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特表2022-549215細胞の原形質膜の透過性を増加させる方法およびそのような方法における使用に適した構造体
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-11-24
(54)【発明の名称】細胞の原形質膜の透過性を増加させる方法およびそのような方法における使用に適した構造体
(51)【国際特許分類】
C12N 13/00 20060101AFI20221116BHJP
C12M 1/42 20060101ALI20221116BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20221116BHJP
C12M 3/00 20060101ALI20221116BHJP
C12N 5/071 20100101ALN20221116BHJP
【ＦＩ】
C12N13/00
C12M1/42
C12M1/00 A
C12M3/00 Z
C12N5/071
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022517857
(86)(22)【出願日】2020-09-21
(85)【翻訳文提出日】2022-05-10
(86)【国際出願番号】 EP2020076287
(87)【国際公開番号】W WO2021058430
(87)【国際公開日】2021-04-01
(31)【優先権主張番号】19198937.5
(32)【優先日】2019-09-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522108677
【氏名又は名称】トリンス ビーブイ
【氏名又は名称原語表記】ＴＲＩＮＣＥ ＢＶ
(74)【代理人】
【識別番号】100147485
【弁理士】
【氏名又は名称】杉村 憲司
(74)【代理人】
【識別番号】230118913
【弁護士】
【氏名又は名称】杉村 光嗣
(74)【代理人】
【識別番号】100225060
【弁理士】
【氏名又は名称】屋代 直樹
(72)【発明者】
【氏名】ケヴィン ブレックマンズ
(72)【発明者】
【氏名】ランホア ション
(72)【発明者】
【氏名】ステファーン ドゥ スメ
【テーマコード（参考）】
4B029
4B033
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B029AA02
4B029AA27
4B029BB11
4B029CC01
4B029GA08
4B029GB10
4B033NG05
4B033NH07
4B033NJ03
4B033NK06
4B033NK10
4B065AA93X
4B065AC20
4B065BA30
4B065BC48
4B065BC50
4B065CA44
4B065CA46
(57)【要約】
本発明は、電磁放射を吸収することができる粒子を含む構造体の上またはその構造体の近くに少なくとも１つの細胞を導入することによって、細胞の原形質膜の透過性を増加させる方法に関する。粒子は、０．００１体積％～２０体積％の範囲の濃度で存在し、構造体の材料に包埋されている。少なくとも６０パーセントの粒子は、これら粒子と構造体の自由エリア表面Ｓとの間の最短距離Ｌが１ｎｍ～５００ｎｍの範囲であるように、材料に包埋されている。本発明はさらに、細胞を透過性にするための光熱プロセスでの使用に適した構造体、およびそのような構造体の使用に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞の原形質膜の透過性を増加させる方法であって、材料と、前記材料に包埋された、電磁放射を吸収することができる平均球相当径ｄを有する粒子と、を含む構造体を提供するステップであって、前記構造体は、体積Ｖおよび自由エリア表面Ｓを画定し、前記粒子は、０．００１体積％～２０体積％（体積粒子／体積構造）の範囲の濃度で前記構造体内に存在し、前記構造体内に存在する前記粒子の少なくともＰパーセントは、前記粒子の前記Ｐパーセントと前記構造体の前記自由エリア表面Ｓとの間の最短距離Ｌが１ｎｍ～５００ｎｍの範囲であるように前記材料に包埋されており、前記Ｐは少なくとも６０パーセントである、提供するステップと、
前記構造体の上または前記構造体から１００μｍ未満の距離に、少なくとも１つの細胞を導入するステップと、
前記構造体に電磁放射を照射するステップと、を含む、方法。
【請求項2】
前記粒子が、０．０１体積％～５体積％の範囲の濃度で前記構造体中に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記構造体の前記自由エリア表面Ｓから最短距離Ｌ（Ｌは５ｎｍ～５００ｎｍの範囲である）に位置する粒子の表面密度が、１０-４μｍ-２～１／ｄ２の範囲であり、前記粒子の表面密度は、前記構造体に存在する粒子の数Ｎに、前記自由エリア表面Ｓから前記最短距離Ｌに位置する前記粒子の前記パーセントＰを掛け、前記構造の前記自由エリア表面の面積で割ったもの（Ｎ×Ｐ／Ｓ）と定義される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記粒子の少なくとも９５％が、前記構造体の前記自由エリア表面に露出されていない、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記粒子が、金属粒子、金属酸化物粒子、炭素もしくは炭素ベースの粒子、ならびに１つ以上の光吸収化合物を含む粒子、および１つ以上の光吸収化合物を取り込んだもしくは１つ以上の光吸収化合物で官能化された粒子からなる群から選択される粒子を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記材料が、無機材料もしくは無機ベースの材料、セラミックもしくはセラミックベースの材料、有機材料もしくは有機ベースの材料、または該材料のうち少なくとも１つを含む複合材料を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記材料が、１つの材料または１つの表面修飾された材料を含み、該材料は、ポリスチレン、ポリカプロラクトン、エチルセルロース、セルロースアセトフタレート、ポリ乳酸、ポリ乳酸－ｃｏ－グリコール酸、セルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、コラーゲン、シルク、アルギン酸塩、ヒアルロン酸、デキストラン、デンプン、ポリカーボネートおよびポリアクリレートからなる群から選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記構造体が、多孔質構造または非多孔質構造を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記構造体が、少なくとも５０％の多孔率を有する多孔質構造を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記多孔質構造が、繊維、粒子状物質、繊維と粒子状物質との組み合わせ、または発泡体を含み、前記粒子は、前記繊維、前記粒子状物質、または前記発泡体に包埋されている、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記照射が、１ｆｓ～１μｓの範囲の持続時間を有するパルスを有し、および／または０．００１～１０Ｊ／ｃｍ２の範囲のパルスあたりのフルエンスを有するパルス放射源による照射を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
構造体の上または該構造体の近くに導入される細胞を透過性にするための光熱プロセスでの使用に適した構造体であって、材料と、該材料に包埋された、電磁放射を吸収することができる平均球相当径ｄを有する粒子と、を含み、かつ、体積Ｖおよび自由エリア表面Ｓを画定し、前記粒子は、０．００１体積％～２０体積％（体積粒子／体積構造）の範囲の濃度で前記構造体内に存在し、前記構造体内に存在する前記粒子の少なくともＰパーセントは、前記粒子の前記Ｐパーセントと前記構造体の前記自由エリア表面Ｓとの間の最短距離Ｌが１ｎｍ～５００ｎｍの範囲であるように前記材料に包埋されており、前記Ｐは少なくとも６０パーセントである、構造体。
【請求項13】
薬物スクリーニング、細胞治療、免疫療法、遺伝子療法、細胞標識、操作された細胞の製造、およびタンパク質干渉研究における、請求項１２に記載の構造体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、包埋された粒子を含む構造体の上または該構造体の近くに細胞を導入し、この構造体を照射することによって、細胞の原形質膜の透過性を増加させる方法に関する。本発明による方法は、粒子と細胞との間の接触を必要としない。本発明はさらに、細胞の原形質膜の透過性を増加させる方法に適した構造体に関する。
【背景技術】
【0002】
細胞内への外因性化合物の細胞内送達は、多くの生物工学的および生物医学的用途における一般的な要求事項である。例としては、基礎研究のための変異細胞系の作製、バイオ医薬品化合物の薬物スクリーニング、および細胞ベースの免疫療法のための細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞など）の製造がある。特定の用途に関わらず、共通の課題は細胞膜を克服することであり、これは、特にＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質などの高分子にとって大きな障害となっている。近年、この分野では、細胞毒性を最小限に抑えながら、分子、特に高分子を送達するのに可能な限り効率的にすべき新たな物理的トランスフェクション法に関する研究が著しく増加してきている。
【0003】
細胞内に化合物を送達するための物理的方法は、かなりの関心を集めている。そのような方法は、細胞膜の透過性を増加させて、化合物が細胞膜を通過することを可能にするという共通点を有する。
【0004】
ナノ粒子（ＮＰｓ）増感光穿孔法（Nanoparticle (NPs) sensitized photoporation）は、化合物を細胞内に送達するための今後有望な物理的方法である。光穿孔法では、細胞膜はレーザー照射および光応答性ナノ粒子の組み合わせによって一時的に透過性になる。細胞は、初めに、細胞膜に吸着できるナノ粒子、通常は金粒子、酸化鉄粒子、または炭素粒子とともにインキュベートされる。次に、局所加熱、圧力波の誘導、または活性酸素種の生成などの光熱的または光化学的効果によって細胞膜が透過性になるように、レーザー照射が印加される。
【0005】
光穿孔法は、例えば細胞治療用に操作された細胞を製造するための有望な技術であるが、ナノ粒子を細胞と接触させることについての一般的な安全上の懸念がある。実際に、一般的にナノ粒子の潜在的な毒物学的影響についてはかなりの不確実性がある。さらに、金ナノ粒子などのプラズモンナノ粒子は、光穿孔法で使用される強力なレーザー照明に対して、より小さな断片に断片化する傾向がある。報告されたところによると、ナノメートルサイズの金粒子は、細胞内に取り込まれると遺伝子毒性を示す可能性がある。光穿孔法が、プラズモンナノ粒子と細胞との間の密接な接触を必要とすることを考慮すると、例えば細胞治療で使用される細胞をトランスフェクトするために光穿孔法を使用することはナノ毒性の懸念があり得る。
【0006】
したがって、光穿孔法中にプラズモンナノ粒子が細胞と直接接触するのを回避する方法を開発することが現在の関心事である。
【0007】
ＵＳ９，９５７，４７６は、プラズモンナノ粒子を使用することによる細胞の穿孔システムを記載している。上記システムは、レーザーを使用して光トラップを作製してナノ粒子を細胞の近くに位置付け、光トラップされた粒子に向けられたレーザーを使用して、光トラップされた粒子のレーザー誘起破壊を引き起こすことにより、細胞の穿孔を引き起こす。ただし、システムのスループットは制限されており、かなりの数の細胞を処理するためのスケールアップができない。結果として、上記システムは、細胞治療のための多数の操作された細胞の製造には不向きである。
【0008】
ＵＳ９，１３９，４１６は、マイクロチャネルの壁にナノワイヤが備えられた該マイクロチャネルを有する基板を含むマイクロ流体デバイスを記載している。細胞がチャネルを流れる間にレーザー光を照射すると、細胞を光穿孔することができる。ただし、上記デバイスでは、特に様々な細胞タイプを扱う場合において、システムのパフォーマンスを最大化する必要性が生じるため、プラズモン構造と細胞との間の距離を調整することができない。さらに、上記デバイスはナノワイヤの損傷に煩わされるため、有効寿命が限られている。
