特表 2022-548957 キャップガイド及びＲＮＡマッピングのためのその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-11-22

(54)【発明の名称】キャップガイド及びＲＮＡマッピングのためのその使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/11 20060101AFI20221115BHJP

   C12Q 1/6813 20180101ALI20221115BHJP

【ＦＩ】

C12N15/11 Z ZNA

C12Q1/6813 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022517933

(86)(22)【出願日】2020-09-18

(85)【翻訳文提出日】2022-03-18

(86)【国際出願番号】 US2020051583

(87)【国際公開番号】W WO2021055811

(87)【国際公開日】2021-03-25

(31)【優先権主張番号】62/902,604

(32)【優先日】2019-09-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】513084469

【氏名又は名称】モデルナティエックス インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＭｏｄｅｒｎａＴＸ，Ｉｎｃ．

(74)【代理人】

【識別番号】100188558

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100195796

【弁理士】

【氏名又は名称】塩尻 一尋

(72)【発明者】

【氏名】ニコラス・ジェイ・アマト

(72)【発明者】

【氏名】セレヌス・フア

(72)【発明者】

【氏名】ケリー・サランドリア

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA20

4B063QQ02

4B063QQ04

4B063QQ05

4B063QQ08

4B063QQ52

4B063QR55

4B063QR62

4B063QS32

4B063QS34

4B063QS36

4B063QX02

(57)【要約】

本開示は、一部の実施形態において、単離核酸（キャップガイドとも呼ばれる）及びＲＮＡマッピングのためのその使用方法に関する。本開示は部分的に、ｍＲＮＡ分子の最初のヌクレオチドの少なくとも７ヌクレオチド下流にある位置に結合するガイドＲＮＡに基づいている。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

５’から３’へと、式、
［Ｒ］_ｑＤ_１Ｄ_２Ｄ_３Ｄ_４［Ｒ］_ｐ
で表される単離核酸であって、
式中、それぞれのＲは非修飾または修飾ＲＮＡヌクレオチドであり、Ｄはデオキシリボヌクレオチド塩基であり、ｑ及びｐのそれぞれは独立して、０～５０の整数であり、
前記単離核酸は、ｍＲＮＡの最初のヌクレオチドの少なくとも７ヌクレオチド下流の位置において前記ｍＲＮＡにハイブリダイズし、
ＲＮａｓｅ Ｈの存在下における前記単離核酸の前記ｍＲＮＡへのハイブリダイゼーションは、前記ＲＮａｓｅ Ｈによる前記ｍＲＮＡの開裂をもたらす、
前記単離核酸。

【請求項2】

前記ｍＲＮＡは配列番号：１または配列番号：２に記載の５’ＵＴＲを含む、請求項１に記載の単離核酸。

【請求項3】

式中、少なくとも１つのＲは、
ｉ）修飾ＲＮＡヌクレオチド、任意選択的に、２’－Ｏ－メチル修飾ＲＮＡ塩基、２’フルオロ修飾ＲＮＡ塩基、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、またはロックド核酸（ＬＮＡ）、
ｉｉ）修飾主鎖であって、任意選択的に、前記修飾主鎖はホスホロチオエート主鎖である、前記修飾主鎖、または
ｉｉｉ）ｉ）とｉｉ）の組み合わせ、
を含む、請求項１または請求項２に記載の単離核酸。

【請求項4】

式中、Ｄ_１及びＤ_３はシトシン（Ｃ）を含み、Ｄ_２及びＤ_４はチミン（Ｔ）を含む、請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の単離核酸。

【請求項5】

５’から３’へと、式、
［Ｒ］_ｑＤ_１Ｄ_２Ｄ_３Ｄ_４［Ｒ］_ｐ
で表される単離核酸であって、
式中、それぞれのＲは非修飾または修飾ＲＮＡ塩基であり、Ｄはデオキシリボヌクレオチド塩基であり、ｑ及びｐのそれぞれは独立して、０～５０の整数であり、
式中、Ｄ_１及びＤ_３はシトシン（Ｃ）を含み、Ｄ_２及びＤ_４はチミン（Ｔ）を含み、
ＲＮａｓｅ Ｈの存在下における前記単離核酸のｍＲＮＡ ５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）へのハイブリダイゼーションは、前記ＲＮａｓｅ Ｈによる前記ｍＲＮＡ ５’ＵＴＲの開裂をもたらす、
前記単離核酸。

【請求項6】

式中、Ｄ_１、Ｄ_２、Ｄ_３、及びＤ_４のうちの少なくとも１つは非修飾デオキシリボヌクレオチド塩基である、請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の単離核酸。

【請求項7】

式中、Ｄ_１、Ｄ_２、Ｄ_３、及びＤ_４のうちの少なくとも１つは修飾デオキシリボヌクレオチド塩基である、請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の単離核酸。

【請求項8】

前記修飾デオキシリボヌクレオチド塩基は、５－ニトロインドール、イノシン、４－ニトロインドール、６－ニトロインドール、３－ニトロピロール、２－６－ジアミノプリン、２－アミノ－アデニン、または２－チオ－チアミンである、請求項７に記載の単離核酸。

【請求項9】

前記ＲＮａｓｅ Ｈによる前記ｍＲＮＡ ５’ＵＴＲの前記開裂は、インタクトｍＲＮＡキャップの遊離をもたらす、請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の単離核酸。

【請求項10】

前記ｍＲＮＡはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）ＲＮＡである、請求項１から請求項９のいずれか１項に記載の単離核酸。

【請求項11】

前記単離核酸は表２に記載の配列から選択される、請求項１から請求項１０のいずれか１項に記載の単離核酸。

【請求項12】

前記単離核酸は配列番号：３または配列番号：４である、請求項１１に記載の単離核酸。

【請求項13】

前記単離核酸は配列番号：５または配列番号：６である、請求項１１に記載の単離核酸。

【請求項14】

前記単離核酸は配列番号：７または配列番号：８である、請求項１１に記載の単離核酸。

【請求項15】

前記単離核酸は配列番号：９または配列番号：１０である、請求項１１に記載の単離核酸。

【請求項16】

前記単離核酸は配列番号：１１または配列番号：１２である、請求項１１に記載の単離核酸。

【請求項17】

前記単離核酸は配列番号：１３または配列番号：１４である、請求項１１に記載の単離核酸。

【請求項18】

前記単離核酸は配列番号：１５である、請求項１１に記載の単離核酸。

【請求項19】

複数の単離核酸を含む組成物であって、前記単離核酸のそれぞれは個別に、請求項１から請求項１８のいずれか１項に記載の単離核酸である、前記組成物。

【請求項20】

前記複数は３つまたはそれ以上の単離核酸である、請求項１９に記載の組成物。

【請求項21】

バッファー、及び任意選択的に、ＲＮａｓｅ Ｈ酵素を更に含む、請求項１９または請求項２０に記載の組成物。

【請求項22】

単離核酸を選択するための方法であって、
請求項１から請求項１８のいずれか１項に記載の単離核酸にハイブリダイズしたｍＲＮＡをＲＮａｓｅ酵素で消化して、複数のｍＲＮＡフラグメントを生成すること、
前記複数のｍＲＮＡフラグメントを物理的に分離すること、
前記複数のｍＲＮＡフラグメントを検出することによって前記ｍＲＮＡのシグネチャープロファイルを作成すること、
前記シグネチャープロファイルを既知のｍＲＮＡシグネチャープロファイルと比較すること、及び
前記シグネチャープロファイルの前記既知のＲＮＡシグネチャープロファイルとの前記比較に基づいて、前記単離核酸を選択すること、
を含む、前記方法。

【請求項23】

前記選択すること及び／または前記検出することは、ゲル電気泳動、キャピラリ電気泳動、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、及び質量分析からなる群から選択される方法を含む、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記ＨＰＬＣはＨＰＬＣ－ＵＶである、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記質量分析はエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）またはマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）質量分析である、請求項２３に記載の方法。

【請求項26】

前記ｍＲＮＡは、消化前において、尿素、ＥＤＴＡ、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ_２）、及びトリスからなる群から選択される少なくとも１種の構成成分を含むバッファーと混合されている、請求項２２から請求項２５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項27】

前記ｍＲＮＡ及び前記バッファーは６０℃～１００℃の温度でインキュベートされる、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記消化に続いて、前記ｍＲＮＡ試料を２’，３’－環状－ヌクレオチド ３’－ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）とインキュベートしてＣＮＰ処理済みｍＲＮＡ試料を作製することを更に含む、請求項２２から請求項２７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項29】

前記ｍＲＮＡをＣＮＰと前記インキュベートすることは約１時間実施される、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記ＣＮＰ処理済みｍＲＮＡを子ウシ腸内アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）とインキュベートすることを更に含む、請求項２８に記載の方法。

【請求項31】

前記ｍＲＮＡを酵素阻害剤とインキュベートすることを更に含む、請求項２８から請求項３０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項32】

前記酵素阻害剤はＥＤＴＡである、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記シグネチャープロファイルは吸収スペクトルまたは質量スペクトルの形態である、請求項２２から請求項３２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項34】

前記単離核酸は請求項１から請求項１８のいずれか１項に記載の単離核酸である、請求項２２から請求項３３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項35】

前記ｍＲＮＡ ５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）は配列番号：１または配列番号：２を含む、請求項２２から請求項３４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項36】

前記比較することは、前記シグネチャープロファイルの前記既知のＲＮＡシグネチャープロファイルとの前記比較に基づいて、前記ｍＲＮＡのキャップ構造を同定することを含む、請求項２２から請求項３５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項37】

ＲＮＡ医薬組成物の品質管理のための方法であって、
前記ＲＮＡ医薬組成物をＲＮａｓｅ Ｈ酵素で消化して、複数のＲＮＡフラグメントを生成すること、
前記複数のＲＮＡフラグメントを物理的に分離すること、
前記複数のフラグメントを検出することによって前記ＲＮＡ医薬組成物のシグネチャープロファイルを作成すること、
前記シグネチャープロファイルを既知のＲＮＡシグネチャープロファイルと比較すること、及び
前記シグネチャープロファイルの前記既知のＲＮＡシグネチャープロファイルとの前記比較に基づいて、前記ＲＮＡの品質を測定すること、
を含み、
前記消化工程は、前記ＲＮＡ医薬組成物をＲＮａｓｅ Ｈ酵素と接触させる前に、前記ＲＮＡ医薬組成物を請求項１から請求項１８のいずれか１項に記載の単離核酸または請求項１９から請求項２１のいずれか１項に記載の医薬組成物と接触させることを含む、
前記方法。

【請求項38】

前記消化工程はブロッキングオリゴヌクレオチドの存在下で実施される、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記ブロッキングオリゴヌクレオチドは少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含み、任意選択的に、前記修飾は、ロックド核酸ヌクレオチド（ＬＮＡ）、２’ＯＭｅ－修飾ヌクレオチド、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）ヌクレオチドから選択される、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

前記ブロッキングオリゴヌクレオチドは前記試験ｍＲＮＡの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）または３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を標的とする、請求項３８または請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

前記ｍＲＮＡはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）によって調製される、請求項３７から請求項４０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項42】

前記ＲＮＡは治療用ｍＲＮＡである、請求項３７から請求項４１のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ｍＲＮＡ生成プロセス中におけるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の特性決定のための方法に関する。
関連出願
本出願は、２０１９年９月１９日出願、表題「ＣＡＰ ＧＵＩＤＥＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＵＳＥ ＴＨＥＲＥＯＦ ＦＯＲ ＲＮＡ ＭＡＰＰＩＮＧ」の米国仮出願シリアル番号６２／９０２，６０４の出願日に対する米国特許法１１９（ｅ）条の利益を主張するものであり、その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

大型ｍＲＮＡの構造バリアント、例えば、配列中断、不均一ポリＡテール、または折り畳み構造などの確認は、前臨床及び臨床試験用に製造されたｍＲＮＡベース製品を特性決定してその製剤の一貫性、安全性、及び活性を確保するために必須である。大きなサイズ及び構造バリアントは、必要な解像度または感度を有していない多くの利用可能な解析ツールに課題を課している。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】WO2018/081462A1

【特許文献2】WO2014/144039A1

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0004】

本開示は少なくとも部分的に、ＲＮａｓｅ Ｈ及びホスファターゼを用いた処理後のｍＲＮＡ上におけるある特定の核酸種（例えば、キャップ種、コード領域種、ポリＡテール種など）の相対存在量を測定するのに有用なキャップガイドの設計、スクリーニング、及び選択に基づいている。本開示は部分的に、標的核酸の最初の核酸残基の少なくとも７ヌクレオチド下流（例えば、標的核酸の最初の核酸残基に対して３’）の位置においてｍＲＮＡ分子などの標的核酸に特異的に結合（例えば、ハイブリダイズ）する単離核酸に基づいている。一部の態様では、このような単離核酸は、１つまたは複数の修飾、例えば、１つまたは複数の２’－Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）修飾、１つまたは複数のホスホロチオエート（ＰＳ）修飾、またはこれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の単離核酸（例えば、キャップガイド）は、これまでに記載されたガイド核酸と比較してより高い感度及び／または特異度でｍＲＮＡ種を検出する。

