特表 2022-550494 難培養性嫌気性微生物の高収率培養のための培地サプリメント及びそれを含む培地組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-12-02

(54)【発明の名称】難培養性嫌気性微生物の高収率培養のための培地サプリメント及びそれを含む培地組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/20 20060101AFI20221125BHJP

【ＦＩ】

C12N1/20 A

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021552153

(86)(22)【出願日】2020-12-28

(85)【翻訳文提出日】2021-09-02

(86)【国際出願番号】 KR2020019214

(87)【国際公開番号】W WO2022102866

(87)【国際公開日】2022-05-19

(31)【優先権主張番号】10-2020-0150111

(32)【優先日】2020-11-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521022956

【氏名又は名称】エンテロバイオーム インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＥＮＴＥＲＯＢＩＯＭＥ ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】110002066

【氏名又は名称】弁理士法人筒井国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ソ，ジョ グ

(72)【発明者】

【氏名】イ，ド キュン

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA21X

4B065AC20

4B065BB12

4B065BB40

4B065CA41

4B065CA44

(57)【要約】

【課題】
【解決手段】本発明は、Ｎ－アセチルヘキソサミン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－システイン及びコバラミンを含む嫌気性微生物の高収率培養用培地サプリメント、これを含む難培養性嫌気性微生物の高収率培養用培地組成物及び培養方法に関し、本発明によれば、高収率培養が非常に困難な嫌気性微生物の高濃度培養が可能で、コストに対して効率的で、特に食品及び医薬品用途に使用するのに適した難培養性嫌気性微生物を大量に培養できる画期的な方法を提供しうる。
【選択図】 図３

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｎ－アセチルヘキソサミン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－システイン及びコバラミンを含む、難培養性嫌気性微生物の高収率培養用培地サプリメント。

【請求項2】

前記培地サプリメントは、Ｎ－アセチルヘキソサミン５ｇ／Ｌ、Ｌ－アスパラギン酸８ｇ／Ｌ、Ｌ－システイン０．５ｇ／Ｌ及びコバラミン０．０００１～０．００５ｇ／Ｌを含むことを特徴とする、請求項１に記載の難培養性嫌気性微生物の高収率培養用培地サプリメント。

【請求項3】

前記嫌気性微生物は、絶対－嫌気性微生物であることを特徴とする、請求項１に記載の難培養性嫌気性微生物の高収率培養用培地サプリメント。

【請求項4】

前記嫌気性微生物は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）、アナエロスティペス・カカエ（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ ｃａｃｃａｅ）、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）、ブチリシコッカス・プリセコルム（Ｂｕｔｙｒｉｃｉｃｏｃｃｕｓ ｐｕｌｌｉｃａｅｃｏｒｕｍ）、ロゼブリア・イヌリニボランス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｕｌｉｎｉｖｏｒａｎｓ）、ロゼブリア・ホミニス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｈｏｍｉｎｉs）、またはビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）であることを特徴とする、請求項３に記載の難培養性嫌気性微生物の高収率培養用培地サプリメント。

【請求項5】

植物ペプトン、酵母エキス、リン酸水素二カリウムを含む培地組成物であって、炭素源としてフルクトースとラクトースを含み、サプリメントとしてＮ－アセチルヘキソサミン、Ｌ－アスパラギン酸とＬ－システインのアミノ酸混合物及びコバラミンを含むことを特徴とする嫌気性微生物の高収率培養用培地組成物。

【請求項6】

前記嫌気性微生物は、絶対－嫌気性微生物であることを特徴とする、請求項５に記載の難培養性嫌気性微生物の高収率培養用培地組成物。

【請求項7】

前記嫌気性微生物は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）、アナエロスティペス・カカエ（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ ｃａｃｃａｅ）、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）、ブチリシコッカス・プリセコルム（Ｂｕｔｙｒｉｃｉｃｏｃｃｕｓ ｐｕｌｌｉｃａｅｃｏｒｕｍ）、ロゼブリア・イヌリニボランス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｕｌｉｎｉｖｏｒａｎｓ）、ロゼブリア・ホミニス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｈｏｍｉｎｉs）、またはビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）であることを特徴とする、請求項５に記載の難培養性嫌気性微生物の高収率培養用培地組成物。

【請求項8】

前記培地組成物は、植物ペプトン２０ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム２．５ｇ／Ｌ、フルクトース２．５ｇ／Ｌ、ラクトース２．５ｇ／Ｌ、Ｎ－アセチルヘキソサミン５ｇ／Ｌ、Ｌ－アスパラギン酸８ｇ／Ｌ、Ｌ－システイン０．５ｇ／Ｌ、及びコバラミン０．０００１～０．００５ｇ／Ｌを含有することを特徴とする、請求項５に記載の難培養性嫌気性微生物の高収率培養用培地組成物。

【請求項9】

前記植物ペプトンは、大豆ペプトン（ｓｏｙ ｐｅｐｔｏｎｅ）、小麦ペプトン（ｗｈｅａｔ ｐｅｐｔｏｎｅ）、綿ペプトン（ｃｏｔｔｏｎ ｐｅｐｔｏｎｅ）、エンドウペプトン（ｐｅａ ｐｅｐｔｏｎｅ）、ソラマメペプトン（ｂｒｏａｄｂｅａｎ ｐｅｐｔｏｎｅ）、ルピンペプトン（ｌｕｐｉｎ ｐｅｐｔｏｎｅ）、及びジャガイモペプトン（ｐｏｔａｔｏ ｐｅｐｔｏｎｅ）から構成されたグループから選ばれることを特徴とする、請求項５に記載の難培養性嫌気性微生物の高収率培養用培地組成物。

【請求項10】

前記培地組成物は、炭素源としてフルクトースの代わりにマルトースを含むか、またはフルクトースに加えてマルトースをさらに含むことを特徴とする、請求項５に記載の難培養性嫌気性微生物の高収率培養用培地組成物。

【請求項11】

請求項５～請求項１０のいずれか一項に記載の培地組成物に嫌気性微生物を接種し、嫌気性条件下で増殖させることを特徴とする、難培養性嫌気性微生物の高収率培養方法。

【請求項12】

前記培養段階は、ｐＨ ６．６～７．０、培養温度３５～３９℃、攪拌速度４０～５０ｒｐｍ、窒素飽和度８０～９０％、二酸化炭素飽和度５～２０％及び水素飽和度０～５％で行うことを特徴とする、請求項１１に記載の難培養性嫌気性微生物の高収率培養方法。

