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特表2022-548913分子コンジュゲート及び共役の示差的特徴付けのための材料及び方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-11-22
(54)【発明の名称】分子コンジュゲート及び共役の示差的特徴付けのための材料及び方法
(51)【国際特許分類】
G01N 27/62 20210101AFI20221115BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20221115BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20221115BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20221115BHJP
G01N 33/68 20060101ALI20221115BHJP
C07K 5/00 20060101ALN20221115BHJP
【ＦＩ】
G01N27/62 V
A61K47/64
A61K47/68
A61K39/395 C
A61K39/395 L
G01N33/68
C07K5/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022517440
(86)(22)【出願日】2020-09-19
(85)【翻訳文提出日】2022-05-17
(86)【国際出願番号】 US2020051686
(87)【国際公開番号】W WO2021055894
(87)【国際公開日】2021-03-25
(31)【優先権主張番号】62/902,958
(32)【優先日】2019-09-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】509087759
【氏名又は名称】ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100095360
【弁理士】
【氏名又は名称】片山 英二
(74)【代理人】
【識別番号】100093676
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 純子
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100153693
【弁理士】
【氏名又は名称】岩田 耕一
(72)【発明者】
【氏名】グナワーデナ，ハーシャ
【テーマコード（参考）】
2G041
2G045
4C076
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G041CA01
2G041FA12
2G041GA09
2G041LA03
2G045DA37
2G045GC17
4C076AA95
4C076CC41
4C076EE59
4C085AA22
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA11
4H045BA12
4H045BA40
4H045BA72
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA50
(57)【要約】
デュアルタンデム質量タグ（ＴＭＴ）に関与するタンデム質量分析法を使用して薬物ポリペプチドコンジュゲートを分析する方法が記載されている。本明細書では、ＴＭＴを使用して、「三重プレイ」と呼ばれる３つの分析測定値を得る統合方法が提供され、これは、薬物占有率、複数の試料間の正規化、及びペイロードの共役部位を特定しかつ局在化させるための追加のＭＳ／ＭＳのトリガーを可能にする。また、現在の質量分析装置と同じ感度を維持しながら、増強されたスループット能力のためのＴＭＴラベリングを用いた単一の実行でコンジュゲーション反応を多重化する方法も記載される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ポリペプチドに共有結合した薬物を含むコンジュゲートを分析する方法であって、（ｉ）前記コンジュゲートを含む試料を第１のタンデム質量タグ（ＴＭＴ）と接触させて、それによって、前記コンジュゲートの前記ポリペプチドを前記第１のＴＭＴで標識することと、
（ｉｉ）前記第１のＴＭＴで標識された前記コンジュゲートの前記ポリペプチドを消化して、１つ又は２つ以上の非標識ペプチドと、前記第１のＴＭＴで標識された１つ又は２つ以上のペプチドと、を含む、第１の混合物を生成することと、
（ｉｉｉ）前記第１の混合物を第２のタンデム質量タグ（ＴＭＴ）と接触させて、それによって、前記第１のＴＭＴ及び前記第２のＴＭＴのうちの少なくとも１つで標識された１つ又は２つ以上のペプチド、任意選択で１つ又は２つ以上の非標識ペプチドを含む、第２の混合物を得ることであって、前記第１のＴＭＴ及び前記第２のＴＭＴが、同じレポーターイオン質量を有しない、得ることと、
（ｉｖ）前記第２の混合物を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）に供して、前記ＬＣの溶出物を生成することと、
（ｖ）前記溶出物をタンデム質量分析法に供して、前記第１のＴＭＴ及び前記第２のＴＭＴのうちの少なくとも１つのレポーターイオンを含むペプチドの質量スペクトルを得ることと、
（ｖｉ）前記少なくとも１つのレポーターイオンに関連付けられた質量電荷比（ｍ／ｚ）を検出し、それによって前記試料中の前記コンジュゲートを分析することと、を含む、方法。
【請求項2】
ポリペプチドに共有結合した薬物を含むコンジュゲートを分析する方法であって、（ｉ）前記コンジュゲートを含む試料を第１のタンデム質量タグ（ＴＭＴ）と接触させて、それによって、前記コンジュゲートの前記ポリペプチドを前記第１のＴＭＴで標識することと、
（ｉｉ）前記第１のＴＭＴで標識された前記コンジュゲートの前記ポリペプチドを消化して、１つ又は２つ以上の非標識ペプチドと、前記第１のＴＭＴで標識された１つ又は２つ以上のペプチドと、を含む、第１の混合物を生成することと、
（ｉｉｉ）前記第１の混合物を第２のタンデム質量タグ（ＴＭＴ）と接触させて、それによって、前記第１のＴＭＴ及び前記第２のＴＭＴのうちの少なくとも１つで標識された１つ又は２つ以上のペプチド、任意選択で１つ又は２つ以上の非標識ペプチドを含む、第２の混合物を得ることと、
（ｉｖ）前記薬物に共有結合していない前記ポリペプチドを含む対照試料を第３のＴＭＴと接触させて、それによって、前記薬物に共有結合していない前記ポリペプチドを前記第３のＴＭＴで標識することと、
（ｖ）前記第３のＴＭＴで標識された前記薬物に共有結合していない前記ポリペプチドを消化して、１つ又は２つ以上の非標識ペプチドと、前記第３のＴＭＴで標識された１つ又は２つ以上のペプチドと、を含む、第３の混合物を生成することと、
（ｖｉ）前記第３の混合物を第４のタンデム質量タグ（ＴＭＴ）と接触させて、それによって、前記第３のＴＭＴ及び前記第４のＴＭＴのうちの少なくとも１つで標識された１つ又は２つ以上のペプチド、任意選択で１つ又は２つ以上の非標識ペプチドを含む、第４の混合物を得ることと、
（ｖｉｉ）前記第２の混合物を前記第４の混合物と組み合わせ、前記組み合わせを液体クロマトグラフィー法（ＬＣ）に供して、前記ＬＣの溶出物を生成することと、
（ｖｉｉｉ）前記溶出物をタンデム質量分析法に供して、前記第１のＴＭＴ、前記第２のＴＭＴ、前記第３のＴＭＴ、及び前記第４のＴＭＴのうちの少なくとも１つのレポーターイオンを含むペプチドの質量スペクトルを得ることと、
（ｉｘ）前記少なくとも１つのレポーターイオンと関連付けられた質量電荷比を検出して、それによって、前記試料中の前記コンジュゲートを分析することと、を含み、
前記第１のＴＭＴ、前記第２のＴＭＴ、前記第３のＴＭＴ、及び前記第４のＴＭＴのうちのいずれも同じレポーターイオン質量を有さず、前記第１のＴＭＴ及び前記第３のＴＭＴが、ＴＭＴの第１の等圧セットから選択され、前記第２のＴＭＴ及び前記第４のＴＭＴが、ＴＭＴの第２の等圧セットから選択され、前記ＴＭＴの第１の等圧セットが、前記薬物で共有結合を形成することができる非共役アミノ酸残基に反応性であり、前記ＴＭＴの第２の等圧セットが、ペプチドのＮ末端でリジン又は遊離アミンに反応性である、方法。
【請求項3】
コンジュゲート中の共役部位の占有率を決定する方法であって、１）請求項２に記載の方法を使用して、前記第１のＴＭＴ及び前記第２のＴＭＴの両方で標識されたペプチド並びに前記第３のＴＭＴ及び前記第４のＴＭＴの両方で標識されたペプチドに対する質量スペクトルを得ることであって、前記質量スペクトルが、前記第１のＴＭＴのレポーターイオンと、前記第３のＴＭＴのレポーターイオンと、前記第２のＴＭＴのレポーターイオンと、前記第４のＴＭＴのレポーターイオンと、を含む、得ることと、
２）前記質量スペクトルにおいて前記レポーターイオンと関連付けられた質量電荷比（ｍ／ｚ）を検出することと、
３）前記質量スペクトルにおける前記第１のＴＭＴの前記レポーターイオンの強度及び前記第３のＴＭＴの前記レポーターイオンの強度、又は前記第２のＴＭＴの前記レポーターイオンの強度及び前記第４のＴＭＴの前記レポーターイオンの強度に基づいて、前記コンジュゲート中の共役部位の前記占有率を決定することであって、好ましくは、前記占有率が、以下の式：
（前記第３のＴＭＴの前記レポーターイオンの強度－前記第１のＴＭＴの前記レポーターイオンの強度）／前記第３のＴＭＴの前記レポーターイオンの強度、又は
（前記第４のＴＭＴの前記レポーターイオンの強度－前記第２のＴＭＴの前記レポーターイオンの強度）／前記第４のＴＭＴの前記レポーターイオンの強度、によって決定される、決定することと、を含む、方法。
【請求項4】
前記コンジュゲート中の前記共役部位の前記占有率が、様々な時点で決定され、追加のＴＭＴが、異なる時点で前記ポリペプチドを標識するために使用される、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
コンジュゲートを含む試料を対照試料で正規化する方法であって、１）請求項２に記載の方法を使用して、前記第２のＴＭＴのみで標識されたペプチド及び前記第４のＴＭＴのみで標識されたペプチドに対する質量スペクトルを得ることであって、前記質量スペクトルが、前記第２のＴＭＴのレポーターイオン及び前記第４のＴＭＴのレポーターイオンを含むが、前記第１のＴＭＴ又は第３のＴＭＴのレポーターイオンを含まない、得ることと、
２）前記レポーターイオンに関連付けられた質量電荷比（ｍ／ｚ）を検出することと、
３）前記第２のＴＭＴの前記レポーターイオンの強度の前記第４のＴＭＴの前記レポーターイオンの強度に対する比によって、前記試料を前記対照試料で正規化することと、を含む、方法。
【請求項6】
コンジュゲート中の薬物共役部位を局在化させる方法であって、１）請求項２に記載の方法を使用して、前記第２のＴＭＴのみで標識されたペプチドの質量スペクトルを得ることであって、前記質量スペクトルが、前記第２のＴＭＴのレポーターイオンのみを含むが、前記第１、第３、又は第４のＴＭＴのレポーターイオンを含まない、得ることと、
２）前記第２のＴＭＴの前記レポーターイオンのみで標識された前記ペプチドに対する第２のタンデム質量分析法の分析をトリガーして、それによって前記薬物共役部位を局在化させることと、を含む、方法。
【請求項7】
前記ペプチドが、前記薬物に完全に共役している、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
コンジュゲート中の薬物共役部位を局在化させる方法であって、１）請求項２に記載の方法を使用して、前記第１及び第２のＴＭＴのみで標識されたペプチドの質量スペクトルを得ることであって、前記質量スペクトルが、前記第１及び前記第２のＴＭＴのレポーターイオンのみを含むが、前記第３又は第４のＴＭＴのレポーターイオンを含まない、得ることと、
２）前記第１及び前記第２のＴＭＴのみで標識された前記ペプチドに対する第２のタンデム質量分析法の分析をトリガーして、それによって前記薬物共役部位を局在化させることと、を含む、方法。
【請求項9】
前記ペプチドが、前記薬物に完全には共役していない、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記タンデム質量分析法が、高エネルギー衝突誘起解離タンデム質量分析法（ＨＣＤ－ＭＳ２）である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記第２のタンデム質量分析法が、電子移動解離タンデム質量分析法（ＥＴＤ－ＭＳ２）又は電子捕獲解離タンデム質量分析法（ＥＣＤ－ＭＳ２）である、請求項６～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
より高いトリガー強度閾値及び／又は狭い単離ウィンドウが、前記第２のタンデム質量分析法のトリガーを改善するために使用される、請求項６～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
トライブリッド技術を用いた同期前駆体選択を、前記タンデム質量分析法に適用して、前記検出及び定量化の特異性及び精度を改善する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記第１のＴＭＴ及び前記第３のＴＭＴの各々が、互いに共有結合している質量レポーター、質量ノーマライザー、及びシステイン反応性基を含み、前記第２のＴＭＴ及び前記第４のＴＭＴの各々が、互いに共有結合している質量レポーター、質量ノーマライザー、及びアミン反応性基を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記第１のＴＭＴ及び前記第３のＴＭＴの各々が、ＩｏｄｏＴＭＴｓｉｘｐｌｅｘの等圧セットから選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記第２のＴＭＴ及び前記第４のＴＭＴの各々が、ＴＭＴ６ｐｌｅｘ、ＴＭＴ１０ｐｌｅｘ、又はＴＭＴ ｐｒｏ１６ ｐｌｅｘの等圧セットから選択される、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項17】
前記コンジュゲートが、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
１つ又は２つ以上のコンジュゲートを含む試料のマルチプレックスが分析される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記コンジュゲート又は前記ＡＤＣが、前記ポリペプチド又は前記抗体のシステイン残基に共役した１つ又は２つ以上の薬物を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記コンジュゲート又は前記ＡＤＣが、前記ポリペプチド又は前記抗体のリジン残基に共役した１つ又は２つ以上の薬物を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記第１のＴＭＴ、第２のＴＭＴ、第３のＴＭＴ、及び第４のＴＭＴの各々が、互いに共有結合している質量レポーター、質量ノーマライザー、及びアミン反応性基を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記第１のＴＭＴ、第２のＴＭＴ、第３のＴＭＴ、及び第４のＴＭＴの各々が、ＴＭＴ６ｐｌｅｘ、ＴＭＴ１０ｐｌｅｘ、又はＴＭＴ ｐｒｏ１６ ｐｌｅｘから選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記コンジュゲート中の前記薬物共役部位が、（２ｎ＋２）レポーターイオンを含む質量分析バーコードにより特徴付けられ、前記コンジュゲートが、ｎ＋１レポーターイオンを含む質量分析バーコードにより正規化され、ｎが、前記方法によって分析される試料の数である、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法のいずれかを実施するためのシステム。
【請求項25】
第１のＴＭＴ及び第２のＴＭＴのうちの少なくとも１つで標識されたペプチドと、任意選択で１つ又は２つ以上の非標識ペプチドとの混合物を含む、組成物であって、前記第１のＴＭＴ及び前記第２のＴＭＴが、同じレポーターイオン質量を有さず、前記ペプチドの混合物が、薬物に共役しており、かつ前記第１のＴＭＴ及び前記第２のＴＭＴのうちの少なくとも１つで標識された、少なくとも１つのペプチドを含む、組成物。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０１９年９月１９日に出願された米国仮出願第６２／９０２，９５８号に対する優先権を主張し、その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本出願は、とりわけ、共役分子を含む分子コンジュゲート、例えば、共役分子を定量化、正規化、検出、及び／又は同定することを含む分子コンジュゲートを特徴付ける、方法及び試薬に関する。本出願に教示されるように、本発明は、例えば、分子コンジュゲート、抗体－薬物コンジュゲート（antibody-drug conjugate、ＡＤＣ）などの薬物コンジュゲートなどを含む、様々な種類の分子と共に使用するのに有用である。
【背景技術】
【0003】
分子の共役は、有利であり得る。例えば、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）などの薬物コンジュゲートは、がんを治療するための治療法（Ｐｏｌａｋｉｓ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗｓ ６８，３－１９（２０１６））及び免疫学的障害（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ２０７８，２３－３６（２０２０））の拡大しているクラスである。ＡＤＣの一般的な構造は、切断可能な又は切断不可能なリンカーを介して薬物に接続されたモノクローナル抗体（monoclonal antibody、ｍＡｂ）を含有する。例えば、ＡＤＣは、酸不安定リンカー、プロテアーゼ切断可能リンカー、又はジスルフィドリンカーなどの切断不可能な又は切断可能なリンカーを介して、細胞毒性物、ステロイド、及びアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの生物学的に活性なペイロードに接続されたヒト化／ヒトｍＡｂを有することができる。リンカーは、リジンカップリング、システインアルキル化、又は酵素反応を介して、共役部位でｍＡｂに共有結合し得る。ＡＤＣは、その標的細胞表面抗原受容体に結合し、これは、標的部位への薬物の標的化送達を可能にし、健康な組織への全身毒性効果を最小限に抑え、結果として、代替化学療法又は他の第１世代ｍＡｂよりも、選択性が増加し、有効性及び安全性が改善される（例えば、Ｄａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｂａｓｅｌ）１１）を参照されたい）。
