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特表2022-549915ノッティン－免疫刺激剤複合体ならびに関連組成物および方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-11-29
(54)【発明の名称】ノッティン－免疫刺激剤複合体ならびに関連組成物および方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20221121BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20221121BHJP
C07K 14/00 20060101ALI20221121BHJP
C07K 16/00 20060101ALI20221121BHJP
C07K 14/46 20060101ALI20221121BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20221121BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20221121BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20221121BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20221121BHJP
A61K 49/00 20060101ALI20221121BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20221121BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20221121BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z
C07K19/00 ZNA
C07K14/00
C07K16/00
C07K14/46
A61K47/64
A61P37/04
A61P43/00 111
A61K31/7088
A61K49/00
A61K39/395 N
A61K39/395 D
A61K39/395 T
A61P35/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022519458
(86)(22)【出願日】2020-09-29
(85)【翻訳文提出日】2022-05-20
(86)【国際出願番号】 US2020053258
(87)【国際公開番号】W WO2021067261
(87)【国際公開日】2021-04-08
(31)【優先権主張番号】62/908,305
(32)【優先日】2019-09-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】503115205
【氏名又は名称】ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー
(74)【代理人】
【識別番号】100083806
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 秀和
(74)【代理人】
【識別番号】100095500
【弁理士】
【氏名又は名称】伊藤 正和
(74)【代理人】
【識別番号】100111235
【弁理士】
【氏名又は名称】原 裕子
(74)【代理人】
【識別番号】100195257
【弁理士】
【氏名又は名称】大渕 一志
(72)【発明者】
【氏名】サジブ―バルフィ、 イディト
(72)【発明者】
【氏名】レヴィ、 ロナルド
(72)【発明者】
【氏名】ミラー、 ケイトリン
(72)【発明者】
【氏名】コクラン、 ジェニファー アール．
(72)【発明者】
【氏名】ベルトッツィ、 キャロライン アール．
【テーマコード（参考）】
4C076
4C085
4C086
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA95
4C076BB01
4C076BB13
4C076CC07
4C076CC27
4C076EE59
4C085AA13
4C085BB01
4C085BB11
4C085BB42
4C085HH01
4C085KA26
4C085KB82
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA52
4C086MA55
4C086MA66
4C086NA05
4C086NA13
4C086ZB09
4C086ZB26
4C086ZC41
4H045BA18
4H045BA41
4H045BA50
4H045BA54
4H045DA75
4H045EA28
(57)【要約】
細胞表面分子に結合する改変されたループを含むノッティンペプチドと、リンカーを介してノッティンペプチドにコンジュゲートされた免疫刺激剤とを含む、複合体が提供される。いくつかの実施形態によれば、免疫刺激剤は、病原体認識受容体（ＰＲＲ）を活性化する。例えば、免疫刺激剤は、トール様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、例えば、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８および／またはＴＬＲ９のアゴニストであり得る。本開示の複合体を含む組成物（例えば医薬組成物）、ならびにそのような組成物を含むキット、および、例えばがんを有する個体を治療するためにそのような組成物を使用する方法もまた提供される。本開示の複合体を作製する方法も提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞表面分子に結合する改変されたループを含むノッティンペプチドと、リンカーを介して前記ノッティンペプチドにコンジュゲートされた免疫刺激剤と
を含む、複合体。
【請求項2】
前記免疫刺激剤は、病原体認識受容体（ＰＲＲ）を活性化する、請求項１に記載の複合体。
【請求項3】
前記ＰＲＲは、トール様受容体（ＴＬＲ）、ＲＩＧ－Ｉ様受容体（ＲＬＲ）、ＮＯＤ様受容体（ＮＬＲ）、Ｃ型レクチン受容体（ＣＬＲ）、サイトゾルｄｓＤＮＡセンサー（ＣＤＳ）、インターフェロン遺伝子の刺激因子（ＳＴＩＮＧ）、およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項２に記載の複合体。
【請求項4】
前記免疫刺激剤は、トール様受容体（ＴＬＲ）アゴニストである、請求項２に記載の複合体。
【請求項5】
前記ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ９アゴニストである、請求項４に記載の複合体。
【請求項6】
前記ＴＬＲアゴニストは、オリゴヌクレオチドベースのＴＬＲアゴニストである、請求項４または５に記載の複合体。
【請求項7】
前記オリゴヌクレオチドベースのＴＬＲアゴニストは、１つ以上のＣｐＧジヌクレオチドを含む、請求項６に記載の複合体。
【請求項8】
前記オリゴヌクレオチドベースのＴＬＲアゴニストは、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である、請求項７に記載の複合体。
【請求項9】
前記ＣｐＧ ＯＤＮは、クラスＡ（タイプＤ）、クラスＢ（タイプＫ）、およびクラスＣからなる群から選択されるクラスからのものである、請求項８に記載の複合体。
【請求項10】
前記ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、またはそれらの両方のアゴニストである、請求項４に記載の複合体。
【請求項11】
前記ＴＬＲアゴニストは、イミダゾキノリン（ＩＭＺＱ）化合物を含む、請求項１０に記載の複合体。
【請求項12】
前記ＴＬＲアゴニストは、Ｔ７８ａ、ハイブリッド－２、パラアミン、メタアミン、ＸＧ１－２３６、ＤＳ８０２、ＣＬ０７５、ＣＬ０９７、およびＲ８４８からなる群から選択される、請求項１１に記載の複合体。
【請求項13】
前記ＴＬＲアゴニストは、Ｔ７８ａである、請求項１２に記載の複合体。
【請求項14】
前記ノッティンペプチドは、２つ以上の免疫刺激剤にコンジュゲートされる、請求項１～１３のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項15】
前記２つ以上の免疫刺激剤のうちの２つは、同じものである、請求項１４に記載の複合体。
【請求項16】
前記２つ以上の免疫刺激剤のうちの２つは、異なるものである、請求項１４または１５に記載の複合体。
【請求項17】
前記２つ以上の免疫刺激剤は、独立して、請求項２～１３のいずれか一項に定義される免疫刺激剤から選択される、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項18】
前記ノッティンペプチドは、検出可能な標識にさらにコンジュゲートされる、請求項１～１７のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項19】
前記検出可能な標識は、インビボ画像化剤である、請求項１８に記載の複合体。
【請求項20】
前記ノッティンペプチドは、１つ以上の異種ポリペプチドに融合されている、請求項１～１９のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項21】
前記１つ以上の異種ポリペプチドは、Ｆｃドメイン、アルブミン、トランスフェリン、ＸＴＥＮ、ホモアミノ酸ポリマー、プロリン－アラニン－セリンポリマー、エラスチン様ペプチド、またはそれらのいずれかの組み合わせを含む、請求項２０に記載の複合体。
【請求項22】
前記１つ以上の異種ポリペプチドは、Ｆｃドメインを含む、請求項２１に記載の複合体。
【請求項23】
前記Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメインである、請求項２２に記載の複合体。
【請求項24】
前記１つ以上の異種ポリペプチドは、インビボで検出可能なポリペプチドを含む、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項25】
前記ノッティンペプチドは、ＥＥＴＩ－ＩＩペプチド、ＡｇＲＰペプチド、ω－コノトキシンペプチド、カラタＢ１ペプチド、ＭＣｏＴＩ－ＩＩペプチド、アガトキシンペプチド、およびクロロトキシンペプチドからなる群から選択される、請求項１～２４のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項26】
前記ノッティンペプチドは、ＥＥＴＩ－ＩＩペプチドである、請求項２５に記載の複合体。
【請求項27】
前記ノッティンペプチドは、配列番号８に記載されるアミノ酸配列に対して７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載の複合体。
【請求項28】
前記ノッティンペプチドは、配列番号９に記載されるアミノ酸配列に対して７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載の複合体。
【請求項29】
前記ノッティンペプチドは、配列番号１０に記載されるアミノ酸配列に対して７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載の複合体。
【請求項30】
前記細胞表面分子は、がん細胞表面分子である、請求項１～２９のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項31】
前記がん細胞表面分子は、固形腫瘍のがん細胞上に存在する、請求項３０に記載の複合体。
【請求項32】
前記がん細胞表面分子は、液性腫瘍のがん細胞上に存在する、請求項３０に記載の複合体。
【請求項33】
前記細胞表面分子は、細胞表面受容体である、請求項１～３２のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項34】
前記細胞表面受容体は、細胞接着受容体である、請求項３３に記載の複合体。
【請求項35】
前記細胞接着受容体は、インテグリンである、請求項３４に記載の複合体。
【請求項36】
前記インテグリンは、αｖβ１インテグリン、αｖβ３インテグリン、αｖβ５インテグリン、αｖβ６インテグリン、α５β１インテグリン、およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項３５に記載の複合体。
【請求項37】
前記細胞接着受容体は、腫瘍血管系細胞上に存在する、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項38】
前記細胞表面受容体は、成長因子受容体、ケモカイン受容体、免疫細胞受容体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３３に記載の複合体。
【請求項39】
前記細胞表面分子は、膜プロテアーゼである、請求項１～３２のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項40】
請求項１～３９のいずれか一項に記載の複合体を含む、組成物。
【請求項41】
前記組成物は、前記複合体と、
薬学的に許容される担体と
を含む、医薬組成物である、請求項４０に記載の組成物。
【請求項42】
前記医薬組成物は、非経口投与のために製剤化される、請求項４１に記載の組成物。
【請求項43】
前記医薬組成物は、経口投与のために製剤化される、請求項４１に記載の組成物。
【請求項44】
治療有効量の請求項４１～４３のいずれか一項に記載の医薬組成物と、それを必要とする個体に前記医薬組成物を投与するための説明書と
を含む、キット。
【請求項45】
前記医薬組成物は、１つまたは複数の単位投与量で存在する、請求項４４に記載のキット。
【請求項46】
治療有効量の請求項４１～４３のいずれか一項に記載の医薬組成物を、それを必要とする個体に投与することを含む、方法。
【請求項47】
前記投与は、全身投与による、請求項４６に記載の方法。
【請求項48】
前記全身投与は、非経口投与による、請求項４７に記載の方法。
【請求項49】
前記非経口投与は、静脈内投与による、請求項４８に記載の方法。
【請求項50】
前記全身投与は、経口投与による、請求項４７に記載の方法。
【請求項51】
前記個体は、がんを有し、改変されたループが、前記個体に存在するがん細胞上の細胞表面分子に結合し、前記方法は、前記個体の前記がんを治療する方法である、請求項４６～５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項52】
前記細胞表面分子は、細胞表面受容体である、請求項５１に記載の方法。
【請求項53】
前記細胞表面受容体は、細胞接着受容体である、請求項５２に記載の方法。
【請求項54】
前記細胞接着受容体は、インテグリンである、請求項５３に記載の方法。
【請求項55】
前記インテグリンは、αｖβ１インテグリン、αｖβ３インテグリン、αｖβ５インテグリン、αｖβ６インテグリン、α５β１インテグリン、およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項56】
前記個体は、前記がん細胞を含む固形腫瘍を有する、請求項５１～５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項57】
前記投与は、全身投与によるものであり、前記固形腫瘍の免疫細胞微小環境は、前記免疫刺激剤のみが前記個体に全身投与されるときの腫瘍の免疫細胞微小環境と比較して、増加した割合のＣＤ８＋Ｔ細胞、増加した割合のＣＤ４＋Ｔ細胞、増加した割合のＢ細胞、および／または減少した割合の骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）のうちの１つまたはいずれかの組み合わせにより特徴付けられる、請求項５６に記載の方法。
【請求項58】
前記投与は、全身投与によるものであり、ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合、ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合、Ｂ細胞の割合、および／または骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）の割合のうちの１つまたはいずれかの組み合わせによって評価される前記固形腫瘍の免疫細胞微小環境は、前記免疫刺激剤のみが個体に腫瘍内投与されるときの腫瘍の免疫細胞微小環境と比較して、統計学的に有意に異ならない、請求項５６に記載の方法。
【請求項59】
前記個体は、前記がん細胞を含む液性腫瘍を有する、請求項５１～５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項60】
ノッティン－免疫刺激剤複合体を作製する方法であって、リンカーを介して免疫刺激剤をノッティンペプチドにコンジュゲートすることを含む、方法。
【請求項61】
前記コンジュゲートすることは、前記免疫刺激剤を官能化することと、
官能化された前記免疫刺激剤を前記ノッティンペプチドにコンジュゲートすることと
を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項62】
前記免疫刺激剤は、一級アミンを含み、前記免疫刺激剤を官能化することは、前記一級アミンをアミン反応性リンカーと反応させることを含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項63】
前記アミン反応性リンカーは、アミン反応性ＮＨＳエステルリンカーである、請求項６２に記載の方法。
【請求項64】
前記アミン反応性リンカーは、ビシクロ［６．１．０］ノニン（ＢＣＮ）、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）、およびアジド部分からなる群から選択される部分を含む、請求項６２または６３に記載の方法。
【請求項65】
前記官能化された免疫刺激剤を前記ノッティンペプチドにコンジュゲートすることは、前記アミン反応性リンカーの前記部分を前記ノッティンペプチドの部分と反応させることを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項66】
前記ノッティンペプチドは、前記ノッティンペプチドの前記部分を含む非天然アミノ酸を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項67】
前記非天然アミノ酸は、５－アジド－Ｌ－ノルバリンである、請求項６６に記載の方法。
【請求項68】
前記ノッティンペプチドの前記部分は、Ｎ末端アミン基である、請求項６５に記載の方法。
【請求項69】
前記免疫刺激剤は、請求項２～１３のいずれか一項に定義される免疫刺激剤である、請求項６０～６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項70】
前記ノッティンペプチドは、請求項２０～３９のいずれか一項に定義されるノッティンペプチドである、請求項６０～６９のいずれか一項に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１９年９月３０日に出願された、米国仮特許出願第６２／９０８，３０５号の利益を主張する。
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１９年９月３０日に出願された、米国仮特許出願第６２／９０８，３０５号の利益を主張する。
