ホーム > 特許ランキング > Ｇｌｙｃｏｍ Ａ／Ｓ
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-12-05
(54)【発明の名称】発酵ブロスからの中性オリゴ糖の分離
(51)【国際特許分類】
C07H 1/08 20060101AFI20221128BHJP
C07H 3/06 20060101ALI20221128BHJP
B01D 61/00 20060101ALI20221128BHJP
B01D 61/14 20060101ALI20221128BHJP
B01D 61/56 20060101ALI20221128BHJP
B01D 71/02 20060101ALI20221128BHJP
B01D 71/58 20060101ALI20221128BHJP
C02F 1/42 20060101ALI20221128BHJP
C02F 1/28 20060101ALI20221128BHJP
【ＦＩ】
C07H1/08
C07H3/06
B01D61/00 500
B01D61/14 500
B01D61/56
B01D71/02
B01D71/58
C02F1/42 B
C02F1/28 D
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022515875
(86)(22)【出願日】2020-10-01
(85)【翻訳文提出日】2022-05-10
(86)【国際出願番号】 IB2020059201
(87)【国際公開番号】W WO2021064629
(87)【国際公開日】2021-04-08
(31)【優先権主張番号】PA201901154
(32)【優先日】2019-10-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】DK
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】508278309
【氏名又は名称】グリコム・アクティーゼルスカブ
【氏名又は名称原語表記】Ｇｌｙｃｏｍ Ａ／Ｓ
(74)【代理人】
【識別番号】100107456
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 成人
(74)【代理人】
【識別番号】100128381
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 義憲
(74)【代理人】
【識別番号】100162352
【弁理士】
【氏名又は名称】酒巻 順一郎
(72)【発明者】
【氏名】カーンジン， ニコライ
(72)【発明者】
【氏名】シャサーニュ， ピエール
(72)【発明者】
【氏名】マチーセン， フレミング
(72)【発明者】
【氏名】テーゲルセン， ジェスパー
(72)【発明者】
【氏名】マトウィユク， マーティン
【テーマコード（参考）】
4C057
4D006
4D025
4D624
【Ｆターム（参考）】
4C057AA03
4C057AA05
4C057AA12
4C057BB04
4D006GA03
4D006GA06
4D006KA01
4D006KA52
4D006KA55
4D006KA57
4D006KA72
4D006KB11
4D006KB12
4D006KB14
4D006MB05
4D006MB06
4D006MC03
4D006MC54
4D006PA01
4D006PB12
4D006PC12
4D025AA10
4D025AB37
4D025AB38
4D025BA09
4D025BA14
4D025BA15
4D025BB01
4D025DA03
4D025DA05
4D025DA10
4D624AA07
4D624AA10
4D624AB04
4D624AB05
4D624BA02
4D624BB01
4D624BC01
4D624BC04
4D624CA01
4D624DB03
4D624DB04
4D624DB07
4D624DB19
(57)【要約】
本発明は、中性ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）の、それが生成された反応環境からの、好ましくは発酵ブロスからの分離及び単離であって、ｉ）任意選択的に、前処理された反応環境を得るための、反応環境の遠心分離、精密ろ過又はフィルタプレス若しくはドラムフィルタでの反応環境のろ過の工程と、ｉｉ）工程ｉ）からの前処理された反応環境のｐＨを３～６に設定するか、又は反応環境のｐＨを直接３～６に設定し、且つ任意選択的に、工程ｉ）からの前処理された反応環境を３５～６５℃に温めるか、又は反応環境を直接３５～６５℃に温める工程と、ｉｉｉ）工程ｉｉ）で得られた反応環境を、５～１０００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する限外ろ過（ＵＦ）膜と接触させ、且つ透過液を回収する工程とを含み、但し、工程ｉ）が実行されない場合、ＵＦ膜は、非高分子膜である、分離及び単離に関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
中性ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）を、それが生成された反応環境から、好ましくは発酵ブロスから得るか又は単離する方法であって、ｉ）任意選択的に、前処理された反応環境を得るための、前記反応環境の遠心分離、精密ろ過又はフィルタプレス若しくはドラムフィルタでの前記反応環境のろ過の工程と、
ｉｉ）工程ｉ）からの前記前処理された反応環境のｐＨを３～６に設定するか、又は前記反応環境のｐＨを直接３～６に設定し、且つ任意選択的に、工程ｉ）からの前記前処理された反応環境を３５～６５℃に温めるか、又は前記反応環境を直接３５～６５℃に温める工程と、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で得られた前記反応環境を、５～１０００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する限外ろ過（ＵＦ）膜と接触させ、且つ透過液を回収する工程と
を含み、但し、工程ｉ）が実行されない場合、前記ＵＦ膜は、非高分子膜である、方法。
【請求項2】
前記ＵＦ膜の分子量カットオフは、１０～１０００ｋＤａである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
工程ｉｉ）は、工程ｉ）からの前記前処理された反応環境の前記ｐＨを設定し、且つそれを温めるか、又は前記反応環境のｐＨを直接設定し、且つそれを温めることを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
工程ｉ）は、実行されず、前記非高分子膜は、セラミック膜である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
工程ｉｉｉ）は、４５～６５℃で実行される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記ＵＦ膜は、セラミック膜であり、及び前記方法は、工程ｉｉｉ）で得られた前記透過液をナノろ過（ＮＦ）膜と接触させ、且つ保持液を回収する工程をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記ＮＦ膜は、６００～３５００Ｄａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有し、前記ＮＦ膜の活性（上）層は、ポリアミドで構成され、前記膜でのＭｇＳＯ４阻止率は、約５０～９０％である、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記ナノろ過保持液は、イオン交換樹脂で処理され、前記イオン交換樹脂による処理は、Ｈ＋形態の強カチオン交換樹脂による前記ＮＨ保持液の処理、その直後の遊離塩基形態の弱アニオン交換樹脂による処理からなる、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項9】
前記ナノろ過保持液は、活性炭で処理され、好ましくは、前記ナノろ過保持液は、３０～６０℃において、活性炭でのクロマトグラフィーであって、前記炭の量は、前記ナノろ過保持液に含有される前記中性ＨＭＯの約２～１０重量％である、クロマトグラフィーに供されて、活性炭溶出液を与える、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項10】
前記イオン交換処理の溶出液は、活性炭で処理され、好ましくは、前記溶出液は、３０～６０℃において、活性炭でのクロマトグラフィーであって、前記炭の量は、前記溶出液に含有される前記中性ＨＭＯの約２～１０重量％である、クロマトグラフィーに供されて、活性炭溶出液を与える、請求項８に記載の方法。
【請求項11】
活性炭溶出液は、イオン交換樹脂で処理され、前記イオン交換樹脂による処理は、Ｈ＋形態の強カチオン交換樹脂による前記活性炭溶出液の処理、その直後の遊離塩基形態の弱アニオン交換樹脂による処理からなる、請求項９に記載の方法。
【請求項12】
前記中性ＨＭＯは、２’－ＦＬ、３－ＦＬ、ＤＦＬ、ＬＮＴ、ＬＮｎＴ又はＬＮＦＰ－Ｉである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記中性ＨＭＯは、２’－ＦＬ又はＬＮｎＴである、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記中性ＨＭＯが生成された前記反応環境は、発酵ブロスである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
発酵は、遺伝子改変微生物、好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）によって実施される、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記遺伝子改変微生物は、ＬａｃＹ＋表現型又はＬａｃＺ－、ＬａｃＹ＋表現型の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
［発明の分野］
本発明は、中性ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）の、それが生成される反応混合物からの分離及び単離に関する。
本発明は、中性ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）の、それが生成される反応混合物からの分離及び単離に関する。
【0002】
［発明の背景］
過去数十年、ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）の調製及び商品化への関心が着実に高まっている。ＨＭＯの重要性は、このＨＭＯの固有の生物学的活性に直接関係しており、従って、ＨＭＯは、栄養用途及び治療用途に重要な潜在的製品となっている。そのため、ＨＭＯを工業的に製造する低コストの方法が模索されている。
過去数十年、ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）の調製及び商品化への関心が着実に高まっている。ＨＭＯの重要性は、このＨＭＯの固有の生物学的活性に直接関係しており、従って、ＨＭＯは、栄養用途及び治療用途に重要な潜在的製品となっている。そのため、ＨＭＯを工業的に製造する低コストの方法が模索されている。
【0003】
現在まで、１４０種を超えるＨＭＯの構造が決定されており、ヒトミルク中には、おそらくはるかにより多くのものが存在する（Ｕｒａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．：Ｍｉｌｋ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｂｏｏｋｓ，２０１１；Ｃｈｅｎ Ａｄｖ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２，１１３（２０１５））。ＨＭＯは、還元末端でラクトース（Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）部分を含み、且つＮ－アセチルグルコサミン又は１つ若しくは複数のＮ－アセチルラクトサミン部分（Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃ）及び／或いはラクト－Ｎ－ビオース部分（Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃ）で伸長され得る。ラクトース及びＮ－アセチルラクトサミニル化ラクトース誘導体又はラクト－Ｎ－ビオシル化ラクトース誘導体を１つ又は複数のフコース及び／又はシアル酸残基でさらに置換するか、又はラクトースを追加のガラクトースで置換して、これまで知られているＨＭＯを得ることができる。
【0004】
近年、ＨＭＯ、特に三糖であるものの直接発酵生成が実用化されている（Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．３０，１２６８（２０１２）及び本明細書で引用されている参考文献）。そのような発酵技術では、組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）システムが使用されており、このシステムでは、ウイルス又は細菌に由来する１つ又は複数のタイプのグリコシルトランスフェラーゼが共発現されて、外部から添加されたラクトースがグリコシル化されており、このラクトースは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＬａｃＹパーミアーゼにより内在化されている。しかしながら、組換えグリコシルトランスフェラーゼ、特に４つ以上の単糖単位のオリゴ糖を生成するための一連の組換えグリコシルトランスフェラーゼは、副生成物を常に形成し、そのため、発酵ブロス中にオリゴ糖の複雑な混合物が生じる。さらに、発酵ブロスは、幅広い非オリゴ糖物質、例えば、細胞、細胞断片、タンパク質、タンパク質断片、ＤＮＡ、ＤＮＡ断片、エンドトキシン、カラメル化副生成物、ミネラル、塩又は他の荷電分子を必然的に含有する。
【0005】
炭水化物副生成物及び他の夾雑成分からＨＭＯを分離するために、最適な方法として、ゲルろ過クロマトグラフィーと組み合わされた活性炭処理が提案されている（国際公開第０１／０４３４１号パンフレット、欧州特許出願公開第Ａ－２４７９２６３号明細書、Ｄｕｍｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．１８，４６５（２００１）、Ｐｒｉｅｍ ｅｔ ａｌ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １２，２３５（２００２）、Ｄｒｏｕｉｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４５，１７７８（２００６）、Ｇｅｂｕｓ ｅｔ ａｌ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３６１，８３（２０１２）、Ｂａｕｍｇａｅｒｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ １５，１８９６（２０１４））。ゲルろ過クロマトグラフィーは、実験室規模の便利な方法ではあるが、工業生産用に効率的にスケールアップすることができない。
【0006】
最近では、欧州特許出願公開第Ａ－２８９６６２８号明細書は、微生物発酵により得られた発酵ブロスからの２’－ＦＬの精製プロセスであって、限外ろ過、強カチオン交換樹脂クロマトグラフィー（Ｈ＋形態）、中和、強アニオン交換樹脂クロマトグラフィー（酢酸塩形態）、中和、活性炭処理、電気透析、第２の強カチオン交換樹脂クロマトグラフィー（Ｈ＋形態又はＮａ＋形態）、第２の強アニオン交換樹脂クロマトグラフィー（Ｃｌ－形態）、第２の活性炭処理、任意選択的な第２の電気透析及び滅菌ろ過の工程を含む精製プロセスを説明している。
【0007】
国際公開第２０１７／１８２９６５号パンフレット及び同第２０１７／２２１２０８号パンフレットは、発酵ブロスからのＬＮＴ又はＬＮｎＴの精製プロセスであって、限外ろ過、ナノろ過、活性炭処理及び強カチオン交換樹脂（Ｈ＋形態）、その後の弱アニオン交換樹脂（塩基形態）による処理を含む精製プロセスを開示している。
【0008】
国際公開第２０１５／１８８８３４号パンフレット及び同第２０１６／０９５９２４号パンフレットは、精製された発酵ブロスからの２’－ＦＬの結晶化を開示しており、この精製は、限外ろ過、ナノろ過、活性炭処理及び強カチオン交換樹脂（Ｈ＋形態）、その後の弱アニオン交換樹脂（塩基形態）による処理を含む。
【0009】
他の先行技術の文献は、ラクトースが少ないか又はラクトースがない発酵ブロスのための緻密な精製方法を開示している。これらの手順によれば、中性ＨＭＯの発酵生成中に過剰に添加されたラクトースは、β－ガラクトシダーゼの作用により、発酵完了後にインサイチュで加水分解されており、ラクトースが実質的に残存していないブロスが得られる。従って、国際公開第２０１２／１１２７７７号パンフレットは、２’－ＦＬを精製するための一連の工程であって、遠心分離、炭でのオリゴ糖の捕捉、その後の溶出及びにイオン交換媒体でのフラッシュクロマトグラフィーを含む工程を開示している。国際公開第２０１５／１０６９４３号パンフレットは、２’－ＦＬの精製であって、限外ろ過、強カチオン交換樹脂クロマトグラフィー（Ｈ＋形態）、中和、強アニオン交換樹脂クロマトグラフィー（Ｃｌ－形態）、中和、ナノろ過／透析ろ過、活性炭処理、電気透析、任意選択的な第２の強カチオン交換樹脂クロマトグラフィー（Ｎａ＋形態）、第２の強アニオン交換樹脂クロマトグラフィー（Ｃｌ－形態）、第２の活性炭処理、任意選択的な第２の電気透析及び滅菌ろ過を含む精製を開示している。国際公開第２０１９／０６３７５７号パンフレットは、中性ＨＭＯの精製プロセスであって、発酵ブロスからバイオマスを分離すること並びにカチオン交換材料、アニオン交換材料及びカチオン交換吸着樹脂による処理を含む精製プロセスを開示している。
【0010】
しかしながら、ＨＭＯの純度を少なくとも維持し、好ましくは改善しつつ、ＨＭＯの回収率を改善し、且つ／又は先行技術の方法を簡略化するために、中性ＨＭＯを、非炭水化物成分が生成された発酵ブロスの非炭水化物成分から単離及び精製するための代替手順、特に工業スケールに適したものが必要とされている。
【0011】
［発明の概要］
本発明は、中性ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）を、それが生成された反応環境から、好ましくは発酵ブロスから得るか又は単離する方法であって、前記ＨＭＯは、内在化した炭水化物前駆体から前記ＨＭＯを生成し得る遺伝子改変微生物を培養することによって生成されており、方法は、
ｉ）前記反応環境のｐＨを酸性、例えば約３～約６、好ましくは約５以下に設定し、且つ／又は前記反応環境を室温（若しくは周囲温度）よりも高い温度、好ましくは約３０～９０℃、より好ましくは約３５～８５℃に温める工程と、
ｉｉ）工程ｉ）で得られた反応環境を、約５～１０００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する限外ろ過（ＵＦ）膜と接触させる工程であって、この膜は、好ましくは、非高分子材料で構成される、工程と
を含む、方法に関する。
本発明は、中性ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）を、それが生成された反応環境から、好ましくは発酵ブロスから得るか又は単離する方法であって、前記ＨＭＯは、内在化した炭水化物前駆体から前記ＨＭＯを生成し得る遺伝子改変微生物を培養することによって生成されており、方法は、
ｉ）前記反応環境のｐＨを酸性、例えば約３～約６、好ましくは約５以下に設定し、且つ／又は前記反応環境を室温（若しくは周囲温度）よりも高い温度、好ましくは約３０～９０℃、より好ましくは約３５～８５℃に温める工程と、
ｉｉ）工程ｉ）で得られた反応環境を、約５～１０００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する限外ろ過（ＵＦ）膜と接触させる工程であって、この膜は、好ましくは、非高分子材料で構成される、工程と
を含む、方法に関する。
【0012】
従って、一実施形態では、本発明は、中性ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）を、それが生成された反応環境から、好ましくは発酵ブロスから得るか又は単離する方法であって、
ｉ）任意選択的に、反応環境の遠心分離、精密ろ過又はフィルタプレス若しくはドラムフィルタでの反応環境のろ過の工程と、
ｉｉ）工程ｉ）からのろ液若しくは上清のｐＨを３～６に設定するか、又は反応環境のｐＨを直接３～６に設定し、且つ／又は工程ｉ）からのろ液若しくは上清を３５～６５℃に温めるか、又は反応環境を直接３５～６５℃に温める工程と、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で得られた反応環境を、５～１０００ｋＤａ、好ましくは１０～１０００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する限外ろ過（ＵＦ）膜と接触させ、且つ透過液を回収する工程と
を含み、但し、工程ｉ）が実行されない場合、ＵＦ膜は、非高分子膜である、方法に関する。
ｉ）任意選択的に、反応環境の遠心分離、精密ろ過又はフィルタプレス若しくはドラムフィルタでの反応環境のろ過の工程と、
ｉｉ）工程ｉ）からのろ液若しくは上清のｐＨを３～６に設定するか、又は反応環境のｐＨを直接３～６に設定し、且つ／又は工程ｉ）からのろ液若しくは上清を３５～６５℃に温めるか、又は反応環境を直接３５～６５℃に温める工程と、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で得られた反応環境を、５～１０００ｋＤａ、好ましくは１０～１０００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する限外ろ過（ＵＦ）膜と接触させ、且つ透過液を回収する工程と
を含み、但し、工程ｉ）が実行されない場合、ＵＦ膜は、非高分子膜である、方法に関する。
【0013】
好ましくは、この方法は、
ｉ）任意選択的に、前処理された反応環境を得るための、反応環境の遠心分離、精密ろ過又はフィルタプレス若しくはドラムフィルタでの反応環境のろ過の工程と、
ｉｉ）工程ｉ）からの前処理された反応環境（典型的には工程ｉ）からのろ液又は上清である）のｐＨを３～６に設定するか、又は反応環境のｐＨを直接３～６に設定し、且つ任意選択的に、工程ｉ）からの前処理された反応環境を３５～６５℃に温めるか、又は反応環境を直接３５～６５℃に温める工程と、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で得られた反応環境を、５～１０００ｋＤａ、好ましくは１０～１０００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する限外ろ過（ＵＦ）膜と接触させ、且つ透過液を回収する工程と
を含み、但し、工程ｉ）が実行されない場合、ＵＦ膜は、非高分子膜である。
ｉ）任意選択的に、前処理された反応環境を得るための、反応環境の遠心分離、精密ろ過又はフィルタプレス若しくはドラムフィルタでの反応環境のろ過の工程と、