【請求項13】

培養された嫌気性微生物が平板計数法によって測定される生菌数１０^１０ＣＦＵ／ｍＬ以上の細胞密度に到達することを特徴とする、請求項１１に記載の難培養性嫌気性微生物の高収率培養方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、難培養性嫌気性微生物を高濃度に培養するための新規な培地サプリメント、それを含む培地組成物及びそれを用いた難培養性嫌気性微生物の高収率培養方法に関し、より詳細にはアッカーマンシア・ムシニフィラを含む難培養性嫌気性微生物の大量生産が可能であり、薬品や食品用途に適した培地サプリメント、培地組成物及び培養方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ヒトマイクロバイオーム（ｈｕｍａｎ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ）とは、ヒトの体に共生する微生物群集とこのような微生物群集の誘電体を意味する用語で、マイクロバイオームがヒトの健康と密接な相関関係があることが明らかになり、多くの関心を集めている。

【0003】

無菌動物モデル（ｇｅｒｍ－ｆｒｅｅ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ）、次世代塩基配列解析（Ｎｅｘｔ－Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＮＧＳ）、マルチオミクス解析（ｍｕｌｔｉ－ｏｍｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ）などの生命工学分野の研究技法の飛躍的発展により、腸内微生物の組成と構造を分析するだけでなく、マイクロバイオームの機能と疾病との関連性を研究できるようになり、これによって、より多くの研究結果が発表されている。マイクロバイオーム治療剤またはパーマバイオティクス治療剤（医療用プロバイオティクス）が効果的な治療剤のない感染疾患、免疫疾患、代謝疾患などの代替治療剤になり得るという点で最近注目されている。マイクロバイオーム治療剤またはパーマバイオティクス治療剤は、大量生産により実用化が可能となれば、様々な難治性疾患に有利に適用可能であるものと予想される。

【0004】

ヒトの腸内は嫌気状態なので、マイクロバイオームを構成する微生物は、ほとんど嫌気性微生物であるが、これらのほとんどは、利用可能な炭素源と窒素源が非常に制限的であり、さらに酸素に極度に敏感な絶対嫌気性という生理的特性のために産業化のための高濃度及び大量培養が難しいのが実情である。絶対嫌気性微生物の培養は極めて難しく、高いバイオマスの収率を得ることはさらに難しい。

【0005】

例えば、大腸の粘膜層に生息し、パーマバイオティクスの候補として有望なアッカーマンシア・ムシニフィラは、一般的に培地に炭素源と窒素源として豚の胃から抽出されたムチン（ｈｏｇ ｇａｓｔｒｉｃ ｍｕｃｉｎ）を添加して培養してもよい（Ｄｅｒｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００４）。また、アッカーマンシア ミューシピラー菌株は、コロンビアブロス（ＣＢ）及び脳心臓浸出液（ＢＨＩ）ブロス上で培養されることもあるが、このような培地には、すべて動物由来成分が含まれ、さらにほとんどのムチン基盤の培地より培養性が劣り、ムチン添加培地により獲得できる最終光学密度の半分程度の最終光学密度に増殖させることができるだけである。

【0006】

動物－由来成分は、ウイルスや細菌起源の汚染物質を含有するか、またはアレルゲン、抗原ペプチドまたは他の望ましくない生成物を含んでもよいため、ヒトにおいて食品や薬剤の用途のために嫌気性微生物を培養するのに適していないものと認識されている。最近までのかなりの努力にもかかわらず、既存の嫌気性微生物の培養のための培地は、組成が難しく、価格が高価で、さらに高収率で嫌気性微生物を培養できないため、特殊な研究目的以外の産業用途として利用できないという限界を持っている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、上述した従来技術の限界ないし問題を克服するためのもので、本発明の一つの目的は、マイクロバイオーム治療剤またはパーマバイオティクスとして使用される嫌気性微生物を産業的に大量に培養するとき、医薬品、食品、または飼料として使用するのに適した長期間にわたって安定的に高収率で製造できる培地サプリメント及び培地組成物を提供することである。

【0008】

本発明の他の目的は、難培養性嫌気性微生物を高い最終光学密度に経済的に培養できる培養方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0009】

上述した課題を解決するための本発明の一態様は、Ｎ－アセチルヘキソサミン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－システイン及びコバラミンを含む嫌気性微生物の高収率培養用培地サプリメントに関する。

【0010】

本発明の培地サプリメントは、Ｎ－アセチルヘキソサミン５ｇ／Ｌ、Ｌ－アスパラギン酸８ｇ／Ｌ、Ｌ－システイン０．５ｇ／Ｌ及びコバラミン０．０００１～０．００５ｇ／Ｌを含んでもよい。

【0011】

前記嫌気性微生物は、ヒトの腸内絶対－嫌気性微生物であって、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）、アナエロスティペス・カカエ（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ ｃａｃｃａｅ）、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）、ブチリシコッカス・プリセコルム（Ｂｕｔｙｒｉｃｉｃｏｃｃｕｓ ｐｕｌｌｉｃａｅｃｏｒｕｍ）、ロゼブリア・イヌリニボランス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｕｌｉｎｉｖｏｒａｎｓ）、ロゼブリア・ホミニス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｈｏｍｉｎｉs）、またはビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）であってもよいが、必ずしもこれらに制限されるものではない。

【0012】

上述した課題を解決するための本発明の他の態様は、
植物ペプトン、酵母エキス、リン酸水素二カリウムを含む培地組成物であって、炭素源としてフルクトース及びラクトースを含み、サプリメントとしてＮ－アセチルヘキソサミン、Ｌ－アスパラギン酸及びＬ－システインのアミノ酸混合物及びコバラミンを含むことを特徴とする嫌気性微生物高収率培養用培地組成物に関する。

【0013】

本発明の嫌気性微生物高収率培養用培地組成物は、フルクトース２．５ｇ／Ｌ、ラクトース２．５ｇ／Ｌ、植物ペプトン２０ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム２．５ｇ／Ｌ、Ｎ－アセチルヘキソサミン５ｇ／Ｌ、Ｌ－アスパラギン酸８ｇ／Ｌ、Ｌ－システイン０．５ｇ／Ｌ、及びコバラミン０．０００１～０．００５ｇ／Ｌを含んでもよい。

