▶ ブラッコ・イメージング・ソシエタ・ペル・アチオニの特許一覧
特表2022-548365ＣＡ－ＩＸアプタマー並びにその診断的および治療的使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-11-18
(54)【発明の名称】ＣＡ－ＩＸアプタマー並びにその診断的および治療的使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/115 20100101AFI20221111BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20221111BHJP
A61K 47/54 20170101ALI20221111BHJP
A61K 49/00 20060101ALI20221111BHJP
A61K 49/06 20060101ALI20221111BHJP
A61K 49/04 20060101ALI20221111BHJP
A61K 49/10 20060101ALI20221111BHJP
A61K 49/22 20060101ALI20221111BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20221111BHJP
A61B 10/00 20060101ALI20221111BHJP
G01T 1/161 20060101ALI20221111BHJP
A61B 5/055 20060101ALI20221111BHJP
A61B 6/03 20060101ALI20221111BHJP
【ＦＩ】
C12N15/115 Z ZNA
A61K45/00
A61K47/54
A61K49/00
A61K49/06
A61K49/04
A61K49/10
A61K49/22
A61P35/00
A61B10/00 E
A61B10/00 T
G01T1/161 A
G01T1/161 B
A61B5/055 383
A61B6/03 375
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022516737
(86)(22)【出願日】2020-09-16
(85)【翻訳文提出日】2022-05-13
(86)【国際出願番号】 EP2020075806
(87)【国際公開番号】W WO2021052982
(87)【国際公開日】2021-03-25
(31)【優先権主張番号】19197506.9
(32)【優先日】2019-09-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】504448162
【氏名又は名称】ブラッコ・イメージング・ソシエタ・ペル・アチオニ
【氏名又は名称原語表記】ＢＲＡＣＣＯ ＩＭＡＧＩＮＧ Ｓ．Ｐ．Ａ．
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100156144
【弁理士】
【氏名又は名称】落合 康
(72)【発明者】
【氏名】デ フランチシス，ヴィットリオ
(72)【発明者】
【氏名】エスポージト，カルラ ルチア
(72)【発明者】
【氏名】カトゥオーニョ，シルヴィア
(72)【発明者】
【氏名】ヌッツォ，シルヴィア
(72)【発明者】
【氏名】マイオッキ，アレッサンドロ
(72)【発明者】
【氏名】イアボーニ，マルゲリータ
(72)【発明者】
【氏名】ディ ヴィート，アルド
(72)【発明者】
【氏名】レイターノ，エリカ
(72)【発明者】
【氏名】ポッジ，ルイーザ
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C085
4C093
4C096
4C188
【Ｆターム（参考）】
4C076AA95
4C076CC27
4C076CC41
4C076EE59
4C084AA17
4C084NA13
4C084NA14
4C084ZB26
4C085HH03
4C085HH05
4C085HH07
4C085HH09
4C085HH11
4C085KA27
4C085KA28
4C085KA29
4C085KB91
4C085LL18
4C093AA22
4C093AA24
4C093EE20
4C093FF21
4C096AA11
4C096AD14
4C096DC22
4C096FC14
4C188EE02
4C188FF04
4C188FF07
4C188KK31
(57)【要約】
本発明は、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡ－ＩＸ）に結合する核酸アプタマー、その誘導体およびコンジュゲート、ならびに特にＣＡ－ＩＸを発現する器官および組織のイメージングのための診断ツールとして、またはＣＡ－ＩＸに関連する疾患の予防または処置のための治療剤としてのそれらの使用を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１および配列番号２から選択される配列を含む、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡ－ＩＸ）に特異的に結合するＲＮＡアプタマー。
【請求項2】
最大で１００ヌクレオチドの長さを有することを特徴とする、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項3】
配列番号１からなる、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項4】
配列番号２からなる、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項5】
すべてのピリミジン残基が２’－フルオロピリミジンに修飾されている、請求項１～４のいずれか一項に記載のアプタマー。
【請求項6】
核酸の糖、リン酸および塩基から選択される位置での化学置換である少なくとも１つの化学修飾を含むようにさらに修飾されている、請求項５に記載のアプタマー。
【請求項7】
