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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-11-30
(54)【発明の名称】抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20221122BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20221122BHJP
G01N 33/574 20060101ALI20221122BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20221122BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28 ZNA
C12Q1/02
G01N33/574 A
C12N15/13
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022519164
(86)(22)【出願日】2020-09-25
(85)【翻訳文提出日】2022-03-29
(86)【国際出願番号】 EP2020076850
(87)【国際公開番号】W WO2021058718
(87)【国際公開日】2021-04-01
(31)【優先権主張番号】19199834.3
(32)【優先日】2019-09-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＢＲＩＪ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】591003013
【氏名又は名称】エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ－ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100157923
【弁理士】
【氏名又は名称】鶴喰 寿孝
(72)【発明者】
【氏名】カサゴルダ，バルリベラ・ダビド
(72)【発明者】
【氏名】ゲルク，ミヒャエル
(72)【発明者】
【氏名】シュレームル，ミヒャエル
【テーマコード（参考）】
4B063
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B063QA19
4B063QQ08
4B063QQ79
4B063QS33
4B063QX02
4H045AA11
4H045DA76
4H045EA50
(57)【要約】
本発明は、ＣＳＦ－１Ｒ（コロニー刺激因子１受容体）、特にヒトＣＳＦ－１Ｒに結合するモノクローナル抗体又はその断片に関する。本発明は更に、試料中のＣＳＦ－１Ｒの検出のための本発明のモノクローナル抗体又はその断片のｉｎ ｖｉｔｒｏ使用に関する。本発明のモノクローナル抗体又はその断片と、ヒトＣＳＦ－１Ｒポリペプチド等のＣＳＦ－１Ｒとを含む複合体も本発明によって更に包含される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＣＳＦ－１Ｒ（Ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ １ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：コロニー刺激因子１受容体）に結合するモノクローナル抗体又はその断片であって、前記モノクローナル抗体又はその断片が、配列番号２に示される配列を有する軽鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一の軽鎖可変ドメインを含み、前記モノクローナル抗体又はその断片が、配列番号３に示される配列を有する重鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一の重鎖可変ドメインを含む、モノクローナル抗体又はその断片。
【請求項2】
ＣＳＦ１－ＲがヒトＣＳＦ－１Ｒである、請求項１に記載のモノクローナル抗体又はその断片。
【請求項3】
前記モノクローナル抗体又はその断片のエピトープが、配列番号１（ＹＫＮＩＨＬＥＫＫＹ）に示される配列を含む、請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体又はその断片。
【請求項4】
前記エピトープの２つのチロシン残基のうちの少なくとも１つがリン酸化されている、請求項３に記載のモノクローナル抗体又はその断片。
【請求項5】
前記エピトープの両方のチロシン残基がリン酸化されている、請求項４に記載のモノクローナル抗体又はその断片。
【請求項6】
前記モノクローナル抗体又はその断片が、配列番号２に示される配列を有する軽鎖可変ドメインと少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインを含み、且つ／又は前記モノクローナル抗体又はその断片が、配列番号３に示される配列を有する重鎖可変ドメインと少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその断片。
【請求項7】
前記モノクローナル抗体又はその断片が、配列番号２に示される配列を有する軽鎖可変ドメインと少なくとも９５％同一の軽鎖可変ドメインを含み、且つ／又は前記モノクローナル抗体又はその断片が、配列番号３に示される配列を有する重鎖可変ドメインと少なくとも９５％同一の重鎖可変ドメインを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその断片。
【請求項8】
モノクローナル抗体又はその断片であって、（ａ）以下を含む軽鎖可変ドメイン：
（ａ１）配列番号４（ＱＳＳＥＳＶＹＳＮＮＦＬＳ）に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１とは合計３個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ１、
（ａ２）配列番号５（ＥＡＳＫＶＡＳ）に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２とは合計３個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ２、及び／又は
（ａ３）配列番号６（ＡＧＧＹＤＶＳＤＤＡ）に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３とは合計３個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ３、
（ｂ）以下を含む重鎖可変ドメイン：
（ｂ１）配列番号７（ＴＡＳＧＦＳＬＳＲＹＷＭＴ）に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１とは合計３個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失により異なる重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ２）配列番号８（ＲＳＧＮＴＹＦＡＤＷＡＫＧ）に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２とは合計３個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失により異なる重鎖ＣＤＲ２、及び／又は
（ｂ３）配列番号９（ＧＧＱＮＮＧＹＤＬ）に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とは合計３個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失により異なる重鎖ＣＤＲ３、
又は
（ｃ）（ａ）で定義される軽鎖可変ドメインと（ｂ）で定義される重鎖可変ドメインの両方、
を含む、モノクローナル抗体又はその断片。
【請求項9】
前記モノクローナル抗体又はその断片が、（ａ）以下を含む軽鎖可変ドメイン：
（ａ１）配列番号４（ＱＳＳＥＳＶＹＳＮＮＦＬＳ）に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１とは１個以下のアミノ酸の付加、置換又は欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ１、
（ａ２）配列番号５（ＥＡＳＫＶＡＳ）に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２とは１個以下のアミノ酸の付加、置換又は欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ２、及び／又は
（ａ３）配列番号６（ＡＧＧＹＤＶＳＤＤＡ）に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３とは１個以下のアミノ酸の付加、置換又は欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ３、
（ｂ）以下を含む重鎖可変ドメイン：
（ｂ１）配列番号７（ＴＡＳＧＦＳＬＳＲＹＷＭＴ）に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１とは１個以下のアミノ酸の付加、置換又は欠失により異なる重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ２）配列番号８（ＲＳＧＮＴＹＦＡＤＷＡＫＧ）に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２とは１個以下のアミノ酸の付加、置換又は欠失により異なる重鎖ＣＤＲ２、及び／又は
（ｂ３）配列番号９（ＧＧＱＮＮＧＹＤＬ）に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とは１個以下のアミノ酸の付加、置換又は欠失により異なる重鎖ＣＤＲ３、
又は
（ｃ）（ａ）で定義される軽鎖可変ドメインと（ｂ）で定義される重鎖可変ドメインの両方、
を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその断片。
【請求項10】
前記モノクローナル抗体又はその断片が、（ａ）以下を含む軽鎖可変ドメイン：
（ａ１）配列番号４（ＱＳＳＥＳＶＹＳＮＮＦＬＳ）に示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ１と、
（ａ２）配列番号５（ＥＡＳＫＶＡＳ）に示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ２と、
（ａ３）配列番号６（ＡＧＧＹＤＶＳＤＤＡ）に示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
を含み、
（ｂ）以下を含む重鎖可変ドメイン：
（ｂ１）配列番号７（ＴＡＳＧＦＳＬＳＲＹＷＭＴ）に示される配列を有する重鎖ＣＤＲ１と、
（ｂ２）配列番号８（ＲＳＧＮＴＹＦＡＤＷＡＫＧ）に示される配列を有する重鎖ＣＤＲ２と、
（ｂ３）配列番号９（ＧＧＱＮＮＧＹＤＬ）に示される配列を有する重鎖ＣＤＲ３、
を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその断片。
【請求項11】
試料中のＣＳＦ－１Ｒの検出のための、請求項１～１０のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその断片のＩｎ ｖｉｔｒｏ使用。
【請求項12】
（ａ）前記試料ががんの処置のための候補化合物と接触させたものであるか、又は前記試料が前記候補化合物と接触させた対象から得たものであり、（ｂ）前記試料ががん細胞又はがん組織であり、
（ｃ）前記対象がヒト対象等の哺乳動物の対象であり、
（ｄ）前記ＣＳＦ－１Ｒの検出がＣＳＦ－１Ｒの定量的検出であり、且つ／又は
（ｅ）前記ＣＳＦ－１Ｒの検出がＣＳＦ－１Ｒの免疫組織化学的検出である、請求項１１に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ使用。
【請求項13】
試料中のＣＳＦ－１Ｒを検出する方法であって、（ａ）ＣＳＦ－１Ｒを含む試料を、請求項１～１０のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその断片と接触させ、それによってＣＳＦ－１Ｒと前記モノクローナル抗体又はその断片とを含む複合体を形成すること、及び
（ｂ）工程（ａ）で形成された複合体を検出し、それによって前記試料中のＣＳＦ－１Ｒを検出すること、を含む、方法。
【請求項14】
請求項１～１０のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその断片と、ＣＳＦ－１Ｒと、を含む複合体。
【請求項15】
前記ＣＳＦ－１Ｒが、ヒトＣＳＲ－１Ｒの６９９位に対応する位置にリン酸化チロシン残基及び／又はヒトＣＳＲ－１Ｒの７０８位に対応する位置にリン酸化チロシン残基を含む、請求項１１若しくは１２に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ使用、請求項１３に記載の方法、又は請求項１４に記載の複合体。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＣＳＦ－１Ｒ（Ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ １ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：コロニー刺激因子１受容体）、特にヒトＣＳＦ－１Ｒに結合するモノクローナル抗体又はその断片に関する。本発明は更に、試料中のＣＳＦ－１Ｒの検出のための本発明のモノクローナル抗体又はその断片のｉｎ ｖｉｔｒｏ使用に関する。本発明のモノクローナル抗体又はその断片と、ヒトＣＳＦ－１Ｒポリペプチド等のＣＳＦ－１Ｒとを含む複合体も本発明によって更に包含される。
【背景技術】
【0002】
ヒトＣＳＦ－１受容体（ＣＳＦ－１Ｒ；コロニー刺激因子１受容体）は増殖因子であり、ｃ－ｆｍｓがん原遺伝子によってコードされる（例えば、Ｒｏｔｈ，Ｐ．，ａｎｄ Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｅ．Ｒ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８１（１９９２）１４１－１６７において総説される）。
【0003】
現在、ＣＳＦ－１Ｒの細胞外ドメインに結合する２つのＣＳＦ－１Ｒリガンドが知られている。１つ目はＣＳＦ－１（コロニー刺激因子１）であり、ジスルフィド結合ホモ二量体として細胞外に見出される（Ｓｔａｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ １２ Ｓｕｐｐｌ．１（１９９５）１５－２４）。２つ目はＩＬ－３４（Ｈｕｍｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１９（２０１２）１８１０－１８２０）である。ＣＳＦ－１Ｒシグナル伝達の主な生物学的効果は、造血前駆細胞からマクロファージ系株への分化、増殖、遊走、及び生存である。ＣＳＦ－１Ｒの活性化は、そのＣＳＦ－１ＲリガンドであるＣＳＦ－１及びＩＬ－３４によって媒介される。ＣＳＦ－１Ｒに対するＣＳＦ－１の結合は、ホモ二量体の形成及びチロシンリン酸化によるキナーゼの活性化を誘導する（Ｓｔａｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．４６（１９９７）４－１０）。
