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特表2022-550794消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを製造するためのキットおよび方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-12-05
(54)【発明の名称】消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを製造するためのキットおよび方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/00 20060101AFI20221128BHJP
C12N 5/071 20100101ALI20221128BHJP
C12M 3/00 20060101ALI20221128BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20221128BHJP
【ＦＩ】
C12N1/00 F
C12N5/071
C12M3/00 Z
C12M1/00 A
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022520037
(86)(22)【出願日】2020-09-29
(85)【翻訳文提出日】2022-05-25
(86)【国際出願番号】 US2020053181
(87)【国際公開番号】W WO2021067211
(87)【国際公開日】2021-04-08
(31)【優先権主張番号】62/909,963
(32)【優先日】2019-10-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/056,898
(32)【優先日】2020-07-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】397068274
【氏名又は名称】コーニング インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100073184
【弁理士】
【氏名又は名称】柳田 征史
(74)【代理人】
【識別番号】100175042
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 秀明
(72)【発明者】
【氏名】フェリー，アン ミージン
(72)【発明者】
【氏名】ゴラール，ヴァシリー ニコラエヴィチ
【テーマコード（参考）】
4B029
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B029AA08
4B029BB11
4B029CC01
4B029CC02
4B029GA02
4B029GB09
4B065AA93X
4B065BC46
4B065CA44
4B065CA46
(57)【要約】
カルシウムを含まないまたはカルシウムキレート化された細胞培養培地中でスフェロイド安定化ヒドロゲルを製造するためのキットは、（ａ）（ｉ）ペクチン酸もしくはその塩、または（ｉｉ）約１～約４０モル％のエステル化度を有する部分的にエステル化されたペクチン酸もしくはその塩のうちの少なくとも一方を含むポリガラクツロン酸（ＰＧＡ）化合物またはアルギン酸化合物を含むゲル化剤と、（ｂ）二価イオンの塩を含む架橋剤と、（ｃ）ラクトン、エステル、または水溶液中で加水分解して１０分～１時間の期間にわたって酸を形成する他の化合物を含む、プロトン供与体とを含む。得られたスフェロイド安定化ヒドロゲルおよびそれを製造する方法。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
カルシウムを含まないまたはカルシウムキレート化された細胞培養培地中でスフェロイド安定化ヒドロゲルを製造するためのキットであって、（ａ）（ｉ）ペクチン酸もしくはその塩、または
（ｉｉ）約１～約４０モル％のエステル化度を有する部分的にエステル化されたペクチン酸もしくはその塩
のうちの少なくとも一方を含むポリガラクツロン酸（ＰＧＡ）化合物またはアルギン酸化合物を含むゲル化剤と、
（ｂ）二価イオンの塩を含む架橋剤と、
（ｃ）ラクトン、エステル、または水溶液中で加水分解して１０分～１時間の期間にわたって酸を形成する他の化合物を含む、プロトン供与体と
を含む、キット。
【請求項2】
前記ＰＧＡ化合物が、前記カルシウムを含まないまたはカルシウムキレート化された細胞培養培地と混合されており、または前記ＰＧＡ化合物が、前記カルシウムを含まないまたはカルシウムキレート化された細胞培養培地とは別個の溶液である、
請求項１記載のキット。
【請求項3】
前記架橋剤が、カルシウム塩であり、前記カルシウム塩が、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸カルシウム、またはこれらの組み合わせから選択され、かつ／または
前記カルシウム塩が、２５℃で０ｍｇ／Ｌ超～約２０ｍｇ／Ｌの水溶性を有する、
請求項１記載のキット。
【請求項4】
前記キットが、三次元（３Ｄ）細胞培養基材をさらに含み、前記３Ｄ細胞培養基材が、少なくとも１つの毛細管構造およびスフェロイド誘引幾何形状を含むマイクロウェルのアレイを有し、かつ／または
前記３Ｄ細胞培養基材が、細胞培養容器の少なくとも一部を含む、
請求項１記載のキット。
【請求項5】
前記キットが、スフェロイド容器；
スフェロイド安定化ヒドロゲルを分解するための消化剤であって、ペクチナーゼと、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＴＧＡ）、クエン酸、酒石酸、またはこれらの組み合わせから選択されるキレート剤とを含む、消化剤；または
これらの組み合わせ
を含む、請求項１記載のキット。
【請求項6】
消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを製造するための方法であって、前記方法が、ポリガラクツロン酸（ＰＧＡ）化合物が架橋剤およびプロトン供与体を介して架橋されて、前記消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを形成する条件下で、
（ａ）カルシウム塩を含む架橋剤およびグルコノラクトンを含むプロトン供与体を、
（ｉ）ペクチン酸もしくはその塩、または
（ｉｉ）約１～約４０モル％のエステル化度を有する部分的にエステル化されたペクチン酸もしくはその塩
のうちの少なくとも一方を含むＰＧＡ化合物またはアルギン酸化合物を含むゲル化剤を含む水性媒体と共に提供するステップ
を含む、方法。
【請求項7】
前記架橋剤および前記プロトン供与体を、前記ＰＧＡ化合物を含む前記ゲル化剤を含む前記水性媒体と共に提供するステップ（ａ）が、（１）前記架橋剤を、前記ＰＧＡ化合物を含む前記水性媒体と混合して、水溶液を形成するステップと、
（２）前記グルコノラクトンに前記水溶液を提供することにより、前記ＰＧＡ化合物の架橋を開始するステップと
を含む、請求項６記載の方法。
【請求項8】
前記消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルが、約１％重量／重量の、前記ペクチン酸である前記ＰＧＡ化合物と、
約２：１の前記プロトン供与体に対する前記架橋剤のモル比と
を含む、請求項６記載の方法。
【請求項9】
前記方法が、（ｂ）前記消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルがｉｎ ｓｉｔｕで形成されるように、前記消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルのゲル化前に、前記架橋剤、前記プロトン供与体、および（ａ）の前記ポリガラクツロン酸（ＰＧＡ）化合物を含む前記ゲル化剤を含む前記水性媒体と、スフェロイドを含む三次元（３Ｄ）細胞培養基材とを提供するステップ
をさらに含む、請求項６記載の方法。
【請求項10】
前記３Ｄ細胞培養基材が、少なくとも１つの毛細管構造およびスフェロイド誘引幾何形状を含むマイクロウェルのアレイを有し、前記スフェロイドが、前記マイクロウェルのアレイに配置されており、
前記提供するステップ（ｂ）が、前記架橋剤、前記プロトン供与体、および（ａ）の前記ポリガラクツロン酸（ＰＧＡ）化合物を含む前記ゲル化剤を含む前記水性媒体を、前記マイクロウェルのうちの少なくとも１つに適用するステップを含む、
請求項９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【0001】
本願は、米国特許法第１２０条のもと、２０１９年１０月３日に出願された米国仮特許出願第６２／９０９９６３号明細書および２０２０年７月２７日に出願された米国仮特許出願第６３／０５６８９８号明細書の優先権の利益を主張し、その内容に依拠するものであって、その内容全体を参照により本明細書に援用するものとする。
【技術分野】
【0002】
本開示は、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを製造するための方法および消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを製造するためのキットに関する。
【背景技術】
【0003】
三次元（以下、「３Ｄ」）細胞培養は、細胞が三次元で増殖しかつ／または相互作用（主に互いに）することを可能にする、人工的に作製された環境である。３Ｄ細胞培養は、二次元（以下、「２Ｄ」）細胞培養単層と比較して、組織の天然の微小環境をより密接に模倣する向上した細胞－細胞相互作用を提供する。例えば、２Ｄ細胞培養単層で増殖させた細胞は、それらが培養される基材に付着する場合があるが、３Ｄ細胞培養で増殖させた細胞は、それらが培養される基材に付着するのではなく、互いに相互作用する場合がある。
【0004】
過去１０年間に、３Ｄ細胞培養は、多種多様なガン性および非ガン性細胞系統をスフェロイドまたは３Ｄ細胞コロニーに成長させるために使用されてきた。スフェロイドは、創薬、毒性学および再生医療の分野において、３Ｄ組織モデリングに使用されている。スフェロイド誘引幾何形状を有する多くの３Ｄ細胞培養基材が開発されてきたが、このような３Ｄ細胞培養基材上に生成されたスフェロイドの輸送は困難となりうる。例えば、スフェロイドは、中程度の期間（例えば、約１時間）でも、直接的なスフェロイド－スフェロイド接触が確立される場合、一緒に融合する傾向を示すため、個々のスフェロイドが物理的に分離されていない３Ｄ細胞培養基材中で輸送されるスフェロイドは、スフェロイド凝集体の形成を生じさせうる。さらに、個々のスフェロイドが物理的に分離されている３Ｄ細胞培養基材中で輸送されるスフェロイドも、輸送中のスフェロイドの変位により、スフェロイド凝集体の形成を生じさせうる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
したがって、輸送中のスフェロイドを安定化させる継続的な必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【0006】
実施形態において、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルが開示される。消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルは、（ａ）（ｉ）ペクチン酸もしくはその塩、または（ｉｉ）約１～約４０モル％のエステル化度を有する部分的にエステル化されたペクチン酸もしくはその塩のうちの少なくとも一方を含むポリガラクツロン酸（以下、ＰＧＡ）化合物を含むゲル化剤またはアルギン酸化合物を含むゲル化剤と、（ｂ）二価カチオンの塩を含む架橋剤と、（ｃ）ラクトン、エステル、または水溶液中で加水分解して１０分～１時間の期間にわたって酸を形成する他の化合物を含む、プロトン供与体とを含む。
【0007】
他の実施形態では、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを製造するための方法が開示される。この方法は、（ａ）架橋剤およびプロトン供与体を、（ｉ）ペクチン酸もしくはその塩、または（ｉｉ）約１～約４０モル％のエステル化度を有する部分的にエステル化されたペクチン酸もしくはその塩のうちの少なくとも一方を含むＰＧＡ化合物またはアルギン酸化合物を含むゲル化剤を含む水性媒体と共に提供するステップを含み、架橋剤が二価イオンの塩を含み、プロトン供与体がラクトン、エステル、または他のゆっくり分解する酸、例えばグルコノラクトンを含む。架橋剤およびプロトン供与体は、ＰＧＡ化合物が架橋剤およびプロトン供与体を介して架橋されて、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを形成する条件下で、ＰＧＡ化合物を含む水性媒体と共に提供される。
【0008】
さらに他の実施形態では、カルシウムを含まないまたはカルシウムキレート化された細胞培養培地中でスフェロイド安定化ヒドロゲルを製造するためのキットが提供される。このキットは、（ａ）（ｉ）ペクチン酸もしくはその塩、または（ｉｉ）約１～約４０モル％のエステル化度を有する部分的にエステル化されたペクチン酸もしくはその塩のうちの少なくとも一方を含むポリガラクツロン酸（ＰＧＡ）化合物またはアルギン酸を含むゲル化剤と、（ｂ）二価イオンの塩を含む架橋剤と、（ｃ）ラクトン、エステル、または水溶液中で加水分解して１０分～１時間の期間にわたって酸を形成する他の化合物を含む、プロトン供与体とを含む。
【0009】
前述の一般的な説明および以下の詳細な説明の両方により、種々の実施形態が説明され、特許請求される主題の性質および特徴を理解するための概観またはフレームワークを提供することを意図していると理解されたい。添付の図面は、種々の実施形態の更なる理解を提供するために含まれ、本明細書に組み込まれ、その一部を構成する。図面は、本明細書に記載された種々の実施形態を示し、説明と共に、特許請求される主題の基本方式および動作を説明する役割を果たす。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1A】消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルの調製を示す模式図であり、ここで、スフェロイドは、細胞培養培地中において、３Ｄ細胞培養基材（すなわち、３Ｄ細胞培養フラスコ）中で培養される。
【図1C】消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルの調製を示す模式図であり、ここで、消化性ＰＧＡスフェロイド安定化ヒドロゲルは、図１Ｂの３Ｄ細胞培養フラスコ中で培養されたスフェロイドに重ねられた配置で提供される。
