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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-12-02
(54)【発明の名称】ヌクレオシドアナログを有するオリゴヌクレオチド
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20221125BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20221125BHJP
C12N 15/115 20100101ALI20221125BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20221125BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20221125BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20221125BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20221125BHJP
A61K 31/711 20060101ALI20221125BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20221125BHJP
A61K 47/62 20170101ALI20221125BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20221125BHJP
A61K 47/61 20170101ALI20221125BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20221125BHJP
A61K 47/54 20170101ALI20221125BHJP
A61K 47/56 20170101ALI20221125BHJP
A61K 31/7068 20060101ALI20221125BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 Z ZNA
C12N15/113 Z
C12N15/115 Z
A61P35/00
A61K31/7088
A61K31/7105
A61K31/713
A61K31/711
A61K48/00
A61K47/62
A61K47/68
A61K47/61
A61K47/64
A61K47/54
A61K47/56
A61K31/7068
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022520735
(86)(22)【出願日】2020-10-02
(85)【翻訳文提出日】2022-05-27
(86)【国際出願番号】 US2020054093
(87)【国際公開番号】W WO2021067825
(87)【国際公開日】2021-04-08
(31)【優先権主張番号】62/909,526
(32)【優先日】2019-10-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/927,500
(32)【優先日】2019-10-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/977,630
(32)【優先日】2020-02-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】509127310
【氏名又は名称】サーナオミクス インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】エヴァンズ， デーヴィッド エム．
(72)【発明者】
【氏名】ルー， パトリック ワイ．
(72)【発明者】
【氏名】ルー， シャオヤン
(72)【発明者】
【氏名】ロッシュ， エリック
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA95
4C076CC27
4C076CC41
4C076DD33
4C076EE17
4C076EE41
4C076EE59
4C076FF31
4C076FF68
4C084AA13
4C084MA02
4C084NA05
4C084NA13
4C084ZB261
4C084ZB262
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086EA17
4C086MA01
4C086MA02
4C086MA04
4C086MA05
4C086NA05
4C086NA13
4C086ZB26
(57)【要約】
ｓｉＲＮＡ配列内にシトシン部分の代わりにゲムシタビン（ＧＥＭ）を含むｓｉＲＮＡ組成物が提供される。これらのｓｉＲＮＡ分子を含む医薬組成物及びがん等の疾患を治療するために組成物を使用する方法が提供される。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヌクレオチド及び１つ又は複数の抗がんヌクレオシドアナログを含むオリゴヌクレオチド。
【請求項2】
ヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドを含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項3】
ヌクレオチドがリボヌクレオチドを含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項4】
ヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドを含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項5】
１つ又は複数の抗がんヌクレオシドアナログが分子の末端に結合している、請求項１から４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項6】
１つ又は複数の抗がんヌクレオシドアナログが分子内にある、請求項１から４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項7】
１つ又は複数の抗がんヌクレオシドアナログが分子の２つの鎖間にループとして又はループ内に結合している、請求項１から４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項8】
１つ又は複数の抗がんヌクレオシドアナログが、それに対する１つ又は複数のアナログである１つ又は複数のヌクレオチドを置換する、請求項１から７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項9】
オリゴヌクレオチドが１～１０個の抗がんヌクレオシドアナログを有する、請求項１から８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項10】
オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項11】
オリゴヌクレオチドがｍｉＲＮＡを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項12】
オリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項13】
オリゴヌクレオチドがＤＮＡアプタマー又はＲＮＡアプタマーを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項14】
オリゴヌクレオチドががん細胞内の特定の遺伝子の発現を標的とし、それをサイレンシングするか又は低下させる、請求項１０から１２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項15】
ｓｉＲＮＡが、サイレンシングされた際にがん細胞内の抗がんヌクレオシドの作用を増強する標的をサイレンシングするか、又はサイレンシングされた際に細胞の死滅における抗がんヌクレオシドの作用を増強する遺伝子をサイレンシングする、請求項１０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項16】
オリゴヌクレオチドがヌクレアーゼの安定性を改善するために化学修飾されたヌクレオチドを含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項17】
オリゴヌクレオチドに対する修飾が、２’－０－メチル又は２’－フルオロ又はホスホロチオエートアナログである、請求項１６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項18】
抗がんヌクレオシドアナログが、ゲムシタビン、シタラビン、５－ＦＵ、５－デオキシ－５－フルオロウリジン、フルダラビン、カペシタビン、クラドリビン、トロキサシタビン又はクロファラビン、アザシチジン及び５－デオキシアザシチジンからなる群から選択される、請求項１から１７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項19】
抗がんヌクレオシドアナログがゲムシタビンを含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項20】
ヌクレオチドが、複数のゲムシタビンヌクレオシドを連続して含むポリＧＥＭ配列を含む、請求項１９に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項21】
オリゴヌクレオチドががん細胞内の特定の遺伝子の発現を標的とし、それをサイレンシングするか又は低下させる、請求項１から２０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項22】
遺伝子が、ＡＴＲ、ＡＴＭ、ＷＥＥ１、ＣＨＫ１、ＣＨＫ１Ａ、ＣＨＫ１Ｂ、ＣＨＫ２、ＲＡＤ１７、ＢＣＬ２、シチジンデアミナーゼ及びＢＣＬＸＬからなる群から選択される、請求項２１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項23】
遺伝子がＣＨＫ１又はＣＨＫ２である、請求項２１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項24】
遺伝子がＣＨＫ１又はＲＡＤ１７である、請求項２１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項25】
標的化リガンドをさらに含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項26】
リガンドががん細胞上の受容体又はタンパク質に対して特異的であり、リガンドが細胞に結合する、請求項２５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項27】
受容体が、がん細胞上で、非がん細胞よりも高いレベルで発現する、請求項２６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項28】
標的化リガンドが、ペプチド、低分子、タンパク質、アプタマー、抗体、ナノボディ、ＳｃＦｖ断片及び炭水化物部分からなる群から選択される、請求項２４から２７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項29】
炭水化物部分がＧａｌＮａｃを含む、請求項２８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項30】
標的化リガンドが、腫瘍細胞上で上方制御された特定の受容体を標的とするペプチドを含む、請求項２４から２７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項31】
受容体がインテグリン受容体を含む、請求項３０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項32】
インテグリン受容体がアルファ５ベータ３又はアルファ５ベータ６を含み、リガンドがこれらの２つの受容体の間で差次的な親和性を示す、請求項３１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項33】
標的化リガンドが口蹄疫ウイルス（ＦＭＶ）結合ペプチドに由来する、請求項３２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項34】
標的化リガンドが、ＦＭＤＶ２０ペプチド配列（ＮＡＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴ）の１０～２０のアミノ酸を含む、請求項３３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項35】
ペプチドが標準的なＬ－アミノ酸よりもＤ－アミノ酸を含むように最初及び最後の位置で修飾されている（｛Ｄ－ＡＳＮ｝ＡＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲ｛Ｄ－ＴＨＲ｝）、請求項３４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項36】
ペプチドが、溶解度及び／又はＰＫ性質を改善するように分子に沿ったある点でｐｅｇ化されている（例えば、ＰＥＧ－｛Ｄ－ＡＳＮ｝ＡＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲ｛Ｄ－ＴＨＲ｝）、請求項３５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項37】
ペプチド配列がオリゴヌクレオチド－ポリＧＥＭ分子に共有結合している、請求項３６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項38】
ペプチドが、オリゴヌクレオチド－ポリＧＥＭ分子を、関連する受容体を過剰発現する哺乳動物組織又は器官中のがん細胞に送達する、請求項３７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項39】
オリゴヌクレオチド－ポリＧｅｍ分子がエンドサイトーシスによってがん細胞に取り込まれる、請求項３８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項40】
オリゴヌクレオチドが、がん細胞を死滅させる、請求項３９に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項41】
ヌクレオチド及び１つ又は複数の抗がんヌクレオシドアナログを含むオリゴヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＡＳＯ、ＤＮＡアプタマー又はＲＮＡアプタマーを含み、１つ又は複数の抗がんヌクレオシドアナログがゲムシタビンを含む、オリゴヌクレオチド。
【請求項42】
オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを含み、１つ又は複数の抗がんヌクレオシドアナログがゲムシタビンを含む、請求項４１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項43】
１つ又は複数のゲムシタビンヌクレオシドが、ｓｉＲＮＡ分子又はｍｉＲＮＡ分子の配列内のシトシン分子を置換する、請求項４１又は４２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項44】
１つ又は複数のゲムシタビンヌクレオシドがｓｉＲＮＡのセンス又はアンチセンス鎖に取り込まれる、請求項４３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項45】
ゲムシタビン又は他の抗がんヌクレオシドアナログが、がん細胞の細胞質内におけるオリゴヌクレオチドの分解時に放出される、請求項４１又は４２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項46】
オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡであり、ゲムシタビンが、がん細胞内のＲＩＳＣ複合体によるアンチセンス鎖の取り込み時に細胞質中に放出されるｓｉＲＮＡのセンス鎖上にある、請求項４１から４５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項47】
アンチセンスｓｉＲＮＡ鎖が目的の遺伝子をサイレンシングする、請求項４６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項48】
オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡであり、細胞質中に放出されたゲムシタビンが、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡのサイレンシング効果の活性を増強し、がん細胞内の治療効果をもたらす、例えば複製若しくは増殖を防止するか、又はがん細胞を能動的に死滅させる、請求項４１から４７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項49】
ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡが、サイレンシングされた際に、がん細胞の死滅におけるゲムシタビンの作用を増強する標的遺伝子をサイレンシングする、請求項４１から４７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項50】
標的遺伝子が、ＡＴＲ、ＡＴＭ、ＷＥＥ１、ＣＨＫ１、ＣＨＫ１Ａ、ＣＨＫ１Ｂ、ＣＨＫ２、ＲＡＤ１７、ＢＣＬ２、シチジンデアミナーゼ及びＢＣＬＸＬからなる群から選択される、請求項４９に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項51】
標的遺伝子がＣＨＫ１又はＲＡＤ１７である、請求項４９に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項52】
マウス及びヒト細胞において配列に同一性を有するＣＨＫ１をサイレンシングし、ＣＨＫ１に対するＣＨＫ＿Ａｚ ｓｉＲＮＡ配列上に存在する２つのシトシンと比較してＧＥＭによって置換されていてもよいシトシン部分の数が多いｓｉＲＮＡ配列を含む（配列：ＳＳ：５’－ＡＡＧＡＡＡＧＡＧＡＵ［ＧＥＭ］ＵＧＵＡＵ［ＧＥＭ］ＡＡＵ－ｄＴｄＴ－３’：非－Ｇｅｍ含有ＡＳ鎖 ５’－ＡＵＵＧＡＵＡＣＡＧＡＵＣＵＣＵＵＵＣＵＵ－ｄＴｄＴ－３’）、請求項４９に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項53】
ｓｉＲＮＡ分子が以下の配列：ＳＳ＝５’－ＣＣＵ ＧＵＧ ＧＡＡ ＵＡＧ ＵＡＣ ＵＵＡ ＣＵＧ ＣＡＡ Ｕ－３’ ＣＨＫ１ ｓｉＲＮＡセンス鎖
ＡＳ＝５’－Ａ ＵＵＧ ＣＡＧ ＵＡＡ ＧＵＡ ＣＵＡ ＵＵＣ ＣＡＣ ＡＧＧ－３’ ＣＨＫ１ ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖
を含む、請求項４１から５２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項54】
ゲムシタビンがセンス鎖内の選択シトシン部分を置換する：ＳＳ＝５’－ＣＣＵ ＧＵＧ ＧＡＡ ＵＡＧ ＵＡ［ＧＥＭ］ ＵＵＡ ［ＧＥＭ］ＵＧ ［ＧＥＭ］ＡＡ Ｕ－３’（「Ｃ」の代わりに［ＧＥＭ］）
ＡＳ＝５’－Ａ ＵＵＧ ＣＡＧ ＵＡＡ ＧＵＡ ＣＵＡ ＵＵＣ ＣＡＣ ＡＧＧ－３’（ＡＳ鎖上にＧＥＭなし）、請求項５３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項55】
ＲＡＤ１７についてのマウス及びヒト遺伝子に対するｓｉＲＮＡ配列を含み、センス鎖（ＳＳ）がＲＡＤ１７＿７（６）：ＳＳ－５’ＣＣＡＡＣＡＡＵＵＡＵＧＡＵＧＡＡＡＵＵＵＣＵＵＡ－３’である、請求項４１から５２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項56】
ｓｉＲＮＡのＳＳ上の選択「Ｃ」基が下記のようにＧＥＭ部分によって置換されている：ＳＳ－５’ＣＣＡＡ［ＧＥＭ］ＡＡＵＵＡＵＧＡＵＧＡＡＡＵＵＵ［ＧＥＭ］ＵＵＡ－３’、請求項５５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項57】
ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡが化学修飾されており、特定の受容体にオリゴヌクレオチドを標的化しそれを送達し、次いで細胞に取り込まれるリガンドに直接結合されている、請求項４１から５６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項58】
標的化リガンドがＧａｌＮａｃを含み、受容体が肝臓の肝細胞上のＡＳＧＰＲ受容体を含む、請求項５７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項59】
標的化リガンドが、治療薬に応答する腫瘍細胞、例えばＣＨＫ１サイレンシングに応答する膵臓がん細胞に特異的であり、その増殖が阻害される、請求項５７に記載のオリゴヌクレオチド。ＧＥＭを、ＣＨＫ１を標的とするｓｉＲＮＡに付加すると、膵臓及び他の腫瘍細胞における効果をさらに増強し得る。
【請求項60】
請求項１から５９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド及び薬学的に許容される担体を含む、組成物。
【請求項61】
薬学的に許容される担体が水及び以下の塩又はバッファー：リン酸カリウム一塩基性無水ＮＦ、塩化ナトリウムＵＳＰ、リン酸ナトリウム二塩基性七水和物ＵＳＰ、及びリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の１つ又は複数を含む、請求項６０に記載の組成物。
【請求項62】
薬学的に許容される担体が、生分解性ヒスチジン－リジンポリマー、生分解性ポリエステル、例えばポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）及びポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー、カチオン性脂質、例えばＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ、ＤＯＴＭＡ及びＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ、ＰＥＧ化ＰＥＩ及び脂質、例えばリポフェクトアミンからなる群から選択される１つ又は複数の成分を含む、請求項６０に記載の組成物。
【請求項63】
薬学的に許容される担体が、ヒスチジン－リジンコポリマー（ＨＫＰ）を含む、請求項６０に記載の組成物。
【請求項64】
ＨＫＰが構造（Ｒ）Ｋ（Ｒ）－Ｋ（Ｒ）－（Ｒ）Ｋ（Ｘ）を含み、Ｒ＝ＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫ、Ｋ＝リジン及びＨ＝ヒスチジンである、請求項６３に記載の組成物。
【請求項65】
薬学的に許容される担体が分岐状ヒスチジン－リジンコポリマーを含む、請求項６０に記載の組成物。
【請求項66】
分岐状ヒスチジン－リジンポリマーが式（Ｒ）Ｋ（Ｒ）－Ｋ（Ｒ）－（Ｒ）Ｋ（Ｘ）を有し、Ｒ＝ＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫ又はＲ＝ＫＨＨＨＫＨＨＨＮＨＨＨＮＨＨＨＮであり、Ｘ＝Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｋ＝リジン、Ｈ＝ヒスチジン及びＮ＝アスパラギンである、請求項６５に記載の組成物。
【請求項67】
薬学的に許容される担体が、スペルミン－脂質コンジュゲート（ＳＬｉＣ）及びコレステロールを含むリポソームを含む、請求項６０に記載の組成物。
【請求項68】
薬学的に許容される担体が、式Ｋｐ｛［（Ｈ）ｎ（Ｋ）ｍ］｝ｙ又はＫｐ｛［（Ｈ）ｎ（Ｋ）ｍ］｝ｙ－Ｃ－ｘ－Ｚ又は式Ｋｐ｛［（Ｈ）ａ（Ｋ）ｍ（Ｈ）ｂ（Ｋ）ｍ（Ｈ）ｃ（Ｋ）ｍ（Ｈ）ｄ（Ｋ）ｍ］｝ｙ又はＫｐ｛［（Ｈ）ａ（Ｋ）ｍ（Ｈ）ｂ（Ｋ）ｍ（Ｈ）ｃ（Ｋ）ｍ（Ｈ）ｄ（Ｋ）ｍ］｝ｙ－Ｃ－ｘ－Ｚのペプチドを含み、Ｋがリジンであり、Ｈがヒスチジンであり、Ｃがシステインであり、ｘがリンカーであり、Ｚが哺乳動物細胞－標的化リガンドであり、ｐが０又は１であり、ｎが１～５の整数であり、ｍが０～３の整数であり、ａ、ｂ、ｃ及びｄが３又は４のいずれかであり、ｙが３～１０の整数である、請求項６０に記載の組成物。
【請求項69】
薬学的に許容される担体が、切断可能な結合を介して架橋された請求項６８に記載のペプチドを少なくとも２つ含むポリペプチドを含む、請求項６８に記載の組成物。
【請求項70】
組成物がナノ粒子を含む、請求項６０から６９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項71】
第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドを含み、第１のオリゴヌクレオチド又は第２のオリゴヌクレオチド又は両方のオリゴヌクレオチドが１つ又は複数の抗がんヌクレオシドアナログを含む、組成物。
【請求項72】
オリゴヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＡＳＯ、ＤＮＡアプタマー及びＲＮＡアプタマーからなる群から選択される、請求項７１に記載の組成物。
【請求項73】
第１のオリゴヌクレオチドが第１のｓｉＲＮＡを含み、第２のオリゴヌクレオチドが第１のｓｉＲＮＡとは異なる第２のｓｉＲＮＡを含む、請求項７１又は７２に記載の組成物。
【請求項74】
ｓｉＲＮＡ標的遺伝子が、ＡＴＲ、ＡＴＭ、ＷＥＥ１、ＣＨＫ１、ＣＨＫ１Ａ、ＣＨＫ１Ｂ、ＣＨＫ２、ＲＡＤ１７、ＢＣＬ２、シチジンデアミナーゼ及びＢＣＬＸＬからなる群から選択される、請求項７１から７３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項75】
第１のｓｉＲＮＡがＣＨＫ１を標的とし、第２のｓｉＲＮＡがＲＡＤ１７を標的とする、請求項７４に記載の組成物。
【請求項76】
１つ又は複数の抗がんヌクレオシドアナログがここに記載する通りである、請求項７１から７５のいずれか一項に記載の組成物を含む組成物。
【請求項77】
１つ又は複数の抗がんヌクレオシドアナログがゲムシタビンを含む、請求項７１から７６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項78】
ここに記載する標的化リガンドをさらに含む、請求項７１から７７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項79】
ここに記載する薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項７１から７８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項80】
哺乳動物中のがん細胞を死滅させる方法であって、哺乳動物に、治療的有効量の請求項１から５９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又は請求項６０から７９のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項81】
がんが、膵臓がん、肝臓がん、結腸がん、膀胱がん、非小細胞肺がん、乳がん、卵巣がん又は頭頸部がんを含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項82】
肝臓がんが、転移性膵臓がん、肝細胞癌又は転移性結腸がんを含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項83】
哺乳動物が実験動物である、請求項８０から８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項84】
哺乳動物がヒトである、請求項８０から８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項85】
組成物が、がん細胞を含む腫瘍に直接注入される、請求項８０から８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項86】
ｓｉＲＮＡ分子が配列：ＣＨＫ１＿ＡＺ ＳＳ（内部ＧＥＭ）５’－ＡＡＧＡＡＡＧＡＧＡＵ［ＧＥＭ］ＵＧＵＡＵ［ＧＥＭ］ＡＡＵ－ｄＴｄＴ－３’；
ＡＳ鎖：
ＣＨＫ１＿ＡＺ ＡＳ（Ｇｅｍなし）５’－ＡＵＵＧＡＵＡＣＡＧＡＵＣＵＣＵＵＵＣＵＵ－ｄＴｄＴ－３’
を含む、請求項４１から５２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項87】
前記ｓｉＲＮＡ分子が、一対の配列：（ａ）Ｃｈｋ１＿ＡＺ ＳＳ（末端ＧＥＭ）：５’－ＡＡＧＡＡＡＧＡＧＡＵＣＵＧＵＡＵＣＡＡＵ［ＧＥＭ］［ＧＥＭ］－ｄＴｄＴ－３’
ＣＨＫ１＿ＡＺ ＡＳ（Ｇｅｍなし）５’－ＡＵＵＧＡＵＡＣＡＧＡＵＣＵＣＵＵＵＣＵＵ－ｄＴｄＴ－３’；
（ｂ）．Ｃｈｋ１＿ＡＺ ＳＳ（ＧＥＭなし）：５’－ＡＡＧＡＡＡＧＡＧＡＵＣＵＧＵＡＵＣＡＡＵ－ｄＴｄＴ－３’
Ｃｈｋ１＿ＡＺ ＡＳ（末端ＧＥＭ）５’－ＡＵＵＧＡＵＡＣＡＧＡＵＣＵＣＵＵＵＣ－ＵＵ［ＧＥＭ］［ＧＥＭ］ｄＴｄＴ－３’又は
（ｃ）Ｃｈｋ１＿ＡＺ ＳＳ（末端ＧＥＭ）：５’－ＡＡＧＡＡＡＧＡＧＡＵＣＵＧＵＡＵＣＡＡＵ［ＧＥＭ］［ＧＥＭ］－ｄＴｄＴ－３’
Ｃｈｋ１＿ＡＺ ＡＳ（末端ＧＥＭ）５’－ＡＵＵＧＡＵＡＣＡＧＡＵＣＵＣＵＵＵＣ－ＵＵ［ＧＥＭ］［ＧＥＭ］ｄＴｄＴ－３’
の１つを含む、請求項４１から５２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０１９年１０月２日に出願された米国特許仮出願第６２／９０９５２６号、２０１９年１０月２９日に出願された同第６２／９２７５００号及び２０２０年２月１７日に出願された第６２／９７７，６３０号に対する優先権を主張するものであり、それぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【0002】
ｓｉＲＮＡは、センス鎖及び相補的なアンチセンス鎖からなる二本鎖ＲＮＡ分子である。これらの分子は、各鎖が１９～２９塩基長である平滑末端分子であっても、又は２塩基のオーバーハング（典型的にはｄＴｄＴ）を示してもよい。
【0003】
ｓｉＲＮＡの各鎖は、典型的には、所望の配列の次の塩基を、成長しているオリゴヌクレオチドに結合している前の塩基にコンジュゲートすることによって、合成剤上で作製される。アミダイト化学又は他の合成手法は、当分野において周知されている。一度合成されると、二本鎖は次いで互いにアニーリングされ、二本鎖を形成する。
【0004】
がん細胞内の選択標的に対するｓｉＲＮＡは、サイレンシングされた遺伝子標的によってコードされるタンパク質の発現を低下させ得ることが示されている。これらの遺伝子をサイレンシングすることによって、次いで、細胞の増殖を阻害し得る。細胞が具体的に、ｓｉＲＮＡがアクセスし得る疾患細胞（例えば、がん細胞）である場合、ｓｉＲＮＡは治療薬として作用し得る。さらに、いくつかの場合、現在治療の「ゴールドスタンダード」である選択治療薬（低分子阻害剤、モノクローナル抗体等）の使用は、選択経路の遺伝子をサイレンシングすることにより増強され得ることが見出されている。
【0005】
ゲムシタビン（２’，２’－ジフルオロ２’－デオキシシチジン）は全身的に投与された場合、ヌクレオシドトランスポーターによって取り込まれ、デオキシシチジンキナーゼによるトリリン酸化により活性化され、次いでＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかに取り込まれ得るピリミジンベースのヌクレオシドアナログである。これは、ＤＮＡ複製（細胞分裂）の間に核酸シチジンを置換し、腫瘍増殖を阻害し得るが、これは、新規のヌクレオシドがこのヌクレオシド模倣物に結合することができず、細胞のアポトーシスが引き起こされるためである（Ｄａｍａｒａｊｕ他、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２２：７５２４～７５３６（２００３））。
【0006】
ゲムシタビンは、膵臓がんを処置する際の主要な治療薬である（Ｂｕｒｒｉｓ他、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １５：２４０３～２４１３（１９９７）が、多数の他のがん、例えば胆管細胞癌（Ｊｏ ａｎｄ Ｓｏｎｇ、“Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｓｕｒｇｅｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｉｌｉａｒｙ Ｔｒｅｅ”、ｃｈａｐｔｅｒ ３；３５～５２ページ。ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．５７７２／ｉｎｔｅｃｈｏｐｅｎ．７６１３４、Ｓ．Ｙ．（２０１８））、非小細胞肺がん（Ｍｕｇｇｉａ他、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｄｒｕｇｓ、２１：４、４０３～４０８（２０１２））、卵巣がん（Ｌｅ他、Ｇｙｎａｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ．４：１６（２０１７）及び乳がん（Ｘｉｅ他、Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ、９：７１４８～７１６１（２０１８））の処置において使用されている。ゲムシタビンはヌクレオシドトランスポーターによって取り込まれ、デオキシシチジンキナーゼによって活性化され、ＲＮＡ及びＤＮＡの両方に取り込まれる。リボヌクレオチドレダクターゼ及びｄＣＭＰデアミナーゼの阻害は、その活性化を増強し、一方、シチジンデアミナーゼは、ゲムシタビンをその不活性と考えられる代謝物２’，２’－ジフルオロデオキシウリジンに変換し、これは次いでそのヌクレオチド形態で、チミジル酸合成酵素を阻害し得る。ゲムシタビンはＩＶ点滴によって患者に全身的に投与される。ゲムシタビンの標準的な投与は、１０００ｍｇ／ｍ２において、３０分間、週１回の点滴によるものであるが、その有用性は限定的なものであり、これは、腫瘍細胞だけでなく正常細胞にも分布するために、有意な毒性を示すためである。さらに、いくつかの種類の腫瘍においては、有効性を見るためには、用量が非常に高いレベルに上昇する必要があり、その薬物についての治療指数は非常に限定的であり得る。