【0005】

それゆえ、本開示の態様は、５’から３’へと、式、
［Ｒ］_ｑＤ_１Ｄ_２Ｄ_３Ｄ_４［Ｒ］_ｐ
で表される単離核酸に関し、
式中、それぞれのＲは非修飾または修飾ＲＮＡ塩基であり、Ｄはデオキシリボヌクレオチド塩基であり、ｑ及びｐのそれぞれは独立して、０～５０の整数であり、単離核酸は、ｍＲＮＡの最初のヌクレオチドの少なくとも７ヌクレオチド下流の位置においてｍＲＮＡにハイブリダイズし、ＲＮａｓｅ Ｈの存在下における単離核酸のｍＲＮＡへのハイブリダイゼーションは、ＲＮａｓｅ ＨによるｍＲＮＡの開裂をもたらす。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは配列番号：１または配列番号：２に記載の５’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、Ｄ_１及びＤ_３はシトシン（Ｃ）を含み、Ｄ_２及びＤ_４はチミン（Ｔ）を含む。一部の実施形態では、それぞれのＲは、２’ＯＭｅ修飾及び／またはホスホロチオエート修飾を含む。

【0006】

本開示の態様は、５’から３’へと、式、
［Ｒ］_ｑＤ_１Ｄ_２Ｄ_３Ｄ_４［Ｒ］_ｐ
で表される単離核酸に関し、
式中、それぞれのＲは非修飾または修飾ＲＮＡ塩基であり、Ｄはデオキシリボヌクレオチド塩基であり、ｑ及びｐのそれぞれは独立して、０～５０の整数であり、ＲＮａｓｅ Ｈの存在下における、ｍＲＮＡ ５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）の＋７位への単離核酸のハイブリダイゼーションは、ＲＮａｓｅ ＨによるｍＲＮＡ ５’ＵＴＲの開裂をもたらし、ｍＲＮＡ ５’ＵＴＲは配列番号：１または配列番号：２を含む。一部の実施形態では、Ｄ_１及びＤ_３はシトシン（Ｃ）を含み、Ｄ_２及びＤ_４はチミン（Ｔ）を含む。

【0007】

本開示の態様は、５’から３’へと、式、
［Ｒ］_ｑＤ_１Ｄ_２Ｄ_３Ｄ_４［Ｒ］_ｐ
で表される単離核酸に関し、
式中、それぞれのＲは非修飾または修飾ＲＮＡ塩基であり、Ｄはデオキシリボヌクレオチド塩基であり、ｑ及びｐのそれぞれは独立して、０～５０の整数であり、式中、Ｄ_１及びＤ_３はシトシン（Ｃ）を含み、Ｄ_２及びＤ_４はチミン（Ｔ）を含み、ＲＮａｓｅ Ｈの存在下における、ｍＲＮＡ ５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）の＋７位への単離核酸のハイブリダイゼーションは、ＲＮａｓｅ ＨによるｍＲＮＡ ５’ＵＴＲの開裂をもたらす。

【0008】

一部の実施形態では、少なくとも１つのＲは、修飾ＲＮＡヌクレオチド、任意選択的に、２’－Ｏ－メチル修飾ＲＮＡヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ＲＮＡヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、またはロックド核酸（ＬＮＡ）である。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲは、修飾ＲＮＡ主鎖、任意選択的に、ホスホロチオエート（ＰＳ）主鎖を含む。一部の実施形態では、Ｄ_１、Ｄ_２、Ｄ_３、及びＤ_４のうちの少なくとも１つは非修飾デオキシリボヌクレオチド塩基である。一部の実施形態では、Ｄ_１、Ｄ_２、Ｄ_３、及びＤ_４のうちの少なくとも１つは修飾デオキシリボヌクレオチド塩基である。

【0009】

一部の実施形態では、修飾デオキシリボヌクレオチド塩基は、５－ニトロインドール、イノシン、４－ニトロインドール、６－ニトロインドール、３－ニトロピロール、２－６－ジアミノプリン、２－アミノ－アデニン、または２－チオ－チアミンである。

【0010】

一部の実施形態では、ＲＮａｓｅ ＨによるｍＲＮＡの開裂は、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲの遊離をもたらす。一部の実施形態では、ＲＮａｓｅ ＨによるｍＲＮＡの開裂は、ｍＲＮＡのポリＡテールの遊離をもたらす。一部の実施形態では、ＲＮａｓｅ ＨによるｍＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ ５’ＵＴＲ）の開裂は、インタクトｍＲＮＡキャップの遊離をもたらす。一部の実施形態では、ｍＲＮＡはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）ＲＮＡである。

【0011】

一部の実施形態では、単離核酸は表２に記載の配列から選択される。一部の実施形態では、単離核酸は配列番号：３または配列番号：４である。一部の実施形態では、単離核酸は配列番号：５または配列番号：６である。一部の実施形態では、単離核酸は配列番号：７または配列番号：８である。一部の実施形態では、単離核酸は配列番号：９または配列番号：１０である。一部の実施形態では、単離核酸は配列番号：１１または配列番号：１２である。一部の実施形態では、単離核酸は配列番号：１３または配列番号：１４である。一部の実施形態では、単離核酸は配列番号：１５である。

【0012】

本開示の態様は、複数の単離核酸を含む組成物に関し、単離核酸のそれぞれは個別に、本明細書に記載の単離核酸である。一部の実施形態では、複数は３つまたはそれ以上の単離核酸である。一部の実施形態では、組成物は、バッファー、及び任意選択的に、ＲＮａｓｅ Ｈ酵素を更に含む。

【0013】

本開示の態様は、単離核酸を選択するための方法に関し、方法は、本明細書で提供する単離核酸にハイブリダイズしたｍＲＮＡをＲＮａｓｅ酵素で消化して、複数のｍＲＮＡフラグメントを生成すること、複数のｍＲＮＡフラグメントを物理的に分離すること、複数のｍＲＮＡフラグメントを検出することによってｍＲＮＡのシグネチャープロファイルを作成すること、シグネチャープロファイルを既知のｍＲＮＡシグネチャープロファイルと比較すること、及び、シグネチャープロファイルの既知のＲＮＡシグネチャープロファイルとの比較に基づいて、単離核酸を選択することを含む。

【0014】

一部の実施形態では、選択すること及び／または検出することは、ゲル電気泳動、キャピラリ電気泳動、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、及び質量分析からなる群から選択される方法を含む。一部の実施形態では、ＨＰＬＣはＨＰＬＣ－ＵＶである。一部の実施形態では、質量分析はエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）またはマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）質量分析である。

【0015】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、消化前において、尿素、ＥＤＴＡ、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ_２）、及びトリスからなる群から選択される少なくとも１種の構成成分を含むバッファーと混合されている。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ及びバッファーは６０℃～１００℃の温度でインキュベートされる。

【0016】

一部の実施形態では、本明細書で提供する方法は、消化に続いて、ｍＲＮＡ試料を２’，３’－環状－ヌクレオチド ３’－ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）とインキュベートしてＣＮＰ処理済みｍＲＮＡ試料を作製することを更に含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡをＣＮＰとインキュベートすることは約１時間実施される。一部の実施形態では、方法は、ＣＮＰ処理済みｍＲＮＡを子ウシ腸内アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）とインキュベートすることを更に含む。

【0017】

一部の実施形態では、方法は、ｍＲＮＡを酵素阻害剤とインキュベートすることを更に含む。一部の実施形態では、酵素阻害剤はＥＤＴＡである。

【0018】

一部の実施形態では、シグネチャープロファイルは吸収スペクトルまたは質量スペクトルの形態である。

【0019】

一部の実施形態では、単離核酸は本明細書に記載の単離核酸である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ ５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）は配列番号：１または配列番号：２を含む。

【0020】

一部の実施形態では、シグネチャープロファイルは、シグネチャープロファイルの既知のＲＮＡシグネチャープロファイルとの比較に基づいて、ｍＲＮＡのキャップ構造を同定することを含む。

【0021】

本開示の態様は、ＲＮＡ医薬組成物をＲＮａｓｅ Ｈ酵素で消化して、複数のＲＮＡフラグメントを生成すること、複数のＲＮＡフラグメントを物理的に分離すること、複数のフラグメントを検出することによってＲＮＡ医薬組成物のシグネチャープロファイルを作成すること、シグネチャープロファイルを既知のＲＮＡシグネチャープロファイルと比較すること、及び、シグネチャープロファイルの既知のＲＮＡシグネチャープロファイルとの比較に基づいて、ＲＮＡの品質を測定すること、を含む、ＲＮＡ医薬組成物の品質管理のための方法に関し、消化工程は、ＲＮＡ医薬組成物をＲＮａｓｅ Ｈ酵素と接触させる前に、ＲＮＡ医薬組成物を本明細書に記載の単離核酸または本明細書に記載の医薬組成物と接触させることを含む。

【0022】

一部の実施形態では、消化工程はブロッキングオリゴヌクレオチドの存在下で実施される。一部の実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含み、任意選択的に、修飾は、ロックド核酸ヌクレオチド（ＬＮＡ）、２’ＯＭｅ－修飾ヌクレオチド、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）ヌクレオチドから選択される。一部の実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の修飾主鎖結合、例えば、１つまたは複数のホスホロチオエート結合を含む。一部の実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、完全修飾主鎖、例えば、ホスホロチオエート（ＰＳ）主鎖を含む。一部の実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、試験ｍＲＮＡの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、オープンリーディングフレーム、または３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を標的とする。

【0023】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）によって調製される。一部の実施形態では、ＲＮＡは治療用ｍＲＮＡである。

【0024】

本発明の限定のそれぞれは本発明の様々な実施形態を包含し得る。それゆえ、任意の１つの要素または要素の組み合わせを含む本発明の限定のそれぞれが本発明のそれぞれの態様に含まれ得ることが予想される。本発明はその適用において、以下の説明に記載するまたは図面に示す構造の詳細及び構成成分の配合に限定されない。本発明はその他の実施形態においても可能であり、また様々な方法で実施または実行可能である。また、本明細書で使用する表現及び専門用語は説明を目的としたものであり、限定としてみなされるべきではない。本明細書で使用する、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、または「有する」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、及びその変化形態は、その後に列記される要素及びそれらの等価物、ならびに更なる要素を包含することを意味する。

【0025】

以下の図面は本明細書の一部を形成し、本開示の特定の態様を更に説明するために含まれるが、本明細書で提供する特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせてこれら図面のうちの１つまたは複数を参照することにより、本開示の特定の態様をより適切に理解することが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1】ＲＮａｓｅ Ｈ及びホスファターゼを用いた処理後のｍＲＮＡ上におけるキャップ種の相対存在量の代表的なデータを示す。

【図2】ＲＮａｓｅ Ｈ及びホスファターゼを用いた処理後のｍＲＮＡ上におけるキャップ種の代表的な質量分析プロファイルを示す。

【図3】キャップ種の保持時間の代表的なトータルイオンクロマトグラム（ＴＩＣ）データを示す。

【図4】試料１の相対キャップ定量比較の代表的なデータを示す。

【図5】試料６の相対キャップ定量比較の代表的なデータを示す。

【図6】目的の主鎖修飾の代表的な構造を示す。

【図7】隣接ＬＮＡ配列または隣接ＬＮＡ／２’ＯＭｅ配列を含むキャップガイド配列を示す。配列番号：１８～２３を示す。

【図8】主鎖修飾スクリーニングによる正規化キャップ１存在度の代表的なデータを示す。

【図9】主鎖修飾スクリーニングによる保持時間の代表的なトータルイオンクロマトグラム（ＴＩＣ）データを示す。

【図10】異なる濃度の修飾キャップガイドを使用した解析によるキャップ１存在量の代表的なデータを示す。

【図11】キャップガイド７ＰＳ直線性の代表的なデータを示す。

【図12A】ワクシニアキャップ付加ｍＲＮＡにおけるキャップガイド７ＰＳ及び現行キャップガイドの存在率の代表的なデータを示す。

【図12B】キャップガイド７ＰＳ及び現行キャップガイドの存在量の代表的なデータを示す。

【図13】ワクシニアキャップ付加ｍＲＮＡ及び共転写（共転写物）キャップ付加ｍＲＮＡにおけるキャップガイド７ＰＳ及び現行キャップガイドの存在率の代表的なデータを示す。

【図14】ＬＣ－ＵＶ分析による共転写物アッセイの代表的なデータを示す。

【図15】共転写物ＬＣ－ＵＶキャップアッセイによる配列バリアントの効果の代表的なデータを示す。

【図16】従来ガイド条件対ピーク面積（上段パネル）及び７ｎｔガイド条件対ピーク面積（下段パネル）の代表的なデータを示す。

【図17】従来ガイド及び７ｎｔガイドにおけるガイド濃度及び消化時間の代表的なデータを示す。

【発明を実施するための形態】

【0027】

治療的文脈における対象へのｍＲＮＡ分子の送達は、核酸ベース送達システム（例えば、ウイルスベクター及びＤＮＡベースプラスミド）を必要とすることなくｍＲＮＡの細胞内翻訳及び少なくとも１種の目的のコードペプチドまたはポリペプチドの生成を可能とする点から期待が持てる。治療用ｍＲＮＡ分子は一般的に研究室で合成される（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって）。しかしながら、製造プロセス中には、不純物または夾雑物、例えば、誤って合成されたｍＲＮＡ及び／または望ましくない合成試薬などを最終治療用製剤へと持ち越してしまうという潜在的なリスクがある。不純または汚染されたｍＲＮＡの投与を防止するため、使用前に、ｍＲＮＡ分子に対して品質管理（ＱＣ）手順（例えば、認証または確認された）を実施してもよい。認証により、適切なｍＲＮＡ分子が合成されておりかつ純粋であることが確実となる。

