▶ リサーチ インスティチュート アット ネイションワイド チルドレンズ ホスピタルの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-11-22
(54)【発明の名称】ＮＫ細胞ドナーを同定するための万能ドナー選択方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/04 20060101AFI20221115BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20221115BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20221115BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20221115BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20221115BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20221115BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20221115BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20221115BHJP
A61P 31/10 20060101ALI20221115BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20221115BHJP
G01N 33/68 20060101ALI20221115BHJP
C12N 5/0783 20100101ALN20221115BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20221115BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/04
C12N5/10
A61K35/17 Z
A61P35/00
A61P31/00
A61P35/02
A61P31/12
A61P31/04
A61P31/10
G01N33/50 P
G01N33/68
C12N5/0783
C12N15/09 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022516176
(86)(22)【出願日】2020-09-14
(85)【翻訳文提出日】2022-04-20
(86)【国際出願番号】 US2020050634
(87)【国際公開番号】W WO2021051042
(87)【国際公開日】2021-03-18
(31)【優先権主張番号】62/900,245
(32)【優先日】2019-09-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/049,325
(32)【優先日】2020-07-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】17/018,681
(32)【優先日】2020-09-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】515289842
【氏名又は名称】リサーチ インスティチュート アット ネイションワイド チルドレンズ ホスピタル
(74)【代理人】
【識別番号】100105957
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100068755
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 博宣
(74)【代理人】
【識別番号】100142907
【弁理士】
【氏名又は名称】本田 淳
(74)【代理人】
【識別番号】100152489
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 美樹
(72)【発明者】
【氏名】リー、ディーン
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
2G045AA24
2G045BB24
2G045CB01
2G045DA13
2G045DA14
2G045DA36
2G045FA37
2G045FB01
2G045FB02
2G045FB03
2G045FB05
2G045FB08
2G045FB12
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ08
4B063QQ42
4B063QR62
4B063QS10
4B063QS25
4B063QS36
4B065AA93X
4B065AB01
4B065BB19
4B065BD39
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB37
4C087BB64
4C087DA32
4C087NA05
4C087NA14
4C087ZB26
4C087ZB27
4C087ZB32
4C087ZB33
4C087ZB35
(57)【要約】
本明細書には、万能ドナーナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む組成物、かかる細胞の集団、かかる細胞を入手及び調製する方法並びに癌及び感染症の医学的治療におけるかかる細胞及び組成物の使用方法が記載される。一態様において、本開示は、万能ドナーＮＫ細胞を、それを必要としている対象への治療的投与のために選択する方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
万能ドナーＮＫ細胞を、それを必要としている対象への治療的投与のために選択する方法であって、前記方法は、ＮＫ細胞ドナーからの候補ＮＫ細胞のＫＩＲ表現型を決定することであって、前記ＫＩＲ表現型は、ＮＫ細胞集団中における１つ以上の可変的に遺伝する抑制型ＫＩＲ ２ＤＬ１、２ＤＬ２、２ＤＬ３及び３ＤＬ１の存在を示す、決定すること；及び前記ＫＩＲ表現型が、１つ以上の可変的に遺伝する抑制型ＫＩＲ ２ＤＬ１、２ＤＬ２、２ＤＬ３及び３ＤＬ１の存在を示すとき、前記候補ＮＫ細胞を治療的投与のための万能ドナーＮＫ細胞として選択すること、を含む方法。
【請求項2】
万能ドナーＮＫ細胞を、それを必要としている対象への治療的投与のために選択する方法であって、前記方法は、ＮＫ細胞ドナーからの候補ＮＫ細胞のＨＬＡ遺伝子型を入手することであって、前記ＨＬＡ遺伝子型は、ＮＫ細胞集団中における少なくとも２つのＨＬＡ Ｃ１、Ｃ２及びＢｗ４アレルの存在又は非存在を示し、且つそれにより１つ以上の可変的に遺伝する抑制型ＫＩＲ ２ＤＬ１、２ＤＬ２、２ＤＬ３及び３ＤＬ１の存在を示す、入手すること；及び
前記候補ＮＫ細胞の前記ＨＬＡ遺伝子型が前記ＨＬＡ Ｃ１、Ｃ２及びＢｗ４アレルの少なくとも２つの存在を示すとき、前記候補ＮＫ細胞を治療的投与のための万能ドナーＮＫ細胞として選択すること
を含む方法。
【請求項3】
前記候補ＮＫ細胞のＫＩＲ遺伝子型を入手することを更に含み、前記ＫＩＲ遺伝子型は、２ＤＳ１／２、２ＤＳ３／５、３ＤＳ１及び２ＤＳ４からなる群より選択される少なくとも３つの活性型ＫＩＲの存在又は非存在を示し、前記候補ＮＫ細胞を万能ドナーＮＫ細胞として選択することは、前記活性型ＫＩＲ ２ＤＳ１／２、２ＤＳ３／５、３ＤＳ１及び／又は２ＤＳ４の少なくとも３つを含む前記候補ＮＫ細胞を選択することを更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
万能ドナーＮＫ細胞を、それを必要としている対象への治療的投与のために選択する方法であって、前記方法は、候補ＮＫ細胞のＫＩＲ遺伝子型を入手することであって、前記ＫＩＲ遺伝子型は、２ＤＳ１／２、２ＤＳ３／５、３ＤＳ１及び２ＤＳ４からなる群から選択される少なくとも３つの活性型ＫＩＲの存在又は非存在を示す、入手すること；及び前記ＫＩＲ遺伝子型が前記活性型ＫＩＲ ２ＤＳ１／２、２ＤＳ３／５、３ＤＳ１及び／又は２ＤＳ４の少なくとも３つの存在を示すとき、前記候補ＮＫ細胞を治療的投与のための万能ドナーＮＫ細胞として選択すること、を含む方法。
【請求項5】
候補ＮＫ細胞のＨＬＡ遺伝子型を入手することであって、前記ＨＬＡ遺伝子型は、ＨＬＡ Ｃ１、Ｃ２及びＢｗ４アレルの各々の存在又は非存在を示す、入手すること；及び前記候補ＮＫ細胞の前記ＨＬＡ遺伝子型が前記ＨＬＡアレルＨＬＡ Ｃ１、Ｃ２及びＢｗ４の少なくとも２つの存在を示すとき、前記候補ＮＫ細胞を治療的投与のための万能ドナーＮＫ細胞として選択すること
を更に含む、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
ＮＫ細胞の供給源を、それを必要としている対象への治療的投与用に提供するために、ドナーからの候補ＮＫ細胞集団をスクリーニングして、前記集団中における万能ＮＫドナー細胞を同定する方法であって、前記方法は、ＮＫ細胞ドナーからの候補ＮＫ細胞のＨＬＡ遺伝子型を入手することであって、前記ＨＬＡ遺伝子型は、ＨＬＡ Ｃ１、Ｃ２及びＢｗ４アレルの少なくとも２つの存在又は非存在を示し、ＨＬＡ Ｃ１、Ｃ２及びＢｗ４の少なくとも２つのＨＬＡアレルを含む候補ＮＫ細胞は、万能ドナーＮＫ細胞として同定される、入手すること
を含む方法。
【請求項7】
前記候補ＮＫ細胞のＫＩＲ遺伝子型を入手することを更に含み、前記ＫＩＲ遺伝子型は、２ＤＳ１／２、２ＤＳ３／５、３ＤＳ１及び２ＤＳ４からなる群から選択される少なくとも３つの活性型ＫＩＲの存在又は非存在を示し；少なくとも３つの活性型ＫＩＲ ２ＤＳ１／２、２ＤＳ３／５、３ＤＳ１及び／又は２ＤＳ４を含む候補ＮＫ細胞は、万能ＮＫ細胞として同定される、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記選択された万能ドナーＮＫ細胞は、少なくとも５０％～８５％のレシピエント対象について組織学的に最適化される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記候補ＮＫ細胞のＣＭＶ血清反応陽性状態を入手するか又は入手していることを更に含み、候補ＮＫ細胞を万能ドナーＮＫ細胞として選択することは、ＣＭＶについて血清反応陽性であるか、又はＮＫＧ２Ｃ発現の参照レベルと比較して高いＮＫＧ２Ｃ発現を有する候補ＮＫ細胞を選択することを更に含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
請求項１～５、８若しくは９のいずれか一項に記載の方法によって選択されるか；又は請求項６若しくは７に記載の方法によるスクリーニングによって同定される単離された万能ドナーＮＫ細胞。
【請求項11】
前記ＮＫ細胞がＮＫＧ２Ｃ＋である、請求項１０に記載の単離された万能ＮＫ細胞。
【請求項12】
前記ＮＫ細胞は、インビトロでＩＬ－２１の存在下において前記万能ドナーＮＫ細胞をインキュベートすることによって活性化される、請求項１０に記載の単離された万能ＮＫ細胞。
【請求項13】
前記インビトロ活性化に使用される前記ＩＬ－２１は、可溶性ＩＬ－２１、ＩＬ－２１発現フィーダ細胞（ＦＣ２１）、ＩＬ－２１細胞膜粒子（ＰＭ２１）及びＩＬ－２１エキソソーム（ＥＸ２１）の少なくとも１つを含む、請求項１２に記載の単離された万能ＮＫ細胞。
【請求項14】
対象の癌又は感染症を治療する方法であって、請求項１～５、８若しくは９のいずれか一項に記載の方法によって選択されるか；又は請求項６若しくは７に記載の方法によるスクリーニングによって同定されたドナーＮＫ細胞を前記対象に投与すること；或いは請求項１０～１３のいずれか一項に記載の単離された万能ＮＫ細胞を投与することを含む方法。
【請求項15】
対象の癌又は感染症を治療する方法であって、（ａ）ＮＫ細胞ドナーからの候補ＮＫ細胞のＨＬＡ遺伝子型を入手するか又は入手していることであって、前記ＨＬＡ遺伝子型は、ＨＬＡ Ｃ１、Ｃ２及びＢｗ４アレルの各々の存在又は非存在を示し、且つそれにより１つ以上の可変的に遺伝する抑制型ＫＩＲ ２ＤＬ１、２ＤＬ２、２ＤＬ３及び３ＤＬ１の存在を示す、入手するか又は入手していること；（ｂ）前記候補ＮＫ細胞のＫＩＲ遺伝子型を入手するか又は入手していることであって、前記ＫＩＲ遺伝子型は、２ＤＳ１／２、２ＤＳ３／５、３ＤＳ１及び２ＤＳ４からなる群から選択される活性型ＫＩＲの各々の存在又は非存在を示す、入手するか又は入手していること；及び（ｃ）（ｉ）前記ＨＬＡ遺伝子型が前記ＨＬＡアレルＨＬＡ Ｃ１、Ｃ２及びＢｗ４の少なくとも２つの存在を示すとき；及び（ｉｉ）前記ＫＩＲ遺伝子型が前記活性型ＫＩＲ ２ＤＳ１／２、２ＤＳ３／５、３ＤＳ１及び／又は２ＤＳ４の少なくとも３つの存在を示すとき、候補ＮＫ細胞を治療的投与のための万能ドナーＮＫ細胞として選択すること
を含む方法。
【請求項16】
前記選択された万能ドナーＮＫ細胞は、少なくとも５０％～８５％のレシピエント対象について組織学的に最適化される、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項17】
前記候補ＮＫ細胞の前記ＣＭＶ血清反応陽性状態を入手するか又は入手していることを更に含み；ＮＫ候補細胞を選択することは、前記ＮＫ細胞ドナーがＣＭＶについて血清反応陽性であるとき又は前記ＮＫ細胞ドナーからの前記ＮＫ細胞が、ＮＫＧ２Ｃ発現の参照レベルと比較して高いＮＫＧ２Ｃ発現を有するとき、候補ＮＫ細胞を選択することを更に含む、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
インビトロでＩＬ－２１の存在下において万能ドナーＮＫ細胞を入手するか又は有することを更に含む、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
インビトロ培養に使用される前記ＩＬ－２１は、可溶性ＩＬ－２１、ＩＬ－２１発現フィーダ細胞（ＦＣ２１）、ＩＬ－２１細胞膜粒子（ＰＭ２１）及びＩＬ－２１エキソソーム（ＥＸ２１）の少なくとも１つを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記癌は、血液癌、肺癌、食道癌、胃癌、膵癌、肝癌、胆道癌、結腸癌、直腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、腎癌、膀胱癌、精巣癌、前立腺癌、喉頭癌、甲状腺癌、脳癌又は皮膚癌から選択される、請求項１４～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記感染症は、ウイルス、細菌又は真菌から選択される病原体によって引き起こされる、請求項１４～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
万能ドナーＮＫ細胞集団を、それを必要としている対象への治療的投与のために調製する方法であって、（ａ）ＮＫ細胞ドナーから初期ＮＫ細胞集団を入手することであって、前記ＮＫ細胞ドナーは、（ｉ）可変的に遺伝する活性型ＫＩＲ ２ＤＳ１／２、２ＤＳ３／５、３ＤＳ１及び／又は２ＤＳ４の少なくとも２つ；及び（ｉｉ）Ｃ１、Ｃ２及びＢｗ４アレルの少なくとも１つの存在を示す遺伝子型を有する、入手すること；及び（ｂ）前記初期ＮＫ細胞集団を拡大するのに十分な時間にわたって且つ条件下において、前記初期ＮＫ細胞集団をインビトロでＩＬ－２１に曝露すること、を含む方法。
【請求項23】
前記ドナー遺伝子型は、Ｃ１、Ｃ２及びＢｗ４アレルの存在を示す、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
ステップ（ｂ）は、少なくとも１回の集団倍化を達成するための時間にわたって且つ条件下で行われる、請求項２２に記載の方法。
【請求項25】
前記ＮＫ細胞ドナーは、ＮＫＧ２Ｃ＋ ＮＫ細胞の存在を示すＣＭＶ血清反応陽性プロファイルを更に有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項26】
前記初期ＮＫ細胞集団をＩＬ－２１に曝露することは、前記ＮＫ細胞を、可溶性ＩＬ－２１、ＩＬ－２１発現フィーダ細胞（ＦＣ２１）、ＩＬ－２１細胞膜粒子（ＰＭ２１）及びＩＬ－２１エキソソーム（ＥＸ２１）の少なくとも１つとインビトロで接触させることを含む、請求項２２～２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
フィーダ細胞（ＦＣ２１）、ＩＬ－２１細胞膜粒子（ＰＭ２１）及びＩＬ－２１エキソソーム（ＥＸ２１）に存在する前記ＩＬ－２１は、（ａ）ＩＬ－２１のための改変された膜結合形態、（ｂ）ＦＣ２１、ＰＭ２１若しくはＥＸ２１の表面に化学的にコンジュゲートされたＩＬ－２１、又は（ｃ）前記ＮＫ細胞と相互接触するように混合された溶液中におけるＩＬ－２１から選択される形態のＩＬ－２１を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記ＦＣ２１、ＰＭ２１又はＥＸ２１のいずれか１つは、（ａ）ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－１５、ＩＬ－７、ＵＬＢＰ、ＭＩＣＡ、ＯＸ４０Ｌ、ＮＫＧ２Ｄアゴニスト、デルタ－１、ノッチリガンド、ＮＫｐ４６アゴニスト、ＮＫｐ４４アゴニスト、ＮＫｐ３０アゴニスト、他のＮＣＲアゴニスト、ＣＤ１６アゴニストから選択されるＮＫ刺激性リガンド；又は（ｂ）膜結合型ＴＧＦ－βを更に含む、請求項２２～２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
請求項２２～２８のいずれか一項に記載の方法によって調製される万能ドナーＮＫ細胞集団。
【請求項30】
請求項２２～２９のいずれか一項に記載の方法によって調製されるＮＫ細胞集団であって、前記拡大されたＮＫ細胞集団は、ＩＦＮｙ又はＴＮＦａの抗腫瘍性サイトカインを産生及び分泌する増加した能力によって特徴付けられる、ＮＫ細胞集団。
【請求項31】
前記拡大されたＮＫ細胞集団は、ＮＫＧ２Ｄの増加した発現、ＣＤ１６の増加した発現、ＮＫｐ４６の増加した発現、増加したＫＩＲ発現によって特徴付けられる、請求項２９又は３０に記載の万能ドナーＮＫ細胞集団。
【請求項32】
改変されたＮＫ細胞又は細胞株であって、前記ＮＫ細胞又は細胞株は、Ｃ１、Ｃ２又はＢｗ４を含む１つ以上のＨＬＡアレルを発現するように形質転換されている、改変されたＮＫ細胞又は細胞株。
【請求項33】
前記ＮＫ細胞又は細胞株は、Ｃ１、Ｃ２及びＢｗ４を発現するように形質転換されている、請求項３２に記載の改変されたＮＫ細胞又は細胞株。
【請求項34】
前記ＮＫ細胞又は細胞株は、２ＤＳ１／２、２ＤＳ３／５、３ＤＳ１又は２ＤＳ４を含む１つ以上の可変的に遺伝する活性型ＫＩＲを発現するように更に形質転換されている、請求項３２又は３３に記載の改変されたＮＫ細胞又は細胞株。
【請求項35】
前記ＮＫ細胞又は細胞株は、２ＤＳ１／２、２ＤＳ３／５、３ＤＳ１又は２ＤＳ４を含む３つ以上の可変的に遺伝する活性型ＫＩＲを発現するように更に形質転換されている、請求項３２～３４のいずれか一項に記載の改変されたＮＫ細胞又は細胞株。
【請求項36】
フィーダ細胞（ＦＣ２１）、ＩＬ－２１細胞膜粒子（ＰＭ２１）及びＩＬ－２１エキソソーム（ＥＸ２１）に存在する前記ＩＬ－２１は、（ａ）ＩＬ－２１のための改変された膜結合形態、（ｂ）ＦＣ２１、ＰＭ２１若しくはＥＸ２１の表面に化学的にコンジュゲートされたＩＬ－２１、又は（ｃ）前記ＮＫ細胞と接触するように混合された溶液中におけるＩＬ－２１から選択される形態のＩＬ－２１を含む、請求項５、１１又は３４～３５、４１又は４９～５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
前記ＦＣ２１、ＰＭ２１又はＥＸ２１のいずれか１つは、（ａ）ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－１５、ＩＬ－７、ＵＬＢＰ、ＭＩＣＡ、ＯＸ４０Ｌ、ＮＫＧ２Ｄアゴニスト、デルタ－１、ノッチリガンド、ＮＫｐ４６アゴニスト、ＮＫｐ４４アゴニスト、ＮＫｐ３０アゴニスト、他のＮＣＲアゴニスト、ＣＤ１６アゴニストから選択されるＮＫ刺激性リガンド；又は（ｂ）膜結合型ＴＧＦ－βを更に含む、請求項５、１１、３４～３６、４１又は４９～５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項38】
対象の癌又は感染症の治療における使用のための、請求項１～４、７若しくは８のいずれか一項に記載の方法によって選択されるか；又は請求項６若しくは７に記載の方法によってスクリーニングされたドナーＮＫ細胞；或いは請求項１０～１３のいずれか一項に記載の単離された万能ＮＫ細胞；或いは請求項２９～３１のいずれか一項に記載の万能ドナーＮＫ細胞集団；或いは請求項３２～３５のいずれか一項に記載の改変されたＮＫ細胞又は細胞株。
【請求項39】
対象の癌又は感染症の治療における使用のためのＮＫ細胞集団であって、前記ＮＫ細胞集団は、（ｉ）２ＤＬ１、２ＤＬ２、２ＤＬ３及び３ＤＬ１から選択される１つ以上の可変的に遺伝する抑制型ＫＩＲの存在を示す、ＨＬＡ Ｃ１、Ｃ２及びＢｗ４から選択される少なくとも２つのＨＬＡアレルを含むＨＬＡ遺伝子型；及び
（ｉｉ）２ＤＳ１／２、２ＤＳ３／５、３ＤＳ１及び２ＤＳ４からなる群から選択される少なくとも３つの活性型ＫＩＲを含むＫＩＲ遺伝子型
を含むＮＫ細胞集団。
【請求項40】
ＮＫ細胞またはＮＫ細胞集団は、少なくとも５０％～８５％の前記レシピエント対象について組織学的に最適化される、請求項３８に記載のＮＫ細胞又は請求項３９に記載のＮＫ細胞集団。
【請求項41】
前記ＮＫ細胞又はＮＫ細胞集団の前記ドナーは、ＣＭＶについて血清反応陽性であり、及び／又は前記ＮＫ細胞若しくはＮＫ細胞集団は、ＮＫＧ２Ｃ発現の参照レベルと比較して高いＮＫＧ２Ｃ発現を有する、請求項３８に記載のＮＫ細胞又は請求項３９に記載のＮＫ細胞集団。
【請求項42】
前記治療における前記使用前に、前記ＮＫ細胞又は前記ＮＫ細胞集団をインビトロでＩＬ－２１の存在下において培養することを更に含む、請求項３８～４１のいずれか一項に記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞集団。
【請求項43】
前記インビトロ培養における前記ＩＬ－２１は、ＩＬ－２１、ＩＬ－２１発現フィーダ細胞（ＦＣ２１）、ＩＬ－２１細胞膜粒子（ＰＭ２１）又はＩＬ－２１エキソソームを含む、請求項４２に記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞集団。
【請求項44】
前記癌は、血液癌、肺癌、食道癌、胃癌、膵癌、肝癌、胆道癌、結腸癌、直腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、腎癌、膀胱癌、精巣癌、前立腺癌、喉頭癌、甲状腺癌、脳癌又は皮膚癌から選択される、請求項３８～４３のいずれか一項に記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞集団。
【請求項45】
前記感染症は、ウイルス、細菌又は真菌から選択される病原体によって引き起こされる、請求項３８～４３のいずれか一項に記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞集団。
【請求項46】
前記ＮＫ細胞若しくはＮＫ細胞集団及び／又は前記ＮＫ細胞若しくはＮＫ細胞集団の前記ドナーは、前記ＨＬＡ遺伝子型及び前記ＫＩＲ遺伝子型が決定されている２つ以上の細胞、集団及び／又はドナーを含む集合から選択される、請求項３８～４３のいずれか一項に記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞集団。
【請求項47】
ドナーからＮＫ細胞コレクションを調製する方法であって、（ｉ）１つ以上のドナーから、（ａ）ＨＬＡ Ｃ１、Ｃ２及びＢｗ４アレルの存在又は非存在を示し、それにより１つ以上の可変的に遺伝する抑制型ＫＩＲ ２ＤＬ１、２ＤＬ２、２ＤＬ３及び３ＤＬ１の存在を示すＨＬＡ遺伝子型；及び（ｂ）２ＤＳ１／２、２ＤＳ３／５、３ＤＳ１及び２ＤＳ４からなる群から選択される活性型ＫＩＲの存在又は非存在を示すＫＩＲ遺伝子型を決定すること；及び（ｉｉ）（ｉ）前記ＨＬＡ遺伝子型が少なくとも２つのＨＬＡアレルＨＬＡ Ｃ１、Ｃ２及びＢｗ４の存在を示すとき；及び（ｉｉ）前記ＫＩＲ遺伝子型が少なくとも３つの活性型ＫＩＲ ２ＤＳ１／２、２ＤＳ３／５、３ＤＳ１及び／又は２ＤＳ４の存在を示すとき、前記ドナーから、ＮＫ細胞の治療的投与のための万能ドナーＮＫを選択すること；及び
（ｉｉｉ）前記万能ドナーのＮＫ細胞のエキソビボバッチから前記ＮＫ細胞コレクションを調製すること
を含む方法。
【請求項48】
前記治療的投与のための万能ドナーＮＫ細胞としての前記選択は、ＮＫＧ２Ｃ＋ ＮＫ細胞の存在を示すＣＭＶ血清反応陽性プロファイルを有するドナーを選択することを更に含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項49】
対象の癌又は感染症を治療するための医薬の製造における、請求項１～５、８若しくは９のいずれか一項に記載の方法によって選択されるか；又は請求項６若しくは７に記載の方法によってスクリーニングされたドナーＮＫ細胞；或いは請求項１０～１３のいずれか一項に記載の単離された万能ＮＫ細胞；或いは請求項２９～３１のいずれか一項に記載の万能ドナーＮＫ細胞集団；或いは請求項３２～３５のいずれか一項に記載の改変されたＮＫ細胞又は細胞株の使用。
【請求項50】
対象の癌又は感染症を治療するための医薬の製造におけるＮＫ細胞集団の使用であって、前記ＮＫ細胞集団は、（ｉ）２ＤＬ１、２ＤＬ２、２ＤＬ３及び３ＤＬ１から選択される１つ以上の可変的に遺伝する抑制型ＫＩＲの存在を示す、ＨＬＡ Ｃ１、Ｃ２及びＢｗ４から選択される少なくとも２つのＨＬＡアレルを含むＨＬＡ遺伝子型；及び
（ｉｉ）２ＤＳ１／２、２ＤＳ３／５、３ＤＳ１及び２ＤＳ４からなる群から選択される少なくとも３つの活性型ＫＩＲを含むＫＩＲ遺伝子型
を含む、使用。
【請求項51】
前記ＮＫ細胞又はＮＫ細胞集団は、少なくとも５０％～８５％の前記レシピエント対象について組織学的に最適化される、請求項４９又は５０に記載の使用。
【請求項52】
前記ＮＫ細胞又はＮＫ細胞集団の前記ドナーは、ＣＭＶについて血清反応陽性であるか、又は前記ＮＫ細胞若しくはＮＫ細胞集団は、ＮＫＧ２Ｃ発現の参照レベルと比較して高いＮＫＧ２Ｃ発現を有する、請求項４９～５１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項53】
前記治療における前記使用前に、前記ＮＫ細胞又は前記ＮＫ細胞集団をインビトロでＩＬ－２１の存在下において培養することを更に含む、請求項４９～５２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項54】
前記インビトロ培養における前記ＩＬ－２１は、ＩＬ－２１、ＩＬ－２１発現フィーダ細胞（ＦＣ２１）、ＩＬ－２１細胞膜粒子（ＰＭ２１）又はＩＬ－２１エキソソームを含む、請求項５３に記載の使用。
【請求項55】
前記癌は、血液癌、肺癌、食道癌、胃癌、膵癌、肝癌、胆道癌、結腸癌、直腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、腎癌、膀胱癌、精巣癌、前立腺癌、喉頭癌、甲状腺癌、脳癌又は皮膚癌から選択される、請求項４９～５４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項56】
前記感染症は、ウイルス、細菌又は真菌から選択される病原体によって引き起こされる、請求項４９～５５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項57】
前記ＮＫ細胞若しくはＮＫ細胞集団及び／又は前記ＮＫ細胞若しくはＮＫ細胞集団の前記ドナーは、前記ＨＬＡ遺伝子型及び前記ＫＩＲ遺伝子型が決定されている２つ以上の細胞、集団及び／又はドナーを含む集合から選択される、請求項４９～５６のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、概して、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のドナー選択方法に関し、より具体的には、万能ドナー細胞を、それを必要としているレシピエントへの治療的投与のために選択する方法を提供することに関する。
【背景技術】
【0002】
ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ分子と相互作用する複数の受容体を発現する。これらのＮＫ細胞受容体は、２つの主要なタンパク質スーパーファミリ、免疫グロブリンスーパーファミリ又はＣ型レクチンスーパーファミリの一方に属する。ＮＫ細胞が正常組織を病的自己組織と見分ける能力は、大部分がキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）ファミリの抑制機能によって説明され、これは、潜在的標的上の古典的ＨＬＡクラスＩ分子を優勢に認識する。この自己主要組織適合遺伝子複合体（ＭＦＩＣ）認識により、ＮＫ細胞には、その活性型受容体を通して惹起される機能的能力が付与され、この過程は、ライセンス化と呼ばれる。結果として、自己ＭＨＣ特異的受容体を有するライセンス化ＮＫ細胞は、自己ＭＨＣ特異的受容体を有しない非ライセンス化ＮＫ細胞と比較したとき、より容易に活性化される。種々のＫＩＲファミリメンバーが個別のＩ ＩＬＡクラスＩアロタイプと相互作用し、広範な遺伝的多様性を有する。同様に、ＮＫ細胞は、複数の異なる受容体を異なる特異性で同時に発現する。結果として、養子免疫療法にＮＫ細胞を利用しようとする試みのいずれも、ＮＫ細胞ドナーとレシピエントとの間の適合性に対処しなければならない。特定の患者に対する特定のドナーを同定するために複数のドナーを検査することは、高コストであり、多大な時間を要し得る。必要とされているのは、適合性の問題を被ることのない万能なＮＫ細胞供給源である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0003】
一態様において、本開示は、万能ドナー（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｄｏｎｏｒ）ＮＫ細胞を、それを必要としている対象への治療的投与のために選択する方法に関し、この方法は、ＮＫ細胞ドナーからの候補ＮＫ細胞のＫＩＲ表現型を決定することであって、ＫＩＲ表現型は、１つ以上の可変的に遺伝する（ｖａｒｉａｂｌｙ ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ）抑制型ＫＩＲ ２ＤＬ１、２ＤＬ２、２ＤＬ３及び３ＤＬ１の存在を示す、決定すること；及びＫＩＲ表現型が、１つ以上の可変的に遺伝する抑制型ＫＩＲ ２ＤＬ１、２ＤＬ２、２ＤＬ３及び３ＤＬ１の存在を示すとき、その候補ＮＫ細胞を治療的投与のための万能ドナーＮＫ細胞として選択することを含む。
【0004】
別の態様において、本開示は、万能ドナーＮＫ細胞を、それを必要としているレシピエント対象への治療的投与のために選択する方法に関し、この方法は、ＮＫ細胞ドナーからの候補ＮＫ細胞のＨＬＡ遺伝子型を入手することであって、ＨＬＡ遺伝子型は、少なくとも２つのＨＬＡ Ｃ１、Ｃ２及びＢｗ４アレルの存在又は非存在を示し、且つそれにより１つ以上の可変的に遺伝する抑制型ＫＩＲ ２ＤＬ１、２ＤＬ２、２ＤＬ３及び３ＤＬ１の存在を示す、入手すること；及び候補ＮＫ細胞のＨＬＡ遺伝子型がＨＬＡ Ｃ１、Ｃ２及びＢｗ４アレルの少なくとも２つの存在を示すとき、その候補ＮＫ細胞を治療的投与のための万能ドナーＮＫ細胞として選択することを含む。本方法は、候補ＮＫ細胞のＫＩＲ表現型を入手するか又は入手していることであって、ＫＩＲ表現型は、２ＤＳ１／２、２ＤＳ３／５、３ＤＳ１及び２ＤＳ４からなる群から選択される活性型（ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ）ＫＩＲの存在又は非存在を示す、入手するか又は入手していること；及び候補ＮＫ細胞をあるものとして更に選択することを更に含み得、ここで、少なくとも３つの活性型ＫＩＲ ２ＤＳ１／２、２ＤＳ３／５、３ＤＳ１及び／又は２ＤＳ４を含む候補ＮＫ細胞は、万能ＮＫ細胞である。本方法は、ＮＫ細胞ドナーからの候補ＮＫ細胞のＨＬＡ遺伝子型を入手するか又は入手していることであって、１－ＩＬＡ遺伝子型は、ＨＬＡ Ｃｌ、Ｃ２及びＢｗ４アレルの存在又は非存在を示し、且つそれにより１つ以上の可変的に遺伝する抑制型ＫＩＲ ２ＤＬ１、２ＤＬ２、２ＤＬ３及び３ＤＬ１の存在を示す、入手するか又は入手していること、及びＨＬＡ遺伝子型が少なくとも２つのＨＬＡアレルＨＬＡ Ｃｌ、Ｃ２及びＢｗ４の存在を示すとき、その候補ＮＫ細胞を治療的投与のための万能ドナーＮＫ細胞として更に選択することを更に含み得る。
【0005】
本開示は、万能ドナーＮＫ細胞を、それを必要としているレシピエント対象への治療的投与のために選択する方法にも関し、この方法は、候補ＮＫ細胞のＫＩＲ遺伝子型を入手するか又は入手していることであって、ＫＩＲ遺伝子型は、２ＤＳ１／２、２ＤＳ３／５、３ＤＳ１及び２ＤＳ４からなる群から選択される活性型ＫＩＲの存在又は非存在を示す、入手するか又は入手していること、及びＫＩＲ遺伝子型が少なくとも３つの活性型ＫＩＲ ２ＤＳ１／２、２ＤＳ３／５、３ＤＳ１及び／又は２ＤＳ４の存在を示すとき、その候補ＮＫ細胞を治療的投与のための万能ドナーＮＫ細胞として選択することを含む。
【0006】
本開示は、加えて、ＮＫ細胞の供給源を、それを必要としている対象への治療的投与のために提供するために、ドナーからの候補ＮＫ細胞集団をスクリーニングして、集団中における万能ＮＫドナー細胞を同定する方法に関し、この方法は、（ａ）ＮＫ細胞ドナーからの候補ＮＫ細胞のＨＬＡ遺伝子型を入手するか又は入手していることであって、ＨＬＡ遺伝子型は、ＨＬＡ Ｃｌ、Ｃ２及びＢｗ４アレルの存在又は非存在を示し、且つそれにより１つ以上の可変的に遺伝する抑制型ＫＩＲ ２ＤＬ１、２ＤＬ２又は２ＤＬ３及び／又は３ＤＬ１の存在を示す、入手するか又は入手していることを含み；ここで、少なくとも２つのＨＬＡアレルＨＬＡ Ｃｌ、Ｃ２及びＢｗ４を含む候補ＮＫ細胞、従って可変的に遺伝する抑制型ＫＩＲ ２ＤＬ１、２ＤＬ２又は２ＤＬ３及び／又は３ＤＬ１の少なくとも１つを含む候補ＮＫ細胞は、万能ドナーＮＫ細胞である。この方法は、候補ＮＫ細胞のＫＩＲ遺伝子型を入手するか又は入手していることであって、ＫＩＲ遺伝子型は、２ＤＳ１／２、２ＤＳ３／５、３ＤＳ１及び２ＤＳ４からなる群から選択される活性型ＫＩＲの存在又は非存在を示す、入手するか又は入手していることを更に含み得；ここで、少なくとも３つの活性型ＫＩＲ ２ＤＳ１／２、２ＤＳ３／５、３ＤＳ１及び／又は２ＤＳ４を含む候補ＮＫ細胞は、万能ＮＫ細胞である。これらの方法のいずれにおいても、選択された万能ドナーＮＫ細胞は、少なくとも５０％～８５％のレシピエント対象について組織学的に最適化され得る。これらの方法のいずれも、候補ＮＫ細胞のＣＭＶ血清反応陽性状態を入手するか又は入手していることであって、ＮＫ細胞ドナーがＣＭＶについて血清反応陽性であるとき又はＮＫ細胞ドナーからのＮＫ細胞がＮＫＧ２Ｃ発現の参照レベルと比較して高いＮＫＧ２Ｃ発現を示すとき、そのＮＫ候補ＮＫ細胞は、更に選択される、入手するか又は入手していることを含み得る。かかる方法の一態様において、ＮＫＧ２Ｃ発現の参照レベルは、５％未満のＮＫ細胞がＮＫＧ２Ｃを発現するものである。かかる方法の別の態様において、ＮＫＧ２Ｃ高発現は、５％～約２２％のＮＫ細胞がＮＫＧ２Ｃを発現するものである。
【0007】
別の態様において、本開示は、本明細書で考察される方法のいずれかによって選択又はスクリーニングされた単離された万能ドナーＮＫ細胞を提供し、ここで、ＮＫ細胞は、ＮＫＧ２Ｃ＋である。単離された万能ＮＫ細胞は、万能ドナーＮＫ細胞をインビトロでＩＬ－２１の存在下においてインキュベートすることによって活性化され得る。インビトロ活性化に使用されるＩＬ－２１は、可溶性ＩＬ－２１、ＩＬ－２１発現フィーダ細胞（ＦＣ２１）、ＩＬ－２１細胞膜粒子（ＰＭ２１）又はＩＬ－２１エキソソーム（ＥＸ２１）を含み得る。
【0008】
別の態様において、本開示は、対象の癌又は感染症を治療する方法を提供し、この方法は、上記で考察される方法のいずれか１つ以上によって選択されたドナーＮＫ細胞若しくは上記で考察される方法のいずれか１つ以上によってスクリーニングされたドナーＮＫ細胞；又は上記で考察される方法の一部若しくは全てによって考察される単離された万能ＮＫ細胞を対象に投与することを含む。
【0009】
本開示は、対象の癌又は感染症を治療する方法であって、（ａ）ＮＫ細胞ドナーからの候補ＮＫ細胞のＨＬＡ遺伝子型を入手するか又は入手していることであって、ＨＬＡ遺伝子型は、ＨＬＡ Ｃｌ、Ｃ２及びＢｗ４アレルの存在又は非存在を示し、且つそれにより１つ以上の可変的に遺伝する抑制型ＫＩＲ ２ＤＬ１、２ＤＬ２、２ＤＬ３及び３ＤＬ１の存在を示す、入手するか又は入手していること；（ｂ）候補ＮＫ細胞のＫＩＲ遺伝子型を入手するか又は入手していることであって、ＫＩＲ遺伝子型は、２ＤＳ１／２、２ＤＳ３／５、３ＤＳ１及び２ＤＳ４からなる群から選択される活性型ＫＩＲの存在又は非存在を示す、入手するか又は入手していること；及び（ｃ）（ｉ）ＨＬＡ遺伝子型が少なくとも２つのＨＬＡアレルＨＬＡ Ｃｌ、Ｃ２及びＢｗ４の存在を示すとき；及び（ｉｉ）ＫＩＲ遺伝子型が少なくとも３つの活性型ＫＩＲ ２ＤＳ１／２、２ＤＳ３／５、３ＤＳ１及び／又は２ＤＳ４の存在を示すとき、その候補ＮＫ細胞を治療的投与のための万能ドナーＮＫ細胞として選択することを含む方法に更に関する。一態様において、選択された万能ドナーＮＫ細胞は、少なくとも５０％～８５％のレシピエント対象について組織学的に最適化され得る。別の態様において、本方法は、候補ＮＫ細胞のＣＭＶ血清反応陽性状態を入手するか又は入手していることであって、ＮＫ細胞ドナーがＣＭＶについて血清反応陽性であるとき又はＮＫ細胞ドナーからのＮＫ細胞がＮＫＧ２Ｃ発現の参照レベルと比較して高いＮＫＧ２Ｃ発現を示すとき、そのＮＫ候補ＮＫ細胞が更に選択される、入手するか又は入手していることを更に含み得る。本方法は、選択された万能ドナーＮＫ細胞をインビトロでＩＬ－２１の存在下においてインキュベートすることを更に含み得る。インビトロ培養に使用されるＩＬ－２１は、可溶性ＩＬ－２１、ＩＬ－２１発現フィーダ細胞（ＦＣ２１）、ＩＬ－２１細胞膜粒子（ＰＭ２１）及び／又はＩＬ－２１エキソソーム（ＥＸ２１）を含み得る。本方法において、癌は、血液癌、肺癌、食道癌、胃癌、膵癌、肝癌、胆道癌、結腸癌、直腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、腎癌、膀胱癌、精巣癌、前立腺癌、喉頭癌、甲状腺癌、脳癌又は皮膚癌から選択され得る。本方法の別の態様において、感染症は、ウイルス、細菌又は真菌から選択される病原体によって引き起こされ得る。
【0010】
本開示は、万能ドナーＮＫ細胞集団を、それを必要としている対象への治療的投与のために調製する方法に更に関し、この方法は、（ａ）ＮＫ細胞ドナーから初期ＮＫ細胞集団を入手することであって、ＮＫ細胞ドナーは、（ｉ）可変的に遺伝する活性型ＫＩＲ ２ＤＳ１／２、２ＤＳ３／５、３ＤＳ１及び／又は２ＤＳ４の少なくとも２つ；及び（ｉｉ）Ｃｌ、Ｃ２及びＢｗ４アレルの少なくとも１つの存在を示す遺伝子型を有すること；及び（ｂ）初期ＮＫ細胞集団を拡大する（ｅｘｐａｎｄ）のに十分な時間にわたって且つ条件下において初期ＮＫ細胞集団をインビトロでＩＬ－２１に曝露することを含む。本方法の一態様において、ドナー遺伝子型は、Ｃｌ、Ｃ２及びＢｗ４アレルの存在を示し得る。本方法の別の態様において、ステップ（ｂ）は、少なくとも１回の集団倍化を達成するための時間にわたって且つ条件下において行われ得る。本方法の別の態様において、好ましいドナーは、ＮＫＧ２Ｃ＋ ＮＫ細胞の存在を示すＣＭＶ血清反応陽性プロファイルを有し得る。本方法の別の態様において、初期ＮＫ細胞集団をＩＬ－２１に曝露することは、ＮＫ細胞を可溶性ＩＬ－２１、ＩＬ－２１発現フィーダ細胞（ＦＣ２１）、ＩＬ－２１細胞膜粒子（ＰＭ２１）及びＩＬ－２１エキソソーム（ＥＸ２１）の少なくとも１つ又はこれらの任意の組み合わせとインビトロで接触させることを含み得る。本方法の別の態様において、フィーダ細胞（ＦＣ２１）、ＩＬ－２１細胞膜粒子（ＰＭ２１）及びＩＬ－２１エキソソーム（ＥＸ２１）に存在するＩＬ－２１は、（ａ）ＩＬ－２１のための改変された膜結合形態、（ｂ）ＦＣ２１、ＰＭ２１又はＥＸ２１の表面に化学的にコンジュゲートされたＩＬ－２１、又は（ｃ）又はＮＫ細胞と相互接触するように混合された溶液中におけるＩＬ－２１から選択される形態のＩＬ－２１を含み得る。本方法の別の態様において、ＦＣ２１、ＰＭ２１又はＥＸ２１のいずれか１つは、（ａ）ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－１５、ＩＬ－７、ＵＬＢＰ、ＭＩＣＡ、ＯＸ４ＯＬ、ＮＫＧ２Ｄアゴニスト、デルタ－１、ノッチリガンド、ＮＫｐ４６アゴニスト、ＮＫｐ４４アゴニスト、ＮＫｐ３０アゴニスト、他のＮＣＲアゴニスト、ＣＤ１６アゴニストから選択されるＮＫ刺激性リガンド；又は（ｂ）膜結合型ＴＧＦ－βを更に含み得る。本方法の別の態様において、ＮＫ細胞は、可溶性及び／又は膜結合型リガンドの群から選択される１つ以上のＮＫ刺激性リガンドに更に曝露され得る。本方法の更に別の態様において、万能ドナーＮＫ細胞集団が調製され得る。
【0011】
別の態様において、本開示は、前述の方法のいずれか１つ以上によって調製されるＮＫ細胞集団を提供し、ここで、拡大されたＮＫ細胞集団は、ＩＦＮｙ又はＴＮＦａの抗腫瘍性サイトカインを産生及び分泌する増加した能力によって特徴付けられる。別の態様において、前述の方法のいずれか１つ以上によって調製されるＮＫ細胞集団は、ＮＫＧ２Ｄの増加した発現、ＣＤ１６の増加した発現、ＮＫｐ４６の増加した発現及び／又は増加したＫＩＲ発現によって特徴付けられる拡大されたＮＫ細胞集団を含む。本方法の一態様において、フィーダ細胞（ＦＣ２１）、ＩＬ－２１細胞膜粒子（ＰＭ２１）及びＩＬ－２１エキソソーム（ＥＸ２１）に存在するＩＬ－２１は、（ａ）ＩＬ－２１のための改変された膜結合形態、（ｂ）ＦＣ２１、ＰＭ２１又はＥＸ２１の表面に化学的にコンジュゲートされたＩＬ－２１、又は（ｃ）ＮＫ細胞と相互接触するように混合された溶液中におけるＩＬ－２１から選択される形態のＩＬ－２１を含み得る。前述のいずれかの態様の方法において、ＦＣ２１、ＰＭ２１又はＥＸ２１のいずれか１つは、（ａ）ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－１５、ＩＬ－７、ＵＬＢＰ、ＭＩＣＡ、ＯＸ４ＯＬ、ＮＫＧ２Ｄアゴニスト、デルタ－１、ノッチリガンド、ＮＫｐ４６アゴニスト、ＮＫｐ４４アゴニスト、ＮＫｐ３０アゴニスト、他のＮＣＲアゴニスト、ＣＤ１６アゴニストから選択されるＮＫ刺激性リガンド；又は（ｂ）膜結合型ＴＧＦ－βを更に含み得る。一態様において、ＦＣ２１、ＰＭ２１又はＥＸ２１のいずれか１つは、可溶性及び／又は膜結合型刺激性リガンドを更に含む。
【0012】
本開示は、加えて、改変されたＮＫ細胞又は細胞株に関し、ここで、ＮＫ細胞は、Ｃｌ、Ｃ２又はＢｗ４を含む１つ以上のＨＬＡアレルを発現するように形質転換される。前述の態様の改変されたＮＫ細胞又は細胞株において、ＮＫ細胞は、ＣＩ、Ｃ２及びＢｗ４を発現するように形質転換され得る。前述のいずれかの態様の改変されたＮＫ細胞又は細胞株において、ＮＫ細胞は、２ＤＳ１／２、２ＤＳ３／５、３ＤＳ１又は２ＤＳ４を含む１つ以上の可変的に遺伝する活性型ＫＩＲを発現するように更に形質転換され得る。前述のいずれかの態様の改変されたＮＫ細胞又は細胞株において、ＮＫ細胞は、２ＤＳ１／２、２ＤＳ３／５、３ＤＳ１又は２ＤＳ４を含む２つ若しくは３つ又はそれを超える可変的に遺伝する活性型ＫＩＲを発現するように更に形質転換され得る。
【0013】
それを必要としているレシピエント対象への治療的投与に使用することができる万能ドナーＮＫ細胞に関する方法及び組成物も開示される。一態様において、本明細書には、万能ドナーＮＫ細胞を、それを必要としているレシピエント対象への治療的投与のために選択する方法が開示され、この方法は、（ａ）ＮＫ細胞ドナーからの候補ＮＫ細胞のＨＬＡ遺伝子型を入手するか又は入手していることであって、ＨＬＡ遺伝子型は、ＨＬＡ Ｃｌ、Ｃ２及びＢｗ４アレルの存在又は非存在を示し、且つそれにより１つ以上の可変的に遺伝する抑制型ＫＩＲ ２ＤＬ Ｉ、２ＤＬ２、２ＤＬ３及び３ＤＬ１の存在を示す、入手するか又は入手していること、及び／又は（ｂ）候補ＮＫ細胞のＫＩＲ遺伝子型を入手するか又は入手していることであって、ＫＩＲ遺伝子型は、２ＤＳ１／２、２ＤＳ３／５、３ＤＳ１及び２ＤＳ４からなる群から選択される活性型ＫＩＲの存在又は非存在を示す、入手するか又は入手していること、及び（ｃ）（ｉ）ＨＬＡ遺伝子型が少なくとも２つのＨＬＡアレルＨＬＡ Ｃｌ、Ｃ２及びＢｗ４の存在を示すとき、及び／又は（ｉｉ）ＫＩＲ遺伝子型が少なくとも３つの活性型ＫＩＲ ２ＤＳｌ／２、２ＤＳ３／５、３ＤＳ１及び／又は２ＤＳ４の存在を示すとき、その候補ＮＫ細胞を治療的投与のための万能ドナーＮＫ細胞として選択することを含む。
【0014】
本明細書には、ＮＫ細胞の供給源を、それを必要としている対象への治療的投与を提供するために、ドナーからの候補ＮＫ細胞集団をスクリーニングして、集団中における万能ＮＫドナー細胞を同定する方法も開示され、この方法は、（ａ）ＮＫ細胞ドナーからの候補ＮＫ細胞のＨＬＡ遺伝子型を入手するか又は入手していることであって、ＨＬＡ遺伝子型は、ＨＬＡ Ｃｌ、Ｃ２及びＢｗ４アレルの存在又は非存在を示し、且つそれにより１つ以上の可変的に遺伝する抑制型ＫＩＲ ２ＤＬ１、２ＤＬ２又は２ＤＬ３及び／又は３ＤＬ１の存在を示す、入手するか又は入手していること、及び／又は（ｂ）候補ＮＫ細胞のＫＩＲ遺伝子型を入手するか又は入手していることであって、ＫＩＲ遺伝子型は、２ＤＳ１／２、２ＤＳ３／５、３ＤＳ１及び２ＤＳ４からなる群から選択される活性型ＫＩＲの存在又は非存在を示す、入手するか又は入手していることを含み；ここで、（ｉ）少なくとも２つのＨＬＡアレルＨＬＡ ＣＩ、Ｃ２及びＢｗ４を含み、従って可変的に遺伝する抑制型ＫＩＲ ２ＤＬ１、２ＤＬ２又は２ＤＬ３及び／又は３ＤＬ１の少なくとも１つを含む候補ＮＫ細胞、及び／又は（ｉｉ）少なくとも３つの活性型ＫＩＲ ２ＤＳ１／２、２ＤＳ３／５、３ＤＳ１及び／又は２ＤＳ４を含む候補ＮＫ細胞は、万能ＮＫ細胞である。
【0015】
別の態様において、本明細書には、前述のいずれかの態様のＮＫ細胞集団をスクリーニングする方法又はレシピエント対象への治療的投与のための万能ドナーＮＫ細胞を選択する方法が開示され、ここで、選択された万能ドナーＮＫ細胞は、少なくとも５０％～８５％のレシピエント対象について組織学的に最適化される。
【0016】
