特表 2022-549276 ＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲＡに基づくヘテロ二量体タンパク質複合体を含む、イムノサイトカイン

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-11-24

(54)【発明の名称】ＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲＡに基づくヘテロ二量体タンパク質複合体を含む、イムノサイトカイン

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20221116BHJP

   C07K 14/715 20060101ALI20221116BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20221116BHJP

   C07K 14/54 20060101ALI20221116BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20221116BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20221116BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20221116BHJP

   C12N 15/24 20060101ALI20221116BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20221116BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20221116BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20221116BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20221116BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20221116BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20221116BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20221116BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20221116BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20221116BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20221116BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20221116BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z

C07K14/715 ZNA

C07K19/00

C07K14/54

C07K16/28

C12N15/13

C12N15/12

C12N15/24

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/02 C

A61K38/20

A61P35/00

A61P37/06

A61P43/00 111

A61K39/395 N

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022518285

(86)(22)【出願日】2020-09-20

(85)【翻訳文提出日】2022-05-23

(86)【国際出願番号】 RU2020050233

(87)【国際公開番号】W WO2021054867

(87)【国際公開日】2021-03-25

(31)【優先権主張番号】2019129569

(32)【優先日】2019-09-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】RU

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】516261966

【氏名又は名称】ジョイント・ストック・カンパニー “バイオキャド”

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100107386

【弁理士】

【氏名又は名称】泉谷 玲子

(72)【発明者】

【氏名】ウリティン，アンドレイ・ボリソビッチ

(72)【発明者】

【氏名】コノノフ，アレクセイ・ウラディミロビッチ

(72)【発明者】

【氏名】アゲエフ，セルゲイ・アンドレービッチ

(72)【発明者】

【氏名】ゴルディエフ，アレクサンドル・アンドレービッチ

(72)【発明者】

【氏名】ビノグラドーワ，エレーナ・ウラジミロフナ

(72)【発明者】

【氏名】エフドキモフ，スタニスラフ・ルドルフォビッチ

(72)【発明者】

【氏名】シュマコーワ，アレクサンドラ・パブロフナ

(72)【発明者】

【氏名】ミトロシン，イワン・ウラディミロビッチ

(72)【発明者】

【氏名】モロゾフ，ドミトリー・バレンチノビッチ

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG03

4B064AG20

4B064AG26

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA87X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065AC20

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4C084AA02

4C084AA07

4C084BA01

4C084BA02

4C084BA41

4C084CA53

4C084DA12

4C084NA14

4C084ZB081

4C084ZB082

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZC41

4C085AA14

4C085BB11

4C085BB36

4C085BB41

4C085BB42

4C085BB43

4C085DD62

4C085EE01

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA02

4H045DA50

4H045DA75

4H045EA20

4H045EA50

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒαに基づくヘテロ二量体タンパク質複合体を含むイムノサイトカインに、そして療法剤としての、特に癌および自己免疫疾患の治療のための剤としてのその使用に関する。本発明はさらに、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒαに基づくヘテロ二量体タンパク質複合体および免疫調節抗体を含むイムノサイトカインに、そして療法剤としての、特に癌および自己免疫疾患の治療のための剤としてのその使用に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＩＬ－１５Ｒベータ／ガンマ陽性細胞の活性化および／または増殖を刺激するためのイムノサイトカインであって：
１）以下に連結されているＩＬ－１５Ｒα
ａ）抗体軽鎖定常ドメイン、または
ｂ）第一の（ＣＨ１）重鎖定常ドメインならびに第二の（ＣＨ２）および第三の（ＣＨ３）重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む、抗体重鎖定常ドメイン；
２）以下に連結されているＩＬ－１５
ａ）第一の（ＣＨ１）重鎖定常ドメインならびに第二の（ＣＨ２）および第三の（ＣＨ３）重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む、抗体重鎖定常ドメイン、または
ｂ）抗体軽鎖定常ドメイン
を含む、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒαに基づくヘテロ二量体タンパク質複合体を含み；
ヘテロ二量体複合体内の第一の抗体重鎖定常ドメインおよび抗体軽鎖定常ドメインが、天然Ｓ－Ｓ架橋を通じた共有会合を持つかまたは持たず、そして
ＩＬ－１５またはＩＬ－１５Ｒαが抗体軽鎖定常ドメインに連結されている場合、ＩＬ－１５ＲαまたはＩＬ－１５より選択されるヘテロ二量体タンパク質複合体のもう一方の部分が抗体重鎖定常ドメインに連結されている
前記イムノサイトカイン。

【請求項2】

抗体軽鎖定常ドメインがＣＫまたはＣＬより選択される、請求項１のイムノサイトカイン。

【請求項3】

ＩＬ－１５Ｒαが、配列番号９によって示されるアミノ酸配列、または類似の生物学的活性を有する任意の既知の突然変異体ＩＬ－１５Ｒα変異体を有する、請求項１のイムノサイトカイン。

【請求項4】

ＩＬ－１５が、配列番号１０によって示されるアミノ酸配列、または類似の生物学的活性を有する任意の既知の突然変異体ＩＬ－１５変異体を有する、請求項１のイムノサイトカイン。

【請求項5】

ＩＬ－１５Ｒαが抗体軽鎖定常ドメインに連結されている、請求項１のイムノサイトカイン。

【請求項6】

抗体軽鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５Ｒαが、配列番号１または配列番号１９によって示されるアミノ酸配列を有する、請求項５のイムノサイトカイン。

【請求項7】

ＩＬ－１５が抗体軽鎖定常ドメインに連結されている、請求項１のイムノサイトカイン。

【請求項8】

抗体軽鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５が、配列番号３または配列番号２１によって示されるアミノ酸配列を有する、請求項７のイムノサイトカイン。

【請求項9】

第一の（ＣＨ１）重鎖定常ドメイン、ならびに第二の（ＣＨ２）および第三の（ＣＨ３）重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体が、ヒンジを通じて連結されている、請求項１のイムノサイトカイン。

【請求項10】

ＩＬ－１５またはＩＬ－１５Ｒαが、以下の順序：ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３で配置された抗体重鎖定常ドメインに連結されている、請求項１のイムノサイトカイン。

【請求項11】

ＩＬ－１５Ｒαが抗体重鎖定常ドメインに連結されている、請求項１０のイムノサイトカイン。

【請求項12】

抗体重鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５Ｒαが、配列番号４または配列番号２２によって示されるアミノ酸配列を有する、請求項１１のイムノサイトカイン。

【請求項13】

ＩＬ－１５が抗体重鎖定常ドメインに連結されている、請求項１０のイムノサイトカイン。

【請求項14】

抗体重鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５が、配列番号２または配列番号２０によって示されるアミノ酸配列を有する、請求項１３のイムノサイトカイン。

【請求項15】

抗体軽鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５Ｒαが、配列番号１または配列番号１９によって示されるアミノ酸配列を有し、そして
抗体重鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５が、配列番号２または配列番号２０によって示されるアミノ酸配列を有する
請求項１のイムノサイトカイン。

【請求項16】

抗体重鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５Ｒαが、配列番号４または配列番号２２によって示されるアミノ酸配列を有し、そして
抗体軽鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５が、配列番号３または配列番号２１によって示されるアミノ酸配列を有する
請求項１のイムノサイトカイン。

【請求項17】

請求項１のイムノサイトカインであって、前記イムノサイトカインにおいて、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、および／またはＡＤＣＰ特性の不全を引き起こす、Ｆｃ断片単量体中の突然変異を含む、前記イムノサイトカイン。

【請求項18】

Ｆｃ断片がＩｇＧに属する、請求項１のイムノサイトカイン。

【請求項19】

Ｆｃ断片アイソタイプが：ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４を含む群より選択される、請求項１８のイムノサイトカイン。

【請求項20】

ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒαに基づく上記２つのヘテロ二量体タンパク質複合体を含む、請求項１～１９のいずれかのイムノサイトカイン。

【請求項21】

癌または自己免疫疾患の治療のための療法剤として使用するための、請求項２０のイムノサイトカイン。

【請求項22】

ＩＬ－１５Ｒベータ／ガンマ陽性細胞の活性化および／または増殖を刺激するためのイムノサイトカインであって、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒαに基づくヘテロ二量体タンパク質複合体、およびＰＤ－１経路を特異的に阻害する免疫調節抗体またはその抗原結合断片を含み、
ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒαに基づくヘテロ二量体タンパク質複合体が：
１）以下に連結されているＩＬ－１５Ｒα
ａ）抗体軽鎖定常ドメイン、または
ｂ）第一の（ＣＨ１）重鎖定常ドメインならびに第二の（ＣＨ２）および第三の（ＣＨ３）重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む、抗体重鎖定常ドメイン；
２）以下に連結されているＩＬ－１５
ａ）第一の（ＣＨ１）重鎖定常ドメインならびに第二の（ＣＨ２）および第三の（ＣＨ３）重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む、抗体重鎖定常ドメイン、または
ｂ）抗体軽鎖定常ドメイン
を含み；
ヘテロ二量体複合体内の第一の抗体重鎖定常ドメインおよび抗体軽鎖定常ドメインが、天然Ｓ－Ｓ架橋を通じた共有会合を持つかまたは持たず、そして
ＩＬ－１５またはＩＬ－１５Ｒαが抗体軽鎖定常ドメインに連結されている場合、ＩＬ－１５ＲαまたはＩＬ－１５より選択されるヘテロ二量体タンパク質複合体のもう一方の部分が抗体重鎖定常ドメインに連結されている
前記イムノサイトカイン。

【請求項23】

抗体軽鎖定常ドメインがＣＫまたはＣＬより選択される、請求項２２のイムノサイトカイン。

【請求項24】

ＩＬ－１５Ｒαが、配列番号９によって示されるアミノ酸配列、または類似の生物学的活性を有する任意の既知の突然変異体ＩＬ－１５Ｒα変異体を有する、請求項２２のイムノサイトカイン。

【請求項25】

ＩＬ－１５が、配列番号１０によって示されるアミノ酸配列、または類似の生物学的活性を有する任意の既知の突然変異体ＩＬ－１５変異体を有する、請求項２２のイムノサイトカイン。

【請求項26】

ＩＬ－１５Ｒαが抗体軽鎖定常ドメインに連結されている、請求項２２のイムノサイトカイン。

【請求項27】

抗体軽鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５Ｒαが、配列番号１または配列番号１９によって示されるアミノ酸配列を有する、請求項２６のイムノサイトカイン。

【請求項28】

ＩＬ－１５が抗体軽鎖定常ドメインに連結されている、請求項２２のイムノサイトカイン。

【請求項29】

抗体軽鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５が、配列番号３または配列番号２１によって示されるアミノ酸配列を有する、請求項２８のイムノサイトカイン。

【請求項30】

第一の（ＣＨ１）重鎖定常ドメイン、ならびに第二の（ＣＨ２）および第三の（ＣＨ３）重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体が、ヒンジを通じて連結されている、請求項２２のイムノサイトカイン。

【請求項31】

ＩＬ－１５またはＩＬ－１５Ｒαが、以下の順序：ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３で配置された抗体重鎖定常ドメインに連結されている、請求項２２のイムノサイトカイン。

【請求項32】

ＩＬ－１５Ｒαが抗体重鎖定常ドメインに連結されている、請求項３１のイムノサイトカイン。

【請求項33】

抗体重鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５Ｒαが、配列番号６または配列番号２４によって示されるアミノ酸配列を有する、請求項３２のイムノサイトカイン。

【請求項34】

ＩＬ－１５が抗体重鎖定常ドメインに連結されている、請求項３１のイムノサイトカイン。

【請求項35】

抗体重鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５が、配列番号５または配列番号２３によって示されるアミノ酸配列を有する、請求項３４のイムノサイトカイン。

【請求項36】

ＰＤ－１経路を特異的に阻害する免疫調節抗体またはその抗原結合断片が、ＰＤ－１に特異的に結合する抗体である、請求項２２のイムノサイトカイン。

【請求項37】

免疫調節抗体が：
ａ）軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む軽鎖；
ｂ）重鎖可変ドメイン、ならびに第一の（ＣＨ１）重鎖定常ドメイン、および第二の（ＣＨ１）および第三の（ＣＨ３）重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む、抗体重鎖定常ドメインを含む、重鎖
を含む、請求項２２のイムノサイトカイン。

【請求項38】

軽鎖可変ドメインが、それぞれ配列番号１４、配列番号１５、および配列番号１６のアミノ酸配列によって示されるＬＣＤＲ １、２、および３（超可変領域１、２、および３）を含む、請求項３７のイムノサイトカイン。

【請求項39】

軽鎖可変ドメインが配列番号１８によって示されるアミノ酸配列を含む、請求項３８のイムノサイトカイン。

【請求項40】

重鎖可変ドメインが、それぞれ配列番号１１、配列番号１２、および配列番号１３のアミノ酸配列によって示される、ＨＣＤＲ １、２、および３（超可変領域１、２、および３）を含む、請求項３７のイムノサイトカイン。

【請求項41】

重鎖可変ドメインが配列番号１７によって示されるアミノ酸配列を含む、請求項４０のイムノサイトカイン。

【請求項42】

１）軽鎖可変ドメインが、それぞれ配列番号１４、配列番号１５、および配列番号１６のアミノ酸配列によって示される、ＬＣＤＲ １、２、および３（超可変領域１、２、および３）を含み、
２）重鎖可変ドメインが、それぞれ配列番号１１、配列番号１２、および配列番号１３のアミノ酸配列によって示される、ＨＣＤＲ １、２、および３（超可変領域１、２、および３）を含む
請求項３７のイムノサイトカイン。

【請求項43】

１）軽鎖可変ドメインが配列番号１８によって示されるアミノ酸配列を含み；
２）重鎖可変ドメインが配列番号１７によって示されるアミノ酸配列を含む
請求項４２のイムノサイトカイン。

【請求項44】

免疫調節抗体が配列番号８によって示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項３７のイムノサイトカイン。

【請求項45】

免疫調節抗体が配列番号７によって示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項３７のイムノサイトカイン。

【請求項46】

免疫調節抗体が：
配列番号７によって示されるアミノ酸配列を含む重鎖；
配列番号８によって示されるアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、請求項３７のイムノサイトカイン。

【請求項47】

ＰＤ－１経路を特異的に阻害する免疫調節抗体またはその抗原結合断片が、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗体である、請求項２２のイムノサイトカイン。

【請求項48】

ａ）ヘテロ二量体タンパク質複合体が、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒαに基づいて：
配列番号１または配列番号１９によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体軽鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５Ｒα、および
配列番号５または配列番号２３によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体重鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５
を含み；
ｂ）免疫調節抗体が：
配列番号７によって示されるアミノ酸配列を含む重鎖；
配列番号８によって示されるアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、請求項２２のイムノサイトカイン。

【請求項49】

ａ）抗体重鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５Ｒαが、配列番号６または配列番号２４によって示されるアミノ酸配列を有し、そして
抗体軽鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５が、配列番号３または配列番号２１によって示されるアミノ酸配列を有し；
ｂ）免疫調節抗体が：
配列番号７によって示されるアミノ酸配列を含む重鎖；
配列番号８によって示されるアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、請求項２２のイムノサイトカイン。

【請求項50】

２つの異なる部分のヘテロ二量体化を誘導する、抗体定常ドメイン中の突然変異を有する、請求項２２または３７のイムノサイトカインであって、部分の一方が、共有的にまたは非共有的に会合した、抗体定常ドメインに連結されているＩＬ－１５Ｒαおよび抗体定常ドメインに連結されているＩＬ－１５を含み、そしてもう一方の部分が、共有的にまたは非共有的に会合した、抗体の軽鎖および重鎖を含む、前記イムノサイトカイン。

【請求項51】

第一のＦｃ単量体および第二のＦｃ単量体が、以下の群：第一のＦｃ単量体がノブ修飾Ｆｃであり、そして第二のＦｃ単量体がホール修飾Ｆｃである場合、または第二のＦｃ単量体が信修飾Ｆｃであり、そして第一のＦｃ単量体がホール修飾Ｆｃである場合より選択される、請求項２２または３７のいずれかのイムノサイトカイン。

【請求項52】

ａ）第一のＦｃ単量体がアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗを有し、そして第二のＦｃ単量体がアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖを有し、
ｂ）第一のＦｃ単量体がアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７を有し、そして第二のＦｃ単量体がアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗを有する
請求項５１のイムノサイトカイン。

【請求項53】

Ｆｃ断片がＩｇＧに属する、請求項２２または３７のいずれかのイムノサイトカイン。

【請求項54】

Ｆｃ断片アイソタイプが：ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４を含む群より選択される、請求項５３のイムノサイトカイン。

【請求項55】

請求項２２または３７のいずれかのイムノサイトカインであって、前記イムノサイトカインにおいて、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、および／またはＡＤＣＰ特性の不全を引き起こす、Ｆｃ断片単量体中の突然変異を有する、前記イムノサイトカイン。

【請求項56】

腫瘍性疾患または自己免疫疾患の治療のための、請求項２２～５５のいずれかのイムノサイトカイン。

【請求項57】

請求項１～２０または２２～５５のいずれかのイムノサイトカインをコードする単離核酸。

【請求項58】

核酸がＤＮＡである、請求項５７の核酸。

【請求項59】

請求項５７～５８のいずれかの核酸を含む、発現ベクター。

【請求項60】

請求項５９のベクターで細胞を形質転換する工程を含む、請求項１～２０または２２～５５のいずれかのイムノサイトカインを産生するための宿主細胞を産生するための方法。

【請求項61】

請求項５７～５８のいずれかの核酸を含む、請求項１～２０または２２～５５のいずれかのイムノサイトカインを産生するための宿主細胞。

【請求項62】

請求項１～２０または２２～５５のいずれかのイムノサイトカインを含む産物を産生するための方法であって、請求項６１の宿主細胞を、前記イムノサイトカインを産生するために十分な条件下で、培地中で培養し、必要であれば、その後、産生されたイムノサイトカインを単離および精製する工程を含む、前記方法。

【請求項63】

１つまたはそれより多くの薬学的に許容されうる賦形剤と組み合わせた、療法的有効量の請求項１～２０または２２～５５のいずれかのイムノサイトカインを含む、ＩＬ－１５Ｒベータ／ガンマ陽性細胞の活性化および／または増殖を刺激するための薬学的組成物。

【請求項64】

腫瘍性疾患または自己免疫疾患の治療のための、請求項６３の薬学的組成物。

【請求項65】

腫瘍性疾患が：ＨＮＳＣＣ（頭頸部扁平上皮癌）、子宮頸癌、未知の原発性癌、神経膠芽腫、食道癌、膀胱癌、ＴＮＢＣ（トリプルネガティブ乳癌）、ＣＲＣ（結腸直腸癌）、肝細胞癌、黒色腫、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）、腎臓癌、卵巣癌、ＭＳＩ ＣＲＣ（マイクロサテライト不安定性を伴う結腸直腸癌）、白血病（急性白血病または骨髄芽球性白血病）、リンパ腫、多発性骨髄腫、黒色腫、乳癌、結腸直腸癌、前立腺癌、膀胱癌、肉腫、肝細胞癌、神経膠芽腫、ホジキンリンパ腫、ＴおよびＢ細胞急性リンパ芽球性白血病、小細胞肺癌、急性骨髄芽球性白血病、難治性非ホジキンＢ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、頭頸部扁平上皮癌、膵臓癌、卵巣癌、急性骨髄芽球性白血病および高リスク骨髄異形成症候群を含む群より選択される、請求項６４の薬学的組成物。

【請求項66】

腫瘍性疾患の治療法であって、こうした治療が必要な被験体に、請求項１～２０または２２～５５のいずれかのイムノサイトカイン、あるいは請求項６３の薬学的組成物を、療法的有効量で投与する、前記方法。

【請求項67】

腫瘍性疾患が：ＨＮＳＣＣ（頭頸部扁平上皮癌）、子宮頸癌、未知の原発性癌、神経膠芽腫、食道癌、膀胱癌、ＴＮＢＣ（トリプルネガティブ乳癌）、ＣＲＣ（結腸直腸癌）、肝細胞癌、黒色腫、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）、腎臓癌、卵巣癌、ＭＳＩ ＣＲＣ（マイクロサテライト不安定性を伴う結腸直腸癌）、白血病（急性白血病または骨髄芽球性白血病）、リンパ腫、多発性骨髄腫、黒色腫、乳癌、結腸直腸癌、前立腺癌、膀胱癌、肉腫、肝細胞癌、神経膠芽腫、ホジキンリンパ腫、ＴおよびＢ細胞急性リンパ芽球性白血病、小細胞肺癌、急性骨髄芽球性白血病、難治性非ホジキンＢ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、頭頸部扁平上皮癌、膵臓癌、卵巣癌、急性骨髄芽球性白血病および高リスク骨髄異形成症候群を含む群より選択される、請求項５５の治療法。

【請求項68】

Ｔ細胞集団またはＮＫ細胞集団の生物学的活性の活性化を必要とする被験体において、こうした活性を活性化するための方法であって、請求項１～２０または２２～５５のいずれかのイムノサイトカイン、あるいは請求項６３の薬学的組成物の有効量を被験体に投与する工程を含む、前記方法。

【請求項69】

腫瘍性疾患の治療を必要とする被験体における治療のための、請求項１～２０または２２～５５のいずれかのイムノサイトカイン、あるいは請求項６３の薬学的組成物の使用。

【請求項70】

腫瘍性疾患が：ＨＮＳＣＣ（頭頸部扁平上皮癌）、子宮頸癌、未知の原発性癌、神経膠芽腫、食道癌、膀胱癌、ＴＮＢＣ（トリプルネガティブ乳癌）、ＣＲＣ（結腸直腸癌）、肝細胞癌、黒色腫、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）、腎臓癌、卵巣癌、ＭＳＩ ＣＲＣ（マイクロサテライト不安定性を伴う結腸直腸癌）、白血病（急性白血病または骨髄芽球性白血病）、リンパ腫、多発性骨髄腫、黒色腫、乳癌、結腸直腸癌、前立腺癌、膀胱癌、肉腫、肝細胞癌、神経膠芽腫、ホジキンリンパ腫、ＴおよびＢ細胞急性リンパ芽球性白血病、小細胞肺癌、急性骨髄芽球性白血病、難治性非ホジキンＢ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、頭頸部扁平上皮癌、膵臓癌、卵巣癌、急性骨髄芽球性白血病および高リスク骨髄異形成症候群を含む群より選択される、請求項６９の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒαに基づくヘテロ二量体タンパク質複合体を含むイムノサイトカインに、そして療法剤としての、特に癌および自己免疫疾患の治療のための剤としてのその使用に関する。本発明はさらに、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒαに基づくヘテロ二量体タンパク質複合体および免疫調節抗体を含むイムノサイトカインに、そして療法剤としての、特に癌および自己免疫疾患の治療のための剤としてのその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

サイトカインは、シグナル伝達タンパク質および糖タンパク質のカテゴリーであり、ホルモンおよび神経伝達物質同様、細胞コミュニケーションに広く用いられている。ホルモンは特定の臓器から血液に分泌され、そして神経伝達物質は神経活性に関連付けられるが、サイトカインは、起源および目的に関して、より多様なクラスの化合物である。これらは、非常に多様な造血細胞および非造血細胞によって産生され、そして近傍の細胞および生物全体の両方に影響を及ぼす可能性もあり、そして時に、他の化学物質の存在に強く依存する。サイトカインファミリーは、主に、８～３０ｋＤａの間の範囲の質量を持つ小分子水溶性タンパク質および糖タンパク質からなる。サイトカインは、自然免疫反応および適応免疫反応の両方の発展および機能に非常に重要である。これらはしばしば、病原体に遭遇した免疫細胞によって分泌され、それによってさらなる免疫細胞を活性化し、そして補充して、病原体に対する系の反応を増加させる。

【0003】

サイトカインの中でも、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）は、ＩＬ－２に構造的類似性を有するサイトカインであり；前者は、ウイルス（単数または複数）感染後、あるいは「非自己」と認識されるかまたは弱っている細胞による間接刺激後に、単核貪食細胞（およびいくつかの他の細胞）によって分泌される。このサイトカインは、ナチュラルキラー細胞；その主な役割がウイルス感染細胞を殺すことである自然免疫系の細胞の細胞増殖を誘導する。この遺伝子にコードされるタンパク質は、Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞活性化および増殖を制御するサイトカインである。

【0004】

インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）は、Ｔ細胞活性化因子として２つのグループによって同時に同定された１４～１５ｋＤａの糖タンパク質である（Ｇｒａｂｓｔｅｉｎ， Ｋ．Ｈ．ら， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９４， ２６４， ９６５； Ｂｕｒｔｏｎ， Ｊ．Ｄ．ら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １９９４， ９１， ４９３５）。ＩＬ－１５ ｍＲＮＡは、異なる細胞および組織で広く発現されているが、翻訳および細胞内輸送のレベルで、その発現が強く転写後調節されているため、これらの細胞中または細胞上清中でこのタンパク質を発見することは困難である（Ｂａｍｆｏｒｄ ＲＮ．ら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９８， １６０：４４１８－４４２６； Ｋｕｒｙｓ Ｇら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２０００， ２７５：３０６５３－３０６５９）。さらに、ＩＬ－１５は、膜タンパク質として、活性型で存在しうることが示されてきており（Ｍｕｓｓｏら， Ｂｌｏｏｄ １９９９， Ｖｏｌ． ９３， Ｎｏ １０（５月１５日）： ｐｐ ３５３１－３５３９）、そして近年、ＩＬ－１５はリガンドとしてまたは受容体としてのいずれかで機能して（Ｂｕｄａｌｇｉａｎら， ＪＢＣ ２００４， ｖｏｌ ２７９， Ｎｏ ４０： ｐｐ ４２１９２－４２２０１）、この経路を通じて、炎症促進性サイトカインの分泌を誘導することが注目された。可溶性タンパク質の高発現レベルは、自己免疫および炎症性疾患の病因形成に関連付けられてきている。ＩＬ－１５は、クローン病（Ｋｉｒｍａｎ Ｉ．， １９９６， Ａｍ． Ｊ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ． ９１， １７８９）、乾癬（Ｒｕｃｋｅｒｔ Ｒ． ２０００， １６５：２２４０－２２５０）、白血病（Ｙａｍａｄａ Ｙ． １９９９， Ｌｅｕｋｅｍｉａ ａｎｄ Ｌｙｍｐｈｏｍａ， ３５（１－２）：３７－４５）および関節リウマチ（ＲＡ）（Ｍｃｌｎｎｅｓ Ｉ．Ｂ． １９９８， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ， １９， ７５－７９）を含むいくつかの疾患において検出されてきている。リガンドがＴ細胞受容体に結合すると、ＩＬ－１５Ｒαの発現、ならびにいくつかの活性化抗原、例えばＣＤ６９、ＣＤ２５およびＴＮＦＲＩＩの発現が誘導される。さらに、ＩＬ－１５は、ヒト血中Ｔリンパ球の化学誘引剤である（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ １９９５， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８１， １２５５－１２５９）。これらのデータはすべて、抗原提示細胞によって発現されるＩＬ－１５が、炎症部位での初期Ｔ細胞活性化に対して重要でありうることを示唆する。