前記修飾が、修飾ヌクレオチドの組み込み、化合物とのコンジュゲーションおよびレポーター部分による標識からなる群から選択される、請求項６に記載のアプタマー。
【請求項8】
レポーター部分が、フルオロフォア部分、磁性または常磁性部分、放射性標識部分、親和性標識、Ｘ線部分、超音波イメージング部分、光音響イメージング部分およびナノ粒子ベースの部分からなる群から選択される、請求項７に記載のアプタマー。
【請求項9】
親和性標識がビオチンである、請求項８に記載のアプタマー。
【請求項10】
ＣＡ－ＩＸの発現と相関する癌疾患の診断、治療または視覚化に使用するための、請求項１～９のいずれかに記載のアプタマー。
【請求項11】
前記癌疾患が、腎臓癌、子宮頸癌、結腸癌、前立腺癌、乳癌および頭頸部癌から選択される、請求項１０に記載のアプタマー。
【請求項12】
前記診断または視覚化が、ＣＡ－ＩＸを発現する体組織または器官のイメージングを含んでなる、請求項１０に記載のアプタマー。
【請求項13】
請求項１～１２のいずれかに定義されるアプタマーと、薬学的に許容される担体および賦形剤とを含んでなる、診断、治療またはイメージング用組成物。
【請求項14】
ＣＡ－ＩＸを発現する器官および組織のイメージングに適した、請求項１３に記載の組成物。
【請求項15】
前記イメージングが、磁気共鳴イメージング、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、超音波、光音響イメージング（ＰＡＩ）、近赤外蛍光（ＮＩＲＦ）、または単一光子放射型コンピューター断層撮影（ＳＰＥＣＴ）に基づくものである、請求項１４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡ－ＩＸ）に結合する核酸アプタマー、その誘導体およびコンジュゲート、ならびに診断ツール（特にＣＡ－ＩＸを発現する器官および組織のイメージングのための）としての、またはＣＡ－ＩＸ関連疾患の予防または処置のための治療薬としての、その使用を提供する。
【背景技術】
【0002】
アプタマー
最近、アプタマーと呼ばれる機能的なオリゴヌクレオチドベースの生体分子が、抗体の潜在的な代替物として大きな関心を集めている。アプタマー選択の技術は、病気の診断と治療に適用できるため、科学界の注目を集めている。
最近、アプタマーと呼ばれる機能的なオリゴヌクレオチドベースの生体分子が、抗体の潜在的な代替物として大きな関心を集めている。アプタマー選択の技術は、病気の診断と治療に適用できるため、科学界の注目を集めている。
【0003】
オリゴヌクレオチドアプタマーのサイズは約２０～約８０塩基（８～２５ｋＤａ）であり、それらの構造は分子内相互作用に関与している（Levy-Nissenbaum E. et al., Trends Biotechnol. 2008, 26（8）, 442-449）。アプタマーは、芳香族化合物間の相互作用、水素ライゲーションによる塩基対形成、ファンデルワールス相互作用、および荷電基または水素結合間の静電相互作用によって標的に結合する。結果として、アプタマーは、標的認識と生体分子の相互作用の後にコンフォメーション変化を受ける。
【0004】
これらの生物学的、物理的および化学的特性により、これらのオリゴヌクレオチドは診断および治療のための効果的な認識ツールとなる。生物学分野でのアプタマーの適用は主に、リボザイムによる分解のために制限されている。ヌクレアーゼからそれらを保護し、それらの熱安定性およびそれらの薬物動態学的特性を改善するために、化学修飾が必要である。
【0005】
修飾として、リボースの２’位のＯＨを２’－Ｆまたは２’－ＮＨ２基に交換して、細胞環境でのアプタマーの安定性を向上させることができる。アプタマーの他の変更としては、アミン、リン酸基、またはチミジンや他の非天然塩基の残基などの小分子による末端のキャッピングが挙げられる（Gao S. et al、Anal. Bioanal. Chem. 2016, 408（17）, 4567-4573）。
【0006】
アプタマーは、ＳＥＬＥＸ（Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment）法による試験管内の方法によって選択される。この方法は、Tuerk and Gold（Science, 1990, 249, 505-510）およびEllington and Szostak（Nature, 1990, 346, 818-822）により同時に記述された。ＳＥＬＥＸ法は、結合サイクル、溶出、およびランダムな核酸ライブラリーからのリガンドの増幅の繰り返しによってアプタマーを漸進的に選択し、選択された標的に対してより高い結合親和性を有する配列を選択するというものである。
【0007】
「cell-SELEX」と呼ばれるこの技術の新しい応用法が開発され、特定の標的細胞に結合するアプタマーを選択できるようになった（de Franciscis V. et al., Methods Mol Biol., 2016, 1380, 33-46）。選択パラメーターは、様々な条件（例えば、ｐＨ、温度、バッファー組成など）に対しより効率的なアプタマーを取得するために簡単に操作できる（Radom F. et al, Biotechnol. Adv. 2013, 31(8), 1260-1274）。従来のＳＥＬＥＸメソッドには、アフィニティークロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、ろ過膜など、アフィニティーと特異性を最大化し特定のアプタマーの選択速度と成功率を上げるためのいくつかの修正が含まれている（Stoltenburg R et al, Biomol. Eng. 2007, 24(4), 381-403）。選択されたオリゴヌクレオチドの特性は、さまざまな物理的、化学的、生物学的アッセイを使用して識別される（Song KM et al, Sensors, 2012, 12(1), 612-631）。一旦選択すれば、化学反応により高精度かつ再現性のある大量合成が可能である。これらの化学的方法は、抗体の生産よりも費用効果が高い。
