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特表2022-548776ヒト人工多能性幹細胞のための費用効果の高い培地およびプロトコル
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-11-21
(54)【発明の名称】ヒト人工多能性幹細胞のための費用効果の高い培地およびプロトコル
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20221114BHJP
C12N 5/07 20100101ALI20221114BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10 ZNA
C12N5/07
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022518207
(86)(22)【出願日】2020-09-18
(85)【翻訳文提出日】2022-04-13
(86)【国際出願番号】 US2020051620
(87)【国際公開番号】W WO2021055841
(87)【国際公開日】2021-03-25
(31)【優先権主張番号】62/902,561
(32)【優先日】2019-09-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522109216
【氏名又は名称】ノースウェスタン ユニバーシティ
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(72)【発明者】
【氏名】ポール バーリッジ
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065AB01
4B065AC20
4B065BA02
4B065BB02
4B065BB06
4B065BB19
4B065BB20
(57)【要約】
低播種密度条件下で高い増殖速度をサポートし、最小限の培地交換を必要とし、低コストで分化の再現性を維持するように完全に最適化された新規の培地の処方を提供する。この処方は、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）の生成および１００継代を超える培養の両方をサポートすることができる。１００リットルの培地を作製するのに適したＢ８サプリメントのアリコートの生成は、基本的な機器を備えた研究室では簡単であり、培地の完全なボトルのコストは１リットルあたり約１２米ドルまでである。この製剤では、ウィークエンドフリーなｈｉＰＳＣ細胞培養法が可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下を含む、ヒト人工多能性幹細胞の増殖のための細胞培養培地：細胞培養基本培地；
線維芽細胞増殖因子２；
インスリンまたはＩＧＦ１；
セレンの供給源。
【請求項2】
トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦβ１）、アクチビンＡ、またはアルブミンを実質的に含まない、請求項１に記載の細胞培養培地。
【請求項3】
ＴＧＦβ３、ＮＲＧ１；トランスフェリン、アスコルビン酸、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項１に記載の細胞培養培地。
【請求項4】
チアゾビビンをさらに含む、請求項１に記載の細胞培養培地。
【請求項5】
ｐＨが７．１であることをさらに特徴とする、請求項１に記載の細胞培養培地。
【請求項6】
浸透圧が３１０ｍＯｓｍ／ｌであることをさらに特徴とする、請求項１に記載の細胞培養培地。
【請求項7】
２４３８μｇ／ｍｌの量の重炭酸ナトリウムをさらに特徴とする、請求項１に記載の細胞培養培地。
【請求項8】
前記細胞培養基本培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２であることを特徴とする、請求項１に記載の細胞培養培地。
【請求項9】
ＦＧＦ２は、配列番号４、５、または１５からなる群から選択される組換えタンパク質である、請求項１に記載の細胞培養培地。
【請求項10】
亜セレン酸塩は、亜セレン酸ナトリウムである、請求項１に記載の細胞培養培地。
【請求項11】
ＴＧＦβ３が配列番号１６の組換えタンパク質であるか、またはＮＲＧ１が配列番号１７の組換えタンパク質である、請求項３に記載の細胞培養培地。
【請求項12】
前記培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養培地中に処方された、４０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２－Ｇ３、２０μｇ／ｍｌのインスリン、２０ｎｇ／ｍｌの亜セレン酸ナトリウムを含む、請求項１に記載の細胞培養培地。
【請求項13】
ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養培地中に処方された、４０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２－Ｇ３（配列番号１５）、２０μｇの／ｍｌインスリン、２０ｎｇ／ｍｌの亜セレン酸ナトリウム、２０μｇ／ｍｌのトランスフェリン、０．１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ３（配列番号１６）、０．１ｎｇ／ｍｌのＮＲＧ１（配列番号１７）、２００μｇ／ｍｌのアスコルビン酸２－リン酸、２４３８μｇ／ｍｌの重炭酸ナトリウムを含む、請求項１２に記載の細胞培養培地。
【請求項14】
本質的に以下からなる培地： 細胞培養基本培地；線維芽細胞増殖因子２－Ｇ３；インスリンまたはＩＧＦ１；セレンの供給源、ＴＧＦβ３、ＮＲＧ１；トランスフェリン、およびアスコルビン酸。
【請求項15】
以下からなる培地： 細胞培養基本培地；線維芽細胞増殖因子２－Ｇ３；インスリンまたはＩＧＦ１；セレンの供給源、ＴＧＦβ３、ＮＲＧ１；トランスフェリン、およびアスコルビン酸。
【請求項16】
以下を含む、細胞培養培地を調製するためのキット：ＦＧＦ２－Ｇ３、ＴＧＦβ３、およびＮＲＧ１をコードするプラスミド；
ＦＧＦ２－Ｇ３、ＴＧＦβ３、およびＮＲＧ１タンパク質を調製し、および細胞培養培地を調製するための説明書。
【請求項17】
以下の一つまたは複数をさらに含む、請求項１６に記載のキット：培養培地、亜セレン酸ナトリウム、インスリンまたはＩＧＦ１、トランスフェリン、アスコルビン酸２－リン酸、重炭酸ナトリウム、またはチアゾビビン。
【請求項18】
以下を含む、培養においてヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）を増殖させる、および継代する方法：以下を含む細胞培養培地を入手する工程：
ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養培地中に処方された、ＦＧＦ２－Ｇ３（配列番号１５）、インスリンまたはＩＧＦ１、亜セレン酸ナトリウム、トランスフェリン、ＴＧＦβ３（配列番号１６）、ＮＲＧ１（配列番号１７）、アスコルビン酸２－リン酸、重炭酸ナトリウム；
マトリックスコート済プレートを準備する工程；
０日目にｈｉＰＳＣをマトリックスに追加する工程；
１日目に細胞培養培地を交換する工程；
３．５日目に細胞を継代するか、または７日間連続して細胞を増殖させる工程；
ここで、３．５日の継代または７日の細胞増殖サイクルの少なくとも１日は、細胞培養培地の交換を必要としない。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
相互参照
本出願は、２０１９年９月１９日に出願された米国仮出願第６２／９０２，５６１号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年９月１９日に出願された米国仮出願第６２／９０２，５６１号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
政府の権利
本発明は、国立衛生研究所によって授与された契約ＨＬ１２１１７７の下で政府の支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所によって授与された契約ＨＬ１２１１７７の下で政府の支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【0003】
配列表の参照
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２０年９月１日に作成された上記のＡＳＣＩＩコピーは、４７４６０－１０８＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名前で、サイズは１６，４５２バイトである。
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２０年９月１日に作成された上記のＡＳＣＩＩコピーは、４７４６０－１０８＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名前で、サイズは１６，４５２バイトである。
【0004】
技術の領域
多能性細胞の状態および細胞増殖、特にヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）を維持するために必要な成分および濃度で最適化された細胞培養培地を提供する。
多能性細胞の状態および細胞増殖、特にヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）を維持するために必要な成分および濃度で最適化された細胞培養培地を提供する。
【背景技術】
【0005】
ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）は機能的に不死であり、人体内のすべての２００に及ぶ細胞系統に分化する可能性を維持しながら、無制限に増殖することができる。ｈｉＰＳＣの生成は、ＣＤ７１+血液前赤芽球（Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）または骨髄細胞（Ｅｍｉｎｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｓｔａｅｒｋ ｅｔ ａｌ．，２０１０）の増幅、ならびにセンダイウイルスベースの市販のリプログラミング因子の発現（Ｆｕｊｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｆｕｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００９）が単純なため、ルーチン的になっている。この単純さにより、再生医療、疾患モデリング、創薬、および薬理ゲノミクス等、多くの分野でｈｉＰＳＣ由来細胞の潜在的な用途に対する熱意が高まっている。
【0006】
しかしながら、これらの用途では、大量のｈｉＰＳＣまたは多数の患者に由来するｈｉＰＳＣ系統の培養が必要であり、３つの主要な制限が明らかになった： １、患者数の多いプロジェクトでは桁違いの、大規模な多能性細胞培養のコスト； ２、業界の研究所にとって特に問題である、毎日の培地交換に時間がかかる要件； ３、多能性培養の一貫性および方法に大きく依存する分化効率の系統間変動。
【発明の概要】
【0007】
ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）培養はルーチン的になっているが、多能性細胞培地のコスト、頻繁な培地交換、および分化の再現性の制約があるままであり、大規模プロジェクトの可能性を制限している。ここでは、培地の成分および濃度の徹底的な最適化の結果としての新規ｈｉＰＳＣ培地（Ｂ８）の処方について記載し、多能性状態および細胞増殖に対する各成分の必要性および相対的な寄与を確立している。Ｂ８は、市販の培地のコストの９７％を削減する。Ｂ８処方は、低い播種密度での急速な増殖および堅牢性のために特別に最適化されている。
【0008】
核型の安定性を維持しながら、Ｂ８で２９のｈｉＰＳＣ系統の誘導、および多能性の長期的な維持を実証した。この処方はまた、成長率または分化能力を犠牲にすることなく、ウィークエンドフリーの栄養補給（ｆｅｅｄｉｎｇ）スケジュールを可能にする。したがって、このシンプルで費用効果の高いＢ８培地は、薬理ゲノミクスおよび再生医療に必要な大規模な細胞生産で行われているような大規模なｈｉＰＳＣ疾患モデリングプロジェクトを可能にする。ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）培養はルーチン的になっているが、多能性細胞培地のコスト、頻繁な培地交換、および分化の再現性の制約があるままであり、大規模プロジェクトの可能性を制限している。ここでは、培地の成分および濃度の徹底的な最適化の結果としての新規ｈｉＰＳＣ培地（Ｂ８）の処方について記載し、多能性状態および細胞増殖に対する各成分の必要性および相対的な寄与を確立している。
【0009】
他の方法、特徴、および／または利点は、以下の図および詳細な説明を検討することで明らかであるか、または明らかになるであろう。そのようなすべての追加の方法、機能、および利点が本明細書に含まれ、付随する特許請求の範囲によって保護されることが意図されている。
【0010】
配列の簡単な説明
配列番号１は、ヒトＦＧＦ１のアミノ酸配列である： MFNLPPGNYK KPKLLYCSNG GHFLRILPDG TVDGTRDRSD QHIQLQLSAE SVGEVYIKST ETGQYLAMDT DGLLYGSQTP NEECLFLERL EENHYNTYIS KKHAEKNWFV GLKKNGSCKR GPRTHYGQKA ILFLPLPVSS D
配列番号１は、ヒトＦＧＦ１のアミノ酸配列である： MFNLPPGNYK KPKLLYCSNG GHFLRILPDG TVDGTRDRSD QHIQLQLSAE SVGEVYIKST ETGQYLAMDT DGLLYGSQTP NEECLFLERL EENHYNTYIS KKHAEKNWFV GLKKNGSCKR GPRTHYGQKA ILFLPLPVSS D
【0011】
配列番号２はヒトＦＧＦ１－４Ｘのアミノ酸配列である： MFNLPPGNYK KPKLLYCSNG GHFLRILPDG TVDGTRDRSD PHIQLQLIAE SVGEVYIKST ETGQYLAMDT DGLLYGSQTP NEECLFLERL EENGYNTYIS KKHAEKNWFV GLNKNGSCKR GPRTHYGQKA ILFLPLPVSS D
【0012】
配列番号３は、ヒトＦＧＦ２のアミノ酸配列である： MAAGSITTLP ALPEDGGSGA FPPGHFKDPK RLYCKNGGFF LRIHPDGRVD GVREKSDPHI KLQLQAEERG VVSIKGVCAN RYLAMKEDGR LLASKCVTDE CFFFERLESN NYNTYRSRKY TSWYVALKRT GQYKLGSKTG PGQKAILFLP MSAKS
【0013】
配列番号４はヒトＦＧＦ２ Ｋ１２８Ｎのアミノ酸配列である： MAAGSITTLP ALPEDGGSGA FPPGHFKDPK RLYCKNGGFF LRIHPDGRVD GVREKSDPHI KLQLQAEERG VVSIKGVCAN RYLAMKEDGR LLASKCVTDE CFFFERLESN NYNTYRSRKY TSWYVALNRT GQYKLGSKTG PGQKAILFLP MSAKS
【0014】
配列番号５は、ヒトＦＧＦ２－Ｇ３ Ｒ３１Ｌ、Ｖ５２Ｔ、Ｅ５４Ｄ、Ｈ６９Ｆ、Ｌ９２Ｙ、Ｓ９４Ｉ、Ｃ９６Ｎ、Ｓ１０９Ｅ、Ｔ１２１Ｐのアミノ酸配列である： MAAGSITTLP ALPEDGGSGA FPPGHFKDPK LLYCKNGGFF LRIHPDGRVD GTRDKSDPFI KLQLQAEERG VVSIKGVCAN RYLAMKEDGR LYAIKNVTDE CFFFERLEEN NYNTYRSRKY PSWYVALKRT GQYKLGSKTG PGQKAILFLP MSAKS
【0015】
配列番号６は、ＦＧＦ１－４Ｘの増殖因子プラスミドを生成するためのヌクレオチド配列である：
GGATCCATGTTCAACTTACCCCCCGGCAACTACAAGAAGCCGAAGCTGCTGTATTGCAGCAATGGCGGCCACTTTCTGCGCATTTTACCGGATGGTACCGTTGATGGTACCCGTGATCGTTCAGATCCGCACATCCAGTTACAGCTGATCGCAGAAAGCGTGGGTGAAGTGTACATCAAGAGCACCGAAACCGGCCAGTATCTGGCAATGGATACCGATGGCCTGCTGTATGGTTCACAAACCCCGAACGAAGAATGCCTGTTCCTGGAACGCCTGGAAGAAAACGGCTACAACACCTACATCAGCAAGAAGCACGCGGAGAAGAACTGGTTTGTTGGCCTGAACAAGAACGGCAGCTGCAAACGTGGTCCTCGTACCCATTATGGCCAGAAAGCGATTC TGTTTCTGCCGTTACCGGTTAGCAGCGATGAATTC
GGATCCATGTTCAACTTACCCCCCGGCAACTACAAGAAGCCGAAGCTGCTGTATTGCAGCAATGGCGGCCACTTTCTGCGCATTTTACCGGATGGTACCGTTGATGGTACCCGTGATCGTTCAGATCCGCACATCCAGTTACAGCTGATCGCAGAAAGCGTGGGTGAAGTGTACATCAAGAGCACCGAAACCGGCCAGTATCTGGCAATGGATACCGATGGCCTGCTGTATGGTTCACAAACCCCGAACGAAGAATGCCTGTTCCTGGAACGCCTGGAAGAAAACGGCTACAACACCTACATCAGCAAGAAGCACGCGGAGAAGAACTGGTTTGTTGGCCTGAACAAGAACGGCAGCTGCAAACGTGGTCCTCGTACCCATTATGGCCAGAAAGCGATTC TGTTTCTGCCGTTACCGGTTAGCAGCGATGAATTC
【0016】
配列番号７は、ＦＧＦ２－Ｋ１２８Ｎの増殖因子プラスミドを生成するためのヌクレオチド配列である：
GGATCCATGGCAGCAGGTAGCATTACTACTTTACCGGCGCTGCCGGAAGATGGTGGTTCAGGTGCATTTCCTCCTGGCCACTTCAAAGATCCTAAACGCCTGTACTGCAAGAATGGCGGCTTCTTTCTGCGCATTCACCCGGATGGCCGTGTTGATGGTGTTCGCGAAAAATCAGATCCGCACATCAAGCTGCAGTTACAGGCGGAAGAACGTGGCGTTGTGAGCATCAAGGGCGTTTGTGCAAACCGCTATTTAGCGATGAAAGAAGACGGCCGCCTGTTAGCGAGCAAGTGTGTGACCGACGAATGCTTCTTCTTCGAACGCCTGGAAAGCAACAACTACAACACCTACCGCAGCCGCAAGTACACCAGCTGGTATGTTGCGTTAAACCGTACCGGCCAGTACAAATTAGGCAGCAAAACCGGCCCGGGTCAGAAAGCGATTCTGTTTCTGC C T AT G AGC GC G A AG AGC T GAG A ATT C
