特表 2022-549186 高い標的密度の細胞に対する選択性を向上させた多量体抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-11-24

(54)【発明の名称】高い標的密度の細胞に対する選択性を向上させた多量体抗体

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20221116BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20221116BHJP

   C07K 16/30 20060101ALI20221116BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20221116BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20221116BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20221116BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20221116BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20221116BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20221116BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20221116BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20221116BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20221116BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20221116BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20221116BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20221116BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20221116BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13

C07K16/00 ZNA

C07K16/30

C12N15/62 Z

C07K16/28

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/21

C12N1/19

C12N5/10

C12P21/08

A61K39/395 Y

A61P35/00

A61P35/02

A61K47/68

A61K38/20

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022517731

(86)(22)【出願日】2020-09-18

(85)【翻訳文提出日】2022-04-25

(86)【国際出願番号】 US2020051513

(87)【国際公開番号】W WO2021055765

(87)【国際公開日】2021-03-25

(31)【優先権主張番号】62/902,915

(32)【優先日】2019-09-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】517252624

【氏名又は名称】アイジーエム バイオサイエンシズ インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100102118

【弁理士】

【氏名又は名称】春名 雅夫

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100205707

【弁理士】

【氏名又は名称】小寺 秀紀

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(72)【発明者】

【氏名】バリガ ラメシュ

(72)【発明者】

【氏名】ヒントン ポール

(72)【発明者】

【氏名】ケイト ブルース

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C076

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA05

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA87X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4C076AA95

4C076CC27

4C076CC41

4C084AA02

4C084BA44

4C084DA12

4C084NA14

4C084ZB261

4C084ZB271

4C085AA13

4C085BB11

4C085BB37

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA41

4H045DA76

4H045EA28

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、多量体結合分子を、例えば、ＩｇＭ、ＩｇＭ様、ＩｇＡ、またはＩｇＡ様結合分子を、例えば、高密度で標的抗原を発現する細胞、例えば腫瘍細胞に対する選択性を向上させた抗体を、提供する。選択性の向上は、例えば、標的抗原に対する結合親和性の調節によって、及び／または多量体抗原結合を介してアビディティーを調節することによって達成され得る。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

２、５、または６個の二価結合ユニットを含む多量体結合分子であって、
前記二価結合ユニットが、それぞれ４、１０、または１２個の結合ユニット関連抗原結合ドメインを集合的に含み、
各結合ユニットが、２つの抗体重鎖を含み、各抗体重鎖が、ＩｇＡ重鎖定常領域、ＩｇＡ様重鎖定常領域、ＩｇＭ重鎖定常領域、もしくはＩｇＭ様重鎖定常領域またはその多量体化フラグメントもしくはバリアント、及び結合ユニット関連抗原結合ドメインまたはそのサブユニットを含み、
前記結合分子の前記結合ユニット関連抗原結合ドメインのうちの少なくとも３つが、細胞の表面上の同じ所定の標的に特異的に結合し、
前記結合分子が、より低い密度で前記所定の標的を発現する細胞と比較して、より高い密度で前記所定の標的を発現する細胞に優先的に結合する、
前記多量体結合分子。

【請求項2】

各抗体重鎖が、結合ユニット関連抗原結合ドメインの重鎖可変領域（ＶＨ）部分を含む、請求項１に記載の結合分子。

【請求項3】

細胞の表面上の前記同じ所定の標的に結合する前記少なくとも３つの結合ユニット関連抗原結合ドメインが、各々、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、請求項１または請求項２に記載の結合分子。

【請求項4】

前記少なくとも３つの抗原結合ドメインが、各々、前記所定の標的上の同じエピトープに結合する、請求項１～３のいずれか１項に記載の結合分子。

【請求項5】

細胞の表面上の前記同じ所定の標的に結合する前記少なくとも３つの結合ユニット関連抗原結合ドメインが、同一である、請求項４に記載の結合分子。

【請求項6】

少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、または１２個の結合ユニット関連抗原結合ドメインが、細胞の表面上の前記同じ所定の標的に結合し、かつ同一である、請求項５に記載の結合分子。

【請求項7】

前記細胞の表面上の前記所定の標的に特異的に結合する前記同一の結合ユニット関連抗原結合ドメインのうちの２つのみを有する参照二価ＩｇＧ抗体と比較して、より高い密度で前記所定の標的を発現する細胞に優先的に結合する、請求項５または請求項６に記載の結合分子。

【請求項8】

前記結合分子が、より高い密度で前記標的抗原を発現する細胞に結合することができ、前記細胞の表面上の前記所定の標的に特異的に結合する前記同一の結合ユニット関連抗原結合ドメインのうちの２つのみを有する前記参照二価ＩｇＧ抗体が、より高い密度で前記標的抗原を発現する前記細胞に結合することができない、請求項７に記載の結合分子。

【請求項9】

より低い密度で前記所定の標的を発現する細胞に検出可能に結合しない、請求項１～８のいずれか１項に記載の結合分子。

【請求項10】

高密度で前記所定の標的を発現する前記細胞が、がん細胞であり、低密度で前記所定の標的を発現する前記細胞が、正常細胞である、請求項１～９のいずれか１項に記載の結合分子。

【請求項11】

前記結合分子が、五量体または六量体であり、それぞれ５または６個の二価のＩｇＭ結合ユニットまたはＩｇＭ様結合ユニットを含み、
各結合ユニットが、結合ユニット関連抗原結合ドメインまたはそのサブユニットに各々関連付けられた２つのＩｇＭ重鎖定常領域もしくはＩｇＭ様重鎖定常領域またはその多量体化フラグメントもしくはバリアントを含む、
請求項１～１０のいずれか１項に記載の結合分子。

【請求項12】

前記ＩｇＭ重鎖定常領域もしくはＩｇＭ様重鎖定常領域またはその多量体化フラグメントもしくはバリアントが、各々、Ｃμ４ドメイン及びＩｇＭテールピース（ｔｐ）ドメインを含む、請求項１１に記載の結合分子。

【請求項13】

前記ＩｇＭ重鎖定常領域もしくはＩｇＭ様重鎖定常領域またはその多量体化フラグメントもしくはバリアントが、各々、Ｃμ１ドメイン、Ｃμ２ドメイン、Ｃμ３ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む、請求項１１または請求項１２に記載の結合分子。

【請求項14】

前記ＩｇＭ重鎖定常領域または前記ＩｇＭ様重鎖定常領域が、ヒトＩｇＭ定常領域またはヒト由来のＩｇＭ様定常領域を含む、請求項１１～１３のいずれか１項に記載の結合分子。

【請求項15】

各結合ユニットが、
前記ＩｇＭ定常領域もしくはＩｇＭ様定常領域またはその多量体化フラグメントもしくはバリアントに対しアミノ末端側に位置するＶＨを各々含む、２つのＩｇＭ重鎖またはＩｇＭ様重鎖と、
免疫グロブリン軽鎖定常領域に対しアミノ末端側に位置するＶＬを各々含む、２つの免疫グロブリン軽鎖と
を含む、
請求項１１～１４のいずれか１項に記載の結合分子。

【請求項16】

五量体であり、Ｊ鎖またはその機能的フラグメントもしくはバリアントをさらに含む、請求項１１～１５のいずれか１項に記載の結合分子。

【請求項17】

前記結合分子が、二量体であり、２つの二価のＩｇＡ結合ユニットもしくはＩｇＡ様結合ユニット及びＪ鎖またはその機能的フラグメントもしくはバリアントを含み、
各結合ユニットが、結合ユニット関連抗原結合ドメインまたはそのサブユニットに各々関連付けられた２つのＩｇＡ重鎖定常領域もしくはＩｇＡ様重鎖定常領域またはその多量体化フラグメントもしくはバリアントを含む、
請求項１～１０のいずれか１項に記載の結合分子。

【請求項18】

分泌成分、またはその機能的フラグメントもしくはバリアントをさらに含む、請求項１７に記載の結合分子。

【請求項19】

前記ＩｇＡ重鎖定常領域もしくはＩｇＡ様重鎖定常領域またはその多量体化フラグメントもしくはバリアントが、各々、Ｃα３ドメイン及びＩｇＡテールピース（ｔｐ）ドメインを含む、請求項１７または請求項１８に記載の結合分子。

【請求項20】

前記ＩｇＡ重鎖定常領域もしくはＩｇＡ様重鎖定常領域またはその多量体化フラグメントもしくはバリアントが、各々、Ｃα１ドメイン、Ｃα２ドメイン、ＩｇＡヒンジ領域、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む、請求項１９に記載の結合分子。

【請求項21】

前記ＩｇＡ重鎖定常領域もしくはＩｇＡ様重鎖定常領域またはその多量体化フラグメントもしくはバリアントが、ヒトＩｇＡ重鎖定常領域またはヒト由来ＩｇＡ様重鎖定常領域である、請求項１７～２０のいずれか１項に記載の結合分子。

【請求項22】

各結合ユニットが、
前記ＩｇＡ重鎖定常領域もしくはＩｇＡ様重鎖定常領域またはその多量体化フラグメントもしくはバリアントに対しアミノ末端側に位置するＶＨを各々含む、２つのＩｇＡ重鎖またはＩｇＡ様重鎖と、
免疫グロブリン軽鎖定常領域に対しアミノ末端側に位置するＶＬを各々含む、２つの免疫グロブリン軽鎖と
を含む、
請求項１７～２１のいずれか１項に記載の結合分子。

【請求項23】

前記Ｊ鎖またはそのフラグメントもしくはバリアントが、配列番号４２のアミノ酸配列を含むヒトＪ鎖またはその機能的フラグメントもしくはバリアントである、請求項１６～２２のいずれか１項に記載の結合分子。

【請求項24】

前記Ｊ鎖またはその機能的フラグメントもしくはバリアントが、野生型Ｊ鎖と比較して、前記結合分子の血清半減期に影響を及ぼし得る１つ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を含むバリアントＪ鎖であり、前記結合分子が、動物に投与されると、前記１つ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を除いて同一でありかつ同じ動物種に同じようにして投与される参照結合分子と比較して、増加した血清半減期を示す、請求項１６～２３のいずれか１項に記載の結合分子。

【請求項25】

前記Ｊ鎖またはその機能的フラグメントもしくはバリアントが、野生型ヒトＪ鎖（配列番号４２）のアミノ酸Ｙ１０２に対応するアミノ酸位置にアミノ酸置換を含む、請求項２４に記載の結合分子。

【請求項26】

配列番号４２のＹ１０２に対応する前記アミノ酸が、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、またはアルギニン（Ｒ）で置換されている、請求項２５に記載の結合分子。

【請求項27】

配列番号４２のＹ１０２に対応する前記アミノ酸が、アラニン（Ａ）で置換されている、請求項２６に記載の結合分子。

【請求項28】

前記Ｊ鎖が、バリアントヒトＪ鎖であり、かつ配列番号４３（Ｊ^＊）のアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の結合分子。

【請求項29】

前記Ｊ鎖またはそのフラグメントもしくはバリアントが、異種部分をさらに含む修飾Ｊ鎖であり、前記異種部分が、前記Ｊ鎖またはそのフラグメントもしくはバリアントに化学的にコンジュゲートまたは融合されている、請求項１６～２８のいずれか１項に記載の結合分子。

【請求項30】

前記異種部分が、異種ポリペプチドである、請求項２９に記載の結合分子。

【請求項31】

前記異種ポリペプチドが、ペプチドリンカーを介して前記Ｊ鎖またはそのフラグメントもしくはバリアントに融合されている、請求項３０に記載の結合分子。

【請求項32】

前記ペプチドリンカーが、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、または配列番号６１からなる、請求項３１に記載の結合分子。

【請求項33】

前記異種ポリペプチドが、前記Ｊ鎖またはそのフラグメントもしくはバリアントのＮ末端に融合されているか、前記Ｊ鎖またはそのフラグメントもしくはバリアントのＣ末端に融合されているか、あるいは
異種ポリペプチドが、前記Ｊ鎖またはそのフラグメントもしくはバリアントの前記Ｎ末端及び前記Ｃ末端の両方に融合されている、
請求項３０～３２のいずれか１項に記載の結合分子。

【請求項34】

前記結合分子が、前記Ｊ鎖またはそのフラグメントもしくはバリアントに融合した少なくとも２つの異種ポリペプチドを含み、前記少なくとも２つの異種ポリペプチドが、同じであり得るかまたは異なり得る、請求項３０～３３のいずれか１項に記載の結合分子。

【請求項35】

少なくとも１つの異種ポリペプチドが、Ｊ鎖関連抗原結合ドメインを含む、請求項３０～３４のいずれか１項に記載の結合分子。

【請求項36】

前記Ｊ鎖関連抗原結合ドメインが、抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項３５に記載の結合分子。

【請求項37】

前記抗原結合フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）フラグメント、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項３６に記載の結合分子。

【請求項38】

前記Ｊ鎖関連抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖフラグメントを含む、請求項３７に記載の結合分子。

【請求項39】

前記Ｊ鎖関連抗原結合ドメインが、免疫エフェクター細胞に特異的に結合する、請求項３５～３８のいずれか１項に記載の結合分子。

【請求項40】

前記免疫エフェクター細胞が、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である、請求項３９に記載の結合分子。

【請求項41】

前記免疫エフェクター細胞が、Ｔ細胞であり、前記Ｊ鎖関連抗原結合ドメインが、ＣＤ３εに特異的に結合するｓｃＦｖフラグメントを含む、請求項３９または請求項４０に記載の結合分子。

【請求項42】

前記Ｔ細胞が、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞である、請求項４１に記載の結合分子。

【請求項43】

前記ｓｃＦｖフラグメントが、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、
前記ＶＨが、ＶＨ相補性決定領域ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、及びＶＨＣＤＲ３を含み、それらはそれぞれ、
配列番号４９、配列番号５０、及び配列番号５１のアミノ酸配列、または
前記ＶＨＣＤＲのうちの１つ以上に１、２、もしくは３つのアミノ酸置換を有する配列番号４９、配列番号５０、及び配列番号５１のアミノ酸配列
を含み、
前記ＶＬが、ＶＬ相補性決定領域ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、及びＶＬＣＤＲ３を含み、それらはそれぞれ、
配列番号５３、配列番号５４、及び配列番号５５のアミノ酸配列、または
前記ＶＬＣＤＲのうちの１つ以上に１、２、もしくは３つのアミノ酸置換を有する配列番号５３、配列番号５４、及び配列番号５５のアミノ酸配列
を含む、
請求項４１または請求項４２に記載の結合分子。

【請求項44】

前記ｓｃＦｖフラグメントが、配列番号４８のＶＨアミノ酸配列と配列番号５２のＶＬアミノ酸配列とを含む、請求項４３に記載の結合分子。

【請求項45】

前記ｓｃＦｖフラグメントが、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、前記ＶＨ及び前記ＶＬが、それぞれ、配列番号４４及び配列番号４５のアミノ酸配列を含む、請求項４１または請求項４２に記載の結合分子。

【請求項46】

前記修飾Ｊ鎖が、配列番号４６のアミノ酸２０～４１２（Ｖ１５Ｊ）、配列番号４７のアミノ酸２０～４１２（Ｖ１５Ｊ＊）、または配列番号５６のアミノ酸２０～４２０（ＳＪ＊）を含む、請求項４１または請求項４２に記載の結合分子。

【請求項47】

前記免疫エフェクター細胞が、ＮＫ細胞であり、前記ｓｃＦｖフラグメントが、ＣＤ１６に特異的に結合する、請求項４０に記載の結合分子。

【請求項48】

前記修飾Ｊ鎖が、前記Ｊ鎖またはそのフラグメントもしくはバリアントに融合または化学的にコンジュゲートされた免疫刺激剤（「ＩＳＡ」）をさらに含む、請求項２９～４７のいずれか１項に記載の結合分子。

【請求項49】

前記ＩＳＡが、サイトカインまたはその受容体結合フラグメントもしくはバリアントを含む、請求項４８に記載の結合分子。

【請求項50】

前記ＩＳＡが、
（ａ）インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）タンパク質またはその受容体結合フラグメントもしくはバリアント（「Ｉ」）、及び
（ｂ）Ｉと会合することができるスシドメインまたはそのバリアントを含むインターロイキン－１５受容体α（ＩＬ－１５Ｒα）フラグメント（「Ｒ」）
を含み、
前記Ｊ鎖またはそのフラグメントもしくはバリアント、ならびにＩ及びＲのうちの少なくとも１つが、融合タンパク質として会合し、
Ｉ及びＲが、会合して前記ＩＳＡとして機能することができる、
請求項４９に記載の結合分子。

【請求項51】

前記ＩＳＡが、ペプチドリンカーを介して前記Ｊ鎖に融合されている、請求項４８～５０のいずれか１項に記載の結合分子。

【請求項52】

前記所定の標的が、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ５２、ＣＤ３０、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣＤ３８、ＧＤ２、ＳＬＡＭＦ７、血小板由来成長因子受容体Ａ（ＰＤＧＦＲＡ）、ＣＤ２２、ＦＬＴ３（ＣＤ１３５）、ＣＤ１２３、ＭＵＣ－１６、がん胎児性抗原関連細胞接着分子１（ＣＥＡＣＡＭ－１）、メソテリン、腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー２（Ｔｒｏｐ－２）、グリピカン－３（ＧＰＣ－３）、ヒト血液型Ｈタイプ１三糖（Ｇｌｏｂｏ－Ｈ）、シアリルＴｎ抗原（ＳＴｎ抗原）、またはＣＤ３３である、請求項１～５１のいずれか１項に記載の結合分子。

【請求項53】

前記所定の標的に特異的な前記少なくとも３つの同一の結合ユニット関連抗原結合ドメインが、前記所定の標的に結合することが知られている既存の抗体の抗原結合ドメインの親和性低減バリアントであり、前記既存の抗体の抗原結合ドメインが、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、請求項５～５２のいずれか１項に記載の結合分子。

【請求項54】

前記既存の抗体が、アレムツズマブ、アテゾリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、ベバシズマブ、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブ、カプロマブ、セツキシマブ、ダラツムマブ、デノスマブ、ジヌツキシマブ、デュルバルマブ、エロツズマブ、ゲムツズマブ、イブリツモマブ、イピリムマブ、イノツズマブ、ネシツムマブ、ニボルマブ、ニボルマブ、オビヌツズマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オマリズマブ、パニツムマブ、ペムブロリズマブ、ペルツズマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、トラスツズマブ、またはトレメリムマブである、請求項５３に記載の結合分子。

【請求項55】

前記既存の抗体よりも少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、または少なくとも１０００倍低い前記所定の標的に対する結合親和性で、前記所定の標的に結合する、請求項５３または請求項５４に記載の結合分子。

【請求項56】

前記既存の抗体の前記抗原結合ドメインのＶＨ及びＶＬが、それぞれ、配列番号７及び配列番号８、配列番号１４及び配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７、配列番号１８及び配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１、配列番号２２及び配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５、配列番号２６及び配列番号２７、配列番号２８及び配列番号２９、配列番号３０及び配列番号３１、配列番号３２及び配列番号３３、配列番号３４及び配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３７、配列番号３８及び配列番号３９、または配列番号４０及び配列番号４１のアミノ酸配列を含む、請求項５３～５５のいずれか１項に記載の結合分子。

【請求項57】

前記既存の抗体の前記抗原結合ドメインが、配列番号７の前記ＶＨアミノ酸配列及び配列番号８の前記ＶＬアミノ酸配列を含み、前記親和性低減バリアントが、配列番号８の前記ＶＬのＮ９３位にアミノ酸置換を含む、請求項５６に記載の結合分子。

【請求項58】

前記アミノ酸置換が、Ｎ９３ＤまたはＮ９３Ｅである、請求項５７に記載の結合分子。

【請求項59】

前記所定の標的に特異的な前記少なくとも３つの同一の結合ユニット関連抗原結合ドメインが、配列番号７の前記ＶＨアミノ酸配列と、配列番号９または配列番号１０の前記ＶＬアミノ酸配列とを含む、請求項５８に記載の結合分子。

【請求項60】

低密度でＣＤ２０を発現するＢ細胞のＥＣ５０濃度よりも、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、または少なくとも１０００倍低いＥＣ５０濃度で、高密度でＣＤ２０を発現するＢ細胞の補体指向性細胞傷害性（ＣＤＣ）を導くことができる、請求項５７～５９のいずれか１項に記載の結合分子。

【請求項61】

高密度でＣＤ２０を発現するＢ細胞のＣＤＣを導くことができるが、低密度でＣＤ２０を発現するＢ細胞については導くことができない、請求項５７～６０のいずれか１項に記載の結合分子。

【請求項62】

五量体ＩｇＭもしくはＩｇＭ様結合分子、または二量体ＩｇＡもしくはＩｇＡ様結合分子であり、ＣＤ３εに特異的に結合するｓｃＦｖを含む修飾Ｊ鎖をさらに含む、請求項５７～６１のいずれか１項に記載の結合分子。

【請求項63】

前記修飾Ｊ鎖が、配列番号４６のアミノ酸２０～４１２（Ｖ１５Ｊ）、配列番号４７のアミノ酸２０～４１２（Ｖ１５Ｊ＊）、または配列番号５６のアミノ酸２０～４２０（ＳＪ＊）を含む、請求項６２に記載の結合分子。

【請求項64】

低密度でＣＤ２０を発現するＢ細胞株または正常なＢ細胞のＥＣ５０濃度よりも少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、または少なくとも１０００倍低いＥＣ５０濃度で、高密度でＣＤ２０を発現するＢ細胞のＴ細胞指向性細胞傷害性（ＴＤＣＣ）、またはＴＤＣＣ及びＣＤＣの両方を導くことができる、請求項６２または請求項６３に記載の結合分子。

【請求項65】

高密度でＣＤ２０を発現するＢ細胞のＴＤＣＣ、またはＴＤＣＣ及びＣＤＣの両方を導くことができるが、低密度でＣＤ２０を発現するＢ細胞については導くことができない、請求項６２～６４のいずれか１項に記載の結合分子。

【請求項66】

高密度及び低密度の両方でＣＤ２０を発現する前記Ｂ細胞が、リンパ腫細胞株である、請求項６０～６５のいずれか１項に記載の結合分子。

【請求項67】

高密度でＣＤ２０を発現する前記リンパ腫細胞株が、Ｒａｍｏｓ細胞株、Ｒａｊｉ細胞株、ＤｏＨＨ－２細胞株、ＪｅＫｏ－１細胞株、Ｚ－１３８細胞株、Ｄａｕｄｉ細胞株、Ｇｒａｎｔａ細胞株、またはＤｏＨＨ２細胞株であり、低密度でＣＤ２０を発現する前記リンパ腫細胞株が、ＣＡ４６細胞株、Ｎａｌｍ－１細胞株、Ｔｏｌｅｄｏ細胞株、ＢＪＡＢ細胞株、Ｋａｓｕｍｉ－２細胞株、ＲＰＭＩ８２２６細胞株、ＨＴ細胞株、ＳＵ－ＤＨＬ－８細胞株、ＪＭ１細胞株、Ｎａｍａｌｗａ細胞株、Ｎａｌｍ－６細胞株、またはＺ１３８細胞株である、請求項６６に記載の結合分子。

【請求項68】

前記結合分子が、Ｒａｍｏｓ細胞のＣＤＣを導くことができ、前記結合分子と同じ抗原結合ドメインを含む等量の単一特異性二価ＩｇＧ１抗体が、Ｒａｍｏｓ細胞の検出可能な補体媒介性殺滅を示さない、請求項６６または請求項６７のいずれか１項に記載の結合分子。

【請求項69】

前記高密度でＣＤ２０を発現するＢ細胞が、がんを有する対象におけるＣＤ２０陽性の悪性Ｂ細胞であり、前記低密度でＣＤ２０を発現するＢ細胞が、前記がんを有する対象における正常なＢ細胞である、請求項６０～６５のいずれか１項に記載の結合分子。

【請求項70】

前記がんが、ＣＤ２０陽性の白血病、リンパ腫、または骨髄腫である、請求項６９に記載の結合分子。

【請求項71】

前記対象が、ヒトである、請求項６９または７０に記載の結合分子。

【請求項72】

請求項１～７１のいずれか１項に記載の結合分子と担体とを含む、組成物。

【請求項73】

請求項１～７１のいずれか１項に記載の結合分子、またはその抗原結合及び多量体化フラグメント、またはそのサブユニットをコードする核酸分子を含む、単離されたポリヌクレオチド。

【請求項74】

前記サブユニットが、抗体重鎖または多量体化フラグメントもしくはそのバリアント、抗体軽鎖またはそのフラグメント、Ｊ鎖またはそのフラグメントもしくはそのバリアント、あるいはそれらの任意の組み合わせである、請求項７３に記載のポリヌクレオチド。

【請求項75】

請求項７３または請求項７４に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。

【請求項76】

請求項７５に記載のベクターを含む、宿主細胞。

【請求項77】

請求項１～７１のいずれか１項に記載の結合分子の産生方法であって、請求項７６に記載の宿主細胞を培養する工程と、前記結合分子を回収する工程とを含む、前記産生方法。

【請求項78】

５個の二価結合ユニット及び修飾Ｊ鎖を含むＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体であって、
各結合ユニットが、結合ユニット関連抗原結合ドメインに各々関連付けられた２つのヒトＩｇＭ重鎖定常領域またはヒト由来のＩｇＭ様重鎖定常領域またはその多量体化フラグメントもしくはバリアントを含み、
前記抗体の各結合ユニット関連抗原結合ドメインが、配列番号７のＶＨアミノ酸配列と、配列番号９または配列番号１０のＶＬアミノ酸配列とを含み、
前記修飾Ｊ鎖が、ＣＤ３εに特異的に結合するｓｃＦｖを含むＪ鎖関連結合ドメインを含み、
前記ＩｇＭ抗体は、低密度でＣＤ２０を発現するＢ細胞株または正常Ｂ細胞のＥＣ５０濃度よりも少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、または少なくとも１０００倍低いＥＣ５０濃度で、高密度でＣＤ２０を発現するＢ細胞のＴＤＣＣ、ＣＤＣ、またはＴＤＣＣ及びＣＤＣの両方を導くことができる、
前記ＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体。

【請求項79】

高密度でＣＤ２０を発現するＢ細胞のＣＤＣ、ＴＤＣＣ、またはＴＤＣＣ及びＣＤＣの両方を導くことができるが、低密度でＣＤ２０を発現するＢ細胞については導くことができない、請求項７８に記載のＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体。

【請求項80】

前記修飾Ｊ鎖が、配列番号４６のアミノ酸２０～４１２（Ｖ１５Ｊ）、配列番号４７のアミノ酸２０～４１２（Ｖ１５Ｊ＊）、または配列番号５６のアミノ酸２０～４２０（ＳＪ＊）を含む、請求項７８または請求項７９に記載のＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体。

【請求項81】

前記高密度及び低密度でＣＤ２０を発現する細胞が、リンパ腫細胞株である、請求項７８～８０のいずれか１項に記載のＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体。

【請求項82】

前記高密度でＣＤ２０を発現する細胞が、Ｒａｍｏｓ細胞株であり、前記低密度でＣＤ２０を発現する細胞が、ＣＡ４６細胞株である、請求項８１に記載のＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体。

【請求項83】

前記ＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体が、Ｒａｍｏｓ細胞の補体媒介性殺滅を導くことができ、同じ抗原結合ドメインを含む等量の単一特異性二価ＩｇＧ１抗体が、Ｒａｍｏｓ細胞の検出可能な補体媒介性殺滅を示さない、請求項７８～８２のいずれか１項に記載のＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体。

【請求項84】

前記高密度でＣＤ２０を発現する細胞が、がんを有する対象における悪性Ｂ細胞であり、前記低密度でＣＤ２０を発現する細胞が、前記がんを有する対象における正常なＢ細胞である、請求項７８～８０のいずれか１項に記載のＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体。

【請求項85】

前記がんが、ＣＤ２０陽性の白血病、リンパ腫、または骨髄腫である、請求項８４に記載のＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体。

【請求項86】

前記対象が、ヒトである、請求項８４または請求項８５に記載のＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体。

【請求項87】

対象におけるがんを治療するための方法であって、有効量の請求項１～７１のいずれか１項に記載の結合分子、請求項７２に記載の組成物、または請求項７８～８６のいずれか１項に記載のＩｇＭもしくはＩｇＭ様抗体を、治療を必要とする対象に投与する工程を含む、前記方法。

【請求項88】

がんを治療するための薬剤の調製における、有効量の請求項１～７１のいずれか１項に記載の結合分子、請求項７２に記載の組成物、または請求項７８～８６のいずれか１項に記載のＩｇＭもしくはＩｇＭ様抗体の使用。

【請求項89】

がんの治療における使用のための、請求項１～７１のいずれか１項に記載の結合分子、請求項７２に記載の組成物、または請求項７８～８６のいずれか１項に記載のＩｇＭもしくはＩｇＭ様抗体。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年９月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／９０２，９１５号の利益を主張し、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。このＡＳＣＩＩの写しは、２０２０年９月１７日に作成されたものであり、０２３ＷＯ１－Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｌｉｓｔｉｎｇと名付けられ、８２，２８３バイトのサイズである。

