生存率の向上
この実施例では、エレクトロポレーション後のＴ細胞の生存に対するＤＮアーゼの影響を調査した。図１４の代表的な写真に示すように、プラスミドドナーベクターを用いたエレクトロポレーションの１４、２４時間後、ＤＮアーゼで処理されなかった活性化Ｔ細胞培養物は細胞凝集及び培地上に浮遊する死細胞を示したが、ＤＮアーゼで処理されたＴ細胞培養物は、細胞凝集または浮遊する細胞の死骸を示さなかった。

【0685】

実施例９：ＤＮアーゼ処理によるＴ細胞の生存率及びトランスフェクション効率の向上
この実施例では、エレクトロポレーション後のＴ細胞の生存ならびにトランスフェクション効率に対するＤＮアーゼの影響を調査した。初代ヒトＴ細胞を培養し、ＩＬ－２、ＩＬ－７、及びＩＬ－１５で刺激した。その後、Ｔ細胞を、刺激から３６時間または４８時間後にパルス（対照）または１．５μｇのｐＭＮＤ－ＧＦＰプラスミド（約７．５ｋｂ）でトランスフェクトした。比較のために、ＤＮアーゼを、トランスフェクトした１群の細胞の回復培地に１０μｇ／ｍｌで加えた。エレクトロポレーション後、細胞をこの回復培地で３０分間インキュベートした。そして、回復後、洗浄ステップなしで２倍量の完全培地を加えた（したがって、希釈されたＤＮアーゼが培地に残っていた）。

【0686】

図１５Ａに示されるように、細胞を、エレクトロポレーションの２４時間後にフローサイトメトリーによって分析して、回復した生細胞のパーセンテージを決定した。図１５Ｂは、各群におけるトランスフェクトされた細胞の回復率を示すグラフである。ＤＮアーゼは、刺激後３６時間で細胞にｐＭＮＤ－ＧＦＰプラスミドをトランスフェクトした「３６時間ｐＭＮＤ－ＧＦＰ」群と、刺激後４８時間で細胞にｐＭＮＤ－ＧＦＰをトランスフェクトした「４８時間ｐＭＮＤ－ＧＦＰ」群の両方で回復率が増加した。

【0687】

トランスフェクション効率はまた、プラスミドによって導入された導入遺伝子の安定な発現を調査することによっても評価した。図１５Ｃは、細胞の各群におけるＧＦＰ発現細胞のパーセンテージを示すグラフであり、図１５Ｄは、細胞の各群におけるｍＴＣＲ発現細胞のパーセンテージを示すグラフである。これらの実験では、０日目または１日目にＧＦＰまたはｍＴＣＲを発現するプラスミドドナーを用いたエレクトロポレーションにより初代Ｔ細胞をトランスフェクトし、エレクトロポレーション後１４日目に導入遺伝子の発現を調べるためにＦＡＣを実行した。図１５Ｃ及び図１５Ｄに示されるように、ＤＮアーゼ処理により、試験したしたすべての条件下でＧＦＰとｍＴＣＲの両方の組み込み効率が向上した。

【0688】

実施例１０．ＤＮアーゼ及びＲＳ－１処理によるＴ細胞のトランスフェクション効率の向上
この実施例では、エレクトロポレーションしたＴ細胞をＤＮアーゼ、ＲＳ－１、またはＤＮアーゼとＲＳ－１の両方で処理した場合のトランスフェクション効率への影響を調査した。初代Ｔ細胞を、０日目または１日目にＧＦＰまたはｍＴＣＲを発現するプラスミドドナーを用いたエレクトロポレーションによりトランスフェクトし、エレクトロポレーション後１４日目に導入遺伝子の発現を調査するためにＦＡＣを実行した。

【0689】

図１６Ａ及び図１６Ｂは、それぞれ、ＧＦＰ＋及びｍＴＣＲ＋細胞のパーセンテージを示す。図に示すように、１日目にＴ細胞をトランスフェクトした場合、ＤＮアーゼとＲＳ－１とを組み合わせて処理すると、ＧＦＰ発現とｍＴＣＲ発現の両方が促進された。

