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特表2022-548993ＤＮＡメチル化異常を用いた免疫抗癌治療反応性予測方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-11-22
(54)【発明の名称】ＤＮＡメチル化異常を用いた免疫抗癌治療反応性予測方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/68 20180101AFI20221115BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20221115BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/68
C12M1/34 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022518340
(86)(22)【出願日】2020-09-16
(85)【翻訳文提出日】2022-03-18
(86)【国際出願番号】 KR2020012487
(87)【国際公開番号】W WO2021054713
(87)【国際公開日】2021-03-25
(31)【優先権主張番号】10-2019-0114977
(32)【優先日】2019-09-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】514291196
【氏名又は名称】コリア アドバンスト インスティチュート オブ サイエンス アンド テクノロジー
(71)【出願人】
【識別番号】522110164
【氏名又は名称】ペンタメディックス・カンパニー・リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＰＥＮＴＡＭＥＤＩＸ ＣＯ．， ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】５１７ＨＯ， ５１６， ４２， ＣＨＡＮＧＥＯＰ‐ＲＯ， ＳＵＪＥＯＮＧ‐ＧＵ， ＳＥＯＮＧＮＡＭ‐ＳＩ ＧＹＥＯＮＧＧＩ‐ＤＯ １３４４９， ＲＥＰＵＢＬＩＣ ＯＦ ＫＯＲＥＡ
(74)【代理人】
【識別番号】110001818
【氏名又は名称】弁理士法人Ｒ＆Ｃ
(72)【発明者】
【氏名】チョイ，ジュン・ギュン
(72)【発明者】
【氏名】ジュン，ヒュン・チュル
(72)【発明者】
【氏名】チョ，デ・ヨン
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B029AA07
4B029BB20
4B029FA12
4B029FA15
4B063QA01
4B063QA18
4B063QA19
4B063QQ03
4B063QQ42
4B063QR55
(57)【要約】
本発明は、癌患者の試料から検出されたグローバルＤＮＡメチル化レベルに関する情報を取得する工程、及び前記グローバルＤＮＡメチル化レベルに関する情報に基づいて癌治療に対する反応性を評価する工程、を含む、癌治療反応性を予測するための情報提供方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
癌患者の試料から検出されたグローバルＤＮＡメチル化レベルに関する情報を取得する工程、及び、前記グローバルＤＮＡメチル化レベルに関する情報に基づいて癌治療に対する反応性を評価する工程、を含む、癌治療反応性を予測するための情報提供方法。
【請求項2】
前記グローバルＤＮＡメチル化レベルは、複数のＬＩＮＥ－１（Ｌｏｎｇ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｅｌｅｍｅｎｔ－１）因子で発生するメチル化の平均値として測定されるものである請求項１に記載の癌治療反応性を予測するための情報提供方法。
【請求項3】
前記ＬＩＮＥ－１因子は、Ｌ１ＨＳまたはＬ１ＰＡである請求項２に記載の癌治療反応性を予測するための情報提供方法。
【請求項4】
前記癌治療に対する反応性を評価する工程は、前記グローバルＤＮＡメチル化レベルが低い場合、癌治療に対する抵抗性が高いものと判断する請求項１に記載の癌治療反応性を予測するための情報提供方法。
【請求項5】
前記癌治療は、免疫療法である請求項１に記載の癌治療反応性を予測するための情報提供方法。
【請求項6】
前記試料は、組織、全血、血清、唾液、喀痰、脳脊髄液または尿である請求項１に記載の癌治療反応性を予測するための情報提供方法。
【請求項7】
前記癌は、黒色腫、膀胱癌、食道癌、神経膠腫、副腎癌、肉腫、甲状腺癌、結腸直腸癌、前立腺癌、頭頸部癌、尿路上皮癌、胃癌、膵臓癌、肝癌、精巣癌、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、脳癌、乳癌、腎臓癌または肺癌である請求項１に記載の癌治療反応性を予測するための情報提供方法。
【請求項8】
癌患者の試料から検出されたグローバルＤＮＡメチル化レベルに関する情報を取得する工程、前記試料から腫瘍突然変異負荷（ｍｕｔａｔｉｏｎ ｂｕｒｄｅｎ）に関する情報を取得する工程、及び、
前記グローバルＤＮＡメチル化レベルに関する情報及び腫瘍突然変異負荷に関する情報に基づいて癌治療に対する反応性を評価する工程、を含む、癌治療反応性を予測するための情報提供方法。
【請求項9】
癌患者の試料から検出されたグローバルＤＮＡメチル化レベルに関する情報を取得する工程、前記試料から腫瘍突然変異負荷ｍｕｔａｔｉｏｎ ｂｕｒｄｅｎに関する情報を取得する工程、
前記試料から染色体異数性情報を取得する工程、及び、
前記グローバルＤＮＡメチル化レベルに関する情報、前記腫瘍突然変異負荷に関する情報及び前記染色体異数性情報に基づいて癌治療に対する反応性を評価する工程、を含む、癌治療反応性を予測するための情報提供方法。
【請求項10】
癌治療反応性予測装置において、プロセッサを含み、前記プロセッサは、患者の試料から検出されたグローバルＤＮＡメチル化レベルに関する情報を取得し、
前記グローバルＤＮＡメチル化レベルに関する情報に基づいて癌治療に対する反応性を評価する癌治療反応性予測装置。
【請求項11】
前記プロセッサは、前記グローバルＤＮＡメチル化レベルが低い場合、癌治療に対する抵抗性が高いものと判断する請求項１０に記載の癌治療反応性予測装置。
【請求項12】
前記癌治療は、免疫療法である請求項１０に記載の癌治療反応性予測装置。
【請求項13】
前記試料は、組織、全血、血清、唾液、喀痰、脳脊髄液または尿である請求項１０に記載の癌治療反応性予測装置。
【請求項14】
前記癌は、黒色腫、膀胱癌、食道癌、神経膠腫、副腎癌、肉腫、甲状腺癌、結腸直腸癌、前立腺癌、頭頸部癌、尿路上皮癌、胃癌、膵臓癌、肝癌、精巣癌、 卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、脳癌、乳癌、腎臓癌または肺癌である請求項１０に記載の癌治療反応性予測装置。
【請求項15】
癌治療反応性予測装置において、プロセッサを含み、前記プロセッサは、患者の試料から検出されたグローバルＤＮＡメチル化レベルに関する情報を取得し、
前記試料から腫瘍突然変異負荷（ｍｕｔａｔｉｏｎ ｂｕｒｄｅｎ）に関する情報を取得し、
前記グローバルＤＮＡメチル化レベル及び前記腫瘍突然変異負荷に関する情報に基づいて癌治療に対する反応性を評価する癌治療反応性予測装置。
【請求項16】
癌治療反応性予測装置において、プロセッサを含み、前記プロセッサは、患者の試料から検出されたグローバルＤＮＡメチル化レベルに関する情報を取得し、
前記試料から腫瘍突然変異負荷（ｍｕｔａｔｉｏｎ ｂｕｒｄｅｎ）に関する情報を取得し、
前記試料から染色体異数性に関する情報を取得し、
