特表 2022-549852 ケトレダクターゼポリペプチドおよびポリヌクレオチド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-11-29

(54)【発明の名称】ケトレダクターゼポリペプチドおよびポリヌクレオチド

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/53 20060101AFI20221121BHJP

   C12N 9/02 20060101ALI20221121BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20221121BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20221121BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20221121BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20221121BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20221121BHJP

【ＦＩ】

C12N15/53

C12N9/02 ZNA

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022518961

(86)(22)【出願日】2020-09-24

(85)【翻訳文提出日】2022-05-11

(86)【国際出願番号】 US2020052396

(87)【国際公開番号】W WO2021061915

(87)【国際公開日】2021-04-01

(31)【優先権主張番号】62/906,268

(32)【優先日】2019-09-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】502427921

【氏名又は名称】コデクシス， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】リャン， ジャック

(72)【発明者】

【氏名】スブラマニアン， ナンディタ

(72)【発明者】

【氏名】チン， シャーリーン

(72)【発明者】

【氏名】ホーマン， デイビッド ウィリアム

(72)【発明者】

【氏名】ウォーレン， ケイティ

(72)【発明者】

【氏名】ジョーンズ， マシュー ブレイク

【テーマコード（参考）】

4B050

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B050CC04

4B050CC07

4B050LL05

4B065AA01X

4B065AA01Y

4B065AA57X

4B065AA57Y

4B065AA72X

4B065AA72Y

4B065AA83X

4B065AA83Y

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA28

4B065CA60

(57)【要約】

本発明は、天然に存在する野生型ケトレダクターゼ酵素と比較して改善された特性を有する操作されたケトレダクターゼ酵素、ならびに操作されたケトレダクターゼ酵素をコードするポリヌクレオチド、操作されたケトレダクターゼ酵素を発現することができる宿主細胞、および操作されたケトレダクターゼ酵素を使用してキラルアルコールを合成する方法を提供する。本発明は、操作された酵素を使用する方法をさらに提供する。本発明は、例えば、配列番号４、６、８０、１０４、１７２、１８６、１９４、２５２、２７０、２７２、２８６、３２８、および／または３３０と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有する操作されたケトレダクターゼバリアントを提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号４、６、８０、１０４、１７２、１８６、１９４、２５２、２７０、２７２、２８６、３２８、および／または３３０と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有する操作されたケトレダクターゼバリアント。

【請求項2】

配列番号４と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに位置１２、２１、８７、９３、９７、１１０、１４５、１４８、１５２、１５３、１９４、１９６、１９７、２００、２０６、２１２、および２２６から選択される１つまたは複数の位置における少なくとも１つの置換または置換セットを有する操作されたケトレダクターゼバリアントであって、前記位置が、配列番号４に関して番号付けされている、操作されたケトレダクターゼバリアント。

【請求項3】

配列番号６と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに１２／１１０／１４５／１５２、１２／１４５、８７／１１０／１４５、８７／１１０／１４５／１９４、８７／１４５／１９４、１１０、１１０／１４５／１５２／１９７、１１０／１４５／１９４、１４５、１４５／１５２、１４５／１９７／２２６、および１５２から選択される少なくとも１つの置換または置換セットを有する操作されたケトレダクターゼバリアントであって、位置が、配列番号６に関して番号付けされている、操作されたケトレダクターゼバリアント。

【請求項4】

配列番号８０と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに１７、２１、４６、５６、７２、７９、９５、１０１、１１０、１５２、１６２、１９０、１９８、２１０、２１１、および２２７から選択される少なくとも１つの置換または置換セットを有する操作されたケトレダクターゼバリアントであって、位置が、配列番号８０に関して番号付けされている、操作されたケトレダクターゼバリアント。

【請求項5】

配列番号８０と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに１７、７９、１５７、１５９、１９０／１９１／１９４、１９０／１９４、１９１／１９４、１９４、１９８、および２１１から選択される少なくとも１つの置換または置換セットを有する操作されたケトレダクターゼバリアントであって、位置が、配列番号８０に関して番号付けされている、操作されたケトレダクターゼバリアント。

【請求項6】

配列番号１０４と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに１７／４６／１９０、１７／４６／１９８／２１１、１７／９６／１９４／１９８、１７／１９０／１９８、４６／１９０／１９４／１９８、および４６／１９４／１９８から選択される少なくとも１つの置換または置換セットを有する操作されたケトレダクターゼバリアントであって、位置が、配列番号１０４に関して番号付けされている、操作されたケトレダクターゼバリアント。

【請求項7】

配列番号１７２と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに４５、１０１、１７９、１９４、２０４、２２６、および２３１から選択される少なくとも１つの置換または置換セットを有する操作されたケトレダクターゼバリアントであって、位置が、配列番号１７２に関して番号付けされている、操作されたケトレダクターゼバリアント。

【請求項8】

配列番号１８６と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに９５／９６／９７／１５０／１５３／２０５、９５／９６／１５０／１５３／２０５／２０６／２１１／２４９、９５／９７／１４３／１４５／１５０／１５３／２０２／２０５、９５／９７／１４３／１４５／１５０／１５３／２４９、９５／９７／１５０／１５３、９５／９７／１５０／１５３／２０２／２０５／２０６、９５／１５０／１５３／２０５／２０６／２１１、９５／１５０／１５３／２０５／２１１、９５／１５０／１５３／２０６／２４９、９６／１５０／１５３、９６／１５０／１５３／２０６、９７／１５０／１５３、９７／１５０／１５３／２０５、９７／１５０／１５３／２０５／２１１、９７／１５０／１５３／２０６、１４３／１４４／１４５／１５０／１５３／２０２／２０５／２４９、１４３／１４５／１５０／１５３、１４４／１４５／１５０／１５３／２０５／２０６、１４４／１５０／１５３、１４４／１５０／１５３／２０２／２０５／２０６、１４５／１５０／１５３／２０６／２４９、１４５／１５３／２１１、１５０／１５３／２０２／２０６／２４９、１５０／１５３／２０５／２１１、１５０／１５３／２０６／２１１、１５０／１５３／２１１、および１５０／１５３／２４９から選択される少なくとも１つの置換または置換セットを有する操作されたケトレダクターゼバリアントであって、位置が、配列番号１８６に関して番号付けされている、操作されたケトレダクターゼバリアント。

【請求項9】

配列番号１８６と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに７／１４７、１０３／１４７、１１０、１１０／１７９／１９４、１４７、および２４９から選択される少なくとも１つの置換または置換セットを有する操作されたケトレダクターゼバリアントであって、位置が、配列番号１８６に関して番号付けされている、操作されたケトレダクターゼバリアント。

【請求項10】

配列番号１９４と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに７／１２／５４／１１０／１５０／１５３／１９４／２０５／２１１／２４９、１２／５４／７２／１１０／１５０／１５２／１５３／１９４／２０５／２１１／２４９、１２／７２／１０１／１０３／１１０／１５２／２４９、１２／７２／１１０／１４７／１５２／２０４、４５／５４／７２／１１０／１５２／１９４／２０４、７２／１１０／１４７／１５０／１５２／１５３／１９４／２０５／２１１／２４９、および１１０／１５０／１５３／１７９／１９４／２０５／２１１／２４９から選択される少なくとも１つの置換または置換セットを有する操作されたケトレダクターゼバリアントであって、位置が、配列番号１９４に関して番号付けされている、操作されたケトレダクターゼバリアント。

【請求項11】

配列番号２５２と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに７／１２／５４／１７９／２４９、７／１５２、１２／５４／７２／１５２／１７９／２４９、４０、５４／７２、７２／１４７／１５２／１７９／２４９、および２４９から選択される少なくとも１つの置換または置換セットを有する操作されたケトレダクターゼバリアントであって、位置が、配列番号２５２に関して番号付けされている、操作されたケトレダクターゼバリアント。

【請求項12】

配列番号２７０と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに９２／９３、１５０／１５２、１５０／１５２／１５３、および１９４／１９５から選択される少なくとも１つの置換または置換セットを有する操作されたケトレダクターゼバリアントであって、位置が、配列番号２７０に関して番号付けされている、操作されたケトレダクターゼバリアント。

【請求項13】

配列番号２７２と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに９２／９３／９５、９３、９３／９５、９３／９５／１０９、９３／９５／１０９／１１４、９３／９５／１１４、９３／１０９／１１４、および１１４から選択される少なくとも１つの置換または置換セットを有する操作されたケトレダクターゼバリアントであって、位置が、配列番号２７２に関して番号付けされている、操作されたケトレダクターゼバリアント。

【請求項14】

配列番号２８６と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに１２／４５／７２／１０９／２４９、１２／４５／９３／２４９、１２／４５／２４９、１２／１０９／２４９、４５／７２／２４９、４５／１０９／２４９、４５／２４９、９６、および１４５／１５０から選択される少なくとも１つの置換または置換セットを有する操作されたケトレダクターゼバリアントであって、位置が、配列番号２８６に関して番号付けされている、操作されたケトレダクターゼバリアント。

【請求項15】

配列番号３２８と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに１５０、１５０／１５１、１５０／１９５、および１９５から選択される少なくとも１つの置換または置換セットを有する操作されたケトレダクターゼバリアントであって、位置が、配列番号３２８に関して番号付けされている、操作されたケトレダクターゼバリアント。

【請求項16】

配列番号３３０と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに１２／７２／１０９／１９５、１７／７３／２００、１７／１１５、６８／７２／１０１／１５２／２０５、６８／７２／１２４、６８／７２／１２４／１５２、６８／１０１／１２４／１５２／２０５、６８／１２４／２０５、７２／１０９／１５２／１９５、７２／１０９／１９５、７２／１５２、７２／１５２／１９５、７２／１９５、７３、７３／１４７、７９、９３、９３／９５／１４５／１９５、９３／１０９／１１４／１４５／１９５、９３／１９５、９５／１９５、９６／１０８／１４７／２００、９６／１９４／２００、１０１／２０５、１４５／１９５、１４７、１４７／２００、１９２、１９４、１９４／２００、１９５、１９８、および２００から選択される少なくとも１つの置換または置換セットを有する操作されたケトレダクターゼバリアントであって、位置が、配列番号３３０に関して番号付けされている、操作されたケトレダクターゼバリアント。

【請求項17】

配列番号４、６、８０、１０４、１７２、１８６、１９４、２５２、２７０、２７２、２８６、３２８、および／または３３０と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項１から１６のいずれかに記載の操作されたケトレダクターゼバリアント。

【請求項18】

配列番号４、６、８０、１０４、１７２、１８６、１９４、２５２、２７０、２７２、２８６、３２８、および／または３３０と少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項１から１７のいずれかに記載の操作されたケトレダクターゼバリアント。

【請求項19】

配列番号６、８０、１０４、１７２、１８６、１９４、２５２、２７０、２７２、２８６、３２８、および／または３３０に示されるポリペプチド配列を含む、請求項１から１８のいずれかに記載の操作されたケトレダクターゼバリアント。

【請求項20】

前記操作されたケトレダクターゼが、表５－１、６－１、７－１、８－１、１０－１、１１－１、１６－１、１７－２、１８－１、１９－１、１９－２、２０－１、２０－２、２１－１、２２－１および／または２４－１に与えられるバリアントをコードするポリペプチド配列を含む、請求項１から１９のいずれかに記載の操作されたケトレダクターゼバリアント。

【請求項21】

前記操作されたケトレダクターゼが、配列番号６から４１２に示される偶数番号の配列から選択されるポリペプチド配列を含む、請求項１から２０のいずれかに記載の操作されたケトレダクターゼバリアント。

【請求項22】

１つまたは複数のイソα酸基質を１つまたは複数の対応するジヒドロ－（ｒｈｏ）－イソα酸生成物に変換することができる、請求項１に記載の操作されたケトレダクターゼバリアント。

【請求項23】

配列番号４の参照ポリペプチドの少なくとも１０倍の活性で、１つまたは複数のイソα酸基質を１つまたは複数の対応するジヒドロ－（ｒｈｏ）－イソα酸生成物に変換することができる、請求項１に記載の操作されたケトレダクターゼバリアント。

【請求項24】

配列番号４のケトレダクターゼと比較して改善された特性を含む、請求項１から２３のいずれかに記載の操作されたケトレダクターゼバリアント。

【請求項25】

前記改善された特性が、配列番号４のケトレダクターゼと比較して、イソα酸を対応するジヒドロ－（ｒｈｏ）－イソα酸に変換する改善された活性を含む、請求項２４に記載の操作されたケトレダクターゼバリアント。

【請求項26】

前記改善された特性が、高い基質濃度での、配列番号４のケトレダクターゼと比較して改善された活性を含む、請求項２４に記載の操作されたケトレダクターゼバリアント。

【請求項27】

前記改善された特性が、低い補因子濃度での、配列番号４のケトレダクターゼと比較して改善された活性を含む、請求項２４に記載の操作されたケトレダクターゼバリアント。

【請求項28】

請求項１から２７のいずれかに記載の操作されたケトレダクターゼバリアントをコードする操作されたポリヌクレオチド配列。

【請求項29】

配列番号５から４１１に示される奇数番号の配列から選択される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えて同一であるポリヌクレオチド配列を含む、請求項２８に記載の操作されたポリヌクレオチド配列。

【請求項30】

請求項２８および／または２９に記載の操作されたポリヌクレオチド配列を含むベクター。

【請求項31】

少なくとも１つの制御配列をさらに含む、請求項３０に記載のベクター。

【請求項32】

配列番号４１３または４１４を含む、請求項３０および／または３１に記載のベクター。

【請求項33】

請求項３０、３１および／または３２のいずれかに記載のベクターを含む宿主細胞。

【請求項34】

請求項１から２７のいずれかに記載の操作されたケトレダクターゼバリアントを生成するための方法であって、請求項３３に記載の宿主細胞を、前記操作されたケトレダクターゼバリアントが前記宿主細胞によって産生される条件下で培養するステップを含む、方法。

【請求項35】

前記宿主細胞によって産生された前記操作されたケトレダクターゼバリアントを回収するステップをさらに含む、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記操作されたケトレダクターゼバリアントが、配列番号４１３および／または４１４のベクターを含む宿主細胞によって産生される、請求項３４および／または３５に記載の方法。

【請求項37】

請求項１から２７のいずれかに記載の少なくとも１つの操作されたケトレダクターゼバリアントを含む組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願は、２０１９年９月２６日に出願した米国特許仮出願第６２／９０６，２６８号の優先権を主張するものであり、前記仮出願は、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表、表またはコンピュータープログラムの参照
ファイル名ＣＸ８－１９５ＷＯ２＿ＳＴ２５．ｔｘｔとして、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して、コンピューター可読形態（ＣＲＦ）で、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１により本明細書と同時に提出した配列表は、参照により本明細書に組み込まれる。この配列表の電子コピーは、２０２０年９月２３日に作成され、ファイルサイズは６６４キロバイトであった。

【0003】

発明の分野
本発明は、天然に存在する野生型ケトレダクターゼ酵素と比較して改善された特性を有する操作されたケトレダクターゼ酵素、ならびに操作されたケトレダクターゼ酵素をコードするポリヌクレオチド、操作されたケトレダクターゼ酵素を発現することができる宿主細胞、および操作されたケトレダクターゼ酵素を使用する方法を提供する。

【背景技術】

【0004】

背景
ケトレダクターゼ（ＫＲＥＤ）またはカルボニルレダクターゼクラス（ＥＣ１．１．１．１８４）に属する酵素は、対応するプロキラルケトン基質からの、および対応するラセミ体アルデヒド基質の立体選択的還元による光学活性アルコールの合成に有用である。ＫＲＥＤは、典型的には、ケトンおよびアルデヒド基質を対応するアルコール生成物に変換するが、逆反応、すなわちアルコール基質の対応するケトン／アルデヒド生成物への酸化も触媒し得る。ＫＲＥＤなどの酵素によるケトンおよびアルデヒドの還元ならびにアルコールの酸化は、補因子、最も一般的には還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）、および酸化反応にはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋）を必要とする。ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨは、電子供与体としての役割を果たし、その一方でＮＡＤ＋およびＮＡＤＰ＋は、電子受容体としての役割を果たす。ケトレダクターゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼが、リン酸化された補因子またはリン酸化されていない補因子のいずれか（その酸化および還元状態）を受容することが観察されることが多いが、両方の補因子を受容することが観察されることはほとんどない。

【0005】

重要な化合物の生産のための多くの化学合成手順を回避するために、異なるケトおよびアルデヒド基質のキラルアルコール生成物への酵素変換にケトレダクターゼがますます用いられている。これらの適用は、ケトレダクターゼを発現する全細胞を、生体触媒的ケトンおよびアルデヒド還元もしくは生体触媒的アルコール酸化に用いることができ、または全細胞中の多数のケトレダクターゼの存在が所望の生成物の立体純度および収量に悪影響を及ぼす場合には、精製された酵素の使用によって用いることができる。

【0006】

「苦味」は、ホップ（植物Ｈｕｍｕｌｕｓ ｌｕｐｕｌｕｓ Ｌ．の花）の添加から典型的に生じるビールの重要な味覚特性である。イソα酸は、醸造プロセス中に、ホップ植物のルプリン腺に天然に存在する化合物であるフムロンの異性化によって形成される。具体的には、６つの主要なイソα酸が苦い味の原因となる：ｃｉｓ－イソフムロン、ｔｒａｎｓ－イソフムロン、ｃｉｓ－イソ－ｃｏ－フムロン、ｔｒａｎｓ－イソ－ｃｏ－フムロン、ｃｉｓ－イソ－ａｄ－フムロン、およびｔｒａｎｓ－イソ－ａｄ－フムロン。

【0007】

しかし、イソα酸は、光安定性でなく、３－メチル－２－ブテン－１－チオール（３－ＭＢＴ）の光誘起形成は、ビールに顕著な光に誘発されたまたは嫌な風味および匂いを付ける。このためビールを褐色瓶または缶に詰める必要がある。もう１つの解決策は、イソα酸のカルボニル基を還元して対応するジヒドロ－（ｒｈｏ）－イソα酸を生じさせることによって十分に光安定性のビールを作ることである。これらの還元型ジヒドロ－（ｒｈｏ）－イソα酸は、安定しており、透明なまたは緑色の瓶に詰めることができる。

【0008】

しかし、今のところ、毒性の危険な非食品等級の化学物質（例えば、水素化ホウ素ナトリウム）を使用しなければイソα酸をジヒドロ－（ｒｈｏ）－イソα酸に変換することができない。それ故、イソα酸のジヒドロ－（ｒｈｏ）－イソα酸への安全な食品等級の変換には、かなりの商業的価値がある。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0009】

発明の概要
本発明は、天然に存在する野生型ケトレダクターゼ酵素と比較して改善された特性を有する操作されたケトレダクターゼ酵素、ならびに操作されたケトレダクターゼ酵素をコードするポリヌクレオチド、操作されたケトレダクターゼ酵素を発現することができる宿主細胞、および操作されたケトレダクターゼ酵素を使用する方法を提供する。

【0010】

本発明は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒからの天然に存在する野生型ケトレダクターゼ（配列番号２）と比較して、または配列番号４、６、８０、１０４、１７２、１８６、１９４、２５２、２７０、２７２、２８６、３２８および／もしくは３３０の操作されたケトレダクターゼポリペプチドを含む、他の操作されたケトレダクターゼ酵素と比較した場合、イソα酸の対応するジヒドロ－（ｒｈｏ）－イソα酸への変換において改善された酵素活性を有する操作されたケトレダクターゼ（「ＫＲＥＤ」）酵素を提供する。

【0011】

一部のさらなる実施形態では、操作された酵素は、改善された酵素活性に加えて１つまたは複数の改善された特性を有する。酵素特性の改善には、これらに限定されないが、様々な基質にわたっての改善された活性、高い基質濃度での改善された活性、および低い補因子濃度での改善された活性が挙げられる。

【0012】

本発明は、配列番号４、６、８０、１０４、１７２、１８６、１９４、２５２、２７０、２７２、２８６、３２８、および／または３３０と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有する操作されたケトレダクターゼバリアントを提供する。

【0013】

本発明はまた、配列番号４と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに位置１２、２１、８７、９３、９７、１１０、１４５、１４８、１５２、１５３、１９４、１９６、１９７、２００、２０６、２１２、および２２６から選択される１つまたは複数の位置における少なくとも１つの置換または置換セットを有する操作されたケトレダクターゼバリアントであって、位置が、配列番号４に関して番号付けされている、操作されたケトレダクターゼバリアントを提供する。一部の追加の実施形態では、操作されたケトレダクターゼバリアントは、１２Ｉ、２１Ｒ、８７Ｌ、９３Ｄ、９３Ｍ、９３Ｔ、９３Ｖ、９７Ｇ、１１０Ｉ、１４５Ｃ、１４５Ｇ、１４５Ｍ、１４５Ｓ、１４８Ｉ、１５２Ｇ、１５２Ｓ、１５３Ｃ、１５３Ｒ、１５３Ｖ、１９４Ｈ、１９４Ｎ、１９４Ｒ、１９６Ｈ、１９６Ｋ、１９６Ｒ、１９７Ｇ、１９７Ｒ、２００Ｌ、２００Ｑ、２００Ｒ、２０６Ｖ、２１２Ｓ、および２２６Ｌから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、位置は、配列番号４に関して番号付けされている。一部のさらなる実施形態では、操作されたケトレダクターゼバリアントは、Ｖ１２Ｉ、Ｌ２１Ｒ、Ｖ８７Ｌ、Ｉ９３Ｄ、Ｉ９３Ｍ、Ｉ９３Ｔ、Ｉ９３Ｖ、Ｋ９７Ｇ、Ｌ１１０Ｉ、Ｌ１４５Ｃ、Ｌ１４５Ｇ、Ｌ１４５Ｍ、Ｌ１４５Ｓ、Ｖ１４８Ｉ、Ｔ１５２Ｇ、Ｔ１５２Ｓ、Ｌ１５３Ｃ、Ｌ１５３Ｒ、Ｌ１５３Ｖ、Ｐ１９４Ｈ、Ｐ１９４Ｎ、Ｐ１９４Ｒ、Ｌ１９６Ｈ、Ｌ１９６Ｋ、Ｌ１９６Ｒ、Ｄ１９７Ｇ、Ｄ１９７Ｒ、Ｅ２００Ｌ、Ｅ２００Ｑ、Ｅ２００Ｒ、Ｍ２０６Ｖ、Ｔ２１２Ｓ、およびＩ２２６Ｌから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、位置は、配列番号４に関して番号付けされている。

【0014】

本発明はまた、配列番号６と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに位置１２／１１０／１４５／１５２、１２／１４５、８７／１１０／１４５、８７／１１０／１４５／１９４、８７／１４５／１９４、１１０、１１０／１４５／１５２／１９７、１１０／１４５／１９４、１４５、１４５／１５２、１４５／１９７／２２６、および１５２から選択される１つまたは複数の位置における少なくとも１つの置換または置換セットを有する操作されたケトレダクターゼバリアントであって、位置が、配列番号６に関して番号付けされている、操作されたケトレダクターゼバリアントを提供する。一部の実施形態では、操作されたケトレダクターゼバリアントは、１２Ｉ／１１０Ｉ／１４５Ｍ／１５２Ｇ、１２Ｉ／１４５Ｍ、８７Ｌ／１１０Ｉ／１４５Ｍ、８７Ｌ／１１０Ｉ／１４５Ｍ／１９４Ｈ、８７Ｌ／１１０Ｉ／１４５Ｍ／１９４Ｎ、８７Ｌ／１４５Ｍ／１９４Ｈ、１１０Ｉ、１１０Ｉ／１４５Ｍ／１５２Ｇ／１９７Ｇ、１１０Ｉ／１４５Ｍ／１９４Ｈ、１４５Ｍ、１４５Ｍ／１５２Ｇ、１４５Ｍ／１９７Ｇ／２２６Ｌ、および１５２Ｓから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、位置は、配列番号６に関して番号付けされている。一部の追加の実施形態では、操作されたケトレダクターゼバリアントは、Ｖ１２Ｉ／Ｌ１１０Ｉ／Ｌ１４５Ｍ／Ｔ１５２Ｇ、Ｖ１２Ｉ／Ｌ１４５Ｍ、Ｖ８７Ｌ／Ｌ１１０Ｉ／Ｌ１４５Ｍ、Ｖ８７Ｌ／Ｌ１１０Ｉ／Ｌ１４５Ｍ／Ｐ１９４Ｈ、Ｖ８７Ｌ／Ｌ１１０Ｉ／Ｌ１４５Ｍ／Ｐ１９４Ｎ、Ｖ８７Ｌ／Ｌ１４５Ｍ／Ｐ１９４Ｈ、Ｌ１１０Ｉ、Ｌ１１０Ｉ／Ｌ１４５Ｍ／Ｔ１５２Ｇ／Ｄ１９７Ｇ、Ｌ１１０Ｉ／Ｌ１４５Ｍ／Ｐ１９４Ｈ、Ｌ１４５Ｍ、Ｌ１４５Ｍ／Ｔ１５２Ｇ、Ｌ１４５Ｍ／Ｄ１９７Ｇ／Ｉ２２６Ｌ、およびＴ１５２Ｓから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、位置は、配列番号６に関して番号付けされている。