【0004】
ＣＳＦ－１Ｒは、多くの疾患及び障害に関連している（例えば、Ｃａｎｎａｒｉｌｅ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０１７），Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｃａｎｃｅｒ ５（１）：５３，Ｒｉｅｓ，Ｃ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．（２０１４），Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２５（６）：８４６－８５９を参照されたい）。例えば、ＣＳＦ－１Ｒは、炎症性、がん及び骨の障害の開始において重要な役割を果たす。したがって、多くのＣＳＦ－１Ｒ阻害剤（小分子阻害剤及びモノクローナル抗体等）が記載されており、臨床試験で分析されている（Ｅｌ－Ｇａｍａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．２０１８，６１（１３）：５４５０－５４６６によって総説される）。
【0005】
抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体は、例えば、国際公開第２０１１／１２３３８１号、国際公開第２０１１／１４０２４９号及び国際公開第２０１２／１１０３６０号に開示されている。
【0006】
ＣＳＦ－１受容体の細胞外ドメイン（ＣＳＦ－１Ｒ－ＥＣＤ）は、５つのサブドメイン（Ｄ１～Ｄ５）を含む。生物学的に活性なホモ二量体ＣＳＦ－１は、サブドメインＤ１～Ｄ３内のＣＳＦ－１Ｒに結合する。細胞外ドメインのサブドメインＤ４～Ｄ５は、ＣＳＦ－１結合に関与しない（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３（１９９３）５３４８－５３５９）。サブドメインＤ４は、二量体化に関与している（Ｐｉｘｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４（２００４）６２８－６３８）。
【0007】
多くの治療候補抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体は、ＣＳＦ－１受容体（ＣＳＦ－１Ｒ－ＥＣＤ）の細胞外ドメインに結合する。例えば、国際公開第２００９／０２６３０３号及び国際公開第２００９／１１２２４５号は、細胞外ドメインの最初の３つのサブドメイン（Ｄ１～Ｄ３）内のＣＳＦ－１Ｒに結合する抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体を開示している。国際公開第２０１１／０７００２４号は、二量体化ドメイン（Ｄ４～Ｄ５）内のＣＳＦ－１Ｒに結合する抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体を開示している。
【0008】
ＣＳＦ－１受容体の細胞外ドメインに結合する抗体に加えて、ＣＳＦ－１Ｒキナーゼドメインに結合する抗体等の他のドメインに結合する抗体が記載されている。例えば、ＣＳＦ－１Ｒのリン酸化部位に結合するポリクローナル抗体は、ホスホ－ＣＳＦ１Ｒ（Ｔｙｒ５６１）、ホスホ－ＣＳＦ１Ｒ（Ｔｙｒ６９９）、ホスホ－ＣＳＦ１Ｒ（Ｔｙｒ７０８）、ホスホ－ＣＳＦ１Ｒ（Ｔｙｒ７２３）、ホスホ－ＣＳＦ１Ｒ（Ｔｙｒ８０９）、ホスホ－ＣＳＦ１Ｒ（Ｔｙｒ９２１）等、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから市販されている。ポリクローナル抗体は、免疫原として化学合成されたホスホペプチドを使用することによって生成された。
【0009】
また、ヒトＣＳＦ－１Ｒ受容体タンパク質のＴｙｒ７０８を囲む残基に相当する合成ホスホペプチドでウサギを免疫することによりモノクローナル抗体を作製した。「ホスホ－Ｍ－ＣＳＦ受容体（Ｔｙｒ７０８）（Ｄ５Ｆ４Ｙ）ウサギｍＡｂ＃１４５９１」と呼ばれる抗体は、Ｂｉｏｋｅ（オランダ、ライデン）から市販されている。抗体は、Ｔｙｒ７０８でリン酸化された場合にのみＣＳＦ－１Ｒの内因性レベルを認識するが、ホスホ－Ｓｒｃ等の他の活性化タンパク質チロシンキナーゼと交差反応し得る。したがって、抗体は免疫組織化学（ＩＨＣ）に適していない可能性がある。
【0010】
国際公開第２０１２／１５０３２０号は、抗体の産生のための足場技術を記載している。この文書は、ペプチジル－プロリルシス／トランスイソメラーゼ又はＦＫＢＰドメインファミリーメンバーの１つ以上の断片を含む融合ポリペプチド、及び抗体スクリーニング／選択のための方法におけるその使用、エピトープマッピングのための使用、並びに融合ポリペプチドによって提示される免疫原性ペプチド又は二次構造に特異的に結合する抗体の産生のための免疫原としてのその使用を記載する。国際公開第２０１５／０４４０８３号は、テルムス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳｌｙＤ ＦＫＢＰドメインが抗体を生成するための融合ポリペプチドに適していることを開示している。
【0011】
本発明者らは、ヒトＣＳＦ－１Ｒのキナーゼドメインの断片をテルムス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳｌｙＤ ＦＫＢＰ足場に移植した。作製した融合ポリペプチドを、ウサギにおけるモノクローナル抗体の作製のための免疫原として使用した。抗体は、ＣＳＦ－１Ｒ、特に「１Ｈ１１」と呼ばれる抗体に対して高い抗体／受容体親和性及び特異性を示すことが示された。抗体は優れた免疫組織化学的性能を示したことから、ＣＳＦ－１Ｒを標的とする小分子又は抗体を用いた臨床試験に適用することができた。驚くべきことに、抗体は、天然及び変性ＣＳＦ－１Ｒの両方を検出することができた。
【発明の概要】
【0012】
本発明は、ＣＳＦ－１Ｒ（Ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ １ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：コロニー刺激因子１受容体）、特にヒトＣＳＦ－１Ｒに結合するモノクローナル抗体又はその断片に関する。
【0013】
本発明の一実施形態では、モノクローナル抗体又はその断片は、配列番号２に示される配列を有する軽鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一の軽鎖可変ドメインを含み、且つ／又は当該モノクローナル抗体又はその断片は、配列番号３に示される配列を有する重鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一の重鎖可変ドメインを含む。
【0014】
本発明の一実施形態では、モノクローナル抗体又はその断片は、
（ａ）以下を含む軽鎖可変ドメイン：
（ａ１）配列番号４（ＱＳＳＥＳＶＹＳＮＮＦＬＳ）に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１とは合計３個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ１、
（ａ２）配列番号５（ＥＡＳＫＶＡＳ）に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２とは合計３個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ２、及び／又は
（ａ３）配列番号６（ＡＧＧＹＤＶＳＤＤＡ）に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３とは合計３個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ３、
（ｂ）以下を含む重鎖可変ドメイン：
（ｂ１）配列番号７（ＴＡＳＧＦＳＬＳＲＹＷＭＴ）に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１とは合計３個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失が異なる重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ２）配列番号８（ＲＳＧＮＴＹＦＡＤＷＡＫＧ）に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２とは合計３個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失により異なる重鎖ＣＤＲ２、及び／又は
（ｂ３）配列番号９（ＧＧＱＮＮＧＹＤＬ）に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とは合計３個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失により異なる重鎖ＣＤＲ３、
又は
（ｃ）（ａ）で定義される軽鎖可変ドメインと（ｂ）で定義される重鎖可変ドメインの両方、を含む。
（ａ）以下を含む軽鎖可変ドメイン：
（ａ１）配列番号４（ＱＳＳＥＳＶＹＳＮＮＦＬＳ）に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１とは合計３個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ１、
（ａ２）配列番号５（ＥＡＳＫＶＡＳ）に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２とは合計３個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ２、及び／又は
（ａ３）配列番号６（ＡＧＧＹＤＶＳＤＤＡ）に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３とは合計３個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ３、
（ｂ）以下を含む重鎖可変ドメイン：
（ｂ１）配列番号７（ＴＡＳＧＦＳＬＳＲＹＷＭＴ）に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１とは合計３個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失が異なる重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ２）配列番号８（ＲＳＧＮＴＹＦＡＤＷＡＫＧ）に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２とは合計３個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失により異なる重鎖ＣＤＲ２、及び／又は
（ｂ３）配列番号９（ＧＧＱＮＮＧＹＤＬ）に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とは合計３個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失により異なる重鎖ＣＤＲ３、
又は
（ｃ）（ａ）で定義される軽鎖可変ドメインと（ｂ）で定義される重鎖可変ドメインの両方、を含む。
【0015】
本発明のモノクローナル抗体又はその断片の一実施形態では、モノクローナル抗体又はその断片のエピトープは、配列番号１（ＹＫＮＩＨＬＥＫＫＹ）に示される配列を含む。好ましくは、当該エピトープの２つのチロシン残基のうちの少なくとも１つ、特に両方のチロシン残基がリン酸化される。
【0016】
一実施形態では、モノクローナル抗体又はその断片は、
（ａ）以下を含む軽鎖可変ドメイン：
（ａ１）配列番号４（ＱＳＳＥＳＶＹＳＮＮＦＬＳ）に示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、
（ａ２）配列番号５（ＥＡＳＫＶＡＳ）に示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び
（ａ３）配列番号６（ＡＧＧＹＤＶＳＤＤＡ）に示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
並びに
（ｂ）以下を含む重鎖可変ドメイン：
（ｂ１）配列番号７（ＴＡＳＧＦＳＬＳＲＹＷＭＴ）に示される配列を有する重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ２）配列番号８（ＲＳＧＮＴＹＦＡＤＷＡＫＧ）に示される配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び
（ｂ３）配列番号９（ＧＧＱＮＮＧＹＤＬ）に示される配列を有する重鎖ＣＤＲ３、を含む。
（ａ）以下を含む軽鎖可変ドメイン：
（ａ１）配列番号４（ＱＳＳＥＳＶＹＳＮＮＦＬＳ）に示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、
（ａ２）配列番号５（ＥＡＳＫＶＡＳ）に示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び
（ａ３）配列番号６（ＡＧＧＹＤＶＳＤＤＡ）に示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
並びに
（ｂ）以下を含む重鎖可変ドメイン：
（ｂ１）配列番号７（ＴＡＳＧＦＳＬＳＲＹＷＭＴ）に示される配列を有する重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ２）配列番号８（ＲＳＧＮＴＹＦＡＤＷＡＫＧ）に示される配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び
（ｂ３）配列番号９（ＧＧＱＮＮＧＹＤＬ）に示される配列を有する重鎖ＣＤＲ３、を含む。
【0017】
本発明は更に、試料中のＣＳＦ－１Ｒの検出のための本発明のいずれか１つのモノクローナル抗体又はその断片のｉｎ ｖｉｔｒｏ使用に関する。
【0018】
本発明は更に、試料中のＣＳＦ－１Ｒを検出する方法であって、
（ａ）ＣＳＦ－１Ｒを含む試料を本発明のモノクローナル抗体又はその断片と接触させ、それによってＣＳＦ－１Ｒ及び当該モノクローナル抗体又はその断片を含む複合体を形成すること、並びに
（ｂ）工程（ａ）で形成された複合体を検出し、それによって上記試料中のＣＳＦ－１Ｒを検出すること、を含む方法を企図する。
（ａ）ＣＳＦ－１Ｒを含む試料を本発明のモノクローナル抗体又はその断片と接触させ、それによってＣＳＦ－１Ｒ及び当該モノクローナル抗体又はその断片を含む複合体を形成すること、並びに
（ｂ）工程（ａ）で形成された複合体を検出し、それによって上記試料中のＣＳＦ－１Ｒを検出すること、を含む方法を企図する。
【0019】