【0009】
ＥＰ２２７２９４５は、金の層などの薄い金属層でコーティングされた表面構造を備えた基板の表面またはその近くに細胞を配置し、基板の表面にレーザーパルスを照射することによって細胞を穿孔する方法を記載している。そのような方法は、細胞膜が片側で、すなわち細胞が基板の表面構造と接触している側（細胞の下側）で透過性である一方で、細胞内に送達される必要のある化合物が主に反対側（細胞の上側）に存在してしまうという欠点を有する。このことは、分子が細胞に入ることができる効率、特に大きな分子が細胞に入ることができる効率を制限する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明の目的は、当技術分野で知られている方法の欠点を回避する、細胞の原形質膜の透過性を増加させる方法を提供することである。
【0011】
本発明の別の目的は、光熱プロセスによって、特に、例えばレーザー放射などの電磁放射による照射によって、細胞の透過性を増加させる方法を提供することである。
【0012】
本発明の別の目的は、構造内に包埋された粒子を含む構造体を使用して、該構造体の上または該構造体の近くに細胞を導入しかつ該構造体に電磁放射を照射することによって、細胞の原形質膜の透過性を増加させる方法を提供することである。
【0013】
本発明のさらなる目的は、粒子、例えばナノ粒子またはそれらの構成要素への細胞の直接的な露出が制限されるか、または回避さえされる、細胞の透過性を増加させる方法を提供することである。
【0014】
本発明のさらなる目的は、パルスレーザー放射、例えばナノ秒パルス放射を使用することによって細胞の透過性を増加させる方法を提供することである。
【0015】
さらには、細胞不透過性物質の細胞内送達、特には高分子の細胞内送達のために効率を増強させた細胞の透過性を増加させる方法を提供することを目的とする。
【0016】
細胞の原形質膜の透過性を増加させるためにナノ粒子などの電磁放射を吸収することができる粒子を含む構造であって、該粒子およびそれらの構成要素が、レーザー活性化時に構造内にほとんど、好ましくは完全に保持される構造体を提供することも目的とする。
【0017】
さらに、薬物スクリーニング、細胞治療、免疫療法、遺伝子療法、細胞標識、および操作された細胞の製造に使用するのに適した細胞の透過性を増加させる方法を提供することを目的とする。
【0018】
本発明の目的は、光熱プロセスで使用するのに適した構造体であって、該構造体の上または該構造体の近くに導入された細胞を透過性にする構造体を提供することである。
【0019】
本発明のさらなる目的は、細胞の透過性を繰り返し増加させるために、レーザー照射によって複数回活性化することができる構造体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0020】
本発明の第１の態様によれば、細胞の原形質膜の透過性を増加させる方法が提供される。該方法は、
材料を含み、電磁放射を吸収することができる粒子を含む構造体を提供するステップを含む。ここで、該粒子は平均球相当径ｄを有し、該材料に包埋されている。該構造体は、体積Ｖおよび自由エリア表面（free area surface）Ｓを画定する。該粒子は、０．００１体積％～２０体積％の範囲の濃度で構造体内に存在する（体積粒子／体積構造）。該構造体内に存在する該粒子の少なくともＰパーセントは、粒子のこのＰパーセントと該構造体の前記自由面積表面Ｓとの間の最短距離Ｌが１ｎｍ～５００ｎｍの範囲であるように該材料に包埋されており、Ｐは少なくとも６０パーセントである。
また、該方法は、前記構造体の上または該構造体の近くに、好ましくは前記構造体から１００μｍ未満の距離に、少なくとも１つの細胞を導入するステップを含む。
また、該方法は、前記構造体に電磁放射を照射するステップを含む。
材料を含み、電磁放射を吸収することができる粒子を含む構造体を提供するステップを含む。ここで、該粒子は平均球相当径ｄを有し、該材料に包埋されている。該構造体は、体積Ｖおよび自由エリア表面（free area surface）Ｓを画定する。該粒子は、０．００１体積％～２０体積％の範囲の濃度で構造体内に存在する（体積粒子／体積構造）。該構造体内に存在する該粒子の少なくともＰパーセントは、粒子のこのＰパーセントと該構造体の前記自由面積表面Ｓとの間の最短距離Ｌが１ｎｍ～５００ｎｍの範囲であるように該材料に包埋されており、Ｐは少なくとも６０パーセントである。
また、該方法は、前記構造体の上または該構造体の近くに、好ましくは前記構造体から１００μｍ未満の距離に、少なくとも１つの細胞を導入するステップを含む。
また、該方法は、前記構造体に電磁放射を照射するステップを含む。
【0021】
構造体に電磁放射を照射すると、構造内に存在する、すなわち構造体に包埋された粒子が光熱効果をもたらし、構造体および構造体の自由エリア表面Ｓが局所的かつ一時的に加熱される。光熱効果は、特に、照射された粒子に近接する材料の局所的かつ一時的な加熱を引き起こす。その結果、粒子に近接する自由エリア表面の温度が上昇する。照射時に誘発される局所的かつ一時的な加熱は、構造体と接触しているか、または構造体に近接する膜または障壁(barrier)、例えば細胞の原形質膜の透過化または穿孔をもたらし得る。
【0022】
粒子に最も近接する自由エリア表面Ｓの温度は、例えば、その初期温度より少なくとも１０℃高い温度、例えば、その初期温度より少なくとも２０℃または少なくとも３０℃高い温度に達し、これは、少なくとも１ｎｍ２の面積に対して少なくとも１ｎｓ（ナノ秒）間である。粒子に最も近接する自由エリア表面Ｓでの温度上昇がより高くなり得ることは明らかであり、例えば、少なくとも１ｎｍ２の面積に対して少なくとも１ｎｓの間で、初期温度より少なくとも５０℃または少なくとも１００℃高くなり得る。
【0023】
粒子に最も近接する自由エリア表面Ｓの温度は、例えば、６０℃の温度に達し、細胞膜が透過性になると考えられる温度である。その結果、構造体の局所的に加熱された領域と接触または近接している、すなわち、照射された粒子に最も近接する自由エリア表面と接触または近接している細胞は、透過性になる。粒子に最も近接する自由エリア表面Ｓの温度は、６０℃より高く、例えば、１００℃を超える温度に達し得ることは明らかである。
【0024】
本発明に係る方法は、粒子と細胞との間の直接接触を必要とせずに、構造体の上または構造体の近くに導入された細胞の透過性を増加させることを可能にする。構造体の上に細胞を導入することは、細胞または細胞の少なくとも一部が構造体、すなわち構造体の自由エリア表面Ｓに接触するように細胞が導入されることを意味する。構造体の近くに細胞を導入するということは、細胞または細胞の少なくとも一部と構造体との距離が、１００μｍまたは１００μｍ未満、例えば５０μｍ、２０μｍ、１０μｍ、５μｍ、３μｍ、２μｍ、１μｍ、０．５μｍ、または０．１μｍであるように導入されることを意味する。これは、細胞または細胞の少なくとも一部と構造体の自由エリア表面Ｓとの間の（最も近い）距離が、１００μｍ以下、例えば５０μｍ、２０μｍ、１０μｍ、５μｍ、３μｍ、２μｍ、１μｍ、０．５μｍ、または０．１μｍであることを意味する。
【0025】
さらに、本発明に係る方法は、構造中に存在する粒子の材料が全く、または実質的に全く放出されないという利点を有する。実質的に全く材料が（放出され）ないということは、構造内に存在する粒子の総粒子質量の１％未満、好ましくは０．５％未満、０．１％未満、０．０５％未満が放出されることを意味する。
【0026】
本発明の目的において、構造体の「体積」（Ｖ）という用語は、構造体の内部体積とも呼ばれ、この構造によって占められる総空間、すなわち、構造体の材料および粒子によって占められる総空間と定義される。
【0027】
構造体の「自由エリア表面」（Ｓ）という用語は、構造体の（内部）体積を囲む構造体の全外面、すなわち、周囲環境と直接接触している構造体の全表面と定義される。構造体が流体、例えば液体（（生物学的）細胞またはガス、例えば空気を含む媒体）に沈められ、該構造体がその流体に対して不浸透性である材料を含む場合、構造体の自由エリア表面は、その流体と接触している、または接触し得る構造体の材料の全表面と定義することもできる。
【0028】
好ましくは、構造体の体積に対する構造体の自由エリア表面の面積Ｓの比、すなわちＳ／Ｖ比は、１０－２～１０２μｍ－１の範囲、例えば、１０－１～５０μｍ－１、または１～１０μｍ－１の範囲である。
【0029】
（ある１つの）粒子から構造体の自由エリア表面Ｓまでの最短距離Ｌは、（ある１つの）粒子の外面から構造体の自由エリア表面Ｓまで測定された最短距離と定義される。
【0030】
粒子（例えば、球形粒子、縦長の粒子（longitudinal particle）、または不規則な形状の粒子）の平均球相当径ｄは、その粒子と等価体積である球体の平均直径と定義される。粒子の平均球相当径ｄは、粒子の平均体積相当径（average equivalent volume diameter）とも呼ばれる。粒子が球形粒子からなる場合、平均球相当径がその粒子の平均直径に一致することは明らかである。
【0031】
上記のように、本発明に係る構造体中に存在する電磁放射を吸収することができる粒子の濃度は、０．００１体積％～２０体積％の範囲である。より好ましくは、本発明に係る構造体中に存在する電磁放射を吸収することができる粒子の濃度は、０．０１体積％～１０体積％または０．０１体積％～５体積％の範囲であり、例えば、０．０５体積％、０．１体積％、０．２体積％、０．５体積％、１体積％、２体積％、または５体積％である。
【0032】
本発明に係る構造体中に存在する粒子は、好ましくは、構造体中に存在する少なくとも６０％の粒子と自由エリア表面Ｓとの最短距離Ｌが、１ｎｍ～５００ｎｍの間、例えば、２ｎｍ～５００ｎｍまたは５ｎｍ～５００ｎｍの範囲であるように材料に包埋される。より好ましくは、粒子は、構造体中に存在する少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の粒子と自由エリア表面Ｓとの最短距離Ｌが、１ｎｍ～５００ｎｍの間、例えば、２ｎｍ～５００ｎｍまたは５ｎｍ～５００ｎｍの範囲であるように材料に包埋される。
【0033】
好ましい実施形態では、粒子は、構造体中に存在する少なくとも６０％の粒子と自由エリア表面Ｓとの最短距離Ｌが、１ｎｍ～２５０ｎｍの間、例えば、２ｎｍ～２５０ｎｍまたは５ｎｍ～２５０ｎｍの範囲であるように材料に包埋される。より好ましくは、粒子は、構造体中に存在する少なくとも７０％の粒子、構造体中に存在する少なくとも８０％の粒子、少なくとも９０％の粒子と自由エリア表面Ｓとの最短距離Ｌが、１ｎｍ～２５０ｎｍの間、例えば、２ｎｍ～２５０ｎｍまたは５ｎｍ～２５０ｎｍの範囲であるように材料に包埋される。
【0034】
他の実施形態では、粒子は、構造体中に存在する少なくとも６０％の粒子と自由エリア表面Ｓとの最短距離Ｌが、１ｎｍ～１００ｎｍの間、例えば、２ｎｍ～１００ｎｍまたは５ｎｍ～１００ｎｍの範囲であるように材料に包埋される。より好ましくは、粒子は、構造体中に存在する少なくとも７０％の粒子、構造体中に存在する少なくとも８０％の粒子、少なくとも９０％の粒子と自由エリア表面Ｓとの最短距離Ｌが、１ｎｍ～１００ｎｍの間、例えば、２ｎｍ～１００ｎｍまたは５ｎｍ～１００ｎｍの範囲であるように材料に包埋される。
【0035】
好ましくは、構造体の自由エリア表面Ｓから最短距離Ｌ（Ｌは１ｎｍ～５００ｎｍの範囲である）に位置する粒子の表面密度は、１０－４μｍ－２～１／ｄ２の範囲であり（ｄは、μｍで表される粒子の平均球相当径である）、例えば、２×１０－４μｍ－２～２μｍ－２の間、または２×１０－３μｍ－２～０．２μｍ－２の間である。したがって、粒子の表面密度は、前記構造体に存在する粒子の数Ｎに、自由エリア表面Ｓから最短距離Ｌに位置する粒子のパーセントＰを掛け（Ｌは１ｎｍ～５００ｎｍの範囲、例えば５ｎｍ～５００ｎｍの範囲である）、構造体の自由エリア表面の面積で割ったものと定義される。１ｎｍ～５００ｎｍの範囲、例えば５ｎｍ～５００ｎｍの範囲の距離Ｌに位置する粒子の表面密度は、式Ｎ×Ｐ／Ｓを使用して計算することができる。
【0036】
好ましい実施形態では、構造体の自由エリア表面Ｓから最短距離Ｌ（Ｌは１ｎｍ～２５０ｎｍの範囲である）に位置する粒子の表面密度は、１０－４μｍ－２～１／ｄ２の範囲であり、例えば、２×１０－４μｍ－２～２μｍ－２の間、または２×１０－３μｍ－２～０．２μｍ－２の間の範囲である。
【0037】