【0005】

ＩＬ－１５は、サイトカインの小分子４アルファらせん束ファミリーのメンバーである。ＩＬ－１５の生物学的効果は、３つのサブユニット、α、β、およびγで構成される細胞膜受容体への結合を通じて仲介される。ＩＬ－１５Ｒαは、非常に高いアフィニティＫｄ １０^－１１で結合するこのサイトカインに特異的なサブユニットであり、そして膜受容体としてまたは可溶性型で見出されうる（Ｂｕｄａｇｉａｎ Ｖ．ら， ＪＢＣ ２００４， ２７９， ３９：４０３６８－４０３７５； Ｍｏｒｔｉｅｒら， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ２００４， １７３：１６８１－１６８８）。ＩＬ－１５Ｒａは、ＩＬ－１５に結合可能であり、そして結合後のＩＬ－１５の生物学的機能に必須である、Ｓｕｓｈｉドメインを含有する。

【0006】

ＩＬ－１５は、低分子量であり、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期が短く、反復投薬の制御が困難であり、そして全身性免疫副作用を引き起こす可能性があることに関連する制限がある。ｉｎ ｖｉｖｏ半減期を増加させ、そしてｉｎ ｖｉｖｏでのＩＬ－１５の生物学的活性を促進するかまたは増進させることが可能なアプローチを発見する喫緊の必要がある。

【0007】

近年、ＩＬ－１５およびその受容体ＩＬ－１５Ｒαによって形成される複合体は、ＩＬ－１５の生物学的活性を有意に増進させうることが見出された。研究によって、ＩＬ－１５および可溶性受容体ＩＬ－１５Ｒαによって形成される複合体が、メモリーＣＤ８＋ Ｔリンパ球およびＮＴ／ＮＫＴ細胞の増殖を刺激する際に、ＩＬ－１５単独よりも有意に優れていることが示された。ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα複合体は、メモリーＣＤ８＋ Ｔ細胞の増殖を刺激する際に、そしてその生存を維持する際に、ＩＬ－１５単独よりも１０倍以上より強く、そしてこの機構はｃｉｓ提示と関連しうる。

【0008】

国際出願ＷＯ２００７０４６００６、ＷＯ２０１６０９５６４２は、ＩＬ－１５Ｒベータ／ガンマシグナル伝達経路を刺激して、それによってＩＬ－１５Ｒベータ／ガンマ陽性細胞、例えばＮＫおよび／またはＴ細胞の活性化および／または増殖を誘導しそして／または刺激することを意図する融合タンパク質であって、ＩＬ－１５Ｒアルファの細胞外領域のｓｕｓｈｉドメインを含有するポリペプチドに共有結合によって間接的に連結されているＩＬ－１５を含むことで特徴づけられる前記融合タンパク質、および癌治療におけるその使用を開示する。しかし、ＷＯ２００７０４６００６は、ＮおよびＣ末端アミノ酸を通じてリンカーペプチドによってＩＬ－１５Ｒアルファに連結されているＩＬ－１５に関してのみスーパーアゴニストの実験データおよび特徴を提供する一方、ＷＯ２０１６０９５６４２は、ＩＬ－１５リガンドおよびＩＬ－１５Ｒアルファ自体のＣｙｓ突然変異によって形成されるキメラＳ－Ｓ結合によって連結されているものに関してのみ、スーパーアゴニストの実験データおよび特徴を提供する。どちらも、Ｓ－Ｓ結合（単数または複数）によって連結されている、またはＳ－Ｓ架橋を伴わない融合タンパク質ドメインを含む、ＩＬ１５スーパーアゴニスト変異体の活性および物理化学特性に関するいかなる証拠も提供しない。

【0009】

これらの物体には、分子量が小さく、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期が短いことに関連する制限がある。これらは、インターロイキン１５の限定された活性を有し、そしてその産生は、特にチャイニーズハムスター卵巣細胞において非常に困難であり、そして低収量と関連する。

【0010】

国際出願ＷＯ ２０１５１０３９２８、ＷＯ２０１８０７１９１９は、上記問題の解決に向けた変異体、特に、タンパク質（Ｉ）およびタンパク質（ＩＩ）を含むヘテロ二量体ＩＬ－１５アゴニストタンパク質であって、前記タンパク質（Ｉ）が第一のＦｃ変異体に融合したＩＬ－１５によって形成され、第一のＦｃ変異体がＩＬ－１５のＣ末端に連結されており、そして前記タンパク質（ＩＩ）が、第二のＦｃ変異体であるかあるいは第二のＦｃ変異体に融合したＩＬ－１５Ｒαまたはその変異体によって形成され、第二のＦｃ変異体がＩＬ－１５ＲαのＣ末端に連結されている、前記変異体を開示する。タンパク質（Ｉ）およびタンパク質（ＩＩ）は、第一のＦｃ変異体および第二のＦｃ変異体の間の「ノブ・イントゥ・ホール（ｋｏｎｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）」相互作用を通じて、安定なヘテロ二量体タンパク質を形成する。

【0011】

ＩＬ－１５に基づくイムノサイトカインの生成は、インターロイキン１５の免疫調節効果を腫瘍に向ける、腫瘍特異的抗体の好適な特性と組み合わせるために特に関心が持たれる。

【0012】

国際出願ＷＯ２０１５０１８５２８、ＷＯ２０１８０７１９１８は、コンジュゲート、および前記コンジュゲートに共有結合によって直接または間接的に連結されている免疫調節抗体またはその断片を含むイムノサイトカインであって、前記コンジュゲートがインターロイキン－１５のアミノ酸配列またはその誘導体、およびＩＬ－１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメインのアミノ酸配列またはその誘導体を含むポリペプチドを含む、前記イムノサイトカインを開示する。

【0013】

国際出願ＷＯ ２０１２１７５２２２は、癌治療のためのイムノサイトカインであって、コンジュゲート、ならびに抗体またはＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｃｂ、Ｆｄ、およびｓｃＦｖを含む群より選択されるその断片を含み、前記コンジュゲートが、インターロイキン１５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、およびＩＬ－１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメインのアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、前記イムノサイトカインを開示する。コンジュゲートおよび抗体またはその断片は、タンパク質コンジュゲート化を提供する二官能性共役剤を用いて共有結合される。

【0014】

国際出願ＷＯ２０１９００６４７２は：
ＩＬ－１５Ｒａタンパク質、ＩＬ－１５タンパク質、および第一のＦｃドメインを含むＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒａ融合タンパク質；ならびに
抗原結合ドメイン単量体であって、ヒトＣＤ８、ヒトＮＫＧ２Ａ、およびヒトＮＫＧ２Ｄからなる群より選択される抗原に結合し、ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３単量体を含む重鎖を含み、ＶＨが重鎖可変ドメインであり、そしてＣＨ２－ＣＨ３が第二のＦｃドメインであり、そして軽鎖が可変軽鎖（ＶＬ）および軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含む、前記抗原結合ドメイン単量体
を含み、
前記の第一および第二のＦｃドメインが：

【0015】

【化1】

【0016】

からなる群より選択されるアミノ酸置換セットを有する
二官能性ヘテロ二量体タンパク質を開示する。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0017】

【特許文献1】ＷＯ２００７０４６００６

【特許文献2】ＷＯ２０１６０９５６４２

【特許文献3】ＷＯ ２０１５１０３９２８

【特許文献4】ＷＯ２０１８０７１９１９

【特許文献5】ＷＯ２０１５０１８５２８

【特許文献6】ＷＯ２０１８０７１９１８

【特許文献7】ＷＯ ２０１２１７５２２２

【特許文献8】ＷＯ２０１９００６４７２

【非特許文献】

【0018】

【非特許文献1】Ｇｒａｂｓｔｅｉｎ， Ｋ．Ｈ．ら， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９４， ２６４， ９６５

【非特許文献2】Ｂｕｒｔｏｎ， Ｊ．Ｄ．ら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １９９４， ９１， ４９３５

【非特許文献3】Ｂａｍｆｏｒｄ ＲＮ．ら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９８， １６０：４４１８－４４２６

【非特許文献4】Ｋｕｒｙｓ Ｇら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２０００， ２７５：３０６５３－３０６５９

【非特許文献5】Ｍｕｓｓｏら， Ｂｌｏｏｄ １９９９， Ｖｏｌ． ９３， Ｎｏ １０（５月１５日）： ｐｐ ３５３１－３５３９

【非特許文献6】Ｂｕｄａｌｇｉａｎら， ＪＢＣ ２００４， ｖｏｌ ２７９， Ｎｏ ４０： ｐｐ ４２１９２－４２２０１

【非特許文献7】Ｋｉｒｍａｎ Ｉ．， １９９６， Ａｍ． Ｊ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ． ９１， １７８９

【非特許文献8】Ｒｕｃｋｅｒｔ Ｒ． ２０００， １６５：２２４０－２２５０

【非特許文献9】Ｙａｍａｄａ Ｙ． １９９９， Ｌｅｕｋｅｍｉａ ａｎｄ Ｌｙｍｐｈｏｍａ， ３５（１－２）：３７－４５

【非特許文献10】Ｍｃｌｎｎｅｓ Ｉ．Ｂ． １９９８， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ， １９， ７５－７９

【非特許文献11】Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ １９９５， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８１， １２５５－１２５９

【非特許文献12】Ｂｕｄａｇｉａｎ Ｖ．ら， ＪＢＣ ２００４， ２７９， ３９：４０３６８－４０３７５

【非特許文献13】Ｍｏｒｔｉｅｒら， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ２００４， １７３：１６８１－１６８８

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0019】

ＩＬ－１５およびその受容体ＩＬ－１５Ｒαの複合体に関する上記先行技術の解決策にもかかわらず、安定性が高く、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期が延長され、ｉｎ ｖｉｖｏ生物学的活性が増加し、そして哺乳動物細胞における生産性が増加している、ＩＬ－１５に基づく分子に関する必要性がなおある。

【課題を解決するための手段】

【0020】

本発明者らによって開発された、ＩＬ－１５およびＩＬ－１５Ｒαに基づくヘテロ二量体分子を含む、新規イムノサイトカイン形式は、より高い安定性、哺乳動物細胞における増加した生産性、延長されたｉｎ ｖｉｖｏ半減期、および増加したｉｎ ｖｉｖｏ生物学的活性を示す。さらに、これらは、ＩＬ１５活性の特性を有する二重特異性イムノサイトカインに関する普遍的な形式である。本発明者らによって開発された新規イムノサイトカイン形式は、前臨床研究の結果にしたがって、減少した毒性を有する。

【0021】

１つの側面において、本発明は、ＩＬ－１５Ｒベータ／ガンマ陽性細胞の活性化および／または増殖を刺激するためのイムノサイトカインであって：
１）以下に連結されているＩＬ－１５Ｒα
ａ）抗体軽鎖定常ドメイン、または
ｂ）第一の（ＣＨ１）重鎖定常ドメインならびに第二の（ＣＨ２）および第三の（ＣＨ３）重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む、抗体重鎖定常ドメイン；
２）以下に連結されているＩＬ－１５
ａ）第一の（ＣＨ１）重鎖定常ドメインならびに第二の（ＣＨ２）および第三の（ＣＨ３）重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む、抗体重鎖定常ドメイン、または
ｂ）抗体軽鎖定常ドメイン
を含むＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒαヘテロ二量体タンパク質複合体を含み；
ヘテロ二量体複合体内の第一の抗体重鎖定常ドメインおよび抗体軽鎖定常ドメインが、天然Ｓ－Ｓ架橋を通じた共有会合を持つかまたは持たず、そして
ＩＬ－１５またはＩＬ－１５Ｒαが抗体軽鎖定常ドメインに連結されている場合、ＩＬ－１５ＲαまたはＩＬ－１５より選択されるヘテロ二量体タンパク質複合体のもう一方の部分が抗体重鎖定常ドメインに連結されている
前記イムノサイトカインに関する。

【0022】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、ヘテロ二量体複合体内に、天然Ｓ－Ｓ架橋を通じた共有会合を有する、第一の抗体重鎖定常ドメインおよび抗体軽鎖定常ドメインを含む。

【0023】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、ヘテロ二量体複合体内に、天然Ｓ－Ｓ架橋を通じた共有会合を持たない、第一の抗体重鎖定常ドメインおよび抗体軽鎖定常ドメインを含む。

【0024】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、ＣＫまたはＣＬより選択される抗体軽鎖定常ドメインを含む。
いくつかの態様において、イムノサイトカインは、配列番号９によって示されるアミノ酸配列を有するＩＬ－１５Ｒα、または類似の生物学的活性を有する任意の既知の突然変異体ＩＬ－１５Ｒα変異体を含む。

【0025】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、配列番号１０によって示されるアミノ酸配列を有するＩＬ－１５、または類似の生物学的活性を有する任意の既知の突然変異体ＩＬ－１５変異体を含む。

【0026】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、抗体軽鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５Ｒαを含む。
いくつかの態様において、イムノサイトカインは、配列番号１または配列番号１９によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体軽鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５Ｒαを含む。

【0027】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、抗体軽鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５を含む。
いくつかの態様において、イムノサイトカインは、配列番号３または配列番号２１によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体軽鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５を含む。

【0028】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、ヒンジを通じて連結されている、第一の（ＣＨ１）重鎖定常ドメインならびに第二の（ＣＨ２）および第三の（ＣＨ３）重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む。

【0029】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、以下の順序：ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３で配置された抗体重鎖定常ドメインに連結されている、ＩＬ－１５またはＩＬ－１５Ｒαを含む。

【0030】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、抗体重鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５Ｒαを含む。
いくつかの態様において、イムノサイトカインは、配列番号４または配列番号２２によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体重鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５Ｒαを含む。

【0031】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、抗体重鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５を含む。
いくつかの態様において、イムノサイトカインは、配列番号２または配列番号２０によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体重鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５を含む。

【0032】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは：
配列番号１または配列番号１９によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体軽鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５Ｒα、および
配列番号２または配列番号２０によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体重鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５
を含む。

【0033】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは：
配列番号４または配列番号２２によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体重鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５Ｒα、および
配列番号３または配列番号２１によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体軽鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５
を含む。

【0034】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、前記イムノサイトカインにおいて、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、および／またはＡＤＣＰ特性の不全を引き起こす、Ｆｃ断片単量体中の突然変異を含む。

【0035】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、ＩｇＧに属するＦｃ断片を含む。
いくつかの態様において、イムノサイトカインは：ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４を含む群より選択されるＦｃ断片を含む。

【0036】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、上記２つのＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒαヘテロ二量体タンパク質複合体を含む。
いくつかの態様において、イムノサイトカインは、癌または自己免疫疾患の治療のための療法剤として使用される。

【0037】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、癌治療のための療法剤として使用される。
１つの側面において、本発明は、ＩＬ－１５Ｒベータ／ガンマ陽性細胞の活性化および／または増殖を刺激するためのイムノサイトカインであって、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒαに基づくヘテロ二量体タンパク質複合体、およびＰＤ－１経路を特異的に阻害する免疫調節抗体またはその抗原結合断片を含み、
ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒαヘテロ二量体タンパク質複合体が：
１）以下に連結されているＩＬ－１５Ｒα
ａ）抗体軽鎖定常ドメイン、または
ｂ）第一の（ＣＨ１）重鎖定常ドメインならびに第二の（ＣＨ２）および第三の（ＣＨ３）重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む、抗体重鎖定常ドメイン；
２）以下に連結されているＩＬ－１５
ａ）第一の（ＣＨ１）重鎖定常ドメインならびに第二の（ＣＨ２）および第三の（ＣＨ３）重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む、抗体重鎖定常ドメイン、または
ｂ）抗体軽鎖定常ドメイン
を含み；
ヘテロ二量体複合体内の第一の抗体重鎖定常ドメインおよび抗体軽鎖定常ドメインが、天然Ｓ－Ｓ架橋を通じた共有会合を持つかまたは持たず、そして
ＩＬ－１５またはＩＬ－１５Ｒαが抗体軽鎖定常ドメインに連結されている場合、ＩＬ－１５ＲαまたはＩＬ－１５より選択されるヘテロ二量体タンパク質複合体のもう一方の部分が抗体重鎖定常ドメインに連結されている
前記イムノサイトカインに関する。

【0038】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、ヘテロ二量体複合体内に、天然Ｓ－Ｓ架橋を通じた共有会合を有する、第一の抗体重鎖定常ドメインおよび抗体軽鎖定常ドメインを含む。

【0039】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、ヘテロ二量体複合体内に、天然Ｓ－Ｓ架橋を通じた共有会合を持たない、第一の抗体重鎖定常ドメインおよび抗体軽鎖定常ドメインを含む。

【0040】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、ＣＫまたはＣＬより選択される抗体軽鎖定常ドメインを含む。
いくつかの態様において、イムノサイトカインは、配列番号９によって示されるアミノ酸配列を有するＩＬ－１５Ｒα、または類似の生物学的活性を有する任意の既知の突然変異体ＩＬ－１５Ｒα変異体を含む。

【0041】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、配列番号１０によって示されるアミノ酸配列を有するＩＬ－１５、または類似の生物学的活性を有する任意の既知の突然変異体ＩＬ－１５変異体を含む。

【0042】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、抗体軽鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５Ｒαを含む。
いくつかの態様において、イムノサイトカインは、配列番号１または配列番号１９によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体軽鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５Ｒαを含む。

【0043】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、抗体軽鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５を含む。
いくつかの態様において、イムノサイトカインは、配列番号３または配列番号２１によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体軽鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５を含む。

【0044】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、ヒンジを通じて連結されている、第一の（ＣＨ１）重鎖定常ドメインならびに第二の（ＣＨ２）および第三の（ＣＨ３）重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む。

【0045】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、以下の順序：ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３で配置された抗体重鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５またはＩＬ－１５Ｒαを含む。

【0046】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、抗体重鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５Ｒαを含む。
いくつかの態様において、イムノサイトカインは、配列番号６または配列番号２４によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体重鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５Ｒαを含む。

【0047】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、抗体重鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５を含む。
いくつかの態様において、イムノサイトカインは、配列番号５または配列番号２３によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体重鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５を含む。

【0048】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、ＰＤ－１経路を特異的に阻害し、そしてＰＤ－１に特異的に結合する抗体である免疫調節抗体またはその抗原結合断片を含む。

【0049】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは：
ａ）軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む軽鎖；
ｂ）重鎖可変ドメイン、ならびに第一の（ＣＨ１）重鎖定常ドメイン、および第二の（ＣＨ１）および第三の（ＣＨ３）重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む、抗体重鎖定常ドメインを含む、重鎖
を含む、免疫調節抗体を含む。

【0050】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、それぞれ配列番号１４、配列番号１５、および配列番号１６のアミノ酸配列によって示されるＬＣＤＲ １、２、および３（超可変領域１、２、および３）を含む、軽鎖可変ドメインを含む。

【0051】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、配列番号１８によって示されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変ドメインを含む。
いくつかの態様において、イムノサイトカインは、それぞれ配列番号１１、配列番号１２、および配列番号１３のアミノ酸配列によって示される、ＨＣＤＲ １、２、および３（超可変領域１、２、および３）を含む、重鎖可変ドメインを含む。

【0052】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、配列番号１７によって示されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変ドメインを含む。
いくつかの態様において、イムノサイトカインは：
１）それぞれ配列番号１４、配列番号１５、および配列番号１６のアミノ酸配列によって示される、ＬＣＤＲ １、２、および３（超可変領域１、２、および３）を含む、軽鎖可変ドメイン
２）それぞれ配列番号１１、配列番号１２、および配列番号１３のアミノ酸配列によって示される、ＨＣＤＲ １、２、および３（超可変領域１、２、および３）を含む、重鎖可変ドメイン
を含む。

【0053】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは：
１）配列番号１８によって示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン
２）配列番号１７によって示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン
を含む。

【0054】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、配列番号８によって示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、免疫調節抗体を含む。
いくつかの態様において、イムノサイトカインは、配列番号７によって示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む、免疫調節抗体を含む。

【0055】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは：
配列番号７によって示されるアミノ酸配列を含む重鎖；
配列番号８によって示されるアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、免疫調節抗体を含む。

【0056】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗体である、ＰＤ－１経路を特異的に阻害する免疫調節抗体またはその抗原結合断片を含む。
いくつかの態様において、イムノサイトカインは：
ａ）ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒαに基づいて：
配列番号１または配列番号１９によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体軽鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５Ｒα、および
配列番号５または配列番号２３によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体重鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５
を含む、ヘテロ二量体タンパク質複合体；
ｂ）
配列番号７によって示されるアミノ酸配列を含む重鎖；
配列番号８によって示されるアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、免疫調節抗体
を含む。

【0057】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは：
ａ）配列番号６または配列番号２４によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体重鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５Ｒα、および
配列番号３または配列番号２１によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体軽鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５；
ｂ）
配列番号７によって示されるアミノ酸配列を含む重鎖；
配列番号８によって示されるアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、免疫調節抗体
を含む。

【0058】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、２つの異なる部分のヘテロ二量体化を誘導する、抗体定常ドメイン中の突然変異を有し、部分の一方は、共有的にまたは非共有的に会合した、抗体定常ドメインに連結されているＩＬ－１５Ｒαおよび抗体定常ドメインに連結されているＩＬ－１５を含み、そしてもう一方の部分は、共有的にまたは非共有的に会合した、抗体の軽鎖および重鎖を含む。

【0059】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは：
第一のＦｃ単量体および第二のＦｃ単量体であって、以下の群：第一のＦｃ単量体がノブ修飾Ｆｃであり、そして第二のＦｃ単量体がホール修飾Ｆｃである場合、または第二のＦｃ単量体がノブ修飾Ｆｃであり、そして第一のＦｃ単量体がホール修飾Ｆｃである場合より選択される、前記の第一のＦｃ単量体および第二のＦｃ単量体
を含む。

【0060】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗを有する第一のＦｃ単量体、およびアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖを有する第二のＦｃ単量体を含む。

【0061】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７を有する第一のＦｃ単量体、およびアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗを有する第二のＦｃ単量体を含む。

【0062】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、ＩｇＧに属するＦｃ断片を含む。
いくつかの態様において、イムノサイトカインは：ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４を含む群より選択されるＦｃ断片を含む。

【0063】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、前記イムノサイトカインにおいて、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、および／またはＡＤＣＰ特性の不全を引き起こす、Ｆｃ断片単量体中の突然変異を含む。

【0064】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、腫瘍性疾患または自己免疫疾患の治療のために使用される。
いくつかの態様において、イムノサイトカインは、腫瘍性疾患の治療のために使用される。

【0065】

１つの側面において、本発明は、上記イムノサイトカインのいずれかをコードする単離核酸に関する。
いくつかの態様において、核酸はＤＮＡである。

【0066】

１つの側面において、本発明は、上記核酸を含む、発現ベクターに関する。
１つの側面において、本発明は、上記ベクターで細胞を形質転換する工程を含む、上記イムノサイトカインを産生するための宿主細胞を産生するための方法に関する。

【0067】

１つの側面において、本発明は、上記核酸を含む、上記イムノサイトカインを産生するための宿主細胞に関する。
１つの側面において、本発明は、上記イムノサイトカインを含む薬剤を産生するための方法であって、上記宿主細胞を、前記イムノサイトカインを産生するために十分な条件下で、培地中で培養し、必要であれば、その後、生じたイムノサイトカインを単離および精製する工程を含む、前記方法に関する。

【0068】

１つの側面において、本発明は、１つまたはそれより多くの薬学的に許容されうる賦形剤と組み合わせた、療法的有効量の上記イムノサイトカインを含む、ＩＬ－１５Ｒベータ／ガンマ陽性細胞の活性化および／または増殖を刺激するための薬学的組成物に関する。

【0069】

いくつかの態様において、薬学的組成物は、腫瘍性疾患または自己免疫疾患の治療のために使用される。
いくつかの態様において、薬学的組成物は、腫瘍性疾患の治療のために使用される。

【0070】

いくつかの態様において、薬学的組成物は：ＨＮＳＣＣ（頭頸部扁平上皮癌）、子宮頸癌、未知の原発性癌、神経膠芽腫、食道癌、膀胱癌、ＴＮＢＣ（トリプルネガティブ乳癌）、ＣＲＣ（結腸直腸癌）、肝細胞癌、黒色腫、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）、腎臓癌、卵巣癌、ＭＳＩ ＣＲＣ（マイクロサテライト不安定性を伴う結腸直腸癌）、白血病（急性白血病または骨髄芽球性白血病）、リンパ腫、多発性骨髄腫、黒色腫、乳癌、結腸直腸癌、前立腺癌、膀胱癌、肉腫、肝細胞癌、神経膠芽腫、ホジキンリンパ腫、ＴおよびＢ細胞急性リンパ芽球性白血病、小細胞肺癌、急性骨髄芽球性白血病、難治性非ホジキンＢ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、頭頸部扁平上皮癌、膵臓癌、卵巣癌、急性骨髄芽球性白血病および高リスク骨髄異形成症候群を含む群より選択される、腫瘍性疾患の治療のために使用される。