【0028】

本明細書では、ｍＲＮＡ（例えば、ＲＮＡ試料中の標的ｍＲＮＡ）を解析及び特性決定するための組成物及び方法を提供する。本開示は部分的に、標的核酸の最初の核酸位置の少なくとも７ヌクレオチド下流（例えば、標的核酸の最初の核酸位置に対して３’）の位置においてｍＲＮＡ分子などの標的核酸に特異的に結合（例えば、ハイブリダイズ）する単離核酸に基づいている。一部の実施形態では、このような単離核酸は「＋７ガイド」または「７ｎｔ」ガイドと呼ばれる。一部の態様では、このような単離核酸（例えば、７ｎｔガイド）は、１つまたは複数の修飾、例えば、１つまたは複数の２’－Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）修飾、１つまたは複数のホスホロチオエート（ＰＳ）修飾、またはこれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の単離核酸（例えば、キャップガイド）は、これまでに記載されたガイド核酸と比較してより高い感度及び／または特異度でｍＲＮＡ種を検出する。

【0029】

一部の実施形態では、本開示の単離核酸は、ｍＲＮＡを解析及び特性決定するために使用される。それゆえ、一部の実施形態では、本開示は、ｍＲＮＡを解析及び特性決定するための単離核酸を選択するための方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載の単離核酸を含むｍＲＮＡ医薬組成物の品質管理のための方法を提供する。

【0030】

単離核酸
一部の態様では、本開示は、ｍＲＮＡ（例えば、標的ｍＲＮＡ）にアニールしてそのｍＲＮＡのＲＮａｓｅ Ｈ開裂を誘導する単離核酸（例えば、特定のオリゴ）を提供する。一部の実施形態では、単離核酸は「ガイド鎖」または「キャップガイド」と呼ばれる。

【0031】

「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、互いに共有結合した少なくとも２つのヌクレオチドであり、一部の例では、ホスホジエステル結合（例えば、ホスホジエステル「主鎖」）または修飾結合（例えば、修飾主鎖）、例えば、ホスホロチオエート結合（例えば、ホスホロチオエート（ＰＳ）主鎖）などを含有していてもよい。「単離核酸」は自然に発生しない核酸である。一部の例では、ｍＲＮＡ試料中のｍＲＮＡは単離ｍＲＮＡを含む。しかしながら、全体として単離核酸が天然ではないという一方で、自然に発生するヌクレオチド配列を含み得るということを理解すべきである。それゆえ、「ポリヌクレオチド」または「核酸」配列は、一般的にＤＮＡ及びＲＮＡ内における、一続きのヌクレオチド塩基（「ヌクレオチド」とも呼ばれる）であり、２つまたはそれ以上のヌクレオチドの任意の鎖のことを意味する。この用語は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、任意の合成及び遺伝子操作されたポリヌクレオチドを含む。この用語は、一本鎖分子及び二本鎖分子、すなわち、ＤＮＡ－ＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡ、及びＲＮＡ－ＲＮＡハイブリッドに加えて、塩基をアミノ酸主鎖にコンジュゲートすることによって形成された「タンパク質核酸」（ＰＮＡ）、及び、２’酸素及び４’炭素を連結する追加の架橋でＲＮＡのリボース部分を修飾することによって形成された「ロックド核酸」を含む。

【0032】

単離核酸は、長さにおいて、例えば、約２ヌクレオチド長～約５０，０００ヌクレオチド長の範囲であってもよい。一部の実施形態では、単離核酸は、約２～１０、５～２０、１０～５０、５０～２００、１００～５００、２５０～１０００、５００～２５００、１０００～５０００、２５００～１０，０００、５，０００～２５，０００、１０，０００～５０，０００、またはそれ以上のヌクレオチド長の範囲である。一部の実施形態では、単離核酸は５０，０００ヌクレオチド長よりも長い。

【0033】

本開示の態様は、最初の核酸位置（例えば、核酸塩基）の少なくとも７ヌクレオチド「下流」のｍＲＮＡの位置に結合する単離核酸（例えば、ガイド）に関する。一部の実施形態では、単離核酸（例えば、ガイド）は、最初の核酸位置の４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、またはそれ以上の数のヌクレオチド下流の位置においてｍＲＮＡに結合する。一部の実施形態では、単離核酸（例えば、ガイド）は、最初の核酸位置の２５ヌクレオチド超（例えば、３０、４０、５０、１００、２００、５００、またはそれ以上の数）のヌクレオチド下流の位置においてｍＲＮＡに結合する。一部の実施形態では、単離核酸（例えば、ガイド）は、ｍＲＮＡ非翻訳領域（ＵＴＲ）、例えば、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲなどの１つまたは複数の核酸位置に結合する。一部の実施形態では、単離核酸（例えば、ガイド）は、ｍＲＮＡのタンパク質コード領域の１つまたは複数の核酸位置（例えば、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲと３’ＵＴＲの間の１つまたは複数の位置、例えば、オープンリーディングフレームなど）に結合する。一部の実施形態では、単離核酸は、最後のタンパク質コード核酸位置（例えば、「終止」コドンの最後の核酸位置）の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、またはそれ以上の数のヌクレオチド上流に結合する。

【0034】

一部の態様では、本開示は、５’から３’へと、式、
［Ｒ］_ｑＤ_１Ｄ_２Ｄ_３Ｄ_４［Ｒ］_ｐ
で表される単離核酸に関し、
式中、それぞれのＲは非修飾または修飾ＲＮＡ塩基であり、Ｄはデオキシリボヌクレオチド塩基であり、ｑ及びｐのそれぞれは独立して、０～５０の整数であり、単離核酸は、ｍＲＮＡの最初のヌクレオチドの少なくとも７ヌクレオチド下流の位置においてｍＲＮＡにハイブリダイズし、ＲＮａｓｅ Ｈの存在下における単離核酸のｍＲＮＡへのハイブリダイゼーションは、ＲＮａｓｅ ＨによるｍＲＮＡの開裂をもたらす。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは配列番号：１または配列番号：２に記載の５’ＵＴＲを含む。

【0035】

一部の態様では、本開示は、５’から３’へと、式、
［Ｒ］_ｑＤ_１Ｄ_２Ｄ_３Ｄ_４［Ｒ］_ｐ
で表される単離核酸を提供し、
式中、それぞれのＲは修飾または非修飾ＲＮＡ塩基であり、Ｄはデオキシリボヌクレオチド塩基であり、ｑ及びｐのそれぞれは独立して、０～５０の整数であり、ＲＮａｓｅ Ｈの存在下における単離核酸のｍＲＮＡ ５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）へと少なくとも７ｎｔ内側の核酸位置へのハイブリダイゼーションは、ＲＮａｓｅ ＨによるｍＲＮＡ ５’ＵＴＲの開裂をもたらす。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ ５’ＵＴＲは配列番号：１または配列番号：２を含む。

【表1】

【0036】

一部の態様では、本開示は、５’から３’へと、式、
［Ｒ］_ｑＤ_１Ｄ_２Ｄ_３Ｄ_４［Ｒ］_ｐ
で表される単離核酸を提供し、
式中、それぞれのＲは修飾または非修飾ＲＮＡ塩基であり、Ｄはデオキシリボヌクレオチド塩基であり、ｑ及びｐのそれぞれは独立して、０～５０の整数であり、式中、Ｄ_１及びＤ_３はシトシン（Ｃ）を含み、Ｄ_２及びＤ_４はチミン（Ｔ）を含み、ＲＮａｓｅ Ｈの存在下における単離核酸のｍＲＮＡ ５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）へのハイブリダイゼーションは、ＲＮａｓｅ ＨによるｍＲＮＡ ５’ＵＴＲの開裂をもたらす。

【0037】

一部の実施形態では、少なくとも１つのＲは、修飾ＲＮＡヌクレオチド、例えば、２’－Ｏ－メチル修飾ＲＮＡヌクレオチドである。修飾の例としては、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－シュードウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５－メトキシウリジン、２’－Ｏ－メチルウリジン、及び２’－フルオロが挙げられるがこれらに限定されない。本明細書に記載のｍＲＮＡに有用な修飾のその他の例としては、米国特許出願公開番号２０１５／００６４２３５に列挙されているようなものが挙げられる。

【0038】

一部の実施形態では、少なくとも１つのＲは主鎖修飾を含む。「主鎖修飾」とは、単離核酸への１つまたは複数の非天然ホスフェート系結合の導入のことを意味する。例えば、例えば、リン酸基の酸素のうちの１つまたは複数を硫黄で置換すること（例えば、ホスホロチオエート（ＰＳ））によって、または、例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．２０００ Ａｐｒ．１０（２）：１１７－２１，Ｒｕｓｃｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．２０００ Ｏｃｔ．１０（５）：３３３－４５，Ｓｔｅｉｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．２００１ Ｏｃｔ．１１（５）：３１７－２５，Ｖｏｒｏｂｊｅｖ ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．２００１ Ａｐｒ．１１（２）：７７－８５、及び米国特許第５，６８４，１４３号に記載されているように、ヌクレオチドがその目的の機能を実行可能とするようなその他の置換を実施することによって、ヌクレオチドのリン酸基を修飾してもよい。上で言及した修飾（例えば、リン酸基修飾）のうちの特定のものは、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、上記アナログを含むポリヌクレオチドの加水分解速度を好ましくは低下させる。一部の実施形態では、単離核酸のそれぞれのＲは主鎖修飾を含む（例えば、ガイドは「Ｒ」部分に対する完全修飾主鎖を含む）。

【0039】

［Ｒ］_ｑ及び［Ｒ］_ｐのそれぞれの長さは独立して、様々な長さであり得る。例えば、一部の実施形態では、ｑは０～５０の整数（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０）であり、ｐは０～５０の整数（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０）である。

【0040】

一部の実施形態では、ｑは０～３０の整数（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）であり、ｐは０～３０の整数（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）である。

【0041】

一部の実施形態では、ｑは０～１５の整数（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５）であり、ｐは０～１５の整数（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５）である。

【0042】

一部の実施形態では、ｑは０～６の整数（例えば、０、１、２、３、４、５、または６）であり、ｐは１～１０の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）である。一部の実施形態では、ｐは０～６の整数（例えば、０、１、２、３、４、５、または６）であり、ｑは１～１０の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）である。

【0043】

一部の実施形態では、Ｄ_１及びＤ_２のそれぞれは非修飾（例えば、天然）デオキシリボヌクレオチド塩基である。本明細書で使用する場合、「非修飾デオキシリボヌクレオチド塩基」とは、天然ＤＮＡ塩基、例えば、アデノシン、グアノシン、シトシン、チミン、またはウラシルなどのことを意味する。一部の実施形態では、Ｄ_３、Ｄ_４、またはＤ_３及びＤ_４は、非天然（例えば、修飾）デオキシリボヌクレオチド塩基である。一部の実施形態では、Ｄ_１は非天然（例えば、修飾）デオキシリボヌクレオチド塩基である。一部の実施形態では、Ｄ_２は非天然（例えば、修飾）デオキシリボヌクレオチド塩基である。一部の実施形態では、Ｄ_３は非天然（例えば、修飾）デオキシリボヌクレオチド塩基である。一部の実施形態では、Ｄ_４は非天然（例えば、修飾）デオキシリボヌクレオチド塩基である。

【0044】

用語「修飾デオキシリボヌクレオチド塩基」、「ヌクレオチドアナログ」、または「変異ヌクレオチド」とは、非天然デオキシリボヌクレオチドを含む非標準的なヌクレオチドのことを意味する。好ましいヌクレオチドアナログは、ヌクレオチドアナログがその目的の機能を実行する能力をなおも保持しつつヌクレオチドの特定の化学的特性が変化するように、任意の位置で修飾されている。誘導体化され得るヌクレオチドの位置の例としては、５位、例えば、５－（２－アミノ）プロピルウリジン、５－ブロモウリジン、５－プロピンウリジン、５－プロペニルウリジンなど、６位、例えば、６－（２－アミノ）プロピルウリジン、アデノシン及び／またはグアノシンにおける８位、例えば、８－ブロモグアノシン、８－クロログアノシン、８－フルオログアノシンなどが挙げられる。ヌクレオチドアナログとしてはまた、デアザヌクレオチド、例えば、７－デアザ－アデノシン、Ｏ－及びＮ－修飾（例えば、アルキル化、例えば、Ｎ６－メチルアデノシン、または別の当該技術分野において周知のもの）ヌクレオチド、及び、Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，２０００ Ａｕｇ．１０（４）：２９７－３１０に記載されているようなその他の複素環的に修飾されたヌクレオチドアナログが挙げられる。

【0045】

ヌクレオチドアナログはまた、ヌクレオチドの糖部分に修飾を含んでいてもよい。例えば、２’ ＯＨ－基は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ_２、ＮＨＲ、ＮＲ_２、ＣＯＯＲ、またはＯＲから選択される基で置換されていてもよく、式中、Ｒは、置換または非置換Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールなどである。