【0004】
完全な共役は、達成することが困難である。不完全な共役プロセスは、遊離若しくは非共役薬物、薬物リンカー、又は薬物関連不純物をもたらし得る。分解生成物が、製剤において及びインビボで経時的に発生し得る。ＡＤＣの特性評価及び定量化は、ＡＤＣの安全性、有効性、及び均一性にとって重要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
本出願は、薬物コンジュゲートなどの治療コンジュゲートを含む、分子コンジュゲートの効率的な同定及び定量化のための、改善された、例えば、より正確で、信頼性が高く、高感度であるなどの材料及び方法を提供する。本発明は、例えば、そのような改善された特性評価のための材料及び方法を教示する。
【0006】
本出願は、とりわけ、タンデム質量タグ（Tandem Mass Tag、ＴＭＴ）を使用することによってポリペプチドに共有結合した薬物を含むコンジュゲートを分析する方法に関する。
【0007】
一態様では、本出願は、ポリペプチドに共有結合した薬物を含むコンジュゲートを分析する方法であって、
（ｉ）コンジュゲートを含む試料を第１のタンデム質量タグ（ＴＭＴ）と接触させて、それによって、コンジュゲートのポリペプチドを第１のＴＭＴで標識することと、
（ｉｉ）第１のＴＭＴで標識されたコンジュゲートのポリペプチドを消化して、１つ又は２つ以上の非標識ペプチドと、第１のＴＭＴで標識された１つ又は２つ以上のペプチドと、を含む、第１の混合物を生成することと、
（ｉｉｉ）第１の混合物を第２のタンデム質量タグ（ＴＭＴ）と接触させて、それによって、第１のＴＭＴ及び第２のＴＭＴのうちの少なくとも１つで標識された１つ又は２つ以上のペプチド、任意選択で１つ又は２つ以上の非標識ペプチド含む、第２の混合物を得ることであって、第１のＴＭＴ及び第２のＴＭＴが、同じレポーターイオン質量を有しない、得ることと、
（ｉｖ）第２の混合物を液体クロマトグラフィー（liquid chromatography、ＬＣ）に供して、ＬＣの溶出物を生成することと、
（ｖ）溶出物をタンデム質量分析法に供して、第１のＴＭＴ及び第２のＴＭＴの少なくとも１つのレポーターイオンを含むペプチドの質量スペクトルを得ることと、
（ｖｉ）少なくとも１つのレポーターイオンに関連付けられた質量電荷比（ｍ／ｚ）を検出し、それによって試料中のコンジュゲートを分析することと、を含む、方法に関する。
（ｉ）コンジュゲートを含む試料を第１のタンデム質量タグ（ＴＭＴ）と接触させて、それによって、コンジュゲートのポリペプチドを第１のＴＭＴで標識することと、
（ｉｉ）第１のＴＭＴで標識されたコンジュゲートのポリペプチドを消化して、１つ又は２つ以上の非標識ペプチドと、第１のＴＭＴで標識された１つ又は２つ以上のペプチドと、を含む、第１の混合物を生成することと、
（ｉｉｉ）第１の混合物を第２のタンデム質量タグ（ＴＭＴ）と接触させて、それによって、第１のＴＭＴ及び第２のＴＭＴのうちの少なくとも１つで標識された１つ又は２つ以上のペプチド、任意選択で１つ又は２つ以上の非標識ペプチド含む、第２の混合物を得ることであって、第１のＴＭＴ及び第２のＴＭＴが、同じレポーターイオン質量を有しない、得ることと、
（ｉｖ）第２の混合物を液体クロマトグラフィー（liquid chromatography、ＬＣ）に供して、ＬＣの溶出物を生成することと、
（ｖ）溶出物をタンデム質量分析法に供して、第１のＴＭＴ及び第２のＴＭＴの少なくとも１つのレポーターイオンを含むペプチドの質量スペクトルを得ることと、
（ｖｉ）少なくとも１つのレポーターイオンに関連付けられた質量電荷比（ｍ／ｚ）を検出し、それによって試料中のコンジュゲートを分析することと、を含む、方法に関する。
【0008】
別の態様では、ポリペプチドに共有結合した薬物のコンジュゲートを含む試料を、薬物に共有結合していないポリペプチドを含む対照試料と共に分析する。本方法は、
（ｉ）コンジュゲートを含む試料を第１のタンデム質量タグ（ＴＭＴ）と接触させて、それによって、コンジュゲートのポリペプチドを第１のＴＭＴで標識することと、
（ｉｉ）第１のＴＭＴで標識されたコンジュゲートのポリペプチドを消化して、１つ又は２つ以上の非標識ペプチドと、第１のＴＭＴで標識された１つ又は２つ以上のペプチドと、を含む、第１の混合物を生成することと、
（ｉｉｉ）第１の混合物を第２のタンデム質量タグ（ＴＭＴ）と接触させて、それによって、第１のＴＭＴ及び第２のＴＭＴのうちの少なくとも１つで標識された１つ又は２つ以上のペプチド、任意選択で１つ又は２つ以上の非標識ペプチド含む、第２の混合物を得ることと、
（ｉｖ）薬物に共有結合していないポリペプチドを含む対照試料を第３のＴＭＴと接触させて、薬物に共有結合していないポリペプチドを第３のＴＭＴで標識することと、
（ｖ）第３のＴＭＴで標識された薬物に共有結合していないポリペプチドを消化して、１つ又は２つ以上の非標識ペプチドと、第３のＴＭＴで標識された１つ又は２つ以上のペプチドと、を含む、第３の混合物を生成することと、
（ｖｉ）第３の混合物を第４のタンデム質量タグ（ＴＭＴ）と接触させて、それによって、第３のＴＭＴ及び第４のＴＭＴのうちの少なくとも１つで標識された１つ又は２つ以上のペプチド、任意選択で１つ又は２つ以上の非標識ペプチドを含む、第４の混合物を得ることと、
（ｖｉｉ）第２の混合物を第４の混合物と組み合わせ、組み合わせを液体クロマトグラフィー法（ＬＣ）に供して、ＬＣの溶出物を生成することと、
（ｖｉｉｉ）溶出物をタンデム質量分析法に供して、第１のＴＭＴ、第２のＴＭＴ、第３のＴＭＴ、及び第４のＴＭＴのうちの少なくとも１つのレポーターイオンを含むペプチドの質量スペクトルを得ることと、
（ｉｘ）少なくとも１つのレポーターイオンと関連付けられた質量電荷比を検出して、それによって、試料中のコンジュゲートを分析することと、を含み、
第１のＴＭＴ、第２のＴＭＴ、第３のＴＭＴ、及び第４のＴＭＴのうちのいずれも同じレポーターイオン質量を有さず、第１のＴＭＴ及び第３のＴＭＴが、ＴＭＴの第１の等圧セットから選択され、第２のＴＭＴ及び第４のＴＭＴが、ＴＭＴの第２の等圧セットから選択され、ＴＭＴの第１の等圧セットが、薬物で共有結合を形成することができる非共役アミノ酸残基に反応性であり、ＴＭＴの第２の等圧セットが、ペプチドのＮ末端でリジン又は遊離アミンに反応性である。
（ｉ）コンジュゲートを含む試料を第１のタンデム質量タグ（ＴＭＴ）と接触させて、それによって、コンジュゲートのポリペプチドを第１のＴＭＴで標識することと、
（ｉｉ）第１のＴＭＴで標識されたコンジュゲートのポリペプチドを消化して、１つ又は２つ以上の非標識ペプチドと、第１のＴＭＴで標識された１つ又は２つ以上のペプチドと、を含む、第１の混合物を生成することと、
（ｉｉｉ）第１の混合物を第２のタンデム質量タグ（ＴＭＴ）と接触させて、それによって、第１のＴＭＴ及び第２のＴＭＴのうちの少なくとも１つで標識された１つ又は２つ以上のペプチド、任意選択で１つ又は２つ以上の非標識ペプチド含む、第２の混合物を得ることと、
（ｉｖ）薬物に共有結合していないポリペプチドを含む対照試料を第３のＴＭＴと接触させて、薬物に共有結合していないポリペプチドを第３のＴＭＴで標識することと、
（ｖ）第３のＴＭＴで標識された薬物に共有結合していないポリペプチドを消化して、１つ又は２つ以上の非標識ペプチドと、第３のＴＭＴで標識された１つ又は２つ以上のペプチドと、を含む、第３の混合物を生成することと、
（ｖｉ）第３の混合物を第４のタンデム質量タグ（ＴＭＴ）と接触させて、それによって、第３のＴＭＴ及び第４のＴＭＴのうちの少なくとも１つで標識された１つ又は２つ以上のペプチド、任意選択で１つ又は２つ以上の非標識ペプチドを含む、第４の混合物を得ることと、
（ｖｉｉ）第２の混合物を第４の混合物と組み合わせ、組み合わせを液体クロマトグラフィー法（ＬＣ）に供して、ＬＣの溶出物を生成することと、
（ｖｉｉｉ）溶出物をタンデム質量分析法に供して、第１のＴＭＴ、第２のＴＭＴ、第３のＴＭＴ、及び第４のＴＭＴのうちの少なくとも１つのレポーターイオンを含むペプチドの質量スペクトルを得ることと、
（ｉｘ）少なくとも１つのレポーターイオンと関連付けられた質量電荷比を検出して、それによって、試料中のコンジュゲートを分析することと、を含み、
第１のＴＭＴ、第２のＴＭＴ、第３のＴＭＴ、及び第４のＴＭＴのうちのいずれも同じレポーターイオン質量を有さず、第１のＴＭＴ及び第３のＴＭＴが、ＴＭＴの第１の等圧セットから選択され、第２のＴＭＴ及び第４のＴＭＴが、ＴＭＴの第２の等圧セットから選択され、ＴＭＴの第１の等圧セットが、薬物で共有結合を形成することができる非共役アミノ酸残基に反応性であり、ＴＭＴの第２の等圧セットが、ペプチドのＮ末端でリジン又は遊離アミンに反応性である。
【0009】
一態様では、本出願の方法は、コンジュゲート中の共役部位の占有率を決定するために使用される。例えば、コンジュゲートの個々の部位占有率は、１）本出願の方法を使用して、第１のＴＭＴ及び第２のＴＭＴの両方で標識されたペプチド並びに第３のＴＭＴ及び第４のＴＭＴの両方で標識されたペプチドに対する質量スペクトルを得ることであって、質量スペクトルが、第１のＴＭＴのレポーターイオンと、第３のＴＭＴのレポーターイオンと、第２のＴＭＴのレポーターイオンと、第４のＴＭＴのレポーターイオンと、を含む、得ることと、２）質量スペクトルにおいてレポーターイオンと関連付けられた質量電荷比（ｍ／ｚ）を検出することと、３）質量スペクトルにおける第１のＴＭＴのレポーターイオンの強度及び第３のＴＭＴのレポーターイオンの強度、又は第２のＴＭＴのレポーターイオンの強度及び第４のＴＭＴのレポーターイオンの強度に基づいて、コンジュゲート中の共役部位の占有率を決定することであって、好ましくは、占有率が、以下の式：
（第３のＴＭＴのレポーターイオンの強度－第１のＴＭＴのレポーターイオンの強度）／第３のＴＭＴのレポーターイオンの強度、又は
（第４のＴＭＴのレポーターイオンの強度－第２のＴＭＴのレポーターイオンの強度）／第４のＴＭＴのレポーターイオンの強度、によって決定される、決定することと、によって決定され得る。
（第３のＴＭＴのレポーターイオンの強度－第１のＴＭＴのレポーターイオンの強度）／第３のＴＭＴのレポーターイオンの強度、又は
（第４のＴＭＴのレポーターイオンの強度－第２のＴＭＴのレポーターイオンの強度）／第４のＴＭＴのレポーターイオンの強度、によって決定される、決定することと、によって決定され得る。
【0010】
特定の実施形態では、コンジュゲート中の共役部位の占有率が、様々な時点で決定され、追加のＴＭＴが、異なる時点でポリペプチドを標識するために使用される。
【0011】
別の実施形態では、本出願の方法は、対照試料でコンジュゲート試料を正規化するために使用される。例えば、コンジュゲート試料は、１）請求項２に記載の方法を使用して、第２のＴＭＴのみで標識されたペプチド及び第４のＴＭＴのみで標識されたペプチドに対する質量スペクトルを得ることであって、質量スペクトルが、第２のＴＭＴのレポーターイオン及び第４のＴＭＴのレポーターイオンを含むが、第１のＴＭＴ又は第３のＴＭＴのレポーターイオンを含まない、得ることと、２）レポーターイオンに関連付けられた質量電荷比（ｍ／ｚ）を検出することと、３）第２のＴＭＴのレポーターイオンの強度の第４のＴＭＴのレポーターイオンの強度に対する比によって、試料を対照試料で正規化することと、を含む方法によって、対照試料で正規化される。
【0012】
更に別の実施形態では、本出願の方法は、薬物共役部位、例えば、薬物が、コンジュゲート中で、ポリペプチドに共有結合する部位を局在化するために使用される。例えば、薬物共役部位は、１）本発明の方法を使用して、第２のＴＭＴのみで標識されたペプチドの質量スペクトルを得ることであって、質量スペクトルが、第２のＴＭＴのレポーターイオンのみを含むが、第１、第３又は第４のＴＭＴのレポーターイオンは含まない、得ることと、２）第２のＴＭＴのレポーターイオンのみで標識されたペプチドに対する第２のタンデム質量分析法の分析をトリガーして、それによって薬物共役部位を局在化することと、を含む方法によって、局在化され得る。特定の実施形態では、第２の混合物の消化後に得られる第２のＴＭＴのレポーターイオンのみで標識されたペプチドは、薬物に完全に結合しており、例えば、薬物に共役することができるペプチド上の全てのアミノ酸残基は、薬物に共有結合している。ペプチドは、薬物と共有結合を形成することができる１つのアミノ酸残基（例えば、Ｃｙｓ又はＬｙｓ）のみを含有する場合、１つの薬物のみに共役され得る。ペプチドは、薬物と共有結合を形成することができる２つ以上のアミノ酸残基（例えば、Ｃｙｓ又はＬｙｓ）を含有する場合、２つ以上の薬物に共役され得る。
【0013】
特定の実施形態では、コンジュゲート中に薬物共役部位を局在化する方法は、１）本出願の方法を使用して、第１及び第２のＴＭＴのみで標識されたペプチドの質量スペクトルを得ることであって、第１及び第２のＴＭＴのレポーターイオンのみを含むが、第３又は第４のＴＭＴのレポーターイオンを含まない、得ることと、２）第１及び第２のＴＭＴのみで標識されたペプチドに対する第２のタンデム質量分析法の分析をトリガーして、それによって薬物共役部位を局在化することと、を含む。特定の実施形態では、第２の混合物の消化後に得られる第１及び第２のＴＭＴでのみ標識されたペプチドは、薬物に完全に共役されておらず、例えば、薬物に共役することができる、全部ではないが、いくつかのアミノ酸残基のみが薬物に共有結合している。
【0014】
本出願の一実施形態では、コンジュゲートは、薬物抗体コンジュゲート（ＡＤＣ）であり、より好ましくは、ＡＤＣは、モノクローナル抗体の１つ又は２つ以上のシステイン（cysteine、Ｃｙｓ）又はリジン（lysine、Ｌｙｓ）残基に共有結合した薬物を含む。
【0015】
当業者には理解されるように、様々な好適なタンデム質量分析法を、本開示を勘案して、本出願の方法で使用することができる。例えば、Ｆｒｉｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ １０，３３５－３４５（２０１８）を、タンデム質量分析法のレビューのために参照されたく、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、高エネルギー衝突誘起解離タンデム質量分析法（high energy collision-induced dissociation tandem mass spectrometry、ＨＣＤ－ＭＳ２）は、第１のＴＭＴ、第２のＴＭＴ、第３のＴＭＴ、及び第４のＴＭＴのうちの少なくとも１つのレポーターイオンを含むペプチドの質量スペクトルを得るために使用される。他の実施形態では、１つ又は２つ以上のＴＭＴレポーターイオンがＨＣＤ－ＭＳ２分析からのペプチドから検出された後、例えば、ペプチド中の薬物共役部位を局在化するために、ペプチドの追加の特性評価のために追加の解離分析がトリガーされる。追加の解離は、第２のタンデム質量分析法の分析によって行われ得る。そのような方法に有用な第２のタンデム質量分析法の例としては、電子移動解離タンデム質量分析法（electron transfer dissociation tandem mass spectrometry、ＥＴＤ－ＭＳ２）又は電子捕獲解離タンデム質量分析法（electron-capture dissociation tandem mass spectrometry、ＥＣＤ－ＭＳ２）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0016】
他の実施形態では、より高いトリガー強度閾値及び／又は狭い単離ウィンドウが、第２のタンデム質量分析法のトリガーを改善するために使用される。特定の実施形態では、トライブリッド技術を用いた同期前駆体選択をタンデム質量分析法に適用して、検出及び定量化の特異性及び精度を改善する。
【0017】
本出願における本開示の観点から、任意の好適なＴＭＴを使用することができる。例えば、ＴＭＴのレビューのために、Ｂａｃｈｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２０１９，２４，７０１を参照されたく、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本出願のいくつかの実施形態では、ＴＭＴの第１の等圧セットは、還元システインに反応性の２つ又は３つ以上のＴＭＴを含む。好ましくは、ＴＭＴの第１の等圧セットは、還元システインに反応性の２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、又はそれ以上のＴＭＴを含む。いくつかの実施形態では、第１の等圧セットは、スルフヒドリル（－ＳＨ）基の共有結合性の不可逆的標識についてヨードアセチル活性化された２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、又はそれ以上の等圧性異性体（例えば、同じ質量及び構造）を含む。いくつかの実施形態では、第１の等圧セットは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（カタログ番号９０１０１）から入手可能な、ＩｏｄｏＴＭＴｓｉｘｐｌｅｘ等圧標識試薬セットの２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つの等圧異性体を含む。
【0018】
特定の実施形態では、第１のＴＭＴ及び第３のＴＭＴの各々は、質量レポーター、質量ノーマライザー、及び互いに共有結合しているシステイン反応性基を含む。したがって、第１及び第３のＴＭＴの各々は、コンジュゲートのポリペプチド中の低減されたシステインを標識し、ポリペプチドの１つ又は２つ以上のシステイン残基に共有結合した薬物を含有するコンジュゲートの分析に使用され得る。好ましくは、第１及び第３のＴＭＴの各々は、ＩｏｄｏＴＭＴｓｉｘｐｌｅｘの等圧セットから選択される。
【0019】
本出願のいくつかの実施形態では、ＴＭＴの第２の等圧セットは、リジン又はペプチドのＮ末端の一級アミンと反応性の２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、又はそれ以上のＴＭＴを含む。本出願の一実施形態では、ＴＭＴの第２の等圧セットは、アミン反応性ＮＨＳ－エステル基、スペーサーアーム及び質量レポーターを有する２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、又はそれ以上の等圧化合物を含む。例えば、第２の等圧セットは、ＴＭＴ１０ｐｌｅｘ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号９０１１０）の２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、又はそれ以上の等圧異性体、ＴＭＴｓｉｘｐｌｅｘ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号９００６１）、又はＴＭＴｐｒｏ（商標）１６ｐｌｅｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ａ４４５２０）標識試薬セットを含み得る。