GGATCCATGGCAGCAGGTAGCATTACTACTTTACCGGCGCTGCCGGAAGATGGTGGTTCAGGTGCATTTCCTCCTGGCCACTTCAAAGATCCTAAACGCCTGTACTGCAAGAATGGCGGCTTCTTTCTGCGCATTCACCCGGATGGCCGTGTTGATGGTGTTCGCGAAAAATCAGATCCGCACATCAAGCTGCAGTTACAGGCGGAAGAACGTGGCGTTGTGAGCATCAAGGGCGTTTGTGCAAACCGCTATTTAGCGATGAAAGAAGACGGCCGCCTGTTAGCGAGCAAGTGTGTGACCGACGAATGCTTCTTCTTCGAACGCCTGGAAAGCAACAACTACAACACCTACCGCAGCCGCAAGTACACCAGCTGGTATGTTGCGTTAAACCGTACCGGCCAGTACAAATTAGGCAGCAAAACCGGCCCGGGTCAGAAAGCGATTCTGTTTCTGC C T AT G AGC GC G A AG AGC T GAG A ATT C
【0017】
配列番号８は、ＦＧＦ２－Ｇ３の増殖因子プラスミドを生成するためのヌクレオチド配列である：
GGATCCATGGCAGCAGGTTCGATCACTACATTACCGGCACTGCCGGAAGATGGTGGTTCAGGTGCATTTCCTCCTGGCCACTTCAAAGACCCTAAACTGCTGTACTGCAAGAATGGCGGCTTCTTTCTGCGCATTCACCCGGATGGCCGTGTTGATGGTACTCGCGATAAATCAGATCCGTTCATCAAGCTGCAGCTGCAAGCGGAAGAACGTGGCGTGGTGAGCATTAAGGGCGTTTGTGCAAACCGTTATTTAGCGATGAAGGAAGACGGCCGCCTGTACGCGATCAAGAACGTGACCGACGAATGCTTCTTCTTTGAACGCCTGGAAGAAAACAACTACAACACCTACCGCAGCCGCAAGTACCCGAGCTGGTATGTTGCGTTAAAGCGTACCGGCCAGTATAAATTAGGCAGCAAAACCGGTCCGGGCCAGAAGGCGATTCTGTTTCTGCCTATGAGCGCGAAGTCAGAATTC
GGATCCATGGCAGCAGGTTCGATCACTACATTACCGGCACTGCCGGAAGATGGTGGTTCAGGTGCATTTCCTCCTGGCCACTTCAAAGACCCTAAACTGCTGTACTGCAAGAATGGCGGCTTCTTTCTGCGCATTCACCCGGATGGCCGTGTTGATGGTACTCGCGATAAATCAGATCCGTTCATCAAGCTGCAGCTGCAAGCGGAAGAACGTGGCGTGGTGAGCATTAAGGGCGTTTGTGCAAACCGTTATTTAGCGATGAAGGAAGACGGCCGCCTGTACGCGATCAAGAACGTGACCGACGAATGCTTCTTCTTTGAACGCCTGGAAGAAAACAACTACAACACCTACCGCAGCCGCAAGTACCCGAGCTGGTATGTTGCGTTAAAGCGTACCGGCCAGTATAAATTAGGCAGCAAAACCGGTCCGGGCCAGAAGGCGATTCTGTTTCTGCCTATGAGCGCGAAGTCAGAATTC
【0018】
配列番号９は、ＮＲＧ１の増殖因子プラスミドを生成するためのヌクレオチド配列である：
GGATCCATGAGCCACCTTGTGAAATGCGCCGAGAAGGAGAAGACCTTTTGCGTGAATGGCGGCGAATGCTTCATGGTGAAGGATCTGTCAAATCCGAGCCGCTACCTGTGCAAATGCCCGAACGAGTTTACCGGCGATCGTTGCCAGAATTACGTTATGGCGAGCTTCTAC AAGC ACCTGGGC ATCGAGTTC ATGGAAGCGGAGT AAGAATT C
GGATCCATGAGCCACCTTGTGAAATGCGCCGAGAAGGAGAAGACCTTTTGCGTGAATGGCGGCGAATGCTTCATGGTGAAGGATCTGTCAAATCCGAGCCGCTACCTGTGCAAATGCCCGAACGAGTTTACCGGCGATCGTTGCCAGAATTACGTTATGGCGAGCTTCTAC AAGC ACCTGGGC ATCGAGTTC ATGGAAGCGGAGT AAGAATT C
【0019】
配列番号１０は、ＴＧＦＢ１の増殖因子プラスミドを生成するためのヌクレオチド配列である：
GGATCCGCGCTGGATACCAACTATTGCTTTAGCAGCACCGAAAAAAACTGCTGCGTGCGCCAGCTGTATATTGATTTTCGCAAAGATCTGGGCTGGAAATGGATTCATGAACCGAAAGGCTATCATGCGAACTTTTGCCTGGGCCCGTGCCCGTATATTTGGAGCCTGGATACCCAGTATAGCAAAGTGCTGGCGCTGTATAACCAGCATAACCCGGGCGCGAGCGCGGCGCCGTGCTGCGTGCCGCAGGCGCTGGAACCGCTGCCGATTGTGTATTATGTGGGCCGC AAACCGAAAGT GGAAC AGCTGAGC AAC ATGATTGT GCGC AGCTGC AAAT GCAGCTGAGAATTC
GGATCCGCGCTGGATACCAACTATTGCTTTAGCAGCACCGAAAAAAACTGCTGCGTGCGCCAGCTGTATATTGATTTTCGCAAAGATCTGGGCTGGAAATGGATTCATGAACCGAAAGGCTATCATGCGAACTTTTGCCTGGGCCCGTGCCCGTATATTTGGAGCCTGGATACCCAGTATAGCAAAGTGCTGGCGCTGTATAACCAGCATAACCCGGGCGCGAGCGCGGCGCCGTGCTGCGTGCCGCAGGCGCTGGAACCGCTGCCGATTGTGTATTATGTGGGCCGC AAACCGAAAGT GGAAC AGCTGAGC AAC ATGATTGT GCGC AGCTGC AAAT GCAGCTGAGAATTC
【0020】
配列番号１１は、ＴＧＦＢ１ｍの増殖因子プラスミドを生成するためのヌクレオチド配列である：
GGATCCGCGCTGGATACCAACTATTGCTTTAGCAGCACCGAAAAAAACTGCTGCGTGCGCCAGCTGTATATTGATTTTCGCAAAGATCTGGGCTGGAAATGGATTCATGAACCGAAAGGCTATCATGCGAACTTTTGCCTGGGCCCGTGCCCGTATATTTGGAGCCTGGATACCCAGTATAGCAAAGTGCTGGCGCTGTATAACCAGCATAACCCGGGCGCGAGCGCGGCGCCGAGCTGC GTGCCGCAGGCGCTGGAACCGCTGCCGATTGTGTATT
GGATCCGCGCTGGATACCAACTATTGCTTTAGCAGCACCGAAAAAAACTGCTGCGTGCGCCAGCTGTATATTGATTTTCGCAAAGATCTGGGCTGGAAATGGATTCATGAACCGAAAGGCTATCATGCGAACTTTTGCCTGGGCCCGTGCCCGTATATTTGGAGCCTGGATACCCAGTATAGCAAAGTGCTGGCGCTGTATAACCAGCATAACCCGGGCGCGAGCGCGGCGCCGAGCTGC GTGCCGCAGGCGCTGGAACCGCTGCCGATTGTGTATT
【0021】
配列番号１２は、ＴＧＦＢ３の増殖因子プラスミドを生成するためのヌクレオチド配列である：
GGATCCGCGCTGGATACCAACTATTGCTTTCGCAACCTGGAAGAAAACTGCTGCGTGCGCCCGCTGTATATTGATTTTCGCCAGGATCTGGGCTGGAAATGGGTGCATGAACCGAAAGGCTATTATGCGAACTTTTGCAGCGGCCCGTGCCCGTATCTGCGCAGCGCGGATACCACCCATAGCACCGTGCTGGGCCTGTATAACACCCTGAACCCGGAAGCGAGCGCGAGCCCGTGCTGC GTGCCGCAGGATCTGGAACCGCTGACCATTCTG
GGATCCGCGCTGGATACCAACTATTGCTTTCGCAACCTGGAAGAAAACTGCTGCGTGCGCCCGCTGTATATTGATTTTCGCCAGGATCTGGGCTGGAAATGGGTGCATGAACCGAAAGGCTATTATGCGAACTTTTGCAGCGGCCCGTGCCCGTATCTGCGCAGCGCGGATACCACCCATAGCACCGTGCTGGGCCTGTATAACACCCTGAACCCGGAAGCGAGCGCGAGCCCGTGCTGC GTGCCGCAGGATCTGGAACCGCTGACCATTCTG
【0022】
配列番号１３は、ＴＧＦＢ３ｍの増殖因子プラスミドを生成するためのヌクレオチド配列である：
GGATCCGCGCTGGATACCAACTATTGCTTTCGCAACCTGGAAGAAAACTGCTGCGTGCGCCCGCTGTATATTGATTTTCGCCAGGATCTGGGCTGGAAATGGGTGCATGAACCGAAAGGCTATTATGCGAACTTTTGCAGCGGCCCGTGCCCGTATCTGCGCAGCGCGGATACCACCCATAGCACCGTGCTGGGCCTGTATAACACCCTGAACCCGGAAGCGAGCGCGAGCCCGAGCTGCGTGCCGCAGGATCTGGAACCGCTGACCATTCTGTATTATGTGGGCCGCACCCCGAAAGTGGAACAGCTGAGCAACATGGTGGTGAAAAGCTGCAAATGCAGCTGAAGGGAATT C
GGATCCGCGCTGGATACCAACTATTGCTTTCGCAACCTGGAAGAAAACTGCTGCGTGCGCCCGCTGTATATTGATTTTCGCCAGGATCTGGGCTGGAAATGGGTGCATGAACCGAAAGGCTATTATGCGAACTTTTGCAGCGGCCCGTGCCCGTATCTGCGCAGCGCGGATACCACCCATAGCACCGTGCTGGGCCTGTATAACACCCTGAACCCGGAAGCGAGCGCGAGCCCGAGCTGCGTGCCGCAGGATCTGGAACCGCTGACCATTCTGTATTATGTGGGCCGCACCCCGAAAGTGGAACAGCTGAGCAACATGGTGGTGAAAAGCTGCAAATGCAGCTGAAGGGAATT C
【0023】
配列番号１４は、Ｋ１２８Ｎ置換を有するＦＧＦ２配列である： AAGSITTLP ALPEDGGSGA FPPGHFKDPK RLYCKNGGFF LRIHPDGRVD GVREKSDPHI KLQLQAEERG VVSIKGVCAN RYLAMKEDGR LLASKCVTDE CFFFERLESN NYNTYRSRKY TSWYVALKRT GQYKLGSKTG PGQKAILFLP MSAKS
【0024】
配列番号１５はＦＧＦ２－Ｇ３配列である： AAGSITTLP ALPEDGGSGA FPPGHFKDPK LLYCKNGGFF LRIHPDGRVD GTRDKSDPFI KLQLQAEERG VVSIKGVCAN RYLAMKEDGR LYAIKNVTDE CFFFERLEEN NYNTYRSRKY PSWYVALKRT GQYKLGSKTG PGQKAILFLP MSAKS
【0025】
配列番号１６はＴＧＦＢ３アミノ酸配列である： ALDTNY CFRN LEENCCVRPL YIDFRQDLGW KWVHEPKGYY ANFCSGPCPY LRSADTTHST VLGLYNTLNP EASASPCCVP QDLEPLTILY YVGRTPKVEQ LSNMVVKSCK CS
【0026】
配列番号１７はＮＲＧ１の切断型バージョンである： SHLYKCAEKE KTFC VNGGECFMVKDL SNP S RYLCKCPNEF TGDRCQNYVM ASFYKHLGIE FMEAE
【図面の簡単な説明】
【0027】
【図1】マトリックス濃度の最適化と培地処方の比較ａ、マトリゲル（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標））またはＣｕｌｔｒｅｘ（登録商標）（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）の希釈液でのｈｉＰＳＣの相対的増殖、Ｃｕｌｔｒｅｘ（登録商標）はＧｅｌｔｒｅｘ（登録商標）（Ｇｉｂｃｏ（商標））と同等である。
【図2】図２Ａ～Ｆ。短期増殖アッセイによる基本的なヒト多能性幹細胞培地成分の最適化。結果は、濃い灰色のバーで示される初期培地成分濃度に正規化し、最適化は短期６日間の増殖アッセイを使用して完了した。対角ハッシュで示される最適化された成分濃度。 （Ａ）相対的増殖に対する組換えヒトＩＧＦ１ ＬＲ３（ｎ＝３）および組換えヒトインスリン（ｎ＝１８～２２）濃度の効果の比較。 （Ｂ）Ｌ－アスコルビン酸２－リン酸（ｎ＝１９～２７）。 （Ｃ）トランスフェリン（ｎ＝２～２０）。 （Ｄ）亜セレン酸ナトリウム（ｎ＝３～２０）。 （Ｅ）ＦＧＦ２－Ｋ１２８Ｎ（ｎ＝３～１２）。 （Ｆ）ＴＧＦｂ１（ｎ＝２０～２５）。 ｎ＝完全な実験再現、対応のないスチューデントのＴ検定、＊Ｐ≦０．０５， ＊＊Ｐ≦０．０１， ＊＊＊Ｐ≦０．００５， ＊＊＊＊ｐ≦０．０００１、ｎ．ｓ．＝有意ではない。
【図3】図３Ａ～Ｈ。短期アッセイにおける追加のヒト多能性幹細胞培地成分の最適化。Ｅ８培地成分濃度は濃い灰色のバーで示され、最適化は単純な６日間の増殖アッセイを使用して完了した。対角ハッシュで示される最適化された成分濃度。（Ａ）継代後の最初の２４時間にＹ２７６３２（１０μＭ）を使用したＲＯＣＫ１／２阻害の有無によるクローン増殖をサポートする組換えトランスフェリン（１０ μｇ ｍｌ－１）の適合性の比較（ｎ＝３） （Ｂ）相対的増殖の継代後の最初の２４時間のみの２つの一般的なＲＯＣＫ１／２阻害剤の比較（ｎ＞ ５）。 （Ｃ）相対的増殖に対する非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）および化学的に定義された脂質（ｎ＝５）の添加の効果の比較。 （Ｄ）脂肪酸を含まないアルブミン（ｎ＝４）。 （Ｅ）重炭酸ナトリウム（ｎ＝５）。 （Ｆ）ｐＨ（ｎ＝９）。 （Ｇ）浸透圧（ｎ＝８）。 （Ｈ）ＦＧＦ２－Ｇ３（ｎ＝３）。 ｎ＝完全な実験再現、対応のないスチューデントのＴ検定、＊Ｐ≦０．０５， ＊＊Ｐ≦０．０１， ＊＊＊Ｐ≦０．００５， ＊＊＊＊ｐ≦０．０００１、ｎ．ｓ．＝有意ではない。
【図4】図４Ａ～Ｂ。組換え増殖因子を生成するために使用されるプラスミド。 （Ａ）精製用のデュアル６×Ｈｉｓ部位およびトロンビン切断部位を示すＦＧＦ２－Ｋ１２８Ｎ。 （Ｂ）改変されたＦＧＦ２プラスミドを生成するために使用されるアミノ酸配列。
【図5】図５Ａ～Ｐ。長期増殖アッセイによるＢ８培地成分の最適化。結果は、濃い灰色のバーで示される初期培地成分濃度に正規化し、最適化は長期の５回の継代、４日間の増殖アッセイを使用して完了した。 （Ａ）組換えヒトインスリン濃度が相対的増殖に及ぼす影響の比較（ｎ＝１０）。 （Ｂ）Ｌ－アスコルビン酸２－リン酸（ｎ＝１０）。 （Ｃ）組換えトランスフェリン（ｎ＝１０）。 （Ｄ）亜セレン酸ナトリウム（ｎ＝５）。 （Ｅ）インハウス製のＦＧＦ２－Ｇ３（ｎ＝６）。 （Ｇ）ＮＯＤＡＬ（ｎ＝５）。 （Ｈ）アクチビンＡ（ｎ＝５）。 （Ｉ）市販のＴＧＦｂ１と比較して９回の継代後にインハウス製のＴＧＦｂ３（ｎ＝９）。 （Ｊ）４０ ｎｇ ｍｌ－１ ＦＧＦ２－Ｇ３へのＮＲＧ１の添加（ｎ＞５）。 （Ｋ）最終的なＢ８処方。 ｎ＝完全な実験再現、対応のないスチューデントのＴ検定、＊Ｐ≦０．０５， ＊＊Ｐ≦０．０１， ＊＊＊Ｐ≦０．００５， ＊＊＊＊ｐ≦０．０００１、ｎ．ｓ．＝有意ではない。
【図6】増殖因子プラスミドを生成するために使用されるＤＮＡ配列。ＦＧＦ２－Ｇ３およびＴＧＦｂ３は、Ｎ末端６×Ｈｉｓタグ／融合タンパク質の切断を必要とせずに機能することが示されたため、Ｃ末端終止コドンも削除して追加の６×Ｈｉｓタグに読み通し、精製効率を高めたことに留意されたい。
【図7】図７Ａ～Ｅ。ｈｉＰＳＣの生成および培養に適したＢ８の認定。 （Ａ）フローサイトメトリーによって評価されたＢ８に由来する２９のｈｉＰＳＣ系統における多能性マーカーの維持の実証。 （Ｂ）様々なＢ８由来のｈｉＰＳＣ系統における多能性マーカーの発現。 （Ｃ）血液由来のＢ８に由来する４つのｈｉＰＳＣ系統のＧバンド核型分析の例。 （Ｄ）Ｅ８と比較したＢ８の低播種密度でのｈｉＰＳＣの成長（ｎ＝８）。 （Ｅ）培地を３７℃で２または７日間保存した後のリン酸化ＥＲＫの刺激の評価。インハウスで生成したＦＧＦ２－Ｇ３を市販のＦＧＦ２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）と比較する。ｈｉＰＳＣはＦＧＦ２を２４時間飢餓状態にした後、指示された培地で１時間処理した後、ウエスタンブロット用に収集した。総ＥＲＫはローディング対照として使用した。
【図8】図８Ａ～Ｈ。単層分化（Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）と互換性のあるウィークエンドフリーな継代スケジュールの最適化。 （Ａ）最適な４日間の培地交換スケジュールの確立。 （Ｂ）培地交換スケジュールを伴う７日の継代。 （Ｃ）７日の継代のみのスケジュール。 （Ｄ）０．５ ｍｇ ｍｌ－１アルブミンの添加の有無にかかわらず、２つの７日のウィークエンドフリーな継代スケジュールを使用した場合の増殖の比較（ｎ＝２）。 （Ｅ）７日の継代および培地交換スケジュールへの様々なレベルのアルブミン（ｍｇ ｍｌ－１）の添加の比較（ｎ＝４）。 （Ｆ）７日の継代および培地交換スケジュールを使用した場合の心臓分化効率（ｎ＝５）。 （Ｇ）７日の継代および培地交換スケジュールを使用した場合の内皮分化効率（ｎ＝６）。 （Ｈ）（Ｇ）７日の継代および培地交換スケジュールを使用した場合の内皮分化効率（ｎ＝５）。
【発明を実施するための形態】
【0028】
発明の詳細な説明
ここで示すのは、低播種密度条件下で高い増殖速度をサポートし、最小限の培地交換を必要とし、低コストで分化の再現性を維持するように完全に最適化された新規の培地の処方（Ｂ８）である。この処方は、ｈｉＰＳＣの生成および１００継代を超える培養の両方をサポートすることができる。１００リットルの培地を作製するのに適したＢ８サプリメントのアリコートの生成は、基本的な機器を備えた研究室では簡単であり、培地の完全なボトルのコストは１リットルあたり約１２米ドルまでである。