【0008】
抗体と比較した場合、アプタマーのサイズは比較的小さいため、化学合成と可能な修飾が容易になる。それらは生体適合性があり、in vivoでの免疫原性が低い。それらは高い選択性と特定の標的に結合して認識する能力を持ち、親和定数（Ｋｄ）はナノモル濃度のレベルであり、一般にミリ／マイクロモル濃度のＫｄを有する抗体よりも低い。また、分子量が非常に小さいため、組織にすばやく効率的に浸透し、抗体では区別できないタンパク質の細胞外ドメインまたは細胞内ドメインを区別できる（Gopinath S.C. et al, J. Gen. Virol., 2006, 87(3), 479-487）。
【0009】
アプタマーの高い標的親和性／選択性、費用対効果、化学的多様性および安全性は、従来のペプチドまたはタンパク質ベースのリガンドよりも優れているため、分子イメージングに特に適している。実際、アプタマーは、長期の安定性のための化学修飾やさまざまな部分へのバイオコンジュゲーションに対する修正が可能であり、したがって、特定の造影剤（例えば、光学、磁気共鳴、核、コンピューター断層撮影、超音波およびマルチモダリティイメージング）として、ならびに治療剤として非常に有用であると考えられている。
【0010】
ＣＡ－ＩＸ
炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡ－ＩＸ）は、細胞の表面に存在する亜鉛金属酵素である。これは、二酸化炭素からプロトンと重炭酸イオン（bicarbonate）への可逆的変換を触媒してｐＨの低下をもたらす酵素の、炭酸脱水酵素（ＣＡ）の大きなファミリーのメンバーである。
炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡ－ＩＸ）は、細胞の表面に存在する亜鉛金属酵素である。これは、二酸化炭素からプロトンと重炭酸イオン（bicarbonate）への可逆的変換を触媒してｐＨの低下をもたらす酵素の、炭酸脱水酵素（ＣＡ）の大きなファミリーのメンバーである。
【0011】
これまで、１６個のＣＡアイソフォームが哺乳動物で特徴づけられており、それらは、細胞内局在、触媒活性、種々の阻害剤に対する感受性、および組織特異的分布において異なる。このうち、ＣＡ－ＩＸは、その遺伝子発現が、低酸素細胞の酸性環境の維持に関与していると考えられている、低酸素誘導因子１（ＨＩＦ－１）と呼ばれる、低酸素のマスターレギュレーターによって促進されるので、腫瘍の低酸素応答のマーカーである（Wykoff et al., Cancer Res. 2000, 60, 7075-7083）。主に灌流不良と貧血に起因する腫瘍低酸素状態は、いくつかの種類の癌において急速な進行と予後不良につながる攻撃的で治療抵抗性の表現型を持つ細胞クローンの発生を誘発する重要な因子の１つである。事実、癌細胞は、それらの遺伝子発現（特にｐＨ制御に関与する遺伝子の）が変化する厳しい環境で生き残る。
【0012】
ＣＡ－ＩＸは、その触媒活性が、癌細胞の増殖と浸潤を増大させる酸性微小環境を生じる細胞外ｐＨ（ｐＨｅ）の低下に寄与するため、多くの腫瘍（腎臓がん、子宮頸がん、結腸がん、前立腺がん、乳がん、頭頸部がんなど）の増殖および転移において重要な役割を果たしている。
【0013】
多くの研究によって、ＣＡ－ＩＸは、他のＣＡと異なり、正常組織では少数（即ち、腸および胃の粘膜、胆嚢、精巣）でのみ発現し、多くの種類の癌細胞で過剰発現することが示されている。したがって、特定のツールを用いたＣＡ－ＩＸターゲティングによって、悪性腫瘍の従来の治療法と早期診断および予後を改善するための新しい重要な分野が開かれる。
【0014】
ＣＡ－ＩＸターゲティング部分、特に抗ＣＡ－ＩＸアプタマーの選択で直面する主な問題は、活性な状態でＣＡ－ＩＸをどのように特異的にターゲティングするかに関する。
イメージングおよび／または治療用途でこれまでに開発されたＣＡ－ＩＸターゲティング剤のクラスには、モノクローナル抗体（例えば、Ｇ２５０、Ｍ７５など）またはミニ抗体（例えば、Ａ３およびＣＣ７など）および無機イオン、スルホンアミドベースの化合物、フェノールおよびクマリンなどの小さな化合物が含まれる。これらの薬剤のいくつかは現在臨床開発中である。
イメージングおよび／または治療用途でこれまでに開発されたＣＡ－ＩＸターゲティング剤のクラスには、モノクローナル抗体（例えば、Ｇ２５０、Ｍ７５など）またはミニ抗体（例えば、Ａ３およびＣＣ７など）および無機イオン、スルホンアミドベースの化合物、フェノールおよびクマリンなどの小さな化合物が含まれる。これらの薬剤のいくつかは現在臨床開発中である。
【0015】
特に、モノクローナル抗体（ｍａｂ）Ｍ７５およびＧ２５０は、ＣＡ－ＩＸ酵素を標的とするために開発された最初の解決手段である。Ｍａｂ Ｍ７５は標的のＮ末端にあるＣＡ－ＩＸのプロテオグリカン様（ＰＧ様）ドメインに結合するが、ｍａｂ Ｇ２５０はＣＡ－ＩＸの触媒ドメインと相互作用する。放射性核種１２４Ｉで標識されたＧ２５０のキメラバージョン（ｃＧ２５０と称する）は、淡明細胞型腎細胞癌（ｃｃＲＣＣ）の検出のために開発された。
【0016】
通常、モノクローナル抗体はほとんどの腫瘍標的化の用途に最適なリガンドと考えられてきたが、それらが多くの不利な点にさらされていることが明らかになってきている。実際、抗体は、腫瘍への浸透が遅く非効率的で、血液中に長く滞留し、長寿命の放射性同位元素の使用と遅い時点でのイメージングが必要となり、患者は高い放射線負荷にさらされる。実際、１２４Ｉ－ｃＧ２５０は、患者への注射から２～７日経たないとイメージングに適した腫瘍／血液比に達しない。さらに、モノクローナル抗体は免疫原性であり得、日常的な診断手順のために反復投与することを妨げる。
【0017】
これらの問題は、小分子を使用することで回避できる。大きな分子とは異なり、小さな分子は血液循環から急速に除去され、初期の時点でイメージングに適した腫瘍／血液比に達する。これにより、医師は抗体ベースの造影剤よりもはるかに迅速に診断情報を取得できる。
【0018】