本発明は更に、本発明のモノクローナル抗体又はその断片と、ヒトＣＳＦ－１Ｒポリペプチド等のＣＳＦ－１Ｒとを含む複合体を企図する。
図面は以下を示す：
図面は以下を示す：
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】円偏光二色性分析。ＴｔＳｌｙＤ－ＣＳＦ１Ｒ免疫原を用いた温度上昇／下降実験。ＴｔＳｌｙＤ－ＣＳＦ１Ｒは、少なくとも６０℃まで安定であり、冷却すると再構築する。
【図2】加熱／冷却前後の免疫原ＴｔＳｌｙＤ－ＣＳＦ１Ｒの円偏光二色性分析。ＴｔＳｌｙＤ－ＣＳＦ１Ｒは、熱変性後に再構築する。
【図3】溶液中の分析物としての捕捉抗体１Ｈ１１対リン酸化ＴｔＳｌｙＤ－ＣＳＦ１Ｒの濃度依存的動態、分析物濃度のオーバーレイ及びラングミュアフィッティングモデル（黒い直線）を示すＢｉａｃｏｒｅセンサーグラム。親和性ＫＤ ０．２ｎＭ、ｋａ ５．７８Ｅ＋０５ １／Ｍｓ、ｋｄ １．２２Ｅ－０４ １／ｓ。
【図4】溶液中の４つの分析物の３００ｎＭ単一分析物濃度注入のオーバーレイを示すＢｉａｃｏｒｅセンサーグラム。最も高いシグナル振幅は、分析物ＴｔＳｌｙＤ－ＣＳＦ１Ｒ（破線）で見られ、２番目に高いシグナル応答は、分析物ｐＹ７２３リン酸化ペプチドＣＳＦ１Ｒ［７１６－７２９］（太い黒線）で見られた。陰性対照分析物は、バックグラウンド結合シグナルレベルのみを有するＴｔＳｌｙＤｓｈ３及び非リン酸化ペプチドＣＳＦ１Ｒ［７１６－７２９］（灰色）である。抗体１Ｈ１１は、ホスホチロシン特異的エピトープ結合特性を示す。
【図5】ＣｅｌｌｕＳｐｏｔ（商標）エピトープマッピング技術。右：ＣＳＦ－１Ｒ １５－ｍｅｒペプチドを二連で含むスライドガラス。左：ＣＳＦ－１Ｒペプチド配列は、単一アミノ酸コードとして与えられる。ｐＹはリン酸化チロシンを意味する。 配列番号１３：Ｐ－Ｅ－Ｇ－Ｇ－Ｖ－Ｄ－ｐＹ－Ｋ－Ｎ－Ｉ－Ｈ－Ｌ－Ｅ－Ｋ－Ｋ， 配列番号１４：Ｅ－Ｇ－Ｇ－Ｖ－Ｄ－ｐＹ－Ｋ－Ｎ－Ｉ－Ｈ－Ｌ－Ｅ－Ｋ－Ｋ－ｐＹ 配列番号１５：Ｇ－Ｇ－Ｖ－Ｄ－ｐＹ－Ｋ－Ｎ－Ｉ－Ｈ－Ｌ－Ｅ－Ｋ－Ｋ－ｐＹ－Ｖ 配列番号１６：Ｇ－Ｖ－Ｄ－ｐＹ－Ｋ－Ｎ－Ｉ－Ｈ－Ｌ－Ｅ－Ｋ－Ｋ－ｐＹ－Ｖ－Ｒ 配列番号１７：Ｖ－Ｄ－ｐＹ－Ｋ－Ｎ－Ｉ－Ｈ－Ｌ－Ｅ－Ｋ－Ｋ－ｐＹ－Ｖ－Ｒ－Ｒ 配列番号１８：Ｄ－ｐＹ－Ｋ－Ｎ－Ｉ－Ｈ－Ｌ－Ｅ－Ｋ－Ｋ－ｐＹ－Ｖ－Ｒ－Ｒ－Ｄ 配列番号１９：ｐＹ－Ｋ－Ｎ－Ｉ－Ｈ－Ｌ－Ｅ－Ｋ－Ｋ－ｐＹ－Ｖ－Ｒ－Ｒ－Ｄ－Ｓ 配列番号２０：Ｋ－Ｎ－Ｉ－Ｈ－Ｌ－Ｅ－Ｋ－Ｋ－ｐＹ－Ｖ－Ｒ－Ｒ－Ｄ－Ｓ－Ｇ 配列番号２１：Ｎ－Ｉ－Ｈ－Ｌ－Ｅ－Ｋ－Ｋ－ｐＹ－Ｖ－Ｒ－Ｒ－Ｄ－Ｓ－Ｇ－Ｆ ＣＳＦ－１Ｒ配列による単一アミノ酸工程分析によって、１Ｈ１１エピトープ配列を決定した。
【図6】ＩＨＣ二重染色。弱い染色のみを示した本発明の基礎となる研究で単離された他の抗体（図示せず）と比較して、抗体１Ｈ１１は非常に強い染色を示した。
【図7-1】選択された抗体のウエスタンブロット分析。（レーン１：ウエスタン標準；レーン２：ＮＩＨ３Ｔ３ ｗｔ；レーン２ ＮＩＨ３Ｔ３＋ＣＳＦ１Ｋ４；レーン４：ＮＩＨ３Ｔ３＋ＣＳＦ１Ｋ８、レーン５：タンパク質標準）抗体１Ｈ１１は最も強い染色を示し、ブロットを過度に露出した。他の試験された抗体は、弱い染色のみを示した。
【図7-2】選択された抗体のウエスタンブロット分析。（レーン１：ウエスタン標準；レーン２：ＮＩＨ３Ｔ３ ｗｔ；レーン２ ＮＩＨ３Ｔ３＋ＣＳＦ１Ｋ４；レーン４：ＮＩＨ３Ｔ３＋ＣＳＦ１Ｋ８、レーン５：タンパク質標準）抗体１Ｈ１１は最も強い染色を示し、ブロットを過度に露出した。他の試験された抗体は、弱い染色のみを示した。
【発明を実施するための形態】
【0021】
上記のように、本発明は、ＣＳＦ－１Ｒ（Ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ １ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：コロニー刺激因子１受容体）、特にヒトＣＳＦ－１Ｒに結合するモノクローナル抗体又はその断片に関する。
【0022】
ＣＳＦ－１Ｒは、受容体チロシンキナーゼのクラスＩＩＩサブファミリーに属するポリペプチドであり、ｃ－ｆｍｓがん原遺伝子によってコードされる。ＣＳＦ－１Ｒの同義語は、Ｍ－ＣＳＦ受容体であるマクロファージコロニー刺激因子１受容体、Ｆｍｓがん原遺伝子及びｃ－ｆｍｓである。ＣＳＦ－１又はＩＬ－３４の結合は、受容体二量体化を誘導し、続いて自己リン酸化及び下流のシグナル伝達カスケードの活性化を誘導する。ＣＳＦ－ＩＲの活性化は、単球及びマクロファージの生存、増殖及び分化を調節する（Ｘｉｏｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８６（２０１１）９５２－９６０）。好ましくは、本発明のモノクローナル抗体（又はその抗原結合断片）は、ヒトＣＳＦ－１Ｒポリペプチドに結合する。ヒトＣＳＦ－ＩＲは、１９８６年以来知られている（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ３２０（１９８６）２７７－２８０）。受容体のクローニングは、Ｒｏｕｓｓｅｌ，Ｍ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２５（１９８７）５４９－５５２に初めて記載された。ＣＳＦ－１Ｒは、一本鎖膜貫通受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）であり、受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）内の５つの反復Ｉｇ様サブドメインＤ１～Ｄ５を特徴とするＲＴＫを含有する免疫グロブリン（Ｉｇ）モチーフのファミリーのメンバーである（Ｗａｎｇ，Ｚ．，ｅｔ ａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３（１９９３）５３４８－５３５９）。ＣＳＦ－１Ｒの細胞内ドメインは、とりわけ、ＣＳＦ－１Ｒのキナーゼドメインを含む。
【0023】
完全長ヒトＣＳＦ－１Ｒのアミノ酸配列は以下の通りである（配列番号１０）：
ＭＧＰＧＶＬＬＬＬＬＶＡＴＡＷＨＧＱＧＩＰＶＩＥＰＳＶＰＥＬＶＶＫＰＧＡＴＶＴＬＲＣＶＧＮＧＳＶＥＷＤＧＰＰＳＰＨＷＴＬＹＳＤＧＳＳＳＩＬＳＴＮＮＡＴＦＱＮＴＧＴＹＲＣＴＥＰＧＤＰＬＧＧＳＡＡＩＨＬＹＶＫＤＰＡＲＰＷＮＶＬＡＱＥＶＶＶＦＥＤＱＤＡＬＬＰＣＬＬＴＤＰＶＬＥＡＧＶＳＬＶＲＶＲＧＲＰＬＭＲＨＴＮＹＳＦＳＰＷＨＧＦＴＩＨＲＡＫＦＩＱＳＱＤＹＱＣＳＡＬＭＧＧＲＫＶＭＳＩＳＩＲＬＫＶＱＫＶＩＰＧＰＰＡＬＴＬＶＰＡＥＬＶＲＩＲＧＥＡＡＱＩＶＣＳＡＳＳＶＤＶＮＦＤＶＦＬＱＨＮＮＴＫＬＡＩＰＱＱＳＤＦＨＮＮＲＹＱＫＶＬＴＬＮＬＤＱＶＤＦＱＨＡＧＮＹＳＣＶＡＳＮＶＱＧＫＨＳＴＳＭＦＦＲＶＶＥＳＡＹＬＮＬＳＳＥＱＮＬＩＱＥＶＴＶＧＥＧＬＮＬＫＶＭＶＥＡＹＰＧＬＱＧＦＮＷＴＹＬＧＰＦＳＤＨＱＰＥＰＫＬＡＮＡＴＴＫＤＴＹＲＨＴＦＴＬＳＬＰＲＬＫＰＳＥＡＧＲＹＳＦＬＡＲＮＰＧＧＷＲＡＬＴＦＥＬＴＬＲＹＰＰＥＶＳＶＩＷＴＦＩＮＧＳＧＴＬＬＣＡＡＳＧＹＰＱＰＮＶＴＷＬＱＣＳＧＨＴＤＲＣＤＥＡＱＶＬＱＶＷＤＤＰＹＰＥＶＬＳＱＥＰＦＨＫＶＴＶＱＳＬＬＴＶＥＴＬＥＨＮＱＴＹＥＣＲＡＨＮＳＶＧＳＧＳＷＡＦＩＰＩＳＡＧＡＨＴＨＰＰＤＥＦＬＦＴＰＶＶＶＡＣＭＳＩＭＡＬＬＬＬＬＬＬＬＬＬＹＫＹＫＱＫＰＫＹＱＶＲＷＫＩＩＥＳＹＥＧＮＳＹＴＦＩＤＰＴＱＬＰＹＮＥＫＷＥＦＰＲＮＮＬＱＦＧＫＴＬＧＡＧＡＦＧＫＶＶＥＡＴＡＦＧＬＧＫＥＤＡＶＬＫＶＡＶＫＭＬＫＳＴＡＨＡＤＥＫＥＡＬＭＳＥＬＫＩＭＳＨＬＧＱＨＥＮＩＶＮＬＬＧＡＣＴＨＧＧＰＶＬＶＩＴＥＹＣＣＹＧＤＬＬＮＦＬＲＲＫＡＥＡＭＬＧＰＳＬＳＰＧＱＤＰＥＧＧＶＤＹＫＮＩＨＬＥＫＫＹＶＲＲＤＳＧＦＳＳＱＧＶＤＴＹＶＥＭＲＰＶＳＴＳＳＮＤＳＦＳＥＱＤＬＤＫＥＤＧＲＰＬＥＬＲＤＬＬＨＦＳＳＱＶＡＱＧＭＡＦＬＡＳＫＮＣＩＨＲＤＶＡＡＲＮＶＬＬＴＮＧＨＶＡＫＩＧＤＦＧＬＡＲＤＩＭＮＤＳＮＹＩＶＫＧＮＡＲＬＰＶＫＷＭＡＰＥＳＩＦＤＣＶＹＴＶＱＳＤＶＷＳＹＧＩＬＬＷＥＩＦＳＬＧＬＮＰＹＰＧＩＬＶＮＳＫＦＹＫＬＶＫＤＧＹＱＭＡＱＰＡＦＡＰＫＮＩＹＳＩＭＱＡＣＷＡＬＥＰＴＨＲＰＴＦＱＱＩＣＳＦＬＱＥＱＡＱＥＤＲＲＥＲＤＹＴＮＬＰＳＳＳＲＳＧＧＳＧＳＳＳＳＥＬＥＥＥＳＳＳＨＬＴＣＣＥＱＧＤＩＡＱＰＬＬＱＰＮＮＹＱＦＣ
ＭＧＰＧＶＬＬＬＬＬＶＡＴＡＷＨＧＱＧＩＰＶＩＥＰＳＶＰＥＬＶＶＫＰＧＡＴＶＴＬＲＣＶＧＮＧＳＶＥＷＤＧＰＰＳＰＨＷＴＬＹＳＤＧＳＳＳＩＬＳＴＮＮＡＴＦＱＮＴＧＴＹＲＣＴＥＰＧＤＰＬＧＧＳＡＡＩＨＬＹＶＫＤＰＡＲＰＷＮＶＬＡＱＥＶＶＶＦＥＤＱＤＡＬＬＰＣＬＬＴＤＰＶＬＥＡＧＶＳＬＶＲＶＲＧＲＰＬＭＲＨＴＮＹＳＦＳＰＷＨＧＦＴＩＨＲＡＫＦＩＱＳＱＤＹＱＣＳＡＬＭＧＧＲＫＶＭＳＩＳＩＲＬＫＶＱＫＶＩＰＧＰＰＡＬＴＬＶＰＡＥＬＶＲＩＲＧＥＡＡＱＩＶＣＳＡＳＳＶＤＶＮＦＤＶＦＬＱＨＮＮＴＫＬＡＩＰＱＱＳＤＦＨＮＮＲＹＱＫＶＬＴＬＮＬＤＱＶＤＦＱＨＡＧＮＹＳＣＶＡＳＮＶＱＧＫＨＳＴＳＭＦＦＲＶＶＥＳＡＹＬＮＬＳＳＥＱＮＬＩＱＥＶＴＶＧＥＧＬＮＬＫＶＭＶＥＡＹＰＧＬＱＧＦＮＷＴＹＬＧＰＦＳＤＨＱＰＥＰＫＬＡＮＡＴＴＫＤＴＹＲＨＴＦＴＬＳＬＰＲＬＫＰＳＥＡＧＲＹＳＦＬＡＲＮＰＧＧＷＲＡＬＴＦＥＬＴＬＲＹＰＰＥＶＳＶＩＷＴＦＩＮＧＳＧＴＬＬＣＡＡＳＧＹＰＱＰＮＶＴＷＬＱＣＳＧＨＴＤＲＣＤＥＡＱＶＬＱＶＷＤＤＰＹＰＥＶＬＳＱＥＰＦＨＫＶＴＶＱＳＬＬＴＶＥＴＬＥＨＮＱＴＹＥＣＲＡＨＮＳＶＧＳＧＳＷＡＦＩＰＩＳＡＧＡＨＴＨＰＰＤＥＦＬＦＴＰＶＶＶＡＣＭＳＩＭＡＬＬＬＬＬＬＬＬＬＬＹＫＹＫＱＫＰＫＹＱＶＲＷＫＩＩＥＳＹＥＧＮＳＹＴＦＩＤＰＴＱＬＰＹＮＥＫＷＥＦＰＲＮＮＬＱＦＧＫＴＬＧＡＧＡＦＧＫＶＶＥＡＴＡＦＧＬＧＫＥＤＡＶＬＫＶＡＶＫＭＬＫＳＴＡＨＡＤＥＫＥＡＬＭＳＥＬＫＩＭＳＨＬＧＱＨＥＮＩＶＮＬＬＧＡＣＴＨＧＧＰＶＬＶＩＴＥＹＣＣＹＧＤＬＬＮＦＬＲＲＫＡＥＡＭＬＧＰＳＬＳＰＧＱＤＰＥＧＧＶＤＹＫＮＩＨＬＥＫＫＹＶＲＲＤＳＧＦＳＳＱＧＶＤＴＹＶＥＭＲＰＶＳＴＳＳＮＤＳＦＳＥＱＤＬＤＫＥＤＧＲＰＬＥＬＲＤＬＬＨＦＳＳＱＶＡＱＧＭＡＦＬＡＳＫＮＣＩＨＲＤＶＡＡＲＮＶＬＬＴＮＧＨＶＡＫＩＧＤＦＧＬＡＲＤＩＭＮＤＳＮＹＩＶＫＧＮＡＲＬＰＶＫＷＭＡＰＥＳＩＦＤＣＶＹＴＶＱＳＤＶＷＳＹＧＩＬＬＷＥＩＦＳＬＧＬＮＰＹＰＧＩＬＶＮＳＫＦＹＫＬＶＫＤＧＹＱＭＡＱＰＡＦＡＰＫＮＩＹＳＩＭＱＡＣＷＡＬＥＰＴＨＲＰＴＦＱＱＩＣＳＦＬＱＥＱＡＱＥＤＲＲＥＲＤＹＴＮＬＰＳＳＳＲＳＧＧＳＧＳＳＳＳＥＬＥＥＥＳＳＳＨＬＴＣＣＥＱＧＤＩＡＱＰＬＬＱＰＮＮＹＱＦＣ
【0024】
上記の配列においてヒトＣＳＦ－１Ｒの細胞外ドメインに下線が引かれており、細胞内ドメインは斜体で示されている。最初の１９アミノ酸（シグナルペプチド）は、翻訳後に切断されて、ＣＳＦ－１Ｒポリペプチドの成熟形態を形成する。本発明の基礎となる研究で同定された抗体のエピトープ領域を太字で示す。エピトープの配列は、配列番号１（ＹＫＮＩＨＬＥＫＫＹ）にも示されている。本明細書で以下により詳細に記載されるように、６９９位のチロシン残基及び／又は７０８位のチロシン残基がリン酸化されている。
【0025】
有利には、本発明の抗体は、天然形態、すなわち未変性形態のＣＳＦ－１Ｒと変性形態のＣＳＦ－１Ｒの両方に結合する。したがって、「ＣＳＦ－１Ｒ」という用語は、天然ＣＳＦ－１Ｒ及び変性ＣＳＦ－１を含む。
【0026】
本発明の抗体又は抗原結合断片は、以下の配列を有するものとする：
好ましくは、ＣＳＦ－１Ｒ（コロニー刺激因子１受容体）に結合するモノクローナル抗体又はその断片は、好ましい順に、配列番号２に示される配列を有する軽鎖可変ドメインと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％同一である軽鎖可変ドメイン、及び／又は配列番号３に示される配列を有する重鎖可変ドメインと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％同一である重鎖可変ドメインを含む。特に、上記モノクローナル抗体又はその断片は、好ましい順に、配列番号２に示される配列を有する軽鎖可変ドメインと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％同一である軽鎖可変ドメインと、配列番号３に示される配列を有する重鎖可変ドメインと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％同一である重鎖可変ドメインとを含む。例えば、上記モノクローナル抗体又はその断片は、好ましい順に、配列番号２に示される配列を有する軽鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一である軽鎖可変ドメインと、配列番号３に示される配列を有する重鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一である重鎖可変ドメインとを含む。
好ましくは、ＣＳＦ－１Ｒ（コロニー刺激因子１受容体）に結合するモノクローナル抗体又はその断片は、好ましい順に、配列番号２に示される配列を有する軽鎖可変ドメインと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％同一である軽鎖可変ドメイン、及び／又は配列番号３に示される配列を有する重鎖可変ドメインと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％同一である重鎖可変ドメインを含む。特に、上記モノクローナル抗体又はその断片は、好ましい順に、配列番号２に示される配列を有する軽鎖可変ドメインと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％同一である軽鎖可変ドメインと、配列番号３に示される配列を有する重鎖可変ドメインと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％同一である重鎖可変ドメインとを含む。例えば、上記モノクローナル抗体又はその断片は、好ましい順に、配列番号２に示される配列を有する軽鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一である軽鎖可変ドメインと、配列番号３に示される配列を有する重鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一である重鎖可変ドメインとを含む。
【0027】
一態様では、モノクローナル抗体は、配列番号２に示される配列を有する軽鎖可変ドメインと、配列番号３に示される配列を有する重鎖可変ドメインとを含む。
軽鎖可変領域の配列は以下の通りである（配列番号２）：
ＡＡＶＬＴＱＴＰＳＰＶＳＡＡＶＧＧＴＶＴＩＳＣＱＳＳＥＳＶＹＳＮＮＦＬＳＷＹＱＬＫＰＧＱＲＰＲＬＬＩＹＥＡＳＫＶＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＱＦＴＬＴＩＳＧＶＱＣＤＤＡＡＴＹＹＣＡＧＧＹＤＶＳＤＤＡＦＧＧＧＴＥＶＬＶＫ
重鎖可変領域の配列は以下の通りである（配列番号３）：
ＱＳＶＥＥＳＧＧＲＬＶＴＰＧＴＰＬＴＬＴＣＴＡＳＧＦＳＬＳＲＹＷＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＹＩＧＷＩＤＲＳＧＮＴＹＦＡＤＷＡＫＧＲＦＴＧＳＫＴＳＴＴＲＤＬＫＩＴＳＰＴＴＥＤＴＡＴＹＦＣＧＲＧＧＱＮＮＧＹＤＬＷＧＰＧＴＬＶＴＶＳＳ