【0071】

１つの側面において、本発明は、腫瘍性疾患の治療法であって、こうした治療が必要な被験体に、前記イムノサイトカインまたは前記薬学的組成物を、療法的有効量で投与する工程を含む、前記方法に関する。

【0072】

治療のための方法のいくつかの態様において、腫瘍性疾患は：ＨＮＳＣＣ（頭頸部扁平上皮癌）、子宮頸癌、未知の原発性癌、神経膠芽腫、食道癌、膀胱癌、ＴＮＢＣ（トリプルネガティブ乳癌）、ＣＲＣ（結腸直腸癌）、肝細胞癌、黒色腫、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）、腎臓癌、卵巣癌、ＭＳＩ ＣＲＣ（マイクロサテライト不安定性を伴う結腸直腸癌）、白血病（急性白血病または骨髄芽球性白血病）、リンパ腫、多発性骨髄腫、黒色腫、乳癌、結腸直腸癌、前立腺癌、膀胱癌、肉腫、肝細胞癌、神経膠芽腫、ホジキンリンパ腫、ＴおよびＢ細胞急性リンパ芽球性白血病、小細胞肺癌、急性骨髄芽球性白血病、難治性非ホジキンＢ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、頭頸部扁平上皮癌、膵臓癌、卵巣癌、急性骨髄芽球性白血病および高リスク骨髄異形成症候群を含む群より選択される。

【0073】

１つの側面において、本発明は、Ｔ細胞集団またはＮＫ細胞集団の生物学的活性の活性化を必要とする被験体において、こうした活性を活性化するための方法であって、上記イムノサイトカインまたは上記薬学的組成物の有効量を被験体に投与する工程を含む、前記方法に関する。

【0074】

１つの側面において、本発明は、腫瘍性疾患の治療を必要とする被験体における治療のための、前記イムノサイトカインまたは前記薬学的組成物の使用に関する。
いくつかの使用において、腫瘍性疾患は：ＨＮＳＣＣ（頭頸部扁平上皮癌）、子宮頸癌、未知の原発性癌、神経膠芽腫、食道癌、膀胱癌、ＴＮＢＣ（トリプルネガティブ乳癌）、ＣＲＣ（結腸直腸癌）、肝細胞癌、黒色腫、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）、腎臓癌、卵巣癌、ＭＳＩ ＣＲＣ（マイクロサテライト不安定性を伴う結腸直腸癌）、白血病（急性白血病または骨髄芽球性白血病）、リンパ腫、多発性骨髄腫、黒色腫、乳癌、結腸直腸癌、前立腺癌、膀胱癌、肉腫、肝細胞癌、神経膠芽腫、ホジキンリンパ腫、ＴおよびＢ細胞急性リンパ芽球性白血病、小細胞肺癌、急性骨髄芽球性白血病、難治性非ホジキンＢ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、頭頸部扁平上皮癌、膵臓癌、卵巣癌、急性骨髄芽球性白血病および高リスク骨髄異形成症候群を含む群より選択される。

【図面の簡単な説明】

【0075】

【図1】ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒαヘテロ二量体タンパク質複合体を含むイムノサイトカイン形式（ＣＫ＿ＩＬ１５Ｒａ＿Ｈｃ＿ＩＬ１５ＣＨ１ＦｃＬＡＬＡ）。

【図2】ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒαヘテロ二量体タンパク質複合体を含むイムノサイトカイン形式（ＣＫ＿ＩＬ１５＿Ｈｃ＿ＩＬ１５ＲａＣＨ１ＦｃＬＡＬＡ）。

【図3】ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒαヘテロ二量体タンパク質複合体、およびＰＤ－１経路を特異的に阻害する免疫調節抗体を含む、イムノサイトカイン形式（Ｆａｂ－ＣＫ＿ＩＬ１５＿Ｈｃ＿ＩＬ１５ＲａＣＨ１ＦｃノブＬＡＬＡ）。 「ノブ」は、ＣＨ３ドメイン中の第一のＦｃ変異体および第二のＦｃ変異体の間の「ノブ・イントゥ・ホール」構造を形成する突然変異を意味すると理解される。

【図4】ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒαヘテロ二量体タンパク質複合体、およびＰＤ－１経路を特異的に阻害する免疫調節抗体を含む、イムノサイトカイン形式（Ｆａｂ－ＣＫ＿ＩＬ１５Ｒａ＿Ｈｃ＿ＩＬ１５ＣＨ１ＦｃノブＬＡＬＡ）。 「ノブ」は、ＣＨ３ドメイン中の第一のＦｃ変異体および第二のＦｃ変異体の間の「ノブ・イントゥ・ホール」構造を形成する突然変異を意味すると理解される。

【図5】ｐＥＥ－ＩＬ１５Ｒａ－ＣＫベクター。 ＡｍｐＲは、アンピシリン耐性を提供するベータ－ラクタマーゼ遺伝子であり、 ｐＵＣ起点は細菌におけるｐＵＣ複製起点であり、 ＣＭＶ－プロモーターは、サイトメガロウイルス初期遺伝子のプロモーターであり、 リーダーはリーダー配列であり、 ＩＬ１５Ｒａは、インターロイキン１５受容体サブユニットアルファをコードする遺伝子であり、 ＣＫは軽鎖定常ドメインをコードする遺伝子であり、 ポリＡは、ｍＲＮＡ安定性を増加させるためのポリアデニル化シグナル配列であり、 ＯｒｉＰは細菌における複製起点であるか、または 細菌細胞における複製の高コピー数ＣｏｌＥ１／ｐＭＢ１／ｐＢＲ３２２／ｐＵＣ起点である。

【図6】ｐＥＥ－ＩＬ１５－ＣＨ１－Ｆｃ－ＬＡＬＡベクター。 ＡｍｐＲは、アンピシリン耐性を提供するベータ－ラクタマーゼ遺伝子であり、 ｐＵＣ起点は細菌におけるｐＵＣ複製起点であり、 ＣＭＶ－プロモーターは、サイトメガロウイルス初期遺伝子のプロモーターであり、 リーダーはリーダー配列であり、 ＩＬ１５は、インターロイキン１５をコードする遺伝子であり、 ＣＨ１は、第一の重鎖定常ドメインをコードする遺伝子であり、 Ｆｃ－ＬＡＬＡは、ＬＡＬＡ突然変異（Ｆｃ断片のＣＨ２定常ドメイン中のＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ突然変異）を所持するＦｃ断片をコードする遺伝子であり、 ポリＡは、ｍＲＮＡ安定性を増加させるためのポリアデニル化シグナル配列であり、 ＯｒｉＰは細菌における複製起点であるか、または 細菌細胞における複製の高コピー数ＣｏｌＥ１／ｐＭＢ１／ｐＢＲ３２２／ｐＵＣ起点である。

【図7】ｐＥＥ－ＢＣＤ１００－０２－ＶＬ－ＣＫベクター。 ＡｍｐＲは、アンピシリン耐性を提供するベータ－ラクタマーゼ遺伝子であり、 ｐＵＣ起点は細菌におけるｐＵＣ複製起点であり、 ＣＭＶ－プロモーターは、サイトメガロウイルス初期遺伝子のプロモーターであり、 リーダーはリーダー配列であり、 ａＰＤ１－ＶＬは、ＰＤ１に特異的に結合する抗体の軽鎖をコードする遺伝子であり、 ＣＫは軽鎖定常ドメインをコードする遺伝子であり、 ポリＡは、ｍＲＮＡ安定性を増加させるためのポリアデニル化シグナル配列であり、 ＯｒｉＰは細菌における複製起点であるか、または 細菌細胞における複製の高コピー数ＣｏｌＥ１／ｐＭＢ１／ｐＢＲ３２２／ｐＵＣ起点である。

【図8】ｐＥＥ－ＢＣＤ１００－０２－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ－ホール－ＬＡＬＡベクター。 ＡｍｐＲは、アンピシリン耐性を提供するベータ－ラクタマーゼ遺伝子であり、 ｐＵＣ起点は細菌におけるｐＵＣ複製起点であり、 プロモーターは、サイトメガロウイルス初期遺伝子のプロモーターであり、 リーダーはリーダー配列であり、 ａＰＤ１－ＶＨは、ＰＤ１に特異的に結合する抗体の重鎖の可変ドメインをコードする遺伝子であり、 ＣＨ１は、第一の重鎖定常ドメインをコードする遺伝子であり、 Ｆｃ－ホール－ＬＡＬＡは、「ホール」を形成する突然変異およびＬＡＬＡ突然変異（Ｆｃ断片のＣＨ２定常ドメイン中のＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ突然変異）を所持するＦｃ断片をコードする遺伝子であり、 停止は停止コドンであり、 ＯｒｉＰは細菌における複製起点であるか、または 細菌細胞における複製の高コピー数ＣｏｌＥ１／ｐＭＢ１／ｐＢＲ３２２／ｐＵＣ起点である。

【図9】ｐＥＥ－ＩＬ１５－ＣＨ１－Ｆｃ－ノブ－ＬＡＬＡベクター。 ＡｍｐＲは、アンピシリン耐性を提供するベータ－ラクタマーゼ遺伝子であり、 ｐＵＣ起点は細菌におけるｐＵＣ複製起点であり、 ＣＭＶ－プロモーターは、サイトメガロウイルス初期遺伝子のプロモーターであり、 リーダーはリーダー配列であり、 ＩＬ１５は、インターロイキン１５をコードする遺伝子であり、 ＣＨ１は、第一の重鎖定常ドメインをコードする遺伝子であり、 Ｆｃ－ノブ－ＬＡＬＡは、「ノブ」を形成する突然変異およびＬＡＬＡ突然変異（Ｆｃ断片のＣＨ２定常ドメイン中のＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ突然変異）を所持するＦｃ断片をコードする遺伝子であり、 停止は停止コドンであり、 ＯｒｉＰは細菌における複製起点であるか、または 細菌細胞における複製の高コピー数ＣｏｌＥ１／ｐＭＢ１／ｐＢＲ３２２／ｐＵＣ起点である。

【図10】図１０Ａ。ベータ－メルカプトエタノールを含むＳＤＳゲル電気泳動 １． 対照抗体 ５μｌ ２． Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ非染色マーカー ３． － ４． 精製前のＣＫ＿ＩＬ１５Ｒａ＿Ｈｃ＿ＩＬ１５ＣＨ１ＦｃＬＡＬＡを含む増殖培地 １０μｌ ５． 精製後のＣＫ＿ＩＬ１５Ｒａ＿Ｈｃ＿ＩＬ１５ＣＨ１ＦｃＬＡＬＡを含む増殖培地 １０μｌ ６． 精製ＣＫ＿ＩＬ１５Ｒａ＿Ｈｃ＿ＩＬ１５ＣＨ１ＦｃＬＡＬＡ １０μｌ ７． － ８． 精製前のＣＫ＿ＩＬ１５＿Ｈｃ＿ＩＬ１５ＲａＣＨ１ＦｃＬＡＬＡを含む増殖培地 １０μｌ ９． 精製後のＣＫ＿ＩＬ１５＿Ｈｃ＿ＩＬ１５ＲａＣＨ１ＦｃＬＡＬＡを含む増殖培地 １０μｌ １０． 精製ＣＫ＿ＩＬ１５＿Ｈｃ＿ＩＬ１５ＲａＣＨ１ＦｃＬＡＬＡ １０μｌ 図１０Ｂ。ベータ－メルカプトエタノールを含まないＳＤＳゲル電気泳動 １． 精製ＣＫ＿ＩＬ１５Ｒａ＿Ｈｃ＿ＩＬ１５ＣＨ１ＦｃＬＡＬＡ １０μｌ ２． 精製ＣＫ＿ＩＬ１５＿Ｈｃ＿ＩＬ１５ＲａＣＨ１ＦｃＬＡＬＡ １０μｌ ３． Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ非染色マーカー ４． 対照抗体 ５μｌ

【図11】増殖活性の測定。ＮＫ－９２細胞株をアッセイで用いた。９６ウェル培養プレート中でアッセイを行った。懸濁物は、ＮＫ－９２細胞、グラフ中に示すような濃度の試験抗体を含んだ。ウシ胎児血清およびグルタミンを補充したＲＰＭＩ－１６４０培地中ですべての懸濁構成要素を調製した。すべての構成要素を添加した後、プレートを３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーションした。次いで、ウェルにＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅを添加した。インキュベーション後、ウェル中の蛍光強度を測定した。

【図12】増殖活性の測定。アッセイは、ネガティブ選択によって、健康なドナーのＰＢＭＣから単離した単離ナチュラルキラー細胞を用いた。９６ウェル培養プレート中でアッセイを行った。懸濁物は、ナチュラルキラー細胞、グラフ中に示すような濃度の試験抗体を含んだ。自己ヒト血漿を補充した培地中ですべての懸濁構成要素を調製した。すべての構成要素を添加した後、プレートを３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーションした。次いで、ウェルにＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅを添加した。インキュベーション後、ウェル中の蛍光強度を測定した。

【図13】ａＰＤ１特異的活性の測定。アッセイのため、本発明者らは、Ｊｕｒｋａｔ細胞株に基づいて生成され、そしてその表面上にＰＤ－１を安定発現し、そしてＮＦＡＴプロモーターの制御下にホタル（ｆｉｒｅｆｌｙ）ルシフェラーゼ・コード遺伝子を含有する、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ－ＦＬｕｃ ＰＤ－１細胞株；およびＲａｊｉ細胞株に基づいて生成され、そしてその表面上にＰＤＬ１を安定発現する、Ｒａｊｉ ＰＤＬ１細胞株を用いた。９６ウェル培養プレート中でアッセイを行った。各ウェル中の懸濁物は、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ－ＦＬｕｃ ＰＤ－１細胞、Ｒａｊｉ ＰＤＬ１細胞、１ｎｇ／ｍｌの濃度のａＣＤ３／ａＴＡＡ１細胞、およびグラフ中に示すような濃度の試験抗体を含んだ。すべての構成要素を添加した後、プレートを３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーションし、そして次いで、発光アッセイキットを用いて、ウェル中のルシフェラーゼ強度を測定した。

【図14】レポーター細胞株に対する抗ＰＤＬ１／ＩＬ１５ＳＡ抗体の特異的活性の決定。

【図15】ＡＤＣＣに対するナチュラルキラー細胞の影響の決定。アッセイは、ネガティブ選択によって、健康なドナーのＰＢＭＣから単離したナチュラルキラー細胞を用いた。９６ウェル培養プレート中でアッセイを行った。懸濁物は、ナチュラルキラー細胞およびＲａｊｉ細胞、エフェクター抗体リツキシマブ、ならびにグラフ中に示すような濃度の試験抗体を含んだ。ウシ胎児血清およびグルタミンを補充した培地中ですべての懸濁構成要素を調製した。すべての構成要素を添加した後、プレートを３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーションした。次いで、培養液を収集し、そしてＬＤＨアッセイキットを用いて乳酸デヒドロゲナーゼ含量を測定した。

【図16】ＴＡＡ－レポーター株に対するリツキシマブのＡＤＣＣ能増進に比較した、イムノサイトカインの特異的活性の決定結果。

【図17】ＮＫ細胞に対する、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα（ＩＬ１５ＳＡ）ヘテロ二量体タンパク質複合体を含むイムノサイトカイン変異体に関する細胞傷害性の研究。 結果は、候補に有意な細胞傷害性効果がない、すなわちＡＢ陰性対照（いかなる外因性抗体も含まない）に比較した際に、免疫反応性細胞数の減少が１０％以下であることを示す。

【図18】Ｂ細胞に対するＩＬ１５ＳＡ変異体に関する細胞傷害性の研究。 結果は、候補に有意な細胞傷害性効果がない、すなわちＡＢ陰性対照（いかなる外因性抗体も含まない）に比較した際に、免疫反応性細胞数の減少が１０％以下であることを示す。

【図19】ＣＤ３＋細胞に対するＩＬ１５ＳＡ変異体に関する細胞傷害性の研究。 結果は、候補に有意な細胞傷害性効果がない、すなわちＡＢ陰性対照（いかなる外因性抗体も含まない）に比較した際に、免疫反応性細胞数の減少が１０％以下であることを示す。

【図20】ＣＤ４＋細胞に対するＩＬ１５ＳＡ変異体に関する細胞傷害性の研究。 結果は、候補に有意な細胞傷害性効果がない、すなわちＡＢ陰性対照（いかなる外因性抗体も含まない）に比較した際に、免疫反応性細胞数の減少が１０％以下であることを示す。

【図21】ＣＤ８＋細胞に対するＩＬ１５ＳＡ変異体に関する細胞傷害性の研究。 結果は、候補に有意な細胞傷害性効果がない、すなわちＡＢ陰性対照（いかなる外因性抗体も含まない）に比較した際に、免疫反応性細胞数の減少が１０％以下であることを示す。

【図22】クロマトグラム。このクロマトグラムは、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒαに基づくヘテロ二量体タンパク質複合体（ＩＬ－１５スーパーアゴニスト）を含むイムノサイトカインの高い均一性を示す（溶液中の凝集物含量は５％以下であった）。

【図23】イムノサイトカインが、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒαに基づくヘテロ二量体タンパク質複合体（ＢＣＤ－２２５）を含む、イムノサイトカイン産物の、ネズミｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍モデルにおける、抗腫瘍活性決定のための実験スキーム。

【図24】イムノサイトカインが、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒαに基づくヘテロ二量体タンパク質複合体（ＢＣＤ－２２５）を含む、イムノサイトカイン産物変異体の、ネズミｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍モデルにおける、抗腫瘍活性決定のための実験結果（グラフ）。

【図25】イムノサイトカインが、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒαに基づくヘテロ二量体タンパク質複合体（ＢＣＤ－２２５）を含む、イムノサイトカイン産物変異体の、ネズミｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍モデルにおける、抗腫瘍活性決定のための実験結果（図表）。

【発明を実施するための形態】

【0076】

一般的な定義および一般的な方法
別に定義しない限り、本明細書で用いるすべての技術的および科学的用語は、一般の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

【0077】

さらに、背景によって別に必要とされない限り、単数形の用語には複数形が含まれるものとし、そして複数形の用語には単数形が含まれるものとする。典型的には、細胞培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、分析化学、有機合成化学、医学的および薬学的化学、ならびに本明細書記載のタンパク質および核酸のハイブリダイゼーションおよび化学の分類および方法は、当業者に周知であり、そして広く用いられる。酵素反応および精製法を、当該技術分野で一般的であるように、または本明細書に記載するように、製造者の指針にしたがって行う。

【0078】

別に明記しない限り、本発明のポリペプチドに関する用語「生物学的に活性な」および「生物学的活性」および「生物学的特性」は、生物学的分子に結合する能力を有することを意味する。

【0079】

用語「組換えタンパク質」は、タンパク質（ポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列（単数または複数）を含む細胞または細胞株において発現される前記タンパク質であって、前記ヌクレオチド配列（単数または複数）が、細胞と天然には関連していない、前記タンパク質を意味する。

【0080】

用語「二重特異性抗体」は、単一の生物学的分子上の２つの別個のエピトープに特異的に結合することが可能であるか、または２つの別個の生物学的分子上のエピトープに特異的に結合することが可能である、抗原結合ドメイン（単数または複数）を有する抗体を指す。二重特異性抗体はまた、本明細書において、「二重特異性」を有するかまたは「二重特異性」抗体であると称される。

【0081】

用語「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」は、細胞の別個のクローン集団によって合成され、そして単離された抗体を指す。クローン集団は、不死化細胞のクローン集団であってもよい。いくつかの態様において、クローン集団中の不死化細胞は、典型的には免疫動物由来の個々のＢリンパ球とリンパ球性腫瘍由来の個々の細胞との融合によって産生されるハイブリッド細胞、ハイブリドーマである。ハイブリドーマは構築された細胞のタイプであり、そして天然には存在しない。

【0082】

用語「Ｋａ」は、本明細書において、特定の抗体－抗原相互作用の会合（オン）速度を指す。
用語「Ｋｄ」は、本明細書において、特定の抗体－抗原相互作用の解離（オフ）速度を指す。

【0083】

「結合アフィニティ」は、一般的に、分子（例えば抗体）およびその結合パートナー（例えば抗原）の単一の結合部位の間の非共有相互作用の総計強度を指す。別に示さない限り、「結合アフィニティ」は、結合対のメンバー（例えば抗体および抗原）間の１：１相互作用を反映する、本質的な（特性的な、真の）結合アフィニティを指す。分子Ｘのその結合パートナーＹに対するアフィニティは、一般的に、解離定数（Ｋｄ）によって示されうる。好ましいＫｄ値は、約２００ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、８ｎＭ、６ｎＭ、４ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、またはそれ未満である。本明細書に記載するものを含めて、当該技術分野に知られる一般的な方法によって、アフィニティを測定してもよい。結合アフィニティを測定する多様な方法が当該技術分野に知られ、本発明の目的のために、これらの方法のいずれを用いてもよい。

【0084】

用語「ペプチドリンカー」は、本明細書において、互いに結合するドメインに応じた長さを持ち、そして任意のアミノ酸配列を含む、ドメインを組み合わせる能力を有する任意のペプチドを意味するよう意図される。好ましくは、ペプチドリンカーは、５アミノ酸より多い長さを有し、そしてＧ、Ａ、Ｓ、Ｐ、Ｅ、Ｔ、Ｄ、Ｋより選択されるアミノ酸の任意のセットからなる。

【0085】

用語「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」は、人工的な条件下、体の外での、生物学的実体、生物学的プロセス、または生物学的反応を指す。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖した細胞は、体の外の環境で、例えば試験管、培養バイアル、またはマイクロタイタープレート中で増殖した細胞と理解されるものとする。

【0086】

本明細書において、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「有する（ｈａｖｅ）」、「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅ）」または変形、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」、「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」または「含まれている（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」およびそのすべての文法的変形は、言及する整数または整数群の包含を示すと理解されるが、いかなる他の整数または整数群の排除も意図しない。

【0087】

発明の詳細な説明
イムノサイトカイン
１つの側面において、本発明は、ＩＬ－１５Ｒベータ／ガンマ陽性細胞の活性化および／または増殖を刺激するためのイムノサイトカインであって：
１）以下に連結されているＩＬ－１５Ｒα
ａ）抗体軽鎖定常ドメイン、または
ｂ）第一の（ＣＨ１）重鎖定常ドメインならびに第二の（ＣＨ２）および第三の（ＣＨ３）重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む、抗体重鎖定常ドメイン；
２）以下に連結されているＩＬ－１５
ａ）第一の（ＣＨ１）重鎖定常ドメインならびに第二の（ＣＨ２）および第三の（ＣＨ３）重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む、抗体重鎖定常ドメイン、または
ｂ）抗体軽鎖定常ドメイン
を含む、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒαに基づくヘテロ二量体タンパク質複合体を含み；
ヘテロ二量体複合体内の第一の抗体重鎖定常ドメインおよび抗体軽鎖定常ドメインが、天然Ｓ－Ｓ架橋を通じた共有会合を持つかまたは持たず、そして
ＩＬ－１５またはＩＬ－１５Ｒαが抗体軽鎖定常ドメインに連結されている場合、ＩＬ－１５ＲαまたはＩＬ－１５より選択されるヘテロ二量体タンパク質複合体のもう一方の部分が抗体重鎖定常ドメインに連結されている
前記イムノサイトカインに関する。

【0088】

上記イムノサイトカインの形式を図１および２に示す。
用語「イムノサイトカイン」は、サイトカインまたはその誘導体に共有結合によって直接または間接的に連結された抗体またはその断片を含む分子を意味する。前記抗体および前記サイトカインは、リンカーペプチドによって連結されていてもよい。

【0089】

本発明のイムノサイトカインは、単離イムノサイトカインを指すよう意図される。
本明細書の多様なイムノサイトカインを記載するために用いられる用語「単離」は、イムノサイトカインが発現される細胞または細胞培養から同定され、そして分離されそして／または再生されているイムノサイトカインを意味する。天然環境由来の不純物（混入構成要素）は、ポリペプチドの診断または療法使用に干渉するであろう物質であり、そしてこれには、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質が含まれうる。好ましい態様において、イムノサイトカインは、（１）スピニングカップ配列決定装置（エドマン配列決定装置）の使用によって、Ｎ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るために十分な度合いまで、あるいは（２）クーマシーブリリアントブルー、または好ましくは銀染色を用いた、非還元または還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥによって、均一になるまで、精製される。単離イムノサイトカインには、ポリペプチドの天然環境の少なくとも１つの構成要素が存在しないであろうため、組換え細胞内の、ｉｎ ｓｉｔｕのイムノサイトカインが含まれる。単離ポリペプチドは、典型的には、少なくとも１つの精製工程によって調製される。

【0090】

本明細書において、「ヘテロ二量体タンパク質複合体」は、ＩＬ－１５およびＩＬ－１５Ｒαの組み合わせから形成されるタンパク質を指す。
本明細書において、「ＩＬ－１５」または「ＩＬ－１５ペプチド」または「インターロイキン－１５」は、任意のＩＬ－１５（インターロイキン－１５）またはその突然変異体でもよく、例えばヒトまたは非ヒト哺乳動物ＩＬ－１５または非哺乳動物ＩＬ－１５であってもよい。例示的な非ヒト哺乳動物には、ブタ、ウサギ、サル、チンパンジー、マウス等の哺乳動物が含まれ；そして非哺乳動物には、ニワトリ等が含まれる。好ましくは、ヒト・インターロイキン－１５成熟分子は、データベースＵｎｉＰｒｏｔＫＢ、寄託番号Ｐ４０９３３、４９～１９２ａａに見出される。用語「ＩＬ－１５変異体」は、１つまたはそれより多くのアミノ酸置換、付加または欠失によって、その受容体に対してアフィニティが増加したかまたは減少した、あるいはＴ細胞またはＮＫ細胞を刺激する活性が増加したかまたは減少した、変異体分子を指す。