【0020】
特定の実施形態では、第２のＴＭＴ及び第４のＴＭＴの各々は、質量レポーター、質量ノーマライザー、及び互いに共有結合しているアミン反応性基を含む。したがって、第２及び第４のＴＭＴの各々は、リジン又はコンジュゲートのポリペプチドのＮ末端を標識し、ポリペプチドの１つ又は２つ以上のシステイン残基に共有結合した薬物を含有するコンジュゲートの分析のために、第１及び第３のＴＭＴと共に使用され得る。好ましくは、第２のＴＭＴ及び第４のＴＭＴの各々は、ＴＭＴ６ｐｌｅｘ、ＴＭＴ１０ｐｌｅｘ、又はＴＭＴ ｐｒｏ１６ ｐｌｅｘの等圧セットから選択される。
【0021】
いくつかの実施形態では、第１の等圧セット及びＴＭＴの第２の等圧セットは、各々独立して、リジン又はペプチドのＮ末端の一級アミンと反応性の２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、又はそれ以上のＴＭＴを含む。特定の実施形態では、第１、第２、第３、及び第４のＴＭＴの各々は、質量レポーター、質量ノーマライザー、及び互いに共有結合しているアミン反応性基を含む。ＴＭＴは、ポリペプチドの１つ又は２つ以上のリジン残基に共有結合した薬物を含むコンジュゲートの分析に使用され得る。
【0022】
いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上のコンジュゲートを含む試料のマルチプレックスを一緒に分析する。特定の実施形態では、コンジュゲート中の薬物共役部位は、（２ｎ＋２）レポーターイオンを含む質量分析バーコードにより特徴付けられ、コンジュゲートは、ｎ＋１レポーターイオンを含む質量分析バーコードにより正規化され、ｎは、この方法によって分析される試料の数である。
【0023】
本出願の他の態様は、請求項１～２３に記載の方法のいずれかを実施するためのシステムに関する。
【0024】
本出願の別の態様は、第１のＴＭＴ及び第２のＴＭＴのうちの少なくとも１つで標識されたペプチドと、任意選択で１つ又は２つ以上の非標識ペプチドとの混合物を含む、組成物であって、第１のＴＭＴ及び第２のＴＭＴが、同じレポーターイオン質量を有さず、ペプチドの混合物が、薬物に共役しており、かつ第１のＴＭＴ及び第２のＴＭＴのうちの少なくとも１つで標識された、少なくとも１つのペプチドを含む、組成物に関する。
【0025】
本発明他の態様、特徴及び利点は、当業者によって理解されるように、例示的かつ非限定的である、発明を実施するための形態及びその好ましい実施形態及び添付の特許請求の範囲を含む、以下の開示から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0026】
上記の概要、及び本出願の好ましい実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むことでより良く理解されるであろう。しかしながら、本出願は、図面に示される実施形態そのものに限定されないことを理解するべきである。
【0027】
本特許又は出願書類は、少なくとも１つのカラーで作成した図面を含む。カラー図面を有する本特許又は特許出願公開の複製は、申請すれば、必要な手数料を支払うことにより、特許庁によって提供されるであろう。
【0028】
特に断らない限り、本明細書の全ての図面において、ＩｄｏＴＭＴのレポーターイオンは
【0029】
【化1】
【0030】
【化2】
【0031】
【化3】
【0032】
【化4】
【0033】
【図1A】以下の、ポリペプチドでシステインを標識するのに有用な例示的なタンデム質量タグ（ＴＭＴ）の構造を示す：図１Ａ－ＩｏｄｏＴＭＴｓｉｘｐｌｅｘセット、図１Ｂ－ＴＭＴｓｉｘｐｌｅｘセット、図１Ｃ－ＴＭＴ１０ｐｌｅｘセット、図１Ｄ－ＴＭＴｐｒｏ １６ ｐｌｅｘ（ＴＭＴの化学構造及び１３Ｃ及び１５Ｎ安定同位体位置（＊）を含む）。
【図1B】以下の、ポリペプチドでシステインを標識するのに有用な例示的なタンデム質量タグ（ＴＭＴ）の構造を示す：図１Ａ－ＩｏｄｏＴＭＴｓｉｘｐｌｅｘセット、図１Ｂ－ＴＭＴｓｉｘｐｌｅｘセット、図１Ｃ－ＴＭＴ１０ｐｌｅｘセット、図１Ｄ－ＴＭＴｐｒｏ １６ ｐｌｅｘ（ＴＭＴの化学構造及び１３Ｃ及び１５Ｎ安定同位体位置（＊）を含む）。
【図1C】以下の、ポリペプチドでシステインを標識するのに有用な例示的なタンデム質量タグ（ＴＭＴ）の構造を示す：図１Ａ－ＩｏｄｏＴＭＴｓｉｘｐｌｅｘセット、図１Ｂ－ＴＭＴｓｉｘｐｌｅｘセット、図１Ｃ－ＴＭＴ１０ｐｌｅｘセット、図１Ｄ－ＴＭＴｐｒｏ １６ ｐｌｅｘ（ＴＭＴの化学構造及び１３Ｃ及び１５Ｎ安定同位体位置（＊）を含む）。
【図1D】以下の、ポリペプチドでシステインを標識するのに有用な例示的なタンデム質量タグ（ＴＭＴ）の構造を示す：図１Ａ－ＩｏｄｏＴＭＴｓｉｘｐｌｅｘセット、図１Ｂ－ＴＭＴｓｉｘｐｌｅｘセット、図１Ｃ－ＴＭＴ１０ｐｌｅｘセット、図１Ｄ－ＴＭＴｐｒｏ １６ ｐｌｅｘ（ＴＭＴの化学構造及び１３Ｃ及び１５Ｎ安定同位体位置（＊）を含む）。
【図2】例えば、定量化する（例えば、薬物の占有率を）、正規化する（例えば、コンジュゲートに対して模擬を正規化する）、及びタンデム質量分析法（ＭＳ２）の分析から検出された所定のＴＭＴレポーター（パターン）の強度及び組み合わせに基づいて試料を検出する（例えば、薬物共役部位を局在化する）ために、試料特徴付けのための本明細書の実施形態による特有のバーコードの作成を示す。
【図3A】定量化、正規化、及び局所化することができる分析スキームを使用して、薬物（Ｄｒｕｇ、Ｄ）、例えば、薬物で共役したその抗体又は断片、及び模擬、例えば、薬物で共役していないその抗体又は断片、とのコンジュゲートの連続二重ＴＭＴ標識化による三重プレイを介してＭＳバーコードを作成する、本出願の実施形態を示す。
【図3B】本出願の実施形態による、トリプシン消化によって得られたペプチドに共役した１つの薬物（Ｄ）との薬物コンジュゲートを定量化するための二重ＴＭＴを使用するプロセスを示す。
【図3C】本出願の一実施形態による、トリプシン消化によって得られたペプチドに共役した最大２つの薬物（Ｄ１及びＤ２）との薬物コンジュゲートを定量化するための二重ＴＭＴを使用するプロセスを示す。
【図3D】本出願の実施形態による、トリプシン消化によって得られたペプチドに共役した最大３つの薬物（Ｄ１、Ｄ２及びＤ３）との薬物コンジュゲートを定量化するための二重ＴＭＴを使用することを示す。
【図4】本発明の方法により分析されるいくつかの例示的な実験ＡＤＣシステムを示し、これは、ヨードアセトアミド（iodoacetamide、ＩＡＡ）及びビオチンＰＥＯヨードアセトアミドとの共役によって形成されたビオチン－ＰＥＯアセトアミドコンジュゲートと、ＮＩＳＴ ｍＡｂ又はＮ－（７－ジメチルアミノ－４－メチル－３－クマリニル）マレイド（ＤＡＣＭ－３）と共役した１～３つのシステインを含有するＨＳＡペプチドと、Ｓｉｇｍａ製のＡＤＣ標準ＭＳＱＣ８（デンシルフルオロフォアＬＣ－ＳＭＣＣ架橋剤）と、を含む。
【図5A】各々、ＨＣＤ－ＭＳ２を実行することによって、ＮＩＳＴ ｍＡｂ上の部位特異的ＡＤＣを定量化するための二重ＴＭＴを使用した本出願の実施形態を示しているが、ＥＴＤ－ＭＳ２などの他のＭＳ２はまた、例えば、ｉｏｄｏＴＭＴ（ｉｏ、Ｃｙｓ残基又はＣを標識する）又はＴＭＴ（ｔｍ、Ｌｙｓ残基又はＮ末端アミンを標識する）レポーターイオン強度を使用して特定の残基に対する薬物の占有率を定量化し、かつ占有率％を計算する式を適用し得、ＡＤＣがＮＩＳＴ ｍＡｂ－ビオチン－ＰＥＯアセトアミドである。
【図5B】各々、ＨＣＤ－ＭＳ２を実行することによって、ＮＩＳＴ ｍＡｂ上の部位特異的ＡＤＣを定量化するための二重ＴＭＴを使用した本出願の実施形態を示しているが、ＥＴＤ－ＭＳ２などの他のＭＳ２はまた、例えば、ｉｏｄｏＴＭＴ（ｉｏ、Ｃｙｓ残基又はＣを標識する）又はＴＭＴ（ｔｍ、Ｌｙｓ残基又はＮ末端アミンを標識する）レポーターイオン強度を使用して特定の残基に対する薬物の占有率を定量化し、かつ占有率％を計算する式を適用し得、ＡＤＣがＮＩＳＴ ｍＡｂ－ビオチン－ＰＥＯアセトアミドである。
【図5C】ＨＣＤ－ＭＳ２によって配列決定されたペプチドの対応するＭＳ２スペクトル（全ての骨格生成物イオンを有する）を示す。
【図5D】ＨＣＤ－ＭＳ２によって配列決定されたペプチドの対応するＭＳ２スペクトル（全ての骨格生成物イオンを有する）を示す。
【図6A】非システインペプチドとの反応条件にわたってＨＣＤ－ＭＳ２を実施することによってＮＩＳＴ ｍＡｂの混合比を正規化するためのＴＭＴを使用した本出願の実施形態を示しているが、他のＥＴＤ－ＭＳ２などの他のＭＳ２も使用され、試料（試料）を含有するＡＤＣ（ＮＩＳＴ ｍＡｂ－ビオチン－ＰＥＯアセトアミド）と非コンジュゲート試料（模擬）との間の混合又は消化バイアスを補正するために式に示される正規化比を使用することもできる。
【図6B】非システインペプチドとの反応条件にわたってＨＣＤ－ＭＳ２を実施することによってＮＩＳＴ ｍＡｂの混合比を正規化するためのＴＭＴを使用した本出願の実施形態を示しているが、他のＥＴＤ－ＭＳ２などの他のＭＳ２も使用され、試料（試料）を含有するＡＤＣ（ＮＩＳＴ ｍＡｂ－ビオチン－ＰＥＯアセトアミド）と非コンジュゲート試料（模擬）との間の混合又は消化バイアスを補正するために式に示される正規化比を使用することもできる。
【図7】薬物からなるペプチドの骨格断片化と、本出願の実施形態による方法並びにＥＴＤ－ＭＳ２を使用した分析を使用して、ビオチンＰＥＯアセトアミド分子の断片化に対応する断片も、含むＨＣＤ－ＭＳ２生成物イオンスペクトルを示す：断片化により生成される複雑なスペクトルを起こしやすい小分子コンジュゲート、及び薬物由来の断片質量は、各薬物に特異的であることに留意されたい。
【図8A】ＮＩＳＴ三重プレイワークフローに対するＴＭＴ－１３０レポータートリガーを示す。
【図8B】本出願の実施形態による方法及び観察された総イオンクロマトグラム（total ion chromatogram、ＴＩＣ）を使用して、ＥＴＤ－ＭＳ２をトリガーして共役薬物を局在化するためにＴＭＴ－１３０シグネチャイオン（バーコード）を使用することを示す。
【図9A】本出願の実施形態による方法を使用して、以下のＴＭＴ－１３０の質量トリガーを介したビオチンＰＥＯアセトアミドの局在化を示す：ＨＣＤ－ＭＳ２からのＴＭＴ－１３０は、一意のトリガーであり、ＡＤＣのタイプ及び薬物の断片化なしでＥＴＤ－ＭＳ２により局在化された薬物に依存しない：Ｄ＝ビオチン－ＰＥＯアセトアミド。
【図9B】本出願の実施形態による方法を使用して、以下のＴＭＴ－１３０の質量トリガーを介したビオチンＰＥＯアセトアミドの局在化を示す：ＨＣＤ－ＭＳ２からのＴＭＴ－１３０は、一意のトリガーであり、ＡＤＣのタイプ及び薬物の断片化なしでＥＴＤ－ＭＳ２により局在化された薬物に依存しない：Ｄ＝ビオチン－ＰＥＯアセトアミド。
【図9C】Ｃｙｓ－２３で共役したビオチンＰＥＯアセトアミドに対応するトリガー質量検出を示し、ＴＭＴ１３０はビオチンＰＥＯアセトアミドによって生成されたインモニウムイオンと比べて豊富ではない。
【図9D】Ｃｙｓ－２３で共役したビオチンＰＥＯアセトアミドに対応するトリガー質量検出を示し、ＴＭＴ１３０はビオチンＰＥＯアセトアミドによって生成されたインモニウムイオンと比べて豊富ではない。
【図10A】本出願の実施形態による以下のトリガーＴＭＴ－１３０の特異性を改善する方法を示す：ペプチドの共単離及び共断片化は、ＴＭＴ－１３０の特異性の喪失をもたらし、より高いトリガー強度閾値又は狭い単離ウィンドウは、改善された質量トリガーをもたらした。
【図10B】本出願の実施形態による以下のトリガーＴＭＴ－１３０の特異性を改善する方法を示す：ペプチドの共単離及び共断片化は、ＴＭＴ－１３０の特異性の喪失をもたらし、より高いトリガー強度閾値又は狭い単離ウィンドウは、改善された質量トリガーをもたらした。
【図11】試料調製ステーション（Sample Prep Station、ＳＰＳ－３）がどのように本出願の実施形態による等圧標識実験に使用されるかを示し、前駆体イオンがイオンルーティング多重極（Ion Routing Multipole、ＩＲＭ）からイオントラップ（Ion trap、ＩＴ）に移送され、同期前駆体選択（synchronous precursor selection、ＳＰＳ）がＩＴで行われる。
【図12C】本出願の実施形態による同期前駆体選択を使用したＴＭＴ定量化の改善された特異性及び精度を示す。図１２Ｃは、レポーター定量化を示し、ＡＤＣは、ダンシルフルオロフォアに共役したＳｉｇｍａＭＡｂ ＡＤＣ模倣物（ＭＳＱＣ８）－ヒトユニバーサルｍＡｂ標準であり、模擬は、薬物に共役していないヒトユニバーサルｍＡｂ標準（ＭＳＱＣ４、ＩｇＧ１ ｍＡｂ）Ｓｉｇｍａ ｍＡｂである。
【図13A】部位特異的共役占有率に対するＭＳベースのバーコードを含む、本出願の実施形態による方法を使用して、ＭＳＱＣ８（ｍＡｂ抗体－薬物コンジュゲート模倣物）上の部位特異的ＡＤＣ（ダンシルフルオロフォア）を定量化するための二重ＴＭＴを使用する実験及び結果を示す。
【図13B】部位特異的共役占有率に対するＭＳベースのバーコードを含む、本出願の実施形態による方法を使用して、ＭＳＱＣ８（ｍＡｂ抗体－薬物コンジュゲート模倣物）上の部位特異的ＡＤＣ（ダンシルフルオロフォア）を定量化するための二重ＴＭＴを使用する実験及び結果を示す。
【図13C】部位特異的共役占有率に対するＭＳベースのバーコードを含む、本出願の実施形態による方法を使用して、ＭＳＱＣ８（ｍＡｂ抗体－薬物コンジュゲート模倣物）上の部位特異的ＡＤＣ（ダンシルフルオロフォア）を定量化するための二重ＴＭＴを使用する実験及び結果を示す。
【図13D】部位特異的共役占有率に対するＭＳベースのバーコードを含む、本出願の実施形態による方法を使用して、ＭＳＱＣ８（ｍＡｂ抗体－薬物コンジュゲート模倣物）上の部位特異的ＡＤＣ（ダンシルフルオロフォア）を定量化するための二重ＴＭＴを使用する実験及び結果を示す。
【図13E】部位特異的共役占有率に対するＭＳベースのバーコードを含む、本出願の実施形態による方法を使用して、ＭＳＱＣ８（ｍＡｂ抗体－薬物コンジュゲート模倣物）上の部位特異的ＡＤＣ（ダンシルフルオロフォア）を定量化するための二重ＴＭＴを使用する実験及び結果を示す。
【図13F】部位特異的共役占有率に対するＭＳベースのバーコードを含む、本出願の実施形態による方法を使用して、ＭＳＱＣ８（ｍＡｂ抗体－薬物コンジュゲート模倣物）上の部位特異的ＡＤＣ（ダンシルフルオロフォア）を定量化するための二重ＴＭＴを使用する実験及び結果を示す。
【図14A】本出願の一実施形態による方法を使用するＭＳＱＣ８部位全体ＡＤＣ定量化は、以下の既知の方法：ＭＳＱＣ８軽鎖共役の三重プレイ量に基づくＣｙｓ－２１８＝６０％と相関し、軽鎖ＳＬＩＭ－ＩＭＳの１：２のＤＡＲ０／ＤＡＲ１比と相関し、かつＣｙｓ－２６６（最大）＝６０％及びＣｙｓ－３７２＝１５％での占有率が推定された一方で、他の全てのシステインは０％の共役を示したことを示す。
【図14B】本出願の一実施形態による方法を使用するＭＳＱＣ８部位全体ＡＤＣ定量化は、以下の既知の方法：ＭＳＱＣ８軽鎖共役の三重プレイ量に基づくＣｙｓ－２１８＝６０％と相関し、軽鎖ＳＬＩＭ－ＩＭＳの１：２のＤＡＲ０／ＤＡＲ１比と相関し、かつＣｙｓ－２６６（最大）＝６０％及びＣｙｓ－３７２＝１５％での占有率が推定された一方で、他の全てのシステインは０％の共役を示したことを示す。
【図14C】本出願の一実施形態による方法を使用するＭＳＱＣ８部位全体ＡＤＣ定量化は、以下の既知の方法：ＭＳＱＣ８軽鎖共役の三重プレイ量に基づくＣｙｓ－２１８＝６０％と相関し、軽鎖ＳＬＩＭ－ＩＭＳの１：２のＤＡＲ０／ＤＡＲ１比と相関し、かつＣｙｓ－２６６（最大）＝６０％及びＣｙｓ－３７２＝１５％での占有率が推定された一方で、他の全てのシステインは０％の共役を示したことを示す。
【図15】本出願の実施形態による方法を使用したＭＳＱＣ８におけるダンシルフルオロフォアの同定を示し、これは、複雑なスペクトルを生成する断片化を起こしやすい小分子コンジュゲート及び薬物由来の断片質量が各薬物に特異的であることを示した。
【図16A】本出願の実施形態による方法を使用した反応時間経過をプロファイリングするためのＴＭＴを使用することを示す。
【図16B】本出願の実施形態による方法を使用した反応時間経過をプロファイリングするためのＴＭＴを使用することを示す。
【図16C】本出願の実施形態による多重方式で複数の薬物（Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、及びＤ５）の反応を監視するために適用される三重プレイワークフローを示す。
【図16D】各薬物分子に特異的な単一のＴＭＴレポーターイオンを介した質量トリガーを示す。
【図17A】ＴＭＴ分析からの結果が高占有率での蛍光定量化からのそれと相関していることを示す。
【図17B】ＴＭＴ分析からの結果が高占有率での蛍光定量化からのそれと相関していることを示す。
【図18A】本出願の一実施形態による二重ＴＭＴを使用した最大４つのＡＤＣ試料の三重プレイ分析のためにＴＭＴが様々な組み合わせでどのように使用されるかについての多重化スキームを記載する。
【図18B】本出願の一実施形態による４つの異なる部位特異的ＡＤＣ占有率を有する４つのＡＤＣ試料の多重分析（ＴＭＴ１０ｐｌｅｘ試薬のＴＭＴを使用した）を示す。
【図19A】例えば、単一の実行における４つのＡＤＣ試料の二重ＴＭＴ定量化である、三重プレイを達成した４つのＡＤＣを分析する、高スループットで分析するための本発明の方法を使用した結果を示す。
【図19B】例えば、単一の実行における４つのＡＤＣ試料の二重ＴＭＴ定量化である、三重プレイを達成した４つのＡＤＣを分析する、高スループットで分析するための本発明の方法を使用した結果を示す。
【図19C】例えば、単一の実行における４つのＡＤＣ試料の二重ＴＭＴ定量化である、三重プレイを達成した４つのＡＤＣを分析する、高スループットで分析するための本発明の方法を使用した結果を示す。
【図20A】ここで、ＭＳ２－ＨＣＤ時の５つのＴＭＴ１０レポーターイオン（１つの模擬物（Ｂ）及び４つのコンジュゲート試料（１）～（４））のバーコードを有する、非システインペプチド配列の使用を示し、多重化実験における試料濃度を補正する。ｉ番目の試料に対する正規化係数は式２によって与えられ、各ＡＤＣ試料に対する補正された占有率は式３によって得ることができる。