前記グローバルＤＮＡメチル化レベル、前記腫瘍突然変異負荷及び前記染色体異数性に関する情報に基づいて癌治療に対する反応性を評価する癌治療反応性予測装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＤＮＡメチル化異常を用いた癌治療反応性を予測するための情報提供方法、並びに予測装置に関する。より具体的には、ＬＩＮＥ－１因子（長鎖散在性反復配列－１（Ｌｏｎｇ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｅｌｅｍｅｎｔ－１））ベースで測定されるグローバルＤＮＡメチル化レベルの情報を用いた癌患者の免疫療法に対する反応性を予測するための情報提供方法、並びに予測装置に関する。
【背景技術】
【0002】
癌は、世界で最も高い死因の一つであり、早期診断の可否が完治率を決定することが多く、健康診断などを通じての癌の早期診断が重要視されている。一般に、健康診断の際によく利用される癌検査は、血液中のタンパク質腫瘍マーカー（ｍａｒｋｅｒ）検査であり、その他に内視鏡、組織検査などを通じて癌発生の有無を確認することができる。
【0003】
癌を引き起こすゲノム異常変異には３種類があることが知られており、染色体の一部が丸ごと変わったり、塩基配列が１～２箇所変わる染色体の順番や塩基配列の変化に加えて、クロマチン修飾（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）であるエピジェネティク修飾がその原因であるといえる（Ｓｔｉｃｋｅｒ Ｔ，Ｃａｔｅｎａｃｃｉ ＤＶ，Ｓｅｉｗｅｒｔ ＴＹ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ－ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ ｏｆ ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｍｅｄｉｃｉｎｅ：ａ ｐｒｉｍｅｒ ｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｔｏｏｌｓ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｔｏ ｂｒｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｅｓｔｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃ．Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２０１１ ３８（２）：１７３－８５）。一般に、染色体の一部または数箇所が変化する変異は、遺伝的（ｇｅｎｅｔｉｃ）なものがその原因とも考えられ、放射線などの突然変異の誘発要因により体細胞において局所的に起こり得る。エピジェネティックゲノム修飾の中でも最も代表とされる癌細胞におけるＤＮＡメチル化の変化は、正確な原因が明らかにされていないが、食生活や環境的要因がその原因であると考えられている。特にこのようなエピジェネティックゲノム修飾は、癌が発生した組織のゲノムに多く見られており、これを用いた診断法の開発など、臨床適用への関心が高まっている。
【0004】
ＤＮＡメチル化（ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）は、シトシンのピリミジン環の５番目の炭素にメチル基（－ＣＨ３）が共有結合で添加される現象であって、ＤＮＡメチル化は、正常な個体の発生においてもゲノム刷り込み、Ｘ染色体不活性化など様々な生命現象で重要な役割を果たしている。
【0005】
癌組織では、正常細胞とは異なる２種のＤＮＡメチル化現象が現れるが、それは、ゲノム全体にわたるグローバルな低メチル化（ｈｙｐｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）現象と、遺伝子発現の調節部位に位置するＣｐＧアイランドの高メチル化（ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）現象である。低メチル化現象は、主に遺伝子と遺伝子間領域（ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ ｒｅｇｉｏｎ）に現れ、これは染色体を不安定にし、細胞分裂過程で染色体の組換え、転移、欠失、再配列などを引き起こすと推測されている。特にＬＩＮＥ－１のようなトランスポゾン（ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）が通常はメチル化により発現が抑制されるが、癌での低メチル化現象により発現され、ゲノムのあちこちに転移され、染色体不安定性の一因となることが知られている。ここで、癌組織におけるＤＮＡメチル化の変化は、エピジェネティック（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ）であると考えられており、このようなエピジェネティック修飾は、細胞分裂後も維持されるので、低メチル化及び高メチル化は、トランスポゾン及びＣｐＧアイランド周辺に位置する遺伝子の発現に持続的な影響を与えることになる。実際、癌抑制遺伝子（ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ）、細胞周期調節遺伝子、ＤＮＡ修復関連遺伝子、細胞接着関連遺伝子などは、癌組織において、ＤＮＡメチル化によって発現が抑制されることにより、これらの遺伝子が崩壊したことと同様の効果を奏することが知られている（ＭｃＣａｂｅ ＭＴ，Ｂｒａｎｄｅｓ ＪＣ， Ｖｅｒｔｉｎｏ ＰＭ．Ｃａｎｃｅｒ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００９ １５（１２）：３９２７－３７）。これら遺伝子の発現が抑制されることによって細胞は異常に増殖し、遺伝的安定性を維持することができなくなり、さらなる突然変異を誘発し、癌を進行させるのに重要な役割をすることになる。
【0006】
一方、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１免疫チェックポイント阻害剤などの免疫抗癌剤は、癌細胞または癌関連遺伝子を標的として作用する既存の抗癌剤とは異なり、体内免疫系を活性化して、免疫細胞が癌細胞を攻撃するように助ける。免疫抗癌剤は、高価格の割に完治に近い効果を示す患者は少数に過ぎず、免疫療法に適した患者グループを選別することが重要であるが、治療反応性を予測する因子に関する知識は非常に制限的であり、免疫療法反応性とＤＮＡメチル化異常の相関関係に対する研究は、皆無であるのが実情である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Ｓｔｉｃｋｅｒ Ｔ，Ｃａｔｅｎａｃｃｉ ＤＶ，Ｓｅｉｗｅｒｔ ＴＹ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ－ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ ｏｆ ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｍｅｄｉｃｉｎｅ：ａ ｐｒｉｍｅｒ ｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｔｏｏｌｓ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｔｏ ｂｒｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｅｓｔｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃ．Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２０１１ ３８（２）：１７３－８５
【非特許文献2】ＭｃＣａｂｅ ＭＴ，Ｂｒａｎｄｅｓ ＪＣ， Ｖｅｒｔｉｎｏ ＰＭ．Ｃａｎｃｅｒ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００９ １５（１２）：３９２７－３７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明の目的は、患者の試料から得られたＬＩＮＥ－１トランスポゾンから測定されたグローバルＤＮＡメチル化データに基づいて癌治療反応を予測するための情報提供方法を提供することである。