【0091】

「ＩＬ－１５Ｒα」は、インターロイキン１５受容体サブユニットアルファ（α）を意味し、そして本発明にしたがって、任意のＩＬ－１５Ｒα化合物またはその機能性断片であってもよく、例えばヒトＩＬ－１５Ｒαまたは非ヒト哺乳動物ＩＬ－１５Ｒα、または非哺乳動物ＩＬ－１５Ｒαであってもよい。例示的な非ヒト哺乳動物には、ブタ、ウサギ、サル、チンパンジー、マウス等の哺乳動物が含まれ；そして非哺乳動物には、ニワトリ等が含まれる。好ましいＩＬ－１５Ｒα分子は、データベースＵｎｉＰｒｏｔＫＢ、寄託番号Ｑ１３２６１（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ１３２６１）に見出される。

【0092】

免疫グロブリンの断片結晶化可能領域（「Ｆｃ領域、Ｆｃ」）は、細胞表面Ｆｃ受容体、ならびに補体系のいくつかのタンパク質と相互作用する、免疫グロブリン分子の「テール」領域である。この特性は、抗体が免疫系を活性化することを可能にする。ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤ抗体アイソタイプにおいて、Ｆｃ領域は、それぞれ、２つの重鎖の第二および第三の定常ドメイン由来の２つの同一のタンパク質断片で構成され；ＩｇＭおよびＩｇＥアイソタイプにおいては、Ｆｃ領域は、各ポリペプチド鎖において、３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４ドメイン）を含有する。

【0093】

「Ｆｃ断片単量体」は、２つの重鎖のうちいずれか一方の第二および第三の定常ドメイン由来のＦｃ領域を意味すると理解され（ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤアイソタイプに関して）；ＩｇＭおよびＩｇＥアイソタイプに関して、Ｆｃ単量体は、２つの重鎖の一方の３つの定常ドメイン（ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４ドメイン）を含む。

【0094】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、ヘテロ二量体複合体内に、天然Ｓ－Ｓ架橋を通じた共有会合を有し、第一の抗体重鎖定常ドメインおよび抗体軽鎖定常ドメインを含む。

【0095】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、ヘテロ二量体複合体内に、天然Ｓ－Ｓ架橋を通じた共有会合を持たず、第一の抗体重鎖定常ドメインおよび抗体軽鎖定常ドメインを含む。

【0096】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、ＣＫまたはＣＬより選択される抗体軽鎖定常ドメインを含む。
哺乳動物において、ラムダ（λ）およびカッパ（κ）と示される軽鎖２種のみが知られる。ラムダ軽鎖の定常ドメインはＣＬと称され、そしてカッパ軽鎖の定常ドメインはＣＫと示される。

【0097】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、

【0098】

【化2】

【0099】

によって示されるアミノ酸配列を有するＩＬ－１５Ｒα、または類似の生物学的活性を有する突然変異を含有するＩＬ－１５Ｒαの任意の既知の変異体を含む。
突然変異体ＩＬ－１５Ｒα、類似の生物学的活性を有するＩＬ－１５Ｒαは、突然変異を含み、そして「野生型」ＩＬ－１５Ｒαの活性と比較した際、類似の生物学的活性を有する、当該技術分野に知られる任意のＩＬ－１５Ｒαを指すと理解される。

【0100】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、

【0101】

【化3】

【0102】

によって示されるアミノ酸配列を有するＩＬ－１５、または類似の生物学的活性を有する突然変異を含有するＩＬ－１５の任意の既知の変異体を含む。
突然変異体ＩＬ－１５、類似の生物学的活性を有するＩＬ－１５は、突然変異を含み、そして「野生型」ＩＬ－１５と比較した際、類似の生物学的活性を有する、当該技術分野に知られる任意のＩＬ－１５を意味する。

【0103】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、抗体軽鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５Ｒαを含む。
いくつかの態様において、イムノサイトカインは、

【0104】

【化4】

【0105】

によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体軽鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５Ｒαを含む。
いくつかの態様において、イムノサイトカインは、

【0106】

【化5】

【0107】

によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体軽鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５Ｒαを含む。
配列番号１９によって示されるアミノ酸配列は、２１６位のシステイン（Ｃ）からアラニン（Ａ）の単一アミノ酸置換によって、配列番号１によって示されるアミノ酸配列から修飾されている。この置換は、天然Ｓ－Ｓ架橋を通じた共有会合を持たず、ヘテロ二量体複合体内で第一の抗体重鎖定常ドメインおよび抗体軽鎖定常ドメインを含む、イムノサイトカインを産生することを可能にする。

【0108】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、抗体軽鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５を含む。
いくつかの態様において、イムノサイトカインは、

【0109】

【化6】

【0110】

によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体軽鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５を含む。
いくつかの態様において、イムノサイトカインは、

【0111】

【化7】

【0112】

によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体軽鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５を含む。
配列番号２１によって示されるアミノ酸配列は、２３３位のシステイン（Ｃ）からアラニン（Ａ）の単一アミノ酸置換によって、配列番号３によって示されるアミノ酸配列から修飾されている。この置換は、天然Ｓ－Ｓ架橋を通じた共有会合を持たず、ヘテロ二量体複合体内で第一の抗体重鎖定常ドメインおよび抗体軽鎖定常ドメインを含む、イムノサイトカインを産生することを可能にする。

【0113】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、ヒンジを通じて連結されている、第一の（ＣＨ１）重鎖定常ドメイン、ならびに第二の（ＣＨ２）および第三の（ＣＨ３）重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む。

【0114】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、以下の順序：ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３で配置された抗体重鎖定常ドメインに連結されている、ＩＬ－１５またはＩＬ－１５Ｒαを含む。

【0115】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、抗体重鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５Ｒαを含む。
いくつかの態様において、イムノサイトカインは、

【0116】

【化8】

【0117】

によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体重鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５Ｒαを含む。
いくつかの態様において、イムノサイトカインは、

【0118】

【化9】

【0119】

によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体重鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５Ｒαを含む。
配列番号２２によって示されるアミノ酸配列は、２１２位のシステイン（Ｃ）からアラニン（Ａ）の単一アミノ酸置換によって、配列番号４によって示されるアミノ酸配列から修飾されている。この置換は、天然Ｓ－Ｓ架橋を通じた共有会合を持たず、ヘテロ二量体複合体内で第一の抗体重鎖定常ドメインおよび抗体軽鎖定常ドメインを含む、イムノサイトカインを産生することを可能にする。

【0120】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、抗体重鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５を含む。
いくつかの態様において、イムノサイトカインは、

【0121】

【化10】

【0122】

によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体重鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５を含む。
いくつかの態様において、イムノサイトカインは、

【0123】

【化11】

【0124】

によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体重鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５を含む。
配列番号２０によって示されるアミノ酸配列は、２２９位のシステイン（Ｃ）からアラニン（Ａ）の単一アミノ酸置換によって、配列番号２によって示されるアミノ酸配列から修飾されている。この置換は、天然Ｓ－Ｓ架橋を通じた共有会合を持たず、ヘテロ二量体複合体内で第一の抗体重鎖定常ドメインおよび抗体軽鎖定常ドメインを含む、イムノサイトカインを産生することを可能にする。

【0125】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは：

【0126】

【化12】

【0127】

によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体軽鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５Ｒα、および

【0128】

【化13】

【0129】

によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体重鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５
を含む。

【0130】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは：

【0131】

【化14】

【0132】

によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体軽鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５Ｒα、および

【0133】

【化15】

【0134】

によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体重鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５
を含む。

【0135】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは：

【0136】

【化16】

【0137】

によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体軽鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５Ｒα、および

【0138】

【化17】

【0139】

によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体重鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５
を含む。

【0140】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは：

【0141】

【化18】

【0142】

によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体重鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５Ｒα、および

【0143】

【化19】

【0144】

によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体軽鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５
を含む。

【0145】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは：

【0146】

【化20】

【0147】

によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体重鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５Ｒα、および

【0148】

【化21】

【0149】

によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体軽鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５
を含む。

【0150】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは：

【0151】

【化22】

【0152】

によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体重鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５Ｒα、および

【0153】

【化23】

【0154】

によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体軽鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５
を含む。

【0155】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、前記イムノサイトカインにおいて、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、および／またはＡＤＣＰ特性の不全を引き起こす、Ｆｃ断片単量体中の突然変異を含む。

【0156】

Ｆｃ断片における突然変異は、本明細書記載の抗体のアミノ酸配列の修飾（単数または複数）を意味すると理解される。適切なヌクレオチド変化を抗体核酸内に導入することによって、またはペプチド合成によって、抗体のアミノ酸配列変異体を調製する。こうした修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失、および／または挿入および／または置換が含まれる。最終構築物が望ましい特性を所持するという条件で、欠失、挿入および置換の任意の組み合わせを行って、最終構築物に到達する。

【0157】

アミノ酸置換を用いた抗体のアミノ酸配列の修飾の変型は、抗体分子中の少なくとも１つのアミノ酸残基の別の残基での置換である。
保存的置換を、表Ａ中の「好ましい置換」以下に示す。

【0158】

【表1】

【0159】

用語、抗体の「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（天然Ｆｃ領域配列またはＦｃ領域アミノ酸変異体）に起因しうる生物学的活性を指し、抗体アイソタイプで多様である。抗体エフェクター機能の例には：Ｃ１_ｑ結合および補体依存性細胞傷害性；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞仲介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体、ＢＣＲ）の下方制御およびＢ細胞活性化が含まれる。

【0160】

「抗体依存性細胞傷害性」または「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）が、ターゲット細胞上に結合した抗体を認識し、そして続いてターゲット細胞の溶解または食作用を引き起こす、細胞仲介性反応を指す。ＡＤＣＣを仲介する主な細胞、ＮＫ細胞は、ＦｃγＲＪＩＩのみを発現する一方、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現は、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７－９２（１９９１）の４６４ページの表３に要約される。関心対象の分子のＡＤＣＣ活性を評価するため、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣアッセイ、例えば米国特許第５，５００，３６２号または第５，８２１，３３７号に記載されるアッセイを実行してもよい。こうしたアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいはまたはさらに、関心対象の分子のＡＤＣＣ活性を、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えばＣｌｙｎｅｓら ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２－６５６（１９９８）に開示されるものなどの動物モデルにおいて、評価してもよい。

【0161】

「ヒトエフェクター細胞」は、１つまたはそれより多いＦｃＲを発現し、そしてエフェクター機能を実行する白血球である。好ましくは、該細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、そしてＡＤＣＣエフェクター機能を実行する。ＡＤＣＣを仲介するヒト白血球の例には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞および好中球が含まれ；ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞を、その天然供給源から、例えば本明細書に記載するように、血液またはＰＢＭＣから単離してもよい。

【0162】

「補体依存性細胞傷害性」および「ＣＤＣ」は、分子が、補体の存在下でターゲットを溶解させる能力を指す。補体活性化経路は、同族（ｃｏｇｎａｔｅ）抗原と複合体化した分子（例えば抗体）への補体系の第一成分（Ｃ１ｑ）の結合によって開始される。補体活性化を評価するため、例えばＧａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）に記載されるようなＣＤＣアッセイを実行してもよい。

【0163】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、ＩｇＧに属するＦｃ断片を含む。
いくつかの態様において、イムノサイトカインは：ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４を含む群より選択されるＦｃ断片を含む。

【0164】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒαに基づく上記の２つのヘテロ二量体タンパク質複合体を含む。
本発明のＩＬ１５スーパーアゴニスト（ＢＣＤ２２５またはＩＬ１５ＳＡまたは（ＩＬ１５ＳＡ）２－Ｆｃとも称される）は、ＣＫ＿ＩＬ１５Ｒａ＿Ｈｃ＿ＩＬ１５ＣＨ１ＦｃＬＡＬＡおよびＣＫ＿ＩＬ１５＿Ｈｃ＿ＩＬ１５ＲａＣＨ１ＦｃＬＡＬＡを指すと理解される。

【0165】

名称ＣＫ、ＩＬ１５Ｒａ、ＩＬ１５、ＣＨ１ＦｃＬＡＬＡの意味は、本出願のテキスト全体に提供される。
ＣＫ＿ＩＬ１５Ｒａ＿Ｈｃ＿ＩＬ１５ＣＨ１ＦｃＬＡＬＡは、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒαに基づく２つのヘテロ二量体タンパク質複合体を含む上記イムノサイトカインであって、抗体軽鎖定常ドメインＣＫに連結されているＩＬ１５Ｒａ、ならびに第一の（ＣＨ１）重鎖定常ドメイン、および第二の（ＣＨ２）および第三の（ＣＨ３）重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む抗体重鎖定常ドメインに連結されているＩＬ１５を含み、ＦｃがＬＡＬＡ突然変異を含む、前記イムノサイトカインである。

【0166】

ＣＫ＿ＩＬ１５＿Ｈｃ＿ＩＬ１５ＲａＣＨ１ＦｃＬＡＬＡは、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒαに基づく２つのヘテロ二量体タンパク質複合体を含む上記イムノサイトカインであって、抗体軽鎖定常ドメインＣＫに連結されているＩＬ１５、ならびに第一の（ＣＨ１）重鎖定常ドメイン、および第二の（ＣＨ２）および第三の（ＣＨ３）重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む抗体重鎖定常ドメインに連結されているＩＬ１５Ｒａを含み、ＦｃがＬＡＬＡ突然変異を含む、前記イムノサイトカインである。

【0167】

上記イムノサイトカインは、ヘテロ二量体複合体内の第一の抗体重鎖定常ドメインおよび抗体軽鎖定常ドメインが、天然Ｓ－Ｓ架橋を通じて共有会合を有する形式、ならびにヘテロ二量体複合体内の第一の抗体重鎖定常ドメインおよび抗体軽鎖定常ドメインが、天然Ｓ－Ｓ架橋を通じて共有会合を持たない形式のどちらで作製されてもよく；特定の場合、後者の目的に向けて、両方のシステインがアラニンによって置換されている。

【0168】

ヘテロ二量体複合体内の第一の抗体重鎖定常ドメインおよび抗体軽鎖定常ドメインが、天然Ｓ－Ｓ架橋を通じて共有会合を有する形式、ならびにヘテロ二量体複合体内の第一の抗体重鎖定常ドメインおよび抗体軽鎖定常ドメインが、天然Ｓ－Ｓ架橋を通じて共有会合を持たない形式の両方の上記イムノサイトカインの実験研究によって、上記イムノサイトカインの活性には有意な相違がないことが示された。

【0169】

上記イムノサイトカインの形式を、図１および図２に示す。
いくつかの態様において、イムノサイトカインは、癌または自己免疫疾患の治療のための療法剤として用いられる。

【0170】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、癌の治療のための療法剤として用いられる。
１つの側面において、本発明は、ＩＬ－１５Ｒベータ／ガンマ陽性細胞の活性化および／または増殖を刺激するためのイムノサイトカインであって、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒαに基づくヘテロ二量体タンパク質複合体、およびＰＤ－１経路を特異的に阻害する免疫調節抗体またはその抗原結合断片を含み、
ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒαに基づくヘテロ二量体タンパク質複合体が：
１）以下に連結されているＩＬ－１５Ｒα
ａ）抗体軽鎖定常ドメイン、または
ｂ）第一の（ＣＨ１）重鎖定常ドメインならびに第二の（ＣＨ２）および第三の（ＣＨ３）重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む、抗体重鎖定常ドメイン；
２）以下に連結されているＩＬ－１５
ａ）第一の（ＣＨ１）重鎖定常ドメインならびに第二の（ＣＨ２）および第三の（ＣＨ３）重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む、抗体重鎖定常ドメイン、または
ｂ）抗体軽鎖定常ドメイン
を含み；
ヘテロ二量体複合体内の第一の抗体重鎖定常ドメインおよび抗体軽鎖定常ドメインが、天然Ｓ－Ｓ架橋を通じた共有会合を持つかまたは持たず、そして
ＩＬ－１５またはＩＬ－１５Ｒαが抗体軽鎖定常ドメインに連結されている場合、ＩＬ－１５ＲαまたはＩＬ－１５より選択されるヘテロ二量体タンパク質複合体のもう一方の部分が抗体重鎖定常ドメインに連結されている
前記イムノサイトカインに関する。

【0171】

用語「抗体」または「免疫グロブリン」（Ｉｇ）には、本明細書において、完全抗体およびその任意の抗原結合断片（すなわち「抗原結合部分」）またはその一本鎖が含まれる。用語「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互連結された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質、またはその抗原結合部分を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと略される）および重鎖定常領域を含む。ギリシャ文字：α、δ、ε、γおよびμで示される哺乳動物Ｉｇ重鎖の５つのタイプが知られる。存在する重鎖のタイプは、抗体クラスを定義する：これらの鎖は、それぞれ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ抗体に見られる。異なる重鎖はサイズおよび組成が異なり；αおよびγはおよそ４５０アミノ酸を含有する一方、μおよびεはおよそ５５０アミノ酸を有する。各重鎖は２つの領域、定常領域および可変領域を有する。定常領域は、同じアイソタイプのすべての抗体で同一であるが、異なるアイソタイプの抗体では異なる。重鎖γ、αおよびδは、３つの定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３（一列に）で構成される、定常領域、ならびに柔軟性を付加するためのヒンジ領域を有し（Ｗｏｏｆ Ｊ．， Ｂｕｒｔｏｎ Ｄ．， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４， ２００４， ｃｃ．８９－９９）；重鎖μおよびεは、４つの定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４で構成される定常領域を有する。哺乳動物において、ラムダ（λ）およびカッパ（κ）によって示される２つのタイプの軽鎖のみが知られる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略される）および軽鎖定常領域からなる。軽鎖のおよその長さは２１１～２１７アミノ酸である。好ましくは、軽鎖はカッパ（κ）軽鎖であり、そして定常ドメインＣＬは好ましくはＣカッパ（κ）である。

【0172】

本発明記載の「抗体」は、任意のクラス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ、好ましくはＩｇＧ）またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２、好ましくはＩｇＧ１）であってもよい。

【0173】

ＶＬおよびＶＨ領域を、より保存される、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される領域の間に散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性領域にさらに分けてもよい。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置される、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の多様な細胞（例えばエフェクター細胞）および古典的補体系の第一成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を仲介しうる。

【0174】

用語、抗体の「抗原結合部分」または「抗原結合断片」（あるいは単に「抗体部分」または「抗体断片」）は、本明細書において、抗原に特異的に結合する能力を保持する、抗体の１つまたはそれより多い断片を指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片によって実行可能であることが示されてきている。用語、抗体の「抗原結合部分」内に含まれる結合断片の例には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片一価断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でのジスルフィド架橋によって連結される２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）ＶＨ／ＶＨＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６）；および（ｖｉ）抽出された相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。さらに、Ｆｖ断片の２つの領域、ＶＬおよびＶＨは、別個の遺伝子によってコードされており、単一のタンパク質鎖を受け入れることが可能であるようにする合成リンカーを用いた組換え法を用いて、これらを連結してもよく、ここで、ＶＬおよびＶＨ領域は対形成して一価分子を形成する（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６；およびＨｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３を参照されたい）。こうした一本鎖分子もまた、用語、抗体の「抗原結合部分」内に含まれると仮定される。これらの抗体断片は、当業者に知られる慣用的技術を用いて得られ、そして該断片は、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）抗体と同じ方式でスクリーニングされる。

【0175】

好ましくは、本発明の抗体の抗原結合部分のＣＤＲまたは全抗原結合部分は、マウス、ラマまたはヒトドナーライブラリーに由来するか、あるいは実質的にヒト起源であり、特定の抗体の特性、例えばＫＤ、ｋｏｆｆ、ＩＣ５０、ＥＣ５０、ＥＤ５０を最適化するため、特定のアミノ酸残基が改変されている、例えば異なるアミノ酸残基で置換されている。好ましくは、本発明の抗体のフレームワーク領域はヒト起源であるかまたは実質的にヒト起源である（少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％ヒト起源）。

【0176】

他の態様において、本発明の抗体の抗原結合部分は、マウス、ラマ、ウサギ、ラットまたはハムスターを含むがこれらに限定されない、他の非ヒト種に由来してもよい。あるいは、抗原結合領域は、ヒト種に由来してもよい。

【0177】

用語「可変」は、可変ドメインの特定の部分で、抗体間で配列が非常に異なる事実を指す。Ｖドメインは、抗原結合を仲介し、そしてその特定の抗原に関する特定の抗体各々の特異性を決定する。しかし、可変性は可変ドメインの１１０アミノ酸スパンに渡って、均一には分布していない。その代わり、Ｖ領域は、「超可変領域」またはＣＤＲと称される極度に可変性のより短い領域によって分離される、１５～３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と称される不変断片からなる。天然重鎖および軽鎖の可変ドメインは、各々、４つのＦＲを含み、これらは主にベータシート配置を採用し、ベータシート構造を連結し、そしてある場合はその一部を形成するループを形成する、３つの超可変領域によって連結される。各鎖中の超可変領域は、ＦＲによってごく近接してともに保持され、そしてもう一方の鎖に由来する超可変領域とともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。定常ドメインは、抗原に対する抗体の結合に直接は関与しないが、多様なエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）における抗体の関与を示す。

【0178】

用語「超可変領域」は、本明細書において、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般的に、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基および／または「超可変ループ」由来の残基を含む。

【0179】

特定の場合、ターゲットエピトープに対する結合アフィニティを改善するため、１つまたはそれより多いＣＤＲアミノ酸残基を改変することが望ましい可能性もまたある。これは、「アフィニティ成熟」として知られ、そして随意に、例えば抗体のヒト化が結合特異性またはアフィニティの減少を導き、そして復帰突然変異のみによっては結合特異性またはアフィニティを十分に改善することが不可能である状況において、ヒト化と関連して実行されてもよい。多様なアフィニティ成熟法が当該技術分野に知られ、例えばＢｕｒｋｓら， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， ９４：４１２－４１７（１９９７）によって記載されるｉｎ ｖｉｔｒｏスキャニング飽和突然変異誘発法、およびＷｕら， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５：６０３７ ６０４２（１９９８）による段階的ｉｎ ｖｉｔｒｏアフィニティ成熟法がある。

【0180】

「フレームワーク領域」（ＦＲ）は、ＣＤＲ残基とは異なる可変ドメインの残基である。各可変ドメインは、典型的には、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４と同定される４つのＦＲを有する。ＣＤＲをＫａｂａｔにしたがって定義した際、軽鎖ＦＲ残基は、およそ、残基１～２３（ＬＣＦＲ１）、３５～４９（ＬＣＦＲ２）、５７～８８（ＬＣＦＲ３）、および９８～１０７（ＬＣＦＲ４）に位置し、そして重鎖ＦＲ残基は、重鎖中、およそ、残基１～３０（ＨＣＦＲ１）、３６～４９（ＨＣＦＲ２）、６６～９４（ＨＣＦＲ３）、および１０３～１１３（ＨＣＦＲ４）に位置する。ＣＤＲが超可変ループ由来のアミノ酸残基を含む場合、軽鎖ＦＲ残基は、軽鎖中、およそ、残基１～２５（ＬＣＦＲ１）、３３～４９（ＬＣＦＲ２）、５３～９０（ＬＣＦＲ３）、および９７～１０７（ＬＣＦＲ４）に位置し、そして重鎖ＦＲ残基は、重鎖残基中、およそ、残基１～２５（ＨＣＦＲ１）、３３～５２（ＨＣＦＲ２）、５６～９５（ＨＣＦＲ３）、および１０２～１１３（ＨＣＦＲ４）に位置する。ＣＤＲがＫａｂａｔによって定義されるＣＤＲおよび超可変ループのものの両方に由来するアミノ酸を含むいくつかの場合、ＦＲ残基は適宜調節されるであろう。例えば、ＣＤＲＨ１にアミノ酸Ｈ２６～Ｈ３５が含まれる場合、重鎖ＦＲ１残基は１～２５位であり、そしてＦＲ２残基は３６～４９位である。

【0181】

ターゲット抗原に「結合する」本発明の抗体は、該抗体が前記抗原を発現するタンパク質または細胞または組織をターゲティングする診断および／または療法剤として使用可能であり、そして他のタンパク質とわずかにしか交差反応しないように、十分なアフィニティで抗原に結合可能な抗体を指す。分析法：蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）またはＥＬＩＳＡにしたがって、こうした態様において、非ターゲットタンパク質に対する抗体結合の度合いは、特異的ターゲットタンパク質への抗体結合の１０％未満である。ターゲット分子への抗体の結合に関して、用語、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチドターゲット上のエピトープに対する「特異的結合」または「特異的に結合する」または「特異的である」は、非特異的相互作用とは測定可能に異なる結合を意味する。

【0182】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、ヘテロ二量体複合体内に、天然Ｓ－Ｓ架橋を通じた共有会合を有する、第一の抗体重鎖定常ドメインおよび抗体軽鎖定常ドメインを含む。

【0183】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、ヘテロ二量体複合体内に、天然Ｓ－Ｓ架橋を通じた共有会合を持たない、第一の抗体重鎖定常ドメインおよび抗体軽鎖定常ドメインを含む。

【0184】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、ＣＫまたはＣＬより選択される抗体軽鎖定常ドメインを含む。
いくつかの態様において、イムノサイトカインは、

【0185】

【化24】

【0186】

によって示されるアミノ酸配列を有するＩＬ－１５Ｒα、または類似の生物学的活性を有する突然変異を含有するＩＬ－１５Ｒαの任意の既知の変異体を含む。
突然変異体ＩＬ－１５Ｒα、類似の生物学的活性を有するＩＬ－１５Ｒαは、突然変異を含み、そして「野生型」ＩＬ－１５Ｒαの活性と比較した際、類似の生物学的活性を有する、当該技術分野に知られる任意のＩＬ－１５Ｒαを指すと理解される。

【0187】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、

【0188】

【化25】

【0189】

によって示されるアミノ酸配列を有するＩＬ－１５、または類似の生物学的活性を有する突然変異を含有するＩＬ－１５の任意の既知の変異体を含む。
突然変異体ＩＬ－１５、類似の生物学的活性を有するＩＬ－１５は、突然変異を含み、そして「野生型」ＩＬ－１５と比較した際、類似の生物学的活性を有する、当該技術分野に知られる任意のＩＬ－１５を意味する。