【0015】

本発明はまた、配列番号８０と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに位置１７、２１、４６、５６、７２、７９、９５、１０１、１１０、１５２、１６２、１９０、１９８、２１０、２１１、および２２７から選択される１つまたは複数の位置における少なくとも１つの置換または置換セットを有する操作されたケトレダクターゼバリアントであって、位置が、配列番号８０に関して番号付けされている、操作されたケトレダクターゼバリアントを提供する。一部の追加の実施形態では、操作されたケトレダクターゼバリアントは、１７Ｑ、１７Ｓ、２１Ａ、４６Ｖ、５６Ｃ、７２Ａ、７９Ｌ、９５Ｉ、１０１Ｃ、１０１Ｌ、１０１Ｔ、１１０Ｖ、１５２Ｋ、１５２Ｌ、１６２Ｇ、１９０Ａ、１９８Ａ、１９８Ｑ、２１０Ｆ、２１０Ｗ、２１１Ｒ、および２２７Ｖから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、位置は、配列番号８０に関して番号付けされている。一部のさらなる実施形態では、操作されたケトレダクターゼバリアントは、Ｌ１７Ｑ、Ｌ１７Ｓ、Ｌ２１Ａ、Ｋ４６Ｖ、Ｖ５６Ｃ、Ｋ７２Ａ、Ｅ７９Ｌ、Ｖ９５Ｉ、Ｄ１０１Ｃ、Ｄ１０１Ｌ、Ｄ１０１Ｔ、Ｉ１１０Ｖ、Ｔ１５２Ｋ、Ｔ１５２Ｌ、Ａ１６２Ｇ、Ｐ１９０Ａ、Ｄ１９８Ａ、Ｄ１９８Ｑ、Ｔ２１０Ｆ、Ｔ２１０Ｗ、Ｌ２１１Ｒ、およびＣ２２７Ｖから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、位置は、配列番号８０に関して番号付けされている。

【0016】

本発明はまた、配列番号８０と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに位置１７、７９、１５７、１５９、１９０／１９１／１９４、１９０／１９４、１９１／１９４、１９４、１９８、および２１１から選択される１つまたは複数の位置における少なくとも１つの置換または置換セットを有する操作されたケトレダクターゼバリアントであって、位置が、配列番号８０に関して番号付けされている、操作されたケトレダクターゼバリアントを提供する。一部の追加の実施形態では、操作されたケトレダクターゼバリアントは、１７Ｍ、１７Ｑ、１７Ｓ、７９Ｌ、１５７Ｃ、１５９Ｔ、１９０Ａ／１９１Ｔ／１９４Ｅ、１９０Ａ／１９４Ｅ、１９１Ｔ／１９４Ｅ、１９４Ｅ、１９８Ａ、１９８Ｑ、および２１１Ｒから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、位置は、配列番号８０に関して番号付けされている。一部のさらなる実施形態では、操作されたケトレダクターゼバリアントは、Ｌ１７Ｍ、Ｌ１７Ｑ、Ｌ１７Ｓ、Ｅ７９Ｌ、Ｎ１５７Ｃ、Ｓ１５９Ｔ、Ｐ１９０Ａ／Ｉ１９１Ｔ／Ｐ１９４Ｅ、Ｐ１９０Ａ／Ｐ１９４Ｅ、Ｉ１９１Ｔ／Ｐ１９４Ｅ、Ｐ１９４Ｅ、Ｄ１９８Ａ、Ｄ１９８Ｑ、およびＬ２１１Ｒから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、位置は、配列番号８０に関して番号付けされている。

【0017】

本発明はまた、配列番号１０４と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに位置１７／４６／１９０、１７／４６／１９８／２１１、１７／９６／１９４／１９８、１７／１９０／１９８、４６／１９０／１９４／１９８、および４６／１９４／１９８から選択される１つまたは複数の位置における少なくとも１つの置換または置換セットを有する操作されたケトレダクターゼバリアントであって、位置が、配列番号１０４に関して番号付けされている、操作されたケトレダクターゼバリアントを提供する。一部の追加の実施形態では、操作されたケトレダクターゼバリアントは、１７Ｍ／４６Ｖ／１９０Ａ、１７Ｍ／４６Ｖ／１９８Ａ／２１１Ｒ、１７Ｍ／９６Ｖ／１９４Ｅ／１９８Ｑ、１７Ｍ／１９０Ａ／１９８Ａ、１７Ｍ／１９０Ａ／１９８Ｑ、４６Ｖ／１９０Ａ／１９４Ｅ／１９８Ｑ、および４６Ｖ／１９４Ｅ／１９８Ｑから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、位置は、配列番号１０４に関して番号付けされている。一部のさらなる実施形態では、操作されたケトレダクターゼバリアントは、Ｑ１７Ｍ／Ｋ４６Ｖ／Ｐ１９０Ａ、Ｑ１７Ｍ／Ｋ４６Ｖ／Ｄ１９８Ａ／Ｌ２１１Ｒ、Ｑ１７Ｍ／Ｉ９６Ｖ／Ｐ１９４Ｅ／Ｄ１９８Ｑ、Ｑ１７Ｍ／Ｐ１９０Ａ／Ｄ１９８Ａ、Ｑ１７Ｍ／Ｐ１９０Ａ／Ｄ１９８Ｑ、Ｋ４６Ｖ／Ｐ１９０Ａ／Ｐ１９４Ｅ／Ｄ１９８Ｑ、およびＫ４６Ｖ／Ｐ１９４Ｅ／Ｄ１９８Ｑから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、位置は、配列番号１０４に関して番号付けされている。

【0018】

本発明はまた、配列番号１７２と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに位置４５、１０１、１７９、１９４、２０４、２２６、および２３１から選択される１つまたは複数の位置における少なくとも１つの置換または置換セットを有する操作されたケトレダクターゼバリアントであって、位置が、配列番号１７２に関して番号付けされている、操作されたケトレダクターゼバリアントを提供する。一部の追加の実施形態では、操作されたケトレダクターゼバリアントは、４５Ｌ、１０１Ｒ、１０１Ｙ、１７９Ｍ、１９４Ｅ、２０４Ｑ、２２６Ｖ、および２３１Ｇから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、位置は、配列番号１７２に関して番号付けされている。一部のさらなる実施形態では、操作されたケトレダクターゼバリアントは、Ｅ４５Ｌ、Ｄ１０１Ｒ、Ｄ１０１Ｙ、Ｙ１７９Ｍ、Ｐ１９４Ｅ、Ｅ２０４Ｑ、Ｉ２２６Ｖ、およびＡ２３１Ｇから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、位置は、配列番号１７２に関して番号付けされている。

【0019】

本発明はまた、配列番号１８６と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに位置９５／９６／９７／１５０／１５３／２０５、９５／９６／１５０／１５３／２０５／２０６／２１１／２４９、９５／９７／１４３／１４５／１５０／１５３／２０２／２０５、９５／９７／１４３／１４５／１５０／１５３／２４９、９５／９７／１５０／１５３、９５／９７／１５０／１５３／２０２／２０５／２０６、９５／１５０／１５３／２０５／２０６／２１１、９５／１５０／１５３／２０５／２１１、９５／１５０／１５３／２０６／２４９、９６／１５０／１５３、９６／１５０／１５３／２０６、９７／１５０／１５３、９７／１５０／１５３／２０５、９７／１５０／１５３／２０５／２１１、９７／１５０／１５３／２０６、１４３／１４４／１４５／１５０／１５３／２０２／２０５／２４９、１４３／１４５／１５０／１５３、１４４／１４５／１５０／１５３／２０５／２０６、１４４／１５０／１５３、１４４／１５０／１５３／２０２／２０５／２０６、１４５／１５０／１５３／２０６／２４９、１４５／１５３／２１１、１５０／１５３／２０２／２０６／２４９、１５０／１５３／２０５／２１１、１５０／１５３／２０６／２１１、１５０／１５３／２１１、および１５０／１５３／２４９から選択される１つまたは複数の位置における少なくとも１つの置換または置換セットを有する操作されたケトレダクターゼバリアントであって、位置が、配列番号１８６に関して番号付けされている、操作されたケトレダクターゼバリアントを提供する。一部の追加の実施形態では、操作されたケトレダクターゼバリアントは、９５Ａ／９６Ａ／９７Ａ／１５０Ａ／１５３Ａ／２０５Ａ、９５Ａ／９６Ａ／１５０Ａ／１５３Ａ／２０５Ａ／２０６Ａ／２１１Ａ／２４９Ａ、９５Ａ／９７Ａ／１４３Ａ／１４５Ａ／１５０Ａ／１５３Ａ／２０２Ａ／２０５Ａ、９５Ａ／９７Ａ／１４３Ａ／１４５Ａ／１５０Ａ／１５３Ａ／２４９Ａ、９５Ａ／９７Ａ／１５０Ａ／１５３Ａ、９５Ａ／９７Ａ／１５０Ａ／１５３Ａ／２０２Ａ／２０５Ａ／２０６Ａ、９５Ａ／１５０Ａ／１５３Ａ／２０５Ａ／２０６Ａ／２１１Ａ、９５Ａ／１５０Ａ／１５３Ａ／２０５Ａ／２１１Ａ、９５Ａ／１５０Ａ／１５３Ａ／２０６Ａ／２４９Ａ、９６Ａ／１５０Ａ／１５３Ａ、９６Ａ／１５０Ａ／１５３Ａ／２０６Ａ、９７Ａ／１５０Ａ／１５３Ａ、９７Ａ／１５０Ａ／１５３Ａ／２０５Ａ、９７Ａ／１５０Ａ／１５３Ａ／２０５Ａ／２１１Ａ、９７Ａ／１５０Ａ／１５３Ａ／２０６Ａ、１４３Ａ／１４４Ａ／１４５Ａ／１５０Ａ／１５３Ａ／２０２Ａ／２０５Ａ／２４９Ａ、１４３Ａ／１４５Ａ／１５０Ａ／１５３Ａ、１４４Ａ／１４５Ａ／１５０Ａ／１５３Ａ／２０５Ａ／２０６Ａ、１４４Ａ／１５０Ａ／１５３Ａ、１４４Ａ／１５０Ａ／１５３Ａ／２０２Ａ／２０５Ａ／２０６Ａ、１４５Ａ／１５０Ａ／１５３Ａ／２０６Ａ／２４９Ａ、１４５Ａ／１５３Ａ／２１１Ａ、１５０Ａ／１５３Ａ／２０２Ａ／２０６Ａ／２４９Ａ、１５０Ａ／１５３Ａ／２０５Ａ／２１１Ａ、１５０Ａ／１５３Ａ／２０６Ａ／２１１Ａ、１５０Ａ／１５３Ａ／２１１Ａ、および１５０Ａ／１５３Ａ／２４９Ａから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、位置は、配列番号１８６に関して番号付けされている。一部のさらなる実施形態では、操作されたケトレダクターゼバリアントは、Ｖ９５Ａ／Ｉ９６Ａ／Ｋ９７Ａ／Ｄ１５０Ａ／Ｌ１５３Ａ／Ｍ２０５Ａ、Ｖ９５Ａ／Ｉ９６Ａ／Ｄ１５０Ａ／Ｌ１５３Ａ／Ｍ２０５Ａ／Ｍ２０６Ａ／Ｌ２１１Ａ／Ｗ２４９Ａ、Ｖ９５Ａ／Ｋ９７Ａ／Ｓ１４３Ａ／Ｍ１４５Ａ／Ｄ１５０Ａ／Ｌ１５３Ａ／Ｗ２０２Ａ／Ｍ２０５Ａ、Ｖ９５Ａ／Ｋ９７Ａ／Ｓ１４３Ａ／Ｍ１４５Ａ／Ｄ１５０Ａ／Ｌ１５３Ａ／Ｗ２４９Ａ、Ｖ９５Ａ／Ｋ９７Ａ／Ｄ１５０Ａ／Ｌ１５３Ａ、Ｖ９５Ａ／Ｋ９７Ａ／Ｄ１５０Ａ／Ｌ１５３Ａ／Ｗ２０２Ａ／Ｍ２０５Ａ／Ｍ２０６Ａ、Ｖ９５Ａ／Ｄ１５０Ａ／Ｌ１５３Ａ／Ｍ２０５Ａ／Ｍ２０６Ａ／Ｌ２１１Ａ、Ｖ９５Ａ／Ｄ１５０Ａ／Ｌ１５３Ａ／Ｍ２０５Ａ／Ｌ２１１Ａ、Ｖ９５Ａ／Ｄ１５０Ａ／Ｌ１５３Ａ／Ｍ２０６Ａ／Ｗ２４９Ａ、Ｉ９６Ａ／Ｄ１５０Ａ／Ｌ１５３Ａ、Ｉ９６Ａ／Ｄ１５０Ａ／Ｌ１５３Ａ／Ｍ２０６Ａ、Ｋ９７Ａ／Ｄ１５０Ａ／Ｌ１５３Ａ、Ｋ９７Ａ／Ｄ１５０Ａ／Ｌ１５３Ａ／Ｍ２０５Ａ、Ｋ９７Ａ／Ｄ１５０Ａ／Ｌ１５３Ａ／Ｍ２０５Ａ／Ｌ２１１Ａ、Ｋ９７Ａ／Ｄ１５０Ａ／Ｌ１５３Ａ／Ｍ２０６Ａ、Ｓ１４３Ａ／Ｉ１４４Ａ／Ｍ１４５Ａ／Ｄ１５０Ａ／Ｌ１５３Ａ／Ｗ２０２Ａ／Ｍ２０５Ａ／Ｗ２４９Ａ、Ｓ１４３Ａ／Ｍ１４５Ａ／Ｄ１５０Ａ／Ｌ１５３Ａ、Ｉ１４４Ａ／Ｍ１４５Ａ／Ｄ１５０Ａ／Ｌ１５３Ａ／Ｍ２０５Ａ／Ｍ２０６Ａ、Ｉ１４４Ａ／Ｄ１５０Ａ／Ｌ１５３Ａ、Ｉ１４４Ａ／Ｄ１５０Ａ／Ｌ１５３Ａ／Ｗ２０２Ａ／Ｍ２０５Ａ／Ｍ２０６Ａ、Ｍ１４５Ａ／Ｄ１５０Ａ／Ｌ１５３Ａ／Ｍ２０６Ａ／Ｗ２４９Ａ、Ｍ１４５Ａ／Ｌ１５３Ａ／Ｌ２１１Ａ、Ｄ１５０Ａ／Ｌ１５３Ａ／Ｗ２０２Ａ／Ｍ２０６Ａ／Ｗ２４９Ａ、Ｄ１５０Ａ／Ｌ１５３Ａ／Ｍ２０５Ａ／Ｌ２１１Ａ、Ｄ１５０Ａ／Ｌ１５３Ａ／Ｍ２０６Ａ／Ｌ２１１Ａ、Ｄ１５０Ａ／Ｌ１５３Ａ／Ｌ２１１Ａ、およびＤ１５０Ａ／Ｌ１５３Ａ／Ｗ２４９Ａから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、位置は、配列番号１８６に関して番号付けされている。

【0020】

本発明はまた、配列番号１８６と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに位置７／１４７、１０３／１４７、１１０、１１０／１７９／１９４、１４７、および２４９から選択される１つまたは複数の位置における少なくとも１つの置換または置換セットを有する操作されたケトレダクターゼバリアントであって、位置が、配列番号１８６に関して番号付けされている、操作されたケトレダクターゼバリアントを提供する。一部の追加の実施形態では、操作されたケトレダクターゼバリアントは、７Ｑ／１４７Ｉ、１０３Ｒ／１４７Ｉ、１１０Ｖ、１１０Ｖ／１７９Ｍ／１９４Ｅ、１４７Ｉ、および２４９Ｙから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、位置は、配列番号１８６に関して番号付けされている。一部のさらなる実施形態では、操作されたケトレダクターゼバリアントは、Ｈ７Ｑ／Ｌ１４７Ｉ、Ｔ１０３Ｒ／Ｌ１４７Ｉ、Ｉ１１０Ｖ、Ｉ１１０Ｖ／Ｙ１７９Ｍ／Ｐ１９４Ｅ、Ｌ１４７Ｉ、およびＷ２４９Ｙから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、位置は、配列番号１８６に関して番号付けされている。

【0021】

本発明はまた、配列番号１９４と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに位置７／１２／５４／１１０／１５０／１５３／１９４／２０５／２１１／２４９、１２／５４／７２／１１０／１５０／１５２／１５３／１９４／２０５／２１１／２４９、１２／７２／１０１／１０３／１１０／１５２／２４９、１２／７２／１１０／１４７／１５２／２０４、４５／５４／７２／１１０／１５２／１９４／２０４、７２／１１０／１４７／１５０／１５２／１５３／１９４／２０５／２１１／２４９、および１１０／１５０／１５３／１７９／１９４／２０５／２１１／２４９から選択される１つまたは複数の位置における少なくとも１つの置換または置換セットを有する操作されたケトレダクターゼバリアントであって、位置が、配列番号１９４に関して番号付けされている、操作されたケトレダクターゼバリアントを提供する。一部の追加の実施形態では、操作されたケトレダクターゼバリアントは、７Ｑ／１２Ｉ／５４Ｓ／１１０Ｖ／１５０Ｄ／１５３Ｌ／１９４Ｅ／２０５Ｍ／２１１Ｌ／２４９Ｙ、１２Ｉ／５４Ｓ／７２Ｔ／１１０Ｖ／１５０Ｄ／１５２Ｍ／１５３Ｌ／１９４Ｅ／２０５Ｍ／２１１Ｌ／２４９Ｙ、１２Ｉ／７２Ｓ／１０１Ｙ／１０３Ｑ／１１０Ｖ／１５２Ｍ／２４９Ｙ、１２Ｉ／７２Ｓ／１１０Ｖ／１４７Ｉ／１５２Ｍ／２０４Ｑ、４５Ｌ／５４Ｓ／７２Ｓ／１１０Ｖ／１５２Ｍ／１９４Ｅ／２０４Ｑ、７２Ｓ／１１０Ｖ／１４７Ｍ／１５０Ｄ／１５２Ｍ／１５３Ｌ／１９４Ｅ／２０５Ｍ／２１１Ｌ／２４９Ｙ、および１１０Ｖ／１５０Ｄ／１５３Ｌ／１７９Ｍ／１９４Ｅ／２０５Ｍ／２１１Ｌ／２４９Ｙから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、位置は、配列番号１９４に関して番号付けされている。一部のさらなる実施形態では、操作されたケトレダクターゼバリアントは、Ｈ７Ｑ／Ｖ１２Ｉ／Ｔ５４Ｓ／Ｉ１１０Ｖ／Ａ１５０Ｄ／Ａ１５３Ｌ／Ｐ１９４Ｅ／Ａ２０５Ｍ／Ａ２１１Ｌ／Ｗ２４９Ｙ、Ｖ１２Ｉ／Ｔ５４Ｓ／Ｋ７２Ｔ／Ｉ１１０Ｖ／Ａ１５０Ｄ／Ｔ１５２Ｍ／Ａ１５３Ｌ／Ｐ１９４Ｅ／Ａ２０５Ｍ／Ａ２１１Ｌ／Ｗ２４９Ｙ、Ｖ１２Ｉ／Ｋ７２Ｓ／Ｒ１０１Ｙ／Ｔ１０３Ｑ／Ｉ１１０Ｖ／Ｔ１５２Ｍ／Ｗ２４９Ｙ、Ｖ１２Ｉ／Ｋ７２Ｓ／Ｉ１１０Ｖ／Ｌ１４７Ｉ／Ｔ１５２Ｍ／Ｅ２０４Ｑ、Ｅ４５Ｌ／Ｔ５４Ｓ／Ｋ７２Ｓ／Ｉ１１０Ｖ／Ｔ１５２Ｍ／Ｐ１９４Ｅ／Ｅ２０４Ｑ、Ｋ７２Ｓ／Ｉ１１０Ｖ／Ｌ１４７Ｍ／Ａ１５０Ｄ／Ｔ１５２Ｍ／Ａ１５３Ｌ／Ｐ１９４Ｅ／Ａ２０５Ｍ／Ａ２１１Ｌ／Ｗ２４９Ｙ、およびＩ１１０Ｖ／Ａ１５０Ｄ／Ａ１５３Ｌ／Ｙ１７９Ｍ／Ｐ１９４Ｅ／Ａ２０５Ｍ／Ａ２１１Ｌ／Ｗ２４９Ｙから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、位置は、配列番号１９４に関して番号付けされている。

【0022】

本発明はまた、配列番号２５２と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに位置７／１２／５４／１７９／２４９、７／１５２、１２／５４／７２／１５２／１７９／２４９、４０、５４／７２、７２／１４７／１５２／１７９／２４９、および２４９から選択される１つまたは複数の位置における少なくとも１つの置換または置換セットを有する操作されたケトレダクターゼバリアントであって、位置が、配列番号２５２に関して番号付けされている、操作されたケトレダクターゼバリアントを提供する。一部の追加の実施形態では、操作されたケトレダクターゼバリアントは、７Ｑ／１２Ｉ／５４Ｓ／１７９Ｙ／２４９Ｙ、７Ｑ／１５２Ｍ、１２Ｉ／５４Ｓ／７２Ｔ／１５２Ｍ／１７９Ｙ／２４９Ｙ、４０Ｅ、５４Ｓ／７２Ｓ、７２Ｓ／１４７Ｍ／１５２Ｍ／１７９Ｙ／２４９Ｙ、および２４９Ｙから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、位置は、配列番号２５２に関して番号付けされている。一部のさらなる実施形態では、操作されたケトレダクターゼバリアントは、Ｈ７Ｑ／Ｖ１２Ｉ／Ｔ５４Ｓ／Ｍ１７９Ｙ／Ｗ２４９Ｙ、Ｈ７Ｑ／Ｔ１５２Ｍ、Ｖ１２Ｉ／Ｔ５４Ｓ／Ｋ７２Ｔ／Ｔ１５２Ｍ／Ｍ１７９Ｙ／Ｗ２４９Ｙ、Ｈ４０Ｅ、Ｔ５４Ｓ／Ｋ７２Ｓ、Ｋ７２Ｓ／Ｌ１４７Ｍ／Ｔ１５２Ｍ／Ｍ１７９Ｙ／Ｗ２４９Ｙ、およびＷ２４９Ｙから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、位置は、配列番号２５２に関して番号付けされている。

【0023】

本発明はまた、配列番号２７０と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに位置９２／９３、１５０／１５２、１５０／１５２／１５３、および１９４／１９５から選択される１つまたは複数の位置における少なくとも１つの置換または置換セットを有する操作されたケトレダクターゼバリアントであって、位置が、配列番号２７０に関して番号付けされている、操作されたケトレダクターゼバリアントを提供する。一部の追加の実施形態では、操作されたケトレダクターゼバリアントは、９２Ａ／９３Ｅ、１５０Ｄ／１５２Ａ／１５３Ｌ、１５０Ｙ／１５２Ａ、１５０Ｙ／１５２Ｓ、および１９４Ｓ／１９５Ａから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、位置は、配列番号２７０に関して番号付けされている。一部のさらなる実施形態では、操作されたケトレダクターゼバリアントは、Ｇ９２Ａ／Ｉ９３Ｅ、Ａ１５０Ｄ／Ｍ１５２Ａ／Ａ１５３Ｌ、Ａ１５０Ｙ／Ｍ１５２Ａ、Ａ１５０Ｙ／Ｍ１５２Ｓ、およびＥ１９４Ｓ／Ｒ１９５Ａから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、位置は、配列番号２７０に関して番号付けされている。

【0024】

本発明はまた、配列番号２７２と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに位置９２／９３／９５、９３、９３／９５、９３／９５／１０９、９３／９５／１０９／１１４、９３／９５／１１４、９３／１０９／１１４、および１１４から選択される１つまたは複数の位置における少なくとも１つの置換または置換セットを有する操作されたケトレダクターゼバリアントであって、位置が、配列番号２７２に関して番号付けされている、操作されたケトレダクターゼバリアントを提供する。一部の追加の実施形態では、操作されたケトレダクターゼバリアントは、９２Ａ／９３Ｄ／９５Ｒ、９３Ａ／９５Ｋ／１０９Ｒ、９３Ａ／９５Ｒ／１０９Ｄ／１１４Ｔ、９３Ｄ／９５Ｒ、９３Ｅ／１０９Ｒ／１１４Ａ、９３Ｍ、９３Ｒ／９５Ａ／１１４Ｔ、および１１４Ａから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、位置は、配列番号２７２に関して番号付けされている。一部のさらなる実施形態では、操作されたケトレダクターゼバリアントは、Ｇ９２Ａ／Ｉ９３Ｄ／Ｖ９５Ｒ、Ｉ９３Ａ／Ｖ９５Ｋ／Ｋ１０９Ｒ、Ｉ９３Ａ／Ｖ９５Ｒ／Ｋ１０９Ｄ／Ｎ１１４Ｔ、Ｉ９３Ｄ／Ｖ９５Ｒ、Ｉ９３Ｅ／Ｋ１０９Ｒ／Ｎ１１４Ａ、Ｉ９３Ｍ、Ｉ９３Ｒ／Ｖ９５Ａ／Ｎ１１４Ｔ、およびＮ１１４Ａから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、位置は、配列番号２７２に関して番号付けされている。