軽鎖可変領域の配列は以下の通りである（配列番号２）：
ＡＡＶＬＴＱＴＰＳＰＶＳＡＡＶＧＧＴＶＴＩＳＣＱＳＳＥＳＶＹＳＮＮＦＬＳＷＹＱＬＫＰＧＱＲＰＲＬＬＩＹＥＡＳＫＶＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＱＦＴＬＴＩＳＧＶＱＣＤＤＡＡＴＹＹＣＡＧＧＹＤＶＳＤＤＡＦＧＧＧＴＥＶＬＶＫ
重鎖可変領域の配列は以下の通りである（配列番号３）：
ＱＳＶＥＥＳＧＧＲＬＶＴＰＧＴＰＬＴＬＴＣＴＡＳＧＦＳＬＳＲＹＷＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＹＩＧＷＩＤＲＳＧＮＴＹＦＡＤＷＡＫＧＲＦＴＧＳＫＴＳＴＴＲＤＬＫＩＴＳＰＴＴＥＤＴＡＴＹＦＣＧＲＧＧＱＮＮＧＹＤＬＷＧＰＧＴＬＶＴＶＳＳ
【0028】
代替的又は追加的に、本発明のモノクローナル抗体又はその断片は、
（ａ）以下を含む軽鎖可変ドメイン：
（ａ１）配列番号４（ＱＳＳＥＳＶＹＳＮＮＦＬＳ）に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１とは合計３個、２個、又は特に１個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ１、
（ａ２）配列番号５（ＥＡＳＫＶＡＳ）に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２とは合計３個、２個、又は特に１個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ２、及び／又は
（ａ３）配列番号６（ＡＧＧＹＤＶＳＤＤＡ）に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３とは合計３個、２個、又は特に１個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ３、及び／又は
（ｂ）以下を含む重鎖可変ドメイン：
（ｂ１）配列番号７（ＴＡＳＧＦＳＬＳＲＹＷＭＴ）に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１とは合計３個、２個、又は特に１個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失により異なる重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ２）配列番号８（ＲＳＧＮＴＹＦＡＤＷＡＫＧ）に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２とは合計３個、２個、又は特に１個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失により異なる重鎖ＣＤＲ２、及び／又は
（ｂ３）配列番号９（ＧＧＱＮＮＧＹＤＬ）に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とは合計３個、２個、又は特に１個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失により異なる重鎖ＣＤＲ３、
又は
（ｃ）（ａ）で定義される軽鎖可変ドメインと（ｂ）で定義される重鎖可変ドメインの両方、を含む。
（ａ）以下を含む軽鎖可変ドメイン：
（ａ１）配列番号４（ＱＳＳＥＳＶＹＳＮＮＦＬＳ）に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１とは合計３個、２個、又は特に１個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ１、
（ａ２）配列番号５（ＥＡＳＫＶＡＳ）に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２とは合計３個、２個、又は特に１個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ２、及び／又は
（ａ３）配列番号６（ＡＧＧＹＤＶＳＤＤＡ）に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３とは合計３個、２個、又は特に１個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ３、及び／又は
（ｂ）以下を含む重鎖可変ドメイン：
（ｂ１）配列番号７（ＴＡＳＧＦＳＬＳＲＹＷＭＴ）に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１とは合計３個、２個、又は特に１個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失により異なる重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ２）配列番号８（ＲＳＧＮＴＹＦＡＤＷＡＫＧ）に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２とは合計３個、２個、又は特に１個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失により異なる重鎖ＣＤＲ２、及び／又は
（ｂ３）配列番号９（ＧＧＱＮＮＧＹＤＬ）に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とは合計３個、２個、又は特に１個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失により異なる重鎖ＣＤＲ３、
又は
（ｃ）（ａ）で定義される軽鎖可変ドメインと（ｂ）で定義される重鎖可変ドメインの両方、を含む。
【0029】
代替的又は追加的に、本発明のモノクローナル抗体又はその断片は、
（ａ）以下を含む軽鎖可変ドメイン：
（ａ１）配列番号４（ＱＳＳＥＳＶＹＳＮＮＦＬＳ）に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１とは合計３個、２個、又は特に１個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ１と、
（ａ２）配列番号５（ＥＡＳＫＶＡＳ）に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２とは合計３個、２個、又は特に１個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ２と、
（ａ３）配列番号６（ＡＧＧＹＤＶＳＤＤＡ）に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３とは合計３個、２個、又は特に１個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ３、
並びに
（ｂ）以下を含む重鎖可変ドメイン：
（ｂ１）配列番号７（ＴＡＳＧＦＳＬＳＲＹＷＭＴ）に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１とは合計３個、２個、又は特に１個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失により異なる重鎖ＣＤＲ１と、
（ｂ２）配列番号８（ＲＳＧＮＴＹＦＡＤＷＡＫＧ）に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２とは合計３個、２個、又は特に１個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失により異なる重鎖ＣＤＲ２と、
（ｂ３）配列番号９（ＧＧＱＮＮＧＹＤＬ）に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とは合計３個、２個、又は特に１個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失により異なる重鎖ＣＤＲ３、を含む。
（ａ）以下を含む軽鎖可変ドメイン：
（ａ１）配列番号４（ＱＳＳＥＳＶＹＳＮＮＦＬＳ）に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１とは合計３個、２個、又は特に１個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ１と、
（ａ２）配列番号５（ＥＡＳＫＶＡＳ）に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２とは合計３個、２個、又は特に１個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ２と、
（ａ３）配列番号６（ＡＧＧＹＤＶＳＤＤＡ）に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３とは合計３個、２個、又は特に１個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ３、
並びに
（ｂ）以下を含む重鎖可変ドメイン：
（ｂ１）配列番号７（ＴＡＳＧＦＳＬＳＲＹＷＭＴ）に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１とは合計３個、２個、又は特に１個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失により異なる重鎖ＣＤＲ１と、
（ｂ２）配列番号８（ＲＳＧＮＴＹＦＡＤＷＡＫＧ）に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２とは合計３個、２個、又は特に１個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失により異なる重鎖ＣＤＲ２と、
（ｂ３）配列番号９（ＧＧＱＮＮＧＹＤＬ）に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とは合計３個、２個、又は特に１個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失により異なる重鎖ＣＤＲ３、を含む。
【0030】
一態様では、本発明のモノクローナル抗体又はその断片は、
（ａ）以下を含む軽鎖可変ドメイン：
（ａ１）配列番号４（ＱＳＳＥＳＶＹＳＮＮＦＬＳ）に示されるアミノ酸配列の少なくとも１１個、特に少なくとも１２個の連続アミノ酸を含む軽鎖ＣＤＲ１、
（ａ２）配列番号５（ＥＡＳＫＶＡＳ）に示されるアミノ酸配列の少なくとも５個、特に少なくとも６個の連続アミノ酸を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び／又は
（ａ３）配列番号６（ＡＧＧＹＤＶＳＤＤＡ）に示されるアミノ酸配列の少なくとも８個、特に少なくとも９個の連続アミノ酸を含む軽鎖ＣＤＲ３、
及び／又は
（ｂ）以下を含む重鎖可変ドメイン：
（ｂ１）配列番号７（ＴＡＳＧＦＳＬＳＲＹＷＭＴ）に示されるアミノ酸配列の少なくとも１１個、特に少なくとも１２個の連続アミノ酸を含む重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ２）配列番号８（ＲＳＧＮＴＹＦＡＤＷＡＫＧ）に示されるアミノ酸配列の少なくとも１１個、特に少なくとも１２個の連続アミノ酸を含む重鎖ＣＤＲ２、及び／又は
（ｂ３）配列番号９（ＧＧＱＮＮＧＹＤＬ）に示されるアミノ酸配列の少なくとも７個、特に少なくとも８個の連続アミノ酸を含む重鎖ＣＤＲ３を含む。
（ａ）以下を含む軽鎖可変ドメイン：
（ａ１）配列番号４（ＱＳＳＥＳＶＹＳＮＮＦＬＳ）に示されるアミノ酸配列の少なくとも１１個、特に少なくとも１２個の連続アミノ酸を含む軽鎖ＣＤＲ１、
（ａ２）配列番号５（ＥＡＳＫＶＡＳ）に示されるアミノ酸配列の少なくとも５個、特に少なくとも６個の連続アミノ酸を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び／又は
（ａ３）配列番号６（ＡＧＧＹＤＶＳＤＤＡ）に示されるアミノ酸配列の少なくとも８個、特に少なくとも９個の連続アミノ酸を含む軽鎖ＣＤＲ３、
及び／又は
（ｂ）以下を含む重鎖可変ドメイン：
（ｂ１）配列番号７（ＴＡＳＧＦＳＬＳＲＹＷＭＴ）に示されるアミノ酸配列の少なくとも１１個、特に少なくとも１２個の連続アミノ酸を含む重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ２）配列番号８（ＲＳＧＮＴＹＦＡＤＷＡＫＧ）に示されるアミノ酸配列の少なくとも１１個、特に少なくとも１２個の連続アミノ酸を含む重鎖ＣＤＲ２、及び／又は
（ｂ３）配列番号９（ＧＧＱＮＮＧＹＤＬ）に示されるアミノ酸配列の少なくとも７個、特に少なくとも８個の連続アミノ酸を含む重鎖ＣＤＲ３を含む。
【0031】
一態様では、本発明のモノクローナル抗体又はその断片は、
（ａ）以下を含む軽鎖可変ドメイン：
（ａ１）配列番号４（ＱＳＳＥＳＶＹＳＮＮＦＬＳ）に示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、
（ａ２）配列番号５（ＥＡＳＫＶＡＳ）に示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び／又は
（ａ３）配列番号６（ＡＧＧＹＤＶＳＤＤＡ）に示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
及び／又は
（ｂ）以下を含む重鎖可変ドメイン：
（ｂ１）配列番号７（ＴＡＳＧＦＳＬＳＲＹＷＭＴ）に示される配列を有する重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ２）配列番号８（ＲＳＧＮＴＹＦＡＤＷＡＫＧ）に示される配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び／又は
（ｂ３）配列番号９（ＧＧＱＮＮＧＹＤＬ）に示される配列を有する重鎖ＣＤＲ３、を含む。
（ａ）以下を含む軽鎖可変ドメイン：
（ａ１）配列番号４（ＱＳＳＥＳＶＹＳＮＮＦＬＳ）に示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、
（ａ２）配列番号５（ＥＡＳＫＶＡＳ）に示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び／又は
（ａ３）配列番号６（ＡＧＧＹＤＶＳＤＤＡ）に示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
及び／又は
（ｂ）以下を含む重鎖可変ドメイン：
（ｂ１）配列番号７（ＴＡＳＧＦＳＬＳＲＹＷＭＴ）に示される配列を有する重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ２）配列番号８（ＲＳＧＮＴＹＦＡＤＷＡＫＧ）に示される配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び／又は
（ｂ３）配列番号９（ＧＧＱＮＮＧＹＤＬ）に示される配列を有する重鎖ＣＤＲ３、を含む。
【0032】
一態様では、本発明のモノクローナル抗体又はその断片は、
（ａ）以下を含む軽鎖可変ドメイン：
（ａ１）配列番号４（ＱＳＳＥＳＶＹＳＮＮＦＬＳ）に示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ１と、
