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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-11-25
(54)【発明の名称】ＪＷＡ遺伝子および関連化合物の老化防止のための使用
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6883 20180101AFI20221117BHJP
A61K 31/454 20060101ALI20221117BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20221117BHJP
A61P 39/06 20060101ALI20221117BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20221117BHJP
A61P 3/06 20060101ALI20221117BHJP
A61P 9/12 20060101ALI20221117BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20221117BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20221117BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20221117BHJP
A61P 19/10 20060101ALI20221117BHJP
A61P 19/08 20060101ALI20221117BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20221117BHJP
A23L 33/10 20160101ALI20221117BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20221117BHJP
G01N 33/68 20060101ALI20221117BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20221117BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20221117BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6883 Z
A61K31/454 ZNA
A61P43/00
A61P39/06
A61P3/10
A61P3/06
A61P9/12
A61P9/10 101
A61P25/28
A61P25/16
A61P19/10
A61P19/08
A61P1/16
A23L33/10
G01N33/50 Z
G01N33/50 P
G01N33/68
G01N33/15 Z
C12N15/12
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021575264
(86)(22)【出願日】2019-07-24
(85)【翻訳文提出日】2021-12-16
(86)【国際出願番号】 CN2019097393
(87)【国際公開番号】W WO2020252845
(87)【国際公開日】2020-12-24
(31)【優先権主張番号】201910540728.6
(32)【優先日】2019-06-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】521550840
【氏名又は名称】シンシア・ファーマシューティカル・カンパニー・リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】ジアンウェイ・ジョウ
(72)【発明者】
【氏名】ション・リ
(72)【発明者】
【氏名】イファン・ウェン
(72)【発明者】
【氏名】イェフェイ・フアン
(72)【発明者】
【氏名】ドンイン・チェン
(72)【発明者】
【氏名】ジンウェン・リウ
(72)【発明者】
【氏名】ジン・シュ
(72)【発明者】
【氏名】アイピン・リ
【テーマコード（参考）】
2G045
4B018
4B063
4C086
【Ｆターム（参考）】
2G045AA40
2G045CB01
4B018MD07
4B018ME10
4B018MF10
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ58
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS34
4B063QX01
4C086AA01
4C086AA02
4C086BC71
4C086GA02
4C086GA08
4C086GA09
4C086GA13
4C086GA14
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA15
4C086ZA16
4C086ZA36
4C086ZA42
4C086ZA45
4C086ZA75
4C086ZA96
4C086ZA97
4C086ZC33
4C086ZC35
4C086ZC41
4C086ZC52
(57)【要約】
ＪＷＡ遺伝子および関連化合物の老化防止のための使用を提供する。ＪＷＡ遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ番号はＡＦ０７０５２３である。ＪＷＡ遺伝子、ＪＷＡ蛋白質は、老化防止、老化関連疾患の治療、酸化防止、生体内安定状態の維持の標的として有用である。式Ｉの化合物は、老化防止、老化関連疾患の治療、酸化防止、生体内安定状態の維持のための製品の製造に用いられる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＧｅｎＢａｎｋ番号がＡＦ０７０５２３であるＪＷＡ遺伝子の使用であって、老化防止製品の製造またはスクリーニング、あるいは老化関連疾患の治療製品の製造またはスクリーニング、あるいは酸化防止製品の製造またはスクリーニング、あるいは生体内安定状態の維持のための製品の製造またはスクリーニング、あるいは老化防止または老化関連疾患の治療または酸化防止または生体内安定状態の維持方法のスクリーニング、あるいは老化または老化関連疾患の診断製品のスクリーニング、あるいはＪＷＡ遺伝子アゴニストのスクリーニングであることを特徴とする、
ＪＷＡ遺伝子の使用。
【請求項2】