【0009】
本発明のもう一つの目的は、患者の試料から得られたＬＩＮＥ－１トランスポゾンから測定されたグローバルＤＮＡメチル化データに基づく癌治療反応性予測装置を提供することである。
【0010】
ただし、本発明が解決しようとする課題は、上述した課題に限定されず、言及されなかった他の課題は、以下の記載により当該技術分野における通常の知識を有する者に明確に理解されるはずであろう。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明の一実施形態によれば、癌患者の試料から検出されたグローバルＤＮＡメチル化レベルに関する情報を取得する工程、及び前記グローバルＤＮＡメチル化レベルに関する情報に基づいて癌治療に対する反応性を評価する工程、を含む、癌治療反応性を予測するための情報提供方法が提供される。
【0012】
一態様によれば、前記グローバルＤＮＡメチル化レベルは、多数のＬＩＮＥ－１因子に生じるメチル化の平均値を用いて測定されてもよい。
【0013】
一態様によれば、前記ＬＩＮＥ－１因子は、Ｌ１ＨＳまたはＬ１ＰＡであってもよい。
【0014】
一態様によれば、前記ＬＩＮＥ－１因子は、進化的新生ＬＩＮＥ－１ファミリーに該当し、進化的新生ＬＩＮＥ－１ファミリーを選別する基準としては、ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒデータベース（http://www.repeatmasker.org）で提供されるＤＮＡ配列を使用することができる。
【0015】
一態様によれば、癌治療に対する反応性を評価する工程は、前記グローバルＤＮＡメチル化レベルが低い場合、癌治療に対する抵抗性が高いものと判断することができる。
【0016】
一態様によれば、癌治療は、免疫療法であってもよい。
【0017】
一態様によれば、前記試料は、癌組織、全血、血清、唾液、喀痰、脳脊髄液または尿であってもよい。
【0018】
一態様によれば、前記癌は、黒色腫、膀胱癌、食道癌、神経膠腫、副腎癌、肉腫、甲状腺癌、結腸直腸癌、前立腺癌、頭頸部癌、尿路上皮癌、胃癌、膵臓癌、肝癌、精巣癌、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、脳癌、乳癌、腎臓癌または肺癌であってもよい。
【0019】
本発明のもう一つの実施形態によれば、癌患者の試料から検出されたグローバルＤＮＡメチル化レベルに関する情報を取得する工程、前記試料から腫瘍突然変異負荷（ｍｕｔａｔｉｏｎ ｂｕｒｄｅｎ）に関する情報を取得する工程、及び、前記グローバルＤＮＡメチル化レベルに関する情報及び前記腫瘍突然変異負荷に関する情報に基づいて癌治療に対する反応性を評価する工程、を含む、癌治療反応性を予測するための情報提供方法が提供される。
【0020】
本発明のもう一つの実施形態によれば、癌患者の試料から検出されたグローバルＤＮＡメチル化レベルに関する情報を取得する工程、前記試料から腫瘍突然変異負荷（ｍｕｔａｔｉｏｎ ｂｕｒｄｅｎ）に関する情報を取得する工程、前記試料から染色体異数性情報を取得する工程、及び、前記グローバルＤＮＡメチル化レベルに関する情報、前記腫瘍突然変異負荷に関する情報、及び、前記染色体異数性情報に基づいて癌治療に対する反応性を評価する工程、を含む、癌治療反応性を予測するための情報提供方法が提供される。
【0021】
本発明のもう一つの実施形態によれば、癌治療反応性予測装置において、プロセッサを含み、前記プロセッサは、患者の試料から検出されたグローバルＤＮＡメチル化レベルに関する情報を取得し、前記グローバルＤＮＡメチル化レベルに関する情報に基づいて癌治療に対する反応性を評価する癌治療反応性予測装置が提供される。
【0022】
本発明のさらにもう一つの一実施形態によれば、癌治療反応性予測装置において、プロセッサを含み、前記プロセッサは、患者の試料から検出されたグローバルＤＮＡメチル化レベルに関する情報を取得し、前記試料から腫瘍突然変異負荷(ｍｕｔａｔｉｏｎ ｂｕｒｄｅｎ)に関する情報を取得し、前記グローバルＤＮＡメチル化レベル及び腫瘍突然変異負荷に関する情報に基づいて癌治療に対する反応性を評価する癌治療反応性予測装置が提供される。
【0023】
本発明のさらにもう一つの一実施形態によれば、癌治療反応性予測装置において、プロセッサを含み、前記プロセッサは、患者の試料から検出されたグローバルＤＮＡメチル化レベルに関する情報を取得し、前記試料から腫瘍突然変異負荷（ｍｕｔａｔｉｏｎ ｂｕｒｄｅｎ）に関する情報を取得し、前記試料から染色体異数性に関する情報を取得し、前記グローバルＤＮＡメチル化レベル、前記腫瘍突然変異負荷及び前記染色体異数性に関する情報に基づいて癌治療に対する反応性を評価する癌治療反応性予測装置が提供される。
【発明の効果】
【0024】
本発明による癌治療反応性を予測するための情報提供方法及び予測装置は、癌患者のグローバルＤＮＡメチル化情報、腫瘍突然変異負荷情報、染色体異数性情報、または、これらの組み合わせに基づいて患者の癌治療に対する抵抗性を予測することができ、高い信頼性でもって迅速かつ簡便に癌治療反応性に関する情報を提供することができる。
【0025】
したがって、本発明の癌治療反応性を予測するための情報提供方法及び予測装置を用いる場合、癌治療、特に免疫療法を進める際に先立って治療効果及び良好な予後が予測される患者グループを選別するのに効果的である。
【0026】
ただし、本発明の効果は、前記の効果に限定されるものではなく、本発明の詳細な説明または特許請求の範囲に記載された発明の構成から推論可能な全ての効果を含むものと理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【0027】
【図1】２１種の癌に対する細胞増殖マーカー（ａ）、腫瘍突然変異負荷（ｂ）、染色体異数性レベル（ｃ）及び腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞マーカー（ｄ）とグローバルＤＮＡメチル化レベルの相関関係を示すものである。
【図2a】グローバル低メチル化が腫瘍突然変異負荷や染色体異数性との関連性とは無関係に癌の免疫性低下に関連していることを示すものであり、図２ａは、グローバルメチル化レベルが癌組織に浸潤している多様な免疫細胞の活性と、正の相関関係（赤色ヒートマップ）を示すことを表し、図２ｂは、グローバルメチル化レベルが癌細胞内で発現される免疫遺伝子（ｈａｌｌｍａｒｋ ｉｍｍｕｎｅ ｇｅｎｅ ｓｅｔ）とは正の相関関係（赤色ヒートマップ）、細胞分裂遺伝子（ｈａｌｌｍａｒｋ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｇｅｎｅ ｓｅｔ）とは負の相関関係（青色ヒートマップ）があることを示す。
【図2b】グローバル低メチル化が腫瘍突然変異負荷や染色体異数性との関連性とは無関係に癌の免疫性低下に関連していることを示すものであり、図２ａは、グローバルメチル化レベルが癌組織に浸潤している多様な免疫細胞の活性と、正の相関関係（赤色ヒートマップ）を示すことを表し、図２ｂは、グローバルメチル化レベルが癌細胞内で発現される免疫遺伝子（ｈａｌｌｍａｒｋ ｉｍｍｕｎｅ ｇｅｎｅ ｓｅｔ）とは正の相関関係（赤色ヒートマップ）、細胞分裂遺伝子（ｈａｌｌｍａｒｋ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｇｅｎｅ ｓｅｔ）とは負の相関関係（青色ヒートマップ）があることを示す。
【図3a】ＤＮＡ複製時期が遅い領域（ｌａｔｅ－ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）における遺伝子の発現量が、グローバルメチル化の高い患者の試料と低い患者の試料の間でどのような差異を見せるかを、各癌腫別に示すものであり、各癌腫において、グローバルメチル化が低い患者から遺伝子の発現が低いことが確認できた。