【0025】

本発明はまた、配列番号２８６と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに位置１２／４５／７２／１０９／２４９、１２／４５／９３／２４９、１２／４５／２４９、１２／１０９／２４９、４５／７２／２４９、４５／１０９／２４９、４５／２４９、９６、および１４５／１５０から選択される１つまたは複数の位置における少なくとも１つの置換または置換セットを有する操作されたケトレダクターゼバリアントであって、位置が、配列番号２８６に関して番号付けされている、操作されたケトレダクターゼバリアントを提供する。一部の追加の実施形態では、操作されたケトレダクターゼバリアントは、１２Ｉ／４５Ｅ／７２Ｔ／１０９Ｄ／２４９Ｙ、１２Ｉ／４５Ｅ／９３Ａ／２４９Ｙ、１２Ｉ／４５Ｅ／２４９Ｙ、１２Ｉ／１０９Ｄ／２４９Ｙ、４５Ｅ／７２Ｔ／２４９Ｙ、４５Ｅ／１０９Ｄ／２４９Ｙ、４５Ｅ／２４９Ｙ、９６Ａ、および１４５Ａ／１５０Ａから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、位置は、配列番号２８６に関して番号付けされている。一部のさらなる実施形態では、操作されたケトレダクターゼバリアントは、Ｖ１２Ｉ／Ｌ４５Ｅ／Ｓ７２Ｔ／Ｋ１０９Ｄ／Ｗ２４９Ｙ、Ｖ１２Ｉ／Ｌ４５Ｅ／Ｉ９３Ａ／Ｗ２４９Ｙ、Ｖ１２Ｉ／Ｌ４５Ｅ／Ｗ２４９Ｙ、Ｖ１２Ｉ／Ｋ１０９Ｄ／Ｗ２４９Ｙ、Ｌ４５Ｅ／Ｓ７２Ｔ／Ｗ２４９Ｙ、Ｌ４５Ｅ／Ｋ１０９Ｄ／Ｗ２４９Ｙ、Ｌ４５Ｅ／Ｗ２４９Ｙ、Ｉ９６Ａ、およびＭ１４５Ａ／Ｙ１５０Ａから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、位置は、配列番号２８６に関して番号付けされている。

【0026】

本発明はまた、配列番号３２８と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに位置１５０、１５０／１５１、１５０／１９５、および１９５から選択される１つまたは複数の位置における少なくとも１つの置換または置換セットを有する操作されたケトレダクターゼバリアントであって、位置が、配列番号３２８に関して番号付けされている、操作されたケトレダクターゼバリアントを提供する。一部の追加の実施形態では、操作されたケトレダクターゼバリアントは、１５０Ａ、１５０Ａ／１５１Ａ、１５０Ａ／１９５Ｓ、１９５Ａ、および１９５Ｓから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、位置は、配列番号３２８に関して番号付けされている。一部のさらなる実施形態では、操作されたケトレダクターゼバリアントは、Ｙ１５０Ａ、Ｙ１５０Ａ／Ｐ１５１Ａ、Ｙ１５０Ａ／Ｒ１９５Ｓ、Ｒ１９５Ａ、およびＲ１９５Ｓから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、位置は、配列番号３２８に関して番号付けされている。

【0027】

本発明はまた、配列番号３３０と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに位置１２／７２／１０９／１９５、１７／７３／２００、１７／１１５、６８／７２／１０１／１５２／２０５、６８／７２／１２４、６８／７２／１２４／１５２、６８／１０１／１２４／１５２／２０５、６８／１２４／２０５、７２／１０９／１５２／１９５、７２／１０９／１９５、７２／１５２、７２／１５２／１９５、７２／１９５、７３、７３／１４７、７９、９３、９３／９５／１４５／１９５、９３／１０９／１１４／１４５／１９５、９３／１９５、９５／１９５、９６／１０８／１４７／２００、９６／１９４／２００、１０１／２０５、１４５／１９５、１４７、１４７／２００、１９２、１９４、１９４／２００、１９５、１９８、および２００から選択される１つまたは複数の位置における少なくとも１つの置換または置換セットを有する操作されたケトレダクターゼバリアントであって、位置が、配列番号３３０に関して番号付けされている、操作されたケトレダクターゼバリアントを提供する。一部の追加の実施形態では、操作されたケトレダクターゼバリアントは、１２Ｖ／７２Ｓ／１０９Ｋ／１９５Ｒ、１７Ａ／７３Ｖ／２００Ｐ、１７Ａ／１１５Ｑ、６８Ｅ／７２Ｄ／１０１Ｋ／１５２Ｑ／２０５Ｌ、６８Ｒ／７２Ｄ／１０１Ｑ／１５２Ｑ／２０５Ｌ、６８Ｒ／７２Ｒ／１２４Ｅ、６８Ｒ／７２Ｒ／１２４Ｅ／１５２Ｑ、６８Ｒ／１０１Ｑ／１２４Ｅ／１５２Ｑ／２０５Ｌ、６８Ｒ／１２４Ｅ／２０５Ｌ、７２Ｄ／１５２Ｑ、７２Ｋ／１５２Ｍ／１９５Ｒ、７２Ｋ／１９５Ｒ、７２Ｓ／１０９Ｋ／１５２Ｍ／１９５Ｒ、７２Ｓ／１０９Ｋ／１９５Ｒ、７３Ｖ、７３Ｖ／１４７Ｉ、７９Ａ、９３Ａ、９３Ａ／９５Ｒ／１４５Ａ／１９５Ｒ、９３Ａ／１０９Ｋ／１１４Ｔ／１４５Ａ／１９５Ｒ、９３Ａ／１９５Ｒ、９５Ｒ／１９５Ｒ、９６Ｐ／１０８Ｓ／１４７Ｉ／２００Ｐ、９６Ｐ／１９４Ｎ／２００Ｐ、１０１Ｍ／２０５Ｌ、１４５Ａ／１９５Ａ、１４７Ｉ、１４７Ｉ／２００Ｐ、１９２Ｒ、１９４Ｎ、１９４Ｎ／２００Ｐ、１９５Ｒ、１９８Ｇ、１９８Ｒ、および２００Ｐから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、位置は、配列番号３３０に関して番号付けされている。一部のさらなる実施形態では、操作されたケトレダクターゼバリアントは、Ｉ１２Ｖ／Ｔ７２Ｓ／Ｄ１０９Ｋ／Ｓ１９５Ｒ、Ｍ１７Ａ／Ｌ７３Ｖ／Ｅ２００Ｐ、Ｍ１７Ａ／Ｌ１１５Ｑ、Ａ６８Ｅ／Ｔ７２Ｄ／Ｒ１０１Ｋ／Ａ１５２Ｑ／Ａ２０５Ｌ、Ａ６８Ｒ／Ｔ７２Ｄ／Ｒ１０１Ｑ／Ａ１５２Ｑ／Ａ２０５Ｌ、Ａ６８Ｒ／Ｔ７２Ｒ／Ｌ１２４Ｅ、Ａ６８Ｒ／Ｔ７２Ｒ／Ｌ１２４Ｅ／Ａ１５２Ｑ、Ａ６８Ｒ／Ｒ１０１Ｑ／Ｌ１２４Ｅ／Ａ１５２Ｑ／Ａ２０５Ｌ、Ａ６８Ｒ／Ｌ１２４Ｅ／Ａ２０５Ｌ、Ｔ７２Ｄ／Ａ１５２Ｑ、Ｔ７２Ｋ／Ａ１５２Ｍ／Ｓ１９５Ｒ、Ｔ７２Ｋ／Ｓ１９５Ｒ、Ｔ７２Ｓ／Ｄ１０９Ｋ／Ａ１５２Ｍ／Ｓ１９５Ｒ、Ｔ７２Ｓ／Ｄ１０９Ｋ／Ｓ１９５Ｒ、Ｌ７３Ｖ、Ｌ７３Ｖ／Ｌ１４７Ｉ、Ｅ７９Ａ、Ｉ９３Ａ、Ｉ９３Ａ／Ｖ９５Ｒ／Ｍ１４５Ａ／Ｓ１９５Ｒ、Ｉ９３Ａ／Ｄ１０９Ｋ／Ｎ１１４Ｔ／Ｍ１４５Ａ／Ｓ１９５Ｒ、Ｉ９３Ａ／Ｓ１９５Ｒ、Ｖ９５Ｒ／Ｓ１９５Ｒ、Ｉ９６Ｐ／Ｒ１０８Ｓ／Ｌ１４７Ｉ／Ｅ２００Ｐ、Ｉ９６Ｐ／Ｅ１９４Ｎ／Ｅ２００Ｐ、Ｒ１０１Ｍ／Ａ２０５Ｌ、Ｍ１４５Ａ／Ｓ１９５Ａ、Ｌ１４７Ｉ、Ｌ１４７Ｉ／Ｅ２００Ｐ、Ｋ１９２Ｒ、Ｅ１９４Ｎ、Ｅ１９４Ｎ／Ｅ２００Ｐ、Ｓ１９５Ｒ、Ｑ１９８Ｇ、Ｑ１９８Ｒ、およびＥ２００Ｐから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、位置は、配列番号３３０に関して番号付けされている。

【0028】

本発明はまた、配列番号４、６、８０、１０４、１７２、１８６、１９４、２５２、２７０、２７２、２８６、３２８、および／または３３０と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチド配列を含む操作されたケトレダクターゼバリアントを提供する。一部の実施形態では、操作されたケトレダクターゼバリアントは、配列番号４、６、８０、１０４、１７２、１８６、１９４、２５２、２７０、２７２、２８６、３２８、および／または３３０と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチド配列を含む。一部のさらなる実施形態では、操作されたケトレダクターゼバリアントは、配列番号４、６、８０、１０４、１７２、１８６、１９４、２５２、２７０、２７２、２８６、３２８および／または３３０に示されるポリペプチド配列を含む。一部の追加の実施形態では、操作されたケトレダクターゼバリアントは、表５－１、６－１、７－１、８－１、１７－２、１８－１、１９－１、１９－２、２０－１、２０－２、２１－１、２２－１および／または２４－１に与えられるバリアントをコードするポリペプチド配列を含む。一部のさらなる実施形態では、操作されたケトレダクターゼバリアントは、配列番号６から４１２に示される偶数番号の配列から選択されるポリペプチド配列を含む。

【0029】

本発明はまた、本明細書において提供される操作されたケトレダクターゼバリアントをコードする操作されたポリヌクレオチド配列を提供する。一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号５から４１１に示される奇数番号の配列から選択される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えて同一であるポリヌクレオチド配列を含む。本発明はまた、本明細書において提供される操作されたケトレダクターゼバリアントをコードする操作されたポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。一部の実施形態では、ベクターは、少なくとも１つの制御配列をさらに含む。一部の実施形態では、ベクターは、配列番号４１３および／または４１４を含む。

【0030】

本発明はまた、本明細書において提供される操作されたケトレダクターゼバリアントをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む宿主細胞を提供する。

【0031】

本発明はまた、本明細書において提供される操作されたケトレダクターゼバリアントを生成する方法であって、操作されたケトレダクターゼバリアントが宿主細胞によって産生される条件下で、本明細書において提供される宿主細胞を培養するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、宿主細胞によって産生される操作されたケトレダクターゼバリアントを回収するステップをさらに含む。一部のさらなる実施形態では、操作されたケトレダクターゼバリアントを生成する方法は、配列番号４１３および／または４１４のベクターを含む宿主細胞を培養するステップを含む。

【0032】

本発明はまた、固定された操作されたケトレダクターゼバリアントを提供する。

【0033】

本発明は、少なくとも１つの、本明細書において提供される操作されたケトレダクターゼバリアントを含む組成物をさらに提供する。一部の実施形態では、組成物は、本明細書において提供される少なくとも１つの固定された操作されたケトレダクターゼバリアントを含む。

【図面の簡単な説明】

【0034】

【図1】図１は、高い基質濃度での配列番号６および配列番号８０のポリペプチドのＫＲＥＤ活性を比較する典型的なＨＰＬＣ反応プロファイルを提供する。

【0035】

【図2】図２は、実施例１１に記載の実験の結果、高い基質および低いＮＡＤＰ濃度での選択されたバリアントのＫＲＥＤ活性（変換％）を提供する。

【0036】

【図3】図３は、配列番号１９４のポリペプチドによって生成されるＲｈｏ種を描示する典型的なＨＰＬＣ反応プロファイルを提供する。

【0037】

【図4】図４は、高い基質および低いＮＡＤＰ濃度での配列番号３２８および配列番号３３０のポリペプチドのＫＲＥＤ活性を比較する典型的なＨＰＬＣ反応プロファイルを提供する。図４について、実線＝４ｇ／Ｌの酵素；破線＝１ｇ／Ｌの酵素；菱形＝配列番号３２８；白抜きの四角＝配列番号３３０。

【0038】

【図5】図５は、高い基質および低いＮＡＤＰ濃度での配列番号２７０、配列番号３２８、配列番号３３０、配列番号３４８、配列番号３４６、および配列番号３５６のポリペプチドのＫＲＥＤ活性を比較する典型的なＨＰＬＣ反応プロファイルを提供する。図５について、白抜きの三角＝配列番号２７０；黒塗りの三角＝配列番号３２８；白抜きの丸＝配列番号３４８；黒塗りの丸＝配列番号３５６；白抜きの四角＝配列番号３３０；黒塗りの四角＝配列番号３４６。

【発明を実施するための形態】

【0039】

発明の説明
本発明は、天然に存在する野生型ケトレダクターゼと比較して改善された特性を有する操作されたケトレダクターゼ酵素、ならびに操作されたケトレダクターゼ酵素をコードするポリヌクレオチド、操作されたケトレダクターゼ酵素を発現することができる宿主細胞、および操作されたケトレダクターゼ酵素を使用する方法を提供する。

【0040】

定義
本発明に関して、この明細書で使用される技術用語および科学用語は、別段具体的に定義されていなければ、当業者によって通常理解される意味を有する。したがって、以下の用語は、以下の意味を有することを意図する。本明細書において言及されるすべての特許および刊行物は、このような特許および刊行物に開示されるすべての配列も含めて、参照により明示的に組み込まれる。別段示されていなければ、本発明の実践は、当業者に公知の分子生物学、発酵、微生物学、および関連する分野で通常使用されている従来の技法に関与する。本明細書で別段定義されていなければ、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、この発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様のまたは同等の任意の方法および材料は、本発明の実践または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料が記載されている。実際に、本発明は、これらが、使用される文脈に応じて変化し得るため、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコール、および試薬に限定されるものではないことが意図される。本明細書で与えられる見出しは、本発明の種々の態様または実施形態の限定ではない。

【0041】

それにもかかわらず、本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語を以下に定義する。数値範囲は、範囲を定義する数値を包括する。よって、本明細書に開示されるすべての数値範囲は、すべてのより狭い数値範囲がすべて本明細書に明示的に記載されているかのように、このようなより広い数値範囲内になるこのようなすべてのより狭い数値範囲を包含することを意図する。本明細書に開示されるすべての最大（または最小）の数値限定は、このようなすべてのより小さい（またはより大きい）数値限定が本明細書に明示的に記載されているかのように、このようなより小さい（または大きい）数値限定を含むことも意図する。

【0042】

本明細書で使用する場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語およびその同族言語は、これらの包括的意味（すなわち、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」およびその対応する同族言語に等価な意味）において使用される。

【0043】

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈において別段明確に示されていなければ、複数の対象を含む。よって、例えば、「宿主細胞」への言及は、複数のこのような宿主細胞を含む。

【0044】

別段示されていなければ、それぞれ、核酸は、５’から３’の方向に左から右に記載され、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシの方向に左から右に記載されている。

【0045】

本明細書で与えられる見出しは、全体として本明細書を参照して有され得る、本発明の種々の態様または実施形態の限定ではない。よって、以下に定義される用語は、全体として本明細書を参照してより十分に定義される。

【0046】

「ケトレダクターゼ」および「ＫＲＥＤ」は、カルボニル基をその対応するアルコールに還元する酵素能力を有するポリペプチドを指すために、本明細書で互換的に使用される。より具体的には、本発明のケトレダクターゼポリペプチドは、スキーム１に示されるように、イソα酸の混合物を対応するジヒドロ－（ｒｈｏ）－イソα酸に還元することができる。本発明のケトレダクターゼ酵素は、Ｌ．ｋｅｆｉｒの天然に存在するＫＲＥＤ（配列番号２）に由来する。しかし、ＫＲＥＤおよびケトレダクターゼという用語は、かように限定されず、天然に存在する酵素、または細菌、植物、藻類および／もしくは動物種の種々の種に由来する酵素を指すことができる。酵素は、合成のものであっても、人工のものであっても、または当業者に公知の種々の方法によって産生されたものであってもよい。

【0047】

「イソα酸」または「ｉｓｏ」は、ホップ、ホップ植物Ｈｕｍｕｌｕｓ ｌｕｐｕｌｕｓ Ｌ．の花、に由来する化合物である、イソフムロンの異性体、エピマー、ジアステレオマー、互変異性体およびエナンチオマーを指すために、本明細書で互換的に使用される。「イソα酸」または「ｉｓｏ」は、これらに限定されないが、ｃｉｓ－イソフムロン、ｔｒａｎｓ－イソフムロン、ｃｉｓ－イソ－ｃｏ－フムロン、ｔｒａｎｓ－イソ－ｃｏ－フムロン、ｃｉｓ－イソ－ａｄ－フムロン、およびｔｒａｎｓ－イソ－ａｄ－フムロンを含む。「イソα酸」または「ｉｓｏ」はまた、同様の化学特性、特に、ビールまたは他のアルコール飲料もしくは同様の飲料に苦い味または苦味を付与する特性を有する、任意の天然に存在するまたは合成の異性体、エピマー、ジアステレオマー、互変異性体、エナンチオマーまたは他の誘導体もしくは同様の化合物を含む。これは、イソフムロンテトロン酸コアの任意の異性体、エピマー、ジアステレオマー、エナンチオマーまたは互変異性体を含む。

【0048】

「ジヒドロ－（ｒｈｏ）－イソα酸」または「ｒｈｏ」は、本明細書で定義される通りの「イソα酸」または「ｉｓｏ」のカルボニル基の還元によって生成される化合物を指すために、本明細書で互換的に使用される。「ジヒドロ－（ｒｈｏ）－イソα酸」または「ｒｈｏ」は、本明細書に記載されているように、１つまたは複数のＫＲＥＤポリペプチドによる変換によって「イソα酸」または「ｉｓｏ」から生成することができる。

【0049】

本明細書で使用する場合、「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」という用語は、長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化、脂質化、ミリスチル化、ユビキチン化など）にかかわらず、アミド結合によって共有結合的に連結された少なくとも２つのアミノ酸のポリマーを示すために、本明細書で互換的に使用される。Ｄ－アミノ酸およびＬ－アミノ酸、ならびにＤ－アミノ酸とＬ－アミノ酸との混合物は、この定義に含まれる。

【0050】

本明細書で使用する場合、「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、共有結合的に一緒に連結された２つまたはそれより多いヌクレオシドを指す。ポリヌクレオチドは、リボヌクレオシドから完全に構成され得るか（すなわち、ＲＮＡ）、２’デオキシリボヌクレオチドから完全に構成され得るか（すなわち、ＤＮＡ）、またはリボヌクレオシドと２’デオキシリボヌクレオシドとの混合物であり得る。ヌクレオシドは、典型的には、標準的なホスホジエステル連結を介して一緒に連結されるが、ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の非標準的な連結を含み得る。ポリヌクレオチドは、一本鎖もしくは二本鎖であってもよく、または一本鎖領域と二本鎖領域の両方を含んでもよい。さらに、ポリヌクレオチドは、典型的には、天然に存在するコード核酸塩基（すなわち、アデニン、グアニン、ウラシル、チミン、およびシトシン）から構成されるが、１つまたは複数の改変核酸塩基および／または合成核酸塩基（例えば、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチンなど）を含み得る。好ましくは、このような改変核酸塩基または合成核酸塩基は、コード核酸塩基である。

【0051】

本明細書で使用する場合、「コード配列」は、タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸（例えば、遺伝子）の部分を指す。

【0052】

本明細書で使用する場合、「天然に存在する」または「野生型」は、天然に見られる形態を指す。例えば、天然に存在するかまたは野生型のポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、生物中に存在する配列であって、天然の供給源から単離することができ、人為的操作によって意図的に改変されていない配列である。

【0053】

本明細書で使用する場合、「天然に存在しない」または「操作された」または「組換え」は、（例えば、細胞、核酸、またはポリペプチド）に関して本発明において使用される場合、普通なら天然に存在しない様式で改変されたか、またはそれと同一であるが合成材料からおよび／もしくは組換え技法を使用する操作によって生産もしくは導出された、材料またはその材料の天然の形態もしくはネイティブな形態に対応する材料を指す。非限定的な例として、とりわけ、ネイティブな（非組換え）形態の細胞内に見られない遺伝子を発現するかまたは普通なら異なるレベルで発現されるネイティブな遺伝子を発現する組換え細胞が挙げられる。

【0054】

本明細書で使用する場合、「配列同一性のパーセンテージ」、「パーセント同一性」および「パーセント同一な」は、ポリヌクレオチド配列間またはポリペプチド配列間の比較を指し、比較ウインドウにわたって最適にアライメントされた２つの配列を比較することによって決定され、比較ウインドウ内のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の一部は、２つの配列の最適なアライメントの参照配列と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。両配列において同一の核酸塩基もしくはアミノ酸残基のいずれかが生じるかまたは核酸塩基もしくはアミノ酸残基がギャップと共にアライメントされる位置の数を決定し、マッチ位置の数を得て、マッチ位置の数を比較のウインドウ内の位置の総数で割り、その結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることによって、このパーセンテージを計算することができる。最適なアライメントおよびパーセント配列同一性の決定は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムを使用して実施される（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５： ４０３－４１０ ［１９９０］；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３３８９－３４０２ ［１９７７］を参照のこと）。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトを通じて公的に利用可能である。

【0055】

簡潔に言えば、ＢＬＡＳＴ分析は、データベース配列内の同じ長さのワードとアライメントした場合に、ある正の値の閾値スコアＴとマッチするかまたはそれを満たす、クエリ配列中の長さＷの短いワードを特定することによって、高いスコアになる配列の対（ＨＳＰ）を最初に特定することに関与する。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．、上掲）。これらの初期の隣接ワードヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを見つける検索を開始するためのシードとしての役割を果たす。次いで、累積アライメントスコアを増加することができる限り、そのワードヒットをそれぞれの配列に沿って両方向に伸長する。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメーターＭ（１対のマッチ残基に対する報酬スコア；常に、＞０）およびＮ（ミスマッチ残基に対するペナルティスコア；常に、＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列については、スコアリング行列を使用して、累積スコアを計算する。それぞれの方向におけるワードヒットの伸長は、累積アライメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ低下するか；累積スコアが１つもしくは複数の負のスコアの残基アライメントの累積に起因してゼロまたはそれ未満になるか；またはいずれかの配列の末端に達する場合に、停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸによって、アライメントの感度および速度が決定される。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列を使用する（例えば、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：１０９１５ ［１９８９］を参照のこと）。

【0056】

２つの配列に対してパーセント同一性を与える際に、ＢＬＡＳＴと同様に機能する多数の他のアルゴリズムが利用可能であり、当技術分野で公知である。比較のための配列の最適なアライメントは、当技術分野で公知の任意の好適な方法を使用するか（例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２ ［１９８１］の局所相同性アルゴリズムによる；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３ ［１９７０］の相同性アライメントアルゴリズムによる；Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５： ２４４４ ［１９８８］の類似性調査法による；ならびに／またはこれらのアルゴリズムのコンピューター制御による実行による［ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ］）、または当技術分野で一般に公知の方法を使用して、目視検査によって行うことができる。さらに、配列アライメントおよびパーセント配列同一性の決定は、提供されたデフォルトのパラメーターを使用して、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）中のＢＥＳＴＦＩＴまたはＧＡＰプログラムを用いることができる。

