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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-11-21
(54)【発明の名称】画像化及び治療用組成物
(51)【国際特許分類】
C07C 239/14 20060101AFI20221114BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20221114BHJP
A61K 33/24 20190101ALI20221114BHJP
A61K 33/244 20190101ALI20221114BHJP
A61K 51/04 20060101ALI20221114BHJP
A61K 51/02 20060101ALI20221114BHJP
A61K 47/18 20060101ALI20221114BHJP
G01T 1/161 20060101ALN20221114BHJP
【ＦＩ】
C07C239/14 CSP
A61P35/00
A61K33/24
A61K33/244
A61K51/04 200
A61K51/02 100
A61K47/18
G01T1/161 A
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022517907
(86)(22)【出願日】2020-09-18
(85)【翻訳文提出日】2022-05-17
(86)【国際出願番号】 AU2020050992
(87)【国際公開番号】W WO2021051168
(87)【国際公開日】2021-03-25
(31)【優先権主張番号】2019903504
(32)【優先日】2019-09-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】304054507
【氏名又は名称】ザ ユニバーシティー オブ メルボルン
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】ポール・スティーブン・ドネリー
(72)【発明者】
【氏名】アシフ・ノール
(72)【発明者】
【氏名】ステイシー・エリン・ラッド
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C085
4C086
4C188
4H006
【Ｆターム（参考）】
4C076AA11
4C076AA95
4C076BB11
4C076BB13
4C076BB15
4C076BB16
4C076BB21
4C076BB24
4C076CC27
4C076DD52
4C076FF31
4C076FF68
4C084AA12
4C084MA05
4C084MA56
4C084MA58
4C084MA65
4C084MA66
4C084NA10
4C084NA13
4C084ZB261
4C084ZB262
4C085HH03
4C085JJ01
4C085KA29
4C085KB02
4C085KB11
4C085KB12
4C085KB15
4C085LL18
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086HA05
4C086HA06
4C086MA02
4C086MA05
4C086NA10
4C086NA13
4C086ZB26
4C188EE02
4C188FF07
4H006AA01
4H006AA03
4H006AB20
(57)【要約】
本願に議論される本発明は、適切な金属中心に結合した場合に画像化剤及び治療剤として有用である、特に腫瘍の画像化のためのヒドロキサム酸系化合物に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
式（Ｉ）の化合物若しくはその薬学的に許容できる誘導体：【化1】
Ｃ１～Ｃ１０アルキル、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、又はその誘導体により任意選択で置換されているアリール；及び
（Ｃ１～Ｃ１０アルキル）ＮＲ７（Ｙ２）Ｒ８（式中、Ｒ７及びＲ８は、Ｃ１～Ｃ１０アルキル又はＣ１～Ｃ１０アルキルフェニルから独立に選択され得て、Ｃ１～Ｃ１０アルキルはｎ個のアミド基により介在され得て、ｎは０～３である）からなる群から選択され；且つ
Ｙ１及びＹ２は、カルボン酸、エステル、無水物、及びアミンからなる群から独立に選択される）。
【請求項2】
Ｘが、フェニル、ベンジル、及びＥＤＴＡ官能化フェニルからなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項3】
Ｘが（Ｃ１～Ｃ１０アルキル）ＮＲ７（Ｙ２）Ｒ８である、請求項１に記載の化合物。
【請求項4】
Ｙ１及びＹ２が、独立に、アミン又はカルボン酸である、請求項１～３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項5】
下記からなる群から選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物：【化2】
【化3】
【請求項6】
前記薬学的に許容できる誘導体が【化4】
【請求項7】
前記薬学的に許容できる誘導体が、【化5】
【化6】
【請求項8】
－請求項１～７のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容できる誘導体及び－ＰＳＭＡ標的剤
を含むコンジュゲート。
【請求項9】
下記からなる群から選択される、請求項８に記載のコンジュゲート：【化7】
【請求項10】
式（ＩＩ）のコンジュゲート若しくはその薬学的に許容できる誘導体：【化8】
【請求項11】
前記薬学的に許容できる誘導体が【化9】
【請求項12】
－請求項８～１１のいずれか一項に記載のコンジュゲート又はその薬学的に許容できる誘導体及び－それに錯化された放射性核種
を含む放射性核種コンジュゲートであって、
前記放射性核種が、ジルコニウム、ガリウム、ルテチウム、ホルミウム、スカンジウム、チタン、インジウム、及びニオブの放射性同位元素から選択される、放射性核種コンジュゲート。
【請求項13】
前記放射性核種が、ジルコニウム（好ましくは８９Ｚｒ）、ガリウム（好ましくは６８Ｇａ）、又はインジウム（好ましくは１１１Ｉｎ）の放射性同位元素である、請求項１２に記載の放射性核種コンジュゲート。
【請求項14】
前記放射性核種が、ジルコニウム（好ましくは８９Ｚｒ）の放射性同位元素である、請求項１３に記載の放射性核種コンジュゲート。
【請求項15】
患者を画像化する方法であって、－患者に、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の放射性核種標識コンジュゲートを投与すること；及び
－前記患者を画像化すること
を含む方法。
【請求項16】
前記標的剤が、前記コンジュゲートをインビボで所望の部位に標的化するように作用する、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記所望の部位が腫瘍である、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
細胞又はインビトロ生検試料を画像化する方法であって、－細胞又はインビトロ生検試料に、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の放射性核種標識コンジュゲートを投与すること；及び
－前記細胞又はインビトロ生検試料を画像化すること
を含む方法。
【請求項19】
患者の癌を治療する方法であって、－前記患者に、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の放射性核種標識コンジュゲートを投与すること；
それにより、前記患者を治療すること
を含む方法。
【請求項20】
患者の癌の治療のための医薬品の製造における、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の放射性核種標識コンジュゲートの使用。
【請求項21】
患者の癌の治療に使用するための、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の放射性核種標識コンジュゲート。
【請求項22】
請求項１５～１９のいずれか一項に記載の方法又は用途に使用するためのキットであって、－請求項１～７のいずれか一項に記載の化合物、請求項８～１１のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又は請求項１２～１４のいずれか一項に記載の放射性核種コンジュゲート；及び
－任意選択で、請求項１５～１９のいずれか一項に記載の方法又は用途に使用するための説明書と共に、ラベル又は添付文書
を含むキット。
【請求項23】
請求項１５～１９のいずれか一項に記載の方法又は用途に使用される場合のキットであって、－請求項１～７のいずれか一項に記載の化合物、請求項８～１１のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又は請求項８～１１のいずれか一項に記載の放射性核種コンジュゲート；及び
－任意選択で、請求項１５～１９のいずれか一項に記載の方法又は用途に使用するための説明書と共に、ラベル又は添付文書
を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
先願への相互参照
本願は、内容が参照により全体として本明細書に組み込まれる、２０１９年９月２０日に出願された「画像化及び治療用組成物」という名称のオーストラリア仮特許出願第２０１９９０３５０４号の優先権を主張する。
本願は、内容が参照により全体として本明細書に組み込まれる、２０１９年９月２０日に出願された「画像化及び治療用組成物」という名称のオーストラリア仮特許出願第２０１９９０３５０４号の優先権を主張する。
【0002】
本発明は、適切な金属中心に結合する場合に画像化剤及び治療剤として有用である、特に腫瘍の画像化及び治療のためのヒドロキサム酸系化合物に関する。本発明は、化合物を含む組成物、並びに化合物を使用して患者を画像化及び治療する方法にも関する。
【背景技術】
【0003】
ジルコニウム－８９（８９Ｚｒ）は、医用画像化用途に使用される陽電子放出放射性核種である。具体的には、それは、癌の検出及び画像化のための陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）に使用される。それは、医用画像化に使用される１８Ｆなどの他の放射性核種よりも長い半減期（ｔ１／２＝７９．３時間）を有する。例えば、１８Ｆは、１１０分のｔ１／２を有し、それは、それを使用するには、サイクロトロン施設に近接していること、並びにそれが組み込まれる薬剤の調製の迅速且つ高収率の合成技法を要することを意味する。８９Ｚｒにはこれらの同じ問題がないので、８９Ｚｒは医用画像化用途での使用に特に魅力的である。
【0004】
デスフェリオキサミン（ＤＦＯ）は、１９６０年代後半から鉄過剰症を治療するために使用されてきた細菌シデロフォアである。ＤＦＯ中の３つのヒドロキサム酸基はＦｅ３＋イオンと配位結合を形成し、基本的に、ＤＦＯをＦｅ３＋イオンをキレートする六座配位子とする。８９Ｚｒの配位構造のため、ＤＦＯは、ＰＥＴ画像化用途において８９Ｚｒのキレート剤としても使用されてきた（非特許文献１）。
【0005】
他のＤＦＯ系放射性同位元素キレート剤もＰＥＴ画像化用途に使用するために調製されてきた。それらには、Ｎ－スクシニル－デスフェリオキサミン－テトラフルオロフェノールエステル（Ｎ－ｓｕｃ－ＤＦＯ－ＴＦＰエステル）ｐ－イソチオシアナトベンジル－デスフェリオキサミン（ＤＦＯ－Ｂｚ－ＮＣＳ、別名ＤＦＯ－Ｐｈ－ＮＣＳ）、デスフェリオキサミン－マレイミド（ＤＦＯ－マレイミド）、及びデスフェリオキサミン－スクアラミド（ＤＦＯ－ｓｑ）がある。これらのキレート剤は全て、抗体又は抗体断片とコンジュゲートされて、画像化剤を、画像化すべき腫瘍に標的化する手段を与えることができる。
【0006】
しかし、腫瘍親和性増大及び標的外組織への低い取込みを含む改善された生体適合性を有する、放射性同位元素と共に使用するための新たな薬剤を開発する必要性が依然として存在する。
【0007】
本明細書における従来技術への言及は、この従来技術がいずれかの管轄における共通一般知識の一部を形成すること、又はこの従来技術が、当業者により理解され、重要であるとみなされ、且つ／若しくは従来技術の他の部分と組み合わされることが当然期待され得ることの承認でも示唆でもない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ ａｌ（２０１２）Ｎａｔｕｒｅ １０：１５８６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0009】
発明者らは、以下に述べられる式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容できる誘導体及び前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）標的剤とのそのコンジュゲート（８９Ｚｒ又は６８Ｇａなどの放射性核種と錯化される場合）が有効なＰＥＴ画像化剤又は治療剤であることを見出した：
（式中、Ｘは、
Ｃ１～Ｃ１０アルキル、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、又はその誘導体により任意選択で置換されているアリール；及び
（Ｃ１～Ｃ１０アルキル）ＮＲ７（Ｙ２）Ｒ８（式中、Ｒ７及びＲ８は、Ｃ１～Ｃ１０アルキル又はＣ１～Ｃ１０アルキルフェニルから独立に選択され得て、Ｃ１～Ｃ１０アルキルはｎ個のアミド基により介在され得て、ｎは０～３である）
からなる群から選択され；且つ
Ｙ１及びＹ２は、カルボン酸、エステル、無水物、及びアミンからなる群から独立に選択される）。
【化1】
Ｃ１～Ｃ１０アルキル、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、又はその誘導体により任意選択で置換されているアリール；及び
（Ｃ１～Ｃ１０アルキル）ＮＲ７（Ｙ２）Ｒ８（式中、Ｒ７及びＲ８は、Ｃ１～Ｃ１０アルキル又はＣ１～Ｃ１０アルキルフェニルから独立に選択され得て、Ｃ１～Ｃ１０アルキルはｎ個のアミド基により介在され得て、ｎは０～３である）
からなる群から選択され；且つ
Ｙ１及びＹ２は、カルボン酸、エステル、無水物、及びアミンからなる群から独立に選択される）。
【0010】
したがって、一態様において、本発明は、本明細書に定義される式（Ｉ）の化合物若しくはその薬学的に許容できる誘導体又はその薬学的に許容できる塩に関する。
【0011】
好ましい実施形態において、Ｘは、フェニル、ベンジル、及びＥＤＴＡ官能化フェニルからなる群から選択される。より好ましくは、Ｘは、
からなる群から選択される。
【化2】
【0012】
この実施形態の好ましい態様において、Ｙ１はカルボン酸である。
【0013】
別の好ましい実施形態において、Ｘは（Ｃ１～Ｃ１０アルキル）ＮＲ７（Ｙ２）Ｒ８である。より好ましくは、Ｘは、
からなる群から選択される。
【化3】
【0014】
この実施形態の好ましい態様において、Ｙ１及びＹ２は、独立に、アミン又はカルボン酸である。好ましくは、Ｙ１とＹ２は同じである。
【0015】
好ましくは、式（Ｉ）の化合物若しくはその薬学的に許容できる誘導体又はその薬学的に許容できる塩は、
からなる群から選択され得る。
【化4】
【化5】
【0016】
別の態様において、本発明は、
－式（Ｉ）の化合物若しくはその薬学的に許容できる誘導体：
又はその薬学的に許容できる塩（式中、Ｘ及びＹ１は本明細書に定義される通りである）及び
－ＰＳＭＡ標的剤
のコンジュゲートにも関する。
－式（Ｉ）の化合物若しくはその薬学的に許容できる誘導体：
【化6】
－ＰＳＭＡ標的剤
のコンジュゲートにも関する。
【0017】
ＰＳＭＡ標的剤は、前立腺特異的膜抗原への選択性を有する部分である。好ましくは、ＰＳＭＡ標的剤は、ペプチド又は尿素連結ジペプチド、より好ましくはＬｙｓ－尿素－Ｇｌｕである。
【0018】
好ましくは、式（Ｉ）の化合物及びＰＳＭＡ標的剤又はその薬学的に許容できる塩のコンジュゲートは、
からなる群から選択され得る。
【化7】
【0019】
別の態様において、本発明は、
－式（Ｉ）の化合物若しくはその薬学的に許容できる誘導体：
又はその薬学的に許容できる塩（式中、Ｘ及びＹ１は本明細書に定義される通りである）
－ＰＳＭＡ標的剤、及び
－それに錯化された放射性核種
の放射性核種標識コンジュゲートに関する。
－式（Ｉ）の化合物若しくはその薬学的に許容できる誘導体：
【化8】
－ＰＳＭＡ標的剤、及び
－それに錯化された放射性核種
の放射性核種標識コンジュゲートに関する。
【0020】
ＰＳＭＡ標的剤は、前立腺特異的膜抗原への選択性を有する部分である。ＰＳＭＡ標的剤はペプチドであり得る。好ましくは、ＰＳＭＡ標的剤は、尿素連結ジペプチド、より好ましくはＬｙｓ－尿素－Ｇｌｕである。
【0021】
別の態様において、本発明は、式（ＩＩ）のコンジュゲート若しくはその薬学的に許容できる誘導体：
又はその薬学的に許容できる塩を提供する（式中、ＲはＣＨ２Ｏ又はＣＯＯである）。一実施形態において、ＲはＣＨ２Ｏである。別の実施形態において、ＲはＣＯＯである。
【化9】
【0022】
別の態様において、本発明は、
－式（ＩＩ）のコンジュゲート若しくはその薬学的に許容できる誘導体：
又はその薬学的に許容できる塩（式中、Ｒは本明細書に定義される通りである）及び
－それに錯化された放射性核種