他の好ましい実施形態では、構造体の自由エリア表面Ｓから最短距離Ｌ（Ｌは１ｎｍ～１００ｎｍの範囲である）に位置する粒子の表面密度は、１０－４μｍ－２～１／ｄ２の範囲であり、例えば、２×１０－４μｍ－２～２μｍ－２の間、または２×１０－３μｍ－２～０．２μｍ－２の間の範囲である。
【0038】
平均球相当径が１６０μｍの酸化鉄粒子の面密度は、例えば、２×１０－４μｍ－２～２μｍ－２の間、１×１０－３μｍ－２～０．４μｍ－２の間、または２×１０－３μｍ－２～０．２μｍ－２の間の範囲である。
【0039】
本発明に係る構造体の好ましい実施形態では、すべてまたは実質的にすべての粒子が構造体の材料に完全に包埋されている。これは、構造体のすべてまたは実質的にすべての粒子が構造体の材料によって完全に囲まれていることを意味する。その結果、全ての粒子がまたは実質的に全ての粒子が、構造体の自由エリア表面に露出されていない。
【0040】
本発明の目的において、「自由エリア表面に露出される粒子」という用語は、構造体の自由エリア表面から出現し、該構造体周囲の外部環境と接触しているそれらの外面の少なくとも一部を有するすべての粒子を指す。
【0041】
本発明の目的において、「実質的にすべての粒子」とは、粒子の少なくとも９５％、好ましくは粒子の少なくとも９９％、例えば粒子の少なくとも９９．９％を意味する。
【0042】
同様に、本発明の目的において、「実質的に粒子がない」とは、粒子が５％未満である、好ましくは粒子が１％未満である、例えば粒子が０．１％未満であることを意味する。
【0043】
本発明に係る構造体に包埋される粒子は、電磁放射を吸収することができ、電磁放射が照射されると光熱効果を生成するように適合された任意の粒子を含み得る。
【0044】
粒子は、マイクロ粒子、ナノ粒子、またはマイクロ粒子およびナノ粒子の組み合わせを含み得る。
【0045】
「マイクロ粒子」という用語は、１μｍ～１００μｍの範囲の球相当径を有する粒子を指す。「ナノ粒子」という用語は、１ｎｍ～１０００ｎｍの範囲の球相当径を有する粒子を指す。
【0046】
粒子は任意の形状をとり得る。それらは、例えば、球形、楕円形、棒状、ピラミッド型、分岐型、または不規則な形状であり得る。
【0047】
粒子は、固体粒子であり得、１つ以上の材料を含むシェル構造またはコアシェル構造を有し得る。
【0048】
好ましい粒子は、金属粒子、金属酸化物粒子、炭素または炭素ベースの粒子、１つ以上の光吸収化合物を含む粒子、または１つ以上の光吸収化合物を取り込んだ(loaded)もしくは１つ以上の光吸収化合物で官能化された粒子を含む。
【0049】
金属粒子の例としては、金粒子、銀粒子、白金粒子、パラジウム粒子、銅粒子、およびそれらの合金を含む。好ましい金属粒子は、金粒子、銀粒子およびそれらの合金を含む。
【0050】
金属酸化物粒子の例としては、酸化鉄、酸化チタン、酸化ジルコニウム、酸化セリウム、酸化亜鉛、および酸化マグネシウムを含む。
【0051】
炭素または炭素ベースの粒子の例としては、グラフェン量子ドット、（還元された）酸化グラフェン、およびカーボンナノチューブを含む。
【0052】
１つ以上の光吸収化合物を含む粒子または１つ以上の光吸収化合物を取り込んだもしくは官能化された粒子の例としては、合成有機もしくは合成無機吸収剤を含むか、またはそれらを取り込んだもしくはそれらで官能化された粒子、ならびに天然に存在する吸収剤もしくはその誘導体を含むか、またはそれらを取り込んだもしくはそれらで官能化された粒子を含む。特定の例としては、リポソーム、固体脂質ナノ粒子、インドシアニングリーンなどの光吸収色素分子を含むか、またはそれらを取り込んだまたはそれらで機能化したポリマーベースの粒子、無機量子ドット（蛍光量子収率は低い）、色素（メラニン、ロドプシン、フォトプシン、またはヨードプシンなど）のような天然に存在する光吸収剤、およびポリドーパミンのような合成類似体、または光線力学療法で使用される光増感剤を含む。
【0053】
粒子は、好ましくは、生体適合性粒子を含む。より好ましくは、粒子は、臨床的に承認された粒子を含むか、または臨床的に承認された粒子から構成される。
【0054】
粒子は、個々の粒子、または互いに近接して位置する２つ以上の粒子の組み合わせもしくはクラスターを含み得る。
【0055】
本発明に係る構造体は、１つのタイプの粒子、または異なる粒子の組み合わせ、例えば、異なるサイズ、異なる組成および／もしくは異なる形状を有する粒子を含み得る。
【0056】
粒子の寸法、例えば、粒子の幅、高さまたは直径は、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）、または原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）を使用して決定され得る。
【0057】
粒子のサイズは、好ましくは、球相当径ｄ（体積相当径とも呼ばれる）によって定義される。
【0058】
電磁放射を吸収することができる粒子が包埋される構造体の材料は、例えば、無機材料または無機ベースの材料、例えば、シリカもしくはシリカベースの材料またはセラミックもしくはセラミックベースの材料、有機材料または有機ベースの材料、例えば、炭素もしくは炭素ベースの材料、またはポリマーもしくはポリマーベースの材料を含む。構造体の材料はまた、上記の材料の少なくとも１つを含む複合材料、例えば、有機および無機材料を含む複合材料を含み得る。
【0059】
構造体の好ましい材料は、ポリスチレン、ポリカプロラクトン、エチルセルロース、セルロースアセトフタレート、ポリ乳酸、ポリ乳酸－ｃｏ－グリコール酸、セルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、コラーゲン、シルク、アルギン酸塩、ヒアルロン酸、デキストラン、デンプン、ポリカーボネートまたはポリアクリレートを含むか、またはそれらをベースとする。
【0060】
好ましい実施形態では、構造体は、表面修飾された材料、例えば、表面修飾されたポリマー材料を含む。表面修飾は、例えば、構造体の材料への細胞接着を増強するためのコーティング（例えば、コラーゲン）の適用を含む。
【0061】
構造体は、連続的または不連続的な構造を含み得る。
【0062】
構造体は、多孔質または非多孔質の構造を含み得る。多孔質構造は、自由エリア表面が大きく、したがって、本発明の方法に係る構造体の上または該構造体の近くに導入される細胞に露出される利用可能な表面が広大であるという利点を有するので、好ましいと言える。好ましくは、多孔質構造は、構造体の上または該構造体の近くに導入された細胞の細孔への部分的または完全な進入を可能にする細孔サイズを有する。好ましくは、多孔質構造は、細胞培地(medium)中に存在する分子の細胞へのアクセスを制限しない細孔サイズを有する。
【0063】
構造体の多孔率(porosity)は、構造体が占める総体積、すなわち、構造の体積Ｖ（材料および材料に包埋された粒子の体積）とその構造体の細孔または空隙の体積との合計に対する、構造体の細孔または空隙の体積の比率と定義される。多孔率は、０％～１００％の範囲であり得る。構造体が多孔質構造を含む場合、構造体の多孔率は、好ましくは、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％である。
【0064】
構造体は平坦もしくは平面であり得るか、または構造体は非平坦、例えば管状であり得る。電磁放射が照射される構造体の表面は、平坦か非平坦となり得る。
【0065】
構造体は、滑らかなまたは滑らかでない表面を有し得る。滑らかでない表面は、例えば、突起を備えた表面を含む。
【0066】
構造体の厚さは、好ましくは、０．１μｍ～１０００μｍの範囲、例えば、０．１μｍ～１００μｍの間、または１μｍ～１０μｍの間である。
【0067】
構造体の厚さとは、構造体の最短寸法に沿って構造体の材料を貫通した距離と定義される。例えば、平坦または平面構造の場合、その厚さは水平面に垂直な方向に沿って測定された構造体の距離に一致する。長い管状構造の場合、その厚さは管状構造の半径方向の直径に一致する。
【0068】
実施形態の第１のグループは、材料と、材料に包埋された電磁放射を吸収することができる粒子とを含む非多孔質構造を含む。例としては、ポリマーシートまたはポリマーホイルに包埋された電磁放射を吸収することができる粒子を含むポリマーシートまたはポリマーホイルを含む。
【0069】
特に好ましい実施形態は、ポリスチレン、ポリカプロラクトン、エチルセルロース、セルロースアセトフタレート、ポリ乳酸、ポリ乳酸－ｃｏ－グリコール酸、セルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、コラーゲン、シルク、アルギン酸塩、ヒアルロン酸、デキストラン、デンプン、ポリカーボネートまたはポリアクリレートを含むか、またはそれらをベースとする。
【0070】
ポリマーシートは、例えば、ポリマーシートに包埋された酸化鉄粒子および／または炭素粒子を含む。
【0071】
上記第１のグループの構造体は、例えば、厚さｔ、長さＡ、幅Ａ’を有する。厚さｔは、好ましくは、０．１μｍ～１００μｍの間、例えば、０．１μｍ～１０μｍの間である。
【0072】
構造体の体積Ｖは、ｔ×Ａ×Ａ’に対応する。
【0073】
第１のグループの構造体の長さおよび幅は、通常、構造の厚さｔよりも極めて大きいため、第１のグループの構造体の自由エリア表面の面積は、２×Ａ×Ａ’に等しいと見積もられ得る。照射される構造の自由エリア表面の面積は、構造の表面の一方（例えば、上面または下面）に対応するため、Ａ×Ａ’に等しいと見積もられ得る。
【0074】
したがって、構造の体積Ｖに対する構造の自由エリア表面の面積Ｓの比、すなわちＳ／Ｖ比は、１／ｔに対応する。
【0075】
実施形態の第２のグループは、材料と、材料に包埋された電磁放射を吸収することができる粒子とを含む多孔質構造を含む。例としては、多孔質ポリマー構造に包埋された粒子を有する多孔質ポリマー構造を含む。
【0076】
多孔質構造の例としては、繊維（例えば、ポリマー繊維）を含む構造、粒子状物質(particulates)（例えば、ポリマー粒子状物質）を含む構造、繊維と粒子状物質との組み合わせ（例えば、ポリマー繊維および／またはポリマー粒子状物質の組み合わせ）を含む構造、および発泡体（例えば、ポリマー発泡体）を含む構造を含む。繊維および／または粒子状物質は、相互に連結されていてもされていなくてもよい。例えばポリマー粒子状物質としての粒子状物質は、球状粒子状物質ならびに不規則な形状の粒子状物質を含み得る。電磁放射を吸収することができる粒子は、好ましくは、粒子が構造の自由エリア表面に（部分的に）露出されないように、好ましくは、繊維、粒子状物質または発泡体に包埋される。
【0077】
第２のグループの構造の第１の例は、（ポリマー）繊維を含む構造である。（ポリマー）繊維の繊維直径は、例えば、０．１μｍ～１０μｍの範囲、例えば、０．５μｍまたは１μｍである。（ポリマー）繊維は、相互に連結されていてもされていなくてもよい。（ポリマー）繊維は、当技術分野で知られている任意の技術によって得ることができる。（ポリマー）繊維を製造するための好ましい技術は、電界紡糸法である。代替技術は、湿式紡糸、溶融紡糸、押出紡糸、乾式噴霧湿式紡糸、乳濁液紡糸および懸濁紡糸を含む。ポリマーの好ましい例としては、ポリスチレン繊維、ポリカプロラクトン繊維、エチルセルロース繊維、セルロースアセトフタレート繊維、ポリ乳酸繊維、およびポリ乳酸－ｃｏ－グリコール酸ベースの繊維を含む。（ポリマー）繊維は表面修飾され得る。
【0078】
（ポリマー）繊維は、繊維の直径ｄｆｉｂｒｅに対応する直径および、繊維の長さＬｆｉｂｒｅに対応する長さを有する長い円筒体と見なすことができるため、繊維の体積Ｖｆｉｂｒｅは、
に対応し、繊維の自由エリア表面の面積Ｓｆｉｂｒｅは、
に対応する。したがって、体積Ｖｆｉｂｒｅに対する自由エリア表面の面積Ｓｆｉｂｒｅの比率は、４／ｄｆｉｂｒｅに対応する。
【数1】
に対応し、繊維の自由エリア表面の面積Ｓｆｉｂｒｅは、
【数2】
に対応する。したがって、体積Ｖｆｉｂｒｅに対する自由エリア表面の面積Ｓｆｉｂｒｅの比率は、４／ｄｆｉｂｒｅに対応する。
【0079】
第２のグループの構造体の第２の例は、例えばポリマー（ミクロ）球体のようなポリマー粒子状物質を含む構造体である。粒子状物質の直径は、例えば、０．１μｍ～１０μｍの範囲、例えば、０．５μｍまたは１μｍである。ポリマー粒子状物質は、相互に連結されていてもされていなくてもよい。（ポリマー）粒子状物質は、当技術分野で知られている任意の技術によって得ることができる。粒子状物質の好ましい例としては、ポリスチレン、ポリカプロラクトン、エチルセルロース、セルロースアセトフタレート、ポリ乳酸、ポリ乳酸－ｃｏ－グリコール酸ベースの繊維を含む。ポリマー粒子状物質は表面修飾され得る。