【図2A】消化性ＰＧＡスフェロイド安定化ヒドロゲルの消化を示す模式図であり、ここで、消化性ＰＧＡスフェロイド安定化ヒドロゲルは、３Ｄ細胞培養フラスコ中で培養されたスフェロイドに重ねられた配置で提供される。
【図3A】消化性ＰＧＡスフェロイド安定化ヒドロゲルを含まないライボビッツＬ－１５培地中において、２Ｄ細胞培養単層上で増殖させた対照ＨｅｐＧ２細胞の明視野画像である。
【図3B】消化性ＰＧＡスフェロイド安定化ヒドロゲルを含まないライボビッツＬ－１５培地中において、２Ｄ細胞培養単層上で増殖させ、赤色蛍光エチジウムホモダイマーおよび緑色蛍光カルセインＡＭで同時に染色された、生きた対照ＨｅｐＧ２細胞の蛍光画像である。
【図3C】消化性ＰＧＡスフェロイド安定化ヒドロゲルを含まないライボビッツＬ－１５培地中において、２Ｄ細胞培養単層上で増殖させ、赤色蛍光エチジウムホモダイマーおよび緑色蛍光カルセインＡＭで同時に染色された、死んだ対照ＨｅｐＧ２細胞の蛍光画像である。
【図4A】重ねられた消化性ＰＧＡスフェロイド安定化ヒドロゲル（１％重量／重量のペクチン酸）を含むライボビッツＬ－１５培地中において、２Ｄ細胞培養単層上で増殖させたＨｅｐＧ２細胞の明視野画像である。
【図4B】重ねられた消化性ＰＧＡスフェロイド安定化ヒドロゲル（１％重量／重量のペクチン酸）を含むライボビッツＬ－１５培地中において、２Ｄ細胞培養単層上で増殖させ、赤色蛍光エチジウムホモダイマーおよび緑色蛍光カルセインＡＭで同時に染色された、生きたＨｅｐＧ２細胞の蛍光画像である。
【図4C】重ねられた消化性ＰＧＡスフェロイド安定化ヒドロゲル（１％重量／重量のペクチン酸）を含むライボビッツＬ－１５培地中において、２Ｄ細胞培養単層上で増殖させ、赤色蛍光エチジウムホモダイマーおよび緑色蛍光カルセインＡＭで同時に染色された、死んだ対照ＨｅｐＧ２細胞の蛍光画像である。
【図5A】消化性ＰＧＡスフェロイド安定化ヒドロゲルを含まないライボビッツＬ－１５培地中において、３Ｄ細胞培養基材上で増殖させた対照ＨｅｐＧ２スフェロイドの明視野画像である。
【図5B】消化性ＰＧＡスフェロイド安定化ヒドロゲルを含まないライボビッツＬ－１５培地中において、３Ｄ細胞培養基材上で増殖させ、赤色蛍光エチジウムホモダイマーおよび緑色蛍光カルセインＡＭで同時に染色された、生きた対照ＨｅｐＧ２スフェロイドの蛍光画像である。
【図5C】消化性ＰＧＡスフェロイド安定化ヒドロゲルを含まないライボビッツＬ－１５培地中において、３Ｄ細胞培養基材上で増殖させ、赤色蛍光エチジウムホモダイマーおよび緑色蛍光カルセインＡＭで同時に染色された、死んだ対照ＨｅｐＧ２スフェロイドの蛍光画像である。
【図6A】重ねられた消化性ＰＧＡスフェロイド安定化ヒドロゲル（１％重量／重量のペクチン酸）を含むライボビッツＬ－１５培地中において、３Ｄ細胞培養基材上で増殖させたＨｅｐＧ２スフェロイドの明視野画像である。
【図6B】重ねられた消化性ＰＧＡスフェロイド安定化ヒドロゲル（１％重量／重量のペクチン酸）を含むライボビッツＬ－１５培地中において、３Ｄ細胞培養基材上で増殖させ、赤色蛍光エチジウムホモダイマーおよび緑色蛍光カルセインＡＭで同時に染色された、生きたＨｅｐＧ２スフェロイドの蛍光画像である。
【図6C】重ねられた消化性ＰＧＡスフェロイド安定化ヒドロゲル（１％重量／重量のペクチン酸）を含むライボビッツＬ－１５培地中において、３Ｄ細胞培養基材上で増殖させ、赤色蛍光エチジウムホモダイマーおよび緑色蛍光カルセインＡＭで同時に染色された、死んだ対照ＨｅｐＧ２スフェロイドの蛍光画像である。
【図7A】落下試験の実行後での、消化性ＰＧＡスフェロイド安定化ヒドロゲルを含まないライボビッツＬ－１５培地中において、３Ｄ細胞培養基材上で増殖させた対照ＨｅｐＧ２スフェロイドの明視野画像である。
【図7B】落下試験の実行後での、消化性ＰＧＡスフェロイド安定化ヒドロゲルを含まないライボビッツＬ－１５培地中において、３Ｄ細胞培養基材上で増殖させ、赤色蛍光エチジウムホモダイマーおよび緑色蛍光カルセインＡＭで同時に染色された、生きた対照ＨｅｐＧ２スフェロイドの蛍光画像である。
【図7C】落下試験の実行後での、消化性ＰＧＡスフェロイド安定化ヒドロゲルを含まないライボビッツＬ－１５培地中において、３Ｄ細胞培養基材上で増殖させ、赤色蛍光エチジウムホモダイマーおよび緑色蛍光カルセインＡＭで同時に染色された、死んだ対照ＨｅｐＧ２スフェロイドの蛍光画像である。
【図8A】落下試験の実行後での、重ねられた消化性ＰＧＡスフェロイド安定化ヒドロゲル（１％重量／重量のペクチン酸）を含むライボビッツＬ－１５培地中において、３Ｄ細胞培養基材上で増殖させたＨｅｐＧ２スフェロイドの明視野画像である。
【図8B】落下試験の実行後での、重ねられた消化性ＰＧＡスフェロイド安定化ヒドロゲル（１％重量／重量のペクチン酸）を含むライボビッツＬ－１５培地中において、３Ｄ細胞培養基材上で増殖させ、赤色蛍光エチジウムホモダイマーおよび緑色蛍光カルセインＡＭで同時に染色された、生きたＨｅｐＧ２スフェロイドの蛍光画像である。
【図8C】落下試験の実行後での、重ねられた消化性ＰＧＡスフェロイド安定化ヒドロゲル（１％重量／重量のペクチン酸）を含むライボビッツＬ－１５培地中において、３Ｄ細胞培養基材上で増殖させ、赤色蛍光エチジウムホモダイマーおよび緑色蛍光カルセインＡＭで同時に染色された、死んだ対照ＨｅｐＧ２スフェロイドの蛍光画像である。
【図9A】波形構成にあるスフェロイド含有細胞培養マイクロウェルのアレイを含む３Ｄ細胞培養基材を示す模式図である。
【図10】スフェロイド含有細胞培養マイクロウェルのアレイを含む３Ｄ細胞培養基材で微細パターン化された底面を有する培養フラスコを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0011】
本明細書で使用する場合、下記用語は、以下で説明される定義を有するものとする。
【0012】
本明細書で使用する場合、「消化性」なる用語は、ペクチン多糖類がその成分であるガラクツロン酸モノマー、ダイマーまたは他のオリゴマーに分解し（break down）かつ／または減成する（degrade）能力を指す。例えば、ペクチン多糖類含有スフェロイド安定化ヒドロゲルは、そのグリコシド結合の開裂を介して、例えば、１，４－α－Ｄ－ガラクツロン酸結合の開裂等を介して消化可能である。実施形態において、ペクチン多糖類含有スフェロイド安定化ヒドロゲルのペクチン多糖類を分解しかつ／または減成することにより、対照スフェロイドと比較して、例えば、重ねられたペクチン多糖類含有スフェロイド安定化ヒドロゲルを含まないスフェロイドの生存率および／またはその消化前の重ねられたペクチン多糖類含有スフェロイド安定化ヒドロゲルを含むスフェロイドの生存率と比較して、ペクチン多糖類含有スフェロイド安定化ヒドロゲルが重ねられたスフェロイドは、約９０％～約１００％の生存率で回収が可能となる。
【0013】
本明細書で使用する場合、「スフェロイド」なる用語は、３Ｄ増殖を可能にするように培養された細胞の凝集体、クラスターおよび／またはアセンブリを指す。例えば、単層等において２Ｄ増殖を可能にするように培養された細胞とは対照的に、スフェロイドは、３Ｄ構造を保持することができかつ／または組織の天然の微小環境をより密接に模倣することができる。
【0014】
本明細書で使用する場合、「安定化する」および「安定化」なる用語は、ペクチン多糖類含有ヒドロゲルが、力を印加された際に、標的位置においてスフェロイドを維持する能力を指す。例えば、３Ｄ細胞培養基材の文脈において、ペクチン多糖類含有ヒドロゲルは、力を印加された際に、標的マイクロウェルおよび／またはその標的毛細管構造において、スフェロイドを維持可能なように安定化している。別の例として、３Ｄ細胞培養基材の文脈において、ペクチン多糖類含有ヒドロゲルは、力を印加された際に、対照スフェロイドと比較して、例えば、重ねられたペクチン多糖類含有ヒドロゲルを含まない３Ｄ細胞培養基材の各標的マイクロウェルおよび／または毛細管構造にスフェロイドを配置する場合（約６０％のスフェロイドのみが各マイクロウェルにおいて保持される）等と比較して、各標的マイクロウェルおよび／またはその毛細管構造において、約９０％～約１００％のスフェロイドを維持可能であるように安定化している。
【0015】
本明細書で使用する場合、「ヒドロゲル」なる用語は、水および／または細胞培養培地で完全にまたは部分的に膨潤された半固体結合および／または架橋ペクチン多糖類マトリクスを指す。ペクチン多糖類マトリクスの結合および／または架橋は、例えば、イオン相互作用、共有結合、ファンデルワールス相互作用、水素結合、鎖絡み合い、および／または自己会合等を介した本質的に物理的かつ／または化学的なものであることができる。ヒドロゲルは、その乾燥重量の約３０％～１００００％の水および／または水相溶性アルコールを吸収可能である場合がある。
【0016】
本明細書で使用する場合、「向上させる」および「向上した」なる用語は、対照スフェロイドと比較して、３Ｄ細胞培養基材中で増殖され、ペクチン多糖類含有ヒドロゲルで覆われたスフェロイドの生存率の向上を指す。例えば、３Ｄ細胞培養基材中で増殖され、ペクチン多糖類含有ヒドロゲルで覆われ、４℃で２４時間培養されたスフェロイドは、対照スフェロイドと比較して、例えば、重ねられたペクチン多糖類含有スフェロイド安定化ヒドロゲルを含まない３Ｄ細胞培養基材中で増殖されたスフェロイドの生存率等と比較して、８４％少ない死んだ細胞を含有した。
【0017】
本明細書で使用する場合、「細胞培養培地」なる用語は、細胞の増殖、例えば、細胞の３Ｄ増殖等を支持する細胞を培養する文脈において使用される培地を指す。細胞培養培地は、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、プリン、ピリミジン、ヌクレオチド、リン脂質前駆体、ビタミン、エネルギー源（例えば、炭水化物）、無機イオン（例えば、カルシウム、マグネシウム、鉄、リン酸塩および／または硫酸塩）、塩、緩衝剤（例えば、リン酸塩および／または酢酸塩）、ｐＨ変化のインジケータ（例えば、フェノールレッドおよび／またはブロモ－クレゾールパープル）および／または水を含むことができる。細胞培養培地の成分を、ｉｎ ｖｉｖｏ環境を模倣するｐＨおよび／または塩濃度を含む場合がある緩衝溶液に提供することができる。実施形態において、細胞培養培地は、カルシウムを含まないまたはカルシウムキレート化された細胞培養培地を含む。特定の細胞培養培地の例は、イーグル基礎培地（以下、「ＢＭＥ」）、イーグル最小必須培地（すなわち、改変イーグル培地、以下、「ＭＥＭ」）、ダルベッコ改変イーグル培地（以下、「ＤＭＥＭ」）、ライボビッツＬ－１５培地（以下、「Ｌ－１５」）、Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ培地（以下、「ＲＰＭＩ」）、ダルベッコ改変イーグル培地：栄養混合物Ｆ－１２培地（以下、「ＤＭＥＭ／Ｆ１２」）、イスコフ改変ダルベッコ培地（以下、「ＩＭＤＭ」）、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ培地（以下、「ＮＣＴＣ」）および／または骨形成誘引培地（以下、「ＯＩＭ」）を含むが、これらに限定されるべきではない。カルシウムを含まない例は、Thermo FisherからのＤＭＥＭ（カタログ番号２１０６８０２８）を含む。
【0018】
本明細書で使用する場合、「ゲル化」なる用語は、ペクチン多糖類の結合および／または架橋を介したゲルの形成を指す。ゲル化により、ペクチン多糖類を含む液体から半固体結合および／または架橋ペクチン多糖類マトリックスの形成をもたらすことができる。ゲル化を、物理的結合および／または架橋ならびに／または化学的結合および／または架橋により生じさせることができる。
【0019】
本明細書で使用する場合、「重ねられた配置」なる用語は、３Ｄ細胞培養基材中のスフェロイドの集団への適用後にｉｎ ｓｉｔｕで形成されるペクチン多糖類含有ヒドロゲルを指す。例えば、ペクチン多糖類含有ヒドロゲルは、ペクチン多糖類マトリクスがそのゲル化前にかつペクチン多糖類含有ヒドロゲルを形成することに適した条件下で、ペクチン多糖類ヒドロゲルが３Ｄ細胞培養基材のマイクロウェルおよび／または毛細管構造中のスフェロイドの集団に適用される、重ねられた配置にある。
【0020】
ここから、図１Ｃ、図２Ａおよび図９Ａ～図１１を参照して、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルの実施形態を詳細に参照するものとする。その後、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを製造するための方法およびキットの実施形態を詳細に説明するものとする。
【0021】
Ｉ．消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル
実施形態において、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルが開示される。消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルは、（ａ）アルギン酸化合物、または（ｉ）ペクチン酸もしくはその塩または（ｉｉ）約１～約４０モル％のエステル化度を有する部分的にエステル化されたペクチン酸もしくはその塩のうちの少なくとも一方を含むＰＧＡ化合物を含むゲル化剤と、（ｂ）二価イオンの塩を含む架橋剤と、（ｃ）ラクトン、エステル、または水溶液中で加水分解して１０分～１時間の期間にわたって酸を形成する他の化合物を含む、プロトン供与体とを含みうる。
実施形態において、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルが開示される。消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルは、（ａ）アルギン酸化合物、または（ｉ）ペクチン酸もしくはその塩または（ｉｉ）約１～約４０モル％のエステル化度を有する部分的にエステル化されたペクチン酸もしくはその塩のうちの少なくとも一方を含むＰＧＡ化合物を含むゲル化剤と、（ｂ）二価イオンの塩を含む架橋剤と、（ｃ）ラクトン、エステル、または水溶液中で加水分解して１０分～１時間の期間にわたって酸を形成する他の化合物を含む、プロトン供与体とを含みうる。
【0022】
実施形態において、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルは、（ａ）ＰＧＡ化合物を含むゲル化剤を含む。ＰＧＡ化合物は、国際公開第２０１６／２００８８８号に記載されているとおりであることができる。同文献は、その内容全体を参照により本明細書に援用するものとする。実施形態において、ＰＧＡ化合物は、α－１，４－結合－Ｄ－ガラクツロン酸モノマーから構成されるペクチン多糖類である。ＰＧＡ化合物は、（ｉ）ガラクツロン酸のポリマーであるペクチン酸、（ｉｉ）カルボキシル基がエステル化されているガラクツロン酸のポリマーであるペクチン酸（すなわち、部分的にエステル化されたペクチン酸）および／または（ｉｉｉ）ペクチン酸および／またはペクチニン酸の塩を含むことができる。実施形態において、ペクチニン酸の塩は、ペクチネートである。
