特表 2022-549932 レンチウイルスベクター製剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-11-29

(54)【発明の名称】レンチウイルスベクター製剤

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/12 20060101AFI20221121BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20221121BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20221121BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20221121BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20221121BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20221121BHJP

   A61P 7/04 20060101ALI20221121BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20221121BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20221121BHJP

   A61K 47/18 20060101ALI20221121BHJP

   A61K 47/04 20060101ALI20221121BHJP

   A61K 47/10 20060101ALI20221121BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20221121BHJP

   C12N 5/10 20060101ALN20221121BHJP

【ＦＩ】

C12N15/12

C12N15/867 Z ZNA

C12N7/01

C12N15/113 Z

C12N15/11 Z

A61K48/00

A61P7/04

A61K35/76

A61K47/26

A61K47/18

A61K47/04

A61K47/10

A61K31/7088

C12N5/10

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022519675

(86)(22)【出願日】2020-09-30

(85)【翻訳文提出日】2022-05-19

(86)【国際出願番号】 US2020053463

(87)【国際公開番号】W WO2021067389

(87)【国際公開日】2021-04-08

(31)【優先権主張番号】62/908,390

(32)【優先日】2019-09-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】512147244

【氏名又は名称】バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド

(71)【出願人】

【識別番号】511262290

【氏名又は名称】フォンダツィオーネ テレトン

(71)【出願人】

【識別番号】514194370

【氏名又は名称】オスペダーレ サン ラファエレ エス．アール．エル

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100140132

【弁理士】

【氏名又は名称】竹林 則幸

(72)【発明者】

【氏名】アンドリュー・クレチ

(72)【発明者】

【氏名】イシドロ・ザラガ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA91X

4B065AA93Y

4B065AA97X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4C076BB13

4C076CC14

4C076DD23Z

4C076DD26Z

4C076DD33

4C076DD46F

4C076DD51Z

4C076DD67

4C076EE23F

4C084AA13

4C084NA03

4C084NA05

4C084ZA531

4C084ZA532

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA03

4C086MA05

4C086NA03

4C086NA05

4C086ZA53

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087NA03

4C087NA05

4C087ZA53

(57)【要約】

安定性が改善された、全身投与に適するレンチウイルスベクター（ＬＶ）製剤、およびそのようなＬＶ製剤を含む医薬組成物を提供する。ＬＶ製剤の全身投与を使用して、障害、特に血液障害を治療する方法も提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

組換えレンチウイルスベクター調製物であって、以下のもの：
（ａ）組換えレンチウイルスベクターの治療有効用量；
（ｂ）ＴＲＩＳ非含有緩衝系；
（ｃ）塩；
（ｄ）界面活性剤；および
（ｅ）炭水化物
を含み、医薬組成物はヒト患者への全身投与に適する、前記組換えレンチウイルスベクター調製物。

【請求項2】

緩衝系または調製物のｐＨは、約６．０～約８．０である、請求項１に記載の調製物。

【請求項3】

緩衝系または調製物のｐＨは、約６．０～約７．５である、請求項１または２に記載の調製物。

【請求項4】

緩衝系または調製物のｐＨは、約６．０～約７．０である、請求項１～３のいずれか１項に記載の調製物。

【請求項5】

緩衝系または調製物のｐＨは、約６．５である、請求項１～４のいずれか１項に記載の調製物。

【請求項6】

緩衝系または調製物のｐＨは、約７．０～約８．０である、請求項１～５のいずれか１項に記載の調製物。

【請求項7】

緩衝系または調製物のｐＨは、約７．３である、請求項１～６のいずれか１項に記載の調製物。

【請求項8】

レンチウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の調製物。

【請求項9】

緩衝系は、リン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の調製物。

【請求項10】

リン酸緩衝液の濃度は、約５ｍＭ～約３０ｍＭである、請求項９に記載の調製物。

【請求項11】

リン酸緩衝液の濃度は、約１０ｍＭ～約２０ｍＭ、約１０ｍＭ～約１５ｍＭ、約２０ｍＭ～約３０ｍＭ、約２０ｍＭ～約２５ｍＭ、または約１５ｍＭ～約２０ｍＭである、請求項１０に記載の調製物。

【請求項12】

ヒスチジン緩衝液の濃度は、約５ｍＭ～約３０ｍＭである、請求項９に記載の調製物。

【請求項13】

ヒスチジン緩衝液の濃度は、約１０ｍＭ～約２０ｍＭ、約１０ｍＭ～約１５ｍＭ、約２０ｍＭ～約３０ｍＭ、約２０ｍＭ～約２５ｍＭ、または約１５ｍＭ～約２０ｍＭである、請求項１２に記載の調製物。

【請求項14】

塩の濃度は、約８０ｍＭ～約１５０ｍＭである、請求項１～１３のいずれか１項に記載の調製物。

【請求項15】

塩の濃度は、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１３０ｍＭ、または約１５０ｍＭである、請求項１～１４のいずれか１項に記載の調製物。

【請求項16】

塩は、塩化物塩である、請求項１～１５のいずれか１項に記載の調製物。

【請求項17】

塩化物塩は、ＮａＣｌである、請求項１６に記載の調製物。

【請求項18】

界面活性剤は、ポロクサマーである、請求項１～１７のいずれか１項に記載の調製物。

【請求項19】

ポロクサマーは、ポロクサマー１０１（Ｐ１０１）、ポロクサマー１０５（Ｐ１０５）、ポロクサマー１０８（Ｐ１０８）、ポロクサマー１２２（Ｐ１２２）、ポロクサマー１２３（Ｐ１２３）、ポロクサマー１２４（Ｐ１２４）、ポロクサマー１８１（Ｐ１８１）、ポロクサマー１８２（Ｐ１８２）、ポロクサマー１８３（Ｐ１８３）、ポロクサマー１８４（Ｐ１８４）、ポロクサマー１８５（Ｐ１８５）、ポロクサマー１８８（Ｐ１８８）、ポロクサマー２１２（Ｐ２１２）、ポロクサマー２１５（Ｐ２１５）、ポロクサマー２１７（Ｐ２１７）、ポロクサマー２３１（Ｐ２３１）、ポロクサマー２３４（Ｐ２３４）、ポロクサマー２３５（Ｐ２３５）、ポロクサマー２３７（Ｐ２３７）、ポロクサマー２３８（Ｐ２３８）、ポロクサマー２８２（Ｐ２８２）、ポロクサマー２８４（Ｐ２８４）、ポロクサマー２８８（Ｐ２８８）、ポロクサマー３３１（Ｐ３３１）、ポロクサマー３３３（Ｐ３３３）、ポロクサマー３３４（Ｐ３３４）、ポロクサマー３３５（Ｐ３３５）、ポロクサマー３３８（Ｐ３３８）、ポロクサマー４０１（Ｐ４０１）、ポロクサマー４０２（Ｐ４０２）、ポロクサマー４０３（Ｐ４０３）、ポロクサマー４０７（Ｐ４０７）、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１８に記載の調製物。

【請求項20】

ポロクサマーは、ポロクサマー１８８（Ｐ１８８）である、請求項１８または１９に記載の調製物。

【請求項21】

ポロクサマーは、ポロクサマー４０７（Ｐ４０７）である、請求項１８または１９に記載の調製物。

【請求項22】

界面活性剤は、ポリソルベートである、請求項１～１７のいずれか１項に記載の調製物。

【請求項23】

ポリソルベートは、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２２に記載の調製物。

【請求項24】

界面活性剤の濃度は、約０．０１％（ｗ／ｖ）～約０．１％（ｗ／ｖ）である、請求項１～２３のいずれか１項に記載の調製物。

【請求項25】

界面活性剤の濃度は、約０．０３％（ｗ／ｖ）、約０．０５％（ｗ／ｖ）、約０．０７％（ｗ／ｖ）、または約０．０９％（ｗ／ｖ）である、請求項１～２４のいずれか１項に記載の調製物。

【請求項26】

炭水化物の濃度は、約０．５％（ｗ／ｖ）～約５％（ｗ／ｖ）である、請求項１～２５のいずれか１項に記載の調製物。

【請求項27】

炭水化物の濃度は、約１％（ｗ／ｖ）、約２％（ｗ／ｖ）、約３％（ｗ／ｖ）、または約４％（ｗ／ｖ）である、請求項１～２６のいずれか１項に記載の調製物。

【請求項28】

炭水化物は、スクロースである、請求項１～２７のいずれか１項に記載の調製物。

【請求項29】

以下のもの：
（ａ）組換えレンチウイルスベクターの治療有効用量；
（ｂ）約１０ｍＭのリン酸塩；
（ｃ）約１００ｍＭの塩化ナトリウム；
（ｄ）約０．０５％（ｗ／ｖ）のポロクサマー１８８；および
（ｅ）約３％（ｗ／ｖ）のスクロース
を含み、調製物のｐＨは約７．３であり、医薬組成物はヒト患者への全身投与に適する、請求項１～２８のいずれか１項に記載の調製物。

【請求項30】

以下のもの：
（ａ）組換えレンチウイルスベクターの治療有効用量；
（ｂ）約１０ｍＭのリン酸塩；
（ｃ）約１３０ｍＭの塩化ナトリウム；
（ｄ）約０．０５％（ｗ／ｖ）のポロクサマー１８８；および
（ｅ）約１％（ｗ／ｖ）のスクロース
を含み、調製物のｐＨは約７．３であり、医薬組成物はヒト患者への全身投与に適する、請求項１～２８のいずれか１項に記載の調製物。

【請求項31】

以下のもの：
（ａ）組換えレンチウイルスベクターの治療有効用量；
（ｂ）約２０ｍＭヒスチジン；
（ｃ）約１００ｍＭの塩化ナトリウム；
（ｄ）約０．０５％（ｗ／ｖ）のポロクサマー１８８；および
（ｅ）約３％（ｗ／ｖ）のスクロース
を含み、調製物のｐＨは約６．５であり、医薬組成物はヒト患者への全身投与に適する、請求項１～２８のいずれか１項に記載の調製物。

【請求項32】

以下のもの：
（ａ）組換えレンチウイルスベクターの治療有効用量；
（ｂ）約１０ｍＭのリン酸塩；
（ｃ）約１００ｍＭの塩化ナトリウム；
（ｄ）約０．０５％（ｗ／ｖ）のポロクサマー１８８；および
（ｅ）約３％（ｗ／ｖ）のスクロース
を含み、調製物のｐＨは約７．０であり、医薬組成物はヒト患者への全身投与に適する、請求項１～２８のいずれか１項に記載の調製物。

【請求項33】

以下のもの：
（ａ）組換えレンチウイルスベクターの治療有効用量；
（ｂ）約２０ｍＭヒスチジン；
（ｃ）約１００ｍＭの塩化ナトリウム；
（ｄ）約０．０５％（ｗ／ｖ）のポロクサマー１８８；および
（ｅ）約３％（ｗ／ｖ）のスクロース
を含み、調製物のｐＨは約７．０であり、医薬組成物はヒト患者への全身投与に適する、請求項１～２８のいずれか１項に記載の調製物。

【請求項34】

組換えレンチウイルスベクターは、配列番号１または配列番号２に示される第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）コード配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一なヌクレオチド配列を含む核酸を含む、請求項１～３３のいずれか１項に記載の調製物。

【請求項35】

組換えレンチウイルスベクターは、配列番号１または配列番号２に示される第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）コード配列を含む核酸を含む、請求項３４に記載の調製物。

【請求項36】

組換えレンチウイルスベクターは、配列番号１または配列番号２に示される第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）コード配列からなる核酸を含む、請求項３４または３５に記載の調製物。

【請求項37】

組換えレンチウイルスベクターは、配列番号３に示される第ＩＸ因子（ＦＩＸ）コード配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一なヌクレオチド配列を含む核酸を含む、請求項１～３６のいずれか１項に記載の調製物。

【請求項38】

組換えレンチウイルスベクターは、配列番号３に示される第ＩＸ因子（ＦＩＸ）コード配列を含む核酸を含む、請求項３７に記載の調製物。

【請求項39】

組換えレンチウイルスベクターは、配列番号３に示される第ＩＸ因子（ＦＩＸ）コード配列からなる核酸を含む、請求項３７または３８に記載の調製物。

【請求項40】

組換えレンチウイルスベクターは、強化トランスサイレチン（ＥＴ）プロモーターを含む、請求項１～３９のいずれか１項に記載の調製物。

【請求項41】

組換えレンチウイルスベクターはさらに、配列番号７に示されるｍｉＲ－１４２の標的配列と少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列を含む、請求項１～４０のいずれか１項に記載の調製物。

【請求項42】

組換えレンチウイルスベクターは、以下の群：ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＮＳＯ細胞、およびＣＡＰ細胞から選択されるトランスフェクト宿主細胞から単離される、請求項１～４１のいずれか１項に記載の調製物。

【請求項43】

宿主細胞は、ＣＤ４７陽性宿主細胞である、請求項４２に記載の調製物。

【請求項44】

障害を有するヒト患者を治療する方法であって、請求項１～４３のいずれか１項に記載の組換えレンチウイルスベクター調製物をヒト患者に投与する工程を含む、前記方法。

【請求項45】

調製物は、ヒト患者に全身投与される、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

調製物は、静脈内に投与される、請求項４４または４５に記載の方法。

【請求項47】

障害は、出血性障害である、請求項４４～４６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項48】

出血性障害は、血友病Ａまたは血友病Ｂである、請求項４７に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、２０１９年９月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／９０８，３９０号に対する優先権を主張し、その開示は参照によってその全体が本明細書に組み入れられる。

【0002】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ書式で電子的に提出された配列表を含み、これはその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。２０２０年９月２８日に作成された前記ＡＳＣＩＩの写しは、「７０９７１８＿ＳＡ９－４７２ＰＣ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」の名称であり、サイズは１０４，４２６バイトである。

【0003】

発明の分野
本開示は、疾患の治療に使用するための組換えレンチウイルスベクター（ＬＶ）の製剤および関連する医薬製品に関する。特に、本開示は、ＬＶの安定性および質を改善し、その一方で、血友病Ａおよび血友病Ｂなどの出血性障害を含む疾患を治療するための対象への全身投与および他の種類の投与における使用への適合性も備える製剤に関する。

【背景技術】

【0004】

レンチウイルスベクター（ＬＶ）および他のウイルスベクターは、遺伝子療法のための魅力的なツールである（非特許文献１）。ＬＶは、肝細胞、ニューロンおよび造血幹細胞などの非分裂細胞を含む広範な組織に形質導入を行うことができる。さらに、ＬＶは標的細胞ゲノムへの組み込みを行い、長期的な導入遺伝子発現をもたらすことができる。

【0005】

遺伝子療法およびワクチン開発の分野において現存する課題の一つは、ＬＶが、より長期間にわたって構造的に安定で生物学的に活性であり続けること、ならびに撹拌、凍結／解凍および一定範囲の温度での貯蔵などの条件に耐えることを可能にする無毒性の液体製剤を作製することである。ＬＶ力価は、凍結／解凍サイクルの増加および比較的高温での貯蔵に伴って二相性様式で減少することが観察されている（非特許文献２）。遺伝子療法を最も有効にするためには、生物活性または効力を維持するレンチウイルスベクターを有することが望ましい。

【0006】

ＬＶの生物活性は、少なくとも以下のものからなる囲い込み構造の立体構造的完全性に依存する：（ａ）コアポリヌクレオチド、（ｂ）コアポリヌクレオチドを取り囲む相互連結したカプシドタンパク質のシェル、および（ｃ）相互連結したカプシドタンパク質のシェルを取り囲む、糖タンパク質が埋め込まれた脂質膜。有機性薬物および無機性薬物とは異なり、ＬＶは非常に複雑な生体構造物であり、些細な化学的または物理的なストレス要因であっても囲い込み構造の構造的完全性の分解に寄与し得る。そのようなストレス要因としては、浸透圧、緩衝液、ｐＨ、粘性、電解質、撹拌、および温度変動が挙げられる。ＬＶの構造的または立体構造的完全性は、その生物活性または効力に直接結びつく。それ故に、ＬＶは、変性、可溶性および不溶性凝集、沈殿ならびに吸着を含む物理的不安定性、さらには加水分解、脱アミドおよび酸化を含む化学的不安定性の結果として効力を失い得る。これらの種類の分解はいずれも生物活性の低下をもたらす可能性があり、毒性の増加および／または免疫原性の変化を伴う副生成物または誘導体の形成をもたらす可能性もある。それ故に、ＬＶの優れた製剤は、妥当な貯蔵寿命だけでなく、全身投与などを介した対象への投与時の毒性の低さを保証するためにも極めて重要である。広範囲の条件にわたってＬＶが安定であるような、ＬＶを安定化して堅牢な製剤をもたらすビヒクルを見出すためには、緩衝液の種類、ｐＨ、および賦形剤の綿密な最適化が必要である。試験する条件の各セットについて、ＬＶの安定性を種々の実験方法によって測定する必要がある。それ故に、変化させ得るすべての因子を考慮すると、ＬＶを製剤化するための最適な条件を見出すことは困難であり、優れた製剤の組成は先験的には予測不能である。

【0007】

したがって、対象への投与に適していて、一定範囲の条件下でＬＶの数量、構造的完全性、および効力を保たせることによってＬＶ安定性を改善する製剤を調製することには、当技術分野において需要がある。本明細書において、本発明者らは、様々な条件下でＬＶの安定性の改善を示す、対象への全身投与に適する製剤を開示する。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Ｔｈｏｍａｓら、２００３年

【非特許文献2】ＫｉｇａｓｈｉｋａｗａおよびＣｈａｎｇ、２００１年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２８０、１２４～１３１頁

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0009】

本開示は、ＴＲＩＳ非含有緩衝系（例えば、リン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液）を炭水化物（例えば、スクロース）、界面活性剤（例えば、ポロクサマーまたはポリソルベート）および塩（例えば、ＮａＣｌまたは他の塩化物塩）との組合せで含むビヒクル中にレンチウイルスベクター（ＬＶ）が懸濁化された場合に、安定性が改善したＬＶ製剤を実現することができるという予想外の発見に基づく。界面活性剤、例えば、ポロクサマーのＬＶ安定性への寄与は、界面活性剤は脂質膜に結合した粒子を不安定化することが当技術分野において知られていることから、驚くべきものであった。ＬＶ製剤が約６．０から約７．５の範囲のｐＨ（例えば、ｐＨ ６．５）で、ＬＶ表面タンパク質（例えば、カプシドタンパク質およびＶＳＶ－Ｇタンパク質）を不安定化してＬＶの解体または崩壊を促進する代わりに、ＬＶ安定性を改善したという観察も驚くべきものであった。さらに、本開示は、本開示のＬＶ製剤が、対象への全身投与（例えば、静脈内投与）に特に適することも示す。

【0010】

一態様では、本開示は、（ａ）組換えレンチウイルスベクターの治療有効用量；（ｂ）ＴＲＩＳ非含有緩衝系；（ｃ）塩；（ｄ）界面活性剤；および（ｅ）炭水化物を含む組換えレンチウイルスベクター調製物を提供し、ここで医薬組成物はヒト患者への全身投与に適する。

【0011】

ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む。

【0012】

ある特定の実施形態では、緩衝系はリン酸緩衝液を含む。

【0013】

ある特定の実施形態では、リン酸緩衝液の濃度は５ｍＭ～３０ｍＭの間である。

【0014】

ある特定の実施形態では、リン酸緩衝液の濃度は、約１０～約２０ｍＭ、約１０～約１５ｍＭ、約２０～約３０ｍＭ、約２０～約２５ｍＭ、または約１５～約２０ｍＭである。

【0015】

ある特定の実施形態では、塩の濃度は、８０ｍＭ～１５０ｍＭの間である。

【0016】

ある特定の実施形態では、塩の濃度は、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１３０ｍＭ、または約１５０ｍＭである。

【0017】

ある特定の実施形態では、塩は塩化物塩である。

【0018】

ある特定の実施形態では、塩化物塩はＮａＣｌである。

【0019】

ある特定の実施形態では、界面活性剤はポロクサマーである。

【0020】

ある特定の実施形態では、ポロクサマーは、ポロクサマー１０１（Ｐ１０１）、ポロクサマー１０５（Ｐ１０５）、ポロクサマー１０８（Ｐ１０８）、ポロクサマー１２２（Ｐ１２２）、ポロクサマー１２３（Ｐ１２３）、ポロクサマー１２４（Ｐ１２４）、ポロクサマー１８１（Ｐ１８１）、ポロクサマー１８２（Ｐ１８２）、ポロクサマー１８３（Ｐ１８３）、ポロクサマー１８４（Ｐ１８４）、ポロクサマー１８５（Ｐ１８５）、ポロクサマー１８８（Ｐ１８８）、ポロクサマー２１２（Ｐ２１２）、ポロクサマー２１５（Ｐ２１５）、ポロクサマー２１７（Ｐ２１７）、ポロクサマー２３１（Ｐ２３１）、ポロクサマー２３４（Ｐ２３４）、ポロクサマー２３５（Ｐ２３５）、ポロクサマー２３７（Ｐ２３７）、ポロクサマー２３８（Ｐ２３８）、ポロクサマー２８２（Ｐ２８２）、ポロクサマー２８４（Ｐ２８４）、ポロクサマー２８８（Ｐ２８８）、ポロクサマー３３１（Ｐ３３１）、ポロクサマー３３３（Ｐ３３３）、ポロクサマー３３４（Ｐ３３４）、ポロクサマー３３５（Ｐ３３５）、ポロクサマー３３８（Ｐ３３８）、ポロクサマー４０１（Ｐ４０１）、ポロクサマー４０２（Ｐ４０２）、ポロクサマー４０３（Ｐ４０３）、ポロクサマー４０７（Ｐ４０７）、およびそれらの組合せからなる群から選択される。

【0021】

ある特定の実施形態では、ポロクサマーはポロクサマー１８８（Ｐ１８８）である。

【0022】

ある特定の実施形態では、ポロクサマーはポロクサマー４０７（Ｐ４０７）である。

【0023】

ある特定の実施形態では、界面活性剤はポリソルベートである。

【0024】

ある特定の実施形態では、ポリソルベートは、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、およびそれらの組合せからなる群から選択される。

【0025】

ある特定の実施形態では、界面活性剤の濃度は、０．０１％（ｗ／ｖ）～０．１％（ｗ／ｖ）の間である。

【0026】

ある特定の実施形態では、界面活性剤の濃度は、約０．０３％（ｗ／ｖ）、約０．０５％（ｗ／ｖ）、約０．０７％（ｗ／ｖ）、または約０．０９％（ｗ／ｖ）である。

【0027】

ある特定の実施形態では、炭水化物の濃度は、０．５％（ｗ／ｖ）～５％（ｗ／ｖ）の間である。

【0028】

ある特定の実施形態では、炭水化物の濃度は、約１％（ｗ／ｖ）、約２％（ｗ／ｖ）、約３％（ｗ／ｖ）、または約４％（ｗ／ｖ）である。

【0029】

ある特定の実施形態では、炭水化物はスクロースである。

【0030】

ある特定の実施形態では、緩衝系または調製物のｐＨは、６．０～８．０の間である。

【0031】

ある特定の実施形態では、ｐＨは、６．０～７．０の間である。

【0032】

ある特定の実施形態では、ｐＨは約６．５である。

【0033】

ある特定の実施形態では、ｐＨは約７．０～約８．０である。

【0034】

ある特定の実施形態では、ｐＨは約７．３である。

【0035】

一態様では、本発明は、（ａ）組換えレンチウイルスベクターの治療有効用量；（ｂ）ヒスチジン緩衝系；（ｃ）塩；（ｄ）界面活性剤；および（ｅ）炭水化物を含む組換えレンチウイルスベクター調製物を対象とし、ここで医薬組成物はヒト患者への全身投与に適する。

【0036】

ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む。

【0037】

ある特定の実施形態では、ヒスチジン緩衝液の濃度は、５ｍＭ～３０ｍＭの間である。

【0038】

ある特定の実施形態では、ヒスチジン緩衝液の濃度は、約１０～約２０ｍＭ、約１０～約１５ｍＭ、約２０～約３０ｍＭ、約２０～約２５ｍＭ、または約１５～約２０ｍＭである。

【0039】

ある特定の実施形態では、塩の濃度は、８０ｍＭ～１５０ｍＭの間である。

【0040】

ある特定の実施形態では、塩の濃度は、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１３０ｍＭ、または約１５０ｍＭである。

【0041】

ある特定の実施形態では、塩は塩化物塩である。

【0042】

ある特定の実施形態では、塩化物塩はＮａＣｌである。

【0043】

ある特定の実施形態では、界面活性剤はポロクサマーである。

【0044】

ある特定の実施形態では、ポロクサマーは、ポロクサマー１０１（Ｐ１０１）、ポロクサマー１０５（Ｐ１０５）、ポロクサマー１０８（Ｐ１０８）、ポロクサマー１２２（Ｐ１２２）、ポロクサマー１２３（Ｐ１２３）、ポロクサマー１２４（Ｐ１２４）、ポロクサマー１８１（Ｐ１８１）、ポロクサマー１８２（Ｐ１８２）、ポロクサマー１８３（Ｐ１８３）、ポロクサマー１８４（Ｐ１８４）、ポロクサマー１８５（Ｐ１８５）、ポロクサマー１８８（Ｐ１８８）、ポロクサマー２１２（Ｐ２１２）、ポロクサマー２１５（Ｐ２１５）、ポロクサマー２１７（Ｐ２１７）、ポロクサマー２３１（Ｐ２３１）、ポロクサマー２３４（Ｐ２３４）、ポロクサマー２３５（Ｐ２３５）、ポロクサマー２３７（Ｐ２３７）、ポロクサマー２３８（Ｐ２３８）、ポロクサマー２８２（Ｐ２８２）、ポロクサマー２８４（Ｐ２８４）、ポロクサマー２８８（Ｐ２８８）、ポロクサマー３３１（Ｐ３３１）、ポロクサマー３３３（Ｐ３３３）、ポロクサマー３３４（Ｐ３３４）、ポロクサマー３３５（Ｐ３３５）、ポロクサマー３３８（Ｐ３３８）、ポロクサマー４０１（Ｐ４０１）、ポロクサマー４０２（Ｐ４０２）、ポロクサマー４０３（Ｐ４０３）、ポロクサマー４０７（Ｐ４０７）、およびそれらの組合せからなる群から選択される。

【0045】

ある特定の実施形態では、ポロクサマーはポロクサマー１８８（Ｐ１８８）である。

【0046】

ある特定の実施形態では、ポロクサマーはポロクサマー４０７（Ｐ４０７）である。

【0047】

ある特定の実施形態では、界面活性剤はポリソルベートである。

【0048】

ある特定の実施形態では、ポリソルベートは、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、およびそれらの組合せからなる群から選択される。

【0049】

ある特定の実施形態では、界面活性剤の濃度は、０．０１％（ｗ／ｖ）～０．１％（ｗ／ｖ）の間である。

【0050】

ある特定の実施形態では、界面活性剤の濃度は、約０．０３％（ｗ／ｖ）、約０．０５％（ｗ／ｖ）、約０．０７％（ｗ／ｖ）、または約０．０９％（ｗ／ｖ）である。

【0051】

ある特定の実施形態では、炭水化物の濃度は、０．５％（ｗ／ｖ）～５％（ｗ／ｖ）の間である。

【0052】

ある特定の実施形態では、炭水化物の濃度は、約１％（ｗ／ｖ）、約２％（ｗ／ｖ）、約３％（ｗ／ｖ）、または約４％（ｗ／ｖ）である。

【0053】

ある特定の実施形態では、炭水化物はスクロースである。

【0054】

ある特定の実施形態では、緩衝系または調製物のｐＨは、６．０～８．０の間である。

【0055】

ある特定の実施形態では、ｐＨは、６．０～７．０の間である。

【0056】

ある特定の実施形態では、ｐＨは約６．５である。

【0057】

ある特定の実施形態では、ｐＨは約７．０～約８．０である。

【0058】

ある特定の実施形態では、ｐＨは約７．３である。

【0059】

一態様では、本発明は、（ａ）組換えレンチウイルスベクターの治療有効用量；（ｂ）リン酸緩衝系；（ｃ）塩；（ｄ）界面活性剤；および（ｅ）炭水化物を含む組換えレンチウイルスベクター調製物を対象とし、ここで医薬組成物はヒト患者への全身投与に適する。

【0060】

ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む。

【0061】

ある特定の実施形態では、リン酸緩衝液の濃度は、５ｍＭ～３０ｍＭの間である。

【0062】

ある特定の実施形態では、リン酸緩衝液の濃度は、約１０～約２０ｍＭ、約１０～約１５ｍＭ、約２０～約３０ｍＭ、約２０～約２５ｍＭ、または約１５～約２０ｍＭである。

【0063】

ある特定の実施形態では、塩の濃度は、８０ｍＭ～１５０ｍＭの間である。

【0064】

ある特定の実施形態では、塩の濃度は、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１３０ｍＭ、または約１５０ｍＭである。

【0065】

ある特定の実施形態では、塩は塩化物塩である。

【0066】

ある特定の実施形態では、塩化物塩はＮａＣｌである。

【0067】

ある特定の実施形態では、界面活性剤はポロクサマーである。

【0068】

ある特定の実施形態では、ポロクサマーは、ポロクサマー１０１（Ｐ１０１）、ポロクサマー１０５（Ｐ１０５）、ポロクサマー１０８（Ｐ１０８）、ポロクサマー１２２（Ｐ１２２）、ポロクサマー１２３（Ｐ１２３）、ポロクサマー１２４（Ｐ１２４）、ポロクサマー１８１（Ｐ１８１）、ポロクサマー１８２（Ｐ１８２）、ポロクサマー１８３（Ｐ１８３）、ポロクサマー１８４（Ｐ１８４）、ポロクサマー１８５（Ｐ１８５）、ポロクサマー１８８（Ｐ１８８）、ポロクサマー２１２（Ｐ２１２）、ポロクサマー２１５（Ｐ２１５）、ポロクサマー２１７（Ｐ２１７）、ポロクサマー２３１（Ｐ２３１）、ポロクサマー２３４（Ｐ２３４）、ポロクサマー２３５（Ｐ２３５）、ポロクサマー２３７（Ｐ２３７）、ポロクサマー２３８（Ｐ２３８）、ポロクサマー２８２（Ｐ２８２）、ポロクサマー２８４（Ｐ２８４）、ポロクサマー２８８（Ｐ２８８）、ポロクサマー３３１（Ｐ３３１）、ポロクサマー３３３（Ｐ３３３）、ポロクサマー３３４（Ｐ３３４）、ポロクサマー３３５（Ｐ３３５）、ポロクサマー３３８（Ｐ３３８）、ポロクサマー４０１（Ｐ４０１）、ポロクサマー４０２（Ｐ４０２）、ポロクサマー４０３（Ｐ４０３）、ポロクサマー４０７（Ｐ４０７）、およびそれらの組合せからなる群から選択される。

【0069】

ある特定の実施形態では、ポロクサマーはポロクサマー１８８（Ｐ１８８）である。

【0070】

ある特定の実施形態では、ポロクサマーはポロクサマー４０７（Ｐ４０７）である。

【0071】

ある特定の実施形態では、界面活性剤はポリソルベートである。

【0072】

ある特定の実施形態では、ポリソルベートは、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、およびそれらの組合せからなる群から選択される。

【0073】

ある特定の実施形態では、界面活性剤の濃度は、０．０１％（ｗ／ｖ）～０．１％（ｗ／ｖ）の間である。

【0074】

ある特定の実施形態では、界面活性剤の濃度は、約０．０３％（ｗ／ｖ）、約０．０５％（ｗ／ｖ）、約０．０７％（ｗ／ｖ）、または約０．０９％（ｗ／ｖ）である。

【0075】

ある特定の実施形態では、炭水化物の濃度は、０．５％（ｗ／ｖ）～５％（ｗ／ｖ）の間である。

【0076】

ある特定の実施形態では、炭水化物の濃度は、約１％（ｗ／ｖ）、約２％（ｗ／ｖ）、約３％（ｗ／ｖ）、または約４％（ｗ／ｖ）である。

【0077】

ある特定の実施形態では、炭水化物はスクロースである。

【0078】

ある特定の実施形態では、緩衝系または調製物のｐＨは、６．０～８．０の間である。

【0079】

ある特定の実施形態では、ｐＨは、６．０～７．０の間である。

【0080】

ある特定の実施形態では、ｐＨは約６．５である。

【0081】

ある特定の実施形態では、ｐＨは約７．０～約８．０である。

【0082】

ある特定の実施形態では、ｐＨは約７．３である。

【0083】

ある特定の実施形態では、組換えレンチウイルスベクターはさらに、配列番号１または配列番号２に示される第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）コード配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列を含む。

【0084】

ある特定の実施形態では、組換えレンチウイルスベクターはさらに、配列番号１または配列番号２に示される第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）コード配列を含む。

【0085】

ある特定の実施形態では、組換えレンチウイルスベクターはさらに、配列番号３に示される第ＩＸ因子（ＦＩＸ）コード配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列を含む。

【0086】

ある特定の実施形態では、組換えレンチウイルスベクターはさらに、配列番号３に示される第ＩＸ因子（ＦＩＸ）コード配列を含む。

【0087】

ある特定の実施形態では、組換えレンチウイルスベクターはさらに、強化トランスサイレチン（ＥＴ）プロモーターを含む。

【0088】

ある特定の実施形態では、組換えレンチウイルスベクターはさらに、配列番号７に示されるｍｉＲ－１４２の標的配列と少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列を含む。

【0089】

ある特定の実施形態では、組換えレンチウイルスベクターは、以下の群：ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＮＳＯ細胞、およびＣＡＰ細胞から選択されるトランスフェクト宿主細胞から単離される。

【0090】

ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ＣＤ４７陽性宿主細胞である。

【0091】

一態様では、本発明は、障害を有するヒト患者を治療する方法であって、（ａ）組換えレンチウイルスベクターの治療有効用量；（ｂ）ＴＲＩＳ非含有緩衝系；（ｃ）塩；（ｄ）界面活性剤；および（ｅ）炭水化物を含む組換えレンチウイルスベクター調製物がヒト患者に投与される方法を対象とし、ここで医薬組成物はヒト患者への全身投与に適する。

【0092】

ある特定の実施形態では、調製物は、ヒト患者に全身投与される。

【0093】

ある特定の実施形態では、調製物は静脈内投与される。

【0094】

ある特定の実施形態では、障害は出血性障害である。

【0095】

ある特定の実施形態では、出血性障害は、血友病Ａまたは血友病Ｂである。

【0096】

別の態様では、（ａ）組換えレンチウイルスベクターの治療有効用量；（ｂ）ＴＲＩＳ非含有緩衝系；（ｃ）塩；（ｄ）界面活性剤；および（ｅ）炭水化物を含む組換えレンチウイルスベクター調製物が提供され、ここで緩衝系または調製物のｐＨは約６．０～約７．５であり、医薬組成物はヒト患者への全身投与に適する。

【0097】

ある特定の例示的な実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む。

【0098】

ある特定の例示的な実施形態では、緩衝系は、リン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液を含む。ある特定の例示的な実施形態では、リン酸緩衝液の濃度は、約５ｍＭ～約３０ｍＭである。ある特定の例示的な実施形態では、リン酸緩衝液の濃度は、約１０ｍＭ～約２０ｍＭ、約１０ｍＭ～約１５ｍＭ、約２０ｍＭ～約３０ｍＭ、約２０ｍＭ～約２５ｍＭ、または約１５ｍＭ～約２０ｍＭである。ある特定の例示的な実施形態では、ヒスチジン緩衝液の濃度は、約５ｍＭ～約３０ｍＭである。ある特定の例示的な実施形態では、ヒスチジン緩衝液の濃度は、約１０ｍＭ～約２０ｍＭ、約１０ｍＭ～約１５ｍＭ、約２０ｍＭ～約３０ｍＭ、約２０ｍＭ～約２５ｍＭ、または約１５ｍＭ～約２０ｍＭである。

【0099】

ある特定の例示的な実施形態では、塩の濃度は、約８０ｍＭ～約１５０ｍＭである。ある特定の例示的な実施形態では、塩の濃度は、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１３０ｍＭ、または約１５０ｍＭである。ある特定の例示的な実施形態では、塩は塩化物塩である。ある特定の例示的な実施形態では、塩化物塩はＮａＣｌである。

【0100】

ある特定の例示的な実施形態では、界面活性剤はポロクサマーである。ある特定の例示的な実施形態では、ポロクサマーは、ポロクサマー１０１（Ｐ１０１）、ポロクサマー１０５（Ｐ１０５）、ポロクサマー１０８（Ｐ１０８）、ポロクサマー１２２（Ｐ１２２）、ポロクサマー１２３（Ｐ１２３）、ポロクサマー１２４（Ｐ１２４）、ポロクサマー１８１（Ｐ１８１）、ポロクサマー１８２（Ｐ１８２）、ポロクサマー１８３（Ｐ１８３）、ポロクサマー１８４（Ｐ１８４）、ポロクサマー１８５（Ｐ１８５）、ポロクサマー１８８（Ｐ１８８）、ポロクサマー２１２（Ｐ２１２）、ポロクサマー２１５（Ｐ２１５）、ポロクサマー２１７（Ｐ２１７）、ポロクサマー２３１（Ｐ２３１）、ポロクサマー２３４（Ｐ２３４）、ポロクサマー２３５（Ｐ２３５）、ポロクサマー２３７（Ｐ２３７）、ポロクサマー２３８（Ｐ２３８）、ポロクサマー２８２（Ｐ２８２）、ポロクサマー２８４（Ｐ２８４）、ポロクサマー２８８（Ｐ２８８）、ポロクサマー３３１（Ｐ３３１）、ポロクサマー３３３（Ｐ３３３）、ポロクサマー３３４（Ｐ３３４）、ポロクサマー３３５（Ｐ３３５）、ポロクサマー３３８（Ｐ３３８）、ポロクサマー４０１（Ｐ４０１）、ポロクサマー４０２（Ｐ４０２）、ポロクサマー４０３（Ｐ４０３）、ポロクサマー４０７（Ｐ４０７）、およびそれらの組合せからなる群から選択される。ある特定の例示的な実施形態では、ポロクサマーはポロクサマー１８８（Ｐ１８８）である。ある特定の例示的な実施形態では、ポロクサマーはポロクサマー４０７（Ｐ４０７）である。

【0101】

ある特定の例示的な実施形態では、界面活性剤はポリソルベートである。ある特定の例示的な実施形態では、ポリソルベートは、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、およびそれらの組合せからなる群から選択される。ある特定の例示的な実施形態では、界面活性剤の濃度は、約０．０１％（ｗ／ｖ）～約０．１％（ｗ／ｖ）である。ある特定の例示的な実施形態では、界面活性剤の濃度は、約０．０３％（ｗ／ｖ）、約０．０５％（ｗ／ｖ）、約０．０７％（ｗ／ｖ）、または約０．０９％（ｗ／ｖ）である。