本明細書には、前述のいずれかの態様のＮＫ細胞集団をスクリーニングする方法又はレシピエント対象への治療的投与のための万能ドナーＮＫ細胞を選択する方法であって、候補ＮＫ細胞のＣＭＶ血清反応陽性状態を入手するか又は入手していることであって、ＮＫ細胞ドナーがＣＭＶについて血清反応陽性であるとき又はＮＫ細胞ドナーからのＮＫ細胞がＮＫＧ２Ｃ発現の参照レベルと比較して高いＮＫＧ２Ｃ発現を示すとき、そのＮＫ候補ＮＫ細胞が更に選択される、入手するか又は入手していることを更に含む方法も開示される。
【0017】
別の態様において、前述のいずれかの態様の方法によって選択又はスクリーニングされた単離された万能ドナーＮＫ細胞も開示される。前述のいずれかの態様のＮＫ細胞は、ＮＫＧ２Ｃ＋であり得る。本明細書には、前述のいずれかの態様の単離された万能ＮＫ細胞又は細胞も開示され、ここで、１つ又は複数のＮＫ細胞は、１つ又は複数の万能ドナーＮＫ細胞をインビトロでＩＬ－２１の存在下においてインキュベートすることによって活性化される。一態様において、インビトロ活性化に使用されるＩＬ－２１は、可溶性ＩＬ－２１、ＩＬ－２１発現フィーダ細胞（ＦＣ２１）、１Ｌ－２１細胞膜粒子（ＰＭ２１）、ＩＬ－２１エキソソーム（ＥＸ２１）又はこれらの任意の組み合わせを含む。
【0018】
別の態様において、本明細書には、それを必要としている対象の癌、転移又は感染症を治療、予防、阻害及び／又は低減する方法であって、前述のいずれかの態様の方法によって選択又はスクリーニングされたドナーＮＫ細胞を対象に投与すること；又は前述のいずれかの態様の単離された万能ＮＫ細胞若しくは細胞を対象に投与することを含む方法が開示される。例えば、一態様において、本明細書には、対象の癌又は感染症を治療する方法であって、（ａ）ＮＫ細胞ドナーからの候補ＮＫ細胞のＨＬＡ遺伝子型を入手するか又は入手していることであって、ＨＬＡ遺伝子型は、ＨＬＡ Ｃｌ、Ｃ２及びＢｗ４アレルの存在又は非存在を示し、且つそれにより１つ以上の可変的に遺伝する抑制型ＫＩＲ ２ＤＬ１、２ＤＬ２、２ＤＬ３及び３ＤＬ１の存在を示す、入手するか又は入手していること；（ｂ）候補ＮＫ細胞のＫＩＲ遺伝子型を入手するか又は入手していることであって、ＫＩＲ遺伝子型は、２ＤＳ１／２、２ＤＳ３／５、３ＤＳ１及び２ＤＳ４からなる群から選択される活性型ＫＩＲの存在又は非存在を示す、入手するか又は入手していること；及び（ｃ）（ｉ）ＨＬＡ遺伝子型が少なくとも２つのＨＬＡアレルＨＬＡ ＣＩ、Ｃ２及びＢｗ４の存在を示すとき；及び（ｉｉ）ＫＩＲ遺伝子型が少なくとも３つの活性型ＫＩＲ ２ＤＳ１／２、２ＤＳ３／５、３ＤＳ１及び／又は２ＤＳ４の存在を示すとき、その候補ＮＫ細胞を治療的投与のための万能ドナーＮＫ細胞として選択することを含む方法が開示される。
【0019】
別の態様において、本明細書には、前述のいずれかの態様の癌又は感染症を治療する方法が開示され、ここで、選択された万能ドナーＮＫ細胞は、少なくとも５０％～８５％のレシピエント対象について組織学的に最適化される。
【0020】
本明細書には、前述のいずれかの態様の癌又は感染症を治療する方法であって、候補ＮＫ細胞のＣＭＶ血清反応陽性状態を入手するか又は入手していることを更に含み；ここで、ＮＫ細胞ドナーがＣＭＶについて血清反応陽性であるとき又はＮＫ細胞ドナーからのＮＫ細胞がＮＫＧ２Ｃ発現の参照レベルと比較して高いＮＫＧ２Ｃ発現を示すとき、そのＮＫ候補ＮＫ細胞が更に選択される、方法も開示される。
【0021】
別の態様において、本明細書には、前述のいずれかの態様の癌又は感染症を治療する方法であって、選択された万能ドナーＮＫ細胞をインビトロでＩＬ－２１の存在下においてインキュベートすることを更に含む方法が開示される。別の態様において、インビトロ培養に使用されるＩＬ－２１は、可溶性ＩＬ－２１、ＩＬ－２１発現フィーダ細胞（ＦＣ２１）、ＩＬ－２１細胞膜粒子（ＰＭ２１）若しくはＩＬ－２１エキソソーム（ＥＸ２１）又はこれらの任意の組み合わせを含む。
【0022】
本明細書には、万能ドナーＮＫ細胞集団を、それを必要としている対象への治療的投与のために調製する方法であって、（ａ）ＮＫ細胞ドナーから初期ＮＫ細胞集団を入手することであって、ＮＫ細胞ドナーは、（ｉ）可変的に遺伝する活性型ＫＩＲ ２ＤＳ１／２、２ＤＳ３／５、３ＤＳ１及び／又は２ＤＳ４の少なくとも２つ；及び（ｉｉ）Ｃｌ、Ｃ２及びＢｗ４アレルを含む少なくとも１つ、２つ又は３つ全てのＨＬＡアレルの存在を示す遺伝子型を有すること；及び（ｂ）初期ＮＫ細胞集団を拡大するのに十分な時間にわたって且つ条件下において初期ＮＫ細胞集団をインビトロでＩＬ－２１に曝露することを含む方法も開示される。
【0023】
別の態様において、本明細書には、前述のいずれかの態様のＮＫ細胞の集団が開示され、ここで、単離されたＮＫ細胞は、ＮＫＧ２Ｃ＋又はＣＭＶ血清反応陽性である。ＮＫ細胞集団を調製する方法であり、ここで、初期ＮＫ細胞集団をＩＬ－２１に曝露することは、ＮＫ細胞を可溶性ＩＬ－２１、ＩＬ－２１発現フィーダ細胞（ＦＣ２１）、ＩＬ－２１細胞膜粒子（ＰＭ２１）及びＩＬ－２１エキソソーム（ＥＸ２１）の少なくとも１つとインビトロで接触させることを含む。例えば、本明細書には、ＮＫ細胞集団を調製する方法が開示され、ここで、フィーダ細胞（ＦＣ２１）、ＩＬ－２１細胞膜粒子（ＰＭ２１）及びＩＬ－２１エキソソーム（ＥＸ２１）に存在するＩＬ－２１は、（ａ）ＩＬ－２１のための改変された膜結合形態、（ｂ）ＦＣ２１、ＰＭ２１又はＥＸ２１の表面に化学的にコンジュゲートされたＩＬ－２１、又は（ｃ）又はＮＫ細胞と相互接触するように混合された溶液中におけるＩＬ－２１から選択される形態のＩＬ－２１を含む。一態様において、ＦＣ２１、ＰＭ２１又はＥＸ２１のいずれか１つは、（ａ）ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－１５、ＩＬ－７、ＵＬＢＰ、ＭＩＣＡ、ＯＸ４ＯＬ、ＮＫＧ２Ｄアゴニスト、デルタ－１、ノッチリガンド、ＮＫｐ４６アゴニスト、ＮＫｐ４４アゴニスト、ＮＫｐ３０アゴニスト、他のＮＣＲアゴニスト、ＣＤ１６アゴニストから選択されるＮＫ刺激性リガンド；又は（ｂ）膜結合型ＴＧＦ－βを更に含む。
【0024】
一態様において、本明細書には、前述のいずれかの態様の方法によって調製される万能ドナーＮＫ細胞集団が開示される。一態様において、ＮＫ細胞集団は、ＩＦＮｙ又はＴＮＦａの抗腫瘍性サイトカインを産生及び分泌する増加した能力によって特徴付けられる。一態様において、拡大されたＮＫ細胞集団は、ＮＫＧ２Ｄの増加した発現、ＣＤ１６の増加した発現、ＮＫｐ４６の増加した発現、増加したＫＩＲ発現によって特徴付けられる。
【0025】
本明細書には、改変されたＮＫ細胞又は細胞株も開示され、ここで、ＮＫ細胞は、ＣＩ、Ｃ２又はＢｗ４を含む１つ、２つ以上のＩ ＩＬＡアレルを発現するように形質転換されており（例えば、Ｃｌ、Ｃ２及びＢｗ４を発現するＮＫ細胞又は細胞株）、及び／又は２ＤＳ１／２、２ＤＳ３／５、３ＤＳ Ｉ又は２ＤＳ４を含む１、２、３、４、５つ又はそれを超える可変的に遺伝する活性型ＫＩＲを発現するように形質転換されている。
【0026】
本発明の一態様には、治療的投与のための万能ドナーＮＫ細胞を選択する方法が含まれ、この方法は、Ｃ１、Ｃ２及びＢＷ３アレルの少なくとも１つを含むＨＬＡ遺伝子型を有するＮＫドナー細胞をＨＬＡドナー細胞と同定することであって、それにより２ＤＬ１、２ＤＬ２、２ＤＬ３及び３ＤＬ１の少なくとも１つを含む１つ以上の可変的に遺伝する抑制型ＫＩＲの存在を示す、同定すること、ＨＬＡドナー細胞に存在する活性型ＫＩＲの数を同定すること、ＨＬＡドナー細胞に存在する活性型ＫＩＲの数が活性化閾値を超えることに応答して、ＨＬＡドナー細胞をＫＩＲドナー細胞と同定すること、ＫＩＲドナー細胞のＮＫＧ２Ｃ発現状態を同定すること、及びＫＩＲドナー細胞がＮＫＧ２Ｃ陽性であることに応答して、そのＫＩＲドナー細胞を治療用ドナー細胞と同定することを含む。
【0027】
本発明の別の態様には、治療的投与のための万能ドナーＮＫ細胞を選択及び改変する方法が含まれ、この方法は、Ｃ１、Ｃ２及びＢＷ３アレルの少なくとも１つを含むＨＬＡ遺伝子型を発現するようにＮＫドナー細胞を改変してＨＬＡ ＮＫ細胞を作成すること、ＨＬＡ ＮＫ細胞のＫＩＲ遺伝子型を入手すること、少なくとも３つの活性型ＫＩＲを発現するようにＨＬＡ ＮＫ細胞を形質転換することであって、３つの活性型ＫＩＲは、２ＤＳ１／２、２ＤＳ３／５、３ＤＳ１及び２ＤＳ４の少なくとも１つを含む、形質転換すること、ＮＫドナー細胞のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）血清反応陽性状態を同定すること、及びＫＩＲドナー細胞がＣＭＶ血清反応陽性であることに応答して、ＫＩＲドナー細胞を治療用ドナー細胞として利用することを含む。
【0028】
本発明の更に別の態様は、治療的投与のための万能ドナーＮＫ細胞を選択、改変及び調製する方法が含まれ、この方法は、ＮＫドナー細胞が、ＨＬＡドナー細胞としてＣ１、Ｃ２及びＢＷ３アレルの少なくとも１つを含むＨＬＡ遺伝子型を有するかどうかを決定することであって、それにより２ＤＬ１、２ＤＬ２、２ＤＬ３及び３ＤＬ１の少なくとも１つを含む１つ以上の可変的に遺伝する抑制型ＫＩＲの存在を示す、決定すること、ＮＫドナー細胞が、Ｃ１、Ｃ２及びＢＷ３アレルの少なくとも１つを含むＨＬＡ遺伝子型を有することに応答して、ＮＫドナー細胞をＨＬＡ ＮＫ細胞として同定すること、ＨＬＡドナー細胞に存在する活性型ＫＩＲの数を同定すること、ＨＬＡドナー細胞に存在する活性型ＫＩＲの数が活性化閾値を超えることに応答して、ＨＬＡドナー細胞をＫＩＲドナー細胞と同定すること、ＫＩＲドナー細胞のＮＫＧ２Ｃ発現状態を同定すること、ＫＩＲドナー細胞がＮＫＧ２Ｃ陽性であることに応答して、ＫＩＲドナー細胞を治療用ドナー細胞と同定すること、及び膜結合型ＩＬ－２１、４－１ＢＢＬ及びＩＬ－２の少なくとも１つを発現する照射Ｋ５６２で第１のフィード期間にわたって治療用ドナー細胞を刺激することを含む。
【0029】
本明細書には、ドナーからＮＫ細胞コレクションを調製する方法であって、（ｉ）１つ以上のドナーから、（ａ）ＨＬＡ Ｃ１、Ｃ２及びＢｗ４アレルの存在又は非存在を示し、それにより１つ以上の可変的に遺伝する抑制型ＫＩＲ ２ＤＬ１、２ＤＬ２、２ＤＬ３及び３ＤＬ１の存在を示すＨＬＡ遺伝子型；及び（ｂ）２ＤＳ１／２、２ＤＳ３／５、３ＤＳ１及び２ＤＳ４からなる群から選択される活性型ＫＩＲの存在又は非存在を示すＫＩＲ遺伝子型を決定すること；（ｉｉ）（ａ）ＨＬＡ遺伝子型が少なくとも２つのＨＬＡアレルＨＬＡ Ｃ１、Ｃ２及びＢｗ４の存在を示すとき；及び（ｂ）ＫＩＲ遺伝子型が少なくとも３つの活性型ＫＩＲ ２ＤＳ１／２、２ＤＳ３／５、３ＤＳ１及び／又は２ＤＳ４の存在を示すとき、前記ドナーからＮＫ細胞の治療的投与のための万能ドナーＮＫを選択すること；及び（ｉｉｉ）前記万能ドナーのＮＫ細胞のエキソビボバッチから前記ＮＫ細胞コレクションを調製すること、を含む方法も開示される。本方法において、治療的投与のための万能ドナーＮＫ細胞としての選択は、ＮＫＧ２Ｃ＋ ＮＫ細胞の存在を示すＣＭＶ血清反応陽性プロファイルを有するドナーを選択することを更に含み得る。
【0030】
別の態様において、本明細書には、対象の癌又は感染症を治療するための医薬の製造における、前述の態様のいずれかの方法によって選択されたドナーＮＫ細胞、前述のいずれかの態様の方法によってスクリーニングされたドナーＮＫ細胞、前述のいずれかの態様の単離された万能ＮＫ細胞、前述のいずれかの態様の万能ドナーＮＫ細胞の集団、前述のいずれかの態様の改変されたＮＫ細胞又は細胞株のいずれか１つ以上の使用が開示される。
【0031】
別の態様において、本明細書には、対象の癌又は感染症を治療するための医薬の製造におけるＮＫ細胞集団の使用が開示され、ここで、ＮＫ細胞集団は、（ｉ）２ＤＬ１、２ＤＬ２、２ＤＬ３及び３ＤＬ１から選択される１つ以上の可変的に遺伝する抑制型ＫＩＲの存在を示す、ＨＬＡ Ｃ１、Ｃ２及びＢｗ４から選択される少なくとも２つのＨＬＡアレルを有するＨＬＡ遺伝子型；及び（ｉｉ）２ＤＳ１／２、２ＤＳ３／５、３ＤＳ１及び２ＤＳ４からなる群から選択される少なくとも３つの活性型ＫＩＲを含むＫＩＲ遺伝子型を含む。前述のいずれかの態様の使用において、ＮＫ細胞又はＮＫ細胞集団は、少なくとも５０％～８５％のレシピエント対象について組織学的に最適化され得る。前述のいずれかの態様の使用において、ＮＫ細胞又はＮＫ細胞集団のドナーは、ＣＭＶについて血清反応陽性であり得るか、又はＮＫ細胞若しくはＮＫ細胞集団は、ＮＫＧ２Ｃ発現の参照レベルと比較して高いＮＫＧ２Ｃ発現を有し得る。前述のいずれかの態様の使用は、治療における使用前に、ＮＫ細胞又はＮＫ細胞集団をインビトロでＩＬ－２１の存在下において培養することを含み得る。前述のいずれかの態様の使用において、インビトロ培養におけるＩＬ－２１は、ＩＬ－２１、ＩＬ－２１発現フィーダ細胞（ＦＣ２１）、ＩＬ－２１細胞膜粒子（ＰＭ２１）又はＩＬ－２１エキソソームを含み得る。前述のいずれかの態様の使用において、癌は、血液癌、肺癌、食道癌、胃癌、膵癌、肝癌、胆道癌、結腸癌、直腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、腎癌、膀胱癌、精巣癌、前立腺癌、喉頭癌、甲状腺癌、脳癌又は皮膚癌から選択され得る。感染症は、ウイルス、細菌又は真菌から選択される病原体によって引き起こされるものであり得る。前述のいずれかの態様の使用において、ＮＫ細胞若しくはＮＫ細胞集団及び／又はＮＫ細胞若しくはＮＫ細胞集団のドナーは、前記ＨＬＡ遺伝子型及び前記ＫＩＲ遺伝子型が決定されている２つ以上の細胞、集団及び／又はドナーを含む集合から選択され得る。
【0032】
本開示が関連する技術分野の当業者には、添付の図面を参照しながら以下の本発明の説明を考察すると、本開示の前述の及び他の特徴及び利点が明らかになるであろう。特に記載がない限り、本図面全体を通して類似の参照符号は、類似の部分を指す。
【図面の簡単な説明】
【0033】
【図1】本開示の一実施形態に係る、活性型ＫＩＲ数が増加すると、標的細胞の溶解の増加に結び付くことを示す。
【図2】本開示の一実施形態に係る、ＫＩＲ遺伝子型の集団分布を示す代表的なデータを含む表を示す。
【図3】本開示の一実施形態に係る、万能ドナーＮＫ細胞を、それを必要としているレシピエント対象への治療的投与のために選択する方法を示す。
【図4】本開示の一実施形態に係る、様々なアレル、ＫＩＲ及び／又は受容体をコード及び／又は発現するようにＮＫ細胞を改変する方法を示す。
【図5】本開示の一実施形態に係る、万能ドナーＮＫ細胞を、それを必要としているレシピエント対象への治療的投与のために採取して調製する方法を示す。
【図5A】ＨＬＡ－Ｃ１、Ｃ２、Ｂｗ４スペクトルにわたるドナーのＫＩＲタイピング（上）によるＫＩＲ遺伝子の存在（灰色）又は非存在（黒色）の評価（下）の概略図を示す。
【図5B】ＮＫ細胞上のＫＩＲ発現を決定するためのフローサイトメトリーによるＰＢＭＣ及びドナー対応ＮＫ細胞の分析を示す。２ＤＬ２／３、２ＤＬ１及び３ＤＬ１の発現を、それぞれＫＩＲ特異的抗体ＲＥＡ１４７／ＣＨ－Ｌ、１４３２１１及びＤＸ９を用いて評価した。個別のドナーについての各ＫＩＲを発現するＮＫ細胞の割合を示す。
【図6】本開示の一実施形態に係る、万能ドナーＮＫ細胞を、それを必要としている第１の疾患タイプを有するレシピエント対象への治療的投与のために採取して調製する方法を示す。
【図7】本開示の一実施形態に係る、第１の疾患タイプを有するレシピエントを同定し、万能ドナーＮＫ細胞を使用して治療を提供する方法を示す。
【図8】フローサイトメトリーを利用して、全てのＣＭＶ＋ドナーにＮＫＧ２Ｃを発現するＮＫ細胞があること及び拡大後にＮＫＧ２Ｃ発現が増加することを示す。
【図9】ｍＲＮＡレベル測定値を利用して、拡大後にＮＫＧ２Ｃ発現が増加することを示す。
【発明を実施するための形態】
【0034】
当業者は、図中の要素が単純さ及び明瞭さのために示され、必ずしも縮尺どおりには描かれていないことを理解するであろう。例えば、本開示の実施形態の理解が向上することを促進するように、図中の一部の要素の寸法が他の要素と比べて誇張されていることもある。
【0035】
装置及び方法の構成要素は、本明細書における説明の利益を得る当業者に容易に明らかであろう詳細によって本開示が不明瞭となることがないように、図面中では、適切な場合には従来の記号によって表し、本開示の実施形態の理解に関わるその特定の詳細のみを示している。
【0036】
ここで、図を参照するが、図中に示される類似の符号が付された特徴は、特に注記しない限り、類似の要素を指す。本開示は、概して、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のドナー選択方法に関し、より具体的には、万能ドナー細胞を、それを必要としているレシピエントへの治療的投与のために選択する方法を提供することに関する。
【0037】
本開示では、幾つもの用語が参照されることになり、それらは、以下の意味を有すると定義されるものとする。
「任意選択の（Ｏｐｔｉｏｎａｌ）」又は「任意選択で（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」とは、続いて記載される事象又は状況が起こることも又は起こらないこともあり、前記事象又は状況が起こる場合と、それが起こらない場合とがその記載に包含されることを意味する。「プライマー」は、ある種の酵素的操作を支援する能力のあり、且つ酵素的操作が起こり得るようにして標的核酸とハイブリダイズすることができる一部のプローブである。プライマーは、酵素的操作に干渉しない当技術分野で利用可能なヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体若しくは類似体の任意の組み合わせで作られたものであり得る。
「任意選択の（Ｏｐｔｉｏｎａｌ）」又は「任意選択で（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」とは、続いて記載される事象又は状況が起こることも又は起こらないこともあり、前記事象又は状況が起こる場合と、それが起こらない場合とがその記載に包含されることを意味する。「プライマー」は、ある種の酵素的操作を支援する能力のあり、且つ酵素的操作が起こり得るようにして標的核酸とハイブリダイズすることができる一部のプローブである。プライマーは、酵素的操作に干渉しない当技術分野で利用可能なヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体若しくは類似体の任意の組み合わせで作られたものであり得る。
【0038】
「プローブ」は、標的核酸と典型的には配列特異的に、例えばハイブリダイゼーションを通して相互作用する能力を有する分子である。核酸のハイブリダイゼーションについては、当技術分野においてよく理解されており、本明細書で考察される。典型的には、プローブは、当技術分野で利用可能なヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体若しくは類似体の任意の組み合わせで作られたものであり得る。
【0039】
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指して同義的に使用される。
用語「配列同一性」は、本明細書で使用されるとき、実質的に等しい長さの２つの配列間における同一性の程度の定量的尺度を指し示す。核酸又はアミノ酸配列に関わらず、２つの配列のパーセント同一性は、２つのアラインメントした配列間における完全な一致の数を短い方の配列の長さで除し、それに１００を乗じたものである。
用語「配列同一性」は、本明細書で使用されるとき、実質的に等しい長さの２つの配列間における同一性の程度の定量的尺度を指し示す。核酸又はアミノ酸配列に関わらず、２つの配列のパーセント同一性は、２つのアラインメントした配列間における完全な一致の数を短い方の配列の長さで除し、それに１００を乗じたものである。
【0040】
核酸配列の近似アラインメントは、スミス及びウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ）著、アドバンシズ・イン・アプライド・マセマティクス（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ）、第２巻、ｐ．４８２～４８９、１９８１年の局所的相同性アルゴリズムによって提供される。このアルゴリズムは、デイホフ（Ｄａｙｈｏｆｆ）著、「タンパク質配列及び構造アトラス（Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）」、Ｍ．０．デイホフ（Ｍ．０．Ｄａｙｈｏｆｆ）編、第５増補版、第３巻、ｐ．３５３～３５８、国立生物医学研究財団（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）、米国ワシントンＤ．Ｃ．（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）によって開発され、且つグリブスコフ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ）著、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）、第１４巻、第６号、ｐ．６７４５～６７６３、１９８６年によって標準化されたスコアリング行列を用いることにより、アミノ酸配列に適用し得る。配列のパーセント同一性を決定するためのこのアルゴリズムの例示的実装が、ジェネティクス・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）（ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．））によって「ベストフィット（ＢｅｓｔＦｉｔ）」ユーティリティアプリケーションに提供されている。配列間のパーセント同一性又は類似性を計算する他の好適なプログラムは、当技術分野において概して公知であり、例えば、別のアラインメントプログラムは、デフォルトパラメータで使用するブラスト（ＢＬＡＳＴ）である。例えば、ブラストＮ（ＢＬＡＳＴＮ）及びブラストＰ（ＢＬＡＳＴＰ）は、以下のデフォルトパラメータを用いて使用することができる：遺伝子コード － 標準；フィルタ － なし；鎖両方；カットオフ＝６０；期待値１０；行列ＢＬＯＳＵＭ６２；記述５０配列；ソート順＝ＨＩＧＨＳＣＯＲＥ；データベース＝非冗長、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ジェンバンクＣＤＳトランスレーションズ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ）＋スイスプロテイン（Ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔｅｉｎ）＋Ｓｐアップデート（Ｓｐｕｐｄａｔｅ）＋Ｐ１Ｒ。これらのプログラムの詳細については、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）のウェブサイトを参照することができる。一般に、置換は保存的アミノ酸置換であり：グループ１：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン；グループ２：セリン、システイン、スレオニン及びメチオニン；グループ３：プロリン；グループ４：フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン；グループ５：アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン及びグルタミンのメンバー内での交換に限定される。
【0041】
核酸及びアミノ酸配列同一性の決定技法は、当技術分野において公知である。典型的には、かかる技法は、遺伝子のｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定すること、及び／又はそれによりコードされるアミノ酸配列を決定すること、及びその配列を第２のヌクレオチド又はアミノ酸配列と比較することを含む。ゲノム配列もこのようにして決定し、比較することができる。一般に、同一性とは、２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の、それぞれヌクレオチドとヌクレオチドとの、又はアミノ酸とアミノ酸との、正確な対応を指す。２つ以上の配列（ポリヌクレオチド又はアミノ酸）は、それらのパーセント同一性を決定することによって比較し得る。
【0042】
上述の細胞及び方法には、本発明の範囲から逸脱することなく様々な変更が行われる可能性があるため、上記の説明及び以下に提供する例に含まれる事項は、全て例示であり、限定する意味はないと解釈されるものとすることが意図される。
【0043】
「増加」は、より程度の高い症状、疾患、組成物、状態又は活性をもたらす任意の変化を指し得る。増加は、状態、症状、活性、組成物の統計的に有意な程度の任意の個別値、中央値又は平均値の増加であり得る。従って、増加は、その増加が統計的に有意である限りは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は１００％の増加であり得る。
【0044】
「減少」は、より程度の低い症状、疾患、組成物、条件又は活性をもたらす任意の変化を指し得る。ある物質は、その物質がある場合の遺伝子産物の遺伝的アウトプットが、その物質がない場合の遺伝子産物のアウトプットと比べて少ないとき、遺伝子の遺伝的アウトプットを減少させることも理解される。例えば、減少は、症状が以前に観察されたものよりも軽くなるような障害の症状の変化でもあり得る。減少は、条件、症状、活性、組成物の統計的に有意な程度の任意の個別値、中央値又は平均値の減少であり得る。従って、減少は、その減少が統計的に有意である限りは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は１００％の減少であり得る。
【0045】
「阻害する」、「阻害している」及び「阻害」は、活性、反応、状態、疾患又は他の生物学的パラメータの減少を意味する。これには、限定はされないが、活性、反応、条件又は疾患の完全な除去が含まれ得る。これには、例えば、天然又は対照レベルと比較したときの活性、反応、条件又は疾患の１０％の低減も含まれ得る。従って、低減は、天然又は対照レベルと比較したときの１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％又は任意の中間的な程度の低減であり得る。
【0046】
「低減する」又は「低減している」若しくは「低減」など、この単語の他の語形は、事象又は特徴（例えば、腫瘍成長）が下がることを意味する。これは、典型的には何らかの標準値又は予想値に対するものであることが理解され、換言すれば、これは相対的であり、しかし常に標準値又は相対値が参照されるとは限らないものである。例えば、「腫瘍成長を低減する」とは、標準又は対照と比べて腫瘍の成長速度を低減することを意味する。
【0047】
「予防する」又は「予防している」若しくは「予防」など、この単語の他の語形は、特定の事象又は特徴を止めること、特定の事象又は特徴の発達又は進行を安定化させる又は遅らせること又は特定の事象又は特徴が起こる可能性を最小限に抑えることを意味する。予防するとは、典型的には、例えば低減すると比べると絶対性が高いため、対照と比較する必要はない。本明細書で使用されるとき、何らかのものが低減されるが、予防されない可能性があり、しかし低減される何らかのものが予防される可能性もある。同様に、何らかのものが予防されるが、低減されない可能性があり、しかし予防される何らかのものが低減される可能性もある。低減又は予防するが使用される場合、特に具体的に指示されない限り、他の単語の使用も明示的に開示されることが理解される。
【0048】
用語「対象」は、投与又は治療の標的である任意の個体を指す。対象は、脊椎動物、例えば哺乳類であり得る。一態様において、対象は、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ亜科動物、ウマ科動物、ブタ、イヌ科動物又はネコ科動物であり得る。対象は、モルモット、ラット、ハムスター、ウサギ、マウス又はモグラでもあり得る。従って、対象は、ヒト又は動物患者であり得る。用語「患者」は、臨床医、例えば医師の治療下にある対象を指す。
【0049】
用語「治療上有効（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ）」は、使用される組成物の量が、疾患又は障害の１つ以上の原因又は症状を改善するのに十分な分量であることを指す。かかる改善には、低下又は変化さえあれば十分であり、必ずしも消失が必要なわけではない。
【0050】
用語「治療」は、疾患、病態又は障害の治癒、改善、安定化又は予防を目的とした患者の医学的管理を指す。この用語には、積極的治療、即ち、特に疾患、病態又は障害の好転に向けて行われる治療が含まれ、原因治療、即ち関連する疾患、病態又は障害の原因の除去に向けて行われる治療も含まれる。加えて、この用語には、姑息的治療、即ち、疾患、病態又は障害の治癒というよりむしろ、症状の軽減のために計画される治療；予防的治療、即ち、関連する疾患、病態又は障害の発生を最小限に抑える又は部分的若しくは完全に抑制するために行われる治療；及び支持的治療、即ち、関連する疾患、病態又は障害の好転に向けて行われる別の特異的療法を補足するために用いられる治療が含まれる。
【0051】
対象への「投与」は、対象に薬剤を導入又は送達する任意の経路を含む。投与は、経口、局所、静脈内、皮下、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経真皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、筋肉内、関節内、非経口、細動脈内、皮内、脳室内、頭蓋内、腹腔内、病巣内、鼻腔内、直腸、膣、吸入による、植え込まれたリザーバ経由、非経口（例えば、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、腹腔内、肝内、病巣内及び頭蓋内注射法又は輸注（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）法）などを含めた、任意の好適な経路によって行うことができる。「並行投与（Ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」、「組み合わせでの投与」、「同時投与（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」又は「同時に投与される」は、本明細書で使用されるとき、化合物が時間的に同じ時点において又は本質的に互いの直後に投与されることを意味する。後者の場合、２つの化合物は、それらの化合物が時間的に同じ時点で投与されたときに実現する結果と区別できない結果が観察されるような十分に近い時点で投与される。「全身投与」は、例えば循環系又はリンパ系への入口から、対象の体の広い範囲（例えば、体の５０％を超える範囲）に薬剤が導入又は送達される経路を経て対象に薬剤を導入又は送達することを指す。対照的に、「局所投与」は、投与箇所の範囲又はそこに直接隣接する範囲へと薬剤が導入又は送達されるが、その薬剤が治療的に意味のある量で全身的に導入されることはない経路を経る対象への薬剤の導入又は送達を指す。例えば、局所投与された薬剤は、投与箇所の局所的な近傍には容易に検出可能であるが、対象の体の離れた部分では検出不能であるか又は無視できるほどの量のみ検出できる。投与には、自己投与及び他者による投与が含まれる。
【0052】
「治療する」、「治療すること」、「治療」及びその文法的変化形は、本明細書で使用されるとき、１つ以上の疾患若しくは病態、疾患若しくは病態の症状又は疾患若しくは病態の根底にある原因を部分的又は完全に予防する、遅延させる、根治する、癒す、改善する、軽減する、変化させる、修復する、改良する、好転させる、安定化させる、緩和する、及び／又はその強度若しくは頻度を低減することを意図した又はそれを目的とする組成物の投与を含む。本発明に係る治療は、防御的に、予防的に、姑息的に又は修復的に適用され得る。予防的治療は、発症する前（例えば、癌の明らかな徴候が出る前に）、早期発症時（例えば、癌の初期徴候及び症状が出たとき）又は癌の発生が確定した後に対象に投与される。予防的投与は、疾患又は感染症の症状が現れる前の１日間（数日間）から数年間にわたって行われ得る。
【0053】
Ｉ．万能ドナーを選択する
ＮＫ細胞は、それが自己ＨＬＡクラスＩ分子に対する抑制型キラー免疫グロブリン受容体（ＫＩＲ）を発現するとき、ライセンス化される（亢進した殺傷能力を獲得する）。これによってＮＫ細胞は、「自己」を認識することが可能になり、自己細胞を殺傷から免れさせる。従って、自己ＨＬＡクラスＩ分子を欠いている標的は、ライセンス化されたＮＫ細胞による認識を誘発する可能性が高くなる。ＮＫアロ反応性に関連することが公知の抑制型ＫＩＲ遺伝子は、（ｉ）ＨＬＡ－Ｃグループ２アレルに結合する２ＤＬ１、（ｉｉ）ＨＬＡ－Ｃグループ１アレルに結合する２ＤＬ２及び２ＤＬ３、（ｉｉｉ）及びＨＬＡ－Ｂ Ｂｗ４アレルに結合する３ＤＬ１である。リガンド欠損モデルによれば、対応するリガンドがレシピエントに存在せず、且つドナーに存在する場合に限り、抑制型ＫＩＲ遺伝子を発現する各ＮＫ細胞にアロ反応性があることになる － 例えば、グループＣｌアレルを保有するドナーは、いずれもグループＣｌアレルを欠く任意の個体にアロ反応性を示す。従って、ＣＩ、Ｃ２及びＢｗ４ファミリのＨＬＡを保有するドナーは、このモデルによれば、ＣＩ、又はＣ２、又はＢｗ４を欠く任意のレシピエントに対してアロ反応性を示すと予測される。
ＮＫ細胞は、それが自己ＨＬＡクラスＩ分子に対する抑制型キラー免疫グロブリン受容体（ＫＩＲ）を発現するとき、ライセンス化される（亢進した殺傷能力を獲得する）。これによってＮＫ細胞は、「自己」を認識することが可能になり、自己細胞を殺傷から免れさせる。従って、自己ＨＬＡクラスＩ分子を欠いている標的は、ライセンス化されたＮＫ細胞による認識を誘発する可能性が高くなる。ＮＫアロ反応性に関連することが公知の抑制型ＫＩＲ遺伝子は、（ｉ）ＨＬＡ－Ｃグループ２アレルに結合する２ＤＬ１、（ｉｉ）ＨＬＡ－Ｃグループ１アレルに結合する２ＤＬ２及び２ＤＬ３、（ｉｉｉ）及びＨＬＡ－Ｂ Ｂｗ４アレルに結合する３ＤＬ１である。リガンド欠損モデルによれば、対応するリガンドがレシピエントに存在せず、且つドナーに存在する場合に限り、抑制型ＫＩＲ遺伝子を発現する各ＮＫ細胞にアロ反応性があることになる － 例えば、グループＣｌアレルを保有するドナーは、いずれもグループＣｌアレルを欠く任意の個体にアロ反応性を示す。従って、ＣＩ、Ｃ２及びＢｗ４ファミリのＨＬＡを保有するドナーは、このモデルによれば、ＣＩ、又はＣ２、又はＢｗ４を欠く任意のレシピエントに対してアロ反応性を示すと予測される。
【0054】
抑制型ＫＩＲがアロ反応性を防ぐのに対し、活性型ＫＩＲは、ＮＫ細胞溶解を促進する活性型リガンドを認識する。活性型ＫＩＲの遺伝には、大きいばらつきがある － いずれの個体にも０～７個のａＫＩＲがあり得る。幹細胞移植を受けた患者からのデータが示すところによれば、活性型ＫＩＲが多いドナーからの同種移植片の提供を受けた患者は、活性型ＫＩＲが少ないドナーからの同種移植片の提供を受けた患者と比べてアウトカム（ｏｕｔｃｏｍｅ）が良好である。他にも、活性型ＫＩＲをより多く受け継ぐ個体において、白血病に対する予防的利益が示されている。本研究室では、活性型ＫＩＲ数が多いＮＫ細胞ほど、標的細胞の溶解を強力に誘導することを示した（図１）。加えて、多変量解析では、活性型ＫＩＲ ２ＤＳ１及び３ＤＳ Ｉは無病生存期間と関連している。
【0055】
最後に、ＮＫＧ２Ｃは、ＮＫ細胞発生の後期に発現する活性型受容体であり、ＨＬＡ－Ｂ又は－ＣよりむしろＨＬＡ－Ｅを認識する。ＮＫＧ２Ｃ発現は、ＣＭＶ感染症患者で誘導され、適応性のＮＫ細胞表現型及び無白血病生存率の改善と相関する。
【0056】
従って、「万能な（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）」ドナーとは、Ｃ１、Ｃ２及びＢｗ４アレルを担持するＨＬＡ遺伝子型を有する者、Ｃｌ、Ｃ２及びＢｗ４に結合する（最大限のライセンス化につながる）抑制型ＫＩＲ（２ＤＬ Ｉ、２ＤＬ２又は３及び３ＤＬ１）を保有する、且つ活性型ＫＩＲの比率が高い（２ＤＳ Ｉ及び３ＤＳ１を含む可変的に遺伝する活性型遺伝子が３つより多い）ＫＩＲ遺伝子型を有する者及びＣＭＶに曝露されたことがあり、結果としてＮＫＧ２Ｃ高発現が生じている者である。
【0057】
白人ドナーについて利用可能なデータを考察すると、集団の３２％にＣ Ｉ／Ｃ２／Ｂｗ４アレルが見られる。集団の８０％を占める２３個のＫＩＲ遺伝子型の２５．３％がこれらの基準全てに合致する（図２） － 成人の約９０％がＣＭＶに曝露されたことがある。従って、１６人中約１人の健常人に、「理想的な」ＮＫ細胞ドナーを同定することができる。この１６人中１人の健常人からのドナーＮＫ細胞に関してスクリーニングし、且つ／又はそれを選択することにより、少なくとも５０％～８５％のレシピエント対象について組織学的に最適化される「万能な」ドナーＮＫ細胞を入手し得ることが理解され、且つ本明細書でそれが企図される。
【0058】
従って、一態様において、本開示は、万能ドナーＮＫ細胞を、それを必要としている対象への治療的投与のために選択する方法に関し、この方法は、ＮＫ細胞ドナーからの候補ＮＫ細胞のＫＩＲ表現型を決定することであって、ＫＩＲ表現型が、１つ以上の可変的に遺伝する抑制型ＫＩＲ ２ＤＬ１、２ＤＬ２、２ＤＬ３及び３ＤＬ１の存在を示す、決定すること；及びＫＩＲ表現型が、１つ以上の可変的に遺伝する抑制型ＫＩＲ ２ＤＬ１、２ＤＬ２、２ＤＬ３及び３ＤＬ１の存在を示すとき、その候補ＮＫ細胞を治療的投与のための万能ドナーＮＫ細胞として選択することを含む。本方法において、ＫＩＲ表現型は、ハイスループット表現型イメージングを促進し得る磁気共鳴画像法など、画像ベースの方法を用いて決定され得る。マイクロコンピュータ断層撮影スキャン技術は、表現型分析を支援するのに好適な高精度の画像化を提供し得る。ゲノムスケールのＲＮＡｉスクリーニングも適用することができる。
【0059】
一態様において、本開示は、図３に示されるとおり、万能ドナーＮＫ細胞を、それを必要としているレシピエント対象への治療的投与のために選択する方法３００を包含する。３０２において、ドナー細胞がＨＬＡ Ｃｌ、Ｃ２及びＢｗ４アレルを有するかどうかが決定される。一態様において、ＨＬＡ Ｃｌ、Ｃ２及びＢｗ４アレルの存在は、ＮＫ細胞ドナーからの候補ＮＫ細胞のＨＬＡ遺伝子型を入手するか又は入手していることによって決定され、ここで、ＨＬＡ遺伝子型は、ＨＬＡ Ｃｌ、Ｃ２及びＢｗ４アレルの存在又は非存在を示し、且つそれにより１つ以上の可変的に遺伝する抑制型ＫＩＲ ２ＤＬ１、２ＤＬ２、２ＤＬ３及び３ＤＬ１の各々の存在又は非存在を示す。３０４において、ドナー細胞がＨＬＡ Ｃｌ、Ｃ２及びＢｗ４アレルの少なくとも１つを欠いていることに応答して、そのドナー細胞が準最適（ｓｕｂ－ｏｐｔｉｍａｌ）としてマークされる。３０６において、ドナー細胞がＨＬＡ Ｃｌ、Ｃ２及びＢｗ４アレルの少なくとも１つを有することに応答して、ドナー細胞が活性化閾値以上の数の活性型ＫＩＲを有するかどうかが決定され、活性化閾値は、存在する活性型ＫＩＲの最小限の数である。非限定的な例として、一態様において、閾値は、少なくとも１つの活性型ＫＩＲであり得、ここで、１つ以上の活性型ＫＩＲの存在が活性化閾値を満たす。代替的な態様において、活性化閾値は、２、３、４、５、６又は７つの活性型ＫＩＲであり、それぞれ２、３、４、５、６又は７つの活性型ＫＩＲの少なくとも１つが存在するときに満たされる。一態様において、活性型ＫＩＲの存在は、候補ＮＫ細胞のＫＩＲ遺伝子型を入手するか又は入手していることによって決定され、ここで、ＫＩＲ遺伝子型は、活性型ＫＩＲの存在又は非存在を示す。３０８において、ドナー細胞が活性化閾値を超える数の活性型ＫＩＲを欠いていることに応答して、そのドナーが非万能ドナーと同定される。
【0060】
３１０では、ドナー細胞が活性化閾値を超える数の活性型ＫＩＲを有することに応答して、活性型ＫＩＲが、２ＤＳ１／２、２ＤＳ３／５、３ＤＳ１及び２ＤＳ４を含む群から選択されるかどうかを決定する。３１２において、ドナー細胞が、２ＤＳ１／２、２ＤＳ３／５、３ＤＳ１及び２ＤＳ４を含む群から選択されるＫＩＲを欠いていることに応答して、そのドナー細胞が非万能ドナー細胞と同定される。
【0061】
一例示的実施形態において、ＫＩＲ遺伝子型は、２ＤＳ１／２、２ＤＳ３／５、３ＤＳ１及び２ＤＳ４からなる群から選択される活性型ＫＩＲの各々の存在又は非存在を示す。３１４において、ドナーがＣＭＶ血清反応陽性状態に関する検査を受けることに応答して、ドナーがＣＭＶ＋であるかどうかが決定される。３１６において、ドナーが検査でＣＭＶ血清反応陰性となることに応答して、そのドナー細胞が非万能ドナー細胞と同定される。
【0062】
３１８において、ドナー細胞がＮＫＧ２Ｃ活性型受容体発現を有することに応答して、そのドナー細胞が万能ドナー細胞と同定される。３２０において、ドナーがＮＫＧ２Ｃ活性型受容体発現の表現型を欠いていることに応答して、そのドナー細胞が非万能ドナー細胞と同定される。３２２において、ドナー細胞がステップ３０２、３０６、３１０、３１４及び／又は３１８の少なくとも１つ、２、３、４又は５つにおいて基準を満たしていることに応答して、ドナー細胞が万能ドナー細胞として同定される。
【0063】
態様では、万能と同定されたドナー細胞は、それを必要としている対象への治療的投与のための万能ドナーＮＫ細胞として選択される。上述のとおり、ＮＫＧ２Ｃは、ＮＫ細胞発生の後期に発現する活性型受容体であり、ＨＬＡ－Ｂ又は－ＣよりむしろＨＬＡ－Ｅを認識する。ＮＫＧ２Ｃ発現は、ＣＭＶ感染症患者で誘導され、適応性のＮＫ細胞表現型及び無白血病生存率の改善と相関する。従って、ＮＫＧ２Ｃが上昇している個体又はＣＭＶ血清反応陽性の個体から候補ドナー細胞を同定することにより、ドナーＮＫ細胞の有効性が更に増加し得る。従って、本明細書には、ＮＫ細胞集団をスクリーニングする方法又はレシピエント対象への治療的投与のための万能ドナーＮＫ細胞を選択する方法も開示され、この方法は、候補ＮＫ細胞のＣＭＶ血清反応陽性状態を入手するか又は入手していることを更に含み；及びＮＫ細胞ドナーがＣＭＶについて血清反応陽性であるとき又はＮＫ細胞ドナーからのＮＫ細胞がＮＫＧ２Ｃ発現の参照レベルと比較して高いＮＫＧ２Ｃ発現を示すとき、そのＮＫ候補ＮＫ細胞が更に選択される。参照レベルは、例えば、対照ドナーから入手したＮＫＧ２Ｃ発現についての所定の参照値又はＣＭＶ血清反応陰性の一組の対照ドナーから入手したＮＫＧ２Ｃ発現レベルの平均値である。当業者によれば、３０２、３０６、３１０、３１４及び／又は３１８に記載される要素の１つの存在又は非存在が、ドナーを最終的に万能ドナーと見なす妨げにはならないことが理解されるであろう。
【0064】
別の態様において、ドナーは、（ｉ）ＨＬＡ遺伝子型が少なくとも２つのＩ ＩＬＡアレルＩ ＩＬＡ Ｃｌ、Ｃ２及びＢｗ４の存在を示すとき、及び／又は（ｉｉ）ＫＩＲ遺伝子型が少なくとも３つの活性型ＫＩＲ ２ＤＳ１／２、２ＤＳ３／５、３ＤＳ１及び／又は２ＤＳ４の存在を示すとき、最適とマークされる。
【0065】
本明細書には、ＮＫ細胞の供給源を、それを必要としている対象への治療的投与を提供するために、ドナーからの候補ＮＫ細胞集団をスクリーニングして、集団中における万能ＮＫドナー細胞を同定する方法も開示される。この方法は、候補ＮＫ細胞集団がスクリーニングされる点を除いて、方法３００と実質的に同じである。方法ステップ３０２～３１８を含む、候補ＮＫ細胞集団をスクリーニングする方法である。
【0066】
別の態様において、候補ＮＫ細胞集団をスクリーニングする方法は、（ａ）ＮＫ細胞ドナーからの候補ＮＫ細胞のＨＬＡ遺伝子型を入手するか又は入手していることであって、ＨＬＡ遺伝子型は、ＨＬＡ ＣＩ、Ｃ２及びＢｗ４アレルの存在又は非存在を示し、且つそれにより１つ以上の可変的に遺伝する抑制型ＫＩＲ ２ＤＬ１、２ＤＬ２又は２ＤＬ３及び／又は３ＤＬ Ｉの存在を示す、入手するか又は入手していること、及び／又は（ｂ）候補ＮＫ細胞のＫＩＲ遺伝子型を入手するか又は入手していることであって、ＫＩＲ遺伝子型は、２ＤＳ１／２、２ＤＳ３／５、３ＤＳ１及び２ＤＳ４からなる群から選択される活性型ＫＩＲの存在又は非存在を示す、入手するか又は入手していることを含み；ここで、（ｉ）少なくとも２つのＨＬＡアレルＨＬＡ Ｃｌ、Ｃ２及びＢｗ４を含む、従って可変的に遺伝する抑制型ＫＩＲ ２ＤＬ１、２ＤＬ２又は２ＤＬ３及び／又は３ＤＬ１の少なくとも１つを含む候補ＮＫ細胞、及び／又は（ｉｉ）少なくとも３つの活性型ＫＩＲ ２ＤＳ１／２、２ＤＳ３／５、３ＤＳ１及び／又は２ＤＳ４を含む候補ＮＫ細胞は、万能ＮＫ細胞である。
【0067】
一態様において、本明細書には、前述のいずれかの態様のＮＫ細胞集団をスクリーニングする方法又はレシピエント対象への治療的投与のための万能ドナーＮＫ細胞を選択する方法が開示され、ここで、選択された万能ドナーＮＫ細胞は、少なくとも５０％～８５％のレシピエント対象について組織学的に最適化される。
【0068】
本開示のスクリーニングし及び選択する方法は、最終的に、単離された万能ドナーＮＫ細胞をもたらすことが理解され、且つ本明細書でそれが企図される。従って、本明細書には、単離された万能ドナーＮＫ細胞が開示され、ここで、単離された万能ドナーＮＫ細胞は、少なくとも２つのＩ ＩＬＡアレルＩ ＩＬＡ Ｃｌ、Ｃ２及びＢｗ４；及び／又は少なくとも３つの活性型ＫＩＲ ２ＤＳ１／２、２ＤＳ３／５、３ＤＳ１及び／又は２ＤＳ４を含む。一態様において、単離された万能ドナーＮＫ細胞は、ＮＫＧ２Ｃ＋であるか、又はＣＭＶ血清反応陽性ドナー供給源に由来する。
【0069】
図４に示される方法４００に示されるとおり、正しい遺伝子型特徴を有する万能ドナーＮＫ細胞を入手するために、ドナー供給源から候補ドナーＮＫ細胞を選択又はスクリーニングするよりむしろ、ＮＫ細胞又は細胞株は、様々なアレル、ＫＩＲ及び／又は受容体をコード及び／又は発現するように改変され得ることが更に理解される。従って、本明細書において、４０２では、改変されたＮＫ細胞又は細胞株が開示され、ここで、ＮＫ細胞は、Ｃｌ、Ｃ２又はＢｗ４を含む１つ、２つ又はそれを超えるＨＬＡアレルを発現するように形質転換されている（例えば、ＣＩ、Ｃ２及びＢｗ４を発現するＮＫ細胞又は細胞株）。４０４において、ＮＫ細胞又は細胞株は、改変され、ここで、ＮＫ細胞は、１つ以上の可変的に遺伝する抑制型ＫＩＲ ２ＤＬ１、２ＤＬ２、２ＤＬ３及び／又は３ＤＬ１の存在を示すＨＬＡアレルを発現するように形質転換される。４０６において、ＮＫ細胞又は細胞株は、活性型ＫＩＲ ２ＤＳ１／２、２ＤＳ３／５、３ＤＳ１及び／又は２ＤＳ４をコード及び／又は発現するように改変され、且つ／又は２ＤＳ１／２、２ＤＳ３／５、３ＤＳ１又は２ＤＳ４を含む１、２、３、４、５つ又はそれを超える可変的に遺伝する活性型ＫＩＲを発現するように形質転換される。４０８において、ＮＫ細胞又は細胞株は、ＮＫＧ２Ｃを活性化させるように改変される（例えば、細胞株をＣＭＶ血清反応陽性条件に曝露する）。方法ステップ４０２～４０８は、利用されているＮＫ細胞株に存在する根底にある遺伝子発現又は細胞活性化に応じて選択的に完成され得、加えて、これらのステップは、準最適としてマークされたドナー細胞（例えば、方法３００のステップ３０４、３０８、３１２、３０６）及び／又は最適としてマークされたドナー細胞（例えば、方法３００のステップ３１８）に対して実施され得る。