ＪＷＡ遺伝子によってコードされる、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２に示す配列を有するＪＷＡ蛋白質の使用であって、老化防止製品の製造またはスクリーニング、あるいは老化関連疾患の治療製品の製造またはスクリーニング、あるいは酸化防止製品の製造またはスクリーニング、あるいは生体内安定状態の維持のための製品の製造またはスクリーニング、あるいは老化防止または老化関連疾患の治療または酸化防止または生体内安定状態の維持方法のスクリーニング、あるいは老化または老化関連疾患の診断製品のスクリーニング、あるいはＪＷＡ蛋白質分解酵素阻害剤のスクリーニングであることを特徴とする、
ＪＷＡ蛋白質の使用。
【請求項3】
式Ｉで表される化合物の使用であって、【化1】
【請求項4】
前記化合物の形態は、化合物または化合物の薬学的に許容される塩であることを特徴とする、請求項３に記載の使用。
【請求項5】
前記薬学的に許容される塩は、塩酸、硫酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、リン酸、臭化水素酸、マレイン酸、フマル酸またはリンゴ酸と化合物とを反応させて得られる塩であることを特徴とする、請求項４に記載の使用。
【請求項6】
前記化合物は、式Ｉの化合物の異性体または同族体であることを特徴とする、請求項３に記載の使用。
【請求項7】
前記製品は、製剤、チップ、試薬、キット、健康食品、医薬または医薬組成物であることを特徴とする、請求項１～６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項8】
前記老化防止は、老化の遅延、寿命の延長、老化関連外観変化の改善を含み、前記生体内安定状態の維持は、生体内の酸化還元安定状態の維持、糖脂質代謝安定状態の維持、内分泌安定状態の維持を含むことを特徴とする、請求項１～６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項9】
前記老化関連疾患は、高血圧、アテローム性動脈硬化症を含む老化関連心血管疾患、パーキンソン病、アルツハイマー病を含む神経変性疾患、骨粗鬆症、骨奇形を含む骨疾患、ＩＩ型糖尿病、非アルコール性脂肪肝を含む慢性代謝性疾患を含むことを特徴とする、請求項１～６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項10】
前記酸化防止は、スーパーオキシドディスムターゼＳＯＤ、カタラーゼＣＡＴ、グルタチオンペルオキシダーゼＧＳＨ－ｐｘを含む生体内酸化防止因子の蓄積増加と、活性酸素ラジカルＲＯＳ、スーパーオキシドアニオンＯ２－、過酸化水素Ｈ２Ｏ２、ヒドロキシラジカルＯＨ－を含む生体内酸化性物質の除去とを含むことを特徴とする、請求項１～６のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＪＷＡ遺伝子の老化防止使用、およびＪＷＡ遺伝子を活性化することができる関連化合物の老化防止使用に関し、老化防止およびその関連疾患の医薬分野に属する。
【背景技術】
【0002】
老衰（ここで加齢や老化とも言う）は、複雑な生物学的過程であり、一般的に生体の生理的完全性が加齢とともに進行性に喪失し、最終的に生体機能の悪化して死亡に向かうことと定義され、不可逆的な現象である。高齢化は、世界的な注目を集めている重要な公衆衛生問題であり、世界的な医療衛生レベルの向上に伴い、人類の期待寿命は絶えず延長しており、世界も急速に高齢化社会に突入している。
【0003】
中国に限って言えば、高齢者は急速に発展しており、今世紀半ばまでに６５歳以上の人口は４億人に達すると予測されている。年齢の増加に伴い、一連の老化関連疾患には、心血管疾患（高血圧、アテローム性動脈硬化症を含む）、神経変性疾患（例えばパーキンソン病、アルツハイマー病）、慢性代謝性疾患（例えばＩＩ型糖尿病、非アルコール性脂肪肝）、悪性腫瘍などの発病率と罹患率も上昇しつつある。そのため、有効な老化防止または老化関連疾患の医薬の探索や研究開発は、ヒトの健康な加齢を確保する重要な保障であり、すでに世界中の各国の政府と関連分野の科学者の広範な注目を集めている。
【0004】
ＪＷＡ遺伝子は、ＡＲＬ６ＩＰ５（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ０７０５２３、１９９８）としても知られており、本発明者である周建偉らにより初めてレチノイン酸誘導のヒト気管支上皮細胞分化モデルから見出され、クローン化され、長期的に焦点を絞って研究された新規な環境応答遺伝子（ストレス応答遺伝子）であり、それがコードする蛋白質は、細胞骨格結合蛋白質である。ＪＷＡは活発な生物学的機能を有し、正常な組織細胞内にＪＷＡ遺伝子の適度な発現が一般的であり、環境の物理化学的要素が細胞に作用すると、ＪＷＡ遺伝子は急速に応答し、発現を増加し、酸化ストレスの抑制、ＤＮＡ損傷の修復などの作用を発揮する（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２００９，３７（６）：１９３６－１９５０；Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ ２００７，４２（１１）：１７０４－１７１４）。
【0005】
本発明者らは、先行研究の中で、ＪＷＡが新しい癌抑制遺伝子であり、複数の下流ノード分子（下流調節因子）を調節することによって、腫瘍細胞の血管新生と転移を抑制し、アポトーシスを促進することができることを発見した。ＪＷＡポリペプチド（ＰＪＰ１）をスクリーニングして得られ、さらにインテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎ）を標的とする特異的ポリペプチド（ＰＪＰ１－ＲＧＤ）を設計することによって、この標的ポリペプチド自体は、細胞や動物に明らかな毒性効果を持たないが、黒色腫や胃癌細胞などの担癌マウスの腫瘍成長をよく抑制でき、黒色腫転移を有効に阻止できることを発見した。同研究成果は、すでに中国で発明の特許が付与されており、その出願番号はＣＮ２０１３１０１７８０９９．Ｘ、授権公告番号はＣＮ１０３２３９７１０Ｂである。
【0006】
その後、本発明者らは、ＪＷＡ遺伝子の研究成果をめぐって、中国で次々と発明の出願番号ＣＮ２０１６１０１６４４９１．２、および出願番号ＣＮ２０１６１０８５７４０９．４として出願してきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】ＣＮ２０１３１０１７８０９９．Ｘ
【特許文献2】ＣＮ２０１６１０１６４４９１．２
【特許文献3】ＣＮ２０１６１０８５７４０９．４
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２００９，３７（６）：１９３６－１９５０