【0057】

本明細書で使用する場合、「参照配列」は、別の配列が比較される規定の配列を指す。参照配列は、より大きい配列のサブセット、例えば、全長遺伝子またはポリペプチド配列のセグメントであり得る。一般的に、参照配列は、長さが少なくとも２０のヌクレオチドもしくはアミノ酸残基、長さが少なくとも２５残基、長さが少なくとも５０残基、または核酸もしくはポリペプチドの全長である。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドはそれぞれ、（１）２つの配列間で類似している配列（すなわち、完全な配列の部分）を含むことができ、（２）２つの配列間で異なる配列をさらに含むことができるので、典型的には、比較ウインドウにわたる２つのポリヌクレオチドの配列を比較して、局所領域の配列類似性を同定および比較することによって、２つの（またはそれより多い）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の配列比較を実施する。「参照配列」という用語は、野生型配列に限定されることを意図するものではなく、操作されたかまたは変更された配列を含むことができる。例えば、一部の実施形態では、「参照配列」は、以前に操作されたかまたは変更されたアミノ酸配列であり得る。

【0058】

本明細書で使用する場合、「比較ウインドウ」は、少なくとも約２０の連続したヌクレオチド位置またはアミノ酸残基の概念上のセグメントを指し、配列は、少なくとも２０の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸の参照配列と比較することができ、比較ウインドウ中の配列の部分は、２つの配列の最適なアライメントに関して、参照配列（付加も欠失も含まない）と比較した場合に、２０パーセントまたはそれより低い付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。比較ウインドウは、２０より長い連続した残基であり得、必要に応じて３０、４０、５０、１００またはそれより長いウインドウを含む。

【0059】

本明細書で使用する場合、「に対応する」、「を参照して」または「に対して」は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列の番号付けとの関連で使用される場合、所与のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列が参照配列と比較される場合の、指定の参照配列の残基の番号付けを指す。換言すれば、所与のポリマーの残基番号または残基位置は、所与のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列内の残基の実際の数値的な位置によってではなく、参照配列に対して指定される。例えば、操作されたケトレダクターゼのアミノ酸配列などの所与のアミノ酸配列は、２つの配列間の残基マッチを最適化するためにギャップを導入することによって、参照配列に対してアライメントさせることができる。これらの場合には、ギャップが存在するが、所与のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列における残基の番号付けは、この配列がアライメントされている参照配列に対してなされる。本明細書で使用する場合、以下でさらに記載されるように、「Ｘｎ」などの残基位置への言及は、別段具体的に表示されていなければ、「に対応する残基」に言及するものとして解釈されるべきである。よって、例えば、「Ｘ９４」は、ポリペプチド配列の位置９４における任意のアミノ酸を指す。

【0060】

本明細書で使用する場合、「立体選択性」は、化学反応または酵素反応における一方の立体異性体の別の立体異性体または別の立体異性体のセットに勝る優先的形成を指す。立体選択性は、立体異性体の形成が別のものより好ましい場合には部分的である場合があり、または一方の立体異性体しか形成されない場合には完全である場合がある。立体異性体がエナンチオマーである場合、その立体選択性はエナンチオ選択性と称され、一方のエナンチオマーの両方のエナンチオマーの合計中の分率である（典型的には、パーセンテージとして報告される）。これは、当技術分野では、通常、代替的に、式［主エナンチオマー－副エナンチオマー］／［主エナンチオマー＋副エナンチオマー］に従ってそれから算出されるエナンチオマー過剰率（ｅ．ｅ．）として（典型的には、パーセンテージとして）報告される。立体異性体が、ジアステレオ異性体である場合、立体選択性は、ジアステレオ選択性とも称され、２つのジアステレオマーの混合物中の一方のジアステレオマーの分率であり（典型的には、パーセンテージとして報告される）、通常、代替的に、ジアステレオマー過剰率（ｄ．ｅ．）として報告される。エナンチオマー過剰率およびジアステレオマー過剰率は、立体異性体過剰率（ｓｔｅｒｅｏｍｅｒｉｃ ｅｘｃｅｓｓ）の種類である。立体選択性が、単一の立体異性体に限定されないことおよび立体異性体のセットについて記載され得ることも理解されるべきである。

【0061】

本明細書で使用する場合、「高度に立体選択的」は、少なくとも約７５％の立体異性体過剰率で、基質をその対応するキラルアルコール生成物に変換することができる化学反応または酵素反応を指す。

【0062】

本明細書で使用する場合、「増加した酵素活性」および「増加した活性」は、操作された酵素の改善された特性を指し、参照酵素と比較して比活性（例えば、生成される生成物／時間／タンパク質重量）の増加または基質の生成物への変換パーセント（例えば、指定量のケトレダクターゼを使用する指定時間内の生成物への基質の出発量の変換パーセント）の増加によって示され得る。酵素活性を決定するための例示的な方法を、実施例に提供する。Ｋｍ、Ｖｍａｘまたはｋｃａｔの古典的酵素特性を含む、その変化によって酵素活性の増加が導かれ得る、酵素活性に関する任意の特性が影響を受ける可能性がある。ケトレダクターゼ活性は、ケトレダクターゼを測定するために使用される標準的なアッセイのいずれか１つ、例えば、基質もしくは生成物の濃度の変化、または補因子（補因子再生系が存在しない場合）の濃度の変化によって、測定することができる。酵素活性の比較は、本明細書中で詳細にさらに説明するような、酵素の規定された調製、設定条件下での規定されたアッセイ、および１つまたは複数の規定された基質を使用してなされる。一般的に、細胞溶解物中の酵素を比較する場合、宿主細胞によって産生され、溶解物中に存在する酵素の量の変動を最小にするために同一の発現系および同一の宿主細胞を使用するのと同様に、アッセイされる細胞の数およびタンパク質の量を決定する。

【0063】

本明細書で使用する場合、「変換」は、基質の対応する生成物への酵素的変換を指す。

【0064】

本明細書で使用する場合、「変換パーセント」は、ある期間内に、指定の条件下で、生成物に変換される基質のパーセントを指す。よって、例えば、ケトレダクターゼポリペプチドの「酵素活性」または「活性」は、基質の生成物への「変換パーセント」として表現され得る。

【0065】

本明細書で使用する場合、「熱安定性（ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ）」または「熱安定性の（ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｌｅ）」は、未処理の酵素と比較して、ある期間（例えば、０．５～２４時間）、温度条件のセット（例えば、４０～８０℃）に曝露した際に不活性化に耐性であり、よって、高温への曝露後にある特定のレベルの残存活性（例として、６０％を超えて、例えば８０％まで）を保持するポリペプチドを指す。

【0066】

本明細書で使用する場合、「溶媒安定な（ｓｏｌｖｅｎｔ ｓｔａｂｌｅ）」は、様々な濃度（例えば、５～９９％）の溶媒への曝露後に、未処理の酵素と比較して同様の活性（例として、例えば６０％を超えて、８０％まで）を維持するポリペプチドの能力を指す。

【0067】

本明細書で使用する場合、「アミノ酸差異」または「残基差異」は、参照配列中の対応する位置のアミノ酸残基に対するポリペプチド配列の位置でのアミノ酸残基の差異を指す。アミノ酸差異の位置は、一般的に、本明細書では「Ｘｎ」（ｎは、残基差異が基づく参照配列における対応する位置を指す）と称される。例えば、「配列番号２と比較した位置Ｘ４０の残基差異」は、配列番号２の位置４０に対応するポリペプチド位置のアミノ酸残基の差異を指す。したがって、配列番号２の参照ポリペプチドが位置４０でヒスチジンを有する場合、「配列番号２と比較した位置Ｘ４０の残基差異」は、配列番号２の位置４０に対応するポリペプチドの位置でのヒスチジン以外の任意の残基のアミノ酸置換を指す。本明細書のほとんどの場合には、ある位置における特定のアミノ酸残基差異は、「ＸｎＹ」（「Ｘｎ」は、上記のように対応する位置を指定し、「Ｙ」は、操作されたポリペプチドに見られるアミノ酸（すなわち、参照ポリペプチド中と異なる残基）の一文字識別子である）として示される。一部の場合には、本発明はまた、従来の表記「ＡｎＢ」（Ａは、参照配列中の残基の一文字識別子であり、「ｎ」は、参照配列中の残基位置の番号であり、Ｂは、操作されたポリペプチドの配列中の残基置換の一文字識別子である）によって表される特定のアミノ酸差異を提供する。一部の場合には、本発明のポリペプチドは、参照配列に対する１つまたは複数のアミノ酸残基差異を含むことができ、これは、残基差異が参照配列に対して存在する指定の位置のリストによって示される。一部の実施形態では、ポリペプチドの特定の残基位置に１つより多くのアミノ酸を使用することができる場合、使用することができる種々のアミノ酸残基は、「／」によって区切られる（例えば、Ｘ１９２Ａ／Ｇ）。本発明は、保存的アミノ酸置換および非保存的アミノ酸置換のいずれかまたは両方を含む１つまたは複数のアミノ酸差異を含む操作されたポリペプチド配列を包含する。本発明の配列表に含まれる特定の組換えケトレダクターゼポリペプチドのアミノ酸配列は、開始メチオニン（Ｍ）残基を含む（すなわち、Ｍは残基位置１を表す）。しかし、この開始メチオニン残基は、開始メチオニン残基を欠くが他の点では酵素の特性を保持する成熟タンパク質を生成するために、例えば宿主細胞またはｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系においてなど、生物学的プロセシング機構によって除去することができることが当業者に理解される。結果として、「位置Ｘｎにおける配列番号２に対するアミノ酸残基差異」という用語は、本明細書で使用する場合、開始メチオニンを欠くようにプロセシングされた参照配列内の位置「Ｘｎ」または対応する位置（例えば、位置（Ｘ－１）ｎ）を指す場合がある。

【0068】

本明細書で使用する場合、「保存的アミノ酸置換」という語句は、類似側鎖を有する残基の互換性を指し、よって、典型的には、ポリペプチド中のアミノ酸を、同一または類似の規定アミノ酸クラス内のアミノ酸で置換することを伴う。一例として限定されないが、一部の実施形態では、脂肪族側鎖を有するアミノ酸は、別の脂肪族アミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン）で置換され；ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸は、ヒドロキシル側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、セリンおよびトレオニン）と置換され；芳香族側鎖を有するアミノ酸は、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、およびヒスチジン）と置換され；塩基性側鎖を有するアミノ酸は、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、リシンおよびアルギニン）と置換され；酸性側鎖を有するアミノ酸は、酸性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）と置換され；および／または、疎水性もしくは親水性アミノ酸は、それぞれ別の疎水性もしくは親水性アミノ酸と置き換えられる。例示的な保存的置換を表１に提供する。

【表1】

【0069】

本明細書で使用する場合、「非保存的置換」という語句は、ポリペプチド中のアミノ酸を、側鎖特性が顕著に異なるアミノ酸に置換することを指す。非保存的置換は、規定のグループ内ではなく規定のグループ間のアミノ酸を使用してもよく、（ａ）置換（例えば、グリシンからプロリン）の領域内のペプチド骨格の構造、（ｂ）電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のかさに影響を及ぼす。一例として限定されないが、例示的な非保存的置換は、塩基性または脂肪族アミノ酸と置換された酸性アミノ酸；小さいアミノ酸と置換された芳香族アミノ酸；および疎水性アミノ酸と置換された親水性アミノ酸であり得る。

【0070】

当業者によって認識されるように、上記で定義したカテゴリーの一部は、特段指定されていなければ、相互に排他的ではない。よって、２つまたはそれより多い物理化学特性を示す側鎖を有するアミノ酸は、複数のカテゴリーに含まれ得る。任意のアミノ酸または残基の適切な分類は、特に、本明細書で提供される詳細な発明を鑑みて、当業者に明らかであろう。

【0071】

本明細書で使用する場合、「欠失」は、参照ポリペプチドから１つまたは複数のアミノ酸を除去することによる、ポリペプチドの改変を指す。欠失は、酵素活性を保持し、および／または操作された酵素の改善された特性を保持する一方で、１もしくはそれより多いアミノ酸、２もしくはそれより多いアミノ酸、５もしくはそれより多いアミノ酸、１０もしくはそれより多いアミノ酸、１５もしくはそれより多いアミノ酸または２０もしくはそれより多いアミノ酸の除去であって、ポリペプチドを構成する全アミノ酸数の１０％まで、またはその全アミノ酸数の２０％までの除去を含み得る。欠失は、ポリペプチドの内部部分および／または末端部分を対象とするものであり得る。種々の実施形態では、欠失は連続的なセグメントを含み得るか、または不連続であり得る。

【0072】

本明細書で使用する場合、「挿入」は、参照ポリペプチドへと１つまたは複数のアミノ酸を付加することによる、ポリペプチドの改変を指す。一部の実施形態では、改善された操作されたケトレダクターゼ酵素は、天然に存在するケトレダクターゼポリペプチドへの１または複数のアミノ酸の挿入、および操作されたケトレダクターゼポリペプチドへの１または複数のアミノ酸の挿入を含む。挿入は、ポリペプチドの内部部分にあり得るか、またはカルボキシ末端もしくはアミノ末端に対するものであり得る。当技術分野で公知であるように、本明細書で使用される挿入は、融合タンパク質を含む。天然に存在するポリペプチドにおいて、挿入は、連続的なアミノ酸セグメントであり得るか、または１つもしくは複数のアミノ酸によって隔てられ得る。

【0073】

「アミノ酸置換セット」または「置換セット」という用語は、参照配列と比較した、ポリペプチド配列内のアミノ酸置換の群を指す。置換セットは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、またはそれを超えるアミノ酸置換を有し得る。一部の実施形態では、置換セットは、実施例において提供される表に列挙されているバリアントＫＲＥＤのいずれかに存在するアミノ酸置換のセットを指す。

【0074】

本明細書で使用する場合、「断片」は、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失を有するが、残りのアミノ酸配列は、配列中の対応する位置と同一である、ポリペプチドを指す。断片は、典型的には、全長ケトレダクターゼポリペプチド、例えば、配列番号４のポリペプチドの約８０％、約９０％、約９５％、約９８％または約９９％を有し得る。一部の実施形態では、断片は、「生物学的に活性」である（すなわち、全長配列と同一の酵素活性を示す）。

【0075】

本明細書で使用する場合、「単離されたポリペプチド」は、天然でそれに付随する他の夾雑物、例えば、タンパク質、脂質、およびポリヌクレオチドから実質的に分離されたポリペプチドを指す。この用語は、それらの天然に存在する環境または発現系（例えば、宿主細胞またはｉｎ ｖｉｔｒｏ合成）から除去または精製されたポリペプチドを包含する。改善されたケトレダクターゼ酵素は、細胞内に存在し得るか、細胞培地中に存在し得るか、または種々の形態、例えば、溶解物または単離された調製物中で調製され得る。したがって、一部の実施形態では、本発明の操作されたケトレダクターゼポリペプチドは、単離されたポリペプチドであり得る。

【0076】

本明細書で使用する場合、「実質的に純粋なポリペプチド」は、そのポリペプチド種が存在する優勢種である（すなわち、モルまたは重量基準で、これが、組成物中の任意の他の個々の高分子種よりも豊富である）組成物を指し、一般的に、目的種が、存在する高分子種の少なくとも約５０モルパーセントまたは約５０重量％を構成する場合、実質的に精製された組成物である。一般的に、実質的に純粋な操作されたケトレダクターゼポリペプチド組成物は、この組成物中に存在するすべての高分子種の約６０モル％もしくは６０重量％またはそれを超える割合、約７０モル％もしくは７０重量％またはそれを超える割合、約８０モル％もしくは８０重量％またはそれを超える割合、約９０モル％もしくは９０重量％またはそれを超える割合、約９１モル％もしくは９１重量％またはそれを超える割合、約９２モル％もしくは９２重量％またはそれを超える割合、約９３モル％もしくは９３重量％またはそれを超える割合、約９４モル％もしくは９４重量％またはそれを超える割合、約９５モル％もしくは９５重量％またはそれを超える割合、約９６モル％もしくは９６重量％またはそれを超える割合、約９７モル％もしくは９７重量％またはそれを超える割合、約９８モル％もしくは９８重量％またはそれを超える割合、あるいは約９９モル％もしくは９９重量％を構成する。溶媒種、小分子（５００ダルトン未満）、および元素イオン種は、高分子種と見なされない。一部の実施形態では、単離された改善されたケトレダクターゼポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチド組成物である。

【0077】

本明細書で使用する場合、核酸またはポリペプチドに関して使用される場合、「異種」という用語は、生物（例えば、野生型生物）によって通常発現および分泌されない配列を指す。一部の実施形態では、この用語は、通常天然に見られるものと互いに同じ関係では見られない、あるいは組換え操作されており、その結果、発現のレベル、または細胞内の他の核酸もしくは他の分子との物理的関係、または構造が通常天然に見られない、２つまたはそれを超える部分配列を含む配列を包含する。例えば、異種核酸は、典型的には、組換えによって生成され、天然に見られない様式で配置された無関係の遺伝子に由来する２つまたはそれを超える配列を有する（例えば、ベクターなどの発現カセットに挿入されたプロモーター配列に作動的に連結した本発明の核酸オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ））。一部の実施形態では、「異種ポリヌクレオチド」は、実験室での技法によって宿主細胞中に導入される任意のポリヌクレオチドを指し、宿主細胞から取り出され、実験室操作に供され、次いで、宿主細胞中に再導入されるポリヌクレオチドを含む。

【0078】

本明細書で使用する場合、「コドン最適化された」は、コードされたタンパク質が目的の生物内で効率的に発現されるように、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンの、特定の生物内で優先的に使用されるものへの変化を指す。一部の実施形態では、ケトレダクターゼ酵素をコードするポリヌクレオチドを、発現のために選択された宿主生物からの最適な産生のためにコドン最適化することができる。

【0079】

本明細書で使用する場合、「制御配列」は、本明細書では、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現に必要または有利なすべての成分を含むように定義される。各制御配列は、目的のポリヌクレオチドにとってネイティブのものであっても、外来のものであってもよい。このような制御配列として、これらに限定されないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターが挙げられる。

【0080】

本明細書で使用する場合、「作動可能に連結した」は、本明細書では、制御配列が、目的のポリヌクレオチドに対してある位置で適切に配置され（すなわち、機能的な関係で）、その結果、制御配列が、目的のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を指示または調節する構成として定義される。

【0081】

本明細書で使用する場合、「補因子再生系」および「補因子リサイクル系」という語句は、補因子の酸化形態を還元する反応（例えば、ＮＡＤＰ＋からＮＡＤＰＨ）に関与する１セットの反応物を指す。ケト基質のケトレダクターゼ触媒還元によって酸化された補因子は、補因子再生系によって還元形態に再生される。補因子再生系は、還元性水素等価物の源であり、かつ、その補因子の酸化形態を還元することができる、化学量論量の還元剤を含む。補因子再生系は、還元剤による補因子の酸化形態の還元を触媒する触媒、例えば、酵素触媒をさらに含んでもよい。それぞれ、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋からＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを再生するための補因子再生系は、当技術分野において公知であり、本明細書に記載の方法において使用することができる。

【0082】

本明細書で使用する場合、「好適な反応条件」は、本発明のケトレダクターゼポリペプチドが基質化合物を生成物化合物に立体選択的に還元することができる下での生体触媒反応溶液の条件（例えば、酵素負荷、基質負荷、補因子負荷、温度、ｐＨ、緩衝液、共溶媒などの範囲）を指す。例示的な「好適な反応条件」は本発明において提供されており、実施例によって例示されている。

【0083】

本明細書で使用する場合、「化合物負荷」、「酵素負荷」、または「補因子負荷」などの「負荷」は、反応開始時における反応混合物中の成分の濃度または量を指す。

【0084】

本明細書で使用する場合、生体触媒媒介プロセスとの関連における「基質」は、生体触媒が作用する化合物または分子を指す。例えば、本明細書に開示されるプロセスにおけるケトレダクターゼ生体触媒の例示的な基質は、イソα酸である。

【0085】

本明細書で使用する場合、生体触媒媒介プロセスとの関連における「生成物」は、生体触媒が作用した結果生じる化合物または分子を指す。

【0086】

本明細書で使用する場合、本明細書で使用される「平衡」は、化学反応または酵素反応の順方向速度定数および逆方向速度定数によって決定される、立体異性体の相互変換を含む化学反応または酵素反応（例えば、２つの種ＡおよびＢの相互変換）において化学種の定常状態の濃度をもたらすプロセスを指す。

【0087】

本明細書で使用する場合、「オキソ」は＝Ｏを指す。

【0088】

本明細書で使用する場合、「オキシ」は、エーテルおよびエステルを含む、異なるオキシ基を形成するための種々の置換を有してもよい、二価の基－Ｏ－を指す。

【0089】

本明細書で使用する場合、「カルボキシ」は、－ＣＯＯＨを指す。

【0090】

本明細書で使用する場合、「カルボニル」は、－Ｃ（Ｏ）－を指し、これは、酸、酸ハロゲン化物、アルデヒド、アミド、エステル、およびケトンを含む異なるカルボニル基を形成するための様々な置換基を有してもよい。

【0091】

本明細書で使用する場合、「ヒドロキシ」は、－ＯＨを指す。

【0092】

本明細書で使用する場合、「必要に応じた（ｏｐｔｉｏｎａｌ）」および「必要に応じて（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」は、次に記載される事象または状況が起こっても起こらなくてもよく、本明細書には、事象または状況が起こる場合および起こらない場合が含まれることを意味する。当業者は、１つまたは複数の必要に応じた置換基を含有することが記載された任意の分子に対して、立体的に実用的なおよび／または合成により実行できる化合物のみが含まれることを意味することを理解するであろう。

【0093】

本明細書で使用する場合、「必要に応じて置換された」は、化学基の用語または一連の化学基において、すべての次の修飾形態を指す。例えば、「必要に応じて置換されたアリールアルキル」という用語において、分子の「アルキル」部分と「アリール」部分は置換されていても置換されていなくてもよく、一連の「必要に応じて置換されたアルキル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリール」では、アルキル、シクロアルキル、アリール、およびヘテロアリール基は、他のものと独立して、置換されていても置換されていなくてもよい。

【0094】

操作された酵素ポリペプチド
ケトレダクターゼ（ＫＲＥＤ）またはカルボニルレダクターゼ生体触媒（ＥＣ１．１．１．１８４）は、アルデヒドおよびケトンからのアルコール、ならびに対応するプロ立体異性体ケトン基質からの光学活性第二級アルコールの合成に有用である。ＫＲＥＤは、逆反応（すなわち、アルコール基質の対応するアルデヒド／ケトン生成物への酸化）も触媒し得る。ＫＲＥＤによるアルデヒドおよびケトンの還元ならびにアルコールの酸化には、補因子、最も一般的には、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）、および酸化反応にはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋）が使用される。ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨは、電子供与体としての役割を果たし、その一方でＮＡＤ＋およびＮＡＤＰ＋は、電子受容体としての役割を果たす。

【0095】

ＫＲＥＤは、当技術分野で公知のように、広範にわたる細菌および酵母において見られ得る（例えば、Ｈｕｍｍｅｌ ａｎｄ Ｋｕｌａ Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １８４：１－１３ ［１９８９］を参照のこと）。Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＪＣ７３３８；ＧＩ：１１３６０５３８）；Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＢＡＡ２４５２８．１；ＧＩ：２８１５４０９）、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ１６０７９９；ＧＩ：６５３９７３４）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＰ９４０２９．１；ＧＩ：３３１１２０５６）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号１ＮＸＱ＿Ａ；ＧＩ：３０７４９７８２）、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ ｂｒｏｃｋｉｉ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｐ１４９４１；ＧＩ：１７７１７９０）のものを含む、多数のＫＲＥＤ遺伝子および酵素配列が報告されている。

【0096】

ケトレダクターゼの立体選択性は、重要な薬学的構成要素の調製に適用されてきた（例えば、Ｂｒｏｕｓｓｙ ｅｔ ａｌ．， Ｏｒｇ． Ｌｅｔｔ．， １１：３０５－３０８ ［２００９］を参照のこと）。有用な化学化合物を生成するための生体触媒プロセスにおける天然に存在するＫＲＥＤまたは操作されたＫＲＥＤの具体的適用は、４－クロロアセトアセテートエステルの還元（例えば、Ｚｈｏｕ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．，１０５：５９２５－５９２６ ［１９８３］；Ｓａｎｔａｎｉｅｌｌｏ， Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ．， （Ｓ）１３２－１３３ ［１９８４］；米国特許第５，５５９，０３０号；米国特許第５，７００，６７０号；および米国特許第５，８９１，６８５号を参照のこと）、ジオキソカルボン酸の還元（例えば、米国特許第６，３９９，３３９号を参照のこと）、ｔｅｒｔ－ブチル（Ｓ）－クロロ－５－ヒドロキシ－３－オキソヘキサノエートの還元（例えば、米国特許第６，６４５，７４６号；およびＷＯ０１／４０４５０を参照のこと）、ピロロトリアジン系化合物の還元（例えば、米国出願公開第２００６／０２８６６４６号を参照のこと）；置換アセトフェノンの還元（例えば、米国特許第６，８００，４７７号および同第８，７４８，１４３号を参照のこと）；およびケトチオランの還元（ＷＯ２００５／０５４４９１）に関して実証されてきた。