【背景技術】
【0002】
in situがんワクチン接種は、トール様受容体（ＴＬＲ）アゴニストなどの免疫増強剤の腫瘍内注射を伴う治療方策を表し、免疫活性化を誘起して腫瘍部位で利用可能な腫瘍関連抗原を利用する。この手法の利点は、事実上あらゆる種類のがんが、特定の腫瘍抗原の事前知識がなくても治療され得ることである。この方策の主な制限は、腫瘍内注射の必要性であり、これは、アクセス可能性が限定されたがん（例えば、肺がん、膵臓がん、腎がんなど）にとって、および原発腫瘍が外科的に切除されている状況での転移性疾患の場合に非常に困難である。
【発明の概要】
【0003】
提供されるものは、細胞表面分子に結合する改変されたループを含むノッティンペプチドと、リンカーを介してノッティンペプチドにコンジュゲートされた免疫刺激剤とを含む、複合体である。いくつかの実施形態によれば、免疫刺激剤は、病原体認識受容体（ＰＲＲ）を活性化する。例えば、免疫刺激剤は、トール様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、例えば、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８および／またはＴＬＲ９のアゴニストであり得る。本開示の複合体を含む組成物（例えば、医薬組成物）、ならびにそのような組成物を含むキット、および例えば、がんを有する個体を治療するためにそのような組成物を使用する方法もまた提供される。本開示の複合体を作製する方法もまた提供される。
【図面の簡単な説明】
【0004】
【図1】インテグリン結合ノッティンペプチドおよびノッティン－Ｆｃ融合体を標的化剤として使用する、腫瘍標的化免疫刺激剤複合体の概略図。
【図2】本開示のいくつかの実施形態による、免疫刺激剤を官能化するための方策。
【図3】本開示のいくつかの実施形態による、ノッティンペプチドの配列および概略図。
【図4】本開示のいくつかの実施形態による、ノッティンペプチドを官能化された免疫刺激剤にコンジュゲートするための方策。
【図5】本開示のいくつかの実施形態による、ＣｐＧが異なる部位に組み込まれたノッティン－ＣｐＧ複合体。
【図6】本開示のいくつかの実施形態による、異なるリンカーを伴って合成されたノッティン－ＣｐＧ複合体。
【図7】本開示のいくつかの実施形態による、ノッティン－ＴＬＲ７／８アゴニスト複合体。
【図8】本開示のいくつかの実施形態による、ノッティン－Ｆｃ免疫刺激剤複合体。
【図9】本開示のいくつかの実施形態による、インビボ蛍光追跡を可能にするために検出可能標識にコンジュゲートされたノッティンペプチドを含む複合体。
【図10】腫瘍内および腫瘍周囲に投与された本開示の複合体のインビボ蛍光画像化を示すデータ。
【図11】静脈内投与された本開示の複合体のインビボ蛍光画像化を示すデータ。
【図12】切除された腫瘍における本開示の複合体のエクスビボ蛍光画像化を示すデータ。
【図13】４Ｔ１－Ｌｕｃ乳がんにおける３ＣＭ－ＣｐＧの治療有効性を実証する生存曲線（ｎ＝９～１０）。
【図14】経時的な４Ｔ１－Ｌｕｃ平均腫瘍成長を示すデータ。
【図15】個々の４Ｔ１－Ｌｕｃ腫瘍成長曲線を示すデータ。
【図16】免疫細胞浸潤データを提供する。４Ｔ１－ｌｕｃ細胞腫瘍を伴うマウスが、以下の群、すなわち、ビヒクルＩＶ、ＣｐＧ ＩＶ、３ＣＭ－ＣｐＧ ＩＶ、およびＣｐＧ ＩＴについて、静脈内（ＩＶ）または腫瘍内（ＩＴ）注射を用いて、概略図に従って処置された。腫瘍が、処置後に切除され、ＦＡＣＳを介して腫瘍浸潤免疫細胞について分析された。提供されているのは、異なる免疫集団の存在量を生存単一細胞全体の％として示すプロットである。
【発明を実施するための形態】
【0005】
本開示の複合体、組成物、キットおよび方法がさらに詳細に説明される前に、該複合体、組成物、キット、および方法は、説明される特定の実施形態に限定されず、当然のことながら変更され得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のためのものにすぎず、（複合体、組成物、キット、および方法の範囲は添付の特許請求の範囲のみによって限定されるため）限定的であることは意図されないこともまた理解されたい。
【0006】
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限との間の（文脈上明確に指示されていない限り、下限の単位の１０分の１に至るまでの）各介在値、およびその記載された範囲内の他のあらゆる記載されたまたは介在する値は、当該複合体、組成物、キットおよび方法内に包含されることを理解されたい。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立して、より小さい範囲に含められ得、やはり当該複合体、組成物、キットおよび方法内に包含され、ただし記載された範囲内で特に除外されている制限を受ける。記載される範囲に上下限の一方または両方が含まれている場合、その含まれる上下限のいずれかまたは両方を除く範囲も、当該複合体、組成物、キットおよび方法に含まれる。
【0007】
特定の範囲は、数値の前に用語「約」が付された状態で本明細書に提示される。「約」という用語は、それが先行する正確な数字、およびその用語が先行する数字に近接または近似する数字に逐語的支持を提供するために本明細書において使用される。ある数が特定の列挙された数に近接または近似するかどうかを決定するにあたり、近似または近似するが列挙されていない数とは、それが提示されている文脈において具体的に列挙された数と実質的に等価な数であり得る。
【0008】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、該複合体、組成物、キット、および方法が属する分野の当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または同等である任意の複合体、組成物、キット、および方法もまた、複合体、組成物、キット、および方法の実践または試験において使用され得るが、代表的な例示的複合体、組成物、キット、および方法が、ここに記載される。
【0009】
本明細書に引用されるすべての刊行物および特許は、各個々の刊行物または特許が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれ、刊行物が引用されるところに関連する方法および／または材料を開示かつ説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。刊行物の引用は、出願日前のその開示についてのものであり、提供される刊行年は、個別に確認を必要とし得る実際の刊行年とは異なる場合があるので、本複合体、組成物、キット、および方法がそのような刊行物よりも先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。
【0010】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。特許請求の範囲は任意選択的な要素を排除するように起草されてもよいことにさらに留意されたい。このように、この記述は、クレーム要素の列挙に関連する「専ら」、「のみ」などのような排他的な用語の使用または「負の」限定の使用のための文言的根拠としての役割を果たすことを意図する。
【0011】
明瞭さのために別々の実施形態の文脈中で記載された、複合体、組成物、キットおよび方法の特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わされても提供され得ることが認識される。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈で説明される、複合体、組成物、キットおよび方法の様々な特徴は、別々にまたは任意の好適なサブコンビネーションで提供されてもよい。実施形態のすべての組み合わせは、本開示によって具体的に包含され、このような組み合わせが実施可能なプロセスおよび／または組成物を包含する限りにおいて、ありとあらゆる組み合わせが個々にまたは明示的に開示されているかのように本明細書に開示される。さらに、そのような可変要素を記載している実施形態に列挙されているすべてのサブコンビネーションも、本複合体、組成物、キットおよび方法によって具体的に包含され、そのようなすべてのサブコンビネーションが個々におよび明示的に開示されているかのように、本明細書に開示される。
【0012】
本開示を読むと当業者には明らかであるように、本明細書に説明され例証された個々の実施形態の各々は、本開示の方法の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離され得る、または組み合わせられ得る個別の構成要素および特徴を有する。いかなる列挙された方法も、列挙された事象の順序で、または論理的に可能なあらゆる他の順序で、実行され得る。
【0013】
複合体
本開示は、ノッティンペプチド－免疫刺激剤複合体を提供する。複合体は、細胞表面分子に結合する改変されたループを含むノッティンペプチドと、リンカーを介して該ノッティンペプチドにコンジュゲートされた免疫刺激剤とを含む。そのような複合体は、種々の用途で有用である。例えば、がん療法との関連で、本明細書に実証されるように、複合体は、予測できなかったことに全身投与後に固形腫瘍に局在化することが可能であり、対応する非コンジュゲート免疫刺激剤よりも実質的に高い治療有効性を達成する。さらに、複合体は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＢ細胞の割合の増加、ならびに骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）の減少によって示されるように、ノッティンペプチドにコンジュゲートされない免疫刺激剤の全身投与と比較して、腫瘍免疫の様相を予想外かつ有意に転換する。ノッティンペプチド－免疫刺激剤複合体を使用した免疫細胞プロファイルのこの劇的な変化は、腫瘍内投与（ＩＴ）された免疫刺激剤による治療から観察された変化と区別できなかった。本開示の複合体に関する詳細が、ここで説明される。
本開示は、ノッティンペプチド－免疫刺激剤複合体を提供する。複合体は、細胞表面分子に結合する改変されたループを含むノッティンペプチドと、リンカーを介して該ノッティンペプチドにコンジュゲートされた免疫刺激剤とを含む。そのような複合体は、種々の用途で有用である。例えば、がん療法との関連で、本明細書に実証されるように、複合体は、予測できなかったことに全身投与後に固形腫瘍に局在化することが可能であり、対応する非コンジュゲート免疫刺激剤よりも実質的に高い治療有効性を達成する。さらに、複合体は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＢ細胞の割合の増加、ならびに骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）の減少によって示されるように、ノッティンペプチドにコンジュゲートされない免疫刺激剤の全身投与と比較して、腫瘍免疫の様相を予想外かつ有意に転換する。ノッティンペプチド－免疫刺激剤複合体を使用した免疫細胞プロファイルのこの劇的な変化は、腫瘍内投与（ＩＴ）された免疫刺激剤による治療から観察された変化と区別できなかった。本開示の複合体に関する詳細が、ここで説明される。
【0014】
「免疫刺激剤」とは、免疫系の１つ以上のタイプの細胞の活性化または成熟を直接的または間接的に誘導する、物質を意味する。様々なタイプの免疫刺激剤が、本開示の複合体において提供され得る。採用され得る免疫刺激剤の非限定的な例は、ポリペプチド、核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）、炭水化物、抗体、リガンド、アプタマー、ナノ粒子、および小分子を含む。いくつかの実施形態では、免疫刺激剤は、非免疫細胞（例えば、上皮細胞、内皮細胞、腫瘍細胞など）を刺激して、炎症性サイトカインを産生させる。
【0015】
いくつかの実施形態によれば、本開示の複合体は、自然免疫系の１つ以上のタイプの細胞の活性化または成熟を直接的または間接的に誘導する、免疫刺激剤を含む。免疫刺激剤によって直接的または間接的に活性化され得る自然免疫系細胞型の非限定的な例は、マクロファージ、樹状細胞、ＮＫ細胞、好中球、好塩基球、好酸球、ランゲルハンス細胞、肥満細胞、および／または単球を含む。特定の実施形態では、本開示の複合体は、適応免疫系の１つ以上のタイプの細胞の活性化または成熟を誘導する、免疫刺激剤を含む。免疫刺激剤によって活性化され得る適応免疫系細胞型の非限定的な例は、Ｔ細胞およびＢ細胞を含む。Ｔ細胞の例は、ナイーブＴ細胞（ＴＮ）、細胞毒性Ｔ細胞（ＴＣＴＬ）、記憶Ｔ細胞（ＴＭＥＭ）、Ｔ記憶幹細胞（ＴＳＣＭ）、中枢記憶Ｔ細胞（ＴＣＭ）、エフェクター記憶Ｔ細胞（ＴＥＭ）、組織常駐記憶Ｔ細胞（ＴＲＭ）、エフェクターＴ細胞（ＴＥＦＦ）、調節性Ｔ細胞（ＴＲＥＧ）、ヘルパーＴ細胞（ＴＨ、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ１７）ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ウイルス特異的Ｔ細胞、アルファベータＴ細胞（Ｔαβ）、およびガンマデルタＴ細胞（Ｔγδ）を含む。
【0016】
特定の実施形態では、免疫刺激剤は、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ：pathogen-associated molecular pattern）を含む。ＰＡＭＰは、病原体のライフサイクルの一部として発現される、病原体特異的な糖、リポタンパク質、および／または核酸（例えば、ジヌクレオチドＣｐＧの１つ以上の非メチル化反復を含むＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、または同等物）を含む。そのような特定の微生物パターンを認識することができる宿主タンパク質は、病原体認識受容体（ＰＲＲ）と呼ばれる。いくつかの実施形態によれば、本開示の複合体の免疫刺激剤は、病原体認識受容体（ＰＲＲ）を活性化する。特定の実施形態では、ＰＲＲは、トール様受容体（ＴＬＲ）、ＲＩＧ－１様受容体（ＲＬＲ）、ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン（ＮＯＤ）様受容体（ＮＬＲ）、Ｃ型レクチン受容体（ＣＬＲ）、サイトゾルｄｓＤＮＡセンサー（ＣＤＳ）、インターフェロン遺伝子の刺激因子（ＳＴＩＮＧ）、およびそれらの任意の組み合わせから選択される。いくつかの実施形態によれば、免疫刺激剤は、ＰＲＲを活性化し、天然または非天然ＰＡＭＰを含む。採用され得る非天然ＰＲＲ活性化因子は、合成小分子ＰＲＲアゴニストを含むが、それらに限定されない。
【0017】
いくつかの実施形態によれば、免疫刺激剤は、トール様受容体（ＴＬＲ）アゴニストである。ＴＬＲは、侵入する病原体または内因性損傷シグナルを感知し、自然および適応免疫応答を開始する、Ｉ型膜貫通ＰＲＲのファミリーである。ヒトには１０個の機能的ＴＬＲ（ＴＬＲ１～１０）があり、マウスには１２個の機能的ＴＬＲ（ＴＬＲ１～９、１１～１３）がある。ＴＬＲの様々な組み合わせは、単球、マクロファージ、樹状細胞、好中球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、線維芽細胞、内皮細胞、および上皮細胞などの免疫および非免疫細胞型の異なるサブセットによって発現される。ヒトＴＬＲのうち、ＴＬＲ１、２、４、５、６、および１０は細胞表面上に発現され、主に、微生物の膜および／または細胞壁成分を認識する一方で、ＴＬＲ３、７、８、および９は、エンドリソソームコンパートメントの膜で発現され、核酸を認識する。ＴＬＲは、それらのＮ末端において異なる数のリガンド感知性ロイシンリッチ反復（ＬＲＲ）と、細胞質トール／ＩＬ－１ Ｒ（ＴＩＲ）ドメインとを有する。ＴＩＲドメインは、ＭｙＤ８８、ＴＲＩＦ、ＴＲＡＭ、およびＴＩＲＡＰ／ＭＡＬを含む、ＴＬＲシグナル伝達の調節に関与するアダプタータンパク質とＴＬＲとの間の相互作用を仲介する。これらのアダプター分子の下流で活性化されるシグナル伝達経路は、炎症性サイトカイン、ケモカイン、ならびにＩ型およびＩＩＩ型インターフェロンの発現を促進する。
【0018】
特定の実施形態では、本開示の複合体は、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、およびＴＬＲ１０のうちの１つ以上のアゴニストである、免疫刺激剤を含む。いくつかの実施形態によれば、免疫刺激剤はＴＬＲ９アゴニストである。ヒトＴＬＲ９遺伝子は、転写の際に異なるアイソフォームにスプライスして、５つのＴＬＲ９アイソフォーム（ＴＬＲ９Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥ）を生成することができる。これらのＴＬＲ９アイソフォームは、脾臓、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、およびリンパ節などの様々な免疫器官および細胞で差次的に発現される。
【0019】
いくつかの実施形態では、免疫刺激剤は、オリゴヌクレオチドベースのＴＬＲ９アゴニストである。本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」は、５～５００個のヌクレオチド、例えば、５～１００個のヌクレオチドによる、ヌクレオチドの一本鎖マルチマーである。オリゴヌクレオチドは、合成であってもよく、または酵素的に作製されてもよく、いくつかの実施形態では、５～５０個のヌクレオチドの長さである。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドモノマーを含有し（すなわち、オリゴリボヌクレオチドまたは「ＲＮＡオリゴヌクレオチド」であり）、デオキシリボヌクレオチドモノマーを含有し（すなわち、オリゴデオキシリボヌクレオチドまたは「ＤＮＡオリゴヌクレオチド」であり）、またはそれらの組み合わせを含有し得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～１００、１００～１５０、もしくは１５０～２００、または最大５００個のヌクレオチドの長さであり得る。
【0020】
免疫刺激剤がオリゴヌクレオチドベースのＴＬＲ９アゴニストであるとき、免疫刺激剤は、１つ以上の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドであり得る。非メチル化ＣｐＧモチーフを含有する細菌および合成ＤＮＡに対する自然免疫応答においてＴＬＲ９が果たす役割は、十分に特性化されている。例えば、Ｕｅｍａｔｓｕ Ｓ，Ａｋｉｒａ Ｓ．（２００６）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ８４（９）：７１２－７２５を参照されたい。いくつかの実施形態によれば、免疫刺激剤がオリゴヌクレオチドベースのＴＬＲ９アゴニストであるとき、免疫刺激剤は、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である。ＣｐＧ ＯＤＮは、インビトロおよびインビボで証明されているように白血球を活性化することができる、特定の配列コンテキスト（ＣｐＧモチーフ）において非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含有する合成一本鎖ＤＮＡ分子である。ＣｐＧ ＯＤＮの３つの主要なクラスが、それらの構造的および生物学的特性に基づいて識別されており、クラスＡ、クラスＢ、およびクラスＣと指定される。中央パリンドローム性ＣｐＧ含有ホスホジエステル（ＰＯ）構造の後にホスホロチオエート（ＰＳ）ホモポリマーＧストレッチが続くものを特徴とする、クラスＡオリゴは、インターフェロン－α（ＩＦＮ－α）産生および樹状細胞成熟の強力な誘導因子である。クラスＢオリゴは、対照的に、通常、完全なホスホロチオエート（ＰＳ）骨格を含む。これらのオリゴもまたＩＦＮ－α産生を刺激するが、その程度はより低い。しかしながら、それらは、Ｂ細胞を強力に活性化する。クラスＣオリゴは、クラスＡおよびＢの特性を組み合わせ、完全なＰＳ骨格およびパリンドローム性ＣｐＧ含有モチーフを特徴とする。ＣｐＧ ＯＤＮは、特定の配列コンテキストにおいて１つ以上の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含有し、哺乳類のゲノムにおいてこの構造は稀であることから、これは微生物の侵入の兆候として哺乳類細胞によって容易に認識される。特定の実施形態では、本開示の複合体は、クラスＡ（タイプＤ）、クラスＢ（タイプＫ）、およびクラスＣから選択されるクラスからのＣｐＧ ＯＤＮを含む。