ｉｉ）工程ｉ）からの前処理された反応環境（典型的には工程ｉ）からのろ液又は上清である）のｐＨを３～６に設定するか、又は反応環境のｐＨを直接３～６に設定し、且つ任意選択的に、工程ｉ）からの前処理された反応環境を３５～６５℃に温めるか、又は反応環境を直接３５～６５℃に温める工程と、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で得られた反応環境を、５～１０００ｋＤａ、好ましくは１０～１０００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する限外ろ過（ＵＦ）膜と接触させ、且つ透過液を回収する工程と
を含み、但し、工程ｉ）が実行されない場合、ＵＦ膜は、非高分子膜である。
【0014】
より好ましくは、上記工程ｉｉ）は、ｐＨの設定及び温めの両方を含み、具体的には、ｐＨの設定を最初に行い、続いて、そのようにして得られた、ｐＨが設定された反応環境又は前処理された反応環境を温める。
【0015】
一実施形態では、上記で開示されている方法は、ナノろ過工程をさらに含む。
【0016】
他の実施形態では、上記で開示されている方法は、１つ又は複数のイオン交換樹脂による処理をさらに含む。
【0017】
他の実施形態では、上記で開示されている方法は、活性炭でのクロマトグラフィーによる処理をさらに含む。
【0018】
他の実施形態では、上記で開示されている方法は、ジビニルベンゼンで架橋されているポリスチレン（ＰＳ－ＤＶＢ）であって、芳香環上において臭素で官能化されているポリスチレンである疎水性固定相を使用するクロマトグラフィーをさらに含む。
【0019】
本方法の一実施形態は、中性ＨＭＯを、それが生成された反応環境から得るか又は単離することであって、
ｉ）前記反応環境のｐＨを酸性、例えば約３～約６、好ましくは約５以下に設定し、且つ／又は前記反応環境を室温（若しくは周囲温度）よりも高い温度、好ましくは約３０～９０℃、より好ましくは約３５～８５℃に温める工程と、
ｉｉ）工程ｉ）で得られた反応環境を、約５～１０００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する限外ろ過（ＵＦ）膜と接触させる工程であって、この膜は、好ましくは、非高分子材料で構成される、接触させる工程と、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で得られた透過液をナノろ過膜と接触させる工程と
を含む、得るか又は単離することに関する。
ｉ）前記反応環境のｐＨを酸性、例えば約３～約６、好ましくは約５以下に設定し、且つ／又は前記反応環境を室温（若しくは周囲温度）よりも高い温度、好ましくは約３０～９０℃、より好ましくは約３５～８５℃に温める工程と、
ｉｉ）工程ｉ）で得られた反応環境を、約５～１０００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する限外ろ過（ＵＦ）膜と接触させる工程であって、この膜は、好ましくは、非高分子材料で構成される、接触させる工程と、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で得られた透過液をナノろ過膜と接触させる工程と
を含む、得るか又は単離することに関する。
【0020】
本方法の一実施形態は、中性ＨＭＯを、それが生成された反応環境から得るか又は単離することであって、
ｉ）前記反応環境のｐＨを酸性、例えば約３～約６、好ましくは約５以下に設定し、且つ／又は前記反応環境を室温（若しくは周囲温度）よりも高い温度、好ましくは約３０～９０℃、より好ましくは約３５～８５℃に温める工程と、
ｉｉ）工程ｉ）で得られた反応環境を、約５～１０００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する限外ろ過（ＵＦ）膜と接触させる工程であって、この膜は、好ましくは、非高分子材料で構成される、接触させる工程と、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で得られた透過液をナノろ過（ＮＦ）膜と接触させる工程と、
ｉｖ）工程ｉｉｉ）で得られた保持液をイオン交換樹脂、好ましくは強カチオンイオン交換樹脂及び弱塩基性イオン交換樹脂で処理して、この保持液を脱塩する工程と
を含む、得るか又は単離することに関する。
ｉ）前記反応環境のｐＨを酸性、例えば約３～約６、好ましくは約５以下に設定し、且つ／又は前記反応環境を室温（若しくは周囲温度）よりも高い温度、好ましくは約３０～９０℃、より好ましくは約３５～８５℃に温める工程と、
ｉｉ）工程ｉ）で得られた反応環境を、約５～１０００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する限外ろ過（ＵＦ）膜と接触させる工程であって、この膜は、好ましくは、非高分子材料で構成される、接触させる工程と、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で得られた透過液をナノろ過（ＮＦ）膜と接触させる工程と、
ｉｖ）工程ｉｉｉ）で得られた保持液をイオン交換樹脂、好ましくは強カチオンイオン交換樹脂及び弱塩基性イオン交換樹脂で処理して、この保持液を脱塩する工程と
を含む、得るか又は単離することに関する。
【0021】
本方法の一実施形態は、中性ＨＭＯを、それが生成された反応環境から得るか又は単離することであって、
ｉ）前記反応環境のｐＨを酸性、例えば約３～約６、好ましくは約５以下に設定し、且つ／又は前記反応環境を室温（若しくは周囲温度）よりも高い温度、好ましくは約３０～９０℃、より好ましくは約３５～８５℃に温める工程と、
ｉｉ）工程ｉ）で得られた反応環境を、約５～１０００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する限外ろ過（ＵＦ）膜と接触させる工程であって、この膜は、好ましくは、非高分子材料で構成される、接触させる工程と、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で得られた透過液をナノろ過（ＮＦ）膜と接触させる工程と、
ｉｖ）工程ｉｉｉ）で得られた保持液をイオン交換樹脂、好ましくは強カチオンイオン交換樹脂及び弱塩基性イオン交換樹脂で処理して、この保持液を脱塩する工程と、
ｖ）工程ｉｖ）で得られた溶液を活性炭（ＡＣ）と接触させるか、若しくはジビニルベンゼンで架橋されているポリスチレン（ＰＳ－ＤＶＢ）であって、芳香環上において臭素で官能化されているポリスチレンである疎水性固定相を使用するクロマトグラフィーに供するか、又は任意の順序で両方を行う工程と
を含む、得るか又は単離することに関する。
ｉ）前記反応環境のｐＨを酸性、例えば約３～約６、好ましくは約５以下に設定し、且つ／又は前記反応環境を室温（若しくは周囲温度）よりも高い温度、好ましくは約３０～９０℃、より好ましくは約３５～８５℃に温める工程と、
ｉｉ）工程ｉ）で得られた反応環境を、約５～１０００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する限外ろ過（ＵＦ）膜と接触させる工程であって、この膜は、好ましくは、非高分子材料で構成される、接触させる工程と、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で得られた透過液をナノろ過（ＮＦ）膜と接触させる工程と、
ｉｖ）工程ｉｉｉ）で得られた保持液をイオン交換樹脂、好ましくは強カチオンイオン交換樹脂及び弱塩基性イオン交換樹脂で処理して、この保持液を脱塩する工程と、
ｖ）工程ｉｖ）で得られた溶液を活性炭（ＡＣ）と接触させるか、若しくはジビニルベンゼンで架橋されているポリスチレン（ＰＳ－ＤＶＢ）であって、芳香環上において臭素で官能化されているポリスチレンである疎水性固定相を使用するクロマトグラフィーに供するか、又は任意の順序で両方を行う工程と
を含む、得るか又は単離することに関する。
【0022】
好ましくは、中性ＨＭＯは、２’－ＦＬ、３－ＦＬ、ＤＦＬ、ＬＮＴ、ＬＮｎＴ又はＬＮＦＰ－Ｉである。
【0023】
好ましくは、中性ＨＭＯが生成された反応環境は、発酵ブロスである。この発酵ブロスは、典型的には、下記を含有する：遺伝子改変微生物、好ましくは適切に設計されている大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が生成する主要化合物としての目的の中性ＨＭＯ、炭水化物副生成物又は夾雑物、例えば前駆体としてのラクトース、好ましくは外部から添加されたラクトースからの目的の中性ＨＭＯの生合成経路における炭水化物中間体、及び／又は生合成経路中での不十分な、不完全な若しくは低下したグリコシル化の結果としてのもの、及び／又は培養条件下での若しくは発酵後操作下での再構成若しくは分解の結果としてのもの、及び／又は発酵中に過剰に添加された未消費遊離体としてのラクトース。さらに、この発酵ブロスは、細胞、タンパク質、タンパク質断片、ＤＮＡ、カラメル化副生成物、ミネラル、塩、有機酸、エンドトキシン及び／又は他の荷電分子を含有し得る。
【0024】
好ましくは、発酵ブロスをＵＦ前に遠心分離、精密ろ過又はフィルタプレス若しくはドラムフィルタでのろ過に供しない場合、ＵＦ膜は、非高分子材料で構成される（例えば、このＵＦ膜は、セラミック膜である）。
【0025】
本発明の特定の実施形態は、１つ又は複数のさらなる任意選択的な工程を含む。好ましくは、このさらなる任意選択的な工程は、電気透析ではない。
【0026】
一実施形態では、好ましくは、ＵＦ透過液がラクトースに乏しいか又はラクトースを本質的に欠く場合、工程ｉｉｉ）に係るＮＦ工程は、目的の中性ヒトミルクオリゴ糖を確実に保持するＭＷＣＯを有するナノろ過膜の使用を含み、即ち、このナノろ過膜のＭＷＣＯは、中性ヒトミルクオリゴ糖の分子量の約２５～５０％、典型的には約１５０～５００Ｄａである。これに関して、中性ヒトミルクオリゴ糖は、ＮＦ保持液（ＮＦＲ）中に蓄積され、一価イオン又は単糖等の塩は、透過液中に蓄積される。
【0027】
他の実施形態では、好ましくは、ＵＦ透過液が相当量のラクトースを含有する場合、工程ｉｉｉ）に係るＮＦ工程は、ＭＷＣＯが、中性ＨＭＯを確実に保持し、且つ一価の塩及び二価の塩並びにラクトースの少なくとも一部が膜を通過することを可能にする約６００～３５００Ｄａであるナノろ過膜の使用であって、このＮＦ膜の活性（上）層は、ポリアミドで構成され、このＮＦ膜でのＭｇＳＯ４阻止率は、約５０～９０％である、使用を含む。
【0028】
他の実施形態では、工程ｖ）に係る、ジビニルベンゼンで架橋されているポリスチレン（ＰＳ－ＤＶＢ）であって、芳香環上において臭素で官能化されているポリスチレンである疎水性固定相を使用するクロマトグラフィーを、好ましくは目的の中性ＨＭＯがＬＮＴ、ＬＮｎＴ又はＬＮＦＰ－Ｉである場合に利用して、夾雑しているオリゴ糖から目的の中性ＨＭＯを分離する。
【0029】
本発明は、別の態様では、発酵プロセス又は酵素プロセスからの水性媒体中の溶解した無機及び有機の塩、酸及び塩基からの中性ＨＭＯの分離であって、この水性媒体を工程ｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）及び任意選択的に工程ｖ）に供する工程を含む分離に関する。
【0030】
［発明の詳細な説明］
［１．用語及び定義］
「中性ヒトミルクオリゴ糖」という用語は、ａ）１つ又は２つのα－Ｌ－フコピラノシル部分で置換されているか、ｂ）ガラクトシル残基で置換されているか、又はｃ）Ｎ－アセチルグルコサミン部分、ラクト－Ｎ－ビオース（Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃ）部分若しくはＮ－アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃ）部分により３’－ＯＨ基を介して伸長されている還元末端でラクトース単位であるコア構造を含む、ヒト母乳中に見出される非シアル化（従って中性）複合炭水化物を意味する（Ｕｒａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．：Ｍｉｌｋ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｂｏｏｋｓ，２０１１；Ｃｈｅｎ Ａｄｖ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２，１１３（２０１５））。Ｎ－アセチルラクトサミン含有誘導体は、Ｎ－アセチルラクトサミン及び／又はラクト－Ｎ－ビオース（ラクト－Ｎ－ビオースは、常に非還元末端である）でさらに置換され得る。Ｎ－アセチルラクトサミン含有誘導体及びラクト－Ｎ－ビオース含有誘導体は、１つ又は複数のα－Ｌ－フコピラノシル部分で任意選択的に置換され得る。中性三糖ＨＭＯの例として下記：２’－Ｏ－フコシルラクトース（２’－ＦＬ、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）、３－Ｏ－フコシルラクトース（３－ＦＬ、Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）Ｇｌｃ）又はラクト－Ｎ－トリオースＩＩ（ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）が挙げられ；中性四糖ＨＭＯの例として下記：２’，３－ジ－Ｏ－フコシルラクトース（ＤＦＬ、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）Ｇｌｃ）、ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ、Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）又はラクト－Ｎ－ｎｅｏテトラオース（ＬＮｎＴ、Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）が挙げられ；中性五糖ＨＭＯの例として下記：ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰＩ、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩ（ＬＮＦＰＩＩ、Ｇａｌβ１－３（Ｆｕｃα１－４）ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩＩ（ＬＮＦＰ ＩＩＩ、Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＶ（ＬＮＦＰ Ｖ、Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）Ｇｌｃ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＶＩ（ＬＮＦＰ ＶＩ、Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）Ｇｌｃ）が挙げられ；中性六糖ＨＭＯの例として下記：ラクト－Ｎ－ジフコヘキソースＩ（ＬＮＤＦＨ Ｉ、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３（Ｆｕｃα１－４）ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩＩ（ＬＮＤＦＨ ＩＩ、Ｇａｌβ１－３（Ｆｕｃα１－４）ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）Ｇｌｃ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩＩＩ（ＬＮＤＦＨ ＩＩＩ、Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）Ｇｌｃ）、ラクト－Ｎ－ヘキソース（ＬＮＨ、Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃβ１－３（Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－６）Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）、パラ－ラクト－Ｎ－ヘキサオース（ｐＬＮＨ、Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）、ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ＬＮｎＨ、Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－３（Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－６）Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）又はパラ－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ｐＬＮｎＨ、Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）が挙げられる。
［１．用語及び定義］
「中性ヒトミルクオリゴ糖」という用語は、ａ）１つ又は２つのα－Ｌ－フコピラノシル部分で置換されているか、ｂ）ガラクトシル残基で置換されているか、又はｃ）Ｎ－アセチルグルコサミン部分、ラクト－Ｎ－ビオース（Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃ）部分若しくはＮ－アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃ）部分により３’－ＯＨ基を介して伸長されている還元末端でラクトース単位であるコア構造を含む、ヒト母乳中に見出される非シアル化（従って中性）複合炭水化物を意味する（Ｕｒａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．：Ｍｉｌｋ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｂｏｏｋｓ，２０１１；Ｃｈｅｎ Ａｄｖ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２，１１３（２０１５））。Ｎ－アセチルラクトサミン含有誘導体は、Ｎ－アセチルラクトサミン及び／又はラクト－Ｎ－ビオース（ラクト－Ｎ－ビオースは、常に非還元末端である）でさらに置換され得る。Ｎ－アセチルラクトサミン含有誘導体及びラクト－Ｎ－ビオース含有誘導体は、１つ又は複数のα－Ｌ－フコピラノシル部分で任意選択的に置換され得る。中性三糖ＨＭＯの例として下記：２’－Ｏ－フコシルラクトース（２’－ＦＬ、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）、３－Ｏ－フコシルラクトース（３－ＦＬ、Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）Ｇｌｃ）又はラクト－Ｎ－トリオースＩＩ（ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）が挙げられ；中性四糖ＨＭＯの例として下記：２’，３－ジ－Ｏ－フコシルラクトース（ＤＦＬ、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）Ｇｌｃ）、ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ、Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）又はラクト－Ｎ－ｎｅｏテトラオース（ＬＮｎＴ、Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）が挙げられ；中性五糖ＨＭＯの例として下記：ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰＩ、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩ（ＬＮＦＰＩＩ、Ｇａｌβ１－３（Ｆｕｃα１－４）ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩＩ（ＬＮＦＰ ＩＩＩ、Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＶ（ＬＮＦＰ Ｖ、Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）Ｇｌｃ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＶＩ（ＬＮＦＰ ＶＩ、Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）Ｇｌｃ）が挙げられ；中性六糖ＨＭＯの例として下記：ラクト－Ｎ－ジフコヘキソースＩ（ＬＮＤＦＨ Ｉ、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３（Ｆｕｃα１－４）ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩＩ（ＬＮＤＦＨ ＩＩ、Ｇａｌβ１－３（Ｆｕｃα１－４）ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）Ｇｌｃ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩＩＩ（ＬＮＤＦＨ ＩＩＩ、Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）Ｇｌｃ）、ラクト－Ｎ－ヘキソース（ＬＮＨ、Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃβ１－３（Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－６）Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）、パラ－ラクト－Ｎ－ヘキサオース（ｐＬＮＨ、Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）、ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ＬＮｎＨ、Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－３（Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－６）Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）又はパラ－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ｐＬＮｎＨ、Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）が挙げられる。
【0031】
「遺伝子改変細胞」又は「遺伝子改変微生物」という用語は、好ましくは、ＤＮＡ配列中に少なくとも１つの変更を含むように遺伝子操作されている微生物の細胞、例えば細菌細胞又は真菌細胞、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を意味する。「少なくとも１つの遺伝子変更」という用語は、野生型細胞の本来の特性に変化をもたらし得る遺伝子変更を意味し、例えば、改変細胞は、野生型細胞中に存在しない酵素の発現をコードする新規の遺伝物質の導入に起因して追加の化学的変換を実施し得るか、又は遺伝子の除去（ノックアウト）に起因して分解のような変換を実行し得ない。遺伝子改変細胞を、当業者に公知の遺伝子操作技術により従来の方法で製造し得る。