【0102】

ある特定の例示的な実施形態では、炭水化物の濃度は、約０．５％（ｗ／ｖ）～約５％（ｗ／ｖ）である。ある特定の例示的な実施形態では、炭水化物の濃度は、約１％（ｗ／ｖ）、約２％（ｗ／ｖ）、約３％（ｗ／ｖ）、または約４％（ｗ／ｖ）である。ある特定の例示的な実施形態では、炭水化物はスクロースである。

【0103】

ある特定の例示的な実施形態では、調製物は、（ａ）組換えレンチウイルスベクターの治療有効用量；（ｂ）約１０ｍＭのリン酸塩；（ｃ）約１００ｍＭの塩化ナトリウム；（ｄ）約０．０５％（ｗ／ｖ）のポロクサマー１８８；および（ｅ）約３％（ｗ／ｖ）のスクロースを含み、調製物のｐＨは約７．３であり、医薬組成物はヒト患者への全身投与に適する。

【0104】

ある特定の例示的な実施形態では、調製物は、（ａ）組換えレンチウイルスベクターの治療有効用量；（ｂ）約１０ｍＭのリン酸塩；（ｃ）約１３０ｍＭの塩化ナトリウム；（ｄ）約０．０５％（ｗ／ｖ）のポロクサマー１８８；および（ｅ）約１％（ｗ／ｖ）のスクロースを含み、調製物のｐＨは約７．３であり、医薬組成物はヒト患者への全身投与に適する。

【0105】

ある特定の例示的な実施形態では、調製物は、（ａ）組換えレンチウイルスベクターの治療有効用量；（ｂ）約２０ｍＭヒスチジン；（ｃ）約１００ｍＭの塩化ナトリウム；（ｄ）約０．０５％（ｗ／ｖ）のポロクサマー１８８；および（ｅ）約３％（ｗ／ｖ）のスクロースを含み、調製物のｐＨは約６．５であり、医薬組成物はヒト患者への全身投与に適する。

【0106】

ある特定の例示的な実施形態では、調製物は（ａ）組換えレンチウイルスベクターの治療有効用量；（ｂ）約１０ｍＭのリン酸塩；（ｃ）約１００ｍＭの塩化ナトリウム；（ｄ）約０．０５％（ｗ／ｖ）のポロクサマー１８８；および（ｅ）約３％（ｗ／ｖ）のスクロースを含み、調製物のｐＨは約７．０であり、医薬組成物はヒト患者への全身投与に適する。

【0107】

ある特定の例示的な実施形態では、調製物は、（ａ）組換えレンチウイルスベクターの治療有効用量；（ｂ）約２０ｍＭヒスチジン；（ｃ）約１００ｍＭの塩化ナトリウム；（ｄ）約０．０５％（ｗ／ｖ）のポロクサマー１８８；および（ｅ）約３％（ｗ／ｖ）のスクロースを含み、調製物のｐＨは約７．０であり、医薬組成物はヒト患者への全身投与に適する。

【0108】

ある特定の例示的な実施形態では、組換えレンチウイルスベクターは、配列番号１または配列番号２に示される第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）コード配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸を含む。ある特定の例示的な実施形態では、組換えレンチウイルスベクターは、配列番号１または配列番号２に示される第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）コード配列を含む核酸を含む。ある特定の例示的な実施形態では、組換えレンチウイルスベクターは、配列番号１または配列番号２に示される第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）コード配列からなる核酸を含む。

【0109】

ある特定の例示的な実施形態では、組換えレンチウイルスベクターは、配列番号３に示される第ＩＸ因子（ＦＩＸ）コード配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一なヌクレオチド配列を含む核酸を含む。ある特定の例示的な実施形態では、組換えレンチウイルスベクターは、配列番号３に示される第ＩＸ因子（ＦＩＸ）コード配列を含む核酸を含む。ある特定の例示的な実施形態では、組換えレンチウイルスベクターは、配列番号３に示される第ＩＸ因子（ＦＩＸ）コード配列からなる核酸を含む。

【0110】

ある特定の例示的な実施形態では、組換えレンチウイルスベクターは、強化トランスサイレチン（ＥＴ）プロモーターを含む。

【0111】

ある特定の例示的な実施形態では、組換えレンチウイルスベクターはさらに、配列番号７に示されるｍｉＲ－１４２の標的配列と少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列を含む。

【0112】

ある特定の例示的な実施形態では、組換えレンチウイルスベクターは、以下の群：ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＮＳＯ細胞、およびＣＡＰ細胞から選択されるトランスフェクト宿主細胞から単離される。ある特定の例示的な実施形態では、宿主細胞は、ＣＤ４７陽性宿主細胞である。

【0113】

別の態様では、障害を有するヒト患者を治療する方法であって、本明細書に記載の組換えレンチウイルスベクター調製物をヒト患者に投与する工程を含む方法が提供される。

【0114】

ある特定の例示的な実施形態では、調製物は、ヒト患者に全身投与される。ある特定の例示的な実施形態では、調製物は静脈内投与される。

【0115】

ある特定の例示的な実施形態では、障害は出血性障害である。ある特定の例示的な実施形態では、出血性障害は、血友病Ａまたは血友病Ｂである。

【0116】

本発明の前記および他の特徴および利点は、添付の図面と併せて行う例示的な実施形態の以下の詳細な説明から、より完全に理解されるであろう。本特許ファイルまたは出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を含む本特許または特許出願公開の写しは、請求に応じて、必要な手数料が支払われた場合に、所轄庁により提供される。

【図面の簡単な説明】

【0117】

【図1】リン酸ビヒクル（１０ｍＭリン酸塩、１００ｍＭ ＮａＣｌ、３％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｐ１８８、ｐＨ ７．３）中への処理後のレンチウイルスベクター（ＬＶ）製剤の特性決定を描写したグラフである。原体（ＤＳ）プールは明瞭な単量体ピークを示し、これは最終的なビヒクル緩衝液への限外濾過／透析濾過の後（タンジェンシャルフロー濾過－ＴＦＦの後）には、より大きなサイズの方に幾分移行し、より大きな一部の粒子の存在がみられる。理論に拘束されるわけではないが、これは材料を処理するストレスの間の粒子の物理的分解に起因する可能性がある。０．２２μｍサイズのフィルター膜を通して濾過した最終的なＤＰでは、プロファイルが処理開始時のＤＳプールに一致するように復帰する。ＴＦＦストレスの影響は、図２Ａ～図２Ｂに示す写真に画像として認めることができる。

【図2】図２Ａ～図２Ｂは、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）後（図２Ａ）および最終的な原体（ＤＳ）プール（図２Ｂ）における、リン酸ビヒクル（１０ｍＭリン酸塩、１００ｍＭ ＮａＣｌ、３％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｐ１８８、ｐＨ ７．３）中のレンチウイルスベクター（ＬＶ）に対する無菌濾過の影響の写真である。

【図3】図３Ａ～図３Ｂは、ｐ２４ ＥＬＩＳＡを使用したｐ２４濃度によって測定した、１％（ｗ／ｖ）Ｐ１８８の添加を伴わない場合（図３Ａ）および１％（ｗ／ｖ）Ｐ１８８の添加を伴う場合（図３Ｂ）の、ビヒクルＴＳＳＭ（２０ｍＭ ＴＲＩＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１％（ｗ／ｖ）スクロース、１％（ｗ／ｖ）マンニトール、ｐＨ ７．３）中でのレンチウイルスベクター（ＬＶ）の安定性を描写したグラフである。

【図4】ＮａｎｏＳｉｇｈｔを使用した粒子濃度および粒子径によって測定した、撹拌後のビヒクルＴＳＳＭ（２０ｍＭ ＴＲＩＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１％（ｗ／ｖ）スクロース、１％（ｗ／ｖ）マンニトール、ｐＨ ７．３）中のレンチウイルスベクター（ＬＶ）の安定性を描写したグラフである。ポロクサマー１８８（Ｐ１８８）の存在下および非存在下で示される、ＴＳＳＭ製剤：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１％（ｗ／ｖ）スクロース、１％（ｗ／ｖ）マンニトール、ｐＨ ７．３を使用した安定性試験。測定はＮａｎｏＳｉｇｈｔを使用して行った。

【図5】図５Ａ～図５Ｂは、ＮａｎｏＳｉｇｈｔを使用した粒子濃度および粒子径によって測定した、撹拌後のビヒクルＴＳＳＭ（２０ｍＭ ＴＲＩＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１％（ｗ／ｖ）スクロース、１％（ｗ／ｖ）マンニトール、ｐＨ ７．３）中のレンチウイルスベクター（ＬＶ）の安定性を描写したグラフである。図５Ａは、撹拌ストレスに応じて、レンチウイルス粒子のサイズが幾分増したように見えることを示している。主ピークは単量体レンチウイルスベクター（約１３０ｎｍ）であると推定され、より小さい大型のピークは単量体粒子の分解によると考えられる。図５Ｂは、１％（ｗ／ｖ）ポロクサマー１８８（Ｐ１８８）の添加がレンチウイルス粒子に干渉しなかったことを示す。

【図6】図６Ａ～図６Ｂは、ｄｄＰＣＲを使用したＴＵ／ｍｌ単位（図６Ａ）およびＴ０に対する％（図６Ｂ）としての機能的力価によって測定した、３７℃での０日、３日間、７日間および１４日間にわたる、ビヒクルＴＳＳＭ（２０ｍＭ ＴＲＩＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１％（ｗ／ｖ）スクロース、１％（ｗ／ｖ）マンニトール、ｐＨ ７．３）中のレンチウイルスベクター（ＬＶ）の安定性を描写したグラフである。図６Ｂは、時間０に対して標準化している。各群のバーは、希釈系列：非希釈（希釈なし）、２０倍希釈（２０×）、１００倍希釈（１００×）を表す。

【図7】図７Ａ～図７Ｂは、ｄｄＰＣＲを使用したＴＵ／ｍｌ単位での機能的力価、およびＮａｎｏＳｉｇｈｔを使用した粒子濃度（図７Ａ）または機能的力価とｐ２４データの重ね合わせ（図７Ｂ）によって測定した、３７℃での０日、３日間、７日間および１４日間にわたる、ビヒクルＴＳＳＭ（２０ｍＭ ＴＲＩＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１％（ｗ／ｖ）スクロース、１％（ｗ／ｖ）マンニトール、ｐＨ ７．３）中でのレンチウイルスベクター（ＬＶ）の安定性を描写したグラフである。

【図8】図８Ａは、Ｎａｎｏｓｉｇｈｔを使用した粒子濃度および粒子径によって測定した、日および週の単位でのインキュベーション時間に応じた、３７℃でのビヒクルＴＳＳＭ（２０ｍＭ ＴＲＩＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１％（ｗ／ｖ）スクロース、１％（ｗ／ｖ）マンニトール、ｐＨ ７．３）中のレンチウイルスベクター（ＬＶ）の安定性を描写したグラフである。図８Ｂは、経時的な粒子径の差異をより明瞭に見るための、対数尺度での３７℃安定性実験の結果を報告しているグラフである。

【図9】ｄｄＰＣＲを使用したＴ０に対する％としての機能的力価およびｐ２４ ＥＬＩＳＡを使用したｐ２４濃度によって測定した、日単位でのインキュベーション時間、インキュベーション温度、撹拌、および凍結／解凍（Ｆ／Ｔ）サイクルに応じた、ビヒクルリン酸製剤（１０ｍＭリン酸塩、１００ｍＭ ＮａＣｌ、３％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｐ１８８、ｐＨ ７．３）中のレンチウイルスベクター（ＬＶ）の安定性を描写したグラフである。

【図10】図１０Ａ～図１０Ｂは、ＮａｎｏＳｉｇｈｔを使用した粒子濃度および粒子径分布によって測定した、日単位での時間に応じた、リン酸製剤（１０ｍＭリン酸塩、１００ｍＭ ＮａＣｌ、３％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｐ１８８、ｐＨ ７．３）を使用した３７℃でのレンチウイルスベクター（ＬＶ）の安定性を描写したグラフである。図１０Ａは、分解ピークの差異をより見やすくするために、１に対して標準化したＮａｎｏＳｉｇｈｔデータを報告している。図１０Ｂは、３７℃インキュベーションでの経時的な単量体ピークの減少を示す生データを提示している。

【図11】図１１Ａ～図１１Ｂは、ｄｄＰＣＲを使用した機能的力価によって測定した、５サイクルおよび１０サイクルの凍結および解凍（Ｆ／Ｔ）を行い（図１１Ａ）、室温（ＲＴ）および撹拌（オービタルシェーカー、３５０ｒｐｍ）を伴うＲＴで３日間比較（図１１Ｂ）した、３種類の製剤：製剤１．リン酸製剤：１０ｍＭリン酸塩、１００ｍＭ ＮａＣｌ、３％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｐ１８８、ｐＨ ７．３；製剤２．１０ｍＭリン酸塩、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、１％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｐ１８８、ｐＨ ７．３；製剤３．２０ｍＭヒスチジン、１００ｍＭ ＮａＣｌ、３％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｐ１８８、ｐＨ ６．５を比較した、レンチウイルスベクター（ＬＶ）の安定性を描写したグラフである。

【図12】図１２Ａ～図１２Ｂは、ＮａｎｏＳｉｇｈｔを使用する粒子数によって測定した、３種類の製剤：製剤１（Ｐｈｏｓ）．リン酸製剤：１０ｍＭリン酸塩、１００ｍＭ ＮａＣｌ、３％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｐ１８８、ｐＨ ７．３；製剤２（Ｐｈｏｓ．ｈｉｇｈｅｒＳａｌｔ）．１０ｍＭリン酸塩、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、１％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｐ１８８、ｐＨ ７．３；製剤３（Ｈｉｓｔ）．２０ｍＭヒスチジン、１００ｍＭ ＮａＣｌ、３％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｐ１８８、ｐＨ ６．５を比較した、レンチウイルスベクター（ＬＶ）の安定性を描写したグラフである。図１２Ａは、室温（ＲＴ）および撹拌（オービタルシェーカー、３５０ｒｐｍ）を伴うＲＴでの３日間のデータを示し、一方、図１２Ｂは、５サイクルおよび１０サイクルの凍結および解凍（Ｆ／Ｔ）に関するデータを示している。

【図13】ＩＶバッグに対して室温で６時間曝露させた１つの製剤：製剤１（リン酸緩衝液）：１０ｍＭリン酸塩、１００ｍＭ ＮａＣｌ、３％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｐ１８８、ｐＨ ７．３を用いる、模擬実用安定性試験を描写したグラフである。

【図14】１回の凍結および解凍サイクル（－８０℃で一晩、３７℃水浴中で解凍）での容器閉鎖（Ｓｃｈｏｔｔ １型ガラス製バイアルおよびＷｅｓｔ ＣＺ ＣＯＰバイアル）の性能を比較する製剤化緩衝液安定性試験を描写したグラフである：製剤１（リン酸緩衝液）：１０ｍＭリン酸塩、１００ｍＭ ＮａＣｌ、３％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｐ１８８、ｐＨ ７．３。粒子濃度は、Ｍｉｃｒｏｆｌｏｗ Ｉｍａｇｉｎｇ（ＭＦＩ）を使用して入手した。

【図15】１回の凍結および解凍サイクル（－８０℃、３７℃水浴中で解凍）による、Ｓｃｈｏｔｔ １型ガラス製バイアルを使用したバイアル歪み試験を描写したグラフである：製剤１（リン酸緩衝液のみ）：１０ｍＭリン酸塩、１００ｍＭ ＮａＣｌ、３％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｐ１８８、ｐＨ ７．３。データは、歪みゲージおよび熱電対を使用して収集した。

【図16-1】図１６Ａ～図１６Ｃは様々な安定性条件に対する、容器閉鎖（Ｓｃｈｏｔｔ １型ガラス製バイアルおよびＷｅｓｔ ＣＺバイアル）性能を比較するＬＶＶ材料適合性を描写したグラフであり、１ＦＴ＝１サイクルの凍結および解凍；２ｈｒ＝室温への２時間の曝露；発泡×３回は、ピペットでの激しい吸引および吐出を行って容器内に視認しうる泡を生じさせることである；１０ｘは、１０倍希釈と同じ安定性パラメーターである。ＬＶＶは製剤１（リン酸緩衝液）：１０ｍＭリン酸塩、１００ｍＭ ＮａＣｌ、３％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｐ１８８、ｐＨ ７．３．とし、機能的力価（図１６Ａ）、ｐ２４濃度（図１６Ｂ）、および粒子濃度（図１６Ｃ）によって測定した。データは、歪みゲージおよび熱電対を使用して収集した。粒子濃度は、ＮａｎｏＳｉｇｈｔを使用して入手した。

【図16-2】図１６－１の続き。

【図17】１０サイクルの凍結および解凍（Ｆ／Ｔ）にわたって２つの製剤を比較し、室温（ＲＴ）で１日間および３日間を比較した、安定性試験を描写したグラフである：製剤１（リン酸緩衝液）：１０ｍＭリン酸塩、１００ｍＭ ＮａＣｌ、３％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｐ１８８、ｐＨ ７．３；製剤３（ヒスチジン緩衝液）。２０ｍＭヒスチジン、１００ｍＭ ＮａＣｌ、３％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｐ１８８、ｐＨ ６．５。

【図18】リン酸製剤およびヒスチジン製剤について、長期安定性（－８０℃で凍結貯蔵した９カ月の時点（９ ｍｏ．））データを描写したグラフである：製剤１（リン酸）：１０ｍＭリン酸塩、１００ｍＭ ＮａＣｌ、３％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｐ１８８、ｐＨ ７．３；製剤３（ヒスチジン）。２０ｍＭヒスチジン、１００ｍＭ ＮａＣｌ、３％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｐ１８８、ｐＨ ６．５。

【図19-1】図１９Ａ～１９Ｄは、機能的力価（図１９Ａ）、標準化機能的力価（図１９Ｂ）、ｐ２４濃度（図１９Ｃ）、および粒子濃度（図１９Ｄ）によって測定して、同じｐＨであるｐＨ ７．０でリン酸緩衝液およびヒスチジン緩衝液を比較した安定性試験を描写したグラフである：製剤４（リン酸）：１０ｍＭリン酸塩、１００ｍＭ ＮａＣｌ、３％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｐ１８８、ｐＨ ７．０；製剤５（ヒスチジン）。２０ｍＭヒスチジン、１００ｍＭ ＮａＣｌ、３％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｐ１８８、ｐＨ ７．０。結果は、機能的力価の単位で、および出発材料（Ｔ０）に対するパーセンテージとして標準化して示している。粒子濃度は、ＮａｎｏＳｉｇｈｔを使用して入手した。

【図19-2】図１９－１の続き。

【発明を実施するための形態】

【0118】

本開示は、とりわけ、組換えＬＶを含むレンチウイルスベクター（ＬＶ）の調製物（製剤）および医薬組成物を提供する。本開示はまた、ＬＶ調製物を使用して、血友病Ａまたは血友病Ｂなどの出血性障害を含む障害を有する対象を治療する方法も提供する。本開示はさらに、ＬＶ調製物を製造するための工程も提供する。

【0119】

一般に、本明細書において細胞培養および組織培養、分子生物学、生物物理学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質化学および核酸化学に関連して使用される命名法は、当技術分野において周知であり、一般的に使用されるものである。本明細書中に提供される方法および手法は、別の指示がない限り、一般に、本明細書の全体にわたって引用および考察される様々な一般的およびより特定的な参考文献に記載される、当技術分野において周知の従来法に従って実施される。酵素反応および精製手法は、製造元の仕様書に従って、当技術分野において一般的に遂行されるように、または本明細書に記載されるように実施される。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、ならびにそれらの医薬品化学および製薬化学に関連して使用される命名法、ならびにそれらの検査手順および手法は、当技術分野において周知であり、一般的に使用される。化学合成、化学分析、医薬品調製、製剤化、および送達、ならびに患者の治療には、標準的な手法が使用される。

【0120】

本明細書で別に定義しない限り、本明細書中で使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有する。何らかの潜在的な曖昧性がある場合には、本明細書中に提供される定義が、あらゆる辞書または付帯的な定義よりも優先される。文脈によって必要とされない限り、単数形の語は複数形を含み、複数形の語は単数形を含むものとする。別に明記する場合を除き、「または」の使用は、「および／または」を意味する。「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語の使用は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などの他の形態と同様に、限定的ではない。

【0121】

本発明がより容易に理解されるように、ある特定の用語をまず定義する。

【0122】

本明細書で用いる場合、「ベクター」という用語は、核酸のクローニングおよび／または宿主細胞への移入のための任意のビヒクルを指す。ベクターは、別の核酸セグメントを結びつけて、結びついたセグメントの複製をもたらすことができるレプリコンであってよい。「レプリコン」は、インビボでの自律的複製単位として機能する、すなわち、それ自身の制御下での複製が可能である、任意の遺伝子エレメント（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）を指す。「ベクター」と言う用語は、インビトロ、エクスビボまたはインビボで核酸を細胞に導入するためのウイルス性ビヒクルおよび非ウイルス性ビヒクルの両方を含む。例えば、プラスミド、改変真核生物ウイルス、または改変細菌ウイルスを含む多数のベクターが、当技術分野において公知であり、使用される。適するベクターへのポリヌクレオチドの挿入は、相補的な付着末端を有する選択されたベクター中に、適切なポリヌクレオチド断片をライゲートすることによって実現することができる。

【0123】

本明細書で用いる場合、「組換えレンチウイルスベクター」という語句は、パッケージング構成要素の存在下で、標的細胞を感染させ得るウイルス粒子へのＲＮＡゲノムのパッケージングを可能にする十分なレンチウイルス遺伝情報を有するベクターを指す。標的細胞の感染は、逆転写および標的細胞ゲノムへの組み込みを含み得る。組換えレンチウイルスベクターは、ベクターによって標的細胞に送達されることになる非ウイルス性コード配列を保有する。組換えレンチウイルスベクターは、最終的な標的細胞内で独立に複製して感染性レンチウイルス粒子を生成することが不可能である。通常、組換えレンチウイルスベクターは、機能的なｇａｇ－ｐｏｌおよび／またはｅｎｖ遺伝子および／または複製のために必須な他の遺伝子を欠く。本発明のベクターを、分割イントロンベクターとして構成することもできる。

【0124】

本明細書で用いる場合、「治療する」という用語は、障害の１つまたはそれ以上の症状の改善または軽減を指す。治療することが、治癒である必要はない。

【0125】

本明細書で用いる場合、「ヒト患者」という用語は、疾患または障害を有し、この疾患または障害に対する治療を必要とするヒトを指す。

【0126】

本明細書で用いる場合、「全身投与する」という語句は、ＬＶが対象の血流に直接導入されるように、ＬＶを含む医薬組成物を対象に処方するかまたは与えることを指す。全身投与の経路の例としては、静脈内、例えば、静脈内注射および静脈内注入、例えば、中心静脈アクセスを介するものが挙げられるが、これらに限定されない。

【0127】

本明細書で用いる場合、「約」という用語は、特定の記載された数値を参照して使用される場合、その値が、記載された値の１０％を超えない範囲で変化し得ることを意味する。例えば、本明細書中で使用する場合、「約１００」という表現は、９０および１１０、ならびにその間にあるすべての値（例えば、９０、９１、９２、９３、９４、９５など）を含む。

【0128】

Ａ．ＴＲＩＳ非含有緩衝系を含むレンチウイルスベクター（ＬＶ）の製剤
一態様では、本発明は、（ａ）組換えレンチウイルスベクターの有効用量；（ｂ）ＴＲＩＳ非含有緩衝系；（ｃ）塩；（ｄ）界面活性剤；および（ｅ）炭水化物を含む組換えレンチウイルスベクター調製物を対象とし、ここで医薬組成物はヒト患者への全身投与に適する。ある特定の実施形態では、ベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、緩衝系のｐＨは、約６．０～約８．０である。ある特定の実施形態では、緩衝系のｐＨは、約６．０～約７．５である。ある特定の実施形態では、緩衝系のｐＨは、約６．０～約７．０である。ある特定の実施形態では、緩衝系のｐＨは、約６．０～約８．０である。ある特定の実施形態では、緩衝系のｐＨは約６．５である。ある特定の実施形態では、緩衝系のｐＨは約７．３である。ある特定の実施形態では、緩衝系はリン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液である。ある特定の実施形態では、リン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液の濃度は、約５ｍＭ～約３０ｍＭである。ある特定の実施形態では、リン酸緩衝液の濃度は、約１０ｍＭ～約２０ｍＭ、約１０ｍＭ～約１５ｍＭ、約２０ｍＭ～約３０ｍＭ、約２０ｍＭ～約２５ｍＭ、または約１５ｍＭ～約２０ｍＭである。ある特定の実施形態では、塩は塩化物塩である。ある特定の実施形態では、塩化物塩の濃度は、約８０ｍＭ～約１５０ｍＭである。ある特定の実施形態では、塩の濃度は、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１３０ｍＭ、または約１５０ｍＭである。ある特定の実施形態では、界面活性剤は、ポロクサマーまたはポリソルベートである。ある特定の実施形態では、ポロクサマーまたはポリソルベートの濃度は、約０．０１％（ｗ／ｖ）～約０．１％（ｗ／ｖ）である。ある特定の実施形態では、炭水化物はスクロースである。ある特定の実施形態では、炭水化物の濃度は、約０．５％（ｗ／ｖ）～約５％（ｗ／ｖ）である。ある特定の実施形態では、塩化物塩は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）である。ある特定の実施形態では、ポロクサマーは、ポロクサマー１０１（Ｐ１０１）、ポロクサマー１０５（Ｐ１０５）、ポロクサマー１０８（Ｐ１０８）、ポロクサマー１２２（Ｐ１２２）、ポロクサマー１２３（Ｐ１２３）、ポロクサマー１２４（Ｐ１２４）、ポロクサマー１８１（Ｐ１８１）、ポロクサマー１８２（Ｐ１８２）、ポロクサマー１８３（Ｐ１８３）、ポロクサマー１８４（Ｐ１８４）、ポロクサマー１８５（Ｐ１８５）、ポロクサマー１８８（Ｐ１８８）、ポロクサマー２１２（Ｐ２１２）、ポロクサマー２１５（Ｐ２１５）、ポロクサマー２１７（Ｐ２１７）、ポロクサマー２３１（Ｐ２３１）、ポロクサマー２３４（Ｐ２３４）、ポロクサマー２３５（Ｐ２３５）、ポロクサマー２３７（Ｐ２３７）、ポロクサマー２３８（Ｐ２３８）、ポロクサマー２８２（Ｐ２８２）、ポロクサマー２８４（Ｐ２８４）、ポロクサマー２８８（Ｐ２８８）、ポロクサマー３３１（Ｐ３３１）、ポロクサマー３３３（Ｐ３３３）、ポロクサマー３３４（Ｐ３３４）、ポロクサマー３３５（Ｐ３３５）、ポロクサマー３３８（Ｐ３３８）、ポロクサマー４０１（Ｐ４０１）、ポロクサマー４０２（Ｐ４０２）、ポロクサマー４０３（Ｐ４０３）、ポロクサマー４０７（Ｐ４０７）、およびそれらの組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ポリソルベートは、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、およびそれらの組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、リン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液のｐＨは、約６．１、約６．３、約６．５、約６．７、約６．９、約７．１、約７．３、約７．５、約７．７、または約７．９である。ある特定の実施形態では、リン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液の濃度は、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、または約２５ｍＭである。ある特定の実施形態では、塩化物塩は、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１３０ｍＭ、または約１５０ｍＭである。ある特定の実施形態では、ポロクサマーまたはポリソルベートの濃度は、約０．０３％（ｗ／ｖ）、約０．０５％（ｗ／ｖ）、約０．０７％（ｗ／ｖ）、または約０．０９％（ｗ／ｖ）である。ある特定の実施形態では、炭水化物の濃度は、約１％（ｗ／ｖ）、約２％（ｗ／ｖ）、約３％（ｗ／ｖ）、または約４％（ｗ／ｖ）である。ある特定の実施形態では、ポロクサマーはポロクサマー１８８（Ｐ１８８）である。ある特定の実施形態では、ポロクサマーはポロクサマー４０７（Ｐ４０７）である。

【0129】

ある特定の実施形態では、本開示は、（ａ）組換えレンチウイルスベクターの治療有効用量；（ｂ）約１０ｍＭのリン酸塩；（ｃ）約１００ｍＭの塩化ナトリウム；（ｄ）約０．０５％（ｗ／ｖ）のポロクサマー１８８；および（ｅ）約３％（ｗ／ｖ）のスクロースを含む組換えレンチウイルスベクター調製物を提供し、ここで調製物のｐＨは約７．３であり、医薬組成物はヒト患者への全身投与に適する。

【0130】

ある特定の実施形態では、本開示は、（ａ）組換えレンチウイルスベクターの治療有効用量；（ｂ）約１０ｍＭのリン酸塩；（ｃ）約１３０ｍＭの塩化ナトリウム；（ｄ）約０．０５％（ｗ／ｖ）のポロクサマー１８８；および（ｅ）約１％（ｗ／ｖ）のスクロースを含む組換えレンチウイルスベクター調製物を提供し、ここで調製物のｐＨは約７．３であり、医薬組成物はヒト患者への全身投与に適する。

【0131】

ある特定の実施形態では、本開示は、（ａ）組換えレンチウイルスベクターの治療有効用量；（ｂ）約２０ｍＭヒスチジン；（ｃ）約１００ｍＭの塩化ナトリウム；（ｄ）約０．０５％（ｗ／ｖ）のポロクサマー１８８；および（ｅ）約３％（ｗ／ｖ）のスクロースを含む組換えレンチウイルスベクター調製物を提供し、ここで調製物のｐＨは約６．５であり、医薬組成物はヒト患者への全身投与に適する。

【0132】

ある特定の実施形態では、本開示は、（ａ）組換えレンチウイルスベクターの治療有効用量；（ｂ）約１０ｍＭのリン酸塩；（ｃ）約１００ｍＭの塩化ナトリウム；（ｄ）約０．０５％（ｗ／ｖ）のポロクサマー１８８；および（ｅ）約３％（ｗ／ｖ）のスクロースを含む組換えレンチウイルスベクター調製物を提供し、ここで調製物のｐＨは約７．０であり、医薬組成物はヒト患者への全身投与に適する。

【0133】

ある特定の実施形態では、本開示は、（ａ）組換えレンチウイルスベクターの治療有効用量；（ｂ）約２０ｍＭヒスチジン；（ｃ）約１００ｍＭの塩化ナトリウム；（ｄ）約０．０５％（ｗ／ｖ）のポロクサマー１８８；および（ｅ）約３％（ｗ／ｖ）のスクロースを含む組換えレンチウイルスベクター調製物を提供し、ここで調製物のｐＨは約７．０であり、医薬組成物はヒト患者への全身投与に適する。

【0134】

Ａ．１．レンチウイルスベクター
レンチウイルスベクターは、より大きな群であるレトロウイルスベクターの一部である（Ｃｏｆｆｉｎら（１９９７年）、「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ Ｅｄｓ：Ｊ Ｍ Ｃｏｆｆｉｎ、Ｓ Ｍ Ｈｕｇｈｅｓ、Ｈ Ｅ Ｖａｒｍｕｓ ７５８～７６３頁）。霊長類レンチウイルスの例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。レンチウイルスファミリーは、レンチウイルスが分裂細胞および非分裂細胞の両方を感染させる能力を有する点で、レトロウイルスとは異なる（Ｌｅｗｉｓら（１９９２年）；ＬｅｗｉｓおよびＥｍｅｒｍａｎ（１９９４年））。

【0135】

レンチウイルスベクターは、本明細書中で使用する場合、レンチウイルスに由来し得る少なくとも１つの構成部分を含むベクターである。好ましくは、その構成部分は、ベクターが細胞を感染させる、遺伝子を発現する、または複製される生物学的機構に関与する。組換えレンチウイルスベクターでは、複製のために必須である１つまたはそれ以上のタンパク質コード領域の少なくとも一部をウイルスから除去することができる。このことは、ウイルスベクターを複製能欠損性にする。また、ウイルスゲノムの部分を導入遺伝子に置換して、それにより、ベクターが、標的非分裂宿主細胞の形質導入および／またはそのゲノムの宿主ゲノム中への組み込みを行えるようにしてもよい。

【0136】

組換えレンチウイルスは通常、シュードタイプ化される。シュードタイプ化は、１つまたはそれ以上の利点を付与しうる。例えば、ＨＩＶを基にしたベクターのｅｎｖ遺伝子産物は、これらのベクターが、ＣＤ４と呼ばれるタンパク質を発現する細胞のみを感染させるように制限すると考えられる。しかし、これらのベクター中のｅｎｖ遺伝子が他のＲＮＡウイルス由来のｅｎｖ配列に置き換えられると、それらはより広い感染スペクトルを有し得る（ＶｅｒｍａおよびＳｏｍｉａ（１９９７年））。ラブドウイルスの１つである水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のエンベロープ糖タンパク質（Ｇ）は、ある特定のレトロウイルスをシュードタイプ化し得ることが示されているエンベロープタンパク質である。シュードタイプ化されたＶＳＶ－Ｇベクターは、広範な哺乳動物細胞の形質導入のために使用することができる。ＶＳＶ－Ｇタンパク質などの非レンチウイルス性シュードタイプ化エンベロープを組み込むことには、ベクター粒子を、感染性を失うことなく高力価に濃縮し得るという利点がある（Ａｋｋｉｎａら（１９９６年）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：２５８１～５頁）。レンチウイルスおよびレトロウイルスのエンベロープタンパク質は、超遠心分離時の剪断力に耐えられないようであり、これはおそらく、それらが非共有結合性に連結した２つのサブユニットからなるためである。このサブユニット間の相互作用は遠心分離によって破壊される。これに比べ、ＶＳＶ糖タンパク質は単一のユニットで構成される。このため、ＶＳＶ－Ｇタンパク質のシュードタイプ化は潜在的な利点をもたらし得る。

【0137】

レンチウイルスには、ウシレンチウイルス群、ウマレンチウイルス群、ネコレンチウイルス群、ヒツジヤギレンチウイルス群、および霊長類レンチウイルス群のメンバーが含まれる。遺伝子療法のためのレンチウイルスベクターの開発は、Ｋｌｉｍａｔｃｈｅｖａら（１９９９年）、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ４：４８１～４９６頁にレビューされている。遺伝子療法に適するレンチウイルスベクターの設計および使用は、例えば、米国特許第６，２０７，４５５号および同第６，６１５，７８２号に記載されている。レンチウイルスの例には、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＨＩＶ－１／ＨＩＶ－２シュードタイプ化、ＨＩＶ－１／ＳＩＶ、ＦＩＶ、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス、およびウシ免疫不全ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。

【0138】

一部の実施形態では、本開示のレンチウイルスベクターは、「第三世代」レンチウイルスベクターである。本明細書で用いる場合、「第三世代」レンチウイルスベクターという用語は、第二世代ベクターシステムの特徴を有し、さらに機能的ｔａｔ遺伝子を欠くレンチウイルスパッケージングシステム、例えば、ｔａｔ遺伝子が欠失しているかまたは不活性化されているものを指す。典型的には、ｒｅｖをコードする遺伝子は、別個の発現構築物上に提供される。例えば、Ｄｕｌｌら（１９９８年）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８４６３～８４７１を参照のこと。本明細書で用いる場合、「第二世代」レンチウイルスベクターシステムとは、機能的アクセサリー遺伝子を欠くレンチウイルスパッケージングシステム、例えば、アクセサリー遺伝子ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、およびｎｅｆが欠失しているかまたは不活性化されているものを指す。例えば、Ｚｕｆｆｅｒｅｙら（１９９７年）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：８７１～８７５頁を参照のこと。本明細書で用いる場合、「パッケージングシステム」とは、組換えウイルスのパッケージングに関与するウイルスタンパク質をコードするウイルス構築物のセットを指す。典型的には、パッケージングシステムの構築物は、最終的にパッケージング細胞に組み込まれる。

【0139】

一部の実施形態では、本開示の第三世代レンチウイルスベクターは、自己不活性化レンチウイルスベクターである。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＶＳＶ．Ｇシュードタイプレンチウイルスベクターである。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、導入遺伝子発現のための肝細胞特異的プロモーターを含む。一部の実施形態では、肝細胞特異的プロモーターは、強化トランスサイレチンプロモーターである。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、導入遺伝子産物に対する免疫応答を低下させるためのｍｉＲ－１４２の１つまたはそれ以上の標的配列を含む。一部の実施形態では、ｍｉＲ－１４２の１つまたはそれ以上の標的配列を本開示のレンチウイルスベクターに組み込むことは、所望の導入遺伝子発現プロファイルを可能にする。例えば、ｍｉＲ－１４２の１つまたはそれ以上の標的配列を組み込むことで、血管内および血管外の造血細胞系列における導入遺伝子発現を抑制することができ、一方、非造血細胞では導入遺伝子発現が維持される。本開示のレンチウイルスベクターシステムで処置された腫瘍傾向マウスにおいて、発がんは全く検出されていない。Ｂｒｏｗｎら（２００７年）Ｂｌｏｏｄ １１０：４１４４～５２頁、Ｂｒｏｗｎら（２００６年）、Ｎａｔ．Ｎｅｄ．１２：５８５～９１頁、およびＣａｎｔｏｒｅら（２０１５年）、Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．７（２７７）：２７７ｒａ２８を参照のこと。

【0140】

本開示のレンチウイルスベクターは、特定のタンパク質、例えば本明細書に記載のＦＶＩＩＩまたはＦＩＸタンパク質をコードする導入遺伝子のコドン最適化ポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸタンパク質の最適化されたコード配列は、発現制御配列に作動可能に連結される。本明細書で使用する場合、２つの核酸配列は、それらが各構成要素の核酸配列がその機能を保持することを可能にするような様式で共有結合している場合、作動可能に連結されている。コード配列および遺伝子発現制御配列は、それらがコード配列の発現もしくは転写および／または翻訳を遺伝子発現制御配列の影響下または制御下に置くような様式で共有結合する場合、作動可能に連結されると言われる。２つのＤＮＡ配列は、５’遺伝子発現配列におけるプロモーターの誘導がコード配列の転写をもたらす場合、および２つのＤＮＡ配列間の連結の性質が、（１）フレームシフト突然変異の導入をもたらさない、（２）プロモーター領域がコード配列の転写を導く能力に干渉しない、または（３）対応するＲＮＡ転写物がタンパク質に翻訳される能力に干渉しない場合、作動可能に連結されると言われる。それ故に、遺伝子発現配列は、結果として生じる転写物が所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳されるように、遺伝子発現配列がそのコード核酸配列の転写を生じさせ得る場合には、コード核酸配列に作動可能に連結されていると考えられる。