（ａ２）配列番号５（ＥＡＳＫＶＡＳ）に示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ２と、
（ａ３）配列番号６（ＡＧＧＹＤＶＳＤＤＡ）に示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
及び
（ｂ）以下を含む重鎖可変ドメイン：
（ｂ１）配列番号７（ＴＡＳＧＦＳＬＳＲＹＷＭＴ）に示される配列を有する重鎖ＣＤＲ１と、
（ｂ２）配列番号８（ＲＳＧＮＴＹＦＡＤＷＡＫＧ）に示される配列を有する重鎖ＣＤＲ２と、
（ｂ３）配列番号９（ＧＧＱＮＮＧＹＤＬ）に示される配列を有する重鎖ＣＤＲ３、を含む。
（ａ）以下を含む軽鎖可変ドメイン：
（ａ１）配列番号４（ＱＳＳＥＳＶＹＳＮＮＦＬＳ）に示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ１と、
（ａ２）配列番号５（ＥＡＳＫＶＡＳ）に示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ２と、
（ａ３）配列番号６（ＡＧＧＹＤＶＳＤＤＡ）に示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
及び
（ｂ）以下を含む重鎖可変ドメイン：
（ｂ１）配列番号７（ＴＡＳＧＦＳＬＳＲＹＷＭＴ）に示される配列を有する重鎖ＣＤＲ１と、
（ｂ２）配列番号８（ＲＳＧＮＴＹＦＡＤＷＡＫＧ）に示される配列を有する重鎖ＣＤＲ２と、
（ｂ３）配列番号９（ＧＧＱＮＮＧＹＤＬ）に示される配列を有する重鎖ＣＤＲ３、を含む。
【0033】
また、ＣＳＦ－１Ｒ（コロニー刺激因子１受容体）に結合するモノクローナル抗体又はその断片は、好ましい順に、配列番号２に示される配列を有する軽鎖可変ドメインと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である軽鎖可変ドメイン、及び／又は配列番号３に示される配列を有する重鎖可変ドメインと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、若しくは１００％同一である重鎖可変ドメインを含み、
軽鎖可変ドメインが、
（ａ１）配列番号４（ＱＳＳＥＳＶＹＳＮＮＦＬＳ）に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１とは合計３個、２個、又は特に１個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ１と、
（ａ２）配列番号５（ＥＡＳＫＶＡＳ）に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２とは合計３個、２個、又は特に１個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ２と、
（ａ３）配列番号６（ＡＧＧＹＤＶＳＤＤＡ）に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３とは合計３個、２個、又は特に１個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ３と、
を含み、
重鎖可変ドメインが、
（ｂ１）配列番号７（ＴＡＳＧＦＳＬＳＲＹＷＭＴ）に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１とは合計３個、２個、又は特に１個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失により異なる重鎖ＣＤＲ１と、
（ｂ２）配列番号８（ＲＳＧＮＴＹＦＡＤＷＡＫＧ）に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２とは合計３個、２個、又は特に１個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失により異なる重鎖ＣＤＲ２と、
（ｂ３）配列番号９（ＧＧＱＮＮＧＹＤＬ）に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とは合計３個、２個、又は特に１個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失により異なる重鎖ＣＤＲ３と、を含む。
軽鎖可変ドメインが、
（ａ１）配列番号４（ＱＳＳＥＳＶＹＳＮＮＦＬＳ）に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１とは合計３個、２個、又は特に１個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ１と、
（ａ２）配列番号５（ＥＡＳＫＶＡＳ）に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２とは合計３個、２個、又は特に１個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ２と、
（ａ３）配列番号６（ＡＧＧＹＤＶＳＤＤＡ）に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３とは合計３個、２個、又は特に１個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ３と、
を含み、
重鎖可変ドメインが、
（ｂ１）配列番号７（ＴＡＳＧＦＳＬＳＲＹＷＭＴ）に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１とは合計３個、２個、又は特に１個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失により異なる重鎖ＣＤＲ１と、
（ｂ２）配列番号８（ＲＳＧＮＴＹＦＡＤＷＡＫＧ）に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２とは合計３個、２個、又は特に１個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失により異なる重鎖ＣＤＲ２と、
（ｂ３）配列番号９（ＧＧＱＮＮＧＹＤＬ）に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とは合計３個、２個、又は特に１個以下のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失により異なる重鎖ＣＤＲ３と、を含む。
【0034】
参照ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、最大パーセントの配列同一性を達成するために、配列をアライメントし、必要に応じてギャップを導入した後の、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。好ましくは、２つの配列の配列同一性の程度を決定するために標準的なパラメータが適用される。好ましくは、同一性の程度は、比較ウィンドウにわたって２つの最適にアラインメントされた配列を比較することによって決定されるべきであり、比較ウィンドウ内のアミノ酸配列の断片は、最適なアラインメントのために、参照配列（付加又は欠失を含まない）と比較して、付加又は欠失（例えば、ギャップ又はオーバーハング）を含み得る。パーセンテージは、両方の配列において同一のアミノ酸残基が出現する位置の数を決定して一致した位置の数を産出し、一致した位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを産出することによって、算出される。比較のための配列の最適なアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）によるホモロジーアラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８５：２４４４（１９８８）による類似検索法、これらのアルゴリズムのコンピュータ実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、ウィスコンシン州マディソン、サイエンスドライブ５７５）のソフトウェアパッケージ、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＰＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）、又は目視検査によって行われ得る。比較のために２つの配列が同定されていることを考えると、ＧＡＰ及びＢＥＳＴＦＩＴを用いて、それらの最適なアラインメント、したがって同一性の程度を決定することが好ましい。好ましくは、ギャップ重みについては５．００、ギャップ重み長については０．３０のデフォルト値が使用される。一実施形態では、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＥＭＢＯＳＳソフトウェアパッケージのニードルプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ，Ｐ．，Ｌｏｎｇｄｅｎ，Ｉ．，ａｎｄ Ｂｌｅａｓｂｙ，Ａ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６（６），２７６－２７７，２０００）に組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ １９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４－４５３）、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス、並びにギャップオープニングペナルティ１０及びギャップ伸長ペナルティ０．５を用いて決定される。ニードルプログラムを使用して２つのアミノ酸配列をアライメントするために使用されるパラメータの好ましい非限定的な例は、ＥＢＬＯＳＵＭ ６２スコアリングマトリクス、１０のギャップオープニングペナルティ及び０．５のギャップ伸長ペナルティを含むデフォルトパラメータである。
【0035】
「抗体」という用語は、例えば、限定されるものではないが、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ、これらの組み合わせ、並びに、任意の脊椎動物、例えば、ヤギ、ウサギ、及びマウス等の哺乳類における免疫応答の間に産生される同様の分子、並びに、非哺乳類種、例えばサメ免疫グロブリンを含む免疫グロブリン又は免疫グロブリン様分子を指す。例えば、抗体はウサギ抗体であり得る。「抗体」という用語は、インタクトな免疫グロブリン、及び他の分子への結合を実質的に排除して目的の分子（又は非常に類似した目的の分子の群）に特異的に結合する「抗体断片」又は「抗原結合断片」を含む。「抗体」という用語には、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異性抗体）等の遺伝子操作された形態も含まれる。Ｐｉｅｒｃｅ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１９９４－１９９５（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，１１１．）；Ｋｕｂｙ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９７も参照されたい。
【0036】
特に、「抗体」という用語は、抗原のエピトープを特異的に認識し、特異的に結合する、少なくとも軽鎖及び重鎖免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドリガンドを意味する。抗体は、重及び軽鎖で構成されており、それらの各々には可変重（ＶＨ）領域及び可変軽（ＶＬ）領域と呼ばれる可変領域がある。合わせて、ＶＨ領域及びＶＬ領域は、抗体によって認識される抗原の結合を担う。典型的には、本発明の抗体は、ジスルフィド結合によって相互接続された重（Ｈ）鎖及び軽（Ｌ）鎖を有する。本明細書で使用される場合、「軽鎖」という用語は、完全長軽鎖、及び結合特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有するその断片を含む。完全長軽鎖は、可変領域ドメインＶＬ及び定常領域ドメインＣＬを含む。軽鎖の可変領域ドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にある。軽鎖には、カッパ鎖及びラムダ鎖が含まれる。「重鎖」という用語は、完全長重鎖、及び結合特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有するその断片を含む。完全長重鎖は、可変領域ドメインＶＨ、並びに３つの定常領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含み、ＶＨドメインはポリペプチドのアミノ末端にあり、ＣＨドメインはカルボキシル末端にあり、ＣＨ３はポリペプチドのカルボキシ末端に最も近くにある。
【0037】
抗体分子の機能活性を決定する５つの主要な重鎖クラス（又はアイソタイプ）：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥが存在する。各重及び軽鎖は、定常領域及び可変領域を含有する（領域は「ドメイン」としても知られている）。組み合わせると、重及び軽鎖可変領域は特異的に、抗原を結合する。軽及び重鎖可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」とも呼ばれる、３つの超可変領域により中断された「フレームワーク」領域を含有する。ＣＤＲは主に、抗原のエピトープへの結合を担う。各鎖のＣＤＲは通常、Ｎ末端から始まって連続して番号付けされている、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と呼ばれ、また、通常は、特定のＣＤＲが位置する鎖により同定される。したがって、ＶＨ ＣＤＲ３は、それが見出される抗体の重鎖の可変ドメインに位置し、一方、ＶＬ ＣＤＲ１は、それが見出される抗体の軽鎖の可変ドメイン由来のＣＤＲ１である。ＣＳＦ－１Ｒに結合する抗体は、特異的ＶＨ領域及びＶＬ領域配列、したがって特異的ＣＤＲ配列を有する。
【0038】
本発明の抗体又はその断片は、一本鎖抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ抗体及びその断片であり得る。例えば、抗体はＩｇＧ抗体、例えばＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、又はＩｇＧ４抗体であり得る。一実施形態では、抗体又はその断片は組換え生産されている。
【0039】