【0690】

図１７Ａ～１７Ｄは、エレクトロポレーション後７日目のＴ細胞のＦＡＣ密度プロットである。図１７Ａは、パルス（対照）、Ｃａｓ９及びｇＲＮＡ、ドナー（ＧＦＰ）、ドナー及びＤＮアーゼ、またはドナー、ＤＮアーゼ、及びＲＳ－１による刺激後０日目にエレクトロポレーションされたＴ細胞の７日目のＧＦＰ発現パーセントを示す。図１７Ｂは、パルス（対照）、Ｃａｓ９及びｇＲＮＡ、ドナー（ＧＦＰ）、ドナー及びＤＮアーゼ、またはドナー、ＤＮアーゼ、及びＲＳ－１による刺激後０日目にエレクトロポレーションされたＴ細胞の７日目のｍＴＣＲ発現パーセントを示す。図１７Ｃは、パルス（対照）、Ｃａｓ９及びｇＲＮＡ、ドナー（ＧＦＰ）、ドナー及びＤＮアーゼ、またはドナー、ＤＮアーゼ、及びＲＳ－１による刺激後１日目にエレクトロポレーションされたＴ細胞の７日目のＧＦＰ発現を示す。図１７Ｄは、パルス（対照）、Ｃａｓ９及びｇＲＮＡ、ドナー（ＧＦＰ）、ドナー及びＤＮアーゼ、またはドナー、ＤＮアーゼ、及びＲＳ－１による刺激後１日目にエレクトロポレーションされたＴ細胞の７日目のｍＴＣＲ発現を示す。各プロットの数値は、ＧＦＰまたはｍＴＣＲシグナルが陽性の細胞のパーセンテージを示す。

【0691】

図１８Ａ～１８Ｂは、エレクトロポレーション後１４日目のＴ細胞のＦＡＣ密度プロットである。図１８Ａは、パルス（対照）、Ｃａｓ９及びｇＲＮＡ、ドナー（ＧＦＰまたはｍＴＣＲ）、ドナー及びＤＮアーゼ、またはドナー、ＤＮアーゼ、及びＲＳ－１による刺激後０日目にエレクトロポレーションされたＴ細胞の１４日目のＧＦＰ及びｍＴＣＲ発現を示す。図５Ｂは、パルス（対照）、Ｃａｓ９及びｇＲＮＡ、ドナー（ＧＦＰまたはｍＴＣＲ）、ドナー及びＤＮアーゼ、またはドナー、ＤＮアーゼ、及びＲＳ－１による刺激後１日目にエレクトロポレーションされたＴ細胞の１４日目のＧＦＰ及びｍＴＣＲ発現を示す。

【0692】

図１９は、刺激の３６時間後または刺激の３６時間後及び最初のエレクトロポレーションの６時間後の、ｍＴＣＲについて、ＲＳ－１、またはＤＮアーゼを用いてまたは用いないでエレクトロポレーションされたドナー０５５３３０のエレクトロポレーション効率のＦＡＣ分析を示す。

【0693】

図２０は、刺激の３６時間後または刺激の３６時間後及び最初のエレクトロポレーションの６時間後の、ｍＴＣＲについて、ＲＳ－１、またはＤＮアーゼを用いてまたは用いないでエレクトロポレーションされたドナー１１９８６６からのＴ細胞のエレクトロポレーション効率のＦＡＣ分析を示す。

【0694】

図２１は、刺激の３６時間後または刺激の３６時間後及び最初のエレクトロポレーションの６時間後の、ｍＴＣＲについて、ＲＳ－１、またはＤＮアーゼを用いてまたは用いないでエレクトロポレーションされたドナー１２０５３４からのＴ細胞のエレクトロポレーション効率のＦＡＣ分析を示す。

【0695】

図２２Ａは、刺激の３６時間後及び最初のエレクトロポレーションの２４時間後の、ｍＴＣＲについて、ＲＳ－１、またはＤＮアーゼを用いてまたは用いないで０５５３３０及び１１９６６６からのＴ細胞のエレクトロポレーション効率のＦＡＣ分析を示す。図２２Ｂは、刺激の３６時間後及び最初のエレクトロポレーションの２４時間後の、ＲＳ－１、またはＤＮアーゼ及びｍＴＣＲを用いてまたは用いないでエレクトロポレーションされたドナー１２０５３４のエレクトロポレーション効率のＦＡＣ分析を示す。

【0696】

実施例１１．Ｔ細胞の生存率及びトランスフェクション効率に対するＮＡＣ、Ａｋｔ阻害剤、及び抗ＩＦＮＡＲ２の効果
この実施例では、ＮＡＣ、Ａｋｔ ＶＩＩＩ阻害剤、または抗ＩＦＮＡＲ２による処理が、エレクトロポレーション後のＴ細胞の生存ならびにトランスフェクション効率に及ぼす影響を調査した。これらの実験では、刺激後３６時間で、１００μｌ中の２×１０^６細胞を非連続的にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、細胞を１５分間回復させ、表５に列挙するように、５つの異なるサプリメント条件間で均等に分割した。ＮＡＣを１０ｍＭで持続的に培地に加え、ＡｋｔＶＩＩＩ阻害剤を８μＭで持続的に加え、抗ＩＦＮＡＲ２抗体を１０μｇ／ｍｌで１回培地に加えた。表２及び図２２Ａ～２２Ｄの「Ｎｕｃ」は、は、外因性ＤＮＡが２０μｇ（”＋２０μｇ）、３５μｇ（”＋３５μｇ）、または５０μｇ（”＋５０μｇ”）で細胞ゲノムに挿入されるように加えられた条件を示す。