ここで示すのは、低播種密度条件下で高い増殖速度をサポートし、最小限の培地交換を必要とし、低コストで分化の再現性を維持するように完全に最適化された新規の培地の処方（Ｂ８）である。この処方は、ｈｉＰＳＣの生成および１００継代を超える培養の両方をサポートすることができる。１００リットルの培地を作製するのに適したＢ８サプリメントのアリコートの生成は、基本的な機器を備えた研究室では簡単であり、培地の完全なボトルのコストは１リットルあたり約１２米ドルまでである。
【0029】
３つの簡単な工程での組換えタンパク質生産の詳細な手順を含む完全なプロトコルが提供される。このプロトコルは、３つのＥ．ｃｏｌｉで発現する、コドン最適化組換えタンパク質のラボ内生成によって可能になる： 熱安定性が改善された線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）の操作型（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｆｏｒｍ）（ＦＧＦ２－Ｇ３）； Ｅ．ｃｏｌｉで発現できるより強力なＴＧＦβであるトランスフォーミング増殖因子ｂ３（ＴＧＦβ３）； およびＥＧＦ様ドメインを含むニューレグリン１（ＮＲＧ１）の誘導体。タンパク質生産用のすべてのプラスミドは、Ａｄｄｇｅｎｅから入手することができる。これらのプロトコルのコモディティ化により、多能性細胞培養コストがほぼ排除され、細胞培養に関連する労力が最小限に抑えられるため、ｈｉＰＳＣで達成できることを大幅に増やすことができると考えている。
【0030】
ｈｉＰＳＣ培養に不可欠な成分は、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、ＦＧＦ２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２の５つだけであり（図２）、５番目の成分であるＴＧＦβ１の重要性は長期アッセイでのみ明らかであった（図２および５）。他の３つの成分、アスコルビン酸２－リン酸、トランスフェリン、およびＮＲＧ１は、ｈｉＰＳＣの増殖に不可欠であるが、それらを除去すると増殖速度が低下する。
【0031】
培地の開発において多くの驚くべき結果がもたらされた。たとえば、それが多くの学術的および市販の培地処方の一般的な構成要素であるにもかかわらず、アルブミンの添加の正または負の効果はない（図３Ｄ）。アクチビンＡは、他の様々な市販の処方に含まれているにもかかわらず、ＴＧＦβ１の有無にかかわらず適切ではなかった（図５）。アクチビンＡは、ＴＧＦβ１よりも程度は低いものの、非常に低用量で成長をサポートできることを示している。
【0032】
一部の市販培地の主な問題は、ウィークエンドフリーなスケジュールは実行可能であるが、ｈｉＰＳＣの増殖はかなり遅く、低密度のコロニーとして細胞を増殖させることが推奨されることである。これらの低密度コロニーは、大多数の系統で一般的になっているように、その後の単層分化プロトコルと互換性がない。熱安定性ＦＧＦ２－Ｇ３の組み込みとともに、特に高速単層増殖のためのＢ８培地の最適化は、一般的な分化プロトコルとの互換性を維持しながら、これらの問題の多くを克服する。
【0033】
増殖因子ＦＧＦ２およびＴＧＦβ１は、総培地コストの８０％以上を占めていた。プラスミドの最適化および必要に応じたチオレドキシン融合タンパク質の生成により、封入体に関連する複雑さの多くと、それに伴い必要になるリフォールディングプロセスを排除することができる。２日間および基本的な実験スキルを必要とする典型的な１リットルのＥ．ｃｏｌｉ培養は、通常、８００リットルのＢ８に十分な８０ｍｇのＦＧＦ２－Ｇ３が提供する。同様に、ＴＧＦβ３またはＮＲＧ１の５００ｍｌ培養は、通常、労働期間で十分なタンパク質を提供する（～８００，０００リットルのＢ８培地）。さらに、これらの成分の濃度は、増殖速度に実質的な影響を与えることなく７５％削減することができ（両方とも５μｇ ｍｌ-1）（図５）、これらの節約に基づいて、低コストに最適化されたＢ８の製剤を開発した（図８）。
【0034】
具体的には、細胞培地は、ヒト人工多能性幹細胞の増殖のために、細胞培養基本培地；線維芽細胞増殖因子２；インスリン；およびセレンの供給源を含む。細胞培養培地は、トランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦβ１）、アクチビンＡ、またはアルブミンを含む必要はない。つまり、細胞培養培地は、トランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦβ１）、アクチビンＡ、またはアルブミンを実質的に含まなくてもよい。細胞培養培地は、微量のトランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦβ１）、アクチビンＡ、またはアルブミンを含んでもよい。細胞培養培地は、測定可能な量のトランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦβ１）、アクチビンＡ、またはアルブミンを含んでもよいが、細胞の増殖、分化、または健康に影響を与えるのに十分な濃度ではない。
【0035】
一部の態様では、インスリンまたはＩＧＦ１は培地において使用することができる。インスリンの組換え型、ＩＧＦ１、機能を損なうことなく生産するのに費用効果の高い任意の誘導体またはバリアントを、インスリンまたはＩＧＦ１の代わりに使用することができる。同様に、セレンの供給源は、セレン塩、Ｌ－セレノメチオニン、セレノシステイン、メチルセレノシステインまたは同様の化合物を含んでもよい。
【0036】
一部の態様では、細胞培養培地は、ＴＧＦβ３、ＮＲＧ１；トランスフェリン、アスコルビン酸、またはそれらの組み合わせも含んでもよい。細胞培養培地はまた、チアゾビビンを含んでもよい。細胞培養培地は、７．１のｐＨまたは３１０ｍＯｓｍ／ｌの浸透圧によって特徴付けられていてもよい。細胞培養培地はまた、２４３８μｇ／ｍｌの量の重炭酸ナトリウムによって特徴付けられていてもよい。
【0037】
一部の態様では、細胞培養基本培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２である。一部の態様では、ＦＧＦ２は、配列番号４、５、または１５のいずれかとして定義される組換えタンパク質、またはそれらの混合物である。一部の態様では、ＦＧＦ２は、組換えタンパク質ＦＧＦ２－Ｇ３（配列番号１５）である。一部の態様では、亜セレン酸塩は亜セレン酸ナトリウムである。一部の態様では、ＴＧＦβ３は、配列番号１６の組換えタンパク質であり、ＮＲＧ１は、配列番号１７の組換えタンパク質である。一部の態様では、細胞培養培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養培地中に処方された、４０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２－Ｇ３、２０μｇ／ｍｌのインスリン、２０ｎｇ／ｍｌの亜セレン酸ナトリウムを含む。別の方法として、細胞培養培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養培地中に処方された、４０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２－Ｇ３（配列番号１５）、２０μｇ／ｍｌのインスリン、２０ｎｇ／ｍｌの亜セレン酸ナトリウム、２０μｇ／ｍｌのトランスフェリン、０．１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ３（配列番号１６）、０．１ｎｇ／ｍｌのＮＲＧ１（配列番号１７）、２００μｇ／ｍｌアスコルビン酸２－リン酸、２４３８μｇ／ｍｌの重炭酸ナトリウムを含んでもよい。
【0038】
細胞培養培地を調製するためのキットも本明細書で提供され、該キットは、以下を含む： ＦＧＦ２－Ｇ３、ＴＧＦβ３、およびＮＲＧ１をコードするプラスミド；およびＦＧＦ２－Ｇ３、ＴＧＦβ３、およびＮＲＧ１タンパク質を調製し、および細胞培養培地を調製するための説明書。キットは、培養培地、亜セレン酸ナトリウム、インスリン、トランスフェリン、アスコルビン酸２－リン酸、重炭酸ナトリウム、またはチアゾビビンもさらに含んでもよい。
【0039】
培養においてヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）を増殖させる、および継代する方法も本明細書で提供され、該方法は、以下を含む： ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養培地中に処方された、ＦＧＦ２－Ｇ３（配列番号１５）、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、トランスフェリン、ＴＧＦβ３（配列番号１６）、ＮＲＧ１（配列番号１７）、アスコルビン酸２－リン酸、重炭酸ナトリウムを含む細胞培養培地を入手する工程；マトリックスコート済プレートを準備する工程；０日目にｈｉＰＳＣをマトリックスに追加する工程；１日目に細胞培養培地を交換する工程；３．５日の継代または７日の細胞増殖サイクルの少なくとも１日は、細胞培養培地の交換を必要としない条件で、３．５日目に細胞を継代するか、または７日間連続して細胞を増殖させる工程。
【0040】
基本培地
本明細書に記載の培地は、培地ベースとしてのＤＭＥＭ／Ｆ１２の使用を示唆している。しかしながら、任意の適切な培養培地ベースは、本明細書に記載のインスリン、アスコルビン酸、トランスフェリン、亜セレン酸塩、ＦＧＦ２、ＴＧＦβ、およびＮＲＧ１と組み合わせることができる。実際、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２および比較的単純なＭＥＭαの間で同等の結果を示した。他の任意の基本的な定義された培養培地もまた、本明細書に記載のインスリン、アスコルビン酸、トランスフェリン、亜セレン酸塩、ＦＧＦ２、ＴＧＦβ、およびＮＲＧ１と組み合わせて使用することができる。
本明細書に記載の培地は、培地ベースとしてのＤＭＥＭ／Ｆ１２の使用を示唆している。しかしながら、任意の適切な培養培地ベースは、本明細書に記載のインスリン、アスコルビン酸、トランスフェリン、亜セレン酸塩、ＦＧＦ２、ＴＧＦβ、およびＮＲＧ１と組み合わせることができる。実際、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２および比較的単純なＭＥＭαの間で同等の結果を示した。他の任意の基本的な定義された培養培地もまた、本明細書に記載のインスリン、アスコルビン酸、トランスフェリン、亜セレン酸塩、ＦＧＦ２、ＴＧＦβ、およびＮＲＧ１と組み合わせて使用することができる。
【0041】
先行技術の培養培地の欠陥：
ヒト多能性幹細胞の培養に必要な培地条件は、過去１５年間で着実に進歩しており、高濃度のＦＧＦ２の必要性（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，２００５）、ＴＧＦβ１の使用（Ａｍｉｔ ｅｔ ａｌ．， ２００４）、２１成分を含むＴｅＳＲ処方によるノックアウト血清置換（ＫＳＲ）の排除（Ｌｕｄｗｉｇ ａｎｄ Ｔｈｏｍｓｏｎ， ２００７； Ｌｕｄｗｉｇ ｅｔ ａｌ．，２００６ａ； Ｌｕｄｗｉｇ ｅｔ ａｌ．，２００６ｂ）、続いてわずか８つの主要成分で構成されている、第一のロバストな化学的に定義された処方、Ｅ８（Ｂｅｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２０１２； Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）の発見から、大きな進歩がもたらされた。以下を含む多くの代替の非化学的に（ｎｏｎ－ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ）定義された多能性製剤（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）が記載されている： ＣＤＭ－ＢＳＡ（Ｈａｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３； Ｖａｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００５； Ｖａｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００９）、ＤＣ－ＨＡＩＦ（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，２０１２； Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００７）、ｈＥＳＦ９Ｔ（Ｆｕｒｕｅ ｅｔ ａｌ．， ２００８； Ｙａｍａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４）、ＦＤＴＡ（Ｂｒｅｃｋｗｏｌｄｔ ｅｔ ａｌ．，２０１７； Ｆｒａｎｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２； Ｐｉｃｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５）、およびｉＤＥＡＬ（Ｍａｒｉｎｈｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５）（図Ｓ１Ａ）。
ヒト多能性幹細胞の培養に必要な培地条件は、過去１５年間で着実に進歩しており、高濃度のＦＧＦ２の必要性（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，２００５）、ＴＧＦβ１の使用（Ａｍｉｔ ｅｔ ａｌ．， ２００４）、２１成分を含むＴｅＳＲ処方によるノックアウト血清置換（ＫＳＲ）の排除（Ｌｕｄｗｉｇ ａｎｄ Ｔｈｏｍｓｏｎ， ２００７； Ｌｕｄｗｉｇ ｅｔ ａｌ．，２００６ａ； Ｌｕｄｗｉｇ ｅｔ ａｌ．，２００６ｂ）、続いてわずか８つの主要成分で構成されている、第一のロバストな化学的に定義された処方、Ｅ８（Ｂｅｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２０１２； Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）の発見から、大きな進歩がもたらされた。以下を含む多くの代替の非化学的に（ｎｏｎ－ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ）定義された多能性製剤（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）が記載されている： ＣＤＭ－ＢＳＡ（Ｈａｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３； Ｖａｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００５； Ｖａｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００９）、ＤＣ－ＨＡＩＦ（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，２０１２； Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００７）、ｈＥＳＦ９Ｔ（Ｆｕｒｕｅ ｅｔ ａｌ．， ２００８； Ｙａｍａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４）、ＦＤＴＡ（Ｂｒｅｃｋｗｏｌｄｔ ｅｔ ａｌ．，２０１７； Ｆｒａｎｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２； Ｐｉｃｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５）、およびｉＤＥＡＬ（Ｍａｒｉｎｈｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５）（図Ｓ１Ａ）。
【0042】
利用可能な各製剤は、３つの主要なシグナル伝達成分のコアで構成されている： １）ＩＮＳＲおよびＩＧＦ１Ｒに結合して、生存および増殖を促進するＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路にシグナルを送る、インスリンまたはＩＧＦ１； ２）ＦＧＦＲ１／ＦＧＦＲ４またはＥＲＢＢ３／ＥＲＢＢ４にそれぞれ結合し、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲおよびＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路を活性化するＦＧＦ２および／またはＮＲＧ１； ３）ＴＧＦＢＲ１／２および／またはＡＣＶＲ２Ａ／２Ｂ／１Ｂ／１Ｃに結合してＴＧＦβシグナル伝達経路を活性化するＴＧＦβ１、ＮＯＤＡＬ、またはアクチビンＡ。ＮＯＤＡＬは、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）でＮＯＤＡＬアンタゴニストＬＥＦＴＹ１／２が発現するため（Ｂｅｓｓｅｒ， ２００４； Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．， ２００３）、ｉｎ ｖｉｔｒｏで高濃度が必要になるので（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１１）、多能性培地製剤ではあまり一般的に使用されない。さらに、ｈＰＳＣ培養における一部またはすべての増殖因子を置換するために小分子を利用する多数の増殖因子フリーの処方が記載されている（Ｂｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０； Ｄｅｓｂｏｒｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００８； Ｋｕｍａｇａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３； Ｔｓｕｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。しかし、これらは一般的な使用法にうまく変換されていない。最近、ＧＳＫ３Ｂ（１－アザケンパウロン［１－ａｚａｋｅｎｐａｕｌｏｎｅ］）、ＤＹＲＫ１（ＩＤ－８）、およびカルシニューリン／ＮＦＡＴ（タクロリムス／ＦＫ５０６）の阻害剤を組み合わせた、増殖因子を含まない処方AKITが示された（Ｙａｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，２０１８）が、増殖とコロニーの成長が大幅に減少し、増殖の系統間変動が増加した。最後に、処方が独自のものであり、研究者に開示されていない１５を超える市販の多能性培地も利用することができる。これらの培地は、ほとんどのｈｉＰＳＣラボの主要なコストであり、研究活動を大幅に制限する。これらの培地処方の一部は、毎日の培地交換なしまたは「ウィークエンドフリー」でｈｉＰＳＣ増殖をサポートすることが示唆されており、おそらく、ヘパリン硫酸を使用して、３７℃で急速に分解するＦＧＦ２を安定化させており（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２； Ｆｕｒｕｅ ｅｔ ａｌ．，２００８）、そして多面的な抗酸化剤として作用するウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む。