【0007】
ゲムシタビンは、主に白金アナログと組み合わせて幅広く使用されている。卵巣がんにおけるゲムシタビンとの組合せの他の選択肢は、リボヌクレオチドレダクターゼの阻害をトリアピン又はヒドロキシウレアによって上昇させることからなる。
【0008】
ゲムシタビン毒性を克服するための種々の方法が試されている。最も見込みがあるものの１つは、正常細胞への送達を低下させながら腫瘍細胞への送達を選択的に強化する標的化された送達剤の使用である。
【0009】
化合物ゲムシタビンの作用を増強する遺伝子の例をいくつか挙げると、ＲＡＤ１７、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、ＡＴＲ、ＡＴＭを標的とするｓｉＲＮＡが挙げられる（参照：Ａｚｏｒｓａ、Ｊ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．７：４３（２００９）；Ｆｒｅｄｅｂｏｈｍ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １２６：３３８０～３３８９、２０１３）及びＰｌｕｎｋｅｔｔ他、Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２３：３～１５（１９９６））。
【0010】
上記の研究は、（アンタゴニスト、例えば低分子又は抗体等によって）阻害される、又は（ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを使用して）サイレンシングされる際に、薬物の用量応答曲線について、同等の有効性を、より低い用量／濃度で示すような有益なシフトをもたらす、細胞内のさらなる標的を見出すことを目的としている。
【0011】
このような用量応答のシフトは、（例として）ＲＡＤ１７又はＣＨＫ１に対するｓｉＲＮＡについて見られる。
【0012】
これらのｓｉＲＮＡの、疾患を示す動物／ヒトの腫瘍環境への送達は、種々の標的化された、又は標的化されていない送達剤を使用して達成し得る。これらの送達ビヒクルは、脂質、修飾脂質、ペプチド送達ビヒクル等からなっていても、又はヌクレアーゼ及び循環内で遭遇する他の酵素によるｓｉＲＮＡの分解を防止するために、骨格の修飾を介して修飾された（化学的に安定な）ｓｉＲＮＡ分子への標的化リガンドの直接結合を介するものであってもよい。
【0013】
近年、ＧａｌＮＡｃ修飾ｓｉＲＮＡは、肝臓内の肝細胞へのこれらのｓｉＲＮＡの特異的な送達を促進するために使用されている。ＧａｌＮａｃ部分は、肝細胞に特異的にかつ多数存在するアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に非常に高い親和性で結合する。ＡＳＧＰＲは、結合時に細胞内に内在化し、それによって結合したｓｉＲＮＡを共に細胞内へ運搬すると考えられている。
【0014】
特定の細胞種にペイロードを送達し得る他の標的化リガンドとしては、ＧＬＰ１ペプチド（膵臓β細胞上のＧＬＰ１受容体に結合）、ＲＧＤモチーフ（例えば、α５β３インテグリン受容体に結合するｃＲＧＤ、ｉＲＧＤ又は口蹄疫ウイルス由来のペプチド（α５β３受容体に対するほとんどマイクロモル濃度の親和性と比較して、α５β６インテグリン受容体にｎＭの親和性で結合））、葉酸リガンド（葉酸受容体に結合）、トランスフェリン受容体に結合するトランスフェリンリガンド及びＥＧＦ受容体を介して標的化するＥＧＦＲが挙げられる。多くの標的化部分の他の例は、異なる細胞種への送達について特異性を示す。
【0015】
ｓｉＲＮＡ（遺伝子をサイレンシングする）の、薬物（例えばゲムシタビン）との共送達をもたらし、ｓｉＲＮＡ又は薬物のいずれかの単独の投与を上回る治療効果をもたらす組成物及び方法が本明細書に記載されている。
【0016】
ゲムシタビン（例えば、５－ＦＵ及び他のヌクレオシドアナログ）は、従来の合成方法（手動又は自動化機器の使用）によってＤＮＡ又はＲＮＡ塩基への直接的な連結を可能にする方法で化学的に合成し得る。
【発明の概要】
【0017】
詳細な説明
ｓｉＲＮＡ配列内にシトシン部分の代わりにゲムシタビン（ＧＥＭ）を含むｓｉＲＮＡ組成物が提供される。これらのｓｉＲＮＡ分子を含む医薬組成物及びがん等の疾患を処置するために組成物を使用する方法が提供される。
ｓｉＲＮＡ配列内にシトシン部分の代わりにゲムシタビン（ＧＥＭ）を含むｓｉＲＮＡ組成物が提供される。これらのｓｉＲＮＡ分子を含む医薬組成物及びがん等の疾患を処置するために組成物を使用する方法が提供される。
【0018】
定義
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）：分子が細胞に導入された後、細胞内の遺伝子の発現に干渉する短い二本鎖ＲＮＡである二本鎖オリゴヌクレオチドである。例えば、一本鎖標的ＲＮＡ分子中の相補的なヌクレオチド配列を標的とし、結合する。ｓｉＲＮＡ分子は、化学的に合成されるか、又は当業者に公知の技術によって構築される。このような技術は、米国特許第５，８９８，０３１号、第６，１０７，０９４号、第６，５０６，５５９号、第７，０５６，７０４号、再発行第４６，８７３号及び米国特許第９，６４２，８７３号及び欧州特許第１２１４９４５号及び第１２３０３７５号に記載されており、これらは全てその全体が参照により本明細書に組み入れられる。当技術分野の慣例によれば、ｓｉＲＮＡが特定のヌクレオチド配列によって特定される場合、配列は二本鎖分子のセンス鎖を指す。分子を含むリボヌクレオチドの１つ又は複数は、当技術分野で公知の技術によって化学修飾されていてもよい。個々のヌクレオチドの１つ又は複数のレベルにおける修飾に加えて、オリゴヌクレオチドの骨格も修飾されていてよい。さらなる修飾としては、低分子（例えば、糖分子）、アミノ酸、ペプチド、コレステロール及びｓｉＲＮＡ分子へのコンジュゲーションのための他の巨大分子が挙げられる。
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）：分子が細胞に導入された後、細胞内の遺伝子の発現に干渉する短い二本鎖ＲＮＡである二本鎖オリゴヌクレオチドである。例えば、一本鎖標的ＲＮＡ分子中の相補的なヌクレオチド配列を標的とし、結合する。ｓｉＲＮＡ分子は、化学的に合成されるか、又は当業者に公知の技術によって構築される。このような技術は、米国特許第５，８９８，０３１号、第６，１０７，０９４号、第６，５０６，５５９号、第７，０５６，７０４号、再発行第４６，８７３号及び米国特許第９，６４２，８７３号及び欧州特許第１２１４９４５号及び第１２３０３７５号に記載されており、これらは全てその全体が参照により本明細書に組み入れられる。当技術分野の慣例によれば、ｓｉＲＮＡが特定のヌクレオチド配列によって特定される場合、配列は二本鎖分子のセンス鎖を指す。分子を含むリボヌクレオチドの１つ又は複数は、当技術分野で公知の技術によって化学修飾されていてもよい。個々のヌクレオチドの１つ又は複数のレベルにおける修飾に加えて、オリゴヌクレオチドの骨格も修飾されていてよい。さらなる修飾としては、低分子（例えば、糖分子）、アミノ酸、ペプチド、コレステロール及びｓｉＲＮＡ分子へのコンジュゲーションのための他の巨大分子が挙げられる。
【0019】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）：一本鎖標的ＲＮＡ分子中の相補的なヌクレオチド配列を標的とし、結合することによって、遺伝子発現のＲＮＡサイレンシング及び翻訳後調節において機能する小さいノンコーディングＲＮＡ分子。
【0020】
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）：一本鎖標的ＲＮＡ分子中の相補的なヌクレオチド配列を標的とし、結合することによって、哺乳動物細胞内の遺伝子の発現を低下させ得る短い一本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡ（典型的には１１～２７塩基）。
【0021】
ＤＮＡ又はＲＮＡアプタマー：特定の標的分子に結合する一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡオリゴヌクレオチド。このような標的としては、低分子、タンパク質及び核酸が挙げられる。このようなアプタマーは、通常、ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択の反復又は試験管内進化法（ＳＥＬＥＸ）によって大きい無作為の配列プールから作製される。
【0022】
ポリＧＥＭ配列：複数のゲムシタビンヌクレオシドを連続して含む配列。
【0023】
オリゴＧＥＭ：複数のゲムシタビンヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチド。ヌクレオシドは、いずれかの末端、又はオリゴヌクレオチド内に連続していても、又は１つ又は両方の末端に単一のヌクレオシドを含んで、オリゴヌクレオチド内に散在していてもよい。
【0024】
ヒスチジン－リジン共重合体：ヒスチジン及びリジンアミノ酸からなるペプチド又はポリペプチド。このような共重合体は、米国特許第７，０７０，８０７号、第７，１６３，６９５号及び第７，７７２，２０１号に記載されており、これらは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【0025】
がんは任意の悪性腫瘍である。
【0026】
悪性腫瘍は、腫瘍性細胞の集団である。
【0027】
肝臓がん：肝臓内の任意の原発性がん、すなわち肝臓中で開始するがん、又は肝臓内の任意の二次がん、すなわち哺乳類の身体内で他の組織から肝臓に転移するがん。原発性肝臓がんの一例は肝細胞癌である。二次肝臓がんの例は結腸がんである。
【0028】
処置すること／処置：がん細胞のいくつか、又は全てを死滅させること、がんのサイズを低下させること、がんの増殖を阻害すること、又はがんの増殖速度を低下させること。
【0029】
抗腫瘍有効性の増強：腫瘍細胞の増殖速度をより低下させること、腫瘍細胞の死滅、及び／又は腫瘍体積の低下において、より大きい効果をもたらすこと、並びに腫瘍を有する患者の寿命を延長することによって、より優れた治療効果を最終的にもたらすことを意味する。
【0030】
ＧＥＭ活性の増強のための標的選択
ＧＥＭを含むコンストラクト
Ａｚｏｒｓａ他（Ｊ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．７：４３（２００９））は、培養中の膵臓がん細胞におけるゲムシタビンの効果の増強を示した、ＣＨＫ１遺伝子に対するｓｉＲＮＡを特定している。その後、Ｆｒｅｄｅｂｏｈｍ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １２６：３３８０～３３８９、２０１３）は、膵臓腫瘍細胞におけるゲムシタビンの効果の増強剤としてＣＨＫ１を検証しており、また、サイレンシングした際にゲムシタビンの活性を改善する他の可能性のある標的をいくつか特定した。ＲＡＤ１７は、これらの標的の１つとして特定され、細胞生存率を低下させる上でのゲムシタビンの作用の重大な改善が実証された。
ＧＥＭを含むコンストラクト
Ａｚｏｒｓａ他（Ｊ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．７：４３（２００９））は、培養中の膵臓がん細胞におけるゲムシタビンの効果の増強を示した、ＣＨＫ１遺伝子に対するｓｉＲＮＡを特定している。その後、Ｆｒｅｄｅｂｏｈｍ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １２６：３３８０～３３８９、２０１３）は、膵臓腫瘍細胞におけるゲムシタビンの効果の増強剤としてＣＨＫ１を検証しており、また、サイレンシングした際にゲムシタビンの活性を改善する他の可能性のある標的をいくつか特定した。ＲＡＤ１７は、これらの標的の１つとして特定され、細胞生存率を低下させる上でのゲムシタビンの作用の重大な改善が実証された。
【0031】
ＲＡＤ１７は、ＣＨＫ１よりも優れた標的であることが提案されたが、これは、この遺伝子を単独でサイレンシングすることは、細胞生存率に対してほとんど影響がなかったが、ゲムシタビンを含めた場合、がん細胞生存率の低下における相乗作用も明らかであったためである。しかしながら、ＣＨＫ１サイレンシングはゲムシタビンが存在しない場合であっても、それ自体が細胞に対していくらかの毒性を呈することが示されており、これは、ＣＨＫ１に対するｓｉＲＮＡの使用が、腫瘍細胞には優先的に取り込まれるが、正常な分裂細胞には取り込まれない方法で投与される必要があることを必要としている。
【0032】
ＲＡＤ１７阻害は、チェックポイントキナーゼの阻害とも協働し得ることが示されている（Ｓｈｅｎ他、Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ６：３５７５５～３５７６９（２０１５））。したがって、膵臓がんに対する活性をさらに増強するために、両方の標的ＲＡＤ１７及びＣＨＫ１に対するｓｉＲＮＡを共送達することも可能であり得る。本明細書に記載するように、ＲＡＤ１７及びＣＨＫ１に対するｓｉＲＮＡは、センス鎖内で共にゲムシタビンヌクレオチドによって修飾されていても、又はセンス鎖の末端に付加されていてもよく、２つのＧｅｍ修飾ｓｉＲＮＡが、単一のポリペプチドナノ粒子内で組み合わされて、細胞にトランスフェクトされた場合に有効性の改善がもたらされるようになっていてもよい。さらに、ヒスチジン－リジン分岐状共重合体を使用して作製したポリペプチドナノ粒子（「ＰＮＰ」）は、同時に同じ細胞に複数のｓｉＲＮＡを同時送達し得る。これらのＰＮＰはまた、動物モデルにおける異種移植片として示される場合、広範の腫瘍細胞種にｓｉＲＮＡを送達するために使用し得る。
【0033】
後述のように、ｓｉＲＮＡ配列の末端に連結した、及び／又は配列の内部にＧＥＭ部分を含むｓｉＲＮＡ分子を調製し得る。これらのＧＥＭ含有ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子をサイレンシングし、ＧＥＭの細胞への放出を介して腫瘍を死滅させる上で有効性の増強をもたらす上で機能的なままであり、ここで、遺伝子サイレンシング活性と薬物の効果の間に相乗作用が見られ、すなわち、見られる結果は、ｓｉＲＮＡ及びＧＥＭを別個の成分として個々に投与することによって達成されるものを上回っている。
【0034】
天然のヌクレオチドによって分離されている場合に、ＧＥＭがよりよくプロセシングされるかを決定するために、ゲムシタビンが、ヌクレオチドシチジンのアナログであるため、シチジン（Ｃ）の代わりにｓｉＲＮＡ配列に直接取り込まれ得ることを利用した。ゲムシタビンアミダイトは、ＧＥＭ部分から全体がなるポリマーを形成するために使用し得る（Ｍａ他、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．、５５：６６０３～６６０６（２０１９））これらのポリマーは、ナノゲルを形成し、これらは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏのがん細胞モデルにおいて一定の活性を示した。アミダイト官能基を取り込んでいる修飾ヌクレオシドは、修飾ヌクレオシド、例えばＧＥＭを、合成の間に二本鎖の１つの鎖に導入するために使用し得る。ｓｉＲＮＡ二本鎖からのアンチセンス鎖は、ｓｉＲＮＡ領域内のセンス鎖の適切な配列とアニーリングしなければならず、アンチセンス鎖は、ＲＩＳＣ複合体に取り込まれ、ｍＲＮＡ配列の適合のための監視に使用されるため、修飾ヌクレオシドは、最初にｓｉＲＮＡのセンス鎖に付加され、アンチセンス鎖に対してセンス鎖の長さの延長部を形成した。複数の（ｎ）非天然ヌクレオシド塩基を、鎖の末端に取り込んで、単一のｓｉＲＮＡ分子の送達によって、複数の（ｎ）非天然ヌクレオシドの共送達がもたらされるようになってもよい。
【0035】
細胞の細胞質内部に一度入ると、アンチセンス鎖はＲＩＳＣ複合体に取り込まれ、適合するｍＲＮＡ配列が特定されると、ｍＲＮＡは、酵素ＤＩＣＥＲによって切断される。センス鎖はこの工程の間に除去され、次いで、細胞質内で切断される。センス鎖の末端に取り込まれた非天然ヌクレオシドアナログは、次いで、内因性のヌクレアーゼによって切断される。遊離したゲムシタビンの分子（又は抗がん非天然ヌクレオシドアナログを含む類似の構造）は、次いで腫瘍細胞複製機構を阻害し、ｓｉＲＮＡによって標的化される遺伝子発現の低下と協調して、これらの剤が存在しない場合よりも、腫瘍細胞増殖の低下に対してよりよい効果を示す。