【0032】
「内在化した炭水化物前駆体から中性ＨＭＯを生成し得る遺伝子改変微生物」という用語は、好ましくは、１種又は複数のグリコシルトランスフェラーゼ酵素であって、活性化糖ヌクレオチドのグリコシル残基を、内在化したアクセプター分子に転移し得、且つ前記中性ＨＭＯの合成、前記グリコシルトランスフェラーゼにより炭水化物前駆体（アクセプター）に転移されるのに適した対応する活性化糖ヌクレオチドドナーを生成するための生合成経路及び炭水化物前駆体（アクセプター）の培養培地から細胞（目的の中性ＨＭＯを生成するためにこのアクセプターがグリコシル化される）中への内在化の機構に必要な１種又は複数のグリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする１種又は複数の内在性遺伝子又は組換え遺伝子を含むように遺伝子操作されている（上記を参照されたい）微生物、例えば、細菌又は真菌（例えば酵母）、好ましくは細菌、より好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細胞を意味する。このグリコシルトランスフェラーゼは、β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、β－１，６－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ、β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ及びα－１，４フコシルトランスフェラーゼから選択される。対応する活性化糖ヌクレオチドは、ＵＤＰ－Ｇａｌ、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ及びＧＤＰ－Ｆｕｃである。
【0033】
発酵に関連して、「バイオマス」という用語は、発酵細胞、例えば無傷の細胞、破壊された細胞、細胞断片、タンパク質、タンパク質断片、多糖に由来する懸濁物質、沈殿物質又は不溶性物質を指す。酵素反応に関連して、「バイオマス」という用語は、使用される酵素に由来する（主に変性している及び／又は沈殿している）タンパク質又はタンパク質断片を指す。バイオマスを例えば遠心分離、精密ろ過、限外ろ過又はフィルタプレス若しくはドラムフィルタでのろ過により上清又は反応混合物から分離し得る。
【0034】
「Ｂｒｉｘ」という用語は、水溶液の糖度（溶液１００ｇ中の糖のｇ）であるＢｒｉｘ度を指す。これに関して、本出願のＮ－アセチルグルコサミン含有中性オリゴ糖溶液のＢｒｉｘは、Ｎ－アセチルグルコサミン含有中性オリゴ糖及びそれに付随する炭水化物を含む溶液の全炭水化物含有量を指す。Ｂｒｉｘを、較正された屈折計で測定する。
【0035】
塩の阻止率（％）は、（１－κｐ／κｒ）・１００（式中、κｐは、透過液中の塩の導電率であり、κｒは、保持液中の塩の導電率である）として算出する。保持液の濃度は、塩に関する供給濃度と実質的に等しい。塩の阻止を測定する手順は、下記の実施例で開示されている。
【0036】
炭水化物の阻止率（％）は、（１－Ｃｐ／Ｃｒ）・１００（式中、Ｃｐは、透過液中の炭水化物の濃度であり、Ｃｒは、保持液中の炭水化物の濃度である）として算出する。保持液の濃度は、炭水化物に関する供給濃度と実質的に等しい。炭水化物の阻止を測定する手順の一例は、下記の実施例で開示されている。
【0037】
２種の炭水化物に関する分離係数は、（Ｃｐ１／Ｃｒ１）／（Ｃｐ２／Ｃｒ２）（式中、Ｃｐ１及びＣｐ２は、それぞれ透過液中の第１の炭水化物及び第２の炭水化物の濃度であり、Ｃｒ１及びＣｒ２は、それぞれ保持液中の第１の炭水化物及び第２の炭水化物の濃度である）として算出する。
【0038】
「純水フラックス」とは、特定の条件（約２３～２５℃、１０ｂａｒ及び３００ｌ／ｈの一定クロスフロー）下での単位時間当たり、単位面積当たりの膜を通過する純水（例えば、蒸留水、ＲＯ水）の体積として定義される。
【0039】
「脱塩」は、好ましくは、液体からミネラル又はミネラル塩を除去するプロセスを意味する。本発明に関連して、脱塩は、好ましくは、イオン交換処理の工程を指し、特に第２のイオン交換体からの溶出液がミネラル若しくはミネラル塩を含有しないか又は非常に少ない量のみ含有するようなカチオン交換樹脂及びアニオン交換樹脂の後続適用を指す。さらに、特にナノろ過工程が脱塩と組み合わされた場合、脱塩は、ナノろ過工程で起こり得る。
【0040】
「精密ろ過」は、好ましくは、約０．１～１０μｍの範囲の孔を有する膜に発酵ブロス又は酵素反応混合物を通してろ過する前処理分離プロセスを意味する。およその分子量に関して、この膜は、保持液中の、分子量が一般的に５００，０００ｇ／ｍｏｌを超える巨大分子を分離し得る。
【0041】
数値に関連して、本発明の明細書全体を通して使用される「およそ」又は「約」という用語は、前記数値が、示された値の１０％まで逸脱する可能性があることを意味する。
【0042】
［２．中性ＨＭＯを、それが生成された反応環境から得るか又は単離する方法］
本発明は、水性媒体から中性ＨＭＯを得るか又は単離する方法であって、この水性媒体は、前記中性ＨＭＯが生成された発酵ブロス又は酵素反応混合物である、方法に関する。この反応環境は、中性ＨＭＯが、副生成物及び前記中性ＨＭＯの合成に必要な残留物のようないくつかの物質を伴うか又はこれらの物質によって夾雑されている複雑なマトリックスである。従って、中性ＨＭＯは、いくつかの連続工程を用いてこの中性ＨＭＯを副生成物及び残留物から分離することにより、この反応環境から得られるか又は単離され、その結果、この中性ＨＭＯは、反応環境中に存在した場合と比べてはるかに純粋な形態で得られるか又は単離される。そのため、本発明は、先行技術と比較して有益な方法で目的の中性ＨＭＯを得ることができるか又は単離することができる精製方法を提供する。そのような利点は、対応する方法の工程に関して下記で開示されている。
本発明は、水性媒体から中性ＨＭＯを得るか又は単離する方法であって、この水性媒体は、前記中性ＨＭＯが生成された発酵ブロス又は酵素反応混合物である、方法に関する。この反応環境は、中性ＨＭＯが、副生成物及び前記中性ＨＭＯの合成に必要な残留物のようないくつかの物質を伴うか又はこれらの物質によって夾雑されている複雑なマトリックスである。従って、中性ＨＭＯは、いくつかの連続工程を用いてこの中性ＨＭＯを副生成物及び残留物から分離することにより、この反応環境から得られるか又は単離され、その結果、この中性ＨＭＯは、反応環境中に存在した場合と比べてはるかに純粋な形態で得られるか又は単離される。そのため、本発明は、先行技術と比較して有益な方法で目的の中性ＨＭＯを得ることができるか又は単離することができる精製方法を提供する。そのような利点は、対応する方法の工程に関して下記で開示されている。
【0043】
バイオテクノロジー方法を使用すると、中性ＨＭＯが生成される方法（発酵又はインビトロでの酵素）に関係なく、反応環境は、バイオマスを含有する。従って、本発明の方法は、この反応環境からバイオマスを分離して、目的の中性ＨＭＯを含む水溶液を得る工程を強制的に含む。この反応環境からバイオマスを分離することは、任意選択的に予備ろ過（即ち遠心分離、精密ろ過又はフィルタプレス若しくはドラムフィルタでのろ過）に続いて、限外ろ過（ＵＦ、下記の詳細を参照されたい）を含む。ＵＦには、通常、ナノろ過工程（ＮＦ、下記の詳細を参照されたい）が続く。さらに、本発明の方法は、任意選択的に、しかしながら好ましくは、イオン交換樹脂による処理、有利にはカチオン交換樹脂及びアニオン交換樹脂による処理を含む。加えて、本発明の方法は、任意選択的に、脱色のための活性炭処理及び／又は残留する疎水性夾雑物を除去するための中性固相でのクロマトグラフィー工程、好ましくは逆相クロマトグラフィーを含み得る。これらの任意選択的な工程をいずれもＵＦ及びＮＦ後に任意の順序で実施され得る。さらに、本発明の方法は、任意選択的に、特に中性ＨＭＯの水溶液を濃縮及び又は脱塩（ｄｅｓａｌｉｎａｔｉｎｇ）／脱塩（ｄｅｍｉｎｅｒａｌｉｚｉｎｇ）するために、少なくとも１つのＮＦ工程を含み得る。代わりに、（例えば、供給物の低い塩含有量に起因して）脱塩が不要である場合、任意選択的な追加のＮＦを蒸発に置き換え得る。
【0044】
ＵＦ、ＮＦ、「イオン交換樹脂による処理」、「活性炭処理」及び「中性固相でのクロマトグラフィー」の工程を、対応する節において下記で詳細に述べる。
【0045】
従って、本方法は、任意の順序で下記の分離／精製工程を含む：
ａ）限外ろ過（ＵＦ）、
ｂ）ナノろ過（ＮＲ）、及び
ｃ）イオン交換樹脂及び／又は中性固相でのクロマトグラフィーによる処理。
ａ）限外ろ過（ＵＦ）、
ｂ）ナノろ過（ＮＲ）、及び
ｃ）イオン交換樹脂及び／又は中性固相でのクロマトグラフィーによる処理。
【0046】
好ましくは、本方法は、電気透析を含まない。
【0047】
有利には、工程ａ）を工程ｂ）前に行う。より有利には、工程ａ）を工程ｂ）及びｃ）のいずれかの前に行う。好ましくは、本方法を、工程ａ）後に工程ｂ）が続き、且つ工程ｂ）後に工程ｃ）が続く順序で実施する。
【0048】
一実施形態では、本方法は、
－ 反応環境又は遠心分離された反応環境の限外ろ過（ＵＦ）及び限外ろ過透過液（ＵＦＰ）の回収、
－ このＵＦＰのナノろ過（ＮＦ）及びナノろ過保持液（ＮＦＲ）の回収、
－ このＮＦＲのイオン交換樹脂による処理及び樹脂溶出液（ＲＥ）の回収、及び
－ このＲＥのクロマトグラフィー
を含む。
－ 反応環境又は遠心分離された反応環境の限外ろ過（ＵＦ）及び限外ろ過透過液（ＵＦＰ）の回収、
－ このＵＦＰのナノろ過（ＮＦ）及びナノろ過保持液（ＮＦＲ）の回収、
－ このＮＦＲのイオン交換樹脂による処理及び樹脂溶出液（ＲＥ）の回収、及び
－ このＲＥのクロマトグラフィー
を含む。
【0049】
別の実施形態では、本方法は、
－ 反応環境又は遠心分離された反応環境の限外ろ過（ＵＦ）及び限外ろ過透過液（ＵＦＰ）の回収、
－ このＵＦＰのナノろ過（ＮＦ）及びナノろ過保持液（ＮＦＲ）の回収、
－ このＮＦＲのクロマトグラフィー及びクロマトグラフィー溶出液（ＣＥ）の回収、及び
－ このＣＥのイオン交換樹脂による処理
を含む。
－ 反応環境又は遠心分離された反応環境の限外ろ過（ＵＦ）及び限外ろ過透過液（ＵＦＰ）の回収、
－ このＵＦＰのナノろ過（ＮＦ）及びナノろ過保持液（ＮＦＲ）の回収、
－ このＮＦＲのクロマトグラフィー及びクロマトグラフィー溶出液（ＣＥ）の回収、及び
－ このＣＥのイオン交換樹脂による処理
を含む。
【0050】
本発明の方法は、ＵＦ、ＮＦ、クロマトグラフィー又はイオン交換樹脂処理後に活性炭処理を含み得る。
【0051】
一実施形態では、本方法は、
－ 反応環境又は遠心分離された反応環境の限外ろ過（ＵＦ）及び限外ろ過透過液（ＵＦＰ）の回収、
－ このＵＦＰのナノろ過（ＮＦ）及びナノろ過保持液（ＮＦＲ）の回収、
－ このＮＦＲの活性炭処理及び炭溶出液（ＣＣＥ）の回収、及び
－ このＣＣＥのイオン交換樹脂による処理
を含む。
－ 反応環境又は遠心分離された反応環境の限外ろ過（ＵＦ）及び限外ろ過透過液（ＵＦＰ）の回収、
－ このＵＦＰのナノろ過（ＮＦ）及びナノろ過保持液（ＮＦＲ）の回収、
－ このＮＦＲの活性炭処理及び炭溶出液（ＣＣＥ）の回収、及び
－ このＣＣＥのイオン交換樹脂による処理
を含む。
【0052】
好ましくは、本方法は、
－ 反応環境又は遠心分離された反応環境の限外ろ過（ＵＦ）及び限外ろ過透過液（ＵＦＰ）の回収、
－ このＵＦＰのナノろ過（ＮＦ）及びナノろ過保持液（ＮＦＲ）の回収、
－ このＮＦＲの活性炭処理及び炭溶出液（ＣＣＥ）の回収、及び
－ このＣＣＥの、Ｈ＋形態の強カチオン交換樹脂及び遊離塩基形態の弱アニオン交換樹脂による処理
を含む。
－ 反応環境又は遠心分離された反応環境の限外ろ過（ＵＦ）及び限外ろ過透過液（ＵＦＰ）の回収、
－ このＵＦＰのナノろ過（ＮＦ）及びナノろ過保持液（ＮＦＲ）の回収、
－ このＮＦＲの活性炭処理及び炭溶出液（ＣＣＥ）の回収、及び
－ このＣＣＥの、Ｈ＋形態の強カチオン交換樹脂及び遊離塩基形態の弱アニオン交換樹脂による処理
を含む。
【0053】
より好ましくは、本方法は、
－ 反応環境又は遠心分離された反応環境の限外ろ過（ＵＦ）及び限外ろ過透過液（ＵＦＰ）の回収、
－ このＵＦＰのナノろ過（ＮＦ）及びナノろ過保持液（ＮＦＲ）の回収、
－ このＮＦＲの活性炭処理及び炭溶出液（ＣＣＥ）の回収、及び
－ このＣＣＥの、Ｈ＋形態の強カチオン交換樹脂及び遊離塩基形態の弱アニオン交換樹脂による処理
を含み、且つこの方法は、電気透析を含まない。
－ 反応環境又は遠心分離された反応環境の限外ろ過（ＵＦ）及び限外ろ過透過液（ＵＦＰ）の回収、
－ このＵＦＰのナノろ過（ＮＦ）及びナノろ過保持液（ＮＦＲ）の回収、
－ このＮＦＲの活性炭処理及び炭溶出液（ＣＣＥ）の回収、及び
－ このＣＣＥの、Ｈ＋形態の強カチオン交換樹脂及び遊離塩基形態の弱アニオン交換樹脂による処理
を含み、且つこの方法は、電気透析を含まない。
【0054】
別の実施形態では、本方法は、
－ 反応環境又は遠心分離された反応環境の限外ろ過（ＵＦ）及び限外ろ過透過液（ＵＦＰ）の回収、
－ このＵＦＰのナノろ過（ＮＦ）及びナノろ過保持液（ＮＦＲ）の回収、
－ このＮＦＲのイオン交換樹脂による処理及び樹脂溶出液（ＲＥ）の回収、及び
－ このＲＥの活性炭処理
を含む。
－ 反応環境又は遠心分離された反応環境の限外ろ過（ＵＦ）及び限外ろ過透過液（ＵＦＰ）の回収、
－ このＵＦＰのナノろ過（ＮＦ）及びナノろ過保持液（ＮＦＲ）の回収、
－ このＮＦＲのイオン交換樹脂による処理及び樹脂溶出液（ＲＥ）の回収、及び
－ このＲＥの活性炭処理
を含む。
【0055】
好ましくは、本方法は、
－ 反応環境又は遠心分離された反応環境の限外ろ過（ＵＦ）及び限外ろ過透過液（ＵＦＰ）の回収、
－ このＵＦＰのナノろ過（ＮＦ）及びナノろ過保持液（ＮＦＲ）の回収、
－ このＮＦＲの、Ｈ＋形態の強カチオン交換樹脂及び遊離塩基形態の弱アニオン交換樹脂による処理並びに樹脂溶出液（ＲＥ）の回収、及び
－ このＲＥの活性炭処理
を含む。
－ 反応環境又は遠心分離された反応環境の限外ろ過（ＵＦ）及び限外ろ過透過液（ＵＦＰ）の回収、
－ このＵＦＰのナノろ過（ＮＦ）及びナノろ過保持液（ＮＦＲ）の回収、
－ このＮＦＲの、Ｈ＋形態の強カチオン交換樹脂及び遊離塩基形態の弱アニオン交換樹脂による処理並びに樹脂溶出液（ＲＥ）の回収、及び
－ このＲＥの活性炭処理
を含む。
【0056】
より好ましくは、本方法は、
－ 反応環境又は遠心分離された反応環境の限外ろ過（ＵＦ）及び限外ろ過透過液（ＵＦＰ）の回収、
－ このＵＦＰのナノろ過（ＮＦ）及びナノろ過保持液（ＮＦＲ）の回収、
－ このＮＦＲの、Ｈ＋形態の強カチオン交換樹脂及び遊離塩基形態の弱アニオン交換樹脂による処理並びに樹脂溶出液（ＲＥ）の回収、及び
このＲＥの活性炭処理
を含み、且つこの方法は、電気透析を含まない。
－ 反応環境又は遠心分離された反応環境の限外ろ過（ＵＦ）及び限外ろ過透過液（ＵＦＰ）の回収、
－ このＵＦＰのナノろ過（ＮＦ）及びナノろ過保持液（ＮＦＲ）の回収、
－ このＮＦＲの、Ｈ＋形態の強カチオン交換樹脂及び遊離塩基形態の弱アニオン交換樹脂による処理並びに樹脂溶出液（ＲＥ）の回収、及び
このＲＥの活性炭処理
を含み、且つこの方法は、電気透析を含まない。
【0057】
さらに別の実施形態では、本方法は、
－ 反応環境又は遠心分離された反応環境の限外ろ過（ＵＦ）及び限外ろ過透過液（ＵＦＰ）の回収、
－ このＵＦＰのナノろ過（ＮＦ）及びナノろ過保持液（ＮＦＲ）の回収、
－ このＮＦＲのクロマトグラフィー及びクロマトグラフィー溶出液（ＣＥ）の回収、及び
－ このＣＥの活性炭処理
を含む。
－ 反応環境又は遠心分離された反応環境の限外ろ過（ＵＦ）及び限外ろ過透過液（ＵＦＰ）の回収、
－ このＵＦＰのナノろ過（ＮＦ）及びナノろ過保持液（ＮＦＲ）の回収、
－ このＮＦＲのクロマトグラフィー及びクロマトグラフィー溶出液（ＣＥ）の回収、及び
－ このＣＥの活性炭処理
を含む。
【0058】
さらに別の実施形態では、本方法は、
－ 反応環境又は遠心分離された反応環境の限外ろ過（ＵＦ）及び限外ろ過透過液（ＵＦＰ）の回収、
－ このＵＦＰのナノろ過（ＮＦ）及びナノろ過保持液（ＮＦＲ）の回収、
－ このＮＦＲの活性炭処理及び炭溶出液（ＣＣＥ）の回収、及び
－ このＣＣＥのクロマトグラフィー
を含む。
－ 反応環境又は遠心分離された反応環境の限外ろ過（ＵＦ）及び限外ろ過透過液（ＵＦＰ）の回収、
－ このＵＦＰのナノろ過（ＮＦ）及びナノろ過保持液（ＮＦＲ）の回収、
－ このＮＦＲの活性炭処理及び炭溶出液（ＣＣＥ）の回収、及び
－ このＣＣＥのクロマトグラフィー
を含む。
【0059】
さらに別の実施形態では、本方法は、
－ 反応環境又は遠心分離された反応環境の限外ろ過（ＵＦ）及び限外ろ過透過液（ＵＦＰ）の回収、
－ このＵＦＰのナノろ過（ＮＦ）及びナノろ過保持液（ＮＦＲ）の回収、
－ このＮＦＲのクロマトグラフィー及びクロマトグラフィー溶出液（ＣＥ）の回収、
－ このＣＥの活性炭処理及び炭溶出液（ＣＣＥ）の回収、及び
－ このＣＣＥのイオン交換樹脂による処理
を含む。
－ 反応環境又は遠心分離された反応環境の限外ろ過（ＵＦ）及び限外ろ過透過液（ＵＦＰ）の回収、
－ このＵＦＰのナノろ過（ＮＦ）及びナノろ過保持液（ＮＦＲ）の回収、
－ このＮＦＲのクロマトグラフィー及びクロマトグラフィー溶出液（ＣＥ）の回収、
－ このＣＥの活性炭処理及び炭溶出液（ＣＣＥ）の回収、及び
－ このＣＣＥのイオン交換樹脂による処理
を含む。
【0060】
さらに別の実施形態では、本方法は、
－ 反応環境又は遠心分離された反応環境の限外ろ過（ＵＦ）及び限外ろ過透過液（ＵＦＰ）の回収、
－ このＵＦＰのナノろ過（ＮＦ）及びこのナノろ過保持液（ＮＦＲ）の回収、
－ このＮＦＲのクロマトグラフィー及びクロマトグラフィー溶出液（ＣＥ）の回収、
－ このＣＥのイオン交換樹脂による処理及び樹脂溶出液（ＲＥ）の回収、及び
－ このＲＥの活性炭処理
を含む。
－ 反応環境又は遠心分離された反応環境の限外ろ過（ＵＦ）及び限外ろ過透過液（ＵＦＰ）の回収、
－ このＵＦＰのナノろ過（ＮＦ）及びこのナノろ過保持液（ＮＦＲ）の回収、
－ このＮＦＲのクロマトグラフィー及びクロマトグラフィー溶出液（ＣＥ）の回収、
－ このＣＥのイオン交換樹脂による処理及び樹脂溶出液（ＲＥ）の回収、及び
－ このＲＥの活性炭処理
を含む。
【0061】
さらに別の実施形態では、本方法は、
－ 反応環境又は遠心分離された反応環境の限外ろ過（ＵＦ）及び限外ろ過透過液（ＵＦＰ）の回収、
－ このＵＦＰのナノろ過（ＮＦ）及びナノろ過保持液（ＮＦＲ）の回収、
－ このＮＦＲのイオン交換樹脂による処理及び樹脂溶出液（ＲＥ）の回収、
－ このＲＥのクロマトグラフィー及びクロマトグラフィー溶出液（ＣＥ）の回収、及び
－ このＣＥの活性炭処理
を含む。
－ 反応環境又は遠心分離された反応環境の限外ろ過（ＵＦ）及び限外ろ過透過液（ＵＦＰ）の回収、
－ このＵＦＰのナノろ過（ＮＦ）及びナノろ過保持液（ＮＦＲ）の回収、
－ このＮＦＲのイオン交換樹脂による処理及び樹脂溶出液（ＲＥ）の回収、
－ このＲＥのクロマトグラフィー及びクロマトグラフィー溶出液（ＣＥ）の回収、及び
－ このＣＥの活性炭処理
を含む。
【0062】
さらに別の実施形態では、本方法は、
－ 反応環境又は遠心分離された反応環境の限外ろ過（ＵＦ）及び限外ろ過透過液（ＵＦＰ）の回収、
－ このＵＦＰのナノろ過（ＮＦ）及びナノろ過保持液（ＮＦＲ）の回収、
－ このＮＦＲのイオン交換樹脂による処理及び樹脂溶出液（ＲＥ）の回収、
－ このＲＥの活性炭処理及び炭溶出液（ＣＣＥ）の回収、及び
－ このＣＣＥのクロマトグラフィー
を含む。
－ 反応環境又は遠心分離された反応環境の限外ろ過（ＵＦ）及び限外ろ過透過液（ＵＦＰ）の回収、
－ このＵＦＰのナノろ過（ＮＦ）及びナノろ過保持液（ＮＦＲ）の回収、
－ このＮＦＲのイオン交換樹脂による処理及び樹脂溶出液（ＲＥ）の回収、
－ このＲＥの活性炭処理及び炭溶出液（ＣＣＥ）の回収、及び
－ このＣＣＥのクロマトグラフィー
を含む。
【0063】
さらに別の実施形態では、本方法は、
－ 反応環境又は遠心分離された反応環境の限外ろ過（ＵＦ）及び限外ろ過透過液（ＵＦＰ）の回収、
－ このＵＦＰのナノろ過（ＮＦ）及びナノろ過保持液（ＮＦＲ）の回収、
－ このＮＦＲの活性炭処理及び炭溶出液（ＣＣＥ）の回収、
－ このＣＣＥのイオン交換樹脂による処理及び樹脂溶出液（ＲＥ）の回収、及び
－ このＲＥのクロマトグラフィー
を含む。
－ 反応環境又は遠心分離された反応環境の限外ろ過（ＵＦ）及び限外ろ過透過液（ＵＦＰ）の回収、
－ このＵＦＰのナノろ過（ＮＦ）及びナノろ過保持液（ＮＦＲ）の回収、
－ このＮＦＲの活性炭処理及び炭溶出液（ＣＣＥ）の回収、
－ このＣＣＥのイオン交換樹脂による処理及び樹脂溶出液（ＲＥ）の回収、及び
－ このＲＥのクロマトグラフィー
を含む。
【0064】
さらに別の実施形態では、本方法は、
－ 反応環境又は遠心分離された反応環境の限外ろ過（ＵＦ）及び限外ろ過透過液（ＵＦＰ）の回収、
－ ＵＦＰのナノろ過（ＮＦ）及びナノろ過保持液（ＮＦＲ）の回収、
－ このＮＦＲの活性炭処理及び炭溶出液（ＣＣＥ）の回収、
－ このＣＣＥのクロマトグラフィー及びクロマトグラフィー溶出液（ＣＥ）の回収、及び
－ このＣＥのイオン交換樹脂による処理
を含む。
－ 反応環境又は遠心分離された反応環境の限外ろ過（ＵＦ）及び限外ろ過透過液（ＵＦＰ）の回収、
－ ＵＦＰのナノろ過（ＮＦ）及びナノろ過保持液（ＮＦＲ）の回収、
－ このＮＦＲの活性炭処理及び炭溶出液（ＣＣＥ）の回収、
－ このＣＣＥのクロマトグラフィー及びクロマトグラフィー溶出液（ＣＥ）の回収、及び
－ このＣＥのイオン交換樹脂による処理
を含む。
【0065】
本発明の方法は、目的の中性ＨＭＯが高度に富化されている溶液を提供し、この溶液からＨＭＯを高収率で得ることができ、好ましくは満足のいく純度、例えば食品用途の厳しい規制要件を満たす純度で得ることができる。
【0066】
［２．１．中性ＨＭＯの生成］
［２．１．１遺伝子改変微生物による中性ＨＭＯの生成］
遺伝子改変細胞を培養することによる中性ＨＭＯの生成は、好ましくは、下記の通りに実施する。
［２．１．１遺伝子改変微生物による中性ＨＭＯの生成］
遺伝子改変細胞を培養することによる中性ＨＭＯの生成は、好ましくは、下記の通りに実施する。
【0067】
外部から添加されたアクセプターは、遺伝子改変細胞により培養培地から内在化し、このアクセプターは、１つ又は複数の酵素的グリコシル化工程を含む反応において目的の中性ＨＭＯに変換される。一実施形態では、この内在化は、外来性アクセプターが細胞の細胞膜にわたって受動的に拡散する受動的輸送機構により起こり得る。この流れは、内在化するアクセプター分子に関する細胞外空間及び細胞内空間での濃度差により導かれ、アクセプターは、濃度がより高い場所から、濃度がより低いゾーンに移動して平衡となる傾向があると考えられる。別の実施形態では、外来性アクセプターは、この外来性アクセプターが細胞の輸送タンパク質又はパーミアーゼの影響下で細胞の細胞膜にわたって拡散する能動的輸送機構により細胞中に内在化し得る。ラクトースパーミアーゼ（ＬａｃＹ）は、単糖又は二糖、例えばガラクトース、Ｎ－アセチル－グルコサミン、ガラクトース化単糖（例えば、ラクトース）及びＮ－アセチル－グルコサミン化単糖に対する特異性を有する。これらの炭水化物誘導体の全ては、能動的輸送により、ＬａｃＹパーミアーゼを発現する細胞（そのような細胞は、本明細書ではＬａｃＹ＋表現型細胞とも称される）に容易に取り込まれて、この細胞中に蓄積された後にグリコシル化され得る（例えば、国際公開第０１／０４３４１号パンフレット、Ｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．２５５８（２００５）、Ｄｒｏｕｉｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４５，１７７８（２００６）、国際公開第２０１２／１１２７７７号パンフレット、同第２０１５／０３６１３８号パンフレットを参照されたい）。好ましくは、ラクトースパーミアーゼをコードするｌａｃＹ遺伝子を発現する細胞は、目的の中性ＨＭＯへの生合成経路中に内在化したアクセプター及び／又は対応する中間体を分解し得る酵素を欠いている。好ましくは、この細胞は、内在性ｌａｃＺ遺伝子の不活性化又は欠失に起因してβ１，４－ガラクトシダーゼ活性を欠いている（そのような細胞は、本明細書ではＬａｃＺ－．表現型細胞とも称される）か、又は少なくともβ１，４－ガラクトシダーゼの活性が低下している（例えば、国際公開第２０１２／１１２７７７号パンフレットに係る、ガラクトシダーゼ活性が低い大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を参照されたい）。