【表5】

【0697】

図２３Ａ～図２３Ｃは、エレクトロポレーション後２、５、及び７日目の各条件での生存細胞計数のグラフをそれぞれ示している。図２３Ｄ～図２３Ｆは、エレクトロポレーション後２、５、及び７日目の各条件での生存細胞のパーセンテージのグラフをそれぞれ示している。図２３Ｂ及び図２３Ｃに示すように、実験条件下で、ＮＡＣ処理及びＩＦＮＡＲ２抗体処理により、エレクトロポレーション後７日目の細胞生存率が向上した。図２４は、エレクトロポレーション後７日目のｍＴＣＲ陽性細胞のパーセンテージのグラフを示す。外因性ＤＮＡを３０μｇ及び５０μｇで加えた場合、ＩＦＮＡＲ２抗体で処理すると、ｍＴＣＲ発現細胞のパーセンテージが増加し、このことは、組み込み効率の向上を示唆している。

【0698】

実施例１２．ドナー導入遺伝子発現におけるＤＮＡ修復タンパク質の評価
例示的なＤＮＡ修復タンパク質、例えば、ＳＳＡまたはＨＲなどの修復機序に関係するものを、ＨＣＴ１１６細胞株においてノックアウトした。改変細胞をインビトロアッセイで利用して、トランスフェクションを受けた細胞において、修復タンパク質が細胞受容体などのドナーの発現に影響を与えるかどうかを決定した。ＲＡＤ５２、Ｅｘｏ１、ＰｏｌＱ、ＢＲＤ３、Ｌｉｇ３、ＲＡＤ５４Ｂ、またはなし（ＷＴ）でノックアウトした細胞に、ＡＡＶＳ１スプライシングアクセプター（ＳＡ）－ＧＦＰドナーをエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後１０日目に測定されたフローサイトメトリーの結果を、図２６Ａに示し、図２６Ｂ及び図２６Ｃにチャート化している。
実施例１３． 導入遺伝子ドナーの送達のタイミング及びノックイン効率
エレクトロポレーションのタイミング

【0699】

導入遺伝子ドナーの細胞への送達タイミングが導入遺伝子発現に何らかの役割を果たすかどうかを決定するために、細胞に、ＡＡＶＳ１に特異的な相同性アーム（ヒトＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ遺伝子のイントロン１内のアデノ随伴ウイルス統合部位（ＡＡＶＳ１）からの左相同性アーム）を含む１ｕｇの例示的なスプライスアクセプターＧＦＰドナー（ＨＲまたはＳＳＡドナー）またはミニサークルベクター（抗メソテリンＣＡＲ ＳＳＡドナー）導入遺伝子を介して送達された１ｕｇの例示的なキメラ抗原受容体を、刺激から２４時間、３６時間、４８時間、及び７２時間後の時点でトランスフェクトした。エレクトロポレーションの７日後にＧＦＰまたはＣＡＲの発現について細胞を評価した。図２８Ａは、対照細胞対ＨＲドナーを送達された細胞のＳ期における完全なＴ細胞を示している。図２８Ｂは、エレクトロポレーション後７日目のＧＦＰパーセントを示し、図２８Ｃは、エレクトロポレーション後７日目のＣＤ３４（ＣＡＲ）パーセントを示す。

【0700】

報告の目的で、強化されたＧＦＰを利用した。哺乳動物のコドン最適化配列は、ＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＰＩＬＶＥＬＤＧＤＶＮＧＨＫＦＳＶＳＧＥＧＥＧＤＡＴＹＧＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＧＫＬＰＶＰＷＰＴＬＶＴＴＬＴＹＧＶＱＣＦＳＲＹＰＤＨＭＫＱＨＤＦＦＫＳＡＭＰＥＧＹＶＱＥＲＴＩＦＦＫＤＤＧＮＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＤＴＬＶＮＲＩＥＬＫＧＩＤＦＫＥＤＧＮＩＬＧＨＫＬＥＹＮＹＮＳＨＮＶＹＩＭＡＤＫＱＫＮＧＩＫＶＮＦＫＩＲＨＮＩＥＤＧＳＶＱＬＡＤＨＹＱＱＮＴＰＩＧＤＧＰＶＬＬＰＤＮＨＹＬＳＴＱＳＡＬＳＫＤＰＮＥＫＲＤＨＭＶＬＬＥＦＶＴＡＡＧＩＴＬＧＭＤＥＬＹＫ（配列番号８７）を含む。