【図20B】単一の取得において４つの試料について得られた正規化された占有率を示す。
【発明を実施するための形態】
【0034】
特に断らない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。そうでない場合、本明細書で使用される特定の用語は、本明細書に記載される意味を有するものである。本明細書に引用する全ての特許、公開された特許出願及び刊行物は、参照によってあたかもその全体が本明細書に記載されているものと同様にして組み込まれる。
【0035】
本明細書に含まれる文書、操作、材料、装置、物品などの考察は、本発明の背景を与えるためのものである。かかる考察は、これらの事物のいずれか又は全てが、開示又は特許請求されるいずれかの発明に対する先行技術の一部を構成することを容認するものではない。
【0036】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特に文脈上明らかでない限り、複数の指示対象物を含むことに留意する必要がある。
【0037】
特に断らない限り、本明細書に記載される濃度又は濃度範囲などのあらゆる数値は、全ての場合において、用語「約」によって修飾されているものとして理解されるべきである。したがって、数値は、典型的には、記載される値の±１０％を含む。例えば、約５０ｐｐｍ以下の量は、４５ｐｐｍ以下～５５ｐｐｍ以下を含む。本明細書で使用するとき、数値範囲の使用は、文脈上そうでない旨が明確に示されない限り、その範囲内の整数及び値の分数を含む、全ての可能な部分範囲、その範囲内の全ての個々の数値を明示的に含む。
【0038】
本明細書及び以下の特許請求の範囲を通して、文脈上必要としない限り、用語「含む（comprise）」並びに「含む（comprises）」及び「含む（comprising）」などの変形は、指定の整数若しくはステップ又は整数若しくはステップの群を含むが、任意の他の整数若しくはステップ又は整数若しくはステップの群を除外するものではないことを意味すると理解されるであろう。本明細書で使用するとき、用語「含む」は、用語「含有する」若しくは「含む（including）」に置き換えることができるか、又は、本明細書で使用するとき、用語「有する」に置き換えることができる場合がある。
【0039】
本明細書で使用するとき、「からなる（consisting of）」は、特許請求の範囲の要素において指定されていない任意の要素、工程、又は成分を除外する。本明細書で使用するとき、「から本質的になる（consisting essentially of）」は、特許請求の範囲の基本的かつ新規の特徴に実質的に影響を及ぼさない材料又は工程は除外しない。本出願の態様又は実施形態に関連して本明細書で使用するとき、本開示の範囲を変化させるために、上述の用語「含む（comprising）」、「含有する（containing）」、「含む（including）」、及び「有する」はいずれも、用語「からなる」又は「から本質的になる」に置き換えることができる。
【0040】
本明細書で使用するとき、複数の列挙された要素間の接続的な用語「及び／又は」は、個々の及び組み合わされた選択肢の両方を包含するものとして理解される。例えば、２つの要素が「及び／又は」によって接続される場合、第１の選択肢は、第２の要素なしに第１の要素が適用可能であることを指す。第２の選択肢は、第１の要素なしに第２の要素が適用可能であることを指す。第３の選択肢は、第１及び第２の要素が一緒に適用可能であることを指す。これらの選択肢のうちのいずれか１つは、意味に含まれ、したがって、本明細書で使用するとき、用語「及び／又は」の要件を満たすことが理解される。選択肢のうちの２つ以上の同時適用性もまた、意味に含まれ、したがって、用語「及び／又は」の要件を満たすことが理解される。
【0041】
本明細書で使用するとき、「ＭＳ／ＭＳ」又は「ＭＳ２」又は「ＭＳ２」はタンデム質量分析法を指す。タンデム質量分析法は、２つ又は３つ以上の質量分析器が、追加の反応ステップを使用して一緒に結合されて試料を分析する能力を高める機器分析における技術である。反応ステップが空間内で分離される（空間内のタンデム）、及び／又は反応ステップが時間的に分離される（時間的なタンデム）質量分析のタンデム使用を行うことができる。タンデム質量分析法の一般的な使用は、タンパク質、ペプチド、有機及び無機分子、脂質、代謝産物、及びオリゴヌクレオチドなどの生体分子の分析である。
【0042】
本明細書で使用するとき、「レポーターイオン」又は「診断イオン」は、ＥＴＤ質量スペクトルで観察されるＮ末端タグ又は標識を含む標識ペプチドの特徴的な生成物イオンを指す。通常、それは、質量スペクトルにおける最も優勢な生成物イオンであり、それは、標識されたペプチドを更に配列するためにその後のＭＳ／ＭＳイベントをトリガーするために使用される。
【0043】
本明細書で使用するとき、「トライブリッド技術」は、複数のタイプの質量分析器を有するハイブリッド質量分析計を使用する技術を指す。これにより、ＴＭＴ試料多重化に大きな柔軟性を有するタンデム質量分析法実験の性能が可能になる。トライブリッド技術を、複雑なマトリックス中の低存在量ペプチド、インタクトなタンパク質の位置及び翻訳後アイソフォームの決定、等圧性代謝産物の分解能、並びに化学的架橋を使用したタンパク質構造の特徴付けを含む、困難な試料の特性評価に使用することができる。
【0044】
本明細書で使用するとき、「ｏｒｂｉｔｒａｐ」又は「ＯＴ」は、２つの外部電極及び中央電極からなるイオントラップ質量分析器を指す。この設定により、ｏｒｂｉｔｒａｐは分析器及び検出器の両方として機能することができる。Ｏｒｂｉｔｒａｐに入るイオンは、中央電極を中心として、２つの外部電極の間に捕捉され、かつ振動する。異なるイオンは異なる周波数で振動し、その結果、それらの分離が生じる。外側電極上のイオンによって誘導される振動周波数が測定され、イオンの質量スペクトルは、画像電流検出を使用して取得される。
【0045】
本明細書で使用するとき、「等圧」は、同じ公称分子量又は式量を有することを指す。好ましくは、本出願の発明に有用な等圧ＴＭＴは、同じ質量及び構造を有し、それらはまた、同位体異性体と呼ばれる。
【0046】
本明細書で使用するとき、「イオン」は、１つ又は２つ以上の電子の損失又は利得により正味電荷を有する分子を指す。イオンの例は、衝突誘起解離（collision-induced dissociation、ＣＩＤ）によるタンパク質の骨格に沿った開裂アミド結合の結果である、ａ、ｂ、又はｙ型の生成物イオンであり得る。
【0047】
本明細書で使用するとき、「配列イオン」は、所与のペプチド結合で分割される特定のペプチドの生成物に対応する１つのイオン（又は複数のイオン）を指す。
【0048】
本明細書で使用するとき、「インモニウムイオン」は、－型又はｙ型開裂の組み合わせによって形成される単一の側鎖を有するペプチドの内部断片に対応する１つのイオン（又は複数のイオン）を指す。
【0049】
本明細書で使用するとき、「レポーターイオン」は、当該技術分野において既知の方法（例えば、ＭＳ２）によって、等圧タグ付きペプチドから開裂されるイオンを指す。
【0050】
本明細書で使用するとき、「同位体」は、少なくとも１つの原子が異なる数の中性子を有するという点で、その親分子とは異なる分子を指す。
【0051】
本明細書で使用するとき、「多極」は、真空システムを通してイオンを輸送するために金属ロッドから構成されるイオンガイドを指す。
【0052】
本明細書で使用するとき、「コンジュゲート」は、１つ又は２つ以上の異種分子に共有結合したタンパク質又はペプチドを指す。異種分子に共有結合することができるタンパク質又はペプチドの例としては、治療用ペプチド又はタンパク質、抗体又はその断片が挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質又はペプチドに共有結合することができる異種分子の例としては、１つ又は２つ以上の小分子化合物、標識などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0053】
本明細書で使用するとき、「ペプチド」は、通常、２０個の共通の天然に存在するアミノ酸のいくつかの組み合わせからなるが、また、非天然アミノ酸モノマー残基を含有するか、又は完全に構成され得るアミノ酸系ポリマーを指す。それは、直鎖アミノ酸ポリマー構成を含み得、又は環状ペプチド、若しくは分岐１つの、又は３つ全ての構成の任意の組み合わせを含み得る。ペプチドはまた、天然に存在する修飾（例えば、リン酸化若しくはグリコシル化）又は天然に存在しない修飾（例えば、カルバミドメチル化）の任意の組み合わせを有し得る。
【0054】
「抗体」は、（ａ）２つの重鎖及び２つの軽鎖を含み、抗原を認識する免疫グロブリン分子と、（ｂ）ポリクローナル又はモノクローナル免疫グロブリン分子と、（ｃ）その一価又は二価の断片と、を含むものとする。免疫グロブリン分子は、ＩｇＡ、分泌ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ及びＩｇＭを含むがこれらに限定されない、一般的に既知のクラスのいずれかに由来し得る。ＩｇＧサブクラスは、当業者に周知であり、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含むが、これらに限定されない。抗体は、天然に存在する、及び非天然に存在する両方であり得る。更に、抗体は、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、完全合成抗体、単鎖抗体、及びそれらの断片などの多重特異性抗体を含む。抗体は、ヒト又は非ヒトであり得る。抗体断片には、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、及び他の抗原結合断片が含まれるが、これらに限定されない。
【0055】
本明細書で使用するとき、「タンデム質量タグ」又は「ＴＭＴ」は、分子の質量分析法（mass spectrometry、ＭＳ）ベースの定量化及び同定に使用することができる化学標識を指す。遊離チオール又は一級アミン又はグリカンを有する任意の分子をタグ付けすることができる。例えば、分子は、タンパク質又はペプチドであり得る。ＴＭＴタグは、典型的には、少なくとも３つの領域、例えば、質量レポーター領域、質量正規化又はバランス領域、及び反応性基を含有する。レポーター質量をインクリメントして、固有の質量を作成する一方で、試薬の総質量をオフセットするようにバランス質量を使用して、別個のレポーター質量をまだ有する同じ全体的な質量を有する一連の試薬を作製することができる。反応性基は、アミン、チオール、オキソニウム、又は他の官能基の付加反応を促進する。それは、例えば、遊離チオール又は還元システイン反応性、一級アミン若しくはリジン反応性、又はアミノキシ反応性であり得る。任意選択的に、ＴＭＴはまた、１つ又は２つ以上の開裂可能なリンカー領域を含有することができる。
【0056】
ＴＭＴの等圧セットは、タンデム質量分析法を使用して、異なる試料中のタンパク質の同時同定及び多重定量化を可能にする。ｎ個のＴＭＴの等圧セットは、ｎ－１個の同位体置換を有する１つのＴＭＴ及び複数のＴＭＴを含有し得る。ＴＭＴの等圧セット内の全てのタグの化学構造は、同一であるが、各々が、
質量レポーター及び質量正規化領域が各タグにおいて異なる分子量を有するように、様々な位置で置換された同位体を含有する一方、ＴＭＴは、クロマトグラフィー又は電気泳動分離中に、及び単一のＭＳモードでは、異なるタグで標識された分子が区別不能であるように、同じ総分子量（等方性）及び構造を有する。例えば、各等圧試薬は、質量レポーター領域において異なる数の重同位体を含有することができ、これにより、試料同定及び相対定量化のためにタンデムＭＳ／ＭＳ中に固有のレポーター質量がもたらされる。ＭＳ／ＭＳモードでの断片化時に、配列情報は、ペプチド骨格の断片化から得られ、定量化データは、タグの断片化から同時に得られ、質量レポーターイオンを生じさせる。等圧セット内の各ＴＭＴは、ＭＳ／ＭＳスペクトルに固有のレポーター質量を生成する。
質量レポーター及び質量正規化領域が各タグにおいて異なる分子量を有するように、様々な位置で置換された同位体を含有する一方、ＴＭＴは、クロマトグラフィー又は電気泳動分離中に、及び単一のＭＳモードでは、異なるタグで標識された分子が区別不能であるように、同じ総分子量（等方性）及び構造を有する。例えば、各等圧試薬は、質量レポーター領域において異なる数の重同位体を含有することができ、これにより、試料同定及び相対定量化のためにタンデムＭＳ／ＭＳ中に固有のレポーター質量がもたらされる。ＭＳ／ＭＳモードでの断片化時に、配列情報は、ペプチド骨格の断片化から得られ、定量化データは、タグの断片化から同時に得られ、質量レポーターイオンを生じさせる。等圧セット内の各ＴＭＴは、ＭＳ／ＭＳスペクトルに固有のレポーター質量を生成する。
【0057】
ＴＭＴ標識、例えば、市販のＴＭＴ標識は、試料を多重化することができ（例えば、６－ｐｌｅｘ、１０－ｐｌｅｘ、又はそれ以上）、それぞれシステイン又はアミンに対して反応性である。重同位体の位置をレポーター基とスペーサーとの間でシフトすることにより、各タグの総質量及び化学構造を同じ（等圧）に保持することができる。例えば、システイン反応性ＩｏｄｏＴＭＴｓｉｘｐｌｅｘ試薬及びアミン反応性ＴＭＴｓｉｘｐｌｅｘ試薬は各々、６つの同一のレポーターイオン質量を有する。しかしながら、各レポーターイオンは、質量電荷比（ｍ／ｚ）が固有であり、又はレポーター質量は、レポーターイオン質量とも呼ばれる。例えば、等圧性ＴＭＴ６セット内の６つのＴＭＴのノミナルレポーター質量の範囲は、１２６～１３１Ｄａ（ダルトン）である。
【0058】
「ＣｙｓＴＭＴ」、「ＩｏｄｏＴＭＴ」、「ＩｏｄｏＴＭＴ６」又は「ＩｏｄｏＴＭＴ６」とも呼ばれる「ＩｏｄｏＴＭＴｓｉｘｐｌｅｘ」の等圧標識試薬セットは、スルフヒドリル（－ＳＨ）基の共有結合性の不可逆的な標識化についてヨードアセチル活性化される６つのＴＭＴの等圧セットを指し、図１Ａに示される化学構造を有する。ＴＭＴは、スペーサーアームによって反応性基に接続された１３Ｃ及び／又は１５Ｎ同位体（図１Ａ～図１Ｄに＊として示される）を含有するシグネチャレポーター基を含有する。ＩｏｄｏＴＭＴｓｉｘｐｌｅｘ等圧標識試薬セットは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（カタログ番号９０１０１）から市販されている。ＩｏｄｏＴＭＴ試薬は、ペプチド及びタンパク質中の還元システイン（Ｃｙｓ）と特異的に反応する。ＩｏｄｏＴＭＴ試薬は、質量分析法（ＭＳ）によって分化され、異なる条件で成長又は処理された培養細胞におけるＳ－ニトロシル化、酸化及びジスルフィド結合などのシステイン修飾の相対存在量の定量化を可能にする。
【0059】
本明細書で「ＴＭＴ６」、「ＴＭＴ６」、「ＴＭＴ６ｐｌｅｘ」とも呼ばれる「ＴＭＴｓｉｘｐｌｅｘ」の等圧標識試薬セットは、一級アミン（－ＮＨ２）基の共有結合性の不可逆的な標識化についてＮＨＳ活性化される６つのＴＭＴの等圧セットを指し、図１Ｂに示される化学構造を有する。ＴＭＴｓｉｘｐｌｅｘ等圧標識試薬セットは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（カタログ番号９００６１）から市販されている。この試薬は、単一のＭＳ分析で最大６つの試料の分析のために、細胞又は組織試料から調製された全てのペプチドを標識する。ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃによれば、ＴＭＴ６試薬は、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ（商標）１．０以上で完全にサポートされたデータ分析を用いるＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｅｌｉｔｅ（商標）及びＯｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ（商標） Ｔｒｉｂｒｉｄ（商標） Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｌｕｍｏｓ（商標）機器などの高分解能Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＭＳ／ＭＳプラットフォームでの使用のために最適化されている。
【0060】
本明細書で「ＴＭＴ１０」、「ＴＭＴ１０」、又は「ＴＭＴ１０ ｐｌｅｘ」とも呼ばれる「ＴＭＴ１０ｐｌｅｘ」の等圧標識試薬セットは、各々がアミン反応性ＮＨＳ－エステル基、スペーサーアーム及び質量レポーターを有する１０個のＴＭＴの等圧セットを指し、図１Ｃに示される化学構造を有する。アミン反応性ＴＭＴ１０ｐｌｅｘは、最大１０個の別個の試料を多重化することができる（１０－ｐｌｅｘ）。ＴＭＴ１０ｐｌｅｘ等圧標識試薬セットは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（カタログ番号９０１１０）から市販されている。１０－ｐｌｅｘ試薬は尚も６つの公称質量（１２６～１３１Ｄａ）を有することに留意することが重要であるが、６つのレポーター質量（１２７～１３０Ｄａ）のうちの４つは各々、６．３２ｍＤａ（ミリダルトン）だけ異なる２つの固有のレポーターイオン質量を有し、Ｃ１２、Ｎ１５原子対はＣ１３、Ｎ１４で置換されている。高分解能質量分析法は、これらのレポーターイオン質量及びそれらの同位体のベースライン分解能の正確な相対的定量化を可能にする。この試薬セットは、細胞又は組織から調製された最大１０個の異なるペプチド試料を並行して標識し、次いで分析のために組み合わせることを可能にする。各試料について、高分解能ＭＳ／ＭＳスペクトルの低質量領域における固有のレポーター質量（すなわち、ＴＭＴ１０ １２６－１３１Ｄａ）を使用して、ペプチド断片化及びタンデム質量分析法中の相対タンパク質発現レベルを測定することができる。ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃによれば、ＴＭＴ１０試薬は、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ（商標）１．４によって完全にサポートされたデータ分析を用いるＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｅｌｉｔｅ（商標）及びＯｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ（商標） Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｅｌｉｔｅ（商標） Ｔｒｉｂｒｉｄ（商標）機器などの高分解能Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＭＳ／ＭＳプラットフォームで使用するために最適化されている。
