▶ シグマ−アルドリッチ・カンパニー・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーの特許一覧 ▶ ワシントン・ユニバーシティの特許一覧
特表2022-549519標的化ヌクレアーゼを用いたマイクロバイオータ組成の調節
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-11-25
(54)【発明の名称】標的化ヌクレアーゼを用いたマイクロバイオータ組成の調節
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20221117BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20221117BHJP
C12N 1/20 20060101ALI20221117BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 110
C12N1/21 ZNA
C12N1/20 C
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022520089
(86)(22)【出願日】2020-09-29
(85)【翻訳文提出日】2022-05-25
(86)【国際出願番号】 US2020053304
(87)【国際公開番号】W WO2021067291
(87)【国際公開日】2021-04-08
(31)【優先権主張番号】62/909,078
(32)【優先日】2019-10-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/052,825
(32)【優先日】2020-07-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/908,130
(32)【優先日】2019-09-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】311016949
【氏名又は名称】シグマ－アルドリッチ・カンパニー・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー
【氏名又は名称原語表記】Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ． ＬＬＣ
(71)【出願人】
【識別番号】597025806
【氏名又は名称】ワシントン・ユニバーシティ
【氏名又は名称原語表記】Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(74)【代理人】
【識別番号】100157956
【弁理士】
【氏名又は名称】稲井 史生
(74)【代理人】
【識別番号】100170520
【弁理士】
【氏名又は名称】笹倉 真奈美
(72)【発明者】
【氏名】イーストランド，エリック
(72)【発明者】
【氏名】ジャン，ジーガン
(72)【発明者】
【氏名】デイビス，グレゴリー ディ
(72)【発明者】
【氏名】ベラー，ザッカリー ウォルター
(72)【発明者】
【氏名】ゴードン，ジェフリー アイバン
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA01Y
4B065AB01
4B065AC20
4B065BA01
4B065CA44
(57)【要約】
微生物の複雑な集団をリモデリングするための組成物および方法が、本明細書にて提供される。ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼシステムは、標的原核生物の染色体ＤＮＡの部位を標的とするように設計されており、ここで、標的原核生物のレベルは、原核生物の混合集団において調節され得る。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細菌または古細菌の染色体と関連する人工ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼシステムを含むタンパク質－核酸複合体であって、ここで、該人工ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼシステムが微生物の染色体内のある部位に標的化されており、かつ該微生物の染色体が、配列番号１に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＵファミリーＤＮＡ結合タンパク質をコード化している、タンパク質－核酸複合体。
【請求項2】
人工ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼシステムが、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステム、タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲシステム、タイプＩＩＩ ＣＲＩＳＰＲシステム、タイプＩＶ ＣＲＩＳＰＲシステム、タイプＶ ＣＲＩＳＰＲシステムまたはタイプＶＩ ＣＲＩＳＰＲシステムから選択されるＣＲＩＳＰＲシステムである、請求項１記載のタンパク質－核酸複合体。
【請求項3】
ＣＲＩＳＰＲシステムが、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡを含む、請求項２記載のタンパク質－核酸複合体。
【請求項4】
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３またはＣａｓＸである、請求項３記載のタンパク質－核酸複合体。
【請求項5】
人工ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼシステムが、該人工ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼシステムをコード化する核酸から発現され、かつ細菌染色体または古細菌染色体に組込まれている、請求項１から４のいずれか一項記載のタンパク質－核酸複合体。
【請求項6】
人工ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼシステムが、該人工ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼシステムをコード化する核酸から発現され、かつ染色体外ベクターに担持されている、請求項１から４のいずれか一項記載のタンパク質－核酸複合体。
【請求項7】
原核生物の染色体がバクテロイデス属細菌内に存在する、請求項１から６のいずれか一項記載のタンパク質－核酸複合体。
【請求項8】
バクテロイデス属細菌が、バクテロイデス・シータイオタオミクロン、バクテロイデス・ブルガータス、バクテロイデス・セルロシリティカス、バクテロイデス・フラジリス、バクテロイデス・ヘルコゲネス、バクテロイデス・オヴァタス、バクテロイデス・サラニトロニス、バクテロイデス・ユニフォーミスまたはバクテロイデス・キシラニソルベンから選択される、請求項７記載のタンパク質－核酸複合体。
【請求項9】
原核生物の混合集団において標的原核生物の増殖を遅らせる方法であって、ここで、該方法は、標的原核生物において人工ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼシステムを発現させることを含み、該人工ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼシステムが、標的原核生物の染色体内のある部位に標的化されて、該標的原核生物の染色体内に少なくとも１つの二本鎖切断が導入されることにより該標的原核生物の増殖を遅らせる、方法。
【請求項10】
標的原核生物の増殖を遅らせることが、原核生物の混合集団における標的原核生物レベルの減少または除去をもたらす、請求項９記載の方法。
【請求項11】
ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼシステムの発現が誘導できる、請求項９または１０記載の方法。
【請求項12】
人工ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼシステムが、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステム、タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲシステム、タイプＩＩＩ ＣＲＩＳＰＲシステム、タイプＩＶ ＣＲＩＳＰＲシステム、タイプＶ ＣＲＩＳＰＲシステムまたはタイプＶＩ ＣＲＩＳＰＲシステムから選択されるＣＲＩＳＰＲシステムである、請求項９から１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項13】
ＣＲＩＳＰＲシステムが、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡを含む、請求項１２記載の方法。
【請求項14】
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３またはＣａｓＸヌクレアーゼである、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡが、標的原核生物の染色体に組込まれた少なくとも１つの核酸から発現される、請求項１３記載の方法。
【請求項16】
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡが、染色体外ベクターに担持された少なくとも１つの核酸から発現される、請求項１３記載の方法。
【請求項17】
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする核酸が、誘導性プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１５または１６記載の方法。
【請求項18】
発現させるステップが、原核生物の混合集団をプロモーター誘導化学物質と接触させることを含む、請求項１７記載の方法。
【請求項19】
原核生物の混合集団が細胞培養物中に保持される、請求項９から１８のいずれか一項記載の方法。
【請求項20】
原核生物の混合集団が哺乳動物の消化管内に保持されている、請求項９から１８のいずれか一項記載の方法。
【請求項21】
人工ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼシステムが、人工ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼシステムであり、人工ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼシステムをコードする少なくとも１つの核酸が標的原核生物に導入され、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする核酸が誘導性プロモーターに作動可能に連結され、そして発現ステップがプロモーター誘導化学物質を哺乳動物に投与することを含む、請求項２０記載の方法。
【請求項22】
投与が、プロモーター誘導化学物質を経口投与することを含む、請求項２１記載の方法。
【請求項23】
プロモーター誘導化学物質がアンヒドロテトラサイクリンである、請求項１８、２１または２２のいずれか一項記載の方法。
【請求項24】
哺乳動物がヒトである、請求項２０から２３のいずれか一項記載の方法。
【請求項25】
ヒトが癌の処置を受けており、ヒトの胃腸管内の原核生物混合集団からの標的原核生物の減少または除去が、癌処置に対する該ヒトの応答を改善する、請求項２４記載の方法。
【請求項26】
癌の処置が免疫療法を含む、請求項２５記載の方法。
【請求項27】
標的原核生物がバクテロイデス属である、請求項９から２６のいずれか一項記載の方法。
【請求項28】
バクテロイデス属が、バクテロイデス・シータイオタオミクロン、バクテロイデス・ブルガータス、バクテロイデス・セルロシリティカス、バクテロイデス・フラジリス、バクテロイデス・ヘルコゲネス、バクテロイデス・オヴァタス、バクテロイデス・サラニトロニス、バクテロイデス・ユニフォーミスまたはバクテロイデス・キシラニソルベンから選択される、請求項２７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、２０１９年９月３０日出願の米国仮特許出願第６２／９０８，１３０号、２０１９年１０月１日出願の米国仮特許出願第６２／９０９，０７８号、および２０２０年７月１６日出願の米国仮特許出願第６３／０５２，８２５号に基づく優先権の利益を主張する。これらのそれぞれの内容全体は、引用により本明細書に包含させる。
本出願は、２０１９年９月３０日出願の米国仮特許出願第６２／９０８，１３０号、２０１９年１０月１日出願の米国仮特許出願第６２／９０９，０７８号、および２０２０年７月１６日出願の米国仮特許出願第６３／０５２，８２５号に基づく優先権の利益を主張する。これらのそれぞれの内容全体は、引用により本明細書に包含させる。
【0002】
配列リスト
本出願には、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で送信された配列表が含まれており、引用によりその全体が組込まれる。２０２０年９月２９日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは、Ｐ１９－１７１－_ＷＯ－ＰＣＴ_ＳＬ.ｔｘｔと称し、サイズは５１，６３４バイトである。
本出願には、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で送信された配列表が含まれており、引用によりその全体が組込まれる。２０２０年９月２９日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは、Ｐ１９－１７１－_ＷＯ－ＰＣＴ_ＳＬ.ｔｘｔと称し、サイズは５１，６３４バイトである。
【0003】
技術分野
本発明は、細菌叢（マイクロバイオータ）の組成をリモデリングするための組成物および方法に関する。
本発明は、細菌叢（マイクロバイオータ）の組成をリモデリングするための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【0004】
背景
微生物集団の組成および発現機能を制御することは、医学、バイオテクノロジーおよび環境サイクルの重要な面である。古典的な抗菌戦略はある程度の制御が可能であるが、依然として解決が望まれるのは、近縁の微生物でさえ区別することができ、微生物集団の構成を細かく制御することができる一般的かつプログラム可能な戦略である。最近の進歩は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼシステムが微生物集団の特定のＤＮＡ配列を標的とするように設計できることを示している。同様の戦略を用いて、複数種の細菌集団から特定の種を標的にして除去することは有益である。
微生物集団の組成および発現機能を制御することは、医学、バイオテクノロジーおよび環境サイクルの重要な面である。古典的な抗菌戦略はある程度の制御が可能であるが、依然として解決が望まれるのは、近縁の微生物でさえ区別することができ、微生物集団の構成を細かく制御することができる一般的かつプログラム可能な戦略である。最近の進歩は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼシステムが微生物集団の特定のＤＮＡ配列を標的とするように設計できることを示している。同様の戦略を用いて、複数種の細菌集団から特定の種を標的にして除去することは有益である。
【図面の簡単な説明】
【0005】
この特許または特許出願ファイルには、カラーで作成された図面が少なくとも１つ含まれている。カラー図面を含むこの特許または特許出願の公報のコピーは、要求によりおよび必要な料金の支払いに応じて、米国特許商標庁から提供される。
【0006】
【図1】図１Ａから図１Ｂは、組込まれた誘導性ＣＲＩＳＰＲシステムを用いた標的化マイクロバイオータ調節を示している。ＣＲＩＳＰＲシステム（Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡ）の発現は、細菌の染色体破壊をもたらし、最終的には細胞死を引き起こす。このように、ターゲティングガイドＲＮＡを含む組込み型ＣＲＩＳＰＲカセットを担持する特定のバクテロイデス菌株は、アンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）誘導時にインサイチュウで混合集団から除去され得る。
【図2】図２は、ＣＲＩＳＰＲ組込みベクターの概略図を示す。Ｃａｓ９タンパク質は、アンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）誘導性プロモーターから発現される。シングルガイドＲＮＡ（Ｎ２０－ｓｇＲＮＡスキャフォールド）はＰ１プロモーターから構成的に発現され、ここで、２０ヌクレオチドのプロトスペーサー配列（Ｎ２０）は、ＰＡＭが存在するとき（Streptococcus pyogenes ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の場合はＮＧＧ）、ゲノム内の標的ＤＮＡ切断を明示する。
【図3】図３Ａから図３Ｃは、ヒトの腸由来細菌であるバクテロイデス・シータイオタオミクロン（Bacteroides thetaiotaomicron）（Ｂｔ）におけるＣＲＩＳＰＲシステムの染色体組込みを示す。図３ＡはＮＢＵ２組込みメカニズムを示す。図３Ｂは、コンジュゲーションを介したＢｔへのＣＲＩＳＰＲ組込みを示す。図３Ｃは、ＣＲＩＳＰＲ組込み体のコロニーＰＣＲスクリーニングを示す。ＰＣＲ Ａ：ａｔｔＢＴ２－１遺伝子座、外側プライマー；ＰＣＲ Ｂ：ａｔｔＢＴ２－２遺伝子座、外側プライマー；ＰＣＲ Ｃ：ａｔｔＢＴ２－１遺伝子座、左接合部；ＰＣＲ Ｄ:ａｔｔＢＴ２－２遺伝子座、左接合部。Ｍ１～Ｍ４：非ターゲティング対照ｇＲＮＡを含む４つのＢｔコロニー、；Ｔ１－Ｔ４：ｔｄｋを標的とするｇＲＮＡを含む４つのＢｔコロニー；Ｓ１－Ｓ４：ｓｕｓＣを標的とするｇＲＮＡを含む４つのＢｔコロニー。
【0007】
【図4】図４Ａから図４Ｂは、組込み型ＣＲＩＳＰＲシステムを用いた個々のバクテロイデス菌株の誘導型ＣＲＩＳＰＲ殺滅（killing）を示す。図４Ａは血液寒天プレートでの結果を示す。選択したＣＲＩＳＰＲインテグレート（Ｍ１およびＴ１）について、ＴＹＧ＋Ｇｍ ２００、Ｅｍ ２５のチューブ培養物を希釈し、それぞれ０ｎｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌ濃度のアンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）を添加したＢＨＩ血液寒天プレート（Ｇｍ ２００、Ｅｍ ２５）に拡散させた（２４時間チューブ培養、１０－６希釈、１００μｌスプレッド）。細胞を３７℃にて４０時間嫌気的にインキュベートした。図４Ｂは、ＴＹＧ液体培地での結果を示す。選択されたＣＲＩＳＰＲインテグラント（Ｍ１、Ｍ２、Ｔ１、Ｔ３、Ｓ１、Ｓ２）を、ＴＹＧ培地中の新鮮なコロニーから３７℃にて６時間、ＯＤ６００ｎｍ～０．６まで嫌気的に増殖させ、それぞれ０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌの終濃度でａＴｃを補充した新鮮なＴＹＧ液体培地（Ｇｍ ２００、Ｅｍ ２５）への１ :１００希釈を行った。３７℃にて２４時間、嫌気性条件下での培養中に増殖を評価した。
【図5】図５Ａから図５Ｃは、インビトロでの混合集団における特定のバクテロイデス菌株の標的化された誘導性ＣＲＩＳＰＲ殺滅(killing)を示す。選択されたＣＲＩＳＰＲ組込み体（Ｍ１、Ｔ１、Ｓ１）を、ＴＹＧ培地中の新鮮なコロニーから３７℃にて６時間嫌気的にＯＤ６００ｎｍ～０．６まで増殖させた。等量の細胞培養物（１：１００希釈）を混合し、終濃度がそれぞれ０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌのａＴｃを添加した新鮮なＴＹＧ液体培地（Ｇｍ ２００、Ｅｍ ２５）に添加した。これらの培養物を３７℃にて２４時間嫌気的にインキュベートした。図５Ａ：ＯＤ６００ｎｍ測定。図５Ｂ：ガイドＲＮＡ領域（Ｃａｓ９およびＮＢＵ２をコードする配列に結合するプライマー、１．５ｋｂのアンプリコンサイズ）を増幅するＰＣＲを、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌおよび０ｎｇ／ｍｌの濃度のａＴｃで処理した培養物に対して実施し、次いでサンガーＤＮＡ配列決定を行った。ａＴｃで処理した培養物は、非ターゲティング対照ｇＲＮＡのみを有する。図５Ｃ：Ｍ１＋Ｓ１_ａＴｃ１００の培養物を希釈し（１０－６）、ＢＨＩ血液寒天プレート（Ｇｍ２００、Ｅｍ２５）上に広げ、３７℃にて４０時間、嫌気的に培養し、単一コロニーを得た。選択した５つのシングルコロニーおよび寒天プレートから掻き出した混合物について、ガイドＲＮＡ領域を増幅するコロニーＰＣＲを行い、その後サンガーＤＮＡ配列決定を行い、増殖した全てのクローンが非標的、対照ｇＲＮＡのみを有していることが示された。