【0036】
ＧＥＭ残基を取り込む化学的に非修飾のｓｉＲＮＡ分子は、血液の循環、又は組織、微小環境等においてｓｉＲＮＡを分解から保護する適切なナノ粒子製剤中で送達し得る。目的の腫瘍又は組織内部に一度入ると、ｓｉＲＮＡは、腫瘍細胞中に放出され、その細胞傷害性効果をもたらす。
【0037】
ＧＥＭアミダイトを使用して合成されるｓｉＲＮＡ分子は、ヒスチジンリジンポリペプチドナノ粒子（ＨＫＰ ＰＮＰ）ナノ粒子システムを使用して送達し得る。ＧＥＭは、遺伝子を標的とし、次いで腫瘍細胞の死滅におけるゲムシタビンの作用を増強するｓｉＲＮＡ二本鎖配列内に含まれていてよく、治療効果を観察するために投与のために必要とされる量を低下させ、ゲムシタビンを単独で患者に投与した場合に観察される毒性の効果の可能性を低減し得る。後述するように、ゲムシタビンをｓｉＲＮＡと別々に（すなわち個々の成分として）投与した際に、ゲムシタビンの相乗作用を示した、以前に公開されているＣＨＫ１に対するｓｉＲＮＡ配列（Ａｚｏｒｓａ、上述）を選択した。
【0038】
ｓｉＲＮＡは、当技術分野で周知の方法を使用することによって、例えば２’－ＯＭｅ及び／又は２’－Ｆ及び／又はホスホロチオエート修飾の使用によって化学修飾によってヌクレアーゼ分解に対して安定化し得る。ｓｉＲＮＡは、標的化部分（例えば、ＧａｌＮａｃ、ＲＧＤ、葉酸、ＴＦＲ、ＥＧＦＲ、ペプチド標的化リガンド、アプタマー又は炭水化物又は、低分子又は抗体又はナノボディであってもよい）に（ＳＳ又はＡＳの末端を介して、又は分子に付加された末端ＧＥＭも介して）所望により化学的に連結していてもよい。標的化部分は、受容体又は細胞表面上の他の標的に対して親和性を有し、これによりこれらの細胞への取り込みが強化される。非修飾のｓｉＲＮＡと同様に、ＳＳ及びＡＳ鎖は細胞内で分離し、ＡＳ鎖は目的の遺伝子のサイレンシングをもたらす一方で、放出されたＳＳ－ポリＧＥＭ構造は分解されてＧＥＭを放出し、これは、サイレンシングされた遺伝子と組み合わされて、いずれか単独よりも大きい効果を示す。
【図面の簡単な説明】
【0039】
【図1】基本的な構造を示す図である。
【図4】Ｇｅｍ－ループを有する等しい長さのセンス及びアンチセンス配列を示す図である。
【図5】Ｇｅｍ－ループを有するアンチセンスに対する長さが等しくないセンス配列を示す図である。
【図6】Ｇｅｍ－ループを有する等しい長さの配列の標的化送達を示す図である。
【図7】Ｇｅｍ－ループを有する長さが等しくない配列の標的化送達を示す図である。
【図8】膵臓がん細胞株ＢｘＰＣ３の細胞生存率（％）に対するｓｉＲＮＡ又はゲムシタビンの効果を示すグラフである。
【図9】ＣＨＫ１に対して設計された８つの数のｓｉＲＮＡ配列のトランスフェクション時の膵臓がん細胞株生存率の感受性を示すグラフである。
【図9-1】ＣＨＫ１に対して設計された８つの数のｓｉＲＮＡ配列のトランスフェクション時の膵臓がん細胞株生存率の感受性を示すグラフである。
【図10】５－フルオロウラシル、ゲムシタビン、アシクロビル及びＡＣＶ－ＴＰ－Ｔの構造を示す式である。
【図11】各ｓｉＲＮＡ又はゲムシタビンの膵臓がんＢｘＰｃ３細胞の細胞生存率に対する効果を示すグラフである。
【図12a】力価及び有効性に対する各ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端における２つのゲムシタビンヌクレオチド付加の効果を示すグラフである。
【図12b】力価及び有効性に対する各ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端における２つのゲムシタビンヌクレオチド付加の効果を示すグラフである。
【図12c】力価及び有効性に対する各ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端における２つのゲムシタビンヌクレオチド付加の効果を示すグラフである。
【図12d】力価及び有効性に対する各ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端における２つのゲムシタビンヌクレオチド付加の効果を示すグラフである。
【図13】センス鎖の３’末端にさらなるＧＥＭを付加することの有効性及び力価に対する効果を示すグラフである。
【図14】トランスフェクション２４時間後の、Ｃｈｋ１／Ｇｅｍ ｓｉＲＮＡの異なるバリアントによるＢｘＰｃ３細胞におけるＣｈｋ１の下方制御を示すグラフである。
【図15】ｓｉＲＮＡ及びｓｉＲＮＡ－ＧＥＭコンストラクトの細胞生存率についての有効性の時間依存性を示すグラフである。
【図15-1】ｓｉＲＮＡ及びｓｉＲＮＡ－ＧＥＭコンストラクトの細胞生存率についての有効性の時間依存性を示すグラフである。
【図16】ＡＳ鎖中のＣの代わりにＧＥＭを含む各ｓｉＲＮＡの細胞生存率に対する効果及びＩＣ５０を示すグラフである。
【図17】ｓｉＲＮＡのＳＳにおけるＧＥＭの位置及び修飾の数の、ｓｉＲＮＡ／Ｇｅｍの組合せの有効性及び力価に対する効果を示すグラフである。
【図18】他の膵臓腫瘍細胞であるＭｉａＰａにおけるコンストラクトの効果を示すグラフである。
【図19】ＭｉａＰａｃａ細胞に対するＧｅｍ修飾ｓｉＲＮＡの効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0040】
基本的な構造を図１に示す。図２は、ポリＧＥＭテイルを有するアンチセンスオリゴヌクレオチド（「ＡＳＯ」）配列を示す。図２ｂは、標的化リガンドを介した標的化されたＡＳＯ送達を示す。図３は、標的化されたオリゴ送達を示し、図３ａは、センス鎖に結合した標的化リガンドを示し、図３ｂは、アンチセンス鎖に結合した標的化リガンドを示す。
【0041】
ポリゲムシタビンはまた、同じ長さのセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方を有する単一オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされてもよい（図４参照）。アニーリング後、二本鎖ＲＮＡの２本の鎖間で結合した「ポリゲムシタビンループ」を形成する。単一のオリゴヌクレオチド配列は、２本の鎖と比較して製造コストが低減しており、また生成物の安定性の改善能及び細胞に送達されるｓｉＲＮＡ当たりはるかに多数のＧＥＭ分子の送達能を有するため、がん細胞に対する有効性が改善される。さらに、特定の環境において、ＲＮＡの２本の鎖は、短い鎖が長い鎖の関連する同族配列へのハイブリダイズが可能になるだけの十分な塩基があれば、同じ長さである必要はない場合もある（図５参照）。これらの環境下において、ゲムシタビンループは２本の鎖の間で対称的でなくてもよい。
【0042】
他の実施形態において、これらのコンストラクトは、他の非標的細胞と比較して、標的細胞上に高いレベルで存在する標的に高い親和性で結合する標的化リガンドを結合することによって、特定の細胞種への送達について標的化されている。標的化された送達のために、複数のリガンドをゲムシタビンループ領域に結合させてもよく（図６参照）、これによって同時に標的に複数のリガンドが標的に結合することによる多価標的化の利点がもたらされる（結合の結合活性の上昇及び、高い可能性で細胞特異性の改善）。標的化リガンドは、リンカーによってループ領域でゲムシタビンとコンジュゲートされる。これによって、標的化された細胞又は組織にオリゴ及びゲムシタビンのコンジュゲートを特異的に送達することが可能になり、ここで、付加的な、又は相乗的、又はより広範の治療効果を誘導し得る。リガンドはまた非対称鎖コンストラクト内でＧｅｍループに付加されてもよい（図７）。
【0043】
ＧＥＭ部分を含むＣＨＫ１ ｓｉＲＮＡ分子の具体例を下記に示す。ＳＳ及びＡＳ鎖は、ＧＥＭの非存在下において、アニーリングしてＣＨＫ１を標的とするｓｉＲＮＡを形成する。この具体的な配列は、ヒト及びマウスのＣＨＫ１遺伝子の間で同一性を有するように設計されており、ＣＨＫ１＿ＡＺ配列よりも遺伝子のサイレンシングにおいて強力であることが示されている（図８及び９参照。
ＳＳ＝５’－ＣＣＵ ＧＵＧ ＧＡＡ ＵＡＧ ＵＡ［ＧＥＭ］ ＵＵＡ ［ＧＥＭ］ＵＧ ［ＧＥＭ］ＡＡ Ｕ－３’（「Ｃ」の代わりに［ＧＥＭ］）
ＡＳ＝５’－Ａ ＵＵＧ ＣＡＧ ＵＡＡ ＧＵＡ ＣＵＡ ＵＵＣ ＣＡＣ ＡＧＧ－３’（ＡＳ鎖上にＧＥＭなし）
ＳＳ＝５’－ＣＣＵ ＧＵＧ ＧＡＡ ＵＡＧ ＵＡ［ＧＥＭ］ ＵＵＡ ［ＧＥＭ］ＵＧ ［ＧＥＭ］ＡＡ Ｕ－３’（「Ｃ」の代わりに［ＧＥＭ］）
ＡＳ＝５’－Ａ ＵＵＧ ＣＡＧ ＵＡＡ ＧＵＡ ＣＵＡ ＵＵＣ ＣＡＣ ＡＧＧ－３’（ＡＳ鎖上にＧＥＭなし）
【0044】
他の分子において、さらなるＧＥＭをＳＳの末端に結合した：
ＳＳ＝５’－ＣＣＵ ＧＵＧ ＧＡＡ ＵＡＧ ＵＡ［ＧＥＭ］ ＵＵＡ ［ＧＥＭ］ＵＧ ［ＧＥＭ］ＡＡ Ｕ－［ＧＥＭ］［ＧＥＭ］…．［ＧＥＭ｝３’（「Ｃ」の代わりに［ＧＥＭ］、ＧＥＭを３’末端に付加）
ＡＳ＝５’－Ａ ＵＵＧ ＣＡＧ ＵＡＡ ＧＵＡ ＣＵＡ ＵＵＣ ＣＡＣ ＡＧＧ－３’（ＡＳ鎖上にＧＥＭなし）
ＳＳ＝５’－ＣＣＵ ＧＵＧ ＧＡＡ ＵＡＧ ＵＡ［ＧＥＭ］ ＵＵＡ ［ＧＥＭ］ＵＧ ［ＧＥＭ］ＡＡ Ｕ－［ＧＥＭ］［ＧＥＭ］…．［ＧＥＭ｝３’（「Ｃ」の代わりに［ＧＥＭ］、ＧＥＭを３’末端に付加）
ＡＳ＝５’－Ａ ＵＵＧ ＣＡＧ ＵＡＡ ＧＵＡ ＣＵＡ ＵＵＣ ＣＡＣ ＡＧＧ－３’（ＡＳ鎖上にＧＥＭなし）
【0045】
ゲムシタビンはシチジンアナログであるため、ゲムシタビン部分を有するＲＮＡオリゴヌクレオチド配列におけるシチジン部分をゲムシタビン部分又はＤＮＡオリゴヌクレオチドにおけるデオキシシチジン部分に置換するのに使用し得る。これらのＧＥＭは、オリゴヌクレオチドの第２の鎖においても依然としてその対応物とハイブリダイズする、すなわち、ＧＥＭは、対向する鎖上の「Ｇ」（グアノシン／デオキシグアノシン）とハイブリダイズする。したがって、サイレンシングされた場合に、細胞増殖の阻害をもたらし、腫瘍細胞を死滅させ得る遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ配列は、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれか、又はアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）のような一本鎖配列においても、シトシン部分の代わりにＧＥＭ部分を含むことによって増強される。後述するように、ＣＨＫ１遺伝子をサイレンシングするｓｉＲＮＡのためにＣＨＫ１＿ＡＺ配列中の２つのシトシン部分をＧＥＭで置換することによって、ｓｉＲＮＡ単独の阻害活性が増強される（下記試験参照）。
ＳＳ＝５’－ＣＣＵ ＧＵＧ ＧＡＡ ＵＡＧ ＵＡ［ＧＥＭ］ ＵＵＡ ［ＧＥＭ］ＵＧ ［ＧＥＭ］ＡＡ Ｕ－３’（「Ｃ」の代わりに［ＧＥＭ］）
ＡＳ＝５’－Ａ ＵＵＧ ＣＡＧ ＵＡＡ ＧＵＡ ＣＵＡ ＵＵＣ ＣＡＣ ＡＧＧ－３’（ＡＳ鎖上にＧＥＭなし）
ＳＳ＝５’－ＣＣＵ ＧＵＧ ＧＡＡ ＵＡＧ ＵＡ［ＧＥＭ］ ＵＵＡ ［ＧＥＭ］ＵＧ ［ＧＥＭ］ＡＡ Ｕ－３’（「Ｃ」の代わりに［ＧＥＭ］）
ＡＳ＝５’－Ａ ＵＵＧ ＣＡＧ ＵＡＡ ＧＵＡ ＣＵＡ ＵＵＣ ＣＡＣ ＡＧＧ－３’（ＡＳ鎖上にＧＥＭなし）
【0046】
ＧＥＭ付加はまた、センス鎖の３’末端上であっても、又は５’末端上であってもよい。それらはまた、ＡＳ鎖の同じ部分に付加されてもよい。付加は、独立して１つ、２つ、３つ、４つ又はそれより多くのＧＥＭ部分を含んでいてもよい。
【0047】
他のヌクレオシド抗がん剤を、ゲムシタビンの代わりにオリゴヌクレオチド骨格に結合してもよい。このようなアナログのいくつかの例としては、シタラビン（ａｒａ－Ｃ）、５－ＦＵ、５－デオキシ－５－フルオロウリジン、フルダラビン、カペシタビン、クラドリビン、トロキサシタビン又はクロファラビン、アザシチジン及び５－デオキシアザシチジンが挙げられる（上記Ｄａｍａｒａｊｕ参照）。
【0048】
多数のｓｉＲＮＡ配列が、センス鎖又はアンチセンス鎖上のポリヌクレオシドアナログ鎖に結合し得る。このようなｓｉＲＮＡ配列の例は、ヌクレオシドアナログの阻害機構に対して逆効果を示すタンパク質をコードする遺伝子をサイレンシングするｓｉＲＮＡである。例えば、ｓｉＲＮＡは、ゲムシタビンの脱アミン化及び不活性化に重要な酵素（シチジンデアミナーゼ又は５’－ヌクレオチダーゼ）又は細胞からのヌクレオシドの放出の増強に重要な酵素－例えば、ヌクレオシドトランスポーター（上述のＤａｍａｒａ及びその中に参照文献を参照のこと］をサイレンシングするために使用し得る。
【0049】
これらのコンストラクトにおいて（ヌクレオシドアナログ鎖に結合して）ｓｉＲＮＡ配列として使用し得る他の可能性のある標的としては、それぞれ、ＭＤＲ１及びＭＲＰ１遺伝子によってコードされる多剤耐性（ＭＤＲ）タンパク質、例えばＰ－糖タンパク質（Ｐ－ｇｐ）及び多剤耐性関連タンパク質－１（ＭＲＰ１）が挙げられる。これらのタンパク質の発現によって、がん化学療法において使用される広範の薬物に対して抵抗性の表現型が付与される。これらのトランスポーターは、広義にはＡＴＰ－結合カセットタンパク質（ＡＢＣ）として分類され、タンパク質スーパーファミリーを構成する。ｓｉＲＮＡを使用したＭＤＲ１及びＭＲＰ１遺伝子のサイレンシングが記載されている。Ｄｏｅｎｍｅｚ ａｎｄ Ｇｕｅｎｄｕｅｚ、Ｂｉｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．６５（２）：８５～９（２０１１）を参照のこと。サイレンシングし得る遺伝子の他の例としては、メチルトランスフェラーゼ、有機アニオン及びカチオントランスポーター（ＯＡＴ及びＯＣＴ）、オキシドレダクターゼフラボタンパク質及びヌクレオシドトランスポーター（ＮＴ）が挙げられ、これらは全て薬物輸送及び細胞内の代謝に関与しており、がん細胞に薬物抵抗性表現型を付与し得る。
【0050】
ｓｉＲＮＡについての他の遺伝子標的は、それ自体がサイレンシングされた際にゲムシタビン又は他のヌクレオシドアナログの作用を増強することが検証されているものである。このような遺伝子標的としては、ＣＨＫ１、ＲＡＤ１７に加えて、ＡＴＲ及びＷＥＥ１が挙げられる。他の標的はサイレンシングされてヌクレオシド活性を増強することが示されているため、これらはまた、適当なヌクレオシドアナログに結合した、それらに対するｓｉＲＮＡを有していてもよい。
【0051】
Ａｚｏｒｓａ配列の使用において、ＳＳ及びＡＳ鎖上にそれぞれ置換され得る２つのＣが存在した。そのため、Ｃの代わりに２つのＧｅｍを取り込むことによってＳＳが修飾されたコンストラクトを作製し、ＡＳ鎖を同様に作製した。次いで２つのＧＥＭを含むＳＳを非修飾のＡＳ鎖とアニーリングし、ＧＥＭ修飾ＡＳ鎖を非修飾のＳＳとアニーリングした。さらに、ＧＥＭ修飾ＳＳをＧＥＭ修飾ＡＳ鎖とアニーリングした。これらのコンストラクトを全て鎖がいずれも修飾されていないｓｉＲＮＡ及びゲムシタビン単独の用量応答と比較した。
【0052】
Ａｚｏｒｓａ他（ＣＨＫ１＿ＡＺ）によって特定されたｓｉＲＮＡ配列は、ＧＥＭ部分を含む分子を調製するのに使用し得るｓｉＲＮＡの一例である。オリゴヌクレオチド合成剤を使用して、以下のｓｉＲＮＡ鎖を、配列中に存在する天然のシチジン（「Ｃ」）基の代わりに含まれるＧＥＭ残基を用いて、及び用いずに作製した。
【0053】
Ｃ１Ｄ－２Ａ（配列 ＡＵＵＧＡＵＡＣＡＧＡＵＣＵＣＵＵＵＣＵＵ）は、シチジン残基の代わりに２つのＧＥＭ残基を含み、３’末端にｄＴｄＴを有するＣＨＫ１ ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖を指し、これはＧＥＭを全く含まないセンス鎖（ＳＳ）（配列 ＡＡＧＡＡＡＧＡＧＡＵＣＵＧＵＡＵＣＡＡＵ）とアニーリングする。
【0054】
Ｃ１Ｄ－２Ｓは、シチジンの代わりに２つのＧＥＭ残基を含み、３’末端にｄＴｄＴを有するＣＨＫ１ ｓｉＲＮＡセンス鎖を指し、これはＧＥＭを全く含まないアンチセンス鎖（ＡＳ）とアニーリングする。
【0055】
Ｃ１Ｄ－４は、２つのＧＥＭ残基を含むＣＨＫ１ ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖を指し、これは、同様に２つのＧＥＭを含むセンス鎖（ＳＳ）とアニーリングしており、すなわちｓｉＲＮＡ当たり４つのｇｅｍを含む。両方の鎖が、上述のように３’末端にｄＴｄＴを有する。
【0056】
このｓｉＲＮＡのアナログが２つ、４つ又は６つのＧＥＭがＳＳの３’末端に付加されて合成され、また、配列内のＣがその位置にＧＥＭを挿入することによって修飾され得る、いくつかの異なるｓｉＲＮＡを設計した。ＧＥＭは、ＧＥＭ含有量の増加が有効性又は力価を改善するかどうかを調査するために、個別に、又は組合せでセンス鎖及びアンチセンス鎖内のＣの代わりに挿入された。非修飾のＣＨＫ１ ｓｉＲＮＡ、Ｃ１Ｄ－２Ａ、Ｃ１Ｄ－２Ｓ及びＣ１Ｄ－４は、ＣＨＫ１＋Ｇｅｍに感受性を示すことが示されている膵臓がん細胞株ＢｘＰＣ３（Ａｚｏｒｓａ、上記）にトランスフェクトされた。ゲムシタビン単独の用量応答を、非サイレンシングｓｉＲＮＡのトランスフェクションと共に（対照として）行った。
【0057】