【0046】

一部の実施形態では、非天然（例えば、修飾）デオキシリボヌクレオチド塩基は５－ニトロインドールまたはイノシンである。一部の実施形態では、修飾デオキシリボヌクレオチドは、４－ニトロインドール、６－ニトロインドール、３－ニトロピロール、２－６－ジアミノプリン、２－アミノ－アデニン、または２－チオ－チアミンである。

【0047】

一部の実施形態では、ＲＮａｓｅ Ｈの存在下における特定の単離核酸（例えば、ガイド鎖）のｍＲＮＡへのハイブリダイゼーションは、ＲＮａｓｅ ＨによるｍＲＮＡからのｍＲＮＡ ５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）の特定の分離をもたらす。いかなる特定の理論に制限されるものではないが、ｍＲＮＡのインタクト５’ＵＴＲの分離により、例えば、５’キャップフラグメントの質量分析によるｍＲＮＡの５’キャップ構造の特性決定が可能となる。一部の実施形態では、単離核酸は、ｍＲＮＡのその他の領域（例えば、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、ポリＡテールなど）の消化を伴うことなく、ｍＲＮＡのインタクト５’ＵＴＲの分離を誘導する。一部の実施形態では、単離核酸は、ｍＲＮＡのその他の領域（例えば、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、ポリＡテールなど）の消化を伴うことなく、ｍＲＮＡのインタクト５’ＵＴＲ及びｍＲＮＡの特定のその他の部分（例えば、コード配列またはその一部）の分離を誘導する。

【0048】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡ ５’ＵＴＲのＲＮａｓｅ Ｈ開裂を誘導する単離核酸（例えば、ガイド鎖）は、ｍＲＮＡにおけるｍＲＮＡの５’末端から７以上のヌクレオチドにある５’ＵＴＲ領域（例えば、ｍＲＮＡ開始コドンの最初のヌクレオチドのすぐ上流の領域）内の任意の場所にハイブリダイズし得る。例えば、一部の実施形態では、単離核酸（例えば、ガイド鎖）は、開始コドンの最初のヌクレオチドの１ヌクレオチド～約２００ヌクレオチド上流のｍＲＮＡ ５’ＵＴＲにハイブリダイズする。一部の実施形態では、単離核酸（例えば、ガイド鎖）は、開始コドンの最初のヌクレオチドの１ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド上流のｍＲＮＡ ５’ＵＴＲにハイブリダイズする。一部の実施形態では、単離核酸（例えば、ガイド鎖）は、開始コドンの最初のヌクレオチドの１ヌクレオチド～約５０ヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０ヌクレオチド）上流のｍＲＮＡ ５’ＵＴＲにハイブリダイズする。ｍＲＮＡ ５’ＵＴＲのＲＮａｓｅ Ｈ開裂をもたらす単離核酸（例えば、ガイド鎖）の非限定例を表２に示す。

【表2】

【0049】

複数の単離核酸を含む組成物（例えば、ガイド鎖のカクテル）についてもまた本開示において検討を行う。一部の実施形態では、複数の単離核酸を含む組成物（例えば、ガイド鎖のカクテル）は、５’ＵＴＲ、ＯＲＦ、及び３’ＵＴＲを含むがこれらに限定されないｍＲＮＡの様々な領域の同時（例えば、「ワンポット」）消化及びそれに続く分離に有用である。本開示に記載する組成物は２～１００の単離核酸（例えば、２～１００のガイド鎖）を含有していてもよい。一部の実施形態では、複数のガイド鎖を含む組成物は、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の固有の単離核酸（例えば、ガイド鎖）を含む。一部の実施形態では、組成物は、３つの異なる単離核酸（例えば、ガイド鎖）を含む。例えば、１つ、または２つのガイド鎖を同時に（例えば、連続的に）使用すると、ｍＲＮＡの複数の直交消化を同一の手順及びランタイムで同時に実施することができ、ＲＮａｓｅマッピング中におけるより高い配列カバレッジが可能となる。

【0050】

一部の態様では、本開示は、本開示に記載の複数の単離核酸を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、複数は３つまたはそれ以上の単離核酸である。一部の実施形態では、複数は、配列番号：３～１５からなる群から選択される３つまたはそれ以上の単離核酸である。

【0051】

一部の実施形態では、複数は、それぞれがｍＲＮＡの異なる部分の開裂（例えば、５’ＵＴＲ、オープンリーディングフレーム、３’ＵＴＲ、ポリＡテールなどの開裂）をもたらす５～５０の単離核酸を含む。一部の実施形態では、複数は、それぞれがｍＲＮＡ ５’ＵＴＲの開裂をもたらす５～５０の単離核酸を含む。一部の実施形態では、複数は、それぞれがｍＲＮＡの異なる部分の開裂（例えば、５’ＵＴＲ、オープンリーディングフレーム、３’ＵＴＲ、ポリＡテールなどの開裂）をもたらす１０～２０の単離核酸を含む。一部の実施形態では、複数は、それぞれがｍＲＮＡの異なる部分の開裂（例えば、５’ＵＴＲ、オープンリーディングフレーム、３’ＵＴＲ、ポリＡテールなどの開裂）をもたらす１～５の単離核酸を含む。一部の実施形態では、複数は、それぞれがｍＲＮＡ ５’ＵＴＲの開裂をもたらす１０～２０の単離核酸を含む。一部の実施形態では、複数は、それぞれがｍＲＮＡ ５’ＵＴＲの開裂をもたらす１～５の単離核酸を含む。

【0052】

一部の実施形態では、複数は、（ｉ）ｍＲＮＡ ５’ＵＴＲの開裂をもたらす少なくとも１つの単離核酸（例えば、本明細書で提供する単離核酸）、及び（ｉｉ）ｍＲＮＡ ３’ＵＴＲの開裂をもたらす少なくとも１つの単離核酸を含む。

【0053】

一部の実施形態では、複数は、（ｉ）ｍＲＮＡ ５’ＵＴＲの開裂をもたらす少なくとも１つの単離核酸（例えば、本明細書で提供する単離核酸）、（ｉｉ）ｍＲＮＡ ３’ＵＴＲの開裂をもたらす少なくとも１つの単離核酸、及び（ｉｉｉ）ｍＲＮＡ ＯＲＦの開裂をもたらす少なくとも１つの単離核酸を含む。

【0054】

ｍＲＮＡ ３’ＵＴＲのＲＮａｓｅ Ｈ開裂をもたらす単離核酸（例えば、ガイド鎖）は、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ領域（例えば、ｍＲＮＡ終止コドンの最後のヌクレオチドのすぐ下流の領域）内の任意の場所にハイブリダイズし得る。例えば、一部の実施形態では、単離核酸（例えば、ガイド鎖）は、終止コドンの最後のヌクレオチドの１ヌクレオチド～約２００ヌクレオチド下流のｍＲＮＡ ３’ＵＴＲにハイブリダイズする。一部の実施形態では、単離核酸（例えば、ガイド鎖）は、終止コドンの最後のヌクレオチドの１ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド下流のｍＲＮＡ ３’ＵＴＲにハイブリダイズする。一部の実施形態では、単離核酸（例えば、ガイド鎖）は、終止コドンの最後のヌクレオチドの１ヌクレオチド～約５０ヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０ヌクレオチド）下流のｍＲＮＡ ３’ＵＴＲにハイブリダイズする。

【0055】

一部の実施形態では、ＲＮａｓｅ Ｈの存在下における単離核酸のｍＲＮＡへのハイブリダイゼーションは、ＲＮａｓｅ ＨによるｍＲＮＡオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の開裂をもたらし、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲの開裂をもたらさない。いかなる特定の理論に制限されるものではないが、単離核酸（例えば、ガイド鎖）の長さを短くすることにより、ＯＲＦのより多くの場所に着下することが可能となり、ｍＲＮＡの特定の完全消化をもたらす二次構造が継続的に抑制される。それゆえ、一部の実施形態では、ｍＲＮＡ ＯＲＦの開裂を誘導する単離核酸（例えば、ガイド鎖）は、４～１６ヌクレオチド長（例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６ヌクレオチド長）である。一部の実施形態では、ガイド鎖は単一の５’または３’に位置する２’Ｏ－メチルＲＮＡ及び４つの非修飾ＤＮＡ塩基を含む。一部の実施形態では、ガイド鎖は４つの非修飾ＤＮＡ塩基で構成される。

【0056】

一部の実施形態では、本開示に記載の組成物は、バッファー、及び任意選択的に、ＲＮａｓｅ Ｈ酵素を更に含む。

【0057】

標的ＲＮＡ
本発明の態様は、標的ＲＮＡ（例えば、標的ｍＲＮＡ）にアニールするキャップガイドに関する。一部の実施形態では、キャップガイドはＲＮＡ試料中のＲＮＡにアニールする。ＲＮＡは反復リボヌクレオシドで構成される。ＲＮＡが１つまたは複数のデオキシリボヌクレオシドを含むことも可能である。好ましい実施形態では、ＲＮＡは、６０％超、７０％超、８０％超、または９０％超のリボヌクレオシドで構成される。その他の実施形態では、ＲＮＡは１００％リボヌクレオシドで構成される。ＲＮＡ試料中のＲＮＡは、好ましくはｍＲＮＡである。

【0058】

本明細書で使用する場合、用語「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」とは、ＲＮＡポリメラーゼ酵素によってＤＮＡ配列から転写され、リボソームと相互作用してＤＮＡがコードするタンパク質を合成するリボ核酸のことを意味する。一般的に、ｍＲＮＡは、２つのサブクラス、プレｍＲＮＡ及び成熟ｍＲＮＡに分類される。前駆体ｍＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）は、ＲＮＡポリメラーゼによって転写されているが、転写後プロセシング（例えば、５’キャッピング、スプライシング、エディティング、及びポリアデニル化）を何ら受けていないｍＲＮＡである。成熟ｍＲＮＡは転写後プロセシングにより修飾されており（例えば、スプライシングを受けてイントロン及びポリアデニル化領域が除去されている）、リボソームと相互作用してタンパク質合成を実施することができる。

【0059】

様々な方法を用いて組織または細胞からｍＲＮＡを単離してもよい。例えば、細胞または細胞溶解物に対してトータルＲＮＡ抽出を実施してもよく、得られた抽出トータルＲＮＡを精製（例えば、オリゴ－ｄＴビーズを含むカラムで）して抽出ｍＲＮＡを得てもよい。

【0060】

代替的に、セルフリー環境、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）でｍＲＮＡを合成してもよい。ＩＶＴは、リボ核酸（ＲＮＡ）（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））の鋳型誘導合成を可能とするプロセスである。ＩＶＴは一般的に、目的の配列の上流のバクテリオファージプロモーター配列を含む鋳型の改変に続く、対応するＲＮＡポリメラーゼを使用した転写に基づいている。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍＲＮＡ転写物をｉｎ ｖｉｖｏ治療薬として使用して、標的組織内へとタンパク質治療薬をリボソームに発現させてもよい。

【0061】

従来より、ｍＲＮＡ分子の基本構成要素としては少なくとも、コード領域、５’－ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、５’キャップ、及びポリＡテールが挙げられる。ＩＶＴ ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡとして機能してもよいが、それらの機能的設計及び／または構造的設計の特徴から野生型ｍＲＮＡと区別することができ、核酸ベース医薬品を用いた効果的なポリペプチド生成に関する従来の課題の克服に貢献している。例えば、ＩＶＴ ｍＲＮＡは構造修飾または化学修飾されていてもよい。本明細書で使用する場合、「構造」修飾は、ヌクレオチド自体に有意な化学修飾を伴うことなく、２つ以上の連結したヌクレオシドがポリヌクレオチド内において挿入、欠失、複製、反転、または無作為化されている修飾である。化学結合が必然的に破壊及び再編成されて構造修飾に影響を及ぼすことから、構造修飾は化学的性質のものであり、それゆえ、化学修飾である。しかしながら、構造修飾は異なる配列のヌクレオチドをもたらす。例えば、ポリヌクレオチド「ＡＴＣＧ」は「ＡＴ－５ｍｅＣ－Ｇ」へと化学修飾され得る。同一のポリヌクレオチドは「ＡＴＣＧ」から「ＡＴＣＣＣＧ」へと構造修飾され得る。ここでは、ジヌクレオチド「ＣＣ」が挿入されることにより、ポリヌクレオチドに構造修飾がもたらされている。

【0062】

ＲＮＡは、天然ヌクレオチド、及び／または非天然ヌクレオチド、例えば、修飾ヌクレオチドなどを含んでいてもよい。一部の実施形態では、ＲＮＡワクチンのＲＮＡポリヌクレオチドは少なくとも１つの化学修飾を含む。一部の実施形態では、化学修飾は、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－シュードウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５－メトキシウリジン、及び２’－Ｏ－メチルウリジンからなる群から選択される。本明細書に記載のｍＲＮＡに有用なその他の例示的な化学修飾としては、米国公開特許出願第２０１５／００６４２３５号に列挙されているようなものが挙げられる。