【図6】図６は、バクテロイデス・ブルガータス（Bacteroides vulgatus (Bv)）の染色体へのＣＲＩＳＰＲ組込みを示す。各コンジュゲーションからのコロニー、Ｂｖ.Ｍ（ＶＭ１、ＶＭ２、ＶＭ３、ＶＭ４、ＶＭ５、ＶＭ６、ＶＭ７とラベル付け)、およびｓｕｓＣ_Ｂｖ（Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４、Ｖ５とラベル付け）をコロニーＰＣＲスクリーニング用に選択した。０、Ｂｖ野生型株；Ｍ、ＤＮＡラダー。ＰＣＲ Ａ（外側プライマー、０．５ｋｂまたは０ｋｂ）を用いて、ａｔｔＢｖ． ３－１遺伝子座での組込みをスクリーニングした；ＰＣＲ Ｂ（外側プライマー、０．５ｋｂまたは０ｋｂ）を用いて、ａｔｔＢｖ． ３－２遺伝子座での組込みをスクリーニングした；そして、ＰＣＲ Ｃ（外側プライマー、０．６ｋｂまたは０ｋｂ）を用いて、ａｔｔＢｖ． ３－３遺伝子座での組込みをスクリーニングした。ＰＣＲ Ｄ（外側プライマーおよびｅｒｍＧコード配列に結合する内部プライマー、０．６ｋｂまたは０ｋｂ：ａｔｔＢｖ． ３－１遺伝子座組込みの左接合部）を用いて、選択したクローンの組込まれた染色体および組込みプラスミド配列の接合部を確認した。左のパネル：非ターゲティング、対照ガイドＲＮＡ（Ｍ）を含む組込み株；右パネル：ｓｕｓＣ_ＢｖガイドＲＮＡをターゲットとする組込み株。
【0008】
【図7】図７Ａから図７Ｃは、バクテロイデス・シータイオタオミクロン（B. thetaiotaomicron）ＣＲＩＳＰＲ変異体の増殖の特徴を示す。図７Ａ：バクテロイデス・シータイオタオミクロンＶＰＩ－５４８２ＣＲＩＳＰＲ変異体を操作するためのプラスミド設計。図７Ｂ：血液寒天プレート±２００ｎｇ／ｍＬ ａＴｃ上で培養されたスクランブルｇＲＮＡまたはｔｄｋターゲティングｇＲＮＡのいずれかを含むＢｔ変異体。図７Ｃ：９ｎｇ／ｍＬ ａＴｃを含むＬＹＢＨＩ培地中で増殖させたとき、Ｂｔ ＣＲＩＳＰＲ変異体のＯＤ６００＝０．２を達成するために必要な時間の箱ひげ図。
【図8】図８Ａから図８Ｄは、バクテロイデス・シータイオタオミクロンノックダウンを示す。図８Ａ：実験計画。矢印は、コンソーシアムが成体のオスの無菌Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスに強制経口投与された時間を示す。各レシピエントマウスは、ａＴｃが投与されなかった１～８日目に０．５％エタノールビークルを投与された。図８Ｂおよび８Ｃ：各処理条件での経時的なＢｔまたはバクテロイデス・セルロシリティカス（B. cellulosilyticus）の相対存在量およびａＴｃ曝露が水平バーで示される。図８Ｄ：ビークル対照アームに対する４日間の処置アームの各時点（行）での各コンソーシアムメンバー（列）の相対存在量の中央値(％)の差を示すヒートマップ。
【0009】
【図11】図１１Ａから図１１Ｄは、血液寒天プレートの写真である。図１１Ａは、血液ＢＨＩプレート上でのａＴｃ誘導を伴うおよび伴わない（左側にはａＴｃなし、右側には１００ｎｇ／ｍｌのａＴｃ）バクテロイデス・シータイオタオミクロンにおけるｓｕｓＣを標的とするｐＲｅｐＡ－ＣＲＩＳＰＲの１０－４希釈を示す。図１１Ｂは、血液ＢＨＩプレート上でのａＴｃ誘導を伴うおよび伴わない（左側にはａＴＣなし、右側には１００ｎｇ／ｍｌのａＴｃ）バクテロイデス・シータイオタオミクロンにおけるｓｕｓＣを標的とするｐＲｅｐＡ－ＣＲＩＳＰＲの１０－６希釈を示す。図１１Ｃは、血液ＢＨＩプレート上でのａＴｃ誘導を伴うおよび伴わない（左側にはａＴＣなし、右側には１００ｎｇ／ｍｌ ａＴｃ）バクテロイデス・シータイオタオミクロンでのｐＲｅｐＡ－ＣＲＩＳＰＲ非ターゲティングの１０－４希釈を示す。図１１Ｄは、血液ＢＨＩプレート上でのａＴｃ誘導を伴いおよび伴わない（左側にはａＴＣなし、右側には１００ｎｇ／ｍｌ ａＴｃ）バクテロイデス・シータイオタオミクロンでのｐＲｅｐＡ－ＣＲＩＳＰＲ非ターゲティングの１０－６希釈を示す。
【図12】図１２は、組込まれた、誘導性ＣＲＩＳＰＲシステムを用いた標的マイクロバイオータ調節を示す。ＣＲＩＳＰＲシステム（Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡ）の発現は、細菌の染色体破壊および最終的には細胞死を引き起こす。このように、ターゲティングガイドＲＮＡを備えた組込みＣＲＩＳＰＲカセットを担持する特定のバクテロイデス菌株は、アンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）誘導時にインサイチュウで混合集団から排除できる。
【発明を実施するための形態】
【0010】
詳細な説明
本発明は、大量の標的化株の選択的ノックダウンによって複雑な微生物集団を再構築するために用いられる人工ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼシステムを提供する。特に、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼシステムは、標的となる原核生物種の染色体ＤＮＡの部位を標的とするように設計されており、ここで、用語“原核生物”とは、細菌ドメインおよび古細菌ドメインのメンバーを意味する。本明細書に記載の組成物および方法は、エクスビボおよび生動物内で微生物群集組成物を操作するために使用できる。
本発明は、大量の標的化株の選択的ノックダウンによって複雑な微生物集団を再構築するために用いられる人工ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼシステムを提供する。特に、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼシステムは、標的となる原核生物種の染色体ＤＮＡの部位を標的とするように設計されており、ここで、用語“原核生物”とは、細菌ドメインおよび古細菌ドメインのメンバーを意味する。本明細書に記載の組成物および方法は、エクスビボおよび生動物内で微生物群集組成物を操作するために使用できる。
【0011】
（Ｉ）タンパク質－核酸複合体
本発明の一面は、原核生物の染色体に関連する操作された人工ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼシステムを含むタンパク質－核酸複合体を提供し、ここで、該人工ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼシステムは、染色体中のある部位を標的し、該細菌染色体は、配列番号１のアミノ酸配列（ＭＮＫＡＤＬＩＳＡＶＡＡＥＡＧＬＳＫＶＤＡＫＫＡＶＥＡＦＶＳＴＶＴＫＡＬＱＥＧＤＫＶＳＬＩＧＦＧＴＦＳＶＡＥＲＳＡＲＴＧＩＮＰＳＴＫＡＴＩＴＩＰＡＫＫＶＴＫＦＫＰＧＡＥＬＡＤＡＩＫ）と少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＵファミリーＤＮＡ結合タンパク質をコードしており、かつ細菌種の染色体は配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するＨＵファミリーＤＮＡ結合タンパク質と関連している。一般的に、細菌種の染色体ＤＮＡを標的とするＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼシステムは、目的の生物に内因性である天然ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ）システム以外のものである。
本発明の一面は、原核生物の染色体に関連する操作された人工ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼシステムを含むタンパク質－核酸複合体を提供し、ここで、該人工ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼシステムは、染色体中のある部位を標的し、該細菌染色体は、配列番号１のアミノ酸配列（ＭＮＫＡＤＬＩＳＡＶＡＡＥＡＧＬＳＫＶＤＡＫＫＡＶＥＡＦＶＳＴＶＴＫＡＬＱＥＧＤＫＶＳＬＩＧＦＧＴＦＳＶＡＥＲＳＡＲＴＧＩＮＰＳＴＫＡＴＩＴＩＰＡＫＫＶＴＫＦＫＰＧＡＥＬＡＤＡＩＫ）と少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＵファミリーＤＮＡ結合タンパク質をコードしており、かつ細菌種の染色体は配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するＨＵファミリーＤＮＡ結合タンパク質と関連している。一般的に、細菌種の染色体ＤＮＡを標的とするＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼシステムは、目的の生物に内因性である天然ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ）システム以外のものである。
【0012】
ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼシステムは、その切断活性がＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡ）によって指示されるＤＮＡエンドヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ)を含む。原核生物は、原核生物の染色体ＤＮＡと結合するＨＵファミリータンパク質を発現する。したがって、本明細書に記載のタンパク質－核酸複合体は、ＤＮＡ／タンパク質複合体（原核生物染色体ＤＮＡおよび関連するＨＵファミリータンパク質）に結合したリボヌクレオタンパク質複合体（ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ／ｇＲＮＡ）を含む。
【0013】
(a)ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼシステム
本明細書に記載のタンパク質－核酸複合体は、その切断活性がガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）によって指示されるＤＮＡエンドヌクレアーゼを含む、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼシステムを含む。以下に詳述するように、ｇＲＮＡは、目的の核酸（例えば、原核生物の染色体）の特定の配列を認識し、標的とするように操作できる。
本明細書に記載のタンパク質－核酸複合体は、その切断活性がガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）によって指示されるＤＮＡエンドヌクレアーゼを含む、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼシステムを含む。以下に詳述するように、ｇＲＮＡは、目的の核酸（例えば、原核生物の染色体）の特定の配列を認識し、標的とするように操作できる。
【0014】
一般的に、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）ヌクレアーゼである。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは細菌または古細菌であり得る。状況によっては、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、タイプＩ ＣＲＩＳＰＲシステム、タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲシステム、タイプＩＩＩ ＣＲＩＳＰＲシステム、タイプＩＶ ＣＲＩＳＰＲシステム、タイプＶ ＣＲＩＳＰＲシステム、またはタイプＶＩ ＣＲＩＳＰＲシステム由来であり得る。特定の態様において、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、タイプＩＩシステム、タイプＶシステムまたはタイプＶＩシステムなどの単一サブユニットエフェクターシステムに由来し得る。様々な態様において、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、タイプＩＩ Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、タイプＶ Ｃａｓ１２（以前はＣｐｆ１と呼ばれる）ヌクレアーゼ、タイプＶＩ Ｃａｓ１３（以前はＣ２ｃｄと呼ばれる）ヌクレアーゼ、ＣａｓＸヌクレアーゼまたはＣａｓＹヌクレアーゼであり得る。
【0015】
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、アカリオクロリス種、アセトハロビウム種、アシダミノコッカス種、アシディチオバチルス種、アシドテルムス種、アッカーマンシア種、アリシクロバチルス種、アロクロマチウム種、アンモニフェックス種、アナベナ種、アルトロスピラ種、バシラス種、ビフィドバクテリウム種、ブルクデリアレス（Burkholderiales）種、カルディセロシルプトル種、カンピロバクター種、カンディダタス種、クロストリジウム種、コリネバクテリウム種、クロコスファエラ種、シアノテース（Cyanothece）種、デルタプロテオバクテリウム種、エクシグオバクテリウム種、フィネゴルディア種、フランシセラ種、ケドノバクター（Ktedonobacter）種、ラクノスピラチェ（Lachnospiraceae）種、ラクトバチルス種、レプトトリキア（Leptotrichia）種、リングビア種、マリノバクター種、メタノハロビウム種、ミクロシラ種、ミクロコレウス種、ミクロシスティス種、マイコプラズマ種、ナトラネロビウス（Natranaerobius）種、ナイセリア種、ニトラトラクター（Nitratifractor）種、ニトロソコッカス種、ノカルディオプシス種、ノデュラリア種、ノストック種、オエノコッカス種、オシラトリア種、パラシュートテレラ（Parasutterella）種、ペロトマクラム種、ペトロトガ種、プラクトマイセス種、ポラロモナス（polaromonas）種、プレボテラ種、シュードアルテロモナス種、ラルストニア種、ルミノコッカス種、スタフィロコッカス種、ストレプトコッカス種、ストレプトマイセス種、ストレプトスポランジウム種、シネコッカス（Synechococcus）種、サーモシーフォ種、ヴェルコミクロビア（Verrucomicrobia）種、またはウォリネラ（Wolinella）種に由来し得る。
【0016】
ある面において、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９、フランシセラ・ノビシダ（Francisella novicida）Ｃａｓ９、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）Ｃａｓ９、ストレプトコッカス・サーモフィルス Ｃａｓ９、ストレプトコッカス・パスツーリアヌス（Streptococcus pasteurianus）Ｃａｓ９、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）Ｃａｓ９、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）Ｃａｓ９、ナイセリアシネレア（Neisseria cinerea）Ｃａｓ９、フランシセラ・ノビシダＣａｓ１２、酪酸生成菌(Acidaminococcus sp.)Ｃａｓ１２、ラクノスピラ属菌（Lachnospiraceae bacterium）ＮＤ２００６ Ｃａｓ１２ａ、レプトトリキア・ウェイディイ（Leptotrichia wadeii）Ｃａｓ１３ａ、レプトトリキア・シャーイイ（Leptotrichia shahii）Ｃａｓ１３ａ、プレボテラ属菌（Prevotella sp.）Ｐ５－１２５ Ｃａｓ１３、ルミノコッカス・フラベファシエンス（Ruminococcus flavefaciens）Ｃａｓ１３ｄ、デルタプロテオバクテリア（Deltaproteobacterium）ＣａｓＸ、プランクトミケス門（Planctomyces）ＣａｓＸ、またはCandidatus ＣａｓＹであり得る。
【0017】
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、野生型または天然タンパク質であり得る。野生型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、一般的に、２つのヌクレアーゼドメインを含み、例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼはＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインを含み、それぞれが二本鎖配列の一本鎖を切断する。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡ（例えば、ＲＥＣ１、ＲＥＣ２）またはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖（例えば、ＲＥＣ３）と相互作用するドメイン、およびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と相互作用するドメイン（すなわち、ＰＡＭ相互作用ドメイン）もまた含む。
【0018】
あるいは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを変更して、ターゲティング特異性の改善、忠実度の改善、ＰＡＭ特異性の変更、オフターゲット効果の減少、および／または安定性の増加を実現できる。例えば、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、１以上の突然変異（すなわち、少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入）を含むように改変され得る。ターゲティング特異性を改善し、忠実度を改善し、および／またはオフターゲット効果を減少させる１以上の突然変異の限定されない例としては、Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｋ８１０Ａ、Ｋ８４８Ａ、Ｋ８５５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ１０６０Ａ、および／またはＤ１１３５Ｅ（ＳｐｙＣａｓ９の番号付けシステムによる)が挙げられる。
【0019】
様々な態様において、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ヌクレアーゼであり得る（すなわち、二本鎖ヌクレオチド配列の両鎖を切断するか、または一本鎖ヌクレオチド配列を切断する）。他の態様において、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、二本鎖配列の一本鎖を切断するニッカーゼ（nickase）であり得る。ニッカーゼは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのヌクレアーゼドメインの１つを不活性化することで操作できる。たとえば、Ｃａｓ９タンパク質のＲｕｖＣドメインは、Ｄ１０Ａ、Ｄ８Ａ、Ｅ７６２Ａおよび／またはＤ９８６Ａなどの変異によって不活化されるか、あるいはＣａｓ９タンパク質ドメインのＨＮＨは、Ｈ８４０Ａ、Ｈ５５９Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８５６Ａおよび／またはＮ８６３Ａ（化膿レンサ球菌Ｃａｓ９、ＳｐｙＣａｓ９の番号付けシステムを参照）などの変異によって不活化されて、Ｃａｓ９ニッカーゼ（例えば、ｎＣａｓ９）を生成する。他のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの同等の変異は、ニッカーゼ（例えば、ｎＣａｓ１２）を生成し得る。
【0020】
ＣＲＩＳＰＲシステムにはガイドＲＮＡもまた含まれる。ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼおよび目的の核酸の標的配列と相互作用し、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを標的配列に誘導する。標的配列は、その配列がプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に隣接していることを除いて、配列の制限はない。異なるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは異なるＰＡＭ配列を認識する。たとえば、Ｃａｓ９タンパク質のＰＡＭ配列には、５’－ＮＧＧ、５’－ＮＧＧＮＧ、５’－ＮＮＡＧＡＡＷ、５’－ＮＮＮＮＧＡＴＴおよび５－ＮＮＮＮＲＹＡＣが含まれ、Ｃａｓ１２タンパク質のＰＡＭ配列には、５’－ＴＴＮおよび５’－ＴＴＴＶが含まれ、ここで、Ｎは何れかのヌクレオチドと定義され、ＲはＧまたはＡと定義され、ＷはＡまたはＴと定義され、ＹはＣまたはＴと定義され、そしてＶはＡ、ＣまたはＧと定義される。一般的に、Ｃａｓ９ ＰＡＭは標的配列の３’にあり、Ｃａｓ１２ ＰＡＭは標的配列の５’にある。
【0021】
ガイドＲＮＡは、特定のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成するように設計されている。一般的に、ガイドＲＮＡは、（ｉ）標的部位でハイブリダイズする５’末端にガイド配列またはスペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、および（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと相互作用するトランザクションｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列を含む。各ガイドＲＮＡのガイド配列またはスペーサー配列は異なる（すなわち、配列特異的である）。ガイドＲＮＡ配列の残りの部分は、一般的に、特定のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成するように設計されたガイドＲＮＡでも同じである。