本発明のモノクローナル抗体の断片も本発明に包含される。断片は、免疫学的に機能的な断片、すなわち抗原結合断片であるものとする。したがって、本発明のモノクローナル抗体の断片は、ヒトＣＳＦ－１Ｒ等のＣＳＦ－１Ｒに結合することができるものとする。したがって、抗体の「免疫学的に機能的な断片」という用語は、本明細書で使用される場合、完全長鎖に存在するアミノ酸の少なくとも一部を欠くが、ＣＳＦ－１Ｒに特異的に結合することができる抗体の部分を指す。免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片及びＦｖ断片が含まれる。抗原結合断片の作製方法は当技術分野で周知である。例えば、断片は、本発明の抗体の酵素的切断によって作製され得る。さらに、断片は、合成又は組換え技術によって生成され得る。Ｆａｂ断片は、好ましくは、抗体のパパイン消化により、Ｆａｂ’断片はペプシン消化及び部分還元により、Ｆ（ａｂ’）２断片はペプシン消化により生成される。Ｆｖ断片は、好ましくは分子生物学技術によって産生される。
【0040】
抗体の断片は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片であるダイアボディであってもよい。ダイアボディは、好ましくは、同じポリペプチド鎖内の軽鎖可変ドメインに接続された重鎖可変ドメインを含む。
【0041】
本発明の抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、Ｂリンパ球の単一クローンによって、又は単一抗体の軽鎖及び重鎖遺伝子がトランスフェクトされた細胞によって産生される抗体を指す。モノクローナル抗体は、当業者に知られている方法によって、例えば、骨髄腫細胞と免疫脾臓細胞との融合からハイブリッド抗体形成細胞を作製することによって産生される。
【0042】
一実施形態では、本発明の抗体は単離された抗体である。したがって、抗体は精製された抗体とする。抗体の精製は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）等の当技術分野で周知の方法によって達成され得る。したがって、抗体は、抗体が産生された細胞から単離されているものとする。いくつかの実施形態では、単離された抗体は、例えば、ローリー（Ｌｏｗｒｙ）法によって測定される場合、抗体の７０重量％超まで、いくつかの実施形態では、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９重量％超まで精製される。或る好ましい実施形態では、本発明による単離された抗体は、タンパク質検出のためにクーマシーブルー染色を使用する還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥによって決定される場合、９０％超の純度まで精製される。
【0043】
本発明のモノクローナル抗体又はその断片は、ＣＳＦ－１Ｒポリペプチド、例えばヒトＣＳＦ－１Ｒポリペプチドに特異的に結合するものとする。「結合する」及び「特異的に結合する」という表現はよく理解されており、抗体（又はその断片）が他の生体分子に有意に結合しないことを示すために使用される。
【0044】
好ましくは、本発明の抗体（又はそのフ断片）は、ＣＳＦ－１Ｒポリペプチドの細胞内ドメイン、特にキナーゼドメインに特異的に結合するものとする。モノクローナル抗体又はその断片のエピトープは、好ましくは、配列番号１（ＹＫＮＩＨＬＥＫＫＹ）に示される配列を含む。配列番号１は、ヒトＣＳＦ－１Ｒのアミノ酸６９９～７０８に対応する（配列番号１０を参照されたい）。したがって、本発明のモノクローナル抗体又はその断片は、この領域に特異的に結合するものとする。好ましくは、上記エピトープの２つのチロシン残基の少なくとも一方、すなわち６９９位のチロシン残基又は７０８位のチロシン残基がリン酸化されている。より好ましくは、当該エピトープの両方のチロシン残基、すなわち、６９９位のチロシン残基及び７０８位のチロシン残基がリン酸化されている。したがって、本発明の抗体又はその断片は、６９９位のチロシン残基及び／又は７０８位のチロシン残基がリン酸化されているヒトＣＳＦ－１Ｒポリペプチドに結合することが想定される。
【0045】
「エピトープ」という用語は、抗体に特異的に結合することができるタンパク質決定基を表す。したがって、この用語は、好ましくは、本発明の抗体（又はその断片）によって特異的に結合され得るＣＳＦ－１Ｒポリペプチド（例えば、ヒトＣＳＦ－１Ｒポリペプチド）の部分を指す。エピトープは、通常、アミノ酸等の分子の化学的に活性な表面集団からなり、通常、特定の三次元構造特性と並んで特定の電荷特性を有する。立体配座エピトープ及び非立体配座エピトープは、変性溶媒の存在下では前者への結合が失われるが後者への結合は失われないという点で区別される。
【0046】
好ましい実施形態ではて、本発明の抗体又はその断片は、検出可能な標識に連結される。本明細書に記載の検出可能な標識は、好ましくは、抗体又はその抗原結合断片に天然に連結されていない標識である。したがって、検出可能な標識は、好ましくは抗体に関して異種である。好適な標識は、適切な検出方法で検出可能な任意の標識である。一実施形態では、当該検出可能な標識は、酵素、ビオチン、放射性標識、蛍光標識、化学発光標識、電気化学発光標識、金標識、又は磁気標識であり得る。である。
【0047】
酵素標識としては、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ及びルシフェラーゼが挙げられる。これらの酵素の基質は当技術分野で周知である。検出に適した基質としては、ジ－アミノ－ベンジジン（ＤＡＢ）、３，３’－５，５’－テトラメチルベンジジン、ＮＢＴ－ＢＣＩＰ（４－ニトロブルーテトラゾリウムクロリド及び５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリルホスフェート）が挙げられる。適切な酵素－基質の組み合わせにより、着色された反応産物、蛍光又は化学発光が生じてもよく、これは、当該技術分野で公知の方法に従って測定することができる。蛍光標識としては、例えば、５－カルボキシフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、テトラメチルローダミン、Ｃｙ２、Ｃｙ３及びＣｙ５、蛍光タンパク質、例えばＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ及びＡｌｅｘａ色素が挙げられる。放射性標識としては、例えば、ヨウ化物、コバルト、セレン、トリチウム、炭素、硫黄及びリンの放射性同位体が挙げられる。放射性標識は、公知かつ適切な、例えば感光膜又はホスホイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｒ ｉｍａｇｅｒ）等の任意の方法により検出され得る。磁気標識としては、例えば、常磁性標識及び超常磁性標識が挙げられる。使用される化学発光標識としては、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩又はシュウ酸エステルが挙げられ得る。
【0048】
本明細書での上記の定義及び説明は、好ましくは、以下について準用する。
【0049】
本発明の抗体又はその抗原結合断片は、ＣＳＦ－１Ｒポリペプチドの局在化及び／又は定量に関する方法において有用である。例えば、抗体又はその断片は、試料中のＣＳＦ－１Ｒポリペプチドの量を決定すること、診断方法で使用すること、又はＣＳＦ－１Ｒポリペプチドを画像化することを可能にする。
【0050】
したがって、本発明は、試料中のＣＳＦ－１Ｒを検出する方法であって、
（ａ）ＣＳＦ－１Ｒを含む試料を本発明のいずれかのモノクローナル抗体又はその断片と接触させ、それによってＣＳＦ－１Ｒ及び当該モノクローナル抗体又はその断片を含む複合体を形成すること、並びに
（ｂ）工程（ａ）で形成された複合体を検出することによって、上記試料中のＣＳＦ－１Ｒを検出することを含む、方法に関する。
（ａ）ＣＳＦ－１Ｒを含む試料を本発明のいずれかのモノクローナル抗体又はその断片と接触させ、それによってＣＳＦ－１Ｒ及び当該モノクローナル抗体又はその断片を含む複合体を形成すること、並びに
（ｂ）工程（ａ）で形成された複合体を検出することによって、上記試料中のＣＳＦ－１Ｒを検出することを含む、方法に関する。
【0051】
本明細書でいう「対象」は、好ましくは哺乳動物である。哺乳類としては、家畜化動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサル等の非ヒト霊長類）、ウサギ、及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、対象は、ヒト対象等の哺乳動物の対象である。上記方法のいくつかの態様では、試料は、がんを有すると診断された、がんを有すると疑われる、又はがんを有するリスクがある対象から得られる。
【0052】
本明細書で使用される場合、「試料」という用語は、対象から単離された組織、細胞及び生体体液、並びに対象内に存在する組織、細胞及び流体を含むことを意図している。本開示の生体試料としては、例えば、全血、血漿、精液、唾液、涙、尿、糞便物質、汗、頬側、皮膚、脳脊髄液及び毛髪が挙げられるが、これらに限定されない。生体試料はまた、内臓の生検又はがんから得ることができる。
【0053】
一実施形態では、試料はがん細胞を含む。がん細胞は、それらを患者にとって病的なものにする悪性形質転換を受けた細胞である。本明細書で使用される場合、「がん細胞」という用語は、原発性がん細胞だけでなく、がん細胞の祖先に由来する任意の細胞も含む。これには、転移したがん細胞、並びにがん細胞に由来するｉｎ ｖｉｔｒｏ培養物及び細胞株が含まれる。
【0054】
好ましくは、がん細胞を含む試料は、がん細胞を含む生検組織である。したがって、試料は、がんに罹患している対象から得られたものである。
【0055】
本発明によれば、試料は、がんの処置のための候補化合物と接触した対象から得られたものである。したがって、当該候補化合物は、試験される試料を得る前に、対象、特にがんに罹患している対象に投与されている。あるいは、試料をがんの処置のための候補化合物と接触させている。
【0056】
一実施形態では、がんを処置するための候補化合物は、ＣＳＦ－１Ｒの阻害剤、例えば小分子阻害剤、又はＣＳＦ－１Ｒに結合するモノクローナル抗体、例えばＣＳＦ－１Ｒの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体である。
【0057】
一実施形態では、ＣＳＦ－１Ｒの阻害剤が、キシダルチニブ、ＰＬＸ７４８６、ＡＲＲＹ－３８２、ＪＮＪ－４０３４６５２７、ＢＬＺ９４５、エマクツズマブ、ＡＭＧ８２０、及びＩＭＣ－ＣＳ４から選択される（Ｃａｎｎａｒｉｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１７ Ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ．５（１）：５３を参照されたい）。
【0058】
上記の方法の一実施形態では、ＣＳＦ－１Ｒの検出は、ＣＳＦ－１Ｒの定量的検出である。したがって、試料中のＣＳＦ－１Ｒの量が決定される。ＣＳＦ－１Ｒの決定された量を、対照生体試料中のＣＳＦ－１Ｒの量と比較することができる。したがって、例えば、試験試料中のＣＳＦ－１Ｒの量が対照試料と比較して増加しているか減少しているかを評価することができる。
【0059】
上記の方法の一実施形態では、ＣＳＦ－１Ｒの検出は、ＣＳＦ－１Ｒの免疫組織化学的検出である。したがって、ＣＳＦ－１Ｒは、顕微鏡で視覚化できる方法で試験試料を本発明の（その抗原結合断片の）抗体で標識することによって、無傷の細胞との関連において同定される。組織環境又は細胞環境に関連してＣＳＦ－１Ｒを同定することにより、バイオマーカーと細胞又は組織試料の他の形態学的又は分子的特徴との間の空間的関係を解明することができ、これは他の分子又は細胞技術からは明らかではない情報を明らかにし得る。
【0060】
ＣＳＦ－１Ｒを検出するため、本発明の抗体（又はその断片）は、本明細書の他の箇所に記載される検出可能な標識を含み得る。
【0061】
本発明は更に、試料中のヒトＣＳＦ－１Ｒ等のＣＳＦ－１Ｒの検出のための本発明のモノクローナル抗体又はその断片のｉｎ ｖｉｔｒｏ使用に関する。
【0062】
「試料」及び「対象」という用語は上記で定義されている。試料は、がん細胞又はがん組織である。上記定義は、適宜、適用される。上記のように、試料はがんの処置のための候補化合物と接触していてもよい。あるいは、上記候補化合物と接触させた対象から試料を得た。
【0063】
本発明はまた、本発明のモノクローナル抗体又はその断片と、ＣＳＦ－１Ｒとを含む複合体に関する。典型的には、モノクローナル抗体又はその断片は、上記複合体内のＣＳＦ－１Ｒ（ヒトＣＳＦ－１Ｒ等）に結合されている。
【0064】
本発明の方法及び使用の一実施形態では、ＣＳＦ－１Ｒの天然形態（ヒトＣＳＦ－１Ｒ等）が検出される。したがって、未変性ＣＳＦ－１Ｒが検出される。代替の実施形態では、変性ＣＳＦ－１Ｒが検出される。したがって、試料は、ＣＳＦ－１Ｒの変性をもたらす少なくとも１つの前処理工程に供されてもよい。例えば、試料が加熱されていてもよく、又は少なくとも１つの変性剤が試料に添加されていてもよい。
【0065】
本発明はまた、本発明の抗体又はその抗原結合断片を産生する宿主細胞に関する。好ましい実施形態では、本発明の抗体を産生する宿主はハイブリドーマ細胞である。さらに、宿主細胞は、本発明による抗体を生成するように操作することができる任意の種類の細胞系であり得る。例えば、宿主細胞は動物細胞、特に哺乳動物細胞であり得る。或る実施形態では、実施例の欄で使用されるＨＥＫ２９３－Ｆ細胞等のＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎臓細胞）又はＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞が宿主細胞として使用される。別の実施形態では、宿主細胞は、非ヒト動物又は哺乳動物細胞である。
【0066】
宿主細胞は、好ましくは、本発明の抗体又はその断片をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。例えば、宿主細胞は、本発明の抗体の軽鎖をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド、及び本発明の抗体の重鎖をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。当該ポリヌクレオチド（複数可）は、適切なプロモーターに作動可能に連結されているものとする。
【0067】
本発明は更に、本発明のモノクローナル抗体又はその断片と、薬学的に許容され得る希釈剤、溶媒、担体、塩及び／又はアジュバントとを含む医薬組成物に関する。
【0068】
本発明は、ＣＳＦ－１Ｒを発現している標的細胞におけるＣＳＦ－１Ｒ発現を減少させるためのｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供し、当該方法は、有効量の本発明のモノクローナル抗体若しくはその断片又は医薬組成物を当該細胞に投与することを含む。
【0069】
本発明は、疾患を処置又は予防する方法であって、治療有効量又は予防有効量のモノクローナル抗体若しくはその断片、又は本発明の医薬組成物を、疾患に罹患しているか、又は疾患に罹患しやすい対象に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、疾患は、がんである。
【0070】
本発明は、医薬に使用するためのモノクローナル抗体若しくはその断片、又は本発明の医薬組成物を提供する。