【表6-1】

【表6-2】

【表6-3】

【表6-4】

【表6-5】

【表6-6】

【表6-7】

【0701】

ＤＮＡセンサー発現及びエレクトロポレーションタイミングの交差
ＤＮＡセンサー（ＲＩＧ－１、ＳＴＩＮＧ、ＩＦＩ１６、及びＡＩＭ２）の発現のタイミングを評価するために、Ｔ細胞を、１：２．５（ビーズ：細胞）の比率で抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８ビーズで刺激した。刺激された細胞に、ＳＡ－ＧＦＰプラスミドのみ（プラスミド対照）を、またはＳＡ－ドナーをＣａｓ９及びＡＡＶＳ１ ｇＲＮＡ（ＨＲ）の組み合わせで、刺激後１２時間、２４時間、３０時間、３６時間、４８時間、及び７２時間目にエレクトロポレーションした。ＤＮＡセンサーの発現を、エレクトロポレーション後に評価した、図２９Ａ。細胞周期の期の決定もまた、同じ時点で決定し、チャート化した、図２９Ｂ。ＧＦＰ発現パーセントを、エレクトロポレーション後に定量化した。図２９Ｃ。

【0702】

実施例１４．組み込み機序は挿入カーゴの発現に影響を与える
Ｔ細胞を、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８でコーティングされたビーズを使用して３６時間刺激し、抗ＫＲＡＳ ＴＣＲのみを有する１μｇのドナープラスミド（対照）、または１．５ｕｇのＣａｓ９ｍＲＮＡ及び１ｕｇのＡＡＶＳ１ ｇＲＮＡ（ＨＲ）と組み合わせた抗ＫＲＡＳ ＴＣＲを有するドナープラスミド、または ＨＭＥＪの場合、抗ＫＲＡＳ ＴＣＲ、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、抗ＡＡＶＳ１ ｇＲＮＡ、及びユニバーサルｇＲＮＡを含有するプラスミドでエレクトロポレーションした。ＨＲカーゴとＨＭＥＪカーゴはどちらも、ＡＡＶＳ１に組み込まれたＳＡ－ＧＦＰコンストラクトである。ＨＲとＨＭＥＪの両方のカーゴは、１ｋｂの相同性（ＨＲの場合）と４８ｂｐの相同性（ＨＭＥＪ）を有するＭＮＤ－ＫＲＡＳ ＴＣＲである。エレクトロポレーションの７日後、ＧＦＰのパーセントを分析した、図３０Ａ（１Ｋｂ）及び図３０Ｂ （２．６ｋｂ）。結果は、少なくともより大きなカーゴの場合、ＨＭＥＪコンストラクトが好ましい送達機序であることを示している。

【0703】

実施例１５．ＨＲ及びＨＭＥＪによる組み込みに対する相同性アーム長さの影響
「ユニバーサル」ｇＲＮＡ切断部位に隣接するさまざまな相同性アーム長（４８、１００、２５０、５００、７５０、及び１０００塩基）のドナー導入遺伝子が生成され、刺激後にＣａｓ９及びＡＡＶＳ１ ｇＲＮＡとともにこれらを使用して、細胞をトランスフェクトした。図３３は、ノックイン後のＣＤ４とＣＤ８細胞の両方におけるＧＦＰの発現を示している。プラスミドのみ（ＣＲＩＳＰＲ試薬を含まないドナー導入遺伝子－エピソーム発現対照）。データは、相同性アームの長さが増加するにつれて、ドナー挿入物の発現が増加したことを示している。

【0704】

第２の実験では、Ｔ細胞を刺激し、その後、１ｕｇドナーのみ（対照）、ＳＡ－ｅＧＦＰ－ｐＡ（ＨＲ）、またはＳＡ－ｅＧＦＰ－ｐＡ（ＨＭＥＪ）コンストラクトでエレクトロポレーションし、それぞれが独立して、長さ４８、１００、２５０、５００、７５０、及び１００塩基対の相同性アームを含んでいた。細胞は２回目の刺激を受け、７日目にフローサイトメトリーを介してノックインのパーセントについて評価された、図３４Ａ。同じデータが図３４Ｂで表にされている。結果は、ＨＭＥＪコンストラクトが同等のＨＲドナーと比較して、特に４８及び１００塩基対のより短い相同性アーム長でより高いノックイン効率を有することを示している。