【非特許文献2】Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ ２００７，４２（１１）：１７０４－１７１４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明の主な目的は、従来技術の問題点を克服し、老化防止医薬の標的となるように、ＪＷＡ遺伝子の老化防止のための使用を提案し、さらにＪＷＡ遺伝子を活性化して老化防止作用を発揮することができる関連化合物の老化防止の使用（老化防止使用）を提案することである。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明の課題を解決するための技術的解決手段は以下の実施形態の通りである。
【0011】
ＧｅｎＢａｎｋ番号がＡＦ０７０５２３であるＪＷＡ遺伝子の使用であって、老化防止製品の製造またはスクリーニング、あるいは老化関連疾患の治療製品の製造またはスクリーニング、あるいは酸化防止製品の製造またはスクリーニング、あるいは生体内安定状態の維持のための製品の製造またはスクリーニング、あるいは老化防止または老化関連疾患の治療または酸化防止または生体内安定状態の維持方法のスクリーニング、あるいは老化または老化関連疾患の診断製品のスクリーニング、あるいはＪＷＡ遺伝子アゴニストのスクリーニングであることを特徴とする、ＪＷＡ遺伝子の使用。
【0012】
ＪＷＡ遺伝子によってコードされる、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２に示す配列を有するＪＷＡ蛋白質の使用であって、老化防止製品の製造またはスクリーニング、あるいは老化関連疾患の治療製品の製造またはスクリーニング、あるいは酸化防止製品の製造またはスクリーニング、あるいは生体内安定状態の維持のための製品の製造またはスクリーニング、あるいは老化防止または老化関連疾患の治療または酸化防止または生体内安定状態の維持方法のスクリーニング、あるいは老化または老化関連疾患の診断製品のスクリーニング、あるいはＪＷＡ蛋白質分解酵素阻害剤のスクリーニングであることを特徴とする、ＪＷＡ蛋白質の使用。
【0013】
なお、上記使用には、ＪＷＡ遺伝子の全長遺伝子または遺伝子断片、あるいはＪＷＡ蛋白質の全長蛋白質または蛋白質断片について、各種活性化（例えば転写活性化）や分解低減（例えばＪＷＡ蛋白質を分解する各種酵素の阻害）を行う技術的手段を用いることが含まれていてもよいと留意されたい。
【0014】
下記の式Ｉで表される化合物の使用であって、
老化防止または老化関連疾患の治療または酸化防止または生体内安定状態の維持のための製品の製造であることを特徴とする、式Ｉの化合物の使用。
【化1】
【0015】
前記化合物の形態は、化合物または化合物の薬学的に許容される塩であることが好ましい。前記薬学的に許容される塩は、塩酸、硫酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、リン酸、臭化水素酸、マレイン酸、フマル酸またはリンゴ酸と反応して形成される塩である。
【0016】
好ましくは、前記化合物は、式Ｉの化合物の異性体または同族体である。
【0017】
好ましくは、前記製品は、製剤、チップ、試薬、キット、健康食品、医薬または医薬組成物である。
【0018】
好ましくは、前記老化防止は、老化の遅延、寿命の延長、老化関連外観変化の改善を含み、前記生体内安定状態の維持は、生体内の酸化還元安定状態の維持、糖脂質代謝安定状態の維持、内分泌安定状態の維持を含む。
【0019】
好ましくは、前記老化関連疾患は、老化関連心血管疾患（高血圧、アテローム性動脈硬化症を含む）、神経変性疾患（パーキンソン病、アルツハイマー病を含む）、骨疾患（骨粗鬆症、骨奇形を含む）、慢性代謝性疾患（ＩＩ型糖尿病、非アルコール性脂肪肝を含む）が挙げられる。
【0020】
好ましくは、前記酸化防止は、生体内酸化防止因子の蓄積増加と、生体内酸化性物質の除去とを含む。前記生体内酸化防止因子は、スーパーオキシドディスムターゼＳＯＤ、カタラーゼＣＡＴ、グルタチオンペルオキシダーゼＧＳＨ－ｐｘが挙げられ、前記生体内酸化性物質は、活性酸素ラジカルＲＯＳ、スーパーオキシドアニオンＯ２－、過酸化水素Ｈ２Ｏ２、ヒドロキシラジカルＯＨ－が挙げられる。
【0021】
実際の研究において、本発明者らは、ＪＷＡ遺伝子と老化との間の密接な関連性を初めて発見し、実証した。ＪＷＡ遺伝子は、一新して老化防止、老化関連疾患の治療、酸化防止、生体内安定状態の維持のための新たな標的となることができる。
【0022】
現在、世界中において、生体内ＪＷＡの発現を活性化することによって老化防止作用を発揮する小分子化合物はまだ報告されておらず、ＪＷＡ分子標的に基づき老化防止医薬を開発することは非常に良い応用価値がある。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【図1】本発明に係る実施例１において異なる週齢別のマウス肝臓および脾臓の組織においてＪＷＡ蛋白質の発現レベルを示す図であり、ＧＡＰＤＨはロードコントロールとする内部標準蛋白質である。
【図2】本発明に係る実施例１において異なる週齢別のマウス肝臓および脾臓の組織においてＪＷＡ蛋白質の発現レベルを示す図であり、ＧＡＰＤＨはロードコントロールとする内部標準蛋白質である。
【図3】本発明に係る実施例１において異なる週齢別のマウス肝臓および脾臓の組織においてＪＷＡ蛋白質の発現レベルを示す図であり、ＧＡＰＤＨはロードコントロールとする内部標準蛋白質である。
【図4】本発明に係る実施例２においてＪＷＡ－／－マウスおよび野生型マウスの体重曲線、外観画像および生存曲線を示す図である。
【図5】本発明に係る実施例２においてＪＷＡ－／－マウスおよび野生型マウスの体重曲線、外観画像および生存曲線を示す図である。
【図6】本発明に係る実施例２においてＪＷＡ－／－マウスおよび野生型マウスの体重曲線、外観画像および生存曲線を示す図である。
【図7】本発明に係る実施例３においてＪＷＡ－／－マウスおよび野生型マウスの組織器官老化表現型の画像を示す図である。
【図8】本発明に係る実施例３においてＪＷＡ－／－マウスおよび野生型マウスの組織器官老化表現型の画像を示す図である。
【図9】本発明に係る実施例３においてＪＷＡ－／－マウスおよび野生型マウスの組織器官老化表現型の画像を示す図である。
【図10】本発明に係る実施例３においてＪＷＡ－／－マウスおよび野生型マウスの組織器官老化表現型の画像を示す図である。
【図11】本発明に係る実施例４においてＪＷＡ遺伝子ノックアウトによる誘導の細胞老化に関する表現型の画像を示す図である。
【図12】本発明に係る実施例４においてＪＷＡ遺伝子ノックアウトによる誘導の細胞老化に関する表現型の画像を示す図である。
【図13】本発明に係る実施例４においてＪＷＡ遺伝子ノックアウトによる誘導の細胞老化に関する表現型の画像を示す図である。
【図14】本発明に係る実施例４においてＪＷＡ遺伝子ノックアウトによる誘導の細胞老化に関する表現型の画像を示す図である。