ＣＡ－ＩＸを標的とする小さな化合物の中で、最もよく研究され、最も堅牢なクラスの阻害剤はスルホンアミドであり、その高い親和性、アベイラビリティー、および化学的操作の容易さに起因している。しかし、それらのいくつかは有望な薬剤であるにもかかわらず、細胞内ＣＡや他の細胞外ＣＡ（腫瘍だけでなく正常組織でも発現するＣＡ－ＸＩＩなど）との相互作用による標的外毒性についての懸念が残っている。
【0019】
ＷＯ２０１４／１２８２５８は、癌の治療に使用するためのＣＡ－ＩＸ標的化合物（例えば抗体ｃＧ２５０）、およびＣＡ－ＩＸ発現の定量化およびＣＡ－ＩＸスコアの決定を含む癌疾患の診断、予測および／または分類のための方法を記載している。
ＷＯ２０１１／１３９３７５は、ＣＡ－ＩＸに結合し、低酸素状態および／またはＣＡ－ＩＸ活性の上昇に関連する癌疾患の診断および治療に有用な、新規な抗体およびその断片を開示している。
ＣＮ１０７６４８６２０およびZhu L. et al, Int. J. Nanomedicine, 2018, 13, 6481-6495は、ナノ粒子の脂質単層の外殻に固定化されたＣＡ－ＩＸアプタマーを運ぶ標的化超音波ナノバブルを開示しており；このような化合物は腫瘍血管系に浸透し、腫瘍実質細胞の超音波分子イメージングに使用できる。
ＷＯ２０１２／０２７４９３は、ＣＡ－ＩＸ、ＣＡ－ＸＩＩなどから選択される標的に特異的に結合する１つまたは複数の標的化イメージングプローブを対象に投与することによって、インビボで癌細胞を検出するための非侵襲的方法を記載している。可能な標的化プローブとしてアプタマーが言及されているが、特定の単離されたオリゴヌクレオチドの例は報告されていない。
ＷＯ２０１１／１３９３７５は、ＣＡ－ＩＸに結合し、低酸素状態および／またはＣＡ－ＩＸ活性の上昇に関連する癌疾患の診断および治療に有用な、新規な抗体およびその断片を開示している。
ＣＮ１０７６４８６２０およびZhu L. et al, Int. J. Nanomedicine, 2018, 13, 6481-6495は、ナノ粒子の脂質単層の外殻に固定化されたＣＡ－ＩＸアプタマーを運ぶ標的化超音波ナノバブルを開示しており；このような化合物は腫瘍血管系に浸透し、腫瘍実質細胞の超音波分子イメージングに使用できる。
ＷＯ２０１２／０２７４９３は、ＣＡ－ＩＸ、ＣＡ－ＸＩＩなどから選択される標的に特異的に結合する１つまたは複数の標的化イメージングプローブを対象に投与することによって、インビボで癌細胞を検出するための非侵襲的方法を記載している。可能な標的化プローブとしてアプタマーが言及されているが、特定の単離されたオリゴヌクレオチドの例は報告されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0020】
これらの努力にもかかわらず、診断および／または治療に使用される、標的に対する高いそして特異的な親和性によって特徴付けられるＣＡ－ＩＸ結合剤を開発する必要が依然としてある。
【課題を解決するための手段】
【0021】
本発明は、高い親和性で炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡ－ＩＸ）酵素を特異的に標的化するＲＮＡアプタマー配列の同定に基づく。
低酸素状態のマーカーとして多くの種類の癌におけるＣＡ－ＩＸのアップレギュレーションを考慮すると、本発明の抗ＣＡ－ＩＸアプタマーは、より効果的な治療的処置の観点から、迅速な癌の診断とステージングに有用であり、播種性転移性疾患の全身や標的化した治療に対する応答の検出および追跡に有用である。
低酸素状態のマーカーとして多くの種類の癌におけるＣＡ－ＩＸのアップレギュレーションを考慮すると、本発明の抗ＣＡ－ＩＸアプタマーは、より効果的な治療的処置の観点から、迅速な癌の診断とステージングに有用であり、播種性転移性疾患の全身や標的化した治療に対する応答の検出および追跡に有用である。
【0022】
特に、本発明のアプタマーは、それが生理学的に存在する部位、すなわちＣＡ－ＩＸが発現される細胞表面上で、標的を特異的に認識することで問題を解決し、インビボでのそれらの使用に適していることを実証する。実際に、本明細書に記載のアプタマーは、それらの表面上でＣＡ－ＩＸを過剰発現している細胞に直接結合することができることが見出された。
その目的のため、細胞－ＳＥＬＥＸ法を、細胞表面に発現するＣＡ－ＩＸに結合するアプタマーの特異的選択に適用した。
その目的のため、細胞－ＳＥＬＥＸ法を、細胞表面に発現するＣＡ－ＩＸに結合するアプタマーの特異的選択に適用した。
【0023】
２’－フルオロピリミジンで修飾されたＲＮＡ分子のライブラリーを、ヒトＣＡ－ＩＸ（ＣＯＳ７－ＣＡＩＸ）で一過性トランスフェクションしたＣＯＳ７細胞に対する結合についてアッセイした。選択方法は、以下のサイクルの反復である：１．カウンター選択ステップのためのＣＯＳ７細胞でのアプタマーライブラリーのインキュベーション；２．非結合配列の回収と、選択ステップのためのＣＯＳ７－ＣＡＩＸ細胞でのインキュベーション；３．結合した配列の回収と増幅。選択ステップを繰り返した後、ＲＮＡ分子の最終プールをクローニングし、最も高いＣＯＳ７－ＣＡ－ＩＸ結合を示す配列を分離し、それらの配列と標的に対する親和性を決定した。
【図面の簡単な説明】
【0024】
【図1】ＥＬＯＮＡアッセイによるＣＡ－ＩＸ精製タンパク質の結合評価。ＳＡＭ－１．Ｔ１とＳＡＭ－２．Ｔ１（左のパネル）および抗ＨＳＡポリクローナル抗体（右のパネル）の４５０ｎｍでの吸光度。
【図2】ヒト血清中のＳＡＭ－１．Ｔ１およびＳＡＭ－２．Ｔ１アプタマーの安定性：種々の時間で回収したａ）ＳＡＭ－１．Ｔ１およびｂ）ＳＡＭ－２．Ｔ１サンプルを変性ゲルにロードした（上のパネル）、ｃ）バンドはＩｍａｇｅＪプログラム（下のパネル）により定量化した。両方のゲルの最初のラインは、サンプルのサイズを正しく評価するための、ヒト血清で処理していない配列を示している。
【図3】ＥＬＯＮＡアッセイによるＨＳＡのＫｄ評価。（ａ）ＳＡＭ－１．Ｔ１、（ｂ）ＳＡＭ－２．Ｔ１、および（ｃ）抗ＨＳＡポリクローナル抗体の４５０ｎｍでの吸光度。