【図3b】ＤＮＡ複製時期が遅い領域にある遺伝子のプロモーターに存在するＣｐＧアイランド中、正常細胞に比べて高メチル化（ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）されたものの個数をグローバルメチル化の高い患者の試料と低い患者の試料の間で各癌腫別に比較したものであって、各癌腫においてグローバルメチル化が低い患者からＣｐＧアイランド高メチル化がより多く起こることが確認できた。
【図3c】細胞分裂に対応する遺伝子は複製時期が早い領域（ｅａｒｌｙ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）により密集しており、逆に免疫応答に関連する遺伝子は複製時期が遅い領域に密集していることを統計学的に示している。
【図4a】肺癌コホート試料（ｎ＝１４１）のグローバルメチル化レベルによるＤＮＡメチル化態様をＣｐＧアイランド（ＣＧＩ）、ショア、シェルフ、及びオープンシー部位に分けて見たものである。
【図4b】前記試料において、グローバルメチル化レベルに応じて、ＣＧＩ及びオープンシー領域におけるメチル化、腫瘍突然変異負荷、染色体異数性レベルがそれぞれ定量的にどのように変化するかを示す。
【図5a】肺癌コホート試料において、Ｃｏｘ比例ハザードモデルを用いて解析したグローバルメチル化レベルによる生存率として２つのコホートを合わせた場合（ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｃｏｈｏｒｔ）、ＩＤＩＢＥＬＬコホート、ＳＭＣコホートそれぞれについての結果を示す。
【図5b】肺癌コホート試料において、Ｃｏｘ比例ハザードモデルを用いて解析した腫瘍突然変異負荷による生存率として２つのコホートを合わせた場合（ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｃｏｈｏｒｔ）、ＩＤＩＢＥＬＬコホート、ＳＭＣコホートそれぞれに対する結果を示す。
【図6】黒色腫コホート試料において、Ｃｏｘ比例ハザードモデルを用いて解析したグローバルメチル化レベルと腫瘍突然変異負荷による生存率とを比較して示している。
【発明を実施するための形態】
【0028】
（発明の実施のための最善の形態）
本発明は、ＤＮＡメチル化異常を用いた免疫抗癌治療反応性予測方法に関するものであって、より具体的には、癌患者の試料から検出されたグローバルＤＮＡメチル化レベルに関する情報を取得する工程及び前記グローバルＤＮＡメチル化レベルに関する情報に基づいて癌治療に対する反応性を評価する工程を含む、癌治療反応性を予測するための情報提供方法またはグローバルＤＮＡメチル化レベルに関する情報に基づいて癌治療に対する反応性を評価する癌治療反応性予測装置に関するものであってもよい。
本発明は、ＤＮＡメチル化異常を用いた免疫抗癌治療反応性予測方法に関するものであって、より具体的には、癌患者の試料から検出されたグローバルＤＮＡメチル化レベルに関する情報を取得する工程及び前記グローバルＤＮＡメチル化レベルに関する情報に基づいて癌治療に対する反応性を評価する工程を含む、癌治療反応性を予測するための情報提供方法またはグローバルＤＮＡメチル化レベルに関する情報に基づいて癌治療に対する反応性を評価する癌治療反応性予測装置に関するものであってもよい。
【0029】
（発明を実施するための形態）
以下、添付された図面を参照にして実施形態を詳細に説明する。しかし、実施形態に様々な変更を加えることができるので、特許出願の権利範囲はこれらの実施形態によって制限または限定されるものではない。これらの実施形態の全ての変更、均等物ないし代替物が権利範囲に含まれることが理解されるべきである。
以下、添付された図面を参照にして実施形態を詳細に説明する。しかし、実施形態に様々な変更を加えることができるので、特許出願の権利範囲はこれらの実施形態によって制限または限定されるものではない。これらの実施形態の全ての変更、均等物ないし代替物が権利範囲に含まれることが理解されるべきである。
【0030】
実施形態で使用した用語は、単に説明のために用いたものであって、限定する意図として解釈されるべきではない。単数の表現は、文脈上明らかに別段の意味がない限り、複数の表現を含む。本明細書において、「含む」または「有する」等の用語は、明細書に記載された特徴、数字、工程、動作、構成要素、部品、またはこれらを組み合わせたものが存在することを指定することを意図したものであり、1つ以上の他の特徴、数字、工程、動作、構成要素、部品、またはそれらの組み合わせの存在または付加の可能性を予め排除しないことが理解されるべきである。
【0031】
特に断りがない限り、技術的または科学的用語を含む本明細書で使用される全ての用語は、実施形態が属する技術分野で通常の知識を有する者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。一般的に使用される辞書で定義されているような用語は、関連技術の文脈上の意味と一致する意味を有することと解釈されるべきであり、本出願で明白に定義されていない限り、理想的または過度に形式的な意味に解釈されるべきではない。
【0032】
なお、添付図面を参照して説明することにあたり、図面符号にかかわらず同じ構成要素は同じ参照符号を付与し、これに対する重複する説明は省略する。実施形態の説明において、関連する公知技術の具体的な説明が実施形態の要旨を不明確にする恐れがあると判断される場合、その詳細な説明を省略する。
【0033】
本発明は、グローバルＤＮＡメチル化が変異した腫瘍の免疫回避反応及び免疫療法に対する抵抗性と関連することを見出して完成に至ったものであり、癌治療反応性及び予後を予測するのに活用できる新たなマーカーであって、グローバルＤＮＡメチル化の使用を提供するものである。
【0034】
本発明の一実施形態によれば、癌患者の試料から検出されたグローバルＤＮＡメチル化レベルに関する情報を取得する工程、及び前記グローバルＤＮＡメチル化レベルに関する情報に基づいて癌治療に対する反応性を評価する工程、を含む、癌治療反応性を予測するための情報提供方法が提供される。
【0035】
本発明において、「癌治療反応性予測をするための情報提供方法」という用語は、診断のための予備的な工程であって、癌の診断に必要な客観的な基礎情報を提供するものであり、医師の臨床的判断または所見は除外される。
【0036】
本発明において、「メチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）」という用語は、ＤＮＡを構成するシトシンのピリミジン環の５番目の炭素にメチル基（－ＣＨ３）が共有結合で付加する現象を意味する。より具体的には、本発明の「グローバルＤＮＡメチル化」は、ＬＩＮＥ－１ ＣｐＧ部位のシトシンで起こるメチル化を意味する。メチル化が起こる場合、それに応じて転写因子の結合が妨げられて特定遺伝子発現が抑制され、逆に脱メチル化（ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）または低メチル化（ｈｙｐｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）が起こる場合には、特定遺伝子発現が増加することができる。
【0037】
本発明において、前記グローバルＤＮＡメチル化レベルは、複数のＬＩＮＥ－１因子で発生するメチル化の平均値として測定されることを意味し、前記ＬＩＮＥ－１因子は進化的新生ＬＩＮＥ－１ファミリーに該当するＬ１ＨＳまたはＬ１ＰＡであってもよい。
【0038】
一方、前記メチル化の平均値は、マイクロアレイ、メチル化特異的ＰＣＲ（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＭＳＰ）、リアルタイムメチル化特異的ＰＣＲ（ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、メチル化ＤＮＡ特異的結合タンパク質を用いたＰＣＲ、パイロシークエンシング、ＭＳ－ＨＲＭ（Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｈｉｇｈ－Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍｅｌｔｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ）、メチル化特異－高解像度溶融曲線分析とメチル化感受性制限酵素を用いたメチル化の有無を測定、ＤＮＡチップ及びバイサルファイトシーケンシングのような自動塩基解析などの方法で測定することができるが、これに限定されるものではない。