【0097】

イソα酸（「ｉｓｏ」）は、ｃｉｓエピマーとｔｒａｎｓエピマーの複合混合物として存在する。すべての場合、３つの異なる側鎖（ｉｓｏ上の「Ｒ」）があり、これらは、一般に、ｎ－、ａｄ－およびｃｏ－（それぞれ、ｉＢｕ、ｓＢｕ、およびｉＰｒ）と呼ばれる。加えて、ａｄ－ｉｓｏ（Ｒ＝ｓ－Ｂｕ）は、１対のエナンチオマーとして存在することが予想される。ｎ－、ａｄ－およびｃｏ－ｉｓｏの各々はまた、対応するｃｉｓ－／ｔｒａｎｓ－異性体対として存在し、還元されるケトンに隣接するＣ４第三級アルコールに由来するエナンチオマー対として存在する可能性もある。すべての場合、テトロン酸コアの互変異性体を考慮しなければ、イソα酸には最大１６の異性体（４つのＲ、ｃｉｓ／ｔｒａｎｓおよびエナンチオマー）がある。

【0098】

酵素は、典型的に、それらが作用する基質に対して非常に選択的である。よって、単一の酵素またはさらには２つの酵素の単純混合物がイソα酸の１６すべての異性体を対応するジヒドロ－（ｒｈｏ）－イソα酸に完全に変換することができるというのは予想外である。驚くべきことに、本発明は、酵素と補因子の単純混合物を使用してイソα酸をジヒドロ－（ｒｈｏ）－イソα酸に変換するためのプロセスを含む。加えて、酵素（ＫＲＥＤ）を使用する生体内変換によって、「天然」として分類／認定されるイソα酸からジヒドロ－（ｒｈｏ）－イソα酸を製造することが可能になる。

【0099】

本発明は、スキーム１に描示するように第三級アルコールに隣接するイソプレニル側鎖上のケトンのみを位置選択的に還元することによってイソα酸の１６の主要異性体を対応するジヒドロ－（ｒｈｏ）－イソα酸に無差別に還元することができる、操作されたケトレダクターゼを提供する。

【化1】

【0100】

配列番号４のケトレダクターゼポリペプチドは、本発明によって提供される改善された酵素の開発のための初期骨格として選択された。配列番号４の酵素は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒからの野生型ケトレダクターゼ（配列番号２）に由来する。配列番号４のポリペプチドは、イソα酸を対応するジヒドロ－（ｒｈｏ）－イソα酸に変換するその高い活性、ならびにその相対的な基質多様性（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｐｒｏｍｉｓｃｕｉｔｙ）および様々なイソフムロン異性体およびエピマーを対応するジヒドロ－（ｒｈｏ）－イソα酸生成物に変換する能力のため、出発骨格として選択された。加えて、配列番号４のポリペプチドは、様々な反応条件下で活性を示した。配列番号２の野生型配列は、イソα酸を対応するジヒドロ－（ｒｈｏ）－イソα酸に変換することにおいて検出可能な活性を有さないことが判明した。

【0101】

本発明の操作されたケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号４の操作されたケトレダクターゼと比較して改善された特性を有するように操作されたケトレダクターゼである。一部の実施形態では、本発明の操作されたケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号４の操作されたポリペプチドと比較して、イソα酸を対応するジヒドロ－（ｒｈｏ）－イソα酸に変換する改善された活性を有する。一部の他の実施形態では、本発明の操作されたケトレダクターゼポリペプチドは、様々なイソα酸基質に対して、配列番号４の操作されたポリペプチドと比較して改善された活性を有する。一部の他の実施形態では、本発明の操作されたケトレダクターゼポリペプチドは、様々な基質および補因子濃度において、配列番号４の操作されたポリペプチドと比較して改善された活性を有する。一部の他の実施形態では、本発明の操作されたケトレダクターゼポリペプチドは、高い基質濃度で、配列番号４の操作されたポリペプチドと比較して改善された活性を有する。一部の他の実施形態では、本発明の操作されたケトレダクターゼポリペプチドは、低い補因子濃度で、配列番号４の操作されたポリペプチドと比較して改善された活性を有する。

【0102】

一部の実施形態では、操作されたケトレダクターゼポリペプチドは、１つまたは複数の基質に対して改善された活性を有する。一部の実施形態では、基質は、イソα酸の混合物を含む。一部の実施形態では、基質は、ｃｉｓ－イソフムロンを含む。一部の実施形態では、基質は、ｔｒａｎｓ－イソフムロンを含む。一部の実施形態では、基質は、ｃｉｓ－イソ－ｃｏ－フムロンを含む。一部の実施形態では、基質は、ｔｒａｎｓ－イソ－ｃｏ－フムロンを含む。一部の実施形態では、基質は、ｃｉｓ－イソ－ａｄ－フムロンを含む。一部の実施形態では、基質は、ｔｒａｎｓ－イソ－ａｄ－フムロンを含む。

【0103】

一部の実施形態では、操作されたケトレダクターゼポリペプチドは、１つまたは複数の基質に対して改善された活性を有する。一部の実施形態では、操作されたケトレダクターゼポリペプチドは、イソα酸の混合物に対して改善された活性を有する。一部の実施形態では、操作されたケトレダクターゼポリペプチドは、ｃｉｓ－イソフムロンに対して改善された活性を有する。一部の実施形態では、操作されたケトレダクターゼポリペプチドは、ｔｒａｎｓ－イソフムロンに対して改善された活性を有する。一部の実施形態では、操作されたケトレダクターゼポリペプチドは、ｃｉｓ－イソ－ｃｏ－フムロンに対して改善された活性を有する。一部の実施形態では、操作されたケトレダクターゼポリペプチドは、ｔｒａｎｓ－イソ－ｃｏ－フムロンに対して改善された活性を有する。一部の実施形態では、操作されたケトレダクターゼポリペプチドは、ｃｉｓ－イソ－ａｄ－フムロンに対して改善された活性を有する。一部の実施形態では、操作されたケトレダクターゼポリペプチドは、ｔｒａｎｓ－イソ－ａｄ－フムロンに対して改善された活性を有する。

【0104】

一部の実施形態では、操作されたケトレダクターゼポリペプチドは、補因子リサイクル系の存在下で基質化合物を生成物化合物に変換する。一部の実施形態では、補因子リサイクル系は、第２の酵素、例えばグルコースデヒドロゲナーゼを損なわせる。一部の実施形態では、補因子リサイクル系は、イソプロパノールを含む。

【0105】

一部の実施形態では、操作されたケトレダクターゼポリペプチドは、好適な反応条件下で、配列番号４、６、８０、１０４、１７２、１８６、１９４、２５２、２７０、２７２、２８６、３２８、および／または３３０の参照ポリペプチドの活性に対して少なくとも約１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、または１００倍増加した活性で、基質化合物を生成物化合物に変換することができる。一部の実施形態では、操作されたケトレダクターゼポリペプチドは、好適な反応条件下で、約４８時間、約３６時間、約２４時間、またはさらに短い時間の反応時間で、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の変換パーセントで、基質化合物を生成物化合物に変換することができる。

【0106】

好適な反応条件は、基質化合物の対応する生成物化合物への生体触媒変換について提供する反応パラメーターの組合せを含み得る。したがって、プロセスの一部の実施形態では、反応パラメーターの組合せは、（ａ）約０．１～２２０ｇ／Ｌの基質化合物；（ｂ）約０．５～５０ｇ／Ｌの操作されたポリペプチド；（ｃ）約１０～６０％のイソプロパノール中の約０．０１～１０ｇ／ＬのＮＡＤＰ^＋；（ｄ）約５～２００ｍＭのトリエタノールアミン^＊Ｈ_２ＳＯ_４；（ｅ）約０～５ｍＭのＭｇＳＯ_４またはＭｇＣｌ_２；（ｆ）約２５℃～６０℃の温度；および（ｇ）６～１０のｐＨを含む。したがって、プロセスの一部の実施形態では、反応パラメーターの組合せは、（ａ）約１０～２２０ｇ／Ｌの基質化合物；（ｂ）約０．５～５０ｇ／Ｌの操作されたポリペプチド；（ｃ）約１０～６０％のイソプロパノール中の約０．０１～１０ｇ／ＬのＮＡＤＰ^＋；（ｄ）約５～２００ｍＭのリン酸カリウムまたはナトリウム；（ｅ）約０～５ｍＭのＭｇＳＯ_４またはＭｇＣｌ_２；（ｆ）約２５℃～６０℃の温度；および（ｇ）約６～１０のｐＨを含む。

【0107】

一部の実施形態では、反応パラメーターの組合せは、（ａ）約８０ｇ／Ｌの基質化合物；（ｂ）約２０ｇ／Ｌの操作されたポリペプチド；（ｃ）４０％のイソプロパノール中の約０．０１ｇ／ＬのＮＡＤＰ^＋；（ｄ）約１００ｍＭのトリエタノールアミン^＊Ｈ_２ＳＯ_４；（ｅ）約２ｍＭのＭｇＳＯ_４；（ｆ）約４０℃；および（ｇ）約８のｐＨを含む。一部の実施形態では、反応パラメーターの組合せは、（ａ）約１６０ｇ／Ｌの基質化合物；（ｂ）約２０ｇ／Ｌの操作されたポリペプチド；（ｃ）４０％のイソプロパノール中の約０．０１ｇ／ＬのＮＡＤＰ^＋；（ｄ）約１００ｍＭのリン酸カリウム；（ｅ）約２ｍＭのＭｇＳＯ_４；（ｆ）約４０℃；および（ｇ）約８のｐＨを含む。

【0108】

さらなる例示的な反応条件は、実施例において提供されるアッセイ条件を含む。

【0109】

一部の実施形態では、改善された操作されたケトレダクターゼ酵素は、天然に存在するケトレダクターゼポリペプチドにおけるアミノ酸残基の欠失、または他の操作されたケトレダクターゼポリペプチドにおけるアミノ酸残基の欠失を含む。よって、本発明の一部の実施形態では、欠失は、ケトレダクターゼの機能的活性が維持される限り、１個または複数のアミノ酸、２個もしくはそれより多いアミノ酸、３個もしくはそれより多いアミノ酸、４個もしくはそれより多いアミノ酸、５個もしくはそれより多いアミノ酸、６個もしくはそれより多いアミノ酸、８個もしくはそれより多いアミノ酸、１０個もしくはそれより多いアミノ酸、１５個もしくはそれより多いアミノ酸、または２０個もしくはそれより多いアミノ酸、ケトレダクターゼポリペプチドのアミノ酸の総数の最大１０％、アミノ酸の総数の最大１０％、アミノ酸の総数の最大２０％またはアミノ酸の総数の最大３０％を含む。一部の実施形態では、欠失は、１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、１～１０、１～１１、１～１２、１～１４、１～１５、１～１６、１～１８、１～２０、１～２２、１～２４、１～２５、１～３０、１～３５または約１～４０個のアミノ酸残基を含み得る。一部の実施形態では、欠失の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０アミノ酸であり得る。一部の実施形態では、欠失は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、または２０個のアミノ酸残基の欠失を含み得る。

【0110】

本明細書に記載されているように、本発明のケトレダクターゼポリペプチドは、ケトレダクターゼが、他のポリペプチド、例えば、抗体タグ（例えば、ｍｙｃエピトープ）または精製配列（例えば、Ｈｉｓタグ）に融合した融合ポリペプチドの形態であり得る。よって、一部の実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、他のポリペプチドへの融合を伴ってまたはそれを伴わずに使用される。

【0111】

一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、遺伝子コード化されたアミノ酸に限定されない。遺伝子コード化されたアミノ酸に加えて、本明細書に記載のポリペプチドは、全部または一部、天然に存在するおよび／または合成の非コード化アミノ酸から構成され得る。本明細書に記載のポリペプチドを構成し得る、ある特定の一般に見かける非コード化アミノ酸として、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：遺伝子コード化されたアミノ酸のＤ立体異性体；２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）；α－アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）；ε－アミノヘキサン酸（Ａｈａ）；δ－アミノ吉草酸（Ａｖａ）；Ｎ－メチルグリシンまたはサルコシン（ＭｅＧｌｙまたはＳａｒ）；オルニチン（Ｏｒｎ）；シトルリン（Ｃｉｔ）；ｔ－ブチルアラニン（Ｂｕａ）；ｔ－ブチルグリシン（Ｂｕｇ）；Ｎ－メチルイソロイシン（ＭｅＩｌｅ）；フェニルグリシン（Ｐｈｇ）；シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）；ノルロイシン（Ｎｌｅ）；ナフチルアラニン（Ｎａｌ）；２－クロロフェニルアラニン（Ｏｃｆ）；３－クロロフェニルアラニン（Ｍｃｆ）；４－クロロフェニルアラニン（Ｐｃｆ）；２－フルオロフェニルアラニン（Ｏｆｆ）；３－フルオロフェニルアラニン（Ｍｆｆ）；４－フルオロフェニルアラニン（Ｐｆｆ）；２－ブロモフェニルアラニン（Ｏｂｆ）；３－ブロモフェニルアラニン（Ｍｂｆ）；４－ブロモフェニルアラニン（Ｐｂｆ）；２－メチルフェニルアラニン（Ｏｍｆ）；３－メチルフェニルアラニン（Ｍｍｆ）；４－メチルフェニルアラニン（Ｐｍｆ）；２－ニトロフェニルアラニン（Ｏｎｆ）；３－ニトロフェニルアラニン（Ｍｎｆ）；４－ニトロフェニルアラニン（Ｐｎｆ）；２－シアノフェニルアラニン（Ｏｃｆ）；３－シアノフェニルアラニン（Ｍｃｆ）；４－シアノフェニルアラニン（Ｐｃｆ）；２－トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｏｔｆ）；３－トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｍｔｆ）；４－トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｐｔｆ）；４－アミノフェニルアラニン（Ｐａｆ）；４－ヨードフェニルアラニン（Ｐｉｆ）；４－アミノメチルフェニルアラニン（Ｐａｍｆ）；２，４－ジクロロフェニルアラニン（Ｏｐｅｆ）；３，４－ジクロロフェニルアラニン（Ｍｐｃｆ）；２，４－ジフルオロフェニルアラニン（Ｏｐｆｆ）；３，４－ジフルオロフェニルアラニン（Ｍｐｆｆ）；ピリド－２－イルアラニン（２ｐＡｌａ）；ピリド－３－イルアラニン（３ｐＡｌａ）；ピリド－４－イルアラニン（４ｐＡｌａ）；ナフト－１－イルアラニン（１ｎＡｌａ）；ナフト－２－イルアラニン（２ｎＡｌａ）；チアゾリルアラニン（ｔａＡｌａ）；ベンゾチエニルアラニン（ｂＡｌａ）；チエニルアラニン（ｔＡｌａ）；フリルアラニン（ｆＡｌａ）；ホモフェニルアラニン（ｈＰｈｅ）；ホモチロシン（ｈＴｙｒ）；ホモトリプトファン（ｈＴｒｐ）；ペンタフルオロフェニルアラニン（５ｆｆ）；スチリルアラニン（ｓｔｙｒｙｌｋａｌａｎｉｎｅ）（ｓＡｌａ）；アントリルアラニン（ａｕｔｈｒｙｌａｌａｎｉｎｅ）（ａＡｌａ）；３，３－ジフェニルアラニン（Ｄｆａ）；３－アミノ－５－フェニルペンタン酸（ｐｈｅｎｙｐｅｎｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）（Ａｆｐ）；ペニシラミン（Ｐｅｎ）；１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸（Ｔｉｃ）；β－２－チエニルアラニン（Ｔｈｉ）；メチオニンスルホキシド（Ｍｓｏ）；Ｎ（ｗ）－ニトロアルギニン（ｎＡｒｇ）；ホモリシン（ｈＬｙｓ）；ホスホノメチルフェニルアラニン（ｐｍＰｈｅ）；ホスホセリン（ｐＳｅｒ）；ホスホトレオニン（ｐＴｈｒ）；ホモアスパラギン酸（ｈＡｓｐ）；ホモグルタミン酸（ｈｏｍｏｇｌｕｔａｎｉｃ ａｃｉｄ）（ｈＧｌｕ）；１－アミノシクロペンタ－（２または３）－エン－４カルボン酸（４ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）；ピペコリン酸（ＰＡ）、アゼチジン－３－カルボン酸（ＡＣＡ）；１－アミノシクロペンタン－３－カルボン酸；アリルグリシン（ａＯｌｙ）；プロパルギルグリシン（ｐｇＧｌｙ）；ホモアラニン（ｈＡｌａ）；ノルバリン（ｎＶａｌ）；ホモロイシン（ｈＬｅｕ）、ホモバリン（ｈＶａｌ）；ホモイソロイシン（ｈｏｍｏｉｓｏｌｅｎｃｉｎｅ）（ｈＩｌｅ）；ホモアルギニン（ｈＡｒｇ）；Ｎ－アセチルリシン（ＡｃＬｙｓ）；２，４－ジアミノ酪酸（Ｄｂｕ）；２，３－ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）；Ｎ－メチルバリン（ＭｅＶａｌ）；ホモシステイン（ｈＣｙｓ）；ホモセリン（ｈＳｅｒ）；ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）およびホモプロリン（ｈＰｒｏ）。本明細書に記載のポリペプチドを構成し得る追加の非コード化アミノ酸は、当業者に明らかである。これらのアミノ酸は、Ｌ立体配置またはＤ立体配置のいずれかであり得る。

【0112】

側鎖保護基を有するアミノ酸または残基はまた、本明細書に記載のポリペプチドを構成する場合があることは、当業者に理解される。このような保護されたアミノ酸（この場合、これらは芳香族カテゴリーに属する）の非限定的な例として、これらに限定されないが、以下（括弧内に保護基を列挙する）が挙げられる：Ａｒｇ（ｔｏｓ）、Ｃｙｓ（メチルベンジル）、Ｃｙｓ（ニトロピリジンスルフェニル）、Ｇｌｕ（δ－ベンジルエステル）、Ｇｌｎ（キサンチル）、Ａｓｎ（Ｎ－δ－キサンチル）、Ｈｉｓ（ｂｏｍ）、Ｈｉｓ（ベンジル）、Ｈｉｓ（ｔｏｓ）、Ｌｙｓ（ｆｍｏｃ）、Ｌｙｓ（ｔｏｓ）、Ｓｅｒ（Ｏ－ベンジル）、Ｔｈｒ（Ｏ－ベンジル）およびＴｙｒ（Ｏ－ベンジル）。

【0113】

本明細書に記載のポリペプチドを構成し得る、コンフォメーションにおいて拘束されている非コード化アミノ酸として、これらに限定されないが、Ｎ－メチルアミノ酸（Ｌ立体配置）；１－アミノシクロペンタ－（２または３）－エン－４－カルボン酸；ピペコリン酸；アゼチジン－３－カルボン酸；ホモプロリン（ｈＰｒｏ）；および１－アミノシクロペンタン－３－カルボン酸が挙げられる。

【0114】

上述のように、操作されたケトレダクターゼ酵素を生成するために天然に存在するポリペプチドに導入された種々の改変は、酵素の特定の特性を標的にし得る。

【0115】

操作された酵素をコードするポリヌクレオチド
別の態様では、本発明は、操作されたケトレダクターゼをコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現することができる組換えポリヌクレオチドを生じさせるために遺伝子発現を制御する１つまたは複数の異種調節配列に作動的に連結させることができる。操作されたケトレダクターゼをコードする異種ポリヌクレオチドを含有する発現構築物を適切な宿主細胞に導入して、対応するケトレダクターゼポリペプチドを発現させることができる。

【0116】

種々のアミノ酸に対応するコドンが知られているため、タンパク質配列を利用できることで、対象をコードできるすべてのポリヌクレオチドの説明が得られる。同じアミノ酸が代替または同義コドンによってコードされる遺伝子コードの縮重は、極めて多数の核酸（これらのすべてが、本明細書に開示されている改善されたケトレダクターゼ酵素をコードする）の作製を可能にする。よって、特定のアミノ酸配列が同定されていれば、当業者は、そのタンパク質のアミノ酸配列を変えないような方法で１つまたは複数のコドンの配列を単に改変することによって、任意の数の異なる核酸を作製することができる。これに関して、本発明は、可能なコドン選択肢に基づいて組合せを選択することによって作製することができるポリヌクレオチドのそれぞれおよびすべての可能なバリエーションを具体的に企図しており、すべてのこのようなバリエーションは、表および実施例に提示するアミノ酸配列を含む本明細書に開示されている任意のポリペプチドについても具体的に開示されていると考えられるべきである。種々の実施形態では、好ましくは、コドンは、タンパク質が産生されている宿主細胞に適合するように選択される。例えば、細菌において使用される好ましいコドンを使用し、細菌において遺伝子を発現させ；酵母において使用される好ましいコドンを酵母での発現に使用し；哺乳動物において使用される好ましいコドンを哺乳動物細胞での発現に使用する。

【0117】

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１によって表されるような、天然に存在するケトレダクターゼポリペプチドアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、各々が、配列番号４、６、８０、１０４、１７２、１８６、１９４、２５２、２７０、２７２、２８６、３２８および／または３３０の同一のポリペプチド配列をそれぞれコードする、配列番号３、５、７９、１０３、１７１、１８５、１９３、２５１、２６９、２７１、２８５、３２７および／または３２９の核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える同一性を含む核酸配列を有する。

【0118】

一部の実施形態では、酵素ポリヌクレオチドは、酵素活性と本明細書で開示される特性を有する操作されたポリペプチドをコードし、ポリペプチドは、本明細書において提供される配列番号から選択される参照配列、または任意のバリアント（例えば、実施例において提供されるもの）のアミノ酸配列と、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含み、参照ポリヌクレオチド、または実施例に開示される任意のバリアントのアミノ酸配列（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０カ所もしくはそれより多いアミノ酸残基位置）と比較して、１つまたは複数の残基差異を含む。一部の実施形態では、参照ポリペプチド配列は、配列番号４、６、８０、１０４、１７２、１８６、１９４、２５２、２７０、２７２、２８６、３２８、および／または３３０から選択される。

【0119】

一部の実施形態では、操作されたケトレダクターゼをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３、５、７９、１０３、１７１、１８５、１９３、２５１、２６９、２７１、２８５、３２７および／または３２９から選択される配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、操作されたケトレダクターゼをコードするポリヌクレオチドは、配列番号５、７９、１０３、１７１、１８５、１９３、２５１、２６９、２７１、２８５、３２７および／または３２９を含む。一部の実施形態では、操作されたケトレダクターゼをコードするポリヌクレオチドは、配列番号５～４１１から選択される配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、操作されたケトレダクターゼをコードするポリヌクレオチドは、配列番号５～４１１から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。

【0120】

一部の実施形態では、操作されたケトレダクターゼ配列は、実施例に記載されているように、有益であると特定された位置を含む配列を含む。

【0121】

一部の実施形態では、改善されたケトレダクターゼポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを、そのポリペプチドの改善された発現および／または産生をもたらすために、様々な方法で操作する。使用される発現ベクターによって、ベクターへと挿入する前に単離されたポリヌクレオチドを操作することが望ましいかまたは必要である場合がある。組換えＤＮＡ方法を利用してポリヌクレオチドおよび核酸配列を修飾する技法は、当技術分野において周知である。

【0122】

細菌宿主細胞のための、本発明の核酸構築物の転写を指示するのに好適なプロモーターとして、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃオペロン、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓアルファ－アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓマルトース生成性アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓアルファ－アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子、ならびに原核生物ベータ－ラクタマーゼ遺伝子から得られるプロモーター（例えば、Ｖｉｌｌａ－Ｋａｍａｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７５： ３７２７－３７３１ ［１９７８］を参照のこと）、ならびにｔａｃプロモーター（例えば、ＤｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０： ２１－２５ ［１９８３］を参照のこと）が挙げられる。追加の好適なプロモーターは、当業者に公知である。

【0123】

糸状菌宿主細胞のための、本発明の核酸構築物の転写を指示するのに好適なプロモーターとして、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ中性アルファ－アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ酸安定性アルファ－アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅアルカリプロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ（ＷＯ９６／００７８７）についての遺伝子から得られるプロモーター、ならびにＮＡ２－ｔｐｉプロモーター（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ中性アルファ－アミラーゼについての遺伝子からのプロモーターおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼについての遺伝子からのプロモーターのハイブリッド）、ならびにそれらの変異体プロモーター、短縮型プロモーターおよびハイブリッドプロモーターが挙げられる。

【0124】

酵母宿主において、有用なプロモーターとして、これらに限定されないが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ－１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ３－ホスホグリセリン酸キナーゼについての遺伝子からのもの、ならびに酵母宿主細胞のための他の有用なプロモーターが挙げられる（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．， Ｙｅａｓｔ ８：４２３－４８８ ［１９９２］を参照のこと）。

【0125】

制御配列は、好適な転写ターミネーター配列、すなわち、宿主細胞によって認識されて転写を終結させる配列である場合もある。ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端にそのターミネーター配列を作動可能に連結させる。選択された宿主細胞において機能できる任意のターミネーターを本発明において使用することができる。