【0063】

「ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写鋳型（ＩＶＴ）」とは、本明細書で使用する場合、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を生成するためのＩＶＴ反応に用いるのに好適なデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のことを意味する。一部の実施形態では、ＩＶＴ鋳型は５’非翻訳領域をコードし、オープンリーディングフレームを含有し、３’非翻訳領域及びポリＡテールをコードする。特定のヌクレオチド配列組成及びＩＶＴ鋳型の長さは、その鋳型がコードする目的のｍＲＮＡによって決まる。

【0064】

「５’非翻訳領域（ＵＴＲ）」とは、タンパク質またはペプチドをコードしない開始コドン（すなわち、リボソームにより翻訳されたｍＲＮＡ転写物の第１コドン）のすぐ上流（すなわち、５’）にあるｍＲＮＡの領域のことを意味する。

【0065】

「３’非翻訳領域（ＵＴＲ）」とは、タンパク質またはペプチドをコードしない終止コドン（すなわち、翻訳の終了を指示するｍＲＮＡ転写物のコドン）のすぐ下流（すなわち、３’）にあるｍＲＮＡの領域のことを意味する。

【0066】

「オープンリーディングフレーム」は、開始コドン（例えば、メチオニン（ＡＴＧ））で始まり終止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＡＧ、またはＴＧＡ）で終わるＤＮＡまたはＲＮＡの連続ストレッチであり、タンパク質またはペプチドをコードする。

【0067】

「ポリＡテール」は、複数の連続したアデノシン一リン酸を含む３’ＵＴＲの下流、例えば、すぐ下流（すなわち、３’）にあるｍＲＮＡの領域である。ポリＡテールは、１０～３００個のアデノシン一リン酸を含んでいてもよい。例えば、ポリＡテールは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、または３００個のアデノシン一リン酸を含んでいてもよい。一部の実施形態では、ポリＡテールは、５０～２５０個のアデノシン一リン酸を含む。適切な生物学的状況（例えば、細胞内、インビボなど）において、ポリ（Ａ）テールは、例えば細胞質内において、ｍＲＮＡを酵素分解から保護するように機能し、転写終了、ｍＲＮＡの核外輸送、及び翻訳に役立つ。しかしながら、一部の実施形態では、ｍＲＮＡ分子はポリＡテールを含まない。一部の実施形態では、このような分子は「テールレス」と呼ばれる。

【0068】

一部の実施形態では、試験または標的ｍＲＮＡ（例えば、ＩＶＴ ｍＲＮＡ）は治療用ｍＲＮＡである。本明細書で使用する場合、用語「治療用ｍＲＮＡ」とは、治療用タンパク質をコードするｍＲＮＡ分子（例えば、ＩＶＴ ｍＲＮＡ）のことを意味する。治療用タンパク質は、疾患を治療するまたは疾患の徴候及び症候を改善するために、宿主細胞または対象内において様々な効果を媒介する。例えば、治療用タンパク質は、不完全または異常なタンパク質を置き換える、内在性タンパク質の機能を補完する、細胞に新規の機能を付与する（例えば、内在性細胞活性を阻害または活性化する）、または、別の治療用化合物（例えば、抗体薬物複合体）のための送達用物質として機能することができる。治療用ｍＲＮＡは、以下の疾患及び症状、細菌感染症、ウイルス感染症、寄生虫感染症、細胞増殖障害、遺伝性疾患、及び自己免疫障害のための、ワクチン接種による治療または予防に有用であり得る。

【0069】

「試験ｍＲＮＡ」または「標的ｍＲＮＡ」（本明細書において同じ意味で用いられる）は、既知の核酸配列を有する目的のｍＲＮＡである。標的ｍＲＮＡはＲＮＡまたはｍＲＮＡ試料内に存在し得る。標的ｍＲＮＡに加え、ＲＮＡまたはｍＲＮＡ試料は、ｍＲＮＡ分子のより大きな集団から得られた複数のｍＲＮＡ分子またはその他の不純物を含んでいてもよい。例えば、ＩＶＴ ｍＲＮＡの調製後、純度の分析を行う及び／またはＩＶＴによって調製されたｍＲＮＡの同一性を確認するために、ＩＶＴ ｍＲＮＡの集団から標的ｍＲＮＡ試料を除去してもよい。

【0070】

ｍＲＮＡ種の特性決定
本明細書で提供する方法は、本明細書で提供するガイドを使用してｍＲＮＡを特性決定することに関する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡを特性決定することは、標的ｍＲＮＡを消化して、そのｍＲＮＡに固有のｍＲＮＡの２つまたはそれ以上のフラグメント（例えば、部分または種、例えば、キャップ種、ＯＲＦ種、３’ＵＴＲ種など）を生成することを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡを特性決定することは標的ｍＲＮＡキャップの消化を含む。ｍＲＮＡキャッピングは、ｍＲＮＡの５’末端を７－メチルグアニル酸キャップ（「キャップ」とも呼ばれる）で修飾して、タンパク質合成中に翻訳を受けることが可能な安定かつ成熟したメッセンジャーＲＮＡを生成するプロセスである。特定の例では、ｍＲＮＡキャッピングプロセスは不完全であり、ｍＲＮＡが部分的キャップ（例えば、７位がメチル化されていないキャップ）を有する状態のままである、またはキャップ非付加ｍＲＮＡである。一部の実施形態では、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲをマッピングして、ｍＲＮＡがキャップ、部分的キャップを含有しているかどうか、または、キャップ非付加である（キャップ種の相対存在量とも呼ばれる）かどうかを確認することが望ましい。一部の実施形態では、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲを特性決定して、例えば、ｍＲＮＡポリＡテール（「テール」とも呼ばれる）の長さを定量することが望ましい。一部の実施形態では、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲをマッピングして、ｍＲＮＡがキャップ、部分的キャップを含有しているかどうか、または、キャップ非付加であるかどうかを確認すること、及び、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲをマッピングして、例えば、ｍＲＮＡポリＡテールの長さを定量することが望ましい。

【0071】

本発明の方法は、ｍＲＮＡを特性決定する能力が重要な様々な用途に使用することができる。例えば、本発明の方法は、合成標的ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ試料のバッチ間のばらつきをモニタリングするのに有用である。既知のシグネチャープロファイルまたはｍＲＮＡの一次分子配列から予測された質量の理論上のプロファイルと比較したシグネチャープロファイルにおける任意の差異を同定することにより、それぞれのバッチの純度を測定してもよい。これらのシグネチャーはまた、試料中における活性成分であり得る望ましくない核酸の存在をモニタリングするのに有用である。どちらの試料がより望ましい純度を有しているかを確認するために、または別様に、試料の純度を比較するために、少なくとも２種の試料に対して本方法をまた実施してもよい。

【0072】

それゆえ、一部の例では、本発明の方法を使用してＲＮＡ試料の純度を測定する。用語「純粋」とは、本明細書で使用する場合、無関係な核酸、すなわち、ＲＮＡフラグメントを含む不純物または夾雑物の存在が低下または排除されることとなるように標的核酸活性剤のみを有している物質のことを意味する。例えば、精製ＲＮＡ試料は１種または複数種の合成標的または試験核酸を含んでいるが、その他の核酸を実質的に含んでいないことが好ましい。本明細書で使用する場合、用語「実質的に含まない」は、物質の解析検査の文脈において実用的に使用される。好ましくは、不純物または夾雑物を実質的に含まない精製物質は少なくとも９５％純粋であり、より好ましくは少なくとも９８％純粋であり、なおもより好ましくは少なくとも９９％純粋である。一部の実施形態では、純粋なＲＮＡ試料は１００％の標的または試験ＲＮＡからなり、その他のＲＮＡを含んでいない。一部の実施形態では、純粋なＲＮＡ試料は単一種の標的または試験ＲＮＡのみを含んでいる。

【0073】

本明細書に記載の技術の一部の実施形態に従い、任意のｍＲＮＡを特性決定してもよい。一部の実施形態では、本明細書で提供する方法は治療用ｍＲＮＡを特性決定することを含む。一部の実施形態では、本明細書で提供する方法は標的ｍＲＮＡを特性決定することを含む。一部の実施形態では、本明細書で提供する方法はｍＲＮＡ試料中の標的ｍＲＮＡを特性決定することを含む。一部の実施形態では、本明細書で提供する方法はｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）ｍＲＮＡを特性決定することを含む。一部の実施形態では、標的ｍＲＮＡ及びｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）ｍＲＮＡは合成ｍＲＮＡとみなされる。

【0074】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡを特性決定することは、ｍＲＮＡにシグネチャープロファイルを割り当てることを含む。「標的ｍＲＮＡのシグネチャープロファイル」は、特定のＲＮａｓｅ酵素を用いた消化により生成されたフラグメントに基づいて標的ｍＲＮＡを有することが疑われるｍＲＮＡ試料から作成したシグネチャーである。例えば、ＲＮａｓｅ Ｔ１を用いたｍＲＮＡの消化に続く、ＨＰＬＣまたは質量分析を用いた得られた複数のｍＲＮＡフラグメントの解析により、トレースもしくは質量プロファイル、またはＲＮａｓｅ Ｔ１を用いたその特定のｍＲＮＡの消化によってのみ作成され得るシグネチャーが作成される。

【0075】

その他の実施形態では、標的ｍＲＮＡはＲＮａｓｅ Ｈを用いて消化される。ＲＮａｓｅ ＨはＤＮＡ／ＲＮＡ二重基質内のＲＮＡの３’－Ｏ－Ｐ結合を開裂させて、３’－ヒドロキシル末端産物及び５’－リン酸末端産物を生成する。それゆえ、特定の核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡとＲＮＡの組み合わせ）オリゴは標的ｍＲＮＡにアニールするように設計され得、得られた二重体はＲＮａｓｅ Ｈを用いて消化され、任意の試験ｍＲＮＡの固有のフラグメントパターンが生成される（固有の質量プロファイルがもたらされる）。

【0076】

ｍＲＮＡ試料のシグネチャーが同定されると、そのシグネチャーを標的ｍＲＮＡの既知のシグネチャープロファイルと比較することができる。「標的ｍＲＮＡの既知のシグネチャープロファイル」とは、本明細書で使用する場合、標的ｍＲＮＡを固有に同定する対照シグネチャーまたはフィンガープリントのことを意味する。純粋な試料の消化に基づいて標的ｍＲＮＡの既知のシグネチャープロファイルを作成し、標的シグネチャープロファイルと比較してもよい。代替的に、対照シグネチャーは電子または非電子データ媒体内に保存された既知の対照シグネチャーであってもよい。例えば、対照シグネチャーは、特定のＲＮＡ（例えば、標的ｍＲＮＡ）の一次分子配列から予測された質量に基づいた理論上のシグネチャーであってもよい。

【0077】

ｍＲＮＡ（例えば、試験ｍＲＮＡ）の様々なバッチを同一条件下で消化してから、不純物または夾雑物（例えば、ＩＶＴ反応から持ち越された化学物質などの添加剤、または誤って転写されたｍＲＮＡ）を同定するために純粋なｍＲＮＡのシグネチャーと比較してもよく、または、標的ｍＲＮＡの既知のシグネチャープロファイルと比較してもよい。標的ｍＲＮＡのシグネチャーが標的ｍＲＮＡの既知のシグネチャープロファイルと同一性を共有している場合、標的ｍＲＮＡの同一性を確認してもよい。一部の実施形態では、試験ｍＲＮＡのシグネチャーは、既知のｍＲＮＡシグネチャーと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％の同一性を共有している。

【0078】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡの様々なバッチをハイスループット様式の同一条件下で消化してもよい。例えば、バッチのそれぞれのｍＲＮＡ試料をマルチウェルプレートの独立した１つのウェルまたは複数のウェルに入れてから、ＲＮａｓｅと同時に消化してもよい。マルチウェルプレートは、６、２４、９６、３８４、または１５３６ウェルのアレイを含んでいてもよい。しかしながら、様々なその他の許容される構成、例えば、６、２４、９６、３８４、または１５３６の倍数の多くのウェルを備えたマルチウェルプレートなどへとマルチウェルプレートを構築してもよいということを当業者は理解するであろう。例えば、一部の実施形態では、マルチウェルプレートは３０７２ウェルのアレイ（１５３６の倍数）を含む。同時に消化する（例えば、マルチウェルプレート内で）ｍＲＮＡ試料の数は様々であり得る。一部の実施形態では、少なくとも２つのｍＲＮＡ試料を同時に消化する。一部の実施形態では、２～９６のｍＲＮＡ試料を同時に消化する。一部の実施形態では、２～３８４のｍＲＮＡ試料を同時に消化する。一部の実施形態では、２～１５３６のｍＲＮＡ試料を同時に消化する。同時に消化するｍＲＮＡ試料のそれぞれが同一のタンパク質または異なるタンパク質をコードし得る（例えば、同一タンパク質のバリアントをコードするｍＲＮＡ、または、完全に異なるタンパク質をコードするｍＲＮＡ、例えば、対照ｍＲＮＡなど）ということを当業者は理解するであろう。