【図15】本発明に係る実施例４においてＪＷＡ遺伝子ノックアウトによる誘導の細胞老化に関する表現型の画像を示す図である。
【図16】本発明に係る実施例４においてＪＷＡ遺伝子ノックアウトによる誘導の細胞老化に関する表現型の画像を示す図である。
【図17】本発明に係る実施例４においてＪＷＡ遺伝子ノックアウトによる誘導の細胞老化に関する表現型の画像を示す図である。
【図18】本発明に係る実施例５においてＪＷＡ遺伝子ノックアウトによる誘導のマウス肝細胞のＤＮＡコピー数変化（コピー数多型）が増加した結果を示す図である。
【図19】本発明に係る実施例５においてＪＷＡ遺伝子ノックアウトによる誘導のマウス肝細胞のＤＮＡコピー数変化（コピー数多型）が増加した結果を示す図である。
【図20】本発明に係る実施例５においてＪＷＡ遺伝子ノックアウトによる誘導のマウス肝細胞のＤＮＡコピー数変化（コピー数多型）が増加した結果を示す図である。
【図21】本発明に係る実施例５においてＪＷＡ遺伝子ノックアウトによる誘導のマウス肝細胞のＤＮＡコピー数変化（コピー数多型）が増加した結果を示す図である。
【図22】本発明に係る実施例６においてＪＷＡ遺伝子ノックアウトよるマウスの基礎代謝低下の結果を示す図である。
【図23】本発明に係る実施例６においてＪＷＡ遺伝子ノックアウトよるマウスの基礎代謝低下の結果を示す図である。
【図24】本発明に係る実施例６においてＪＷＡ遺伝子ノックアウトよるマウスの基礎代謝低下の結果を示す図である。
【図25】本発明に係る実施例６においてＪＷＡ遺伝子ノックアウトよるマウスの基礎代謝低下の結果を示す図である。
【図26】本発明に係る実施例６においてＪＷＡ遺伝子ノックアウトよるマウスの基礎代謝低下の結果を示す図である。
【図27】本発明に係る実施例６においてＪＷＡ遺伝子ノックアウトよるマウスの基礎代謝低下の結果を示す図である。
【図28】本発明に係る実施例６においてＪＷＡ遺伝子ノックアウトよるマウスの基礎代謝低下の結果を示す図である。
【図29】本発明に係る実施例７においてＪＷＡ遺伝子ノックアウトによるマウスの心血管機能変化の結果を示す図である。
【図30】本発明に係る実施例７においてＪＷＡ遺伝子ノックアウトによるマウスの心血管機能変化の結果を示す図である。
【図31】本発明に係る実施例７においてＪＷＡ遺伝子ノックアウトによるマウスの心血管機能変化の結果を示す図である。
【図32】本発明に係る実施例７においてＪＷＡ遺伝子ノックアウトによるマウスの心血管機能変化の結果を示す図である。
【図33】本発明に係る実施例７においてＪＷＡ遺伝子ノックアウトによるマウスの心血管機能変化の結果を示す図である。
【図34】本発明に係る実施例７においてＪＷＡ遺伝子ノックアウトによるマウスの心血管機能変化の結果を示す図である。
【図35】本発明に係る実施例８において既知のＪＷＡ遺伝子の転写開始点の上流２０１２ｂｐのＤＮＡ配列を示す図である。
【図36】本発明に係る実施例８において得られた、ＪＷＡプロモーター配列を含む標的ｐＧＬ３－ＪＷＡ－Ｎｅｏベクターのマップを示す図である。
【図37】本発明に係る実施例１０において、異なる濃度の小分子化合物ＪＡＣ－４でＨＢＥ細胞を処理してＪＷＡ蛋白質の発現の活性化によるのＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ結果を示す図である。ここで、ｔｕｂｕｌｉｎは内部標準蛋白質である。
【図38】本発明に係る実施例１１において特注飼料（カスタム飼料）中の小分子化合物ＪＡＣ－４の含有量の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による検出結果を示す図である。
【図39】本発明に係る実施例１１において特注飼料（カスタム飼料）中の小分子化合物ＪＡＣ－４の含有量の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による検出結果を示す図である。
【図40】本発明に係る実施例１１において特注飼料（カスタム飼料）中の小分子化合物ＪＡＣ－４の含有量の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による検出結果を示す図である。
【図41】本発明に係る実施例１２において、特注飼料（ＪＡＣ－４ １ｇ／ｋｇ含有）と通常飼料を給餌したマウス（１２月齢）の体重曲線を示す図である。
【図42】本発明に係る実施例１２において、特注飼料（ＪＡＣ－４ １ｇ／ｋｇ含有）と通常飼料を給餌したマウス（１２月齢）の体重曲線を示す図である。
【図43】本発明に係る実施例１２において、特注飼料（ＪＡＣ－４ １ｇ／ｋｇ含有）と通常飼料を給餌したマウス（１２月齢）の老化表現型のスコア曲線を示す図である。
【図44】本発明に係る実施例１２において、特注飼料（ＪＡＣ－４ １ｇ／ｋｇ含有）と通常飼料を給餌したマウス（１２月齢）の老化表現型のスコア曲線を示す図である。
【図45】本発明に係る実施例１２において、特注飼料（ＪＡＣ－４ １ｇ／ｋｇ含有）と通常飼料を給餌したマウス（１２月齢）との給餌前後の外観比較を示す図である。
【図46】本発明に係る実施例１３において、特注飼料（ＪＡＣ－４ ２ｇ／ｋｇ含有）を給餌した自然老化マウス（２４月齢）の肝臓および脾臓の組織におけるＪＷＡ蛋白質の発現の活性化によるＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔの結果を示す図である。ここで、ＧＡＰＤＨは内部標準蛋白質である。
【図47】本発明に係る実施例１３において、特注飼料（ＪＡＣ－４ ２ｇ／ｋｇ含有）と通常飼料を給餌した自然老化マウス（２４月齢）の肝臓、脾臓、腎臓のＨＥ染色図を示す図である。ここで、肝臓のＨＥ染色図における矢印は炎症性細胞浸潤を示す。
【図48】本発明に係る実施例１３において、特注飼料（ＪＡＣ－４ ２ｇ／ｋｇ含有）を給餌した自然老化マウス（２４月齢）の血清ブドウ糖とトリグリセリドのレベルの低下結果を示す図である。
【図49】本発明に係る実施例１３において、特注飼料（ＪＡＣ－４ ２ｇ／ｋｇ含有）と通常飼料を給餌した自然老化マウス（２４月齢）の肝臓ＰＡＳ染色を示す図である。矢印はＰＡＳ染色陽性細胞を示し、グリコーゲン蓄積を示唆している。
【図50】本発明に係る実施例１３において、特注飼料（ＪＡＣ－４ ２ｇ／ｋｇ含有）を給餌した自然老化マウス（２４月齢）の肝臓におけるブドウ糖代謝関連律速酵素レベルの調整結果を示す図である。
【図51】本発明に係る実施例１３において、特注飼料（ＪＡＣ－４ ２ｇ／ｋｇ含有）を給餌した自然老化マウス（２４月齢）の肝臓におけるブドウ糖代謝関連ＡＫＴ／ＧＳＫ３βシグナル伝達経路および肝臓組織細胞膜ブドウ糖輸送蛋白質Ｇｌｕｔ ２の調節によるＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔの結果を示す図である。ここで、ＧＡＰＤＨは内部標準蛋白質である。
