特表 2022-550077 組織再生用ハイドロゲル組成物及びこれを用いて製造された支持体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-11-30

(54)【発明の名称】組織再生用ハイドロゲル組成物及びこれを用いて製造された支持体

(51)【国際特許分類】

   A61L 27/52 20060101AFI20221122BHJP

   A61L 27/20 20060101ALI20221122BHJP

   A61L 27/24 20060101ALI20221122BHJP

   A61L 27/36 20060101ALI20221122BHJP

   A61L 27/22 20060101ALI20221122BHJP

【ＦＩ】

A61L27/52

A61L27/20

A61L27/24

A61L27/36 100

A61L27/22

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022519191

(86)(22)【出願日】2020-09-01

(85)【翻訳文提出日】2022-05-25

(86)【国際出願番号】 KR2020011731

(87)【国際公開番号】W WO2021060730

(87)【国際公開日】2021-04-01

(31)【優先権主張番号】10-2019-0118641

(32)【優先日】2019-09-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522077443

【氏名又は名称】リジェン バイオチャーム カンパニー，リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100091683

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼川 俊雄

(74)【代理人】

【識別番号】100179316

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 寛奈

(72)【発明者】

【氏名】キム，ギョン ギュン

(72)【発明者】

【氏名】チェ，ミョン

(72)【発明者】

【氏名】キム，サン ジン

【テーマコード（参考）】

4C081

【Ｆターム（参考）】

4C081AB11

4C081BA13

4C081BA16

4C081CD011

4C081CD081

4C081CD121

4C081CD27

4C081CD34

4C081CE02

4C081CE11

4C081DA12

(57)【要約】

本発明は組織再生用ハイドロゲル組成物及びこれを用いて製造された支持体に関し、より詳細には、陰イオン性多糖類、アミン化したヒアルロン酸及びコラーゲンを含んでなる。上記の成分からなるハイドロゲル組成物及びこれを用いて製造された支持体は、一般的な一端或いは両端にエポキシド基又はアミン基が存在する架橋剤の投入無しで自発的な架橋結合によって迅速に３次元的な構造を形成できるので、軟組織移植が可能な構造を提供する効果を奏する。
【選択図】 図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

陰イオン性多糖類１～１０重量％、アミン化したヒアルロン酸０．１～２重量％、及び、コラーゲン０．１～３重量％を含み、前記陰イオン性多糖類１００重量部に対して、２価陽イオン１５０～４００重量部及びメタノール０．１～２重量部がさらに含まれることを特徴とする組織再生用ハイドロゲル組成物。

【請求項2】

前記陰イオン性多糖類は、重量平均分子量が１００～５００ｋＤａであり、β－Ｄ－マンヌロン酸５０～７０重量％及びα－Ｌ－グルロン酸３０～５０重量％からなることを特徴とする、請求項１に記載の組織再生用ハイドロゲル組成物。

【請求項3】

前記アミン化したヒアルロン酸は、重量平均分子量が１００～５００ｋＤａであることを特徴とする、請求項１に記載の組織再生用ハイドロゲル組成物。

【請求項4】

前記コラーゲンは、重量平均分子量が１００～５００ｋＤａであり、アテロコラーゲンからなることを特徴とする、請求項１に記載の組織再生用ハイドロゲル組成物。

【請求項5】

前記２価陽イオンは、質量濃度が０．５～２％であり、アルカリ土金属又はその化合物からなることを特徴とする、請求項１に記載の組織再生用ハイドロゲル組成物。

【請求項6】

前記メタノールは質量濃度が４０～６０％であることを特徴とする、請求項１に記載の組織再生用ハイドロゲル組成物。

【請求項7】

前記組織再生用ハイドロゲル組成物１００重量部に対して、添加剤０．１～１重量部がさらに含まれ、前記添加剤は、細胞、細胞成長因子、緩衝剤、防腐剤、等張性調節剤、塩、酸化防止剤、滲透圧調節剤、乳化剤、湿潤剤、甘味料、香料剤、痲酔剤からなる群から選ばれる一つ以上からなることを特徴とする、請求項１に記載の組織再生用ハイドロゲル組成物。

【請求項8】

前記細胞は、幹細胞、感覚細胞、脳細胞、生殖細胞、上皮細胞及び免疫細胞からなる群から選ばれる一つ以上からなることを特徴とする、請求項７に記載の組織再生用ハイドロゲル組成物。

【請求項9】

請求項１～８のいずれか一項による組織再生用ハイドロゲル組成物で製造されることを特徴とする組織再生用ハイドロゲル支持体。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、組織再生用ハイドロゲル組成物及びこれを用いて製造された支持体に関し、より詳細には、一般的な一端或いは両端にエポキシド基又はアミン基が存在する架橋剤の投入無しで自発的な架橋結合によって迅速に３次元的な構造を形成できるので、軟組織移植が可能な構造を提供する組織再生用ハイドロゲル組成物及びこれを用いて製造された支持体に関する。