【背景技術】

【0003】

背景
がん細胞及び他の疾患細胞を直接標的とするモノクローナル抗体は、通常、疾患細胞上で過剰発現されるが正常で健康な細胞上でも低減されたレベルで発現される、標的抗原に結合する。したがって、このような抗体での治療は、腫瘍細胞を殺滅させ得るが、この抗体はまた、正常な細胞にも悪影響を及ぼし得る。例えば、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体リツキシマブは、Ｂ細胞リンパ腫を効果的に殺すことができるが、患者の正常なＢ細胞を枯渇させることもできる。Ｋｏｓｍａｓ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ，１６：２００４－２０１５（２００２）（非特許文献１）。最近、Ｓｌａｇａ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓ．Ｍｅｄ．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．ａａｔ５７７５（２０１８）（非特許文献２）は、ＨＥＲ２に二価結合するが、親和性が低減した二重特異性抗ＨＥＲ２／ＣＤ３抗体が、より低い密度のＨＥＲ２を発現する非腫瘍細胞の殺滅と比較して、ＨＥＲ２過剰発現腫瘍細胞の選択的殺滅を示したことを実証した。

【0004】

多量体化することができる抗体及び抗体分子（例えば、ＩｇＡ及びＩｇＭ抗体）は、例えば、免疫腫瘍学及び感染性疾患の分野で、特異性及びアビディティーの改善、ならびに複数の結合標的への結合能をも可能にする有望な薬物候補として浮上している。例えば、米国特許第９，９５１，１３４号（特許文献１）、同第９，９３８，３４７号（特許文献２）、及び同第１０，６１８，９７８号（特許文献３）、米国特許出願公開第ＵＳ２０１９－０１００５９７号（特許文献４）及び第ＵＳ２０１９－０１８５５７０号（特許文献５）、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ２０１６／１５４５９３号（特許文献６）、第ＷＯ２０１６／１６８７５８号（特許文献７）、第ＷＯ２０１８／０１７８８８号（特許文献８）、第ＷＯ２０１８／０１７７６３号（特許文献９）、第ＷＯ２０１８／０１７８８９号（特許文献１０）、第ＷＯ２０１８／０１７７６１号（特許文献１１）、及び第ＷＯ２０１９／１６９３１４号（特許文献１２）を参照されたく、これらの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0005】

低減した密度で抗原を発現する健康な細胞との相互作用を回避しながら、標的抗原を過剰発現する腫瘍または他の疾患細胞をより選択的に標的化することができる治療用モノクローナル抗体の必要性が残っている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】米国特許第９，９５１，１３４号

【特許文献2】同第９，９３８，３４７号

【特許文献3】同第１０，６１８，９７８号

【特許文献4】米国特許出願公開第ＵＳ２０１９－０１００５９７号

【特許文献5】第ＵＳ２０１９－０１８５５７０号

【特許文献6】ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１６／１５４５９３号

【特許文献7】第ＷＯ２０１６／１６８７５８号

【特許文献8】第ＷＯ２０１８／０１７８８８号

【特許文献9】第ＷＯ２０１８／０１７７６３号

【特許文献10】第ＷＯ２０１８／０１７８８９号

【特許文献11】第ＷＯ２０１８／０１７７６１号

【特許文献12】第ＷＯ２０１９／１６９３１４号

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Ｋｏｓｍａｓ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ，１６：２００４－２０１５（２００２）

【非特許文献2】Ｓｌａｇａ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓ．Ｍｅｄ．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．ａａｔ５７７５（２０１８）

【発明の概要】

【0008】

概要
本開示は、２、５、または６個の二価結合ユニットを含む多量体結合分子であって、二価結合ユニットが、それぞれ４、１０、または１２個の結合ユニット関連抗原結合ドメインを集合的に含む、多量体結合分子を提供する。本明細書で提供されるように、各結合ユニットは、２つの抗体重鎖を含み、各抗体重鎖が、ＩｇＡ重鎖定常領域、ＩｇＡ様重鎖定常領域、ＩｇＭ重鎖定常領域、もしくはＩｇＭ様重鎖定常領域またはその多量体化フラグメントもしくはバリアント、及び結合ユニット関連抗原結合ドメインまたはそのサブユニットを有し、結合分子の結合ユニット関連抗原結合ドメインのうちの少なくとも３つが、細胞表面上の同じ所定の標的に特異的に結合し、結合分子が、より低い密度で所定の標的を発現する細胞と比較して、より高い密度で所定の標的を発現する細胞に優先的に結合する。

【0009】

特定の実施形態では、各抗体重鎖は、結合ユニット関連抗原結合ドメインの重鎖可変領域（ＶＨ）部分を含む。特定の実施形態では、細胞の表面上の同じの所定の標的に結合する少なくとも３つの結合ユニット関連抗原結合ドメインは、各々、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。ある特定の実施形態では、少なくとも３つの抗原結合ドメインはそれぞれ、所定の標的上の同じエピトープに結合する。ある特定の実施形態では、細胞の表面上の同じの所定の標的に結合する少なくとも３つの結合ユニット関連抗原結合ドメインは、同一である。

【0010】

ある特定の実施形態では、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、または１２個の結合ユニット関連抗原結合ドメインは、細胞の表面上の同じの所定の標的に結合し、かつ同一である。ある特定の実施形態では、提供される結合分子は、細胞の表面上の所定の標的に特異的に結合する同一の結合ユニット関連抗原結合ドメインのうちの２つのみを有する参照二価ＩｇＧ抗体と比較して、より高い密度で所定の標的を発現する細胞に優先的に結合する。特定の実施形態では、提供される結合分子は、より高い密度で標的抗原を発現する細胞に結合することができ、細胞の表面上の所定の標的に特異的に結合する同一の結合ユニット関連抗原結合ドメインのうちの２つのみを有する参照二価ＩｇＧ抗体は、より高い密度で標的抗原を発現する細胞に結合することができない。ある特定の実施形態では、提供される結合分子は、より低い密度で所定の標的を発現する細胞に検出可能に結合しない。ある特定の実施形態において、高密度で所定の標的を発現する細胞は、がん細胞であり、低密度で所定の標的を発現する細胞は、正常な健康細胞である。

【0011】

ある特定の実施形態では、多量体結合分子は、五量体または六量体であり、それぞれ５または６個の二価のＩｇＭ結合ユニットまたはＩｇＭ様結合ユニットを含み、各結合ユニットは、結合ユニット関連抗原結合ドメインまたはそのサブユニットに各々関連付けられた２つのＩｇＭ重鎖定常領域もしくはＩｇＭ様重鎖定常領域またはその多量体化フラグメントもしくはバリアントを含む。ある特定の実施形態では、ＩｇＭ重鎖定常領域もしくはＩｇＭ様重鎖定常領域、またはそれらの多量体化フラグメントもしくはバリアントは、各々、Ｃμ４ドメイン及びＩｇＭテールピース（ｔｐ）ドメインを含み、さらに、Ｃμ１ドメイン、Ｃμ２ドメイン、Ｃμ３ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。ある特定の実施形態では、ＩｇＭ重鎖定常領域またはＩｇＭ様重鎖定常領域は、ヒトＩｇＭ定常領域またはヒト由来ＩｇＭ様定常領域である。ある特定の実施形態では、各結合ユニットは、ＩｇＭ定常領域もしくはＩｇＭ様定常領域またはその多量体化フラグメントもしくはバリアントに対しアミノ末端側に位置するＶＨを各々含む２つのＩｇＭ重鎖またはＩｇＭ様重鎖と、免疫グロブリン軽鎖定常領域に対してアミノ末端側に位置するＶＬを各々含む２つの免疫グロブリン軽鎖とを含む。多量体結合分子が五量体であるそれらの実施形態では、多量体結合分子は、Ｊ鎖またはその機能的フラグメントもしくはバリアントをさらに含み得る。

【0012】

ある特定の実施形態では、多量体結合分子は二量体であり、２つの二価のＩｇＡ結合ユニットもしくはＩｇＡ様結合ユニット及びＪ鎖もしくはその機能的フラグメントもしくはバリアントを含み、各結合ユニットは、結合ユニット関連抗原結合ドメインもしくはそのサブユニットに各々関連付けられた２つのＩｇＡ重鎖定常領域もしくはＩｇＡ様重鎖定常領域またはその多量体化フラグメントもしくはバリアントを含む。ある特定の実施形態では、二量体結合分子は、分泌成分、またはその機能的フラグメントもしくはバリアントをさらに含むことができる。ある特定の実施形態では、ＩｇＡ重鎖定常領域もしくはＩｇＡ様重鎖定常領域、またはその多量体化フラグメントもしくはバリアントは、各々、Ｃα３ドメイン及びＩｇＡテールピース（ｔｐ）ドメインを含み、さらにＣα１ドメイン、Ｃα２ドメイン、ＩｇＡヒンジ領域、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。ある特定の実施形態では、ＩｇＡ重鎖定常領域もしくはＩｇＡ様重鎖定常領域またはその多量体化フラグメントもしくはバリアントは、ヒトＩｇＡ重鎖定常領域またはヒト由来ＩｇＡ様重鎖定常領域である。ある特定の実施形態では、各結合ユニットは、ＩｇＡ重鎖定常領域もしくはＩｇＡ様重鎖定常領域またはその多量体化フラグメントもしくはバリアントに対しアミノ末端側に位置するＶＨを各々含む２つのＩｇＡ重鎖またはＩｇＡ様重鎖と、免疫グロブリン軽鎖定常領域に対しアミノ末端側に位置するＶＬを各々含む２つの免疫グロブリン軽鎖とを含む。

【0013】

本明細書で提供するある特定の多量体結合分子は、Ｊ鎖またはそのフラグメントもしくはバリアントを含む。ある特定の実施形態において、Ｊ鎖またはそのフラグメントもしくはバリアントは、配列番号４２のアミノ酸配列を含むヒトまたはヒト由来のＪ鎖またはその機能的フラグメントもしくはバリアントである。ある特定の実施形態において、Ｊ鎖またはその機能的フラグメントもしくはバリアントは、野生型Ｊ鎖と比較して、結合分子の血清半減期に影響を及ぼし得る１つ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を含む、バリアントＪ鎖である。これらの実施形態によれば、バリアントＪ鎖を含む結合分子は、動物に投与されると、１つ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を除いて同一でありかつ同じ動物種に同じようにして投与される参照多量体結合分子と比較して、増加した血清半減期を示す。より具体的には、Ｊ鎖またはその機能的フラグメントもしくはバリアントは、野生型ヒトＪ鎖（配列番号４２）のアミノ酸Ｙ１０２に対応するアミノ酸位置にアミノ酸置換を含む。配列番号４２のＹ１０２は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）またはアルギニン（Ｒ）で置換され得る。より具体的には、配列番号４２のＹ１０２に対応するアミノ酸は、アラニン（Ａ）で置換され得る。ある特定の実施形態では、Ｊ鎖は、バリアントヒトＪ鎖であり、かつ配列番号４３（Ｊ^＊）のアミノ酸配列を含む。

【0014】

ある特定の実施形態では、提供される多量体結合分子のＪ鎖またはそのフラグメントもしくはバリアントは、修飾Ｊ鎖であり、異種部分をさらに含み、異種部分は、Ｊ鎖またはそのフラグメントもしくはバリアントに化学的にコンジュゲートまたは融合されている。ある特定の実施形態では、異種部分は、異種ポリペプチドである。異種ポリペプチドは、ペプチドリンカーを介して、Ｊ鎖またはそのフラグメントもしくはバリアントに融合することができる。例えば、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、または配列番号６１から構成され得る。ある特定の実施形態では、異種ポリペプチドは、Ｊ鎖またはそのフラグメントもしくはバリアントのＮ末端に融合されているか、Ｊ鎖またはそのフラグメントもしくはバリアントのＣ末端に融合されているか、異種ポリペプチドが、Ｊ鎖またはそのフラグメントもしくはバリアントのＮ末端及びＣ末端の両方に融合され得る。ある特定の実施形態では、少なくとも２つの異種ポリペプチドは、Ｊ鎖またはそのフラグメントもしくはバリアントに融合することができ、少なくとも２つの異種ポリペプチドは、同じであり得るか、または異なり得る。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの異種ポリペプチドは、Ｊ鎖関連抗原結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、Ｊ鎖関連抗原結合ドメインは、抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）フラグメント、もしくはそれらの任意の組み合わせである。ある特定の実施形態では、抗原結合フラグメントは、ｓｃＦｖフラグメントである。ある特定の実施形態では、Ｊ鎖関連抗原結合ドメインは、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、またはＮＫ細胞に特異的に結合する。

【0015】

免疫エフェクター細胞がＴ細胞である場合、Ｊ鎖関連抗原結合ドメインは、例えば、ＣＤ３εに特異的に結合するｓｃＦｖフラグメントであり得る。ある特定の実施形態では、抗ＣＤ３ε ｓｃＦｖフラグメントが、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、当該ＶＨが、ＶＨ相補性決定領域ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、及びＶＨＣＤＲ３を含み、それらはそれぞれ、配列番号４９、配列番号５０、及び配列番号５１のアミノ酸配列、または該ＶＨＣＤＲのうちの１つ以上に１、２、もしくは３つのアミノ酸置換を有する配列番号４９、配列番号５０、及び配列番号５１のアミノ酸配列、を含み、当該ＶＬが、ＶＬ相補性決定領域ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、及びＶＬＣＤＲ３を含み、それらはそれぞれ、配列番号５３、配列番号５４、及び配列番号５５のアミノ酸配列、または該ＶＬＣＤＲのうちの１つ以上に１、２、もしくは３つのアミノ酸置換を有する配列番号５３、配列番号５４、及び配列番号５５のアミノ酸配列を含む。例えば、ｓｃＦｖフラグメントは、ＶＨアミノ酸配列（配列番号４８）及びＶＬアミノ重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み得、ここで、ＶＨ及びＶＬは、それぞれ配列番号４４及び配列番号４５のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、修飾Ｊ鎖は、配列番号４６のアミノ酸２０～４１２（Ｖ１５Ｊ）、配列番号４７のアミノ酸２０～４１２（Ｖ１５Ｊ＊）、または配列番号５６のアミノ酸２０～４２０（ＳＪ＊）を含むことができる。免疫エフェクター細胞がＮＫ細胞である場合、Ｊ鎖関連抗原結合ドメインは、例えば、ＣＤ１６に特異的に結合するｓｃＦｖフラグメントであり得る。

【0016】

特定の実施形態では、提供される多量体結合分子の修飾Ｊ鎖は、Ｊ鎖またはそのフラグメントもしくはバリアントに融合または化学的にコンジュゲートされた免疫刺激剤（「ＩＳＡ」）を含み得る。ある特定の実施形態では、ＩＳＡは、サイトカインまたは受容体結合フラグメントもしくはそのバリアントを含み得る。例えば、ＩＳは、（ａ）インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）タンパク質もしくは受容体結合フラグメントもしくはそのバリアント（「Ｉ」）、及び（ｂ）Ｉと会合することができるスシドメインまたはそのバリアントを含むインターロイキン－１５受容体－α（ＩＬ－１５Ｒα）フラグメント（「Ｒ」）を含むことができ、ここで、Ｊ鎖またはそのフラグメントもしくはバリアント、ならびにＩ及びＲの少なくとも１つは、融合タンパク質として会合し、Ｉ及びＲは、会合してＩＳＡとして機能することができる。ある特定の実施形態では、ＩＳＡは、ペプチドリンカーを介してＪ鎖に融合され得る。

【0017】

ある特定の実施形態では、提供される多量体結合分子の所定の標的は、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ５２、ＣＤ３０、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣＤ３８、ＧＤ２、ＳＬＡＭＦ７、血小板由来成長因子受容体Ａ（ＰＤＧＦＲＡ）、ＣＤ２２、ＦＬＴ３（ＣＤ１３５）、ＣＤ１２３、ＭＵＣ－１６、がん胎児性抗原関連細胞接着分子１（ＣＥＡＣＡＭ－１）、メソテリン、腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー２（Ｔｒｏｐ－２）、グリピカン－３（ＧＰＣ－３）、ヒト血液型Ｈタイプ１三糖（Ｇｌｏｂｏ－Ｈ）、シアリル抗原（ＳＴｎ抗原）、またはＣＤ３３である。特定の実施形態では、所定の標的に特異的な少なくとも３つの同一の結合ユニット関連抗原結合ドメインは、所定の標的に結合することが知られている既存の抗体の抗原結合ドメインの親和性低減バリアントであり、既存の抗体の抗原結合ドメインは、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。ある特定の実施形態では、既存の抗体は、アレムツズマブ、アテゾリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、ベバシズマブ、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブ、カプロマブ、セツキシマブ、ダラツムマブ、デノスマブ、ジヌツキシマブ、デュルバルマブ、エロツズマブ、ゲムツズマブ、イブリツモマブ、イピリムマブ、イノツズマブ、ネシツムマブ、ニボルマブ、ニボルマブ、オビヌツズマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オマリズマブ、パニツムマブ、ペムブロリズマブ、ペルツズマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、トラスツズマブ、またはトレメリムマブである。ある特定の実施形態では、提供される結合分子は、既存の抗体よりも少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、または少なくとも１０００倍低い所定の標的に対する結合親和性で、所定の標的に結合する。ある特定の実施形態では、既存の抗体の抗原結合ドメインのＶＨ及びＶＬは、それぞれ、配列番号７及び配列番号８、配列番号１４及び配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７、配列番号１８及び配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１、配列番号２２及び配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５、配列番号２６及び配列番号２７、配列番号２８及び配列番号２９、配列番号３０及び配列番号３１、配列番号３２及び配列番号３３、配列番号３４及び配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３７、配列番号３８及び配列番号３９、または配列番号４０及び配列番号４１のアミノ酸配列を含む。

【0018】

より具体的には、既存の抗体の抗原結合ドメインは、ＣＤ２０に特異的に結合し、配列番号７のＶＨアミノ酸配列及び配列番号８のＶＬアミノ酸配列を含み、親和性低減バリアントは、配列番号８のＶＬのＮ９３位にアミノ酸置換を含む。例えば、配列番号８のＮ９３は、Ｎ９３ＤまたはＮ９３Ｅアミノ酸置換を含むことができる。ある特定の実施形態では、所定の標的に特異的な少なくとも３つの同一の結合ユニット関連抗原結合ドメインは、配列番号７のＶＨアミノ酸配列と、配列番号９または配列番号１０のＶＬアミノ酸配列とを含む。ある特定の実施形態では、提供される結合分子は、低密度でＣＤ２０を発現するＢ細胞のＥＣ５０濃度よりも、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、または少なくとも１０００倍低いＥＣ５０濃度で、高密度でＣＤ２０を発現するＢ細胞の補体指向性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ）細胞傷害性（ＣＤＣ）を導くことができる。ある特定の実施形態では、提供される結合分子は、高密度でＣＤ２０を発現するＢ細胞のＣＤＣを導くことができるが、低密度でＣＤ２０を発現するＢ細胞については導くことができない。ある特定の実施形態では、提供される抗ＣＤ２０結合分子は、五量体ＩｇＭまたはＩｇＭ様結合分子、または二量体ＩｇＡまたはＩｇＡ様結合分子であり、ＣＤ３εに特異的に結合するｓｃＦｖを含む修飾Ｊ鎖をさらに含む。例えば、修飾Ｊ鎖は、配列番号４６のアミノ酸２０～４１２（Ｖ１５Ｊ）、配列番号４７のアミノ酸２０～４１２（Ｖ１５Ｊ＊）、または配列番号５６のアミノ酸２０～４２０（ＳＪ＊）を含むことができる。ある特定の実施形態では、提供される抗ＣＤ２０結合分子は、低密度でＣＤ２０を発現するＢ細胞株または正常なＢ細胞のＥＣ５０濃度よりも少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、または少なくとも１０００倍低いＥＣ５０濃度で、高密度でＣＤ２０を発現するＢ細胞のＴ細胞指向性細胞傷害性（ＴＤＣＣ）、またはＴＤＣＣとＣＤＣの両方を導くことができる。ある特定の実施形態では、提供される抗ＣＤ２０結合分子は、高密度でＣＤ２０を発現するＢ細胞のＴＤＣＣ、またはＴＤＣＣ及びＣＤＣの両方を導くことができるが、低密度でＣＤ２０を発現するＢ細胞については導くことができない。ある特定の実施形態では、高密度及び低密度の両方でＣＤ２０を発現するＢ細胞は、リンパ腫細胞株である。例えば、高密度でＣＤ２０を発現するリンパ腫細胞株は、Ｒａｍｏｓ細胞株、Ｒａｊｉ細胞株、ＤｏＨＨ－２細胞株、ＪｅＫｏ－１細胞株、Ｚ－１３８細胞株、Ｄａｕｄｉ細胞株、Ｇｒａｎｔａ細胞株、またはＤｏＨＨ２細胞株であり、低密度でＣＤ２０を発現するリンパ腫細胞株は、ＣＡ４６細胞株、Ｎａｌｍ－１細胞株、Ｔｏｌｅｄｏ細胞株、ＢＪＡＢ細胞株、Ｋａｓｕｍｉ－２細胞株、ＲＰＭＩ８２２６細胞株、ＨＴ細胞株、ＳＵ－ＤＨＬ－８細胞株、ＪＭ１細胞株、Ｎａｍａｌｗａ細胞株、Ｎａｌｍ－６細胞株、またはＺ１３８細胞株である。ある特定の実施形態では、提供される抗ＣＤ２０結合分子は、Ｒａｍｏｓ細胞のＣＤＣを導くことができ、結合分子と同じ抗原結合ドメインを含む等量の単一特異性二価ＩｇＧ１抗体は、Ｒａｍｏｓ細胞の検出可能な補体媒介性殺滅を示さない。ある特定の実施形態では、高密度でＣＤ２０を発現するＢ細胞は、がんを有する対象におけるＣＤ２０陽性の悪性Ｂ細胞であり、低密度でＣＤ２０を発現するＢ細胞は、がんを有する対象における正常なＢ細胞である。ある特定の実施形態では、がんは、ＣＤ２０陽性の白血病、リンパ腫、または骨髄腫である。特定の実施形態では、対象は、ヒトである。

【0019】

本開示はさらに、本開示によって提供される結合分子を含む組成物を提供する。

【0020】

本開示は、提供される結合分子、提供される結合分子の抗原結合及び多量体化フラグメント、またはそのサブユニットをコードする核酸分子を含む、単離されたポリヌクレオチドをさらに提供する。ある特定の実施形態では、サブユニットは、抗体重鎖またはその多量体化フラグメントもしくはバリアント、抗体軽鎖またはそのフラグメント、Ｊ鎖またはそのフラグメントもしくはそのバリアント、あるいはそれらの任意の組み合わせである。さらに、提供されるポリヌクレオチドを含むベクター、及び提供されるベクターまたはポリヌクレオチドを含む宿主細胞が開示される。関連する実施形態では、本開示は、提供される結合分子の産生方法を提供し、本方法は、提供される宿主細胞を培養する工程と、結合分子を回収する工程とを含む。

【0021】

加えて、本開示は、５個の二価結合ユニット及び修飾Ｊ鎖を含むＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体を提供し、各結合ユニットは、結合ユニット関連抗原結合ドメインに各々関連付けられた２つのヒトＩｇＭ重鎖定常領域またはヒト由来のＩｇＭ様重鎖定常領域またはその多量体化フラグメントもしくはバリアントを含み、抗体の各結合ユニット関連抗原結合ドメインは、配列番号７のＶＨアミノ酸配列と、配列番号９または配列番号１０のＶＬアミノ酸配列とを含み、修飾Ｊ鎖は、ＣＤ３εに特異的に結合するｓｃＦｖを含むＪ鎖関連結合ドメインを含み、ＩｇＭ抗体は、低密度でＣＤ２０を発現するＢ細胞株または正常Ｂ細胞のＥＣ５０濃度よりも少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、または少なくとも１０００倍低いＥＣ５０濃度で、高密度でＣＤ２０を発現するＢ細胞のＴＤＣＣ、ＣＤＣ、またはＴＤＣＣ及びＣＤＣの両方を導くことができる。ある特定の実施形態では、ＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体は、高密度でＣＤ２０を発現するＢ細胞のＣＤＣ、ＴＤＣＣ、またはＴＤＣＣ及びＣＤＣの両方を導くことができるが、低密度でＣＤ２０を発現するＢ細胞については導くことができない。ある特定の実施形態では、修飾Ｊ鎖は、配列番号４６のアミノ酸２０～４１２（Ｖ１５Ｊ）、配列番号４７のアミノ酸２０～４１２（Ｖ１５Ｊ＊）、または配列番号５６のアミノ酸２０～４２０（ＳＪ＊）を含む。ある特定の態様では、高密度及び低密度ＣＤ２０発現細胞は、リンパ腫細胞株であり、例えば、高密度でＣＤ２０を発現する細胞は、Ｒａｍｏｓ細胞株であり得、低密度でＣＤ２０を発現する細胞は、ＣＡ４６細胞株であり得る。ある特定の実施形態では、提供されるＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体は、Ｒａｍｏｓ細胞の補体媒介性殺滅を導くことができ、同じ抗原結合ドメインを含む等量の単一特異性二価ＩｇＧ１抗体は、Ｒａｍｏｓ細胞の検出可能な補体媒介性殺滅を示さない。ある特定の実施形態では、高密度でＣＤ２０を発現する細胞は、がんを有する対象における悪性Ｂ細胞であり、低密度でＣＤ２０を発現する細胞は、がんを有する対象における正常なＢ細胞である。がんは、例えば、ＣＤ２０陽性の白血病、リンパ腫、または骨髄腫であり得る。特定の実施形態では、対象は、ヒトである。

【0022】

本開示はさらに、対象におけるがんを治療するための方法を提供し、本方法は、治療を必要とする対象に、有効量の提供される結合分子、提供される組成物、または提供されるＩｇＭもしくはＩｇＭ様抗体を投与する工程を含む。

【0023】

本開示は、がんを治療するための薬剤の調製における、有効量の提供される結合分子、提供される組成物、または提供されるＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体の使用をさらに提供する。

【0024】

本開示は、がんの治療における使用のための、提供される結合分子、提供される組成物、または提供されるＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体をさらに提供する。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1A】結合親和性が変更された抗ＣＤ２０ ＩｇＧ及びＩｇＭの生成。非還元ゲルは、組み立てられたＩｇＧを示す。レーン１：ＲＴＸ－ＩｇＧ ＷＴ、レーン２：ＲＴＸ ＩｇＧ Ｎ９３Ａ、レーン３：ＲＴＸ ＩｇＧ Ｎ９３Ｄ、レーン４：ＲＴＸ ＩｇＧ Ｎ９３Ｅ、レーン５：ＲＴＸ ＩｇＧ Ｎ９３Ｋ、レーン６：ＲＴＸ ＩｇＧ Ｎ９３Ｒ。

【図1B】結合親和性が変更された抗ＣＤ２０ ＩｇＧ及びＩｇＭの生成。還元ゲルは、ＩｇＧ重鎖及び軽鎖を示す。レーン１：ＲＴＸ－ＩｇＧ ＷＴ、レーン２：ＲＴＸ ＩｇＧ Ｎ９３Ａ、レーン３：ＲＴＸ ＩｇＧ Ｎ９３Ｄ、レーン４：ＲＴＸ ＩｇＧ Ｎ９３Ｅ、レーン５：ＲＴＸ ＩｇＧ Ｎ９３Ｋ、レーン６：ＲＴＸ ＩｇＧ Ｎ９３Ｒ。

【図1C】結合親和性が変更された抗ＣＤ２０ ＩｇＧ及びＩｇＭの生成。非還元ゲルは、組み立てられたＩｇＭを示す。レーン１：ＲＴＸ－ＩｇＭ＋Ｊ ＷＴ、レーン２：ＲＴＸ ＩｇＭ＋Ｊ Ｎ９３Ａ、レーン３：ＲＴＸ ＩｇＭ＋Ｊ Ｎ９３Ｄ、レーン４：ＲＴＸ ＩｇＭ＋Ｊ Ｎ９３Ｅ、レーン５：ＲＴＸ ＩｇＭ＋Ｊ Ｎ９３Ｋ、レーン６：ＲＴＸ ＩｇＭ＋Ｊ Ｎ９３Ｒ。

【図1D】結合親和性が変更された抗ＣＤ２０ ＩｇＧ及びＩｇＭの生成。還元ゲルは、ＩｇＭ重鎖及び軽鎖を示す。レーン１：ＲＴＸ－ＩｇＭ＋Ｊ ＷＴ、レーン２：ＲＴＸ ＩｇＭ＋Ｊ Ｎ９３Ａ、レーン３：ＲＴＸ ＩｇＭ＋Ｊ Ｎ９３Ｄ、レーン４：ＲＴＸ ＩｇＭ＋Ｊ Ｎ９３Ｅ、レーン５：ＲＴＸ ＩｇＭ＋Ｊ Ｎ９３Ｋ、レーン６：ＲＴＸ ＩｇＭ＋Ｊ Ｎ９３Ｒ。

【図2A】ＩｇＧとしてのリツキシマブの様々に変更された親和性変異体の、Ｒａｍｏｓ細胞への結合活性。

【図2B】ＩｇＭ＋Ｊとしてのリツキシマブの様々に変更された親和性変異体の、Ｒａｍｏｓ細胞への結合活性。

【図3】Ａは、Ｒａｍｏｓ細胞及びＣＡ４６Ｂ細胞株上におけるリツキシマブの様々に変更された親和性変異体のＣＤＣ活性。Ｒａｍｏｓ細胞上におけるＩｇＧ抗体のＣＤＣ活性。Ｂは、Ｒａｍｏｓ細胞及びＣＡ４６Ｂ細胞株上におけるリツキシマブの様々に変更された親和性変異体のＣＤＣ活性。Ｒａｍｏｓ細胞上におけるＩｇＭ抗体のＣＤＣ活性。Ｃは、Ｒａｍｏｓ細胞及びＣＡ４６Ｂ細胞株上におけるリツキシマブの様々に変更された親和性変異体のＣＤＣ活性。ＣＡ４６細胞上におけるＩｇＧ抗体のＣＤＣ活性。Ｄは、Ｒａｍｏｓ細胞及びＣＡ４６Ｂ細胞株上におけるリツキシマブの様々に変更された親和性変異体のＣＤＣ活性。ＣＡ４６細胞上におけるＩｇＭ抗体のＣＤＣ活性。