【0070】
単離された万能ドナーＮＫ細胞及び改変された万能ドナーＮＫ細胞又は細胞株は、サイトカイン毒性に関連する多くの困難を乗り越えるため、１つ以上のＮＫ細胞エフェクター剤（例えば、刺激性ペプチド、サイトカイン及び／又は接着分子）の存在下で活性化及び／又は拡大され得ることが理解され、且つ本明細書でそれが企図される。ＮＫ細胞活性化剤及び刺激性ペプチドの例としては、限定はされないが、ＩＬ－２１、４１ＢＢＬ、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－７、ＵＬＢＰ、ＭＩＣＡ、ＬＦＡ－１、２Ｂ４、ＢＣＭ／ＳＬＡＭＦ２、ＣＣＲ７、ＯＸ４ＯＬ、ＮＫＧ２Ｄアゴニスト、デルタ－Ｉ、ノッチリガンド、ＮＫｐ４６アゴニスト、ＮＫｐ４４アゴニスト、ＮＫｐ３０アゴニスト、他のＮＣＲアゴニスト、ＣＤ１６アゴニスト；及び／又はＴＧＦ－β及び／又は他のホーミング誘導シグナル伝達分子が挙げられる。サイトカインの例としては、限定はされないが、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、１Ｌ－２１及びＩＬ－１８が挙げられる。
【0071】
接着分子の例としては、限定はされないが、ＬＦＡ－１、ＭＩＣＡ、ＢＣＭ／ＳＬＡＭＦ２が挙げられる。これらのＮＫ細胞エフェクター剤は、溶液中で可溶性を呈するか、又は細胞膜（ＰＭ）粒子、エキソソーム（ＥＸ）又はフィーダ細胞（ＦＣ）の表面上に膜結合剤として存在し得る。ＰＭ粒子、ＥＸエキソソーム及び／又はＦＣ細胞は、膜型のＮＫ細胞活性化剤及び刺激性ペプチドを発現するように改変することができる。代わりに、ＮＫ細胞活性化剤及び刺激性ペプチドは、ＰＭ粒子、ＥＸエキソソーム又はＦＣフィーダ細胞の表面に化学的にコンジュゲートすることができる。例えば、膜結合型ＩＬ－２１を発現するフィーダ細胞から調製される細胞膜（ＰＭ）粒子、フィーダ細胞（ＦＣ）又はエキソソーム（ＥＸ）（それぞれＦＣ２１細胞、ＰＭ２１粒子及びＥＸ２１エキソソーム）。従って、一態様において、本明細書には、単離された万能ドナーＮＫ細胞又は細胞株が開示され、ここで、万能ドナーＮＫ細胞又は細胞株は、４１ＢＢＬ、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－７、ＵＬＢＰ、ＭＩＣＡ、ＬＦＡ－１、２Ｂ４、ＢＣＭ／ＳＬＡＭＦ２、ＣＣＲ７、ＯＸ４ＯＬ、ＮＫＧ２Ｄアゴニスト、デルタ－１、ノッチリガンド、ＮＫｐ４６アゴニスト、ＮＫｐ４４アゴニスト、ＮＫｐ３０アゴニスト、他のＮＣＲアゴニスト、ＣＤ１６アゴニスト；及び／又はＴＧＦ－β（例えば、ＩＬ－２１）を含むが、これらに限定されない１つ以上の活性化剤、刺激性ペプチド、サイトカイン及び／又は接着分子の存在下において万能ドナーＮＫ細胞をインビトロでインキュベートすることによって活性化及び／又は拡大される。一態様において、インビトロ活性化に使用されるＩＬ－２１は、可溶性ＩＬ－２１、ＩＬ－２１発現フィーダ細胞（ＦＣ２１）、ＩＬ－２１細胞膜粒子（ＰＭ２１）又はＩＬ－２１エキソソーム（ＥＸ２１）を含む。膜結合型ＩＬ－２１を発現するＦＣ２１細胞、ＰＭ２１粒子及びＥＸ２１エキソソームは、４１ＢＢＬ、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－７、ＵＬＢＰ、ＭＩＣＡ、ＬＦＡ－１、２Ｂ４、ＢＣＭ／ＳＬＡＭＦ２、ＣＣＲ７、ＯＸ４ＯＬ、ＮＫＧ２Ｄアゴニスト、デルタ－１、ノッチリガンド、ＮＫｐ４６アゴニスト、ＮＫｐ４４アゴニスト、ＮＫｐ３０アゴニスト、他のＮＣＲアゴニスト、ＣＤ１６アゴニスト；及び／又はＴＧＦ－βを含むが、これらに限定されない追加的な１つ以上の活性化剤、刺激性ペプチド、サイトカイン及び／又は接着分子を更に含み得る（例えば、４１ＢＢＬ及び膜結合インターロイキン－２１を発現するＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エキソソーム又はＦＣ細胞）ことが理解され、且つ本明細書でそれが企図される。ＮＫ細胞は、加えて、可溶性及び膜結合型の両方の追加的なリガンドに曝露されることができる。
【0072】
上述のとおり、万能ドナーＮＫ細胞の追加的な活性化及び／又は拡大により、レシピエントに投与されたときの細胞の有効性が増加する。従って、一態様において、本明細書には、万能ドナーＮＫ細胞集団を、それを必要としている対象への治療的投与のために調製する方法が開示され、この方法は、（ａ）ＮＫ細胞ドナーから初期ＮＫ細胞集団を入手することであって、ＮＫ細胞ドナーは、（ｉ）可変的に遺伝する活性型ＫＩＲ ２ＤＳ１／２、２ＤＳ３／５、３ＤＳ１及び／又は２ＤＳ４の少なくとも２つ；及び（ｉｉ）Ｃｌ、Ｃ２及びＢｗ４アレルを含む少なくとも１つ、２つ又は３つ全てのＨＬＡアレルの存在を示す遺伝子型を有すること；及び（ｂ）１１－２１、４１ＢＢＬ、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－７、ＵＬＢＰ、ＭＩＣＡ、ＬＦＡ－１、２Ｂ４、ＢＣＭ／ＳＬＡＭＦ２、ＣＣＲ７、ＯＸ４ＯＬ、ＮＫＧ２Ｄアゴニスト、デルタ－１、ノッチリガンド、ＮＫｐ４６アゴニスト、ＮＫｐ４４アゴニスト、ＮＫｐ３０アゴニスト、他のＮＣＲアゴニスト、ＣＤ１６アゴニスト；及び／又はＴＧＦ－β（例えば、ＩＬ－２１）を含むが、これらに限定されない１つ以上の活性化剤、刺激性ペプチド、サイトカイン及び／又は接着分子に対し、初期ＮＫ細胞集団を拡大するのに十分な時間にわたって且つ条件下において初期ＮＫ細胞集団をインビトロで曝露することを含む。１つ以上の活性化剤への曝露は、少なくとも１回の集団倍化（ｄｏｕｂｌｉｎｇ）を達成する時間にわたって且つ条件下において行われ得ることが理解され、且つ本明細書でそれが企図される。一例示的実施形態において、拡大により、ＮＫＧ２Ｃを発現するＮＫ細胞のＮＫＧ２Ｃ高発現が５％～約２２％から１１％～約３０％に増加する。
【0073】
一態様において、単離された万能ドナーＮＫ細胞若しくは細胞株又はＮＫ細胞集団は、ＩＦＮｙ又はＴＮＦａの抗腫瘍性サイトカインを産生及び分泌する増加した能力によって特徴付けられる。一態様において、拡大されたＮＫ細胞集団は、ＮＫＧ２Ｄの増加した発現、ＣＤ１６の増加した発現、ＮＫｐ４６の増加した発現、増加したＫＩＲ発現によって特徴付けられる。
【0074】
ＩＩ．ドナー選択
一態様において、ドナーは、基準に合致しないドナーを以降の検査から除外する段階的な方法でスクリーニングされる（図３を参照されたい）。初めに、ＫＩＲ２ＤＬ４の機能変異体と欠失変異体との区別を含め、逆配列特異的オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）方法論（例えば、ワンラムダ（Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ））でＮＫ細胞ドナーに関するＫＩＲ遺伝子タイピングを実施し得る。別の例示的実施形態では、活性型ＫＩＲ含量は、活性型ＫＩＲ遺伝子の総数を評点化することによって決定される。ＤＳ指定ＫＩＲ及び機能性ＫＩＲ２ＤＬ４は、全て活性型と見なした。一態様では、一般的な活性型ＫＩＲ（ＫＩＲ２ＤＳ４及び機能性バージョンのＫＩＲ２ＤＬ４）及び５個の可変的に遺伝する活性型ＫＩＲの多い数を有するドナーが選択される。別の態様では、ドナーは、遺伝したＢ－ＫＩＲセグメントの数（例えば、セントロメア及びテロメアＢアレルの３又は４個）に基づき選択される。一例示的実施形態では、多い数とは、可変的に遺伝する活性型ＫＩＲの３、４又は５個である。別の例示的実施形態において、多い数とは、可変的に遺伝する活性型ＫＩＲの４個である。更に別の例示的実施形態において、多い数とは、可変的に遺伝する活性型ＫＩＲを１個以上有することである。
一態様において、ドナーは、基準に合致しないドナーを以降の検査から除外する段階的な方法でスクリーニングされる（図３を参照されたい）。初めに、ＫＩＲ２ＤＬ４の機能変異体と欠失変異体との区別を含め、逆配列特異的オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）方法論（例えば、ワンラムダ（Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ））でＮＫ細胞ドナーに関するＫＩＲ遺伝子タイピングを実施し得る。別の例示的実施形態では、活性型ＫＩＲ含量は、活性型ＫＩＲ遺伝子の総数を評点化することによって決定される。ＤＳ指定ＫＩＲ及び機能性ＫＩＲ２ＤＬ４は、全て活性型と見なした。一態様では、一般的な活性型ＫＩＲ（ＫＩＲ２ＤＳ４及び機能性バージョンのＫＩＲ２ＤＬ４）及び５個の可変的に遺伝する活性型ＫＩＲの多い数を有するドナーが選択される。別の態様では、ドナーは、遺伝したＢ－ＫＩＲセグメントの数（例えば、セントロメア及びテロメアＢアレルの３又は４個）に基づき選択される。一例示的実施形態では、多い数とは、可変的に遺伝する活性型ＫＩＲの３、４又は５個である。別の例示的実施形態において、多い数とは、可変的に遺伝する活性型ＫＩＲの４個である。更に別の例示的実施形態において、多い数とは、可変的に遺伝する活性型ＫＩＲを１個以上有することである。
【0075】
一態様において、ＮＫ細胞ドナーは、市販のキットを用いたＳＳＯ－ＰＣＲ（増幅及びオリゴヌクレオチドシーケンシング）により、ＨＬＡ－Ｂ及び－Ｃ遺伝子座のアレルに関して中程度の又は高度な分解能レベルでＨＬＡタイピングされる。別の態様では、欧州分子生物学研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂ）の欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ＥＭＢＬ－ＥＢＩ）が管理するＫＩＲリガンドカリキュレータ（ＫＩＲ Ｌｉｇａｎｄ Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ）を用いてＫＩＲ－リガンドクラスが予測される。３つ全てのＣｌ、Ｃ２及びＢｗ４クラスを持つ個体が選択される。
【0076】
一態様において、最後にドナーがＣＭＶに関して検査される。ＣＭＶ＋ドナーの検査により、ＮＫＧ２Ｃ＋ ＮＫ細胞の存在を確認することができる。代わりに、ドナーは、ＣＭＶ曝露前に予測される閾値（例えば、約２０％）を上回るＮＫＧ２Ｃ＋ ＮＫ細胞の存在に関してスクリーニングされる。
【0077】
一態様において、本明細書には、図５に示されるとおり、最適な万能ドナーＮＫ細胞ドナーをスクリーニングして、様々な疾患治療における使用に最適な万能ドナーＮＫ細胞を調製する方法５００が開示される。例えば、ステップ５０２において、最適な細胞ドナー（図３の方法３００によって定義されるとおり）が伝染病に関してスクリーニングされる。この例示的実施形態では、最適な万能ドナーＮＫ細胞ドナー（ドナー）が、連邦規則集第２１編第１２７１部、ＦＤＡガイダンス文書「ヒト細胞、組織並びに細胞及び組織ベース産物（ＨＣＴ／Ｐ）のドナーに関する適格性の決定（Ｅｌｉｇｉｂｉｌｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｄｏｎｏｒｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌｓ，Ｔｉｓｓｕｅｓ，ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ－Ｂａｓｅｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（ＨＣＴ／Ｐｓ））」並びに既発行の任意の補足的ガイダンス文書に準拠してＢＴＭＢ機関におけるＨＣＴ／Ｐドナーに要求されるとおりの感染症検査及びスクリーニングを受けることになる。検査は、ＣＬＩＡ公認及びＦＤＡ登録研究所において、ＢＴＭＢとの契約の下に、ＨＣＴ／Ｐドナーに関するＢＴＭＢ指針及びＦＤＡ承認済み検査を利用する別個のドナープロトコルに従い実施される。ドナーは、感染症マーカ（ＩＤＭ）に関して、採取前後７日以内に表１の検体／試験方法論を用いて検査されることになる。ＩＤＭとしては、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ＨＴＬＶ－Ｉ及びＩＩ、ＨＩＶ－１、－２及び－Ｏ、梅毒、クルーズトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）（シャーガス病）、ウエストナイルウイルス、ＣＭＶが挙げられる。
【0078】
【表1】
【0079】
ＩＩＩ．製造及びバイアル封入推定
一態様において、患者のニーズが生じる前に又はそれを受けて、拡大したドナーＮＫ細胞製剤が製造される。一態様において、ドナーは、採取から７日以内に、標準的な感染症スクリーニング及び他のドナースクリーニング（連邦規則集第２１編第１２７１部Ｃ項によって要求されるとおり）を受ける。方法５００のステップ５０４において、ドナーがＩＤＭを欠いていることに応答して、ドナーから末梢血単核球（ＭＮＣ／ＰＢＭＣ）が採取される。別の例示的実施形態において、供給源末梢血単核球（ＰＢＭＣ）が採取され、標準方法によってＮＫ細胞が増殖される。５０６において、採取されたＭＮＣのＣＤ３＋免疫枯渇により枯渇ＭＮＣが形成される。一例示的実施形態において、ＭＮＣ／ＰＢＭＣは、ＭＡＣＳコロイド超常磁性ＣＤ３マイクロビーズを用いてＣＤ３＋ Ｔ細胞が枯渇される。
一態様において、患者のニーズが生じる前に又はそれを受けて、拡大したドナーＮＫ細胞製剤が製造される。一態様において、ドナーは、採取から７日以内に、標準的な感染症スクリーニング及び他のドナースクリーニング（連邦規則集第２１編第１２７１部Ｃ項によって要求されるとおり）を受ける。方法５００のステップ５０４において、ドナーがＩＤＭを欠いていることに応答して、ドナーから末梢血単核球（ＭＮＣ／ＰＢＭＣ）が採取される。別の例示的実施形態において、供給源末梢血単核球（ＰＢＭＣ）が採取され、標準方法によってＮＫ細胞が増殖される。５０６において、採取されたＭＮＣのＣＤ３＋免疫枯渇により枯渇ＭＮＣが形成される。一例示的実施形態において、ＭＮＣ／ＰＢＭＣは、ＭＡＣＳコロイド超常磁性ＣＤ３マイクロビーズを用いてＣＤ３＋ Ｔ細胞が枯渇される。
【0080】
５０８において、枯渇ＭＮＣがフィーダ細胞で第１のフィード期間及び第１のフィード間隔にわたって刺激され、ＮＫ細胞が増殖及び活性化される。一例示的実施形態では、フィーダ細胞は照射フィーダ細胞（ＩＦＣ）である。別の例示的実施形態では、枯渇ＭＮＣは、照射ＣＳＴＸ００２フィーダ細胞（凍結保存又は新鮮）で毎週繰り返し刺激することにより増殖される。ＣＳＴＸ００２は、（ｉ）凍結保存前、又は（ｉｉ）新鮮にＭＮＣ又はＮＫ細胞培養物にそれを加える前のいずれかに１００Ｇｙ（１０，０００ラド）ガンマ線照射で処理される。照射のバリデーションでは、２５Ｇｙで検出可能な増殖が除去されることが実証されており、ＮＫ細胞と共培養すると、更に９９．９％の有効なＩＦＣ除去がもたらされた。一例示的実施形態において、ＩＦＣは、ＲＰＭＩ－１６４０、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ及び１００ＩＵ／ｍＬの組換えヒトＩＬ－２（プロロイキン（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）、プロメテウス（Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ））を含有する培地に、約１：２のＴＮＣ対ＩＦＣ比で加えられる。この例示的実施形態では、第１のフィード期間は１０～１５日であり、第１のフィード間隔は１～５日である。別の例示的実施形態において、第１のフィード期間は１４日であり、第１のフィード間隔は１～３日である。一例示的実施形態において、ＭＮＣ又はＮＫ細胞は、約１：１のＴＮＣ対ＩＦＣ比でＩＦＣによって再刺激され、７日間にわたって（例えば、８～１４日目に）培養される。この実施形態では、第１のフィード間隔が利用され、ここで、８～１４日目の拡大の間に１～３日間隔で培養物が細胞数に関してモニタされ、新鮮なＩＬ－２が１００ＩＵ／ｍＬで、及び１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－βが加えられる。異常増殖を防ぎ、収率を最大にするため、ＮＫ細胞培養物は５～１０×１０６細胞／ｃｍ２を下回るように分割される。培養容器次第では、必要に応じて少なくとも半分の培地を交換することによって新鮮培地も提供される。
【0081】
５１０において、ＣＤ３＋枯渇が決定される。ＣＤ３＋枯渇が閾値を上回ることに応答して、ステップ５０６が繰り返される。一例において、ＣＤ３＋枯渇は、フィーダ細胞の刺激の６日目が終了する１日前に決定される。この実施形態において、細胞カウント、免疫表現型タイピング及び生死判別のための試料は、ＭＮＣ及び／又はＮＫ細胞培養物（例えば、フィーダ細胞の刺激下にあるもの）から入手される。一例示的実施形態において、ＣＤ３＋枯渇の閾値は、５％より多いＣＤ３＋細胞が存在することである。ここで、一例示的実施形態において、繰り返しのステップ５０６は、７日目に第１のフィード期間にわたって２回目のＣＤ３＋枯渇サイクルを実施することを含む。枯渇後、ＣＤ３陰性ＮＫ細胞画分から、細胞カウント、免疫表現型タイピング及び生死判別のための試料を入手することになる。
【0082】
５１２において、ＣＤ３＋枯渇が閾値を下回ることに応答して、ＭＮＣ及び／又はＮＫ細胞がインターロイキン－２（ＩＬ－２）及び／又は形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）と共に第２のフィード期間にわたって第２のフィード間隔で培養される。一例示的実施形態において、第２のフィード期間は約５～８日であり、第２のフィード間隔は約１～５日である。別の例示的実施形態において、第２のフィード期間は７日であり、第２のフィード間隔は約１～３日である。この例示的実施形態では、新鮮なＩＬ－２が１００ＩＵ／ｍＬで加えられ、１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－βが第１のフィード期間の最初の７日間中に第２のフィード間隔で加えられる。
【0083】
５１４において、培養されたナチュラルキラー細胞に関する免疫表現型タイピング及び生死判別が実施される。一例において、第１のフィード期間の１３日目、細胞カウント、免疫表現型タイピング及び生死判別のための試料がＮＫ細胞培養物から入手される。０．３３％未満のＣＤ３＋細胞が存在することに応答して、直ちに又は第１のフィード期間の１４日目の回収前に検査が繰り返され得る。ＣＤ３＋枯渇が第２の閾値（例えば、０．３３％）を超えることに応答して、ステップ５０６に記載されるとおりの更なる枯渇が、１３日目に直ちに又は１４日目の回収後に実施される。細胞カウント及び免疫表現型タイピング及び生死判別のための試料がＣＤ３枯渇ＮＫ細胞画分から入手され、残りは再びＩＬ－２及びＴＧＦ－βと一晩培養されることになる。一例示的実施形態において、ＣＤ３＋枯渇が実施されないことに応答して、次に７日目の免疫表現型タイピングが実施されないことになる。
【0084】
５１６において、培養されたＮＫ細胞が用量濃度に濃縮される。一例において、用量濃度は２×１０６ＮＣ／ｍＬ～２×１０８ＮＣ／ｍＬである。５１８において、用量濃度の培養されたＮＫ細胞が凍結保存される。一例示的実施形態において、ＮＫ細胞は、ＮＫ凍結培地に凍結保存される。例示的実施形態において、ＮＫ凍結培地は、１０％ＤＭＳＯ、１２．５％（ｗ／ｖ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ＵＳＰを含み、且つ／又はプラズマライトＡ（Ｐｌａｓｍａ－Ｌｙｔｅ Ａ）（ＵＳＰ）中に含む。方法５００は、５２０から開始する特定の患者を治療する方法を記載し、この詳細は以下に続く。
【0085】
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）を有するＨＳＶ患者の治療時など、１つの例示的実施形態において、ＨＳＶ患者（ＨＳＶと診断された者）は、５．０×１０７細胞／ｋｇ／用量で投与されるバンク化されたＮＫ細胞の１日１回用量を最大５連続で受ける。この例示的実施形態では、輸血又は輸注反応歴のあるＨＳＶ患者は、ジフェンヒドラミン１ｍｇ／ｋｇ（最大５０ｍｇ）ＩＶ及びアセトアミノフェン１０ｍｇ／ｋｇ（最大６５０ｍｇ）ＰＯが前投薬される。ＨＳＶ患者は、その後の数日間（Ｄ１～Ｄ４）に適格性評価を繰り返し受け、反復投与が適格であるかどうかが決定される。用量は、ＨＳＶ患者に１日１回、５日連続で与えられる。
【0086】
ＣＯＶＩＤ患者（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９感染症又はＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２を有する者）の治療時など、別の例示的実施形態において、ＮＫ細胞は治療として提供される。一例示的実施形態において、輸血又は輸注反応歴のある患者は、ジフェンヒドラミン１ｍｇ／ｋｇ（最大５０ｍｇ）ＩＶ及びアセトアミノフェン１０ｍｇ／ｋｇ（最大６５０ｍｇ）が前投薬される。別の例示的実施形態において、患者は、ＣＯＶＩＤによる入院から４８時間以内にその最初のＮＫ細胞用量を受ける。更に別の例示的実施形態において、同種異系の拡大したＮＫ細胞が、ＣＯＶＩＤに対する自然免疫機能を定量的及び定性的に回復させるため、患者の体重別に用量設定される。この例示的実施形態では、ＣＯＶＩＤ患者に１０７ＮＫ細胞／ｋｇ患者体重の用量（例えば、平均的な患者の末梢血中の全ＮＫ細胞含量を補充すると考えられる用量）が提供される。別の例示的実施形態において、ＣＯＶＩＤ患者は最大２用量を受けることになる。
【0087】
別の態様において、供給源末梢血単核球（ＰＢＭＣ）が採取され、標準方法によってＮＫ細胞が増殖される。更に別の態様において、ＰＢＭＣは、ＭＡＣＳコロイド超常磁性ＣＤ３マイクロビーズを用いてＣＤ３＋ Ｔ細胞が枯渇される。得られた細胞は、ウシ胎仔血清及びＩＬ－２を補足した培地中で照射フィーダ細胞及び／又は膜粒子と共培養される。７日目、培養物が再刺激される。一態様において、ＮＫ細胞製剤は、１４日目に、続く輸注のためのロット出荷試験及び凍結保存が行われる。ＮＫ細胞は、単回用量アリコート（例えば、１０８個のＮＫ細胞／ｍＬを含有する５０ｍＬ）で凍結保存される。初回ドナー採血量が１単位に相当するものとして（４５０ｍＬ）、１．２６×１０５個のＮＫ細胞／ｍＬの含量中央値及び２週間で２，８００倍の拡大中央値を仮定すれば、各ドナーが３１個の単位用量バッグに十分なＮＫ細胞を作成することができる。ＣＤ３枯渇後に中央値３×１０８個のＮＫ細胞を含有する初回ドナーアフェレーシスを仮定すれば（ＭＤアンダーソン実験）、各ドナーが、平均１６８個の単位用量バッグを作成することができる。１個のバッグが、５０ｋｇの個体に対する１０８個のＮＫ細胞／ｋｇの１用量に十分である。成人患者については、１０８個／ｋｇの用量では、１用量当たり患者１人につき最大２～３個のバッグが必要となり得る。１つの例示的な仮定は、凍結用培地が１０％のＤＭＳＯを含有することであり、１０８個／ｋｇ用量について投与されるＤＭＳＯは、０．１ｍ１／ｋｇとなり得る。
【0088】
ＶＩ．遺伝子タイピング、シーケンシング及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）イムノアッセイ及び蛍光色素
様々な有用な免疫検出法のステップが、科学文献に記載されている。イムノアッセイとは、その最も単純で直接的な意味では、抗体と抗原との間の結合が関わる結合アッセイである。多くのタイプ及びフォーマットのイムノアッセイが公知であり、いずれも、開示されるバイオマーカの検出に好適である。イムノアッセイの例は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、放射性免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）、免疫ビーズ捕捉アッセイ、ウエスタンブロッティング、ドットブロッティング、ゲルシフトアッセイ、フローサイトメトリー、タンパク質アレイ、マルチプレックスビーズアレイ、磁気捕捉、インビボイメージング、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）及び光退色後蛍光回復／局在化法（ＦＲＡＰ／ＦＬＡＰ）である。
様々な有用な免疫検出法のステップが、科学文献に記載されている。イムノアッセイとは、その最も単純で直接的な意味では、抗体と抗原との間の結合が関わる結合アッセイである。多くのタイプ及びフォーマットのイムノアッセイが公知であり、いずれも、開示されるバイオマーカの検出に好適である。イムノアッセイの例は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、放射性免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）、免疫ビーズ捕捉アッセイ、ウエスタンブロッティング、ドットブロッティング、ゲルシフトアッセイ、フローサイトメトリー、タンパク質アレイ、マルチプレックスビーズアレイ、磁気捕捉、インビボイメージング、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）及び光退色後蛍光回復／局在化法（ＦＲＡＰ／ＦＬＡＰ）である。
【0089】
一般に、イムノアッセイには、場合によっては免疫複合体を形成させるのに有効な条件下で、目的の分子（開示されるバイオマーカなど）を含有すると疑われる試料を、目的の分子に対する抗体と接触させること又は目的の分子に対する抗体（開示されるバイオマーカに対する抗体など）を、その抗体の結合を受けることのできる分子と接触させることが関わる。免疫複合体（一次免疫複合体）を形成させるのに有効な条件下且つそれに十分な期間にわたって試料を目的の分子に対する抗体と接触させること又は目的の分子に対する抗体の結合を受けることのできる分子と接触させることは、概して、単純に、分子又は抗体と試料とを接触した状態に至らせ、抗体が結合することのできる存在する任意の分子（例えば、抗原）と抗体が免疫複合体を形成する、即ち、それに結合するのに十分に長い期間にわたってその混合物をインキュベートするという問題である。多くの形態のイムノアッセイにおいて、組織切片、ＥＬＩＳＡプレート、ドットブロット又はウエスタンブロットなどの試料－抗体組成物が、次に洗浄されて、あらゆる非特異的に結合した抗体種が取り除かれ得、特異的に結合した抗体のみが、検出しようとする一次免疫複合体内にあることが許される。
【0090】
本発明の方法の実践に際して、核酸分子の発現レベルの決定は、限定はされないが、サザン解析、ノーザン解析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、「ＰＣＲプロトコル：方法及び応用の手引書（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、イニス（Ｉｎｎｉｓ）ら編、１９９０年、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州を参照されたい）、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＴ）、アンカーＰＣＲ、競合的ＰＣＲ（例えば、米国特許第５，７４７，２５１号明細書を参照されたい）、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅法（ＲＡＣＥ）（例えば、「遺伝子クローニング及び分析：現在のイノベーション（Ｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ）」、１９９７年、ｐ．９９～１１５を参照されたい）；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、欧州特許第０１ ３２０３０８号明細書を参照されたい）、片側ＰＣＲ（オハラ（Ｏｈａｒａ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、１９８９年、第８６巻、ｐ．５６７３～５６７７）、インサイチュハイブリダイゼーション、Ｔａｑｍａｎベースのアッセイ（ホランド（Ｈｏｌｌａｎｄ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、１９９１年、第８８巻、ｐ．７２７６～７２８０）、ディファレンシャルディスプレイ法（例えば、リャン（Ｌｉａｎｇ）ら著、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．）、１９９３年、第２１巻、ｐ．３２６９～３２７５を参照されたい）及び他のＲＮＡフィンガープリント法、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）及び他の転写ベース増幅系、Ｑｂｅｔａレプリカーゼ、ストランド置換増幅（ＳＤＡ）、修復連鎖反応（ＲＣＲ）、ヌクレアーゼ保護アッセイ、サブトラクションベースの方法、Ｒａｐｉｄ－Ｓｃａｎ（商標）などを含め、いかなる方法によっても実施され得る。
【0091】
ハイブリダイゼーション技法では、ＮＫ細胞の特定の特徴をコードするポリヌクレオチドを検出するために核酸プローブが用いられ得る。この技法には、概して、核酸プローブと核酸分子の相補配列との間に特異的なハイブリダイゼーションが起こるような条件下で、対象から入手した生体試料中の核酸分子を核酸プローブと接触させること、インキュベートすることが関わる。インキュベーション後、ハイブリダイズしなかった核酸が除去され、プローブにハイブリダイズした核酸の存在及び量が検出及び定量化される。ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションプローブ及び／又はダイレクトＤＮＡシーケンシングの１つによって遺伝子タイピングが実施される。
【0092】
イムノアッセイは、試料中の目的の分子（開示されるバイオマーカ又はその抗体など）の量を検出又は定量化する方法を含み得、それらの方法には、概して、結合過程で形成される任意の免疫複合体の検出又は定量化が関わる。一般に、免疫複合体形成の検出は、当技術分野において周知であり、数多くの手法の適用を通して達成することができる。それらの方法は、概して、任意の放射性、蛍光、生物学的若しくは酵素的タグ又は任意の他の公知の標識など、標識又はマーカの検出に基づく。
【0093】
本明細書で使用されるとき、標識には、蛍光色素、ビオチン／ストレプトアビジンなどの結合対のメンバー、金属（例えば、金）及び／又は色付きの基質若しくは蛍光の発生によるなどして検出することのできる分子と特異的に相互作用するエピトープタグが含まれる。タンパク質を検出可能となるように標識するのに好適な物質としては、蛍光染料（本明細書では蛍光色素及びフルオロフォアとも呼ばれる）及び比色基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）と反応する酵素が挙げられる。蛍光染料は、極めて低量でも検出可能であるため、本発明の実施に際しては、概して蛍光染料の使用が好ましい。更に、単一のアレイと複数の抗原を反応させる場合、同時検出のため、各抗原が異なる蛍光化合物で標識される。アレイ上の標識されたスポットがフルオリメータを用いて検出され、シグナルの存在が、特異的な抗体に結合した抗原を指示する。
【0094】
フルオロフォアは、発光する化合物又は分子である。典型的には、フルオロフォアは、１つの波長の電磁エネルギーを吸収し、第２の波長の電磁エネルギーを放出する。代表的なフルオロフォアとしては、限定はされないが、１，５ ＩＡＥＤＡＮＳ；１，８－ＡＮＳ；４－メチルウンベリフェロン；５－カルボキシ－２，７－ジクロロフルオレセイン；５－カルボキシフルオレセイン（５－ＦＡＭ）；５－カルボキシナフトフルオレセイン；５－カルボキシテトラメチルローダミン（５－ＴＡＭＲＡ）；５－ヒドロキシトリプタミン（５－ＨＡＴ）；５－ＲＯＸ（カルボキシ－Ｘ－ローダミン）；６－カルボキシローダミン６Ｇ；６－ＣＲ ６Ｇ；６－ＪＯＥ；７－アミノ－４－メチルクマリン；７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）；７－ヒドロキシ－４－Ｉメチルクマリン；９－アミノ－６－クロロ－２－メトキシアクリジン（ＡＣＭＡ）；ＡＢＱ；酸性フクシン；アクリジンオレンジ；アクリジンレッド；アクリジンイエロー；アクリフラビン；アクリフラビンフォイルゲンＳＩＴＳＡ；エクオリン（発光タンパク質）；ＡＦＰ－自己蛍光タンパク質－（クアンタム・バイオテクノロジーズ（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））、ｓｇＧＦＰ、ｓｇＢＦＰを参照されたい；アレクサフルオル３５０（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０）（商標）；アレクサフルオル４３０（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０）（商標）；アレクサフルオル４８８（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８）（商標）；アレクサフルオル５３２（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２）（商標）；アレクサフルオル５４６（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６）（商標）；アレクサフルオル５６８（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８）（商標）；アレクサフルオル５９４（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４）（商標）；アレクサフルオル６３３（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３）（商標）；アレクサフルオル６４７（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）（商標）；アレクサフルオル６６０（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０）（商標）；アレクサフルオル６８０（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０）（商標）；アリザリンコンプレクソン；アリザリンレッド；アロフィコシアニン（ＡＰＣ）；ＡＭＣ、ＡＭＣＡ－Ｓ；アミノメチルクマリン（ＡＭＣＡ）；ＡＭＣＡ－Ｘ；アミノアクチノマイシンＤ；アミノクマリン；アニリンブルー；ステアリン酸アントロシル；ＡＰＣ－Ｃｙ７；ＡＰＴＲＡ－ＢＴＣ；ＡＰＴＳ；アストラゾンブリリアントレッド４Ｇ；アストラゾンオレンジＲ；アストラゾンレッド６Ｂ；アストラゾンイエロー７ ＧＬＬ；アタブリン；ＡＴＴＯ－ＴＡＧ（商標）ＣＢＱＣＡ；ＡＴＴＯ－ＴＡＧ（商標）ＦＱ；オーラミン；オーロホスフィンＧ；オーロホスフィン；ＢＡＯ ９（ビスアミノフェニルオキサジアゾール）；ＢＣＥＣＦ（高ｐＨ）；ＢＣＥＣＦ（低ｐＨ）；硫酸ベルベリン；βラクタマーゼ；ＢＦＰ青色シフト型ＧＦＰ（Ｙ６６Ｈ）；青色蛍光タンパク質；ＢＦＰ／ＧＦＰ ＦＲＥＴ；ビマン；ビスベンゼミド；ビスベンズイミド（ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ））；ビス－ＢＴＣ；ブランコフォル（Ｂｌａｎｃｏｐｈｏｒ）ＦＦＧ；ブランコフォル（Ｂｌａｎｃｏｐｈｏｒ）ＳＶ；Ｂ０１３０（商標）－１；ＢＯＢＯ（商標）－３；ボディパイ４９２／５１５（Ｂｏｄｉｐｙ４９２／５１５）；ボディパイ４９３／５０３（Ｂｏｄｉｐｙ４９３／５０３）；ボディパイ５００／５１０（Ｂｏｄｉｐｙ５００／５１０）；ボディパイ５０５／５１５；ボディパイ５３０／５５０（Ｂｏｄｉｐｙ ５３０／５５０）；ボディパイ５４２／５６３（Ｂｏｄｉｐｙ ５４２／５６３）；ボディパイ５５８／５６８（Ｂｏｄｉｐｙ ５５８／５６８）；ボディパイ５６４／５７０（Ｂｏｄｉｐｙ ５６４／５７０）；ボディパイ５７６／５８９（Ｂｏｄｉｐｙ ５７６／５８９）；ボディパイ５８１／５９１（Ｂｏｄｉｐｙ ５８１／５９１）；ボディパイ６３０／６５０－Ｘ（Ｂｏｄｉｐｙ ６３０／６５０－Ｘ）；ボディパイ６５０／６６５－Ｘ（Ｂｏｄｉｐｙ ６５０／６６５－Ｘ）；ボディパイ６６５／６７６（Ｂｏｄｉｐｙ ６６５／６７６）；ボディパイＦｌ（Ｂｏｄｉｐｙ Ｆｌ）；ボディパイＦＬ ＡＴＰ（Ｂｏｄｉｐｙ ＦＬ ＡＴＰ）；ボディパイＦ１－セラミド（Ｂｏｄｉｐｙ Ｆ１－セラミド）；ボディパイＲ６Ｇ ＳＥ（Ｂｏｄｉｐｙ Ｒ６Ｇ ＳＥ）；ボディパイＴＭＲ（Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭＲ）；ボディパイＴＭＲ－Ｘ（Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭＲ－Ｘ）コンジュゲート；ボディパイＴＭＲ－Ｘ、ＳＥ（Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭＲ－Ｘ、ＳＥ）；ボディパイＴＲ（Ｂｏｄｉｐｙ ＴＲ）；ボディパイＴＲ ＡＴＰ（Ｂｏｄｉｐｙ ＴＲ ＡＴＰ）；ボディパイＴＲ－Ｘ ＳＥ（Ｂｏｄｉｐｙ ＴＲ－Ｘ ＳＥ）；ＢＯ－ＰＲＯ（商標）－１；ＢＯ－ＰＲＯ（商標）－３；ブリリアントスルホフラビンＦＦ；ＢＴＣ；ＢＴＣ－５Ｎ；カルセイン；カルセインブルー；カルシウムクリムソン－；カルシウムグリーン；カルシウムグリーン－１ Ｃａ２＋色素；カルシウムグリーン－２ Ｃａ２＋；カルシウムグリーン－５Ｎ Ｃａ２＋；カルシウムグリーン－Ｃ１８ Ｃａ２＋；カルシウムオレンジ；カルコフロールホワイト；カルボキシ－Ｘ－ローダミン（５－ＲＯＸ）；カスケードブルー（Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ）（商標）；カスケードイエロー；カテコールアミン；ＣＣＦ２（ジーンブレイザー（ＧｅｎｅＢｌａｚｅｒ））；ＣＦＤＡ；ＣＦＰ（シアン蛍光タンパク質）；ＣＦＰ／ＹＦＰ ＦＲＥＴ；クロロフィル；クロモマイシンＡ；クロモマイシンＡ；ＣＬ－ＮＥＲＦ；ＣＭＦＤＡ；セレンテラジン；セレンテラジンｃｐ；セレンテラジンｆ；セレンテラジンｆｃｐ；セレンテラジンｈ；セレンテラジンｈｃｐ；セレンテラジンｉｐ；セレンテラジンｎ；セレンテラジン０；クマリンファロイジン；Ｃ－フィコシアニン；ＣＰＭ Ｉメチルクマリン；ＣＴＣ；ＣＴＣホルマザン；Ｃｙ２（商標）；Ｃｙ３．１ ８；Ｃｙ３．５（商標）；Ｃｙ３（商標）；Ｃｙ５．１ ８；Ｃｙ５．５（商標）；Ｃｙ５（商標）；Ｃｙ７（商標）；シアンＧＦＰ；サイクリックＡＭＰフルオロセンサー（ＦｉＣＲｈＲ）；ダブシル；ダンシル；ダンシルアミン；ダンシルカダベリン；塩化ダンシル；ダンシルＤＨＰＥ；フッ化ダンシル；ＤＡＰＩ；ダポキシル；ダポキシル２；ダポキシル３’ＤＣＦＤＡ；ＤＣＦＨ（ジクロロジヒドロフルオレセイン二酢酸塩）；ＤＤＡＯ；ＤＨＲ（ジヒドロローダミン１２３）；ジ－４－ＡＮＥＰＰＳ；ジ－８－ＡＮＥＰＰＳ（非レシオ）；ＤｉＡ（４－ジ１６－ＡＳＰ）；ジクロロジヒドロフルオレセイン二酢酸塩（ＤＣＦＨ）；ＤｉＤ－親油性トレーサ；ＤｉＤ（Ｄｉ１Ｃ１８（５））；ＤＩＤＳ；ジヒドロローダミン１２３（ＤＨＲ）；Ｄｉｌ（ＤｉｌＣ１８（３））；Ｉジニトロフェノール；ＤｉＯ（ＤｉＯＣ１８（３））；ＤｉＲ；ＤｉＲ（Ｄｉ１Ｃ１８（７））；ＤＭ－ＮＥＲＦ（高ｐＨ）；ＤＮＰ；ドーパミン；ＤｓＲｅｄ；ＤＴＡＦ；ＤＹ－６３０－ＮＨＳ；ＤＹ－６３５－ＮＨＳ；ＥＢＦＰ；ＥＣＦＰ；ＥＧＦＰ；ＥＬＦ ９７；エオシン；エリスロシン；エリスロシンＩＴＣ；臭化エチジウム；エチジウムホモ二量体－１（ＥｔｈＤ－１）；オイクリシン（Ｅｕｃｈｒｙｓｉｎ）；ユーコライト（ＥｕｋｏＬｉｇｈｔ）；塩化ユウロピウム（１１１）；ＥＹＦＰ；ファストブルー；ＦＤＡ；フォイルゲン（パラロザニリン）；ＦＩＦ（ホルムアルデヒド誘導性蛍光）；ＦＩＴＣ；フラゾオレンジ；フルオ－３（Ｆｌｕｏ－３）；フルオ－４（Ｆｌｕｏ－４）；フルオレセイン（ＦＩＴＣ）；フルオレセイン二酢酸塩；フルオロエメラルド；フルオロゴールド（ヒドロキシスチルバミジン）；フルオル・ルビー（Ｆｌｕｏｒ－Ｒｕｂｙ）；フルオルＸ（ＦｌｕｏｒＸ）；ＦＭ １－４３（商標）；ＦＭ ４－４６；フラレッド（Ｆｕｒａ Ｒｅｄ）（商標）（高ｐＨ）；Ｆｕｒａ Ｒｅｄ（商標）／フルオ－３（Ｆｌｕｏ－３）；フラ－２（Ｆｕｒａ－２）；フラ－２（Ｆｕｒａ－２）／ＢＣＥＣＦ；ジェナクリル（Ｇｅｎａｃｒｙｌ）ブリリアントレッドＢ；ジェナクリル（Ｇｅｎａｃｒｙｌ）ブリリアントイエロー１０ＧＦ；ジェナクリル（Ｇｅｎａｃｒｙｌ）ピンク３Ｇ；ジェナクリル（Ｇｅｎａｃｒｙｌ）イエロー５ＧＦ；ジーンブレイザー（ＧｅｎｅＢｌａｚｅｒ）；（ＣＣＦ２）；ＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）；ＧＦＰ赤色シフト型（ｒｓＧＦＰ）；ＧＦＰ野生型非ＵＶ励起（ｗｔＧＦＰ）；ＧＦＰ野生型、ＵＶ励起（ｗｔＧＦＰ）；ＧＦＰｕｖ；Ｇｌシュウ酸；グラニュラーブルー；ヘマトポルフィリン；ヘキスト３３２５８（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８）；ヘキスト３３３４２（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２）；ヘキスト３４５８０（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３４５８０）；Ｉ ＩＰＴＳ；ヒドロキシクマリン；ヒドロキシスチルバミジン（フルオルゴールド（Ｆｌｕｏｒ Ｇｏｌｄ））；ヒドロキシトリプタミン；インド－１、高カルシウム；インド－１ 低カルシウム；インドジカルボシアニン（ＤｉＤ）；インドトリカルボシアニン（ＤｉＲ）；イントラホワイトＣｆ（Ｉｎｔｒａｗｈｉｔｅ Ｃｆ）；ＪＣ－１；ＪＯ Ｊ０－１；ＪＯ－ＰＲＯ－１；レーザプロ（ＬａｓｅｒＰｒｏ）；ラロダン（Ｌａｕｒｏｄａｎ）；ＬＤＳ ７５１（ＤＮＡ）；ＬＤＳ ７５１（ＲＮＡ）；ロイコフォルＰＡＦ（Ｌｅｕｃｏｐｈｏｒ ＰＡＦ）；ロイコフォルＳＦ（Ｌｅｕｃｏｐｈｏｒ ＳＦ）；ロイコフォルＷＳ（Ｌｅｕｃｏｐｈｏｒ ＷＳ）；リサミンローダミン；リサミンローダミンＢ；カルセイン／エチジウムホモ二量体；ＬＯＬＯ－１；ＬＯ－ＰＲＯ－１；；ルシファーイエロー；リゾトラッカー（Ｌｙｓｏ Ｔｒａｃｋｅｒ）ブルー；リゾトラッカー（Ｌｙｓｏ Ｔｒａｃｋｅｒ）ブルー－ホワイト；リゾトラッカー（Ｌｙｓｏ Ｔｒａｃｋｅｒ）グリーン；リゾトラッカー（Ｌｙｓｏ Ｔｒａｃｋｅｒ）レッド；リゾトラッカー（Ｌｙｓｏ Ｔｒａｃｋｅｒ）イエロー；リゾセンサー（ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ）ブルー；リゾセンサー（ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ）グリーン；リゾセンサー（ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ）イエロー／ブルー；マググリーン；マグダラレッド（フロキシンＢ）；マグフラレッド；マグフラ２；マグフラ５；マグインド１；マグネシウムグリーン；マグネシウムオレンジ；マラカイトグリーン；マリーナブルー；Ｉマキシロン（Ｍａｘｉｌｏｎ）ブリリアントフラビン１０ ＧＦＦ；マキシロン（Ｍａｘｉｌｏｎ）ブリリアントフラビン８ ＧＦＦ；メロシアニン；メトキシクマリン；ミトトラッカー（Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ）グリーンＦＭ；ミトトラッカー（Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ）オレンジ；ミトトラッカー（Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ）レッド；ミトラマイシン；モノブロモビマン；モノブロモビマン（ｍＢＢｒ－ＧＳＨ）；モノクロロビマン；ＭＰＳ（メチルグリーンピロニンスチルベン）；ＮＢＤ；ＮＢＤアミン；ナイルレッド；ニトロベンゾオキサジアゾール；ノルアドレナリン；ヌクレアファストレッド；ｉヌクレアイエロー；ニロサン（Ｎｙｌｏｓａｎ）ブリリアントフラビンＥ８Ｇ；オレゴングリーン（Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ）（商標）；オレゴングリーン（Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ）（商標）４８８；オレゴングリーン（Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ）（商標）５００；オレゴングリーン（商標）５１４；パシフィックブルー；パラロザニリン（フォイルゲン）；ＰＢＦＩ；ＰＥ－Ｃｙ５；ＰＥ－Ｃｙ７；ＰｅｒＣＰ；ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５；ＰＥ－テキサスレッド（レッド６１３）；フロキシンＢ（マグダラレッド）；フォルワイトＡＲ（Ｐｈｏｒｗｉｔｅ ＡＲ）；フォルワイトＢＫＬ（Ｐｈｏｒｗｉｔｅ ＢＫＬ）；フォルワイトＲｅｖ（Ｐｈｏｒｗｉｔｅ Ｒｅｖ）；フォルワイトＲＰＡ（Ｐｈｏｒｗｉｔｅ ＲＰＡ）；ホスフィン３Ｒ；フォトレジスト；フィコエリトリンＢ［ＰＥ］；フィコエリトリンＲ［ＰＥ］；ＰＫＨ２６（シグマ（Ｓｉｇｍａ））；ＰＫＨ６７；ＰＭＩＡ；ポントクロームブルーブラック（Ｐｏｎｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｂｌｕｅ Ｂｌａｃｋ）；ＰＯＰＯ－１；ＰＯＰＯ－３；ＰＯ－ＰＲＯ－１；ＰＯ－Ｉ ＰＲＯ－３；プリムリン；プロシオンイエロー；ヨウ化プロピジウム（