【0079】

本明細書で使用する場合、用語「消化」とは生体高分子の酵素分解のことを意味する。生体高分子は、タンパク質、ポリペプチド、もしくは核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ）、または上記の任意の組み合わせであってもよい。一般的に、消化を媒介する酵素は、酵素がその機能を実行する基質に応じたプロテアーゼまたはヌクレアーゼである。プロテアーゼは、アミノ酸をペプチド鎖状に連結しているペプチド結合を加水分解する。プロテアーゼの例としては、セリンプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、及びメタロプロテアーゼが挙げられるがこれらに限定されない。ヌクレアーゼは、核酸のヌクレオチドサブユニット間のホスホジエステル結合を開裂させる。一般的に、ヌクレアーゼは、デオキシリボヌクレアーゼ、すなわちＤＮａｓｅ酵素（例えば、ＤＮＡを開裂させるヌクレアーゼ）、及びリボヌクレアーゼ、すなわちＲＮａｓｅ酵素（例えば、ＲＮＡを開裂させるヌクレアーゼ）に分類することができる。ＤＮａｓｅ酵素の例としては、ＤＮＡ分子の末端を開裂させるエキソデオキシリボヌクレアーゼ、及びＤＮＡ配列を含む特定の配列を開裂させる制限酵素が挙げられる。

【0080】

消化される標的ｍＲＮＡの量は様々であり得る。一部の実施形態では、消化される標的ｍＲＮＡの量は、約１ｎｇ～約１００μｇの範囲である。一部の実施形態では、消化される標的ｍＲＮＡの量は、約１０ｎｇ～約８０μｇの範囲である。一部の実施形態では、消化される標的ｍＲＮＡの量は、約１００ｎｇ～約１０００μｇの範囲である。一部の実施形態では、消化される標的ｍＲＮＡの量は、約５００ｎｇ～約４０μｇの範囲である。一部の実施形態では、消化される標的ｍＲＮＡの量は、約１μｇ～約３５μｇの範囲である。一部の実施形態では、消化される標的ｍＲＮＡの量は、約１μｇ、約２μｇ、約３μｇ、約４μｇ、約５μｇ、約６μｇ、約７μｇ、約８μｇ、約９μｇ、約１０μｇ、約１１μｇ、約１２μｇ、約１３μｇ、約１４μｇ、約１５μｇ、約１６μｇ、約１７μｇ、約１８μｇ、約１９μｇ、約２０μｇ、約２１μｇ、約２２μｇ、約２３μｇ、約２４μｇ、約２５μｇ、約２６μｇ、約２７μｇ、約２８μｇ、約２９μｇ、または約３０μｇである。

【0081】

本開示は部分的に、ＲＮａｓｅ酵素を使用してｍＲＮＡを消化することで、ＲＮＡフラグメントの固有の集団、すなわち「シグネチャー」を作成することができるという発見に関する。ＲＮａｓｅ酵素の例としては、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ、ＲＮａｓｅ Ｌ、ＲＮａｓｅ Ｐ、ＲＮａｓｅ Ｅ、ＲＮａｓｅ ＰｈｙＭ、ＲＮａｓｅ Ｔ１、ＲＮａｓｅ Ｔ２、ＲＮａｓｅ Ｕ２、ＲＮａｓｅ Ｖ、ＲＮａｓｅ ＰＨ、ＲＮａｓｅ Ｒ、ＲＮａｓｅ Ｄ、ＲＮａｓｅ Ｔ、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ（ＰＮＰａｓｅ）、オリゴリボヌクレアーゼ、エキソリボヌクレアーゼ Ｉ、及びエキソリボヌクレアーゼ ＩＩが挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、ＲＮａｓｅ Ｔ１またはＲＮａｓｅ Ａを使用して試験ｍＲＮＡの同一性を同定する。一部の実施形態では、ＲＮａｓｅ Ｈを使用して試験ｍＲＮＡの同一性を同定する。一部の実施形態では、試験ｍＲＮＡはＩＶＴプロセスによって生成された合成ｍＲＮＡである。

【0082】

本開示に記載の方法で使用するＲＮａｓｅ酵素の濃度は、消化させるｍＲＮＡの量に応じて様々であり得る。しかしながら、一部の実施形態では、ＲＮａｓｅ酵素の量は約０．１ユニット～約５００ユニットのＲＮａｓｅの範囲である。一部の実施形態では、ＲＮａｓｅ酵素の量は、約０．１Ｕ～約１Ｕ、１Ｕ～約５Ｕ、２Ｕ～約２００Ｕ、１０Ｕ～約４５０Ｕ、約２０Ｕ～約４００Ｕ、約３０Ｕ～約３５０Ｕ、約４０Ｕ～約３００Ｕ、約５０Ｕ～約２５０Ｕ、または約１００Ｕ～約２００Ｕの範囲である。

【0083】

当業者はまた、ＲＮａｓｅ酵素が動物（例えば、哺乳動物、ヒト、ネコ、イヌ、ウシ、ウマなど）、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．など）、及びカビ（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍなど）を含むがこれらに限定されない様々な生物に由来し得るということを理解するであろう。ＲＮａｓｅ酵素はまた、組換え的に作製してもよい。例えば、１つの種に由来するＲＮａｓｅ酵素（例えば、Ａ．ｏｒｙｚａｅに由来するＲＮａｓｅ Ｔ１）をコードする遺伝子を細菌宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）内で非相同発現させてから精製してもよい。一部の実施形態では、消化はＡ．ｏｒｙｚａｅ ＲＮａｓｅ Ｔ１酵素によって実施される。

【0084】

一部の実施形態では、消化はバッファー中で実施される。本明細書で使用する場合、用語「バッファー」とは、一定のｐＨを維持するために酸または塩基のいずれかを中和することができる溶液のことを意味する。バッファーの例としては、トリスバッファー（例えば、トリス－Ｃｌバッファー、トリス－酢酸バッファー、トリス－塩基バッファー）、尿素バッファー、重炭酸バッファー（例えば、重炭酸ナトリウムバッファー）、ＨＥＰＥＳ（４－２－ヒドロキシエチル－１－ピペラジンエタンスルホン酸）バッファー、ＭＯＰＳ（３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸）バッファー、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸））バッファー、及びトリエチルアンモニウム酢酸（ＴＥＡＡｃバッファー）が挙げられるがこれらに限定されない。バッファーはまた、２種以上のバッファー剤、例えば、トリス－Ｃｌ及び尿素を含有していてもよい。バッファー中におけるそれぞれのバッファー剤の濃度は、約１ｍＭ～約１０Ｍの範囲であってもよい。一部の実施形態では、バッファー中におけるそれぞれのバッファー剤の濃度は、約１ｍＭ～約２０ｍＭ、約１０ｍＭ～約５０ｍＭ、約２５ｍＭ～約１００ｍＭ、約７５ｍＭ～約２００ｍＭ、約１００ｍＭ～約５００ｍＭ、約２５０ｍＭ～約１Ｍ、約５００ｍＭ～約３Ｍ、約１Ｍ～約５Ｍ、約３Ｍ～約８Ｍ、または約５Ｍ～約１０Ｍの範囲である。

【0085】

一般的に、バッファーを用いて維持されたｐＨは、約ｐＨ６．０～約ｐＨ１０．０の範囲であってもよい。一部の実施形態では、ｐＨは、約ｐＨ６．８～約７．５の範囲であってもよい。一部の実施形態では、ｐＨは、約ｐＨ６．５、約ｐＨ６．６、約ｐＨ６．７、約ｐＨ６．８、約ｐＨ６．９、約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．１、約ｐＨ７．２、約ｐＨ７．３、約ｐＨ７．４、約ｐＨ７．５、約ｐＨ７．６、約ｐＨ７．７、約ｐＨ７．８、約ｐＨ７．９、約ｐＨ８．０、約ｐＨ８．１、約ｐＨ８．２、約ｐＨ８．３、約ｐＨ８．４、約ｐＨ８．５、約ｐＨ８．６、約ｐＨ８．７、約ｐＨ８．８、約ｐＨ８．９、約ｐＨ９．０、約ｐＨ９．１、約ｐＨ９．２、約ｐＨ９．３、約ｐＨ９．４、約ｐＨ９．５、約ｐＨ９．６、約ｐＨ９．７、約ｐＨ９．８、約ｐＨ９．９、または約ｐＨ１０である。

【0086】

一部の実施形態では、バッファーはキレート化剤を更に含む。キレート化剤の例としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、及び２，３－ジメルカプト－ｌ－プロパンスルホン酸（ＤＭＰＳ）が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、キレート化剤はＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）である。ＥＤＴＡの濃度は、約１ｍＭ～約５００ｍＭの範囲であってもよい。一部の実施形態では、ＥＤＴＡの濃度は、約１０ｍＭ～約３００ｍＭの範囲である。一部の実施形態では、ＥＤＴＡの濃度は、約２０ｍＭ～約２５０ｍＭ ＥＤＴＡの範囲である。

【0087】

消化を促進させるためにＲＮａｓｅ酵素を用いたインキュベーション前にｍＲＮＡを変性させてもよいということを当業者は理解するであろう。一部の実施形態では、少なくとも５０℃、少なくとも６０℃、少なくとも７０℃、少なくとも８０℃、または少なくとも９０℃の温度でｍＲＮＡを変性させる。標的ｍＲＮＡの消化は、ＲＮａｓｅ酵素がその目的の機能を実行する任意の温度で実施してもよい。標的ｍＲＮＡ消化反応の温度は約２０℃～約１００℃の範囲であってもよい。一部の実施形態では、標的ｍＲＮＡ消化反応の温度は約３０℃～約５０℃の範囲である。一部の実施形態では、標的ｍＲＮＡはＲＮａｓｅ酵素によって３７℃で消化される。

【0088】

ＲＮａｓｅ酵素の消化により、下流のプロセシング（例えば、消化された試験ｍＲＮＡフラグメントの検出）を妨げ得る環状ホスフェート及びその他の中間体（例えば、２’または３’－ホスフェート）の形成がもたらされ得る。それゆえ、一部の実施形態では、ｍＲＮＡ消化バッファーは、中間体の形成を阻害または防止する薬剤を更に含む。一部の実施形態では、バッファーは、２’，３’－環状－ヌクレオチド ３’－ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）及び／またはアルカリホスファターゼ、例えば、子ウシ腸内アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）など、またはエビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）を更に含む。中間体の形成を阻害または防止するそれぞれの薬剤の濃度は、約１０ｎｇ／μＬ～約１００ｎｇ／μＬの範囲であってもよい。一部の実施形態では、それぞれの薬剤の濃度は約１５ｎｇ／μＬ～約２５ｎｇ／μＬの範囲である。代替的に、または上記濃度範囲と組み合わせて、薬剤の量は、約１Ｕ～約５０Ｕ、約２Ｕ～約４０Ｕ、約３Ｕ～約３５Ｕ、約４Ｕ～約３０Ｕ、約５Ｕ～約２５Ｕ、または約１０Ｕ～約２０Ｕの範囲であってもよい。一部の実施形態では、ＲＮａｓｅ酵素を用いた消化は、ＣＩＰ及び／またはＣＮＰを含有しない消化バッファー中で実施される。

【0089】

一部の実施形態では、バッファーは塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ_２）を更に含む。一般的に、ＭｇＣｌ_２は、酵素（例えば、ＲＮａｓｅ）活性の補因子として機能し得る。バッファー中におけるＭｇＣｌ_２の濃度は約０．５ｍＭ～約２００ｍＭの範囲である。一部の実施形態では、バッファー中におけるＭｇＣｌ_２の濃度は、約０．５ｍＭ～約１０ｍＭ、１ｍＭ～約２０ｍＭ、５ｍＭ～約２０ｍＭ、１０ｍＭ～約７５ｍＭ、または約５０ｍＭ～約１５０ｍＭの範囲である。一部の実施形態では、バッファー中におけるＭｇＣｌ_２の濃度は、約１ｍＭ、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約５０ｍＭ、約７５ｍＭ、約１００ｍＭ、約１２５ｍＭ、または約１５０ｍＭである。

【0090】

一部の実施形態では、試験ｍＲＮＡの消化は、２つのインキュベーション工程、（ａ）試験ｍＲＮＡのＲＮａｓｅ消化、及び（ｂ）消化済み試験ｍＲＮＡのプロセシングを含む。一部の実施形態では、試験ｍＲＮＡの消化は、消化前に試験ｍＲＮＡを変性させる工程を更に含む。上記の工程（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）のそれぞれのインキュベーション時間は、約１分間～約２４時間の範囲であってもよい。一部の実施形態では、インキュベーション時間は、約１分間～約１０分間の範囲である。一部の実施形態では、インキュベーション時間は、約５分間～約１５分間の範囲である。一部の実施形態では、インキュベーション時間は、約３０分間～約４時間（２４０分間）の範囲である。一部の実施形態では、インキュベーション時間は、約１時間～約５時間の範囲である。一部の実施形態では、インキュベーション時間は、約２時間～約１２時間の範囲である。一部の実施形態では、インキュベーション時間は、約６時間～約２４時間の範囲である。

【0091】

消化反応液中に含まれる構成成分に応じた様々な環境条件下で消化を実施してもよいということを当業者は理解するであろう。上記の構成成分とパラメータの任意の好適な組み合わせを使用してもよい。例えば、表１に記載のプロトコルに従って試験ｍＲＮＡの消化を実施してもよい。