【図4】Ａは、ＣＡ４６細胞上におけるリツキシマブの２つの変更した親和性変異体のＴＤＣＣ活性。白丸：ＲＴＸ－ＩＧＭ Ｖ１５Ｊ、白菱形：ＲＴＸ－ＩｇＭ Ｎ９３Ｅ Ｖ１５Ｊ、白三角：ＲＴＸ－ＩｇＭ Ｎ９３Ｄ Ｖ１５Ｊ。Ｂは、正常Ｂ細胞上におけるリツキシマブの２つの変更した親和性変異体のＴＤＣＣ活性。白丸：ＲＴＸ－ＩＧＭ Ｖ１５Ｊ、白菱形：ＲＴＸ－ＩｇＭ Ｎ９３Ｅ Ｖ１５Ｊ、白三角：ＲＴＸ－ＩｇＭ Ｎ９３Ｄ Ｖ１５Ｊ。Ｃは、Ｒａｍｏｓ細胞上におけるリツキシマブの２つの変更した親和性変異体のＴＤＣＣ活性。白丸：ＲＴＸ－ＩＧＭ Ｖ１５Ｊ、白菱形：ＲＴＸ－ＩｇＭ Ｎ９３Ｅ Ｖ１５Ｊ、白三角：ＲＴＸ－ＩｇＭ Ｎ９３Ｄ Ｖ１５Ｊ。

【発明を実施するための形態】

【0026】

詳細な説明
定義
「１個の」（「ａ」または「ａｎ」）実体という用語は、１個以上のその実体を指し、例えば、「１個の結合分子（ａ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」は、１個以上の結合分子を表す。したがって、「１個の」（「ａ」または「ａｎ」）、「１個以上の」、及び「少なくとも１個」という用語は、本明細書では互換的に使用することができる。

【0027】

さらに、本明細書で使用される場合、「及び／または」は、２つの特定された特徴または構成要素のそれぞれの特定の開示として、他方の特徴または構成要素の有無にかかわらず、解釈されるべきである。したがって、本明細書における「Ａ及び／またはＢ」などの語句で使用される「及び／または」という用語は、「Ａ及びＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、及び「Ｂ」（単独）を含むことが意図される。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」などの語句で使用される「及び／または」という用語は、以下の実施形態のそれぞれを包含することを意図している：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；及びＣ（単独）。

【0028】

他に定義されない限り、本明細書中で使用される技術用語及び科学用語は、本開示が関連する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ－Ｓｈｏｗ，２ｎｄ ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、及びｔｈｅ Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓは、当業者に、本開示で使用される用語の多くの一般的な辞書を提供する。

【0029】

単位、接頭語、及び記号は、国際単位（ＳＩ）の承認された形式で表される。数値範囲は、その範囲を画定する数字を含む。別途指示されない限り、アミノ酸配列はアミノからカルボキシの方向に左から右に記載される。本明細書に提供される見出しは、本明細書を全体的に参照することによって得ることができる、本開示の種々の実施形態の限定ではない。したがって、以下に早速定義される用語は、その全体が本明細書を参照することによってより完全に定義される。

【0030】

本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、単一の「ポリペプチド」ならびに複数の「ポリペプチド」を包含するよう意図されており、アミド結合（ペプチド結合としても知られている）によって直鎖状に連結されたモノマー（アミノ酸）から構成される分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸の任意の鎖または複数の鎖を指し、生成物の特定の長さを指すものではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または２つ以上のアミノ酸の鎖（複数可）を指すために使用される任意の他の用語が、「ポリペプチド」の定義に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のいずれかの代わりに、またはこれらと互換的に使用され得る。「ポリペプチド」という用語はまた、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、及び既知の保護／遮断基による誘導体化、タンパク質分解切断、または非天然アミノ酸による修飾を含むがこれらに限定されない、ポリペプチドの発現後修飾の産物を指すよう意図されている。ポリペプチドは、生物学的供給源に由来し得るか、または組換え技術によって産生され得るが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳されるわけではない。化学合成を含む、任意の様式で生成することができる。

【0031】

本明細書に開示されるポリペプチドは、約３個以上、５個以上、１０個以上、２０個以上、２５個以上、５０個以上、７５個以上、１００個以上、２００個以上、５００個以上、１，０００個以上、または２，０００個以上のアミノ酸のサイズであり得る。ポリペプチドは、必ずしもそのような構造を有するわけではないが、所定三次元構造を有することができる。所定三次元構造を有するポリペプチドは、折り畳まれたと称され、所定三次元構造を有さないが、むしろ多数の異なる立体配座をとることができるポリペプチドである。本明細書で使用される場合、糖タンパク質という用語は、アミノ酸、例えばセリンまたはアスパラギンの酸素含有または窒素含有側鎖を介してタンパク質に付着している少なくとも１つの炭水化物部分に結合されたタンパク質を指す。

【0032】

「単離された」ポリペプチドまたはそのフラグメント、バリアント、もしくは誘導体とは、その天然の環境にはないポリペプチドを意図する。特定の精製レベルが求められるわけではない。例えば、単離されたポリペプチドはその天然のまたは自然な環境から取り出され得る。宿主細胞内で発現させた組換え生成ポリペプチド及びタンパク質は、本明細書に開示される場合、単離されているとみなされ、任意の好適な技法によって分離、分画、または部分的もしくは実質的に精製されたネイティブまたは組換えポリペプチドも同様である。

【0033】

本明細書で使用する場合、「非天然ポリペプチド」という用語またはその任意の文法上の変化形は、裁判官、または行政機関もしくは司法機関によって「天然」であると判定もしくは解釈されるまたはその可能性があるポリペプチドの形態を明示的に除外するが、ただしこのような形態のみを除外する、条件付き定義である。

【0034】

本明細書に開示される他のポリペプチドは、前述のポリペプチドのフラグメント、誘導体、類似体、またはバリアント、及びこれらの任意の組み合わせである。本明細書に開示される場合、「フラグメント」、「バリアント」、「誘導体」、及び「類似体」という用語は、対応するネイティブ抗体またはポリペプチドの特性のうちの少なくともいくつか（例えば、抗体に特異的に結合すること）を保持する任意のポリペプチドを含む。ポリペプチドのフラグメントは、本明細書の他の箇所で論じられている特異的抗体フラグメントに加えて、例えば、タンパク質分解フラグメント、ならびに欠失フラグメントを含む。バリアント、例えばポリペプチドのバリアントには、上述のフラグメントが含まれ、また、アミノ酸の置換、欠失、または挿入による改変アミノ酸配列を有するポリペプチドも含まれる。特定の態様において、バリアントは非天然であり得る。非天然バリアントは、当該技術分野で既知の変異誘発技法を用いて生成することができる。バリアントポリペプチドは、保存的または非保存的なアミノ酸の置換、欠失、または付加を含み得る。誘導体は、元のポリペプチドには見られない追加的な特徴を示すように改変されたポリペプチドである。例としては、融合タンパク質が挙げられる。バリアントポリペプチドは、本明細書で「ポリペプチド類似体」とも呼ばれ得る。本明細書で使用する場合、ポリペプチドの「誘導体」はまた、官能性側鎖の反応によって化学的に誘導体化された１つ以上のアミノ酸を有する主題ポリペプチドも指すことができる。「誘導体」としても含まれるのはまた、２０個の標準アミノ酸のうちの１つ以上の誘導体を含むペプチドである。例えば、４－ヒドロキシプロリンは、プロリンの代わりになり得る；５－ヒドロキシリジンはリジンの代わりになり得る；３－メチルヒスチジンはヒスチジンの代わりになり得る；ホモセリンはセリンの代わりになり得る；そしてオルニチンはリジンの代わりになり得る。

【0035】

「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸が、類似の側鎖を有する別のアミノ酸に置換されているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸ファミリーは、当該技術分野において定義されており、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。例えば、チロシンのフェニルアラニンへの置換は保存的置換である。ある特定の実施形態では、本開示のポリペプチド及び抗体の配列における保存的置換は、アミノ酸配列を含むポリペプチドまたは抗体の、結合分子、例えば抗体が結合する抗原への結合を抑止しない。抗原結合を排除しないヌクレオチド及びアミノ酸保存的置換を同定する方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：１１８０－１１８７（１９９３）、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１２（１０）：８７９－８８４（１９９９）、及びＢｕｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４：４１２－４１７（１９９７）を参照されたい）。

【0036】

「ポリヌクレオチド」という用語は、単一の核酸ならびに複数の核酸を包含するように意図されており、単離された核酸分子または構築物、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、従来的なホスホジエステル結合または従来的でない結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含み得る。「核酸」または「核酸配列」という用語は、ポリヌクレオチドに存在する任意の１つ以上の核酸セグメント、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡフラグメントを指す。

【0037】

「単離された」核酸またはポリヌクレオチドは、その天然の環境から分離された任意の形態の核酸またはポリヌクレオチドを意図する。例えば、ゲル精製されたポリヌクレオチド、またはベクターに含まれるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、「単離された」とみなされるであろう。また、クローニングのための制限部位を有するように操作されたポリヌクレオチドセグメント（例えば、ＰＣＲ産物）も、「単離された」とみなされる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞中に維持された組換えポリヌクレオチド、または緩衝液もしくは生理食塩水などの非天然溶液中の精製された（部分的または実質的に）ポリヌクレオチドが含まれる。単離されたＲＮＡ分子は、インビボまたはインビトロのポリヌクレオチドのＲＮＡ転写産物を含み、転写産物は、天然に見られるものではない。単離されたポリヌクレオチドまたは核酸は、合成的に生成されたそのような分子をさらに含む。加えて、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネーターなどの調節エレメントであり得るか、またはそれを含み得る。

【0038】

本明細書で使用する場合、「非天然ポリヌクレオチド」という用語またはその任意の文法上の変化形は、「天然」である、あるいは裁判官、または行政機関もしくは司法機関によって「天然」であると判定もしくは解釈されるまたはそのような可能性がある核酸またはポリヌクレオチドの形態を明示的に除外するが、ただしこのような形態のみを除外する、条件付き定義である。

【0039】

本明細書で使用する場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の部分である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、またはＴＡＡ）は、アミノ酸に翻訳されないが、コード領域の一部であると考えることができるが、任意の隣接配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写終結因子、イントロン等は、コード領域の一部ではない。２つ以上のコード領域が、（例えば、単一のベクター上の）単一のポリヌクレオチド構築物内に、または（例えば、別々の（異なる）ベクター上の）別々のポリヌクレオチド構築物内に存在し得る。さらに、任意のベクターは、単一のコード領域を含み得るか、または２つ以上のコード領域を含むことができ、例えば、単一のベクターは、免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域を別々にコードすることができる。加えて、ベクター、ポリヌクレオチド、または核酸は、別のコード領域に融合されたまたは融合されていない異種コード領域を含み得る。異種コード領域には、分泌シグナルペプチドまたは異種機能ドメインなどの特殊な要素またはモチーフをコードするものが含まれるが、これらに限定されない。

【0040】

ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドまたは核酸はＤＮＡである。ＤＮＡの場合、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、通常、１つ以上のコード領域と作動可能に連結されたプロモーター及び／または、他の転写もしくは翻訳制御エレメントを含み得る。作動可能な連結とは、調節配列（複数可）の影響下または制御下に遺伝子産物の発現が置かれるような方式で、遺伝子産物（例えば、ポリペプチド）のためのコード領域が１つ以上の調節配列と連結されている場合のことである。２つのＤＮＡフラグメント（ポリペプチドコード領域及びそれに関連するプロモーターなど）が「作動可能に連結する」とは、プロモーター機能の誘導が、所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、ならびに２つのＤＮＡフラグメント間の結合の性質が、遺伝子産物の発現を導く発現調節配列の能力を妨害しない場合、または転写されるＤＮＡテンプレートの能力を妨害しない場合、である。したがって、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写にもたらすことが可能な場合、ポリペプチドをコードする核酸と作動可能に連結するであろう。プロモーターは、所定の細胞におけるＤＮＡの実質的な転写を指示する細胞特異的プロモーターであり得る。プロモーター以外の他の転写制御エレメント、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルは、細胞特異的転写を指示するためにポリヌクレオチドと作動可能に連結することができる。

【0041】

様々な転写制御領域は、当業者に既知である。これらには、限定されないが、サイトメガロウイルス（イントロン－Ａと組み合わせた前初期プロモーター）、シミアンウイルス４０（初期プロモーター）、及びレトロウイルス（ラウス肉腫ウイルス等）からのプロモーター及びエンハンサーセグメント等の脊椎動物細胞において機能する転写制御領域が含まれるが、これらに限定されない。他の転写制御領域としては、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン、ウサギβ－グロビンなどの脊椎動物遺伝子に由来するもの、ならびに真核細胞における遺伝子発現を制御することができる他の配列が挙げられる。さらなる好適な転写制御領域としては、組織特異的プロモーター及びエンハンサー、ならびにリンホカイン誘導性プロモーター（例えば、インターフェロンまたはインターロイキンによって誘導可能なプロモーター）が挙げられる。

【0042】

同様に、様々な翻訳制御エレメントは、当業者に既知である。これらには、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終結コドン、ならびにピコルナウイルスに由来する要素（特に、内部リボソーム進入部位、またはＩＲＥＳ、ＣＩＴＥ配列とも称される）が含まれるが、これらに限定されない。

【0043】

他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、またはリボソームＲＮＡの形態であり得る。

【0044】

ポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する分泌ペプチドまたはシグナルペプチドをコードする追加のコード領域と連結することができる。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、粗面小胞体を横切る成長タンパク質鎖の輸出が開始されると成熟タンパク質から切断されるシグナルペプチドまたは分泌リーダー配列を有する。当業者であれば、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドは、ポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチドを有し得、これは、完全または「完全長」ポリペプチドから切断され、ポリペプチドの分泌形態または「成熟」形態を生成することを認識している。特定の実施形態では、天然シグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖または軽鎖シグナルペプチドが使用されるか、またはそれに作動可能に関連付けられるポリペプチド分泌を指示する能力を保持するその配列の機能的誘導体が使用される。あるいは、異種哺乳動物シグナルペプチドまたはその機能的誘導体を使用することができる。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）またはマウスβ－グルクロニダーゼのリーダー配列で置換することができる。

【0045】

本明細書で使用する場合、「結合分子」という用語は、その最も広い意味において、結合標的（例えば、エピトープまたは抗原決定基）に対し特異的に結合する分子を指す。本明細書でさらに記載されるように、結合分子は、本明細書に記載の１つ以上の「抗原結合ドメイン」を含むことができる。結合分子の非限定的な例は、抗原特異的結合を保持する本明細書に詳細に記載される抗体または抗体様分子である。特定の実施形態では、「結合分子」は、本明細書に詳細に記載される抗体または抗体様分子を含む。

【0046】

本明細書で使用される場合、「結合ドメイン」または「抗原結合ドメイン」という用語（互換的に使用され得る）は、結合標的、例えばエピトープに特異的に結合するのに必要かつ十分な結合分子、例えば抗体または抗体様分子の領域を指す。例えば、「Ｆｖ」、例えば、抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、２つの別個のポリペプチドサブユニットまたは一本鎖のいずれかとして、「結合ドメイン」であるとみなされる。他の抗原結合ドメインとしては、限定するものではないが、ラクダ科動物に由来する抗体の重鎖可変領域（ＶＨＨ）、サメに由来するＶ_ＮＡＲ抗原受容体、または異種骨格、例えばフィブロネクチン骨格内に発現する６個の免疫グロブリン相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。本明細書に記載の「結合分子」または「抗体」は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２の、またはさらに多くの「抗原結合ドメイン」を含むことができる。本明細書で使用される場合、「結合ユニット関連抗原結合ドメイン」は、抗体重鎖及び／または抗体軽鎖の一部である抗原結合ドメインを指す。「Ｊ鎖関連抗原結合ドメイン」という用語は、本明細書に記載の修飾Ｊ鎖、例えば、野生型ヒトＪ鎖に融合したｓｃＦｖ、またはその機能的フラグメントもしくはバリアントに関連する抗原結合ドメインを指す。

【0047】

「抗体」及び「免疫グロブリン」という用語は、本明細書では互換的に使用することができる。抗体（または本明細書に開示されるそのフラグメント、バリアント、もしくは誘導体）は、少なくとも重鎖（ラクダ科動物の場合）の可変領域、または少なくとも重鎖及び軽鎖の可変領域を含む。脊椎動物系における基本的な免疫グロブリン構造は、比較的十分に理解されている。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．１９８８）を参照されたい。別段の明記がない限り、「抗体」という用語は、抗体の小さな抗原結合フラグメントからフルサイズの抗体（例えば、２つの完全な重鎖及び２つの完全な軽鎖を含むＩｇＧ抗体、４つの完全な重鎖及び４つの完全な軽鎖ならびにＪ鎖またはその機能的フラグメントもしくはバリアント及び／または分泌成分を含むＩｇＡ抗体、あるいは１０または１２の完全な重鎖及び１０または１２の完全な軽鎖を含み、任意選択でＪ鎖またはその機能的フラグメントもしくはバリアントを含むＩｇＭ抗体）に及ぶ範囲のあらゆるものを包含する。

【0048】

以下でより詳細に論じられるように、「免疫グロブリン」という用語は、生化学的に区別することができるポリペプチドの様々な広範なクラスを含む。当業者は、重鎖が、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）及びそれらの間のいくつかのサブクラス（例えば、γ１～γ４またはα１～α２）に分類されることを理解するであろう。この鎖の性質が、抗体の「アイソタイプ」をそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥとして決定する。免疫グロブリンのサブクラス（サブタイプ）、例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、ＩｇＡ_２などは、十分に特徴づけられており、機能的な特殊化をもたらすことが知られている。これらの免疫グロブリンの各々の修飾バージョンは、本開示を考慮すれば当業者に容易に認識可能であり、したがって、本開示の範囲内である。

【0049】

軽鎖は、カッパまたはラムダ（κ、λ）のいずれかに分類される。各重鎖クラスは、カッパ軽鎖またはラムダ軽鎖のいずれかと会合し得る。軽鎖及び重鎖は、互いに共有結合しており、免疫グロブリンがハイブリドーマ、Ｂ細胞、遺伝子操作された宿主細胞によって発現される場合、２つの重鎖の「テール」部分は、共有ジスルフィド結合または非共有結合によって互いに結合される。重鎖において、アミノ酸配列は、Ｙ配置の分岐した端部のＮ末端から各鎖の底部のＣ末端まで続く。ある特定の抗体（例えば、ＩｇＧ抗体）の基本構造は、ジスルフィド結合により接続して「Ｙ」構造を形成する２個の重鎖サブユニット及び２個の軽鎖サブユニットを含み、本明細書においてこの構造は「Ｈ２Ｌ２構造」または「結合ユニット」とも呼ばれる。

【0050】

「結合ユニット」という用語は、本明細書では結合分子の一部、例えば、抗体、抗体様分子、その抗原結合フラグメント、またはその多量体化フラグメントを指すために使用され、これは、標準的な「Ｈ２Ｌ２」免疫グロブリン構造、例えば、２つの重鎖またはそのフラグメント、及び２つの軽鎖またはそのフラグメントに対応する。ある特定の実施形態では、結合ユニットは、例えば、ラクダ科動物抗体において、２つの重鎖に対応し得る。ある特定の態様では、例えば、結合分子が二価のＩｇＧ抗体またはその抗原結合フラグメントである場合、「結合分子」及び「結合ユニット」という用語は等価である。他の実施形態では、例えば、結合分子が多量体、例えば、二量体ＩｇＡ抗体もしくはＩｇＡ様抗体、五量体ＩｇＭ抗体もしくはＩｇＭ様抗体、または六量体ＩｇＭ抗体もしくはＩｇＭ様抗体である場合、結合分子は、２つ以上の「結合ユニット」を含む。ＩｇＡ二量体の場合には２個、ＩｇＭ五量体または六量体の場合には、それぞれ５個または６個である。結合ユニットは、全長抗体の重鎖及び軽鎖を含む必要はないが、典型的には二価であり、すなわち、上記で定義されるように、２つの「結合ユニット関連抗原結合ドメイン」を含む。本明細書で使用される場合、本開示で提供されるある特定の結合分子は「二量体」であり、ＩｇＡ定常領域またはその多量体化フラグメントを含む２つの二価結合ユニットを含む。本開示で提供される特定の結合分子は五量体または六量体であり、ＩｇＭ定常領域またはその多量体化フラグメントを含む５個または６個の二価結合ユニットを含む。２個以上、例えば、２個、５個、または６個の結合ユニットを含む結合分子、例えば、抗体または抗体様分子は、本明細書では「多量体」と呼ばれる。「多量体化フラグメント」とは、ＩｇＭの場合には五量体または六量体を、ＩｇＡの場合には二量体を形成するのに十分なＩｇＭまたはＩｇＡ定常領域の一部を意味する。多量体化するのに十分なＩｇＭ及びＩｇＡ定常領域フラグメントは、本明細書の別の箇所に記載されている。

【0051】

本明細書で使用する場合の「Ｊ鎖」という用語は、配列番号４２として提示されている成熟ヒトＪ鎖のアミノ酸配列を含めた、任意の動物種のネイティブ配列ＩｇＭまたはＩｇＡ抗体のＪ鎖、その任意の機能的フラグメント、その誘導体、及び／またはそのバリアントを指す。種々のＪ鎖バリアント及び修飾されたＪ鎖誘導体が本明細書に開示される。本明細書で使用される場合、「機能的フラグメント」または「機能的バリアント」は、ＩｇＭ重鎖定常領域と会合して五量体ＩｇＭ抗体を形成することができる（またはその代わりに、ＩｇＡ重鎖定常領域と会合して二量体ＩｇＡ抗体を形成することができる）フラグメント及びバリアントを含む。

【0052】

「修飾されたＪ鎖」という用語は、異種の部分、例えば、異種のポリペプチド、例えば、ネイティブＪ鎖配列またはバリアントＪ鎖配列に導入された外来の抗原結合ドメイン、を含むネイティブ配列Ｊ鎖ポリペプチドの誘導体を指すために本明細書で使用される。導入は、異種ポリペプチドもしくは他の部分の融合を含む手段、またはペプチドもしくは化学リンカーを介した付着による手段を含む、任意の手段によって達成することができる。「修飾されたヒトＪ鎖」という用語は、限定されるものではないが、異種部分、例えば、異種ポリペプチド、例えば、Ｊ鎖関連抗原結合ドメインの導入によって修飾された、配列番号４２のアミノ酸配列もしくはその機能的フラグメントまたはその機能的バリアントを含むネイティブ配列成熟ヒトＪ鎖を包含する。ある特定の実施形態では、異種部分は、ＩｇＭ単量体の五量体への効率的な重合、及び五量体ＩｇＭの標的への結合を妨害しない。例示的な修飾されたＪ鎖は、例えば、米国特許第９，９５１，１３４号及び第１０，６１８，９７８号、ならびに米国特許出願公開第ＵＳ－２０１９－０１８５５７０号に見出すことができ、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0053】

本明細書で使用される場合、「ＩｇＭ由来結合分子」、「ＩｇＭ様抗体」、「ＩｇＭ様結合ユニット」、または「ＩｇＭ様重鎖定常領域」という用語は、多量体を形成する能力、すなわち六量体を形成する能力、またはＪ鎖と会合して五量体を形成する能力を付与するのに必要なＩｇＭ重鎖の構造部分を依然として保持するバリアント抗体誘導結合分子、抗体、結合ユニット、または重鎖定常領域を指す。ＩｇＭ様抗体または他のＩｇＭ由来結合分子は、典型的には、ＩｇＭ定常領域の少なくともＣμ４及びテールピース（ｔｐ）ドメインを含むが、同じ種由来または異なる種由来の他の抗体アイソタイプ、例えば、ＩｇＧからの重鎖定常領域ドメインを含み得る。ＩｇＭ様抗体または他のＩｇＭ由来結合分子は、同様に、ＩｇＭ様抗体が六量体及び／または五量体を形成可能である限り、１つ以上の定常領域ドメインが欠失しているフラグメントであることができる。したがって、ＩｇＭ様抗体または他のＩｇＭ由来結合分子は、例えば、ハイブリッドＩｇＭ／ＩｇＧ抗体であり得るか、またはＩｇＭ抗体の「多量体化フラグメント」であり得る。

【0054】

本明細書で使用される場合、「ＩｇＡ由来結合分子」、「ＩｇＡ様抗体」、「ＩｇＡ様結合ユニット」、または「ＩｇＡ様重鎖定常領域」という用語は、多量体を形成する能力、すなわちＪ鎖と会合して二量体を形成する能力を付与するのに必要なＩｇＡ重鎖の構造部分を依然として保持するバリアント抗体誘導結合分子、抗体、結合ユニット、または重鎖定常領域を指す。ＩｇＡ様結合分子または他のＩｇＡ由来結合分子は、典型的には、ＩｇＡ定常領域の少なくともＣα３及びテールピース（ｔｐ）ドメインを含むが、同じ種由来または異なる種由来の他の抗体アイソタイプ、例えば、ＩｇＧからの重鎖定常領域ドメインを含み得る。ＩｇＡ様結合分子または他のＩｇＡ由来結合分子は、同様に、ＩｇＡ様抗体がＪ鎖と会合して二量体を形成可能である限り、１つ以上の定常領域ドメインが欠失しているフラグメントであることができる。したがって、ＩｇＡ様抗体または他のＩｇＡ由来結合分子は、例えば、ハイブリッドＩｇＡ／ＩｇＧ抗体であり得るか、またはＩｇＡ抗体の「多量体化フラグメント」であり得る。

【0055】

「価数」、「二価」、「多価」、及び文法的に同等の用語は、所与の結合分子例えば、抗体もしくは抗体様分子、または所与の結合ユニットにおける抗原結合ドメインの数を指す。そのため、所与の結合分子（例えば、ＩｇＭ抗体もしくはＩｇＭ様抗体またはその多量体化フラグメント）に対する「二価」、「四価」、及び「六価」という用語は、それぞれ２つの抗原結合ドメイン、４つの抗原結合ドメイン、及び６つの抗原結合ドメインの存在を示す。各結合ユニットが二価である典型的なＩｇＭ抗体もしくはＩｇＭ様抗体またはＩｇＭ由来結合分子は、五量体ＩｇＭが単一のＪ鎖関連抗原結合ドメインを含む修飾されたＪ鎖を含む場合、１０価または１２価、または１１価を有することができる。二価または多価の結合分子は、単一特異的である（すなわち、すべての抗原結合ドメインが同じである）場合もあれば、二重特異的または多重特異的である（例えば、２つ以上の抗原結合ドメインが異なる、例えば、同じ抗原上の異なるエピトープに結合するか、または完全に異なる抗原に結合する場合）場合もある。

【0056】

「エピトープ」という用語は、抗体または抗体様分子の抗原結合ドメインに特異的に結合することができる任意の分子決定基を含む。ある特定の実施形態において、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、またはスルホニルなどの分子の化学的に活性な表面グルーピングを含むことができ、ある特定の実施形態においては、３次元構造特性、及びまたは特定の電荷特性を有することができる。エピトープは、抗体の抗原結合ドメインによって結合される標的の領域である。

【0057】

「標的」という用語は、結合分子、例えば抗体または抗体様分子によって結合され得る物質を含むように最も広い意味で使用される。標的は、例えば、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、または他の分子であり得る。さらに、「標的」は、例えば、結合分子、例えば抗体または抗体様分子によって結合され得るエピトープを含む細胞、臓器、または生物であり得る。本明細書で使用される場合、「標的抗原」は、結合分子、例えば、本明細書で提供される抗体または抗体様分子によって結合され得る標的分子、例えば、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、または他の分子である。ある特定の実施形態において、標的抗原は、細胞、例えば、腫瘍細胞の表面上に現れることができる。本明細書で使用される「腫瘍特異的抗原」は、少なくとも生物の発達の後期において、腫瘍細胞に特有の、タンパク質または他の細胞表面標的抗原である。本明細書で使用される場合、「腫瘍関連抗原」は、腫瘍細胞に対して必ずしも固有ではないが、典型的には、正常な健康な細胞よりも腫瘍細胞上ではるかに豊富に及び／またはより高い密度で発現されるタンパク質または他の細胞表面標的抗原である。

【0058】

軽鎖と重鎖はともに、構造的相同性及び機能的相同性の領域に分類される。「定常」及び「可変」という用語は、機能的に使用される。軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）の両方の可変領域は、抗原認識及び特異性を決定する。逆に、軽鎖の定常領域（ＣＬ）及び重鎖の定常領域（例えば、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及び／またはＣＨ４）は、分子の柔軟性、分泌、経胎盤移動性、Ｆｃ受容体結合、補体結合などの生物学的特性を付与する。慣例により、定常領域ドメインのナンバリングは、定常領域ドメインが抗体重鎖サブユニットの抗原結合部位またはアミノ末端からより遠位になるにつれて増加する。Ｎ末端側部分は可変領域（ＶＨ）であり、Ｃ末端側部分は定常領域であり、例えば、ＣＨ３及びテールピース（ＩｇＡの場合）またはＣＨ４及びテールピース（ＩｇＭの場合）とＣＬドメインとは、それぞれ重鎖及び軽鎖のカルボキシ末端を含む。