ＰＩ）；ＰｙＭＰＯ；ピレン；ピロニン；ピロニンＢ；ピロザール（Ｐｙｒｏｚａｌ）ブリリアントフラビン７ＧＦ；ＱＳＹ ７；キナクリンマスタード；レゾルフィン；ＲＨ ４１４；ロード２；ローダミン；ローダミン１１０；ローダミン１２３；ローダミン５ ＧＬＤ；ローダミン６Ｇ；ローダミンＢ；ローダミンＢ ２００；ローダミンＢエキストラ；ローダミンＢＢ；ローダミンＢＧ；ローダミングリーン；ローダミンファリシジン；ローダミンファロイジン；ローダミンレッド；ローダミンＷＴ；ローズベンガル；Ｒ－フィコシアニン；Ｒ－フィコエリトリン（ＰＥ）；ｒｓＧＦＰ；Ｓ６５Ａ；Ｓ６５Ｃ；Ｓ６５Ｌ；Ｓ６５Ｔ；サファイアＧＦＰ；ＳＢＦＩ；セロトニン；セブロン（Ｓｅｖｒｏｎ）ブリリアントレッド２Ｂ；セブロン（Ｓｅｖｒｏｎ）ブリリアントレッド４Ｇ；セブロン（Ｓｅｖｒｏｎ）ＩブリリアントレッドＢ；セブロン（Ｓｅｖｒｏｎ）オレンジ；セブロン（Ｓｅｖｒｏｎ）イエローＬ；ｓｇＢＦＰ（商標）（スーパーグローＢＦＰ）；ｓｇＧＦＰ（商標）（スーパーグローＧＦＰ）；ＳＩＴＳ（プリムリン；スチルベンイソチオスルホン酸）；ＳＮＡＦＬカルセイン；ＳＮＡＦＬ－１；ＳＮＡＦＬ－２；ＳＮＡＲＦカルセイン；ＳＮＡＲＦＩ；ナトリウムグリーン；スペクトラムアクア（ＳｐｅｃｔｒｕｍＡｑｕａ）；スペクトラムグリーン（ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ）；スペクトラムオレンジ（ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ）；スペクトルレッド；ＳＰＱ（６－メトキシ－Ｎ－（３スルホプロピル）キノリニウム）；スチルベン；スルホローダミンＢ及びＣ；スルホローダミンエキストラ；ＳＹＴＯ １１；ＳＹＴＯ １２；ＳＹＴＯ １３；ＳＹＴＯ １４；ＳＹＴＯ １５；ＳＹＴＯ １６；ＳＹＴＯ １７；ＳＹＴＯ １８；ＳＹＴＯ ２０；ＳＹＴＯ ２１；ＳＹＴＯ ２２；ＳＹＴＯ ２３；ＳＹＴＯ ２４；ＳＹＴＯ ２５；ＳＹＴＯ ４０；ＳＹＴＯ ４１；ＳＹＴＯ ４２；ＳＹＴＯ ４３；ＳＹＴＯ ４４；ＳＹＴＯ ４５；ＳＹＴＯ ５９；ＳＹＴＯ ６０；ＳＹＴＯ ６１；ＳＹＴＯ ６２；ＳＹＴＯ ６３；ＳＹＴＯ ６４；ＳＹＴＯ ８０；ＳＹＴＯ ８１；ＳＹＴＯ ８２；ＳＹＴＯ ８３；ＳＹＴＯ ８４；ＳＹＴＯ ８５；ＳＹＴＯＸブルー；ＳＹＴＯＸグリーン；ＳＹＴＯＸオレンジ；テトラサイクリン；テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）；テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）（商標）；テキサスレッド－Ｘ（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ－Ｘ）（商標）コンジュゲート；チアジカルボシアニン（ＤｉＳＣ３）；チアジンレッドＲ；チアゾールオレンジ；チオフラビン５；チオフラビンＳ；チオフラビンＴＯＮ；チオライト（Ｔｈｉｏｌｙｔｅ）；チオゾール（Ｔｈｉｏｚｏｌｅ）オレンジ；チノポールＣＢＳ（Ｔｉｎｏｐｏｌ ＣＢＳ）（カルコフロールホワイト）；ＴＩＥＲ；ＴＯ－ＰＲＯ－１；ＴＯ－ＰＲＯ－３；ＴＯ－ＰＲＯ－５；ＴＯＴＯ－１；ＴＯＴＯ－３；トリコロール（ＴｒｉＣｏｌｏｒ）（ＰＥ－Ｃｙ５）；ＴＲＩＴＣイソチオシアン酸テトラメチルローダミン；トゥルーブルー（Ｔｒｕｅ Ｂｌｕｅ）；トゥルーレッド（Ｔｒｕ Ｒｅｄ）；ウルトラライト（Ｕｌｔｒａｌｉｔｅ）；ウラニンＢ；ユビテックスＳＦＣ（Ｕｖｉｔｅｘ ＳＦＣ）；ｗｔ ＧＦＰ；ＷＷ ７８１；Ｘ－ローダミン；ＸＲＩＴＣ；キシレンオレンジ；Ｙ６６Ｆ；Ｙ６６Ｈ；Ｙ６６Ｗ；黄色ＧＦＰ；ＹＦＰ；ＹＯ－ＰＲＯ－１；ＹＯ－ＰＲＯ ３；ＹＯＹ０－１；ＹＯＹ０－３；サイバーグリーン（Ｓｙｂｒ Ｇｒｅｅｎ）；チアゾールオレンジ（インターカレータ型色素）；量子ドットなどの半導体ナノ粒子；又はケージドフルオロフォア（これは光又は他の電磁エネルギー供給源によって活性化可能である）又はこれらの組み合わせが挙げられる。
ＰＩ）；ＰｙＭＰＯ；ピレン；ピロニン；ピロニンＢ；ピロザール（Ｐｙｒｏｚａｌ）ブリリアントフラビン７ＧＦ；ＱＳＹ ７；キナクリンマスタード；レゾルフィン；ＲＨ ４１４；ロード２；ローダミン；ローダミン１１０；ローダミン１２３；ローダミン５ ＧＬＤ；ローダミン６Ｇ；ローダミンＢ；ローダミンＢ ２００；ローダミンＢエキストラ；ローダミンＢＢ；ローダミンＢＧ；ローダミングリーン；ローダミンファリシジン；ローダミンファロイジン；ローダミンレッド；ローダミンＷＴ；ローズベンガル；Ｒ－フィコシアニン；Ｒ－フィコエリトリン（ＰＥ）；ｒｓＧＦＰ；Ｓ６５Ａ；Ｓ６５Ｃ；Ｓ６５Ｌ；Ｓ６５Ｔ；サファイアＧＦＰ；ＳＢＦＩ；セロトニン；セブロン（Ｓｅｖｒｏｎ）ブリリアントレッド２Ｂ；セブロン（Ｓｅｖｒｏｎ）ブリリアントレッド４Ｇ；セブロン（Ｓｅｖｒｏｎ）ＩブリリアントレッドＢ；セブロン（Ｓｅｖｒｏｎ）オレンジ；セブロン（Ｓｅｖｒｏｎ）イエローＬ；ｓｇＢＦＰ（商標）（スーパーグローＢＦＰ）；ｓｇＧＦＰ（商標）（スーパーグローＧＦＰ）；ＳＩＴＳ（プリムリン；スチルベンイソチオスルホン酸）；ＳＮＡＦＬカルセイン；ＳＮＡＦＬ－１；ＳＮＡＦＬ－２；ＳＮＡＲＦカルセイン；ＳＮＡＲＦＩ；ナトリウムグリーン；スペクトラムアクア（ＳｐｅｃｔｒｕｍＡｑｕａ）；スペクトラムグリーン（ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ）；スペクトラムオレンジ（ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ）；スペクトルレッド；ＳＰＱ（６－メトキシ－Ｎ－（３スルホプロピル）キノリニウム）；スチルベン；スルホローダミンＢ及びＣ；スルホローダミンエキストラ；ＳＹＴＯ １１；ＳＹＴＯ １２；ＳＹＴＯ １３；ＳＹＴＯ １４；ＳＹＴＯ １５；ＳＹＴＯ １６；ＳＹＴＯ １７；ＳＹＴＯ １８；ＳＹＴＯ ２０；ＳＹＴＯ ２１；ＳＹＴＯ ２２；ＳＹＴＯ ２３；ＳＹＴＯ ２４；ＳＹＴＯ ２５；ＳＹＴＯ ４０；ＳＹＴＯ ４１；ＳＹＴＯ ４２；ＳＹＴＯ ４３；ＳＹＴＯ ４４；ＳＹＴＯ ４５；ＳＹＴＯ ５９；ＳＹＴＯ ６０；ＳＹＴＯ ６１；ＳＹＴＯ ６２；ＳＹＴＯ ６３；ＳＹＴＯ ６４；ＳＹＴＯ ８０；ＳＹＴＯ ８１；ＳＹＴＯ ８２；ＳＹＴＯ ８３；ＳＹＴＯ ８４；ＳＹＴＯ ８５；ＳＹＴＯＸブルー；ＳＹＴＯＸグリーン；ＳＹＴＯＸオレンジ；テトラサイクリン；テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）；テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）（商標）；テキサスレッド－Ｘ（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ－Ｘ）（商標）コンジュゲート；チアジカルボシアニン（ＤｉＳＣ３）；チアジンレッドＲ；チアゾールオレンジ；チオフラビン５；チオフラビンＳ；チオフラビンＴＯＮ；チオライト（Ｔｈｉｏｌｙｔｅ）；チオゾール（Ｔｈｉｏｚｏｌｅ）オレンジ；チノポールＣＢＳ（Ｔｉｎｏｐｏｌ ＣＢＳ）（カルコフロールホワイト）；ＴＩＥＲ；ＴＯ－ＰＲＯ－１；ＴＯ－ＰＲＯ－３；ＴＯ－ＰＲＯ－５；ＴＯＴＯ－１；ＴＯＴＯ－３；トリコロール（ＴｒｉＣｏｌｏｒ）（ＰＥ－Ｃｙ５）；ＴＲＩＴＣイソチオシアン酸テトラメチルローダミン；トゥルーブルー（Ｔｒｕｅ Ｂｌｕｅ）；トゥルーレッド（Ｔｒｕ Ｒｅｄ）；ウルトラライト（Ｕｌｔｒａｌｉｔｅ）；ウラニンＢ；ユビテックスＳＦＣ（Ｕｖｉｔｅｘ ＳＦＣ）；ｗｔ ＧＦＰ；ＷＷ ７８１；Ｘ－ローダミン；ＸＲＩＴＣ；キシレンオレンジ；Ｙ６６Ｆ；Ｙ６６Ｈ；Ｙ６６Ｗ；黄色ＧＦＰ；ＹＦＰ；ＹＯ－ＰＲＯ－１；ＹＯ－ＰＲＯ ３；ＹＯＹ０－１；ＹＯＹ０－３；サイバーグリーン（Ｓｙｂｒ Ｇｒｅｅｎ）；チアゾールオレンジ（インターカレータ型色素）；量子ドットなどの半導体ナノ粒子；又はケージドフルオロフォア（これは光又は他の電磁エネルギー供給源によって活性化可能である）又はこれらの組み合わせが挙げられる。
【0095】
一態様において、放射性核種などの修飾因子単位が、ハロゲン化によって本明細書に記載される化合物のいずれかに取り込まれるか又はそれに直接取り付けられる。この実施形態において有用な放射性核種の例としては、限定はされないが、トリチウム、ヨウ素１２５、ヨウ素１３１、ヨウ素１２３、ヨウ素１２４、アスタチン２１０、炭素１１、炭素１４、窒素１３、フッ素１８が挙げられる。別の態様において、放射性核種は、連結基に取り付けられるか又はキレート基によって結合し、次にそれが化合物に直接又はリンカーを用いて取り付けられる。この実施形態において有用な放射性核種の例としては、限定はされないが、Ｔｃ－９９ｍ、Ｒｅ－１８６、Ｇａ－６８、Ｒｅ－１８８、Ｙ－９０、Ｓｍ－１５３、Ｂｉ－２１２、Ｃｕ－６７、Ｃｕ－６４及びＣｕ－６２が挙げられる。これらのような放射標識技法は、放射性医薬品業界ではルーチンで用いられている。
【0096】
放射性標識化合物は、哺乳類（例えば、ヒト）における神経学的疾患（例えば、神経変性疾患）若しくは精神状態の診断又はかかる疾患若しくは状態の進行若しくは治療の経過観察のための造影剤として有用である。本明細書に記載される放射性標識は、好都合には、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）又は単光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）などのイメージング技法と併せて使用可能である。
【0097】
標識は、直接標識又は間接標識のいずれかである。直接標識では、検出抗体（目的の分子に対する抗体）又は検出分子（目的の分子に対する抗体の結合を受けることができる分子）が標識を含む。標識の検出が検出抗体又は検出分子の存在を示し、次に、これが、それぞれ目的の分子又は目的の分子に対する抗体の存在を示す。間接標識では、追加の分子又は部分を免疫複合体と接触させるか、又は免疫複合のその部位に生じさせる。例えば、酵素などのシグナル発生分子又は部分を検出抗体又は検出分子に取り付けるか又はそれと結び付けることができる。次に、シグナル発生分子が、免疫複合体のその部位で検出可能シグナルを発生することができる。例えば、酵素は、好適な基質を供給されると、免疫複合体のその部位に視認可能又は検出可能な産物を生じる。ＥＬＩＳＡは、この種の間接標識を用いる。
【0098】
間接標識の別の例として、一次抗体に対する二次抗体など、目的の分子又は目的の分子に対する抗体（一次抗体）のいずれかに結合することができる追加の分子（これは結合剤と称することができる）を免疫複合体と接触させることができる。この追加の分子は、標識又はシグナル発生分子又は部分を有する。追加の分子は、抗体であり得、従って、これは、二次抗体と呼ぶことができる。二次抗体が一次抗体に結合すると、第１の（又は一次）抗体及び目的の分子といわゆるサンドイッチを形成し得る。免疫複合体は、標識された二次抗体と、二次免疫複合体を形成させるのに有効な条件下且つそれに十分な期間にわたって接触させることができる。次に、二次免疫複合体は、概して洗浄され、あらゆる非特異的に結合した標識二次抗体が除去され得、二次免疫複合体の残りの標識が検出され得る。追加の分子は、ビオチン／アビジン対など、互いに結合することのできる一対の分子又は部分の一方でもあり得るか又はそれを含み得る。この方式では、検出抗体又は検出分子は対の他方のメンバーを含まなければならない。
【0099】
他の間接標識方式としては、二段階手法による一次免疫複合体の検出が挙げられる。例えば、目的の分子又は対応する抗体に結合親和性を示す抗体などの分子（例えば、第１の結合剤）を使用して、上記に記載したとおりの二次免疫複合体を形成することができる。
【0100】
洗浄後、二次免疫複合体は、第１の結合剤に結合親和性を示す別の分子（これは第２の結合剤と称することができる）と、この場合もやはり免疫複合体を形成させるのに有効な条件下且つそれに十分な期間にわたって接触させることができる（このようにして三次免疫複合体が形成される）。第２の結合剤は検出可能標識又はシグナル発生分子又は部分に連結され得、このようにして形成された三次免疫複合体の検出が可能となる。このシステムは、シグナルの増幅をもたらし得る。
【0101】
タンパク質又は特異的タンパク質に対する抗体など、物質そのものの検出が関わるイムノアッセイとしては、無標識アッセイ、タンパク質分離法（例えば、電気泳動法）、固体支持体捕捉アッセイ又はインビボ検出が挙げられる。無標識アッセイは、概して、試料中の特異的タンパク質又は特異的タンパク質に対する抗体の存在又は非存在を決定する診断手段である。タンパク質分離法は、加えて、サイズ又は正味電荷など、タンパク質の物理的特性の評価に有用である。捕捉アッセイは、概して、試料中の特異的タンパク質又は特異的タンパク質に対する抗体の濃度の定量的評価に一層有用である。最後に、インビボ検出は、物質の空間的発現パターン、例えば、対象、組織又は細胞中のどこにその物質を見つけ出すことができるかの評価に有用である。
【0102】
濃度が十分であれば、抗体抗原相互作用によって生成される分子複合体（［Ａｂ－Ａｇ］ｎ）は肉眼で見ることができ、しかし少量であっても、光線を散乱させるその能力に起因して検出及び測定し得る。複合体の形成は、両方の反応物が存在することを意味し、免疫沈降アッセイでは、定濃度の試薬抗体を使用して特異的抗原（［Ａｂ－Ａｇ］ｎ）を測定し、試薬抗原を使用して特異的抗体（［Ａｂ－Ａｇ］ｎ）を検出する。試薬種が予め細胞（血球凝集アッセイのように）又は極めて小さい粒子（ラテックス凝集反応アッセイの場合のように）にコーティングされている場合、はるかに低い濃度でも、コーティングされた粒子の「集塊化」が目に見える。このような基本原理に基づく種々のアッセイは、オクタロニー免疫拡散アッセイ、ロケット免疫電気泳動法並びに免疫濁度滴定及び比濁アッセイを含め、一般に用いられている。かかるアッセイの主な制限は、標識を利用するアッセイと比較して感度が限られている（検出限界が低い）ことであり、ある場合には、検体の濃度が極めて高いと、実際には複合体形成が阻害されるため、対抗手段が必要になるという事実により、この手順が一層複雑化する。これらのグループ１アッセイの一部は、直ちに抗体の発見にまで遡り、いずれも実際の「標識」（例えばＡｇ－ｅｎｚ）を有しない。無標識であるイムノアッセイの他の種類は、免疫センサーに依存し、現在、抗体抗原相互作用を直接検出することのできる種々の機器が市販されている。ほとんどは、固定化リガンドを有するセンサー表面にエバネセント波を発生させることに依存し、これがリガンドへの結合の連続的なモニタリングを可能にする。免疫センサーは、速度論的相互作用の容易な調査を可能にし、低価格の専門的な機器が出現すれば、免疫分析において将来、広い応用が見出され得る。
【0103】
イムノアッセイを用いた特異的タンパク質の検出には、電気泳動法によるタンパク質の分離が関わり得る。電気泳動法は、電界に応答した溶液中における荷電分子の遊走である。その遊走速度は、電界強度；分子の正味電荷、サイズ及び形状に依存し、分子が中を動く媒体のイオン強度、粘度及び温度にも依存する。分析ツールとして、電気泳動法は、単純、迅速、且つ高感度である。これは、単一荷電種の特性を試験するため分析的に用いられ、且つ分離技法として用いられる。
【0104】
概して、試料が、紙、酢酸セルロース、デンプンゲル、アガロース又はポリアクリルアミドゲルなどの支持体マトリックスに流される。マトリックスは、加熱によって引き起こされる対流混合を抑制し、電気泳動ランの記録を提供する：ランの終了時、マトリックスを染色して、走査、オートラジオグラフィー又は貯蔵に使用することができる。加えて、最も一般的に用いられる支持体マトリックス － アガロース及びポリアクリルアミド － は、それが多孔質ゲルであるという点で、サイズによる分子の分離手段を提供する。多孔質ゲルは、小型の分子は自由に遊走させつつ、大きい高分子の移動を遅らせるか又はある場合には完全に遮ることにより、篩としての役割を果たし得る。希アガロースゲルは、概して、同じ濃度のポリアクリルアミドと比べてより硬質で、取り扱い易いため、核酸、大型タンパク質及びタンパク質複合体などの大型高分子の分離にはアガロースが使用される。取り扱い易く、且つ高濃度にするのが容易なポリアクリルアミドは、遅らせるために小さいゲル細孔径が必要な多くのタンパク質及び低分子オリゴヌクレオチドの分離に使用される。
【0105】
タンパク質は両性化合物である；従ってその正味電荷は、それが懸濁される媒体のｐＩによって決まる。その等電点を上回るｐＨの溶液中では、タンパク質は負の正味電荷を有し、電界中をアノードに向かって遊走する。その等電点を下回るとき、タンパク質は正電荷であり、カソードに向かって遊走する。加えて、そのサイズとは無関係に、タンパク質が帯びている正味電荷 － 即ち、分子の単位質量当たり（又は長さ当たり、所与のタンパク質及び核酸は、線状の高分子である）に帯びている電荷は、タンパク質毎に異なる。従って所与のｐＨ及び非変性条件下において、タンパク質の電気泳動分離は、分子のサイズ及び電荷の両方によって決まる。
【0106】
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）は、ポリペプチド骨格に「巻き付く」ことによってタンパク質を変性させるアニオン性界面活性剤であり － 及びＳＤＳはタンパク質に対し、１．４：１の質量比でかなり特異的に結合する。その際、ＳＤＳはポリペプチドに、その長さに比例する負電荷を付与する。更に、通常、タンパク質がサイズ別の分離に必要なランダムコイル構造をとる前に、タンパク質のジスルフィド架橋を還元する（変性させる）必要がある；これは、２－メルカプトエタノール又はジチオスレイトール（ＤＴＩ）によって行われる。従ってＳＤＳ－ＰＡＧＥ分離の変性では、遊走はポリペプチドの固有の電荷によって決まるのでなく、分子量によって決まる。
【0107】
分子量の決定は、特徴付けようとするタンパク質と共に既知の分子量のタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけることによって行われる。ＳＤＳ変性したポリペプチド又は未変性の核酸の分子量の対数と、そのＲｆとの間には、線形関係が存在する。Ｒｆは、マーカ色素の最前部が遊走した距離に対する分子が遊走した距離の比として計算される。電気泳動法によって相対分子量（Ｍｒ）を決定する単純な方法は、既知の試料のｌｏｇｌ ＯＭＷに対する遊走した距離の標準曲線をプロットし、同じゲル上を遊走した距離を測定した後に試料のｌｏｇＭｒを読み取ることである。
【0108】
二次元電気泳動法では、初めに、タンパク質は、ある物理的特性を基準として分画され、且つ第２段階において別の基準で分画される。例えば、第１の次元に、好都合にはチューブゲルで行われる等電点電気泳動法を用いることができ、且つ第２の次元に、スラブゲルでのＳＤＳ電気泳動法を用いることができる。レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）緩衝系中のリーディングイオンは塩化物であり、トレーリングイオンはグリシンである。従って、分解用ゲル及びスタッキングゲルは、（種々の濃度及びｐＨの）トリス－ＨＣｌ緩衝液中に構成される一方、泳動槽緩衝液は、トリス－グリシンである。緩衝液は、全て０．１％ＳＤＳを含有する。
【0109】
本方法に企図される電気泳動法を用いるイムノアッセイの一例は、ウエスタンブロット分析である。ウエスタンブロッティング又はイムノブロッティングは、種々の試料中に存在するタンパク質の分子質量の決定及びタンパク質の相対量の測定を可能にする。検出方法には、化学発光法及び発色検出法が含まれる。
【0110】
概して、タンパク質は、ゲル電気泳動、通常、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離される。タンパク質は、一枚の特別なブロッティングペーパ、例えばニトロセルロースに転写されるが、他のタイプのペーパ又は膜も使用し得る。タンパク質は、それがゲルに置かれたときと同じ分離パターンを保っている。ブロットを汎用的なタンパク質（乳タンパク質など）とインキュベートすると、ニトロセルロース上のいずれか残りの粘着性箇所に結合する。次に溶液に抗体が加えられ、この抗体は、その特異的タンパク質に結合することが可能なものである。
【0111】
特異的固定化抗原への特異的抗体の取り付けは、発色基質（例えば、アルカリホスファターゼ又は西洋ワサビペルオキシダーゼ）又は化学発光基質を通常使用する間接的酵素イムノアッセイ技法によって容易に視覚化することができる。他のプローブ法の可能性としては、蛍光又は放射性同位体標識（例えば、フルオレセイン、１２５１）の使用が挙げられる。抗体結合の検出のためのプローブは、コンジュゲート型抗免疫グロブリン、コンジュゲート型ブドウ球菌プロテインＡ（ＩｇＧに結合する）又はビオチン化一次抗体に対するプローブ（例えば、コンジュゲート型アビジン／ストレプトアビジン）であり得る。
【0112】
この技法の力量は、特異的タンパク質を、その抗原性及びその分子質量を用いて同時に検出することにある。初めにタンパク質がＳＤＳ－ＰＡＧＥで質量別に分離され、次にイムノアッセイステップで特異的に検出される。従って、タンパク質標準物質（ラダー）を同時に流して、異種試料中の目的のタンパク質の分子質量を近似することができる。
【0113】
ゲルシフトアッセイ又は電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）は、定性的方法及び定量的方法の両方での、ＤＮＡ結合タンパク質とそのコグネイトＤＮＡ認識配列との間の相互作用の検出に使える。
【0114】
一般的なゲルシフトアッセイでは、精製タンパク質又は粗細胞抽出物が、標識した（例えば、３２Ｐ放射性標識した）ＤＮＡ又はＲＮＡプローブと共にインキュベートされ、続いて非変性ポリアクリルアミドゲル中で複合体が遊離プローブと分離される。複合体は、ゲル中を未結合のプローブと比べてゆっくりと遊走する。結合タンパク質の活性次第で、標識プローブは二本鎖又は一本鎖のいずれでもあり得る。転写因子などのＤＮＡ結合タンパク質の検出には、精製された若しくは部分的に精製されたタンパク質又は核の細胞抽出物のいずれかを使用することができる。ＲＮＡ結合タンパク質の検出には、精製された若しくは部分的に精製されたタンパク質又は核若しくは細胞質の細胞抽出物のいずれかを使用することができる。推定上の結合部位についてのＤＮＡ又はＲＮＡ結合タンパク質の特異性は、目的のタンパク質の結合部位を含むＤＮＡ若しくはＲＮＡ断片若しくはオリゴヌクレオチド又は他の無関係の配列を使用した競合実験によって確立される。特異的及び非特異的競合相手の存在下で形成される複合体の性質及び強度の差から、特異的相互作用を同定することが可能である。ゲルシフト法には、例えば、コロイド形態のクーマシ（ＣＯＯＭＡＳＳＩＥ）（インペリアル・ケミカル・インダストリーズ・リミテッド（Ｉｍｐｅｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ））ブルー染色を用いて、ポリアクリルアミド電気泳動ゲルなどのゲル中のタンパク質を検出することが含まれ得る。上記に参照する従来のタンパク質アッセイ法に加えて、クリーニング用及びタンパク質染色用組成物の組み合わせが、米国特許第５，４２４，０００号明細書（ゲルシフト法に関するその教示について、本明細書に全体として参照により援用される）に記載されている。溶液は、リン酸、硫酸及び硝酸並びにアシッドバイオレット色素を含むことができる。
【0115】
放射性免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）は、放射性標識抗原を用いて血清中の特異的抗体を検出する高感度アッセイである。抗原を血清と反応させておき、次に、例えばプロテインＡセファロースビーズなど、特別な試薬を使用して沈降させる。次に、結合した放射性標識免疫沈降物が、一般にはゲル電気泳動によって分析される。放射性免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）が、ＨＩＶ抗体の存在を診断するための確認試験として用いられることが多い。ＲＩＰＡは、当技術分野では、ファーアッセイ、沈降アッセイ、放射性免疫沈降アッセイ；放射性免疫沈降分析；放射性免疫沈降分析及び放射性免疫沈降分析とも称される。
【0116】
電気泳動法を利用して目的の特異的タンパク質を分離及び検出する上記のイムノアッセイによれば、タンパク質サイズの評価が可能となるが、こうしたアッセイは、タンパク質濃度を評価するには、あまり感度が高くない。しかしながら、タンパク質又はタンパク質に特異的な抗体を固体支持体（例えば、チューブ、ウェル、ビーズ及び／又は細胞）に結合して、同支持体上のタンパク質又はタンパク質に特異的な抗体を検出する方法と組み合わせて、試料からそれぞれ目的の抗体又はタンパク質を捕捉するイムノアッセイも企図される。かかるイムノアッセイの例としては、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、フローサイトメトリー、タンパク質アレイ、マルチプレックスビーズアッセイ及び／又は磁気捕捉が挙げられる。
【0117】
ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）は、放射活性標識した物質（放射性リガンド）を直接的又は間接的のいずれかで使用して抗原抗体反応を検出することにより、特異的抗体又は他の受容体システムに対する非標識物質の結合を測定する古典的な定量アッセイである。ラジオイムノアッセイは、例えば、バイオアッセイを用いる必要のない、血中のホルモンレベルの検査に用いられる。抗体形成の誘導能を有する大型のキャリアータンパク質（例えば、ウシγ－グロブリン又はヒト血清アルブミン）にカップリングされる場合、非免疫原性物質（例えば、ハプテン）も測定することができる。ＲＩＡには、放射性抗原を（ヨウ素原子はタンパク質中のチロシン残基に容易に取り入れることができるため、多くの場合に放射性同位体１２５１又は１３１１が用いられる）、その抗原に対する抗体と混合することが関わる。抗体は、概して、チューブ又はビーズなどの固体支持体に連結される。次に、非標識又は「冷式（ｃｏｌｄ）」抗原を既知量で加えること、置き換えられた（ｄｉｓｐｌａｃｅｄ）標識抗原の量を測定することである。当初、放射性抗原は抗体に結合する。冷式抗原を加えると、これら２つが抗体結合部位に関して競合し － 及び冷式抗原の濃度が高くなると、抗体への結合が増し、放射性変異体に置き換わる。溶液中で結合抗原が未結合抗原と分離され、各々の放射活性を用いて結合曲線がプロットされる。この技法は、感度及び特異度が両方とも極めて高い。
【0118】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）又はより総称的にはＥＩＡ（酵素イムノアッセイ）は、タンパク質に特異的な抗体を検出することのできるイムノアッセイである。かかるアッセイにおいて、抗体結合試薬又は抗原結合試薬のいずれかに結合される検出可能標識は、酵素である。この酵素は、その基質に曝露されると化学的部分を生じるような反応を示し、それを、例えば、分光光度的手段、蛍光定量的手段又は目視手段によって検出することができる。検出に有用な試薬を検出可能となるように標識するために用いることのできる酵素としては、限定はされないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、Ｂ－ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、アスパラギナーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α－グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。
【0119】
ＥＬＩＳＡ法の変形例は、当業者に公知である。１つの変形例では、タンパク質に結合する抗体が、ポリスチレンマイクロタイタープレートのウェルなど、タンパク質親和性を呈する選択の表面に固定化される。次に、マーカ抗原を含有すると疑われる試験組成物がウェルに加えられる。結合させて、非特異的に結合した免疫複合体を洗浄によって除去した後、結合した抗原を検出することが可能である。
【0120】
検出は、標的タンパク質に特異的な、検出可能標識に連結されている二次抗体を加えることによって達成し得る。このタイプのＥＬＩＳＡは、単純「サンドイッチＥＬＩＳＡ」である。検出は、二次抗体を加えた後、続いて二次抗体に結合親和性を示す第３の抗体であって、検出可能標識に連結されている第３の抗体を加えることによっても達成され得る。
【0121】
別の変形例は、競合ＥＬＩＳＡである。競合ＥＬＩＳＡでは、試験試料が既知量の標識抗原又は抗体と結合に関して競合する。試料中の反応種の量は、コートしたウェルとのインキュベーション前又はその最中に、試料を既知の標識種と混合することによって決定し得る。試料中に反応種が存在すると、ウェルへの結合に利用可能な標識種の量を減少させる役割を果たし、従って最終的なシグナルが減少する。利用するフォーマットに関わらず、ＥＬＩＳＡは、コートすること、インキュベートすること又は結合すること、洗浄によって非特異的に結合した種を除去すること及び結合した免疫複合体を検出することなど、共通した特定の特徴を有する。抗原又は抗体は、プレート、ビーズ、ディップスティック、膜又はカラムマトリックスの形態など、固体支持体に連結することができ、この固定化した抗原又は抗体に、分析しようとする試料を適用することができる。プレートを抗原又は抗体のいずれかでコートする際には、概してプレートのウェルを抗原又は抗体の溶液と共に、一晩又は指定された時間のいずれかにわたってインキュベートすることになる。次にプレートのウェルを洗浄して、不完全に吸着した材料を除去することができる。次に、ウェルの残りの利用可能な表面を全て、試験抗血清に関して抗原的に中性の非特異的タンパク質で「コート」することができる。そうした非特異的タンパク質としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン及び粉乳溶液が挙げられる。コートすることにより、固定化表面上の非特異的な吸着部位の遮断が可能となり、従って表面への抗血清の非特異的結合によって引き起こされるバックグラウンドが減少する。
【0122】
ＥＬＩＳＡでは、直接的な手順よりむしろ、二次又は三次検出手段も使用することができる。従って、タンパク質又は抗体をウェルに結合させて、非反応性物質でコートすることによりバックグラウンドを低減し、且つ洗浄によって未結合の材料を除去した後、固定化する表面を、免疫複合体（抗原／抗体）形成を許容するのに有効な条件下で試験下の臨床的又は生物学的対照試料と接触させる。次に免疫複合体の検出には、標識された二次結合剤又は標識された第３の結合剤と併せた二次結合剤のいずれかが必要である。
【0123】
酵素結合イムノスポットアッセイ（エリスポット（ＥＬＩＳＰＯＴ））は、タンパク質又は抗原に特異的な抗体を検出することのできるイムノアッセイである。かかるアッセイにおいて、抗体結合試薬又は抗原結合試薬のいずれかに結合される検出可能標識は、酵素である。この酵素は、その基質に曝露されると化学的部分を生じるような反応を示し、それを、例えば、分光光度的手段、蛍光定量的手段又は目視手段によって検出することができる。検出に有用な試薬を検出可能となるように標識するために用いることのできる酵素としては、限定はされないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、Ｂ－ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、アスパラギナーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α－グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。このアッセイでは、ニトロセルロースマイクロタイタープレートが抗原でコートされる。試験試料を抗原に曝露し、次にＥＬＩＳＡアッセイと同様に反応させる。検出は、ニトロセルロースプレート上のスポットの計数によって検出が決まる点が、従来のＥＬＩＳＡと異なる。スポットの存在は、試料が抗原と反応したことを示している。スポットをカウントし、試料中における抗原に特異的な細胞の数を決定することができる。
【0124】
「免疫複合体（抗原／抗体）形成を許容するのに有効な条件下」とは、非特異的結合を低減し、妥当な信号対雑音比を促進するために、ＢＳＡ、ウシγグロブリン（ＢＧＧ）及びリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）／ツイーン（Ｔｗｅｅｎ（登録商標））などの溶液で抗原及び抗体を希釈することがその条件に含まれることを意味する。
【0125】
好適な条件とは、有効に結合させるのに十分な温度及び期間のインキュベーションであることも意味する。インキュベーションステップは、典型的には、約１分～１２時間、約２０℃～３０℃の温度であり得るか、又は約０℃～約１０℃で一晩インキュベートされ得る。ＥＬＩＳＡにおける全てのインキュベーションステップの後、複合体化していない材料を除去するため、接触させた表面を洗浄することができる。洗浄手順には、ＰＢＳ／ツイーン（Ｔｗｅｅｎ（登録商標））又はホウ酸塩緩衝液などの溶液で洗浄することが含まれ得る。試験試料と当初結合していた材料との間での特異的な免疫複合体の形成及び続く洗浄後、微量の免疫複合体であっても、その出現を決定することができる。
【0126】
検出方法を提供するため、上記に記載したとおり、第２又は第３の抗体は、検出を可能にする関連する標識を有し得る。これは、適切な発色基質とインキュベートしたときに発色を生じることのできる酵素であり得る。従って、例えば、第１又は第２の免疫複合体を標識抗体と接触させて、更なる免疫複合体形成の発生に有利に作用する期間にわたって且つ条件下においてインキュベートすることができる（例えば、ＰＢＳ－ツイーン（Ｔｗｅｅｎ（登録商標））などのＰＢＳ含有溶液中、室温で２時間のインキュベーション）。
【0127】
標識抗体とインキュベートした後及び洗浄による未結合材料の除去に続いて、酵素標識としてペルオキシダーゼの場合、例えば、尿素及びブロモクレゾールパープル又は２，２’－アジド－ジ－（３－エチル－ベンズチアゾリン－６－スルホン酸［ＡＢＴＳ］及び１－１２０２などの発色基質と共にインキュベートすることにより、標識の量を定量化することができる。次に、発色の程度について、例えば可視スペクトル分光光度計を使用して測定することにより、定量化を達成可能である。タンパク質アレイは、ガラス、膜、マイクロタイターウェル、質量分析計プレート及びビーズ又は他の粒子を含めた表面に固定化したタンパク質を使用する固相リガンド結合アッセイシステムである。このアッセイは、高度に並列的であり（マルチプレックス化されている）、多くの場合に小型化されている（マイクロアレイ、タンパク質チップ）。その利点としては、迅速で自動化可能であること、高感度能力があること、試薬を節約できること及び単回の実験で豊富なデータを提供することが挙げられる。バイオインフォマティクス支援は重要である；データ処理には、高性能のソフトウェア及びデータ比較分析が要求される。しかしながら、ソフトウェアは、ハードウェア及び検出システムの多くと同様に、ＤＮＡアレイに使用されるものを応用することができる。
【0128】
主要なフォーマットの１つは、キャプチャーアレイであり、ここで、リガンド結合試薬（これは、通常、抗体であるが、代替的なタンパク質足場、ペプチド又は核酸アプタマーでもあり得る）を使用して、血漿又は組織抽出物などの混合物中の標的分子が検出される。診断法では、キャプチャーアレイを使用することにより、複数のイムノアッセイを並行して、個別の例えば血清中にある幾つかの検体に関して試験すること及び多くの血清試料を同時に試験することの両方とも、行うことができる。プロテオミクスでは、キャプチャーアレイを使用することにより、健常及び疾患の、例えばタンパク質発現プロファイリングの点で種々の試料中のタンパク質レベルが定量化され、比較される。インビトロ機能性相互作用スクリーニングのためのアレイフォーマットでは、タンパク質－タンパク質、タンパク質－ＤＮＡ、タンパク質－薬物、受容体－リガンド、酵素－基質など、特異的リガンド結合剤以外のタンパク質が使用される。捕捉試薬自体は、多くのタンパク質に対して選択され、スクリーニングされるが、これは、複数のタンパク質標的に対するマルチプレックスアレイフォーマットで行うこともできる。
【0129】
アレイを構築するためのタンパク質供給源としては、組換えタンパク質のための細胞ベースの発現系、天然の供給源からの精製、無細胞翻訳系によるインビトロでの作製及びペプチドのための合成方法が挙げられる。これらの方法の多くは、ハイスループット作製のために自動化可能である。キャプチャーアレイ及びタンパク質機能分析については、タンパク質が正しく折り畳まれ、機能性でなければならない点が重要である；これが常に当てはまるとは限らず、例えば、組換えタンパク質が変性条件下で細菌から抽出される場合には当てはまらない。それにも関わらず、変性タンパク質のアレイは、交差反応性に関する抗体のスクリーニング、自己抗体の同定及びリガンド結合タンパク質の選択に有用である。
【0130】
タンパク質アレイは、ＥＬＩＳＡ及びドットブロッティングなど、多くの場合に蛍光読取り値を利用するよく知られたイムノアッセイ方法を小型化したものとして設計されており、ロボティクス及びハイスループット検出システムによって促進されて、複数のアッセイを並行して実行することが可能となっている。よく使用される物理的な支持体としては、スライドグラス、ケイ素、マイクロウェル、ニトロセルロース又はＰＶＤＦ膜並びに磁気及び他のマイクロビーズが挙げられる。タンパク質の微小滴が平面状の表面に送達されるというのが、最もよく知られたフォーマットであるが、他にも代替的な構成として、マイクロフルイディクスにおける開発に基づくＣＤ遠心装置（ジャイロス（Ｇｙｒｏｓ）、ニュージャージ州モンマス・ジャンクション（Ｍｏｎｍｏｕｔｈ Ｊｕｎｃｔｉｏｎ，ＮＪ））及び特殊なチップ設計、例えば、プレートにエンジニアリングされたマイクロチャネル（例えば、ザ・リビングチップ（Ｔｈｅ Ｌｉｖｉｎｇ Ｃｈｉｐ）（商標）、バイオトローブ（Ｂｉｏｔｒｏｖｅ）、マサチューセッツ州ウォバーン（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ））及びケイ素表面上の微細な３Ｄポスト（ザイオミックス（Ｚｙｏｍｙｘ）、カリフォルニア州ヘイワード（Ｈａｙｗａｒｄ ＣＡ））などが挙げられる。懸濁液中の粒子も、それに識別のためのコードが付与されるならば、アレイの基盤として使用することができる；システムとしては、マイクロビーズのカラーコード化（ルミネックス（Ｌｕｍｉｎｅｘ）、テキサス州オースティン（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）；バイオラッド・ラボラトリーズ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））及び半導体ナノ結晶（例えば、ＱＤｏｔ（商標）、カンタム・ドット（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔ）、カリフォルニア州ヘイワード（Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ））及びビーズのバーコード化（ウルトラプレックス（ＵｌｔｒａＰｌｅｘ）（商標）、スマートビード・テクノロジーズ・リミテッド（ＳｍａｒｔＢｅａｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ）、英国ケンブリッジバブラハム（Ｂａｂｒａｈａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ））及び多金属マイクロロッド（例えば、ナノバーコード（Ｎａｎｏｂａｒｃｏｄｅ）（商標）粒子、ナノプレックス・テクノロジーズ（Ｎａｎｏｐｌｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カリフォルニア州マウンテンビュー（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ））が挙げられる。ビーズは、半導体チップ上に平面アレイ状に組み立てることもできる（ＬＥＡＰＳ技術、バイオアレイ・ソリューションズ（ＢｉｏＡｒｒａｙ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）、ニュージャージ州ウォレン（Ｗａｒｒｅｎ，ＮＪ））。
【0131】
タンパク質の固定化には、カップリング試薬及びカップリングされる表面の性質の両方が関わる。良好なタンパク質アレイ支持表面は、カップリングの手順前及び手順後に化学的に安定しており、良好なスポット形態を可能にし、最小限の非特異的結合を呈し、検出系のバックグラウンドに寄与せず、且つ種々の検出系と適合性がある。用いられる固定化方法は、再現性があり、種々の特性（例えば、サイズ、親水性、疎水性など）のタンパク質に適用可能で、ハイスループット及び自動化に適しており、且つ完全な機能性タンパク質活性の保持と適合性がある。表面結合タンパク質の配向は、それをリガンド又は基質に活性状態で提示するのに重要な要因と認識されている；キャプチャーアレイについては、最も効率的な結合結果は、捕捉試薬が適切な配向に置かれているときに達成され、これには概して、タンパク質の部位特異的標識が必要である。
【0132】
共有結合性及び非共有結合性の両方のタンパク質固定化方法が用いられ、これらには様々な利点と難点がある。表面への受動的な吸着は、方法論的には単純であるが、定量化又は配向制御はほとんどできない；これはタンパク質の機能特性を改変することも、しないこともあり、再現性及び効率にばらつきがある。共有結合性カップリング方法は、安定した連結を提供し、様々なタンパク質に適用することができ、且つ再現性が良好であるが、しかしながら、配向にばらつきがあることもあり、化学的誘導体化がタンパク質の機能を改変することもあり、且つ安定な相互作用表面が必要である。タンパク質上のタグを利用する生物学的捕捉方法は、安定した連結を提供し、タンパク質に特異的に、且つ再現性のある配向で結合するが、この生物学的試薬は、初めに適切に固定化しなければならず、アレイに特別な処理が必要となることもあり、且つ安定性にばらつきがある。
【0133】
タンパク質アレイの作製に向けて、幾つかの固定化ケミストリー及びタグが記載されている。共有結合のための基材としては、アミノ含有又はアルデヒド含有シラン試薬でコートされたスライドグラスが挙げられる。ベルサリンクス（Ｖｅｒｓａｌｉｎｘ）（商標）システム（プロリンクス（Ｐｒｏｌｉｎｘ）、ワシントン州ボセル（Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ））では、フェニルジボロン酸で誘導体化されたタンパク質と、支持体表面に固定化されたサリチルヒドロキサム酸との間の相互作用により、可逆的共有結合性カップリングが実現する。これは、バックグラウンド結合が低く、且つ固有蛍光が低く、固定化されたタンパク質が機能を保持することも可能である。三次元ポリアクリルアミドゲルをベースとするハイドロゲル（ＨｙｄｒｏＧｅｌ）（商標）（パーキンエルマ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、マサチューセッツ州ウェルズリー（Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，ＭＡ））などの多孔質構造内では、非修飾タンパク質の非共有結合性結合が起こる；この基材は、高容量及びタンパク質機能の保持と共に、ガラスマイクロアレイ上の特に低いバックグラウンドをもたらすことが報告されている。広く用いられている生物学的カップリング方法は、ビオチン／ストレプトアビジン又はヘキサヒスチジン／Ｎｉ相互作用によるもので、タンパク質を適切に修飾している。ビオチンは、二酸化チタン（ザイオミックス（Ｚｙｏｍｙｘ））又は五酸化タンタル（ゼプトセンス（Ｚｅｐｔｏｓｅｎｓ）、スイス国ヴィッタースヴィル（Ｗｉｔｔｅｒｓｗｉｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））などの表面に固定化されたポリ－リジン骨格にコンジュゲートされ得る。
【0134】
アレイ作製方法には、ロボットによるコンタクトプリント法、インクジェット法、圧電スポッティング及びフォトリソグラフィが含まれる。幾つもの市販のアレイヤー［例えば、パッカード・バイオサイエンシーズ（Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって製造及び販売される］並びに手動の機器［例えば、ブイ・アンド・ピー・サイエンティフィック（Ｖ＆Ｐ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって製造及び販売される］が利用可能である。細菌コロニーをロボットでＰＶＤＦ膜にグリッド化して、インサイチューでのタンパク質発現を誘導することができる。スポットサイズ及び密度の限界点が、ナノメートル空間規模にスポットを有するナノアレイであり、１平方ｍｍ未満の単一のチップ上で数千の反応を実施することが可能である。バイオフォース・ラボラトリーズ（ＢｉｏＦｏｒｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、光学的検出の限界点である１平方ｃｍ当たり２５００万個のスポットに相当する、８５平方ミクロンに１５２１個のタンパク質スポットを有するナノアレイを開発している；その読取り方法は、蛍光及び原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）である。
【0135】
蛍光標識及び検出方法は、広く用いられている。ＤＮＡマイクロアレイの読取りに使用するのと同じ計装をタンパク質アレイにも適用可能である。ディファレンシャルディスプレイ法については、２つの異なる細胞状態からの蛍光標識したタンパク質によってキャプチャー（例えば、抗体）アレイをプローブすることができ、ここで、細胞ライセートが異なるフルオロフォア（例えば、Ｃｙ－３、Ｃｙ－５）と直接コンジュゲートされ、混合されるため、色が標的存在量の変化に関する読取り値としての役割を果たす。蛍光読取り感度は、チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）（パーキンエルマ・ライフサイエンシーズ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ））によって１０～１００倍に増幅させることができる。平面導波路技術（ゼプトセンス（Ｚｅｐｔｏｓｅｎｓ））によって超高感度蛍光検出が可能となり、これは洗浄手順が介在しないという付加的な利点を伴う。高感度は、フィコエリトリンを標識として使用して（ルミネックス（Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）））又は半導体ナノ結晶の特性を用いて（カンタム・ドット（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔ））懸濁ビーズ及び粒子で実現することもできる。特に商業的なバイオテクノロジー業界において、幾つもの新規の代替的読取り法が開発されている。それらには、表面プラズモン共鳴法（例えば、ＦＩＴＳバイオシステムズ（ＦＩＴＳ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、イントリンシック・バイオプローブズ（Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ Ｂｉｏｐｒｏｂｅｓ）、アリゾナ州テンペ（Ｔｅｍｐｅ，ＡＺ）によって製造及び販売される）、ローリングサークルＤＮＡ増幅法（例えば、モレキュラー・ステージング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔａｇｉｎｇ）、コネチカット州ニューヘーブン（Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ ＣＴ）によって製造及び販売される）、質量分析法（例えば、イントリンシック・バイオプローブズ（Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ Ｂｉｏｐｒｏｂｅｓ）；サイファージェン（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ）、カリフォルニア州フレモント（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）によって製造及び販売される）、共鳴光散乱法（例えば、ジェニコン・サイエンシーズ（Ｇｅｎｉｃｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって製造及び販売される）及び原子間力顕微鏡法（例えば、バイオフォース・ラボラトリーズ（ＢｉｏＦｏｒｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって製造及び販売される）の応用が含まれる。