【0126】

例えば、糸状菌宿主細胞のための例示的な転写ターミネーターは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒアルファ－グルコシダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼについての遺伝子から得ることができる。

【0127】

酵母宿主細胞のための例示的なターミネーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅシトクロムＣ（ＣＹＣ１）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼについての遺伝子から得ることができ、さらに当技術分野で公知の酵母宿主細胞のための他の有用なターミネーターであり得る（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．、上掲を参照のこと）。

【0128】

制御配列は、好適なリーダー配列、すなわち、宿主細胞による翻訳のために重要であるｍＲＮＡの非翻訳領域である場合もある。ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端にそのリーダー配列を作動可能に連結させる。選択された宿主細胞において機能できる任意のリーダー配列を使用することができる。糸状菌宿主細胞のための例示的なリーダーは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓトリオースリン酸イソメラーゼについての遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための好適なリーダーは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ－１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ３－ホスホグリセリン酸キナーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ因子、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）についての遺伝子から得られる。

【0129】

制御配列は、ポリアデニル化配列、すなわち、核酸配列の３’末端に作動可能に連結した配列であって、転写されると宿主細胞にシグナルとして認識されて、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加させる配列である場合もある。本発明では、選択された宿主細胞において機能できる任意のポリアデニル化配列を使用することができる。糸状菌宿主細胞のための例示的なポリアデニル化配列は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒアルファ－グルコシダーゼについての遺伝子からのもの、ならびに当技術分野で公知の酵母宿主細胞のための追加の有用なポリアデニル化配列であり得る（例えば、Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １５：５９８３－５９９０ ［１９９５］を参照のこと）。

【0130】

制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に連結されたアミノ酸配列をコードし、そのコードされたポリペプチドを細胞の分泌経路に向ける、シグナルペプチドコード領域であってもよい。核酸配列のコード配列の５’末端は、翻訳リーディングフレームで、分泌されるポリペプチドをコードするコード領域のセグメントと天然で連結されているシグナルペプチドコード領域を固有に含有し得る。あるいは、コード配列の５’末端は、そのコード配列にとって外来であるシグナルペプチドコード領域を含有してもよい。外来シグナルペプチドコード領域は、コード配列がシグナルペプチドコード領域を天然で含有しない場合に必要とされ得る。

【0131】

あるいは、外来シグナルペプチドコード領域で、天然シグナルペプチドコード領域を単に置き換えて、そのポリペプチドの分泌を増強することができる。しかし、発現されたポリペプチドを選択された宿主細胞の分泌経路へと向ける任意のシグナルペプチドコード領域を本発明において使用することができる。

【0132】

細菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ＮＣｌＢ １１８３７マルトース生成性アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓアルファ－アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓサブチリシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓベータ－ラクタマーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）、およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐｒｓＡについての遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域、ならびに当技術分野で公知の追加のシグナルペプチドである（例えば、Ｓｉｍｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ．， ５７： １０９－１３７ ［１９９３］を参照のこと）。

【0133】

糸状菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域として、これらに限定されないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ中性アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓセルラーゼ、およびＨｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａリパーゼについての遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域が挙げられる。酵母宿主細胞のための有用なシグナルペプチドは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ因子およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ転化酵素についての遺伝子からのもの、ならびに追加の有用なシグナルペプチドコード領域であり得る（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．， １９９２、上掲を参照のこと）。

【0134】

制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域であってもよい。結果として得られるポリペプチドは、プロ酵素またはプロポリペプチド（または一部の場合には酵素原）として公知である。プロポリペプチドは、一般的に、不活性であり、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒的または自触反応的開裂によって成熟活性ポリペプチドへと変換され得る。プロペプチドコード領域は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓアルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ因子、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、およびＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａラクターゼ（ＷＯ９５／３３８３６）についての遺伝子から得ることができる。

【0135】

シグナルペプチド領域とプロペプチド領域の両方がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域は、ポリペプチドのアミノ末端の隣に位置し、シグナルペプチド領域は、プロペプチド領域のアミノ末端の隣に位置する。

【0136】

宿主細胞の増殖に対してポリペプチドの発現を調節することを可能にする調節配列を付加させることが望ましい場合もある。調節系の例は、調節化合物の存在を含めて、化学的または物理的刺激に応答して遺伝子の発現をオンまたはオフにさせるものである。原核宿主細胞では、好適な調節配列として、ｌａｃ、ｔａｃおよびｔｒｐオペレーター系が挙げられる。酵母宿主細胞では、好適な調節系として、例として、ＡＤＨ２系またはＧＡＬ１系が挙げられる。糸状菌では、好適な調節配列として、ＴＡＫＡアルファ－アミラーゼプロモーター、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼプロモーター、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅグルコアミラーゼプロモーターが挙げられる。

【0137】

調節配列の他の例は、遺伝子増幅を可能にするものである。真核生物系では、これらとして、メトトレキサートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、および重金属で増幅されるメタロチオネイン遺伝子が挙げられる。これらの場合には、本発明のＫＲＥＤポリペプチドをコードする核酸配列をその調節配列に作動可能に連結させることとなる。

【0138】

よって、一部の実施形態では、本発明は、組換え発現ベクターが導入されることとなる宿主のタイプに応じて、操作されたケトレダクターゼポリペプチドまたはそのバリアントをコードするポリヌクレオチド、ならびに１つまたは複数の発現調節領域、例えば、プロモーターおよびターミネーター、複製起点などを含む、組換え発現ベクターも対象とする。上記の種々の核酸および制御配列を互いに接合させて、組換え発現ベクター（これは、１つまたは複数の好都合な制限部位を含んで、ポリペプチドをコードする核酸配列のそのような部位での挿入または置換を可能にする場合がある）を生じさせ得る。あるいは、本発明の核酸配列を、発現のための適切なベクターに核酸配列またはこの配列を含む核酸構築物を挿入することによって、発現させることができる。発現ベクターを作製する場合には、コード配列をそのベクター内に配置して、そのコード配列を発現のための適切な制御配列と作動可能に連結させる。

【0139】

組換え発現ベクターは、好都合に、組換えＤＮＡ手順に供することができ、ポリヌクレオチド配列の発現をもたらすことができる、任意のベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であってもよい。ベクターの選択は、典型的には、そのベクターを導入することとなる宿主細胞とそのベクターの適合性に依存する。ベクターは、線状プラスミドであっても、閉環状プラスミドであってもよい。

【0140】

発現ベクターは、自律複製ベクター（すなわち、染色体外実体として存在するベクター）であって、その複製が染色体の複製とは独立しているベクター（例えば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体）であってもよい。ベクターは、自己複製を確実にするための任意の手段を含有してもよい。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入された場合に、そのゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体（複数可）と一緒に複製されるものであってもよい。さらに、単一のベクターもしくはプラスミドまたは２つもしくはそれより多いベクターもしくはプラスミド（これらは、一緒に、宿主細胞のゲノムに導入されるべき全ＤＮＡを含有する）、あるいはトランスポゾンを使用してもよい。

【0141】

本発明の発現ベクターは、形質転換された細胞の容易な選択を可能にする１つまたは複数の選択マーカーを好ましくは含有する。選択マーカーは、その生成物が、殺生物剤またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求体への原栄養性などをもたらす遺伝子であり得る。細菌選択マーカーの例は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓもしくはＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓからのｄａｌ遺伝子、または抗生物質耐性、例えばアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、もしくはテトラサイクリン耐性を付与するマーカーである。酵母宿主細胞のための好適なマーカーは、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、およびＵＲＡ３である。

【0142】

糸状菌宿主細胞において使用するための選択マーカーとして、これらに限定されないが、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン－５’－リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ならびにこれらの等価物が挙げられる。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ細胞において使用するための実施形態として、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのａｍｄＳおよびｐｙｒＧ遺伝子ならびにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓのｂａｒ遺伝子が挙げられる。

【0143】

本発明の発現ベクターは、宿主細胞のゲノムへのベクターの組込みを可能にするかまたはそのゲノムとは無関係に細胞におけるベクターの自律複製を可能にするエレメント（複数可）を含有し得る。宿主細胞ゲノムへの組込みのために、ベクターは、ポリペプチドをコードする核酸配列に依存する場合もあり、または相同もしくは非相同組換えによるベクターのゲノムへの組込みのためにベクターの任意の他のエレメントに依存する場合もある。

【0144】

あるいは、発現ベクターは、宿主細胞のゲノムへの相同組換えによる組込みを指示するための追加の核酸配列を含有してもよい。これらの追加の核酸配列は、宿主細胞ゲノムのその（それらの）染色体（複数可）内の正確な位置（複数可）にベクターを組み込むことができる。正確な位置での組込みの尤度を増加させるために、組込みエレメントは、対応する標的配列と高度に相同である核酸の、相同組換えの確率を増すために十分な数、例えば、１００から１０，０００塩基対、好ましくは４００から１０，０００塩基対、最も好ましくは８００から１０，０００塩基対を好ましくは含有すべきである。組込みエレメントは、宿主細胞のゲノム内の標的配列と相同である任意の配列であってもよい。さらに、組込みエレメントは、非コード化核酸配列またはコード化核酸配列であってもよい。一方、ベクターを非相同組換えによって宿主細胞のゲノムに組み込んでもよい。

【0145】

自律複製のために、ベクターは、問題の宿主細胞におけるベクターの自律複製を可能にする複製起点をさらに含んでもよい。細菌の複製起点の例は、Ｐ１５Ａ ｏｒｉまたはＥ．ｃｏｌｉにおける複製を可能にするプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７（このプラスミドはＰ１５Ａ ｏｒｉを有する）、もしくはｐＡＣＹＣ１８４の複製起点、およびＢａｃｉｌｌｕｓにおける複製を可能にするｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＴＡ１０６０もしくはｐＡＭβ１の複製起点である。酵母宿主細胞において使用するための複製起点の例は、２ミクロン複製起点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１とＣＥＮ３の組合せ、およびＡＲＳ４とＣＥＮ６の組合せである。複製起点は、宿主細胞におけるその機能化を温度感受性にする変異を有するものであってもよい（例えば、Ｅｈｒｌｉｃｈ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７５：１４３３ ［１９７８］を参照のこと）。

【0146】

本発明の核酸配列の１つより多くのコピーを宿主細胞に挿入して、遺伝子産物の産生を増加させてもよい。核酸配列のコピー数の増加は、配列の少なくとも１つの追加のコピーを宿主細胞のゲノムに組み込むことによって達成することができるか、または増幅可能な選択マーカー遺伝子をその核酸配列と共に含めることによって達成することができる（この場合、選択マーカー遺伝子の増幅されたコピーを含有し、その結果、追加の核酸配列コピーを含有する細胞は、細胞を適切な選択可能な作用物質の存在下で培養することによって選択することができる）。

【0147】

本発明が本明細書に開示される発現ベクターに限定されることは意図されない。任意の好適な発現ベクターを本発明で使用することができることは、当業者には理解されるであろう。本発明において使用するための発現ベクターの多くは市販されている。好適な市販の発現ベクターとして、これらに限定されないが、哺乳動物宿主細胞における発現のためのＣＭＶプロモーターおよびｈＧＨポリアデニル化部位、ならびにＥ．ｃｏｌｉにおける増幅のためのｐＢＲ３２２複製起点およびアンピシリン耐性マーカーを含む、ｐ３ｘＦＬＡＧＴＭ（商標）発現ベクター（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）が挙げられる。他の市販の好適な発現ベクターとして、これらに限定されないが、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（－）およびｐＢＫ－ＣＭＶベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ならびにｐＢＲ３２２（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、ｐＵＣ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはｐＰｏｌｙから誘導されるプラスミドが挙げられる（Ｌａｔｈｅ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ５７：１９３－２０１ ［１９８７］を参照のこと）。

【0148】

操作されたポリペプチドの発現のための宿主細胞
本発明はまた、本発明の改善されたケトレダクターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、ポリヌクレオチドが、宿主細胞におけるケトレダクターゼ酵素の発現のために１つまたは複数の制御配列に作動的に連結されている、宿主細胞を提供する。本発明の発現ベクターによってコードされるＫＲＥＤポリペプチドを発現させる際に使用される宿主細胞は、当技術分野において周知であり、これらとして、これらに限定されないが、細菌細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｉｎｏｒ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞；真菌細胞、例えば、酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣＣ受託番号２０１１７８））；昆虫細胞、例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞；動物細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、２９３、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞；ならびに植物細胞が挙げられる。上記宿主細胞のための適切な培養培地および増殖条件は、当技術分野において周知である。

【0149】

ケトレダクターゼの発現のためのポリヌクレオチドは、当技術分野において公知の種々の方法によって細胞に導入されてもよい。技法として、とりわけ、エレクトロポレーション、遺伝子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、リポソーム媒介トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクション、およびプロトプラスト融合が挙げられる。細胞にポリヌクレオチドを導入するための種々の方法は、当業者に明らかであろう。

【0150】

Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０は、本発明がこの特定の宿主株に限定されることを意図するものではないが、本発明における使用が見出される宿主株である。ｌａｃＩリプレッサーの制御下で、ｌａｃプロモーターに作動的に連結したプラスミドｐＣＫ１１０９００に、改善された酵素をコードするポリヌクレオチドを作動的に連結させることによって、発現ベクターを作製した。この発現ベクターは、Ｐ１５ａ複製起点およびクロラムフェニコール耐性遺伝子も含有した。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０中の対象ポリヌクレオチドを含有する細胞は、細胞をクロラムフェニコール選択に供することによって単離され得る。

【0151】

操作されたケトレダクターゼポリペプチドの生成方法
一部の実施形態では、本発明の改善されたＫＲＥＤポリヌクレオチドおよびポリペプチドを作製するために、還元反応を触媒する天然に存在するケトレダクターゼ酵素を、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒから得る（または誘導する）。一部の実施形態では、親ポリヌクレオチド配列をコドン最適化して、指定宿主細胞におけるケトレダクターゼの発現を増強させる。実例として、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースから入手できるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒ ＫＲＥＤ配列の公知ポリペプチド配列に基づいて調製したオリゴヌクレオチドから、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒの野生型ＫＲＥＤポリペプチドをコードする親ポリヌクレオチド配列を構築した。親ポリヌクレオチド配列をＥ．ｃｏｌｉでの発現のためにコドン最適化し、コドン最適化されたポリヌクレオチドを発現ベクターへとクローニングし、ｌａｃプロモーターおよびｌａｃＩリプレッサー遺伝子の制御下でケトレダクターゼ遺伝子を発現させた。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて活性ケトレダクターゼを発現するクローンを同定し、遺伝子をシークエンシングして、それらの正体を確認した。

【0152】

一部の実施形態では、操作されたケトレダクターゼは、上で論じたように、天然に存在するケトレダクターゼをコードするポリヌクレオチドを変異誘発および／または定向進化方法に供することによって得られる。変異誘発は、ランダム変異誘発および部位特異的変異誘発を含む、当技術分野で公知の技法のいずれかに従って実施することができる。定向進化法は、シャッフリングを含む、改善されたプロモーターバリアントについてスクリーニングするための当技術分野で公知の技法のいずれかを用いて実施することができる。変異誘発および定向進化方法は、当技術分野で周知である（例えば、米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８１１，２３８号、同第５，８３０，７２１号、同第５，８３４，２５２号、同第５，８３７，４５８号、同第５，９２８，９０５号、同第６，０９６，５４８号、同第６，１１７，６７９号、同第６，１３２，９７０号、同第６，１６５，７９３号、同第６，１８０，４０６号、同第６，２５１，６７４号、同第６，２６５，２０１号、同第６，２７７，６３８号、同第６，２８７，８６１号、同第６，２８７，８６２号、同第６，２９１，２４２号、同第６，２９７，０５３号、同第６，３０３，３４４号、同第６，３０９，８８３号、同第６，３１９，７１３号、同第６，３１９，７１４号、同第６，３２３，０３０号、同第６，３２６，２０４号、同第６，３３５，１６０号、同第６，３３５，１９８号、同第６，３４４，３５６号、同第６，３５２，８５９号、同第６，３５５，４８４号、同第６，３５８，７４０号、同第６，３５８，７４２号、同第６，３６５，３７７号、同第６，３６５，４０８号、同第６，３６８，８６１号、同第６，３７２，４９７号、同第６，３３７，１８６号、同第６，３７６，２４６号、同第６，３７９，９６４号、同第６，３８７，７０２号、同第６，３９１，５５２号、同第６，３９１，６４０号、同第６，３９５，５４７号、同第６，４０６，８５５号、同第６，４０６，９１０号、同第６，４１３，７４５号、同第６，４１３，７７４号、同第６，４２０，１７５号、同第６，４２３，５４２号、同第６，４２６，２２４号、同第６，４３６，６７５号、同第６，４４４，４６８号、同第６，４５５，２５３号、同第６，４７９，６５２号、同第６，４８２，６４７号、同第６，４８３，０１１号、同第６，４８４，１０５号、同第６，４８９，１４６号、同第６，５００，６１７号、同第６，５００，６３９号、同第６，５０６，６０２号、同第６，５０６，６０３号、同第６，５１８，０６５号、同第６，５１９，０６５号、同第６，５２１，４５３号、同第６，５２８，３１１号、同第６，５３７，７４６号、同第６，５７３，０９８号、同第６，５７６，４６７号、同第６，５７９，６７８号、同第６，５８６，１８２号、同第６，６０２，９８６号、同第６，６０５，４３０号、同第６，６１３，５１４号、同第６，６５３，０７２号、同第６，６８６，５１５号、同第６，７０３，２４０号、同第６，７１６，６３１号、同第６，８２５，００１号、同第６，９０２，９２２号、同第６，９１７，８８２号、同第６，９４６，２９６号、同第６，９６１，６６４号、同第６，９９５，０１７号、同第７，０２４，３１２号、同第７，０５８，５１５号、同第７，１０５，２９７号、同第７，１４８，０５４号、同第７，２２０，５６６号、同第７，２８８，３７５号、同第７，３８４，３８７号、同第７，４２１，３４７号、同第７，４３０，４７７号、同第７，４６２，４６９号、同第７，５３４，５６４号、同第７，６２０，５００号、同第７，６２０，５０２号、同第７，６２９，１７０号、同第７，７０２，４６４号、同第７，７４７，３９１号、同第７，７４７，３９３号、同第７，７５１，９８６号、同第７，７７６，５９８号、同第７，７８３，４２８号、同第７，７９５，０３０号、同第７，８５３，４１０号、同第７，８６８，１３８号、同第７，７８３，４２８号、同第７，８７３，４７７号、同第７，８７３，４９９号、同第７，９０４，２４９号、同第７，９５７，９１２号、同第７，９８１，６１４号、同第８，０１４，９６１号、同第８，０２９，９８８号、同第８，０４８，６７４号、同第８，０５８，００１号、同第８，０７６，１３８号、同第８，１０８，１５０号、同第８，１７０，８０６号、同第８，２２４，５８０号、同第８，３７７，６８１号、同第８，３８３，３４６号、同第８，４５７，９０３号、同第８，５０４，４９８号、同第８，５８９，０８５号、同第８，７６２，０６６号、同第８，７６８，８７１号、同第９，５９３，３２６号およびすべての関連する米国以外の対応特許；Ｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２５４（２）：１５７－７８ ［１９９７］； Ｄａｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ５７：３６９－７４ ［１９９６］； Ｓｍｉｔｈ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ．， １９：４２３－４６２ ［１９８５］； Ｂｏｔｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２９：１１９３－１２０１ ［１９８５］； Ｃａｒｔｅｒ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．， ２３７：１－７ ［１９８６］； Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， ３８：８７９－８８７ ［１９８４］； Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， ３４：３１５－３２３ ［１９８５］； Ｍｉｎｓｈｕｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．， ３： ２８４－２９０ ［１９９９］； Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １７： ２５９－２６４ ［１９９９］； Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３９１： ２８８－２９１ ［１９９８］； Ｃｒａｍｅｒｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １５：４３６－４３８ ［１９９７］； Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ９４：４５０４－４５０９ ［１９９７］； Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １４：３１５－３１９ ［１９９６］； Ｓｔｅｍｍｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ， ３７０：３８９－３９１ ［１９９４］； Ｓｔｅｍｍｅｒ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９１：１０７４７－１０７５１ ［１９９４］；ＷＯ９５／２２６２５；ＷＯ９７／００７８；ＷＯ９７／３５９６６；ＷＯ９８／２７２３０；ＷＯ００／４２６５１；ＷＯ０１／７５７６７；およびＷＯ２００９／１５２３３６（これらのすべては参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。

【0153】

変異誘発処理後に得られたクローンを、所望の改善された酵素特性を有する操作されたケトレダクターゼについてスクリーニングする。発現ライブラリーからの酵素活性の測定は、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ濃度が減少する（これらは、ＮＡＤ^＋またはＮＡＤＰ^＋に変換されるので）速度を（吸光度または蛍光の減少によって）モニタリングする標準的な生化学技法を使用して実施することができる。この反応では、ケトレダクターゼがケトン基質を対応するヒドロキシル基に還元するので、そのケトレダクターゼによってＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨが消費（酸化）される。単位時間当たりの、吸光度または蛍光の減少によって測定されるような、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ濃度の減少速度は、固定量の溶解物（またはそれから作製された凍結乾燥粉末）中のＫＲＥＤポリペプチドの相対（酵素）活性を示す。生成物の立体化学は、種々の公知の技法によって、および実施例に提供されるように、確認することができる。所望される改善された酵素特性が熱安定性である場合、酵素活性は、酵素調製物を規定された温度に供し、熱処理後に残存する酵素活性の量を測定した後、測定することができる。次いで、ケトレダクターゼをコードするポリヌクレオチドを含有するクローンを単離し、シークエンシングして（もしあれば）ヌクレオチド配列の変化を特定し、これらを使用して宿主細胞においてその酵素を発現させる。

【0154】

その操作されたポリペプチドの配列が知られている場合、公知の合成方法に従って、標準的な固相方法により、酵素をコードするポリヌクレオチドを調製することができる。一部の実施形態では、約１００塩基までの断片を個々に合成し、次いで、（例えば、酵素的もしくは化学的ライゲーション方法、またはポリメラーゼ媒介方法によって）接合させて、任意の所望される連続配列を形成することができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、化学合成により（例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔ． Ｌｅｔｔ．， ２２：１８５９－６９ ［１９８１］により説明された古典的ホスホルアミダイト方法、または、それを、典型的には、自動合成方法で実施する場合には、Ｍａｔｔｈｅｓ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．， ３：８０１－０５ ［１９８４］により説明された方法を使用して）調製することができる。ホスホルアミダイト方法によれば、オリゴヌクレオチドが合成され（例えば、自動ＤＮＡ合成装置で）、精製され、アニールされ、ライゲーションされ、適切なベクターにクローニングされる。さらに、本質的に、様々な商業的な供給業者（例えば、Ｍｉｄｌａｎｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｍｉｄｌａｎｄ、ＴＸ；Ｇｒｅａｔ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｇｅｎｅ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒａｍｏｎａ、ＣＡ；ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ Ｉｎｃ．、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ；Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡおよび多くの他の業者）のいずれかから任意の核酸を入手することができる。

【0155】

宿主細胞において発現された操作されたケトレダクターゼ酵素は、とりわけ、リゾチーム処理、超音波処理、濾過、塩析、超遠心分離、およびクロマトグラフィーを含む、周知のタンパク質精製技法のいずれか１つまたは複数を使用して、細胞およびまたは培養培地から回収することができる。Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌の溶解およびそれからのタンパク質の高効率抽出に好適な溶液は、商品名ＣｅｌＬｙｔｉｃ Ｂ（商標）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で市販されている。

【0156】

ケトレダクターゼポリペプチドの単離のためのクロマトグラフ技法として、とりわけ、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動法、およびアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。特定の酵素を精製するための条件は、正味電荷、疎水性、親水性、分子量、分子形状などの因子に部分的に依存し、当業者に明らかであろう。

【0157】

一部の実施形態では、アフィニティー技法を使用して、改善されたケトレダクターゼ酵素を単離する。アフィニティークロマトグラフィー精製には、ケトレダクターゼポリペプチドに特異的に結合する任意の抗体を使用することができる。抗体の産生のために、ケトレダクターゼを注射することによって、ウサギ、マウス、ラットなどが挙げられるが、これらに限定されない種々の宿主動物を免疫することができる。ケトレダクターゼポリペプチドは、側鎖官能基または側鎖官能基に付着されたリンカーによって、ＢＳＡなどの好適な担体に付着させてもよい。宿主種に応じて、フロイント（完全または不完全）アジュバント、鉱物ゲル、例えば、水酸化アルミニウム、界面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロニック（登録商標）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびに潜在的に有用なヒトアジュバント、例えば、ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍが挙げられるが、これらに限定されない種々のアジュバントを使用してその免疫応答を増加させることができる。