【0068】
好ましい一実施形態では、外部から添加されるアクセプターは、ラクトースであり、このラクトースの内在化は、細胞のラクトースパーミアーゼ、より好ましくはＬａｃＹにより媒介される能動的輸送機構により起こる。他の実施形態では、外来性アクセプターは、グルコース、例えば国際公開第２０１５／１５０３２８号パンフレットで開示されているグルコースである。
【0069】
細胞中に内在化すると、アクセプターは、既知の技術、例えばこの細胞の染色体に組み込むことによるか又は発現ベクターを使用することにより、この細胞中に導入されている対応する異種遺伝子又は核酸配列により発現される１種又は複数のグリコシルトランスフェラーゼによりグリコシル化される。目的の中性ＨＭＯを作るのに必要なグリコシルトランスフェラーゼは、β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、β－１，６－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ、β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ及びα－１，４フコシルトランスフェラーゼから選択される。遺伝子改変細胞は、通常、対応するグリコシルトランスフェラーゼにより転移されるのに適した１種又は複数の単糖ヌクレオチドドナーを生成するための生合成経路を含む。ほとんどの微生物は、天然の中心炭素代謝によりＵＤＰ－Ｇａｌ又はＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃを生成し得る。ＧＤＰ－Ｆｕｃに関して、遺伝子改変細胞は、２つの方法によりＵＤＰ－Ｇａｌ又はＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃを生成し得る。ＧＤＰ－Ｆｕｃは、グリセロール、フルクトース又はグルコースのような単純炭素源から始まる段階的な反応系列において、ＧＤＰ－Ｆｕｃのデノボ生合成経路に関与する酵素（ＭａｎＢ、ＭａｎＣ、Ｇｍｄ及びＷｃａＧ）の作用下で細胞により作られ得る。代わりに、遺伝子改変細胞は、キナーゼによりリン酸化され、続いてピロホスホリラーゼによりＧＤＰ－Ｆｕｃに変換される再利用フコースを利用し得る（例えば、国際公開第２０１０／０７０１０４号パンフレットを参照されたい）。
【0070】
中性ＨＭＯは、例えば、下記に従って遺伝子改変微生物により生成され得る：Ｄｕｍｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．１８，４６５（２００１）、Ｐｒｉｅｍ ｅｔ ａｌ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １２，２３５（２００２）、Ｄｕｍｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０，４１２（２００４）、Ｄｒｏｕｉｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４５，１７７８（２００６）、Ｇｅｂｕｓ ｅｔ ａｌ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３６１，８３（２０１２）、Ｂａｕｍｇａｅｒｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ １５，１８９６（２０１４）及びＥｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．７５－７６，３７（２０１５）、国際公開第０１／０４３４１号パンフレット、同第２０１０／０７０１０４号パンフレット、同第２０１０／１４２３０５号パンフレット、同第２０１２／１１２７７７号パンフレット、同第２０１４／１５３２５３号パンフレット、同第２０１５／０３２４１２号パンフレット、同第２０１５／０３６１３８号パンフレット、同第２０１５／１５０３２８号パンフレット、同第２０１５／１９７０８２号パンフレット、同第２０１６／００８６０２号パンフレット、同第２０１６／０４０５３１号パンフレット、同第２０１７／０４２３８２号パンフレット、同第２０１７／１０１９５８号パンフレット、同第２０１７／１８８６８４号パンフレット、米国特許出願公開第２０１７／０１５２５３８号明細書、国際公開第２０１８／０７７８９２号パンフレット、同第２０１８／１９４４１１号パンフレット又は同第２０１９／００８１３３号パンフレット。
【0071】
好ましい実施形態では、遺伝子改変微生物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。
【0072】
従って、好ましい実施形態では、生成プロセスは、
ａ）ＬａｃＹ＋表現型又はＬａｃＺ－、ＬａｃＹ＋表現型の遺伝子改変大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を提供する工程であって、前記細胞は、
－ 中性ＨＭＯの合成に必要なβ－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、β－１，６－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ、β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ及びα－１，４フコシルトランスフェラーゼからなる群から選択されるグリコシルトランスフェラーゼをコードする１種又は複数の組換え遺伝子と、
－ 上記で列挙された対応するグリコシルトランスフェラーゼに関するＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ、ＵＤＰ－Ｇａｌ又はＧＤＰ－Ｆｕｃへの生合成経路をコードする１種又は複数の遺伝子と
を含む、工程と、
ｂ）外来性ラクトース及び好適な炭素源の存在下において、このＬａｃＹ＋表現型又はＬａｃＺ－、ＬａｃＹ＋表現型の遺伝子改変大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を培養し、それにより中性ＨＭＯを含む発酵ブロスを生成する工程と
を含む。
ａ）ＬａｃＹ＋表現型又はＬａｃＺ－、ＬａｃＹ＋表現型の遺伝子改変大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を提供する工程であって、前記細胞は、
－ 中性ＨＭＯの合成に必要なβ－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、β－１，６－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ、β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ及びα－１，４フコシルトランスフェラーゼからなる群から選択されるグリコシルトランスフェラーゼをコードする１種又は複数の組換え遺伝子と、
－ 上記で列挙された対応するグリコシルトランスフェラーゼに関するＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ、ＵＤＰ－Ｇａｌ又はＧＤＰ－Ｆｕｃへの生合成経路をコードする１種又は複数の遺伝子と
を含む、工程と、
ｂ）外来性ラクトース及び好適な炭素源の存在下において、このＬａｃＹ＋表現型又はＬａｃＺ－、ＬａｃＹ＋表現型の遺伝子改変大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を培養し、それにより中性ＨＭＯを含む発酵ブロスを生成する工程と
を含む。
【0073】
そのように生成された発酵ブロスは、生成細胞及び培養培地の両方で中性ＨＭＯを含む。細胞内ＨＭＯを回収し、それにより生成物の力価を上昇させるために、上記で説明されている方法は、例えば、加熱により細胞を破壊するか又は透過させる任意選択的な工程ｃ）をさらに含み得る。
【0074】
中性ＨＭＯを含む発酵ブロスは、他の炭水化物化合物を伴い得る。典型的には、別の炭水化物化合物は、中性ＨＭＯを作るための発酵プロセスにおいてアクセプターとして使用されて変換されないままのラクトースである。加えて、別の付随する炭水化物化合物は、所望の中性ＨＭＯへの生合成経路中の中間炭水化物、例えばＬＮＴ又はＬＮｎＴの生成の場合のラクト－Ｎ－トリオースＩＩ）であり得る。例えば、国際公開第２０１２／１１２７７７号パンフレット又は同第２０１５／０３６１３８号パンフレットで開示されているように、これらの量を、下記で開示される分離／精製工程に発酵ブロスを供する前に、この発酵ブロス中で実質的に低減させ得るが、そのようにすることは、必須ではない。特許請求される方法は、一実施形態では、炭水化物化合物を伴う中性ＨＭＯを非炭水化物夾雑物から分離するのに適しているが、炭水化物化合物の相対的割合は、特許請求される方法の過程で実質的に変化しない。従って、特許請求される方法の目的は、一態様では、炭水化物化合物を伴う中性ＨＭＯの、発酵ブロス又は酵素反応環境からの水性媒体中の非炭水化物夾雑物からの分離であり、付随する炭水化物化合物を含むあらゆる他の夾雑物からの中性ＨＭＯの精製ではない。中性ヒトミルクオリゴ糖は、栄養目的で使用されることが意図されており、従って、最終栄養組成物中の主要な中性ＨＭＯ以外の付随する炭水化物の存在は、有害ではないか、又はそれは、さらに有利であり得る。しかしながら、特許請求される方法の別の実施形態は、炭水化物夾雑物及び非炭水化物夾雑物から分離することにより中性ＨＭＯを精製し、それにより実質的に純粋な形態の中性ＨＭＯを得るのに適している。
【0075】
従って、中性ヒトミルクオリゴ糖がＬＮＴであり、且つ発酵により生成される一実施形態では、付随する炭水化物は、主に、ラクトース（発酵で利用されて未反応のままであるアクセプターとして）、ラクト－Ｎ－トリオースＩＩ（ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ、ＬＮＴへの生合成経路中の中間炭水化物として）及びｐ－ＬＮＨ ＩＩ（Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ、ＬＮＴと同様に生物特性を有する過剰グリコシル化ＬＮＴとして）である。中性ヒトミルクオリゴ糖がＬＮｎＴであり、且つ発酵により生成される別の実施形態では、付随する炭水化物は、主に、ラクトース（発酵で利用されて未反応のままであるアクセプターとして）、ラクト－Ｎ－トリオースＩＩ（ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ、ＬＮｎＴへの生合成経路中の中間炭水化物として）及びｐ－ＬＮｎＨ（Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ、ＬＮｎＴと同様の生物特性を有する過剰グリコシル化ＬＮｎＴとして）である。中性ヒトミルクオリゴ糖がラクト－Ｎ－トリオースＩＩ（ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）であり、且つ発酵により生成される別の実施形態では、付随する炭水化物は、主に、ラクトース（発酵で利用されて未反応のままであるアクセプターとして）である。中性ＨＭＯが２’－ＦＬ（Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）であり、且つ発酵により生成される他の実施形態では、付随する炭水化物は、主に、ラクトース（発酵で利用されて未反応のままであるアクセプターとして）及び２’－ＦＬと同様の生物特性を有する過剰フコシル化２’－ＦＬとしてのＤＦＬ（Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－４［Ｆｕｃα１－３］Ｇｌｃ）である。中性ヒトミルクオリゴ糖がＬＮＦＰ Ｉ（フコシル化ＬＮＴ、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）であり、且つ発酵により生成される他の実施形態では、付随する炭水化物は、主に、ラクトース（発酵で利用されて未反応のままであるアクセプターとして）、ラクト－Ｎ－トリオースＩＩ（ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ、ＬＮＦＰ－Ｉへの生合成経路中の中間炭水化物として）、ＬＮＴ（ＬＮＦＰ－Ｉへの生合成経路中の中間炭水化物として）、ｐ－ＬＮＨ ＩＩ（Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ、ＬＮＴと同様の生物特性を有する過剰グリコシル化ＬＮＴとして）及び２’－ＦＬである。上述した付随する炭水化物の全ては、中性ＨＭＯとも見なされる。
【0076】
さらに、発酵ブロス中には、非ＨＭＯ炭水化物夾雑物がさらに存在している可能性がある。これは、典型的には、ラクツロース及びそのグリコシル化誘導体である。ラクツロースは、ラクトースが発酵への添加前及び／又は発酵中に加熱滅菌される場合、転移によりラクトースから形成され得る。ラクツロースも細胞に内在化することから、同時に起こる生体内変換反応でラクトースと同様にグリコシル化され得る。しかしながら、ラクツロース及びそのグリコシル化誘導体の量は、バイオマス分離後のブロスの全乾燥固形物の数十重量％を超えない。
【0077】
本発明によれば、発酵ブロスを、中性ＨＭＯの、他の非炭水化物化合物と、任意選択的に、下記で説明するブロスの炭水化物化合物とからの分離／精製の手順にさらに供する。
【0078】
［２．１．２．エクスビボでの酵素反応による中性ＨＭＯの生成］
中性ＨＭＯは、生体外で起こる反応又は反応系列でのラクトースへの単糖の添加又は連続的添加により、酵素的に生成され得る。典型的には、好適な酵素は、ｐＨが適切に設定されている、出発アクセプター（通常、ラクトース）及び対応するドナーを含有する反応混合物に添加される対応するグリコシルトランスフェラーゼ又は（トランス）グリコシダーゼであり得る。中性ＨＭＯが四糖以上である場合、最初の酵素的工程での三糖生成物は、四糖を作るためのその後の酵素的工程のアクセプターとして機能し、以下同様である。多酵素合成の場合、単一の工程を別々の容器で連続的に実施し得、特定のシナリオでは、酵素カスケード反応を１つのフラスコ中で実行し得る。
中性ＨＭＯは、生体外で起こる反応又は反応系列でのラクトースへの単糖の添加又は連続的添加により、酵素的に生成され得る。典型的には、好適な酵素は、ｐＨが適切に設定されている、出発アクセプター（通常、ラクトース）及び対応するドナーを含有する反応混合物に添加される対応するグリコシルトランスフェラーゼ又は（トランス）グリコシダーゼであり得る。中性ＨＭＯが四糖以上である場合、最初の酵素的工程での三糖生成物は、四糖を作るためのその後の酵素的工程のアクセプターとして機能し、以下同様である。多酵素合成の場合、単一の工程を別々の容器で連続的に実施し得、特定のシナリオでは、酵素カスケード反応を１つのフラスコ中で実行し得る。
【0079】
グリコシルトランスフェラーゼにより媒介される酵素的合成では、ラクトースから目的の中性ＨＭＯを作るのに必要なグリコシルトランスフェラーゼは、β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、β－１，６－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ、β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ及びα－１，４フコシルトランスフェラーゼから選択され、ドナーは、使用されるグリコシルトランスフェラーゼに応じて、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ、ＵＤＰ－Ｇａｌ及びＧＤＰ－Ｆｕｃから選択される。中性ＨＭＯに対するそのようなタイプの酵素的アプローチは、例えば、国際公開第９８／４４１４５号パンフレット、Ａｌｂｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３３４，９７（２００１）又はＳｃｈｅｐｐｏｋａｔ ｅｔ ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ １４，２３８１（２００３）で開示されている。
【0080】
（トランス）グリコシダーゼにより媒介される中性ＨＭＯの酵素的合成では、好適な酵素は、α１，２－（トランス）フコシダーゼ、α１，３－（トランス）フコシダーゼ、α１，４－（トランス）フコシダーゼ、β１，３－（トランス）ラクト－Ｎ－ビオシダーゼ、β１，６－（トランス）ラクト－Ｎ－ビオシダーゼ、β１，３－（トランス）Ｎ－アセチルラクトサミニダーゼ、β１，６－（トランス）Ｎ－アセチルラクトサミニダーゼ、β１，３－（トランス）ガラクトシダーゼ、β１，４－（トランス）ガラクトシダーゼ、β１，３－（トランス）Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ及びβ１，６－（トランス）Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼからなる群から選択される。トランスグリコシダーゼは、加水分解活性が低く、及び／又はアクセプターへのドナーの転移活性がかなり高い点でグリコシダーゼと異なる。例えば、アミノ酸配列を変更させることにより、ヒドロラーゼ活性がトランスグリコシダーゼ作用に有利に消失する指向性トランスグリコシダーゼ酵素変異体を生成することが可能である。好適なドナーに関して、このドナーは、非還元末端で（トランス）グリコシダーゼにより転移される糖部分（例えば、α１，２－（トランス）フコシダーゼの場合、２’－ＦＬ；β１，４－（トランス）ガラクトシダーゼの場合にはラクトース；β１，３－（トランス）Ｎ－アセチルラクトサミニダーゼの場合にはＬＮｎＴ等）を有するか、又はアジド、フルオロ、ｐ－ニトロフェニル等のようなアノマー位置で良好な脱離基により活性化されている糖部分を有する二糖又はオリゴ糖であり得る。中性ＨＭＯを生成するためのそのような酵素反応は、例えば、国際公開第２０１２／１５６８９７号パンフレット、同第２０１２／１５６８９８号パンフレット、同第２０１６／０６３２６１号パンフレット、同第２０１６／０６３２６２号パンフレット、同第２０１６／１５７１０８号パンフレット、同第２０１６／１９９０６９号パンフレット又は同第２０１６／１９９０７１号パンフレットで広く教示されており、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。
【0081】
本発明によれば、酵素反応混合物を、中性ＨＭＯの他の非炭水化物化合物と、任意選択的に、下記で説明する炭水化物化合物とからの分離／精製の手順にさらに供する。
【0082】
［２．２ 中性ＨＭＯの、それが生成された反応環境からの取得］
［２．２．１．限外ろ過前の反応環境の任意選択的な前処理］
発酵ブロスは、典型的には、生成された中性ＨＭＯ以外に、使用された微生物の細胞のバイオマスと、タンパク質、タンパク質断片、ＤＮＡ、ＤＮＡ断片、エンドトキシン、生体アミン、無機塩、未反応の炭水化物アクセプター、例えばラクトース、糖様副生成物、単糖、着色体等とを含有する。任意選択的に、発酵ブロス又は酵素反応混合物の巨大分子をより容易にろ過可能にするために、反応環境のｐＨを約２．５～７．５に調整し、且つ／又は反応環境を３０～７５℃の加熱処理に供し、且つ／又は反応環境を綿状沈殿／凝集により清澄化する。同様に任意選択的に、反応環境（上記で開示されているように処置されているか又は処置されていない）を遠心分離し、精密ろ過し又はフィルタプレス若しくはドラムフィルタでろ過し、それによりバイオマス又は沈殿した／綿状沈殿した／変性した酵素の少なくとも一部が除去される。
［２．２．１．限外ろ過前の反応環境の任意選択的な前処理］
発酵ブロスは、典型的には、生成された中性ＨＭＯ以外に、使用された微生物の細胞のバイオマスと、タンパク質、タンパク質断片、ＤＮＡ、ＤＮＡ断片、エンドトキシン、生体アミン、無機塩、未反応の炭水化物アクセプター、例えばラクトース、糖様副生成物、単糖、着色体等とを含有する。任意選択的に、発酵ブロス又は酵素反応混合物の巨大分子をより容易にろ過可能にするために、反応環境のｐＨを約２．５～７．５に調整し、且つ／又は反応環境を３０～７５℃の加熱処理に供し、且つ／又は反応環境を綿状沈殿／凝集により清澄化する。同様に任意選択的に、反応環境（上記で開示されているように処置されているか又は処置されていない）を遠心分離し、精密ろ過し又はフィルタプレス若しくはドラムフィルタでろ過し、それによりバイオマス又は沈殿した／綿状沈殿した／変性した酵素の少なくとも一部が除去される。
【0083】
そのため、本発明に関連して使用される「前処理された反応環境」という用語は、上記の工程の少なくとも１つを含む。
【0084】
［２．２．２．反応環境又は前処理された反応環境の限外ろ過（ＵＦ）］
特許請求される方法のＵＦ工程は、
ａ）前記反応環境のｐＨを酸性、例えば約３～約６、好ましくは約５以下に設定し、且つ／又は前記反応環境を室温（若しくは周囲温度）よりも高い温度、好ましくは約３０～９０℃、より好ましくは約３５～８５℃に温めることと、
ｂ）工程ｉ）で得られた反応環境を、約５～１０００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する限外ろ過（ＵＦ）膜と接触させることであって、この膜は、好ましくは、非高分子材料で構成される、接触させることと
を含む。
特許請求される方法のＵＦ工程は、
ａ）前記反応環境のｐＨを酸性、例えば約３～約６、好ましくは約５以下に設定し、且つ／又は前記反応環境を室温（若しくは周囲温度）よりも高い温度、好ましくは約３０～９０℃、より好ましくは約３５～８５℃に温めることと、
ｂ）工程ｉ）で得られた反応環境を、約５～１０００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する限外ろ過（ＵＦ）膜と接触させることであって、この膜は、好ましくは、非高分子材料で構成される、接触させることと
を含む。
【0085】
限外ろ過工程により、ブロスの可溶性成分からバイオマス（又は前処理された反応環境のバイオマスの残存部分）及び好ましくは同様に高分子量の浮遊固形物が分離され、この可溶性成分は、透過液へと限外ろ過膜を通過する。このＵＦ透過液（ＵＦＰ）は、生成された中性ＨＭＯを含有する水溶液である。
【0086】
好ましい実施形態では、反応環境を遠心分離するか、精密ろ過するか、又はフィルタプレス若しくはドラムフィルタでろ過する場合、ＵＦ膜は、非高分子材料、より好ましくはセラミック材料で構成される。
【0087】
