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特表2022-549290オリゴペプチド修飾ポリ（β－アミノエステル）のＤＭＳＯを含まない合成およびナノ粒子送達システムにおけるそれらの使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-11-24
(54)【発明の名称】オリゴペプチド修飾ポリ（β－アミノエステル）のＤＭＳＯを含まない合成およびナノ粒子送達システムにおけるそれらの使用
(51)【国際特許分類】
C08G 73/02 20060101AFI20221116BHJP
C12N 15/88 20060101ALI20221116BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20221116BHJP
C12N 15/86 20060101ALI20221116BHJP
C07K 1/113 20060101ALI20221116BHJP
C07K 5/10 20060101ALI20221116BHJP
C07K 7/08 20060101ALI20221116BHJP
C07K 5/09 20060101ALI20221116BHJP
C07K 14/00 20060101ALI20221116BHJP
C07K 7/06 20060101ALI20221116BHJP
C07K 1/34 20060101ALI20221116BHJP
C07K 1/30 20060101ALI20221116BHJP
C07K 1/14 20060101ALI20221116BHJP
C12N 5/10 20060101ALN20221116BHJP
C12N 15/11 20060101ALN20221116BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20221116BHJP
C12N 15/49 20060101ALN20221116BHJP
【ＦＩ】
C08G73/02
C12N15/88 Z ZNA
C12N15/867 Z
C12N15/86 Z
C07K1/113
C07K5/10
C07K7/08
C07K5/09
C07K14/00
C07K7/06
C07K1/34
C07K1/30
C07K1/14
C12N5/10
C12N15/11 Z
C12N15/12
C12N15/49
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022518332
(86)(22)【出願日】2020-09-21
(85)【翻訳文提出日】2022-05-12
(86)【国際出願番号】 IB2020000783
(87)【国際公開番号】W WO2021053400
(87)【国際公開日】2021-03-25
(31)【優先権主張番号】62/903,799
(32)【優先日】2019-09-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522035443
【氏名又は名称】イグザカ フランス
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100157923
【弁理士】
【氏名又は名称】鶴喰 寿孝
(72)【発明者】
【氏名】テズゲル，エズギュル
(72)【発明者】
【氏名】モウレーン，フレデリック
(72)【発明者】
【氏名】ボッシュ，セシール
(72)【発明者】
【氏名】バイヤン，ルノー
【テーマコード（参考）】
4B065
4H045
4J043
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90Y
4B065AA94X
4B065AA95X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA01
4B065BA02
4B065BA05
4B065BD30
4B065BD39
4B065CA24
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA12
4H045BA13
4H045BA14
4H045BA15
4H045BA16
4H045BA17
4H045BA18
4H045BA62
4H045CA01
4H045CA40
4H045EA50
4H045FA20
4H045FA51
4H045FA52
4H045GA01
4H045GA05
4H045GA22
4J043PA08
4J043PB02
4J043PC016
4J043PC206
4J043RA08
4J043SA05
4J043SA71
4J043SB03
4J043TA35
4J043TB01
4J043XA06
4J043YB08
4J043YB31
4J043ZB60
(57)【要約】
オリゴペプチド修飾ポリ－β－アミノ－エステル（ＯＭ－ＰＢＡＥ）および関連するポリマーを、ＤＭＳＯを溶媒として使用せずに合成する方法および精製する方法は、生体適合性緩衝液中での改善された保管安定性を有するＯＭ（ＯＭ）－ＰＢＡＥを提供する。上記ポリマーは長期間保管することができ、また核酸およびウイルスベクターのカプセル化に使用すると、トランスフェクション効率および形質導入効率を低下させることがない。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
末端修飾ポリマーを合成する方法であって、（ａ）末端修飾剤、および末端ビニル炭素を含む末端アクリレート基を含むポリマーを提供することと、
（ｂ）アセトニトリルに溶解させた前記ポリマーを含む第１の溶液を形成することと、
（ｃ）クエン酸水溶液に溶解させた前記末端修飾剤を含む第２の溶液を形成することと、
（ｄ）前記第１の溶液および前記第２の溶液を混合し、それによって前記末端修飾剤が前記末端ビニル炭素に結合して前記末端修飾ポリマーを形成することと、を含む方法。
【請求項2】
前記第２の溶液がさらにアセトニトリルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記末端修飾剤をクエン酸水溶液に、前記末端修飾剤が前記溶液に溶解されるまで混合し、続いて前記溶液にアセトニトリルを添加することによって前記第２の溶液が形成される、請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項4】
前記第２の溶液が、約１／１体積／体積～約２／１体積／体積の比率で水／アセトニトリルを含む、請求項２または３に記載の方法。
【請求項5】
前記第２の溶液が約２５ｍＭのクエン酸塩を含み、約ｐＨ５．０のｐＨを有する、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
【請求項6】
工程（ｄ）における前記第１の溶液および前記第２の溶液の前記混合によって、約３／２体積／体積の比率でアセトニトリル／水を含む溶液が形成される、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
【請求項7】
前記末端修飾剤がチオールを含み、前記末端修飾剤がチオエーテル結合（－Ｃ－Ｓ－Ｃ－）を介して前記末端ビニル炭素に結合する、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
【請求項8】
前記末端修飾剤が、ＣＲＲＲ（配列番号４）、ＣＫＫＫ（配列番号７）、ＣＨＨＨ（配列番号１）、ＣＤＤＤ（配列番号１３）、ＣＥＥＥ（配列番号１０）、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＱ（ＴＡＴ）（配列番号４８）、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＧＧ（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）（配列番号４９）、ＣＧＹＧＰＫＫＫＲＫＶＧＧ（ＮＬＳ配列）（配列番号５０）、ＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ１０）（配列番号５１）、ＲＧＤ、ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＲＶ（ｐｅｐ－１）（配列番号５２）、ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ（ＭＡＰ）（配列番号５３）、ＲＲＲＲＮＲＴＲＲＮＲＲＲＶＲ（ＦＨＶコート）（配列番号５４）およびＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ（ｐＶＥＣ）（配列番号５５）からなる群から選択されるオリゴペプチドである、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
【請求項9】
前記末端修飾剤が、システイン、ホモシステイン、およびシステインまたはホモシステインを含むオリゴペプチドからなる群から選択され、前記オリゴペプチドが２０個以下のアミノ酸を含有する、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
【請求項10】
前記第１の溶液および前記第２の溶液の前記混合によって、約２．２／１～約３／１の範囲のモル比でチオール／アクリレートを含む溶液が形成される、請求項８または９に記載の方法。
【請求項11】
前記オリゴペプチドが、塩酸塩、酢酸塩、ＴＦＡ塩、ギ酸塩またはそれらの組合せとして提供される、請求項８または９に記載の方法。
【請求項12】
前記第１の溶液および前記第２の溶液がＤＭＳＯを含有しない、請求項１～１１のいずれかに記載の方法。
【請求項13】
工程（ｄ）における前記第１の溶液および前記第２の溶液の前記混合が不活性雰囲気中で実施され、前記不活性雰囲気が、前記混合の間の二硫化物の形成を低減させる、請求項１～１２のいずれかに記載の方法。
【請求項14】
工程（ｄ）における前記第１の溶液および前記第２の溶液の前記混合が、約２０時間実施される、請求項１～１３のいずれかに記載の方法。
【請求項15】
工程（ｄ）における前記第１の溶液および前記第２の溶液の前記混合が、約２５℃で実施される、請求項１～１４のいずれかに記載の方法。
【請求項16】
（ｉ）前記末端アクリレート基を含むポリマーが、式ＶＩもしくは式ＶＩＩの構造：【化1】
【化2】
ｎおよびｍは独立して２～１００００の整数であり、ｋは１～５００００の整数であり、ｊは１～２００００の整数であり、Ｘは１～５０００の整数である、請求項１～１５のいずれかに記載の方法。
【請求項17】
（ｅ）工程（ｄ）で得られた前記末端修飾ＰＢＡＥから、残留溶媒を除去することをさらに含む、請求項１～１６のいずれかに記載の方法。
【請求項18】
工程（ｅ）の結果得られる前記末端修飾ポリマーが、残留クエン酸塩を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法から作られる、末端修飾ポリマーを含む組成物。
【請求項20】
ＤＭＳＯを実質的に含まない、請求項１９に記載の組成物。
【請求項21】
水溶液である請求項１９または２０に記載の組成物であって、前記組成物が約－２０℃で保管されるとき、前記末端修飾ＰＢＡＥが少なくとも１０週間の半減期を有する、請求項１９または２０に記載の組成物。
【請求項22】
前記末端修飾ＰＢＡＥが少なくとも１５週間の半減期を有する、請求項２１に記載の組成物。
【請求項23】
ポリマージアクリレートを精製する方法であって、（ａ）酢酸エチルに前記ポリマージアクリレートを溶解することと、
（ｂ）約１０／１体積／体積の酢酸エチルに対するヘプタンの比率を得るように、ヘプタン中に前記ポリマージアクリレートを滴下して添加することによって前記ポリマージアクリレートを沈殿させることと、
（ｃ）工程（ａ）および（ｂ）を２回繰り返し、それによって前記精製ポリマージアクリレートが得られることと、を含む、方法。
【請求項24】
ポリマージアクリレートを精製する方法であって、（ａ）酢酸エチルに前記ポリマージアクリレートを溶解することと、
（ｂ）約２／１体積／体積の酢酸エチルに対するヘプタンの比率を得るように、工程（ａ）で得られる前記溶液から、前記溶液にヘプタンを添加することによって前記ポリマージアクリレートを沈殿させ、それによって前記精製ポリマージアクリレートが沈殿物として得られること、とを含む、方法。
【請求項25】
請求項２４に記載の方法の生成物を、請求項２５に記載の出発物質たるポリマージアクリレートとして用いて、請求項２５に記載の方法を実施することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
請求項２３～２５のいずれかに記載の方法によって得られる、精製ポリマージアクリレート。
【請求項27】
オリゴペプチド修飾ＰＢＡＥ（ＯＭ－ＰＢＡＥ）を精製する方法であって、（ａ）エタノールを用いて前記ＯＭ－ＰＢＡＥを抽出し、続いて前記抽出されたＯＭ－ＰＢＡＥを乾燥させることと、
（ｂ）エタノールに工程（ａ）の結果得られた前記ＯＭ－ＰＢＡＥを再溶解し、約７／３（ｖ／ｖ）の比率のジエチルエーテル／アセトンに前記ＯＭ－ＰＢＡＥを沈殿させることと、
（ｃ）工程（ｂ）の結果得られた前記沈殿物を、ジエチルエーテル／アセトン（約７／３ｖ／ｖ）を用いて洗浄することと、
（ｄ）工程（ｃ）の結果得られた前記ＯＭ－ＰＢＡＥから残留溶媒を除去すること、とを含む、前記方法。
【請求項28】
オリゴペプチド修飾ＰＢＡＥ（ＯＭ－ＰＢＡＥ）を精製する方法であって、（ａ）水を含む溶離液を用いて、前記ＯＭ－ＰＢＡＥをサイズ排除カラムに通過させることと、
（ｂ）前記サイズ排除カラムを通過させた後に、前記ＯＭ－ＰＢＡＥを回収することと、
（ｃ）工程（ｂ）の結果得られた前記ＯＭ－ＰＢＡＥから残留溶媒を除去すること、とを含む、前記方法。
【請求項29】
工程（ｃ）が、真空を適用することもしくは凍結乾燥、沈殿、ろ過、遠心分離を実施すること、ジエチルエーテル／アセトンを用いて前記ＯＭ－ＰＢＡＥを洗浄すること、またはこれらの組合せを含む、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項30】
請求項１９～２２または請求項２７～２９のいずれかに記載の方法によって得られるＯＭ－ＰＢＡＥ。
【請求項31】
請求項３０に記載の前記ＯＭ－ＰＢＡＥでカプセル化される核酸またはウイルスベクターを含む、ナノ粒子。
【請求項32】
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項３１に記載のナノ粒子。
【請求項33】
溶媒としてのＤＭＳＯの使用を含む方法によって作られるＯＭ－ＰＢＡＥを含むナノ粒子と比較して、より高い形質導入効率を有する、請求項３２に記載のナノ粒子。
【請求項34】
溶媒としてのＤＭＳＯの使用を含む方法によって作られるＯＭ－ＰＢＡＥを含むナノ粒子と比較して、細胞の形質導入を行い、より高い細胞生存率をもたらすことができる、請求項３２に記載のナノ粒子。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
オリゴペプチド修飾ポリ－β－アミノ－エステル（ＯＭ－ＰＢＡＥ）および関連するポリマーを、ＤＭＳＯを溶媒として使用せずに合成する方法および精製する方法に関する。
【0002】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年９月２１日に出願された米国仮出願第６２／９０３７９９号の優先権を主張し、その全内容が参照として本明細書に組み込まれている。
本出願は、２０１９年９月２１日に出願された米国仮出願第６２／９０３７９９号の優先権を主張し、その全内容が参照として本明細書に組み込まれている。
【背景技術】
【0003】
遺伝子治療は、幅広い遺伝性または非遺伝性の状態の治療のための、新規の治療的手法を提案している。遺伝子治療領域においては、いくつかのウイルスベクターおよび非ウイルスベクターが探索されている。ウイルスベクターは、トランスフェクション効率が高く、また長期的な遺伝子発現を提供するため、最も評判の良いツールの１つである。しかしウイルスベクターには、毒性の、免疫原性プロファイルおよび非特異性に関して、重大な安全性の懸念がある。非ウイルスベクターは、その相対的な安全性、製造の容易性および特定の細胞を標的化するための修飾を考慮すると、有望な選択肢であるが、低いトランスフェクション効率のために、臨床での利用への移行が制限されている。別の選択肢は、ウイルス性システムおよび非ウイルス性システムの障壁を克服し、相乗効果によって全体的な効率を高める可能性がある、ポリマーを用いたウイルスのコーティングまたは修飾を含む、ナノテクノロジーを介した解決策である。
【0004】
遺伝子治療分野では、カチオン性合成ポリマー、多糖類およびポリペプチドをはじめとするいくつかのポリマー系が適用されている（Ｌｖ、Ｈ ｅｔ ａｌ．２００６）。ポリ（β－アミノエステル）（ＰＢＡＥ）は、生分解性およびｐＨ感受性の特性のために、ポリマー性遺伝子送達システムにおいては、ここ数十年間、最も有望な候補として認識されている。異なるジアクリレートモノマーおよびアミンモノマーを使用して、２０００種を超えるＰＢＡＥが合成されている。さらに、アミン分子、ペプチド分子および糖分子など異なる官能基を用いて末端基修飾が実施されている。異なるＰＢＡＥのスクリーニングによって、ポリマー上の末端基の構造が、遺伝子送達システムの性能および細胞毒性において重要な役割を果たしていることが示された（Zugates, GT, et al., 2007; Green, JJ, et al., 2008, Anderson DG, et al., 2005）。
【0005】
現在に至るまで、大部分のＰＢＡＥの末端修飾反応は、反応溶媒としてのＤＭＳＯ中で実施されている。反応がＤＭＳＯ中で実施されなかった場合でも、ポリマーはＤＭＳＯに溶解され、その後の使用までＤＭＳＯ中で保管された（Green, JJ, et al., 2008）。ＤＭＳＯは、治療的適用において、極性薬剤または無極性薬剤を可溶化するために一般的に用いられる物質であるが、薬剤配合物におけるＤＭＳＯの使用に関しては安全性の懸念がある。ＤＭＳＯの使用に関する明確な見解の一致はないが、ＤＭＳＯの潜在的な細胞毒性は報告されている（de Abreau Costa, et al., 2017, Galvao, J., et al., 2013）。最近では、低い残留濃度のＤＭＳＯさえも望ましくない効果を誘発する可能性があり、そのためＤＭＳＯの使用は回避されるべきであるということも明らかにされている（Verheijem, M, et al., 2019）。したがって、ＤＭＳＯを含まない条件を使用した末端修飾ＰＢＡＥを調製する方法が必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本技術は、ＤＭＳＯを含まない条件での、オリゴペプチド末端修飾ＰＢＡＥおよび関連ポリマーの新規の合成を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0007】
新しい方法によって合成されたＰＢＡＥを使用してレンチウイルス粒子をコーティングし、ナノ粒子遺伝子送達システムを作り出した。さらに、このポリマーコーティングしたウイルス粒子を細胞形質導入実験において使用した。システムの有効性および細胞毒性を評価し、従来通りＤＭＳＯ中で合成されたポリマーによって調製されたシステムと比較した。加えて、ＤＭＳＯを含まない条件下でのＯＭ－ＰＢＡＥの製造は、大規模に実施することができる。
【0008】
本技術によって合成されたＯＭ－ＰＢＡＥは、例えば、下記の式Ｉまたは式ＩＩに示すような構造を有することができる。
末端のＲは、それぞれ２～２０個のアミノ酸残基を含有する同一のまたは異なるオリゴペプチドを示し、「ｍ」および「ｎ」は、それぞれ脂肪族の側鎖または水酸化された側鎖を有する反復単位の数を示し、「ｘ」は、ＯＭ－ＰＢＡＥ中の脂肪族ブロックおよび水酸化ブロックの反復単位の合計数を示す。
【化1】
【0009】
本技術によって合成され得るその他のポリマーとしては、下記の式ＩＩＩ、式ＩＶおよび式Ｖで示されるものが含まれる。
これらのポリマーでは、ｋは１～５００００の整数であり、ｊは１～２００００の整数である。末端のＲは、それぞれ２～２０個のアミノ酸残基を含有する同一のまたは異なるオリゴペプチドを示す。
【化2】
【0010】
オリゴペプチド中のアミノ酸残基は、任意の、天然に存在するアミノ酸、または合成アミノ酸であることができる。アミノ酸残基は、天然に存在するＬ－アミノ酸であることができる。ペプチドは、正電荷を帯びたアミノ酸、中性アミノ酸、疎水性アミノ酸、極性無電荷アミノ酸、または負電荷を帯びたアミノ酸、またはこれらの任意の組合せを含有することができる。オリゴペプチドは末端システインを含有することができ、この末端システインを使用して、チオール－アクリレートマイケル付加反応を介してオリゴペプチドと反応するＰＢＡＥのアクリレート前駆体またはジアクリレート前駆体のアクリレート末端基に、オリゴペプチドをカップリングすることができる。
【0011】