【0059】

「全長ＩｇＭ抗体重鎖」とは、Ｎ末端からＣ末端への方向に、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）、抗体重鎖定常ドメイン１（ＣＭ１またはＣμ１）、抗体重鎖定常ドメイン２（ＣＭ２またはＣμ２）、抗体重鎖定常ドメイン３（ＣＭ３またはＣμ３）、及び抗体重鎖定常ドメイン４（ＣＭ４またはＣμ４）を含み、テールピースをさらに含み得る、ポリペプチドである。

【0060】

「全長ＩｇＡ抗体重鎖」とは、Ｎ末端からＣ末端への方向に、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）、抗体定常重鎖定常ドメイン１（ＣＡ１またはＣα１）、ＩｇＡヒンジ領域、抗体重鎖定常ドメイン２（ＣＡ２またはＣα２）、及び抗体重鎖定常ドメイン３（ＣＡ３またはＣα３）を含み、テールピースをさらに含み得る、ポリペプチドである。

【0061】

上記のように、可変領域（複数可）は、結合分子、例えば、抗体または抗体様分子が、抗原上のエピトープを選択的に認識し、特異的に結合するのを可能にする。すなわち、結合分子、例えば、抗体または抗体様分子のＶＬドメイン及びＶＨドメイン、または相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセットは、抗原結合ドメインを形成するように組み合わされる。より具体的には、抗原結合ドメインは、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖の各々の上の３つのＣＤＲによって定義することができる。ある特定の抗体は、より大きな構造を形成する。例えば、ＩｇＡは、２個のＨ２Ｌ２結合ユニット及びジスルフィド結合を介して共有結合したＪ鎖を含む分子を形成することができ、この分子はさらに分泌構成要素と会合することができ、ＩｇＭは、５個または６個のＨ２Ｌ２結合ユニット及び、任意選択的に、ジスルフィド結合を介して共有結合したＪ鎖を含む五量体または六量体の分子を形成することができる。

【0062】

抗体の抗原結合ドメイン内に存在する６個の「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、短い非連続的なアミノ酸配列であり、抗体が水性環境内で三次元構造を呈するときに抗原結合ドメインを形成するように特異的に配置される。抗原結合ドメイン内の残りのアミノ酸は、「フレームワーク」領域と呼ばれ、より小さい分子間可変性を示す。フレームワーク領域は主としてβシート立体構造を採用し、ＣＤＲは、βシート構造を接続するループを形成し、このループは場合によってはβシート構造の一部を形成する。したがって、フレームワーク領域は、鎖間の非共有結合的相互作用によってＣＤＲを正しい方向に配置するスキャフォールドを形成するように作用する。配置されたＣＤＲによって形成された結合ドメインは、標的抗原上のエピトープに対し相補的な表面を定義する。この相補的表面は、抗体がその同族エピトープに対し非共有結合的に結合するのを促進する。それぞれ、ＣＤＲ及びフレームワーク領域を構成するアミノ酸は、様々な異なる方法で定義されているため、当業者によって、任意の所与の重鎖または軽鎖可変領域について、容易に同定することができる（「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」Ｋａｂａｔ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，（１９８３）、及びＣｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１－９１７（１９８７）を参照されたく、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）

【0063】

当該技術分野内で使用される、及び／または受け入れられる用語の２つ以上の定義がある場合、本明細書で使用される用語の定義は、明示的に反対の記載がない限り、すべてのそのような意味を含むことを意図する。具体例は、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）という用語を使用して、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見出される非隣接抗原結合部位を説明することである。これらの特定の領域は、例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）により及びＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７）により記載され、これらは参照により本明細書に組み込まれる。ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの定義には、互いに対して比較した場合のアミノ酸の重複またはサブセットが含まれる。それにもかかわらず、抗体またはそのバリアントのＣＤＲを指す定義（または当業者に既知の他の定義）のいずれかの適用は、別段の指示がない限り、本明細書で定義及び使用される用語の範囲内にあることが意図される。上記の引用参考文献のそれぞれによって定義されるＣＤＲを包含する適切なアミノ酸を、比較として以下の表１に示す。特定のＣＤＲを包含する正確なアミノ酸番号は、ＣＤＲの配列及びサイズによって異なる。当業者であれば、抗体の可変領域アミノ酸配列を与えられればどのアミノ酸が特定のＣＤＲを構成するかを日常的に決定することができる。

【0064】

（表１）ＣＤＲ定義^＊

^＊表１中のすべてのＣＤＲ定義のナンバリングは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（下記参照）によって定められたナンバリング規則に従う。

【0065】

また、抗体可変領域は、例えば、ＩＭＧＴ情報システム（ｉｍｇｔ＿ｄｏｔ＿ｃｉｎｅｓ＿ｄｏｔ＿ｆｒ／）（ＩＭＧＴ（登録商標）／Ｖ－Ｑｕｅｓｔ）を用いて分析して、ＣＤＲを含めた可変領域セグメントを同定することもできる（例えば、Ｂｒｏｃｈｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３６：Ｗ５０３－５０８，２００８を参照されたい）。

【0066】

Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．は、任意の抗体に適用可能な可変領域及び定常領域配列のナンバリングシステムも定義した。当業者は、配列自体を超える任意の実験データに依存することなく、この「Ｋａｂａｔナンバリング」システムを任意の可変領域配列に明確に割り当てることができる。本明細書で使用される場合、「Ｋａｂａｔナンバリング」は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）により定められたナンバリングシステムを指す。ただし、Ｋａｂａｔナンバリングシステムの使用が明示的に述べられない限り、本開示におけるすべてのアミノ酸配列について連続したナンバリングが使用される。

【0067】

ヒトＩｇＭ定常ドメインに対するＫａｂａｔナンバリングシステムは、Ｋａｂａｔ，ｅｔ．ａｌ．“Ｔａｂｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ，Ｖ－Ｒｅｇｉｏｎｓ，Ｃ－Ｒｅｇｉｏｎｓ，Ｊ－Ｃｈａｉｎ，Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉｇｅｎ，Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ，β－２ Ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ａｎｔｉｇｅｎｓ，Ｔｈｙ－１，Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ，Ｃ－Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｔｈｙｍｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ，Ｐｏｓｔ－ｇａｍｍａ Ｇｌｏｂｕｌｉｎ，α－２ Ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，” Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）に見出すことができる。ＩｇＭ定常領域は、連続的に（すなわち、アミノ酸１番が定常領域の第１のアミノ酸から開始する）、またはＫａｂａｔ付番方式を用いることによって付番され得る。ヒトＩｇＭ定常領域の２つのアレルの連続的なナンバリング（本明細書で配列番号１（アレルＩＧＨＭ＊０３）及び配列番号２（アレルＩＧＨＭ＊０４）として提示される）と、Ｋａｂａｔシステムによるナンバリングとの比較が下記に記載される。下線付きのアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔシステムにおいては考慮されない（下記の二重下線付きの

は、セリン（Ｓ）（配列番号１）またはグリシン（Ｇ）（配列番号２）であり得る）。

【0068】

結合分子、例えば、抗体もしくは抗体様分子またはその抗原結合フラグメント、バリアント、もしくは誘導体、及び／あるいはその多量体化フラグメントとしては、限定されるものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト、ヒト化、またはキメラ抗体、一本鎖抗体、エピトープ結合フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）_２、Ｆｄ、Ｆｖｓ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含むフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生されたフラグメントが挙げられる。ｓｃＦｖ分子は当技術分野で知られており、例えば、米国特許第５，８９２，０１９号に記載されている。

【0069】

「特異的に結合する」とは、概して、結合分子（例えば、抗体またはそのフラグメント、バリアント、もしくは誘導体）が、その抗原結合ドメインを介しエピトープに結合し、その結合が抗原結合ドメインとエピトープとの間に何らかの相補性を伴うことを意味する。この定義によれば、結合分子、例えば抗体または抗体様分子は、その抗原結合ドメインを介して、ランダムな無関係のエピトープに結合するよりも容易にあるエピトープに結合する場合に、そのエピトープに対し「特異的に結合する」と言われる。「特異性」という用語は、本明細書では、ある特定の結合分子がある特定のエピトープに結合する相対的親和性を称するために使用される。例えば、結合分子「Ａ」は、所与のエピトープに対して結合分子「Ｂ」よりも高い特異性を有するとみなすことができ、または結合分子「Ａ」は、関連するエピトープ「Ｄ」に対するよりも高い特異性でエピトープ「Ｃ」に結合すると言うことができる。

【0070】

結合分子、例えば、本明細書に開示される抗体またはそのフラグメント、バリアント、または誘導体は、５×１０^－２秒^－１、１０^－２秒^－１、５×１０^－３秒^－１、１０^－３秒^－１、５×１０^－４秒^－１、１０^－４秒^－１、５×１０^－５秒^－１または１０^－５秒^－１、５×１０^－６秒^－１、１０^－６秒^－１、５×１０^－７秒^－１または１０^－７秒^－１以下のオフレート（ｋ（ｏｆｆ））で標的抗原に結合すると言うことができる。

【0071】

結合分子、例えば、本明細書で開示される抗体またはそのフラグメント、バリアント、もしくは誘導体は、標的抗原に対し、１０^３Ｍ^－１秒^－１、５×１０^３Ｍ^－１秒^－１、１０^４Ｍ^－１秒^－１、５×１０^４Ｍ^－１秒^－１、１０^５Ｍ^－１秒^－１、５×１０^５Ｍ^－１秒^－１、１０^６Ｍ^－１秒^－１、または５×１０^６Ｍ^－１秒^－１、または１０^７Ｍ^－１秒^－１以上のオンレート（ｋ（ｏｎ））で結合すると言うことができる。

【0072】

結合分子、例えば、抗体またはそのフラグメント、バリアント、もしくは誘導体が、参照抗体または抗原結合フラグメントの所与のエピトープとの結合をある程度遮断する範囲において、そのエピトープに優先的に結合する場合、参照抗体または抗原結合フラグメントのそのエピトープとの結合を競合的に阻害すると言われる。競合的阻害は、当技術分野で公知の任意の方法、例えば、競合ＥＬＩＳＡアッセイによって測定することができる。結合分子、例えば抗体は、参照抗体または抗原結合フラグメントの所与のエピトープとの結合を少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％競合的に阻害すると言うことができる。

【0073】

本明細書で使用される場合、「親和性」という用語は、個々のエピトープと、１つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、免疫グロブリン分子の抗原結合ドメイン）との結合の強さの尺度を指す。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．１９８８）の２７～２８ページを参照されたい。抗原に対する抗原結合ドメイン、例えば、Ｆａｂフラグメントの親和性は、解離定数またはＫ_Ｄとして記載または特定することができる。Ｋ_Ｄは、抗体とその抗原との間のｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎの比である平衡解離定数である。Ｋ_Ｄと親和性は、反比例の関係にある。Ｋ_Ｄ値が低いほど、抗体の親和性が高い。ある特定の実施形態では、結合分子、例えば、本明細書で提供される抗体は、解離定数またはＫ_Ｄが、５×１０^－２Ｍ、１０^－２Ｍ、５×１０^－３Ｍ、１０^－３Ｍ、５×１０^－４Ｍ、１０^－４Ｍ、５×１０^－５Ｍ、１０^－５Ｍ、５×１０^－６Ｍ、１０^－６Ｍ、５×１０^－７Ｍ、１０^－７Ｍ、５×１０^－８Ｍ、１０^－８Ｍ、５×１０^－９Ｍ、１０^－９Ｍ、５×１０^－１０Ｍ、１０^－１０Ｍ、５×１０^－１１Ｍ、１０^－１１Ｍ、５×１０^－１２Ｍ、１０^－１２Ｍ、５×１０^－１３Ｍ、１０^－１３Ｍ、５×１０^－１４Ｍ、１０^－１４Ｍ、５×１０^－１５Ｍ、または１０^－１５Ｍ以下である。ある特定の実施形態では、結合分子、例えば、本明細書に提供される抗体またはその抗原結合フラグメントは、より高い密度で標的抗原を発現する細胞、例えば、腫瘍細胞上で腫瘍関連抗原を発現する細胞に対し選択性の向上を有する。「選択性の向上」とは、提供される結合分子、例えば、抗体が、抗原を同様に発現する他の細胞よりもより高い密度で事前選択された標的抗原を発現する標的細胞に結合することを意味する。例えば、腫瘍細胞または悪性細胞は、多くの場合、正常で健康な細胞でも発現する腫瘍関連抗原を発現するが、腫瘍細胞は、正常な細胞よりもはるかに高いレベルまたはより高い密度で標的抗原を発現する。選択性の向上を得るために、結合分子、例えば、本明細書に提供される抗体は、既知の単量体二価参照抗体の等価抗原結合ドメインよりも所定の標的抗原に対する親和性が低い、すなわち、より高いＫ_Ｄを有する、２個を超える抗原結合ドメイン、例えば、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１または１２個の抗原結合ドメインを有するように修飾することができる。例えば、正常な健康な細胞と比べて腫瘍細胞に対する選択性が向上したＩｇＡまたはＩｇＭ抗体は、２個を超える抗原結合ドメイン、例えば、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１または１２個の抗原結合ドメインを有することができ、所定の標的抗原に結合する既知の単量体二価抗体の抗原結合ドメインのＫ_Ｄよりも、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも５０００倍、少なくとも１０，０００倍、またはそれ以上大きいＫ_Ｄを含む。

【0074】

本明細書で使用する場合、「アビディティー」という用語は、抗原結合ドメイン集団と抗原との間における複合体、または抗原の複合体の全体的安定性を指す。例えば、Ｈａｒｌｏｗの２９～３４ページを参照されたい。アビディティーは、特定のエピトープを有する集団内の個々の抗原結合ドメインの親和性と、さらに免疫グロブリン及び抗原の結合価との両方に関連する。例えば、１０価ＩｇＭ抗体は、同等の結合親和性を有する抗原結合ドメインを有する二価ＩｇＧ抗体よりも高いアビディティーで抗原に結合するであろう。アビディティーは抗原の影響も受ける可能性があり、例えば、二価のＩｇＧ抗体と、高度に反復するエピトープ構造（例えば、ポリマー）との間の相互作用は、高いアビディティーの１つになる。二価，四価、もしくは１０価の抗体と、細胞表面に高密度で存在する受容体との間の相互作用も、高いアビディティーを有する。抗体が、細胞の表面上に存在する標的抗原、例えば、腫瘍細胞上の腫瘍特異的または腫瘍関連抗原に結合する場合、以下の少なくとも３つのレバーがアビディティーに影響を与える可能性がある：（ａ）抗体の価数、例えば、二価のＩｇＧ抗体は、等価な抗原結合ドメインを有する１０価のＩｇＭ抗体とは異なるアビディティーを有するであろう、（ｂ）抗体の個々の抗原結合ドメイン、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の抗原結合ドメインの親和性の増加または減少、及び／または（ｃ）細胞の表面の標的抗原の密度、例えば、高密度で腫瘍関連抗原を発現する腫瘍細胞と低密度で標的抗原を発現する正常な健康細胞との間の差異。本開示は、レバー（ａ）及び（ｂ）を操作して、標的抗原を高密度で発現する疾患細胞と、標的抗原を低密度で発現する正常細胞との選択性の向上を提供することができる抗体を提供する。

【0075】

本明細書で開示される結合分子、例えば、抗体または抗体様分子もまた、それらの交差反応性の観点からも説明または特定することができる。本明細書で使用する場合、「交差反応性」という用語は、ある抗原に特異的な結合分子（例えば、抗体またはそのフラグメント、バリアント、もしくは誘導体）が第２の抗原と反応する能力を指し、２つの異なる抗原物質間の関連性の尺度である。したがって、結合分子は、その形成を誘導したエピトープ以外のエピトープに結合する場合、交差反応性である。交差反応性エピトープは、一般に、誘導性エピトープと同じ相補的構造特徴の多くを含有し、場合によっては、実際には元のものよりも良好に適合することができる。

【0076】

一本鎖抗体または他の結合ドメインを含めた「抗原結合抗体フラグメント」は、単独で、または以下：ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、もしくはＣＨ４ドメイン、Ｊ鎖、または分泌構成要素、のうちの１つ以上と組み合わせて存在する場合もある。また、可変領域（複数可）と、ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、もしくはＣＨ４ドメイン、Ｊ鎖、または分泌構成要素のうちの１つ以上との任意の組み合わせを含むことができる抗原結合フラグメントも含まれる。結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合フラグメントは、鳥及び哺乳動物を含めた任意の動物起源からのものとすることができる。抗体は、例えば、ヒト、マウス、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマ、クマまたはニワトリの抗体であり得る。別の実施形態では、可変領域は、（例えば、サメからの）コンドリクトイド（ｃｏｎｄｒｉｃｔｈｏｉｄ）起源であり得る。本明細書で使用される場合、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンライブラリーから単離された抗体または１つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子導入動物から単離された抗体を含み、場合によっては、内因性免疫グロブリンを発現することができ、場合によっては、以下に記載するように、例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ ｅｔ ａｌによる米国特許第５，９３９，５９８号に記載されているように、内因性免疫グロブリンを発現することができない。本開示の実施形態によれば、ＩｇＭもしくはＩｇＭ様抗体、ＩｇＡもしくはＩｇＡ様抗体、または本明細書で提供されるＩｇＭもしくはＩｇＡ由来結合分子は、それが多量体、例えば、二量体、六量体、または五量体を形成することができる限り、抗体の抗原結合フラグメント、例えば、ＳｃＦｖフラグメントを含むことができる。

【0077】

本明細書で使用する場合、「重鎖サブユニット」という用語は、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列を含む。重鎖サブユニットは、ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（例えば、上部、中部、及び／または下部ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、テールピース（ｔｐ）、またはそれらのバリアントもしくはフラグメントのうちの少なくとも１つを含み得る。さらに、重鎖サブユニットは、ある特定の定常領域部分、例えば、ＣＨ１ドメイン及び／またはＣＨ２ドメインの全部または一部が欠如している可能性がある。これらのドメイン（例えば、重鎖サブユニット）は、元の重鎖サブユニットからアミノ酸配列が変化するように修飾することができる。本開示の実施形態によれば、本明細書に提供されるＩｇＭまたはＩｇＭ様重鎖、またはＩｇＡまたはＩｇＡ様重鎖を含む多量体結合分子は、結合分子が多量体、例えば、二量体、六量体、または五量体を形成することを可能にするために、ＩｇＭ、ＩｇＭ様、ＩｇＡ、またはＩｇＡ様重鎖定常領域（複数可）の十分な部分を含み、例えば、重鎖定常領域は、ＩｇＭ、ＩｇＭ様、ＩｇＡ、またはＩｇＡ様重鎖定常領域の「多量体化フラグメント」を含む。

【0078】

本明細書で使用する場合、「軽鎖サブユニット」という用語は、免疫グロブリン軽鎖に由来するアミノ酸配列を含む。軽鎖サブユニットは少なくともＶＬを含み、さらに、ＣＬ（例えば、ＣκまたはＣλ）ドメインを含むことができる。

【0079】

結合分子（例えば、抗体、抗体様分子、その抗原結合フラグメント、バリアント、もしくは誘導体、またはその多量体化フラグメント）は、結合分子が認識または特異的に結合する抗原のエピトープ（複数可）または一部（複数可）の観点から説明または特定することができる。抗体の抗原結合ドメインと特異的に相互作用する標的抗原の一部は、「エピトープ」または「抗原決定基」である。標的抗原は、単一のエピトープまたは少なくとも２個のエピトープを含むことができ、抗原のサイズ、立体構造、及びタイプに応じて、任意の数のエピトープを含むことができる。

【0080】

本明細書で使用する場合、「ヒンジ領域」という用語は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＤの重鎖においてＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに連結する重鎖分子の一部を含む。このヒンジ領域は約２５個のアミノ酸を含み、柔軟性を有し、これにより、２個のＮ末端抗原結合領域が独立して動くことが可能である。

【0081】

本明細書中で使用する場合、「ジスルフィド結合」という用語は、２個の硫黄原子間に形成された共有結合を含む。アミノ酸システインはチオール基を含み、このチオール基によって第２のチオール基とのジスルフィド結合または架橋が形成され得る。

【0082】

本明細書で使用される場合、「キメラ抗体」という用語は、免疫反応領域または部位が第１の種から得られるかまたは誘導され、定常領域（無傷、部分的、または修飾され得る）が第２の種から得られる抗体を指す。いくつかの実施形態において、標的結合領域または部位は、非ヒト供給源（例えば、マウスまたは霊長類）に由来し、定常領域はヒトのものである。

【0083】

「多重特異性抗体」または「二重特異性抗体」という用語は、単一の抗体分子内の、２つ以上の異なるエピトープに対する抗原結合ドメインを有する抗体または抗体様分子を指す。カノニカルな抗体構造に追加される他の結合分子は、２つの結合特異性を用いて構築され得る。

【0084】

本明細書で使用する場合、「操作抗体」という用語は、重鎖及び軽鎖のいずれかまたは両方の可変領域が、ＣＤＲ内またはフレームワーク領域内いずれかの１つ以上のアミノ酸の少なくとも部分的な置換によって変更されている抗体を指す。ある特定の実施形態では、結合分子、例えば、本明細書に提供される抗体は、既知の参照抗体、例えば、承認された治療抗体または開発中の治療抗体の親和性よりも標的抗原に対して低減した親和性を有するように操作され得る。ある特定の実施形態では、既知の特異性の抗体からのＣＤＲ全体を、異種抗体のフレームワーク領域に移植することができる。代替のＣＤＲは、フレームワーク領域が由来する抗体と同じクラスまたはサブクラスの抗体から誘導し得るが、ＣＤＲは、異なるクラスの抗体、例えば異なる種からの抗体からも誘導することができる。既知の特異性を有する非ヒト抗体からの１つ以上の「ドナー」ＣＤＲがヒト重鎖または軽鎖フレームワーク領域に移植される操作抗体は、本明細書では「ヒト化抗体」と呼ばれる。ある特定の態様では、すべてのＣＤＲがドナー可変領域からの完全なＣＤＲで置き換えられるわけではないが、それでもドナーの抗原結合能力をレシピエントの可変ドメインに移行させることができる。例えば、米国特許第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７６２号、及び第６，１８０，３７０号に記載の説明を考慮すれば、これは十分に当業者の技能範囲内であり、日常的な実験を行うことにより、または試行錯誤試験により、機能的操作された抗体またはヒト化抗体が得られる。

【0085】

本明細書で使用される場合、「操作された」という用語は、合成手段による核酸またはポリペプチド分子の操作（例えば、組換え技術、インビトロペプチド合成、ペプチド、核酸、またはグリカンの酵素的または化学的カップリング、またはこれらの技術のいくつかの組み合わせによる）を含む。

【0086】

本明細書で使用する場合、「結合」、「融合された」、もしくは「融合」という用語、または他の文法上の同等物は、互換的に使用することができる。これらの用語は、化学的コンジュゲーションまたは組換え手段を含むあらゆる手段による、２つ以上の要素、または構成要素が一緒に結合することを指す。「インフレーム融合」は、２つ以上のポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、元のＯＲＦの翻訳的リーディングフレームを維持する方法で、結合して連続したより長いＯＲＦを形成することを指す。したがって、組換え融合タンパク質は、元のＯＲＦによってコードされるポリペプチドに対応する２つ以上のセグメントを含有する単一のタンパク質である（これらのセグメントは、通常、自然界ではそれほど結合されない）。したがって、リーディングフレームは、融合セグメント全体にわたって連続して作製されるが、セグメントは、例えば、インフレームリンカー配列によって物理的または空間的に分離され得る。例えば、免疫グロブリン可変領域のＣＤＲをコードするポリヌクレオチドは、インフレームで融合することができるが、「融合」ＣＤＲが連続的なポリペプチドの一部として同時翻訳される限り、少なくとも１個の免疫グロブリンフレームワーク領域または追加のＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドによって分離することができる。

【0087】

ポリペプチドの文脈において、「線状配列」または「配列」とは、アミノ末端からカルボキシル末端への方向におけるポリペプチド内のアミノ酸の順序であり、配列内で隣り合ったアミノ酸は、ポリペプチドの一次構造内で連続している。ポリペプチドの別の部分に対し「アミノ末端側」または「Ｎ末端側」であるポリペプチドの部分は、連続したポリペプチド鎖の先に現れる部分である。同様に、ポリペプチドの別の部分に対し「カルボキシ末端側」または「Ｃ末端側」であるポリペプチドの部分は、連続したポリペプチド鎖内で後に現れる部分である。例えば、典型的な抗体において、可変領域は、定常領域に対して「Ｎ末端」であり、定常領域は、可変領域に対して「Ｃ末端」である。

【0088】

本明細書で使用する場合、「発現」という用語は、遺伝子が生化学物質、例えばポリペプチドをもたらすプロセスを指す。このプロセスは、遺伝子ノックダウン、ならびに一過性発現及び安定した発現の両方を含むが、これらに限定されない、細胞内の遺伝子の機能的存在の任意の発現を含む。これには、限定されるものではないが、遺伝子のＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））への転写、及びこのようなｍＲＮＡのポリペプチド（複数可）への翻訳が含まれる。最終的な所望の産物が生化学的である場合、発現は、その生化学的及び任意の前駆体の作製を含む。遺伝子の発現は「遺伝子産物」を産生する。本明細書で使用される場合、遺伝子産物は、核酸、例えば、遺伝子の転写によって産生されるメッセンジャーＲＮＡ、または転写産物から翻訳されるポリペプチドのいずれかであり得る。本明細書に記載される遺伝子産物にはさらに、転写後修飾（例えば、ポリアデニル化）を有する核酸、または翻訳後修飾（例えば、メチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、タンパク質分解切断など）を有するポリペプチドが含まれる。

【0089】

「治療する」もしくは「治療」もしくは「治療すること」、または「緩和する」もしくは「緩和すること」などの用語は、既存の診断された疾患、病的状態または障害の、その症状を治癒する、減速する、軽減する、及び／またはその進行を停止もしくは減速する治療的措置を指す。「防止する」、「防止」、「回避する」、「阻止」などといった用語は、診断されていない標的とされる疾患、病的状態または障害の発症を防止する予防的または防止的措置を指す。したがって、「治療を必要とする対象」には、障害を既に有する対象、障害を起こし易い対象、及び障害が防止されるべきである対象が含まれる。

【0090】

本明細書で使用する場合、「血清半減期」または「血漿半減期」という用語は、投与後に、タンパク質または薬物（例えば、本明細書に記載の抗体または抗体様分子などの結合分子）の血清中または血漿中濃度が５０％低下するのにかかる時間（例えば、分、時間、または日単位）を指す。下記の２つの半減期が説明され得る：中央コンパートメント（例えば、静脈内送達の場合は血液）から末梢コンパートメント（例えば、組織または臓器）への薬物の再分配プロセスに起因する血漿中濃度の低下速度である、アルファ半減期もしくはα半減期、またはｔ_１／２α、及び排泄または代謝プロセスに起因する低下速度である、ベータ半減期もしくはβ半減期、またはｔ_１／２β。

【0091】

本明細書で使用される場合、「薬物血漿中濃度時間曲線下面積」または「ＡＵＣ」という用語は、ある用量の薬物の投与後の薬物への実際の身体曝露を反映し、ｍｇ＊ｈ／Ｌで表される。この曲線下面積は、時間０（ｔ_０）から無限大（∞）まで測定され、体内からの薬物の排除速度及び投与量に依存する。

【0092】

本明細書で使用する場合、「平均滞留時間」または「ＭＲＴ」という用語は、薬物が体内に留まる平均的な時間の長さを指す。

【0093】

「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳類」とは、診断、予後、または治療が所望される任意の対象、特に哺乳類対象を意味する。哺乳類対象には、ヒト、飼育動物、家畜、及び動物園、スポーツ、または愛玩動物、例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ブタ、ウシ、クマなどが含まれる。

【0094】

本明細書で使用する場合、「療法から利益を得る対象」及び「治療を必要とする動物」のような表現は、所与の治療薬、例えば１つ以上の抗原結合ドメインを含む結合分子（例えば、抗体または抗体様分子）の投与から利益を得るであろう、すべての予期的対象の中からの対象のサブセットを指す。このような結合分子（例えば、抗体または抗体様分子）は、例えば、診断手順及び／または疾患の治療もしくは防止のために使用することができる。

【0095】

ＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、及びＩｇＭ由来結合分子
ＩｇＭは、抗原による刺激に応答してＢ細胞によって産生される第１の免疫グロブリンであり、血清中におよそ１．５ｍｇ／ｍｌで自然に存在し、半減期は約５日である。ＩｇＭは、五量体または六量体分子であり、したがって、５個または６個の結合ユニットが含まれる。ＩｇＭ結合ユニットは通常、２つの軽鎖及び２つの重鎖を含む。ＩｇＧ重鎖定常領域には３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を含むが、ＩｇＭの重（μ）定常領域にはさらに、第４の定常ドメイン（ＣＨ４）を含み、Ｃ末端側の「テールピース」（ｔｐ）が含まれる。いくつかのヒト対立遺伝子が存在するが、ヒトＩｇＭ定常領域は典型的には、アミノ酸配列番号１（ＩＭＧＴ対立遺伝子ＩＧＨＭ＊０３、例えばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ｐｉｒ｜｜Ｓ３７７６８と同一）または配列番号２（ＩＭＧＴ対立遺伝子ＩＧＨＭ＊０４、例えばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ｓｐ｜Ｐ０１８７１．４と同一）を含む。ヒトＣμ１領域は、配列番号１または配列番号２のおよそアミノ酸５からおよそアミノ酸１０２の範囲にあり、ヒトＣμ２領域は、配列番号１または配列番号２のおよそアミノ酸１１４からおよそアミノ酸２０５の範囲にあり、ヒトＣμ３領域は、配列番号１または配列番号２のおよそアミノ酸２２４からおよそアミノ酸３１９の範囲にあり、Ｃμ４領域は、配列番号１または配列番号２のおよそアミノ酸３２９からおよそアミノ酸４３０の範囲にあり、テールピースは、配列番号１または配列番号２のおよそアミノ酸４３１からおよそアミノ酸４５３の範囲にある。