【0014】

前記植物ペプトンは、大豆ペプトン（ｓｏｙ ｐｅｐｔｏｎｅ）、小麦ペプトン（ｗｈｅａｔ ｐｅｐｔｏｎｅ）、綿ペプトン（ｃｏｔｔｏｎ ｐｅｐｔｏｎｅ）、エンドウペプトン（ｐｅａ ｐｅｐｔｏｎｅ）、ソラマメペプトン（ｂｒｏａｄｂｅａｎ ｐｅｐｔｏｎｅ）、ルピンペプトン（ｌｕｐｉｎ ｐｅｐｔｏｎｅ）、及びジャガイモペプトン（ｐｏｔａｔｏ ｐｅｐｔｏｎｅ）から構成されたグループから選ばれてもよいが、必ずしもこれらに制限されるものではない。

【0015】

上述した課題を解決するための本発明のさらに他の態様は、上述した培地組成物に嫌気性微生物を接種して嫌気性条件下で増殖させることを特徴とする嫌気性微生物の高収率培養方法に関する。

【0016】

前記培養段階は、ｐＨ６．６～７．０、培養温度３５～３９℃、攪拌速度４０～５０ｒｐｍ、窒素飽和度８０～９０％、水素飽和度０～５％、二酸化炭素飽和度５～２０％の条件で行ってもよい。

【0017】

本発明の嫌気性微生物の高収率培養方法では、培養された嫌気性微生物が平板計数法により測定される生菌数が１０^１０ＣＦＵ／ｍＬ以上の細胞密度に到達することを特徴とする。

【発明の効果】

【0018】

本発明の様々な実施例によれば、マイクロバイオーム治療剤またはパーマバイオティクスとして用いられる嫌気性微生物を産業的に大量に培養するとき、医薬品、食品または飼料として使用するのに適するように安定的に高収率で製造しうる。

【0019】

本発明の培地サプリメント及び培地組成物によれば、パーマバイオティクス候補として有力であるが、酸素に非常に敏感で、微量の酸素にも死滅して大量生産が不可能であった難培養性菌種であるアッカーマンシア・ムシニフィラを薬品または食品用途に適合するように高濃度で培養しうる。

【0020】

本発明の培地サプリメントまたは培養培地において高収率で培養された嫌気性微生物は、パーマバイオティクス医薬品、乳酸菌製剤、乳加工品及び生菌剤などに広範囲に用いることができるだろう。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】アッカーマンシア・ムシニフィラ菌株の炭素代謝過程を示す模式図である。

【図2】アスパラギン酸から様々なアミノ酸の生合成過程を示す模式図である。

【図3】本発明の培地サプリメントを含む培地で培養された嫌気性微生物の菌種別細胞の形態を示す写真である。

【図4】本発明の実施例において、アッカーマンシア・ムシニフィラ菌株を培養した培養器における培養時間による培地の色の変化を示した写真である。

【図5】アッカーマンシア・ムシニフィラの顕微鏡観察及び特異的プライマーを用いたＰＣＲ解析結果を通じて培養液の純度確認結果を示したものである。

【図6】フルクトースが添加された本発明の培地で培養時間によるアッカーマンシア・ムシニフィラ菌株の成長曲線（Ａ）及びｐＨの変化（Ｂ）を示したグラフである。

【図7】マルトースが添加された本発明の培地で培養時間によるアッカーマンシア・ムシニフィラ菌株の成長曲線（Ａ）及びｐＨの変化（Ｂ）を示したグラフである。

【図8】フルクトースが添加された本発明の培地で高純度窒素ガスのみを用いて培養したとき、培養時間によるアッカーマンシア・ムシニフィラ菌株の成長曲線（Ａ）及びｐＨの変化（Ｂ）を示したグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0022】

以下、添付図面を参照し、本発明について詳細に説明する。

【0023】

本発明において、用語の「培地（ｍｅｄｉａ）」または「培養培地（ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ）」とは、微生物の成長または増殖に必要なすべての栄養素及び必須物理的成長パラメータを含有する固体、半固体または液体培地を意味する。

【0024】

本明細書に使用される場合、微生物の「培養」または「成長」という用語は、微生物有機体をその成長に役立つ条件下で所定の培養培地中で繁殖させることにより、これを増大させることを意味する。

【0025】

本発明において培地の「サプリメント」とは、望む嫌気性微生物の成長、増殖または他の特徴を促進するために選ばれた構成成分から構成される添加物を意味する。

【0026】

本明細書に使用される場合、用語の「嫌気性微生物」とは、酸素に敏感で、酸素の存在下で成長しない微生物を意味する。嫌気性微生物は、絶対（ｓｔｒｉｃｔ ｏｒ ｏｂｌｉｇａｔｅ）嫌気性微生物及び通性（ｆａｃｕｌｔａｔｉｖｅ）嫌気性微生物を含んでもよい。

【0027】

本願で使用される場合、用語の「含む」及びその変形は、これらの用語が説明及び請求範囲に示される場合、制限的な意味を持たない。また、本明細書において、終点（ｅｎｄｐｏｉｎｔ）による数値範囲の言及は、その範囲内に含まれるすべての数を含む（例えば、１～５は、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５などを含む）。

【0028】

本発明の一態様は、Ｎ－アセチルヘキソサミン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－システイン及びコバラミンを含む嫌気性微生物の高収率培養用培地サプリメントに関する。前記培地サプリメントは、Ｎ－アセチルヘキソサミン５ｇ／Ｌ、Ｌ－アスパラギン酸８ｇ／Ｌ、Ｌ－システイン０．５ｇ／Ｌ及びコバラミン０．０００１ｇ～０．００５ｇ／Ｌを含んでもよい。

【0029】

本発明の培地サプリメントは、主に嫌気性微生物の培養に使用されるが、このような嫌気性微生物は、ヒトの腸内絶対－嫌気性微生物（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｓｔｒｉｃｔ－ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）である。

【0030】

これらの嫌気性微生物の例としては、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）、アナエロスティペス・カカエ（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ ｃａｃｃａｅ）、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）、ブチリシコッカス・プリセコルム（Ｂｕｔｙｒｉｃｉｃｏｃｃｕｓ ｐｕｌｌｉｃａｅｃｏｒｕｍ）、ロゼブリア・イヌリニボランス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｕｌｉｎｉｖｏｒａｎｓ）、ロゼブリア・ホミニス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｈｏｍｉｎｉs）、またはビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）が挙げられるが、必ずしもこれらに制限されるものではない。