オリゴペプチドは、任意のアミノ酸配列を有することができる。この配列は、例えば、Ｎ末端システインと、Ｈ、ＲおよびＫの任意の組合せなどの１個以上の正電荷を帯びたアミノ酸と、最大で２０個のアミノ酸残基を含有することができる。この配列は、例えば、Ｎ末端システインと、ＤおよびＥの任意の組合せなどの１個以上の負電荷を帯びたアミノ酸と、最大で２０個のアミノ酸残基を含有することができる。この配列は、例えば、Ｎ末端システインと、Ｈ、ＲおよびＫなどの１個以上の正電荷を帯びたアミノ酸とを、任意の順序でＤまたはＥなどの任意の負電荷を帯びたアミノ酸と組み合わせて、最大で２０個のアミノ酸残基を含有することができる。例示的なアミノ酸配列としては、ＣＨ、ＣＨＨ、ＣＨＨＨ（配列番号１）、ＣＨＨＨＨ（配列番号２）、ＣＨＨＨＨＨ（配列番号３）、ＣＲ、ＣＲＲ、ＣＲＲＲ（配列番号４）、ＣＲＲＲＲ（配列番号５）、ＣＲＲＲＲＲ（配列番号６）が挙げられる。ＣＫ、ＣＫＫ、ＣＫＫＫ（配列番号７）、ＣＫＫＫＫ（配列番号８）、ＣＫＫＫＫＫ（配列番号９）、ＣＥ、ＣＥＥ、ＣＥＥＥ（配列番号１０）、ＣＥＥＥＥ（配列番号１１）、ＣＥＥＥＥＥ（配列番号１２）、ＣＤ、ＣＤＤ、ＣＤＤＤ（配列番号１３）、ＣＤＤＤＤ（配列番号１４）、ＣＤＤＤＤＤ（配列番号１５）、ＣＨＲＨ（配列番号１６）、ＣＨＲＲ（配列番号１７）、ＣＨＫＨ（配列番号１８）、ＣＨＫＫ（配列番号１９）、ＣＨＥＨ（配列番号２０）、ＣＨＥＥ（配列番号２１）、ＣＨＤＨ（配列番号２２）、ＣＨＤＤ（配列番号２３）、ＣＲＨＲ（配列番号２４）、ＣＲＨＨ（配列番号２５）、ＣＲＫＲ（配列番号２６）、ＣＲＫＫ（配列番号２７）、ＣＲＥＲ（配列番号２８）、ＣＲＥＥ（配列番号２９）、ＣＲＤＲ（配列番号３０）、ＣＲＤＤ（配列番号３１）、ＣＫＨＫ（配列番号３２）、ＣＫＨＨ（配列番号３３）、ＣＫＲＫ（配列番号３４）、ＣＫＲＲ（配列番号３５）、ＣＤＨＤ（配列番号３６）、ＣＤＨＨ（配列番号３７）、ＣＤＲＤ（配列番号３８）、ＣＤＲＲ（配列番号３９）、ＣＤＫＤ（配列番号４０）、ＣＤＫＫ（配列番号４１）、ＣＥＨＥ（配列番号４２）、ＣＥＨＨ（配列番号４３）、ＣＥＲＥ（配列番号４４）、ＣＥＲＲ（配列番号４５）、ＣＥＤＥ（配列番号４６）およびＣＥＤＤ（配列番号４７）。
【0012】
本技術のオリゴペプチドはまた、細胞膜透過性ペプチド、例えば、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＱ（ＴＡＴ）（配列番号４８）、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＧＧ（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）（配列番号４９）、ＣＧＹＧＰＫＫＫＲＫＶＧＧ（ＮＬＳ配列）（配列番号５０）、ＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ１０）（配列番号５１）、ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＲＶ（ｐｅｐ－１）（配列番号５２）、ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ（ＭＡＰ）（配列番号５３）、ＲＲＲＲＮＲＴＲＲＮＲＲＲＶＲ（ＦＨＶ ｃｏａｔ）（配列番号５４）、およびＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ（ｐＶＥＣ）（配列番号５５）であることができる。本技術のオリゴペプチドはまた、インテグリン結合ペプチド、例えばＲＧＤまたはその他のインテグリン結合ペプチドであることができる。
【0013】
本技術は、末端修飾ポリ－β－アミノ－エステル（ＰＢＡＥ）を合成する方法を含む。本方法は、（ａ）オリゴペプチドなどの末端修飾剤、および末端アクリレート基を含むＰＢＡＥ（ＰＢＡＥアクリレートまたはＰＢＡＥジアクリレート）を提供する工程と、（ｂ）アセトニトリルに溶解させたＰＢＡＥを含有する第１の溶液を形成または提供する工程と、（ｃ）クエン酸水溶液に溶解させた末端修飾剤を含有する第２の溶液を形成または提供する工程と、（ｄ）第１の溶液および第２の溶液を混合し、それによって末端修飾剤が末端ビニル炭素に結合して末端修飾ＰＢＡＥを形成する工程と、を含む。
【0014】
上述の合成に用いられるＰＢＡＥジアクリレートは、例えば、下記の式ＶＩまたは式ＶＩＩに従う構造を有することができる。
【化3】
【0015】
ＰＢＡＥジアクリレートの主鎖構造は、合成での使用に異なるジアクリレート出発物質を選択することによって、さらに変化させることができる。例えば、式ＶＩＩＩ、式ＩＸまたは式Ｘの以下のポリマージアクリレートを合成に使用することができる。
式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、水素、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、フェニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリールおよびヘテロアリールからなる第１の群から選択され、Ｒ１およびＲ２では、それぞれ独立して１個以上の炭素がＯ、Ｎ、ＢまたはＳによって置換されてもよく、独立してそれぞれ第１の群の構成成分は、所望によりさらに、－ＯＨ、ハロゲン、ハロゲン化アシル、炭酸塩、ケトン、アルデヒド、エステル、メトキシ、エーテル、アミド、アミン、ニトリルおよび第１の群の任意のその他の構成成分からなる第２の群から選択された１種以上の置換基によって置換されることができ、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して最大で合計２０個の炭素を有し、ｎおよびｍは独立して２～１００００の整数であり、ｋは１～５００００の整数であり、ｊは１～２００００の整数であり、Ｘは１～５０００の整数である。
【化4】
【0016】
本明細書で使用される場合、「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素から選択される元素である。「アルキル」基は、非分岐鎖または分枝鎖であることができ、分子構造への置換基として、任意の水素原子との置換によって所望により追加されることができる。結合されるアルキル鎖原子は炭素でもよく、またはアルキルが１種以上のヘテロ原子を含有する場合、Ｏ、Ｎ、ＢもしくはＳでもよい。
【0017】
本技術はまた、ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーを精製する方法を含む。
本方法は、（ａ）ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーを酢酸エチルに溶解する工程と、（ｂ）約１０／１体積／体積の酢酸エチルに対するヘプタンの比率を得るように、ヘプタン中に上記酢酸エチルを滴下して添加することによって、ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーを沈殿させる工程と、（ｃ）工程（ａ）および（ｂ）を２回繰り返し、それによって精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーが得られる工程と、を含む。
本方法は、（ａ）ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーを酢酸エチルに溶解する工程と、（ｂ）約１０／１体積／体積の酢酸エチルに対するヘプタンの比率を得るように、ヘプタン中に上記酢酸エチルを滴下して添加することによって、ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーを沈殿させる工程と、（ｃ）工程（ａ）および（ｂ）を２回繰り返し、それによって精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーが得られる工程と、を含む。
【0018】
本技術はまた、ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーを精製する別の方法を含む。本方法は、（ａ）ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーを酢酸エチルに溶解する工程と、（ｂ）約２／１体積／体積の酢酸エチルに対するヘプタンの比率を得るように、工程（ａ）で得られる溶液から、溶液にヘプタンを添加することによってＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーを沈殿させ、それによって精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーが沈殿物として得られる工程と、を含む。
【0019】
本技術はまた、オリゴペプチド修飾ＰＢＡＥ（ＯＭ－ＰＢＡＥ）を精製する方法を含む。本方法は、（ａ）エタノールを用いてＯＭ－ＰＢＡＥを抽出し、続いて抽出されたＯＭ－ＰＢＡＥを乾燥させる工程と、（ｂ）エタノールに工程（ａ）の結果得られたＯＭ－ＰＢＡＥを再溶解し、約７／３（ｖ／ｖ）の比率のジエチルエーテル／アセトンにＯＭ－ＰＢＡＥを沈殿させる工程と、（ｃ）工程（ｂ）の結果得られた沈殿物を、ジエチルエーテル／アセトン（約７／３ｖ／ｖ）を用いて洗浄する工程と、（ｄ）工程（ｃ）の結果得られたＯＭ－ＰＢＡＥから残留溶媒を除去する工程と、を含む。
【0020】
本技術はまた、オリゴペプチド修飾ＰＢＡＥ（ＯＭ－ＰＢＡＥ）を精製する方法を含む。本方法は、（ａ）水を含む溶離液を用いて、ＯＭ－ＰＢＡＥをサイズ排除カラムに通過させる工程と、（ｂ）サイズ排除カラムを通過させた後に、ＯＭ－ＰＢＡＥを回収する工程と、（ｃ）工程（ｂ）の結果得られたＯＭ－ＰＢＡＥから残留溶媒を除去する工程と、を含む。
【0021】
本技術は、以下の特徴によってさらに要約することができる。
１．末端修飾ポリマーを合成する方法であって、
（ａ）末端修飾剤、および末端ビニル炭素を含む末端アクリレート基を含むポリマーを提供することと、
（ｂ）アセトニトリルに溶解させた上記ポリマーを含む第１の溶液を形成することと、
（ｃ）クエン酸水溶液に溶解させた上記末端修飾剤を含む第２の溶液を形成することと、
（ｄ）第１の溶液および第２の溶液を混合し、それによって末端修飾剤が末端ビニル炭素に結合して末端修飾ポリマーを形成すること、とを含む方法。
２．第２の溶液がアセトニトリルをさらに含む、特徴１に記載の方法。
３．末端修飾剤をクエン酸水溶液に、末端修飾剤が上記溶液に溶解されるまで混合し、続いて上記溶液にアセトニトリルを添加することによって第２の溶液が形成される、特徴２のいずれかに記載の方法。
４．第２の溶液が、約１／１体積／体積～約２／１体積／体積の比率で水／アセトニトリルを含む、特徴２または特徴３に記載の方法。
５．第２の溶液が約２５ｍＭのクエン酸塩を含み、約ｐＨ５．０のｐＨを有する、特徴１～特徴４のいずれかに記載の方法。
６．工程（ｄ）における第１の溶液および第２の溶液の混合によって、約３／２体積／体積の比率でアセトニトリル／水を含む溶液が形成される、特徴１～特徴５のいずれかに記載の方法。
７．末端修飾剤がチオールを含み、末端修飾剤がチオエーテル結合（－Ｃ－Ｓ－Ｃ－）を介して末端ビニル炭素に結合する、特徴１～特徴６のいずれかに記載の方法。
８．末端修飾剤が、ＣＲＲＲ（配列番号４）、ＣＫＫＫ（配列番号７）、ＣＨＨＨ（配列番号１）、ＣＤＤＤ（配列番号１３）、ＣＥＥＥ（配列番号１０）、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＱ（ＴＡＴ）（配列番号４８）、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＧＧ（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）（配列番号４９）、ＣＧＹＧＰＫＫＫＲＫＶＧＧ（ＮＬＳ、ＳＶ－４０ ｌａｒｇｅＴ抗原の核内移行配列）（配列番号５０）、ＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ１０）（配列番号５１）、ＲＧＤ、ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＲＶ（ｐｅｐ－１）（配列番号５２）、ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ（ＭＡＰ）（配列番号５３）、ＲＲＲＲＮＲＴＲＲＮＲＲＲＶＲ（ＦＨＶコート）（配列番号５４）およびＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ（ｐＶＥＣ）（配列番号５５）からなる群から選択されるオリゴペプチドである、特徴１～特徴７のいずれかに記載の方法。
９．末端修飾剤が、システイン、ホモシステイン、およびシステインまたはホモシステインを含むオリゴペプチドからなる群から選択され、オリゴペプチドが２０個以下のアミノ酸を含有する、特徴１～特徴８のいずれかに記載の方法。
１０．第１の溶液および第２の溶液の混合によって、約２．２／１～約３／１の範囲のモル比でチオール／アクリレートを含む溶液が形成される、特徴８または特徴９に記載の方法。
１．末端修飾ポリマーを合成する方法であって、
（ａ）末端修飾剤、および末端ビニル炭素を含む末端アクリレート基を含むポリマーを提供することと、
（ｂ）アセトニトリルに溶解させた上記ポリマーを含む第１の溶液を形成することと、
（ｃ）クエン酸水溶液に溶解させた上記末端修飾剤を含む第２の溶液を形成することと、
（ｄ）第１の溶液および第２の溶液を混合し、それによって末端修飾剤が末端ビニル炭素に結合して末端修飾ポリマーを形成すること、とを含む方法。
２．第２の溶液がアセトニトリルをさらに含む、特徴１に記載の方法。
３．末端修飾剤をクエン酸水溶液に、末端修飾剤が上記溶液に溶解されるまで混合し、続いて上記溶液にアセトニトリルを添加することによって第２の溶液が形成される、特徴２のいずれかに記載の方法。
４．第２の溶液が、約１／１体積／体積～約２／１体積／体積の比率で水／アセトニトリルを含む、特徴２または特徴３に記載の方法。
５．第２の溶液が約２５ｍＭのクエン酸塩を含み、約ｐＨ５．０のｐＨを有する、特徴１～特徴４のいずれかに記載の方法。
６．工程（ｄ）における第１の溶液および第２の溶液の混合によって、約３／２体積／体積の比率でアセトニトリル／水を含む溶液が形成される、特徴１～特徴５のいずれかに記載の方法。
７．末端修飾剤がチオールを含み、末端修飾剤がチオエーテル結合（－Ｃ－Ｓ－Ｃ－）を介して末端ビニル炭素に結合する、特徴１～特徴６のいずれかに記載の方法。
８．末端修飾剤が、ＣＲＲＲ（配列番号４）、ＣＫＫＫ（配列番号７）、ＣＨＨＨ（配列番号１）、ＣＤＤＤ（配列番号１３）、ＣＥＥＥ（配列番号１０）、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＱ（ＴＡＴ）（配列番号４８）、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＧＧ（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）（配列番号４９）、ＣＧＹＧＰＫＫＫＲＫＶＧＧ（ＮＬＳ、ＳＶ－４０ ｌａｒｇｅＴ抗原の核内移行配列）（配列番号５０）、ＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ１０）（配列番号５１）、ＲＧＤ、ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＲＶ（ｐｅｐ－１）（配列番号５２）、ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ（ＭＡＰ）（配列番号５３）、ＲＲＲＲＮＲＴＲＲＮＲＲＲＶＲ（ＦＨＶコート）（配列番号５４）およびＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ（ｐＶＥＣ）（配列番号５５）からなる群から選択されるオリゴペプチドである、特徴１～特徴７のいずれかに記載の方法。
９．末端修飾剤が、システイン、ホモシステイン、およびシステインまたはホモシステインを含むオリゴペプチドからなる群から選択され、オリゴペプチドが２０個以下のアミノ酸を含有する、特徴１～特徴８のいずれかに記載の方法。
１０．第１の溶液および第２の溶液の混合によって、約２．２／１～約３／１の範囲のモル比でチオール／アクリレートを含む溶液が形成される、特徴８または特徴９に記載の方法。
【0022】
１１．オリゴペプチドが、塩酸塩、酢酸塩、ＴＦＡ塩、ギ酸塩またはそれらの組合せとして提供される、特徴８または特徴９に記載の方法。
１２．第１の溶液および第２の溶液がＤＭＳＯを含有しない、特徴１～特徴１１のいずれかに記載の方法。
１３．工程（ｄ）における第１の溶液および第２の溶液の混合が不活性雰囲気中で実施され、不活性雰囲気が、混合中の二硫化物の形成を低減させる、特徴１～特徴１２のいずれかに記載の方法。
１４．工程（ｄ）における第１の溶液および第２の溶液の混合が約２０時間実施される、特徴１～特徴１３のいずれかに記載の方法。
１５．工程（ｄ）における第１の溶液および第２の溶液の混合が約２５℃で実施される、特徴１～特徴１４のいずれかに記載の方法。
１６．（ｉ）末端アクリレート基を含むＰＢＡＥが、式ＶＩもしくは式ＶＩＩの構造：
を有する、または（ｉｉ）末端アクリレート基を含むポリマーが、式ＶＩＩＩ、式ＩＸもしくは式Ｘの構造：
を有し、式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、水素、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、フェニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリールおよびヘテロアリールからなる第１の群から選択され、Ｒ１およびＲ２では、それぞれ独立して１個以上の炭素がＯ、Ｎ、ＢまたはＳによって置換されてもよく、独立してそれぞれ第１の群の構成成分は、所望によりさらに、－ＯＨ、ハロゲン、ハロゲン化アシル、炭酸塩、ケトン、アルデヒド、エステル、メトキシ、エーテル、アミド、アミン、ニトリルおよび第１の群の任意のその他の構成成分からなる第２の群から選択された１種以上の置換基によって置換されることができ、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して最大で合計２０個の炭素を有し、
ｎおよびｍは独立して２～１００００の整数であり、ｋは１～５００００の整数であり、ｊは１～２００００の整数であり、Ｘは１～５０００の整数である、特徴１～特徴１５のいずれかに記載の方法。
１７．（ｅ）工程（ｄ）で得られた末端修飾ポリマーから、残留溶媒を除去することをさらに含む、特徴１～特徴１６のいずれかに記載の方法。
１８．工程（ｅ）の結果得られる末端修飾ポリマーが、残留クエン酸塩を含む、特徴１７に記載の方法。
１９．特徴１～特徴１８のいずれか１項に記載の方法によって作られる、末端修飾ポリマーを含む組成物。
２０．ＤＭＳＯを実質的に含まない、特徴１９に記載の組成物。
１２．第１の溶液および第２の溶液がＤＭＳＯを含有しない、特徴１～特徴１１のいずれかに記載の方法。
１３．工程（ｄ）における第１の溶液および第２の溶液の混合が不活性雰囲気中で実施され、不活性雰囲気が、混合中の二硫化物の形成を低減させる、特徴１～特徴１２のいずれかに記載の方法。
１４．工程（ｄ）における第１の溶液および第２の溶液の混合が約２０時間実施される、特徴１～特徴１３のいずれかに記載の方法。
１５．工程（ｄ）における第１の溶液および第２の溶液の混合が約２５℃で実施される、特徴１～特徴１４のいずれかに記載の方法。
１６．（ｉ）末端アクリレート基を含むＰＢＡＥが、式ＶＩもしくは式ＶＩＩの構造：
【化5】
【化6】
ｎおよびｍは独立して２～１００００の整数であり、ｋは１～５００００の整数であり、ｊは１～２００００の整数であり、Ｘは１～５０００の整数である、特徴１～特徴１５のいずれかに記載の方法。
１７．（ｅ）工程（ｄ）で得られた末端修飾ポリマーから、残留溶媒を除去することをさらに含む、特徴１～特徴１６のいずれかに記載の方法。
１８．工程（ｅ）の結果得られる末端修飾ポリマーが、残留クエン酸塩を含む、特徴１７に記載の方法。
１９．特徴１～特徴１８のいずれか１項に記載の方法によって作られる、末端修飾ポリマーを含む組成物。
２０．ＤＭＳＯを実質的に含まない、特徴１９に記載の組成物。
【0023】
２１．水溶液である特徴１９または特徴２０に記載の組成物であって、組成物が約－２０℃で保管されるとき、末端修飾ＰＢＡＥが少なくとも１０週間の半減期を有する、特徴１９または特徴２０に記載の組成物。
２２．末端修飾ＰＢＡＥが少なくとも１５週間の半減期を有する、特徴２１に記載の組成物。
２３．ポリマージアクリレートを精製する方法であって、
（ａ）酢酸エチルにポリマージアクリレートを溶解することと、
（ｂ）約１０／１体積／体積の酢酸エチルに対するヘプタンの比率を得るように、ヘプタン中に上記ポリマージアクリレートを滴下して添加することによってポリマージアクリレートを沈殿させることと、
（ｃ）工程（ａ）および（ｂ）を２回繰り返し、それによって精製ポリマージアクリレートが得られること、とを含む方法。
２４．ポリマージアクリレートを精製する方法であって、
（ａ）酢酸エチルにポリマージアクリレートを溶解することと、
（ｂ）約２／１体積／体積の酢酸エチルに対するヘプタンの比率を得るように、工程（ａ）で得られる溶液から、溶液にヘプタンを添加することによってポリマージアクリレートを沈殿させ、それによって精製ポリマージアクリレートが沈殿物として得られること、とを含む方法。
２５．特徴２４の方法の生成物を、特徴２５の出発ポリマージアクリレートとして用いて特徴２５の方法を実施することをさらに含む、特徴２４に記載の方法。
２６．特徴２３～特徴２５のいずれかに記載の方法によって得られる、精製ポリマージアクリレート。
２７．オリゴペプチド修飾ＰＢＡＥ（ＯＭ－ＰＢＡＥ）を精製する方法であって、
（ａ）エタノールを用いてＯＭ－ＰＢＡＥを抽出し、続いて抽出されたＯＭ－ＰＢＡＥを乾燥させることと、
（ｂ）エタノールに工程（ａ）の結果得られたＯＭ－ＰＢＡＥを再溶解し、約７／３（ｖ／ｖ）の比率のジエチルエーテル／アセトン中でＯＭ－ＰＢＡＥを沈殿させることと、
（ｃ）工程（ｂ）の結果得られた沈殿物を、ジエチルエーテル／アセトン（約７／３ｖ／ｖ）を用いて洗浄することと、
（ｄ）工程（ｃ）の結果得られたＯＭ－ＰＢＡＥから残留溶媒を除去すること、とを含む方法。
２８．オリゴペプチド修飾ＰＢＡＥ（ＯＭ－ＰＢＡＥ）を精製する方法であって、
（ａ）水を含む溶離液を用いて、ＯＭ－ＰＢＡＥをサイズ排除カラムに通過させることと、
（ｂ）サイズ排除カラムを通過させた後に、ＯＭ－ＰＢＡＥを回収することと、