【0158】

ケトレダクターゼを、酵素を発現する細胞の形態で、粗抽出物として、または単離もしくは精製された調製物として、調製し、使用することができる。ケトレダクターゼを、粉末の形態（例えば、アセトン粉末）での凍結乾燥物として調製することができ、または酵素溶液として調製することができる。一部の実施形態では、ケトレダクターゼは、実質的に純粋な調製物の形態であり得る。

【0159】

一部の実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドは、固体基材に付着され得る。この基材は、固相、表面、および／または膜であり得る。固体支持体は、有機ポリマー、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシ、およびポリアクリルアミド、ならびにそのコポリマーおよびグラフトから構成され得る。固体支持体はまた、無機、例えば、ガラス、シリカ、細孔制御ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）（ＣＰＧ）、逆相シリカまたは金もしくは白金などの金属でもあり得る。基材の構成は、ビーズ、球、粒子、顆粒、ゲル、膜または表面の形態であり得る。表面は、平面、実質的に平面、または非平面であり得る。固体支持体は、多孔性または非多孔性であり得、膨潤するまたは膨潤しない特徴を有し得る。固体支持体は、ウェル、くぼみ、もしくは他のコンテナ、容器、特色、または場所の形態で構成され得る。複数の支持体が、試薬のロボット送達のためにアドレス指定できる種々の場所に、または検出方法および／もしくは検出装置によって種々の場所に、アレイに構成され得る。

【0160】

当業者に公知であるように、ケトレダクターゼ触媒還元反応は、典型的には、補因子を必要とする。操作されたケトレダクターゼの多くの実施形態は、野生型ケトレダクターゼ酵素により触媒される反応よりもはるかに少ない補因子を必要とするが、本明細書に記載の操作されたケトレダクターゼ酵素によって触媒される還元反応はまた、典型的には、補因子を必要とする。本明細書で使用する場合、「補因子」という用語は、ケトレダクターゼ酵素との組合せで動作する非タンパク質化合物を指す。本明細書に記載の操作されたケトレダクターゼ酵素と共に使用するために好適な補因子として、これらに限定されないが、ＮＡＤＰ^＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）、ＮＡＤＰＨ（ＮＡＤＰ^＋の還元形態）、ＮＡＤ^＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）およびＮＡＤＨ（ＮＡＤ^＋の還元形態）が挙げられる。一般的に、補因子の還元形態を反応混合物に添加する。還元ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ形態は、必要に応じて、補因子再生系を使用してその酸化ＮＡＤ（Ｐ）^＋形態から再生させることができる。「補因子再生系」という用語は、補因子の酸化形態を還元する反応（例えば、ＮＡＤＰ^＋からＮＡＤＰＨ）に関与する１セットの反応物を指す。ケト基質のケトレダクターゼ触媒還元によって酸化された補因子は、補因子再生系によって還元形態に再生される。補因子再生系は、還元性水素等価物の供給源であり、その補因子の酸化形態を還元できる、化学量論量の還元剤を含む。補因子再生系は、還元剤による補因子の酸化形態の還元を触媒する触媒、例えば、酵素触媒をさらに含んでもよい。補因子再生系はまた、補基質、例えば、イソプロパノールを含んでもよい。それぞれ、ＮＡＤ^＋またはＮＡＤＰ^＋からＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを再生するための補因子再生系は、当技術分野において公知であり、本明細書に記載の方法において使用することができる。

【実施例】

【0161】

本発明の種々の特色および実施形態は以下の代表的な実施例において例証され、これらは、例証を意図するものであり、限定を意図するものではない。

【0162】

以下の実験の開示では、以下の略語が適用される：ｐｐｍ（百万分率）；Ｍ（モル濃度）；ｍＭ（ミリモル濃度）、ｕＭおよびμＭ（マイクロモル濃度）；ｎＭ（ナノモル濃度）；ｍｏｌ（モル）；ｇｍおよびｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；ｕｇおよびμｇ（マイクログラム）；Ｌおよびｌ（リットル）；ｍｌおよびｍＬ（ミリリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；ｕｍおよびμｍ（マイクロメートル）；ｓｅｃ．（秒）；ｍｉｎ（分）；ｈおよびｈｒ（時間）；Ｕ（単位）；ＭＷ（分子量）；ｒｐｍ（毎分回転数）；℃（摂氏度）；ＲＴ（室温）；ＣＤＳ（コード配列）；ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）；ＲＮＡ（リボ核酸）；ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）；ＦＩＯＰＣ（陽性対照に対する倍数改善（ｆｏｌｄ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ））；ＨＴＰ（ハイスループット）；ＬＢ（ルリアブロス）；ＫＰＯ_４（リン酸カリウム）；ＫＰＯ_３（亜リン酸カリウム）；ＴＥｏＡ（トリエタノールアミン）；ＰＭＢＳ（硫酸ポリミキシンＢ）；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｃｏｒｐ．、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ ＭＡ）；Ｄｉｆｃｏ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）；Ｄａｉｃｅｌ（Ｄａｉｃｅｌ、Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）；Ｇｅｎｅｔｉｘ（Ｇｅｎｅｔｉｘ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．、Ｂｅａｖｅｒｔｏｎ、ＯＲ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒｐ．の一部門、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）、Ａｇｉｌｅｎｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの一部門、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）；Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）；およびＢｉｏ－Ｒａｄ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）。

【0163】

以下の配列を、本発明の開発において使用した。
配列番号４１３：

【化2-1】

【化2-2】

【化2-3】

配列番号４１４：

【化3-1】

【化3-2】

【0164】

（実施例１）
組換えＫＲＥＤ遺伝子を含有するＥ．ｃｏｌｉ発現宿主
本発明のバリアントを生成するために使用した最初のＫＲＥＤ酵素は、Ｃｏｄｅｘｉｓの市販のＫＲＥＤ酵素パネル収集物から得た。最初のスクリーニング中に、配列番号４のバリアントは、ＬＣ／ＭＳによって決定して最も多くの生成物を生成した。ＫＲＥＤコード遺伝子を、ｌａｃｌリプレッサーの制御下にあるｌａｃプロモーターに作動的に連結した、ｐＣＫ１１０９００（米国特許出願公開第２００６／０１９５９４７号の図３を参照のこと）、配列番号４１３、または配列番号４１４を含む、発現ベクター系にクローニングした。発現ベクター系はまた、Ｐ１５ａ複製起点およびクロラムフェニコール耐性遺伝子を含有する。本発明が本明細書に開示される発現ベクターに限定されることを意図していない。これらに限定されないが、ｐ３ｘＦＬＡＧＴＭ（商標）発現ベクター（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（－）およびｐＢＫ－ＣＭＶベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ならびにｐＢＲ３２２（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、ｐＵＣ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはｐＰｏｌｙ（Ｌａｔｈｅ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ５７：１９３－２０１ ［１９８７］を参照のこと）に由来するプラスミドを含む、任意の好適な発現ベクターを、本発明において使用することができることは、当業者に理解されるであろう。

【0165】

得られたプラスミドを、当技術分野において公知の標準的な方法を使用してＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０に形質転換した。形質転換体を、当技術分野において公知であるようにクロラムフェニコール選択に細胞を供することによって単離した（例えば、米国特許第８，３８３，３４６号およびＷＯ２０１０／１４４１０３を参照のこと）。

【0166】

（実施例２）
ＨＴＰ ＫＲＥＤ含有湿潤細胞ペレットの調製
モノクローナルコロニーからの組換えＫＲＥＤコード遺伝子を含有するＥ．ｃｏｌｉ細胞を、９６ウェルシャローウェルマイクロタイタープレートのウェル内の１％のグルコースおよび３０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含有する１９０μｌのＬＢに接種した。プレートをＯ２透過性シールで密封し、培養物を一晩、２０℃、２００ｒｐｍおよび湿度８５％で増殖させた。次いで、細胞培養物の各々の２０μｌを、３８０μＬのＴＢおよび３０μｇ／ｍＬのＣＡＭを含有する９６ウェルディープウェルプレートのウェルに移した。ディープウェルプレートをＯ２透過性シールで密封し、０．６～０．８のＯＤ６００に達するまで３０℃、２５０ｒｐｍおよび湿度８５％でインキュベートした。次いで、細胞培養物を１ｍＭの最終濃度までのＩＰＴＧによって誘導し、最初に使用したのと同じ条件下で一晩インキュベートした。次いで、４℃、４０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を使用して細胞をペレット化した。上清を廃棄し、ペレットを溶解の前に－８０℃で凍結させた。

【0167】

（実施例３）
ＨＴＰ ＫＲＥＤ含有細胞溶解物の調製
先ず、実施例２に記載したように産生した細胞ペレットを、２ｍＭのＭｇＳＯ_４を伴う１００ｍＭ ｐＨ８のトリエタノールアミン^＊Ｈ_２ＳＯ_４と、または２ｍＭのＭｇＳＯ_４を伴う１００ｍＭ ｐＨ８のリン酸カリウムと、１ｇ／Ｌのリゾチームと、０．５ｇ／ＬのＰＭＢＳとを含有する１５０μＬの溶解緩衝液を添加することによって溶解した。次いで、ベンチトップシェーカーを用いて、細胞ペレットを室温で２時間、振盪させた。プレートを４℃で１５分間、４０００ｒｐｍで遠心分離して、細胞デブリを除去した。次いで、上清を生体触媒反応に使用して、活性レベルを決定した。

【0168】

（実施例４）
振盪フラスコ（ＳＦ）培養物からの凍結乾燥溶解物の調製
振盪フラスコ手順を使用して、二次スクリーニングアッセイに有用である、および／または本明細書に記載の生体触媒プロセスにおける使用に有用である、操作されたＫＲＥＤポリペプチド振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）を生成することができる。酵素の振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）調製によって、ＨＴＰアッセイで使用される細胞溶解物と比較して、操作された酵素のより精製された調製物（例えば、総タンパク質の３０％まで）が得られ、より濃縮された酵素溶液の使用も可能になる。これを開始するために、上述のように増殖させた選択されたＨＴＰ培養物を１％のグルコースおよび３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（ＣＡＭ）を含むＬＢ寒天プレートに播種し、一晩、３７℃で増殖させた。各培養物からの単一コロニーを、１％のグルコースおよび３０μｇ／ｍｌのＣＡＭを含む６ｍｌのＬＢに移した。培養物を３０℃で１８時間、２５０ｒｐｍで増殖させ、３０μｇ／ｍｌのＣＡＭを含有する２５０ｍｌのＴＢへのおおよそ１：５０の継代培養を行って０．０５の最終ＯＤ_６００にした。培養物を３０℃でおおよそ３時間、２５０ｒｐｍで増殖させて０．８～１．０の間のＯＤ_６００にし、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。次いで、培養物を３０℃で２０時間、２５０ｒｐｍで増殖させた。培養物を遠心分離した（４℃で２０分間４０００ｒｐｍ）。上清を廃棄し、ペレットを、２ｍＭのＭｇＳＯ_４を伴う３５ｍｌの５０ｍＭ ｐＨ８のリン酸カリウムに再懸濁させた。再懸濁した細胞を遠心分離した（４℃で２０分間４０００ｒｐｍ）。上清を廃棄し、ペレットを、２ｍＭのＭｇＳＯ_４を伴う６ｍＬの５０ｍＭ ｐＨ８のリン酸カリウムに再懸濁させ、Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓからの細胞破砕装置（Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ）を使用して細胞を溶解した。溶解物をペレット化し（４℃で６０分間１０，０００ｒｐｍ）、上清を凍結させ、凍結乾燥させて、振盪フラスコ（ＳＦ）酵素を生成した。

【0169】

（実施例５）
配列番号４から誘導した操作されたポリペプチドの進化および前記ポリペプチドの改善されたＫＲＥＤ活性についてのスクリーニング
イソα酸基質の還元についてのバリアントのスクリーニングの結果に基づいて、配列番号４を親酵素として選択した。操作された遺伝子のライブラリーを、十分に確立されている技法（例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して産生した。各遺伝子によってコードされるポリペプチドを、実施例２に記載したようにＨＴＰで産生し、可溶性溶解物を、実施例３に記載したように生成した。

【0170】

配列番号４のＫＲＥＤ活性を有するポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド（すなわち、配列番号３）を使用して、表５－１のさらなる操作されたポリペプチドを生成した。これらのポリペプチドは、出発ポリペプチドと比較して、イソα酸からジヒドロ－（ｒｈｏ）－イソα酸の改善された形成を示した。操作されたポリペプチドを、上述のような定向進化方法を下の表５－２に記載するＨＴＰアッセイおよび分析法と共に使用して配列番号４の「骨格」アミノ酸配列から生成した。

【0171】

定向進化は、配列番号３に示されるポリヌクレオチドを用いて開始した。操作されたポリペプチドを、次に、出発「骨格」遺伝子配列として選択した。操作されたポリペプチドのライブラリーを、種々の周知の技法（例えば、飽和変異誘発、以前に同定された有益なアミノ酸差異の組換え）を使用して生成し、イソα酸基質を所望のジヒドロ－（ｒｈｏ）－イソα酸生成物に変換するポリペプチドの能力を測定するＨＴＰアッセイおよび分析方法を使用して、スクリーニングした。

【0172】

酵素アッセイは、９６ウェル形式で、２ｍＭのＭｇＳＯ_４を伴う１００ｍＭ ｐＨ８のトリエタノールアミン^＊Ｈ_２ＳＯ_４中の、５０％ｖ／ｖのＨＴＰ酵素溶解物と、８ｇ／Ｌのイソα酸基質（Ｉｓｏｌｏｎｅ（登録商標）Ｉｓｏｍｅｒｉｚｅｄ Ｈｏｐ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｋａｌｓｅｃ）と、４０体積％のイソプロパノール（ＩＰＡ）中０．１ｇ／ＬのＮＡＤＰとを含む、総体積２００μＬ／ウェルで行った。プレートを密封し、６００ｒｐｍで振盪しながら２０～２４時間、４０℃でインキュベートした。

【0173】

２０～２４時間後、０．１％の酢酸を伴う１０００μＬのアセトニトリルを添加した。プレートを密封し、４℃で１０分間、４０００ｒｐｍで遠心分離した。クエンチした試料をＨＰＬＣ分析の前に５０：５０のアセトニトリル：水混合物でさらに４～５倍希釈した。ＨＰＬＣ実行パラメーターを下の表５－２に記載する。

【表5-1-1】

【表5-1-2】

【表5-2-1】

【表5-2-2】

【0174】

（実施例６）
配列番号６から誘導した操作されたポリペプチドの進化および前記ポリペプチドの改善されたＫＲＥＤ活性についてのスクリーニング
操作された遺伝子のライブラリーを、十分に確立されている技法（例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して産生した。各遺伝子によってコードされるポリペプチドを、実施例２に記載したようにＨＴＰで産生し、可溶性溶解物を、実施例３に記載したように生成した。

【0175】

配列番号６のＫＲＥＤ活性を有するポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド（すなわち、配列番号５）を使用して、表６－１のさらなる操作されたポリペプチドを生成した。これらのポリペプチドは、出発ポリペプチドと比較して、イソα酸からジヒドロ－（ｒｈｏ）－イソα酸の改善された形成を示した。操作されたポリペプチドを、上述のような定向進化方法を下の表５－２に記載するＨＴＰアッセイおよび分析法と共に使用して、配列番号６の「骨格」アミノ酸配列から生成した。

【0176】

定向進化は、配列番号５に示されるポリヌクレオチドを用いて開始した。操作されたポリペプチドを、次に、出発「骨格」遺伝子配列として選択した。操作されたポリペプチドのライブラリーを、種々の周知の技法（例えば、飽和変異誘発、以前に同定された有益なアミノ酸差異の組換え）を使用して生成し、イソα酸基質を所望のジヒドロ－（ｒｈｏ）－イソα酸生成物に変換するポリペプチドの能力を測定するＨＴＰアッセイおよび分析方法を使用して、スクリーニングした。

【0177】

酵素アッセイは、９６ウェル形式で、２ｍＭのＭｇＳＯ_４を伴う１００ｍＭ ｐＨ８のトリエタノールアミン^＊Ｈ_２ＳＯ_４中の、５０％ｖ／ｖのＨＴＰ酵素溶解物と、１６または４０ｇ／Ｌのイソα酸基質（Ｉｓｏｌｏｎｅ（登録商標）Ｉｓｏｍｅｒｉｚｅｄ Ｈｏｐ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｋａｌｓｅｃ）と、４０体積％のイソプロパノール（ＩＰＡ）中０．１ｇ／ＬのＮＡＤＰとを含む、総体積２００μＬ／ウェルで行った。プレートを密封し、６００ｒｐｍで振盪しながら２０～２４時間、４０℃でインキュベートした。

【0178】

２０～２４時間後、０．１％の酢酸を伴う１０００μＬのアセトニトリルを添加した。プレートを密封し、４℃で１０分間、４０００ｒｐｍで遠心分離した。クエンチした試料をＨＰＬＣ分析の前に５０：５０のアセトニトリル：水混合物でさらに１０～２０倍希釈した。ＨＰＬＣ実行パラメーターを表５－２に記載する。

【表6-1】

【0179】

（実施例７）
配列番号８０から誘導した操作されたポリペプチドの進化および前記ポリペプチドの改善されたＫＲＥＤ活性についてのスクリーニング
操作された遺伝子のライブラリーを、十分に確立されている技法（例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して産生した。各遺伝子によってコードされるポリペプチドを、実施例２に記載したようにＨＴＰで産生し、可溶性溶解物を、実施例３に記載したように生成した。

【0180】

配列番号８０のＫＲＥＤ活性を有するポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド（すなわち、配列番号７９）を使用して、表７－１のさらなる操作されたポリペプチドを生成した。これらのポリペプチドは、出発ポリペプチドと比較して、イソα酸からジヒドロ－（ｒｈｏ）－イソα酸の改善された形成を示した。操作されたポリペプチドを、上述のような定向進化方法を下の表５－２に記載するＨＴＰアッセイおよび分析法と共に使用して、配列番号８０の「骨格」アミノ酸配列から生成した。

【0181】

定向進化は、配列番号７９に示されるポリヌクレオチドを用いて開始した。操作されたポリペプチドを、次に、出発「骨格」遺伝子配列として選択した。操作されたポリペプチドのライブラリーを、種々の周知の技法（例えば、飽和変異誘発、以前に同定された有益なアミノ酸差異の組換え）を使用して生成し、イソα酸基質を所望のジヒドロ－（ｒｈｏ）－イソα酸生成物に変換するポリペプチドの能力を測定するＨＴＰアッセイおよび分析方法を使用して、スクリーニングした。

【0182】

酵素アッセイは、９６ウェル形式で、２ｍＭのＭｇＳＯ_４を伴う１００ｍＭ ｐＨ８のリン酸カリウム中の、２５％ｖ／ｖのＨＴＰ酵素溶解物と、６０または８０ｇ／Ｌのイソα酸基質（Ｉｓｏｌｏｎｅ（登録商標）Ｉｓｏｍｅｒｉｚｅｄ Ｈｏｐ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｋａｌｓｅｃ）と、４０体積％のイソプロパノール（ＩＰＡ）中０．０２ｇ／ＬのＮＡＤＰとを含む、総体積２００μＬ／ウェルで行った。プレートを密封し、６００ｒｐｍで振盪しながら２０～２４時間、４５℃でインキュベートした。

【0183】

２０～２４時間後、０．１％の酢酸を伴う１０００μＬのアセトニトリルを添加した。プレートを密封し、４℃で１０分間、４０００ｒｐｍで遠心分離した。クエンチした試料をＨＰＬＣ分析の前に５０：５０のアセトニトリル：水混合物でさらに２０～４０倍希釈した。ＨＰＬＣ実行パラメーターを表５－２に記載する。

【表7-1-1】

【表7-1-2】

【0184】

（実施例８）
配列番号８０から誘導した操作されたポリペプチドの進化および前記ポリペプチドの改善されたＫＲＥＤ活性についてのスクリーニング
操作された遺伝子のライブラリーを、十分に確立されている技法（例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して産生した。各遺伝子によってコードされるポリペプチドを、実施例２に記載したようにＨＴＰで産生し、可溶性溶解物を、実施例３に記載したように生成した。

【0185】

配列番号８０のＫＲＥＤ活性を有するポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド（すなわち、配列番号７９）を使用して、表８－１のさらなる操作されたポリペプチドを生成した。これらのポリペプチドは、出発ポリペプチドと比較して、イソα酸からジヒドロ－（ｒｈｏ）－イソα酸の改善された形成を示した。操作されたポリペプチドを、上述のような定向進化方法を下の表５－２に記載するＨＴＰアッセイおよび分析法と共に使用して、配列番号８０の「骨格」アミノ酸配列から生成した。

【0186】

定向進化は、配列番号７９に示されるポリヌクレオチドを用いて開始した。操作されたポリペプチドを、次に、出発「骨格」遺伝子配列として選択した。操作されたポリペプチドのライブラリーを、種々の周知の技法（例えば、飽和変異誘発、以前に同定された有益なアミノ酸差異の組換え）を使用して生成し、イソα酸基質を所望のジヒドロ－（ｒｈｏ）－イソα酸生成物に変換するポリペプチドの能力を測定するＨＴＰアッセイおよび分析方法を使用して、スクリーニングした。

【0187】

酵素アッセイは、９６ウェル形式で、２ｍＭのＭｇＳＯ_４を伴う１００ｍＭ ｐＨ８のリン酸カリウム中の、１０～２０％ｖ／ｖのＨＴＰ酵素溶解物と、８０または１６０ｇ／Ｌのイソα酸基質（Ｉｓｏｌｏｎｅ（登録商標）Ｉｓｏｍｅｒｉｚｅｄ Ｈｏｐ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｋａｌｓｅｃ）と、４０体積％のイソプロパノール（ＩＰＡ）中０．０２ｇ／ＬのＮＡＤＰとを含む、総体積２００μＬ／ウェルで行った。プレートを密封し、６００ｒｐｍで振盪しながら２０～２４時間、４５℃でインキュベートした。

【0188】

２０～２４時間後、０．１％の酢酸を伴う１０００μＬのアセトニトリルを添加した。プレートを密封し、４℃で１０分間、４０００ｒｐｍで遠心分離した。クエンチした試料をＨＰＬＣ分析の前に５０：５０のアセトニトリル：水混合物でさらに２０～４０倍希釈した。ＨＰＬＣ実行パラメーターを表５－２に記載する。

【表8-1】

【0189】

（実施例９）
配列番号６および配列番号８０から誘導した操作されたポリペプチドの進化ならびに前記ポリペプチドの高い基質濃度での改善されたＫＲＥＤ活性についてのスクリーニング
２ｍＭのＭｇＳＯ_４を伴う５ｍＬの１００ｍＭ ｐＨ８のトリエタノールアミン^＊Ｈ_２ＳＯ_４に、２００ｍｇの酵素粉末を溶解することによって、４０ｇ／Ｌの酵素ストック溶液を調製した。２ｍＬのアリコートを取り、２回の逐次的な１：１ｖ／ｖ希釈に供して、各々２０および１０ｇ／Ｌにした。５００μＬの酵素ストック溶液（１０、２０または４０ｇ／Ｌ）を、空気下で撹拌棒を用いてバイアルに添加した。撹拌酵素ストック溶液に、緩衝液中の１ｇ／ＬのＮＡＤＰの１００μＬのアリコート、およびイソプロパノール（ＩＰＡ）中２５ｇ／Ｌのイソα酸４００μＬを添加した。最終反応組成は、５、１０または２０ｇ／Ｌの酵素、１０ｇ／Ｌのイソα酸、および４０％のＩＰＡ中０．１ｇ／ＬのＮＡＤＰであった。バイアルを２５℃または４０℃の加熱ブロック内に配置し、１、２、４、８および２４時間後に試料採取し、ＨＰＬＣ－ＵＶによって分析した。配列番号６および配列番号８０を比較する典型的な反応プロファイルを図１に示す。

【0190】

（実施例１０）
配列番号８０、１０４、１００、１３６、１１６、１３２、１６２、１５０、１５２、１４４および１４６から誘導した操作されたポリペプチドの進化ならびに前記ポリペプチドの高い基質および低いＮＡＤＰ濃度での改善されたＫＲＥＤ活性についてのスクリーニング
２ｍＭのＭｇＳＯ_４および０．１ｇ／ＬのＮＡＤＰを伴う５００μＬの１００ｍＭ ｐＨ８のリン酸カリウム緩衝液に１００ｍｇの酵素粉末を溶解することによって、２００ｇ／Ｌの酵素ストック溶液を調製した。９６ディープウェルプレート内のウェルに、４０μＬの酵素／ＮＡＤＰストック溶液、８０μＬのイソプロパノール、および８０μＬの４０重量％のイソα酸水溶液を添加した。最終反応組成は、４０ｇ／Ｌの酵素、１６０ｇ／Ｌのイソα酸、および４０％のＩＰＡ中０．０２ｇ／ＬのＮＡＤＰであった。プレートを密封し、４０℃で２４時間インキュベートし、次いでクエンチし、ＨＰＬＣ－ＵＶによって分析した。データを表１１－１に示し、図２に描示する。