の放射性核種標識コンジュゲートに関する。
－式（ＩＩ）のコンジュゲート若しくはその薬学的に許容できる誘導体：
【化10】
－それに錯化された放射性核種
の放射性核種標識コンジュゲートに関する。
【0023】
本発明のいずれの態様又は実施形態においても、本発明の式（Ｉ）若しくは（ＩＩ）の化合物、コンジュゲート、若しくは放射性核種コンジュゲート中、又は本明細書に示されるあらゆる構造中のＤＦＯは、その薬学的に許容できる誘導体、例えばＤＦＯ＊などのＤＦＯ－アナログに置換され得る。式（Ｉ）及び式（ＩＩ）の薬学的に許容できる誘導体は、例えば
である。
【化11】
【0024】
上記態様のいずれの実施形態においても、放射性同位元素は、ＰＥＴ画像化に好適な診断用の放射性同位元素であり得る。放射性核種は、ジルコニウム、ガリウム、又はインジウムの放射性同位元素であり得る。ジルコニウムの放射性同位元素は８９Ｚｒであり得る。ガリウムの放射性同位元素は６８Ｇａであり得る。インジウムの放射性同位元素は１１１Ｉｎであり得る。
【0025】
上記態様のいずれの実施形態においても、放射性同位元素は治療用放射性同位元素であり得る。放射性核種は、ガリウム、ルテチウム、スカンジウム、チタン、マンガン、又はインジウムの放射性同位元素であり得る。ガリウムの放射性同位元素は６７Ｇａであり得る。ルテチウムの放射性同位元素は１７７Ｌｕであり得る。スカンジウムの放射性同位元素は４３／４４Ｓｃであり得る。チタンの放射性同位元素は４５Ｔｉであり得る。マンガンの放射性同位元素は５２Ｍｎであり得る。インジウムの放射性同位元素は１１１Ｉｎであり得る。
【0026】
別の態様において、本発明は、患者を画像化する方法であって、
－患者に、本明細書に定義される放射性核種標識コンジュゲートを投与すること、及び
－患者を画像化すること
を含む方法に関する。
－患者に、本明細書に定義される放射性核種標識コンジュゲートを投与すること、及び
－患者を画像化すること
を含む方法に関する。
【0027】
別の態様において、本発明は、細胞又はインビトロ生検試料を画像化する方法であって、
－細胞又はインビトロ生検試料に、本明細書に定義される放射性核種標識コンジュゲートを投与すること、及び
－細胞又はインビトロ生検試料を画像化すること
を含む方法に関する。
－細胞又はインビトロ生検試料に、本明細書に定義される放射性核種標識コンジュゲートを投与すること、及び
－細胞又はインビトロ生検試料を画像化すること
を含む方法に関する。
【0028】
別の態様において、本発明は、患者の癌を治療する方法であって、
－患者に、本明細書に定義される放射性核種標識コンジュゲートを提供すること、それにより
－患者を治療すること
を含む方法に関する。
－患者に、本明細書に定義される放射性核種標識コンジュゲートを提供すること、それにより
－患者を治療すること
を含む方法に関する。
【0029】
別の態様において、本発明は、患者の癌の治療に使用するための、本明細書に定義される放射性核種標識コンジュゲートの製造に関する。
【0030】
別の態様において、本発明は、患者の癌の治療に使用するための、本明細書に定義される放射性核種標識コンジュゲートに関する。
【0031】
別の態様において、本発明は、患者の癌を治療する方法であって、本明細書に定義される放射性核種標識コンジュゲートを患者に投与すること、それにより患者の癌を治療することを含む方法に関する。
【0032】
本明細書で使用される通り、文脈により別のことが要求されない限り、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」並びに「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含んでいた（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」などの用語の変形体は、さらなる添加剤、成分、整数、又は工程を除外しないものとする。本明細書で使用される通り、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」と「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は互換的に使用される。
【0033】
本発明のさらなる態様及び前述の段落に記載された態様のさらなる実施形態は、例として挙げられ且つ添付図面を参照して与えられる、以下の説明から明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【0034】
【図1】実例となるモノマー性及びダイマー性ＰＳＭＡリガンドの構造。
【図2】ＬＮＣａＰ異種移植片腫瘍を有するマウスの、８９Ｚｒ－ＤＦＯＳｑ ＰＳＭＡトレーサーの注射の１及び１８時間後の代表的な全身マイクロＰＥＴ及びＣＴ画像（ＣＴは８９Ｚｒ－（２）に関しては実施されなかった）。
【図3】ａ）ＬＮＣａＰ腫瘍へのトレーサー取込みの時間放射能曲線。各試験のＰＥＴ画像は分析され、結果は平均±ＳＥＭ、ｎ＝３で示される。データは、各時点での腫瘍ＳＵＶｍａｘの差異に関して分析された（ｔ検定）。ｎ．ｓ．Ｐ＝非有意、＊Ｐ＜０．０５；上部から下部への曲線：８９Ｚｒ－（４）、８９Ｚｒ－（３）、８９Ｚｒ－（１）、及び８９Ｚｒ－（２）、ｂ）エクスビボ生体内分布分析。マウスは注射の１及び１８時間後に安楽死させられ、トレーサー取込みは、グラム組織あたりの注射線量（ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｄｏｓｅ）のパーセントとして表される。データは、ｎ＝３マウス／群の平均±ＳＥＭを表す。
【図4】：エクスビボ生体内分布分析。マウスは、注射後１及び１８時間で安楽死させられた。組織は収集され、秤量され、ガンマカウンターで計測された。トレーサー取込みは、グラム組織あたりの注射線量のパーセントで表される。データは、ｎ＝３マウス／群の平均±ＳＥＭを表す。
【図5】ＬＮＣａＰ異種移植片腫瘍を有するマウスの、６８Ｇａ－ＤＦＯＳｑ ＰＳＭＡトレーサーの注射の１及び２時間後の代表的な全身マイクロＰＥＴ及びＣＴ画像。
【図6】（左）インビボのＬＮＣａＰ腫瘍へのＰＳＭＡトレーサーの取込み。各試験のＰＥＴ画像は分析され、結果は平均±ＳＥＭ、ｎ＝３で示される。（右）エクスビボ生体内分布分析。マウスは、（１）（上部パネル）又は（３）（下部パネル）による注射後（ｐ．ｉ．）１及び２．５時間で安楽死させられた。組織は収集され、秤量され、ガンマカウンターを使用して計測された。トレーサー取込みは、グラム組織あたりの注射線量のパーセントで表される。データは、ｎ＝３マウス／群の平均±ＳＥＭを表す。
【図7】
８９Ｚｒ－ＰＳＭＡトレーサーのＰＳＭＡ陽性ＬＮＣａｐ細胞取込み、左パネル、細胞表面結合放射能及び右パネル、内在化放射能。取込みは、添加放射能（ＡＲ）／ｍｇタンパク質のパーセンテージで表される。結果は平均±ＳＥＭ、ｎ＝３技術的反復を表す。
【図8】
８９Ｚｒ－（３）のラジオＨＰＬＣトレース。
【図9】
８９Ｚｒ－（４）のラジオＨＰＬＣトレース。
【図10】ＤＦＯ－Ｓｑコンジュゲートされたオクトレオテート及びオクトレオチド分子の構造。
【図11】
８９Ｚｒ－ＤＦＯＳｑＴＩＤＥ／ＴＡＴＥペプチドのラジオＨＰＬＣトレース（方法、８９Ｚｒ－ＤＦＯＳｑＴＩＤＥ：１５分にわたりＡ（ＭｉｌｌＩＱ中０．０５％ＴＦＡ）に対して２０～１００％緩衝液Ｂ（０．０５％ＴＦＡ ＡＣＮ）８９Ｚｒ－ＤＦＯＳｑＴＡＴＥ：１５分にわたりＡ（ＭｉｌｌＩＱ中０．０５％ＴＦＡ）に対して０～９５％緩衝液Ｂ（０．０５％ＴＦＡ ＡＣＮ）。上部トレースは８９Ｚｒ－ＤＦＯＳｑＴＩＤＥであり、下部トレースは８９Ｚｒ－ＤＦＯＳｑＴＡＴＥである。
【図12】
８９Ｚｒ－ＤＦＯＳｑＴＩＤＥ及び８９Ｚｒ－ＤＦＯＳｑＴＡＴＥを注射されたマウスの、異なる時点で画像化された代表的なＰＥＴ画像。
【図13】ａ）ＡＲ４２Ｊ腫瘍へのトレーサー取込みの時間放射能曲線及び腫瘍対肝臓の比。各試験のＰＥＴ画像は分析され、結果は平均±ＳＥＭ、ｎ＝３で示される。データは、時点での腫瘍ＳＵＶｍａｘの差異に関して分析された（ｔ検定）。＊＊Ｐ＜０．０１；ｂ）エクスビボ生体内分布分析。マウスは、ＤＦＯＳｑＴＩＤＥ又はＤＦＯＳｑＴＡＴＥの注射後１及び１８時間で安楽死させられた。組織は収集され、秤量され、ガンマカウンターで計測された。トレーサー取込みは、グラム組織あたりの注射線量のパーセントで表される。データはｎ＝３マウス／群の平均±ＳＥＭを表す。
【図14】
６８Ｇａ－ＤＦＯＳｑＴＩＤＥ／ＴＡＴＥペプチドのラジオＨＰＬＣトレース（方法、１５分にわたりＡ（ＭｉｌｌＩＱ中０．０５％ＴＦＡ）に対して２０～１００％緩衝液Ｂ（０．０５％ＴＦＡ ＡＣＮ）。上部トレースは６８Ｇａ－ＤＦＯＳｑＴＩＤＥであり、下部トレースは６８Ｇａ－ＤＦＯＳｑＴＡＴＥである。
【図15】
６８ＧａＤＦＯＳｑ－ＴＩＤＥ及び６８ＧａＤＦＯＳｑ－ＴＡＴＥトレーサーを注射されたマウスの、異なる時点で画像化された代表的なＰＥＴ画像。標準取込値（ＳＵＶｍａｘ＝組織中の放射能／注射された放射能／ＢＷ）を使用する画像における取込みの定量化を（ｃ）に示す。
【図16】マウスが６８ＧａＤＦＯＳｑ－ＴＩＤＥか６８ＧａＤＦＯＳｑ－ＴＡＴＥ（２～３ＭＢｑ、１μｇ、０．５ナノモル）のいずれかを注射され、次いで投与後１時間か２時間のいずれかで安楽死されられたマウスモデルにおけるエクスビボ生体内分布試験。腫瘍及び主要器官内の組織のグラムあたりの注射された放射能の量（％ＩＡ／ｇ）が定量化された。
【発明を実施するための形態】
【0035】
本明細書に開示され定義される本発明が、言及されるか又は文章若しくは図面から明らかである個別の特徴の２つ以上の選択し得る組合せの全てに及ぶことが理解されるだろう。これらの異なる組合せの全てが、本発明の種々の選択し得る態様を構成する。
【0036】
本発明のさらなる態様及び前述の段落に記載された態様のさらなる実施形態は、例として挙げられ且つ添付図面を参照して与えられる以下の説明から明らかになるだろう。
【0037】
本発明の特定の実施形態が詳細に言及されるだろう。本発明は、実施形態と併せて説明されるが、その意図が本発明をそれらの実施形態に限定するのではないことが理解されるだろう。それとは逆に、本発明は、特許請求の範囲により定義される本発明の範囲内に含まれ得る全代替物、改変物、及び等価物を含むものとする。
【0038】
本発明は、本明細書に定義される式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容できる誘導体、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）標的剤とのそのコンジュゲート、及びその放射性核種コンジュゲートに関する。
【0039】
一態様において、本発明は、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容できる誘導体を提供する：
（式中、Ｘは、
Ｃ１～Ｃ１０アルキル、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、又はその誘導体により任意選択で置換されているアリール；及び
（Ｃ１～Ｃ１０アルキル）ＮＲ７（Ｙ２）Ｒ８（式中、Ｒ７及びＲ８は、Ｃ１～Ｃ１０アルキル又はＣ１～Ｃ１０アルキルフェニルから独立に選択され得て、Ｃ１～Ｃ１０アルキルはｎ個のアミド基により介在され得て、ｎは０～３である）
からなる群から選択され、且つ
Ｙ１及びＹ２は、カルボン酸、エステル、無水物、及びアミンからなる群から独立に選択される）。
【化12】
Ｃ１～Ｃ１０アルキル、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、又はその誘導体により任意選択で置換されているアリール；及び
（Ｃ１～Ｃ１０アルキル）ＮＲ７（Ｙ２）Ｒ８（式中、Ｒ７及びＲ８は、Ｃ１～Ｃ１０アルキル又はＣ１～Ｃ１０アルキルフェニルから独立に選択され得て、Ｃ１～Ｃ１０アルキルはｎ個のアミド基により介在され得て、ｎは０～３である）
からなる群から選択され、且つ
Ｙ１及びＹ２は、カルボン酸、エステル、無水物、及びアミンからなる群から独立に選択される）。
【0040】
式（Ｉ）の化合物は、ＰＳＭＡ標的剤とのコンジュゲートに好適な「ＤＦＯ－スクアラミド」（本明細書で「ＤＦＯＳｑ」とも称される）の誘導体である。発明者らは、驚くべきことに、芳香族又はアリールリンカー基を、ＤＦＯ系部分と標的剤の間に含むことにより、腫瘍標的化が改善されることを見出した。腫瘍標的化の改善は、多数の標的剤をＤＦＯ系部分にコンジュゲートすることによっても達成された。驚くべきことに、腫瘍標的化は、多数の標的剤を、芳香族リンカー基を介してＤＦＯ系部分にコンジュゲートすることによりさらに改善した。
【0041】
ＰＳＭＡ標的剤をダイマー配置で含む式（Ｉ）の化合物は、驚くべきことに、腫瘍標的化改善を示した。好都合には、ＰＳＭＡ標的剤をダイマー配置で含む式（Ｉ）の化合物は、化合物の腫瘍中のより高い総取込み及び標的とされた腫瘍への特異性増加の両方を示した。ＰＳＭＡ標的剤をダイマー配置で含む式（Ｉ）の化合物は、モノマー配置を有する標的剤と比べて注射後２時間までの腫瘍中のより長い滞留時間を示した。
【0042】
式（Ｉ）のその薬学的に許容できる誘導体は、ＤＦＯ＊などのＤＦＯ－アナログから調製され得る（Ｐａｔｒａ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０１４，５０，１１５２３－１１５２５）。ＤＦＯ＊はＤＦＯ－アナログであり、追加のヒドロキサム酸を有するＤＦＯの拡大バージョンであり、ＤＦＯから容易に調製される。ＤＦＯ＊は、Ｚｎ４＋の八座キレート剤であり、８９Ｚｎ－ＤＦＯ＊錯体は、ＤＦＯ錯体と比べて増加したインビトロ安定性を示すことが示された。ＤＦＯ＊及びＤＦＯ＊－スクアラミドは、ＰＳＭＡ標的剤とのコンジュゲートに好適である。さらに、モデルタンパク質と連結されたＤＦＯ＊誘導体は、担癌マウスにおいて良好な腫瘍取込み及び著しい低い骨取込みを示した。改善されたインビトロ安定性及びインビボ性質は、ＤＦＯ＊、ＤＦＯ＊－スクアラミド、又はその誘導体が本発明の化合物に組み込まれるのにも好適であり得ることを示す。
【0043】
本発明のいずれの態様又は実施形態においても、本発明の式（Ｉ）若しくは（ＩＩ）の化合物、コンジュゲート、若しくは放射性核種コンジュゲート中、又は本明細書に示されるあらゆる構造中のＤＦＯは、その薬学的に許容できる誘導体、例えばＤＦＯ＊などのＤＦＯ－アナログに置換され得る。ＤＦＯ＊の構造は、以下に示される：
。
【化13】
【0044】
本発明のいずれの態様又は実施形態においても、式（Ｉ）の化合物のＤＦＯ＊アナログは、以下の式による構造を有する：
。
【化14】
【0045】
本発明のいずれの態様又は実施形態においても、式（ＩＩ）の化合物のＤＦＯ＊アナログは、以下の式による構造を有する：
。
【化15】
【0046】
本発明のいずれの態様又は実施形態においても、式（Ｉ）の化合物のＤＦＯ＊アナログ若しくはその薬学的に許容できる誘導体、又はその薬学的に許容できる塩は、
からなる群から選択され得る。
【化16】
【化17】
【0047】
アリールリンカー及びＰＳＭＡ標的剤の両方をダイマー配置で含む式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容できる誘導体は、驚くべきことに、ＰＳＭＡ標的剤のみをダイマー配置で含む式（Ｉ）の化合物と比べて改善された腫瘍標的化を示した。
【0048】
アリールリンカー及びＰＳＭＡ標的剤の両方をダイマー配置で含む式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容できる誘導体は、ＰＳＭＡ標的剤のみをダイマー配置で含む化合物と比べて増加した細胞内在化を示した。
【0049】
本発明の式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容できる誘導体は、注射後１８時間で著しいクリアランス（５０％以上）を示した。
【0050】
発明者らは、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容できる誘導体とＰＳＭＡ標的剤の放射性標識されたコンジュゲートが、ＰＥＴ画像化剤として使用されるいくつかの公知の放射性核種キレート剤（特に他のＤＦＯ系キレート剤）よりも改善された腫瘍標的化及び組織選択性を示すことを見出した。
【0051】
本発明は、式（ＩＩ）のコンジュゲート若しくはその薬学的に許容できる誘導体：
又は薬学的に許容できるその塩も提供する（式中、ＲはＣＨ２Ｏ又はＣＯＯである）。一実施形態において、ＲはＣＨ２Ｏである。別の実施形態において、ＲはＣＯＯである。
【化18】
【0052】
式（ＩＩ）のコンジュゲートは、ソマトスタチンサブタイプ２受容体（ｓｓｔｒ２）標的剤を含む「ＤＦＯ－スクアラミド」（本明細書で「ＤＦＯＳｑ」とも称される）の誘導体である。用語「ｓｓｔｒ２標的剤」は、ソマトスタチンサブタイプ２受容体を標的化する能力を有するペプチドを指す。薬剤はペプチドであり得る。一実施形態において、ＲがＣＨ２Ｏである場合、ｓｓｔｒ２標的剤はオクトレオチドである。別の実施形態において、ＲがＣＯＯである場合、ｓｓｔｒ２標的剤はオクトレオテートである。
【0053】
式（ＩＩ）の化合物又はその薬学的に許容できる誘導体は、好都合には、注射の２時間後に、ｓｓｔｒタンパク質がない腫瘍と比べてｓｓｔｒタンパク質の存在下で、腫瘍中で増加した滞留を示した。
【0054】
ＲがＣＯＯである式（ＩＩ）の化合物は、好都合には、なおさらに改善された腫瘍標的化を提供する。ＲがＣＯＯである式（ＩＩ）の化合物は、標的とされた腫瘍中での増加した取込み及び注射後２時間で増加した滞留を示した。式（ＩＩ）の化合物は、注射後１８時間で著しい（５０％以上）クリアランスを示した。