（ｃ）工程（ｂ）の結果得られたＯＭ－ＰＢＡＥから残留溶媒を除去すること、とを含む方法。
２９．工程（ｃ）が、真空を適用することもしくは凍結乾燥、沈殿、ろ過、遠心分離を実施すること、ジエチルエーテル／アセトンを用いてＯＭ－ＰＢＡＥを洗浄すること、またはこれらの組合せを含む、特徴２７または特徴２８に記載の方法。
３０．特徴１９～特徴２２または特徴２７～特徴２９のいずれかに記載の方法によって得られるＯＭ－ＰＢＡＥ。
２２．末端修飾ＰＢＡＥが少なくとも１５週間の半減期を有する、特徴２１に記載の組成物。
２３．ポリマージアクリレートを精製する方法であって、
（ａ）酢酸エチルにポリマージアクリレートを溶解することと、
（ｂ）約１０／１体積／体積の酢酸エチルに対するヘプタンの比率を得るように、ヘプタン中に上記ポリマージアクリレートを滴下して添加することによってポリマージアクリレートを沈殿させることと、
（ｃ）工程（ａ）および（ｂ）を２回繰り返し、それによって精製ポリマージアクリレートが得られること、とを含む方法。
２４．ポリマージアクリレートを精製する方法であって、
（ａ）酢酸エチルにポリマージアクリレートを溶解することと、
（ｂ）約２／１体積／体積の酢酸エチルに対するヘプタンの比率を得るように、工程（ａ）で得られる溶液から、溶液にヘプタンを添加することによってポリマージアクリレートを沈殿させ、それによって精製ポリマージアクリレートが沈殿物として得られること、とを含む方法。
２５．特徴２４の方法の生成物を、特徴２５の出発ポリマージアクリレートとして用いて特徴２５の方法を実施することをさらに含む、特徴２４に記載の方法。
２６．特徴２３～特徴２５のいずれかに記載の方法によって得られる、精製ポリマージアクリレート。
２７．オリゴペプチド修飾ＰＢＡＥ（ＯＭ－ＰＢＡＥ）を精製する方法であって、
（ａ）エタノールを用いてＯＭ－ＰＢＡＥを抽出し、続いて抽出されたＯＭ－ＰＢＡＥを乾燥させることと、
（ｂ）エタノールに工程（ａ）の結果得られたＯＭ－ＰＢＡＥを再溶解し、約７／３（ｖ／ｖ）の比率のジエチルエーテル／アセトン中でＯＭ－ＰＢＡＥを沈殿させることと、
（ｃ）工程（ｂ）の結果得られた沈殿物を、ジエチルエーテル／アセトン（約７／３ｖ／ｖ）を用いて洗浄することと、
（ｄ）工程（ｃ）の結果得られたＯＭ－ＰＢＡＥから残留溶媒を除去すること、とを含む方法。
２８．オリゴペプチド修飾ＰＢＡＥ（ＯＭ－ＰＢＡＥ）を精製する方法であって、
（ａ）水を含む溶離液を用いて、ＯＭ－ＰＢＡＥをサイズ排除カラムに通過させることと、
（ｂ）サイズ排除カラムを通過させた後に、ＯＭ－ＰＢＡＥを回収することと、
（ｃ）工程（ｂ）の結果得られたＯＭ－ＰＢＡＥから残留溶媒を除去すること、とを含む方法。
２９．工程（ｃ）が、真空を適用することもしくは凍結乾燥、沈殿、ろ過、遠心分離を実施すること、ジエチルエーテル／アセトンを用いてＯＭ－ＰＢＡＥを洗浄すること、またはこれらの組合せを含む、特徴２７または特徴２８に記載の方法。
３０．特徴１９～特徴２２または特徴２７～特徴２９のいずれかに記載の方法によって得られるＯＭ－ＰＢＡＥ。
【0024】
３１．特徴３０に記載のＯＭ－ＰＢＡＥでカプセル化される核酸またはウイルスベクターを含む、ナノ粒子。
３２．ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、特徴３１に記載のナノ粒子。
３３．溶媒としてのＤＭＳＯの使用を含む方法によって作られたＯＭ－ＰＢＡＥを含むナノ粒子と比較して、より高い形質導入効率を有する、特徴３２に記載のナノ粒子。
３４．溶媒としてのＤＭＳＯの使用を含む方法によって作られるＯＭ－ＰＢＡＥを含むナノ粒子と比較して、細胞の形質導入を行い、より高い細胞生存率をもたらすことができる、特徴３２に記載のナノ粒子。
３２．ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、特徴３１に記載のナノ粒子。
３３．溶媒としてのＤＭＳＯの使用を含む方法によって作られたＯＭ－ＰＢＡＥを含むナノ粒子と比較して、より高い形質導入効率を有する、特徴３２に記載のナノ粒子。
３４．溶媒としてのＤＭＳＯの使用を含む方法によって作られるＯＭ－ＰＢＡＥを含むナノ粒子と比較して、細胞の形質導入を行い、より高い細胞生存率をもたらすことができる、特徴３２に記載のナノ粒子。
【0025】
本明細書で使用する場合、用語「約」は、記載された値の１０％、５％、１％または０．５％以内の値を含む。
【0026】
本明細書で使用される場合、「本質的にからなる」とは、特許請求の範囲の基本的かつ新規の特徴に実質的に影響を及ぼさない材料または工程を含めることを可能にする。本明細書の「含む」という用語の任意の記述は、特に組成物の成分の説明において、または装置の要素の説明において、代替的な表現である、「本質的にからなる」または「からなる」と交換することができる。
【図面の簡単な説明】
【0027】
【図1】一般有機溶媒および溶媒混合物における、ＰＢＡＥ－ジアクリレート、ペプチド－ＨＣｌ塩およびＯＭ－ＰＢＡＥの溶解度に関する溶媒スクリーニングの結果を示す（作業濃度約１０～２０ｍｇ／ｍＬ）。ＣＩＴ＝ｐＨ５．０の２５ｍＭクエン酸塩緩衝液。陰影パターン：Ｘ＝可溶性、黒＝可溶性でない、白＝試験せず。べたの灰色で示される組合せは、溶解度試験（１時間以内）の間は不溶であると見なされたが、後に反応およびワークアップの間に可溶であるのが観察されたものである。これが、溶解時間、濃度、固体の表面積の違いおよび／またはその他の溶質の存在に起因したかどうかは不明である。
【図2】古典的プロトコルによって得られた粗ＰＢＡＥ－ジアクリレート（レーン１）、１／１０の酢酸エチル／ヘプタンによる精製ＰＢＡＥ－ジアクリレート（レーン２）および、本明細書に記載される新規な合成プロトコルによって得られた１／２の酢酸エチル／ヘプタンによる精製ＰＢＡＥ－ジアクリレート（レーン３）で点を付けた薄層クロマトグラフィープレートを示す。ジクロロメタン／メタノール（１２／１、ｖ／ｖ）を移動相として使用し、ＫＭｎＯ４で染色した。
【図3A】古典的方法によって得られた粗ＰＢＡＥ－ジアクリレートのＧＰＣトレースを示す。
【図3B】本明細書に記載の新たな合成プロトコルを経て得られた精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーのＧＰＣトレースを示す。
【図4A】クエン酸塩緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ５．０）において、ｔ＝０での粗ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマー溶液および精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマー溶液を用いて実施される物理的外観試験を示す。
【図4B】クエン酸塩緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ５．０）において、ｔ＝２０時間での粗ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマー溶液および精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマー溶液を用いて実施される物理的外観試験を示す。
【図5】粗ＰＢＡＥ－ジアクリレートを出発物質として使用して、アセトニトリル／クエン酸塩（２５ｍＭ、ｐＨ５．０）（３／２、ｖ／ｖ）中で合成される、ＰＢＡＥ－ＣＲ３のＮＭＲスペクトルを示す。ＣＨ３ピークに対するアクリレートの積分値の比率を使用して、アクリレート変換率を算出した。
【図6】精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートを出発物質として、および２倍濃縮ペプチド溶液を使用して、アセトニトリル／クエン酸塩（２５ｍＭ、ｐＨ５．０）（３／２、ｖ／ｖ）中で合成されたＰＢＡＥ－ＣＲ３のＮＭＲスペクトルを示す。ＣＨ３ピークに対するアクリレートの積分値の比率を使用して、アクリレート変換率を算出した。
【図7A】古典的プロトコル（先行技術）における、ＯＭ－ＰＢＡＥ合成工程および精製工程の概要を示す。
【図7B】本技術の新たなＤＭＳＯを含まない方法における、ＯＭ－ＰＢＡＥ合成工程および精製工程の概要を示す。 図８Ａ、図８Ｂおよび図８Ｃ～図８Ｊは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードし、粗ＰＢＡＥ－ジアクリレートを用いて得られたＤＭＳＯ中のＰＢＡＥ－ＣＲ３（エントリ３）；粗ＰＢＡＥ－ジアクリレートを用いて得られたＰＢＡＥ－ＣＨ３（エントリ２）；粗ＰＢＡＥ－ジアクリレートを用いて得られたＰＢＡＥ－ＣＲ３／ＰＢＡＥ－ＣＨ３の６０／４０または４０／６０の混合物；精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートを用いて得られたＰＢＡＥ－ＣＲ３（エントリ８）；粗ＰＢＡＥ－ジアクリレートを用いて得られたＰＢＡＥ－ＣＨ３（エントリ７）；精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートを用いて得られたＰＢＡＥ－ＣＲ３／ＰＢＡＥ－ＣＨ３の６０／４０または４０／６０の混合物でコーティングした、レンチベクターによって形質導入された、凍結ヒトリンパ球調製物を用いて得られたインビトロの結果を示す。
【図8A】試験した各条件での形質導入効率を示す。
【図8B】形質導入後、７２時間での細胞の細胞生存率を示す。
【図8C】異なるポリマーでコーティングしたレンチウイルスベクターによって形質導入され、Ｔ（ＣＤ３＋）特異的抗体およびＢ（ＣＤ１９＋）特異的抗体によって染色され、フローサイトメトリーによって分析されるリンパ球集団を比較する。対照には、形質導入されなかったが、実験全体にわたって培養物中に維持された細胞（ＮＴ）、および非カプセル化ＶＳＶ－Ｇ（－）（「禿（Ｂａｌｄ）」）レンチウイルスベクター粒子によって形質導入された細胞（ＬＶ）が含まれる。
【図8D】異なるポリマーでコーティングしたレンチウイルスベクターによって形質導入され、Ｔ（ＣＤ３＋）特異的抗体およびＢ（ＣＤ１９＋）特異的抗体によって染色され、フローサイトメトリーによって分析されるリンパ球集団を比較する。対照には、形質導入されなかったが、実験全体にわたって培養物中に維持された細胞（ＮＴ）、および非カプセル化ＶＳＶ－Ｇ（－）（「禿（Ｂａｌｄ）」）レンチウイルスベクター粒子によって形質導入された細胞（ＬＶ）が含まれる。
【図8E】異なるポリマーでコーティングしたレンチウイルスベクターによって形質導入され、Ｔ（ＣＤ３＋）特異的抗体およびＢ（ＣＤ１９＋）特異的抗体によって染色され、フローサイトメトリーによって分析されるリンパ球集団を比較する。対照には、形質導入されなかったが、実験全体にわたって培養物中に維持された細胞（ＮＴ）、および非カプセル化ＶＳＶ－Ｇ（－）（「禿（Ｂａｌｄ）」）レンチウイルスベクター粒子によって形質導入された細胞（ＬＶ）が含まれる。
【図8F】異なるポリマーでコーティングしたレンチウイルスベクターによって形質導入され、Ｔ（ＣＤ３＋）特異的抗体およびＢ（ＣＤ１９＋）特異的抗体によって染色され、フローサイトメトリーによって分析されるリンパ球集団を比較する。対照には、形質導入されなかったが、実験全体にわたって培養物中に維持された細胞（ＮＴ）、および非カプセル化ＶＳＶ－Ｇ（－）（「禿（Ｂａｌｄ）」）レンチウイルスベクター粒子によって形質導入された細胞（ＬＶ）が含まれる。
【図8G】異なるポリマーでコーティングしたレンチウイルスベクターによって形質導入され、Ｔ（ＣＤ３＋）特異的抗体およびＢ（ＣＤ１９＋）特異的抗体によって染色され、フローサイトメトリーによって分析されるリンパ球集団を比較する。対照には、形質導入されなかったが、実験全体にわたって培養物中に維持された細胞（ＮＴ）、および非カプセル化ＶＳＶ－Ｇ（－）（「禿（Ｂａｌｄ）」）レンチウイルスベクター粒子によって形質導入された細胞（ＬＶ）が含まれる。
【図8H】異なるポリマーでコーティングしたレンチウイルスベクターによって形質導入され、Ｔ（ＣＤ３＋）特異的抗体およびＢ（ＣＤ１９＋）特異的抗体によって染色され、フローサイトメトリーによって分析されるリンパ球集団を比較する。対照には、形質導入されなかったが、実験全体にわたって培養物中に維持された細胞（ＮＴ）、および非カプセル化ＶＳＶ－Ｇ（－）（「禿（Ｂａｌｄ）」）レンチウイルスベクター粒子によって形質導入された細胞（ＬＶ）が含まれる。
【図8I】異なるポリマーでコーティングしたレンチウイルスベクターによって形質導入され、Ｔ（ＣＤ３＋）特異的抗体およびＢ（ＣＤ１９＋）特異的抗体によって染色され、フローサイトメトリーによって分析されるリンパ球集団を比較する。対照には、形質導入されなかったが、実験全体にわたって培養物中に維持された細胞（ＮＴ）、および非カプセル化ＶＳＶ－Ｇ（－）（「禿（Ｂａｌｄ）」）レンチウイルスベクター粒子によって形質導入された細胞（ＬＶ）が含まれる。
【図8J】異なるポリマーでコーティングしたレンチウイルスベクターによって形質導入され、Ｔ（ＣＤ３＋）特異的抗体およびＢ（ＣＤ１９＋）特異的抗体によって染色され、フローサイトメトリーによって分析されるリンパ球集団を比較する。対照には、形質導入されなかったが、実験全体にわたって培養物中に維持された細胞（ＮＴ）、および非カプセル化ＶＳＶ－Ｇ（－）（「禿（Ｂａｌｄ）」）レンチウイルスベクター粒子によって形質導入された細胞（ＬＶ）が含まれる。
【図10A】図８Ａ～図８Ｂに示された実験と類似しているが、ＧＦＰをコードし、図示されるように、ＤＭＳＯ中で粗ＰＢＡＥ－ジアクリレートを用いて得られた、ＰＢＡＥ－ＣＲ３（エントリ３）／ＰＢＡＥ－ＣＨ３（エントリ２）（左のバー、濃い灰色）、粗ＰＢＡＥ－ジアクリレートを用いてカップリング後の精製無しで得られた、ＤＭＳＯを含まないＰＢＡＥ－ＣＲ３／ＰＢＡＥ－ＣＨ３（中央のバー、薄い灰色）、または粗ＰＢＡＥ－ジアクリレートおよびカップリング後の精製を用いて得られた、ＤＭＳＯを含まないＰＢＡＥ－ＣＲ３（エントリ１３）／ＰＢＡＥ－ＣＨ３（エントリ１２）（右のバー、白色）の１００／０、６０／４０、４０／６０もしくは０／１００の混合物でコーティングされたレンチベクターを用いて形質導入された、単離したてのヒトＰＢＭＣで実施された形質導入効率の結果を示す。
【図10B】図８Ａ～図８Ｂに示された実験と類似しているが、ＧＦＰをコードし、図示されるように、ＤＭＳＯ中で粗ＰＢＡＥ－ジアクリレートを用いて得られた、ＰＢＡＥ－ＣＲ３（エントリ３）／ＰＢＡＥ－ＣＨ３（エントリ２）（左のバー、濃い灰色）、粗ＰＢＡＥ－ジアクリレートを用いてカップリング後の精製無しで得られた、ＤＭＳＯを含まないＰＢＡＥ－ＣＲ３／ＰＢＡＥ－ＣＨ３（中央のバー、薄い灰色）、または粗ＰＢＡＥ－ジアクリレートおよびカップリング後の精製を用いて得られた、ＤＭＳＯを含まないＰＢＡＥ－ＣＲ３（エントリ１３）／ＰＢＡＥ－ＣＨ３（エントリ１２）（右のバー、白色）の１００／０、６０／４０、４０／６０もしくは０／１００の混合物でコーティングされたレンチベクターを用いて形質導入された、単離したてのヒトＰＢＭＣで実施された細胞生存率の結果を示す。
【図11A】図８Ａ～図８Ｂに示された実験と類似しているが、ＧＦＰをコードし、ＤＭＳＯ中で粗ＰＢＡＥ－ジアクリレートを用いて得られた、ＰＢＡＥ－ＣＲ３（エントリ３）／ＰＢＡＥ－ＣＨ３（エントリ２）の６０／４０の混合物、および粗ＰＢＡＥ－ジアクリレートおよびカップリング後の精製を用いて得られた、ＤＭＳＯを含まないＰＢＡＥ－ＣＲ３（エントリ１３）／ＰＢＡＥ－ＣＨ３（エントリ１２）の６０／４０の混合物でコーティングされたレンチベクターを用いて形質導入された、単離したてのヒトＰＢＭＣで実施された形質導入効率の結果を示す。
【図11B】図８Ａ～図８Ｂに示された実験と類似しているが、ＧＦＰをコードし、ＤＭＳＯ中で粗ＰＢＡＥ－ジアクリレートを用いて得られた、ＰＢＡＥ－ＣＲ３（エントリ３）／ＰＢＡＥ－ＣＨ３（エントリ２）の６０／４０の混合物、および粗ＰＢＡＥ－ジアクリレートおよびカップリング後の精製を用いて得られた、ＤＭＳＯを含まないＰＢＡＥ－ＣＲ３（エントリ１３）／ＰＢＡＥ－ＣＨ３（エントリ１２）の６０／４０の混合物でコーティングされたレンチベクターを用いて形質導入された、単離したてのヒトＰＢＭＣで実施された細胞生存率の結果を示す。本技術の新規合成プロトコルを用いて調製され、水中に再懸濁したての、または－２０℃で５週間もしくは１５週間、水中で保管したポリマーの生物的性質を、古典的プロトコルを用いてＤＭＳＯ中で調製されたポリマーと比較する。
【図12A】図８Ａ～図８Ｂに示された実験と類似しているが、ＧＦＰをコードし、ＤＭＳＯ中で粗ＰＢＡＥ－ジアクリレートを用いて得られた、ＰＢＡＥ－ＣＲ３（エントリ３）／ＰＢＡＥ－ＣＨ３（エントリ２）の６０／４０の混合物（灰色のバー）；粗ＰＢＡＥ－ジアクリレートおよびカップリング後の精製を用いて得られた、ＤＭＳＯを含まないＰＢＡＥ－ＣＲ３（エントリ１３）／ＰＢＡＥ－ＣＨ３（エントリ１２）の６０／４０の混合物（右から３番目のバー）；精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートを用いてカップリング後の精製無しで得られた、ＤＭＳＯを含まないＰＢＡＥ－ＣＲ３（エントリ１６）／ＰＢＡＥ－ＣＨ３（エントリ２２）の６０／４０の混合物（右から２番目のバー）；精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートおよびカップリング後の精製を用いて得られた、ＤＭＳＯを含まないＰＢＡＥ－ＣＲ３（エントリ１７）／ＰＢＡＥ－ＣＨ３（エントリ２３）の６０／４０の混合物（最も右のバー）でコーティングされたレンチベクターを用いて形質導入された、単離したてのヒトＰＢＭＣで実施された形質導入効率の結果を示す。
【図12B】図８Ａ～図８Ｂに示された実験と類似しているが、ＧＦＰをコードし、ＤＭＳＯ中で粗ＰＢＡＥ－ジアクリレートを用いて得られた、ＰＢＡＥ－ＣＲ３（エントリ３）／ＰＢＡＥ－ＣＨ３（エントリ２）の６０／４０の混合物（灰色のバー）；粗ＰＢＡＥ－ジアクリレートおよびカップリング後の精製を用いて得られた、ＤＭＳＯを含まないＰＢＡＥ－ＣＲ３（エントリ１３）／ＰＢＡＥ－ＣＨ３（エントリ１２）の６０／４０の混合物（右から３番目のバー）；精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートを用いてカップリング後の精製無しで得られた、ＤＭＳＯを含まないＰＢＡＥ－ＣＲ３（エントリ１６）／ＰＢＡＥ－ＣＨ３（エントリ２２）の６０／４０の混合物（右から２番目のバー）；精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートおよびカップリング後の精製を用いて得られた、ＤＭＳＯを含まないＰＢＡＥ－ＣＲ３（エントリ１７）／ＰＢＡＥ－ＣＨ３（エントリ２３）の６０／４０の混合物（最も右のバー）でコーティングされたレンチベクターを用いて形質導入された、単離したてのヒトＰＢＭＣで実施された細胞生存率の結果を示す。
【図13A】図８Ａ～図８Ｂに示された実験と類似しているが、ＧＦＰをコードし、ＤＭＳＯ中で粗ＰＢＡＥ－ジアクリレートを用いて得られた、ＰＢＡＥ－ＣＲ３（エントリ３）／ＰＢＡＥ－ＣＨ３（エントリ２）の６０／４０の混合物；精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートおよびカップリング後の精製を用いて得られた、ＤＭＳＯを含まないＰＢＡＥ－ＣＲ３（エントリ１７）／ＰＢＡＥ－ＣＨ３（エントリ２３）の６０／４０の混合物でコーティングされたレンチベクターを用いて実施された形質導入効率の結果を示す。
【図13B】図８Ａ～図８Ｂに示された実験と類似しているが、ＧＦＰをコードし、ＤＭＳＯ中で粗ＰＢＡＥ－ジアクリレートを用いて得られた、ＰＢＡＥ－ＣＲ３（エントリ３）／ＰＢＡＥ－ＣＨ３（エントリ２）の６０／４０の混合物；精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートおよびカップリング後の精製を用いて得られた、ＤＭＳＯを含まないＰＢＡＥ－ＣＲ３（エントリ１７）／ＰＢＡＥ－ＣＨ３（エントリ２３）の６０／４０の混合物でコーティングされたレンチベクターを用いて実施された細胞生存率の結果を示す。各条件について、左のバーは、ＤＭＳＯを含まない緩衝液中での保管時間０時間を示し、中央のバーは、－２０℃でのＤＭＳＯを含まない緩衝液中での保管時間２週間を示し、右のバーは、－２０℃でのＤＭＳＯを含まない緩衝液中での保管時間１０週間を示す。新規合成プロトコルを用いて調製され、水中に再懸濁したての、または－２０℃で２週間もしくは１０週間、水中で保管したポリマーの生物的性質を、古典的プロトコルを用いてＤＭＳＯ中で調製されたポリマーと比較する。
【図14A】図８Ａ～図８Ｂに示された実験と類似しているが、ＧＦＰをコードし、ＤＭＳＯ中で粗ＰＢＡＥ－ジアクリレートを用いて得られたＰＢＡＥ－ＣＲ３（エントリ３）／ＰＢＡＥ－ＣＨ３（エントリ２）の６０／４０の混合物；精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートおよびカップリング後の精製を用いて得られた、ＤＭＳＯを含まないＰＢＡＥ－ＣＲ３（エントリ１７）／ＰＢＡＥ－ＣＨ３（エントリ２３）の６０／４０の混合物；精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートを用いて得られ、カップリング反応には２倍濃縮ペプチド溶液を使用し、カップリング後の精製を使用した、ＤＭＳＯを含まないＰＢＡＥ－ＣＲ３（エントリ１８）／ＰＢＡＥ－ＣＨ３（エントリ２３）の６０／４０の混合物；精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートを用いて得られ、カップリング反応には２倍濃縮ＣＲＲＲペプチド溶液を使用し、エタノール抽出を３回繰り返し、エタノール中に乾燥エタノール抽出物を溶解するカップリング後の精製を使用した、ＤＭＳＯを含まないＰＢＡＥ－ＣＲ３（エントリ１９）／ＰＢＡＥ－ＣＨ３（エントリ２３）の６０／４０の混合物；精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートを用いて得られ、カップリング反応には２倍濃縮ＣＲＲＲペプチド溶液を使用し、エタノール抽出を２回繰り返し、エタノール／水（４／１、ｖ／ｖ）中に乾燥エタノール抽出物を溶解するカップリング後の精製を使用した、ＤＭＳＯを含まないＰＢＡＥ－ＣＲ３（エントリ２０）／ＰＢＡＥ－ＣＨ３（エントリ２３）の６０／４０の混合物；精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートを用いて得られ、カップリング反応には２倍濃縮ＣＲＲＲペプチド溶液を使用し、エタノール抽出を２回繰り返し、エタノール／水（３／２、ｖ／ｖ）中に乾燥エタノール抽出物を溶解するカップリング後の精製を使用した、ＤＭＳＯを含まないＰＢＡＥ－ＣＲ３（エントリ２１）／ＰＢＡＥ－ＣＨ３（エントリ２３）の６０／４０の混合物でコーティングされたレンチベクターを用いて実施された形質導入効率の結果を示す。