【発明を実施するための形態】
【0025】
第１の態様において、本発明は、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡ－ＩＸ）に結合することができ、ＵＣＧＡＡＵＧＡＡＣＣＡＡＧＧＵＵＣＣＵＣＧＧＣ（配列番号１）およびＵＵＣＧＵＧＣＣＧＣＵＧＡＧＵＧＣＧＵＡＣＧＧＧＣ（配列番号２）から選択されるＲＮＡ配列を含む２つのアプタマーまたはそれらの誘導体を提供する。
【0026】
一実施形態では、上記のアプタマーは、最大で１００ヌクレオチドの長さを有する。
それぞれ２４ヌクレオチド、２５ヌクレオチドの、配列番号１、配列番号２に対応する特定のＲＮＡ配列は、イメージングおよび治療に有用な小さな配列を得るために、最初に選択された２つの８４ｍｅｒアプタマーを短くすることによって得られた。
それぞれ２４ヌクレオチド、２５ヌクレオチドの、配列番号１、配列番号２に対応する特定のＲＮＡ配列は、イメージングおよび治療に有用な小さな配列を得るために、最初に選択された２つの８４ｍｅｒアプタマーを短くすることによって得られた。
【0027】
好ましい実施形態において、上で定義されたＲＮＡアプタマーは、ヌクレアーゼに耐性であることを特徴とする。より好ましい実施形態において、上で定義されたＲＮＡアプタマーは、すべてのピリミジン残基が２’－Ｆ（フルオロピリミジン）で修飾されていることを特徴とする。
【0028】
別のより好ましい実施形態では、上で定義されたＲＮＡアプタマーは、ビオチンなどの結合部分に結合することができる。
【0029】
本発明の好ましいアプタマーは、配列番号１または配列番号２からなる。より好ましいのは、配列番号１からなるアプタマーである。
【0030】
アプタマー修飾
本発明のアプタマーは、例えば、ヌクレアーゼに対する耐性を高めるため、薬物動態を調節するため、または診断または治療部分とコンジュゲートさせるために、修飾することができる。
好ましくは、本発明のＲＮＡアプタマーは、ピリミジン残基の少なくとも１つまたはすべてが２’－フルオロで修飾されている。さらに、その修飾は、核酸の糖、リン酸および塩基からなる群から好ましく選択される位置で化学置換を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾は以下からなる群から選択される：ビオチン化、蛍光標識の組み込み、修飾ヌクレオチドの組み込み、２’－ピリミジン修飾、３’－位キャッピング、リンカーとのコンジュゲーション、化合物又は薬物とのコンジュゲーション、細胞毒性部分とのコンジュゲーション、およびフルオロフォア、放射性同位体、超音波造影剤またはレポーター部分による標識。修飾の位置は、アプタマーに結合する部分のタイプに応じて変更することができる。例えば、アプタマー配列は、３’末端および／または５’末端で修飾することができる。
本発明のアプタマーは、例えば、ヌクレアーゼに対する耐性を高めるため、薬物動態を調節するため、または診断または治療部分とコンジュゲートさせるために、修飾することができる。
好ましくは、本発明のＲＮＡアプタマーは、ピリミジン残基の少なくとも１つまたはすべてが２’－フルオロで修飾されている。さらに、その修飾は、核酸の糖、リン酸および塩基からなる群から好ましく選択される位置で化学置換を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾は以下からなる群から選択される：ビオチン化、蛍光標識の組み込み、修飾ヌクレオチドの組み込み、２’－ピリミジン修飾、３’－位キャッピング、リンカーとのコンジュゲーション、化合物又は薬物とのコンジュゲーション、細胞毒性部分とのコンジュゲーション、およびフルオロフォア、放射性同位体、超音波造影剤またはレポーター部分による標識。修飾の位置は、アプタマーに結合する部分のタイプに応じて変更することができる。例えば、アプタマー配列は、３’末端および／または５’末端で修飾することができる。
【0031】
好ましい実施形態において、アプタマーはビオチンに連結される、例えば、次式（Ｉ）に示すように、３’末端でビオチン化されている。
【化1】
【0032】
レポーターまたは治療部分と適切に標識またはコンジュゲートされた本発明のアプタマーは、ＣＡ－ＩＸ関連状態、障害、機能不全、状態または疾患、特に癌疾患、の診断、治療または視覚化に使用することができる。例示的な用途としては、例えば腎臓癌、子宮頸癌、結腸癌、前立腺癌、乳癌および頭頸部癌などのＣＡ－ＩＸの発現に関連する癌疾患、ならびに心不全の診断または治療が挙げられる。
【0033】
本発明の特定の実施形態において、レポーター部分で標識されたアプタマーは、ＣＡ－ＩＸを発現する身体の組織または器官、特に腫瘍実質組織、のイメージングに使用することができる。
【0034】
適切なイメージング技術としては、磁気共鳴イメージング、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、超音波、光音響イメージング（ＰＡＩ）、近赤外蛍光（ＮＩＲＦ）、単一光子放射型コンピューター断層撮影（ＳＰＥＣＴ）が挙げられる。
【0035】
イメージングに適用する場合、アプタマーに連結するレポーター部分は、一般的に以下から選択される：フルオレセインなどの蛍光シグナルを生成できる分子；ＦＩＴＣ；アレクサ色素；Ｃｙ色素；ＤｙＬｉｇｈｔ色素；ＩＲＤｙｅ色素またはＶｉｖｏＴａｇ色素；光学イメージングを使用してコントラストまたは信号を生成するのに使用できる薬剤を含む光学部分；常磁性金属イオンと安定な錯体を形成することができる磁気共鳴剤用のキレート剤を含む磁性部分；放射性標識部分；ヨウ素化有機分子または重金属イオンのキレートなどの、Ｘ線イメージングを使用してコントラストまたは信号を生成するのに使用できるＸ線部分；超音波標的化マイクロバブルを使用してコントラストまたは信号を生成するのに使用できる超音波イメージング部分；および光音響イメージングと互換性のある薬剤を含む、光音響イメージング部分。
【0036】