【0092】

一部の態様では、本開示は、核酸（例えば、標的ｍＲＮＡ）を特性決定するための「ワンポット」ＲＮａｓｅ Ｈ消化アッセイを提供する。一般的に、ＲＮａｓｅ Ｈ消化アッセイは、（ｉ）ガイド鎖を標的ｍＲＮＡにアニールする及び（ｉｉ）ガイド鎖－ｍＲＮＡ二重体を消化するための独立した工程を含む。本開示は部分的に、条件が適切な場合（例えば、表１に記載のような）、ガイド鎖アニール工程とＲＮａｓｅ Ｈ消化工程を単一工程に集約させることができるという発見に関する。いかなる特定の理論に制限されるものではないが、本開示に記載のワンポットＲＮａｓｅ Ｈ消化アッセイは、一部の実施形態において、ランタイムが短く、複数の工程（例えば、独立したアニール工程及び消化工程など）を要する方法と比較して、解析法（例えば、ＨＰＬＣ／ＭＳなど）用のより高い品質の試料を提供する。

【0093】

目的のポリヌクレオチドの「フラグメント」は、上記試験ＲＮＡの配列に由来する一続きの連続ヌクレオチドを含む。例えば、目的のポリヌクレオチドの「フラグメント」は、ポリヌクレオチドの配列に由来する少なくとも１、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０連続ヌクレオチド（例えば、上記ポリヌクレオチドの少なくとも１、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも３５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、または１０００連続核酸残基）を含んでいてもよい（またはそれらからなっていてもよい）。ポリヌクレオチドのフラグメント（例えば、ｍＲＮＡフラグメント）は、別のフラグメントと同一のヌクレオチド配列からなっていてもよい、または固有のヌクレオチド配列からなっていてもよい。

【0094】

「複数のｍＲＮＡフラグメント」とは、少なくとも２種のｍＲＮＡフラグメントの集団のことを意味する。複数を含むｍＲＮＡフラグメントは、同一、固有、または同一と固有の組み合わせ（例えば、一部のフラグメントは同一であり、一部は固有である）であってもよい。フラグメントがまた、同一の長さを有しているが、異なるヌクレオチド配列を含み得る（例えば、ＣＡＣＧＵ及びＡＡＡＧＣは両方とも５ヌクレオチド長であるが異なる配列を含む）ということを当業者は理解するであろう。一部の実施形態では、複数のｍＲＮＡフラグメントは、単一種のｍＲＮＡの消化によって生成される。複数のｍＲＮＡフラグメントは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、または少なくとも５００のｍＲＮＡフラグメントであってもよい。一部の実施形態では、複数のｍＲＮＡフラグメントは、５００超のｍＲＮＡフラグメントを含む。

【0095】

複数のフラグメントは物理的に分離している。本明細書で使用する場合、用語「物理的に分離した」とは、選択基準に基づいたｍＲＮＡフラグメントの単離のことを意味する。例えば、試験ｍＲＮＡの消化により得られた複数のｍＲＮＡフラグメントは、クロマトグラフィーまたは質量分析によって物理的に分離することができる。一部の実施形態では、試験ｍＲＮＡのフラグメントは、電気泳動図を作成するためのキャピラリ電気泳動によって物理的に分離することができる。クロマトグラフィー法の例としては、サイズ排除クロマトグラフィー及び高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が挙げられる。質量分析物理的分離技術の例としては、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）及びマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）が挙げられる。一部の実施形態では、複数のｍＲＮＡフラグメントのうちのそれぞれのフラグメントは、物理的分離中に検出される。例えば、ＨＰＬＣ装置につないだＵＶ分光光度計を使用して、物理的分離中にｍＲＮＡフラグメントを検出してもよい（例えば、吸収スペクトルプロファイル）。得られたデータ（「トレース」とも呼ばれる）は、複数のｍＲＮＡフラグメントの組成のグラフ表示を提供する。別の実施形態では、質量分光光度計は、複数のｍＲＮＡフラグメントの物理的分離中に質量データを生成する。質量データのグラフ描画により、複数のｍＲＮＡフラグメントの成分を同定する「マスフィンガープリント」がもたらされ得る。

【0096】

質量分析は、混合物中の化合物を同定及び特性決定するための広範囲の技術を包含する。異なるタイプの質量分析ベース手法を使用して、試料を解析しその組成を同定してもよい。質量分析は、イオン化プロセスによって、解析を行う試料を複数のイオンに変換することを含む。力場に置かれたときに生じたイオンのそれぞれは、その加速度がその質量電荷比に反比例することになるように軌道に沿って場内を移動する。それゆえ、分子の質量スペクトルは、前駆体イオンのその質量電荷比に対する相対存在度のプロットを示すように生成される。それに続く段階の質量分析計、例えば、タンデム質量分析計などを使用して、前駆体イオンにより高いエネルギーをかけることによって試料を更に解析する場合、それぞれの前駆体イオンは、生成イオンと呼ばれるフラグメントへの解離を受け得る。得られたフラグメントを使用して、その前駆体分子の性質及び構造に関する情報を提供してもよい。

【0097】

ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型）質量分析は、光吸収物質のマトリックス内に検体を包埋してから、揮発によりイオン化して飛行している状態の分子の重量を測定することによって、低揮発性のイオン化が不十分な検体または容易に断片化した検体の質量の分光測定を提供する。電場と磁場の組み合わせを試料にかけ、分子の個々の質量及び電荷に応じてイオン化物質を移動させる。Ｋｏｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．に発行された米国特許第６，０４３，０３１号は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ及びその他の質量分析法を使用してＤＮＡ内の一塩基変異を同定するための例示的な方法について記載している。

【0098】

ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）は、生体高分子の特性に基づいた生体高分子の分析的分離のために使用される。ＨＰＬＣを使用し、サイズ及び／または電荷に基づいて核酸配列を分離してもよい。ＨＰＬＣを使用して、別の核酸との１塩基対の差異を有する核酸配列を分離してもよい。それゆえ、特定の核酸フラグメントの有無を確認するために、ＨＰＬＣを使用して、１つのヌクレオチド以外は同一である核酸試料を区別的に分離してもよい。好ましくは、ＨＰＬＣはＨＰＬＣ－ＵＶである。

【0099】

本発明の方法を使用して作成したデータを個別に処理してもよく、またはコンピュータで処理してもよい。例えば、ＲＮＡ試料のシグネチャープロファイルの代表的なデータセットを表すデータ構造（コンピュータ可読媒体内に実質的に組み入れられた）を作成するためのコンピュータ実装方法を本発明に従って実施してもよい。

【0100】

一部の実施形態は、少なくとも１つのプロセッサによって実行された場合に試料中のＲＮＡを同定するための方法を実施する、コンピュータ実行可能命令を格納した少なくとも１つの非一過性コンピュータ可読記憶媒体に関する。

【0101】

それゆえ、一部の実施形態は、優れた精度、感度、及び速度で試料中の不純物を同定し得るＭＳ／ＭＳデータを処理するための技術を提供する。その技術は、ＲＮＡフラグメントの構造がこれまでに同定済みであるか参照データベース内に含まれているかにかかわらず、ＲＮＡフラグメントの構造同定に関係していてもよい。分析済み質量分析データを取得するために使用する技術にスコアが依存しないことから、計算されたスコアを用いて試料中に含まれる不純物の可能性を同定することを可能とするスコアリング手法を利用してもよい。

【0102】

一部の実施形態では、既知のｍＲＮＡデータの既知のシグネチャープロファイルを計算的に生成または計算してから、例えば、第１のデータベース内に格納してもよい。第１のデータベースは、完全なシグネチャー及び任意のその他の好適な情報を形成するために、それぞれのＲＮＡフラグメントの識別子を含む、ＲＮＡに関する任意のタイプの情報を格納していてもよい。一部の実施形態では、既知のシグネチャーを含む第２のデータベースから読み込んだ計算フラグメントのそれぞれのセットについてスコアを計算してもよく、スコアは既知のシグネチャーのセットと実験によって得られたフラグメントのセットの間の相関関係を示す。スコアを計算するために、例えば、実験によって得られたフラグメントのセット内の対応するフラグメントにマッチする計算フラグメントのセット内のそれぞれのフラグメントに、実験によって得られたフラグメントの相対存在度に応じた重みを割り当ててもよい。それゆえ、そのセット内のフラグメントに割り当てた重みに応じ、計算フラグメントのそれぞれのセットについてスコアを計算してもよい。次に、スコアを使用して、ＲＮＡ試料と既知の配列の間の差異を同定してもよい。

【0103】

上記をコンピュータプログラムとして実行可能なコンピュータシステムは一般的に、ユーザーに情報を表示する出力デバイスとユーザーからの入力を受け取る入力デバイスの両方に接続したメインユニットを含んでいてもよい。メインユニットは一般的に、相互接続機構を介してメモリシステムに接続したプロセッサを含む。入力デバイス及び出力デバイスはまた、相互接続機構を介してプロセッサ及びメモリシステムに接続していてもよい。

【0104】

一部の実施形態と関連させて使用することができるコンピュータシステムの例示的な実装を使用して、上記の機能のいずれかを実施してもよい。コンピュータシステムは、１つまたは複数のプロセッサ及び１つまたは複数のコンピュータ可読記憶媒体（すなわち、有形の非一過性コンピュータ可読媒体）、例えば、任意の好適なデータ記憶媒体で形成されていてもよい揮発性記憶媒体及び１つまたは複数の不揮発性記憶媒体を含んでいてもよい。プロセッサは、揮発性記憶装置及び不揮発性記憶装置へのデータ書き込み及びそれらからのデータ読み込みを、この点において実施形態が限定されない限り任意の好適な様式で制御していてもよい。本明細書に記載の機能のいずれかを実施するために、プロセッサは、プロセッサによる実行のための命令を格納した有形の非一過性コンピュータ可読媒体として機能し得る１つまたは複数のコンピュータ可読記憶媒体（例えば、揮発性記憶装置及び／または不揮発性記憶装置）内に格納された１つまたは複数の命令を実行してもよい。

【0105】

上記の実施形態を多数の様式のうちのいずれかを用いて実施してもよい。例えば、ハードウェア、ソフトウェア、またはこれらの組み合わせを使用して、実施形態を実施してもよい。ソフトウェアを用いて実施する場合、単一のコンピュータに供給されているかまたは複数のコンピュータ間に分散されているかにかかわらず、任意の好適なプロセッサまたはプロセッサの集合体上でソフトウェアコードを実行してもよい。上記の機能を実施する任意の構成要素または構成要素の集合体が一般的に、上で論じた機能を制御する１つまたは複数のコントローラとみなされ得るということを理解されたい。１つまたは複数のコントローラは、多数の様式、例えば、マイクロコードを用いてプログラムされた専用ハードウェアもしくは汎用ハードウェア（例えば、１つまたは複数のプロセッサ）または上で列挙した機能を実施するためのソフトウェアなどを用いて実施してもよい。

【0106】

この点において、１つの実装が、少なくとも１つのコンピュータ可読記憶媒体（すなわち、少なくとも１つの有形の非一過性コンピュータ可読媒体）、例えば、１つまたは複数のプロセッサ上で実行されると上で論じた機能を実行するコンピュータプログラム（すなわち、複数の命令）を用いてコードされたコンピュータメモリ（例えば、ハードドライブ、フラッシュメモリ、プロセッサワーキングメモリなど）、フロッピーディスク、光ディスク、磁気テープ、またはその他有形の非一過性コンピュータ可読媒体などを含むということを理解されたい。コンピュータ可読記憶媒体は、そこに格納されたプログラムが任意のコンピュータリソースにロードされて本明細書で論じる技術を実施可能となるように可搬式であってもよい。加えて、実行されると上で論じた機能を実行するコンピュータプログラムへの言及がホストコンピュータ上で走行するアプリケーションプログラムに限定されないということを理解されたい。むしろ、本明細書において一般的な意味で用いる用語「コンピュータプログラム」とは、上記の技術を実施するために１つまたは複数のプロセッサをプログラムするのに採用され得るあらゆるタイプのコンピュータコード（例えば、ソフトウェアまたはマイクロコード）のことを意味する。

【0107】

標的ｍＲＮＡまたはＲＮＡ試料の特性決定に関連する更なる態様については、２０１８年６月６日出願、表題「ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＲＮＡ ＭＡＰＰＩＮＧ」の米国特許出願公開番号ＵＳ２０１８／０２７４００９（その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる）に提供されている。

【0108】

単離核酸を選択するための方法
本開示の態様は、ＲＮＡ試料（例えば、標的ｍＲＮＡ）を解析及び特性決定するための本明細書に記載の単離核酸を選択するための方法に関する。

【0109】

一部の実施形態では、単離核酸を選択するための方法は、本明細書で提供する単離核酸にハイブリダイズしたｍＲＮＡをＲＮａｓｅ酵素で消化して、複数のｍＲＮＡフラグメントを生成すること、複数のｍＲＮＡフラグメントを物理的に分離すること、複数のｍＲＮＡフラグメントを検出することによってｍＲＮＡのシグネチャープロファイルを作成すること、シグネチャープロファイルを既知のｍＲＮＡシグネチャープロファイルと比較すること、及び、シグネチャープロファイルの既知のＲＮＡシグネチャープロファイルとの比較に基づいて、単離核酸を選択することを含む。