【図14B】図８Ａ～図８Ｂに示された実験と類似しているが、ＧＦＰをコードし、ＤＭＳＯ中で粗ＰＢＡＥ－ジアクリレートを用いて得られたＰＢＡＥ－ＣＲ３（エントリ３）／ＰＢＡＥ－ＣＨ３（エントリ２）の６０／４０の混合物；精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートおよびカップリング後の精製を用いて得られた、ＤＭＳＯを含まないＰＢＡＥ－ＣＲ３（エントリ１７）／ＰＢＡＥ－ＣＨ３（エントリ２３）の６０／４０の混合物；精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートを用いて得られ、カップリング反応には２倍濃縮ペプチド溶液を使用し、カップリング後の精製を使用した、ＤＭＳＯを含まないＰＢＡＥ－ＣＲ３（エントリ１８）／ＰＢＡＥ－ＣＨ３（エントリ２３）の６０／４０の混合物；精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートを用いて得られ、カップリング反応には２倍濃縮ＣＲＲＲペプチド溶液を使用し、エタノール抽出を３回繰り返し、エタノール中に乾燥エタノール抽出物を溶解させるカップリング後の精製を使用した、ＤＭＳＯを含まないＰＢＡＥ－ＣＲ３（エントリ１９）／ＰＢＡＥ－ＣＨ３（エントリ２３）の６０／４０の混合物；精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートを用いて得られ、カップリング反応には２倍濃縮ＣＲＲＲペプチド溶液を使用し、エタノール抽出を２回繰り返し、エタノール／水（４／１、ｖ／ｖ）中に乾燥エタノール抽出物を溶解するカップリング後の精製を使用した、ＤＭＳＯを含まないＰＢＡＥ－ＣＲ３（エントリ２０）／ＰＢＡＥ－ＣＨ３（エントリ２３）の６０／４０の混合物；精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートを用いて得られ、カップリング反応には２倍濃縮ＣＲＲＲペプチド溶液を使用し、エタノール抽出を２回繰り返し、エタノール／水（３／２、ｖ／ｖ）中に乾燥エタノール抽出物を溶解するカップリング後の精製を使用した、ＤＭＳＯを含まないＰＢＡＥ－ＣＲ３（エントリ２１）／ＰＢＡＥ－ＣＨ３（エントリ２３）の６０／４０の混合物でコーティングされたレンチベクターを用いて実施された細胞生存率の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0028】
詳細な説明
本技術は、反応中に溶媒としてＤＭＳＯを使用せずに、末端修飾ＰＢＡＥまたはオリゴペプチド修飾ＰＢＡＥ（ＯＭ－ＰＢＡＥ）を合成する方法を提供する。また、本技術は、合成されたポリマーを含有する組成物、上記組成物を利用する方法、ならびに合成の反応物および生成物の精製方法も提供する。
本技術は、反応中に溶媒としてＤＭＳＯを使用せずに、末端修飾ＰＢＡＥまたはオリゴペプチド修飾ＰＢＡＥ（ＯＭ－ＰＢＡＥ）を合成する方法を提供する。また、本技術は、合成されたポリマーを含有する組成物、上記組成物を利用する方法、ならびに合成の反応物および生成物の精製方法も提供する。
【0029】
ＯＭ－ＰＢＡＥのＤＭＳＯを含まない合成方法は、少なくとも１個の末端アクリレート基を有するＰＢＡＥポリマーを、溶媒または溶媒混合物に溶解することを含むことができる。オリゴペプチドなどの末端修飾剤は、上記と同一の溶媒または溶媒混合物に溶解することができるか、または上記可溶性ポリマーと混合される、別の溶液中に提供することができる。末端修飾剤は、反応時間の間、ポリマーとの反応溶液中にあった後、末端修飾剤の少なくとも一部は、ポリマーの末端ビニル炭素と反応し、末端修飾ＰＢＡＥまたは末端修飾ＯＭ－ＰＢＡＥを形成する。反応は、任意の好適な反応時間、任意の好適な反応温度および圧力で実施されることができる。その他の好適な反応条件は、触媒の使用、電磁放射線（例えばＵＶ／可視光線、マイクロ波）の適用、超音波混合、撹拌、ｐＨ、還流またはこれらの任意の組合せなど、所望に応じて選択することができる。反応は、マイケル付加またはその他の反応機構を通して行うことができる。
【0030】
少なくとも１個の末端アクリレート基を含む出発物質のＰＢＡＥポリマー、および末端修飾剤は、反応方法のための選択した溶媒または溶媒混合物に、少なくとも部分的に可溶性であるべきである。後述のように、反応性末端ビニル基または末端アクリレート基を有する任意の可溶性ポリマーが、好適な求核試薬を有する末端修飾剤とともに本方法に適用されることができる。例えば、本技術を任意の特定の反応機構に限定することは意図しないが、本明細書の反応は、ビニル基の末端炭素に求核攻撃を行い、合成工程における結合を形成することができる。その他の条件は、この工程の前か後に使用され得る。当該反応の反応速度は、例えば、ゲルまたは粘性の溶媒条件、立体障害効果、温度、基質、粒子または添加剤の利用によって変えることができる。別の例では、末端修飾剤を、保護基、固定基質または粒子に結合していないポリマーまたはＰＢＡＥの一端に選択的に結合させるために、末端アクリレート基を含むポリマーまたはＰＢＡＥは、保護基とともに、または固定基質もしくは粒子への結合とともに提供され得る。このように、立体効果を本明細書における方法に含めることができる。
【0031】
末端修飾剤はオリゴペプチドであることができる。オリゴペプチドは、ビニル基の末端炭素と、末端炭素の還元によって反応することができる。オリゴペプチドは、求核性の炭素、硫黄、窒素、酸素またはその他の原子を含むことができる。求核試薬は、オリゴペプチドの末端にあることができ、例えばシステイン上のチオールなどである。どの求核試薬が受容体（末端ビニル炭素）に結合するかという決定は、選択された反応条件によって変えることができる。
【0032】
末端修飾ＰＢＡＥを作る方法は、１段階合成戦略を含むことができ、末端アクリレート基を含むポリマーまたはＰＢＡＥの少なくとも一部が、単一の合成工程において末端修飾ＰＢＡＥ、すなわち反応生成物に変換される。例えば、ポリマーの溶液は、本明細書における単一の合成工程で、少なくとも部分的に末端修飾ＰＢＡＥに変換されてよい。末端修飾ＰＢＡＥを合成する方法は、末端修飾剤と、末端アクリレート基を含み、末端ビニル炭素を含むポリマーまたはＰＢＡＥとを提供することと、ＰＢＡＥおよび末端修飾剤を溶解させた溶液を形成し、それによって末端修飾剤が末端ビニル炭素に結合し、末端修飾ＰＢＡＥを形成すること、とを含むことができる。上記溶液は、アセトニトリルとクエン酸水溶液との混合物、またはその他の好適な溶媒もしくは溶媒混合物であることができる。好ましくは、溶媒または溶媒混合物は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含まない。好ましくは、溶媒または溶媒混合物は、体積または重量基準で、１０％未満、５％未満、２％未満、１％未満、または０．１％未満、またはさらに０．０１％未満のＤＭＳＯ、または０％のＤＭＳＯを含有する。溶液が形成された後、１段階合成は、しばらくの時間、混合もしくはその他の条件とともに、またはそれら無しで実施されることができる。末端修飾ＰＢＡＥ形成の後、末端修飾ＰＢＡＥの単離または精製を、任意の既知の手段によって実施することができる。
【0033】
図７Ａは、溶媒としてＤＭＳＯを使用して実施される、ペプチドを末端にカップリングさせたＰＢＡＥの古典的な合成方法を示す。図７Ａの上部では、主鎖重合によってポリマーが形成される。図７Ａの中央では、ペプチド末端カップリングがＤＭＳＯ中でなされ、図７Ａの下部では、反応生成物は－２０℃でＤＭＳＯ中に保管される。図７Ｂでは、本明細書の、ペプチドが末端にカップリングしたＰＢＡＥの、ＤＭＳＯを含まない合成方法が示されている。黒色の背景に示される精製工程は任意である。図７Ｂの中央では、ペプチド末端カップリングがＤＭＳＯを含まない反応条件で実施される。アセトニトリル／クエン酸塩溶媒混合物（ＡＣＮ／クエン酸塩）の使用により、オリゴペプチド修飾ＰＢＡＥ（ＯＭ－ＰＢＡＥ）の、ＤＭＳＯを全く含まない合成が可能となり得る。
【0034】
本明細書に記載される合成方法は、複数工程で実施されることができる。末端アクリレート基を有するＰＢＡＥおよび末端修飾剤などの出発物質は、例えば溶解を促進するために、塩として提供されることができる。出発物質は、１段階合成戦略を形成するために、別々の溶液に提供され、混合されることができる。合成後に実施される精製、保管またはその他の方法は、例えば毒性を低減させ、保管安定性を高めるために、またはトランスフェクション効率もしくは形質導入効率を保つもしくは高めるために、さらに有利であり得る。
【0035】
本明細書にて開示される方法または組成物はいずれも、任意の塩の形態、任意の結晶の形態、任意の共結晶の形態、非晶質の形態、任意の多形体の形態またはこれらの組合せで提供される、または保管されることができる。
【0036】
合成が起こるための、反応物および生成物の効果的な可溶化がもたらされるように、異なる溶媒、異なる溶媒混合物、または異なる溶媒の比率の溶解度の比較を実施することができる。溶解度比較の例が図１（実施例２）で提供される。ＰＢＡＥジアクリレートおよび末端修飾剤などの出発物質は、塩とともに、または塩無しで試験されることができる。反応生成物は試験されることができる。低い溶解度を有する溶媒または溶媒混合物は、より遅い反応条件を提供することができる。反応速度は所望により変更することができる。以下で実施例２において論じるように、反応溶媒としてのエタノールは、低い反応率を提供し得る。メタノールは分子量の低下をもたらし得る。
【0037】
本明細書にて開示される方法または組成物はいずれも、不活性雰囲気において実施することができる、または反応物もしくは生成物は不活性雰囲気において保管することができる。不活性雰囲気は、副産物、不純物または望ましくないジスルフィド結合の形成を防ぐことができる。不活性雰囲気は、望ましくない結果を防ぐ任意のガス体、例えば真空、窒素、アルゴン、ヘリウム、クリプトン、キセノンおよびラドンであることができる。
【0038】
末端アクリレート基を有するＰＢＡＥを溶解でき、さらにオリゴペプチドもまた溶解できる溶媒の例は、クエン酸水溶液（クエン酸塩緩衝液）と組み合わせたアセトニトリル（ＡＣＮ）である。クエン酸塩緩衝液は、任意の望ましい濃度であることができ、例えば約２５ミリモルのクエン酸塩を含有し、約５．０のｐＨを有することができる。組み合わせる前に体積で測定したＡＣＮ／クエン酸塩緩衝液の比率は、任意の望ましい比率であることができ、例えば約１：１～約２：１であることができる。この比率は、約１．２５：１、約１．５：１、約１．７５：１または約２：１であることができる。この比率は約３：２であることができる。ＰＢＡＥアクリレートをＡＣＮに溶解することができ、末端修飾剤をクエン酸塩緩衝液に溶解することができ、続いて２種の溶液を組み合わせることができる。追加のＡＣＮを、クエン酸塩緩衝液中の末端修飾剤の溶液に所望により添加し、その後、それをＰＢＡＥアクリレートの溶液と組み合わせることができる。所望により添加されるＡＣＮの量（水の体積：ＡＣＮの体積）は、約１：０．５、約１：１、約１．５：１、約２：１または約２．５：１であることができ、添加されるＡＣＮの望ましい量は、例えば温度またはｐＨに依存し得る。出発物質が混ぜられた後、その他の操作、例えば混合、撹拌、温度変化またはその他の条件の変更をなし得る。末端修飾剤はチオール官能基を含むことができ、反応はＣ－Ｓ－Ｃ結合を形成することができる。
【0039】
反応用の出発物質は、反応前に、任意の既知の方法によって精製されることができる。例えば、ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーは、酢酸エチルへの溶解およびヘプタン中の沈殿によって精製することができる。ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーまたは末端修飾剤は、逆相、順相、フラッシュ、イオン交換、疎水性相互作用、ゲルろ過、サイズ排除もしくは親水性相互作用（ＨＩＬＩＣ）クロマトグラフィーなどによって、または透析、凍結乾燥、沈殿、遠心分離、分別または沈降によって精製することができる。
【実施例】
【0040】
実施例１：ＤＭＳＯ中のＯＭ－ＰＢＡＥの合成、精製およびキャラクタリゼーション－古典的方法。
ポリ（β－アミノエステル）（ＰＢＡＥ）を、Ｄｏｓｔａ ｅｔ ａｌ．によって記載されているような２段階製法に、わずかな変更を加えて調製した。第１の工程はＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーの合成であり、第２の工程にはＤＭＳＯ中のペプチド修飾ＰＢＡＥ（ＯＭ－ＰＢＡＥ）の合成が含まれる。
ポリ（β－アミノエステル）（ＰＢＡＥ）を、Ｄｏｓｔａ ｅｔ ａｌ．によって記載されているような２段階製法に、わずかな変更を加えて調製した。第１の工程はＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーの合成であり、第２の工程にはＤＭＳＯ中のペプチド修飾ＰＢＡＥ（ＯＭ－ＰＢＡＥ）の合成が含まれる。
【0041】
ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーの合成、精製およびキャラクタリゼーション
ポリ（β－アミノエステル）－ジアクリレートポリマーを、付加型の重合を介して、第１級アミンモノマーおよびジアクリレート官能性モノマーを使用して合成した。５－アミノ－１－ペンタノール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、９５．７％の純度、３．９ｇ、３６．２ｍｍｏｌ）、１－ヘキシルアミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、９９．９の純度、３．８ｇ、３８ｍｍｏｌ）および１，４－ブタンジオールジアクリレート（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、８９．１％の純度、１８ｇ、８１ｍｍｏｌ）を、第１級アミン基に対するアクリレートのモル比２．２：１で、丸底フラスコ中で混合した。混合物を９０℃で２０時間撹拌した。次に、反応混合物を室温まで冷却することによって、粗生成物、すなわち薄黄色の粘性の油状物が得られ、さらに使用するまで－２０℃で保管した。
ポリ（β－アミノエステル）－ジアクリレートポリマーを、付加型の重合を介して、第１級アミンモノマーおよびジアクリレート官能性モノマーを使用して合成した。５－アミノ－１－ペンタノール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、９５．７％の純度、３．９ｇ、３６．２ｍｍｏｌ）、１－ヘキシルアミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、９９．９の純度、３．８ｇ、３８ｍｍｏｌ）および１，４－ブタンジオールジアクリレート（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、８９．１％の純度、１８ｇ、８１ｍｍｏｌ）を、第１級アミン基に対するアクリレートのモル比２．２：１で、丸底フラスコ中で混合した。混合物を９０℃で２０時間撹拌した。次に、反応混合物を室温まで冷却することによって、粗生成物、すなわち薄黄色の粘性の油状物が得られ、さらに使用するまで－２０℃で保管した。
【0042】
１Ｈ－ＮＭＲ分光法を使用して構造を確認し、ＧＰＣを使用して分子量特性を決定して、合成されたＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーの特徴付けを行った。５ｍｍのＢｒｕｋｅｒ製ＰＡＢＢＯ ＢＢプローブを備えたＢｒｕｋｅｒ ４００ＭＨｚ Ａｖａｎｃｅ ＩＩＩ ＮＭＲ分光計中にＮＭＲスペクトルを集め、ＤＭＳＯ－ｄ６を重水素化溶媒として使用した。分子量測定を、ＧＰＣ ＳＨＯＤＥＸ ＫＦ－６０３カラム（６．０×約１５０ｍｍ）、および移動相としてのＴＨＦおよびＲＩ検出器を備えたＷａｔｅｒｓ ＨＰＬＣシステムで実施した。ポリスチレン標準により得られた従来の較正曲線を用いて、分子量を決定した。粗ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーの重量平均分子量（Ｍｗ）および数平均分子量（Ｍｎ）を、それぞれ４９００ｇ／ｍｏｌおよび２９００ｇ／ｍｏｌと決定した。
【0043】
ＤＭＳＯ中におけるＯＭ－ＰＢＡＥの合成、精製およびキャラクタリゼーション
ＯＭ－ＰＢＡＥポリマーを、ＤＭＳＯにおける、２．８：１の比率のチオール／ジアクリレート中のチオール－アクリレートマイケル付加反応を介する、ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーのペプチド末端修飾によって得た。一例として、トリ－アルギニン修飾ＰＢＡＥポリマー（ＰＢＡＥ－ＣＲ３）の合成を挙げる。粗ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマー（１９９ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）中に溶解し、ＮＨ２－Ｃｙｓ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－ＣＯＯＨペプチド（配列番号４）の塩酸塩（ＣＲ３―９５％の純度―Ｏｎｔｏｒｅｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（浙江省、中国）から購入）（１６８ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）中に溶解した。続いて、ポリマー溶液およびペプチド溶液を混合し、温度制御された恒温水槽において、２５℃で２０時間撹拌した。ペプチド修飾ＰＢＡＥを２０ｍＬのジエチルエーテル／アセトン（７／３、ｖ／ｖ）中で沈殿させ、続いて生成物を７．５ｍＬのジエチルエーテル／アセトン（７／３、ｖ／ｖ）を用いて２回洗浄し、その後、真空乾燥し、得られた生成物を１００ｍｇ／ｍＬの濃度でＤＭＳＯ中に再懸濁させ、さらなる使用のために－２０℃で保管した。
ＯＭ－ＰＢＡＥポリマーを、ＤＭＳＯにおける、２．８：１の比率のチオール／ジアクリレート中のチオール－アクリレートマイケル付加反応を介する、ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーのペプチド末端修飾によって得た。一例として、トリ－アルギニン修飾ＰＢＡＥポリマー（ＰＢＡＥ－ＣＲ３）の合成を挙げる。粗ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマー（１９９ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）中に溶解し、ＮＨ２－Ｃｙｓ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－ＣＯＯＨペプチド（配列番号４）の塩酸塩（ＣＲ３―９５％の純度―Ｏｎｔｏｒｅｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（浙江省、中国）から購入）（１６８ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）中に溶解した。続いて、ポリマー溶液およびペプチド溶液を混合し、温度制御された恒温水槽において、２５℃で２０時間撹拌した。ペプチド修飾ＰＢＡＥを２０ｍＬのジエチルエーテル／アセトン（７／３、ｖ／ｖ）中で沈殿させ、続いて生成物を７．５ｍＬのジエチルエーテル／アセトン（７／３、ｖ／ｖ）を用いて２回洗浄し、その後、真空乾燥し、得られた生成物を１００ｍｇ／ｍＬの濃度でＤＭＳＯ中に再懸濁させ、さらなる使用のために－２０℃で保管した。
【0044】