【0023】
一部の実施形態では、ゲル化剤は、アルギン酸塩化合物を含むことができる。アルギン酸塩化合物は、アルギン酸を含むことができ、アルギン酸は、（１－４）結合 β－Ｄ－マンヌロネート（Ｍ）およびそのＣ－５エピマー α－Ｌ－グルロネート（Ｇ）残基それぞれのホモポリマーブロック同士が種々の配列またはブロックで共有結合した直鎖コポリマーである。一部の実施形態では、アルギン酸塩は、アルギン酸の塩を含むことができる（例えば、アルギン酸ナトリウムは、アルギン酸のナトリウム塩であり、アルギン酸カリウムは、アルギン酸のカリウム塩である化合物である）。
【0024】
実施形態において、ＰＧＡ化合物は、ペクチン酸を含む。実施形態において、ペクチン酸は、下記式を有する。
【0025】
【化1】
【0026】
式Ｉ中、ｎの値は、使用されるペクチン酸に基づいて変化する場合がある。一部の実施形態では、ｎは、約１～約１００または約１００以上であることができる。一部の特定の実施形態では、ｎは、少なくとも約１であり、約５０以下、約４０以下、約３０以下または約２０以下であることができる。特定の実施形態では、ｎは、約８～約１６である。
【0027】
実施形態において、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルは、約１％重量／重量～約２％重量／重量または約１％重量／重量～約３％重量／重量または約１％重量／重量～約４％重量／重量または約１％重量／重量～約５％重量／重量または約１％重量／重量～約１０％重量／重量または約１％重量／重量のペクチン酸を含む。消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルは、用途に応じてより高い％重量／重量のペクチン酸を含むことができるが、このペクチン酸の増加により、ヒドロゲルの消化性に影響を与えうることが企図される。ペクチン酸は、一部のペクチンエステルの加水分解により形成されうる。ペクチンは、細胞壁多糖類であり、ペクチンの供給源は、柑橘類の皮およびリンゴの皮を含むが、これらに限定されるべきではない。実施形態において、ペクチンは、１，２－結合 Ｌ－ラムノースによりランダムに中断される１，４－結合 α－Ｄ－ガラクツロン酸骨格を有する主に直鎖ポリマーである。実施形態において、ペクチンの平均分子量は、約５００００ダルトン～約２０００００ダルトンの範囲であることができる。
【0028】
実施形態において、ＰＧＡ化合物は、ペクチニン酸（すなわち、部分的にエステル化されたペクチン酸）を含む。実施形態において、ペクチニン酸は、約１～約４０モル％または約５～約３０モル％または約１０～約２０モル％のエステル化度を有する。実施形態において、ＰＧＡ化合物は、約１～約４０モル％のエステル化度を有するペクチニン酸を含む。ペクチニン酸または部分的にエステル化されたペクチン酸を、メチル基でエステル化することができる。さらに、ペクチニン酸の遊離カルボキシル基を、一価イオン、例えば、ナトリウム、カリウムおよび／またはアンモニウムイオン等で部分的かつ／または完全に中和することができる。
【0029】
実施形態において、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルは、約０．５％重量／重量～約２％重量／重量または約０．７５％重量／重量～約１．７５％重量／重量または約１％重量／重量のペクチニン酸を含む。実施形態において、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルは、約０．５％重量／重量～約２％重量／重量または約０．７５％重量／重量～約１．７５％重量／重量または約１％重量／重量のメチル基でエステル化されたペクチニン酸を含む。
【0030】
実施形態において、ＰＧＡ化合物は、ペクチン酸および／またはペクチニン酸の塩を含む。ペクチン酸および／またはペクチニン酸の具体的な塩の例は、一価カチオンの塩、例えば、Ｎａ＋およびＫ＋の塩を含むことができるが、これらに限定されるべきではない。
【0031】
実施形態において、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルは、約０．５％重量／重量～約２％重量／重量または約０．７５％重量／重量～約１．７５％重量／重量または約１％重量／重量のペクチン酸および／またはペクチニン酸の塩を含む。
【0032】
実施形態において、ＰＧＡ化合物は、ペクチン酸、ペクチニン酸ならびに／またはペクチン酸および／もしくはペクチニン酸の塩の混合物を含む。代替的な実施形態では、ＰＧＡ化合物は、純粋なペクチン酸、ペクチニン酸またはこれらの塩を含む。実施形態において、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルは、ＰＧＡ化合物と相溶性ポリマーとのブレンドを含む。ＰＧＡ化合物とのブレンドに使用することができる特定の相溶性ポリマーの例は、デキストラン、置換セルロース誘導体、アルギン酸、デンプン、グリコーゲン、アラビノキシランおよび／もしくはアガロースから選択される多糖類；ヒアルロン酸および／もしくはコンドロイチン硫酸から選択されるグリコサミノグリカン；エラスチン、フィブロイン、コラーゲンおよび／もしくはこれらの誘導体から選択されるタンパク質ならびに／またはポリアルキレングリコール、ポリ（ヒドロキシアルキル（メタ）アクリレート）、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリ（Ｎ－ビニル－２－ピロリドン）、ポリビニルアルコールおよび／もしくはこれらの誘導体から選択される水溶性合成ポリマーを含むが、これらに限定されるべきではない。ポリマーは、ＰＧＡ化合物とのブレンド中へのそれらの包含が消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルの消化を損なわない場合、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル中で相溶性であると考えることができる。
【0033】
実施形態において、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルは、（ｂ）二価イオンの塩を含む架橋剤を含む。実施形態において、架橋剤は、カルシウム塩を含む。実施形態において、カルシウム塩は、炭酸カルシウム（すなわち、ＣａＣＯ３）、シュウ酸カルシウム（すなわち、ＣａＣ２Ｏ４）および／またはリン酸カルシウム（すなわち、Ｃａ３（ＰＯ４）２）から選択されるが、細胞に対して非毒性である他のカルシウム塩も企図される。実施形態において、カルシウム塩は、炭酸カルシウムである。酸性条件において解離可能で、低い溶解性を有する他の二価塩も企図される。実施形態において、カルシウム塩は、２５℃で約０ｍｇ／Ｌ超～約２０ｍｇ／Ｌまたは約３ｍｇ／Ｌ～約２０ｍｇ／Ｌまたは約６ｍｇ／Ｌ～約２０ｍｇ／Ｌの水溶性を有する。実施形態において、架橋剤は、イオン性架橋剤である。理論に拘束されるものではないが、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル中にイオン性架橋剤を包含させると、ＰＧＡのポリマー鎖が架橋されて、溶液中でゲルが形成されると考えられる。さらに、塩の低い溶解性により、混合時の早すぎるまたは瞬間的なゲル化が減少しまたは防止されると考えられる。
【0034】
実施形態において、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルは、（ｃ）ラクトン、エステル、または水溶液中で加水分解して１０分～１時間の期間にわたって酸を形成する他の化合物を含む、プロトン供与体を含む。実施形態において、プロトン供与体は、溶液内で二価イオンの塩を溶解させかつ／またはゆっくり放出させるための解離剤として作用する。例えば、架橋剤がカルシウム塩である実施形態では、プロトン供与体は、カルシウム塩、例えば、溶液内で炭酸カルシウムを溶解させかつ／またはＣａ２＋イオンをゆっくり放出させる解離剤として作用することができる。適切なプロトン供与体の例は、ラクトン、エステルまたは他のゆっくり溶解する酸、例えば、グルコノラクトン等を含む。実施形態において、プロトン供与体は、グルコノラクトンを含む。グルコノラクトンは、下記式を有する。
【0035】
【化2】
【0036】
実施形態において、ＰＧＡ化合物は、架橋剤およびプロトン供与体を介して架橋されて、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを形成する。実施形態において、架橋剤は、プロトン供与体に曝露されると、無機カルシウムイオン、すなわち、Ｃａ２＋の供給源を提供する。より具体的には、実施形態において、架橋剤は、グルコノラクトンに曝露された場合に、カルシウム塩、例えば、ＣａＣＯ３等の解離に際して、無機カルシウムイオンの供給源を提供する。実施形態において、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルは、約０．７：２～約１：２または約１：２～約１：２．３のプロトン供与体に対する架橋剤のモル比を含む。実施形態において、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルは、約１：２のプロトン供与体に対する架橋剤のモル比を含む。
【0037】
実施形態において、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルは、細胞の増殖を支持する細胞培養培地の成分をさらに含む。実施形態において、細胞培養培地の成分は、細胞の増殖、例えば、細胞の３Ｄ増殖等を支持し、ｉｎ ｖｉｖｏ環境を模倣するｐＨおよび／または塩濃度を含む。例えば、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルは、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、プリン、ピリミジン、ヌクレオチド、リン脂質前駆体、ビタミン、エネルギー源（例えば、炭水化物）、無機イオン（例えば、カルシウム、マグネシウム、鉄、リン酸塩および／または硫酸塩）、塩、緩衝剤（例えば、リン酸塩および／または酢酸塩）、ｐＨ変化のためのインジケータ（例えば、フェノールレッドおよび／またはブロモ－クレゾールパープル）および／または水を含むことができる。
【0038】
実施形態において、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルは、体積に基づいて、約５０％の水および５０％の細胞の増殖を支持する細胞培養培地～約０％の水および１００％の細胞培養培地または約５０％のＤＰＢＳおよび５０％の細胞培養培地～約１００％の細胞培養培地を含む。実施形態において、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルは、カルシウムを含まない細胞培養培地またはカルシウムキレート化された細胞培養培地を含む。
【0039】
図１Ｃ、図２Ａ、図９Ａおよび図９Ｂを参照すると、実施形態において、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００は、前述のように、スフェロイド５００を含む３Ｄ細胞培養基材１００と共に提供される。スフェロイドを形成することに適した３Ｄ細胞培養基材１００は、当業者に公知である。例えば、３Ｄ細胞培養基材１００は、国際公開第２０１６／０６９８９２号に記載されているようなものであることができる。同文献は、その内容全体を参照により本明細書に援用するものとする。更なる３Ｄ細胞培養基材１００は、米国特許出願公開第２００４／０１２５２６６号明細書、同第２０１２／００６４６２７号明細書、同第２０１４／０２２７７８４号明細書、同第２０１７／０２２６４５５号明細書、国際公開第２００８／１０６７７１号、同第２０１４／１６５２７３号に記載されているようなものであることができる。これらの文献はそれぞれ、その内容全体を参照により本明細書に援用するものとする。
【0040】
実施形態において、３Ｄ細胞培養基材１００は、少なくとも１つのマイクロウェル１３０を画定するフレーム１１０を含む。実施形態において、３Ｄ細胞培養基材１００は、マイクロウェルのアレイ１５０を画定するフレーム１１０を含む。３Ｄ細胞培養基材１００の各マイクロウェル１３０は、少なくとも１つの側壁１３２（例えば、側壁）、ウェル底部１３４（例えば、最下点）および開口上部１３６（例えば、上部開口）を含むことができる。実施形態において、各マイクロウェル１３０は、水溶液、例えば細胞培養培地等を収容するように構成されている。実施形態において、３Ｄ細胞培養基材１００は、スフェロイド容器を含む。スフェロイド容器の例は、国際公開第２０１９／０１４６１０号に示されている。同文献は、参照により本明細書に援用される。
【0041】
図９Ａ～図９Ｂを参照すると、実施形態において、各マイクロウェル１３０は、スフェロイド誘引幾何形状１７０および／またはマイクロ毛細管構造１７０を有する。実施形態において、各マイクロウェル１３０は、スフェロイド誘引幾何形状１７０、例えば、丸みを帯びたウェル底部１３４（例えば、丸みを帯びたウェル底部１３４上に見られる半球または凹面）等を有する。実施形態において、スフェロイド誘引幾何形状１７０は、柱、不連続壁、丸みを帯びたウェル底部、窪んだウェル底部、ピットおよび／またはペン先領域から選択される。実施形態において、各マイクロウェル１３０は、培養中のスフェロイド５００の形成に役立つ環境を提供するようなスフェロイド誘引幾何形状１７０を含むように構造化されかつ／または配置される。
【0042】
図９Ａ～図９Ｂをさらに参照すると、実施形態において、各マイクロウェル１３０は、マイクロ毛細管構造１７０を有する。適切なマイクロ毛細管構造１７０の例は、口領域、隆起、裂け目、柱、不連続壁、波形壁、放物線状ウェル形状および／または洞様毛細管ウェル形状を含むが、これらに限定されるべきではない。実施形態において、マイクロ毛細管構造１７０により、溶液、例えば、液体溶液等をマイクロウェル１３０に導入する際に、空気の排出が容易になる。図９Ａ～図９Ｂに示されているように、実施形態において、各マイクロウェル１３０は、波形の側壁１３２を含む。このため、各マイクロウェル１３０が波形側壁１３２を含む実施形態では、３Ｄ細胞培養基材のマイクロウェルのアレイ１５０は、個々のマイクロウェル１３０の列を含む。実施形態において、波形側壁１３２は、溶液、例えば、液体溶液の導入の際に、空気が第１の（より狭い）領域からより広い第２の領域へと移動し、空気溜まりを回避するマイクロ毛細管構造１７０である。
【0043】