【背景技術】

【0002】

現在の組織工学は、様々な細胞で構成された機能を有する人体の組織と器官を作り、損傷した組織と器官を代替することが主な目標である。バイオプリンティングインクは、このような組織工学の目標を早めに実現可能に助ける技術であり、バイオプリンティングは、自動化したバイオプリンタ技術に基づいて、細胞と生体材料を用いて所望の３次元構造の組織と器官を作る。自動化したコンピュータバイオプリンティング技術は、インクジェットベースのプロセス（ｉｎｋｊｅｔ－ｂａｓｅｄ ｐｒｏｃｅｓｓ）、レーザーベースのプロセス（ｌａｓｅｒ－ｂａｓｅｄ ｐｒｏｃｅｓｓ）、及び押出ベースのプロセス（ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ－ｂａｓｅｄ ｐｒｏｃｅｓｓ）に発展してきた。このようなバイオプリンティングの基本プロセスは、コンピュータ利用設計モデルから取得されたイメージを模し、細胞と物質を含んでいるバイオインクを用いて３次元構造の形態を作ることである。コンピュータ利用設計モデルは、核磁気共鳴イメージ及びコンピュータ化した位相スキャニングにより、３Ｄ医療イメージを用いて作ることができる。ここで、生きている細胞を含む生体材料を、バイオプリンティングプロセスの基本材料として使用する。

【0003】

細胞を含む３Ｄプリントされた生体摸倣構造体が構造的側面と生物学的側面で機能を発揮するためには、バイオインクは、印刷適性、細胞適合性、生分解性、ゲル化特性／機械的物性、そして細胞の成長と分化を調節できる特性を有する必要がある。

【0004】

すなわち、バイオプリントされた構造物は、所望の模様を再生期間中に保持しなければならず、生体内での再生中に適切な速度で分解されなければならない。現在活用されているバイオインクとしては、スキャフォールドに基づく水和ゲル（ｈｙｄｒｏｇｅｌ）、マイクロキャリア、細胞の除去された細胞外基質（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）などがあり、スキャフォ－ルド（ｓｃａｆｆｏｌｄ）無しで細胞集合体をバイオインクとして使用することもある。

【0005】

水和ゲルは、商品化しバイオインクの代表であり、生体適合性に優れ、人体の組織と類似な構造を有しており、細胞及び生理活性物質のカプセル化が容易である。コラーゲン、ゼラチン、アルジネート、ヒアルロン酸とポリ（エチレングルコール）ジアクリレート（ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）ｄｉａｃｒｙｌａｔｅ；ＰＥＧＤＡ））、コラーゲンメタクリロイル（ｃｏｌｌａｇｅｎ ｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｙｌ；ＣｏｌｌａｇｅｎＭＡ）、ゼラチンメタクリロイル（ｇｅｌａｔｉｎ ｍｅｔｈａｃａｙｌｏｙｌ；ＧｅｌＭＡ）などが代表的な水和ゲルバイオインク製品である。

【0006】

押出ベースのプリンティングは、最も一般的に３Ｄバイオプリンティングで用いられる方法であり、商品化した３Ｄバイオプリンタは、たいてい押出ベースのプリンティングプロセスを使用する。押出ベースのプリンティングは、空気圧又は機械的な力を用いて、注射器中のバイオインクを細い糸状に押出することで、３Ｄ細胞構造体を製造する。押出ベースのプリンティングでは、幅広い粘性（３０^－６×１０^６ｍＰａ・ｓ）と高濃度の細胞と細胞楕円集合体（ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ）のバイオインクを使用することができる。ただし、押出ベースのプリンティングは、低い解像度（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ：２００～１０００μｍ）を有し、押出過程中に細胞にせん断応力を加えることがあり、細胞の生存力に影響を及ぼし得る。このため、押出ベースのプリンティングに用いられるバイオインクは、せん断減少特性（ｓｈｅａｒ ｔｈｉｎｎｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）を有するべきであり、プリンティング後に、プリントされた形態をよく保持し、細胞をせん断応力から保護しなければならない。

【0007】

インクジェットベースのプリンティングは、圧電気（ｐｉｅｚｏｅｌｅｃｔｒｉｃ）又は熱（ｔｈｅｒｍａｌ）を用いて、細胞を含むバイオインクから小さい水滴（１０～５０μｍ）を生成し、ノズルから噴射する原理を利用する。インクジェットベースのプリンティングプロセス期間においてバイオインク中の細胞は、短い期間（２μｓ）の高熱に露出されるが、細胞生存性に大きく影響を受けない。インクジェットベースのプリンティングにおいてバイオインクは低い粘性（１０ｍＰａ．Ｓ未満）を有しなければならず、低い細胞濃度（１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ未満）を使用しなければならないという短所がある。