【0031】

本発明の嫌気性微生物の高収率培養用培地サプリメントは、Ｎ－アセチルヘキソサミン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｈｅｘｏｓａｍｉｎｅｓ）を含む。Ｎ－アセチルヘキソサミン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｈｅｘｏｓａｍｉｎｅｓ）としては、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）またはＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含んでもよいが、好ましくは、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を含む。図１は、アッカーマンシア・ムシニフィラの炭素代謝過程を示す模式図である。図１を参照すると、アッカーマンシア・ムシニフィラは、ラクトースをガラクトースとグルコースに変換する酵素であるベータ－ガラクトシダーゼ（β－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）と、マルトースをグルコースに変換する酵素であるアルファ－グルコシダーゼ（α－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）を有しているため、ラクトース、マルトース、フルクトースのような炭素原は、すべて該当過程（ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ）を経て、高エネルギー分子であるＡＴＰを形成するのに使用される。外部から供給されるＮ－アセチルグルコサミン（Ｇｌｃ－ＮＡｃ）は、細胞壁合成（ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）及びエネルギー代謝に使用され、Ｎ－アセチルグルコサミンは、代謝されてアンモニアを生成するが、アンモニアは、細胞質を中和し、窒素源として供給する機能も可能である。Ｎ－アセチルグルコサミン（Ｇｌｃ－ＮＡｃ）の他にＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａＬ－ＮＡｃ）がさらに追加されてもよい。

【0032】

前記Ｎ－アセチルヘキソサミンは、約２．５～５ｇ／Ｌの範囲の量で含まれてもよい。

【0033】

アミノ酸は、細胞培養培地の中で培養された細胞の代謝機能を維持させるのに重要である。嫌気性微生物の高濃度培養時に良好な増殖を持続させるためには、外部タンパク質供給源が必須的である。本発明者らは、様々なアミノ酸のうち、アスパラギン酸とシステインの組み合わせが嫌気性微生物に対するタンパク質供給源ないし窒素源として非常に効果的であることを確認した。アミノ酸としては、Ｌ－アラニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－システイン、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グルタミン、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－ヒドロキシプロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－トレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、及びＬ－バリンなどがあり、アッカーマンシア・ムシニフィラが分解できるムチンは、セリン、トレオニン、プロリン及びシステインが豊富なアミノ酸配列の繰り返し構造の特徴を有している。しかし、本発明では、このアミノ酸のうち、アスパラギン酸とシステインの追加でアッカーマンシア・ムシニフィラを高収率で増殖させることができる。アスパラギン酸とシステインは、Ｄ－形態及びＬ－形態で存在してもよい。

【0034】

図２は、アスパラギン酸から様々なアミノ酸の生合成過程を示す模式図である。図２を参照すると、アスパラギン酸は、トレオニン及びメチオニン生合成の中間体であるホモセリン（ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ）に変換されてもよく、セリン、プロリンを含む様々なアミノ酸がアスパラギン酸から生合成されてもよい。さらに、アスパラギン酸は、核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、脂肪酸（ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ）とグルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ、一部の細菌において非常に重要な抗酸化剤）の合成に必要なペントースリン酸塩（ｐｅｎｔｏｓｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ）とニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）の生成を増加させて酸性ストレスに対する抵抗性を改善させることができる。また、アスパラギン酸からリシン（Ｌｙｓｉｎｅ）とトレオニン（Ｔｈｒｅｏｉｎｅ）の生合成は、いくつかの菌種の増殖に役立ち、アスパラギン酸の摂取により腸内ミクロビオータの多様性が増加することもある。

【0035】

本発明の培地サプリメントの組成物は、アスパラギン酸とシステインをそれぞれ例えば、約４～８ｇ／Ｌと約０．５～１ｇ／Ｌの範囲の量で含んでもよい。

【0036】

本発明の培地サプリメントは、コバラミン（ｃｏｂａｌａｍｉｎ）、すなわちビタミンＢ１２を含む。コバラミンは、補助因子として細胞によって使用される。培養培地にムチンが含まれない場合、嫌気性微生物が高密度に成長するためには、相当量のコバラミンを必要とする。コバラミンはコバラミンと同等の化合物を含んでもよい。例えば、コバラミンとしては、シアノコバラミン、メチルコバラミン、アデノシルコバラミン（ａｄｅｎｏｓｙｌ ｃｏｂａｌａｍｉｎ）、ヒドロキシルコバラミン（ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｃｏｂａｌａｍｉｎ）及び他の機能的に同等の化合物を含んでもよい。本発明の培養培地サプリメントは、コバラミンを約０．０００１～０．００５ｇ／Ｌの範囲の量で含んでもよい。

【0037】

ビタミンとしては、ビオチン、コリンクロリド、葉酸、ミオイノシトール、ニアシンアミド、ピリドキシンＨＣｌ、Ｄ－パントテン酸（ｈｅｍｉＣａ）、リボフラビン、チアミンＨＣｌなどもあるが、コバラミンを培地に添加する場合に嫌気性微生物の相対的な豊富度を増加させ、他のビタミンを追加してもコバラミンを単独で添加した場合と効果上大きな差がない。アッカーマンシア・ムシニフィラの誘電体分析において、ＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５菌株とＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株を含むほとんどの菌株は、ビタミンＢ群（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ９）の生合成（ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）に関連した遺伝子は、確認されたが、ビタミンＢ１２の生合成関連遺伝子は有していないことが分かった。また、アッカーマンシア・ムシニフィラにおけるコバラミンは、スクシネートからプロピオネートの合成に重要な助酵素として作用しうる。

【0038】

本発明の他の態様は、本発明の培地サプリメントを含む嫌気性微生物の高収率培養のための培地組成物に関する。

【0039】

本発明の嫌気性微生物の高収率培養のための培地組成物を準備するための基礎培地としては、大量培養による産業的生産を目的とする場合には、液体培地が好ましいが、植物ペプトン、酵母エキス、リン酸水素二カリウムを含む培地であってもよい。