実施形態において、各マイクロウェル１３０は、例えばフレーム１１０、側壁１３２および／またはウェル底部１３４等の表面を含み、この表面は、細胞が３Ｄ細胞培養基材１００とではなく相互に作用して例えばスフェロイドを形成できるように、細胞に対して非接着性である。３Ｄ細胞培養基材１００のこのような表面を形成しかつ／または適用することができる非接着性材料の例は、ペルフルオロ化ポリマー、オレフィン、アガロースならびに／または非イオン性ヒドロゲル、例えば、ポリアクリルアミド、ポリエーテル、例えば、ポリエチレンオキシドおよびポリオール、例えば、ポリビニルアルコール等を含むが、これらに限定されるべきではない。
【0044】
実施形態において、各マイクロウェル１３０は、マイクロウェル１３０がウェル底部１３４まで収縮しかつ／または狭くなる、より開口した領域を提供する開口上部１３６に隣接する口領域を有する。実施形態において、開口上部１３６の口領域により、その中に導入された溶液がウェル底部１３４に流れることが可能となり、ウェル底部１３４での細胞の凝集およびスフェロイドの形成が促進される。加えて、開口上部１３６の口領域により、口領域間の環状内部表面と側壁１３２との間に移行部が形成され、これにより、マイクロウェル１３０内の空気溜まりを防止することができる幾何構造を提供することができる。実施形態において、口領域により、９０°の角度ではない、開口上部１３６と側壁１３２との間の移行部が提供され、これにより、マイクロウェル１３０内の気泡の形成を低減することができる。一部の実施形態では、側壁１３２の高さ（例えば、開口上部１３６からウェル底部１３４まで）は、開口上部１３６の口領域におけるマイクロウェル１３０の直径の１００％以上である。一部の実施形態では、側壁１３２の高さ（例えば、開口上部１３６からウェル底部１３４まで）は、開口上部１３６の口領域におけるマイクロウェル１３０の直径の約１００％～約４００％または約１１０％～約３７５％または約１２０％～約３５０％または約１３０％～約３２５％または約１４０％～約３００％または約１５０％～約２７５％または約１６０％～約２５０％または約１７０％～約２２５％または約１８０％～約２００％または約１９０％である。
【0045】
図１０～図１１を参照すると、実施形態において、３Ｄ細胞培養基材１００は、細胞培養容器７００を含みかつ／または細胞培養容器７００にその一部として含まれる。例えば、細胞培養容器７００は、その表面として３Ｄ細胞培養基材１００を含むことができる。細胞培養容器７００を、多層プレート、ディッシュ、フラスコ、チューブ、多層フラスコ、軟質側フラスコおよび／またはバッグから選択することができる。
【0046】
図１０に示されているように、実施形態において、細胞培養容器７００はフラスコである。フラスコは、上面７１０と、３Ｄ細胞培養基材１００から上面７１０まで延在する少なくとも１つの側壁７３０と、上面７１０、少なくとも１つの側壁７３０および／または３Ｄ細胞培養基材１００により画定される細胞培養チャンバ７５０とを含むことができる。実施形態において、フラスコはポート７７０を含む。更なる実施形態では、フラスコは、スクリュートップ７９０を有するポート７７０を含む。ポート７７０は、上面７１０、少なくとも１つの側壁７３０および／または３Ｄ細胞培養基材１００により画定することができる。実施形態において、ポート７７０は、適切な配管および／または接続部の使用を介して、細胞培養チャンバ７５０との間で細胞および／または細胞培養培地を除去するように機能する。
【0047】
実施形態において、３Ｄ細胞培養基材１００を、ガラス、ポリカーボネート、ポリメチルペンテン、Ｋ樹脂、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、ポリスチレンブタジエンコポリマー、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ環状オレフィン、ポリ塩化ビニル、ポリスルホン、フルオロポリマー、ポリアミド、完全水素化スチレンポリマー、ポリカーボネートポリジメチルシロキサン（すなわち、ＰＤＭＳ）コポリマーおよび／または環状オレフィンコポリマーを含むが、これらに限定されない材料から形成することができる。
【0048】
実施形態において、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００は、スフェロイド５００を含む３Ｄ細胞培養基材１００を備える。実施形態において、スフェロイド５００は、３Ｄ細胞培養基材１００のマイクロウェルアレイ１５０内に配置される。実施形態において、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００は、スフェロイド５００が消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００で覆われるように、スフェロイド５００を含む３Ｄ細胞培養基材１００を備える。実施形態において、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００により、３Ｄ細胞培養基材１００中でのスフェロイド５００の生存率が向上しかつ／または３Ｄ細胞培養基材１００中の標的位置においてスフェロイド５００が安定化される。例えば、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００が、スフェロイド５００を含む３Ｄ細胞培養基材１００を備える場合、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００により、スフェロイド５００が消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００の適用前に形成されかつ／または配置された同じマイクロウェル１３０内に残るように、３Ｄ細胞培養基材１００内の標的マイクロウェル１３０における個々のスフェロイド５００を安定化させることができる。
【0049】
実施形態において、スフェロイド５００を、天然の細胞タイプおよび／または遺伝的に改変された細胞タイプから形成することができる。実施形態において、スフェロイド５００は、体細胞、幹細胞、前駆細胞、例えば、胚性幹細胞等および／または誘導多能性幹細胞から、任意の所望の分化状態、例えば、多能性、多分化性、決定された運命および／または不死化の状態で形成される。実施形態において、スフェロイド５００は、疾患細胞および／または疾患モデル細胞、例えば、ガン性細胞および／または過剰増殖状態に誘引された形質転換細胞等から形成される。
【0050】
実施形態において、スフェロイド５００は、副腎；膀胱；血管；骨；骨髄；脳；軟骨；子宮頸管；子宮内膜；食道；胃腸；免疫系、例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、白血球、マクロファージおよび／もしくは樹状細胞等；肝臓；肺；リンパ管；筋肉、例えば心筋等；神経；卵巣；膵臓、例えば島細胞等；下垂体；前立腺；腎臓；唾液；皮膚；腱；精巣；ならびに／または甲状腺細胞を含むが、これらに限定されない、任意の所望の組織および／または臓器タイプに由来する細胞から形成される。実施形態において、スフェロイド５００は、肝細胞から形成される。実施形態において、スフェロイド５００は、ほ乳類細胞、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ニワトリ、ヤギおよび／またはウマ等の細胞から形成される。実施形態において、スフェロイド５００は、３Ｄ細胞増殖を可能にするように培養された１種以上の細胞タイプから形成される。実施形態において、スフェロイド５００は、単一の細胞タイプおよび／または細胞タイプの混合物から形成される。
【0051】
消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００の実施形態を詳細に記載してきた。ここから、図１Ａ～図２Ｃを参照して、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００を製造するための方法の実施形態を詳細に参照するものとする。その後、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００を製造するためのキットの実施形態を詳細に説明するものとする。
【0052】
ＩＩ．消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを製造するための方法
実施形態において、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００を製造するための方法が開示される。この方法は、（ａ）架橋剤およびプロトン供与体を、（ｉ）ペクチン酸もしくはその塩、または（ｉｉ）約１～約４０モル％のエステル化度を有する部分的にエステル化されたペクチン酸もしくはその塩のうちの少なくとも一方を含むＰＧＡ化合物またはアルギン酸化合物を含むゲル化剤を含む水性媒体と共に提供するステップを含むことができ、架橋剤が二価イオンの塩を含み、プロトン供与体がラクトン、エステル、または水溶液中で加水分解して１０分～１時間の期間にわたって酸を形成する他の化合物を含む。架橋剤およびプロトン供与体は、ＰＧＡ化合物が架橋剤およびプロトン供与体を介して架橋されて、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００を形成する条件下で、ＰＧＡ化合物を含むゲル化剤を含む水性媒体と共に提供される。
実施形態において、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００を製造するための方法が開示される。この方法は、（ａ）架橋剤およびプロトン供与体を、（ｉ）ペクチン酸もしくはその塩、または（ｉｉ）約１～約４０モル％のエステル化度を有する部分的にエステル化されたペクチン酸もしくはその塩のうちの少なくとも一方を含むＰＧＡ化合物またはアルギン酸化合物を含むゲル化剤を含む水性媒体と共に提供するステップを含むことができ、架橋剤が二価イオンの塩を含み、プロトン供与体がラクトン、エステル、または水溶液中で加水分解して１０分～１時間の期間にわたって酸を形成する他の化合物を含む。架橋剤およびプロトン供与体は、ＰＧＡ化合物が架橋剤およびプロトン供与体を介して架橋されて、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００を形成する条件下で、ＰＧＡ化合物を含むゲル化剤を含む水性媒体と共に提供される。
【0053】
実施形態において、この方法は、（ａ）架橋剤およびプロトン供与体を、ＰＧＡ化合物を含むゲル化剤を含む水性媒体と共に提供するステップを含む。架橋剤、プロトン供与体およびゲル化剤は、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００に関して前述したとおりである。より具体的には、架橋剤、プロトン供与体およびゲル化剤に利用される組成および量は、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００に関して前述したとおりである。例えば、架橋剤は、カルシウム塩であることができ、プロトン供与体は、グルコノラクトンであることができ、ＰＧＡ化合物を含むゲル化剤は、ペクチン酸であることができる。更なる例として、約２：１のプロトン供与体に対する架橋剤のモル比および約１％重量／重量のＰＧＡ化合物としてのペクチン酸を、水性媒体と共に提供することができる。
【0054】
実施形態において、この方法は、（ａ）架橋剤およびプロトン供与体を、ＰＧＡ化合物を含むゲル化剤を含む水性媒体と共に提供するステップを含む。実施形態において、水性媒体は、細胞培養培地を含む。実施形態において、細胞培養培地は、カルシウムを含まない細胞培養培地またはカルシウムキレート化された細胞培養培地を含む。実施形態において、細胞培養培地は、ＢＭＥ、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、Ｌ－１５、ＲＰＭＩ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＩＭＤＭ、ＮＣＴＣおよび／またはＯＩＭから選択される。実施形態において、細胞培養培地は、Ｌ－１５である。実施形態において、細胞培養培地は、この方法を、適切な細胞培養ｐＨを維持するために、二酸化炭素、すなわち、ＣＯ２の添加を必要とせずに実施するように選択される。例えば、理論に拘束されるものではないが、水性媒体としてＬ－１５細胞培養培地を使用することにより、二酸化炭素を添加することなく、この方法を実施することが可能となると考えられる。細胞培養培地を、容器のサイズに応じて、架橋剤、プロトン供与体およびＰＧＡ化合物と共に、約３００μＬ～約１０ｍＬまたは約３００μＬ～約３ｍＬまたは約１ｍＬ～約１０ｍＬの体積で提供することができる。実施形態において、ＰＧＡ化合物は、細胞培養培地とは別個の溶液である。例えば、ＰＧＡ化合物を、カルシウムを含まない培地および／またはカルシウムキレート化された培地とは別個の溶液として提供することができる。実施形態において、ＰＧＡ化合物を、カルシウムを含まない培地および／またはカルシウムキレート化された培地とは別個の溶液として提供し、それらと混合することができる。
【0055】
実施形態において、架橋剤およびプロトン供与体は、ステップ（ａ）において、ＰＧＡ化合物が架橋剤およびプロトン供与体を介して架橋されて、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００を形成する条件下で、ＰＧＡ化合物を含むゲル化剤を含む水性媒体と共に提供される。実施形態において、ＰＧＡ化合物が架橋剤およびプロトン供与体を介して架橋される条件は、この方法の成分、すなわち、反応物の量および／もしくは濃度、この方法の温度、この方法のｐＨ、利用される混合方法、体積、反応物の純度ならびに／またはこの方法の反応時間を含むが、これらに限定されるべきではない。実施形態において、この方法の成分の量および／または濃度は、前述のとおりである。実施形態において、この方法は、周囲温度および／または室温で実施される。一部の実施形態では、この方法は、約０℃～約３５℃または約５℃～３２℃の範囲の温度で実施される。実施形態において、この方法を、適切な細胞培養ｐＨを維持するように実施することができる。例えば、この方法を、約６．５～約８または約７～約７．５のｐＨを維持するように実施することができる。実施形態において、この方法を、ゲル化が起こるための反応時間で実施することができる。例えば、この方法を、容器の種類、重ねられる容器の数、ＰＧＡの濃度または封入されるスフェロイドの数に応じて、約３０秒～約５分以上の反応時間で実施することができる。理論に拘束されるものではないが、ゲル化が起こるための反応時間は、架橋剤および／またはプロトン供与体の量および／または濃度により決まる場合があると考えられる。例えば、架橋剤および／またはプロトン供与体のより少ない量および／またはより低い濃度により、ゲル化が起こるためのより長い反応時間がもたらされる場合がある。逆に、別の例として、架橋剤および／またはプロトン供与体のより多い量および／またはより高い濃度により、ゲル化が起こるためのより短い反応時間がもたらされる場合がある。さらに、ゲル化は、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００の表面での架橋により、拡散制限させることができることが留意される。