【0008】

レーザーベースのプリンティングは、ノズルが不要であり、ノズルによって塞がる現象がなく、ノズルを通過しないので、バイオインク中の細胞がせん断応力に露出されないという長所がある。レーザーベースのプリンティングは、パルスされたレーザービームを、金又はチタンの吸収層とバイオインク層とから構成されたドナーリボン（ｄｏｎｏｒ ｒｉｂｂｏｎ）に晒して泡を生成・推進する原理を利用する。レーザーベースのプリンティングは、１～３００ｍＰａ．ｓの粘性と１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞の濃度を持つバイオインクを使用することができ、１０～１００μｍの解像度を有する。高エネルギーのレーザーは一時的加熱をバイオインクに与えることができ、熱伝導性が大きくないバイオインクは、インク中の細胞生存性を向上させることができる。

【0009】

現在用いられているプリンティング技術の共通点は、生体適合性素材を用いたバイオインクの重要性にある。

【0010】

このような３次元支持体は、組織類似器官及び移植可能な構造体を精密に製造するための素材を用いて作製した。このような技術は、人間の実際の組織をほぼ同一に摸倣した微細及び巨大組織構造体を生成することを可能にしている。

【0011】

しかしながら、このような細胞を運搬する支持体、すなわちバイオインクは、その活用度において多くの限界点を示している。このようなバイオ素材の限界点である活用範囲を広めるために、バイオプリンティング及び注射注入が可能なハイドロゲル複合体が必要な現状にある。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0012】

【特許文献1】韓国公開特許第１０－２０１８－０１１７４１７号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0013】

本発明の目的は、一般的な一端或いは両端にエポキシド基又はアミン基が存在する架橋剤の投入無しで自発的な架橋結合によって迅速に３次元的な構造を形成できるので、軟組織移植が可能な構造を提供する組織再生用ハイドロゲル組成物及びこれを用いて製造された支持体を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0014】

本発明の目的は、陰イオン性多糖類、アミン化したヒアルロン酸及びコラーゲンを含むことを特徴とする組織再生用ハイドロゲル組成物を提供することによって達成される。

【0015】

本発明の好ましい特徴によれば、前記組織再生用ハイドロゲル組成物は、陰イオン性多糖類１～１０重量％、アミン化したヒアルロン酸０．１～２重量％、及びコラーゲン０．１～３重量％を含むものとする。

【0016】

本発明のより好ましい特徴によれば、前記陰イオン性多糖類は、重量平均分子量が１００～５００ｋＤａであり、β－Ｄ－マンヌロン酸５０～７０重量％、及びα－Ｌ－グルロン酸３０～５０重量％からなるものとする。

【0017】

本発明のさらに好ましい特徴によれば、前記アミン化したヒアルロン酸は、重量平均分子量が１００～５００ｋＤａであるものとする。

【0018】

本発明のさらに好ましい特徴によれば、前記コラーゲンは、重量平均分子量が１００～５００ｋＤａであり、アテロコラーゲンからなるものとする。

【0019】

本発明のさらに好ましい特徴によれば、前記組織再生用ハイドロゲル組成物には、前記組織再生用ハイドロゲル組成物に含まれた陰イオン性多糖類１００重量部に対して、２価陽イオン１５０～４００重量部及びメタノール０．１～２重量部がさらに含まれるものとする。

【0020】

本発明のさらに好ましい特徴によれば、前記２価陽イオンは、質量濃度が０．５～２％であり、アルカリ土金属又はその化合物からなるものとする。

【0021】

本発明のさらに好ましい特徴によれば、前記メタノールは、質量濃度が４０～６０％であるものとする。

【0022】

本発明のさらに好ましい特徴によれば、前記組織再生用ハイドロゲル組成物には、前記組織再生用ハイドロゲル組成物１００重量部に対して、添加剤０．１～１重量部がさらに含まれ、前記添加剤は、細胞、細胞成長因子、緩衝剤、防腐剤、等張性調節剤、塩、酸化防止剤、滲透圧調節剤、乳化剤、湿潤剤、甘味料、香料剤、痲酔剤からなる群から選ばれる一つ以上からなるものとする。

【0023】

本発明のさらに好ましい特徴によれば、前記細胞は、幹細胞、感覚細胞、脳細胞、生殖細胞、上皮細胞及び免疫細胞からなる群から選ばれる一つ以上からなるものとする。

【0024】

また、本発明の目的は、前記組織再生用ハイドロゲル組成物で製造されることを特徴とする組織再生用ハイドロゲル支持体を提供することによって達成される。

【発明の効果】

【0025】

本発明に係る組織再生用ハイドロゲル組成物及びこれを用いて製造された支持体は、一般的な一端或いは両端にエポキシド基又はアミン基が存在する架橋剤の投入無しで自発的な架橋結合によって迅速に３次元的な構造を形成できるので、軟組織移植が可能な構造を提供する優れた効果を奏する。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1】本発明の製造例５で製造されたハイドロゲル支持体を撮影した写真である。