アプタマーと、レポーター部分または標識は、共有結合または非共有結合のいずれかで、場合により、ペプチド、アミノ酸または核酸を含む適切なリンカーまたはスペーサーを介して連結することができる。さらに、アプタマーと、レポーター部分または標識は、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、ビオチン／ニュートラアビジン、またはジゴキシゲニン（ＤＩＧ）系を含む標識系を用いて連結することができる。
【0037】
さらなる態様では、本発明は、本明細書で定義される少なくとも１つのアプタマーと、１つまたは複数の適切な薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤および／または添加剤を含んでなる組成物を提供する。組成物の成分は使用目的、診断、治療、またはイメージングの用途かによって変更することができる。例えば、組成物は、１つ以上の治療用化合物および／または１つ以上の造影剤をさらに含むことができる。
【0038】
一実施形態では、組成物は、ＣＡ－ＩＸを有する標的組織のイメージングに使用され、上記で定義されたレポーター部分でコンジュゲーションまたは標識されたアプタマーを含む。組成物は、例えば、リポソームまたはナノ粒子の形態であり、さまざまな種類の投与に適している。一実施形態では、組成物は、非経口投与、好ましくは静脈内または皮下投与に適している。この組成物は、腫瘍実質組織などのＣＡ－ＩＸ発現組織または器官を視覚化するために使用することができる。
【0039】
さらに、好ましくはレポーターまたは治療部分で標識またはコンジュゲーションされている、本発明の少なくとも１つのアプタマーを１つまたは複数の容器内に含むキットも提供される。
【0040】
配列表の簡単な説明
配列番号１は、ＳＡＭ－２．Ｔ１と称する２４ヌクレオチドの短いアプタマー配列：
５’－ＵＣＧＡＡＵＧＡＡＣＣＡＡＧＧＵＵＣＣＵＣＧＧＣ－３’；
配列番号２は、ＳＡＭ－１．Ｔ１と称する２５ヌクレオチドの短いアプタマー配列：
５’－ＵＵＣＧＵＧＣＣＧＣＵＧＡＧＵＧＣＧＵＡＣＧＧＧＣ－３’
を示す。
配列番号１は、ＳＡＭ－２．Ｔ１と称する２４ヌクレオチドの短いアプタマー配列：
５’－ＵＣＧＡＡＵＧＡＡＣＣＡＡＧＧＵＵＣＣＵＣＧＧＣ－３’；
配列番号２は、ＳＡＭ－１．Ｔ１と称する２５ヌクレオチドの短いアプタマー配列：
５’－ＵＵＣＧＵＧＣＣＧＣＵＧＡＧＵＧＣＧＵＡＣＧＧＧＣ－３’
を示す。
【実施例】
【0041】
装置
ＲＴ－ｑＰＣＲは、ＳｔｅｐＯｎｅ（登録商標）ＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（Applied Biosystems）により実行した。ゲルの視覚化は、Gel Doc EZ System（Bio-Rad）を用いて実行した。ＥＬＯＮＡデータは、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ（登録商標）ＦＣマイクロプレート光度計（ThermoFisher Scientific）により得た。
ＲＴ－ｑＰＣＲは、ＳｔｅｐＯｎｅ（登録商標）ＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（Applied Biosystems）により実行した。ゲルの視覚化は、Gel Doc EZ System（Bio-Rad）を用いて実行した。ＥＬＯＮＡデータは、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ（登録商標）ＦＣマイクロプレート光度計（ThermoFisher Scientific）により得た。
【0042】
【表1】
【0043】
実施例１：抗ＣＡ－ＩＸアプタマーの選択と調製
選択：ＣＡ－ＩＸに対するＲＮＡ配列は、ｃｅｌｌ－ＳＥＬＥＸアプローチに従って、８４ｎｔフラグメントの非ナイーブライブラリーからスクリーニングした。この方法には、事前に豊富化したアプタマープールを、それぞれＣＯＳ７－ＷＴおよび一過性トランスフェクトしたＣＯＳ７－ＣＡ－ＩＸ細胞上で、ＣＡに対する親和性でカウンター選択／選択するステップのサイクルが含まれ、各ラウンドで選択圧を生じさせた。
濃縮したプールを、ＣＡ－ＩＸによって維持される細胞外ｐＨ（約６．８）にするため酸性条件（６０ｍＭ ＭＥＳバッファーの存在下）にて細胞上でインキュベートした。細胞ＳＥＬＥＸの各ラウンドの前に、ＲＮＡ配列に２’－フルオロピリミジンを組み込むことができる変異型のＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用してプールを転写した。カウンター選択ステップをＣＯＳ７－ＷＴ細胞に対して実行し、ＣＯＳ７細胞上に通常発現するタンパク質を認識するアプタマーの選択を回避した。選択ステップは、標的に特異的なアプタマーを選択するために、一過性トランスフェクトしたＣＯＳ７－ＣＡ－ＩＸ細胞に対して実行した。各サイクルで、２’－フルオロピリミジンＲＮＡ配列のプールを最初にＣＯＳ７－ＷＴ細胞上で３７℃にてインキュベートし、次いで結合しなかった２’－フルオロピリミジンＲＮＡ配列をＣＯＳ７－ＣＡ－ＩＸ細胞上でインキュベートした。数回洗浄した後、全ＲＮＡ抽出により配列を回収した。ｃｅｌｌ－ＳＥＬＥＸプロトコルの最後に、最終サイクルのクローンを作成し、サンプルの配列を決定した。得られた配列を豊富化について分析し、ＣＯＳ７－ＣＡ－ＩＸ細胞に結合できる配列を選択するためにＲＴ－ｑＰＣＲによる結合アッセイを実施した。基本的に、ＤＮＡ配列を増幅および転写した後、ＲＮＡ配列を、酵母ｔＲＮＡ ２００μｇ／ｍＬで前処理した後、酸性条件下、最終濃度として１００ｎＭ、３７℃にて、ＣＯＳ７－ＷＴ細胞およびＣＯＳ７－ＣＡ－ＩＸ細胞上で１５分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＴＲＩｓｕｒｅ試薬中に回収した。参照対照として使用するＲＮＡ配列を、正規化のために各ポイントにスポットした。倍率は、ＣＯＳ７－ＷＴ細胞に対しＣＯＳ７－ＣＡ－ＩＸの結合値を比較して計算した。同一配列のカップルまたはグループを表す６つの配列をスクリーニングした。さらなる分析のため、実験を３回繰り返して倍率が高いものを選択した。イメージングへの適用に有用なより短い配列を得るため、より構造化された領域を単離し、短い配列の各々が長いアプタマーの対応する部分の折り畳みを維持していることを確認することにより、８４ｍｅｒの元の分子をトランケートし、配列番号１（ＳＡＭ－２．Ｔ１）および配列番号２（ＳＡＭ－１．Ｔ１）に対応するより短い配列を選択した。以下の実施例２で、トランケートされた配列における結合能力の保持について評価した。