【実施例】
【0043】
実施例
特定の実施形態を実施例の形で以下に記載する。実施形態はかなり詳細に記載されているが、添付の特許請求の範囲をそのような詳細または任意の特定の実施形態に制限すること、または何らかの方法で制限することを意図するものではない。以下の実験手順は、実施例全体を通して使用される。
特定の実施形態を実施例の形で以下に記載する。実施形態はかなり詳細に記載されているが、添付の特許請求の範囲をそのような詳細または任意の特定の実施形態に制限すること、または何らかの方法で制限することを意図するものではない。以下の実験手順は、実施例全体を通して使用される。
【0044】
実験手順：
ヒト人工多能性細胞培養
すべての多能性およびリプログラミング細胞培養は、５％ＣＯ2および５％Ｏ2を含むＨｅｒａｃｅｌｌ（商標）ＶＩＯＳ １６０ｉ直接熱加湿インキュベーター（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））で３７℃に維持した。分化培養は５％ＣＯ2および大気（～２１％）Ｏ2で維持した。すべての培養物（多能性および分化）は、表面積９．６ｃｍ2あたり２ｍｌの培地または同等物で維持した。すべての培地は４℃で使用し、ＦＧＦ２の熱安定性の懸念から（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）、細胞に添加する前に３７℃に温めなかった。冷たい培地の使用による細胞増殖への検出可能な影響を見出さなかった。ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（商標）ＰＬＵＳキット（Ｌｏｎｚａ）および３８４ウェルＶａｒｉｏｓｋａｎ（商標）ＬＵＸ（（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））プレートリーダーを使用して、すべての培養物のマイコプラズマを定期的に試験した。Ｅ８培地は、前述のようにインハウスで作製し（Ｂｕｒｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１５； Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１１）、ＤＭＥＭ ／ Ｆ１２（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）、１０－０９２－ＣＭ）、２０μｇ ｍｌ-1のＥ．ｃｏｌｉ由来組換えヒトインスリン（Ｇｉｂｃｏ（商標）、Ａ１１３８２ＩＪ）、６４μｇ ｍｌ-1のＬ－アスコルビン酸２－リン酸三ナトリウム塩（和光、３２１－４４８２３）、１０μｇ ｍｌ-1のＯｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ由来組換えヒトトランスフェリン（Ｏｐｔｉｆｅｒｒｉｎ、ＩｎＶｉｔｒｉａ、７７７ＴＲＦ０２９－１０Ｇ、）、１４ｎｇ ｍｌ-1の亜セレン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、Ｓ５２６１）、１００ｎｇ ｍｌ-1の組換えヒトＦＧＦ２－Ｋ１２８Ｎ（インハウス製、以下を参照）、２ｎｇ ｍｌ-1の組換えヒトＴＧＦβ１（１１２アミノ酸、ＨＥＫ２９３由来、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、１００－２１）で構成されていた。細胞は、１：８００に希釈された増殖因子で還元されたマトリゲル（登録商標）上のＥ８培地で日常的に維持された（以下を参照）。Ｅ８には、継代後の最初の２４時間、１０μＭのＹ２７６３２二塩酸塩（ＬＣ Ｌａｂｓ、Ｙ－５３０１）（以降、Ｅ８Ｙと呼ぶ）を補充した。標準培養では、～７０－８０％のコンフルエンスを達成した後、ＤＰＢＳ（Ｃａ2+およびＭｇ2+なし、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標））中の０．５ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＵｌｔｒａＰｕｒｅ）を使用して、細胞を４日ごとに１：２０の比率で継代した。細胞系統は継代２０から１００の間に使用された。試験された他の培地成分は、Ｈｕｍａｎ Ｌｏｎｇ Ｒ３ ＩＧＦ１（Ｓｉｇｍａ、９１５９０Ｃ）、チアゾビビン（ＬＣ Ｌａｂｓ、Ｔ－９７５３）、組換えヒトＴＧＦβ３（Ｃｅｌｌ Ｇｕｉｄａｎｃｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＧＦＨ１０９）、重炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）、ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ（商標））、ＣＤ脂質（Ｇｉｂｃｏ（商標））、脂肪酸を含まないアルブミン（ＧｅｎＤＥＰＯＴ、Ａ０１００）であった。ｐＨは１０Ｎ ＨＣｌまたはＩＮ ＮａＯＨ（両方ともＳｉｇｍａ製）で調整し、ＳｅｖｅｎＣｏｍｐａｃｔ（商標）ｐＨメーター（ＭｅｔｔｌｅｒＴｏｌｅｄｏ）を使用して測定した。浸透圧は、塩化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）または細胞培養水（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標））で調整し、浸透圧計（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で測定した。
ヒト人工多能性細胞培養
すべての多能性およびリプログラミング細胞培養は、５％ＣＯ2および５％Ｏ2を含むＨｅｒａｃｅｌｌ（商標）ＶＩＯＳ １６０ｉ直接熱加湿インキュベーター（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））で３７℃に維持した。分化培養は５％ＣＯ2および大気（～２１％）Ｏ2で維持した。すべての培養物（多能性および分化）は、表面積９．６ｃｍ2あたり２ｍｌの培地または同等物で維持した。すべての培地は４℃で使用し、ＦＧＦ２の熱安定性の懸念から（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）、細胞に添加する前に３７℃に温めなかった。冷たい培地の使用による細胞増殖への検出可能な影響を見出さなかった。ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（商標）ＰＬＵＳキット（Ｌｏｎｚａ）および３８４ウェルＶａｒｉｏｓｋａｎ（商標）ＬＵＸ（（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））プレートリーダーを使用して、すべての培養物のマイコプラズマを定期的に試験した。Ｅ８培地は、前述のようにインハウスで作製し（Ｂｕｒｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１５； Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１１）、ＤＭＥＭ ／ Ｆ１２（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）、１０－０９２－ＣＭ）、２０μｇ ｍｌ-1のＥ．ｃｏｌｉ由来組換えヒトインスリン（Ｇｉｂｃｏ（商標）、Ａ１１３８２ＩＪ）、６４μｇ ｍｌ-1のＬ－アスコルビン酸２－リン酸三ナトリウム塩（和光、３２１－４４８２３）、１０μｇ ｍｌ-1のＯｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ由来組換えヒトトランスフェリン（Ｏｐｔｉｆｅｒｒｉｎ、ＩｎＶｉｔｒｉａ、７７７ＴＲＦ０２９－１０Ｇ、）、１４ｎｇ ｍｌ-1の亜セレン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、Ｓ５２６１）、１００ｎｇ ｍｌ-1の組換えヒトＦＧＦ２－Ｋ１２８Ｎ（インハウス製、以下を参照）、２ｎｇ ｍｌ-1の組換えヒトＴＧＦβ１（１１２アミノ酸、ＨＥＫ２９３由来、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、１００－２１）で構成されていた。細胞は、１：８００に希釈された増殖因子で還元されたマトリゲル（登録商標）上のＥ８培地で日常的に維持された（以下を参照）。Ｅ８には、継代後の最初の２４時間、１０μＭのＹ２７６３２二塩酸塩（ＬＣ Ｌａｂｓ、Ｙ－５３０１）（以降、Ｅ８Ｙと呼ぶ）を補充した。標準培養では、～７０－８０％のコンフルエンスを達成した後、ＤＰＢＳ（Ｃａ2+およびＭｇ2+なし、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標））中の０．５ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＵｌｔｒａＰｕｒｅ）を使用して、細胞を４日ごとに１：２０の比率で継代した。細胞系統は継代２０から１００の間に使用された。試験された他の培地成分は、Ｈｕｍａｎ Ｌｏｎｇ Ｒ３ ＩＧＦ１（Ｓｉｇｍａ、９１５９０Ｃ）、チアゾビビン（ＬＣ Ｌａｂｓ、Ｔ－９７５３）、組換えヒトＴＧＦβ３（Ｃｅｌｌ Ｇｕｉｄａｎｃｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＧＦＨ１０９）、重炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）、ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ（商標））、ＣＤ脂質（Ｇｉｂｃｏ（商標））、脂肪酸を含まないアルブミン（ＧｅｎＤＥＰＯＴ、Ａ０１００）であった。ｐＨは１０Ｎ ＨＣｌまたはＩＮ ＮａＯＨ（両方ともＳｉｇｍａ製）で調整し、ＳｅｖｅｎＣｏｍｐａｃｔ（商標）ｐＨメーター（ＭｅｔｔｌｅｒＴｏｌｅｄｏ）を使用して測定した。浸透圧は、塩化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）または細胞培養水（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標））で調整し、浸透圧計（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で測定した。
【0045】
マトリゲル（登録商標）の最適化
全体の標準条件は、６ウェルプレートまたは同等品のウェルあたり２ｍｌのＤＭＥＭ（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）、１０－０１７－ＣＶ）で希釈した２ｍｌの１：８００還元増殖因子マトリゲル（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）、３５４２３０）であった。Ｇｅｌｔｒｅｘ（登録商標）（Ｇｉｂｃｏ（商標））およびＣｕｌｔｒｅｘ（登録商標）（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）も試験した。プレートを作製し、３７℃のインキュベーターで最長１ヶ月間保管した。
全体の標準条件は、６ウェルプレートまたは同等品のウェルあたり２ｍｌのＤＭＥＭ（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）、１０－０１７－ＣＶ）で希釈した２ｍｌの１：８００還元増殖因子マトリゲル（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）、３５４２３０）であった。Ｇｅｌｔｒｅｘ（登録商標）（Ｇｉｂｃｏ（商標））およびＣｕｌｔｒｅｘ（登録商標）（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）も試験した。プレートを作製し、３７℃のインキュベーターで最長１ヶ月間保管した。
【0046】
ＦＧＦ２－Ｋ１２８Ｎの生成
Ｋ１２８Ｎ置換（太字／下線付き）を有する全長（１５４アミノ酸）ＦＧＦ２配列（配列番号１４） AAGSITTLP ALPEDGGSGA FPPGHFKDPK RLYCKNGGFF LRIHPDGRVD GVREKSDPHI KLQLQAEERG VVSIKGVCAN RYLAMKEDGR LLASKCVTDE CFFFERLESN NYNTYRSRKY TSWYVALKRT GQYKLGSKTG PGQKAILFLP MSAKS は、配列の開始（５’）にＢａｍＨ１部位、最後（３’）にＥｃｏＲＩ部位を付加することにより、Ｅ．ｃｏｌｉに対してコドン最適化されていた。この配列は、ＢｉｏＸｐ ３２００（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）で合成した。次に、インサートをＢａｍＨ１およびＥｃｏＲＩ（Ａｎｚａ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で消化し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ａｎｚａ）でｐＥＴ－２８ａ発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ／ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）にライゲーションし、Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ（商標）ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（商標）（ＤＥ３）化学的コンピテントＥ．ｃｏｌｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。Ｅ．ｃｏｌｉは、２５％グリセロール（Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に－８０℃で保存した。培養スターターは、５０μｇ ｍｌ-1の1カナマイシン硫酸塩（Ｆｉｓｈｅｒ ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ）を添加した１０ｍｌのＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（Ｆｉｓｈｅｒ ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ）をバクテリアチューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｆａｌｃｏｎ）に接種し、Ｉｎｎｏｖａ（登録商標）－４４ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ－Ｓｈａｋｅｒ（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ（商標））で２２０ｒｐｍ、３７℃（ＮＲＧ１の場合）または３０℃（ＦＧＦ２またはＴＧＦβ３の場合）で一晩培養した。タンパク質発現は、２８００ｍｌのバッフル付きシェーカーフラスコ（ＢＢＶ２８００、Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ（商標））を使用して、以下のように行った： １０ｍｌの培養スターター全体を、５０μｇ ｍｌ-1の1カナマイシン硫酸塩（Ｆｉｓｈｅｒ ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ）を添加した５００ｍｌのＭａｇｉｃＭｅｄｉａ（商標）（Ｋ６８１５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））に添加し、３７℃（ＮＲＧ１の場合）または３０℃（ＦＧＦ２またはＴＧＦβ３の場合）で２４時間培養した。培養物を２×２５０ｍｌ遠心分離ボトル（Ｎａｌｇｅｎｅ（登録商標）、３１２０－０２５０）に回収し、Ｏｐｔｉｍｉａ（商標）ＸＰＮ－１００超遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で、ＳＷ ３２Ｔｉローターを５，０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離した。上清を注意深く注ぎ出し、ペレットを秤量し、下流プロセスのために－８０℃で保存した。細菌細胞ペレット１グラムあたり５ｍｌのＢ－ＰＥＲ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｒｅａｇｅｎｔを使用して、細胞ペレットをＢ－ＰＥＲ溶解バッファー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、７８２４８）に再懸濁した。細胞を穏やかに揺り動かしながら室温で１５分間インキュベートした。次に、ライセートを含むボトルを超遠心分離機で１６，０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離した。上清を収集し、細胞破片を廃棄した。精製は、３ｍｌのＨｉｓＰｕｒ（商標）Ｎｉ－ＮＴＡスピン精製キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、８８２２９）を使用して、メーカーの推奨に従って完了した。レジンベッドへのタンパク質結合効率を高めるために、試料を４℃で３０分間インキュベートした。１０分ごとに１つずつ、４つの溶出液を収集した。カラムは、メーカーの再生プロトコルに従って再利用した。タンパク質濃度は、Ｑｕｂｉｔ ３蛍光光度計でＱｕａｎｔ－ｉＴ（商標）Ｑｕｂｉｔ（登録商標）タンパク質アッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｑ３３２１）を使用して評価した。６×Ｈｉｓタグは、ＦＧＦ２機能に干渉しないことが以前に示されているため、切断しなかった（Ｓｏｌｅｙｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。標準的な１リットルの培養物は８０ｍｇのＦＧＦ２を産生した。