【0055】
本明細書に開示される化合物の「薬学的に許容できる塩」は、過度の毒性も発癌性もなしに、且つ、好ましくは刺激、アレルギー反応、又は他の問題若しくは合併症なしに、ヒト又は動物の組織と接触させて使用するのに好適であると一般的に当分野において考えられる酸又は塩基塩である。そのような塩としては、アミンなどの塩基性残基の無機及び有機酸塩、並びにカルボン酸などの酸性残基のアルカリ又は有機塩がある。
【0056】
好適な薬学的に許容できる塩としては、塩化水素酸、リン酸、臭化水素酸、リンゴ酸、グリコール酸、フマル酸、硫酸、スルファミン酸、スルファニル酸、ギ酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、エタンジスルホン酸、２－ヒドロキシエチルスルホン酸、硝酸、安息香酸、２－アセトキシ安息香酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、ステアリン酸、サリチル酸、グルタミン酸、アスコルビン酸、パモ酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、プロピオン酸、ヒドロキシマイエン酸（ｈｙｄｒｏｘｙｍａｉｅｉｃ）、ヨウ化水素酸、フェニル酢酸、アルカン酸（酢酸など、ｎが０～６の整数、すなわち０、１、２、３、４、５又は６であるＨＯＯＣ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯＯＨ）などの酸の塩があるが、これらに限定されない。同様に、薬学的に許容できるカチオンとしては、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アルミニウム、リチウム、及びアンモニウムがあるが、これらに限定されない。当業者は、本明細書に提供される化合物のためのさらなる薬学的に許容できる塩を認識するだろう。一般に、薬学的に許容できる酸又は塩基塩は、従来の化学的方法により、塩基性又は酸性部分を含む親化合物から合成できる。簡潔にいうと、そのような塩は、遊離酸又は塩基形態のこれらの化合物を、化学量論量の適切な塩基又は酸と、水中若しくは有機溶媒（エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、又はアセトニトリルなど）中、又は２種の混合物中で反応させることにより調製できる。
【0057】
式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物又はコンジュゲートが、水和物、溶媒和物、又は（放射性核種以外の金属への）非共有結合性の錯体として存在し得るが、そのように存在することが必要ではないことが明らかだろう。さらに、種々の結晶形及び多形体は、本明細書に提供される化合物のプロドラッグと同様に、本発明の範囲内にある。
【0058】
「プロドラッグ」は、本明細書に提供される化合物の構造的要件を完全に満たさない可能性があるが、対象又は患者への投与後にインビボで修飾されて、本明細書に提供される放射性標識されたコンジュゲートを生み出す化合物である。例えば、プロドラッグは、放射性標識されたコンジュゲートのアシル化された誘導体であり得る。プロドラッグは、ヒドロキシル又はアミン基が、哺乳動物の対象に投与されると、切断して、それぞれ遊離のヒドロキシル又はアミン基を形成する任意の基に結合している化合物を含む。プロドラッグの例としては、放射性標識されたコンジュゲート内のアミン官能基のアセテート、ホルメート、ホスフェート、及びベンゾエート誘導体があるが、これらに限定されない。プロドラッグは、修飾部分がインビボで切断されて親化合物が生じるように、化合物中に存在する官能基を修飾することにより調製され得る。
【0059】
本明細書で使用される「置換基」は、着目した分子内の原子に共有結合している分子部分を指す。本明細書で使用される用語「置換された」は、指定された原子の正常な原子価を超えず、置換が、安定な化合物、すなわち単離、特性化、及び生物学的活性の試験ができる化合物を生み出すという条件で、指定された原子上の任意の１つ以上の水素が、示される置換基から選ばれたものに置き換えられることを意味する。置換基が、オキソ、すなわち＝Ｏである場合、原子上の２つの水素が置き換えられている。芳香族炭素原子の置換基であるオキソ基は、－ＣＨ－の－Ｃ（＝Ｏ）－への転化及び芳香族性の喪失をもたらす。例えば、オキソにより置換されたピリジル基はピリドンである。好適な置換基の例は、アルキル、ヘテロアルキル、ハロゲン（例えば、フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素原子）、ＯＨ、＝Ｏ、ＳＨ、ＳＯ２、ＮＨ２、ＮＨアルキル、＝ＮＨ、Ｎ３、及びＮＯ２基である。
【0060】
用語「任意選択で置換されている」は、１、２、３、又はそれ以上の水素原子が、互いに独立に、アルキル、ハロゲン（例えば、フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素原子）、ＯＨ、＝Ｏ、ＳＨ、＝Ｓ、ＳＯ２、ＮＨ２、ＮＨアルキル、＝ＮＨ、Ｎ３、又はＮＯ２基で置き換えられた基を指す。
【0061】
多重の置換度は、指定された原子の正常な原子価を超えず、置換が、安定な化合物、すなわち単離、特性化、及び生物学的活性の試験ができる化合物を生み出すという条件で許容され得る。
【0062】
本明細書で使用される通り、例えば、「１～１０」など、長さの範囲の限界を定義する言い方は、１～１０のあらゆる整数、すなわち１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０を意味する。言い換えると、明示される２つの整数により定義されるあらゆる範囲は、前記限界を定義するあらゆる整数及び前記範囲に含まれるあらゆる整数を含み、開示することを意味する。
【0063】
用語「アルキル」は、１～１０個の炭素原子、例えばｎ－オクチル基、特に１～６個、すなわち１、２、３、４、５、又は６個の炭素原子を含む飽和、直鎖又は分岐鎖炭化水素基を指す。本明細書で使用されるアルキルの例としては、メチル、エチル、プロピル、ｉｓｏ－プロピル、ｎ－ブチル、ｉｓｏ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、ｉｓｏ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、２，２－ジメチルブチルがあるが、これらに限定されない。アルキル基は、置換基により任意選択で置換されていてよく、多重の置換度が許容される。アルキル基は、Ｎ、Ｓ、又はＯ原子などの非炭素原子により介在され得る。一実施形態において、Ｃ１～Ｃ１０アルキル基は、ｎ個のアミド基により介在され得て、ここで、ｎは０～３である。ｎ個のアミド基により介在されるＣ１～Ｃ１０アルキル基としては、（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）３及び（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）３Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２がある。
【0064】
本明細書で使用される通り、用語「アルキル」は、１～２０原子の最長の直鎖長さ、すなわち１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個の原子を含み、直鎖が、Ｎ、Ｓ、又はＯ原子などの非炭素原子を含み得る基も指し得る。一実施形態において、１～２０原子の最長直鎖長さを含むアルキル基は、ｎ個のアミド基（式中、ｎは０～３である）を含み得る。ｎ個のアミド基を含み、１～２０原子の最長直鎖長さを含むアルキル基としては、（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）３及び（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）３Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２がある。
【0065】
用語「アリール」は、６～１４個の環炭素原子、好ましくは６～１０（特に６）個の環炭素原子を含む１個以上の環を含む芳香族基を指す。例は、フェニル、ナフチル、及びビフェニル基である。本発明における使用に好適な置換されたアリール基の例としては、ｐ－トルエンスルホニル（Ｔｓ）、ベンゼンスルホニル（Ｂｓ）、及びｍ－ニトロベンゼンスルホニル（Ｎｓ）がある。
【0066】
Ｘは、ＤＦＯＳｑ分子に１結合部位で、Ｙ１に第２の結合部位で共有結合しているリンカー基である。Ｙ１は、リンカー基Ｘを介するＰＳＭＡ標的剤のＤＦＯＳｑ分子へのコンジュゲーションのための任意の好適な官能基であり得る。
【0067】
本発明の好ましい化合物は、Ｘが、
Ｃ１～Ｃ１０アルキル、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、又はその誘導体により任意選択で置換されているアリール；及び
（Ｃ１～Ｃ１０アルキル）ＮＲ７（Ｙ２）Ｒ８（式中、Ｒ７及びＲ８は、Ｃ１～Ｃ１０アルキル又はＣ１～Ｃ１０アルキルフェニルから独立に選択され得て、Ｃ１～Ｃ１０アルキルはｎ個のアミド基により介在され得て、ｎは０～３である）からなる群から選択され、且つ
Ｙ１及びＹ２が、カルボン酸、エステル、無水物、及びアミンからなる群から独立に選択されるものである。
Ｃ１～Ｃ１０アルキル、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、又はその誘導体により任意選択で置換されているアリール；及び
（Ｃ１～Ｃ１０アルキル）ＮＲ７（Ｙ２）Ｒ８（式中、Ｒ７及びＲ８は、Ｃ１～Ｃ１０アルキル又はＣ１～Ｃ１０アルキルフェニルから独立に選択され得て、Ｃ１～Ｃ１０アルキルはｎ個のアミド基により介在され得て、ｎは０～３である）からなる群から選択され、且つ
Ｙ１及びＹ２が、カルボン酸、エステル、無水物、及びアミンからなる群から独立に選択されるものである。
【0068】
一実施形態において、式（Ｉ）の化合物はモノマー性である。モノマー形態の式（Ｉ）の化合物は１つのＹ官能基（Ｙ１）を含み、１つのＰＳＭＡ標的剤をコンジュゲートすることが可能である。この実施形態の好ましい形態において、Ｘは芳香族基を含む。より好ましくは、Ｘは、フェニル、ベンジル、及びＥＤＴＡ官能化フェニルからなる群から選択される。好ましくは、Ｙ１はカルボキシル基である。
【0069】
別の実施形態において、式（Ｉ）の化合物はダイマー性である。ダイマー形態の式（Ｉ）の化合物は２つのＹ官能基（Ｙ１及びＹ２）を含み、２つのＰＳＭＡ標的剤をコンジュゲートすることが可能である。この実施形態の好ましい形態において、Ｘは、（Ｃ１～Ｃ１０アルキル）ＮＲ７（Ｙ２）Ｒ８、好ましくは（ＣＨ２）２ＮＲ７（Ｙ２）Ｒ８であり、式中、Ｒ７及びＲ８は、Ｃ１～Ｃ１０アルキル又はＣ１～Ｃ１０アルキルフェニルから独立に選択され得て、Ｃ１～Ｃ１０アルキルはｎ個のアミド基により介在され得て、ｎは０～３である。好ましくは、Ｒ７及びＲ８は、（ＣＨ２）２、（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）３、及び（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）３Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２－フェニルから独立に選択される。Ｒ７とＲ８は、同一でも、異なっていてもよく、好ましくは同一である。この実施形態の好ましい態様において、Ｙ１及びＹ２はアミン又はカルボン酸である。好ましくは、Ｙ１とＹ２は同一である。
【0070】
本明細書で使用される通り、用語「放射性核種標識コンジュゲート」は、
－放射性核種と配位錯体を形成したＰＳＭＡ標的剤にコンジュゲートされた本明細書に定義される式（Ｉ）の化合物；又は
－放射性核種と配位錯体を形成した式（ＩＩ）のコンジュゲート
を指す。
－放射性核種と配位錯体を形成したＰＳＭＡ標的剤にコンジュゲートされた本明細書に定義される式（Ｉ）の化合物；又は
－放射性核種と配位錯体を形成した式（ＩＩ）のコンジュゲート
を指す。
【0071】
一般的に、これは、式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物又はコンジュゲートの電子供与性基（ヒドロキサメート基など）と放射性核種の間の配位結合の形成の結果として起こる。
【0072】
本発明の化合物において、配位結合は、ＤＦＯ又はＤＦＯ＊のヒドロキサム酸基と放射性核種の間に形成されると仮定される。しかし、理論により拘束されることは望まないが、発明者らは、（ＤＦＯ又はＤＦＯ＊のヒドロキサム酸基に加えて）スクアレート部分上のオキソ基もドナー原子として機能して、式（Ｉ）の化合物が放射性核種に結合できる１つ又は２つの追加の部位を提供するとも考えている。これは、八配位錯体をもたらし、八配位構造を有する放射性核種（８９Ｚｒなど）の安定性の観点から非常に好都合であり、本発明の錯体に関して観察される安定性を説明し得る。具体的には、それは、他のＤＦＯ又はＤＦＯ＊系の画像化剤と比べて、放射性核種が標的組織から（骨などの他の組織に）容易に浸出せず、したがって改善された画像化の質をもたらす理由を説明し得る。現在使用されているキレート剤に対する本発明の化合物のこれらの利点は、図及び実施例に説明される。
【0073】
スクアレート部分、例えばスクアラミドは、標的剤の標的化を補助する役割も果たし得る。さらに、スクアレート部分は、イソチオシアナトＤＦＯ誘導体と比べて高い溶解度も提供する。
【0074】
本明細書で使用される通り、用語「放射性核種」（通常、放射性同位元素又は放射性同位体とも称される）は、不安定な核を有する原子である。それは、放射性崩壊をして、核放射線（ガンマ線及び／又はアルファ若しくはベータ粒子などの亜原子粒子など）の放出を起こす。一実施形態において、放射性核種は、放射線免疫療法用途にも有用であるものである（例えば、ベータ粒子放射体）。好ましくは、放射性核種は八配位構造を有する。本発明での使用に好適な放射性核種の例としては、ジルコニウム（例えば、８９Ｚｒ）、ガリウム（例えば、６７Ｇａ及び６８Ｇａ）、ルテチウム（例えば、１７６Ｌｕ及び１７７Ｌｕ）、ホルミウム（例えば、１６６Ｈｏ）、スカンジウム（例えば、４３Ｓｃ、４４Ｓｃ、及び４７Ｓｃ）、チタン（例えば、４５Ｔｉ）、マンガン（例えば、５２Ｍｎ）、インジウム（例えば、１１１Ｉｎ及び１１５Ｉｎ）、イットリウム（例えば、８６Ｙ及び９０Ｙ）、テルビウム例えば、（１４９Ｔｂ、１５２Ｔｂ、１５５Ｔｂ、及び１６１Ｔｂ）、テクネチウム（例えば、９９ｍＴｃ）、サマリウム（例えば、１５３Ｓｍ）、及びニオブ（例えば、９５Ｎｂ及び９０Ｎｂ）の放射性同位元素がある。本発明に使用するための放射性核種は、ガリウム（具体的には、６７Ｇａ及び６８Ｇａ）、インジウム（具体的には、１１１Ｉｎ）、ジルコニウム（具体的には、８９Ｚｒ）、及びアルミニウムフルオリド（具体的には、１８Ｆが放射性同位元素であり、Ａｌが担体であるＡｌ１８Ｆ）から選択され得る。本発明に使用するための放射性核種は、６８Ｇａ、１１１Ｉｎ、及び８９Ｚｒから選択され得る。例えば、６８Ｇａは、ＤＦＯと結合することが示されており（Ｕｅｄａ ｅｔ ａｌ（２０１５）Ｍｏｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｂｉｏｌ，ｖｏｌ．１７，ｐａｇｅｓ １０２－１１０参照）、インジウムはジルコニウムに類似の配位化学を有する（したがって、同様に式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物に結合すると予測されるだろう）。
【0075】
本発明の化合物又はコンジュゲートが、ＭＲＩなどの画像化用途に使用される非放射性金属も錯化できることが当業者により理解されるだろう。そのような金属の例はガドリニウム（例えば、１５２Ｇｄ）である。
【0076】
上述の通り、本発明は、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容できる塩とＰＳＭＡ標的剤のコンジュゲートにも関する。
【0077】
本明細書で使用される通り、用語「ＰＳＭＡ標的剤」は、前立腺特異的膜抗原を標的化する能力を有する部分を指す。好ましくは、ＰＳＭＡ標的剤はペプチドであるか、又は尿素連結ジペプチド、より好ましくはＬｙｓ－尿素－Ｇｌｕである。標的剤は、官能基Ｙ（Ｙ１及び／又はＹ２）と反応して、標的剤と式（Ｉ）の化合物の間の共有結合を形成する官能基（リジン残基のアミン基など）を有するだろう。これにより、コンジュゲートが形成される。コンジュゲートは、それに錯化された放射性核種も含み得る。これにより、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容できる塩と、標的剤と、それに錯化された放射性核種の放射性核種標識コンジュゲートが製造される。一実施形態において、放射性核種は、ジルコニウムの放射性同位元素（例えば、８９Ｚｒ）である。
【0078】
式（Ｉ）の化合物、コンジュゲート、及び放射性核種錯体は、当業者に公知である任意の好適な方法により合成できる。本発明によるコンジュゲートが、式（Ｉ）の化合物をＰＳＭＡ標的剤と反応させることにより調製され得ることは当業者には明らかだろう。本発明によるコンジュゲートが、ＰＳＭＡ標的剤を、リンカー基Ｘ（又はその一部）により官能基Ｙ（Ｙ１及び／又はＹ２）を介して官能化し、官能化されたＰＳＭＡ標的剤をＤＦＯＳｑと反応させることにより調製され得ることも当業者には明らかだろう。
【0079】