選択：ＣＡ－ＩＸに対するＲＮＡ配列は、ｃｅｌｌ－ＳＥＬＥＸアプローチに従って、８４ｎｔフラグメントの非ナイーブライブラリーからスクリーニングした。この方法には、事前に豊富化したアプタマープールを、それぞれＣＯＳ７－ＷＴおよび一過性トランスフェクトしたＣＯＳ７－ＣＡ－ＩＸ細胞上で、ＣＡに対する親和性でカウンター選択／選択するステップのサイクルが含まれ、各ラウンドで選択圧を生じさせた。
濃縮したプールを、ＣＡ－ＩＸによって維持される細胞外ｐＨ（約６．８）にするため酸性条件（６０ｍＭ ＭＥＳバッファーの存在下）にて細胞上でインキュベートした。細胞ＳＥＬＥＸの各ラウンドの前に、ＲＮＡ配列に２’－フルオロピリミジンを組み込むことができる変異型のＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用してプールを転写した。カウンター選択ステップをＣＯＳ７－ＷＴ細胞に対して実行し、ＣＯＳ７細胞上に通常発現するタンパク質を認識するアプタマーの選択を回避した。選択ステップは、標的に特異的なアプタマーを選択するために、一過性トランスフェクトしたＣＯＳ７－ＣＡ－ＩＸ細胞に対して実行した。各サイクルで、２’－フルオロピリミジンＲＮＡ配列のプールを最初にＣＯＳ７－ＷＴ細胞上で３７℃にてインキュベートし、次いで結合しなかった２’－フルオロピリミジンＲＮＡ配列をＣＯＳ７－ＣＡ－ＩＸ細胞上でインキュベートした。数回洗浄した後、全ＲＮＡ抽出により配列を回収した。ｃｅｌｌ－ＳＥＬＥＸプロトコルの最後に、最終サイクルのクローンを作成し、サンプルの配列を決定した。得られた配列を豊富化について分析し、ＣＯＳ７－ＣＡ－ＩＸ細胞に結合できる配列を選択するためにＲＴ－ｑＰＣＲによる結合アッセイを実施した。基本的に、ＤＮＡ配列を増幅および転写した後、ＲＮＡ配列を、酵母ｔＲＮＡ ２００μｇ／ｍＬで前処理した後、酸性条件下、最終濃度として１００ｎＭ、３７℃にて、ＣＯＳ７－ＷＴ細胞およびＣＯＳ７－ＣＡ－ＩＸ細胞上で１５分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＴＲＩｓｕｒｅ試薬中に回収した。参照対照として使用するＲＮＡ配列を、正規化のために各ポイントにスポットした。倍率は、ＣＯＳ７－ＷＴ細胞に対しＣＯＳ７－ＣＡ－ＩＸの結合値を比較して計算した。同一配列のカップルまたはグループを表す６つの配列をスクリーニングした。さらなる分析のため、実験を３回繰り返して倍率が高いものを選択した。イメージングへの適用に有用なより短い配列を得るため、より構造化された領域を単離し、短い配列の各々が長いアプタマーの対応する部分の折り畳みを維持していることを確認することにより、８４ｍｅｒの元の分子をトランケートし、配列番号１（ＳＡＭ－２．Ｔ１）および配列番号２（ＳＡＭ－１．Ｔ１）に対応するより短い配列を選択した。以下の実施例２で、トランケートされた配列における結合能力の保持について評価した。
【0044】
調製：次に、本発明の選択されたアプタマーを人工合成によって得た。例えば、それらを、当技術分野で周知の方法に従って、ＲＮＡシンセサイザーを用いた固相合成によって合成した。次いで、それらを配列の３’末端でビオチンに結合させた。
ＲＮＡ配列は、Ｃ６－アミノリンカー（３’－Ｃ６－ＮＨ２）を挿入した後、３’末端で市販のビオチンに結合させた。リンカーは、塩基性触媒作用にて、Ｃ６脂肪族ジアミンとの縮合により３’末端のリン酸に挿入した。生じたフリーのＮＨ２部分をビオチン－ＮＨＳエステルと結合させ、アミド共有結合を形成した。ビオチン－ＮＨＳエステルを高品質の無水ＤＭＦまたはＤＭＳＯに溶解し、０．１～０．２Ｍの重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）中、室温にて反応を行った。ＰＡＧＥ次いでＨＰＬＣにより、精製を行った。
ＲＮＡ配列は、Ｃ６－アミノリンカー（３’－Ｃ６－ＮＨ２）を挿入した後、３’末端で市販のビオチンに結合させた。リンカーは、塩基性触媒作用にて、Ｃ６脂肪族ジアミンとの縮合により３’末端のリン酸に挿入した。生じたフリーのＮＨ２部分をビオチン－ＮＨＳエステルと結合させ、アミド共有結合を形成した。ビオチン－ＮＨＳエステルを高品質の無水ＤＭＦまたはＤＭＳＯに溶解し、０．１～０．２Ｍの重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）中、室温にて反応を行った。ＰＡＧＥ次いでＨＰＬＣにより、精製を行った。
【0045】
実施例２：ＣＡ－ＩＸ陽性細胞に対するアプタマーＳＡＭ－１．Ｔ１およびＳＡＭ－２．Ｔ１の結合と親和性
短いアプタマーＳＡＭ－１．Ｔ１（配列番号２）およびＳＡＭ－２．Ｔ１（配列番号１）が元の分子の活性部位を含み、ＣＯＳ７－ＣＡ－ＩＸ細胞に対する高い結合性と親和性を維持していることを確認する目的で、結合アッセイを重複して行い、ＣＯＳ７－ＷＴ細胞に対するＣＯＳ７－ＣＡ－ＩＸの配列結合能力を比較した。ＣＯＳ７細胞を播種し、ヒトＣＡ－ＩＸｃＤＮＡでトランスフェクトした。２４時間後、ＲＮＡ配列を最終濃度１００ｎＭで、酸性条件下、３７℃にて、ＣＯＳ７－ＷＴおよびＣＯＳ７－ＣＡ－ＩＸ上で１５分間インキュベートした。結合したアプタマーの量を定量するためサンプルをＲＴ－ｑＰＣＲで分析し、ＣＯＳ７－ＷＴ細胞に対する倍率を計算した。
アプタマーＳＡＭ－１．Ｔ１およびＳＡＭ－２．Ｔ１について、倍率はそれぞれ１．３および２．４であった。この結果から、それらが細胞表面の膜上で生理学的コンフォメーションにて標的ＣＡ－ＩＸに結合する能力が確認された。