【0136】
キャプチャーアレイは、発現プロファイリングのための診断的チップ及びアレイの基礎を成す。キャプチャーアレイは、従来の抗体、シングルドメイン、改変された足場、ペプチド又は核酸アプタマーなど、高親和性捕捉試薬を利用して、特異的な標的リガンドをハイスループット方式で結合し、検出する。抗体アレイは、要求される特異性特性及び許容できるバックグラウンドを有し、一部は市販されている（例えば、ＢＤバイオサイエンシーズ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、カリフォルニア州サンノゼ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）；クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、カリフォルニア州マウンテンビュー（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）；及び／又はバイオラド（ＢｉｏＲａｄ）；シグマ（Ｓｉｇｍａ）、ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）によって製造及び販売されるとおり）。キャプチャーアレイのための抗体は、従来の免疫化（ポリクローナル血清及びハイブリドーマ）によって作られるか、又はファージ若しくはリボソームディスプレイライブラリからの選択後、通常、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現させる組換え断片として作られるかのいずれかである（例えば、ケンブリッジ・アンチボディ・テクノロジー（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、英国ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）；バイオインベント（ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ）、スウェーデン国ルンド（Ｌｕｎｄ）；アフィテック（Ａｆｆｉｔｅｃｈ）、カリフォルニア州ウォールナットクリーク（Ｗａｌｎｕｔ Ｃｒｅｅｋ，ＣＡ）；及び／又はバイオサイト（Ｂｉｏｓｉｔｅ）、カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって製造及び販売される）。従来の抗体、Ｆａｂ及びｓｃＦｖ断片に加えて、ラクダ科動物由来のシングルＶ－ドメイン又は改変されたヒト同等物（例えば、ドマンティス（Ｄｏｍａｎｔｉｓ）、マサチューセッツ州ウォルサム（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）によって製造及び販売される）もアレイにおいて有用であり得る。
【0137】
用語「足場」は、タンパク質のリガンド結合ドメインを指し、これは、抗体様の特異性及び親和性特性を持つ多様な標的分子を結合する能力のある複数の変異体となるように改変される。これらの変異体は、遺伝子ライブラリフォーマットで作製し、ファージ、細菌又はリボソームディスプレイによって個別の標的に対して選択することができる。かかるリガンド結合足場又はフレームワークとしては、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈ．ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡをベースとする「アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標））」（例えば、アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）、スウェーデン国ブロンマ（Ｂｒｏｍｍａ）によって製造及び販売される）、フィブロネクチンをベースとする「トリネクチン（Ｔｒｉｎｅｃｔｉｎ）」（例えば、フィロス（Ｐｈｙｌｏｓ）、マサチューセッツ州レキシントン（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）によって製造及び販売される）及びリポカリン構造をベースとする「アンチカリン（Ａｎｔｉｃａｌｉｎ（登録商標））」（例えば、ピエリス・プロテオラボ（Ｐｉｅｒｉｓ Ｐｒｏｔｅｏｌａｂ）、独国フライジング－グヴァイエンシュテファン（Ｆｒｅｉｓｉｎｇ－Ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎ）によって製造及び販売される）が挙げられる。これらはキャプチャーアレイで抗体と同様に使用することができ、ロバスト性及び製造の容易さが利点であり得る。
【0138】
タンパク質リガンドを高い特異性及び親和性で結合する非タンパク質捕捉分子、特に、一本鎖核酸アプタマーもアレイにおいて使用される（例えば、ソマロジック（ＳｏｍａＬｏｇｉｃ）、コロラド州ボールダ（Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）によって製造及び販売される）。アプタマーは、オリゴヌクレオチドのライブラリからセレックス（Ｓｅｌｅｘ）（商標）手順によって選択され、臭素化デオキシウリジン及びＵＶ活性化架橋（光アプタマー）の取込みを通して、タンパク質とのその相互作用を共有結合によって亢進させることができる。リガンドに光架橋すると、特異的な立体要件に起因して、アプタマーの交差反応性が低下する。
【0139】
アプタマーは、自動化されたオリゴヌクレオチド合成による製造の容易さ並びにＤＮＡの安定性及びロバスト性の利点を備えている；光アプタマーアレイ上で、普遍的な蛍光タンパク質染色を用いて結合を検出することができる。
【0140】
抗体アレイに結合したタンパク質検体は、直接検出され得るか、又はサンドイッチアッセイで二次抗体を介して検出され得る。異なる色による異なる試料の比較には、直接標識が用いられる。同じタンパク質リガンドに向けられる抗体の対が利用可能な場合、サンドイッチイムノアッセイが高い特異性及び感度を提供し、従ってこれが、サイトカインなど、存在量が少ないタンパク質に選ばれる方法となり；これは、タンパク質修飾の検出可能性も提供する。無標識検出方法は、質量分析法、表面プラズモン共鳴法及び原子間力顕微鏡法を含め、リガンドの変化を回避する。いずれの方法でも要求されるのは、最適な感度及び特異性であり、ここで、低いバックグラウンドが高い信号対雑音をもたらす。検体濃度は広い範囲を網羅するため、合わせて感度が適切に調整されなければならない；種々の親和性の試料の段階希釈又は抗体の使用が、この問題に対する解決法である。目的のタンパク質は、サイトカイン又は細胞内の低発現産物など、ｐｇ範囲以下の検出が要求される、体液及び抽出物中において低濃度のものであることが多い。
【0141】
捕捉分子のアレイに代わる選択肢は、「分子インプリンティング」技術を通して作られるものであり、ここで、ペプチド（例えば、タンパク質のＣ末端領域からのもの）を鋳型として使用して、重合可能なマトリックスに構造的に相補的な配列特異的空隙を生じさせ；従って、これらの空隙が、適切な一次アミノ酸配列を有する（変性した）タンパク質を特異的に捕捉することができる（例えば、アスピラ・バイオシステムズ（Ａｓｐｉｒａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、カリフォルニア州バーリンゲーム（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）によってプロテインプリント（ＰｒｏｔｅｉｎＰｒｉｎｔ）（商標）として製造及び販売される）。
【0142】
診断的に且つ発現プロファイリングで用いることのできる別の方法論は、プロテインチップ（ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ）（登録商標）アレイ（例えば、サイファージェン（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ）、カリフォルニア州フレモント（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）によって製造及び販売される）であり、ここで、固相クロマトグラフィー表面は、血漿又は腫瘍抽出物などの混合物から、同様の電荷又は疎水性特徴を有するタンパク質を結合し、それらの保持されたタンパク質が、ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法を用いて検出される。多数の精製タンパク質を固定化することにより、大規模機能性チップが構築されており、他のタンパク質とのタンパク質相互作用、薬物－標的相互作用、酵素－基質など、広範な生化学的機能のアッセイに用いられている。概して、これには、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母などにクローニングされた発現ライブラリが必要であり、次に発現したタンパク質が例えばＨｉｓタグでそこから精製され且つ固定化される。無細胞タンパク質転写／翻訳は、細菌又は他のインビボ系での発現が不十分なタンパク質を合成するための実行可能な選択肢である。
【0143】
タンパク質間相互作用の検出には、タンパク質アレイが、分泌タンパク質又はジスルフィド架橋を有するタンパク質が関わる相互作用など、細胞ベースの酵母２ハイブリッドシステムが不十分である場合、それに代わるインビトロでの選択肢となることができ、有用であり得る。酵母プロテインキナーゼについて及び酵母プロテオームの様々な機能（タンパク質－タンパク質及びタンパク質－脂質相互作用）について、アレイ上での生化学的活性のハイスループット分析が記載されており、ここで、全酵母オープンリーディングフレームの大部分がマイクロアレイ上で発現し、固定化された。大規模な「プロテオームチップ」は、機能的相互作用の同定、薬物スクリーニング等において極めて有用となる見込みがある（例えば、プロテオメディクス（Ｐｒｏｔｅｏｍｅｔｒｉｘ）、コネチカット州ブランフォード（Ｂｒａｎｆｏｒｄ，ＣＴ）によって製造及び販売される）。
【0144】
抗体、合成足場、ペプチド及びアプタマーを含め、特異的結合パートナを選択するため、個々のエレメントの二次元ディスプレイとしてタンパク質アレイを使用して、ファージ又はリボソームディスプレイライブラリをスクリーニングすることができる。このようにして、「ライブラリ対ライブラリ」スクリーニングを行うことができる。薬物候補のスクリーニングを、ゲノム計画から同定されるタンパク質標的アレイに対する化学的ライブラリと組み合わせることは、この手法の別の適用である。
【0145】
マルチプレックスビーズアッセイ、例えば、ＢＤＴＭサイトメトリービーズアレイなどは、個別的なスペクトルの一連の粒子であり、可溶性検体の捕捉及び定量化に使用することができる。次に検体が、蛍光ベースの発光の検出及びフローサイトメトリー分析によって測定される。マルチプレックス化ビーズアッセイは、ＥＬＩＳＡベースのアッセイと同等の、しかし「マルチプレックス化」した、即ち同時に行われる形式でデータを生成する。サイトメトリービーズアレイについて、任意のサンドイッチフォーマットアッセイと同様に、例えば、既知の標準物質を用いて、未知を標準曲線に対してプロットして未知の濃度が計算される。更に、マルチプレックスビーズアッセイは、試料容積の制限に起因してこれまで考えられたことのなかった試料中の可溶性検体の定量化が可能である。定量的データに加えて、強力な視覚的画像を生成することができ、使用者に一目で分かる更なる情報を与えるユニークなプロファイル又はシグネチャが明らかになる。
【0146】
Ｖ．組成物の使用方法
一態様において、本明細書には、対象の癌、転移又は感染症を治療、予防、阻害及び／又は低減する方法であって、本明細書に開示される単離された若しくは改変された万能ドナーＮＫ細胞若しくは細胞株のいずれか或いは方法３００、４００によって選択若しくはスクリーニングされたか、又は本明細書に開示される方法のいずれかによって調製されたいずれかの万能ドナーＮＫ細胞若しくは細胞株又は改変万能ドナーＮＫ細胞若しくは細胞株を対象に投与することを含む方法が開示される。
一態様において、本明細書には、対象の癌、転移又は感染症を治療、予防、阻害及び／又は低減する方法であって、本明細書に開示される単離された若しくは改変された万能ドナーＮＫ細胞若しくは細胞株のいずれか或いは方法３００、４００によって選択若しくはスクリーニングされたか、又は本明細書に開示される方法のいずれかによって調製されたいずれかの万能ドナーＮＫ細胞若しくは細胞株又は改変万能ドナーＮＫ細胞若しくは細胞株を対象に投与することを含む方法が開示される。
【0147】
例えば、一態様において、本明細書には、対象の癌又は感染症を治療する方法であって、図３の方法３００に記載されるとおり万能ドナー細胞を同定及び／又は入手すること及び／又は図４の方法４００に記載されるとおり万能ドナー細胞を改変することを含む方法が開示される。別の態様において、万能ドナー細胞を同定及び／又は入手することを含む対象の癌又は感染症を治療する方法は、（ａ）ＮＫ細胞ドナーからの候補ＮＫ細胞のＨＬＡ遺伝子型を入手するか又は入手していることであって、ＨＬＡ遺伝子型は、ＨＬＡ ＣＩ、Ｃ２及びＢｗ４アレルの存在又は非存在を示し、且つそれにより１つ以上の可変的に遺伝する抑制型ＫＩＲ ２ＤＬ１、２ＤＬ２、２ＤＬ３及び３ＤＬ１の存在を示す、入手するか又は入手していること；（ｂ）候補ＮＫ細胞のＫＩＲ遺伝子型を入手するか又は入手していることであって、ＫＩＲ遺伝子型は、２ＤＳ１／２、２ＤＳ３／５、３ＤＳ１及び２ＤＳ４からなる群から選択される活性型ＫＩＲの存在又は非存在を示す、入手するか又は入手していること；及び（ｃ）（ｉ）ＨＬＡ遺伝子型が少なくとも２つのＩ ＩＬＡアレルＨＬＡ ＣＩ、Ｃ２及びＢｗ４の存在を示すとき；及び（ｉｉ）ＫＩＲ遺伝子型が少なくとも３つの活性型ＫＩＲ ２ＤＳ１／２、２ＤＳ３／５、３ＤＳ Ｉ及び／又は２ＤＳ４の存在を示すとき、その候補ＮＫ細胞を治療的投与のための万能ドナーＮＫ細胞として選択することを含む。
【0148】
一態様において、本明細書には、癌又は感染症を治療する方法が開示され、ここで、選択された万能ドナーＮＫ細胞は、少なくとも５０％～８５％のレシピエント対象に伴い組織学的に最適化されている。一態様において、前述のいずれかの態様の癌又は感染症を治療する方法であって、候補ＮＫ細胞のＣＭＶ血清反応陽性状態を入手するか又は入手していることを更に含み；ここで、ＮＫ細胞ドナーがＣＭＶについて血清反応陽性であるとき又はＮＫ細胞ドナーからのＮＫ細胞がＮＫＧ２Ｃ発現の参照レベルと比較して高いＮＫＧ２Ｃ発現を示すとき、そのＮＫ候補ＮＫ細胞が更に選択される、方法である。
【0149】
図５に説明され、且つ上記から続く方法５００は、５２０から始めて特定の患者を治療する方法を記載する。ステップ５２０において、患者／レシピエントの割り当て用量レベルのパーセンテージの範囲内の濃度でＮＫ細胞が作成される。一例示的実施形態において、ＴＧＦ－βｉ ＮＫ細胞／ｋｇの濃度は、患者の割り当て用量レベル（ａｓｓｉｇｎｅｄ ｄｏｓｅ ｌｅｖｅｌ）の２０％以内である。ＮＫ細胞で治療しようとする患者毎に、その患者が同種免疫されたＨＬＡ型を有するドナーからのＴＧＦ－βｉ ＮＫ細胞製剤を除外できるようにするため、血小板反応性抗体検査が実施される。患者の体重を用いて、ＴＧＦ－βｉ ＮＫ用量、患者の割り当て用量レベル及び予定輸注日が計算される。一例示的実施形態において、残りのドナー（例えば、除外されなかったドナー）から、各用量への分配用に貯蔵ＴＧＦ－βｉ ＮＫ細胞が調製される。これらの用量は、ＮＫ細胞、Ｔ細胞及びエンドトキシン用量について確認される。
【0150】
ステップ５２２において、ＮＫ細胞に存在するＣＤ３＋細胞が、割り当て用量レベルのＴ細胞閾値を下回ることが決定される。ＮＫ細胞に存在するＣＤ３＋細胞が割り当て用量レベルのＴ細胞閾値を上回ると決定される場合、その用量は除外される。一例示的実施形態において、Ｔ細胞閾値は、患者の割り当て用量レベルの累積Ｔ細胞用量最大値（以下の表２を参照されたい）以下である。
【0151】
ステップ５２４において、除外されなかったドナー細胞のエンドトキシン用量がエンドトキシン閾値以下であると決定され、ドナー適格細胞と同定される。一例示的実施形態において、エンドトキシン閾値は５ＥＵ／ｋｇ以下である。ステップ５２６において、ＮＫ細胞の用量が患者に閾値用量サイクルの間にわたって提供される。一例示的実施形態において、閾値用量サイクルは、イリノテカン、テモゾロミド、ジヌツキシマブ及びサルグラモスチム並びに万能ドナーＴＧＦ－βｉエキソビボ拡大ＮＫ細胞（例えば、ドナー適格細胞）からなる６回の２１日サイクルである。万能ドナー拡大ＴＧＦ－βｉ ＮＫ細胞は、２１日サイクルの８日目に１×１０８個のＮＫ細胞／ｋｇ患者体重の用量でＩＶによって投与される。一例示的実施形態において、用量漸増がある。別の例示的実施形態において、用量漸増はない。
【0152】
対象への治療的投与の前に万能ドナーＮＫ細胞を活性化させる及び／又は拡大すると、サイトカイン毒性に関連する多くの困難を克服することを促進し得ることが理解され、且つ本明細書でそれが企図される。一態様において、前述のいずれかの態様の癌又は感染症を治療する方法であって、選択された万能ドナーＮＫ細胞をインビトロで１つ以上のＮＫ細胞エフェクター剤（例えば、刺激性ペプチド、サイトカイン及び／又は接着分子）（例えばＩＬ－２１）の存在下においてインキュベートすることを更に含む方法である。ＮＫ細胞活性化剤及び刺激性ペプチドの例としては、限定はされないが、ＩＬ－２１、４１ＢＢＬ、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－７、ＵＬＢＰ、ＭＩＣＡ、ＬＦＡ－１、２Ｂ４、ＢＣＭ／ＳＬＡＭＦ２、ＣＣＲ７、ＯＸ４ＯＬ、ＮＫＧ２Ｄアゴニスト、デルタ－１、ノッチリガンド、ＮＫｐ４６アゴニスト、ＮＫｐ４４アゴニスト、ＮＫｐ３０アゴニスト、他のＮＣＲアゴニスト、ＣＤ１６アゴニスト；及び／又はＴＧＦ－β及び／又は他のホーミング誘導シグナル伝達分子が挙げられる。サイトカインの例としては、限定はされないが、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１及びＩＬ－１８が挙げられる。接着分子の例としては、限定はされないが、ＬＦＡ－１、ＭＩＣＡ、ＢＣＭ／ＳＬＡＭＦ２が挙げられる。
【0153】
これらのＮＫ細胞エフェクター剤は、溶液中で可溶性を呈するか、又は細胞膜（ＰＭ）粒子、エキソソーム（ＥＸ）又はフィーダ細胞（ＦＣ）の表面上に膜結合剤として存在する。ＰＭ粒子、ＥＸエキソソーム及び／又はＦＣ細胞は、膜型のＮＫ細胞活性化剤及び刺激性ペプチドを発現するように改変することができる。代わりに、ＮＫ細胞活性化剤及び刺激性ペプチドは、ＰＭ粒子、ＥＸエキソソーム又はＦＣフィーダ細胞の表面に化学的にコンジュゲートすることができる。例えば、膜結合型ＩＬ－２１を発現するフィーダ細胞（それぞれＦＣ２１細胞、ＰＭ２１粒子及びＥＸ２１エキソソーム）から調製される細胞膜（ＰＭ）粒子、フィーダ細胞（ＦＣ）又はエキソソーム（ＥＸ）。膜結合型ＩＬ－２１発現ＦＣ２１細胞、ＰＭ２１粒子及びＥＸ２１エキソソームは、限定はされないが、４１ＢＢＬ、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－７、ＵＬＢＰ、ＭＩＣＡ、ＬＥＡ－Ｉ、２Ｂ４、ＢＣＭ／ＳＬＡＭＦ２、ＣＣＲ７、ＯＸ４ＯＬ、ＮＫＧ２Ｄアゴニスト、デルタ－１、ノッチリガンド、ＮＫｐ４６アゴニスト、ＮＫｐ４４アゴニスト、ＮＫｐ３０アゴニスト、他のＮＣＲアゴニスト、ＣＤ１６アゴニスト；及び／又はＴＧＦ－βを含めた、追加的な１つ以上の活性化剤、刺激性ペプチド、サイトカイン及び／又は接着分子を更に含み得ること（例えば、４１ＢＢＬ及び膜結合型インターロイキン－２１を発現するＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エキソソーム又はＦＣ細胞）が理解され、且つ本明細書でそれが企図される。
【0154】
病原体はウイルスであり得ることが理解される。従って一実施形態において、病原体は、単純ヘルペスウイルス１型、単純ヘルペスウイルス２型、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス６型、痘瘡ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ）ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ポリオーマウイルス、ヒトパピローマウイルス（Ｐａｐｉｌｏｍａｖｉｒｕｓ）、呼吸器合胞体ウイルス、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、デングウイルス、ムンプスウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、レオウイルス、黄熱病ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、ラッサ熱ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、マレーバレー熱ウイルス、ウエストナイルウイルス、リフトバレー熱ウイルス、Ａ型ロタウイルス、Ｂ型ロタウイルス、Ｃ型ロタウイルス、シンドビスウイルス、サル免疫不全ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型、ハンタウイルス、風疹ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１型及び／又はヒト免疫不全ウイルス２型からなる群から選択することができる。
【0155】
病原体が細菌である方法も開示される。病原体は、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ウシ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）、ウシ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）ＢＣＧ株、ＢＣＧ亜株、トリ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ）、アフリカ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、マイコバクテリウム・カンサシ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ）、マイコバクテリウム・マリヌム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ）、マイコバクテリウム・ウルセランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ）、トリ型結核菌亜種パラ結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ノカルジア・アステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）、他のノカルジア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）種、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、他のレジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）種、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）、他のサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種、シゲラ・ボイディ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｂｏｙｄｉｉ）、志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、シゲラ・ソネイ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ）、シゲラ・フレックスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、他の赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）種、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）、ヘモリチカ菌（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、他のパスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）種、アクチノバチルス・プルロニューモニエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リステリア・イバノビイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ）、ウシ流産菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ）、他のブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）種、心糸状虫（Ｃｏｗｄｒｉａ ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ボルデテラ・アビウム（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ａｖｉｕｍ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、ボルデテラ・トレマツム（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｔｒｅｍａｔｕｍ）、ボルデテラ・ヒンジイ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｈｉｎｚｉｉ）、ボルデテラ・ペツリイ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｔｒｉｉ）、パラ百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ボルデテラ・アンソルピイ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ａｎｓｏｒｐｉｉ）、他のボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）種、鼻疽菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅｉ）、類鼻疽菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）、セパシア菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）、肺炎クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、オウム病クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）、Ｑ熱コクシエラ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ）、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）種、エーリキア属（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）種、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｅａ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、他のシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、軟性下疳菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ）、他のヘモフィルス属（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）種、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、他のクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種、腸炎エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、及び／又は他のエルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）種、及び／又はマイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）種からなる細菌の群から選択することができる。一態様において、細菌は炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）ではない。
【0156】
感染症を治療する方法も開示され、ここで、病原体は、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）、南アメリカ分芽菌（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、ブラストミセス・デルマチチジス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、ニューモシスチス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）、ペニシリウム・マルネッフェイ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍａｒｎｅｆｆｅｉ）及び／又はアルテルナリア・アルテルナータ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａ）からなる真菌の群から選択される真菌である。
【0157】
病原体が、トキソプラズマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、他のプラスモジウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種、赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、フォーラーネグレリア（Ｎａｅｇｌｅｒｉａ ｆｏｗｌｅｒｉ）、リノスポリジウム・セーベリ（Ｒｈｉｎｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｅｅｂｅｒｉ）、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ）、蟯虫（Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ ｖｅｒｍｉｃｕｌａｒｉｓ）、エンテロビウス・グレゴリイ（Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ ｇｒｅｇｏｒｉｉ）、回虫（Ａｓｃａｒｉｓ ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ）、ズビニ鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ ｄｕｏｄｅｎａｌｅ）、アメリカ鉤虫（Ｎｅｃａｔｏｒ ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ）、クリプトスポリジウム属種（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．）、ブルーストリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）、クルーズトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）、大形リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ）、他のリーシュマニア種、広節裂頭条虫（Ｄｉｐｈｙｌｌｏｂｏｔｈｒｉｕｍ ｌａｔｕｍ）、小形条虫（Ｈｙｍｅｎｏｌｅｐｉｓ ｎａｎａ）、縮小条虫（Ｈｙｍｅｎｏｌｅｐｉｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ）、単包条虫（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ）、多包条虫（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｌａｒｉｓ）、フォーゲル包条虫（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｖｏｇｅｌｉ）、ヤマネコ包条虫（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｏｌｉｇａｒｔｈｒｕｓ）、広節裂頭条虫（Ｄｉｐｈｙｌｌｏｂｏｔｈｒｉｕｍ ｌａｔｕｍ）、肝吸虫（Ｃｌｏｎｏｒｃｈｉｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）；クロノルキス・ビベリニ（Ｃｌｏｎｏｒｃｈｉｓ ｖｉｖｅｒｒｉｎｉ）、肝蛭（Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ）、巨大肝蛭（Ｆａｓｃｉｏｌａ ｇｉｇａｎｔｉｃａ）、槍形吸虫（Ｄｉｃｒｏｃｏｅｌｉｕｍ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｕｍ）、肥大吸虫（Ｆａｓｃｉｏｌｏｐｓｉｓ ｂｕｓｋｉ）、横川吸虫（Ｍｅｔａｇｏｎｉｍｕｓ ｙｏｋｏｇａｗａｉ）、タイ肝吸虫（Ｏｐｉｓｔｈｏｒｃｈｉｓ ｖｉｖｅｒｒｉｎｉ）、ネコ肝吸虫（Ｏｐｉｓｔｈｏｒｃｈｉｓ ｆｅｌｉｎｅｕｓ）、肝吸虫（Ｃｌｏｎｏｒｃｈｉｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、膣トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、アカントアメーバ属（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ）種、インターカラタム住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｕｍ）、ビルハルツ住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｈａｅｍａｔｏｂｉｕｍ）、日本住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、マンソン住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉ）、他の住血吸虫属（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）種、トリコビルハルジア・レゲンティ（Ｔｒｉｃｈｏｂｉｌｈａｒｚｉａ ｒｅｇｅｎｔｉ）、旋毛虫（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ ｓｐｉｒａｌｉｓ）、トリキネラ・ブリトビ（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ ｂｒｉｔｏｖｉ）、トリキネラ・ネルソニ（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ ｎｅｌｓｏｎｉ）、トリキネラ・ナチバ（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ ｎａｔｉｖａ）及び／又は赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）からなる寄生生物の群から選択される寄生虫である感染症を治療する方法も開示される。
【0158】
開示される組成物は、癌など、無制御な細胞増殖が起こる任意の疾患の治療に使用することができる。開示される組成物を治療に使用することができる癌の代表的な、但し非限定的なリストは、以下である：リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉症、ホジキン病、骨髄性白血病、膀胱癌、脳癌、神経系癌、頭頸部癌、頭頸部扁平上皮癌、小細胞肺癌及び非小細胞肺癌などの肺癌、神経芽細胞腫／膠芽腫、卵巣癌、皮膚癌、肝癌、甲状腺癌、黒色腫、口腔、咽頭、喉頭及び肺の扁平上皮癌、子宮頸癌（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ）、子宮頸癌（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、乳癌及び上皮癌、腎癌、泌尿生殖器癌、肺癌、食道癌、頭頸部癌、大腸癌、造血系癌；精巣癌；結腸癌、直腸癌、胃癌、前立腺癌及び／又は膵癌。
【0159】
示される例示的な実施形態図６において、ＮＫ細胞は、神経芽細胞腫などの癌を治療する治療製剤方法６００に利用される。ステップ６０２において、最適ドナーとしてのドナー適格性が確認される。一例示的実施形態において、最適ドナーは、上記の図３に記載したとおり確認され、及び／又は最適ドナー細胞は、図４にあるとおり改変される。従って、最適ドナーとは、Ｃ１、Ｃ２及びＢｗ４アレルを担持するＨＬＡ遺伝子型を有する者、Ｃ１、Ｃ２及びＢｗ４に結合する（最大限のライセンス化につながる）抑制型ＫＩＲ（２ＤＬ１、２ＤＬ２又は３及び３ＤＬ１）を保有する、且つ活性型ＫＩＲの比率が高い（２ＤＳ１及び３ＤＳ１を含む可変的に遺伝する活性型遺伝子が３つ以上の）ＫＩＲ遺伝子型を有する者及びＣＭＶに曝露されたことがあり、結果としてＮＫＧ２Ｃ高発現が生じている者である。
【0160】
ステップ６０４において、最適細胞ドナーのＭＮＣのＣＤ３＋免疫枯渇が実施される。一例示的実施形態において、ＣＤ３＋免疫枯渇は、方法５００のステップ５０６にあるものと同じである。ステップ６０６において、枯渇した最適ドナー細胞が芽細胞腫間隔について芽細胞腫期間にわたって拡大される。一例示的実施形態において、芽細胞腫期間（ｂｌａｓｔｏｍａ ｄｕｒａｔｉｏｎ）は１０～１８日である。別の例示的実施形態において、芽細胞腫期間は１４日である。別の例示的実施形態において、芽細胞腫間隔（例えば、拡大誘導エレメントが加えられるとき）は、１～３日である。拡大中、ステップ６０８において、枯渇した最適ドナー細胞が、膜結合型インターロイキン（Ｉｌ）Ｉｌ－２１、Ｉｌ－２及び／又は４－１ＢＢＬを発現する照射Ｋ５６２のフィーダ細胞で刺激される。一例示的実施形態において、ＮＫ細胞は、膜結合型ＩＬ－２１及び４－１ＢＢＬ並びにＩＬ－２を発現する照射Ｋ５６２（例えば、濃度１００ＩＵ／ｍＬ）のフィーダ細胞を用いて刺激する間に生成される。照射フィーダ細胞（ＩＦＣ）は、芽細胞腫期間の最初の７日間に約１：２のＴＮＣ対ＩＦＣ比で加えられ、芽細胞腫期間の２回目の７日間に１：１比で加えられる。一例示的実施形態において、芽細胞腫間隔毎に、新鮮なＩＬ－２が加えられる。
【0161】
６１２において、確認されたドナー適格細胞に対して形質転換成長因子β（ＴＧＦ－β）を使用するか又はインプリントすることにより、ＴＧＦ－βｉ ＮＫ細胞が作成される。一例示的実施形態において、ドナー適格細胞は、ＴＧＦ－β（例えば、濃度１０ｎｇ／ｍＬ）によって慢性的に刺激される。別の例示的実施形態において、芽細胞腫期間中、芽細胞腫間隔毎に新鮮なＴＧＦ－βが加えられる。拡大過程でＴＧＦ－βを加えると、拡大後の最終的なＮＫ細胞製剤の拡大倍数（４６５～３２００倍の拡大）も、生存能（＞９６％）も損なわれない。ＴＧＦ－βｉ ＮＫ細胞は、腫瘍標的と培養したとき、インターフェロン－γ及び腫瘍壊死因子－αの分泌過多を伴う炎症誘発性の表現型を呈するが、これにより、典型的に拡大したＮＫ細胞と比較して、培養物中におけるサイトカイン産生ＮＫ細胞の割合及びこれらの細胞の各々が産生するサイトカインの量の両方が増加したため、抗腫瘍性サイトカイン分泌が増加した。これらの細胞は、表現型及び転写の変化を示し、それがＴＧＦ－βによる抑制に対する抵抗性を付与する。
【0162】
６１４において、培養したＮＫ細胞が用量濃度に濃縮される。一例において、用量濃度は２×１０６ＮＣ／ｍＬ～２×１０８ＮＣ／ｍＬである。６１６において、拡大し、かつ形質転換したＮＫ細胞が用量濃度で凍結保存される。一実施形態において、ＮＫ細胞はＮＫ凍結培地に凍結保存される。別の例示的実施形態において、ＮＫ凍結培地は、１０％ＤＭＳＯ、１２．５％（ｗ／ｖ）ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ＵＳＰを含み、且つ／又はプラズマライトＡ（Ｐｌａｓｍａ－Ｌｙｔｅ Ａ）（ＵＳＰ）中に含む。
【0163】
示される例示的な実施形態図７には、神経芽細胞腫などの１つ以上の癌を治療するためのレシピエント適格性及び治療方法７００におけるレシピエント／患者の適格性及びＮＫ細胞による治療が記載される。７０２において、レシピエントが、組織学的に確定された再発性非転移性テント上（ｓｕｐｒａｔｅｎｔｏｒｉａｌ）世界保健機関（ＷＨＯ）グレードＩＩＩ／ＩＶ悪性脳腫瘍を有するかどうかが決定される。一例示的実施形態において、脳腫瘍としては、退形成性上衣腫、胎児性腫瘍、退形成性神経外胚葉性腫瘍、ＡＴ／ＲＴ、退形成性星状細胞腫、退形成性乏突起星細胞腫、退形成乏突起膠腫、退形成性多形黄色星状細胞腫、多形性膠芽腫、神経膠肉腫及び／又は悪性神経膠腫ＮＯＳが挙げられる。
【0164】
７０４において、組織学的に確定された再発性非転移性テント上ＷＨＯグレードＩＩＩ／ＩＶ悪性脳腫瘍がレシピエントにないことに応答して、そのレシピエントが準最適（ｓｕｂ－ｏｐｔｉｍａｌ）としてマークされる（例えば、ＮＫドナー細胞を受ける候補でない）。７０６において、組織学的に確定された再発性非転移性テント上ＷＨＯグレードＩＩＩ／ＩＶ悪性脳腫瘍がレシピエントに見られることに応答して、レシピエントが再発性腫瘍の切除術／直視下生検の候補（切除術候補）であるかどうか、及び／又は腔内／腫瘍内に置かれるオンマヤ貯留槽（Ｏｍｍａｙａ ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）の留置候補（オンマヤ候補）と見なされるかどうかが決定される。７０８において、レシピエントが切除術候補又はオンマヤ候補と見なされないことに応答して、そのレシピエントは準最適としてマークされる。
【0165】
７１０において、にレシピエントが切除術候補及び／又はオンマヤ候補と見なされること応答して、レシピエントが１６歳以下の場合に５０以上のランスキースコア（最適ランスキースコア）又はレシピエントが１６歳を超える場合に５０以上のカルノフスキースコア（最適カルノフスキースコア）をレシピエントが有するかどうかが決定される。一例示的実施形態において、最適な候補は、研究への登録時点で３歳以上２５歳未満である。７１２において、レシピエントがその年齢に最適なランスキースコア又は最適なカルノフスキースコアを有しないと見なされることに応答して、レシピエントは準最適としてマークされる。
【0166】
７１４において、レシピエントがその年齢に最適なランスキースコア又は最適なカルノフスキースコアを有すると見なされることに応答して、レシピエントが機能閾値を超える臓器機能を有するかどうかが決定される。一例示的実施形態において、機能閾値は、２１日間のＮＫ細胞投与において輸注又は成長因子なしに十分な骨髄機能を有することである。別の例示的実施形態において、十分な骨髄機能は、２．５×１０３／マイクロリットル以上の白血球細胞（ＷＢＣ）、９ｇｍ／ｄＬ以上のヘモグロビン（Ｈｇｂ）、１，０００細胞／マイクロリットル以上の好中球絶対数（ＡＮＣ）及び７５，０００細胞／マイクロリットル以上の血小板数として定義される。一例示的実施形態において、機能閾値は、十分な肝機能及び／又は十分な腎機能を有することである。一例示的実施形態において、十分な肝機能は、ＡＬＴ、ＡＳＴ及びアルカリホスファターゼがＵＬＮの２倍未満であり、及びビリルビンがＵＬＮの１．５倍未満であることと定義され、十分な腎機能は、ＢＵＮ又はクレアチニンがＵＬＮの１．５倍未満であることと定義される。７１６において、レシピエントが臓器機能閾値を超える臓器機能を有しないと見なされることに応答して、そのレシピエントは準最適としてマークされる。
【0167】