【0040】

本発明の嫌気性微生物高収率培養用培地組成物は、植物ペプトン、酵母エキス、リン酸水素二カリウムを含む培地を基礎にし、炭素源としてフルクトース及びラクトースを含み、サプリメントとしてＮ－アセチルヘキソサミン、Ｌ－アスパラギン酸とＬ－システインのアミノ酸混合物及びコバラミンを含む。

【0041】

本発明の培地組成物は、嫌気性微生物、具体的には絶対－嫌気性微生物の培養に適する。絶対－嫌気性微生物の非限定的な例としては、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）、アナエロスティペス・カカエ（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ ｃａｃｃａｅ）、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）、ブチリシコッカス・プリセコルム（Ｂｕｔｙｒｉｃｉｃｏｃｃｕｓ ｐｕｌｌｉｃａｅｃｏｒｕｍ）、ロゼブリア・イヌリニボランス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｕｌｉｎｉｖｏｒａｎｓ）、ロゼブリア・ホミニス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｈｏｍｉｎｉs）、またはビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）が含まれてもよいが、必ずしもこれらに制限されるものではない。本発明の培地組成物は、特にアッカーマンシア属、具体的にアッカーマンシア・ムシニフィラを産業的規模で高収率で培養するのに適する。

【0042】

本発明の嫌気性微生物高収率培養用培地組成物は、植物ペプトン２０ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム２．５ｇ／Ｌ、フルクトース２．５ｇ／Ｌ、ラクトース２．５ｇ／Ｌ、Ｎ－アセチルヘキソサミン５ｇ／Ｌ、Ｌ－アスパラギン酸８ｇ／Ｌ、Ｌ－システイン０．５ｇ／Ｌ、及びコバラミン０．０００１～０．００５ｇ／Ｌを含んでもよい。

【0043】

本発明の嫌気性微生物高収率培養用培地は、植物ペプトンを含んでもよい。植物ペプトンは、植物タンパク質加水分解物（ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ）である。これは、任意の植物から由来したものであってもよい。前記植物ペプトンは、例えば、大豆ペプトン（ｓｏｙ ｐｅｐｔｏｎｅ）、小麦ペプトン（ｗｈｅａｔ ｐｅｐｔｏｎｅ）、綿ペプトン（ｃｏｔｔｏｎ ｐｅｐｔｏｎｅ）、エンドウペプトン（ｐｅａ ｐｅｐｔｏｎｅ）、ソラマメペプトン（ｂｒｏａｄｂｅａｎ ｐｅｐｔｏｎｅ）、ルピンペプトン（ｌｕｐｉｎ ｐｅｐｔｏｎｅ）、及びジャガイモペプトン（ｐｏｔａｔｏ ｐｅｐｔｏｎｅ）から構成されたグループから選ばれてもよい。前記植物ペプトンは、例えば、約１５～２０ｇ／Ｌの量で含んでもよい。

【0044】

本発明の嫌気性微生物高収率培養用培地は、酵母エキスを含む。酵母エキスを添加する場合、タンパク質供給源の増加が非－動物由来の培地上で嫌気性微生物の増殖をさらに増加させることができる。酵母エキスは、酵母自己溶解物（ａｕｔｏｌｙｓａｔｅ）、限外ろ過された酵母エキスまたは合成酵母エキスであってもよい。酵母エキスの濃度は、５ｇ／Ｌ～１０ｇ／Ｌ、例えば、約１０ｇ／Ｌであってもよい。

【0045】

本発明の培地は、フォスフェイト－含有成分、例えば、Ｎａ_２ＨＰＯ_４、Ｋ_２ＨＰＯ_４またはＫＨ_２ＰＯ_４をさらに含む。これらの成分は、等張性条件を維持させ、浸透圧の不均衡を防ぐために細胞培養培地に添加される。本発明の培地組成物は、ｐＨを６．５～８．０、好ましくは、６．０～７．０、より好ましくは、約ｐＨ６．８±１の範囲に維持させることが好ましい。

【0046】

本発明の嫌気性微生物の高収率培養のための培地組成物は、炭素源及びエネルギー源としてフルクトースとラクトースを含み、選択的にマルトースをさらに含んでもよい。フルクトースまたはマルトースの濃度は、２．５ｇ／Ｌ～５．０ｇ／Ｌ、例えば、約２．５ｇ／Ｌであってもよい。

【0047】

炭素源としてグルコースを含んでもよいが、グルコースの添加時に微生物の指数的成長を誘導するが、長く持続されておらず、グルコースがガラクトースとβ（１→４）－グリコシドで結合されているラクトースを分解してグルコースが供給されることができ、代謝経路においてＮ－アセチルグルコサミンとグルコースは、相互変換が可能なため、グルコースよりはフルクトースとラクトースの組み合わせがより好ましい。

【0048】

本発明において、培養培地は、多数の構成成分を含む、「粉末培地（ｐｏｗｄｅｒｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）」、または「濃縮培地（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）」であって、一般的に言及された粉末または濃縮物の形態で提供されるか、または液体培地に望む濃度の特定の構成成分を提供するための所定の体積の水と結合されてもよい。このような粉末培地または濃縮培地は、使用前に適切な水、普通の滅菌水に溶解されてもよい。

【0049】

本発明において、培地や培地組成物は、嫌気性微生物を培養するのに適した濃度で構成要素を含む最終培地及び希釈のために適切な粉末または濃縮培地をすべて含む。

【0050】

本発明の培養培地は、嫌気性微生物の培養のために選択的に還元剤を含んでもよい。適切な還元試薬は、培養培地の酸化－還元電位を下げて溶存酸素を除去（ｏｘｙｇｅｎ ｓｃａｖａｎｇｅｒ）することにより、嫌気性微生物の成長を促進させることができる。適切な還元剤としては、例えば、チオグリコール酸ナトリウム、Ｌ－システイン、ジチオトレイトール、ルジチオエリトリトール、硫化ナトリウム（Ｎａ_２Ｓ）及びこれらの組み合わせを含むが、必ずしもこれらに制限されるものではない。

【0051】

本発明の一実施例によれば、本発明の培地の嫌気性は、窒素（Ｎ_２）、水素（Ｈ_２）、及び二酸化炭素（ＣＯ_２）が１００：０：０～９０：５：５の体積比で混合された混合ガスによる培地内の酸素の置換によって組成されてもよい。本発明の一実施例によれば、培地内の気圧は、０．１～０．３気圧であってもよく、好ましくは、０．２気圧（０．０２ＭＰａ）であってもよい。