一実施形態では、反応環境のｐＨ又は前処理、例えば、遠心分離された反応環境のｐＨを酸性、例えば約３～約６に設定し、好ましくは約５以下、好ましくは約４以下、より好ましくは約３～４の値に設定する。上記で開示されているようにｐＨを設定することは、特に有利であり、なぜなら、より効果的な変性及び沈殿に起因して、可溶性タンパク質及びＤＮＡ等の溶解した生体分子の量が大幅に減少するからである。溶解した生体分子の量がより少ないと、後続する工程において、ＭＷＣＯがより高いＵＶ膜を使用することが可能になり、そのため、より高い生産性への要因であるより良好なフラックスが得られる。
【0088】
他の実施形態では、反応環境又は前処理、例えば遠心分離された反応環境を周囲温度、即ち室温又は反応環境温度よりも高い温度、例えば約３０～約９０℃、好ましくは約３５～８５℃、例えば約３５～７５℃、より好ましくは約５０～７５℃、例えば約６０～６５℃の範囲内の温度まで加熱する。ＵＦ前のこの加熱処理により、反応環境中の生存微生物の総数（総微生物数）が大幅に減少し、そのため、本方法の後段での滅菌ろ過工程が不要となる場合がある。さらに、この加熱処理により、より効果的な変性及び沈殿に起因して可溶性タンパク質の量が減少し、これによりイオン交換処理工程（後の任意選択的な工程）での残存タンパク質の除去効果が増加する。
【0089】
一実施形態では、上記の工程ａ）は、前記任意選択的に前処理された反応環境のｐＨを設定することと、前記任意選択的に前処理された反応環境を温めることとを含み、好ましくは、このｐＨの設定を行い、続いてこの加温を行う。好ましくは、上記の工程ａ）は、前記任意選択的に前処理された反応環境のｐＨを５以下に設定することと、前記任意選択的に前処理された反応環境を約３０～９０℃、好ましくは約３５～８５℃、例えば約３５～７５℃、より好ましくは約５０～７５℃、例えば約６０～６５℃に温めることとを含み、これによりタンパク質の溶解性が特に低下し、それにより後続のＵＦ工程でのＵＦ透過液へのタンパク質の漏出が減少する。
【0090】
本方法での工程ｂ）では、非高分子材料で構成されるＵＦ膜、好ましくはセラミック膜を使用する。この非高分子ＵＦ膜は、ＵＦを高温で実行する場合、この温度に対して耐性を示す。また、非高分子膜、有利にはセラミック膜の適用可能なフラックスは、通常、ＭＷＣＯが同一であるか又は類似する高分子ＵＦ膜の場合と比べて高く、加えて、非高分子膜、有利にはセラミック膜は、ファウリング又は詰まりを起こし難い。工業用途では、ＵＦ膜の再生は、コスト及び技術的に重要な要素である。非高分子膜、有利にはセラミック膜は、懸濁固形分が高い発酵流を限外ろ過する場合に必要であり得る厳しい定置洗浄（ＣＩＰ）条件、例えば高温での苛性／強酸処理（高分子膜には適用不能）を使用することを可能にする。さらに、非高分子膜、有利にはセラミック膜は、高いクロスフローで循環する固体粒子に対する不活性及び耐摩耗性に起因して寿命がより長い。
【0091】
分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）範囲が約５～約１０００ｋＤａ、例えば、約１０～１０００、５～２５０、５～５００、５～７５０、５０～２５０、５０～５００、１００～２５０、１００～５００、１００～７５０、２５０～５００、２５０～７５０、５００～７５０ｋＤａ又は任意の他の好適な部分範囲である任意の従来の非高分子限外ろ過膜、有利にはセラミック膜を使用し得る。
【0092】
本方法の工程ｂ）は、低温（約５℃～ｒｔ）、約室温又は高温で行われ得、好ましくは高温で行われ得る。この高温は、好ましくは、約６５℃を超えず、好適な温度範囲は、例えば、約３５～５０、３５～６５、４５～６５、５０～６５、５５～６５又は６０～６５℃であり得る。ＵＦ工程を高温で行うことにより、反応環境中の生存微生物の総数（総微生物数）が大幅に減少し、そのため、本方法の後段での滅菌ろ過工程が不要となる場合がある。さらに、より効果的な変性及び沈殿に起因して可溶性タンパク質の量が減少し、これによりイオン交換処理工程（後の任意選択的な工程）での残存タンパク質の除去効果が増加する。
【0093】
好ましくは、工程ｂ）を高温で実行する場合、先行する工程ａ）において反応環境のｐＨを約５以下に設定することが有利であり、なぜなら、タンパク質の溶解性が特に低下し、それによりＵＦ透過液へのタンパク質の漏出が減少するからである。
【0094】
限外ろ過工程をデッドエンドモード又はクロスフローモードで適用し得る。
【0095】
一実施形態では、本発明の方法において単一のＵＦ工程のみを行う。
【0096】
他の実施形態では、本発明の方法は、ＭＷＣＯが異なる膜を使用する（例えば、２つの限外ろ過分離であって、第１の膜のＭＷＣＯは、第２の膜のＭＷＣＯと比べて高い、２つの限外ろ過分離を使用する）複数の限外ろ過工程を含み得、但し、少なくとも１つのＵＦ膜は、非高分子膜、好ましくはセラミック膜である。この配置により、ブロスの分子量がより高い成分の分離効果が良好になり得る。
【0097】
さらに一実施形態では、限外ろ過を透析ろ過と組み合わせ得る。
【0098】
上記で開示されている工程ａ）及びｂ）を含む限外ろ過を行った後、ＵＦ透過液は、利用された膜のＭＷＣＯ、任意選択的に一連の膜が使用される場合には最後の膜のＭＷＣＯと比べて分子量が低い物質、例えば目的の中性ＨＭＯを含有する。
【0099】
［２．２．３．ナノろ過］
本発明の方法は、ナノろ過（ＮＦ）工程を含む。好ましくは、このＮＦ工程は、反応環境又は遠心分離された反応環境の限外ろ過の直後であり、即ち、このＮＦ工程の供給物は、目的の中性ＨＭＯを含有するＵＦ透過液である。任意選択的に、このＵＦ透過液を、このＮＦ工程を行う前に、活性炭（下記を参照されたい）を使用することにより脱色し得る。このナノろ過工程を有利に使用して、ＵＦ透過液を濃縮し得、且つ／又は中性ＨＭＯと比べて分子量が小さいイオン、主に一価イオン及び有機物、例えば、単糖を除去し得る。ナノろ過膜は、先行する工程で使用された限外ろ過膜と比べてＭＷＣＯが低く、目的の中性ＨＭＯが確実に保持される。
本発明の方法は、ナノろ過（ＮＦ）工程を含む。好ましくは、このＮＦ工程は、反応環境又は遠心分離された反応環境の限外ろ過の直後であり、即ち、このＮＦ工程の供給物は、目的の中性ＨＭＯを含有するＵＦ透過液である。任意選択的に、このＵＦ透過液を、このＮＦ工程を行う前に、活性炭（下記を参照されたい）を使用することにより脱色し得る。このナノろ過工程を有利に使用して、ＵＦ透過液を濃縮し得、且つ／又は中性ＨＭＯと比べて分子量が小さいイオン、主に一価イオン及び有機物、例えば、単糖を除去し得る。ナノろ過膜は、先行する工程で使用された限外ろ過膜と比べてＭＷＣＯが低く、目的の中性ＨＭＯが確実に保持される。
【0100】
ナノろ過の第１の態様では、ＮＦ膜のＭＷＣＯは、目的の中性ＨＭＯの分子量の約２５～５０％、典型的には約１５０～５００Ｄａである。これに関して、目的の中性ＨＭＯは、ＮＦ保持液（ＮＦＲ）中に蓄積される。ナノろ過を、水による透析ろ過と組み合わせて、一価イオン等の透過性塩をより効果的に除去し得るか、又はこの塩の量をより効果的に減少させ得る。
【0101】
第１の態様の一実施形態では、ＵＦ透過液が透析ろ過されることなくナノろ過されるようにＮＦがＵＦに後続し、中性ＨＭＯを含有するＮＦ保持液を回収して、本方法のさらなる分離工程に供する。
【0102】
第１の態様の他の実施形態では、ＵＦ透過液がナノろ過された後に透析ろ過されるようにＮＦがＵＦに後続し、中性ＨＭＯを含有するＮＦ保持液を回収して、本方法のさらなる分離工程に供する。
【0103】
ナノろ過の第１の態様は、ラクトースを含有しないか又はごくわずかな量（多くとも目的の中性ＨＭＯの重量の約１～２％）のラクトースを含有するＵＦ透過液に有利に適用される。
【0104】
より多くのラクトースを含有するＵＦ透過液に有利に適用されるナノろ過の第２の態様では、膜は、ＭＷＣＯが、三又はより高次の中性ＨＭＯを確実に保持し、且つラクトースの少なくとも一部がこの膜を通過することを可能にする６００～３５００Ｄａであり、この膜の活性（上）層は、ポリアミドで構成され、前記膜でのＭｇＳＯ４阻止率は、約２０～９０％、好ましくは５０～９０％である。
【0105】
「三又はより高次の中性ＨＭＯを確実に保持する」という用語は、好ましくは、ナノろ過工程中、膜を三又はより高次の中性ＨＭＯが通過しないか又は少なくとも有意に通過せず、そのため、この大部分が保持液中に存在することを意味する。「ラクトースの少なくとも一部が膜を通過することを可能にする」という用語は、好ましくは、ラクトース（少なくとも一部）が膜を透過して透過液中に回収され得ることを意味する。ラクトースの阻止が高い（約９０％）場合、ラクトースの全て又は少なくとも大部分を透過液中に移動させるために、純水による後続の透析ろ過が必要な場合がある。ラクトースの阻止が高いほど、効率的な分離のために、より多くの透析ろ過水が必要である。
【0106】
ＮＦの第２の態様に従って適用されるナノろ過膜は、三及びより高次の中性ＨＭＯを効率的に保持するために、この中性ＨＭＯに対して厳格であるであろう。好ましくは、三又はより高次の中性ＨＭＯの阻止は、９５％超、より好ましくは９７％、さらにより好ましくは９９％である。ＭＷＣＯが３５００Ｄａ超である膜は、三又はより高次の中性ＨＭＯのより多くの又は有意な量が膜を通過することを可能にすると予想され、そのため、三又はより高次の中性ＨＭＯの保持の減少が示され、従って本発明の目的に不適であり、除外され得る。ラクトースの阻止が８０～９０％以下であることが好ましい。ラクトースの阻止が９０±１～２％となる場合、実質的に満足する分離を達成するために、三糖又は四糖の中性ＨＭＯの阻止は、好ましくは、約９９％以上であるであろう。
【0107】
オリゴ糖の阻止率及び分離係数は、国際公開第２０１９／００３１３３号パンフレットで開示されているように測定して算出される。
【0108】
上記の要件は、膜がＭｇＳＯ４に対して比較的緩い、即ち、この阻止が約５０～９０％である場合に同時に満たされる。これに関して、上記の膜は、三及びより高次の中性ＨＭＯに対して厳格であり、且つ単糖及びラクトース並びにＭｇＳＯ４に対して緩い。従って、ヒトミルクオリゴ糖を酵素的に、又は発酵により作る際の前駆体であるラクトースを、良好な有効性でナノろ過により中性ヒトミルクオリゴ糖生成物から分離することが可能であり、加えて、二価イオンの相当部分を透過液に通過させることも可能である。いくつかの実施形態では、ＭｇＳＯ４阻止率は、３０～９０％、２０～８０％、４０～９０％、４０～８０％、６０～９０％、７０～９０％、５０～８０％、５０～７０％、６０～７０％又は７０～８０％である。好ましくは、前記膜でのＭｇＳＯ４阻止率は、８０～９０％である。同様に好ましくは、この膜は、ＮａＣｌの阻止率がＭｇＳＯ４の場合と比べて低い。一実施形態では、ＮａＣｌの阻止率は、約５０％以下である。他の実施形態では、ＮａＣｌの阻止率は、約４０％以下である。他の実施形態では、ＮａＣｌの阻止率は、約３０％以下である。他の実施形態では、ＮａＣｌの阻止率は、約２０％以下である。約２０～３０％のＮａＣｌ阻止において、保持液中の全ての一価塩の相当な減少も達成可能である。
【0109】
膜でのＮａＣｌ及びＭｇＳＯ４の阻止の決定は、国際公開第２０１９／００３１３３号パンフレットで開示されている。
【0110】
同様に好ましくは、いくつかの実施形態では、膜の純水フラックスは、少なくとも５０ｌ／ｍ２ｈ（２３～２５℃、１０ｂａｒ及び３００ｌ／ｈの一定クロスフローで測定した場合）である。好ましくは、膜の純水フラックスは、少なくとも６０ｌ／ｍ２ｈ、少なくとも７０ｌ／ｍ２ｈ、少なくとも８０ｌ／ｍ２ｈ又は少なくとも９０ｌ／ｍ２ｈである。
【0111】
ＮＦ工程の第２の態様で好適なナノろ過膜の活性層又は上層は、好ましくは、ポリアミドで作られる。タイプが異なる膜、例えばラクトース及び３’－ＳＬを分離するための活性層としてスルホン化ＰＥＳを有するＮＴＲ－７４５０は、有望な分離効果を有するように見えるが（Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｒｅｓ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１６６，９（２０１４）；Ｎｏｒｄｖａｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｓｅｐａｒ．Ｐｕｒｉｆ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１３８，７７（２０１４））、本発明で使用される上記の膜は、中性ＨＭＯからのラクトースの良好な分離を常に示す。加えて、上述したＮＴＲ－７４５０膜は、ファウリングが発生しやすく、このファウリングにより、典型的にはフラックスが低下してラクトース阻止が増加し、従って分離係数が低下する。さらに好ましくは、ポリアミド膜は、アミンとしてフェニレンジアミン構成要素又はピペラジン構成要素を有するポリアミド、より好ましくはピペラジンを有するポリアミド（ピペラジン系ポリアミドとも称される）である。
【0112】
さらに好ましくは、本発明の目的に好適な膜は、薄膜複合（ＴＦＣ）膜である。
【0113】
好適なピペラジン系ポリアミドＴＦＣ膜の一例は、ＴｒｉＳｅｐ（登録商標）ＵＡ６０である。
【0114】
ＮＦ工程の第２の工程で好適なナノろ過膜は、上記の特徴のいくつか又は全てを特徴とし、そのため、下記の利点の１つ又は複数が提供される：三又はより高次の中性ＨＭＯからラクトースを選択的に及び効率的に除去し、富化された三又はより高次の中性ＨＭＯ画分が得られること；一価及び二価の塩を効率的に除去し、それによりイオン交換工程が不要であり得るか、又は脱塩が依然として必要である場合、イオン交換処理に必要な樹脂が大幅に少ないこと；先行技術において同一又は類似の目的のために使用される他の膜と比較して、ナノろ過中の高いフラックスが維持され得、そのため、操作時間が短縮されること；上記で開示されている膜は、先行技術の解決策と比較して詰まりを起こし難いこと；上記で開示されている膜は、完全に洗浄されて再生され得、従って性能が実質的に低下することなく再利用され得ること。
【0115】
ＮＦ工程の第２の態様の一実施形態では、この工程は、
－ ＵＦ透過液を、三又はより高次の中性ＨＭＯを確実に保持し、且つラクトースの少なく一部が膜を通過することを可能にする６００～３５００Ｄａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有するナノろ過膜と接触させることであって、この膜の活性（上）層は、ポリアミドで構成され、前記膜でのＭｇＳＯ４阻止率は、約５０～９０％である、接触させることと、
－ その後の任意選択的な前記膜による透析ろ過と、
－ 三又はより高次の中性ＨＭＯが富化された保持液を回収することと
を含む。
－ ＵＦ透過液を、三又はより高次の中性ＨＭＯを確実に保持し、且つラクトースの少なく一部が膜を通過することを可能にする６００～３５００Ｄａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有するナノろ過膜と接触させることであって、この膜の活性（上）層は、ポリアミドで構成され、前記膜でのＭｇＳＯ４阻止率は、約５０～９０％である、接触させることと、
－ その後の任意選択的な前記膜による透析ろ過と、
－ 三又はより高次の中性ＨＭＯが富化された保持液を回収することと
を含む。
【0116】
他の実施形態では、ＮＦ工程は、
－ ＵＦ透過液を、三又はより高次の中性ＨＭＯを確実に保持し、且つラクトースの少なく一部が膜を通過することを可能にする６００～３５００Ｄａ、好ましくは１０００～３５００Ｄａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有するピペラジン系ポリアミドナノろ過膜と接触させることであって、前記膜でのＭｇＳＯ４阻止率は、約８０～９０％であり、
－ 前記膜でのＮａＣｌ阻止率は、ＭｇＳＯ４，の場合と比べて低く、及び／又は
－ 前記膜の純水フラックス値は、少なくとも約５０ｌ／ｍ２ｈである、
接触させることと、
－ その後の任意選択的な前記膜による透析ろ過と、
－ 三又はより高次の中性ＨＭＯが富化された保持液を回収することと
を含む。
－ ＵＦ透過液を、三又はより高次の中性ＨＭＯを確実に保持し、且つラクトースの少なく一部が膜を通過することを可能にする６００～３５００Ｄａ、好ましくは１０００～３５００Ｄａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有するピペラジン系ポリアミドナノろ過膜と接触させることであって、前記膜でのＭｇＳＯ４阻止率は、約８０～９０％であり、
－ 前記膜でのＮａＣｌ阻止率は、ＭｇＳＯ４，の場合と比べて低く、及び／又は
－ 前記膜の純水フラックス値は、少なくとも約５０ｌ／ｍ２ｈである、
接触させることと、
－ その後の任意選択的な前記膜による透析ろ過と、
－ 三又はより高次の中性ＨＭＯが富化された保持液を回収することと
を含む。
【0117】
好ましくは、この膜のＮａＣｌ阻止率は、最大でＭｇＳＯ４阻止率の半分である。
【0118】
上述した利点の全てを達成するために、ＮＦ工程の第２の態様で適用されるナノろ過膜は、好ましくは、
－ ６００～３５００Ｄａ、好ましくは１０００～３５００ＤａのＭＷＣＯを有するピペラジン系ポリアミド膜であり、
－ 約５０～９０％、好ましくは８０～９０％のＭｇＳＯ４阻止を有し、
－ 約３０％以下のＮａＣｌ阻止を有し、及び
－ 約５０ｌ／ｍ２ｈ（２３～２５℃、１０ｂａｒ及び３００ｌ／ｈの一定クロスフローで測定）、好ましくは約９０ｌ／ｍ２ｈの純水フラックス値を有する。
－ ６００～３５００Ｄａ、好ましくは１０００～３５００ＤａのＭＷＣＯを有するピペラジン系ポリアミド膜であり、
－ 約５０～９０％、好ましくは８０～９０％のＭｇＳＯ４阻止を有し、
－ 約３０％以下のＮａＣｌ阻止を有し、及び
－ 約５０ｌ／ｍ２ｈ（２３～２５℃、１０ｂａｒ及び３００ｌ／ｈの一定クロスフローで測定）、好ましくは約９０ｌ／ｍ２ｈの純水フラックス値を有する。
【0119】
ＮＦ工程の第２の態様の一実施形態では、三又はより高次の中性ＨＭＯに対するラクトースの分離係数は、約１０超、好ましくは１５～２５超、より好ましくは３０～５０超、さらにより好ましくは７５～１００超である。
【0120】
ＮＦ工程の第２の態様の他の実施形態では、ＬＮＴｒｉ ＩＩに対するラクトースの分離係数は、約１０超、好ましくは約２０超、より好ましくは約３０超である。
【0121】
ＮＦ工程の第２の態様の他の実施形態では、ＬＮＴ又はＬＮｎＴに対するラクトースの分離係数は、約３０超、より好ましくは約５０超である。
【0122】
ＮＦ工程の第２の態様の他の実施形態では、ｐＬＮｎＨ又はｐＬＮＨ ＩＩに対するラクトースの分離係数は、約１５０超、より好ましくは約２５０超である。
【0123】
ＮＦ工程の第２の態様を、透過液側と比較して正圧を有する接線流又はクロスフローろ過による従来のナノろ過、その後の透析ろ過（両方の操作をバッチモード又は好ましくは連続モードで実施することが可能である）に使用される条件下で行い得る。任意選択的な透析ろ過を、上記で開示されているナノろ過工程後の保持液に純水を添加し、ナノろ過と同一か又は同様の条件下での透過液の持続的除去によるろ過プロセスを継続することにより行う。水添加の好ましい様式は、連続であり、即ち、添加の流速は、透過液の流速とほぼ一致している。ＮＦをバッチモードで実施することが可能であり、このモードでは、保持液流は、供給タンクに戻されてリサイクルされ、透析ろ過（ＤＦ）を、この供給タンクに精製水又は脱イオン水を連続的に添加することに行う。最も好ましくは、ＤＦ水を、特定の量の透過液を除去することによる少なくとも数回の前濃縮後に添加する。ＤＦの開始前に濃縮係数が高いほど、良好なＤＦ効果が達成される。ＤＦの完了後、余分な量の透過液を除去することにより、更なる濃縮を達成することが可能である。代わりに、ＮＦを連続モードで実施することが可能であり、好ましくはマルチループシステムで実施することが可能であり、このシステムでは、保持液は、各ループから次のループに移される。この場合、ＤＦ水を、各ループでの透過液の流速に一致する流速か又はより低い流速において各ループで別々に添加することが可能である。バッチモードのＤＦと同様に、ＤＦの効果を改善するために、より高い濃縮係数を達成するために例えば最初のループにおいて少ない水を添加すべきであるか、又は水を添加すべきではない。マルチループシステムでの水の分配並びに他のプロセスパラメータ、例えば膜貫通圧、温度及びクロスフローは、日常的に最適化される。
【0124】
ＮＦ工程の第２の態様に適用される供給溶液のｐＨは、好ましくは、約７以下、より好ましくは約３～７、さらにより好ましくは約４及び５又は約５及び６である。３未満のｐＨは、膜及び溶質の性質に悪影響を及ぼす場合がある。
【0125】
ＮＦ工程の第２の態様に適用される好都合な温度範囲は、約１０～約８０℃である。より高い温度は、より高いフラックスをもたらし、そのため、プロセスが加速される。膜は、より高い温度でフロースルーに対してより開放的であることが予想されるが、これにより分離係数が大きく変化することはない。本発明に係るナノろ過分離を行うための好ましい温度範囲は、約１５～４５℃、例えば２０～４５℃である。
【0126】
ナノろ過分離での好ましい印加圧力は、約２～５０ｂａｒ、例えば約１０～４０ｂａｒである。一般的に、圧力が高いほどフラックスが高い。
【0127】
特定の実施形態では、本発明の方法は、好ましくは活性炭処理（下記を参照されたい）、及び／又はイオン交換処理（下記を参照されたい）、及び／又は中性固定相でのクロマトグラフィー（下記を参照されたい）に続いて、追加の（１つ又は複数の）ＮＦ工程を含み得、このＮＦ工程では、主な目的は、目的の中性ＨＭＯを含有する水溶液を濃縮することである。
【0128】
［２．２．４．イオン交換樹脂による処理］
上記で開示されているＵＦ透過液又は上記で開示されているＮＦ保持液として得られる中性ＨＭＯの水溶液をイオン交換樹脂により任意選択的にさらに精製し得る。任意のＵＦ透過液及びＮＦ保持液を、イオン交換樹脂による処理前に、活性炭（下記を参照されたい）を使用することにより任意選択的に脱色し得る。残存する塩、色体、イオン化可能な基を含有する生体分子（例えば、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ及びエンドトキシン）、イオン化可能な官能基（例えば、生体アミン、アミノ酸等の代謝産物でのアミノ基）を含有する中性又は双性のイオン化合物、酸含有基を有する化合物（例えば、有機酸、アミノ酸）を樹脂による処理によってさらに除去し得る。特に、樹脂溶出液の低い塩含有量（脱塩）は、「イオン交換樹脂による処理」でカチオン交換樹脂及びアニオン交換樹脂が適用される場合に達成され得る。
上記で開示されているＵＦ透過液又は上記で開示されているＮＦ保持液として得られる中性ＨＭＯの水溶液をイオン交換樹脂により任意選択的にさらに精製し得る。任意のＵＦ透過液及びＮＦ保持液を、イオン交換樹脂による処理前に、活性炭（下記を参照されたい）を使用することにより任意選択的に脱色し得る。残存する塩、色体、イオン化可能な基を含有する生体分子（例えば、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ及びエンドトキシン）、イオン化可能な官能基（例えば、生体アミン、アミノ酸等の代謝産物でのアミノ基）を含有する中性又は双性のイオン化合物、酸含有基を有する化合物（例えば、有機酸、アミノ酸）を樹脂による処理によってさらに除去し得る。特に、樹脂溶出液の低い塩含有量（脱塩）は、「イオン交換樹脂による処理」でカチオン交換樹脂及びアニオン交換樹脂が適用される場合に達成され得る。
【0129】