【0021】
いくつかの実施形態では、免疫刺激剤が、１つ以上の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドベースのＴＬＲ９アゴニスト（例えば、ＣｐＧ ＯＤＮ）であるとき、免疫刺激剤は、少なくとも５個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、免疫刺激剤は、２～１００、例えば、約８～約４０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、免疫刺激剤は、１０～３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、免疫刺激剤は、１５～２５個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、免疫刺激剤は、１つ以上のポリＴ配列を含み、かつ／または約２５％を超えるＴヌクレオチド残基を有する、Ｔリッチオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、免疫刺激剤は、ＣＧジヌクレオチドの代わりにＧＴＣトリヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、免疫刺激剤は、１つ以上の修飾シトシンを有する。いくつかの実施形態では、免疫刺激剤は、部分的に一本鎖で、ダンベル型であって、共有結合で閉鎖される、デオキシリボ核酸分子である。いくつかの実施形態では、免疫刺激剤は、以下の構造のうちの１つ以上、すなわち、［ＣＧＮ］ｘ、［ＮａＣＧ］ｘ、［ＮａＣＧＮｂ］ｘ、［ＮａＣＧＴＴＮｂ］ｘ、および［ＮａＣＧＮｂＣＧＮｃ］ｘを含み、ここで、Ｎは任意のヌクレオチド塩基であり、ｘは０～２５であり、ａ、ｂ、およびｃは独立して１～１５である。例えば、［ＮａＣＧＮｂ］ｘ内に該当する配列は、ＡＣＧＴ、ＧＴＣＧＴＴ、ＴＣＧＧＴＴ、ＴＧＡＣＧＴＴ、およびＡＣＧＴＡＣＧＴを含む。
【0022】
ＣｐＧモチーフは、種特異性を示す。例えば、最適なマウスＣｐＧモチーフがＧＡＣＧＴＴである一方で、ヒトの文脈での使用のための最適モチーフはＧＴＣＧＴＴである。クラスＢ ＣｐＧ ＯＤＮである、ＣｐＧ ＯＤＮ １８２６は、明確に定義されたマウスＴＬＲ９アゴニストであり、したがって、げっ歯類モデルで広く使用される。このオリゴは、マウスＢ細胞増殖、抗原提示細胞の成熟、および極性化されたＴｈ１型細胞応答の誘発に効果的である。ＣｐＧ ＯＤＮ １８２６は、２つのＣｐＧジヌクレオチドを含有し、両方とも５’末端に－ＧＡ、３’末端に－ＴＴが隣接している。その骨格は、完全にホスホチオエート化され、細菌またはウイルスゲノムで見出される天然ＰＯ骨格とは対照的に、ヌクレアーゼ耐性を提供する。
【0023】
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドベースのＴＬＲ９アゴニストは、ヒトＣｐＧ ＯＤＮである。そのようなヒトＣｐＧ ＯＤＮは、ＣｐＧモチーフＧＴＣＧＴＴを含み得る。そのようなヒトＣｐＧ ＯＤＮの非限定的な例は、配列ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ（配列番号１）を有する。いくつかの実施形態によれば、オリゴヌクレオチドベースのＴＬＲ９アゴニストは、マウスＣｐＧ ＯＤＮである。そのようなマウスＣｐＧ ＯＤＮは、ＣｐＧモチーフＧＡＣＧＴＴを含み得る。そのようなマウスＣｐＧ ＯＤＮの非限定的な例は、配列ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ（配列番号２）を有する。
【0024】
オリゴヌクレオチドベースの免疫刺激剤は、例えば、ヌクレアーゼ感受性を減少させる、または防ぐために、１つ以上の修飾を含み得る。そのような修飾の例は、天然のホスホジエステルオリゴデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドのポリマーへの修飾を含む。例えば、オリゴヌクレオチドベースの免疫刺激剤は、１つ以上のホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含み得る。ＰＳ結合は、オリゴヌクレオチドのホスフェート骨格内の非架橋酸素に硫黄原子を置換する。ＰＳ修飾は、ヌクレオチド間結合をヌクレアーゼ分解に対してより耐性にする。
【0025】
いくつかの実施形態によれば、免疫刺激剤は、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、またはそれらの両方である。多種多様なＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８アゴニストが、公知である。特定の実施形態では、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８アゴニストは、イミダゾキノリン（ＩＭＺＱ）化合物を含む。イミダゾキノリンは、トール様受容体、特に、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８を通して機能する、強力な免疫刺激剤である。特定の実施形態では、ＩＭＺＱ化合物を含むＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８アゴニストは、Ｔ７８ａであり、その構造は、図２に提供されている。いくつかの実施形態によれば、ＩＭＺＱ化合物を含むＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８アゴニストは、ハイブリッド－２（１－（４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル）－２－メチルプロパン－２－オール）、ＸＧ１－２３６（２－ブチル－２Ｈ－ピラゾロ［３、４－ｃ］キノリン－４－アミン）、ＤＳ８０２（２－ブチル［１、３］オキサゾロ［４、５－ｃ］キノリン－４－アミン）、ＣＬ０７５（２－プロピル［１、３］チアゾロ［４、５－ｃ］キノリン－４－アミン）、ＣＬ０９７（２－（エトキシメチル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－４－アミン）、Ｒ８４８（１－［４－アミノ－２－（エトキシメチル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル］－２－メチルプロパン－２－オール）、メタアミン、またはパラアミンである。例えば、Ｋｕｂｌｉ－Ｇａｒｆｉａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１７）ＰＬｏＳ ＯＮＥ １２（６）：ｅ０１７８８４６、およびＧａｎａｐａｔｈｉ ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＰＬｏＳ ＯＮＥ １０（８）：ｅ０１３４６４０を参照されたい。
【0026】
特定の実施形態では、本開示の複合体は、ノッティンペプチドにコンジュゲートされた２つ以上の免疫刺激剤を含む。例えば、ノッティンペプチドは、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、または１０個以上の免疫刺激剤にコンジュゲートされ得る。ノッティンペプチドが２つ以上の免疫刺激剤にコンジュゲートされるとき、２つ以上の免疫刺激剤のうちの２つは、同じまたは異なり得る。いくつかの実施形態によれば、２つ以上の免疫刺激剤は、独立して、本明細書に説明される免疫刺激剤（例えば、ＴＬＲ９アゴニスト、ＴＬＲ７および／または８アゴニスト、ならびに／もしくは同等物）のいずれかから選択される。
【0027】
いくつかの実施形態によれば、本開示の複合体のノッティンペプチドは、検出可能な標識にさらにコンジュゲートされる。「検出可能な標識」とは、複合体が目的の用途（例えば、インビトロおよび／またはインビボ研究ならびに／もしくは臨床用途）で検出され得るようにノッティンペプチドを標識する薬剤を意味する。目的の検出可能な標識は、蛍光標識（例えば、本明細書の実験の節に説明されるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６８０などのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒフルオロフォア）、放射性同位体、検出可能な生成物を生成する酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼなど）、蛍光タンパク質、常磁性原子、および同等物を含む。特定の態様では、ノッティンペプチドは、検出可能な標識の特異的結合パートナーにコンジュゲートされ、例えば、アビジン／ストレプトアビジンを含む検出可能な標識を介して検出が起こり得るように、ビオチンにコンジュゲートされる。
【0028】
特定の実施形態によれば、検出可能な標識は、近赤外線（ＮＩＲ）光学画像化、単一光子放射型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）／ＣＴ画像化、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、または同等物などのインビボ画像化において使用を見出す。そのような用途で使用を見出す検出可能な標識は、蛍光標識、放射性同位体、および同等物を含むが、これらに限定されない。特定の態様では、検出可能な標識は、２つ以上の画像化手法を使用したインビボ画像化を可能にする、マルチモーダルインビボ画像化剤である（例えば、Ｔｈｏｒｐ－Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ ａｎｄ Ｃｏｏｇａｎ（２０１１）Ｄａｌｔｏｎ Ｔｒａｎｓ．４０：６１２９－６１４３を参照されたい）。
【0029】
特定の実施形態では、検出可能な標識は、近赤外線（ＮＩＲ）画像化用途で使用を見出す、インビボ画像化剤である。そのような薬剤は、Ｋｏｄａｋ Ｘ－ＳＩＧＨＴ色素、Ｐｚ ２４７、ＤｙＬｉｇｈｔ ７５０および８００ Ｆｌｕｏｒｓ、Ｃｙ ５．５および７ Ｆｌｕｏｒｓ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０および７５０ Ｄｙｅｓ、ＩＲＤｙｅ ６８０および８００ＣＷ Ｆｌｕｏｒｓを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態によれば、検出可能な標識は、ＳＰＥＣＴ画像化用途で使用を見出す、インビボ画像化剤であり、その非限定的な例は、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉｎ、２０１Ｔ１、および１３３Ｘｅを含む。特定の実施形態では、検出可能な標識は、例えば１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、６４Ｃｕ、６２Ｃｕ、１２４Ｉ、７６Ｂｒ、８２Ｒｂ、６８Ｇａ、または同等物など、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）画像化用途で使用を見出すインビボ画像化剤である。
【0030】
ノッティンペプチド
本開示の複合体は、細胞表面分子に結合する改変されたループを含む、ノッティンペプチドを含む。本開示の複合体で採用されるノッティンペプチドのタイプは様々であり得る。採用され得るノッティンペプチドの非限定的な例は、ＥＥＴＩ－ＩＩペプチド、ＡｇＲＰペプチド、ω－コノトキシンペプチド、カラタＢ１ペプチド、ＭＣｏＴＩ－ＩＩペプチド、アガトキシンペプチド、およびクロロトキシンペプチドを含む。ノッティンペプチドの三次元構造は、３つのジスルフィド結合の特定の配置によって最小限定義される。この特徴的なトポロジーは、１つのジスルフィド結合が他の２つの鎖内ジスルフィド架橋によって形成されたマクロ環を通過する、分子ノットを形成する。それらの二次構造含量は一般に低いが、ノッティンは、ジスルフィド結合フレームワークによって安定化される小さな三本鎖逆平行βシートが共通している。ノッティンの折り畳みおよび機能的活性は、多くの場合、長さおよびアミノ酸組成の両方が多様であるループ領域によって媒介される。３つのジスルフィド結合が、このペプチドファミリーの折り畳みを定義する最小数であるが、ノッティンは、付加的システイン残基を含有することもでき、それらの構造に４つ以上のジスルフィド結合および付加的拘束ループを伴う分子を生じさせる。「シスチン」という用語は、硫黄基がジスルフィド結合を通して別のアミノ酸に連結されているＣｙｓ残基を指す。「システイン」という用語は、その残基の－ＳＨ（「半シスチン」）形態を指す。結合ループ部分は、該結合ループの一次配列中に他の介在するシスチンが存在しないように、シスチンに隣接し得る。
本開示の複合体は、細胞表面分子に結合する改変されたループを含む、ノッティンペプチドを含む。本開示の複合体で採用されるノッティンペプチドのタイプは様々であり得る。採用され得るノッティンペプチドの非限定的な例は、ＥＥＴＩ－ＩＩペプチド、ＡｇＲＰペプチド、ω－コノトキシンペプチド、カラタＢ１ペプチド、ＭＣｏＴＩ－ＩＩペプチド、アガトキシンペプチド、およびクロロトキシンペプチドを含む。ノッティンペプチドの三次元構造は、３つのジスルフィド結合の特定の配置によって最小限定義される。この特徴的なトポロジーは、１つのジスルフィド結合が他の２つの鎖内ジスルフィド架橋によって形成されたマクロ環を通過する、分子ノットを形成する。それらの二次構造含量は一般に低いが、ノッティンは、ジスルフィド結合フレームワークによって安定化される小さな三本鎖逆平行βシートが共通している。ノッティンの折り畳みおよび機能的活性は、多くの場合、長さおよびアミノ酸組成の両方が多様であるループ領域によって媒介される。３つのジスルフィド結合が、このペプチドファミリーの折り畳みを定義する最小数であるが、ノッティンは、付加的システイン残基を含有することもでき、それらの構造に４つ以上のジスルフィド結合および付加的拘束ループを伴う分子を生じさせる。「シスチン」という用語は、硫黄基がジスルフィド結合を通して別のアミノ酸に連結されているＣｙｓ残基を指す。「システイン」という用語は、その残基の－ＳＨ（「半シスチン」）形態を指す。結合ループ部分は、該結合ループの一次配列中に他の介在するシスチンが存在しないように、シスチンに隣接し得る。
【0031】
ノッティンペプチドは、シスチンノットモチーフを含むと識別された数千のポリペプチドの詳細なアミノ酸配列、構造、分類、および機能情報を含む、オンラインのＫＮＯＴＴＩＮデータベースに記載されているペプチドであり得る。ノッティンは、種々の植物、動物、昆虫、および菌類で見出される。
【0032】
ノッティンペプチドは全長（すなわち、野生型のペプチド／ポリペプチドの長さ）であるか、ノッティンペプチドは野生型のペプチド／ポリペプチドの長さに対して短縮されるか、またはノッティンペプチドは、ペプチドが野生型のペプチド／ポリペプチドの長さに比べてより長くなるように付加的アミノ酸を含み得る。
【0033】
特定の実施形態によれば、本開示のノッティン薬物複合体（ＫＤＣ）は、Ecballium elateriumトリプシン阻害剤ＩＩ（ＥＥＴＩ－ＩＩ）ペプチド、アグーチ関連タンパク質（ＡｇＲＰ）ペプチド、ω－コノトキシンペプチド、カラタＢ１ペプチド、ＭＣｏＴＩ－ＩＩペプチド、アグーチキシンペプチド、またはクロロトキシンペプチドのうちのいずれか１つに基づくノッティンペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ノッティンペプチドは、Ecballium elateriumトリプシン阻害剤ＩＩ（ＥＥＴＩ－ＩＩ）ペプチドに基づく。いくつかの実施形態では、ノッティンペプチドは、アグーチ関連タンパク質（ＡｇＲＰ）ペプチドに基づく。
【0034】
「ＥＥＴＩ」とは、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ Ｅｎｔｒｙ（ＰＤＢ）２ＥＴＩを意味する。ＫＮＯＴＴＩＮデータベース内のそのエントリは、ＥＥＴＩ－ＩＩである。特定の様態では、本開示の複合体のノッティンペプチドは、以下のアミノ酸配列を有するＥＥＴＩ－ＩＩペプチドに基づく。
ＧＣＰＲＩＬＭＲＣＫＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧ（配列番号３）
ＧＣＰＲＩＬＭＲＣＫＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧ（配列番号３）
【0035】
「ＡＧＲＰ」とは、ＰＤＢエントリ１ＨＹＫおよびＫＮＯＴＴＩＮデータベースエントリＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ＡＧＲＰ＿ＨＵＭＡＮを意味する。ＡＧＲＰは、ヒトの脳内のメラノコルチン受容体に結合し、代謝および食欲の調節に関与する、１３２アミノ酸神経ペプチドである。ＡｇＲＰの生物学的活性は、５つのジスルフィド結合を含有するＣ末端システインノットドメインによって仲介されるが、４つのジスルフィド結合のみを含有する完全に活性な３４アミノ酸短縮型ＡｇＲＰが開発されている。特定の様態では、本開示の複合体のノッティンペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する短縮型ＡＧＲＰペプチドに基づく。
ＣＶＲＬＨＥＳＣＬＧＱＱＶＰＣＣＤＰＡＡＴＣＹＣＲＦＦＮＡＦＣＹＣＲ（配列番号４）
ＣＶＲＬＨＥＳＣＬＧＱＱＶＰＣＣＤＰＡＡＴＣＹＣＲＦＦＮＡＦＣＹＣＲ（配列番号４）
【0036】
いくつかの実施形態によれば、本開示の複合体のノッティンペプチドは、以下のアミノ酸配列を有するカラタＢ１ペプチドに基づく。
ＣＧＥＴＣＶＧＧＴＣＮＴＰＧＣＴＣＳＷＰＶＣＴＲＮＧＬＰＶ（配列番号５）
ＣＧＥＴＣＶＧＧＴＣＮＴＰＧＣＴＣＳＷＰＶＣＴＲＮＧＬＰＶ（配列番号５）
【0037】
特定の実施形態では、本開示の複合体のノッティンペプチドは、以下のアミノ酸配列を有するＭＣｏＴＩ－ＩＩペプチドに基づく。
ＳＧＳＤＧＧＶＣＰＫＩＬＫＫＣＲＲＤＳＤＣＰＧＡＣＩＣＲＧＮＧＹＣＧ（配列番号６）
ＳＧＳＤＧＧＶＣＰＫＩＬＫＫＣＲＲＤＳＤＣＰＧＡＣＩＣＲＧＮＧＹＣＧ（配列番号６）
【0038】
特定の実施形態によれば、本開示の複合体のノッティンペプチドは、以下のアミノ酸配列を有するクロロトキシンペプチドに基づく。
ＭＣＭＰＣＦＴＴＤＨＱＭＡＲＫＣＤＤＣＣＧＧＫＧＲＧＫＣＹＧＰＱＣＬＣＲ（配列番号７）