【図2】本発明の製造例５で進行されるハイドロゲル支持体の製造過程を示す概略図である。

【図3】２価陽イオンの濃度による圧縮強度を測定して示すグラフである。

【図4】本発明の製造例３で製造されたハイドロゲル組成物を撮影した写真である。

【図5】製造例３で製造されたハイドロゲル組成物を凍結乾燥後に光学顕微鏡で撮影した写真である。

【図6】本発明の製造例５で製造されたハイドロゲル支持体を凍結乾燥後に光学顕微鏡で撮影した写真である。

【発明を実施するための形態】

【0027】

以下には、本発明の好ましい実施例と各成分の物性を詳細に説明するが、これは、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が発明を容易に実施できる程度に詳細に説明するためのものであり、これによって本発明の技術的な思想及び範ちゅうが限定されることを意味するものではない。

【0028】

本発明に係る組織再生用ハイドロゲル組成物は、陰イオン性多糖類、アミン化したヒアルロン酸及びコラーゲンを含んでなり、陰イオン性多糖類１～１０重量％、アミン化したヒアルロン酸０．１～２重量％、及びコラーゲン０．１～３重量％を含んでなることが好ましい。

【0029】

上記のように、陰イオン性多糖類、アミン化したヒアルロン酸及びコラーゲンからなるハイドロゲルを用いることにより、速い架橋結合及びプリンティングされた構造物を保持する機械的特性を示すと同時に、皮膚軟組織に注射注入が可能な特性を示し、バイオ素材の限界点を解決することができる。

【0030】

また、上記の成分からなるハイドロゲル組成物に組織由来細胞外基質成分を添加する又は特定の細胞分化調節物質を添加することが可能であり、特定組織への分化を誘導することもできる。

【0031】

また、本発明で使われる「ハイドロゲル」とは、薬物伝達及び生体組織的合成材料として使用可能な水膨潤性高分子のことを意味する。このような水膨潤性高分子は、水を吸収するか水に溶解されない高分子、すなわち十分の水膨潤性を保有している親水性高分子を意味し、細胞及び成長因子とブレンディング可能なので、より生体適合性を有する支持体を提供することができる。

【0032】

前記陰イオン性多糖類は１～１０重量％が含まれ、重量平均分子量が１００～５００ｋＤａであり、β－Ｄ－マンヌロン酸（β－Ｄ－Ｍａｎｎｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）５０～７０重量％及びα－Ｌ－グルロン酸（α－Ｌ－Ｇｕｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）３０～５０重量％からなるが、前記陰イオン性多糖類の含有量は、本発明に係る組織再生用ハイドロゲル組成物全体に対して１～１０重量％を占め、好ましくは４～１０重量％を占めることができる。

【0033】

上記の陰イオン性多糖類の含有量が１重量％未満である又は１０重量％を超えると、２価陽イオン添加時にエグボックス（ｅｇｇ ｂｏｘ）が形成されずに済むか、局所的にエグボックスが形成されても、水不溶性ハイドロゲルが形成されずに済む。

【0034】

前記アミン化したヒアルロン酸は、０．１～２重量％が含まれ、重量平均分子量が１００～５００ｋＤａを示すが、アミン化したヒアルロン酸は、ヒアルロン酸の水酸基水素原子中の少なくとも一部が、４級アンモニウム陽イオン基を有する基に置換されたものを使用することが好ましい。

【0035】

上記のように、４級アンモニウム陽イオン基を有するヒアルロン酸は、第１ハイドロゲルの０．１～２重量％が含まれ、０．５～１重量％が含まれることが好ましいが、上記のアミン化したヒアルロン酸の含有量が２重量％を超えると、ハイドロゲル組成物の陰イオン性を有する多糖類との共存により、アミン化したヒアルロン酸との両者の静電的相互作用によってポリイオンコンプレックスを形成し、局所的に不均一な水不溶性ゲルが沈殿し、前記アミン化したヒアルロン酸の含有量が０．１重量％未満であると、溶媒上でコラーゲンとのβシートが正常に形成されなくなる問題点が発生する。

【0036】

前記コラーゲンは０．１～３重量％が含まれ、重量平均分子量が１００～５００ｋＤａであるアテロコラーゲンからなるが、アテロコラーゲンのうち、第１型、第２型、第３型の１つ又はそれ以上を任意に選択して使用することができ、官能基末端にコハク酸或いは硫化結合で置換されたものを使用することが好ましい。

【0037】

前記コラーゲンは、組織再生用ハイドロゲル組成物中に０．１～３重量％で含まれ、０．５～１．５重量％含まれることが好ましいが、前記コラーゲンの含有量が３重量％を超えると、溶媒によってβシートへの転換が急激に起きて部分的に不均一となり、均一なハイドロゲル組成物及び支持体を製造できなく、前記コラーゲンの含有量が０．１重量％未満であると、ハイドロゲル組成物状態では均一な形状を示すが、支持体を製造する過程で不均一な繊維化現象が発生する問題点がある。