式（Ｉ）の化合物のモノマー性コンジュゲートの合成方法の一例はスキーム１で以下に与えられる。
スキーム１：モノマー性ＰＳＭＡリガンドへの合成経路。（ｉ）ＨＡＴＵ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦ、Ｆｍｏｃ－ＰＡＭＢＡ－ＯＨ又はＦｍｏｃ－ＰＡＢＡ－ＯＨ（ｉｉ）ＴＦＡ、（ｉｉｉ）ＤＦＯＳｑ、０．１Ｍホウ酸緩衝液ｐＨ９．０（ｉｖ）ＥＤＴＡ－無水物、次いでエチレンジアミン、ＤＭＦ。
【化19】
【0080】
式（Ｉ）の化合物のダイマー性コンジュゲートの合成方法の一例はスキーム２で以下に与えられる。
スキーム２：ダイマー性ＰＳＭＡリガンドへの合成経路、（ｉ）グルタル酸無水物、ＤＩＰＥＡ、ＤＣＭ（ｉｉ）Ｆｍｏｃ－ＰＡＭＢＡ－ＯＨ、ＨＡＴＵ、ＤＭＦ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦ中２０％ピペリジン（ｉｉｉ）グルタル酸無水物、ＤＩＰＥＡ、ＤＣＭ（ｉｖ）トレン、ＤＭＦ（ｖ）ＦｅＣｌ３、ＨＡＴＵ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦ、Ｇｌｕｔ－ＰＳＭＡ（ＯｔＢｕ）３リガンド又はＧｌｕｔ－ＰｈＰＳＭＡ（ＯｔＢｕ）３リガンド（ｖ）ＥＤＴＡ、ＤＭＦ、水、次いでＤＣＭ中２０％ＴＦＡ。
【化20】
【0081】
式（Ｉ）又は（ＩＩ）のコンジュゲートを放射性核種がない状態で調製できることも当業者には明らかだろう。この実施形態において、放射性核種は、コンジュゲートが調製されるとコンジュゲートに加えられる。或いは、放射性核種がない式（Ｉ）又は（ＩＩ）のコンジュゲートは、癌細胞から必須栄養素である（Ｆｅ）を奪うことにより、癌の標的化された鉄キレート化治療に有用であり得る。
【0082】
本発明は、
－式（Ｉ）の化合物：
又はその薬学的に許容できる塩（式中、Ｘ及びＹは本明細書に定義される通りである）、
－ＰＳＭＡ標的剤、及び
－それに錯化された放射性核種
の放射性核種標識コンジュゲート並びに１種以上の薬学的に許容できる担体物質、賦形剤、及び／又は補助剤を含む医薬組成物にも関する。
－式（Ｉ）の化合物：
【化21】
－ＰＳＭＡ標的剤、及び
－それに錯化された放射性核種
の放射性核種標識コンジュゲート並びに１種以上の薬学的に許容できる担体物質、賦形剤、及び／又は補助剤を含む医薬組成物にも関する。
【0083】
本発明は、
－式（ＩＩ）のコンジュゲート：
又はその薬学的に許容できる塩（式中、Ｒは本明細書に定義される通りである）、及び
－それに錯化された放射性核種
の放射性核種標識コンジュゲート並びに１種以上の薬学的に許容できる担体物質、賦形剤、及び／又は補助剤を含む医薬組成物にも関する。
－式（ＩＩ）のコンジュゲート：
【化22】
－それに錯化された放射性核種
の放射性核種標識コンジュゲート並びに１種以上の薬学的に許容できる担体物質、賦形剤、及び／又は補助剤を含む医薬組成物にも関する。
【0084】
医薬組成物は、例えば、水、緩衝液（例えば、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、クエン酸塩、及び酢酸塩）、エタノール、油、炭水化物（例えば、グルコース、フルクトース、マンノース、スクロース、及びマンニトール）、タンパク質、ポリペプチド又はグリシンなどのアミノ酸、酸化防止剤（例えば、亜硫酸水素ナトリウム）、張性調整剤（塩化カリウム及び塩化カルシウムなど）、ＥＤＴＡなどのキレート剤、又はグルタチオン、ビタミン及び／若しくは保存剤の１種以上を含み得る。
【0085】
医薬組成物は、好ましくは非経口投与用に製剤されるだろう。本明細書で使用される用語「非経口」は、皮下、皮内、血管内（例えば、静脈内）、筋肉内、脊髄、頭蓋内、髄腔内、眼内、眼球周囲、眼窩内、関節滑液嚢内、及び腹腔内注射、並びにあらゆる類似の注射又は注入技法を含む。静脈内投与が好ましい。非経口製剤の好適な成分及びそのような製剤を製造する方法は、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”を含む種々の教科書に詳述されている。
【0086】
本発明の組成物は、通常の方法で、患者に非経口で投与されるだろう。その場合、ＤＦＯ－スクアラミドコンジュゲート錯体は、全身で標的部位に分布するには１時間～２４時間の範囲かかり得る。所望の分布が達成されると、患者は画像化されるだろう。
【0087】
したがって、本発明は、患者を画像化する方法であって、
－患者に、本明細書に定義される放射性核種標識コンジュゲートを投与すること；及び
－前記患者を画像化すること
を含む方法にも関する。
－患者に、本明細書に定義される放射性核種標識コンジュゲートを投与すること；及び
－前記患者を画像化すること
を含む方法にも関する。
【0088】
本発明は、細胞又はインビトロ生検試料を画像化する方法であって、
－細胞又はインビトロ生検試料に、本明細書に定義される放射性核種標識コンジュゲートを投与すること；及び
－細胞又はインビトロ生検試料を画像化すること
を含む方法にも関する。
－細胞又はインビトロ生検試料に、本明細書に定義される放射性核種標識コンジュゲートを投与すること；及び
－細胞又はインビトロ生検試料を画像化すること
を含む方法にも関する。
【0089】
式（Ｉ）のコンジュゲートでは、ＰＳＭＡ標的剤は、コンジュゲートを、インビボで所望の部位に、又は細胞若しくは生検試料中の所望の部位に、特に前立腺腫瘍に標的化するように作用する。
【0090】
式（ＩＩ）のコンジュゲートでは、ｓｓｔｒ２標的剤は、コンジュゲートを、インビボで所望の部位に、又は細胞若しくは生検試料中の所望の部位に、特に神経内分泌腫瘍に標的化するように作用する。
【0091】
別の態様において、本発明は、患者の癌を治療する方法であって、
－患者に、本明細書に定義される放射性核種標識コンジュゲートを投与すること、それにより
患者を治療すること
を含む方法に関する。
－患者に、本明細書に定義される放射性核種標識コンジュゲートを投与すること、それにより
患者を治療すること
を含む方法に関する。
【0092】
別の態様において、本発明は、患者の癌の治療のための医薬品の製造における、本明細書に定義される放射性核種標識コンジュゲートの使用に関する。
【0093】
別の態様において、本発明は、患者の癌の治療に使用するための、本明細書に定義される放射性核種標識コンジュゲートに関する。
【0094】
特定の患者のための具体的な用量段階及び薬剤が標的部位に達するのにかかる時間の長さが、利用される具体的な化合物の活性、年齢、体重、全般的な健康状態、性別、食事、投与の時間、投与経路、及び排泄速度、並びに療法を受けている特定の障害の重症度を含む種々の因子に依存することが理解されるだろう。
【0095】
用語「有効量」は、放射性核種標識コンジュゲートの患者への投与後に検出可能な量の放射線をもたらす量を指す。当業者は、毒性の観点から問題を起こさずに最適な画像化能力を達成するために、どれくらい多くの放射性核種標識コンジュゲートを患者に投与すべきかを知っているだろう。本発明の放射性核種標識コンジュゲートは、癌がどこにあるか（受容体などの標的が腫瘍上に均質に存在しているかどうかを含む）、どのような治療に癌が反応するか（治療選択及び最適用量の決定を容易にする）、及びどれくらい多くの治療が最終的に標的部位に達するかを臨床医が決定するのを補助する特定の用途がある。
【0096】
患者は、霊長類、特にヒト、イヌ、ネコ、ウマなどの飼いならされた伴侶動物、並びにウシ、ブタ、及びヒツジなどの家畜を含み得るがこれらに限定されず、用量は本明細書に記載される通りである。
【0097】
上述の通り、本発明の放射性核種標識コンジュゲートは、腫瘍（制御不能又は進行性の細胞の増殖の結果として形成する）を画像化及び／又は治療するのに特に有用である。そのような制御不能に増殖している細胞の一部は良性であるが、他方は「悪性」と称され、生物の死をもたらし得る。悪性新生物又は「癌」は、急速な細胞増殖を示すことに加え、それらが周囲組織に浸潤し、転移し得るという点で、良性の成長から区別される。さらに、悪性新生物には、それらが、より多い分化の喪失（より多い「脱分化」）並びに互いに対する及びそれらの周囲組織に対する、より多いそれらの組織化の喪失を示すという特徴がある。この性質は「退形成」とも称される。本発明により治療可能な新生物は、固相腫瘍／悪性腫瘍、すなわち癌腫、局所進行性腫瘍及びヒト軟部組織肉腫も含む。癌腫は、周囲組織に浸潤（浸入）し、リンパ行性転移を含むメタスタスティック（ｍｅｔａｓｔａｓｔｉｃ）癌を引き起こす上皮細胞由来の悪性新生物を含む。
【0098】
腺癌は、腺組織由来であるか、又は認識可能な腺構造を形成する癌腫である。癌の別の広い区分は肉腫を含み、それは、その細胞が胚性結合組織のような線維状又は同質な物質に埋め込まれている腫瘍である。
【0099】
本発明による画像化に適する可能性がある癌又は腫瘍細胞の種類には、前立腺癌及び神経内分泌癌がある。
【0100】
抗癌活性を有する薬物と共に本発明の放射性核種標識コンジュゲートを投与することも好都合であり得る。この点で好適な薬物の例としては、フロオロウラシル、イミキモド、アナストロゾール、アキシチニブ、ベリノスタット、ベキサロテン、ビカルタミド、ボルテゾミブ、ブスルファン、カバジタキセル、カペシタビン、カルムスチン、シスプラチン、ダブラフェニブ、ダウノルビシン塩酸塩、ドセタキセル、ドキソルビシン、エロキサチ（ｅｌｏｘａｔｉ）、エルロチニブ、エトポシド、エキセメスタン、フルベストラント、メトトレキサート、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、イホスファミド、イリノテカン、イキサベピロン、ラナリドミド（ｌａｎａｌｉｄｏｍｉｄｅ）、レトロゾール、ロムスチン、酢酸メゲストロール、テモゾロミド、ビノレルビン、ニロチニブ、タモキシフェン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ラロキシフェン、ペメトレキセド、ソラフェニブ、サリドマイド、トポテカン、ベルムラフェニブ（ｖｅｒｍｕｒａｆｅｎｉｂ）、及びビンクリスチンがある。
【0101】
本発明の放射性核種標識コンジュゲートは、特定の腫瘍が１種以上の受容体を有するかどうか、したがって、患者が特定の療法から利益を受け得るかどうかを決定するためにも使用できる。例えば、式（Ｉ）の放射性標識されたコンジュゲート中にｌｙｓ－尿素－ｇｌｕを標的分子として使用することにより、患者の腫瘍上のＰＳＭＡの存在を試験できる。腫瘍がＰＳＭＡ陰性である場合（すなわちＰＳＭＡ細胞表面受容体を有さない）、画像化剤は腫瘍に「粘着」しない。或いは、式９ＩＩ）の放射性標識されたコンジュゲート中にｓｓｔｒ２を標的分子として使用することにより、患者の腫瘍上のｓｓｔｒ２の存在を試験できる。腫瘍がｓｓｔｒ２陰性である場合（すなわちｓｓｔｒ２細胞表面受容体を有さない）、画像化剤は腫瘍に「粘着」しない。
【0102】
本明細書に開示され、定義される本発明が、言及されるか又は文書若しくは図面から明らかである個別の特徴の２つ以上の選択し得る組合せの全てに及ぶことが理解されるだろう。これらの異なる組合せの全ては、本発明の種々の選択し得る態様を構成する。
【0103】
別の態様において、本明細書に記載される化合物、コンジュゲート、又は放射性核種コンジュゲート、上述の薬学的に許容できる塩、希釈剤若しくは賦形剤、及び／又は医薬組成物を含むキット又は製造物が提供される。さらに、キットは、本明細書に記載される本発明の任意の方法又は用途における使用のための説明書を含み得る。
【0104】
他の実施形態において、上述の治療及び／又は診断用途における使用のための、又は使用される場合のキットであって、
－本明細書に記載される化合物、コンジュゲート、若しくは放射性核種コンジュゲート、又は医薬組成物の形態の治療用又は診断用組成物を収容する容器；
－本明細書に記載される本発明の任意の方法又は用途における使用のための説明書を伴うラベル又は添付文書
を含むキットが提供される。
－本明細書に記載される化合物、コンジュゲート、若しくは放射性核種コンジュゲート、又は医薬組成物の形態の治療用又は診断用組成物を収容する容器；
－本明細書に記載される本発明の任意の方法又は用途における使用のための説明書を伴うラベル又は添付文書
を含むキットが提供される。
【0105】
特定の実施形態において、キットは、癌の治療若しくは診断のための１種以上のさらなる有効成分又は成分を含み得る。
【0106】
キット又は「製造物」は、容器及び容器上又は容器と関連してラベル又は添付文書を含み得る。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ブリスターパックなどがある。容器は、ガラス又はプラスチックなどの種々の材料から形成され得る。容器は、病態を治療又は画像化するのに有効である治療用又は診断用組成物を収容し、滅菌されたアクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針により突き刺せるストッパーを有する静注液バッグ又はバイアルであり得る）。ラベル又は添付文書は、治療用組成物が、選択される病態を治療又は画像化するために使用されることを示す。一実施形態において、ラベル又は添付文書は使用説明書を含み、治療用又は診断用組成物が本明細書に記載される癌を治療するために使用できることを示す。
【実施例】
【0107】
全試薬及び溶媒は、標準的な商業的供給源から得て、特記されない限り受け取ったまま使用した。
【0108】
実施例１－ＰＳＭＡを標的とする放射線画像化剤
尿素連結ジペプチド（リジン－尿素－Ｇｌｕ）に基づく小分子は、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）と選択的に結合する。この研究の目的は、新たな８９Ｚｒ－ＤＦＯＳｑコンジュゲートされたＰＳＭＡ放射性トレーサーを開発することである。ＤＦＯ－ｓｑコンジュゲートされたモノマー性及びダイマー性ＰＳＭＡ標的化リジン－尿素－Ｇｌｕフラグメントのファミリーを合成し、８９Ｚｒ及び６８Ｇａ ＰＥＴ放射性核種を使用してインビボで試験した。
尿素連結ジペプチド（リジン－尿素－Ｇｌｕ）に基づく小分子は、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）と選択的に結合する。この研究の目的は、新たな８９Ｚｒ－ＤＦＯＳｑコンジュゲートされたＰＳＭＡ放射性トレーサーを開発することである。ＤＦＯ－ｓｑコンジュゲートされたモノマー性及びダイマー性ＰＳＭＡ標的化リジン－尿素－Ｇｌｕフラグメントのファミリーを合成し、８９Ｚｒ及び６８Ｇａ ＰＥＴ放射性核種を使用してインビボで試験した。
【0109】
一般的実験及び材料。特記されない限り、全試薬は商業的供給源から購入し、さらに精製せずに使用した。ＤＦＯＳｑは、既報の手順に従って調製した（Ｒｕｄｄ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２０１６，５２（８０），１１８８９－１１８９２）。フラッシュカラムクロマトグラフィーは、シリカゲル（４０～６３ミクロン）を固定相として使用して実施した。分析ＴＬＣを、プレコートされたシリカゲルプレート（厚さ０．２５ｍｍ、６０Ｆ２５４、Ｍｅｒｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で実施して、紫外線の下で可視化した。ＥＳＩ－ＭＳスペクトルを、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＯｒｂｉＴＲＡＰ注入質量分析計で記録した。非放射性試料のＨＰＬＣ精製及び分析は、溶媒Ａ＝Ｍｉｌｌｉ中０．１％ＴＦＡ及び溶媒Ｂ＝ＣＨ３ＣＮ中０．１％ＴＦＡを使用してＡｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズで実施した。分析ＨＰＬＣでは、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ（登録商標）５μｍ Ｃ１８（２）１００Å ＬＣカラム１５０×４．６ｍｍを１ｍＬ／分の流量で使用したが、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ（登録商標）５μｍ Ｃ１８（２）１００Å、ＬＣカラム２５０×２１ｍｍを５～８ｍＬ／分の流量で分取ＨＰＬＣに使用した。ラジオＨＰＬＣを、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＳＰＤ－１０Ａ ＶＰ ＵＶ検出器、それに続いて放射線検出器を有する、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＳＣＬ－１０Ａ ＶＰ／ＬＣ－１０ ＡＴ ＶＰシステムで実施した（プリアンプリファイヤー、Ｏｒｔｅｃ ９２５－ＳＣＩＮＴ ＡＣＥ ｍａｔｅプリアンプリファイヤーを有するＯｒｔｅｃモデル２７６フォトマルチプライヤーベース、バイアス電源及びＳＣＡ、Ｂｉｃｒｏｎ １Ｍ １１／２フォトマルチプライヤーチューブ）。１ｍＬ／分の流量でＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ（登録商標）５μｍ Ｃ１８（２）１００Å、ＬＣカラム１５０×４．６ｍｍ ＭｉｌｌＱ水中０．０５％ＴＦＡ緩衝液及びアセトニトリル使用）。
【0110】