【0141】

ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を感染させることができる組換えレンチウイルスのベクターである。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、肝臓細胞（例えば、肝細胞）を感染させることができる組換えレンチウイルスのベクターである。レンチウイルスゲノムおよびプロウイルスＤＮＡは、典型的には、レトロウイルスに見出される３つの遺伝子、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖを有し、これらには２つの長末端反復（ＬＴＲ）配列が隣接している。ｇａｇ遺伝子は内部構造（マトリックス、カプシドおよびヌクレオカプシド）タンパク質をコードし；ｐｏｌ遺伝子はＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）、プロテアーゼおよびインテグラーゼをコードし；ｅｎｖ遺伝子はウイルスのエンベロープ糖タンパク質をコードする。５’および３’ＬＴＲは、ビリオンＲＮＡの転写およびポリアデニル化を促進する働きをする。ＬＴＲは、ウイルス複製のために必要な他のすべてのシス作用性配列を含有する。レンチウイルスは、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、ｎｅｆおよびｖｐｘを含む追加の遺伝子を有する（ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２および／またはＳＩＶにおいて）。

【0142】

５’ＬＴＲには、ゲノムの逆転写のため（ｔＲＮＡプライマー結合部位）、およびウイルスＲＮＡの粒子への効率的なカプシド形成のため（Ｐｓｉ部位）に必要な配列が隣接している。カプシド形成（またはレトロウイルスＲＮＡの感染性ビリオンへのパッケージング）のために必要な配列がウイルスゲノムに欠けている場合は、シス欠損のためにゲノムＲＮＡのカプシド形成が妨げられる。

【0143】

しかし、結果として生じる突然変異体は、すべてのビリオンタンパク質の合成を導くことが可能なままである。本開示は、非分裂細胞を感染させることができる組換えレンチウイルスを作製する方法であって、パッケージング機能、すなわちｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ、ならびにｒｅｖおよびｔａｔを保有する２つまたはそれ以上のベクターを、適する宿主細胞にトランスフェクトする工程を含む方法を提供する。本明細書で以下に開示されるように、ある特定の用途のためには、機能的ｔａｔ遺伝子を欠くベクターが望ましい。それ故に、例えば、第１のベクターがウイルスｇａｇおよびウイルスｐｏｌをコードする核酸を提供し、別のベクターがウイルスｅｎｖをコードする核酸を提供することで、パッケージング細胞を生成することができる。本明細書で移入ベクターとして特定される、異種遺伝子を提供するベクターをパッケージング細胞に導入することにより、目的の外来遺伝子を保有する感染性ウイルス粒子を放出するプロデューサー細胞が生じる。

【0144】

ベクターおよび外来遺伝子の上記の構成によれば、第２のベクターは、ウイルスエンベロープ（ｅｎｖ）遺伝子をコードする核酸を提供することができる。ｅｎｖ遺伝子は、レトロウイルスを含む、ほぼあらゆる適するウイルスに由来し得る。一部の実施形態では、ｅｎｖタンパク質は、ヒトおよび他の種の細胞の形質導入を可能にする両種指向性エンベロープタンパク質である。

【0145】

レトロウイルス由来のｅｎｖ遺伝子の例としては、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶまたはＭＭＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶまたはＨＳＶ）、マウス乳がんウイルス（ＭｕＭＴＶまたはＭＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶまたはＧＡＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）が挙げられるが、これらに限定されない。他のｅｎｖ遺伝子、例えば、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）タンパク質Ｇ（ＶＳＶ－Ｇ）、肝炎ウイルスおよびインフルエンザのそれも使用することができる。一部の実施形態では、ウイルスｅｎｖ核酸配列は、本明細書の他の箇所に記載される調節配列と作動可能に関連付けられる。ある特定の実施形態では、本開示の製剤化緩衝液は、特に、ＶＳＶ－Ｇを含むレンチウイルスについて、レンチウイルス安定性を付与し、長期凍結貯蔵をもたらす。本発明の製剤化緩衝液は、特に、ＶＳＶ－Ｇを含むレンチウイルスについて、凍結および解凍ならびに高温への曝露に対するレンチウイルス安定性の強化を提供する。

【0146】

ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ベクターが非分裂細胞に形質導入する能力を損なうことなく、ＨＩＶ病原性遺伝子ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕおよびｎｅｆが欠失している。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、３’ＬＴＲのＵ３領域の欠失を含む。Ｕ３領域の欠失は、完全欠失または部分的欠失であり得る。

【0147】

一部の実施形態では、本明細書に記載のＦＶＩＩＩヌクレオチド配列を含む本開示のレンチウイルスベクターは、（ａ）ｇａｇ、ｐｏｌ、またはｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含む第１のヌクレオチド配列、ならびに（ｂ）異種ｅｎｖ遺伝子を含む第２のヌクレオチド配列を有する細胞内でトランスフェクトすることができ；ここでレンチウイルスベクターは機能的ｔａｔ遺伝子を欠く。他の実施形態では、細胞はさらに、ｒｅｖ遺伝子を含む第４のヌクレオチド配列でトランスフェクトされる。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘおよびｎｅｆ、またはそれらの組合せから選択される機能的遺伝子を欠く。

【0148】

ある特定の実施形態では、本開示のレンチウイルスベクターは、ｇａｇタンパク質、Ｒｅｖ応答エレメント、セントラルポリプリン配列（ｃＰＰＴ）、またはその任意の組合せをコードする１つまたはそれ以上のヌクレオチド配列を含む。

【0149】

一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、レンチウイルスベクターまたはコードされるＦＶＩＩＩポリペプチドの標的化および／または活性を改善する１つまたはそれ以上のポリペプチドをその表面に発現する。１つまたはそれ以上のポリペプチドは、レンチウイルスベクターによってコードされるか、または宿主細胞からのレンチウイルスベクターの出芽の間に組み込むことができる。レンチウイルスの生成の間に、ウイルス粒子は産生宿主細胞から出芽する。出芽過程の間に、ウイルス粒子は脂質コートを獲得し、それは宿主細胞の脂質膜に由来する。その結果として、ウイルス粒子の脂質コートは、宿主細胞の表面に前から存在していた膜結合ポリペプチドを含むことができる。

【0150】

一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ヒト対象への投与後のレンチウイルスベクターに対する免疫応答を阻害する、１つまたはそれ以上のポリペプチドをその表面に発現する。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの表面は、１つまたはそれ以上のＣＤ４７分子を含む。ＣＤ４７は「自己マーカー」タンパク質であり、ヒト細胞上に遍在的に発現される。ＣＤ４７の表面発現は、ＣＤ４７とマクロファージにより発現されるＳＩＲＰαとの相互作用を通じて、内因性細胞のマクロファージ誘導食作用を阻害する。高レベルのＣＤ４７を発現する細胞は、インビボでヒトマクロファージによって標的化されて破壊される可能性が低い。

【0151】

一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、高濃度のＣＤ４７ポリペプチド分子をその表面に発現する。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、高いＣＤ４７発現レベルを有する細胞系において生成される。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターはＣＤ４７^ｈｉｇｈ細胞で生成され、細胞は細胞膜上にＣＤ４７の高発現を有する。特定の実施形態では、レンチウイルスベクターはＣＤ４７^ｈｉｇｈＨＥＫ ２９３Ｔ細胞で生成され、ＨＥＫ ２９３Ｔは細胞膜上にＣＤ４７の高発現を有する。一部の実施形態では、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞は、非改変ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞に比してＣＤ４７の発現が増加するように改変される。ある特定の実施形態では、ＣＤ４７はヒトＣＤ４７である。

【0152】

一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）の表面発現をほとんどまたは全く有しない。表面に発現されるＭＨＣ－Ｉは、細胞内からの「非自己」タンパク質のペプチド断片、例えば、感染を示すタンパク質断片を提示し、細胞に対する免疫応答を促進する。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターはＭＨＣ－Ｉ^ｌｏｗ細胞で生成され、細胞は細胞膜上のＭＨＣ－Ｉの発現低下を有する。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＭＨＣ－Ｉ^－（または「ＭＨＣ－Ｉ^ｆｒｅｅ」、「ＭＨＣ－１^ｎｅｇ」または「ＭＨＣ陰性」）細胞において生成され、細胞はＭＨＣ－Ｉの発現を欠く。

【0153】

特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、高濃度のＣＤ４７ポリペプチドを含みＭＨＣ－Ｉポリペプチドを欠く脂質コートを含む。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＣＤ４７^ｈｉｇｈ／ＭＨＣ－Ｉ^ｌｏｗ細胞系、例えば、ＣＤ４７^ｈｉｇｈ／ＭＨＣ－Ｉ^ｌｏｗＨＥＫ ２９３Ｔ細胞系において生成される。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＣＤ４７^ｈｉｇｈ／ＭＨＣ－Ｉ^ｆｒｅｅ細胞系、例えば、ＣＤ４７^ｈｉｇｈ／ＭＨＣ－Ｉ^ｆｒｅｅＨＥＫ ２９３Ｔ細胞系において生成される。

【0154】

レンチウイルスベクターの例は、米国特許第９，０５０，２６９号ならびにＷＯ９９３１２５１、ＷＯ９７１２６２２、ＷＯ９８１７８１５、ＷＯ９８１７８１６、およびＷＯ９８１８９３４に開示されており、これらはその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。

【0155】

一部の実施形態では、本開示は、表１に示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を含むレンチウイルスベクターを提供する。

【0156】

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表1-4】

【表1-5】

【表1-6】

【表1-7】

【表1-8】

【表1-9】

【0157】

本開示のレンチウイルスベクターは、５×１０^１０ＴＵ／ｋｇまたはそれ未満、１０^９ＴＵ／ｋｇまたはそれ未満、または１０^８ＴＵ／ｋｇまたはそれ未満の用量で投与される場合、治療的に有効である。そのような投与量では、本開示のレンチウイルスベクターの投与は、対象における基礎レベルに比して、対照レンチウイルスベクターを投与された対象におけるレベルに比して、対照核酸分子を投与された対象におけるレベルに比して、または対照核酸分子によってコードされるポリペプチドの投与後の対象におけるレベルに比して、それを必要とする対象における血漿中ＦＶＩＩＩ活性の、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約５５倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約６５倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約８５倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約９５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１１０倍、少なくとも約１２０倍、少なくとも約１３０倍、少なくとも約１４０倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約１６０倍、少なくとも約１７０倍、少なくとも約１８０倍、少なくとも約１９０倍、または少なくとも約２００倍への増加をもたらし得る。

【0158】

ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクター内に、例えば、導入遺伝子、例えば最適化ＦＶＩＩＩ導入遺伝子に作動可能に連結される、１つまたはそれ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含めることが有用であると考えられる。それ故に、本開示はまた、最適化ＦＶＩＩＩもしくは最適化ＦＩＸヌクレオチド配列に作動可能に連結されるか、または他の様式でレンチウイルスベクター内に挿入される、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ配列標的も提供する。レンチウイルスベクターに含まれるｍｉＲＮＡ標的配列の１つを上回るコピーは、システムの有効性を高めることができる。

【0159】

異なるｍｉＲＮＡ標的配列も含められる。例えば、１つを上回る導入遺伝子を発現するレンチウイルスベクターは、同じであっても異なってもよい、１つを上回るｍｉＲＮＡ標的配列の制御下にある導入遺伝子を有し得る。ｍｉＲＮＡ標的配列は縦列性であってよいが、他の配置も含まれる。ｍｉＲＮＡ標的配列を含有する導入遺伝子発現カセットを、アンチセンスの向きでレンチウイルスベクター内に挿入することもできる。アンチセンスの向きは、ウイルス粒子の生成において、通常であればプロデューサー細胞に有毒な可能性のある遺伝子産物の発現を回避するために有用となり得る。

【0160】

他の実施形態では、レンチウイルスベクターは、同じまたは異なるｍｉＲＮＡ標的配列の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたは８つのコピーを含む。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、いかなるｍｉＲＮＡ標的配列も含まない。ｍｉＲＮＡ標的配列を含めるか否か（およびその数）の選択は、意図する組織標的、要求される発現のレベル等の公知のパラメーターによって導かれると考えられる。

【0161】

一実施形態では、標的配列は、骨髄球拘束前駆細胞において最も効果的に、およびより初期のＨＳＰＣにおいて少なくとも部分的に発現をブロックすることが報告されている、ｍｉＲ－２２３標的である。ｍｉＲ－２２３標的は、顆粒球、単球、マクロファージ、骨髄樹状細胞を含む分化した骨髄系細胞における発現をブロックすることができる。ｍｉＲ－２２３標的はまた、リンパ球系列または赤血球系列における強固な導入遺伝子発現に依拠する遺伝子療法の適用に適する可能性もある。ｍｉＲ－２２３標的はまた、ヒトＨＳＣにおいて非常に効果的に発現をブロックすることもできる。

【0162】

別の実施形態では、標的配列は、ｍｉＲ１４２標的（ｔｃｃａｔａａａｇｔａｇｇａａａｃａｃｔａｃａ（配列番号７））である。一実施形態では、レンチウイルスベクターは、ｍｉＲ－１４２標的配列の４つのコピーを含む。ある特定の実施形態では、造血特異的マイクロＲＮＡの相補的配列、例えばｍｉＲ－１４２（１４２Ｔ）は、レンチウイルスベクターの３’非翻訳領域に組み込まれ、導入遺伝子をコードする転写物をｍｉＲＮＡ介在ダウンレギュレーションに対して感受性にする。この方法により、導入遺伝子発現を、非造血細胞では維持しながら、造血系列の抗原提示細胞（ＡＰＣ）で阻止することができる（Ｂｒｏｗｎら、Ｎａｔ Ｍｅｄ、２００６年）。この戦略は、導入遺伝子発現に対してストリンジェントな転写後制御を課すことができ、それ故に、導入遺伝子の安定した送達および長期発現を可能にする。一部の実施形態では、ｍｉＲ－１４２調節は、形質導入された細胞の免疫介在性除去を阻止し、かつ／または抗原特異的調節性Ｔ細胞（Ｔ ｒｅｇ）を誘導して、導入遺伝子によってコードされる抗原に対する強固な免疫寛容を媒介する。

【0163】

一部の実施形態では、標的配列は、ｍｉＲ１８１標的である。Ｃｈｅｎ Ｃ－ＺおよびＬｏｄｉｓｈ Ｈ、Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００５年） １７（２）：１５５～１６５頁は、マウス骨髄内のＢ細胞において特異的に発現されるｍｉＲＮＡであるｍｉＲ－１８１を開示している（ＣｈｅｎおよびＬｏｄｉｓｈ、２００５年）。それはまた、一部のヒトｍｉＲＮＡが白血病に関連付けられることも開示している。

【0164】

標的配列は、ｍｉＲＮＡに対して完全または部分的に相補的であり得る。「完全に相補的な」という用語は、標的配列が、それを認識するｍｉＲＮＡの配列に対して１００％相補的である核酸配列を有することを意味する。「部分的に相補的な」という用語は、標的配列が、それが認識するｍｉＲＮＡの配列に対して部分的にのみ相補的であり、その際、部分的に相補的な配列が依然としてｍｉＲＮＡによって認識されることを意味する。換言すれば、本開示の文脈において、部分的に相補的な標的配列は、対応するｍｉＲＮＡを認識して、そのｍｉＲＮＡを発現する細胞における導入遺伝子発現の阻止または低下を生じさせるのに有効である。ｍｉＲＮＡ標的配列の例は、ＷＯ２００７／０００６６８、ＷＯ２００４／０９４６４２、ＷＯ２０１０／０５５４１３、またはＷＯ２０１０／１２５４７１に記載されており、それらはその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。

【0165】

Ａ．２．製剤の賦形剤、担体、および他の成分
遺伝子療法のために、レンチウイルスベクター（ＬＶ）はしばしば、全身性に、すなわち、患者の血流中に直接的に投与される。それ故に、毒性がなく、それでもなおＬＶの安定性および効力を維持するＬＶの製剤を作製することには広く関心が持たれる。ＬＶ製剤を作製するためにビヒクルを試験する場合には、いくつかの基本原則に留意しなければならない。製剤が投与される対象のショックを確実に最小限に抑えるために、ｐＨ、イオン濃度、および浸透圧を、生理的条件に適合するように最適化しなければならない。どの緩衝液、塩、および炭水化物を組み合わせるか（それぞれｐＨ、イオン濃度、および浸透圧を調節するために）は、先験的には決定不能であり、実験的に試験する必要がある。

【0166】

例えば、米国特許出願公開第２０１７００７３７０２Ａ１号は、ＴＳＳＭビヒクル（２０ｍＭ ＴＲＩＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１％（ｗ／ｖ）スクロース、１％（ｗ／ｖ）マンニトール、ｐＨ ７．３）を開示しており、これは哺乳動物への全身投与において無毒性であると予想することができた。しかし、ＴＳＳＭを単独で、またはＬＶと組み合わせて使用した製剤は、マウスに対して毒性があることが判明した（実施例２参照）。しかし、驚くべきことに、リン酸ビヒクル（１０ｍＭリン酸塩、１００ｍＭ ＮａＣｌ、３％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｐ１８８、ｐＨ ７．３）またはヒスチジンビヒクル（２０ｍＭヒスチジン、１００ｍＭ ＮａＣｌ、３％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｐ１８８、ｐＨ ６．５）を使用した場合には、製剤はマウスに対して無毒性であった。

【0167】

先験的には予想されなかったことであろうが、リン酸ビヒクルを用いた製剤は、ＴＳＳＭ製剤と比較して、ＬＶのより高い安定性および完全性をもたらした（実施例３および実施例４）。予想外のことに、ヒスチジンビヒクルは、リン酸ビヒクルよりも高い安定性をＬＶに付与した（実施例４）。ヒスチジン製剤のこの重要な特徴、すなわち、リン酸緩衝液またはＴＲＩＳ緩衝液の中性ｐＨ（ｐＨ ７．３）と比較してｐＨが低いビヒクル（ｐＨ ６．５）にもレンチウイルスベクターが適合性であることは、少なくとも以下の理由から驚くべきものであった。ＶＳＶ－Ｇエンベロープタンパク質はレンチウイルスベクターの重要な構成要素であり、これは細胞内へのその感染性を促進する。ＶＳＶ－ＧのｐＩ（等電点）はおよそ５であり、これは溶液のｐＨがこのｐＩに近づくほど、タンパク質の電荷がより中性になることを意味する。タンパク質の電荷がより中性になるほど、それらが互いに引き合う能力は強くなり、これは凝集（分解機構）を招いて、それによって感染能力を損なう可能性がある。

【0168】

界面活性剤であるポロクサマー１８８（Ｐ１８８）をリン酸製剤およびヒスチジン製剤に含めることにより、ＴＳＳＭ製剤と比較してＬＶの安定性および完全性が向上したことも、驚くべきことであった。界面活性剤はＬＶの外側脂質膜エンベロープを不安定化し、それ故にＬＶの安定性および完全性を低下させると予想されていたことから、これは予想外であった。同様に、製剤からのマンニトールの除去が、ＬＶの安定性および完全性がより高い製剤をもたらすことは、先験的には明らかではなかった（実施例３および実施例４）。

【0169】

このようにして、本明細書に記載される知見に基づいて、ＴＲＩＳ非含有緩衝系を含むレンチウイルスベクター調製物は、向上したレンチウイルスベクター安定性および完全性を提供することが見出された。ＴＲＩＳ非含有緩衝系が、ＴＲＩＳ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、トロメタミン、またはＴＨＡＭとしても知られる）を含まない任意の緩衝系を指すことは、当業者には理解されるであろう。ある特定の実施形態では、ＴＲＩＳ非含有緩衝系はリン酸塩を含む。ある特定の実施形態では、ＴＲＩＳ非含有緩衝系はヒスチジンを含む。

【0170】

ある特定の実施形態では、ＴＲＩＳ非含有緩衝系または調製物のｐＨは、約６．０～約８．０である。ある特定の実施形態では、ＴＲＩＳ非含有緩衝系または調製物のｐＨは、約６．０～約７．５である。ある特定の実施形態では、ＴＲＩＳ非含有緩衝系または調製物のｐＨは、約６．０～約７．０である。ある特定の実施形態では、ＴＲＩＳ非含有緩衝系または調製物のｐＨは、約７．０～約８．０である。ある特定の実施形態では、ＴＲＩＳ非含有緩衝系または調製物のｐＨは、約６．５である。ある特定の実施形態では、ＴＲＩＳ非含有緩衝系または調製物のｐＨは、約７．３である。

【0171】

当業者は、標的ｐＨまたは標的ｐＨ範囲を維持するために、本明細書に開示される調製物のＴＲＩＳ非含有緩衝系において採用されるべき好適な緩衝液構成成分を決定することができると考えられる。ある特定の実施形態では、ＴＲＩＳ非含有緩衝系は、約６．０～約８．０の有効ｐＨ緩衝範囲を有する緩衝液構成成分を含む。ある特定の実施形態では、ＴＲＩＳ非含有緩衝系は、約６．０～約７．５の有効ｐＨ緩衝範囲を有する緩衝液構成成分を含む。ある特定の実施形態では、ＴＲＩＳ非含有緩衝系は、約６．０～約７．０の有効ｐＨ緩衝範囲を有する緩衝液構成成分を含む。ある特定の実施形態では、ＴＲＩＳ非含有緩衝系は、約７．０～約８．０の有効ｐＨ緩衝範囲を有する緩衝液構成成分を含む。ある特定の実施形態では、ＴＲＩＳ非含有緩衝系は、ｐＨ ６．５を維持し得る有効ｐＨ緩衝範囲を有する緩衝液構成成分を含む。ある特定の実施形態では、ＴＲＩＳ非含有緩衝系は、ｐＨ ７．３を維持し得る有効ｐＨ緩衝範囲を有する緩衝液構成成分を含む。

【0172】

本明細書に開示されるレンチウイルス遺伝子療法ベクターを含有する組成物、または本開示の宿主細胞（例えば、本明細書に開示されるレンチウイルス遺伝子療法ベクターによって標的化される肝細胞）は、好適な薬学的に許容される担体を含有することができる。例えば、それらは、作用部位への送達のために設計された調製物への活性化合物のプロセシングを促進する賦形剤および／または補助剤を含有することができる。

【0173】

医薬組成物は、ボーラス注射による非経口投与（すなわち、静脈内、皮下、または筋肉内）用に製剤化することができる。注射用の製剤は、単位剤形で、例えば、アンプルまたは複数回投与容器に保存剤を添加した状態で提供することができる。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁剤、液剤、または乳剤などの形態をとることができ、懸濁化剤、安定化剤および／または分散化剤などの製剤化剤を含有することができる。あるいは、活性成分が、好適なビヒクル、例えば、パイロジェンフリー水による構成のための粉末形態であってもよい。

【0174】

非経口投与用の好適な製剤としては、水溶性形態、例えば、水溶性塩である活性化合物の水性液剤も挙げられる。加えて、適切な油性注射懸濁剤として活性化合物の懸濁剤を投与することもできる。好適な親油性溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油、例えば、ゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチルまたはトリグリセリドが挙げられる。水性注射用懸濁剤は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよびデキストランを含む、懸濁剤の粘性を高める物質を含有することができる。場合により、懸濁剤が安定化剤を含有することもできる。細胞または間質腔への送達用に本開示の分子を封入するためにリポソームを使用することもできる。例示的な薬学的に許容される担体は、生理的に適合性のある溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどである。一部の実施形態では、組成物は、等張化剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、または塩化ナトリウムを含む。他の実施形態では、組成物は、湿潤剤などの薬学的に許容される物質、または活性成分の貯蔵寿命もしくは有効性を向上させる湿潤剤もしくは乳化剤、保存剤もしくは緩衝剤などの少量の補助物質を含む。

【0175】

本開示の組成物は、例えば、液体（例えば、注射用溶液および注入用溶液）、分散液、懸濁液、半固体および固体の剤形を含む、様々な形態であり得る。好ましい形態は、投与様式および治療用途に応じて変わる。

【0176】

組成物は、液剤、マイクロエマルジョン剤、分散剤、リポソーム、または高い薬物濃度に適する他の規則的構造物として製剤化することができる。滅菌注射用液剤は、必要に応じて、上に列挙した成分のうちの１つまたは組合せとともに、活性成分を所要量で適切な溶媒中に組み込んで濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散剤は、塩基性分散媒および上に列挙したもののうち必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに、活性成分を組み込むことによって調製される。滅菌注射用液剤を調製するための滅菌散剤の場合には、好ましい調製方法は、事前に滅菌濾過した溶液から、活性成分に任意の所望の追加成分を加えた粉末を得る真空乾燥および凍結乾燥である。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散剤の場合には所要の粒子径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。注射用組成物の吸収時間の延長は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物に含めることによって実現することができる。

【0177】

活性成分は、放出制御製剤または放出制御デバイスを用いて製剤化することができる。そのような製剤およびデバイスの例としては、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達系が挙げられる。生分解性生体適合性ポリマー、例えば、エチレンビニルアセテート、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸を使用することができる。そのような製剤およびデバイスの調製方法は、当技術分野で公知である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌ ｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７８年を参照のこと。

【0178】

注射用デポー製剤は、ポリ乳酸－ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中に薬物のマイクロカプセル化マトリックスを形成することによって作製することができる。薬物のポリマーに対する比率、および採用するポリマーの性質に応じて、薬物放出の速度を制御することができる。他の例示的な生分解性ポリマーには、ポリオルトエステルおよびポリ酸無水物がある。注射用デポー製剤は、薬物をリポソームまたはマイクロエマルジョン中に捕捉することによって調製することもできる。

【0179】

補足的な活性化合物を組成物中に組み込むことができる。一実施形態では、本開示のキメラタンパク質は、他の凝固因子、またはそのバリアント、断片、類似体もしくは誘導体とともに製剤化される。例えば、凝固因子としては、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、プロトロンビン、フィブリノーゲン、フォンビルブランド因子もしくは組換え可溶性組織因子（ｒｓＴＦ）または前記のいずれかの活性化形態が挙げられるが、これらに限定されない。止血剤の凝固因子として、抗線溶薬、例えば、イプシロン－アミノカプロン酸、トラネキサム酸を挙げることもできる。

【0180】

投薬レジメンは、最適な所望の応答が得られるように調整することができる。例えば、単回ボーラス投与を行うこと、数回の分割投与を時間をかけて行うこと、または治療状況の緊急性によって示されるのに応じて用量を相応に減少もしくは増加させることもできる。投与の容易さおよび投薬量の均一化のために、非経口組成物を投薬量単位形態で製剤化することが有益である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．１９８０年）を参照のこと。

【0181】

活性化合物に加えて、液体剤形は、水、エチルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油、グリセリン、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステルなどの不活性成分を含有することができる。

【0182】

好適な医薬担体の非限定的な例は、Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓにも記載されている。賦形剤のいくつかの例としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセリンモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセリン、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物は、ｐＨ緩衝試薬、および湿潤剤または乳化剤を含有することもできる。

【0183】

経口投与用には、医薬組成物は、従来の手段によって調製した錠剤またはカプセル剤の形態をとることができる。組成物を液剤、例えば、シロップ剤または懸濁剤として調製することもできる。液剤は、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ剤、セルロース誘導体または水素添加食用脂）、乳化剤（レシチンまたはアラビアガム）、非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、または分別植物油）、および保存剤（例えば、メチルもしくはプロピル－ｐ－ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）を含むことができる。調製物は、矯味矯臭剤、着色剤および甘味剤を含むこともできる。あるいは、組成物を、水または別の好適なビヒクルで構成するための乾燥製品として提供することもできる。

【0184】

口腔内投与用には、組成物は、従来のプロトコールに従って錠剤またはロゼンジ剤の形態をとることができる。

【0185】

吸入による投与用には、本開示に従う使用のための化合物は、賦形剤を含むかもしくは含まない噴霧エアロゾル剤の形態で、または場合によっては噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロメタン、二酸化炭素もしくは他の好適な気体とともに加圧パックもしくはネブライザーからのエアロゾルスプレーの形態で、好都合に送達される。加圧エアロゾル剤の場合には、投薬量単位は、計量された量を送達するための弁を設けることによって決定することができる。化合物とラクトースまたはデンプンなどの好適な粉末基剤との粉末混合物を含有する、吸入器または注入器において使用するための、例えば、ゼラチンのカプセル剤およびカートリッジを製剤化することができる。

【0186】

また、医薬組成物を、例えば、カカオ脂または他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を含有する、坐薬または滞留浣腸として直腸投与用に製剤化することもできる。

【0187】

一実施形態では、医薬組成物は、第ＶＩＩＩ因子活性または第ＩＸ因子活性を有するポリペプチドをコードする最適化された核酸分子を含むレンチウイルスベクター、および薬学的に許容される担体を含む。別の実施形態では、医薬組成物は、第ＶＩＩＩ因子活性または第ＩＸ因子活性を有するポリペプチドをコードする最適化された核酸分子を含むレンチウイルスベクターを含む宿主細胞（例えば、肝細胞）、および薬学的に許容される担体を含む。

【0188】

一部の実施形態では、組成物は、局所投与、眼内投与、非経口投与、髄腔内投与、硬膜下投与および経口投与からなる群から選択される経路によって投与される。非経口投与は、静脈内投与または皮下投与であり得る。

【0189】

治療用製剤を研究室から、製造可能で市場性のある高い一貫した品質の製品に確実に移行させるための基本的側面は、剤形におけるその安定性である。ウイルスの表面タンパク質およびカプシドタンパク質などのタンパク質は、その複雑な化学的特性および構造のために、最終的製品の生物学的効能および安全性を損なうおそれのある、様々な形の物理的および化学的分解を受けやすい。例えば、タンパク質の凝集は、タンパク質を原料とする製品で慣行的にモニターされる重要な品質属性であり、製品の貯蔵寿命の決定にとって極めて重要である。基本的なレベルで、タンパク質の凝集は、タンパク質のネイティブ形態の安定性と関連しており、非ネイティブ細胞（例えば、非ネイティブ哺乳動物細胞）における成長は一般に凝集の速度および範囲の増加と関連している。したがって、製品の貯蔵寿命（速度論的安定性）中の凝集を制御して最小限に抑える試みが、しばしばタンパク質のコンフォメーション安定性を高めることを意図した賦形剤または製剤化条件の使用を介して行われることは、驚くには当たらない。基本的には、凝集能を持つ「非ネイティブ」種の集団を最小限に抑えるために、タンパク質をそのネイティブなコンフォメーションで安定化することが意図される。スクロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトールなどの糖およびポリオールは、タンパク質をネイティブな状態で安定化して凝集速度を低下させるためにしばしば使用される。しかし、これらの安定化剤を使用することの望ましくない影響の一つに、溶液粘性の濃度依存的な増加がある。

【0190】

溶液粘性は、タンパク質製品、特に高タンパク質濃度で配合されるものの重要な属性であり、製品の有用性および成果に決定的な影響を与え得る。製品の製造可能性および患者または医療従事者による最終的な使用は、溶液が途切れずに流れる能力と密接に関連している。例えば、粘性が高い場合には、所望の集団に常に適するとは限らない特殊な投与デバイス装置またはプロトコールの使用を必要とすることがあり、それによって製品の使用が制限される。他の例では、溶液粘性が高い場合には、タンパク質の安定性に悪影響を及ぼす可能性のある製造技術（例えば、高温処理）の適用を必要とすることがある。このため、高タンパク質濃度の溶液に、塩およびアミノ酸などの粘性低下賦形剤を採用することは珍しいことではない。しかし、これらの賦形剤はタンパク質の安定性に悪影響を与え、それにより、粘性低下剤を含まない高粘性対照溶液と比較して凝集速度が高い溶液が結果として生じることがある。要するに、一般的に採用される安定化剤および粘性低下賦形剤は、製品の性能に対して逆効果を及ぼすことがあり、それによってその開発が複雑になるおそれがある。

【0191】

注射用製品（ほとんどはタンパク質を原材料とする製品）にとって考慮しなければならないもう一つの重要な属性は、その浸透圧である。静脈内注射用溶液は一般に等張である必要があるが、皮下注射用溶液は高張であることが珍しくない。実際、高張製剤が皮下投与後のタンパク質の生物学的利用能を高めるという文献上のエビデンスがある（Ｆａｔｈａｌｌａｈ，Ａ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｐｈａｒｍ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｐｏｓ．２０１５年３月；３６（２）：１１５～２５頁）。したがって、患者集団における注射部位の不快感および／または反応、ならびに生物学的利用能に対する溶液浸透圧（およびそれ故に張性）の影響は、臨床開発段階において慎重にモニターして特徴付ける必要がある。

【0192】

製剤は時に、特定の利益を付与し得る、ポロクサマーおよびポリソルベートなどの界面活性剤を含有してもよい。ポロクサマーは、非イオン性ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）－ポリ（プロピレンオキシド）（ＰＰＯ）共重合体である。これは界面活性剤、乳化剤、可溶化剤、分散剤、インビボ吸光度強化剤として医薬品の製剤に使用される。ポロクサマーは、以下のコア式を有する合成トリブロック共重合体である：（ＰＥＯ）ａ－（ＰＰＯ）ｂ－（ＰＥＯ）ａ。ポロクサマーはすべて類似した化学構造を有するが、分子量および親水性ＰＥＯブロックと疎水性ＰＰＯブロックとの組成が異なる。最も一般的に使用されるポロクサマーは、分子量が７６８０～９５１０Ｄａの範囲であるポロクサマー１８８（ａ＝８０、ｂ＝２７）、および分子量が９８４０～１４６００Ｄａの範囲であるポロクサマー４０７（ａ＝１０１、ｂ＝５６）の２つである。他のポロクサマーとしては、以下のものが挙げられる：ポロクサマー１０１（Ｐ１０１）、ポロクサマー１０５（Ｐ１０５）、ポロクサマー１０８（Ｐ１０８）、ポロクサマー１２２（Ｐ１２２）、ポロクサマー１２３（Ｐ１２３）、ポロクサマー１２４（Ｐ１２４）、ポロクサマー１８１（Ｐ１８１）、ポロクサマー１８２（Ｐ１８２）、ポロクサマー１８３（Ｐ１８３）、ポロクサマー１８４（Ｐ１８４）、ポロクサマー１８５（Ｐ１８５）、ポロクサマー２１２（Ｐ２１２）、ポロクサマー２１５（Ｐ２１５）、ポロクサマー２１７（Ｐ２１７）、ポロクサマー２３１（Ｐ２３１）、ポロクサマー２３４（Ｐ２３４）、ポロクサマー２３５（Ｐ２３５）、ポロクサマー２３７（Ｐ２３７）、ポロクサマー２３８（Ｐ２３８）、ポロクサマー２８２（Ｐ２８２）、ポロクサマー２８４（Ｐ２８４）、ポロクサマー２８８（Ｐ２８８）、ポロクサマー３３１（Ｐ３３１）、ポロクサマー３３３（Ｐ３３３）、ポロクサマー３３４（Ｐ３３４）、ポロクサマー３３５（Ｐ３３５）、ポロクサマー３３８（Ｐ３３８）、ポロクサマー４０１（Ｐ４０１）、ポロクサマー４０２（Ｐ４０２）、およびポロクサマー４０３（Ｐ４０３）。

【0193】

ポリソルベートは、いくつかの医薬製剤および食品調製製剤に使用される乳化剤のクラスである。ポリソルベートは、ソルビトールの誘導体であるエトキシル化ソルビタンを脂肪酸でエステル化したものに由来する油状の液体である。ポリソルベートの一般的な商品名としては、Ｓｃａｔｔｉｃｓ、Ａｌｋｅｓｔ、Ｃａｎａｒｃｅｌ、およびＴｗｅｅｎが挙げられる。ポリソルベートの命名規則は通常、以下の通りである：ポリソルベートｘ（ポリオキシエチレン（ｙ）ソルビタンモノ‘ｚ’）、式中、ｘはポリオキシエチレンソルビタンに結合した脂肪酸（ｚ）の種類に関し、ｙはポリソルベート分子中に見出されるオキシエチレン－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）－基の総数を指す。ポリソルベートの例としては、以下のものが挙げられる：（ａ）ポリソルベート２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）、（ｂ）ポリソルベート４０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート）、（ｃ）ポリソルベート６０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート）、（ｄ）ポリソルベート８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）。

【0194】

Ｂ．血液障害の治療に使用するためのレンチウイルスベクター（ＬＶ）製剤
一態様では、本発明は、（ａ）組換えレンチウイルスベクターの有効用量；（ｂ）ＴＲＩＳ非含有緩衝系；（ｃ）塩；（ｄ）界面活性剤；（ｅ）炭水化物、および（ｆ）配列番号１もしくは配列番号２に示される第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）コード配列または配列番号３に示される第ＩＸ因子（ＦＩＸ）コード配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列を含む組換えレンチウイルスベクター調製物を対象とし、ここで医薬組成物はヒト患者への全身投与に適する。ある特定の実施形態では、ベクターは、配列番号１または配列番号２に示される第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）コード配列を含む。ある特定の実施形態では、ベクターは、配列番号３に示される第ＩＸ因子（ＦＩＸ）コード配列を含む。

【0195】

別の態様では、本発明は、（ａ）組換えレンチウイルスベクターの治療有効用量；（ｂ）ＴＲＩＳ非含有緩衝系；（ｃ）塩；（ｄ）界面活性剤；および（ｅ）炭水化物を含む組換えレンチウイルスベクター調製物を提供し、ここで組換えレンチウイルスベクターは、配列番号１もしくは配列番号２に示される第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）コード配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％同一なヌクレオチド配列、または配列番号３に示される第ＩＸ因子（ＦＩＸ）コード配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％同一なヌクレオチド配列を含む組換えレンチウイルスベクターを含み、医薬組成物はヒト患者への全身投与に適する。ある特定の実施形態では、組換えレンチウイルスベクターは、配列番号１または配列番号２に示される第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）コード配列を含む核酸を含む。ある特定の実施形態では、組換えレンチウイルスベクターは、配列番号３に示される第ＩＸ因子（ＦＩＸ）コード配列を含む核酸を含む。ある特定の実施形態では、組換えレンチウイルスベクターは、配列番号１または配列番号２に示される第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）コード配列からなる核酸を含む。ある特定の実施形態では、組換えレンチウイルスベクターは、配列番号３に示される第ＩＸ因子（ＦＩＸ）コード配列からなる核酸を含む。