【0071】
本発明は、がんの処置又は予防に使用するための本発明のモノクローナル抗体若しくはその断片又は医薬組成物を提供する。
【0072】
本発明は、がんを処置又は予防するための医薬を調製するための、本発明のモノクローナル抗体若しくはその断片又は医薬組成物の使用を提供する。
【実施例】
【0073】
本発明は、以下の実施例によって単に例示されるものである。上記実施例は、いかなる場合でも、本発明の範囲を限定する方法で解釈されないものとする。
実施例１：免疫原の調製
実施例１：免疫原の調製
【0074】
ＴｔＳｌｙＤ－ＣＳＦ１Ｒ及びＴｔＳｌｙＤ－ｓｈ３ ＯＲＦをＧｅｎｅＡｒｔによって合成し、アンピシリン耐性クローニングベクター内に送達した。ＴｔＳｌｙＤ－ＣＳＦ１Ｒは、以下のアミノ酸配列をコードする：
＞ＴｔＳｌｙＤ－ＣＳＦ１Ｒ（配列番号１１）
ＭＲＳＫＶＧＱＤＫＶ ＶＴＩＲＹＴＬＱＶＥ ＧＥＶＬＤＱＧＥＬＳ ＹＬＨＧＨＲＮＬＩＰ ＧＬＥＥＡＬＥＧＲＥ ＥＧＥＡＦＱＡＨＶＰ ＡＥＫＡＹＧＡＧＳＭ ＬＧＰＳＬＳＰＧＱＤ ＰＥＧＧＶＤＹＫＮＩ ＨＬＥＫＫＹＶＲＲＤ ＳＧＦＳＳＱＧＶＤＴ ＹＶＥＭＲＰＶＳＴＳ ＳＮＤＳＦＳＥＱＤＬ ＤＫＥＤＧＲＰＧＳＳ ＧＫＤＬＤＦＱＶＥＶ ＶＫＶＲＥＡＴＰＥＥ ＬＬＨＧＨＡＨＧＧＧ ＳＲＰＬＬＰＰＬＰＧ ＧＧＳＲＫＨＨＨＨＨ ＨＨＨ
ＴｔＳｌｙＤ－ｓｈ３は挿入フリー対照タンパク質として適用され、以下のアミノ酸配列をコードする：
＞ＴｔＳｌｙＤｓｈ３（配列番号１２）
ＭＲＳＫＶＧＱＤＫＶ ＶＴＩＲＹＴＬＱＶＥ ＧＥＶＬＤＱＧＥＬＳ ＹＬＨＧＨＲＮＬＩＰ ＧＬＥＥＡＬＥＧＲＥ ＥＧＥＡＦＱＡＨＶＰ ＡＥＫＡＹＧＡＧＳＧ ＳＳＧＫＤＬＤＦＱＶ ＥＶＶＫＶＲＥＡＴＰ ＥＥＬＬＨＧＨＡＨＧ ＧＧＳＲＰＬＬＰＰＬ ＰＧＧＧＳＲＫＨＨＨ ＨＨＨＨＨ
＞ＴｔＳｌｙＤ－ＣＳＦ１Ｒ（配列番号１１）
ＭＲＳＫＶＧＱＤＫＶ ＶＴＩＲＹＴＬＱＶＥ ＧＥＶＬＤＱＧＥＬＳ ＹＬＨＧＨＲＮＬＩＰ ＧＬＥＥＡＬＥＧＲＥ ＥＧＥＡＦＱＡＨＶＰ ＡＥＫＡＹＧＡＧＳＭ ＬＧＰＳＬＳＰＧＱＤ ＰＥＧＧＶＤＹＫＮＩ ＨＬＥＫＫＹＶＲＲＤ ＳＧＦＳＳＱＧＶＤＴ ＹＶＥＭＲＰＶＳＴＳ ＳＮＤＳＦＳＥＱＤＬ ＤＫＥＤＧＲＰＧＳＳ ＧＫＤＬＤＦＱＶＥＶ ＶＫＶＲＥＡＴＰＥＥ ＬＬＨＧＨＡＨＧＧＧ ＳＲＰＬＬＰＰＬＰＧ ＧＧＳＲＫＨＨＨＨＨ ＨＨＨ
ＴｔＳｌｙＤ－ｓｈ３は挿入フリー対照タンパク質として適用され、以下のアミノ酸配列をコードする：
＞ＴｔＳｌｙＤｓｈ３（配列番号１２）
ＭＲＳＫＶＧＱＤＫＶ ＶＴＩＲＹＴＬＱＶＥ ＧＥＶＬＤＱＧＥＬＳ ＹＬＨＧＨＲＮＬＩＰ ＧＬＥＥＡＬＥＧＲＥ ＥＧＥＡＦＱＡＨＶＰ ＡＥＫＡＹＧＡＧＳＧ ＳＳＧＫＤＬＤＦＱＶ ＥＶＶＫＶＲＥＡＴＰ ＥＥＬＬＨＧＨＡＨＧ ＧＧＳＲＰＬＬＰＰＬ ＰＧＧＧＳＲＫＨＨＨ ＨＨＨＨＨ
【0075】
制限酵素及び「Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」をＲｏｃｈｅから入手した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１－Ｂｌｕｅスーパーコンピテント細胞及びＢＬ２１ Ｃｏｄｏｎ ＰｌｕｓをＳｔｒａｔａｇｅｎｅから入手した。ＤＮＡの精製には、「Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」及び「Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＰＣＲ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（Ｒｏｃｈｅ）を用いた。ｐＱＥ８０Ｌをクローニング及び発現ベクターとして使用した。
【0076】
細菌を、選択抗生物質（１００μｇ／ｍｌアンピシリン）を含むＬｙｓｏｇｅｎｙブロス（ＬＢ：５ｇ／ｌ酵母抽出物、１０ｇ／ｌトリプトン、５ｇ／ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）中で増殖させた。タンパク質発現中の増殖を改善するため、ＬＢ培地をスーパーブロス培地（ＳＢ：２０ｇ／ｌ酵母抽出物、３２ｇ／ｌトリプトン、５ｇ／ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に交換した。
【0077】
ＴｔＳｌｙＤ－ＣＳＦ１Ｒを、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを含む送達ベクターから放出させ、発現ベクターｐＱＥ８０－Ｌにライゲートし、その後ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化した。大腸菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ細菌の形質転換後、プラスミドＤＮＡを得て、大腸菌ＢＬ２１ Ｃｏｄｏｎ Ｐｌｕｓで形質転換した。簡潔には、組換え発現及び精製のため、細胞を３７℃のＳＢ培地中で成長させた。指数期に達したら、０．５ｍＭイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＧＴ）を用いて少なくとも３時間、ＴｔＳｌｙＤ変異体の発現を誘導した。細胞ペレットからの封入体を、７．０Ｍ ＧｄｍＣｌを含有する冷却したリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に再懸濁し、完全な細胞溶解まで２時間撹拌した。事前に清澄化した溶解物をＮｉ－ＮＴＡカラムに適用し、１０～１５カラム容量の洗浄緩衝液（リン酸緩衝液ｐＨ８．０、７．０Ｍ ＧｄｍＣｌ、１０ｍＭイミダゾール）を適用した。同時精製プロテアーゼの再活性化を回避するため、プロテアーゼ阻害剤カクテル（完全ＥＤＴＡ不含、Ｒｏｃｈｅ）をリフォールディング緩衝液（リン酸緩衝液ｐＨ８．０、２０ｍＭイミダゾール）に含めた。合計２０～２５カラム容量のリフォールディング緩衝液を一晩ゆっくりと適用した。２５０ｍＭイミダゾールの勾配でタンパク質を溶出する前に、阻害剤カクテルを、リフォールディング緩衝液で５～１０カラム容量の更なる洗浄で除去した。タンパク質含有画分をプールし、保存緩衝液（５０ｍＭ ＫＨ２Ｐ０４ ｐＨ６．９５、１００ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴ）中のサイズ排除クロマトグラフィーカラム（ＨｉＬｏａｄ（商標）２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５サイズ排除クロマトグラフィーカラム、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を通して再度精製した。モノマー含有画分のみを回収し、ＳＤＳ変性ゲル中の純度について評価した。ウエスタンブロット分析のために、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ Ｇｅｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）Ｓａｆｅ－Ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてクマシー様タンパク質染色を行った。タンパク質濃度の測定を、ＤＵＲ７４００分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ（商標））を用いて行った。融合タンパク質のモル吸光係数（ε２８０）を、バイオインフォマティクスによって計算した。
実施例２：円偏光二色性スペクトル分析
実施例２：円偏光二色性スペクトル分析
【0078】
タンパク質濃度の測定を、ＤＵＲ７４００分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ（商標））を用いて行った。融合タンパク質のモル吸光係数（ε２８０）を、バイオインフォマティクスによって計算した。
【0079】
近ＵＶ ＣＤスペクトルを、２０℃に設定したサーモスタット式セルホルダーを備えたＪａｓｃｏ－７２０分光偏光計を使用して記録し、平均残基楕円率に変換した。緩衝液は、５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．９５）、１００ｍＭ ＫＣｌ及び０．５ｍＭ ＥＤＴＡであった。スペクトルを、経路長０．２ｃｍで３３０～２５０ｎｍの間で記録し、タンパク質濃度は５００μＭであった。バンド幅は１ｎｍ、走査速度は分解能０．５ｎｍで２０ｎｍ／分、応答は１秒であった。シグナル対ノイズ比を改善するために、スペクトルを９回測定し、平均した。遠ＵＶ ＣＤスペクトルを、２０℃に設定したサーモスタット式セルホルダーを備えたＪａｓｃｏ－７２０分光偏光計を使用して記録し、平均残基楕円率に変換した。緩衝液は、１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．９５）及び１０ｍＭ ＫＣｌであった。スペクトルを、経路長０．２ｃｍで２５０～１９０ｎｍの間で記録し、タンパク質濃度は５μＭであった。バンド幅は１ｎｍ、走査速度は分解能０．５ｎｍで２０ｎｍ／分、応答は１秒であった。シグナル対ノイズ比を改善するために、スペクトルを９回測定し、平均した。
【0080】
融合タンパク質の熱的アンフォールディング転移について、５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．９５）、１００ｍＭ ＫＣｌ及び０．５ｍＭ ＥＤＴＡ中５００μＭでタンパク質を測定した。熱誘導されたアンフォールディング－リフォールディング転移を２７８ｎｍで記録し、キュベットの経路長は０．２ｃｍであった。加熱及び冷却速度は１℃／分であり、応答時間は４秒であった。アンフォールディングの可逆性を評価するため、熱誘導されたアンフォールディング－リフォールディングサイクルの前後に、融合タンパク質の近ＵＶ ＣＤスペクトルを記録した。
【0081】
タンパク質濃度の測定を、ＤＵＲ７４００分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ（商標））を用いて行った。融合タンパク質のモル吸光係数（ε２８０）を、Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ ２００５に従い、バイオインフォマティクスによって計算した。
【0082】
蛍光スペクトルを、２０℃に設定した恒温セルホルダーを備えたＣａｒｙ Ｅｃｌｉｐｓｅ蛍光分光光度計（Ｖａｒｉａｎ）を使用して記録した。緩衝液は、５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．９５）、１００ｍＭ ＫＣｌ及び０．５ｍＭ ＥＤＴＡであった。試料を２８０／２９０／２９５ｎｍで励起し、１ｃｍの経路長で３００～４２５ｎｍの間でスペクトルを記録した。タンパク質濃度は１０～３０μＭであった。バンド幅は５ｎｍ、走査速度は分解能１ｎｍで１２０ｎｍ／分、応答は０．５秒であった。
【0083】
融合タンパク質の熱的アンフォールディング転移のため、同じ濃度及び緩衝液を使用した。単回測定と同じ仕様で、熱誘導アンフォールディング転移について全スペクトルを記録した。加熱間隔を５℃に設定し、温度変化間の安定化期間を１０分に設定した。アンフォールディングの可逆性を評価するため、熱誘導されたアンフォールディング－リフォールディングサイクルの前後に融合タンパク質の蛍光スペクトルを記録した。
実施例３：ＴｔＳｌｙＤ－ＣＳＦ１Ｒのリン酸化及び精製
実施例３：ＴｔＳｌｙＤ－ＣＳＦ１Ｒのリン酸化及び精製
【0084】
緩衝液成分はＭｅｒｃｋ、Ｒｏｃｈｅ及びＳｉｇｍａから入手した。Ｓｒｃ（１－５３０）活性キナーゼは、Ｕｐｓｔａｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）から購入した。製造説明書に従い、Ｓｒｃキナーゼを希釈し（２０ｍＭ ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ ｐＨ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％Ｂｒｉｊ－３０、５％グリセロール、０．１％β－メルカプトエタノール及び１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）、アリコートに分け、－８０℃で保存した。ウエスタンブロット分析のために、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ Ｇｅｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。リン酸化タンパク質を検出するため、いくつかのｐａｎ－ｐＴｙｒの一次抗体：Ｐ－Ｔｙｒ－４Ｇ１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｐ－Ｔｙｒ－１００及びＰ－Ｔｙｒ－１０２（Ｃｅｌｌ Ｓｉｎｇａｌｉｎｇ）、並びに二次抗体としてのＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。結果をＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標）ＭＰ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）によって分析し、膜をＬｕｍｉ－Ｌｉｇｈｔ ＰＬＵＳウェスタンブロッティング基質（ＩＲｏｃｈｅ）とインキュベートした。
【0085】
４．５ｍｇのＴｔＳｌｙＤ－ＣＳＦ１Ｒを反応緩衝液（１０ｍＭ ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ ｐＨ７．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００１％Ｂｒｉｊ－３０、０．５％グリセロール、１０ｍＭ ＭｇＡｃ、０．１ｍＭ ＡＴＰ、０．２５ｍＭオルトバナジン酸塩及び０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）で６０μＭ濃度に希釈した。４単位のＳｒｃ（１．９７Ｕ／μｇ）を添加し、反応物を３０℃で２時間インキュベートした。その後、ＥＤＴＡを使用してＭｇ２＋カチオンをキレート化することによって反応を停止した。緩衝液及び混入タンパク質を除去するために、滅菌濾過したＰＢＳ ｐＨ６．９５をシース溶液として使用して、溶液をＨｉＬｏａｄ（商標）１６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００サイズ排除クロマトグラフィーカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に充填した。ＴｔＳｌｙＤ－ＣＳＦ１Ｒ含有画分を回収し、Ｕｌｔｒａｃｅｌｌ（商標）１０ｋ Ａｍｉｃｏｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してタンパク質を濃縮した。初期タンパク質の８１％が回収された。
実施例４：ウサギモノクローナル抗体の産生
実施例４：ウサギモノクローナル抗体の産生
【0086】