７１８において、レシピエントが臓器機能閾値を超える臓器機能を有すると見なされることに応答して、レシピエントが治療期間内に毒性療法を受けたかどうかが決定される。一例示的実施形態において、最適なレシピエントは、万能ドナーＮＫ細胞治療を受ける前に、放射線療法及び／又は化学療法による第一選択治療を完了している。一例示的実施形態において、治療期間は、初期放射線療法の完了から少なくとも１２週間である。別の例示的実施形態において、治療期間は、任意の細胞毒性化学療法レジメンの完了から少なくとも６週間である。更に別の例示的実施形態において、治療期間は、いずれかの毒性薬剤の最終回投与から最低でも２週間である。この例示的実施形態では、レシピエントは、万能ＮＫドナー細胞の治療前に、毒性薬剤のいかなる毒性からも回復していると見なされる。一例示的実施形態において、治療期間は、癌の診断と現時点との間である。別の例示的実施形態において、毒性療法は、全身性ステロイドであり（補充療法を除く）、治療期間はＮＫ細胞輸注前の少なくとも３日間である。別の例示的実施形態において、毒性療法はベバシズマブであり、治療期間は、ＮＫ細胞輸注開始前の少なくとも６週間である。７２０において、レシピエントが治療期間内に毒性療法を受けたと見なされることに応答して、そのレシピエントが準最適としてマークされる。７２２において、レシピエントが治療期間外に毒性療法を受けたと見なされることに応答して、そのレシピエントが万能ドナーＮＫ細胞療法を受けるのに最適としてマークされる。
【0168】
７２４において、割り当て用量レベルのパーセンテージ（例えば、以下の表２に記載されるとおり）の範囲内のＮＫ細胞濃度を有するＮＫ細胞（図６の方法６００を用いて作成される）が作成される。一例示的実施形態において、療法継続期間は３ヵ月であり、且つ／又は疾患進行まで、更なる治療投与を妨げる併発病が起こるまで、許容できない１つ又は複数の有害事象が起こるまで、患者が中止することに決めるまで、プロトコルの重大な患者ノンコンプライアンスが起こるまで、患者の状態の全般的又は特異的な変化により、臨床医の決定で患者が更なる治療を許容できなくなるまでである。７２６において、ＮＫ細胞の用量が、閾値用量サイクルにわたる最適なレシピエントでの使用向けに提供される（例えば、以下の表２を参照されたい）。一例において、ＮＫ細胞の用量は、静脈内、筋肉内等の方法を用いて提供される。
【0169】
７２８において、ＮＫ細胞の用量は、閾値用量サイクルの間にわたるオンマヤ貯留槽における使用向けに提供される（例えば、以下の表２を参照されたい）。患者は腫瘍切除及びオンマヤ留置のための手術に進む。一例示的実施形態において、第１の用量のＴＧＦβｉ ＮＫ細胞がオンマヤ貯留槽留置後少なくとも１４間投与される。オンマヤ貯留槽からのＴＧＦβｉ ＮＫ細胞注入が、週１回、３週間にわたって行われた後、１週間の安静が続き、合計３回の（４週間）サイクルにわたって行われる。患者が疾患の安定又は好転を示す場合、次に患者は引き続き、合計１２サイクルにわたって療法を受ける。一例示的実施形態において、最適なレシピエントは、３サイクルのＴＧＦβｉ ＮＫ細胞注入を受ける。各サイクルが４週間の継続期間である。最初の３週間中、ＴＧＦβｉ ＮＫ細胞が週１回輸注される。第４週目が安静週間である。ＴＧＦβｉ ＮＫ細胞注入は、少なくとも３日間空けて送達されなければならない（例えば、第１週の金曜日及び第２週の月曜日）。用量設定は、レシピエント体表面積（ＢＳＡ）を基準とする。
【0170】
【表2】
【0171】
本明細書では、対象の癌又は転移を治療、予防、阻害又は低減する本開示の方法が、癌又は転移の低減、阻害、治療及び／又は消失に更に役立つであろう任意の抗癌剤（例えば、ゲムシタビンなど）の投与を更に含み得ることも企図される。本明細書に開示される対象の癌又は転移を低減し、阻害し、治療し、及び／又は消失させる方法のための本開示の生体応答性ヒドロゲル中に使用するか、又は本開示の医薬組成物、改変粒子及び／又は生体応答性ヒドロゲル（改変粒子が中に封入されている生体応答性ヒドロゲルを含む）に加えて追加の治療用薬剤として使用することのできる抗癌剤は、限定はされないが、アベマシクリブ、アビラテロン酢酸塩、アビトレキサート（Ａｂｉｔｒｅｘａｔｅ）（メトトレキサート）、アブラキサン（Ａｂｒａｘａｎｅ）（パクリタキセル・アルブミン安定化ナノ粒子製剤）、ＡＢＶＤ、ＡＢＶＥ、ＡＢＶＥ－ＰＣ、ＡＣ、ＡＣ－Ｔ、アドセトリス（Ａｄｃｅｔｒｉｓ）（ブレンツキシマブベドチン）、ＡＤＥ、Ａｄｏ－トラスツズマブエムタンシン、アドリアマイシン（ドキソルビシン塩酸塩）、アファチニブジマレイン酸塩、アフィニトール（Ａｆｉｎｉｔｏｒ）（エベロリムス）、アキンゼオ（Ａｋｙｎｚｅｏ）（ネツピタント及びパロノセトロン塩酸塩）、アルダラ（Ａｌｄａｒａ）（イミキモド）、アルデスロイキン、アレセンサ（Ａｌｅｃｅｎｓａ）（アレクチニブ）、アレクチニブ、アレムツズマブ、アリムタ（Ａｌｉｍｔａ）（ペメトレキセド二ナトリウム）、アリコパ（Ａｌｉｑｏｐａ）（コパンリシブ塩酸塩）、アルケラン（Ａｌｋｅｒａｎ）注射液（メルファラン塩酸塩）、アルケラン（Ａｌｋｅｒａｎ）錠（メルファラン）、アロキシ（Ａｌｏｘｉ）（パロノセトロン塩酸塩）、アルンブリグ（Ａｌｕｎｂｒｉｇ）（ブリガチニブ）、アンボクロリン（Ａｍｂｏｃｈｌｏｒｉｎ）（クロラムブシル）、アンボクロリン（Ａｍｂｏｃｈｌｏｒｉｎ）クロラムブシル）、アミホスチン、アミノレブリン酸、アナストロゾール、アプレピタント、アレディア（Ａｒｅｄｉａ）（パミドロン酸二ナトリウム）、アリミデックス（Ａｒｉｍｉｄｅｘ）（アナストロゾール）、アロマシン（Ａｒｏｍａｓｉｎ）（エキセメスタン）、アラノン（Ａｒｒａｎｏｎ）（ネララビン）、三酸化ヒ素、アーゼラ（Ａｒｚｅｒｒａ）（オファツムマブ）、アスパラギナーゼ・エルウィニア・クリサンテミ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）、アテゾリズマブ、アバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ）（ベバシズマブ）、アベルマブ、アキシチニブ、アザシチジン、バベンチオ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ）（アベルマブ）、ＢＥＡＣＯＰＰ、ベセナム（Ｂｅｃｅｎｕｍ）（カルムスチン）、ベレオダック（Ｂｅｌｅｏｄａｑ）（ベリノスタット）、ベリノスタット、ベンダムスチン塩酸塩、ＢＥＰ、ベスポンサ（Ｂｅｓｐｏｎｓａ）（イノツズマブオゾガマイシン）、ベバシズマブ、ベキサロテン、ベキサール（Ｂｅｘｘａｒ）（トシツモマブ及びヨウ素Ｉ１３１トシツモマブ）、ビカルタミド、ＢｉＣＮＵ（カルムスチン）、ブレオマイシン、ブリナツモマブ、ビーリンサイト（Ｂｌｉｎｃｙｔｏ）（ブリナツモマブ）、ボルテゾミブ、ボシュリフ（Ｂｏｓｕｌｉｆ）（ボスチニブ）、ボスチニブ、ブレンツキシマブベドチン、ブリガチニブ、ＢｕＭｅｌ、ブスルファン、ブスルフェクス（Ｂｕｓｕｌｆｅｘ）（ブスルファン）、カバジタキセル、カボメティクス（Ｃａｂｏｍｅｔｙｘ）（カボザンチニブ－Ｓ－リンゴ酸塩）、カボザンチニブ－Ｓ－リンゴ酸塩、ＣＡＦ、キャンパス（Ｃａｍｐａｔｈ）（アレムツズマブ）、カンプトサール（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ）（イリノテカン塩酸塩）、カペシタビン、ＣＡＰＤＸ、カラック（Ｃａｒａｃ）（フルオロウラシル－局所）、カルボプラチン、カルボプラチン－タキソール（Ｔａｘｏｌ）、カルフィルゾミブ、カルムブリス（Ｃａｒｍｕｂｒｉｓ）（カルムスチン）、カルムスチン、カルムスチンインプラント、カソデックス（Ｃａｓｏｄｅｘ）（ビカルタミド）、ＣＥＭ、セリチニブ、セルビジン（Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ）（ダウノルビシン塩酸塩）、サーバリックス（Ｃｅｒｖａｒｉｘ）（組換えＨＰＶ二価ワクチン）、セツキシマブ、ＣＥＶ、クロラムブシル、クロラムブシル－プレドニゾン、ＣＨＯＰ、シスプラチン、クラドリビン、クラフェン（Ｃｌａｆｅｎ）（シクロホスファミド）、クロファラビン、クロファレックス（Ｃｌｏｆａｒｅｘ）（クロファラビン）、クロラール（Ｃｌｏｌａｒ）（クロファラビン）、ＣＭＦ、コビメチニブ、コメトリック（Ｃｏｍｅｔｒｉｑ）（カボザンチニブ－Ｓ－リンゴ酸塩）、コパンリシブ塩酸塩、ＣＯＰＤＡＣ、ＣＯＰＰ、ＣＯＰＰ－ＡＢＶ、コスメゲン（Ｃｏｓｍｅｇｅｎ）（ダクチノマイシン）、コテリック（Ｃｏｔｅｌｌｉｃ）（コビメチニブ）、クリゾチニブ、ＣＶＰ、シクロホスファミド、サイフォス（Ｃｙｆｏｓ）（イホスファミド）、サイラムザ（Ｃｙｒａｍｚａ）（ラムシルマブ）、シタラビン、シタラビンリポソーム、サイトサールＵ（Ｃｙｔｏｓａｒ－Ｕ）（シタラビン）、シトキサン（シクロホスファミド）、ダブラフェニブ、ダカルバジン、ダコゲン（Ｄａｃｏｇｅｎ）（デシタビン）、ダクチノマイシン、ダラツムマブ、ダラザレックス（Ｄａｒｚａｌｅｘ）（ダラツムマブ）、ダサチニブ、ダウノルビシン塩酸塩、ダウノルビシン塩酸塩及びシタラビンリポソーム、デシタビン、デフィブロチドナトリウム、デファイテリオ（Ｄｅｆｉｔｅｌｉｏ）（デフィブロチドナトリウム）、デガレリクス、デニロイキンジフチトクス、デノスマブ、デポサイト（ＤｅｐｏＣｙｔ）（シタラビンリポソーム）、デキサメサゾン、デクスラゾキサン塩酸塩、ジヌツキシマブ、ドセタキセル、ドキシル（Ｄｏｘｉｌ）（ドキソルビシン塩酸塩リポソーム）、ドキソルビシン塩酸塩、ドキソルビシン塩酸塩リポソーム、Ｄｏｘ－ＳＬ（ドキソルビシン塩酸塩リポソーム）、ＤＴＩＣドーム（ＤＴＩＣ－Ｄｏｍｅ）（ダカルバジン）、デュルバルマブ、エフデックス（Ｅｆｕｄｅｘ）（フルオロウラシル－局所）、エリテック（Ｅｌｉｔｅｋ）（ラスブリカーゼ）、エレンス（Ｅｌｌｅｎｃｅ）（エピルビシン塩酸塩）、エロツズマブ、エロキサチン（Ｅｌｏｘａｔｉｎ）（オキサリプラチン）、エルトロンボパグオラミン、イメンド（Ｅｍｅｎｄ）（アプレピタント）、エムプリシティ（Ｅｍｐｌｉｃｉｔｉ）（エロツズマブ）、エナシデニブメシル酸塩、エンザルタミド、エピルビシン塩酸塩、ＥＰＯＣＨ、アービタックス（Ｅｒｂｉｔｕｘ）（セツキシマブ）、エリブリンメシル酸塩、エリベッジ（Ｅｒｉｖｅｄｇｅ）（ビスモデギブ）、エルロチニブ塩酸塩、アーウィナーゼ（Ｅｒｗｉｎａｚｅ）（アスパラギナーゼ・エルウィニア・クリサンテミ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ））、エチオール（Ｅｔｈｙｏｌ）（アミホスチン）、エトポフォス（Ｅｔｏｐｏｐｈｏｓ）（リン酸エトポシド）、エトポシド、リン酸エトポシド、エバセト（Ｅｖａｃｅｔ）（ドキソルビシン塩酸塩リポソーム）、エベロリムス、エビスタ（Ｅｖｉｓｔａ）（ラロキシフェン塩酸塩）、エボメラ（Ｅｖｏｍｅｌａ）（メルファラン塩酸塩）、エキセメスタン、５－ＦＵ（フルオロウラシル注射液）、５－ＦＵ（フルオロウラシル－局所）、フェアストン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）（トレミフェン）、ファリーダック（Ｆａｒｙｄａｋ）（パノビノスタット）、フェソロデックス（Ｆａｓｌｏｄｅｘ）（フルベストラント）、ＦＥＣ、フェマーラ（Ｆｅｍａｒａ）（レトロゾール）、フィルグラスチム、フルダラ（Ｆｌｕｄａｒａ）（リン酸フルダラビン）、リン酸フルダラビン、フルオロプレックス（Ｆｌｕｏｒｏｐｌｅｘ）（フルオロウラシル－局所）、フルオロウラシル注射液、フルオロウラシル－局所、フルタミド、フォレックス（Ｆｏｌｅｘ）（メトトレキサート）、フォレックスＰＦＳ（Ｆｏｌｅｘ ＰＦＳ）（メトトレキサート）、フォルフィリ（ＦＯＬＦＩＲＩ）、フォルフィリ（ＦＯＬＦＩＲＩ）－ベバシズマブ、フォルフィリ（ＦＯＬＦＩＲＩ）－セツキシマブ、フォルフィリノックス（ＦＯＬＦＩＲＩ ＮＯＸ）、フォルフォックス（ＦＯＬＦＯＸ）、フォロチン（Ｆｏｌｏｔｙｎ）（プララトレキサート）、ＦＵ－ＬＶ、フルベストラント、ガーダシル（Ｇａｒｄａｓｉｌ）（組換えＨＰＶ四価ワクチン）、ガーダシル９（Ｇａｒｄａｓｉｌ ９）（組換えＨＰＶ九価ワクチン）、ガザイバ（Ｇａｚｙｖａ）（オビヌツズマブ）、ゲフィチニブ、ゲムシタビン塩酸塩、ゲムシタビン－シスプラチン、ゲムシタビン－オキサリプラチン、ゲムツズマブオゾガマイシン、ジェムザール（Ｇｅｍｚａｒ）（ゲムシタビン塩酸塩）、ジロトリフ（Ｇｉｌｏｔｒｉｆ）（アファチニブジマレイン酸塩）、グリベック（Ｇｌｅｅｖｅｃ）（イマチニブメシル酸塩）、グリアデル（Ｇｌｉａｄｅｌ）（カルムスチンインプラント）、グリアデルウエハー（Ｇｌｉａｄｅｌ ｗａｆｅｒ）（カルムスチンインプラント）、グルカルピダーゼ、ゴセレリン酢酸塩、ハラヴェン（Ｈａｌａｖｅｎ）（エリブリンメシル酸塩）、ヘマンジオル（Ｈｅｍａｎｇｅｏｌ）（プロプラノロール塩酸塩）、ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）（トラスツズマブ）、ＨＰＶ二価ワクチン、組換え、ＨＰＶ九価ワクチン、組換え、ＨＰＶ四価ワクチン、組換え、ハイカムチン（Ｈｙｃａｍｔｉｎ）（トポテカン塩酸塩）、ハイドレア（ヒドロキシウレア）、ヒドロキシウレア、ハイパーＣＶＡＤ（Ｈｙｐｅｒ－ＣＶＡＤ）、イブランス（Ｉｂｒａｎｃｅ）（パルボシクリブ）、イブリツモマブチウキセタン、イブルチニブ、ＩＣＥ、アイクルシグ（Ｉｃｌｕｓｉｇ）（ポナチニブ塩酸塩）、イダマイシン（Ｉｄａｍｙｃｉｎ）（イダルビシン塩酸塩）、イダルビシン塩酸塩、イデラリシブ、アイディハイファ（Ｉｄｈｉｆａ）（エナシデニブメシル酸塩）、アイフェックス（Ｉｆｅｘ）（イホスファミド）、イホスファミド、アイフォスファミダム（イホスファミド）、ＩＬ－２（アルデスロイキン）、イマチニブメシル酸塩、イムブルビカ（Ｉｍｂｒｕｖｉｃａ）（イブルチニブ）、イミフィンジ（Ｉｍｆｉｎｚｉ）（デュルバルマブ）、イミキモド、イムリジック（Ｉｍｌｙｇｉｃ）（タリモジーン・ラハーパレプベック）、インライタ（Ｉｎｌｙｔａ）（アキシチニブ）、イノツズマブオゾガマイシン、インターフェロンα－２ｂ、組換え、インターロイキン－２（アルデスロイキン）、イントロンＡ（組換えインターフェロンα－２ｂ）、ヨウ素Ｉ１３１トシツモマブ及びトシツモマブ、イピリムマブ、イレッサ（Ｉｒｅｓｓａ）（ゲフィチニブ）、イリノテカン塩酸塩、イリノテカン塩酸塩リポソーム、イストダックス（Ｉｓｔｏｄａｘ）（ロミデプシン）、イクサベピロン、イキサゾミブクエン酸塩、イグゼンプラ（Ｉｘｅｍｐｒａ）（イクサベピロン）、ジャカフィ（Ｊａｋａｆｉ）（ルキソリチニブリン酸塩）、ＪＥＢ、ジェブタナ（Ｊｅｖｔａｎａ）（カバジタキセル）、カドサイラ（Ｋａｄｃｙｌａ）（ａｄｏ－トラスツズマブエムタンシン）、ケオキシフェン（ラロキシフェン塩酸塩）、ケピバンス（Ｋｅｐｉｖａｎｃｅ）（パリフェルミン）、キイトルーダ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ）（ペンブロリズマブ）、キスカリ（Ｋｉｓｑａｌｉ）（リボシクリブ）、キムリア（Ｋｙｍｒｉａｈ）（チサゲンレクロイセル）、カイプロリス（Ｋｙｐｒｏｌｉｓ）（カルフィルゾミブ）、ランレオチド酢酸塩、ラパチニブ二トシル酸塩、ラルトルボ（Ｌａｒｔｒｕｖｏ）（オララツマブ）、レナリドマイド、レンバチニブメシル酸塩、レンビマ（Ｌｅｎｖｉｍａ）（レンバチニブメシル酸塩）、レトロゾール、ロイコボリンカルシウム、リューケラン（Ｌｅｕｋｅｒａｎ）（クロラムブシル）、ロイプロリド酢酸塩、ロイスタチン（Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ）（クラドリビン）、レブラン（Ｌｅｖｕｌａｎ）（アミノレブリン酸）、リンホリジン（Ｌｉｎｆｏｌｉｚｉｎ）（クロラムブシル）、リポドックス（ＬｉｐｏＤｏｘ）（ドキソルビシン塩酸塩リポソーム）、ロムスチン、ロンサーフ（Ｌｏｎｓｕｒｆ）（トリフルリジン及びチピラシル塩酸塩）、リュープロン（Ｌｕｐｒｏｎ）（ロイプロリド酢酸塩）、リュープロン
（Ｌｕｐｒｏｎ）デポ剤（ロイプロリド酢酸塩）、リュープロン（Ｌｕｐｒｏｎ）デポ剤－小児用（ロイプロリド酢酸塩）、リムパーザ（Ｌｙｎｐａｒｚａ）（オラパリブ）、マルキボ（Ｍａｒｑｉｂｏ）（ビンクリスチン硫酸塩リポソーム）、マチュレーン（Ｍａｔｕｌａｎｅ）（プロカルバジン塩酸塩）、メクロレタミン塩酸塩、メゲストロール酢酸塩、メキニスト（Ｍｅｋｉｎｉｓｔ）（トラメチニブ）、メルファラン、メルファラン塩酸塩、メルカプトプリン、メスナ、メスネックス（Ｍｅｓｎｅｘ）（メスナ）、メタゾラストン（Ｍｅｔｈａｚｏｌａｓｔｏｎｅ）（テモゾロミド）、メトトレキサート、メトトレキサートＬＰＦ（メトトレキサート）、メチルナルトレキソン臭化物、メキサート（Ｍｅｘａｔｅ）（メトトレキサート）、メキサートＡＱ（Ｍｅｘａｔｅ－ＡＱ）（メトトレキサート）、ミドスタウリン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン塩酸塩、マイトザイトレックス（Ｍｉｔｏｚｙｔｒｅｘ）（マイトマイシンＣ）、ＭＯＰＰ、モゾビル（Ｍｏｚｏｂｉｌ）（プレリキサホル）、マスタージェン（Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ）（メクロレタミン塩酸塩）、ムタマイシン（Ｍｕｔａｍｙｃｉｎ）（マイトマイシンＣ）、ミレラン（Ｍｙｌｅｒａｎ）（ブスルファン）、マイロサール（Ｍｙｌｏｓａｒ）（アザシチジン）、マイロターグ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ）（ゲムツズマブオゾガマイシン）、ナノ粒子パクリタキセル（パクリタキセル・アルブミン安定化ナノ粒子製剤）、ナベルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ）（酒石酸ビノレルビン）、ネシツムマブ、ネララビン、ネオサール（Ｎｅｏｓａｒ）（シクロホスファミド）、ネラチニブマレイン酸塩、ネルリンクス（Ｎｅｒｌｙｎｘ）（ネラチニブマレイン酸塩）、ネツピタント及びパロノセトロン塩酸塩、ニューラスタ（Ｎｅｕｌａｓｔａ）（ペグフィルグラスチム）、ニューポジェン（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）（フィルグラスチム）、ネクサバール（Ｎｅｘａｖａｒ）（ソラフェニブトシル酸塩）、ニランドロン（Ｎｉｌａｎｄｒｏｎ）（ニルタミド）、ニロチニブ、ニルタミド、ニンラーロ（Ｎｉｎｌａｒｏ）（イキサゾミブクエン酸塩）、ニラパリブトシル酸塩一水和物、ニボルマブ、ノルバデックス（Ｎｏｌｖａｄｅｘ）（タモキシフェンクエン酸塩）、エヌプレート（Ｎｐｌａｔｅ）（ロミプロスチム）、オビヌツズマブ、オドムゾ（Ｏｄｏｍｚｏ）（ソニデギブ）、ＯＥＰＡ、オファツムマブ、ＯＦＦ、オラパリブ、オララツマブ、オマセタキシンメペスクシネート、オンカスパール（Ｏｎｃａｓｐａｒ）（ペグアスパラガーゼ）、オンダンセトロン塩酸塩、オニバイド（Ｏｎｉｖｙｄｅ）（イリノテカン塩酸塩リポソーム）、オンタク（Ｏｎｔａｋ）（デニロイキンジフチトクス）、オプジーボ（Ｏｐｄｉｖｏ）（ニボルマブ）、ＯＰＰＡ、オシメルチニブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、パクリタキセル・アルブミン安定化ナノ粒子製剤、ＰＡＤ、パルボシクリブ、パリフェルミン、パロノセトロン塩酸塩、パロノセトロン塩酸塩及びネツピタント、パミドロン酸二ナトリウム、パニツムマブ、パノビノスタット、パラプラット（Ｐａｒａｐｌａｔ）（カルボプラチン）、パラプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ）（カルボプラチン）、パゾパニブ塩酸塩、ＰＣＶ、ＰＥＢ、ペグアスパラガーゼ、ペグフィルグラスチム、ペグインターフェロンアルファ－２ｂ、ペグイントロン（ＰＥＧ－Ｉｎｔｒｏｎ）（ペグインターフェロンアルファ－２ｂ）、ペンブロリズマブ、ペメトレキセド二ナトリウム、パージェタ（Ｐｅｒｊｅｔａ）（ペルツズマブ）、ペルツズマブ、プラチノール（Ｐｌａｔｉｎｏｌ）（シスプラチン）、プラチノールＡＱ（Ｐｌａｔｉｎｏｌ－ＡＱ）（シスプラチン）、プレリキサホル、ポマリドミド、ポマリスト（Ｐｏｍａｌｙｓｔ）（ポマリドミド）、ポナチニブ塩酸塩、ポートラーザ（Ｐｏｒｔｒａｚｚａ）（ネシツムマブ）、プララトレキサート、プレドニゾン、プロカルバジン塩酸塩、プロロイキン（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）（アルデスロイキン）、プロリア（Ｐｒｏｌｉａ）（デノスマブ）、プロマクタ（Ｐｒｏｍａｃｔａ）（エルトロンボパグオラミン）、プロプラノロール塩酸塩、プロベンジ（Ｐｒｏｖｅｎｇｅ）（シプロイセル－Ｔ）、プリントール（Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ）（メルカプトプリン）、プリキサン（Ｐｕｒｉｘａｎ）（メルカプトプリン）、ラジウム２２３二塩化物、ラロキシフェン塩酸塩、ラムシルマブ、ラスブリカーゼ、Ｒチョップ（Ｒ－ＣＨＯＰ）、Ｒ－ＣＶＰ、組換えヒトパピローマウイルス（ｌ－ＩＰＶ）二価ワクチン、組換えヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）九価ワクチン、組換えヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）四価ワクチン、組換えインターフェロンα－２ｂ、レゴラフェニブ、レリストール（Ｒｅｌｉｓｔｏｒ）（メチルナルトレキソン臭化物）、Ｒエポック（Ｒ－ＥＰＯＣＨ）、レブラミド（Ｒｅｖｌｉｍｉｄ）（レナリドマイド）、リウマトレックス（Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ）（メトトレキサート）、リボシクリブ、Ｒアイス（Ｒ－ＩＣＥ）、リツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ）（リツキシマブ）、リツキサンハイセラ（Ｒｉｔｕｘａｎ Ｈｙｃｅｌａ）（リツキシマブ及びヒアルロニダーゼ（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ）ヒト）、リツキシマブ、リツキシマブ及びヒアルロニダーゼ（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ）ヒト、ロラピタント塩酸塩、ロミデプシン、ロミプロスチム、ルビドマイシン（ダウノルビシン塩酸塩）、ルブラカ（Ｒｕｂｒａｃａ）（ルカパリブカンシル酸塩）、ルカパリブカンシル酸塩、ルキソリチニブリン酸塩、ライダプト（Ｒｙｄａｐｔ）（ミドスタウリン）、スクレロゾル（Ｓｃｌｅｒｏｓｏｌ）胸膜内エアロゾル（タルク）、シルツキシマブ、シプロイセル－Ｔ、ソマチュリン（Ｓｏｍａｔｕｌｉｎｅ）デポ剤（ランレオチド酢酸塩）、ソニデギブ、ソラフェニブトシル酸塩、スプリセル（Ｓｐｒｙｃｅｌ）（ダサチニブ）、スタンフォード（ＳＴＡＮＦＯＲＤ Ｖ）、滅菌タルク粉末（タルク）、ステリタルク（Ｓｔｅｒｉｔａｌｃ）（タルク）、スチバーガ（Ｓｔｉｖａｒｇａ）（レゴラフェニブ）、スニチニブリンゴ酸塩、スーテント（Ｓｕｔｅｎｔ）（スニチニブリンゴ酸塩）、シラトロン（Ｓｙｌａｔｒｏｎ）（ペグインターフェロンアルファ－２ｂ）、シルバント（Ｓｙｌｖａｎｔ）（シルツキシマブ）、シンリボ（Ｓｙｎｒｉｂｏ）（オマセタキシンメペスクシネート）、タブロイド（Ｔａｂｌｏｉｄ）（チオグアニン）、ＴＡＣ、タフィンラー（Ｔａｆｉｎｌａｒ）（ダブラフェニブ）、タグリッソ（Ｔａｇｒｉｓｓｏ）（オシメルチニブ）、タルク、タリモジーン・ラハーパレプベック、タモキシフェンクエン酸塩、タラビンＰＦＳ（Ｔａｒａｂｉｎｅ ＰＦＳ）（シタラビン）、タルセバ（Ｔａｒｃｅｖａ）（エルロチニブ塩酸塩）、タルグレチン（Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ）（ベキサロテン）、タシグナ（Ｔａｓｉｇｎａ）（ニロチニブ）、タキソール（Ｔａｘｏｌ）（パクリタキセル）、タキソテール（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）（ドセタキセル）、テセントリク（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ）（アテゾリズマブ）、テモダール（Ｔｅｍｏｄａｒ）（テモゾロミド）、テモゾロミド、テムシロリムス、サリドマイド、サロミド（Ｔｈａｌｏｍｉｄ）（サリドマイド）、チオグアニン、チオテパ、チサゲンレクロイセル、トラック（Ｔｏｌａｋ）（フルオロウラシル－局所）、トポテカン塩酸塩、トレミフェン、トーリセル（Ｔｏｒｉｓｅｌ）（テムシロリムス）、トシツモマブ及びヨウ素Ｉ１３１トシツモマブ、トテクト（Ｔｏｔｅｃｔ）（デクスラゾキサン塩酸塩）、ＴＰＦ、トラベクテジン、トラメチニブ、トラスツズマブ、トレアンダ（Ｔｒｅａｎｄａ）（ベンダムスチン塩酸塩）、トリフルリジン及びチピラシル塩酸塩、トリセノックス（Ｔｒｉｓｅｎｏｘ）（三酸化ヒ素）、タイケルブ（Ｔｙｋｅｒｂ）（ラパチニブ二トシル酸塩）、ユニツキシン（Ｕｎｉｔｕｘｉｎ）（ジヌツキシマブ）、ウリジン三酢酸塩、ＶＡＣ、バンデタニブ、ＶＡＭＰ、バルビ（Ｖａｒｕｂｉ）（ロラピタント塩酸塩）、ベクティビックス（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ）（パニツムマブ）、ＶｅＩＰ、ベルバン（Ｖｅｌｂａｎ）（ビンブラスチン硫酸塩）、ベルケイド（Ｖｅｌｃａｄｅ）（ボルテゾミブ）、ベルサール（Ｖｅｌｓａｒ）（ビンブラスチン硫酸塩）、ベムラフェニブ、ベネクレクスタ（Ｖｅｎｃｌｅｘｔａ）（ベネトクラクス）、ベネトクラクス、ベージニオ（Ｖｅｒｚｅｎｉｏ）（アベマシクリブ）、ビアデュール（Ｖｉａｄｕｒ）（ロイプロリド酢酸塩）、ビダーザ（Ｖｉｄａｚａ）（アザシチジン）、ビンブラスチン硫酸塩、ビンカサールＰＦＳ（Ｖｉｎｃａｓａｒ ＰＦＳ）（ビンクリスチン硫酸塩）、ビンクリスチン硫酸塩、ビンクリスチン硫酸塩リポソーム、酒石酸ビノレルビン、ＶＩＰ、ビスモデギブ、ビストガード（Ｖｉｓｔｏｇａｒｄ）（ウリジン三酢酸塩）、ボラキサゼ（Ｖｏｒａｘａｚｅ）（グルカルピダーゼ）、ボリノスタット、ボトリエント（Ｖｏｔｒｉｅｎｔ）（パゾパニブ塩酸塩）、ヴィキセオス（Ｖｙｘｅｏｓ）（ダウノルビシン塩酸塩及びシタラビンリポソーム）、ウェルコボリン（Ｗｅｌｌｃｏｖｏｒｉｎ）（ロイコボリンカルシウム）、ザーコリ（Ｘａｌｋｏｒｉ）（クリゾチニブ）、ゼローダ（Ｘｅｌｏｄａ）（カペシタビン）、ＸＥＬＩＲＩ、ＸＥＬＯＸ、イクスゲバ（Ｘｇｅｖａ）（デノスマブ）、ゾーフィゴ（Ｘｏｆｉｇｏ）（ラジウム２２３二塩化物）、イクスタンジ（Ｘｔａｎｄｉ）（エンザルタミド）、ヤーボイ（Ｙｅｒｖｏｙ）（イピリムマブ）、ヨンデリス（Ｙｏｎｄｅｌｉｓ）（トラベクテジン）、ザルトラップ（Ｚａｌｔｒａｐ）（Ｚｉｖ－アフリベルセプト）、ザルキシオ（Ｚａｒｘｉｏ）（フィルグラスチム）、ゼジューラ（Ｚｅｊｕｌａ）（ニラパリブトシル酸塩一水和物）、ゼルボラフ（Ｚｅｌｂｏｒａｆ）（ベムラフェニブ）、ゼヴァリン（Ｚｅｖａｌｉｎ）（イブリツモマブチウキセタン）、ジネカード（Ｚｉｎｅｃａｒｄ）（デクスラゾキサン塩酸塩）、Ｚｉｖ－アフリベルセプト、ゾフラン（Ｚｏｆｒａｎ）（オンダンセトロン塩酸塩）、ゾラデックス（Ｚｏｌａｄｅｘ）（ゴセレリン酢酸塩）、ゾレドロン酸、ゾリンザ（Ｚｏｌｉｎｚａ）（ボリノスタット）、ゾメタ（Ｚｏｍｅｔａ）（ゾレドロン酸）、ザイデリグ（Ｚｙｄｅｌｉｇ）（イデラリシブ）、ジカディア（Ｚｙｋａｄｉａ）（セリチニブ）及び／又はザイティガ（Ｚｙｔｉｇａ）（アビラテロン酢酸塩）、ザイティガ（Ｚｙｔｉｇａ）（アビラテロン酢酸塩）を含めた、当技術分野において公知の任意の抗癌剤を含むことができる。チェックポイント阻害薬としては、限定はされないが、ＰＤ－１（ニボルマブ（ＢＭＳ－９３６５５８又はＭＤＸ１１０６）、ＣＴ－０１１、ＭＫ－３４７５）、ＰＤ－ＬＩ（ＭＤＸ－１１０５（ＢＭＳ－９３６５５９）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）、ＰＤ－Ｌ２（ｒＨＩｇＭ１２Ｂ７）、ＣＴＬＡ－４（イピリムマブ（ＭＤＸ－０１０）、トレメリムマブ（ＣＰ－６７５，２０６））、ＩＤＯ、Ｂ７－Ｈ３（ＭＧＡ２７１）、Ｂ７－Ｈ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ－３（ＢＭＳ－９８６０１６）を遮断する抗体が挙げられる。
（Ｌｕｐｒｏｎ）デポ剤（ロイプロリド酢酸塩）、リュープロン（Ｌｕｐｒｏｎ）デポ剤－小児用（ロイプロリド酢酸塩）、リムパーザ（Ｌｙｎｐａｒｚａ）（オラパリブ）、マルキボ（Ｍａｒｑｉｂｏ）（ビンクリスチン硫酸塩リポソーム）、マチュレーン（Ｍａｔｕｌａｎｅ）（プロカルバジン塩酸塩）、メクロレタミン塩酸塩、メゲストロール酢酸塩、メキニスト（Ｍｅｋｉｎｉｓｔ）（トラメチニブ）、メルファラン、メルファラン塩酸塩、メルカプトプリン、メスナ、メスネックス（Ｍｅｓｎｅｘ）（メスナ）、メタゾラストン（Ｍｅｔｈａｚｏｌａｓｔｏｎｅ）（テモゾロミド）、メトトレキサート、メトトレキサートＬＰＦ（メトトレキサート）、メチルナルトレキソン臭化物、メキサート（Ｍｅｘａｔｅ）（メトトレキサート）、メキサートＡＱ（Ｍｅｘａｔｅ－ＡＱ）（メトトレキサート）、ミドスタウリン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン塩酸塩、マイトザイトレックス（Ｍｉｔｏｚｙｔｒｅｘ）（マイトマイシンＣ）、ＭＯＰＰ、モゾビル（Ｍｏｚｏｂｉｌ）（プレリキサホル）、マスタージェン（Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ）（メクロレタミン塩酸塩）、ムタマイシン（Ｍｕｔａｍｙｃｉｎ）（マイトマイシンＣ）、ミレラン（Ｍｙｌｅｒａｎ）（ブスルファン）、マイロサール（Ｍｙｌｏｓａｒ）（アザシチジン）、マイロターグ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ）（ゲムツズマブオゾガマイシン）、ナノ粒子パクリタキセル（パクリタキセル・アルブミン安定化ナノ粒子製剤）、ナベルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ）（酒石酸ビノレルビン）、ネシツムマブ、ネララビン、ネオサール（Ｎｅｏｓａｒ）（シクロホスファミド）、ネラチニブマレイン酸塩、ネルリンクス（Ｎｅｒｌｙｎｘ）（ネラチニブマレイン酸塩）、ネツピタント及びパロノセトロン塩酸塩、ニューラスタ（Ｎｅｕｌａｓｔａ）（ペグフィルグラスチム）、ニューポジェン（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）（フィルグラスチム）、ネクサバール（Ｎｅｘａｖａｒ）（ソラフェニブトシル酸塩）、ニランドロン（Ｎｉｌａｎｄｒｏｎ）（ニルタミド）、ニロチニブ、ニルタミド、ニンラーロ（Ｎｉｎｌａｒｏ）（イキサゾミブクエン酸塩）、ニラパリブトシル酸塩一水和物、ニボルマブ、ノルバデックス（Ｎｏｌｖａｄｅｘ）（タモキシフェンクエン酸塩）、エヌプレート（Ｎｐｌａｔｅ）（ロミプロスチム）、オビヌツズマブ、オドムゾ（Ｏｄｏｍｚｏ）（ソニデギブ）、ＯＥＰＡ、オファツムマブ、ＯＦＦ、オラパリブ、オララツマブ、オマセタキシンメペスクシネート、オンカスパール（Ｏｎｃａｓｐａｒ）（ペグアスパラガーゼ）、オンダンセトロン塩酸塩、オニバイド（Ｏｎｉｖｙｄｅ）（イリノテカン塩酸塩リポソーム）、オンタク（Ｏｎｔａｋ）（デニロイキンジフチトクス）、オプジーボ（Ｏｐｄｉｖｏ）（ニボルマブ）、ＯＰＰＡ、オシメルチニブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、パクリタキセル・アルブミン安定化ナノ粒子製剤、ＰＡＤ、パルボシクリブ、パリフェルミン、パロノセトロン塩酸塩、パロノセトロン塩酸塩及びネツピタント、パミドロン酸二ナトリウム、パニツムマブ、パノビノスタット、パラプラット（Ｐａｒａｐｌａｔ）（カルボプラチン）、パラプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ）（カルボプラチン）、パゾパニブ塩酸塩、ＰＣＶ、ＰＥＢ、ペグアスパラガーゼ、ペグフィルグラスチム、ペグインターフェロンアルファ－２ｂ、ペグイントロン（ＰＥＧ－Ｉｎｔｒｏｎ）（ペグインターフェロンアルファ－２ｂ）、ペンブロリズマブ、ペメトレキセド二ナトリウム、パージェタ（Ｐｅｒｊｅｔａ）（ペルツズマブ）、ペルツズマブ、プラチノール（Ｐｌａｔｉｎｏｌ）（シスプラチン）、プラチノールＡＱ（Ｐｌａｔｉｎｏｌ－ＡＱ）（シスプラチン）、プレリキサホル、ポマリドミド、ポマリスト（Ｐｏｍａｌｙｓｔ）（ポマリドミド）、ポナチニブ塩酸塩、ポートラーザ（Ｐｏｒｔｒａｚｚａ）（ネシツムマブ）、プララトレキサート、プレドニゾン、プロカルバジン塩酸塩、プロロイキン（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）（アルデスロイキン）、プロリア（Ｐｒｏｌｉａ）（デノスマブ）、プロマクタ（Ｐｒｏｍａｃｔａ）（エルトロンボパグオラミン）、プロプラノロール塩酸塩、プロベンジ（Ｐｒｏｖｅｎｇｅ）（シプロイセル－Ｔ）、プリントール（Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ）（メルカプトプリン）、プリキサン（Ｐｕｒｉｘａｎ）（メルカプトプリン）、ラジウム２２３二塩化物、ラロキシフェン塩酸塩、ラムシルマブ、ラスブリカーゼ、Ｒチョップ（Ｒ－ＣＨＯＰ）、Ｒ－ＣＶＰ、組換えヒトパピローマウイルス（ｌ－ＩＰＶ）二価ワクチン、組換えヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）九価ワクチン、組換えヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）四価ワクチン、組換えインターフェロンα－２ｂ、レゴラフェニブ、レリストール（Ｒｅｌｉｓｔｏｒ）（メチルナルトレキソン臭化物）、Ｒエポック（Ｒ－ＥＰＯＣＨ）、レブラミド（Ｒｅｖｌｉｍｉｄ）（レナリドマイド）、リウマトレックス（Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ）（メトトレキサート）、リボシクリブ、Ｒアイス（Ｒ－ＩＣＥ）、リツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ）（リツキシマブ）、リツキサンハイセラ（Ｒｉｔｕｘａｎ Ｈｙｃｅｌａ）（リツキシマブ及びヒアルロニダーゼ（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ）ヒト）、リツキシマブ、リツキシマブ及びヒアルロニダーゼ（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ）ヒト、ロラピタント塩酸塩、ロミデプシン、ロミプロスチム、ルビドマイシン（ダウノルビシン塩酸塩）、ルブラカ（Ｒｕｂｒａｃａ）（ルカパリブカンシル酸塩）、ルカパリブカンシル酸塩、ルキソリチニブリン酸塩、ライダプト（Ｒｙｄａｐｔ）（ミドスタウリン）、スクレロゾル（Ｓｃｌｅｒｏｓｏｌ）胸膜内エアロゾル（タルク）、シルツキシマブ、シプロイセル－Ｔ、ソマチュリン（Ｓｏｍａｔｕｌｉｎｅ）デポ剤（ランレオチド酢酸塩）、ソニデギブ、ソラフェニブトシル酸塩、スプリセル（Ｓｐｒｙｃｅｌ）（ダサチニブ）、スタンフォード（ＳＴＡＮＦＯＲＤ Ｖ）、滅菌タルク粉末（タルク）、ステリタルク（Ｓｔｅｒｉｔａｌｃ）（タルク）、スチバーガ（Ｓｔｉｖａｒｇａ）（レゴラフェニブ）、スニチニブリンゴ酸塩、スーテント（Ｓｕｔｅｎｔ）（スニチニブリンゴ酸塩）、シラトロン（Ｓｙｌａｔｒｏｎ）（ペグインターフェロンアルファ－２ｂ）、シルバント（Ｓｙｌｖａｎｔ）（シルツキシマブ）、シンリボ（Ｓｙｎｒｉｂｏ）（オマセタキシンメペスクシネート）、タブロイド（Ｔａｂｌｏｉｄ）（チオグアニン）、ＴＡＣ、タフィンラー（Ｔａｆｉｎｌａｒ）（ダブラフェニブ）、タグリッソ（Ｔａｇｒｉｓｓｏ）（オシメルチニブ）、タルク、タリモジーン・ラハーパレプベック、タモキシフェンクエン酸塩、タラビンＰＦＳ（Ｔａｒａｂｉｎｅ ＰＦＳ）（シタラビン）、タルセバ（Ｔａｒｃｅｖａ）（エルロチニブ塩酸塩）、タルグレチン（Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ）（ベキサロテン）、タシグナ（Ｔａｓｉｇｎａ）（ニロチニブ）、タキソール（Ｔａｘｏｌ）（パクリタキセル）、タキソテール（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）（ドセタキセル）、テセントリク（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ）（アテゾリズマブ）、テモダール（Ｔｅｍｏｄａｒ）（テモゾロミド）、テモゾロミド、テムシロリムス、サリドマイド、サロミド（Ｔｈａｌｏｍｉｄ）（サリドマイド）、チオグアニン、チオテパ、チサゲンレクロイセル、トラック（Ｔｏｌａｋ）（フルオロウラシル－局所）、トポテカン塩酸塩、トレミフェン、トーリセル（Ｔｏｒｉｓｅｌ）（テムシロリムス）、トシツモマブ及びヨウ素Ｉ１３１トシツモマブ、トテクト（Ｔｏｔｅｃｔ）（デクスラゾキサン塩酸塩）、ＴＰＦ、トラベクテジン、トラメチニブ、トラスツズマブ、トレアンダ（Ｔｒｅａｎｄａ）（ベンダムスチン塩酸塩）、トリフルリジン及びチピラシル塩酸塩、トリセノックス（Ｔｒｉｓｅｎｏｘ）（三酸化ヒ素）、タイケルブ（Ｔｙｋｅｒｂ）（ラパチニブ二トシル酸塩）、ユニツキシン（Ｕｎｉｔｕｘｉｎ）（ジヌツキシマブ）、ウリジン三酢酸塩、ＶＡＣ、バンデタニブ、ＶＡＭＰ、バルビ（Ｖａｒｕｂｉ）（ロラピタント塩酸塩）、ベクティビックス（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ）（パニツムマブ）、ＶｅＩＰ、ベルバン（Ｖｅｌｂａｎ）（ビンブラスチン硫酸塩）、ベルケイド（Ｖｅｌｃａｄｅ）（ボルテゾミブ）、ベルサール（Ｖｅｌｓａｒ）（ビンブラスチン硫酸塩）、ベムラフェニブ、ベネクレクスタ（Ｖｅｎｃｌｅｘｔａ）（ベネトクラクス）、ベネトクラクス、ベージニオ（Ｖｅｒｚｅｎｉｏ）（アベマシクリブ）、ビアデュール（Ｖｉａｄｕｒ）（ロイプロリド酢酸塩）、ビダーザ（Ｖｉｄａｚａ）（アザシチジン）、ビンブラスチン硫酸塩、ビンカサールＰＦＳ（Ｖｉｎｃａｓａｒ ＰＦＳ）（ビンクリスチン硫酸塩）、ビンクリスチン硫酸塩、ビンクリスチン硫酸塩リポソーム、酒石酸ビノレルビン、ＶＩＰ、ビスモデギブ、ビストガード（Ｖｉｓｔｏｇａｒｄ）（ウリジン三酢酸塩）、ボラキサゼ（Ｖｏｒａｘａｚｅ）（グルカルピダーゼ）、ボリノスタット、ボトリエント（Ｖｏｔｒｉｅｎｔ）（パゾパニブ塩酸塩）、ヴィキセオス（Ｖｙｘｅｏｓ）（ダウノルビシン塩酸塩及びシタラビンリポソーム）、ウェルコボリン（Ｗｅｌｌｃｏｖｏｒｉｎ）（ロイコボリンカルシウム）、ザーコリ（Ｘａｌｋｏｒｉ）（クリゾチニブ）、ゼローダ（Ｘｅｌｏｄａ）（カペシタビン）、ＸＥＬＩＲＩ、ＸＥＬＯＸ、イクスゲバ（Ｘｇｅｖａ）（デノスマブ）、ゾーフィゴ（Ｘｏｆｉｇｏ）（ラジウム２２３二塩化物）、イクスタンジ（Ｘｔａｎｄｉ）（エンザルタミド）、ヤーボイ（Ｙｅｒｖｏｙ）（イピリムマブ）、ヨンデリス（Ｙｏｎｄｅｌｉｓ）（トラベクテジン）、ザルトラップ（Ｚａｌｔｒａｐ）（Ｚｉｖ－アフリベルセプト）、ザルキシオ（Ｚａｒｘｉｏ）（フィルグラスチム）、ゼジューラ（Ｚｅｊｕｌａ）（ニラパリブトシル酸塩一水和物）、ゼルボラフ（Ｚｅｌｂｏｒａｆ）（ベムラフェニブ）、ゼヴァリン（Ｚｅｖａｌｉｎ）（イブリツモマブチウキセタン）、ジネカード（Ｚｉｎｅｃａｒｄ）（デクスラゾキサン塩酸塩）、Ｚｉｖ－アフリベルセプト、ゾフラン（Ｚｏｆｒａｎ）（オンダンセトロン塩酸塩）、ゾラデックス（Ｚｏｌａｄｅｘ）（ゴセレリン酢酸塩）、ゾレドロン酸、ゾリンザ（Ｚｏｌｉｎｚａ）（ボリノスタット）、ゾメタ（Ｚｏｍｅｔａ）（ゾレドロン酸）、ザイデリグ（Ｚｙｄｅｌｉｇ）（イデラリシブ）、ジカディア（Ｚｙｋａｄｉａ）（セリチニブ）及び／又はザイティガ（Ｚｙｔｉｇａ）（アビラテロン酢酸塩）、ザイティガ（Ｚｙｔｉｇａ）（アビラテロン酢酸塩）を含めた、当技術分野において公知の任意の抗癌剤を含むことができる。チェックポイント阻害薬としては、限定はされないが、ＰＤ－１（ニボルマブ（ＢＭＳ－９３６５５８又はＭＤＸ１１０６）、ＣＴ－０１１、ＭＫ－３４７５）、ＰＤ－ＬＩ（ＭＤＸ－１１０５（ＢＭＳ－９３６５５９）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）、ＰＤ－Ｌ２（ｒＨＩｇＭ１２Ｂ７）、ＣＴＬＡ－４（イピリムマブ（ＭＤＸ－０１０）、トレメリムマブ（ＣＰ－６７５，２０６））、ＩＤＯ、Ｂ７－Ｈ３（ＭＧＡ２７１）、Ｂ７－Ｈ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ－３（ＢＭＳ－９８６０１６）を遮断する抗体が挙げられる。
【0172】
参考文献
アルマルト・Ｚ（Ａｌｍａｌｔｅ Ｚ）、サマラニ・Ｓ（Ｓａｍａｒａｎｉ Ｓ）、イアンネロ・Ａ（Ｉａｎｎｅｌｌｏ Ａ）ら著、「活性化型キラー細胞免疫グロブリン様受容体遺伝子と小児白血病との間の新規関連性（Ｎｏｖｅｌ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｋｉｌｌｅｒ－ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ）」、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、２０１１年、第１１８巻、第５号、ｐ．１３２３～１３２８。
アルマルト・Ｚ（Ａｌｍａｌｔｅ Ｚ）、サマラニ・Ｓ（Ｓａｍａｒａｎｉ Ｓ）、イアンネロ・Ａ（Ｉａｎｎｅｌｌｏ Ａ）ら著、「活性化型キラー細胞免疫グロブリン様受容体遺伝子と小児白血病との間の新規関連性（Ｎｏｖｅｌ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｋｉｌｌｅｒ－ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ）」、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、２０１１年、第１１８巻、第５号、ｐ．１３２３～１３２８。
【0173】
ブラウド・ＶＭ（Ｂｒａｕｄ ＶＭ）、アラン・ＤＳ（Ａｌｌａｎ ＤＳ）、オカラハン・ＣＡ（Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ ＣＡ）ら著、「ＨＬＡ－Ｅはナチュラルキラー細胞受容体ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、Ｂ及びＣに結合する（ＨＬＡ－Ｅ ｂｉｎｄｓ ｔｏ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ，Ｂ ａｎｄ Ｃ）」、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、１９９８年、第３９１巻、第６６６９号、ｐ．７９５～７９９。
【0174】
シコースキ・Ｆ（Ｃｉｃｈｏｃｋｉ Ｆ）、クーリ・Ｓ（Ｃｏｏｌｅｙ Ｓ）、デイビス・Ｚ（Ｄａｖｉｓ Ｚ）ら著、「ＣＤ５６ｄｉｍＣＤ５７＋ＮＫＧ２Ｃ＋ ＮＫ細胞拡大は強度軽減ＨＣＴ後の白血病の再発低下に関連する（ＣＤ５６ｄｉｍＣＤ５７＋ＮＫＧ２Ｃ＋ ＮＫ ｃｅｌｌ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｒｅｄｕｃｅｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｒｅｌａｐｓｅ ａｆｔｅｒ ｒｅｄｕｃｅｄ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ＨＣＴ）」、リューケミア（Ｌｅｕｋｅｍｉａ）、２０１６年、第３０巻、第２号、ｐ．４５６～４６３。
【0175】
フォーリ・Ｂ（Ｆｏｌｅｙ Ｂ）、クーリ・Ｓ（Ｃｏｏｌｅｙ Ｓ）、ベルネリス・ＭＲ（Ｖｅｒｎｅｒｉｓ ＭＲ）ら著、「同種移植後のサイトメガロウイルス再活性化は、強力な機能を有する教育されたＮＫＧ２Ｃ＋ナチュラルキラー細胞の持続的な増加を促進する（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ａ ｌａｓｔｉｎｇ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｅｄｕｃａｔｅｄ ＮＫＧ２Ｃ＋ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｐｏｔｅｎｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、２０１２年、第１１９巻、第１１号、ｐ．２６６５～２６７４。
【0176】
フォーリ・Ｂ（Ｆｏｌｅｙ Ｂ）、クーリ・Ｓ（Ｃｏｏｌｅｙ Ｓ）、ベルネリス・ＭＲ（Ｖｅｒｎｅｒｉｓ ＭＲ）ら著、「ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）誘導性記憶様ＮＫＧ２Ｃ（＋）ＮＫ細胞は移植可能であり、レシピエントＣＭＶ抗原に応答してインビボで拡大する（Ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（ＣＭＶ）－ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｅｍｏｒｙ－ｌｉｋｅ ＮＫＧ２Ｃ（＋）ＮＫ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｂｌｅ ａｎｄ ｅｘｐａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ ＣＭＶ ａｎｔｉｇｅｎ）」、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、２０１２年、第１８９巻、第１０号、ｐ．５０８２～５０８８。
【0177】
マンクーシ・Ａ（Ｍａｎｃｕｓｉ Ａ）、ルッゲリ・Ｌ（Ｒｕｇｇｅｒｉ Ｌ）、ウルバニ・Ｅ（Ｕｒｂａｎｉ Ｅ）ら著、「活性型ＫＩＲを有するＫＩＲリガンド不適合ドナーからのハプロタイプ一致造血細胞移植は無再発死亡率を低下させる（Ｈａｐｌｏｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ＫＩＲ ｌｉｇａｎｄ－ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ ｄｏｎｏｒｓ ｗｉｔｈ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ＫＩＲｓ ｒｅｄｕｃｅｓ ｎｏｎｒｅｌａｐｓｅ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ）」、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、２０１５年、第１２５巻、第２０号、ｐ．３１７３～３１８２。
【0178】
ピッタリ・Ｇ（Ｐｉｔｔａｒｉ Ｇ）、フレグニ・Ｇ（Ｆｒｅｇｎｉ Ｇ）、ロゲ・Ｌ（Ｒｏｇｕｅｔ Ｌ）ら著、「移植後急性骨髄性白血病患者におけるナチュラルキラー活性の早期評価（Ｅａｒｌｙ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｐａｔｉｅｎｔｓ）」、ボーン・マロー・トランスプランテーション（Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．）、２０１０年、第４５巻、第５号、ｐ．８６２～８７１。
【0179】