【0196】

ある特定の実施形態では、緩衝系のｐＨは、約６．０～約８．０である。ある特定の実施形態では、緩衝系のｐＨは、約６．０～約７．５である。ある特定の実施形態では、緩衝系のｐＨは、約６．０～約７．０である。ある特定の実施形態では、緩衝系のｐＨは、約６．０～約８．０である。ある特定の実施形態では、緩衝系のｐＨは約６．５である。ある特定の実施形態では、緩衝系のｐＨは約７．３である。ある特定の実施形態では、緩衝系はリン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液である。ある特定の実施形態では、リン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液の濃度約５ｍＭ～約３０ｍＭである。ある特定の実施形態では、リン酸緩衝液の濃度は、約１０ｍＭ～約２０ｍＭ、約１０ｍＭ～約１５ｍＭ、約２０ｍＭ～約３０ｍＭ、約２０ｍＭ～約２５ｍＭ、または約１５ｍＭ～約２０ｍＭである。ある特定の実施形態では、塩は塩化物塩である。ある特定の実施形態では、塩化物塩の濃度は、約８０ｍＭ～約１５０ｍＭである。ある特定の実施形態では、塩の濃度は、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１３０ｍＭ、または約１５０ｍＭである。ある特定の実施形態では、界面活性剤はポロクサマーまたはポリソルベートである。ある特定の実施形態では、ポロクサマーまたはポリソルベートの濃度は、約０．０１％（ｗ／ｖ）～約０．１％（ｗ／ｖ）である。ある特定の実施形態では、炭水化物はスクロースである。ある特定の実施形態では、炭水化物の濃度は、約０．５％（ｗ／ｖ）～約５％（ｗ／ｖ）である。ある特定の実施形態では、塩化物塩は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）である。ある特定の実施形態では、ポロクサマーは、ポロクサマー１０１（Ｐ１０１）、ポロクサマー１０５（Ｐ１０５）、ポロクサマー１０８（Ｐ１０８）、ポロクサマー１２２（Ｐ１２２）、ポロクサマー１２３（Ｐ１２３）、ポロクサマー１２４（Ｐ１２４）、ポロクサマー１８１（Ｐ１８１）、ポロクサマー１８２（Ｐ１８２）、ポロクサマー１８３（Ｐ１８３）、ポロクサマー１８４（Ｐ１８４）、ポロクサマー１８５（Ｐ１８５）、ポロクサマー１８８（Ｐ１８８）、ポロクサマー２１２（Ｐ２１２）、ポロクサマー２１５（Ｐ２１５）、ポロクサマー２１７（Ｐ２１７）、ポロクサマー２３１（Ｐ２３１）、ポロクサマー２３４（Ｐ２３４）、ポロクサマー２３５（Ｐ２３５）、ポロクサマー２３７（Ｐ２３７）、ポロクサマー２３８（Ｐ２３８）、ポロクサマー２８２（Ｐ２８２）、ポロクサマー２８４（Ｐ２８４）、ポロクサマー２８８（Ｐ２８８）、ポロクサマー３３１（Ｐ３３１）、ポロクサマー３３３（Ｐ３３３）、ポロクサマー３３４（Ｐ３３４）、ポロクサマー３３５（Ｐ３３５）、ポロクサマー３３８（Ｐ３３８）、ポロクサマー４０１（Ｐ４０１）、ポロクサマー４０２（Ｐ４０２）、ポロクサマー４０３（Ｐ４０３）、ポロクサマー４０７（Ｐ４０７）、およびそれらの組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ポリソルベートは、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、およびそれらの組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、リン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液のｐＨは、約６．１、約６．３、約６．５、約６．７、約６．９、約７．１、約７．３、約７．５、約７．７、または約７．９である。ある特定の実施形態では、リン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液の濃度は、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、または約２５ｍＭである。ある特定の実施形態では、塩化物塩は、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１３０ｍＭ、または約１５０ｍＭである。ある特定の実施形態では、ポロクサマーまたはポリソルベートの濃度は、約０．０３％（ｗ／ｖ）、約０．０５％（ｗ／ｖ）、約０．０７％（ｗ／ｖ）、または約０．０９％（ｗ／ｖ）である。ある特定の実施形態では、炭水化物の濃度は、約１％（ｗ／ｖ）、約２％（ｗ／ｖ）、約３％（ｗ／ｖ）、または約４％（ｗ／ｖ）である。ある特定の実施形態では、ポロクサマーはポロクサマー１８８（Ｐ１８８）である。ある特定の実施形態では、ポロクサマーはポロクサマー４０７（Ｐ４０７）である。

【0197】

ある特定の実施形態では、本開示は、（ａ）組換えレンチウイルスベクターの治療有効用量；（ｂ）約１０ｍＭのリン酸塩；（ｃ）約１００ｍＭの塩化ナトリウム；（ｄ）約０．０５％（ｗ／ｖ）のポロクサマー１８８；および（ｅ）約３％（ｗ／ｖ）スクロースを含む組換えレンチウイルスベクター調製物を提供し、ここで調製物のｐＨは約７．３であり、医薬組成物はヒト患者への全身投与に適し、組換えレンチウイルスベクターは、配列番号１もしくは配列番号２に示される第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）コード配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％同一なヌクレオチド配列、または配列番号３に示される第ＩＸ因子（ＦＩＸ）コード配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％同一なヌクレオチド配列を含む核酸を含み、医薬組成物はヒト患者への全身投与に適する。ある特定の実施形態では、組換えレンチウイルスベクターは、配列番号１または配列番号２に示される第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）コード配列を含む核酸を含む。ある特定の実施形態では、組換えレンチウイルスベクターは、配列番号３に示される第ＩＸ因子（ＦＩＸ）コード配列を含む核酸を含む。ある特定の実施形態では、組換えレンチウイルスベクター配列番号１または配列番号２に示される第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）コード配列からなる核酸を含む。ある特定の実施形態では、組換えレンチウイルスベクターは、配列番号３に示される第ＩＸ因子（ＦＩＸ）コード配列からなる核酸を含む。

【0198】

ある特定の実施形態では、本開示は、（ａ）組換えレンチウイルスベクターの治療有効用量；（ｂ）約１０ｍＭのリン酸塩；（ｃ）約１３０ｍＭの塩化ナトリウム；（ｄ）約０．０５％（ｗ／ｖ）のポロクサマー１８８；および（ｅ）約１％（ｗ／ｖ）スクロースを含む組換えレンチウイルスベクター調製物を提供し、ここで調製物のｐＨは約７．３であり、医薬組成物はヒト患者への全身投与に適し、組換えレンチウイルスベクターは、配列番号１もしくは配列番号２に示される第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）コード配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％同一なヌクレオチド配列、または配列番号３に示される第ＩＸ因子（ＦＩＸ）コード配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％同一なヌクレオチド配列を含む核酸を含み、医薬組成物はヒト患者への全身投与に適する。ある特定の実施形態では、組換えレンチウイルスベクターは、配列番号１または配列番号２に示される第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）コード配列を含む核酸を含む。ある特定の実施形態では、組換えレンチウイルスベクターは、配列番号３に示される第ＩＸ因子（ＦＩＸ）コード配列を含む核酸を含む。ある特定の実施形態では、組換えレンチウイルスベクター配列番号１または配列番号２に示される第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）コード配列からなる核酸を含む。ある特定の実施形態では、組換えレンチウイルスベクターは、配列番号３に示される第ＩＸ因子（ＦＩＸ）コード配列からなる核酸を含む。

【0199】

ある特定の実施形態では、本開示は、（ａ）組換えレンチウイルスベクターの治療有効用量；（ｂ）約２０ｍＭのヒスチジン；（ｃ）約１００ｍＭの塩化ナトリウム；（ｄ）約０．０５％（ｗ／ｖ）のポロクサマー１８８；および（ｅ）約３％（ｗ／ｖ）スクロースを含む組換えレンチウイルスベクター調製物を提供し、ここで調製物のｐＨは約６．５であり、医薬組成物はヒト患者への全身投与に適し、組換えレンチウイルスベクターは、配列番号１もしくは配列番号２に示される第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）コード配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％同一なヌクレオチド配列、または配列番号３に示される第ＩＸ因子（ＦＩＸ）コード配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％同一なヌクレオチド配列を含む核酸を含み、医薬組成物はヒト患者への全身投与に適する。ある特定の実施形態では、組換えレンチウイルスベクターは、配列番号１または配列番号２に示される第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）コード配列を含む核酸を含む。ある特定の実施形態では、組換えレンチウイルスベクターは、配列番号３に示される第ＩＸ因子（ＦＩＸ）コード配列を含む核酸を含む。ある特定の実施形態では、組換えレンチウイルスベクター配列番号１または配列番号２に示される第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）コード配列からなる核酸を含む。ある特定の実施形態では、組換えレンチウイルスベクターは、配列番号３に示される第ＩＸ因子（ＦＩＸ）コード配列からなる核酸を含む。

【0200】

ある特定の実施形態では、本開示は、（ａ）組換えレンチウイルスベクターの治療有効用量；（ｂ）約１０ｍＭのリン酸塩；（ｃ）約１００ｍＭの塩化ナトリウム；（ｄ）約０．０５％（ｗ／ｖ）のポロクサマー１８８；および（ｅ）約３％（ｗ／ｖ）スクロースを含む組換えレンチウイルスベクター調製物を提供し、ここで調製物のｐＨは約７．０であり、医薬組成物はヒト患者への全身投与に適し、組換えレンチウイルスベクターは、配列番号１もしくは配列番号２に示される第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）コード配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％同一なヌクレオチド配列、または配列番号３に示される第ＩＸ因子（ＦＩＸ）コード配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％同一なヌクレオチド配列を含む核酸を含み、医薬組成物はヒト患者への全身投与に適する。ある特定の実施形態では、組換えレンチウイルスベクターは、配列番号１または配列番号２に示される第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）コード配列を含む核酸を含む。ある特定の実施形態では、組換えレンチウイルスベクターは、配列番号３に示される第ＩＸ因子（ＦＩＸ）コード配列を含む核酸を含む。ある特定の実施形態では、組換えレンチウイルスベクター配列番号１または配列番号２に示される第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）コード配列からなる核酸を含む。ある特定の実施形態では、組換えレンチウイルスベクターは、配列番号３に示される第ＩＸ因子（ＦＩＸ）コード配列からなる核酸を含む。

【0201】

ある特定の実施形態では、本開示は、（ａ）組換えレンチウイルスベクターの治療有効用量；（ｂ）約２０ｍＭのヒスチジン；（ｃ）約１００ｍＭの塩化ナトリウム；（ｄ）約０．０５％（ｗ／ｖ）のポロクサマー１８８；および（ｅ）約３％（ｗ／ｖ）スクロースを含む組換えレンチウイルスベクター調製物を提供し、ここで調製物のｐＨは約７．０であり、医薬組成物はヒト患者への全身投与に適し、組換えレンチウイルスベクターは、配列番号１もしくは配列番号２に示される第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）コード配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％同一なヌクレオチド配列、または配列番号３に示される第ＩＸ因子（ＦＩＸ）コード配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％同一なヌクレオチド配列を含む核酸を含み、医薬組成物はヒト患者への全身投与に適する。ある特定の実施形態では、組換えレンチウイルスベクターは、配列番号１または配列番号２に示される第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）コード配列を含む核酸を含む。ある特定の実施形態では、組換えレンチウイルスベクターは、配列番号３に示される第ＩＸ因子（ＦＩＸ）コード配列を含む核酸を含む。ある特定の実施形態では、組換えレンチウイルスベクター配列番号１または配列番号２に示される第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）コード配列からなる核酸を含む。ある特定の実施形態では、組換えレンチウイルスベクターは、配列番号３に示される第ＩＸ因子（ＦＩＸ）コード配列からなる核酸を含む。

【0202】

ある特定の実施形態では、組換えレンチウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、組換えレンチウイルスベクターは、強化トランスサイレチン（ＥＴ）プロモーターを含む。ある特定の実施形態では、組換えレンチウイルスベクターは、配列番号７に示されるｍｉＲ－１４２の標的配列と少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列を含む。

【0203】

ある特定の実施形態では、組換えレンチウイルスベクターは、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＮＳＯ細胞、およびＣＡＰ細胞を含むトランスフェクト宿主細胞から単離される。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ＣＤ４７陽性宿主細胞である。

【0204】

ある特定の実施形態では、調製物は、ヒト患者に全身投与される。ある特定の実施形態では、調製物は静脈内に投与される。

【0205】

ある特定の実施形態では、緩衝系のｐＨは、６．０～８．０の間である。ある特定の実施形態では、緩衝系はリン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液である。ある特定の実施形態では、リン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液の濃度は、５ｍＭ～３０ｍＭの間である。ある特定の実施形態では、リン酸緩衝液の濃度は、約１０～約２０ｍＭ、約１０～約１５ｍＭ、約２０～約３０ｍＭ、約２０～約２５ｍＭ、または約１５～約２０ｍＭである。ある特定の実施形態では、塩は塩化物塩である。ある特定の実施形態では、塩化物塩の濃度は、８０ｍＭ～１５０ｍＭの間である。ある特定の実施形態では、塩の濃度は、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１３０ｍＭ、または約１５０ｍＭである。ある特定の実施形態では、界面活性剤はポロクサマーまたはポリソルベートである。ある特定の実施形態では、ポロクサマーまたはポリソルベートの濃度は、０．０１％（ｗ／ｖ）～０．１％（ｗ／ｖ）の間である。ある特定の実施形態では、炭水化物はスクロースである。ある特定の実施形態では、炭水化物の濃度は、０．５％（ｗ／ｖ）～５％（ｗ／ｖ）の間である。ある特定の実施形態では、塩化物塩はＮａＣｌである。ある特定の実施形態では、ポロクサマーは、ポロクサマー１０１（Ｐ１０１）、ポロクサマー１０５（Ｐ１０５）、ポロクサマー１０８（Ｐ１０８）、ポロクサマー１２２（Ｐ１２２）、ポロクサマー１２３（Ｐ１２３）、ポロクサマー１２４（Ｐ１２４）、ポロクサマー１８１（Ｐ１８１）、ポロクサマー１８２（Ｐ１８２）、ポロクサマー１８３（Ｐ１８３）、ポロクサマー１８４（Ｐ１８４）、ポロクサマー１８５（Ｐ１８５）、ポロクサマー１８８（Ｐ１８８）、ポロクサマー２１２（Ｐ２１２）、ポロクサマー２１５（Ｐ２１５）、ポロクサマー２１７（Ｐ２１７）、ポロクサマー２３１（Ｐ２３１）、ポロクサマー２３４（Ｐ２３４）、ポロクサマー２３５（Ｐ２３５）、ポロクサマー２３７（Ｐ２３７）、ポロクサマー２３８（Ｐ２３８）、ポロクサマー２８２（Ｐ２８２）、ポロクサマー２８４（Ｐ２８４）、ポロクサマー２８８（Ｐ２８８）、ポロクサマー３３１（Ｐ３３１）、ポロクサマー３３３（Ｐ３３３）、ポロクサマー３３４（Ｐ３３４）、ポロクサマー３３５（Ｐ３３５）、ポロクサマー３３８（Ｐ３３８）、ポロクサマー４０１（Ｐ４０１）、ポロクサマー４０２（Ｐ４０２）、ポロクサマー４０３（Ｐ４０３）、ポロクサマー４０７（Ｐ４０７）、およびそれらの組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ポリソルベートは、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、およびそれらの組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、リン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液のｐＨは、６．１、６．３、６．５、６．７、６．９、７．１、７．３、７．５、７．７、または７．９である。ある特定の実施形態では、リン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液の濃度は、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、または２５ｍＭである。ある特定の実施形態では、塩化物塩は、１００ｍＭ、１１０ｍＭ、１３０ｍＭ、または１５０ｍＭである。ある特定の実施形態では、ポロクサマーまたはポリソルベートの濃度は、０．０３％（ｗ／ｖ）、０．０５％（ｗ／ｖ）、０．０７％（ｗ／ｖ）、または０．０９％（ｗ／ｖ）である。ある特定の実施形態では、炭水化物の濃度は、１％（ｗ／ｖ）、２％（ｗ／ｖ）、３％（ｗ／ｖ）、または４％（ｗ／ｖ）である。ある特定の実施形態では、ポロクサマーはポロクサマー１８８（Ｐ１８８）である。ある特定の実施形態では、ポロクサマーはポロクサマー４０７（Ｐ４０７）である。

【0206】

一態様では、本発明は、（ａ）組換えレンチウイルスベクターの有効用量；（ｂ）ＴＲＩＳ非含有緩衝系；（ｃ）塩；（ｄ）界面活性剤；（ｅ）炭水化物、および（ｆ）強化トランスサイレチン（ＥＴ）プロモーターを含む組換えレンチウイルスベクター調製物を対象とし、ここで医薬組成物はヒト患者への全身投与に適する。ある特定の実施形態では、ベクターはさらに、配列番号１もしくは配列番号２に示される第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）コード配列または配列番号３に示される第ＩＸ因子（ＦＩＸ）コード配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列を含み、ここで医薬組成物はヒト患者への全身投与に適する。ある特定の実施形態では、ベクターは、配列番号１または配列番号２に示される第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）コード配列を含む。ある特定の実施形態では、ベクターは、配列番号３に示される第ＩＸ因子（ＦＩＸ）コード配列を含む。

【0207】

ある特定の実施形態では、ベクターはさらに、ＶＳＶ－Ｇまたはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、緩衝系のｐＨは、６．０～８．０の間である。ある特定の実施形態では、緩衝系はリン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液である。ある特定の実施形態では、リン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液の濃度は、５ｍＭ～３０ｍＭの間である。ある特定の実施形態では、リン酸緩衝液の濃度は、約１０～約２０ｍＭ、約１０～約１５ｍＭ、約２０～約３０ｍＭ、約２０～約２５ｍＭ、または約１５～約２０ｍＭである。ある特定の実施形態では、塩は塩化物塩である。ある特定の実施形態では、塩化物塩の濃度は、８０ｍＭ～１５０ｍＭの間である。ある特定の実施形態では、塩の濃度は、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１３０ｍＭ、または約１５０ｍＭである。ある特定の実施形態では、界面活性剤はポロクサマーまたはポリソルベートである。ある特定の実施形態では、ポロクサマーまたはポリソルベートの濃度は、０．０１％（ｗ／ｖ）～０．１％（ｗ／ｖ）の間である。ある特定の実施形態では、炭水化物はスクロースである。ある特定の実施形態では、炭水化物の濃度は、０．５％（ｗ／ｖ）～５％（ｗ／ｖ）の間である。ある特定の実施形態では、塩化物塩はＮａＣｌである。ある特定の実施形態では、ポロクサマーは、ポロクサマー１０１（Ｐ１０１）、ポロクサマー１０５（Ｐ１０５）、ポロクサマー１０８（Ｐ１０８）、ポロクサマー１２２（Ｐ１２２）、ポロクサマー１２３（Ｐ１２３）、ポロクサマー１２４（Ｐ１２４）、ポロクサマー１８１（Ｐ１８１）、ポロクサマー１８２（Ｐ１８２）、ポロクサマー１８３（Ｐ１８３）、ポロクサマー１８４（Ｐ１８４）、ポロクサマー１８５（Ｐ１８５）、ポロクサマー１８８（Ｐ１８８）、ポロクサマー２１２（Ｐ２１２）、ポロクサマー２１５（Ｐ２１５）、ポロクサマー２１７（Ｐ２１７）、ポロクサマー２３１（Ｐ２３１）、ポロクサマー２３４（Ｐ２３４）、ポロクサマー２３５（Ｐ２３５）、ポロクサマー２３７（Ｐ２３７）、ポロクサマー２３８（Ｐ２３８）、ポロクサマー２８２（Ｐ２８２）、ポロクサマー２８４（Ｐ２８４）、ポロクサマー２８８（Ｐ２８８）、ポロクサマー３３１（Ｐ３３１）、ポロクサマー３３３（Ｐ３３３）、ポロクサマー３３４（Ｐ３３４）、ポロクサマー３３５（Ｐ３３５）、ポロクサマー３３８（Ｐ３３８）、ポロクサマー４０１（Ｐ４０１）、ポロクサマー４０２（Ｐ４０２）、ポロクサマー４０３（Ｐ４０３）、ポロクサマー４０７（Ｐ４０７）、およびそれらの組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ポリソルベートは、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、およびそれらの組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、リン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液のｐＨは、６．１、６．３、６．５、６．７、６．９、７．１、７．３、７．５、７．７、または７．９である。ある特定の実施形態では、リン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液の濃度は、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、または２５ｍＭである。ある特定の実施形態では、塩化物塩は、１００ｍＭ、１１０ｍＭ、１３０ｍＭ、または１５０ｍＭである。ある特定の実施形態では、ポロクサマーまたはポリソルベートの濃度は、０．０３％（ｗ／ｖ）、０．０５％（ｗ／ｖ）、０．０７％（ｗ／ｖ）、または０．０９％（ｗ／ｖ）である。ある特定の実施形態では、炭水化物の濃度は、１％（ｗ／ｖ）、２％（ｗ／ｖ）、３％（ｗ／ｖ）、または４％（ｗ／ｖ）である。ある特定の実施形態では、ポロクサマーはポロクサマー１８８（Ｐ１８８）である。ある特定の実施形態では、ポロクサマーはポロクサマー４０７（Ｐ４０７）である。一態様では、本発明は、（ａ）組換えレンチウイルスベクターの有効用量；（ｂ）ＴＲＩＳ非含有緩衝系；（ｃ）塩；（ｄ）界面活性剤；（ｅ）炭水化物、および（ｆ）配列番号７に示されるｍｉＲ－１４２の標的配列と少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列を含む組換えレンチウイルスベクター調製物を対象とし、ここで医薬組成物はヒト患者への全身投与に適する。ある特定の実施形態では、ベクターはさらに、強化トランスサイレチン（ＥＴ）プロモーターを含む。ある特定の実施形態では、ベクターはさらに、配列番号１もしくは配列番号２に示される第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）コード配列または配列番号３に示される第ＩＸ因子（ＦＩＸ）コード配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ベクターは、配列番号１または配列番号２に示される第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）コード配列を含む。ある特定の実施形態では、ベクターは、配列番号３に示される第ＩＸ因子（ＦＩＸ）コード配列を含む。

【0208】

ある特定の実施形態では、ベクターはさらに、ＶＳＶ－Ｇまたはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、緩衝系のｐＨは、６．０～８．０の間である。ある特定の実施形態では、緩衝系はリン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液である。ある特定の実施形態では、リン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液の濃度は、５ｍＭ～３０ｍＭの間である。ある特定の実施形態では、リン酸緩衝液の濃度は、約１０～約２０ｍＭ、約１０～約１５ｍＭ、約２０～約３０ｍＭ、約２０～約２５ｍＭ、または約１５～約２０ｍＭである。ある特定の実施形態では、塩は塩化物塩である。ある特定の実施形態では、塩化物塩の濃度は、８０ｍＭ～１５０ｍＭの間である。ある特定の実施形態では、塩の濃度は、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１３０ｍＭ、または約１５０ｍＭである。ある特定の実施形態では、界面活性剤はポロクサマーまたはポリソルベートである。ある特定の実施形態では、ポロクサマーまたはポリソルベートの濃度は、０．０１％（ｗ／ｖ）～０．１％（ｗ／ｖ）の間である。ある特定の実施形態では、炭水化物はスクロースである。ある特定の実施形態では、炭水化物の濃度は、０．５％（ｗ／ｖ）～５％（ｗ／ｖ）の間である。ある特定の実施形態では、塩化物塩はＮａＣｌである。ある特定の実施形態では、ポロクサマーは、ポロクサマー１０１（Ｐ１０１）、ポロクサマー１０５（Ｐ１０５）、ポロクサマー１０８（Ｐ１０８）、ポロクサマー１２２（Ｐ１２２）、ポロクサマー１２３（Ｐ１２３）、ポロクサマー１２４（Ｐ１２４）、ポロクサマー１８１（Ｐ１８１）、ポロクサマー１８２（Ｐ１８２）、ポロクサマー１８３（Ｐ１８３）、ポロクサマー１８４（Ｐ１８４）、ポロクサマー１８５（Ｐ１８５）、ポロクサマー１８８（Ｐ１８８）、ポロクサマー２１２（Ｐ２１２）、ポロクサマー２１５（Ｐ２１５）、ポロクサマー２１７（Ｐ２１７）、ポロクサマー２３１（Ｐ２３１）、ポロクサマー２３４（Ｐ２３４）、ポロクサマー２３５（Ｐ２３５）、ポロクサマー２３７（Ｐ２３７）、ポロクサマー２３８（Ｐ２３８）、ポロクサマー２８２（Ｐ２８２）、ポロクサマー２８４（Ｐ２８４）、ポロクサマー２８８（Ｐ２８８）、ポロクサマー３３１（Ｐ３３１）、ポロクサマー３３３（Ｐ３３３）、ポロクサマー３３４（Ｐ３３４）、ポロクサマー３３５（Ｐ３３５）、ポロクサマー３３８（Ｐ３３８）、ポロクサマー４０１（Ｐ４０１）、ポロクサマー４０２（Ｐ４０２）、ポロクサマー４０３（Ｐ４０３）、ポロクサマー４０７（Ｐ４０７）、およびそれらの組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ポリソルベートは、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、およびそれらの組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、リン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液のｐＨは、６．１、６．３、６．５、６．７、６．９、７．１、７．３、７．５、７．７、または７．９である。ある特定の実施形態では、リン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液の濃度は、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、または２５ｍＭである。ある特定の実施形態では、塩化物塩は、１００ｍＭ、１１０ｍＭ、１３０ｍＭ、または１５０ｍＭである。ある特定の実施形態では、ポロクサマーまたはポリソルベートの濃度は、０．０３％（ｗ／ｖ）、０．０５％（ｗ／ｖ）、０．０７％（ｗ／ｖ）、または０．０９％（ｗ／ｖ）である。ある特定の実施形態では、炭水化物の濃度は、１％（ｗ／ｖ）、２％（ｗ／ｖ）、３％（ｗ／ｖ）、または４％（ｗ／ｖ）である。ある特定の実施形態では、ポロクサマーはポロクサマー１８８（Ｐ１８８）である。ある特定の実施形態では、ポロクサマーはポロクサマー４０７（Ｐ４０７）である。

【0209】

一態様では、本発明は、組換えレンチウイルスベクター調製物を対象とし、ここで組換えレンチウイルスベクターは、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＮＳＯ細胞、およびＣＡＰ細胞を含むトランスフェクト宿主細胞から単離され、組換えレンチウイルスベクター調製物は、（ａ）組換えレンチウイルスベクターの有効用量；（ｂ）ＴＲＩＳ非含有緩衝系；（ｃ）塩；（ｄ）界面活性剤；および（ｅ）炭水化物を含み、医薬組成物はヒト患者への全身投与に適する。ある特定の実施形態では、宿主細胞はＣＤ４７陽性宿主細胞である。ある特定の実施形態では、ベクターはさらに、強化トランスサイレチン（ＥＴ）プロモーターを含む。ある特定の実施形態では、ベクターはさらに、配列番号７に示されるｍｉＲ－１４２の標的配列と少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ベクターはさらに、配列番号１もしくは配列番号２に示される第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）コード配列または配列番号３に示される第ＩＸ因子（ＦＩＸ）コード配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ベクターは、配列番号１または配列番号２に示される第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）コード配列を含む。ある特定の実施形態では、ベクターは、配列番号３に示される第ＩＸ因子（ＦＩＸ）コード配列を含む。

【0210】

ある特定の実施形態では、ベクターはさらに、ＶＳＶ－Ｇまたはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、緩衝系のｐＨは、６．０～８．０の間である。ある特定の実施形態では、緩衝系はリン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液である。ある特定の実施形態では、リン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液の濃度は、５ｍＭ～３０ｍＭの間である。ある特定の実施形態では、リン酸緩衝液の濃度は、約１０～約２０ｍＭ、約１０～約１５ｍＭ、約２０～約３０ｍＭ、約２０～約２５ｍＭ、または約１５～約２０ｍＭである。ある特定の実施形態では、塩は塩化物塩である。ある特定の実施形態では、塩化物塩の濃度は、８０ｍＭ～１５０ｍＭの間である。ある特定の実施形態では、塩の濃度は、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１３０ｍＭ、または約１５０ｍＭである。ある特定の実施形態では、界面活性剤はポロクサマーまたはポリソルベートである。ある特定の実施形態では、ポロクサマーまたはポリソルベートの濃度は、０．０１％（ｗ／ｖ）～０．１％（ｗ／ｖ）の間である。ある特定の実施形態では、炭水化物はスクロースである。ある特定の実施形態では、炭水化物の濃度は、０．５％（ｗ／ｖ）～５％（ｗ／ｖ）の間である。ある特定の実施形態では、塩化物塩はＮａＣｌである。ある特定の実施形態では、ポロクサマーは、ポロクサマー１０１（Ｐ１０１）、ポロクサマー１０５（Ｐ１０５）、ポロクサマー１０８（Ｐ１０８）、ポロクサマー１２２（Ｐ１２２）、ポロクサマー１２３（Ｐ１２３）、ポロクサマー１２４（Ｐ１２４）、ポロクサマー１８１（Ｐ１８１）、ポロクサマー１８２（Ｐ１８２）、ポロクサマー１８３（Ｐ１８３）、ポロクサマー１８４（Ｐ１８４）、ポロクサマー１８５（Ｐ１８５）、ポロクサマー１８８（Ｐ１８８）、ポロクサマー２１２（Ｐ２１２）、ポロクサマー２１５（Ｐ２１５）、ポロクサマー２１７（Ｐ２１７）、ポロクサマー２３１（Ｐ２３１）、ポロクサマー２３４（Ｐ２３４）、ポロクサマー２３５（Ｐ２３５）、ポロクサマー２３７（Ｐ２３７）、ポロクサマー２３８（Ｐ２３８）、ポロクサマー２８２（Ｐ２８２）、ポロクサマー２８４（Ｐ２８４）、ポロクサマー２８８（Ｐ２８８）、ポロクサマー３３１（Ｐ３３１）、ポロクサマー３３３（Ｐ３３３）、ポロクサマー３３４（Ｐ３３４）、ポロクサマー３３５（Ｐ３３５）、ポロクサマー３３８（Ｐ３３８）、ポロクサマー４０１（Ｐ４０１）、ポロクサマー４０２（Ｐ４０２）、ポロクサマー４０３（Ｐ４０３）、ポロクサマー４０７（Ｐ４０７）、およびそれらの組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ポリソルベートは、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、およびそれらの組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、リン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液のｐＨは、６．１、６．３、６．５、６．７、６．９、７．１、７．３、７．５、７．７、または７．９である。ある特定の実施形態では、リン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液の濃度は、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、または２５ｍＭである。ある特定の実施形態では、塩化物塩は、１００ｍＭ、１１０ｍＭ、１３０ｍＭ、または１５０ｍＭである。ある特定の実施形態では、ポロクサマーまたはポリソルベートの濃度は、０．０３％（ｗ／ｖ）、０．０５％（ｗ／ｖ）、０．０７％（ｗ／ｖ）、または０．０９％（ｗ／ｖ）である。ある特定の実施形態では、炭水化物の濃度は、１％（ｗ／ｖ）、２％（ｗ／ｖ）、３％（ｗ／ｖ）、または４％（ｗ／ｖ）である。ある特定の実施形態では、ポロクサマーはポロクサマー１８８（Ｐ１８８）である。ある特定の実施形態では、ポロクサマーはポロクサマー４０７（Ｐ４０７）である。

【0211】

一態様では、本発明は、障害を有するヒト患者を治療する方法であって、（ａ）組換えレンチウイルスベクターの有効用量；（ｂ）ＴＲＩＳ非含有緩衝系；（ｃ）塩；（ｄ）界面活性剤；および（ｅ）炭水化物を含む組換えレンチウイルスベクター調製物がヒト患者に全身投与される方法を対象とし、ここで医薬組成物はヒト患者への全身投与に適する。ある特定の実施形態では、調製物は、ヒト患者に全身投与される。ある特定の実施形態では、調製物は静脈内に投与される。

【0212】

ある特定の実施形態では、障害は出血性障害である。ある特定の実施形態では、出血性障害は、血友病Ａまたは血友病Ｂである。

【0213】

ある特定の実施形態では、ベクターはさらに、強化トランスサイレチン（ＥＴ）プロモーターを含む。ある特定の実施形態では、ベクターはさらに、配列番号７に示されるｍｉＲ－１４２の標的配列と少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ベクターはさらに、配列番号１もしくは配列番号２に示される第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）コード配列または配列番号３に示される第ＩＸ因子（ＦＩＸ）コード配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ベクターは、配列番号１または配列番号２に示される第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）コード配列を含む。ある特定の実施形態では、ベクターは、配列番号３に示される第ＩＸ因子（ＦＩＸ）コード配列を含む。

【0214】

ある特定の実施形態では、ベクターはさらに、ＶＳＶ－Ｇまたはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、緩衝系のｐＨは、６．０～８．０の間である。ある特定の実施形態では、緩衝系はリン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液である。ある特定の実施形態では、リン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液の濃度は、５ｍＭ～３０ｍＭの間である。ある特定の実施形態では、リン酸緩衝液の濃度は、約１０～約２０ｍＭ、約１０～約１５ｍＭ、約２０～約３０ｍＭ、約２０～約２５ｍＭ、または約１５～約２０ｍＭである。ある特定の実施形態では、塩は塩化物塩である。ある特定の実施形態では、塩化物塩の濃度は、８０ｍＭ～１５０ｍＭの間である。ある特定の実施形態では、塩の濃度は、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１３０ｍＭ、または約１５０ｍＭである。ある特定の実施形態では、界面活性剤はポロクサマーまたはポリソルベートである。ある特定の実施形態では、ポロクサマーまたはポリソルベートの濃度は、０．０１％（ｗ／ｖ）～０．１％（ｗ／ｖ）の間である。ある特定の実施形態では、炭水化物はスクロースである。ある特定の実施形態では、炭水化物の濃度は、０．５％（ｗ／ｖ）～５％（ｗ／ｖ）の間である。ある特定の実施形態では、塩化物塩はＮａＣｌである。ある特定の実施形態では、ポロクサマーは、ポロクサマー１０１（Ｐ１０１）、ポロクサマー１０５（Ｐ１０５）、ポロクサマー１０８（Ｐ１０８）、ポロクサマー１２２（Ｐ１２２）、ポロクサマー１２３（Ｐ１２３）、ポロクサマー１２４（Ｐ１２４）、ポロクサマー１８１（Ｐ１８１）、ポロクサマー１８２（Ｐ１８２）、ポロクサマー１８３（Ｐ１８３）、ポロクサマー１８４（Ｐ１８４）、ポロクサマー１８５（Ｐ１８５）、ポロクサマー１８８（Ｐ１８８）、ポロクサマー２１２（Ｐ２１２）、ポロクサマー２１５（Ｐ２１５）、ポロクサマー２１７（Ｐ２１７）、ポロクサマー２３１（Ｐ２３１）、ポロクサマー２３４（Ｐ２３４）、ポロクサマー２３５（Ｐ２３５）、ポロクサマー２３７（Ｐ２３７）、ポロクサマー２３８（Ｐ２３８）、ポロクサマー２８２（Ｐ２８２）、ポロクサマー２８４（Ｐ２８４）、ポロクサマー２８８（Ｐ２８８）、ポロクサマー３３１（Ｐ３３１）、ポロクサマー３３３（Ｐ３３３）、ポロクサマー３３４（Ｐ３３４）、ポロクサマー３３５（Ｐ３３５）、ポロクサマー３３８（Ｐ３３８）、ポロクサマー４０１（Ｐ４０１）、ポロクサマー４０２（Ｐ４０２）、ポロクサマー４０３（Ｐ４０３）、ポロクサマー４０７（Ｐ４０７）、およびそれらの組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ポリソルベートは、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、およびそれらの組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、リン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液のｐＨは、６．１、６．３、６．５、６．７、６．９、７．１、７．３、７．５、７．７、または７．９である。ある特定の実施形態では、リン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液の濃度は、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、または２５ｍＭである。ある特定の実施形態では、塩化物塩は、１００ｍＭ、１１０ｍＭ、１３０ｍＭ、または１５０ｍＭである。ある特定の実施形態では、ポロクサマーまたはポリソルベートの濃度は、０．０３％（ｗ／ｖ）、０．０５％（ｗ／ｖ）、０．０７％（ｗ／ｖ）、または０．０９％（ｗ／ｖ）である。ある特定の実施形態では、炭水化物の濃度は、１％（ｗ／ｖ）、２％（ｗ／ｖ）、３％（ｗ／ｖ）、または４％（ｗ／ｖ）である。ある特定の実施形態では、ポロクサマーはポロクサマー１８８（Ｐ１８８）である。ある特定の実施形態では、ポロクサマーはポロクサマー４０７（Ｐ４０７）である。

【0215】

Ｂ．１．出血性障害
出血性障害は、血管損傷部位で血餅を形成する血液の能力が損なわれる結果である。出血性障害には、血友病Ａ、血友病Ｂ、フォンビルブランド病、および稀な因子欠乏症を含む、いくつかの種類がある。血友病Ａは、第ＶＩＩＩ因子の遺伝子の突然変異または低発現によって引き起こされる第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の欠乏に起因し、一方、血友病Ｂは、第ＩＸ因子の遺伝子の突然変異または低発現によって引き起こされる第ＩＸ因子（ＦＩＸ）の欠乏に起因する。

【0216】

米国疾病対策センターによれば、血友病は約５，０００人の出生に１人の割合で発生する。米国には約２０，０００人の血友病患者がいる。すべての人種および民族が罹患している。血友病Ａの頻度は血友病Ｂの４倍であり、血友病Ａの患者の過半数が重症型の血友病を有する。血友病に罹患した人々には、生涯にわたって広範な医療モニタリングが必要である。介入がなければ、罹患個体には関節の自然出血が起こり、これは激しい痛みおよび衰弱性不動を生じさせる。出血が筋肉内に及ぶとその組織に血液の蓄積が生じ、一方、頭頸部における自然出血は、直ちに治療されなければ窒息を引き起こす可能性がある。手術、事故による軽度の負傷、または抜糸の後の腎出血および重度の出血もよくみられる。

【0217】

本明細書には、それを必要とする対象における出血性疾患または状態を治療するために使用される製剤が開示される。出血性疾患または状態は、出血性凝固障害、関節血症、筋肉出血、口内出血、出血、筋肉への出血、口腔内出血、外傷、頭部外傷、胃腸出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系出血、咽頭後隙における出血、後腹膜腔における出血、腸腰筋鞘における出血、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される。さらに他の実施形態では、対象は、手術を受けることが予定されている。さらに他の実施形態では、治療は予防的またはオンデマンドである。

【0218】

レンチウイルスベクター（ＬＶ）の安定で効力のある製剤を使用した遺伝子療法は、十分なレベルの機能的な第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子の発現をもたらす、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子遺伝子の細胞への安定した組み込みを通じて、血友病ＡまたはＢに罹患した個体の治療において大きな有望性を示す。