【0022】
ｃｒＲＮＡは、５’末端のガイド配列、ならびにｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端の配列と塩基対を形成して二重構造を形成する３’末端の追加配列を含み、該ｔｒａｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰヌクレアーゼと相互作用する少なくとも１つのステムループ構造を形成する。ガイドＲＮＡは、単一分子（例えば、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）または１ピースｓｇＲＮＡ）であり、ここで、ｃｒＲＮＡ配列がｔｒａｃｒＲＮＡ配列に連結されている。あるいは、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む２つの別個の分子（例えば、２ピースｇＲＮＡ）であり得る。
【0023】
ｃｒＲＮＡガイド配列は、目的の核酸中の標的配列（すなわち、プロトスペーサー）の補体とハイブリダイズするように設計されている。一般的に、ガイド配列および標的配列の間の相補性は、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％である。特定の態様において、相補性は完全（すなわち、１００％）である。様々な態様において、ｃｒＲＮＡガイド配列の長さは、約１５ヌクレオチドから約２５ヌクレオチドの範囲であり得る。例えば、ｃｒＲＮＡガイド配列は、約１５ヌクレオチド長、１６ヌクレオチド長、１７ヌクレオチド長、１８ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、２１ヌクレオチド長、２２ヌクレオチド長、２３ヌクレオチド長、２４ヌクレオチド長または２５ヌクレオチド長であり得る。特定の態様において、ガイドは、約１９ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長または２１ヌクレオチド長である。一態様において、ｃｒＲＮＡガイド配列は、２０ヌクレオチド長を有する。特定の態様において、ｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡと相互作用する追加の３’配列を含み得る。追加の配列は、約１０から約４０ヌクレオチドを含み得る。ガイドＲＮＡが単一分子を含む態様において、ｇＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分およびｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、ループを形成する配列によって連結され得る。ループを形成する配列は、長さが約４ヌクレオチド長から約１０ヌクレオチド長またはそれ以上の範囲であり得る。
【0024】
上記のように、ｔｒａｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと相互作用する少なくとも１つのステムループ構造を形成するリピート配列を含む。各ループおよびステムの長さはさまざまである。例えば、ループは長さが約３から約１０ヌクレオチドの範囲であってよく、ステムは長さが約６から約２０塩基対の範囲であり得る。ステムは、１から約１０ヌクレオチドの１以上のバルジ(bulges)を含むことができる。ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、一般的に、野生型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと相互作用する野生型ｔｒａｃｒＲＮＡの配列に基づいている。野生型配列は、二次構造の形成、二次構造の安定性の向上などを促進するように改変できる。例えば、１以上のヌクレオチド変化をガイドＲＮＡ配列に導入できる。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、長さが約５０ヌクレオチド長から約３００ヌクレオチド長の範囲であり得る。様々な態様において、ｔｒａｃｒＲＮＡは、長さが約５０から約９０ヌクレオチド長、約９０から約１１０ヌクレオチド長、約１１０から約１３０ヌクレオチド長、約１３０から約１５０ヌクレオチド長、約１５０から約１７０ヌクレオチド長、約１７０から約２００ヌクレオチド長、約２００から約２５０ヌクレオチド長、または約２５０から約３００ヌクレオチド長の範囲であり得る。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡの３’末端に任意の延長を含んでいてよい。
【0025】
ガイドＲＮＡは、標準的なリボヌクレオチドおよび／または修飾されたリボヌクレオチドを含み得る。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、標準的または改変されたデオキシリボヌクレオチドを含み得る。ガイドＲＮＡが酵素的に（すなわち、インビボまたはインビトロで）合成される態様において、ガイドＲＮＡは、一般的に、標準的なリボヌクレオチドを含む。ガイドＲＮＡが化学的に合成される態様において、ガイドＲＮＡは、標準的にまたは改変されたリボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドを含み得る。修飾リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドには、塩基修飾(例えば、シュードウリジン、２－チオウリジン、Ｎ６－メチルアデノシンなど）および／または糖修飾（例えば、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、２’－アミノ、ロックド核酸（ＬＮＡ）など）が含まれる。ガイドＲＮＡの骨格は、ホスホロチオエート結合、ボラノホスフェート結合またはペプチド核酸を含むように修飾することもできる。
【0026】
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼシステムのガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼシステムを原核生物の染色体ＤＮＡの特定の部位に向けるように設計されているため、上記のようにタンパク質－核酸複合体を形成できる。一般的に、タンパク質－核酸複合体は原核生物内で形成される。
【0027】
いくつかの態様において、人工ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼシステムは、原核生物の染色体に組込まれ、そしてそこから発現され得る。他の態様において、人工ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼシステムは、染色体外ベクターを担持し発現させることができる。人工ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼシステムの発現を調節できる。たとえば、人工ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼシステムの発現は、誘導性プロモーターによって調節できる。
【0028】
（ｂ）原核生物染色体
本明細書に記載のタンパク質－核酸複合体は、原核染色体をさらに含み、ここで、原核染色体は、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＵファミリーＤＮＡ結合タンパク質をコードし、原核生物の染色体ＤＮＡは、上記のＨＵファミリーＤＮＡ結合タンパク質と関連している。ＤＮＡ結合タンパク質のＨＵファミリーは、配列特異性なしに二本鎖ＤＮＡに結合し、フォーク（fork）、３／４ウェイジャンクション、ニック、オーバーハングおよびバルジなどのＤＮＡ構造に結合する小さな（約９０アミノ酸の）塩基性ヒストン様タンパク質を含む。ＨＵファミリーのＤＮＡ結合タンパク質の結合は、ＤＮＡを安定させ、極端な環境条件下での変性から保護できる。
本明細書に記載のタンパク質－核酸複合体は、原核染色体をさらに含み、ここで、原核染色体は、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＵファミリーＤＮＡ結合タンパク質をコードし、原核生物の染色体ＤＮＡは、上記のＨＵファミリーＤＮＡ結合タンパク質と関連している。ＤＮＡ結合タンパク質のＨＵファミリーは、配列特異性なしに二本鎖ＤＮＡに結合し、フォーク（fork）、３／４ウェイジャンクション、ニック、オーバーハングおよびバルジなどのＤＮＡ構造に結合する小さな（約９０アミノ酸の）塩基性ヒストン様タンパク質を含む。ＨＵファミリーのＤＮＡ結合タンパク質の結合は、ＤＮＡを安定させ、極端な環境条件下での変性から保護できる。
【0029】
染色体は、ドメイン細菌またはドメイン古細菌のメンバー内にあり得る。ある態様において、生物は、細菌種またはその種の異なる株である。ある態様において、ＨＵファミリーＤＮＡ結合タンパク質は、配列番号１に対して少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0030】
特定の態様において、原核生物はバクテロイデス属のメンバーである。バクテロイデス属は、哺乳動物の腸内細菌叢の顕著な嫌気性シンビオントである。それらは様々な糖分解酵素を含み、腸内の多糖類の主要な発酵槽である。それらは、腸内に保持されているとき、宿主との複雑で一般的に有益な関係を維持するが、この環境から逃れると重大な病状を引き起こす可能性がある。バクテロイデス属の限定されない例としては、Ｂ. アシディファシエンス、Ｂ. バクテリウム、Ｂ. バルニシアエス、Ｂ. カッキー、Ｂ. ケーシコラ、B. ケーシガリナラム、Ｂ. キャピローシス、Ｂ. セルロシリティカス、Ｂ. セルロソルベン、Ｂ. クラルス、Ｂ. コアグランス、Ｂ. コプロコラ、Ｂ. コプロスイ（coprosuis）、Ｂ. ジスタゾニス、Ｂ. ドレイ、Ｂ. エガーシイ、Ｂ. グラスィリス（gracilis）、Ｂ. フェシキンチラエ、Ｂ. フェシス（faecis）、Ｂ. ファインゴールジ（finegoldii）、Ｂ. フルクサス、Ｂ. フラジリス、Ｂ. ガラクツロニクス（galacturonicus）、Ｂ. ガリナセウム、Ｂ．ガリナラム、Ｂ．ゴルドステイニイ（goldsteinii）、Ｂ．グラミニソルベンス（graminisolvens）、Ｂ．ヘルコジーン（helcogene）、Ｂ．ヘパリノリティカ（heparinolyticus）、Ｂ．インテスティナリス（intestinalis）、Ｂ．ジョンソニー（johnsonii）、Ｂ．ルーティ（luti）、Ｂ．マシリエンシス（massiliensis）、Ｂ．メラニノゲニカス、Ｂ．ネオナチ（neonati）、Ｂ．ノルディ（nordii）、Ｂ．オレイシプレヌス、Ｂ．オリス、Ｂ．オバツス、Ｂ．パウロサッカロリティカス（paurosaccharolyticus）、Ｂ．プレビウス（plebeius）、Ｂ．ポリプラグマチス（polypragmatus）、Ｂ．プロピオニシファシエンス、Ｂ．プトレディネス、Ｂ．ピオゲネス、Ｂ．レチカロテルミチス（reticulotermitis）、Ｂ．ロデンチウム（rodentium）、Ｂ．サラニトロニス、Ｂ．セイリヤーシアエ（salyersiae）、Ｂ．サートーリアイ、Ｂ．セディメント（sediment）、Ｂ．ステラコリス（stercoris）、Ｂ．スターコリロソリス（stercorirosoris）、Ｂ．スイ（suis）、Ｂ．テクタス（tectus）、バクテロイデス・シータイオタオミクロン、Ｂ．チモネンシス（timonensis）、Ｂ．ユニフォルミス、バクテロイデス・ブルガータス（B. vulgatus）、Ｂ．キシラニソルベンス（xylanisolvens）、Ｂ．キシラノリティカス（xylanolyticus）、およびＢ．ズウグレオフォルマンスが挙げられる。
【0031】
ある態様において、原核生物の染色体は、バクテロイデス・シータイオタオミクロン、バクテロイデス・バルガタス、バクテロイデス・セルロシリティカス、バクテロイデス・フラジリス、バクテロイデス・ヘルコゲネス、バクテロイデス・オバタス、バクテロイデス・サラナイトロニス、バクテロイデス ユニフォーミス、またはバクテロイデスキシランソルベンスから選択される。
【0032】
ある態様において、染色体は、バルネシエラ種、バルネシエラ・ビスセリコラ（Barnesiella viscericola）、カプノサイトファーガ種、オドリバクター・スプランクニカス（Odoribacter splanchnicus）、パルジバクター種（Paludibacter sp.）、パラバクテロイデス種、ポルフィロモナダ菌種、およびシュライフェリア種（Schleiferia sp）から選択される。
【0033】
（ｃ) 特定のタンパク質－核酸複合体
特定の態様において、タンパク質－核酸複合体は、バクテロイデス属の染色体と結合するか、またはそれと結合する人工ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９／ｇＲＮＡシステムまたは人工ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１２／ｇＲＮＡシステムを含み得る。
特定の態様において、タンパク質－核酸複合体は、バクテロイデス属の染色体と結合するか、またはそれと結合する人工ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９／ｇＲＮＡシステムまたは人工ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１２／ｇＲＮＡシステムを含み得る。
【0034】
（ＩＩ）タンパク質－核酸複合体を作製する方法
本発明のさらなる面は、人工ＲＮＡ誘導型（ＣＲＩＳＰＲ）ヌクレアーゼシステムおよび上記のようなＨＵファミリーＤＮＡ結合タンパク質をコードする原核生物染色体を含む複合体を生成するための方法を提供する。前記方法は、（ａ）原核生物染色体中の部位を標的とするようにＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼシステムを操作すること、および（ｂ）人工ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼシステムを原核生物に導入することを含む。
本発明のさらなる面は、人工ＲＮＡ誘導型（ＣＲＩＳＰＲ）ヌクレアーゼシステムおよび上記のようなＨＵファミリーＤＮＡ結合タンパク質をコードする原核生物染色体を含む複合体を生成するための方法を提供する。前記方法は、（ａ）原核生物染色体中の部位を標的とするようにＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼシステムを操作すること、および（ｂ）人工ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼシステムを原核生物に導入することを含む。
【0035】
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼシステムのエンジニアリングには、ｃｒＲＮＡガイド配列がＰＡＭ配列（目的のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼによって認識される）に隣接する原核生物染色体の特定の(～１９－２２ｎｔ）配列を標的とし、かつｔｒａｃｒＲＮＡ配列が、上記のセクション（Ｉ）（ａ）に記載のように、目的のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼによって認識される、ガイドＲＮＡの設計が含まれる。人工ＣＲＩＳＰＲシステムは、コード化核酸として原核生物に導入され得る。例えば、コード化核酸はベクターの一部であり得る。様々なベクターを送達または導入するための手段は、当技術分野でよく知られている。
【0036】
人工ＣＲＩＳＰＲシステムをコードするベクター（すなわち、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡ）は、プラスミドベクター、ファージミドベクター、ウイルスベクター、バクテリオファージベクター、バクテリオファージ－プラスミドハイブリッドベクター、または他の適切なベクターであり得る。ベクターは、組込みベクター、コンジュゲーションベクター、シャトルベクター、発現ベクター、染色体外ベクターなどであり得る。
【0037】
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする核酸配列は、原核生物での発現のためにプロモーターに作動可能に連結できる。特定の態様において、人工ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに作動可能に連結されたプロモーターは、調節されたプロモーターであり得る。ある面において、調節されたプロモーターは、化学物質を誘導するプロモーターによって調節され得る。そのような態様において、プロモーターは、大腸菌Ｔｎ１０由来のｔｅｔ調節システムに基づき、強力なｔｅｔオペレーター（ｔｅｔＯ）を含むマイコバクテリアプロモーターおよびリプレッサー（ＴｅｔＲ）の発現カセットからなるｐＴｅｔＯであってよく、プロモーター誘導性化学物質はアンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）であり得る。他の態様において、プロモーターは、ｐＢＡＤまたはａｒａＣ－ＰａｒａＢＡＤであってよく、そしてプロモーター誘導化学物質は、アラビノースであり得る。さらなる態様において、プロモーターは、ｐＬａｃまたはｔａｃ（ｔｒｐ－ｌａｃ）であってよく、そしてプロモーター誘導化学物質は、ラクトース／ＩＰＴＧであり得る。他の態様において、プロモーターはｐＰｒｐＢであってよく、そしてプロモーター誘導化学物質はプロピオネートであり得る。
【0038】
少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードする核酸配列は、目的の原核生物における発現のためにプロモーターに作動可能に連結され得る。目的の原核生物がバクテロイデスである態様において、構成的プロモーターは、バクテロイデス・シータイオタオミクロン １６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子 ＢＴ_ｒ０９の上流に位置するＰ１プロモーターであり得る（Wegmann et al., Applied Environ. Microbiol., 2013, 79:1980-1989）。他の適切なバクテロイデスプロモーターとしては、Ｐ２、Ｐ１ＴＤ、Ｐ１ＴＰ、Ｐ１ＴＤＰ（Lim et al., Cell, 2017, 169:547-558)、ＰＡＭ、ＰｃｆｉＡ、ＰｃｅｐＡ、ＰＢＴ１３１１（Mimee et al., Cell Systems, 2015, 1:62-71）または上記のプロモーターのいずれかの変異体が挙げられる。他の態様において、構成的プロモーターは、大腸菌σ７０プロモーターまたはその誘導体、バチルス・サブティリス（B. subtilis）σＡプロモーターまたはその誘導体、あるいはサルモネラＰｐｐｖ２プロモーターまたはその誘導体であり得る。当業者は、目的の原核生物に適した追加の構成的プロモーターに精通している。
【0039】
いくつかの態様において、ベクターは、組込みベクターであり得、そしてリコンビナーゼ、ならびに１以上のリコンビナーゼ認識部位をコードする配列をさらに含み得る。一般的に、リコンビナーゼは不可逆的なリコンビナーゼである。適切なリコンビナーゼの限定されない例としては、バクテロイデス属ｉｎｔＮ２チロシンインテグラーゼ（ＮＢＵ２遺伝子によってコードされる）、ストレプトミセス属ファージｐｈｉＣ３１（ΦＣ３１）リコンビナーゼ、コリファージＰ４リコンビナーゼ、コリファージラムダインテグラーゼ、リステリアＡ１１８ファージリコンビナーゼ、およびアクチノファージＲ４ Ｓｒｅリコンビナーゼが挙げられる。リコンビナーゼ／インテグラーゼは、２つの配列特異的認識（または付着）部位（例えば、ａｔｔＰ部位およびａｔｔＢ部位）間の組換えに介在する。いくつかの態様において、ベクターは、リコンビナーゼ認識部位の１つ（例えば、ａｔｔＰ）を含むことができ、他のリコンビナーゼ認識部位（例えば、ａｔｔＢ）は、原核生物の染色体に（例えば、ｔＲＮＡ－ｓｅｒ遺伝子の近くに）位置できる。このような状況では、ベクター全体を原核生物の染色体に組込むことができる。他の態様において、人工ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼシステムをコードする配列は、２つのリコンビナーゼ認識部位に隣接でき、その結果、人工ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼシステムをコードする配列のみが原核生物染色体に組込まれる。
【0040】
上記のベクターの何れも、少なくとも１つの転写終結配列、ならびに少なくとも１つの複製起点および／または目的の原核細胞における増殖および選択のための少なくとも１つの選択可能なマーカー配列（例えば、抗生物質耐性遺伝子）をさらに含み得る。
【0041】