さらに他の例では、ＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解した粗ＰＢＡＥ－ジアクリレート（１９９ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）の溶液、およびＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解したＮＨ２－Ｃｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ＣＯＯＨ（配列番号７）（ＣＫ３）の塩酸塩（１４９ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）の溶液を混合し、その後、ＰＢＡＥ－ＣＲ３に対して上述した精製工程を行うことによって、トリ－リシン末端修飾ＰＢＡＥポリマーを得た。トリ－ヒスチジン末端修飾ＰＢＡＥポリマー、すなわちＰＢＡＥ－ＣＨ３では、ＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）中に溶解したＰＢＡＥ－ジアクリレート（１９９ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）の溶液を、ＤＭＳＯ（１．０ｍＬ）中に溶解したＮＨ２－Ｃｙｓ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－ＣＯＯＨ（配列番号１）（ＣＨ３）の塩酸塩（１５４ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）の溶液と混合した。トリ－アスパルテート末端修飾ＰＢＡＥポリマー、すなわちＰＢＡＥ－ＣＤ３では、ＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）中に溶解したＰＢＡＥ－ジアクリレート（１９９ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）の溶液を、ＤＭＳＯ（１ｍＬ）中に溶解したＮＨ２－Ｃｙｓ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－ＣＯＯＨ（配列番号１３）（ＣＤ３）の塩酸塩（１１４ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）の溶液と混合した。最後に、トリ－グルタメート末端修飾ＰＢＡＥポリマー、すなわちＰＢＡＥ－ＣＥ３では、ＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）中に溶解したＰＢＡＥ－ジアクリレート（１９９ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）の溶液を、ＤＭＳＯ（１ｍＬ）中に溶解したＮＨ２－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－ＣＯＯＨ（配列番号１０）（ＣＥ３）の塩酸塩（１２４ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）の溶液と混合した。
【0045】
１Ｈ－ＮＭＲ解析で、予想される構造を確認した。さらに、アクリレートの変換率を、残留アクリレートのピーク（５．７５～６．５ｐｐｍ）に対する、出発物質のスペクトルと同じ値に較正されたポリマー主鎖上のＣＨ３プロトン（０．８ｐｐｍ）の比率から決定した。したがって、アクリレートピークの積分値が６（アクリレート基上のプロトンの数である）になるように割ると、残留アクリレート量が得られた。粗ＰＢＡＥ－ジアクリレートからペプチド修飾ＰＢＡＥへのマイケル付加反応の効率は、ＰＢＡＥ－ＣＲ３：８４％、ＰＢＡＥ－ＣＫ３：９３％、ＰＢＡＥ－ＣＨ３：９３％、ＰＢＡＥ－ＣＤ３：９６％、およびＰＢＡＥ－ＣＥ３：９８％であると決定された。ただし、すべての場合について、反応の全体的な収率は１００％を超えており、これは大過剰の残留ＤＭＳＯが存在していることを示している（表１）。さらに、それぞれのペプチド修飾ＰＢＡＥ中の残留ペプチド含有量を、ＢＥＨ Ｃ１８カラム（１３０Ａ、１．７μｍ、２．１×５０ｍｍ、温度３５℃）を備え、０．１％ＴＦＡ入りのアセトニトリル／水をグラジエントとして使用したＵＰＬＣ ＡＣＱＵＩＴＹシステム（Ｗａｔｅｒｓ）による分離後、ＵＶ検出（波長２２０ｎｍ）によって定量化した。
【0046】
実施例２：ＯＭ－ＰＢＡＥの新規合成、精製およびキャラクタリゼーション。
ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーの精製工程の実施
実施例１に記載されているようにＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーを合成した後、ジクロロメタン／メタノール（１２／１、ｖ／ｖ）を移動相として用いた薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって、反応を監視した。続いて、重合中にアミン官能性モノマーが完全に消費されたことを、ニンヒドリン染色によって確認した。過マンガン酸カリウム（ＫＭｎＯ４）を用いた追加の染色によって、古典的合成からの粗生成物中に無極性不純物が存在することが示された（図２、レーン１）。ＰＢＡＥに関連するすべての科学的および技術的レポートにおいては、粗生成物は、さらに精製されることなく、得られたままで使用されていた。本実施例では、ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーの精製の性能を試験し、精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートの、ＯＭ－ＰＢＡＥの合成および生物活性への作用をさらに試験した。
ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーの精製工程の実施
実施例１に記載されているようにＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーを合成した後、ジクロロメタン／メタノール（１２／１、ｖ／ｖ）を移動相として用いた薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって、反応を監視した。続いて、重合中にアミン官能性モノマーが完全に消費されたことを、ニンヒドリン染色によって確認した。過マンガン酸カリウム（ＫＭｎＯ４）を用いた追加の染色によって、古典的合成からの粗生成物中に無極性不純物が存在することが示された（図２、レーン１）。ＰＢＡＥに関連するすべての科学的および技術的レポートにおいては、粗生成物は、さらに精製されることなく、得られたままで使用されていた。本実施例では、ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーの精製の性能を試験し、精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートの、ＯＭ－ＰＢＡＥの合成および生物活性への作用をさらに試験した。
【0047】
したがって、合成されたＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーの一部をヘプタン中の沈殿によって精製した。粗生成物を酢酸エチルに溶解し、これを過剰量のヘプタン（１／１０、ｖ／ｖ）に滴下して添加し、この手順を２回繰り返した。またはポリマーを酢酸エチルに溶解し、２／１（ｖ／ｖ）の酢酸エチルに対するヘプタンの比率で、ヘプタンを徐々に添加して、ポリマーを沈殿させた。精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーをＴＬＣによって監視し、続いてＫＭｎＯ４染色を行った。沈殿による精製後、ほとんどの無極性不純物が除去されたことが、ＴＬＣプレートによって示された（図２、レーン２およびレーン３）。加えて、１／２（ｖ／ｖ）の比率での酢酸エチル／ヘプタンによる精製は、分子量特性に大きく影響するようであった。ＮＭＲにより得られた粗生成物の重合度（ＤＰ）は７であり、１／２の比率の酢酸エチル／ヘプタンによって精製されるＰＢＡＥ－ジアクリレートのＤＰは１７であり、１／１０の比率の酢酸エチル／ヘプタンによって精製されるＰＢＡＥ－ジアクリレートのＤＰは１０であった。したがって、１／１０（ｖ／ｖ）の比率での酢酸エチル／ヘプタンをＰＢＡＥ－ジアクリレートの精製のための溶媒系として選択した。酢酸エチル／ヘプタン（１／１０、ｖ／ｖ）を用いた精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートは８６％の収率で得られ、ＧＰＣによって、それぞれ５２００ｇ／ｍｏｌおよび３３００ｇ／ｍｏｌのＭｗおよびＭｎを有すると特徴付けされた。加えて、古典的方法によって得られた粗ＰＢＡＥ－ジアクリレートおよび精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーのＧＰＣ曲線によって、粗生成物のＧＰＣトレース上の低分子量領域の低いピークが、精製後に消え、ピーク分子量が高い値にわずかに移動した（粗ポリマーおよび精製ポリマーに対して、それぞれ４９００および５０００）ことが示された（図３Ａと図３Ｂとの比較）。
【0048】
さらに、物理的外観試験を実施し、機能的細胞アッセイで使用される溶媒系である、ｐＨ５．０の２５ｍＭクエン酸塩緩衝液において、粗ポリマー対精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーの安定性を測定した。両方のポリマーをクエン酸塩緩衝液に溶解し、２５℃にて２０時間撹拌した。ｔ＝０では、両方のポリマーが可溶であり、澄んだ透明な溶液が得られた。しかしｔ＝２０時間では、粗ＰＢＡＥ－ジアクリレートの溶液は濁った。一方で、ｔ＝２０時間で、精製ポリマーの溶液は透明なままであった（図４Ａおよび図４Ｂを参照）。
【0049】
精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートを出発物質として使用したＯＭ－ＰＢＡＥの、ＤＭＳＯ中での合成
ＯＭ－ＰＢＡＥポリマーを、ＤＭＳＯにおける、２．８：１の比率のチオール／ジアクリレート中のチオール－アクリレートマイケル付加反応を介する、ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーのペプチド末端修飾によって得た。一例として、トリ－アルギニン修飾ＰＢＡＥポリマー（ＰＢＡＥ－ＣＲ３）の合成を挙げる。精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマー（１９９ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）中に溶解し、ＮＨ２－Ｃｙｓ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－ＣＯＯＨペプチド（配列番号４）の塩酸塩（ＣＲ３―９５％の純度―Ｏｎｔｏｒｅｓから購入）（１６８ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）中に溶解した。続いて、ポリマー溶液およびペプチド溶液を混合し、温度制御された恒温水浴において、２５℃で２０時間撹拌した。ペプチド修飾ＰＢＡＥを２０ｍＬのジエチルエーテル／アセトン（７／３、ｖ／ｖ）中で沈殿させ、続いて生成物を７．５ｍＬのジエチルエーテル／アセトン（７／３、ｖ／ｖ）を用いて２回洗浄し、その後、真空乾燥し、得られた生成物を１００ｍｇ／ｍＬの濃度でＤＭＳＯ中に再懸濁させ、さらなる使用のために－２０℃で保管した。
ＯＭ－ＰＢＡＥポリマーを、ＤＭＳＯにおける、２．８：１の比率のチオール／ジアクリレート中のチオール－アクリレートマイケル付加反応を介する、ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーのペプチド末端修飾によって得た。一例として、トリ－アルギニン修飾ＰＢＡＥポリマー（ＰＢＡＥ－ＣＲ３）の合成を挙げる。精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマー（１９９ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）中に溶解し、ＮＨ２－Ｃｙｓ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－ＣＯＯＨペプチド（配列番号４）の塩酸塩（ＣＲ３―９５％の純度―Ｏｎｔｏｒｅｓから購入）（１６８ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）中に溶解した。続いて、ポリマー溶液およびペプチド溶液を混合し、温度制御された恒温水浴において、２５℃で２０時間撹拌した。ペプチド修飾ＰＢＡＥを２０ｍＬのジエチルエーテル／アセトン（７／３、ｖ／ｖ）中で沈殿させ、続いて生成物を７．５ｍＬのジエチルエーテル／アセトン（７／３、ｖ／ｖ）を用いて２回洗浄し、その後、真空乾燥し、得られた生成物を１００ｍｇ／ｍＬの濃度でＤＭＳＯ中に再懸濁させ、さらなる使用のために－２０℃で保管した。
【0050】
さらに他の例では、ＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解した精製ＰＢＡＥ－ジアクリレート（１９９ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）の溶液、およびＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解したＮＨ２－Ｃｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ＣＯＯＨ（配列番号７）（ＣＫ３）の塩酸塩（１４９ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）の溶液を混合し、その後、上述したＰＢＡＥ－ＣＲ３での精製工程を行うことによって、トリ－リシン末端修飾ＰＢＡＥポリマーを得た。トリ－ヒスチジン末端修飾ＰＢＡＥポリマー、すなわちＰＢＡＥ－ＣＨ３では、ＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）中に溶解した精製ＰＢＡＥ－ジアクリレート（１９９ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）の溶液を、ＤＭＳＯ（１．０ｍＬ）中に溶解したＮＨ２－Ｃｙｓ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－ＣＯＯＨ（配列番号１）（ＣＨ３）の塩酸塩（１５４ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）の溶液と混合した。トリ－アスパルテート末端修飾ＰＢＡＥポリマー、すなわちＰＢＡＥ－ＣＤ３では、ＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）中に溶解した精製ＰＢＡＥ－ジアクリレート（１９９ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）の溶液を、ＤＭＳＯ（１ｍＬ）中に溶解したＮＨ２－Ｃｙｓ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－ＣＯＯＨ（配列番号１３）（ＣＤ３）の塩酸塩（１１４ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）の溶液と混合した。最後に、トリ－グルタメート末端修飾ＰＢＡＥポリマー、すなわちＰＢＡＥ－ＣＥ３では、ＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）中に溶解したＰＢＡＥ－ジアクリレート（１９９ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）の溶液を、ＤＭＳＯ（１ｍＬ）中に溶解したＮＨ２－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－ＣＯＯＨ（配列番号１０）（ＣＥ３）の塩酸塩（１２４ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）の溶液と混合した。
【0051】
１Ｈ－ＮＭＲ解析で、予想される構造を確認した。さらに、アクリレートの変換率を、残留アクリレートのピーク（５．７５～６．５ｐｐｍ）に対する、出発物質のスペクトルと同じ値に較正されたポリマー主鎖上のＣＨ３プロトン（０．８ｐｐｍ）の比率から決定した。したがって、アクリレートピークの積分値が６（アクリレート基上のプロトンの数である）になるように割ると、残留アクリレート量が得られた。精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートを使用したペプチド修飾ＰＢＡＥのマイケル付加反応の効率は、ＰＢＡＥ－ＣＲ３：９２％、ＰＢＡＥ－ＣＫ３：９８％、ＰＢＡＥ－ＣＨ３：９４％、ＰＢＡＥ－ＣＤ３：９６％、およびＰＢＡＥ－ＣＥ３：＞９５％であると報告された。表１は、ＰＢＡＥ－ジアクリレートの合成において実施された精製工程が、マイケル付加反応の効率に負の影響を与えず、むしろ出発物質として精製された主鎖を使用することで、特に塩基性ペプチド（ＣＫ３、ＣＨ３およびＣＲ３（表１、エントリ６、７および８）でのアクリレート変換率をさらに高めたことを示す。
【0052】
【表1】
【0053】
ＯＭ－ＰＢＡＥのＤＭＳＯを含まない合成のための新たな溶媒系の選別
ペプチド修飾ＰＢＡＥの、ＤＭＳＯを含まない合成をさらに試みるために、溶解度試験を実施し、ＰＢＡＥ－ジアクリレート、テトラペプチド塩酸塩およびＯＭ－ＰＢＡＥの共通の溶媒を決定した。試験する化合物を、１０～２０ｍｇ／ｍＬの濃度で異なる溶媒に溶解し、２５℃にて１時間保温静置した後、溶液の巨視的外観を視覚的に確認した。図１に示されるＰＢＡＥ－ジアクリレート、ペプチドおよびＯＭ－ＰＢＡＥの溶解度に基づいて、３種の異なる溶媒系（メタノール、エタノールおよびアセトニトリル／クエン酸塩（２５ｍＭ、ｐＨ５．０）（３／２、ｖ／ｖ）を選択した。
ペプチド修飾ＰＢＡＥの、ＤＭＳＯを含まない合成をさらに試みるために、溶解度試験を実施し、ＰＢＡＥ－ジアクリレート、テトラペプチド塩酸塩およびＯＭ－ＰＢＡＥの共通の溶媒を決定した。試験する化合物を、１０～２０ｍｇ／ｍＬの濃度で異なる溶媒に溶解し、２５℃にて１時間保温静置した後、溶液の巨視的外観を視覚的に確認した。図１に示されるＰＢＡＥ－ジアクリレート、ペプチドおよびＯＭ－ＰＢＡＥの溶解度に基づいて、３種の異なる溶媒系（メタノール、エタノールおよびアセトニトリル／クエン酸塩（２５ｍＭ、ｐＨ５．０）（３／２、ｖ／ｖ）を選択した。
【0054】
メタノール、エタノールおよびアセトニトリル／クエン酸塩（２５ｍＭ、ｐＨ５．０）（３／２、ｖ／ｖ）におけるＰＢＡＥ－ジアクリレートの安定性
最初に、メタノール（１００ｍｇ／ｍＬ）、エタノール（１００ｍｇ／ｍＬ）およびアセトニトリル／クエン酸塩（２５ｍＭ、ｐＨ５．０）（３／２、ｖ／ｖ）（５０ｍｇ／ｍＬ）中にＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーを溶解し、２５℃にて２０時間保温静置した。減圧下でのロータリーエバポレーターによって、すべての残留溶媒を除去した後、ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーの分子量を、ＧＰＣ ＳＨＯＤＥＸ ＫＦ－６０３カラム（６．０×約１５０ｍｍ）、移動相としてのＴＨＦ、および屈折率（ＲＩ）検出器を備えたＷａｔｅｒｓ ＨＰＬＣシステムを用いるＧＰＣシステムによって決定した。ポリスチレン標準により得られた従来の較正曲線を用いて、分子量を算出した。エタノールおよびアセトニトリル／クエン酸塩（２５ｍＭ、ｐＨ５．０）（３／２、ｖ／ｖ）中で保温静置したＰＢＡＥ－ジアクリレートは、分子量に大きな変化を示さなかった（エタノールでの保温静置前：Ｍｗ＝５６００ｇ／ｍｏｌ、Ｍｎ＝３４００ｇ／ｍｏｌ、エタノールでの保温静置後：Ｍｗ＝５７００ｇ／ｍｏｌ、Ｍｎ＝３４００ｇ／ｍｏｌ、アセトニトリル／クエン酸塩での保温静置前：Ｍｗ＝７０００ｇ／ｍｏｌ、Ｍｎ＝３８００ｇ／ｍｏｌ、アセトニトリル／クエン酸塩での保温静置後：Ｍｗ＝６３００ｇ／ｍｏｌ、Ｍｎ＝３４００ｇ／ｍｏｌ）。一方で、メタノールでの保温静置は分子量を大きく低下させた（メタノールでの保温静置前：Ｍｗ＝５２００ｇ／ｍｏｌ、Ｍｎ＝３３００ｇ／ｍｏｌ、メタノールでの保温静置後：Ｍｗ＝２７００ｇ／ｍｏｌ、Ｍｎ＝１８００ｇ／ｍｏｌ）。したがって、メタノールは使用可能な反応溶媒として選択しなかった。
最初に、メタノール（１００ｍｇ／ｍＬ）、エタノール（１００ｍｇ／ｍＬ）およびアセトニトリル／クエン酸塩（２５ｍＭ、ｐＨ５．０）（３／２、ｖ／ｖ）（５０ｍｇ／ｍＬ）中にＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーを溶解し、２５℃にて２０時間保温静置した。減圧下でのロータリーエバポレーターによって、すべての残留溶媒を除去した後、ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーの分子量を、ＧＰＣ ＳＨＯＤＥＸ ＫＦ－６０３カラム（６．０×約１５０ｍｍ）、移動相としてのＴＨＦ、および屈折率（ＲＩ）検出器を備えたＷａｔｅｒｓ ＨＰＬＣシステムを用いるＧＰＣシステムによって決定した。ポリスチレン標準により得られた従来の較正曲線を用いて、分子量を算出した。エタノールおよびアセトニトリル／クエン酸塩（２５ｍＭ、ｐＨ５．０）（３／２、ｖ／ｖ）中で保温静置したＰＢＡＥ－ジアクリレートは、分子量に大きな変化を示さなかった（エタノールでの保温静置前：Ｍｗ＝５６００ｇ／ｍｏｌ、Ｍｎ＝３４００ｇ／ｍｏｌ、エタノールでの保温静置後：Ｍｗ＝５７００ｇ／ｍｏｌ、Ｍｎ＝３４００ｇ／ｍｏｌ、アセトニトリル／クエン酸塩での保温静置前：Ｍｗ＝７０００ｇ／ｍｏｌ、Ｍｎ＝３８００ｇ／ｍｏｌ、アセトニトリル／クエン酸塩での保温静置後：Ｍｗ＝６３００ｇ／ｍｏｌ、Ｍｎ＝３４００ｇ／ｍｏｌ）。一方で、メタノールでの保温静置は分子量を大きく低下させた（メタノールでの保温静置前：Ｍｗ＝５２００ｇ／ｍｏｌ、Ｍｎ＝３３００ｇ／ｍｏｌ、メタノールでの保温静置後：Ｍｗ＝２７００ｇ／ｍｏｌ、Ｍｎ＝１８００ｇ／ｍｏｌ）。したがって、メタノールは使用可能な反応溶媒として選択しなかった。
【0055】
エタノールにおける、ＯＭ－ＰＢＡＥのＤＭＳＯを含まない合成