【0219】

体細胞遺伝子療法は、出血性障害に対する可能性のある治療として検討されている。遺伝子療法は、各々の凝固因子をコードするベクターの単回投与後にＦＶＩＩＩまたはＦＩＸの連続的な内因性産生を通じて疾患を治癒させる可能性があることから、血友病に対する特に魅力的な治療である。血友病Ａ（ＦＶＩＩＩの欠乏）および血友病Ｂ（ＦＩＸの欠乏）は、その臨床病態が血漿中を微量（２００ｎｇ／ｍｌ）に循環する単一の遺伝子産物（ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸ）の欠如に完全に起因するため、遺伝子補充アプローチによく適する。

【0220】

レンチウイルスは、その収容力が大きく、組み込みを介して導入遺伝子の発現を維持する能力があることから、遺伝子送達ビヒクルとして注目を集めている。レンチウイルスは、過去１０年間にわたり、数多くのエクスビボ細胞療法臨床プログラムで評価され、有望な有効性および安全性プロファイルが示されており、広く経験を得ている。レンチウイルスのインビボ遺伝子療法における使用が一般に認められつつあることから、長期貯蔵のためにレンチウイルスの安定性を高める、改良された製剤を提供することが、当技術分野で必要とされている。

【0221】

本開示は、レンチウイルス安定性を付与し、長期冷凍貯蔵を可能にする製剤化緩衝液またはビヒクルを提供することによって、当技術分野における重要な必要性を満たす。ある特定の例示的な実施形態では、製剤化緩衝液は、投与経路が全身性である場合、レンチウイルス安定性を付与し、長期冷凍貯蔵を可能にする。一部の実施形態では、レンチウイルスは精製後に、本開示の製剤化緩衝液またはビヒクル中で処理される。製剤化されると、レンチウイルスは凍結貯蔵される。本発明の製剤化緩衝液またはビヒクルは、凍結および解凍ならびに高温への曝露に対して、より高い安定性を提供する。

【0222】

本明細書には、対象における発現の増加を示し、遺伝子治療の方法に使用された場合により高い治療効果をもたらす可能性のある、コドン最適化ＦＶＩＩＩ配列またはコドン最適化ＦＩＸ配列を含むレンチウイルスベクターが提供される。本開示の実施形態は、本明細書に記載されるように、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする１つもしくはそれ以上のコドン最適化核酸分子を含むレンチウイルスベクター、またはＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードする１つもしくはそれ以上のコドン最適化核酸分子を含むレンチウイルスベクター、レンチウイルスベクターを含む宿主細胞（例えば、肝細胞）、および開示されるレンチウイルスベクターの使用方法（例えば、本明細書に開示されるレンチウイルスベクターを使用する出血性障害に対する治療）を対象とする。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、スケールアップ処理中に、本開示の製剤化緩衝液またはビヒクル中に処理されるレンチウイルスの中にパッケージングされる。

【0223】

一般に、本明細書に開示される治療方法は、ＦＶＩＩＩ凝固因子をコードする少なくとも１つのコドン最適化核酸配列を含む核酸分子を含むレンチウイルスベクター、またはＦＩＸ凝固因子をコードする少なくとも１つのコドン最適化核酸配列を含む核酸分子を含むレンチウイルスベクターの投与を伴う。一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩ凝固因子をコードする核酸配列は、好適な発現制御配列に作動可能に連結され、それは一部の実施形態では、レンチウイルスベクター（例えば、複製能欠損レンチウイルスウイルスベクター）に組み込まれる。一部の実施形態では、ＦＩＸ凝固因子をコードする核酸配列は、好適な発現制御配列に作動可能に連結され、それは一部の実施形態では、レンチウイルスベクター（例えば、複製能欠損レンチウイルスウイルスベクター）に組み込まれる。

【0224】

本開示は、それを必要とする対象における出血性障害（例えば、血友病Ａまたは血友病Ｂ）を治療する方法であって、ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むレンチウイルスベクターの少なくとも１回の用量を対象に投与する工程を含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、本発明の製剤化緩衝液中に処理されるレンチウイルスの中にパッケージングされる。ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、表１に示されている配列番号１に示される核酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、または少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、表１に示されている配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、表１に示されている配列番号２に示される核酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、または少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、表１に示されている配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、表１に示されている配列番号３に示される核酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、または少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、表１に示されている配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなる。

【0225】

本開示は、それを必要とする対象における出血性障害（例えば、血友病Ａまたは血友病Ｂ）を治療する方法であって、ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むレンチウイルスベクターの少なくとも１回の用量を対象に投与する工程を含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、本発明の製剤化緩衝液またはビヒクル中に処理されるレンチウイルスの中にパッケージングされる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるＦＶＩＩＩまたはＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むレンチウイルスベクターの、５×１０^１０またはそれ未満の形質導入単位／ｋｇ（ＴＵ／ｋｇ）（または１０^９ＴＵ／ｋｇまたはそれ未満、もしくは１０^８ＴＵ／ｋｇまたはそれ未満）である少なくとも１回の用量が、対象に投与される。

【0226】

一部の実施形態では、用量は、約５．０×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約４．９×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約４．８×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約４．７×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約４．６×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約４．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約４．４×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約４．３×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約４．２×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約４．１×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約４．０×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約３．９×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約３．８×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約３．７×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約３．６×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約３．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約３．４×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約３．３×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約３．２×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約３．１×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約３．０×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約２．９×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約２．８×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約２．７×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約２．６×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約２．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約２．４×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約２．３×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約２．２×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約２．１×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約２．０×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約１．９×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約１．８×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約１．７×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約１．６×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約１．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約１．４×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約１．３×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約１．２×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、約１．１×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、または約１．０×１０^１０ＴＵ／ｋｇである。

【0227】

一部の実施形態では、用量は、約９．９×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約９．８×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約９．７×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約９．６×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約９．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約９．４×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約９．３×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約９．２×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約９．１×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約９．０×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約８．９×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約８．８×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約８．７×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約８．６×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約８．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約８．４×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約８．３×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約８．２×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約８．１×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約８．０×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約７．９×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約７．８×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約７．７×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約７．６×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約７．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約７．４×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約７．３×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約７．２×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約７．１×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約７．０×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約６．９×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約６．８×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約６．７×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約６．６×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約６．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約６．４×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約６．３×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約６．２×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約６．１×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約６．０×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約５．９×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約５．８×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約５．７×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約５．６×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約５．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約５．４×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約５．３×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約５．２×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約５．１×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約５．０×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約４．９×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約４．８×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約４．７×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約４．６×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約４．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約４．４×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約４．３×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約４．２×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約４．１×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約４．０×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約３．９×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約３．８×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約３．７×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約３．６×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約３．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約３．４×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約３．３×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約３．２×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約３．１×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約３．０×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約２．９×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約２．８×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約２．７×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約２．６×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約２．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約２．４×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約２．３×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約２．２×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約２．１×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約２．０×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約１．９×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約１．８×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約１．７×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約１．６×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約１．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約１．４×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約１．３×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約１．２×１０^９ＴＵ／ｋｇ、約１．１×１０^９ＴＵ／ｋｇ、または約１．０×１０^９ＴＵ／ｋｇである。

【0228】

一部の実施形態では、用量は、約９．９×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約９．８×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約９．７×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約９．６×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約９．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約９．４×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約９．３×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約９．２×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約９．１×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約９．０×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約８．９×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約８．８×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約８．７×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約８．６×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約８．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約８．４×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約８．３×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約８．２×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約８．１×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約８．０×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約７．９×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約７．８×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約７．７×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約７．６×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約７．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約７．４×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約７．３×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約７．２×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約７．１×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約７．０×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約６．９×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約６．８×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約６．７×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約６．６×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約６．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約６．４×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約６．３×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約６．２×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約６．１×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約６．０×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約５．９×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約５．８×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約５．７×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約５．６×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約５．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約５．４×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約５．３×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約５．２×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約５．１×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約５．０×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約４．９×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約４．８×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約４．７×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約４．６×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約４．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約４．４×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約４．３×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約４．２×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約４．１×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約４．０×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約３．９×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約３．８×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約３．７×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約３．６×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約３．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約３．４×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約３．３×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約３．２×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約３．１×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約３．０×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約２．９×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約２．８×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約２．７×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約２．６×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約２．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約２．４×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約２．３×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約２．２×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約２．１×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約２．０×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約１．９×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約１．８×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約１．７×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約１．６×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約１．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約１．４×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約１．３×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約１．２×１０^８ＴＵ／ｋｇ、約１．１×１０^８ＴＵ／ｋｇ、または約１．０×１０^８ＴＵ／ｋｇである。

【0229】

一部の実施形態では、用量は、５．０×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、４．９×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、４．８×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、４．７×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、４．６×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、４．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、４．４×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、４．３×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、４．２×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、４．１×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、４．０×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、３．９×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、３．８×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、３．７×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、３．６×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、３．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、３．４×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、３．３×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、３．２×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、３．１×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、３．０×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、２．９×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、２．８×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、２．７×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、２．６×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、２．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、２．４×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、２．３×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、２．２×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、２．１×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、２．０×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、１．９×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、１．８×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、１．７×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、１．６×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、１．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、１．４×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、１．３×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、１．２×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満、１．１×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、または１．０×１０^１０ＴＵ／ｋｇ未満である。

【0230】

一部の実施形態では、用量は、９．９×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、９．８×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、９．７×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、９．６×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、９．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、９．４×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、９．３×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、９．２×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、９．１×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、９．０×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、８．９×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、８．８×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、８．７×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、８．６×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、８．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、８．４×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、８．３×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、８．２×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、８．１×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、８．０×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、７．９×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、７．８×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、７．７×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、７．６×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、７．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、７．４×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、７．３×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、７．２×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、７．１×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、７．０×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、６．９×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、６．８×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、６．７×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、６．６×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、６．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、６．４×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、６．３×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、６．２×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、６．１×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、６．０×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、５．９×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、５．８×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、５．７×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、５．６×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、５．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、５．４×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、５．３×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、５．２×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、５．１×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、５．０×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、４．９×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、４．８×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、４．７×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、４．６×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、４．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、４．４×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、４．３×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、４．２×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、４．１×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、４．０×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、３．９×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、３．８×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、３．７×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、３．６×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、３．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、３．４×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、３．３×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、３．２×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、３．１×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、３．０×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、２．９×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、２．８×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、２．７×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、２．６×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、２．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、２．４×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、２．３×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、２．２×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、２．１×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、２．０×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、１．９×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、１．８×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、１．７×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、１．６×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、１．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、１．４×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、１．３×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、１．２×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満、１．１×１０^９ＴＵ／ｋｇ、または１．０×１０^９ＴＵ／ｋｇ未満である。

【0231】

一部の実施形態では、用量は、９．９×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、９．８×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、９．７×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、９．６×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、９．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、９．４×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、９．３×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、９．２×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、９．１×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、９．０×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、８．９×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、８．８×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、８．７×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、８．６×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、８．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、８．４×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、８．３×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、８．２×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、８．１×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、８．０×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、７．９×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、７．８×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、７．７×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、７．６×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、７．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、７．４×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、７．３×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、７．２×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、７．１×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、７．０×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、６．９×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、６．８×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、６．７×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、６．６×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、６．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、６．４×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、６．３×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、６．２×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、６．１×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、６．０×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、５．９×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、５．８×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、５．７×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、５．６×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、５．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、５．４×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、５．３×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、５．２×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、５．１×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、５．０×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、４．９×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、４．８×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、４．７×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、４．６×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、４．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、４．４×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、４．３×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、４．２×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、４．１×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、４．０×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、３．９×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、３．８×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、３．７×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、３．６×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、３．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、３．４×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、３．３×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、３．２×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、３．１×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、３．０×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、２．９×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、２．８×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、２．７×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、２．６×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、２．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、２．４×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、２．３×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、２．２×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、２．１×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、２．０×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、１．９×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、１．８×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、１．７×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、１．６×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、１．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、１．４×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、１．３×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、１．２×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満、１．１×１０^８ＴＵ／ｋｇ、または１．０×１０^８ＴＵ／ｋｇ未満である。

【0232】

一部の実施形態では、用量は、１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、１．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、２×１０^８ＴＵ／ｋｇ～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、２．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、３×１０^８ＴＵ／ｋｇ～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、３．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、４×１０^８ＴＵ／ｋｇ～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、４．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、５×１０^８ＴＵ／ｋｇ～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、５．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、６×１０^８ＴＵ／ｋｇ～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、６．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、７×１０^８ＴＵ／ｋｇ～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、７．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、８×１０^８ＴＵ／ｋｇ～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、８．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、９×１０^８ＴＵ／ｋｇ～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、９．５×１０^８ＴＵ／ｋｇ～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、１×１０^９ＴＵ／ｋｇ～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、１．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、２×１０^９ＴＵ／ｋｇ～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、２．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、３×１０^９ＴＵ／ｋｇ～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、３．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、４×１０^９ＴＵ／ｋｇ～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、４．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、５×１０^９ＴＵ／ｋｇ～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、５．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、６×１０^９ＴＵ／ｋｇ～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、６．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、７×１０^９ＴＵ／ｋｇ～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、７．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、８×１０^９ＴＵ／ｋｇ～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、８．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、９×１０^９ＴＵ／ｋｇ～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、９．５×１０^９ＴＵ／ｋｇ～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、１０^１０ＴＵ／ｋｇ～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、１．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、２×１０^１０ＴＵ／ｋｇ～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、２．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、３×１０^１０ＴＵ／ｋｇ～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、３．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、４×１０^１０ＴＵ／ｋｇ～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、または４．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇ～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間である。

【0233】

一部の実施形態では、用量は、１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～５×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～４．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～４×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～３．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～３×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～２．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～２×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～１．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～９×１０^９ＴＵ／ｋｇの間、１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～８．５×１０^９ＴＵ／ｋｇの間、１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～８×１０^９ＴＵ／ｋｇの間、１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～７．５×１０^９ＴＵ／ｋｇの間、１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～７×１０^９ＴＵ／ｋｇの間、１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～６．５×１０^９ＴＵ／ｋｇの間、１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～６×１０^９ＴＵ／ｋｇの間、１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～５．５×１０^９ＴＵ／ｋｇの間、１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～５×１０^９ＴＵ／ｋｇの間、１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～４．５×１０^９ＴＵ／ｋｇの間、１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～４×１０^９ＴＵ／ｋｇの間、１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～３．５×１０^９ＴＵ／ｋｇの間、１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～３×１０^９ＴＵ／ｋｇの間、１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～２．５×１０^９ＴＵ／ｋｇの間、１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～２×１０^９、１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～１．５×１０^９ＴＵ／ｋｇの間、１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～１×１０^９ＴＵ／ｋｇの間、１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～９．５×１０^８ＴＵ／ｋｇの間、１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～９×１０^８ＴＵ／ｋｇの間、１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～８．５×１０^８ＴＵ／ｋｇの間、１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～８×１０^８ＴＵ／ｋｇの間、１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～７．５×１０^８ＴＵ／ｋｇの間、１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～７×１０^８ＴＵ／ｋｇの間、１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～６．５×１０^８ＴＵ／ｋｇの間、１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～６×１０^８ＴＵ／ｋｇの間、１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～５．５×１０^８ＴＵ／ｋｇの間、１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～５×１０^８ＴＵ／ｋｇの間、１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～４．５×１０^８ＴＵ／ｋｇの間、１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～４×１０^８ＴＵ／ｋｇの間、１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～３．５×１０^８ＴＵ／ｋｇの間、１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～３×１０^８ＴＵ／ｋｇの間、１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～２．５×１０^８ＴＵ／ｋｇの間、１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～２×１０^８、または１×１０^８ＴＵ／ｋｇ～１．５×１０^８ＴＵ／ｋｇの間である。

【0234】

一部の実施形態では、用量は、１×１０^１０ＴＵ／ｋｇ～２×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、１．１×１０^１０ＴＵ／ｋｇ～１．９×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、１．２×１０^１０ＴＵ／ｋｇ～１．８×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間、１．３×１０^１０ＴＵ／ｋｇ～１．７×１０^１０ＴＵ／ｋｇ、または１．４×１０^１０ＴＵ／ｋｇ～１．６×１０^１０ＴＵ／ｋｇの間である。一部の実施形態では、用量は約１．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇである。一部の実施形態では、用量は１．５×１０^１０ＴＵ／ｋｇである。

【0235】

一部の実施形態では、用量は、１×１０^９ＴＵ／ｋｇ～２×１０^９ＴＵ／ｋｇの間、１．１×１０^９ＴＵ／ｋｇ～１．９×１０^９ＴＵ／ｋｇの間、１．２×１０^９ＴＵ／ｋｇ～１．８×１０^９ＴＵ／ｋｇの間、１．３×１０^９ＴＵ／ｋｇ～１．７×１０^９ＴＵ／ｋｇ、または１．４×１０^９ＴＵ／ｋｇ～１．６×１０^９ＴＵ／ｋｇの間である。一部の実施形態では、用量は１．５×１０^９ＴＵ／ｋｇである。ある特定の実施形態では、用量は約３．０×１０^９ＴＵ／ｋｇである。

【0236】

一部の実施形態では、本開示のレンチウイルスベクターの投与後２４時間、３６時間、または４８時間の時点での血漿中ＦＶＩＩＩ活性は、対照レンチウイルスベクターを投与された対象における血漿中ＦＶＩＩＩ活性に比して増加する。一部の実施形態では、本開示のレンチウイルスベクターの投与後２４時間、３６時間、または４８時間の時点での血漿中ＦＶＩＩＩ活性は、対照核酸分子を投与された対象における血漿中ＦＶＩＩＩ活性に比して増加する。

【0237】

一部の実施形態では、本開示のレンチウイルスベクターの投与後２４時間、３６時間、または４８時間の時点での血漿中ＦＩＸ活性は、対照レンチウイルスベクターを投与された対象における血漿中ＦＩＸ活性に比して増加する。一部の実施形態では、本開示のレンチウイルスベクターの投与後２４時間、３６時間、または４８時間の時点での血漿中ＦＩＸ活性は、対照核酸分子を投与された対象における血漿中ＦＩＸ活性に比して増加する。

【0238】

一部の実施形態では、血漿中ＦＶＩＩＩ活性または血漿中ＦＩＸ活性は、本開示のレンチウイルスベクターの投与後約６時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、約１４日、約１５日、約１６日、約１７日、約１８日、約１９日、約２０日、約２１日、約２２日、約２３日、約２４日、約２５日、約２６日、約２７日、または約２８日の時点で、対照レンチウイルスベクターまたは対照核酸分子を投与された対象に比して増加する。

【0239】

一部の実施形態では、対象における血漿中ＦＶＩＩＩ活性または血漿中ＦＩＸ活性は、対象における基礎レベルに比して、対照レンチウイルスベクターまたは対照核酸分子を投与された対象におけるレベルに比して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約５５倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約６５倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約８５倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約９５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１１０倍、少なくとも約１２０倍、少なくとも約１３０倍、少なくとも約１４０倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約１６０倍、少なくとも約１７０倍、少なくとも約１８０倍、少なくとも約１９０倍、または少なくとも約２００倍に増加する。

【0240】

一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、単回用量または複数回用量として投与される。一部の実施形態では、レンチウイルスベクター用量は、一度に、または複数の部分用量、例えば、２つの部分用量、３つの部分用量、４つの部分用量、５つの部分用量、６つの部分用量、もしくは６つを上回る部分用量に分割して投与される。一部の実施形態では、複数のレンチウイルスベクターが投与される。

【0241】

一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの用量は、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、または少なくとも１０回、繰り返して投与される。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、静脈内注射を介して投与される。

【0242】

一部の実施形態では、対象は小児対象である。一部の実施形態では、対象は成人対象である。

【0243】

一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、少なくとも１つの組織特異的プロモーター、すなわち、特定の組織または細胞型におけるＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドまたはＦＩＸ活性を有するポリペプチドの発現を調節すると考えられるプロモーターを含む。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターの中の組織特異的プロモーターは、標的肝臓細胞においてＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドの発現を選択的に強化する。一部の実施形態では、標的肝臓細胞においてＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドの発現を選択的に強化する組織特異的プロモーターは、ｍＴＴＲプロモーターを含む。一部の実施形態では、標的肝臓細胞においてＦＩＸ活性を有するポリペプチドの発現を選択的に強化する組織特異的プロモーターは、ＡＰＯＡ２プロモーター、ＳＥＲＰＩＮＡ１（ｈＡＡＴ）プロモーター、ｍＴＴＲプロモーター、ＭＩＲ１２２プロモーター、ＥＴプロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ第ＡＹ６６１２６５号；Ｖｉｇｎａら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １１（５）：７６３頁（２００５年）も参照のこと）、またはその任意の組合せを含む。一部の実施形態では、標的肝臓細胞は肝細胞である。

【0244】

レンチウイルスベクターは、すべての肝臓細胞型に形質導入を行うことができるため、異なる細胞型における導入遺伝子（例えば、ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸ）の発現を、レンチウイルスベクター中の異なるプロモーターを使用して制御することができる。それ故に、レンチウイルスベクターは、異なる組織または細胞型、例えば異なる肝組織または細胞型におけるＦＶＩＩＩ導入遺伝子またはＦＩＸ導入遺伝子の発現を制御すると考えられる特異的プロモーターを含み得る。それ故に、一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、肝内皮組織におけるＦＶＩＩＩ導入遺伝子もしくはＦＩＸ導入遺伝子の発現を制御すると考えられる内皮特異的プロモーター、もしくは肝細胞におけるＦＶＩＩＩ導入遺伝子もしくはＦＩＸ導入遺伝子の発現を制御すると考えられる肝細胞特異的プロモーター、またはその両方を含むことができる。

【0245】

一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、肝臓以外の組織におけるＦＶＩＩＩ導入遺伝子またはＦＩＸ導入遺伝子の発現を制御する、１つまたは複数の組織特異的プロモーターを含む。一部の実施形態では、単離された核酸分子は、標的細胞または標的組織のゲノム、例えば、肝細胞のゲノムまたは肝内皮細胞のゲノムの中に安定して組み込まれる。

【0246】

一部の実施形態では、本開示のレンチウイルスベクターの中の単離された核酸分子は、異種アミノ酸配列（例えば、半減期延長剤）をコードする異種ヌクレオチド配列をさらに含む。一部の実施形態では、異種アミノ酸配列は、免疫グロブリン定常領域またはその一部分、ＸＴＥＮ、トランスフェリン、アルブミン、またはＰＡＳ配列である。一部の実施形態では、異種アミノ酸配列は、ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列のＮ末端もしくはＣ末端に連結されるか、または表２から選択される１つもしくはそれ以上の挿入部位のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列の中の２つのアミノ酸の間に挿入される。異種ヌクレオチド配列については本明細書中にさらに説明する。

【0247】

一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドは、ヒトＦＶＩＩＩである。一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドは、完全長ＦＶＩＩＩである。一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドは、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩである。

【0248】

一部の実施形態では、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドは、ヒトＦＩＸである。一部の実施形態では、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドは、完全長ＦＩＸである。一部の実施形態では、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドは、ヒトＦＩＸのバリアントである。ある特定の実施形態では、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドは、ヒトＦＩＸのＲ３３８Ｌバリアントである。ある特定の実施形態では、ＦＩＸ活性を有するポリペプチドは、Ｐａｄｕａバリアントである。

【0249】

本明細書に開示されるレンチウイルスベクターは、治療的に有益であると考えられる、出血性凝固障害、関節血症、筋肉出血、口内出血、出血、筋肉への出血、口腔内出血、外傷、頭部外傷、胃腸出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系出血、咽頭後隙における出血、後腹膜腔における出血、腸腰筋鞘における出血、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される出血性疾患または障害の治療のための遺伝子療法アプローチを使用して、哺乳動物、例えば、ヒト患者においてインビボで使用することができる。一実施形態では、出血性疾患または障害は血友病である。別の実施形態では、出血性疾患または障害は血友病Ａである。別の実施形態では、出血性疾患または障害は血友病Ｂである。

【0250】

一部の実施形態では、標的細胞（例えば、肝細胞）は、患者に投与される前に、本明細書に開示されるレンチウイルスベクターにより、インビトロで処理される。ある特定の実施形態では、標的細胞（例えば、肝細胞）は、患者に投与される前に、本明細書に開示されるレンチウイルスベクターにより、インビトロで処理される。さらに別の実施形態では、患者からの細胞（例えば、肝細胞）は、患者に投与される前に、本明細書に開示されるレンチウイルスベクターにより、インビトロで処理される。

【0251】

一部の実施形態では、本明細書に開示されるレンチウイルスベクター（例えば、１０^１０ＴＵ／ｋｇもしくはそれ未満、１０^９ＴＵ／ｋｇもしくはそれ未満、または１０^８ＴＵ／ｋｇもしくはそれ未満で投与される）の投与後の血漿中ＦＶＩＩＩ活性は、生理的に正常なＦＶＩＩＩレベルに比して、少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１７０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約１９０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２１０％、少なくとも約２２０％、少なくとも約２３０％、少なくとも約２４０％、少なくとも約２５０％、少なくとも約２６０％、少なくとも約２７０％、少なくとも約２８０％、少なくとも約２９０％、または少なくとも約３００％増加する。

【0252】

一部の実施形態では、本明細書に開示されるレンチウイルスベクター（例えば、１０^１０ＴＵ／ｋｇもしくはそれ未満、１０^９ＴＵ／ｋｇもしくはそれ未満、または１０^８ＴＵ／ｋｇもしくはそれ未満で投与される）の投与後の血漿中ＦＩＸ活性は、生理的に正常な流血中ＦＩＸレベルに比して、少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１７０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約１９０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２１０％、少なくとも約２２０％、少なくとも約２３０％、少なくとも約２４０％、少なくとも約２５０％、少なくとも約２６０％、少なくとも約２７０％、少なくとも約２８０％、少なくとも約２９０％、または少なくとも約３００％増加する。

【0253】

一実施形態では、本開示のレンチウイルスベクターの投与後の血漿中ＦＶＩＩＩ活性は、生理的に正常なＦＶＩＩＩレベルに比して、少なくとも約３，０００％～約５，０００％増加する。一部の実施形態では、本明細書に記載の第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）活性を有するポリペプチドをコードするコドン最適化遺伝子を含むレンチウイルスベクターの投与後に、血漿中ＦＶＩＩＩ活性は、対照レンチウイルスベクターまたは対照核酸分子を投与された対象に比して、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１１０倍、少なくとも約１２０倍、少なくとも約１３０倍、少なくとも約１４０倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約１６０倍、少なくとも約１７０倍、少なくとも約１８０倍、少なくとも約１９０倍、または少なくとも約２００倍増加する。

【0254】

一実施形態では、本開示のレンチウイルスベクターの投与後の血漿中ＦＩＸ活性は、生理的に正常な流血中ＦＩＸレベルに比して、少なくとも約３，０００％～約５，０００％増加する。一部の実施形態では、本明細書に記載の第ＩＸ因子（ＦＩＸ）活性を有するポリペプチドをコードするコドン最適化遺伝子を含むレンチウイルスベクターの投与後に、血漿中ＦＩＸ活性は、対照レンチウイルスベクターまたは対照核酸分子を投与された対象に比して、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１１０倍、少なくとも約１２０倍、少なくとも約１３０倍、少なくとも約１４０倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約１６０倍、少なくとも約１７０倍、少なくとも約１８０倍、少なくとも約１９０倍、または少なくとも約２００倍増加する。

【0255】

本開示はまた、それを必要とする対象における止血障害（例えば、血友病Ａまたは血友病Ｂなどの出血性障害）を治療する、予防する、または改善する方法であって、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドまたはＦＩＸ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を含むレンチウイルスベクターの治療有効量を対象に投与する工程を含む方法も提供する。

【0256】

本開示のレンチウイルスベクターによる治療、改善、および予防は、バイパス療法であってよい。バイパス療法を受ける対象は、凝固因子、例えば、ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸに対するインヒビターを既に生じているか、または凝固因子インヒビターを生じやすい状態にある。

【0257】

本開示のレンチウイルスベクターは、フィブリン塊の形成を促進することによって、止血障害を治療または予防する。本開示の核酸分子によってコードされるＦＶＩＩＩまたはＦＩＸ活性を有するポリペプチドは、凝固カスケードのメンバーを活性化することができる。凝固因子は、外因性経路、内因性経路またはその両方に関与するものであり得る。

【0258】

本開示のレンチウイルスベクターは、ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸによって治療し得ることが知られている止血障害を治療するために使用することができる。本開示の方法を使用して治療し得る止血障害には、血友病Ａ、血友病Ｂ、フォンビルブランド病、第ＸＩ因子欠乏症（ＰＴＡ欠乏症）、第ＸＩＩ因子欠乏症、ならびにフィブリノーゲン、プロトロンビン、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子または第ＸＩＩＩ因子の欠乏症または構造的な異常、関節血症、筋肉出血、口内出血、出血、筋肉への出血、口腔内出血、外傷、頭部外傷、胃腸出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系出血、咽頭後隙における出血、後腹膜腔における出血、腸腰筋鞘における出血が挙げられるが、これらに限定されない。

【0259】

対象への投与のための組成物としては、ＦＶＩＩＩ凝固因子またはＦＩＸ凝固因子をコードする本開示の最適化されたヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むレンチウイルスベクター（遺伝子療法用途のため）、ならびにＦＶＩＩＩまたはＦＩＸポリペプチド分子が挙げられる。一部の実施形態では、投与のための組成物は、本開示のレンチウイルスベクターとインビボ、インビトロ、またはエクスビボで接触させた細胞である。

【0260】

一部の実施形態では、止血障害は遺伝性障害である。一実施形態では、対象は血友病Ａを有する。他の実施形態では、止血障害は、ＦＶＩＩＩの欠乏の結果である。他の実施形態では、止血障害は、欠陥のあるＦＶＩＩＩ凝固因子の結果であり得る。一実施形態では、対象は血友病Ｂを有する。他の実施形態では、止血障害は、ＦＩＸの欠乏の結果である。他の実施形態では、止血障害は、欠陥のあるＦＩＸ凝固因子の結果であり得る。

【0261】

別の実施形態では、止血障害は、後天性障害であり得る。後天性障害は、基礎にある二次性の疾患または状態に起因し得る。非関連性の状態としては、限定的ではないが、一例として、がん、自己免疫疾患、または妊娠が挙げられる。後天性障害は、老齢に、または基礎にある二次障害を治療するための薬物療法（例えば、がん化学療法）に起因し得る。

【0262】

本開示はまた、止血障害または止血障害の獲得をもたらす二次性の疾患もしくは状態を有しない対象を治療する方法にも関する。本開示はそれ故に、一般的な止血剤を必要とする対象を治療する方法であって、本開示のレンチウイルスベクターの治療有効量を投与する工程を含む方法に関する。例えば、一実施形態では、一般的な止血剤を必要とする対象は、手術を受けているか、または受けようとしている。本開示のレンチウイルスベクターは、予防薬として手術の前後に投与することができる。

【0263】

本開示のレンチウイルスベクターは、急性出血エピソードを制御するために、手術中または手術後に投与することができる。手術としては、肝移植、肝切除、または幹細胞移植が挙げられるが、これらに限定されない。

【0264】

別の実施形態では、本開示のレンチウイルスベクターは、止血障害を有しない、急性出血エピソードを有する対象を処置するために使用することができる。急性出血エピソードは、重度の外傷、例えば、手術、自動車事故、創傷、裂傷銃撃、または止血不能な出血をもたらす任意の他の外傷イベントに起因し得る。

【0265】

レンチウイルスベクターは、止血障害を有する対象を予防的に処置するために使用することができる。レンチウイルスベクターは、止血障害を有する対象において急性出血エピソードを治療するために使用することもできる。

【0266】

別の実施形態では、本明細書に開示されるレンチウイルスベクターの投与および／またはＦＶＩＩＩタンパク質もしくはＦＩＸタンパク質のその後の発現は、対象における免疫応答を誘導しない。一部の実施形態では、免疫応答は、ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸに対する抗体の発生を含む。一部の実施形態では、免疫応答は、サイトカイン分泌を含む。一部の実施形態では、免疫応答は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、またはＢ細胞とＴ細胞の両方の活性化を含む。一部の実施形態では、免疫応答は、対象における免疫応答が、免疫応答を生じていない対象におけるＦＶＩＩＩの活性に比してＦＶＩＩＩタンパク質の活性を低下させる、抑制性免疫応答である。ある特定の実施形態では、本開示のレンチウイルスベクターを投与することによるＦＶＩＩＩタンパク質の発現は、単離された核酸分子またはレンチウイルスベクターから発現されるＦＶＩＩＩタンパク質またはＦＶＩＩＩタンパク質に対する抑制性免疫応答を阻止する。

【0267】

一部の実施形態では、本開示のレンチウイルスベクターは、止血を促進する少なくとも１つの他の薬剤と組み合わせて投与される。止血を促進する前記他の薬剤は、凝固活性を有することが実証されている治療薬である。止血剤としては、限定的ではないが、一例として、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、プロトロンビン、もしくはフィブリノーゲン、または前記のいずれかの活性化形態が挙げられる。凝固因子または止血剤として、抗線溶剤、例えば、イプシロン－アミノカプロン酸、トラネキサム酸を挙げることもできる。

【0268】

本開示の一実施形態では、組成物（例えば、レンチウイルスベクター）は、対象に投与された場合にＦＶＩＩＩが活性化可能な形態で存在するものである。本開示の一実施形態では、組成物（例えば、レンチウイルスベクター）は、対象に投与された場合にＦＶＩＸが活性化可能な形態で存在するものである。そのような活性化可能な分子は、対象への投与後に凝固部位においてインビボで活性化し得る。

【0269】

本開示のレンチウイルスベクターは、静脈内、皮下、筋肉内に、または任意の粘膜表面を通して、例えば、経口、舌下、口腔内、舌下、経鼻、直腸、経膣により、または肺経路を介して投与することができる。レンチウイルスベクターは、所望の部位へのベクターの徐放を可能にするバイオポリマー固体支持体の中に植え込むか、またはそれに接続することができる。

【0270】

一実施形態では、レンチウイルスベクターの投与経路は、非経口的である。非経口的という用語は、本明細書中で使用する場合、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸または膣投与を含む。静脈内形態の非経口投与が好ましい。投与のこれらのすべての形態は本開示の範囲内にあると明らかに企図されるが、投与のための形態は注射用溶液になると考えられ、特に静脈内または動脈内の注射または点滴のためにはそうである。通常、注射のための好適な医薬組成物は、緩衝液（例えば、酢酸、リン酸またはクエン酸緩衝液）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、場合により安定化剤（例えば、ヒトアルブミン）などを含むことができる。しかし、本明細書における教示に適合する他の方法では、レンチウイルスベクターは、有害な細胞集団の部位に直接送達して、それにより、患部組織の治療剤への曝露を増加させることができる。

【0271】

非経口投与のための調製物としては、無菌の水性または非水性の溶液、懸濁液、および乳剤が挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、植物油、例えばポリエチレングリコール、オリーブ油、および注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体としては、食塩水および緩衝媒体を含む、水、アルコール性／水性の溶液、乳濁液または懸濁液が挙げられる。本開示では、薬学的に許容される担体としては、０．０１～０．１Ｍ、好ましくは０．０５Ｍのリン酸緩衝液または０．８％食塩水が挙げられるが、これらに限定されない。他の一般的な非経口ビヒクルとしては、リン酸ナトリウム溶液、リンゲルブドウ糖液、ブドウ糖および塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液、または固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、補液および栄養素補液、電解質補液、例えば、リンゲルブドウ糖液をベースにするものが挙げられる。保存剤および他の添加物、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤、および不活性ガスが存在してもよい。

【0272】

より詳細には、注射用に適する医薬組成物としては、無菌の水性溶液（水溶性）または分散液、および無菌の注射用溶液または分散液の即時使用調製物のための無菌の粉末が挙げられる。そのような場合、組成物は無菌でなければならず、容易に注射し得る程度に流動性である必要がある。それは製造および貯蔵の条件下で安定であるべきであり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に抗して保存されることが好ましいと考えられる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）およびその好適な混合物を含有する、溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材の使用によって、分散液の場合は要求される粒子径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持することができる。

【0273】

微生物活動の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合には、等張剤、例えば、糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましいと考えられる。吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含めることによって、注射用組成物の長期吸収をもたらすことができる。

【0274】

いずれの場合にも、無菌の注射溶液は、必要に応じて、本明細書に列挙された成分の１つまたはその組合せと一緒に、活性化合物（例えば、ポリペプチド単独または他の活性剤との組合せ）を必要な量で適切な溶媒に組み込み、続いて濾過滅菌を行うことによって調製することができる。一般に、分散液は、塩基性分散媒体および上に列挙されるものからの必要とされる他の成分を含有する無菌ビヒクルに活性化合物を組み込むことによって調製される。無菌注射用溶液の調製のための無菌粉末の場合は、好ましい調製方法は、有効成分とあらかじめ濾過滅菌しておいた溶液からの任意の所望の追加成分との粉末が得られる真空乾燥および凍結乾燥である。注射のための調製物は、処理されて、アンプル、バッグ、ボトル、シリンジまたはバイアルなどの容器に充填され、当技術分野で公知の方法に従って無菌条件下で密封される。さらに、調製物をキットの形でパッケージ化して販売することができる。そのような製造品は、付随する組成物が、凝固障害に罹患しているかまたはその素因を有する対象を治療するために有用であることを示すラベルまたは添付文書を有することが好ましいと考えられる。

【0275】

また、医薬組成物を、例えば、カカオ脂または他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を含有する、坐薬または滞留浣腸として直腸投与用に製剤化することもできる。

【0276】

状態の治療のための本開示の組成物の有効用量は、投与の手段、標的部位、患者の生理的状態、患者がヒトであるかまたは動物であるか、投与される他の医薬品、および治療が予防的であるかまたは治療的であるかを含む、多くの異なる因子によって異なる。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含む非ヒト哺乳動物を治療することもできる。安全性および有効性を最適化するために、当業者に公知である慣行的な方法を使用して、治療投薬量を調節することができる。

【0277】

レンチウイルスベクターは、単回用量としてまたは複数回用量として投与することができ、複数回用量は連続的にまたは特定の時間間隔で投与することができる。最適な用量範囲および／または投与スケジュールを決定するために、インビトロアッセイを用いることができる。凝固因子活性を測定するインビトロアッセイは、当技術分野で公知である。加えて、有効用量を、動物モデル、例えば血友病のイヌ（Ｍｏｕｎｔら、２００２年、Ｂｌｏｏｄ ９９（８）：２６７０頁）から得られる用量反応曲線から外挿して推定することもできる。

【0278】

上記の範囲内にある中間の用量も、本開示の範囲内にあるものとする。そのような用量を、毎日、隔日、毎週または実証的分析によって決定される任意の他のスケジュールに従って、対象に投与することができる。例示的な治療は、長期間、例えば、少なくとも６カ月にわたる複数の投薬による投与を必要とする。