【0056】
ゲル化を、物理的および／または化学的結合および／または架橋を介して起こすことができる。実施形態において、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００のゲル化は、ＰＧＡ化合物のイオン結合および／または架橋を介して起こる。ＰＧＡ化合物のイオン結合および／または架橋を、イオン性架橋剤、例えば、カルシウム塩等の使用を介して達成することができる。消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００に関して前述されたように、架橋剤は、プロトン供与体への曝露時に、カルシウムイオン源を提供することができる。実施形態において、プロトン供与体、例えば、グルコノラクトンは、前述のように、架橋剤への暴露時に、ｐＨおよび温度速度依存的様式でグルコン酸に加水分解して、カルシウムイオン源を提供する。実施形態において、架橋剤およびプロトン供与体は、約２：１のモル比で提供される。
【0057】
実施形態において、（ａ）架橋剤およびプロトン供与体を、ＰＧＡ化合物を含むゲル化剤を含む水性媒体と共に提供するステップは、（１）架橋剤を、ＰＧＡ化合物を含むゲル化剤を含む水性媒体と混合して、水溶液を形成するステップおよび／または（２）グルコノラクトンに水溶液を提供することにより、ＰＧＡ化合物の架橋を開始するステップを含む。（１）に関して、実施形態において、架橋剤を、ＰＧＡ化合物を含むゲル化剤を含む水性媒体、例えば、細胞培養培地等と混合して、水溶液を形成するステップは、実質的に均質な水溶液を提供するためにボルテックスするステップを含む。また、（１）に関して、実施形態において、ＰＧＡ化合物を含むゲル化剤は、それに架橋剤を提供する前に、水性媒体、例えば、細胞培養培地等と共に提供されかつ／またはそれに添加される。さらに（１）に関して、実施形態において、架橋剤は、水性媒体およびＰＧＡ化合物を含むゲル化剤を提供する前に混合される。
【0058】
（２）に関して、実施形態において、ＰＧＡ化合物の架橋は、グルコノラクトンを（１）で形成された水溶液に提供することにより開始される。実施形態において、グルコノラクトンを（１）で形成された水溶液に提供するステップは、グルコノラクトンをこの水溶液と混合するステップを含む。
【0059】
実施形態において、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００を製造するための方法は、（ｂ）消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００のゲル化の前に、架橋剤、プロトン供与体、および（ａ）のＰＧＡ化合物を含むゲル化剤を含む水性媒体と、スフェロイド５００を含む３Ｄ細胞培養基材１００とを提供するステップをさらに含む。３Ｄ細胞培養基材１００およびスフェロイド５００は、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００に関して前述したとおりであることができる。実施形態において、スフェロイド５００は、３Ｄ細胞培養基材１００のマイクロウェルアレイ１５０内に配置される。（ｂ）に関して、実施形態において、架橋剤、プロトン供与体、および（ａ）のＰＧＡ化合物を含むゲル化剤を含む水性媒体と３Ｄ細胞培養基材１００とを提供するステップは、架橋剤、プロトン供与体、および（ａ）のＰＧＡ化合物を含むゲル化剤を含む水性媒体を、スフェロイド５００を含む少なくとも１つのマイクロウェル１３０および／またはマイクロウェルのアレイ１５０に適用するステップを含む。実施形態において、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００は、スフェロイド５００を含む少なくとも１つのマイクロウェル１３０および／またはマイクロウェルのアレイ１５０に適用されると、ｉｎ ｓｉｔｕで形成される。このようにして、（ａ）の水溶液のゲル化は、３Ｄ細胞培養基材１００への適用前には起こらない。また、このようにして、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００を、３Ｄ細胞培養基材１００の少なくとも１つのマイクロウェル１３０および／またはマイクロウェルのアレイ１５０上および／または中に、重ねられた配置で形成することができる。
【0060】
図１Ｃおよび図２Ａを参照すると、前述の方法に従って調製された消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００が示される。具体的には、記載された方法に従って調製された消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００が重ねられた配置で示される。
【0061】
図１Ａ～図１Ｂを参照すると、前述のように消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００を調製しかつ／または重ねる前に、スフェロイド５００を、３Ｄ細胞培養基材１００中で培養することができる。具体的には、図１Ａに示されているように、スフェロイド５００を、前述の３Ｄ細胞培養基材１００中で、これも前述の細胞培養培地９００中において培養することができる。ついで、図１Ｂを参照すると、前述のように消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００を調製しかつ／または重ねる前に、細胞培養培地９００を３Ｄ細胞培養基材１００から除去することができる。ついで、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００を調製しかつ／または重ねるための方法を、前述のようにかつ図１Ｃおよび図２Ａに示されているように実施することができる。
【0062】
図２Ｂ～図２Ｃを参照すると、前述のように消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００を調製しかつ／または重ねた後、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００を消化することができる。例えば、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００を、消化剤１１００、例えば、消化溶液１１００等を提供しかつ／または添加することにより消化することができる。実施形態において、消化剤１１００および／または消化溶液１１００は、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００を分解するための作用剤を含む。例えば、消化剤１１００および／または消化溶液１１００は、少なくとも１種のペクチナーゼ、少なくとも１種のアルギン酸リアーゼ（またはアルギナーゼ）および／または少なくとも１種のキレート剤を含むことができる。更なる例として、消化剤１１００および／または消化溶液１１００は、少なくとも１種のペクチナーゼおよび／または少なくとも１種のキレート剤を含むことができる。更なる例として、消化剤１１００および／または消化溶液１１００は、少なくとも１種のアルギナーゼおよび／または少なくとも１種のキレート剤を含むことができる。
【0063】
実施形態において、ペクチナーゼおよび／またはアルギナーゼを、ヒドロラーゼ、リアーゼおよび／またはエステラーゼから選択することができる。ペクチナーゼおよび／またはアルギナーゼは、その触媒作用を介して、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００を消化しかつ／または分解するように機能することができる。例えば、ペクチナーゼおよび／またはアルギナーゼは、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００を解離させ、そこからスフェロイドを放出させるように機能することができる。実施形態において、ペクチナーゼは、アスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ｎｉｇｅｒ）から産生される。実施形態によれば、アルギナーゼは、海藻、海洋軟体動物（タマキビガイ属（Ｌｉｔｔｏｒｉｎａ ｓｐｐ）、ミミガイ属（Ｈａｌｉｏｔｉｓ ｓｐｐ）、サザエ（Ｔｕｒｂｏ ｃｏｒｎｕｔｕｓ））ならびに広範囲の海洋細菌および陸生細菌を含む種々の供給源から単離することができる。本開示の実施形態の実施例では、Sigma-Aldrichから市販されているアルギン酸リアーゼ（製品番号：Ａ１６０３、ＣＡＳ番号：９０２４－１５－１）を使用した。実施形態において、ペクチナーゼおよび／またはアルギナーゼは、約１０Ｕ／ｍｌ～約１０００Ｕ／ｍｌまたは約２０Ｕ／ｍｌ～約５００Ｕ／ｍｌまたは約５０Ｕ／ｍｌ～約２００Ｕ／ｍｌまたは約１００Ｕ／ｍｌの濃度で、前述の消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００と共に提供されかつ／またはこれに添加される。
【0064】
実施形態において、キレート剤を、エチエレンジアミンテトラ酢酸（すなわち、ＥＤＴＡ）、シクロヘキサンジアミン四酢酸（すなわち、ＣＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（すなわち、ＥＧＴＡ）、クエン酸および／または酒石酸から選択することができる。実施形態において、キレート剤はＥＤＴＡである。一部の実施形態では、キレート剤はＢＡＰＴＡである。実施形態において、ペクチナーゼは、消化溶液１１００を消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００と共に提供する前に、キレート剤と混合される。実施形態において、キレート剤と混合されたペクチナーゼ、すなわち、消化溶液は、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００の約２倍の体積で、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００と共に提供されかつ／またはこれに添加される。例えば、２ｍＬの消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００を含むマイクロウェル１３０に、４ｍＬの消化溶液を、それと共に提供しかつ／またはそれに添加することができる。
【0065】
実施形態において、消化溶液１１００は、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００と共に、消化反応時間提供される。例えば、消化溶液１１００を、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００と共に、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００を成分であるガラクツロン酸モノマーに分解しかつ／または減成することを可能するために十分な反応時間提供することができる。理論に拘束されるものではないが、消化が起こるための反応時間は、ＰＧＡ化合物を含むゲル化剤の量および／または濃度により決めることができると考えられる。例えば、ＰＧＡ化合物のより少ない量および／またはより低い濃度により、消化が起こるためのより短い反応時間がもたらされる場合がある。逆に、別の例として、ＰＧＡ化合物のより多い量および／またはより高い濃度により、消化が起こるためのより短い反応時間がもたらされる場合がある。消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００を、スフェロイド５００を含む３Ｄ細胞培養基材１００中で消化することにより、スフェロイド５００を回収することができる。実施形態において、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００を分解しかつ／または減成することにより、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００で覆われている生きたスフェロイド５００の回収が可能となる。
【0066】
図２Ｂ～図２Ｃを参照すると、スフェロイド５００の消化および／または回収後、消化溶液１１００を、細胞培養培地９００で置き換えることができる。具体的には、消化溶液１１００を除去することができ、細胞培養培地９００を、３Ｄ細胞培養基材１００内に配置されたスフェロイド５００と共に提供しかつ／またはこれに添加することができる。
【0067】
消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００を製造するための方法の実施形態を、詳細に記載してきた。ここから、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００を製造するためのキットの実施形態を詳細に参照するものとする。
【0068】
ＩＩＩ．スフェロイド安定化ヒドロゲルを製造するためのキット
実施形態において、カルシウムを含まないまたはカルシウムキレート化された細胞培養培地中でスフェロイド安定化ヒドロゲル３００を調製しかつ／または製造するためのキットが開示される。このキットは、（ａ）アルギン酸、または（ｉ）ペクチン酸もしくはその塩または（ｉｉ）約１～約４０モル％のエステル化度を有する部分的にエステル化されたペクチン酸もしくはその塩のうちの少なくとも一方を含むＰＧＡ化合物を含むゲル化剤と、（ｂ）二価イオンの塩を含む架橋剤と、（ｃ）ラクトン、エステル、または水溶液中で加水分解して１０分～１時間の期間にわたって酸を形成する他の化合物を含むプロトン供与体とを含むことができる。実施形態において、このキットは、（ｄ）３Ｄ細胞培養基材１００も含む。
実施形態において、カルシウムを含まないまたはカルシウムキレート化された細胞培養培地中でスフェロイド安定化ヒドロゲル３００を調製しかつ／または製造するためのキットが開示される。このキットは、（ａ）アルギン酸、または（ｉ）ペクチン酸もしくはその塩または（ｉｉ）約１～約４０モル％のエステル化度を有する部分的にエステル化されたペクチン酸もしくはその塩のうちの少なくとも一方を含むＰＧＡ化合物を含むゲル化剤と、（ｂ）二価イオンの塩を含む架橋剤と、（ｃ）ラクトン、エステル、または水溶液中で加水分解して１０分～１時間の期間にわたって酸を形成する他の化合物を含むプロトン供与体とを含むことができる。実施形態において、このキットは、（ｄ）３Ｄ細胞培養基材１００も含む。