ＯＭ－ＰＢＡＥポリマーを、エタノールにおいて、２．８：１の比率のチオール／ジアクリレートでのチオール－アクリレートマイケル付加反応を介する、ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーのペプチド末端修飾によって調製した。一例として、トリ－アルギニン修飾ＰＢＡＥポリマー（ＰＢＡＥ－ＣＲ３）の合成を挙げる。粗ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマー（１９９ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）をエタノール（２ｍＬ）中に溶解し、ＮＨ２－Ｃｙｓ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－ＣＯＯＨペプチド（配列番号４）の塩酸塩（ＣＲ３―９５％の純度―Ｏｎｔｏｒｅｓから購入）（１６８ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）をエタノール（２ｍＬ）中に溶解した。続いて、ポリマーおよびペプチドの溶液を混合し、それによって懸濁液を形成した。得られた懸濁液を２５℃で１日撹拌し、続いて、反応混合物を１１ｍＬの追加のエタノールを用いて希釈（最終的な体積は２５ｍＬであった）し、遠心分離にかけた。得られたペレットを、７．５ｍＬのエタノールを用いて２回抽出し、エタノール抽出物を乾燥させ、１Ｈ－ＮＭＲによって分析し、残留アクリレートピーク（５．７５～６．５ｐｐｍ）に対するポリマー主鎖上のＣＨ３プロトン（０．８ｐｐｍ）の比率から、アクリレート変換効率を算出した。ＣＫ３、ＣＨ３およびＣＤ３ペプチドでも同一の手順を行った。試験したすべてのペプチドで、マイケル付加反応の効率は３０％未満であったため、エタノールは低い反応率を有する反応溶媒であることが示された。
ＯＭ－ＰＢＡＥポリマーを、エタノールにおいて、２．８：１の比率のチオール／ジアクリレートでのチオール－アクリレートマイケル付加反応を介する、ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーのペプチド末端修飾によって調製した。一例として、トリ－アルギニン修飾ＰＢＡＥポリマー（ＰＢＡＥ－ＣＲ３）の合成を挙げる。粗ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマー（１９９ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）をエタノール（２ｍＬ）中に溶解し、ＮＨ２－Ｃｙｓ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－ＣＯＯＨペプチド（配列番号４）の塩酸塩（ＣＲ３―９５％の純度―Ｏｎｔｏｒｅｓから購入）（１６８ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）をエタノール（２ｍＬ）中に溶解した。続いて、ポリマーおよびペプチドの溶液を混合し、それによって懸濁液を形成した。得られた懸濁液を２５℃で１日撹拌し、続いて、反応混合物を１１ｍＬの追加のエタノールを用いて希釈（最終的な体積は２５ｍＬであった）し、遠心分離にかけた。得られたペレットを、７．５ｍＬのエタノールを用いて２回抽出し、エタノール抽出物を乾燥させ、１Ｈ－ＮＭＲによって分析し、残留アクリレートピーク（５．７５～６．５ｐｐｍ）に対するポリマー主鎖上のＣＨ３プロトン（０．８ｐｐｍ）の比率から、アクリレート変換効率を算出した。ＣＫ３、ＣＨ３およびＣＤ３ペプチドでも同一の手順を行った。試験したすべてのペプチドで、マイケル付加反応の効率は３０％未満であったため、エタノールは低い反応率を有する反応溶媒であることが示された。
【0056】
アセトニトリル／クエン酸塩（２５ｍＭ、ｐＨ５．０）（３／２、ｖ／ｖ）における、カップリング後の精製工程を用いた、ＯＭ－ＰＢＡＥのＤＭＳＯを含まない合成
ＯＭ－ＰＢＡＥポリマーを、アセトニトリル／クエン酸塩（２５ｍＭ、ｐＨ５．０）（３／２、ｖ／ｖ）における、２．８：１の比率のチオール／ジアクリレートでのチオール－アクリレートマイケル付加反応を介する、ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーのペプチド末端修飾によって得た。使用したのは、粗ＰＢＡＥ－ジアクリレートであった。一例として、トリ－アルギニン修飾ＰＢＡＥポリマー（ＰＢＡＥ－ＣＲ３）の合成を挙げる。粗ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマー（１９９ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２ｍＬ）中に溶解し、ＮＨ２－Ｃｙｓ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－ＣＯＯＨペプチド（配列番号４）の塩酸塩（ＣＲ３―９５％の純度―Ｏｎｔｏｒｅｓから購入）（１６８ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を、ｐＨ５．０の２５ｍＭクエン酸塩緩衝液（４ｍＬ）中に溶解した。ペプチドが完全に溶解した後、４ｍＬのアセトニトリルをペプチド溶液に添加した。続いて、ポリマー溶液をペプチド溶液に添加し、温度制御された恒温水槽において２５℃で２０時間撹拌した。続いて、すべての溶媒を、減圧下、４０℃で蒸発させた。古典的プロトコルのさらなる改善として、抽出工程を追加し、最終生成物から未反応のテトラペプチド塩およびその他の副産物を除去した。得られたペレットを、１０ｍＬのエタノールを用いて２回抽出した。エタノール抽出物を乾燥させた。得られた生成物を５ｍＬのエタノール中に再溶解し、２０ｍＬのジエチルエーテル／アセトン（７／３、ｖ／ｖ）中で沈殿させた。続いて、生成物を７．５ｍＬのジエチルエーテル／アセトン（７／３、ｖ／ｖ）を用いて２回洗浄し、その後真空乾燥し、さらなる使用のために－２０℃で保管した。
ＯＭ－ＰＢＡＥポリマーを、アセトニトリル／クエン酸塩（２５ｍＭ、ｐＨ５．０）（３／２、ｖ／ｖ）における、２．８：１の比率のチオール／ジアクリレートでのチオール－アクリレートマイケル付加反応を介する、ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーのペプチド末端修飾によって得た。使用したのは、粗ＰＢＡＥ－ジアクリレートであった。一例として、トリ－アルギニン修飾ＰＢＡＥポリマー（ＰＢＡＥ－ＣＲ３）の合成を挙げる。粗ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマー（１９９ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２ｍＬ）中に溶解し、ＮＨ２－Ｃｙｓ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－ＣＯＯＨペプチド（配列番号４）の塩酸塩（ＣＲ３―９５％の純度―Ｏｎｔｏｒｅｓから購入）（１６８ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を、ｐＨ５．０の２５ｍＭクエン酸塩緩衝液（４ｍＬ）中に溶解した。ペプチドが完全に溶解した後、４ｍＬのアセトニトリルをペプチド溶液に添加した。続いて、ポリマー溶液をペプチド溶液に添加し、温度制御された恒温水槽において２５℃で２０時間撹拌した。続いて、すべての溶媒を、減圧下、４０℃で蒸発させた。古典的プロトコルのさらなる改善として、抽出工程を追加し、最終生成物から未反応のテトラペプチド塩およびその他の副産物を除去した。得られたペレットを、１０ｍＬのエタノールを用いて２回抽出した。エタノール抽出物を乾燥させた。得られた生成物を５ｍＬのエタノール中に再溶解し、２０ｍＬのジエチルエーテル／アセトン（７／３、ｖ／ｖ）中で沈殿させた。続いて、生成物を７．５ｍＬのジエチルエーテル／アセトン（７／３、ｖ／ｖ）を用いて２回洗浄し、その後真空乾燥し、さらなる使用のために－２０℃で保管した。
【0057】
さらに他の例では、アセトニトリル（２ｍＬ）に溶解した粗ＰＢＡＥ－ジアクリレート（１９９ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）の溶液、およびｐＨ５．０の２５ｍＭクエン酸塩緩衝液（４ｍＬ）に溶解したＮＨ２－Ｃｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ＣＯＯＨ（ＣＫ３）（配列番号７）の塩酸塩（１４９ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を混合することによって、トリ－リシン末端修飾ＰＢＡＥポリマーを得た。ペプチドが完全に溶解した後、４ｍＬのアセトニトリルをペプチド溶液に添加した。続いて、アセトニトリル中のポリマー溶液を、アセトニトリル／クエン酸塩（２５ｍＭ、ｐＨ５．０）（１／１、ｖ／ｖ）中のペプチド溶液に添加し、室温で２０時間撹拌した。ＰＢＡＥ－ＣＲ３で上述したような、精製工程を行った。トリ－ヒスチジン末端修飾ＰＢＡＥポリマー、すなわちＰＢＡＥ－ＣＨ３では、アセトニトリル（２ｍＬ）中に溶解したＰＢＡＥ－ジアクリレート（１９９ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）の溶液を、アセトニトリル／クエン酸塩（２５ｍＭ、ｐＨ５．０）（１／１、ｖ／ｖ）（８ｍＬ）中のＮＨ２－Ｃｙｓ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－ＣＯＯＨ（配列番号１）（ＣＨ３）塩酸塩（１５４ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）の溶液と混合した。トリ－アスパルテート末端修飾ＰＢＡＥポリマー、すなわちＰＢＡＥ－ＣＤ３では、アセトニトリル（２ｍＬ）中に溶解したＰＢＡＥ－ジアクリレート（１９９ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）の溶液を、アセトニトリル／クエン酸塩（２５ｍＭ、ｐＨ５．０）（１／１、ｖ／ｖ）（８ｍＬ）中のＮＨ２－Ｃｙｓ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－ＣＯＯＨ（配列番号１３）（ＣＤ３）塩酸塩（１１４ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）の溶液と混合した。最後に、トリ－グルタメート末端修飾ＰＢＡＥポリマー、すなわちＰＢＡＥ－ＣＥ３では、アセトニトリル（２ｍＬ）中に溶解したＰＢＡＥ－ジアクリレート（１９９ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）の溶液を、アセトニトリル／クエン酸塩（２５ｍＭ、ｐＨ５．０）（１／１、ｖ／ｖ）（８ｍＬ）中のＮＨ２－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－ＣＯＯＨ（配列番号１３）（ＣＥ３）塩酸塩（１２４ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）の溶液と混合した。ＰＢＡＥ－ＣＤ３およびＰＢＡＥ－ＣＥ３では、ＰＢＡＥ－ＣＤ３およびＰＢＡＥ－ＣＥ３の溶解度特性が異なるため、上記のＰＢＡＥ－ＣＲ３、ＰＢＡＥ－ＣＨ３およびＰＢＡＥ－ＣＫ３の反応後の精製プロトコルとはわずかに異なる反応後の精製プロトコルを適用した。得られたポリマーを水（１ｍＬ）に溶解し、エタノール（１０ｍＬ）中で２回沈殿させ、真空下にてさらに乾燥させ、さらなる使用のために－２０℃で固体の状態で保管した。
【0058】
１Ｈ－ＮＭＲ解析を使用して、予想される構造を確認した。加えて、アクリレート変換率を、残留アクリレートピーク（５．７５～６．５ｐｐｍ）に対するポリマー主鎖上のＣＨ３プロトン（０．８ｐｐｍ）の比率から決定した（図５、ＰＢＡＥ－ＣＲ３の典型的なＮＭＲスペクトル）。粗ＰＢＡＥ－ジアクリレートからのペプチド修飾ＰＢＡＥでのアクリレート変換率は、ＰＢＡＥ－ＣＲ３：７８％、ＰＢＡＥ－ＣＫ３：９３％、ＰＢＡＥ－ＣＨ３：８６％、ＰＢＡＥ－ＣＤ３：１００％およびＰＢＡＥ－ＣＥ３：１００％であると決定された。ＤＭＳＯ中のＯＭ－ＰＢＡＥ合成、およびＤＭＳＯを含まない条件でのＯＭ－ＰＢＡＥ合成の総括的結果を表２に示す。
【0059】
それぞれのペプチド修飾ＰＢＡＥ中の残留ペプチド含有量を、ＢＥＨ Ｃ１８カラム（１３０Ａ、１．７μｍ、２．１×５０ｍｍ、温度３５℃）を備え、０．１％ＴＦＡ入りのアセトニトリル／水をグラジエントとして使用したＵＰＬＣ ＡＣＱＵＩＴＹシステム（Ｗａｔｅｒｓ）による分離後、ＵＶ検出（波長２２０ｎｍ）によって定量化した。
【0060】
【表2】
【0061】
アセトニトリル／クエン酸塩（２５ｍＭ、ｐＨ５．０）（３／２、ｖ／ｖ）における、精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートを用いた、反応後の精製工程を含む、ＯＭ－ＰＢＡＥのＤＭＳＯを含まない合成
ＯＭ－ＰＢＡＥポリマーを、アセトニトリル／クエン酸塩（２５ｍＭ、ｐＨ５．０）（３／２、ｖ／ｖ）における、２．８：１の比率のチオール／ジアクリレートでのチオール－アクリレートマイケル付加反応を介する、ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーのペプチド末端修飾によって得た。使用したのは、精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートであった。一例として、トリ－アルギニン修飾ＰＢＡＥポリマー（ＰＢＡＥ－ＣＲ３）の合成を挙げる。精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマー（１９９ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２ｍＬ）中に溶解し、ＮＨ２－Ｃｙｓ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－ＣＯＯＨペプチド（配列番号４）の塩酸塩（ＣＲ３―９５％の純度―Ｏｎｔｏｒｅｓから購入）（１６８ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を、ｐＨ５．０の２５ｍＭクエン酸塩緩衝液中に溶解した。ペプチドが完全に溶解した後、４ｍＬのアセトニトリルをペプチド溶液に添加した。続いて、ポリマー溶液をペプチド溶液に添加し、温度制御された恒温水槽において２５℃で２０時間撹拌した。続いて、すべての溶媒を、減圧下、４０℃で蒸発させた。得られたペレットを、１０ｍＬのエタノールを用いて２回抽出した。エタノール抽出物を乾燥させた。得られた生成物を５ｍＬのエタノール中に再溶解し、２０ｍＬのジエチルエーテル／アセトン（７／３、ｖ／ｖ）中で沈殿させた。続いて、生成物を７．５ｍＬのジエチルエーテル／アセトン（７／３、ｖ／ｖ）を用いて２回洗浄し、その後真空乾燥し、さらなる使用のために－２０℃で保管した。
ＯＭ－ＰＢＡＥポリマーを、アセトニトリル／クエン酸塩（２５ｍＭ、ｐＨ５．０）（３／２、ｖ／ｖ）における、２．８：１の比率のチオール／ジアクリレートでのチオール－アクリレートマイケル付加反応を介する、ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーのペプチド末端修飾によって得た。使用したのは、精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートであった。一例として、トリ－アルギニン修飾ＰＢＡＥポリマー（ＰＢＡＥ－ＣＲ３）の合成を挙げる。精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマー（１９９ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２ｍＬ）中に溶解し、ＮＨ２－Ｃｙｓ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－ＣＯＯＨペプチド（配列番号４）の塩酸塩（ＣＲ３―９５％の純度―Ｏｎｔｏｒｅｓから購入）（１６８ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を、ｐＨ５．０の２５ｍＭクエン酸塩緩衝液中に溶解した。ペプチドが完全に溶解した後、４ｍＬのアセトニトリルをペプチド溶液に添加した。続いて、ポリマー溶液をペプチド溶液に添加し、温度制御された恒温水槽において２５℃で２０時間撹拌した。続いて、すべての溶媒を、減圧下、４０℃で蒸発させた。得られたペレットを、１０ｍＬのエタノールを用いて２回抽出した。エタノール抽出物を乾燥させた。得られた生成物を５ｍＬのエタノール中に再溶解し、２０ｍＬのジエチルエーテル／アセトン（７／３、ｖ／ｖ）中で沈殿させた。続いて、生成物を７．５ｍＬのジエチルエーテル／アセトン（７／３、ｖ／ｖ）を用いて２回洗浄し、その後真空乾燥し、さらなる使用のために－２０℃で保管した。
【0062】
さらに他の例では、トリ－ヒスチジン末端修飾ＰＢＡＥポリマー、すなわちＰＢＡＥ－ＣＨ３では、アセトニトリル（２ｍＬ）中に溶解したＰＢＡＥ－ジアクリレート（１９９ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）の溶液を、アセトニトリル／クエン酸塩（２５ｍＭ、ｐＨ５．０）（１／１、ｖ／ｖ）（８ｍＬ）中のＮＨ２－Ｃｙｓ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－ＣＯＯＨ（配列番号１）（ＣＨ３）塩酸塩（１５４ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）の溶液と混合した。ＰＢＡＥ－ＣＲ３で記載されているのと同様の精製プロトコルを行った。
【0063】
１Ｈ－ＮＭＲを使用して、アセトニトリル／クエン酸塩（２５ｍＭ、ｐＨ５．０）（３／２、ｖ／ｖ）におけるマイケル付加反応の効率を決定した。アクリレート変換率を、残留アクリレートピーク（５．７５～６．５ｐｐｍ）に対するポリマー主鎖上のＣＨ３プロトン（０．８ｐｐｍ）の比率から決定した。精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートからのペプチド修飾ＰＢＡＥでのアクリレート変換率は、ＰＢＡＥ－ＣＲ３：８５％およびＰＢＡＥ－ＣＨ３：９５％であると決定された。
【0064】
アセトニトリル／クエン酸塩（２５ｍＭ、ｐＨ５．０）（３／２、ｖ／ｖ）における、精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートおよび２倍濃縮ペプチド溶液を用いた、カップリング後の精製工程を含む、ＯＭ－ＰＢＡＥのＤＭＳＯを含まない合成
合成のさらなる開発は、ＣＲＲＲペプチド末端修飾工程の間のアクリレート変換効率を高めること、および完全に変換されたＯＭ－ＰＢＡＥから、結合しなかったＰＢＡＥ－ジアクリレート副生成物を分離する抽出／精製条件を見いだすことで構成された。ＯＭ－ＰＢＡＥポリマーを、アセトニトリル／クエン酸塩（２５ｍＭ、ｐＨ５．０）（３／２、ｖ／ｖ）における、２．８：１の比率のチオール／ジアクリレートでのチオール－アクリレートマイケル付加反応を介する、ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーのペプチド末端修飾によって得た。精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートおよび２倍濃縮ペプチド溶液を使用して、反応体積を低減させ、アクリレートの変換への反応を促進した。一例として、トリ－アルギニン修飾ＰＢＡＥポリマー（ＰＢＡＥ－ＣＲ３）の合成を挙げる。精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマー（１９９ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１ｍＬ）中に溶解し、ＮＨ２－Ｃｙｓ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－ＣＯＯＨペプチド（配列番号４）の塩酸塩（ＣＲ３―９５％の純度―Ｏｎｔｏｒｅｓから購入）（１６８ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を、ｐＨ５．０の２５ｍＭクエン酸塩緩衝液中に溶解した。ペプチドが完全に溶解した後、４ｍＬのアセトニトリルをペプチド溶液に添加した。続いて、ポリマー溶液をペプチド溶液に添加し、温度制御された恒温水槽において２５℃で２０時間撹拌した。続いて、すべての溶媒を、減圧下、４０℃で蒸発させた。得られたペレットを、１０ｍＬのエタノールを用いて２回抽出した。エタノール抽出物を乾燥させた。乾燥した残部を５ｍＬのエタノール中に再溶解し、２０ｍＬのジエチルエーテル／アセトン（７／３、ｖ／ｖ）中で沈殿させた。続いて、生成物を７．５ｍＬのジエチルエーテル／アセトン（７／３、ｖ／ｖ）を用いて２回洗浄し、その後真空乾燥し、さらなる使用のために－２０℃で保管した（エントリ１８）。あるいは、ペレットを１５ｍＬのエタノールを用いて３回抽出し、エタノール抽出物を混ぜ合わせ、乾燥させた。乾燥した残部に５ｍＬのエタノールを溶解し、その後２０ｍＬのジエチルエーテル／アセトン（７／３、ｖ／ｖ）中で沈殿させた（エントリ１９）。ｉｉ）ペレットを１０ｍＬのエタノールを用いて２回抽出し、エタノール抽出物を混ぜ合わせ、乾燥させた。乾燥した残部に５ｍＬのエタノール／水（４／１、ｖ／ｖ）を溶解し、その後２０ｍＬのジエチルエーテル／アセトン（７／３、ｖ／ｖ）中で沈殿させた（エントリ２０）。または、ｉｉｉ）上記の条件で５ｍＬのエタノール／水（３／２、ｖ／ｖ）を使用した（エントリ２１）。