ＰＡＢＡ－ＰＳＭＡリガンドの合成。樹脂結合ＰＳＭＡリガンド（ｌｙｓ－尿素－ｇｌｕ）（４３ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）の懸濁液に、Ｆｍｏｃ－ＰＡＢＡ－ＯＨ（７２ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（７０μＬ、０．４ｍｍｏｌ）及びＨＢＴＵ（３８ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を加え、ＤＭＦ（５ｍＬ）中で一晩撹拌し、次いで樹脂を濾過し、２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液により１時間処理し、次いで再び濾過した。次いで、樹脂をＴＦＡ（１ｍｌ）により１５分間処理し、次いでＴＦＡを窒素気流下で除去し、氷冷ジエチルエーテル（３０ｍＬ）を加えると生成物が沈殿し、それを遠心分離により回収して、ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ（登録商標）５μｍ Ｃ１８（２）１００Å、ＬＣカラム２５０×２１ｍｍ ＭｉｌｌＱ水中０．１％ＴＦＡ緩衝液及びアセトニトリルを使用）により精製すると、ＰＡＢＡ－ＰＳＭＡリガンドを白色の固体として与えた（１８ｍｇ、収率４１％）。ＥＳＩ－ＭＳ：（ポジティブイオン）［Ｍ＋Ｈ＋］ｍ／ｚ＝４３９．１８２５（実験値）、［Ｃ１９Ｈ２７Ｎ４Ｏ８］＋の計算値：ｍ／ｚ＝４３９．１８２９。
【0111】
ＥＤ－ＥＤＴＡ－ＰＡＢＡ－ＰＳＭＡリガンドの合成。ＰＡＢＡ－ＰＳＭＡリガンド（６ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ）及びＥＤＴＡ無水物（３．５ｍｇ、０．００１４）を、窒素気流下、エッペンドルフチューブ中で乾燥ＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解させた。溶液を５時間室温で撹拌し、次いで大過剰のエチレンジアミン（５０ｕＬ）を加え、混合物をそのまま一晩撹拌した。溶媒を真空下で除去し、残渣をＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ（登録商標）５μｍ Ｃ１８（２）１００Å、ＬＣカラム２５０×２１ｍｍ ＭｉｌｌＱ水中０．１％ＴＦＡ緩衝液及びアセトニトリルを使用）により精製すると、ＥＤ－ＥＤＴＡ－ＰＡＢＡ－ＰＳＭＡリガンドを白色の固体として与えた（２．５ｍｇ、収率２５％）。ＥＳＩ－ＭＳ：（ポジティブイオン）［Ｍ＋Ｈ＋］ｍ／ｚ＝７５５．３２０５（実験値）、［Ｃ３１Ｈ４５Ｎ８Ｏ１４］＋の計算値：ｍ／ｚ＝７５５．３２１２。
【0112】
ＰｈＰＳＭＡリガンドの合成。樹脂結合ＰＳＭＡリガンド（４３ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）の懸濁液に、Ｆｍｏｃ－ＰＡＭＢＡ－ＯＨ（７５ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（７０μＬ、０．４ｍｍｏｌ）及びＨＢＴＵ（３８ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を加え、ＤＭＦ（５ｍＬ）中で一晩撹拌し、次いで、樹脂を濾過して、２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液により１時間処理し、次いで再び濾過した。次いで、樹脂をＴＦＡ １ｍｌにより１５分間処理し、次いで、ＴＦＡを窒素気流下で除去し、氷冷ジエチルエーテル（３０ｍＬ）を加えると生成物が沈殿し、それを遠心分離により回収し、ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ（登録商標）５μｍ Ｃ１８（２）１００Å、ＬＣカラム２５０×２１ｍｍ ＭｉｌｌＱ水中０．１％ＴＦＡ緩衝液及びアセトニトリルを使用）により精製すると、ＰｈＰＳＭＡリガンドを白色の固体として与えた（１２ｍｇ、収率２６％）。ＥＳＩ－ＭＳ：（ポジティブイオン）［Ｍ＋Ｈ＋］ｍ／ｚ＝４５３．１９８２（実験値）、［Ｃ２０Ｈ２９Ｎ４Ｏ８］＋の計算値：ｍ／ｚ＝４５３．１９８５。
【0113】
ＤＦＯＳｑ－ＥＤＴＡ－ＰＳＭＡリガンド（２）の合成。ＤＭＳＯ（１００μＬ）中のＤＦＯＳｑ（２０ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ）とホウ酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ９．０、９００ｕＬ）中のＥＤ－ＥＤＴＡ－ＰＡＢＡ－ＰＳＭＡリガンド（９１ｍｇ、０．１３２ｍｍｏｌ）の混合物を室温で３日間撹拌し、ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ（登録商標）５μｍ Ｃ１８（２）１００Å、ＬＣカラム２５０×２１ｍｍ ＭｉｌｌＱ水中０．１％ＴＦＡ緩衝液及びアセトニトリルを使用）により精製すると、（２）を白色の固体として与えた（６ｍｇ、収率１６％）。ＥＳＩ－ＭＳ：（ポジティブイオン）［Ｍ＋Ｈ＋］ｍ／ｚ＝１３９３．６４８３（実験値）、［Ｃ６０Ｈ９３Ｎ１４Ｏ２４］＋の計算値：ｍ／ｚ＝１３９３．６４８７。
【0114】
ＤＦＯＳｑ－ＰｈＰＳＭＡリガンド（１）の合成。ＤＭＳＯ（１００μＬ）中のＤＦＯＳｑ（５ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）とホウ酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ９．０、９００ｕＬ）中のＰＡＭＢＡ－ＰＳＭＡリガンド（９１ｍｇ、０．１３２ｍｍｏｌ）の混合物を３７℃で６日間撹拌し、次いでＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ（登録商標）５μｍ Ｃ１８（２）１００Å、ＬＣカラム２５０×２１ｍｍ ＭｉｌｌＱ水中０．１％ＴＦＡ緩衝液及びアセトニトリルを使用）により精製すると、（１）を白色の固体として与えた（２ｍｇ、収率１７％）。ＥＳＩ－ＭＳ：（ポジティブイオン）［Ｍ＋Ｈ＋］ｍ／ｚ＝１０９１．５２５４（実験値）、［Ｃ４９Ｈ７５Ｎ１０Ｏ１８］＋の計算値：ｍ／ｚ＝１０９１．５２６１。
【0115】
Ｇｌｕｔ－ＰＳＭＡ（ＯｔＢｕ）３リガンドの合成。ＰＳＭＡ（ＯｔＢｕ）３リガンド（５０ｍｇ、０．１０３ｍｍｏｌ）及びグルタル酸無水物（５９ｍｇ、０．５１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解させ、次いでＤＩＰＥＡ（１７９μＬ、１．０２ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を室温で１時間撹拌した。次いで、冷ジエチルエーテル（４０ｍＬ）を反応混合物に加え、生じた粗生成物を遠心分離により単離し、それに続いてＨＰＬＣ精製（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ（登録商標）５μｍ Ｃ１８（２）１００Å、ＬＣカラム２５０×２１ｍｍ ＭｉｌｌＱ水中０．１％ＴＦＡ緩衝液及びアセトニトリルを使用）を行うと、Ｇｌｕｔ－ＰＳＭＡ（ＯｔＢｕ）３リガンドを白色の固体として与えた（３０ｍｇ、収率４８％）。ＥＳＩ－ＭＳ：（ポジティブイオン）［Ｍ＋Ｈ＋］ｍ／ｚ＝６０２．３６５７（実験値）、［Ｃ２９Ｈ５２Ｎ３Ｏ１０］＋の計算値：ｍ／ｚ＝６０２．３６５３。
【0116】
ＰｈＰＳＭＡ（ＯｔＢｕ）３リガンドの合成。ＰＳＭＡ（ＯｔＢｕ）３リガンド（５００ｍｇ、１．０３ｍｍｏｌ）、ＥＤＬ．ＨＣｌ（３９３ｍｇ、２．０３ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（３１４ｍｇ、２．０３ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ－ＰＡＭＢＡ－ＯＨ（４５０ｍｇ、１．２３ｍｍｏｌ）、及びＤＩＥＡ（８３９μＬ、５．１３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解させ、溶液を室温で２４時間撹拌した。次いで、水５０ｍＬを反応混合物に加え、生じた沈殿物を遠心分離により回収した。ＤＭＦ（１０ｍＬ）中２０％ピペリジンを残渣に加え、溶液を１時間撹拌し、次いで溶媒を除去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中５％ＭｅＯＨ）により精製すると、ＰｈＰＳＭＡ（ＯｔＢｕ）３リガンドを白色の固体として与えた（４１０ｍｇ、６４％）。ＥＳＩ－ＭＳ：（ポジティブイオン）［Ｍ＋Ｈ＋］ｍ／ｚ＝６２１．３８６２（実験値）、［Ｃ３２Ｈ５３Ｎ４Ｏ８］＋の計算値：ｍ／ｚ＝６２１．３８６３。
【0117】
Ｇｌｕｔ－ＰｈＰＳＭＡ（ＯｔＢｕ）３リガンドの合成。ＰｈＰＳＭＡ（ＯｔＢｕ）３リガンド（３３０ｍｇ、０．５３２ｍｍｏｌ）及びグルタル酸無水物（３０３ｍｇ、２．６ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１０ｍＬ）に溶解させ、次いで数滴のＤＩＰＥＡを加えた。溶液を室温で４時間撹拌した。反応混合物をＤＣＭ（５０ｍＬ）で抽出し、次いで溶媒を除去し、残渣をＨＰＬＣ精製すると（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ（登録商標）５μｍ Ｃ１８（２）１００Å、ＬＣカラム２５０×２１ｍｍ ＭｉｌｌＱ水中０．１％ＴＦＡ緩衝液及びアセトニトリルを使用）、Ｇｌｕｔ－ＰｈＰＳＭＡ（ＯｔＢｕ）３リガンドを白色の固体として与えた（２３６ｍｇ、６０％）。ＥＳＩ－ＭＳ：（ポジティブイオン）［Ｍ＋Ｈ＋］ｍ／ｚ＝７３５．４１８１（実験値）、［Ｃ３７Ｈ５９Ｎ４Ｏ１１］＋の計算値：ｍ／ｚ＝７３５．４１８０。
【0118】
ＤＦＯＳｑ－トレンの合成。ＤＦＯＳｑ（１００ｍｇ、０．１４６ｍｍｏｌ）及びトリス（２－アミノエチル）アミン（２３７μＬ、１．４６０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解させ、次いで溶液を室温で一晩撹拌した。次いで、ジエチルエーテルを反応混合物に加え、生じた粗生成物を遠心分離により単離し、それに続いてＨＰＬＣ精製すると（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ（登録商標）５μｍ Ｃ１８（２）１００Å、ＬＣカラム２５０×２１ｍｍ ＭｉｌｌＱ水中０．１％ＴＦＡ緩衝液及びアセトニトリルを使用）、ＤＦＯＳｑ－トレンを白色の蝋状固体として与えた（６５ｍｇ、５７％）。ＥＳＩ－ＭＳ：（ポジティブイオン）［Ｍ＋Ｈ＋］ｍ／ｚ＝７８５．４８６０（実験値）、［Ｃ３５Ｈ６５Ｎ１０Ｏ１０］＋の計算値：ｍ／ｚ＝７８５．４８８５。
【0119】
ＤＦＯＳｑ－ビスＰＳＭＡリガンド（３）の合成。ＤＦＯＳｑ－トレン（２０ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）及びＦｅＣｌ３（７ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１５０μＬ）中で、室温で撹拌し、次いで、ＨＡＴＵ（２９ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（４０μＬ、０．２４８ｍｍｏｌ）、及びＧｌｕｔ－ＰＳＭＡ（ＯｔＢｕ）３リガンド（３０ｍｇ、０．０５０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２００μＬ）溶液に加えた。生じた溶液を室温で１時間撹拌し、次いで冷ジエチルエーテル（１０ｍＬ）を加え、生じた沈殿物を遠心分離により回収した。残渣をＤＭＦ（１００μＬ）に溶解させ、ＤＭＦ：水混合物（１：１、１ｍＬ）中のＥＤＴＡの飽和溶液を加え、色が赤から薄黄色に変わるまで溶液を４０℃で加熱した。反応混合物をＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ（登録商標）５μｍ Ｃ１８（２）１００Å、ＬＣカラム２５０×２１ｍｍ ＭｉｌｌＱ水中０．１％ＴＦＡ緩衝液及びアセトニトリルを使用）により精製し、精製したフラクションをＤＣＭ中２０％ＴＦＡにより処理してＯｔＢｕ基を除去した。溶媒を窒素気流下で除去し、残渣をＨＰＬＣにより精製すると、（３）を白色の固体として与えた（９ｍｇ、２２％）。ＥＳＩ－ＭＳ：（ポジティブイオン）［Ｍ＋２Ｈ］＋ｍ／ｚ＝８０８．４０８０（実験値）、［Ｃ６８Ｈ１１６Ｎ１６Ｏ２８］２＋の計算値：ｍ／ｚ＝８０８．４０７２。
【0120】
ＤＦＯＳｑ－ビスＰｈＰＳＭＡリガンド（４）の合成。ＤＦＯＳｑ－トレン（１０．６８ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ）及びＦｅＣｌ３（３．６８ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１５０μＬ）中で、室温で撹拌し、次いで、ＨＡＴＵ（１２．４２ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（１１μＬ、０．０６８ｍｍｏｌ）、及びＧｌｕｔ－ＰｈＰＳＭＡ（ＯｔＢｕ）３リガンド（２０ｍｇ、０．０２８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２００μＬ）溶液に加えた。生じた溶液を室温で１時間撹拌し、次いで冷ジエチルエーテル（１０ｍＬ）を加え、生じた沈殿物を遠心分離により回収した。残渣をＤＭＦ（１００μＬ）に溶解させ、ＤＭＦ：水混合物（１：１、１ｍＬ）中のＥＤＴＡの飽和溶液を加え、色が赤から薄黄色に変わるまで溶液を４０℃で加熱した。反応混合物をＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ（登録商標）５μｍ Ｃ１８（２）１００Å、ＬＣカラム２５０×２１ｍｍ ＭｉｌｌＱ水中０．１％ＴＦＡ緩衝液及びアセトニトリルを使用）により精製し、精製したフラクションをＤＣＭ中２０％ＴＦＡにより処理してＯｔＢｕ基を除去した。溶媒を窒素気流下で除去し、残渣をＨＰＬＣにより精製すると、（４）を白色の固体として与えた（７ｍｇ、２７％）。ＥＳＩ－ＭＳ：（ポジティブイオン）［Ｍ＋２Ｈ＋］ｍ／ｚ＝９４１．４５８０（実験値）、［Ｃ８５Ｈ１２９Ｎ１８Ｏ３０］２＋の計算値：ｍ／ｚ＝９４１．４５９４。
【0121】
（１）の８９Ｚｒ放射性標識。１Ｍシュウ酸中の８９Ｚｒ（５０μＬ、６６ＭＢｑ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＮＥＺ３０８０００ＭＣ）をＭｉｌｌｉＱ水（５０μＬ）で希釈し、次いで一連の小体積のＮａ２ＣＯ３水溶液の添加（１Ｍ、５×５μＬ）により中和した（ｐＨ６～７）。次いで、ＨＥＰＥＳ緩衝液（４１μＬ、１Ｍ、ｐＨ７．０）を加え、溶液を５分間静置してからｐＨを再び試験した。混合物がｐＨ６～７を有することを確認した後で、１２５μＬ（５０ＭＢｑ）の８９Ｚｒを（１）に加え（１００μＬ中１００μｇ、１．８ナノモル／ＭＢｑ）、反応混合物を室温で３０分間静置し、次いでアリコートをラジオＨＰＬＣ（１５分にわたり１ｍＬ／分でＡに対して０～１００％の緩衝液Ｂ、Ａ＝ＭｉｌｌｉＱ中０．０５％ＴＦＡ及びＢ＝アセトニトリル中０．０５％ＴＦＡ、Ｌｕｎａ Ｃ１８カラム４．６×１５０ｍｍ、５μｍ）により分析した。粗製のトレーサーを、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＳｔｒａｔａＸカートリッジ（Ｃ１８、６０ｍｇ）によりエタノールを溶離液として使用して精製し、ほとんどの標識された生成物を含むフラクション（２２ＭＢｑ）を合わせ、ＰＢＳ中８％エタノールに希釈して、１．２ｍＬの最終体積にした。１７０μＬ中におよそ３．０ＭＢｑを含む６本のシリンジ（ＢＤ Ｕｌｔｒａ－Ｆｉｎｅ（商標）、０．３ｍＬ）（およそペプチド質量６μｇ、５．４ナノモル）を調製した。
【0122】
（２）の８９Ｚｒ放射性標識。１Ｍシュウ酸中の８９Ｚｒ（１００μＬ、７２ＭＢｑ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＮＥＺ３０８０００ＭＣ）をＭｉｌｌｉＱ水（１００μＬ）で希釈し、次いで一連の小体積のＮａ２ＣＯ３水溶液の添加（１Ｍ、８０μＬ）により中和した（ｐＨ６～７）。次いで、ＨＥＰＥＳ緩衝液（９３μＬ、１Ｍ、ｐＨ７．０）を加え、溶液を５分間静置してからｐＨを再び試験した。混合物がｐＨ６～７を有することを確認した後で、（２）（０．２５Ｍ ＨＥＰＥＳ中５００μＬ中５００μｇ）を８９Ｚｒ溶液に加え、反応混合物を室温で６０分間静置して、次いでアリコートをラジオＨＰＬＣ（１５分にわたり１ｍＬ／分でＡに対して０～１００％の緩衝液Ｂ、Ａ＝ＭｉｌｌｉＱ中０．０５％ＴＦＡ及びＢ＝アセトニトリル中０．０５％ＴＦＡ、Ｌｕｎａ Ｃ１８カラム４．６×１５０ｍｍ、５μｍ）により分析した。それは、７０％以上の放射化学的収率を示した。粗製のトレーサーを、エタノールを溶離液として使用してＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＳｔｒａｔａＸカートリッジ（Ｃ１８、６０ｍｇ）により精製して、ほとんどの標識された生成物を含むフラクション（２０ＭＢｑ）を合わせ、ＰＢＳ中８％エタノールに希釈して１．２ｍＬの最終体積にした。画像化及び生体内分布のために、それぞれおよそ２．６ＭＢｑ（およそ２８μｇ）を含む６本のシリンジ（０．３ｍＬ ＢＤ Ｕｌｔｒａ－Ｆｉｎｅ（商標））を注射用に調製した。
【0123】