【0038】

また、本発明に係る組織再生用ハイドロゲル組成物には、前記組織再生用ハイドロゲル組成物に含まれた陰イオン性多糖類１００重量部に対して、２価陽イオン１５０～４００重量部及びメタノール０．１～２重量部がさらに含まれてよいが、上記のように、陽イオンがさらに含まれると、本発明に係る組織再生用ハイドロゲル組成物が水不溶化される。

【0039】

このとき、前記２価陽イオンは質量濃度が０．５～２％であり、アルカリ土金属又はその化合物からなることが好ましく、前記アルカリ土金属には、ベリリウム、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウム及びラジウムからなることがより好ましい。

【0040】

また、前記メタノールは、組織再生用ハイドロゲル組成物を、上記のように水不溶化する過程でハイドロゲル組成物の構造に変化を与える役割を担うが、質量濃度が４０～６０％であることが好ましい。

【0041】

上記の２価陽イオンとメタノールを混合してハイドロゲル組成物を水不溶化する過程は特に限定されないが、製品の均一性及び大量生産化に適している製造方式を選択して使用することが好ましく、より詳細には、ハイドロゲル組成物を製造した後に２価陽イオンを噴射し、メタノールを滴加した後、０～６０℃の温度で－０．０５Ｍｐａの陰圧を加えてメタノールを除去する過程からなることがより好ましい。

【0042】

このとき、上記の温度及び陰圧の条件は、本発明の権利範囲を限定するものでなく、様々に変更可能であり、前記メタノール除去工程は、温度及び陰圧の方法に限定されず、透析膜を用いて除去する工程も利用可能である。

【0043】

また、本発明に係る組織再生用ハイドロゲル組成物には、前記組織再生用ハイドロゲル組成物１００重量部に対して、添加剤０．１～１重量部がさらに含まれてよく、前記添加剤は、細胞、細胞成長因子、緩衝剤、防腐剤、等張性調節剤、塩、酸化防止剤、滲透圧調節剤、乳化剤、湿潤剤、甘味料、香料剤、痲酔剤からなる群から選ばれる一つ以上からなることが好ましい、