Ｋ１２８Ｎ置換（太字／下線付き）を有する全長（１５４アミノ酸）ＦＧＦ２配列（配列番号１４） AAGSITTLP ALPEDGGSGA FPPGHFKDPK RLYCKNGGFF LRIHPDGRVD GVREKSDPHI KLQLQAEERG VVSIKGVCAN RYLAMKEDGR LLASKCVTDE CFFFERLESN NYNTYRSRKY TSWYVALKRT GQYKLGSKTG PGQKAILFLP MSAKS は、配列の開始（５’）にＢａｍＨ１部位、最後（３’）にＥｃｏＲＩ部位を付加することにより、Ｅ．ｃｏｌｉに対してコドン最適化されていた。この配列は、ＢｉｏＸｐ ３２００（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）で合成した。次に、インサートをＢａｍＨ１およびＥｃｏＲＩ（Ａｎｚａ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で消化し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ａｎｚａ）でｐＥＴ－２８ａ発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ／ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）にライゲーションし、Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ（商標）ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（商標）（ＤＥ３）化学的コンピテントＥ．ｃｏｌｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。Ｅ．ｃｏｌｉは、２５％グリセロール（Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に－８０℃で保存した。培養スターターは、５０μｇ ｍｌ-1の1カナマイシン硫酸塩（Ｆｉｓｈｅｒ ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ）を添加した１０ｍｌのＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（Ｆｉｓｈｅｒ ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ）をバクテリアチューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｆａｌｃｏｎ）に接種し、Ｉｎｎｏｖａ（登録商標）－４４ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ－Ｓｈａｋｅｒ（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ（商標））で２２０ｒｐｍ、３７℃（ＮＲＧ１の場合）または３０℃（ＦＧＦ２またはＴＧＦβ３の場合）で一晩培養した。タンパク質発現は、２８００ｍｌのバッフル付きシェーカーフラスコ（ＢＢＶ２８００、Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ（商標））を使用して、以下のように行った： １０ｍｌの培養スターター全体を、５０μｇ ｍｌ-1の1カナマイシン硫酸塩（Ｆｉｓｈｅｒ ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ）を添加した５００ｍｌのＭａｇｉｃＭｅｄｉａ（商標）（Ｋ６８１５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））に添加し、３７℃（ＮＲＧ１の場合）または３０℃（ＦＧＦ２またはＴＧＦβ３の場合）で２４時間培養した。培養物を２×２５０ｍｌ遠心分離ボトル（Ｎａｌｇｅｎｅ（登録商標）、３１２０－０２５０）に回収し、Ｏｐｔｉｍｉａ（商標）ＸＰＮ－１００超遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で、ＳＷ ３２Ｔｉローターを５，０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離した。上清を注意深く注ぎ出し、ペレットを秤量し、下流プロセスのために－８０℃で保存した。細菌細胞ペレット１グラムあたり５ｍｌのＢ－ＰＥＲ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｒｅａｇｅｎｔを使用して、細胞ペレットをＢ－ＰＥＲ溶解バッファー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、７８２４８）に再懸濁した。細胞を穏やかに揺り動かしながら室温で１５分間インキュベートした。次に、ライセートを含むボトルを超遠心分離機で１６，０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離した。上清を収集し、細胞破片を廃棄した。精製は、３ｍｌのＨｉｓＰｕｒ（商標）Ｎｉ－ＮＴＡスピン精製キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、８８２２９）を使用して、メーカーの推奨に従って完了した。レジンベッドへのタンパク質結合効率を高めるために、試料を４℃で３０分間インキュベートした。１０分ごとに１つずつ、４つの溶出液を収集した。カラムは、メーカーの再生プロトコルに従って再利用した。タンパク質濃度は、Ｑｕｂｉｔ ３蛍光光度計でＱｕａｎｔ－ｉＴ（商標）Ｑｕｂｉｔ（登録商標）タンパク質アッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｑ３３２１）を使用して評価した。６×Ｈｉｓタグは、ＦＧＦ２機能に干渉しないことが以前に示されているため、切断しなかった（Ｓｏｌｅｙｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。標準的な１リットルの培養物は８０ｍｇのＦＧＦ２を産生した。
【0047】
ＦＧＦ２－Ｇ３の生成
Ｒ３１Ｌ、Ｖ５２Ｔ、Ｅ５４Ｄ、Ｈ５９Ｆ、Ｌ９２Ｙ、Ｓ９４Ｉ、Ｃ９６Ｎ、Ｓ１０９Ｅ、およびＴ１２１Ｐ置換（太字）を含む１５４アミノ酸配列（配列番号１５）： AAGSITTLP ALPEDGGSGA FPPGHFKDPK LLYCKNGGFF LRIHPDGRVD GTRDKSDPFI KLQLQAEERG VV SIKGV CAN RYLAMKEDGR LYAIKNVTDE CFFFERLEEN NYNTYRSRKY は、Ｅ．ｃｏｌｉ用にコドン最適化されており、上記のように生成した。ＦＧＦ１－４Ｘも同様に生成した。
Ｒ３１Ｌ、Ｖ５２Ｔ、Ｅ５４Ｄ、Ｈ５９Ｆ、Ｌ９２Ｙ、Ｓ９４Ｉ、Ｃ９６Ｎ、Ｓ１０９Ｅ、およびＴ１２１Ｐ置換（太字）を含む１５４アミノ酸配列（配列番号１５）： AAGSITTLP ALPEDGGSGA FPPGHFKDPK LLYCKNGGFF LRIHPDGRVD GTRDKSDPFI KLQLQAEERG VV SIKGV CAN RYLAMKEDGR LYAIKNVTDE CFFFERLEEN NYNTYRSRKY は、Ｅ．ｃｏｌｉ用にコドン最適化されており、上記のように生成した。ＦＧＦ１－４Ｘも同様に生成した。
【0048】
ＴＧＦβ３の生成
１１２アミノ酸配列（配列番号１６）： ALDTNY CFRN LEENCCVRPL YIDFRQDLGW KWVHEPKGYY ANFCSGPCPY LRSADTTHST VLGLYNTLNP EASASPCCVP QDLEPLTILY YVGRTPKVEQ LSNMVVKSCK CS をＥ．ｃｏｌｉ用にコドン最適化し、上記のように生成し、ｐＥＴ－３２ａ発現ベクターにライゲーションし、Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ（商標）ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（商標）（ＤＥ３）にクローニングした。ｐＥＴ－３２ａを使用すると、封入体でのタンパク質発現を妨げるチオレドキシン－ＴＧＦＢβ３融合タンパク質が生成される。ＴＧＦＢβ３を活性化するためにチオレドキシンを切断する必要はない。ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ１ｍ（Ｃ７７Ｓ）、およびＴＧＦβ３ｍ（Ｃ７７Ｓ）も同様に生成した。
１１２アミノ酸配列（配列番号１６）： ALDTNY CFRN LEENCCVRPL YIDFRQDLGW KWVHEPKGYY ANFCSGPCPY LRSADTTHST VLGLYNTLNP EASASPCCVP QDLEPLTILY YVGRTPKVEQ LSNMVVKSCK CS をＥ．ｃｏｌｉ用にコドン最適化し、上記のように生成し、ｐＥＴ－３２ａ発現ベクターにライゲーションし、Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ（商標）ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（商標）（ＤＥ３）にクローニングした。ｐＥＴ－３２ａを使用すると、封入体でのタンパク質発現を妨げるチオレドキシン－ＴＧＦＢβ３融合タンパク質が生成される。ＴＧＦＢβ３を活性化するためにチオレドキシンを切断する必要はない。ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ１ｍ（Ｃ７７Ｓ）、およびＴＧＦβ３ｍ（Ｃ７７Ｓ）も同様に生成した。
【0049】
ＮＲＧ１の生成
ＥＧＦドメインのみを含むＮＲＧ１の短縮バージョンである６５アミノ酸配列（配列番号１７）： SHLVKCAEKE KTFCVNGGEC FMVKDLSNPS RYLCKCPNEF T GDRCQNYVM ASFYKHLGIE FMEAE は、E.ｃｏｌｉ用にコドン最適化し、上記のように生成し、ｐＥＴ－３２ａ発現ベクターにライゲーションし、Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ（商標）ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（商標）（ＤＥ３）にクローニングした。ｐＥＴ－３２ａを使用すると、封入体でのタンパク質発現を妨げるチオレドキシン－ＮＲＧ１融合タンパク質が生成される。Ｔｈｒｏｍｂｉｎ ＣｌｅａｎＣｌｅａｖｅ（商標）キット（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）を使用してチオレドキシンを切断し、その後、上清を保持したまま再精製する必要があることが見出された。
ＥＧＦドメインのみを含むＮＲＧ１の短縮バージョンである６５アミノ酸配列（配列番号１７）： SHLVKCAEKE KTFCVNGGEC FMVKDLSNPS RYLCKCPNEF T GDRCQNYVM ASFYKHLGIE FMEAE は、E.ｃｏｌｉ用にコドン最適化し、上記のように生成し、ｐＥＴ－３２ａ発現ベクターにライゲーションし、Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ（商標）ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（商標）（ＤＥ３）にクローニングした。ｐＥＴ－３２ａを使用すると、封入体でのタンパク質発現を妨げるチオレドキシン－ＮＲＧ１融合タンパク質が生成される。Ｔｈｒｏｍｂｉｎ ＣｌｅａｎＣｌｅａｖｅ（商標）キット（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）を使用してチオレドキシンを切断し、その後、上清を保持したまま再精製する必要があることが見出された。
【0050】
培地可変性最適化プロトコル［Ｍｅｄｉａ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ］
ｈｉＰＳＣ系統１９－３をＴｒｙｐＬＥ（Ｇｉｂｃｏ（商標）、１２６０４－０１３）で３７℃で３分間分離し、細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２に再懸濁し、１５ｍｌコニカルチューブ（Ｆａｌｃｏｎ）に移し、２００×ｇで３分遠心分離した（Ｓｏｒｖａｌｌ ＳＴ４０）。ペレットをＤＭＥＭ／Ｆ１２に再懸濁し、１ｍｌあたり１×１０5細胞に希釈し、１ウェルあたり１０，０００個の細胞を、２ｍＭチアゾビビンとともに最初の２４時間、試験する培地中のマトリゲル（登録商標）（１：８００）でコーティングした１２ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に播種した。培地を毎日交換し、細胞を６日間増殖させた。この通常よりも低い播種密度を使用して、より極端な条件下でのみ検出可能な因子を発見できるようにし、したがって、製剤のロバスト性に関するデータを提供した。
ｈｉＰＳＣ系統１９－３をＴｒｙｐＬＥ（Ｇｉｂｃｏ（商標）、１２６０４－０１３）で３７℃で３分間分離し、細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２に再懸濁し、１５ｍｌコニカルチューブ（Ｆａｌｃｏｎ）に移し、２００×ｇで３分遠心分離した（Ｓｏｒｖａｌｌ ＳＴ４０）。ペレットをＤＭＥＭ／Ｆ１２に再懸濁し、１ｍｌあたり１×１０5細胞に希釈し、１ウェルあたり１０，０００個の細胞を、２ｍＭチアゾビビンとともに最初の２４時間、試験する培地中のマトリゲル（登録商標）（１：８００）でコーティングした１２ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に播種した。培地を毎日交換し、細胞を６日間増殖させた。この通常よりも低い播種密度を使用して、より極端な条件下でのみ検出可能な因子を発見できるようにし、したがって、製剤のロバスト性に関するデータを提供した。
【0051】
ウエスタンブロット
ストック溶解バッファーは、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、および１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００として調製し、４℃で保存した。フレッシュな完全溶解バッファーは、最終濃度が１×プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、５８９２７９１００１）、１×ホスファターゼ阻害剤カクテル２（Ｐ５７２６、Ｓｉｇｍａ）、１×ホスファターゼ阻害剤カクテル３（Ｓｉｇｍａ、Ｐ００４４）、２ｍＭ ＰＭＳＦ（Ｓｉｇｍａ、Ｐ７６２６）、および１％ＳＤＳ溶液（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＢＰ２４３６２００）となるよう調製した。ｈｉＰＳＣは、ＦＧＦ２を含まないＢ８を使用して２４時間飢餓状態にした後、対応するＦＧＦ２を含む培地で１時間処理した。次に培地を除去し、細胞をＤＰＢＳで１回洗浄し、ＤＰＢＳ中の０．５ｍＭ ＥＤＴＡで回収し、チューブに移した。５００×ｇで３分間遠心分離して試料をペレット化し、上清を捨てた。ペレットを１５０μｌの完全溶解バッファーに再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。 １０，０００×ｇで４℃で１０分間遠心分離することにより、透明なライセートを回収した。タンパク質濃度は、Ｑｕｂｉｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｑ３３２１１）およびＱｕｂｉｔ４蛍光光度計を使用して測定した。ライセートは使用前に－８０℃で保存した。ＮｕＰＡＧＥ（商標）ＬＤＳサンプルバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｂ０００７）およびＮｕＰＡＧＥ（商標）還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｂ０００９）を使用して、製造元の指示に従って１０ｍｇの試料を調製し、ＮｕＰＡＧＥ（商標）１０％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＮＰ０３０２ＢＯＸ）およびBolt MES SDSランニングバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｂ０００２０２）を備えたミニゲルタンクシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ２５９７７）で１００Ｖで１時間行った。ＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２ Ｐｒｅ－Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＬＣ５９２５）をラダーとして使用した。次に、ゲルをミニトランスブロットセルシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、１７０３９３０）でＰＶＤＦトランスファーメンブレン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、８８５１８）に２４０ｍＡで１時間３０分間トランスファーした。メンブレンを１％ＴＢＳＴ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＢＰ２４７１－１、ＢＰ３３７－１００）中の５％ＢＳＡ（ＧｅｎＤＥＰＯＴ、Ａ０１００）で一晩ブロッキングした。すべての一次および二次抗体は、１％ＴＢＳＴ中の５％ＢＳＡで希釈した。洗浄は、短いリンスとして行い、その後、それぞれ５分間の５回の長い洗浄が続いた。一次抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９１０１、９１０２）と二次抗体（９２６３２２１１、ＬＩ－ＣＯＲ）の両方を室温で１時間インキュベートした。ブロットはＯｄｙｓｓｅｙ ＣＬｘ（ＬＩ－ＣＯＲ）で画像化した。ブロットをＲｅｓｔｏｒｅ（商標）ＰＬＵＳウエスタンブロットストリッピングバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、４６４３０）で室温で１５分間ストリッピングし、１％ＴＢＳＴでリンスし、５％ＢＳＡで３０分間再ブロッキングした。