【0052】

本発明のさらに他の態様は、以上で説明した本発明の培地組成物に嫌気性微生物を接種して嫌気性条件下で増殖させることを特徴とする嫌気性微生物の高収率培養方法に関する。

【0053】

微生物の培養条件は、通常の技術者によってよく知られているように、微生物の成長速度に影響を及ぼすことができる。本発明において、培養段階は、ｐＨ６．６～７．０、培養温度３５～３９℃、攪拌速度４０～５０ｒｐｍ、窒素飽和度８０～９０％、水素飽和度０～５％、二酸化炭素飽和度５～２０％で行ってもよい。

【0054】

本発明において嫌気性微生物の培養は、マイクロプレートリーダーを用いて６００ｎｍの波長で測定された光学密度（ＯＤ_６００）によって結晶時、０．６以上の細胞密度を持つまで行われ、このときの平板計数法により測定される生菌数１０^１０ＣＦＵ／ｍＬ以上の細胞密度に到達するように高濃度で培養しうる。

【0055】

嫌気性微生物の高濃度培養のための培養温度は、３５～３９℃、特に３６～３８℃が好ましい。培養時、微生物群集懸濁液が接種された組成物を攪拌しうる。例えば、培養器の毎分回転速度（ｒｐｍ）は、４０ｒｐｍ～５０ｒｐｍであってもよいが、これに限定されるものではない。培養期間は、嫌気性微生物の生育状態に応じて適宜調整してもよいが、一般的に２０～１００時間、特に２４～４８時間程度が適当である。

【0056】

本発明の一実施例によれば、本発明の培地の嫌気性は、窒素（Ｎ_２）、水素（Ｈ_２）、及び二酸化炭素（ＣＯ_２）が９０：５：５～８０：０：２０の体積比で混合された混合ガスによる培地内の酸素の置換によって組成されてもよい。混合ガスによる培地内の酸素の置換は、培地体積１ｍＬを基準に３０秒以上行われることが好ましく、最も好ましくは、２分であってもよい。

【0057】

アッカーマンシア・ムシニフィラは、代謝経路でＡＴＰ合成に水素イオンが使用され、嫌気性条件で水素（Ｈ_２）がＮｉ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅによる嫌気性呼吸に重要である。したがって、本発明の培地でアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株の高濃度培養のためには、水素が含まれた混合ガスや水に溶けて炭酸と水素イオンを発生できる二酸化炭素が含まれたガスを注入することが必要である。

【0058】

以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。特に明示されない限り、本実施例に言及されたすべての部及び百分率は、重量基準であり、すべての温度は、摂氏温度で表現される。

【0059】

また、以下の実施例において、嫌気性微生物の濃度（バイオマスの生成量）は、培養期間中に分光光度計を用いて６００ｎｍで培養液の光学密度を測定して求めた。ΔＯＤは、初期と４８時間（または７２時間）培養後の吸光度の差により算出した。

【0060】

実施例
実施例１：培養培地でムチン代替成分組成の最適化
大豆カゼイン消化液体培地（Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ、ＴＳＢ）をベースにムチンに代わる基質及び成分の最適な組み合わせを探索し、このために表１のようにそれぞれの準備された培地に０．１％ｖ／ｖの割合でアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９（ＫＣＴＣ １３７６１ＢＰ）菌株を接種した後、３７℃、嫌気条件（９０％Ｎ_２、５％ＣＯ_２、５％Ｈ_２）で２４～４８時間培養し、光学密度（ＯＤ_６００）の変化を測定し、その結果を下記表１に示した。

【0061】

【表1】

【0062】

アッカーマンシア・ムシニフィラ菌株は、ＴＳＢ培地ではほとんど増殖されなかったが、ムチンに代わる成分としてＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）とトレオニンを追加すると、培養が可能であることが分かった。しかし、トレオニンをアスパラギン酸（Ａｓｐａｒｔａｔｅ）に代わる場合に、同じ濃度（４ｇ／Ｌ）で培養性が改善されることが分かり、最大８ｇ／Ｌの濃度のアスパラギン酸を添加するまで倍養性が増加した。

【0063】

前記表１から分かるように、ＴＳＢに基づいてＮ－アセチルグルコサミン、ラクトース、アスパラギン酸とビタミンが添加された培地で吸光度の変化量は、０．４水準であり、このときの生菌数は、１０^９ＣＦＵ／ｍＬと測定され、これと比較してＰＭ培地で吸光度の変化量は、０．１水準であり、このときの生菌数は、１０^８ＣＦＵ／ｍＬと測定され、１０倍以上の差があることが分かった。

【0064】

これはオキサロアセテート／アスパラギン酸アミノ酸系がリシン、アスパラギン、メチオニン、トレオニン及びイソロイシンから構成され、代謝過程においてアスパラギン酸はリシン、アスパラギン、メチオニン及びトレオニンに変換できるためであると考えられる。

【0065】

実施例２：互いに異なる炭素源を有する培地の倍養性の比較
動物由来成分または動物由来酵素が使用されて製造された成分を排除するため、植物ペプトンと酵母エキスに基づいて、本発明の培地サプリメントの嫌気性微生物培養性を試験した。

【0066】

植物ペプトンとして大豆ペプトンと酵母エキスは、それぞれ５、１０、１５、２０ｇ／Ｌの濃度を互いに組み合わせてテストした結果、２０ｇ／Ｌの濃度の大豆ペプトンと１０ｇ／Ｌの濃度の酵母エキスの組み合わせにおいて培養性が最も優れており、ｐＨ調節のためにリン酸水素二カリウムを２．５ｇ／Ｌの濃度で添加して基礎培地を製造した。

【0067】

嫌気性微生物であるアッカーマンシア・ムシニフィラの培養性に影響を及ぼす炭素源を調査するために窒素源基礎培地に表２に示すように、様々な炭素源を添加し、０．１％ｖ／ｖの割合でアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９（ＫＣＴＣ １３７６１ＢＰ）菌株を接種した後、３７℃、嫌気条件（９０％Ｎ_２、５％ＣＯ_２、５％Ｈ_２）で２４～４８時間培養した後、光学密度（ＯＤ_６００）の変化を測定し、その結果を下記表３に示した。