【0044】

このとき、前記細胞は、幹細胞、感覚細胞、脳細胞、生殖細胞、上皮細胞及び免疫細胞からなる群から選ばれる一つ以上からなってよい。

【0045】

また、前記痲酔剤は、例えば、アミノアミド（ａｍｉｎｏａｍｉｄｅ）局所痲酔又はアミノエステル（ａｍｉｎｏｅｓｔｅｒ）局所痲酔のような局所痲酔剤であってよい。局所痲酔剤の例に、リドカイン（ｌｉｄｏｃａｉｎｅ）、アムブカイン（ａｍｂｕｃａｉｎｅ）、アモラノン（ａｍｏｌａｎｏｎｅ）、アミロカイン（ａｍｙｌｏｃａｉｎｅ）、ベノキシネート（ｂｅｎｏｘｉｎａｔｅ）、ベンゾカイン（ｂｅｎｓｏｃａｉｎｅ）、べトキシカイン（ｂｅｔｏｘｙｃａｉｎｅ）、ビフェナミン（ｂｉｐｈｅｎａｍｉｎｅ）、ブピバカイン（ｂｕｐｉｖａｃａｉｎｅ）、ブタカイン（ｂｕｔａｃａｉｎｅ）、ブタンホウ素（ｂｕｔａｍｂｅｎ）、ブタニリカイン（ｂｕｔａｎｉｌｉｃａｉｎｅ）、ブテタミン（ｂｕｔｅｔｈａｍｉｎｅ）、ブトキシカイン（ｂｕｔｏｘｙｃａｉｎｅ）、カチカイン（ｃａｒｔｉｃａｉｎｅ）、クロロプロカイン（ｃｈｌｏｒｏｐｒｏｃａｉｎｅ）、コカエチレン（ｃｏｃａｅｔｈｙｌｅｎｅ） 、シクロメチカイン（ｃｙｃｌｏｍｅｔｈｙｃａｉｎｅ）、ジブカイン（ｄｉｂｕｃａｉｎｅ）、ジメチコキノン（ｄｉｍｅｔｈｉｓｏｑｕｉｎ）、ジメトカイン（ｄｉｍｅｔｈｏｃａｉｎｅ）、ジフェロドン（ｄｉｐｅｒｏｄｏｎ）、ジシクロミン（ｄｉｃｙｃｌｏｍｉｎｅ）、エゴニジン（ｅｃｇｏｎｉｄｉｎｅ）、エゴニン（ｅｃｇｏｎｉｎｅ）、エチルクロリド（ｅｔｈｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、エチドカイン（ｅｔｉｄｏｃａｉｎｅ）、β－ユカイン（β－ｅｕｃａｉｎｅ）、ユープロシン（ｅｕｐｒｏｃｉｎ）、フェナルコミン（ｆｅｎａｌｃｏｍｉｎｅ）、フォルモカイン（ｆｏｒｍｏｃａｉｎｅ）、ヘキシルカイン（ｈｅｘｙｌｃａｉｎｅ），ヒドロキシテトラカイン（ｈｙｄｒｏｘｙｔｅｔｒａｃａｉｎｅ）、イソブチルｐ－アミノベンゾエート（ｉｓｏｂｕｔｙｌ ｐ－ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏａｔｅ）、ロイシノカインメシレート（ｌｅｕｃｉｎｏｃａｉｎｅ ｍｅｓｙｌａｔｅ）、レボキサドロール（ｌｅｖｏｘａｄｒｏｌ）、リドカイン（ｌｉｄｏｃａｉｎｅ）、メピバカイン（ｍｅｐｉｖａｃａｉｎｅ） 、メプリルカイン（ｍｅｐｒｙｌｃａｉｎｅ）、メタブトキシカイン（ｍｅｔａｂｕｔｏｘｙｃａｉｎｅ）、メチルクロリド（ｍｅｔｈｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ミルテカイン（ｍｙｒｔｅｃａｉｎｅ）、ネパイン（ｎａｅｐａｉｎｅ）、オクタカイン（ｏｃｔａｃａｉｎｅ）、オルソカイン（ｏｒｔｈｏｃａｉｎｅ）、オキセサゼイン（ｏｘｅｔｈａｚａｉｎｅ）、パレトキシカイン（ｐａｒｅｔｈｏｘｙｃａｉｎｅ）、フェナカイン（ｐｈｅｎａｃａｉｎｅ）、フェノール（ｐｈｅｎｏｌ）、ピペロカイン（ｐｉｐｅｒｏｃａｉｎｅ）、ピリドカイン（ｐｉｒｉｄｏｃａｉｎｅ）、ポリドカノール（ｐｏｌｉｄｏｃａｎｏｌ）、パラモキシン（ｐｒａｍｏｘｉｎｅ）、プリロカイン（ｐｒｉｌｏｃａｉｎｅ）、プロカイン（ｐｒｏｃａｉｎｅ）、プロパノカイン（ｐｒｏｐａｎｏｃａｉｎｅ）、プロパラカイン（ｐｒｏｐａｒａｃａｉｎｅ）、プロピポカイン（ｐｒｏｐｉｐｏｃａｉｎｅ）、プロポキシカイン（ｐｒｏｐｏｘｙｃａｉｎｅ）、プソイドコカイン（ｐｓｅｕｄｏｃｏｃａｉｎｅ）、ピロカイン（ｐｙｒｒｏｃａｉｎｅ）、ロピバカイン（ｒｏｐｉｖａｃａｉｎｅ）、サリチルアルコール（ｓａｌｉｃｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）、テトラカイン（ｔｅｔｒａｃａｉｎｅ）、トリカイン（ｔｏｌｙｃａｉｎｅ）、トリメカイン（ｔｒｉｍｅｃａｉｎｅ）、ゾラミン（ｚｏｌａｍｉｎｅ）、それらの組み合わせ、及びそれらの塩があり、これらに限定されない。アミノエステル局所麻酔剤の例としては、プロカイン（ｐｒｏｃａｉｎｅ）、クロロプロカイン（ｃｈｌｏｒｏｐｒｏｃａｉｎｅ）、コカイン（ｃｏｃａｉｎｅ）、シクロメチルカイン（ｃｙｃｌｏｍｅｔｈｙｃａｉｎｅ）、ジメトカイン（ラロカイン）（ｄｉｍｅｔｈｏｃａｉｎｅ（ｌａｒｏｃａｉｎｅ））、プロポキシカイン（ｐｒｏｐｏｘｙｃａｉｎｅ）、プロカイン（ノボカイン）（ｐｒｏｃａｉｎｅ（ｎｏｖｏｃａｉｎｅ））、プロパラカイン（ｐｒｏｐａｒａｃａｉｎｅ）、テトラカイン（アメトカイン）（ｔｅｔｒａｃａｉｎｅ（ａｍｅｔｈｏｃａｉｎｅ））があり、これに限定されない。アミノアミド（ａｍｉｎｏａｍｉｄｅ）の局所麻酔剤の非限定的な例としては、アーティカイン（ａｒｔｉｃａｉｎｅ）、ブピバカイン（ｂｕｐｉｖａｃａｉｎｅ）、シンコカイン（ジブカイン）（ｃｉｎｃｈｏｃａｉｎｅ（ｄｉｂｕｃａｉｎｅ））、エチドカイン（ｅｔｉｄｏｃａｉｎｅ）、レボブピカイン（ｌｅｖｏｂｕｐｉｖａｃａｉｎｅ）、リドカイン（リグノカイン）（ｌｉｄｏｃａｉｎｅ （ｌｉｇｎｏｃａｉｎｅ））、メピバカイン（ｍｅｐｉｖａｃａｉｎｅ）、ピペロカイン（ｐｉｐｅｒｏｃａｉｎｅ）、プリロカイン（ｐｒｉｌｏｃａｉｎｅ）、ロピバカイン（ｒｏｐｉｖａｃａｉｎｅ）、トリメカイン（ｔｒｉｍｅｃａｉｎｅ））、又はそれらの組み合わせが含まれる。