【0279】

本開示のレンチウイルスベクターは、複数の機会に投与することができる。単一の投薬の間隔は、週、週、月または年の単位であってよい。また、間隔が、患者で改変ポリペプチドまたは抗原の血中レベルを測定することによって指示される通りに不規則であってもよい。本開示のレンチウイルスベクターの投薬量および頻度は、患者における導入遺伝子によってコードされるＦＶＩＩＩポリペプチドまたはＦＩＸポリペプチドの半減期によって異なる。

【0280】

本開示のレンチウイルスベクターの投与の投薬量および頻度は、治療が予防的であるかまたは治療的であるかに応じて異なり得る。予防的適用では、本開示のレンチウイルスベクターを含有する組成物は、まだ疾患状態にはない患者に対して、患者の抵抗性を強化するかまたは疾患の影響を最小にするために投与される。そのような量は、「予防的有効用量」と定義される。長期間にわたって、比較的低頻度の間隔で、比較的低い投薬量が投与される。一部の患者は、残りの存命期間中、治療を受け続ける。

【0281】

本開示のレンチウイルスベクターは、場合により、治療（例えば、予防的または治療的）を必要とする障害または状態の治療において有効である他の薬剤と組み合わせて投与することができる。

【0282】

本明細書で使用する場合、補助療法と併用してまたは組み合わせての本開示のレンチウイルスベクターの投与は、その療法および開示されるポリペプチドの逐次的な、同時の、共存性の、並行性の、併存性のまたは同時発生的な投与または適用を意味する。当業者は、組み合わせる治療レジメンの様々な構成要素の投与または適用の時間を、治療の全体的な効果を強化するために調整し得ることを理解するであろう。当業者（例えば、医師）は、選択される補助療法および本明細書の教示に基づいて、不必要な実験を行わずに有効な併用療法レジメンを容易に見極めることができると考えられる。

【0283】

さらに、本開示のレンチウイルスベクターを、（例えば、併用療法レジメンを提供するために）１つまたは複数の薬剤と併用して、または組み合わせて使用し得ることが理解されるであろう。本開示のレンチウイルスベクターと組み合わせることができる例示的な薬剤としては、治療される特定の障害に対する現行の標準医療に相当する薬剤が挙げられる。そのような薬剤は、化学的または生物学的な性質のものであり得る。「生物学的」または「生物学的薬剤」という用語は、生体および／またはその産物から作製される、治療薬としての使用を目的とする任意の薬学的活性薬剤を指す。

【0284】

本開示のレンチウイルスベクターと組み合わせて使用される薬剤の量は、対象によって異なることがあり、または当技術分野で公知であるものに従って投与することができる。例えば、ＧＯＯＤＭＡＮ＆ＧＩＬＭＡＮ’Ｓ ＴＨＥ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧ ＩＣＡＬ ＢＡＳＩＳ ＯＦ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ １２３３～１２８７頁の、Ｂｒｕｃｅ Ａ Ｃｈａｂｎｅｒら、Ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ（Ｊｏｅｌ Ｇ．Ｈａｒｄｍａｎら編、第９版、１９９６年）を参照のこと。別の実施形態では、標準医療に合致するそのような薬剤の量が投与される。

【0285】

ある特定の実施形態では、本開示のレンチウイルスベクターは、免疫抑制剤、抗アレルギー剤または抗炎症剤と併用して投与される。これらの薬剤は一般に、本明細書において治療される対象の免疫系を抑制またはマスキングするように作用する物質を指す。これらの薬剤には、サイトカイン産生を抑制するか、自己抗原の発現をダウンレギュレートもしくは抑制するか、またはＭＨＣ抗原をマスキングする物質が含まれる。そのような薬剤の例としては、２－アミノ－６－アリール－５置換ピリミジン；アザチオプリン；シクロホスファミド；ブロモクリプチン；ダナゾール；ダプソン；グルタルアルデヒド；ＭＨＣ抗原およびＭＨＣ断片に対する抗イディオタイプ抗体；シクロスポリンＡ；糖質コルチコイドなどのステロイド、例えば、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、およびデキサメタゾン；抗インターフェロン－γ、－βまたは－α抗体、抗腫瘍壊死因子－α抗体、抗腫瘍壊死因子－β抗体、抗インターロイキン－２抗体および抗ＩＬ－２受容体抗体を含むサイトカインまたはサイトカイン受容体アンタゴニスト；抗ＣＤ１１ａおよび抗ＣＤ１８抗体を含む抗ＬＦＡ－１抗体；抗Ｌ３Ｔ４抗体；異種抗リンパ球グロブリン；ｐａｎ－Ｔ抗体；ＬＦＡ－３結合ドメインを含有する可溶性ペプチド；ストレプトキナーゼ；ＴＧＦ－β；ストレプトドルナーゼ；ＦＫ５０６；ＲＳ－６１４４３；デオキシスペルグアリン；ならびにラパマイシンが挙げられる。ある特定の実施形態では、薬剤は抗ヒスタミン剤である。本明細書で使用される「抗ヒスタミン剤」は、ヒスタミンの生理作用に拮抗する薬剤である。抗ヒスタミン剤の例としては、クロルフェニラミン、ジフェンヒドラミン、プロメタジン、クロモリンナトリウム、アステミゾール、マレイン酸アザタジン、マレイン酸ブロフェニラミン、マレイン酸カルビノキサミン、塩酸セチリジン、フマル酸クレマスチン、塩酸シプロヘプタジン、ｄ－マレイン酸ブロムフェニラミン、ｄ－マレイン酸クロルフェニラミン、ジメンヒドリナート、塩酸ジフェンヒドラミン、コハク酸ドキシラミン、塩酸フェキソフェンダジン、塩酸テルフェナジン、塩酸ヒドロキシジン、ロラチジン、塩酸メクリジン、クエン酸トリペラナミン、塩酸トリペレナミン、および塩酸トリプロリジンが挙げられる。

【0286】

免疫抑制剤、抗アレルギー剤または抗炎症剤を、レンチウイルスベクター投与レジメンに組み込んでもよい。例えば、免疫抑制剤または抗炎症剤の投与を、開示されるレンチウイルスベクターの投与の前に開始してよく、その後に単回またはそれ以上の回数の投与を続けてもよい。ある特定の実施形態では、免疫抑制剤または抗炎症剤は、レンチウイルスベクターの前投薬として投与される。

【0287】

以前に考察したように、本開示のレンチウイルスベクターは、凝固障害のインビボ治療のために薬学的有効量で投与することができる。この点に関して、本開示のレンチウイルスベクターを、投与を助けて活性薬剤の安定性を促進するために製剤化し得ることが理解されるであろう。好ましくは、本開示による医薬組成物は、生理的食塩水、非毒性緩衝液、保存剤などの薬学的に許容される非毒性無菌担体を含む。当然ながら、本開示の医薬組成物は、ポリペプチドの薬学的有効量を提供するために、単回または複数回の用量で投与することができる。

【0288】

凝固系の機能を判定するために、いくつかの試験が利用可能である：活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）試験、発色アッセイ、ＲＯＴＥＭ（登録商標）アッセイ、プロトロンビン時間（ＰＴ）試験（ＩＮＲの決定にも使用される）、フィブリノーゲン試験（しばしばクラウス法による）、血小板数、血小板機能試験（しばしばＰＦＡ－１００による）、ＴＣＴ、出血時間、混合試験（患者の血漿を正常な血漿と混合した場合に異常が是正されるか否か）、凝固因子アッセイ、抗リン脂質抗体、Ｄ－ダイマー、遺伝子検査（例えば、Ｖ因子ライデン、プロトロンビン突然変異Ｇ２０２１０Ａ）、希釈ラッセル蛇毒時間（ｄＲＶＶＴ）、その他の血小板機能試験、トロンボエラストグラフィ（ＴＥＧまたはＳｏｎｏｃｌｏｔ）、トロンボエラストメトリー（ＴＥＭ（登録商標）、例えば、ＲＯＴＥＭ（登録商標））、またはオイグロブリン溶解時間（ＥＬＴ）。

【0289】

ａＰＴＴ試験は、「内因性」凝固経路（接触活性化経路とも呼ばれる）および一般的な凝固経路の効力を測定する性能指数である。この試験は、市販されている組換え凝固因子、例えば、ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸの凝固活性を測定するために一般的に使用される。これは外因性経路を測定するプロトロンビン時間（ＰＴ）と併用して使用される。

【0290】

ＲＯＴＥＭ（登録商標）分析は、止血の全体的な動態：凝固時間、クロット形成、血塊の安定性および溶解に関する情報を提供する。トロンボエラストメトリーにおける種々のパラメーターは、血漿凝固系の活性、血小板機能、線溶、またはこれらの相互作用に影響を及ぼす多くの因子に依存する。このアッセイは、二次性止血の完全な像を提供することができる。

【0291】

Ｂ．２．組織特異的発現
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクター内に、例えば、最適化ＦＶＩＩＩ導入遺伝子に作動可能に連結される、１つまたはそれ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含めることが有用であると考えられる。それ故に、本開示はまた、最適化ＦＶＩＩＩもしくは最適化ＦＩＸヌクレオチド配列に作動可能に連結されるか、または他の様式でレンチウイルスベクター内に挿入される、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ配列標的も提供する。レンチウイルスベクターに含まれるｍｉＲＮＡ標的配列の１つを上回るコピーは、システムの有効性を高めることができる。

【0292】

異なるｍｉＲＮＡ標的配列も含められる。例えば、１つを上回る導入遺伝子を発現するレンチウイルスベクターは、同じであっても異なってもよい、１つを上回るｍｉＲＮＡ標的配列の制御下にある導入遺伝子を有し得る。ｍｉＲＮＡ標的配列は縦列性であってよいが、他の配置も含まれる。ｍｉＲＮＡ標的配列を含有する導入遺伝子発現カセットを、アンチセンスの向きでレンチウイルスベクター内に挿入することもできる。アンチセンスの向きは、ウイルス粒子の生成において、通常であればプロデューサー細胞に有毒な可能性のある遺伝子産物の発現を回避するために有用となり得る。

【0293】

他の実施形態では、レンチウイルスベクターは、同じまたは異なるｍｉＲＮＡ標的配列の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたは８つのコピーを含む。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、いかなるｍｉＲＮＡ標的配列も含まない。ｍｉＲＮＡ標的配列を含めるか否か（およびその数）の選択は、意図する組織標的、要求される発現のレベルなどの公知のパラメーターによって導かれると考えられる。

【0294】

一実施形態では、標的配列は、骨髄球拘束前駆細胞において最も効果的に、およびより初期のＨＳＰＣにおいて少なくとも部分的に発現をブロックすることが報告されている、ｍｉＲ－２２３標的である。ｍｉＲ－２２３標的は、顆粒球、単球、マクロファージ、骨髄樹状細胞を含む分化した骨髄系細胞における発現をブロックすることができる。ｍｉＲ－２２３標的はまた、リンパ球系列または赤血球系列における強固な導入遺伝子発現に依拠する遺伝子療法の適用に適する可能性もある。ｍｉＲ－２２３標的はまた、ヒトＨＳＣにおいて非常に効果的に発現をブロックすることもできる。

【0295】

別の実施形態では、標的配列は、ｍｉＲ１４２標的（ｔｃｃａｔａａａｇｔａｇｇａａａｃａｃｔａｃａ（配列番号７））である。一実施形態では、レンチウイルスベクターは、ｍｉＲ－１４２標的配列の４つのコピーを含む。ある特定の実施形態では、造血特異的マイクロＲＮＡの相補的配列、例えばｍｉＲ－１４２（１４２Ｔ）は、レンチウイルスベクターの３’非翻訳領域に組み込まれ、導入遺伝子をコードする転写物をｍｉＲＮＡ介在ダウンレギュレーションに対して感受性にする。この方法により、導入遺伝子発現を、非造血細胞では維持しながら、造血系列の抗原提示細胞（ＡＰＣ）で阻止することができる（Ｂｒｏｗｎら、Ｎａｔ Ｍｅｄ ２００６年）。この戦略は、導入遺伝子発現に対してストリンジェントな転写後制御を課すことができ、それ故に、導入遺伝子の安定した送達および長期発現を可能にする。一部の実施形態では、ｍｉＲ－１４２調節は、形質導入された細胞の免疫介在性除去を阻止し、かつ／または抗原特異的調節性Ｔ細胞（Ｔ ｒｅｇ）を誘導して、導入遺伝子によってコードされる抗原に対する強固な免疫寛容を媒介する。

【0296】

一部の実施形態では、標的配列は、ｍｉＲ１８１標的である。Ｃｈｅｎ Ｃ－ＺおよびＬｏｄｉｓｈ Ｈ、Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００５年） １７（２）：１５５～１６５頁は、マウス骨髄内のＢ細胞において特異的に発現されるｍｉＲＮＡであるｍｉＲ－１８１を開示している（ＣｈｅｎおよびＬｏｄｉｓｈ、２００５年）。それはまた、一部のヒトｍｉＲＮＡが白血病に関連付けられることも開示している。

【0297】

標的配列は、ｍｉＲＮＡに対して完全または部分的に相補的であり得る。「完全に相補的な」という用語は、標的配列が、それを認識するｍｉＲＮＡの配列に対して１００％相補的である核酸配列を有することを意味する。「部分的に相補的な」という用語は、標的配列が、それが認識するｍｉＲＮＡの配列に対して部分的にのみ相補的であり、その際、部分的に相補的な配列が依然としてｍｉＲＮＡによって認識されることを意味する。換言すれば、本開示の文脈において、部分的に相補的な標的配列は、対応するｍｉＲＮＡを認識して、そのｍｉＲＮＡを発現する細胞における導入遺伝子発現の阻止または低下を生じさせるのに有効である。ｍｉＲＮＡ標的配列の例は、ＷＯ２００７／０００６６８、ＷＯ２００４／０９４６４２、ＷＯ２０１０／０５５４１３、またはＷＯ２０１０／１２５４７１に記載されており、これらはその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。

【0298】

Ｂ．３．異種ヌクレオチド配列
一部の実施形態では、単離された核酸分子は、異種ヌクレオチド配列をさらに含む。一部の実施形態では、単離された核酸分子は、少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列をさらに含む。異種ヌクレオチド配列は、本開示のＦＶＩＩＩもしくはＦＩＸコード配列に５’末端、３’末端で連結することができるか、または中間に挿入することができる。それ故に、一部の実施形態では、異種ヌクレオチド配列によってコードされる異種アミノ酸配列は、ヌクレオチド配列によってコードされるＦＶＩＩＩアミノ酸配列もしくはＦＩＸアミノ酸配列のＮ末端もしくはＣ末端に連結されるか、またはＦＶＩＩＩアミノ酸配列もしくはＦＩＸアミノ酸配列の中の２つのアミノ酸の間に挿入される。一部の実施形態では、異種アミノ酸配列は、表２から選択される１つまたはそれ以上の挿入部位でＦＶＩＩＩポリペプチドの２つのアミノ酸の間に挿入することができる。一部の実施形態では、異種アミノ酸配列は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、国際公開ＷＯ２０１３／１２３４５７Ａ１および同ＷＯ２０１５／１０６０５２Ａ１または米国特許出願公開第２０１５／０１５８９２９Ａ１号に開示される任意の部位で、本開示の核酸分子によってコードされるＦＶＩＩＩポリペプチドの中に挿入することができる。

【0299】

一部の実施形態では、異種ヌクレオチド配列によってコードされる異種アミノ酸配列は、Ｂドメインまたはその断片の中に挿入される。一部の実施形態では、異種アミノ酸配列は、ＦＶＩＩＩの中の、成熟ヒトＦＶＩＩＩ（配列番号４）のアミノ酸７４５に対応するアミノ酸のすぐ下流に挿入される。特定の一実施形態では、ＦＶＩＩＩは、成熟ヒトＦＶＩＩＩ（配列番号４）に対応するアミノ酸７４６～１６４６の欠失を含み、異種ヌクレオチド配列によってコードされる異種アミノ酸配列は、成熟ヒトＦＶＩＩＩ（配列番号４）に対応するアミノ酸７４５のすぐ下流に挿入される。

【0300】

【表2】

【0301】

他の実施形態では、単離された核酸分子は、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたは８つの異種ヌクレオチド配列をさらに含む。一部の実施形態では、すべての異種ヌクレオチド配列は同一である。一部の実施形態では、少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列は、他の異種ヌクレオチド配列と異なる。一部の実施形態では、本開示は、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたは７つを超える異種ヌクレオチド配列を縦列性に含むことができる。

【0302】

一部の実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、アミノ酸配列をコードする。一部の実施形態では、異種ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列は、ＦＶＩＩＩ分子の半減期を延長することができる異種部分（「半減期延長剤」）である。

【0303】

一部の実施形態では、異種部分は、本開示のタンパク質に組み込まれた場合にインビボ半減期の延長を伴う、非構造的または構造的な特徴のいずれかを有するペプチドまたはポリペプチドである。非限定的な例として、アルブミン、アルブミン断片、免疫グロブリンのＦｃ断片、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、ＨＡＰ配列、ＸＴＥＮ配列、トランスフェリンもしくはその断片、ＰＡＳポリペプチド、ポリグリシンリンカー、ポリセリンリンカー、アルブミン結合部分、またはこれらのポリペプチドの任意の断片、誘導体、バリアント、もしくは組合せが挙げられる。特定の一実施形態では、異種アミノ酸配列は、免疫グロブリン定常領域もしくはその一部分、トランスフェリン、アルブミン、またはＰＡＳ配列である。

【0304】

一部の態様では、異種部分は、フォンビルブランド因子またはその断片を含む。他の関連する態様では、異種部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリシアル酸、またはこれらのエレメントの任意の誘導体、バリアント、もしくは組合せなどの非ポリペプチド部分に対する結合部位（例えば、システインアミノ酸）を含み得る。一部の態様では、異種部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリシアル酸、またはこれらのエレメントの任意の誘導体、バリアント、もしくは組合せなどの非ポリペプチド部分に対する結合部位として機能するシステインアミノ酸を含む。

【0305】

具体的な一実施形態では、第１の異種ヌクレオチド配列は、当技術分野で公知の半減期延長性分子である第１の異種部分をコードし、第２の異種ヌクレオチド配列は、当技術分野で公知の半減期延長性分子であってもよい第２の異種部分をコードする。ある特定の実施形態では、第１の異種部分（例えば、第１のＦｃ部分）および第２の異種部分（例えば、第２のＦｃ部分）は、互いに会合して二量体を形成する。一実施形態では、第２の異種部分は第２のＦｃ部分であり、ここで第２のＦｃ部分は、第１の異種部分、例えば、第１のＦｃ部分に連結しているかまたはそれと会合する。例えば、第２の異種部分（例えば、第２のＦｃ部分）は、リンカーによって第１の異種部分（例えば、第１のＦｃ部分）に連結することができるか、または共有結合もしくは非共有性結合によって第１の異種部分と会合することができる。

【0306】

一部の実施形態では、異種部分は、少なくとも約１０個、少なくとも約１００個、少なくとも約２００個、少なくとも約３００個、少なくとも約４００個、少なくとも約５００個、少なくとも約６００個、少なくとも約７００個、少なくとも約８００個、少なくとも約９００個、少なくとも約１０００個、少なくとも１１００個、少なくとも約１２００個、少なくとも約１３００個、少なくとも約１４００個、少なくとも約１５００個、少なくとも約１６００個、少なくとも約１７ ００個、少なくとも約１８００個、少なくとも約１９００個、少なくとも約２０００個、少なくとも約２５００個、少なくとも約３０００個、または少なくとも約４０００個のアミノ酸を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるポリペプチドである。

【0307】

他の実施形態では、異種部分は、約１００～約２００アミノ酸、約２００～約３００アミノ酸、約３００～約４００アミノ酸、約４００～約５００アミノ酸、約５００～約６００アミノ酸、約６００～約７００アミノ酸、約７００～約８００アミノ酸、約８００～約９００アミノ酸、または約９００～約１０００アミノ酸を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるポリペプチドである。

【0308】

ある特定の実施形態では、異種部分は、その生物活性または機能に重大な影響を及ぼすことなく、ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸタンパク質の１つまたはそれ以上の薬物動態特性を改善する。

【0309】

ある特定の実施形態では、異種部分は、本開示のＦＶＩＩＩまたはＦＩＸタンパク質のインビボおよび／またはインビトロ半減期を延長する。他の実施形態では、異種部分は、本開示のＦＶＩＩＩもしくはＦＩＸタンパク質またはその断片（例えば、ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸタンパク質のタンパク質分解切断後の異種部分を含む断片）の可視化または局在化を促進する。本開示のＦＶＩＩＩもしくはＦＩＸタンパク質またはその断片の可視化および／または局在化は、インビボ、インビトロ、エクスビボ、またはこれらの組合せであり得る。

【0310】

他の実施形態では、異種部分は、本開示のＦＶＩＩＩもしくはＦＩＸタンパク質またはその断片（例えば、ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸタンパク質のタンパク質分解切断後の異種部分を含む断片）の安定性を高める。本明細書で使用する場合、「安定性」という用語は、環境条件（例えば、温度上昇または低下）に応じて、ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸタンパク質の１つまたはそれ以上の物理特性の維持についての当技術分野で認識される尺度を指す。ある特定の態様では、物理特性は、ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸタンパク質の共有結合構造の維持（例えば、タンパク質分解切断、望ましくない酸化または脱アミド化のないこと）である。他の態様では、物理特性は、正しくフォールディングされた状態にあるＦＶＩＩＩまたはＦＩＸタンパク質の存在（例えば、可溶性または不溶性の凝集または沈殿のないこと）でもあり得る。

【0311】

一態様では、ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸタンパク質の安定性は、ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸタンパク質の生物物理学的特性、例えば、熱安定性、ｐＨアンフォールディングプロファイル、グリコシル化の安定な除去、溶解度、生化学的機能（例えば、タンパク質、受容体またはリガンドに結合する能力）など、および／またはこれらの組合せをアッセイすることによって測定される。別の態様では、生化学的機能は、相互作用の結合親和性によって実証される。一態様では、タンパク質安定性の尺度は、熱安定性、すなわち、熱の負荷に対する耐性である。安定性は、ＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）、ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）、ＤＬＳ（動的光散乱）などの当技術分野で公知の方法を使用して測定することができる。熱安定性を測定する方法としては、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、示差走査蛍光定量（ＤＳＦ）、円二色性（ＣＤ）、および熱負荷アッセイが挙げられるが、これらに限定されない。

【0312】

ある特定の態様では、本開示の核酸分子によってコードされるＦＶＩＩＩまたはＦＩＸタンパク質は、少なくとも１つの半減期延長剤、すなわち、ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸタンパク質のインビボ半減期を、異種部分を欠く対応するＦＶＩＩＩまたはＦＩＸタンパク質のインビボ半減期に比して増加させる、そのような異種部分を含む。ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸタンパク質のインビボ半減期は、当業者に公知の任意の方法、例えば、活性アッセイ（発色アッセイまたは一段階凝固ａＰＴＴアッセイ）、ＥＬＩＳＡ、ＲＯＴＥＭ（登録商標）などによって決定することができる。

【0313】

一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の半減期延長剤の存在は、ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸタンパク質の半減期を、そのような１つまたはそれ以上の半減期延長剤を欠く対応するタンパク質の半減期と比較して延長させる。半減期延長剤を含むＦＶＩＩＩまたはＦＩＸタンパク質の半減期は、そのような半減期延長剤を欠く対応するＦＶＩＩＩまたはＦＩＸタンパク質のインビボ半減期よりも、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、または少なくとも約１２倍の長さである。

【0314】

一実施形態では、半減期延長剤を含むＦＶＩＩＩまたはＦＩＸタンパク質の半減期は、そのような半減期延長剤を欠く対応するタンパク質のインビボ半減期よりも、約１．５倍～約２０倍、約１．５倍～約１５倍、または約１．５倍～約１０倍の長さである。別の実施形態では、半減期延長剤を含むＦＶＩＩＩまたはＦＩＸタンパク質の半減期は、そのような半減期延長剤を欠く対応するタンパク質のインビボ半減期と比較して、約２倍～約１０倍、約２倍～約９倍、約２倍～約８倍、約２倍～約７倍、約２倍～約６倍、約２倍～約５倍、約２倍～約４倍、約２倍～約３倍、約２．５倍～約１０倍、約２．５倍～約９倍、約２．５倍～約８倍、約２．５倍～約７倍、約２．５倍～約６倍、約２．５倍～約５倍、約２．５倍～約４倍、約２．５倍～約３倍、約３倍～約１０倍、約３倍～約９倍、約３倍～約８倍、約３倍～約７倍、約３倍～約６倍、約３倍～約５倍、約３倍～約４倍、約４倍～約６倍、約５倍～約７倍、または約６倍～約８倍に延長される。

【0315】

他の実施形態では、半減期延長剤を含むＦＶＩＩＩまたはＦＩＸタンパク質の半減期は、少なくとも約１７時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約１９時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２１時間、少なくとも約２２時間、少なくとも約２３時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約２６時間、少なくとも約２７時間、少なくとも約２８時間、少なくとも約２９時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３１時間、少なくとも約３２時間、少なくとも約３３時間、少なくとも約３４時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約８４時間、少なくとも約９６時間、または少なくとも約１０８時間である。

【0316】

さらに他の実施形態では、半減期延長剤を含むＦＶＩＩＩまたはＦＩＸタンパク質の半減期は、約１５時間～約２週間、約１６時間～約１週間、約１７時間～約１週間、約１８時間～約１週間、約１９時間～約１週間、約２０時間～約１週間、約２１時間～約１週間、約２２時間～約１週間、約２３時間～約１週間、約２４時間～約１週間、約３６時間～約１週間、約４８時間～約１週間、約６０時間～約１週間、約２４時間～約６日間、約２４時間～約５日間、約２４時間～約４日間、約２４時間～約３日間、または約２４時間～約２日間である。

【0317】

一部の実施形態では、半減期延長剤を含むＦＶＩＩＩまたはＦＩＸタンパク質の対象あたりの平均半減期は、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間（１日間）、約２５時間、約２６時間、約２７時間、約２８時間、約２９時間、約３０時間、約３１時間、約３２時間、約３３時間、約３４時間、約３５時間、約３６時間、約４０時間、約４４時間、約４８時間（２日間）、約５４時間、約６０時間、約７２時間（３日間）、約８４時間、約９６時間（４日間）、約１０８時間、約１２０時間（５日間）、約６日間、約７日間（１週間）、約８日間、約９日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間、約１３日間、または約１４日間である。

【0318】

１つまたはそれ以上の半減期延長剤を、ＦＶＩＩＩもしくはＦＩＸのＣ末端もしくはＮ末端に融合させること、またはＦＶＩＩＩもしくはＦＩＸの内部に挿入することができる。

【0319】

Ｂ．３．ａ．免疫グロブリン定常領域またはその一部分
別の態様では、異種部分は、１つまたはそれ以上の免疫グロブリン定常領域またはその部分（例えば、Ｆｃ領域）を含む。一実施形態では、本開示の単離された核酸分子は、免疫グロブリン定常領域またはその一部分をコードする異種核酸配列をさらに含む。一部の実施形態では、免疫グロブリン定常領域またはその部分は、Ｆｃ領域である。

【0320】

免疫グロブリン定常領域は、ＣＨ（定常重鎖）ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２など）で示されるドメインから構成される。アイソタイプ（すなわち、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ ＩｇＤ、またはＩｇＥ）に応じて、定常領域は３つまたは４つのＣＨドメインから構成される。いくつかのアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ）定常領域は、ヒンジ領域も含有する。Ｊａｎｅｗａｙら、２００１年、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎ．Ｙ．、Ｎ．Ｙ．を参照のこと。

【0321】

本開示のＦＶＩＩＩまたはＦＩＸタンパク質を生成するための免疫グロブリン定常領域またはその一部分は、いくつかの異なる供給源から得ることができる。一実施形態では、免疫グロブリン定常領域またはその一部分は、ヒト免疫グロブリンに由来する。しかし、免疫グロブリン定常領域またはその一部分は、例えば、齧歯類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット）または非ヒト霊長類（例えば、チンパンジー、マカクザル）種を含む、別の哺乳動物種の免疫グロブリンに由来し得ることも理解されよう。さらに、免疫グロブリン定常領域またはその一部分は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥを含む任意の免疫グロブリンクラス、ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む任意の免疫グロブリンアイソタイプにも由来し得る。一実施形態では、ヒトアイソタイプＩｇＧ１が使用される。

【0322】

種々の免疫グロブリン定常領域の遺伝子配列（例えば、ヒト定常領域の遺伝子配列）が、公的にアクセス可能な寄託物の形態で利用可能である。特定のエフェクター機能を有する（または特定のエフェクター機能を欠く）か、または免疫原性を低下させる特定の改変を伴う定常領域ドメインの配列を選択することができる。抗体および抗体をコードする遺伝子の多くの配列が公開されており、好適なＩｇ定常領域の配列（例えば、ヒンジ、ＣＨ２、および／もしくはＣＨ３配列、またはその部分）を、当技術分野で認識される技法を使用して、これらの配列から導き出すことができる。続いて、前述の方法のいずれかを使用して得られる遺伝物質を変更または合成して、本開示のポリペプチドを得ることができる。この開示の範囲は、定常領域ＤＮＡ配列の対立遺伝子、バリアントおよび突然変異を包含することがさらに認識されるであろう。

【0323】

免疫グロブリン定常領域またはその一部分の配列は、例えば、目的のドメインを増幅するために選択されるポリメラーゼ連鎖反応およびプライマーを使用してクローニングすることができる。抗体から免疫グロブリン定常領域またはその一部分の配列をクローニングするために、ｍＲＮＡを、ハイブリドーマ、脾臓、またはリンパ細胞から単離し、ＤＮＡに逆転写させて、ＰＣＲによって抗体遺伝子を増幅することができる。ＰＣＲ増幅方法は、米国特許第４，６８３，１９５号；同第４，６８３，２０２号；同第４，８００，１５９号；同第４，９６５，１８８号；および例えば、「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｉｎｎｉｓら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０年）；Ｈｏら、１９８９年、Ｇｅｎｅ ７７：５１頁；Ｈｏｒｔｏｎら、１９９３年、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２７０頁に詳述されている。ＰＣＲは、コンセンサス定常領域のプライマーによって、または公開された重鎖および軽鎖のＤＮＡおよびアミノ酸配列に基づく、より特異的なプライマーによって開始することができる。ＰＣＲは、抗体の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡクローンを単離するためにも使用することができる。この場合には、コンセンサスプライマー、またはより大きな同種プローブ、例えばマウス定常領域のプローブによって、ライブラリーをスクリーニングすることができる。抗体遺伝子の増幅に好適な多数のプライマーセットが、当技術分野で公知である（例えば、精製抗体のＮ末端配列に基づく５’プライマー（ＢｅｎｈａｒおよびＰａｓｔａｎ．１９９４年、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７：１５０９頁）；ｃＤＮＡ末端の迅速増幅（Ｒｕｂｅｒｔｉ，Ｆ．ら、１９９４年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １７３：３３頁）；抗体リーダー配列（Ｌａｒｒｉｃｋら、１９８９年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１６０：１２５０頁）。抗体配列のクローニングは、１９９５年１月２５日に出願されたＮｅｗｍａｎらの米国特許第５，６５８，５７０号にさらに記載されており、これは参照によって本明細書に組み入れられる。

【0324】

本明細書で使用される免疫グロブリン定常領域は、すべてのドメインおよびヒンジ領域またはそれらの部分を含むことができる。一実施形態では、免疫グロブリン定常領域またはその一部分は、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、およびヒンジ領域、すなわち、Ｆｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーを含む。

【0325】

本明細書で使用する場合、「Ｆｃ領域」という用語は、ネイティブＩｇのＦｃ領域に対応するポリペプチドの部分として、すなわち、その２つの重鎖の各々のＦｃドメインの二量体会合によって形成される部分として定義される。ネイティブＦｃ領域は、別のＦｃ領域とホモ二量体を形成する。対照的に、「遺伝子的に融合されるＦｃ領域」または「単鎖Ｆｃ領域」（ｓｃＦｃ領域）という用語は、本明細書で使用する場合、単一ポリペプチド鎖内で遺伝子的に連結される（すなわち、単一の連続した遺伝子配列でコードされる）Ｆｃドメインから構成される合成二量体Ｆｃ領域を指す。その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、国際特許出願公開ＷＯ２０１２／００６６３５を参照のこと。

【0326】

一実施形態では、「Ｆｃ領域」は、パパイン切断部位のすぐ上流のヒンジ領域（すなわち、重鎖定常領域の第１の残基を１１４とした場合の、ＩｇＧの残基２１６）で始まって、抗体のＣ末端で終わる、単一のＩｇ重鎖の部分を指す。したがって、完全Ｆｃ領域は、少なくともヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む。

【0327】

免疫グロブリン定常領域またはその一部分は、ＦｃＲｎ結合パートナーであり得る。ＦｃＲｎは成体上皮組織で活性であり、腸の管腔、肺気道、鼻腔面、膣表面、結腸および直腸表面において発現される（米国特許第６，４８５，７２６号）。ＦｃＲｎ結合パートナーは、ＦｃＲｎに結合する免疫グロブリンの一部分である。

【0328】

ＦｃＲｎ受容体は、ヒトを含むいくつかの哺乳動物種から単離されている。ヒトＦｃＲｎ、サルＦｃＲｎ、ラットＦｃＲｎ、およびマウスＦｃＲｎの配列が公知である（Ｓｔｏｒｙら、１９９４年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：２３７７頁）。ＦｃＲｎ受容体は、ＩｇＧ（ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥなどの他の免疫グロブリンクラスではなく）に比較的低いｐＨで結合し、ＩｇＧを管腔から漿膜の方向に経細胞的に能動輸送し、続いて間質液で見られる比較的高いｐＨでＩｇＧを遊離する。これは、肺および腸の上皮（Ｉｓｒａｅｌら、１９９７年、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ９２：６９頁）、腎近位尿細管上皮（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、２００２年、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８２：Ｆ３５８頁）ならびに鼻腔上皮、膣表面、および胆道系表面を含む、成体上皮組織（米国特許第６，４８５，７２６号、同第６，０３０，６１３号、同第６，０８６，８７５号；ＷＯ０３／０７７８３４；米国特許出願公開第２００３－０２３５５３６Ａ１号）において発現される。

【0329】

本開示において有用なＦｃＲｎ結合パートナーは、ＩｇＧ全体、ＩｇＧのＦｃ断片、およびＦｃＲｎ受容体の完全結合領域を含む他の断片を含む、ＦｃＲｎ受容体が特異的に結合することができる分子を範囲に含む。ＦｃＲｎ受容体に結合するＩｇＧのＦｃ部分の領域は、Ｘ線結晶学に基づいて記載されている（Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒら、１９９４年、Ｎａｔｕｒｅ ３７２：３７９頁）。ＦｃのＦｃＲｎとの主な接触領域は、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの接合部に近い。Ｆｃ－ＦｃＲｎ接触はすべて、単一のＩｇ重鎖内である。ＦｃＲｎ結合パートナーとしては、ＩｇＧ全体、ＩｇＧのＦｃ断片、およびＦｃＲｎの完全結合領域を含むＩｇＧの他の断片が挙げられる。主な接触部位としては、ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２４８、２５０～２５７、２７２、２８５、２８８、２９０～２９１、３０８～３１１および３１４、ならびにＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３８５～３８７、４２８および４３３～４３６が挙げられる。免疫グロブリンもしくは免疫グロブリン断片、または領域のアミノ酸番号付けに対してなされる言及はすべて、Ｋａｂａｔら、１９９１年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．に基づく。

【0330】

ＦｃＲｎに結合したＦｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーは、ＦｃＲｎによって上皮障壁を越えて効率的に行き来し得るため、所望の治療用分子を全身投与するための非侵襲的手段を提供する。さらに、Ｆｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーを含む融合タンパク質は、ＦｃＲｎを発現する細胞によって貪食される。しかし、これらの融合タンパク質は分解の対象とはされず、リサイクルされて再び血液循環に入るため、これらのタンパク質のインビボ半減期は延長する。ある特定の実施形態では、免疫グロブリン定常領域の部分は、典型的にはジスルフィド結合および他の非特異的相互作用を介して別のＦｃ領域または別のＦｃＲｎ結合パートナーと会合して、二量体およびより高次の多量体を形成する、Ｆｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーである。

【0331】

２つのＦｃＲｎ受容体が単一のＦｃ分子に結合することができる。結晶学的データから、各ＦｃＲｎ分子がＦｃホモ二量体の単一のポリペプチドに結合することが示唆される。一実施形態では、ＦｃＲｎ結合パートナー、例えば、ＩｇＧのＦｃ断片を生物活性分子に連結させることにより、生物活性分子を、経口、口腔内、舌下、直腸、膣内に、経鼻的もしくは経肺経路によるエアロゾル投与として、または眼経路によって送達する手段が得られる。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質を、侵襲的に、例えば、皮下、静脈内に投与することができる。

【0332】

ＦｃＲｎ結合パートナー領域は、ＦｃＲｎ受容体が特異的に結合し、その結果、ＦｃＲｎ受容体によるＦｃ領域の能動輸送を可能にする分子またはその部分である。特異的な結合とは、生理的条件下で、比較的安定である複合体を形成する２つの分子を指す。特異的結合は、高い親和性および低いないし中程度の結合能によって特徴付けられ、通常は親和性が低く結合能が中程度から高度である非特異的結合と区別される。典型的には、親和性定数ＫＡが１０^６Ｍ^－１よりも高いか、または１０^８Ｍ^－１よりも高い場合に、結合は特異的であると考えられる。必要に応じて、非特異的結合は、結合条件を変えることによって、特異的な結合に実質的な影響を及ぼすことなく減少させ得る。適切な結合条件、例えば、分子の濃度、溶液のイオン強度、温度、結合させる時間、ブロッキング剤（例えば、血清アルブミン、乳カゼイン）の濃度を、当業者は慣行的な技法を使用して最適化することができる。

【0333】

ある特定の実施形態では、本開示の核酸分子によってコードされるＦＶＩＩＩタンパク質は、短縮されているにもかかわらず、Ｆｃ領域にＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合特性を付与するのに十分な、１つまたはそれ以上の短縮されたＦｃ領域を含む。例えば、ＦｃＲｎに結合するＦｃ領域の部分（すなわち、ＦｃＲｎ結合部分）は、ＥＵの番号付けで、ＩｇＧ１のアミノ酸約２８２～４３８を含む（主要な接触部位は、ＣＨ２ドメインのアミノ酸２４８、２５０～２５７、２７２、２８５、２８８、２９０～２９１、３０８～３１１および３１４、ならびにＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３８５～３８７、４２８および４３３～４３６である）。それ故に、本開示のＦｃ領域は、ＦｃＲｎ結合部分を含むか、またはそれからなる場合がある。ＦｃＲｎ結合部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む、任意のアイソタイプの重鎖に由来し得る。一実施形態では、ヒトアイソタイプＩｇＧ１の抗体由来のＦｃＲｎ結合部分が使用される。別の実施形態では、ヒトアイソタイプＩｇＧ４の抗体由来のＦｃＲｎ結合部分が使用される。