ウサギをそれぞれ３０日間、１００μｇの抗原で皮下免疫した。血清を４５日目から採取し、抗原に対する抗体力価を試験した。２ヶ月後、免疫原力価は２００．０００超であった。末梢血をブーストの５～６日後に毎月採取した。血液をクエン酸塩で処置して凝固を回避し、同日に新たに処理した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、抗体産生Ｂ細胞又はそれらの分泌増殖因子に対するマクロファージのいずれかを得るために必要であった。ＰＢＭＣを末梢ウサギ血液から得て、Ｓｅｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１４），ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１４ Ｆｅｂ ４；９（２）に記載されているように抗原特異的モノクローナル抗体を生成した。５．１０ｅ７ ＰＭＢＣ／ｍｌを、２５０ｎＭのビオチン化抗原と共にＦＡＣＳ Ｐｕｆｆｅｒ（ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ）に再懸濁した。４℃で１５～２０分間インキュベートした後、細胞をＰＢＳ ４０ｍｌで洗浄し、標識緩衝液（ＰＢＳ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ）中で１０ｅ８ ＰＭＢＣ／ｍｌに再懸濁した。１０％体積のストレプトアビジンビーズを添加し（ＭＡＣＳ Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、それらを４℃で１５～２０分間インキュベートした。細胞を４０ｍｌのＰＢＳで洗浄し、ＭＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ＋０．５％ＢＳＡ）中で２．１０ｅ８ ＰＭＢＣ／ｍｌに再懸濁した。懸濁液を予備平衡化ＭＳカラム（ＭＡＣＳ Ｍｉｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）に充填し、３容量のＭＡＣＳ緩衝液で洗浄し、結合した細胞を１ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液中に回収した。細胞型を識別するため、回収した細胞をウサギＩｇＧに対する蛍光抗体（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）で染色し、ＦＡＣＳＡｒｉａ Ｉセルソーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＩｇＧ陽性細胞を単一細胞選別を行った。Ｓｅｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．に記載されているように、細胞をＢ細胞培地中で１週間インキュベートした。１週間後、クローンの上清を、ＨｉｔＥＬＩＳＡ技術を用いてＩｇＧ産生及び抗原特異性について試験した。陽性クローンを選択し、ＲＮＡ溶解緩衝液を用いて－８０℃で保存した。ＨｉｔＥＬＩＳＡを細胞培養上清及び精製ｍＡｂを用いて行った。ＥＬＩＳＡプレート（Ｒｏｃｈｅ）を炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中１００～２５０ｎｇ／ｍｌの抗原でコーティングした。ビオチン化抗原を、同じ抗原濃度を使用してストレプトアビジン被覆プレート（Ｒｏｃｈｅ）に直接結合させた。洗浄後、プレートをインキュベーション緩衝液（ＩＢ：１％ＢＳＡ ０．０５％Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳ）でブロッキングした。プレートを細胞上清又はＩＢで希釈した精製ｍＡｂと共にインキュベートした。洗浄後、ＨＲＰコンジュゲートＦ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｄｉａｎｏｖａ）と１時間インキュベートし、１００μｌのＡＢＴＳ溶液（Ｒｏｃｈｅ）を添加することによってプレートを展開した。ＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダーを使用して適切な波長で光学密度を測定した。ＩｇＧ濃度サンドイッチＥＬＩＳＡ。ＥＬＩＳＡプレートを、炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中の３μｇ／ｍｌのヤギ抗ウサギＩｇＧでコーティングした。洗浄後、プレートをＩＢでブロッキングした。プレートをＩＢで希釈した細胞上清と共にインキュベートした。その後のＥＬＩＳＡを上記と同様に行った。
【0087】
Ｂ細胞ｍＲＮＡを、－８０℃で凍結した陽性単一メモリーＢ細胞培養物からＲＮｅａｓｙＲ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱｉａｇｅｎＲ）を用いて精製した。Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｃＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて逆転写を行った。ｃＤＮＡプレートを更に使用するまで－２０℃で保存した。ＩｇＨ、Ｉｇλ及びＩｇκ可変遺伝子を、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて鋳型として２μｌのｃＤＮＡから開始して、適切なプライマーを用いたＰＣＲにより独立して増幅した。精製された単一増幅バンド及びＩｇＧ定常領域を含むプラスミドをＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）で消化して５’オーバーハングを生成し、続いてＲｅｃＡ処置（ＮＥ Ｂｉｏｌａｂｓ）を行って配列及びライゲーション非依存性クローニング（ＳＬＩＣ）によって再度ライゲートした。組み換えたプラスミドを形質転換し、標準的な消化及び配列決定プロトコルを使用して正しい挿入クローニングについて試験した。
【0088】
２９３－Ｆｒｅｅ（商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＮｏｖａｇｅｎＲ）を使用して、無血清ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地（ＧｉｂｃｏＲＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で増殖させたＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３－Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）への、対になった重鎖及び軽鎖ＴＩＰＥプラスミドの一過性コトランスフェクションによって、完全長ＩｇＧ ｍＡｂを産生した。細胞を１８０ｒｐｍで連続振盪しながら３７℃／５～８％ＣＯ２で１週間培養した。上清を遠心分離によって回収し、－２０℃で保存した。
実施例５：相互作用分析
実施例５：相互作用分析
【0089】
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｂ ３０００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ＴｔＳｌｙＤ－ＣＳＦ１Ｒに対する動態及び結合特異性についてウサギ抗体を動態評価した。ＣＭ５シリーズセンサーをシステムに取り付け、製造業者の指示に従ってＨＢＳ－ＥＴ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ ｗ／ｖ Ｔｗｅｅｎ ２０）中で正規化した。試料緩衝液は、１ｍｇ／ｍｌのＣＭＤ（カルボキシメチルデキストラン、Ｓｉｇｍａ ＃８６５２４）を追加したシステム緩衝液であった。システムは２５℃で動作した。１００００ ＲＵのＧＡＲ＜Ｆ（ａｂ）２＞（相対単位のヤギ抗ウサギＦ（ａｂ）２／Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号１０００１８）を、全てのフローセルに対してＥＤＣ／ＮＨＳ化学を用いて製造者の説明書に従って固定化した。センサを１Ｍエタノールアミンで飽和させた。分析物に対する抗体の結合活性を速度論的に試験した。溶液中の分析物は、Ｙ７２３がリン酸化及び非リン酸化された２つの２ｋＤａペプチドＣＳＦ１Ｒ（７１６～７２９）、ＣＳＦ１Ｒ非関連挿入ドメインを有する１４ｋＤａ ＴｔＳｌｙＤｓｈ３対照タンパク質、及び２１ｋＤａ ＴｔＳｌｙＤ－ＣＳＦ１Ｒタンパク質であった。試料緩衝液で１：２に希釈した１０μｌ／分の細胞培養ＨＥＫ上清の２分間の注射によって抗体を捕捉した。流速を１００μｌ／分とした。分析物を、０ｎＭ、１．１ｎＭ、３．７ｎＭ、１１．１ｎＭ、３３．１ｎＭ、１００ｎＭ及び３００ｎＭの異なる濃度段階で２分間注入した。解離を５分間監視した。速度論的シグネチャを、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ及びＲＭＡＸローカルを用いたバイナリーラングミュアフィッティングモデルを用いて監視及び評価した。センサ表面の酸性再生を、１０ｍＭグリシンｐＨ１．７を３０μｌ／分で６０秒間の３回の連続注入を用いて達成した。
実施例６：線形エピトープマッピング
実施例６：線形エピトープマッピング
【0090】
ペプチドベースのエピトープマッピングを、記載され、ＣｅｌｌｕＳｐｏｔ（商標）技術を使用してＩｎｔａｖｉｓ（ドイツ国ケルン、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｔａｖｉｓ．ｃｏｍ）により市販されているとおりに行った。エピトープマッピングを、ヒトＣＳＦ１Ｒ ＫＩＤドメインの配列に対応する重複固定化ペプチド断片（長さ：１５アミノ酸）のライブラリーによって行った。合成された各ペプチドは、一つのアミノ酸だけシフトしており、すなわち、前のペプチド及び次のペプチドとそれぞれ１４個のアミノ酸がオーバーラップしていた。ペプチドアレイの調製のため、Ｉｎｔａｖｉｓ ＣｅｌｌｕＳｐｏｔ（商標）技術を使用した。このアプローチでは、合成後に溶解される修飾セルロースディスク上で自動合成装置（Ｉｎｔａｖｉｓ ＭｕｌｔｉＰｅｐ ＲＳ）を用いてペプチドを合成する。次いで、高分子セルロースに共有結合した個々のペプチドの溶液を、コーティングされた顕微鏡スライド上にスポットする。ＣｅｌｌｕＳｐｏｔ（商標）合成は、３８４ウェル合成プレート中のアミノ修飾セルロースディスク上で９－フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化学を利用して段階的に実施した。各カップリングサイクルにおいて、対応するアミノ酸をＤＭＦ中のＤＩＣ／ＨＯＢｔの溶液で活性化した。カップリング工程の間に、未反応アミノ基を無水酢酸、ジイソプロピルエチルアミン及び１－ヒドロキシベンゾトリアゾールの混合物でキャッピングした。合成が完了すると、セルロースディスクを９６ウェルプレートに移し、側鎖脱保護のためトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ジクロロメタン、トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）及び水の混合物で処置した。切断溶液の除去後、セルロース結合ペプチドをＴＦＡ、ＴＦＭＳＡ、ＴＩＳ及び水の混合物と共に溶解し、ジイソプロピルエーテルで沈殿させ、ＤＭＳＯに再懸濁させる。続いて、ペプチド溶液を、Ｉｎｔａｖｉｓスライドスポッティングロボットを使用してＩｎｔａｖｉｓ ＣｅｌｌｕＳｐｏｔ（商標）スライド上にスポットした。
【0091】
線形エピトープ分析のため、上記のように調製したスライドを、ＢｅｎｃｈＭａｒｋ ＸＴ自動スライド調製システム（Ｖｅｎｔａｎａ）を用いて処置した。スライドを、ＯｐｔｉＶｉｅｗ ＤＡＢ ＩＨＣ検出キットに加えてＯｐｔｉＶｉｅｗ増幅キット（Ｖｅｎｔａｎａ）を用いて、標準化されたプロトコルに従って発色させた。簡潔には、スライドをシステムに「湿式充填」し、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中の１％ＢＳＡで３２分間ブロッキングした。抗体を抗体希釈剤（Ｖｅｎｔａｎａ）で１μｇ／ｍｌに希釈し、室温で１時間スライドに手動で適用し、Ａｍｐｌｉｆｉｅｒ及びＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｕｌｔｉｍｅｒ試薬の両方を、対比染色なしでそれぞれ８分間インキュベートした。比色染色を分析するため、ＣｈｅｍｉＤｏｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＢｉｏＲＡＤ）を使用した。
【0092】
高シグナルが望まれる場合、スライドを化学発光試薬で手動で処置した。簡潔には、スライドをエタノールで洗浄し、次いで、５ｍＬの１０×ウェスタンブロッキング試薬（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、ＴＢＳ中２．５ｇスクロース、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０で４℃で１６時間ブロッキングする前に、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ８）で洗浄した。スライドをＴＢＳ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０で洗浄し、その後、ＴＢＳ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０中の１μｇ／ｍＬの対応する抗体と共に周囲温度で２時間インキュベートし、続いてＴＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０で洗浄した。検出のため、スライドを抗ウサギ／抗マウス二次ＨＲＰ抗体（ＴＢＳ－Ｔで１：２００００）とインキュベートし、続いて化学発光基質ルミノールとのインキュベーションを行い、ＬｕｍｉＩｍａｇｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）で可視化した。ＥＬＩＳＡ陽性ＳＰＯＴを定量し、対応するペプチド配列の割り当てにより、抗体結合エピトープを同定した。
免疫組織化学
免疫組織化学
【0093】
ＢｅｎｃｈＭａｒｋ ＸＴ自動スライド調製システム（Ｖｅｎｔａｎａ）を使用して免疫組織化学を実施した。スライドを、標準化されたプロトコルに従って、ｉＶＩＥＷ ＤＡＢ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｖｅｎｔａｎａ）を用いて発色させた。簡単に説明すると、スライドをＣｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ １（ＣＣ１、Ｖｅｎｔａｎａ）で脱パラフィンし、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中１％ＢＳＡで３２分間ブロッキングした。抗体をＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｉｌｕｅｎｔ（Ｖｅｎｔａｎａ）で１μｇ／ｍｌに希釈し、室温で１時間、スライドに手動で適用した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7-1】
【図7-2】
【配列表】
【国際調査報告】