ＳＳの３’末端にさらにＧＥＭを付加すること（通常のｄＴｄＴ末端基の前）は、２つのＧＥＭを付加することを上回るさらなる効果を有するものではなく、４つ又は６つを付加した場合、力価及び有効性は上昇しないことが観察された。理論に縛られるものではないが、細胞内に存在するヌクレアーゼは、ＧＥＭ部分間のポリＧＥＭ配列を切断することができず、その前の非修飾のヌクレオチドからＧＥＭを切断することができるのみであり、配列中のＧＥＭに関わらずポリＧＥＭ配列内の１つのＧＥＭのみが放出されることが推測された。結果として、ＳＳの３’末端に４又は６つのＧＥＭを有するコンストラクトは、この部位における２つのＧＥＭと比較して、有する力価が同等であるか、又はわずかに低かった。
【0058】
ＳＳにＣの代わりにＧＥＭを挿入することによって、同じ時間インキュベートされた非修飾のｓｉＲＮＡ（ＩＣ５０＝３ｎＭ；図５、右側パネル））と比較して、ＩＣ５０及び有効性が改善された産物が得られた（ＩＣ５０＝０．３８ｎＭ（図６））。Ｃ残基の代わりにアンチセンス鎖にＧＥＭを付加することによって、ｓｉＲＮＡのＲＩＳＣ複合体へのローディング又は、それに続く同族ｍＲＮＡの認識及び、その後のＤｉｃｅｒによる切断を干渉する能力が得られた。しかし、選択した特定のＣＨＫ１ ｓｉＲＮＡ配列を用いることによって、ＡＳ鎖へのＧＥＭの付加は、力価及び有効性を改善したが（ＩＣ５０ １．８ｎＭ）、これはＳＳについて観察される程度ではないことが見出された。さらに、２つの鎖を組み合わせること（これにより合計４つのＧＥＭを含む）によって、主要な寄与が両方の鎖からのＧＥＭの放出である場合に期待し得るような、力価のさらなる改善（１．９８ｎＭ）はもたらされなかった。このＩＣ５０は、ＡＳ鎖単独における２つのＧＥＭと同等であった。ｓｉＲＮＡのＲＩＳＣ複合体へのローディングの間に、鎖は分離し、センス鎖が細胞質へと放出されそこで分解されることが知られている。ＡＳ鎖はしばらくＲＩＳＣに維持され、そのため、混合物にＧＥＭを付与することがない－したがって、全てのＧＥＭはＳＳに由来するものである。
【0059】
これは種々のコンストラクトによって誘導されるサイレンシングのＱＰＣＲ解析によっても確認された。図４は、ＳＳ、ＡＳ鎖又は両方の鎖におけるＧＥＭの数に関わらず、ｓｉＲＮＡによって同等の遺伝子サイレンシングが得られたことを示している。
【0060】
ｓｉＲＮＡが細胞内でプロセシングされる際、アンチセンス鎖はセンス鎖からほどかれ、ＲＩＳＣ複合体にローディングされ、ここで同族ｍＲＮＡ配列について細胞を監視する。アンチセンス鎖によって特定及び結合されると、ｍＲＮＡはＤＩＣＥＲ酵素によって切断され、アンチセンス鎖はＲＩＳＣにローディングされ、センス鎖は細胞質中に放出され、ここで分解される。以前の出版物（Ｍａ他、２０１９）において、１０のゲムシタビンの反復配列からなるポリゲムシタビンナノゲルを合成し、これらの構造は自己アニーリングして、膵臓腫瘍細胞において有効性の改善を示すナノゲルを形成した。センス鎖の末端上のＧＥＭの反復配列の付加は、ｓｉＲＮＡが細胞内に送達すると同時に、ゲムシタビンの送達において同等の改善をもたらすことが予期された。しかしながら、非修飾のアンチセンス鎖とアニーリングする前に、センス鎖の［３’］末端に２、４又は６つのいずれかのＧｅｍを付加することは、予期される力価の上昇をもたらさないことが見出された。むしろ、２、４及び６つのＧＥＭ配列は、１つのＧＥＭが各配列から放出されたのと同じ力価しか示さない。これは、エキソ又はエンドヌクレアーゼが、ポリＧＥＭ配列を切断できないことの結果でも、又は放出及びそれに続くリン酸化によるｇｅｍの活性化が非常に遅いことの結果でもあり得る。これらの構造のそれぞれの細胞生存率試験における有効性の結果は、インキュベーション時間を増加させることによって何の改善も示さなかった（７２時間から９６時間）。
【0061】
ＧＥＭを用いたｓｉＲＮＡ合成
ＣＨＫ－Ａｚ ｓｉＲＮＡは、各鎖の３’末端に２塩基（ｄＴｄＴ）のオーバーハングを含む１９－ｍｅｒ ｓｉＲＮＡであった。センス鎖内にゲムシタビン部分を含むことによって修飾されている場合、これらをセンス鎖の末端とｄＴｄＴ末端基の前の間に挿入した。ｄＴｄＴ末端は、ヌクレアーゼ分解に対してｓｉＲＮＡを安定させるのを補助することができ、これは、次いで、切断され、サイレンシングされる同族ｍＲＮＡ配列についてＡＳ鎖を監視する間にＲＩＳＣ複合体中でＡＳから放出される際のセンス鎖からのＧｅｍの放出の速度に影響し得る。
ＣＨＫ－Ａｚ ｓｉＲＮＡは、各鎖の３’末端に２塩基（ｄＴｄＴ）のオーバーハングを含む１９－ｍｅｒ ｓｉＲＮＡであった。センス鎖内にゲムシタビン部分を含むことによって修飾されている場合、これらをセンス鎖の末端とｄＴｄＴ末端基の前の間に挿入した。ｄＴｄＴ末端は、ヌクレアーゼ分解に対してｓｉＲＮＡを安定させるのを補助することができ、これは、次いで、切断され、サイレンシングされる同族ｍＲＮＡ配列についてＡＳ鎖を監視する間にＲＩＳＣ複合体中でＡＳから放出される際のセンス鎖からのＧｅｍの放出の速度に影響し得る。
【0062】
ＧＥＭを有する２５ｍｅｒと比較してＧＥＭを有するＣＨＫ１＿ＡＺによる改善の根拠
我々が設計した２５ｍｅｒ ｓｉＲＮＡは平滑末端のｓｉＲＮＡであり、一方Ａｚｏｒｓａが使用したｓｉＲＮＡ 配列は、３’末端に２塩基（ｄＴｄＴ）オーバーハングを有する１９ｍｅｒ ｓｉＲＮＡであった。２つのＧＥＭ部分がｓｉＲＮＡ ＳＳの最後のヌクレオチドとｄＴｄＴオーバーハングの間に付加される場合、この配列が、ＢｘＰＣ３細胞よりもＭｉａＰａｃａ細胞に対してはるかに高い有効性を示す様子が見られた。配列の末端上にｄＴｄＴを含むことは、ＳＳがＡＳ鎖からほどかれ、細胞質中に放出される際の、このコンストラクトにおけるＳＳからのＧＥＭの放出速度を低下させ得る。これによって、ＧＥＭがＳＳから放出される前に、ＡＳ配列が遺伝子のサイレンシングを誘導することが可能になる可能性があり、これによって、ＢｘＰＣ３細胞と比較して、ＭｉａＰａｃａ細胞におけるこの組合せの有効性が増強され得る。
我々が設計した２５ｍｅｒ ｓｉＲＮＡは平滑末端のｓｉＲＮＡであり、一方Ａｚｏｒｓａが使用したｓｉＲＮＡ 配列は、３’末端に２塩基（ｄＴｄＴ）オーバーハングを有する１９ｍｅｒ ｓｉＲＮＡであった。２つのＧＥＭ部分がｓｉＲＮＡ ＳＳの最後のヌクレオチドとｄＴｄＴオーバーハングの間に付加される場合、この配列が、ＢｘＰＣ３細胞よりもＭｉａＰａｃａ細胞に対してはるかに高い有効性を示す様子が見られた。配列の末端上にｄＴｄＴを含むことは、ＳＳがＡＳ鎖からほどかれ、細胞質中に放出される際の、このコンストラクトにおけるＳＳからのＧＥＭの放出速度を低下させ得る。これによって、ＧＥＭがＳＳから放出される前に、ＡＳ配列が遺伝子のサイレンシングを誘導することが可能になる可能性があり、これによって、ＢｘＰＣ３細胞と比較して、ＭｉａＰａｃａ細胞におけるこの組合せの有効性が増強され得る。
【0063】
膵臓がん治療についての改善された選択肢
示されたデータから、我々は、ゲムシタビンを含むことによって膵臓がん細胞におけるゲムシタビン作用の有効性の劇的な改善を示し得ると考えられる。複数のＧＥＭをｓｉＲＮＡのセンス鎖に取り込むことによって、ＧＥＭを同じ細胞に送達することができ、ここでｓｉＲＮＡはその効果を有する。以前の研究（Ａｚｏｒｓａ、２００９）において、ＣＨＫ１のサイレンシングがゲムシタビンの作用を増強し得ることが示された。したがって、ＣＨＫ１をサイレンシングすることができるｓｉＲＮＡ配列にＧＥＭを付加することによって、相互作用におけるいくらかの相加性／相乗作用が予期される。ヒスチジンリジンポリペプチドナノ粒子（ＰＮＰ）を使用することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおいて多くの異なる種類の腫瘍にｓｉＲＮＡを送達する能力が示された。そのため、我々は、ＧＥＭ ＣＨＫ１ ｓｉＲＮＡの送達を、がんを処置するための新規治療様式として研究している。さらに、ポリペプチドナノ粒子は、１を超える標的に対するｓｉＲＮＡを同時に同じ細胞に送達することができるため、第１のｓｉＲＮＡと協働し得る第２の遺伝子標的もサイレンシングし得る。出版物（Ｐａｕｌ他、２０１５）によって、膵臓がんにおけるＣＨＫ１及びＲＡＤ１７の阻害の相乗作用が示されたため、ＧＥＭ－ＣＨＫ１ ｓｉＲＮＡと組み合わせてＲＡＤ１７のサイレンシングから利益を得ることができることは実現可能である。ＧＥＭ－Ｃｈｋ１ ｓｉＲＮＡによって送達されるゲムシタビンの量が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏにおいて頑強な効果をもたらすには不十分である場合、ＲＡＤ１７ ＳＳをさらに修飾して「Ｃ」の代わりにこの配列にＧｅｍを導入してもよい。
示されたデータから、我々は、ゲムシタビンを含むことによって膵臓がん細胞におけるゲムシタビン作用の有効性の劇的な改善を示し得ると考えられる。複数のＧＥＭをｓｉＲＮＡのセンス鎖に取り込むことによって、ＧＥＭを同じ細胞に送達することができ、ここでｓｉＲＮＡはその効果を有する。以前の研究（Ａｚｏｒｓａ、２００９）において、ＣＨＫ１のサイレンシングがゲムシタビンの作用を増強し得ることが示された。したがって、ＣＨＫ１をサイレンシングすることができるｓｉＲＮＡ配列にＧＥＭを付加することによって、相互作用におけるいくらかの相加性／相乗作用が予期される。ヒスチジンリジンポリペプチドナノ粒子（ＰＮＰ）を使用することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおいて多くの異なる種類の腫瘍にｓｉＲＮＡを送達する能力が示された。そのため、我々は、ＧＥＭ ＣＨＫ１ ｓｉＲＮＡの送達を、がんを処置するための新規治療様式として研究している。さらに、ポリペプチドナノ粒子は、１を超える標的に対するｓｉＲＮＡを同時に同じ細胞に送達することができるため、第１のｓｉＲＮＡと協働し得る第２の遺伝子標的もサイレンシングし得る。出版物（Ｐａｕｌ他、２０１５）によって、膵臓がんにおけるＣＨＫ１及びＲＡＤ１７の阻害の相乗作用が示されたため、ＧＥＭ－ＣＨＫ１ ｓｉＲＮＡと組み合わせてＲＡＤ１７のサイレンシングから利益を得ることができることは実現可能である。ＧＥＭ－Ｃｈｋ１ ｓｉＲＮＡによって送達されるゲムシタビンの量が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏにおいて頑強な効果をもたらすには不十分である場合、ＲＡＤ１７ ＳＳをさらに修飾して「Ｃ」の代わりにこの配列にＧｅｍを導入してもよい。
【0064】
ゲムシタビン選択肢
ゲムシタビン活性は、リボヌクレオチドレダクターゼ及びｄＣＭＰデアミナーゼの阻害により増強し得る。
ゲムシタビン活性は、リボヌクレオチドレダクターゼ及びｄＣＭＰデアミナーゼの阻害により増強し得る。
【0065】
ゲムシタビンは、主に白金アナログと組み合わされて幅広く使用されており、他の組合せは、使用されている頻度が低いか、又は現在調査されているところである。ゲムシタビンの標準的な投与は、１０００ｍｇ／ｍ２における３０分間、週に１回の点滴であるが、選択肢、例えばプロドラッグ（例えばＣＯ－１．０１、輸送欠損を回避することができる）、固定用量速度の点滴（１０ｍｇ／ｍ２／分）及び２４時間の肝動脈点滴による投与の局所経路、膀胱内滴下又は腹腔内投与による進行型卵巣がんの処置等が調査されている。卵巣がんにおけるゲムシタビンの組合せについての他の選択肢は、リボヌクレオチドレダクターゼの阻害をトリアピン又はヒドロキシウレアを用いて上昇させることからなる。ゲムシタビンのシグナル伝達に対する作用はまた、シグナル伝達経路の組合せについての合理的な概念を提供する。
【0066】
結論
アミダイトとしてのゲムシタビンは、オリゴヌクレオチドの合成の間に含まれていてもよく、ヌクレオチド配列の中に取り込まれる。我々は、ＧＥＭをｓｉＲＮＡに付加することによって、ｓｉＲＮＡ及びゲムシタビンを同じ細胞に共送達することを可能にし得ることを示した。腫瘍細胞の生存率を低下させる上でのゲムシタビンの効果を改善することが予期される分子標的に対するｓｉＲＮＡを選択することによって、いずれかの剤単独では見られない有効性の明白な改善が見られる。
アミダイトとしてのゲムシタビンは、オリゴヌクレオチドの合成の間に含まれていてもよく、ヌクレオチド配列の中に取り込まれる。我々は、ＧＥＭをｓｉＲＮＡに付加することによって、ｓｉＲＮＡ及びゲムシタビンを同じ細胞に共送達することを可能にし得ることを示した。腫瘍細胞の生存率を低下させる上でのゲムシタビンの効果を改善することが予期される分子標的に対するｓｉＲＮＡを選択することによって、いずれかの剤単独では見られない有効性の明白な改善が見られる。
【0067】
例としてＣＨＫ１及びＲＡＤ１７を標的とするｓｉＲＮＡを使用することを選択しながら、ゲムシタビンを同様の結果を有する他の任意のオリゴヌクレオチドに取り込み得る。ゲムシタビン活性を増強するｓｉＲＮＡの例もまた、ｃＭｙｃを適当な遺伝子標的として記載している（Ｚｈａｎｇ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ ２６：８５～１１０（２０１３））。したがって、ｃＭｙｃに対するｓｉＲＮＡはまた、ＧＥＭを直接取り込み、がん、例えばＮＳＣＬＣの処置に使用し得る。実際、オリゴヌクレオチドは、サイレンシング効果を全く有していなくてもよく、単に疾患に対する有効性のためにゲムシタビンを送達するために使用し得る。
【0068】
オリゴヌクレオチドｓｉＲＮＡ構造内の塩基に対する化学修飾（例えば、２’－ＯＭｅ、２’－フルオロ、ホスホロチオエート修飾等）は、ｉｎ ｖｉｖｏで投与された際のヌクレアーゼ攻撃に対してオリゴヌクレオチドを安定化し得ることは周知である。このような化学修飾されたオリゴが直接標的化リガンドに連結され、これにより、がん細胞上の受容体への結合を介して直接的な送達が可能になることは実現可能なことである。
【0069】
さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞内の選択遺伝子の発現を変更するために使用されており、これらの一本鎖のオリゴはまた、ｇｅｍによって修飾されていてもよい。これらの（Ｃ塩基における）修飾又は配列の末端への付加は、特定の標的へのハイブリダイゼーション有効性の変更並びにゲムシタビンの共送達を補助するために使用し得る。
【0070】
同様に、ｍｉＲＮＡ（模倣物又は阻害剤）は、抗がん効果を有することが記載されており、これらは、同じ細胞への共送達（ｄｏ－ｄｅｌｉｖｅｒｙ）のためにその配列にゲムシタビンを挿入することによって修飾され得る。特に、ゲムシタビンの作用を増強し得るｍｉＲＮＡは目的のものであろう。
【0071】
最終的に、アプタマーは、選択標的に高親和性で結合するように設計及び作製されたＲＮＡ又はＤＮＡオリゴヌクレオチドである。いくつかの例において、これらは、細胞上の受容体又は具体的には、がん細胞上で上方制御されている受容体であり得る。Ｇｅｍヌクレオチドは、これらの配列に（Ｃの代わりに）付加又は挿入されて、がん細胞上の標的受容体への高親和性の結合を可能にしてよく、次いで細胞へのオリゴの取り込みが可能になり、ここで、ゲムシタビンが放出され、治療効果が発揮される。
【0072】
ゲムシタビン修飾オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）は、複数のがん種においてがんの処置の選択肢を改善する上で有用であり得る。
【0073】
ゲムシタビンはまた、放射線増感剤（腫瘍の照射処置の有効性を改善する）として作用することができる。したがって、ゲムシタビンが上述のオリゴの修飾を介して特定のがん細胞へ送達されることは実現可能なことであろう。ゲムシタビンが一度送達されると、腫瘍は照射に暴露され、これは次いで腫瘍細胞を死滅させる。時として、この照射暴露がさらに工程中に放出された腫瘍特異的抗原に対する免疫反応をもたらし得る。
【0074】
そのため、ゲムシタビン又は他の非ヌクレオシドアナログを含むオリゴヌクレオチドは、がん及び、非ヌクレオシド（又はヌクレオチド）アナログが有効であり得る他の疾患についての実行可能な処置様式であり得る。非ヌクレオシドアナログ又はヌクレオチドアナログの使用の他の例は、ウイルス性疾患の処置における使用である。例えば、ウイルス性疾患において、非ヌクレオシド（又はヌクレオチド）アナログを含むオリゴヌクレオチドを共投与することが可能であり得る。これらは、ヌクレオシド及びヌクレオチド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）、例えばジドブジン、ジダノシン、ザルシタビン、スタブジン、ラミブジン、アバカビル、エムトリシタビン及びテノホビル又は非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）、例えばネビラピン、デラビルジン、エファビレンツ及びエトラビリンを含み得る。
【実施例】
【0075】
実施例１
方法
ＢｘＰＣ３細胞を、２つの３８４ウェルプレートに５００細胞／ウェルで播種した。翌日に、細胞を種々の濃度のＣＩＤ２Ａ、ＣＩＤ２Ｓ、ＣＩＤ４ ｓｉＲＮＡ（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸを使用して製剤化）又はゲムシタビン（０．１～１０００ｎＭ）によって７２時間処置した。３７℃で７２時間インキュベーションした後、生存可能細胞の数をＣＴＧ２試薬を使用して評価した。未処置の細胞を１００％として設定した。