【0096】

わずかな配列変異を有するヒトＩｇＭ定常領域の他の形態が存在し、これには、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｎｏ．ＣＡＢ３７８３８．１及びｐｉｒ｜｜ＭＨＨＵが含まれるが、これらに限定されない。本開示の他の箇所に記載され、特許請求される配列番号１または配列番号２に対応する位置におけるアミノ酸置換、挿入、及び／または欠失は、同様に、代替のヒトＩｇＭ配列、ならびに他の種のＩｇＭ定常領域アミノ酸配列に組み込むことができる。

【0097】

各ＩｇＭ重鎖定常領域は、抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖまたはＶＨＨ、または抗原結合ドメインのサブユニット、例えば、ＶＨ領域と会合することができる。

【0098】

５個のＩｇＭ結合ユニットは、追加の小さなポリペプチド鎖（Ｊ鎖またはその機能的フラグメント、バリアント、または誘導体）と複合体を形成して、１０個の結合ユニット関連抗原結合ドメインを有する五量体ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体を形成することができる。ヒトＪ鎖の前駆体型では、シグナルペプチド（下線）は配列番号６のアミノ酸１から約２２まで、成熟ヒトＪ鎖は配列番号６のアミノ酸２３から約１５９まで延びる。成熟ヒトＪ鎖は、配列番号４２のアミノ酸配列を有する。

【0099】

例示的なバリアント及び修飾Ｊ鎖は、本明細書の他の場所に提供されている。Ｊ鎖がない場合、ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体は、典型的には、６個の結合ユニット及び最大１２個の結合ユニット関連抗原結合ドメインを含む六量体に組み立てられる。Ｊ鎖を有する場合、ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体は、典型的には、５個の結合ユニット及び最大１０個の結合ユニット関連抗原結合ドメイン、またはＪ鎖が１つ以上の異種ポリペプチドを含む修飾Ｊ鎖である場合（例えば、Ｊ鎖関連抗原結合ドメイン（複数可）であり得る）、それ以上を含む五量体に組み立てられる。五量体または六量体ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体への５個または６個のＩｇＭ結合ユニットの組み立ては、５個または６個の結合ユニットのＣμ４とテールピースドメインとの間の相互作用を伴うと考えられる。例えば、Ｂｒａａｔｈｅｎ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：４２７５５－４２７６２（２００２）を参照されたい。したがって、本開示において提供される五量体または六量体ＩｇＭ抗体または抗体様分子の定常領域は、典型的には、少なくともＣμ４及び／またはテールピースドメイン（本明細書ではまとめてＣμ４－ｔｐとも称される）を含む。したがって、ＩｇＭ重鎖定常領域の「多量体化フラグメント」は、少なくともＣμ４－ｔｐドメインを含む。ＩｇＭ重鎖定常領域はさらに、Ｃμ３ドメインもしくはそのフラグメント、Ｃμ２ドメインもしくはそのフラグメント、Ｃμ１ドメインもしくはそのフラグメントを含むことができる。ある特定の実施形態において、結合分子、例えば、ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体は、完全なＩｇＭ重（μ）鎖定常ドメイン（例えば、配列番号１または配列番号２）、またはそのバリアント、誘導体、もしくは類似体（例えば本明細書に提供されるもの）を含み得る。

【0100】

ある特定の実施形態において、本開示は、５個の二価結合ユニットを含む五量体ＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体を提供し、各結合ユニットは、それぞれが抗原結合ドメインまたは抗原結合ドメインのサブユニットに関連する２個のＩｇＭ重鎖定常領域またはその多量体化フラグメントもしくはバリアントを含む。ある特定の実施形態では、２つのＩｇＭ重鎖定常領域は、ヒト重鎖定常領域である。

【0101】

本明細書で提供されるＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体が五量体である場合、ＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体は、典型的には、Ｊ鎖、またはその機能的フラグメントもしくはバリアントをさらに含む。ある特定の実施形態において、Ｊ鎖は、例えば、標的、例えば、免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞またはＮＫ細胞）に特異的に結合するＪ鎖関連抗原結合ドメインを含む修飾Ｊ鎖であり得る。ある特定の実施形態では、修飾Ｊ鎖は、それに結合した１つ以上の異種部分、例えば、免疫刺激剤をさらに含み得る。ある特定の実施形態では、Ｊ鎖は、本明細書の他の箇所で論じられるように、本明細書に提供されるＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体の血清半減期に影響を及ぼす、例えば、増強するように変異され得る。ある特定の実施形態では、Ｊ鎖は、本開示の別の箇所で論じられるように、グリコシル化に影響を及ぼすように変異させることができる。

【0102】

いくつかの実施形態では、多量体結合分子は六量体であり、６個の二価結合ユニットまたはそのバリアントもしくはフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、多量体結合分子は、六量体であり、６個の二価結合ユニットまたはそのバリアントもしくはフラグメントを含み、各結合ユニットは、２つのＩｇＭ重鎖定常領域またはその多量体化フラグメントもしくはバリアントを含む。

【0103】

ＩｇＭ重鎖定常領域は、Ｃμ１ドメインもしくはそのフラグメントもしくはバリアント、Ｃμ２ドメインもしくはそのフラグメントもしくはバリアント、Ｃμ３ドメインもしくはそのフラグメントもしくはバリアント、Ｃμ４ドメインもしくはそのフラグメントもしくはバリアント、及び／またはテールピース（ｔｐ）もしくはそのフラグメントもしくはバリアントのうちの１つ以上を含むことができるが、ただし、定常領域は、ＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体において所望の機能を果たすことができ、例えば、第２のＩｇＭ定常領域と会合して、１つ、２つ、または複数の抗原結合ドメイン（複数可）を有する結合ユニットを形成し、かつ／または他の結合ユニット（五量体の場合、Ｊ鎖）と会合して、六量体または五量体を形成することができる。ある特定の態様では、個々の結合ユニット内の２つのＩｇＭ重鎖定常領域またはそのフラグメントもしくはバリアントはそれぞれ、Ｃμ４ドメインまたはそのフラグメントもしくはバリアント、テールピース（ｔｐ）またはそのフラグメントもしくはバリアント、あるいはＣμ４ドメイン、ｔｐ、またはそれらのフラグメントもしくはバリアントの任意の組み合わせを含む。ある特定の実施形態では、個々の結合ユニット内の２つのＩｇＭ重鎖定常領域もしくはそのフラグメントもしくはバリアントは、それぞれ、Ｃμ３ドメインもしくはそのフラグメントもしくはバリアント、Ｃμ２ドメインもしくはそのフラグメントもしくはバリアント、Ｃμ１ドメインもしくはそのフラグメントもしくはバリアント、またはこれらの任意の組み合わせをさらに含む。

【0104】

いくつかの実施形態では、ＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体の結合ユニットは２つの軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体の結合ユニットは、軽鎖の２つのフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、軽鎖は、カッパ軽鎖である。いくつかの実施形態では、軽鎖は、ラムダ軽鎖である。いくつかの実施形態では、各結合ユニットは、２つの免疫グロブリン軽鎖を含み、それぞれが、免疫グロブリン軽鎖定常領域のアミノ末端に位置するＶＬを含む。

【0105】

血清半減期が延長されたＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、及びＩｇＭ由来結合分子
本明細書に提供されるような特定のＩｇＭ由来結合分子は、血清半減期を延長するように改変することができる。ＩｇＭ由来結合分子の延長し得る例示的なＩｇＭ重鎖定常領域変異は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１９／１６９３１４号に開示され、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例えば、明細書に提供されるようなＩｇＭ由来結合分子のバリアントＩｇＭ重鎖定常領域は、野生型ヒトＩｇＭ定常領域（例えば、配列番号１または配列番号２）のアミノ酸Ｓ４０１、Ｅ４０２、Ｅ４０３、Ｒ３４４、及び／またはＥ３４５に対応するアミノ酸位置にアミノ酸置換を含み得る。「野生型ヒトＩｇＭ定常領域のアミノ酸Ｓ４０１、Ｅ４０２、Ｅ４０３、Ｒ３４４、及び／またはＥ３４５に対応するアミノ酸」とは、ヒトＩｇＭ定常領域におけるＳ４０１、Ｅ４０２、Ｅ４０３、Ｒ３４４、及び／またはＥ３４５に相同である、任意の種のＩｇＭ定常領域の配列におけるアミノ酸を意味する。ある特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２のＳ４０１、Ｅ４０２、Ｅ４０３、Ｒ３４４、及び／またはＥ３４５に対応するアミノ酸は、任意のアミノ酸、例えば、アラニンで置換され得る。

【0106】

ＣＤＣ活性が低下したＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、及びＩｇＭ由来結合分子
本明細書で提供されるある特定のＩｇＭ由来多量体結合分子は、参照ＩｇＭ抗体または対応する参照ヒトＩｇＭ定常領域が同一であるＩｇＭ様抗体と比較して、補体の存在下での細胞に対する補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）活性の低下を示すように操作することができるが、ＣＤＣ活性の低下を与える変異は除かれる。これらのＣＤＣ変異は、本明細書に提供されるように、血清半減期の増加を付与するために、任意の変異と組み合わせることができる。「対応する野生型ヒトＩｇＭ定常領域」とは、ＣＤＣ活性に影響を及ぼす定常領域における修飾（単数または複数）を除いて、バリアントＩｇＭ定常領域と同一であるヒトＩｇＭ定常領域またはその一部、例えばＣμ３ドメインを意味する。ある特定の実施形態において、バリアントヒトＩｇＭ定常領域は、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ／２０１８／１８７７０２号（これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように、野生型ヒトＩｇＭ定常領域と比べて、例えばＣμ３ドメインにおいて、１つ以上のアミノ酸置換を含む。ＣＤＣを測定するためのアッセイが当業者に周知されており、例示的なアッセイが、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ／２０１８／１８７７０２号に記載されている。

【0107】

ある特定の実施形態では、ＣＤＣ活性の低下を与えるバリアントヒトＩｇＭ定常領域は、配列番号１（ヒトＩｇＭ定常領域対立遺伝子ＩＧＨＭ＊０３）または配列番号２（ヒトＩｇＭ定常領域対立遺伝子ＩＧＨＭ＊０４）のＬ３１０、Ｐ３１１、Ｐ３１３、及び／またはＫ３１５位で野生型ヒトＩｇＭ定常領域に対応するアミノ酸置換を含む。ある特定の実施形態では、ＣＤＣ活性の低下を与えるバリアントヒトＩｇＭ定常領域は、配列番号１または配列番号２のＰ３１１位で野生型ヒトＩｇＭ定常領域に対応するアミノ酸置換を含む。他の実施形態では、本明細書で提供するバリアントＩｇＭ定常領域は、配列番号１または配列番号２のＰ３１３位で野生型ヒトＩｇＭ定常領域に対応するアミノ酸置換を含む。他の実施形態では、本明細書で提供するバリアントＩｇＭ定常領域は、配列番号１及び／または配列番号２のＰ３１１位及び配列番号１または配列番号２のＰ３１３位で野生型ヒトＩｇＭ定常領域に対応する置換の組み合わせを含む。これらのプロリン残基は、任意のアミノ酸、例えば、アラニン、セリン、またはグリシンで独立して置換され得る。ある特定の実施形態では、ＣＤＣ活性の低下を与えるバリアントヒトＩｇＭ定常領域は、配列番号１または配列番号２のＫ３１５位で野生型ヒトＩｇＭ定常領域に対応するアミノ酸置換を含む。リジン残基は、任意のアミノ酸、例えば、アラニン、セリン、グリシン、またはアスパラギン酸で独立して置換され得る。ある特定の実施形態では、ＣＤＣ活性の低下を与えるバリアントヒトＩｇＭ定常領域は、配列番号１または配列番号２のＫ３１５位で野生型ヒトＩｇＭ定常領域に対応するアスパラギン酸によるアミノ酸置換を含む。ある特定の実施形態において、ＣＤＣ活性の低下を与えるバリアントヒトＩｇＭ定常領域は、配列番号１または配列番号２のＬ３１０位で野生型ヒトＩｇＭ定常領域に対応するアミノ酸置換を含む。このリジン残基は、任意のアミノ酸、例えば、アラニン、セリン、グリシン、またはアスパラギン酸で独立して置換され得る。ある特定の実施形態では、ＣＤＣ活性の低下を与えるバリアントヒトＩｇＭ定常領域は、配列番号１または配列番号２のＬ３１０位で野生型ヒトＩｇＭ定常領域に対応するアスパラギン酸によるアミノ酸置換を含む。

【0108】

ヒトＩｇＭ定常領域、及び特定の非ヒト霊長類ＩｇＭ定常領域は、典型的には、５個の天然アスパラギン（Ｎ）－結合型グリコシル化モチーフまたは部位を含む。本明細書で使用する場合、「Ｎ－結合型グリコシル化モチーフ」は、アミノ酸配列Ｎ－Ｘ_１－Ｓ／Ｔを含むか、またはそれからなり、ここで、Ｎはアスパラギンであり、Ｘ_１は、プロリン（Ｐ）を除く任意のアミノ酸であり、Ｓ／Ｔはセリン（Ｓ）またはトレオニン（Ｔ）である。グリカンは、アスパラギン残基の窒素原子に付着している。例えば、Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ Ｋ，Ｔａｙｌｏｒ ＭＥ（２００６），Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ（２ｎｄ ｅｄ．）．Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，ＵＳＡを参照されたい。Ｎ－結合型グリコシル化モチーフは、配列番号１または配列番号２のヒトＩｇＭ重鎖定常領域において生じ、４６位（「Ｎ１」）、２０９位（「Ｎ２」）、２７２位（「Ｎ３」）、２７９位（「Ｎ４」）、及び４４０位（「Ｎ５」）で開始する。これらの５個のモチーフは、非ヒト霊長類ＩｇＭ重鎖定常領域において保存されており、５個のうちの４個は、マウスＩｇＭ重鎖定常領域において保存されている。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に提供される多量体結合分子のＩｇＭ重鎖定常領域は、５個のＮ－結合型グリコシル化モチーフ：Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、及びＮ５を含む。いくつかの実施形態では、各ＩｇＭ重鎖定常領域上のＮ－結合グリコシル化モチーフのうちの少なくとも３つ（例えば、Ｎ１、Ｎ２、及びＮ３）は、複合体グリカンによって占有される。

【0109】

ある特定の実施形態では、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのＮ－Ｘ_１－Ｓ／Ｔモチーフは、そのモチーフにおけるグリコシル化を防止するアミノ酸の挿入、欠失、または置換を含み得る。ある特定の実施形態では、ＩｇＭ由来の多量体結合分子は、モチーフＮ１、モチーフＮ２、モチーフＮ３、モチーフＮ５、またはモチーフＮ１、Ｎ２、Ｎ３、もしくはＮ５のうちの２つ以上、３つ以上、もしくは４つすべての任意の組み合わせにおけるアミノ酸の挿入、欠失、もしくは置換を含むことができ、アミノ酸の挿入、欠失、もしくは置換は、そのモチーフにおけるグリコシル化を防止する。いくつかの実施形態では、ＩｇＭ定常領域は、配列番号１（ヒトＩｇＭ定常領域対立遺伝子ＩＧＨＭ＊０３）または配列番号２（ヒトＩｇＭ定常領域対立遺伝子ＩＧＨＭ＊０４）の４６、２０９、２７２、または４４０位で野生型ヒトＩｇＭ定常領域に対して１つ以上の置換を含む。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国仮出願第６２／８９１，２６３号を参照されたい。

【0110】

ＩｇＡ抗体、ＩｇＡ様抗体、及びＩｇＡ由来結合分子
ＩｇＡは粘膜免疫において決定的な役割を担っており、産生される総免疫グロブリンの約１５％を構成する。ＩｇＡは、単量体であっても多量体であってもよく、主に二量体分子を形成するが、三量体、四量体、及び／または五量体としても組み立てることができる。例えば、ｄｅ Ｓｏｕｓａ－Ｐｅｒｅｉｒａ，Ｐ．，ａｎｄ Ｊ．Ｍ．Ｗｏｏｆ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ８：５７（２０１９）を参照されたい。

【0111】

いくつかの実施形態では、多量体結合分子は二量体であり、２つの二価結合ユニットまたはそのバリアントもしくはフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、多量体結合分子は二量体であり、２つの二価結合ユニットまたはそのバリアントもしくはフラグメントを含み、本明細書に記載のＪ鎖またはその機能的フラグメントもしくはバリアントをさらに含む。いくつかの実施形態では、多量体結合分子は二量体であり、２つの二価結合ユニットまたはそのバリアントまたはフラグメントを含み、本明細書に記載のＪ鎖またはその機能的フラグメントもしくはバリアントをさらに含み、各結合ユニットは２つのＩｇＡ重鎖定常領域またはその多量体化フラグメントもしくはバリアントを含む。

【0112】

いくつかの実施形態では、多量体結合分子は四量体であり、４つの二価結合ユニットまたはそのバリアントもしくはフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、多量体結合分子は四量体であり、４つの二価結合ユニットまたはそのバリアントもしくはフラグメントを含み、本明細書に記載のＪ鎖またはその機能的フラグメントもしくはバリアントをさらに含む。いくつかの実施形態では、多量体結合分子は四量体であり、４つの二価結合ユニットまたはそのバリアントまたはフラグメントを含み、本明細書に記載のＪ鎖またはその機能的フラグメントもしくはバリアントをさらに含み、各結合ユニットは２つのＩｇＡ重鎖定常領域またはその多量体化フラグメントもしくはバリアントを含む。

【0113】

特定の実施形態では、本開示によって提供される多量体結合分子は、ＩｇＡ重鎖定常領域、またはその多量体化フラグメントを含む二量体結合分子であり、それぞれ、結合ユニット関連抗原結合ドメインと会合して、合計４つの結合ユニット関連抗原結合ドメインである。本明細書で提供される場合、ＩｇＡ抗体、ＩｇＡ由来結合分子、またはＩｇＡ様抗体は、２つの結合ユニット及びＪ鎖、例えば、本明細書の他の箇所に記載される修飾Ｊ鎖を含む。提供される各結合ユニットは、２つのＩｇＡ重鎖定常領域またはその多量体化フラグメントもしくはバリアントを含む。ある特定の実施形態では、多量体結合分子の少なくとも３つまたは４つすべての結合ユニット関連抗原結合ドメインは、同じ標的抗原に結合する。ある特定の実施形態では、多量体結合分子の少なくとも３つまたは４つすべての結合ユニット関連抗原結合ドメインは、同一である。

【0114】

二価ＩｇＡ由来結合ユニットは、２つのＩｇＡ重鎖定常領域を含み、二量体ＩｇＡ由来結合分子は、典型的には、２つの結合ユニットを含む。ＩｇＡには、次の重鎖定常ドメイン、Ｃα１（またはその代わりにＣＡ１もしくはＣＨ１）、ヒンジ領域、Ｃα２（またはその代わりにＣＡ２もしくはＣＨ２）、及びＣα３（またはその代わりにＣＡ３もしくはＣＨ３）、ならびにＣ末端の「テールピース」を含有する。ヒトＩｇＡは２つのサブタイプ、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２を有する。ヒトＩｇＡ１定常領域は、典型的には、配列番号３のアミノ酸配列を含む。ヒトＣα１ドメインは配列番号３の約アミノ酸６から約アミノ酸９８まで延びており、ヒトＩｇＡ１ヒンジ領域は配列番号３の約アミノ酸１０２から約アミノ酸１２４まで延びており、ヒトＣα２ドメインは配列番号３の約アミノ酸１２５から約アミノ酸２１９まで延びており、ヒトＣα３ドメインは配列番号３の約アミノ酸２２８から約アミノ酸３３０まで延びており、テールピースは配列番号３の約アミノ酸３３１から約アミノ酸３５２まで延びている。ヒトＩｇＡ２定常領域は、典型的には、配列番号４のアミノ酸配列を含む。ヒトＣα１ドメインは配列番号４の約アミノ酸６から約アミノ酸９８まで延びており、ヒトＩｇＡ２ヒンジ領域は配列番号４の約アミノ酸１０２から約アミノ酸１１１まで延びており、ヒトＣα２ドメインは配列番号４の約アミノ酸１１３から約アミノ酸２０６まで延びており、ヒトＣα３ドメインは配列番号４の約アミノ酸２１５から約アミノ酸３１７まで延びており、テールピースは配列番号４の約アミノ酸３１８から約アミノ酸３４０まで延びている。

【0115】

２つのＩｇＡ結合ユニットが、２つの追加のポリペプチド鎖、Ｊ鎖（配列番号４２）、及び分泌成分（前駆体：配列番号５、成熟：配列番号５のアミノ酸１９から６０３）と複合体を形成して、本明細書に提供されるような二価の分泌型ＩｇＡ（ｓＩｇＡ）由来結合分子を形成することができる。２つのＩｇＡ結合ユニットが集合して二量体ＩｇＡ由来結合分子を形成することには、Ｃα３ドメイン及びテールピースドメインが関与すると考えられている。例えば、Ｂｒａａｔｈｅｎ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：４２７５５－４２７６２（２００２）を参照されたい。したがって、この開示に提供される多量体化二量体ＩｇＡ由来結合分子は、典型的には、少なくともＣα３ドメイン及びテールピースドメインを含むＩｇＡ定常領域を含む。４つのＩｇＡ結合ユニットも同様に、Ｊ鎖と四量体複合体を形成することができる。ｓＩｇＡ抗体はまた、より高次の多量体、例えば、四量体として形成することもできる。

【0116】

ＩｇＡ重鎖定常領域は、Ｃα２ドメインもしくはそのフラグメント、ＩｇＡヒンジ領域もしくはそのフラグメント、Ｃα１ドメインもしくはそのフラグメント、及び／または、他のＩｇＡ（または他の免疫グロブリン、例えばＩｇＧ）重鎖ドメイン（例えばＩｇＧヒンジ領域を含む）を追加的に含み得る。ある特定の実施形態では、本明細書に提供されるような結合分子は、完全なＩｇＡ重（α）鎖定常ドメイン（例えば、配列番号３または配列番号４）、またはそのバリアント、誘導体、もしくは類似体を含み得る。いくつかの実施形態では、ＩｇＡ重鎖定常領域またはその多量体化フラグメントは、ヒトＩｇＡ定常領域である。

【0117】

ある特定の実施形態では、本明細書に提供されるような多量体結合分子の各結合ユニットは、それぞれが少なくともＩｇＡＣα３ドメイン及びＩｇＡテールピースドメインを含む、２つのＩｇＡもしくはＩｇＡ様重鎖定常領域またはその多量体化フラグメントもしくはバリアントを含む。ある特定の実施形態では、ＩｇＡまたはＩｇＡ重鎖定常領域は各々、ＩｇＡ Ｃα３ドメイン及びＩｇＡテールピースドメインのＮ末端側に位置するＩｇＡ Ｃα２ドメインをさらに含み得る。例えば、ＩｇＡ重鎖定常領域は、配列番号３のアミノ酸１２５から３５３、または配列番号４のアミノ酸１１３から３４０を含み得る。ある特定の実施形態では、ＩｇＡまたはＩｇＡ重鎖定常領域は各々、ＩｇＡ Ｃα２ドメインのＮ末端側に位置するＩｇＡまたはＩｇＧヒンジ領域をさらに含み得る。例えば、ＩｇＡ重鎖定常領域は、配列番号３のアミノ酸１０２から３５３、または配列番号４のアミノ酸１０２から３４０を含み得る。ある特定の実施形態では、ＩｇＡまたはＩｇＡ様重鎖定常領域は各々、ＩｇＡヒンジ領域のＮ末端側に位置するＩｇＡ Ｃα１ドメインをさらに含み得る。

【0118】

いくつかの実施形態では、ＩｇＡ抗体、ＩｇＡ様抗体、または他のＩｇＡ由来結合分子の各結合ユニットは、２つの軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＡ抗体、ＩｇＡ様抗体、または他のＩｇＡ由来結合分子の各結合ユニットは、２つのフラグメント軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、軽鎖は、カッパ軽鎖である。いくつかの実施形態では、軽鎖は、ラムダ軽鎖である。いくつかの実施形態では、軽鎖は、キメラカッパラムダ軽鎖である。いくつかの実施形態では、各結合ユニットは、２つの免疫グロブリン軽鎖を含み、それぞれが、免疫グロブリン軽鎖定常領域のアミノ末端に位置するＶＬを含む。

【0119】

修飾Ｊ鎖及び／またはバリアントＪ鎖
ある特定の実施形態では、本明細書で提供する多量体結合分子は、Ｊ鎖またはその機能的フラグメントもしくはバリアントを含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される多量体結合分子は、五量体であり、Ｊ鎖またはその機能的フラグメントもしくはバリアントを含む。特定の実施形態では、本明細書で提供する多量体結合分子は、二量体ＩｇＡ分子または五量体ＩｇＭ分子であり、Ｊ鎖またはその機能的フラグメントもしくはバリアントを含む。いくつかの実施形態では、多量体結合分子は、成熟ヒトＪ鎖配列（例えば、配列番号４２）などの天然に存在するＪ鎖配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、多量体結合分子は、天然に存在するまたはバリアントＪ鎖の機能的フラグメントを含むことができる。

【0120】

ある特定の実施形態では、本明細書に提供される、五量体のＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体、または二量体のＩｇＡまたはＩｇＡ様抗体のＪ鎖は、ＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体、またはＩｇＡまたはＩｇＡ様抗体が集合して、その結合標的（複数可）に結合する能力を妨げることなく、例えば、異種部分、または２つ以上の異種部分、例えば、ポリペプチドの導入によって修飾され得る。各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第９，９５１，１３４号及び第１０，６１８，９７８号、ならびに米国特許出願公開第ＵＳ－２０１９－０１８５５７０号を参照されたい。したがって、二重特異性もしくは多重特異性ＩｇＭもしくはＩｇＭ様抗体、またはＩｇＡもしくはＩｇＡ様抗体を含む、本明細書に提供されるＩｇＭもしくはＩｇＭ様抗体またはＩｇＡもしくはＩｇＡ様抗体には、Ｊ鎖またはそのフラグメントもしくはバリアントに導入される異種部分、例えば、異種ポリペプチドをさらに含む、修飾Ｊ鎖もしくはその機能的フラグメントもしくはバリアントを含めることができる。特定の実施形態では、異種部分は、限定するものではないが、インフレームで融合されたペプチドもしくはポリペプチド、またはＪ鎖またはそのフラグメントもしくはバリアントに化学的にコンジュゲートされたペプチド、ポリペプチド、もしくは他の化学的もしくは生物学的部分であり得る。ある特定の実施形態では、異種ポリペプチドは、リンカー、例えば、少なくとも５アミノ酸からなり、ただし５０アミノ酸よりも多くからはならない、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０個のアミノ酸から構成されるペプチドリンカーを介して、Ｊ鎖またはその機能的フラグメントもしくはバリアントに融合されている。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号５７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５８）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５９）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６０）、またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６１）からなる。ある特定の態様では、異種部分は、Ｊ鎖にコンジュゲートした化学的または生物学的部分であり得る。Ｊ鎖に付着される異種部分には、限定されるものではないが、Ｊ鎖関連抗原結合ドメイン、例えば、抗体またはその抗原結合フラグメントもしくはサブユニット、例えば、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、ＩｇＭ、ＩｇＭ様、ＩｇＡまたはＩｇＡ様抗体の半減期を増加させることができる安定化ペプチド、またはポリマーもしくは細胞毒素などの化学部分が含まれ得る。いくつかの実施形態では、異種部分は、結合分子、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはＨＳＡ結合分子の半減期を増加させることができる安定化ペプチドを含む。

【0121】

いくつかの実施形態では、修飾Ｊ鎖は、Ｊ鎖関連抗原結合ドメイン、例えば、標的抗原に特異的に結合することができるポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、Ｊ鎖関連抗原結合ドメインは、本明細書の他の箇所に記載される抗体またはその抗原結合フラグメントであり得る。ある特定の実施形態では、Ｊ鎖関連抗原結合ドメインは、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗原結合ドメインまたは、例えばラクダ科抗体またはコンドリクトイド（ｃｏｎｄｒｉｃｔｈｏｉｄ）抗体に由来する、一本鎖抗原結合ドメインであり得る。Ｊ鎖関連抗原結合ドメインは、Ｊ鎖の機能または関連するＩｇＭ、ＩｇＭ様、ＩｇＡ、またはＩｇＡ様抗体の機能を妨害することなく、Ｊ鎖関連抗原結合ドメインのその結合標的への結合を可能にする任意の位置でＪ鎖に導入することができる。挿入位置としては、限定されるものではないが、Ｃ末端もしくはその付近、Ｎ末端もしくはその付近、またはＪ鎖の三次元構造に基づいてアクセス可能な内部の位置が挙げられる。ある特定の実施形態では、Ｊ鎖関連抗原結合ドメインは、配列番号４２の成熟ヒトＪ鎖、または配列番号４２のアミノ酸９２及び１０１に対応するシステイン残基間のそのバリアントに導入することができる。さらなる実施形態では、Ｊ鎖関連抗原結合ドメインは、グリコシル化部位またはその付近で配列番号４２のヒトＪ鎖に導入することができる。さらなる実施形態では、Ｊ鎖関連抗原結合ドメインは、配列番号４２のヒトＪ鎖またはそのバリアントに、Ｃ末端から１０アミノ酸残基以内、及び／またはＮ末端から１０アミノ酸以内に、導入され得る。さらなる実施形態では、Ｊ鎖関連抗原結合ドメインは、配列番号４２のヒトＪ鎖またはそのバリアントのＣ末端に、及び／またはＮ末端に、導入され得る。