【0069】
３Ｄ細胞培養基材１００、ゲル化剤、架橋剤およびプロトン供与体は、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００および／または消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００を製造するための方法に関して前述したとおりである。例えば、ＰＧＡ化合物を含むゲル化剤は、ペクチン酸であることができ、架橋剤は、カルシウム塩であることができ、プロトン供与体は、グルコノラクトンであることができる。別の例として、３Ｄ細胞培養基材１００は、スフェロイド容器であることができる。
【0070】
実施形態において、３Ｄ細胞培養基材１００は、少なくとも１つの毛細管構造１７０および／またはスフェロイド誘引幾何形状１７０を含むマイクロウェルのアレイ１５０を含む。実施形態において、少なくとも１つの毛細管構造１７０は、口領域、隆起、裂け目、柱、不連続壁、波形壁、放物線状ウェル形状および／または洞様毛細管ウェル形状から選択される。実施形態において、スフェロイド誘引幾何形状１７０は、柱、不連続壁、丸みを帯びたウェル底部、窪んだウェル底部、ピットおよび／またはペン先領域から選択される。実施形態において、３Ｄ細胞培養基材１００は、細胞培養容器７００を含みかつ／または細胞培養容器７００にその一部として含まれる。細胞培養容器７００を、多層プレート、ディッシュ、フラスコ、チューブ、多層フラスコ、軟質側フラスコおよび／またはバッグから選択することができる。
【0071】
実施形態において、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００を調製しかつ／または製造するためのキットは、細胞培養培地をさらに含む。実施形態において、細胞培養培地は、カルシウムを含まない細胞培養培地またはカルシウムキレート化された細胞培養培地である。細胞培養培地は、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルならびに／または消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００を調製しかつ／もしくは製造するための方法に関して前述したとおりである。実施形態において、ＰＧＡ化合物は、細胞培養培地とは別個の溶液である。例えば、ＰＧＡ化合物を、カルシウムを含まない培地および／またはカルシウムキレート化された培地とは別個の溶液として提供することができる。実施形態において、ＰＧＡ化合物を、カルシウムを含まない培地および／またはカルシウムキレート化された培地とは別個の溶液として提供することができ、それらと混合することができる。
【0072】
実施形態において、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００を調製しかつ／または製造するためのキットは、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００を分解するための消化剤をさらに含む。実施形態において、消化剤は、ペクチナーゼおよび／またはキレート剤を含む。ペクチナーゼおよびキレート剤は、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００および／または消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００を製造するための方法に関して前述したとおりである。実施形態において、キレート剤は、ＥＤＴＡ、ＣＤＴＡ、ＥＴＧＡ、クエン酸および／または酒石酸から選択される。実施形態において、キレート剤は、ＥＤＴＡである。
【0073】
実施形態において、このキットは、３Ｄ細胞培養基材１００、ＰＧＡ化合物を含むゲル化剤、架橋剤、プロトン供与体、細胞培養培地および／または消化剤の使用に関するガイダンスを提供するための説明書をさらに含む。例えば、このキットは、前述の消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００を製造するための方法および／または消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００を消化するための方法に関する説明書を含むことができる。実施形態において、このキットは、（ａ）消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００を製造するための方法に関して前述されたように、架橋剤およびプロトン供与体を、ＰＧＡ化合物を含むゲル化剤を含む水性媒体と共に提供するステップおよび関連する反応条件ならびに／または消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル３００を消化剤１１００で消化するステップおよび関連する反応条件についての説明書を含む。説明書により、前述の３Ｄ細胞培養基材１００、ＰＧＡ化合物を含むゲル化剤、架橋剤、プロトン供与体、細胞培養培地および／または消化剤の使用が伝えられると理解される。
【0074】
消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを製造するための方法ならびに消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを調製しかつ／または製造するためのキットの種々の態様が本明細書中に記載され、このような態様を、種々の他の態様と組み合わせて利用することができることを、ここで理解されたい。
【0075】
第１の態様では、本開示は、（ａ）アルギン酸、または（ｉ）ペクチン酸もしくはその塩、または（ｉｉ）約１～約４０モル％のエステル化度を有する部分的にエステル化されたペクチン酸もしくはその塩のうちの少なくとも一方を含むポリガラクツロン酸（ＰＧＡ）化合物を含むゲル化剤と、（ｂ）二価イオンの塩を含む架橋剤と、（ｃ）ラクトン、エステル、または水溶液中で加水分解して、１０分～１時間の期間にわたって酸を形成する他の化合物を含むプロトン供与体とを含み、ＰＧＡ化合物が架橋剤およびプロトン供与体を介して架橋されて、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを形成する、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを提供する。
【0076】
第２の態様では、本開示は、ＰＧＡ化合物がペクチン酸を含む、第１の態様記載の消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを提供する。
【0077】
第３の態様では、本開示は、二価イオンの塩がカルシウム塩を含む、第１または第２の態様記載の消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを提供する。
【0078】
第４の態様では、本開示は、二価イオンの塩が炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはこれらの組み合わせから選択されるカルシウム塩を含む、第１から第３までのいずれか１つの態様記載の消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを提供する。
【0079】
第５の態様では、本開示は、二価イオンの塩が炭酸カルシウムを含む、第１から第４までのいずれか１つの態様記載の消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを提供する。
【0080】
第６の態様では、本開示は、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルが約１％重量／重量のＰＧＡ化合物と、約２：１のプロトン供与体に対する架橋剤のモル比とを含む、第１から第５までのいずれか１つの態様記載の消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを提供する。
【0081】
第７の態様では、本開示は、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルが二価イオンの塩として炭酸カルシウムと、約１％重量／重量のペクチン酸と、プロトン供与体としてグルコノラクトンと、約２：１のグルコノラクトンに対する炭酸カルシウムのモル比とを含む、第１から第６までのいずれか１つの態様記載の消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを提供する。
【0082】
第８の態様では、本開示は、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルが細胞の増殖を支持する細胞培養培地の成分をさらに含む、第１から第７までのいずれか１つの態様記載の消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを提供する。
【0083】
第９の態様では、本開示は、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルがカルシウムを含まないまたはカルシウムキレート化された細胞培養培地をさらに含む、第１から第８までのいずれか１つの態様記載の消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを提供する。
【0084】
第１０の態様では、本開示は、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルがスフェロイドを含む三次元（３Ｄ）細胞培養基材と共に提供される、第１から第９までのいずれか１つの態様記載の消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを提供する。
【0085】
第１１の態様では、本開示は、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルがスフェロイドを含む三次元（３Ｄ）細胞培養基材と共に提供され、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルにより、３Ｄ細胞培養基材中でのスフェロイドの生存率が向上しかつ／または３Ｄ細胞培養基材中の標的位置においてスフェロイドが安定化される、第１から第１０までのいずれか１つの態様記載の消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを提供する。
【0086】
第１２の態様では、本開示は、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルがスフェロイド容器と共に提供される、第１から第１１までのいずれか１つの態様記載の消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを提供する。
【0087】
第１３の態様では、本開示は、二価イオンの塩が２５℃で０ｍｇ／Ｌ超～約２０ｍｇ／Ｌの水溶性を有するカルシウム塩を含む、第１から第１２までのいずれか１つの態様記載の消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを提供する。
【0088】
第１４の態様では、本開示は、プロトン供与体がグルコノラクトンを含む、第１から第１３までのいずれか１つの態様記載の消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを提供する。
【0089】
第１５の態様では、本開示は、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを製造するための方法であって、ＰＧＡ化合物が架橋剤およびプロトン供与体を介して架橋されて、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを形成する条件下で、（ａ）架橋剤およびプロトン供与体を、（ｉ）ペクチン酸もしくはその塩、または（ｉｉ）約１～約４０モル％のエステル化度を有する部分的にエステル化されたペクチン酸もしくはその塩のうちの少なくとも一方を含むポリガラクツロン酸（ＰＧＡ）化合物またはアルギン酸を含むゲル化剤を含む水性媒体と共に提供するステップを含み、架橋剤が二価イオンの塩を含み、プロトン供与体がラクトン、エステル、または水溶液中で加水分解して１０分～１時間の期間にわたって酸を形成する他の化合物を含む、方法を提供する。
【0090】
第１６の態様では、本開示は、二価イオンの塩がカルシウム塩を含む、第１５の態様記載の消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを製造するための方法を提供する。
【0091】
第１７の態様では、本開示は、ＰＧＡ化合物がペクチン酸を含み、二価イオンの塩が炭酸カルシウムを含む、第１５または第１６の態様記載の消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを製造するための方法を提供する。
【0092】
第１８の態様では、本開示は、水性媒体が細胞培養培地を含む、第１５から第１７までのいずれか１つの態様記載の消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを製造するための方法を提供する。
【0093】
第１９の態様では、本開示は、水性媒体がカルシウムを含まないまたはカルシウムキレート化された細胞培養培地を含む、第１５から第１８までのいずれか１つの態様記載の消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを製造するための方法を提供する。
【0094】
第２０の態様では、本開示は、架橋剤およびプロトン供与体を、ＰＧＡ化合物を含むゲル化剤を含む水性媒体と共に提供するステップ（ａ）が（１）架橋剤を、ＰＧＡ化合物を含むゲル化剤を含む水性媒体と混合して、水溶液を形成するステップと、（２）プロトン供与体に水溶液を提供することにより、ＰＧＡ化合物の架橋を開始するステップとを含む、第１５から第１９までのいずれか１つの態様記載の消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを製造するための方法を提供する。
【0095】
第２１の態様では、本開示は、架橋剤およびプロトン供与体を、ＰＧＡ化合物を含むゲル化剤を含む水性媒体と共に提供するステップ（ａ）が（１）架橋剤を、ＰＧＡ化合物を含むゲル化剤を含む水性媒体と混合して、水溶液を形成するステップと、（２）プロトン供与体を水溶液と混合することにより、ＰＧＡ化合物の架橋を開始するステップとを含む、第１５から第２０までのいずれか１つの態様記載の消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを製造するための方法を提供する。