【図52】本発明に係る実施例１３において、特注飼料（ＪＡＣ－４ ２ｇ／ｋｇ含有）を給餌した自然老化マウス（２４月齢）の血清と肝臓におけるスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）の蓄積の増加結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0024】
以下、添付図面を参照しながら実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。ただし、本発明は上記の例に限定されない。使用方法は、特に断らない限り常法であり、使用する試薬や材料は特に断らない限り市販品である。ＪＷＡ遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ番号はＡＦ０７０５２３であり、ＪＷＡ遺伝子の配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１に示す通りである。ＪＷＡ蛋白質はＪＷＡ遺伝子によってコードされ、ＪＷＡ蛋白質の配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２に示す通りである。
【0025】
実施例１：マウス肝臓、脾臓組織におけるＪＷＡ発現は週齢の増加に伴う低下
本実施例は、週齢別マウス組織におけるＪＷＡの発現レベルを検出し、ＪＷＡ発現が週齢と相関しているかどうかを観察することを目的とする。
本実施例は、週齢別マウス組織におけるＪＷＡの発現レベルを検出し、ＪＷＡ発現が週齢と相関しているかどうかを観察することを目的とする。
【0026】
週齢別（１６週齢、１９週齢、４８週齢、９６週齢を含む）のマウスを安楽死させ、肝臓、脾臓組織を－８０℃で凍結保存した。プロテアーゼ阻害剤を添加した組織溶解液を用いて肝臓と脾臓組織の総蛋白質を抽出し、１２．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で総蛋白質を分離し、蛋白質分子量マーカー（Ｍａｒｋｅｒ）の指示で２０～２５ｋＤａのゲルを切り出し、ゲル上の蛋白質をＰＶＤＦ膜に定電流湿式回転法で移し、マウス抗ＪＷＡ抗体とＨＰＲヤギ抗マウスＩｇＧ抗体ＪＷＡ蛋白質をブロット（インプリント）し、ＨＰＲ基質と化学発光計でＪＷＡ蛋白質の発現レベルを検出した。
【0027】
【0028】
実施例２：ＪＷＡ遺伝子ノックアウトマウスによる体重減少と寿命短縮
本実施例は、Ｃｒｅ－Ｌｏｘｐ系で構築した全体のＪＷＡ遺伝子ノックアウトマウスを観察コホートに組み入れたものであり、コホート中９２７匹のマウスのうち、ホモ接合体（ＪＷＡ－／－）マウス２１５匹、野生型（ＪＷＡ＋／＋）マウス２３６匹、ヘテロ接合体（ＪＷＡ＋／－）マウス４７６匹を長期観察したところ、約９０．７％（１９５／２１５）のホモ接合体マウスと約４．２％（２０／４７６）のヘテロ接合体マウスに明らかな老化表現型が認められた。図４～図６に示すように、生後４週目（初回検査）から、ホモ接合体マウスの体重は野生型マウスよりも有意に低くなり、寿命は野生型マウスよりも有意に低くなり、生存期間の中央値はわずかに５．８月（１．４～１１．８月）であり、野生型マウスの寿命は約２．５年（３０月）であった。
本実施例は、Ｃｒｅ－Ｌｏｘｐ系で構築した全体のＪＷＡ遺伝子ノックアウトマウスを観察コホートに組み入れたものであり、コホート中９２７匹のマウスのうち、ホモ接合体（ＪＷＡ－／－）マウス２１５匹、野生型（ＪＷＡ＋／＋）マウス２３６匹、ヘテロ接合体（ＪＷＡ＋／－）マウス４７６匹を長期観察したところ、約９０．７％（１９５／２１５）のホモ接合体マウスと約４．２％（２０／４７６）のヘテロ接合体マウスに明らかな老化表現型が認められた。図４～図６に示すように、生後４週目（初回検査）から、ホモ接合体マウスの体重は野生型マウスよりも有意に低くなり、寿命は野生型マウスよりも有意に低くなり、生存期間の中央値はわずかに５．８月（１．４～１１．８月）であり、野生型マウスの寿命は約２．５年（３０月）であった。
【0029】
実施例３：ＪＷＡ遺伝子ノックアウト後のマウスの組織器官老化表現型
実施例２で述べたように、ＪＷＡ遺伝子ノックアウトホモ接合体マウスでは、約９０．７％に顕著な体重減少と寿命低下の老化表現型が認められた。生体組織器官は常に退化して老化し、最終的には生体全体の機能が失われ、死に向かっているが、本実施例では、６月齢のＪＷＡ遺伝子ノックアウトホモ接合型マウスおよび野生型マウスに対し、大まかな形態学的観察、組織切片のヘマトキシリン－エオシン（ＨＥ）染色、Ｘ線造影などの方法により、ＪＷＡ遺伝子ノックアウトマウスに明らかな免疫器官萎縮、皮膚萎縮、骨格奇形、小腸粘膜上皮の絨毛と陰窩構造萎縮などの組織器官の老化表現型が認められ、その結果を図７～図１０に示す。
実施例２で述べたように、ＪＷＡ遺伝子ノックアウトホモ接合体マウスでは、約９０．７％に顕著な体重減少と寿命低下の老化表現型が認められた。生体組織器官は常に退化して老化し、最終的には生体全体の機能が失われ、死に向かっているが、本実施例では、６月齢のＪＷＡ遺伝子ノックアウトホモ接合型マウスおよび野生型マウスに対し、大まかな形態学的観察、組織切片のヘマトキシリン－エオシン（ＨＥ）染色、Ｘ線造影などの方法により、ＪＷＡ遺伝子ノックアウトマウスに明らかな免疫器官萎縮、皮膚萎縮、骨格奇形、小腸粘膜上皮の絨毛と陰窩構造萎縮などの組織器官の老化表現型が認められ、その結果を図７～図１０に示す。
【0030】
実施例４：ＪＷＡ遺伝子ノックアウトによる誘導の細胞老化表現型
細胞老化は組織器官の老化の基礎であり、本実施例では、まず６月齢のＪＷＡ－／－マウスおよび野生型マウスの肝臓組織切片を老化指標β－ガラクトシダーゼ（ＳＡ－β－ｇａｌ）で染色し、ＲＴ－ＰＣＲ法により肝臓細胞の相対的テロメアの長さを検出した後、ＪＷＡ－／－マウスおよび野生型マウスの胚線維芽細胞（ＭＥＦｓ）を抽出して体外で培養し、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）処理により細胞老化を誘導し、ＳＡ－β－ｇａｌ染色により老化細胞を示し、細胞分裂周期の構成とアポトーシス細胞の割合をフローサイトメトリーにより検出し、細胞計数により継代過程に伴う細胞倍増比率（ｃｅｌｌ ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｒａｔｅ、細胞倍増率）の変化を計算し、ＲＴ－ＰＣＲ法により細胞継代に伴う老化関連遺伝子ｐ２１の発現変化を検出した。