ＭＣＭＰＣＦＴＴＤＨＱＭＡＲＫＣＤＤＣＣＧＧＫＧＲＧＫＣＹＧＰＱＣＬＣＲ（配列番号７）
【0039】
ＥＥＴＩ－ＩＩ、ＡｇＲＰ、ω－コノトキシン、カラタＢ１、ＭＣｏＴＩ－ＩＩ、アガトキシン、クロロトキシン、および本開示の複合体のノッティンペプチドが基づく可能性がある他のノッティンペプチドの配列および構造（例えば、ループ）情報が、ＰＤＢ、ＫＮＯＴＴＩＮデータベース、および他のタンパク質データベースに見出され得る。
【0040】
ノッティンペプチドは、細胞表面分子に結合する、改変されたループを包含し、すなわち、ループは、細胞の表面上の標的分子に結合するように改変される。ノッティンは、ループ領域を逆平行βシートのコアに拘束する、分子「ノット」に織り込まれた３つのジスルフィド結合を含有する。野生型ＥＥＴＩは、例えば、ループ１（トリプシン結合ループ、残基３～８）、ループ２（残基１０～１４）、およびループ３（残基２２～２６）という３つのジスルフィド拘束ループを有する２８個のアミノ酸で構成される。プロテアーゼ阻害剤、毒素、および抗菌剤を含むノッティンファミリーメンバーは、それらのコアシステイン残基を除いて、配列相同性をほとんど共有しない。その結果、それらのジスルフィド拘束ループは多くの配列多様性を許容し、ノッティンを、その三次元折り畳みを廃止することなく、タンパク質に突然変異を導入することを要するタンパク質操作アプリケーションに適したものにする。
【0041】
改変されたループは、ノッティンペプチドの既存のループにおけるアミノ酸置換、挿入、および／もしくは欠失を含み得、または改変されたループは、ノッティンタンパク質に付加されたループであり得る。すなわち、複合体のノッティンペプチドは、野生型ペプチドに存在する１つ以上のループに加えて、ループを含み得る。指向進化と計算共分散分析を組み合わせることにより、ノッティン足場のループ領域に改変（アミノ酸配列およびループ長の両方）を導入するためのガイドラインが解明された。例えば、Ｌａｈｔｉ ｅｔ ａｌ．（２００９）ＰｌｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．５（９）：ｅ１０００４９９を参照されたい。
【0042】
いくつかの実施形態では、ノッティンのループは、がん細胞表面分子に結合するように改変される。「がん細胞」とは、例えば、異常な細胞成長、異常な細胞増殖、密度依存性の成長阻害の損失、足場非依存性の成長能力、免疫無防備状態の非ヒト動物モデルにおける腫瘍成長および／もしくは発生を促進する能力、ならびに／または細胞形質転換の任意の適切な指標のうちの１つ以上を特徴とし得る、新生物細胞表現型を示す細胞を意味する。「がん細胞」は、本明細書において「腫瘍細胞」、「悪性細胞」、または「がん性細胞」と互換的に使用され得、固形腫瘍、半固形腫瘍、液性腫瘍、原発腫瘍、転移性腫瘍、および同等物のがん細胞を包含する。そのような改変されたループは、ノッティンペプチドに、野生型ペプチドには存在しないがん細胞表面分子認識特性を与える。特定の態様では、がんは、１つ以上の腫瘍抗原を有することが知られているがんである。ノッティンの改変されたループが結合し得る、腫瘍抗原の非限定的な例は、５Ｔ４、ＡＸＬ受容体チロシンキナーゼ（ＡＸＬ）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ｃ－ＭＥＴ、Ｃ４．４ａ、炭酸アンヒドラーゼ６（ＣＡ６）、炭酸アンヒドラーゼ９（ＣＡ９）、カドヘリン－６、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、がん胚性抗原（ＣＥＡ）、ｃＫｉｔ、Ｃｒｉｐｔｏタンパク質、ＣＳ１、デルタ様カノニカルノッチリガンド３（ＤＬＬ３）、エンドセリン受容体タイプＢ（ＥＤＮＲＢ）、エフリンＡ４（ＥＦＮＡ４）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ３（ＥＮＰＰ３）、ＥＰＨ受容体Ａ２（ＥＰＨＡ２）、線維芽細胞成長因子受容体２（ＦＧＦＲ２）、線維芽細胞成長因子受容体３（ＦＧＦＲ３）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）、糖タンパク質非転移性Ｂ（ＧＰＮＭＢ）、グアニル酸シクラーゼ２Ｃ（ＧＵＣＹ２Ｃ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、ヒト上皮成長因子受容体３（ＨＥＲ３）、インテグリンアルファ、リソソーム関連膜タンパク質１（ＬＡＭＰ－１）、ルイスＹ、ＬＩＶ－１、１５含有ロイシンリッチ反復（ＬＲＲＣ１５）、メソセリン（ＭＳＬＮ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、ムチン１６（ＭＵＣ１６）、ナトリウム依存性リン酸輸送タンパク質２Ｂ（ＮａＰｉ２ｂ）、ネクチン－４、ＮＭＢ、ＮＯＴＣＨ３、ｐ－カドヘリン（ｐ－ＣＡＤ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、プロテインチロシンキナーゼ７（ＰＴＫ７）、溶質担体ファミリー４４メンバー４（ＳＬＣ４４Ａ４）、ＳＬＩＴ様ファミリーメンバー６（ＳＬＩＴＲＫ６）、ＳＴＥＡＰファミリーメンバー１（ＳＴＥＡＰ１）、組織因子（ＴＦ）、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンタンパク質－１（ＴＩＭ－１）、ならびに栄養芽細胞表面抗原（ＴＲＯＰ－２）を含む。
【0043】
いくつかの実施形態によれば、ノッティンの改変されたループが結合する細胞表面分子は、受容体、例えば、細胞接着受容体、可溶性因子の受容体（例えば、成長因子、ケモカイン、または他の可溶性因子の受容体）、免疫細胞受容体、または同等物である。いくつかの実施形態によれば、ノッティンの改変されたループが結合する細胞表面分子は、細胞接着受容体、例えば、がん細胞の表面上に発現される、腫瘍血管系細胞の表面上に発現される、および／または同等物である、細胞接着受容体（例えば、インテグリン）である。特定の実施形態では、受容体が細胞接着受容体であるとき、受容体は、インテグリンである。例えば、本開示の複合体は、αｖβ１インテグリン、αｖβ３インテグリン、αｖβ５インテグリン、αｖβ６インテグリン、α５β１インテグリン、またはそれらの任意の組み合わせのいずれか１つに結合するように改変されたループを有する、ノッティンペプチドを含み得る。特定の実施形態によれば、改変されたループは、αｖβ１インテグリン、αｖβ３インテグリン、αｖβ５インテグリン、αｖβ６インテグリン、およびα５β１インテグリンのそれぞれに結合する。
【0044】
本開示の複合体で採用され得る、αｖβ１インテグリン、αｖβ３インテグリン、αｖβ５インテグリン、αｖβ６インテグリン、およびα５β１インテグリンのそれぞれに結合する、改変された結合ループを有するＥＥＴＩベースのノッティンペプチド（ＥＥＴＩ－２．５Ｄと指定）は、以下のアミノ酸配列を有する（インテグリン結合ループに下線が引かれている）。
ＧＣＰＱＧＲＧＤＷＡＰＴＳＣＫＱＤＳＤＣＲＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧ（配列番号８）
ＧＣＰＱＧＲＧＤＷＡＰＴＳＣＫＱＤＳＤＣＲＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧ（配列番号８）
【0045】
本開示の複合体で採用され得る、αｖβ１インテグリン、αｖβ３インテグリン、αｖβ５インテグリン、αｖβ６インテグリン、およびα５β１インテグリンのそれぞれに結合する、改変された結合ループを有するＥＥＴＩベースのノッティンペプチド（ＥＥＴＩ－２．５Ｆと指定）は、以下のアミノ酸配列を有する（インテグリン結合ループに下線が引かれている）。
ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＳＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧ（配列番号９）
ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＳＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧ（配列番号９）
【0046】
本開示の複合体で採用され得る、αｖβ１インテグリン、αｖβ３インテグリン、αｖβ５インテグリン、αｖβ６インテグリン、およびα５β１インテグリンのそれぞれに結合する、改変された結合ループを有するＥＥＴＩベースのノッティンペプチド（３ＣＭと指定）は、Ｚ＝５－アジド－Ｌ－ノルバリンである、以下のアミノ酸配列を有する（インテグリン結合ループに下線が引かれている）。
ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＺＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＹＣＧ（配列番号１０）
ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＺＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＹＣＧ（配列番号１０）
【0047】
いくつかの実施形態では、本開示の複合体のノッティンペプチドは、表１に記載されるようなインテグリン結合ＥＥＴＩベースのノッティンペプチドである。
【表1】
【0048】
いくつかの実施形態では、本開示の複合体のノッティンペプチドは、表２に記載されるようなインテグリン結合ＡｇＲＰベースのノッティンペプチドである。
【表2】
【0049】
いくつかの実施形態によれば、本開示の複合体のノッティンペプチドは、プロテアーゼに結合する改変されたループを含む。プロテアーゼの非限定的な例は、膜プロテアーゼ、例えば、マトリプターゼを含む。
【0050】
いくつかの実施形態では、ノッティンペプチドは、１つ以上の非天然アミノ酸を含む。そのような１つ以上の非天然アミノ酸は、例えば、薬物のノッティンペプチドへの結合を促進するために使用され得る。例えば、本開示の複合体を調製するために使用を見出す非天然アミノ酸は、アジド、アルキン、アルケン、アミノオキシ、ヒドラジン、アルデヒド、ニトロン、ニトリルオキシド、シクロプロペン、ノルボルネン、イソシアニド、ハロゲン化アリール、およびボロン酸官能基から選択される官能基を有するものを含む。本開示のノッティン薬物複合体のノッティンペプチドに組み込まれ得る非天然アミノ酸であって、目的の官能基を提供するために選択され得る、非天然アミノ酸が、公知であり、例えば、Ｍａｚａ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．２６（９）：１８８４－９、Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．９：５９２－６０５、Ａｄｕｍｅａｕ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｍｏｌ．Ｉｍａｇｉｎｇ Ｂｉｏｌ．（２）：１５３－６５、および他の場所に記載されている。特定の実施形態では、ノッティンペプチドは、１つ以上の５－アジド－Ｌ－ノルバリン残基またはその誘導体、例えば、官能化された免疫刺激剤に該残基をコンジュゲートする際に産生される誘導体を含む。
【0051】
本開示の複合体は、例えば上記の表１または表２に提供されるノッティンペプチド配列のいずれかなど、本明細書に記載されるノッティンペプチドのアミノ酸配列に対して７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、または１００％の同一性を有するノッティンペプチドを含み得る。
【0052】
いくつかの実施形態によれば、本開示の複合体のノッティンペプチドは、１つ以上の異種ポリペプチドに融合される。ノッティンペプチドは、異種ポリペプチドに直接融合され得る。特定の実施形態では、ノッティンペプチドは、リンカーを介して異種ポリペプチドに直接融合される。採用され得るリンカーの非限定的な例は、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）３（配列番号４４）を含むセリン－グリシンリンカーなどのセリン－グリシンリンカーである。目的の異種ポリペプチドは、Ｆｃドメイン（例えば、ヒトまたはマウスＦｃドメイン）、アルブミン、トランスフェリン、ＸＴＥＮ、ホモアミノ酸ポリマー、プロリン－アラニン－セリンポリマー、エラスチン様ペプチド、またはそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、異種ポリペプチドは、異種ポリペプチドに融合されていない同じノッティンペプチドと比較して、必要とする個体へのその投与の際にノッティンペプチドの安定性および／または血清半減期を増加させる。特定の実施形態では、ヒトＦｃドメイン（例えば、全長ヒトＦｃドメインまたはその断片）に融合された本開示のノッティンペプチドのいずれかを含む、融合タンパク質が提供される。本開示のいくつかの実施形態による、Ｆｃドメインに融合され免疫刺激剤にコンジュゲートされたノッティンペプチドを含む複合体の概略図が、図１に概略的に図示されている。いくつかの実施形態によれば、そのような融合タンパク質は、例えば、本開示の方法に従ってそれを必要とする個体（例えばがんを有する個体）に投与すことにおいて使用を見出す。本開示の複合体のノッティンペプチドに融合され得るヒトＦｃドメインの非限定的な例は、以下の表３に記載される配列（配列番号４５）を有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインまたはその断片である。
【表3】
【0053】
いくつかの実施形態では、ノッティンペプチドが１つ以上の異種ポリペプチドに融合される場合、ノッティンペプチドは、インビボで検出可能な異種ポリペプチドに融合される。インビボで検出可能なポリペプチドの非限定的な例は、生物発光レポーターを含む。特定の実施形態では、生物発光レポーターは、ルシフェラーゼ、例えば、ナノルシフェラーゼである。
【0054】
細胞表面分子に結合する改変されたループを有するノッティンペプチドが開発される様式は、変化し得る。合理的かつコンビナトリアルな手法が、新しい分子認識特性を有するノッティンを設計するために使用されている。例えば、ノッティンタンパク質のライブラリーが作成され、例えば、細菌ディスプレイ、ファージディスプレイ、酵母表面ディスプレイ、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、および／または任意の他の好適なスクリーニング方法によってスクリーニングされ得る。
【0055】
酵母表面ディスプレイは、新規の分子認識特性、増加した標的結合親和性、適切な折り畳み、および改善された安定性を伴うタンパク質を作製するために使用されてきた強力なコンビナトリアル技術である。このプラットフォームでは、所望の生化学的および生物物理学的特性を伴う変異体を単離するために、タンパク質バリアントのライブラリーが高スループット様式で生成およびスクリーニングされる。酵母表面ディスプレイは、改変された分子認識を伴うノッティンを作製するための成功したコンビナトリアル方法であることが証明されている。酵母表面ディスプレイは、真核生物分泌経路、シャペロンの補助による折り畳み、および効率的なジスルフィド結合形成の品質管理機構から利益を得る。
【0056】
目的の細胞表面分子に結合する、改変されたループを有するノッティンペプチドを開発するための１つの例示的な手法は、２つのジスルフィド結合によって酵母細胞壁タンパク質Ａｇａ１ｐに付着される酵母接合アグルチニンタンパク質Ａｇａ２ｐに該ペプチドを遺伝子的に融合させることを伴う。このＡｇａ２ｐ融合構築物、および染色体に組み込まれたＡｇａ１ｐ発現カセットは、ガラクトース誘導性プロモーター等の好適なプロモーターの制御下で発現され得る。ＮまたはＣ末端エピトープタグが、蛍光標識された一次または二次抗体を使用するフローサイトメトリーによって細胞表面発現レベルを測定するために含まれ得る。この構築物は、ノッティン（または操作される他のタンパク質）のＮ末端がＡｇａ２に融合される、最も広く使用されているディスプレイフォーマットを表すが、酵母表面ディスプレイプラスミドのいくつかの代替変形例が記述されており、本開示の複合体で使用するためのノッティンペプチドを開発するために採用され得る。ファージまたはｍＲＮＡディスプレイで使用されるパニングに基づく方法に勝る、このスクリーニングプラットフォームの利点の１つは、２色ＦＡＣＳを使用して、所望の標的に対する結合親和性がわずか２倍程しか異ならないクローンを定量的に判別し得ることである。
【0057】
ＤＮＡレベルでノッティンループ領域を選択的に変異させるために、例えば、重複伸長ＰＣＲを使用したオリゴヌクレオチドアセンブリによって縮重コドンが導入されることができる。次に、酵母における相同組換えのために酵母ディスプレイベクターと十分に重複する隣接プライマーを使用して遺伝物質が増幅され得る。このアセンブリーおよび増幅の方法により、ノッティンライブラリーを比較的低いコストおよび労力で作成することができる。ライブラリー組成に対する明確な制御を可能にする、合成オリゴヌクレオチドライブラリーおよび最新の方法が開発されている。
【0058】
特定の態様では、ディスプレイライブラリー（例えば、酵母ディスプレイライブラリー）が、ＦＡＣＳによって目的の細胞表面分子への結合についてスクリーニングされる。ＦＡＣＳによってノッティンライブラリーをスクリーニングするとき、一般的に４～７ラウンドのソーティングで、結合剤の富化されたプールが出現する。ライブラリースクリーニングのために２色ＦＡＣＳが使用されてもよく、その場合一方の蛍光標識はｃ－ｍｙｃエピトープタグを検出するために使用され、他方の蛍光標識は目的の結合標的に対するノッティン変異体の相互作用を測定するために使用されることができる。単一細胞分解能で２つの蛍光体の励起および発光特性を測定するために、異なる機器レーザーおよび／またはフィルターセットが使用され得る。これにより、結合によって酵母の発現レベルを正規化することが可能になる。すなわち、低い酵母発現を示すが高量の標的に結合するノッティンを、高レベルで発現されるが標的に弱く結合するノッティンから区別することができる。したがって、結合対発現の二次元フローサイトメトリープロットでは、対角線上に標的抗原に結合する酵母細胞の集団が現れる。高親和性結合剤は、ライブラリー選別ゲートを使用して単離されることができる。代替的に、最初の選別ラウンドにおいて、全長タンパク質を発現しない望ましくないクローンをライブラリーから除去することが有用であり得る。スクリーニングで使用される標的は、最終的なアプリケーションに構造的および機能的に関連しており、例えば、目的の細胞表面分子を模倣するものである。
【0059】
目的の細胞表面分子に対する結合剤についてノッティンライブラリーを濃縮することに続いて、酵母プラスミドが回収され、配列決定される。増加された選別ストリンジェンシーの下で、さらなるラウンドのＦＡＣＳが実施され得る。次いで、個々の酵母に提示されたノッティンクローンの結合親和性または動的解離速度が測定され得る。
【0060】
目的の細胞表面分子に結合する、改変されたループを有するノッティンペプチドが表面ディスプレイ（例えば、酵母表面ディスプレイ）によって識別されると、改変されたノッティンは、適切な方法を使用して産生され得る。ノッティンはサイズが小さいため、化学合成および組換え発現の両方による産生が可能となる。特定の実施形態によれば、ノッティンペプチドは、固相ペプチド合成とそれに続くインビトロ折り畳みによって産生され得る。化学合成により、非天然アミノ酸または他の化学的ハンドルをノッティンペプチドに容易に組み込むことができる。