ルッゲリ・Ｌ（Ｒｕｇｇｅｒｉ Ｌ）、マンクーシ・Ａ（Ｍａｎｃｕｓｉ Ａ）、ペルッチオ・Ｋ（Ｐｅｒｒｕｃｃｉｏ Ｋ）、ブルチエッリ・Ｅ（Ｂｕｒｃｈｉｅｌｌｉ Ｅ）、マルテッリ・ＭＦ（Ｍａｒｔｅｌｌｉ ＭＦ）、ベラルディ・Ａ（Ｖｅｌａｒｄｉ Ａ）著、「白血病治療のためのナチュラルキラー細胞アロ反応性（Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ａｌｌｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｆｏｒ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｔｈｅｒａｐｙ）」、ジャーナル・オブ・イムノセラピー（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．）、２００５年、第２８巻、第３号、ｐ．１７５～１８２。
【0180】
ストリンガリス・Ｋ（Ｓｔｒｉｎｇａｒｉｓ Ｋ）、アダムス・Ｓ（Ａｄａｍｓ Ｓ）、Ｕｒｉｂｅ・Ｍ（Ｕｒｉｂｅ Ｍ）ら著、「ドナーＫＩＲ遺伝子２ＤＬ５Ａ、２ＤＳ１及び３ＤＳ１は、急性骨髄性白血病に対してはＨＬＡ一致同胞幹細胞移植後の白血病再発率の低下に関連するが、他の血液学的悪性腫瘍に対しては関連しない（Ｄｏｎｏｒ ＫＩＲ Ｇｅｎｅｓ ２ＤＬ５Ａ，２ＤＳ１ ａｎｄ ３ＤＳ１ ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｒｅｄｕｃｅｄ ｒａｔｅ ｏｆ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｒｅｌａｐｓｅ ａｆｔｅｒ ＨＬＡ－ｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｓｉｂｌｉｎｇ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｂｕｔ ｎｏｔ ｏｔｈｅｒ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ）」、バイオロジー・オブ・ブラッド・アンド・マロー・トランスプランテーション（Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．）、２０１０年、第１６巻、第９号、ｐ．１２５７～１２６４。
【0181】
前述の本明細書では、具体的な実施形態が記載されている。しかしながら、当業者は、以下の特許請求の範囲に定められる本開示の範囲から逸脱することなく、様々な修正形態及び変更形態がなされ得ることを理解する。従って、本明細書及び図は、限定的な意味でなく、むしろ例示的な意味で解釈されるべきであり、かかる修正形態は、全て本教示の範囲内に含まれることが意図される。
【0182】
利益、利点、問題の解決法及び任意の利益、利点又は解決法を想起させるか又は一層際立たせ得る任意の１つ又は複数の要素は、あらゆる特許請求の範囲の決定的な、要求される又は不可欠な特徴又は要素と解釈されてはならない。本開示は、本願の係属中に行われる任意の補正及び付与されるとおりのその特許請求の範囲の全ての均等物を含め、添付の特許請求の範囲によってのみ定義される。
【0183】
更に、本明細書では、第１及び第２、上及び下など、関係を示す用語は、ある実体又は動作を別の実体又は動作と区別するためにのみ用いられ得、必ずしもかかる実体又は動作の間のいずれかの実際のかかる関係又は順序を必要とするか又は含意するわけではない。用語「含む」、「含んでいる」、「有する」、「有している」、「包含する」、「包含している（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する」、「含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」又はこれらの任意の他の変化形は、要素のリストを含む、有する、包含する、含有するプロセス、方法、物品又は装置が、それらの要素を包含するのみならず、明示的に挙げられていないか、又はかかるプロセス、方法、物品若しくは装置に固有の他の要素を包含し得るように、非排他的包含を網羅することが意図される。「・・・を含む」、「・・・を有する」、「・・・を包含する」、「・・・を含有する」が前に付く要素は、それ以上の制約なしには、その要素を含む、有する、包含する、含有するプロセス、方法、物品又は装置に追加的な同一の要素が存在することを除外しない。用語「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、本明細書に特に明記しない限り、１つ又は複数として定義される。用語「実質的に」、「本質的に」、「近似的に」、「約」又はこれらの任意の他の変化形は、当業者が理解するとおり、近いこととして定義される。非限定的な一実施形態において、これらの用語は、例えば１０％以内、別の可能な実施形態では５％以内、別の可能な実施形態では１％以内及び別の可能な実施形態では０．５％以内にあると定義される。用語「カップリングされている（ｃｏｕｐｌｅｄ）」は、本明細書で使用されるとき、一時的又は永久的のいずれかで、必須ではないが直接及び必ずしも機械的ではなく接続されているか、又は接触した状態にあることとして定義される。ある種の方法で「構成されている（ｃｏｎｆｉｇｕｒｅｄ）」装置又は構造は、少なくともその方法で構成されるが、挙げられていない方法でも構成され得る。
【0184】
本化合物、組成物、物品、装置及び／又は方法を開示及び説明する前に、特に指定されない限り、それらが具体的な合成方法又は具体的な組換えバイオテクノロジー方法に限定されず、又は特に指定されない限り、詳細な試薬に限定されず、従って当然ながら変わり得ることが理解されるべきである。本明細書で使用される用語法は、あくまでも詳細な実施形態を説明する目的に過ぎず、限定することは意図しないことも理解されるべきである。開示される参考文献は、その参考文献が依拠する文章中で考察される、そこに含まれる資料についても、個別且つ具体的に参照によって本明細書に援用される。
【0185】
前述の実施形態のいずれか１つ又はその構成要素についての資料が特定されない限りにおいて、当業者であれば、意図した目的に好適な資料が分かるであろうことが理解されるべきである。本明細書で参照されるいずれの項目、テキスト、特許、特許公報、特許出願番号も、あらゆる目的から全体として参照により本明細書に援用される。
【0186】
範囲は、本明細書では、「約」１つの特定の値から及び／又は「約」もう１つの特定の値までとして表され得る。かかる範囲が表されるとき、別の実施形態は、その一方の特定の値から及び／又はその他方の特定の値までを含む。同様に、先行する「約」を用いることによって値が近似値として表されるとき、その特定の値が別の実施形態を形成することが理解されるであろう。更に、範囲の各々の端点が両方とも、他方の端点に対して、他方の端点とは無関係に有意であることが理解されるであろう。本明細書には開示される値が幾つもあり、その各値も、本明細書では、その値自体に加えて、「約」その特定の値と開示されることが理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、「約１０」も開示される。ある値が開示されるとき、当業者によって適切に理解されるとおり、その値「以下」、その値「以上」及び値の間にある可能な範囲も開示されることも理解される。例えば、値「１０」が開示されるとき、「１０以下」並びに「１０以上」も開示される。本願全体を通して、データが幾つもの異なる形式で提供されること及びこのデータが端点及び始点並びにそれらのデータ点の任意に組み合わせについての範囲を表すことも理解される。
【0187】
例えば、特定のデータ点「２０」及び特定のデータ点２５が開示される場合、２０及び２５より大きい、それら以上、それら未満、それら以下及びそれらに等しいという開示が、２０～２５の開示と同じくなされていると見なされることが理解される。２つの特定の単位の間の各単位も開示されることも理解される。例えば、２０及び２５が開示される場合、２１、２２、２３及び２４も開示される。
【0188】
読者が本技術的開示の性質を迅速に確かめることができるように、本開示の要約が提供される。これは、それが特許請求の範囲又は意味を解釈又は制限するために用いられないであろうという理解の下で提出される。加えて、前述の詳細な説明では、本開示を簡素化する目的で様々な特徴が様々な実施形態に１つにまとめられているのを見ることができる。この開示方法は、特許請求される実施形態に、各請求項に明示的に記載されるよりも多くの特徴が必要であるという意図を反映するものと解釈されてはならない。むしろ、以下の特許請求の範囲が反映するとおり、発明の主題は、単一の開示される実施形態の全てに満たない特徴にある。従って、以下の特許請求の範囲は、本明細書によって詳細な説明に援用され、各請求項は、個別に特許請求される主題として自立している。
【実施例】
【0189】
本発明が更に十分に理解され得るように、以下の例を示す。本願に記載される例は、本明細書に提供される方法及び組成物を例示するために提供され、その範囲を限定するものと決して解釈されてはならない。
【0190】
実施例１：一貫した且つ強力な「オフ・ザ・シェルフ」ＮＫ細胞治療用製剤を作成するための「理想的」ドナーを選択する
ＮＫ細胞は、それが自己ＨＬＡクラスＩ分子に対する抑制型キラー免疫グロブリン受容体（ＫＩＲ）を発現するとき、ライセンス化される（亢進した殺傷能力を獲得する）。これによってＮＫ細胞は、「自己」を認識することが可能になり、自己細胞を殺傷から免れさせる。従って、自己ＨＬＡクラスＩ分子を欠いている標的は、ライセンス化されたＮＫ細胞による認識を誘発する可能性が高くなる。ＮＫアロ反応性に関連することが公知の抑制型ＫＩＲ遺伝子は、（ｉ）ＨＬＡ－Ｃグループ２アレルに結合する２ＤＬ１、（ｉｉ）ＨＬＡ－Ｃグループ１アレルに結合する２ＤＬ２及び２ＤＬ３、（ｉｉｉ）及びＨＬＡ－Ｂ Ｂｗ４アレルに結合する３ＤＬ１である。リガンド欠損モデルによれば、対応するリガンドがレシピエントに存在せず、且つドナーに存在する場合に限り、抑制型ＫＩＲ遺伝子を発現する各ＮＫ細胞にアロ反応性があることになり、例えば、グループＣ１アレルを保有するドナーは、いずれもグループＣ１アレルを欠く任意の個体にアロ反応性を示すことになる。従って、Ｃ１、Ｃ２及びＢｗ４ファミリのＨＬＡを保有するドナーは、このモデルによれば、Ｃ１、又はＣ２、又はＢｗ４を欠く任意のレシピエントに対してアロ反応性を示すと予測される。
ＮＫ細胞は、それが自己ＨＬＡクラスＩ分子に対する抑制型キラー免疫グロブリン受容体（ＫＩＲ）を発現するとき、ライセンス化される（亢進した殺傷能力を獲得する）。これによってＮＫ細胞は、「自己」を認識することが可能になり、自己細胞を殺傷から免れさせる。従って、自己ＨＬＡクラスＩ分子を欠いている標的は、ライセンス化されたＮＫ細胞による認識を誘発する可能性が高くなる。ＮＫアロ反応性に関連することが公知の抑制型ＫＩＲ遺伝子は、（ｉ）ＨＬＡ－Ｃグループ２アレルに結合する２ＤＬ１、（ｉｉ）ＨＬＡ－Ｃグループ１アレルに結合する２ＤＬ２及び２ＤＬ３、（ｉｉｉ）及びＨＬＡ－Ｂ Ｂｗ４アレルに結合する３ＤＬ１である。リガンド欠損モデルによれば、対応するリガンドがレシピエントに存在せず、且つドナーに存在する場合に限り、抑制型ＫＩＲ遺伝子を発現する各ＮＫ細胞にアロ反応性があることになり、例えば、グループＣ１アレルを保有するドナーは、いずれもグループＣ１アレルを欠く任意の個体にアロ反応性を示すことになる。従って、Ｃ１、Ｃ２及びＢｗ４ファミリのＨＬＡを保有するドナーは、このモデルによれば、Ｃ１、又はＣ２、又はＢｗ４を欠く任意のレシピエントに対してアロ反応性を示すと予測される。
【0191】
抑制型ＫＩＲがアロ反応性を防ぐのに対し、活性型ＫＩＲは、ＮＫ細胞溶解を促進する活性型リガンドを認識する。活性型ＫＩＲの遺伝には、大きいばらつきがあり、どの個体にも０～７個のａＫＩＲがあり得る。幹細胞移植を受けた患者からのデータが示すところによれば、活性型ＫＩＲが多いドナーからの同種移植片の提供を受けた患者は、活性型ＫＩＲが少ないドナーからの同種移植片の提供を受けた患者と比べてアウトカムが良好である。他にも、活性型ＫＩＲをより多く受け継ぐ個体において、白血病に対する予防的利益が示されている。本発明者らの研究室では、活性型ＫＩＲ数が多いＮＫ細胞ほど、標的細胞の溶解を強力に誘導することを示した（図１）。加えて、多変量解析では、活性型ＫＩＲ ２ＤＳ１及び３ＤＳ１は無病生存期間と関連している。
【0192】
最後に、ＮＫＧ２Ｃは、ＮＫ細胞発生の後期に発現する活性型受容体であり、ＨＬＡ－Ｂ又は－ＣよりむしろＨＬＡ－Ｅを認識する。ＮＫＧ２Ｃ発現は、ＣＭＶ感染症患者で誘導され、適応性のＮＫ細胞表現型及び無白血病生存率の改善と相関する。
【0193】
従って、「最適な」ドナーとは、Ｃ１、Ｃ２及びＢｗ４アレルを担持するＨＬＡ遺伝子型を有する者、Ｃ１、Ｃ２及びＢｗ４に結合する（最大限のライセンス化につながる）抑制型ＫＩＲ（２ＤＬ１、２ＤＬ２又は３及び３ＤＬ１）を保有する、且つ活性型ＫＩＲの比率が高い（２ＤＳ１及び３ＤＳ１を含む可変的に遺伝する活性型遺伝子が３つ以上の）ＫＩＲ遺伝子型を有する者及びＣＭＶに曝露されたことがあり、結果としてＮＫＧ２Ｃ高発現が生じている者である。
【0194】
白人ドナーについて利用可能なデータを考察すると、集団の３２％にＣ１／Ｃ２／Ｂｗ４アレルが見られる。集団の８０％を占める２３個のＫＩＲ遺伝子型の２５．３％がこれらの基準に合致する。成人の約９０％が、ＣＭＶに曝露されたことがあることになる。フローサイトメトリーによる図８に示されるとおり、全てのＣＭＶ＋ドナーが、ＮＫＧ２Ｃを発現するＮＫ細胞を有し、これは、図６に説明される方法６００の６０６に記載されるなどの拡大後に増加する。ｍＲＮＡレベル測定による図９に示されるとおり、図６に説明される方法６００の６０６に記載されるなどの拡大後に、ＮＫＧ２Ｃ発現は増加した。
【0195】
従って、１６人中約１人の健常人に、「理想的な」ＮＫ細胞ドナーを同定することができる。
ドナー選択：
最大限の費用節約及び時間効率のため、ドナーは段階的アルゴリズムでスクリーニングし、基準に合致しないドナーを更なる検査から除外する。
ドナー選択：
最大限の費用節約及び時間効率のため、ドナーは段階的アルゴリズムでスクリーニングし、基準に合致しないドナーを更なる検査から除外する。
【0196】
ドナー選択には、ＨＬＡ及びＫＩＲ遺伝子タイピング、ＫＩＲ表現型タイピング及びＮＫ作製が関わる（図５Ａ、上）。ドナーをＫＩＲタイピングすることにより、ＫＩＲ遺伝子の存在（灰色）又は非存在（黒色）を評価し得る（図５Ａ、下）。一例では、ＰＢＭＣ及びドナー対応ＮＫ細胞をフローサイトメトリーによって分析し、ＮＫ細胞上のＫＩＲ発現を決定した。２ＤＬ２／３、２ＤＬ１及び３ＤＬ１の発現を、それぞれＫＩＲ特異的抗体ＲＥＡ１４７／ＣＨ－Ｌ、１４３２１１及びＤＸ９を用いて決定した。個別のドナーについての各ＫＩＲを発現するＮＫ細胞の割合を決定した（図５Ｂ）。
【0197】
ＮＫ細胞ドナーについて、逆配列特異的オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）方法論（例えば、ワンラムダ（Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ））でＫＩＲ遺伝子タイピングを実施すると、ＫＩＲ２ＤＬ４の機能変異体と欠失変異体との区別が可能となり得る。ＫＩＲ－Ｂ含量は、ＥＭＢＬ－ＥＢＩが管理するＢコンテントカリキュレータ（Ｂ Ｃｏｎｔｅｎｔ Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ）（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｐｄ／ｋｉｒ／ｄｏｎｏｒ＿ｂ＿ｃｏｎｔｅｎｔ．ｈｔｍｌ）を使用して決定することができる。活性型ＫＩＲ含量は、活性型ＫＩＲ遺伝子の総数を評点化することによって決定することになる。ＤＳ指定ＫＩＲ及び機能性ＫＩＲ２ＤＬ４は、全て活性型と見なした。一般的な活性型ＫＩＲ（ＫＩＲ２ＤＳ４及び機能性バージョンのＫＩＲ２ＤＬ４）及び５個の可変的に遺伝する活性型ＫＩＲの少なくとも３個を有するドナーが選択されることになる。
【0198】
市販のキットを用いたＳＳＯ－ＰＣＲ（増幅及びオリゴヌクレオチドシーケンシング）により、ＨＬＡ－Ｂ及びＣ遺伝子座におけるアレルに関してＮＫ細胞ドナーを高分解能レベルでＨＬＡタイピングし得る。ＫＩＲリガンドクラスは、欧州分子生物学研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂ）の欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ＥＭＢＬ－ＥＢＩ）が管理するＫＩＲリガンドカリキュレータ（ＫＩＲ Ｌｉｇａｎｄ Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ）（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｐｄ／ｋｉｒ／ｌｉｇａｎｄ．ｈｔｍｌ）を使用して予測することができる。３つのＣ１、Ｃ２及びＢｗ４クラス全てを保有する個体を選択しなければならない。
【0199】
ドナーは、ＣＭＶに関しても検査される。検査でＣＭＶ＋ドナーが出ると、ＮＫＧ２Ｃ＋ ＮＫ細胞の存在が確認される。
ＯＴＳ ＮＫ細胞製剤の製造及びバイアル封入推定：
対象の登録前に、拡大したドナーＮＫ細胞製剤（ｅｘｐａｎｄｅｄ ｄｏｎｏｒ ＮＫ ｃｅｌｌ ｐｒｏｄｕｃｔ）を製造する。全てのドナーが、採取から７日以内に、標準的な感染症スクリーニング及び他のドナースクリーニング（連邦規則集第２１編第１２７１部Ｃ項によって要求されるとおり）を受ける。ＦＤＡ ＩＮＤ申請のＣＭＣの節に概説される手順のとおりに供給源ＰＢＭＣを採取し、ＮＫ細胞を増殖させる。簡潔に言えば、ＰＢＭＣは、ＭＡＣＳコロイド超常磁性ＣＤ３マイクロビーズを用いてＣＤ３＋ Ｔ細胞を枯渇させる。ウシ胎仔血清及びＩＬ－２を補足した培地中で、得られた細胞を照射フィーダ細胞及び／又は膜粒子と共培養する。７日目、培養物を再刺激する。ＮＫ細胞製剤は、１４日目に、続く輸注のためのロット出荷試験及び凍結保存を行う。無菌検査は、凍結保存時点で一部が完了し、全ての検査は、製品の出荷前に終了となる。ＮＫ細胞は、１０８個のＮＫ細胞／ｍＬを含有する５０ｍＬの単回用量アリコートで凍結保存する。１単位（４５０ｍＬ）に相当する初回ドナー採血、１．２６×１０５個のＮＫ細胞／ｍＬの含量中央値及び２週間で２，８００倍の拡大中央値を仮定すれば、各ドナーが、３１個の単位用量バッグに十分なＮＫ細胞を作成する。ＣＤ３枯渇後に中央値３×１０８個のＮＫ細胞を含有する初回ドナーアフェレーシスを仮定すれば、各ドナーは平均１６８個の単位用量バッグを作成することが可能であり得る。１個のバッグが、５０ｋｇの個体に対する１０８個のＮＫ細胞／ｋｇの１用量に十分である。成人患者については、１０８個／ｋｇの用量に対し、１用量当たり患者１人につき最大２～３個のバッグが必要であり得る。凍結用培地が１０％のＤＭＳＯを含有すると仮定すれば、１０８個／ｋｇ用量について投与されるＤＭＳＯは、０．１ｍｌ／ｋｇとなり得る。
ＯＴＳ ＮＫ細胞製剤の製造及びバイアル封入推定：
対象の登録前に、拡大したドナーＮＫ細胞製剤（ｅｘｐａｎｄｅｄ ｄｏｎｏｒ ＮＫ ｃｅｌｌ ｐｒｏｄｕｃｔ）を製造する。全てのドナーが、採取から７日以内に、標準的な感染症スクリーニング及び他のドナースクリーニング（連邦規則集第２１編第１２７１部Ｃ項によって要求されるとおり）を受ける。ＦＤＡ ＩＮＤ申請のＣＭＣの節に概説される手順のとおりに供給源ＰＢＭＣを採取し、ＮＫ細胞を増殖させる。簡潔に言えば、ＰＢＭＣは、ＭＡＣＳコロイド超常磁性ＣＤ３マイクロビーズを用いてＣＤ３＋ Ｔ細胞を枯渇させる。ウシ胎仔血清及びＩＬ－２を補足した培地中で、得られた細胞を照射フィーダ細胞及び／又は膜粒子と共培養する。７日目、培養物を再刺激する。ＮＫ細胞製剤は、１４日目に、続く輸注のためのロット出荷試験及び凍結保存を行う。無菌検査は、凍結保存時点で一部が完了し、全ての検査は、製品の出荷前に終了となる。ＮＫ細胞は、１０８個のＮＫ細胞／ｍＬを含有する５０ｍＬの単回用量アリコートで凍結保存する。１単位（４５０ｍＬ）に相当する初回ドナー採血、１．２６×１０５個のＮＫ細胞／ｍＬの含量中央値及び２週間で２，８００倍の拡大中央値を仮定すれば、各ドナーが、３１個の単位用量バッグに十分なＮＫ細胞を作成する。ＣＤ３枯渇後に中央値３×１０８個のＮＫ細胞を含有する初回ドナーアフェレーシスを仮定すれば、各ドナーは平均１６８個の単位用量バッグを作成することが可能であり得る。１個のバッグが、５０ｋｇの個体に対する１０８個のＮＫ細胞／ｋｇの１用量に十分である。成人患者については、１０８個／ｋｇの用量に対し、１用量当たり患者１人につき最大２～３個のバッグが必要であり得る。凍結用培地が１０％のＤＭＳＯを含有すると仮定すれば、１０８個／ｋｇ用量について投与されるＤＭＳＯは、０．１ｍｌ／ｋｇとなり得る。
【0200】
実施例２：再発／難治性急性骨髄性白血病の寛解導入のためのＩＬ－２１拡大ナチュラルキラー細胞の安全性及び実行可能性を試験する第Ｉ／ＩＩ相臨床試験
１．０ バックグラウンド及び理論的根拠
１．１ 再発ＡＭＬ及び造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）
造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）は、ＡＭＬに対する有効な治療である。ＨＳＣＴでは、初回寛解期に移植された患者の長期無病生存率が約６０％である。再発後、患者がＨＳＣＴ時点で寛解期にあった場合、この率は、約４０％に下がる。再発ＡＭＬを有する、ＨＳＣＴを受けていない患者の長期無病生存率は５～１０％である。多くの再発患者が、難治性化学療法抵抗性疾患を有し、治癒の可能性のあるＨＳＣＴに適格となる寛解を得ることは二度とないか、又はその疾患の長期にわたる集中的な再寛解導入の間に重大な合併する共存症を発症する。従って、再発患者において移植前に寛解を達成するための改良された戦略が、こうした患者の生存率の改善に決定的に重要である。
１．０ バックグラウンド及び理論的根拠
１．１ 再発ＡＭＬ及び造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）
造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）は、ＡＭＬに対する有効な治療である。ＨＳＣＴでは、初回寛解期に移植された患者の長期無病生存率が約６０％である。再発後、患者がＨＳＣＴ時点で寛解期にあった場合、この率は、約４０％に下がる。再発ＡＭＬを有する、ＨＳＣＴを受けていない患者の長期無病生存率は５～１０％である。多くの再発患者が、難治性化学療法抵抗性疾患を有し、治癒の可能性のあるＨＳＣＴに適格となる寛解を得ることは二度とないか、又はその疾患の長期にわたる集中的な再寛解導入の間に重大な合併する共存症を発症する。従って、再発患者において移植前に寛解を達成するための改良された戦略が、こうした患者の生存率の改善に決定的に重要である。
【0201】
１．２ ＡＭＬに対する再寛解導入化学療法
再発ＡＭＬにおける再寛解導入化学療法は、寛解率に大きいばらつきが生じ、これは一部には、この集団の不均一性が理由である。過去２０年間にわたる３１件の試験のメタレビューから、優れたレジメンが１つもないことが明らかになった。ある研究では、高リスク患者（初回完全寛解（ＣＲ１）が１年未満であった者）の平均第二完全寛解（ＣＲ２）率は２７．６％±１５．５（加重平均値±ＳＤ）であり、一方、低リスク患者（ＣＲ１が１年以上の患者）については、ＣＲ２率は５６．１％±２５．９であった。別の研究では、高リスク疾患（原発性難治性疾患又はＣＲ１が６ヵ月未満）を有する患者は僅か１０％のＣＲ２率であったのに対し、低リスク疾患を有する患者は（ＣＲ１が１８ヵ月以上）については５０％を超えており、予後良好の核型を有する患者は、予後不良の核型を有する患者よりも高い頻度で第二又は第三寛解を達成する。
再発ＡＭＬにおける再寛解導入化学療法は、寛解率に大きいばらつきが生じ、これは一部には、この集団の不均一性が理由である。過去２０年間にわたる３１件の試験のメタレビューから、優れたレジメンが１つもないことが明らかになった。ある研究では、高リスク患者（初回完全寛解（ＣＲ１）が１年未満であった者）の平均第二完全寛解（ＣＲ２）率は２７．６％±１５．５（加重平均値±ＳＤ）であり、一方、低リスク患者（ＣＲ１が１年以上の患者）については、ＣＲ２率は５６．１％±２５．９であった。別の研究では、高リスク疾患（原発性難治性疾患又はＣＲ１が６ヵ月未満）を有する患者は僅か１０％のＣＲ２率であったのに対し、低リスク疾患を有する患者は（ＣＲ１が１８ヵ月以上）については５０％を超えており、予後良好の核型を有する患者は、予後不良の核型を有する患者よりも高い頻度で第二又は第三寛解を達成する。
【0202】
ＡＭＬの治療のための一次及び救援レジメンにおける統合薬剤としての高用量シトシンアラビノシド（シタラビン、Ａｒａ－Ｃ）の重要性は、十分に確立されている。フルダラビンは、リンパ球輸注前に患者のリンパ球を枯渇させるために広く使用されており、通常、アントラサイクリンと共に又はそれ無しでシタラビンと組み合わせるフルダラビン含有レジメンが、原発性難治性又は再発ＡＭＬの再寛解導入に用いられている。フルダラビンは、ＡＭＬ芽球において、シタラビンの活性代謝産物であるＡｒａ－ＣＴＰの細胞内蓄積の増加を増強することが実証された。これが、ＡＭＬに対する高活性ＦＬＡＧ（フルダラビン、シタラビン、Ｇ－ＣＳＦ）レジメンの開発につながった。
【0203】
ＦＬＡＧ化学療法は、当初から記載されていたとおり、６０歳を超える患者で過剰な毒性を呈したが、この年齢群に対する臨床試験では、フルダラビン及びシタラビンを５日から４日に減量すると、安全に送達されている。
【0204】
１．３ ＡＭＬの治療におけるコロニー刺激因子の使用
顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）は、高用量化学療法後の好中球回復を亢進させる。ＡＭＬに対する寛解導入療法の間にＧ－ＣＳＦを使用すると、優れた無イベント生存率が得られる。加えて、これらは、Ａｒａ－ＣＴＰの蓄積の増大によってシタラビンに対する骨髄性白血病幹細胞の感度を高め、従ってＦＬＡＧなどの併用化学療法の抗白血病効果を増大させるために用いられている。更に、ＧＭ－ＣＳＦは、インビトロ及び自家移植セッティングで、ＡＭＬ芽球に対するＮＫ細胞の活性を亢進させることが示されている。
顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）は、高用量化学療法後の好中球回復を亢進させる。ＡＭＬに対する寛解導入療法の間にＧ－ＣＳＦを使用すると、優れた無イベント生存率が得られる。加えて、これらは、Ａｒａ－ＣＴＰの蓄積の増大によってシタラビンに対する骨髄性白血病幹細胞の感度を高め、従ってＦＬＡＧなどの併用化学療法の抗白血病効果を増大させるために用いられている。更に、ＧＭ－ＣＳＦは、インビトロ及び自家移植セッティングで、ＡＭＬ芽球に対するＮＫ細胞の活性を亢進させることが示されている。
【0205】
１．４ 抗腫瘍療法のメディエータとしてのヒトＮＫ細胞
ヒトＮＫ細胞は、典型的にはＣＤ５６又はＣＤ１６の発現及びＴ細胞受容体ＣＤ３の欠如によって定義される一部の末梢血リンパ球である。幾つもの研究が、ＮＫ細胞に腫瘍監視の役割があることを示唆している。ＮＫ溶解を受け易い細胞株は、「ＮＫ感受性」標的と呼ばれている。プロトタイプのＮＫ感受性標的は、白血病細胞株Ｋ５６２である。サイトカイン、詳細にはＩＬ－２によってＮＫ細胞が活性化すると、通常、ＮＫ溶解に感受性を有しない腫瘍標的（ＮＫ抵抗性標的）を溶解させる能力がＮＫ細胞に備わるようになる。
ヒトＮＫ細胞は、典型的にはＣＤ５６又はＣＤ１６の発現及びＴ細胞受容体ＣＤ３の欠如によって定義される一部の末梢血リンパ球である。幾つもの研究が、ＮＫ細胞に腫瘍監視の役割があることを示唆している。ＮＫ溶解を受け易い細胞株は、「ＮＫ感受性」標的と呼ばれている。プロトタイプのＮＫ感受性標的は、白血病細胞株Ｋ５６２である。サイトカイン、詳細にはＩＬ－２によってＮＫ細胞が活性化すると、通常、ＮＫ溶解に感受性を有しない腫瘍標的（ＮＫ抵抗性標的）を溶解させる能力がＮＫ細胞に備わるようになる。
【0206】
ＮＫ細胞は、ＫＩＲ受容体－リガンド相互作用によって調節され、特定のＨＬＡクラスＩ不適合標的に対して細胞毒性を示す。ＳＣＴセッティングにおけるアロ反応性ＨＬＡハプロタイプ一致ＮＫ細胞が生着を亢進させ、ＧｖＨＤを低減し、且つ白血病の再発を防ぐことが報告されている。ＡＭＬ患者における造血細胞移植を伴わないヒトハプロタイプ一致ＮＫ細胞の輸注が研究されている。この細胞は、細胞減少化学療法後に、リンパ球減少を誘導し、輸注後のＮＫ細胞の恒常的拡大を支援するために投与された。ＮＫ細胞は、ＣＤ５６＋細胞の二次ポジティブ選択を伴う又は伴わない、ドナーの白血球アフェレーシスと、続くＣＤ３＋ Ｔ細胞の枯渇によって入手し、次にそれをＩＬ－２によって一晩活性化させた。
【0207】
最大２×１０７個のＮＫ細胞／ｋｇの輸注が良好に忍容され、１５例中５例の難治性ＡＭＬ患者に寛解が生じた。移植片対宿主病及び遷延性汎血球減少は起こらなかった。ドナー細胞は最長４週間まで検出可能であった。
【0208】
先行試験における自家ＮＫ細胞による抗腫瘍効果の不良は、腫瘍の抵抗性の性質、腫瘍によって放出される因子及びキラー免疫グロブリン受容体（ＫＩＲ）を含め、幾つかの要因が理由であり得る。移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）及び移植片対腫瘍（ＧＶＴ）を媒介するエフェクターについては、なおも不確かながら、一部のマウスモデルにおいて、インビボでのＧＶＴ活性がインビトロでのＮＫ活性と強く相関することが示唆されている。Ａ２０白血病細胞株に対する同種移植モデルを用いると、同種異系ＮＫ輸注には白血病再発を防ぐ作用があり、白血球生着に対して有害な効果はなかった。インビトロ細胞毒性アッセイでは、同系又は自家ＮＫ細胞と比較したときの、同種異系ＩＬ２活性化ＮＫ細胞の優れた溶解能が示されている。ＮＫ細胞の輸注なく同系又は自家リンパ球枯渇輸注液を移植したところ、無病生存期間率は１０及び１５％であった。しかしながら、ＩＬ２活性化した同系ＮＫ細胞の養子移入は、生存率を５０％にまで改善した。対照的に、同種異系ＮＫ細胞で処理すると、一層強力でさえある抗腫瘍効果が得られ、動物の８５％が無疾患生存であった。クラスＩ誘導性のＮＫ細胞溶解阻害が抗腫瘍療法において重要であるという仮説は、同種異系ＮＫ細胞が自家ＮＫ細胞よりも高いインビボ抗腫瘍活性を呈することを示すこれらのインビボマウス実験によって強く裏付けられる。
【0209】
１．５ ＫＩＲ不適合（ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ）ドナー及びレシピエントの選択
［０００１］ＮＫ細胞は、ＨＬＡクラスＩ関連ＫＩＲを通して自家標的上の「自己」を認識する。この過程は、標的のＮＫ細胞溶解を抑制する。４つの抑制型ＫＩＲ遺伝子が、ＮＫアロ反応性に関連性があることが分かっており、ＨＬＡ特異性が公知である：２ＤＬ１はＨＬＡ－Ｃグループ２アレルに結合し、２ＤＬ２及び２ＤＬ３はＨＬＡ－Ｃグループ１アレルに結合し、及び３ＤＬ１はＨＬＡ－Ｂ Ｂｗ４アレルに結合する。存在するＫＩＲ遺伝子毎のリガンド欠損モデルによれば、対応するリガンドが患者に存在せず、ドナーに存在する場合に限り、アロ反応性があることになる。以下、白人ドナーの例示的なデータを表３に示し、これは、ドナーＧＶＬアロ反応性についてのＨＬＡ Ｂｗ及びＣグループ遺伝子座並びにＫＩＲ発現の分析をまとめたものである。集団の３２％にＣ１／Ｃ２／Ｂｗ４アレルが見られる。集団の８０％を占める２３個のＫＩＲ遺伝子型の２５．３％がこれらの基準に合致する。成人の約９０％が、ＣＭＶに曝露されたことがあることになる。従って、１６人中約１人の健常人に、「理想的な」ＮＫ細胞ドナーを同定することができる。
［０００１］ＮＫ細胞は、ＨＬＡクラスＩ関連ＫＩＲを通して自家標的上の「自己」を認識する。この過程は、標的のＮＫ細胞溶解を抑制する。４つの抑制型ＫＩＲ遺伝子が、ＮＫアロ反応性に関連性があることが分かっており、ＨＬＡ特異性が公知である：２ＤＬ１はＨＬＡ－Ｃグループ２アレルに結合し、２ＤＬ２及び２ＤＬ３はＨＬＡ－Ｃグループ１アレルに結合し、及び３ＤＬ１はＨＬＡ－Ｂ Ｂｗ４アレルに結合する。存在するＫＩＲ遺伝子毎のリガンド欠損モデルによれば、対応するリガンドが患者に存在せず、ドナーに存在する場合に限り、アロ反応性があることになる。以下、白人ドナーの例示的なデータを表３に示し、これは、ドナーＧＶＬアロ反応性についてのＨＬＡ Ｂｗ及びＣグループ遺伝子座並びにＫＩＲ発現の分析をまとめたものである。集団の３２％にＣ１／Ｃ２／Ｂｗ４アレルが見られる。集団の８０％を占める２３個のＫＩＲ遺伝子型の２５．３％がこれらの基準に合致する。成人の約９０％が、ＣＭＶに曝露されたことがあることになる。従って、１６人中約１人の健常人に、「理想的な」ＮＫ細胞ドナーを同定することができる。
【0210】
【表3】
【0211】
指示される組み合わせで、アロ反応性がＧＶＬ方向に起こるものと思われる。本研究では、このモデルを使用して、ＧＶＬ方向におけるＫＩＲ反応性の可能性が最も高いドナーを選択する。Ｃ１、Ｃ２及びＢｗ４ ＨＬＡを有するドナーが最大限の不適合を有すると、最も多いレシピエントにＧｖＬが提供される。
【0212】
１．７ ＮＫ細胞のエキソビボ拡大
養子ＮＫ細胞免疫療法にとっての大きい障害は、十分な細胞数の入手であり、これは、これらの細胞が末梢白血球のごく一部に相当し、エキソビボでの増殖が不良であり、且つインビボでの寿命が限られていることに伴うものである。共通γ鎖サイトカインは、ＮＫ細胞の活性化、成熟及び増殖において重要である。他にも、可溶性サイトカイン、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）及び共刺激分子並びに／又は膜結合型ＩＬ－１５（ｍＩＬ－１５）で改変したａＡＰＣによるエキソビボ拡大の改良が記載されている。本発明者らのグループは、膜結合型ＩＬ－２１融合タンパク質（ｍＩＬ２１）を作成し、ｍＩＬ２１並びに共刺激分子ＣＤ８６及びＣＤ１３７Ｌを発現するように遺伝子修飾されたＫ５６２ ａＡＰＣで刺激したとき、ＮＫ細胞のエキソビボ拡大が優れていることを見出した。新鮮に単離した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を照射Ｋ５６２ ａＡＰＣと２：１（ａＡＰＣ：ＰＢＭＣ）の比で５０ＩＵ／ｍｌのｒｈＩＬ－２の存在下において共培養し、次に７日毎に１：１の比のａＡＰＣで再刺激する。
養子ＮＫ細胞免疫療法にとっての大きい障害は、十分な細胞数の入手であり、これは、これらの細胞が末梢白血球のごく一部に相当し、エキソビボでの増殖が不良であり、且つインビボでの寿命が限られていることに伴うものである。共通γ鎖サイトカインは、ＮＫ細胞の活性化、成熟及び増殖において重要である。他にも、可溶性サイトカイン、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）及び共刺激分子並びに／又は膜結合型ＩＬ－１５（ｍＩＬ－１５）で改変したａＡＰＣによるエキソビボ拡大の改良が記載されている。本発明者らのグループは、膜結合型ＩＬ－２１融合タンパク質（ｍＩＬ２１）を作成し、ｍＩＬ２１並びに共刺激分子ＣＤ８６及びＣＤ１３７Ｌを発現するように遺伝子修飾されたＫ５６２ ａＡＰＣで刺激したとき、ＮＫ細胞のエキソビボ拡大が優れていることを見出した。新鮮に単離した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を照射Ｋ５６２ ａＡＰＣと２：１（ａＡＰＣ：ＰＢＭＣ）の比で５０ＩＵ／ｍｌのｒｈＩＬ－２の存在下において共培養し、次に７日毎に１：１の比のａＡＰＣで再刺激する。
【0213】
Ｋ５６２－ｍＩＬ２１ ａＡＰＣは、２１日目までに３７，２００倍の平均ＮＫ細胞拡大を促進するがこと可能であり、８５％のドナーが少なくとも５，０００倍の拡大を達成した（実施例１も参照されたい）。拡大された細胞（Ｅｘｐａｎｄｅｄ ｃｅｌｌｓ）は、極めて高いＣＤ１６レベル、ＮＣＲレベルを発現し、拡大前のＫＩＲレパートリを保持していた。これらの細胞は、腫瘍標的に対する高い細胞毒性及びＡＤＣＣ関与を示した。
【0214】
従って、ｍＩＬ２１を発現するａＡＰＣを用いると、少量の末梢血試料からの臨床的に有意なＮＫ細胞拡大が可能である。
１．８ 臨床試験の目的
再発ＡＭＬは、生存の最適化のため同種異系ＨＳＣＴ前に寛解を必要とするが、化学療法の奏効率が低い疾患である。ＨＬＡハプロタイプ一致ＮＫ濃縮末梢血細胞輸注は、予後不良ＡＭＬ患者において安全性を示している。かかる評価の検出力はないが、この試験は、寛解率について、有望な、しかし統計的には有意でない傾向を示した。ＡＭＬ、特に再発ＡＭＬに対するＮＫ細胞療法は、白血球アフェレーシスを通して達成可能なＮＫ細胞の数が少ないことによって制限される。しかしながら、本明細書に記載されるとおり、少量の採血からエキソビボで多数のＮＫ細胞を増殖させることができれば、ドナー白血球アフェレーシスの必要性が軽減される。
１．８ 臨床試験の目的
再発ＡＭＬは、生存の最適化のため同種異系ＨＳＣＴ前に寛解を必要とするが、化学療法の奏効率が低い疾患である。ＨＬＡハプロタイプ一致ＮＫ濃縮末梢血細胞輸注は、予後不良ＡＭＬ患者において安全性を示している。かかる評価の検出力はないが、この試験は、寛解率について、有望な、しかし統計的には有意でない傾向を示した。ＡＭＬ、特に再発ＡＭＬに対するＮＫ細胞療法は、白血球アフェレーシスを通して達成可能なＮＫ細胞の数が少ないことによって制限される。しかしながら、本明細書に記載されるとおり、少量の採血からエキソビボで多数のＮＫ細胞を増殖させることができれば、ドナー白血球アフェレーシスの必要性が軽減される。
【0215】
本試験の目的は、再発／難治性ＡＭＬ患者におけるＦＬＡＧ化学療法と併せたｍＩＬ２１拡大ハプロタイプ一致ＮＫ細胞の安全性、実行可能性及び最大耐量を決定することである。
【0216】
２．０ 適格性
２．１ 患者組入れ基準（Ｐａｔｅｉｎｔ Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ）
１．再発又は原発性難治性ＡＭＬ患者。同種異系幹細胞移植後の再発ＡＭＬ患者は、ドナーリンパ球輸注を受けたことのある患者を含め、活動性ＧｖＨＤがなく、且つ免疫抑制剤投与中でない場合に限り、適格である。
２．１ 患者組入れ基準（Ｐａｔｅｉｎｔ Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ）
１．再発又は原発性難治性ＡＭＬ患者。同種異系幹細胞移植後の再発ＡＭＬ患者は、ドナーリンパ球輸注を受けたことのある患者を含め、活動性ＧｖＨＤがなく、且つ免疫抑制剤投与中でない場合に限り、適格である。
【0217】
２．可能な範囲で最良のＫＩＲ反応性となるように選択されるハプロタイプ一致家族末梢血ドナーを有する。
３．患者の年齢１８歳以上。
３．患者の年齢１８歳以上。
【0218】
４．パフォーマンスステータス：カルノフスキー又はランスキーパフォーマンス尺度（ＰＳ）７０以上。
５．腎機能：血清クレアチニン２ｍｇ／ｄｌ未満又はクレアチニンクリアランス４０ｃｃ／分以上。小児患者についてはクレアチニン２ｍｇ／ｄｌ未満又は年齢の正常上限の２倍未満（いずれか少ない方）。
５．腎機能：血清クレアチニン２ｍｇ／ｄｌ未満又はクレアチニンクリアランス４０ｃｃ／分以上。小児患者についてはクレアチニン２ｍｇ／ｄｌ未満又は年齢の正常上限の２倍未満（いずれか少ない方）。
【0219】
６．肺機能：ＦＥＶ１、ＦＶＣ及びＤＬＣＯのヘモグロビン補正値が予想値の５０％超。小児患者については、肺機能検査を実施できない場合（７歳未満のほとんどの小児）、室内空気でパルスオキシメトリによるパルスオキシメトリ９２％以上。
【0220】
７．肝機能：総ビリルビン２ｍｇ／ｄｌ未満又は年齢のＵＬＮの２．５倍未満（ジルベール症候群を除く）及びＳＧＰＴ（ＡＬＴ）年齢のＵＬＮの２．５倍未満。
８．心機能：左室駆出率４０％超。無制御な不整脈又は無制御な症候性心疾患がない。
８．心機能：左室駆出率４０％超。無制御な不整脈又は無制御な症候性心疾患がない。
【0221】
９．妊娠可能な女性における登録前２週間以内の妊娠を除外するための血清検査陰性（妊娠可能でないとは、初経前である者、閉経後１年を超えている者又は不妊手術を受けた者として定義される）。
【0222】
１０．性的活動のある男性及び妊娠可能女性は、治験責任医師によって有効と見なされ、且つ医学的に許可される形態の避妊法を用いることに同意しなければならない。
１１．ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）陰性血清。
１１．ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）陰性血清。
【0223】
２．２ 患者除外基準
１．本プロトコルに関する治療開始前４週間における治験中の治療。
２．スクリーニング前６ヵ月未満におけるうっ血性心不全。
１．本プロトコルに関する治療開始前４週間における治験中の治療。
２．スクリーニング前６ヵ月未満におけるうっ血性心不全。
【0224】
３．スクリーニング前６ヵ月未満における不安定狭心症。
４．スクリーニング前６ヵ月未満における心筋梗塞。
５．自然に消散することがないか又は適切な療法の開始後に有意な消散のエビデンスを示さない感染症として定義される無制御な感染症、但し、慢性無症候性ウイルス感染症（例えば、ＨＰＶ、ＢＫウイルス、ＨＣＶ等）は除外する。
４．スクリーニング前６ヵ月未満における心筋梗塞。
５．自然に消散することがないか又は適切な療法の開始後に有意な消散のエビデンスを示さない感染症として定義される無制御な感染症、但し、慢性無症候性ウイルス感染症（例えば、ＨＰＶ、ＢＫウイルス、ＨＣＶ等）は除外する。
【0225】
２．３ ドナー適格性判定基準及び提供前評価
１．ドナーは１６歳以上で、体重が少なくとも５０ｋｇ（１１０ポンド）でなければならない。
１．ドナーは１６歳以上で、体重が少なくとも５０ｋｇ（１１０ポンド）でなければならない。
【0226】
２．ドナーは、ＮＫアロ反応性が最良となるように選択されるか（ドナーＮＫ細胞上に存在するＫＩＲ遺伝子を有し、それについての関連性のあるＨＬＡハプロタイプ（ＫＩＲリガンド）がレシピエントには存在せず、ドナーには存在することとして定義される）又は活性型ＫＩＲ遺伝子含量を基準に選択されるＨＬＡハプロタイプ一致血縁者でなければならない。
【0227】
３．ドナーは、治療用細胞製剤提供のための標準的な施設内適格性判定基準及びドナー認定基準を満たさなければならない。
４．妊娠可能な女性（妊娠可能でないとは、初経前、不妊手術歴又は閉経後１２ヵ月超として定義される）では、血清妊娠検査（βＨＣＧ）陰性によって定義されるとおり妊娠中でない。
４．妊娠可能な女性（妊娠可能でないとは、初経前、不妊手術歴又は閉経後１２ヵ月超として定義される）では、血清妊娠検査（βＨＣＧ）陰性によって定義されるとおり妊娠中でない。
【0228】
５．評価：
病歴及び身体検査
臨床検査：血液学、電解質、化学
感染症スクリーニング及び血清検査
ＨＬＡ及びＫＩＲタイピング
３．０ 治療計画
本研究では、初回ＮＫ細胞輸注を０日目（Ｄ０）と称し、Ｄ０前又はＤ０後の治療計画活動は、マイナス日数（Ｄ－）又はプラス日数（Ｄ＋）で表記する。
病歴及び身体検査
臨床検査：血液学、電解質、化学
感染症スクリーニング及び血清検査
ＨＬＡ及びＫＩＲタイピング
３．０ 治療計画
本研究では、初回ＮＫ細胞輸注を０日目（Ｄ０）と称し、Ｄ０前又はＤ０後の治療計画活動は、マイナス日数（Ｄ－）又はプラス日数（Ｄ＋）で表記する。
【0229】
３．１ ドナー末梢血ＮＫ
１４日間のａＡＰＣに対するＮＫ細胞拡大を開始するため、ドナーから１単位（約５００ｍＬ）の末梢血を採取することになる。
１４日間のａＡＰＣに対するＮＫ細胞拡大を開始するため、ドナーから１単位（約５００ｍＬ）の末梢血を採取することになる。
【0230】
３．２ 標準治療実践に従うＦＬＡＧ治療投与
ＮＫ細胞拡大のためのドナー末梢血の採取後、治療を行う医師によって適切と見なされ次第、レシピエントがＦＬＡＧ化学療法を開始し得る。Ｇ－ＣＳＦは、フルダラビン／シタラビンの初回用量の１日前に開始して毎日投与され、最下点後の好中球絶対数（ＡＮＣ）が１０００以上になるまで継続されることになる。Ｇ－ＣＳＦは、患者の安全性のため、医師の裁量で末梢芽球数高値が保たれ得る。フルダラビンは、３０ｍｇ／ｍ２／日で５日間投与されることになり、この用量は、実際の体重及び身長から計算した実際のＢＳＡを基準とする。約４時間後、シタラビンが２ｇ／ｍ２／日で５日間投与されることになる。６０歳を超える患者は、フルダラビン及びシタラビンを４日間のみ受けることによる用量修正を受けることになる。
ＮＫ細胞拡大のためのドナー末梢血の採取後、治療を行う医師によって適切と見なされ次第、レシピエントがＦＬＡＧ化学療法を開始し得る。Ｇ－ＣＳＦは、フルダラビン／シタラビンの初回用量の１日前に開始して毎日投与され、最下点後の好中球絶対数（ＡＮＣ）が１０００以上になるまで継続されることになる。Ｇ－ＣＳＦは、患者の安全性のため、医師の裁量で末梢芽球数高値が保たれ得る。フルダラビンは、３０ｍｇ／ｍ２／日で５日間投与されることになり、この用量は、実際の体重及び身長から計算した実際のＢＳＡを基準とする。約４時間後、シタラビンが２ｇ／ｍ２／日で５日間投与されることになる。６０歳を超える患者は、フルダラビン及びシタラビンを４日間のみ受けることによる用量修正を受けることになる。
【0231】
ＮＫ細胞輸注前２～１４日間にわたる安静期間。
３．３ 用量漸増スキーマによる合計６用量にわたる０～１４日目のＮＫ細胞輸注
拡大細胞についての出荷判定基準を満たし次第、フルダラビン／シタラビンの最終投与後２日以上１５日以下に始まるように、ＮＫ細胞輸注を開始し得る。ＮＫ細胞は週３回、少なくとも４日間の期間にわたって（例えば、ＭＷＦ（月曜日、水曜日、金曜日）、ＭＴｕＴｈ（月曜日、火曜日、木曜日）、ＴｕＴｈＦ（火曜日、木曜日、金曜日）等）送達されることになる。ＮＫ細胞は、幹細胞移植・細胞療法部門（ＳＣＴＣＴ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ）の治療用細胞輸注に関する標準業務手順書（ＳＯＰ）に従い輸注されることになる。
３．３ 用量漸増スキーマによる合計６用量にわたる０～１４日目のＮＫ細胞輸注
拡大細胞についての出荷判定基準を満たし次第、フルダラビン／シタラビンの最終投与後２日以上１５日以下に始まるように、ＮＫ細胞輸注を開始し得る。ＮＫ細胞は週３回、少なくとも４日間の期間にわたって（例えば、ＭＷＦ（月曜日、水曜日、金曜日）、ＭＴｕＴｈ（月曜日、火曜日、木曜日）、ＴｕＴｈＦ（火曜日、木曜日、金曜日）等）送達されることになる。ＮＫ細胞は、幹細胞移植・細胞療法部門（ＳＣＴＣＴ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ）の治療用細胞輸注に関する標準業務手順書（ＳＯＰ）に従い輸注されることになる。
【0232】