合成のさらなる開発は、ＣＲＲＲペプチド末端修飾工程の間のアクリレート変換効率を高めること、および完全に変換されたＯＭ－ＰＢＡＥから、結合しなかったＰＢＡＥ－ジアクリレート副生成物を分離する抽出／精製条件を見いだすことで構成された。ＯＭ－ＰＢＡＥポリマーを、アセトニトリル／クエン酸塩（２５ｍＭ、ｐＨ５．０）（３／２、ｖ／ｖ）における、２．８：１の比率のチオール／ジアクリレートでのチオール－アクリレートマイケル付加反応を介する、ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーのペプチド末端修飾によって得た。精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートおよび２倍濃縮ペプチド溶液を使用して、反応体積を低減させ、アクリレートの変換への反応を促進した。一例として、トリ－アルギニン修飾ＰＢＡＥポリマー（ＰＢＡＥ－ＣＲ３）の合成を挙げる。精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマー（１９９ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１ｍＬ）中に溶解し、ＮＨ２－Ｃｙｓ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－ＣＯＯＨペプチド（配列番号４）の塩酸塩（ＣＲ３―９５％の純度―Ｏｎｔｏｒｅｓから購入）（１６８ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を、ｐＨ５．０の２５ｍＭクエン酸塩緩衝液中に溶解した。ペプチドが完全に溶解した後、４ｍＬのアセトニトリルをペプチド溶液に添加した。続いて、ポリマー溶液をペプチド溶液に添加し、温度制御された恒温水槽において２５℃で２０時間撹拌した。続いて、すべての溶媒を、減圧下、４０℃で蒸発させた。得られたペレットを、１０ｍＬのエタノールを用いて２回抽出した。エタノール抽出物を乾燥させた。乾燥した残部を５ｍＬのエタノール中に再溶解し、２０ｍＬのジエチルエーテル／アセトン（７／３、ｖ／ｖ）中で沈殿させた。続いて、生成物を７．５ｍＬのジエチルエーテル／アセトン（７／３、ｖ／ｖ）を用いて２回洗浄し、その後真空乾燥し、さらなる使用のために－２０℃で保管した（エントリ１８）。あるいは、ペレットを１５ｍＬのエタノールを用いて３回抽出し、エタノール抽出物を混ぜ合わせ、乾燥させた。乾燥した残部に５ｍＬのエタノールを溶解し、その後２０ｍＬのジエチルエーテル／アセトン（７／３、ｖ／ｖ）中で沈殿させた（エントリ１９）。ｉｉ）ペレットを１０ｍＬのエタノールを用いて２回抽出し、エタノール抽出物を混ぜ合わせ、乾燥させた。乾燥した残部に５ｍＬのエタノール／水（４／１、ｖ／ｖ）を溶解し、その後２０ｍＬのジエチルエーテル／アセトン（７／３、ｖ／ｖ）中で沈殿させた（エントリ２０）。または、ｉｉｉ）上記の条件で５ｍＬのエタノール／水（３／２、ｖ／ｖ）を使用した（エントリ２１）。
【0065】
１Ｈ－ＮＭＲを使用して、構造を確認し、アセトニトリル／クエン酸塩（２５ｍＭ、ｐＨ５．０）（３／２、ｖ／ｖ）におけるマイケル付加反応の効率を決定した。アクリレート変換率を、残留アクリレートピーク（５．７５～６．５ｐｐｍ）に対するポリマー主鎖上のＣＨ３プロトン（０．８ｐｐｍ）の比率から決定した（図６）。精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートおよび濃縮反応混合物からのペプチド修飾ＰＢＡＥでのアクリレート変換率は、ＰＢＡＥ－ＣＲ３：＞９０％であると決定された。さらに、異なる条件下での、ＰＢＡＥ－ＣＲ３およびＰＢＡＥ－ＣＨ３のＤＭＳＯを含まない合成および精製の概要を表３に示す。２倍濃縮ペプチド溶液の使用によりアクリレート変換率が９０％以上改善された場合、精製工程が多くなるほど、全体的な反応収率は低くなった。
【0066】
【表3-1】
【表3-2】
【0067】
ＯＭ－ＰＢＡＥの、ＤＭＳＯを含まない、１ｇ規模での合成
ＯＭ－ＰＢＡＥの１ｇ規模での合成を、表３、エントリ１８に記載されるように、アセトニトリル／クエン酸塩（２５ｍＭ、ｐＨ５．０）（３／２、ｖ／ｖ）において、精製ＰＢＡＥ－ジアクリレート前駆体ポリマーおよび２倍濃縮ペプチド溶液を使用して実施した。エントリ１８に記載されるプロトコルに加えて、反応媒体中のジスルフィド形成を防ぐために、反応中、不活性窒素（Ｎ２）雰囲気を適用した。一例として、トリ－アルギニン修飾ＰＢＡＥポリマー（ＰＢＡＥ－ＣＲ３）の合成を挙げた。精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマー（１９９９ｍｇ、０．６２４ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２０ｍｌ）中に溶解し、ＮＨ２－Ｃｙｓ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－ＣＯＯＨペプチド（配列番号４）の塩酸塩（ＣＲ３―９７％の純度―Ｏｎｔｏｒｅｓから購入）（１６８４ｍｇ、２．３ｍｍｏｌ）を、クエン酸塩緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ５．０）（２０ｍｌ）中に溶解し、ペプチドを完全に溶解させた後、１０ｍｌのアセトニトリルを添加した。続いて、アセトニトリル中のポリマー溶液を、クエン酸塩（２５ｍＭ、ｐＨ５．０）／アセトニトリル（２／１、ｖ／ｖ）中のペプチド溶液に添加し、２５℃に温度制御された恒温水槽において、Ｎ２雰囲気下にて２０時間撹拌した。続いて、すべての溶媒を、減圧下、４０℃で蒸発させた。得られたペレットを、１００ｍｌのエタノールを用いて２回抽出した。エタノール抽出物を乾燥させた。乾燥した残部を５０ｍＬのエタノール中に再溶解させ、２００ｍｌのジエチルエーテル／アセトン（７／３、ｖ／ｖ）中で沈殿させた。続いて、生成物を７５ｍｌのジエチルエーテル／アセトン（７／３、ｖ／ｖ）を用いて２回洗浄した。残留有機溶媒を真空下で除去し、さらに凍結乾燥によって３７％（ｗｔ％）の収率を有する最終生成物を得て、さらなる使用のために－２０℃で保管した。残りの１ｇの規模でのＰＢＡＥ－ＣＲ３の特性を表４、エントリ２４に示す。
ＯＭ－ＰＢＡＥの１ｇ規模での合成を、表３、エントリ１８に記載されるように、アセトニトリル／クエン酸塩（２５ｍＭ、ｐＨ５．０）（３／２、ｖ／ｖ）において、精製ＰＢＡＥ－ジアクリレート前駆体ポリマーおよび２倍濃縮ペプチド溶液を使用して実施した。エントリ１８に記載されるプロトコルに加えて、反応媒体中のジスルフィド形成を防ぐために、反応中、不活性窒素（Ｎ２）雰囲気を適用した。一例として、トリ－アルギニン修飾ＰＢＡＥポリマー（ＰＢＡＥ－ＣＲ３）の合成を挙げた。精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマー（１９９９ｍｇ、０．６２４ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２０ｍｌ）中に溶解し、ＮＨ２－Ｃｙｓ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－ＣＯＯＨペプチド（配列番号４）の塩酸塩（ＣＲ３―９７％の純度―Ｏｎｔｏｒｅｓから購入）（１６８４ｍｇ、２．３ｍｍｏｌ）を、クエン酸塩緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ５．０）（２０ｍｌ）中に溶解し、ペプチドを完全に溶解させた後、１０ｍｌのアセトニトリルを添加した。続いて、アセトニトリル中のポリマー溶液を、クエン酸塩（２５ｍＭ、ｐＨ５．０）／アセトニトリル（２／１、ｖ／ｖ）中のペプチド溶液に添加し、２５℃に温度制御された恒温水槽において、Ｎ２雰囲気下にて２０時間撹拌した。続いて、すべての溶媒を、減圧下、４０℃で蒸発させた。得られたペレットを、１００ｍｌのエタノールを用いて２回抽出した。エタノール抽出物を乾燥させた。乾燥した残部を５０ｍＬのエタノール中に再溶解させ、２００ｍｌのジエチルエーテル／アセトン（７／３、ｖ／ｖ）中で沈殿させた。続いて、生成物を７５ｍｌのジエチルエーテル／アセトン（７／３、ｖ／ｖ）を用いて２回洗浄した。残留有機溶媒を真空下で除去し、さらに凍結乾燥によって３７％（ｗｔ％）の収率を有する最終生成物を得て、さらなる使用のために－２０℃で保管した。残りの１ｇの規模でのＰＢＡＥ－ＣＲ３の特性を表４、エントリ２４に示す。
【0068】
トリ－ヒスチジン末端修飾ＰＢＡＥポリマー（ＰＢＡＥ－ＣＨ３）に対しては、精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマー（１９９９ｍｇ、０．６２４ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２０ｍｌ）中に溶解し、ＮＨ２－Ｃｙｓ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－ＣＯＯＨペプチドの塩酸塩（ＣＨ３―９８％の純度―Ｏｎｔｏｒｅｓから購入）（１．５３８ｍｇ、２．３ｍｍｏｌ）を、ｐＨ５．０の２５ｍＭクエン酸塩緩衝液２０ｍｌ中に溶解した。ＣＨ３ペプチドが完全に溶解した後、１０ｍＬのアセトニトリルを添加した。続いて、アセトニトリル中のポリマー溶液を、アセトニトリル／クエン酸塩（２５ｍＭ、ｐＨ５．０）（２／１、ｖ／ｖ）中のペプチド溶液に添加し、２５℃に温度制御された恒温水槽において、不活性Ｎ２雰囲気下にて２０時間撹拌した。続いて、すべての溶媒を、減圧下、４０℃で蒸発させた。得られたペレットを、１００ｍｌのエタノールを用いて２回抽出した。エタノール抽出物を乾燥させた。乾燥した残部を５０ｍＬのエタノール中に再溶解させ、２００ｍｌのジエチルエーテル／アセトン（７／３、ｖ／ｖ）中で沈殿させた。続いて、生成物を７５ｍｌのジエチルエーテル／アセトン（７／３、ｖ／ｖ）を用いて２回洗浄した。残留有機溶媒を真空下で除去し、さらに４５．３％（ｗｔ％）の収率を有する最終生成物を得て、さらなる使用のために－２０℃で保管した。残りの１ｇの規模でのＰＢＡＥ－ＣＨ３の特性を表４、エントリ２５に示す。
【0069】
同一手順を使用してトリ－グルタミン酸末端修飾ＰＢＡＥポリマー（ＰＢＡＥ－ＣＥ３）の合成を実施した。すなわち、精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマー（３６６８ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２４ｍｌ）中に溶解し、ＮＨ２－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－ＣＯＯＨペプチド（配列番号１０）の塩酸塩（ＣＥ３―９７％の純度―Ｏｎｔｏｒｅｓから購入）（１５１６ｍｇ、２．７８ｍｍｏｌ）を、ｐＨ５．０の２５ｍＭクエン酸塩緩衝液４８ｍｌ中に溶解した。ペプチドが完全に溶解した後、４８ｍｌのアセトニトリルをペプチド溶液に添加した。続いて、アセトニトリル中のポリマー溶液を、アセトニトリル／クエン酸塩（２５ｍＭ、ｐＨ５．０）（１／１、ｖ／ｖ）中のペプチド溶液に添加し、２５℃に温度制御された恒温水槽において、不活性Ｎ２雰囲気下にて２０時間撹拌した。続いて、すべての溶媒を、減圧下、４０℃で蒸発させた。負に帯電したオリゴペプチドを用いて実施される小規模反応（エントリ１４および１５）と比較して、未反応のペプチドのより良好な除去を達成するために、ＰＢＡＥ－ＣＥ３の精製を変更して、溶離液としてｐＨ７．２の水を使用するＳｅｐｈａｄｅｘ ＰＤ Ｍｉｄｉｔｒａｐ Ｇ－１０サイズ排除カラム上に反応生成物を適用した。続いて、回収したポリマー部分を混合、凍結乾燥し、さらなる使用のために－２０℃で保管した。ＣＥ３－ＰＢＡＥの設計を表５、エントリ２６に示す。
【0070】
【表4】
【0071】
実施例３：ポリマーコーティングしたレンチウイルスベクター製造のためのＯＭ－ＰＢＡＥの使用。
上記の異なるプロトコルによって合成したＯＭ－ＰＢＡＥの機能特性を、細胞形質導入研究にて使用するための、ポリマーコーティングしたレンチウイルスベクターを形成する能力に基づいて評価した。以下の原料および方法を使用して、ポリマーコーティングしたレンチウイルスベクターを調製した。
上記の異なるプロトコルによって合成したＯＭ－ＰＢＡＥの機能特性を、細胞形質導入研究にて使用するための、ポリマーコーティングしたレンチウイルスベクターを形成する能力に基づいて評価した。以下の原料および方法を使用して、ポリマーコーティングしたレンチウイルスベクターを調製した。
【0072】
原料
トランスファーベクタープラスミドは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子を有するｐＡＲＡ－ＣＭＶ－ＧＦＰであった。カナマイシン耐性プラスミドは、プロウイルス（ＨＩＶ－１、ＮＬ４－３株由来の非病原性、非複製性の組換えプロウイルスＤＮＡ）をコードし、その中に発現カセットがクローニングされた。インサートには、導入遺伝子、導入遺伝子発現のためのプロモーター、および導入遺伝子発現を高め、レンチウイルスベクターが、非有糸分裂の細胞を含むすべての細胞種を形質導入できるようにするために追加された配列が含有された。プロモーターは、ヒトユビキチンプロモーターまたはＣＭＶプロモーターであった。これらはいかなるエンハンサー配列も欠いており、高いレベルで遍在的に遺伝子発現を促進した。非コード配列および発現シグナルは、５´ＬＴＲ（Ｕ３－Ｒ－Ｕ５）では全体的なシス活性エレメントを有し、３´ＬＴＲではこのエレメントが削除され、それゆえプロモーター域（ΔＵ３－Ｒ－Ｕ５）を欠いている長い末端反復配列（ＬＴＲ）に相当した。転写および組込み実験のために、カプシド形成配列（ＳＤおよび５´Ｇａｇ）、ベクターの核トランスロケーションのためのセントラルポリプリントラクト／Ｃｅｎｔｒａｌ Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ Ｓｉｔｅ、およびＢＧＨポリアデニル化部位を加えた。
トランスファーベクタープラスミドは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子を有するｐＡＲＡ－ＣＭＶ－ＧＦＰであった。カナマイシン耐性プラスミドは、プロウイルス（ＨＩＶ－１、ＮＬ４－３株由来の非病原性、非複製性の組換えプロウイルスＤＮＡ）をコードし、その中に発現カセットがクローニングされた。インサートには、導入遺伝子、導入遺伝子発現のためのプロモーター、および導入遺伝子発現を高め、レンチウイルスベクターが、非有糸分裂の細胞を含むすべての細胞種を形質導入できるようにするために追加された配列が含有された。プロモーターは、ヒトユビキチンプロモーターまたはＣＭＶプロモーターであった。これらはいかなるエンハンサー配列も欠いており、高いレベルで遍在的に遺伝子発現を促進した。非コード配列および発現シグナルは、５´ＬＴＲ（Ｕ３－Ｒ－Ｕ５）では全体的なシス活性エレメントを有し、３´ＬＴＲではこのエレメントが削除され、それゆえプロモーター域（ΔＵ３－Ｒ－Ｕ５）を欠いている長い末端反復配列（ＬＴＲ）に相当した。転写および組込み実験のために、カプシド形成配列（ＳＤおよび５´Ｇａｇ）、ベクターの核トランスロケーションのためのセントラルポリプリントラクト／Ｃｅｎｔｒａｌ Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ Ｓｉｔｅ、およびＢＧＨポリアデニル化部位を加えた。
【0073】
パッケージングプラスミドは、ｐＡＲＡ－Ｐａｃｋであった。カナマイシン耐性プラスミドは、レンチウイルスプロウイルスのカプシド形成のトランスのために使用される、構造レンチウイルスのタンパク質（ＧＡＧ、ＰＯＬ、ＴＡＴおよびＲｅｖ）をコードした。コード配列は、構造タンパク質（マトリックスＭＡ、カプシドＣＡおよびヌクレオカプシドＮＣ）、酵素タンパク質（プロテアーゼＰＲ、インテグラーゼＩＮおよび逆転写酵素ＲＴ）、ならびに制御タンパク質（ＴＡＴおよびＲｅｖ）をコードする、ポリシストロン性遺伝子であるｇａｇ－ｐｏｌ－ｔａｔ－ｒｅｖに相当した。非コード配列および発現シグナルは、転写開始のためのＣＭＶからの最小プロモーター、転写終結のためのインシュリン遺伝子からのポリアデニル化シグナル、パッケージングＲＮＡの核外移行に関与するＨＩＶ－１ Ｒｅｖ応答配列（ＲＲＥ）に相当した。
【0074】
ＶＳＶ－Ｇ－（「禿（Ｂａｌｄ）」）レンチウイルスベクター粒子の製造
２つの３０００ｍＬエルレンマイヤーフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中、１０００ｍＬのＬＶｍａｘ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において、ＬＶ２９３細胞を５×１０５細胞／ｍＬで播種した。２つのエルレンマイヤーフラスコを、３７℃、６５ｒｐｍで、加湿した８％のＣＯ２の下でインキュベートした。播種の翌日、一過性トランスフェクションを行った。ＰＥＩＰｒｏトランスフェクタント試薬（ＰｏｌｙＰｌｕｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、イルキルシュ、フランス）を、トランスファーベクタープラスミドｐＡＲＡ－ＣＭＶ－ＧＦＰおよびパッケージングプラスミド（ｐＡＲＡ－パック）と混合した。室温でのインキュベーション後、ＰＥＩＰｒｏ／プラスミド混合物を細胞株に滴下し、３７℃、６５ｒｐｍで、加湿した８％のＣＯ２の下でインキュベートした。３日目に、レンチベクターの産生を、５ｍＭの最終濃度の酪酸ナトリウムによって刺激した。バルク混合物を、３７℃、６５ｒｐｍで、加湿した８％のＣＯ２の下で２４時間インキュベートした。５μｍおよび０．５μｍの深層ろ過（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）による清澄化の後、清澄化されたバルク混合物を、ＤＮＡ分解酵素処置のために、室温で１時間インキュベートした。
２つの３０００ｍＬエルレンマイヤーフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中、１０００ｍＬのＬＶｍａｘ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において、ＬＶ２９３細胞を５×１０５細胞／ｍＬで播種した。２つのエルレンマイヤーフラスコを、３７℃、６５ｒｐｍで、加湿した８％のＣＯ２の下でインキュベートした。播種の翌日、一過性トランスフェクションを行った。ＰＥＩＰｒｏトランスフェクタント試薬（ＰｏｌｙＰｌｕｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、イルキルシュ、フランス）を、トランスファーベクタープラスミドｐＡＲＡ－ＣＭＶ－ＧＦＰおよびパッケージングプラスミド（ｐＡＲＡ－パック）と混合した。室温でのインキュベーション後、ＰＥＩＰｒｏ／プラスミド混合物を細胞株に滴下し、３７℃、６５ｒｐｍで、加湿した８％のＣＯ２の下でインキュベートした。３日目に、レンチベクターの産生を、５ｍＭの最終濃度の酪酸ナトリウムによって刺激した。バルク混合物を、３７℃、６５ｒｐｍで、加湿した８％のＣＯ２の下で２４時間インキュベートした。５μｍおよび０．５μｍの深層ろ過（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）による清澄化の後、清澄化されたバルク混合物を、ＤＮＡ分解酵素処置のために、室温で１時間インキュベートした。
【0075】
Ｑ ｍｕｓｔａｎｇメンブレン（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）でのクロマトグラフィーによってレンチベクター精製を実施し、ＮａＣｌグラジエントによって溶出させた。１００ｋＤａのＨＹＤＲＯＳＯＲＴメンブレン（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）でタンジェンシャルフローろ過を実施し、それによって体積を低下させ、ｐＨ７の特定の緩衝液中で製剤化して、少なくとも２年の安定性を確保することが可能となった。０．２２μｍでのろ過滅菌法（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の後、バルク医薬製品を１ｍｌ未満の量で２ｍＬのガラスバイアル中に充填し、続いて標識化し、＜－７０℃で凍結および保管した。
【0076】
禿（ｂａｌｄ）ＬＶ数を、物理的な力価定量化によって評価した。ＨＩＶ－１ ｐ２４コアタンパク質に関連するレンチウイルス（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．）のみの検出および定量化によってアッセイを実施した。試料の前処理によって、破壊されたレンチベクターと遊離ｐ２４との区別が可能となる。物理的力価、粒子分布および粒子寸法を、調節可能抵抗パルスセンサ（ＴＲＰ）技術（ｑＮａｎｏ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｉｚｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、オックスフォード、英国）によって測定した。ＮＰ１５０ナノポア、１１０ｎｍのキャリブレーションビーズおよび４４～４７ｍｍの膜を使用した。ＩＺＯＮ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｕｉｔｅソフトウエアを使用して、結果を決定した。
【0077】
オリゴペプチド修飾ＰＢＡＥを用いた、禿（Ｂａｌｄ）のレンチウイルスベクターのコーティング
禿（ｂａｌｄ）のレンチウイルスベクター（８×１０９レンチウイルス粒子）のコーティングを、レンチウイルスベクター粒子当たり１０９のポリマー分子の比率で、以下の通り実施した。禿（ｂａｌｄ）のレンチウイルスベクターを、ｐＨ５．４の２５ｍＭクエン酸塩緩衝液中に希釈し、複製当たり７５μｌの最終体積で調製した。ＰＢＡＥポリマーを、同一の緩衝液中（複製当たり７５μＬ）に希釈し、均質化のために２秒ボルテックスした。希釈したベクターに希釈したポリマーを１：１の比率（ｖ／ｖ）で添加し、混合物を１０秒間静かにボルテックスし、室温において１０分間インキュベートした。最後に、等容積の培養液（１５０μｌ）をコーティングした粒子に添加し、その後細胞に移した。