ストック溶解バッファーは、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、および１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００として調製し、４℃で保存した。フレッシュな完全溶解バッファーは、最終濃度が１×プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、５８９２７９１００１）、１×ホスファターゼ阻害剤カクテル２（Ｐ５７２６、Ｓｉｇｍａ）、１×ホスファターゼ阻害剤カクテル３（Ｓｉｇｍａ、Ｐ００４４）、２ｍＭ ＰＭＳＦ（Ｓｉｇｍａ、Ｐ７６２６）、および１％ＳＤＳ溶液（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＢＰ２４３６２００）となるよう調製した。ｈｉＰＳＣは、ＦＧＦ２を含まないＢ８を使用して２４時間飢餓状態にした後、対応するＦＧＦ２を含む培地で１時間処理した。次に培地を除去し、細胞をＤＰＢＳで１回洗浄し、ＤＰＢＳ中の０．５ｍＭ ＥＤＴＡで回収し、チューブに移した。５００×ｇで３分間遠心分離して試料をペレット化し、上清を捨てた。ペレットを１５０μｌの完全溶解バッファーに再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。 １０，０００×ｇで４℃で１０分間遠心分離することにより、透明なライセートを回収した。タンパク質濃度は、Ｑｕｂｉｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｑ３３２１１）およびＱｕｂｉｔ４蛍光光度計を使用して測定した。ライセートは使用前に－８０℃で保存した。ＮｕＰＡＧＥ（商標）ＬＤＳサンプルバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｂ０００７）およびＮｕＰＡＧＥ（商標）還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｂ０００９）を使用して、製造元の指示に従って１０ｍｇの試料を調製し、ＮｕＰＡＧＥ（商標）１０％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＮＰ０３０２ＢＯＸ）およびBolt MES SDSランニングバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｂ０００２０２）を備えたミニゲルタンクシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ２５９７７）で１００Ｖで１時間行った。ＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２ Ｐｒｅ－Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＬＣ５９２５）をラダーとして使用した。次に、ゲルをミニトランスブロットセルシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、１７０３９３０）でＰＶＤＦトランスファーメンブレン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、８８５１８）に２４０ｍＡで１時間３０分間トランスファーした。メンブレンを１％ＴＢＳＴ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＢＰ２４７１－１、ＢＰ３３７－１００）中の５％ＢＳＡ（ＧｅｎＤＥＰＯＴ、Ａ０１００）で一晩ブロッキングした。すべての一次および二次抗体は、１％ＴＢＳＴ中の５％ＢＳＡで希釈した。洗浄は、短いリンスとして行い、その後、それぞれ５分間の５回の長い洗浄が続いた。一次抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９１０１、９１０２）と二次抗体（９２６３２２１１、ＬＩ－ＣＯＲ）の両方を室温で１時間インキュベートした。ブロットはＯｄｙｓｓｅｙ ＣＬｘ（ＬＩ－ＣＯＲ）で画像化した。ブロットをＲｅｓｔｏｒｅ（商標）ＰＬＵＳウエスタンブロットストリッピングバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、４６４３０）で室温で１５分間ストリッピングし、１％ＴＢＳＴでリンスし、５％ＢＳＡで３０分間再ブロッキングした。
【0052】
ヒト人工多能性幹細胞の誘導
プロトコルは、ノースウェスタン大学の機関審査委員会によって承認された。書面による同意を得て、各ボランティアから約９ｍｌの末梢血を採取し、４℃で保存し、試料をＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）－１０７７（Ｓｉｇｍａ）で満たされたＬｅｕｃｏｓｅｐチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に移した。１×１０6個の単離された末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）を、１０ ｎｇ ｍｌ-1のＩＬ３、５０ｎｇ ｍｌ-1のＳＣＦ（ＫＩＴＬＧ）、４０ｎｇ ｍｌ-1のＩＧＦ１（すべてＰｅｐｒｏｔｅｃｈ）、２Ｕ ｍｌ-1のＥＰＯ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、１ｍＭデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）（Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）を添加した２ｍｌのＳＦＥＭ ＩＩ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中の２４ウェル組織培養処理プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）で、増殖させた。５０％培地は１日おきに交換した。１２日間の増殖後、６×１０4個の細胞を、メーカーの推奨の５％（１：２０）に希釈したＣｙｔｏＴｕｎｅ（商標）－ｉＰＳ２．０センダイリプログラミングキットウイルス粒子因子（Ｇｉｂｃｏ（商標））を添加した増殖因子を含む５００μＬのＳＦＥＭ ＩＩの24ウェルプレートのウェルに移した（Ｆｕｊｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４； Ｆｕｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００９）。細胞を３．５μＬ、３．５μｌ、および２．２μｌのｈＫＯＳ（０．８５×１０8 ＣＩＵ ｍｌ-1）、ｈＭＹＣ（０．８５×１０8 ＣＩＵ ｍｌ-1）、およびｈＫＬＦ４（０．８２×１０8 ＣＩＵ ｍｌ-1）でそれぞれ５：５：３（ＫＯＳ：ＭＹＣ：ＫＬＦ４）のＭＯＩで処理した。遠心分離（３００×ｇ、４分）により２４時間後に１００％培地を、増殖因子を含む２ｍｌのフレッシュなＳＦＥＭ ＩＩに交換し、細胞を１：８００のマトリゲル（登録商標）でコーティングした６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）の１つのウェルに移した。５０％培地は１日おきに穏やかに交換した。形質導入後８日目に、培地の１００％をＢ８培地に交換した。培地は毎日交換した。１７日目に、個々のコロニーをマトリゲル（登録商標）でコーティングした１２ウェルプレートに採取した（ウェルごとに１つのコロニー）。
プロトコルは、ノースウェスタン大学の機関審査委員会によって承認された。書面による同意を得て、各ボランティアから約９ｍｌの末梢血を採取し、４℃で保存し、試料をＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）－１０７７（Ｓｉｇｍａ）で満たされたＬｅｕｃｏｓｅｐチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に移した。１×１０6個の単離された末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）を、１０ ｎｇ ｍｌ-1のＩＬ３、５０ｎｇ ｍｌ-1のＳＣＦ（ＫＩＴＬＧ）、４０ｎｇ ｍｌ-1のＩＧＦ１（すべてＰｅｐｒｏｔｅｃｈ）、２Ｕ ｍｌ-1のＥＰＯ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、１ｍＭデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）（Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）を添加した２ｍｌのＳＦＥＭ ＩＩ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中の２４ウェル組織培養処理プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）で、増殖させた。５０％培地は１日おきに交換した。１２日間の増殖後、６×１０4個の細胞を、メーカーの推奨の５％（１：２０）に希釈したＣｙｔｏＴｕｎｅ（商標）－ｉＰＳ２．０センダイリプログラミングキットウイルス粒子因子（Ｇｉｂｃｏ（商標））を添加した増殖因子を含む５００μＬのＳＦＥＭ ＩＩの24ウェルプレートのウェルに移した（Ｆｕｊｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４； Ｆｕｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００９）。細胞を３．５μＬ、３．５μｌ、および２．２μｌのｈＫＯＳ（０．８５×１０8 ＣＩＵ ｍｌ-1）、ｈＭＹＣ（０．８５×１０8 ＣＩＵ ｍｌ-1）、およびｈＫＬＦ４（０．８２×１０8 ＣＩＵ ｍｌ-1）でそれぞれ５：５：３（ＫＯＳ：ＭＹＣ：ＫＬＦ４）のＭＯＩで処理した。遠心分離（３００×ｇ、４分）により２４時間後に１００％培地を、増殖因子を含む２ｍｌのフレッシュなＳＦＥＭ ＩＩに交換し、細胞を１：８００のマトリゲル（登録商標）でコーティングした６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）の１つのウェルに移した。５０％培地は１日おきに穏やかに交換した。形質導入後８日目に、培地の１００％をＢ８培地に交換した。培地は毎日交換した。１７日目に、個々のコロニーをマトリゲル（登録商標）でコーティングした１２ウェルプレートに採取した（ウェルごとに１つのコロニー）。
【0053】
多能性細胞フローサイトメトリー
ｈｉＰＳＣをＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｇｉｂｃｏ（商標））で３７℃で３分間分離し、１×１０6個の細胞をフローサイトメトリーチューブに移した（Ｆａｌｃｏｎ、３５２００８）。１：２０マウスＩｇＧ３ ＳＳＥＡ４－４８８クローンＭＣ－８１３－７０（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＦＡＢ １４３５Ｆ、ロットＹＫＭ０４０９１２１）および１：２０マウスＩｇＭ ＴＲＡ－１－６０－４８８クローンＴＲＡ－１－６０を使用して、ＤＰＢＳ中の０．５％脂肪酸を含まないアルブミンで細胞を氷上で３０分間染色し、次に洗浄した。アイソタイプコントロールマウスＩｇＧ３－４８８クローンＪ６０６（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５６３６３６、ロット７１２８８４９）およびマウスＩｇＭ－４８８クローンＧ１５５－２２８（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、５６２４０９、ロット７１２８８４８）を使用してゲーティングを確立した。ＣｙｔＥｘｐｅｒｔ ２．２ソフトウェアを備えたＣｙｔｏＦＬＥＸ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、すべての細胞を分析した。
ｈｉＰＳＣをＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｇｉｂｃｏ（商標））で３７℃で３分間分離し、１×１０6個の細胞をフローサイトメトリーチューブに移した（Ｆａｌｃｏｎ、３５２００８）。１：２０マウスＩｇＧ３ ＳＳＥＡ４－４８８クローンＭＣ－８１３－７０（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＦＡＢ １４３５Ｆ、ロットＹＫＭ０４０９１２１）および１：２０マウスＩｇＭ ＴＲＡ－１－６０－４８８クローンＴＲＡ－１－６０を使用して、ＤＰＢＳ中の０．５％脂肪酸を含まないアルブミンで細胞を氷上で３０分間染色し、次に洗浄した。アイソタイプコントロールマウスＩｇＧ３－４８８クローンＪ６０６（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５６３６３６、ロット７１２８８４９）およびマウスＩｇＭ－４８８クローンＧ１５５－２２８（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、５６２４０９、ロット７１２８８４８）を使用してゲーティングを確立した。ＣｙｔＥｘｐｅｒｔ ２．２ソフトウェアを備えたＣｙｔｏＦＬＥＸ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、すべての細胞を分析した。
【0054】
免疫蛍光染色
ｈｉＰＳＣを０．５ｍＭのＥＤＴＡで分離し、マトリゲル（登録商標）で３日間処理したＮｕｎｃ Ｌａｂ－Ｔｅｋ ＩＩ ８チャンバースライドにＢ８培地で播種した（最初の２４時間はＢ８Ｔ）。細胞を固定し、透過処理し、ＰＳＣ ４－Ｍａｒｋｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｋｉｔ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａ２４８８１、ロット １６１０７２０）を使用して、製造元の説明書に従ってＯＣＴ４、ＳＳＥＡ４、ＳＯＸ２、ＴＲＡ－１－６０で染色した。細胞を３回洗浄し、ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用したＰｒｏＬｏｎｇ（商標） Ｄｉａｍｏｎｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔでマウントした。スライドは、ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ４．４ Ａｄｖａｎｃｅｄソフトウェアを使用して、Ｔｉ－Ｅ倒立蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）およびＺｙｌａ ｓＣＭＯＳカメラ（Ａｎｄｏｒ）で画像化した。
ｈｉＰＳＣを０．５ｍＭのＥＤＴＡで分離し、マトリゲル（登録商標）で３日間処理したＮｕｎｃ Ｌａｂ－Ｔｅｋ ＩＩ ８チャンバースライドにＢ８培地で播種した（最初の２４時間はＢ８Ｔ）。細胞を固定し、透過処理し、ＰＳＣ ４－Ｍａｒｋｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｋｉｔ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａ２４８８１、ロット １６１０７２０）を使用して、製造元の説明書に従ってＯＣＴ４、ＳＳＥＡ４、ＳＯＸ２、ＴＲＡ－１－６０で染色した。細胞を３回洗浄し、ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用したＰｒｏＬｏｎｇ（商標） Ｄｉａｍｏｎｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔでマウントした。スライドは、ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ４．４ Ａｄｖａｎｃｅｄソフトウェアを使用して、Ｔｉ－Ｅ倒立蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）およびＺｙｌａ ｓＣＭＯＳカメラ（Ａｎｄｏｒ）で画像化した。
【0055】
集団倍加レベル（Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｌｅｖｅｌ）評価
集団倍加レベル（ＰＤＬ）は、以下の式に従って計算された：
ＰＤＬ＝３．３２［ｌｏｇ10（ｎ／ｎ0）］
ここで、ｎ＝細胞数およびｎ0＝播種された細胞の数である。
集団倍加レベル（ＰＤＬ）は、以下の式に従って計算された：
ＰＤＬ＝３．３２［ｌｏｇ10（ｎ／ｎ0）］
ここで、ｎ＝細胞数およびｎ0＝播種された細胞の数である。
【0056】
心臓の分化
心筋細胞への分化は、わずかな変更を加えた前述のプロトコルに従って行った（Ｂｕｒｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｈ，２０１５； Ｂｕｒｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｈ，２０１４）。簡単に説明すると、ｈｉＰＳＣを上記のように０．５ｍＭ ＥＤＴＡを使用して１：２０の比率で分割し、Ｂ８培地で４日間増殖させて、～７５％のコンフルエンスに達した。分化の開始時（０日目）に、Ｂ８培地をＲＰＭＩ １６４０（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）、１０－０４０－ＣＭ）、５００μｇ ｍｌ-1の脂肪酸フリーウシ血清アルブミン（ＧｅｎＤＥＰＯＴ）、および２００μｇ ｍｌ-1のＬ－アスコルビン酸２－リン酸（和光）からなるＣＤＭ３（化学的に定義された培地、３成分）に変更した（Ｂｕｒｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｈ， ２０１４）。最初の２４時間、ＣＤＭ３培地に６ｍＭのグリコーゲンシンターゼキナーゼ３－β阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１（ＬＣ Ｌａｂｓ、Ｃ－６５５６）を添加した。１日目に培地をＣＤＭ３に交換し、２日目に培地を２μＭのＷｎｔ阻害剤Ｗｎｔ－Ｃ５９（Ｂｉｏｒｂｙｔ、ｏｒｂｌ８１１３２）を添加したＣＤＭ３に交換した。その後、培地を４日目と１日おきにＣＤＭ３に交換した。収縮細胞は７日目から記録された。分化の１４日目に、心筋細胞はＤＰＢＳを使用して３７℃で２０分間解離し、続いてＤＰＢＳで希釈した１：２００のＬｉｂｅｒａｓｅＴＨ（Ｒｏｃｈｅ）を３７℃で２０分間使用し、３００ｇで５分間遠心分離し、１００μｍセルストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ）でろ過した。
心筋細胞への分化は、わずかな変更を加えた前述のプロトコルに従って行った（Ｂｕｒｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｈ，２０１５； Ｂｕｒｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｈ，２０１４）。簡単に説明すると、ｈｉＰＳＣを上記のように０．５ｍＭ ＥＤＴＡを使用して１：２０の比率で分割し、Ｂ８培地で４日間増殖させて、～７５％のコンフルエンスに達した。分化の開始時（０日目）に、Ｂ８培地をＲＰＭＩ １６４０（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）、１０－０４０－ＣＭ）、５００μｇ ｍｌ-1の脂肪酸フリーウシ血清アルブミン（ＧｅｎＤＥＰＯＴ）、および２００μｇ ｍｌ-1のＬ－アスコルビン酸２－リン酸（和光）からなるＣＤＭ３（化学的に定義された培地、３成分）に変更した（Ｂｕｒｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｈ， ２０１４）。最初の２４時間、ＣＤＭ３培地に６ｍＭのグリコーゲンシンターゼキナーゼ３－β阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１（ＬＣ Ｌａｂｓ、Ｃ－６５５６）を添加した。１日目に培地をＣＤＭ３に交換し、２日目に培地を２μＭのＷｎｔ阻害剤Ｗｎｔ－Ｃ５９（Ｂｉｏｒｂｙｔ、ｏｒｂｌ８１１３２）を添加したＣＤＭ３に交換した。その後、培地を４日目と１日おきにＣＤＭ３に交換した。収縮細胞は７日目から記録された。分化の１４日目に、心筋細胞はＤＰＢＳを使用して３７℃で２０分間解離し、続いてＤＰＢＳで希釈した１：２００のＬｉｂｅｒａｓｅＴＨ（Ｒｏｃｈｅ）を３７℃で２０分間使用し、３００ｇで５分間遠心分離し、１００μｍセルストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ）でろ過した。