【0096】
第２２の態様では、本開示は、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルが、約１％重量／重量のペクチン酸であるＰＧＡ化合物と、約２：１のプロトン供与体に対する架橋剤のモル比とを含む、第１５から第２１までのいずれか１つの態様記載の消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを製造するための方法を提供する。
【0097】
第２３の態様では、本開示は、（ｂ）消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルがｉｎ ｓｉｔｕで形成されるように、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルのゲル化前に、架橋剤、プロトン供与体、および（ａ）のポリガラクツロン酸（ＰＧＡ）化合物を含むゲル化剤を含む水性媒体と、スフェロイドを含む三次元（３Ｄ）細胞培養基材とを提供するステップをさらに含む、第１５から第２２までのいずれか１つの態様記載の消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを製造するための方法を提供する。
【0098】
第２４の態様では、本開示は、３Ｄ細胞培養基材が少なくとも１つの毛細管構造およびスフェロイド誘引幾何形状を含むマイクロウェルのアレイを含み、スフェロイドがマイクロウェルのアレイに配置され、ステップ（ｂ）が、架橋剤、プロトン供与体、および（ａ）のポリガラクツロン酸（ＰＧＡ）化合物を含むゲル化剤を含む水性媒体を、マイクロウェルのうちの少なくとも１つに適用するステップを含む、第２３の態様記載の消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを製造するための方法を提供する。
【0099】
第２５の態様では、本開示は、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルが重ねられた配置で形成される、第２３または第２４の態様記載の消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを製造するための方法を提供する。
【0100】
第２６の態様では、本開示は、ペクチナーゼまたはアルギナーゼを提供するステップをさらに含む、第１５から第２５までのいずれか１つの態様記載の消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを製造するための方法を提供する。
【0101】
第２７の態様では、本開示は、ペクチナーゼまたはアルギナーゼを添加して、ヒドロゲルを解離させ、そこからスフェロイドを放出させる、第２６の態様記載の消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを製造するための方法を提供する。
【0102】
第２８の態様では、本開示は、プロトン供与体がグルコノラクトンを含む、第１５から第２７までのいずれか１つの態様記載の消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを製造するための方法を提供する。
【0103】
第２９の態様では、本開示は、（ａ）アルギン酸、または（ｉ）ペクチン酸もしくはその塩、または（ｉｉ）約１～約４０モル％のエステル化度を有する部分的にエステル化されたペクチン酸もしくはその塩のうちの少なくとも一方を含むポリガラクツロン酸（ＰＧＡ）化合物を含むゲル化剤と、（ｂ）二価イオンの塩を含む架橋剤と、（ｃ）ラクトン、エステル、または水溶液中で加水分解して１０分～１時間の期間にわたって酸を形成する他の化合物を含むプロトン供与体とを含む、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを調製しかつ／または製造するためのキットを提供する。
【0104】
第３０の態様では、本開示は、（ｄ）３Ｄ細胞培養基材をさらに含む、第２９の態様記載の消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを調製しかつ／または製造するためのキットを提供する。
【0105】
第３１の態様では、本開示は、３Ｄ細胞培養基材が少なくとも１つの毛細管構造およびスフェロイド誘引幾何形状を含むマイクロウェルのアレイを有する、第３０の態様記載の消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを調製しかつ／または製造するためのキットを提供する。
【0106】
第３２の態様では、本開示は、３Ｄ細胞培養基材が細胞培養容器の少なくとも一部を含む、第３０または第３１の態様記載の消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを調製しかつ／または製造するためのキットを提供する。
【0107】
第３３の態様では、本開示は、細胞培養容器が多層プレート、ディッシュ、フラスコ、チューブ、多層フラスコ、軟質側フラスコまたはバッグから選択される、第３２の態様記載の消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを調製しかつ／または製造するためのキットを提供する。
【0108】
第３４の態様では、本開示は、３Ｄ細胞培養基材の少なくとも１つの毛細管構造が隆起、裂け目、柱、不連続壁、波形壁、口、放物線状ウェル形状、洞様毛細管ウェル形状またはこれらの組み合わせから選択される、第３１から第３３までのいずれか１つの態様記載の消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを調製しかつ／または製造するためのキットを提供する。
【0109】
第３５の態様では、本開示は、スフェロイド誘引幾何形状が柱、不連続壁、波形壁、丸みを帯びたウェル底部、窪んだウェル底部、ピット、ペン先領域またはこれらの組み合わせを含む、第３１から第３４までのいずれか１つの態様記載の消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを調製しかつ／または製造するためのキットを提供する。
【0110】
第３６の態様では、本開示は、３Ｄ細胞培養基材がスフェロイド容器である、第３０から第３５までのいずれか１つの態様記載の消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを調製しかつ／または製造するためのキットを提供する。
【0111】
第３７の態様では、本開示は、ＰＧＡ化合物を含むゲル化剤がペクチン酸を含む、第２９から第３６までのいずれか１つの態様記載の消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを調製しかつ／または製造するためのキットを提供する。
【0112】
第３８の態様では、本開示は、二価イオンの塩がカルシウム塩を含む、第２９から第３７までのいずれか１つの態様記載の消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを調製しかつ／または製造するためのキットを提供する。
【0113】
第３９の態様では、本開示は、二価イオンの塩が炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはこれらの組み合わせから選択されるカルシウム塩を含む、第２９から第３８までのいずれか１つの態様記載の消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを調製しかつ／または製造するためのキットを提供する。
【0114】
第４０の態様では、本開示は、二価イオンの塩が炭酸カルシウムである、第２９から第３９までのいずれか１つの態様記載の消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを調製しかつ／または製造するためのキットを提供する。
【0115】
第４１の態様では、本開示は、二価イオンの塩が２５℃で約０ｍｇ／Ｌ～約２０ｍｇ／Ｌの水溶性を有するカルシウム塩である、第２９から第４０までのいずれか１つの態様記載の消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを調製しかつ／または製造するためのキットを提供する。
【0116】
第４２の態様では、本開示は、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを分解するための消化剤をさらに含み、消化剤がペクチナーゼまたはアルギナーゼと、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＴＧＡ）、クエン酸、酒石酸またはこれらの組み合わせから選択されるキレート剤とを含む、第２９から第４１までのいずれか１つの態様記載の消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを調製しかつ／または製造するためのキットを提供する。
【0117】
第４３の態様では、本開示は、キレート剤がエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む、第４２の態様記載の消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを調製しかつ／または製造するためのキットを提供する。
【0118】
第４４の態様では、本開示は、細胞培養培地をさらに含む、第２９から第４３までのいずれか１つの態様記載の消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを調製しかつ／または製造するためのキットを提供する。
【0119】
第４５の態様では、本開示は、細胞培養培地がカルシウムを含まないまたはカルシウムキレート化された細胞培養培地を含む、第４４の態様記載の消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを調製しかつ／または製造するためのキットを提供する。
【0120】
第４６の態様では、本開示は、ＰＧＡ化合物が細胞培養培地と混合されている、第４４または第４５の態様記載の消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを調製しかつ／または製造するためのキットを提供する。
【0121】
第４７の態様では、本開示は、ＰＧＡ化合物が細胞培養培地とは別個の溶液である、第４４または第４５の態様記載の消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを調製しかつ／または製造するためのキットを提供する。
【0122】
第４８の態様では、本開示は、プロトン供与体がグルコノラクトンを含む、第２９から第４７までのいずれか１つの態様記載の消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを調製しかつ／または製造するためのキットを提供する。
【実施例】
【0123】
本明細書に記載された実施形態は、下記実施例によりさらに明確にされるであろう。
【0124】
実施例１
重ねられた消化性ＰＧＡスフェロイド安定化ヒドロゲルの細胞生存率への影響
実験プロトコル。ＨｅｐＧ２細胞の生存率に対する、重ねられた消化性ＰＧＡスフェロイド安定化ヒドロゲルの影響を研究した。より具体的には、２Ｄ細胞培養単層上で増殖させたＨｅｐＧ２細胞および３Ｄ細胞培養基材上でスフェロイドに増殖させたＨｅｐＧ２細胞の生存率に対する、重ねられた消化性ＰＧＡスフェロイド安定化ヒドロゲルの影響を研究した。
重ねられた消化性ＰＧＡスフェロイド安定化ヒドロゲルの細胞生存率への影響
実験プロトコル。ＨｅｐＧ２細胞の生存率に対する、重ねられた消化性ＰＧＡスフェロイド安定化ヒドロゲルの影響を研究した。より具体的には、２Ｄ細胞培養単層上で増殖させたＨｅｐＧ２細胞および３Ｄ細胞培養基材上でスフェロイドに増殖させたＨｅｐＧ２細胞の生存率に対する、重ねられた消化性ＰＧＡスフェロイド安定化ヒドロゲルの影響を研究した。
【0125】
２Ｄ細胞培養単層。Corning Ｔ－７５フラスコ（フラスコ当たり約３×１０６個の細胞）中で細胞培養培地中においてＨｅｐＧ２細胞を増殖させることにより、ＨｅｐＧ２細胞（ＡＴＣＣ；ＨＢ－８０６５）を、２Ｄ細胞培養基材上に播種するために調製した。細胞培養培地は、ＧｌｕｔａＭＡＸを含む最小必須培地ならびにThermoFisherからの１×ペニシリン－ストレプトマイシンおよびThermoFisherからの１０％ウシ胎仔血清を含むThermoFisherからのイーグル塩とした。ＨｅｐＧ２細胞を、Ｔ－７５フラスコ中で約９０％コンフルエントまで増殖させた。ついで、細胞培養培地をＴ－７５フラスコから除去し、２．５ｍＬの０．２５％のトリプシン－エチレンジアミン四酢酸（すなわち、ＥＤＴＡ）溶液（ThermoFisher）をＴ－７５フラスコに添加した。Ｔ－７５フラスコを、３７℃、５％のＣＯ２および約９５％の相対湿度のＣＯ２インキュベータを使用して、標準的な組織培養により、３７℃で５分間インキュベートした。１０％のウシ胎仔血清（すなわち、ＦＢＳ；カタログ番号３５－０１０－ＣＶ、Corning, Incorporated, Corning, NY）を含む、１２．５ｍＬの最小必須培地（すなわち、ＭＥＭ；カタログ番号１１０９５０８０、Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA）を、Ｔ－７５フラスコに添加して、混合物を形成した。ついで、この混合物を、数回ピペットで上下させて、ＨｅｐＧ２細胞のあらゆるクラスターを破壊した。ついで、２０μＬの混合物をセロメーター（Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ Ａｕｔｏ Ｔ４、Nexcelom, Lawrence, MA）に入れ、ＨｅｐＧ２細胞を混合物１ｍＬ当たりでカウントした。ついで、ＨｅｐＧ２細胞を、３５ｍＬのＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ中で、１ｍＬ当たり約４×１０５個の細胞の最終濃度に希釈した。
【0126】
２Ｄ細胞培養基材中に播種するためのＨｅｐＧ２細胞を調製すると、ついで、ＨｅｐＧ２を、ウェル当たり５ｍＬの、ＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ中で希釈したＨｅｐＧ２細胞をアリコートすることにより、２Ｄ細胞培養基材（Corning Inc.からのカタログ番号４３０６４１Ｕ細胞培養フラスコ）上に播種した。ＨｅｐＧ２細胞を、室温で３０分間放置し、その後インキュベートした。ついで、２Ｄ細胞培養基材中のＨｅｐＧ２細胞を、５％のＣＯ２および９５％の相対湿度を有するインキュベータ（Fisher ScientificからのＮＡＰＣＯシリーズ８０００ ＤＨ ＣＯ２インキュベータ）中において、３７℃で一晩（約１６時間）インキュベートした。