【0334】

Ｆｃ領域は、いくつかの異なる供給源から得ることができる。一実施形態では、ポリペプチドのＦｃ領域は、ヒト免疫グロブリンに由来する。しかし、Ｆｃ部分が、例えば、齧歯類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット）または非ヒト霊長類（例えば、チンパンジー、マカクザル）種を含む、別の哺乳動物種の免疫グロブリンに由来し得ることも理解されよう。さらに、Ｆｃドメインまたはその部分は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥを含む任意の免疫グロブリンクラス、ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む任意の免疫グロブリンアイソタイプにも由来し得る。別の実施形態では、ヒトアイソタイプＩｇＧ１が使用される。

【0335】

ある特定の実施形態では、Ｆｃバリアントは、前記野生型Ｆｃドメインを含むＦｃ部分によって付与される少なくとも１つのエフェクター機能に変化をもたらす（例えば、Ｆｃ領域が、Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、またはＦｃγＲＩＩＩ）もしくは補体タンパク質（例えば、Ｃ１ｑ）に結合するか、または抗体依存性細胞障害性（ＡＤＣＣ）、食作用、もしくは補体依存性細胞障害性（ＣＤＣＣ）を誘発する能力の改善または低下）。他の実施形態では、Ｆｃバリアントは、操作されたシステイン残基をもたらす。

【0336】

本開示のＦｃ領域は、エフェクター機能および／またはＦｃＲもしくはＦｃＲｎの結合の変化（例えば、増強または低下）をもたらすことが知られている、当技術分野で認識されるＦｃバリアントを用いることができる。具体的には、本開示のＦｃ領域は、例えば、そのそれぞれが参照によって本明細書に組み入れられる、国際ＰＣＴ出願公開ＷＯ８８／０７０８９Ａ１、同ＷＯ９６／１４３３９Ａ１、同ＷＯ９８／０５７８７Ａ１、同ＷＯ９８／２３２８９Ａ１、同ＷＯ９９／５１６４２Ａ１、同ＷＯ９９／５８５７２Ａ１、同第ＷＯ００／０９５６０Ａ２、同ＷＯ００／３２７６７Ａ１、同ＷＯ００／４２０７２Ａ２、同ＷＯ０２／４４２１５Ａ２、同ＷＯ０２／０６０９１９Ａ２、同ＷＯ０３／０７４５６９Ａ２、同ＷＯ０４／０１６７５０Ａ２、同ＷＯ０４／０２９２０７Ａ２、同ＷＯ０４／０３５７５２Ａ２、同ＷＯ０４／０６３３５１Ａ２、同ＷＯ０４／０７４４５５Ａ２、同ＷＯ０４／０９９２４９Ａ２、同ＷＯ０５／０４０２１７Ａ２、同ＷＯ０４／０４４８５９、同ＷＯ０５／０７０９６３Ａ１、同ＷＯ０５／０７７９８１Ａ２、同ＷＯ０５／０９２９２５Ａ２、同ＷＯ０５／１２３７８０Ａ２、同ＷＯ０６／０１９４４７Ａ１、同ＷＯ０６／０４７３５０Ａ２および同ＷＯ０６／０８５９６７Ａ２；米国特許出願公開第２００７／０２３１３２９号、同第２００７／０２３１３２９号、同第２００７／０２３７７６５号、同第２００７／０２３７７６６号、同第２００７／０２３７７６７号、同第２００７／０２４３１８８号、同第２００７／０２４８６０３号、同第２００７／０２８６８５９号、同第２００８／００５７０５６号；または米国特許第５，６４８，２６０号、同第５，７３９，２７７号、同第５，８３４，２５０号、同第５，８６９，０４６号、同第６，０９６，８７１号、同第６，１２１，０２２号、同第６，１９４，５５１号、同第６，２４２，１９５号、同第６，２７７，３７５号、同第６，５２８，６２４号、同第６，５３８，１２４号、同第６，７３７，０５６号、同第６，８２１，５０５号、同第６，９９８，２５３号、同第７，０８３，７８４号、同第７，４０４，９５６号、および同第７，３１７，０９１号に開示されているアミノ酸位置のうちの１つまたはそれ以上に、変更（例えば、置換）を含むことができる。一実施形態では、具体的な変更（例えば、当技術分野において開示される１つまたはそれ以上のアミノ酸の具体的な置換）を、開示されるアミノ酸位置のうちの１つまたはそれ以上において行うことができる。別の実施形態では、開示されるアミノ酸位置のうちの１つまたはそれ以上において、異なる変更（例えば、当技術分野において開示される１つまたはそれ以上のアミノ酸位置の異なる置換）を行うことができる。

【0337】

部位特異的突然変異誘発などの十分に認識されている手順に従って、ＩｇＧのＦｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーを改変して、ＦｃＲｎが結合する改変されたＩｇＧもしくはＦｃ断片またはその部分を得ることができる。そのような改変としては、ＦｃＲｎ接触部位から離れた部位の改変のほかに、ＦｃＲｎへの結合を保持するかまたはさらには増強する、接触部位内での改変が挙げられる。例えば、ＦｃＲｎに対するＦｃ結合親和性を著しく失うことなく、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（Ｆｃ １）における以下の単一のアミノ酸残基を置換することができる：Ｐ２３８Ａ、Ｓ２３９Ａ、Ｋ２４６Ａ、Ｋ２４８Ａ、Ｄ２４９Ａ、Ｍ２５２Ａ、Ｔ２５６Ａ、Ｅ２５８Ａ、Ｔ２６０Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｓ２６７Ａ、Ｈ２６８Ａ、Ｅ２６９Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｅ２７２Ａ、Ｌ２７４Ａ、Ｎ２７６Ａ、Ｙ２７８Ａ、Ｄ２８０Ａ、Ｖ２８２Ａ、Ｅ２８３Ａ、Ｈ２８５Ａ、Ｎ２８６Ａ、Ｔ２８９Ａ、Ｋ２９０Ａ、Ｒ２９２Ａ、Ｅ２９３Ａ、Ｅ２９４Ａ、Ｑ２９５Ａ、Ｙ２９６Ｆ、Ｎ２９７Ａ、Ｓ２９８Ａ、Ｙ３００Ｆ、Ｒ３０１Ａ、Ｖ３０３Ａ、Ｖ３０５Ａ、Ｔ３０７Ａ、Ｌ３０９Ａ、Ｑ３１１Ａ、Ｄ３１２Ａ、Ｎ３１５Ａ、Ｋ３１７Ａ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２０Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｓ３２４Ａ、Ｋ３２６Ａ、Ａ３２７Ｑ、Ｐ３２９Ａ、Ａ３３０Ｑ、Ｐ３３１Ａ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ｔ３３５Ａ、Ｓ３３７Ａ、Ｋ３３８Ａ、Ｋ３４０Ａ、Ｑ３４２Ａ、Ｒ３４４Ａ、Ｅ３４５Ａ、Ｑ３４７Ａ、Ｒ３５５Ａ、Ｅ３５６Ａ、Ｍ３５８Ａ、Ｔ３５９Ａ、Ｋ３６０Ａ、Ｎ３６１Ａ、Ｑ３６２Ａ、Ｙ３７３Ａ、Ｓ３７５Ａ、Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｑ、Ｅ３８０Ａ、Ｅ３８２Ａ、Ｓ３８３Ａ、Ｎ３８４Ａ、Ｑ３８６Ａ、Ｅ３８８Ａ、Ｎ３８９Ａ、Ｎ３９０Ａ、Ｙ３９１Ｆ、Ｋ３９２Ａ、Ｌ３９８Ａ、Ｓ４００Ａ、Ｄ４０１Ａ、Ｄ４１３Ａ、Ｋ４１４Ａ、Ｒ４１６Ａ、Ｑ４１８Ａ、Ｑ４１９Ａ、Ｎ４２１Ａ、Ｖ４２２Ａ、Ｓ４２４Ａ、Ｅ４３０Ａ、Ｎ４３４Ａ、Ｔ４３７Ａ、Ｑ４３８Ａ、Ｋ４３９Ａ、Ｓ４４０Ａ、Ｓ４４４Ａ、およびＫ４４７Ａ、ここで例えばＰ２３８Ａは、位置番号２３８における野生型プロリンのアラニンへの置換を表す。一例として、具体的な一実施形態では、Ｎ２９７Ａ突然変異を組み込んで、高度に保存されたＮグリコシル化部位を除去する。アラニンに加えて、上で特定した位置の野生型アミノ酸を他のアミノ酸で置換することもできる。突然変異を個々にＦｃに導入して、ネイティブＦｃと異なる１００種を上回るＦｃ領域を生じさせることができる。さらに、これらの個々の突然変異のうちの２つ、３つ、またはそれ以上の組合せを一緒に導入して、さらに数百ものＦｃ領域を生じさせることができる。

【0338】

上記のうちのある特定の突然変異により、Ｆｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーに新たな機能を付与することができる。例えば、一実施形態では、Ｎ２９７Ａを組み込んで、高度に保存されたＮ－グリコシル化部位を除去する。この突然変異の効果は、免疫原性を低下させて、それにより、Ｆｃ領域の循環血液中半減期を強化すること、およびＦｃＲｎに対する親和性を損なうことなく、Ｆｃ領域がＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、およびＦｃγＲＩＩＩＡに結合不能にすることである（Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅら、１９９５年、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６０：８４７頁；Ｆｒｉｅｎｄら、１９９９年、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６８：１６３２頁；Ｓｈｉｅｌｄｓら、１９９５年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１頁）。上記の突然変異によって生じる新たな機能のさらなる例として、いくつかの場合に、ＦｃＲｎに対する親和性を野生型の親和性よりも高めることができる。この親和性の増加は、「会合」速度の上昇、「解離」速度の低下、または「会合」速度の上昇および「解離」速度の低下の両方を反映し得る。ＦｃＲｎに対する親和性の増加をもたらすと考えられる突然変異の例としては、Ｔ２５６Ａ、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ、およびＮ４３４Ａが挙げられるが、これらに限定されない（Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１頁）。

【0339】

さらに、少なくとも３つのヒトＦｃγ受容体は、下流のヒンジ領域、一般的にはアミノ酸２３４～２３７において、ＩｇＧ上の結合部位を認識すると考えられる。したがって、新たな機能および免疫原性の潜在的な減少の別の例を、この領域の突然変異、例えば、ヒトＩｇＧ１のアミノ酸２３３～２３６「ＥＬＬＧ」（配列番号８）を、ＩｇＧ２由来の対応する配列「ＰＶＡ」（１アミノ酸の欠失を有する）で置換することなどによって生じさせることができる。そのような突然変異が導入された場合には、様々なエフェクター機能を媒介するＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩが、ＩｇＧ１に結合しなくなることが示されている。ＷａｒｄおよびＧｈｅｔｉｅ、１９９５年、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２：７７頁およびＡｒｍｏｕｒら、１９９９年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：２６１３頁。

【0340】

別の実施形態では、免疫グロブリン定常領域またはその一部分は、第２の免疫グロブリン定常領域またはその一部分と１つまたはそれ以上のジスルフィド結合を形成するアミノ酸配列を、ヒンジ領域またはその一部分に含む。第２の免疫グロブリン定常領域またはその一部分は、第２のポリペプチドに連結して、ＦＶＩＩＩタンパク質および第２のポリペプチドを一つにすることができる。一部の実施形態では、第２のポリペプチドはエンハンサー部分である。本明細書で使用する場合、「エンハンサー部分」という用語は、ＦＶＩＩＩの凝固促進活性を強化することが可能な分子、その断片またはポリペプチドの構成要素を指す。エンハンサー部分は、可溶性組織因子（ｓＴＦ）などの補因子であるか、または凝固促進ペプチドであり得る。それ故に、ＦＶＩＩＩが活性化されると、エンハンサー部分が利用可能となってＦＶＩＩＩの活性を強化する。

【0341】

ある特定の実施形態では、本開示の核酸分子によってコードされるＦＶＩＩＩタンパク質は、免疫グロブリン定常領域またはその一部分に対するアミノ酸置換（例えば、Ｆｃバリアント）を含み、これはＩｇ定常領域の抗原依存性エフェクター機能、特に、タンパク質の流血中半減期を変化させる。

【0342】

Ｂ．３．ｂ．ｓｃＦｃ領域
別の態様では、異種部分は、ｓｃＦｃ（単鎖Ｆｃ）領域を含む。一実施形態では、本開示の単離された核酸分子は、ＳｃＦｃ領域をコードする異種核酸配列をさらに含む。ｓｃＦｃ領域は、同じ直鎖状ポリペプチド鎖内に、フォールディング（例えば、分子内または分子間フォールディング）を行って、Ｆｃペプチドリンカーによって連結される１つの機能性ｓｃＦｃ領域を形成することが可能な、少なくとも２つの免疫グロブリン定常領域またはその部分（例えば、Ｆｃ部分またはＦｃドメイン（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上のＦｃ部分またはドメイン））を含む。例えば、一実施形態では、本開示のポリペプチドは、半減期を改善する、または免疫エフェクター機能（例えば、抗体依存性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）、食作用、または補体依存性細胞障害作用（ＣＤＣＣ））を誘発する、かつ／または製造性を改善する目的で、そのＳｃＦｃ領域を介して、少なくとも１つのＦｃ受容体（例えば、ＦｃＲｎ、ＦｃγＲ受容体（例えば、ＦｃγＲＩＩＩ）、または補体タンパク質（例えば、Ｃ１ｑ））に結合することが可能である。

【0343】

Ｂ．３．ＣＴＰ
別の態様では、異種部分は、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットの１つのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）またはその断片、バリアントもしくは誘導体を含む。組換えタンパク質に挿入された１つまたはそれ以上のＣＴＰペプチドは、そのタンパク質のインビボ半減期を延長させることが知られている。例えば、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、米国特許第５，７１２，１２２号を参照のこと。

【0344】

例示的なＣＴＰペプチドとしては、ＤＰＲＦＱＤＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬ（配列番号９）またはＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号１０）が挙げられる。例えば、参照によって組み入れられる、米国特許出願公開第２００９／００８７４１１Ａ１号を参照のこと。

【0345】

Ｂ．３．ｄ．ＸＴＥＮ配列
一部の実施形態では、異種部分は、１つまたはそれ以上のＸＴＥＮ配列、その断片、バリアントまたは誘導体を含む。本明細書で使用する場合、「ＸＴＥＮ配列」は、小型の親水性アミノ酸で主に構成され、生理的条件下では二次構造または三次構造をとる程度が低いかまたはとらない、天然に存在しない実質的に非反復性の配列を有する、伸長したポリペプチドを指す。異種部分として、ＸＴＥＮは、半減期延長部分としての役割を果たすことができる。加えて、ＸＴＥＮは、薬物動態パラメーターおよび溶解特性の強化を含むがこれらに限定されない、所望の特性をもたらすことができる。

【0346】

ＸＴＥＮ配列を含む異種部分を、本開示のタンパク質への組み込むことにより、以下の有利な特性：コンフォメーションの柔軟性、水溶解性の向上、高度なプロテアーゼ耐性、免疫原性の低さ、哺乳動物受容体への結合性の低さ、または流体力学的（またはストークス）半径の増加、のうちの１つまたはそれ以上を、タンパク質に付与することができる。

【0347】

ある特定の態様では、ＸＴＥＮ配列は、より長いインビボ半減期または曲線下面積（ＡＵＣ）の増加といった薬物動態特性を向上させることができ、その結果、本開示のタンパク質はインビボに留まり、ＸＴＥＮ異種部分を有しないこと以外は同じであるタンパク質と比較して長い期間にわたって凝固促進活性を有する。

【0348】

一部の実施形態では、本開示に関して有用なＸＴＥＮ配列は、約２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、５５０個、６００個、６５０個、７００個、７５０個、８００個、８５０個、９００個、９５０個、１０００個、１２００個、１４００個、１６００個、１８００個、または２０００個を上回るアミノ酸残基を有するペプチドまたはポリペプチドである。ある特定の実施形態では、ＸＴＥＮは、約２０～約３０００個を上回るアミノ酸残基、３０～約２５００個を上回る残基、４０～約２０００個を上回る残基、５０～約１５００個を上回る残基、６０～約１０００個を上回る残基、７０～約９００個を上回る残基、８０～約８００個を上回る残基、９０～約７００個を上回る残基、１００～約６００個を上回る残基、１１０～約５００個を上回る残基、または１２０～約４００個を上回る残基を有するペプチドまたはポリペプチドである。特定の一実施形態では、ＸＴＥＮは、長さが４２アミノ酸よりも長く１４４アミノ酸よりも短いアミノ酸配列を含む。

【0349】

本開示のＸＴＥＮ配列は、５～１４個（例えば、９～１４個）のアミノ酸残基の１つもしくはそれ以上の配列モチーフ、または配列モチーフと少なくとも８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むことができ、そのモチーフは、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）からなる群から選択される４～６種のアミノ酸（例えば、５種類のアミノ酸）を含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなる。米国特許出願第２０１０－０２３９５５４Ａ１号を参照のこと。

【0350】

一部の実施形態では、ＸＴＥＮは、配列の約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％または約１００％が、表３から選択される単一のモチーフファミリーから選択される非重複配列の複数ユニットからなり、その結果ファミリー配列をもたらす、非重複配列モチーフを含む。

【0351】

本明細書で使用する場合、「ファミリー」は、ＸＴＥＮが表３からの単一モチーフカテゴリー、すなわち、ＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＭ、ＡＱ、ＢＣ、またはＢＤ ＸＴＥＮのみから選択されるモチーフを有すること、およびファミリーモチーフに由来しないＸＴＥＮにおける任意の他のアミノ酸は、コードするヌクレオチドによる制限部位の組込み、切断配列の組込みを可能にするといった必要とされる特性を実現するために、またはＦＶＩＩＩへのより良好な連結を実現するために選択されることを意味する。ＸＴＥＮファミリーの一部の実施形態では、ＸＴＥＮ配列は、ＡＤモチーフファミリー、またはＡＥモチーフファミリー、またはＡＦモチーフファミリー、またはＡＧモチーフファミリー、またはＡＭモチーフファミリー、またはＡＱモチーフファミリー、またはＢＣファミリー、またはＢＤファミリーの非重複配列モチーフを複数ユニット含み、結果として得られるＸＴＥＮは、上記の範囲の相同性を示す。他の実施形態では、ＸＴＥＮは、表３のモチーフファミリーのうちの２つまたはそれ以上からのモチーフ配列を複数ユニット含む。

【0352】

これらの配列は、以下にさらに詳しく説明される、モチーフのアミノ酸組成によって付与される実効電荷、親水性、二次構造の欠如、または反復性の欠如などの特性を含む、所望の物理的／化学的特徴を実現するように選択することができる。この段落で説明される上記の実施形態では、本明細書に記載される方法を使用して、ＸＴＥＮに組み込まれるモチーフを選択して組み立てて、約３６～約３０００アミノ酸残基のＸＴＥＮを実現することができる。

【0353】

【表3】

【0354】

本開示のキメラタンパク質において異種部分として使用し得るＸＴＥＮ配列の例は、例えば、それぞれその全体が参照によって本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第２０１０／０２３９５５４Ａ１号、同第２０１０／０３２３９５６Ａ１号、同第２０１１／００４６０６０Ａ１号、同第２０１１／００４６０６１Ａ１号、同第２０１１／００７７１９９Ａ１号もしくは同第２０１１／０１７２１４６Ａ１号、または国際特許出願公開ＷＯ２０１０／０９１１２２Ａ１、同ＷＯ２０１０／１４４５０２Ａ２、同ＷＯ２０１０／１４４５０８Ａ１、同ＷＯ２０１１／０２８２２８Ａ１、同ＷＯ２０１１／０２８２２９Ａ１、もしくは同ＷＯ２０１１／０２８３４４Ａ２に開示されている。

【0355】

ＸＴＥＮは、ＦＶＩＩＩへの挿入または連結のために様々な長さを有し得る。一実施形態では、ＸＴＥＮ配列の長さは、融合タンパク質において実現しようとする特性または機能に基づいて選択される。意図する特性または機能に応じて、ＸＴＥＮは、長さが短いかもしくは中程度の配列であってもよく、または担体としての役割を果たし得るより長い配列であってもよい。ある特定の実施形態では、ＸＴＥＮは、約６～約９９個のアミノ酸残基という短いセグメント、約１００～約３９９個のアミノ酸残基という中程度の長さ、および約４００～約１０００個、最大で約３０００個のアミノ酸残基というより長い長さを含む。それ故に、ＦＶＩＩＩに挿入または連結されるＸＴＥＮは、約６個、約１２個、約３６個、約４０個、約４２個、約７２個、約９６個、約１４４個、約２８８個、約４００個、約５００個、約５７６個、約６００個、約７００個、約８００個、約８６４個、約９００個、約１０００個、約１５００個、約２０００個、約２５００個、または最大で約３０００個のアミノ酸残基長を有する場合がある。他の実施形態では、ＸＴＥＮ配列は、約６～約５０個、約５０～約１００個、約１００～１５０個、約１５０～２５０個、約２５０～４００個、約４００～約５００個、約５００～約９００個、約９００～１５００個、約１５００～２０００個、または約２０００～約３０００個のアミノ酸残基長である。

【0356】

ＦＶＩＩＩに挿入または連結されるＸＴＥＮの正確な長さは、ＦＶＩＩＩの活性に有害な影響を及ぼすことなく、様々であり得る。一実施形態では、本発明で使用されるＸＴＥＮのうちの１つまたはそれ以上は、４２個のアミノ酸、７２個のアミノ酸、１４４個のアミノ酸、２８８個のアミノ酸、５７６個のアミノ酸、または８６４個のアミノ酸長を有し、ＸＴＥＮファミリー配列、すなわち、ＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＭ、ＡＱ、ＢＣまたはＢＤのうちの１つまたはそれ以上から選択することができる。

【0357】

一部の実施形態では、本開示で使用されるＸＴＥＮ配列は、ＡＥ４２、ＡＧ４２、ＡＥ４８、ＡＭ４８、ＡＥ７２、ＡＧ７２、ＡＥ１０８、ＡＧ１０８、ＡＥ１４４、ＡＦ１４４、ＡＧ１４４、ＡＥ１８０、ＡＧ１８０、ＡＥ２１６、ＡＧ２１６、ＡＥ２５２、ＡＧ２５２、ＡＥ２８８、ＡＧ２８８、ＡＥ３２４、ＡＧ３２４、ＡＥ３６０、ＡＧ３６０、ＡＥ３９６、ＡＧ３９６、ＡＥ４３２、ＡＧ４３２、ＡＥ４６８、ＡＧ４６８、ＡＥ５０４、ＡＧ５０４、ＡＦ５０４、ＡＥ５４０、ＡＧ５４０、ＡＦ５４０、ＡＤ５７６、ＡＥ５７６、ＡＦ５７６、ＡＧ５７６、ＡＥ６１２、ＡＧ６１２、ＡＥ６２４、ＡＥ６４８、ＡＧ６４８、ＡＧ６８４、ＡＥ７２０、ＡＧ７２０、ＡＥ７５６、ＡＧ７５６、ＡＥ７９２、ＡＧ７９２、ＡＥ８２８、ＡＧ８２８、ＡＤ８３６、ＡＥ８６４、ＡＦ８６４、ＡＧ８６４、ＡＭ８７５、ＡＥ９１２、ＡＭ９２３、ＡＭ１３１８、ＢＣ８６４、ＢＤ８６４、ＡＥ９４８、ＡＥ１０４４、ＡＥ１１４０、ＡＥ１２３６、ＡＥ１３３２、ＡＥ１４２８、ＡＥ１５２４、ＡＥ１６２０、ＡＥ１７１６、ＡＥ１８１２、ＡＥ１９０８、ＡＥ２００４Ａ、ＡＧ９４８、ＡＧ１０４４、ＡＧ１１４０、ＡＧ１２３６、ＡＧ１３３２、ＡＧ１４２８、ＡＧ１５２４、ＡＧ１６２０、ＡＧ１７１６、ＡＧ１８１２、ＡＧ１９０８、ＡＧ２００４、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。米国特許出願第２０１０－０２３９５５４Ａ１号を参照のこと。特定の一実施形態では、ＸＴＥＮは、ＡＥ４２、ＡＥ７２、ＡＥ１４４、ＡＥ２８８、ＡＥ５７６、ＡＥ８６４、ＡＧ４２、ＡＧ７２、ＡＧ１４４、ＡＧ２８８、ＡＧ５７６、ＡＧ８６４、またはそれらの任意の組合せを含む。

【0358】

本開示のキメラタンパク質において、異種部分として使用することができる例示的なＸＴＥＮ配列としては、ＸＴＥＮ ＡＥ４２－４（配列番号４１）、ＸＴＥＮ １４４－２Ａ（配列番号４２）、ＸＴＥＮ Ａ１４４－３Ｂ（配列番号４３）、ＸＴＥＮ ＡＥ１４４－４Ａ（配列番号４４）、ＸＴＥＮ ＡＥ１４４－５Ａ（配列番号４５）、ＸＴＥＮ ＡＥ１４４－６Ｂ（配列番号４６）、ＸＴＥＮ ＡＧ１４４－１（配列番号４７）、ＸＴＥＮ ＡＧ１４４－Ａ（配列番号４８）、ＸＴＥＮ ＡＧ１４４－Ｂ（配列番号４９）、ＸＴＥＮ ＡＧ１４４－Ｃ（配列番号５０）、およびＸＴＥＮ ＡＧ１４４－Ｆ（配列番号５１）が挙げられる。特定の一実施形態では、ＸＴＥＮは、配列番号５２によってコードされる。

【0359】

一部の実施形態では、ＸＴＥＮのアミノ酸の１００％未満が、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）から選択されるか、または配列の１００％未満が、表３からの配列モチーフもしくは本明細書において提供されるＸＴＥＮ配列からなる。そのような実施形態では、ＸＴＥＮの残りのアミノ酸残基は、他の１４種の天然Ｌ－アミノ酸のうちのいずれかから選択されるが、ＸＴＥＮ配列が、親水性アミノ酸を少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも約９９％含有するように、親水性アミノ酸から優先的に選択することができる。

【0360】

コンジュゲーション構築物中に利用されるＸＴＥＮにおける疎水性アミノ酸の含有率は、５％未満、または２％未満、または１％未満である。ＸＴＥＮの構築においてそれほど好ましくない疎水性残基としては、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、およびメチオニンが挙げられる。さらに、ＸＴＥＮ配列は、以下のアミノ酸：メチオニン（例えば、酸化を回避するため）、またはアスパラギンおよびグルタミン（脱アミド化を回避するため）を、５％未満または４％未満または３％未満または２％未満または１％未満または０％含有することができる。

【0361】

１つまたはそれ以上のＸＴＥＮ配列を、ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列のＣ末端もしくはＮ末端に挿入することができるか、またはヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列の２つのアミノ酸の間に挿入することができる。例えば、ＸＴＥＮは、表２から選択される１つまたはそれ以上の挿入部位の２つのアミノ酸の間に挿入することができる。ＸＴＥＮ挿入を許容するＦＶＩＩＩの中の部位の例は、例えば、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる、国際公開番号ＷＯ２０１３／１２３４５７Ａ１または米国特許出願公開第２０１５／０１５８９２９Ａ１号に見出すことができる。

【0362】

Ｂ．３．ｅ．アルブミンまたはその断片、誘導体、もしくはバリアント
一部の実施形態では、異種部分は、アルブミンまたはその機能的断片を含む。完全長形態では６０９アミノ酸のタンパク質であるヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、またはＨＡ）は、血清の浸透圧のかなりの部分を担っており、内因性および外因性リガンドの担体としても機能する。本明細書で使用する場合、「アルブミン」という用語は、完全長アルブミンまたはその機能的断片、バリアント、誘導体、もしくは類似体を含む。アルブミンまたはその断片もしくはバリアントの例は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第２００８／０１９４４８１Ａ１号、同第２００８／０００４２０６Ａ１号、同第２００８／０１６１２４３Ａ１号、同第２００８／０２６１８７７Ａ１号、もしくは同第２００８／０１５３７５１Ａ１号、またはＰＣＴ特許出願公開ＷＯ２００８／０３３４１３Ａ２、同ＷＯ２００９／０５８３２２Ａ１、もしくは同ＷＯ２００７／０２１４９４Ａ２に開示されている。

【0363】

一実施形態では、本開示の核酸分子によってコードされるＦＶＩＩＩタンパク質は、免疫グロブリン定常領域またはその部分（例えばＦｃ領域）、ＰＡＳ配列、ＨＥＳ、およびＰＥＧからなる群から選択される第２の異種部分にさらに連結されたアルブミン、その断片、またはバリアントを含む。

【0364】

Ｂ．３．ｆ．アルブミン結合部分
ある特定の実施形態では、異種部分は、アルブミン結合ペプチド、細菌アルブミン結合ドメイン、アルブミン結合抗体断片、またはこれらの任意の組合せを含むアルブミン結合部分である。

【0365】

例えば、アルブミン結合タンパク質は、細菌アルブミン結合タンパク質、ドメイン抗体を含む抗体または抗体断片であってよい（米国特許第６，６９６，２４５号を参照のこと）。アルブミン結合タンパク質は、例えば、連鎖球菌タンパク質Ｇのものなどの細菌アルブミン結合ドメインであってよい（Ｋｏｎｉｇ，ＴおよびＳｋｅｒｒａ，Ａ．（１９９８年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２１８、７３～８３頁）。コンジュゲーションパートナーとして使用することができるアルブミン結合ペプチドの他の例は、例えば、米国特許出願公開第２００３／００６９３９５号またはＤｅｎｎｉｓら（Ｄｅｎｎｉｓら（２００２年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７、３５０３５～３５０４３頁）に記載されている、Ｃｙｓ－Ｘａａ_１－Ｘａａ_２－Ｘａａ_３－Ｘａａ_４－Ｃｙｓコンセンサス配列（配列番号５２）（式中、Ｘａａ_１は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＴｒｐであり、Ｘａａ_２は、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、またはＬｙｓであり、Ｘａａ_３は、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒであり、Ｘａａ_４は、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒである）を有するものである。

【0366】

Ｋｒａｕｌｉｓら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３７８：１９０～１９４頁（１９９６年）およびＬｉｎｈｕｌｔら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１１：２０６～２１３頁（２００２年）に開示されているように、連鎖球菌タンパク質Ｇ由来のドメイン３は、細菌アルブミン結合ドメインの一例である。アルブミン結合ペプチドの例として、コア配列ＤＩＣＬＰＲ ＷＧＣＬＷ（配列番号５４）を有する一連のペプチドが挙げられる。例えば、Ｄｅｎｎｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２年、２７７：３５０３５～３５０４３頁（２００２）を参照のこと。アルブミン結合抗体断片の例は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、ＭｕｌｌｅｒおよびＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ ４０ ｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．９：３１９～３２６頁（２００７年）；Ｒｏｏｖｅｒｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５６：３０３～３１７頁（２００７年）、およびＨｏｌｔら、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．Ｄｅｓｉｇｎ Ｓｃｉ．、２１：２８３～２８８頁（２００８）に開示されている。そのようなアルブミン結合部分の例は、Ｔｒｕｓｓｅｌら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２０：２２８６～２ ２９２頁（２００９年）に開示されている、２－（３－マレイミドプロパンアミド）－６－（４－（４－ヨードフェニル）ブタンアミド）ヘキサノエート（「Ａｌｂｕ」タグ）である。

【0367】

脂肪酸、特に、長鎖脂肪酸（ＬＣＦＡ）および長鎖脂肪酸様アルブミン結合化合物を使用して、本開示のＦＶＩＩＩタンパク質のインビボ半減期を延長することができる。ＬＣＦＡ様アルブミン結合化合物の例は、１６－（１－（３－（９－（（（２，５－ジオキソピロリジン－１－イルオキシ）カルボニルオキシ）－メチル）－７－スルホ－９Ｈ－フルオレン－２－イルアミノ）－３－オキソプロピル）－２，５－ジオキソピロリジン－３－イルチオ）ヘキサデカン酸である（例えば、ＷＯ２０１０／１４０１４８を参照のこと）。

【0368】

Ｂ．３．ｇ．ＰＡＳ配列
他の実施形態では、異種部分はＰＡＳ配列である。ＰＡＳ配列は、本明細書で使用する場合、アラニン残基およびセリン残基を主に含むか、またはアラニン残基、セリン残基、およびプロリン残基を主に含むアミノ酸配列であって、生理的条件下でランダムコイルコンフォメーションを形成するアミノ酸配列を意味する。したがって、ＰＡＳ配列は、キメラタンパク質において異種部分の一部として使用し得るアラニン、セリン、およびプロリンを含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなる構成単位、アミノ酸ポリマー、または配列カセットである。ただし、ＰＡＳ配列における微量構成要素としてアラニン、セリン、およびプロリン以外の残基が付加される場合にも、アミノ酸ポリマーがランダムコイルコンフォメーションを形成し得ることを当業者は周知している。

【0369】

「微量構成要素」という用語は、本明細書で使用する場合、アラニン、セリン、およびプロリン以外のアミノ酸を、ＰＡＳ配列にある特定の程度まで、例えば、最大で約１２％、すなわちＰＡＳ配列の１００個のアミノ酸のうちの約１２個、最大で約１０％、すなわちＰＡＳ配列の１００個のアミノ酸のうちの約１０個、最大で約９％、すなわち１００個のアミノ酸のうちの約９個、最大で約８％、すなわち１００個のアミノ酸のうちの約８個、約６％、すなわち１００個のアミノ酸のうちの約６個、約５％、すなわち１００個のアミノ酸のうちの約５個、約４％、すなわち１００個のアミノ酸のうちの約４個、約３％、すなわち１００個のアミノ酸のうちの約３個、約２％、すなわち１００個のアミノ酸のうちの約２個、約１％、すなわち１００個のアミノ酸のうちの約１個を付加し得ることを意味する。アラニン、セリン、およびプロリンと異なるアミノ酸は、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＶａｌからなる群から選択することができる。

【0370】

生理的条件下では、ＰＡＳ配列ストレッチは、ランダムコイルコンフォメーションを形成し、それにより、ＦＶＩＩＩタンパク質に対して、インビボおよび／またはインビトロ安定性の増加を媒介することができる。ランダムコイルドメインそれ自体は安定な構造または機能を有しないため、ＦＶＩＩＩタンパク質によって媒介される生体活性は、本質的に保持される。他の実施形態では、ランダムコイルドメインを形成するＰＡＳ配列は、特に血漿中でのタンパク質分解、免疫原性、等電点／静電挙動、細胞表面受容体への結合または内部移行に関して生物学的に不活性であるが、生分解性を保っており、そのことがＰＥＧなどの合成ポリマーを上回る明らかな利点をもたらす。

【0371】

ランダムコイルコンフォメーションを形成するＰＡＳ配列の非限定な例は、ＡＳＰＡＡＰＡＰＡＳＰＡＡＰＡＰＳＡＰＡ（配列番号５５）、ＡＡＰＡＳＰＡＰＡＡＰＳＡＰＡＰＡＡＰＳ（配列番号５６）、ＡＰＳＳＰＳＰＳＡＰＳＳＰＳＰＡＳＰＳＳ（配列番号５７）、ＡＰＳＳＰＳＰＳＡＰＳＳＰＳＰＡＳＰＳ（配列番号５８）、ＳＳＰＳＡＰＳＰＳＳＰＡＳＰＳＰＳＳＰＡ（配列番号５９）、ＡＡＳＰＡＡＰＳＡＰＰＡＡＡＳＰＡＡＰＳＡＰＰＡ（配列番号６０）およびＡＳＡＡＡＰＡＡＡＳＡＡＡＳＡＰＳＡＡＡ（配列番号６１）またはこれらの任意の組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。ＰＡＳ配列のさらなる例は、例えば、米国特許出願公開第２０１０／０２９２１３０Ａ１号およびＰＣＴ特許出願公開ＷＯ２００８／１５５１３４Ａ１から公知である。

【0372】

Ｂ．３．ｈ．ＨＡＰ配列
ある特定の実施形態では、異種部分は、グリシンリッチホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ）である。ＨＡＰ配列は、少なくとも５０個のアミノ酸、少なくとも１００個のアミノ酸、１２０個のアミノ酸、１４０個のアミノ酸、１６０個のアミノ酸、１８０個のアミノ酸、２００個のアミノ酸、２５０個のアミノ酸、３００個のアミノ酸、３５０個のアミノ酸、４００個のアミノ酸、４５０個のアミノ酸、または５００個のアミノ酸の長さを有するグリシン反復配列を含み得る。一実施形態では、ＨＡＰ配列は、ＨＡＰ配列に融合または連結された部分の半減期を延長することが可能である。ＨＡＰ配列の非限定な例としては、（Ｇｌｙ）_ｎ、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_ｎまたはＳ（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_ｎ（式中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０である）が挙げられるが、これに限定されない。一実施形態では、ｎは、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２６、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０である。別の実施形態では、ｎは、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００である。

【0373】

Ｂ．３．ｉ．トランスフェリンまたはその断片
ある特定の実施形態では、異種部分は、トランスフェリンまたはその断片である。任意のトランスフェリンを使用して、本開示のＦＶＩＩＩタンパク質を作製することができる。一例として、野生型ヒトＴＦ（ＴＦ）は、およそ７５ＫＤａの６７９アミノ酸のタンパク質であり（グリコシル化は考慮せず）、２つの主要ドメイン、Ｎ（約３３０アミノ酸）およびＣ（約３４０アミノ酸）を有し、これらは遺伝子重複に起因すると考えられる。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ００１０６３、ＸＭ００２７９３、Ｍ１２５３０、ＸＭ０３９８４５、ＸＭ０３９８４７およびＳ９５９３６（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を参照されたく、これらはすべてその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。トランスフェリンは、ＮドメインおよびＣドメインという２つのドメインを含む。Ｎドメインは、Ｎ１ドメインおよびＮ２ドメインという２つのサブドメインを含み、Ｃドメインは、Ｃ１ドメインおよびＣ２ドメインという２つのサブドメインを含む。

【0374】

一実施形態では、トランスフェリン異種部分として、トランスフェリンスプライスバリアントが挙げられる。一例では、トランスフェリンスプライスバリアントは、ヒトトランスフェリンのスプライスバリアント、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＡＡＡ６１１４０であり得る。別の実施形態では、キメラタンパク質のトランスフェリン部分は、トランスフェリン配列の１つまたはそれ以上のドメイン、例えば、Ｎドメイン、Ｃドメイン、Ｎ１ドメイン、Ｎ２ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメインまたはこれらの任意の組合せを含む。