【0068】

【表2】

【0069】

【表3】

【0070】

前記表３の結果から分かるように、炭素源としてラクトースを基本とし、これにＮ－アセチルグルコサミンを添加するか、またはＮ－アセチルグルコサミンとグルコースをともに添加した場合に比べて、フルクトースを添加する場合にアッカーマンシア・ムシニフィラ菌株の倍養性がはるかに優れていることが分かった。吸光度の変化量（△ＯＤ）は、平均０．５～０．６水準であり、生菌数は、約１０^１０ＣＦＵ／ｍＬと測定され、本発明の場合に生菌数を基準に１０～１００倍増加されて培養性が著しく向上したことを確認した。また、グルコース２分子がβ（１→４）－グリコシドで結合されているマルトース（Ｍａｌｔｏｓｅ）を添加したときにも、培養性はグルコースを添加したときよりも改善された。

【0071】

実施例３：倍養性の改善に重要なビタミンＢ群の選別
本実施例では、アッカーマンシア・ムシニフィラ菌株の培養培地にビタミンＢ群の添加による倍養性の改善の有無を確認した。嫌気性微生物の増殖に影響を及ぼす特定のビタミンを選別するためにビタミンＢ群に属するすべてのビタミンをそれぞれ個別に、またはＢ群複合体（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１２）に対してテストを行った。

【0072】

表４のようにそれぞれの準備された培地に０．１％ｖ／ｖの割合でアッカーマンシア・ムシニフィラ菌株を接種した後、３７℃、嫌気条件（９０％Ｎ_２、５％ＣＯ_２、５％Ｈ_２）において２４～４８時間培養し、光学密度（ＯＤ_６００）の変化を測定し、その結果を下記表４に示した。

【0073】

【表4】

【0074】

表４から確認できるように、培地にシアノコバラミン（ビタミンＢ１２）が含まれる場合（Ｂ１２、Ｂ２＋Ｂ６＋Ｂ９＋Ｂ１２、Ｂ１＋Ｂ２＋Ｂ３＋Ｂ５＋Ｂ６＋Ｂ７＋Ｂ９＋Ｂ１２またはＢ１＋Ｂ２＋Ｂ３＋Ｂ５＋Ｂ６＋Ｂ７＋Ｂ９＋Ｂ１０＋Ｂ１２）にのみ培養性が増加することが分かり、ビタミンＢ１２を単独で添加したものは、ビタミンＢ群複合体で添加したときに比べて有意な差はなかった。

【0075】

また、コバラミンの最適濃度を見つけるため、コバラミンの濃度を変更するとともに培養した後、光学密度（ＯＤ_６００）の変化を測定し、その結果を下記表５に示した。

【0076】

【表5】

【0077】

前記表５結果から分かるように、培地に添加されるビタミンＢ１２の最適濃度を確認した結果、０．１ｍｇ／Ｌ未満の濃度では、培養性が次第に減少することが分かり、０．１ｍｇ／Ｌから５ｍｇ／Ｌ濃度では、培養性において有意な差がないため、０．１ｍｇ／Ｌでの濃度が最も適すると考えられる。

【0078】

実施例４：培地成分の最適化
嫌気性微生物の高濃度培養に必要な必須構成成分及び最適の組み合わせを探索するため、アッカーマンシア・ムシニフィラ菌株を様々な成分の組み合わせを有する培地に同一条件で培養した後、その結果を下記表６に示した。

【0079】

【表6】

【0080】

本発明の培地において各成分別培養に及ぼす影響を確認した結果、前記組み合わせにおいて単糖類の窒素含有誘導体であるＮ－アセチルグルコサミンは、アッカーマンシア・ムシニフィラ培養に最も必須的な成分であると確認されており、Ｎ－アセチルグルコサミンと代謝経路の一部を互いに共有している炭素源であるフルクトースとラクトースは、高濃度培養のために必要な成分であることが分かった。主なアミノ酸供給源である大豆ペプトンと、アスパラギン酸、及びシアノコバラミンの組み合わせは、培養性の改善に重要な成分であることが確認された。

【0081】

マルトースは、グルコースやフルクトースを代替可能であり、培養初期の増殖速度は、フルクトースやグルコースに比べて早い方であり、培養性においても大きな差を示さなかった。しかし、現在マルトースは、フルクトースやグルコースに比べて多少高価であるため、産業用培地としてはフルクトースが最も適すると考えられる。結論的に、表６から分かるように、本発明の培地のすべての構成成分は、アッカーマンシア・ムシニフィラ菌株の高濃度培養のために必要であり、すべての成分が組み合わせたときに培養性が最も優れていることが確認された。

【0082】

実施例５：本発明の培地において様々なアッカーマンシア・ムシニフィラ菌株の培養性確認
前記表２に記載された培地を用いて、培養菌株の種類を下記表７に記載されたように、異にしたことを除いては、実施例１と同様に行って０．１％ｖ／ｖの割合でアッカーマンシア・ムシニフィラ菌株を接種した後、３７℃、嫌気条件（９０％Ｎ_２、５％ＣＯ_２、５％Ｈ_２）で２４～４８時間培養し、光学密度（ＯＤ_６００）の変化を測定し、その結果を下記表７に示した。

【0083】

【表7】

【0084】

前記表７の結果から確認されるように、本発明の培地を用いて、アッカーマンシア・ムシニフィラ標準菌株（ＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５^Ｔ）及び互いに異なるアッカーマンシア・ムシニフィラ菌株の培養性を確認した結果、すべてのアッカーマンシア・ムシニフィラ菌株において類似した培養水準を示し、したがって、すべてのアッカーマンシア・ムシニフィラ菌株の高濃度培養培地に活用可能であることが確認できる。

【0085】

実施例６：様々な難培養性絶対嫌気性微生物の倍養性比較
培養菌株の種類を下記表８に記載されたように、異にしたことを除いては、実施例１と同様に行って０．１％ｖ／ｖの割合でフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）、アナエロスティペス・カカエ（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ ｃａｃｃａｅ）またはビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）菌株を接種した後、３７℃、嫌気条件（９０％Ｎ_２、５％ＣＯ_２、５％Ｈ_２）で２４～４８時間培養し、光学密度（ＯＤ_６００）の変化を測定し、その結果を下記表８に示した。対照のために培養性が優れていることが知られている対照培地でも培養し、本発明の培地における培養性と比較した。対照培地としてＦ．Ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉは、脳心臓浸出培地（Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ、ＢＨＩ）に５ｇ／Ｌ酵母エキス、１ｇ／Ｌセロビオース及び１ｇ／Ｌマルトースを補充した培地で同じ条件で培養した。Ａ．ｃａｃｃａｅは、ＴＳＢ培地に５ｇ／Ｌ酵母エキスを補充した培地で培養し、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍは、ＢＬブロス培地で培養した。