（３）の８９Ｚｒ放射性標識。１Ｍシュウ酸中の８９Ｚｒ（７０μＬ、６０ＭＢｑ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＮＥＺ３０８０００ＭＣ）をＭｉｌｌｉＱ水（７０μＬ）で希釈し、次いで一連の小体積のＮａ２ＣＯ３水溶液の添加（１Ｍ、４×１０μＬ）により中和した（ｐＨ６～７）。次いで、ＨＥＰＥＳ緩衝液（５９μＬ、１Ｍ、ｐＨ７．０）を加え、溶液を５分間静置してからｐＨを再び試験した。混合物がｐＨ６～７を有することを確認した後で、１９０μＬ（５０ＭＢｑ）の８９Ｚｒを（３）に加え（７５μＬ中１５０μｇ、１．８ナノモル／ＭＢｑ）、反応混合物を室温で３０分間静置し、次いでアリコートを、ラジオＨＰＬＣ（１５分にわたり１ｍＬ／分でＡに対して０～１００％の緩衝液Ｂ、Ａ＝ＭｉｌｌｉＱ中０．０５％ＴＦＡ及びＢ＝アセトニトリル中０．０５％ＴＦＡ、Ｌｕｎａ Ｃ１８カラム４．６×１５０ｍｍ、５μｍ）により分析した。粗製のトレーサーを、８％エタノールを溶離液として使用してＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＳｔｒａｔａＸカートリッジ（Ｃ１８、６０ｍｇ）により精製し、いくつかのフラクション（およそ２５０μＬ）を回収して、合わせると、およそ１．５ｍＬの標識されたトレーサー中の１７ＭＢｑを得た。２２０μＬ中におよそ２．６ＭＢｑ（およそペプチド質量７．８μｇ、４．８ナノモル）を含む６本のシリンジ（ＢＤ Ｕｌｔｒａ－Ｆｉｎｅ（商標）、０．３ｍＬ）を調製した。
【0124】
（４）の８９Ｚｒ放射性標識。１Ｍシュウ酸中の８９Ｚｒ（７０μＬ、６２ＭＢｑ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＮＥＺ３０８０００ＭＣ）をＭｉｌｌｉＱ水（７０μＬ）で希釈し、次いで一連の小体積のＮａ２ＣＯ３水溶液の添加（１Ｍ、３×１０μＬ）により中和した（ｐＨ６～７）。次いで、ＨＥＰＥＳ緩衝液（５９μＬ、１Ｍ、ｐＨ７．０）を加え、溶液を５分間静置してからｐＨを再び試験した。混合物がｐＨ６～７を有することを確認した後で、（４）（２２μＬ中２２０μｇ、１：１ ＤＭＳＯ：ＭｉｌｌｉＱ、１．８ナノモル／ＭＢｑ）を、８９Ｚｒ溶液（２２０μＬ）に加え、反応混合物を室温で７０分間静置し、次いでアリコートを、ラジオＨＰＬＣ（１５分にわたり１ｍＬ／分でＡに対して０～１００％の緩衝液Ｂ、Ａ＝ＭｉｌｌｉＱ中０．０５％ＴＦＡ及びＢ＝アセトニトリル中０．０５％ＴＦＡ、Ｌｕｎａ Ｃ１８カラム４．６×１５０ｍｍ、５μｍ）により分析した。それは７０％以上の放射化学的収率を示した。粗製のトレーサーをＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＳｔｒａｔａＸ（Ｃ１８、６０ｍｇ）カートリッジに吸着させ、次いでＰＢＳ中８％エタノールを溶離液として使用した。いくつかのフラクション（およそ２５０μＬ）を回収し、合わせると、９５％以上の放射化学的純度を有するおよそ１．１ｍＬの標識されたトレーサー中に１７．１ＭＢｑを得た。画像化及び生体内分布のために、それぞれおよそ１．８ＭＢｑ（およそ６．４μｇ、３．３ナノモル）を含む６本のシリンジ（０．３ｍＬ ＢＤ Ｕｌｔｒａ－Ｆｉｎｅ（商標））を注射用に調製した。
【0125】
（１）の６８Ｇａ放射性標識。ＨＣｌ中の６８Ｇａ（４５０μＬ、４２ＭＢｑ）を、酢酸ナトリウム（１Ｍ、５０μＬ、ｐＨ４．５）次いで（１）（２．９μＬ中２．９μｇ、２．６ナノモル）により緩衝し、反応混合物を室温で１０分間静置して、次いでアリコートを、ラジオＨＰＬＣ（１５分にわたり１ｍＬ／分でＡに対して０～１００％の緩衝液Ｂ、Ａ＝ＭｉｌｌｉＱ中０．０５％ＴＦＡ及びＢ＝アセトニトリル中０．０５％ＴＦＡ、Ｌｕｎａ Ｃ１８カラム４．６×１５０ｍｍ、５μｍ）により分析した。１０×ＰＢＳ緩衝液（５５μＬ、ｐＨ７．４）を混合物に加え、次いで１×ＰＢＳ（５５０μＬ、ｐＨ７．４）でさらに希釈すると、２．４μＭの最終ペプチド濃度を与え、１５０μＬ中におよそ３．５ＭＢｑ（およそのペプチド質量０．４μｇ、０．３６ナノモル）を含む６本のシリンジ（ＢＤ Ｕｌｔｒａ－Ｆｉｎｅ（商標）、０．３ｍＬ）を調製した。
【0126】
（４）の６８Ｇａ放射性標識。ＨＣｌ中の６８Ｇａ（９００μＬ、４２ＭＢｑ）を、酢酸ナトリウム（１Ｍ、１００μＬ、ｐＨ４．５）で、次いで（４）（５μＬ中５μｇ、２．６ナノモル）で緩衝し、反応混合物を室温で１０分間静置し、次いでアリコートを、ラジオＨＰＬＣ（１５分にわたり１ｍＬ／分でＡに対して０～１００％の緩衝液Ｂ、Ａ＝ＭｉｌｌｉＱ中０．０５％ＴＦＡ及びＢ＝アセトニトリル中０．０５％ＴＦＡ、Ｌｕｎａ Ｃ１８カラム４．６×１５０ｍｍ、５μｍ）により分析した。１０×ＰＢＳ緩衝液（１１０μＬ、ｐＨ７．４）を混合物に加えて、２．４μＭの最終ペプチド濃度を与え、１５０μＬ中におよそ４．０ＭＢｑ（およそのペプチド質量０．６８μｇ、０．３６ナノモル）を含む６本のシリンジ（ＢＤ Ｕｌｔｒａ－Ｆｉｎｅ（商標）、０．３ｍＬ）を調製した。
【0127】
ＰＥＴ－ＣＴ画像化及び生体内分布。雄のＢａｌｂ／ｃヌードマウス（８．５週齢）又は雄のＮＳＧマウス（１２週齢）の右脇腹に、ＰＢＳ：マトリゲル（１：１）中の６×１０６ ＬＮＣａｐ細胞を皮下接種した。マウスの体重を量り、腫瘍を週に２回電子カリパスを使用して測定した。腫瘍体積（ｍｍ３）を、長さ×幅×高さ×π／６として計算した。マウスを、画像化及び生体内分布試験に割り当てた（腫瘍体積：８５～４５０ｍｍ３）。次いで、８９Ｚｒ－ＤＦＯＳｑ－ＰＳＭＡトレーサーを、尾静脈注射により６匹のマウスに静脈内投与した。注射後１、２、４、及び１８時間で、３匹のマウスに、イソフルランを使用して麻酔をかけ、Ｇ８ ＰＥＴ／ＣＴスキャナー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）のイメージングベッド上に配置した。ＣＴスキャンを実施し、直ちに１０分スタティックＰＥＴスキャンを実施した。最尤推定－期待値最大化（ＭＬ－ＥＭ）アルゴリズムを使用して、ＰＥＴ画像を再構築した。ＶｉｖｏＱｕａｎｔ（Ｉｎｖｉｃｒｏ）及び決定された腫瘍ＳＵＶｍａｘ又は腫瘍ＳＵＶｍａｘ／バックグラウンド平均（ＴＢＲ）を使用して、ＰＥＴ画像を分析した。１８時間での画像化の後、マウスを安楽死させ、選択した組織を摘出し、秤量し、Ｃａｐｉｎｔｅｃ（Ｃａｐｔｕｓ ４０００ｅ）ガンマカウンターを使用して計測した。３匹のマウスの別なコホートを、上述の生体内分布分析のために注射後１時間で収集した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７を使用してデータを分析し、トレーサーの間の差異を、ｔ検定を使用して分析した。
【0128】
細胞結合及び内在化試験。ＬＮＣａｐ細胞（１５０，０００／ウェル）を、０．０５％ポリ－Ｌ－リジンがプレコートされた２４ウェルプレートのウェル中で１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地に播種し、一晩３７℃及び５％ＣＯ２でインキュベートした。翌日細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ウェルあたり１ｍＬの内在化緩衝液（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｓａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）（ＭＥＭ、１％ＦＢＳ）中で、１時間３７℃でインキュベートした。次いで、緩衝液を、ウェルあたり１ｍｌの、内在化緩衝液中に０．５μＣｉ ８９Ｚｒ－ＤＦＯｓｑ－ＰＳＭＡトレーサーを含む加温した溶液に替えた。細胞を、三連で、５、１５、３０、又は６０分間、３７℃及び５％ＣＯ２でインキュベートした。各時点で、細胞を、氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、洗浄液を計測のために収集した（未結合フラクション）。次いで、細胞を、１０μＭ ＰＭＰＡを含む塩水中で、２回１０分間インキュベートし、各洗浄液を計測のために収集した（表面結合フラクション）。次いで、細胞を、１Ｍ ＮａＯＨに可溶化させた（内在化フラクション）。ＢＣＡプロテインアッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、総タンパク含量をこのフラクションで決定した。次いで、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ２４８０ Ｗｉｚａｒｄ自動ガンマカウンターを使用して、未結合、表面結合、及び内在化フラクション中のＺｒ－８９放射能を測定した。表面結合及び内在化フラクションを、タンパク質のｍｇあたりの全体の添加放射能のパーセンテージとして表した。非特異的膜結合及び内在化は、細胞を、過剰の（１０μＭ）ＰＭＰＡの存在下で８９Ｚｒ－ＤＦＯＳｑ－ＰＳＭＡトレーサーとインキュベートすることにより決定した。６０分での８９Ｚｒ－ＤＦＯＳｑ－ＰＳＭＡトレーサー取込みも、ＰＳＭＡ陰性細胞株であるＤＵ１４５細胞（１２５，０００細胞／ウェルで播種）中で決定した。生データを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７を使用して分析した。
【0129】
結果
ＰＳＭＡトレーサーの合成及び放射性標識
モノマー性ＰＳＭＡリガンドの合成では、ｌｙｓ－尿素－ｇｌｕ尿素連結ジペプチド前駆体を、既報の文献（Ｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１２，２３（４），６８８－６９７）に記載される固相化学を使用して樹脂上で調製した。樹脂結合ＰＳＭＡ前駆体を、Ｆｍｏｃ保護ｐ－アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）又はｐ－アミノメチル安息香酸（ＰＡＭＢＡ）と反応させて、樹脂結合中間体ＰＡＢＡ－ＰＳＭＡリガンド及び樹脂からの切断後にＰｈＰＳＭＡリガンドを生じさせた。ＰｈＰＳＭＡリガンドを、ｐＨ９．０の０．１Ｍホウ酸緩衝液中でＤＦＯＳｑに６～７日にわたり室温でコンジュゲートし、（１）リガンドを収率２６％で与えた。ＥＤＴＡ架橋リガンドの合成では、最初に、ＰＡＢＡ－ＰＳＭＡリガンド前駆体をＥＤＴＡ－無水物と反応させ、それに続いてエチレンジアミンと反応させて、ＥＤ－ＥＤＴＡ－ＰＡＢＡ－ＰＳＭＡリガンドビルディングブロックを与えた。ＤＦＯＳｑコンジュゲーションは、（１）に関して記載された類似の方法（スキーム１）を使用して収率１６％で達成された。
ＰＳＭＡトレーサーの合成及び放射性標識
モノマー性ＰＳＭＡリガンドの合成では、ｌｙｓ－尿素－ｇｌｕ尿素連結ジペプチド前駆体を、既報の文献（Ｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１２，２３（４），６８８－６９７）に記載される固相化学を使用して樹脂上で調製した。樹脂結合ＰＳＭＡ前駆体を、Ｆｍｏｃ保護ｐ－アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）又はｐ－アミノメチル安息香酸（ＰＡＭＢＡ）と反応させて、樹脂結合中間体ＰＡＢＡ－ＰＳＭＡリガンド及び樹脂からの切断後にＰｈＰＳＭＡリガンドを生じさせた。ＰｈＰＳＭＡリガンドを、ｐＨ９．０の０．１Ｍホウ酸緩衝液中でＤＦＯＳｑに６～７日にわたり室温でコンジュゲートし、（１）リガンドを収率２６％で与えた。ＥＤＴＡ架橋リガンドの合成では、最初に、ＰＡＢＡ－ＰＳＭＡリガンド前駆体をＥＤＴＡ－無水物と反応させ、それに続いてエチレンジアミンと反応させて、ＥＤ－ＥＤＴＡ－ＰＡＢＡ－ＰＳＭＡリガンドビルディングブロックを与えた。ＤＦＯＳｑコンジュゲーションは、（１）に関して記載された類似の方法（スキーム１）を使用して収率１６％で達成された。
【0130】
ダイマー性リガンドでは、ＤＦＯＳｑを、トリス（２－アミノエチル）アミンとの反応により修飾して、２つの遊離アミン基を含むＤＦＯＳｑ－トレンを与えた。２つの酸官能化ＰＳＭＡ分子を、異なるリンカー分子を含む別なビルディングブロックとして調製した。出発ＯｔＢｕ保護ＰＳＭＡ分子を、既報の手順に従って調製し、次いでグルタル酸無水物と反応させて、Ｇｌｕｔ－ＰＳＭＡ（ＯｔＢｕ）３リガンドを与えた。芳香族リンカーを有する中間体を、最初に、ＰＳＭＡ（ＯｔＢｕ）３リガンドを４－アミノメチル安息香酸と反応させ、それに続いてグルタル酸無水物と反応させること以外、同様に調製した。ＤＦＯＳｑ－トレンを、Ｇｌｕｔ－ＰＳＭＡ（ＯｔＢｕ）３リガンド又はＧｌｕｔ－ＰｈＰＳＭＡ（ＯｔＢｕ）３リガンドと典型的なＨＡＴＵ／ＤＩＥＡカップリングを使用して結合させたが、良好な収率でカップリングを達成するには、ＤＦＯＳｑモチーフ上のヒドロキシメート（ｈｙｄｒｏｘｙｍａｔｅｓ）基の保護が必要であった。Ｆｅ及びＯｔＢｕ基はどちらも、カップリング後に、その後の２工程で、それぞれＥＤＴＡ及びＤＣＭ中１０％ＴＦＡを使用して除去され、ダイマー性ＰＳＭＡリガンドを２２～２７％収率で与えた。
【0131】
８９ＺｒによるＰＳＭＡリガンドの放射性標識は、温和な反応条件下で達成された。８９Ｚｒを１Ｍシュウ酸溶液中に得たが、それを１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３で中和し、ＨＥＰＥＳで緩衝して、０．２５Ｍの最終濃度にした。３０～４５分の反応時間で最大放射化学的収率を達成するために要求されるペプチド質量を、（１）リガンドを使用して最適化した。リガンドを０．１μｇ／ＭＢｑ～２μｇ／ＭＢｑの８９Ｚｒで標識し、分析ラジオＨＰＬＣは、３０分の反応時間で９５％超の放射化学的収率に要求される最低ペプチド質量が２μｇ／ＭＢｑ（マウスあたり１．８ナノモル／ＭＢｑ）であることを示す。両ダイマー性リガンドを、中和された８９ＺｒのＭＢｑあたり同じ等価モル数の各ペプチドを使用して放射性標識して、（２）以外は類似の放射化学的収率を達成したが、（２）は、９８％超の放射化学的純度を有する放射性トレーサーを得るために、他のトレーサーと比べて５倍過剰のペプチド量が必要であり、その理由は、ペプチド質量が低いと、多種の放射性標識された生成物（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｌｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）ができたからである。６８Ｇａによる放射性標識は、１０分以内の反応時間で、室温で、はるかに低いペプチド濃度（およそ５μｇ／ｍＬの６８Ｇａ溶出液、マウスあたり０．３６ナノモル／ＭＢｑ）で達成され、高い放射化学的収率及び純度のトレーサーを与え、粗製のトレーサーの精製は必要なかった。
【0132】
ＰＥＴ－ＣＴ画像化及び生体内分布
８９Ｚｒ標識されたトレーサー：８９Ｚｒ放射性標識されたＰＳＭＡトレーサーを、ＬＮＣａＰ（ヒトＰＳＭＡを発現している前立腺癌細胞株）腫瘍を有するマウスに、尾静脈により静脈内注射した。注射後１、２、４、及び１８時間で、マウスに、イソフルランにより麻酔をかけ、１０分にわたり画像化した。８９Ｚｒ放射性標識されたＰＳＭＡトレーサーを注射されたマウスの１及び１８時間での代表的なＰＥＴ画像を図１に示し、各トレーサーの腫瘍ＳＵＶｍａｘの定量化を図２ａに示す。全トレーサーのＰＥＴ画像は、モノマー性トレーサーでは腎臓に見られる非常に強い取込みと腫瘍でのより低い取込みを示すが、両ダイマー性トレーサーはより高い取込みを示す。全時点で、他の全トレーサーと比べて（４）トレーサーで、より高い腫瘍ＳＵＶｍａｘの傾向があった。同様に、生体内分布結果は、他と比べて（４）でより高い腫瘍％ＩＤ／ｇの傾向を示した。腫瘍取込み値の比較を図２ｂに示し、１及び１８時間でのトレーサーの組織生体内分布データを図３にまとめる。全トレーサーは、１８時間で腫瘍から実質的に除かれ（（１）５．４から２．２％ＩＤ／ｇ、（２）３．２から１．０％ＩＤ／ｇ、（３）５．９から２．５％ＩＤ／ｇ及び（４）９．３から３．７％ＩＤ／ｇ）、これらのデータは、全トレーサーの１時間取込みが１８時間で５５～６５％著しく減少した画像化データ図２ａにより支持される。
８９Ｚｒ標識されたトレーサー：８９Ｚｒ放射性標識されたＰＳＭＡトレーサーを、ＬＮＣａＰ（ヒトＰＳＭＡを発現している前立腺癌細胞株）腫瘍を有するマウスに、尾静脈により静脈内注射した。注射後１、２、４、及び１８時間で、マウスに、イソフルランにより麻酔をかけ、１０分にわたり画像化した。８９Ｚｒ放射性標識されたＰＳＭＡトレーサーを注射されたマウスの１及び１８時間での代表的なＰＥＴ画像を図１に示し、各トレーサーの腫瘍ＳＵＶｍａｘの定量化を図２ａに示す。全トレーサーのＰＥＴ画像は、モノマー性トレーサーでは腎臓に見られる非常に強い取込みと腫瘍でのより低い取込みを示すが、両ダイマー性トレーサーはより高い取込みを示す。全時点で、他の全トレーサーと比べて（４）トレーサーで、より高い腫瘍ＳＵＶｍａｘの傾向があった。同様に、生体内分布結果は、他と比べて（４）でより高い腫瘍％ＩＤ／ｇの傾向を示した。腫瘍取込み値の比較を図２ｂに示し、１及び１８時間でのトレーサーの組織生体内分布データを図３にまとめる。全トレーサーは、１８時間で腫瘍から実質的に除かれ（（１）５．４から２．２％ＩＤ／ｇ、（２）３．２から１．０％ＩＤ／ｇ、（３）５．９から２．５％ＩＤ／ｇ及び（４）９．３から３．７％ＩＤ／ｇ）、これらのデータは、全トレーサーの１時間取込みが１８時間で５５～６５％著しく減少した画像化データ図２ａにより支持される。
【0133】
６８Ｇａ標識されたトレーサー：６８Ｇａ（１）及び６８Ｇａ（４）を注射されたマウスの代表的なＰＥＴ画像を図４に示し、腫瘍ＳＵＶｍａｘの定量化を図５ａに示す。ＰＥＴ画像は、６８Ｇａ（１）の腎臓、胆嚢、及び腸への高い取込みとＬＮＣａｐ腫瘍への中程度取込みを示す。６８Ｇａ（４）は、高い腎臓取込み、中程度の腫瘍取込み、及び腸取込みなしと関連していた。６８Ｇａ（４）の腫瘍取込みは、注射後１及び２時間でそれぞれ６８Ｇａ（１）の１．６及び１．８倍であった。これは、６８Ｇａ（４）の腫瘍％ＩＤ／ｇが、注射後１時間で（１０．８±１．３対６．５±０．４）及び２．５時間で（８．６±１．０対４．１±０．５）６８Ｇａ（１）より高かった生体内分布結果と一致する。１及び２時間でのトレーサーの組織生体内分布を図５ｂにまとめる。６８Ｇａ（１）の著しい腫瘍クリアランスが注射後２．５時間で明らかであった（１時間で６．５±０．４％ＩＤ／ｇ対２．５時間で４．１±０．５％ＩＤ／ｇ）。対照的に、注射後１及び２．５時間で６８Ｇａ（４）腫瘍滞留に著しい変化はなかった（１０．８±１．３％ＩＤ／ｇ対８．６±０．９％ＩＤ／ｇ、図５ｂ）。これらのデータは、それぞれ２時間で、６８Ｇａ（１）の１時間取込みが１３％減少し、６８Ｇａ（４）取込みが９％減少する画像化データ（図５ａ）により支持される。