【0080】
粒子状物質が直径ｄｍｓのミクロ球体である場合、ミクロ球体の体積Ｖｍｓは、
に対応し、ミクロ球体の自由エリア表面の面積Ｓｍｓは、
に対応する。したがって、ミクロ球体の体積Ｖｍｓに対する自由エリア表面の面積Ｓｍｓの比率は、６／ｄｍｓに対応する。
【数3】
に対応し、ミクロ球体の自由エリア表面の面積Ｓｍｓは、
【数4】
に対応する。したがって、ミクロ球体の体積Ｖｍｓに対する自由エリア表面の面積Ｓｍｓの比率は、６／ｄｍｓに対応する。
【0081】
細胞は、例えば、構造体の上または該構造体の近くに細胞を含む懸濁液を付与することによって、構造体の上または該構造体の近くに導入される。細胞は、構造体の上または該構造体の近くに連続的に導入することも、不連続的に導入することもできる。
【0082】
懸濁液中の細胞の濃度は、好ましくは１ｍＬあたり１～１０６細胞の範囲である。
【0083】
好ましい方法では、懸濁液、すなわち細胞は、特定の期間中、構造体の上または該構造体の近くで培養される。
【0084】
代替の方法では、細胞は、構造体の上または該構造体の近くに導入された直後、または導入後間もなく、電磁照射によって構造体を活性化させることにより処理される。
【0085】
構造、特に構造体に包埋された粒子は、パルス放射源によって照射されることが好ましいが、連続波放射源による照射も検討され得る。構造体は、１つ以上のパルスによって照射され得る。
【0086】
パルス放射源が使用される場合、パルスは、好ましくは、１ｆｓ（フェムト秒）～１ｍｓ（ミリ秒）の範囲、例えば、１ｆｓ～１００μｓ（マイクロ秒）の範囲、１０ｆｓ～１０μｓの範囲、１０ｆｓ～１μｓ、または１０ｆｓ～１０ｎｓの範囲の持続時間を有する。
【0087】
放射源のパルスあたりのフルエンス（単位面積あたりに送達される電磁エネルギー）は、好ましくは、０．００１～１０００Ｊ／ｃｍ２の間、例えば、０．００１～１００Ｊ／ｃｍ２の間、０．０１～１０Ｊ／ｃｍ２の間、例えば、０．１Ｊ／ｃｍ２～１Ｊ／ｃｍ２の範囲である。
【0088】
放射源の波長は、紫外線領域から赤外線領域までの範囲であり得る。好ましい方法では、使用される放射線の波長範囲は、可視領域から近赤外領域である。
【0089】
本発明に係る方法は、例えば、ＥＰ２２７２９４５に記載されている方法のように当技術分野で知られている方法と比較して、増強された効率、例えば、増強されたトランスフェクションの効率を示す。出願人はいかなる理論にも拘束されることを望まないが、出願人は、効率の増強は、細胞と構造体との接触の増加の直接的な結果であると考える。細胞と構造体との間の接触が増加するため、細胞膜のより広い面積が透過性になり、その結果、より多くのおよび／またはより大きな分子が細胞に入ることができる。構造体が多孔質構造を含む場合、自由エリア表面がより大きくなり、細胞が様々な側から構造体の自由エリア表面に到達することができるため、効率がさらに増加され得る。
【0090】
これまで、大きな高分子を細胞内に送達するには、蒸気ナノバブルを作製し、細胞の膜、例えば細胞の原形質膜を透過し得る局所的な圧力波を引き起こすことを目的に、高強度のレーザーパルスが必要であると考えられていた。驚くべきことに、本発明に係る方法は、はるかに低い強度の単一レーザーパルス、例えば、０．００１Ｊ／ｃｍ２～１Ｊ／ｃｍ２の範囲、好ましくは０．０１Ｊ／ｃｍ２～０．５Ｊ／ｃｍ２の範囲、より好ましくは０．０５Ｊ／ｃｍ２～０．２Ｊ／ｃｍ２のフルエンス範囲を有する単一レーザーパルスを使用して、細胞の膜、例えば細胞の原形質膜を透過性にすることを可能にすることが見出された。さらに、本発明に係る方法は、低いレーザー強度を使用する場合でさえ、比較的大きな細孔を引き起こすことを可能にし、比較的大きな高分子、例えば、公称サイズが５００ｋＤａの高分子の細胞内送達までも可能にする。
【0091】
本発明に係る方法のさらなる利点は、構造体に包埋された粒子の断片化または放出が回避される点である。ＩＣＰ－ＭＳ分析が、放出された粒子の材料の量が検出不可能であることを示した。これは、一方では細胞が粒子の潜在的に有毒な材料に露出されていないことを意味し、他方では粒子が照射後も無傷かつ機能し続けることを意味する。技術分野で知られている光穿孔法技術では、照射された（ナノ）粒子は、単一のレーザーパルスでしばしば断片化される。その結果、当技術分野で知られている技術では、（ナノ）粒子はしばしば一度だけしか使用できない。本発明に係る方法では、この構造体を繰り返し照射に用いることができる。
【0092】
本発明に係る方法のさらなる利点は、構造体の製造の容易さである。
【0093】
本発明の第２の態様によれば、構造体の上または該構造体の近くに導入される細胞、特に細胞の原形質膜を透過性にするための光熱プロセスでの使用に適した前記構造体が提供される。該構造体は、材料と、該材料に包埋された電磁放射を吸収できる粒子と、を含む。該粒子は、平均球相当径ｄを有する。該構造体は、体積Ｖおよび自由エリア表面Ｓを画定する。該粒子は、０．００１体積％～２０体積％の範囲（体積粒子／体積構造）、例えば、０．０１体積％～１０体積％の間、または０．０１体積％～１０体積％の範囲の濃度で構造内に存在する。該構造内に存在する該粒子の少なくともＰパーセントは、該構造体の該自由エリア表面から最短距離Ｌに位置し、Ｌは１ｎｍ～５００ｎｍの範囲であり、それにより、Ｐは少なくとも６０％である。
【0094】
構造体は、上記の任意のタイプの構造を含み得る。
【0095】
本発明に係る構造体は、薬物スクリーニング、細胞治療、免疫療法、遺伝子療法、細胞標識、および操作された細胞の製造に使用するのに特に適している。
【0096】
構造体は、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｐＤＮＡを含む核酸の細胞内送達での使用に特に適している。
【0097】
構造体はまた、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡなどのリボ核タンパク質を含む核タンパク質の細胞内送達での使用にも適している。
【0098】
さらに、構造体は、ナノボディまたは抗体などのペプチドおよびタンパク質の細胞内送達での使用に適している。
【0099】
くわえて、構造体は、蛍光標識ポリマー、量子ドット、酸化鉄ナノ粒子、ガドリニウムキレートなどの造影剤の細胞内送達での使用に適している。
【0100】
構造体はさらに、例えば、ＬＳＰＲセンサー（局在表面プラズモン共鳴）またはＳＥＲＳ（表面増強ラマン分光法）などの感知および特性評価の目的で、プラズモンナノ粒子の細胞内送達に使用するのに適している。
【0101】
本発明に係る構造体は、インビトロおよびエクスビボ用途での使用に適している。構造体はさらに、インビボ用途での使用に適している。
【0102】
本発明の第３の態様によれば、特に、薬物スクリーニング、細胞治療、免疫療法、遺伝子療法、細胞標識、操作された細胞の製造、およびタンパク質干渉研究において、本発明に係る構造体の使用が提供される。構造体は、インビトロおよびエクスビボ用途で使用され得る。構造体はさらに、インビボ用途で使用され得る。
【0103】
好ましい使用では、構造体は、上記のように細胞の透過性を増加させる方法において使用される。
【図面の簡単な説明】
【0104】
本発明は、添付の図面に関連して以下でより詳細に論じられる：
【図1】本発明に係る細胞膜の透過性を増加させる方法を概略的に示す図である。
【図2】カルセイン－ＡＭ生存率染色、およびフルエンスが増加する単一の７ｎｓレーザーパルスによる１０ｋＤａ（ＲＤ１０）の赤色蛍光標識デキストランの細胞内送達を示す共焦点画像を示す図である。
【図3】異なるレーザーパルスフルエンスおよび酸化鉄ナノ粒子（ＩＯＮＰ）の異なる濃度を用いた、赤色蛍光標識された１０ｋＤａデキストラン（ＲＤ１０）の送達効率および細胞生存率（カルセイン陽性細胞）を示す。
【図4】初めに赤色蛍光１０ｋＤａデキストラン（ＲＤ１０）を、次いで緑色蛍光ＦＩＴＣ－デキストラン（ＦＤ１０）を用いて光穿孔法を繰り返した場合の共焦点画像を示す。
【図5】ＲＤ１０およびＦＤ１０を用いて光穿孔法を繰り返した場合の、細胞の９０％がＲＤ１０およびＦＤ１０の両方を含むことを示すフローサイトメトリーデータを示している。
【図6】各光穿孔法ステップ間（Ｎ＝１～４）でその濃度が２倍になっているＦＤ１０を用いたＨＥＬＡ細胞の連続光穿孔法の場合の送達効率を示す。
【図7】ＦＤ１０を用いたＨＥＬＡ細胞の連続する光穿孔法の場合の、光穿孔法ステップの数の増加に伴う細胞あたりの相対蛍光強度中央値(average relative mean fluorescence intensity)（ｒＭＦＩ）を示す。
【図8】光穿孔法の数の増加（Ｎ＝１、２、４）に対して、さまざまな分子量（１０、４０、７０、１５０、および５００ｋＤ）のＦＩＴＣ－デキストラン分子の送達効率を示す。
【図9】光穿孔法の数の増加に伴う異なるＦＩＴＣ－デキストラン分子についての細胞あたりの相対蛍光強度中央値（ｒＭＦＩ）を示す。
【図10】異なる濃度のＩＯＮＰを有し、異なるフルエンスのレーザーパルスで照射された繊維を含む構造についてのジャーカット細胞におけるＦＤ１０の送達効率および生存率を示す。
【図11】未処理の細胞（ネガティブコントロール）、ＩＯＮＰと共にインキュベートした細胞（ポジティブコントロール）、および異なる濃度のＩＯＮＰを含有する繊維からなる構造で光穿孔法によって処理した細胞において、ＩＣＰ－ＭＳによって測定された鉄濃度を示す。
【図12】蒸留水中（ネガティブコントロール）、異なる濃度のＩＯＮＰを有する培養ウェルに匹敵する量の繊維を消化する王水によって消化された異なる濃度のＩＯＮＰを有する繊維中（ポジティブコントロール）、および光穿孔法後に構造体から収集された蒸留水中において、ＩＣＰ－ＭＳによって測定された鉄濃度を示す。
【図13】ＧＦＰを安定して発現し、Ｎ回の光穿孔法（Ｎ＝１～４）後にファイバー基質上で増殖したＨ１２９９細胞のＭＦＩ、ノックダウン効率、および細胞生存率を示す。該ファイバー基質は、異なる濃度Ｃ（Ｃ＝０．５～５０μＭ）のｓｉＲＮＡを有するＩＯＮＰを含む。
【図14】異なるＩＯＮＰ濃度およびレーザーフルエンスを用いた光穿孔法によるヒトＴ細胞におけるＦＤ１０の細胞内送達を示す。
【図15】光穿孔法を繰り返した場合のヒトＴ細胞におけるＦＤ１０の細胞内送達を示す（Ｎ＝１～４）。
【図16】電気穿孔法（ＥＰ）、本発明に係る光穿孔法（ＰＥＮ）、および金ナノ粒子増感光穿孔法（ＰＰ）を用いた、刺激されたヒトＴ細胞におけるｓｉＲＮＡ送達性能を示し、図１６ａは生存率を、図１６ｂはトランスフェクション収率をそれぞれ示し、該トランスフェクション収率は、陽性細胞のパーセンテージに生細胞のパーセンテージを掛けて得られた、生きていて、かつトランスフェクトされた細胞のパーセンテージである。
【図17】ＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＰＤ１発現を示す例示的なヒストグラムを示す。
【図18】電気穿孔法（ＥＰ）、本発明に係る光穿孔法（ＰＥＮ）、および金ナノ粒子増感光穿孔法（ＰＰ）による送達後７２時間までの、ｓｉＲＮＡを用いたヒトＣＤ３ Ｔ細胞におけるＰＤ１ノックダウンのレベルを示す。
【図19】Ｈ１２９９におけるＣａｓ－９遺伝子ノックアウトに対する１％ ＩＯＮＰを有するポリカプロラクトン（ＰＣＬ）由来のナノファイバーを含む構造体の適用を示す。
【図20】Ｈ９ヒト胚性幹細胞における高分子送達に対する１％ ＩＯＮＰを有するポリカプロラクトン（ＰＣＬ）由来のナノファイバーを含む構造体の適用を示す。
【図22】異なる濃度のＩＯＮＰを有するポリマーシートを用いたＨｅＬａ細胞の光穿孔法に対する、ＦＤ５００陽性細胞、生存率、および相対蛍光強度中央値を示す。
【図23】異なるレーザーフルエンスを使用した特定濃度のＩＯＮＰを有するポリマーシートを用いたＨｅＬａ細胞の光穿孔法に対する、ＦＤ５００陽性細胞のパーセンテージ、生存細胞のパーセンテージ、および相対蛍光強度中央値を示す。
【発明を実施するための形態】
【0105】
本発明は、特定の実施形態に関して、および特定の図面を参照して説明されるが、本発明は、それに限定されず、特許請求の範囲によってのみ説明される。図面は概略的なものであり、限定的なものではない。図面の一部の要素のサイズは、例としての説明のために誇張されており、縮尺どおりに描かれていない場合がある。寸法および相対寸法は、本発明を実施するための実際の縮小に対応していない。
【0106】
範囲の終点を参照する場合、範囲の終点の値が含まれる。
【0107】