【0039】
なお、メチル化部位はＣＧＩを基準にして離れた距離に応じてシェルフ、ショア、オープンシーに分類できるが、ＣＧＩから２ｋｂ以内に位置している場合をショア、ショアから２ｋｂまでをシェルフ、ＣＧＩから４ｋｂ以上離れた地域をオープンシーと示す。
【0040】
本発明において、前記癌治療に対する反応性を評価する工程は、前記グローバルＤＮＡメチル化レベルが低い場合、癌治療に対する対抗性が高いものと判断することができる。具体的には、低いグローバルＤＮＡメチル化レベルを有するほど癌組織に浸潤した免疫細胞の活性が阻害されており、癌細胞内で発現される免疫反応遺伝子の発現量が減少するからである。また、以下の実施形態に示すように、この免疫療法コホート癌患者の生存率が統計学的に有意に減少しており、これは腫瘍突然変異負荷及び染色体異数性情報とは独立して作用する変数として現れ、実際に多く使用されている予測因子である腫瘍突然変異負荷よりも高い精度がいくつかのコホートから一貫して見られることが確認できるところ、本発明の方法により、非常に効果的に癌治療に対する反応性を予測することができる。
【0041】
前記癌治療は免疫療法として、免疫チェックポイント阻害剤（ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、免疫細胞治療剤（ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ）、治療用抗体（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）等を含むことができる。免疫チェックポイント阻害剤は、Ｔ細胞阻害に関与する免疫チェックポイントタンパク質の活性化を遮断し、Ｔ細胞を活性化させて癌細胞を攻撃する薬剤であり、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１阻害剤などであってもよいが、これに限定されるものではない。
【0042】
一態様によれば、前記試料は、癌組織、全血、血清、唾液、喀痰、脳脊髄液または尿であってもよい。
【0043】
一態様によれば、前記癌は、黒色腫、膀胱癌、食道癌、神経膠腫、副腎癌、肉腫、甲状腺癌、結腸直腸癌、前立腺癌、頭頸部癌、尿路上皮癌、胃癌、膵臓癌、肝癌、精巣癌、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、脳癌、乳癌、腎臓癌または肺癌であってもよい。
【0044】
本発明のもう一つの実施形態によれば、癌患者の試料から検出されたグローバルＤＮＡメチル化レベルに関する情報を取得する工程、前記試料から腫瘍突然変異負荷（ｍｕｔａｔｉｏｎ ｂｕｒｄｅｎ）に関する情報を取得する工程、及び、前記グローバルＤＮＡメチル化レベルに関する情報及び前記腫瘍突然変異負荷に関する情報に基づいて癌治療に対する反応性を評価する工程、を含む、癌治療反応性を予測するための情報提供方法が提供される。
【0045】
本発明のもう一つの実施形態によれば、癌患者の試料から検出されたグローバルＤＮＡメチル化レベルに関する情報を取得する工程、前記試料から腫瘍突然変異負荷（ｍｕｔａｔｉｏｎ ｂｕｒｄｅｎ）に関する情報を取得する工程、前記試料から染色体異数性情報を取得する工程、及び前記グローバルＤＮＡメチル化レベルに関する情報、前記腫瘍突然変異負荷に関する情報、及び、前記染色体異数性情報に基づいて癌治療に対する反応性を評価する工程、を含む、癌治療反応性を予測するための情報提供方法が提供される。
【0046】
前記の情報提供方法において、グローバルＤＮＡメチル化レベルの測定、ＬＩＮＥ－１因子、癌治療、試料及び癌腫についての説明は、前述の通りである。
【0047】
なお、本発明において、用語「腫瘍突然変異負荷（Ｔｕｍｏｒ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｂｕｒｄｅｎ、ＴＭＢ）」とは、突然変異の個数を定量的に表現する数値であって、癌組織のシークエンシング結果から百万塩基（ｍｅｇａ ｂａｓｅ）当たり観察される突然変異の個数を意味する。
【0048】
本発明において、用語「染色体異数性（Ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ）」は、細胞、個体または系統において、１つの細胞当たりの染色体数が基本数の整数倍にならず、整数倍に対して１～数個が多いもしくは少ない状態、すなわち不完全な構成をしたゲノムを含む状態を意味する。本発明において、染色体異数性数値は、ＣＮＶ（コピー数多型（Ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ））から導き出すことができるが、これは閾値±０．２（ＬＵＡＤ及びＬＵＳＣの平均値）をｌｏｇ２比率（腫瘍対正常）に適用して染色体の腕部の少なくとも１０％または染色体の５％に影響を及ぼす重複／欠失を検出することによって絶対セグメントｌｏｇ２比の総和で求めた。
【0049】
本発明のもう一つの実施形態によれば、癌治療反応性予測装置において、プロセッサを含み、前記プロセッサは、患者の試料から検出されたグローバルＤＮＡメチル化レベルに関する情報を取得し、前記グローバルＤＮＡメチル化レベルに関する情報に基づいて癌治療に対する反応性を評価する癌治療反応性予測装置が提供される。
【0050】
本発明のさらにもう一つの一実施形態によれば、癌治療反応性予測装置において、プロセッサを含み、前記プロセッサは、患者の試料から検出されたグローバルＤＮＡメチル化レベルに関する情報を取得し、前記試料から腫瘍突然変異負荷(ｍｕｔａｔｉｏｎ ｂｕｒｄｅｎ)に関する情報を取得し、前記グローバルＤＮＡメチル化レベル及び前記腫瘍突然変異負荷に関する情報に基づいて癌治療に対する反応性を評価する癌治療反応性予測装置が提供される。
【0051】
本発明のさらにもう一つの一実施形態によれば、癌治療反応性予測装置において、プロセッサを含み、前記プロセッサは、患者の試料から検出されたグローバルＤＮＡメチル化レベルに関する情報を取得し、前記試料から腫瘍突然変異負荷（ｍｕｔａｔｉｏｎ ｂｕｒｄｅｎ）に関する情報を取得し、前記試料から染色体異数性に関する情報を取得し、前記グローバルＤＮＡメチル化レベル、前記腫瘍突然変異負荷及び前記染色体異数性に関する情報に基づいて癌治療に対する反応性を評価する癌治療反応性予測装置が提供される。
【0052】
前記癌治療反応性予測装置において、グローバルＤＮＡメチル化レベルの測定、ＬＩＮＥ－１因子、癌治療、試料及び癌腫についての説明は、上述した通りである。
【0053】
以下、本発明の理解を手助けするために好ましい実施形態を提示する。ただし、以下の実施形態は、本発明をより容易に理解するために提供されるものにすぎず、実施形態によって本発明の内容が限定されるものではない。
【実施例】
【0054】
実施形態１．グローバルＤＮＡメチル化と免疫回避の相関関係の導出
１－１．対象データの選定