短いアプタマーＳＡＭ－１．Ｔ１（配列番号２）およびＳＡＭ－２．Ｔ１（配列番号１）が元の分子の活性部位を含み、ＣＯＳ７－ＣＡ－ＩＸ細胞に対する高い結合性と親和性を維持していることを確認する目的で、結合アッセイを重複して行い、ＣＯＳ７－ＷＴ細胞に対するＣＯＳ７－ＣＡ－ＩＸの配列結合能力を比較した。ＣＯＳ７細胞を播種し、ヒトＣＡ－ＩＸｃＤＮＡでトランスフェクトした。２４時間後、ＲＮＡ配列を最終濃度１００ｎＭで、酸性条件下、３７℃にて、ＣＯＳ７－ＷＴおよびＣＯＳ７－ＣＡ－ＩＸ上で１５分間インキュベートした。結合したアプタマーの量を定量するためサンプルをＲＴ－ｑＰＣＲで分析し、ＣＯＳ７－ＷＴ細胞に対する倍率を計算した。
アプタマーＳＡＭ－１．Ｔ１およびＳＡＭ－２．Ｔ１について、倍率はそれぞれ１．３および２．４であった。この結果から、それらが細胞表面の膜上で生理学的コンフォメーションにて標的ＣＡ－ＩＸに結合する能力が確認された。
【0046】
実施例３：ヒトＣＡ－ＩＸ精製タンパク質に対するアプタマーＳＡＭ－１．Ｔ１およびＳＡＭ－２．Ｔ１の結合アッセイ
さらに別の実験で、アプタマーＳＡＭ－１．Ｔ１（配列番号２）およびＳＡＭ－２．Ｔ１（配列番号１）の結合について調べた。ビオチン化アプタマーＳＡＭ－１．Ｔ１およびＳＡＭ－２．Ｔ１を、ヒトＣＡ－ＩＸ精製タンパク質に対して試験して、標的を認識する能力を確認した。
配列ＳＡＭ－１．Ｔ１およびＳＡＭ－２．Ｔ１ ２００ｎＭを、３’末端でビオチン化し、５０ｎＭのヒトＣＡ－ＩＸ精製タンパク質を事前にコーティングしたまたはコーティングしていない（ブランク）９６ウェルマイクロタイター高結合プレートでインキュベートした。各実験では、抗ＣＡ－ＩＸ抗体を陽性対照として使用した。
次いで、サンプルをＥＬＯＮＡアッセイで分析した。図１に示す結果は、アプタマーはいずれも抗ＣＡ－ＩＸ抗体と同様にＣＡ－ＩＸヒトタンパク質に結合することを示している。
さらに別の実験で、アプタマーＳＡＭ－１．Ｔ１（配列番号２）およびＳＡＭ－２．Ｔ１（配列番号１）の結合について調べた。ビオチン化アプタマーＳＡＭ－１．Ｔ１およびＳＡＭ－２．Ｔ１を、ヒトＣＡ－ＩＸ精製タンパク質に対して試験して、標的を認識する能力を確認した。
配列ＳＡＭ－１．Ｔ１およびＳＡＭ－２．Ｔ１ ２００ｎＭを、３’末端でビオチン化し、５０ｎＭのヒトＣＡ－ＩＸ精製タンパク質を事前にコーティングしたまたはコーティングしていない（ブランク）９６ウェルマイクロタイター高結合プレートでインキュベートした。各実験では、抗ＣＡ－ＩＸ抗体を陽性対照として使用した。
次いで、サンプルをＥＬＯＮＡアッセイで分析した。図１に示す結果は、アプタマーはいずれも抗ＣＡ－ＩＸ抗体と同様にＣＡ－ＩＸヒトタンパク質に結合することを示している。
【0047】
実施例４：ヒト血清中のアプタマーＳＡＭ－１．Ｔ１およびＳＡＭ－２．Ｔ１の安定性
酵素分解に対する耐性を評価するため、アプタマーＳＡＭ－１．Ｔ１およびＳＡＭ－２．Ｔ１を、ヒト血清中での安定性について試験した。それらを８７％ヒト血清中で３７℃にてインキュベートした。実験は３回行った。種々の時間（Ｔ０、１、２、４、８、１２、２４、４８、７２時間）でサンプルを回収し、血清タンパク質を分解するためにプロテイナーゼＫと３７℃にて１時間インキュベートし、変性ゲルにロードした。
図２に報告されている結果は、ＳＡＭ－１．Ｔ１およびＳＡＭ－２．Ｔ１アプタマーがヒト血清中で非常に安定していることを示している。特に、ＳＡＭ－１．Ｔ１アプタマーは２４時間まで安定しており、ＳＡＭ－２．Ｔ１アプタマーは７２時間を超えても安定していた。
酵素分解に対する耐性を評価するため、アプタマーＳＡＭ－１．Ｔ１およびＳＡＭ－２．Ｔ１を、ヒト血清中での安定性について試験した。それらを８７％ヒト血清中で３７℃にてインキュベートした。実験は３回行った。種々の時間（Ｔ０、１、２、４、８、１２、２４、４８、７２時間）でサンプルを回収し、血清タンパク質を分解するためにプロテイナーゼＫと３７℃にて１時間インキュベートし、変性ゲルにロードした。
図２に報告されている結果は、ＳＡＭ－１．Ｔ１およびＳＡＭ－２．Ｔ１アプタマーがヒト血清中で非常に安定していることを示している。特に、ＳＡＭ－１．Ｔ１アプタマーは２４時間まで安定しており、ＳＡＭ－２．Ｔ１アプタマーは７２時間を超えても安定していた。
【0048】
実施例５：ＨＳＡに対するアプタマーＳＡＭ－１．Ｔ１およびＳＡＭ－２．Ｔ１の結合親和性
ＳＡＭ－１．Ｔ１およびＳＡＭ－２．Ｔ１アプタマーのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に対する結合を評価するためＥＬＯＮＡアッセイを実施した。ビオチン化ＳＡＭ－１．Ｔ１およびＳＡＭ－２．Ｔ１アプタマーを、２５ｎＭ ＨＳＡで事前にコーティングしたまたはコーティングされていない（ブランク）９６ウェルマイクロタイター高結合プレート上にて、濃度を上げて（１０－１００－１０００ｎＭ）インキュベートした。使用したどの条件でもアプタマーの結合は検出されず、ＳＡＭ－１．Ｔ１およびＳＡＭ－２．Ｔ１アプタマーが１０００ｎＭまでＨＳＡと反応しないことを示した。各実験では、抗ＨＳＡビオチン化ポリクローナル抗体を陽性対照として使用した。結果を図３に示す。
ＳＡＭ－１．Ｔ１およびＳＡＭ－２．Ｔ１アプタマーのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に対する結合を評価するためＥＬＯＮＡアッセイを実施した。ビオチン化ＳＡＭ－１．Ｔ１およびＳＡＭ－２．Ｔ１アプタマーを、２５ｎＭ ＨＳＡで事前にコーティングしたまたはコーティングされていない（ブランク）９６ウェルマイクロタイター高結合プレート上にて、濃度を上げて（１０－１００－１０００ｎＭ）インキュベートした。使用したどの条件でもアプタマーの結合は検出されず、ＳＡＭ－１．Ｔ１およびＳＡＭ－２．Ｔ１アプタマーが１０００ｎＭまでＨＳＡと反応しないことを示した。各実験では、抗ＨＳＡビオチン化ポリクローナル抗体を陽性対照として使用した。結果を図３に示す。
【図1】
【図2】
【図3】
【配列表】
【国際調査報告】