【0046】

上記のような成分からなる添加剤が含まれると、本発明に係るハイドロゲル組成物が皮膚の状態を改善する、シワを埋める、或いは顔面又は身体輪郭を形成する目的で利用可能である。のみならず、真皮充填剤として有用に利用可能である。

【0047】

以下では、本発明に係る組織再生用ハイドロゲル組成物の製造方法及びその製造方法で製造されたハイドロゲル組成物を用いて支持体を製造する方法とそれぞれの物性を、実施例を挙げて説明する。

【0048】

＜製造例１＞注射注入用ハイドロゲル組成物の製造
重量平均分子量が１００ｋＤａ～５００ｋＤａである陰イオン性多糖類（β－Ｄ－マンヌロン酸とα－Ｌ－グルロン酸が５０：５０で混合）７重量％を常温で混合した後、重量平均分子量が１００ｋＤａ～５００ｋＤａであるアミン化したヒアルロン酸を０．７重量％混合して混合物を製造し、前記混合物のｐＨを６．０を保持した後、重量平均分子量が１００ｋＤａ～５００ｋＤａであるアテロ第１型コラーゲン１重量％を混合して、注射注入用ハイドロゲル組成物を製造した。

【0049】

＜製造例２＞添加剤が含まれた注射注入用ハイドロゲル組成物の製造
前記製造例１で製造された注射注入用ハイドロゲル組成物１００重量部に、添加剤（緩衝剤、滲透圧調節剤、乳化剤、リドカインが混合）０．５重量部を混合して、添加剤が含まれた注射注入用ハイドロゲル組成物を製造した。

【0050】

＜製造例３＞注射注入用不水溶性ハイドロゲル組成物の製造
前記製造例１で製造されたハイドロゲル組成物に、質量濃度が１％である塩化カルシウムを常温で混合し、１００ｒｐｍの速度で撹拌して反応させた後に、質量濃度６０％のメタノールを投入した後、常温で５００ｒｐｍの速度で撹拌し、撹拌が完了した後、透析膜或いは回転式真空蒸発器で残留メタノールを除去し、注射注入用の不水溶性ハイドロゲル組成物を製造した。

【0051】

＜製造例４＞添加剤が含まれた注射注入用不水溶性ハイドロゲル組成物の製造
前記製造例２で製造されたハイドロゲル組成物に、質量濃度が１％である塩化カルシウムを常温で混合し、１００ｒｐｍの速度で撹拌して反応させた後に、質量濃度６０％のメタノールを投入した後、常温で５００ｒｐｍの速度で撹拌し、撹拌が完了した後、透析膜或いは回転式真空蒸発器で残留メタノールを除去し、注射注入用不水溶性ハイドロゲル組成物を製造した。

【0052】

＜製造例５＞３Ｄプリンタ用ハイドロゲル支持体の製造
第１溶液（重量平均分子量が１００ｋＤａ～５００ｋＤａであるβ－Ｄ－マンヌロン酸とα－Ｌ－グルロン酸を常温で５０：５０に混合して製造）７重量％を、質量濃度が１％である塩化カルシウムと常温で混合し、１００ｒｐｍの速度で撹拌して反応させた後に乾燥させて支持体を製造し、製造された支持体を、第２溶液（重量平均分子量が１００ｋＤａ～５００ｋＤａであるアミン化したヒアルロン酸のｐＨを６．０を保持した後、重量平均分子量が１００ｋＤａ～５００ｋＤａであるアテロ第１型コラーゲン１重量％を混合して製造）に浸漬して支持体内部に第２溶液を浸透させた後に、第２溶液の浸透した支持体を質量濃度６０％のメタノールに浸漬し、真空乾燥させて、３Ｄプリンタ用ハイドロゲル支持体を製造した。

【0053】

＜製造例６＞添加剤が含まれた３Ｄプリンタ用ハイドロゲル支持体の製造
前記製造例５と同一に行うが、第１溶液として重量平均分子量が１００ｋＤａ～５００ｋＤａであるβ－Ｄ－マンヌロン酸とα－Ｌ－グルロン酸を常温で５０：５０に混合して製造された混合物に、添加剤（緩衝剤、滲透圧調節剤、乳化剤、リドカインが混合）０．５重量部を混合して製造されたものを使用し、添加剤が含まれた３Ｄプリンタ用ハイドロゲル支持体を製造した。