【0061】
本明細書で「ＴＭＴ１６」、「ＴＭＴ１６」、「ＴＭＴｐｒｏ」又は「ＴＭＴｐｒｏ１６ ｐｌｅｘ」とも呼ばれる「ＴＭＴｐｒｏ １６ｐｌｅｘ」の等圧標識試薬セットは、図１Ｄに示される化学構造を有する１６個のアミン反応性ＮＨＳエステル活性化試薬の等圧セットを指す。１６個のＴＭＴは各々、Ｎ末端でリジン又は一級アミンと反応する基を有する。ＴＭＴｐｒｏ １６ ｐｌｅｘは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（カタログ番号Ａ４４５２０）から市販されている。ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃによれば、ＴＭＴｐｒｏ標識試薬は、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ ２．３によって完全にサポートされたデータ分析を用いるＯｒｂｉｔｒａｐ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｒｉｂｒｉｄ及びＯｒｂｉｔｒａｐ Ｅｘｐｌｏｒｉｓ ４８０質量分析計を含むＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ及びＯｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｔｒｉｒｉｄ機器シリーズなどの高分解能Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＭＳ／ＭＳプラットフォームでの使用に最適化された次世代のタンデム質量タグである。
【0062】
６つのレポーター（ＴＭＴ－６ ｐｌｅｘ）のセット、１０個のレポーター（ＴＭＴ－１０ ｐｌｅｘ）のセット、１１個のレポーター（ＴＭＴ－１１ ｐｌｅｘ）のセット、及びそのようなＴＭＴの最大１６個のレポーター（ＴＭＴ－１６ ｐｌｅｘ）を、本発明の方法で使用することができる。本開示を考慮して、ＴＭＴの他の例も本発明において使用することができる。特に、ｎ＞１６であるＴＭＴ１６－ｐｌｅｘ及び将来のｎ－ｐｌｅｘ試薬は、二重ＴＭＴ標識化で標識され得る試料の数を増加させる。ＴＭＴは、当該技術分野で既知の方法を使用して、又はＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃなどの商業的供給源から入手され得る。しかしながら、２つのＴＭＴがタンデムで使用される場合、それらは同じレポーターイオン質量を有することができない。例えば、ＩｏｄｏＴＭＴ及びＴＭＴ６は同じ一連のレポーター質量を有するため、ＩｏｄｏＴＭＴ及びＴＭＴ６の等圧セットが二重標識化に使用される場合、選択されたＩｏｄｏＴＭＴ及びＴＭＴは、デュアル標識化に使用される場合、同じレポーター質量を有しない必要がある。同様に、試料及び模擬の分析に一緒に、又は複数の試料の分析に一緒に使用されるＴＭＴなどの、３つ以上のＴＭＴが同じ分析で使用される場合、分析で使用されるＴＭＴの各々は、固有のレポーター質量を有する必要があり、同じアッセイで使用されるＴＭＴのいずれも同じレポーター質量を有することはできない。
【0063】
ＡＤＣ効率、安全性、及び選択性の重要なメトリックは、薬物抗体比（drug-antibody ratio、ＤＡＲ）によって決定される。クロマトグラフィーアプローチ、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（size exclusion chromatography、ＳＥＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（hydrophobic interaction chromatography、ＨＩＣ）、及び逆相液体クロマトグラフィー（reversed phase liquid chromatography、ＲＰＬＣ）を使用して、ＤＡＲ値を得、ＡＤＣを特徴付けることができる。しかしながら、これらのアプローチは、例えば、それらが通常、長い分離及びカラム再生時間のために低いスループットを示す、重大な欠点を有する。更に、特定の必要な移動相は、質量分析（ＭＳ）へのオンライン結合を防止する。天然ＭＳベースのアプローチは、非共有結合相互作用を保持し、結果として、可能な薬物コンジュゲート種のアレイに関する情報を得ることができる。
【0064】
別のアプローチは、質量分析法（ＩＭＳ－ＭＳ）と結合されたイオン移動度分光法である。ＩＭＳ－ＭＳにより、単一のアッセイにおいて構造情報及び質量情報の両方が得られる。ＩＭＳ－ＭＳとＭＳとの間のＤＡＲ特性評価における一致が実証されている。したがって、ＩＭＳ－ＭＳを使用して、ＡＤＣの薬物負荷分布を研究し、ｍＡｂを特徴付けることができる。
【0065】
しかしながら、薬物コンジュゲートの定量化及び同定のための従来の方法は、任意の低感度、不十分な選択性、及び／又は相対的に長い分析時間若しくは高コストの欠点を有する。例えば、天然ＭＳ、クロマトグラフィー、及びＩＭＳ－ＭＳアプローチは、ｍＡｂの部位特異的薬物共役、並びに抗体に結合した薬物の占有率及び位置がＡＤＣの選択性又は有効性を変化させるかどうかに関する情報はほとんどを提供しない。ペプチドの完全な薬物分子による同定は、小分子及びリンカーのサイズのために困難である。
【0066】
共役ペプチド強度を未修飾ペプチド対応物及び共役ペプチドの合計強度で正規化することによって、共役ペプチドを定量化するための比を得ることができる。このアドホックな比率は、関心部位に対する試料にわたる共役レベルの相対推定を容易にする。化学量論ベースのアプローチはまた、修飾の占有率が、修飾を化学的に除去することによって、又は安定した同位体標識合成ペプチド及び安定した同位体標識細胞株を使用することによって、間接的に決定される（例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ８，６７７－６８３（２０１１）、Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ １６，４２１７－４２２６（２０１７）を参照されたい）。一級アミンに特異的な等方性標識化は、等圧標識化に基づく化学量論ベースのアプローチの有用性を示すために、モデルＮＩＳＴ ｍＡｂの占有率を研究するために利用されている（Ｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ ８，１７６８０（２０１８））。それにもかかわらず、化学量論ベースの定量化方法は、例えば、複雑で困難な試料調製、薬物コンジュゲーションに基づいて組成的な違いを得るために必要な精巧な分析スキームなどのために、定量化又はＡＤＣ分析のための医薬パイプラインに統合されていない（Ｊａｎｉｎ－Ｂｕｓｓａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｂ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｎｄ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓ ９８１－９８２，９－１３（２０１５）、Ｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ８４，７４７９－７４８６ （２０１２））。
【0067】
ＴＭＴの等圧セットを使用して、ＡＤＣなどの薬物ポリペプチドコンジュゲートのセットを標識及び研究することができる。これらのレポーターイオン質量のベースライン分解能及びそれらの同位体置換体が、高分解能質量分析法を使用して、正確な相対定量化のために可能である。本出願の一態様では、ＴＭＴは、試料の質量分析バーコードの特徴付けのための、試料、特に薬物コンジュゲートのタンデム質量分析法（ＭＳ２）の分析において使用される。
【0068】
質量スペクトルは、質量分析計を使用して取得されたヒストグラムである。分析の質量スペクトルは、通常、強度（Ｙ）対ｍ／ｚ（質量電荷）比（Ｘ）プロットとしてプロットされる。ＴＭＴに対するレポーターイオンは、質量スペクトルに対するそのｍ／ｚ比によって検出され得る。Ｙ軸は、イオンの信号強度を表す。
【0069】
機器及びソフトウェアに応じて、信号強度が測定され、かつ異なるよう表され得る。例えば、カウント検出器を使用する場合、強度は、多くの場合、秒当たりのカウント（counts per second、ｃｐｓ）で測定される。アナログ検出電子機器を使用する場合、強度は、典型的には、ボルトで測定される。フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析法及びＯｒｂｉｔｒａｐにおいて、周波数ドメイン信号（ｙ軸）は、信号正弦波の累乗（約二乗振幅）に関連する（多くの場合、累乗ｒｍｓに低減される）。いくつかのソフトウェアは、強度ではなく、レポーター面積を計算する。本明細書で使用するとき、質量スペクトルに関して、用語「強度」は、任意の方法によって測定され、任意の形式で表現されるイオンの信号強度を包含する。例えば、レポーティングイオンの「強度」は、レポーターイオンの強度、レポーター面積、又は質量分析法の分析からのイオンの信号強度の任意の他の変形を含み得る。
【0070】
本明細書で使用するとき、試料の「質量分析バーコード」、「ＭＳバーコード」、「レポーターイオン質量バーコード」、「バーコード」又は「質量バーコード」は、レポーターイオンのセットの情報を含有し、測定値が試料に固有である、タンデム質量分析法（ＭＳ２）の分析からの試料の測定値を指す。試料についての固有のバーコードは、タンデムＭＳ２から検出されたＴＭＴレポーターイオンのセットの強度及び／又は存在（パターン）若しくは不在に基づき得る。１つ又は２つ以上のバーコードが、試料の三重プレイ分析に使用され得る。
【0071】
図２は、消化前のタンパク質上又は各試料の消化後にシステインを有するサロゲートペプチド上で標識化が行われ得る６つの異なる細胞溶解物を多重化するためのＩｏｄｏＴＭＴｓｉｘｐｌｅｘ及びＴＭＴ６を示す。６つの試料の各々は、ＩｏｄｏＴＭＴセット内のＴＭＴで標識し、ＬＣ－ＭＳ２分析と一緒に組み合わせて対象になって、６つの試料の各々について別個のバーコードを得ることができる。バーコードは、タンデム質量スペクトル上のＴＭＴによって生成されたレポーターイオンのｍ／ｚの強度及びパターンによって規定される。特に、標識化は、質量によって区別不能である各細胞株について同じペプチドの等圧質量を生成する。しかしながら、衝突（ＨＣＤ）か、又は電子ベースの解離（ＥＴＤ）のいずれかによる解離後、固有のレポーターイオンが生成される。ＨＣＤは、レポーター全体が解離する一方、ＥＴＤが第２の一連の固有のレポーターイオン質量を生成する一連の荷電断片を生成することに留意することが重要である。同様に、ＴＭＴ標識化はまた、あらゆるペプチドがＮ末端を有し、かつＴＭＴ試薬が、Ｎ末端アミン及び／又はリジンを標識し、それによって、全てのペプチドに付着することができるため、任意のペプチドの異なる試料のレポーターの６、１０、１１、及び１６セットを比較するために、プロテオミクスに使用することができる。
【0072】
したがって、本出願は、薬物コンジュゲートの正確で高感度かつ効率的な同定及び定量化のための改善された方法を提供する。本発明の一態様では、ＡＤＣなどの薬物ポリペプチドコンジュゲートは、Ｃｙｓ反応性ＩｏｄｏＴＭＴなどの第１のＴＭＴと、Ｎ末端のＬｙｓ又は一級アミンと反応するＴＭＴなどの第２のＴＭＴとで逐次標識され、標識された薬物コンジュゲートは、タンデム質量分析法の分析の対象となる。逐次標識化スキームは、薬物コンジュゲートを調べるのに役立つ。本出願の実施形態に従って、２つの平行な試料調製アームを使用して、薬物コンジュゲート（コンジュゲート試料）及び非共役模擬（参照又は対照試料）を標識することができる。両方の標識は、試料及び模擬又は参照を区別する固有のレポーターイオンシグネチャのコード化を容易にする。参照試料は参照レポーターイオンチャネルを生成し、コンジュゲート試料は試料レポーターイオンチャネルを生成する。固有のレポーターイオンは、解離後に、ＨＣＤ又はＥＴＤなどの電子ベースの解離のいずれかを介して生成される。ＴＭＴに関連する特異性を実施するレポーターイオン領域のチャネルの数、それらの比及び／又は他の質量分析を使用して、薬物コンジュゲートを特徴付けるための固有のバーコードを作成することができる。例えば、バーコードは、別個のセットのレポーターイオン及び／又は質量バーコードを含み得る。
【0073】
図３Ａに示すように、本出願の方法を使用して、例えば、コンジュゲート中のＣｙｓ含有ペプチドのより低いｍ／ｚ領域レポーターイオン強度の質量スペクトルを、薬物に共役していないポリペプチドを含有する模擬対象の質量スペクトルと比較することによって、コンジュゲート中の薬物の占有率を定量化することができる。この方法を使用して、模擬対照及びコンジュゲートを正規化することもできる。
【0074】
本出願の別の態様は、例えば、追加の解離ステップをトリガーするように１つ又は２つのＴＭＴレポーターイオンを使用して、薬物に共有結合したペプチドを更に特徴付けることによって、ポリペプチドにおける共役部位を局在化する方法に関する。本出願の一実施形態では、１つ又は２つのＴＭＴレポーターイオンは、ＨＣＤ分析などの第１のタンデム質量分析法の分析を使用して生成される。次いで、ペプチドのＥＴＤスキャンをトリガーするようにレポーターイオンを使用して、ＥＴＤスペクトルを得る。ＥＴＤスペクトルは、ＥＴＤが薬物コンジュゲートでの残基の局在化を支援する配列イオンを提供するように、コンジュゲートを特徴付けるためのＨＣＤスペクトルを補完する。あるいは、次いで、ＥＣＤスキャンをトリガーするようにレポーターイオンを使用して、ペプチドの更なる分析のためにＥＴＤスペクトルを得る。
【0075】
図３Ａ～図３Ｃは、ｍＡｂ及びそれらの薬物コンジュゲートを標識するためにＩｏｄｏＴＭＴ６及びＴＭＴ６を使用する二重ＴＭＴワークフローを示す。特に、ＩｏｄｏＴＭＴ６は、６つの異なる試料（例えば、細胞溶解物）を多重化するために使用される。この場合、標識化は、消化前のタンパク質において、又は各試料の消化後のシステインを有するサロゲートペプチドにおいて実施され得る。ｉｏｄｏＴＭＴ６及びＴＭＴ６試薬の両方は、同じ公称質量を有するレポーターを有する。等圧標識ペプチドは、質量が非重複である試薬の選択のために生成される。先ず、逐次標識がｍＡｂのｉｏｄｏＴＭＴ６で実施され、続いて、トリプシン処理及びＴＭＴ６標識を有するトリプシン消化によって得られたペプチドの標識化が実施される。コンジュゲート試料及び模擬由来のペプチドを、等モル比で混合し、ＬＣ－ＭＳの対象とする。本明細書に記載の逐次標識化スキームは、ペプチドを調べるための新規の方法論であり、これは、本出願の実施形態による質量分析バーコードの作成を容易にする。
【0076】
特定の実施形態では、例示されるワークフローは、薬物コンジュゲート及び非共役模擬のための２つの並行試料調製アームを有する。例えば、ＩｏｄｏＴＭＴ６及びＴＭＴ６標識の両方が、試料及び模擬又は参照を区別する、例えば、参照試料が参照レポーターイオンチャネルを生成し、コンジュゲート試料が試料レポーターイオンチャネルを生成する、固有のレポーターイオンシグネチャのコード化を容易にする。また、レポーターイオン領域におけるチャネルの数及びそれらの比は、得ることができる占有率及び実験測定値のタイプをコードし、各実験測定値は、レポーターイオン又は質量バーコードの異なるセットを有する。
【0077】
したがって、本出願の態様は、第１のＴＭＴ及び第２のＴＭＴのうちの少なくとも１つで標識されたペプチドと、任意選択で１つ又は２つ以上の非標識ペプチドとの混合物を含む、組成物であって、第１のＴＭＴ及び第２のＴＭＴが同じレポーターイオン質量を有さず、ペプチドの混合物が、薬物に共役しており、かつ第１のＴＭＴ及び第２のＴＭＴのうちの少なくとも１つで標識された少なくとも１つのペプチドを含む、組成物に関する。例えば、本出願の組成物は、第１のＴＭＴ及び第２のＴＭＴのうちの少なくとも１つで標識されたコンジュゲート試料に由来するペプチドと、任意選択で１つ又は２つ以上の非標識ペプチドとの混合物を含み得る。組成物はまた、本明細書に記載のコンジュゲート試料に由来するペプチドの混合物と、第３のＴＭＴ及び第４のＴＭＴのうちの少なくとも１つで標識された模擬に由来するペプチドと、任意選択で１つ又は２つ以上の非標識ペプチドとの混合物を含み得る。
【0078】
図３Ａは、消化前に、ｉｏｄｏＴＭＴ標識が、非共役である画分上のｍＡｂの遊離チオールで行われる、サロゲートトリプシンペプチドに見られる単一のシステインでの薬物共役を示す。試料調製及びＬＣ－ＭＳは、共役部位の数に関係なく同じままであり得る。データ依存性ＭＳ２又はデータ依存性ＳＰＳ－ＭＳ３（同期前駆体選択及び三重ステージ質量分析法）並びにＴＭＴレポーターイオントリガーＥＴＤ－ＭＳは、質量分析バーコードを生成するために使用される機器ソフトウェアの完全な制御下でシームレスな方法で行われ得る。この新規の自動化３ステップ方法は、本明細書では「三重プレイ」と称され、特定のレポーターイオンの組み合わせが、薬物ポリペプチドコンジュゲートを定量化し、正規化し、かつ検出するために使用される。本出願のいくつかの実施形態では、三重プレイは、二重ＴＭＴレポーターを用いて実施されて、薬物占有率を定量化し、複数の試料中の薬物コンジュゲートを正規化し、コンジュゲート部位を（例えば、追加のＭＳ２をトリガーすることによって）検出又は局在化する。好ましくは、薬物ポリペプチドコンジュゲートは、ＡＤＣである。
【0079】
図３Ａ～図３Ｂを参照すると、図に示されるワークフローに続いて、ｉｏｄｏＴＭＴ標識化セットで標識された単一のシステイン共役部位を担持する全てのペプチドは、４つのレポーターイオン（すなわち、ＩｏｄｏＴＭＴ－１２６及びＩｏｄｏＴＭＴ－１２７及びＴＭＴ－１２９及びＴＭＴ－１３０）を生成し、一方、全ての非システイン標識ペプチドは、２つのレポーターイオンＴＭＴ－１２９及びＴＭＴ－１３０を生成し、これを使用して、試料混合及び正規化の違いを補正することができる。薬物共役ペプチドに一意に見られる単一レポーターＴＭＴ－１３０を使用して、部位局在化のための追加のＥＴＤ－ＭＳ２スキャンをトリガーすることができる（例えば、図３Ｂを参照されたい）。ＴＭＴ－１３０レポーターイオンは、ペプチドに共役され、かつ薬物の断片に依存しない薬物に依存しない。結果として、トリガーされたＭＳ２は、任意の種類の薬物コンジュゲートのために、又は薬物を容易に同定及び局在化するために固有のレポーターイオンを有する薬物のライブラリをスクリーニングするために使用され得る。
【0080】