ベクターおよびその使用に関する追加情報は、“Current Protocols in Molecular Biology” Ausubel et al., John Wiley & Sons, New York, 2003または“Molecular Cloning: A Laboratory Manual” Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 3rd edition, 2001に見いだされ得る。
【0042】
人工ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼシステムをコードするベクターが組込みベクターである態様において、人工ＣＲＩＳＰＲシステムをコードする核酸（またはベクター全体）は、細菌へのベクターの送達（およびリコンビナーゼ／インテグラーゼの発現）後に細菌染色体に安定して組込まれ得る。人工ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼシステムをコードするベクターが組込みベクターではない態様において、ベクターは、微生物へのベクターの送達後、染色体外に留まることができる。
【0043】
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列が誘導性プロモーターに作動可能に連結されている態様において、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼシステムの発現は、原核生物に化学物質を誘導するプロモーターを導入することによって調節できる。特定の態様において、プロモーター誘導化学物質は、アンヒドロテトラサイクリンであり得る。誘導されると、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが合成され、少なくとも１つのガイドＲＮＡと複合体を形成し、このガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼシステムを細菌染色体の標的部位に向け、それによって本明細書に記載のタンパク質－核酸複合体を形成する。
【0044】
（ＩＩＩ）マイクロバイオータ組成を調節するための方法
本発明のさらなる面は、微生物の混合集団における標的微生物(原核生物)の増殖を選択的に遅らせることによって、微生物の集団および組成を変更するための方法を包含する。この方法は、標的原核生物において人工ＲＮＡ誘導（ＣＲＩＳＰＲ）ヌクレアーゼシステムを発現することを含み、人工ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼシステムは、少なくとも１つの二本鎖切断が導入されるように、標的原核生物の染色体中の部位を標的とし、これにより、標的原核生物の成長または増殖が遅くなる。ＤＮＡ切断は一般に原核生物では修復されないか、修復が効率的でないため、染色体ＤＮＡに少なくとも１つの二本鎖切断を含む標的原核生物の成長は遅くなるか停止する。標的原核生物の増殖を遅らせることは、原核生物の混合集団における標的原核生物のレベルの低下または排除をもたらす。
本発明のさらなる面は、微生物の混合集団における標的微生物(原核生物)の増殖を選択的に遅らせることによって、微生物の集団および組成を変更するための方法を包含する。この方法は、標的原核生物において人工ＲＮＡ誘導（ＣＲＩＳＰＲ）ヌクレアーゼシステムを発現することを含み、人工ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼシステムは、少なくとも１つの二本鎖切断が導入されるように、標的原核生物の染色体中の部位を標的とし、これにより、標的原核生物の成長または増殖が遅くなる。ＤＮＡ切断は一般に原核生物では修復されないか、修復が効率的でないため、染色体ＤＮＡに少なくとも１つの二本鎖切断を含む標的原核生物の成長は遅くなるか停止する。標的原核生物の増殖を遅らせることは、原核生物の混合集団における標的原核生物のレベルの低下または排除をもたらす。
【0045】
上記のセクション（Ｉ）（ａ）に記載のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼシステムはいずれも、上記のセクション（ＩＩ）に記載のように、目的の原核生物の染色体内の部位を標的とするように設計でき、それらはセクション（Ｉ）（ｂ）に記載されている。人工ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼシステムは、上記のセクション（ＩＩ）に記載のように、ベクターの一部として原核生物に導入できる。一般的に、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは誘導性である（すなわち、そのコード配列は誘導性プロモーターに作動可能に連結されている）。そのため、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは定義された時点で発現させることができる。プロモーター誘導化学物質がない場合、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼシステムを生成することはできない。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、原核生物をプロモーター誘導化学物質に曝露することによって生成でき、その結果、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、上記のセクション（ＩＩ）に記載のように、染色体に組込まれたコード配列または染色体外コード配列から発現される。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、染色体に組込まれたコード配列または染色体外コード配列から構成的に発現される少なくとも１つのガイドＲＮＡと複合体を形成し、それによって活性なＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼシステムを形成する。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼシステムは、原核生物の染色体の標的部位を標的としており、染色体ＤＮＡに二本鎖切断を導入する。二本鎖切断は、標的原核生物の増殖の遅延および／または細胞死をもたらす。結果として、原核生物の混合集団は、標的原核生物のレベルを減少または排除した。
【0046】
いくつかの態様において、標的原核生物は、上記のセクション（Ｉ）（ｂ）に詳述されるように、バクテロイデス属であり得る。
【0047】
人工ＣＲＩＳＰＲシステムは、原核生物の混合集団内の標的原核生物に導入できる。あるいは、人工ＣＲＩＳＰＲシステムを標的原核生物に導入し、その後、原核生物の混合集団と混合することもできる。
【0048】
いくつかの態様において、原核生物の混合集団を細胞培養に添加(harbored)し、化学物質を誘導するプロモーターへの曝露は、標的原核生物のレベルの低下または排除をもたらす。
【0049】
他の態様において、原核生物の混合集団を、哺乳動物の消化管（または腸）に添加でき、ここで、化学物質を誘導するプロモーターの投与は、腸内細菌叢における標的原核生物のレベルの低下または排除をもたらす。プロモーター誘導化学物質は、経口投与できる（例えば、食物、飲料または医薬製剤を介して）。哺乳動物は、マウス、ラットまたは他の研究動物であり得る。特定の態様において、哺乳動物はヒトであり得る。標的原核生物（例えば、バクテロイデス）の減少または排除は、腸の健康の改善につながる可能性がある。
【0050】
原核生物の混合集団（細胞培養または消化管内）は、多種多様な分類群を含み得る。例えば、ヒトの腸内細菌叢は、何百もの異なる種の細菌およびこれらの種の多くの菌株レベルの変異体を含み得る。
【0051】
特定の態様において、哺乳動物（例えば、ヒト）は、癌免疫療法を受けることができ、ここで、免疫療法応答者は、非応答者と比較して、腸内細菌叢においてより低いレベルのバクテロイデス種を有することが示されている（Gopalakrishnan et al., Science, 2018, 359:97-103）。したがって、腸内細菌叢におけるバクテロイデス種のレベルの低下は、より良いヒトの癌免疫療法の結果をもたらし得る。
【0052】
特定の態様において、哺乳動物（例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ブタ、ウマまたはウシ）は、炎症性腸疾患、クローン病、大腸憩室炎、腸閉塞、ポリープ除去、癌組織除去、潰瘍性大腸炎、腸切除、直腸切除、完全結腸切除または部分的結腸切除を含むがこれらに限定されない様々な理由で腸手術を受けることができ、ここで、誘導型ＣＲＩＳＰＲシステムによる哺乳動物腸内のバクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）種の術前減弱が、腸の外側であるが哺乳動物の体内の場所でのバクテロイデス・フラジリスによる術後感染のリスクを低減できる可能性がある。腸の外側の場所には、腸の外表面が含まれる。バクテロイデス・フラジリス内の誘導型ＣＲＩＳＰＲシステムは、病原性アイランド、毒素（すなわち、バクテロイデス・フラジリス毒素またはＢＦＴ）、またはバクテロイデス・フラジリスの感染性株もしくは術後感染症を引き起こすことが知られている他の天然腸プロカリオテスに関連する他の固有の配列に類似するがこれらに限定されない場所を切断または修飾することを目標とすることができる。例えば、非毒素原性バクテロイデス・フラジリス（ＮＴＢＦ）および腸管毒素原性バクテロイデス・フラジリス（ＥＴＢＦ）のレベルは、ＮＴＢＦ株ではなく、ＥＴＢＦ株内に配置された人工誘導型ＣＲＩＳＰＲシステムを用いて選択的に調節され得る。腸の手術後に感染症を引き起こす他の細菌分類には、バクテロイデス・カピローシス、大腸菌、エンテロコッカス・フェカーリス、ガメラ・ヘモリサンおよびモルガネラ菌が含まれ得る。腸内細菌叢への誘導型ＣＲＩＳＰＲシステムの送達は、手術前、手術中または手術後のプロバイオティクス処置の一部として行われ得る。誘導型ＣＲＩＳＰＲシステムの標的原核生物への送達は、哺乳動物体外または哺乳動物体内で起こり得る。誘導型ＣＲＩＳＰＲシステムの標的原核生物への送達は、プラスミドまたはバクテリオファージなどの核酸ベクターを介して行われ得る。プラスミドの送達は、エレクトロポレーション、化学形質転換または細菌から細菌への接合を介して行われてもよい。
【0053】
様々な態様において、標的原核生物のレベルは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの発現前と比較して少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または少なくとも約９９％減少させることができる。特定の態様において、標的原核生物は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの発現後に、原核生物の混合集団において検出不可能なレベルに低減され得る。
【0054】
（ＩＶ）プロバイオティクスとしてのＣＲＩＳＰＲ組込み原核生物
本発明のさらに別の態様は、プロバイオティクスとして用いるために改変された原核生物を包含する。改変された原核生物は、原核生物の染色体に組込まれた、または原核生物の細胞内でエピソームベクターとして維持された、セクション（Ｉ）に記載された改変されたＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼシステムのいずれかを含む。ある態様において、操作された原核生物は、誘導型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼシステムを含む操作されたバクテロイデスである。哺乳動物対象への操作されたバクテロイデスの投与とそれに続くＣＲＩＳＰＲシステムの誘導は、腸内細菌叢におけるバクテロイデス菌株の相対的な存在量を減らすために使用できる。他の態様において、バクテロイデス菌株は、腸内細菌叢においてバクテロイデス属の野生型菌株を打ち負かすように操作され得る。これらおよび他の態様において、哺乳動物対象に治療的利益を提供する操作されたバクテロイデス株は、その後、誘導型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼシステムの誘導によって哺乳動物対象から除去され得る。
本発明のさらに別の態様は、プロバイオティクスとして用いるために改変された原核生物を包含する。改変された原核生物は、原核生物の染色体に組込まれた、または原核生物の細胞内でエピソームベクターとして維持された、セクション（Ｉ）に記載された改変されたＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼシステムのいずれかを含む。ある態様において、操作された原核生物は、誘導型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼシステムを含む操作されたバクテロイデスである。哺乳動物対象への操作されたバクテロイデスの投与とそれに続くＣＲＩＳＰＲシステムの誘導は、腸内細菌叢におけるバクテロイデス菌株の相対的な存在量を減らすために使用できる。他の態様において、バクテロイデス菌株は、腸内細菌叢においてバクテロイデス属の野生型菌株を打ち負かすように操作され得る。これらおよび他の態様において、哺乳動物対象に治療的利益を提供する操作されたバクテロイデス株は、その後、誘導型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼシステムの誘導によって哺乳動物対象から除去され得る。
【0055】
定義
別段の定義がない限り、本明細書で用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。以下の文献は、本発明で用いる多くの用語の一般的な定義を含む技術の１つを提供する：Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd Ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); および、Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書で用いる以下の用語は、他に明記しない限り、それぞれの用語の意味を有する。
別段の定義がない限り、本明細書で用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。以下の文献は、本発明で用いる多くの用語の一般的な定義を含む技術の１つを提供する：Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd Ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); および、Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書で用いる以下の用語は、他に明記しない限り、それぞれの用語の意味を有する。
【0056】
本発明の要素またはその好ましい態様（複数可）を導入するとき、冠詞“a”、“an”、“the”および“該”は、１以上の要素が存在することを意味することを意図している。用語“含む（comprising）”、“含む（including）”および“有する（having）”は、包括的であることを意図しており、記載された要素以外の追加の要素が存在する可能性があることを意味する。
【0057】
数値ｘに関連して用いられる用語“約”とは、例えば、ｘ±５％を意味する。
【0058】
本明細書で用いる用語“相補的（complementary）”または“相補性（complementarity）”とは、特定の水素結合を介した塩基対形成による二本鎖核酸の会合を意味する。塩基対は、標準のワトソン－クリック塩基対であり得る（たとえば、５’－ＡＧＴＣ－３’と相補配列３’－ＴＣＡＧ－５’の対）。塩基対形成はまた、フーグスティーン（Hoogsteen）または逆フーグスティーン水素結合であり得る。相補性は通常、二重領域に関して測定されるため、たとえばオーバーハングは除外される。二本鎖領域の２つの鎖間の相補性は部分的であり、塩基の一部（例えば、７０％）のみが相補的である場合、パーセンテージ（例えば、７０％）として表され得る。相補的でない塩基は“ミスマッチ”である。二本鎖領域のすべての塩基が相補的である場合、相補性も完全であり得る（すなわち、１００％）。
【0059】
遺伝子またはポリヌクレオチドに関する用語“発現”は、遺伝子またはポリヌクレオチドの転写、および適切な場合には、ｍＲＮＡ転写物のタンパク質またはポリペプチドへの翻訳を意味する。したがって、文脈から明らかなように、タンパク質またはポリペプチドの発現は、オープンリーディングフレームの転写および／または翻訳に起因する。
【0060】
本明細書で用いる用語“遺伝子”は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（エキソンおよびイントロンを含む）、ならびに遺伝子産物の産生を調節するすべてのＤＮＡ領域を意味し、かかる調節配列がコード配列および／または転写配列に隣接するか否かにかかわらず、全ての領域を意味する。したがって、遺伝子は、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位および内部リボソーム侵入部位などの翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、境界要素、複製起点、マトリックス付着部位および遺伝子座制御領域を含むが、必ずしもこれらに限定されない。
【0061】
用語“異種”は、目的の細胞に対して内因性または天然でない存在(entity)を意味する。例えば、異種タンパク質は、外来的に導入された核酸配列のような外来起源に由来する、または元々由来していたタンパク質を意味する。いくつかの例において、異種タンパク質は、目的の細胞によって通常は産生されない。
【0062】
用語“ヌクレアーゼ”は、用語“エンドヌクレアーゼ”と互換的に用いられ、二本鎖核酸配列の両鎖を切断する、または一本鎖核酸配列を切断する酵素を意味する。
【0063】
用語“核酸”および“ポリヌクレオチド”は、線状または環状のコンフォメーションで、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを意味する。本発明の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定的に解釈されるものではない。この用語は、天然ヌクレオチドの既知の類縁体、ならびに塩基、糖および／またはリン酸部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）において修飾されているヌクレオチドを包含し得る。一般に、特定のヌクレオチドの類縁体は、同じ塩基対特異性を有する；すなわち、Ａの類縁体は、Ｔと塩基対を形成する。
【0064】
用語“ヌクレオチド”は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを意味する。ヌクレオチドは、標準的なヌクレオチド（すなわち、アデノシン、グアノシン、シチジン、チミジンおよびウリジン）、ヌクレオチド異性体、またはヌクレオチド類縁体であってよい。ヌクレオチド類縁体とは、修飾されたプリン塩基もしくはピリミジン塩基または修飾されたリボース部位を有するヌクレオチドを意味する。ヌクレオチド類縁体は、天然ヌクレオチド（例えば、イノシン、プソイドウリジンなど）または非天然ヌクレオチドであってもよい。ヌクレオチドの糖または塩基部分上の修飾の限定されない例としては、アセチル基、アミノ基、カルボキシル基、カルボキシメチル基、ヒドロキシル基、メチル基、リン酸基、チオール基の付加（または除去）、ならびに塩基の炭素および窒素原子の他の原子での置換（例えば、７デアザプリン）などが挙げられる。ヌクレオチド類縁体には、ジデオキシヌクレオチド、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）およびモルフォリノも含まれる。
【0065】
用語“ポリペプチド”および“タンパク質”は、アミノ酸残基のポリマーを意味するために互換的に用いられる。
【0066】
用語“標的配列”および“標的部位”は、ＣＲＩＳＰＲシステムが標的とされる目的の核酸（例えば、染色体ＤＮＡまたは細胞ＲＮＡ)中の特定の配列、およびＣＲＩＳＰＲシステムは、核酸または核酸に関連するタンパク質を変更する。
【0067】