一実施形態によれば、イオン交換樹脂は、カチオン交換樹脂、好ましくは強酸性カチオン交換樹脂であり、好ましくはプロトン化された形態である。この工程では、正に帯電した物質が樹脂に結合することから、この物質を供給溶液から除去し得る。中性ＨＭＯの溶液を、正に帯電した物質がカチオン交換樹脂上に吸着され、且つ中性ＨＭＯが通過することを可能にするであろう任意の好適な方法でカチオン交換樹脂と接触させる。結果として得られた液体は、カチオン交換樹脂との接触後、対応する酸）の形態のアニオン以外に中性ＨＭＯを含み、（１つ又は複数の前の精製工程後に依然として残っている場合に）ラクトースのような中性炭水化物を含有する。この酸を従来の方法で中和し得る。
【0130】
一実施形態によれば、イオン交換樹脂は、アニオン交換樹脂である。このアニオン交換樹脂は、好ましくは、ＯＨ－形態を有する強アニオン交換樹脂であり得る。この工程では、負に帯電した物質が樹脂に結合することから、この物質を供給溶液から除去し得る。中性ＨＭＯの水溶液を、負に帯電した物質がアニオン交換樹脂上に吸着され、且つ中性ＨＭＯが通過することを可能にするであろう任意の好適な方法でアニオン交換樹脂と接触させる。結果として得られた液体は、アニオン交換樹脂との接触後、水、カチオン（対応する塩基の形態）及び（１つ又は複数の前の精製工程後に依然として残っている場合に）ラクトースのような中性炭水化物を主に含有する。この塩基を従来の方法で中和し得る。
【0131】
必要な純度で中性ＨＭＯを得るために、上記で開示されているイオン交換樹脂処理の一方で十分な場合がある。必要に応じて、カチオン交換樹脂クロマトグラフィー及びアニオン交換樹脂クロマトグラフィーの両方を任意の順序で適用し得る。
【0132】
一実施形態では、カチオン樹脂処理及びアニオン樹脂処理の両方が適用される場合、カチオン交換樹脂は、Ｈ＋形態であり、且つアニオン交換樹脂は、遊離塩基形態の弱アニオン樹脂である。カチオン交換樹脂は、好ましくは、強交換体である。この特定の配置により、残存する培養培地からの塩及び荷電分子の除去に加えて、培養培地中に残っていたタンパク質、ＤＮＡ及び着色体／カラメル体を効率的に物理吸着し得る。
【0133】
遊離塩基形態の弱塩基性アニオン交換体（即ち、樹脂の官能基は、第一級、第二級又は第三級のアミンである）の適用は、ＯＨ－形態の強塩基性アニオン交換体の適用と比較して有利である。この強塩基性交換体は、その強塩基性に起因して、中性ＨＭＯのアノマーＯＨ－基を脱プロトン化する能力を有する。これにより、中性ＨＭＯの構造の再構成反応が始まり、そのため、副生成物が生じ、且つ／又は相当量の中性ＨＭＯが樹脂に結合する。その結果、両方の事象は、中性のＨＭＯの回収率の低下の一因となる。
【0134】
さらに、Ｈ＋形態の強カチオン交換樹脂処理直後の遊離塩基形態の弱アニオン交換樹脂の適用は、下記のさらなる利点を有する：
－ カチオン交換体から回収された酸性溶出液が効果的に中和され、従って２種のイオン交換体による処理間に余分な中和工程を必要とすることなく、中性溶出液が得られること、
－後に除去する必要があるであろうＣｌ－、ＡｃＯ－又はＨＣＯ３ －のような強アニオン交換体のアニオンが導入されないこと、
－ 本設定により、樹脂負荷の導電率が効率的にほぼ２桁低下し、導電率が低く（約２００μＳ／ｃｍ未満、好ましくは約１００μＳ／ｃｍ未満、より好ましくは約５０μＳ／ｃｍ未満）、結果として塩電解質含有量が低い溶出液が直接得られること。
－ カチオン交換体から回収された酸性溶出液が効果的に中和され、従って２種のイオン交換体による処理間に余分な中和工程を必要とすることなく、中性溶出液が得られること、
－後に除去する必要があるであろうＣｌ－、ＡｃＯ－又はＨＣＯ３ －のような強アニオン交換体のアニオンが導入されないこと、
－ 本設定により、樹脂負荷の導電率が効率的にほぼ２桁低下し、導電率が低く（約２００μＳ／ｃｍ未満、好ましくは約１００μＳ／ｃｍ未満、より好ましくは約５０μＳ／ｃｍ未満）、結果として塩電解質含有量が低い溶出液が直接得られること。
【0135】
一実施形態では、特許請求される方法の任意選択的なイオン交換樹脂処理工程は、中性ＨＭＯの水溶液（この水溶液は、上記で開示されているように活性炭により任意選択的に脱色され得るＵＦ透過液であるか、又は上記で開示されているように活性炭により任意選択的に脱色され得るＮＦ保持液である）の、Ｈ＋形態の強カチオン交換樹脂による処理、その直後の遊離塩基形態の弱アニオン交換樹脂による処理からなる。
【0136】
他の実施形態では、中性ＨＭＯを、それが生成された反応環境から得るか又は単離するための特許請求される方法は、
－ 中性ＨＭＯの水溶液（この水溶液は、上記で開示されているように活性炭により任意選択的に脱色され得るＵＦ透過液であるか、又は上記で開示されているように活性炭により任意選択的に脱色され得るＮＦ保持液である）の、Ｈ＋形態の強カチオン交換樹脂による処理、その直後の遊離塩基形態の弱アニオン交換樹脂による処理からなるイオン交換樹脂処理工程を含み、及び
－ 電気透析を含まない。
－ 中性ＨＭＯの水溶液（この水溶液は、上記で開示されているように活性炭により任意選択的に脱色され得るＵＦ透過液であるか、又は上記で開示されているように活性炭により任意選択的に脱色され得るＮＦ保持液である）の、Ｈ＋形態の強カチオン交換樹脂による処理、その直後の遊離塩基形態の弱アニオン交換樹脂による処理からなるイオン交換樹脂処理工程を含み、及び
－ 電気透析を含まない。
【0137】
他の実施形態では、中性ＨＭＯを、それが生成された反応環境から得るか又は単離するための特許請求される方法は、中性ＨＭＯの水溶液（この水溶液は、上記で開示されているように活性炭により任意選択的に脱色され得るＵＦ透過液であるか、又は上記で開示されているように活性炭により任意選択的に脱色され得るＮＦ保持液である）の、Ｈ＋形態の強カチオン交換樹脂による処理、その直後の遊離塩基形態の弱アニオン交換樹脂による処理からなる単一のイオン交換樹脂処理工程のみを含む。Ｈ＋形態の強カチオン交換樹脂、その直後の遊離塩基形態の弱アニオン交換樹脂からなる単一のイオン交換処理工程により、国際公開第２０１９／０６３７５７号パンフレットで開示されている３種のイオン交換体の樹脂設定と同程度に溶出液の導電率が低下する。加えて、樹脂供給物を活性炭で既に処理してない場合、供給溶液の少なくとも約１０倍の減色が達成可能である。
【0138】
他の実施形態では、中性ＨＭＯを、それが生成された反応環境から得るか又は単離するための特許請求される方法は、いかなるイオン交換処理工程も含まず、但し、この方法は、好ましくは、最終工程として中性ＨＭＯの結晶化を含む。有利には、中性ＨＭＯは、２’－ＦＬであり、結晶化を、例えば国際公開第２０１６／０９５９２４号パンフレットで開示されているように、酢酸水溶液を使用して行う。
【0139】
イオン交換樹脂を使用する場合、この樹脂の架橋度をイオン交換カラムの操作条件に応じて選択し得る。高度に架橋された樹脂は、耐久性及び高い機械的強度という利点を示すが、低い空隙率及び物質移動の低下という問題がある。低架橋樹脂は、より壊れやすく、且つ移動相の吸収により膨潤する傾向がある。イオン交換樹脂の粒径は、帯電した物質が依然として効率的に除去されつつ、溶出液の効率的な流れを可能にするように選択される。カラムの溶出側に負圧を印加するか又はカラムの負荷側に正圧を印加し、溶出液を回収することにより、好適な流速も得ることができる。正圧及び負圧の両方の組み合わせも使用し得る。イオン交換処理を従来の方法で実行し得、例えばバッチ式又は連続で実行し得る。
【0140】
好適な酸性カチオン交換樹脂の非限定的な例は、例えば、下記であり得る：Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ１００、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ１２０、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＦＰＣ２２、Ｄｏｗｅｘ ５０ＷＸ、Ｆｉｎｅｘ ＣＳ１６ＧＣ、Ｆｉｎｅｘ ＣＳ１３ＧＣ、Ｆｉｎｅｘ ＣＳ１２ＧＣ、Ｆｉｎｅｘ ＣＳ１１ＧＣ、Ｌｅｗａｔｉｔ Ｓ、Ｄｉａｉｏｎ ＳＫ、Ｄｉａｉｏｎ ＵＢＫ、Ａｍｂｅｒｊｅｔ １０００、Ａｍｂｅｒｊｅｔ １２００、Ｄｏｗｅｘ ８８。
【0141】
好適な塩基性アニオン交換樹脂の非限定的な例は、例えば、下記であり得る：Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＡ６７、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＡ ９６、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＡ７４３、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＦＰＡ５３、Ｄｉａｉｏｎ ＣＲＢ０３、Ｄｉａｉｏｎ ＷＡ１０、Ｄｏｗｅｘ ６６、Ｄｏｗｅｘ Ｍａｒａｔｈｏｎ、Ｌｅｗａｔｉｔ ＭＰ６４。
【0142】
Ｈ＋形態の強カチオン交換樹脂、その直後の遊離塩基形態の弱アニオン交換樹脂からなる単一のイオン交換処理工程の場合、樹脂負荷中における目的の中性ＨＭＯの量は、両方の樹脂に関して、少なくとも約０．５ｋｇ／ｌ樹脂、より好ましくは少なくとも約０．８ｋｇ／ｌ樹脂、例えば約１．０～１．５ｋｇ／ｌ樹脂であり、ここで、樹脂の量は、水中で完全に膨潤している湿潤樹脂の量に対応する。
【0143】
［２．２．５ 活性炭処理］
特定の実施形態によれば、本発明の方法は、任意選択的な活性炭処理の工程を含む。この任意選択的な活性炭処理は、全て上記で開示されているＵＦ工程、ＮＦ工程又はイオン交換処理工程のいずれかに後続し得る。この活性炭処理は、必要に応じて着色剤を除去し、且つ／又は塩等の他の水溶性夾雑物の量を減少させるのに役立つ。さらに、この活性炭処理により、前工程後に付随して残る場合がある残存するか又は微量のタンパク質、ＤＮＡ又はエンドトキシンが除去される。
特定の実施形態によれば、本発明の方法は、任意選択的な活性炭処理の工程を含む。この任意選択的な活性炭処理は、全て上記で開示されているＵＦ工程、ＮＦ工程又はイオン交換処理工程のいずれかに後続し得る。この活性炭処理は、必要に応じて着色剤を除去し、且つ／又は塩等の他の水溶性夾雑物の量を減少させるのに役立つ。さらに、この活性炭処理により、前工程後に付随して残る場合がある残存するか又は微量のタンパク質、ＤＮＡ又はエンドトキシンが除去される。
【0144】
目的の中性ＨＭＯのような炭水化物物質は、この炭水化物物質の水溶液、例えばＵＦ工程、ＮＦ工程又はイオン交換処理工程後に得られる水溶液から炭粒子の表面に結合する傾向がある。同様に、着色剤もこの炭に吸着し得る。これらの炭水化物及び着色物質は、吸着されるが、炭に結合していないか又はより弱く結合している水溶性物質は、水により溶出され得る。溶出液を水から水性アルコール、例えばエタノールに変更することにより、吸着した中性ＨＭＯが容易に溶出されて別の画分に回収され得る。吸着した着色物質は、依然として炭に吸着したままであり、そのため、この任意選択的な工程で脱色及び部分的な脱塩の両方が同時に達成され得る。しかしながら、溶出溶媒中の有機溶媒（エタノール）の存在に起因して、脱色の効果は、溶出が純水により行われる場合と比較して低い（下記を参照されたい）。
【0145】
特定の条件下では、中性ＨＭＯは、炭粒子に吸着しないか、又は少なくとも実質的に吸着せず、水による溶出により、中性ＨＭＯの水溶液がその量を実質的に失うことなく得られ、さらに着色物質が吸着したたままである。この場合、溶出のためにエタノール等の有機溶媒を使用する必要はない。中性ＨＭＯがその水溶液から炭に結合するであろう条件を決定することは、通常の技能の問題である。例えば、一実施形態では、中性ＨＭＯの量と比較して、より希釈された中性ＨＭＯの溶液又はより多い量の炭が使用され、別の実施形態では、中性ＨＭＯの量と比較して、より濃縮された中性ＨＭＯの溶液及びより少ない量の炭が適用される。
【0146】
炭処理を、撹拌下で中性ＨＭＯの水溶液に炭粉末を添加し、この炭をろ過し、撹拌下で水性エタノールに再懸濁させ、ろ過によりこの炭を分離することにより行い得る。より大規模の精製では、中性ＨＭＯの水溶液を、好ましくはセライトと任意選択的に混合され得る炭が充填されているカラムに負荷し、次いでこのカラムを必要な溶出液で洗浄する。中性ＨＭＯを含有する画分を回収する。溶出に使用した場合に残存するアルコールを例えば蒸発によりこれらの画分から除去して、中性ＨＭＯの水溶液を得ることができる。
【0147】
好ましくは、使用される活性炭は、粒状である。これにより、高圧を印加することなく好都合な流速が確保される。
【0148】
同様に好ましくは、ＵＦ工程、ＮＦ工程又はイオン交換処理工程からの目的の中性ＨＭＯを含有する水溶液の活性炭処理、より好ましくは活性炭クロマトグラフィーを高温で行う。高温では、色体、残存タンパク質等の炭粒子への結合は、より短い接触時間で起こり、従って流速が好都合に上昇され得る。さらに、高温で行われる活性炭処理により、中性ＨＭＯの水溶液中の生存微生物の総数（総微生物数）が実質的に減少し、そのため、本方法の後の工程での滅菌ろ過工程が不要になる場合がある。この高温は、少なくとも３０～３５℃、例えば少なくとも４０℃、少なくとも５０℃、約４０～５０℃又は約６０℃である。
【0149】
同様に好ましくは、適用される炭の量は、負荷に含有される中性ＨＭＯの約１０重量％以下、より好ましくは約２～６重量％である。これは、経済的であり、なぜなら、上記で開示されている全ての利点は、非常に少ない量の炭で好都合に達成され得るからである。
【0150】
活性炭処理、好ましくはクロマトグラフィーを水溶液中の目的の中性ＨＭＯの量に対して約１０重量％以下、好ましくは約２～６重量％の活性炭で高温において行うことが特に好ましい。
【0151】
［２．２．６ 中性固相でのクロマトグラフィー精製］
この任意選択的な工程では、全て上記で詳細に開示されているＵＦ工程、ＮＦ工程、イオン交換処理工程又は活性炭処理からの中性ＨＭＯの水溶液を中性固相でのクロマトグラフィーによりさらに精製し得る。
この任意選択的な工程では、全て上記で詳細に開示されているＵＦ工程、ＮＦ工程、イオン交換処理工程又は活性炭処理からの中性ＨＭＯの水溶液を中性固相でのクロマトグラフィーによりさらに精製し得る。
【0152】
ＵＦ工程、ＮＦ工程、イオン交換処理工程又は活性炭処理後に得られた水溶液は、除去すべき少量の他の可溶性疎水性不純物を含有する場合がある。この不純物を、この水性媒体を中性固相でのクロマトグラフィー、有利には逆相クロマトグラフィーに供することにより除去し得る。これにより、疎水性部分を含有する夾雑物は、疎水性相互作用に起因して、固定相のゲルマトリックス（樹脂）の疎水性リガンド、例えばアルキル側鎖又はアリール側鎖に吸着して、その結果として保持されるが、より親水性の中性ＨＭＯは、逆相クロマトグラフィー媒体上に結合せず、従って移動相として使用される水性媒体により溶出される。
【0153】
逆相クロマトグラフィーを従来の方法で実行し得る。好ましくは、逆相シリカ及び有機ポリマー、特にスチレン又はジビニルベンゼンとメタクリル酸ポリマーとのコポリマーからなる群から選択される疎水性クロマトグラフィー媒体が使用される。このシリカは、好ましくは、Ｃ１～Ｃ１８（Ｃ１、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ８及びＣ１８が最も一般的である）の長さの範囲の直鎖アルキル炭化水素又は他の疎水性リガンド（例えば、フェニル若しくはシアノ）で誘導体化される。
【0154】
逆相クロマトグラフィーでの移動相として使用される水性媒体に有機溶媒を添加して、この水性媒体の極性を変更し、それにより精製を高め得る。この目的のために、低級アルカノール、例えばメタノール、エタノール及びイソプロパノール、又はアセトニトリル、又はテトラヒドロフラン、又はアセトンのような多くの有機溶媒、好ましくは水と混和する溶媒を使用し得る。
【0155】
同様に中性ＨＭＯの精製を高めるために、逆相クロマトグラフィー前に水性媒体のｐＨを好ましくはｐＨ約３～８、例えば約４～７に調整する。これは、好ましくは、例えばギ酸アンモニウム、酢酸アンモニウム又は炭酸水素アンモニウムの添加により、従来方法で達成される。
【0156】
同様に中性ＨＭＯの精製を高めるために、逆相クロマトグラフィー前に水性媒体に好ましくは塩を溶解させる。この塩により、非糖類夾雑物の疎水性相互作用が増加して、疎水性クロマトグラフィー媒体によるこの非糖類夾雑物の除去が増加する。使用され得る塩として、下記が挙げられる：Ｎａ２ＳＯ４、Ｋ２ＳＯ４、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＮａＣｌ、ＮＨ４Ｃｌ、ＮａＢｒ、ＮａＳＣＮ及びＮａＣｌＯ４。
【0157】
逆相クロマトグラフィーを他に従来の方法において、例えばバッチ式又は連続的に実行し得る。精製を、実験室規模又は工業規模の従来のクロマトグラフィーカラム又は容器を使用することにより容易に行い得、疎水性クロマトグラフィー媒体を（例えば、ビーズとして）容易に充填し得るか又は懸濁させ得る。
【0158】
［２．２．６．１ 臭素官能化ＰＳ－ＤＶＢ疎水性固定相でのクロマトグラフィー］
典型的には、高度に疎水性の固定クロマトグラフィー媒体の適用は、高度に極性のオリゴ糖の分離に適していない（例えば、国際公開第２０１７／２２１２０８号パンフレットを参照されたい）。しかしながら、目的の中性ＨＭＯの微生物的生成又は酵素的生成中、目的の中性ＨＭＯ以外の付随のオリゴ糖が副生成物として形成される場合がある（上記の２．１を参照されたい）。これらのいくつかを、反応環境（上記の２．１を参照されたい）から又は特殊な条件下でのナノろ過（上記の２．２．２を参照されたい）により、直接除去し得るか又は少なくともその量を減少させ得る。
典型的には、高度に疎水性の固定クロマトグラフィー媒体の適用は、高度に極性のオリゴ糖の分離に適していない（例えば、国際公開第２０１７／２２１２０８号パンフレットを参照されたい）。しかしながら、目的の中性ＨＭＯの微生物的生成又は酵素的生成中、目的の中性ＨＭＯ以外の付随のオリゴ糖が副生成物として形成される場合がある（上記の２．１を参照されたい）。これらのいくつかを、反応環境（上記の２．１を参照されたい）から又は特殊な条件下でのナノろ過（上記の２．２．２を参照されたい）により、直接除去し得るか又は少なくともその量を減少させ得る。
【0159】
目的の中性ＨＭＯが、付随するオリゴ糖の夾雑が非常に少量である高純度で利用可能であることが求められる場合、ジビニルベンゼンで架橋された臭素官能化ポリスチレン（ＰＳ－ＤＶＢ）疎水性固定相でのクロマトグラフィーを含むさらなる精製工程が必要な場合がある。
【0160】
好ましくは、ＢＰＳ－ＤＶＢ樹脂の臭素化レベルは、約２５～６１ｗ／ｗ％、例えば約２５～３５ｗ／ｗ％である。
【0161】
上記のクロマトグラフィー分離プロセスは、バッチプロセスとしてもマルチカラム設定においても頑強であり、Ｒ＆Ｄ研究室からパイロットプラント、次いで工業用フルスケールまで幅広い。固相及び関連のクロマトグラフィーの実行を、例えば水性アルコールを使用して勾配が適用される方法で行うことができるが、有機溶媒を用いることなく完全に実行することもできる（純水）。このプロセスは、高温（例えば、最大で約６０℃）で十分に機能し、微生物増殖のリスクの低減及び生産性の増加という利点をもたらす。加えて、固相を、例えば水性酢酸を使用して完全に再生し得、それにより、この固相は、食品関連の処理に非常に適している。
【0162】
分離方法を従来の方法で実行し得る。目的の中性ＨＭＯを含む水溶液をこのクロマトグラフィーでの移動相として使用する。この水溶液に有機溶媒、好ましくはＣ１～Ｃ４アルコールを添加し得る。この水溶液のｐＨは、好ましくは、約３～約８、より好ましくは約４～約７である。必要に応じて、このｐＨを、酸、塩基又は緩衝剤の水溶液の添加により従来の方法で必要な値に調整し得る。分離を、実験室規模又は工業規模の従来のクロマトグラフィーカラム又は容器を使用することにより容易に行い得、ＰＳ－ＤＶＢ－Ｂｒ樹脂を（例えば、ビーズとして）充填し得るか又は懸濁させ得る。好ましくは、分離方法をカラムで実施する。
【0163】
分離の程度は、多くのパラメータ、例えば流速／溶出速度の性質、回収される画分の量、樹脂の質量又は樹脂床の量に対するオリゴ糖負荷の質量等に依存する。これらのパラメータを通常の技術により最適化し得る。「分離」という用語は、目的の中性ＨＭＯの、付随するオリゴ糖からの完全分離を意味し、即ち、この中性ＨＭＯは、他のオリゴ糖を含有しない純粋な形態で画分から回収されて単離される。また、「分離」という用語は、部分的分離も意味し、この部分的分離では、目的の中性ＨＭＯを純粋な形態で少なくとも１つの画分から得ることができるか、又は画分での付随するオリゴ糖に対する目的の中性ＨＭＯの比率が供給溶液での比率と比べて高く、それにより目的の中性ＨＭＯが富化される。
【0164】
好ましくは、ＢＰＳ－ＤＶＢ固定媒体でのクロマトグラフィーは、
－ ＢＰＳ－ＤＶＢ媒体上に、目的の中性ＨＭＯを含有する水溶液を負荷することと、
－ 任意選択的にＣ１～Ｃ４アルコールを含有する水で溶出させることと、
次いで
－ 少なくとも目的の中性ＨＭＯが富化されている画分を回収することと
を含む。
－ ＢＰＳ－ＤＶＢ媒体上に、目的の中性ＨＭＯを含有する水溶液を負荷することと、
－ 任意選択的にＣ１～Ｃ４アルコールを含有する水で溶出させることと、
次いで
－ 少なくとも目的の中性ＨＭＯが富化されている画分を回収することと
を含む。
【0165】
クロマトグラフィー後、ＢＰＳ－ＤＶＢ媒体を、水混和性有機溶媒を含有する水で溶出することにより再生して再利用し得る。
【0166】
目的の中性ＨＭＯを、上記で説明されているＢＰＳ－ＤＶＢでのクロマトグラフィーにより、付随するオリゴ糖から分離する方法では、目的の中性ＨＭＯ及び付随するオリゴ糖は、少なくとも１つの構造的特徴が互いに異なり、例えば少なくとも１つの単糖単位が異なるか、単糖単位の数が異なるか、又は少なくとも１つのグリコシド間連結の方向が異なる（α又はβ）。一実施形態では、オリゴ糖の１つは、他と比べて少なくとも２つ多い単糖単位からなり、例えば、オリゴ糖の１つは、三糖であり、且つ他は、五糖であるか、又はオリゴ糖の１つは、四糖であり、且つ他は、六糖である。他の実施形態では、目的の中性ＨＭＯの１つは、少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃ単位を含むが、付随するオリゴ糖は、含まない。他の実施形態では、オリゴ糖の１つは、他と比べて多いＧｌｃＮＡｃ単位を含む。
【0167】
好ましくは、目的の中性は、四糖、例えばＬＮｎＴであり、付随するオリゴ糖は、五糖又は六糖、例えばｐＬＮｎＨである。同様に好ましくは、中性ＨＭＯ四糖は、ＬＮＴであり、付随するオリゴ糖は、五糖又は六糖、例えばｐＬＮＨ ＩＩである。
【0168】
［２．２．７ 単離形態で目的の中性ＨＭＯを得ること］
上記の２．２．２～２．２．６のいずれかで開示されている分離／精製工程後、そのようにして得られた目的の中性ＨＭＯを噴霧乾燥、凍結乾燥又は結晶化により固体形態で得ることができる。従って、本発明の方法は、単離形態、好ましくは乾燥形態で目的の中性ＨＭＯを得るための１つ又は複数のさらなる工程を含み得、例えば、ＵＦ工程、ＮＦ工程、活性炭処理、イオン交換処理及び／若しくは中性固相でのクロマトグラフィー後に得られた中性ＨＭＯの水溶液を噴霧乾燥させる工程を含み得るか、又はＵＦ工程、ＮＦ工程、活性炭処理、イオン交換処理及び／若しくは中性固相でのクロマトグラフィー後に得られた中性ＨＭＯの水溶液を噴霧乾燥させる工程を含み得るか、又はＵＦ工程、ＮＦ工程、活性炭処理、イオン交換処理及び／若しくは中性固相でのクロマトグラフィー後に得られた中性ＨＭＯ（但し、目的の中性ＨＭＯは、結晶形態で存在する）を結晶化させる工程を含み得る。代わりに、ＵＦ工程、ＮＦ工程、活性炭処理、イオン交換処理及び／又は中性固相でのクロマトグラフィー後に得られた中性ＨＭＯを、例えば蒸留、好ましくは真空蒸留又はナノろ過により水を除去することにより、濃縮水溶液又はシロップの形態で提供することができる。