【0190】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、抗体軽鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５Ｒαを含む。
いくつかの態様において、イムノサイトカインは、

【0191】

【化26】

【0192】

によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体軽鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５Ｒαを含む。
いくつかの態様において、イムノサイトカインは、

【0193】

【化27】

【0194】

によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体軽鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５Ｒαを含む。
配列番号１９によって示されるアミノ酸配列は、２１６位のシステイン（Ｃ）からアラニン（Ａ）の単一アミノ酸置換によって、配列番号１によって示されるアミノ酸配列から修飾されている。この置換は、天然Ｓ－Ｓ架橋を通じた共有会合を持たず、ヘテロ二量体複合体内で第一の抗体重鎖定常ドメインおよび抗体軽鎖定常ドメインを含む、イムノサイトカインを産生することを可能にする。

【0195】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、抗体軽鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５を含む。
いくつかの態様において、イムノサイトカインは、

【0196】

【化28】

【0197】

によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体軽鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５を含む。
いくつかの態様において、イムノサイトカインは、

【0198】

【化29】

【0199】

によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体軽鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５を含む。
配列番号２１によって示されるアミノ酸配列は、２３３位のシステイン（Ｃ）からアラニン（Ａ）の単一アミノ酸置換によって、配列番号３によって示されるアミノ酸配列から修飾されている。この置換は、天然Ｓ－Ｓ架橋を通じた共有会合を持たず、ヘテロ二量体複合体内で第一の抗体重鎖定常ドメインおよび抗体軽鎖定常ドメインを含む、イムノサイトカインを産生することを可能にする。

【0200】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、ヒンジを通じて連結されている、第一の（ＣＨ１）重鎖定常ドメイン、ならびに第二の（ＣＨ２）および第三の（ＣＨ３）重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む。

【0201】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、以下の順序：ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３で配置された抗体重鎖定常ドメインに連結されている、ＩＬ－１５またはＩＬ－１５Ｒαを含む。

【0202】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、抗体重鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５Ｒαを含む。
いくつかの態様において、イムノサイトカインは、

【0203】

【化30】

【0204】

によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体重鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５Ｒαを含む。
いくつかの態様において、イムノサイトカインは、

【0205】

【化31】

【0206】

によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体重鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５Ｒαを含む。
配列番号２４によって示されるアミノ酸配列は、２１２位のシステイン（Ｃ）からアラニン（Ａ）の単一アミノ酸置換によって、配列番号６によって示されるアミノ酸配列から修飾されている。この置換は、天然Ｓ－Ｓ架橋を通じた共有会合を持たず、ヘテロ二量体複合体内で第一の抗体重鎖定常ドメインおよび抗体軽鎖定常ドメインを含む、イムノサイトカインを産生することを可能にする。

【0207】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、抗体重鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５を含む。
いくつかの態様において、イムノサイトカインは、

【0208】

【化32】

【0209】

によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体重鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５を含む。
いくつかの態様において、イムノサイトカインは、

【0210】

【化33】

【0211】

によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体重鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５を含む。
配列番号２３によって示されるアミノ酸配列は、２２９位のシステイン（Ｃ）からアラニン（Ａ）の単一アミノ酸置換によって、配列番号５によって示されるアミノ酸配列から修飾されている。この置換は、天然Ｓ－Ｓ架橋を通じた共有会合を持たず、ヘテロ二量体複合体内で第一の抗体重鎖定常ドメインおよび抗体軽鎖定常ドメインを含む、イムノサイトカインを産生することを可能にする。

【0212】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、ＰＤ－１経路を特異的に阻害し、そしてＰＤ－１に特異的に結合する抗体である、免疫調節抗体またはその抗原結合断片を含む。

【0213】

例えば、対照分子の結合に比較した、分子の結合を決定することによって、特異的結合を測定してもよい。例えば、ターゲットに類似の対照分子、例えば過剰な非標識ターゲットとの競合によって、特異的結合を決定してもよい。この場合、プローブに対する標識ターゲットの結合が、過剰な非標識ターゲットによって競合的に阻害された場合、特異的結合が示される。本明細書において、用語、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチドターゲット上のエピトープに対する「特異的結合」または「特異的に結合する」または「特異的である」は、少なくとも約２００ｎＭ、または少なくとも約１５０ｎＭ、または少なくとも約１００ｎＭ、または少なくとも約６０ｎＭ、または少なくとも約５０ｎＭ、または少なくとも約４０ｎＭ、または少なくとも約３０ｎＭ、または少なくとも約２０ｎＭ、または少なくとも約１０ｎＭ、または少なくとも約８ｎＭ、または少なくとも約６ｎＭ、または少なくとも約４ｎＭ、または少なくとも約２ｎＭ、または少なくとも約１ｎＭ、またはそれよりも大きい、ターゲットに対するＫｄを有する分子によって記載されうる。１つの態様において、用語「特異的結合」は、任意の他のポリペプチドまたはポリペプチドエピトープへの実質的な結合を伴わずに、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド上のエピトープに分子が結合する場合の結合を指す。

【0214】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは：
ａ）軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む軽鎖；
ｂ）重鎖可変ドメイン、ならびに第一の（ＣＨ１）重鎖定常ドメイン、および第二の（ＣＨ１）および第三の（ＣＨ３）重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む、抗体重鎖定常ドメインを含む、抗体重鎖定常ドメインを含む、重鎖
を含む、免疫調節抗体を含む。

【0215】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、それぞれ、アミノ酸配列ＧＧＮＮＩＧＳＫＮＶＨ（配列番号１４）、ＲＤＳＮＲＰＳ（配列番号１５）、およびＣＱＶＷＤＳＳＴＡＶ（配列番号１６）によって示されるＬＣＤＲ １、２、および３（超可変領域１、２、および３）を含む軽鎖可変ドメインを含む。

【0216】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、

【0217】

【化34】

【0218】

によって示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。
いくつかの態様において、イムノサイトカインは、それぞれ、アミノ酸配列ＦＴＦＳＳＹＷＭＹ（配列番号１１）、ＡＩＤＴＧＧＧＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１２）、およびＣＡＲＤＥＧＧＧＴＧＷＧＶＬＫＤＷＰＹＧＬＤＡ（配列番号１３）によって示されるＨＣＤＲ １、２、および３（超可変領域１、２、および３）を含む重鎖可変ドメインを含む。

【0219】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、

【0220】

【化35】

【0221】

によって示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
いくつかの態様において、イムノサイトカインは：
１）それぞれ、アミノ酸配列ＧＧＮＮＩＧＳＫＮＶＨ（配列番号１４）、ＲＤＳＮＲＰＳ（配列番号１５）、およびＣＱＶＷＤＳＳＴＡＶ（配列番号１６）によって示されるＬＣＤＲ １、２、および３（超可変領域１、２、および３）を含む軽鎖可変ドメイン；
２）それぞれ、アミノ酸配列ＦＴＦＳＳＹＷＭＹ（配列番号１１）、ＡＩＤＴＧＧＧＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１２）、およびＣＡＲＤＥＧＧＧＴＧＷＧＶＬＫＤＷＰＹＧＬＤＡ（配列番号１３）によって示されるＨＣＤＲ １、２、および３（超可変領域１、２、および３）を含む重鎖可変ドメイン
を含む。

【0222】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは：
１）

【0223】

【化36】

【0224】

によって示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
２）

【0225】

【化37】

【0226】

によって示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン
を含む。
いくつかの態様において、イムノサイトカインは

【0227】

【化38】

【0228】

によって示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、免疫調節抗体を含む。
いくつかの態様において、イムノサイトカインは

【0229】

【化39】

【0230】

によって示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む、免疫調節抗体を含む。
いくつかの態様において、イムノサイトカインは：

【0231】

【化40】

【0232】

によって示されるアミノ酸配列を含む重鎖；

【0233】

【化41】

【0234】

によって示されるアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、免疫調節抗体を含む。
いくつかの態様において、イムノサイトカインは、免疫調節抗体プロルゴリマブ（ＢＣＤ１００、ＷＯ２０１８０１３０１７）を含む。

【0235】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、ＰＤ－１経路を特異的に阻害する免疫調節抗体またはその抗原結合断片であって、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する前記抗体または断片を含む。

【0236】

いくつかの態様において、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗体は、ＲＵ２６６５７９０（ＷＯ２０１８９４４９６）に開示されるＢＣＤ１３５である。
いくつかの態様において、イムノサイトカインは：
ａ）ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒαに基づいて：

【0237】

【化42】

【0238】

によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体軽鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５Ｒα、および

【0239】

【化43】

【0240】

によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体重鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５
を含む、ヘテロ二量体タンパク質複合体；
ｂ）

【0241】

【化44】

【0242】

によって示されるアミノ酸配列を含む重鎖；

【0243】

【化45】

【0244】

によって示されるアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、免疫調節抗体
を含む。

【0245】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは：
ａ）ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒαに基づいて：

【0246】

【化46】

【0247】

によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体軽鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５Ｒα、および

【0248】

【化47】

【0249】

によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体重鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５
を含む、ヘテロ二量体タンパク質複合体；
ｂ）

【0250】

【化48】

【0251】

によって示されるアミノ酸配列を含む重鎖；

【0252】

【化49】

【0253】

によって示されるアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、免疫調節抗体
を含む。

【0254】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは：
ａ）

【0255】

【化50】

【0256】

によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体重鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５Ｒα、および

【0257】

【化51】

【0258】

によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体軽鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５；
ｂ）

【0259】

【化52】

【0260】

によって示されるアミノ酸配列を含む重鎖；

【0261】

【化53】

【0262】

によって示されるアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、免疫調節抗体
を含む。

【0263】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは：
ａ）

【0264】

【化54】

【0265】

によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体重鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５Ｒα、および

【0266】

【化55】

【0267】

によって示されるアミノ酸配列を有する、抗体軽鎖定常ドメインに連結されているＩＬ－１５；
ｂ）

【0268】

【化56】

【0269】

によって示されるアミノ酸配列を含む重鎖；

【0270】

【化57】

【0271】

によって示されるアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、免疫調節抗体
を含む。

【0272】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、２つの異なる部分のヘテロ二量体化を誘導する、抗体定常ドメイン中の突然変異を有し、部分の一方は、共有的にまたは非共有的に会合した、抗体定常ドメインに連結されているＩＬ－１５Ｒαおよび抗体定常ドメインに連結されているＩＬ－１５を含み、そしてもう一方の部分は、共有的にまたは非共有的に会合した、抗体の軽鎖および重鎖を含む。

【0273】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは：
以下の群：第一のＦｃ単量体がノブ修飾Ｆｃであり、そして第二のＦｃ単量体がホール修飾Ｆｃである場合、または第二のＦｃ単量体がノブ修飾Ｆｃであり、そして第一のＦｃ単量体がホール修飾Ｆｃである場合より選択される、第一のＦｃ単量体および第二のＦｃ単量体
を含む。

【0274】

「ノブ・イントゥ・ホール」（「ノブ・イントゥ・ホール」型の相互作用）は、誤った対形成の（ｍｉｓｐａｉｒｅｄ）副産物に関連する問題を回避することが可能なアプローチである。このアプローチは、ＣＨ３ドメイン内に、接触界面を修飾する突然変異を導入することによって、２つの異なる抗体重鎖の対形成を強いることを目的とする。一方の鎖上で、かさばる（ｂｕｌｋｙ）アミノ酸を、短い側鎖を持つアミノ酸で置換して、「ホール」を形成する。逆に、大きな側鎖を持つアミノ酸をもう一方のＣＨ３ドメイン内に導入して、「ノブ」を生成する。これらの２つの重鎖を同時発現することによって、ホモ二量体形成（「ホール－ホール」または「ノブ－ノブ」）に対して、高収率のヘテロ二量体形成（「ノブ－ホール」）が観察された（Ｒｉｄｇｗａｙ， Ｊ． Ｂ．， Ｐｒｅｓｔａ Ｌ Ｇ， Ｃａｒｔｅｒ Ｐ；およびＷＯ １９９６／０２７０１１）。ファージディスプレイ技術およびヘテロ二量体を安定化させるジスルフィド架橋の導入を用いて、２つのＣＨ３ドメインの界面をリモデリングすることによって、ヘテロ二量体の割合をさらに増加させてもよい（Ｍｅｒｃｈａｎｔ， Ａ． Ｍ．ら， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １６（１９９８）６７７－６８１； Ａｔｗｅｌｌ， Ｓ．， Ｒｉｄｇｗａｙ， Ｊ． Ｂ．， Ｗｅｌｌｓ， Ｊ． Ａ．， Ｃａｒｔｅｒ， Ｐ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２７０（１９９７）２６－３５）。

【0275】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗを有する第一のＦｃ単量体、およびアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖを有する第二のＦｃ単量体を含む。

【0276】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７を有する第一のＦｃ単量体、およびアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗを有する第二のＦｃ単量体を含む。

【0277】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、ＩｇＧに属するＦｃ断片を含む。
いくつかの態様において、イムノサイトカインは、Ｆｃ断片アイソタイプが：ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４を含む群より選択されるＦｃ断片を含む。

【0278】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、前記イムノサイトカインにおいて、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、および／またはＡＤＣＰ特性の不全を引き起こす、Ｆｃ断片単量体中の突然変異を含む。

【0279】

さらに、二重特異性ＩＬ１５スーパーアゴニストまたは二重特異性ＩＬ１５イムノサイトカインまたは抗ＰＤ１／ＩＬ１５ＳＡイムノサイトカイン（ＩＬ－１５ＳＡおよび抗ＰＤ－１ Ｆａｂ断片を含む二重特異性モノクローナル抗体）は、以下を意味すると理解される：
抗ＰＤ－１ Ｆａｂ－ＣＫ＿ＩＬ１５Ｒａ＿Ｈｃ＿ＩＬ１５ＣＨ１ＦｃノブＬＡＬＡ、
抗ＰＤ－１ Ｆａｂ－ＣＫ＿ＩＬ１５＿Ｈｃ＿ＩＬ１５ＲａＣＨ１ＦｃノブＬＡＬＡ。

【0280】

さらに抗ＰＤ－Ｌ１／ＩＬ１５ＳＡイムノサイトカインは、以下を意味すると理解される：
抗ＰＤ－Ｌ１ Ｆａｂ－ＣＫ＿ＩＬ１５Ｒａ＿Ｈｃ＿ＩＬ１５ＣＨ１ＦｃノブＬＡＬＡ、
抗ＰＤ－Ｌ１ Ｆａｂ－ＣＫ＿ＩＬ１５＿Ｈｃ＿ＩＬ１５ＲａＣＨ１ＦｃノブＬＡＬＡ。

【0281】

名称、抗ＰＤ－１ Ｆａｂ、抗ＰＤ－Ｌ１ Ｆａｂ、ＣＫ、ＩＬ１５Ｒａ、ＩＬ１５、ＣＨ１ＦｃノブＬＡＬＡの意味は、本出願のテキスト全体に提供される。
抗ＰＤ－１ Ｆａｂ－ＣＫ＿ＩＬ１５Ｒａ＿Ｈｃ＿ＩＬ１５ＣＨ１ＦｃノブＬＡＬＡは、抗ＰＤ１抗体、抗体軽鎖定常ドメインＣＫに連結されているＩＬ１５Ｒａ、ならびに第一の（ＣＨ１）重鎖定常ドメイン、および第二の（ＣＨ２）および第三の（ＣＨ３）重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む抗体重鎖定常ドメインに連結されているＩＬ１５を含む、上記イムノサイトカインであって、Ｆｃがヘテロ二量体化を形成する突然変異（例えばノブ）およびＬＡＬＡを含む、前記イムノサイトカインである。

【0282】

抗ＰＤ－１ Ｆａｂ－ＣＫ＿ＩＬ１５＿Ｈｃ＿ＩＬ１５ＲａＣＨ１ＦｃノブＬＡＬＡは、抗ＰＤ１抗体、抗体軽鎖定常ドメインＣＫに連結されているＩＬ１５、ならびに第一の（ＣＨ１）重鎖定常ドメイン、および第二の（ＣＨ２）および第三の（ＣＨ３）重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む抗体重鎖定常ドメインに連結されているＩＬ１５Ｒａを含む、上記イムノサイトカインであって、Ｆｃがヘテロ二量体化を形成する突然変異（例えばノブ）およびＬＡＬＡを含む、前記イムノサイトカインである。

【0283】

抗ＰＤ－Ｌ１ Ｆａｂ－ＣＫ＿ＩＬ１５Ｒａ＿Ｈｃ＿ＩＬ１５ＣＨ１ＦｃノブＬＡＬＡは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗体軽鎖定常ドメインＣＫに連結されているＩＬ１５Ｒａ、ならびに第一の（ＣＨ１）重鎖定常ドメイン、および第二の（ＣＨ２）および第三の（ＣＨ３）重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む抗体重鎖定常ドメインに連結されているＩＬ１５を含む、上記イムノサイトカインであって、Ｆｃがヘテロ二量体化を形成する突然変異（例えばノブ）およびＬＡＬＡを含む、前記イムノサイトカインである。

【0284】

抗ＰＤ－Ｌ１ Ｆａｂ－ＣＫ＿ＩＬ１５＿Ｈｃ＿ＩＬ１５ＲａＣＨ１ＦｃノブＬＡＬＡは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗体軽鎖定常ドメインＣＫに連結されているＩＬ１５、ならびに第一の（ＣＨ１）重鎖定常ドメイン、および第二の（ＣＨ２）および第三の（ＣＨ３）重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む抗体重鎖定常ドメインに連結されているＩＬ１５Ｒａを含む、上記イムノサイトカインであって、Ｆｃがヘテロ二量体化を形成する突然変異（例えばノブ）およびＬＡＬＡを含む、前記イムノサイトカインである。

【0285】

上記イムノサイトカインは、ヘテロ二量体複合体内の第一の抗体重鎖定常ドメインおよび抗体軽鎖定常ドメインが、天然Ｓ－Ｓ架橋を通じた共有会合を有する形式、ならびにヘテロ二量体複合体内の第一の抗体重鎖定常ドメインおよび抗体軽鎖定常ドメインが、天然Ｓ－Ｓ架橋を通じた共有会合を持たない形式のどちらで作製されてもよく；特定の場合、後者の目的に向けて、両方のシステインがアラニンによって置換されている。

【0286】

ヘテロ二量体複合体内の第一の抗体重鎖定常ドメインおよび抗体軽鎖定常ドメインが、天然Ｓ－Ｓ架橋を通じた共有会合を有する形式、ならびにヘテロ二量体複合体内の第一の抗体重鎖定常ドメインおよび抗体軽鎖定常ドメインが、天然Ｓ－Ｓ架橋を通じた共有会合を持たない形式の両方の上記イムノサイトカインの実験研究によって、上記サイトカインの活性には有意な相違がないことが示された。

【0287】

「ノブ」は、上記のように、ＣＨ３ドメイン中の第一のＦｃ変異体および第二のＦｃ変異体の間の「ノブ・イントゥ・ホール」構造を形成する突然変異を意味するよう理解される。

【0288】

上記イムノサイトカインの形式を、図３および４に示す。
いくつかの態様において、イムノサイトカインは、腫瘍性疾患または自己免疫疾患の治療に用いられる。

【0289】

いくつかの態様において、イムノサイトカインは、腫瘍性疾患の治療に用いられる。
核酸
１つの側面において、本発明は、上記イムノサイトカインのいずれかをコードする単離核酸に関する。

【0290】

用語「核酸」、「核配列（ｎｕｃｌｅｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」および「ヌクレオチド配列」は、本明細書において交換可能に用いられ、修飾されているかまたはされていないヌクレオチドの正確な配列を意味し、核酸の断片または領域を決定し、非天然ヌクレオチドを含有するかまたは含有せず、そして二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいは前記ＤＮＡの転写産物のいずれかである。

【0291】

本発明が天然染色体環境にある、すなわち天然状態にあるヌクレオチド配列と関連しないこともまた、本明細書に含まれなければならない。本発明の配列は、単離され、そして／または精製されており、すなわちこれらは、例えばコピーによって、直接または間接的にサンプリングされ、その環境は少なくとも部分的に修飾されている。したがって、組換え遺伝学によって、例えば宿主細胞によって得られるか、または化学合成によって得られる単離核酸もまた、本明細書に言及されなければならない。

【0292】

「単離」核酸分子は、天然供給源において結合している、少なくとも１つの核酸分子不純物から同定されそして分離されているものである。単離核酸分子は、天然条件下で見出される型またはセットとは異なる。したがって、単離核酸分子は、天然条件下の細胞中に存在する核酸分子とは異なる。しかし、例えば核酸分子が天然条件下での細胞における位置とは異なる染色体局在を有する場合、単離核酸分子には、イムノサイトカインが通常発現される細胞に位置する核酸分子が含まれる。

【0293】

いくつかの態様において、核酸はＤＮＡである。
１つの態様において、本発明は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４より選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子に関する。核酸分子はまた、上記ヌクレオチド配列の任意の組み合わせを含んでもよい。

【0294】

当業者に認識されるであろうように、遺伝暗号の縮重により、多様な異なるＤＮＡ配列が、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードしうる。同じアミノ酸配列をコードするこれらの代替ＤＮＡ配列を生成することは、十分に、当該技術分野で訓練された当業者の技術範囲内である。こうした変異体ＤＮＡ配列は、本発明の範囲内である。

【0295】

発現ベクター
１つの側面において、本発明は、上記核酸を含む発現ベクターに関する。
用語「ベクター」は、本明細書において、連結されている別の核酸を輸送可能な核酸分子を意味する。いくつかの態様において、ベクターは、プラスミド、すなわち、その中にさらなるＤＮＡセグメントを連結可能なＤＮＡの環状二本鎖片である。いくつかの態様において、ベクターはウイルスベクターであり、ここで、さらなるＤＮＡセグメントをウイルスゲノム内に連結してもよい。いくつかの態様において、ベクターは、導入される宿主細胞において自律複製可能である（例えば複製の細菌起点部位を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。さらなる態様において、ベクター（例えば非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞内への導入に際して、宿主細胞のゲノム内に組み込まれてもよく、そしてそれによって宿主遺伝子とともに複製される。さらに、特定のベクターは、機能可能であるように連結されている遺伝子の発現を指示することが可能である。こうしたベクターは、本明細書において、「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と称される。

【0296】

本発明は、本明細書に記載するように、上記イムノサイトカインまたはその構造部分のアミノ酸配列いずれかをコードする上記核酸分子を含むベクターに関する。
いくつかの態様において、本発明のイムノサイトカインは、第一および第二のイムノサイトカインドメイン（例えば抗体定常ドメイン（単数または複数）に連結されているＩＬ１５またはＩＬ１５Ｒαを含むドメイン、ならびに／あるいは抗体軽鎖および重鎖）の配列を部分的にまたは完全にコードするＤＮＡを挿入することによって発現され、該遺伝子が、所望の発現制御配列、例えば転写および翻訳制御配列に機能可能であるように連結されている発現ベクター中で、上述のように産生される。発現ベクターには、プラスミド、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、植物ウイルス、例えばカリフラワーモザイクウイルス、タバコモザイクウイルス、コスミド、ＹＡＣ、ＥＢＶ由来エピソーム等が含まれる。ベクター内の転写および翻訳制御配列が、ＤＮＡの転写および翻訳を制御する意図される機能を果たすように、ＤＮＡ分子をベクター内に連結してもよい。用いる発現宿主細胞と適合するように、発現ベクターおよび発現制御配列を選択してもよい。第一および第二の結合ドメインの配列（例えば、結合ドメインが重鎖および軽鎖配列を含む場合の重鎖および軽鎖配列）を部分的にまたは完全にコードするＤＮＡ分子を個々のベクター内に導入してもよい。１つの態様において、前記ＤＮＡ分子の任意の組み合わせを同じ発現ベクター内に導入する。標準法（例えば抗体遺伝子断片およびベクター上の相補的制限部位の連結、または制限部位が存在しない場合、平滑端連結）によって、ＤＮＡ分子を発現ベクター内に導入してもよい。

【0297】

適切なベクターは、いかなる配列、ＶＨまたはＶＬまたはＩＬ１５またはＩＬ１５Ｒαも、上述のように容易に挿入されそして発現されうるように、適切な制限部位操作で、機能的に完全なヒトＣＨまたはＣＬ／ＣＫ免疫グロブリン配列をコードするものである。こうしたベクターにおけるＨＣおよびＬＣコード遺伝子は、対応するｍＲＮＡを安定化させることによって、全体の抗体タンパク質収量の増進を生じる、イントロン配列を含有してもよい。該イントロン配列には、ＲＮＡスプライシングがどこで起こるかを決定する、スプライスドナーおよびスプライスアクセプター部位が隣接する。イントロン配列の位置は、抗体鎖の可変または定常領域のいずれにあってもよく、あるいは多数のイントロンを用いる場合、可変および定常領域の両方にあってもよい。ポリアデニル化および転写終結は、コード領域下流の天然染色体部位で起こってもよい。組換え発現ベクターはまた、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドもコードしてもよい。シグナルペプチドが免疫グロブリン鎖のアミノ末端のリーディングフレームに連結されるように、抗体鎖遺伝子あるいはＩＬ１５またはＩＬ１５Ｒαを含む鎖の遺伝子をベクター内にクローニングしてもよい。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド（すなわち非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）であってもよい。