核酸およびアミノ酸配列の同一性を決定するための技術は、当技術分野で知られている。一般的には、そのような技術は、遺伝子のｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定すること、および／またはそれによってコードされるアミノ酸配列を決定すること、およびこれらの配列を第２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較することを含む。この方法でゲノム配列を決定し、比較することもできる。一般に、同一性とは、それぞれ２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の対応を意味する。２以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、それらのパーセント同一性を決定することによって比較できる。核酸またはアミノ酸配列であるかどうかにかかわらず、２つの配列のパーセント同一性は、２つの整列した配列間の完全一致の数を短い配列の長さで割って１００を掛けたものである。核酸配列のおおよそのアラインメントは、Smith and Waterman、Advances in Applied Mathematics 2:482-489(1981)の局所ホモロジーアルゴリズムによって提供される。このアルゴリズムは、Dayhoff、Atlas of Protein Sequences and Structure、MO Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358、National Biomedical Research Foundation、Washington、DC、USAによって開発され、かつGribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763(1986)によって正規化されたスコアリングマトリックスを用いてアミノ酸配列に適用できる。配列のパーセント同一性を決定するためのこのアルゴリズムの例示的な実装（implementation）は、Genetics Computer Group(Madison、Wis.)によって“BestFit”ユーティリティアプリケーションとして提供されている。配列間のパーセント同一性または類似性を計算するための他の適切なプログラムは、当技術分野で一般に知られており、例えば、別のアラインメントプログラムは、デフォルトパラメーターで用いられるＢＬＡＳＴである。たとえば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、次のデフォルトパラメータを用いて使用できる：遺伝子コード（genetic code）＝標準（standard）；フィルター（filter）＝なし（none）；鎖（strand）＝両方（both）；カットオフ（cutoff）＝６０；expect＝１０；マトリックス（Matrix）＝ＢＬＯＳＵＭ６２；説明（Descriptions）＝５０個の配列（sequences）；並べ替え（sort by）＝HIGH SCORE；データベース（Databases）＝非冗長（non-redundant）、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ 翻訳＋スイスタンパク質＋Spupdate+PIR。これらのプログラムの詳細は、GenBankのウェブサイトに見い出すことができる。
【0068】
本発明の範囲から逸脱することなく、上記の細胞および方法に様々な変更を加えることができるため、上記の説明および以下に示す実施例に含まれるすべての事項は、例示として解釈されるべきであり、制限するものと解釈されない。
【実施例】
【0069】
実施例
以下の実施例は、本発明の特定の面を示している。
以下の実施例は、本発明の特定の面を示している。
【0070】
実施例１．ベクター構築
ＣＲＩＳＰＲ組込みｐＮＢＵ２－ＣＲＩＳＰＲプラスミドを、pExchange-tdkのプラスミド骨格（RP4-oriT、R6K ori、bla、ermG）、pNBU2-tetQbのＮＢＵ２インテグラーゼ、および化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）株ＳＦ３７０の合成ＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのＰＣＲから作製されたアンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）誘導型ＣＲＩＳＰＲカセット（P2-A21-tetR、P1TDP-GH023-SpCas9、P1-N20 sgRNAスキャフォールド）を用いてギブソンクローニング（NEBuild HIFI DNA Assembly Master Mix、New England Biolabs）により構築した。図２は、プラスミド設計を示す。
ＣＲＩＳＰＲ組込みｐＮＢＵ２－ＣＲＩＳＰＲプラスミドを、pExchange-tdkのプラスミド骨格（RP4-oriT、R6K ori、bla、ermG）、pNBU2-tetQbのＮＢＵ２インテグラーゼ、および化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）株ＳＦ３７０の合成ＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのＰＣＲから作製されたアンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）誘導型ＣＲＩＳＰＲカセット（P2-A21-tetR、P1TDP-GH023-SpCas9、P1-N20 sgRNAスキャフォールド）を用いてギブソンクローニング（NEBuild HIFI DNA Assembly Master Mix、New England Biolabs）により構築した。図２は、プラスミド設計を示す。
【0071】
プラスミド骨格は、大腸菌でのアンピシリン選択のためのＲ６Ｋ複製起点およびｂｌａ配列、結合のためのＲＰ４－ｏｒｉＴ配列、ならびにバクテロイデス属でのエリスロマイシン（Ｅｍ）選択のためのｅｒｍＧ配列を含む。ＮＢＵ２は、ｉｎｔＮ２チロシンインテグラーゼをコードする。これは、ｐＮＢＵ２－ＣＲＩＳＰＲプラスミド上のａｔｔＮ２部位とバクテロイデス属細胞の染色体上にあるａｔｔＢ部位の１つとの間の配列特異的組換えを組換えに介在する。ａｔｔＮ２およびａｔｔＢは同じ１３ｂｐの認識ヌクレオチド配列（５’－３’）：ＣＣＴＧＴＣＴＣＴＣＣＧＣ（配列番号２）を有している。
【0072】
誘導型ＣＲＩＳＰＲカセットには、ＴｅｔＲレギュレーターの制御下にあるａＴｃ誘導性ＳｐＣａｓ９（Ｐ２－Ａ２１－ｔｅｔＲ、Ｐ１ＴＤＰ－ＧＨ０２３－ＳｐＣａｓ９）、およびＰ１プロモーター下に構成的に発現するガイドＲＮＡ（Ｐ１－Ｎ２０ ｓｇＲＮＡスキャッホルド）が含まれる。プロモーターおよびリボソーム結合部位は、Lim et al., Cell, 2017, 169:547-558に記載の通り、バクテロイデス・シータイオタオミクロン １６ＳｒＲＮＡ遺伝子の調節配列に由来し、操作されている。ガイドＲＮＡは、コーディングＤＮＡ配列、非コーディングＤＮＡ配列または非標的化スクランブルヌクレオチド配列と相同なヌクレオチド配列である。この配列は、異なるＣａｓ９ホモログのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）要求（requirements）と互換性がある限り、どのような形式でも構わない。ガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡの別個の転写ユニットにあるか、またはハイブリッドキメラｔｒａｃｒ／ｃｒＲＮＡシングルガイド（ｓｇＲＮＡ）に融合されている。
【0073】
上記のプラスミドのＤＮＡ配列は、配列番号３に示されている。
【表1】
【表2】
【表3】
【表4】
【表5】
【表6】
【表7】
【0074】
実施例２．バクテロイデス・シータイオタオミクロンの染色体へのＣＲＩＳＰＲ組込み
ｐＮＢＵ２.ＣＲＩＳＰＲプラスミドをＥ.ｃｏｌｉ Ｓ－１７ラムダｐｉｒに形質転換した後、コンジュゲーションを介してバクテロイデス細胞に送達した。この特定の例において、ｐＮＢＵ２－ＣＲＩＳＰＲプラスミドはｉｎｔＮ２チロシンインテグラーゼをコードしており、ｐＮＢＵ２－ＣＲＩＳＰＲプラスミド上のａｔｔＮ２部位とバクテロイデス・シータイオタオミクロンＶＰＩ－５４８２（略してＢｔ）の染色体上の２つのｔＲＮＡ－Ｓｅｒ遺伝子、ＢＴ_ｔ７０（ａｔｔＢＴ２－１）およびＢＴ_ｔ７１（ａｔｔＢＴ２－２）の３’末端に位置する２つのａｔｔＢＴ部位の１つとの間の配列特異的組換えに介在する。ｐＮＢＵ２－ＣＲＩＳＰＲプラスミドを挿入すると、２つのｔＲＮＡ－Ｓｅｒ遺伝子の１つが不活性化され、ｔＲＮＡ－Ｓｅｒが必須であるために、ＢＴ_ｔ７０およびＢＴ_ｔ７１の両方に同時に挿入される可能性は低くなる。
ｐＮＢＵ２.ＣＲＩＳＰＲプラスミドをＥ.ｃｏｌｉ Ｓ－１７ラムダｐｉｒに形質転換した後、コンジュゲーションを介してバクテロイデス細胞に送達した。この特定の例において、ｐＮＢＵ２－ＣＲＩＳＰＲプラスミドはｉｎｔＮ２チロシンインテグラーゼをコードしており、ｐＮＢＵ２－ＣＲＩＳＰＲプラスミド上のａｔｔＮ２部位とバクテロイデス・シータイオタオミクロンＶＰＩ－５４８２（略してＢｔ）の染色体上の２つのｔＲＮＡ－Ｓｅｒ遺伝子、ＢＴ_ｔ７０（ａｔｔＢＴ２－１）およびＢＴ_ｔ７１（ａｔｔＢＴ２－２）の３’末端に位置する２つのａｔｔＢＴ部位の１つとの間の配列特異的組換えに介在する。ｐＮＢＵ２－ＣＲＩＳＰＲプラスミドを挿入すると、２つのｔＲＮＡ－Ｓｅｒ遺伝子の１つが不活性化され、ｔＲＮＡ－Ｓｅｒが必須であるために、ＢＴ_ｔ７０およびＢＴ_ｔ７１の両方に同時に挿入される可能性は低くなる。
【0075】
この特定の例において、非ターゲティング対照ガイドＲＮＡ（‘Ｍ’と呼ばれる）、Ｂｔゲノム内のｔｄｋ ＿Ｂｔ（ＢＴ＿２２７５）およびｓｕｓＣ ＿Ｂｔ （ＢＴ＿３７０２）コーディング配列を標的化するガイドＲＮＡを発現する３つのプラスミドを構築した。ｔｄｋ遺伝子はチミジンキナーゼをコード化し、ｓｕｓＣ遺伝子はバクテロイデス・シータイオタオミクロンのデンプン結合(starch binding)に関与する外膜タンパク質をコード化する。ｔｄｋ ＿Ｂｔのプロトスペーサー配列は、５’－ＡＡＴＴＧＡＧＧＣＡＴＣＧＧＴＣＣＧＡＡ－３’（配列番号４）であり、ｓｕｓＣ ＿Ｂｔのプロトスペーサー配列は、５’ ＡＴＧＡＣＧＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣＣＣＡＧ－３’ （配列番号５）である。バクテロイデスのゲノムに対する非ターゲティング対照プロトスペーサー配列（５’－ＴＧＡＴＧＧＡＧＡＧＧＴＧＣＡＡＧＴＡＧ－３’；配列番号６）のインシリコ分析では、有意な配列一致は得られなかったため、“オフターゲット”活性は期待されない。ｓｇＲＮＡ足場配列は、５’－ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＴ－３’（配列番号７）であった。得られたプラスミドは、それぞれｐＮＢＵ２－ＣＲＩＳＰＲ.Ｍ、ｐＮＢＵ２－ＣＲＩＳＰＲ．ｔｄｋ_Ｂｔ、およびｐＮＢＵ２－ＣＲＩＳＰＲ．ｓｕｓＣ_Ｂｔと呼ばれる。
【0076】
ｐＮＢＵ２－ＣＲＩＳＰＲプラスミドをエリスロマイシン選択を有するＢｔ細胞にコンジュゲートし、コンジュゲーションあたり５００～１０００個のコロニーが得られた（図３Ａ、３Ｂ）。バクテロイデス属の複製起点がないため、これらのプラスミドはバクテロイデス細胞で維持できない。エリスロマイシン耐性コロニーはおそらく染色体組込み体であった。Ｍ（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４）、ｔｄｋ _Ｂｔ（Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４）およびｓｕｓＣ _Ｂｔ（Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４）とラベル付けされた各コンジュゲーションからの４つのコロニーが、２つのａｔｔＢＴ遺伝子座のいずれか一方におけるＣＲＩＳＰＲ組込みのコロニーＰＣＲスクリーニング用に選択された（図３Ｃ）。各遺伝子座の外部プライマーを用いて、ＰＣＲアンプリコンのサイズを特定した：野生型またはプラスミドを組込んだものである。プラスミド全体が約１０ｋｂであるため、コロニーＰＣＲを用いて組込むためのＰＣＲアンプリコンを得ることはまず不可能であるが、精製されたゲノムＤＮＡを用いることは可能である。各遺伝子座について、外側プライマー（outside primers）を用いるＰＣＲを行った。組込みが起こらなかった場合、ゲル上で約０．５ｋｂ（ａｔｔＢＴ２－１遺伝子座）または０．６５ｋｂ（ａｔｔＢＴ２－２遺伝子座）のＰＣＲアンプリコンが予想されるが、それ以外の場合、ＰＣＲ産物は期待されない。さらに、組込みの左接合部を増幅するＰＣＲを、染色体配列に結合する外部プライマーと、組込みプラスミドからのｅｒｍＧコード配列に結合する内部プライマーを用いて行った。組込みが起こった場合、ゲル上にＰＣＲ産物が見られるはずである。それ以外の場合、ＰＣＲ産物は期待されない。ＰＣＲ増幅は、Ｑ５ Ｈｏｔ－ｓｔａｒｔ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（New England Biolabs）を用いて、次のサイクリング条件を用いて行った：９８℃にて３０秒間の初期変性；９８℃にて２０秒間、５８℃にて２０秒間および７２℃にて４５秒間を２５サイクル；そして、７２℃にて５分間の最終延長。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで分離した。図３Ｃに示すように、外部プライマーを用いたＰＣＲ Ａ（ａｔｔＢＴ２－１遺伝子座）およびＰＣＲ Ｂ（ａｔｔＢＴ２－２遺伝子座）のサイズに基づいて、クローンＭ１－Ｍ４、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ４、Ｓ１、Ｓ３、Ｓ４はすべて、ａｔｔＢＴ２－１遺伝子座に組込まれたＣＲＩＳＰＲカセットを担持しているが、クローンＴ３およびＳ２は、Ｂｔ染色体上のａｔｔＢＴ２－２遺伝子座に組込まれていると推定される。染色体配列とプラスミド配列との間の接合部は、選択されたクローンＭ１、Ｍ２、Ｔ１、Ｔ３、Ｓ１およびＳ２のＰＣＲ（ＰＣＲ ＣおよびＤ）およびサンガーＤＮＡ配列決定によってさらに正しいことが確認された。
【0077】
実施例３．個々のバクテロイデス・シータイオタオミクロン株の誘導型ＣＲＩＳＰＲ殺滅
選択されたバクテロイデス・シータイオタオミクロンＣＲＩＳＰＲ組込み体Ｍ１、Ｔ１およびＳ１について、すべてａｔｔＢＴ２－１遺伝子座に誘導型ＣＲＩＳＰＲカセットが組込まれているため、誘導型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介した細胞死をＢＨＩ血液寒天プレートまたはＴＹＧ液体培地のいずれかで調べた（それぞれ、図４Ａおよび４Ｂ）。Ｍ１株およびＴ１株の単一コロニーを、ｃｏｙチャンバー（Coy Laboratory Products Inc.）中で、２００μｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｇｍ）および２５μｇ／ｍｌエリスロマイシン（Ｅｍ）を添加した５ｍｌ ＴＹＧ液体培地を含むファルコンチューブ培養で、一晩、嫌気的に増殖させた。培養物を希釈し（１０－６）、１００μｌを、それぞれ０ｎｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌの濃度のアンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）を添加したＢＨＩ血液寒天プレート（Ｇｍ ２００μｇ／ｍｌおよびＥｍ ２５μｇ/ｍｌ）に播種した。寒天プレートを嫌気的に３７℃にて２～３日間インキュベートした。すべての菌株について、ａＴｃが存在しない（０ｎｇ／ｍｌ）血液寒天プレート上で約１０３－１０４ ＣＦＵ（コロニー形成単位）が得られた。Ｔ１株について、ａＴｃが存在する（１００ｎｇ／ｍｌ）血液寒天プレートではＣＦＵの形成は観察されなかったが、Ｍ１株では、１０３－１０４ ＣＦＵが得られた（図４Ａ）。
選択されたバクテロイデス・シータイオタオミクロンＣＲＩＳＰＲ組込み体Ｍ１、Ｔ１およびＳ１について、すべてａｔｔＢＴ２－１遺伝子座に誘導型ＣＲＩＳＰＲカセットが組込まれているため、誘導型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介した細胞死をＢＨＩ血液寒天プレートまたはＴＹＧ液体培地のいずれかで調べた（それぞれ、図４Ａおよび４Ｂ）。Ｍ１株およびＴ１株の単一コロニーを、ｃｏｙチャンバー（Coy Laboratory Products Inc.）中で、２００μｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｇｍ）および２５μｇ／ｍｌエリスロマイシン（Ｅｍ）を添加した５ｍｌ ＴＹＧ液体培地を含むファルコンチューブ培養で、一晩、嫌気的に増殖させた。培養物を希釈し（１０－６）、１００μｌを、それぞれ０ｎｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌの濃度のアンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）を添加したＢＨＩ血液寒天プレート（Ｇｍ ２００μｇ／ｍｌおよびＥｍ ２５μｇ/ｍｌ）に播種した。寒天プレートを嫌気的に３７℃にて２～３日間インキュベートした。すべての菌株について、ａＴｃが存在しない（０ｎｇ／ｍｌ）血液寒天プレート上で約１０３－１０４ ＣＦＵ（コロニー形成単位）が得られた。Ｔ１株について、ａＴｃが存在する（１００ｎｇ／ｍｌ）血液寒天プレートではＣＦＵの形成は観察されなかったが、Ｍ１株では、１０３－１０４ ＣＦＵが得られた（図４Ａ）。
【0078】
同様に、Ｍ１を除いて、３７℃にて４日間嫌気的に培養した後でも、１００ｎｇ／ｍｌのａＴｃを添加したＴＹＧ培地を含む液体チューブ培養では細胞増殖は観察されなかった。ただし、嫌気的培養の２４時間後に１０ｎｇ／ｍｌのａＴｃ濃度でクローンＴ１およびＳ２のわずかな増殖が観察され、完全な枯渇にはより高いａＴｃ濃度が望ましいことが示唆された（図４Ｂ）。データは、染色体に組込まれたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムが外因的に提供されたインデューサーａＴｃによって活性化され、標的化ＲＮＡ（ｔｄｋ_ＢｔまたはｓｕｓＣ_Ｂｔ）によって誘導される致命的なゲノムＤＮＡ切断を提供し、その結果、細胞生存性を失うことを示す。
【0079】
実施例４．インビトロでの混合集団におけるバクテロイデス・シータイオタオミクロン細胞の標的化された誘導型ＣＲＩＳＰＲ殺滅
非ターゲティング（Ｍ）またはターゲティング（ｔｄｋ_ＢｔまたはｓｕｓＣ_Ｂｔ）ガイドＲＮＡのいずれかを発現するＣＲＩＳＰＲ組込みＢｔ株の混合培養を用いて、インビトロでの混合集団における特定の株の標的化ＣＲＩＳＰＲ殺滅を実証した。等量の指数増殖期培養物を混合し、それぞれ終濃度０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌまたは１００ｎｇ／ｍｌのａＴｃを添加した５ｍｌのＴＹＧ液体培地中で嫌気的にインキュベートした。２４時間後、すべての培養物は約１．３ ＯＤ６００ｎｍまで増殖した（図５Ａ）。ａＴｃ処理培養物の１セット（それぞれ０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌのａＴｃを添加したＭ１＋Ｔ１）について、ガイドＲＮＡ（Ｐ１－Ｎ２０ ｓｇＲＮＡ骨格）の領域でＰＣＲおよびとＤＮＡ配列決定を行った。ＤＮＡ配列決定クロマトグラムから、ａＴｃ処理培養物（ａＴｃ１０およびａＴｃ１００）は、非ターゲティングの対照ガイドＲＮＡ（Ｍ）を含む細胞のみであったが、ａＴｃ処理なしの培養物（ａＴｃ ０）は、非ターゲティングガイドＲＮＡ（Ｍ）およびｔｄｋ _ＢｔターゲティングガイドＲＮＡ（図５Ｂ）の両方を含む細胞の混合集団である。
非ターゲティング（Ｍ）またはターゲティング（ｔｄｋ_ＢｔまたはｓｕｓＣ_Ｂｔ）ガイドＲＮＡのいずれかを発現するＣＲＩＳＰＲ組込みＢｔ株の混合培養を用いて、インビトロでの混合集団における特定の株の標的化ＣＲＩＳＰＲ殺滅を実証した。等量の指数増殖期培養物を混合し、それぞれ終濃度０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌまたは１００ｎｇ／ｍｌのａＴｃを添加した５ｍｌのＴＹＧ液体培地中で嫌気的にインキュベートした。２４時間後、すべての培養物は約１．３ ＯＤ６００ｎｍまで増殖した（図５Ａ）。ａＴｃ処理培養物の１セット（それぞれ０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌのａＴｃを添加したＭ１＋Ｔ１）について、ガイドＲＮＡ（Ｐ１－Ｎ２０ ｓｇＲＮＡ骨格）の領域でＰＣＲおよびとＤＮＡ配列決定を行った。ＤＮＡ配列決定クロマトグラムから、ａＴｃ処理培養物（ａＴｃ１０およびａＴｃ１００）は、非ターゲティングの対照ガイドＲＮＡ（Ｍ）を含む細胞のみであったが、ａＴｃ処理なしの培養物（ａＴｃ ０）は、非ターゲティングガイドＲＮＡ（Ｍ）およびｔｄｋ _ＢｔターゲティングガイドＲＮＡ（図５Ｂ）の両方を含む細胞の混合集団である。
【0080】
ａＴｃで処理した培養物の１つ（Ｍ１＋Ｓ１－ａＴｃ１００）を希釈し、ａＴｃを添加せずにＢＨＩ血液寒天培地に播種し、単一コロニーを得た。個々のコロニーおよび寒天プレート上のコロニーの掻取り（scrape）を、ｇＲＮＡ領域のＰＣＲ、次いでサンガーＤＮＡ配列決定によって分析した。すべての個々のコロニーおよびコロニー混合物は、非ターゲティングの対照ｇＲＮＡのみを含むことがわかった。このことは、組込みを含むｓｕｓＣ_Ｂｔ ｇＲＮＡが、チューブ培養における誘導性Ｃａｓ９タンパク質発現自体による増殖阻害ではなく、ａＴｃ誘導性ＣＲＩＳＰＲ殺滅によって正常に枯渇したことを示唆している（図５Ｃ）。
【0081】
Ｍ１＋Ｔ１の混合培養についても同様の実験を行った結果、同じ観察結果が得られた。これらのデータは、インビトロでの混合集団におけるバクテロイデス・シータイオタオミクロン細胞の標的化された誘導型ＣＲＩＳＰＲ殺滅を示した。
【0082】
実施例５．抗生物質選択なしのバクテロイデス・シータイオタオミクロン株の長期的増殖および標的化ＣＲＩＳＰＲ殺滅