【0061】
大きな異種ドメインに融合されていないノッティンペプチドは、自動シンセサイザー上で固相ペプチド化学を使用して容易に合成される。例えば、標準的な９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）ベースの固相ペプチド化学が利用され得る。線状ペプチドは、次いで、システイン側鎖チオールの酸化を促進してジスルフィド結合を形成する条件下で折り畳まれ、続いて、例えば、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）によって精製され得る。
【0062】
特定の様態では、ノッティンペプチドまたはそれを含む融合タンパク質は、組換えＤＮＡ手法を使用して産生される。種々の宿主細胞型において組換え法を使用してノッティンペプチドを産生するための任意の適切な方策が利用され得る。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズム空間における折り畳みを促進して有用な精製ハンドルとしての役割を果たす、バルナーゼを遺伝子融合パートナーとして用いて機能的ノッティンが産生された。特定の実施形態によれば、改変されたノッティンペプチドは、酵母で発現される。例えば、酵母菌株Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓが、２～１０ｍｇ／Ｌの精製された改変ノッティンを産生するために成功裏に利用された。酵母発現構築物は、１つ以上のタグ（例えば金属キレートクロマトグラフィー（Ｎｉ－ＮＴＡ）による精製のための、例えば、Ｃ末端ヘキサヒスタジンタグ）をコードしてもよい。次いで、凝集物、誤って折り畳まれた多量体等を除去するためにサイズ排除クロマトグラフィーが使用され得る。
【0063】
本開示の態様は、本開示の複合体で採用されるノッティンペプチドおよび融合タンパク質をコードする核酸を含む。すなわち、目的の細胞表面分子に結合する改変されたループを有する、本明細書に記載されるノッティンペプチドおよび融合タンパク質のいずれかをコードする核酸が提供される。特定の態様では、そのような核酸は、発現ベクター中に存在する。発現ベクターは、ノッティンペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含み、プロモーターは、ノッティンペプチドを発現するために選択された宿主細胞のタイプに基づいて選択される。本開示のノッティンペプチドをコードする核酸のいずれかを含む宿主細胞、ならびにそれを含む任意の発現ベクターも提供される。
【0064】
直接結合または競合結合アッセイを使用して、細胞（例えば、哺乳動物がん細胞等のがん細胞）の表面上に発現される分子に対するノッティンの親和性を測定するための方法が利用可能である。直接結合アッセイでは、平衡結合定数（ＫＤ）は、フルオロフォアもしくは放射性同位体にコンジュゲートされたノッティン、または標識抗体による検出のためのＮ末端もしくはＣ末端エピトープタグを含有するノッティンを使用して、測定され得る。標識またはタグが実行可能でないまたは望ましくない場合には、競合結合アッセイが、標識競合物の最大シグナルの５０％が検出可能な非標識ノッティンの量である最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）を決定するために使用されることができる。次いで、測定されたＩＣ５０値からＫＤ値を計算することができる。リガンドの枯渇は、高親和性相互作用因子を低濃度範囲で測定する場合により顕著になり、実験に添加される細胞の数を減少させることによって、または結合反応体積を増加させることによって、回避または最小限化することができる。
【0065】
特定の様態では、ノッティンペプチドは、約０．０１ｎＭ～１００ｎＭ、例えば約０．０２５ｎＭ～７５ｎＭ、約０．０５ｎＭ～５０ｎｍ、約０．０７５ｎＭ～２５ｎＭ、または約０．１ｎＭ～１０ｎＭの、細胞表面分子に対する平衡結合定数（ＫＤ）を有する。いくつかの実施形態では、ノッティンペプチドは、約０．１ｎＭ～１０ｎＭの、細胞表面分子に対する平衡結合定数（ＫＤ）を有する。いくつかの実施形態では、ノッティンペプチドは、約０．１ｎＭの、細胞表面分子に対する平衡結合定数（ＫＤ）を有する。いくつかの実施形態では、ノッティンペプチドは、約０．５ｎＭの、細胞表面分子に対する平衡結合定数（ＫＤ）を有する。いくつかの実施形態では、ノッティンペプチドは、約１ｎＭの、細胞表面分子に対する平衡結合定数（ＫＤ）を有する。いくつかの実施形態では、ノッティンペプチドは、約５ｎＭの、細胞表面分子に対する平衡結合定数（ＫＤ）を有する。いくつかの実施形態では、ノッティンペプチドは、約１０ｎＭの、細胞表面分子に対する平衡結合定数（ＫＤ）を有する。
【0066】
ノッティンライブラリーの構築およびスクリーニングを含む、酵母表面ディスプレイ技術によるノッティンの操作、ならびに化学合成および組換え発現によるノッティン産生、さらに直接結合または競合結合アッセイを用いた細胞表面発現分子（例えば受容体）に対するノッティンの親和性を測定する細胞結合アッセイのための詳細なガイダンスおよび具体的なプロトコルが、Ｍｏｏｒｅ，Ｓ． ａｎｄ Ｃｏｃｈｒａｎ，Ｊ．（２０１２）Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｋｎｏｔｔｉｎｓ ａｓ Ｎｏｖｅｌ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｇｅｎｔｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，５０３，２２３－２５１に記載されている。
【0067】
リンカー
本開示の免疫刺激剤は、種々の適切なリンカーを介してノッティンペプチドにコンジュゲートされ得る。本開示の複合体で使用を見出すリンカーには、エステルリンカー、アミドリンカー、マレイミドまたはマレイミドベースのリンカー、バリン－シトルリンリンカー、ヒドラゾンリンカー、Ｎ－スクシンイミジル－４－（２－ピリジルジチオ）ブチレート（ＳＰＤＢ）リンカー、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）リンカー、ビニルスルホンベースのリンカー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むリンカー（テトラエチレングリコールなどであるがこれらに限定されない）、プロパン酸を含むリンカー、カプロレイン酸を含むリンカー、およびそれらの任意の組み合わせを含む、リンカーが含まれる。
本開示の免疫刺激剤は、種々の適切なリンカーを介してノッティンペプチドにコンジュゲートされ得る。本開示の複合体で使用を見出すリンカーには、エステルリンカー、アミドリンカー、マレイミドまたはマレイミドベースのリンカー、バリン－シトルリンリンカー、ヒドラゾンリンカー、Ｎ－スクシンイミジル－４－（２－ピリジルジチオ）ブチレート（ＳＰＤＢ）リンカー、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）リンカー、ビニルスルホンベースのリンカー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むリンカー（テトラエチレングリコールなどであるがこれらに限定されない）、プロパン酸を含むリンカー、カプロレイン酸を含むリンカー、およびそれらの任意の組み合わせを含む、リンカーが含まれる。
【0068】
特定の態様では、リンカーは、化学的に不安定なリンカーであり、例えば中性ｐＨ（血流ｐＨ７．３～７．５）で安定であるが標的細胞（例えば、がん細胞）の弱酸性エンドソーム（ｐＨ５．０～６．５）およびリソソーム（ｐＨ４．５～５．０）への内部移行の際に加水分解を受ける、酸切断性リンカーなどである。化学的に不安定なリンカーには、ヒドラゾン系リンカー、オキシム系リンカー、カーボネート系リンカー、エステル系リンカーなどが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態によれば、リンカーは酵素不安定性リンカーであり、例えば、血流中で安定であるが、標的細胞への内部移行の際に、例えば標的細胞（例えばがん細胞）のリソソーム内のリソソームプロテアーゼ（カテプシンまたはプラスミンなど）によって酵素的切断を受ける酵素不安定性リンカーである。酵素不安定性リンカーには、ペプチド結合を含むリンカー、例えば、バリン－シトルリンリンカー（例えばマレイミドカプロイル－バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジル（ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ）リンカー）、バリル－アラニル－パラ－アミノベンジルオキシ（Ｖａｌ－Ａｌａ－ＰＡＢ）リンカー、および同等物などのジペプチドベースのリンカーが含まれるが、これらに限定されない。化学的に不安定なリンカー、酵素不安定性リンカー、および切断不可能なリンカーは、公知であり、例えば、Ｄｕｃｒｙ＆Ｓｔｕｍｐ （２０１０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２１：５－１３に詳細に記載されている。
【0069】
特定の実施形態では、本開示の複合体は、本開示で後述する複合体を作製する方法および実験のセクションならびに図面に記載される、リンカーを介してノッティンペプチドにコンジュゲートされた免疫刺激剤を含む。
【0070】
複合体を作製する方法
複合体を作製する方法も提供される。いくつかの実施形態によれば、ノッティン－免疫刺激剤複合体を作製する方法であって、リンカーを介して免疫刺激剤をノッティンペプチドにコンジュゲートすることを含む、方法が提供される。特定の実施形態では、コンジュゲートすることは、免疫刺激剤を官能化することと、官能化された免疫刺激剤をノッティンペプチドにコンジュゲートすることとを含む。いくつかの実施形態によれば、ノッティンペプチドおよび／または免疫刺激剤は、本明細書の先行部分および下記の実験セクションに記載されているノッティンペプチドおよび／または免疫刺激剤のいずれかから選択される。
複合体を作製する方法も提供される。いくつかの実施形態によれば、ノッティン－免疫刺激剤複合体を作製する方法であって、リンカーを介して免疫刺激剤をノッティンペプチドにコンジュゲートすることを含む、方法が提供される。特定の実施形態では、コンジュゲートすることは、免疫刺激剤を官能化することと、官能化された免疫刺激剤をノッティンペプチドにコンジュゲートすることとを含む。いくつかの実施形態によれば、ノッティンペプチドおよび／または免疫刺激剤は、本明細書の先行部分および下記の実験セクションに記載されているノッティンペプチドおよび／または免疫刺激剤のいずれかから選択される。
【0071】
いくつかの実施形態によれば、免疫刺激剤は、一級アミンを含み、免疫刺激剤を官能化することは、一級アミンをアミン反応性リンカーと反応させることを含む。種々のアミン反応性リンカーが、ノッティン－免疫刺激剤複合体を作製する方法を実践するときに採用され得る。１つの非限定的な例によれば、アミン反応性リンカーは、アミン反応性ＮＨＳエステルリンカーである。特定の実施形態では、アミン反応性リンカーが採用される場合において、アミン反応性リンカーは、ビシクロ［６．１．０］ノニン（ＢＣＮ）、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）、およびアジド部分から選択される部分（moiety）を含む。アミン反応性リンカーがそのような部分を含むとき、官能化された免疫刺激剤をノッティンペプチドにコンジュゲートすることは、アミン反応性リンカーの当該部分をノッティンペプチドの部分と反応させることを含み得る。いくつかの実施形態によれば、ノッティンペプチドは、ノッティンペプチドの上記部分を含む非天然アミノ酸を含む。例えば、非天然アミノ酸は、アジド部分を提供し得る。１つの非限定的な例では、アジド部分は、１つ以上の５－アジド－Ｌ－ノルバリンをノッティンペプチドの所望の位置に組み込むことによって提供される。特定の実施形態では、官能化された免疫刺激剤が反応されるノッティンペプチドの部分は、Ｎ末端アミン基である。
【0072】
いくつかの実施形態では、本開示のノッティン－免疫刺激剤複合体は、図２～４、８および９に図示される手法のいずれかに従って、かつ／または以下の実験の節に記載されるように作製される。
【0073】
図２は、免疫刺激剤を官能化するための例示的な方策を提供する。（Ａ）コンジュゲート化に利用可能な一級アミンを伴う免疫刺激剤は、（Ｂ）クリックケミストリーハンドル（例えば、ＢＣＮ、ＤＢＣＯ、アジド）を有するアミン反応性ＮＨＳエステルリンカーと反応され、（Ｃ）クリックケミストリーハンドル（例えば、ＢＣＮ、ＤＢＣＯ、アジド）を有する官能化された免疫刺激剤をもたらし得、これは、免疫刺激剤を腫瘍標的化剤にコンジュゲートするために使用される（図４に記載）。
【0074】
図３は、ノッティンペプチドの例示的な配列および図解を提供する。（Ａ）インテグリン結合ループ（ＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴ）およびシステインノット足場のジスルフィド結合が示されたノッティンペプチド２．５Ｆおよび３ＣＭの配列。（Ｂ）Ｎ末端アミン基が示されている２．５ＦおよびＸ１位置に５－アジド－Ｌ－ノルバリンが示された３ＣＭのノッティンペプチド構造の図解。ノッティンペプチド２．５ＦはＮ末端アミン基においてコンジュゲートされることができる一方で、３ＣＭは、Ｘ１アジド部位（この目的のために組み込まれた非天然アミノ酸）においてコンジュゲートされることができる。３ＣＭはまた、免疫刺激剤またはフルオロフォアなどのプローブと反応され得る、利用可能なＮ末端アミン基も有する（図９参照）。さらに、２．５ＦのＸ２位置におけるフェニルアラニンは、ＵＶ吸収による濃度測定を促進するように、３ＣＭにおいてチロシンに置き換えられ得る。Ｘ２におけるどちらのアミノ酸も結合親和性を損なうことなく使用され得る。
【0075】
図４に示されているものは、官能化された免疫刺激剤にノッティンペプチドをコンジュゲートするための例示的な方策である。（Ａ）３ＣＭのＸ１アジドは、ひずみ促進アジド－アルキン付加環化（ＳＰＡＡＣ）を使用して、ＢＣＮまたはＤＢＣＯで官能化された免疫刺激剤（例えば、本明細書では図面、その説明、および実験のセクションにおいて「ＣｐＧ」と称されることもある、１つ以上のＣｐＧジヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドベースのＴＬＲ ９アゴニスト（例えば、ＣｐＧ ＯＤＮ）、またはＴ７８ａ）と反応され得る。（Ｂ）２．５ＦのＮ末端アミンは、Ｎ末端アジドを組み込むように、アジド－ＰＥＧ４－ＮＨＳエステルリンカーを使用して修飾され得る。Ｎ末端アジドは、ＳＰＡＡＣを使用して、ＢＣＮまたはＤＢＣＯ官能化免疫刺激剤と反応され得る。
【0076】
図８（上）は、本開示の実施形態によるノッティン－免疫刺激剤複合体（この例ではノッティン－Ｆｃ－Ｔ７８ａ）を作製する方法を概略的に図示する。示されるように、ノッティン－Ｆｃ（ＫＦｃ）をＴ７８ａにコンジュゲートしてＫＦｃ－Ｔ７８ａを産生するために、ＢＣＮ修飾ＫＦｃとアジド－Ｔ７８ａが利用された。
【0077】
図９（上）は、ノッティンが検出可能な標識にさらにコンジュゲートされる、ノッティン－免疫刺激剤複合体を作製する方法を概略的に図示する。この例では、検出可能な標識は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６８０である。３ＣＭ－ＣｐＧ－ＡＦ６８０を合成するためのこの例示的手法によれば、３ＣＭは、Ｎ末端においてＡＦ６８０－ＮＨＳエステル（フルオロフォア）で修飾され、Ｘ１アジドにおいてＤＢＣＯ－ＣｐＧで修飾された。
【0078】
組成物
上記に要約されたように、本開示は、組成物を提供する。組成物は、上記の複合体のセクション（ここに組み込まれるが、簡潔にするためにここでは繰り返さない）に記載された複合体を含め、本開示の複合体のいずれかを含み得る。
上記に要約されたように、本開示は、組成物を提供する。組成物は、上記の複合体のセクション（ここに組み込まれるが、簡潔にするためにここでは繰り返さない）に記載された複合体を含め、本開示の複合体のいずれかを含み得る。
【0079】
特定の態様では、組成物は、液体媒体中に存在する本開示の複合体を含む。液体媒体は、水、緩衝溶液、および同等物等の水性液体媒体であり得る。塩（例えば、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４）、緩衝剤（トリス緩衝剤、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－（２－エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳ）、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ－トリス［ヒドロキシメチル］メチル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）等）、プロテアーゼ阻害剤、グリセロール、および同等物などの１つ以上の添加剤が、そのような組成物中に存在し得る。
【0080】
医薬組成物もまた、提供される。医薬組成物は、本開示の複合体のいずれか、および薬学的に許容される担体を含む。医薬組成物は、一般に、治療有効量の複合体を含む。「治療有効量」とは、所望の結果を生じるために十分な投与量、例えば、改変されたループが結合するところの細胞表面分子に関連する細胞増殖性障害（例えば、がん）を有する個体における細胞増殖の減少などの、有益なまたは所望の治療的（予防を含む）結果をもたらすために十分な量を意味する。有効量は、１回または複数回の投与で投与され得る。
【0081】
本開示の複合体は、治療用投与のための種々の製剤に組み込まれることができる。より具体的には、複合体は、適切な薬学的に許容される賦形剤または希釈剤との組み合わせによって、医薬組成物に製剤化されることができ、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏、溶液、注射液、吸入剤、およびエアロゾルなどの固体、半固体、液体またはガス状形態の製剤に製剤化され得る。
【0082】
個体への投与に好適な（例えば、ヒト投与に好適な）本開示の複合体の製剤は、一般に無菌であり、さらに、選択される投与経路に従って個体に投与するためには禁忌である検出可能な発熱物質または他の混入物質を含まない状態であり得る。
【0083】
医薬剤形において、複合体は、単独で、または他の薬学的に活性な化合物との適切な会合や組み合わせで投与されることができる。以下の方法および賦形剤は単なる例であり、決して限定するものではない。
【0084】
経口製剤の場合、複合体は、例えば、ラクトース、マンニトール、トウモロコシデンプンまたはジャガイモデンプンなどの従来の添加剤、結晶セルロース、セルロース誘導体、アラビアゴム、コーンスターチ、またはゼラチンなどの結合剤、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、またはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどの崩壊剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、所望される場合、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、防腐剤、および香味剤を用いて、錠剤、散剤、顆粒剤、またはカプセル剤を製造するために、単独で、または適切な添加剤と組み合わせて、使用されることができる。