【0298】

抗体鎖遺伝子あるいはＩＬ１５またはＩＬ１５Ｒαを含む鎖の遺伝子に加えて、本発明の組換えベクター発現は、宿主細胞における該遺伝子の発現を制御する、制御配列を含んでもよい。当業者には、制御配列の選択を含めて、発現ベクターの設計が、形質転換しようとする宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベル等に依存しうることが理解されるであろう。哺乳動物における発現宿主細胞のための好ましい制御配列には、哺乳動物細胞において、高レベルのタンパク質発現を確実にするウイルス要素、例えばレトロウイルスＬＴＲ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えばＣＭＶプロモーター／エンハンサー）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えばＳＶ４０プロモーター／エンハンサー）、アデノウイルス（例えば主要後期プロモーターアデノウイルス（ＡｄＭＬＰ））、ポリオーマウイルスおよび強力な哺乳動物プロモーター、例えば天然免疫グロブリンプロモーターまたはアクチンプロモーターが含まれる。ウイルス制御要素およびその配列のさらなる説明に関しては、例えば、米国特許第５，１６８，０６２号、第４，５１０，２４５号および第４，９６８，６１５号を参照されたい。細菌細胞または真菌細胞、例えば酵母細胞においてポリペプチドを発現するための方法もまた、当該技術分野に周知である。

【0299】

上記遺伝子および制御配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、さらなる配列、例えば宿主細胞におけるベクターの複製を制御する配列（例えば複製起点）および選択可能マーカー遺伝子を所持してもよい。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を容易にする（例えば米国特許第４，３９９，２１６号、第４，６３４，６６５号および第５，１７９，０１７号を参照されたい）。例えば、典型的には、選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞に対して、医薬品剤、例えばＧ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキセートに対する耐性を与える。例えば、選択可能マーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキセート選択／増幅中、ｄｈｆｒ－宿主細胞において使用するため）、ｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）、およびグルタミン酸シンテターゼ遺伝子が含まれる。

【0300】

用語「発現制御配列」は、本明細書において、連結されているコード配列の発現およびプロセシングに影響を及ぼすために必要であるポリヌクレオチド配列を指す。発現制御配列には、適切な転写開始、終結、プロモーターおよびエンハンサー配列；効率的ＲＮＡプロセシングシグナル、例えばスプライシングおよびポリアデニル化シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を増進させる配列（すなわちコザック・コンセンサス配列）；タンパク質安定性を増進させる配列；ならびに望ましい場合、タンパク質分泌を増進させる配列が含まれる。こうした制御配列の性質は、宿主生物に応じて異なり；原核生物においては、こうした制御配列には、一般的に、リボソーム結合部位のプロモーター、および転写終結配列が含まれ；真核生物においては、典型的には、こうした制御配列には、プロモーターおよび転写終結配列が含まれる。用語「制御配列」には、少なくとも、その存在が、発現およびプロセシングに必須であるすべての構成要素が含まれ、そしてまた、その存在が好適であるさらなる構成要素、例えばリーダー配列および融合パートナーの配列も含まれてもよい。

【0301】

用語「制御配列」は、特定の宿主生物における、機能可能であるように連結されているコード配列の発現のために必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に適切な制御配列には、例えば、プロモーター、随意にオペレーター配列、およびリボソーム結合部位が含まれる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが知られる。

【0302】

核酸は、別の核酸配列と機能的関連に置かれた際、「機能可能であるように連結されている」。例えば、プレ配列または分泌リーダー配列のＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されている場合、ポリペプチドに関するＤＮＡに機能可能であるように連結されており；プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に機能可能であるように連結されており；リボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置されている場合、コード配列に機能可能であるように連結されている。一般的に、「機能可能であるように連結されている」は、連結されているＤＮＡ配列が隣接しており、そして分泌リーダーの場合、隣接しそして読み枠中にあることを意味する。しかし、エンハンサーは隣接している必要はない。

【0303】

宿主細胞およびその産生法
１つの側面において、本発明は、上記ベクターで細胞を形質転換することを含む、上記イムノサイトカイン産生のための宿主細胞の産生法に関する。

【0304】

本発明のイムノサイトカインをコードする核酸分子およびこれらの核酸分子を含むベクターを、適切な哺乳動物またはその細胞、植物またはその細胞、細菌または酵母宿主細胞のトランスフェクションに用いてもよい。形質転換は、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための任意の既知の技術によってもよい。哺乳動物細胞内に異種ポリヌクレオチドを導入するための方法は、当該技術分野に周知であり、そしてこれには、デキストラン仲介性トランスフェクション、陽イオン性ポリマー－核酸複合体トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン仲介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、リポソーム中のポリヌクレオチド（単数または複数）の被包、および核内へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションが含まれる。さらに、ウイルスベクターによって、哺乳動物細胞内に核酸分子を導入してもよい。細胞をトランスフェクションするための方法は、当該技術分野に周知である。例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、第４，９１２，０４０号、第４，７４０，４６１号および第４，９５９，４５５号を参照されたい。植物細胞を形質転換するための方法が当該技術分野に周知であり、これには、例えばアグロバクテリウム仲介形質転換、微粒子銃形質転換、直接注入、エレクトロポレーションおよびウイルス形質転換が含まれる。細菌および酵母細胞を形質転換する方法もまた、当該技術分野に周知である。

【0305】

１つの側面において、本発明は、上記核酸を含む、上記イムノサイトカインの産生のための宿主細胞に関する。
１つの側面において、本発明は、上記イムノサイトカインを含む薬剤の産生法であって、上記宿主細胞を、前記イムノサイトカインを産生するために十分な条件下で、培地中で培養し、必要であれば、その後、生じたイムノサイトカインの単離および精製を行う、前記方法に関する。

【0306】

用語「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）は、本明細書において、組換え発現ベクターが導入されている細胞を指す。本発明は、例えば、上述の本発明記載のベクターが含まれうる宿主細胞に関する。本発明はさらに、例えば本発明のイムノサイトカインまたはその上記部分をコードするヌクレオチド配列を含む、宿主細胞に関する。「組換え宿主細胞」および「宿主細胞」が、特定の対象細胞だけでなく、こうした細胞の子孫もまた指すことを理解しなければならない。突然変異または環境の影響のいずれかにより、続く世代で修飾が生じうるため、こうした子孫は、実際、親細胞と同一でない可能性もあるが、こうした細胞はなお、本明細書において、用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。

【0307】

形質転換のための宿主として用いる哺乳動物細胞株が当該技術分野に周知であり、そしてこれには、入手可能な多数の不死化細胞株が含まれる。これらには、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＮＩＨ－３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えばＨｅｐＧ２）、Ａ５４９細胞、および多くの他の細胞株が含まれる。どの細胞株が高発現レベルを有し、そして産生するタンパク質に必要な特性を提供するかを決定することによって、細胞株を選択する。使用可能な他の細胞株は、昆虫細胞株、例えばＳｆ９またはＳｆ２１細胞である。本発明のイムノサイトカインまたはその部分をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞内に導入する際、宿主細胞における本発明のイムノサイトカインまたはその部分の発現、あるいはより好ましくは、宿主細胞を培養する培地内へのイムノサイトカインの分泌を可能にするために十分な期間、宿主細胞を培養することによって、イムノサイトカインを産生する。標準的なタンパク質精製技術を用いて、培地から、イムノサイトカインを単離してもよい。植物宿主細胞には、例えばニコチアナ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、ウキクサ（ｄｕｃｋｗｅｅｄ）、トウモロコシ、コムギ、ジャガイモ等が含まれる。細菌宿主細胞には、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）およびストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種が含まれる。酵母宿主細胞には、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）が含まれる。

【0308】

さらに、多くの既知の技術を用いて、産生細胞株からの本発明記載のイムノサイトカインの産生レベルを増進させてもよい。例えば、グルタミンシンテターゼ遺伝子発現系（ＧＳ系）は、特定の条件下で発現を増進させるための一般的なアプローチである。ＧＳ系は、ＥＰ第０２１６８４６号、第０２５６０５５号、第０３２３９９７号および第０３３８８４１号と関連して、全体にまたは部分的に論じられる。

【0309】

異なる細胞株または宿主細胞における本発明のイムノサイトカインまたはその部分は、互いに異なるグリコシル化パターンを有するであろう。しかし、本明細書に提供するアミノ酸配列を含む、本明細書開示のイムノサイトカインまたはその部分（ドメイン）は、結合分子のグリコシル化に関わらず、そして一般的に翻訳後修飾の存在または非存在に関わらず、本発明の一部である。

【0310】

薬学的組成物
１つの側面において、本発明は、ＩＬ－１５Ｒベータ／ガンマ陽性細胞の活性化および／または増殖を刺激するための薬学的組成物であって、１つまたはそれより多くの薬学的に許容されうる賦形剤と組み合わせて、療法的有効量の上記イムノサイトカインを含む、前記薬学的組成物に関する。

【0311】

「薬学的組成物」は、本発明のイムノサイトカイン、および薬学的に許容されうるそして薬理学的に適合する賦形剤、例えば充填剤、溶媒、希釈剤、キャリアー、補助剤、分配剤、送達剤、保存剤、安定化剤、乳化剤、懸濁剤、増粘剤、持続送達制御剤からなる群より選択される少なくとも１つの構成要素を含む組成物を意味し、これらの選択および比率は、投与および投薬のタイプおよび経路に応じる。本発明の薬学的組成物およびその調製法は、明確に、当業者に明らかであろう。薬学的組成物は、好ましくは、ＧＭＰ（製造管理および品質管理に関する基準）要件に適合して製造されなければならない。組成物は、緩衝剤組成物、等張剤、安定化剤および可溶化剤を含んでもよい。活性薬学的成分の吸収を遅延させる剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンによって、組成物の作用の持続を達成してもよい。適切なキャリアー、溶媒、希釈剤および送達剤の例には、水、エタノール、ポリアルコールおよびその混合物、油、ならびに注射用の有機エステルが含まれる。

【0312】

「療法的有効量」は、ある程度の度合いまで、治療中の障害の症状の１つまたはそれより多くを軽減するであろう、投与される療法剤の量を指す。
「医薬品（薬剤）」は、ヒトおよび動物において、生理学的機能の回復、改善または修飾のために、そして疾患の治療および防止のために、診断、麻酔、避妊、美容術等のために意図される、錠剤、カプセル、粉末、凍結乾燥物、注射剤、注入剤、軟膏および他の既製品型の薬学的組成物としての化合物または化合物の混合物である。当該技術分野において許容される、ペプチド、タンパク質または抗体を投与するための任意の方法を、本発明のイムノサイトカインに関して、適切に使用してもよい。

【0313】

用語「薬学的に許容されうる」は、哺乳動物、好ましくはヒトにおける投与に適した１つまたはそれより多い適合する液体または固体構成要素を指す。
用語「賦形剤」は、本明細書において、本発明の上記成分以外の任意の成分を記載するよう用いられる。これらは、薬剤産物に、必要な物理化学特性を与えるため、薬剤製造において用いられる無機または有機性の物質である。

【0314】

用語「緩衝液」、「緩衝剤組成物」、「緩衝剤」は、その酸－塩基コンジュゲート構成要素の作用によって、ｐＨの変化に抵抗することが可能であり、そして本発明のイムノサイトカイン産物が、ｐＨの変化に抵抗することを可能にする、溶液を指す。一般的に、薬学的組成物は、好ましくは、４．０～８．０の範囲のｐＨを有する。用いる緩衝剤の例には、限定されるわけではないが、酢酸、リン酸、クエン酸、ヒスチジン、コハク酸等の緩衝溶液が含まれる。

【0315】

用語「等張剤」、「浸透圧調節物質」または「浸透圧調節剤」は、本明細書において、液体抗体配合物の浸透圧を増加させうる賦形剤を指す。「等張」薬剤は、ヒト血液のものと等しい浸透圧を有する薬剤である。等張薬剤は、典型的には、約２５０～３５０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する。用いられる等張剤には、限定されるわけではないが、ポリオール、糖類およびスクロース、アミノ酸、金属塩、例えば塩化ナトリウム等が含まれる。

【0316】

「安定化剤」は、活性剤の物理的および／または化学的安定性を提供する、賦形剤、あるいは２つまたはそれより多い賦形剤の混合物を指す。安定化剤には、アミノ酸、例えば限定されるわけではないが、アルギニン、ヒスチジン、グリシン、リジン、グルタミン、プロリン；界面活性剤、例えば限定されるわけではないが、ポリソルベート２０（商品名：Ｔｗｅｅｎ ２０）、ポリソルベート８０（商品名：Ｔｗｅｅｎ ８０）、ポリエチレン－ポリプロピレングリコールおよびそのコポリマー（商品名：ポロキサマー、プルロニック（登録商標）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；酸化防止剤、例えば限定されるわけではないが、メチオニン、アセチルシステイン、アスコルビン酸、モノチオグリセロール、亜硫酸塩等；キレート剤、例えば限定されるわけではないが、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、クエン酸ナトリウム等が含まれる。

【0317】

明記される保存可能期間中に、保存温度、例えば２～８℃で、活性剤が、その物理的安定性および／または化学的安定性および／または生物学的活性を保持するならば、薬学的組成物は「安定」である。好ましくは、活性剤は、物理的および化学的安定性、ならびに生物学的活性の両方を保持する。加速されたまたは天然の経年変化（ａｇｉｎｇ）状態において、安定性試験の結果に基づいて、保存期間を調節する。

【0318】

既製配合物の形の、単一単位用量または複数の単一単位用量の形で、本発明の薬学的組成物を製造するか、パッケージングするか、または広く販売してもよい。用語「単一単位用量」は、本明細書において、活性成分のあらかじめ決定した量を含有する、別個の量の薬学的組成物を指す。活性成分の量は、典型的には、被験体に投与しようとする活性成分の用量、あるいはこうした用量の好適な部分、例えばこうした用量の半量または三分の一量と等しい。

【0319】

本発明記載の薬学的組成物は、典型的には、注射、注入および移植により、胃腸管を迂回して、皮膚または粘膜障壁における割れ目（ｂｒｅａｃｈ）を通じてヒト体内に投与されるよう意図された無菌配合物としての、非経口投与に適している。例えば、非経口投与には、とりわけ、皮下、腹腔内、筋内、胸骨内、静脈内、動脈内、クモ膜下腔内、心室内、尿道内、頭蓋内、滑膜内、経皮注射または注入；および腎臓透析注入技術が含まれると意図される。腫瘍内送達、例えば腫瘍内注射もまた使用してもよい。局所灌流もまた提供される。好ましい態様には、静脈内および皮下経路が含まれる。当該技術分野に許容される、ペプチドまたはタンパク質を投与するための任意の方法を、本発明のイムノサイトカインに適切に使用してもよい。

【0320】

限定なしに、単位投薬型で、例えばアンプル、バイアル中、プラスチック容器、あらかじめ充填したシリンジ、自動注射（ａｕｔｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）デバイス中で、注射可能配合物を調製するか、パッケージングするか、または販売してもよい。非経口投与のための配合物には、とりわけ、懸濁物、溶液、油性または水性基剤中のエマルジョン、ペースト等が含まれる。

【0321】

別の態様において、本発明は、投与前に適切な基剤（例えば無菌病原体不含水）で再構成するための乾燥（すなわち粉末または顆粒）型で提供される、薬学的組成物を含む、非経口投与のための組成物を提供する。こうした配合物を、例えば凍結乾燥プロセスによって調製してもよく、該プロセスは、フリーズドライとして当該技術分野に知られ、そして産物を凍結し、その後、凍結した物質から溶媒を除去する工程を伴う。

【0322】

また、本発明記載のイムノサイトカインを、鼻内または吸入によって、単独で、適切な薬学的に許容されうる賦形剤との混合物としてのいずれかで、吸入装置、例えば加圧エアロゾルコンテナ、ポンプ、スプレー、アトマイザーまたはネブライザーから、適切な噴霧剤を用いまたは用いず、あるいは点鼻剤として、またはスプレーで、投与してもよい。

【0323】

非経口投与のための投薬型を、即時または修飾放出されるように、配合してもよい。修飾放出配合物には、遅延、持続、パルス、制御、ターゲティングおよびプログラム放出が含まれる。

【0324】

いくつかの態様において、薬学的組成物は、腫瘍性疾患または自己免疫疾患の治療に用いられる。
いくつかの態様において、薬学的組成物は、自己免疫疾患の治療に用いられる。

【0325】

用語「自己免疫疾患」は、本明細書において、個体自身の（自己）抗原および／または組織から生じ、そしてこれらに対して向けられる非悪性疾患または障害を指す。
「自己免疫疾患」の定義は、限定されるわけではないが、関節リウマチ、変形性関節症、若年性慢性関節炎、敗血症関節炎、ライム変形性関節症、乾癬性関節炎、反応性関節炎、脊椎関節症、全身性エリテマトーデス、クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、糖尿病、甲状腺炎、喘息、アレルギー性疾患、乾癬、アトピー性皮膚炎、強皮症、「移植片対宿主」反応、臓器移植拒絶、移植に関連する急性または慢性免疫疾患、サルコイドーシス、川崎病、グレーブス病、ネフローゼ症候群、慢性疲労症候群、ウェゲナー肉芽腫症、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、顕微鏡性腎血管炎、慢性活性肝炎、ブドウ膜炎（ｕｖｅｎｉｔａ）、敗血症ショック、毒性ショック症候群、敗血症症候群、悪液質、後天性免疫不全症候群、急性横断性脊髄炎、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、原発性胆汁性肝硬変、溶血性貧血、成人（急性）呼吸促迫症候群、脱毛症、限局性脱毛症、血清陰性関節症、関節症、ライター病、潰瘍性大腸炎関節症と関連する乾癬性関節症、アトピー性アレルギー、自己免疫水疱症、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、天疱瘡病、線状ＩｇＡ、自己免疫溶血性貧血、クームス陽性溶血性貧血、悪性貧血、若年性悪性貧血、関節炎、原発性硬化性肝炎Ａ、特発性自己免疫肝炎、線維性肺疾患、特発性線維性肺胞炎、炎症後間質性肺疾患、間質性肺炎、慢性好酸球性肺炎、感染後間質性肺疾患、痛風関節炎、自己免疫肝炎、Ｉ型自己免疫肝炎（古典的自己免疫肝炎またはルポイド）、ＩＩ型自己免疫肝炎、変形性関節症、原発性硬化性胆管炎、Ｉ型乾癬、ＩＩ型乾癬、特発性白血球減少症、自己免疫好中球減少症、腎ＮＯＳ疾患、糸球体腎炎、顕微鏡性腎血管炎、円板状エリテマトーデス、特発性または雄性ＮＯＳ不妊症、精子に対する自己免疫、多発性硬化症（すべてのサブタイプ）、交感性眼炎、結合組織疾患に続く肺高血圧、グッドパスチャー症候群、結節性多発性関節炎（ｐｏｌｙａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｎｏｄｏｓａ）の肺症状、急性リウマチ熱、リウマチ性脊椎炎、強直性脊椎炎、スティル病、全身性硬化症、シェーグレン症候群、高安病、自己免疫血小板減少症、特発性血小板減少症、自己免疫甲状腺炎、甲状腺機能亢進症、橋本病、自己免疫萎縮性甲状腺機能低下症、原発性粘液水腫、水晶体起因性ブドウ膜炎、原発性血管炎、白斑、急性肝疾患、慢性肝疾患、アレルギー、喘息、精神障害（うつ状態および統合失調症を含む）、Ｔｈ２型／Ｔｈ１型仲介性疾患、結膜炎、アレルギー性接触性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、アルファ－Ｉアンチトリプシン欠損症、筋委縮性側索硬化症、貧血、嚢胞性線維症、サイトカイン療法に関連する障害、脱髄性疾患、皮膚炎、虹彩毛様体炎／ブドウ膜炎／視神経炎、虚血再灌流傷害、虚血性脳卒中、若年性関節リウマチ、自己免疫腸疾患、自己免疫難聴、自己免疫リンパ増殖性症候群、自己免疫心筋炎、自己免疫早期卵巣機能不全および眼瞼炎を含む。

【0326】

いくつかの態様において、薬学的組成物は、腫瘍性疾患の治療に用いられる。
用語「腫瘍性疾患」、「癌」および「癌性」は、典型的には細胞の制御されない成長／増殖によって特徴づけられる、哺乳動物における生理学的状態を指すかまたは生理学的状態を記載する。癌性疾患の例には、限定されるわけではないが、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、および白血病が含まれる。こうした癌性疾患のより具体的な例には、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌および肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌を含む胃癌、膵臓癌、神経膠芽腫、神経膠腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌または腎癌、前立腺癌、膣癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、黒色腫、および多様な頭頸部癌が含まれる。

【0327】

いくつかの態様において、薬学的組成物は：ＨＮＳＣＣ（頭頸部扁平上皮癌）、子宮頸癌、未知の原発性癌、神経膠芽腫、食道癌、膀胱癌、ＴＮＢＣ（トリプルネガティブ乳癌）、ＣＲＣ（結腸直腸癌）、肝細胞癌、黒色腫、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）、腎臓癌、卵巣癌、ＭＳＩ ＣＲＣ（マイクロサテライト不安定性を伴う結腸直腸癌）、白血病（急性白血病または骨髄芽球性白血病）、リンパ腫、多発性骨髄腫、黒色腫、乳癌、結腸直腸癌、前立腺癌、膀胱癌、肉腫、肝細胞癌、神経膠芽腫、ホジキンリンパ腫、ＴおよびＢ細胞急性リンパ芽球性白血病、小細胞肺癌、急性骨髄芽球性白血病、難治性非ホジキンＢ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、頭頸部扁平上皮癌、膵臓癌、卵巣癌、急性骨髄芽球性白血病および高リスク骨髄異形成症候群を含む群より選択される腫瘍性疾患の治療のために用いられる。

【0328】

用語「抗増殖活性」は、細胞、例えば癌細胞の増殖を停止させるかまたは阻害することを指すよう意図される。
用語「ＩＣ_５０」（５０％阻害濃度）は、測定可能な活性または反応、例えば腫瘍細胞などの細胞の成長／増殖を、５０％阻害する薬剤濃度を指す。適切な用量－反応曲線を用い、曲線適合のための特別な統計ソフトウェアを用いて、ＩＣ_５０値を計算してもよい。

【0329】

用語ＧＩ５０（５０％増殖阻害）は、腫瘍細胞などの細胞の増殖を５０％阻害する薬剤濃度を指す。
用語「ＥＤ５０」（ＥＣ５０）（５０％有効用量／濃度）は、５０％の生物学的影響（細胞傷害性も含まれうる）を生じる薬剤濃度を指す。

【0330】

治療法／治療のための使用
１つの側面において、本発明は、腫瘍性疾患の治療法であって、こうした治療が必要な被験体に、療法的有効量の前記イムノサイトカインまたは前記薬学的組成物を投与する工程を含む、前記方法に関する。

【0331】

「治療する」、「治療」および「療法」は、生物学的障害および／またはその関連する症状の少なくとも１つを減弱させるかまたは排除する方法を指す。本明細書において、疾患、障害または状態を「緩和する」ことは、疾患、障害または状態の症状の重症度および／または発生頻度を減少させることを意味する。さらに、本明細書における「治療」への言及には、治癒的、対症的および予防的療法への言及が含まれる。

【0332】

１つの側面において、治療の被験体または患者は、哺乳動物、好ましくはヒト被験体である。前記被験体は、任意の年齢の男性または女性であってもよい。
用語「疾患」は、本発明記載の治療によって利益を得るであろう任意の状態を意味する。この用語の定義には、慢性および急性障害または疾患が含まれる。

【0333】

治療のための方法のいくつかの態様において、腫瘍性疾患は：ＨＮＳＣＣ（頭頸部扁平上皮癌）、子宮頸癌、未知の原発性癌、神経膠芽腫、食道癌、膀胱癌、ＴＮＢＣ（トリプルネガティブ乳癌）、ＣＲＣ（結腸直腸癌）、肝細胞癌、黒色腫、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）、腎臓癌、卵巣癌、ＭＳＩ ＣＲＣ（マイクロサテライト不安定性を伴う結腸直腸癌）、白血病（急性白血病または骨髄芽球性白血病）、リンパ腫、多発性骨髄腫、黒色腫、乳癌、結腸直腸癌、前立腺癌、膀胱癌、肉腫、肝細胞癌、神経膠芽腫、ホジキンリンパ腫、ＴおよびＢ細胞急性リンパ芽球性白血病、小細胞肺癌、急性骨髄芽球性白血病、難治性非ホジキンＢ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、頭頸部扁平上皮癌、膵臓癌、卵巣癌、急性骨髄芽球性白血病および高リスク骨髄異形成症候群を含む群より選択される。

【0334】

１つの側面において、本発明は、Ｔ細胞集団またはＮＫ細胞集団の生物学的活性を、こうした活性化を必要とする被験体において活性化するための方法であって、有効量の上記イムノサイトカインまたは上記薬学的組成物を被験体に投与する工程を含む、前記方法に関する。

【0335】

１つの側面において、本発明は、治療のための前記イムノサイトカインまたは前記薬学的組成物の、腫瘍性疾患のこうした治療を必要とする被験体における使用に関する。
いくつかの使用において、腫瘍性疾患は：ＨＮＳＣＣ（頭頸部扁平上皮癌）、子宮頸癌、未知の原発性癌、神経膠芽腫、食道癌、膀胱癌、ＴＮＢＣ（トリプルネガティブ乳癌）、ＣＲＣ（結腸直腸癌）、肝細胞癌、黒色腫、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）、腎臓癌、卵巣癌、ＭＳＩ ＣＲＣ（マイクロサテライト不安定性を伴う結腸直腸癌）、白血病（急性白血病または骨髄芽球性白血病）、リンパ腫、多発性骨髄腫、黒色腫、乳癌、結腸直腸癌、前立腺癌、膀胱癌、肉腫、肝細胞癌、神経膠芽腫、ホジキンリンパ腫、ＴおよびＢ細胞急性リンパ芽球性白血病、小細胞肺癌、急性骨髄芽球性白血病、難治性非ホジキンＢ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、頭頸部扁平上皮癌、膵臓癌、卵巣癌、急性骨髄芽球性白血病および高リスク骨髄異形成症候群を含む群より選択される。