【0110】

シグネチャープロファイル、例えば、標的ｍＲＮＡのシグネチャープロファイルの任意の特徴に基づいて、単離核酸を選択してもよい。一部の実施形態では、シグネチャープロファイルは吸収スペクトルまたは質量スペクトルの形態である。一部の実施形態では、シグネチャープロファイルは、シグネチャープロファイルの既知のＲＮＡシグネチャープロファイルとの比較に基づいて、ｍＲＮＡのキャップ構造を同定することを含む。一部の実施形態では、シグネチャープロファイルは生の質量分析プロファイルを含む。一部の実施形態では、シグネチャープロファイルは保持時間を含む。

【0111】

一部の実施形態では、単離核酸を選択することは、標的ｍＲＮＡのシグネチャープロファイルを既知のｍＲＮＡシグネチャープロファイルと比較することを含む。一部の実施形態では、単離核酸を選択することは、本明細書に記載の単離核酸を選択することを含む。一部の実施形態では、単離核酸を選択することは、配列番号：３～１５からなる群から単離核酸を選択することを含む。一部の実施形態では、単離核酸を選択することは、配列番号：３～１５のうちの少なくとも１つを選択することを含む。一部の実施形態では、単離核酸を選択することは、配列番号：３～１５のうちの少なくとも２つを選択することを含む。一部の実施形態では、単離核酸を選択することは、配列番号：３～１５のうちの少なくとも３つを選択することを含む。

【実施例】

【0112】

本明細書に記載の本発明がより完全に理解され得ることになるように、以下の実施例を記載する。本出願に記載の実施例は本明細書で提供するシステム及び方法を説明するために提供されるものであり、いかなる様式によってもその範囲を限定するものと解釈されるべきではない。

【0113】

実施例１：物質及び方法
ＲＮａｓｅ Ｈガイド
キャップ：５’－ｍＣ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＡ＊ｍＣ＊ｍＵ＊ｍＣ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＣ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＣ＊ｄＴｄＣｄＴｄＣｍＵ＊ｍＵ＊ｍＡ－３’（配列番号：１６）
（ｍＮ＊＝２’ＯＭｅホスホロチオエート）
テール：５’－ｍＣｍＡｍＧｍＡｍＣｄＴｄＴｄＴｄＡｍＵｍＵｍＣｍＡｍＡ（配列番号：１７）
（ｍＮ＝２’ＯＭｅ）

【0114】

ＲＮａｓｅ Ｈ消化混合液
以下の構成成分を混合してＲＮａｓｅ Ｈ消化混合液を調製した。

【表3】

【0115】

試料調製及び解析
以下の反応用物質をＰＣＲプレート内で混合させた。

【表4】

【0116】

次に、プレートを密閉してから、穏やかにボルテックスして混合し、１０００ｒｐｍ、３０秒間の遠心分離にかけた。プレートをサーモサイクラー内で１５分間６５℃でインキュベートしてから、５℃で静置した。それぞれの試料に５μＬの消化クエンチバッファー（１Ｍトリエチルアンモニウム酢酸（ＴＥＡＡ）、２５０ｍＭ ＥＤＴＡ）を加えることにより、反応を停止させた。次に、ＬＣ－ＭＳまたはＨＰＬＣ－ＵＶを用いて試料を分析した。

【0117】

実施例２：キャップガイドの選択
本実施例では、ＲＮａｓｅ ＨによるｍＲＮＡキャップ領域の消化について説明する。簡潔に説明すると、キャップ領域に特異的なＲＮａｓｅ Ｈガイド鎖を使用してｍＲＮＡを消化した。次に、ＬＣ－ＭＳ分析を行い、以下のデータ、（ｉ）キャップの同定及び相対定量、（ｉｉ）ポリＡテールの長さ同定及び相対定量、任意選択的に、（ｉｉｉ）完全消化及びマッピングの解析を行った。

【0118】

図１は、本明細書に記載の様々なキャップバリアントを用いて消化したｍＲＮＡの代表的な抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）データを示している。ガイド番号：７、７ａ、８、及び９と記載されたキャップバリアントにおいて高レベルのＲＮａｓｅ Ｈキャップシグナルが検出された。

【0119】

ＲＮａｓｅ Ｈの特異度及びＲＮａｓｅ Ｈガイド鎖長の自由度を管理する能力は、ＲＮａｓｅ Ｈ標的フラグメント（例えば、キャップフラグメント）及びＲＮａｓｅ Ｈガイド自体の保持時間を管理する人物の能力を有意に促進させるため、その人物に望ましくない共溶出を防止させることができ、その結果、比較的一定で信頼性が高くきれいなＬＣ－ＭＳデータが生成される。一部の例においては、ｍＲＮＡのＲＮａｓｅ Ｈ開裂が完全ではないがＤＮＡｚｙｍｅで失敗するほとんどのケースにおいて成功し得ると予測されるということに留意すべきである。それゆえ、ＲＮａｓｅ Ｈの基質特異性について調査を行った。切断部位のＲＮＡ塩基５’及び３’に対するＲＮａｓｅ Ｈの開裂能を評価した。データは、切断部位の３’及び５’においてＲＮａｓｅ Ｈ開裂が生じていないことを示している（図２）。

【0120】

図３は、ワンポットキャップＲＮａｓｅ Ｈアッセイのトータルイオンクロマトグラム（ＴＩＣ）の代表的な生データを示している。キャップフラグメントとの重複は認められなかった。保持時間は、ガイド番号：７、７ａ、及び８と記載されたキャップバリアントにおいて、その他のキャップバリアントと比較してより互換性があった。

【0121】

キャップ領域に特異的なＲＮａｓｅ Ｈガイド鎖を使用して、ヒトＥＰＯ（ｈＥＰＯ）及びウイルス抗原（ウイルスＡｇ）をコードするｍＲＮＡを消化した。次に、ＬＣ－ＭＳ分析を行ってから、キャップ同定を行い、試料１（図４）及び試料６（図５）の相対定量を行った。

【0122】

実施例３：修飾キャップガイド
修飾キャップガイド（ガイド番号：７、７ａ、８、及び９の修飾型）の試験をワンポットキャップＲＮａｓｅ Ｈアッセイで行った。目的の主鎖修飾の代表的な構造を図６に示している。隣接ＬＮＡ配列または隣接ＬＮＡ／２’ＯＭｅ配列を含む代表的なキャップガイド配列を図７に示している。修飾キャップガイドを使用して、ウイルスＡｇまたはＩＬ－１２をコードするｍＲＮＡを消化した。正規化キャップ１存在度の代表的なデータを図８に示している。保持時間の代表的なトータルイオンクロマトグラム（ＴＩＣ）データを図９に示している。濃度を上昇させていく修飾キャップバリアントを用いて、ウイルスＡｇまたはＩＬ－１２をコードするｍＲＮＡを消化した。キャップ１存在量の代表的なデータを図１０に示している。

【0123】

図１１に示すとおり、％キャップ１と入力％キャップ１の間の関係は、２’ＯＭｅホスホロチオエート（７ＰＳ）を含有するガイド番号：７において直線的であった。７ＰＳは、対照キャップガイド（現行）と比較した存在率（図１２Ａ）及び未加工存在量（図１２Ｂ）において、類似した結果をもたらした。７ＰＳを含む試料において対照キャップと比較してわずかにより多くのキャップ非付加ｍＲＮＡが検出された（図１３）。代表的なＬＣ－ＵＶデータを図１４に示し、配列バリアントの効果を図１５に示している。様々な条件におけるキャップガイド７ＰＳ及び対照の結果を示す代表的なデータを図１６～図１７に示している。

【0124】

本発明のいくつかの実施形態について本明細書で記載及び説明してきたが、当業者は、本明細書に記載の機能を実施するための、及び／または、本明細書に記載の結果及び／または本明細書に記載の利点のうちの１つまたは複数を得るための、様々なその他の方法及び／または構成を容易に想像し、このような変化形態及び／または修正のそれぞれは、本発明の範囲内であるとみなされる。より一般的に言えば、本明細書に記載の全てのパラメータ、寸法、物質、及び構成が例示的であることを意味し、実際のパラメータ、寸法、物質、及び／または構成が、本発明の教示を利用する一特定用途または複数の特定用途に依存する、ということを当業者は容易に理解するであろう。本明細書に記載の本発明の具体的な実施形態に対する多くの等価物について、当業者は理解し、または、通常の実験を行うだけで確認することが可能であろう。それゆえ、上記の実施形態が単なる例として提供されており、添付の特許請求の範囲及びその等価物の範囲内において、具体的に記載及び請求したもの以外の本発明を別様に実施することができる、と理解すべきである。本発明は、本明細書に記載のそれぞれ個々の特徴、システム、物品、物質、及び／または方法に関する。加えて、２つまたはそれ以上のこのような特徴、システム、物品、物質、及び／または方法の任意の組み合わせは、このような特徴、システム、物品、物質、及び／または方法が互いに矛盾しない場合、本発明の範囲内に含まれる。

【0125】

本明細書及び特許請求の範囲において使用される不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、反対のことを明確に指し示さない限り、「少なくとも１つ」を意味するものと理解すべきである。

【0126】

本明細書及び特許請求の範囲において使用される語句「及び／または」は、そのように連結された要素、すなわち、一部の例では接続的に示される要素、またその他の例では離接続的に示される要素の「一方またはその両方」を意味するものと理解すべきである。反対のことを明確に指し示さない限り、具体的に示されるそれら要素と関連しているかまたは関連していないかにかかわらず、「及び／または」節が具体的に示す要素以外のその他の要素を任意選択的に示してもよい。それゆえ、非限定例として、「Ａ及び／またはＢ」への言及とは、「含む」などのオープンエンド用語と共に使用する場合、一実施形態ではＢを伴わないＡ（Ｂ以外の要素を任意選択的に含む）、別の実施形態ではＡを伴わないＢ（Ａ以外の要素を任意選択的に含む）、更に別の実施形態ではＡとＢの両方（その他の要素を任意選択的に含む）、などのことを意味し得る。

【0127】

本明細書及び特許請求の範囲において使用する場合、「または」は、上で定義した「及び／または」と同一の意味を有すると理解すべきである。例えば、一覧の要素を分ける場合、「または」または「及び／または」は、包括的、すなわち、要素の数または一覧及び任意選択的に別の列挙されていない要素のうちの少なくとも１つを含むが、それらのうちの２つ以上もまた含む、と解釈されるべきである。反対のことを明確に指し示す用語、例えば、「のうちの１つのみ」もしくは「のうちの厳密に１つ」など、または特許請求の範囲において用いられる「からなる」に限り、要素の数または一覧のうちの厳密に１つの要素を含むことを意味する。一般的に、本明細書で使用する用語「または」は、「いずれか」、「のうちの１つ」、「のうちの１つのみ」、または「のうちの厳密に１つ」などの排他性の用語が先行する場合、排他的な選択肢（すなわち、「一方またはもう一方であるが両方ではない」）を指し示すと専ら解釈されるべきである。「から本質的になる」は、特許請求の範囲において使用する場合、特許法の分野で使用されるその通常の意味を有するべきである。

【0128】

本明細書及び特許請求の範囲において使用する場合、１つまたは複数の要素の一覧に関する語句「少なくとも１つ」は、要素の一覧における要素のうちのいずれか１つまたは複数から選択される少なくとも１つの要素を意味するものと理解されるべきであるが、要素の一覧内に具体的に列挙される全ての要素のうちの少なくとも１つを必ずしも含む必要はなく、要素の一覧内の要素の任意の組み合わせを除外するものでもない。この定義はまた、具体的に示されるそれら要素と関連しているかまたは関連していないかにかかわらず、語句「少なくとも１つ」が意味する要素の一覧内に具体的に示される要素以外の要素を任意選択的に示してもよいということを可能とする。それゆえ、非限定例として、「Ａ及びＢのうちの少なくとも１つ」（すなわち、「ＡまたはＢのうちの少なくとも１つ」、すなわち、「Ａ及び／またはＢのうちの少なくとも１つ」）とは、一実施形態では、Ｂの存在を伴わない、２つ以上を任意選択的に含む少なくとも１つのＡ（Ｂ以外の要素を任意選択的に含む）、別の実施形態では、Ａの存在を伴わない、２つ以上を任意選択的に含む少なくとも１つのＢ（Ａ以外の要素を任意選択的に含む）、更に別の実施形態では、２つ以上を任意選択的に含む少なくとも１つのＡ、及び２つ以上を任意選択的に含む少なくとも１つのＢ（その他の要素を任意選択的に含む）、などのことを意味し得る。

【0129】

特許請求の範囲に加え上記の本明細書において、全ての移行句、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有する」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「含む（ｈｏｌｄｉｎｇ）」などは、オープンエンドである、すなわち、含むがこれらに限定されないということを意味するものと理解されるべきである。米国特許庁特許審査基準２１１１．０３条に記載のとおり、移行句「からなる」及び「から本質的になる」のみがそれぞれクローズド移行句またはセミクローズド移行句であるとする。

【0130】

クレーム内においてクレーム要素を修飾している順序を表す用語、例えば、「第１の」、「第２の」、「第３の」などの使用は、それ自体が、あるクレーム要素の別のクレーム要素に対する優先、優位、もしくは順序、または方法の行為を実施する時間的順序を何ら暗示するものではなく、単に、ある特定の名称を有するあるクレーム要素を同一の名称を有する別の要素と区別して（順序を表す用語の使用がなければ）クレーム要素を区別するための表示として使用されるものである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【配列表】

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【国際調査報告】