【0122】

ある特定の実施形態では、本明細書に提供するＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＡ様抗体、またはＩｇＭまたはＩｇＡ由来結合分子のＪ鎖は、本明細書に提供するバリアントＪ鎖を含むＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＡ様抗体、またはＩｇＭまたはＩｇＡ由来結合分子の血清半減期を変化、例えば増加させることができる１つ以上のアミノ酸置換を含むバリアントＪ鎖である。例えば、特定のアミノ酸の置換、欠失、または挿入によって、対象動物に投与されると、バリアントＪ鎖における１つ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を除いて同一であり、かつ同じ方法を使用して同じ動物種に投与される参照ＩｇＭ由来の結合分子と比較して、血清半減期の増加を示すＩｇＭ由来の結合分子をもたらすことができる。ある特定の実施形態において、バリアントＪ鎖は、参照Ｊ鎖と比較して、１つ、２つ、３つ、または４つの単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を含むことができる。

【0123】

いくつかの実施形態では、多量体結合分子は、グリコシル化が低減したまたは１つ以上の高分子Ｉｇ受容体（例えば、ｐＩｇＲ、Ｆｃアルファ－ミュー受容体（ＦｃαμＲ）、またはＦｃミュー受容体（ＦｃμＲ））への結合が低減した、本明細書に記載のバリアント配列などのバリアントＪ鎖配列を含むことができる。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１９／１６９３１４号を参照されたい。ある特定の実施形態では、バリアントＪ鎖は、成熟した野生型ヒトＪ鎖（配列番号４２）のアミノ酸Ｙ１０２に対応するアミノ酸位置にアミノ酸置換を含み得る。「成熟した野生型ヒトＪ鎖のアミノ酸Ｙ１０２に対応するアミノ酸」とは、ヒトＪ鎖におけるＹ１０２に相同である任意の種のＪ鎖の配列におけるアミノ酸を意味する。その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開第ＷＯ／２０１９／１６９３１４号を参照されたい。配列番号４２におけるＹ１０２に対応する位置は、少なくとも４３の他の種のＪ鎖アミノ酸配列において保存されている。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，９５１，１３４号の図４を参照されたい。配列番号４２のＹ１０２に対応する位置における特定の変異は、特定の免疫グロブリン受容体、例えば、ヒトまたはマウスＦｃαμ受容体、マウスＦｃμ受容体、及び／またはヒトまたはマウス高分子Ｉｇ受容体（ｐＩｇ受容体）の、バリアントＪ鎖を含むＩｇＭ五量体への結合を阻害することができる。配列番号４２のＹ１０２に対応するアミノ酸での置換を含むＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、及びＩｇＭ由来結合分子は、動物に投与された場合、置換を除いて同一であり、かつ同じ方法で同じ種に投与される対応する抗体、抗体様分子、または結合分子よりもの血清半減期が改善される。ある特定の実施形態では、配列番号４２のＹ１０２に対応するアミノ酸は、任意のアミノ酸で置換され得る。ある特定の実施形態では、配列番号４２のＹ１０２に対応するアミノ酸は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、またはアルギニン（Ｒ）で置換され得る。ある特定の実施形態では、配列番号４２のＹ１０２に対応するアミノ酸は、アラニンで置換され得る。特定の実施形態では、Ｊ鎖またはその機能的フラグメントもしくはバリアントはバリアントヒトＪ鎖であり、本明細書で「Ｊ＊」と称されるＪ鎖である配列番号４３のアミノ酸配列を含む。ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１９／１６９３１４号を参照されたい。

【0124】

野生型Ｊ鎖は、典型的には、１つのＮ－結合グリコシル化部位を含む。特定の実施形態では、本明細書で提供する多量体結合分子のバリアントＪ鎖またはその機能的フラグメントは、アスパラギン（Ｎ）結合グリコシル化モチーフＮ－Ｘ_１－Ｓ／Ｔ内に、例えば、成熟ヒトＪ鎖（配列番号４２）またはＪ＊（配列番号４３）のアミノ酸４９（モチーフＮ６）に対応するアミノ酸位置から開始する、変異を含み、式中、Ｎは、アスパラギンであり、Ｘ_１は、プロリンを除く任意のアミノ酸であり、Ｓ／Ｔは、セリンまたはスレオニンであり、この変異は、そのモチーフにおけるグリコシル化を防止する。ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１９／１６９３１４号で実証されるように、この部位でのグリコシル化を防止する変異は、対象動物へ投与されると、バリアントＪ鎖におけるグリコシル化を防止する変異または変異を除いて同一であり、かつ同じ動物種に同じように投与される参照多量体結合分子と比較して、血清半減期の増加を示す、本明細書で提供する多量体結合分子をもたらすことができる。

【0125】

例えば、ある特定の実施形態では、本明細書に提供されるＪ鎖を含む結合分子のバリアントＪ鎖またはその機能的フラグメントは、配列番号４２もしくは配列番号４３のアミノ酸Ｎ４９もしくはアミノ酸Ｓ５１に対応するアミノ酸位置にアミノ酸置換を含むことができるが、Ｓ５１に対応するアミノ酸がスレオニン（Ｔ）で置換されていないか、またはバリアントＪ鎖が、配列番号４２もしくは配列番号４３のアミノ酸Ｎ４９及びＳ５１の両方に対応するアミノ酸位置にアミノ酸置換を含むことを条件とする。ある特定の実施形態では、配列番号４２または配列番号４３のＮ４９に対応する位置が、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、またはアスパラギン酸（Ｄ）で置換される。特定の実施形態では、配列番号４２または配列番号４３のＮ４９に対応する位置は、アラニン（Ａ）で置換され得る。特定の実施形態では、配列番号４２または配列番号４３のＮ４９に対応する位置は、アスパラギン酸（Ｄ）で置換され得る。ある特定の実施形態では、配列番号４２または配列番号４３のＳ５１に対応する位置は、アラニン（Ａ）またはグリシン（Ｇ）で置換される。ある特定の実施形態では、配列番号４２または配列番号４３のＳ５１に対応する位置は、アラニン（Ａ）で置換される。

【0126】

ある特定の実施形態では、提供される結合分子のＪ鎖関連抗原結合ドメインは、抗体またはそのフラグメントを含む。ある特定の実施形態では、抗体フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）フラグメント、またはそれらの任意の組み合わせである。ある特定の実施形態では、抗体フラグメントは一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。ｓｃＦｖは、Ｊ鎖またはフラグメントもしくはバリアント、例えば、Ｊ＊に、融合または化学的にコンジュゲートすることができる。ある特定の実施形態では、ｓｃＦｖフラグメントは、ペプチドリンカー、例えば、配列番号５７～６１を介してＪ鎖に融合される。ｓｃＦｖフラグメントは、修飾Ｊ鎖がＩｇＭ、ＩｇＭ様、ＩｇＡ、またはＩｇＡ様結合ユニットと集合して二量体または五量体を形成する能力が影響を受けない限り、任意の方法でＪ鎖またはそのフラグメントもしくはバリアントに融合することができる。例えば、ｓｃＦｖフラグメントは、Ｊ鎖またはそのフラグメントもしくはバリアントのＮ末端、Ｊ鎖またはそのフラグメントもしくはバリアントのＣ末端、またはＪ鎖またはそのフラグメントもしくはバリアントのＮ末端及びＣ末端の両方に融合され得る。

【0127】

ある特定の実施形態では、修飾Ｊ鎖のｓｃＦｖは、免疫エフェクター細胞上の標的に結合する。Ｊ鎖関連抗原結合ドメインによって結合される免疫エフェクター細胞は、例えば、腫瘍関連標的または腫瘍特異的標的を標的とする結合ユニット関連抗原結合ドメインと会合した場合に有益な効果を付与する任意の免疫エフェクター細胞であってもよく、例えば、腫瘍細胞の細胞ベースの殺滅を媒介する。ある特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、またはγδＴ細胞、Ｂ細胞、形質細胞、マクロファージ、樹状細胞、またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞であり得るが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ＮＫ細胞である。

【0128】

免疫エフェクター細胞がＴ細胞、例えばＣＤ８＋Ｔ細胞である場合、Ｊ鎖関連ｓｃＦｖフラグメントは、Ｔ細胞表面抗原ＣＤ３、例えばＣＤ３εに特異的に結合することができる。ある特定の実施形態では、抗ＣＤ３ε ｓｃＦｖフラグメントが、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、当該ＶＨが、ＶＨ相補性決定領域ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、及びＶＨＣＤＲ３を含み、それらはそれぞれ、配列番号４９、配列番号５０、及び配列番号５１のアミノ酸配列、または該ＶＨＣＤＲのうちの１つ以上に１、２、もしくは３つのアミノ酸置換を有する配列番号４９、配列番号５０、及び配列番号５１のアミノ酸配列、を含み、当該ＶＬが、ＶＬ相補性決定領域ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、及びＶＬＣＤＲ３を含み、それらはそれぞれ、配列番号５３、配列番号５４、及び配列番号５５のアミノ酸配列、または該ＶＬＣＤＲのうちの１つ以上に１、２、もしくは３つのアミノ酸置換を有する配列番号５３、配列番号５４、及び配列番号５５のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＳｃＦｖフラグメントは、配列番号４８のＶＨアミノ酸配列と配列番号５２のＶＬアミノ酸配列とを含む。他の実施形態では、抗ＣＤ３ε ｓｃＦｖフラグメントは、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬは、それぞれアミノ酸配列番号４４及び配列番号４５を含む。特定の実施形態では、修飾Ｊ鎖は、配列番号４６のアミノ酸２０～４１２、配列番号４７のアミノ酸２０～４１２、または配列番号５６のアミノ酸２０～４２０を含むアミノ酸配列を含む。

【0129】

ある特定の他の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ＮＫ細胞であり、ｓｃＦｖフラグメントは、ＣＤ１６またはＣＤ５６に特異的に結合できる。

【0130】

本明細書で提供される多量体結合分子の修飾Ｊ鎖は、Ｊ鎖に付着した追加の異種部分を含むようにさらに修飾され得る。例示的な部分は、例えば、米国特許第９，９５１，１３４号及び第１０，６１８，９７８号、ならびに米国特許出願公開第ＵＳ２０１９－０１８５５７０号、ならびにＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０４６３７９号に記載されており、これらのすべてはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ある特定の実施形態では、本明細書で提供する多量体結合分子の修飾Ｊ鎖は、Ｊ鎖またはそのフラグメントもしくはバリアントに融合または化学的にコンジュゲートされた免疫刺激剤（「ＩＳＡ」）をさらに含むことができる。例えば、ＩＳＡは、サイトカインまたは受容体結合フラグメントもしくはそのバリアントを含み得る。特定の実施形態では、Ｊ鎖関連ＩＳＡは、（ａ）インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）タンパク質または受容体結合フラグメントもしくはそのバリアント（「Ｉ」）、及び（ｂ）Ｉと会合することができるスシドメインまたはそのバリアントを含むインターロイキン－１５受容体－α（ＩＬ－１５Ｒα）フラグメント（「Ｒ」）を含むことができ、Ｊ鎖またはそのフラグメントもしくはバリアント、ならびにＩ及びＲのうちの少なくとも１つ、またはＩ及びＲの両方は、融合タンパク質として会合し、Ｉ及びＲは、会合してＩＳＡとして機能することができる。ある特定の実施形態では、ＩＳＡは、ペプチドリンカーを介してＪ鎖に融合され得る。

【0131】

高い標的密度を有する細胞に対する選択性が向上した多価抗体
本開示は、正常な健康な細胞と比較して、疾患細胞、例えば、がん細胞または腫瘍細胞への結合に対する選択性が向上した多量体結合分子、例えば、ＩｇＭ、ＩｇＭ様、ＩｇＡ、またはＩｇＡ様抗体を提供する。提供される結合分子は、２個の二価結合ユニット（例えば、二量体ｓＩｇＡ抗体の場合）、または５個または６個の二価結合ユニット（例えば、五量体または六量体ＩｇＭ抗体の場合）を含むことができる。提供される結合分子の各結合ユニットは、典型的には、ＩｇＡ、ＩｇＡ様、ＩｇＭ、もしくはＩｇＭ様重鎖定常領域またはその多量体化フラグメントもしくはバリアントをそれぞれ含む２つの抗体重鎖を含み、フラグメント（複数可）は、ＩｇＡ重鎖定常領域のＣＨ３及びｔｐドメイン、またはＩｇＭ重鎖定常領域のＣＨ４及びｔｐドメインを少なくとも含む。もちろん、重鎖は、追加のＩｇＡもしくはＩｇＡ様重鎖定常領域ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２）、またはＩｇＭもしくはＩｇＭ様重鎖定常領域ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）、またはそれらのフラグメントを含み得、また、例えば、１つ以上のＩｇＧ定常領域ドメイン（例えば、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、またはＣＨ３）、または別の抗体アイソタイプの定常領域ドメインまたは別の種由来の定常領域ドメインを含むハイブリッド重鎖定常領域もあり得る。提供される結合分子の各重鎖定常領域は、結合ユニット関連抗原結合ドメインまたはそのサブユニット、例えば、軽鎖可変領域（ＶＬ）、ｓｃＦｖ、または一本鎖可変領域、例えば、サメまたはラクダ由来のものと会合することができる重鎖可変領域（ＶＨ）と会合することができる。

【0132】

本明細書で提供する多量体結合分子において、結合分子の少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８つ、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１または１２個の結合ユニット関連抗原結合ドメインは、細胞表面上の同じ所定の標的、例えば、細胞上に発現される同じ標的抗原、または標的抗原上の同じエピトープに特異的に結合する。ある特定の実施形態において、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、または１２の結合ユニット関連抗原結合ドメインは、同一である。ある特定の実施形態において、標的は、腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原である。本明細書に提供される多量体結合分子は、正常な健康細胞などのより低い密度で所定の標的を発現する細胞と比較して、より高い密度で所定の標的を発現する、細胞、例えば、疾患細胞、例えば、腫瘍または他のがん細胞に優先的または選択的に結合する。

【0133】

本明細書で使用される場合、「より低い密度で所定の標的を発現する細胞と比較して、より高い密度で所定の標的を発現する細胞」は、例えば、参照細胞よりも多くの数の標的、例えば、標的抗原のコピーを細胞の表面上で発現する細胞、または標的抗原が参照細胞上の同じ標的抗原よりもより緊密にクラスター化されるように、ラフトまたはクラスターにおいて標的、例えば、標的抗原を発現する細胞を指す。ある特定の実施形態では、「より高い密度で所定の標的を発現する細胞」は、疾患細胞、例えば、がん細胞または腫瘍細胞であり、「より低い密度で所定の標的を発現する」参照細胞は、正常な健康細胞である。ある特定の実施形態では、「所定の標的」は、細胞の疾患状態に応答して過剰発現される抗原である。ある特定の実施形態では、所定の標的は、腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原である。

【0134】

ある特定の実施形態では、「所定の標的」は、特定の免疫細胞、例えば、活性化ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞、または調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）上で過剰発現されたＴＮＦ受容体スーパーファミリー（ＴＮＦｒＳＦ）標的であり得る。ヒトでは、例えば、ＴＮＦｒＳＦメンバーＯＸ４０及びＧＩＴＲは、活性化ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞ならびに活性化Ｔｒｅｇ上で発現されるが、ほとんどの静止ナイーブＴ細胞または記憶Ｔ細胞では発現されない。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋エフェクターＴ細胞上に発現したＯＸ４０またはＧＩＴＲを介したシグナル伝達により、共刺激性の増殖、生存、及びエフェクター機能が強化される（Ｉｄ．Ｓｔｕｂｅｒ，Ｅ，ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２：５０７－２１（１９９５）、Ｔｏｎｅ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１００：１５０５９－１５０６４（２００３）、Ｒｏｎｃｈｅｔｔｉ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４：６１３－６２２（２００４））。適切なサイトカイン環境を考慮すると、ＯＸ４０またはＧＩＴＲシグナル伝達はまた、Ｔｒｅｇの免疫抑制能力をブロックし、それによって細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）機能を強化することもできる（Ｌｉｎｃｈ，ＳＮ，ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔ．Ｏｎｃｏｌ．５：ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｏｎｃ．２０１５．０００３４（２０１５）、Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌ ３：１３５－１４２（２００２））。

【0135】

ある特定の実施形態において、「所定の標的」は、免疫細胞上で差異的に発現される免疫チェックポイント分子、例えば、ＣＴＬＡ４であり得る。

【0136】

任意の所与の細胞の抗原密度は、様々な方法で測定及び発現することができる。例えば、細胞は、蛍光タグに結合した抗体で処理し、次に蛍光活性化細胞選別、またはＦＡＣＳに供することができ、細胞上に発現する標的抗原の相対レベルは、相対平均蛍光強度、またはＭＦＩとして報告することができる。ある特定の実施形態では、より高い密度で所定の標的を発現する細胞は、より低い密度で標的抗原を発現する参照細胞について測定したＭＦＩよりも少なくとも０．５倍、１倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、５０００倍、１０，０００倍、５０，０００倍、または１００，０００倍大きいＭＦＩを有することができる。また、細胞の相対的な標的密度は、所定量の一次抗体、例えば、ＱＩＦＩＫｉｔ（ＤＡＫＯ）と結合したキャリブレーションビーズを含むキットを使用するフローサイトメトリーにより測定することができる。キャリブレーションビーズによって提供される標準曲線を使用して、相対抗原密度は、細胞当たりの「特異的抗体結合能」（ｓＡＢＣ）として表すことができる。

【0137】

特定の実施形態では、多量体結合分子、例えば、本明細書に提供されるＩｇＭ、ＩｇＭ様、ＩｇＡ、またはＩｇＡ様抗体は、例えば、同等及び／または同一の結合ユニット関連抗原結合ドメインを有する、同じ標的に結合する対応する二価のＩｇＧ治療用モノクローナル抗体と比較して、少なくとも部分的には、所定の標的に対する結合分子の価数の増加により、比較的高密度で所定の標的を発現する細胞に対して向上した選択性を有することができる。例えば、１０個の結合ユニット関連抗原結合ドメインを含む五量体ＩｇＭ抗体は、結合ユニット関連抗原結合ドメインのうちの２つのみを含む対応する二価ＩｇＧ抗体よりも、腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原を過剰発現する細胞をより容易に認識し、それに結合することができる。ある特定の実施形態では、結合分子、例えば、本明細書に提供されるＩｇＭ、ＩｇＭ様、ＩｇＡ、またはＩｇＡ様抗体は、それが弱く結合するか、またはより低い密度で所定の標的抗原を発現する細胞、例えば、正常な健常な細胞に検出可能に結合しないが、より高い密度で標的抗原を発現する細胞に検出可能に結合することができるように操作され得る。ある特定の実施形態では、結合分子、例えば、本明細書に提供されるＩｇＭ、ＩｇＭ様、ＩｇＡ、またはＩｇＡ様抗体は、標的抗原をより高い密度で発現する細胞に結合することができ、ここで、細胞の表面上の所定の標的に特異的に結合するわずか２つの同等または同一の結合ユニット関連抗原結合ドメインを有する対応する二価のＩｇＧ抗体は、より高い密度で標的抗原を発現する細胞、またはより低い密度で標的抗原を発現する細胞に結合することができない。

【0138】

特定の実施形態では、結合分子、例えば、本明細書に提供されるＩｇＭ、ＩｇＭ様、ＩｇＡ、またはＩｇＡ様抗体は、例えば、ＩｇＭ、ＩｇＭ様、ＩｇＡ、またはＩｇＡ様抗体であるために、増加した価数ならびに所定の標的抗原に対する各結合ユニット関連抗原結合ドメインの親和性の低減の組み合わせによって、より高い密度で所定の標的抗原を発現する細胞に向上した選択性で結合する。例えば、結合分子、例えば、標的抗原に対する結合親和性が低い１０個の結合ユニット関連抗原結合ドメインを含むＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体は、標的に対するそれらのアビディティーの増加に起因して標的抗原を高密度で発現する細胞のみを選択的に標的化することができる。以下の実施例の節に示すように、本発明者らは、結合ユニット関連抗原結合ドメインが標的に対して低減した親和性を有するように、Ｂ細胞マーカーＣＤ２０に結合する既知の治療抗体の結合ユニット関連抗原結合ドメインを操作した。これらの親和性の低減した結合ユニット関連抗原結合ドメインは、二価のＩｇＧバックグラウンドに組み込まれると、任意のＢ細胞株において結合して補体媒介性細胞傷害性（ＣＤＣ）を誘導することができないが、同じ親和性低減抗原結合ドメインが、ＩｇＭバックグラウンに組み込まれると、低密度でＣＤ２０を発現するＢ細胞株において検出可能に結合またはＣＤＣを誘導しないが、高密度でＣＤ２０を発現するＢ細胞株においてはＣＤＣを誘導する。同様に、これらの親和性の低減した結合ユニット関連抗原結合ドメインは、二重特異性ＩｇＭバックグラウンドに組み込まれると、ＩｇＭ抗体が、ＣＤ３εに特異的に結合するＪ鎖関連抗原結合ドメインを含む修飾Ｊ鎖をさらに含む場合、低密度でＣＤ２０を発現するＢ細胞株のＴ細胞指向性細胞傷害性（ＴＤＣＣ）を誘導しないが、高密度でＣＤ２０を発現するＢ細胞株のＴＤＣＣを誘導する。親和性の低減を有する標的に結合することが予測される既知の治療抗体のバリアントを同定するための方法は、本明細書の他の場所に提示される。そのようなバリアントを作製する方法は当業者に周知である。

【0139】

ある特定の実施形態では、「より高い密度で所定の標的を発現する細胞」は、がん細胞または腫瘍細胞であり得る。ある特定の実施形態では、標的は、腫瘍特異的抗原、すなわち、腫瘍もしくはがん細胞上でのみ大部分発現されるか、または成人の正常な健康な細胞において検出不可能なレベルでのみ発現され得る標的抗原である。ある特定の実施形態では、標的は、腫瘍関連抗原、すなわち、健康な細胞及びがん性細胞の両方に発現されるが、正常な健康な細胞よりもがん性細胞においてはるかに高密度で発現される標的抗原である。例示的な腫瘍特異的及び腫瘍関連抗原としては、限定するものではないが、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ２とも呼ばれる）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）、受容体チロシン－タンパク質キナーゼＥｒｂＢ４、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦ受容体－１（ＶＥＧＦＲ１）、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ５２、ＣＤ３０、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣＤ３８、ガングリオシドＧＤ２、シグナル伝達リンパ球活性化分子ファミリーメンバー７（ＳＬＡＭＦ７）の自己リガンド受容体、血小板由来成長因子受容体Ａ（ＰＤＧＦＲＡ）、ＣＤ２２、ＦＬＴ３（ＣＤ１３５）、ＣＤ１２３、ＭＵＣ－１６、がん胎児性抗原関連細胞接着分子１（ＣＥＡＣＡＭ－１）、メソテリン、腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー２（Ｔｒｏｐ－２）、グリピカン－３（ＧＰＣ－３）、ヒト血液型Ｈタイプ１三糖（Ｇｌｏｂｏ－Ｈ）、シアリルＴｎ抗原（ＳＴｎ抗原）、またはＣＤ３３が挙げられる。当業者は、これらの標的抗原が多くの異なる名称によって文献に現れるが、これらの周知の治療標的は、オンラインで入手可能なデータベース、例えば、ＥＸＰＡＳＹ．ｏｒｇを使用して容易に識別することができることを理解するであろう。

【0140】

他の腫瘍関連抗原及び／または腫瘍特異的抗原としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＤＬＬ４、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、Ｎｏｔｃｈ４、ＪＡＧ１、ＪＡＧ２、ｃ－Ｍｅｔ、ＩＧＦ－１Ｒ、Ｐａｔｃｈｅｄ、Ｈｅｄｇｅｈｏｇファミリーポリペプチド、ＷＮＴファミリーポリペプチド、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＦＺＤ１０、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＩＬ－６、ＴＮＦアルファ、ＩＬ－２３、ＩＬ－１７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ３、ＣＥＡ、Ｍｕｃ１６、ＰＳＣＡ、ＣＤ４４、ｃ－Ｋｉｔ、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４、ＢＭＰファミリーポリペプチド、ＢＭＰＲ１ａ、ＢＭＰＲ１ｂ、またはＴＮＦスーパーファミリー受容体タンパク質、例えばＴＮＦＲ１（ＤＲ１）、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦＲ１／２、ＣＤ４０（ｐ５０）、Ｆａｓ（ＣＤ９５、Ａｐｏ１、ＤＲ２）、ＣＤ３０、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７、ＩＬＡ）、ＴＲＡＩＬＲ１（ＤＲ４、Ａｐｏ２）、ＤＲ５（ＴＲＡＩＬＲ２）、ＴＲＡＩＬＲ３（ＤｃＲ１）、ＴＲＡＩＬＲ４（ＤｃＲ２）、ＯＰＧ（ＯＣＩＦ）、ＴＷＥＡＫＲ（ＦＮ１４）、ＬＩＧＨＴＲ（ＨＶＥＭ）、ＤｃＲ３、ＤＲ３、ＥＤＡＲ、またはＸＥＤＡＲ。

【0141】

ある特定の実施形態では、所定の標的に特異的な、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１または１２の結合ユニット関連抗原結合ドメインは、所定の標的、例えば、承認された治療抗体または前臨床または臨床開発中の治療抗体に結合することが知られている既存の抗体の抗原結合ドメインの親和性低減バリアントである。親和性の低減したバリアントを調製するための例示的な既知の治療用抗体には、限定されないが、アレムツズマブ（ＣＤ５２に結合する）、アテゾリズマブ（ＰＤ－Ｌ１に結合する）、アベルマブ（ＰＤ－Ｌ１に結合する）、ベバシズマブ（ＶＥＧＦに結合する）、ブリナツモマブ（ＣＤ１９に結合する）、ブレンツキシマブ（ＣＤ３０に結合する）、カプロマブ（ＰＳＭＡに結合する）、セツキシマブ（ＥＧＦＲに結合する）、ダラツムマブ（ＣＤ３８に結合する）、デノスマブ（ＲＡＮＫＬに結合する）、ジヌツキシマブ（ＧＤ２に結合する）、デュルバルマブ（ＰＤ－Ｌ１に結合する）、エロツズマブ（ＳＬＡＭＦ７に結合する）、ゲムツズマブ（ＣＤ３３に結合する）、イブリツモマブ（ＣＤ２０に結合する）、イピリムマブ（ＣＴＬＡ４に結合する）、イノツズマブ（ＣＤ２２に結合する）、ネシツムマブ（ＥＧＦＲに結合する）、ニボルマブ（ＰＤ－１に結合する）、オビヌツズマブ（ＣＤ２０に結合する）、オクレリズマブ（ＣＤ２０に結合する）、オファツムマブ（ＣＤ２０に結合する）、オララツマブ（ＰＤＧＦＲＡに結合する）、オマリズマブ（ＩｇＥに結合する）、パニツムマブ（ＥＧＦＲに結合する）、ペムブロリズマブ（ＰＤ－１に結合する）、ペルツズマブ（ＨＥＲ２に結合する）、ラムシルマブ（ＶＥＧＦＲ２に結合する）、ラニビズマブ（ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２に結合する）、リツキシマブ（ＣＤ２０に結合する）、トラスツズマブ（ＨＥＲ２に結合する）、またはトレメリムマブ（ＣＴＬＡ４に結合する）が挙げられる。

【0142】

ある特定の実施形態では、上記に列挙されるものを含むが、これらに限定されない、既存の抗体の抗原結合ドメインの親和性低減バリアントは、既存の抗体の抗原結合ドメインの結合親和性よりも、少なくとも１倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも５０００倍、少なくとも１０，０００倍、少なくとも５０，０００倍、または少なくとも１００，０００倍以上低い所定の標的に対する結合親和性で、所定の標的に結合する。言い換えれば、親和性低減バリアント結合ドメインは、既存の抗体の抗原結合ドメインのＫ_Ｄよりも高い値である解離定数（Ｋ_Ｄ）を含む。

【0143】

ある特定の実施形態では、既存の抗体の抗原結合ドメインは、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）及び抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、それぞれ、リツキシマブのＶＨ及びＶＬアミノ酸配列、配列番号７及び配列番号８、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体１．５．３のＶＨ及びＶＬアミノ酸配列、配列番号１４及び配列番号１５、イピリムマブのＶＨ及びＶＬアミノ酸配列、配列番号１６及び配列番号１７、トレメリムマブのＶＨ及びＶＬアミノ酸配列、配列番号１８及び配列番号１９、トラスツズマブのＶＨ及びＶＬアミノ酸配列、配列番号２０及び配列番号２１、セツキシマブのＶＨ及びＶＬアミノ酸配列、配列番号２２及び配列番号２３、オクレリズマブのＶＨ及びＶＬアミノ酸配列、配列番号２４及び配列番号２５、オビヌツズマブのＶＨ及びＶＬアミノ酸配列２６及び配列番号２７、ペルツズマブのＶＨ及びＶＬアミノ酸配列、配列番号２８及び配列番号２９、オマリズマブのＶＨ及びＶＬアミノ酸配列、配列番号３０及び配列番号３１、ペムブロリズマブのＶＨ及びＶＬアミノ酸配列、配列番号３２及び配列番号３３、アベルマブのＶＨ及びＶＬアミノ酸配列、配列番号３４及び配列番号３５、アテゾリズマブのＶＨ及びＶＬアミノ酸配列、配列番号３６及び配列番号３７、デュルバルマブのＶＨ及びＶＬアミノ酸配列、配列番号３８及び配列番号３９、またはニボルマブのＶＨ及びＶＬアミノ酸配列、配列番号４０及び配列番号４１を含む。これらの配列を表２に示す。