方法
ＢｘＰＣ３細胞を、２つの３８４ウェルプレートに５００細胞／ウェルで播種した。翌日に、細胞を種々の濃度のＣＩＤ２Ａ、ＣＩＤ２Ｓ、ＣＩＤ４ ｓｉＲＮＡ（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸを使用して製剤化）又はゲムシタビン（０．１～１０００ｎＭ）によって７２時間処置した。３７℃で７２時間インキュベーションした後、生存可能細胞の数をＣＴＧ２試薬を使用して評価した。未処置の細胞を１００％として設定した。
【0076】
ｓｉＲＮＡ設計
Ａｚｏｒｓａ ｃｈｋ１配列に対するｓｉＲＮＡは、論文より取った（Ａｚｏｒｓａ、上記）。これは、各鎖の３’末端に２塩基のｄＴｄＴオーバーハングを有する１９ｍｅｒである。さらなるｓｉＲＮＡを使用してＲＡＤ１７及びＣＨＫ１をサイレンシングする能力について試験するために、２５ｍｅｒの平滑末端ｓｉＲＮＡ配列を、マウスとヒトの間の遺伝子に同一性を有するように設計した。
Ａｚｏｒｓａ ｃｈｋ１配列に対するｓｉＲＮＡは、論文より取った（Ａｚｏｒｓａ、上記）。これは、各鎖の３’末端に２塩基のｄＴｄＴオーバーハングを有する１９ｍｅｒである。さらなるｓｉＲＮＡを使用してＲＡＤ１７及びＣＨＫ１をサイレンシングする能力について試験するために、２５ｍｅｒの平滑末端ｓｉＲＮＡ配列を、マウスとヒトの間の遺伝子に同一性を有するように設計した。
【0077】
標的サイレンシングのｓｉＲＮＡ検証（ｑＲＴＰＣＲ）
データは、ＲＡＤ１７又はＣＨＫ１のいずれかに対して設計したいくつかのｓｉＲＮＡの、それぞれの標的遺伝子に対するサイレンシング能に対する相対的な効果を示す。これらの試験は、下記のｓｉＲＮＡを使用して行った。遺伝子標的サイレンシングの程度は、（５０ｎＭ）においてｓｉＲＮＡをトランスフェクトされた細胞において測定し、遺伝子サイレンシングの程度をｑＲＴＰＣＲ（βアクチンをデータの基準化のための対照ハウスキーピング遺伝子として使用）を使用して測定した。
データは、ＲＡＤ１７又はＣＨＫ１のいずれかに対して設計したいくつかのｓｉＲＮＡの、それぞれの標的遺伝子に対するサイレンシング能に対する相対的な効果を示す。これらの試験は、下記のｓｉＲＮＡを使用して行った。遺伝子標的サイレンシングの程度は、（５０ｎＭ）においてｓｉＲＮＡをトランスフェクトされた細胞において測定し、遺伝子サイレンシングの程度をｑＲＴＰＣＲ（βアクチンをデータの基準化のための対照ハウスキーピング遺伝子として使用）を使用して測定した。
【0078】
結果
図８は、膵臓がん細胞株ＢｘＰＣ３が、送達剤としてＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用して投与された非サイレンシングｓｉＲＮＡ（ＮＳ／ｌｉｐｏ）に対して応答を示さないことを示している。しかし、同じ試薬を使用してＣＨＫ１ ｓｉＲＮを投与した場合（Ｃｈｋ＿Ａｚ／Ｌｉｐｏ）、７２時間暴露後に用量を上昇させるにつれて約５０％までの細胞生存率の低下が観察された。ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを、２つのシトシンをＣＨＫ＿Ａｚ ｓｉＲＮＡ配列（２Ｓ／ｌｉｐｏ）のセンス鎖中のＧＥＭによって置換するか、又は、２つのシトシンをアンチセンス鎖（２Ａ／ｌｉｐｏ）中のＧＥＭによって置換して製造した。ＧＥＭを含有するセンス鎖を非標識アンチセンス鎖とアニーリングして２Ｓを形成するか、又はＧＥＭを含有するアンチセンス鎖を非標識センス鎖とアニーリングして２Ａを形成するか、又は２つのＧＥＭを含むセンス鎖を２つのＧＥＭを含むアンチセンス鎖とアニーリングして化合物４を形成した。選択した配列において、サイレンシング活性は、２Ｓ生成物のＣＨＫ１遺伝子についてのみ見られた。ゲムシタビンを表す活性は、２Ａ生成物においてのみ観察された。さらに、ＧＥＭ－ＳＳがＧＥＭ－ＡＳとアニーリングして化合物４を得る場合、ｓｉＲＮＡ配列についてサイレンシング効果は見られなかったが、ｓｉＲＮＡ当たり４つのＧＥＭが存在することによって、用量応答の左向きのシフトが観察された。図８のグラフは、グラフの下の表に表されるデータを示す。表は、表の最上列に示す濃度（ｎＭ）におけるそれぞれの処置下で存在する生存可能細胞の％を表す。
図８は、膵臓がん細胞株ＢｘＰＣ３が、送達剤としてＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用して投与された非サイレンシングｓｉＲＮＡ（ＮＳ／ｌｉｐｏ）に対して応答を示さないことを示している。しかし、同じ試薬を使用してＣＨＫ１ ｓｉＲＮを投与した場合（Ｃｈｋ＿Ａｚ／Ｌｉｐｏ）、７２時間暴露後に用量を上昇させるにつれて約５０％までの細胞生存率の低下が観察された。ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを、２つのシトシンをＣＨＫ＿Ａｚ ｓｉＲＮＡ配列（２Ｓ／ｌｉｐｏ）のセンス鎖中のＧＥＭによって置換するか、又は、２つのシトシンをアンチセンス鎖（２Ａ／ｌｉｐｏ）中のＧＥＭによって置換して製造した。ＧＥＭを含有するセンス鎖を非標識アンチセンス鎖とアニーリングして２Ｓを形成するか、又はＧＥＭを含有するアンチセンス鎖を非標識センス鎖とアニーリングして２Ａを形成するか、又は２つのＧＥＭを含むセンス鎖を２つのＧＥＭを含むアンチセンス鎖とアニーリングして化合物４を形成した。選択した配列において、サイレンシング活性は、２Ｓ生成物のＣＨＫ１遺伝子についてのみ見られた。ゲムシタビンを表す活性は、２Ａ生成物においてのみ観察された。さらに、ＧＥＭ－ＳＳがＧＥＭ－ＡＳとアニーリングして化合物４を得る場合、ｓｉＲＮＡ配列についてサイレンシング効果は見られなかったが、ｓｉＲＮＡ当たり４つのＧＥＭが存在することによって、用量応答の左向きのシフトが観察された。図８のグラフは、グラフの下の表に表されるデータを示す。表は、表の最上列に示す濃度（ｎＭ）におけるそれぞれの処置下で存在する生存可能細胞の％を表す。
【0079】
この試験からの結果により、ＧＥＭは、ｓｉＲＮＡのＳＳ内に付加し得ること及びｓｉＲＮＡサイレンシングの腫瘍細胞、具体的にはこの膵臓腫瘍株ＢｘＰＣ３を死滅させる上での活性を増強し得ることが確認される。図８を参照のこと。
【0080】
非サイレンシングｓｉＲＮＡ（ＮＳ）は、７２時間のインキュベーション時間の間、細胞生存率に全く効果を示さなかった。ゲムシタビン暴露（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－ｇｅｍなし）は、ＩＣ５０ 約７ｎＭの、用量依存的な細胞生存率の低下を示した。非修飾のＣＨＫ１ ｓｉＲＮＡ（Ｃｈｋ－Ａｚ）は、０．１ｎＭまでの用量依存的な効果を示したが、その後、効果は細胞生存率の最大阻害５０％でプラトーに達した。
【0081】
ＣＨＫ１ ｓｉＲＮＡの有効性に対する内部ＧＥＭの効果
２つのＧＥＭがＡＳ鎖に含まれる場合（２Ａ）、用量応答はＧＥＭ単独の用量応答曲線に非常に類似していた。２つのＧＥＭがＳＳに含まれる場合（２Ｓ）、用量応答曲線の最初の部分は、ＣＨＫ１ ｓｉＲＮＡ（０～０．１ｎＭ）によってもたらされるサイレンシングにより類似していた。しかしながら、５０％細胞生存率でプラトーに達するＣＨＫ１ ｓｉＲＮＡ効果と異なり、１ｎＭを超える濃度の２Ｓは、細胞生存率に対する阻害効果をもたらし続け、５０ｎＭにおける１４％の細胞生存率で最大に達した。この効果は、ＧＥＭ単独で見られる応答（同じ濃度（５０ｎＭ）において２６％の細胞生存率で最大に達する）により類似していた。それぞれ２つのＧＥＭを含む２つの鎖をアニーリングすることによって、ｓｉＲＮＡ分子当たり４つのＧＥＭが得られた（Ｃ１Ｄ－４）。２Ａと比較して、この物質について用量応答の左向きのシフトが見られた（力価を上昇させるＧＥＭの数が多いことを反映している）。しかしながら、ＣＨＫ１ ｓｉＲＮＡ単独と比較すると、細胞生存率の最初の低下は見られなかったが、曲線はＧＥＭ単独のものと平行であり、これは、効果がｓｉＲＮＡ当たり２倍の数のＧＥＭを導入することによってもたされるものに過ぎないことを示している。
２つのＧＥＭがＡＳ鎖に含まれる場合（２Ａ）、用量応答はＧＥＭ単独の用量応答曲線に非常に類似していた。２つのＧＥＭがＳＳに含まれる場合（２Ｓ）、用量応答曲線の最初の部分は、ＣＨＫ１ ｓｉＲＮＡ（０～０．１ｎＭ）によってもたらされるサイレンシングにより類似していた。しかしながら、５０％細胞生存率でプラトーに達するＣＨＫ１ ｓｉＲＮＡ効果と異なり、１ｎＭを超える濃度の２Ｓは、細胞生存率に対する阻害効果をもたらし続け、５０ｎＭにおける１４％の細胞生存率で最大に達した。この効果は、ＧＥＭ単独で見られる応答（同じ濃度（５０ｎＭ）において２６％の細胞生存率で最大に達する）により類似していた。それぞれ２つのＧＥＭを含む２つの鎖をアニーリングすることによって、ｓｉＲＮＡ分子当たり４つのＧＥＭが得られた（Ｃ１Ｄ－４）。２Ａと比較して、この物質について用量応答の左向きのシフトが見られた（力価を上昇させるＧＥＭの数が多いことを反映している）。しかしながら、ＣＨＫ１ ｓｉＲＮＡ単独と比較すると、細胞生存率の最初の低下は見られなかったが、曲線はＧＥＭ単独のものと平行であり、これは、効果がｓｉＲＮＡ当たり２倍の数のＧＥＭを導入することによってもたされるものに過ぎないことを示している。
【0082】
スクリーニングによって膵臓腫瘍細胞阻害に対する力価を有するｓｉＲＮＡ配列を特定する
図９は、ＣＨＫ１に対して設計された８つの多数のｓｉＲＮＡ配列のトランスフェクション時の膵臓がん細胞株生存率の感受性を示す。ｓｉＲＮＡ配列の培養細胞へのトランスフェクションの７２時間後の生存可能細胞のパーセント比率を示す（上部パネル－ＢｘＰＣ３細胞、下部パネル－ＣＦＰＡＣ細胞）。１００％生存率は、非サイレンシング対照ｓｉＲＮＡ（ＮＳ）の存在下における生存率として定義する。ＣＨＫ１＿ＡＺ（ＡＺ）を、コンパレータとして試験した。ＣＤ＝Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ｓｉＲＮＡ－細胞にトランスフェクトされた際に多くの細胞種の最大の死滅をもたらすことが知られている。
図９は、ＣＨＫ１に対して設計された８つの多数のｓｉＲＮＡ配列のトランスフェクション時の膵臓がん細胞株生存率の感受性を示す。ｓｉＲＮＡ配列の培養細胞へのトランスフェクションの７２時間後の生存可能細胞のパーセント比率を示す（上部パネル－ＢｘＰＣ３細胞、下部パネル－ＣＦＰＡＣ細胞）。１００％生存率は、非サイレンシング対照ｓｉＲＮＡ（ＮＳ）の存在下における生存率として定義する。ＣＨＫ１＿ＡＺ（ＡＺ）を、コンパレータとして試験した。ＣＤ＝Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ｓｉＲＮＡ－細胞にトランスフェクトされた際に多くの細胞種の最大の死滅をもたらすことが知られている。
【0083】
Ｃｈｋ４配列は、ＢｘＰＣ３細胞において最も強い効果をもたらした。これはまた、他の膵臓がん細胞－ＣＦＰＡＣにトランスフェクトされた場合に細胞生存率に対して非常に明白な影響を有していた。
【0084】
試験した配列は次の通りである：
１． ＧＧＧＡＧＡＡＧＧＴＧＣＣＴＡＴＧＧＡＧＡＡＧＴＴ
２． ＧＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＴＧＣＴＧＴＧＡＡＴＡ
３． ＣＣＡＧＴＴＧＡＴＧＴＴＴＧＧＴＣＣＴＧＴＧＧＡＡ
４． ＣＣＴＧＴＧＧＡＡＴＡＧＴＡＣＴＴＡＣＴＧＣＡＡＴ
５． ＧＧＡＡＴＡＡＣＴＣＡＣＡＧＧＧＡＴＡ
６． ＧＧＧＡＴＡＴＴＡＡＡＣＣＡＧＡＡＡＡ
７． ＧＣＡＧＡＡＣＣＡＧＴＴＧＡＴＧＴＴＴ
８． ＧＧＡＡＴＡＧＴＡＣＴＴＡＣＴＧＣＡＡ
１． ＧＧＧＡＧＡＡＧＧＴＧＣＣＴＡＴＧＧＡＧＡＡＧＴＴ
２． ＧＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＴＧＣＴＧＴＧＡＡＴＡ
３． ＣＣＡＧＴＴＧＡＴＧＴＴＴＧＧＴＣＣＴＧＴＧＧＡＡ
４． ＣＣＴＧＴＧＧＡＡＴＡＧＴＡＣＴＴＡＣＴＧＣＡＡＴ
５． ＧＧＡＡＴＡＡＣＴＣＡＣＡＧＧＧＡＴＡ
６． ＧＧＧＡＴＡＴＴＡＡＡＣＣＡＧＡＡＡＡ
７． ＧＣＡＧＡＡＣＣＡＧＴＴＧＡＴＧＴＴＴ
８． ＧＧＡＡＴＡＧＴＡＣＴＴＡＣＴＧＣＡＡ
【0085】
Ｃｈｋ４は、ＢｘＰＣ３細胞においてＣＨＫ－ＡＺ（Ａｚｏｒｓａ論文からのＣＨＫ１ ｓｉＲＮＡ配列）よりも高い力価を示した。さらに、この配列は３つのシトシンを有し、ここでＧＥＭはＣＨＫ１＿ＡＺ上の２つと比較して置換されてよい。これにより、分子当たりで、より多数のＧＥＭを送達することによって、ＣＨＫ１遺伝子のサイレンシングにおいてより多い力価を有する可能性がもたらされ、修飾ＣＨＫ１＿ＡＺと比較してこの活性がさらに増強され、力価及び有効性が改善される。
【0086】
これらのデータは以下を示す：
１．ＣＨＫ１ ｓｉＲＮＡのＳＳに２つのＧＥＭを配置することによって、ｓｉＲＮＡ単独と比較して有効性が改善される。
２．ＡＳ鎖上の２つのＧＥＭを配置－ｓｉＲＮＡサイレンシング効果に対する効果は見られないが、ＧＥＭの細胞生存率に対する効果は見られる
３．ＡＳ及びＳＳのアニーリング－２つのＧＥＭをそれぞれ含むことによって、分子当たり４つのＧＥＭが得られる。しかし、＃２と同様に、ＡＳ鎖上の２つのＧＥＭは、ＡＳ鎖が遺伝子サイレンシング効果をもたらすことを防止し、ｓｉＲＮＡ当たり４つのＧＥＭを送達しているために、力価の改善が見られるのみである。
４．各鎖の３’末端におけるｄＴｄＴ部分の付加は、ＧＥＭの放出を遅延化してもよく、これにより、遺伝子サイレンシング効果から離れた効果を区別することが可能になる
５．ＡＳ鎖内のＧＥＭは、ＡＳ鎖がＲＩＳＣ複合体に結合し、標的化された遺伝子のサイレンシングを誘導する能力を妨害する場合、ｓｉＲＮＡ有効性を阻害し得る。しかし、ＡＳ鎖の３’末端上のＧＥＭは、ＡＳ鎖によって誘導されるサイレンシングによってさらなる活性を示すことが示された。１つ又は２つのＧＥＭを、このさらなる活性のために付加してもよい。さらなるＧＥＭも付加し得る。
６．ＳＳ上のＧＥＭは、細胞生存率に対する阻害効果を付加されたｓｉＲＮＡ介在性サイレンシングを示すことによって有効性を改善する。
１．ＣＨＫ１ ｓｉＲＮＡのＳＳに２つのＧＥＭを配置することによって、ｓｉＲＮＡ単独と比較して有効性が改善される。
２．ＡＳ鎖上の２つのＧＥＭを配置－ｓｉＲＮＡサイレンシング効果に対する効果は見られないが、ＧＥＭの細胞生存率に対する効果は見られる
３．ＡＳ及びＳＳのアニーリング－２つのＧＥＭをそれぞれ含むことによって、分子当たり４つのＧＥＭが得られる。しかし、＃２と同様に、ＡＳ鎖上の２つのＧＥＭは、ＡＳ鎖が遺伝子サイレンシング効果をもたらすことを防止し、ｓｉＲＮＡ当たり４つのＧＥＭを送達しているために、力価の改善が見られるのみである。
４．各鎖の３’末端におけるｄＴｄＴ部分の付加は、ＧＥＭの放出を遅延化してもよく、これにより、遺伝子サイレンシング効果から離れた効果を区別することが可能になる
５．ＡＳ鎖内のＧＥＭは、ＡＳ鎖がＲＩＳＣ複合体に結合し、標的化された遺伝子のサイレンシングを誘導する能力を妨害する場合、ｓｉＲＮＡ有効性を阻害し得る。しかし、ＡＳ鎖の３’末端上のＧＥＭは、ＡＳ鎖によって誘導されるサイレンシングによってさらなる活性を示すことが示された。１つ又は２つのＧＥＭを、このさらなる活性のために付加してもよい。さらなるＧＥＭも付加し得る。
６．ＳＳ上のＧＥＭは、細胞生存率に対する阻害効果を付加されたｓｉＲＮＡ介在性サイレンシングを示すことによって有効性を改善する。
【0087】
２ｘＧＥＭを有するこのＳＳ鎖を２ｘＧＥＭを有するＡＳ鎖と組み合わせることによって、４つのＧＥＭによってよりよい有効性がもたらされるが、ｓｉＲＮＡによる標的化された遺伝子のサイレンシングは見られない。
【0088】
改善されたＣＨＫ１ ｓｉＲＮＡ（ＣＨＫ＿ＤＥ４）は、以前の試験におけるＡｚｏｒｓａ配列よりも優れたサイレンシングを示した。
【0089】
試験した配列は以下の通りである：（これらはセンス鎖配列を表す）
【0090】
したがって、ＳＳ＝
ＳＳ＝５’－ＣＣＵ ＧＵＧ ＧＡＡ ＵＡＧ ＵＡ［ＧＥＭ］ ＵＵＡ ［ＧＥＭ］ＵＧ ［ＧＥＭ］ＡＡ Ｕ－３’（「Ｃ」の代わりに［ＧＥＭ］）
ＡＳ＝５’－Ａ ＵＵＧ ＣＡＧ ＵＡＡ ＧＵＡ ＣＵＡ ＵＵＣ ＣＡＣ ＡＧＧ－３’（ＡＳ鎖上のＧＥＭなし）
ＳＳ＝５’－ＣＣＵ ＧＵＧ ＧＡＡ ＵＡＧ ＵＡ［ＧＥＭ］ ＵＵＡ ［ＧＥＭ］ＵＧ ［ＧＥＭ］ＡＡ Ｕ－３’（「Ｃ」の代わりに［ＧＥＭ］）
ＡＳ＝５’－Ａ ＵＵＧ ＣＡＧ ＵＡＡ ＧＵＡ ＣＵＡ ＵＵＣ ＣＡＣ ＡＧＧ－３’（ＡＳ鎖上のＧＥＭなし）
【0091】
ＡＳを全て修飾された塩基として作製する。ＳＳは全て修飾されている（２’－Ｏ－Ｍｅ）として作製し、比較のために全てを非修飾として作製する。
【0092】
目的のさらなる配列：
ＣＨＫ１Ａ：標的配列：ＣＨＫ１－Ａ：ＡＡＧＡＡＡＧＡＧＡＵＣＵＧＵＡＵＣＡＡＵ；「Ｃ」の代わりにＧＥＭがある２つの箇所
ＣＨＫ１Ｂ：標的配列：Ｃｈｋ１－Ｂ：ＵＵＧＧＡＡＵＡＡＣＵＣＣＡＣＧＧＧＡＵＡ。この配列内にＧＥＭを配置する場所が４箇所ある。
ＣＨＫ１Ａ：標的配列：ＣＨＫ１－Ａ：ＡＡＧＡＡＡＧＡＧＡＵＣＵＧＵＡＵＣＡＡＵ；「Ｃ」の代わりにＧＥＭがある２つの箇所