【0057】
内皮分化
ｈｉＰＳＣは、約５０～７０％のコンフルエントに増殖し、前述のプロトコルの適合バージョンに従って分化した（Ｐａｔｓｃｈ ｅｔ ａｋ， ２０１５）。分化の５日目に、内皮細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）（Ｇｉｂｃｏ（商標））で３７℃で５分間分離し、３００ｇで５分間遠心分離し、分析した。
ｈｉＰＳＣは、約５０～７０％のコンフルエントに増殖し、前述のプロトコルの適合バージョンに従って分化した（Ｐａｔｓｃｈ ｅｔ ａｋ， ２０１５）。分化の５日目に、内皮細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）（Ｇｉｂｃｏ（商標））で３７℃で５分間分離し、３００ｇで５分間遠心分離し、分析した。
【0058】
上皮分化
上記のように０．５ｍＭのＥＤＴＡを使用してｈｉＰＳＣを１：２０比で分割し、Ｂ８Ｔ培地で１日間増殖させ、分化の開始時に～１５％コンフルエンスに達した。表層外胚葉の分化は、以前に記載されたプロトコルの適合バージョンに従って行った（Ｌｉ ｅｔ ａｋ，２０１５； Ｑｕ ｅｔ ａｋ，２０１６）。分化の４日目に、上皮細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｇｉｂｃｏ（商標））で３７℃で５分間解離し、３００ｇで５分間遠心分離し、分析した。
上記のように０．５ｍＭのＥＤＴＡを使用してｈｉＰＳＣを１：２０比で分割し、Ｂ８Ｔ培地で１日間増殖させ、分化の開始時に～１５％コンフルエンスに達した。表層外胚葉の分化は、以前に記載されたプロトコルの適合バージョンに従って行った（Ｌｉ ｅｔ ａｋ，２０１５； Ｑｕ ｅｔ ａｋ，２０１６）。分化の４日目に、上皮細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｇｉｂｃｏ（商標））で３７℃で５分間解離し、３００ｇで５分間遠心分離し、分析した。
【0059】
分化細胞フローサイトメトリー
心筋細胞を上記のようにＬｉｂｅｒａｓｅＴＨで解離し、フローサイトメトリーチューブに移し、４％ＰＦＡ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）で室温で１５分間固定した後、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｆｉｓｈｅｒ ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ）で室温で１５分間透過処理し、ＤＰＢＳで１回洗浄し、１：３３マウスモノクローナルＩｇＧ1 ＴＮＮＴ２－６４７クローン１３－１１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５６５７４４、ロット７２４８６３７）を使用して室温で２０分間染色し、再度洗浄した。アイソタイプコントロールマウスＩｇＧ1－６４７クローンＭＯＰＣ－２１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５６５５７１、ロット８１０７６６８）を使用して、ゲーティングを確立した。内皮細胞を上記のようにＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）で解離し、フローサイトメトリーチューブに移し、１：１００マウスＩｇＧ２ａ ＣＤ３１－６４７クローンＭ８９Ｄ３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、５５８０９４、ロット８１４５７７１）で氷上で３０分間染色し、ＤＰＢＳで１回洗浄した。アイソタイプコントロールマウスＩｇＧ1－６４７クローンＭＯＰＣ－２１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５６５５７１、ロット８１０７６６８）を使用して、ゲーティングを確立した。上皮細胞を上記のようにＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）で分離し、フローサイトメトリーチューブに移し、４％ＰＦＡ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）で室温で１０分間固定した後、ＤＰＢＳ中の０．１％サポニン（Ｓｉｇｍａ）で室温で１５間透過処理した。細胞を洗浄バッファー（５％ＦＢＳ、０．１％ＮａＮ3、０．１％サポニンを含むＤＰＢＳ）で１回洗浄し、１：２００マウスＩｇＧ1 ＫＲＴ１８－６４７クローンＤＡ－７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、６２８４０４、ロットＢ２０８１２６）で室温で３０分間染色した後、洗浄バッファーで２回洗浄した。アイソタイプコントロールマウスＩｇＧ1－６４７クローンＭＯＰＣ－２１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５６５５７１、ロット８１０７６６８）を使用して、ゲーティングを確立した。ＣｙｔＥｘｐｅｒｔ ２．２ソフトウェアを備えたＣｙｔｏＦＬＥＸ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、すべての細胞を分析した。
心筋細胞を上記のようにＬｉｂｅｒａｓｅＴＨで解離し、フローサイトメトリーチューブに移し、４％ＰＦＡ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）で室温で１５分間固定した後、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｆｉｓｈｅｒ ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ）で室温で１５分間透過処理し、ＤＰＢＳで１回洗浄し、１：３３マウスモノクローナルＩｇＧ1 ＴＮＮＴ２－６４７クローン１３－１１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５６５７４４、ロット７２４８６３７）を使用して室温で２０分間染色し、再度洗浄した。アイソタイプコントロールマウスＩｇＧ1－６４７クローンＭＯＰＣ－２１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５６５５７１、ロット８１０７６６８）を使用して、ゲーティングを確立した。内皮細胞を上記のようにＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）で解離し、フローサイトメトリーチューブに移し、１：１００マウスＩｇＧ２ａ ＣＤ３１－６４７クローンＭ８９Ｄ３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、５５８０９４、ロット８１４５７７１）で氷上で３０分間染色し、ＤＰＢＳで１回洗浄した。アイソタイプコントロールマウスＩｇＧ1－６４７クローンＭＯＰＣ－２１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５６５５７１、ロット８１０７６６８）を使用して、ゲーティングを確立した。上皮細胞を上記のようにＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）で分離し、フローサイトメトリーチューブに移し、４％ＰＦＡ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）で室温で１０分間固定した後、ＤＰＢＳ中の０．１％サポニン（Ｓｉｇｍａ）で室温で１５間透過処理した。細胞を洗浄バッファー（５％ＦＢＳ、０．１％ＮａＮ3、０．１％サポニンを含むＤＰＢＳ）で１回洗浄し、１：２００マウスＩｇＧ1 ＫＲＴ１８－６４７クローンＤＡ－７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、６２８４０４、ロットＢ２０８１２６）で室温で３０分間染色した後、洗浄バッファーで２回洗浄した。アイソタイプコントロールマウスＩｇＧ1－６４７クローンＭＯＰＣ－２１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５６５５７１、ロット８１０７６６８）を使用して、ゲーティングを確立した。ＣｙｔＥｘｐｅｒｔ ２．２ソフトウェアを備えたＣｙｔｏＦＬＥＸ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、すべての細胞を分析した。
【0060】
統計的方法
データはＥｘｃｅｌまたはＲで分析し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８でグラフ化した。詳細な統計情報は、対応する図の凡例に含む。 データは平均±ＳＥＭとして提示された。比較は、対応のない両側スチューデントのｔ検定を介して行われ、有意差はＰ＜０．０５（＊）、Ｐ＜０．０１（＊＊）、Ｐ＜０．００５（＊＊＊）、およびｐ＜０．０００１（＊＊＊＊）として定義された。サンプルサイズを事前に決定するために統計的手法は使用されなかった。実験は無作為化されておらず、研究者は実験および結果の評価中に割り当てを知らされていなかった。
データはＥｘｃｅｌまたはＲで分析し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８でグラフ化した。詳細な統計情報は、対応する図の凡例に含む。 データは平均±ＳＥＭとして提示された。比較は、対応のない両側スチューデントのｔ検定を介して行われ、有意差はＰ＜０．０５（＊）、Ｐ＜０．０１（＊＊）、Ｐ＜０．００５（＊＊＊）、およびｐ＜０．０００１（＊＊＊＊）として定義された。サンプルサイズを事前に決定するために統計的手法は使用されなかった。実験は無作為化されておらず、研究者は実験および結果の評価中に割り当てを知らされていなかった。
【0061】
実施例１： 短期アッセイによる培地成分の最適化
最初の工程として、ｈｉＰＳＣが成長するマトリックスの濃度を決定した。ラミニン－５１１（Ｒｏｄｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１０）、ラミニン－５２１（Ｒｏｄｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）、ビトロネクチン（Ｂｒａａｍ ｅｔ ａｌ．， ２００８）、およびＳｙｎｔｈｅｍａｘ（商標）－ＩＩ（Ｍｅｌｋｏｕｍｉａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１０）がｈｉＰＳＣ培養（Ｂｕｒｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）に適しているが、適切な費用対効果の高いものはなく、ビトロネクチンまたはＳｙｎｔｈｅｍａｘ－ＩＩも、その後の分化には適していない（Ｂｕｒｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）。マトリゲル（登録商標）は未定義の製品であるが（Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０）、費用効果が高く、一般的に使用されているマトリックスであり、５０μｇ ｃｍ-2で使用した実質的なデータがある（Ｌｕｄｗｉｇ ｅｔ ａｌ．，２００６ａ）。２つの類似した市販製品であるマトリゲル（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標））とＣｕｌｔｒｅｘ（登録商標）／Ｇｅｌｔｒｅｘ（登録商標）（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ（商標））を比較したところ、どちらも１０μｇ ｃｍ-2（１：１０００希釈）という低い濃度で使用されていることを見出し（図１）、そしてその後、すべての将来の実験のために保存的な１：８００希釈で使用した。
最初の工程として、ｈｉＰＳＣが成長するマトリックスの濃度を決定した。ラミニン－５１１（Ｒｏｄｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１０）、ラミニン－５２１（Ｒｏｄｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）、ビトロネクチン（Ｂｒａａｍ ｅｔ ａｌ．， ２００８）、およびＳｙｎｔｈｅｍａｘ（商標）－ＩＩ（Ｍｅｌｋｏｕｍｉａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１０）がｈｉＰＳＣ培養（Ｂｕｒｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）に適しているが、適切な費用対効果の高いものはなく、ビトロネクチンまたはＳｙｎｔｈｅｍａｘ－ＩＩも、その後の分化には適していない（Ｂｕｒｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）。マトリゲル（登録商標）は未定義の製品であるが（Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０）、費用効果が高く、一般的に使用されているマトリックスであり、５０μｇ ｃｍ-2で使用した実質的なデータがある（Ｌｕｄｗｉｇ ｅｔ ａｌ．，２００６ａ）。２つの類似した市販製品であるマトリゲル（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標））とＣｕｌｔｒｅｘ（登録商標）／Ｇｅｌｔｒｅｘ（登録商標）（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ（商標））を比較したところ、どちらも１０μｇ ｃｍ-2（１：１０００希釈）という低い濃度で使用されていることを見出し（図１）、そしてその後、すべての将来の実験のために保存的な１：８００希釈で使用した。
【0062】
Ｌｕｄｗｉｇ ｅｔ ａｌ．およびＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．によって使用されたものをモデルにした多能性増殖アッセイは、解離細胞の自動細胞カウント（６ウェル）または小型フォーマット生存アッセイ（すなわち９６ウェル）のいずれも適切にロバストではないと判断した後に確立された。増殖アッセイの概要は以下の通りである：
【0063】
【表1】
【0064】
このアッセイプラットフォームの開発中に、相対的増殖の正確な測定が多能性状態（ＮＡＮＯＧ発現等）の測定基準の適切な代替であることを見出した。ＴＧＦβ１を処方から省略した場合等、細胞が自発的に分化し始めた場合、結果として生じる増殖の遅延は簡単に検出することができた。
【0065】
市販の細胞培養培地の各成分について、性能および費用対効果を評価した。市販の細胞培養培地は以下を含む：
【0066】
【表2】
【0067】
６つの主要なｈｉＰＳＣ培地成分（図２Ａ～Ｆ）のそれぞれの濃度範囲を評価した。この段階で、インスリンが不可欠であり、非常に高レベルのＩＧＦ１ ＬＲ３（≧１μｇ ｍｌ-1）でしか置換することができないことを確認したが、これは費用効果が高くなかった（図２Ａ）。インスリンの効果は、２０μｇ ｍｌ-1まで用量依存的であった。以前に示されたように（Ｐｒｏｗｓｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０）、アスコルビン酸２－リン酸は必須ではなかったが、より高い量（≧２００μｇ ｍｌ-1）では増殖を促進した（図２Ｂ）。注目すべきことに、この量のアスコルビン酸２－リン酸は、心臓分化培地ＣＤＭ３で最適化された量と同様である（Ｂｕｒｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）。トランスフェリンも培地処方に必須ではなかったが、２０μｇ ｍｌ-1で用量依存的に増殖が改善され、費用対効果を維持しながら最適な増殖を示した（図２Ｃ）。セレンの供給源が不可欠であることが示されたが、２～２００ｎｇ ｍｌ-1の亜セレン酸ナトリウムの濃度は増殖に大きな影響を与えず、亜セレン酸ナトリウムは２００ｎｇ ｍｌ-1以上になると毒性になった（図２Ｄ）。ＦＧＦ２－Ｋ１２８Ｎは４０ｎｇ ｍｌ-1以上で最適であり（図２Ｅ）、この単純な１継代増殖アッセイではＴＧＦβ１は０．５ｎｇ ｍｌ-1以上で十分であった（図２Ｆ）。
【0068】
実施例２： 追加の培地成分の最適化
ここで図３を参照して、実施例１の短期アッセイにおける追加の培地成分を評価した。図３Ａは、継代後少なくとも最初の２４時間にＲＯＣＫ１／２阻害剤を含めることが最適であることを示唆している。
ここで図３を参照して、実施例１の短期アッセイにおける追加の培地成分を評価した。図３Ａは、継代後少なくとも最初の２４時間にＲＯＣＫ１／２阻害剤を含めることが最適であることを示唆している。
【0069】
最初の２４時間に２μＭのチアゾビビンをわずかに添加すると、有意ではないが、１０ｍＭのＹ２７６３２を超える増殖が改善され、５倍以上費用効果の高い選択肢であった（図３Ｂ）。
【0070】
最近の一部のｈｉＰＳＣ増殖処方（ｇｒｏｗｔｈ ｆｏｒｍｕｌａｅ）は、高レベル（２×）の非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）および／または低レベル（０．１×）の化学的に定義された脂質の添加が増殖を促進することを示唆している（図３Ｃ）。発明者らのアッセイでは、ＮＥＡＡは成長を増強せず、脂質の添加は最低レベルを除いてすべて阻害的であった（図３Ｃ）。
【0071】
一般的なｈＰＳＣ培地成分であるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の補充は、成長に正または負の影響を及ぼさず、化学的に定義された処方を維持するために除外された（図３Ｄ）。
【0072】
Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）のＤＭＥＭ／Ｆ１２基礎培地は、他のメーカーのＤＭＥＭ／Ｆ１２と比較して、高レベルの重炭酸ナトリウム（～２９ｍＭまたは２４３８ｍｇ ｌ-1）を含む。１４ｍＭの重炭酸ナトリウムを含むＧｉｂｃｏ（商標）ＤＭＥＭ／Ｆ１２に、２０ｍＭの追加の重炭酸ナトリウムを追加すると、培地のアシドーシスを抑制することにより、ｈｉＰＳＣの増殖速度に有利であることが最近実証された（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。しかしながら、図３Ｅによれば、標準の２９ｍＭの重炭酸ナトリウムが最適であった。