上記の２．２．２～２．２．６のいずれかで開示されている分離／精製工程後、そのようにして得られた目的の中性ＨＭＯを噴霧乾燥、凍結乾燥又は結晶化により固体形態で得ることができる。従って、本発明の方法は、単離形態、好ましくは乾燥形態で目的の中性ＨＭＯを得るための１つ又は複数のさらなる工程を含み得、例えば、ＵＦ工程、ＮＦ工程、活性炭処理、イオン交換処理及び／若しくは中性固相でのクロマトグラフィー後に得られた中性ＨＭＯの水溶液を噴霧乾燥させる工程を含み得るか、又はＵＦ工程、ＮＦ工程、活性炭処理、イオン交換処理及び／若しくは中性固相でのクロマトグラフィー後に得られた中性ＨＭＯの水溶液を噴霧乾燥させる工程を含み得るか、又はＵＦ工程、ＮＦ工程、活性炭処理、イオン交換処理及び／若しくは中性固相でのクロマトグラフィー後に得られた中性ＨＭＯ（但し、目的の中性ＨＭＯは、結晶形態で存在する）を結晶化させる工程を含み得る。代わりに、ＵＦ工程、ＮＦ工程、活性炭処理、イオン交換処理及び／又は中性固相でのクロマトグラフィー後に得られた中性ＨＭＯを、例えば蒸留、好ましくは真空蒸留又はナノろ過により水を除去することにより、濃縮水溶液又はシロップの形態で提供することができる。
【0169】
目的の中性ＨＭＯが噴霧乾燥形態で単離される場合、好ましくは、例えば国際公開第２０１３／１８５７８０号パンフレットで開示されているように行うか、又は噴霧乾燥プロセスを１１０～１９０℃のノズル温度及び６０～１１０℃の出口温度において、例えば目的の中性ＨＭＯの１５～６５ｗ／ｖ％水溶液で実施し、但し、このノズル温度は、出口温度と比べて少なくとも１０℃高い。
【0170】
目的の中性ＨＭＯが結晶形態で単離される場合、結晶化は、好ましくは、
－ 国際公開第２０１６／０９５９２４号パンフレットで開示されているように水性酢酸から実施して、国際公開第２０１１／１５０９３９号パンフレットに係る２’－ＦＬ多形ＩＩを単離すること、又は
－ 国際公開第２０１１／１００９８０号パンフレットで開示されているように水性メタノールから実施して、このパンフレットで特徴付けられているＬＮｎＴ多形を単離すること
によって実施される。
－ 国際公開第２０１６／０９５９２４号パンフレットで開示されているように水性酢酸から実施して、国際公開第２０１１／１５０９３９号パンフレットに係る２’－ＦＬ多形ＩＩを単離すること、又は
－ 国際公開第２０１１／１００９８０号パンフレットで開示されているように水性メタノールから実施して、このパンフレットで特徴付けられているＬＮｎＴ多形を単離すること
によって実施される。
【0171】
［３．本発明の好ましい実施形態］
好ましい実施形態及びより好ましい実施形態を含む、本発明の実施形態は、電気透析工程を含まない。
好ましい実施形態及びより好ましい実施形態を含む、本発明の実施形態は、電気透析工程を含まない。
【0172】
本方法の一実施形態は、中性ＨＭＯを、それが生成された発酵ブロスから得るか又は単離することであって、
ａ）前記反応ブロスのｐＨをｐＨ＝３～５に設定する工程、
ｂ）任意選択的に、工程ａ）で得られたｐＨ調整ブロスを５～１５℃まで冷却して１～１５日にわたり保存する工程、
ｃ）工程ａ）又は工程ｂ）のブロスを６０～６５℃まで加熱する工程、
ｄ）工程ｃ）で得られたブロスを、約５～１０００ｋＤａ、例えば１０～１０００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する限外ろ過（ＵＦ）膜と任意選択的に４０～６５℃で接触させる工程であって、この膜は、セラミック膜である、工程、
ｅ）工程ｄ）で得られた透過液の任意選択的な滅菌ろ過の工程、
ｆ）工程ｄ）で得られた透過液又は工程ｅ）で得られた滅菌ろ過透過液を、６００～３５００ＤａのＭＷＣＯを有するナノろ過（ＮＦ）膜と接触させる工程であって、この膜の活性（上）層は、ポリアミドで構成され、前記膜でのＭｇＳＯ４阻止率は、約２０～９０％、好ましくは５０～９０％である、工程、
ｇ）工程ｆ）で得られた保持液をＨ＋形態の強カチオンイオン交換樹脂、続いて塩基形態の弱塩基イオン交換樹脂により処理して、この保持液を脱塩する工程、
ｈ）３０～６０℃での、工程ｇ）で得られた溶液の活性炭クロマトグラフィーの工程であって、この炭の量は、負荷に含有される中性ＨＭＯの約２～１０重量％である、工程、
ｉ）工程ｈ）で得られた溶液を１５０～５００Ｄａの膜でナノろ過して、この溶液を濃縮する工程、
ｊ）工程ｉ）の溶液を噴霧乾燥させることにより水を除去して、非晶質固体として中性ＨＭＯを得るか、又は工程ｉ）で得られた溶液から中性ＨＭＯを結晶化させる工程
を含む、得るか又は単離することに関する。
ａ）前記反応ブロスのｐＨをｐＨ＝３～５に設定する工程、
ｂ）任意選択的に、工程ａ）で得られたｐＨ調整ブロスを５～１５℃まで冷却して１～１５日にわたり保存する工程、
ｃ）工程ａ）又は工程ｂ）のブロスを６０～６５℃まで加熱する工程、
ｄ）工程ｃ）で得られたブロスを、約５～１０００ｋＤａ、例えば１０～１０００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する限外ろ過（ＵＦ）膜と任意選択的に４０～６５℃で接触させる工程であって、この膜は、セラミック膜である、工程、
ｅ）工程ｄ）で得られた透過液の任意選択的な滅菌ろ過の工程、
ｆ）工程ｄ）で得られた透過液又は工程ｅ）で得られた滅菌ろ過透過液を、６００～３５００ＤａのＭＷＣＯを有するナノろ過（ＮＦ）膜と接触させる工程であって、この膜の活性（上）層は、ポリアミドで構成され、前記膜でのＭｇＳＯ４阻止率は、約２０～９０％、好ましくは５０～９０％である、工程、
ｇ）工程ｆ）で得られた保持液をＨ＋形態の強カチオンイオン交換樹脂、続いて塩基形態の弱塩基イオン交換樹脂により処理して、この保持液を脱塩する工程、
ｈ）３０～６０℃での、工程ｇ）で得られた溶液の活性炭クロマトグラフィーの工程であって、この炭の量は、負荷に含有される中性ＨＭＯの約２～１０重量％である、工程、
ｉ）工程ｈ）で得られた溶液を１５０～５００Ｄａの膜でナノろ過して、この溶液を濃縮する工程、
ｊ）工程ｉ）の溶液を噴霧乾燥させることにより水を除去して、非晶質固体として中性ＨＭＯを得るか、又は工程ｉ）で得られた溶液から中性ＨＭＯを結晶化させる工程
を含む、得るか又は単離することに関する。
【0173】
本方法の一実施形態は、中性ＨＭＯを、それが生成された発酵ブロスから得るか又は単離することであって、
ａ）前記反応ブロスのｐＨを約５．５のｐＨに設定する工程、
ｂ）工程ａ）で得られたブロスを遠心分離する工程、
ｃ）任意選択的に、工程ｂ）の上清を６０～６５℃まで加熱する工程、
ｄ）工程ｂ）又は工程ｃ）の上清を、約５～１０００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する限外ろ過（ＵＦ）膜と任意選択的に４０～６５℃で接触させる工程、
ｅ）工程ｄ）で得られた透過液を、ナノろ過（ＮＦ）膜であって、
－ ６００～３５００Ｄａを有し、この膜の活性（上）層は、ポリアミドで構成され、前記膜でのＭｇＳＯ４阻止率は、約２０～９０％、好ましくは５０～９０％である、ナノろ過（ＮＦ）膜、又は
－ １５０～５００ＤａのＭＷＣＯを有するナノろ過（ＮＦ）膜
と接触させる工程、
ｆ）３０～６０℃での、工程ｅ）で得られた保持液の活性炭クロマトグラフィーの工程であって、この炭の量は、負荷に含有される中性ＨＭＯの約２～１０重量％である、工程、
ｇ）工程ｆ）で得られた溶液をＨ＋形態の強カチオンイオン交換樹脂、続いて塩基形態の弱塩基イオン交換樹脂で処理して、この溶液を脱塩する工程、
ｈ）工程ｇ）で得られた溶液を１５０～５００Ｄの膜でナノろ過して、この溶液を濃縮する工程、
ｉ）工程ｉ）の溶液を噴霧乾燥させて、非晶質固体として中性ＨＭＯを得るか、又は工程ｈ）で得られた溶液から中性ＨＭＯを結晶化させる工程
を含む、得るか又は単離することに関する。
ａ）前記反応ブロスのｐＨを約５．５のｐＨに設定する工程、
ｂ）工程ａ）で得られたブロスを遠心分離する工程、
ｃ）任意選択的に、工程ｂ）の上清を６０～６５℃まで加熱する工程、
ｄ）工程ｂ）又は工程ｃ）の上清を、約５～１０００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する限外ろ過（ＵＦ）膜と任意選択的に４０～６５℃で接触させる工程、
ｅ）工程ｄ）で得られた透過液を、ナノろ過（ＮＦ）膜であって、
－ ６００～３５００Ｄａを有し、この膜の活性（上）層は、ポリアミドで構成され、前記膜でのＭｇＳＯ４阻止率は、約２０～９０％、好ましくは５０～９０％である、ナノろ過（ＮＦ）膜、又は
－ １５０～５００ＤａのＭＷＣＯを有するナノろ過（ＮＦ）膜
と接触させる工程、
ｆ）３０～６０℃での、工程ｅ）で得られた保持液の活性炭クロマトグラフィーの工程であって、この炭の量は、負荷に含有される中性ＨＭＯの約２～１０重量％である、工程、
ｇ）工程ｆ）で得られた溶液をＨ＋形態の強カチオンイオン交換樹脂、続いて塩基形態の弱塩基イオン交換樹脂で処理して、この溶液を脱塩する工程、
ｈ）工程ｇ）で得られた溶液を１５０～５００Ｄの膜でナノろ過して、この溶液を濃縮する工程、
ｉ）工程ｉ）の溶液を噴霧乾燥させて、非晶質固体として中性ＨＭＯを得るか、又は工程ｈ）で得られた溶液から中性ＨＭＯを結晶化させる工程
を含む、得るか又は単離することに関する。
【0174】
本方法の一実施形態は、２’－ＦＬを、それが生成された発酵ブロスから得るか又は単離することであって、
ａ）このブロスのｐＨを約３～約６のｐＨに設定し、且つ／又は前記ブロスを約３５～６５℃の温度に温める工程、
ｂ）工程ａ）のブロスを、約５～１０００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する限外ろ過（ＵＦ）膜と任意選択的に４０～６５℃で接触させる工程、
ｃ）工程ｂ）で得られた透過液を、ナノろ過（ＮＦ）膜であって、
－ ６００～３５００Ｄａを有し、この膜の活性（上）層は、ポリアミドで構成され、前記膜でのＭｇＳＯ４阻止率は、約２０～９０％、好ましくは５０～９０％である、ナノろ過（ＮＦ）膜、又は
－ １５０～５００ＤａのＭＷＣＯを有するナノろ過（ＮＦ）膜
と接触させる工程、
ｄ）３０～６０℃での、工程ｃ）で得られた保持液の活性炭クロマトグラフィーの工程、
ｅ）２’－ＦＬの濃度が約４００～７００ｇ／ｌに達するまで、工程ｄ）で得られた溶液を蒸発させる工程、
ｆ）メタノール又は酢酸、好ましくは酢酸を用いて、工程ｅ）で得られた溶液から２’－ＦＬを結晶化させて、２’－ＦＬ多形ＩＩを得る工程
を含む、得るか又は単離することに関する。
ａ）このブロスのｐＨを約３～約６のｐＨに設定し、且つ／又は前記ブロスを約３５～６５℃の温度に温める工程、
ｂ）工程ａ）のブロスを、約５～１０００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する限外ろ過（ＵＦ）膜と任意選択的に４０～６５℃で接触させる工程、
ｃ）工程ｂ）で得られた透過液を、ナノろ過（ＮＦ）膜であって、
－ ６００～３５００Ｄａを有し、この膜の活性（上）層は、ポリアミドで構成され、前記膜でのＭｇＳＯ４阻止率は、約２０～９０％、好ましくは５０～９０％である、ナノろ過（ＮＦ）膜、又は
－ １５０～５００ＤａのＭＷＣＯを有するナノろ過（ＮＦ）膜
と接触させる工程、
ｄ）３０～６０℃での、工程ｃ）で得られた保持液の活性炭クロマトグラフィーの工程、
ｅ）２’－ＦＬの濃度が約４００～７００ｇ／ｌに達するまで、工程ｄ）で得られた溶液を蒸発させる工程、
ｆ）メタノール又は酢酸、好ましくは酢酸を用いて、工程ｅ）で得られた溶液から２’－ＦＬを結晶化させて、２’－ＦＬ多形ＩＩを得る工程
を含む、得るか又は単離することに関する。
【0175】
本方法の一実施形態は、２’－ＦＬを、それが生成された発酵ブロスから得るか又は単離することであって、
ａ）このブロスのｐＨを約３～約６のｐＨに設定し、且つ／又は前記ブロスを約３５～６５℃の温度に温める工程、
ｂ）工程ａ）のブロスを、約５～１０００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する限外ろ過（ＵＦ）膜と任意選択的に４０～６５℃で接触させる工程、
ｃ）工程ｂ）で得られた透過液を、ナノろ過（ＮＦ）膜であって、
－ ６００～３５００ＤａのＭＷＣＯを有し、この膜の活性（上）層は、ポリアミドで構成され、前記膜でのＭｇＳＯ４阻止率は、約２０～９０％、好ましくは５０～９０％である、ナノろ過（ＮＦ）膜、又は
－ １５０～５００ＤａのＭＷＣＯを有するナノろ過（ＮＦ）膜
と接触させる工程、
ｄ）３０～６０℃での、工程ｃ）で得られた保持液の活性炭クロマトグラフィーの工程、
ｅ）工程ｄ）で得られた溶液を、６００～３５００ＤａのＭＷＣＯを有するナノろ過（ＮＦ）膜と接触させる工程であって、この膜の活性（上）層は、ポリアミドで構成され、前記膜でのＭｇＳＯ４阻止率は、約２０～９０％、好ましくは５０～９０％である、工程、
ｆ）工程ｅ）で得られた透過液を蒸発させるか、又は工程ｅ）で得られた透過液を１５０～３００Ｄａの膜でナノろ過して、２’－ＦＬの濃度が約４００～７００ｇ／ｌに達するまでこの溶液を濃縮する工程、
ｇ）酢酸を用いて、工程ｆ）で得られた溶液から２’－ＦＬを結晶化させて、２’－ＦＬ多形ＩＩを得る工程
を含む、得るか又は単離することに関する。
ａ）このブロスのｐＨを約３～約６のｐＨに設定し、且つ／又は前記ブロスを約３５～６５℃の温度に温める工程、
ｂ）工程ａ）のブロスを、約５～１０００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する限外ろ過（ＵＦ）膜と任意選択的に４０～６５℃で接触させる工程、
ｃ）工程ｂ）で得られた透過液を、ナノろ過（ＮＦ）膜であって、
－ ６００～３５００ＤａのＭＷＣＯを有し、この膜の活性（上）層は、ポリアミドで構成され、前記膜でのＭｇＳＯ４阻止率は、約２０～９０％、好ましくは５０～９０％である、ナノろ過（ＮＦ）膜、又は
－ １５０～５００ＤａのＭＷＣＯを有するナノろ過（ＮＦ）膜
と接触させる工程、
ｄ）３０～６０℃での、工程ｃ）で得られた保持液の活性炭クロマトグラフィーの工程、
ｅ）工程ｄ）で得られた溶液を、６００～３５００ＤａのＭＷＣＯを有するナノろ過（ＮＦ）膜と接触させる工程であって、この膜の活性（上）層は、ポリアミドで構成され、前記膜でのＭｇＳＯ４阻止率は、約２０～９０％、好ましくは５０～９０％である、工程、
ｆ）工程ｅ）で得られた透過液を蒸発させるか、又は工程ｅ）で得られた透過液を１５０～３００Ｄａの膜でナノろ過して、２’－ＦＬの濃度が約４００～７００ｇ／ｌに達するまでこの溶液を濃縮する工程、
ｇ）酢酸を用いて、工程ｆ）で得られた溶液から２’－ＦＬを結晶化させて、２’－ＦＬ多形ＩＩを得る工程
を含む、得るか又は単離することに関する。
【0176】
本方法の一実施形態は、２’－ＦＬを、それが生成された発酵ブロスから得るか又は単離することであって、
ａ）このブロスのｐＨを約３～約６のｐＨに設定し、且つ／又は前記ブロスを約３５～６５℃の温度に温める工程、
ｂ）工程ａ）のブロスを、約５～１０００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する限外ろ過（ＵＦ）膜と任意選択的に４０～６５℃で接触させる工程、
ｃ）工程ｂ）で得られた透過液を、ナノろ過（ＮＦ）膜であって、
－ ６００～３５００ＤａのＭＷＣＯを有し、この膜の活性（上）層は、ポリアミドで構成され、前記膜でのＭｇＳＯ４阻止率は、約２０～９０％、好ましくは５０～９０％である、ナノろ過（ＮＦ）膜、又は
－ １５０～５００ＤａのＭＷＣＯを有するナノろ過（ＮＦ）膜
と接触させる工程、
ｄ）工程ｃ）で得られた保持液をＨ＋形態の強カチオンイオン交換樹脂、続いて塩基形態の弱塩基イオン交換樹脂で処理して、この溶液を脱塩する工程、
ｅ）３０～６０℃での、工程ｄ）で得られた溶液の活性炭クロマトグラフィーの工程、
ｆ）工程ｅ）で得られた溶液を蒸発させるか、又は工程ｅ）で得られた溶液を１５０～３００Ｄａの膜でナノろ過して、この溶液を濃縮する工程、
ｇ）酢酸を用いて、工程ｆ）で得られた溶液から２’－ＦＬを結晶化させて２’－ＦＬ多形ＩＩを得るか、又は工程ｆ）で得られた溶液を噴霧乾燥させて非晶質粉末として２’－ＦＬを得る工程
を含む、得るか又は単離することに関する。
ａ）このブロスのｐＨを約３～約６のｐＨに設定し、且つ／又は前記ブロスを約３５～６５℃の温度に温める工程、
ｂ）工程ａ）のブロスを、約５～１０００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する限外ろ過（ＵＦ）膜と任意選択的に４０～６５℃で接触させる工程、
ｃ）工程ｂ）で得られた透過液を、ナノろ過（ＮＦ）膜であって、
－ ６００～３５００ＤａのＭＷＣＯを有し、この膜の活性（上）層は、ポリアミドで構成され、前記膜でのＭｇＳＯ４阻止率は、約２０～９０％、好ましくは５０～９０％である、ナノろ過（ＮＦ）膜、又は
－ １５０～５００ＤａのＭＷＣＯを有するナノろ過（ＮＦ）膜
と接触させる工程、
ｄ）工程ｃ）で得られた保持液をＨ＋形態の強カチオンイオン交換樹脂、続いて塩基形態の弱塩基イオン交換樹脂で処理して、この溶液を脱塩する工程、
ｅ）３０～６０℃での、工程ｄ）で得られた溶液の活性炭クロマトグラフィーの工程、
ｆ）工程ｅ）で得られた溶液を蒸発させるか、又は工程ｅ）で得られた溶液を１５０～３００Ｄａの膜でナノろ過して、この溶液を濃縮する工程、
ｇ）酢酸を用いて、工程ｆ）で得られた溶液から２’－ＦＬを結晶化させて２’－ＦＬ多形ＩＩを得るか、又は工程ｆ）で得られた溶液を噴霧乾燥させて非晶質粉末として２’－ＦＬを得る工程
を含む、得るか又は単離することに関する。
【0177】
本方法の一実施形態は、中性ＨＭＯを、それが生成された発酵ブロスから得るか又は単離することであって、
ａ）前記反応ブロスのｐＨを約３～６のｐＨに設定する工程、
ｂ）任意選択的に、工程ａ）のブロスを３０～６５℃まで加熱する工程、
ｃ）工程ａ）又はｂ）のブロスを、約１０～１０００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する限外ろ過（ＵＦ）膜と任意選択的に４０～６５℃で接触させる工程、
ｄ）工程ｃ）で得られた透過液を、ナノろ過（ＮＦ）膜であって、
－ ６００～３５００ＤａのＭＷＣＯを有し、この膜の活性（上）層は、ポリアミドで構成され、前記膜でのＭｇＳＯ４阻止率は、約２０～９０％、好ましくは５０～９０％である、ナノろ過（ＮＦ）膜、又は
－ １５０～５００ＤａのＭＷＣＯを有するナノろ過（ＮＦ）膜
と接触させる工程、
ｅ）３０～６０℃での、工程ｄ）で得られた保持液の活性炭クロマトグラフィーの工程であって、この炭の量は、負荷に含有される中性ＨＭＯの約２～１０重量％である、工程、
ｆ）工程ｅ）で得られた溶液をＨ＋形態の強カチオンイオン交換樹脂、続いて塩基形態の弱塩基イオン交換樹脂で処理して、この溶液を脱塩する工程、
ｇ）工程ｆ）で得られた溶液を１５０～３００Ｄａの膜でナノろ過して、この溶液を濃縮する工程、
ｈ）工程ｇ）で得られた溶液から中性ＨＭＯを結晶化させる工程であって、
この中性ＨＭＯは、２’－ＦＬ、ＬＮｎＴ又はＬＮＴである、工程
を含む、得るか又は単離することに関する。
ａ）前記反応ブロスのｐＨを約３～６のｐＨに設定する工程、
ｂ）任意選択的に、工程ａ）のブロスを３０～６５℃まで加熱する工程、
ｃ）工程ａ）又はｂ）のブロスを、約１０～１０００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する限外ろ過（ＵＦ）膜と任意選択的に４０～６５℃で接触させる工程、
ｄ）工程ｃ）で得られた透過液を、ナノろ過（ＮＦ）膜であって、
－ ６００～３５００ＤａのＭＷＣＯを有し、この膜の活性（上）層は、ポリアミドで構成され、前記膜でのＭｇＳＯ４阻止率は、約２０～９０％、好ましくは５０～９０％である、ナノろ過（ＮＦ）膜、又は
－ １５０～５００ＤａのＭＷＣＯを有するナノろ過（ＮＦ）膜
と接触させる工程、
ｅ）３０～６０℃での、工程ｄ）で得られた保持液の活性炭クロマトグラフィーの工程であって、この炭の量は、負荷に含有される中性ＨＭＯの約２～１０重量％である、工程、
ｆ）工程ｅ）で得られた溶液をＨ＋形態の強カチオンイオン交換樹脂、続いて塩基形態の弱塩基イオン交換樹脂で処理して、この溶液を脱塩する工程、
ｇ）工程ｆ）で得られた溶液を１５０～３００Ｄａの膜でナノろ過して、この溶液を濃縮する工程、
ｈ）工程ｇ）で得られた溶液から中性ＨＭＯを結晶化させる工程であって、
この中性ＨＭＯは、２’－ＦＬ、ＬＮｎＴ又はＬＮＴである、工程
を含む、得るか又は単離することに関する。
【0178】
本方法の一実施形態は、３－ＦＬを、それが生成された発酵ブロスから得るか又は単離することであって、
ａ）このブロスのｐＨを約３～約６のｐＨに設定し、且つ／又は前記ブロスを約３５～６５℃の温度に温める工程、
ｂ）工程ａ）のブロスを、約５～１０００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する限外ろ過（ＵＦ）膜と任意選択的に４０～６５℃で接触させる工程、
ｃ）工程ｂ）で得られた透過液を、ナノろ過（ＮＦ）膜であって、
－ ６００～３５００ＤａのＭＷＣＯを有し、この膜の活性（上）層は、ポリアミドで構成され、前記膜でのＭｇＳＯ４阻止率は、約２０～９０％、好ましくは５０～９０％である、ナノろ過（ＮＦ）膜、又は
－ １５０～５００ＤａのＭＷＣＯを有するナノろ過（ＮＦ）膜
と接触させる工程、
ｄ）工程ｃ）で得られた保持液をＨ＋形態の強カチオンイオン交換樹脂、続いて塩基形態の弱塩基イオン交換樹脂で処理して、この溶液を脱塩する工程、
ｅ）３０～６０℃での、工程ｄ）で得られた溶液の活性炭クロマトグラフィーの工程、
ｆ）工程ｅ）で得られた溶液を蒸発させるか、又は工程ｅ）で得られた溶液を１５０～３００Ｄａの膜でナノろ過して、この溶液を濃縮する工程、
ｇ）工程ｆ）で得られた溶液を噴霧乾燥させて、非晶質粉末として３－ＦＬを得る工程
を含む、得るか又は単離することに関する。
ａ）このブロスのｐＨを約３～約６のｐＨに設定し、且つ／又は前記ブロスを約３５～６５℃の温度に温める工程、
ｂ）工程ａ）のブロスを、約５～１０００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する限外ろ過（ＵＦ）膜と任意選択的に４０～６５℃で接触させる工程、
ｃ）工程ｂ）で得られた透過液を、ナノろ過（ＮＦ）膜であって、
－ ６００～３５００ＤａのＭＷＣＯを有し、この膜の活性（上）層は、ポリアミドで構成され、前記膜でのＭｇＳＯ４阻止率は、約２０～９０％、好ましくは５０～９０％である、ナノろ過（ＮＦ）膜、又は
－ １５０～５００ＤａのＭＷＣＯを有するナノろ過（ＮＦ）膜
と接触させる工程、
ｄ）工程ｃ）で得られた保持液をＨ＋形態の強カチオンイオン交換樹脂、続いて塩基形態の弱塩基イオン交換樹脂で処理して、この溶液を脱塩する工程、
ｅ）３０～６０℃での、工程ｄ）で得られた溶液の活性炭クロマトグラフィーの工程、
ｆ）工程ｅ）で得られた溶液を蒸発させるか、又は工程ｅ）で得られた溶液を１５０～３００Ｄａの膜でナノろ過して、この溶液を濃縮する工程、
ｇ）工程ｆ）で得られた溶液を噴霧乾燥させて、非晶質粉末として３－ＦＬを得る工程
を含む、得るか又は単離することに関する。
【0179】
本方法の一実施形態は、ＬＮｎＴを、それが生成された発酵ブロスから得るか又は単離することであって、
ａ）このブロスのｐＨを約３～約６のｐＨに設定し、且つ／又は前記ブロスを約３５～６５℃の温度に温める工程、
ｂ）工程ａ）のブロスを、約５～１０００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する限外ろ過（ＵＦ）膜と任意選択的に４０～６５℃で接触させる工程、