【0134】
細胞結合及び内在化試験
過剰なＰＭＰＡがある場合とない場合の（１）の表面結合は全時点で類似であった（２％ＡＲ／ｍｇタンパク質）。内在化活性は６０分のインキュベーションで７％ＡＲ／ｍｇタンパク質に増加したが、最大５％ＡＲ／ｍｇタンパク質の内在化が過剰なＰＭＰＡの存在下で見られた。軽微な結合が、ＰＳＭＡ陰性細胞株であるＤＵ１４５に見られた。６０分で、６％未満の添加放射能／ｍｇタンパク質（％ＡＲ／ｍｇ）は細胞表面結合であったが、３９％超の％ＡＲ／ｍｇは内在化された。内在化放射能は６０分試験の過程で増加した。内在化及び表面結合放射能は、過剰なＰＭＰＡにより効果的に遮断され、表面結合放射能は２．５％未満で内在化放射能は１３％ＡＲ／ｍｇタンパク質未満であった。軽微な結合が、ＰＳＭＡ陰性細胞株であるＤＵ１４５に見られた。
過剰なＰＭＰＡがある場合とない場合の（１）の表面結合は全時点で類似であった（２％ＡＲ／ｍｇタンパク質）。内在化活性は６０分のインキュベーションで７％ＡＲ／ｍｇタンパク質に増加したが、最大５％ＡＲ／ｍｇタンパク質の内在化が過剰なＰＭＰＡの存在下で見られた。軽微な結合が、ＰＳＭＡ陰性細胞株であるＤＵ１４５に見られた。６０分で、６％未満の添加放射能／ｍｇタンパク質（％ＡＲ／ｍｇ）は細胞表面結合であったが、３９％超の％ＡＲ／ｍｇは内在化された。内在化放射能は６０分試験の過程で増加した。内在化及び表面結合放射能は、過剰なＰＭＰＡにより効果的に遮断され、表面結合放射能は２．５％未満で内在化放射能は１３％ＡＲ／ｍｇタンパク質未満であった。軽微な結合が、ＰＳＭＡ陰性細胞株であるＤＵ１４５に見られた。
【0135】
種々の新たなモノマー性及びダイマー性のＰＳＭＡコンジュゲートを設計し、合成した。キレーター部とＰＳＭＡ結合モチーフの間のリンカーの長さ及び親油性が、驚くべきことに、トレーサーの生理学的性質及び結合親和性を制御する重要な因子であることを見出した。ＰＳＭＡコンジュゲートを、８９Ｚｒにより容易に放射性標識して、放射性標識されたトレーサーを高い放射化学的収率及び純度で与えた。インビボデータは、インビトロ試験と非常に良好に相関する。８９ＺｒＤＦＯＳｑ－ビスＰｈＰＳＭＡは、特異的結合及びＬＮＣａｐ細胞への迅速な内在化をインビトロで示した。８９Ｚｒ試験から得られた結果に基づき、２種のトレーサーを選択して、６８Ｇａ放射性標識及びインビボ試験を調査した。６８Ｇａ（１）は、６８Ｇａ（３）より高い腸取込みと関連しており、注射後２．５時間でＬＮＣａＰ腫瘍から実質的に除去された。６８Ｇａ（４）は、ＰＥＴ画像化及び生体内分布の両方によりモノマー性アナログより高い腫瘍取込みを示したが、これらの結果は８９Ｚｒ試験で得られたデータと一致する。
【0136】
【表1】
【0137】
【表2】
【0138】
ｌｙｓ－尿素－ｇｌｕ尿素連結ジペプチド部分に基づく数種のＰＳＭＡトレーサーを設計し、合成し、ＰＳＭＡ結合モチーフのモノマー性及びダイマー性配置でＤＦＯＳｑリガンドに戦略的にバイオコンジュゲートした。リガンドを、温和な条件下で８９Ｚｒ及び６８Ｇａ放射性核種により容易に放射性標識でき、高放射化学的収率及び純度を与える。トレーサーは、ＰＥＴ－ＣＴ及び生体内分布分析に基づく前立腺癌の診断用画像化の可能性を示した。
【0139】
実施例２－神経内分泌腫瘍中のＳＳＴＲ２を標的とする放射線画像化剤
発明者らは、８９ＺｒＤＦＯ－ｓｑコンジュゲートされたオクトレオチド及びオクトレオテートなどのソマトスタチンアナログに基づく２種の新たな放射性トレーサーを開発し、比較した（図１０）。両ペプチドは、多くの種類の神経内分泌腫瘍中で過剰発現されるソマトスタチンサブタイプ２受容体（ｓｓｔｒ２）に結合する。
発明者らは、８９ＺｒＤＦＯ－ｓｑコンジュゲートされたオクトレオチド及びオクトレオテートなどのソマトスタチンアナログに基づく２種の新たな放射性トレーサーを開発し、比較した（図１０）。両ペプチドは、多くの種類の神経内分泌腫瘍中で過剰発現されるソマトスタチンサブタイプ２受容体（ｓｓｔｒ２）に結合する。
【0140】
材料及び方法
一般的な実験及び材料。特記されない限り、全試薬を商業的供給源から購入し、さらに精製せずに使用した。フラッシュカラムクロマトグラフィーを、シリカゲル（４０～６３ミクロン）を固定相として使用して実施した。分析ＴＬＣは、プレコートされたシリカゲルプレート（厚さ０．２５ｍｍ、６０Ｆ２５４、Ｍｅｒｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で実施し、紫外線の下で可視化した。非放射性試料のＨＰＬＣ精製及び分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズで、溶媒Ａ＝Ｍｉｌｌｉ中０．１％ＴＦＡ及び溶媒Ｂ＝ＣＨ３ＣＮ中０．１％ＴＦＡを使用して実施した。分析ＨＰＬＣでは、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ（登録商標）５μｍ Ｃ１８（２）１００Å、ＬＣカラム１５０×４．６ｍｍを１ｍＬ／分の流量で使用し、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ（登録商標）５μｍ Ｃ１８（２）１００Å、ＬＣカラム２５０×２１ｍｍを５～８ｍＬ／分の流量で分取ＨＰＬＣに使用した。ラジオＨＰＬＣは、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＳＰＤ－１０Ａ ＶＰ ＵＶ検出器とそれに続いて放射線検出器を有する、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＳＣＬ－１０Ａ ＶＰ／ＬＣ－１０ ＡＴ ＶＰシステムにより実施した（プリアンプリファイヤー、Ｏｒｔｅｃ ９２５－ＳＣＩＮＴ ＡＣＥ ｍａｔｅプリアンプリファイヤーを有するＯｒｔｅｃモデル２７６フォトマルチプライヤーベース、バイアス電源及びＳＣＡ、Ｂｉｃｒｏｎ １Ｍ １１／２フォトマルチプライヤーチューブ）。Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ（登録商標）５μｍ Ｃ１８（２）１００Å、ＬＣカラム１５０×４．６ｍｍ ＭｉｌｌＱ中０．０５％ＴＦＡ緩衝液を使用。
一般的な実験及び材料。特記されない限り、全試薬を商業的供給源から購入し、さらに精製せずに使用した。フラッシュカラムクロマトグラフィーを、シリカゲル（４０～６３ミクロン）を固定相として使用して実施した。分析ＴＬＣは、プレコートされたシリカゲルプレート（厚さ０．２５ｍｍ、６０Ｆ２５４、Ｍｅｒｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で実施し、紫外線の下で可視化した。非放射性試料のＨＰＬＣ精製及び分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズで、溶媒Ａ＝Ｍｉｌｌｉ中０．１％ＴＦＡ及び溶媒Ｂ＝ＣＨ３ＣＮ中０．１％ＴＦＡを使用して実施した。分析ＨＰＬＣでは、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ（登録商標）５μｍ Ｃ１８（２）１００Å、ＬＣカラム１５０×４．６ｍｍを１ｍＬ／分の流量で使用し、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ（登録商標）５μｍ Ｃ１８（２）１００Å、ＬＣカラム２５０×２１ｍｍを５～８ｍＬ／分の流量で分取ＨＰＬＣに使用した。ラジオＨＰＬＣは、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＳＰＤ－１０Ａ ＶＰ ＵＶ検出器とそれに続いて放射線検出器を有する、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＳＣＬ－１０Ａ ＶＰ／ＬＣ－１０ ＡＴ ＶＰシステムにより実施した（プリアンプリファイヤー、Ｏｒｔｅｃ ９２５－ＳＣＩＮＴ ＡＣＥ ｍａｔｅプリアンプリファイヤーを有するＯｒｔｅｃモデル２７６フォトマルチプライヤーベース、バイアス電源及びＳＣＡ、Ｂｉｃｒｏｎ １Ｍ １１／２フォトマルチプライヤーチューブ）。Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ（登録商標）５μｍ Ｃ１８（２）１００Å、ＬＣカラム１５０×４．６ｍｍ ＭｉｌｌＱ中０．０５％ＴＦＡ緩衝液を使用。
【0141】
リジン側鎖保護Ｔｙｒ３－オクトレオチド／オクトレオテートペプチドの一般的な合成。配列［Ｄ－Ｐｈｅ－Ｃｙｓ（Ａｃｍ）－Ｔｙｒ－（ｔＢｕ）－Ｄ（Ｔｒｐ）－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ（Ａｃｍ）－Ｔｈｒ－（ｔＢｕ）－ＯＬ又はＯＨ］を有するＴｙｒ３－オクトレオチド又はＴｙｒ３－オクトレオテート直鎖ペプチドを、ＣＥＭ Ｌｉｂｅｒｔｙ Ｂｌｕｅ（商標）自動化マイクロ波ペプチド合成装置で、標準的なＦｍｏｃ自動化固相ペプチド合成により調製した。オクトレオテートペプチドでは、第１のアミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ＯｔＢｕ）－ＯＨをワング樹脂上にロードし、オクトレオチドでは、市販のＦｍｏｃ－トレニノール（ｔＢｕ）－２－Ｃｌ－Ｔｒｔ樹脂を使用した。各カップリングサイクルは、１当量のＨＡＴＵ及び５当量のＤＩＰＥＡ並びに脱保護工程用のＤＭＦ中２０％ピペリジンを使用し、Ｎ－末端Ｆｍｏｃ基の最終的な脱保護はなかった。樹脂結合直鎖ペプチドを、ＤＭＦ（２０ｍＬ）中のヨウ素（１ｍｇ／樹脂のｍｇ）を使用して環化した。樹脂切断は、トリイソプロピルシラン（２．５％）、蒸留水（２．５％）及び３，６－ジオキサ－１，８－オクタンジチオール（２．５％）、チオアニソール（２．５％）及びＴＦＡ（９０％）の５ｍＬ溶液を使用して、穏やかに振盪しながら２時間室温で実施した。次いで、混合物を濾過し、Ｎ２を散布して体積を減らし、次いでエーテル（４０ｍＬ）を加えてペプチドを沈殿させ、それを遠心分離後に回収した。粗製のペプチド材料をセミ分取逆相ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ（登録商標）５μｍ Ｃ１８（２）１００Å、ＬＣカラム２５０×２１ｍｍ ＭｉｌｌＱ水中０．１％ＴＦＡ緩衝液及びアセトニトリルを使用）により精製した。ペプチドが何であるかをＥＳＩ－ＭＳにより確認した。精製された環状ペプチドをＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解させ、ＤＩＰＥＡ（１当量）の存在下４時間室温でジ－ｔｅｒｔ－ブチルジカーボネート（５当量）で処理して、リジン側鎖をＢｏｃ基により保護した。冷ジエチルエーテルを反応混合物に加えて、生成物を沈殿させ、それを遠心分離により回収した。残渣を、ＤＭＦ中２０％ピペリジン（１ｍＬ）により３０分間室温で処理し、次いで冷ジエチルエーテルで沈殿させ、残渣を遠心分離により回収し、セミ分取逆相ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ（登録商標）５μｍ Ｃ１８（２）１００Å、ＬＣカラム２５０×２１ｍｍ ＭｉｌｌＱ水中０．１％ＴＦＡ緩衝液及びアセトニトリルを使用）により精製した。ＥＳＩ－ＭＳ：Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）ＴＩＤＥ（ポジティブイオン）［Ｍ＋Ｈ＋］ｍ／ｚ＝１１３５．４９５２（実験値）、［Ｃ５４Ｈ７５Ｎ１０Ｏ１３Ｓ２］＋の計算値：ｍ／ｚ＝１１３５．４９５６；Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）ＴＡＴＥ（ポジティブイオン）［Ｍ＋Ｈ＋］ｍ／ｚ＝１１４９．４７３９（実験値）、［Ｃ５４Ｈ７３Ｎ１０Ｏ１４Ｓ２］＋の計算値：ｍ／ｚ＝１１４９．４７４９。
【0142】
オクトレオチド／オクトレオテートペプチドのＤＦＯＳｑコンジュゲーションの一般的手順。リジン（Ｂｏｃ）側鎖保護オクトレオチド及びオクトレオテートペプチド並びにＤＦＯ－Ｓｑ（５当量）をＤＭＳＯ（１００μＬ）に溶解させ、次いでホウ酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ９．０、９００ｕＬ）を加えた。溶液を、室温で７日間ゆっくりと撹拌し、次いで１０％ＴＦＡで中和して、セミ分取逆相ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ（登録商標）５μｍ Ｃ１８（２）１００Å、ＬＣカラム２５０×２１ｍｍ ＭｉｌｌＱ水中０．１％ＴＦＡ緩衝液及びアセトニトリルを使用）により精製した。精製されたフラクションを、ＤＣＭ中２０％ＴＦＡで、３０分間室温で処理し、次いでＴＦＡをＮ２流の下で除去し、それに続いてＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ（登録商標）５μｍ Ｃ１８（２）１００Å、ＬＣカラム２５０×２１ｍｍ ＭｉｌｌＱ水中０．１％ＴＦＡ緩衝液及びアセトニトリルを使用）を行った。ＥＳＩ－ＭＳ：ＤＦＯＳｑＴＩＤＥ（ポジティブイオン）［Ｍ＋Ｈ＋］ｍ／ｚ＝１６７３．７７１６（実験値）、［Ｃ７８Ｈ１１３Ｎ１６Ｏ２１Ｓ２］＋の計算値：ｍ／ｚ＝１６７３．７７０８；ＤＦＯＳｑＴＡＴＥ（ポジティブイオン）［Ｍ＋Ｈ＋］ｍ／ｚ＝１６８７．７５００（実験値）、［Ｃ７８Ｈ１１１Ｎ１６Ｏ２２Ｓ２］＋の計算値：ｍ／ｚ＝１６８７．７５００。
【0143】
ＤＦＯＳｑＴＩＤＥを８９Ｚｒ放射性標識する。１Ｍシュウ酸中の８９Ｚｒ（６０μＬ、６０ＭＢｑ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＮＥＺ３０８０００ＭＣ）をＭｉｌｌｉＱ水（６０μＬ）で希釈し、次いで一連の小体積のＮａ２ＣＯ３水溶液の添加（１Ｍ、４×１０μＬ）により中和した（ｐＨ６～７）。次いで、ＨＥＰＥＳ緩衝液（５４μＬ、１Ｍ、ｐＨ７．０）を加え、溶液を５分間静置してからｐＨを再び試験した。混合物がｐＨ６～７を有することを確認した後で、ＤＦＯ－Ｓｑ－ＴＩＤＥの溶液（６０μＬの０．２５Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液中１２０μｇ、１０％ＤＭＳＯ、１．１８ナノモル／ＭＢｑ）を加え、反応混合物を室温で３０分間静置し、次いでアリコートを、ラジオＨＰＬＣ（１５分にわたり１ｍＬ／分でＡに対して２０～１００％の緩衝液Ｂ、Ａ＝ＭｉｌｌｉＱ中０．０５％ＴＦＡ及びＢ＝アセトニトリル中０．０５％ＴＦＡ、Ｌｕｎａ Ｃ１８カラム４．６×１５０ｍｍ、５μｍ）により分析した。粗製のトレーサーを、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＳｔｒａｔａＸカートリッジ（Ｃ１８、６０ｍｇ）により、エタノールを溶離液として使用して精製した。いくつかのフラクション（およそ１００μＬ）を回収し、ほとんどの放射能を含むフラクションを滅菌濾過したＰＢＳ中で希釈し、８％（ｖ／ｖ）の最終エタノール濃度にした。それぞれおよそ２．２ＭＢｑ（４．４μｇのペプチド、１６５μＬ、２．６ナノモル）を含む６本のシリンジ（ＢＤ Ｕｌｔｒａ－Ｆｉｎｅ（商標）、０．３ｍＬ）を調製した。
【0144】
ＤＦＯＳｑＴＡＴＥを８９Ｚｒ放射性標識する。１Ｍシュウ酸中の８９Ｚｒ（７０μＬ、５６ＭＢｑ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＮＥＺ３０８０００ＭＣ）をＭｉｌｌｉＱ水（７０μＬ）で希釈し、次いで一連の小体積のＮａ２ＣＯ３水溶液の添加（１Ｍ、４×１０μＬ）により中和した（ｐＨ６～７）。次いで、ＨＥＰＥＳ緩衝液（６２μＬ、１Ｍ、ｐＨ７．０）を加え、溶液を５分間静置してからｐＨを再び試験した。混合物がｐＨ６～７を有することを確認した後で、ＤＦＯ－Ｓｑ－ＴＡＴＥの溶液（５６μＬの０．２５Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液中１１２μｇ、１０％ＤＭＳＯ、１．１９ナノモル／ＭＢｑ）を加え、反応混合物を室温で３０分間静置し、次いでアリコートを、ラジオＨＰＬＣ（１５分にわたり１ｍＬ／分でＡに対して２０～１００％の緩衝液Ｂ、Ａ＝ＭｉｌｌｉＱ中０．０５％ＴＦＡ及びＢ＝アセトニトリル中０．０５％ＴＦＡ、Ｌｕｎａ Ｃ１８カラム４．６×１５０ｍｍ、５μｍ）により分析した。粗製のトレーサーを、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＳｔｒａｔａＸカートリッジ（Ｃ１８、６０ｍｇ）により、エタノールを溶離液として使用して精製した。いくつかのフラクション（およそ１００μＬ）を回収し、ほとんどの放射能を含むフラクションを滅菌濾過したＰＢＳ中に希釈して、８％（ｖ／ｖ）の最終エタノール濃度にした。それぞれおよそ２．５ＭＢｑ（５μｇのペプチド、１５０μＬ、２．９ナノモル）を含む６本のシリンジ（ＢＤ Ｕｌｔｒａ－Ｆｉｎｅ（商標）、０．３ｍＬ）を調製した。
【0145】