抗生物質での選択をせずに液体培養で長期的な増殖および標的殺滅を試験するために、連続限界希釈を用いた。ＣＲＩＳＰＲ組込みＢｔ株Ｍ１、Ｔ１およびＳ１をグリセロールストックからＴＹＧ培地に播種し、コイチャンバー内で３７℃にて２４時間、嫌気的に増殖させた。培養物を１：１００希釈で新鮮なＴＹＧ培地に再播種し、さらに２４時間嫌気的に増殖させた。同じ手順を４回繰り返した結果、液体培地で約５日間、４０世代の増殖が得られた。次に、培養物をＢＨＩ血液寒天プレートに拡散し、単一コロニーを形成した。それぞれ約５０コロニーの抗生物質耐性株を、Ｇｍ（２００μｇ／ｍｌ）またはＥｍ（２５μｇ／ｍｌ）のいずれかを添加したＢＨＩ血液寒天プレート上で試験した。試験されたすべてのコロニーは両抗生物質に耐性があり、このことは、組込まれたＢｔ株でのＣＲＩＳＰＲカセットの長期維持を示唆している。
抗生物質での選択をせずに液体培養で長期的な増殖および標的殺滅を試験するために、連続限界希釈を用いた。ＣＲＩＳＰＲ組込みＢｔ株Ｍ１、Ｔ１およびＳ１をグリセロールストックからＴＹＧ培地に播種し、コイチャンバー内で３７℃にて２４時間、嫌気的に増殖させた。培養物を１：１００希釈で新鮮なＴＹＧ培地に再播種し、さらに２４時間嫌気的に増殖させた。同じ手順を４回繰り返した結果、液体培地で約５日間、４０世代の増殖が得られた。次に、培養物をＢＨＩ血液寒天プレートに拡散し、単一コロニーを形成した。それぞれ約５０コロニーの抗生物質耐性株を、Ｇｍ（２００μｇ／ｍｌ）またはＥｍ（２５μｇ／ｍｌ）のいずれかを添加したＢＨＩ血液寒天プレート上で試験した。試験されたすべてのコロニーは両抗生物質に耐性があり、このことは、組込まれたＢｔ株でのＣＲＩＳＰＲカセットの長期維持を示唆している。
【0083】
実施例６．バクテロイデス・ブルガータスの染色体へのＣＲＩＳＰＲ組込み
誘導型ＣＲＩＳＰＲカセットは、バクテロイデス・ブルガータス ＡＴＣＣ８４８２株（略して、Ｂｖ）の染色体にも組込まれている。Ｂｖへの染色体組込みに用いられるｐＮＢＵ２.ＣＲＩＳＰＲプラスミドは、Ｂｖゲノム上のｓｕｓＣ _Ｂｖ（ＢＶＵ_ＲＳ０５０９５）を標的とするガイドＲＮＡがクローン化されたことを除いて、実施例１と同様に構築された。ｓｕｓＣ_ＢｖガイドＲＮＡを発現させるための２０ｂｐプロトスペーサー配列は、５’－ＡＴＴＣＧＧＣＡＧＴＧＡＡＴＴＣＣＡＧＡ－３’（配列番号８）である。
誘導型ＣＲＩＳＰＲカセットは、バクテロイデス・ブルガータス ＡＴＣＣ８４８２株（略して、Ｂｖ）の染色体にも組込まれている。Ｂｖへの染色体組込みに用いられるｐＮＢＵ２.ＣＲＩＳＰＲプラスミドは、Ｂｖゲノム上のｓｕｓＣ _Ｂｖ（ＢＶＵ_ＲＳ０５０９５）を標的とするガイドＲＮＡがクローン化されたことを除いて、実施例１と同様に構築された。ｓｕｓＣ_ＢｖガイドＲＮＡを発現させるための２０ｂｐプロトスペーサー配列は、５’－ＡＴＴＣＧＧＣＡＧＴＧＡＡＴＴＣＣＡＧＡ－３’（配列番号８）である。
【0084】
非ターゲティング対照ガイドＲＮＡ（Ｍ）またはｓｕｓＣ _ＢｖターゲティングガイドＲＮＡのいずれかを発現するｐＮＢＵ２－ＣＲＩＳＰＲプラスミドを、大腸菌Ｓ１７ラムダｐｉｒに形質転換し、Ｂｖ細胞に結合させた。各結合で約１０，０００個のＥｍ耐性コロニーが得られた。コロニーＰＣＲによる染色体ＣＲＩＳＰＲ組込みスクリーニングのために、７つのコロニー（ＶＭ１、ＶＭ２、ＶＭ３、ＶＭ４、ＶＭ５、ＶＭ６およびＶＭ７とラベル付け）を、非ターゲティング対照コンジュゲーションプレートから選択し、５つのコロニー（Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４、Ｖ５とラベル付け）を、ｓｕｓＣ_Ｂｖからそれぞれ選択した。Ｂｖ染色体には３つの潜在的なＮＢＵ２インテグラーゼ認識遺伝子座ａｔｔＢｖがぞんざいする：ａｔｔＢｖ．３－１（ｔＲＮＡ－Ｓｅｒ、ＢＶＵ＿ＲＳ１０５９５）、ａｔｔＢｖ．３－２（ＢＶＵ＿ＲＳ２１６２５）およびａｔｔＢｖ．３－３（遺伝子間領域、３，１７１，４６２から３，１７１，４７４のヌクレオチド座標）。各遺伝子座について、外部プライマーを用いたＰＣＲを実施した。組込みが起こらなかった場合、ゲル上で約０．５ｋｂのＰＣＲアンプリコンが予想される。そうでない場合、ＰＣＲ産物は期待されない。ａｔｔＢｖ３－１遺伝子座の場合、組込みの左接合部を増幅するＰＣＲは、染色体配列に結合する外部プライマー、および組込みプラスミドからのｅｒｍＧコーディング配列に結合する内部プライマーを用いて実行した。ａｔｔＢｖ.３－１遺伝子座の場合、約０．６ｋｂのＰＣＲ産物がゲル上に見い出されるはずである。そうでない場合、ＰＣＲ産物は期待されない。図６に示すように、非ターゲティング対照ガイドＲＮＡ組込み（ＶＭ）の場合、７つのクローンすべてがａｔｔＢｖ.３－１遺伝子座でＣＲＩＳＰＲ組込みを担持していた；ｓｕｓＣ _ＢｖターゲティングガイドＲＮＡ組込み（Ｖ）の場合、クローンＶ１はａｔｔＢｖ.３－１遺伝子座およびａｔｔＢｖ.３－２遺伝子座の両方でＣＲＩＳＰＲ組込みを担持し得る;クローンＶ２は、ａｔｔＢｖ.３－１遺伝子座およびａｔｔＢｖ.３－２遺伝子座の両方でＣＲＩＳＰＲ組込みを担持し得る；そして、クローンＶ３、Ｖ４およびＶ５の場合、それらはすべてａｔｔＢｖ.３－１遺伝子座でのみＣＲＩＳＰＲカセット組込みを担持していた。このデータセットは、ＮＢＵ２ベースのＣＲＩＳＰＲ組込みシステムがバクテロイデス・ブルガータス株で良く機能することを示している。
【0085】
実施例７．バクテロイデス・ブルガータスの標的化された誘導型ＣＲＩＳＰＲ殺滅
実施例３と同様に、個々のＣＲＩＳＰＲ組込みＢｖ株ＶＭ１（非標的化ガイドＲＮＡを発現する）およびＶ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４、Ｖ５（すべてｓｕｓＣ_ＢｖガイドＲＮＡを発現する）を、ＴＹＧ液体培地中で一晩、嫌気的に増殖させた。次に、培養物を１００ｎｇ／ｍｌ ａＴｃを添加した新鮮なＴＹＧ培地に再播種（１：１００希釈）した後、３７℃にて２４時間、好気的に増殖させた。ＶＭ１培養物のみが高濁度に増殖したが、標的化ガイドＲＮＡを発現する他の培養物は増殖を示さなかった。
実施例３と同様に、個々のＣＲＩＳＰＲ組込みＢｖ株ＶＭ１（非標的化ガイドＲＮＡを発現する）およびＶ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４、Ｖ５（すべてｓｕｓＣ_ＢｖガイドＲＮＡを発現する）を、ＴＹＧ液体培地中で一晩、嫌気的に増殖させた。次に、培養物を１００ｎｇ／ｍｌ ａＴｃを添加した新鮮なＴＹＧ培地に再播種（１：１００希釈）した後、３７℃にて２４時間、好気的に増殖させた。ＶＭ１培養物のみが高濁度に増殖したが、標的化ガイドＲＮＡを発現する他の培養物は増殖を示さなかった。
【0086】
実施例４と同様に、ＶＭ１（非ターゲティングガイドＲＮＡ）およびＶ３（ｓｕｓＣ _ＢｖガイドＲＮＡを発現）の混合培養物を、１００ｎｇ／ｍｌのａＴｃで処理した後、ＴＹＧ液体培地で２４時間嫌気的に培養した。培養物は高濁度に増殖した。混合培養物のガイドＲＮＡ領域のＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定は、処理された培養物が非ターゲティング対照ガイドＲＮＡを発現する細胞のみを含んでいたことを示す。これは、インデューサーの添加により、混合細胞集団で特定のバクテロイデス・ブルガータス株のＣＲＩＳＰＲ殺滅を示す。
【0087】
実施例８．他のバクテロイデス菌株の染色体へのＣＲＩＳＰＲの組込み
ＮＢＵ２インテグラーゼ組換えｔＲＮＡ－ｓｅｒ部位（１３ｂｐ）は保存されており、公開されているゲノム配列から、バクテロイデス・セルロシリティカス、バクテロイデス・フラジリス、バクテロイデス・ヘルコジネス（Bacteroides helcogenes）、バクテロイデス・オバツス（Bacteroides ovatus）、バクテロイデス・サラニトロニス（Bacteroides salanitronis）バクテロイデス・ユニフォルミスおよびバクテロイデス・キシラニソルベンスを含む他の多くのバクテロイデス株にも存在する。ターゲティングガイドＲＮＡを発現する誘導型ＣＲＩＳＰＲカセットは、これらのバクテロイデス菌株の染色体に組込むことができ（実施例３および６に記載）、ターゲティングガイドＲＮＡを発現する特定の菌株のターゲットＣＲＩＳＰＲ殺滅は、ａＴｃインデューサーで処理することにより達成できる（実施例４、５および７に記載）。
ＮＢＵ２インテグラーゼ組換えｔＲＮＡ－ｓｅｒ部位（１３ｂｐ）は保存されており、公開されているゲノム配列から、バクテロイデス・セルロシリティカス、バクテロイデス・フラジリス、バクテロイデス・ヘルコジネス（Bacteroides helcogenes）、バクテロイデス・オバツス（Bacteroides ovatus）、バクテロイデス・サラニトロニス（Bacteroides salanitronis）バクテロイデス・ユニフォルミスおよびバクテロイデス・キシラニソルベンスを含む他の多くのバクテロイデス株にも存在する。ターゲティングガイドＲＮＡを発現する誘導型ＣＲＩＳＰＲカセットは、これらのバクテロイデス菌株の染色体に組込むことができ（実施例３および６に記載）、ターゲティングガイドＲＮＡを発現する特定の菌株のターゲットＣＲＩＳＰＲ殺滅は、ａＴｃインデューサーで処理することにより達成できる（実施例４、５および７に記載）。
【0088】
特定の種の染色体上にＮＢＵ２インテグラーゼ部位がない状況では、これらの１３塩基対のＤＮＡ配列は、組換え（Ｃｒｅ／ｌｏｘＰなど）によるか、または当技術分野で知られているアレル交換を介して、染色体に容易に挿入でき、染色体ＣＲＩＳＰＲ組込みおよび標的株殺滅を可能にする。
【0089】
実施例９．ヒトプロバイオティクスとして送達されるＣＲＩＳＰＲ組込みバクテロイデス菌株
ＣＲＩＳＰＲを組込まれたバクテロイデス菌株は、ヒトの腸内の野生型バクテロイデス菌株の相対的な存在量を減らす方法として使用できる。ヒト黒色腫患者における抗ＰＤ－１免疫療法は、腸内細菌叢におけるバクテロイデス菌株の存在に応じて異なることが示されている（Gopalakrishnan et al., Science, 2018, 359:97-103）。非応答者は、免疫療法応答者と比較したとき、微生物叢中のバクテロイデス菌株の相対量が増加している。免疫療法を開始する前に、誘導された組込みＣＲＩＳＰＲシステムを介したバクテロイデス菌株の除去を行い、ヒトの癌免疫療法の結果を改善できる。
ＣＲＩＳＰＲを組込まれたバクテロイデス菌株は、ヒトの腸内の野生型バクテロイデス菌株の相対的な存在量を減らす方法として使用できる。ヒト黒色腫患者における抗ＰＤ－１免疫療法は、腸内細菌叢におけるバクテロイデス菌株の存在に応じて異なることが示されている（Gopalakrishnan et al., Science, 2018, 359:97-103）。非応答者は、免疫療法応答者と比較したとき、微生物叢中のバクテロイデス菌株の相対量が増加している。免疫療法を開始する前に、誘導された組込みＣＲＩＳＰＲシステムを介したバクテロイデス菌株の除去を行い、ヒトの癌免疫療法の結果を改善できる。
【0090】
実施例１０．モデルヒト腸内細菌叢のバクテロイデスメンバーの発現におけるＣＲＩＳＰＲを標的とした減少
腸内細菌叢は、ヒトの健康ならびにさまざまな疾患の多くの面の重要な決定要因である。宿主生物学に対するその無数の効果に対する評価が急速に高まっているため、微生物叢に直接作用する治療法を開発する取り組みが刺激されている。これらの新しい治療法の多くは、腸内細菌叢の初期構成に著しく依存していることが分かっている。そのため、微生物叢のメンバー間の生態学的関係（例えば、栄養素の競争／協力の基盤を含むニッチな分割）を明確にするためのツールは、効果的な微生物叢指向の治療法の進歩において重要な役割を果たす（例えば、Patnode et al., 2019）。
腸内細菌叢は、ヒトの健康ならびにさまざまな疾患の多くの面の重要な決定要因である。宿主生物学に対するその無数の効果に対する評価が急速に高まっているため、微生物叢に直接作用する治療法を開発する取り組みが刺激されている。これらの新しい治療法の多くは、腸内細菌叢の初期構成に著しく依存していることが分かっている。そのため、微生物叢のメンバー間の生態学的関係（例えば、栄養素の競争／協力の基盤を含むニッチな分割）を明確にするためのツールは、効果的な微生物叢指向の治療法の進歩において重要な役割を果たす（例えば、Patnode et al., 2019）。
【0091】
腸内細菌群集メンバー間の相互作用を研究するために、本発明者らは、定義されたモデルのヒト腸内細菌叢における特定の腸内細菌株の発現を独立して混乱させる能力を備えた遺伝子システムを開発した。このシステムは、健康な個体の成人の腸内細菌叢の著名かつ一般的なメンバーであるバクテロイデス・シータイオタオミクロンを用いて実施された。
【0092】
バクテロイデス・シータイオタオミクロン株ＶＰＩ－５４８２（Ｂｔ）で一連の変異株を生成した。変異体には、（ｉ）アンヒドロテトラサイクリン誘導型（ａＴｃ）ｓｐＣａｓ９遺伝子、（ｉｉ）エリスロマイシン耐性カセット、および（ｉｉｉ）無作為な非ゲノム配列（ネガティブ対照）、または２つＢｔ遺伝子（ｔｄｋおよびＳｕｓＣ）のうちの１つを標的とする構成的に活性なガイドＲＮＡが含まれていた。これらのカセットは、２つのゲノム位置の１つに組込まれている。これらの変異体を用いて、プレートアッセイおよび液体培養における強力なａＴｃ誘導性殺滅を記録した（図７Ａから図７Ｃ）。
【0093】
そのゲノムが配列決定された１３個の培養ヒト腸内細菌株のコンソーシアムで無菌マウスにコロニー形成させた（以下参照）。このコンソーシアムには、ｔｄｋを標的とするｇＲＮＡを含むＢｔ－ＣＲＩＳＰＲ変異体が含まれていた。マウスは単独で飼育され、飽和脂肪が多く果物や野菜が少ないヒト用の食餌を与えられた。低繊維の‘ＨｉＳＦ／ＬｏＦＶ’食には１０％（ｗ／ｗ）のエンドウ豆繊維が追加された。この配合は、このコミュニティ／食餌の状況でＢｔの相対存在量を１５～２０％に維持することが以前に示されていた（Patnode et al., 2019）。処置群では、強制経口投与（食餌）後１日または４日目に、飲料水に１０μｇ／ｍＬのａＴｃを補充した（図８Ａ）。それ以外の場合、強制経口投与後１日目以降、マウスは、０．５％エタノールのみを含む飲料水（すなわち、ａＴｃ溶解度を維持するために用いたビークル）を受けた。糞便ＤＮＡのショートリードショットガンシーケンシングを用いて、菌株レベルの解像度でコミュニティメンバーの相対的な存在量を定義した。さらに、哺乳動物の腸内には見いだされない２つの「スパイクイン」細菌分類群を含めることにより、生物の絶対量を定量化した(詳細については以下を参照)。
【0094】
結果は、４日間の処置群ではａＴｃ処理開始の２日後にＢｔの相対的存在量および絶対的存在量が３５分の１に減少し、早期処理条件でも同様の効果を有したことを明らかにした（相対的存在量の５０分の１の減少）。Ｂｔの存在量は、この最下点に達した後に増加し始めたが、対照群で観察されたレベルには達しなかった（図８Ｂ）。
【0095】
Ｂｔの枯渇は、他のいくつかのバクテロイデス属：B. cellulosilyticus 、B. ovatus およびB. caccaeの相対存在量の顕著な変化を伴った（図８Ｃ、Ｄ；線形混合モデル限界平均値Ｐ＜０．０５）。Ｂｔおよびこれらの他のバクテロイデスの絶対存在量の変化のパターンは、相対存在量の測定値と平行していた。
【0096】
関連する試験において、マウスは、ＷＴ Ｂｔ株を含む１３個のメンバーのコミュニティ、またはＢｔを除く１２個のメンバーのコミュニティでコロニーを形成させた。これらのマウスを単独で飼育し、強制経口投与後２０日間、ＨｉＳＦ／ＬｏＦＶ＋１０％エンドウ豆繊維食餌を自由摂取させた。連続的に採取した糞便サンプルから分離されたＤＮＡのＣＯＰＲＯ－Ｓｅｑ分析により、コンソーシアムの設置前にＷＴ Ｂｔを排除すると、これらの他のバクテロイデスの相対的／絶対的存在量が変化し、ＣＲＩＳＰＲ－Ｂｔノックダウンの効果とほぼ一致することが明らかになった（図９Ａから図９Ｂ）。
【0097】
Ａ．インビトロ増殖アッセイ
すべての増殖アッセイは、３％水素、２０％ＣＯ２、および７７％Ｎ２の雰囲気下で、ソフトサイド嫌気性増殖チャンバー（Coy Laboratory Products）内で行われた。アンヒドロテトラサイクリン塩酸塩（３７９１９、Millipore Sigma）のストック溶液をエタノール中で２ｍｇ／ｍＬに調製し、フィルター滅菌した（Millipore Sigma SLGV033RS）。Ｂｔ変異体のストックを連続希釈し、血液寒天プレート±２００ｎｇ／ｍＬアンヒドロテトラサイクリン上に播種した。２日間の増殖後、プレートを画像化した。Ｂｔ変異体のグリセロールストックをコロニー精製し、２５μｇ／ｍＬエリスロマイシンを含む５ｍＬ ＬＹＢＨＩに播種した。一晩のインキュベーション後、培養物を９ｎｇ／ｍＬ ａＴｃを含むＬＹＢＨＩ培地で１：５０に希釈し、２００μＬのアリコートを９６ウェルフルエリアプレート（Costar;カタログ番号;CLS3925）のウェルにピペット注入した。プレートを、光学的に透明な膜（Axygen;カタログ番号;UC500）で密封し、３７℃にて１５分毎に、光学密度（６００ｎｍ）を介して増殖をモニターした（Biotek Eon with BioStack 4）。
すべての増殖アッセイは、３％水素、２０％ＣＯ２、および７７％Ｎ２の雰囲気下で、ソフトサイド嫌気性増殖チャンバー（Coy Laboratory Products）内で行われた。アンヒドロテトラサイクリン塩酸塩（３７９１９、Millipore Sigma）のストック溶液をエタノール中で２ｍｇ／ｍＬに調製し、フィルター滅菌した（Millipore Sigma SLGV033RS）。Ｂｔ変異体のストックを連続希釈し、血液寒天プレート±２００ｎｇ／ｍＬアンヒドロテトラサイクリン上に播種した。２日間の増殖後、プレートを画像化した。Ｂｔ変異体のグリセロールストックをコロニー精製し、２５μｇ／ｍＬエリスロマイシンを含む５ｍＬ ＬＹＢＨＩに播種した。一晩のインキュベーション後、培養物を９ｎｇ／ｍＬ ａＴｃを含むＬＹＢＨＩ培地で１：５０に希釈し、２００μＬのアリコートを９６ウェルフルエリアプレート（Costar;カタログ番号;CLS3925）のウェルにピペット注入した。プレートを、光学的に透明な膜（Axygen;カタログ番号;UC500）で密封し、３７℃にて１５分毎に、光学密度（６００ｎｍ）を介して増殖をモニターした（Biotek Eon with BioStack 4）。
【0098】
Ｂ．ノトバイオート（Gnotobiotic）マウス
飼育－ マウスを伴うすべての試験は、セントルイスのワシントン大学の動物研究委員会によって承認されたプロトコールに従って実施した。無菌の雄のＣ５７／Ｂ６マウス（１８－２２週齢）を、薄膜の柔軟なプラスチック製アイソレータ内にあるケージに単独飼いし、オートクレーブ可能なマウスチャウ（Envigo；カタログ番号：2018S）を給餌した。ケージには環境エンリッチメントのための紙製ハウスを入れた。動物を、厳密な明暗サイクル（０６００時に点灯、１９００時間に消灯）で維持した。
飼育－ マウスを伴うすべての試験は、セントルイスのワシントン大学の動物研究委員会によって承認されたプロトコールに従って実施した。無菌の雄のＣ５７／Ｂ６マウス（１８－２２週齢）を、薄膜の柔軟なプラスチック製アイソレータ内にあるケージに単独飼いし、オートクレーブ可能なマウスチャウ（Envigo；カタログ番号：2018S）を給餌した。ケージには環境エンリッチメントのための紙製ハウスを入れた。動物を、厳密な明暗サイクル（０６００時に点灯、１９００時間に消灯）で維持した。
【0099】
ＨｉＳＦ／ＬｏＦＶ＋１０％エンドウ豆繊維は、全米健康栄養調査（ＮＨＡＮＥＳ）データベース１からの消費パターンに基づいて選択したヒト食品を用いて製造した。食餌を粉末に粉砕し（Ｄ９０粒子サイズ、９８０ｍｍ）、１０％（ｗ／ｗ）の食物繊維（Rattenmaier；カタログ番号：Pea Fiber EF 100）と混合した。次に、この混合物をペレットに押し出した。このペレットを包装して真空密封し、ガンマ線照射により滅菌した（２０～５０キログラム）。無菌性は、ＴＹＧ培地を用いて３７℃にて好気的条件および嫌気的条件（雰囲気、７５％Ｎ２、２０％ＣＯ２、５％Ｈ２）で培養し、この飼料を無菌マウスに与えた後にその糞便ＤＮＡをショートリードショットガンシーケンス（Community PROfiling by sequencing、COPRO-Seq）解析することによって確認した。
【0100】
０．５％エタノールまたは１０μｇ／ｍＬ ａＴＣを含む新鮮な滅菌飲料水を、ノトバイオート・アイソレーターに１日おきに調製した。
【0101】
コロニー形成－ Bacteroides caccae TSDC17.2-1.2、Bacteroides finegoldii TSDC17.2-1.1、Bacteroides massiliensis TSDC17.2-1.1、Collinsella aerofaciens TSDC17.2-1.1、Escherichia coli TSDC17.2-1.2、Odoribacter splanchnicus TSDC17.2-1.2、Parabacteroides distasonis TSDC17.2-1.1、Ruminococcaceae sp。TSDC17.2-1.2、およびSubdoligranulum variabile TSDC17.2-1.1を、肥満において一致しない双子ペア［Ridaura et al. (2013) の Twin Pair 1］のうち、痩せた双子の一方から採取した糞便サンプルから培養した。これらの単離株、およびバクテロイデス・オバタスＡＴＣＣ ８４８３、バクテロイデス・バルガタスＡＴＣＣ ８４８２、バクテロイデス・シータイオタオミクロンＶＰＩ－５４８２およびバクテロイデス・セルロシリティカスＷＨ２の注釈付きゲノム配列は、Patnode et al 2019に記載されている。バクテロイデス・シータイオタオミクロンＶＰＩ－５４８２変異体は、上記で定義されたプロトコールに従って生成された。これらの１３株のそれぞれをコロニー精製し、ＴＹＧまたはＬＹＢＨＩ培地中で初期定常期まで増殖させた（Goodman et al., 2019）。単培養物のアリコートを、１５％グリセロール中で－８０℃にて保存した。等価数の生物をプールし（ＯＤ６００測定に基づく）、アリコートを用いるまで－８０℃で１５％グリセロール中に維持した。試験０日目に、アリコートを解凍し、ノトバイオートアイソレーターに導入した。細菌コンソーシアムを、プラスチックチップの経口ガベージ針を通して無菌マウスに投与した（総容量、マウスあたり３００μＬ）。