【0375】

Ｂ．３．ｊ．クリアランス受容体
ある特定の実施形態では、異種部分は、クリアランス受容体、その断片、バリアント、または誘導体である。ＬＲＰ１は、第Ｘ因子などの種々のタンパク質の受容体媒介性クリアランスに関与する６００ＫＤａの膜内在性タンパク質である。例えば、Ｎａｒｉｔａら、Ｂｌｏｏｄ ９１：５５５～５６０頁（１９９８）を参照のこと。

【0376】

Ｂ．３．ｋ．フォンビルブランド因子またはその断片
ある特定の実施形態では、異種部分は、フォンビルブランド因子（ＶＷＦ）またはその１つもしくはそれ以上の断片である。

【0377】

ＶＷＦ（Ｆ８ＶＷＦとしても知られる）は、血漿中に存在し、内皮（バイベルパラーデ小体内）、巨核球（血小板のα顆粒）、および内皮下結合組織において恒常的に産生される大きな多量体糖タンパク質である。基本的なＶＷＦ単量体は、２８１３アミノ酸のタンパク質である。各単量体は、Ｄ’およびＤ３ドメイン（ともに第ＶＩＩＩ因子に結合する）、Ａ１ドメイン（血小板ＧＰＩｂ受容体、ヘパリン、および／またはおそらくコラーゲンに結合する）、Ａ３ドメイン（コラーゲンに結合する）、Ｃ１ドメイン（このドメインが活性化すると、ＲＧＤドメインが血小板インテグリンαＩＩｂβ３に結合する）、ならびにタンパク質のＣ末端にある「システインノット」ドメイン（ＶＷＦは、このドメインを血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、形質転換成長因子－β（ＴＧＦβ）およびβ－ヒト絨毛性ゴナドトロピン（βＨＣＧ）と共有する）という、特有の機能を有するいくつかの特有のドメインを含有する。

【0378】

ヒトＶＷＦの２８１３個の単量体アミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＮＰ０００５４３．２として報告されている。ヒトＶＷＦをコードするヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＮＭ００５５２．３として報告されている。配列番号６２は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ００５５２．３に報告されているアミノ酸配列である。Ｄ’ドメインは、配列番号６２のアミノ酸７６４から８６６までを含む。Ｄ３ドメインは、配列番号４４のアミノ酸８６７から１２４０までを含む。

【0379】

血漿中では、ＦＶＩＩＩの９５～９８％は、完全長ＶＷＦとの強固な非共有結合複合体として循環する。この複合体の形成は、インビボでＦＶＩＩＩＩの適切な血漿中レベルを維持するために重要である。Ｌｅｎｔｉｎｇら、Ｂｌｏｏｄ．９２（１１）：３９８３～９６（１９９８年）；Ｌｅｎｔｉｎｇら、Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．５（７）：１３５３～６０頁（２００７年）。重鎖の３７２位および７４０位、ならびに軽鎖の１６８９位におけるタンパク質分解によってＦＶＩＩＩが活性化されると、ＦＶＩＩＩに結合したＶＷＦが、活性化ＦＶＩＩＩから離脱する。

【0380】

ある特定の実施形態では、異種部分は、完全長フォンビルブランド因子である。他の実施形態では、異種部分は、フォンビルブランド因子断片である。本明細書で使用する場合、「１つのＶＷＦ断片」または「複数のＶＷＦ断片」という用語は、ＦＶＩＩＩと相互作用して、完全長ＶＷＦによってＦＶＩＩＩに通常もたらされる少なくとも１つまたはそれ以上の特性、例えば、ＦＶＩＩＩａに対する早期活性化を阻止すること、早期タンパク質分解を阻止すること、早期クリアランスを招き得るリン脂質膜との会合を阻止すること、裸のＦＶＩＩＩには結合し得るがＶＷＦの結合したＦＶＩＩＩには結合することができないＦＶＩＩＩクリアランス受容体への結合を阻止すること、および／またはＦＶＩＩＩの重鎖および軽鎖の相互作用を安定化することを保持する、任意のＶＷＦ断片を意味する。具体的な一実施形態では、異種部分は、ＶＷＦのＤ’ドメインおよびＤ３ドメインを含む（ＶＷＦ）断片である。Ｄ’ドメインおよびＤ３ドメインを含むＶＷＦ断片は、Ａ１ドメイン、Ａ２ドメイン、Ａ３ドメイン、Ｄ１ドメイン、Ｄ２ドメイン、Ｄ４ドメイン、Ｂ１ドメイン、Ｂ２ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン、ＣＫドメイン、これらの１つまたはそれ以上の断片、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択されるＶＷＦドメインをさらに含むことができる。ＶＷＦ断片に融合したＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドのさらなる例は、いずれも参照によってその全体が本明細書に組み入れられる、２０１２年７月３日に出願された米国仮特許出願第６１／６６７，９０１号、および米国特許出願公開第２０１５／００２３９５９Ａ１号に開示されている。

【0381】

Ｂ．３．ｌ．リンカー部分
ある特定の実施形態では、異種部分はペプチドリンカーである。

【0382】

本明細書で使用する場合、「ペプチドリンカー」または「リンカー部分」という用語は、ポリペプチド鎖の直鎖状アミノ酸配列における２つのドメインを接続するペプチドまたはポリペプチド配列（例えば、合成ペプチドまたはポリペプチド配列）を指す。

【0383】

一部の実施形態では、ペプチドリンカーをコードする異種ヌクレオチド配列は、本開示の最適化ＦＶＩＩＩポリヌクレオチド配列と、例えばアルブミンなどの上記の異種部分の１つをコードする異種ヌクレオチド配列との間に挿入することができる。ペプチドリンカーは、キメラポリペプチド分子に柔軟性を提供することができる。リンカーは典型的には切断されないが、そのような切断が望ましいことがある。一実施形態では、これらのリンカーは、処理の間に除去されない。

【0384】

本開示のキメラタンパク質中に存在することができるタイプのリンカーは、切断部位（すなわち、プロテアーゼ切断部位基質、例えば、第ＸＩａ因子、第Ｘａ因子、またはトロンビン切断部位）を含み、その切断部位のＮ末端もしくはＣ末端のいずれかまたは両側に追加のリンカーを含むことができる、プロテアーゼで切断可能なリンカーである。これらの切断可能なリンカーは、本開示の構築物に組み込まれると、異種切断部位を有するキメラ分子を生じる。

【0385】

一実施形態では、本開示の核酸分子によってコードされるＦＶＩＩＩポリペプチドは、単一のポリペプチド鎖に含まれるＦｃ領域を形成するように、ｃｓｃＦｃリンカーを介して連結された２つまたはそれ以上のＦｃドメインもしくはＦｃ部分を含む。ｃｓｃＦｃリンカーは、少なくとも１つの細胞内プロセシング部位、すなわち、細胞内酵素によって切断される部位に隣接している。少なくとも１つの細胞内プロセシング部位でポリペプチドが切断されると、少なくとも２本のポリペプチド鎖を含むポリペプチドが得られる。

【0386】

他のペプチドリンカーを、本開示の構築物において、例えば、ＦＶＩＩＩタンパク質をＦｃ領域に接続するために、場合により使用することができる。本開示との関連で使用し得るいくつかの例示的なリンカーとしては、例えば、下にさらに詳述されるＧｌｙＳｅｒアミノ酸を含むポリペプチドが挙げられる。

【0387】

一実施形態では、ペプチドリンカーは、合成性、すなわち天然に存在しないものである。一実施形態では、ペプチドリンカーは、アミノ酸からなる第１の直鎖状配列を、天然においては連結されていないかまたは自然においては遺伝的に融合されていないアミノ酸からなる第２の直鎖状配列に連結または遺伝的に融合するアミノ酸配列を含むペプチド（またはポリペプチド）（天然に存在し得るか、または存在することができない）を含む。例えば、一実施形態では、ペプチドリンカーは、天然に存在するポリペプチドの改変形態である（例えば、付加、置換または欠失などの突然変異を含む）天然に存在しないポリペプチドを含むことができる。別の実施形態では、ペプチドリンカーは、天然に存在しないアミノ酸を含むことができる。別の実施形態では、ペプチドリンカーは、自然においては存在しない直鎖状配列中に存在する、天然に存在するアミノ酸を含むことができる。さらに別の実施形態では、ペプチドリンカーは、天然に存在するポリペプチド配列を含むことができる。

【0388】

例えば、ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーを使用して、同一のＦｃ部分に融合させ、それによって、ホモ二量体ｓｃＦｃ領域を形成することができる。他の実施形態では、ペプチドリンカーを使用して、異なるＦｃ部分（例えば、野生型Ｆｃ部分およびＦｃ部分バリアント）に融合させ、それによって、ヘテロ二量体ｓｃＦｃ領域を形成することができる。

【0389】

別の実施形態では、ペプチドリンカーは、ｇｌｙ－ｓｅｒリンカーを含むかまたはそれからなる。一実施形態では、ｓｃＦｃまたはｃｓｃＦｃリンカーは、免疫グロブリンヒンジおよびｇｌｙ－ｓｅｒリンカーの少なくとも一部分を含む。本明細書で使用する場合、「ｇｌｙ－ｓｅｒリンカー」という用語は、グリシン残基およびセリン残基からなるペプチドを指す。ある特定の実施形態では、前記ｇｌｙ－ｓｅｒリンカーは、ペプチドリンカーの２つの他の配列の間に挿入することができる。他の実施形態では、ｇｌｙ－ｓｅｒリンカーは、ペプチドリンカーの別の配列の一端または両端に結合する。また他の実施形態では、２つまたはそれ以上のｇｌｙ－ｓｅｒリンカーは、ペプチドリンカーに直列に組み込まれる。一実施形態では、本開示のペプチドリンカーは、ヒンジ領域（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４分子に由来する）上流の少なくとも一部、ヒンジ領域（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４分子に由来する）中央の少なくとも一部、および一連のｇｌｙ／ｓｅｒアミノ酸残基を含む。

【0390】

本開示のペプチドリンカーは、少なくとも１アミノ酸長であり、様々な長さであり得る。一実施形態では、本開示のペプチドリンカーは、約１～約５０アミノ酸長である。この文脈で使用する場合、「約」という用語は、＋／－２個のアミノ酸残基を示す。リンカー長は、正の整数でなければならないため、約１～約５０アミノ酸長の長さは、１～３から４８～５２アミノ酸長の長さを意味する。別の実施形態では、本開示のペプチドリンカーは、約１０～約２０アミノ酸長である。別の実施形態では、本開示のペプチドリンカーは、約１５～約５０アミノ酸長である。別の実施形態では、本開示のペプチドリンカーは、約２０～約４５アミノ酸長である。別の実施形態では、本開示のペプチドリンカーは、約１５～約３５または約２０～約３０アミノ酸長である。別の実施形態では、本開示のペプチドリンカーは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１０００または２０００アミノ酸長である。一実施形態では、本開示のペプチドリンカーは、２０または３０アミノ酸長である。

【0391】

一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、または少なくとも１００個のアミノ酸を含むことができる。他の実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも２００個、少なくとも３００個、少なくとも４００個、少なくとも５００個、少なくとも６００個、少なくとも７００個、少なくとも８００個、少なくとも９００個、または少なくとも１０００個のアミノ酸を含むことができる。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも約１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、１０００個、１１００個、１２００個、１３００個、１４００個、１５００個、１６００個、１７００個、１８００個、１９００個、または２０００個のアミノ酸を含むことができる。ペプチドリンカーは、１～５個のアミノ酸、１～１０個のアミノ酸、１～２０個のアミノ酸、１０～５０個のアミノ酸、５０～１００個のアミノ酸、１００～２００個のアミノ酸、２００～３００個のアミノ酸、３００～４００個のアミノ酸、４００～５００個のアミノ酸、５００～６００個のアミノ酸、６００～７００個のアミノ酸、７００～８００個のアミノ酸、８００～９００個のアミノ酸、または９００～１０００個のアミノ酸を含むことができる。

【0392】

ペプチドリンカーは、当技術分野で公知の技法を使用して、ポリペプチド配列に導入することができる。改変は、ＤＮＡ配列解析によって確認することができる。プラスミドＤＮＡを使用して、産生されるポリペプチドが安定して産生されるように宿主細胞を形質転換することができる。

【0393】

Ｂ．３．ｍ．単量体－二量体ハイブリッド
一部の実施形態では、異種ヌクレオチド配列をさらに含む本開示の単離された核酸分子は、ＦＶＩＩＩを含む単量体－二量体ハイブリッド分子をコードする。

【0394】

本明細書で使用される「単量体－二量体ハイブリッド」という用語は、ジスルフィド結合によって互いに会合する第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖を含むキメラタンパク質を指し、第１の鎖は、第ＶＩＩＩ因子および第１のＦｃ領域を含み、第２の鎖は、ＦＶＩＩＩを含まない第２のＦｃ領域を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。よって、単量体－二量体ハイブリッド構築物は、１つの凝固因子のみを有する単量体の態様、および２つのＦｃ領域を有する二量体の態様を含むハイブリッドである。

【0395】

Ｂ．３．ｎ．発現制御エレメント
一部の実施形態では、本開示の核酸分子またはベクターは、少なくとも１つの発現制御配列をさらに含む。発現制御配列は、本明細書で使用する場合、プロモーター配列またはプロモーターとエンハンサーの組合せなどの任意の調節ヌクレオチド配列であって、その配列が作動可能に連結するコード核酸の効率的な転写と翻訳を促進する配列である。例えば、本開示の単離された核酸分子は、少なくとも１つの転写制御配列に作動可能に連結される。

【0396】

遺伝子発現制御配列は、例えば、哺乳動物またはウイルスのプロモーター、例えば構成的または誘導可能なプロモーターであってよい。哺乳動物の構成的プロモーターとしては、以下の遺伝子に関するプロモーター：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルベートキナーゼ、ベータアクチンプロモーター、および他の構成的プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。真核細胞において構成的に機能する例示的なウイルスプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス（例えば、ＳＶ４０）、パピローマウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ラウス肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルスの長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）、および他のレトロウイルスからのプロモーター、ならびに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターが挙げられる。

【0397】

他の構成的プロモーターは、当業者に知られている。本開示の遺伝子発現配列として有用なプロモーターとして、誘導性プロモーターも挙げられる。誘導性プロモーターは、誘導剤の存在下で発現する。例えば、メタロチオネインプロモーターは、ある特定の金属イオンの存在下で、転写および翻訳を促進するように誘導される。他の誘導性プロモーターは、当業者に知られている。

【0398】

一実施形態では、本開示は、組織特異的プロモーターおよび／またはエンハンサーの制御下で、導入遺伝子を発現させることを含む。別の実施形態では、プロモーターまたは他の発現制御配列は、肝細胞における導入遺伝子の発現を選択的に増強する。肝特異的プロモーターの例として、マウスチレチンプロモーター（ｍＴＴＲ）、内因性ヒト第ＶＩＩＩ因子プロモーター（Ｆ８）、ヒトアルファ１－アンチトリプシンプロモーター（ｈＡＡＴ）、ヒトアルブミン最小プロモーター、およびマウスアルブミンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、プロモーターは、ｍＴＴＲプロモーターを含む。ｍＴＴＲプロモーターは、Ｒ．Ｈ．Ｃｏｓｔａら、１９８６年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：４６９７頁に記載されている。Ｆ８プロモーターは、ＦｉｇｕｅｉｒｅｄｏおよびＢｒｏｗｎｌｅｅ、１９９５年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１１８２８～１１８３８頁に記載されている。

【0399】

１つまたはそれ以上のエンハンサーを使用して、発現レベルをさらに高めて、治療効能を達成することができる。１つまたはそれ以上のエンハンサーは、単独でまたは１つまたはそれ以上のプロモーターエレメントと一緒に提供することができる。典型的には、発現制御配列は、複数のエンハンサーエレメントおよび組織特異的プロモーターを含む。一実施形態では、エンハンサーは、α１－ミクログロブリン／ビクニンエンハンサーの１つまたはそれ以上の複製を含む（Ｒｏｕｅｔら、１９９２年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２０７６５～２０７７３頁；Ｒｏｕｅｔら、１９９５年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：３９５～４０４頁；Ｒｏｕｅｔら、１９９８年、Ｂｉｏｃｈ ｅｍ．Ｊ．３３４：５７７～５８４頁；Ｉｌｌら、１９９７年、Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａ ｇｕｌａｔｉｏｎ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ８：Ｓ２３～Ｓ３０頁）。別の実施形態では、エンハンサーは、ＥＢＰ、ＤＢＰ、ＨＮＦ１、ＨＮＦ３、ＨＮＦ４、ＨＮＦ６のような肝特異的転写因子結合部位に由来し、Ｅｎｈ１は、ＨＮＦ１、（センス）－ＨＮＦ３、（センス）－ＨＮＦ４、（アンチセンス）－ＨＮＦ１、（アンチセンス）－ＨＮＦ６、（センス）－ＥＢＰ、（アンチセンス）－ＨＮＦ４（アンチセンス）を含む。

【0400】

特定の一例では、本開示のために有用なプロモーターは、配列番号６３（すなわち、ＥＴプロモーター）を含み、この配列はＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＹ６６１２６５としても公知である。Ｖｉｇｎａら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １１（５）：７６３頁（２００５年）も参照のこと。他の好適なベクターおよび遺伝子調節エレメントの例は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、ＷＯ０２／０９２１３４、ＥＰ１３９５２９３、または米国特許第６，８０８，９０５号、同第７，７４５，１７９号、もしくは同第７，１７９，９０３号に記載されている。

【0401】

一般に、発現制御配列は、必要に応じて、それぞれ転写および翻訳の開始に関与する５’非転写および５’非翻訳配列、例えば、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などを含むものとする。特に、そのような５’非転写配列は、作動可能に連結されたコード核酸の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含む。遺伝子発現配列は、場合により、所望に応じたエンハンサー配列または上流の活性化因子配列を含む。

【実施例1】

【0402】

組換えレンチウイルスベクター（ＬＶ）調製物
レンチウイルスベクター医薬製品の安定性を、様々なストレス条件（例えば、凍結および解凍（Ｆ／Ｔ）、高温（３７℃）、撹拌）へのベクターの曝露、および経時的な変化のモニタリングによって判定した。安定性を判定する方法には以下を含めた：機能的力価に関するｄｄＰＣＲ、ｐ２４濃度に関するｐ２４ ＥＬＩＳＡ、ならびに粒子径分布および粒子濃度に関するＮａｎｏＳｉｇｈｔ。機能的力価は、ＬＶを細胞とインキュベートして細胞ゲノム中に組み込ませ、抽出し、ＤＮＡをｄｄＰＣＲによって測定する、細胞ベースのアッセイ（ＨＥＫ２９３）である。ＥＬＩＳＡベースのｐ２４法は、ウイルスカプシドタンパク質ｐ２４を測定して総粒子濃度と関連付ける、キットベースの方法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。ＮａｎｏＳｉｇｈｔは、粒子のブラウン運動を使用して、溶液中のＬＶ粒子のサイズおよび濃度を評価する方法である。

【0403】

機能的力価は用量を規定するパラメーターであり、重要な尺度である。これは、ＬＶが安定であり、そのためそのペイロードを細胞に組み込むことができるか否かに関する情報（薬物の安定性および作用機序に関連する）を提供する。機能的力価は、用量を規定する基準である。

【0404】

ベクターの作製および測定
ＶＳＶ－シュードタイプ化第三世代レンチウイルスベクター（ＬＶ）を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞への一過性の４プラスミドコトランスフェクションによって作製し、ＯＸＢ社への特許（米国特許第９，１６９，４９１ Ｂ２号）に記載された通りに、陰イオン交換によって精製した。ベクター粒子をまず機能的力価およびＨＩＶ－Ｉ ｇａｇ ｐ２４抗原イムノキャプチャー（ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）によって分析して、適正なトランスフェクション、産生および精製収量であることを確かめた。濃縮ベクター発現力価または機能的力価は、すべてのベクターについて１～１０Ｅ８ ＴＵ／ｍＬ形質導入単位^２９３Ｔ（ＴＵ）／ｍｌであった。

【0405】

細胞培養
付着性ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にレンチベクターによる形質導入を行うことによって、機能的力価を測定した。細胞を３回分割し、続いてゲノムＤＮＡ単離のために採取した。ＬＶの組込みを、レンチベクター特異的プライマーおよびプローブを使用するドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）により、ゲノムＤＮＡにおいて測定した。ＨＥＫ２９３Ｔ付着細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ）ならびにペニシリン－ストレプトマイシンおよびグルタミンの組合せを添加したイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ；Ｇｉｂｃｏ）中で維持した。

【0406】

ＬＶのビヒクル中への処理（製剤化）
精製後にＬＶ材料（原体‐ＤＳ）をプールし、ホローファイバー膜を使用して、緩衝液を各々の製剤化緩衝液に交換した。まずＤＳをおよそ１０倍に濃縮し、続いて濃縮ＤＳの６倍容積の各々の製剤化緩衝液に交換した（例えば、１ｍＬの濃縮ＤＳごとに緩衝液６ｍＬ）。最終的な製剤化されたＬＶを医薬製品（ＤＰ）と考えて、安定性に関して試験した。図７Ａ～図７Ｂおよび図８Ａ～図８Ｂは、ビヒクルＴＳＳＭ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１％（ｗ／ｖ）スクロース、１％（ｗ／ｖ）マンニトール、ｐＨ ７．３）からリン酸ビヒクル（製剤１）（１０ｍＭリン酸塩、１００ｍＭ ＮａＣｌ、３％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｐ１８８、ｐＨ ７．３）に再処理した時の製剤の特性決定を示している。ＴＳＳＭのほかに、本明細書で試験した代替的製剤は４つあった：製剤２（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ＨｉｇｈｅｒＳａｌｔ）。１０ｍＭリン酸塩、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、１％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｐ１８８、ｐＨ ７．３；製剤３（ヒスチジン）。２０ｍＭヒスチジン、１００ｍＭ ＮａＣｌ、３％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｐ１８８、ｐＨ ６．５；製剤４（リン酸塩 ｐＨ ７．０）。１０ｍＭリン酸塩、１００ｍＭ ＮａＣｌ、３％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｐ１８８、ｐＨ ７．０；製剤５（ヒスチジン ｐＨ ７．０）。２０ｍＭヒスチジン、１００ｍＭ ＮａＣｌ、３％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｐ１８８、ｐＨ ７．０。

【実施例2】

【0407】

レンチウイルスベクター（ＬＶ）調製物のインビボ投与
５週齢のＣＤ－１マウスおよびＣ５７ＢＬ６マウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から購入し、特定病原体除去条件下で保った。６匹の雄性ＨｅｍＡマウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ社で飼育されている本発明者らのコロニーから入手した。ベクター＋ビヒクルまたはビヒクルのみの投与は、マウスにおける尾静脈注射または側頭静脈注射によって実施した。動物の処置はすべて、Ｂｉｏｖｅｒａｔｉｖ社／Ｓａｎｏｆｉ社のＩＡＣＵＣによって承認されたプロトコール（動物プロトコール５４７）に従って行った。３種類の製剤を試験した：（１）２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１％（ｗ／ｖ）スクロース、１％（ｗ／ｖ）マンニトール、ｐＨ ７．３（ＴＳＳＭ）；（２）１０ｍＭリン酸塩、１００ｍＭ ＮａＣｌ、３％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｐ１８８、ｐＨ ７．３（リン酸塩）；および（３）２０ｍＭヒスチジン、１００ｍＭ ＮａＣｌ、３％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｐ１８８、ｐＨ ６．５（ヒスチジン）（表４）。

【0408】

【表4】

【0409】

製剤：ビヒクル（ＴＳＳＭ）のみ、およびＬＶを有するビヒクル（ＴＳＳＭ）
ＬＶ－ｃｏＦＩＸの用量反応試験を、Ｃ５７ＢＬ６およびＣＤ－１成体マウスにおいて単回静脈内投与後に実施した。１１匹の雄性Ｃ５７ＢＬ６マウス（５週齢）および１１匹の雄性ＣＤ－１マウス（５週齢）を使用した。投与した用量は以下の通りである：６Ｅ１０（ｎ＝３）、２Ｅ１０（ｎ＝４）、および７．５Ｅ９（ｎ＝４）ＴＵ／ｋｇ。製剤ビヒクルはＴＳＳＭ緩衝液とした。

【0410】

Ｃ５７ＢＬ６マウスおよびＣＤ－１マウスに、ＴＳＳＭ緩衝液中に製剤化したＬＶ－ＦＩＸベクターを投与した。６Ｅ１０ ＴＵ／ｋｇの用量は、希釈せずにそのまま１３．３～１５ｍｌ／ｋｇを投与した。より低い他の２つの用量は、投与前にＰＢＳで希釈した。各系統のマウス３匹に高用量を投与した。Ｃ５７ＢＬ６マウス１匹は、６Ｅ１０ ＴＵ／ｋｇ用量の注射後直ちに心停止に至って死亡した。この群の他のマウスは約３０分後に有害作用を呈した。過度のグルーミングに続き、被毛の粗さ、気力低下、および不活動が観察された。これらのマウスは注射後数時間で回復したように見えた。高用量（６Ｅ１０ ＴＵ／ｋｇ）群のマウスのみが有害作用を示した。希釈用量を投与されたマウスは有害作用を全く示さなかった。その後に、ＣＤ－１マウスの２匹およびＣ５７ＢＬ６マウスの２匹に、ＴＳＳＭビヒクル製剤化緩衝液のみを１０～１５ｍｌ／ｋｇ投与した。これらのマウスも注射後に有害作用（過度のグルーミング、その後の被毛の粗さ、気力低下、および不活動）を呈したが、約１時間後に正常化した。結果を表４にまとめた。

【0411】

製剤：ビヒクル（リン酸塩）のみ
ＨｅｍＡマウスを用いて用量反応試験を実施した。３匹の雄性ＨｅｍＡマウス（９週齢）を使用した。投与する用量は１５ｍｌ／ｋｇとした。製剤化ビヒクルはリン酸緩衝液とした。

【0412】

インビボ有害作用の試験のために、３匹のＨｅｍＡマウスに１５ｍｌ／ｋｇのリン酸製剤化緩衝液を投与した。以後２日間にわたってマウスを詳細に観察した。ＴＳＳＭ製剤化緩衝液で認められた、過度のグルーミング、被毛の粗さ、気力低下、および不活動を含む有害作用は認められなかった。

【0413】

製剤：ＬＶを有するビヒクル（リン酸塩）
ＬＶ－ｃｏＦＶＩＩＩ－６ＸＴＥＮを使用する用量反応試験を、ＨｅｍＡ仔マウスにおいて側頭静脈注射によって実施した。２２匹の雄性および雌性ＨｅｍＡ仔マウス（２日齢）を使用した。投与した用量は以下の通りである：３Ｅ９および１．５Ｅ９ ＴＵ／ｋｇ。製剤化ビヒクルはリン酸緩衝液とした。

【0414】

２日齢マウスに対して、リン酸緩衝液中に製剤化したＬＶ－ＦＶＩＩＩＸＴＥＮを、３Ｅ９または１．５Ｅ９ ＴＵ／ｋｇで側頭静脈注射によって投与した。高用量（３Ｅ９）は希釈せずに投与した。これらのマウスでは注射後に有害作用は認められなかった。

【0415】

製剤：ビヒクル（ヒスチジン）のみ
ＨｅｍＡマウスを使用して用量反応試験を実施した。３匹の雄性ＨｅｍＡマウス（１９週齢）を使用した。投与する用量は１５ｍｌ／ｋｇとした。製剤化ビヒクルはヒスチジン緩衝液とした。

【0416】

インビボ有害作用の試験のために、３匹のＨｅｍＡマウスに１５ｍｌ／ｋｇのヒスチジン製剤化緩衝液を投与した。以後２日間にわたってマウスを詳細に観察した。ＴＳＳＭ製剤化緩衝液で認められた、過度のグルーミング、被毛の粗さ、気力低下、および不活動を含む有害作用は認められなかった。

【0417】

製剤：ＬＶを有するビヒクル（ヒスチジン）
ＬＶ－ｃｏＦＶＩＩＩ－６ＸＴＥＮを使用する用量反応試験を、寛容化した成体ＨｅｍＡマウスにおいて尾静脈注射によって実施した。４匹の雄性ＨＦ８マウス（１２週齢）を使用した。投与する用量は１５ｍｌ／ｋｇとした。製剤化ビヒクルはヒスチジン緩衝液とした。

【0418】

４匹の寛容化ＨｅｍＡマウス（ＨＦ８）に対して、ヒスチジン製剤化緩衝液中に製剤化したＬＶ－ＦＶＩＩＩＸＴＥＮベクターを１５ｍｌ／ｋｇ投与した。ＴＳＳＭ製剤で認められた、過度のグルーミング、被毛の粗さ、気力低下、および不活動を含む有害作用は認められなかった。

【0419】

以上をまとめると、製剤の各々について、マウスにベクター＋ビヒクルまたはビヒクルのみを注射した。表４は、ＴＳＳＭ注射はベクター＋ビヒクルおよびビヒクルのみの両方で、１匹の死亡を含め、マウスに有害な毒性作用を及ぼしたことを示している。その反対に、リン酸製剤およびヒスチジン製剤は、ベクター＋ビヒクルもビヒクルのみも、マウスにおける反応（毒性作用）を生じさせなかった。

【実施例3】

【0420】

ビヒクルＴＳＳＭを使用する製剤の試験
撹拌、凍結－解凍、および温度の条件
最終濃度１％（ｗ／ｖ）Ｐ１８８での１％（ｗ／ｖ）Ｐ１８８の添加を伴うかまたは伴わない、ＴＳＳＭ製剤（ベクター＋ビヒクル）の安定性を、製剤を撹拌、凍結－解凍（Ｆ／Ｔ）サイクル（５回および１０回）、および６時間の室温インキュベーションに供することによって試験した（図３Ａ～図３Ｂ、図４、図５Ａ～図５Ｂ、表５）。ベクターの安定性は、機能的力価、ｐ２４濃度、ならびに粒子径および分布（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ）を決定することによって測定した。図３Ａ～図３Ｂ、図４、図５Ａ～図５Ｂ、および表５に示すように、Ｐ１８８の存在下および非存在下で、製剤に対する種々の条件下でベクター安定性の有意な変化はみられなかった。ベクターの完全性は、ＮａｎｏＳｉｇｈｔを使用する粒子径測定によって判定した。

【0421】

【表5】

【0422】

希釈条件
ＴＳＳＭ製剤（ベクター＋ビヒクル）を１倍、２０倍、および１００倍に希釈し、３７℃でインキュベートした上で、第０日、第３日、第７日および第１４日にｄｄＰＣＲを介した機能的力価の測定によって安定性を判定した。図６Ａおよび図６Ｂは、希釈が高温での２週間にわたる安定性に影響を及ぼさなかったことを示している。

【0423】

種々の期間にわたるインキュベーション
ＴＳＳＭ製剤（ベクター＋ビヒクル）を、３７℃で０日、３日間、７日間、または１４日間インキュベートした。ｄｄＰＣＲを介した機能的力価の決定によって安定性を測定し、一方、粒子完全性（粒子濃度）についてはＮａｎｏｓｉｇｈｔまたはｐ２４ ＥＬＩＳＡを使用して測定した。図７Ａ～図７Ｂおよび図８Ａ～図８Ｂに示すように、インキュベーション時間に応じた安定性およびベクター完全性（粒子濃度）を判定した。ベクター安定性はインキュベーション時間が長くなると低下し、一方、粒子濃度は増加した。

【0424】

３７℃での長時間インキュベーション
ＴＳＳＭ製剤（ベクター＋ビヒクル）を３７℃で０日、３日間、１週間、または２週間インキュベートした。Ｎａｎｏｓｉｇｈｔを使用して粒子径分布を測定した。図７Ａ～図７Ｂおよび図８Ａ～図８Ｂに示すように、インキュベーション時間が長くなると、粒子径分布の幅が広くなり、一方、粒子濃度は増加した。これらの結果は以下のように説明し得る。総粒子濃度が増加するとともに感染性は低下するが、これは３７℃の温度への長期曝露がカプシドの崩壊を引き起こし、ＥＬＩＳＡで測定される見かけのｐ２４の増加をもたらすためである。その上、ウイルス崩壊はより小径の種の増加にもつながる。

【実施例4】

【0425】

リン酸ビヒクルおよびヒスチジンを使用した製剤の試験
リン酸製剤
レンチウイルスベクター（ＬＶ）製剤を、リン酸ビヒクル（１０ｍＭリン酸塩、１００ｍＭ ＮａＣｌ、３％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｐ１８８、ｐＨ ７．３）中への処理後に特性決定した。Ｎａｎｏｓｉｇｈｔを使用して粒子径および分布を測定した（図１）。図１は、Ｎａｎｏｓｉｇｈｔによる結果を示すプロットであり、原体（ＤＳ）プールの明瞭な単量体ピークを示すが、最終的なビヒクル緩衝液中への限外濾過／透析濾過の後（タンジェンシャルフロー濾過－ＴＦＦの後）には、より大きな一部の粒子の存在の様相を伴って、より大きな粒子径の方に幾分移行する。理論に拘束されるわけではないが、これは材料を処理するストレスの間の粒子の物理的分解に起因する可能性がある。０．２２μｍサイズのフィルター膜を通して濾過した最終的な医薬製品（ＤＰ）では、粒子径および粒子分布プロファイルが、処理開始時のＤＳプールに一致するように復帰する。ＴＦＦストレスは、図２Ａ～図２Ｂの写真に画像として示されている。

【0426】

リン酸製剤（ベクター＋ビヒクル）について、ベクターの安定性を、撹拌、３７℃でのインキュベーション、持続時間および希釈を含む、種々の条件下で試験した（図９および図１０Ａ～図１０Ｂ）。

【0427】

図１０Ａ～図１０Ｂは、３７℃での１週間にわたるリン酸緩衝液に関するＮａｎｏＳｉｇｈｔのサイズデータを示している。インキュベーション時間に伴って、より高分子量の種がわずかに増加し、それとともに総粒子数が全体的に減少している。このデータは、ＲＴまたは３７℃での安定性の経過を通じて図９に示された機能的力価の損失が、図１０Ａ～図１０Ｂに観察される粒子の物理的損失に対応する可能性を示唆する。

【0428】

臨床投与時の典型的な注入場面の過程におけるリン酸製剤の安定性を判定する目的で、模擬実用試験を行った。ＬＶＶ材料をリン酸ビヒクルで希釈して、空のＩＶバッグに注入した。室温で６時間かけてデータを収集した、図１３。安定性試験からは機能的力価およびｐ２４の損失の徴候は示されず、このことはベクターが試験期間にわたって安定であったことを示す。

【0429】

予期される容器閉鎖システムとの適合性を検討するために、Ｓｃｈｏｔｔ １型ガラス製バイアルおよびＷｅｓｔ ＣＺ ＣＯＰバイアルにおけるベクターおよびリン酸ビヒクルの安定性を調べるための試験を行った（図１４、図１５、および図１６Ａ～図１６Ｃ）。このデータは、１型バイアルおよびＣＺバイアルのいずれにおいても、ビヒクルのみで処理した場合には有意な粒子が生成されなかったことを示す、図１４。凍結および解凍の際にバイアルに加わる歪みを判定するために、歪みゲージをガラス製バイアルに接着固定し、－８０℃フリーザーに入れて２時間置き、その後に３７℃水浴で急速に温めた、図１５。この試験では、バイアルに測定可能な明確な歪みは示されず、このことは、特定のバイアルを損傷させることが文献で示されている、５ｍＬというこの比較的多い充填容積で、リン酸製剤が容器に高度のストレスを与えなかったことを示唆する。図１６Ａ～図１６Ｃに示すように、ＬＶＶ材料を各々の容器との適合性についても検討した。形質導入力価（図１６Ａ）、ｐ２４（図１６Ｂ）、および粒子濃度（図１６Ｃ）の各試験を通じて、ガラス製およびプラスチック製バイアルの両方の容器閉鎖形式との適合性を示す、ベクターの比較上の安定性および完全性が認められた。

【0430】

リン酸製剤とヒスチジン製剤の比較
リン酸製剤（製剤１および製剤２）およびヒスチジン製剤（製剤３）（ベクター＋ビヒクル）について、種々のストレス条件下でのベクター安定性を検討した（図１１Ａ～図１１Ｂ、図１２Ａ～図１２Ｂ）。凍結－解凍サイクル試験では、リン酸製剤では両方とも、サイクルの繰り返しに応じた機能的力価の低下が観察された。対照的に、ヒスチジン製剤は機能低下を示さず、安定に保たれた。室温保持および撹拌のストレス条件下では、リン酸製剤は高レベルの機能低下を示した（定量限界まで低下）。驚いたことに、ヒスチジン製剤は、室温での３日間のインキュベーションによっても３日間の撹拌によっても影響を受けないままであった。さらに、リン酸製剤に対する塩化ナトリウムの追加およびスクロースの減少（製剤１と製剤２の比較）は、ベクター安定性に影響を及ぼさなかった。

【0431】

材料の別の調製物において、図１１Ａ～図１１Ｂにおける安定性試験の再試験を繰り返して図１７に報告した。機能的力価の損失はリン酸製剤の場合ほど激しくはないが、傾向はヒスチジン製剤とリン酸製剤との間で一貫していた。

【0432】

９カ月間の過程にわたる凍結（－８０℃）、安定性試験で、リン酸製剤１およびヒスチジン製剤３の両方の緩衝液は、安定したＬＶＶ ＤＰを可能にするようであった、図１８。機能的力価に基づけば、このデータは、アッセイ変動の範囲内で、－８０℃での貯蔵にわたって材料の損失がなかったことを示唆する。

【0433】

最後に、緩衝液のみ（リン酸およびヒスチジン）の影響を評価する目的で、２つの製剤を同じｐＨである７．０で全く同じように調製した。すなわち、製剤４と製剤５との唯一の違いは、緩衝液構成成分（リン酸またはヒスチジンのいずれか）である。製造工程の状況では、この２つの製剤は、限外濾過および透析濾過（ＴＦＦ）、ならびに最終の無菌濾過を通じて類似の挙動であるようである、表６。

【0434】

【表6】

【0435】

各々の製剤を調製した上で、緩衝液成分を比較するために安定性試験を実施した。図１９Ａ～１９Ｄは、機能的および標準化した機能的力価、ｐ２４および粒子濃度にわたる安定性条件に応じて示された、いずれの製剤のＬＶＶ安定性の間にもわずかな差しかなかったという知見をまとめている。このことは、図１１Ａ～図１１Ｂ、図１２Ａ～図１２Ｂおよび図１３に提示された結果は、安定性のレベルの変化が、緩衝液組成（リン酸またはヒスチジン）ではなく、ｐＨの違い（７．３および６．５）に起因することを反映するようであることを示唆すると思われる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16-1】

【図16-2】

【図17】

【図18】

【図19-1】

【図19-2】

【配列表】

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【国際調査報告】