本発明を説明するとき、使用される用語は、他に示されない限り、以下の定義に従って解釈される。
【0108】
説明および特許請求の範囲で使用される「第１」、「第２」などの用語は、類似の要素を区別するために使用され、必ずしも時間的、空間的、ランク付けまたは他の方法で順序を説明するものではない。そのように使用される用語は、状況に応じて交換可能であり、本明細書に記載の本発明の実施形態は、本明細書に記載または図示された以外の順序で動作可能であることを理解されたい。
【0109】
２つ以上のアイテムをリストする場合の「および／または」という用語は、リストされたアイテムのいずれか１つを単独で採用できること、またはリストされたアイテムの２つ以上の任意の組み合わせを採用できることを意味する。
【0110】
「細胞」という用語は、真核細胞、原核細胞を含むすべての種類の生物学的細胞を指す。
【0111】
「透過性を増加させる(increase the permeability of)」、「透過性にする(permeabilize)」、「透過性にする(permeabilizing)」および「透過性化(permeabilization)」という用語は、膜または障壁、例えば細胞の原形質膜の透過性を少なくとも部分的または局所的に変化させる任意の方法を指す。透過性化後、膜または障壁、例えば細胞の原形質膜は、例えば分子、高分子、粒子またはナノ粒子などの１つ以上のタイプの化合物に対してより透過性であるように変化する。
【0112】
「穿孔する(perforate)」、「穿孔(perforating)」または「穿孔(perforation)」という用語は、膜または障壁、例えば細胞の原形質膜に対して１つ以上の開口部、穴または細孔を提供する任意の方法を指す。膜または障壁、例えば細胞の原形質膜を穿孔することにより、開口部が膜または障壁、例えば細胞の原形質膜に作製され、膜または障壁、例えば細胞の原形質膜を通って、分子、高分子、粒子またはナノ粒子などの化合物の輸送を可能にする。
【0113】
本発明の目的において、「透過性を増加させる(increase the permeability of)」、「透過性にする(permeabilize)」、「透過性にする(permeabilizing)」および「透過性化(permeabilization)」という用語と、「穿孔する(perforate)」、「穿孔(perforating)」または「穿孔(perforation)」という用語は、交換可能に用いられる。
【0114】
同様に、本発明の目的において、「開口部」、「穴」、および「細孔」という用語は交換可能に用いられる。
【実施例】
【0115】
［実施例１ ナノファイバーのウェブおよびナノファイバーに包埋された粒子を含む多孔質構造］
本発明に係る構造体の第２の実施形態は、ナノファイバーおよびナノファイバーに包埋された電磁放射を吸収することができる粒子を含む多孔質構造を含む。以下に説明する実施例は、構造体の材料としてのポリカプロラクトンと、電磁放射を吸収することができる粒子としての酸化鉄ナノ粉末とを含む。他の材料および他の粒子も検討できることは明らかである。
本発明に係る構造体の第２の実施形態は、ナノファイバーおよびナノファイバーに包埋された電磁放射を吸収することができる粒子を含む多孔質構造を含む。以下に説明する実施例は、構造体の材料としてのポリカプロラクトンと、電磁放射を吸収することができる粒子としての酸化鉄ナノ粉末とを含む。他の材料および他の粒子も検討できることは明らかである。
【0116】
［１－ａ．光熱電界紡糸されたナノファイバーの合成および特性評価］
ナノファイバーウェブの合成には、以下の材料が使用される：
－ ポリカプロラクトン（ＰＣＬ、Ｍｗ≒７０，０００ｇ／ｍｏｌ）;
－ Ｎ、Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）;
－ テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）;
－ 酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４）ナノパウダー（ＩＯＮＰ）（＃ＭＫＢＷ３２６２、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ベルギー）;
－ ポリ（アリルアミン塩酸塩）（ＰＡＨ、Ｍｗ＝１７，５６０ｇ／ｍｏｌ、＃ＭＫＢＺ２８２４Ｖ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ベルギー）;
－ 濃硫酸溶液（９６％）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）;
－ Ｉ型コラーゲンラットタンパク質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃Ａ１０４８３０１、Ｇｉｂｃｏ（商標）、ベルギー）。
ナノファイバーウェブの合成には、以下の材料が使用される：
－ ポリカプロラクトン（ＰＣＬ、Ｍｗ≒７０，０００ｇ／ｍｏｌ）;
－ Ｎ、Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）;
－ テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）;
－ 酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４）ナノパウダー（ＩＯＮＰ）（＃ＭＫＢＷ３２６２、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ベルギー）;
－ ポリ（アリルアミン塩酸塩）（ＰＡＨ、Ｍｗ＝１７，５６０ｇ／ｍｏｌ、＃ＭＫＢＺ２８２４Ｖ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ベルギー）;
－ 濃硫酸溶液（９６％）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）;
－ Ｉ型コラーゲンラットタンパク質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃Ａ１０４８３０１、Ｇｉｂｃｏ（商標）、ベルギー）。
【0117】
０体積％～１．１５体積％の異なる濃度のＰＣＬを添加した１：１ ＤＭＦ／ＴＨＦ溶液に、ＩＯＮＰを再分散した。
【0118】
このようにして得られた混合物を使用して、電界紡糸法によってナノファイバーを製造した。接地された回転コレクターに取り付けられた顕微鏡ガラススライド（＃１０００９１２、マリーエンフェルト、ドイツ）上に、ナノファイバーを収集した。
【0119】
電界紡糸中に、特に明記しない限り、印加電圧、流量および電界紡糸距離は、それぞれ１０ｋＶ、０．３ｍｌ／ｈ、および２０ｃｍに固定した。接地された回転コレクターを５００ｒｐｍの回転速度に設定した。３０分（または具体的に示された時間）後、電界紡糸プロセスを停止し、ナノファイバーウェブを備えたスライドガラスを回転コレクターから分離し、層流キャビネット内で４５分間のＵＶ照射により滅菌した。
【0120】
ナノファイバーのサイズおよび直径を、走査型電子顕微鏡を使用して決定した。ＩＯＮＰを含まないファイバーの平均直径は３００ｎｍであった。１．１５体積％までのＩＯＮＰを含めた場合、平均直径は有意に変化しなかった。
【0121】
構造体の厚さを、共焦点顕微鏡を使用して調査した。電界紡糸の持続時間が長くなると、構造体は１時間後に４μｍまで徐々に厚くなった。ウェブは３０分後にあまり変化しなくなったので、電界紡糸時間は３０分とした。
【0122】
ナノファイバーに対してＩＯＮＰの量を増加させて使用した場合、ナノファイバーウェブの厚さは有意には変化しなかった。これは、ナノファイバーウェブの厚さが使用範囲内のＩＯＮＰ含有量とは無関係であることを明確に示している。
【0123】
ＩＯＮＰをナノファイバー内に包埋した。これは、２０ｋＶの電圧を用いたＳＥＭで明確に見ることができる。ＳＥＭ画像は、ＩＯＮＰが個々の粒子として、または２つ以上の個々の粒子のクラスターとして存在し得ることを示した。簡便にするために、包埋されたＩＯＮＰは、「ＩＯＮＰクラスター」または「クラスター」と呼ばれ、「ＩＯＮＰクラスター」またはクラスターという用語は個々の粒子およびクラスター化された粒子の両方を含むと解釈する。ＳＥＭにより、ＳＥＭ画像の面積１０００μｍ２あたりのウェブ全体のＩＯＮＰクラスターの見掛け密度を定量化することが可能となった。ＩＯＮＰ含有量が０．００４６体積％から１．１５体積％に増加するにつれて、密度は１．７から１９２クラスター／１０００μｍ２に直線的に増加した。
【0124】
［１－ｂ．細胞培養基質としてのナノファイバーウェブの調製］
８ウェルＳｅｃｕｒｅ－Ｓｅａｌ（商標）両面接着スペーサー（＃Ｓ２４７３７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、層流キャビネット内で４５分間ＵＶ照射により滅菌した。接着スペーサーの片側から保護シールを剥がした後、ナノファイバーウェブに静かに貼り付けた。次に、スライドガラスからウェブ（上部に接着スペーサーを付けた状態）を容易に取り外すため、これらのサンプルを蒸留水に３分間浸した。ウェブを、１個あたり１つまたは４つの接着ウェル（細胞を増殖させることができる）を使用して手動で小さな断片に切断し、ＰＢＳバッファーに保存した。
８ウェルＳｅｃｕｒｅ－Ｓｅａｌ（商標）両面接着スペーサー（＃Ｓ２４７３７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、層流キャビネット内で４５分間ＵＶ照射により滅菌した。接着スペーサーの片側から保護シールを剥がした後、ナノファイバーウェブに静かに貼り付けた。次に、スライドガラスからウェブ（上部に接着スペーサーを付けた状態）を容易に取り外すため、これらのサンプルを蒸留水に３分間浸した。ウェブを、１個あたり１つまたは４つの接着ウェル（細胞を増殖させることができる）を使用して手動で小さな断片に切断し、ＰＢＳバッファーに保存した。
【0125】
次に、これらの細胞培養基質をさらに、最適な細胞付着のためにコラーゲンで修飾した。細胞培養基質を３２％硫酸溶液（６ウェルプレートのウェルあたり３ｍｌ）に３分間浸した。蒸留水で洗浄した後、高分子電解質ＰＡＨ（２ｍｇ／ｍｌ、０．５Ｍ ＮａＣｌ）の水溶液に１５分間浸し、蒸留水で３回すすいだ。ナノファイバー表面へのＰＡＨの物理吸着により、ナノファイバーは正に帯電した。次に、ＰＡＨでコーティングされたナノファイバーをＩ型コラーゲンラットテールプロテインの０．５ｍｇ／ｍｌ水溶液に１５分間浸し、ＰＢＳ溶液ですすいだ。最後に、修飾された基質を、さらなる使用の前にＰＢＳに保存した。
【0126】
［１－ｃ．光穿孔処理のための細胞培養基質における細胞の培養または収集］
ＨｅＬａ細胞（＃ＣＣＬ－２）およびジャーカットクローンＥ６．１（＃ＴＩＢ－１５２）を、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手し、光穿孔法による付着細胞および浮遊細胞のトランスフェクションのモデルとして採用した。増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）を安定して発現するヒト肺上皮細胞（Ｈ１２９９）を、ｓｉＲＮＡノックダウン実験の検証用に使用した。２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシンおよび１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ－１２から、ＨｅＬａ細胞培養培地を作製した。Ｈ１２９９およびジャーカット細胞培養培地は、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシンおよび１０％ＦＢＳ含むＲＰＭＩ１６４０からなるものであった。
ＨｅＬａ細胞（＃ＣＣＬ－２）およびジャーカットクローンＥ６．１（＃ＴＩＢ－１５２）を、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手し、光穿孔法による付着細胞および浮遊細胞のトランスフェクションのモデルとして採用した。増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）を安定して発現するヒト肺上皮細胞（Ｈ１２９９）を、ｓｉＲＮＡノックダウン実験の検証用に使用した。２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシンおよび１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ－１２から、ＨｅＬａ細胞培養培地を作製した。Ｈ１２９９およびジャーカット細胞培養培地は、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシンおよび１０％ＦＢＳ含むＲＰＭＩ１６４０からなるものであった。