細胞老化は組織器官の老化の基礎であり、本実施例では、まず６月齢のＪＷＡ－／－マウスおよび野生型マウスの肝臓組織切片を老化指標β－ガラクトシダーゼ（ＳＡ－β－ｇａｌ）で染色し、ＲＴ－ＰＣＲ法により肝臓細胞の相対的テロメアの長さを検出した後、ＪＷＡ－／－マウスおよび野生型マウスの胚線維芽細胞（ＭＥＦｓ）を抽出して体外で培養し、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）処理により細胞老化を誘導し、ＳＡ－β－ｇａｌ染色により老化細胞を示し、細胞分裂周期の構成とアポトーシス細胞の割合をフローサイトメトリーにより検出し、細胞計数により継代過程に伴う細胞倍増比率（ｃｅｌｌ ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｒａｔｅ、細胞倍増率）の変化を計算し、ＲＴ－ＰＣＲ法により細胞継代に伴う老化関連遺伝子ｐ２１の発現変化を検出した。
【0031】
その結果、図１１～図１７に示すように、６月齢のＪＷＡ－／－マウス肝臓切片ＳＡ－β－ｇａｌ染色陽性細胞は野生型マウスよりも有意に多くなり（図１１）、ＪＷＡ－／－マウス肝細胞のテロメアの長さは野生型マウスよりも有意に短くなり（図１２）、ＪＷＡ－／－マウス由来のＭＥＦｓ細胞はＨ２Ｏ２などで刺激された後、ＳＡ－β－ｇａｌ陽性老化細胞は野生型ＭＥＦｓよりも有意に増加しており（図１３）、継代数の増加に伴い、ＪＷＡ－／－マウス由来のＭＥＦｓのうち、ＳＡ－β－ｇａｌ陽性老化細胞は野生型ＭＥＦｓよりも有意に増加しており（図１４）、フローサイトメトリー解析の結果では、ＪＷＡ－／－マウス由来のＭＥＦｓ細胞は分裂期（Ｓ期）の細胞数とアポトーシス細胞数が野生型由来のマウスよりも有意に少なくなり（図１５）、ＪＷＡ－／－ＭＥＦｓ細胞は細胞周期停止状態にあることが示唆され、これは細胞老化の主要なマーカーの一つであるため、継代が増加するにつれ、ＪＷＡ－／－ＭＥＦｓ細胞の倍増速度も野生型よりも有意に低くなり（図１６）、ＲＴ－ＰＣＲの結果では、ＪＷＡ－／－ＭＥＦｓにおける老化関連遺伝子ｐ２１の発現も野生型よりも有意に低くなることが示された（図１７）。
【0032】
実施例５：ＪＷＡ遺伝子ノックアウトマウスの肝臓染色体ＤＮＡコピー数変化の増加
ＤＮＡコピー数変化の増加も老化のマーカーの一つであり、本実施例では、肝臓における染色体ＤＮＡのコピー数変化を検出するために、比較ゲノムハイブリダイゼーションマイクロアレイ分析を用いたが、図１８～図２１に示すように、ＪＷＡ－／－マウスの肝臓におけるＤＮＡのコピー数変化（挿入または欠失）は、野生型マウスよりも有意に多くなった。
ＤＮＡコピー数変化の増加も老化のマーカーの一つであり、本実施例では、肝臓における染色体ＤＮＡのコピー数変化を検出するために、比較ゲノムハイブリダイゼーションマイクロアレイ分析を用いたが、図１８～図２１に示すように、ＪＷＡ－／－マウスの肝臓におけるＤＮＡのコピー数変化（挿入または欠失）は、野生型マウスよりも有意に多くなった。
【0033】
実施例６：ＪＷＡ遺伝子ノックアウトがマウス基礎代謝過程を遅らせること
基礎代謝異常も老化のマーカーの一つであり、本実施例では６月齢のＪＷＡ－／－マウスおよび野生型マウスの代謝過程をＴＳＥ Ｐｈｅｎｏｍａｓｔｅｒ小動物代謝モニタリングシステムでモニタリングした。主なモニタリング指標は毎日の摂食量、毎日の飲水量、酸素吸入速度、二酸化炭素呼出速度、運動速度と熱産生速度などを含む。
基礎代謝異常も老化のマーカーの一つであり、本実施例では６月齢のＪＷＡ－／－マウスおよび野生型マウスの代謝過程をＴＳＥ Ｐｈｅｎｏｍａｓｔｅｒ小動物代謝モニタリングシステムでモニタリングした。主なモニタリング指標は毎日の摂食量、毎日の飲水量、酸素吸入速度、二酸化炭素呼出速度、運動速度と熱産生速度などを含む。
【0034】
その結果、図２２～図２８に示すように、ＪＷＡ－／－マウスの基礎代謝率は、野生型マウスに比べて有意に低くなり、具体的には、毎日の摂食量（図２２）および毎日の飲水量（図２３）の低下、呼吸交換率（図２４）の低下、酸素吸入速度（図２５）および二酸化炭素呼出速度（図２６）の低下、運動速度（図２７）の有意な変化は見られなかったが、ＪＷＡ－／－マウスの熱産生速度（図２８）は、野生型マウスに比べて有意に低くなった。
【0035】
実施例７：ＪＷＡ遺伝子ノックアウトによるマウスの心臓血管機能の変化
老化は慢性心血管疾患の主要な危険因子の一つであり、本実施例はＢＰ－２０００ラット及びマウスの非侵襲血圧モニターにより６月齢のマウスの血圧、脈拍などの指標を検出し、Ｖｅｖｏ２１００小動物の高周波カラー超音波システムによりマウスの心臓機能を検出する。
老化は慢性心血管疾患の主要な危険因子の一つであり、本実施例はＢＰ－２０００ラット及びマウスの非侵襲血圧モニターにより６月齢のマウスの血圧、脈拍などの指標を検出し、Ｖｅｖｏ２１００小動物の高周波カラー超音波システムによりマウスの心臓機能を検出する。
【0036】
その結果、図２９～図３４に示すように、心臓臓器体重比（心臓重量／体重）には有意な変化は見られなかったが（図２９）、ＪＷＡ－／－マウスの左心室重量は、野生型マウス（図３０）よりも有意に低く、ＪＷＡ－／－マウスの収縮期圧（図３１）および脈拍（図３２）の低下をもたらし、左心室駆出率（図３３）および短軸収縮指数（図３４）も代償性に増加した。
【0037】
実施例８：ネオマイシン耐性を持つ環境応答遺伝子のＪＷＡプロモーターレポーター遺伝子プラスミドの構築
本実施例は、ＪＷＡプロモーターを有するレポーターベクタープラスミドを構築し、ＪＷＡ遺伝子の発現を効率的に活性化する化合物の後続のスクリーニングに用いることを目的とする。
本実施例は、ＪＷＡプロモーターを有するレポーターベクタープラスミドを構築し、ＪＷＡ遺伝子の発現を効率的に活性化する化合物の後続のスクリーニングに用いることを目的とする。
【0038】
ヒト由来のＪＷＡプロモーター配列（図３５）から、まずＲＴ－ＰＣＲ法によりＪＷＡ転写開始部位より２０１２ｂｐ上流の断片を増幅し、ＫｐｎＩとＮｈｅＩの２つの制限酵素部位を用いてｐＧＬ３－Ｎｅｏベクターにクローン配列を挿入し、プロモーター配列を含む目的ベクターを得た（図３６）。連結して得られた組換えベクターをＥＣｏｌｉ．（ＤＨ５α）大腸菌に形質転換し、さらに形質転換陽性クローン配列の正確性を配列決定により確認し、ネオマイシン耐性ＪＷＡプロモーターレポータープラスミドの構築に成功し、構築に成功したプラスミドと対応する菌株を－７０℃で保存した。
【0039】
実施例９：ＪＷＡの特異的調節分子のスクリーニング
本実施例は、ＪＷＡプロモーターレポーター遺伝子実験により、化合物ライブラリーからＪＷＡ発現を有意に活性化する化合物をスクリーニングすることを目的とする。
本実施例は、ＪＷＡプロモーターレポーター遺伝子実験により、化合物ライブラリーからＪＷＡ発現を有意に活性化する化合物をスクリーニングすることを目的とする。
【0040】