ｃ）工程ｂ）で得られた透過液を、６００～３５００ＤａのＭＷＣＯを有するナノろ過（ＮＦ）膜と接触させる工程であって、この膜の活性（上）層は、ポリアミドで構成され、前記膜でのＭｇＳＯ４阻止率は、約２０～９０％、好ましくは５０～９０％である、工程、
ｄ）３０～６０℃での、工程ｃ）で得られた保持液の活性炭クロマトグラフィーの工程、
ｅ）工程ｄ）で得られた溶液をＨ＋形態の強カチオンイオン交換樹脂、続いて塩基形態の弱塩基イオン交換樹脂で処理して、この溶液を脱塩する工程、
ｆ）工程ｅ）で得られた溶液を蒸発させるか、又は工程ｅ）で得られた溶液を１５０～３００Ｄａの膜でナノろ過して、この溶液を濃縮する工程、
ｇ）メタノールを用いて、工程ｆ）で得られた溶液からＬＮｎＴを結晶化させる工程
を含む、得るか又は単離することに関する。
ａ）このブロスのｐＨを約３～約６のｐＨに設定し、且つ／又は前記ブロスを約３５～６５℃の温度に温める工程、
ｂ）工程ａ）のブロスを、約５～１０００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する限外ろ過（ＵＦ）膜と任意選択的に４０～６５℃で接触させる工程、
ｃ）工程ｂ）で得られた透過液を、６００～３５００ＤａのＭＷＣＯを有するナノろ過（ＮＦ）膜と接触させる工程であって、この膜の活性（上）層は、ポリアミドで構成され、前記膜でのＭｇＳＯ４阻止率は、約２０～９０％、好ましくは５０～９０％である、工程、
ｄ）３０～６０℃での、工程ｃ）で得られた保持液の活性炭クロマトグラフィーの工程、
ｅ）工程ｄ）で得られた溶液をＨ＋形態の強カチオンイオン交換樹脂、続いて塩基形態の弱塩基イオン交換樹脂で処理して、この溶液を脱塩する工程、
ｆ）工程ｅ）で得られた溶液を蒸発させるか、又は工程ｅ）で得られた溶液を１５０～３００Ｄａの膜でナノろ過して、この溶液を濃縮する工程、
ｇ）メタノールを用いて、工程ｆ）で得られた溶液からＬＮｎＴを結晶化させる工程
を含む、得るか又は単離することに関する。
【0180】
本方法の一実施形態は、ＬＮｎＴを、それが生成された発酵ブロスから得るか又は単離することであって、
ａ）このブロスのｐＨを約３～約６のｐＨに設定し、且つ／又は前記ブロスを約３５～６５℃の温度に温める工程、
ｂ）工程ａ）のブロスを、約５～１０００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する限外ろ過（ＵＦ）膜と任意選択的に４０～６５℃で接触させる工程、
ｃ）工程ｂ）で得られた透過液を、６００～３５００ＤａのＭＷＣＯを有するナノろ過（ＮＦ）膜と接触させる工程であって、この膜の活性（上）層は、ポリアミドで構成され、前記膜でのＭｇＳＯ４阻止率は、約２０～９０％、好ましくは５０～９０％である、工程、
ｄ）工程ｃ）で得られた保持液をＨ＋形態の強カチオンイオン交換樹脂、続いて塩基形態の弱塩基イオン交換樹脂で処理して、この溶液を脱塩する工程、
ｅ）３０～６０℃での、工程ｄ）で得られた溶液の活性炭クロマトグラフィーの工程、
ｆ）工程ｅ）で得られた溶液を蒸発させるか、又は工程ｅ）で得られた溶液を１５０～３００Ｄａの膜でナノろ過して、この溶液を濃縮する工程、
ｇ）メタノールを用いて、工程ｆ）で得られた溶液からＬＮｎＴを結晶化させる工程
を含む、得るか又は単離することに関する。
ａ）このブロスのｐＨを約３～約６のｐＨに設定し、且つ／又は前記ブロスを約３５～６５℃の温度に温める工程、
ｂ）工程ａ）のブロスを、約５～１０００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する限外ろ過（ＵＦ）膜と任意選択的に４０～６５℃で接触させる工程、
ｃ）工程ｂ）で得られた透過液を、６００～３５００ＤａのＭＷＣＯを有するナノろ過（ＮＦ）膜と接触させる工程であって、この膜の活性（上）層は、ポリアミドで構成され、前記膜でのＭｇＳＯ４阻止率は、約２０～９０％、好ましくは５０～９０％である、工程、
ｄ）工程ｃ）で得られた保持液をＨ＋形態の強カチオンイオン交換樹脂、続いて塩基形態の弱塩基イオン交換樹脂で処理して、この溶液を脱塩する工程、
ｅ）３０～６０℃での、工程ｄ）で得られた溶液の活性炭クロマトグラフィーの工程、
ｆ）工程ｅ）で得られた溶液を蒸発させるか、又は工程ｅ）で得られた溶液を１５０～３００Ｄａの膜でナノろ過して、この溶液を濃縮する工程、
ｇ）メタノールを用いて、工程ｆ）で得られた溶液からＬＮｎＴを結晶化させる工程
を含む、得るか又は単離することに関する。
【0181】
本方法の一実施形態は、ＬＮｎＴを、それが生成された発酵ブロスから得るか又は単離することであって、
ａ）ブロスのｐＨを約３～約６のｐＨに設定し、且つ／又は前記ブロスを約３５～６５℃の温度に温める工程、
ｂ）工程ａ）のブロスを、約５～１０００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する限外ろ過（ＵＦ）膜と任意選択的に４０～６５℃で接触させる工程、
ｃ）工程ｂ）で得られた透過液を、ナノろ過（ＮＦ）膜であって、
－ ６００～３５００ＤａのＭＷＣＯを有し、この膜の活性（上）層は、ポリアミドで構成され、前記膜でのＭｇＳＯ４阻止率は、約２０～９０％、好ましくは５０～９０％である、ナノろ過（ＮＦ）膜、又は
－ １５０～５００ＤａのＭＷＣＯを有するナノろ過（ＮＦ）膜
と接触させる工程、
ｄ）３０～６０℃での、工程ｃ）で得られた保持液の活性炭クロマトグラフィーの工程、
ｅ）工程ｄ）で得られた溶液をＨ＋形態の強カチオンイオン交換樹脂、続いて塩基形態の弱塩基イオン交換樹脂で処理して、この溶液を脱塩する工程、
ｆ）ジビニルベンゼンで架橋された臭素官能化ポリスチレン（ＰＳ－ＤＶＢ）疎水性固定相による、工程ｅ）で得られた溶液のクロマトグラフィーを行って、ＬＮｎＴが富化された画分を回収する工程、
ｇ）工程ｆ）で得られた画分を蒸発させるか、又は工程ｆ）で得られた画分を１５０～３００Ｄａの膜でナノろ過して、この溶液を濃縮する工程、
ｈ）工程ｇ）で得られた溶液を噴霧乾燥させて、非晶質粉末としてＬＮｎＴを得る工程
を含む、得るか又は単離することに関する。
ａ）ブロスのｐＨを約３～約６のｐＨに設定し、且つ／又は前記ブロスを約３５～６５℃の温度に温める工程、
ｂ）工程ａ）のブロスを、約５～１０００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する限外ろ過（ＵＦ）膜と任意選択的に４０～６５℃で接触させる工程、
ｃ）工程ｂ）で得られた透過液を、ナノろ過（ＮＦ）膜であって、
－ ６００～３５００ＤａのＭＷＣＯを有し、この膜の活性（上）層は、ポリアミドで構成され、前記膜でのＭｇＳＯ４阻止率は、約２０～９０％、好ましくは５０～９０％である、ナノろ過（ＮＦ）膜、又は
－ １５０～５００ＤａのＭＷＣＯを有するナノろ過（ＮＦ）膜
と接触させる工程、
ｄ）３０～６０℃での、工程ｃ）で得られた保持液の活性炭クロマトグラフィーの工程、
ｅ）工程ｄ）で得られた溶液をＨ＋形態の強カチオンイオン交換樹脂、続いて塩基形態の弱塩基イオン交換樹脂で処理して、この溶液を脱塩する工程、
ｆ）ジビニルベンゼンで架橋された臭素官能化ポリスチレン（ＰＳ－ＤＶＢ）疎水性固定相による、工程ｅ）で得られた溶液のクロマトグラフィーを行って、ＬＮｎＴが富化された画分を回収する工程、
ｇ）工程ｆ）で得られた画分を蒸発させるか、又は工程ｆ）で得られた画分を１５０～３００Ｄａの膜でナノろ過して、この溶液を濃縮する工程、
ｈ）工程ｇ）で得られた溶液を噴霧乾燥させて、非晶質粉末としてＬＮｎＴを得る工程
を含む、得るか又は単離することに関する。
【0182】
本方法の一実施形態は、ＬＮｎＴを、それが生成された発酵ブロスから得るか又は単離することであって、
ａ）ブロスのｐＨを約３～約６のｐＨに設定し、且つ／又は前記ブロスを約３５～６５℃の温度に温める工程、
ｂ）工程ａ）のブロスを、約５～１０００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する限外ろ過（ＵＦ）膜と任意選択的に４０～６５℃で接触させる工程、
ｃ）工程ｂ）で得られた透過液を、ナノろ過（ＮＦ）膜であって、
－ ６００～３５００ＤａのＭＷＣＯを有し、この膜の活性（上）層は、ポリアミドで構成され、前記膜でのＭｇＳＯ４阻止率は、約２０～９０％、好ましくは５０～９０％である、ナノろ過（ＮＦ）膜、又は
－ １５０～５００ＤａのＭＷＣＯを有するナノろ過（ＮＦ）膜
と接触させる工程、
ｄ）工程ｃ）で得られた保持液をＨ＋形態の強カチオンイオン交換樹脂、続いて塩基形態の弱塩基イオン交換樹脂で処理して、この溶液を脱塩する工程、
ｅ）３０～６０℃での、工程ｄ）で得られた溶液の活性炭クロマトグラフィーの工程、
ｆ）ジビニルベンゼンで架橋された臭素官能化ポリスチレン（ＰＳ－ＤＶＢ）疎水性固定相による、工程ｅ）で得られた溶液のクロマトグラフィーを行って、ＬＮｎＴが富化された画分を回収する工程、
ｇ）工程ｆ）で得られた画分を蒸発させるか、又は工程ｆ）で得られた画分を１５０～３００Ｄａの膜でナノろ過して、この溶液を濃縮する工程、
ｈ）工程ｇ）で得られた溶液を噴霧乾燥させて、非晶質粉末としてＬＮｎＴを得る工程
を含む、得るか又は単離することに関する。
ａ）ブロスのｐＨを約３～約６のｐＨに設定し、且つ／又は前記ブロスを約３５～６５℃の温度に温める工程、
ｂ）工程ａ）のブロスを、約５～１０００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する限外ろ過（ＵＦ）膜と任意選択的に４０～６５℃で接触させる工程、
ｃ）工程ｂ）で得られた透過液を、ナノろ過（ＮＦ）膜であって、
－ ６００～３５００ＤａのＭＷＣＯを有し、この膜の活性（上）層は、ポリアミドで構成され、前記膜でのＭｇＳＯ４阻止率は、約２０～９０％、好ましくは５０～９０％である、ナノろ過（ＮＦ）膜、又は
－ １５０～５００ＤａのＭＷＣＯを有するナノろ過（ＮＦ）膜
と接触させる工程、
ｄ）工程ｃ）で得られた保持液をＨ＋形態の強カチオンイオン交換樹脂、続いて塩基形態の弱塩基イオン交換樹脂で処理して、この溶液を脱塩する工程、
ｅ）３０～６０℃での、工程ｄ）で得られた溶液の活性炭クロマトグラフィーの工程、
ｆ）ジビニルベンゼンで架橋された臭素官能化ポリスチレン（ＰＳ－ＤＶＢ）疎水性固定相による、工程ｅ）で得られた溶液のクロマトグラフィーを行って、ＬＮｎＴが富化された画分を回収する工程、
ｇ）工程ｆ）で得られた画分を蒸発させるか、又は工程ｆ）で得られた画分を１５０～３００Ｄａの膜でナノろ過して、この溶液を濃縮する工程、
ｈ）工程ｇ）で得られた溶液を噴霧乾燥させて、非晶質粉末としてＬＮｎＴを得る工程
を含む、得るか又は単離することに関する。
【0183】
［実施例］
［全般：］
目的の中性ＨＭＯの濃度を、３７℃で屈折率検出器を使用して、１．１ｍｌ／分の流速及び２５℃で、６４ｖ／ｖ％のアセトニトリルを用いるＴＳＫｇｅｌ Ａｍｉｄｅ－８０（１５０ｍｍ×４．６ｍｍ、粒径：３μｍ）によるＨＰＬＣでアッセイした。
［全般：］
目的の中性ＨＭＯの濃度を、３７℃で屈折率検出器を使用して、１．１ｍｌ／分の流速及び２５℃で、６４ｖ／ｖ％のアセトニトリルを用いるＴＳＫｇｅｌ Ａｍｉｄｅ－８０（１５０ｍｍ×４．６ｍｍ、粒径：３μｍ）によるＨＰＬＣでアッセイした。
【0184】
有機不純物の濃度を、帯電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）を使用して、１．１ｍｌ／分の流速及び２５℃で、７２ｖ／ｖ％のアセトニトリルを用いるａｐＨｅｒａ ＮＨ２ポリマー（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ；５μｍ）によるＨＰＬＣで測定した。
【0185】
［実施例１］
発酵：２’－ＦＬ含有ブロスを、ＬａｃＺ－、ＬａｃＹ＋表現型の遺伝子改変大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を使用する発酵により生成し、前記株は、ＧＤＰ－フコースのフコースを内在化ラクトースに転移させ得るα１，２－フコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする組換え遺伝子と、ＧＤＰ－フコースへの生合成経路をコードする遺伝子とを含む。この発酵を、外部から添加したラクトースと、好適な炭素源（例えば、国際公開第２０１５／１９７０８２号パンフレットに係る炭素源）との存在下でこの株を培養することにより実施し、それにより発酵ブロス中の主要な炭水化物不純物としてのＤＦＬ及び未反応のラクトースを伴う２’－ＦＬが生成された。
発酵：２’－ＦＬ含有ブロスを、ＬａｃＺ－、ＬａｃＹ＋表現型の遺伝子改変大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を使用する発酵により生成し、前記株は、ＧＤＰ－フコースのフコースを内在化ラクトースに転移させ得るα１，２－フコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする組換え遺伝子と、ＧＤＰ－フコースへの生合成経路をコードする遺伝子とを含む。この発酵を、外部から添加したラクトースと、好適な炭素源（例えば、国際公開第２０１５／１９７０８２号パンフレットに係る炭素源）との存在下でこの株を培養することにより実施し、それにより発酵ブロス中の主要な炭水化物不純物としてのＤＦＬ及び未反応のラクトースを伴う２’－ＦＬが生成された。
【0186】
この発酵が完了した後、発酵ブロスを１０℃まで冷却し、ｐＨが４．０で安定するまで数時間かけて２５％硫酸溶液を添加した。
【0187】
得られたブロス（１６．６９ｋｇ）は、９９．８６ｇ／ｌの２’－ＦＬ、１１．４ｇ／ｌのラクトース及び３．６１ｇ／ｌのＤＦＬを含有し、導電率は、５．６５ｍＳ／ｃｍであり、及びＢＷＭ（生物湿塊）は、２８．３％であり、このＢＭＷを、室温での小さいブロスサンプルの遠心分離により得られる上清の除去後の湿った固体塊をこのブロスサンプルの初期質量で除算することにより算出する。
【0188】
ブロスの一部（約（ｃｃａ．）１０ｋｇ）を、１５ｋＤａセラミック膜を備えたＭＭＳ ＳＷ１８膜ろ過システムに移し、約４５分にわたり６０℃で平衡化した。バッチ限外ろ過をＴＭＰ＝６ｂａｒ及び０．９ｍ／ｓ クロスフロー速度で開始した。残りのブロスを少量ずつ添加した。供給量を約半分（濃縮係数、ＣＦ＝２）まで減少させた後、初期供給量と同量の水（１６．７ｋｇ、「１容量ＤＦ」）で透析ろ過（ＤＦ）を開始し、ＤＦ開始前の透過液流速とほぼ一致する５．４ｌ／ｈの流速で連続的に添加した。結果として、ＵＦ透過液２８．４５ｋｇを透明な褐色溶液として得、このＵＦ透過液は、５２．８ｇ／ｌの２’－ＦＬ、４．９４ｇ／ｌのラクトース、１．３３ｇ／ｌのＤＦＬ及び２６．３ｍｇ／ｌのタンパク質を含有し、Ｂｒｉｘは、８．５であり、導電率は、５．９６ｍＳ／ｃｍであり、ｐＨは、４．４３であった。２’－ＦＬの回収率は、９６％であった。
【0189】
得られたＵＦ透過液（２８．４２ｋｇ）を、ｓｐｉｒａｌ－ｗｏｕｎｄ Ｔｒｉｓｅｐ－ＵＡ６０ １８１２膜（仕様書によるとＭＷＣＯ １０００～３５００Ｄａ）を備えた別のＳＷ１８膜ろ過システムに分割して移した。ＮＦ透過液の回収を、ＮＦ透過液２０．３８ｋｇが０．９のＢｒｉｘで回収されるまでＴＭＰ＝３５ｂａｒで開始した。保持液のｐＨを５０％ＮａＯＨ溶液１０ｍｌで４．３から５．５に調整した。この時点で水２５ｋｇによる連続ＤＦを５．５ｌ／ｈの流速で開始した。このＤＦ中、ＴＭＰは、４０．０ｂａｒまで上昇し、温度は、４５℃で安定した。そのようにして得られた（第１の）ＮＦ保持液（５．７６ｋｇ、Ｂｒｉｘ ２７．７、ｄ＝１．１２ｇ／ｃｍ３、導電率３．０２ｍＳ／ｃｍ、ｐＨ５．６４）は、２０２．４３ｇ／ｌの２’－ＦＬ、７．２４ｇ／ｌのラクトース、７．６３ｇ／ｌのＤＦＬ及び１００．１ｍｇ／ｌのタンパク質を含有し、ラクトース／２’－ＦＬ比率は、最初のＵＦ透過液での９．４％から３．６％に低下した。他の低分子の量も効率的に減少した。同様に、凍結乾燥後の固体サンプル中の全２’－ＦＬ純度は、６２．４％（ＵＦ透過液中）から８２．６％（ＮＦ保持液）に改善された。算出した工程収率は、７８．６％であった。この収率を改善するために、ＤＦ透過液（２７．３０ｋｇ）を、上記で説明したように少量（約２．３１）に濃縮し、続いて水１０ｋｇによる透析ろ過により、同一のＮＦシステムで再処理して、第２のＮＦ保持液（１．３６５ｋｇ）を得た。第１のＮＦ保持液及び第２のＮＦ保持液を合わせた２’－ＦＬの回収率は、９４％であった。ＵＦ＋ＮＦ工程の２’－ＦＬ回収率は、７５．４％（第１のＮＦの再処理を行っていない）であり、これは、第１のＮＦ透過液の再処理により９０％まで改善された。
【0190】
第１のＮＦ保持液（５．７４ｋｇ）を、再生されたＤｏｗｅｘ ６６樹脂（弱アニオン交換体、第三級アミン、遊離塩基形態）０．８ｌが充填された別の１リットルカラムに接続された、再生されたＤｏｗｅｘ ８８樹脂（スルホン酸基を有する強カチオン交換体、Ｈ＋形態）０．８ｌが充填されたチューブ内径５ｃｍの１リットルカラムに約２．４ｌ／ｈの流速で通過させた。最初の空隙容量６４０ｍｌを廃棄し、続いて主要画分を回収した。全ての供給溶液が消費された後、脱イオン水 約１．６ｌによる溶出を同一の流速で継続した。回収した主要画分は、重量が６７６０ｇであり（密度１．０９、Ｂｒｉｘ ２１．８、導電率０．１５２ｍＳ／ｃｍ、ｐＨ６．２１）、１８０．１７ｇ／ｌの２’－ＦＬ、５．９７ｇ／ｌのラクトース、６．２ｇ／ｌのＤＦＬ及びわずか０．９ｍｇ／ｌのタンパク質を含有し、２’－ＦＬの回収は、ほぼ定量的であった。加えて、導電率の低下から、塩含有量の９５％超の減少が推定され、色も暗褐色から淡黄色に大幅に薄くなった。同様の供給量及び組成による別の実行では、４００ｎｍでのＵＶ吸光により、ＮＦ保持液での＞３．０から脱塩後の０．４４までの色の減少を定量した。有効性を説明すると、樹脂による負荷は、全固形物に関して約２ｋｇ／ｌの湿潤樹脂であり、且つ２’－ＦＬに関して約１．４ｋｇ／ｌの湿潤樹脂であった。ＮＦ工程が１５０～３００ｋＤａのＭＷＣＯのＮＦ膜により実施された場合、色及び導電率の同一の低下を達成するために、少なくとも５倍超の樹脂（１／５以下の負荷を意味する）が必要である。
【0191】
上記の脱塩工程で得られた淡黄色溶液（６．７４ｋｇ）を、水に懸濁されてヒートジャケット付ＧＥ ＸＫ－１６／１００カラムに充填された顆粒活性炭（８８ｇ、供給物中の総固形物に対して６ｗ／ｗ％）に６０℃及び１．５ｌ／ｈの流速で通過させ、続いて、脱イオン水２００ｍｌを通過させて、無色透明溶液（６９１９ｇ、密度１．０８６、Ｂｒｉｘ ２０．７、導電率０．１６ｍＳ／ｃｍ、ｐＨ６．１）を得、この溶液は、１７４．６５ｇ／ｌの２’－ＦＬ、５．６０ｇ／ｌのラクトース、５．９５ｇ／ｌのＤＦＬ及び＜１ｍｇ／ｌのタンパク質を含有し、２’－ＦＬの収率は、ほぼ定量的であった。同様の供給量及び組成による別の実行では、４００ｎｍでのＵＶ吸光により色の減少を定量して、供給物での０．４４から炭クロマトグラフィー後の０．０１までの色の大幅な減少を得た。
【0192】
前工程からの溶液を減圧下で３．４５ｋｇ（Ｂｒｉｘ ４１．６）まで濃縮し、この溶液のｐＨを少量の３７％ＨＣｌ溶液によりｐＨ＝６．５から４．８３に調整した。得られた濃縮シロップを２００ｎｍフィルタにより滅菌ろ過し、脱イオン水で洗浄した。そのようにして得られたシロップ（３．９７ｋｇ、Ｂｒｉｘ ３６．２）を７部に分けて凍結乾燥させて最終生成物１４０５ｇを得、この最終生成物を移して粉砕して白色粉体を得、この白色粉体は、下記を含有した：８６．０７％の２’－ＦＬ、３．８３％のラクトース、４．７５％のＤＦＬ及び２．８１％の残留水；タンパク質＜０．００１７％、カリウム＜１０ｍｇ／ｋｇ、マグネシウム＜５ｍｇ／ｋｇ、ナトリウム２２０ｍｇ／ｋｇ、銅＜０．１ｍｇ／ｋｇ、鉄＜０．５ｍｇ／ｋｇ、マンガン＜０．１ｍｇ／ｋｇ、鉛＜０．０１ｍｇ／ｋｇ、亜鉛０．２ｍｇ／ｋｇ、アンモニウム＜５０ｍｇ／ｋｇ、リン酸塩＜５０ｍｇ／ｋｇ、硫酸塩２０ｍｇ／ｋｇ、塩化物２８２ｍｇ／ｋｇ、硫酸塩灰分０．０９％、エンドトキシン０．００３ＥＵ／ｍｇ、総プレート数（微生物学的パラメータ）＜１０ｃｆｕ／ｇ。
【0193】
［実施例２］
２’－ＦＬ発酵ブロスのいくつかのサンプルを、室温で撹拌しつつ２５％Ｈ２ＳＯ４溶液の添加によりｐＨ調整し、ｐＨを２０分にわたる平衡後及び２時間後に測定した。得られた液体のサンプルを室温で遠心分離し、他のサンプルを１０分にわたり６０℃で恒温した後、室温で遠心分離した。得られた上清を可溶性タンパク質含有量に関してＢｒａｄｆｏｒｄ試験により分析した。結果を下記の表にまとめる。結果として、低いｐＨ（＜４）及び中程度の加熱処理（６０℃）の組み合わせにより、未処理ブロスと比較して、可溶性タンパク質の量を最大０．１部減少させ得る。
２’－ＦＬ発酵ブロスのいくつかのサンプルを、室温で撹拌しつつ２５％Ｈ２ＳＯ４溶液の添加によりｐＨ調整し、ｐＨを２０分にわたる平衡後及び２時間後に測定した。得られた液体のサンプルを室温で遠心分離し、他のサンプルを１０分にわたり６０℃で恒温した後、室温で遠心分離した。得られた上清を可溶性タンパク質含有量に関してＢｒａｄｆｏｒｄ試験により分析した。結果を下記の表にまとめる。結果として、低いｐＨ（＜４）及び中程度の加熱処理（６０℃）の組み合わせにより、未処理ブロスと比較して、可溶性タンパク質の量を最大０．１部減少させ得る。
【0194】
【表1】
【0195】
［実施例３］
実施例１で説明したように２０ｌスケールで生成したいくつかの２’－ＦＬ発酵ブロスを様々なｐＨ値に調整し、実施例１で説明したのと同一の６０℃でのＵＦ条件下で処理した。ＵＦ透過液中のタンパク質含有量は、ｐＨ調整なしのｐＨ＝６．３でのＵＦ実行と比較して、ｐＨ＝３．８で５倍減少しており、これは、実施例２で得られた同様のｐＨ値での上清中のタンパク質の減少と一致する。さらに、ｐＨ５．８及び６．３では、タンパク質含有量の差違をほとんど観察しなかったが、ｐＨ３．８対ｐＨ４．３５では、２倍のタンパク質減少が達成され得た。
実施例１で説明したように２０ｌスケールで生成したいくつかの２’－ＦＬ発酵ブロスを様々なｐＨ値に調整し、実施例１で説明したのと同一の６０℃でのＵＦ条件下で処理した。ＵＦ透過液中のタンパク質含有量は、ｐＨ調整なしのｐＨ＝６．３でのＵＦ実行と比較して、ｐＨ＝３．８で５倍減少しており、これは、実施例２で得られた同様のｐＨ値での上清中のタンパク質の減少と一致する。さらに、ｐＨ５．８及び６．３では、タンパク質含有量の差違をほとんど観察しなかったが、ｐＨ３．８対ｐＨ４．３５では、２倍のタンパク質減少が達成され得た。
【0196】
［実施例４］
ＬＮｎＴを、国際公開第２０１７／１８２９６５号パンフレットで開示されている遺伝子改変大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を使用する発酵により製造し、それにより中間体ラクト－Ｎ－トリオースＩＩ、ｐＬＮｎＨ及び未反応のラクトースを伴うＬＮｎＴを含有するブロスが生成された。
ＬＮｎＴを、国際公開第２０１７／１８２９６５号パンフレットで開示されている遺伝子改変大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を使用する発酵により製造し、それにより中間体ラクト－Ｎ－トリオースＩＩ、ｐＬＮｎＨ及び未反応のラクトースを伴うＬＮｎＴを含有するブロスが生成された。
【0197】
得られたブロスをｐＨ＝５．０に調整して３等分した。各部を、それぞれ実施例１での２’－ＦＬに関して説明されたのと同一の方法（ＣＦ＝２．０までの濃縮、続いて最初の供給量に対する１容量の水によるＤＦを含む）で４０℃、５０℃及び６０℃での５０ｎｍセラミック膜によるバッチモードのＵＦにより処理した。ＬＮｎＴの収率及びＵＦ透過液中のタンパク質含有量を下記の表にまとめる。
【0198】
【表2】
【国際調査報告】