解析のために、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）で産生されたＤＮＡメチル化（Ｉｎｆｉｎｉｕｍ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ４５０ｋ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙに基づく）、ｍＲＮＡ発現及び遺伝子突然変異データをダウンロードした（https://gdc.cancer.gov/about-data/publications/pancanatlas）。すべての分子データと年齢情報が含まれた１００以上の患者の試料がある癌腫として、膀胱癌（ＢＬＣＡ）、乳房腺癌（ＢＲＣＡ）、子宮頸癌、扁平上皮細胞癌、子宮頸部腺癌（ＣＥＳＣ）、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、食道癌（ＥＳＣＡ）、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣ）、淡明細胞型腎細胞癌（ＫＩＲＣ）、乳頭状腎細胞癌（ＫＩＲＰ）、低悪性度神経膠腫（ＬＧＧ）、肝細胞癌（ＬＩＨＣ）、肺腺癌（ＬＵＡＤ）、肺扁平上皮癌（ＬＵＳＣ）、膵臓癌（ＰＡＡＤ）、副腎癌（ＰＣＰＧ）、前立腺癌（ＰＲＡＤ）、肉腫（ＳＡＲＣ）、皮膚黒色腫（ＳＫＣＭ）、胃腺癌（ＳＴＡＤ）、精巣癌（ＴＧＣＴ）、甲状腺癌（ＴＨＣＡ）、及び子宮内膜癌（ＵＣＥＣ）の２１種の癌を選定し、これは６９６８個の試料が含まれた。染色体異数性レベルは、Ｔａｙｌｏｒ et al.(（Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３３，６７６－６８９．ｅ３（２０１８））の図表から得た。
１－１．対象データの選定
解析のために、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）で産生されたＤＮＡメチル化（Ｉｎｆｉｎｉｕｍ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ４５０ｋ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙに基づく）、ｍＲＮＡ発現及び遺伝子突然変異データをダウンロードした（https://gdc.cancer.gov/about-data/publications/pancanatlas）。すべての分子データと年齢情報が含まれた１００以上の患者の試料がある癌腫として、膀胱癌（ＢＬＣＡ）、乳房腺癌（ＢＲＣＡ）、子宮頸癌、扁平上皮細胞癌、子宮頸部腺癌（ＣＥＳＣ）、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、食道癌（ＥＳＣＡ）、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣ）、淡明細胞型腎細胞癌（ＫＩＲＣ）、乳頭状腎細胞癌（ＫＩＲＰ）、低悪性度神経膠腫（ＬＧＧ）、肝細胞癌（ＬＩＨＣ）、肺腺癌（ＬＵＡＤ）、肺扁平上皮癌（ＬＵＳＣ）、膵臓癌（ＰＡＡＤ）、副腎癌（ＰＣＰＧ）、前立腺癌（ＰＲＡＤ）、肉腫（ＳＡＲＣ）、皮膚黒色腫（ＳＫＣＭ）、胃腺癌（ＳＴＡＤ）、精巣癌（ＴＧＣＴ）、甲状腺癌（ＴＨＣＡ）、及び子宮内膜癌（ＵＣＥＣ）の２１種の癌を選定し、これは６９６８個の試料が含まれた。染色体異数性レベルは、Ｔａｙｌｏｒ et al.(（Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３３，６７６－６８９．ｅ３（２０１８））の図表から得た。
【0055】
１－２．グローバルメチル化レベルの測定
グローバルメチル化レベルを測定するために、Ｉｎｆｉｎｉｕｍ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ４５０ｋ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙの各プローブ（ｐｒｏｂｅ）配列の９０％（４５ｂｐ）以上がＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒデータベース（www.repeatmasker.org）が提供するｙｏｕｎｇ ＬＩＮＥ－１サブファミリ（Ｌ１ＨＳ及びＬ１ＰＡ）にマッピングされるプローブを選定した。各腫瘍の試料から選択されたプローブの平均β値を平均化し、グローバルメチル化レベルの推定値として使用した。
グローバルメチル化レベルを測定するために、Ｉｎｆｉｎｉｕｍ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ４５０ｋ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙの各プローブ（ｐｒｏｂｅ）配列の９０％（４５ｂｐ）以上がＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒデータベース（www.repeatmasker.org）が提供するｙｏｕｎｇ ＬＩＮＥ－１サブファミリ（Ｌ１ＨＳ及びＬ１ＰＡ）にマッピングされるプローブを選定した。各腫瘍の試料から選択されたプローブの平均β値を平均化し、グローバルメチル化レベルの推定値として使用した。
【0056】
実施形態２．グローバルＤＮＡメチル化レベル相関関係の導出
前記実施形態１で得られた値を用いて、２１種の癌についてグローバルＤＮＡメチル化レベルと細胞増殖マーカー、腫瘍突然変異負荷、染色体異数性及び腫瘍浸潤ＣＤ８＋ Ｔ細胞マーカーの相関関係を導き出し、その結果を図１に示す。細胞増殖マーカーとは、細胞分裂及び細胞周期に関与する遺伝子を意味し、ＣＤ８＋ Ｔ細胞マーカーとは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞にて特異的に発現される遺伝子を意味し、所与の癌組織転写物データにおいて、これらの遺伝子の発現量をマーカーの活性として使用した。各マーカーの定義は、既存の文献（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４８，８１２－８３０．ｅ１４（２０１８））に従った。癌腫別にそれぞれの中央値を求め、統計学的有意性は、スピアマンの相関（Ｓｅｐａｒｍａｎ´ｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）を用いて検証された。
前記実施形態１で得られた値を用いて、２１種の癌についてグローバルＤＮＡメチル化レベルと細胞増殖マーカー、腫瘍突然変異負荷、染色体異数性及び腫瘍浸潤ＣＤ８＋ Ｔ細胞マーカーの相関関係を導き出し、その結果を図１に示す。細胞増殖マーカーとは、細胞分裂及び細胞周期に関与する遺伝子を意味し、ＣＤ８＋ Ｔ細胞マーカーとは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞にて特異的に発現される遺伝子を意味し、所与の癌組織転写物データにおいて、これらの遺伝子の発現量をマーカーの活性として使用した。各マーカーの定義は、既存の文献（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４８，８１２－８３０．ｅ１４（２０１８））に従った。癌腫別にそれぞれの中央値を求め、統計学的有意性は、スピアマンの相関（Ｓｅｐａｒｍａｎ´ｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）を用いて検証された。
【0057】
図１に見られるように、ＤＮＡメチル化レベルが増加するにつれて、細胞増殖マーカーの発現、腫瘍突然変異負荷及び染色体異数性は、減少する傾向、腫瘍浸潤ＣＤ８＋ Ｔ細胞マーカー発現は増加する傾向を示した。これにより、細胞分裂が起こるにつれて漸進的にＤＮＡメチル化レベルが減少し（脱メチル化またはメチル化損失）、腫瘍突然変異負荷と染色体異数性など、ＤＮＡ上の変異も増加する正の相関関係が存在するという既存の事実を確認することができた。しかし、本発明で確認された新しい事実は、これらの指標と免疫応答間に相関関係が存在するということである。
【0058】
前記絡み合った相関関係を解くために、癌腫別に各遺伝子に対するｍＲＮＡ発現レベルを反応変数として用い、グローバルメチル化、腫瘍突然変異負荷、染色体異数性、腫瘍純度、年齢、及び腫瘍ステージを予測変数として線形回帰モデルを適用した。
【0059】
次の公式を用いた回帰モデルは、Ｒのｌｍ関数を用いて作成された。
遺伝子ＹのｍＲＮＡ発現～β１＊グローバルメチル化レベル＋β２＊腫瘍突然変異負荷＋β３＊染色体異数性レベル＋β４＊腫瘍純度＋β５＊年齢＋β６＊腫瘍ステージ
遺伝子ＹのｍＲＮＡ発現～β１＊グローバルメチル化レベル＋β２＊腫瘍突然変異負荷＋β３＊染色体異数性レベル＋β４＊腫瘍純度＋β５＊年齢＋β６＊腫瘍ステージ