単一のシステインを有するペプチドとは異なり、複数のシステイン残基を有するペプチドは、システイン残基のうちの１つ又は２つ以上に共有結合した薬物を有し得る。例えば、ＩｇＧ１及びＩｇＧ４ ｍＡｂの２つのヒンジシステインは、任意の単一のシステインの二重占有及び単一の占有の可能性を有する。ＩｇＧ２上の４つのヒンジシステイン（ＩｇＧ２－Ａ、ＩｇＧ２－Ｂ及びＩｇＧ２－Ａ／Ｂアイソフォームを有する）は、更に可能性のある組み合わせ共役の可能性を増加させる（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ ４，１７－２３ （２０１２））。
【0081】
本出願の実施形態による方法は、ポリペプチドに共役した１つ又は２つ以上の薬物（抗体など）との薬物コンジュゲートを研究するために使用され得る。１つ又は２つ以上の薬物は、単一の消化されたペプチド内にあり得る。薬物分子は、同じ種類又は異なる種類のものであり得る。図３Ｂ～図３Ｄは、１つ、２つ、又は３つの薬物を単一の消化されたペプチドに含有する薬物コンジュゲートの研究を例示し、Ｄ１、Ｄ２、及びＤ３は、同一又は一意であり得る。定量化及び正規化のためのバーコードの数は、利用可能なコンジュゲート部位の数、及びそれらが完全に又は部分的に共役されているかどうかに関係なく、変化しない。そのような例における占有率は、全ての位置アイソフォームの総薬物占有率であり、正規化のためのバーコードの数は、２つのレポーターのままである。更に、単一ペプチド内の共役部位の数がペプチドあたり２より大きい場合、部分的な共役は、２つのレポーター、例えば、ＴＭＴ－１２７及びＴＭＴ－１３０イオンを生成し、完全な共役は、共役薬物を適切なアミノ酸残基に局在化させるために占有研究のためのＥＴＤ－ＭＳ２スキャンをトリガーするために、単一のレポーター、例えば、ＴＭＴ－１３０イオンを作成する。本明細書で使用するとき、薬物への「完全な共役」を有する又は薬物に「完全に共役した」ペプチドは、薬物に共役することができる全てのアミノ酸残基において薬物に共有結合するペプチドを指す。本明細書で使用するとき、「完全な共役」を有する又は「薬物に完全に共役していない」ペプチドは、薬物に共役することができる全てのアミノ酸残基ではなく、一部のみでの薬物に共有結合するペプチドを指す。薬物に完全に結合したペプチドは、それに共役した１つ、２つ、３つ、又はそれ以上の薬物を有し得る。
【0082】
試料調製ワークフローは、このような共役反応を分析するために同じままであるが、ＴＭＴトリガーのための質量分析パラメータには、完全な多重の共役又は部分的に多重の共役の局在化のためのトリガー設定に含まれる２つのレポーターのうちの１つか又は２つのレポーターのうちの２つのいずれかが必要である。同様の方法／スキームを使用して、本開示を考慮して、本出願の方法を使用して４つ以上の薬物を含有する薬物コンジュゲートを研究することができる。
【0083】
図４は、本発明の方法によって分析されるいくつかの例示的な実験ＡＤＣシステムを示す。例えば、ＮＩＳＴ ｍＡｂ－ビオチンＰＥＯアセトアミドＡＤＣは、ｍＡｂに共役したビオチンＰＥＯアセトアミド及び共役薬物を含まない抗体のみを含有するその模擬対照を有する。抗体又はその断片に加えて、他のポリペプチドとの薬物コンジュゲートも、本出願の方法によって特徴付けられ得る。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）ペプチドを一例として使用する。２つのシステインを有する１つのペプチドのみを有するＮＩＳＴとは異なり、ＨＳＡペプチドは、同じペプチド上に複数のシステインを有する。それを使用して、蛍光アッセイ及びＩｏｄｏＴＭＴ標識化などの、本出願の実施形態による方法で試験した。
【0084】
図４に示される代表的な構造において、２つのビオチンＰＥＯアセトアミドは、ＮＩＳＴ ｍＡｂ、軽鎖中の１つ、及びＮＩＳＴ ｍＡｂの重鎖中の１つに共役される。しかしながら、ＮＩＳＴ ｍＡｂ－ビオチンＰＥＯアセトアミドＡＤＣは、ビオチンＰＥＯアセトアミドが存在し、異なるレベル又は占有率を有するＮＩＳＴ抗体内の異なるシステイン残基に結合している占有率の異なる組み合わせを有するいくつかの異なるアイソフォームを有し得る。同様に、図４に示されるＭＳＱＣ８の代表的な構造は、ｍＡｂに共役した１つのダンシルフルオロフォアのみを有するが（ＭＳＱＣ４）、１つ又は２つ以上の他の部位でｍＡｂに共役したダンシルフルオロフォアと異なるアイソフォームを有することができる。
【0085】
図４に示されるＡＤＣのいずれかを含むがこれに限定されない任意のＡＤＣ、及びその模擬対照は、Ｃｙｓ反応性ＩｏｄｏＴＭＴのＴＭＴなどの二重ＴＭＴ、及びＮ末端のＬｙｓ又は一級アミンに反応するＴＭＴを有する本出願の実施形態によるタンデム質量分析法の分析に供され得る。この分析から得られた質量スペクトルの例、並びに分析からの結果は、例えば、図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６Ａ、図６Ｂ、図７、図９Ａ～図９Ｄなどに示されている。
【0086】
別の実施形態では、３つの異なる種類のレポーターバーコードを使用して、各システイン残基における薬物占有率を計算する。図５Ａは、ＮＩＳＴ ｍＡｂ軽鎖の二重ＴＭＴ標識等圧ペプチドのＨＣＤ－ＭＳ２スペクトルを示す。ペプチドは、ｉｏｄｏＴＭＴ（ｉｏ）で標識された非占有システイン残基及びＴＭＴ（ｔｍ）で標識されたＮ末端及び末端リジン残基を有する。ＨＣＤスペクトル（左側面パネル）は、対応するＴＭＴ標識で標識部位を局在化する一連の特徴ｂ及びｙ型骨格生成物イオンからなる。より低い質量範囲は、４つのレポーターイオンを示し、これは、各二重ＴＭＴチャネルのレポーターイオン質量、すなわち、模擬チャネルを表すｉｏｄｏＴＭＴ－１２９及びＴＭＴ－１２８対、並びにコンジュゲート試料チャネルを表すｉｏｄｏＴＭＴ－１２６及びＴＭＴ－１３０対を含む、拡大された右側パネルにより明確に示されている。占有率は、模擬（Ａ２）及びコンジュゲート（Ａ１）のＩｏｄｏＴＭＴ強度か、又は模擬（Ｂ２）及びコンジュゲート（Ｂ１）のＴＭＴ強度を使用することのいずれかによって導出され得る。ＨＣＤスペクトルは、配列イオン及びスペクトル比の両方を提供して、約５０％の占有率で、軽鎖Ｃｙｓ－１９３での部位共役をビオチンＰＥＯアセトアミドで同定する。同様に、コンジュゲート生成のための所与の反応条件について、占有率が得られ得る。例えば、図５Ｂは、２つの追加の部位のレポーターイオン領域：約６５％のビオチンＰＥＯアセトアミド占有率を有する軽鎖Ｃｙｓ－６３及び約１００％のビオチンＰＥＯアセトアミド占有率を有する重鎖Ｃｙｓ－１４７を示し、図５Ｃ及び図５Ｄは、ＨＣＤ－ＭＳ２によって配列決定されたペプチドの対応するＭＳ２スペクトル（全ての骨格生成物イオンを有する）を示す。
【0087】
二重ＴＭＴワークフローは、コンジュゲート試料と模擬試料との間の正規化係数を使用して、占有率推定値の偏差を補正する。例えば、図６Ａ及び図６Ｂは、ＮＩＳＴ ｍＡｂ重鎖の二重ＴＭＴ標識等圧ペプチドのＨＣＤ－ＭＳ２スペクトルを示す。ペプチドのＮ末端及びＣ末端リジンは、ＴＭＴで標識される。ＨＣＤスペクトル（図６Ａ）は、ＴＭＴ標識部位を局在化する一連の特徴的なｂ及びｙ型骨格生成物イオンからなる。より低い質量範囲は、２つのレポーターイオンを示し、レポーターイオンＴＭＴ－１２８、ＴＭＴ－１３０対（図６Ｂ）は、それぞれ、模擬及びコンジュゲート試料チャネルを表す。システイン残基を欠くペプチドは、レポーターイオンの強度が模擬及びコンジュゲート試料の濃度を表す２つのレポーターイオンのそのような特徴的な質量バーコードを示す。典型的には、完全に標識されているそのような非システインペプチドについて、１の比が観察される。
【0088】
別の実施形態では、対応する薬物断片の配列イオン及びインモニウムイオンは、共役ペプチドの占有部位を決定するのに役立つ（例えば、図７を参照されたい）。複数の潜在的な共役部位が同じペプチド上に存在する場合、従来の方法を使用して部位局在を決定することは困難である。部位に特異的な配列イオンは、存在しないことが多く、ペプチドの局在は、ペプチド配列の質量電荷比が区別できないときを決定することが困難である。結果として、共役部位の正確な局在を決定することは、当該技術分野で知られている追加の相補的解離方法によって得られる部位特異的配列イオンを必要とすることが多い。例えば、ＥＴＤ－ＭＳ２は、ＨＣＤ－ＭＳ２に相補的である。部位を識別可能にし得るか、又は換言すれば、修飾された残基を局在化させ得る、配列イオンを生成するための２つの方法を使用することができる。例えば、薬物共役システインは、非結合システインから局在され得る。本出願の実施形態に従う方法は、相補的解離法を使用せずに、複数の共役部位を有するものを含む共役ペプチドの占有部位を決定することを可能にする。例えば、解離は、ペイロードを同定及び局在化するために行うことができる。
【0089】
本出願の方法は、本開示を考慮して当該技術分野で知られている方法を使用して、質量トリガー、定量化感度、及び精度を改善するためのステップを更に含み得る。例えば、ＨＣＤ－ＭＳ２は、イオンルーティング多重極中のＴＭＴ標識ペプチドコンジュゲートの質量選択された前駆体イオンに対して実行され得る（例えば、図８Ａ及び図８Ｂを参照されたい）。生成されたイオンスペクトルは、ＴＭＴレポーターイオンが検出されるＯｒｂｉｔｒａｐで取得される。レポーターイオン質量（図８Ａにおける１３０．１４Ｄａ）は、同じ前駆体イオンのトリガー質量選択及びイオントラップへの移動として使用され得る。続いて、ＥＴＤ－ＭＳ２は、イオントラップ内で実行され、得られた生成物イオンは、Ｏｒｂｉｔｒａｐで質量分析される。例えば、図８Ｂは、ＮＩＳＴ軽鎖ｃｙｓ－１９３ビオチンＰＥＯアセトアミドコンジュゲートペプチドのＭＳ、ＭＳ２、及びトリガーＭＳ２から順次発生するデータ依存性スキャンについてのＴＩＣ及び対応する質量スペクトルを示す。１で標識されたＴＩＣは、Ｏｒｂｉｔｒａｐで収集された全ＭＳスキャンである。２で標識されたＴＩＣは、２つの連続するスキャンにおいてＯｒｂｉｔｒａｐで取得された質量選択前駆体イオンのＨＣＤ－ＭＳ２であり、３で標識されたＴＩＣは、Ｏｒｂｉｔｒａｐで分析された同じスキャン周期及び質量内で得られるＴＭＴ－１３０トリガーＥＴＤ－ＭＳ２スペクトルである。両方のＭＳ２生成物イオンスペクトルに対する高分解能Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析配列について生じる時間ペナルティは、薬物コンジュゲートペプチドの比較的小さなサブセットに影響を与えない可能性が高い。
【0090】
レポーターイオンＴＭＴ－１３０などのＨＣＤ－ＭＳ２によって生成された電荷損失イオンを使用して、ＥＴＤ－ＭＳ２をトリガーし、ＥＴＤスペクトルを生成することができる。図９Ａ及び図９Ｂは、それぞれＣｙｓ－１９３ビオチンＰＥＯアセトアミドコンジュゲートペプチドについての注釈付きＨＣＤ及びＥＴＤスペクトルを示す。薬物からの高選択的なＴＭＴ１３０イオン及びインモニウムイオンがスペクトルで容易に観察されることに注意することが重要である。加えて、レポーターの特徴的なニュートラルロス及びタグ全体が、図９Ｂ及び図９Ｄにアスタリスク付きで示されているＥＴＤスペクトルで観察された。ＥＴＤ及びＨＣＤの両方からの骨格断片は、相補的であり、かつＣｙｓ－１９３上のビオチンＰＥＯアセトアミドを局在化する。ＴＭＴ１３０は、最も豊富なインモニウムイオンではないにもかかわらず、有用なインモニウムイオンであることが示されている。例えば、図９Ｃ及び図９Ｄは、Ｃｙｓ－２３で共役したペプチド対応ビオチンＰＥＯアセトアミドのトリガー質量検出を示し、ＴＭＴ１３０は、ビオチンＰＥＯアセトアミドによって生成された免疫イオンと比較してより豊富ではなかった。ＴＭＴ１３０質量トリガーを生成する特異性はまた、前駆体イオンの質量選択ウィンドウを低減させることによってペプチドを妨害するために制御され得る。
【0091】
例えば、ペプチドの共単離及び共断片化は、ポリペプチド上の共役部位を局在化するためのＡＤＣ－ペプチド上のＥＴＤ－ＭＳ２分析をトリガーするのに役立つＴＭＴ－１３０のレポートイオンの特異性の喪失をもたらし得る。より高いトリガー強度閾値又は狭い分離ウィンドウ（例えば、０．４Ｄａ）を使用して、質量トリガーを改善することができる（例えば、図１０Ａ及び図１０Ｂを参照されたい）。様々なレポーターイオンは、トリガーのためにバーコードの種類に影響を与える可能性があり、特に、共単離及び共断片化は、同じ単離ウィンドウサイズ（例えば、２Ｄａ）で共溶出するペプチドに起因して起こる（図１０Ｂ）。
【0092】
別の実施形態では、ＳＰＳ－ＭＳ３を使用して、検出及び定量化の特異性及び精度を更に改善することができる（例えば、図１１を参照されたい）。前駆体イオンは、イオントラップ内の衝突誘起解離（ＣＩＤ）によって解離され、いくつかの生成物イオン質量は、イオントラップに適用されるノッチ波形態を使用して同期して単離される。単離された生成物イオンは、ＨＣＤ－ＭＳ３断片化が実行されるイオンルーティング多重極に移送される。ＳＰＳにより、標準的なＨＣＤ中の共断片化によるいかなる妨害も軽減され、これにより、妨害が少ないかないレポーターイオンがもたらされる。
【0093】
例えば、同期前駆体選択は、図４に示される構造を有するＭＳＱＣ８、及び本出願の実施形態による方法を使用して共役薬物を含まない抗体であるその模擬対照ＭＳＱＣ４のＡＤＣに対しての研究のレポーター定量化に使用された。図１２Ａ～図１２Ｃに示されるように、同期前駆体選択の適用により、正確なＴＭＴレポートが許可され、これにより、定量化感度及び精度が改善された。正確なレポーターイオン比が、ＳＰＳ－ＭＳ３後に、ＭＳＱＣ８を表すｉｏｄｏＴＭＴ－１２８、ＴＭＴ－１２９レポーターイオン対、及びＭＳＱＣ４（模擬）を表すｉｏｄｏＴＭＴ－１３０、ＴＭＴ－１３１レポーターイオン対を有するＮ＝５イオンを使用して観察された。ＭＳＱＣ８のレポーターイオン比：ＭＳＱＣ４は１であり、システイン残基が非共役であったことを示した。
【0094】
図１３Ａ、図１３Ｂ、及び図１４は、本出願の実施形態による方法を使用して、ＭＳＱＣ８上の部位特異的ＡＤＣを定量化するための二重ＴＭＴを使用する実験及び結果を示す。図１３Ａ及び図１３Ｂに示されるように、ＡＤＣの標識化が完了していない場合、例えば、コンジュゲートは、Ｌｙｓ反応性ＴＭＴではなく、Ｃｙｓ反応性ＴＭＴでのみ標識されており、検出された占有率（％ＡＤＣ）は、完全な標識化を有するものに比べてわずかに低かった。興味深いことに、不完全な標識化でペプチドを見つけるにもかかわらず、同様の部位占有率５５～６０％が観察され、これは、本出願の方法の堅牢性を示すものである。
【0095】
好ましくは、コンジュゲートは、両方のＴＭＴで完全に標識される。標識化の完了は、質量スペクトル上のＴＭＴに対するレポートイオンの強度によって測定され得る。図１３Ｃ～図１３Ｆに示される結果は、ＭＳＱＣ８において、薬物がＣｙｓ－２６６及びＣｙｓ－３７２で抗体に共役されることを示す。Ｃｙｓ－２１８は、部位占有率６０％を有する軽鎖上のダンシルカダベリン－ＳＭＣＣの唯一の共役部位であり、ＳＬＩＭ－ＩＭＳによって観察された平均１のＤＡＲ（Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ９２，５００４－５０１２ （２０２０））、並びにＭＳＱＣ８の質量分析の低減（データは示さず）と密接に一致していることも観察された。６０％のＣｙｓ－２６６（最大）での及び１５％のＣｙｓ－３７２での占有率が推定されたが、他の全てのシステインは、０％の共役を示した（例えば、図１４Ａ～図１４Ｃを参照されたい）。そのような結果は、既存の方法、例えば、軽鎖のイオン移動度分光法と組み合わせた無損失イオン操作のための構造（structure for lossless ion manipulation combined with ion mobility spectrometry、ＳＬＩＭ－ＩＭＳ）から得られた１：２のＤＡＲ０／ＤＡＲ１比と一致している。更に、２つの試料（すなわち、ＭＳＱＣ８ ＡＤＣ試料とＭＳＱＣ４模擬との）間の混合の違いを正規化するために多数のペプチドを使用することにより、各共役部位について占有率推定値が正確であることが確実になる。
【0096】
本出願の実施形態による方法を使用して、ポリペプチドに共役した薬物の構造を特徴付けるか、又は同定することもできる。図１５に示すように、小分子コンジュゲートは、複雑なスペクトルを生成する断片化を起こしやすい。薬物からの断片質量は、薬物ごとに特異的であり、薬物の同定に使用され得る。図１５は、ビオチンＰＥＯアセトアミドのインモニウムイオンとは大きく異なるＳｉｇｍＭＡｂダンシル－カダベリン－ＳＭＣＣコンジュゲートの一連のインモニウムイオンを示す。図８Ａ及び図８Ｂの結果と同様に、ＥＴＤをトリガーするために特定のレポーターイオンｍ／ｚを使用することによって、本発明の方法は、断片を生成する傾向がある小分子薬物の構造に依存しないＥＴＤ－ＭＳ２を使用して不明確な部位の局在を可能にする。言い換えれば、ＴＭＴレポーターｍ／ｚは特異的であるが、ｍ／ｚを変える薬物からのレポーターは分子の構造に依存する。
【0097】
本出願の他の実施形態によれば、本発明による二重ＴＭＴ質量分析は、共役反応の反応時間経過をプロファイリングするためにも使用することができる（例えば、図１６Ａ～図１６Ｂ、図１７Ａ及び図１７Ｂを参照されたい）。図１６Ａ及び図１６Ｂの二重ＴＭＴ実験スキームでは、単一のＴＭＴを、ＴＭＴを蛍光と組み合わせた多重反応時間経過実験のための異なる数のシステイン残基を有する合成ペプチド標準（ＨＳＡペプチドなど）に使用した。
【0098】
本出願の更なる実施形態では、本発明による二重ＴＭＴ質量分析を、薬物ポリペプチドコンジュゲートの多重定量化に使用して、スループットを増加させ、かつコストを低減することができる。図１８Ａは、追加の薬物コンジュゲート試料が元のワークフローに追加される多重フォーマットを示す。多重化により、複数の反応条件を単一の分析で監視することができ、これは、各試料について別個のワークフローよりも有利である。非重複レポーターイオン質量を有するＴＭＴ試薬の注意深い選択により、更により高次の試料多重化が可能である。多重化はまた、バーコード内のレポーターの数が試料数ｎに対して（２ｎ＋２）である占有のためにレポーターイオンシグネチャを変更する。図１８Ａの例では、第２の試料の添加は、合計６つのレポーターをもたらす。また、これらのレポーターは、等しい数のＩｏｄｏＴＭＴ試薬及びＴＭＴ試薬由来である。正規化のためのバーコード内のレポーターイオンの数は、占有のためのバーコードとしての数の半分であり、（２ｎ＋２）／２である。これは常に、アミン反応性ＴＭＴレポーターイオンのみを使用して試料全体での正規化を実行する二重ＴＭＴ戦略である。ペプチド薬物コンジュゲートの質量トリガーのためのバーコードにおけるレポーターイオンの数は試料の数に依存しないことに留意することが重要である。むしろ、質量トリガーのためのレポーターの数は、可能な共役部位の数ｍに依存する。典型的には、ｍ＝１の場合、単一のレポーターが観察され、ｍ＞１の場合、薬物は全ての部位で共役されていず、２つのレポーターイオンが観察される。