【0085】
複合体は、植物油もしくは他の類似の油、合成脂肪酸グリセリド、高次脂肪酸のエステル、またはプロピレングリコール等の水性もしくは非水性溶媒に溶解、懸濁、または乳化することによって、また、所望される場合、可溶化剤、等張剤、懸濁化剤、乳化剤、安定剤、および防腐剤等の従来の添加剤を用いて、注射用製剤に製剤化されることができる。
【0086】
医薬組成物は、液体形態、凍結乾燥形態、または凍結乾燥形態から再構成された液体形態であってもよく、凍結乾燥調製物は、投与前に滅菌溶液で再構成されるべきである。凍結乾燥組成物を再構成するための標準的な手順は、一定量の純水（典型的には、凍結乾燥中に除去された体積と等量である）を加え戻すことであるが、抗菌剤を含む溶液が、非経口投与用の医薬組成物の産生のために使用されてもよい。
【0087】
複合体の水性製剤は、例えば、約４．５～約７．５などの約４．０～約８．０、例えば、約５．０～約７．０の範囲のｐＨ緩衝溶液中で調製され得る。この範囲内のｐＨに好適である緩衝液の例には、リン酸、ヒスチジ、クエン酸、コハク酸、酢酸、および他の有機酸緩衝液が含まれる。緩衝液の濃度は、例えば、緩衝液および製剤の所望の張性に応じて、約１ｍＭ～約１００ｍＭ、または約５ｍＭ～約５０ｍＭであり得る。
【0088】
キット
本開示の態様は、キットをさらに含む。いくつかの実施形態では、主題キットは、本開示の複合体のいずれか（ここ組み込まれるが簡潔性のためにここでは繰り返さない、上記の複合体のセクションに記載された複合体のいずれかを含む）またはそれを含む医薬組成物、およびそれを必要とする個体に医薬組成物を投与するための説明書を含む。特定の実施形態では、複合体は、がん細胞表面分子および／または腫瘍血管系細胞の表面上の分子に結合する、改変されたループ（例えば、本明細書の他の場所に記載される、腫瘍抗原、細胞接着受容体（例えば、インテグリン）等に結合する、改変されたループ）を含む、ノッティンペプチドを含み、説明書は、がんを有する個体に医薬組成物を投与し、がんを治療するためのものである。
本開示の態様は、キットをさらに含む。いくつかの実施形態では、主題キットは、本開示の複合体のいずれか（ここ組み込まれるが簡潔性のためにここでは繰り返さない、上記の複合体のセクションに記載された複合体のいずれかを含む）またはそれを含む医薬組成物、およびそれを必要とする個体に医薬組成物を投与するための説明書を含む。特定の実施形態では、複合体は、がん細胞表面分子および／または腫瘍血管系細胞の表面上の分子に結合する、改変されたループ（例えば、本明細書の他の場所に記載される、腫瘍抗原、細胞接着受容体（例えば、インテグリン）等に結合する、改変されたループ）を含む、ノッティンペプチドを含み、説明書は、がんを有する個体に医薬組成物を投与し、がんを治療するためのものである。
【0089】
いくつかの実施形態では、複合体または医薬組成物は、１つまたは複数（例えば、２つ以上）の単位投与量で存在する。「単位投与量」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒトおよび動物対象のための単一の投与量として適切な物理的に別個の単位を指し、各単位は、所望の効果を生じるために十分な量で計算された所定量の複合体または組成物を含有する。単位投与量の量は、採用される特定の複合体、達成されるべき効果、および個体における複合体と関連付けられる薬力学などの様々な要因に依存する。さらに他の実施形態では、キットは、複合体または医薬組成物の単一の複数回投与量を含み得る。
【0090】
キットの構成要素は、別々の容器内に存在し得、または複数の構成要素が単一の容器内に存在し得る。
【0091】
キットに含まれる説明書は、適切な記録媒体上に記録され得る。例えば、説明書は、紙またはプラスチックなどの基材上に印刷され得る。したがって、説明書は、添付文書としてキット内に、またはキットの容器もしくはその構成要素のラベル内などに（すなわち、包装または副包装に付随して）存在し得る。他の実施形態では、説明書は、適切なコンピュータ可読記憶媒体、例えば、ポータブルフラッシュドライブ、ＤＶＤ、ＣＤ－ＲＯＭ、ディスケットなどに存在する、電子記憶データファイルとして存在する。さらに他の実施形態では、キット中には実際の説明書は存在しないが、例えば、インターネットを介してリモートソースから説明書を取得するための手段が提供される。この実施形態の一例は、説明書が閲覧され得る、かつ／または説明書がダウンロードされ得る、ウェブアドレスを含むキットである。説明書と同様に、説明書を取得するための手段は、好適な基材上に記録される。
【0092】
使用方法
上記に要約されたように、本開示の複合体を使用する方法も提供される。いくつかの実施形態では、当該方法は、ここに組み込まれるが簡潔にするためにここでは繰り返さない、上記の複合体のセクションに記載された複合体のいずれかを使用することを含む。
上記に要約されたように、本開示の複合体を使用する方法も提供される。いくつかの実施形態では、当該方法は、ここに組み込まれるが簡潔にするためにここでは繰り返さない、上記の複合体のセクションに記載された複合体のいずれかを使用することを含む。
【0093】
いくつかの実施形態では、治療有効量の本開示の複合体のいずれかまたは本開示の医薬組成物のいずれかを、それを必要とする個体に投与することを含む、方法が提供される。特定の実施形態では、個体は、がんを有し、複合体のノッティンペプチドは、個体に存在するがん細胞および／または腫瘍血管系細胞上の細胞表面分子に結合する、改変されたループを含み、複合体を含む医薬組成物は、がんを治療するために有効な量で個体に投与される。したがって、本開示の態様は、がんを有する個体に、治療有効量の本開示の複合体のいずれかまたは医薬組成物のいずれかを投与することによって、がんを治療する方法を含む。
【0094】
種々の個体が、主題の方法に従って治療可能である。一般に、そのような個体は、「哺乳動物」または「哺乳類」であり、これらの用語は、肉食動物（例えば、イヌおよびネコ）、げっ歯類（例えば、マウス、モルモット、およびラット）、ならびに霊長類（例えば、ヒト、チンパンジー、およびサル）を含む哺乳動物のクラス内にある生物を記述するために広く使用される。いくつかの実施形態では、個体は、ヒトである。いくつかの実施形態では、個体は、マウスモデルなどの動物モデルである。
【0095】
いくつかの実施形態では、有効量の複合体（または同複合体を含む医薬組成物）は、単独で（例えば、単剤療法において）、または１つ以上の付加的な治療薬剤と組み合わせて（例えば、併用療法において）、１回以上の用量で投与されたときに、複合体または医薬組成物を用いた治療が存在しない状態での個体における症状と比較して、個体の病状（例えば、がんなど）の症状を、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％またはそれ以上低減させるために有効な量である。
【0096】
いくつかの実施形態では、個体は、がんを有し、本開示の方法は、個体のがんを治療する際に使用を見出す。特定の実施形態では、個体は、固形腫瘍、半固形腫瘍、原発腫瘍、転移性腫瘍、液性腫瘍（例えば、白血病、リンパ腫等）、および／または同等物の存在によって特徴付けられる、がんを有する。いくつかの実施態様では、個体は、膠芽腫、神経芽細胞腫、頭頸部がん、胃がん、卵巣がん、皮膚がん（例えば、基底細胞がん、メラノーマ、または同等物）、肺がん、結腸直腸がん、前立腺がん、神経膠腫、膀胱がん、子宮内膜がん、腎臓がん、白血病（例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ））、肝臓がん（例えば、原発性または再発性ＨＣＣなどの肝細胞がん（ＨＣＣ））、非ホジキンリンパ腫、膵臓がん、甲状腺がん、Ｂ細胞悪性腫瘍、それらの任意の組み合わせ、およびそれらの任意の亜型から選択される、がんを有する。特定の実施形態によれば、個体は、腫瘍性および／または悪性細胞の存在によって特徴付けられる状態を有する。
【0097】
「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、個体の病状（例えば、細胞増殖性障害、例えば、がん）と関連付けられる症状の少なくとも改善を意味し、改善は、治療されている病状と関連付けられるパラメータ、例えば、症状の大きさの少なくとも低減を指すために広義に使用される。したがって、治療はまた、個体が、病状または少なくとも病状を特徴付ける症状にそれ以上苦しむことがないように、病状（例えば、がん）または少なくともそれと関連付けられる症状が、完全に阻害された、例えば、発生することを防止された、または停止された、例えば、中止された状況も含む。
【0098】
複合体または医薬組成物は、インビボおよびエクスビボでの方法、ならびに全身および局所的投与経路を含む、薬物送達に好適な任意の利用可能な方法および経路を使用して、個体に投与され得る。従来の医薬的に許容される投与経路には、鼻腔内、筋肉内、気管内、皮下、皮内、局所適用、眼内、静脈内、動脈内、経鼻、経口、および他の経腸ならびに非経口投与経路が含まれる。いくつかの態様では、投与は、非経口投与によるものである。投与経路は、複合体および／または所望の効果に応じて、望ましい場合は組み合わせられ、または調節され得る。複合体または医薬組成物は、単回用量または複数回用量で投与され得る。いくつかの実施形態では、複合体または医薬組成物は、静脈内投与される。いくつかの実施形態では、複合体または医薬組成物は、例えば、全身送達（例えば、静脈内注入）のために、または局所部位に、例えば、腫瘍内注射、腫瘍周囲注射、および／または同等物によって投与される。
【0099】
いくつかの実施形態では、個体は、固形腫瘍を有する。いくつかの実施形態では、個体が固形腫瘍を有する場合において、方法は、本開示のノッティン－免疫刺激剤複合体を個体に投与することを含む。本明細書に実証されるように、そのような複合体は、全身投与に続いて固形腫瘍に局在化する、予想外の能力を示し、対応する非コンジュゲート免疫刺激剤よりも実質的に高い治療有効性を達成する。いくつかの実施形態によれば、個体は、固形腫瘍を有し、投与は、全身投与によるものであり、固形腫瘍の免疫細胞微小環境は、免疫刺激剤のみが個体に全身投与されるときの腫瘍の免疫細胞微小環境と比較して、増加した割合のＣＤ８＋Ｔ細胞、増加した割合のＣＤ４＋Ｔ細胞、増加した割合のＢ細胞、および／または減少した割合の骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）の１つまたは任意の組み合わせを特徴とする。いくつかの実施形態によれば、個体は、固形腫瘍を有し、投与は、全身投与によるものであり、ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合、ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合、Ｂ細胞の割合、および／また骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）の割合のうちの１つまたは任意の組み合わせによって評価される固形腫瘍の免疫細胞微小環境は、免疫刺激剤のみが個体に腫瘍内投与されるときの腫瘍の免疫細胞微小環境と比較して、統計学的に有意に異ならない。
【0100】
いくつかの実施形態では、個体は、その治療が血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することを複合体に要求する、がんを有する。そのようながんの非限定的な例は、脳腫瘍、例えば、膠芽腫または同等物である。いくつかの実施形態では、個体が、その治療がＢＢＢを通過することを複合体に要求するがんを有する場合において、方法は、本開示のノッティン－薬物複合体などの低分子量複合体を個体に投与することを含む。
【0101】
以下の実施例は、限定ではなく、例示として提供される。
【実施例】
【0102】
実験
実施例１―異なる部位に組み込まれたＣｐＧを伴うノッティン－ＣｐＧ複合体
この実施例では、異なる部位に組み込まれた免疫刺激剤を用いて、ノッティンペプチド－免疫刺激剤複合体が調製された。この特定の実施例は、異なる部位に組み込まれたＣｐＧ ＯＤＮ（本明細書および図面では「ＣｐＧ」と称される）にコンジュゲートされたノッティンペプチド２．５Ｆおよび３ＣＭを含む。図５の左側のパネルには、アミノ－ＣｐＧ、３ＣＭ－ＣｐＧ（Ｘ１アジド）、および２．５Ｆ－ＣｐＧ（Ｎ末端アジド）についてのＲＡＷ－Ｂｌｕｅ ＮＦ－κＢ活性化アッセイの結果が示される。ＢＣＮ－ＣｐＧが、括弧内に示される部位でコンジュゲートされた。図５の右側のパネルには、３ＣＭ、３ＣＭ－ＣｐＧ（Ｘ１アジド）、および２．５Ｆ－ＣｐＧ（Ｎ末端アジド）を比較する競合結合アッセイの結果が示される。
実施例１―異なる部位に組み込まれたＣｐＧを伴うノッティン－ＣｐＧ複合体
この実施例では、異なる部位に組み込まれた免疫刺激剤を用いて、ノッティンペプチド－免疫刺激剤複合体が調製された。この特定の実施例は、異なる部位に組み込まれたＣｐＧ ＯＤＮ（本明細書および図面では「ＣｐＧ」と称される）にコンジュゲートされたノッティンペプチド２．５Ｆおよび３ＣＭを含む。図５の左側のパネルには、アミノ－ＣｐＧ、３ＣＭ－ＣｐＧ（Ｘ１アジド）、および２．５Ｆ－ＣｐＧ（Ｎ末端アジド）についてのＲＡＷ－Ｂｌｕｅ ＮＦ－κＢ活性化アッセイの結果が示される。ＢＣＮ－ＣｐＧが、括弧内に示される部位でコンジュゲートされた。図５の右側のパネルには、３ＣＭ、３ＣＭ－ＣｐＧ（Ｘ１アジド）、および２．５Ｆ－ＣｐＧ（Ｎ末端アジド）を比較する競合結合アッセイの結果が示される。
【0103】
ノッティン－ＣｐＧ複合体は（いずれかのコンジュゲーション部位においても）アミノ－ＣｐＧ（陽性対照）と比較して同様のＮＦ－κＢ活性化プロファイルを示し、また、未修飾３ＣＭ（陽性対照）と比較して同様の結合プロファイルを示した。したがって、どちらのコンジュゲーション部位（Ｘ１アジドまたはＮ末端アジド）も、ＴＬＲアゴニスト活性または結合親和性に悪影響を与えることなく、ノッティン－ＣｐＧ複合体を合成するために使用されることができる。アミノ－ＣｐＧは、未修飾ＣｐＧと同じＮＦ－κＢ活性化プロファイルを示した（データは示していない）。
【0104】
実施例２―異なるリンカーを伴って合成されたノッティン－ＣｐＧ複合体
この実施例では、異なるリンカーを使用してノッティンペプチド－免疫刺激剤複合体が調製された。この特定の実施例は、異なるリンカーを使用してＣｐＧにコンジュゲートされたノッティンペプチド３ＣＭが関わる。図６の左側のパネルには、アミノ－ＣｐＧ、３ＣＭ－ＣｐＧ（ＤＢＣＯ）、および３ＣＭ－ＣｐＧ（ＢＣＮ）についてのＲＡＷ－Ｂｌｕｅ ＮＦ－κＢ活性化アッセイの結果が示される。両方の複合体について、ＣｐＧは３ＣＭ上のＸ１アジドにコンジュゲートされた。図６の右側のパネルには、３ＣＭ、３ＣＭ－ＣｐＧ（ＤＢＣＯ）、および３ＣＭ－ＣｐＧ（ＢＣＮ）を比較した競合結合アッセイの結果が示される。
この実施例では、異なるリンカーを使用してノッティンペプチド－免疫刺激剤複合体が調製された。この特定の実施例は、異なるリンカーを使用してＣｐＧにコンジュゲートされたノッティンペプチド３ＣＭが関わる。図６の左側のパネルには、アミノ－ＣｐＧ、３ＣＭ－ＣｐＧ（ＤＢＣＯ）、および３ＣＭ－ＣｐＧ（ＢＣＮ）についてのＲＡＷ－Ｂｌｕｅ ＮＦ－κＢ活性化アッセイの結果が示される。両方の複合体について、ＣｐＧは３ＣＭ上のＸ１アジドにコンジュゲートされた。図６の右側のパネルには、３ＣＭ、３ＣＭ－ＣｐＧ（ＤＢＣＯ）、および３ＣＭ－ＣｐＧ（ＢＣＮ）を比較した競合結合アッセイの結果が示される。
【0105】
ノッティン－ＣｐＧ複合体は（いずれかのリンカーを伴ってもアミノ－ＣｐＧ（陽性対照）と比較して同様のＮＦ－κＢ活性化プロファイルを示し、また、未修飾３ＣＭ（陽性対照）と比較して同様の結合プロファイルを示した。したがって、どちらののリンカー方策（ＤＢＣＯまたはＢＣＮ）も、ＴＬＲアゴニスト活性または結合親和性に悪影響を与えることなく、ノッティン－ＣｐＧ複合体を合成するために使用されることができる。
【0106】
実施例３―ノッティン－ＴＬＲ７／８アゴニスト（Ｔ７８ａ）複合体
この実施例では、ノッティンペプチド－免疫刺激剤が調製され試験されたが、ここでノッティンペプチドは３ＣＭであり、免疫刺激剤はＴＬＲ７／８アゴニストＴ７８ａであった。図７の左側のパネルには、３ＣＭ、Ｔ７８ａ、および３ＣＭ－Ｔ７８ａについてのＲＡＷ－Ｂｌｕｅ ＮＦ－κＢ活性化アッセイの結果が示される。図７の右側のパネルには、３ＣＭおよび３ＣＭ－Ｔ７８ａを比較する競合結合アッセイの結果が示される。
この実施例では、ノッティンペプチド－免疫刺激剤が調製され試験されたが、ここでノッティンペプチドは３ＣＭであり、免疫刺激剤はＴＬＲ７／８アゴニストＴ７８ａであった。図７の左側のパネルには、３ＣＭ、Ｔ７８ａ、および３ＣＭ－Ｔ７８ａについてのＲＡＷ－Ｂｌｕｅ ＮＦ－κＢ活性化アッセイの結果が示される。図７の右側のパネルには、３ＣＭおよび３ＣＭ－Ｔ７８ａを比較する競合結合アッセイの結果が示される。
【0107】
ＴＬＲ７／８アゴニスト（Ｔ７８ａ）が、試験された高濃度（５００～５，０００ｎＭ）でのみＮＦ－κＢを活性化した一方で、３ＣＭ－Ｔ７８ａ複合体は、より低い濃度で活性化を誘発した（５０～５，０００ｎＭ）。さらに、３ＣＭ－Ｔ７８ａは、非コンジュゲート化３ＣＭと同様の結合プロファイルを示し、したがって、インテグリンに対する高い親和性を保持した。
【0108】
実施例４―ノッティン－Ｆｃ免疫刺激剤複合体
この実施例では、Ｆｃドメインに融合され免疫刺激剤にコンジュゲートされたノッティンペプチドを含む複合体が、合成され試験された。図８（上）は、複合体（この例では、ノッティン－Ｆｃ－Ｔ７８ａ）を作製する方法を概略的に図示する。示されるように、ノッティン－Ｆｃ（ＫＦｃ）をＴ７８ａにコンジュゲートしてＫＦｃ－Ｔ７８ａを産生するために、ＢＣＮ修飾ＫＦｃおよびアジド－Ｔ７８ａが採用された。図８（下のパネル）は、ＫＦｃ、Ｔ７８ａ、およびＫＦｃ－Ｔ７８ａ複合体についてのＲＡＷ－Ｂｌｕｅ ＮＦ－κＢ活性化アッセイの結果を示す。
この実施例では、Ｆｃドメインに融合され免疫刺激剤にコンジュゲートされたノッティンペプチドを含む複合体が、合成され試験された。図８（上）は、複合体（この例では、ノッティン－Ｆｃ－Ｔ７８ａ）を作製する方法を概略的に図示する。示されるように、ノッティン－Ｆｃ（ＫＦｃ）をＴ７８ａにコンジュゲートしてＫＦｃ－Ｔ７８ａを産生するために、ＢＣＮ修飾ＫＦｃおよびアジド－Ｔ７８ａが採用された。図８（下のパネル）は、ＫＦｃ、Ｔ７８ａ、およびＫＦｃ－Ｔ７８ａ複合体についてのＲＡＷ－Ｂｌｕｅ ＮＦ－κＢ活性化アッセイの結果を示す。
【0109】
ＫＦｃ－Ｔ７８ａのＮＦ－κＢ活性化は、試験された各濃度でＫＦｃまたはＴ７８ａよりも有意に高い（ｐ＜０．０００１）。合成については、ＫＦｃがアジド－ＮＨＳエステルリンカーで修飾されてＢＣＮ－Ｔ７８ａ（またはＢＣＮ－ＣｐＧ）にコンジュゲートされるように、ＢＣＮ基とアジド基は交換され得る。ＤＢＣＯがＢＣＮに代用されることもできる。
【0110】
実施例５―検出可能に標識されたノッティン－免疫刺激剤複合体
この実施例では、免疫刺激剤および検出可能標識（ここでは、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６８０）にコンジュゲートされたノッティンペプチドを含む複合体が、合成され試験された。図９（上）は、この実施例で採用された手法を概略的に図示する。３ＣＭ－ＣｐＧ－ＡＦ６８０を合成するために、３ＣＭは、Ｎ末端においてＡＦ６８０－ＮＨＳエステル（フルオロフォア）で修飾され、Ｘ１アジドにおいてＤＢＣＯ－ＣｐＧで修飾された。図９（下）は、３ＣＭと比較した３ＣＭ－ＣｐＧ－ＡＦ６８０についての競合結合アッセイの結果を示す。