【0336】

腫瘍（例えば癌）の場合、本発明のイムノサイトカインの療法的有効量は、癌細胞の数を減少させ；最初の腫瘍サイズを減少させ；癌細胞が末梢臓器内に浸潤することを阻害し（すなわちある程度遅延させ、そして好ましくは停止し）；腫瘍転移を阻害し（すなわちある程度遅延させ、そして好ましくは停止し）；腫瘍増殖をある程度阻害し；そして／または障害と関連する症状の１つまたはそれより多くを、ある程度軽減することも可能である。本発明のイムノサイトカインは、存在する癌細胞の増殖をある程度防止し、そして／またはこうした細胞を殺してもよく、細胞分裂停止性そして／または細胞傷害性であってもよい。癌治療において、ｉｎ ｖｉｖｏ有効性を、例えば、生存、疾患進行までの時間（ＴＴＰ）、治療に対する腫瘍の反応速度（ＲＲ）、反応期間および／または生活の質を評価することによって測定することも可能である。

【0337】

本発明のイムノサイトカインを、さらなる療法的治療を伴わずに、すなわち独立療法として投与してもよい。さらに、本発明のイムノサイトカインによる治療は、少なくとも１つのさらなる療法的治療（併用療法）を含んでもよい。いくつかの態様において、イムノサイトカインを、癌治療のための別の薬物／調製物とともに投与してもよいし、または配合してもよい。

【0338】

本明細書において、本発明のイムノサイトカインおよび１つまたはそれより多い他の療法剤に言及する用語、「同時投与」、「同時投与された」および「と組み合わされた」は、以下を意味するか、以下を指すか、または以下を含むと意図される：
１）本発明のイムノサイトカインおよび療法剤のこうした組み合わせの、治療が必要な患者への同時投与であって、こうした構成要素が、前記構成要素を前記患者に実質的に同時に放出する、単一の投薬型内にともに配合されている場合の、前記投与、
２）本発明のイムノサイトカインおよび療法剤のこうした組み合わせの、治療が必要な患者への同時投与であって、こうした構成要素が別個の投薬型に互いに分かれて配合され、これらが、前記患者に実質的に同時に摂取され、これに際して前記構成要素が、前記患者に実質的に同時に放出される場合の、前記投与、
３）本発明のイムノサイトカインおよび療法剤のこうした組み合わせの、治療が必要な患者への連続投与であって、こうした構成要素が別個の投薬型に互いに分かれて配合され、これらが、各投与の間に十分な時間間隔を伴い、前記患者によって連続した時間で摂取され、投与に際して、前記構成要素が前記患者に、実質的に異なる時点で放出される場合の、前記投与；および
４）本発明のイムノサイトカインおよび療法剤のこうした組み合わせの、治療が必要な患者への連続投与であって、こうした構成要素が、単一の投薬型にともに配合され、該投薬型が、前記構成要素を制御された方式で放出し、放出に際して、前記患者に同じおよび／または異なる時点で、同時に、連続して、または重複して放出され、ここで各部分が、同じまたは異なる経路のいずれかによって、投与されうる場合の、前記投与。

【0339】

本発明のイムノサイトカインを：細胞傷害剤、化学療法剤、抗ホルモン剤、または別の療法抗体を含む群より選択される療法剤と組み合わせてもよい。
本明細書において、用語「細胞傷害剤」は、細胞の機能を阻害するかまたは防止し、そして／または細胞の破壊を引き起こす物質を指す。該用語は、放射性同位体（例えば、Ａｔ^２１１、Ｉ^１３１、Ｉ^１２５、Ｙ^９０、Ｒｅ^１８６、Ｒｅ^１８８、Ｓｍ^１５３、Ｂｉ^２１２、Ｐ^３２およびＬｕの放射性同位体）、化学療法剤、ならびにその断片および／または変異体を含む、細菌、真菌、植物または動物起源の毒素、例えば小分子毒素または酵素的に活性である毒素を含むよう意図される。

【0340】

「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、アルキル化剤、例えばチオテパおよびシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標））；スルホン酸アルキル、例えばブスルファン、イムプロスルファンおよびピポスルファン；アジリジン、例えばベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、およびウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミドおよびトリメチルメラミンを含むエチレンイミンおよびメチルアメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）；アセトゲニン（例えばブラタシンおよびブラタシノン）；デルタ－９－テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；ベータ－ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン（合成類似体トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ＣＰＴ－１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン、および９－アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ－１０６５（その合成類似体アドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシンを含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（例えばクリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体ＫＷ－２１８９およびＣＢ１－ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコディクチン；スポンジスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ ｏｘｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、メルファラン、ノベムビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソ尿素、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチンおよびラニムスチン；抗生物質、例えばエンジイン抗生物質（例えばカリケアマイシン、例えばカリケアマイシン・ガンマＩＩおよびカリケアマイシン・オメガＩＩ（例えばＡｇｎｅｗ， Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔｌ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ．， ３３：１８３－１８６（１９９４）を参照されたい））；ダイネマイシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）Ａを含むダイネマイシン；エスペラマイシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団および関連色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウスラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシニス（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎｉｓ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）、モルホリノ－ドキソルビシン、シアノモルホリノ－ドキソルビシン、２－ピロリノ－ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射剤（ＤＯＸＯＬ（登録商標））、リポソームドキソルビシンＴＬＣ Ｄ－９９（ＭＹＯＣＥＴ（登録商標））、ＰＥＧ化リポソームドキソルビシン（ＣＡＥＬＹＸ（登録商標））、およびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えばマイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗剤、例えばメトトレキセート、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、テガファー（ＵＦＴＯＲＡＬ（登録商標））、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））、エポチロン、および５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）；葉酸類似体、例えばデノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセート；プリン類似体、例えばフルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモファー、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン；抗副腎機能剤（ａｎｔｉ－ａｄｒｅｎａｌｓ）、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充剤、例えばフロリン酸；アセグラトン；アルドホスファミド配糖体；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジクオン；エルフォルニチン；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；メイタンシノイド、例えばメイタンシンおよびアンサミトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、オレゴン州ユージーン）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”－トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（例えばＴ－２毒素、ベラキュリンＡ、ロリジンＡおよびアングイジン）；ウレタン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子配合物（ＡＢＲＡＸＡＮＥＴＭ）、およびドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））；クロラムブシル；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；白金剤、例えばシスプラチン、オキサリプラチン、およびカルボプラチン；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））、ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））、ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標））、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標）、およびビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））を含む、チューブリン重合が微小管を形成するのを防止するビンカ類；エトポシド（ＶＰ１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ロイコボリン；ノバントロン；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；ベキサロテン（ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ（登録商標））を含むレチノイン酸などのレチノイド；ビスホスホネート、例えばクロドロネート（例えば、ＢＯＮＥＦＯＳ（登録商標）またはＯＳＴＡＣ（登録商標））、エチロドネート（ＤＩＤＲＯＣＡＬ（登録商標））、ＮＥ－５８０９５、ゾレドロン酸／ゾレドロネート（ＺＯＭＥＴＡ（登録商標））、アレンドロネート（ＦＯＳＡＭＡＪＸ（登録商標））、パミドロネート（ＡＲＥＤＩＡ（登録商標））、チルドロネート（ＳＫＥＬＩＤ（登録商標））、またはリセドロネート（ＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標））；トロキサシタビン（１，３－ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば異常な細胞増殖に関与するシグナル伝達経路における遺伝子、例えば、ＰＫＣ－アルファ、Ｒａｆ、Ｈ－Ｒａｓ、および上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ－Ｒ）の発現を阻害するもの；ワクチン、例えばＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチンおよび遺伝子治療ワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、およびＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン；トポイソメラーゼ１阻害剤（例えばＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標））；ｒｍＲＨ（例えばＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標））；ＢＡＹ４３９００６（ソラフェニブ；Ｂａｙｅｒ）；ＳＵ－１１２４８（Ｐｆｉｚｅｒ）；ペリフォシン、ＣＯＸ－２阻害剤（例えばセレコキシブまたはエトリコキシブ）、プロテオソーム阻害剤（例えばＰＳ３４１）；ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標））；ＣＣＩ－７７９；ティピファルニブ（ＲＩ １５７７）；オラフェニブ、ＡＢＴ５１０；Ｂｃｌ－２阻害剤、例えばオブリメルセンナトリウム（ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ（登録商標））；ピキサントロン；ＥＧＦＲ阻害剤（以下の定義を参照されたい）；チロシンキナーゼ阻害剤（以下の定義を参照されたい）；ならびに上記いずれかの薬学的に許容されうる塩、酸または誘導体；ならびに上記の２つまたはそれより多くの組み合わせ、例えばシクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾロンの併用療法の略語であるＣＨＯＰ、ならびに５－ＦＵおよびロイコボリンと組み合わせたオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮＴＭ）での治療措置の略語であるＦＯＬＦＯＸが含まれる。

【0341】

この定義にやはり含まれるのは、腫瘍に対するホルモン作用を制御するかまたは阻害するように作用する、抗ホルモン剤、例えば混合アゴニスト／アンタゴニストプロファイルを持つ抗エストロゲンであり、これには、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標））、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、トレミフェン（ＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標））、イドキシフェン、ドロロキシフェン、ラロキシフェン（ＥＶＴＳＴＡ（登録商標））、トリオキシフェン、ケオキシフェン、および選択的エストロゲン受容体調節剤（ＳＥＲＭ）、例えばＳＥＲＭ３；アゴニスト特性を含まない純粋抗エストロゲン、例えばフルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標））、およびＥＭ８００（こうした剤は、エストロゲン受容体（ＥＲ）二量体化を遮断し、ＤＮＡ結合を阻害し、ＥＲ代謝回転を増加させ、そして／またはＥＲレベルを抑制することも可能である）；ステロイド性アロマターゼ阻害剤、例えばフォルメスタンおよびエキセメスタン（ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標））、ならびに非ステロイド性アロマターゼ阻害剤、例えばアナストラゾール（ＡＲＥＶＩＩＤＥＸ（登録商標））、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標））およびアミノグルテチミド、ならびにボロゾール（ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標））、酢酸メゲストロール（ＭＥＧＡＳＥ（登録商標））、ファドロゾール、イミダゾールを含む他のアロマターゼ阻害剤を含む、アロマターゼ阻害剤；リュープロリド（ＬＵＰＲＯＮ（登録商標）およびＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標））、ゴセレリン、ブセレリン、およびトリプテレリンを含む、黄体形成ホルモン放出ホルモンアゴニスト；プロゲスチン、例えば酢酸メゲストロールおよび酢酸メドロキシプロゲステロン、エストロゲン、例えばジエチルスチルベストロールおよびプレマリン、ならびにアンドロゲン／レチノイド、例えばフロキシメステロン、オールトランスレチノイン酸およびフェンレチニドを含む性ステロイド；オナプリストン；抗プロゲステロン；エストロゲン受容体下方制御剤（ＥＲＤ）；抗アンドロゲン、例えばフルタミド、ニルタミドおよびビカルタミド；テストラクトン；ならびに上記いずれかの薬学的に許容されうる塩、酸または誘導体；ならびに上記の２つまたはそれより多くの組み合わせである。

【0342】

本発明のイムノサイトカインと組み合わせて用いてもよい他の療法剤は、ＰＤ１に対する抗体（例えばプロルゴリマブ、ペムブロリズマブまたはニボルマブ）、ＰＤ－Ｌ１に対する抗体、ＣＴＬＡ４に対する抗体、４－１ＢＢに対する抗体、ＯＸ４０に対する抗体、ＧＩＴＲに対する抗体、ＣＤ２０に対する抗体（例えばリツキシマブ）、ＨＥＲ２に対する抗体（例えばトラスツズマブまたはペルツズマブ）、ＶＥＧＦに対する抗体（例えばベバシズマブ）、またはその組み合わせを含む群より選択される療法抗体であってもよい。

【0343】

本発明記載のイムノサイトカインと組み合わせて用いてもよい他の療法剤は、自然免疫または適応免疫の活性化剤の群より選択される、療法的に活性である抗腫瘍化合物であってもよい。

【0344】

本発明のイムノサイトカインを、上述のような治療法において、上述のような治療において、そして／または上述の療法適用のための薬剤製造において、用いてもよいことが理解される。

【0345】

用量および投与経路
本発明のイムノサイトカインは、問題の状態の治療に有効な量で、すなわち望ましい結果を達成するために必要な用量で、そして必要な期間、投与されるであろう。療法的に有効な量は、治療中の特定の状態、患者の年齢、性別および体重、ならびにイムノサイトカインを、単独で、あるいは１つまたはそれより多いさらなる薬剤または治療技術との組み合わせで、投与するかどうかなどの要因にしたがって、多様でありうる。

【0346】

投薬措置を調節して、最適な所望の反応を提供してもよい。例えば、単一ボーラスを投与してもよいし、いくつかの分割用量を長期に渡って投与してもよいし、あるいは療法状況の緊急事態によって示されるように、用量を比例して減少させるかまたは増加させてもよい。投与の容易さおよび投薬の均一性のため、単位投薬型での非経口組成物を配合することが特に好適である。本明細書において、単位投薬型は、治療しようとする患者／被験体のための単位投薬として適した物理的に別個の単位を指し；各単位は、所望の薬学的キャリアーと関連して、所望の療法効果を生じるよう計算された、あらかじめ決定された量の活性化合物を含有する。本発明の単位投薬型の詳述は、典型的には、（ａ）化学療法剤のユニークな特性、および達成しようとする特定の療法的または予防的効果、ならびに（ｂ）治療のためのこうした活性化合物を化合する技術分野に生得的な被験体感度の限界によって決定づけられ、そしてこれらに直接依存する。

【0347】

したがって、当業者は、本明細書に提供する開示に基づき、療法分野に周知の方法にしたがって、用量および投薬措置が調節されることを認識するであろう。すなわち、最大許容用量は、容易に確立可能であり、そして患者に対して検出可能な療法効果を提供する有効な量もまた決定可能であり、患者に対して検出可能な療法効果を提供するために各剤を投与するための一時的な要件も同様である。したがって、本明細書において、特定の用量および投与措置を例示するが、これらの例は、本発明の態様の実施において、患者に提供されうる用量および投与措置を、いかなる意味でも限定しない。

【0348】

投薬値が、軽減しようとする状態のタイプおよび重症度に応じて多様である可能性があり、そしてこれには単一または多数の用量が含まれてもよいことが注目されるものとする。さらに、任意の特定の被験体に関して、個体の必要性、および組成物を投与するかまたは投与を監視する医学的専門家の判断にしたがって、特定の投薬措置を長期に渡って調節すべきであり、そして本明細書に示す投薬範囲は例示のみであり、そして請求する組成物の範囲または実施を制限するとは意図されないことが理解されるものとする。さらに、本発明の組成物を含む投薬措置は、疾患のタイプ、患者の年齢、体重、性別、医学的状態、状態の重症度、投与経路、および使用する本発明の特定のイムノサイトカインを含む、多様な要因に基づきうる。したがって、投薬措置は、広く多様である可能性もあるが、標準法を用いて、ルーチンに決定可能である。例えば、臨床効果、例えば毒性効果および／または実験室値を含んでもよい薬物動態学または薬力学的パラメータに基づいて、用量を調節してもよい。したがって、本発明は、当業者によって決定されるような、患者内用量増大を含む。適切な投薬量および措置を決定するための方法は、当該技術分野に周知であり、そして本明細書に開示するアイディアをひとたび提供されれば、当業者によって理解されるであろう。

【0349】

適切な投薬法の例を上記に提供する。
本発明のイムノサイトカインの適切な用量は、０．１～２００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１～１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり、約０．５～５０ｍｇ／ｋｇ、例えば約１～２０ｍｇ／ｋｇを含むであろう。例えば少なくとも０．２５ｍｇ／ｋｇ、例えば少なくとも０．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１ｍｇ／ｋｇを含む、例えば少なくとも１．５ｍｇ／ｋｇ、例えば少なくとも２ｍｇ／ｋｇ、例えば少なくとも３ｍｇ／ｋｇ、少なくとも４ｍｇ／ｋｇを含む、例えば少なくとも５ｍｇ／ｋｇ；そして例えば最大５０ｍｇ／ｋｇまで、最大３０ｍｇ／ｋｇまで、例えば最大２０ｍｇ／ｋｇまでを含む、最大１５ｍｇ／ｋｇまでを含む用量で、イムノサイトカインを投与してもよい。投与は、典型的には、適切な時間間隔で、例えば週１回、２週ごとに１回、３週ごとに１回、または４週ごとに１回、そして責任者である医師によって適切と判断されるだけ長く反復され、該医師は、いくつかの場合、必要であれば、用量を増加させるかまたは減少させてもよい。

【実施例】

【0350】

以下の実施例は、本発明のよりよい理解のために提供される。これらの実施例は、例示のみの目的のためであり、そしていかなる形でも、本発明の範囲を制限するとは見なされないものとする。

【0351】

本明細書に引用されるすべての刊行物、特許および特許出願は、本明細書に援用される。前述の発明は、理解を明確にする目的のため、例示および例によってある程度詳細に記載されているが、一般の当業者には、本発明の解説を考慮して、付随する態様の精神または範囲から逸脱することなく、特定の変化および修飾を行ってもよいことが、容易に明らかであろう。

【0352】

材料および一般的な方法
組換えＤＮＡ技術
Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．ら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ； Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９に記載されるような標準技術によって、ＤＮＡ操作を行った。製造者のプロトコルにしたがって、分子生物学試薬を用いた。

【0353】

遺伝子合成
化学合成によって、作製したオリゴヌクレオチドから、所望の遺伝子セグメントを調製した。ＰＣＲ増幅を含むオリゴヌクレオチドのアニーリングおよび連結によって、唯一の制限部位が隣接する長さ３００～４０００ｂｐの遺伝子セグメントを組み立て、そして続いて明記する制限部位を通じてクローニングした。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列をＤＮＡ配列決定によって確認した。

【0354】

ＤＮＡ配列決定
サンガー配列決定によって、ＤＮＡ配列を決定した。
ＤＮＡおよびタンパク質配列分析、ならびに配列データ管理
ＩｎｆｏｍａｘのＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ａｄｖａｎｃｅパッケージソフト、バージョン８．０およびＳｎａｐＧｅｎｅ Ｖｉｅｗｅｒを配列生成、マッピング、分析、注釈付けおよび例示に用いた。

【0355】

実施例１
哺乳動物細胞の懸濁培養における組換えタンパク質の産生
図１、図２、図３および図４に模式的に示す組換えＩＬ１５スーパーアゴニストタンパク質を産生するため、本発明者らは、ヒトＩＬ１５リガンド（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ４０９３３）およびＩＬ１５Ｒα（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ１３２６１）の配列断片を含む構築物を合成した。どちらの遺伝子の配列も、ＰＣＲを用いてオリゴヌクレオチドから合成した。

【0356】

図１中のＣＫ＿ＩＬ１５Ｒａ＿Ｈｃ＿ＩＬ１５ＣＨ１ＦｃＬＡＬＡおよび図２中のＣＫ＿ＩＬ１５＿Ｈｃ＿ＩＬ１５ＲａＣＨ１ＦｃＬＡＬＡによって示されるようなＩＬ１５スーパーアゴニスト変異体（本明細書において、以後、ＩＬ１５ＳＡまたはＢＣＤ２２５と称する）を産生するため、前記遺伝子を、ＳａｌＩ／ＢｓｉＷＩ制限部位でベクターｐＥＥ－ＩＬ１５Ｒａ－ＣＫ（またはｐＥＥ－ＩＬ１５－ＣＫ）内の抗体のカッパ軽鎖の第一の定常ドメインと（図５）、そしてＳａｌＩ／ＮｈｅＩ制限部位でベクターｐＥＥ－ＩＬ１５－ＣＨ１－Ｆｃ－ＬＡＬＡ（またはｐＥＥ－ＩＬ１５Ｒａ－ＣＨ１－Ｆｃ－ＬＡＬＡ）ＩｇＧ１内の抗体重鎖の第一の定常ドメインと（図６）、Ｎ末端融合（融合タンパク質）として、プラスミド内にクローニングし、そして両方のベクターをトランスフェクション工程で組み合わせた。

【0357】

図４中のＦａｂ－ＣＫ＿ＩＬ１５Ｒａ＿Ｈｃ＿ＩＬ１５ＣＨ１ＦｃノブＬＡＬＡ（本明細書において、以後、ＩＬ１５ＳＡ／ＰＤ１または抗ＰＤ１／ＩＬ１５ＳＡまたはＩＬ１５ＳＡ／ＰＤＬ１または抗ＰＤＬ１／ＩＬ１５ＳＡと称する）および図３中のＦａｂ－ＣＫ＿ＩＬ１５＿Ｈｃ＿ＩＬ１５ＲａＣＨ１ＦｃノブＬＡＬＡによって示されるような二重特異性ＩＬ１５スーパーアゴニスト変異体を産生するため、ＩＬ１５リガンドおよび受容体遺伝子を、ＳａｌＩ／ＢｓｉＷＩ制限部位でベクターｐＥＥ－ＩＬ１５Ｒａ－ＣＫ（またはｐＥＥ－ＩＬ１５－ＣＫ）内の抗体のカッパ軽鎖の第一の定常ドメインと（図５）、そしてＳａｌＩ／ＮｈｅＩ制限部位でベクターｐＥＥ－ＩＬ１５－ＣＨ１－Ｆｃ－ノブ－ＬＡＬＡ（またはｐＥＥ－ＩＬ１５Ｒａ－ＣＨ１－Ｆｃ－ノブ－ＬＡＬＡ）ＩｇＧ１内の抗体重鎖の第一の定常ドメインと（図９）、Ｎ末端融合として、プラスミド内にクローニングした。さらに、図３および図４に示すような非対称抗体のＦａｂ部分を形成するため、抗ＰＤ１（プロルゴリマブ）（本明細書において、以後、ＩＬ１５ＳＡ／ＰＤ１または抗ＰＤ１／ＩＬ１５ＳＡと称する）または抗ＰＤＬ１（ＢＣＤ－１３５）抗体（本明細書において、以後、ＩＬ１５ＳＡ／ＰＤＬ１または抗ＰＤＬ１／ＩＬ１５ＳＡと称する）の可変ドメインの遺伝子を、ＳａｌＩ／ＢｓｉＷＩ制限部位でベクターｐＥＥ－ＢＣＤ１００－０２－ＶＬ－ＣＫ内の抗体のカッパ軽鎖の第一の定常ドメインと（図７）、そしてＳａｌＩ／ＮｈｅＩ制限部位でベクターｐＥＥ－ＢＣＤ１００－０２－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ－ホール－ＬＡＬＡ ＩｇＧ１内の抗体重鎖の第一の定常ドメインと（図８）、Ｎ末端融合として、プラスミド内にクローニングした。その結果、上記の４つのベクターがトランスフェクション工程で組み合わされて、１つの細胞において、４つの別個のポリペプチドを合成し、そして二重特異性イムノサイトカインを形成した。

【0358】

大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）細胞において、必要量の上記プラスミドすべてを産生し、そしてＭａｘｉｐｒｅｐ Ｑｉａｇｅｎキットを用いて精製した。
公表されるプロトコルにしたがって産生されたチャイニーズハムスター卵巣細胞株（ＣＨＯ－Ｋ１）において、ＩＬ１５ＳＡを含む組換えタンパク質を一過性に培養した［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ． ２００５ Ｓｅｐ ２０； ９１（６）：６７０－６７７， Ｌｉａｏ Ｍｅｔａｌ．， ２００４； Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ． ２００６ Ｊｕｎ；２８（１１）：８４３－８４８； Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ． ２００３ Ｎｏｖ ５；８４（３）：３３２－３４２］。ＥＢＮＡ１（エプスタイン・バーウイルス核抗原１）タンパク質遺伝子を恒常的に発現している細胞を用いた。Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの血清不含培地を用い、そして製造者の指示にしたがって、軌道振盪装置上のフラスコ中で、懸濁培養を行った。一過性発現のため、直鎖ポリエチレンイミン（ＰＥＩ ＭＡＸ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって、２^＊１０^６／ｍｌの濃度の細胞をトランスフェクションした。ＤＮＡ／ＰＥＩ比は、１：３～１：１０であった。トランスフェクションの５～７日後、２０００ｇで２０分間、細胞培養を遠心分離し、そして０．２２μｍフィルターを通じて濾過した。アフィン（ａｆｆｉｎｅ）ＨＰＬＣによって、培養液から、ターゲットタンパク質を単離した。

【0359】

プロテインＡアフィニティクロマトグラフィカラムを用いて、培養液から組換えタンパク質を単離し、そして精製した。清澄化した培養液を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で平衡化した５ｍｌ ＨｉＴｒａｐ ｒプロテインＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通過させた。次いで、カラムを５カラム体積のＰＢＳで洗浄して、非特異的結合構成要素を除去した。０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８）を用いて、結合した抗原を溶出させた。主要タンパク質溶出ピークを収集し、そして１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８）で中性ｐＨにした。すべての段階を１１０ｃｍ／ｈ流速下で行った。次いで、ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チュービング技術を用いて、タンパク質をＰＢＳ（ｐＨ７．４）内に透析し、濾過し（０．２２μｍ）、チューブ内にトランスファーし、そして－７０℃で保存した。

【0360】

ＳＤＳゲル電気泳動によって、生じたタンパク質溶液の純度を評価した（図１０の例を参照されたい）。
実施例２
（ＩＬ１５ＳＡ）２－ＦｃおよびヒトＩＬ２βγ受容体相互作用の動力学アッセイ
ＦｏｒｔｅＢｉｏの指示にしたがって、ＯｃｔｅｔＲｅｄＢｉｏ装置を用いて、（ＩＬ１５ＳＡ）２－Ｆｃ（本明細書において、以後、図１中のＣＫ＿ＩＬ１５Ｒａ＿Ｈｃ＿ＩＬ１５ＣＨ１ＦｃＬＡＬＡおよび図２中のＣＫ＿ＩＬ１５＿Ｈｃ＿ＩＬ１５ＲａＣＨ１ＦｃＬＡＬＡと称する）およびヒトＩＬ２βγの結合に関するアフィニティ定数を得た。ＡＲ２ＧバイオセンサーをｍＱ中で１時間、あらかじめ再水和した。バイオセンサーの活性化後、酢酸緩衝液ｐＨ４中、２５μｇ/ｍｌの濃度で、（ＩＬ１５ＳＡ）２－Ｆｃ産物を、バイオセンサー上に非特異的に（ＮＨ_２基によって）固定した。次いで、０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０および０．１％ ＢＳＡを補充したＰＢＳ緩衝液中、３０℃で、ヒトＣＤ１２２／ＩＬ－２ＲＢタンパク質（Ｆｃタグ）溶液（１および０．５μｇ／ｍｌ）を含有するウェル内にセンサーを浸した。ＩＬ１５ＳＡ／ＩＬ２βγ複合体は、この溶液中で会合した。次いで、続く解離工程のため、センサーを緩衝溶液中に浸した。作業緩衝液として、０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０および０．１％ ＢＳＡを補充したＰＢＳを用いて、アッセイを３０℃で行った。