【0127】
付着細胞を増殖させるために、細胞培養基質を、ＨｅＬａまたはＨ１２９９を添加した６ウェル力価プレート（＃１００６２－８９２、ＶＷＲ）に配置した（２ｍｌの細胞培養培地で約１×１０６細胞）。細胞を、５％ＣＯ２の加湿雰囲気において、３７℃の細胞インキュベーター内で２４時間、付着および増殖させた。光穿孔処理の直前に、細胞に送達される必要のある目的の分子を細胞培地に添加した。
【0128】
ジャーカット細胞を、７５ｃｍ２または１７５ｃｍ２のフラスコ（＃７３４－２３１３、＃７３４－２３１５、ＶＷＲ（登録商標））において、１×１０５～１×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で培養した。光穿孔法のために、目的の分子を細胞培地に添加し、細胞を約２×１０５細胞／ウェルで細胞基質に移した。光穿孔法のレーザースキャンを開始する前に、細胞をファイバーウェブ上に５分間沈降させた。
【0129】
最終実験を、ゲント大学病院から入手したヒトＴ細胞で実施した。バフィーコートを健康なドナーから入手した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｌｅｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、オスロ、ノルウェー）を用いた密度遠心分離によって単離した。次に、ＰＢＭＣを１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、Ｂｏｖｏｇｅｎ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２ｍＭグルタミンおよび５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－２（Ｒｏｃｈｅ、Ｖｉｌｖｏｏｒｄｅ、ベルギー）を添加したＩＭＤＭ（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｍｅｒｅｌｂｅｋｅ、ベルギー）でインキュベートし、ＣＤ２３／ＣＤ２８ビーズ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、バンクーバー、カナダ）をビーズと細胞との比率が１：１となるように用いて刺激した。７日後、細胞（ＰＢＭＣ）を回収し、Ｘ線照射（４０Ｇｙ）（ＳＡＲＲＰ）したＰＢＭＣ（１：２比）を、Ｘ線照射（５０ Ｇｙ）ＪＹ（５：１比）した、１μｇ／ｍｌフィトヘマグルチニン（Ｒｅｍｅｌ Ｅｕｒｏｐｅ、ＫＥＮＴ、ＵＫ）を添加した完全ＩＭＤＭのフィーダー細胞と共に再びインキュベートした。さらに１４日後、ＣＤ３＋細胞を回収し、さらに示すように実験に使用した。小動物放射線研究プラットフォーム（Ｘｓｔｒａｈｌ、サリー、英国）を使用してフィーダー細胞を照射した。光穿孔処理のために、Ｔ細胞を約８×１０５細胞／ウェルの密度で、すでに存在するトランスフェクション分子のもとで培養基質に移した。レーザー処理を開始する前に、細胞をファイバーウェブ上に５分間沈降させた。
【0130】
［１－ｄ．付着細胞の光穿孔法］
本発明に係る方法は、図１に概略的に示されている。初めに、材料および電磁放射を吸収することができる粒子を含む構造体が提供される（図１ａ）。構造体は、例えば上記の通りに合成される。続いて、細胞は、例えば上記のような構造体の上で増殖する（図１ｂ）。細胞については、いくつかの小さな修正を加えて以前に報告されたカスタムビルドの光学セットアップを使用して光穿孔した（R.H. Xiong et al., Comparison of Gold Nanoparticle Mediated Photoporation: Vapor Nanobubbles Outperform Direct Heating for Delivering Macromolecules in Live Cells, Acs Nano, 8 (2014) 6288-6296）（図１ｃ）。簡潔に説明すると、パルス持続時間７ｎｓのパルスレーザーを波長６４７ｎｍで調整し（ＯｐｏｌｅｔｔｅＴＭ ＨＥ ３５５ ＬＤ、ＯＰＯＴＥＫ Ｉｎｃ、カナダ）、ナノファイバーおよびＩＯＮＰを含む構造体を照射するように応用した。コリメートされたパルスレーザービームは、１°の光整形ディフューザー（Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｏｐｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、カナダ）に向けられ、顕微鏡の入り口の前にあるアクロマートレンズおよび１０倍の対物レンズ（Ｐｌａｎ Ｆｌｕｏｒ、Ｎｉｋｏｎ）を組み合わせることで、サンプルでのレーザービーム幅は約２５０μｍとなった。レーザーパルスエネルギーを、パルスレーザーに同期したエネルギーメーター（Ｊ－２５ＭＢ－ＨＥ＆ＬＥ、Ｃｏｈｅｒｅｎｔ）によってモニタリングした。本発明に係るナノファイバーおよびＩＯＮＰ（直径約９ｍｍ）を含む構造体の上のすべての細胞をスキャンするために、電動顕微鏡のステージを使用して、固定レーザービームを通してサンプルをスキャンした。レーザーの繰り返し周波数は２０Ｈｚであるため、スキャン速度を３ｍｍ／ｓに設定し、後続のライン間の距離は０．１５ｍｍであった。このようにして、すべての細胞は、隣接する照射ゾーン間のオーバーラップ領域で最大４つまでの少なくとも１つのレーザーパルスを受けた。ジャーカット細胞またはヒトＴ細胞を用いたいくつかの実験では、本文に示されているように、細胞を複数回スキャンした。その場合、細胞を新しい場所でナノファイバーにランダムに付着させるために、細胞をウェル内に再懸濁し、各スキャンの間に再び沈降させた。トランスフェクトされた細胞を図１ｄに示す。
本発明に係る方法は、図１に概略的に示されている。初めに、材料および電磁放射を吸収することができる粒子を含む構造体が提供される（図１ａ）。構造体は、例えば上記の通りに合成される。続いて、細胞は、例えば上記のような構造体の上で増殖する（図１ｂ）。細胞については、いくつかの小さな修正を加えて以前に報告されたカスタムビルドの光学セットアップを使用して光穿孔した（R.H. Xiong et al., Comparison of Gold Nanoparticle Mediated Photoporation: Vapor Nanobubbles Outperform Direct Heating for Delivering Macromolecules in Live Cells, Acs Nano, 8 (2014) 6288-6296）（図１ｃ）。簡潔に説明すると、パルス持続時間７ｎｓのパルスレーザーを波長６４７ｎｍで調整し（ＯｐｏｌｅｔｔｅＴＭ ＨＥ ３５５ ＬＤ、ＯＰＯＴＥＫ Ｉｎｃ、カナダ）、ナノファイバーおよびＩＯＮＰを含む構造体を照射するように応用した。コリメートされたパルスレーザービームは、１°の光整形ディフューザー（Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｏｐｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、カナダ）に向けられ、顕微鏡の入り口の前にあるアクロマートレンズおよび１０倍の対物レンズ（Ｐｌａｎ Ｆｌｕｏｒ、Ｎｉｋｏｎ）を組み合わせることで、サンプルでのレーザービーム幅は約２５０μｍとなった。レーザーパルスエネルギーを、パルスレーザーに同期したエネルギーメーター（Ｊ－２５ＭＢ－ＨＥ＆ＬＥ、Ｃｏｈｅｒｅｎｔ）によってモニタリングした。本発明に係るナノファイバーおよびＩＯＮＰ（直径約９ｍｍ）を含む構造体の上のすべての細胞をスキャンするために、電動顕微鏡のステージを使用して、固定レーザービームを通してサンプルをスキャンした。レーザーの繰り返し周波数は２０Ｈｚであるため、スキャン速度を３ｍｍ／ｓに設定し、後続のライン間の距離は０．１５ｍｍであった。このようにして、すべての細胞は、隣接する照射ゾーン間のオーバーラップ領域で最大４つまでの少なくとも１つのレーザーパルスを受けた。ジャーカット細胞またはヒトＴ細胞を用いたいくつかの実験では、本文に示されているように、細胞を複数回スキャンした。その場合、細胞を新しい場所でナノファイバーにランダムに付着させるために、細胞をウェル内に再懸濁し、各スキャンの間に再び沈降させた。トランスフェクトされた細胞を図１ｄに示す。
【0131】
［１－ｅ．光穿孔法による分子の細胞内送達］
本発明に係る構造体の光穿孔法による細胞内送達を評価するために、１０ｋＤａの赤色蛍光標識デキストラン（ＲＤ１０）を、ナノファイバーおよび０．２３体積％ ＩＯＮＰを含む構造体において培養されたＨｅＬａ細胞に添加した。上記のように、細胞を７ｎｓのパルスレーザービーム（λ＝６４７ｎｍ）でスキャンした。レーザー処理後、細胞を洗浄し、カルセインＡＭ生存率染色剤を細胞に添加した。異なるレーザーフルエンスを使用した共焦点画像の例を図２に示す。図２ａは、カルセインＡＭ生存率染色からの緑色蛍光を示す共焦点画像を示しており、最高値である０．１２Ｊ／ｃｍ２のレーザーフルエンスでのみ細胞毒性が明らかになったことが示された。図２ｂは、ＲＤ１０からの赤色蛍光を示す共焦点画像を示しており、レーザーフルエンスの増加に伴ってＲＤ１０の細胞内送達が増加していることが示された。
本発明に係る構造体の光穿孔法による細胞内送達を評価するために、１０ｋＤａの赤色蛍光標識デキストラン（ＲＤ１０）を、ナノファイバーおよび０．２３体積％ ＩＯＮＰを含む構造体において培養されたＨｅＬａ細胞に添加した。上記のように、細胞を７ｎｓのパルスレーザービーム（λ＝６４７ｎｍ）でスキャンした。レーザー処理後、細胞を洗浄し、カルセインＡＭ生存率染色剤を細胞に添加した。異なるレーザーフルエンスを使用した共焦点画像の例を図２に示す。図２ａは、カルセインＡＭ生存率染色からの緑色蛍光を示す共焦点画像を示しており、最高値である０．１２Ｊ／ｃｍ２のレーザーフルエンスでのみ細胞毒性が明らかになったことが示された。図２ｂは、ＲＤ１０からの赤色蛍光を示す共焦点画像を示しており、レーザーフルエンスの増加に伴ってＲＤ１０の細胞内送達が増加していることが示された。
【0132】
ＲＤ１０の細胞内送達および細胞生存率を、異なるＩＯＮＰ濃度で調製された様々なレーザーフルエンスおよび構造体について、共焦点顕微鏡によって体系的に評価した（図３）。送達効率をＲＤ１０陽性細胞のパーセンテージとして定量化し、生存率をカルセイン陽性細胞のパーセンテージとして表した。予想通り、レーザー照射がない場合（０Ｊ／ｃｍ２）、ＨｅＬａ細胞へのＲＤ１０の顕著な取り込みは発生しなかった。レーザー照射をすると、ＲＤ１０は、印加されたレーザーフルエンスおよびＩＯＮＰ含有量に依存する程度まで細胞に正常に送達された。レーザーフルエンスまたはＩＯＮＰ含有量を増やすと、一般的に細胞内送達をより増やすことになるが、細胞毒性もまた徐々に増加する。興味深いことに、最適な送達効率につながるレーザーフルエンスとＩＯＮＰ濃度との組み合わせがいくつか存在することを見出した。例えば、ＩＯＮＰ含有量が最小の０．０２３体積％（３．６ ＩＯＮＰ／細胞に対応）の構造体の場合、０．５６Ｊ／ｃｍ２のレーザーフルエンスにより、８５％を超える陽性細胞が得られ、細胞生存率は約８７％であった。これは、０．２３体積％のＩＯＮＰ（４３ ＩＯＮＰ／細胞）の構造体で得られたものと実質的に同一であるが、レーザーフルエンスはほぼ７分の１の０．０８Ｊ／ｃｍ２である。
【0133】
［１－ｆ．細胞のトランスフェクションのための構造体の繰り返し活性化］
当技術分野で知られているナノ粒子増感光穿孔法では、ナノ粒子、例えば、金ナノ粒子を用いるが、金ナノ粒子は最初のレーザーパルスの後に断片化する傾向があるためにたった一度だけ活性化され得るが、結果としてその光熱機能を失ってしまう。しかしながら、送達効率をさらに改善することを目的として、本発明に係る構造体の複数の照射サイクルを評価した。
当技術分野で知られているナノ粒子増感光穿孔法では、ナノ粒子、例えば、金ナノ粒子を用いるが、金ナノ粒子は最初のレーザーパルスの後に断片化する傾向があるためにたった一度だけ活性化され得るが、結果としてその光熱機能を失ってしまう。しかしながら、送達効率をさらに改善することを目的として、本発明に係る構造体の複数の照射サイクルを評価した。
【0134】