この実施例では、免疫刺激剤および検出可能標識（ここでは、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６８０）にコンジュゲートされたノッティンペプチドを含む複合体が、合成され試験された。図９（上）は、この実施例で採用された手法を概略的に図示する。３ＣＭ－ＣｐＧ－ＡＦ６８０を合成するために、３ＣＭは、Ｎ末端においてＡＦ６８０－ＮＨＳエステル（フルオロフォア）で修飾され、Ｘ１アジドにおいてＤＢＣＯ－ＣｐＧで修飾された。図９（下）は、３ＣＭと比較した３ＣＭ－ＣｐＧ－ＡＦ６８０についての競合結合アッセイの結果を示す。
【0111】
３ＣＭ－ＣｐＧ－ＡＦ６８０の結合親和性は、３ＣＭと有意に異ならない（対応のないスチューデントのｔ検定によって決定）。データは、３回の独立した実験の平均（±標準偏差、ＳＤ）を表す。
【0112】
実施例６―非侵襲的インビボおよびエクスビボ蛍光画像化
この実施例では、腫瘍内および腫瘍周囲に注射された３ＣＭ－ＣｐＧ－ＡＦ６８０複合体の非侵襲的インビボ蛍光画像化が実施された。結果が、図１０に示される。左右の肩に２つのＣＴ２６結腸がん腫瘍を有するマウスの、腫瘍内に（ＩＴ、左腫瘍内に）または腫瘍周囲に（ＰＴ、左腫瘍に隣接して）、示された用量で３ＣＭ－ＣｐＧ－ＡＦ６８０を注射した。「用量」は、腫瘍内ＣｐＧ療法のための典型的な用量（等モル）＝５．２ｎｍｏｌ（５０μｇ）である。画像の左側に時間数で示される時間は、注射後の時間数である。３ＣＭ－ＣｐＧ－ＡＦ６８０複合体は、ＩＴまたはＰＴ注射に続いて、４時間または２６時間の後、非注射腫瘍部位には局在しなかった。
この実施例では、腫瘍内および腫瘍周囲に注射された３ＣＭ－ＣｐＧ－ＡＦ６８０複合体の非侵襲的インビボ蛍光画像化が実施された。結果が、図１０に示される。左右の肩に２つのＣＴ２６結腸がん腫瘍を有するマウスの、腫瘍内に（ＩＴ、左腫瘍内に）または腫瘍周囲に（ＰＴ、左腫瘍に隣接して）、示された用量で３ＣＭ－ＣｐＧ－ＡＦ６８０を注射した。「用量」は、腫瘍内ＣｐＧ療法のための典型的な用量（等モル）＝５．２ｎｍｏｌ（５０μｇ）である。画像の左側に時間数で示される時間は、注射後の時間数である。３ＣＭ－ＣｐＧ－ＡＦ６８０複合体は、ＩＴまたはＰＴ注射に続いて、４時間または２６時間の後、非注射腫瘍部位には局在しなかった。
【0113】
この実施例ではまた、静脈内注射された３ＣＭ－ＣｐＧ－ＡＦ６８０複合体の非侵襲的インビボ蛍光画像化が実施された。結果が、図１１に示される。左右の肩に２つのＣＴ２６結腸がん腫瘍を有するマウスに、示された用量で３ＣＭ－ＣｐＧ－ＡＦ６８０を静脈内に（ＩＶ、尾静脈）注射した。「用量」は、腫瘍内ＣｐＧ療法ためのの典型的な用量（等モル）＝５．２ｎｍｏｌ（５０μｇ）である。画像の左側に時間数で示される時間は、注射後の時間数である。３ＣＭ－ＣｐＧ－ＡＦ６８０（４×用量）は、ＩＶ注射後４時間以内に両方の腫瘍に局在し、２４時間以上腫瘍部位内に保持される。より低い用量もまた、腫瘍への局在化をもたらし得るが、インビボ蛍光画像化によって測定可能ではない。
【0114】
腫瘍は、２６時間後に切除され、２×用量および４×用量（図１２参照）を注射されたマウスからのエクスビボでの腫瘍蛍光が観察された。結果が、図１２に示される。左右の肩に２つのＣＴ２６結腸がん腫瘍を有するマウスの、腫瘍内に（ＩＴ、左腫瘍内に）、腫瘍周囲に（ＰＴ、左腫瘍に隣接して）、または静脈内に（ＩＶ、尾静脈に）、示された用量で３ＣＭ－ＣｐＧ－ＡＦ６８０を注射した。「用量」は、腫瘍内ＣｐＧ療法のための典型的な用量（等モル）＝５．２ｎｍｏｌ（５０ｕｇ）である。腫瘍は、注射後２６時間で画像化のために切除された。エクスビボ画像は、インビボ画像化からの観察を支持している。Ａ）３ＣＭ－ＣｐＧ－ＡＦ６８０は、ＩＴまたはＰＴ注射に続いて、２６時間の後、注射されていない腫瘍（右腫瘍）には局在しない。
Ｂ）ＰＴで送達された３ＣＭ－ＣｐＧ－ＡＦ６８０は、注射後２６時間で腫瘍取り込みをもたらし、複合体は腫瘍周囲注射部位に（腫瘍を囲む領域内に）も存在し得る。Ｃ）ＩＶで送達された３ＣＭ－ＣｐＧ－ＡＦ６８０（４×用量）は、注射後２６時間で両方の腫瘍に局在する。局在化は、３ＣＭ－ＣｐＧ－ＡＦ６８０（２×用量）をＩＶ送達された１つの腫瘍でも観察された。
Ｂ）ＰＴで送達された３ＣＭ－ＣｐＧ－ＡＦ６８０は、注射後２６時間で腫瘍取り込みをもたらし、複合体は腫瘍周囲注射部位に（腫瘍を囲む領域内に）も存在し得る。Ｃ）ＩＶで送達された３ＣＭ－ＣｐＧ－ＡＦ６８０（４×用量）は、注射後２６時間で両方の腫瘍に局在する。局在化は、３ＣＭ－ＣｐＧ－ＡＦ６８０（２×用量）をＩＶ送達された１つの腫瘍でも観察された。
【0115】
実施例７―腫瘍成長によって示されるノッティン－免疫刺激剤複合体の治療有効性
この実施例では、例示的ノッティン－免疫刺激剤複合体の治療有効性が評価された。原理の証明として、３ＣＭ－ＣｐＧ複合体がこの実施例で採用された。侵襲性４Ｔ１乳がんマウスモデルが使用された。４Ｔ１－Ｌｕｃ乳がん（ｎ＝９～１０）における３ＣＭ－ＣｐＧの治療有効性を実証する生存曲線が、図１３に示される。３用量の静脈内ノッティン－ＣｐＧを受けた、確立された腫瘍有するマウスは、３用量の静脈内未修飾ＣｐＧまたはビヒクル対照で処置されたマウスと比較して、有意に延長された生存を有した。
この実施例では、例示的ノッティン－免疫刺激剤複合体の治療有効性が評価された。原理の証明として、３ＣＭ－ＣｐＧ複合体がこの実施例で採用された。侵襲性４Ｔ１乳がんマウスモデルが使用された。４Ｔ１－Ｌｕｃ乳がん（ｎ＝９～１０）における３ＣＭ－ＣｐＧの治療有効性を実証する生存曲線が、図１３に示される。３用量の静脈内ノッティン－ＣｐＧを受けた、確立された腫瘍有するマウスは、３用量の静脈内未修飾ＣｐＧまたはビヒクル対照で処置されたマウスと比較して、有意に延長された生存を有した。
【0116】
さらに、ノッティン－ＣｐＧ処置は、９匹中６匹のマウスで完全な腫瘍退縮を誘発し、残りの３匹は、ビヒクル処置マウスと比較して、腫瘍成長の遅延を示した。完全な腫瘍退縮を示したマウスでは、マウスの５０％（６匹中３匹）が、腫瘍退縮に続いて数ヶ月間、腫瘍再発の兆候を伴わずに治癒された。代替の全身単剤療法を用いて４Ｔ１モデルにおいて治癒を達成することは前例がないため、これらの結果は、重要かつ予想外である。
【0117】
また、接種後１４１日目に、生存マウスが、元の接種に使用された数の２倍の細胞を使用して、反対側の腹部の皮下に４Ｔ１－ｌｕｃ腫瘍細胞を再注射された、再負荷実験も実施された。ナイーブマウスもまた、同数の腫瘍細胞を注射された。接種後１６日で、上記生存マウスのいずれも腫瘍を有していなかった一方、すべてのナイーブマウスが腫瘍を確立していた。
【0118】
図１４には、経時的な４Ｔ１－Ｌｕｃ平均腫瘍成長が示される。（ビヒクル群からの）最初のマウスが安楽死させられたときまでの平均腫瘍体積が各群についてプロットされている。矢印は、３用量を受けた群についての処置日（７、９、１１）を示し、１用量群については第７日のみであった。データは、平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝９～１０）。
【0119】
図１５には、個々の４Ｔ１－Ｌｕｃ腫瘍成長曲線が示される。再発を伴わない完全応答（ＣＲ）を実証する各群からのマウス（「長期生存者」）の割合および再発を伴うＣＲを示すマウスの割合が、個々のプロット上に示される。ＣＲは、腫瘍の完全な退縮として定義される。再発を伴うＣＲは、腫瘍退縮後のある時点での再成長が後に続く、腫瘍の完全な退縮として定義される。
【0120】
実施例８―ノッティン－免疫刺激剤複合体による腫瘍免疫微小環境の転換
この実施例では、静脈内投与された例示的なノッティン－免疫刺激剤複合体の治療有効性の機構が、腫瘍浸潤性免疫細胞についてアッセイを行うことによって評価された。ノッティン－免疫刺激剤複合体の開発の背後にある１つの動機は、腫瘍部位への標的化送達を伴う全身注射を可能にすることであった。ノッティン－免疫刺激剤が腫瘍部位に到達して免疫応答を刺激する場合、この抗腫瘍免疫応答を促進するために、腫瘍内の免疫細胞プロファイルが変化するであろうと予期される（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加）。原理の証明として、３ＣＭ－ＣｐＧ複合体がこの実施例で採用された。免疫細胞プロファイルの所望の変化の陽性対照として、腫瘍に直接注射され（したがって腫瘍部位に到達し）免疫応答を局所的に刺激することが知られる、腫瘍内ＣｐＧで処置されたマウスの群が含められた。
この実施例では、静脈内投与された例示的なノッティン－免疫刺激剤複合体の治療有効性の機構が、腫瘍浸潤性免疫細胞についてアッセイを行うことによって評価された。ノッティン－免疫刺激剤複合体の開発の背後にある１つの動機は、腫瘍部位への標的化送達を伴う全身注射を可能にすることであった。ノッティン－免疫刺激剤が腫瘍部位に到達して免疫応答を刺激する場合、この抗腫瘍免疫応答を促進するために、腫瘍内の免疫細胞プロファイルが変化するであろうと予期される（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加）。原理の証明として、３ＣＭ－ＣｐＧ複合体がこの実施例で採用された。免疫細胞プロファイルの所望の変化の陽性対照として、腫瘍に直接注射され（したがって腫瘍部位に到達し）免疫応答を局所的に刺激することが知られる、腫瘍内ＣｐＧで処置されたマウスの群が含められた。
【0121】
４Ｔ１－ｌｕｃ細胞が、ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹部の片側に皮下移植され、９日間成長させられた。腫瘍が発達すると、マウスは、概略図（図１６、左上）に従って、以下の群（ｎ＝群あたり３匹のマウス）について静脈内（ＩＶ）または腫瘍内（ＩＴ）注射で２回処置された：ビヒクルＩＶ、ＣｐＧ ＩＶ（１８．２ｎｍｏｌ）、３ＣＭ－ＣｐＧ ＩＶ（１８．２ｎｍｏｌ）、およびＣｐＧ ＩＴ（５．２ｎｍｏｌ、典型的なＩＴ用量）。処置後３日目に、腫瘍は、切除され、ＦＡＣＳを介して腫瘍浸潤免疫細胞について分析された。図１６には、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）、およびＮＫ細胞を含む、異なる免疫集団の存在量のプロットが（生存単一細胞全体の％として）示される。テューキーの多重比較検定とともに一元配置分散分析を使用して統計学的分析が実施された。各群が、すべての他の群と比較された。統計学的に有意であった群比較は、右側にアスタリスクが付いた、２つの群の間に引かれた黒い線でマークされ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１である。すべての他のマークされていない群比較は、有意差がなかった。図１７には、各処置群の免疫細胞集団および２つの非特性化細胞集団（「その他」）の平均存在量（生存単一細胞全体の％）を要約する円グラフが示される。腫瘍細胞、間質細胞、およびこの分析で定義されていない他の免疫細胞を含み得る、非特性化細胞は、それらのＣＤ１１ｂ発現を示すために２つの集団に分けられた。
【0122】
これらの結果は、３ＣＭ－ＣｐＧ ＩＶが、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＢ細胞の割合の増加、ならびに骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）の減少によって示されるように、ビヒクルＩＶおよびＣｐＧ ＩＶ処置と比較して、腫瘍免疫の様相を有意に転換することを実証する。さらに、３ＣＭ－ＣｐＧ ＩＶによる免疫細胞プロファイルのこの劇的な変化は、ＣｐＧ ＩＴを用いた処置から観察された変化と区別できなかった。これらの結果は、ノッティン－免疫刺激剤複合体の全身注射が、あたかも免疫刺激剤がその腫瘍部位に直接注射されたかのように、免疫細胞集団を誘発させ得ることを実証する。
【0123】
材料および方法
細胞株およびマウス
Ｂ１６Ｆ１０メラノーマおよびＣＴ２６結腸がん株はＡＴＣＣから取得され、４Ｔ１－Ｌｕｃ乳がん細胞株は贈与として取得された。腫瘍細胞は、１０％ウシ胎児血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有する完全培地（４Ｔ１－ＬｕｃおよびＣＴ２６については、５０μＭの２－メルカプトエタノールを伴うＲＰＭＩ １６４０、Ｂ１６－Ｆ１０についてはＤＭＥＭ）内で培養された。細胞株はマイコプラズマ汚染について定期的に検査された。６～８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入された。
細胞株およびマウス
Ｂ１６Ｆ１０メラノーマおよびＣＴ２６結腸がん株はＡＴＣＣから取得され、４Ｔ１－Ｌｕｃ乳がん細胞株は贈与として取得された。腫瘍細胞は、１０％ウシ胎児血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有する完全培地（４Ｔ１－ＬｕｃおよびＣＴ２６については、５０μＭの２－メルカプトエタノールを伴うＲＰＭＩ １６４０、Ｂ１６－Ｆ１０についてはＤＭＥＭ）内で培養された。細胞株はマイコプラズマ汚染について定期的に検査された。６～８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入された。
【0124】
ＮＦ－κＢ活性化アッセイ
アゴニストの効力は、マウスＲＡＷ ２６４．７マクロファージに由来するＲＡＷ－Ｂｌｕｅレポーター細胞株（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を使用して評価された。ＴＬＲアゴニストを用いたレポーター細胞株の刺激は、ＮＦ－κＢおよびＡＰ－１の活性化、ならびに後続の分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の産生につながる、シグナル伝達経路を誘導する。ＲＡＷ－Ｂｌｕｅ細胞は、様々な濃度のＴＬＲアゴニスト（遊離または複合体化）とともに２４時間インキュベートされた。上清中のＳＥＡＰのレベルは、製造元のプロトコル（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）に従ってＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ検出培地を使用した比色分析によって定量化された。データは、未処置対照と比較して、ＮＦ－κＢ活性の倍数変化として報告される。エラーバーは、３回実施された実験の標準偏差を表す。処置条件と未処置対照との間の統計学的差異は、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用した通常の二元配置分散分析およびＴｕｋｅｙの多重比較検定によって決定された。統計学的有意性については、未処置対照と比較して、＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１、および＊＊＊＊ｐ≦０．０００１である。
アゴニストの効力は、マウスＲＡＷ ２６４．７マクロファージに由来するＲＡＷ－Ｂｌｕｅレポーター細胞株（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を使用して評価された。ＴＬＲアゴニストを用いたレポーター細胞株の刺激は、ＮＦ－κＢおよびＡＰ－１の活性化、ならびに後続の分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の産生につながる、シグナル伝達経路を誘導する。ＲＡＷ－Ｂｌｕｅ細胞は、様々な濃度のＴＬＲアゴニスト（遊離または複合体化）とともに２４時間インキュベートされた。上清中のＳＥＡＰのレベルは、製造元のプロトコル（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）に従ってＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ検出培地を使用した比色分析によって定量化された。データは、未処置対照と比較して、ＮＦ－κＢ活性の倍数変化として報告される。エラーバーは、３回実施された実験の標準偏差を表す。処置条件と未処置対照との間の統計学的差異は、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用した通常の二元配置分散分析およびＴｕｋｅｙの多重比較検定によって決定された。統計学的有意性については、未処置対照と比較して、＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１、および＊＊＊＊ｐ≦０．０００１である。
【0125】
競合結合アッセイ
非標識ノッティンおよびノッティン－ＴＬＲアゴニスト複合体の相対的結合親和性を比較するために、細胞ベースの競合結合アッセイが、いくつかの修正を伴ってＣｏｘ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ．５５（３４）：９８９４－７に以前に記載されたように実施された。非標識リガンド（すなわち、非蛍光３ＣＭ－免疫刺激剤複合体）の結合親和性を比較するために、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８標識３ＣＭ（３ＣＭ－ＡＦ４８８）が競合剤として使用された。
非標識ノッティンおよびノッティン－ＴＬＲアゴニスト複合体の相対的結合親和性を比較するために、細胞ベースの競合結合アッセイが、いくつかの修正を伴ってＣｏｘ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ．５５（３４）：９８９４－７に以前に記載されたように実施された。非標識リガンド（すなわち、非蛍光３ＣＭ－免疫刺激剤複合体）の結合親和性を比較するために、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８標識３ＣＭ（３ＣＭ－ＡＦ４８８）が競合剤として使用された。
【0126】
Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞（サンプルあたり５×１０４）が、細胞解離緩衝液を用いて脱離され、ＰＢＳで洗浄され、２００μＬのインテグリン結合緩衝液（ＩＢＢ：２５ｍＭのトリスｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＭｎＣｌ２、および０．１％ＢＳＡ）中の０．５ｎＭの３ＣＭ－ＡＦ４８８および種々の濃度の非標識リガンドと共に、４℃で３時間インキュベートされた。ＣｐＧが関わる結合アッセイでは、細胞表面のＤＮＡ結合相互作用を通じて媒介されるリガンドの枯渇を低減させるように、細胞は、インテグリン結合剤とのインキュベーションの前に未修飾ＣｐＧで前処理された。細胞は、競合剤および非標識リガンドの溶液（最終体積２００μＬ／サンプル）を添加する前に、５００ｎＭの未修飾ＣｐＧ（１００μＬ／サンプル）で室温において１０分間前処理された。
【0127】
ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡで数回洗浄した後に残っている細胞結合蛍光が、フローサイトメトリーによって分析された。各サンプルからの幾何平均蛍光強度（ＭＦＩ）が決定され、データセットは、競合剤のみで処理された細胞からのＭＦＩが１００％結合に等しくなるように正規化された。半最大阻害濃度（ＩＣ５０）値は、Ｃｈｅｎｇ－Ｐｒｕｓｏｆｆの関係を使用して、平衡解離定数（Ｋｉ）値に変換するための非線形回帰分析によって決定された。