３８４ウェルプレートを用いて細胞播種を行い、ウェルあたり３０００個の細胞を播種し、壁に付着した後にトランスフェクトした。プラスミドＤＮＡ（０．０４μｇ）とウミシイタケルシフェラーゼｐｈＲＬ－ｔｋ（０．０１μｇ）を４：１の割合で６．２５μＬの無血清無抗生物質のＤＭＥＭをＡ溶液として加え、均一に混合し、室温で５分間インキュベートした。１μＬのｌｉｐｏｆｅ２０００トランスフェクション試薬を６．２５μＬの無血清無抗生物質のＤＭＥＭをＢ溶液として加え、均一に混合し、室温で５ｍｉｎインキュベートした。Ａ溶液とＢ溶液（Ａ＋Ｂ：ＡにＢを加える）を均一に混合し、室温で２０ｍｉｎインキュベートした。３８４ウェルプレートから培養液を吸引し、ＰＢＳで２～３回洗浄し、血清あり抗生物質なしのＤＭＥＭ２５μＬを加えた。インキュベーション時間が終了すると、ＡとＢの混合液を加え、均一に振動し、細胞培養インキュベーターで培養し、２４ｈ後、培養液を廃棄し、完全なＤＭＥＭに置換した。化合物別に一定濃度で細胞を２４ｈ処理した。
【0041】
インキュベーション時間が終了したら、３８４細胞培養プレートを取り出し、１８℃～２２℃の室温まで試薬と細胞を平衡化し、培養液６０μＬ／ウェルを吸引し（残りの培養液は２０μＬ／ウェルにし）、そして等体積（２０μＬ）の検出試薬を加え、室温で暗所で３０分間振盪機上でインキュベートした。Ｐｒｏｍｅｇａ社の二重レポーター遺伝子検出キット（Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ）を用いてルシフェラーゼ活性を検出した。検出装置は、化学発光計（３０１０Ｃ化学発光モニター）であり、すべての実験は厳密に三重反復で平行に操作した（３平行）。
【0042】
蛍光値＞ｘ＋３Ｓを基準にしてＪＷＡ発現を有意に活性化する化合物を選択し、本発明が提供する式Ｉの化合物は良好な用量－効果関係を有し、ＪＡＣ－４と命名し、以下の実施例でさらに検討した。
【化2】
【0043】
実施例１０：ヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥ）におけるＪＷＡ蛋白質の発現レベルに対する小分子化合物ＪＡＣ－４の影響
本実施例は、細胞モデルによってスクリーニング結果の正確性を検証し、ＪＡＣ－４がＪＷＡ蛋白質の発現を確実に向上させる役割を有意にすることを目的とする。
本実施例は、細胞モデルによってスクリーニング結果の正確性を検証し、ＪＡＣ－４がＪＷＡ蛋白質の発現を確実に向上させる役割を有意にすることを目的とする。
【0044】
対数増殖期にあるＨＢＥ細胞を常規消化し、５×１０５／ウェルで６０ｍｍ細胞培養皿に均一に接種し、異なる用量の小分子化合物ＪＡＣ－４で細胞を２４ｈと４８ｈ処理した後、０．１８ｍＬのＲＩＰＡ（０．５％ ＰＭＳＦを含む）細胞溶解液を加えて蛋白を採集し、１２０００×ｇで１５分間遠心分離した後、上清を取って、蛋白濃度を検出し、蛋白質を加熱した。１２．５％濃度のポリアクリルアミドゲルを選択して蛋白質を電気泳動を行い、各ウェルに７０μｇの蛋白質を加え、電気泳動条件は６０Ｖで３０ｍｉｎ、９０Ｖで１～１．５ｈを選択した。電気泳動終了後、半乾燥転写装置で行い、蛋白質をゲルからＰＶＤＦ膜に転写した。転写後、５％スキムミルクは常温で１～２ｈブロックし、ＴＢＳＴ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０含有）で５ｍｉｎずつ３回洗浄し、そして対応する抗体を４℃で一晩インキュベートした。翌日、ＴＢＳ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０含有）で膜を５ｍｉｎずつ３回洗浄し、室温で二次抗体を１～２ｈインキュベートし、ＴＢＳＴ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０含有）で膜を５ｍｉｎずつ８回洗浄した。膜上にＥＣＬ発光液を滴下し、露光した。
【0045】
実験結果は、図３７に示すように、ＪＡＣ－４の濃度が１、１０、１００μｍｏｌ／Ｌでそれぞれ２４ｈおよび４８ｈを処理し、ＨＢＥ細胞におけるＪＷＡの蛋白発現を活性化することができる。
【0046】
実施例１１：小分子化合物ＪＡＣ－４を含む実験動物飼料の特注
化合物ＪＡＣ－４（純度＞９９％）をマウス標準飼料に等量混合し、具体的には、化合物１ｇを飼料基礎原料１ｇに均一に混合し、次いでこの混合物２ｇを飼料基礎原料２ｇに混合し、次いでこの混合物４ｇを飼料基礎原料４ｇに混合するようにして、最終的に小分子化合物ＪＡＣ－４の含有量が１ｇ／ｋｇと２ｇ／ｋｇとの２種類の試験用混合飼料を得た。飼料メーカーの標準的な操作手順に従って顆粒状飼料を調製し、乾燥し、真空包装し、Ｃｏ６０源照射で滅菌し、特注飼料は専門メーカーに生産を委託した。ＪＡＣ－４が設計要求通りに飼料中に均一に分布し、かつ加工中に化合物分子が破壊されていないかどうかを検証するために、滅菌後の製品飼料を無作為にサンプリングし、有機溶媒で十分に抽出した後、高速液体クロマトグラフィーにより飼料中の化合物ＪＡＣ－４の含有量を検出し、分子が破壊されておらずに含有量の要求に達していることを確認した（図３８～図４０）。
化合物ＪＡＣ－４（純度＞９９％）をマウス標準飼料に等量混合し、具体的には、化合物１ｇを飼料基礎原料１ｇに均一に混合し、次いでこの混合物２ｇを飼料基礎原料２ｇに混合し、次いでこの混合物４ｇを飼料基礎原料４ｇに混合するようにして、最終的に小分子化合物ＪＡＣ－４の含有量が１ｇ／ｋｇと２ｇ／ｋｇとの２種類の試験用混合飼料を得た。飼料メーカーの標準的な操作手順に従って顆粒状飼料を調製し、乾燥し、真空包装し、Ｃｏ６０源照射で滅菌し、特注飼料は専門メーカーに生産を委託した。ＪＡＣ－４が設計要求通りに飼料中に均一に分布し、かつ加工中に化合物分子が破壊されていないかどうかを検証するために、滅菌後の製品飼料を無作為にサンプリングし、有機溶媒で十分に抽出した後、高速液体クロマトグラフィーにより飼料中の化合物ＪＡＣ－４の含有量を検出し、分子が破壊されておらずに含有量の要求に達していることを確認した（図３８～図４０）。
【0047】
実施例１２：ＪＡＣ－４含有量１ｇ／ｋｇの特注飼料で１２月齢マウスへの給餌
１２月齢のマウスをＳＰＦ級バリアーシステムで飼育し、環境温度２２±２℃、相対湿度４０％～６０％とし、昼夜周期１２ｈ／１２ｈの交替環境を照明でシミュレートし、無菌酸性化水、通常飼料（ＪＡＣ－４を含まない）または特注飼料（ＪＡＣ－４を含む）を自由に摂取できるようにした。マウスの１匹あたりの平均体重２０ｇ、１日あたりの飼料摂食量が体重の１０％すなわち２ｇとして計算し、マウスの１日あたりのＪＡＣ－４摂食量は約１００ｍｇ／ｋｇ体重であった。給餌開始から２週間ごとに体重を量り、６週目から２週間ごとにマウスの老化外観（老化表現型）をスコアし、スコアが高いほど老化が顕著であることを示し、さらにマウスの外観の変化を比較するためにマウスを毎月に造影した。本実施例に係る動物実験は、実験動物の倫理要件を満たしている。