ＣＨＫ１Ｂ：標的配列：Ｃｈｋ１－Ｂ：ＵＵＧＧＡＡＵＡＡＣＵＣＣＡＣＧＧＧＡＵＡ。この配列内にＧＥＭを配置する場所が４箇所ある。
【0093】
我々は、ＣＨＫ１－Ｂ＿ＡＺ ＷＩＴＨ ４ ＧＥＭ ＳＳが、ＣＨＫ１Ａにおいて２よりも優れた活性を示すことを予期している。
【0094】
ゲムシタビンは、多数のがん、例えば、膀胱、膵臓、卵巣、乳がん及び非小細胞肺がんを処置するために使用される。これらの他のがん種は、本明細書に記載する方法を使用して、活性を増強するためのさらなるｓｉＲＮＡ分子を任意に使用して処置し得る。
【0095】
実施例２
膵臓がんＢｘＰＣ３細胞を１０００細胞／ｍｌで播種し、３８４ウェルプレート中で単層として増殖させた。細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してＣＨＫ１又はＲａｄ１７に対して示されるｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトするか、又はＸ軸上に示す濃度のゲムシタビンで処置した。５％ＣＯ２、３７℃で９６時間インキュベーションした後に、細胞生存率をＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ発光検出オプティクスを備えたＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーにおいて試薬によってもたらされる発光シグナルをモニターすることによって決定した。図面から、ゲムシタビン（ＧＥＭ）が、約６ｎＭのＩＣ５０及び、＞８０％の細胞死滅の細胞最大有効性で、用量依存的な細胞生存率の阻害をもたらすことが見られる。ＲＡＤ１７に対する２５ｍｅｒの平滑末端ｓｉＲＮＡは、細胞生存率の６０％のみの低下及び約５ｎＭのＩＣ５０の最大有効性の用量依存的な細胞生存率の阻害をもたらした。以前に公開された上記Ａｚｏｒｓａ由来のＣＨＫ１に対する１９ｍｅｒ ｓｉＲＮＡ配列を使用することによって、Ｒａｄ１７ ｓｉＲＮＡと同等の細胞生存率の最大有効性が観察された。ＣＨＫ１に対する平滑末端の２５ｍｅｒ ｓｉＲＮＡは、１００ｎＭにおける細胞生存率の約９０％阻害を有し、Ａｚｏｒｓａ ＣＨＫ１ ｓｉＲＮＡ配列よりも高い有効性を示した。後者のｓｉＲＮＡについてのＩＣ５０は、Ａｚｏｒｓａ配列（約０．３ｎＭ）についてのものと同等であった。図１１に示す結果は、ＣＨＫ１及びＲＡＤ１７単独に対するｓｉＲＮＡが膵臓がん細胞生存率を阻害し得ることを示す。
膵臓がんＢｘＰＣ３細胞を１０００細胞／ｍｌで播種し、３８４ウェルプレート中で単層として増殖させた。細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してＣＨＫ１又はＲａｄ１７に対して示されるｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトするか、又はＸ軸上に示す濃度のゲムシタビンで処置した。５％ＣＯ２、３７℃で９６時間インキュベーションした後に、細胞生存率をＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ発光検出オプティクスを備えたＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーにおいて試薬によってもたらされる発光シグナルをモニターすることによって決定した。図面から、ゲムシタビン（ＧＥＭ）が、約６ｎＭのＩＣ５０及び、＞８０％の細胞死滅の細胞最大有効性で、用量依存的な細胞生存率の阻害をもたらすことが見られる。ＲＡＤ１７に対する２５ｍｅｒの平滑末端ｓｉＲＮＡは、細胞生存率の６０％のみの低下及び約５ｎＭのＩＣ５０の最大有効性の用量依存的な細胞生存率の阻害をもたらした。以前に公開された上記Ａｚｏｒｓａ由来のＣＨＫ１に対する１９ｍｅｒ ｓｉＲＮＡ配列を使用することによって、Ｒａｄ１７ ｓｉＲＮＡと同等の細胞生存率の最大有効性が観察された。ＣＨＫ１に対する平滑末端の２５ｍｅｒ ｓｉＲＮＡは、１００ｎＭにおける細胞生存率の約９０％阻害を有し、Ａｚｏｒｓａ ＣＨＫ１ ｓｉＲＮＡ配列よりも高い有効性を示した。後者のｓｉＲＮＡについてのＩＣ５０は、Ａｚｏｒｓａ配列（約０．３ｎＭ）についてのものと同等であった。図１１に示す結果は、ＣＨＫ１及びＲＡＤ１７単独に対するｓｉＲＮＡが膵臓がん細胞生存率を阻害し得ることを示す。
【0096】
実施例３
示されるｓｉＲＮＡ配列のセンス鎖のそれぞれについて３’末端に付加されたゲムシタビンヌクレオチドアミダイトを使用してｓｉＲＮＡを合成した。ｓｉＲＮＡを細胞にトランスフェクトし、図１に詳述するようにインキュベートした。全ての配列の最大有効性はここで、１０ｎＭを超える濃度において細胞生存率の＞９５％阻害まで改善された。非常に低い濃度（０．１ｎＭ）において、ゲムシタビン修飾ＲＡＤ１７ ｓｉＲＮＡは、それ自体は細胞生存率に対して何の影響もないが、ゲムシタビン修飾ＣＨＫ１ ｓｉＲＮＡはこの同じ濃度において、細胞生存率の３１％阻害（２５ｍｅｒ）又は５６％阻害（１９ｍｅｒ）をもたらした。ゲムシタビンヌクレオチドを、ｓｉＲＮＡ配列内のシチジンヌクレオチドを置換し得るかを見るために試験した。ＡＺ ＣＨｋ１配列は、ＧＥＭによって置換された２つの「Ｃ」基を有し、このｓｉＲＮＡ（ＣＨＫ１－ＡＺ－２Ｓ）が、３’末端に２つのＧＥＭを有するｓｉＲＮＡ（ＣＨＫ－ＡＺ－Ｐｏｌｙ２）とほとんど同一の挙動を示すことが見られる。図１２ａ～１２ｄは、力価及び有効性に対する各ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端における２つのゲムシタビンヌクレオチド付加の効果を示す。
示されるｓｉＲＮＡ配列のセンス鎖のそれぞれについて３’末端に付加されたゲムシタビンヌクレオチドアミダイトを使用してｓｉＲＮＡを合成した。ｓｉＲＮＡを細胞にトランスフェクトし、図１に詳述するようにインキュベートした。全ての配列の最大有効性はここで、１０ｎＭを超える濃度において細胞生存率の＞９５％阻害まで改善された。非常に低い濃度（０．１ｎＭ）において、ゲムシタビン修飾ＲＡＤ１７ ｓｉＲＮＡは、それ自体は細胞生存率に対して何の影響もないが、ゲムシタビン修飾ＣＨＫ１ ｓｉＲＮＡはこの同じ濃度において、細胞生存率の３１％阻害（２５ｍｅｒ）又は５６％阻害（１９ｍｅｒ）をもたらした。ゲムシタビンヌクレオチドを、ｓｉＲＮＡ配列内のシチジンヌクレオチドを置換し得るかを見るために試験した。ＡＺ ＣＨｋ１配列は、ＧＥＭによって置換された２つの「Ｃ」基を有し、このｓｉＲＮＡ（ＣＨＫ１－ＡＺ－２Ｓ）が、３’末端に２つのＧＥＭを有するｓｉＲＮＡ（ＣＨＫ－ＡＺ－Ｐｏｌｙ２）とほとんど同一の挙動を示すことが見られる。図１２ａ～１２ｄは、力価及び有効性に対する各ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端における２つのゲムシタビンヌクレオチド付加の効果を示す。
【0097】
実施例４
１０００細胞／ウェルで３８４ウェルプレートに播種したＢｘＰＣ３細胞は、ｓｉＲＮＡ コンストラクトによってトランスフェクトされるか、又は図中に示す濃度のゲムシタビンに暴露された。試験した試料は、ゲムシタビン単独（ＧＥＭ）、ＣＨＫ１に対する非修飾の１９ｍｅｒ ｓｉＲＮＡ（ＣＨＫ－ＡＺ）及び、センス鎖の３’末端に同じアンチセンス鎖へのアニーリング前に２つ（Ｐｏｌｙ－２）、４つ（Ｐｏｌｙ－４）又は６つ（Ｐｏｌｙ－６）のゲムシタビンヌクレオチドが付加されているｓｉＲＮＡの同じ配列である。種々の剤に１２０時間暴露した後、細胞生存率をＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（ＰＥ）を添加することによって決定し、プレートを１０～２０分間振盪した後、細胞生存率に相関する発光シグナルをＰＥ Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーにおいて決定した。図１３は、センス鎖の３’末端にさらなるＧＥＭを付加することの有効性及び力価に対する効果を示す。
１０００細胞／ウェルで３８４ウェルプレートに播種したＢｘＰＣ３細胞は、ｓｉＲＮＡ コンストラクトによってトランスフェクトされるか、又は図中に示す濃度のゲムシタビンに暴露された。試験した試料は、ゲムシタビン単独（ＧＥＭ）、ＣＨＫ１に対する非修飾の１９ｍｅｒ ｓｉＲＮＡ（ＣＨＫ－ＡＺ）及び、センス鎖の３’末端に同じアンチセンス鎖へのアニーリング前に２つ（Ｐｏｌｙ－２）、４つ（Ｐｏｌｙ－４）又は６つ（Ｐｏｌｙ－６）のゲムシタビンヌクレオチドが付加されているｓｉＲＮＡの同じ配列である。種々の剤に１２０時間暴露した後、細胞生存率をＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（ＰＥ）を添加することによって決定し、プレートを１０～２０分間振盪した後、細胞生存率に相関する発光シグナルをＰＥ Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーにおいて決定した。図１３は、センス鎖の３’末端にさらなるＧＥＭを付加することの有効性及び力価に対する効果を示す。
【0098】
膵臓がん細胞生存率に対する有効性のこのような改善が、２つのＧＥＭヌクレオチドをｓｉＲＮＡのＳＳに付加することによって得られたため、さらにＧＥＭを付加することがｓｉＲＮＡの有効性及び／又は力価をさらに改善すると推論された。この目的のために、非修飾の１９ｍｅｒ ｓｉＲＮＡ（ＣＨＫ－ＡＺ）を、２つのＧｅｍがＳＳの３’末端に付加された（Ｐｏｌｙ－２）、４つのＧＥＭが付加された（Ｐｏｌｙ－４）又は６つ（Ｐｏｌｙ－６）のＧＥＭが付加された同じ配列と比較した。これらの配列を、ゲムシタビン単独（ＧＥＭ）と比較した。試験は、図１と同様にＢｘＰＣ３細胞にｓｉＲＮＡをトランスフェクションすることによって行ったが、細胞生存率の測定前の暴露時間は１２０時間であった。インキュベーション時間がより長いため、ｓｉＲＮＡの用量応答は、はるかに低い濃度において調査した。これにより、真のＩＣ５０値を確認することが可能になった。ＧＥＭはそれ自体でこの細胞株における完全用量応答をもたらし、このインキュベーション時間において、５０ｎＭを超える濃度において細胞生存率の１００％の低下及び３ｎＭのＩＣ５０がもたらされた。非修飾の１９ｍｅｒ ｓｉＲＮＡ（ＣＨＫ－ＡＺ）からは、０．１６ｎＭのＩＣ５０が得られた。しかし、有効性はこの延長した暴露時間においてさえも細胞生存率の約７０％阻害で最大に達した。２つ、４つ又は６つのＧｅｍのｓｉＲＮＡの３’末端への付加は、全て生成物の最大有効性を、細胞生存率が１０ｎＭを超える濃度において１０％未満になるように改善した。しかし、より多くのＧＥＭがｓｉＲＮＡの力価を改善するという予測は満たされず、２つのＧＥＭを有する配列は、４つのＧｅｍ又は６つのＧｅｍのコンストラクトのいずれよりも強力であった。２つのＧＥＭのコンストラクトは、ゲムシタビン単独（３ｎＭ）と比較して、１１５倍のＩＣ５０（０．０２６ｎＭ）の改善を示した。これらのデータから、ｓｉＲＮＡのＳＳの３’末端における２を超えるＧＥＭは、細胞生存率アッセイにおいてコンストラクトの力価又は有効性に対してさらなる効果を有さなかったことが示される。
【0099】
実施例４
ＢｘＰＣ３細胞（１２ウェルプレートのウェル当たり２．５ｘ１０５細胞）はＣｈｋ１／Ｇｅｍ ｓｉＲＮＡ（５０ｎＭ）の異なるバリアントでトランスフェクトされた。トランスフェクションの２４時間後、Ｃｈｋ１ ＲＮＡの相対的なレベルをＳｙｂｒ Ｇｒｅｅｎ ＲＴ－ＰＣＲによって決定した。Ｂ－アクチンの発現レベルを基準化因子として使用した。全ての試料におけるｍＲＮＡレベルを、ΔΔＣｔ法を用いて、未処置細胞に対して算出した。
２ＡＧｅｍ／Ｃｈｋ－ＣＨＫ１ ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖上のＣを２つのゲムシタビンが置換
２ＡＧｅｍ／ＮＳ－非サイレンシングｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖上のＣを２つのゲムシタビンが置換
２ＳＧｅｍ／Ｃｈｋ－ＣＨＫ１ ｓｉＲＮＡのセンス鎖上のＣを２つのゲムシタビンが置換
２ＳＧｅｍ／ＮＳ－非サイレンシングｓｉＲＮＡのセンス鎖上のＣを２つのゲムシタビンが置換
４Ｇｅｍ／ＣＨＫ－ＣＨＫ１ ｓｉＲＮＡ ＣＨＫ１ ｓｉＲＮＡのセンス鎖上のＣを２つのゲムシタビンが置換及びＣＨＫ１ ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖上のＣを２つのゲムシタビンが置換
４Ｇｅｍ／ＮＳ－非サイレンシングｓｉＲＮＡのセンス鎖上のＣを２つのゲムシタビンが置換及び非サイレンシングｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖上のＣを２つのゲムシタビンが置換
Ｂｌｎｋ－未処置試料
Ｃｈｋ＿Ａｚ（ａ）－非修飾のＣＨＫ１ ｓｉＲＮＡ
ＮＳ－非サイレンシングｓｉＲＮＡ単独
ＢｘＰＣ３細胞（１２ウェルプレートのウェル当たり２．５ｘ１０５細胞）はＣｈｋ１／Ｇｅｍ ｓｉＲＮＡ（５０ｎＭ）の異なるバリアントでトランスフェクトされた。トランスフェクションの２４時間後、Ｃｈｋ１ ＲＮＡの相対的なレベルをＳｙｂｒ Ｇｒｅｅｎ ＲＴ－ＰＣＲによって決定した。Ｂ－アクチンの発現レベルを基準化因子として使用した。全ての試料におけるｍＲＮＡレベルを、ΔΔＣｔ法を用いて、未処置細胞に対して算出した。
２ＡＧｅｍ／Ｃｈｋ－ＣＨＫ１ ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖上のＣを２つのゲムシタビンが置換
２ＡＧｅｍ／ＮＳ－非サイレンシングｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖上のＣを２つのゲムシタビンが置換
２ＳＧｅｍ／Ｃｈｋ－ＣＨＫ１ ｓｉＲＮＡのセンス鎖上のＣを２つのゲムシタビンが置換
２ＳＧｅｍ／ＮＳ－非サイレンシングｓｉＲＮＡのセンス鎖上のＣを２つのゲムシタビンが置換
４Ｇｅｍ／ＣＨＫ－ＣＨＫ１ ｓｉＲＮＡ ＣＨＫ１ ｓｉＲＮＡのセンス鎖上のＣを２つのゲムシタビンが置換及びＣＨＫ１ ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖上のＣを２つのゲムシタビンが置換
４Ｇｅｍ／ＮＳ－非サイレンシングｓｉＲＮＡのセンス鎖上のＣを２つのゲムシタビンが置換及び非サイレンシングｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖上のＣを２つのゲムシタビンが置換
Ｂｌｎｋ－未処置試料
Ｃｈｋ＿Ａｚ（ａ）－非修飾のＣＨＫ１ ｓｉＲＮＡ
ＮＳ－非サイレンシングｓｉＲＮＡ単独
【0100】
図１４は、センス／アンチセンス鎖内にゲムシタビンを挿入する効果及び遺伝子サイレンシングに対する効果を示す（ｑＰＣＲ結果）。
【0101】
実施例５
ＢｘＰＣ３細胞においてＧＥＭ修飾ｓｉＲＮＡを用いて観察された結果は、これらの剤に対する暴露時間に依存していた。図１５は、ｓｉＲＮＡ及びｓｉＲＮＡ－ＧＥＭコンストラクトの細胞生存率についての有効性の時間依存性を示す。化合物に暴露された細胞の生存率を、４８時間（左パネル）、７２時間（中央パネル）又は１２０時間（右パネル）における種々の濃度において試験した。各時点において、非標識ｓｉＲＮＡ（ＣＨＫ－Ａｚ）は、最高濃度（１００ｎＭ）においてＧＥＭ修飾ｓｉＲＮＡ（３’末端に含まれる２つ、４つ又は６つのゲムシタビン部分を有するＰｏｌｙ－２、Ｐｏｌｙ－４又はＰｏｌｙ－６）よりも弱い効果を示すことが見られる。２つのＧｅｍ（Ｐｏｌｙ－２）を含むｓｉＲＮＡを、４つ（Ｐｏｌｙ－４）又は６つのＧｅｍ（Ｐｏｌｙ－６）と比較して、力価又は有効性には大きな差異がなかったが、ポリＧＥＭコンストラクトのいずれかによる細胞死滅の程度は暴露時間の増加に伴って上昇した（４８時間における約４０％から、７２時間における約７０％及び１２０時間における１００％）。このデータから、細胞に入るｓｉＲＮＡ当たり１つ又は２つのみのゲムシタビン分子が放出されることが示される。さらに、時間依存性は、ＧＥＭ自体の影響を増強するために頑強な遺伝子サイレンシングを得るためにかかる時間を反映していても、又は放出されたＧＥＭを活性化するために必要な工程も時間を要し得ることを示していてもよい。これは、ゲムシタビン部分の放出及び、その後ヌクレアーゼ安定ＧＥＭヌクレオシドを延長配列に取り込むことによって複製フォークをブロックし得る活性部分をもたらすために、必要なヌクレオチドの三重リン酸化に必要な時間である。これはまた、特定の細胞種についての細胞周期及び分裂（複製）時間に依存していてもよく、ＢｘＰＣ３については、これは約４８～６０時間であるため、１２０時間においては、７２時間における１回と比較して、２～３回の分裂周期を通過している。