【0060】
癌腫別に３つの予測変数（グローバルメチル化レベル、腫瘍突然変異負荷、及び染色体異性）について有意な回帰係数を有する遺伝子（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ ａｎｄ Ｈｏｃｈｂｅｒｇ ＦＤＲ ＜０．０５）の機能を把握するために、Ｇｅｎｅ Ｓｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＧＳＥＡ；Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０２，１５５４５－１５５５０（２００５））を行い、有意なＮＥＳ（Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｓｃｏｒｅｓ）（ＦＥＲ＜０．２５）を有する細胞は、色調を調整してＧＳＥＡ ＮＥＳｓヒートマップを図２ａ、２ｂに示した。
【0061】
その結果、図２ａ及び図２ｂに示すように、グローバルメチル化レベルが低いほど、腫瘍突然変異負荷と染色体異数性とは無関係に、独立して癌組織に浸潤している多様な免疫細胞の活性も劣っており、癌細胞内で発現される免疫遺伝子の発現量も低くなっていることが確認できた。
【0062】
実施形態３．グローバルＤＮＡメチル化と免疫遺伝子の発現関係
前記実施形態２に示すように、細胞分裂が起こるにつれて漸進的にＤＮＡメチル化レベルが減少し、それにより癌細胞内で発現される免疫遺伝子の発現量が低くなるが、細胞分裂によるメチルの減少は、主にＤＮＡ複製時期が遅い領域（ｌａｔｅ－ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）で起こることが知られている。実際には、グローバルメチル化が高い患者の試料と低い患者の試料の間でＤＮＡ複製時期が遅い領域の遺伝子発現量にどのような差があるか、癌腫別に比較した。その結果、図３ａに示すように、種々の癌腫からグローバルメチル化が低い患者の遺伝子発現が低いことが確認できた。
前記実施形態２に示すように、細胞分裂が起こるにつれて漸進的にＤＮＡメチル化レベルが減少し、それにより癌細胞内で発現される免疫遺伝子の発現量が低くなるが、細胞分裂によるメチルの減少は、主にＤＮＡ複製時期が遅い領域（ｌａｔｅ－ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）で起こることが知られている。実際には、グローバルメチル化が高い患者の試料と低い患者の試料の間でＤＮＡ複製時期が遅い領域の遺伝子発現量にどのような差があるか、癌腫別に比較した。その結果、図３ａに示すように、種々の癌腫からグローバルメチル化が低い患者の遺伝子発現が低いことが確認できた。
【0063】
また、癌の全体的なメチル化の変化は、ＬＩＮＥのようなトランスポゾンでは低メチル化が起こるのに対し、遺伝子プロモーターに存在するＣｐＧアイランドでは、逆に高メチル化が伴うことが知られている。実際、グローバルなメチル化の高い患者の試料と低い患者の試料の間でＤＮＡ複製時期が遅い領域にある遺伝子のプロモーターに存在するＣｐＧアイランドの高メチル化の程度を癌腫別に比較した。その結果、図３ｂに示すように、種々の癌腫において、グローバルメチル化が低い患者からＣｐＧアイランドと高メチル化がより多く起こることが確認できた。
【0064】
前記実施形態２の結果に示すグローバルメチル化の減少による免疫遺伝子の発現量の減少は、複製時期が遅い領域における前記変化と一致すべきであることを推論することができるが、実際に図３ｃに示すように、細胞分裂に関与する遺伝子は 複製時期が早い領域により密集していたのに対し、免疫反応に関連する遺伝子は複製時期が遅い領域に密集していることを統計学的に確認することができた。
【0065】
実施形態４．グローバルＤＮＡメチル化と免疫療法反応性の相関関係
４－１．肺癌チェックポイント阻害剤に対する患者コホート
Ｓａｍｓｕｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（ＳＭＣ）で、２０１４年から２０１７年まで抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１で治療を受けた６０名の進行性非小細胞性肺癌患者を対象に本研究に登録した。
４－１．肺癌チェックポイント阻害剤に対する患者コホート
Ｓａｍｓｕｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（ＳＭＣ）で、２０１４年から２０１７年まで抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１で治療を受けた６０名の進行性非小細胞性肺癌患者を対象に本研究に登録した。
【0066】
【表2-1】
【表2-2】
【0067】
臨床反応は、Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ（ＲＥＣＩＳＴ）バージョン１．１の応答評価基準に基づいて少なくとも６ヶ月間の追跡観察によって評価された。免疫療法に対する反応は、持続的臨床的有用性（ｄｕｒａｂｌｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｂｅｎｅｆｉｔ）（ＤＣＢ，応答者（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ））または 非持続的臨床的有用性（ｎｏｎ－ｄｕｒａｂｌｅ ｂｅｎｅｆｉｔ）（ＮＤＢ，非応答者（ｎｏｎ－ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ））に分類された。部分寛解（ＰＲ）または６ヶ月以上持続した不変（ＳＤ）は、ＤＣＢ／応答者とみなされた。進行（ＰＤ）または６ヶ月未満持続したＳＤは、ＮＤＢ／非応答者と見なされた。無増悪生存率（ＰＦＳ）は、治療開始日から進行日または死亡日のうち早い日まで計算して求めた。患者が癌が進行せず生存している場合は、ＰＦＳに対する最後の追跡観察日に検閲された。ＩＤＩＢＥＬＬコホートと名付けられた、同種類の肺癌試料８１個のメチル化データは、以下の文献で提供されるものを使用した。Ｄａｖａｌｏｓ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ａｎｔｉ－ＰＤ－１ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎ ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ－ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ：ａ ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｒｅ，ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｌａｎｃｅｔ Ｒｅｓｐｉｒ．Ｍｅｄ．６，７７１－７８１（２０１８）。
【0068】
４－２．ＳＭＣ試料に対するメチル化及び腫瘍突然変異負荷の解析
腫瘍試料は、抗ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１治療前に得て、ホルマリン固定後にパラフィンに埋め込んだり、または新鮮な状態で保存された。全エクソームシーケンスのためのライブラリーを調製するために、ＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、８０２０４），ＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、８０２８４）またはＱｌＡａｍｐ ＤＮＡ ＦＦＰＥ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，５６４０４）を用いてＤＮＡを調製した。ライブラリーの調製は、指針に従ってＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔＸＴ Ｈｕｍａｎ Ａｌｌ Ｅｘｏｎ Ｖ５（Ａｇｉｌｅｎｔ，５１９０－６２０９）を使用して行った。連結したＤＮＡは、ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔＸＴ Ｈｕｍａｎ Ａｌｌ Ｅｘｏｎ Ｖ５のｗｈｏｌｅ ｅｘｏｍｅ ｂａｉｔｓを用いてハイブリダイズした後、ライブラリーをＱｕｂｉｔ及び２２００ Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎによって定量し、２Ｘ１００ ｂｐの対になった端部をＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２５００プラットフォームでシーケンスした。