【0144】

（表２）抗体配列

【0145】

ある特定の実施形態では、既存の抗体の抗原結合ドメインは、それぞれ、リツキシマブのＶＨ及びＶＬアミノ酸配列、配列番号７及び配列番号８を含む抗体重鎖可変領域（ＶＨ）及び抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。本発明者らは、ＣＤ２０タンパク質に結合したリツキシマブＦａｂの既知の結晶構造と併せて、リツキシマブのＶＨ及びＶＬアミノ酸配列のシリコモデリングを行い、ＣＤ２０上のそのエピトープに対する抗原結合ドメインの結合親和性を増加または減少させることが予測される様々なアミノ酸置換を特定した。ＢｉｏＬｕｍｉｎａｔｅ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ）、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｓｕｉｔｅ（ＤＮＡＳＴＡＲ）、Ｉｍｍｕｎｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ＯＭＩＣ Ｔｏｏｌｓ）、Ｂｉｏｖｉａ（Ｄａｓｓａｕｌｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、及びＲｏｓｅｔｔａＡｎｔｉｂｏｄｙ（Ｒｏｓｅｔｔａ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を含むがこれらに限定されない様々なタンパク質モデリング及び予測アルゴリズムを使用して、抗体結合特性を予測することができる。あるいは、既知の抗体のＶＨ及びＶＬ配列は、例えば、アラニンスキャニングを使用する標準的な方法によってショットガン変異誘発に供することができ、得られた抗原結合ドメインは、目的の所定の標的抗原への結合の親和性の低減について試験することができる。

【0146】

ＢｉｏＬｕｍｉｎａｔｅツールを使用して、本発明者は、改変された結合親和性をもたらすことが予測される、Ｎ９３位でリツキシマブ（配列番号８）のＶＬのアミノ酸置換を有するリツキシマブ抗原結合ドメインのいくつかの例示的なバリアントを同定し、構築した。リツキシマブ軽鎖可変領域の位置Ｎ９３におけるいくつかの置換を、結合親和性に対するそれらの予測される効果に従ってランク付けした（Ｎ９３Ｄ＜Ｎ９３Ｅ＜Ｎ９３Ａ＜ＷＴ＜Ｎ９３Ｋ＜Ｎ９３Ｒ）。これらの変異型軽鎖可変領域ＲＴＸ Ｎ９３Ｄ（配列番号９）、ＲＴＸ Ｎ９３Ｅ（配列番号１０）、ＲＴＸ Ｎ９３Ａ（配列番号１１）、ＲＴＸ Ｎ９３Ｋ（配列番号１２）、及びＲＴＸ Ｎ９３Ｒ（配列番号１３）をコードするＤＮＡフラグメントを、以下の実施例に記載されるように合成した。これらのうち、Ｎ９３Ｄ及びＮ９３Ｅ置換を有するバリアント抗原結合ドメインは、予測されるように、野生型リツキシマブ抗原結合ドメインと比較して、ＣＤ２０に対する親和性の低減を示した。バリアント結合ユニット関連抗原結合ドメインを含むＩｇＭ抗体は、高密度でＣＤ２０を発現するＢ細胞株の補体媒介性（ＣＤＣ）殺滅を導くことができるが、低密度でＣＤ２０を発現するＢ細胞株のＣＤＣを導かなかった。バリアント抗原結合ドメインを含むＩｇＧ抗体は、高密度ＣＤ２０発現細胞株に結合できず、高密度または低密度ＣＤ２０発現Ｂ細胞株のいずれかでＣＤＣを誘発することができなかった。

【0147】

ある特定の実施形態において、例えば、より高い及びより低い密度で目的の所定の標的を発現する細胞へのそれらの結合特性について抗原結合ドメインを試験することが所望される場合、様々な細胞株を用いることができる。例えば、ＣＤ２０が目的の所定の標的である場合、高密度及び低密度ＣＤ２０発現細胞株、例えば、Ｂ細胞リンパ腫細胞株が利用可能であり、それらのＣＤ２０発現レベルについて様々な方法によって等級付けすることができ、これらの方法のいくつかは、本明細書の他の場所で提供される。高密度でＣＤ２０を発現する細胞株としては、Ｒａｍｏｓ細胞株、Ｒａｊｉ細胞株、ＤｏＨＨ－２細胞株、ＪｅＫｏ－１細胞株、Ｚ－１３８細胞株、Ｄａｕｄｉ細胞株、Ｇｒａｎｔａ細胞株、またはＤｏＨＨ２細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。より低い密度でＣＤ２０を発現する細胞株としては、ＣＡ４６細胞株、Ｎａｌｍ－１細胞株、Ｔｏｌｅｄｏ細胞株、ＢＪＡＢ細胞株、Ｋａｓｕｍｉ－２細胞株、ＲＰＭＩ８２２６細胞株、ＨＴ細胞株、ＳＵ－ＤＨＬ－８細胞株、ＪＭ１細胞株、Ｎａｍａｌｗａ細胞株、Ｎａｌｍ－６細胞株、またはＺ１３８細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。

【0148】

ある特定の実施形態では、本明細書に提供される多量体抗ＣＤ２０結合分子、例えば、アミノ酸配列番号７を有するＶＨ及びアミノ酸配列番号９もしくは配列番号１０を有するＶＬを含む結合ユニット関連抗原結合ドメインを少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１または１２個含むＩｇＡ、ＩｇＡ様、ＩｇＭ、またはＩｇＭ様抗体は、Ｒａｍｏｓ細胞の補体媒介性殺滅を導くことができ、同じ抗原結合ドメインのうちの２つを含む等量の単一特異性二価ＩｇＧ１抗体は、Ｒａｍｏｓ細胞の検出可能な補体媒介性殺滅を示さない。さらに、ある特定の実施形態では、本明細書に提供される多量体抗ＣＤ２０結合分子、例えば、アミノ酸配列番号７を有するＶＨ及びアミノ酸配列番号９もしくは配列番号１０を有するＶＬを含む結合ユニット関連抗原結合ドメインを少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１または１２個含むＩｇＡ、ＩｇＡ様、ＩｇＭ、またはＩｇＭ様抗体は、がんを有する対象において、補体媒介性（ＣＤＣ）、Ｔ細胞媒介性（結合分子が二重特異性であり、例えば、本明細書の他の箇所に記載されるように、ＣＤ３εに結合する修飾Ｊ鎖を含む場合に）、または補体媒介性とＴ細胞媒介性の両方のＣＤ２０陽性悪性Ｂ細胞殺滅を導くことができるが、がんを有する対象の正常なＢ細胞に最小限の影響を及ぼすか、影響を与えない。ある特定の実施形態では、がんは、高発現ＣＤ２０陽性白血病、リンパ腫、または骨髄腫である。ある特定の実施形態では、対象は、ヒト対象である。

【0149】

本明細書に記載されるものを含むがこれらに限定されない他の既知の治療抗体の親和性の低減したバリアントは、本明細書に記載される方法によって同様に、予測、構築、及び試験することができる。例えば、２つのＣＴＬＡ４抗体、イピリムマブ（ＶＨ：配列番号１６及びＶＬ：配列番号１７）及びトレメリムマブ（ＶＨ：配列番号１８及びＶＬ：配列番号１９）の同様のモデリングは、イピリムマブ及びトレメリムマブの抗原結合ドメインのＦａｂの既知の結晶構造と組み合わせて、ＢｉｏＬｕｍｉｎａｔｅソフトウェアを使用して実施した。モデリングは、以下の置換がこれらの抗原結合ドメインの標的であるＣＴＬＡ４に対する結合親和性を潜在的に低下させるとして、予測した。

【0150】

イピリムマブの場合、ＣＴＬＡ４に対する抗原結合ドメインの結合親和性を低減させると予測されるアミノ酸置換としては、配列番号１６のＦ５０での重鎖置換、例えば、Ｆ５０Ｄ、Ｆ５０Ｎ、Ｆ５０Ｈ、もしくはＦ５０Ｅ、配列番号１６のＳ５２での重鎖置換、例えば、Ｓ５２Ｈ、Ｓ５２Ｄ、Ｓ５２Ｋ、Ｓ５２Ｉ、Ｓ５２Ｔ、Ｓ５２Ｆ、Ｓ５２Ｎ、Ｓ５２Ｗ、もしくはＳ５２Ｙ、配列番号１６のＹ５３での重鎖置換、例えば、Ｙ５３Ｓ、Ｙ５３Ｑ、Ｙ５２Ｋ、Ｙ５３Ｔ、Ｙ５３Ｆ、Ｙ５３Ｎ、Ｙ５３Ｈ、Ｙ５３Ｗ、Ｙ５３Ｖ、Ｙ５３Ｅ、もしくはＹ５３Ｌ、配列番号１６のＮ５６での重鎖置換、例えばＮ５６Ｄ、配列番号１６のＮ５７での重鎖置換、例えばＮ５７Ｄ、Ｎ５７Ｓ、Ｎ５７Ｇ、もしくはＮ５７Ｅ、配列番号１６のＹ５９での重鎖置換、例えばＹ５９Ｈ、Ｙ５９Ｋ、Ｙ５９Ｉ、Ｙ５９Ｆ、Ｙ５９Ｒ、Ｙ５９Ｗ、もしくはＹ５９Ｌ、配列番号１７のＧ９３での軽鎖置換、例えばＧ９３Ｅ、配列番号１７のＳ９５での軽鎖置換、例えばＳ９５Ｈ、Ｓ９５Ｋ、Ｓ９５Ｎ、Ｓ９５Ｇ、もしくはＳ９５Ａ、または配列番号１７のＷ９７での軽鎖置換、例えばＷ９７Ｄ、もしくはＷ９７Ｅが挙げられるが、これらに限定されない。

【0151】

トレメリムマブの場合、ＣＴＬＡ４に対する抗原結合ドメインの結合親和性を低減させると予測されるアミノ酸置換としては、配列番号１８のＷ５２での重鎖置換、例えば、Ｗ５２Ｑ、Ｗ５２Ｇ、Ｗ５２Ｅ、Ｗ５２Ｃ、Ｗ５２Ｄ、Ｗ５２Ｓ、Ｗ５２Ｐ、Ｗ５２Ｈ、Ｗ５２Ｎ、Ｗ５２Ｖ、Ｗ５２Ｔ、もしくはＷ５２Ａ、配列番号１８のＮ５７での重鎖置換、例えば、Ｎ５７Ｄ、配列番号１８のＲ１０１での任意の重鎖置換、配列番号１８のＧ１０２での重鎖置換、例えば、Ｇ１０２Ｑ、Ｇ１０２Ｄ、もしくはＧ１０２Ｆ、配列番号１８のＹ１０６での重鎖置換、例えば、Ｙ１０６Ｇ、Ｙ１０６Ｅ、もしくはＹ１０６Ｄ、配列番号１８のＹ１０７での重鎖置換、例えば、Ｙ１０７Ｑ、Ｙ１０７Ｃ、Ｙ１０７Ｋ、Ｙ１０７Ｐ、Ｙ１０７Ｈ、Ｙ１０７Ｎ、Ｙ１０７Ｖ、Ｙ１０７Ｔ、Ｙ１０７Ａ、もしくはＹ１０７Ｌ、配列番号１８のＹ１１０での重鎖置換、例えば、Ｙ１１０Ｉ、Ｙ１１０Ｑ、Ｙ１１０Ｇ、Ｙ１１０Ｅ、Ｙ１１０Ｃ、Ｙ１１０Ｄ、Ｙ１１０Ｓ、Ｙ１１０Ｋ、Ｙ１１０Ｐ、Ｙ１１０Ｎ、Ｙ１１０Ｈ、Ｙ１１０Ｖ、Ｙ１１０Ｔ、Ｙ１１０Ｗ、もしくはＹ１１０Ａ、配列番号１９のＳ２８での軽鎖置換、例えば、Ｓ２８Ｈ、もしくはＳ２８Ｒ、配列番号１９のＩ２９での軽鎖置換、例えば、Ｉ２９Ｗ、配列番号１９のＮ３０での軽鎖置換、例えば、Ｎ３０Ｉ、Ｎ３０Ｇ、Ｎ３０Ｅ、Ｎ３０Ｃ、Ｎ３０Ｄ、Ｎ３０Ｓ、Ｎ３０Ｋ、Ｎ３０Ｈ、Ｎ３０Ｖ、Ｎ３０Ｔ、Ｎ３０Ｆ、Ｎ３０Ａ、もしくはＮ３０Ｌ、または配列番号１９のＹ３２での軽鎖置換、例えば、Ｙ３２Ｉ、Ｙ３２Ｑ、Ｙ３２Ｃ、Ｙ３２Ｋ、Ｙ３２Ｐ、Ｙ３２Ｈ、Ｙ３２Ｎ、Ｙ３２Ｖ、Ｙ３２Ｔ、もしくはＹ３２Ｌが挙げられるが、これらに限定されない。

【0152】

ある特定の実施形態では、結合分子、例えば、本明細書に提供される抗体の少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、または１２個の抗原結合ドメインは、同一であり、細胞表面上の所定の標的に特異的に結合する。

【0153】

特定の実施形態では、結合分子は、２つの二価ＩｇＡ結合ユニット及びＪ鎖または機能的フラグメントもしくはそのバリアントを含む二量体抗体、例えば、四価ＩｇＡまたはＩｇＡ様抗体であり、各結合ユニットは、例えば、少なくともＣα３ドメイン及びテールピース（ｔｐ）ドメインを含み、例えば、Ｃα３ドメイン及びｔｐドメインならびにＣα１ドメイン、ＩｇＡヒンジ領域、及び／またはＣα２ドメインを含み、それぞれが結合ユニット関連抗原結合ドメイン、例えば本明細書で提供される親和性の低減した抗原結合ドメインと会合する、２つのＩｇＡもしくはＩｇＡ様重鎖定常領域またはその多量体化フラグメントを含む。抗体は、分泌成分、またはそのフラグメントもしくはバリアントをさらに含み得る。

【0154】

特定の実施形態では、結合分子は、それぞれ５個または６個の二価のＩｇＭ結合ユニットを含む、五価または六量体のＩｇＭまたはＩｇＭ様の抗体であり、各結合ユニットは、少なくともＣμ４ドメイン及びｔｐドメイン、例えば、Ｃμ４ドメイン及びｔｐドメインならびにＣμ２ドメイン、Ｃμ１ドメイン、及び／またはＣμ３ドメインを含み、それぞれ、結合ユニット関連抗原結合ドメイン、例えば、本明細書で提供される親和性を低減した抗原結合ドメインと会合する、２つのＩｇＭまたはＩｇＭ様の重鎖定常領域またはその多量体化フラグメントを含む。ある特定の実施形態において、ＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体は、五量体であり、Ｊ鎖、またはその機能的フラグメントもしくはバリアントをさらに含む。ある特定の実施形態では、ＩｇＭまたはＩｇＭ様重鎖定常領域は、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を促進する結合分子の能力を調節、例えば低減または遮断するように修飾することができる。いくつかの実施形態では、ＩｇＭまたはＩｇＭ様重鎖定常領域は、結合分子の血清半減期を増加させるように修飾され得る。

【0155】

ある特定の実施形態では、本明細書に提供される多量体結合分子、例えば、ＩｇＭ、ＩｇＭ様、ＩｇＡ、またはＩｇＡ様抗体は、Ｊ鎖またはその機能的フラグメントもしくはバリアント、例えば、アミノ酸配列番号４２またはその機能的フラグメントもしくはその機能的バリアント、例えば、バリアントＪ鎖（例えば、配列番号４３）を含むＩｇＭ五量体抗体の血清半減期を増加させる、１０２位にアミノ酸置換（Ｙ１０２Ａ）を有する、配列番号４２のバリアントを含むヒトＪ鎖を含む。ある特定の実施形態では、Ｊ鎖またはそのフラグメントは、１つ以上の異種ポリペプチドをさらに含む修飾Ｊ鎖であり、異種ポリペプチドは、例えば、ペプチドリンカーを介して、Ｊ鎖またはそのフラグメントに直接的または間接的に融合される。ある特定の実施形態では、修飾Ｊ鎖は、ＣＤ３εに特異的に結合する修飾ヒトＪ鎖であり、例えば、配列番号４６、配列番号４７、または配列番号５６である。

【0156】

ポリヌクレオチド、ベクター、及び宿主細胞
本開示はさらに、ポリヌクレオチド、例えば、単離された、組換えの、及び／または非天然のポリヌクレオチドであって、本明細書で提供される多量体結合分子、例えばＩｇＭ、ＩｇＭ様、ＩｇＡ、ＩｇＡ様抗体のポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチドを提供する。「ポリペプチドサブユニット」とは、独立に翻訳され得る抗体、結合分子、結合ユニット、または結合ドメインの一部を意味する。例としては、限定されるものではないが、抗体ＶＨ、抗体ＶＬ、一本鎖Ｆｖ、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖定常領域、抗体軽鎖定常領域、Ｊ鎖、分泌成分及び／またはこれらの任意の機能的（例えば、抗原結合及び／または多量体化）フラグメントが挙げられる。

【0157】

本開示はさらに、２つ以上のポリヌクレオチドを含む組成物を提供し、２つ以上のポリヌクレオチドは、本明細書に提供されるような多量体結合分子、例えば、ＩｇＭ、ＩｇＭ様、ＩｇＡ、またはＩｇＡ様抗体を集合的にコードすることができる。ある特定の実施形態では、組成物は、ＩｇＭ、ＩｇＭ様、ＩｇＡ、もしくはＩｇＡ様重鎖もしくはそのフラグメント、例えば、上記のヒトＩｇＭ、ＩｇＭ様、ＩｇＡ、もしくはＩｇＡ様重鎖をコードするポリヌクレオチドであって、ＩｇＭ、ＩｇＭ様、ＩｇＡ、もしくはＩｇＡ様重鎖は、所定の標的、例えば、腫瘍特異的抗原もしくは腫瘍関連抗原に結合する結合ユニット関連抗原結合ドメインのＶＨを少なくとも含み、結合分子、例えば、ＩｇＭ、ＩｇＭ様、ＩｇＡ、もしくはＩｇＡ様抗体は、より低い密度で所定の標的を発現する参照細胞、例えば正常な健康細胞よりもより高い密度で所定の標的を発現する細胞に選択的に結合する、該ポリヌクレオチドと、軽鎖もしくはそのフラグメント、例えばヒトカッパ鎖またはラムダ鎖をコードするポリヌクレオチドであって、例えば、所定の標的、例えば、腫瘍特異的抗原もしくは腫瘍関連抗原に結合する結合ユニット関連抗原結合ドメインの少なくともＶＬを含み、ここで、結合分子、例えば、ＩｇＭ、ＩｇＭ様、ＩｇＡ、もしくはＩｇＡ様抗体は、より低い密度で所定の標的を発現する参照細胞、例えば正常な健康細胞よりもより高い密度で所定の標的抗原を発現する細胞に選択的に結合する、該ポリヌクレオチドとを含むことができる。提供されるポリヌクレオチド組成物はさらに、Ｊ鎖（例えば、ヒトＪ鎖）、またはそのフラグメントもしくはバリアントをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。ある特定の実施形態では、本明細書に提供されるような組成物を構成するポリヌクレオチドは、２つまたは３つの別個のベクター、例えば、発現ベクター上に位置することができる。そのようなベクターは本開示によって提供される。ある特定の態様では、本明細書で提供される組成物を構成するポリヌクレオチドのうちの２つ以上は、単一のベクター、例えば、発現ベクター上に位置してもよい。そのようなベクターは本開示によって提供される。

【0158】

本開示はさらに、本明細書に提供されるような多量体結合分子例えば、ＩｇＭ、ＩｇＭ様、ＩｇＡ、もしくはＩｇＡ様抗体、またはその任意のサブユニットをコードする１つのポリヌクレオチドもしくは２つ以上のポリヌクレオチド、本明細書に提供されるようなポリヌクレオチド組成物、あるいは、本明細書に提供されるような多量体結合分子例えば、ＩｇＭ、ＩｇＭ様、ＩｇＡ、もしくはＩｇＡ様抗体、またはその任意のサブユニットを合わせてコードする１個のベクター、２個、３個、もしくはそれよりも多くのベクターを含む、宿主細胞、例えば、原核または真核宿主細胞を提供する。ある特定の実施形態において、本開示によって提供される宿主細胞は、多量体結合分子、例えば、本明細書に提供されるＩｇＭ、ＩｇＭ様、ＩｇＡ、またはＩｇＡ様抗体、またはそのサブユニットを発現することができる。

【0159】

関連する実施形態において、本開示は、本明細書に提供される多量体結合分子、例えば、ＩｇＭ、ＩｇＭ様、ＩｇＡ、またはＩｇＡ様抗体を産生する方法を提供し、この方法は、上述の宿主細胞を培養し、結合分子、例えば、ＩｇＭ、ＩｇＭ様、ＩｇＡ、またはＩｇＡ様抗体を回収することを含む。

【0160】

使用方法
本開示は、本明細書に提供される多量体結合分子、例えば、ＩｇＭ、ＩｇＭ様、ＩｇＡ、またはＩｇＡ様抗体を使用して、細胞に基づく疾患、例えば、がんを治療するための方法を提供し、結合分子、例えば、ＩｇＭ、ＩｇＭ様、ＩｇＡ、またはＩｇＡ様抗体は、標的抗原を発現し、より低い密度である参照細胞、例えば、正常な健康細胞のものよりもより高い密度で、目的の所定の標的抗原を発現する細胞に選択的に結合する。本開示はさらに、細胞に基づく疾患、例えば、がんを治療するための医薬の調製において、本明細書に提供される多量体結合分子、例えば、ＩｇＭ、ＩｇＭ様、ＩｇＡ、またはＩｇＡ様抗体の使用を提供し、結合分子、例えば、ＩｇＭ、ＩｇＭ様、ＩｇＡ、またはＩｇＡ様抗体は、標的抗原を発現し、より低い密度である参照細胞、例えば、正常な健康細胞のものよりもより高い密度で、目的の所定の標的抗原を発現する細胞に選択的に結合する。本開示はさらに、多量体結合分子、例えば、細胞に基づく疾患、例えば、がんを治療するための本明細書に提供される多量体結合分子、例えば、ＩｇＭ、ＩｇＭ様、ＩｇＡ、またはＩｇＡ様抗体を提供し、結合分子、例えば、ＩｇＭ、ＩｇＭ様、ＩｇＡ、またはＩｇＡ様抗体は、標的抗原を発現し、より低い密度である参照細胞、例えば、正常な健康細胞のものよりもより高い密度で、目的の所定の標的抗原を発現する細胞に選択的に結合する。以下に記載される方法は、疾患を治療するための薬剤の調製における提供される組成物の使用、及び疾患を治療するための提供される組成物に等しく適用される。

【0161】

本明細書に提供される治療方法は、例えば、表２に提供されるＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を含む抗体の親和性低減バリアント、またはその抗原結合バリアント、誘導体、もしくは類似体を含むが、これらに限定されない、本明細書に記載されるもの等の既存の治療抗体に由来する、３以上、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、または１２個の抗原結合ドメイン、例えば親和性を低減した抗原結合ドメインを含む、結合分子、例えば、ＩｇＭ、ＩｇＭ様、ＩｇＡ、またはＩｇＡ様抗体を利用する。ある特定の実施形態では、多量体結合分子、例えば、ＩｇＭ、ＩｇＭ様、ＩｇＡ、またはＩｇＡ様抗体は、より高い密度で所定の標的抗原を発現する細胞、例えば、がん細胞に対して向上した選択性を提供することができる。本開示に基づき、より高い密度で所定の標的抗原を発現する細胞に対する選択性が向上した多量体ＩｇＡまたはＩｇＭベースの結合分子、例えば、ＩｇＭ、ＩｇＭ様、ＩｇＡ、またはＩｇＡ様抗体の構築は、当業者の能力内にある。正常な健康な細胞は免れることができるため、改善された選択性は、例えば、既存の療法と比較して安全性を改善し、副作用を予防することができる。

【0162】

さらに別の実施形態では、本明細書に提供されるがん細胞に対する向上した選択性を有する多量体結合分子、例えば、ＩｇＭ、ＩｇＭ様、ＩｇＡ、またはＩｇＡ様抗体は、がん治療を必要とする対象に有効用量として投与された場合、例えば、腫瘍成長を遅延させ、腫瘍成長を停止させ、または既存の腫瘍のサイズを低減させることによって、がん治療を容易にすることができる。本開示は、治療を必要とする対象に、有効用量の本明細書に提供される多量体結合分子、例えば、ＩｇＭ、ＩｇＭ様、ＩｇＡ、またはＩｇＡ様抗体を投与することを含む、がんを治療する方法を提供する。

【0163】

「がん」、「腫瘍」、「がん性」、及び「悪性」という用語は、典型的には制御されていない細胞成長を特徴とする哺乳類の生理的状態を指すまたは説明する。がんの例としては、限定されるものではないが、腺癌、リンパ腫、芽腫、黒色腫、肉腫、及び白血病を含めた癌腫が挙げられる。

【0164】

提供される方法のある特定の実施形態では、治療されるがんは、固形腫瘍、血液悪性腫瘍、それらの任意の転移、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。ある特定の実施形態では、固形腫瘍は、例えば、肉腫、癌腫、黒色腫、リンパ腫、それらの任意の転移、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。より具体的には、固形腫瘍は、例えば、扁平上皮癌、腺癌、基底細胞癌、腎細胞癌、乳房の腺管癌、軟部組織肉腫、骨肉腫、黒色腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、胃癌、膵臓癌、神経内分泌癌、膠芽腫、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、脳癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜または子宮癌、食道癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、頭頚部癌、これらの任意の転移、またはこれらの任意の組み合わせがあり得る。

【0165】

提供される方法のある特定の実施形態では、治療されるがんは、血液悪性腫瘍またはその転移であり得る。ある特定の実施形態では、血液悪性腫瘍は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、有毛細胞白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、これらの任意の転移、またはこれらの任意の組み合わせがあり得る。

【0166】

ある特定の実施形態では、本明細書で提供する方法は、追加のがん療法、例えば、手術、化学療法、放射線療法、がんワクチン、またはそれらの任意の組み合わせの投与をさらに含むことができる。

【0167】

本開示は、がんの予防または治療を必要とする対象におけるがんの予防または治療方法であって、有効量の多量体結合分子、例えば、本明細書に提供されるＩｇＭ、ＩｇＭ様、ＩｇＡ、またはＩｇＡ様抗体を、結合分子、例えば、抗体、または本明細書に記載のポリヌクレオチド、ベクター、もしくは宿主細胞を含む組成物または製剤を、対象に投与することを含む、方法をさらに提供する。

【0168】

「治療上有効な用量または量」または「有効量」とは、投与されたときに、がん患者の治療に関して正の免疫療法応答をもたらす多量体結合分子、例えばＩｇＭ、ＩｇＭ様、ＩｇＡ、またはＩｇＡ様抗体の量が意図されている。ある特定の実施形態では、治療上有効な用量または量は、がん細胞を殺滅させるが、正常細胞に最小限の影響しか及ぼさないか、または影響を与えない。ある特定の実施形態では、治療有効量は、最小限の副作用を提供する。

【0169】

がん治療のための組成物の有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理的状態、患者がヒトであるか動物であるか、投与される他の薬剤、及び処置が予防的なものであるか治療的なものであるかを含めた、多くの異なる因子に応じて変動する。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳類を含めた非ヒト哺乳類も治療することができる。当業者に知られている通例の方法を用いて治療用量を滴定して、安全性及び有効性を最適化することができる。

【0170】

その最も単純な形態では、対象に投与される調製物は、多量体結合分子、本明細書に提供されるような例えば、ＩｇＭ、ＩｇＭ様、ＩｇＡ、またはＩｇＡ様抗体であり、本明細書の他の箇所に記載されるような医薬賦形剤、担体、または希釈剤と組み合わせることができる従来的な剤形で投与される。

【0171】

医薬組成物及び投与方法
多量体結合分子、例えば本明細書に提供されるようなＩｇＭ、ＩｇＭ様、ＩｇＡ、またはＩｇＡ様抗体を調製する方法及びそれを必要とする対象に投与する方法は、当業者に周知されているか、または本開示を考慮して当業者によって容易に決定される。結合分子、例えば抗体の投与経路は、例えば、腫瘍内、経口、非経口、吸入または局所によるものであり得る。本明細書で使用される非経口という用語には、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸、または膣投与が含まれる。これらの投与形態は好適な形態として企図されているが、別の投与形態の例として、注射用溶液、詳細には腫瘍内、静脈内または動脈内の注射または点滴用の溶液が考えられる。ある特定の実施形態では、結合分子、例えば、本明細書に提供されるＩｇＭ、ＩｇＭ様、ＩｇＡ、またはＩｇＡ様抗体は、腫瘍内、または腫瘍細胞の近傍、例えば、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）内に局所的に導入され得る。好適な医薬組成物は、緩衝液（例えば、酢酸、リン酸、またはクエン酸緩衝液）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、任意選択で安定化剤（例えば、ヒトアルブミン）などを含むことができる。