１２月齢のマウスをＳＰＦ級バリアーシステムで飼育し、環境温度２２±２℃、相対湿度４０％～６０％とし、昼夜周期１２ｈ／１２ｈの交替環境を照明でシミュレートし、無菌酸性化水、通常飼料（ＪＡＣ－４を含まない）または特注飼料（ＪＡＣ－４を含む）を自由に摂取できるようにした。マウスの１匹あたりの平均体重２０ｇ、１日あたりの飼料摂食量が体重の１０％すなわち２ｇとして計算し、マウスの１日あたりのＪＡＣ－４摂食量は約１００ｍｇ／ｋｇ体重であった。給餌開始から２週間ごとに体重を量り、６週目から２週間ごとにマウスの老化外観（老化表現型）をスコアし、スコアが高いほど老化が顕著であることを示し、さらにマウスの外観の変化を比較するためにマウスを毎月に造影した。本実施例に係る動物実験は、実験動物の倫理要件を満たしている。
【0048】
その結果、図４１～図４２に示すように、２２週目には、特注飼料を給餌したマウスの体重は、通常飼料を給餌したマウスよりもやや低かったが、統計学的な差はなかった。図４３～図４４に示すように、特注飼料を給餌したマウスの老化表現型スコアは、通常飼料を給餌したマウスよりも有意に低くなった。図４５に示すように、通常飼料を給餌したマウスでは明らかな脱毛現象が見られた。以上の結果は、ＪＡＣ－４が顕著な老化遅延作用を有することを示唆している。
【0049】
実施例１３：２４月齢の自然老化マウスへの、ＪＡＣ－４含有量２ｇ／ｋｇの特注飼料による給餌
マウス飼育環境は実施例１２と同様であった。マウスの１匹あたりの平均体重２０ｇに対し、１日当たりの飼料摂食量２ｇを摂取し、マウスの１日あたりの小分子化合物ＪＡＣ－４摂食量は約２００ｍｇ／ｋｇ体重であった。給餌１０週間後、マウスを麻酔し、全血を採取して室温で３０ｍｉｎ静置し、３０００ｒｐｍで１５ｍｉｎ遠心分離し、上清血清を分離し、日立７１００全自動生化学分析器を用いて血清生化学分析を行った。マウスの肝臓、脾臓と腎臓の組織を氷上で分離し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、または－８０℃で凍結保存した。パラホルムアルデヒドで固定した組織を厚さ約５μｍのパラフィン切片または凍結切片に作製し、ＨＥ染色により肝臓、脾臓と腎臓の形態学的および病理学的変化を観察した。オイルレッドＯ染色により肝臓中の脂肪沈着を観察した。ＰＡＳ染色により肝臓中のグリコーゲンの蓄積を観察した。－８０℃で肝臓組織を凍結保存して総蛋白質と細胞膜蛋白質をそれぞれに抽出し、脾臓組織から総蛋白質を抽出し、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ実験により、肝臓組織と脾臓組織中のＪＷＡ蛋白質の発現、肝臓組織中のｐ－ＡＫＴ、ＡＫＴ、ｐ－ＧＳＫ３βとＧＳＫ３β蛋白質の発現および肝臓組織細胞膜蛋白質中のブドウ糖輸送体（Ｇｌｕｔ２）の発現を検出した。南京建成公司（Ｎａｎｊｉｎｇ Ｊｉａｎｃｈｅｎｇ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）製造の生化学キットを用いて肝臓組織中のスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、ブドウ糖と脂質代謝の主要な律速酵素のレベルを検出した。本実施例に係る動物実験は、実験動物の倫理要件を満たしている。
マウス飼育環境は実施例１２と同様であった。マウスの１匹あたりの平均体重２０ｇに対し、１日当たりの飼料摂食量２ｇを摂取し、マウスの１日あたりの小分子化合物ＪＡＣ－４摂食量は約２００ｍｇ／ｋｇ体重であった。給餌１０週間後、マウスを麻酔し、全血を採取して室温で３０ｍｉｎ静置し、３０００ｒｐｍで１５ｍｉｎ遠心分離し、上清血清を分離し、日立７１００全自動生化学分析器を用いて血清生化学分析を行った。マウスの肝臓、脾臓と腎臓の組織を氷上で分離し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、または－８０℃で凍結保存した。パラホルムアルデヒドで固定した組織を厚さ約５μｍのパラフィン切片または凍結切片に作製し、ＨＥ染色により肝臓、脾臓と腎臓の形態学的および病理学的変化を観察した。オイルレッドＯ染色により肝臓中の脂肪沈着を観察した。ＰＡＳ染色により肝臓中のグリコーゲンの蓄積を観察した。－８０℃で肝臓組織を凍結保存して総蛋白質と細胞膜蛋白質をそれぞれに抽出し、脾臓組織から総蛋白質を抽出し、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ実験により、肝臓組織と脾臓組織中のＪＷＡ蛋白質の発現、肝臓組織中のｐ－ＡＫＴ、ＡＫＴ、ｐ－ＧＳＫ３βとＧＳＫ３β蛋白質の発現および肝臓組織細胞膜蛋白質中のブドウ糖輸送体（Ｇｌｕｔ２）の発現を検出した。南京建成公司（Ｎａｎｊｉｎｇ Ｊｉａｎｃｈｅｎｇ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）製造の生化学キットを用いて肝臓組織中のスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、ブドウ糖と脂質代謝の主要な律速酵素のレベルを検出した。本実施例に係る動物実験は、実験動物の倫理要件を満たしている。
【0050】
実験結果が、図４６～図５２に示すように、ＪＡＣ－４を含む特注飼料を給餌した後、老化マウスの肝臓と脾臓の組織中のＪＷＡ蛋白質の発現レベルは、有意に上昇した。ＪＡＣ－４はマウス肝臓、腎臓と脾臓の形態学に異常な変化がないだけでなく、肝臓中心静脈周囲の加齢に関連する炎症細胞浸潤を有意に減少させた。ＪＡＣ－４は自然老化マウスの血清ブドウ糖とトリグリセリドのレベルを有意に低下させ、肝臓のグリコーゲン合成を促進した。さらに実験結果により、ＪＡＣ－４は、肝臓中のブドウ糖分解に関連する律速酵素とグリコーゲン合成酵素を増加し、細胞膜ブドウ糖輸送蛋白質（ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）Ｇｌｕｔ ２の発現を増加し、ＡＫＴリン酸化を活性化し、ＧＳＫ３βを抑制してグリコーゲン合成を促進したことを示した。
【0051】
以上の実施例から、化合物ＪＡＣ－４は、ＪＷＡ遺伝子の発現を活性化することにより、老化の遅延、生体内安定状態の維持等の関連する機能的作用を達成することが示された。
【0052】
本発明は、上記実施形態以外にも他の実施形態も可能である。なお、いずれの等価置換または等価変換を採用して構成された技術案は、本発明の特許請求の範囲に属する。
【図1】
【図2】
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【図47】
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【図52】
【配列表】
【国際調査報告】