アナフィラキシー薬物療法：ＮＫ細胞輸注前に、以下の薬物療法を直ちに利用できるようにしておくこと。アナフィラキシーが起こった場合、医師（ＭＤ）に知らせ、呼び出すこと。
【0233】
エピネフリン（１：１０００）０．５ｍＬ皮下投与
ジフェンヒドラミン５０ｍｇ静脈内投与
アナフィラキシーの場合コルチコステロイド薬の投与前に医師（ＭＤ）と協議しなければならない。
ジフェンヒドラミン５０ｍｇ静脈内投与
アナフィラキシーの場合コルチコステロイド薬の投与前に医師（ＭＤ）と協議しなければならない。
【0234】
追加の支持的ケア措置については、ＭＤアンダーソン癌センター（ＭＤＡＣＣ）の過敏性反応（ＨＳＲ）アルゴリズムに従うこと。
前投薬：ＮＫ細胞の輸注前。ジフェンヒドラミン２５ｍｇ静脈内投与。
前投薬：ＮＫ細胞の輸注前。ジフェンヒドラミン２５ｍｇ静脈内投与。
【0235】
拡大後のＮＫ細胞は、その活性化した表現型が原因で毒性の増加を呈し得るため、初回ＮＫ細胞投与コホートは、アフェレーシス由来のＮＫ細胞について現在確立されている安全用量をはるかに下回ることになる。準最適用量の患者が集積することを回避するため、用量漸増スキーマに従うことになる。
【0236】
【表4】
【0237】
本研究では、ＮＫ細胞の現在の安全用量まで迅速に進めることができるように、急速用量漸増法の原理を用いる。
１回又は複数回のＮＫ輸注を受けることができるために、患者は、以下の要件を満たさなければならない：
１．直前７２時間の期間中にコルチコステロイド投薬中でない。
１回又は複数回のＮＫ輸注を受けることができるために、患者は、以下の要件を満たさなければならない：
１．直前７２時間の期間中にコルチコステロイド投薬中でない。
【0238】
２．人工呼吸器による補助又は酸素補給が不要。
３．パフォーマンスステータスカルノフスキー又はランスキーが７０％以上。
ＮＫ細胞用量は、総有核細胞（ＴＮＣ）数及びフローサイトメトリーによるＣＤ５６＋ＣＤ３－率の判定に基づくことになる。輸注される細胞製剤の最大容積は、１００ｍｌである。輸注される細胞は、ＮＫ細胞／ｋｇレシピエント体重を基準として送達されることになる。総ＣＤ３＋ Ｔ細胞は、全てのコホートについて１×１０５／ｋｇレシピエント体重未満でなければならない。現在のコホートのＮＫ細胞数を輸注すると、１０５個のＣＤ３＋細胞／ｋｇレシピエント体重より多く送達されることになる場合、ＮＫ細胞輸注用量は、輸注されたＣＤ３＋細胞が１×１０５／ｋｇレシピエント体重未満となる最も高いコホートの用量にまで減量されることになる。一部のドナーＮＫ細胞拡大では、計画したＮＫ細胞用量に達するのに十分な細胞が生じないこともある。標的ＮＫ細胞／ｋｇレシピエント体重を送達することができない場合、そのときＮＫ細胞輸注用量は、達成可能な最も高いコホートの用量にまで減量されることになる。統計的分析には、その患者データは、そのコホートに含められることになり、現在の用量レベルに追加の対象が登録されることになる。
３．パフォーマンスステータスカルノフスキー又はランスキーが７０％以上。
ＮＫ細胞用量は、総有核細胞（ＴＮＣ）数及びフローサイトメトリーによるＣＤ５６＋ＣＤ３－率の判定に基づくことになる。輸注される細胞製剤の最大容積は、１００ｍｌである。輸注される細胞は、ＮＫ細胞／ｋｇレシピエント体重を基準として送達されることになる。総ＣＤ３＋ Ｔ細胞は、全てのコホートについて１×１０５／ｋｇレシピエント体重未満でなければならない。現在のコホートのＮＫ細胞数を輸注すると、１０５個のＣＤ３＋細胞／ｋｇレシピエント体重より多く送達されることになる場合、ＮＫ細胞輸注用量は、輸注されたＣＤ３＋細胞が１×１０５／ｋｇレシピエント体重未満となる最も高いコホートの用量にまで減量されることになる。一部のドナーＮＫ細胞拡大では、計画したＮＫ細胞用量に達するのに十分な細胞が生じないこともある。標的ＮＫ細胞／ｋｇレシピエント体重を送達することができない場合、そのときＮＫ細胞輸注用量は、達成可能な最も高いコホートの用量にまで減量されることになる。統計的分析には、その患者データは、そのコホートに含められることになり、現在の用量レベルに追加の対象が登録されることになる。
【0239】
４．０ 薬物情報
４．１ シトシンアラビノシド（シタラビン、Ａｒａ－Ｃ）
シタラビンは、代謝拮抗薬である。シタラビン注射薬は、溶液として市販されている。取り扱い、再構成及び投与については、施設内指針に従わなければならない。シタラビンは、心肥大、昏睡、神経毒性（用量依存性、小脳毒性は高用量シタラビン［３６～４８ｇ／ｍ２／サイクル超］の投与を受けている患者に起こり得る；発生率は、腎機能障害を有する患者では５５％にまで上り得る）、人格変化、傾眠、脱毛（全頭性）、落屑、発疹（重度）、胃腸潰瘍、腹膜炎、腸管嚢腫様気腫症、高ビリルビン血症、肝膿瘍、肝損傷、壊死性大腸炎、末梢性ニューロパチ（運動及び感覚）、角膜毒性、出血性結膜炎、肺水腫、急性呼吸促迫症候群及び敗血症を引き起こし得る。
４．１ シトシンアラビノシド（シタラビン、Ａｒａ－Ｃ）
シタラビンは、代謝拮抗薬である。シタラビン注射薬は、溶液として市販されている。取り扱い、再構成及び投与については、施設内指針に従わなければならない。シタラビンは、心肥大、昏睡、神経毒性（用量依存性、小脳毒性は高用量シタラビン［３６～４８ｇ／ｍ２／サイクル超］の投与を受けている患者に起こり得る；発生率は、腎機能障害を有する患者では５５％にまで上り得る）、人格変化、傾眠、脱毛（全頭性）、落屑、発疹（重度）、胃腸潰瘍、腹膜炎、腸管嚢腫様気腫症、高ビリルビン血症、肝膿瘍、肝損傷、壊死性大腸炎、末梢性ニューロパチ（運動及び感覚）、角膜毒性、出血性結膜炎、肺水腫、急性呼吸促迫症候群及び敗血症を引き起こし得る。
【0240】
製剤：１００、５００、１０００又は２０００ｍｇバイアルに静脈内使用向けの溶液として
市販品
貯蔵：室温
安定性：室温で２８日
投与：シタラビンは、５％デキストロース又は０．９％塩化ナトリウム中に更に希釈される。
市販品
貯蔵：室温
安定性：室温で２８日
投与：シタラビンは、５％デキストロース又は０．９％塩化ナトリウム中に更に希釈される。
【0241】
４．２ フルダラビン
フルダラビンは、代謝拮抗薬である。フルダラビン注射薬は、滅菌水で再構成される凍結乾燥ケーキとして市販されている。取り扱い、再構成及び投与については、施設内指針に従わなければならない。フルダラビンは、本研究で投与されるよりも高い用量では、血液数減少、免疫系の抑制、悪心嘔吐、発熱、過敏性反応、腫瘍溶解、一過性の血清トランスアミナーゼ上昇、溶血及び神経毒性を引き起こし得る。
フルダラビンは、代謝拮抗薬である。フルダラビン注射薬は、滅菌水で再構成される凍結乾燥ケーキとして市販されている。取り扱い、再構成及び投与については、施設内指針に従わなければならない。フルダラビンは、本研究で投与されるよりも高い用量では、血液数減少、免疫系の抑制、悪心嘔吐、発熱、過敏性反応、腫瘍溶解、一過性の血清トランスアミナーゼ上昇、溶血及び神経毒性を引き起こし得る。
【0242】
製剤：５０ｍｇバイアルに静脈内使用向けの白色の凍結乾燥ケーキとして市販されている。
貯蔵：室温
混合：２ｍＬ滅菌水をバイアルに入れ、２５ｍｇ／ｍＬの終濃度にする。
貯蔵：室温
混合：２ｍＬ滅菌水をバイアルに入れ、２５ｍｇ／ｍＬの終濃度にする。
【0243】
安定性：静注溶液は、混合してから８時間以内に使用しなければならない。
投与：フルダラビンは、１００ｍＬの５％デキストロース又は０．９％塩化ナトリウム中に更に希釈される。
投与：フルダラビンは、１００ｍＬの５％デキストロース又は０．９％塩化ナトリウム中に更に希釈される。
【0244】
４．３ フィルグラスチム（Ｇ－ＣＳＦ；顆粒球コロニー刺激因子）
フィルグラスチムは、好中球の産生、成熟及び活性化を刺激する。フィルグラスチムは、好中球を活性化させて、その遊走及び細胞毒性の両方も増加させる。フィルグラスチムは、化学療法誘発性好中球減少症（非骨髄性悪性腫瘍、急性骨髄性白血病及び骨髄移植）；重症慢性好中球減少症（ＳＣＮ）；末梢血前駆細胞（ＰＢＰＣ）採取を受けている患者において使用される。
フィルグラスチムは、好中球の産生、成熟及び活性化を刺激する。フィルグラスチムは、好中球を活性化させて、その遊走及び細胞毒性の両方も増加させる。フィルグラスチムは、化学療法誘発性好中球減少症（非骨髄性悪性腫瘍、急性骨髄性白血病及び骨髄移植）；重症慢性好中球減少症（ＳＣＮ）；末梢血前駆細胞（ＰＢＰＣ）採取を受けている患者において使用される。
【0245】
フィルグラスチムは、以下と関連付けられている：
アレルギー反応：初回又は後続の投与に伴い発疹、蕁麻疹、喘鳴音、呼吸困難、頻脈及び／又は低血圧症が起こっている。反応は、静脈内投与で且つ投与から３０分以内により高頻度で起こる傾向がある。
アレルギー反応：初回又は後続の投与に伴い発疹、蕁麻疹、喘鳴音、呼吸困難、頻脈及び／又は低血圧症が起こっている。反応は、静脈内投与で且つ投与から３０分以内により高頻度で起こる傾向がある。
【0246】
呼吸促迫症候群：成人呼吸促迫症候群のまれな症例が報告されている；患者に呼吸促迫を報告するよう指示しなければならない。
脾臓破裂：脾臓破裂のまれな症例が報告されている；患者に左上腹部痛又は肩先痛を報告するよう指示しなければならない。
脾臓破裂：脾臓破裂のまれな症例が報告されている；患者に左上腹部痛又は肩先痛を報告するよう指示しなければならない。
【0247】
薬力学／動態学
作用の発現：２４時間；３～５日でプラトーに達する
持続時間：ＡＮＣはＧ－ＣＳＦの中断後２日以内に５０％減少する；白血球数は４～７日で正常範囲に戻る；ピーク血漿レベルは最長１２時間にわたって維持することができる
吸収：皮下：１００％
分布：１５０ｍＬ／ｋｇ；１１日～２０日期間での薬物蓄積のエビデンスなし
代謝：全身的に分解される
消失半減期：１．８～３．５時間。ピークに達するまでの時間、血清：皮下：２～６時間
投薬量：皮下：≦５ｍｃｇ／ｋｇ／日、化学療法後２４～７２時間で開始し；好中球絶対数が目標に達するまで継続する。小児患者は、特別に計算された用量を受けなければならない。成人用量は、バイアルサイズ（３００ｍｃｇ又は４８０ｍｃｇ）に最も近い概数を用いなければならない
自家幹細胞採取：５ｍｃｇ／ｋｇ皮下、１２時間毎に５日間（合計１０用量）
投薬量製剤化：
注射、溶液：３００ｍｃｇ／ｍＬ（１ｍＬ、１．６ｍＬ）
注射、溶液［プレフィルドシリンジ］：３００ｍｃｇ／０．５ｍＬ
５．０ 研究評価
５．１ ＦＬＡＧ標準治療の開始前（ベースライン）：
５．１．１ 病歴及び身体検査
５．１．２ 分画（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）を含むＣＢＣ
５．２ 毎回ＮＫ輸注前に：
６．２．１ 病歴及び身体検査
６．２．２ 分画を含むＣＢＣ
６．２．３ パルスオキシメトリ
５．３ 最終回輸注後：患者が好中球減少下にある間に週２回の分画を含むＣＢＣ
５．４ 好中球回復後：ＮＫ輸注１回目からＤ＋５６まで、週１回の分画を含むＣＢＣ。
作用の発現：２４時間；３～５日でプラトーに達する
持続時間：ＡＮＣはＧ－ＣＳＦの中断後２日以内に５０％減少する；白血球数は４～７日で正常範囲に戻る；ピーク血漿レベルは最長１２時間にわたって維持することができる
吸収：皮下：１００％
分布：１５０ｍＬ／ｋｇ；１１日～２０日期間での薬物蓄積のエビデンスなし
代謝：全身的に分解される
消失半減期：１．８～３．５時間。ピークに達するまでの時間、血清：皮下：２～６時間
投薬量：皮下：≦５ｍｃｇ／ｋｇ／日、化学療法後２４～７２時間で開始し；好中球絶対数が目標に達するまで継続する。小児患者は、特別に計算された用量を受けなければならない。成人用量は、バイアルサイズ（３００ｍｃｇ又は４８０ｍｃｇ）に最も近い概数を用いなければならない
自家幹細胞採取：５ｍｃｇ／ｋｇ皮下、１２時間毎に５日間（合計１０用量）
投薬量製剤化：
注射、溶液：３００ｍｃｇ／ｍＬ（１ｍＬ、１．６ｍＬ）
注射、溶液［プレフィルドシリンジ］：３００ｍｃｇ／０．５ｍＬ
５．０ 研究評価
５．１ ＦＬＡＧ標準治療の開始前（ベースライン）：
５．１．１ 病歴及び身体検査
５．１．２ 分画（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）を含むＣＢＣ
５．２ 毎回ＮＫ輸注前に：
６．２．１ 病歴及び身体検査
６．２．２ 分画を含むＣＢＣ
６．２．３ パルスオキシメトリ
５．３ 最終回輸注後：患者が好中球減少下にある間に週２回の分画を含むＣＢＣ
５．４ 好中球回復後：ＮＫ輸注１回目からＤ＋５６まで、週１回の分画を含むＣＢＣ。
【0248】
５．５ 疾患判定：好中球回復後及び／又は約Ｄ＋２８のいずれか早い方：
１．細胞診、フローサイトメトリー、ＭＲＤ、キメリズム（ＳＴＲ又はＦＩＳＨ）、細胞遺伝学及びＦＩＳＨ（公知の腫瘍マーカについて）のための片側骨髄生検及び吸引液
２．＋２８日目までに回復が起こらなかった場合、そのときは好中球回復時点又は約＋５６日目のいずれか早い方の時点で第２の骨髄を入手することになる。
１．細胞診、フローサイトメトリー、ＭＲＤ、キメリズム（ＳＴＲ又はＦＩＳＨ）、細胞遺伝学及びＦＩＳＨ（公知の腫瘍マーカについて）のための片側骨髄生検及び吸引液
２．＋２８日目までに回復が起こらなかった場合、そのときは好中球回復時点又は約＋５６日目のいずれか早い方の時点で第２の骨髄を入手することになる。
【0249】
５．６ リー博士（Ｄｒ．Ｌｅｅ）の研究室（ＭＯＤ１．０２０）に送られることになる研究の副次的目的に取り組むための末梢血
１．ＦＬＡＧ標準治療の開始前（ベースライン）。
１．ＦＬＡＧ標準治療の開始前（ベースライン）。
【0250】
２．毎回のＮＫ輸注前及び輸注完了後２時間（±１時間）。
３．Ｄ＋１４（±３日）、＋１６（±３日）、＋１８（±３日）及び＋２１（±３日）、次に、輸注したＮＫ細胞を高い信頼性で検出できる間は、Ｄ＋５６まで毎週。試料は、目標期日のＤ＋２８の±３日前及びＤ＋２８の±５日後に入手することができる。各試料につき、緑色の上蓋のヘパリンＮａチューブに４０ｍＬまで（最大０．５ｍＬ／ｋｇ）抜き取り、且つ１０ｍＬまでの血清を抜き取る（１本の赤色の上蓋のチューブ）。
３．Ｄ＋１４（±３日）、＋１６（±３日）、＋１８（±３日）及び＋２１（±３日）、次に、輸注したＮＫ細胞を高い信頼性で検出できる間は、Ｄ＋５６まで毎週。試料は、目標期日のＤ＋２８の±３日前及びＤ＋２８の±５日後に入手することができる。各試料につき、緑色の上蓋のヘパリンＮａチューブに４０ｍＬまで（最大０．５ｍＬ／ｋｇ）抜き取り、且つ１０ｍＬまでの血清を抜き取る（１本の赤色の上蓋のチューブ）。
【0251】
６．０ 有害事象
６．１ 有害事象属性の評価
本研究の治療計画の研究要素は、ＮＫ細胞輸注である。ＦＬＡＧ化学療法及びＧＣＳＦが標準治療と考えられ、その関連する有害事象は周知である。従って、本研究の目的上、ＮＫ細胞輸注との直接的な関係が疑われる有害事象の存在下で、その事象はＮＫ細胞輸注が原因であるとされることになる。
６．１ 有害事象属性の評価
本研究の治療計画の研究要素は、ＮＫ細胞輸注である。ＦＬＡＧ化学療法及びＧＣＳＦが標準治療と考えられ、その関連する有害事象は周知である。従って、本研究の目的上、ＮＫ細胞輸注との直接的な関係が疑われる有害事象の存在下で、その事象はＮＫ細胞輸注が原因であるとされることになる。
【0252】
ＦＬＡＧ化学療法によって引き起こされることが公知の事象及びその直接的な帰結並びにＧｖＨＤ、感染症の治療及び支持的治療に使用される薬物に関係することが公知の事象は、ＮＫ細胞輸注に無関係との評点が付けられることになる。
【0253】
首席治験責任医師が、事象の属性の決定における最終的な判定者であることになる。
６．２ 有害事象の重症度の判定
初回ＮＫ細胞輸注の開始からＤ＋５６まで、共通用語規準第４．０版（ＣＴＣＡＥ）に従い有害事象（ＡＥ）の重症度をグレード分けすることになる。
６．２ 有害事象の重症度の判定
初回ＮＫ細胞輸注の開始からＤ＋５６まで、共通用語規準第４．０版（ＣＴＣＡＥ）に従い有害事象（ＡＥ）の重症度をグレード分けすることになる。
【0254】
ＣＴＣＡＥの表に掲載されていない事象は、以下のとおり評点が付けられることになる：
一般的なグレード分け：
グレード１：
軽度：苦痛はあるが、日常活動に支障は見られず、予防の域を越える治療は要さない。
一般的なグレード分け：
グレード１：
軽度：苦痛はあるが、日常活動に支障は見られず、予防の域を越える治療は要さない。
【0255】
グレード２：
中等度：苦痛があるため、日常活動に一部支障が見られ、治療を要する。
グレード３：
重度：第一選択治療に反応しない、通常の日常活動を妨げる苦痛がある。
中等度：苦痛があるため、日常活動に一部支障が見られ、治療を要する。
グレード３：
重度：第一選択治療に反応しない、通常の日常活動を妨げる苦痛がある。
【0256】
グレード４：
生命を脅かす：直ちに死亡する危険性のある苦痛。
６．３ 同種異系ＮＫ細胞の輸注に関連する可能性のある予想される有害事象：
１．急性有害事象：
２４時間未満持続する事象：
グレードＩ 悪寒
グレードＩ 咳
グレードＩ又はＩＩ 血管性浮腫
グレードＩ又はＩＩ 呼吸困難
グレードＩ又はＩＩ 低血圧
グレードＩ又はＩＩ 頻脈
グレードＩ又はＩＩ 頭痛
４８時間未満持続する事象：
グレードＩ又はＩＩ 疲労
グレードＩ又はＩＩ 神経因性疼痛
グレードＩ又はＩＩ 嘔吐
グレードＩ又はＩＩ ＳＧＰＴの変化
グレードＩ又はＩＩ 低アルブミン血症
グレードＩ又はＩＩ 低カルシウム血症
グレードＩ又はＩＩ 発熱
グレードＩ又はＩＩ 掻痒
グレードＩ 発疹
グレードＩ又はＩＩ リンパ球減少
グレードＩ又はＩＩ 好中球減少
グレードＩ又はＩＩ 白血球減少
グレードＩ又はＩＩ サイトカイン放出／急性輸注反応
２．７２時間未満持続する事象：
グレードＩ又はＩＩ 悪心
腫瘍溶解症候群
３．初回ＮＫ細胞輸注後２～３週間経った後の血球減少
フルダラビン及びシタラビンは、２～３週間持続する一過性の骨髄抑制を引き起こすと予想される。しかしながら、同種異系ＮＫ細胞に起因する血液毒性は、更に後になって起こり得るため、従って予想される化学療法誘発性の最下点を越える血液学的回復が判定されることになる。例えば、同種異系ＨＳＣＴ後にドナーリンパ球輸注療法を受ける患者の１０～１５％が、骨髄抑制を生じる。
生命を脅かす：直ちに死亡する危険性のある苦痛。
６．３ 同種異系ＮＫ細胞の輸注に関連する可能性のある予想される有害事象：
１．急性有害事象：
２４時間未満持続する事象：
グレードＩ 悪寒
グレードＩ 咳
グレードＩ又はＩＩ 血管性浮腫
グレードＩ又はＩＩ 呼吸困難
グレードＩ又はＩＩ 低血圧
グレードＩ又はＩＩ 頻脈
グレードＩ又はＩＩ 頭痛
４８時間未満持続する事象：
グレードＩ又はＩＩ 疲労
グレードＩ又はＩＩ 神経因性疼痛
グレードＩ又はＩＩ 嘔吐
グレードＩ又はＩＩ ＳＧＰＴの変化
グレードＩ又はＩＩ 低アルブミン血症
グレードＩ又はＩＩ 低カルシウム血症
グレードＩ又はＩＩ 発熱
グレードＩ又はＩＩ 掻痒
グレードＩ 発疹
グレードＩ又はＩＩ リンパ球減少
グレードＩ又はＩＩ 好中球減少
グレードＩ又はＩＩ 白血球減少
グレードＩ又はＩＩ サイトカイン放出／急性輸注反応
２．７２時間未満持続する事象：
グレードＩ又はＩＩ 悪心
腫瘍溶解症候群
３．初回ＮＫ細胞輸注後２～３週間経った後の血球減少
フルダラビン及びシタラビンは、２～３週間持続する一過性の骨髄抑制を引き起こすと予想される。しかしながら、同種異系ＮＫ細胞に起因する血液毒性は、更に後になって起こり得るため、従って予想される化学療法誘発性の最下点を越える血液学的回復が判定されることになる。例えば、同種異系ＨＳＣＴ後にドナーリンパ球輸注療法を受ける患者の１０～１５％が、骨髄抑制を生じる。
【0257】
血球減少の原因は、このセッティングでは、通常、宿主造血細胞のＴ細胞抑制にある。Ｔ細胞を枯渇させたＮＫ細胞輸注の輸注後には、この状況はありそうにないが、ＮＫ媒介性骨髄抑制の可能性を予め否定することはできない。加えて、正常な造血の回復にかかる時間は、正常な骨髄予備能の存在に大きく依存し、何度も再発を繰り返す、重点的に治療される患者のセッティングでは、骨髄予備能はほぼ存在しない。
【0258】
４．急性移植片対宿主病
ＧｖＨＤは同種異系Ｔ細胞に関連する。輸注される細胞はＴ細胞枯渇に供されることになるため、ＧｖＨＤは予想されず、同種異系ＮＫ細胞療法を用いた先行試験でも、概して起こっていない。しかしながら、少量のＴ細胞が輸注され得るか、又はＮＫ細胞が生着して、ＧｖＨＤ症候群を引き起こし得る。
ＧｖＨＤは同種異系Ｔ細胞に関連する。輸注される細胞はＴ細胞枯渇に供されることになるため、ＧｖＨＤは予想されず、同種異系ＮＫ細胞療法を用いた先行試験でも、概して起こっていない。しかしながら、少量のＴ細胞が輸注され得るか、又はＮＫ細胞が生着して、ＧｖＨＤ症候群を引き起こし得る。
【0259】
総合グレード２を上回るＧｖＨが起こることは予想されない。
重篤と考えられる有害事象
１．難治性ＧｖＨＤ
２．入院を要する好中球減少期間中の感染症
３．不可逆的な状態をもたらす及び／又は死亡につながるＮＫ細胞製剤に関係があると考えられる任意の予想される事象又は予想外の事象。
重篤と考えられる有害事象
１．難治性ＧｖＨＤ
２．入院を要する好中球減少期間中の感染症
３．不可逆的な状態をもたらす及び／又は死亡につながるＮＫ細胞製剤に関係があると考えられる任意の予想される事象又は予想外の事象。
【0260】
ＦＬＡＧ化学療法に関連することが公知の予想される有害事象
フルダラビン、シタラビン及びＧ－ＣＳＦ（ＦＬＡＧ）の組み合わせで起こることが公知の毒性については、既発表の第１相及び第２相試験に十分に記載されている。ＦＬＡＧの開始後及びＮＫ細胞の投与前に初めて認められる予想される毒性並びに骨髄抑制、血球減少及び感染症は、ＤＬＴを決定する目的上、ＮＫ細胞が原因とはされないことになる。
フルダラビン、シタラビン及びＧ－ＣＳＦ（ＦＬＡＧ）の組み合わせで起こることが公知の毒性については、既発表の第１相及び第２相試験に十分に記載されている。ＦＬＡＧの開始後及びＮＫ細胞の投与前に初めて認められる予想される毒性並びに骨髄抑制、血球減少及び感染症は、ＤＬＴを決定する目的上、ＮＫ細胞が原因とはされないことになる。
【0261】
ＦＬＡＧに関連する有害事象（％グレードＩＩＩ及びＩＶ）：
１．肝臓：
ＡＬＴ（２５％）、ビリルビン（７％）、ＡＳＴ（７％）、アルカリホスファターゼ（５％）。
１．肝臓：
ＡＬＴ（２５％）、ビリルビン（７％）、ＡＳＴ（７％）、アルカリホスファターゼ（５％）。
【0262】
２．胃腸管：
ＡＬＴ（２５％）、粘膜炎（５％）、悪心／嘔吐（３０％）、下痢（６％）、便秘（４％）。
ＡＬＴ（２５％）、粘膜炎（５％）、悪心／嘔吐（３０％）、下痢（６％）、便秘（４％）。
【0263】
３．その他：
出血（５％）、発疹（５％），ＢＵＮ（４％）、薬剤熱（３％）、頭痛（３％）及び視力変化（１％）。
出血（５％）、発疹（５％），ＢＵＮ（４％）、薬剤熱（３％）、頭痛（３％）及び視力変化（１％）。
【0264】
４．骨髄抑制及び付随する血球減少、化学療法の０日目からの回復までの時間中央値（９５％ＣＩ）：好中球３２（２７～３５）日、血小板４１（３５～４７）日。
５．血球減少期間の間、患者は感染症のリスクがある。
５．血球減少期間の間、患者は感染症のリスクがある。
【0265】
有害事象データ収集
Ｄ０からＤ＋５６まで、有害事象の収集資料に、発生日及び消散日及び最高グレードが反映されることになる。間欠的な事象は、そのように表示し、消散するまで追跡しなければならない。
Ｄ０からＤ＋５６まで、有害事象の収集資料に、発生日及び消散日及び最高グレードが反映されることになる。間欠的な事象は、そのように表示し、消散するまで追跡しなければならない。
【0266】
事象がなおも進行中である間に患者が研究から外れる場合、別の療法が開始されない限り、それは消散するまで追跡されることになる。既存の医学的状態は、積極的治療期間中に増悪が起こった場合にのみ記録されることになる。併存事象は、個別には評点付けされないことになる。
【0267】
有害事象は、フローシートを含め、電子的（クリニック・ステーション（Ｃｌｉｎｉｃ Ｓｔａｔｉｏｎ））患者診療記録にある経過ノートに基づき文書化されることになる。
このプロトコルの電子症例報告書としては、ＰＤＭＳ／ＣＯＲｅが使用されることになり、及び全てのプロトコル特異的データがＰＤＭＳ／ＣＯＲｅに入力されることになる。
このプロトコルの電子症例報告書としては、ＰＤＭＳ／ＣＯＲｅが使用されることになり、及び全てのプロトコル特異的データがＰＤＭＳ／ＣＯＲｅに入力されることになる。
【0268】
併用薬物療法
このプロトコルで治療される患者には、支持的ケア治療（併用薬物療法）が必要となるであろう。これらの薬物療法は標準治療と考えられ、プロトコルへの科学的な寄与はなく、従って必要なそれらの様々な薬物療法又はその副作用に関してデータは捕捉されない。
このプロトコルで治療される患者には、支持的ケア治療（併用薬物療法）が必要となるであろう。これらの薬物療法は標準治療と考えられ、プロトコルへの科学的な寄与はなく、従って必要なそれらの様々な薬物療法又はその副作用に関してデータは捕捉されない。
【0269】
７．０ 統計的考察
本研究の主要目的は、再発／難治性急性骨髄性白血病の治療に対するＦＬＡＧ前処置レジメン後の拡大したハプロタイプ一致ドナーＮＫ細胞製剤の安全性及び実行可能性を評価すること及び最大耐量（ＭＴＤ）を定義することである。ＮＫ細胞輸注の最大耐量のエンドポイントは、本明細書に記載される。安全性及び実行可能性のエンドポイントは、ＮＫ細胞を作成し、１０例中７例以上の対象において、過度の毒性限界なしに最大耐量の細胞用量で輸注できることとして定義される。副次的エンドポイントには、ハプロタイプ一致ＮＫ細胞の活性化状態及び持続性、ハプロタイプ一致ＮＫ細胞の免疫表現型及び機能、ＡＭＬ疾患の寛解率、このレジメンを受けている患者の移植実施可能率及び利用可能なドナーを有する患者についての移植までの時間を判定することが含まれる。
本研究の主要目的は、再発／難治性急性骨髄性白血病の治療に対するＦＬＡＧ前処置レジメン後の拡大したハプロタイプ一致ドナーＮＫ細胞製剤の安全性及び実行可能性を評価すること及び最大耐量（ＭＴＤ）を定義することである。ＮＫ細胞輸注の最大耐量のエンドポイントは、本明細書に記載される。安全性及び実行可能性のエンドポイントは、ＮＫ細胞を作成し、１０例中７例以上の対象において、過度の毒性限界なしに最大耐量の細胞用量で輸注できることとして定義される。副次的エンドポイントには、ハプロタイプ一致ＮＫ細胞の活性化状態及び持続性、ハプロタイプ一致ＮＫ細胞の免疫表現型及び機能、ＡＭＬ疾患の寛解率、このレジメンを受けている患者の移植実施可能率及び利用可能なドナーを有する患者についての移植までの時間を判定することが含まれる。
【0270】
ＮＫ細胞のサイトカイン媒介性活性化は、標準化した標的に応答したＮＫ細胞のＣＤ１０７ａ発現を決定するフローベースの活性化アッセイによって決定されることになる。ＮＫ細胞の機能は、標準化した標的の細胞溶解によって判定されることになる。寛解は、骨髄中の芽球が５％未満の骨髄回復として定義されることになる。臨床応答は、患者のＡＭＬ芽球におけるインビボでのＮＫ細胞拡大、サイトカインレベル、活性化マーカの発現及びＮＫ細胞リガンドの発現と相関することになる。指示される時点で、この療法が免疫系に及ぼす効果を研究するための拡大ＮＫ細胞のインビボ活性化の実験室評価用に、追加的な研究試料が収集されることになる。毒性及び有害事象の発生がモニタされることになる。
【0271】
７．１ 用量漸増（Ｄｏｓｅ Ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ）
用量制限毒性（ＤＬＴ）は、以下として定義される：
１．ＮＫ細胞輸注に関係するグレード３より高い輸注アレルギー反応。
用量制限毒性（ＤＬＴ）は、以下として定義される：
１．ＮＫ細胞輸注に関係するグレード３より高い輸注アレルギー反応。
【0272】
２．治療によって１週間以内にグレード１以下に消散しないグレード３より高い急性総合ＧｖＨＤ
３．ＮＫ細胞輸注に関係する疑いのある、ほぼ確実に関係する又は確実に関係する、グレード３を超える予期せぬ毒性。７２時間以内に消散するグレード３毒性は、ＤＬＴとは見なさないものとする。
３．ＮＫ細胞輸注に関係する疑いのある、ほぼ確実に関係する又は確実に関係する、グレード３を超える予期せぬ毒性。７２時間以内に消散するグレード３毒性は、ＤＬＴとは見なさないものとする。
【0273】
用量レベル１～４に相当する用量で送達されるＮＫ細胞は、他の第Ｉ相試験において安全であることが示されているため、本発明者らは、それらの用量レベルによる急速用量漸増法を利用することになる。本発明者らは、用量レベル５～６について標準３＋３デザインを使用することになる。研究の３＋３部分が実行されたところで、いずれかの用量レベルにおける同時登録を、ＭＴＤの超過を宣言するのに必要な最小数の対象に制限することになる（例えば、用量レベルは２例の対象の同時登録から開始し、しかし３番目の対象の登録に至り、最初の２例の対象の少なくとも１例は、＋２８日目までＤＬＴがないことが観察されなければならない。
【0274】
用量レベル１～４について、１例の患者が各用量レベル１で治療されることになる（１０６／ｋｇ／用量、週３回×６用量）。この患者が、急速漸増相について定義された毒性限界を超えない場合（下記の１つ目の箇条書きを参照されたい）、次の患者が次の用量レベルで治療されることになる。用量レベル１～４における任意の時点で、記載されるとおりのグレード２以上の関連毒性が観察された場合、直ちに標準３＋３が開始されることになり、現在の用量レベルで追加の２例の患者が登録することになる。最初の４用量を通して３＋３が開始されなかった場合、標準３＋３デザインは用量レベル５（１０８／ｋｇ／用量）について開始される。３例の患者が治療され、毒性に関して評価されることになる。ＤＬＴが見られた患者が３例中０例であった場合、次のコホートの３例の患者が次に高い用量レベルで治療されることになる。ある用量レベルで治療された３例の患者の１例にＤＬＴが見られた場合、更に３例の患者が同じ用量レベルで治療されることになる。これらの６例の患者の中でのＤＬＴの発生率が６例に１例である場合、次のコホートが次に高い用量レベルで治療される。ある用量レベルで治療された６例の患者の３例以上にＤＬＴが見られた場合、ＭＴＤを超えたと見なされる。６例の患者が既にその用量で治療済みでない限り、更に３例の患者が、上記に記載したとおりの次に低い用量で治療されることになる。ＭＴＤは、６例の患者が治療され、ＤＬＴが認められる患者が多くとも２例である研究された中で最も高い用量として定義される。６例中２例のＤＬＴが認められる場合、その用量レベルが中止され、ＭＴＤとして宣言される。
【0275】
ＭＴＤとして定義されるコホートは、毒性及び相関データを更に評価するため、最大１０例の患者に拡大され得る。拡大中、任意の時点で３分の１を超える患者にＤＬＴが見られる場合、その拡大コホートは終了されることになる。ＭＴＤ拡大コホートが過度の毒性に起因して終了される場合、次に低い用量が１０例に拡大され、探索され得る。ＭＴＤで治療される全ての患者が、拡大分析及びモニタリングに含まれることになる。
【0276】
・急速漸増相では、患者の安全性を確保するため、毒性に関してよりストリンジェントな基準が利用されることになる。ＮＫ細胞製剤輸注の開始から２１日以内の任意の１例の患者による、グレード２の発熱、悪寒／さむけ、疲労、嘔吐／悪心、掻痒／かゆみ、電解質不均衡、低アルブミン血症及びリンパ球減少を除く、ＮＫ細胞製剤関連グレード２毒性の発生：現在及び後続（ある場合）のコホートを拡大して最大３例の患者を含める。
【0277】
・ＭＴＤが用量レベル６によっても確立されない場合、この用量レベルが１０例の患者に拡大され、拡大ＮＫ細胞の安全性及びそれによる抗腫瘍治療反応性が更に評価されることになる。
【0278】
・コホート拡大中の任意の時点で中止規則が適用された場合、その拡大コホートへの患者登録は保留されることになる。
・コホート中の最後の患者が治療を完了した後、臨床及び安全性データが分析されることになり、用量漸増は、上記に定義した用量漸増規則に従うことになる。
・コホート中の最後の患者が治療を完了した後、臨床及び安全性データが分析されることになり、用量漸増は、上記に定義した用量漸増規則に従うことになる。
【0279】
・ＭＴＤ－最大耐量は、６患者コホート中、治療時にＤＬＴが見られる患者が２例以下である最も高い用量レベルとして定義される。６例中２例のＤＬＴが認められた場合、その用量レベルを中止し、ＭＴＤとして宣言すること。
【0280】
７．２ 試験サイズの妥当性
本試験の用量漸増相では、各コホートにつき最大６例の患者を登録し得る。ＮＫ細胞の最大耐量の決定後、本発明者らは、ＭＴＤレベル又は最も高い用量レベルのＮＫ細胞輸注が成功した研究参加中の対象が１０例になるまで、対象を登録することになる。本発明者らは、これらの患者を２年かけて集積する見込みである。ＮＫ細胞輸注を受けるための判定基準を満たさない患者は、実行可能性の主要目的の決定に含めないことになる。予定された用量レベルのＮＫ細胞輸注を受けなかった各登録患者に対し、追加の患者が登録されることになる。本発明者らは、ＦＬＡＧレジメンの毒性が理由で、最大６例の患者がＭＴＤ又は最も高い用量レベルのＮＫ細胞を受けることができないことがあり得ると予想する。従って、本試験は、１７例という少ない対象で用量レベル６を完了することもあるか、又は最大４６例の対象を登録することもある。
本試験の用量漸増相では、各コホートにつき最大６例の患者を登録し得る。ＮＫ細胞の最大耐量の決定後、本発明者らは、ＭＴＤレベル又は最も高い用量レベルのＮＫ細胞輸注が成功した研究参加中の対象が１０例になるまで、対象を登録することになる。本発明者らは、これらの患者を２年かけて集積する見込みである。ＮＫ細胞輸注を受けるための判定基準を満たさない患者は、実行可能性の主要目的の決定に含めないことになる。予定された用量レベルのＮＫ細胞輸注を受けなかった各登録患者に対し、追加の患者が登録されることになる。本発明者らは、ＦＬＡＧレジメンの毒性が理由で、最大６例の患者がＭＴＤ又は最も高い用量レベルのＮＫ細胞を受けることができないことがあり得ると予想する。従って、本試験は、１７例という少ない対象で用量レベル６を完了することもあるか、又は最大４６例の対象を登録することもある。
【0281】
本研究の副次的目標は、ＮＫ細胞の輸注後５６日目における完全寛解（ＣＲ）の判定であることになる。有効性について、本発明者らは、患者リスクを基準としてアウトカムを判定することになる。複数のレジメンにわたる再発ＡＭＬの先例の寛解率は、低リスク患者について５６．１％、高リスク患者について２７．６％である。
【0282】
７．３ 研究中止規則
・米国国立癌研究所有害事象共通用語規準（ＮＣＩ ＣＴＣ ＡＥ）第４．０版の判定基準に従い有害事象が定義されることになる。
・米国国立癌研究所有害事象共通用語規準（ＮＣＩ ＣＴＣ ＡＥ）第４．０版の判定基準に従い有害事象が定義されることになる。
【0283】
・心肺系、肝臓系（アルブミンを除く）、神経系又は腎臓系が関わる、輸注されたＮＫ細胞製剤が原因である疑いのある、それがほぼ確実に原因である又はそれが確実に原因であるグレード４を超える有害事象又は重度の（グレード４を超える）感染症が３例以上の対象に見られる場合、安全性判定基準及び／又は同意書を修正する必要が生じる可能性があるかを見直すため、本発明者らは本試験への新規患者登録を一時的に締め切ることになる。
【0284】
・輸注されたＮＫ細胞が原因である疑いのある、それがほぼ確実に原因である又はそれが確実に原因である何らかの死亡がＮＫ細胞輸注から３０日以内に研究参加者に起こった場合、本発明者らは、安全性判定基準及び／又は同意書を修正する必要が生じる可能性があるかを見直すため、本試験への新規患者登録を一時的に締め切ることになる。ＮＫ細胞輸注後３０日を超えて死亡が起こるときは、その死亡の原因が確実にＮＫ細胞療法である場合に限り、研究が一時的に停止され、見直される。
【0285】
７．４ 副次的試験エンドポイントの分析
７．４．１ インビボでのＮＫ細胞数値的拡大の分析：
療法前、ＮＫ細胞治療期間中及びＮＫ細胞治療後に、末梢血を入手することになる。本研究は、フローサイトメトリー解析及び選別並びに分子的研究を含み得る。ドナーＮＫ細胞拡大は、輸注後レベルを上回って増加する循環ドナー由来ＮＫ細胞絶対数として定義されることになる。以下のキメリズム法を用いて循環ＮＫ細胞の起源及び数を決定することになる：
７．４．２ キメリズム研究：
・キメリズムは、ハプロタイプ特異的抗体を用いたフローサイトメトリーによって決定され得る。
７．４．１ インビボでのＮＫ細胞数値的拡大の分析：
療法前、ＮＫ細胞治療期間中及びＮＫ細胞治療後に、末梢血を入手することになる。本研究は、フローサイトメトリー解析及び選別並びに分子的研究を含み得る。ドナーＮＫ細胞拡大は、輸注後レベルを上回って増加する循環ドナー由来ＮＫ細胞絶対数として定義されることになる。以下のキメリズム法を用いて循環ＮＫ細胞の起源及び数を決定することになる：
７．４．２ キメリズム研究：
・キメリズムは、ハプロタイプ特異的抗体を用いたフローサイトメトリーによって決定され得る。
【0286】
・キメリズムは、ＳＴＲ多型によって決定され得る。
・ドナーとレシピエントとの間に性別不適合があるとき、性染色体頻度の決定に基づくアッセイが用いられ得る。検査は、首席治験責任医師又は被指名人によって変更され得る。
・ドナーとレシピエントとの間に性別不適合があるとき、性染色体頻度の決定に基づくアッセイが用いられ得る。検査は、首席治験責任医師又は被指名人によって変更され得る。
【0287】
７．５ 臨床アウトカム
本発明者らは、記述統計学を用いて、本研究の患者の人口統計学的及び臨床的特徴を要約することになる。本発明者らは、カプラン・マイヤー推定量で完全寛解率（ＣＲ）及び移植までの時間（ＴＴＴ）を推定し、９５％信頼区間と共に表にすることになる。本発明者らは、ＣＲ及びＴＴＰを９５％信頼区間と共に推定することになる。本発明者らは、インビボＮＫ細胞拡大が成功した患者の比率を９５％信頼区間と共に推定することになる。本発明者らは、Ｃｏｘ比例ハザード回帰を用いて、ＮＫ細胞用量の関数としてのＣＲ及びＴＴＴをモデル化することになる。
本発明者らは、記述統計学を用いて、本研究の患者の人口統計学的及び臨床的特徴を要約することになる。本発明者らは、カプラン・マイヤー推定量で完全寛解率（ＣＲ）及び移植までの時間（ＴＴＴ）を推定し、９５％信頼区間と共に表にすることになる。本発明者らは、ＣＲ及びＴＴＰを９５％信頼区間と共に推定することになる。本発明者らは、インビボＮＫ細胞拡大が成功した患者の比率を９５％信頼区間と共に推定することになる。本発明者らは、Ｃｏｘ比例ハザード回帰を用いて、ＮＫ細胞用量の関数としてのＣＲ及びＴＴＴをモデル化することになる。
【0288】
７．６ 集積率推定
本発明者らは、最低でも１年に１５例の適格患者が登録されると見込んでいる。このプロトコルは、完了までに３年かかり得る。
本発明者らは、最低でも１年に１５例の適格患者が登録されると見込んでいる。このプロトコルは、完了までに３年かかり得る。
【0289】
８．０ 研究の判定基準
８．１ 回復：持続的ＡＮＣが１０００／ｕＬ以上になった初日として定義される。
８．２ 長期好中球減少（Ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ Ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉａ）：ＮＫ細胞の輸注後２８日以内に回復に達しなかったこと。
８．１ 回復：持続的ＡＮＣが１０００／ｕＬ以上になった初日として定義される。
８．２ 長期好中球減少（Ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ Ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉａ）：ＮＫ細胞の輸注後２８日以内に回復に達しなかったこと。
【0290】
８．３ 疾患の進行：骨髄及び／又は末梢血検査による遷延性又は進行性の基礎疾患の検出。
８．４ 研究離脱：
８．４．１ 製剤汚染又は細胞用量の不足が原因でＮＫ細胞製剤を輸注できない。
８．４ 研究離脱：
８．４．１ 製剤汚染又は細胞用量の不足が原因でＮＫ細胞製剤を輸注できない。
【0291】
８．４．２ 更なる治療を要する生着不全。
８．４．３ 更なる治療を要する疾患進行。
８．４．４ 患者が治療に反応し、次に他の療法（例えば、幹細胞移植）を始める。
８．４．３ 更なる治療を要する疾患進行。
８．４．４ 患者が治療に反応し、次に他の療法（例えば、幹細胞移植）を始める。
【0292】
８．４．５ 予期せぬパターンの毒性。
８．４．６ 患者によるインフォームドコンセントの撤回。
８．４．７ 患者が治療スキーマにノンコンプライアンスである。
８．４．６ 患者によるインフォームドコンセントの撤回。
８．４．７ 患者が治療スキーマにノンコンプライアンスである。
【0293】
８．４．８ 治療完了後、Ｄ＋５６。
実施例３：万能ドナー由来のＰＢＭＣから拡大したナチュラルキラー細胞の細胞毒性
ＮＫ細胞は、図３に記載する方法によって同定される万能ドナーから入手したＰＢＭＣからの拡大によって調製される。拡大は、膜結合型ＩＬ－２１を持つ照射フィーダ細胞、ＩＬ－２１を保持している細胞膜粒子又はＩＬ－２１を保持しているエキソソームの形態の膜結合型ＩＬ－２１の存在下で実施される。ＰＢＭＣは、初めにバフィーコートから単離し、１０％ＦＢＳを補足した細胞培地で成長させて、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中３７℃で維持する。培養５日目以降、隔日で、１００ＵのＩＬ－２を補足した新鮮培地に培地の半分を入れ替えることにより、培地を交換する。細胞を隔日でカウントし、７日目以降は培養内容物を定期的に確認する。ＮＫ細胞は、少なくとも７～１４日間にわたって拡大する。以下のとおり細胞毒性アッセイを実施する：緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をトランスフェクトした卵巣癌由来の標的細胞株ＳＫＯＶ３を標的として使用して、万能ドナーＰＢＭＣから拡大したエフェクターＮＫ細胞の抗腫瘍細胞毒性を測定する。標的細胞を単独で培養するか（対照ウェル）、又はＮＫ細胞と５％ＣＯ２雰囲気にて３７℃で４５分間共培養する。次に細胞を遠心し、抗体を含有する標識緩衝液に再懸濁し、インキュベートした後、フローサイトメトリーによって分析する。細胞毒性は、各ウェルに残存する、「標的単独」対照ウェルの平均ＶＴＣと比べた生存標的細胞（ＧＦＰ＋／抗体－）の絶対量に基づき決定される。
実施例３：万能ドナー由来のＰＢＭＣから拡大したナチュラルキラー細胞の細胞毒性
ＮＫ細胞は、図３に記載する方法によって同定される万能ドナーから入手したＰＢＭＣからの拡大によって調製される。拡大は、膜結合型ＩＬ－２１を持つ照射フィーダ細胞、ＩＬ－２１を保持している細胞膜粒子又はＩＬ－２１を保持しているエキソソームの形態の膜結合型ＩＬ－２１の存在下で実施される。ＰＢＭＣは、初めにバフィーコートから単離し、１０％ＦＢＳを補足した細胞培地で成長させて、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中３７℃で維持する。培養５日目以降、隔日で、１００ＵのＩＬ－２を補足した新鮮培地に培地の半分を入れ替えることにより、培地を交換する。細胞を隔日でカウントし、７日目以降は培養内容物を定期的に確認する。ＮＫ細胞は、少なくとも７～１４日間にわたって拡大する。以下のとおり細胞毒性アッセイを実施する：緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をトランスフェクトした卵巣癌由来の標的細胞株ＳＫＯＶ３を標的として使用して、万能ドナーＰＢＭＣから拡大したエフェクターＮＫ細胞の抗腫瘍細胞毒性を測定する。標的細胞を単独で培養するか（対照ウェル）、又はＮＫ細胞と５％ＣＯ２雰囲気にて３７℃で４５分間共培養する。次に細胞を遠心し、抗体を含有する標識緩衝液に再懸濁し、インキュベートした後、フローサイトメトリーによって分析する。細胞毒性は、各ウェルに残存する、「標的単独」対照ウェルの平均ＶＴＣと比べた生存標的細胞（ＧＦＰ＋／抗体－）の絶対量に基づき決定される。
【0294】
細胞毒性Ｅ：Ｔ（％）＝（ＶＴＣＥ：Ｔ／平均ＶＴＣＴ対照）×１００
万能ドナーから入手されるＰＢＭＣから拡大したＮＫ細胞の細胞毒性は、本明細書に提供される万能ドナーの判定基準を満たさない対照ドナーから入手されるＰＢＭＣから拡大したＮＫ細胞と比べると、ＳＫＯＶ３細胞に対する細胞毒性の増加を呈することが分かる。
万能ドナーから入手されるＰＢＭＣから拡大したＮＫ細胞の細胞毒性は、本明細書に提供される万能ドナーの判定基準を満たさない対照ドナーから入手されるＰＢＭＣから拡大したＮＫ細胞と比べると、ＳＫＯＶ３細胞に対する細胞毒性の増加を呈することが分かる。
【0295】
実施例４：万能ドナー由来のＰＢＭＣから拡大したＮＫ細胞を用いる治療
少なくとも１５例のＡＭＬ患者を実施例２に記載されるとおり選択し、万能ドナーに由来する、且つ実施例３に従い拡大したＮＫ細胞を使用して、実施例２（第３節）に詳述する臨床試験プロトコルに従い約３年間にわたって治療する。療法前、ＮＫ細胞治療期間中及びＮＫ細胞治療後に、各患者から末梢血を入手する。治療中、フローサイトメトリー解析及び選別並びに分子的研究を実施する。完全寛解率（ＣＲ）及び移植までの時間（ＴＴＴ）をカプラン・マイヤー推定量で決定し、９５％信頼区間と共に表にする。ＣＲ及びＴＴＰを９５％信頼区間と共に決定する。インビボＮＫ細胞拡大が成功した患者の比率を９５％信頼区間と共に決定する。Ｃｏｘ比例ハザード回帰を用いて、ＮＫ細胞用量の関数としてのＣＲ及びＴＴＴをモデル化する。回復は、持続的ＡＮＣが１０００／ｕＬ以上になった初日として定義される。長期好中球減少は、ＮＫ細胞の輸注後２８日以内に回復に達しなかったこととして定義される。疾患の進行は、骨髄及び／又は末梢血検査によって遷延性又は進行性の基礎疾患が検出されると決定される。ＡＭＬ患者の大多数が良好なアウトカムを示す。
少なくとも１５例のＡＭＬ患者を実施例２に記載されるとおり選択し、万能ドナーに由来する、且つ実施例３に従い拡大したＮＫ細胞を使用して、実施例２（第３節）に詳述する臨床試験プロトコルに従い約３年間にわたって治療する。療法前、ＮＫ細胞治療期間中及びＮＫ細胞治療後に、各患者から末梢血を入手する。治療中、フローサイトメトリー解析及び選別並びに分子的研究を実施する。完全寛解率（ＣＲ）及び移植までの時間（ＴＴＴ）をカプラン・マイヤー推定量で決定し、９５％信頼区間と共に表にする。ＣＲ及びＴＴＰを９５％信頼区間と共に決定する。インビボＮＫ細胞拡大が成功した患者の比率を９５％信頼区間と共に決定する。Ｃｏｘ比例ハザード回帰を用いて、ＮＫ細胞用量の関数としてのＣＲ及びＴＴＴをモデル化する。回復は、持続的ＡＮＣが１０００／ｕＬ以上になった初日として定義される。長期好中球減少は、ＮＫ細胞の輸注後２８日以内に回復に達しなかったこととして定義される。疾患の進行は、骨髄及び／又は末梢血検査によって遷延性又は進行性の基礎疾患が検出されると決定される。ＡＭＬ患者の大多数が良好なアウトカムを示す。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【国際調査報告】