禿（ｂａｌｄ）のレンチウイルスベクター（８×１０９レンチウイルス粒子）のコーティングを、レンチウイルスベクター粒子当たり１０９のポリマー分子の比率で、以下の通り実施した。禿（ｂａｌｄ）のレンチウイルスベクターを、ｐＨ５．４の２５ｍＭクエン酸塩緩衝液中に希釈し、複製当たり７５μｌの最終体積で調製した。ＰＢＡＥポリマーを、同一の緩衝液中（複製当たり７５μＬ）に希釈し、均質化のために２秒ボルテックスした。希釈したベクターに希釈したポリマーを１：１の比率（ｖ／ｖ）で添加し、混合物を１０秒間静かにボルテックスし、室温において１０分間インキュベートした。最後に、等容積の培養液（１５０μｌ）をコーティングした粒子に添加し、その後細胞に移した。
【0078】
実施例４：ポリマーコーティングしたレンチウイルスベクターによる、ヒトリンパ球の形質導入。
ＯＭ－ＰＢＡＥは、真核細胞に遺伝物質（プラスミドまたはその他の核酸分子）を送達できるポリマーカプセル化ビークルを形成するトランスフェクション剤として、すでに記載されている（米国特許出願公開第２０１６／０１４５３４８号明細書、Ｍａｎｇｒａｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．２０１５、Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２００４、国際公開第２０１６／１１６８８７号）。ここでは、ＯＭ－ＰＢＡＥを使用して、形質導入欠損レンチウイルスベクターをコーティングし、ヒト細胞がリポーター遺伝子（ＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙ）ならびにキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などの各種の導入遺伝子を安定して発現するように設計した（国際公開第２０１９１４５７９６号）。
ＯＭ－ＰＢＡＥは、真核細胞に遺伝物質（プラスミドまたはその他の核酸分子）を送達できるポリマーカプセル化ビークルを形成するトランスフェクション剤として、すでに記載されている（米国特許出願公開第２０１６／０１４５３４８号明細書、Ｍａｎｇｒａｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．２０１５、Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２００４、国際公開第２０１６／１１６８８７号）。ここでは、ＯＭ－ＰＢＡＥを使用して、形質導入欠損レンチウイルスベクターをコーティングし、ヒト細胞がリポーター遺伝子（ＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙ）ならびにキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などの各種の導入遺伝子を安定して発現するように設計した（国際公開第２０１９１４５７９６号）。
【0079】
異なる合成プロトコルを用いて得られたＯＭ－ＰＢＡＥの特性を比較するために、ポリマーコーティングした、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするレンチウイルスベクターを用いたインビトロのアッセイを実施し、合成および精製プロトコルを変更した際の、ヒトリンパ球の形質導入効率への影響、および細胞生存率への影響を評価した。カプセル化実験に使用されたポリマーは、帯電したペプチドと複合化されたポリ（β－アミノエステル）（ＰＢＡＥ）であった。ポリマーＰＢＡＥ－ＣＲ３は、ペプチドＣＲＲＲ（配列番号４）と複合化されたＰＢＡＥ（両端に同一のペプチド）を意味する。ＰＢＡＥ－ＣＨ３ポリマーは、ペプチドＣＨＨＨ（配列番号１）と複合化されたＰＢＡＥを意味する。これらのＯＭ－ＰＢＡＥの６０／４０ｖ／ｖおよび４０／６０ｖ／ｖの比率での混合物も同様に試験した。
【0080】
調製したての末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、健康なドナー（Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ Ｆｒａｎｃａｉｓ ｄｕ Ｓａｎｇ、Ｄｉｖｉｓｉｏｎ Ｒｈｏｎｅｓ－Ａｌｐｅｓ）から入手したバフィーコートから分離された。血液をＤＰＢＳで希釈した後、ＰＢＭＣをＦＩＣＯＬＬ密度勾配（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で分離し、ＤＰＢＳで２回洗浄し、再懸濁して目的の細胞密度を得て、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を３７℃、５％ＣＯ２で補充した、ＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。インビトロのアッセイはまた、健康なドナーからの凍結ヒトリンパ球調製物（Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ Ｆｒａｎｃａｉｓ ｄｕ Ｓａｎｇ， Ｄｉｖｉｓｉｏｎ Ｒｈｏｎｅｓ－Ａｌｐｅｓ）を用いても実施され、ＰＢＭＣと同一の条件下で培養した。
【0081】
ヒトＰＢＭＣおよびリンパ球調製物を、２４ウエルプレートに、ウエル当たり１０５の細胞密度で、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ培地に播種した。３００μＬのカプセル化されたベクターを細胞に添加した。３７℃、ＣＯ２５％での２時間のインキュベーション後、５００μＬの新鮮な完全培地をそれぞれのウエルに添加した。ＧＦＰを発現する細胞の率を、形質導入の７２時間後に、ＢＬ１チャネルを使用したＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーターを用いて決定した。ＧＦＰ導入遺伝子を発現する、形質導入された細胞の表現型を、製造業者（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の説明書に従って、以下の細胞種、ＣＤ３（Ｔリンパ球）およびＣＤ１９（Ｂリンパ球）に特異的な抗体を用いたフローサイトメトリー染色によって決定した。細胞生存率を、形質導入の７２時間後に、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）によって、前方散乱×側方散乱ゲーティングした個体群における、凝集体および細胞片を除外したシングレットの生細胞をカウントすることによって決定した。すべての条件を、独立して３回試験した。
【0082】
最初に、古典的プロトコルによって合成されたＰＢＡＥ－ＣＨ３およびＰＢＡＥ－ＣＲ３の異なる混合物（エントリ２および３）、またはペプチドカップリングの前に１／１０のＥｔＯＡｃ／ヘプタン沈殿が行われたＰＢＡＥ－ＣＨ３およびＰＢＡＥ－ＣＲ３の異なる混合物（エントリ７および８）の生物的性質への、ＰＢＡＥ－ジアクリレートの精製による影響を研究した。このような実験系では、「禿（ｂａｌｄ）のＬＶ」（ＬＶ）は、ＶＳＶ－Ｇタンパク質を欠いているため形質導入を行うことができないが、それらはＧＦＰ陽性リンパ球をもたらすＯＭ－ＰＢＡＥポリマーによるカプセル化の後、形質導入できるようになる。非形質導入細胞（ＮＴ）を有する別の対照が、実験の間のＧＦＰ発現のバックグラウンドレベル、培地構成成分の自己蛍光および細胞生存率を観察するために含まれる。
【0083】
図８Ａおよび図８Ｂにて示すように、ＰＢＡＥ精製に由来するポリマーと、古典的プロトコルのような未処理のポリマーとの間に、形質導入効率および細胞毒性の差は観察されなかった。ＰＢＡＥ－ジアクリレート精製により、ポリマーコーティングしたレンチウイルスベクターによって形質導入されたリンパ球亜群の分布が変化することはなかった（図８Ｃ～図８Ｊ参照）。凍結ヒトリンパ球から調製した細胞が、調製したてのＰＢＭＣによって置き換えられた場合も、同じ結果が得られた（図９Ａおよび図９Ｂ）。
【0084】
次の工程として、オリゴペプチド末端カップリング反応の間、ＤＭＳＯをアセトニトリル／クエン酸塩によって置き換えたことによる影響を研究し、ここでも未処理の反応生成物が、異なるＰＢＡＥ－ＣＨ３／ＰＢＡＥ－ＣＲ３混合物で試験されたときに、形質導入効率および細胞毒性の差は観察されなかった（図１０Ａおよび図１０Ｂ参照）。プロトコルにカップリング後の精製工程を導入することにより、形質導入効率がわずかに改善された。
【0085】
ＤＭＳＯを含まないオリゴペプチドカップリング反応により、生物系と適合性がある緩衝液中で再懸濁されることができる、残留クエン酸塩を有する凍結乾燥ポリマーが生成される。ＰＢＡＥ系統のポリマーは、ｐＨ７．０の水性緩衝液中で分解することが報告されるように、長期的な安定性の問題がある（Ｌｙｎｎ ｅｔ ａｌ．２０００）。この安定性の問題は、－２０℃でＤＭＳＯ中でＰＢＡＥを保管することによってすでに回避された。したがって、ＤＭＳＯを含まないカップリングによって得られ、カップリング後の精製（エントリ１２および１３）を加え、水中に再懸濁したての、または－２０℃で５週間もしくは１５週間、水中で保管したＰＢＡＥ－ＣＲ３およびＰＢＡＥ－ＣＨ３の６０／４０の比率での機能についての調査を実施し、それらの安定性を、古典的プロトコルによって合成され（エントリ２および３）、－２０℃でＤＭＳＯ中で同じ期間保管されたポリマーと比較した。図１１Ａおよび図１１Ｂに要約された結果は、水中で製剤化されたポリマーは機能的であり、水中での長期間の保管に際してもそれらの形質導入効率が失われていないことを明らかに示している。３種の異なるＰＢＭＣ調製物において、ＤＭＳＯを含まないＯＭ－ＰＢＡＥは、古典的プロトコルによって得られたＯＭ－ＰＢＡＥより、細胞に対する毒性が高くなかった。それにより、水性条件での保管中に分解副生成物が生成されないことが示唆される。
【0086】
次に、ＰＢＡＥ－ジアクリレートの精製、ＤＭＳＯを含まないオリゴペプチドカップリングおよびカップリング後の精製を組み合わせた、新たな合成プロトコルによって得られたＯＭ－ＰＢＡＥの挙動を確認した。ＤＭＳＯを含まないポリマーが、古典的プロトコルによって得られたポリマーと比較して、通常ＰＢＭＣに対して毒性が高いと思われる場合、ＰＢＡＥ－ジアクリレート精製を追加することで、観察される毒性が低下した（図１２Ｂ参照）。一方で、図１２Ａに示すように、形質導入効率は影響を受けなかった。
【0087】
これらの有望な結果に基づいて、ＤＭＳＯを含まないカップリングによって得られ、ＰＢＡＥ－ジアクリレートの精製を加え、カップリング後の精製（エントリ１７および２３）を加え、水中に再懸濁したての、または－２０℃で２週間もしくは１０週間、水中で保管したＰＢＡＥ－ＣＲ３およびＰＢＡＥ－ＣＨ３の６０／４０での比率の安定性を評価し、それを、古典的プロトコル（エントリ２および３）によって合成され、－２０℃でＤＭＳＯ中で保管されたポリマーと比較した。異なる試験時点で、古典的方法を用いて得られたポリマーと、新しく実施された合成を用いて得られたポリマーとの間に、形質導入効率または細胞毒性の差は観察されなかった（図１３Ａおよび１３Ｂ参照）。したがって、－２０℃で水中に保管されるときの、ＤＭＳＯを含まないポリマーの安定性を確認した。
【0088】
最後に、残留遊離アクリレート含有量の、最も難しいＯＭ－ＰＢＡＥであることが分かっている、ＰＢＡＥ－ＣＲ３の生物的性質への影響を、ペプチド末端カップリング効率の観点から評価した。ペプチド末端カップリング反応の最適化によって、９０％を超えるアクリレート変換収率、および古典的方法を用いて得られたポリマーと同等の形質導入効率または細胞毒性を示したポリマーがもたらされた。結合していないＰＢＡＥ－ジアクリレートを除去するための、カップリング後の精製のさらなる改善により、より毒性が低いＰＢＡＥ－ＣＲ３誘導体へ変換されたが、これは形質導入剤としては魅力的ではないようだった（図１４Ａおよび図１４Ｂ参照）。
【0089】
概して、これらの結果により、機能性ＯＭ－ＰＢＡＥは、ＤＭＳＯを含まない条件でより少ない不純物を伴って合成でき、生物系と適合性がある条件で安定して保管されることができるため、ヒト細胞に対して有毒性ではない、遺伝子送達のための新規の物質を提供することが示される。
【0090】
参考文献
Anderson DJ, Peng W, Akinc A, Hossain N, Kohn A Padera R et al., A polymer library approach to suicide gene therapy for cancer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004, 101:16028-33.
Anderson DG, Akinc A, Hossain N. and Langer, R. Structure/property studies of polymeric gene delivery using a library of poly(beta-amino esters). Mol. Ther. 2005, 11, 426.
de Abreu Costa L, Henrique Fernandes Ottoni M, Dos Santos MG, Meireles AB, Gomes de Almeida V et al. Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Decreases Cell Proliferation and TNF-α, IFN-γ, and IL-2 Cytokines Production in Cultures of Peripheral Blood Lymphocytes Molecules. 2017 Nov 10;22(11)
Dosta P, Segovia N, Cascante A, Ramos V, Borros S. Surface charge tunability as a powerful strategy to control electrostatic interaction for high efficiency silencing, using tailored oligopeptide- modified poly(beta-amino ester)s (PBAEs), Acta Biomaterialia. 2015 Jul;20:82-93.
Galvao J, Davis B, Tilley M, Normando E, Duchen MR et al. Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO. FASEB J. 2014, 28:1317-30
Green JJ, Zhou BY, Mitalipova MM, Beard C, Langer R et al., Nanoparticles for Gene Transfer to Human Embryonic Stem Cell Colonies. Nano letters. 2008, 8:3126-3130
Lynn DM and Langer R. Degradable Poly(b-amino esters): Synthesis, Characterization, and
Self-Assembly with Plasmid DNA. JACS 2000, 122: 10761-68.
Lv H, Zhang S, Wang B, Cui S, Yan J. Toxicity of cationic lipids and cationic polymers in gene delivery. J Control Release. 2006, 114:100-9
Mangraviti A, Tzeng SY, Kozielski KL, Wang Y, Jin Y, Gullotti D, et al. Polymeric Nanoparticles for Nonviral Gene Therapy Extend Brain Tumor Survival in Vivo, ACS Nano 2015, 9:1236-1249.
Verheijen M, Lienhard M, Schrooders Y, Clayton O, Nudischer R et al. DMSO induces drastic changes in human cellular processes and epigenetic landscape in vitro. Scientific reports. 2019, 9:4641.
Zugates, GT, Tedford NC, Zumbuehl A, Jhunjhunwala S, Kang CS, et al. Gene delivery properties of end-modified poly(beta-amino ester)s. Bioconjugate Chem. 2007,18 :1887-96
Anderson DJ, Peng W, Akinc A, Hossain N, Kohn A Padera R et al., A polymer library approach to suicide gene therapy for cancer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004, 101:16028-33.
Anderson DG, Akinc A, Hossain N. and Langer, R. Structure/property studies of polymeric gene delivery using a library of poly(beta-amino esters). Mol. Ther. 2005, 11, 426.
de Abreu Costa L, Henrique Fernandes Ottoni M, Dos Santos MG, Meireles AB, Gomes de Almeida V et al. Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Decreases Cell Proliferation and TNF-α, IFN-γ, and IL-2 Cytokines Production in Cultures of Peripheral Blood Lymphocytes Molecules. 2017 Nov 10;22(11)
Dosta P, Segovia N, Cascante A, Ramos V, Borros S. Surface charge tunability as a powerful strategy to control electrostatic interaction for high efficiency silencing, using tailored oligopeptide- modified poly(beta-amino ester)s (PBAEs), Acta Biomaterialia. 2015 Jul;20:82-93.
Galvao J, Davis B, Tilley M, Normando E, Duchen MR et al. Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO. FASEB J. 2014, 28:1317-30
Green JJ, Zhou BY, Mitalipova MM, Beard C, Langer R et al., Nanoparticles for Gene Transfer to Human Embryonic Stem Cell Colonies. Nano letters. 2008, 8:3126-3130
Lynn DM and Langer R. Degradable Poly(b-amino esters): Synthesis, Characterization, and
Self-Assembly with Plasmid DNA. JACS 2000, 122: 10761-68.
Lv H, Zhang S, Wang B, Cui S, Yan J. Toxicity of cationic lipids and cationic polymers in gene delivery. J Control Release. 2006, 114:100-9
Mangraviti A, Tzeng SY, Kozielski KL, Wang Y, Jin Y, Gullotti D, et al. Polymeric Nanoparticles for Nonviral Gene Therapy Extend Brain Tumor Survival in Vivo, ACS Nano 2015, 9:1236-1249.
Verheijen M, Lienhard M, Schrooders Y, Clayton O, Nudischer R et al. DMSO induces drastic changes in human cellular processes and epigenetic landscape in vitro. Scientific reports. 2019, 9:4641.
Zugates, GT, Tedford NC, Zumbuehl A, Jhunjhunwala S, Kang CS, et al. Gene delivery properties of end-modified poly(beta-amino ester)s. Bioconjugate Chem. 2007,18 :1887-96
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図8E】
【図8F】
【図8G】
【図8H】
【図8I】
【図8J】
【図9A】
【図9B】
【図10A】
【図10B】
【図11A】
【図11B】
【図12A】
【図12B】
【図13A】
【図13B】
【図14A】
【図14B】
【配列表】
【国際調査報告】