【0361】

ＣＫ＿ＩＬ１５Ｒａ＿Ｈｃ＿ＩＬ１５ＣＨ１ＦｃＬＡＬＡに関して、そしてＣＫ＿ＩＬ１５＿Ｈｃ＿ＩＬ１５ＲａＣＨ１ＦｃＬＡＬＡに関して、生じたセンソグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）を表１に示し、標準処置にしたがって、Ｏｃｔｅｔデータ分析ソフトウェア（バージョン８．０）を用い、そして１：１相互作用モデルを用いて、参照シグナルを減じた後に分析した。生じたアフィニティ定数を表１に示す。研究した両変異体は、ヒトＩＬ２βγに高いアフィニティおよび特異性を示した。

【0362】

表１． ヒトＩＬ２βγ－Ｆｃと相互作用する（ＩＬ１５ＳＡ）２－Ｆｃイムノサイトカインに関するアフィニティ定数。

【0363】

【表2】

【0364】

実施例３
二重特異性ＩＬ１５スーパーアゴニストならびにヒトＩＬ２βγ受容体および免疫細胞の他の細胞性受容体の間の相互作用の動力学アッセイ
ＦｏｒｔｅＢｉｏの指示にしたがって、ＯｃｔｅｔＲｅｄ ９６を用いて、ＩＬ２βγおよびヒトＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１受容体へのＩＬ１５ＳＡ二重特異性イムノサイトカイン（本明細書において、以後、抗ＰＤ１－Ｆａｂ－ＣＫ＿ＩＬ１５Ｒａ＿Ｈｃ＿ＩＬ１５ＣＨ１ＦｃノブＬＡＬＡおよび抗ＰＤ－Ｌ１－Ｆａｂ－ＣＫ＿ＩＬ１５Ｒａ＿Ｈｃ＿ＩＬ１５ＣＨ１ＦｃノブＬＡＬＡと称する）の結合に関するアフィニティ定数を測定した。ＡＲ２ＧバイオセンサーをｍＱ中で１時間、あらかじめ再水和した。バイオセンサーの活性化後、酢酸緩衝液ｐＨ４中、２５μｇ/ｍｌの濃度で、二重特異性イムノサイトカインを、バイオセンサー上に非特異的に（ＮＨ_２基によって）固定した。次いで、０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０および０．１％ ＢＳＡを補充したＰＢＳ緩衝液中、ヒトＣＤ１２２／ＩＬ－２ＲＢタンパク質（Ｆｃタグ）またはＰＤ－１－Ｆｃ受容体またはＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ受容体（１および０．５μｇ／ｍｌ）を含有するウェル内にセンサーを浸して、二重特異性スーパーアゴニストおよび試験受容体を会合させた。次いで、続く解離工程のため、センサーを緩衝溶液中に浸した。

【0365】

標準処置にしたがって、Ｏｃｔｅｔデータ分析ソフトウェア（バージョン８．０）を用い、そして１：１相互作用モデルを用いて、参照シグナルを減じた後に装置データを分析した。

【0366】

生じたアフィニティ定数を表２に示す。研究したどちらの変異体も、ヒトＩＬ２βγに関して、そして対形成受容体に関してのどちらでも、高アフィニティおよび特異性を示し、そして他の受容体への非特異的活性は欠いていた。

【0367】

表２． ヒトＩＬ２βγ－Ｆｃおよび第二の受容体と相互作用する、二重特異性ＩＬ１５スーパーアゴニスト抗体に関するアフィニティ定数。

【0368】

【表3】

【0369】

実施例４
ＮＫ９２株に対するＩＬ１５スーパーアゴニストの増殖活性決定のための細胞アッセイ
ＮＫ－９２細胞株をアッセイに用いた。９６ウェル培養プレート中でアッセイを行った。懸濁物は、ＮＫ－９２細胞、グラフに示すような濃度の試験抗体を含んだ。すべての懸濁構成要素を、ウシ胎児血清およびグルタミンを補充したＲＰＭＩ－１６４０培地中で調製した。すべての構成要素を添加した後、プレートを３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベーションした。次いで、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅをウェルに添加した。インキュベーション後、ウェル中の蛍光強度を測定した。ＩＬ１５ＳＡ産物（ＣＫ＿ＩＬ１５Ｒａ＿Ｈｃ＿ＩＬ１５ＣＨ１ＦｃＬＡＬＡ）、ＩＬ１５ＳＡ／ＰＤ１（抗ＰＤ－１ Ｆａｂ－ＣＫ＿ＩＬ１５Ｒａ＿Ｈｃ＿ＩＬ１５ＣＨ１ＦｃＬＡＬＡ）およびＩＬ１５ＳＡ／ＰＤＬ１（抗ＰＤＬ－１ Ｆａｂ－ＣＫ＿ＩＬ１５Ｒａ＿Ｈｃ＿ＩＬ１５ＣＨ１ＦｃＬＡＬＡ）を比較研究した。

【0370】

上記イムノサイトカインの特異的活性の決定結果によって、ＮＫ９２株に対する高い増殖活性が示された。すべての候補に関する概算ＥＣ５０は同一であり、そして上部プラトーによって決定されるような活性化レベルもまた完全に同じであった（図１１）。ＩＬ１５ＳＡ部分の結合価、およびしたがって異なるアビディティは、この活性に有意に影響を及ぼさなかったことに注目すべきである。

【0371】

実施例５
ナチュラルキラー株に対するＩＬ１５スーパーアゴニストの増殖活性決定のための細胞アッセイ
アッセイは、ネガティブ選択によって健康なドナーのＰＢＭＣから単離された単離ナチュラルキラー細胞を用いた。９６ウェル培養プレート中でアッセイを行った。懸濁物は、ナチュラルキラー細胞、グラフに示すような濃度の試験抗体を含んだ。すべての懸濁構成要素を、自己ヒト血漿を補充した培地中で調製した。すべての構成要素を添加した後、プレートを３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベーションした。次いで、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅをウェルに添加した。インキュベーション後、ウェル中の蛍光強度を測定した。ナチュラルキラー細胞の増殖能に対する、ＩＬ１５ＳＡ産物（ＣＫ＿ＩＬ１５Ｒａ＿Ｈｃ＿ＩＬ１５ＣＨ１ＦｃＬＡＬＡ）、ＩＬ１５ＳＡ／ＰＤ１（抗ＰＤ－１ Ｆａｂ－ＣＫ＿ＩＬ１５Ｒａ＿Ｈｃ＿ＩＬ１５ＣＨ１ＦｃノブＬＡＬＡ）およびヒト・インターロイキン－２（ＩＬ２）（Ｒｏｎｌｅｕｋｉｎ、ＰＣＩ Ｂｉｏｔｅｃｈ）の影響を比較研究した。

【0372】

上記イムノサイトカインの特異的活性の決定結果によって、ナチュラルキラー細胞に対する高い増殖活性が示された（図１２）。すべての候補に関する概算ＥＣ５０は、誤差限界内で同一であり、そしてＩＬ２サイトカインに関するものよりわずかに低かった。さらに、上部プラトーによって定義されるような活性化レベルもまた完全に同じであった。ＩＬ１５ＳＡ部分の結合価、およびしたがって異なるアビディティは、この活性に有意に影響を及ぼさなかったことに注目すべきである。

【0373】

実施例６
レポーター株に対するＩＬ１５スーパーアゴニストの抗ＰＤ１アンタゴニスト活性決定のための細胞アッセイ
このアッセイのため、本発明者らは、Ｊｕｒｋａｔ細胞株に基づいて生成され、そしてその表面上でＰＤ－１を安定発現し、そしてＮＦＡＴプロモーターの制御下でホタル・ルシフェラーゼ・コード遺伝子を含有する、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ－ＦＬｕｃ ＰＤ－１細胞株；およびＲａｊｉ細胞株に基づいて生成され、そしてその表面上でＰＤＬ１を安定発現する、Ｒａｊｉ ＰＤＬ１細胞株を用いた。レポーター細胞系における活性化能に対する、ＩＬ１５ＳＡ産物（ＣＫ＿ＩＬ１５Ｒａ＿Ｈｃ＿ＩＬ１５ＣＨ１ＦｃＬＡＬＡ）、抗ＰＤ１／ＩＬ１５ＳＡ（抗ＰＤ－１ Ｆａｂ－ＣＫ＿ＩＬ１５Ｒａ＿Ｈｃ＿ＩＬ１５ＣＨ１ＦｃノブＬＡＬＡ）、および抗ＰＤ１アンタゴニスト（プロルゴリマブ）の影響を比較研究した。

【0374】

９６ウェル培養プレート中でアッセイを行った。各ウェル中の懸濁物は、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ－ＦＬｕｃ ＰＤ－１細胞、Ｒａｊｉ ＰＤＬ１細胞、１ｎｇ／ｍｌの濃度のａＣＤ３／ａＴＡＡ１細胞、およびグラフに示すような濃度の試験抗体を含有した。すべての構成要素を添加した後、プレートを３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベーションし、そして次いで発光アッセイキットを用いて、ウェル中のルシフェラーゼ強度を測定した。

【0375】

上記イムノサイトカインの特異的活性の決定結果によって、療法的に有効な抗ＰＤ１モノクローナル抗体プロルゴリマブに比較した際の、抗ＰＤ１／ＩＬ１５ＳＡに関する一桁低い特異的活性ＥＣ５０値が示された（図１３）。さらに、最大活性レベル（上部プラトー）は３０％減少した。プロルゴリマブに比較した際の抗ＰＤ１／ＩＬ１５ＳＡのより低い特異的活性は、古典的抗体に比較した際の抗ＰＤ１／ＩＬ１５ＳＡ分子内の一価Ｆａｂ結合ＰＤ１によってのみ説明可能である。これはまた、実施例３（表２）のデータにしたがったＰＤ－１受容体に関するアフィニティおよびプロルゴリマブに関して明記されるような値のほぼ一桁の相違によっても裏付けられる。ＩＬ１５ＳＡのアンタゴニスト活性は、バックグラウンドとして観察され、すなわち実質的に欠けていることに注目すべきである。

【0376】

実施例７
レポーター株に対するＩＬ１５スーパーアゴニストの抗ＰＤＬ１アンタゴニスト活性決定のための細胞アッセイ
アッセイのため、本発明者らは、Ｊｕｒｋａｔ細胞株に基づいて生成され、そしてその表面上でＰＤ－１を安定発現し、そしてＮＦＡＴプロモーターの制御下でホタル・ルシフェラーゼ・コード遺伝子を含有する、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ－ＦＬｕｃ ＰＤ－１細胞株；およびＲａｊｉ細胞株に基づいて生成され、そしてその表面上でＰＤＬ１を安定発現する、Ｒａｊｉ ＰＤＬ１細胞株を用いた。レポーター細胞系における活性化能に対する、ＩＬ１５ＳＡ産物（ＣＫ＿ＩＬ１５Ｒａ＿Ｈｃ＿ＩＬ１５ＣＨ１ＦｃＬＡＬＡ）、抗ＰＤＬ１／ＩＬ１５ＳＡ（抗ＰＤ－Ｌ１ Ｆａｂ－ＣＫ＿ＩＬ１５Ｒａ＿Ｈｃ＿ＩＬ１５ＣＨ１ＦｃノブＬＡＬＡ）、および抗ＰＤＬ１アンタゴニスト（アテゾリズマブ）の影響を比較研究した。

【0377】

９６ウェル培養プレート中でアッセイを行った。各ウェル中の懸濁物は、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ－ＦＬｕｃ ＰＤ－１細胞、Ｒａｊｉ ＰＤＬ１細胞、１ｎｇ／ｍｌの濃度のａＣＤ３／ａＴＡＡ１細胞、およびグラフに示すような濃度の試験抗体を含有した。すべての構成要素を添加した後、プレートを３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベーションし、そして次いで発光アッセイキットを用いて、ウェル中のルシフェラーゼ強度を測定した。

【0378】

上記イムノサイトカインの特異的活性の決定結果によって、療法的に有効な抗ＰＤＬ１モノクローナル抗体アテゾリズマブに比較した際の、抗ＰＤＬ１／ＩＬ１５ＳＡに関する３０倍低い特異的活性ＥＣ５０値が示された（図１４）。しかし、最大活性レベル（上部プラトー）は１０％しか減少しなかった。アテゾリズマブのものに比較した際の抗ＰＤＬ１／ＩＬ１５ＳＡのより低い特異的活性は、古典的抗体に比較した際の抗ＰＤ１／ＩＬ１５ＳＡ分子内の一価Ｆａｂ結合ＰＤ－Ｌ１によってのみ説明可能である。それによって、ＩＬ１５ＳＡの有意なアンタゴニスト活性は観察されなかった。

【0379】

実施例８
腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）レポーター株に対するナチュラルキラー細胞の抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）に対する、ＴＡＡに特異的な抗体の存在下でのＩＬ１５スーパーアゴニストの効果決定のための細胞アッセイ
アッセイは、ネガティブ選択によって健康なドナーのＰＢＭＣから単離されたナチュラルキラー細胞を用いた。９６ウェル培養プレート中でアッセイを行った。懸濁物は、ナチュラルキラー細胞およびＲａｊｉ細胞、エフェクター抗体リツキシマブ、ならびにグラフに示すような濃度の試験抗体を含有した。すべての懸濁物構成要素を、ウシ胎児血清およびグルタミンを補充した培地中で調製した。すべての構成要素を添加した後、プレートを３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベーションした。次いで、培養液を収集し、そしてＬＤＨアッセイキットを用いて、乳酸デヒドロゲナーゼ含量を測定した。レポーター細胞系におけるリツキシマブのＡＤＣＣ能に関して、ＩＬ１５ＳＡ産物（ＣＫ＿ＩＬ１５Ｒａ＿Ｈｃ＿ＩＬ１５ＣＨ１ＦｃＬＡＬＡ）、抗ＰＤ１／ＩＬ１５ＳＡ（抗ＰＤ－１ Ｆａｂ－ＣＫ＿ＩＬ１５Ｒａ＿Ｈｃ＿ＩＬ１５ＣＨ１ＦｃノブＬＡＬＡ）を比較研究した。

【0380】

上記イムノサイトカインの特異的活性の決定結果は、ＴＡＡレポーター株に対するリツキシマブのＡＤＣＣ能の増進に比較して、高い活性を示した（図１５および図１６）。その表面上に過剰発現されたＣＤ２０受容体を伴う、溶解されたＲａｊｉ細胞の割合によって測定されるような、リツキシマブ依存性ＡＤＣＣの有効性は、リツキシマブ単独に比較して、研究した各候補の存在下で３０％増加した。この効果は、実施例４および５に提供する結果にしたがって、アッセイにおいて、ＩＬ－１５ＳＡおよび抗ＰＤ１／ＩＬ１５ＳＡの影響下での活性ナチュラルキラー細胞の増殖によって説明されるようである。すべての候補に関して概算されるＥＣ５０は、誤差限度内で同一であった。ＩＬ１５ＳＡ部分の結合価およびしたがって異なるアビディティは、この活性に有意に影響を及ぼさず、この事実は、実施例４および５によってさらに裏付けられることに注目すべきである。

【0381】

実施例９
健康なドナーの全血に由来するＰＢＭＣに対するＩＬ１５スーパーアゴニストの細胞傷害性決定のための細胞アッセイ
Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離によって、健康なドナー由来の全血から、ＰＢＭＣを単離した。

【0382】

９６ウェル培養プレート中でアッセイを行った。懸濁物は、（ウェルあたり）新鮮な単離ＰＭＢＣおよび０．１μｇ／ｍｌの濃度のグラフに示すような抗体を含有した。ＰＢＭＣおよび抗体を混合した後、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で１６時間インキュベーションした。次いで、懸濁物中のＰＢＭＣのＣＤ５６＋、ＣＤ１９＋、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋下位集団の比率を、対応するＣＤに対する蛍光標識抗体で懸濁物を直接染色し、そしてフローサイトフルオロメーターを用いて、細胞をさらに分析することによって、測定した。ＣＤ５６＋、ＣＤ１９＋、ＣＤ３＋細胞に関しては、グラフは、試験懸濁物のすべての細胞に比較したその比率を示し、一方、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋細胞に関しては、グラフは、ＣＤ３＋細胞に比較したその比率を示す。ヒトＰＢＭＣに対する、ＩＬ１５ＳＡ産物（ＣＫ＿ＩＬ１５Ｒａ＿Ｈｃ＿ＩＬ１５ＣＨ１ＦｃＬＡＬＡ）、抗ＰＤ１／ＩＬ１５ＳＡ（抗ＰＤ－１ Ｆａｂ－ＣＫ＿ＩＬ１５Ｒａ＿Ｈｃ＿ＩＬ１５ＣＨ１ＦｃノブＬＡＬＡ）、抗ＰＤ１（プロルゴリマブ）、抗ＰＤ１（プロルゴリマブ）＋ＩＬ１５ＳＡの混合物、抗ＣＤ２０ ＧＡ１０１抗体の細胞傷害効果を比較研究した。

【0383】

図１７～２１に提供するような結果は、候補の細胞傷害性は有意でない、すなわちＡＢ陰性対照（すなわちいかなる外因性抗体も存在しない）と比較した際の免疫反応性細胞数の１０％を超えない減少であることを立証する。それによって、対照抗ＣＤ２０抗体は、ＣＤ２０＋ Ｂ細胞集団の一貫して完全な枯渇を示した。したがって、問題のすべての候補は、ヒト血液細胞に対して、いかなる有意な非特異的ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性も示さない。

【0384】

実施例１０
熱ストレス条件下でのＩＬ１５スーパーアゴニストの凝集安定性の決定
ＰＢＳ緩衝液中、９ｍｇ／ｍｌの濃度でのＩＬ１５スーパーアゴニスト産物を５０℃の温度で１２時間加熱した。熱ストレス後の凝集を、高性能ゲル濾過クロマトグラフィによって決定した。Ｔｏｓｏｈ ＴＳＫｇｅｌ Ｇｕａｒｄ ＳＷＸＬプレカラム、６．０ｍｍｘ４．０ｃｍ、粒子直径７μｍ、注文番号０８５４３を伴う、Ｔｏｓｏｈ ＴＳＫ－Ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム、７．８ｍｍｘ３０ｃｍ、注文番号０８５４１上のＨＰＬＣ系（Ａｇｉｌｅｎｔ）でクロマトグラフィを行った。均一濃度様式、移動相：５０ｍＭ ＮａＦｂ、０．３Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０、流速０．５ｍｌ／分で、溶出を行った。２１４および２８０ｎｍの波長で検出を行った。抗体試料をＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．５で、～１ｍｇ／ｍｌの濃度まで希釈した。注入体積は１０マイクロリットルであった。ゲル濾過標準較正混合物（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、注文番号１５１－１９０１をプレクロマトグラフした。図２２は、ＩＬ１５スーパーアゴニストが高い均一性を示すクロマトグラムを示す（溶液中の凝集物含量は５％を超えなかった）。

【0385】

実施例１１
同系Ｂ１６Ｆ１０黒色腫モデルにおける、ＩＬ１５スーパーアゴニスト産物の抗腫瘍活性の評価
Ｂ１６Ｆ１０腫瘍株を接種された免疫適格性Ｃ５７ＢＬ／６マウスを用いて有効性を評価した。１．５ｘ１０^５腫瘍細胞を群の各動物の右脇腹内に皮下注射した。細胞接種後、第７日（実験の第１日）、動物を表３に示すような群に分けた。以下の産物の１用量を用いて有効性を評価した：ＢＣＤ－２２５、ＩＬ１５ＳＡ／ａ－ｍＰＤ－１（ＩＬ－１５ＳＡおよびマウスＰＤ－１に対するＦａｂ断片を含む二重特異性モノクローナル抗体、マウスＲＰＭ１－１４抗体の誘導体）。ＲＭＰ１－１４抗体の可変ドメインの配列は、順天堂大学医学部の八木田秀雄博士の厚意により提供された。遺伝子およびＲＭＰ１－１４抗体産物可変ドメインを実施例１にしたがって合成した。さらに、本発明者らは、参照産物ＡＬＴ－８０３［Ｈａｎ ＫＰら， Ｃｙｔｏｋｉｎｅ． ２０１１ Ｄｅｃ；５６（３）：８０４－１０．］（陽性対照）およびプラセボ（陰性対照）を合成した。抗マウスＰＤ－１抗体（ａ－ｍＰＤ－１）と組み合わせた産物の抗腫瘍活性もまた評価した。

【0386】

表３． ＩＬ１５スーパーアゴニストの抗腫瘍活性研究における動物群

【0387】

【表4】

【0388】

ＢＣＤ－２２５（ＩＬ１５ＳＡ）、ＩＬ１５ＳＡ／ａ－ｍＰＤ－１およびＡＬＴ－８０３産物を、実験第１日、第４日、第８日、および第１１日、０．２ｍｌの体積で腹腔内注射した。抗ｍＰＤ－１産物を、実験第２日、第５日、第９日、および第１２日、０．２ｍｌの体積で腹腔内注射した。陰性対照群に、０．２ｍｌの体積で、実験第１日、第２日、第４日、第５日、第８日、第９日、第１１日および第１２日に酢酸ナトリウム緩衝液を注射した（図２３）。

【0389】

マウス体重および腫瘍線形寸法を実験全体で測定した。以下の式を用いて、腫瘍体積を計算した：Ｖ＝ＬｘＷｘＷｘπ／６。以下の等式：

【0390】

【化58】

【0391】

を用いて、陰性対照群（Ｖ_ｃ）および産物群（Ｖ_ｔ）における中央値腫瘍体積を考慮して計算された、腫瘍増殖阻害インデックス（ＴＧＩ）によって、試験産物の有効性を評価した。

【0392】

実験結果を図２４および２５に示す。提供するのは、実験第１１日時点のデータであり、これは、ほぼすべての実験群の動物が、腫瘍負荷のために死亡し、第１５日の産物の抗腫瘍活性を、信頼性を持って評価することが不可能となったためである。

【0393】

研究結果にしたがって、ＢＣＤ－２２５産物および参照ＡＬＴ－８０３産物は、ＢＣＤ－２２５群で５２％、およびＡＬＴ－８０３群で５３％のＴＧＩの匹敵する抗腫瘍活性を示した。本発明者らは、ＢＣＤ－２２５およびＡＬＴ－８０３群のＴＧＩ値に比較した際、ＩＬ１５ＳＡ／抗ｍＰＤ－１二重特異性抗体群のＴＧＩ値において、増加傾向を観察した。ＩＬ１５ＳＡ／抗ｍＰＤ－１群のＴＧＩは、実験第１１日に５８％であった。

【0394】

産物組み合わせ群、ＢＣＤ－２２５＋抗ｍＰＤ－１およびＡＬＴ－８０３＋抗ｍＰＤ－１のＴＧＩ値は、実験第１１日に７２％であり、そして産物組み合わせ群ＩＬ１５ＳＡ／ａ－ｍＰＤ－１および抗ｍＰＤ－１では、ＴＧＩ値は６９％であった。生じたＴＧＩ値は、単一療法におけるこれらの産物の活性に比較して、試験産物および抗ｍＰＤ－１の組み合わせのより顕著な抗腫瘍活性を示す。

【0395】

実施例１２
同系Ｂ１６Ｆ１０黒色腫モデルにおけるＩＬ１５スーパーアゴニストおよびＡＬＴ８０３産物でのマウスにおける比較死亡率の評価および分析
ＩＬ１５スーパーアゴニスト産物の使用後のマウスにおける死亡率の比較評価を、実施例１１に記載するようなモデルおよび動物を用いて行った。死亡した動物または苦痛状態で安楽死させた動物を計数することによって、生存を評価した。

【0396】

結果を表４に示す。生じたデータからわかるように、ＩＬ１５ＳＡ／ａ－ｍＰＤ－１およびＩＬ１５ＳＡ／ａ－ｍＰＤ－１＋抗ｍＰＤ－１産物群の死亡率は、平均して、ＩＬ１５ＳＡ（ＢＣＤ２２５）、ＩＬ１５ＳＡ＋抗ｍＰＤ－１、ＡＬＴ－８０３、ＡＬＴ－８０３＋抗ｍＰＤ－１のものに比較した際、マウス数および生存期間に関してより少ない。生じた死亡率値は、単一特異性二価ＩＬ１５ＳＡおよびＡＬＴ－８０３のものに比較した際、おそらくＩＬ１５ＳＡ／ａ－ｍＰＤ－１二重特異性イムノサイトカインのより顕著でない毒性を示す。抗ＰＤ１抗体の存在または非存在は、死亡率に対して統計的に有意な影響を持たなかった。さらに、ＩＬ１５ＳＡおよびＡＬＴ－８０３バッチ由来の死亡マウスの臓器検査によって、肝細胞の壊死、類洞圧迫を伴う水症ジストロフィー肝臓の存在；実質におけるリンパ組織球浸潤、および類洞におけるリンパ球の集積が明らかになった。これらの知見は、ＩＬ１５に基づくスーパーアゴニストがマウスにおいて肝臓損傷を引き起こす能力に関する、以前報告された文献データと一致する。

【0397】

表４． ＩＬ１５スーパーアゴニストおよびＡＬＴ８０３スーパーアゴニスト産物ならびに抗ＰＤ１抗体とのそれらの組み合わせ後の死亡率研究における動物群

【0398】

【表5】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【配列表】

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【国際調査報告】