【0128】
インビボ蛍光画像化
ＣＴ２６結腸がん細胞（５×１０５）が、左右の肩の両方に皮下注射された。両方の腫瘍が確立された５日後、マウスに、腫瘍内（ＩＴ、左腫瘍内）、腫瘍周囲（ＰＴ、左腫瘍の隣）、または尾静脈を介した静脈内（ＩＶ）のいずれかで、示された用量での３ＣＭ－ＣｐＧ－ＡＦ６８０を注射した。「用量」は、ＣｐＧの標準腫瘍内用量の等モル量（５．２ｎｍｏｌ、５０ｕｇ）である。したがって、０．２×用量＝１ｎｍｏｌ、１×用量＝５．２ｎｍｏｌ、２×用量＝１０．４ｎｍｏｌ、および４×用量＝２０．８ｎｍｏｌである。
ＣＴ２６結腸がん細胞（５×１０５）が、左右の肩の両方に皮下注射された。両方の腫瘍が確立された５日後、マウスに、腫瘍内（ＩＴ、左腫瘍内）、腫瘍周囲（ＰＴ、左腫瘍の隣）、または尾静脈を介した静脈内（ＩＶ）のいずれかで、示された用量での３ＣＭ－ＣｐＧ－ＡＦ６８０を注射した。「用量」は、ＣｐＧの標準腫瘍内用量の等モル量（５．２ｎｍｏｌ、５０ｕｇ）である。したがって、０．２×用量＝１ｎｍｏｌ、１×用量＝５．２ｎｍｏｌ、２×用量＝１０．４ｎｍｏｌ、および４×用量＝２０．８ｎｍｏｌである。
【0129】
注射後４時間および２６時間で、マウスは、２％イソフルランガスを使用して麻酔され、Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｍａｇｉｎｇ Ａｍｉ Ｉｍａｇｅｒを使用して画像化された。注射後２６時間での最後のスキャンの後、群あたり１匹のマウスが、犠牲にされ、腫瘍が切除および画像化された。蛍光画像化設定：励起／発光：６４０／７３０ｎｍ、励起出力＝１０、ビニング＝２、露光時間＝１０秒、Ｆｓｔｏｐ＝２、ＦＯＶ＝２５であった。
【0130】
腫瘍接種および治療研究
４Ｔ１－Ｌｕｃ腫瘍細胞（１×１０４）が、ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹部の右側に皮下注射された（０日目）。接種の７日後、マウスは、無作為に実験群分けされた（群あたりｎ＝９～１０）。マウスに、尾静脈を介して、３用量（７、９、１１日目）もしくは１用量（７日目のみ）のＣｐＧ（１８．２ｎｍｏｌ、１７６ｕｇ）、または等モル量の３ＣＭ－ＣｐＧ（１８．２ｎｍｏｌ、２５０ｕｇ）を注射した。ビヒクル群のマウスには、滅菌ＰＢＳを静脈内注射した（７、９、１１日目）。すべての処置は、滅菌ＰＢＳ中で製剤化され、注射前に濾過された（０．２ｕｍ滅菌フィルター）。腫瘍の大きさは、デジタルノギス（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ）で２～３日毎に監視され、体積（長さ×幅×高さ）として表された。マウスは、腫瘍サイズが最大直径で１．５ｃｍに達した場合、または腫瘍がガイドラインに従って潰瘍化した場合、安楽死させられた。記録された生存日は、所与のマウスが安楽死基準に達したときを示す。カプランマイヤー法が、生存分析に使用された。Ｐ値はログランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定を使用して計算された。
４Ｔ１－Ｌｕｃ腫瘍細胞（１×１０４）が、ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹部の右側に皮下注射された（０日目）。接種の７日後、マウスは、無作為に実験群分けされた（群あたりｎ＝９～１０）。マウスに、尾静脈を介して、３用量（７、９、１１日目）もしくは１用量（７日目のみ）のＣｐＧ（１８．２ｎｍｏｌ、１７６ｕｇ）、または等モル量の３ＣＭ－ＣｐＧ（１８．２ｎｍｏｌ、２５０ｕｇ）を注射した。ビヒクル群のマウスには、滅菌ＰＢＳを静脈内注射した（７、９、１１日目）。すべての処置は、滅菌ＰＢＳ中で製剤化され、注射前に濾過された（０．２ｕｍ滅菌フィルター）。腫瘍の大きさは、デジタルノギス（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ）で２～３日毎に監視され、体積（長さ×幅×高さ）として表された。マウスは、腫瘍サイズが最大直径で１．５ｃｍに達した場合、または腫瘍がガイドラインに従って潰瘍化した場合、安楽死させられた。記録された生存日は、所与のマウスが安楽死基準に達したときを示す。カプランマイヤー法が、生存分析に使用された。Ｐ値はログランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定を使用して計算された。
【0131】
合成―官能化免疫刺激剤
免疫刺激剤は、ひずみ促進アジド－アルキン付加環化反応（ＳＰＡＡＣ）を使用した標的化薬剤への取り付け可能にするように、クリックケミストリーハンドルで官能化された。一級アルキルアミン修飾ＴＬＲ７／８アゴニスト（Ｔ７８ａと称される）および５’アミン修飾クラスＣ ＣｐＧ－Ｃ７９２（アミノ－ＣｐＧと称される）は、それぞれ、Ａｃｍｅ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓおよびＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入された。免疫刺激剤は、修飾を受けられると報告されている部位においてコンジュゲート化され、イミダゾキノリンについてはＮ１結合、クラスＣ ＣｐＧについては５’リン酸であった。
免疫刺激剤は、ひずみ促進アジド－アルキン付加環化反応（ＳＰＡＡＣ）を使用した標的化薬剤への取り付け可能にするように、クリックケミストリーハンドルで官能化された。一級アルキルアミン修飾ＴＬＲ７／８アゴニスト（Ｔ７８ａと称される）および５’アミン修飾クラスＣ ＣｐＧ－Ｃ７９２（アミノ－ＣｐＧと称される）は、それぞれ、Ａｃｍｅ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓおよびＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入された。免疫刺激剤は、修飾を受けられると報告されている部位においてコンジュゲート化され、イミダゾキノリンについてはＮ１結合、クラスＣ ＣｐＧについては５’リン酸であった。
【0132】
免疫刺激剤（アミノ－ＣｐＧまたはＴ７８ａ）の一級アルキルアミンは、対応するリンカー、すなわち、ＢＣＮ－ＰＥＧ２－ＮＨＳエステル、ＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－ＮＨＳエステル、またはアジド－ＰＥＧ４－ＮＨＳエステルを使用してビシクロノニン（ＢＣＮ）、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）、またはアジドハンドルを組みむように、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルリンカーを用いて官能化された（図２参照）。アミノ－ＣｐＧ（１等量）が、２５％ＤＭＳＯ／７５％１００ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）中でＮＨＳエステルリンカー（１５等量）と混合され、室温で一晩撹拌された。サンプル装填の前にＰＢＳに緩衝液交換されたＺｅｂａスピン脱塩カラム（７Ｋ ＭＷＣＯ）を使用したサイズ排除により、官能化ＣｐＧが残りのＮＨＳエステルリンカーから精製された。Ｔ７８ａ（１．２等量）は、４．４等量トリエチルアミンを伴う無水ＤＭＳＯ中のＮＨＳエステルリンカー（１等量）と混合され、室温で５～８時間撹拌された。反応は、分析用Ｃ１８カラムを使用した分析用ＨＰＬＣおよび／またはＬＣＭＳを使用して監視された。ＣｐＧ官能化を監視するためのＨＰＬＣ方法：３０分にわたる５％～６５％溶媒Ｂの直線勾配（溶媒Ａ：水中の１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム、ｐＨ７；溶媒Ｂ：アセトニトリル；３５℃）。Ｔ７８ａの官能化を監視するためのＨＰＬＣ方法：２分間の５％溶媒Ｂにおける定組成保持の後、１５分間にわたる５％～７５％溶媒の直線勾配（溶媒Ａ：水＋０．１％ＴＦＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル＋０．１％ ＴＦＡ；室温）。
【0133】
ＤＢＣＯ－ＣｐＧの合成に加えて、ＤＢＣＯ－ＣｐＧもまた、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）から直接注文された。
【0134】
合成―ノッティンペプチド複合体
固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）が、標準的Ｆｍｏｃ条件を使用して、ノッティンペプチドを合成するために使用された。ペプチド合成、開裂、折り畳み、およびＨＰＬＣ精製プロトコルは、Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ．５５（３４）：９８９４－７に記載されている。ノッティンペプチドはリジン残基を有しないため、２．５Ｆは、以下のようにしてＮ末端アミンにおいて部位特異的にコンジュゲートされた：ＤＭＳＯ中の４．４当量のＴＥＡを伴うアジド－ＰＥＧ４－ＮＨＳエステルリンカーを使用し、室温で一晩撹拌して、Ｎ末端アジド修飾２．５Ｆを産生し、これをＲＰ－ＨＰＬＣによって精製した。３ＣＭと称される、２．５Ｆの改変バージョンは、代替的コンジュゲーション部位（図３ＡでＸ１アジドとして示される）を提供するように、２．５Ｆの配列の１５位において非天然アミノ酸５－アジド－Ｌ－ノルバリンを用いて合成された。加えて、３１位におけるフェニルアラニン（図３ＡでＸ２として示される）が、ＵＶ吸収による濃度測定を容易にするために、３ＣＭではチロシンに置換された。しかしながら、３１位におけるどちらのアミノ酸も、結合親和性を損なうことなく使用されることができる。
固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）が、標準的Ｆｍｏｃ条件を使用して、ノッティンペプチドを合成するために使用された。ペプチド合成、開裂、折り畳み、およびＨＰＬＣ精製プロトコルは、Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ．５５（３４）：９８９４－７に記載されている。ノッティンペプチドはリジン残基を有しないため、２．５Ｆは、以下のようにしてＮ末端アミンにおいて部位特異的にコンジュゲートされた：ＤＭＳＯ中の４．４当量のＴＥＡを伴うアジド－ＰＥＧ４－ＮＨＳエステルリンカーを使用し、室温で一晩撹拌して、Ｎ末端アジド修飾２．５Ｆを産生し、これをＲＰ－ＨＰＬＣによって精製した。３ＣＭと称される、２．５Ｆの改変バージョンは、代替的コンジュゲーション部位（図３ＡでＸ１アジドとして示される）を提供するように、２．５Ｆの配列の１５位において非天然アミノ酸５－アジド－Ｌ－ノルバリンを用いて合成された。加えて、３１位におけるフェニルアラニン（図３ＡでＸ２として示される）が、ＵＶ吸収による濃度測定を容易にするために、３ＣＭではチロシンに置換された。しかしながら、３１位におけるどちらのアミノ酸も、結合親和性を損なうことなく使用されることができる。
【0135】
図４に示されるように、アジド含有ノッティン（３ＣＭまたはアジド－２．５Ｆ）（１．２等量）が、ＰＢＳ中のＢＣＮ修飾またはＤＢＣＯ修飾ＣｐＧ（１等量）と３０℃で一晩反応させられ、ノッティン－ＣｐＧ複合体（３ＣＭ－ＣｐＧまたは２．５Ｆ－ＣｐＧ）を産生した。サンプル装填の前にＰＢＳに緩衝液交換されたＺｅｂａスピン脱塩カラム（７Ｋ ＭＷＣＯ）を使用したサイズ排除により、ノッティン－ＣｐＧ複合体を、未反応のノッティンペプチドから精製した。３ＣＭ－Ｔ７８ａを産生するためには、ＢＣＮ－Ｔ７８ａ（１．１５等量）が、１：１ ＤＭＳＯ／ＰＢＳ中で３ＣＭ（１等量）と室温で一晩撹拌されて反応させられた。反応物は、以下のメソッドを用いたＣ１８カラム上のＲＰ－ＨＰＬＣによって精製した：２分間の５％溶媒Ｂにおける定組成保持から開始し、、続いて、３０分にわたる５％～７５％溶媒の直線勾配（溶媒Ａ：水＋０．１％ＴＦＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル＋０．１％ＴＦＡ；室温）。生成物画分が収集され、水で希釈され、凍結され、凍結乾燥された。ＣｐＧおよびＴ７８ａについての「官能化免疫刺激剤」のセクションに記載されたのと同じ方法を使用して、反応を監視するために分析用ＨＰＬＣおよび／またはＬＣＭＳが使用された。
【0136】
合成―ノッティン－Ｆｃ複合体
ノッティン－Ｆｃ（ＫＦｃ）融合タンパク質が、組換え発現され、以前に記載されたように精製された（Ｂ．Ｈ．Ｋｗａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２０１７，２１４（６）：１６７９－９０）。図８に示されるように、ＢＣＮ－ＰＥＧ２－ＮＨＳエステルリンカーを使用してクリック可能なハンドル（ＢＣＮ基）でＫＦｃ融合体を官能化するために、ＮＨＳエステル標識が使用された。ＮＨＳエステルは、タンパク質中の一級アミン（リジン残基およびＮ末端）と反応して、安定したアミド結合を形成する。ＫＦｃは、ｐＨ８．３の１００ｍＭ重炭酸ナトリウム緩衝液中のＢＣＮ－ＰＥＧ２－ＮＨＳエステルリンカー（６等量）と、室温で２時間混合された。この標識プロトコルは、典型的には、ＫＦｃあたり２～３個の連結を産生する。サンプル装填の前にＰＢＳに緩衝液交換されたＺｅｂａスピン脱塩カラム（７Ｋ ＭＷＣＯ）を使用したサイズ排除により、ＢＣＮ修飾ＫＦｃを残りのリンカーから精製した。
ノッティン－Ｆｃ（ＫＦｃ）融合タンパク質が、組換え発現され、以前に記載されたように精製された（Ｂ．Ｈ．Ｋｗａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２０１７，２１４（６）：１６７９－９０）。図８に示されるように、ＢＣＮ－ＰＥＧ２－ＮＨＳエステルリンカーを使用してクリック可能なハンドル（ＢＣＮ基）でＫＦｃ融合体を官能化するために、ＮＨＳエステル標識が使用された。ＮＨＳエステルは、タンパク質中の一級アミン（リジン残基およびＮ末端）と反応して、安定したアミド結合を形成する。ＫＦｃは、ｐＨ８．３の１００ｍＭ重炭酸ナトリウム緩衝液中のＢＣＮ－ＰＥＧ２－ＮＨＳエステルリンカー（６等量）と、室温で２時間混合された。この標識プロトコルは、典型的には、ＫＦｃあたり２～３個の連結を産生する。サンプル装填の前にＰＢＳに緩衝液交換されたＺｅｂａスピン脱塩カラム（７Ｋ ＭＷＣＯ）を使用したサイズ排除により、ＢＣＮ修飾ＫＦｃを残りのリンカーから精製した。
【0137】
ＫＦｃ－免疫刺激剤複合体を産生するために、ＢＣＮ修飾ＫＦｃ（１等量）が、ＰＢＳ中のアジド－Ｔ７８ａ（６等量）と室温で一晩撹拌されて反応させられた。サンプル装填の前にＰＢＳに緩衝液交換されたＺｅｂａスピン脱塩カラム（７Ｋ ＭＷＣＯ）を使用したサイズ排除により、ＫＦｃ－Ｔ７８ａ複合体が未反応のアジド－Ｔ７８ａから精製された。
【0138】
合成については、ＫＦｃがアジド－ＮＨＳエステルリンカーで修飾されてＢＣＮ－Ｔ７８ａにコンジュゲートされるように、ＢＣＮとアジド基を交換することができる。官能化ＣｐＧを官能化Ｔ７８ａに代用することもできる。ＢＣＮもいつでもＤＢＣＯで代用し得る。
【0139】
免疫細胞浸潤
４Ｔ１－ｌｕｃ細胞（２×１０４）が、ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹部の片側に皮下移植され、９日間成長させられた。腫瘍が発達すると（処置後０日目と称される）、マウスは、処置後０日目にＩＶ処置、および２日目に以下の群（ｎ＝群あたり３匹のマウス）について静脈内（ＩＶ）または腫瘍内（ＩＴ）注射された：ビヒクルＩＶ（ＰＢＳ）、ＣｐＧ ＩＶ（１８．２ｎｍｏｌ）、３ＣＭ－ＣｐＧ ＩＶ（１８．２ｎｍｏｌ）、およびＣｐＧ ＩＴ（５．２ｎｍｏｌ）。ＣｐＧ ＩＴ用量（５．２ｎｍｏｌ＝５０ｕｇ）は、マウスに投与される典型的なＩＴ用量であり、ＩＶ用量よりも低い。最初の用量から３日後、腫瘍が切除され、単細胞懸濁液へと機械的に解離された。
４Ｔ１－ｌｕｃ細胞（２×１０４）が、ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹部の片側に皮下移植され、９日間成長させられた。腫瘍が発達すると（処置後０日目と称される）、マウスは、処置後０日目にＩＶ処置、および２日目に以下の群（ｎ＝群あたり３匹のマウス）について静脈内（ＩＶ）または腫瘍内（ＩＴ）注射された：ビヒクルＩＶ（ＰＢＳ）、ＣｐＧ ＩＶ（１８．２ｎｍｏｌ）、３ＣＭ－ＣｐＧ ＩＶ（１８．２ｎｍｏｌ）、およびＣｐＧ ＩＴ（５．２ｎｍｏｌ）。ＣｐＧ ＩＴ用量（５．２ｎｍｏｌ＝５０ｕｇ）は、マウスに投与される典型的なＩＴ用量であり、ＩＶ用量よりも低い。最初の用量から３日後、腫瘍が切除され、単細胞懸濁液へと機械的に解離された。
【0140】
抗体染色の前に、細胞は、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎと共にインキュベートされた。細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、１％ウシ血清アルブミン、および０．０１％アジ化ナトリウム中の蛍光標識抗体で表面染色され、２％パラホルムアルデヒドで固定され、フローサイトメトリーによって分析された。データは、Ｃｙｔｏｂａｎｋ（ｗｗｗ．ｃｙｔｏｂａｎｋ．ｏｒｇ）を使用して保存および分析された。
【0141】
データ分析のために、細胞は、生存単一細胞のみを含むようにゲートされた。骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）は、ＣＤ１１ｂ＋ ＧＲ１＋として特徴付けられた。ＮＫ細胞は、ＣＤ３－ ＣＤ４９ｂ＋として特徴付けられた。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ３＋ ＣＤ８＋ ＣＤ４９ｂ－として特徴付けられた。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ３＋ ＣＤ４＋ ＣＤ４９ｂ－として特徴付けられた。ＣＤ８＋Ｂ細胞は、ＣＤ３－ Ｂ２２０＋ ＣＤ４９ｂ－として特徴付けられた。
【0142】
このように、前述の内容は、単に本開示の原理を例証するにすぎない。本明細書に明示的に記述または図示されていないが本発明の原理を具現化しその趣旨および範囲内に含まれる、様々な構成を、当業者であれば工夫できるであろうことを理解されたい。さらに、本明細書に列挙されたすべての例および条件的文言は、主として本発明の原理および当該技術分野の促進のために発明者らにより寄与された概念を理解する上で読者を助けることを意図しており、そのような具体的に列挙された例および条件への限定を伴わないものとして解釈されるべきである。また、本発明の原理、態様、および実施形態、ならびにそれらの具体的な例を列挙する本明細書におけるすべての記述は、その構造的および機能的等価物の両方を包含することを意図する。加えて、そのような等価物は、現在公知である等価物および将来開発される等価物の両方、すなわち、構造にかかわらず同じ機能を果たす、開発されるあらゆる要素も含むことが意図される。したがって、本発明の範囲は、本明細書に示され説明された例示的な実施形態に限定されることを意図しない。
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8-1】
【図8-2】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16-1】
【図16-2】
【図17】
【配列表】
【国際調査報告】