【0086】

【表8】

【0087】

前記表８の結果から確認されるように、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）、アナエロスティペス・カカエ（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ ｃａｃｃａｅ）のような難培養性絶対嫌気性微生物及びビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）の培養の可能性を行った結果、培養性が優れていることが知られている対照培地と比較し、本発明の培地が培養性がさらに優れていることを確認した。

【0088】

実施例７：大量培養のための工程条件最適化－培養条件別倍養性比較分析
図４に示すような嫌気性発酵システムを用いて、３Ｌ－スケールにおいて表２の培地で炭素源の種類を変更した培地を使用して下記表９の条件で培養を行っており、アッカーマンシア・ムシニフィラ菌株の成長曲線（ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅ）及びｐＨの変化を確認した。また、顕微鏡観察による菌数の変化と形態学的変化を確認して図５に示し、平板計数法（ｐｌａｔｅ ｃｏｕｎｔ ｍｅｔｈｏｄ）を用いて生菌数を測定し、表１０に示した。

【0089】

【表9】

【0090】

【表10】

【0091】

本発明の培地を用いて嫌気性発酵システムにおいて、アッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株を培養した結果、指数増殖期は、接種後５～２５時間であることが分かり、ｐＨの変化も９～１８．５時間に急激に発生したことが確認された。２４時間培養を基準に光学密度（ＯＤ_６００）は、０．７９８水準であることが分かり、このときの生菌数は、５．５ｘ１０^１０ＣＦＵ／ｍＬと測定された（図６及び表１０参照）。

【0092】

本発明の培地においてフルクトースをマルトースに置き換えたとき、指数増殖期は、接種後３．５～２１時間であることが分かり、ｐＨの変化も７～１４時間に急激に発生していることが確認された。フルクトースを用いて培養した結果と比較すると、マルトースが含まれた本発明の培地では、誘導期が１．５時間短くなる特徴を示し、２４時間培養を基準に吸光度は０．６３２水準となり、多少低くなったが、このときの生菌数は、５．１ｘ１０^１０ＣＦＵ／ｍＬと大きな差はなかった（図７及び表９参照）。
フルクトースが含まれた本発明の培地で混合ガス（９０％Ｎ_２、５％ＣＯ_２、５％Ｈ_２）の代わりに、より経済的で工業化に適した水素を含まないガス{高純度窒素ガス（１００％Ｎ_２）または８０％Ｎ_２と２０％ＣＯ_２から構成された混合ガス}を用いて培養した結果、高純度窒素ガスの場合、既存の培養結果と比較して培養性が著しく劣ることが分かるが、８０％Ｎ_２と２０％ＣＯ_２から構成されたガスでは、培養性において大きな差はなかった（図８及び表１０参照）。

【0093】

また、前記表１０から分かるように、本発明の培地においてすべての構成成分は、アッカーマンシア・ムシニフィラ菌株の高濃度培養のために必要であり、さらに水素や二酸化炭素を含む混合ガスの注入が必要であることが確認された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【手続補正書】

【提出日】2021-09-02

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

植物ペプトン、酵母エキス、リン酸水素二カリウムを含む培地組成物であって、炭素源としてフルクトースとラクトースを含み、サプリメントとしてＮ－アセチルヘキソサミン、Ｌ－アスパラギン酸とＬ－システインのアミノ酸混合物及びコバラミンを含み、
前記嫌気性微生物は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）、アナエロスティペス・カカエ（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ ｃａｃｃａｅ）、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）、またはビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）であることを特徴とする嫌気性微生物の培養用培地組成物。

【請求項2】

前記培地組成物は、植物ペプトン２０ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム２．５ｇ／Ｌ、フルクトース２．５ｇ／Ｌ、ラクトース２．５ｇ／Ｌ、Ｎ－アセチルヘキソサミン５ｇ／Ｌ、Ｌ－アスパラギン酸８ｇ／Ｌ、Ｌ－システイン０．５ｇ／Ｌ、及びコバラミン０．０００１～０．００５ｇ／Ｌを含有することを特徴とする、請求項１に記載の難培養性嫌気性微生物の培養用培地組成物。

【請求項3】

前記植物ペプトンは、大豆ペプトン（ｓｏｙ ｐｅｐｔｏｎｅ）、小麦ペプトン（ｗｈｅａｔ ｐｅｐｔｏｎｅ）、綿ペプトン（ｃｏｔｔｏｎ ｐｅｐｔｏｎｅ）、エンドウペプトン（ｐｅａ ｐｅｐｔｏｎｅ）、ソラマメペプトン（ｂｒｏａｄｂｅａｎ ｐｅｐｔｏｎｅ）、ルピンペプトン（ｌｕｐｉｎ ｐｅｐｔｏｎｅ）、及びジャガイモペプトン（ｐｏｔａｔｏ ｐｅｐｔｏｎｅ）から構成されたグループから選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の難培養性嫌気性微生物の培養用培地組成物。

【請求項4】

前記培地組成物は、炭素源としてフルクトースの代わりにマルトースを含むか、またはフルクトースに加えてマルトースをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の難培養性嫌気性微生物の培養用培地組成物。

【請求項5】

請求項１～請求項４のいずれか一項に記載の培地組成物に嫌気性微生物を接種し、嫌気性条件下で増殖させることを特徴とする、難培養性嫌気性微生物の培養方法。

【請求項6】

前記培養段階は、ｐＨ ６．６～７．０、培養温度３５～３９℃、攪拌速度４０～５０ｒｐｍ、窒素飽和度８０～９０％、二酸化炭素飽和度５～２０％及び水素飽和度０～５％で行うことを特徴とする、請求項５に記載の難培養性嫌気性微生物の培養方法。

【請求項7】

培養された嫌気性微生物が平板計数法によって測定される生菌数１０^１０ＣＦＵ／ｍＬ以上の細胞密度に到達することを特徴とする、請求項５に記載の難培養性嫌気性微生物の培養方法。

【国際調査報告】