【0099】
本出願の特定の実施形態では、多重化された三重プレイ分析を使用して、２つ以上の共役部位を有するコンジュゲートを含有する複数の試料を分析することができる。例えば、蛍光分子ＤＣＡＭ－３と共役した１～３つのシステイン残基を有する合成ペプチドは、本出願の方法を使用して分析される。図１６Ｂは、未反応システインをブロックするＩＡＡと組み合わせたｉｏｄｏＴＭＴ６を使用して反応の時点を監視するための本出願の方法を使用することを示す。この方法では、ＩｏｄｏＴＭＴ６は、多重化の上限がアッセイ条件下では４であるため、ＴＭＴ１０との共役における二重標識化アプローチとして使用されなかった。現在、ＴＭＴ１６（１６－ｐｌｅｘ）及びｎ＞１６である将来のｎ－ｐｌｅｘ試薬の利用可能性は、二重ＴＭＴアプローチの試料の数によって大幅に促進される。蛍光ベースの定量化を標準として使用し、ＴＭＴベースの占有推定と比較した。図１６Ｃは、複数の薬物：多重化様式にあるＤ１～Ｄ５の反応の監視に適用される本出願の三重プレイワークフローを示す。このスキームは、二重標識化を達成するためのＩＡＡ又はｉｏｄｏＴＭＴでのＴＭＴ標識化を表す。占有率は、反応性Ｄ５＞Ｄ３＞Ｄ１及び占有率がゼロであるＤ２、Ｄ４の不合格反応についてのランク順序を示すレポーター強度を使用して、各薬物について推定され得る。図１６Ｄは、各薬物分子、すなわち、Ｄ１についてのＴＭＴ１２７、Ｄ２についてのＴＭＴ１２９、及びＤ３についてのＴＭＴ１３０に特異的な単一のＴＭＴレポーターイオンを介した質量トリガーを示す。
【0100】
図１７Ａ及び図１７Ｂは、反応時点が、ペプチド－ＤＡＣＭ－３共役パーセント比０、２０、４０、６０、及び８０を混合することによってシミュレートされた多重化実験の結果を示す。非共役ペプチド対応物を最初に低減させ、全ての遊離チオールをＩＡＡでブロックするように、各ペプチド混合物を別々に調製した。共役ペプチド混合物及び各ペプチド配列の非共役対応物を２つの並行実験に使用した。先ず、ＤＡＣＭ共役及び混合を確実にするために、蛍光定量的測定を実行した。１～３つのシスチン残基を有する全てのペプチドの蛍光強度は、共役なし（模擬）から８０％の共役までの線形応答を示す。次に、０、２０、４０、６０、８０の５つのペプチド－ＤＡＣＭコンジュゲート比及び模擬及び各試料を、それぞれｉｏｄｏＴＭＴ１２６、１２７、１２８、１２９、１３０及び１３１で標識し、等モル量をレポーターイオンの定量化のために混合した。ＨＣＤ－ＭＳ２レポーターイオンは、反応が進行するにつれて反応物が枯渇し、プラトーに達する反応のための一意のバーコードを反映する。その模擬に対するペプチド混合物のレポーター強度は、予想どおりに、共役の増加に伴って減少する。観察された共役レベルの予想の又は理論的な共役レベルとの相関は、ＴＭＴレポーターイオンに基づいて得られた。ＴＭＴレポーターイオン強度は共役レベルに反比例することに留意することが重要である。特に、低強度レポーターイオンに対するＴＭＴ比の動的圧縮が、高薬物コンジュゲートに最も影響を与える。
【0101】
Ｓａｖｉｓｋｙ ｅｔ ａｌ．によって報告されたものなどのアルゴリズムを使用して、比率圧縮を補正することができ（Ｓａｖｉｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ １２，３５８６－３５９８）、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。電流計装で利用可能なＳＰＳ－ＭＳ３ルーチンはまた、比率圧縮を改善することができる（ＭｃＡｌｉｓｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ８６，７１５０－７１５８（２０１４）。それにもかかわらず、いかなる補正も伴わない本出願の方法は、ＴＭＴ応答が共役の線形関数である低レベルの共役の正確な推定を提供し得る。コンジュゲートの低化学量論の検出は、ほとんどのオフターゲットの共役が望ましくなく、より正確に監視することができるために、有益である。多重ＴＭＴ比及び／又は逆ＴＭＴ比（部位占有率）を蛍光ベースの収率推定値と比較した。蛍光ベースの測定のための線形ダイナミックレンジは、比率圧縮によるＴＭＴレポーターの占有のためのダイナミックレンジと比較して高い。しかしながら、高強度を有するＴＭＴレポーターはまた、より少ない比率の圧縮効果及び欠落値で測定することができる低レベルの共役を有するチャネルである（Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ １６，４２１７－４２２６（２０１７））。
【0102】
別の実施形態では、本出願の方法は、ロボットシステムを使用することを含む。例えば、本出願の三重プレイワークフローは、ＴＭＴ試薬を用いた二重標識化及び試料多重化がＴＭＴベースの定量化の正確度及び精度を高めることができるＡｓａｙＭａｐ Ｂｒａｖｏ液体処理ロボットシステムに実装され得る。図１８Ａは、自動化が、合成点での反応の堅牢な監視に特に利益を与えることができるスキーム全体を示す。複数の薬物共役反応の同時分析は、反応条件を迅速に最適化する必要がある場合に有用であり得る。また、全体的な収率を最適化するために、最終生成物に加えて、中間ステップの薬物占有率の推定が、連続的な共役反応には必要である。任意の自動化プラットフォームが多重化を提供する速度及び再現性が、試料取り扱い中に人間による誤差を低減するために必要である。
【0103】
一実施形態では、本出願の試料多重化スキームは、二重の２つの異なる濃度で、ＭＳＱＣ８などの試料の二重ＴＭＴ標識化を使用して最大４つのＡＤＣ試料を分析することができる。図１８Ｂは、全ての質量が一意であるようなＴＭＴ１０由来の二重ＴＭＴレポーター及びＩｏｄｏＴＭＴ６試薬の選択を示す。ＴＭＴ１０（１０－ｐｌｅｘ）試薬は、標識された同位体置換体、又はＣ１２、Ｎ１５原子対がＣ１３、Ｎ１４で置換されている６．３２ｍＤａ（ミリダルトン）だけ異なるＴＭＴ１０ｘＮ又はＴＭＴ１０ｘＣとして標識されている１０個の同位体のうちの６つを有する。ＴＭＴ１０ｘＣ同位体置換体質量は、ｉｏｄｏＴＭＴ試薬と同一の質量であり、同時に使用され得ない。試料がレポーターイオンの適切な組み合わせと多重化されると、高分解能質量分析法により、レポーターイオン質量及びそれらの同位体置換体のベースライン分離が可能になる。４つの異なるＡＤＣ試料及び模擬又は非共役試料は、スキームに示されるように標識された二重ＴＭＴであり、それにより、トリプシンペプチドを含有するシステインは、５つのＴＭＴレポーター及び５つのｉｏｄｏＴＭＴレポーターの等圧混合物である。ＭＳ２時に、バーコードは１０個のレポーターイオンからなる。
【0104】
４つのＭＳＱＣ８薬物コンジュゲート模倣物を以下の２つの濃度で調製した：元の試料、及びＭＳＱＣ４とＭＳＱＣ８とで希釈することによる半分の濃度の別の試料。これらの試料の各々は、二重ＴＭＴ標識化で複製された試料であった。図１９は、ＨＣＤ－ＭＳ２後のＣｙｓ－２１８ペプチドのレポーターイオンを示す。模擬（ＭＳＱＣ４）のレポーターは、ＴＭＴ１０－１２６及びＩｏｄｏＴＭＴ６－１３０対で二重標識され、一方、４つの試料をＴＭＴ１０ｘＮ、ＩｏｄＴＭＴ６ｘで標識し、式中、ｘは１２７～１３０の範囲である。ＭＳＱＣ８の複製１を二重試薬ｘ＝１２７で標識し、ＭＳＱＣ８の複製を二重試薬ｘ＝１３０で標識した。同様に、ＭＳＱＣ８及びＭＳＱＣ４標識試薬の等モル混合物についての２つの複製物は、ｘ＝１２８及び１２９である。ｉ番目の試料の場合のＣｙｓ－２１８での部位占有率は、式１で与えられる。図２０Ａは、ここでＭＳ２－ＨＣＤ時に５つのＴＭＴ１０レポーターイオン（１つの模擬及び４つの試料）のバーコードを有して、多重化実験で試料濃度を補正する非システインペプチド配列の使用を示す。ｉ番目の試料についての正規化係数は、式２で与えられる。各ＡＤＣ試料についての補正された占有率は、式３によって得られ得る。図２０Ｂは、単一の取得において４つの試料について得られた正規化占有率を示す。原理的にこれらの多重実験を使用して、トリガー質量を使用して薬物コンジュゲートを同定することもできる。
【0105】
本出願の一実施形態では、反応が中間ステップを介して進行する場合、又は参照材料が利用できない場合に、任意の２つの反応ステップ間の相対的な占有率が決定され得る（例えば、図２０Ａ及び図２０Ｂを参照されたい）。図１６Ａ及び図１６Ｂに示されるように、２つのステップ抗体共役反応を介して、フルオロフォア薬物模倣物、ＤＡＣＭ－３に共役したペプチドについて、占有率が推定され得る。２ステップ抗体共役反応の例は、トランスグルタミナーゼ反応、それに続く細胞傷害性ペイロードのクリック付加である。例えば、Ｈｕｇｇｉｎｓ，ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１９ Ｓｅｐ；２４（１８）：３２８７も参照されたく、その内容はその全体が本明細書に組み込まれる。２ステップ抗体共役反応によって調製されるＡＤＣのいずれも、本出願の方法によって分析することができる。
【0106】
ここで、本発明について、以下の特定の非限定的な実施例を参照して更に詳細に説明する。以下の実施例に開示される技術が、本発明の実施において十分に機能する発明者によって発見された技術を表し、したがって、その実施のための好ましいモードを構成すると見なすことができることを、当業者は理解されたい。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示されている特定の実施形態において多くの変更を行い、本発明の範囲から逸脱することなく、同様又は類似の結果を依然として得ることができると理解するであろう。
【実施例】
【0107】
実施例１：二重ＴＭＴ標識化及び非共役ｍＡｂの共役
還元及び薬物共役されたＮＩＳＴモノクローナル抗体（（ｍＡｂ）、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号８６７１）（試料＃１）から非還元及びＩｏｄｏＴＭＴ（商標）タグ付きＮＩＳＴ ｍＡｂ（試料＃２）の４つの異なる比（１：１、１：９、９：１、及び１：３）を調製した。ＮＩＳＴ ｍＡｂが、ヨードアセトアミド（iodoacetamide、ＩＡＡ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号１６１２５）か又はビオチンＰＥＯヨードアセトアミド（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｂ２０５９）のいずれかを使用して共役された。試料＃１について、１００μｇのＮＩＳＴ（５０μｌの２ｍｇ／ｍｌのＮＩＳＴ）の２つのアリコートを、１０μｌのストック（１０ｍｇ／ｍｌ）を８Ｍの塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｇ３２７２）、及び４ｍＭのエチレンジアミンエトラ四酢酸（ethylenediaminetetraacetic acid、ＥＤＴＡ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号０３６２０）を含む４０μｌの溶液と組み合わせることによって調製した。次いで、ＮＩＳＴアリコートを１０μｌの１Ｍ ＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号１０１９７７７００１）の添加によって還元し、３７℃で１時間インキュベートした。あるいは、ＴＣＥＰは、ＤＴＴの代わりに還元剤としても使用され得る。ＤＴＴは、通常、中性～塩基性ｐＨ条件で活性であるが、ＴＣＥＰは、広いｐＨ範囲及びより強い還元剤を有する。
還元及び薬物共役されたＮＩＳＴモノクローナル抗体（（ｍＡｂ）、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号８６７１）（試料＃１）から非還元及びＩｏｄｏＴＭＴ（商標）タグ付きＮＩＳＴ ｍＡｂ（試料＃２）の４つの異なる比（１：１、１：９、９：１、及び１：３）を調製した。ＮＩＳＴ ｍＡｂが、ヨードアセトアミド（iodoacetamide、ＩＡＡ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号１６１２５）か又はビオチンＰＥＯヨードアセトアミド（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｂ２０５９）のいずれかを使用して共役された。試料＃１について、１００μｇのＮＩＳＴ（５０μｌの２ｍｇ／ｍｌのＮＩＳＴ）の２つのアリコートを、１０μｌのストック（１０ｍｇ／ｍｌ）を８Ｍの塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｇ３２７２）、及び４ｍＭのエチレンジアミンエトラ四酢酸（ethylenediaminetetraacetic acid、ＥＤＴＡ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号０３６２０）を含む４０μｌの溶液と組み合わせることによって調製した。次いで、ＮＩＳＴアリコートを１０μｌの１Ｍ ＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号１０１９７７７００１）の添加によって還元し、３７℃で１時間インキュベートした。あるいは、ＴＣＥＰは、ＤＴＴの代わりに還元剤としても使用され得る。ＤＴＴは、通常、中性～塩基性ｐＨ条件で活性であるが、ＴＣＥＰは、広いｐＨ範囲及びより強い還元剤を有する。
【0108】
ＮＩＳＴを１ＭのＩＡＡと共役させた。１ＭのＩＡＡを、３００μｌのトリメチルアンモニウムバイオレート（trimethyl ammonium bicarbonate、ＴＥＡＢ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＴＭＴ標識キットのパート）をエッペンドルフチューブに添加することによって調製し、これをボルテックスし、２０分間超音波処理して、使用前にＴＭＴ試薬を室温に平衡化させた。次いで、２４μｌの１ＭのＩＡＡを還元ＮＩＳＴ試料に添加し、これを暗所において室温で１時間インキュベートした。インキュベーション期間に続いて、１５μｌの１ＭのＤＴＴを試料に添加して、共役反応をクエンチした。試料を緩衝液交換溶液（８Ｍ ＧｕＨＣｌ＋４Ｍ ＥＤＴＡ）と組み合わせ、７ｋＤａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号８９８８２）の分子量カットオフを有するＺｅｂｒａ（商標）スピン脱塩カラムを通して配置した。
【0109】
還元ＮＩＳＴ試料をビオチンＰＥＯヨードアセトアミドと共役させるために、試料を、約７．５のｐＨでスルフヒドリルを含まないＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に緩衝液交換した。使用直前に、ビオチンＰＥＯヨードアセトアミドの２０ｍＭの原液を調製した（１９０μｌのＰＢＳをエッペンドルフチューブ中の２ｍｇのビオチンＰＥＯヨードアセトアミドに添加した）。ＰＢＳ中の還元ＮＩＳＴ試料を、５μｌの２０ｍＭのビオチンＰＥＯヨードアセトアミドと組み合わせて、混合した。反応物を、氷上又は室温で２時間インキュベートした。インキュベーション期間に続いて、試料を脱塩した。試料は、緩衝液交換溶液（８Ｍ ＧｕＨＣｌ＋４Ｍ ＥＤＴＡ）中に配置され、７ｋＤａの分子量カットオフを有するＺｅｂｒａ（商標）スピン脱塩カラムを通された。
【0110】
試料＃２（ＩｏｄｏＴＭＴ（商標）タグ付き非還元ＮＩＳＴ試料）を、ＮＩＳＴの３つのアリコート（１０μｌのストック（１０ｍｇ／ｍｌ）と組み合わせた５０μｌの２ｍｇ／ｍｌのＮＩＳＴ）を生成し、４０μｌの溶液（８ＭのＧｕＨＣｌ＋４ｍＭのＥＤＴＡ）に添加することによって調製した。各アリコートを、８ＭのＧｕＨＣｌ及び４ｍＭのＥＤＴＡを含有する５０ｕｌの溶液と組み合わせて、その体積をオフセットした。その後のｉｏｄｏＴＭＴ標識化のための試料を還元させるために、１０μｌのＤＴＴを各アリコートに添加し、試料を３７℃で１時間インキュベートした。試料＃１及び試料＃２の以下の４つの比率を調製した：１）１：９の比（１０μｌの還元ＮＩＳＴ：９０μｌの非還元ＮＩＳＴ）、２）１：３の比（２５μｌの還元ＮＩＳＴ：７５μｌの非還元ＮＩＳＴ）、３）１：１の比（５０μｌの還元ＮＩＳＴ：５０μｌの非還元ＮＩＳＴ）、及び４）９：１の比（９０μｌの還元ＮＩＳＴ：１０μｌの非還元ＮＩＳＴ）。１００μｇのＮＩＳＴ及び２μｌのＩｏｄｏＴＭＴ（商標）－ＬａｂｅｌＡ１（１０μｌのメタノールを２００μｇのＩｏｄｏＴＭＴ（商標）に添加した）を含有する各混合試料を、全ての試料に添加した。次いで、試料を暗所において３７℃で１時間インキュベートした。標識化反応をクエンチするために、４μｌの０．５ＭのＤＴＴを各試料に添加し、暗所において３７℃で更に１５分間インキュベートした。試料は、ＴＥＡＢと交換されたそれらの緩衝液を有し、ＩｏｄｏＴＭＴ（商標）標識タンパク質を、４μｌのトリプシン（１ｍｇ／ｍｌ）で４時間から一晩中、３７℃で消化した。トリプシンを２μｌの９８％のギ酸でクエンチし、２μｌのＴＭＴ－ＬａｂｅｌＢ１（４０μｌの無水アセトニトリルに溶解した８００μｇ）を４つの試料の各々に添加した。試料を暗所において３７℃で１時間インキュベートし、室温で１５分間、８μｌの５％のヒドロキシルアミンを添加することによって反応をクエンチした。
【0111】
試料＃１及び試料＃２に加えて、試料＃３と呼ばれる参照又は模擬試料を調製し、ＩｏｄｏＴＭＴ（商標）タグでタグ付けした。試料＃３は、３つの試料に代えて４つの試料を生成したことを除いて、試料＃２に使用されるプロトコルと同様に調製された。試料＃３を別々にトリプシン処理し、ＴＭＴ－ＬａｂｅｌＢ２で標識した。試料＃１及び試料＃２各々を、１３２μｌの試料＃３と１：１の体積比で混合し、これにより、質量分析法のために４つの多重化された試料を形成する固有の等圧レポーターイオン質量を有するＴＭＴ標識タンパク質を得た。最大４つの反応混合物は、ＩｏｄｏＴＭＴ（商標）及びアミン反応性ＴＭＴ１０ｐｌｅｘ（商標）試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号９０１１０）からの５つの固有のレポーター質量での二重標識化により多重化され得る。二重標識された４つの共役試料及び単一の模擬／参照対照試料を、１：１：１：１：１の体積比で組み合わせ、これにより、液体クロマトグラフィー－質量分析用の単一の多重化試料が生成された。
【0112】