【0705】

実施例１６．追加の刺激
プロトコル２に記載されているような追加の刺激を実行することの利点を評価するために、Ｔ細胞を活性化し、刺激し、ＡＡＶＳ１を標的とする相同性アーム（ＨＲ）またはＨＭＥＪドナー（ＳＳＡと表記）を含むＳＡ－ｅＧＦＰ－ｐＡ（ＨＲ）またはＳＡ－ｅＧＦＰ－ｐＡ（ＨＭＥＪ）ドナーを含むコンストラクトで、本明細書で以前に記載されたエレクトロポレーション法によりエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの約３０分後、細胞を追加の刺激に曝露した。ＧＦＰを、エレクトロポレーション後７日目に測定した。追加の刺激は、エレクトロポレーション後の細胞における細胞増殖の欠陥を克服するのを助ける、例えば、図２５Ａ及び図２５Ｂを参照されたい。さらに、結果は、追加の刺激により、ＳＡ－ＥＧＦＰ－ｐＡ（ＨＭＥＪ）改変Ｔ細胞の倍数増殖が増加することを示している、図３５Ａ及び図３５Ｂを参照されたい。

【0706】

図３６に概説されるように、追加の刺激を臨床ワークフローに導入することができる。例えば、追加の刺激は、ステップ（２）の後及び／またはステップ（３）の後に実行することができる。

【0707】

実施例１７．ＴＣＲ改変Ｔ細胞を使用したがん患者の治療
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、ＴＣＲ遺伝子をがん患者の自家初代Ｔ細胞に導入するように設計することができる。ＴＣＲ遺伝子は、患者において同定されたがん細胞によって発現される標的抗原に対して高い親和性を有するように設計することができる。ＴＣＲ遺伝子は、強力なプロモーターによって駆動され、初代Ｔ細胞によって発現される内因性ＴＣＲ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）Ｕ３、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、β－アクチン、ユビキチン、及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）／ＣＤ４３複合プロモーターと競合する可能性がある。患者にはＴＣＲ改変Ｔ細胞が投与される。

【0708】

自家ＣＤ３＋Ｔ細胞は、実施例６に記載されているプロトコルに従って、患者の末梢血から得られる。単離されたＴ細胞は、ＧＭＰガイダンスに従って標準的な条件下で培養される。

【0709】

エレクトロポレーションの少なくとも３０分前に、ＣＤ３＋Ｔ細胞を抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８コーティングビーズを使用して刺激する。ビーズは、細胞あたり２ビーズ、または２．５細胞あたり１ビーズの比率でプレーティングすることができる。エレクトロポレーションを、２つのステップで実行する：最初に、ＣＤ３＋Ｔ細胞をＣａｓ９ ｍＲＮＡの存在下でエレクトロポレーションする；６～２４時間後、細胞を、ＴＣＲ遺伝子含有ミニサークルコンストラクト及びｇＲＮＡを用いたエレクトロポレーションにかける。ｇＲＮＡは、ＡＡＶＳ１部位のようなヒトゲノムのセーフハーバー部位を標的にするように設計される。ＴＣＲ遺伝子の安定な発現を、トランスフェクションの２週間後に次世代シーケンシングによって検証する。エレクトロポレーションしたＴ細胞の細胞生存率、トランスフェクション効率、及び導入遺伝子量を評価する。安全上の懸念を最小限に抑えるために、ある特定の措置も講じる。

【0710】

検証後、ＴＣＲ改変Ｔ細胞をがん患者に注入する。注入されたＴＣＲ改変Ｔ細胞は、患者の末梢血流中のＴＣＲ改変Ｔ細胞の数、移植されたＴＣＲ遺伝子の発現レベルなど、臨床的に所望のレベルまでインビトロにて増殖すると予想される。注入レジメンはまた、臨床評価、例えば、がんの病期、患者の治療歴、ＣＢＣ（全血球計数）、及び治療日の患者のバイタルサインに基づいて決定する。注入量は、疾患の進行、患者の反発反応、及び他の多くの医学的要因に応じて、段階的に増加または減少する場合がある。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図15D】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26A-1】

【図26A-2】

【図26A-3】

【図26B】

【図26C】

【図27】

【図28】

【図29A】

【図29B】

【図29C】

【図30】

【図31A】

【図31B】

【図31C】

【図32A】

【図32B】

【図32C】

【図33】

【図34】

【図35A】

【図35B】

【図36】

【配列表】

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【国際調査報告】