ＢｘＰＣ３細胞においてＧＥＭ修飾ｓｉＲＮＡを用いて観察された結果は、これらの剤に対する暴露時間に依存していた。図１５は、ｓｉＲＮＡ及びｓｉＲＮＡ－ＧＥＭコンストラクトの細胞生存率についての有効性の時間依存性を示す。化合物に暴露された細胞の生存率を、４８時間（左パネル）、７２時間（中央パネル）又は１２０時間（右パネル）における種々の濃度において試験した。各時点において、非標識ｓｉＲＮＡ（ＣＨＫ－Ａｚ）は、最高濃度（１００ｎＭ）においてＧＥＭ修飾ｓｉＲＮＡ（３’末端に含まれる２つ、４つ又は６つのゲムシタビン部分を有するＰｏｌｙ－２、Ｐｏｌｙ－４又はＰｏｌｙ－６）よりも弱い効果を示すことが見られる。２つのＧｅｍ（Ｐｏｌｙ－２）を含むｓｉＲＮＡを、４つ（Ｐｏｌｙ－４）又は６つのＧｅｍ（Ｐｏｌｙ－６）と比較して、力価又は有効性には大きな差異がなかったが、ポリＧＥＭコンストラクトのいずれかによる細胞死滅の程度は暴露時間の増加に伴って上昇した（４８時間における約４０％から、７２時間における約７０％及び１２０時間における１００％）。このデータから、細胞に入るｓｉＲＮＡ当たり１つ又は２つのみのゲムシタビン分子が放出されることが示される。さらに、時間依存性は、ＧＥＭ自体の影響を増強するために頑強な遺伝子サイレンシングを得るためにかかる時間を反映していても、又は放出されたＧＥＭを活性化するために必要な工程も時間を要し得ることを示していてもよい。これは、ゲムシタビン部分の放出及び、その後ヌクレアーゼ安定ＧＥＭヌクレオシドを延長配列に取り込むことによって複製フォークをブロックし得る活性部分をもたらすために、必要なヌクレオチドの三重リン酸化に必要な時間である。これはまた、特定の細胞種についての細胞周期及び分裂（複製）時間に依存していてもよく、ＢｘＰＣ３については、これは約４８～６０時間であるため、１２０時間においては、７２時間における１回と比較して、２～３回の分裂周期を通過している。
【0102】
実施例６
我々はさらに、ＧＥＭヌクレオチドをｓｉＲＮＡのアンチセンス（ＡＳ）鎖のｓｉＲＮＡにおけるシチジンヌクレオチドの置換に使用し得るかを決定した。これを調査するために、我々は再びＡｚｏｒｓａ他由来のＣＨＫ１に対する１９ｍｅｒ ｓｉＲＮＡ配列を使用した。図１６において：
２Ａ－ＣＨＫ１は、ＣＨＫ１をサイレンシングするｓｉＲＮＡのＡＳ鎖において２つのＧＥＭがＣを置換していることを指す
２Ａ／ＮＳは、非サイレンシング（ＮＳ）ｓｉＲＮＡ配列において２つのＧＥＭがＣを置換していることを指す
２Ｓ／Ｃｈｋ１は、ＣＨＫ１に対するｓｉＲＮＡのセンス鎖において２つのＧＥＭがＣを置換していることを指す。
２Ｓ／ＮＳは、非サイレンシング（ＮＳ）ｓｉＲＮＡのセンス鎖において２つのＧＥＭがＣを置換していることを指す。
ＣＩＤ４／Ｃｈｋ１は、ＳＳ及びＡＳ鎖の両方がそれぞれ２つのＧｅｍを含むＣＨＫ１ ｓｉＲＮＡを指し、４つのＧＥＭが存在する単一のｓｉＲＮＡが作製される。
ＣＩＤ４／ＮＳは、ＳＳ及びＡＳ鎖の両方がそれぞれ２つのＧｅｍを含む非サイレンシング（ＮＳ）ｓｉＲＮＡを指し、アニーリング時に４つのＧＥＭが存在する単一のｓｉＲＮＡが作製される。
我々はさらに、ＧＥＭヌクレオチドをｓｉＲＮＡのアンチセンス（ＡＳ）鎖のｓｉＲＮＡにおけるシチジンヌクレオチドの置換に使用し得るかを決定した。これを調査するために、我々は再びＡｚｏｒｓａ他由来のＣＨＫ１に対する１９ｍｅｒ ｓｉＲＮＡ配列を使用した。図１６において：
２Ａ－ＣＨＫ１は、ＣＨＫ１をサイレンシングするｓｉＲＮＡのＡＳ鎖において２つのＧＥＭがＣを置換していることを指す
２Ａ／ＮＳは、非サイレンシング（ＮＳ）ｓｉＲＮＡ配列において２つのＧＥＭがＣを置換していることを指す
２Ｓ／Ｃｈｋ１は、ＣＨＫ１に対するｓｉＲＮＡのセンス鎖において２つのＧＥＭがＣを置換していることを指す。
２Ｓ／ＮＳは、非サイレンシング（ＮＳ）ｓｉＲＮＡのセンス鎖において２つのＧＥＭがＣを置換していることを指す。
ＣＩＤ４／Ｃｈｋ１は、ＳＳ及びＡＳ鎖の両方がそれぞれ２つのＧｅｍを含むＣＨＫ１ ｓｉＲＮＡを指し、４つのＧＥＭが存在する単一のｓｉＲＮＡが作製される。
ＣＩＤ４／ＮＳは、ＳＳ及びＡＳ鎖の両方がそれぞれ２つのＧｅｍを含む非サイレンシング（ＮＳ）ｓｉＲＮＡを指し、アニーリング時に４つのＧＥＭが存在する単一のｓｉＲＮＡが作製される。
【0103】
これらのコンストラクトはそれぞれウェル当たり１０００細胞の密度の３８４ウェルプレート内のＢｘＰＣ３細胞にトランスフェクトされた。細胞を次いで、５％ＣＯ２及び９５％湿度、３７℃におけるトランスフェクション後、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（ＰＥ）を以前に記載されているように使用して細胞生存率を測定する前に１２０時間インキュベートした。
【0104】
この試験によって、ＣＨＫ１を標的とするｓｉＲＮＡ（２Ｓ／Ｃｈｋ１）のＳＳに２つのＧＥＭを取り込むことで、この遺伝子をサイレンシングする効果と細胞内でゲムシタビンを放出する効果の組合せ効果が得られ、完全な有効性をも維持しながら、ＩＣ５０（０．３５ｎＭ）のシフトがもたらされることが示された。これは、２つのＧＥＭを非サイレンシング（ＮＳ）ｓｉＲＮＡのＳＳへの取り込みと比較し、ここで、ＧＥＭの放出との相乗作用を見るためにＣＨＫ１をサイレンシングする利点は得られず、ＧＥＭ放出の見かけ上のＩＣ５０（５．４ｎＭ）に対する効果のみが見られる。したがって、Ｃｈｋ１ ｓｉＲＮＡに２つのＧＥＭを付加するだけで、ＮＳ ｓｉＲＮＡ ＳＳに２つのＧＥＭを有するよりも約１５倍の改善が見られる。
【0105】
ＣＨＫ１及びＮＳ ｓｉＲＮＡのＡＳ鎖に２つのＧＥＭを付加することによって、ＣＨＫ１－ＧＥＭ ＩＣ５０（２Ａ－Ｃｈｋ１）は、ＮＳ ｓｉＲＮＡ（２Ａ／Ｎｓ）の６．６８ｎＭと比較して１．９７５ｎＭに低下したことが分かる。このことから、ＣＨＫ１のＡＳ配列にＧＥＭを有することは、ＮＳ－ＧＥＭと比較してある程度の有効性が得られるが、効果の差はわずか３倍であり、ＣＨＫ１のＡＳ鎖にＧＥＭを挿入するとＳＳの２つのＧＥＭと比較して６倍程度の力価の低下がもたらされることが示された。これは、ＡＳ鎖中のＧＥＭがＡＳ鎖のサイレンシング能力に干渉しており、そのために、ＣＨＫ１遺伝子をサイレンシングすることによって誘導される増強が得られないことが示される。ＣＨＫ１ ＡＳ及びＳＳ鎖の両方にそれぞれ２つのＧＥＭが組み込まれたｓｉＲＮＡ鎖の組合せについてのＩＣ５０（ＣＩＤ４／Ｃｈｋ１；１．８ｎＭ）は、ＡＳ鎖にのみ２つのＧＥＭを取り込んだｓｉＲＮＡのＩＣ５０（２Ａ－Ｃｈｋ１；１．９８ｎＭ）と非常に近い。これは、４つのＧＥＭを付加することによる利点がほとんどないことを示しており、ＳＳに２つのＧＥＭを有する場合と同等の力価が見られる。これは、ＡＳ鎖がＲＩＳＣ複合体の中で遺伝子サイレンシングのために保持される（しかし、この鎖上のＧｅｍは良好なサイレンシングを妨げる）一方、センス鎖上の２つのＧＥＭ（これはＲＩＳＣに組み込まれる際にＡＳ鎖からほどかれ、その後、細胞質内のヌクレアーゼによって切断される）は放出され、観察される最大活性に寄与するという予測と一致している。２Ｓ／ＮＳ ＩＣ５０（５．４ｎＭ）はＣＩＤ４／ＮＳ ＩＣ５０（５．１９ｎＭ）と非常に類似しているため、これはＮＳ ｓｉＲＮＡについてさえも一致している。
【0106】
２Ｓ／ＮＳ、２Ａ／ＮＳ、ＣＩＤ４／ＮＳの曲線は全て重なっており、ＣＨＫ１がサイレンシングされた場合よりもはるかに低いＩＣ５０を有している。前者のｓｉＲＮＡは遺伝子サイレンシングを行わないため、その効果は全て、切断時にＳＳ上に存在する２つのＧＥＭの放出のみによるものであり、ゲムシタビン単独の用量反応と同様のＩＣ５０値及び同等の効果をもたらす（図１３及び図１４を参照）。図１６は、ＡＳ鎖中のＣの代わりにＧＥＭを含むことの影響を示す。
【0107】
実施例７：
表１：ポリＧＥＭ Ｃｈｋ１－Ａｚ ｓｉＲＮＡ配列の構造
下記の表は、Ａｚｏｒｓａ １９ｍｅｒ ｓｉＲＮＡと共に使用したポリＧＥＭコンストラクトのセンス鎖の配列を示す。２つ、４つ、又は６つのＧｅｍヌクレオチドを、ｄＴｄＴ２塩基オーバーハング前のｓｉＲＮＡの３’末端のＳＳに挿入した。合成後、ＨＰＬＣにより２つのＧＥＭ ｄの放出のみによって各オリゴの純度を評価し、３つのオリゴのそれぞれについて７５～８２％の純度が観察された（右列）。これらの配列（又はＧＥＭを付加していない同じＳＳ）のそれぞれを、次に対応する塩基適合ＡＳ鎖とアニーリングしてｓｉＲＮＡ二重鎖を形成した。各二重鎖の濃度はＡ２６０／Ａ２８０測定により決定し、これを３列目に示す。
表１：ポリＧＥＭ Ｃｈｋ１－Ａｚ ｓｉＲＮＡ配列の構造
下記の表は、Ａｚｏｒｓａ １９ｍｅｒ ｓｉＲＮＡと共に使用したポリＧＥＭコンストラクトのセンス鎖の配列を示す。２つ、４つ、又は６つのＧｅｍヌクレオチドを、ｄＴｄＴ２塩基オーバーハング前のｓｉＲＮＡの３’末端のＳＳに挿入した。合成後、ＨＰＬＣにより２つのＧＥＭ ｄの放出のみによって各オリゴの純度を評価し、３つのオリゴのそれぞれについて７５～８２％の純度が観察された（右列）。これらの配列（又はＧＥＭを付加していない同じＳＳ）のそれぞれを、次に対応する塩基適合ＡＳ鎖とアニーリングしてｓｉＲＮＡ二重鎖を形成した。各二重鎖の濃度はＡ２６０／Ａ２８０測定により決定し、これを３列目に示す。
【0108】
【0109】
表２に示すｓｉＲＮＡ配列を、１２０時間の暴露後にＢｘＰＣ３膵臓がん細胞生存率に対する有効性及び力価について試験した。上図は、１２０時間暴露後に決定されたＢｘＰＣ３細胞の生存率に対するゲムシタビン単独（ＧＥＭ）の滴定の効果を示す。ＩＣ５０は約５ｎＭであったが、１００ｎＭにおいてすら最大有効性は生存細胞率の８５％に過ぎない。
【0110】
ＲＡＤ１７に対する非飾飾のｓｉＲＮＡ（ＳＬ－Ｐ４９－３）は、ＩＣ５０が約４ｎＭであり、細胞生存率の約６０％のみの阻害の最大有効性で細胞生存率の用量依存的な低下を示した。このｓｉＲＮＡがセンス鎖の３’末端に付加された２つのゲムシタビン部分を有する場合、力価に変化はなく（ＩＣ５０ 約４ｎＭ）、有効性の劇的な改善（３０ｎＭで１００％細胞死滅）が見られる。
【0111】
２５ｍｅｒ平滑末端ｓｉＲＮＡ配列は、ＧＥＭ修飾なしで使用した場合、非常に強力な細胞死滅効果を持つことが示された（ＳＬ－Ｐ４９－１；ＩＣ５０ ０．２５ｎＭ及び１００ｎＭで有効性９０％）。
【0112】
ＲＡＤ１７と同様に、ＳＳの３’末端に２つのＧＥＭを付加することによって、ＩＣ５０値は同等であるが、より大きな有効性（３０ｎＭで約１００％阻害）を有する生成物（ＳＬ－Ｐ４９－２）が得られた。
【0113】
図１７は、ｓｉＲＮＡのＳＳにおけるＧＥＭの位置及び修飾の数の、ｓｉＲＮＡ／Ｇｅｍの組合せの有効性及び力価に対する効果を示す。
【0114】
２つのＧｅｍ（ＳＬ－Ｐ４９－６）又は３つのＧｅｍ（ＳＬ－Ｐ４９－５）のいずれかを含むＣＨｋ１ ｓｉＲＮＡのＳＳの５’端を短くすることによって、同じ効果（ＩＣ５０ 約３ｎＭ、３０ｎＭにおいて８３～９７％の最大有効性）が得られた。このことは、いずれかのｓｉＲＮＡ形態の単一のＧＥＭの放出によって増強された平凡なサイレンシング効果を示している。
【0115】
Ｃの代わりに４つのＧＥＭを含む同じＳＳ配列（ＳＬ－Ｐ４９－７）を使用することによって、２つのＧＥＭのみを含む配列（ＳＬ－４９Ｐ－２）と同様のＩＣ５０及び有効性値が得られた。この結果は、このｓｉＲＮＡアンチセンス配列が最大量の遺伝子サイレンシングを提供していることを示しているが、２つ又は４つのいずれかのＧｅｍを含むＳＳから放出されたＧＥＭは、同等の有効性の改善をもたらし、これは、４つのＧｅｍを放出しても２つと比較して有効性が改善しないため、Ｇｅｍによる効果が飽和しているに違いないことが示された。１分子につき１つを超えるＧｅｍを放出すると、さらなるＧＥＭの切断は見られず、さらなる効果がもたらされない可能性がある。我々は、エキソヌクレアーゼが同じ配列の他のＧＥＭに直接結合している場合、第２のＧＥＭを切断して放出できない可能性があることを考えた（例えば、表２及び上図のＳＬ－Ｐ４９－２）。しかし、ヌクレアーゼ感受性のヌクレオチドによってＧＥＭを分離した場合（例えばＳＬ－４９Ｐ－５又はＳＬ－４９Ｐ－７）ですら、力価又は有効性のさらなる改善は見られなかった。この結果から、単一のＧｅｍのみが、見られる効果をもたらし得ることが示される。これは、ｓｉＲＮＡ ＲＩＳＣのローディングの間にＡＳ鎖からＳＳを放出するのに必要な時間、その後の複製中のＤＮＡフォーク構造に挿入するためのリン酸化を必要とするＧＥＭの放出に伴う細胞質におけるＳＳの分解の結果であり得る。あるいは、放出されるＧＥＭの量は、細胞の複製周期と相関し、そのため、フォークへのＧｅｍの取り込み速度という点では限定的であり得る。
【0116】
実施例８
ゲムシタビン又はＢｘＰＣ３細胞に対して用いた（図１）のと同じ非修飾のｓｉＲＮＡ及び暴露時間（９６時間）を用いて、他の膵臓がん細胞株ＭｉａＰａｃａ－２に対する効果を試験した。ＢｘＰＣ３細胞と同様に、ゲムシタビン単独では、ＩＣ５０値及び最大有効性が同等であり、用量依存的な細胞生存率の低下がもたらされた。ＣＨＫ１に対して設計された１９ｍｅｒ ｓｉＲＮＡ（ＣＨＫ－Ａｚ）及び２５ｍｅｒ平滑末端ｓｉＲＮＡは、いずれも同等の有効性（最大阻害約８０％）を示したが、これはＢｘＰＣ３細胞において１９ｍｅｒで観察された６０％阻害よりはるかに大きく、これらの細胞に対して２５ｍｅｒと同等であった。しかし、ＲＡＤ１７ ｓｉＲＮＡは、ＭｉａＰａｃａ細胞に対して単独で使用した場合（最大阻害は約３０％に過ぎない）、ＢｘＰＣ３細胞に対する（最大阻害約６０％）よりもはるかに低い有効性を示した。図１８は、他の膵臓腫瘍細胞であるＭｉａＰａにおけるコンストラクトの効果を示す。
ゲムシタビン又はＢｘＰＣ３細胞に対して用いた（図１）のと同じ非修飾のｓｉＲＮＡ及び暴露時間（９６時間）を用いて、他の膵臓がん細胞株ＭｉａＰａｃａ－２に対する効果を試験した。ＢｘＰＣ３細胞と同様に、ゲムシタビン単独では、ＩＣ５０値及び最大有効性が同等であり、用量依存的な細胞生存率の低下がもたらされた。ＣＨＫ１に対して設計された１９ｍｅｒ ｓｉＲＮＡ（ＣＨＫ－Ａｚ）及び２５ｍｅｒ平滑末端ｓｉＲＮＡは、いずれも同等の有効性（最大阻害約８０％）を示したが、これはＢｘＰＣ３細胞において１９ｍｅｒで観察された６０％阻害よりはるかに大きく、これらの細胞に対して２５ｍｅｒと同等であった。しかし、ＲＡＤ１７ ｓｉＲＮＡは、ＭｉａＰａｃａ細胞に対して単独で使用した場合（最大阻害は約３０％に過ぎない）、ＢｘＰＣ３細胞に対する（最大阻害約６０％）よりもはるかに低い有効性を示した。図１８は、他の膵臓腫瘍細胞であるＭｉａＰａにおけるコンストラクトの効果を示す。
【0117】
実施例９
ＭｉａＰａｃａ細胞では、２つの非修飾のｓｉＲＮＡ、Ｃｈｋ１＿ｄｅ（２５ｍｅｒの平滑末端配列）又はＣｈｋ－Ａｚ（２塩基ｄＴｄＴオーバーハングを有する１９ｍｅｒ）は、８０％阻害という同様の最大有効性を示した。ＣＨＫ１－Ａｚの配列への２つのＧＥＭの付加－ＳＳの３’末端（Ｃｈｋ－ａｚ－Ｐｏｌｙ２）又はＳＳ内のＣの置換（Ｃｈｋ１－ＡＺ－２Ｓ）によって、ＭｉａＰａｃａ細胞を死滅させる際のｓｉＲＮＡの有効性の有意な改善がもたらされた（１０ｎＭにおいて最大阻害約１００％）。２５ｍｅｒ ｓｉＲＮＡ（Ｃｈｋｄｅ＿２Ｇｅｍ）のＳＳの３’末端に２つのＧＥＭを付加した場合も同様であり、これによっても１０ｎＭにおいてＭｉａＰａｃａ細胞に対して約１００％の最大有効性がもたらされた。ＲＡＤ１７を標的とする非修飾の２５ｍｅｒ ｓｉＲＮＡは、ＭｉａＰａｃａ細胞生存率に対してほとんど有効性を示さなかった（最大約２５％）一方で、このｓｉＲＮＡのＳＳの３’末端に２つのＧｅｍを付加することによって、このコンストラクトの有効性が劇的に改善された（３０ｎＭにおいて９３％の阻害）。全ての修飾ｓｉＲＮＡは、ゲムシタビンを単独で使用して達成可能なものを超える最大有効性を示した（１００ｎＭで９０％の最大阻害）。図１９は、ＭｉａＰａｃａ細胞に対するＧｅｍ修飾ｓｉＲＮＡの効果を示す。
ＭｉａＰａｃａ細胞では、２つの非修飾のｓｉＲＮＡ、Ｃｈｋ１＿ｄｅ（２５ｍｅｒの平滑末端配列）又はＣｈｋ－Ａｚ（２塩基ｄＴｄＴオーバーハングを有する１９ｍｅｒ）は、８０％阻害という同様の最大有効性を示した。ＣＨＫ１－Ａｚの配列への２つのＧＥＭの付加－ＳＳの３’末端（Ｃｈｋ－ａｚ－Ｐｏｌｙ２）又はＳＳ内のＣの置換（Ｃｈｋ１－ＡＺ－２Ｓ）によって、ＭｉａＰａｃａ細胞を死滅させる際のｓｉＲＮＡの有効性の有意な改善がもたらされた（１０ｎＭにおいて最大阻害約１００％）。２５ｍｅｒ ｓｉＲＮＡ（Ｃｈｋｄｅ＿２Ｇｅｍ）のＳＳの３’末端に２つのＧＥＭを付加した場合も同様であり、これによっても１０ｎＭにおいてＭｉａＰａｃａ細胞に対して約１００％の最大有効性がもたらされた。ＲＡＤ１７を標的とする非修飾の２５ｍｅｒ ｓｉＲＮＡは、ＭｉａＰａｃａ細胞生存率に対してほとんど有効性を示さなかった（最大約２５％）一方で、このｓｉＲＮＡのＳＳの３’末端に２つのＧｅｍを付加することによって、このコンストラクトの有効性が劇的に改善された（３０ｎＭにおいて９３％の阻害）。全ての修飾ｓｉＲＮＡは、ゲムシタビンを単独で使用して達成可能なものを超える最大有効性を示した（１００ｎＭで９０％の最大阻害）。図１９は、ＭｉａＰａｃａ細胞に対するＧｅｍ修飾ｓｉＲＮＡの効果を示す。
【0118】
本発明は、その特定の実施形態に関連して記載され、多くの詳細が説明の目的で示されているが、本発明は追加の実施形態の影響を受けやすく、本明細書に記載された特定の詳細は、本発明の基本原理から逸脱せずに変化し得ることは当業者には明らかであろう。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図9-1】
【図10】
【図11】
【図12a】
【図12b】
【図12c】
【図12d】
【図13】
【図14】
【図15】
【図15-1】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【配列表】
【国際調査報告】