図１３Ａ、図１３Ｂ、及び図１４は、本出願の実施形態による方法を使用して、ＭＳＱＣ８上の部位特異的ＡＤＣを定量化するための二重ＴＭＴを使用する実験及び結果を示す。図１３Ａに示されるように、ＡＤＣの標識化が完了していない場合、例えば、コンジュゲートが、それぞれＭＳＱＣ－４及びＭＳＱＣ－８の各々について、Ｃｙｓ反応性ＴＭＴ、例えば、ＩｏｄｏＴＭＴ１２８及びＩｏｄｏＴＭＴ１３０のみで、しかし、Ｌｙｓ反応性ＴＭＴ、例えば、ＴＭＴ１２９及びＩｏｄｏＴＭＴ１３１ではなく、標識された場合、単一の標識化における検出された部位占有率（例えば、５５～６０％ＡＤＣ）は、二重標識化によるものに比べてわずかに少なかった。ＭＳＱＣ－４のための二重標識、例えば、ＩｏｄｏＴＭＴ１２８及びＴＭＴ１２９を有する非共役ペプチド、並びにＭＳＱＣ－８のＩｏｄｏＴＭＴ１３０及びＴＭＴ１３１は、６０％のより正確な推定値（１つに代えて２つのレポーターからの測定推定値）を提供する。標識化の完了は、質量スペクトルに対するＴＭＴについてのレポートイオンの強度によって測定された。ＭＳＱＣ８はいくつかの共役部位を有したことが知られていた。図１３Ｂに示される結果は、ＭＳＱＣ８において、薬物がＣｙｓ－２６６及びＣｙｓ－３７２で抗体に共役したことを示す。Ｃｙｓ－２１８は、部位占有率６０％を有する軽鎖上のダンシル－カダベリン－ＳＭＣＣの唯一の共役部位であり、ＳＬＩＭ－ＩＭＳによって観察された平均１のＤＡＲ（例えば、抗体の両方の鎖に結合した薬物を見出した、Ｎａｇｙ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ９２，５００４－５０１２（２０２０））と密接に一致していた。更に、６０％のＣｙｓ－２６６（最大）及び１５％のＣｙｓ－３７２でのＭＳＱＣ８占有率の質量分析の低減が推定された一方、他の全てのシステインは、０％の共役を示した（例えば、図１４を参照されたい）。そのような結果は、既存の方法、例えば、軽鎖のイオン移動度分光法と組み合わせた無損失イオン操作のための構造（ＳＬＩＭ－ＩＭＳ）から得られた１：２のＤＡＲ０／ＤＡＲ１比と一致している。２つの試料（すなわち、ＭＳＱＣ８ ＡＤＣ試料及びＭＳＱＣ４模擬）間の混合の違いを正規化するために多数のペプチドを使用することは、各コンジュゲーション部位の占有推定値が正確であることを確実にすることに留意することが重要である。
【0113】
実施例２：共役ｍＡｂの二重ＴＭＴ標識化
共役ｍＡｂを、二重ＴＭＴ標識プロトコルで標識した。ＭＳＱＣ８（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ｍＡｂ抗体－薬物コンジュゲート模倣物）及びＭＳＱＣ４（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ｍＡｂ標準）を、それぞれ共役試料及び参照又は模擬試料として使用した。試料を、ＮＩＳＴ ｍＡＢをタグ付けし、かつ別々にトリプシン処理してペプチドを生成するために記載されたように使用した試料プロトコルに従って、別個のＩｏｄｏＴＭＴ（商標）タグでタグ付けした。ＭＳＱＣ８及びＭＳＱＣ４から得られたペプチド混合物を、ＮＩＳＴ ｍＡｂをＴＭＴ又はＩｏｄｏＴＭＴ（商標）で標識するために使用される同じプロトコルに従って、別個のアミン反応性ＴＭＴタグで別々に標識した。ＴＭＴ二重標識化後、試料を１：１の体積比で混合し、これにより、質量分析のために多重化された単一試料が生成された。
共役ｍＡｂを、二重ＴＭＴ標識プロトコルで標識した。ＭＳＱＣ８（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ｍＡｂ抗体－薬物コンジュゲート模倣物）及びＭＳＱＣ４（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ｍＡｂ標準）を、それぞれ共役試料及び参照又は模擬試料として使用した。試料を、ＮＩＳＴ ｍＡＢをタグ付けし、かつ別々にトリプシン処理してペプチドを生成するために記載されたように使用した試料プロトコルに従って、別個のＩｏｄｏＴＭＴ（商標）タグでタグ付けした。ＭＳＱＣ８及びＭＳＱＣ４から得られたペプチド混合物を、ＮＩＳＴ ｍＡｂをＴＭＴ又はＩｏｄｏＴＭＴ（商標）で標識するために使用される同じプロトコルに従って、別個のアミン反応性ＴＭＴタグで別々に標識した。ＴＭＴ二重標識化後、試料を１：１の体積比で混合し、これにより、質量分析のために多重化された単一試料が生成された。
【0114】
実施例３：ＡｓｓａｙＭａｐ ＢｒａｖｏにおけるＴＭＴ標識化の自動化
二重ＴＭＴ標識化プロトコルは、ＬＣ－ＭＳで分析する前にタンパク質試料の調製を自動化するＡｓｓａｙＭＡＰ Ｂｒａｖｏ（Ａｇｉｌｅｎｔ）ロボットシステムに実装された。非共役ＮＩＳＴ ｍＡｂの共役の二重ＴＭＴ標識化を、前述のように実行した。その全体が参照により本明細書に組み込まれる、製造業者の指示に従った、溶液内消化単一プレートプロトコルを使用した（ワールドワイドウェブ：ａｇｉｌｅｎｔ．ｃｏｍ／ｃｓ／ｌｉｂｒａｒｙ／ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ－ｐｒｏｔｅａｓｅ－ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ－ｉｎ－ｓｏｌｕｔｉｏｎ－ａｓｓａｙｍａｐ－５９９４－１６８２ｅｎ－ａｇｉｌｅｎｔ．ｐｄｆを参照されたい）。自動化試料調製が、最小体積５μｌを分注するようにプログラムされ、試料を、当該技術分野で知られているＲＰ－Ｗカートリッジ適用を使用して、逆相タンパク質クリーンアップにより脱塩した。異なる試料比（例えば、１：１、１：９、９：１、及び１：３）を、ＡｓｓａｙＭＡＰ Ｂｒａｖｏロボットシステムの再フォーマットユーティリティを用いて実行した。
二重ＴＭＴ標識化プロトコルは、ＬＣ－ＭＳで分析する前にタンパク質試料の調製を自動化するＡｓｓａｙＭＡＰ Ｂｒａｖｏ（Ａｇｉｌｅｎｔ）ロボットシステムに実装された。非共役ＮＩＳＴ ｍＡｂの共役の二重ＴＭＴ標識化を、前述のように実行した。その全体が参照により本明細書に組み込まれる、製造業者の指示に従った、溶液内消化単一プレートプロトコルを使用した（ワールドワイドウェブ：ａｇｉｌｅｎｔ．ｃｏｍ／ｃｓ／ｌｉｂｒａｒｙ／ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ－ｐｒｏｔｅａｓｅ－ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ－ｉｎ－ｓｏｌｕｔｉｏｎ－ａｓｓａｙｍａｐ－５９９４－１６８２ｅｎ－ａｇｉｌｅｎｔ．ｐｄｆを参照されたい）。自動化試料調製が、最小体積５μｌを分注するようにプログラムされ、試料を、当該技術分野で知られているＲＰ－Ｗカートリッジ適用を使用して、逆相タンパク質クリーンアップにより脱塩した。異なる試料比（例えば、１：１、１：９、９：１、及び１：３）を、ＡｓｓａｙＭＡＰ Ｂｒａｖｏロボットシステムの再フォーマットユーティリティを用いて実行した。
【0115】
実施例４：共役ペプチドの多重ＴＭＴ標識化
１～３つのシステイン残基を有する合成ｍＡｂを、別々に、タンパク質標識化のための適合された製造業者のプロトコルを介して、Ｎ－（７－ジメチルアミノ－４－メチルクマリン－３－イル）マレイミド（ＤＡＣＭ－３；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｄ１０２５１）と共役させた。１６．７６ｍＭのＤＡＣＭ－３の原液を調製した。１ｍｇの各ペプチドを、１００ｍＭのＰＢＳ、０．１ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）及び５０μｌの１６．７６ｍＭのＤＡＣＭ－３を含む１ｍＬの溶液に溶解した。ペプチドを軽質保護カバーで密封し、周囲温度で約５分間インキュベートした。質量分析を使用して、ペプチドが完全に共役したことを確認した。Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（ＮＩＳＴモノクローナル抗体由来のシステインペプチド標準物質を、Ｂｉｏｍａｔｉｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって純度９９．９９％に合成した）の試料及び標準曲線の試料の相対蛍光（相対蛍光単位又はＲＦＵ）を測定した（励起＝３８５ｎｍ、放出＝４６５ｎｍ、４５５ｎｍカットオフ）、蛍光プレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ使用）。各ペプチドについての遊離チオール又は共役チオールの相対濃度を、内部Ｎ－アセチル－システイン曲線の回帰分析から計算した。Ｎ－アセチル－Ｌ－システインは、ＤＡＣＭ－３と実質的に１００％反応すると決定された。
１～３つのシステイン残基を有する合成ｍＡｂを、別々に、タンパク質標識化のための適合された製造業者のプロトコルを介して、Ｎ－（７－ジメチルアミノ－４－メチルクマリン－３－イル）マレイミド（ＤＡＣＭ－３；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｄ１０２５１）と共役させた。１６．７６ｍＭのＤＡＣＭ－３の原液を調製した。１ｍｇの各ペプチドを、１００ｍＭのＰＢＳ、０．１ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）及び５０μｌの１６．７６ｍＭのＤＡＣＭ－３を含む１ｍＬの溶液に溶解した。ペプチドを軽質保護カバーで密封し、周囲温度で約５分間インキュベートした。質量分析を使用して、ペプチドが完全に共役したことを確認した。Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（ＮＩＳＴモノクローナル抗体由来のシステインペプチド標準物質を、Ｂｉｏｍａｔｉｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって純度９９．９９％に合成した）の試料及び標準曲線の試料の相対蛍光（相対蛍光単位又はＲＦＵ）を測定した（励起＝３８５ｎｍ、放出＝４６５ｎｍ、４５５ｎｍカットオフ）、蛍光プレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ使用）。各ペプチドについての遊離チオール又は共役チオールの相対濃度を、内部Ｎ－アセチル－システイン曲線の回帰分析から計算した。Ｎ－アセチル－Ｌ－システインは、ＤＡＣＭ－３と実質的に１００％反応すると決定された。
【0116】
ペプチドのＤＡＣＭ－３共役に続いて、ペプチドをＴＭＴで標識した。各ＤＡＣＭ－３共役ペプチドを非標識ペプチド対応物と混合して、様々な化学量論比（０、０．２、０．４、０．６、及び０．８）で５つの混合物を生成した。非標識ペプチドは対照として供された。試料は、ＤＡＣＭ－３標識がＴＭＴ標識化の前に適切に機能したことを確実にするために、本開示を考慮して当該技術分野で既知の蛍光アッセイで評価された。アミン反応性６－ｐｌｅｘ ＴＭＴ標識化を、トリプシンペプチドのＴＭＴ標識化について前述した各試料に対して実行した。最後に、標識された５つの混合物及び対照を各々、１：１の体積比で組み合わせ、本開示を考慮して当該技術分野で知られている方法を使用してＬＣ－ＭＳで分析した。
【0117】
実施例５：ＬＣ－ＭＳ２（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）分析
ＬＣ－ＭＳ２で分析した試料を、６５℃でＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍａｐｐｉｎｇカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ、カタログ番号８６４６００－９１１）を用いてＡｇｉｌｅｎｔ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ １２９００ ＵＨＰＬＣで分離した。移動相Ａとしての０．１％のギ酸及び移動相Ｂとしてのアセトニトリルを含むＬＣ－ＭＳグレードの水を使用した５０分液体クロマトグラフィー（ＬＣ）勾配プログラムを、以下のプロトコルに従って行った：０分、２％Ｂ；３５分、３０％Ｂ；４０分、８０％Ｂ；４５分、８５％Ｂ；４５．５分、２％Ｂ；及び５分、２％Ｂでの続く再平衡化。流量を０．２ｍＬ／分に設定し、注入量を２μｌに設定した。質量分析計を、当該技術分野で既知のデータ依存性（data dependent、ｄｄ）ＭＳ２ ＨＣＤ（ＭＳ／ＭＳ－ＨＣＤ）及び電子移動解離（ＥＴＤ）方法を用いて正イオン化モードで動作させた。以下の界面条件を使用した：エミッタ電圧、＋２６００Ｖ；気化器温度、３２５℃；イオントランスファーチューブ、３２５℃；シースガス、５５（任意単位）；補助ガス、１０（任意単位）；及びスイープガス、１（任意単位）。
ＬＣ－ＭＳ２で分析した試料を、６５℃でＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍａｐｐｉｎｇカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ、カタログ番号８６４６００－９１１）を用いてＡｇｉｌｅｎｔ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ １２９００ ＵＨＰＬＣで分離した。移動相Ａとしての０．１％のギ酸及び移動相Ｂとしてのアセトニトリルを含むＬＣ－ＭＳグレードの水を使用した５０分液体クロマトグラフィー（ＬＣ）勾配プログラムを、以下のプロトコルに従って行った：０分、２％Ｂ；３５分、３０％Ｂ；４０分、８０％Ｂ；４５分、８５％Ｂ；４５．５分、２％Ｂ；及び５分、２％Ｂでの続く再平衡化。流量を０．２ｍＬ／分に設定し、注入量を２μｌに設定した。質量分析計を、当該技術分野で既知のデータ依存性（data dependent、ｄｄ）ＭＳ２ ＨＣＤ（ＭＳ／ＭＳ－ＨＣＤ）及び電子移動解離（ＥＴＤ）方法を用いて正イオン化モードで動作させた。以下の界面条件を使用した：エミッタ電圧、＋２６００Ｖ；気化器温度、３２５℃；イオントランスファーチューブ、３２５℃；シースガス、５５（任意単位）；補助ガス、１０（任意単位）；及びスイープガス、１（任意単位）。
【0118】
以下の内部質量分析計の設定を、以下のＭＳスキャンについて使用した：ＲＦ（無線周波数）レンズ、６０％；ＡＧＣ（自動利得対照）標的、１ｅ６；最大注入時間、５０ｍｓ；Ｏｒｂｉｔｒａｐ（Orbitrap、ＯＴ）質量分析計における７０Ｋ解像度のプロファイルモードで１μｓｃａｎ。この方法は、当該技術分野で既知の任意のＭＳ２ ＨＣＤイベントの前に一連のフィルタを順次含んでいた。モノアイソトピックピーク選択フィルタが含まれ、全ての方法に対してペプチドとして設定され、１ｅ５の強度フィルタを使用した。いくつかの方法は、任意の電荷状態フィルタを使用して、前駆体電荷状態２～６を選択する。更に、特定の方法は、任意選択的な動的排除（dynamic exclusion、ＤＥ）フィルタを使用して、１２秒か又は３秒の排除ウィンドウのいずれかを有する試料中のペプチドをより効率的に同定し、以下の共通パラメータを示した：ｎ＝１時間を除く；＋／－３ｐｐｍ；同位体を除く；及び前駆体あたり単独の電荷状態。一方法は、Ａｐｅｘ検出を含み、これは、以下のパラメータを使用した：予想ピーク幅、６秒；所望のａｐｅｘウィンドウ、３０％。
【0119】
５ｄｄＭＳ２ ＯＴ－ＨＣＤ（データ依存ＭＳ／ＭＳ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ検出－高エネルギー衝突解離）スキャンは、以下の設定で実行された：四重極単離、１．６ｍ／ｚ単離ウィンドウ；検出器タイプ、Ｏｒｂｉｔｒａｐ、自動ｍ／ｚ通常スキャン範囲、７０Ｋ分解能、１００ｍ／ｚ第１の質量；ＡＧＣ標的、２ｅ５は、利用可能な全ての並列化可能な時間、５０ｍｓの最大注入時間でイオンを注入する；１μｓｃａｎ、プロファイル。ｄｄＭＳ２ ＯＴ－ＨＣＤに従って、標的質量トリガー（ＴＭＴ）を実施し、これは、システムがユーザ定義のリストから生成物イオンを検出する場合にのみトリガーされるスキャンである。標的イオン質量は、レポーター質量のリスト（例えば、１２６～１３１Ｄａ）からペイロードを検出することに特異的なＴＭＴレポーターイオンを含んでおり、最上位１０以内の最も強い質量対電荷比のイオンのみを、全ての質量トリガーに対して使用した。以下の条件をｄｄＭＳ２ ＯＴ－ＥＴＤ（データ依存ＭＳ／ＭＳ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ検出－電子移動解離）には使用した：ＭＳｎレベル、２；四重極単離、１．６ｍ／ｚ単離ウィンドウ；５０ｍｓのＥＴＤ反応時間；検出器タイプ、Ｏｒｂｉｔｒａｐ、自動ｍ／ｚ正常走査範囲、３０Ｋ分解能；ＡＧＣ標的、５ｅ４、利用可能な全ての並列化可能な時間、２２ｍｓの最大注入時間でイオンを注入する；１μｓｃａｎ、プロファイル。ｄｄＭＳ２ ＯＴ－ＨＣＤとｄｄＭＳ２ ＯＴ－ＥＴＤとの間の依存スキャンの数を１に設定した。
【0120】
様々な質量分析法の分析からのデータを、Ｘｃａｌｉｂｕｒ（商標）データ取得及び解釈ソフトウェア（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号ＯＰＴＯＮ－３０９６ ７、ＭａｘＱｕａｎｔ及びＰｅｒｓｅｕｓソースプロテオミクスデータ分析ソフトウェア（ＭａｘＰｌａｎｃｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、及びＲ ３．６統計プログラミングソフトウェア（Ｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ、Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ）で処理した。部位占有率は、ＩｏｄｏＴＭＴレポーターイオンピーク面積を用いた式１によって推定され、式中、Ａ２は非コンジュゲート試料の面積であり、Ａ１は共役試料の面積である。正規化係数は、ＴＭＴレポーターイオンを使用する式２によって計算され、式中、Ｂ１は共役試料のピーク面積であり、Ｂ２は非共役試料のピーク面積である。
【0121】
【数1】
【0122】
本明細書に記載された実施例及び実施形態は、例示のみを目的としたものであり、上述の実施形態に対する変更は、その広範な発明概念から逸脱することなくなされ得ることが理解される。したがって、本発明は、開示された特定の実施形態に制限されず、添付の特許請求の範囲によって定義されるような本発明の趣旨及び範囲内の修正をも包含することを意図するものと理解される。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図10A】
【図10B】
【図11】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図13D】
【図13E】
【図13F】
【図14A】
【図14B】
【図14C】
【図15】
【図16A】
【図16B】
【図16C】
【図16D】
【図17A】
【図17B】
【図18A】
【図18B】
【図19A】
【図19B】
【図19C】
【図20A】
【図20B】
【国際調査報告】