【0102】
マウスを、コロニー形成の前に４日間、無補給のＨｉＳＦ／ＬｏＦＶ食餌の自由摂食に切り替えた。コロニー形成後、マウスは１０%のエンドウ豆繊維を添加したＨｉＳＦ／ＬｏＦＶを開始した。強制経口投与の１日後、０．５％エタノールまたはアンヒドロテトラサイクリン（１０μｇ／ｍＬ）を含む飲料水を全マウスに開始した。コロニー形成後およびａＴｃ離脱後、床敷（Aspen Woodchips; Northeastern Products）を取り替えた。糞便サンプルを、試験０－８日目に各動物から排便後数秒以内に採取し、直ちに－８０℃で凍結した。
【0103】
Ｃ．ＣＯＰＲＯ－Ｓｅｑによるコミュニティメンバーの相対的存在量および絶対的存在量の解析
凍結糞便サンプルおよび糞便内容物（安楽死時に採取）を１．８ｍＬスクリュートップチューブで秤量した。哺乳動物の微生物叢には見いだされない２つの細菌株を、既知の濃度で各サンプルチューブに「スパイクイン」した［２．２２×１０８ 細胞／ｍＬ アリシクロバチラス・アシディフィラス（Alycyclobacillus acidiphilus ＤＳＭ １４５５８および９．９３×１０８ 細胞／ｍＬ アグロバクテリウム・ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter） ＤＳＭ ３０１４７の両方を３０μＬずつ］。ＤＮＡ抽出は、２５０μＬの０．１ｍｍジルコニア／シリカビーズおよび１個の３．９７ｍｍスチールボールを５００μＬの２ｘバッファーＡ（２００ ｍＭ Ｔｒｉｓ、２００ ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ）、２１０μＬ ２０％ （ｗｔ：ｗｔ）ドデシル硫酸ナトリウム、５００μＬフェノール：クロロホルム：アミルアルコール（２５：２４：１）中で４分間、ビーズ法（bead-beating）サンプルから始めた（Biospec Minibeadbeater-96）。３，２２０ｇで４分間遠心分離した後、４２０μＬの水相を除去し、製造元のプロトコールに従って精製した（QIAquick 96 PCR purification kit; Qiagen）。
凍結糞便サンプルおよび糞便内容物（安楽死時に採取）を１．８ｍＬスクリュートップチューブで秤量した。哺乳動物の微生物叢には見いだされない２つの細菌株を、既知の濃度で各サンプルチューブに「スパイクイン」した［２．２２×１０８ 細胞／ｍＬ アリシクロバチラス・アシディフィラス（Alycyclobacillus acidiphilus ＤＳＭ １４５５８および９．９３×１０８ 細胞／ｍＬ アグロバクテリウム・ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter） ＤＳＭ ３０１４７の両方を３０μＬずつ］。ＤＮＡ抽出は、２５０μＬの０．１ｍｍジルコニア／シリカビーズおよび１個の３．９７ｍｍスチールボールを５００μＬの２ｘバッファーＡ（２００ ｍＭ Ｔｒｉｓ、２００ ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ）、２１０μＬ ２０％ （ｗｔ：ｗｔ）ドデシル硫酸ナトリウム、５００μＬフェノール：クロロホルム：アミルアルコール（２５：２４：１）中で４分間、ビーズ法（bead-beating）サンプルから始めた（Biospec Minibeadbeater-96）。３，２２０ｇで４分間遠心分離した後、４２０μＬの水相を除去し、製造元のプロトコールに従って精製した（QIAquick 96 PCR purification kit; Qiagen）。
【0104】
Nextera DNA Library Prep Kit （Illumina; カタログ番号: 15028211）およびカスタムバーコードプライマー（Ａｄｅｙ）の組み合わせを用いて、精製ＤＮＡからシーケンスライブラリーを調製した。ライブラリーは、Illumina NextSeq装置を用いて配列決定した［リード長、７５ｎｔ；配列決定深度、１．０２ ｘ １０６ ± ２．２ ｘ １０４ リード／サンプル（平均±ＳＤ）］。リードは、Ｂｏｗｔｉｅ ＩＩで細菌ゲノム上にマッピングされ、相対的存在量は、情報量の多いゲノムサイズでスケーリングしたリードカウントを用いて計算した（Hibberd et al., 2017）。１００，０００リード未満のサンプルは、さらなる解析から除外した。本発明者らは、与えられたコミュニティメンバーの絶対的存在量を、以下の関係を用いて定義した：
【数1】
【0105】
Ｄ．線形モデリング
強制経口投与の４～７日後のビークル対照群および４日間処置群からの相対存在量データを、線形モデル（R core team, 2018）を用いて、以下の形式でモデル化した：
ｌｍ（ｌｏｇ１０（ｐｅｒｃｅｎｔ） ～ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ＊ＤＰＧ, ｄａｔａ ＝ ｄａｔａ）。
推定周辺平均（Lenth, 2019）を用いて、各日による条件の効果を、応答尺度上で有意さについて試験した。
強制経口投与の４～７日後のビークル対照群および４日間処置群からの相対存在量データを、線形モデル（R core team, 2018）を用いて、以下の形式でモデル化した：
ｌｍ（ｌｏｇ１０（ｐｅｒｃｅｎｔ） ～ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ＊ＤＰＧ, ｄａｔａ ＝ ｄａｔａ）。
推定周辺平均（Lenth, 2019）を用いて、各日による条件の効果を、応答尺度上で有意さについて試験した。
【0106】
実施例１１．ベクター構築
安定に維持されたＲｅｐＡ ＣＲＩＳＰＲプラスミドを、ｐＥｘｃｈａｎｇｅｔｄｋからのプラスミド骨格（ＲＰ４－ｏｒｉＴ、Ｒ６Ｋ ｏｒｉ、ｂｌａ、ｅｒｍＧ）、ｐＢＩ１４３からのＲｅｐＡ（Smith et al, Plasmid, 1995, 34:211-222）、および合成ＤＮＡまたはストレプトコッカス・ピオゲネス株ＳＦ３７０のゲノムＤＮＡのＰＣＲから組み立てられたアンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）誘導型ＣＲＩＳＰＲカセット（Ｐ２－Ａ２１－ｔｅｔＲ、Ｐ１ＴＤＰ－ＧＥＦ０２３－ＳｐＣａｓ９、Ｐ１－Ｎ２０ ｓｇＲＮＡ ｓｃａｆｆｏｌｄ）を用いてギブソンクローニング法により構築した。図１０は、プラスミドデザインを示す。
安定に維持されたＲｅｐＡ ＣＲＩＳＰＲプラスミドを、ｐＥｘｃｈａｎｇｅｔｄｋからのプラスミド骨格（ＲＰ４－ｏｒｉＴ、Ｒ６Ｋ ｏｒｉ、ｂｌａ、ｅｒｍＧ）、ｐＢＩ１４３からのＲｅｐＡ（Smith et al, Plasmid, 1995, 34:211-222）、および合成ＤＮＡまたはストレプトコッカス・ピオゲネス株ＳＦ３７０のゲノムＤＮＡのＰＣＲから組み立てられたアンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）誘導型ＣＲＩＳＰＲカセット（Ｐ２－Ａ２１－ｔｅｔＲ、Ｐ１ＴＤＰ－ＧＥＦ０２３－ＳｐＣａｓ９、Ｐ１－Ｎ２０ ｓｇＲＮＡ ｓｃａｆｆｏｌｄ）を用いてギブソンクローニング法により構築した。図１０は、プラスミドデザインを示す。
【0107】
プラスミド骨格は、大腸菌のアンピシリン選択のためのＲ６Ｋ複製起源およびＢｌａ配列、バクテロイデス属の複製のためのｒｅｐＡ配列、コンジュゲーション用のＲＰ４－ｏｒｉＴ配列およびバクテロイデス属のエリスロマイシン（Ｅｍ）選択のためのｅｒｍＧ配列を担持する。
【0108】
誘導型ＣＲＩＳＰＲカセットは、ＴｅｔＲレギュレーターの制御下にあるａＴｃ誘導性ＳｐＣａｓ９（P2-A21-tetR、P1TDP-GH023-SpCas9）、およびＰ１プロモーター下で構成的に発現されるガイドＲＮＡ（P1-N20 sgRNA scaffold）を含む。プロモーターおよびリボソーム結合部位は、Lim et al.、Cell、2017、169:547-558に記載の、バクテロイデス・シータイオタオミクロン １６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の調節配列に由来し設計される。ガイドＲＮＡは、コーディングＤＮＡ配列、または非コーディングＤＮＡ配列、または非ターゲティングスクランブルヌクレオチド配列と相同性を有するヌクレオチド配列である。この配列は、異なるＣａｓ９ホモログのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）要求に適合する限り、何れの形態であってもよい。ガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡの別々の転写単位であるか、またはハイブリッドキメラｔｒａｃｒ／ｃｒＲＮＡシングルガイド（ｓｇＲＮＡ）に融合されるかのいずれかであり得る。
【0109】
上記プラスミドのＤＮＡ配列は、配列番号９に示される。
【表8】
【表9】
【表10】
【表11】
【表12】
【表13】
【表14】
【0110】
実施例１２．個々のバクテロイデス・シータイオタオミクロン株の誘導性ＣＲＩＳＰＲ殺滅
抗生物質選択をしないBrain Heart Infusion（ＢＨＩ）血液寒天プレート上で、２つの安定に維持されたプラスミドをバクテロイデス・シータイオタオミクロンにコンジュゲートさせた。一方のプラスミドは、スクランブルされた非標的化プロトスペーサー配列（５’－ＴＧＡＴＧＧＡＧＡＧＧＴＧＣＡＡＧＴＡＧ－３’；配列番号６）を有する陰性対照（“Ｍ”と称する）であった。この非ターゲティング対照プロトスペーサー配列のバクテロイデスゲノムに対するインシリコ解析では、有意な配列の一致は見られなかったため、‘オフターゲット’活性は予期されない。もう一方のプラスミドは、Ｂｔゲノム上のｓｕｓＣ＿Ｂｔ （ＢＴ＿３７０２）コーディング配列を標的とするプロトスペーサー配列（５’－ＡＴＧＡＣＧＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣＣＣＡＧ－３’；配列番号５）を有する。ｓｕｓＣ遺伝子はバクテロイデス・シータイオタオミクロンにおけるデンプン結合に関与する外膜たんぱく質をコードしている。ｓｇＲＮＡの骨格配列は、５’－ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＴ－３’（配列番号７）である。得られた２つのプラスミドをｐＲｅｐＡ－ＣＲＩＳＰＲ.Ｍａｎｄ ｐＲｅｐＡ－ＣＲＩＳＰＲ.ｓｕｓＣ_Ｂｔと呼ぶ。コロニーを採取し、２００μｇ／ｍｌのゲンタミン（Ｇｍ）および５０μｇ／ｍｌのエリスロマイシン（Ｅｍ）を加えたＢＨＩ血液寒天プレートに再播種し、コイチャンバー（Coy Laboratory Products Inc）上で嫌気的に増殖させた。この再播種プレートから単一コロニーを採取し、１０ｍｌのＴＹＧ液体培地で２００μｇ/ｍｌ Ｇｍおよび５０μｇ/ｍｌ Ｅｍで増殖させた。ＯＤ６００ｎｍを測定し、ＯＤが１になるように濃度を調整し、１ｍｌ容量で１～１０倍希釈した。２００μｇ／ｍｌのゲンタミン（Ｇｍ）および５０μｇ／ｍｌのエリスロマイシン（Ｅｍ）にそれぞれ０んｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌの濃度のアンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）を添加したＢＨＩ血液寒天プレートに２種の希釈液（１０－４および１０－６）の１００μｌを播種した。寒天培地は嫌気的に３７℃にて２～３日間培養した。ａＴｃを含まない血液寒天培地プレート（０ｎｇ／ｍｌ）では、すべての株でコロニー形成単位（ＣＦＵ）が得られた。ｓｕｓＣ標的化プラスミドについてａＴｃが存在する（１００ｎｇ／ｍｌ）血液寒天プレート上ではＣＦＵ形成が観察されなかったが、Ｍ株については依然としてＣＦＵが得られた（図１１Ａ～Ｄ）。
抗生物質選択をしないBrain Heart Infusion（ＢＨＩ）血液寒天プレート上で、２つの安定に維持されたプラスミドをバクテロイデス・シータイオタオミクロンにコンジュゲートさせた。一方のプラスミドは、スクランブルされた非標的化プロトスペーサー配列（５’－ＴＧＡＴＧＧＡＧＡＧＧＴＧＣＡＡＧＴＡＧ－３’；配列番号６）を有する陰性対照（“Ｍ”と称する）であった。この非ターゲティング対照プロトスペーサー配列のバクテロイデスゲノムに対するインシリコ解析では、有意な配列の一致は見られなかったため、‘オフターゲット’活性は予期されない。もう一方のプラスミドは、Ｂｔゲノム上のｓｕｓＣ＿Ｂｔ （ＢＴ＿３７０２）コーディング配列を標的とするプロトスペーサー配列（５’－ＡＴＧＡＣＧＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣＣＣＡＧ－３’；配列番号５）を有する。ｓｕｓＣ遺伝子はバクテロイデス・シータイオタオミクロンにおけるデンプン結合に関与する外膜たんぱく質をコードしている。ｓｇＲＮＡの骨格配列は、５’－ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＴ－３’（配列番号７）である。得られた２つのプラスミドをｐＲｅｐＡ－ＣＲＩＳＰＲ.Ｍａｎｄ ｐＲｅｐＡ－ＣＲＩＳＰＲ.ｓｕｓＣ_Ｂｔと呼ぶ。コロニーを採取し、２００μｇ／ｍｌのゲンタミン（Ｇｍ）および５０μｇ／ｍｌのエリスロマイシン（Ｅｍ）を加えたＢＨＩ血液寒天プレートに再播種し、コイチャンバー（Coy Laboratory Products Inc）上で嫌気的に増殖させた。この再播種プレートから単一コロニーを採取し、１０ｍｌのＴＹＧ液体培地で２００μｇ/ｍｌ Ｇｍおよび５０μｇ/ｍｌ Ｅｍで増殖させた。ＯＤ６００ｎｍを測定し、ＯＤが１になるように濃度を調整し、１ｍｌ容量で１～１０倍希釈した。２００μｇ／ｍｌのゲンタミン（Ｇｍ）および５０μｇ／ｍｌのエリスロマイシン（Ｅｍ）にそれぞれ０んｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌの濃度のアンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）を添加したＢＨＩ血液寒天プレートに２種の希釈液（１０－４および１０－６）の１００μｌを播種した。寒天培地は嫌気的に３７℃にて２～３日間培養した。ａＴｃを含まない血液寒天培地プレート（０ｎｇ／ｍｌ）では、すべての株でコロニー形成単位（ＣＦＵ）が得られた。ｓｕｓＣ標的化プラスミドについてａＴｃが存在する（１００ｎｇ／ｍｌ）血液寒天プレート上ではＣＦＵ形成が観察されなかったが、Ｍ株については依然としてＣＦＵが得られた（図１１Ａ～Ｄ）。
【0111】
実施例１３．べクター構築
ＣＲＩＳＰＲ組み込みｐＮＢＵ２．ＣＲＩＳＰＲプラスミドを、ｐＥｘｃｈａｎｇｅｔｄｋからのプラスミド骨格（ＲＰ４－ｏｒｉＴ、Ｒ６Ｋ ｏｒｉ、ｂｌａ、ｅｒｍＧ）、ｐＮＢＵ２－ｔｅｔＱｂからのＮＢＵ２インテグラーゼ、および化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）株ＳＦ３７０の合成ＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのＰＣＲから作製されたアンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）誘導型ＣＲＩＳＰＲカセット（P2-A21-tetR、P1TDP-GH023-SpCas9、P1-N20 sgRNAスキャフォールド）を用いてギブソンクローニング（NEBuild HIFI DNA Assembly Master Mix、New England Biolabs）により構築した。エリスロマイシン（ｅｒｍＧ）抗生物質耐性遺伝子は、合成ＤＮＡおよび従来の制限酵素クローニングを用いて、セフォキシチン抗生物質耐性遺伝子（ｃｆｘＡ）に置換した。図１２は、プラスミド設計を示す。
ＣＲＩＳＰＲ組み込みｐＮＢＵ２．ＣＲＩＳＰＲプラスミドを、ｐＥｘｃｈａｎｇｅｔｄｋからのプラスミド骨格（ＲＰ４－ｏｒｉＴ、Ｒ６Ｋ ｏｒｉ、ｂｌａ、ｅｒｍＧ）、ｐＮＢＵ２－ｔｅｔＱｂからのＮＢＵ２インテグラーゼ、および化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）株ＳＦ３７０の合成ＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのＰＣＲから作製されたアンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）誘導型ＣＲＩＳＰＲカセット（P2-A21-tetR、P1TDP-GH023-SpCas9、P1-N20 sgRNAスキャフォールド）を用いてギブソンクローニング（NEBuild HIFI DNA Assembly Master Mix、New England Biolabs）により構築した。エリスロマイシン（ｅｒｍＧ）抗生物質耐性遺伝子は、合成ＤＮＡおよび従来の制限酵素クローニングを用いて、セフォキシチン抗生物質耐性遺伝子（ｃｆｘＡ）に置換した。図１２は、プラスミド設計を示す。
【0112】
プラスミド骨格は、大腸菌のアンピシリン選択のためのＲ６Ｋ複製起源およびＢｌａ配列、コンジュゲーション用のＲＰ４－ｏｒｉＴ配列およびバクテロイデス属のセフォキシチン（ＦＯＸ）選択用のｃｆｘＡ配列を担持する（Parker and Smith、Antimicrobial agents and Chemotherapy、1993、37: 1028-1036）。ＮＢＵ２は、ｐＮＢＵ２－ＣＲＩＳＰＲプラスミド上のａｔｔＮ２部位とバクテロイデス細胞の染色体上に存在するａｔｔＢ部位の一つとの間の配列特異的組換えに介在するｉｎｔＮ２チロシンインテグラーゼをコードしている。ａｔｔＮ２およびａｔｔＢは同じ１３ｂｐの認識塩基配列（５’－３’）：ＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＣ（配列番号２）を有している。
【0113】
誘導型ＣＲＩＳＰＲカセットは、ＴｅｔＲレギュレーターの制御下にあるａＴｃ誘導性ＳｐＣａｓ９（Ｐ２－Ａ２１－ｔｅｔＲ、Ｐ１ＴＤＰ－ＧＨ０２３－ＳｐＣａｓ９）、およびＰ１プロモーター下で構成的に発現するガイドＲＮＡ（Ｐ１－Ｎ２０ ｓｇＲＮＡ ｓｃａｆｆｏｌｄ）を含む。プロモーター結合部位およびリボソーム結合部位は、Lim et al.、Cell、2017、169:547-558に記載の、バクテロイデス・シータイオタオミクロン １６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の調節配列に由来し設計される。ガイドＲＮＡは、コーディングＤＮＡ配列、または非コーディングＤＮＡ配列、または非標的化スクランブルヌクレオチド配列と相同性を有するヌクレオチド配列である。この配列は、異なるＣａｓ９ホモログのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）要件に適合する限り、何れの形態であってもよい。ガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡの別々の転写単位であるか、またはハイブリッドキメラｔｒａｃｒ／ｃｒＲＮＡシングルガイド（ｓｇＲＮＡ）に融合されるかのいずれかであり得る。
【0114】
【0115】
実施例１４．バクテロイデス・セルロシリティカスＷＨ２の染色体へのＣＲＩＳＰＲ組込み
ＮＢＵ２－ＣＲＩＳＰＲププラスミドを大腸菌Ｓ－１７ ラムダｐｉｒに形質転換し、次いでコンジュゲーションを介してバクテロイデス・セルロシリティカスＨ２細細胞へ送達した。この具体例では、ＮＢＵ２－ＣＲＩＳＰＲププラスミドは、ＮＢＵ２－ＣＲＩＳＰＲプラスミド上のａｔｔＮ２部位と、バクテロイデス・セルロシリティカスＷＨ２（略称ＢＷＨ２）の染色体上の２つのｔＲＮＡ－Ｓｅｒ遺伝子ＢｃｅｌｌＷＨ２＿ＲＳ２２７９５またはＢｃｅｌｌＷＨ２＿ＲＳ２３０００、あるいは非コード領域（塩基座標６０７１７９１－６０７１８０３）の３’末端に位置する３つのａｔｔＢＷＨ２部位のうちの１つとの間の配列特異的組換えに介在するｉｎｔＮ２チロシンインテグラーゼをコードしている。上の３’末端に位置する３つのａｔｔＢＷＨ２サイトのうちの１つを選択することができる。ｐＮＢＵ２－ＣＲＩＳＰＲプラスミドを挿入すると、２つのｔＲＮＡ－Ｓｅｒ遺伝子のうち１つを不活性化する可能性があり（非コーディング領域に挿入した場合はｔＲＮＡ－Ｓｅｒ遺伝子を不活性化しない）、ｔＲＮＡ－Ｓｅｒの必須性から両方のｔＲＮＡ－Ｓｅｒ遺伝子への同時挿入はあり得ない。