【0172】

本明細書で考察されるように、多量体結合分子、例えば、本明細書に提供されるＩｇＭ、ＩｇＭ様、ＩｇＡ、またはＩｇＡ様抗体は、がんのインビボ免疫療法治療のために、医薬的に有効な量で投与され得る。開示される結合分子、例えば、ＩｇＭ、ＩｇＭ様、ＩｇＡ、またはＩｇＡ様抗体は、投与を容易にし、活性薬剤の安定性を促進するように製剤化することができる。したがって、医薬組成物は、医薬的に許容される無毒性の無菌担体、例えば、生理食塩水、無毒性緩衝液、保存料などを含むことができる。多量体結合分子、例えば、本明細書に提供されるようなＩｇＭ、ＩｇＭ様、ＩｇＡ、またはＩｇＡ様抗体の医薬有効量は、標的に対する有効な結合を達成し、かつ治療上の有益性を達成するのに十分な量を意味する。特定の態様では、医薬的に有効な量は最小限の副作用を引き起こす。好適な製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ）２２ｄ ｅｄ．（２０１２）に記載されている。

【0173】

単一の剤形を作製するために担体材料と組み合わされ得る多量体結合分子、例えば、ＩｇＭ、ＩｇＭ様、ＩｇＡ、またはＩｇＡ様抗体の量は、例えば、治療される対象及び特定の投与様式に応じて変動する。組成物は、単回用量、複数回用量として、または輸注において確立された期間にわたり、投与することができる。薬用量レジメンも、最適な所望の応答（例えば、治療または予防応答）をもたらすように調整され得る。

【0174】

本開示は、別段の指示がない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、及び免疫学の従来的技法を用い、このような技法は当業者の技能範囲内である。このような技法は、文献内で十分に説明されている。例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｄ．（２０１２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ ｅｄ．；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．（１９９２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ）、Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ａｎｄ Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ，ｅｄｓ．，（１９９５）ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ），Ｖｏｌｕｍｅｓ １－４、Ｇａｉｔ，ｅｄ．（１９９０）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）、Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．米国特許第４，６８３，１９５号、Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）、Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（２０１６）Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，７^ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ （Ｗｉｌｅｙ－Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ）、Ｗｏｏｄｗａｒｄ，Ｊ．，Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ） （１９８５）、Ｐｅｒｂａｌ （１９８８） Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；２ｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．（１９８７）Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｓ．Ｃ．Ｍａｋｒｉｄｅｓ（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５１－１５５（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）、Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）、Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．、及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ）を参照されたい。

【0175】

抗体工学の一般原理は、例えば、Ｓｔｒｏｈｌ，Ｗ．Ｒ．，ａｎｄ Ｌ．Ｍ．Ｓｔｒｏｈｌ（２０１２），Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｗｏｏｄｈｅａｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）に記載されている。タンパク質工学の一般原理は、例えば、Ｐａｒｋ ａｎｄ Ｃｏｃｈｒａｎ，ｅｄｓ．（２００９），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｓｉｇｎ（ＣＤＣ Ｐｒｅｓｓ）に記載されている。免疫学の一般原理は、例えば、Ａｂｂａｓ ａｎｄ Ｌｉｃｈｔｍａｎ（２０１７）Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ９^ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）に記載されている。さらに、当技術分野で知られている免疫学の標準的方法は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ Ｏｎｌｉｎｅ Ｌｉｂｒａｒｙ）、Ｗｉｌｄ，Ｄ．（２０１３），Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ４^ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，ｅｄ．（２０１３），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）、及びＯｓｓｉｐｏｗ ａｎｄ Ｆｉｓｃｈｅｒ，ｅｄｓ．，（２０１４），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）に従うことができる。

【0176】

上で引用されるすべての参照文献、及び本明細書で引用されるすべての参照文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0177】

下記の実施例は、限定するものではなく、例証として提供されている。

【実施例】

【0178】

実施例１：選択性が向上された悪性Ｂ細胞との親和性が変化した抗ＣＤ２０ ＩｇＭ抗体のモデリング、構築、及び発現
抗ＣＤ２０抗体、例えば、リツキシマブは、Ｂ細胞悪性腫瘍、例えば、リンパ腫の治療に広く使用される。残念ながら、ＣＤ２０はまた、正常なＢ細胞上にも広く発現され、抗ＣＤ２０がん療法中に望ましくないＢ細胞枯渇を引き起こす。悪性Ｂ細胞上での抗原発現は、典型的には、正常Ｂ細胞上よりもはるかに高密度である。この実施例は、親和性を低減した抗ＣＤ２０結合ドメインを有するＩｇＭ抗体の構築及び特性評価を示す。ＩｇＭのアビディティーの増加は、より高い密度でＣＤ２０を発現する細胞を選択的に標的とする抗体をもたらす。

【0179】

リツキシマブと比較して親和性が低減したＣＤ２０に特異的に結合することができる五量体または六量体ＩｇＭ抗体を、以下の方法によって作製した。リツキシマブのＶＨ（配列番号７）及びＶＬ（配列番号８）アミノ酸配列を、ＢｉｏＬｕｍｉｎａｔｅ（Ｓｈｒｏｄｉｎｇｅｒ）及びリツキシマブＦａｂ及びＣＤ２０の利用可能な結晶構造を使用してシリコモデリングに供して、結合親和性の低減をもたらすアミノ酸置換を予測した。リツキシマブ軽鎖可変領域の位置Ｎ９３におけるいくつかの置換を、結合親和性に対するそれらの予測される効果に従ってランク付けした（Ｎ９３Ｄ＜Ｎ９３Ｅ＜Ｎ９３Ａ＜ＷＴ＜Ｎ９３Ｋ＜Ｎ９３Ｒ）。これらの変異型軽可変領域ＲＴＸ Ｎ９３Ｄ（配列番号９）、ＲＴＸ Ｎ９３Ｅ（配列番号１０）、ＲＴＸ Ｎ９３Ａ（配列番号１１）、ＲＴＸ Ｎ９３Ｋ（配列番号１２）、及びＲＴＸ Ｎ９３Ｒ（配列番号１３）をコードするＤＮＡフラグメントを、野生型リツキシマブＶＨをＩｇＧ及びＩｇＭ抗体としてコードするコンストラクトとともに、商業的ベンダーによって合成した。

【0180】

これらの抗体コンストラクトを以下に記載のように発現及び精製した。ＩｇＧ及びＩｇＭ分子は、以下のように還元ゲル及び非還元ゲル上で分解された。精製抗ＣＤ２０ＩｇＧ及びＩｇＭ＋野生型Ｊ鎖抗体を、還元及び非還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で分析した。図１Ａは、組み立てられたＩｇＧを分解するための非還元ゲルを示し、図１Ｂは、ＩｇＧ重鎖及び軽鎖を示すための還元ゲルを示し、図１Ｃは、組み立てられたＩｇＭを分解するための非還元ゲルを示し、図１Ｂは、ＩｇＭ重鎖及び軽鎖を示すための還元ゲルを示す。非還元ＩｇＭゲル試料をＮｕＰａｇｅ ＬＤＳ試料緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃ＮＰ０００７）と混合し、ＮａｔｉｖｅＰａｇｅ Ｎｏｖｅｘ ３～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃ＢＮ１００３）にロードした。ＮｏｖｅｘＴｒｉｓ－アセテートＳＤＳ泳動用緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃ＬＡ００４１）をゲル電気泳動に使用し、ゲルをＣｏｌｌｏｉｄａｌ Ｂｌｕｅ Ｓｔａｉｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃ＬＣ６０２５）で染色した。非還元ＩｇＧ試料を試料緩衝液と混合し、８０℃で１０分間加熱し、ＮｕＰａｇｅ Ｎｏｖｅｘ ４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃ＮＰ０３２２）にロードした。ＮｕＰａｇｅ ＭＥＳ ＳＤＳ泳動用緩衝液をゲル電気泳動に使用し、ゲルをＣｏｌｌｏｉｄａｌ Ｂｌｕｅで染色した。還元ゲルの場合、試料を試料緩衝液及びＮｕＰａｇｅ還元剤（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃ＮＰ０００４）と混合し、８０℃で１０分間加熱し、ＮｕＰａｇｅ Ｎｏｖｅｘ４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃ＮＰ０３２２）にロードした。ＮｕＰａｇｅ ＭＥＳ ＳＤＳ泳動用緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃ＮＰ０００２）をゲル電気泳動に使用し、ゲルをＣｏｌｌｏｉｄａｌ Ｂｌｕｅで染色した。

【0181】

タンパク質の発現、精製、及び特性評価
トランスフェクション。ＩｇＧまたはＩｇＭ重鎖、軽鎖、及びＪ鎖ＤＮＡ（ＩｇＭ五量体コンストラクトの場合）を、例えば、Ｅｘｐｉ２９３細胞にトランスフェクトした。発現ベクター用のＤＮＡをエクスピフェクタミン（Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ）と混合した後、細胞に添加した。Ｅｘｐｉ２９３細胞による一過性トランスフェクションは製造業者の推奨に従って実施した。

【0182】

ＩｇＧ発現産物を、例えば、製造業者の推奨に従って、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ親和性マトリックス（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ カタログ番号１７－５４３８－０１）を使用して精製した。

【0183】

Ｊ鎖の有無にかかわらず、ＩｇＭ発現産物は、例えば、Ｃａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ ＩｇＭ親和性マトリックス（ＢＡＣ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号２８９０．０５）を使用して、製造業者の推奨に従って精製した。

【0184】

実施例２：Ｂ細胞株上のＣＤ２０密度の特性評価
様々なＢ細胞株：Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＣＬ－８６）、Ｒａｍｏｓ（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ－１５９６）、ＣＡ４６（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ－１６４８）、ＤＢ（ＡＴＣＣカタログＣＲＬ－２２８９）、ＤｏＨＨ－２（ＤＳＭＺカタログ番号ＡＣＣ－４７）、ＪｅＫｏ－１（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ－３００６）、Ｚ－１３８（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ－３００１）、Ｔｏｌｅｄｏ（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ－２６３１）、ＢＪＡＢ（ＤＳＭＺカタログ番号ＡＣＣ－７５７）、Ｋａｓｕｍｉ－２（ＤＳＭＺカタログ番号ＡＣＣ－５２６）、Ｎａｌｍ－１（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ－１５６７）、ＲＰＭＩ ８２２６（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＣＬ－１５５）、ＨＴ（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ－２２６０）、ＳＵ－ＤＨＬ－８（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ－２９６１）、及びＪＭ１（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ－１０４２３）を、ＱＩＦＩＫｉｔ（ＤＡＫＯ）を使用して、相対的なＣＤ２０表面密度について試験した。非コンジュゲートマウスＣＤ２０抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を、一価結合を可能にするために、２０μｇ／ｍＬでの一次抗体として、飽和点で使用した。ＦＩＴＣコンジュゲートＦ（ａｂ’）２抗体（Ｄａｋｏ）を、１：５０にて二次抗体として使用した。ある範囲の規定量の一次Ｍａｂと結合したキャリブレーションビーズの５集団（Ｄａｋｏ）を混合し、細胞と同じ方法で染色し、標準曲線として設定した。標準的な操作手順を使用したＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を利用して、細胞表面抗原を測定した。ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）を使用して、各試料からＭＦＩ（平均蛍光強度）を計算した。Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して、各細胞株の標準曲線から抗原密度を内挿した。細胞当たりの分子におけるＡｂ結合能（ＡＢＣ）として表される抗原密度を計算した。最後に、表３における「抗原密度」は、ＡＢＣからアイソタイプ対照のバックグラウンドＡｂ当量を差し引くことによって決定される特異的ＡＢＣ（ｓＡＢＣ）として表される。

【0185】

細胞株はまた、以下の方法により、ＦＡＣＳ分析によってＣＤ２０密度についても試験した。細胞を洗浄し、０．４８×１０^６細胞／ｍＬの密度でＦＡＣＳ染色緩衝液（ＦＳＢ、ＢＤカタログ番号５５４６５６）中に再懸濁し、２５μＬ／ウェルをＶ底９６ウェルプレートに添加した。各ウェルについて、５μＬのＣＤ２０抗体（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８コンジュゲート、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号３０２３１６、濃度２００μｇ／ｍＬ）及び２０μＬのＣＤ１９（ＰＥコンジュゲート、ＢＤカタログ番号５５５４１３、濃度０．０１５μｇ／２０μＬ）を添加した。アイソタイプ対照については、５μＬのマウスＩｇＧ２ｂ抗体（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８コンジュゲート、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号４００３２９）及び２０μＬのマウスＩｇＧ１抗体（ＰＥコンジュゲート、ＢＤカタログ番号５５５７４９）を添加した。プレートを暗所及び氷上で３０分間インキュベートした。プレートを２００μＬのＦＡＣＳ染色緩衝液で２回洗浄した。細胞を５０μＬの固定緩衝液（ＰＢＳ中で１：８希釈したＢＤカタログ番号５５４６５５）で一晩固定した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒサイトメーターでデータを得て、その後、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を使用して解析した。

【0186】

様々な細胞株を、補体依存性細胞傷害性を介して１０％正常ヒト血清中で殺滅させる能力についても、以下の方法によって試験した。Ｂ細胞株を、（各細胞株に応じて）１０～２０％の熱不活性化ウシ胎仔血清（ＨＩ－ＦＢＳ）を含有するＲＰＭＩ完全培地（ＲＰＭＩ－Ｃ；ＲＰＭＩ１６４０培地、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１倍のＭＥＭ非必須アミノ酸、１倍のＧｌｕｔａＭＡＸ）での培養で、３７℃、５％のＣＯ_２インキュベーター内で維持した。細胞密度を０．２～２．０×１０^６個の細胞／ｍＬに維持するために、必要に応じて２～３日ごとに細胞を分割した。約５．０×１０^６個の細胞を遠心分離によって回収し、５．０ｍＬのＲＰＭＩ－Ｃ中に再懸濁した（１．０×１０^６個の細胞／ｍＬ）。精製した抗ＣＤ２０ＩｇＧ抗体（リツキシマブ）をＲＰＭＩ－Ｃ、１０％ＨＩ ＦＢＳで３０μｇ／ｍＬに希釈し、次いで非組織培養処理９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ ３５１１７７）中でＲＰＭＩ－Ｃ、１０％ＨＩ ＦＢＳ中で３倍に段階希釈した。１０μＬの細胞（１０，０００個の細胞／ウェル）、及び１０μＬの段階希釈したＡｂを３８４ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ １６４６１０）中で合わせ、３７℃で２時間、５％ＣＯ_２インキュベーター内でインキュベートした。正常なヒト血清補体（Ｑｕｉｄｅｌ Ａ１１３）をＲＰＭＩ－Ｃ、１０％ＨＩ ＦＢＳ（１．５ｍＬ：３．５ｍＬ）で３０％に希釈し、次いで（１０μＬ／ウェル ３０％ＮＨＳまたはＲＰＭＩ－Ｃ、１０％ＨＩ ＦＢＳ）を各ウェルに添加し、５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃で４時間インキュベートした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｇ７５７２）（１０μＬ／ウェル）を各ウェルに加え、プレートシェーカーで２分間、次いで室温で１０分間混合し、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＥｎＶｉｓｉｏｎ２１０４で発光を読み取った。

【0187】

結果を表３に示す。細胞上の相対的なＣＤ２０抗原密度は、ＭＦＩ及びＣＤＣによって殺滅させる細胞の能力と相関した。

【0188】

（表３）様々なＢ細胞株のＣＤ２０抗原密度

【0189】

実施例３：Ｒａｍｏｓ細胞に対するＩｇＧ及びＩｇＭ抗ＣＤ２０変異体の結合活性
実施例１で作製した様々なＩｇＧ及びＩｇＭ抗ＣＤ２０変異体ＩｇＧ及びＩｇＭ抗体の、Ｒａｍｏｓ細胞に対する結合親和性を、以下の方法によるフローサイトメトリーによって測定した。Ｒａｍｏｓ細胞を、３７℃で５％ＣＯ_２インキュベーター内での１０％ＨＩ－胎児ウシ血清を含有するＲＰＭＩ完全培地（ＲＰＭＩ－Ｃ；ＲＰＭＩ１６４０培地、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１倍のＭＥＭ非必須アミノ酸、１倍のＧｌｕｔａＭＡＸ）での培養で維持した。細胞密度を０．２～２．０×１０^６個の細胞／ｍＬに維持するために、必要に応じて２～３日ごとに細胞を分割した。約２×１０^６個の細胞を遠心分離によって回収し、４．０ｍＬのＦＡＣＳ染色緩衝液（ＦＳＢ、ＢＤ５５４６５６；０．５×１０^６個の細胞／ｍＬ）中に再懸濁した。実施例１に記載されるように調製した精製ＩｇＧまたはＩｇＭ抗体を、２０μｇ／ｍＬのＦＢＳに希釈し、次いで、非ＴＣ処理９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ ３５１１７７）中でＦＳＢで３倍に段階希釈した。細胞（２５μＬ、１２，５００細胞／ウェル）及び段階希釈した抗体試料（２５μＬ）を９６ウェルのＶ底プレート（Ｓａｒｓｔｅｄｔ ８２．１５８３．００１）中で合わせ、５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃で２時間インキュベートした。細胞を２００μＬの冷ＦＳＢで２回洗浄し、５０μＬのマウス抗ヒトカッパ抗体ＡＦ６４７に１μｇ／ｍＬで再懸濁した（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ３１６５１４、クローンＭＨＫ－４９、５０μｇ／ｍＬ；１００μＬの抗体：５ｍＬのＦＳＢ）。抗体細胞混合物を暗所で氷上で３０分間インキュベートした。細胞を再び洗浄し、次いで８０μＬのＦＳＢ（未染色細胞）または８０μＬの１％ ７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ、ＢＤ ５１－８８８８１Ｅ、ＦＳＢ中１：１００）（染色細胞）中に再懸濁し、混合物をミニチューブ（Ｎｏｖａ ３２０２２）に移した。標準設定を使用してＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒで蛍光染色データを取得し、ＦｌｏＪｏ１０で解析した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）値をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにインポートし、得られた曲線適合からＥＣ５０またはＫ_Ｄ値を計算した。

【0190】

結果を図２Ａ（ＩｇＧ）及び図２Ｂ（ＩｇＭ＋Ｊ）、ならびに表４及び５に示す。Ｎ９３Ｄ及びＮ９３Ｅ変異体は、ＩｇＧとしてＲａｍｏｓに対して測定可能な親和性を有さず、ｗｔリツキシマブ（２つの異なるバッチに対して０．１６ｎＭまたは０．１９ｎＭ）と比較した場合に、ＩｇＭとして約１０倍高いＥＣ５０（それぞれ、２．８ｎＭ及び１．９ｎＭ）を示した。

【0191】

（表４）ＩｇＧ抗体に対するＥＣ５０値

【0192】

（表５）ＩｇＭ抗体に対するＥＣ５０値

【0193】

Ｎ９３Ｄ及びＮ９３Ｅ変異体は、野生型リツキシマブとは対照的に、Ｒａｍｏｓ細胞上のＣＤ２０に対する親和性の低減を示した。実際、Ｎ９３Ｄ及びＮ９３Ｅ変異体は、ＩｇＧとして、Ｒａｍｏｓ上に測定可能な親和性を有しなかった。ＩｇＭとして、２つの変異体は、ＩｇＭとして野生型リツキシマブよりも約１０倍高いＥＣ５０を有した。

【0194】

実施例４：Ｒａｍｏｓ及びＣＡ４６細胞に対するＩｇＧ及びＩｇＭ抗ＣＤ２０変異体のＣＤＣ活性
実施例１で作製したＩｇＧ及びＩｇＭの改変親和性変異体の、２つのＢ細胞株に対する補体依存性細胞傷害性を促進する能力を、以下の方法によって評価した。実施例２に示されるように、ＣＤ２０密度が異なる２つのＢ細胞株、Ｒａｍｏｓ（より高い密度のＣＤ２０）及びＣＡ４６（中～低密度のＣＤ２０）を、（各細胞株に応じて）１０～２０％の熱不活性化ウシ胎仔血清（ＨＩ－ＦＢＳ）を含有するＲＰＭＩ完全培地（ＲＰＭＩ－Ｃ；ＲＰＭＩ１６４０培地、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１倍のＭＥＭの非必須アミノ酸、１倍のＧｌｕｔａＭＡＸ）での培養で３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で維持した。必要に応じて２～３日ごとに分割して、細胞密度を０．２～２．０×１０^６個の細胞／ｍＬの間に維持する。細胞密度を０．２～２．０×１０^６個の細胞／ｍＬに維持するために、必要に応じて２～３日ごとに細胞を分割した。約５．０×１０^６個の細胞を遠心分離によって回収し、５．０ｍＬのＲＰＭＩ－Ｃ中に再懸濁した（１．０×１０^６個の細胞／ｍＬ）。実施例１に記載されるように調製した精製された抗ＣＤ２０ ＩｇＭ及びＩｇＧ抗体を、ＲＰＭＩ－Ｃ、１０％ＨＩ ＦＢＳで３０μｇ／ｍＬ（ＩｇＧ）または３μｇ／ｍＬ（ＩｇＭ）に希釈し、次いで、非組織培養処理９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ ３５１１７７）中で、ＲＰＭＩ－Ｃ、１０％ＨＩ ＦＢＳで３倍に段階希釈した。細胞試料（１０μＬ、約１０，０００細胞／ウェル）を、３８４ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ １６４６１０）中で１０μＬの段階希釈した抗体試料と合わせ、５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃で２時間インキュベートした。正常ヒト血清補体（Ｑｕｉｄｅｌ Ａ１１３）をＲＰＭＩ－Ｃ、１０％ＨＩ ＦＢＳ（１．５ｍＬ：３．５ｍＬ）で３０％に希釈し、１０μＬの３０％ＮＨＳまたはＲＰＭＩ－Ｃ、１０％ＨＩ ＦＢＳを各ウェルに添加した。プレートを５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃で４時間インキュベートした。Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬（１０μＬ、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｇ７５７２）を各ウェルに添加し、プレートシェーカー上で２分間混合し、次いで室温で１０分間インキュベートした。発光をＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＥｎＶｉｓｉｏｎ ２１０４で読み取った。生データをエクセルのデータにインポートし、すべての値からバックグラウンドを減算した（培地＋Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ、細胞なし、からのシグナル）。データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍに転送した。Ｙ値は、１００％細胞生存率が抗体の非存在下でインキュベートされた細胞の平均最大値として定義されるように正規化された。抗体濃度（ｎＭ）を、Ｘ＝ｌｏｇ（Ｘ）を使用して変換し、次いで、可変傾斜４パラメータロジスティックフィット［アゴニスト対ｌｏｇ（Ｘ）］を使用して、曲線へのデータに適合させた。ＥＣ５０値を、得られた曲線適合から計算した。

【0195】

結果を図３Ａ～Ｄに示す。より高いＣＤ２０密度のＲａｍｏｓ細胞において、Ｎ９３Ｄ及びＮ９３Ｅ変異体は、ＩｇＧとしてＣＤＣ活性を全く示さなかったが（図３Ａ）、ＩｇＭのアビディティーの増加を考慮すると、低親和性のＮ９３Ｄ及びＮ９３Ｅ変異体は、高アビディティーＩｇＭとして測定可能なＣＤＣ活性（約０．１～１０ｎＭのＥＣ５０）を示した（図３Ｂ）。対照的に、より低いＣＤ２０密度のＣＡ４６細胞では、Ｎ９３Ｄ及びＮ９３Ｅ変異体のＩｇＧ（図３Ｃ）及びＩｇＭバージョン（図３Ｄ）はいずれも、測定可能なＣＤＣ活性を示さなかった。

【0196】

実施例５：Ｒａｍｏｓ及びＣＡ４６細胞に対するＩｇＭ抗ＣＤ２０変異体のＴＤＣＣ活性
実施例１で作製したＩｇＭの改変親和性変異体の、２つのＢ細胞株、及び健常なドナー由来の正常なＢ細胞に対する、Ｔ細胞依存性細胞傷害性（ＴＤＣＣ）を促進する能力を、以下の方法によって評価した。

【0197】

実験の１日前に、ＣＤ８＋ Ｔ細胞（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ８４３００）を解凍し、１０％の熱不活化ウシ胎仔血清（ＨＩ－ＦＢＳ）を含有するＲＰＭＩ完全培地（ＲＰＭＩ－Ｃ；ＲＰＭＩ１６４０培地、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１倍ＭＥＭ非必須アミノ酸、１倍ＧｌｕｔａＭＡＸ）に約１．０～２．０×１０^６個の細胞／ｍＬの細胞密度で再懸濁し、次いで、５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃で一晩静置した。実験当日、Ｔ細胞を、ＲＰＭＩ－Ｃ、１０％ＨＩ－ＦＢＳで約１．０×１０^６個の細胞／ｍＬの密度に調整した。実施例２に示されるように、ＣＤ２０密度が異なる２つのＢ細胞株、Ｒａｍｏｓ（より高い密度のＣＤ２０）及びＣＡ４６（中～低密度のＣＤ２０）を、（各細胞株に応じて）１０～２０％のＨＩ－ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ－Ｃでの培養で、５％のＣＯ_２インキュベーター内で３７℃で維持した。細胞密度を０．２～２．０×１０^６個の細胞／ｍＬに維持するために、必要に応じて２～３日ごとに細胞を分割した。

【0198】

健常なドナーからの約１．０×１０^６個のＢ細胞を遠心分離によって回収し、１．０ｍＬのＲＰＭＩ－Ｃ、１０％ＨＩ－ＦＢＳ中に再懸濁した（１．０×１０６個の細胞／ｍＬ）。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｏｒｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ４８８（ＬｉｆｅＴｅｃｈ ３４５５０）を２～５μＭの最終濃度に添加し、続いて５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃で約３０分間インキュベーションすることによって、細胞を蛍光標識した。標識細胞を１０ｍＬのＲＰＭＩ－Ｃで２回洗浄して過剰な標識を除去し、ＲＰＭＩ－Ｃ中に約１．０×１０^５個の細胞／ｍＬの最終密度で再懸濁した。蛍光顕微鏡で細胞を調べることによって、蛍光標識を確認した。

【0199】

実施例１に記載されるように調製したＣＤ３εに特異的に結合する修飾Ｊ鎖（Ｊ鎖アミノ酸配列番号４６）を含む精製された二重特異性抗ＣＤ２０ ＩｇＭ抗体を、ＲＰＭＩ－Ｃ、１０％ＨＩ ＦＢＳで２μｇ／ｍＬ（野生型）または２０μｇ／ｍＬ（バリアント）に希釈し、次に、非ＴＣ処理９６ウェルＵ底プレート（Ｆａｌｃｏｎ ３５１１７７）中でＲＰＭＩ－Ｃ、１０％ＨＩ ＦＢＳで３倍に段階希釈した。蛍光標識Ｂ細胞（５０μＬ、約５，０００細胞／ウェル）を、９６ウェルＵ底プレート（Ｆａｌｃｏｎ３５１１７７）中で５０μＬの段階希釈した抗体試料及びＣＤ８＋ Ｔ細胞（５０μＬ、約５０，０００細胞／ウェル）と合わせ、５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃でインキュベートした。約４８時間後、５μＬ／ウェルのＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃ３６９５０）を添加し、細胞を２００μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液（ＦＢＳ；ＢＤ ５５４６５６）で１回洗浄し、次いで１％ ７－ＡＡＤ（ＢＤ ５１－８８８８１Ｅ）を含有する約６０μＬ／ウェルのＦＢＳに再懸濁した。細胞－ビーズ混合物を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ）を用いてフローサイトメトリーによって分析し、データをリストモードで保存した。データを、ソフトウェアプログラムＦｌｏｗＪｏ、バージョン１０（ＢＤ）を使用して解析した。Ｂ細胞を、ＦＬ１（緑色）チャネル内の側方散乱（ＳＳＣ）対蛍光でゲーティングし、生Ｂ細胞を、ＦＬ４（赤色）チャネル内のＦＬ１蛍光対非蛍光でゲーティングした。カウンティングビーズを、ＳＳＣ対ＦＬ１蛍光でゲーティングした。生Ｂ細胞／ウェルの数を、カウンティングビーズを使用する洗浄による損失について正規化した。溶解パーセントは、処理試料中の正規化された生細胞の数／ウェルを未処理試料中の平均正規化された生細胞の数／ウェルから割ることによって算出し、得られた比率を１から差し引き、結果に１００を乗じることにより算出した。データを、ソフトウェアプログラムＰｒｉｓｍ、ｖｅｒｓｉｏｎ７（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用してさらに解析した。抗体濃度（ｐＭ）を、Ｘ＝ｌｏｇ（Ｘ）を使用して変換し、可変傾斜４パラメータロジスティックフィット［アゴニスト対ログ（Ｘ）］を使用して曲線に適合させた。ＥＣ５０値を曲線適合から計算した。

【0200】

結果を、図４Ａ～４Ｃ、及び表６に示す。

【0201】

（表６）ＩｇＭ抗ＣＤ２０親和性が低減した変異体のＴＤＣＣ活性

【0202】

より高いＣＤ２０密度のＲａｍｏｓ細胞では、Ｎ９３Ｄ及びＮ９３Ｅ ＩｇＭ変異体は、高アビディティーＩｇＭとして測定可能なＴＤＣＣ活性（約０．１～０．７ｎＭのＥＣ５０）を示した（図４Ｃ）。対照的に、より低いＣＤ２０密度のＣＡ４６細胞では、Ｎ９３Ｄ及びＮ９３Ｅ ＩｇＭ変異体は、測定可能なＴＤＣＣ活性を示さなかった（図４Ａ）。Ｎ９３Ｅ変異体は、０．１４ｎＭの中程度のＥＣ５０で正常な健常なＢ細胞の最大２７％を殺滅させ、Ｎ９３Ｄ変異体は、目立ったＴＤＣＣ活性を示さなかった（図４Ｂ）。

【0203】

本開示の広がり及び範囲は、上述の例示的な実施形態のいずれによっても限定されるべきではなく、以下の特許請求の範囲及びそれらの均等物に従ってのみ定義されるべきである。

【0204】

（表７）追加配列

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【配列表】

2022549186000001.app

【国際調査報告】