腫瘍試料は、抗ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１治療前に得て、ホルマリン固定後にパラフィンに埋め込んだり、または新鮮な状態で保存された。全エクソームシーケンスのためのライブラリーを調製するために、ＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、８０２０４），ＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、８０２８４）またはＱｌＡａｍｐ ＤＮＡ ＦＦＰＥ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，５６４０４）を用いてＤＮＡを調製した。ライブラリーの調製は、指針に従ってＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔＸＴ Ｈｕｍａｎ Ａｌｌ Ｅｘｏｎ Ｖ５（Ａｇｉｌｅｎｔ，５１９０－６２０９）を使用して行った。連結したＤＮＡは、ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔＸＴ Ｈｕｍａｎ Ａｌｌ Ｅｘｏｎ Ｖ５のｗｈｏｌｅ ｅｘｏｍｅ ｂａｉｔｓを用いてハイブリダイズした後、ライブラリーをＱｕｂｉｔ及び２２００ Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎによって定量し、２Ｘ１００ ｂｐの対になった端部をＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２５００プラットフォームでシーケンスした。
【0069】
正常試料の対象範囲は、５０×、腫瘍試料は１００×とし、体細胞変異体を導出するためにＳｔｒｅｌｋａ２ ５４を使用し、腫瘍において少なくとも１０及び５回の読み取りによってカバーされる単一ヌクレオチド変異体（ＳＮＶ）及びインデルをそれぞれ選択した。また、ｄｂＳＮＰ １５０に存在する一般的な生殖細胞変異体をさらにフィルタリングし、ＡＮＮＯＶＡＲを使用して体細胞変異体に注釈を付けた。
【0070】
次いで、メチル化解析は、Ｉｎｆｉｎｉｕｍ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ＥＰｌＣ ＢｅａｄＣｈＩＰ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＷＧ－３１７－１００２）の指針に従って行った。未加工メチル化値は、ベータ値で前処理した後、前記実施形態１－２の「グローバルメチル化レベルの測定」にて説明通りに処理した。
【0071】
４－３．グローバルＤＮＡメチル化レベルのチェックポイント阻害剤への影響評価
前記のような過程を通じて測定されたグローバルＤＮＡメチル化レベルの中央値に基づいて、高いグループと低いグループに分けてチェックポイント阻害剤に対する影響を評価した。
前記のような過程を通じて測定されたグローバルＤＮＡメチル化レベルの中央値に基づいて、高いグループと低いグループに分けてチェックポイント阻害剤に対する影響を評価した。
【0072】
その結果、低いグループにおいて、主にオープンシー領域に低メチル化が示されるのに対し、ＣｐＧアイランド及びその周辺領域では、高メチル化現象があらわれることが分かり（図４ａ及び４ｂ）、前記ＴＣＧＡ実施形態の図１にて観察したように、低いグループにおいて腫瘍突然変異負荷と染色体異数性も同様に増加していることが確認できた。
【0073】
重要なのは、チェックポイント治療後の生存率が変異グループにおいてより低いことが分かった。図５のａ、ｂから確認できるように、腫瘍突然変異負荷は生存率に有意な相関関係を示さなかったが、グローバルＤＮＡメチル化を予測変数として用いる場合には、低いグループにおいて生存率が有意に減少することが確認できた。
【0074】
以上の結果は癌患者の免疫療法に対する反応性、さらには予後予測にグローバルＤＮＡメチル化レベルが有意なマーカーとして用いることができ、従来知られている腫瘍突然変異負荷よりも癌治療反応性の予測因子としての精度がより高いことを示唆する。
【0075】
実施形態５．グローバルＤＮＡメチル化と黒色腫に対する免疫療法反応性の相関関係
さらに、免疫チェックポイント阻害剤（イピリムマブ（ｌｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、ヤーボイ（Ｙｅｒｖｏｙ）、または、ペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ））を投与された黒色腫患者１５名の無無増悪生存データをＯｃｋ ｅｔ．ａｌ（Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．８，１０５０（２０１７））から得た。さらに、他の種類の免疫療法を受けた２５名の患者のデータをＧＤＣ ｌｅｇａｃｙ ａｒｃｈｉｖｅ（https://portal.gdc.cancer.gov/legacy-archive）から取得した。それらのメチル化及び突然変異データは、前記実施形態１－１と同様にＴＣＧＡから得た。前記実施形態３の記載と同様の方法でグローバルＤＮＡメチル化と患者の生存間の相関関係を評価した。
さらに、免疫チェックポイント阻害剤（イピリムマブ（ｌｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、ヤーボイ（Ｙｅｒｖｏｙ）、または、ペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ））を投与された黒色腫患者１５名の無無増悪生存データをＯｃｋ ｅｔ．ａｌ（Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．８，１０５０（２０１７））から得た。さらに、他の種類の免疫療法を受けた２５名の患者のデータをＧＤＣ ｌｅｇａｃｙ ａｒｃｈｉｖｅ（https://portal.gdc.cancer.gov/legacy-archive）から取得した。それらのメチル化及び突然変異データは、前記実施形態１－１と同様にＴＣＧＡから得た。前記実施形態３の記載と同様の方法でグローバルＤＮＡメチル化と患者の生存間の相関関係を評価した。
【0076】
その結果、図６に示すように、グローバルＤＮＡメチル化レベルが低い場合、無増悪生存率が減少する様相を呈したが、腫瘍突然変異負荷の場合、無増悪生存率に対する有意な相関関係が確認されなかった。
【0077】
以上のように実施形態が限定された図面によって説明されたが、当該技術分野で通常の知識を有する者であれば、前記に基づいて様々な技術的修正及び変形を適用することができる。例えば、記載された技術が記載された方法とは異なる順序で実行したり、及び／または記載された構成要素が記載された方法とは異なる形態で結合または組み合わせたり、他の構成要素または均等物によって置換または置換されたりしても、適切な結果に至ることができる。
【0078】
したがって、他の具現例、もう一つの実施形態、及び特許請求の範囲と均等なものも添付された特許請求の範囲に属する。
【図1】
【図2a】
【図2b】
【図3a】
【図3b】
【図3c】
【図4a】
【図4b】
【図5a】
【図5b】
【図6】
【国際調査報告】