【表10-1】

【0191】

（実施例１１）
配列番号１０４から誘導した操作されたポリペプチドの進化および前記ポリペプチドの改善されたＫＲＥＤ活性についてのスクリーニング
実施例８に記載したように、操作された遺伝子のライブラリーを、十分に確立されている技法（例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して産生した。各遺伝子によってコードされるポリペプチドを、実施例２に記載したようにＨＴＰで産生し、可溶性溶解物を、実施例３に記載したように生成した。

【0192】

配列番号１０４のＫＲＥＤ活性を有するポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド（すなわち、配列番号１０３）を使用して、表１１－１のさらなる改善された、操作されたポリペプチドを生成した。

【表11-1】

【0193】

（実施例１２）
組換えＫＲＥＤ遺伝子を含有するＥ．ｃｏｌｉ発現宿主
本発明のバリアントを生成するために使用した最初のＫＲＥＤ酵素は、Ｃｏｄｅｘｉｓの市販のＫＲＥＤ酵素パネル収集物から得た。最初のスクリーニング中に、配列番号１７２のポリペプチドまたは配列番号２７０のポリペプチドは、ＬＣ／ＭＳによって決定して最も多くの生成物を生成した。ＫＲＥＤコード遺伝子を、ｌａｃｌリプレッサーの制御下にあるｌａｃプロモーターに作動的に連結した配列番号４１３または配列番号４１４の発現ベクターにクローニングした。発現ベクターはまた、Ｐ１５ａ複製起点およびクロラムフェニコール耐性遺伝子を含有する。得られたプラスミドを、当技術分野において公知の標準的な方法を使用してＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０に形質転換した。形質転換体を、当技術分野において公知であるようなトリクロサン選択に細胞を供することによって単離した（例えば、米国特許第８，３８３，３４６号およびＷＯ２０１０／１４４１０３を参照のこと）。

【0194】

（実施例１３）
ＨＴＰ ＫＲＥＤ含有湿潤細胞ペレットの調製
モノクローナルコロニーからの組換えＫＲＥＤコード遺伝子を含有するＥ．ｃｏｌｉ細胞を、９６ウェルシャローウェルマイクロタイタープレートのウェル内の１％のグルコースおよび０．１２μｇ／ｍＬのトリクロサンを含有する１９０μｌのＬＢに接種した。プレートをＯ_２透過性シールで密封し、培養物を一晩、２０℃、２００ｒｐｍおよび湿度８５％で増殖させた。次いで、細胞培養物の各々の２０μｌを、３８０μＬのＴＢおよび３０μｇ／ｍＬのＣＡＭを含有する９６ウェルディープウェルプレートのウェルに移した。ディープウェルプレートをＯ_２透過性シールで密封し、０．６～０．８のＯＤ_６００に達するまで３０℃、２５０ｒｐｍおよび湿度８５％でインキュベートした。次いで、細胞培養物を１ｍＭの最終濃度までのＩＰＴＧによって誘導し、最初に使用したのと同じ条件下で一晩インキュベートした。次いで、４℃、４０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を使用して細胞をペレット化した。上清を廃棄し、ペレットを溶解の前に－８０℃で凍結させた。

【0195】

（実施例１４）
ＨＴＰ ＫＲＥＤ含有細胞溶解物の調製
先ず、実施例２に記載したように産生した細胞ペレットを、２ｍＭのＭｇＳＯ_４を伴う１００ｍＭ、ｐＨ８のリン酸カリウムと、または２ｍＭのＭｇＳＯ_４を伴う１００ｍＭ、ｐＨ８のリン酸カリウムと、１ｇ／Ｌのリゾチームと、０．５ｇ／ＬのＰＭＢＳとを含有する１５０μＬの溶解緩衝液を添加することによって溶解した。次いで、ベンチトップシェーカーを用いて、細胞ペレットを室温で２時間、振盪させた。プレートを４℃で１５分間、４，０００ｒｐｍで遠心分離して、細胞デブリを除去した。次いで、上清を生体触媒反応に使用して、活性レベルを決定した。

【0196】

（実施例１５）
振盪フラスコ（ＳＦ）培養物からの凍結乾燥溶解物の調製
振盪フラスコ手順を使用して、二次スクリーニングアッセイに有用である、および／または本明細書に記載の生体触媒プロセスにおける使用に有用である、操作されたＫＲＥＤポリペプチド振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）を生成することができる。酵素の振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）調製によって、ＨＴＰアッセイで使用される細胞溶解物と比較して、操作された酵素のより精製された調製物（例えば、総タンパク質の３０％まで）が得られ、より濃縮された酵素溶液の使用も可能になる。これを開始するために、上述のように増殖させた選択されたＨＴＰ培養物を、１％のグルコースおよび０．１２μｇ／ｍＬのトリクロサンを含むＬＢ寒天プレートに播種し、一晩、３７℃で増殖させた。各培養物からの単一コロニーを、１％のグルコースおよび３０μｇ／ｍｌのＣＡＭを含む６ｍｌのＬＢに移した。培養物を３０℃で１８時間、２５０ｒｐｍで増殖させ、０．１２μｇ／ｍＬのトリクロサンを含有する２５０ｍｌのＴＢへのおおよそ１：５０の継代培養を行って、０．０５の最終ＯＤ_６００にした。培養物を３０℃でおおよそ３時間、２５０ｒｐｍで増殖させて０．８～１．０の間のＯＤ_６００にし、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。次いで、培養物を３０℃で２０時間、２５０ｒｐｍで増殖させた。培養物を遠心分離した（４℃で２０分間４，０００ｒｐｍ）。上清を廃棄し、ペレットを、２ｍＭのＭｇＳＯ_４を伴う３５ｍｌの５０ｍＭ、ｐＨ８のリン酸カリウムに再懸濁させた。再懸濁した細胞を遠心分離した（４℃で２０分間４，０００ｒｐｍ）。上清を廃棄し、ペレットを、２ｍＭのＭｇＳＯ_４を伴う６ｍｌの５０ｍＭ、ｐＨ８のリン酸カリウムに再懸濁させ、Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓからの細胞破砕装置（Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ）を使用して細胞を溶解した。溶解物をペレット化し（４℃で６０分間１０，０００ｒｐｍ）、上清を凍結させ、凍結乾燥させて、振盪フラスコ（ＳＦ）酵素を生成した。

【0197】

（実施例１６）
配列番号１７２から誘導した操作されたポリペプチドの進化および前記ポリペプチドの改善されたＫＲＥＤ活性についてのスクリーニング
イソα酸基質の還元についてのバリアントのスクリーニングの結果に基づいて、配列番号１７２のポリペプチドを親酵素として選択した。操作された遺伝子のライブラリーを、十分に確立されている技法（例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して産生した。各遺伝子によってコードされるポリペプチドを、実施例２に記載したようにＨＴＰで産生し、可溶性溶解物を、実施例３に記載したように生成した。

【0198】

配列番号１７２のＫＲＥＤ活性を有するポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチドを使用して、表１６－１のさらなる操作されたポリペプチドを生成した。これらのポリペプチドは、出発ポリペプチドと比較して、イソα酸からジヒドロ－（ｒｈｏ）－イソα酸の改善された形成を示した。操作されたポリペプチドを、上述のような定向進化方法を下の表１６－１に記載するＨＴＰアッセイおよび分析法と共に使用して、配列番号１７２の「骨格」アミノ酸配列から生成した。

【0199】

定向進化は、配列番号１７１に示されるポリヌクレオチドを用いて開始した。操作されたポリペプチドを、次に、出発「骨格」遺伝子配列として選択した。操作されたポリペプチドのライブラリーを、種々の周知の技法（例えば、飽和変異誘発、以前に同定された有益なアミノ酸差異の組換え）を使用して生成し、イソα酸基質を所望のジヒドロ－（ｒｈｏ）－イソα酸生成物に変換するポリペプチドの能力を測定するＨＴＰアッセイおよび分析方法を使用して、スクリーニングした。

【0200】

酵素アッセイは、９６ディープウェルプレート形式で、２ｍＭのＭｇＳＯ_４を伴う１００ｍＭ、ｐＨ８のリン酸カリウム中の、２０％ｖ／ｖのＨＴＰ酵素溶解物と、４０％ｖ／ｖの４０重量％のイソα酸基質水溶液（Ｉｓｏｌｏｎｅ（登録商標）Ｉｓｏｍｅｒｉｚｅｄ Ｈｏｐ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｋａｌｓｅｃ）と、４０体積％のイソプロパノール（ＩＰＡ）中０．０２ｇ／ＬのＮＡＤＰとを含む、総体積１００μＬ／ウェルで行った。プレートを密封し、６００ｒｐｍで振盪しながら２０～２４時間、４５℃でインキュベートした。

【0201】

２０～２４時間後、０．１％の酢酸を伴う１０００μＬのアセトニトリルを添加した。プレートを密封し、４℃で１０分間、４，０００ｒｐｍで遠心分離した。クエンチした試料をＨＰＬＣ分析の前に５０：５０のアセトニトリル：水混合物でさらに４～５倍希釈した。ＨＰＬＣ実行パラメーターは、下の表５－２にある。

【表16-1-1】

【表16-1-2】

【0202】

（実施例１７）
配列番号１８６から誘導した操作されたポリペプチドの進化および前記ポリペプチドのＴｒａｎｓ－ＩＳＯに対する改善されたＫＲＥＤ活性についてのスクリーニング
イソα酸基質の還元についてのバリアントのスクリーニングの結果に基づいて、配列番号１８６を親酵素として選択した。操作された遺伝子のライブラリーを、十分に確立されている技法（例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して産生した。各遺伝子によってコードされるポリペプチドを、実施例２に記載したようにＨＴＰで産生し、可溶性溶解物を、実施例３に記載したように生成した。

【0203】

配列番号１８５のＫＲＥＤ活性を有するポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチドを使用して、表１７－２のさらなる操作されたポリペプチドを生成した。これらのポリペプチドは、出発ポリペプチドと比較して、イソα酸からジヒドロ－（ｒｈｏ）－イソα酸の改善された形成を示した。操作されたポリペプチドを、上述のような定向進化方法を表５－２に記載のＨＴＰアッセイおよび分析法と共に使用して、配列番号１８６の「骨格」アミノ酸配列から生成した。

【0204】

定向進化は、配列番号１８５に示されるポリヌクレオチドを用いて開始した。操作されたポリペプチドを、次に、出発「骨格」遺伝子配列として選択した。操作されたポリペプチドのライブラリーを、種々の周知の技法（例えば、飽和変異誘発、以前に同定された有益なアミノ酸差異の組換え）を使用して生成し、イソα酸基質を所望のジヒドロ－（ｒｈｏ）－イソα酸生成物に変換するポリペプチドの能力を測定するＨＴＰアッセイおよび分析方法を使用して、スクリーニングした。

【0205】

酵素アッセイは、９６ディープウェルプレート形式で、２ｍＭのＭｇＳＯ_４を伴う１００ｍＭ、ｐＨ８のリン酸カリウム中の、５０％ｖ／ｖのＨＴＰ酵素溶解物と、１０％ｖ／ｖの１０ｇ／Ｌの配列番号１８６と、１ｇ／Ｌのイソα酸基質（Ｉｓｏｌｏｎｅ（登録商標）Ｉｓｏｍｅｒｉｚｅｄ Ｈｏｐ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｋａｌｓｅｃ）と、４０体積％のイソプロパノール（ＩＰＡ）中０．１ｇ／ＬのＮＡＤＰとを含む、総体積１００μＬ／ウェルで行った。プレートを密封し、６００ｒｐｍで振盪しながら４４～４８時間、３０℃でインキュベートした。

【0206】

２０～２４時間後、０．１％の酢酸を伴う１０００μＬのアセトニトリルを添加した。プレートを密封し、４℃で１０分間、４，０００ｒｐｍで遠心分離した。クエンチした試料をＨＰＬＣ分析の前に５０：５０のアセトニトリル：水混合物でさらに４～５倍希釈した。ＨＰＬＣ実行パラメーターを下の表１７－１に記載する。図３を参照のこと。Ｔｒａｎｓ－ＩＳＯに対して改善された活性を示したバリアントを表１７－２に示す。

【表17-1】

【表17-2-1】

【表17-2-2】

【0207】

（実施例１８）
配列番号１８６から誘導した操作されたポリペプチドの進化および前記ポリペプチドの改善されたＫＲＥＤ活性についてのスクリーニング
実施例１６に記載したように、操作された遺伝子のライブラリーを、十分に確立されている技法（例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して産生した。各遺伝子によってコードされるポリペプチドを、実施例２に記載したようにＨＴＰで産生し、可溶性溶解物を、実施例３に記載したように生成した。

【0208】

配列番号１８６のＫＲＥＤ活性を有するポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド（すなわち、配列番号１８５）を使用して、表１８－１のさらなる改善された、操作されたポリペプチドを生成した。

【表18-1】

【0209】

（実施例１９）
配列番号１９４、配列番号２５２から誘導した操作されたポリペプチドの進化ならびに前記ポリペプチドの高い基質および低いＮＡＤＰ濃度での改善されたＫＲＥＤ活性についてのスクリーニング
２ｍＭのＭｇＳＯ４および０．１ｇ／ＬのＮＡＤＰを伴う５００μＬの１００ｍＭ、ｐＨ８のリン酸カリウム緩衝液に１００ｍｇの酵素粉末を溶解することによって、２００ｇ／Ｌの酵素ストック溶液を調製した。９６ディープウェルプレート内のウェルに、酵素／ＮＡＤＰストック溶液の４０μＬのアリコート、８０μＬのイソプロパノール、および８０μＬの４０重量％のイソα酸水溶液を添加した。最終反応組成は、４０ｇ／Ｌの酵素、１６０ｇ／Ｌのイソα酸、および４０％のＩＰＡ中０．０２ｇ／ＬのＮＡＤＰであった。プレートを密封し、４０℃で２４時間インキュベートし、次いでクエンチし、ＨＰＬＣ－ＵＶによって分析した。データを表１９－１、１９－２および１９－３に示す。

【表19-1】

【表19-2】

【表19-3-1】

【表19-3-2】

【0210】

（実施例２０）
配列番号２７０および配列番号２７２から誘導した操作されたポリペプチドの進化ならびに前記ポリペプチドの高い基質および低いＮＡＤＰ濃度での改善されたＫＲＥＤ活性についてのスクリーニング
実施例１８に記載したように、操作された遺伝子のライブラリーを、十分に確立されている技法（例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して産生した。各遺伝子によってコードされるポリペプチドを、実施例２に記載したようにＨＴＰで産生し、可溶性溶解物を、実施例３に記載したように生成した。

【0211】

配列番号２７０のＫＲＥＤ活性を有するポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド（すなわち、配列番号２６９）および配列番号２７２のＫＲＥＤ活性を有するポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド（すなわち、配列番号２７１）を使用して、表２０－１および２０－２のさらなる改善された、操作されたポリペプチドを生成した。

【表20-1】

【表20-2-1】

【表20-2-2】

【0212】

（実施例２１）
配列番号２８６から誘導した操作されたポリペプチドの進化ならびに前記ポリペプチドの高い基質および低いＮＡＤＰ濃度での改善されたＫＲＥＤ活性についてのスクリーニング
実施例１８に記載したように、操作された遺伝子のライブラリーを、十分に確立されている技法（例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して産生した。各遺伝子によってコードされるポリペプチドを、実施例２に記載したようにＨＴＰで産生し、可溶性溶解物を、実施例３に記載したように生成した。

【0213】

配列番号２８６のＫＲＥＤ活性を有するポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド（すなわち、配列番号２８５）を使用して、表２１－１のさらなる改善された、操作されたポリペプチドを生成した。

【表21-1】

【0214】

（実施例２２）
配列番号３２８から誘導した操作されたポリペプチドの進化および前記ポリペプチドの改善されたＫＲＥＤ活性についてのスクリーニング
イソα酸基質の還元についてのバリアントのスクリーニングの結果に基づいて、配列番号３２８を親酵素として選択した。操作された遺伝子のライブラリーを、十分に確立されている技法（例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して産生した。各遺伝子によってコードされるポリペプチドを、実施例２に記載したようにＨＴＰで産生し、可溶性溶解物を、実施例３に記載したように生成した。

【0215】

配列番号３２７のＫＲＥＤ活性を有するポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチドを使用して、表２２－１のさらなる操作されたポリペプチドを生成した。これらのポリペプチドは、出発ポリペプチドと比較して、イソα酸からジヒドロ－（ｒｈｏ）－イソα酸の改善された形成を示した。操作されたポリペプチドを、上述のような定向進化方法を表５－２に記載のＨＴＰアッセイおよび分析法と共に使用して、配列番号３２８の「骨格」アミノ酸配列から生成した。

【0216】

定向進化は、配列番号３２７に示されるポリヌクレオチドを用いて開始した。操作されたポリペプチドを、次に、出発「骨格」遺伝子配列として選択した。操作されたポリペプチドのライブラリーを、種々の周知の技法（例えば、飽和変異誘発、以前に同定された有益なアミノ酸差異の組換え）を使用して生成し、イソα酸基質を所望のジヒドロ－（ｒｈｏ）－イソα酸生成物に変換するポリペプチドの能力を測定するＨＴＰアッセイおよび分析方法を使用して、スクリーニングした。

【0217】

酵素アッセイは、９６ウェル丸底プレートで、２ｍＭのＭｇＳＯ_４を伴う１００ｍＭ、ｐＨ８のリン酸カリウム中の、２０％ｖ／ｖのＨＴＰ酵素溶解物と、４０％ｖ／ｖの４０重量％のイソα酸基質水溶液（Ｉｓｏｌｏｎｅ（登録商標）Ｉｓｏｍｅｒｉｚｅｄ Ｈｏｐ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｋａｌｓｅｃ）と、４０体積％のイソプロパノール（ＩＰＡ）中０．０２ｇ／ＬのＮＡＤＰとを含む、総体積２００μＬ／ウェルで行った。プレートを密封し、６００ｒｐｍで振盪しながら２０～２４時間、４５℃でインキュベートした。

【0218】

２０～２４時間後、０．１％の酢酸を伴う１０００μＬのアセトニトリルを添加した。プレートを密封し、４℃で１０分間、４，０００ｒｐｍで遠心分離した。クエンチした試料をＨＰＬＣ分析の前に５０：５０のアセトニトリル：水混合物でさらに４～５倍希釈した。ＨＰＬＣ実行パラメーターを表５－２および表１７－１に記載する。改善されたバリアントを表２２－１に示す。

【表22-1-1】

【表22-1-2】

【0219】

（実施例２３）
高い基質および低いＮＡＤＰ負荷での配列番号３２８および配列番号３３０の性能
８ｇの４０重量％のＩＳＯ水溶液の試料を、８ｍＬのイソプロパノール（ＩＰＡ）および２ｍＬの１００ｍＭ、ｐＨ８のリン酸カリウム緩衝液に溶解した。４Ｎ ＮａＯＨおよび／または１０％のＨ_３ＰＯ_４を用いて、ｐＨを８に調整した。４．５ｍＬのｐＨ調整したＩＳＯ／ＩＰＡ／緩衝溶液を、撹拌棒を用いて窒素ブランケット下、４０℃の加熱ブロック内で、セプタムキャップ付バイアルに添加した。１０ｍＭのＭｇＳＯ４および０．２ｇ／ＬのＮＡＤＰを伴う１００ｍＭ、ｐＨ８のリン酸カリウム緩衝液中の１０または４０ｇ／ＬのＫＲＥＤの０．５ｍＬを溶液に添加した（最終ＫＲＥＤおよびＮＡＤＰ負荷は、それぞれ、１または４ｇ／ＬのＫＲＥＤ、および０．０２ｇ／ＬのＮＡＤＰである）。種々の時間間隔で、２０μＬのアリコートを注射器によって反応から取り出し、０．１％の酢酸を伴う１０００μＬの１：１のアセトニトリル／水でクエンチした。２０℃で５分間、４，０００ｒｐｍでの遠心分離後、ＨＰＬＣ分析（表５－２および表１７－１）のために、２０μＬの上清を、０．１％の酢酸を伴う１８０μＬの１：１のアセトニトリル／水で希釈した。図４を参照のこと。

【0220】

（実施例２４）
配列番号３３０から誘導した操作されたポリペプチドの進化および前記ポリペプチドの改善されたＫＲＥＤ活性についてのスクリーニング
イソα酸基質の還元についてのバリアントのスクリーニングの結果に基づいて、配列番号３３０を親酵素として選択した。操作された遺伝子のライブラリーを、十分に確立されている技法（例えば、飽和変異誘発、および以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して産生した。各遺伝子によってコードされるポリペプチドを、実施例２に記載したようにＨＴＰで産生し、可溶性溶解物を、実施例３に記載したように生成した。

【0221】

配列番号３２９のＫＲＥＤ活性を有するポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチドを使用して、表２４－１のさらなる操作されたポリペプチドを生成した。これらのポリペプチドは、出発ポリペプチドと比較して、イソα酸からジヒドロ－（ｒｈｏ）－イソα酸の改善された形成を示した。操作されたポリペプチドを、上述のような定向進化方法を下の表２４－１に記載するＨＴＰアッセイおよび分析法と共に使用して、配列番号３３０の「骨格」アミノ酸配列から生成した。

【0222】

定向進化は、配列番号３２９に示されるポリヌクレオチドを用いて開始した。操作されたポリペプチドを、次に、出発「骨格」遺伝子配列として選択した。操作されたポリペプチドのライブラリーを、種々の周知の技法（例えば、飽和変異誘発、以前に同定された有益なアミノ酸差異の組換え）を使用して生成し、イソα酸基質を所望のジヒドロ－（ｒｈｏ）－イソα酸生成物に変換するポリペプチドの能力を測定するＨＴＰアッセイおよび分析方法を使用して、スクリーニングした。

【0223】

酵素アッセイは、９６丸底プレート形式で、２ｍＭのＭｇＳＯ_４を伴う１００ｍＭ、ｐＨ８のリン酸カリウム中の、５０％ｖ／ｖのＨＴＰ酵素溶解物と、１０％ｖ／ｖの４０重量％のイソα酸基質水溶液（Ｉｓｏｌｏｎｅ（登録商標）Ｉｓｏｍｅｒｉｚｅｄ Ｈｏｐ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｋａｌｓｅｃ）と、４０体積％のイソプロパノール（ＩＰＡ）中０．０２ｇ／ＬのＮＡＤＰとを含む、総体積２００μＬ／ウェルで行った。プレートを密封し、６００ｒｐｍで振盪しながら２０～２４時間、４５℃でインキュベートした。

【表24-1-1】

【表24-1-2】

【0224】

（実施例２５）
高い基質および低いＮＡＤＰ負荷での配列番号２７０、配列番号３２８、配列番号３３０、配列番号３４８、配列番号３４６および配列番号３５６の性能
８０ｍｇの各バリアントの試料を、１００ｍＬの１００ｍＭ、ｐＨ９のリン酸カリウムおよび１０ｍＭのＭｇＳＯ_４中の１０ｍｇのＮＡＤＰで構成されているＮＡＤＰストック溶液の１ｍＬに溶解した。ストック溶液を、５回の逐次的な１：１希釈に供して、ＮＡＤＰストック溶液中の８０、４０、２０、１０および５ｇ／Ｌの酵素のストック溶液を得た。ストック溶液の２０ｕＬのアリコートを、丸底プレート内の４０ｕＬの４０重量％のＩＳＯ溶液および４０ｕＬのＩＰＡに添加して、０．０２ｇ／ＬのＮＡＤＰと、２０ｍＭ、ｐＨ８のリン酸カリウムおよび２ｍＭのＭｇＳＯ_４中の４０体積％のＩＰＡ中の１６０ｇ／ＬのＩＳＯの最終組成を得た。最終酵素濃度は、それぞれ、１６、８、４、２および１ｇ／Ｌであった。プレートを密封し、４０°および６００ｒｐｍのシェーカーに２４時間、入れておいた。２４時間後、プレートを２０℃で１０分間、４，０００ｒｐｍで遠心分離し、１００ｕｌの上清を、ディープウェルプレート内の０．１％の酢酸を伴う１ｍＬの＿：１のアセトニトリル／水に移した。クエンチした反応混合物を有するディープウェルプレートを２０℃で１０分間、４，０００ｒｐｍで遠心分離し、５ｕＬの上清を、表５－２および１７－１によるＨＰＬＣ分析のために、０．１％の酢酸を伴う２００ｕＬの１：１のアセトニトリル／水に移した。図５を参照のこと。

【0225】

この出願で引用されるすべての刊行物、特許、特許出願および他の文書は、それぞれ個々の刊行物、特許、特許出願または他の文書が、すべての目的のために参照により組み込まれることを個別に示されているのと同程度に、すべての目的のためにそれらの全体として、参照により本明細書に組み込まれる。

【0226】

種々の具体的な実施形態を例証し、記載したが、本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく種々の変化を加えることができることは理解されるであろう。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

2022549852000001.app

【国際調査報告】