本発明に係るナノファイバーおよびＩＯＮＰを含む構造体の上の細胞を２回照射した。第１のラウンドでは、前述のようにＲＤ１０が送達された。続いて細胞を洗浄した。図４ａは、第１のラウンド後の共焦点画像を示している。次いで、１０ｋＤａの緑色蛍光ＦＩＴＣ－デキストラン高分子（ＦＤ１０）の存在下において、同じ構造体で細胞を２回照射した。第２のラウンド後の共焦点画像を図４ｂに示す。図４ａと図４ｂとの重ね合わせたものを図４ｃに示し、これによると、多くの細胞が緑色および赤色の両方の蛍光を示している。
【0135】
図５に示すフローサイトメトリーによる定量分析により、９０％の細胞がＲＤ１０およびＦＤ１０の両方に対して陽性であることを確認した。
【0136】
同じ構造体を使用して、繰り返しの光穿孔法のさらなる証拠を提供するために、ＨＥＬＡ細胞についてＦＤ１０を用いて最大４回、光穿孔した。ＦＤ１０濃度を、各光穿孔ラウンド間で２倍（０．２ｍｇ／ｍｌ～１．６ｍｇ／ｍｌ）にし、細胞内送達の増加をより簡単に確認できるようにした（拡散駆動であるため、濃度勾配を必要とする）。各光穿孔後の陽性細胞のパーセンテージを図６に示す。各光穿孔後の細胞あたりの相対蛍光強度中央値を図７に示す。陽性細胞のパーセンテージは約７０％から約９０％に増加したが（図６）、送達の増加は、細胞あたりの相対蛍光強度中央値（ｒＭＦＩ）から最も明白であり、光穿孔の追加ラウンドごとにほぼ直線的に増加した（図８）。
【0137】
［１－ｇ．光穿孔法による高分子の細胞内送達］
より大きな高分子、すなわちタンパク質またはｍＲＮＡの分子量を有する分子の細胞内送達を評価するために、４０ｋＤａ、７０ｋＤａ、１５０ｋＤａ、および５００ｋＤａのＦＩＴＣ－デキストラン（ＦＤ４０、ＦＤ７０、ＦＤ１５０およびＦＤ５００）分子を、１倍、２倍および４倍の光穿孔によってＨｅＬａ細胞に送達した。取り込みをフローサイトメトリーによって測定し、陽性細胞（図８）のパーセンテージおよびｒＭＦＩ（図９）として表した。
より大きな高分子、すなわちタンパク質またはｍＲＮＡの分子量を有する分子の細胞内送達を評価するために、４０ｋＤａ、７０ｋＤａ、１５０ｋＤａ、および５００ｋＤａのＦＩＴＣ－デキストラン（ＦＤ４０、ＦＤ７０、ＦＤ１５０およびＦＤ５００）分子を、１倍、２倍および４倍の光穿孔によってＨｅＬａ細胞に送達した。取り込みをフローサイトメトリーによって測定し、陽性細胞（図８）のパーセンテージおよびｒＭＦＩ（図９）として表した。
【0138】
図８および図９に示すように、分子量が増加するにつれて送達効率は徐々に低下し、これは、分子の組み合わせが細孔サイズと比較して大きくなり、分子拡散が遅くなるためである。光穿孔法の手順を繰り返すと、一般的にわずかにより多くの陽性細胞が得られるが、平均して細胞あたりの送達量は改善されなかった。
【0139】
図８および図９から、本発明に係る方法は、少なくとも５００ｋＤａまでの化合物で細胞をトランスフェクトすることに成功しており、トランスフェクトされた細胞のパーセンテージは、分子サイズに応じて６５～９０％の範囲である。
【0140】
［１－ｈ．光穿孔法による浮遊細胞のトランスフェクション］
本発明に係る方法が浮遊細胞のトランスフェクションにどの程度成功するかを調査するために、ジャーカット細胞（トランスフェクトが困難な初代ヒトＴ細胞のモデルとして広く使用されているヒトＴリンパ球の不死化系）を使用した。ナノファイバーおよびＩＯＮＰを含む構造体に細胞を添加する前に、初めに２ｍｇ／ｍｌ ＦＤ１０をジャーカット細胞懸濁液に添加した。細胞を５分間沈降させたが、これはファイバーウェブ上面に細胞を収集するのに十分な時間であった。その後、付着細胞の場合とまったく同じ方法でレーザービームをスキャンすることにより、それらを光穿孔した。細胞あたりの利用可能なＩＯＮＰクラスターの数を、ジャーカット細胞の面積にＩＯＮＰ密度（この場合は７．７～２８．４ ＩＯＮＰ／細胞の範囲）を掛けることによって定量化した。
本発明に係る方法が浮遊細胞のトランスフェクションにどの程度成功するかを調査するために、ジャーカット細胞（トランスフェクトが困難な初代ヒトＴ細胞のモデルとして広く使用されているヒトＴリンパ球の不死化系）を使用した。ナノファイバーおよびＩＯＮＰを含む構造体に細胞を添加する前に、初めに２ｍｇ／ｍｌ ＦＤ１０をジャーカット細胞懸濁液に添加した。細胞を５分間沈降させたが、これはファイバーウェブ上面に細胞を収集するのに十分な時間であった。その後、付着細胞の場合とまったく同じ方法でレーザービームをスキャンすることにより、それらを光穿孔した。細胞あたりの利用可能なＩＯＮＰクラスターの数を、ジャーカット細胞の面積にＩＯＮＰ密度（この場合は７．７～２８．４ ＩＯＮＰ／細胞の範囲）を掛けることによって定量化した。
【0141】
次に、レーザーフルエンスおよびＩＯＮＰ含有量の関数としてのトランスフェクション効率を調査した。図１０ａ、図１０ｂ、および１０ｃに示すように、カルセイン赤－オレンジＡＭ生存率染色剤で測定した場合、細胞生存率を犠牲にして、レーザーフルエンスの増加に伴って送達効率が増加する。同様に、所定のレーザーフルエンスのＩＯＮＰ含有量を増やすと、一般に送達効率が増加する。生存率の閾値を最小で８０％に設定すると、ナノファイバーおよび０．４６体積％ ＩＯＮＰ（～１２ ＩＯＮＰ／細胞）ならびに０．１６Ｊ／ｃｍ２のレーザーフルエンスを含む構造体で最高のトランスフェクション効率（～７５％陽性細胞）が得られた。最後に、繰り返しの光穿孔法をテストし（図１０ｄ）、細胞の生存率にほとんど影響を与えずに手順を繰り返すことで、陽性細胞のパーセンテージを増加させ得ることを再び見出した。上記実験については、ナノファイバーおよび０．４６体積％ ＩＯＮＰを含み、レーザーフルエンスが最適以下の０．０８Ｊ／ｃｍ２を使用して、上記段階的な改善をよりよく示していることに注意してほしい。後続のレーザースキャンの間に細胞を穏やかに再懸濁し、新しい場所で細胞がナノファイバーにランダムに付着するように、再び沈降させた。
【0142】
［１－ｉ．レーザー照射時にナノファイバーおよびＩＯＮＰを含む構造体からのＩＯＮＰの漏出可能性を検出するためのＩＣＰ－ＭＳ測定］
構造体の材料に包埋された電磁放射を吸収できる粒子と細胞とが直接接触しているかどうかを評価するために、光穿孔後の細胞の鉄含有量をＩＣＰ－ＭＳ（誘導結合プラズマ質量分析）で測定した。
構造体の材料に包埋された電磁放射を吸収できる粒子と細胞とが直接接触しているかどうかを評価するために、光穿孔後の細胞の鉄含有量をＩＣＰ－ＭＳ（誘導結合プラズマ質量分析）で測定した。
【0143】
ナノファイバーおよびＩＯＮＰを含む構造体への照射を、ファイバー上に細胞が存在する場合と存在しない場合とで行った。細胞が存在しない場合は、蒸留水をナノファイバーおよび粒子を含む構造体に加えた。ＩＣＰ－ＭＳ分析のためにレーザー処理した後、蒸留水を再度収集した。細胞を含むサンプルを、上記のように調製した。レーザー照射後、浮遊細胞の場合はＰＢＳで洗浄することにより、付着細胞の場合はトリプシン処理することにより細胞を収集した。最後に、１００μｌの王水（塩酸および硝酸の３：１混合物）をサンプルに添加して、存在し得る細胞またはその他の有機物を分解した。次に、鉄含有量をＩＣＰ－ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ ８８００、カリフォルニア州サンタクララ、米国）で測定した。具体的には、サンプル溶液を金属フリーのチューブで１００倍に希釈し、内部標準としてＹを添加して（最終濃度１μｇ／Ｌ）、機器の不安定性および／またはシグナルドリフトを補正し、２％ＨＮＯ３を含む１０ｍＬの最終体積とした。外部校正スタンダード（０、０．５、１、２．５、５、および１０μｇ／Ｌ Ｆｅ ＋ １μｇ／Ｌ Ｙ）を、１，０００ｍｇ／Ｌ Ｆｅ標準原液から、弱酸性溶液を使用して適切な量に希釈することにより調製し、これにより、サンプル溶液のマトリックスを模倣する。サンプル調製のすべてのステップを通して、ボルテックスミキサーを使用して溶液を完全に混合した。
【0144】
内部標準補正を、次の式に従って実施した：
ＲFe,corrは、補正された５６Ｆｅ（ＮＨ３）２＋信号応答(signal response)、ＲFeは、測定された５６Ｆｅ（ＮＨ３）２＋信号応答、およびＲYは、８９Ｙ（ＮＨ３）６＋信号応答である。相対標準偏差を、すべての計算ステップ（内部標準化および外部校正）の誤差伝搬によって計算した。Ｆｅのバックグラウンド濃度が通常わずかに上昇するため、バックグラウンド等価濃度（ＢＥＣ）が、分析性能のより代表的な測定値であるがゆえに、検出／定量限界（ＬＯＤ／ＬＯＱ）の代わりに上記ＢＥＣを計算した。ＨｅＬａ細胞およびジャーカット細胞を、ナノファイバーおよび各々０．２３体積％または０．４６体積％ ＩＯＮＰを含む構造を使用して、上記のように光穿孔した。ポジティブコントロールとして、ポリエチレングリコールでコーティングされた５００μｇ／ｍｌの３０ｎｍ ＩＯＮＰで３７℃、４時間インキュベートした細胞も含ませた。図１１に示すように、ポジティブコントロールは、両方の細胞タイプのネガティブコントロール（未処理の細胞）と比較して、実際に有意に高い鉄濃度を示した。ただし、重要なことに、光穿孔された細胞の鉄含有量は、テストされたレーザーフルエンス（０．０８～０．１６Ｊ／ｃｍ２）またはレーザースキャンの数（最大Ｎ＝４）のいずれについても未処理の細胞と有意差はなかった。これは、細胞内の鉄含有量には測定可能なほどの増加がないことを証明しているが、わずかな増加を簡単に検出し得ないほど細胞内の内因性鉄含有量がすでに相当高いと言うことができる。したがって、純粋な蒸留水に沈め、レーザー光（細胞が存在しない）で照射したときの本発明に係る構造体からの潜在的な鉄放出を評価した。図１２の結果は、ナノファイバーおよびＩＯＮＰを含む構造体へのレーザー活性化後の蒸留水中の鉄含有量が有意に増加せず、機器の検出感度である０．０８２ｍｇ／Ｌを下回ったままであることを示している。このことは、ナノファイバーおよび０．２３体積％ ＩＯＮＰを含む構造体のみならず、最大０．１６Ｊ／ｃｍ２のフルエンスで複数のレーザー活性化サイクル（最大Ｎ＝４）を行った後でも、ＩＯＮＰ含有量が最高の１．１５体積％の構造体にも当てはまった。ポジティブコントロールとして、ナノファイバーを含む構造体に存在するのと同量のファイバーを王水で分解したことにより、すべてのＩＯＮＰが放出されたに違いない。その場合、ＩＣＰ－ＭＳは、包埋されたＩＯＮＰ含有量（０．２３体積％、０．４６体積％、または１．１５体積％ ＩＯＮＰ）に比例する非常に高い鉄濃度を実際に検出した。本発明に係る構造体は、潜在的に毒性の増感ナノ粒子またはその構成要素への細胞の直接的な露出を回避しながら、レーザー活性化によって意図された効率的な細胞トランスフェクションというゴールへ到達すると結論付けることができる。
【数5】
【0145】
［１－ｊ．光穿孔法による付着細胞における効率的な遺伝子サイレンシング］
機能性高分子としてのｓｉＲＮＡの細胞内送達を評価するために、抗ｅＧＦＰ ｓｉＲＮＡを、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を安定して発現する付着性Ｈ１２９９細胞内に送達した。細胞を、０．２３体積％ ＩＯＮＰを有するコラーゲン－コーティングされたナノファイバーウェブ上で３７℃、２４時間増殖させた後、コントロールおよび抗ＧＦＰ ｓｉＲＮＡを用いて光穿孔し（０．０８Ｊ／ｃｍ２）、ＧＦＰ発現を測定する前に２４時間増殖させ続けた。５μＭ ｓｉＲＮＡを用いたトライアル実験の共焦点顕微鏡による検査では、抗ＧＦＰ ｓｉＲＮＡで処理した場合は明確なＧＦＰ発現低下が示され、コントロールｓｉＲＮＡで処理した場合は示されなかった。フローサイトメトリーでこれらの結果を確認すると、コントロールｓｉＲＮＡで処理した場合は７７％のＧＦＰ陽性細胞であったが、機能性ｓｉＲＮＡで処理した場合は２８％に減少した。ｓｉＲＮＡ濃度（０．５、１、２、５μＭ）の関数としてのノックダウン効率および細胞毒性を体系的に評価した。ｅＧＦＰの発現は、ｓｉＲＮＡ濃度が高くなると減少し、５μＭ ｓｉＲＮＡでは有意な遺伝子サイレンシングを有する細胞が７５％に達した（図１３ａ、図１３ｂ）。繰り返しの光穿孔がｓｉＲＮＡ遺伝子サイレンシングにも有益であるかどうかを評価した。実際、各スキャンで最大４回レーザースキャンを繰り返すと、ｅＧＦＰの発現は徐々に減少し、４回のレーザー照射を繰り返した後は、ノックダウン効率が最大７５％に達した。すべての条件において、ここで細胞力価－Ｇｌｏ発光アッセイ(cell Titer-Glo luminescent assay)によって測定された細胞生存率は非常に良好なままであった（＞７５％、図１３ｂ）。