ＮＢＵ２－ＣＲＩＳＰＲププラスミドを大腸菌Ｓ－１７ ラムダｐｉｒに形質転換し、次いでコンジュゲーションを介してバクテロイデス・セルロシリティカスＨ２細細胞へ送達した。この具体例では、ＮＢＵ２－ＣＲＩＳＰＲププラスミドは、ＮＢＵ２－ＣＲＩＳＰＲプラスミド上のａｔｔＮ２部位と、バクテロイデス・セルロシリティカスＷＨ２（略称ＢＷＨ２）の染色体上の２つのｔＲＮＡ－Ｓｅｒ遺伝子ＢｃｅｌｌＷＨ２＿ＲＳ２２７９５またはＢｃｅｌｌＷＨ２＿ＲＳ２３０００、あるいは非コード領域（塩基座標６０７１７９１－６０７１８０３）の３’末端に位置する３つのａｔｔＢＷＨ２部位のうちの１つとの間の配列特異的組換えに介在するｉｎｔＮ２チロシンインテグラーゼをコードしている。上の３’末端に位置する３つのａｔｔＢＷＨ２サイトのうちの１つを選択することができる。ｐＮＢＵ２－ＣＲＩＳＰＲプラスミドを挿入すると、２つのｔＲＮＡ－Ｓｅｒ遺伝子のうち１つを不活性化する可能性があり（非コーディング領域に挿入した場合はｔＲＮＡ－Ｓｅｒ遺伝子を不活性化しない）、ｔＲＮＡ－Ｓｅｒの必須性から両方のｔＲＮＡ－Ｓｅｒ遺伝子への同時挿入はあり得ない。
【0116】
非ターゲティング対照ガイド（“Ｍ”と称する）、ｔｄｋ＿ＢＷＨ２（ＢｃｅｌｌＷＨ２＿ＲＳ１７９７５）を標的とする２つのガイドＲＮＡ（“Ｔ２”および“Ｔ３”と称する）ならびにｓｕｓＣ＿ＢＷＨ２（ＢｃｅｌｌＷＨ２＿ＲＳ２６２９５）を標的とする２つのガイドＲＮＡ（“Ｓ６”および“Ｓ１９”と称する）を発現する５つのプラスミドを構築した。ｔｄｋ遺伝子はチミジンキナーゼをコードし、ｓｕｓＣ遺伝子はバクテロイデス・セルロシリティカス ＷＨ２のデンプン結合に関与するＳｕｓＣ／ＲａｇＡファミリーＴｏｎ－Ｂ結合型外膜タンパク質をコードしている。ｔｄｋ＿ＢＷＨ２の２つのプロトスペーサー配列は、Ｔ２（５’－ＡＴＡＣＡＧＧＡＡＡＣＣＡＡＴＣＧＴＡＧ－３’；配列番号１１）およびＴ３（５’－ＧＧＡＡＧＡＡＴＣＧＡＡＧＴＴＡＴＡＴＧ－３’；配列番号１２）であり、ｓｕｓＣ＿ＢＷＨ２についてはＳ６（５’－ＡＡＴＣＣＡＣＴＧＧＡＴＧＣＣＡＴＣＣＧ－３’；配列番号１３）およびＳ１９（５’－ＧＣＴＴＡＴＧＴＣＴＡＴＣＴＡＴＣＣＧＧ－３’；配列番号１４）である。バクテロイデスゲノムに対する非ターゲティング対照プロトスペーサー配列Ｍ（５’－ＴＧＡＴＧＧＡＧＡＧＧＴＧＣＡＡＧＴＡＧ－３’；配列番号６）のインシリコ分析は、有意な配列一致をもたらさなかったため、“オフターゲット”活性は予期されない。ｓｇＲＮＡ足場配列は、５’ ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＴ－３’（配列番号７）であった。得られたプラスミドをｐＮＢＵ２－ＣＲＩＳＰＲ．Ｍ＿ＢＷＨ２、ｐＮＢＵ２－ＣＲＩＳＰＲ．ｔｄｋ＿ＢＷＨ２－２、ｐＮＢＵ２－ＣＲＩＳＰＲ．ｔｄｋ＿ＢＷＨ２－３、ｐＮＢＵ２－ＣＲＩＳＰＲ．ｓｕｓＣ＿ＢＷＨ２－６およびｐＮＢＵ２－ＣＲＩＳＰＲ．ｓｕｓＣ＿ＢＷＨ２－１９と称する。
【0117】
セフォキシチン耐性を有するｐＮＢＵ２－ＣＲＩＳＰＲプラスミド上のａｔｔＮ２部位とバクテロイデス・セルロシリティカスＷＨ２ゲノム中の３つのａｔｔＢＷＨ２部位のうちの１つとの間の標的挿入の例を図１３Ａ－Ｂに示す。プラスミドｐＮＢＵ２－ＣＲＩＳＰＲ.ｓｕｓＣ_ＢＷＨ２－１９は、ｔ－ＲＮＡ－Ｓｅｒ遺伝子、ＢｃｅｌｌＷＨ２_ＲＳ２２７９５のａｔｔＢＷＨ２部位にのみ組込まれた。プラスミド組込み部位の５’末端を図１３Ａに、プラスミド組込み部位の３’末端を図１３Ｂに示す。配列決定はIllumina Next Gen Sequencing technologyを用いて行い、解析はGeneious align／assemble ソフトウェアを用いて行った。
【0118】
実施例１５．個々のバクテロイデス・セルロシリティカスＷＨ２株の誘導型ＣＲＩＳＰＲ殺滅
選択されたバクテロイデス・セルロシリティカスＷＨ２組込み体（Ｍ１、Ｍ２、Ｔ２、Ｔ３、Ｓ６およびＳ１９）について、ＴＹＧ液体培地中で誘導型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９介在細胞死について試験した。Ｍ１、Ｍ２、Ｔ２、Ｔ３、Ｓ６およびＳ１９の単一コロニー（Ｍ１およびＭ２は同じＭ非ターゲティング結合プレートからの別個のコロニー）を、２００μｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｇｍ）および１０μｇ／ｍｌセフォキシチン（ＦＯＸ）を補充したＴＹＧ液体培地５ｍｌを含むファルコンチューブ中で一晩、コイチャンバー（coy Laboratory Products Inc.）内で嫌気的に増殖させた。一晩培養したものを、ＴＹＧ培地でＯＤ６００ｎｍが１になるように規格化した。これらの標準化培養物を１：１００の比率で希釈し（２４．７５ ｍｌのＴＹＧ中、２５０μｌ）、種培養物を作製した。この２５ｍｌの種培養物を、新鮮な１５ｍｌのファルコンチューブ中５ｍｌの培養物に分注した。アンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）を０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌまたは１００ｎｇ／ｍｌのいずれかで５ｍｌの培養物に添加し、３７℃にて２４時間嫌気的に培養した。２４時間の増殖の後に読み取られたＯＤ６００ｎｍの測定値を図１４に示す。このデータは、染色体上に組込まれたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムが、外因的に提供された誘導体（ａＴｃ）によって活性化され、標的ＲＮＡ（tdk＿BWH2またはsusC＿BWH2）によって導かれる致死ゲノムＤＮＡ切断を生じ、結果として、細胞生存能の喪失をもたらすことを示す。
選択されたバクテロイデス・セルロシリティカスＷＨ２組込み体（Ｍ１、Ｍ２、Ｔ２、Ｔ３、Ｓ６およびＳ１９）について、ＴＹＧ液体培地中で誘導型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９介在細胞死について試験した。Ｍ１、Ｍ２、Ｔ２、Ｔ３、Ｓ６およびＳ１９の単一コロニー（Ｍ１およびＭ２は同じＭ非ターゲティング結合プレートからの別個のコロニー）を、２００μｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｇｍ）および１０μｇ／ｍｌセフォキシチン（ＦＯＸ）を補充したＴＹＧ液体培地５ｍｌを含むファルコンチューブ中で一晩、コイチャンバー（coy Laboratory Products Inc.）内で嫌気的に増殖させた。一晩培養したものを、ＴＹＧ培地でＯＤ６００ｎｍが１になるように規格化した。これらの標準化培養物を１：１００の比率で希釈し（２４．７５ ｍｌのＴＹＧ中、２５０μｌ）、種培養物を作製した。この２５ｍｌの種培養物を、新鮮な１５ｍｌのファルコンチューブ中５ｍｌの培養物に分注した。アンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）を０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌまたは１００ｎｇ／ｍｌのいずれかで５ｍｌの培養物に添加し、３７℃にて２４時間嫌気的に培養した。２４時間の増殖の後に読み取られたＯＤ６００ｎｍの測定値を図１４に示す。このデータは、染色体上に組込まれたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムが、外因的に提供された誘導体（ａＴｃ）によって活性化され、標的ＲＮＡ（tdk＿BWH2またはsusC＿BWH2）によって導かれる致死ゲノムＤＮＡ切断を生じ、結果として、細胞生存能の喪失をもたらすことを示す。
【0119】
文献
Goodman, A. L. et al. Identifying genetic determinants needed to establish a human gut symbiont in its habitat. Cell Host Microbe 6, 279-289 (2009).
Hibberd, M. C. et al. The effects of micronutrient deficiencies on bacterial species from the human gut microbiota. Sci. Transl. Med. 9, eaal4069 (2017).
Patnode, M. et al. Interspecies competition impacts targeted manipulation of human gut bacteria by fiber-derived glycans. Cell, 179(1), 59-73.
Lenth, R. (2019). emmeans: Estimated Marginal Means, aka Least-Squares Means. R package version 1.4.1. https://CRAN.R-project.org/package=emmeans.
Ridaura, V. K. et al. Gut microbiota from twins discordant for obesity modulate metabolism in mice. Science 341, 1241214.
R Core Team (2018). R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. URL https://www.R-project.org/.
Smith, C. J. et al. Nucleotide Sequence Determination and Genetic Analysis of the Bacteroides Plasmid, pBI143. Plasmid, 1995, 34:211-222
Lim et al. Engineered Regulatory Systems Modulate Gene Expression of Human Commensals in the Gut. Cell, 2017, 169:547-558
Goodman, A. L. et al. Identifying genetic determinants needed to establish a human gut symbiont in its habitat. Cell Host Microbe 6, 279-289 (2009).
Hibberd, M. C. et al. The effects of micronutrient deficiencies on bacterial species from the human gut microbiota. Sci. Transl. Med. 9, eaal4069 (2017).
Patnode, M. et al. Interspecies competition impacts targeted manipulation of human gut bacteria by fiber-derived glycans. Cell, 179(1), 59-73.
Lenth, R. (2019). emmeans: Estimated Marginal Means, aka Least-Squares Means. R package version 1.4.1. https://CRAN.R-project.org/package=emmeans.
Ridaura, V. K. et al. Gut microbiota from twins discordant for obesity modulate metabolism in mice. Science 341, 1241214.
R Core Team (2018). R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. URL https://www.R-project.org/.
Smith, C. J. et al. Nucleotide Sequence Determination and Genetic Analysis of the Bacteroides Plasmid, pBI143. Plasmid, 1995, 34:211-222
Lim et al. Engineered Regulatory Systems Modulate Gene Expression of Human Commensals in the Gut. Cell, 2017, 169:547-558
【図1】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4】
【図5-1】
【図5-2】
【図5-3】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8-1】
【図8-2】
【図9】
【図10】
【図11-1】
【図11-2】
【図11-3】
【図11-4】
【図12】
【図13-1】
【図13-2】
【図14】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2022-05-25
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0007】
【図4】図４Ａから図４Ｂは、組込み型ＣＲＩＳＰＲシステムを用いた個々のバクテロイデス菌株の誘導型ＣＲＩＳＰＲ殺滅（killing）を示す。図４Ａは血液寒天プレートでの結果を示す。選択したＣＲＩＳＰＲインテグレート（Ｍ１およびＴ１）について、ＴＹＧ＋Ｇｍ ２００、Ｅｍ ２５のチューブ培養物を希釈し、それぞれ０ｎｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌ濃度のアンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）を添加したＢＨＩ血液寒天プレート（Ｇｍ ２００、Ｅｍ ２５）に拡散させた（２４時間チューブ培養、１０－６希釈、１００μｌスプレッド）。細胞を３７℃にて４０時間嫌気的にインキュベートした。図４Ｂは、ＴＹＧ液体培地での結果を示す。選択されたＣＲＩＳＰＲインテグラント（Ｍ１、Ｍ２、Ｔ１、Ｔ３、Ｓ１、Ｓ２）を、ＴＹＧ培地中の新鮮なコロニーから３７℃にて６時間、ＯＤ６００ｎｍ～０．６まで嫌気的に増殖させ、それぞれ０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌの終濃度でａＴｃを補充した新鮮なＴＹＧ液体培地（Ｇｍ ２００、Ｅｍ ２５）への１ :１００希釈を行った。３７℃にて２４時間、嫌気性条件下での培養中に増殖を評価した。
【図5】図５Ａから図５Ｃは、インビトロでの混合集団における特定のバクテロイデス菌株の標的化された誘導性ＣＲＩＳＰＲ殺滅(killing)を示す。選択されたＣＲＩＳＰＲ組込み体（Ｍ１、Ｔ１、Ｓ１）を、ＴＹＧ培地中の新鮮なコロニーから３７℃にて６時間嫌気的にＯＤ６００ｎｍ～０．６まで増殖させた。等量の細胞培養物（１：１００希釈）を混合し、終濃度がそれぞれ０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌのａＴｃを添加した新鮮なＴＹＧ液体培地（Ｇｍ ２００、Ｅｍ ２５）に添加した。これらの培養物を３７℃にて２４時間嫌気的にインキュベートした。図５Ａ：ＯＤ６００ｎｍ測定。図５Ｂ：ガイドＲＮＡ領域（Ｃａｓ９およびＮＢＵ２をコードする配列に結合するプライマー、１．５ｋｂのアンプリコンサイズ）を増幅するＰＣＲを、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌおよび０ｎｇ／ｍｌの濃度のａＴｃで処理した培養物に対して実施し、次いでサンガーＤＮＡ配列決定を行った。ａＴｃで処理した培養物は、非ターゲティング対照ｇＲＮＡのみを有する。図５Ｂに示されるＤＮＡ配列は、上から下の順に、配列番号１５（４例）および配列番号１６（１例）である。図５Ｃ：Ｍ１＋Ｓ１_ａＴｃ１００の培養物を希釈し（１０－６）、ＢＨＩ血液寒天プレート（Ｇｍ２００、Ｅｍ２５）上に広げ、３７℃にて４０時間、嫌気的に培養し、単一コロニーを得た。選択した５つのシングルコロニーおよび寒天プレートから掻き出した混合物について、ガイドＲＮＡ領域を増幅するコロニーＰＣＲを行い、その後サンガーＤＮＡ配列決定を行い、増殖した全てのクローンが非標的、対照ｇＲＮＡのみを有していることが示された。図５Ｃに示されるＤＮＡ配列は、上から下の順に、それぞれ配列番号１７（７例）である。
【図6】図６は、バクテロイデス・ブルガータス（Bacteroides vulgatus (Bv)）の染色体へのＣＲＩＳＰＲ組込みを示す。各コンジュゲーションからのコロニー、Ｂｖ.Ｍ（ＶＭ１、ＶＭ２、ＶＭ３、ＶＭ４、ＶＭ５、ＶＭ６、ＶＭ７とラベル付け)、およびｓｕｓＣ_Ｂｖ（Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４、Ｖ５とラベル付け）をコロニーＰＣＲスクリーニング用に選択した。０、Ｂｖ野生型株；Ｍ、ＤＮＡラダー。ＰＣＲ Ａ（外側プライマー、０．５ｋｂまたは０ｋｂ）を用いて、ａｔｔＢｖ． ３－１遺伝子座での組込みをスクリーニングした；ＰＣＲ Ｂ（外側プライマー、０．５ｋｂまたは０ｋｂ）を用いて、ａｔｔＢｖ． ３－２遺伝子座での組込みをスクリーニングした；そして、ＰＣＲ Ｃ（外側プライマー、０．６ｋｂまたは０ｋｂ）を用いて、ａｔｔＢｖ． ３－３遺伝子座での組込みをスクリーニングした。ＰＣＲ Ｄ（外側プライマーおよびｅｒｍＧコード配列に結合する内部プライマー、０．６ｋｂまたは０ｋｂ：ａｔｔＢｖ． ３－１遺伝子座組込みの左接合部）を用いて、選択したクローンの組込まれた染色体および組込みプラスミド配列の接合部を確認した。左のパネル：非ターゲティング、対照ガイドＲＮＡ（Ｍ）を含む組込み株；右パネル：ｓｕｓＣ_ＢｖガイドＲＮＡをターゲットとする組込み株。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0009】
【図11】図１１Ａから図１１Ｄは、血液寒天プレートの写真である。図１１Ａは、血液ＢＨＩプレート上でのａＴｃ誘導を伴うおよび伴わない（左側にはａＴｃなし、右側には１００ｎｇ／ｍｌのａＴｃ）バクテロイデス・シータイオタオミクロンにおけるｓｕｓＣを標的とするｐＲｅｐＡ－ＣＲＩＳＰＲの１０－４希釈を示す。図１１Ｂは、血液ＢＨＩプレート上でのａＴｃ誘導を伴うおよび伴わない（左側にはａＴＣなし、右側には１００ｎｇ／ｍｌのａＴｃ）バクテロイデス・シータイオタオミクロンにおけるｓｕｓＣを標的とするｐＲｅｐＡ－ＣＲＩＳＰＲの１０－６希釈を示す。図１１Ｃは、血液ＢＨＩプレート上でのａＴｃ誘導を伴うおよび伴わない（左側にはａＴＣなし、右側には１００ｎｇ／ｍｌ ａＴｃ）バクテロイデス・シータイオタオミクロンでのｐＲｅｐＡ－ＣＲＩＳＰＲ非ターゲティングの１０－４希釈を示す。図１１Ｄは、血液ＢＨＩプレート上でのａＴｃ誘導を伴いおよび伴わない（左側にはａＴＣなし、右側には１００ｎｇ／ｍｌ ａＴｃ）バクテロイデス・シータイオタオミクロンでのｐＲｅｐＡ－ＣＲＩＳＰＲ非ターゲティングの１０－６希釈を示す。
【図12】図１２は、組込まれた、誘導性ＣＲＩＳＰＲシステムを用いた標的マイクロバイオータ調節を示す。ＣＲＩＳＰＲシステム（Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡ）の発現は、細菌の染色体破壊および最終的には細胞死を引き起こす。このように、ターゲティングガイドＲＮＡを備えた組込みＣＲＩＳＰＲカセットを担持する特定のバクテロイデス菌株は、アンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）誘導時にインサイチュウで混合集団から排除できる。
【図13】図１３Ａから図１３Ｂは、プラスミドｐＮＢＵ２－ＣＲＩＳＰＲ．ｓｕｓＣ＿ＢＷＨ２－１９（図１２）がｔ－ＲＮＡ－Ｓｅｒ遺伝子、ＢｃｅｌｌＷＨ２_ＲＳ２２７９５のａｔｔＢＷＨ２部位にのみ組込まれていることを示す。プラスミド組込み部位の５’末端を図１３Ａに示し、プラスミド組込み部位の３’末端を図１３Ｂに示す。図１３Ａに示されるＤＮＡ配列リストは、上から順に以下の通りである：配列番号１８（左から右）；配列番号１９（右から左）；配列番号１９（右から左）；配列番号１８（左から右）；配列番号１９（右から左）；配列番号１８（左から右）；配列番号１９（右から左）；配列番号１８（左から右）；配列番号１９（右から左）；配列番号１８（左から右）；配列番号１９（右から左）；配列番号１８（左から右）；配列番号１９（右から左）；配列番号２０（左から右）；配列番号２１（右から左）；配列番号２２（左から右）；配列番号２３（右から左）；および配列番号２４（左から右）である。例えば、配列番号１９は、配列番号１８の相補鎖であることなどが理解され得る。図１３Ｂに示されるＤＮＡ配列リストは、上から順に以下の通りである：配列番号２５（左から右）；配列番号２６（右から左）；配列番号２５（左から右）；配列番号２６（右から左）；配列番号２５（左から右）；配列番号２６（右から左）；配列番号２７（左から右）；配列番号２８（右から左）；配列番号２９（左から右）；配列番号３０（右から左）；配列番号２５（左から右）；配列番号２６（右から左）；配列番号２５（左から右）；配列番号２６（右から左）；配列番号２５（左から右）；配列番号２６（右から左）；配列番号２５（左から右）；配列番号２６（右から左）；配列番号２５（左から右）；配列番号２６（右から左）；配列番号３１（左から右）；配列番号３２（右から左）；配列番号２５（左から右）；配列番号２６（右から左）；配列番号２５（左から右）；配列番号２６（右から左）；配列番号３３（左から右）；配列番号３４（右から左）；配列番号３５（左から右）；配列番号３６（右から左）；配列番号２５（左から右）；配列番号２６（右から左）；配列番号３７（左から右）；および配列番号３８（右から左）など。例えば、配列番号２６は、配列番号２５の相補鎖であることなどが理解され得る。
【国際調査報告】