オクトレオテート／オクトレオチドトレーサーのＰＥＴ－ＣＴ画像化及び生体内分布。雌のＢａｌｂ／ｃヌードマウス（９週齢）の右脇腹に、ＰＢＳ：マトリゲル（１：１）中の３×１０６ＡＲ４２Ｊ細胞を皮下接種した。マウスの体重を量り、電子カリパスを使用して腫瘍を週に２回測定した。腫瘍体積（ｍｍ３）を、長さ２×幅／２として計算した。１２匹のマウスを画像化及び生体内分布試験に割り当てた（腫瘍体積：１７０～５５０ｍｍ３）。ＤＦＯＳｑＴＩＤＥ（２．５ＭＢｑ）及びＤＦＯＳｑＴＡＴＥ（２．２ＭＢｑ）を、尾静脈注射によりマウスに静脈内投与した。注射後１、２、４、及び１８時間で、３匹のマウスにイソフルランを使用して麻酔をかけ、Ｇ８ ＰＥＴ／ＣＴスキャナー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）のイメージングベッド上に配置した。ＣＴスキャンを実施して、それに続いて直ちに１０分のスタティックＰＥＴスキャンを行った。ＰＥＴ画像を、最尤推定－期待値最大化（ＭＬ－ＥＭ）アルゴリズムを使用して再構成した。ＶｉｖｏＱｕａｎｔ（Ｉｎｖｉｃｒｏ）並びに決定された腫瘍ＳＵＶｍａｘ、腫瘍ＳＵＶｍａｘ／バックグラウンド平均（ＴＢＲ）、及び腫瘍ＳＵＶｍａｘ／肝臓平均（ＴＬＲ）を使用して、ＰＥＴ画像を分析した。１８時間で画像化の後、マウスを安楽死させ、選択した組織を摘出し、秤量し、Ｃａｐｉｎｔｅｃ（Ｃａｐｔｕｓ ４０００ｅ）ガンマカウンターを使用して計測した。３匹のマウスの別なコホートを、生体内分布分析のために注射後１時間で収集した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７を使用してデータを分析し、トレーサー間の差異を、ｔ検定を使用して分析した。
【0146】
ＤＦＯＳｑＴＩＤＥの６８Ｇａ放射性標識。ＨＣｌ中の６８ＧａＩＩＩ（６３０μＬ、４４ＭＢｑ）を、酢酸ナトリウム（１Ｍ、７０μＬ、ｐＨ４．５）で、次いでＨ３ＤＦＯＳｑ－ＴＩＤＥ（６μＬ ＤＭＳＯ中の６μｇ、３．３ナノモル）で緩衝し、反応混合物を室温で１５分間静置し、次いでアリコートを、ラジオＨＰＬＣ（１５分にわたり１ｍＬ／分でＡに対して０～９５％の緩衝液、Ａ＝ＭｉｌｌｉＱ中０．０５％ＴＦＡ及びＢ＝アセトニトリル中０．０５％ＴＦＡ、Ｌｕｎａ Ｃ１８カラム４．６×１５０ｍｍ、５μｍ）により分析した。トレースは、９８％超の放射化学的純度と共に、９８％超の放射化学的収率を示した。反応混合物をＭｉｌｌｉＱ水（４７０μＬ）で希釈し、次いで１０×ＰＢＳ緩衝液（１３０μＬ、ｐＨ７．４）で緩衝して、１．３ｍＬの最終体積にした。２００μＬ中におよそ３．５ＭＢｑ（およそのペプチド質量１μｇ、０．５ナノモル）を含む６本のシリンジ（ＢＤ Ｕｌｔｒａ－Ｆｉｎｅ（商標）、０．３ｍＬ）を調製した。
【0147】
ＤＦＯＳｑＴＡＴＥの６８Ｇａ放射性標識。ＨＣｌ中の６８ＧａＩＩＩ（９００μＬ、４０ＭＢｑ）を、酢酸ナトリウム（１Ｍ、１００μＬ、ｐＨ４．５）で、次いでＨ３ＤＦＯＳｑ－ＴＡＴＥ（６μＬ ＤＭＳＯ中の６μｇ、３．３ナノモル）で緩衝し、反応混合物を室温で１５分間静置し、次いでアリコートを、ラジオＨＰＬＣ（１５分にわたり１ｍＬ／分でＡに対して０～９５％の緩衝液Ｂ、Ａ＝ＭｉｌｌｉＱ中０．０５％ＴＦＡ及びＢ＝アセトニトリル中０．０５％ＴＦＡ、Ｌｕｎａ Ｃ１８カラム４．６×１５０ｍｍ、５μｍ）により分析した。トレースは、９５％超の放射化学的純度と共に、９５％超の放射化学的収率を示した。反応混合物をＭｉｌｌｉＱ水（１００μＬ）で希釈し、次いで１０×ＰＢＳ緩衝液（１１０μＬ、ｐＨ７．４）で緩衝して、１．２ｍＬの最終体積にした。２００μＬ中におよそ２．３ＭＢｑ（およそのペプチド質量１．０μｇ、０．５ナノモル）を含む６本のシリンジ（ＢＤ Ｕｌｔｒａ－Ｆｉｎｅ（商標）、０．３ｍＬ）を調製した。
【0148】
結果及び議論
合成及び放射性標識又はＤＦＯＳｑＴＩＤＥ／ＤＦＯＳｑＴＡＴＥ
樹脂結合直鎖Ｔｙｒ３－オクトレオチド／オクトレオテートペプチドは、標準的な自動化固相ペプチド合成技法をＦｍｏｃ保護アミノ酸と共に使用して、ワング及びクロロトリチル樹脂上でのＨＡＴＵ／ＤＩＰＥＡカップリングを使用し、最終的なＦｍｏｃ脱保護工程なしで調製した。Ｆｍｏｃ基の脱保護は、各サイクルでＤＭＦ中２０％ピペリジンにより固相上で達成した。第２と第７システイン残基の間の分子内ジスルフィド架橋による環化は、システイン残基上のアセトアミドメチル（Ａｃｍ）のインサイチュ脱保護と、それに続くＤＭＦ中のヨウ素を使用するジスルフィド結合形成により達成した。環化の後、固体担体からの最終的な切断及び残存する保護基の脱保護を、標準的なトリフルオラ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）カクテルを使用して達成した（スキーム３）。ＤＦＯｓｑのバイオコンジュゲーションは、特にＮ－末端Ｄ－Ｐｈｅユニット上で望ましく、その理由は、ペプチドのＤ（Ｔｒｐ）－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ部分が受容体結合において重要な役割を果たすからであり、そのため、リジンユニットを、Ｂｏｃ無水物を使用して保護し、それに続いてＤ－Ｐｈｅユニット上の最終的なＦｍｏｃ脱保護を、ＤＭＦ中２０％ピペリジンを使用して行った。生じたＬｙｓ（Ｂｏｃ）－ペプチドは、ホウ酸緩衝液により良好な溶解度を示し、ＤＦＯＳｑとのカップリングは、ペプチド及びＤＦＯＳｑを０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）中で１０％ＤＭＳＯと共に７日にわたりインキュベートすることにより達成した。最終的なＤＦＯｓｑコンジュゲートされたペプチドアセンブリーは、ＴＦＡによるリジンからのＢｏｃ基の脱保護と、それに続くＨＰＬＣ精製の後に得られた。
スキーム３：ＤＦＯＳｑ－オクトレオテート及び－オクトレオチドペプチドの合成（ｉ）ヨウ素、ＤＭＦ、（ｉｉ）ＴＦＡカクテル、（ｉｉｉ）Ｂｏｃ－無水物、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦ、（ｉｖ）ＤＭＦ中２０％ピペリジン、（ｖ）ＤＦＯＳｑ、０．１Ｍホウ酸緩衝液、ｐＨ９．０、（ｖｉ）ＤＣＭ中２０％ＴＦＡ。
合成及び放射性標識又はＤＦＯＳｑＴＩＤＥ／ＤＦＯＳｑＴＡＴＥ
樹脂結合直鎖Ｔｙｒ３－オクトレオチド／オクトレオテートペプチドは、標準的な自動化固相ペプチド合成技法をＦｍｏｃ保護アミノ酸と共に使用して、ワング及びクロロトリチル樹脂上でのＨＡＴＵ／ＤＩＰＥＡカップリングを使用し、最終的なＦｍｏｃ脱保護工程なしで調製した。Ｆｍｏｃ基の脱保護は、各サイクルでＤＭＦ中２０％ピペリジンにより固相上で達成した。第２と第７システイン残基の間の分子内ジスルフィド架橋による環化は、システイン残基上のアセトアミドメチル（Ａｃｍ）のインサイチュ脱保護と、それに続くＤＭＦ中のヨウ素を使用するジスルフィド結合形成により達成した。環化の後、固体担体からの最終的な切断及び残存する保護基の脱保護を、標準的なトリフルオラ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）カクテルを使用して達成した（スキーム３）。ＤＦＯｓｑのバイオコンジュゲーションは、特にＮ－末端Ｄ－Ｐｈｅユニット上で望ましく、その理由は、ペプチドのＤ（Ｔｒｐ）－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ部分が受容体結合において重要な役割を果たすからであり、そのため、リジンユニットを、Ｂｏｃ無水物を使用して保護し、それに続いてＤ－Ｐｈｅユニット上の最終的なＦｍｏｃ脱保護を、ＤＭＦ中２０％ピペリジンを使用して行った。生じたＬｙｓ（Ｂｏｃ）－ペプチドは、ホウ酸緩衝液により良好な溶解度を示し、ＤＦＯＳｑとのカップリングは、ペプチド及びＤＦＯＳｑを０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）中で１０％ＤＭＳＯと共に７日にわたりインキュベートすることにより達成した。最終的なＤＦＯｓｑコンジュゲートされたペプチドアセンブリーは、ＴＦＡによるリジンからのＢｏｃ基の脱保護と、それに続くＨＰＬＣ精製の後に得られた。
【化23】
【0149】
８９Ｚｒによる両ペプチドの放射性標識を、温和な反応条件下で達成した。８９Ｚｒを、１Ｍシュウ酸溶液中に得て、それを１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３で中和し、ＨＥＰＥＳで緩衝して、０．２５Ｍの最終濃度にした。ペプチドを、８９Ｚｒの２μｇ／ＭＢｑの濃度で標識し、分析ラジオＨＰＬＣは、３０～６０分の反応時間で９５％超の放射化学的収率を示した。粗製のトレーサーを、エタノールを溶離液として使用してＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＳｔａｒａＸ Ｃ１８カートリッジにより精製して、９８％超の放射化学的純度を有するトレーサーが生じた（図１１）。
【0150】
ＤＦＯＳｑ－ＴＡＴＥ及びＤＦＯ－ＴＩＤＥの両方の［６８Ｇａ］ＧａＩＩＩによる放射性標識を、室温で、１０分で達成した。６８Ｇｅ／６８Ｇａジェネレーターの０．０５Ｍ ＨＣｌによる溶離から得られた［６８Ｇａ］ＧａＩＩＩの水性混合物を、酢酸ナトリウム緩衝液（１Ｍ、ｐＨ４．５）によりｐＨ４～５に部分的に中和した。比較的低いペプチド質量（およそ１５０ｎｇ／［６８Ｇａ］ＧａＩＩＩのＭＢｑ）の使用によっても、６８ＧａＤＦＯＳｑＴＡＴＥ及び６８ＧａＤＦＯＳｑ－ＴＩＤＥを高い放射化学的収率（９８％以上）及び純度（（９８％以上）を得ることが可能であり、インビボ実験のために粗製のトレーサーの精製は必要ではなかった（図１４）。
【0151】
８９Ｚｒ－ＤＦＯＳｑＴＩＤＥ／ＤＦＯＳｑＴＡＴＥのＰＥＴ－ＣＴ画像化及び生体内分布
ＡＲ４２Ｊ（ラット膵臓癌細胞株）腫瘍を有する上述のＢａｌｂ／ｃヌードマウスに、尾静脈注射により、８９ＺｒＤＦＯＳｑＴＡＴＥ又は８９ＺｒＤＦＯＳｑＴＩＤＥ（２～３ＭＢｑ）を静脈内注射した。注射後１、２、４、及び１８時間で、マウスに、イソフルランにより麻酔をかけ、１０分にわたり画像化した。ＤＦＯＳｑＴＩＤＥ及びＤＦＯＳｑＴＡＴＥの注射後１時間で、腎臓、腫瘍、及び肝臓への取込みを観察した。ＤＦＯＳｑＴＩＤＥ及びＤＦＯＳｑＴＡＴＥを注射したマウスの代表的なＰＥＴ画像を図１２に示し、各放射性トレーサーの腫瘍ＳＵＶｍａｘの定量化を図１３ａにまとめる。
ＡＲ４２Ｊ（ラット膵臓癌細胞株）腫瘍を有する上述のＢａｌｂ／ｃヌードマウスに、尾静脈注射により、８９ＺｒＤＦＯＳｑＴＡＴＥ又は８９ＺｒＤＦＯＳｑＴＩＤＥ（２～３ＭＢｑ）を静脈内注射した。注射後１、２、４、及び１８時間で、マウスに、イソフルランにより麻酔をかけ、１０分にわたり画像化した。ＤＦＯＳｑＴＩＤＥ及びＤＦＯＳｑＴＡＴＥの注射後１時間で、腎臓、腫瘍、及び肝臓への取込みを観察した。ＤＦＯＳｑＴＩＤＥ及びＤＦＯＳｑＴＡＴＥを注射したマウスの代表的なＰＥＴ画像を図１２に示し、各放射性トレーサーの腫瘍ＳＵＶｍａｘの定量化を図１３ａにまとめる。
【0152】
これらの知見は、ＤＦＯＳｑＴＡＴＥの腫瘍％ＩＤ／ｇが、ＤＦＯＳｑＴＩＤＥより、１時間（１０．４±０．５対３．４±０．４、Ｐ＜０．００１）、及び１８時間（４．９±０．８対１．７±０．１、Ｐ＜０．０５）で高かったという生体内分布結果と一致している。画像化データは、ＤＦＯＳｑＴＡＴＥより低い腫瘍対肝臓比をもたらす、肝臓によるＤＦＯＳｑＴＩＤＥの高い取込みを示す。生体内分布データにより、ＤＦＯＳｑＴＩＤＥの、ＤＦＯＳｑＴＡＴＥより高い肝臓中の蓄積が確認される（注射後１時間で１０．８±０．４対４．３±０．４％ＩＤ、Ｐ＜０．０１）。図１３ｂ中の生体内分布データは、両放射性トレーサーが１８時間で腫瘍から実質的に除去されたことを表す。ＤＦＯＳｑＴＩＤＥでは、％ＩＤ／ｇは、１時間での３．４±０．４から１８時間での１．５±０．１に減少し（Ｐ＜０．０５）、ＤＦＯＳｑＴＡＴＥは、１時間での１０．４±０．５から１８時間での４．９±０．８に減少した（Ｐ＜０．０１）。これらのデータは、ＤＦＯＳｑＴＩＤＥの１時間取込みが１８時間で５５％減少し（Ｐ＜０．０１）、ＤＦＯＳｑＴＡＴＥ取込みが５８％減少した（Ｐ＜０．０１）画像化データ（図１２）により支持される。
【0153】
要約すると、８９Ｚｒ－ＤＦＯ－ＳｑＴＡＴＥは、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおいて８９Ｚｒ－ＤＦＯ－Ｓｑ－ＴＩＤＥより高いＡＲ４２Ｊ腫瘍取込み及びより低い肝臓蓄積を示した。両放射性トレーサーは、注射後１８時間までにＡＲ４２Ｊ腫瘍から実質的に除去された。
【0154】
【表3】
【0155】
両ペプチドを、温和な反応条件下で６８Ｇａにより容易に放射性標識できる。６８ＧａをＨＣｌ溶液として得て、それを酢酸ナトリウム（１Ｍ、ｐＨ４．５）により緩衝して、ｐＨを４．０に上げてから標識した。１０分後の反応混合物の分析ラジオＨＰＬＣは、精製を必要としない高い放射化学的純度の完全な標識を示す（図１４）。
【0156】
２種の新たなＳＳＴＲ２結合性Ｔｙｒ３－オクトレオテート及びオクトレオチドペプチドを設計し、合成し、ＤＦＯＳｑリガンドにＮ－末端に戦略的にバイオコンジュゲートした。ペプチドは合成が容易で、温和な条件下で８９Ｚｒ及び６８Ｇａ放射性核種により容易に放射性標識でき、高い放射化学的収率及び純度を与える。両ペプチドは、ＰＥＴ－ＣＴ及び生体内分布分析に基づく神経内分泌腫瘍の診断用画像化の可能性を示した。
【0157】
６８ＧＡＤＦＯＳｑＴＩＤＥ／ＤＦＯＳｑＴＡＴＥのＰＥＴ－ＣＴ画像化及び生体内分布
６８ＧａＤＦＯＳｑ－ＴＩＤＥ及び６８ＧａＤＦＯＳｑ－ＴＡＴＥトレーサーを、尾静脈により、ＡＲ４２Ｊ（ラット膵臓癌細胞株）腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃヌードマウスに静脈内注射した（２～３ＭＢｑ、１μｇ、０．５ナノモル）。ＰＥＴ画像を、注射後１及び２時間で得た（図１５ａ及びｂ）。ＰＥＴ画像を検査すると、両トレーサーで腫瘍の明確な描写が表されるが、６８ＧａＤＦＯＳｑ－ＴＡＴＥはより高い腫瘍取込みを有する。標準取込値（ＳＵＶｍａｘ＝組織中の放射能／注射された放射能／ＢＷ）を使用する画像中の取込みの定量化により、６８ＧａＤＦＯＳｑ－ＴＡＴＥでより高い取込みを確認する（１時間；ＳＵＶｍａｘ１．２１±０．２０と比べて１．８±０．２、図１５ｃ）。６８ＧａＤＦＯＳｑＴＡＴＥのより高い腫瘍取込みは、注射後２時間でＳＵＶｍａｘが５％しか減少しない高度の腫瘍滞留とも関連していた一方で、６８ＧａＤＦＯＳｑＴＩＤＥの腫瘍ＳＵＶｍａｘは、注射後２時間で３０％６８ＧａＤＦＯＳｑＴＡＴＥ減少した。両トレーサーは血液から迅速に除去され、安定なガリウム－６８錯体と一致する骨中の低い取込み並びに筋中の低い取込みがある。両トレーサーは、腎臓及び膀胱中に著しい取込みを有する。過剰なそれぞれの非放射性のペプチド（２０倍、２０μｇ、１１．１ナノモル）を加えると、腫瘍取込みが著しく減少し、腫瘍中の両トレーサーの取込みが受容体介在性であることを示唆している。
６８ＧａＤＦＯＳｑ－ＴＩＤＥ及び６８ＧａＤＦＯＳｑ－ＴＡＴＥトレーサーを、尾静脈により、ＡＲ４２Ｊ（ラット膵臓癌細胞株）腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃヌードマウスに静脈内注射した（２～３ＭＢｑ、１μｇ、０．５ナノモル）。ＰＥＴ画像を、注射後１及び２時間で得た（図１５ａ及びｂ）。ＰＥＴ画像を検査すると、両トレーサーで腫瘍の明確な描写が表されるが、６８ＧａＤＦＯＳｑ－ＴＡＴＥはより高い腫瘍取込みを有する。標準取込値（ＳＵＶｍａｘ＝組織中の放射能／注射された放射能／ＢＷ）を使用する画像中の取込みの定量化により、６８ＧａＤＦＯＳｑ－ＴＡＴＥでより高い取込みを確認する（１時間；ＳＵＶｍａｘ１．２１±０．２０と比べて１．８±０．２、図１５ｃ）。６８ＧａＤＦＯＳｑＴＡＴＥのより高い腫瘍取込みは、注射後２時間でＳＵＶｍａｘが５％しか減少しない高度の腫瘍滞留とも関連していた一方で、６８ＧａＤＦＯＳｑＴＩＤＥの腫瘍ＳＵＶｍａｘは、注射後２時間で３０％６８ＧａＤＦＯＳｑＴＡＴＥ減少した。両トレーサーは血液から迅速に除去され、安定なガリウム－６８錯体と一致する骨中の低い取込み並びに筋中の低い取込みがある。両トレーサーは、腎臓及び膀胱中に著しい取込みを有する。過剰なそれぞれの非放射性のペプチド（２０倍、２０μｇ、１１．１ナノモル）を加えると、腫瘍取込みが著しく減少し、腫瘍中の両トレーサーの取込みが受容体介在性であることを示唆している。
【0158】
高い腫瘍取込みは、同じマウスモデルでのエクスビボ生体内分布試験により確認したが、試験では、マウスに、６８ＧａＤＦＯＳｑ－ＴＩＤＥか６８ＧａＤＦＯＳｑ－ＴＡＴＥのいずれか（２～３ＭＢｑ、１μｇ、０．５ナノモル）を注射し、次いで投与後１時間か２時間のいずれかで安楽死させた。腫瘍及び主要器官中の組織のグラムあたりの注射された放射能の量（％ＩＡ／ｇ）を定量化した（図１６）。注射後１時間で、６８ＧａＤＦＯＳｑＴＡＴＥ（９．８０±２．３３％ＩＡ／ｇ）の投与は、６８ＧａＤＦＯＳｑＴＩＤＥ（８．８１±１．０３％ＩＡ／ｇそれぞれ）より高い腫瘍中の取込みをもたらし、ＰＥＴ画像と一致した。６８ＧａＤＦＯＳｑＴＩＤＥの初期の腫瘍取込みは、注射後１時間での８．８１±１．０３％ＩＡ／ｇから注射後２時間での４．４±１．１％ＩＡ／ｇに減少した。対照的に、注射後１時間での６８ＧａＤＦＯＳｑＴＡＴＥの高い腫瘍取込み（９．８０±２．３３％ＩＤ／ｇ）は、ＰＥＴ画像と一致して注射後２時間で維持されている（９．２２±０．９２％ＩＤ／ｇ）。６８ＧａＤＦＯＳｑＴＩＤＥは、６８ＧａＤＦＯＳｑＴＡＴＥ（１時間、１５．９８±３．２７％ＩＡ／ｇ）より、腎臓中のより高度の取込み（１時間、３７．５６±３．５０％ＩＡ／ｇ）を示す。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【国際調査報告】