機能性高分子としてのｓｉＲＮＡの細胞内送達を評価するために、抗ｅＧＦＰ ｓｉＲＮＡを、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を安定して発現する付着性Ｈ１２９９細胞内に送達した。細胞を、０．２３体積％ ＩＯＮＰを有するコラーゲン－コーティングされたナノファイバーウェブ上で３７℃、２４時間増殖させた後、コントロールおよび抗ＧＦＰ ｓｉＲＮＡを用いて光穿孔し（０．０８Ｊ／ｃｍ２）、ＧＦＰ発現を測定する前に２４時間増殖させ続けた。５μＭ ｓｉＲＮＡを用いたトライアル実験の共焦点顕微鏡による検査では、抗ＧＦＰ ｓｉＲＮＡで処理した場合は明確なＧＦＰ発現低下が示され、コントロールｓｉＲＮＡで処理した場合は示されなかった。フローサイトメトリーでこれらの結果を確認すると、コントロールｓｉＲＮＡで処理した場合は７７％のＧＦＰ陽性細胞であったが、機能性ｓｉＲＮＡで処理した場合は２８％に減少した。ｓｉＲＮＡ濃度（０．５、１、２、５μＭ）の関数としてのノックダウン効率および細胞毒性を体系的に評価した。ｅＧＦＰの発現は、ｓｉＲＮＡ濃度が高くなると減少し、５μＭ ｓｉＲＮＡでは有意な遺伝子サイレンシングを有する細胞が７５％に達した（図１３ａ、図１３ｂ）。繰り返しの光穿孔がｓｉＲＮＡ遺伝子サイレンシングにも有益であるかどうかを評価した。実際、各スキャンで最大４回レーザースキャンを繰り返すと、ｅＧＦＰの発現は徐々に減少し、４回のレーザー照射を繰り返した後は、ノックダウン効率が最大７５％に達した。すべての条件において、ここで細胞力価－Ｇｌｏ発光アッセイ(cell Titer-Glo luminescent assay)によって測定された細胞生存率は非常に良好なままであった（＞７５％、図１３ｂ）。
【0146】
［１２－ｋ．光穿孔法による初代ヒトＴ細胞における効率的な遺伝子サイレンシング］
本発明に係るナノファイバーおよびＩＯＮＰを含む構造上のヒト患者由来のＣＤ３＋Ｔ細胞の光穿孔法を評価した。０．２３体積％、１．１５体積％、２．３体積％ ＩＯＮＰを有する構造体を調製し、Ｔ細胞を０．１６Ｊ／ｃｍ２の固定レーザーフルエンスでトランスフェクトした（これがジャーカットに最適であったため）。最良のトランスフェクション効率（約３０％の陽性細胞）が、１．１５体積％のＩＯＮＰで得られた（図１４）。次に、レーザーフルエンスを最適化し、トランスフェクション効率が０．１６Ｊ／ｃｍ２で最適であることを確認した。興味深いことに、レーザーフルエンスを０．３２Ｊ／ｃｍ２に増加させても、理論シミュレーションで予測されたようなさらなるトランスフェクション効率の改善は起こらなかった。ジャーカットと同様に、繰り返しの光穿孔はＦＤ１０陽性細胞のパーセンテージを改善した（図１５）。例えば、３回の光穿孔によりトランスフェクション効率５３％が達成され、細胞生存率は６０％を超えた。これらの結果に基づいて、ヒトＴ細胞でのさらなる実験のために、Ｉ＝０．１６Ｊ／ｃｍ２、１．１５体積％ ＩＯＮＰ中性ナノファイバー、およびＮ＝３を選択した。
本発明に係るナノファイバーおよびＩＯＮＰを含む構造上のヒト患者由来のＣＤ３＋Ｔ細胞の光穿孔法を評価した。０．２３体積％、１．１５体積％、２．３体積％ ＩＯＮＰを有する構造体を調製し、Ｔ細胞を０．１６Ｊ／ｃｍ２の固定レーザーフルエンスでトランスフェクトした（これがジャーカットに最適であったため）。最良のトランスフェクション効率（約３０％の陽性細胞）が、１．１５体積％のＩＯＮＰで得られた（図１４）。次に、レーザーフルエンスを最適化し、トランスフェクション効率が０．１６Ｊ／ｃｍ２で最適であることを確認した。興味深いことに、レーザーフルエンスを０．３２Ｊ／ｃｍ２に増加させても、理論シミュレーションで予測されたようなさらなるトランスフェクション効率の改善は起こらなかった。ジャーカットと同様に、繰り返しの光穿孔はＦＤ１０陽性細胞のパーセンテージを改善した（図１５）。例えば、３回の光穿孔によりトランスフェクション効率５３％が達成され、細胞生存率は６０％を超えた。これらの結果に基づいて、ヒトＴ細胞でのさらなる実験のために、Ｉ＝０．１６Ｊ／ｃｍ２、１．１５体積％ ＩＯＮＰ中性ナノファイバー、およびＮ＝３を選択した。
【0147】
刺激されたヒトＴ細胞における光穿孔のｓｉＲＮＡ送達性能を、蛍光標識されたモデルｓｉＲＮＡ（生物学的機能なし）を用いてテストした。電気穿孔法、および従来の金ナノ粒子増感光穿孔法という、他の２つの確立された物理的トランスフェクション技術を用いて、直接的な比較を実施した。図１６において、電気穿孔法はＥＰであり、本発明に係る光穿孔法はＰＥＮであり、金ナノ粒子増感光穿孔法はＰＰである。電気穿孔法で頻繁に観察されるように、処理から生存した細胞はごくわずかであった（１４．２％、図１６ｂ）が、ほとんどすべてがｓｉＲＮＡについて陽性であった（９４．２％、図１６ａ）。両方の測定の積は、いわゆるトランスフェクション収率、つまり、生きていて、かつトランスフェクトされた細胞のパーセンテージであり、電気穿孔法ではわずか１３．５％に達したのみである。金ナノ粒子増感光穿孔法および本発明に係る構造を使用する光穿孔法は両方とも、細胞生存率が６０％を超え、かつ陽性細胞が４０～５０％であったので、細胞に対してはるかに穏やかであった。これにより、本発明に係る構造体を使用する光穿孔法のトランスフェクション収率は３５％、金ナノ粒子増感光穿孔法のトランスフェクション収率は３０％という結果になった（図１６ｂ）。したがって、本発明に係る光穿孔法を用いたトランスフェクション収率は、従来の光穿孔法と同様であるが、電気穿孔法よりも２．５倍以上優れていると結論付けることができる。後者は、この結果が本発明に係る粒子と細胞との間の直接的な接触なしに得られるという事実を考えると、驚くべき成果である。
【0148】
機能的なｓｉＲＮＡによる遺伝子サイレンシングを評価するために、ＰＤ－１受容体を標的とした。初日、Ｔ細胞をドナーから収集し、第１回目の刺激を行った。７日後、細胞をｓｉＲＮＡのトランスフェクションのために収集し、第２回目の刺激を行った。細胞を１μＭ ｓｉＰＤ１でトランスフェクトし、ＰＤ－１抗体染色後にフローサイトメトリーにより、２４時間、４８時間、７２時間後のＰＤ１発現を定量した。トランスフェクションを、電気穿孔法、光穿孔法、金ナノ粒子増感光穿孔法の間で再度比較した。例示的なフローサイトメトリーヒストグラムが図１７に示され、ｋは、コントロールｓｉＲＮＡおよびｓｉＰＤ１を用いた光穿孔法の４８時間後の細胞で、後者の場合のＰＤ１発現の減少を示している。生細胞の全集団にわたるＰＤ－１抗体染色の減少から、ノックダウン効率を経時的に定量化した（図１８）。３つのトランスフェクション方法すべてで同様のレベルのＰＤ－１遺伝子サイレンシングが得られ、４８時間後に最大４０％のノックダウンに達していた。光穿孔法はその毒性の低さゆえ、電気穿孔法よりも２．５倍高いトランスフェクション収率を示すことを念頭に置きつつ、該光穿孔法は養子Ｔ細胞治療のために操作されたＴ細胞を製造するための非常に有望で効果的なトランスフェクション法であることを確認する。
【0149】
図１９は、Ｈ１２９９におけるＣａｓ－９遺伝子ノックアウトに対する１％ ＩＯＮＰを有するポリカプロラクトン（ＰＣＬ）由来のナノファイバーを含む構造の適用を示す。図１９ａは、ＧＦＰ発現をノックアウトするように設計された４μＭのＣａｓ－９リボヌクレオプロテインによる光穿孔法の前（左）および後（右）に、ＧＦＰを安定して発現するＨ１２９９細胞の緑色蛍光を示す共焦点画像を示している。サンプルは、０．０８Ｊ／ｃｍ２のレーザーフルエンスで１回スキャンした。図１９ｂは、対応するサイトメトリーヒストグラムを示しており、各々９０．５％および３３．５％のｅＧＦＰ陽性細胞を用いた光穿孔法の前後でｅＧＦＰ発現が細胞集団全体にわたってどのように分布しているかを図示している。図１９ｃおよび図１９ｄは、Ｈ１２９９細胞の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）およびノックダウン効率（＝ｅＧＦＰ陰性細胞のパーセンテージ）をそれぞれ示しており、該Ｈ１２９９細胞については、Ｃａｓ－９リボヌクレオプロテインの濃度を増加させながら（０．５、１、２、４μＭ）、かつ０．５μＭの濃度で複数回（Ｎ＝２、３、４）光穿孔している。
【0150】
Ｈ９ヒト胚性幹細胞における高分子送達に対する１％ ＩＯＮＰを有するポリカプロラクトン（ＰＣＬ）由来のナノファイバーを含む構造体の適用を示す。
【0151】
図２０aは、光穿孔前（上段）、１回の光穿孔サイクル後（２段目）、および２回の光穿孔サイクル後（下段）における１０ｋＤａ（ＲＤ１０）の蛍光標識デキストランの送達が成功したことを示す共焦点画像を示している。生細胞をカルセインＡＭで染色し、死細胞はヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の陽性シグナルで認識できる。光穿孔法を０．０８Ｊ／ｃｍ２のレーザーフルエンスを用いて実施した。
【0152】
図２０ｂは、レーザーフルエンス（Ｉ＝０．０８、０．１２、０．２４Ｊ／ｃｍ２）および複数の光穿孔サイクル（Ｎ＝２、３、４）の関数として、画像処理によって定量化した細胞生存率およびＲＤ陽性細胞のパーセンテージを示す。
【0153】
［実施例２ ポリマー材料およびナノ粒子を含む非多孔質構造］
図２１ａは、本発明に係る構造体１の実施形態の概略図を示す。図２１ｂは、線Ａ－Ａ'に沿った図２１ａに示される構造体１の断面図を示す。構造体１は、ポリマー材料２および電磁放射を吸収することができる粒子３を含むポリマーシートを含む。粒子３は、例えば、炭素粒子もしくは酸化鉄粒子、または炭素粒子と酸化鉄粒子との組み合わせを含む。粒子３は、材料２に包埋されており、例えば、平均球相当径ｄが１０００ｎｍである。
図２１ａは、本発明に係る構造体１の実施形態の概略図を示す。図２１ｂは、線Ａ－Ａ'に沿った図２１ａに示される構造体１の断面図を示す。構造体１は、ポリマー材料２および電磁放射を吸収することができる粒子３を含むポリマーシートを含む。粒子３は、例えば、炭素粒子もしくは酸化鉄粒子、または炭素粒子と酸化鉄粒子との組み合わせを含む。粒子３は、材料２に包埋されており、例えば、平均球相当径ｄが１０００ｎｍである。
【0154】
構造体の厚さｔは、０．１μｍ～１００μｍの範囲であり、例えば１μｍ、２μｍまたは５μｍの厚さである。
【0155】
構造体の体積Ｖに対する構造の自由エリア表面の面積Ｓの比、すなわちＳ／Ｖ比は、１／ｔに対応する。
【0156】
ポリマーシートは、好ましくは、ポリスチレン、ポリカプロラクトン、エチルセルロース、セルロースアセトフタレートまたはポリ乳酸－ｃｏ－グリコール酸、セルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、コラーゲン、シルク、アルギン酸塩、ヒアルロン酸、デキストラン、デンプン、ポリカーボネートまたはポリアクリレートを含むか、またはそれらをベースとする。
【0157】
粒子は、０．００１体積～２０体積％（体積粒子／体積構造）の範囲の濃度で、例えば、１体積％、２体積％または５体積％の濃度で、材料中に存在する。
【0158】
好ましくは、すべてまたは実質的にすべての粒子が構造体の材料に完全に包埋され、これは、構造体のすべてまたは構造体の実質的にすべての粒子が構造体の材料によって完全に囲まれ、全ての粒子がまたは実質的に全ての粒子が、構造の自由エリア表面に露出されていないことを意味する。
【0159】
構造体内に存在する少なくとも６０％の粒子は、この粒子と自由エリア表面Ｓとの最短距離Ｌが１ｎｍ～１００ｎｍの範囲になるように材料に包埋される。
【0160】
図２２は、ＩＯＮＰを有さないＰＬＡフィルム（２％ＰＬＡ）（コントロール）、０．００５％ＩＯＮＰを有するＰＬＡフィルム（２％ＰＬＡ）、０．０１％ＩＯＮＰを有するＰＬＡフィルム（２％ＰＬＡ）、０．１％ＩＯＮＰを有するＰＬＡフィルム（２％ＰＬＡ）を用いたＨｅＬａ細胞の光穿孔法に対する、ＦＤ５００（ＦＩＣＴ－デキストラン５００ｋＤａ）陽性細胞のパーセンテージ、細胞力価－Ｇｌｏ代謝アッセイで測定した細胞の生存率、および相対蛍光強度中央値を示す。
【0161】
さらに、ＦＤ５００陽性細胞のパーセンテージ、生存率、および相対蛍光強度中央値（ｒＭＦＩ）を、各々、０．３Ｊ／ｃｍ２（＝Ｅ１）、０．５Ｊ／ｃｍ２（＝Ｅ２）、０．８４Ｊ／ｃｍ２（＝Ｅ３）、１．２６Ｊ／ｃｍ２（＝Ｅ４）、および１．６Ｊ／ｃｍ２（＝Ｅ５）という異なるレーザーフルエンスを使用して、０．０２５％ＩＯＮＰを有するＰＬＡフィルム（２％ＰＬＡ）を使用したＨｅＬａ細胞の光穿孔法（１光穿孔サイクル）について決定した。結果を図２３に示す。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21a】
【図21b】
【図22】
【図23】
【国際調査報告】