【0054】

＜実施例１＞２価陽イオンの濃度による製造
２価陽イオンの濃度による固体状態の変化を測定し、下記の表１に示した。

【0055】

【表1】

【0056】

前記表１には、２価陽イオンの濃度及びβ－Ｄ－マンヌロン酸、α－Ｌ－グルロン酸混合物濃度による状態変化を示しているが、前記β－Ｄ－マンヌロン酸、α－Ｌ－グルロン酸混合物の濃度が第１ハイドロゲル中に４重量％であり、カルシウムイオンの質量濃度が１．０～１．５％であるとき、図４のような状態になった。

【0057】

また、前記β－Ｄ－マンヌロン酸、α－Ｌ－グルロン酸混合物の濃度が、ハイドロゲル組成物中に６重量％であり、カルシウムイオンの質量濃度が０．５～１．０％であるとき、図４のような状態になったし、カルシウムイオンの質量濃度が１．５％のときに、図１のように固いゲルを形成した。

【0058】

また、前記β－Ｄ－マンヌロン酸、α－Ｌ－グルロン酸混合物の濃度がハイドロゲル組成物中に８重量％であり、カルシウムイオンの質量濃度が０．５％であるときに、図４のような状態になり、カルシウムイオンの濃度が１．０％のときに、図１のような固いゲルを形成した。

【0059】

また、前記β－Ｄ－マンヌロン酸、α－Ｌ－グルロン酸混合物の濃度がハイドロゲル組成物中に１０重量％であり、カルシウムイオンの質量濃度が０．５％であるときに、図４のような状態になった。

【0060】

前記表１示したように、β－Ｄ－マンヌロン酸、α－Ｌ－グルロン酸混合物の濃度及び２価陽イオンの濃度によって注射注入用又は３Ｄプリンタ用支持体へと適用範囲が区分される。このとき、前記カルシウムイオンの投入量は、β－Ｄ－マンヌロン酸、α－Ｌ－グルロン酸の混合物と３：７に投入する条件であった。

【0061】

＜実施例２＞２価陽イオンの濃度によるモルフォロジー変化
前記実施例１でβ－Ｄ－マンヌロン酸、α－Ｌ－グルロン酸の混合物の濃度が、ハイドロゲル組成物に対して４、６、８、１０重量％であり、２価陽イオンの濃度によるモルフォロジー変化を測定した。

【0062】

【表2】

【0063】

前記表２示したように、β－Ｄ－マンヌロン酸、α－Ｌ－グルロン酸の混合物の濃度及び２価陽イオンの濃度によってゲルの引張強度はたいてい増加するが、混合物の濃度が高くなると同時に２価陽イオンの濃度が高くなると、β－Ｄ－マンヌロン酸、α－Ｌ－グルロン酸の内部カルボキシル基と２価陽イオンが、急激なエグボックスが起きて不均一なゲル化が進行されることが分かる。

【0064】

＜実施例３＞β－Ｄ－マンヌロン酸、α－Ｌ－グルロン酸、アミン化したヒアルロン酸及びコラーゲン混合物のモルフォロジー変化

【0065】

【表3】

【0066】

前記表３示したように、前記表２と同様に、β－Ｄ－マンヌロン酸、α－Ｌ－グルロン酸の混合物の濃度及び２価陽イオンの濃度によってゲルの引張強度はたいてい増加するが、混合物の濃度が高くなると同時に２価陽イオンの濃度が高くなると、β－Ｄ－マンヌロン酸、α－Ｌ－グルロン酸の内部カルボキシル基と２価陽イオンが、急激なエグボックスが起きて不均一なゲル化が進行されることが分かる。すなわち、２価陽イオンの濃度によるエグボックス化に影響を受けないことを示している資料である。

【0067】

＜試験例１＞製造例３のハイドロゲル細胞毒性実験
前記製造例３で製造されたハイドロゲル組成物を１０ｗｔ％でＰＢＳに溶解し、この混合物にフィブロブラストを１×１０^６／１００μｌ追加した。細胞の混ざっている液にＤＥＭＥ（ＦＢＳ １０％、抗生物質１％）培地で３日間培養後に、Ｌｉｖｅ ａｎｄ Ｄｅａｄキットを用いて細胞毒性実験を実施した。

【0068】

観察の結果、３日後に、細胞生存率が平均して９６％以上と示された。

【0069】

＜試験例２＞製造例５のハイドロゲル支持体の細胞毒性実験
前記製造例５で製造されたハイドロゲル支持体を１０ｗｔ％でＰＢＳに溶解し、この混合物にフィブロブラストを１×１０^６／１００μｌ追加した。細胞が混ざっている溶液にＤＥＭＥ（ＦＢＳ １０％、抗生物質１％）培地で３日間培養後に、Ｌｉｖｅ ａｎｄ Ｄｅａｄキットを用いて細胞毒性実験を実施した。

【0070】

観察の結果、３日後に、細胞生存率が平均して９８％以上と示された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【国際調査報告】