【0073】
増殖に対するｐＨおよび浸透圧の影響も評価した。ｐＨ７．１（図３Ｆ）および３１０ｍＯｓｍ ｌ-1の浸透圧（図３Ｇ）は、最高の増殖速度を促進することが見出された。発明者らの実験はすべて、５％Ｏ2および５％ＣＯ2に最適化されており、Ｎ2の使用量が多いこと、または重曹のレベルを上げる必要があることから示唆されている１０％ＣＯ2による大幅なコストの増加はない（Ｌｕｄｗｉｇ ｅｔ ａｌ．，２００６ｂ）。
【0074】
ＦＧＦ２
初期の研究では、市販の組換えヒトＦＧＦ２が提供された。この構成要素は、培地コストの６０％超を占めた。次に、追加のＦＧＦ２バリアントを評価した。収量を高めるためのＥ．ｃｏｌｉ最適化コドン使用および熱安定性を改善するためのＫ１２８Ｎ点突然変異（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）を伴うＦＧＦ２配列を、精製中に切断されなかったデュアル６×Ｈｉｓタグを利用して組換えタンパク質産生プラスミド（ｐＥＴ－２８ａ）に挿入した（図４）。その後、２つの追加の熱安定性ＦＧＦ２バリアント： ＦＧＦ１－４Ｘ（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）、およびＦＧＦ２－Ｇ３（Ｄｖｏｒａｋ ｅｔ ａｌ．，２０１８）を生成した。発明者は、９つの点突然変異を有するＦＧＦ２－Ｇ３がＦＧＦ２－Ｋ１２８Ｎよりも強力であり、５ ｎｇ ｍｌ-1での増殖速度に対して１００ｎｇ ｍｌ-1でのＦＧＦ２－Ｋ１２８Ｎと同様の効果を示すことを発見した（図３Ｈ）。
初期の研究では、市販の組換えヒトＦＧＦ２が提供された。この構成要素は、培地コストの６０％超を占めた。次に、追加のＦＧＦ２バリアントを評価した。収量を高めるためのＥ．ｃｏｌｉ最適化コドン使用および熱安定性を改善するためのＫ１２８Ｎ点突然変異（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）を伴うＦＧＦ２配列を、精製中に切断されなかったデュアル６×Ｈｉｓタグを利用して組換えタンパク質産生プラスミド（ｐＥＴ－２８ａ）に挿入した（図４）。その後、２つの追加の熱安定性ＦＧＦ２バリアント： ＦＧＦ１－４Ｘ（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）、およびＦＧＦ２－Ｇ３（Ｄｖｏｒａｋ ｅｔ ａｌ．，２０１８）を生成した。発明者は、９つの点突然変異を有するＦＧＦ２－Ｇ３がＦＧＦ２－Ｋ１２８Ｎよりも強力であり、５ ｎｇ ｍｌ-1での増殖速度に対して１００ｎｇ ｍｌ-1でのＦＧＦ２－Ｋ１２８Ｎと同様の効果を示すことを発見した（図３Ｈ）。
【0075】
実施例３： 長期アッセイを使用した培地成分の最適化
発明者らの最初の短期実験では予備的な最適化が提供されたが、発明者らは、以前の実験から、ＴＧＦβ１の除去等の一部の変数は短期的には最小限の影響しかなく、長期的な実験では検出可能な負の影響しか持たないことを理解した。したがって、長期アッセイの有効性は、以下のアッセイプロトコルで評価された：
発明者らの最初の短期実験では予備的な最適化が提供されたが、発明者らは、以前の実験から、ＴＧＦβ１の除去等の一部の変数は短期的には最小限の影響しかなく、長期的な実験では検出可能な負の影響しか持たないことを理解した。したがって、長期アッセイの有効性は、以下のアッセイプロトコルで評価された：
【0076】
【表3】
【0077】
各実験は独立して少なくとも５回繰り返された。これらの実験により、インスリン（２０μｇ ｍｌ-1；図５Ａ）、アスコルビン酸２－リン酸（２００μｇ ｍｌ-1；図５Ｂ）、トランスフェリン（２０μｇ ｍｌ-1；図５Ｃ）、亜セレン酸ナトリウム（２０ｎｇ ｍｌ-1；図５Ｄ）、およびＦＧＦ２－Ｇ３（４０ｎｇ ｍｌ-1；図５Ｅ）の濃度が再度確認された。
【0078】
ＴＧＦβ１は現在最もコストのかかる成分（総コストの～２０％）であるため、発明者らは、長期アッセイでもこれまでに示唆された濃度（０．１ｎｇ ｍｌ-1）よりも低い濃度で使用できることを見出した（図５Ｆ）。発明者らは、ＮＯＤＡＬ等の他のアクチビン／ＮＯＤＡＬ／ＴＧＦβ１シグナル伝達源はコストが非常に高いレベル（１００ｎｇ ｍｌ-1）で必要であり（図５Ｇ）、アクチビンＡはＴＧＦβ１と同じレベルに増殖を維持するのに適していないことを見出した（図５Ｈ）。ＴＧＦβ１と組み合わせたアクチビンＡも増殖に悪影響を及ぼした（図５Ｉ）。ＴＧＦβ１は２つのＴＧＦＢ１遺伝子産物のホモ二量体であるため、組換えタンパク質は一般に哺乳動物細胞で産生されるため、基礎研究室での産生は複雑になる。これらの哺乳動物細胞は、グリコシル化、リン酸化、タンパク質分解プロセシング、およびＥ．ｃｏｌｉには存在しないジスルフィド結合の形成等の生物活性に重要な翻訳後修飾を提供する。この問題を克服するために、発明者らは、点突然変異のためにダイマーを形成できないバージョンのＴＧＦβ１（ＴＧＦβ１ｍ）を生成した。このモノマータンパク質は、ＴＧＦβ１の～２０分の１の効力であると予測されているが、Ｅ．ｃｏｌｉで簡単に大量に生産することができる（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。研究者らの最初の実験では、Ｅ．ｃｏｌｉに最適化されたコドン使用のＴＧＦＢ１配列が封入体で発現していることが示された。これを克服するために、細胞質での発現を可能にするチオレドキシン融合タンパク質を生成するように設計されたタンパク質生成プラスミド（ｐＥＴ－３２ａ）に配列を挿入した。ＴＧＦβ３はＴＧＦβ１よりも強力であることが示されている（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ１ｍ、ＴＧＦβ３、およびＴＧＦβ３ｍを比較すると、発明者らは、ＴＧＦβ３は、Ｅ．ｃｏｌｉで生産でき、０．１ｎｇ ｍｌ-1での使用に適しているという最良の組み合わせを提供することがわかり（図５Ｊ～Ｌ）、したがって最終処方に選択された。
【0079】
最後に、発明者らが研究した２つのｈＥＳＣ培地製剤、ＤＣ－ＨＡＩＦおよびｉＤＥＡＬは、ＦＧＦ２およびニューレグリン１（ＮＲＧ１）の両方を含む。ＮＲＧ１はＦＧＦ２の非存在下では増殖をサポートできないが（図５Ｏ）、発明者らは、ＮＲＧ１のすべての試験レベルでの補充が、ＦＧＦ２－Ｇ３単独の場合よりも１５％超、成長を増強することを見出した（図５Ｍ～Ｎ）。同様に、ｐＥＴ－３２ａを使用して組換えＮＲＧ１タンパク質を生成した。これにより、封入体としての生成が妨げられ、続いてトロンビンを使用して切断され、活性タンパク質が形成された（図５Ｐおよび図６）。
【0080】
これらの長期アッセイ最適化から得られた本発明の一つの最終的なＢ８培地製剤は、以下の通りである：
【0081】
【表4】
【0082】
実施例４： ｈｉＰＳＣ生成に対するＢ８の適合性の実証
ｈｉＰＳＣ系統を生成するためのＢ９培地の適合性が確認された。発明者らは、確立されたプロトコルを使用しているが、Ｂ８を使用して、２６人の患者からｈｉＰＳＣ系統を生成した。系統はすべてのドナーから首尾よく生成され、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ－１－６０のフローサイトメトリー（図７Ａ）、ＳＳＥＡ４、ＰＯＵ５Ｆ１、ＳＯＸ２、およびＴＲＡ－１－６０の免疫蛍光染色（図７Ｂ）、および核型の安定性（図７Ｃ）を含む多能性の標準アッセイに合格した。発明者らは、次に、このＢ８処方を市販のＥ８処方と比較し、一般的に使用される分割比全体でＢ８と同様の成長を見出した（図７Ｄ）。市販のＦＧＦ２とは異なり、ＦＧＦ２－Ｇ３等のＦＧＦ２の耐熱性バリアントは、培地を３７℃で長期間保存した後でも、ＦＧＦ飢餓細胞にｐＥＲＫを誘導することができることが実証されている（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１２； Ｄｖｏｒａｋ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）。発明者らのＦＧＦ２－Ｇ３が同様に機能することを確認するために、発明者らは、同等のアッセイを実行し、ＦＧＦ２－Ｇ３が３７℃で７日後に安定しているのに対し、市販のＦＧＦ２は３７℃で２日後にｐＥＲＫを刺激することができないことを確認した。ＳｔｅｍＦｌｅｘ等の一般的な「ウィークエンドフリー」培地処方はアルブミンの使用に戻り、ヘパリンを含む可能性があるが、どちらも化学的に定義されていないため、発明者らは、このアッセイでこれらの成分の機能を評価し、両方がＦＧＦ２－Ｇ３の安定性を改善することを見出した（図７Ｅ）。
ｈｉＰＳＣ系統を生成するためのＢ９培地の適合性が確認された。発明者らは、確立されたプロトコルを使用しているが、Ｂ８を使用して、２６人の患者からｈｉＰＳＣ系統を生成した。系統はすべてのドナーから首尾よく生成され、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ－１－６０のフローサイトメトリー（図７Ａ）、ＳＳＥＡ４、ＰＯＵ５Ｆ１、ＳＯＸ２、およびＴＲＡ－１－６０の免疫蛍光染色（図７Ｂ）、および核型の安定性（図７Ｃ）を含む多能性の標準アッセイに合格した。発明者らは、次に、このＢ８処方を市販のＥ８処方と比較し、一般的に使用される分割比全体でＢ８と同様の成長を見出した（図７Ｄ）。市販のＦＧＦ２とは異なり、ＦＧＦ２－Ｇ３等のＦＧＦ２の耐熱性バリアントは、培地を３７℃で長期間保存した後でも、ＦＧＦ飢餓細胞にｐＥＲＫを誘導することができることが実証されている（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１２； Ｄｖｏｒａｋ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）。発明者らのＦＧＦ２－Ｇ３が同様に機能することを確認するために、発明者らは、同等のアッセイを実行し、ＦＧＦ２－Ｇ３が３７℃で７日後に安定しているのに対し、市販のＦＧＦ２は３７℃で２日後にｐＥＲＫを刺激することができないことを確認した。ＳｔｅｍＦｌｅｘ等の一般的な「ウィークエンドフリー」培地処方はアルブミンの使用に戻り、ヘパリンを含む可能性があるが、どちらも化学的に定義されていないため、発明者らは、このアッセイでこれらの成分の機能を評価し、両方がＦＧＦ２－Ｇ３の安定性を改善することを見出した（図７Ｅ）。
【0083】
実施例５： ウィークエンドフリー培養のためのＢ８の適合性の実証
Ｂ８が様々な次善の条件でｈｉＰＳＣの増殖をサポートすることを理解した上で（図７Ｄ）、培地の交換の日数をスキップするこの処方の適合性を確立した。チアゾビビンがある場合とない場合の両方で培地交換日のマトリックスを確立し（図８Ａ）、毎日のＢ８培地交換（上段）が驚くことに、増殖速度に最も適していないことを示した。培地を交換しないＢ８Ｔ処理は、チアゾビビンを含むプロトコル（下段）の中で最も効果が低かったのに対し、Ｂ８Ｔに続いてＢ８（濃い灰色のバー）は、増殖速度とチアゾビビンへの長期曝露との間の適切な妥協点であった。様々な培地交換スキップタイムラインの影響を認識した上で、発明者らは、週末に培地交換をスキップできるように、３．５日ごとに細胞を継代することからなる、７日間のスケジュールを考案した。これは、現在のｈｉＰＳＣ培養プロトコルの主な注意点である（図８Ｂおよび８Ｃ）。発明者らのデータは、最初の２４時間後の培地交換を伴う３．５日間のスケジュールが長期的に適切であったのに対し、培地交換なし（すなわち継代のみ）は適切ではなかったことを示した（図８Ｄ）。さらに、培地に０．５ｍｇ ｍｌ-1のアルブミンを補充しても、この不足は解消されなかった（図８Ｄ）。様々な用量のアルブミンまたはヘパリンを用いたさらなる実験により、これらがＢ８において相加効果を有さないことがさらに確認された（図８Ｅ）。培地交換をスキップする際の主な注意点の一つは、分化効率および再現性が低下することである。既存の心臓（Ｂｕｒｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）、内皮（Ｐａｔｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１５）、および上皮分化（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１５； Ｑｕ ｅｔ ａｌ．，２０１６）プロトコルを使用して、Ｂ８が毎日の培地交換または発明者らの７日間のプロトコルのいずれかで同様に高いレベルへの分化をサポートすることを実証した（図８Ｆおよび８Ｇ）。
Ｂ８が様々な次善の条件でｈｉＰＳＣの増殖をサポートすることを理解した上で（図７Ｄ）、培地の交換の日数をスキップするこの処方の適合性を確立した。チアゾビビンがある場合とない場合の両方で培地交換日のマトリックスを確立し（図８Ａ）、毎日のＢ８培地交換（上段）が驚くことに、増殖速度に最も適していないことを示した。培地を交換しないＢ８Ｔ処理は、チアゾビビンを含むプロトコル（下段）の中で最も効果が低かったのに対し、Ｂ８Ｔに続いてＢ８（濃い灰色のバー）は、増殖速度とチアゾビビンへの長期曝露との間の適切な妥協点であった。様々な培地交換スキップタイムラインの影響を認識した上で、発明者らは、週末に培地交換をスキップできるように、３．５日ごとに細胞を継代することからなる、７日間のスケジュールを考案した。これは、現在のｈｉＰＳＣ培養プロトコルの主な注意点である（図８Ｂおよび８Ｃ）。発明者らのデータは、最初の２４時間後の培地交換を伴う３．５日間のスケジュールが長期的に適切であったのに対し、培地交換なし（すなわち継代のみ）は適切ではなかったことを示した（図８Ｄ）。さらに、培地に０．５ｍｇ ｍｌ-1のアルブミンを補充しても、この不足は解消されなかった（図８Ｄ）。様々な用量のアルブミンまたはヘパリンを用いたさらなる実験により、これらがＢ８において相加効果を有さないことがさらに確認された（図８Ｅ）。培地交換をスキップする際の主な注意点の一つは、分化効率および再現性が低下することである。既存の心臓（Ｂｕｒｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）、内皮（Ｐａｔｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１５）、および上皮分化（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１５； Ｑｕ ｅｔ ａｌ．，２０１６）プロトコルを使用して、Ｂ８が毎日の培地交換または発明者らの７日間のプロトコルのいずれかで同様に高いレベルへの分化をサポートすることを実証した（図８Ｆおよび８Ｇ）。
【0084】
あらゆる培地で長期間細胞を培養する場合と同様に、他の要因も考慮する必要がある。たとえば、発明者らは、培地中のＬ－グルタミンは３７℃で不安定であり、濃度は４日間で約３分の１に減少することを知っている。発明者らはまた、細胞がアンモニアを生成し、培地のｐＨを低下させていることも知っているが、これはＨＥＰＥＳおよび重炭酸ナトリウムによって部分的に緩衝されている。最後に、ｈｉＰＳＣは、分化を誘導する可能性のあるオートクリンまたはパラクリン因子を培地に放出し、時間の経過に伴うこれらの因子の増加は、栄養素の使用と代謝廃棄物の生成から切り離されていない。
【0085】
「約」は、特定の値が目的の結果に影響を与えることなくエンドポイントの「わずかに上」または「わずかに下」になることを提供することにより、数値範囲エンドポイントに柔軟性を提供するために使用されている。
【0086】
本明細書における「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、または「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語の使用、およびそれらの変形は、その後に列挙される要素およびその同等物ならびに追加の要素を包含することを意味する。特定の要素を「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、または「有する（ｈａｖｉｎｇ）」と記載される実施形態はまた、それらの特定の要素から「本質的になる」および「からなる」ことが企図される。本明細書で使用される場合、「および／または」は、関連する列挙された項目の一つまたは複数の、ありとあらゆる可能な組み合わせ、ならびに代替（「または」）で解釈される組み合わせの欠如を指し、包含する。
【0087】
本明細書で使用される場合、「本質的になる」（および文法的変形）移行句は、特許請求される発明の「および基本的かつ新規の特性に実質的に影響を及ぼさない」記載された材料または工程を包含すると解釈されるべきである。Ｉｎ ｒｅ Ｈｅｒｚ， ５３７ Ｆ．２ｄ ５４９， ５５１－５２， １９０ Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｑ． ４６１， ４６３ （ＣＣＰＡ １９７６）も参照されたい（オリジナルの強調）。また、ＭＰＥＰ §２１１１．０３も参照されたい。したがって、「本質的になる」という用語は、「含む」と同等であると解釈されるべきではない。さらに、本開示は、一部の実施形態では、任意の特徴または特徴の組み合わせを除外または省略できることを企図している。
【0088】
説明のために、複合体が成分Ａ、Ｂ、およびＣを含むと本明細書が述べている場合、Ａ、Ｂ、またはＣのいずれか、またはそれらの組み合わせを省略して、単独でまたは任意の組み合わせで免責することができることが特に意図されている。値の範囲の列挙は、特に明記されていない限り、範囲内の各個別の値を個別に参照する簡単な方法として機能することを目的としており、個別の値は個別に記載されているかのように明細書に組み込まれる。たとえば、濃度範囲が１％～５０％と記載されている場合、２％～４０％、１０％～３０％、または１％～３％等の値を明示的に列挙することを意図している。これらは、具体的に意図されたものの単なる例であり、列挙された最低値と最高値との間の数値の可能なすべての組み合わせは、本開示において明示的に述べられていると見なされるべきである。別段の定義がない限り、すべての専門用語は、本開示が属する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【0089】
上記のように、本出願は実施形態の説明によって例示されており、実施形態はかなり詳細に記載されているが、添付の特許請求の範囲をそのような詳細に制限または何らかの方法で制限することを意図するものではない。追加の利点および改変は、本願の利点を有する当業者には容易に現れるであろう。したがって、本願は、そのより広い態様において、示されている特定の詳細および例示的な例に限定されない。一般的な発明概念の趣旨または範囲から逸脱することなく、そのような詳細および実施例から離れることができる。
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4-1】
【図4-2】
【図5-1】
【図5-2】
【図5-3】
【図5-4】
【図6】
【図7-1】
【図7-2】
【図7-3】
【図8-1】
【図8-2】
【図8-3】
【配列表】
【国際調査報告】