【0127】
消化性ＰＧＡスフェロイド安定化ヒドロゲル（以下、「ＰＧＡヒドロゲル」）を調製し、Ｌ－１５培地（ＡＴＣＣ（登録商標）３０－２００８（商標）、カタログ番号２１０８３０２７、Thermo Fisher Scientific）に重ねた。重ねられるＰＧＡヒドロゲルについての調製において、残存する何らかの液体を２Ｄ細胞培養基材のウェルから除去し、Ｌ－１５培地中の１ｍＬのポリガラクツロン酸（すなわち、ＰＧＡまたはペクチン酸；Sigma Aldrich ＃Ｐ３８５０）を２Ｄ細胞培養基材の各ウェルに添加し、室温で５分間インキュベートした。ＰＧＡを、１％重量／重量のＰＧＡ濃度でライボビッツ培地に添加した。ついで、Ｌ－１５培地中のＰＧＡをウェルから除去した。
【0128】
ＰＧＡヒドロゲルを、Ｌ－１５培地中のＰＧＡを１５ｍＬのコニカルチューブ（Corning, Inc.）に添加することにより調製した。ＰＧＡを、濃度がＬ－１５培地中で１％重量／重量となるように添加した。ついで、炭酸カルシウム（すなわち、ＣａＣＯ３；Sigma Aldrich製品番号：７９５４４５Ｇ）を、１ｍｇ／ｍＬの濃度まで添加した。１５ｍＬのコニカルチューブの底部に沈殿することを避けるために、ＣａＣＯ３を十分に混合し、その後、Ｌ－１５培地中のＰＧＡを添加した。ついで、１５ｍＬのコニカルチューブを、短時間（約２秒）ボルテックスして、ＣａＣＯ３がＬ－１５培地中のＰＧＡ中に均一に分配されることを確実にした。ついで、グルコノデルタ－ラクトン（すなわち、ＧＤＬ；Sigma Aldrich）を、Ｌ－１５培地中のＰＧＡ中に均一に分配されたＣａＣＯ３に添加した。ＧＤＬを、約３．５６ｍｇ／ｍＬの最終濃度まで添加した。ついで、１５ｍＬのコニカルチューブを数回反転させて、Ｌ－１５培地中のＰＧＡ、ＣａＣＯ３およびＧＤＬの適切な混合を確実にした。反転後、１～２ｍＬのＬ－１５培地中のＰＧＡ、ＣａＣＯ３およびＧＤＬの混合物を、２Ｄ細胞培養基材の各ウェルに添加した。Ｌ－１５培地中のＰＧＡ、ＣａＣＯ３およびＧＤＬの混合物のゲル化を室温で約３０分間起こさせ、重ねられたＰＧＡヒドロゲルを形成した。対照ウェルを提供するために、Ｌ－１５培地中のＰＧＡ、ＣａＣＯ３およびＧＤＬの混合物を添加する代わりに、１～２ｍＬ（約２２０μＬ／ｃｍ２）のＬ－１５培地を対照ウェルに添加した。
【0129】
ついで、２Ｄ細胞培養基材を、約２℃～約８℃の温度での冷蔵庫中で一晩保存した。
【0130】
ついで、生細胞／死細胞染色を下記プロトコルに従って行った。２Ｄ細胞培養基材を、５℃での保存から取り出し、室温まで約１５分間温めた。ついで、等量（ウェルに添加されたＰＧＡ／ＣａＣＯ３およびＧＤＬ混合物の容量に応じて、１～２ｍＬ）のカルシウムおよびマグネシウムを含まないダルベッコリン酸緩衝食塩水（すなわち、ＤＰＢＳ；ThermoFisher）を、２Ｄ細胞培養基材の各ウェルに添加し、５分間インキュベートした。ついで、重ねられたＰＧＡヒドロゲルのいずれも除去しないように注意して、ＤＰＢＳを各ウェルから除去した。
【0131】
生細胞／死細胞染色溶液を、１５μＬの赤色蛍光エチジウムホモダイマーおよび７．５ｍＬの緑色蛍光カルセインＡＭを１５ｍＬのＤＰＢＳに添加し、ほ乳類細胞用のＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ／Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙキット（カタログ番号Ｌ３２２４、Thermo Fisher Scientific）を使用して十分混合することにより調製した。赤色蛍光エチジウムホモダイマーは、原形質膜の完全性の喪失を示し、インタクトな原形質膜は、生きた細胞の区別できる特徴であり、対照的に、緑色蛍光カルセインＡＭは、細胞内エステラーゼ活性を示し、遍在する細胞内エステラーゼ活性は、生きた細胞の区別できる特徴である。このようにして、生きた細胞を、赤色蛍光エチジウムホモダイマーおよび緑色蛍光カルセインＡＭによる同時染色により、死んだ細胞と識別することができる。
【0132】
ついで、等量の調製された生細胞／死細胞染色溶液を、各ウェル中の重ねられたＰＧＡヒドロゲルに添加した（すなわち、１ｍＬのＰＧＡヒドロゲルに、１ｍＬの調製された、生細胞／死細胞染色溶液を添加した）。ついで、添加された生細胞／死細胞染色溶液を、５℃で２時間インキュベートした。インキュベート後、細胞を、Ｎｉｋｏｎ ＥＣＬＩＰＳＥ Ｔｉ明視野顕微鏡およびＮｉｋｏｎ ＥＣＬＩＰＳＥ Ｔｉ蛍光顕微鏡下で検査して、生きた細胞（すなわち、緑色蛍光を示す細胞）および死んだ細胞（すなわち、赤色蛍光を示す細胞）を可視化した。
【0133】
３Ｄ細胞培養。Ｔ－７５フラスコ（フラスコ当たり約３×１０６個の細胞）中で細胞培養培地中においてＨｅｐＧ２細胞を増殖させることにより、ＨｅｐＧ２細胞を、３Ｄ細胞培養基材上に播種するために調製した。ＨｅｐＧ２細胞を、Ｔ－７５フラスコ中で約９０％コンフルエントまで増殖させた。ついで、細胞培養培地をＴ－７５フラスコから除去し、２．５ｍＬの０．２５％のトリプシン－ＥＤＴＡ溶液をＴ－７５フラスコに添加した。Ｔ－７５フラスコを、５％のＣＯ２および９５％の相対湿度のＣＯ２インキュベータ中において、３７℃で５分間インキュベートした。１０％のＦＢＳ（カタログ番号３５－０１０－ＣＶ、Corning, Incorporated）を含む、１２．５ｍＬのＭＥＭ（カタログ番号１１０９５０８０、Thermo Fisher Scientific）を、Ｔ－７５フラスコに添加して、混合物を形成した。ついで、この混合物を、数回ピペットで上下させて、ＨｅｐＧ２細胞のあらゆるクラスターを破壊した。ついで、２０μＬの混合物を、セロメーター（Nexcelom, Lawrence, MA）に入れ、ＨｅｐＧ２細胞を、混合物１ｍＬ当たりでカウントした。ついで、ＨｅｐＧ２細胞を、３５ｍＬのＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ中で、１ｍＬ当たり約３．２×１０５個の細胞の最終濃度に希釈した。
【0134】
３Ｄ細胞培養基材中に播種するためのＨｅｐＧ２細胞を調製すると、ＨｅｐＧ２を、ウェル当たり５ｍＬの、ＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ中で希釈したＨｅｐＧ２細胞をアリコートすることにより、３Ｄ細胞培養基材上に播種した。３Ｄ細胞培養基材の各ウェルは、約１３００個のマイクロキャビティを含む。約１２００個のＨｅｐＧ２細胞を、各マイクロキャビティに播種した。ＨｅｐＧ２細胞を、室温で３０分間放置し、その後、インキュベートした。ついで、３Ｄ細胞培養基材中のＨｅｐＧ２細胞を、５％のＣＯ２および９５％のＲＨを有するインキュベータ中において、３７℃で３日間インキュベートして、スフェロイドを形成した（約１５００個の細胞／スフェロイド）。
【0135】
ＰＧＡヒドロゲルを調製し、Ｌ－１５培地（カタログ番号２１０８３０２７、Thermo Fisher Scientific）に重ねた。重ねられるＰＧＡヒドロゲルについての調製において、残存する何らかの液体を、スフェロイドのいずれも吸引しないように注意して、３Ｄ細胞培養基材のウェルから除去した。ついで、Ｌ－１５培地中の１ｍＬのＰＧＡを、３Ｄ細胞培養基材の各ウェルに添加し、室温で５分間インキュベートした。ついで、Ｌ－１５培地中のＰＧＡを、再度、スフェロイドのいずれも吸引しないように注意して、ウェルから除去した。
【0136】
ＰＧＡヒドロゲルを、Ｌ－１５培地中のＰＧＡを１５ｍＬのコニカルチューブに添加することにより調製した。ＰＧＡを、濃度がＬ－１５培地中で１％重量／重量となるように添加した。ついで、ＣａＣＯ３を、１ｍｇ／ｍＬの濃度まで添加した。１５ｍＬのコニカルチューブの底部に沈殿することを避けるために、ＣａＣＯ３を十分に混合し、その後、Ｌ－１５培地中のＰＧＡを添加した。ついで、１５ｍＬのコニカルチューブを、短時間（約２秒）ボルテックスして、ＣａＣＯ３がＬ－１５培地中のＰＧＡ中に均一に分配されることを確実にした。ＧＤＬを、Ｌ－１５培地中のＰＧＡ中に均一に分配されたＣａＣＯ３に添加した。ＧＤＬを、約３．５６ｍｇ／ｍＬの最終濃度まで添加した。ついで、１５ｍＬのコニカルチューブを数回反転させて、Ｌ－１５培地中のＰＧＡ、ＣａＣＯ３およびＧＤＬの適切な混合を確実にした。反転後、２～３ｍＬのＬ－１５培地中のＰＧＡ、ＣａＣＯ３およびＧＤＬの混合物を、３Ｄ細胞培養基材の各ウェルに添加した。Ｌ－１５培地中のＰＧＡ、ＣａＣＯ３およびＧＤＬの混合物のゲル化を室温で約３０分間起こさせ、ＰＧＡヒドロゲルを形成した。対照ウェルを提供するために、Ｌ－１５培地中のＰＧＡ、ＣａＣＯ３およびＧＤＬの混合物を添加する代わりに、１ｍＬのＬ－１５培地を対照ウェルに添加し、５分間インキュベートし、除去し、ついで、２～３ｍＬのＬ－１５培地を対照ウェルに添加した。
【0137】
ついで、３Ｄ細胞培養基材を、約２℃～約８℃の温度の冷蔵庫中で一晩保存した。
【0138】
ついで、生細胞染色／死細胞染色を、下記プロトコルに従って行った。３Ｄ細胞培養基材を５℃での保存から取り出し、室温まで約１５分間温めた。ついで、等量（ウェルに添加されたＰＧＡ／ＣａＣＯ３およびＧＤＬ混合物の容量に応じて、１～２ｍＬ）のＤＰＢＳを、３Ｄ細胞培養基材の各ウェルに添加し、５分間インキュベートした。ついで、ＰＧＡヒドロゲルのいずれも除去しないように注意して、ＤＰＢＳを各ウェルから除去した。
【0139】
生細胞／死細胞染色溶液を、１５μＬの赤色蛍光エチジウムホモダイマーおよび７．５ｍＬの緑色蛍光カルセインＡＭを１５ｍＬのＤＰＢＳに添加し、ほ乳類細胞用のＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ／Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙキット（カタログ番号Ｌ３２２４、Thermo Fisher Scientific）を使用して十分混合することにより調製した。赤色蛍光エチジウムホモダイマーは、原形質膜の完全性の喪失を示し、インタクトな原形質膜は、生きた細胞の区別できる特徴であり、対照的に、緑色蛍光カルセインＡＭは、細胞内エステラーゼ活性を示し、遍在する細胞内エステラーゼ活性は、生きた細胞の区別できる特徴である。このようにして、生きた細胞を、赤色蛍光エチジウムホモダイマーおよび緑色蛍光カルセインＡＭによる同時染色により、死んだ細胞と識別することができる。
【0140】
ついで、等量の調製された生細胞／死細胞染色溶液を、各ウェル中のＰＧＡヒドロゲルに添加した（すなわち、１ｍＬのＰＧＡヒドロゲルに、１ｍＬの調製された、生細胞／死細胞染色溶液を添加した）。ついで、添加された生細胞／死細胞染色溶液を、５℃で２時間インキュベートした。ついで、細胞を、明視野顕微鏡および蛍光顕微鏡下で検査して、生きた細胞（緑色蛍光）および死んだ細胞（赤色蛍光）を可視化した。
【0141】
結果。図３Ａ～図３Ｃおよび図４Ａ～図４Ｃを参照すると、重ねられたＰＧＡヒドロゲルを含む２Ｄ細胞培養単層上で増殖させたＨｅｐＧ２細胞は、ＰＧＡヒドロゲルを有さない２Ｄ細胞培養基材上で増殖させた対照ＨｅｐＧ２細胞（例えば、図３Ｂ～図３Ｃを参照のこと）よりも高い生存率を示した（例えば、図４Ｂ～図４Ｃを参照のこと）。図５Ａ～図５Ｃおよび図６Ａ～図６Ｃを参照すると、重ねられたＰＧＡヒドロゲルを含む３Ｄ細胞培養基材上で増殖させたＨｅｐＧ２スフェロイドは、ＰＧＡヒドロゲルを有さない３Ｄ細胞培養基材上で増殖させた対照ＨｅｐＧ２スフェロイド（例えば、図５Ｂ～図５Ｃを参照のこと）よりも高い生存率を示した（例えば、図６Ｂ～図６Ｃを参照のこと）。このような向上した生存率を考慮して、理論に拘束されることなく、重ねられたＰＧＡヒドロゲルにより、インキュベートの間にＨｅｐＧ２細胞に細胞保存特性が提供されたと考えられる。
【0142】
実施例２
重ねられたＰＧＡヒドロゲルを含む３Ｄ細胞培養基材上で増殖させたスフェロイドの落下試験
実験プロトコル。スフェロイドの輸送を模倣するために、落下試験を、重ねられたＰＧＡヒドロゲルを含む３Ｄ細胞培養基材上で増殖させたＨｅｐＧ２スフェロイドについて行った。重ねられたＰＧＡヒドロゲルを含む３Ｄ細胞培養基材上で増殖させたＨｅｐＧ２スフェロイドを、実施例１の実験プロトコルに記載されたように調製した。また、生細胞染色／死細胞染色も、実施例１の実験プロトコルに記載されたように行った。落下試験の前に、３Ｄマイクロキャビティプレート中の細胞の生／死染色により、対照プレート上の細胞の全体的な健康を観察した。試験プレートを、ＰＧＡヒドロゲル上に重ねられた生／死溶液と共に、５℃で２時間インキュベートして、この溶液をヒドロゲル層および細胞に浸透させ、その後、可視化した。さらに、ＰＧＡヒドロゲルを有さない３Ｄ細胞培養基材上で増殖させた対照ＨｅｐＧ２スフェロイドを、実施例１の実験プロトコルに記載されたように調製した。また、生細胞染色／死細胞染色も、実施例１の実験プロトコルに記載されかつ上記されたように行った。ＨｅｐＧ２スフェロイドおよび重ねられたＰＧＡヒドロゲルを含む３Ｄ細胞培養基材を、バブルラップ（厚さ約２インチ（約５．０８ｃｍ））の層で包み、厚紙輸送箱に梱包した。また、ＰＧＡヒドロゲルを含まない対照ＨｅｐＧ２スフェロイドを含む３Ｄ細胞培養基材も、バブルラップ（厚さ約２インチ（約５．０８ｃｍ））の層で包み、厚紙輸送箱に梱包した。
重ねられたＰＧＡヒドロゲルを含む３Ｄ細胞培養基材上で増殖させたスフェロイドの落下試験
実験プロトコル。スフェロイドの輸送を模倣するために、落下試験を、重ねられたＰＧＡヒドロゲルを含む３Ｄ細胞培養基材上で増殖させたＨｅｐＧ２スフェロイドについて行った。重ねられたＰＧＡヒドロゲルを含む３Ｄ細胞培養基材上で増殖させたＨｅｐＧ２スフェロイドを、実施例１の実験プロトコルに記載されたように調製した。また、生細胞染色／死細胞染色も、実施例１の実験プロトコルに記載されたように行った。落下試験の前に、３Ｄマイクロキャビティプレート中の細胞の生／死染色により、対照プレート上の細胞の全体的な健康を観察した。試験プレートを、ＰＧＡヒドロゲル上に重ねられた生／死溶液と共に、５℃で２時間インキュベートして、この溶液をヒドロゲル層および細胞に浸透させ、その後、可視化した。さらに、ＰＧＡヒドロゲルを有さない３Ｄ細胞培養基材上で増殖させた対照ＨｅｐＧ２スフェロイドを、実施例１の実験プロトコルに記載されたように調製した。また、生細胞染色／死細胞染色も、実施例１の実験プロトコルに記載されかつ上記されたように行った。ＨｅｐＧ２スフェロイドおよび重ねられたＰＧＡヒドロゲルを含む３Ｄ細胞培養基材を、バブルラップ（厚さ約２インチ（約５．０８ｃｍ））の層で包み、厚紙輸送箱に梱包した。また、ＰＧＡヒドロゲルを含まない対照ＨｅｐＧ２スフェロイドを含む３Ｄ細胞培養基材も、バブルラップ（厚さ約２インチ（約５．０８ｃｍ））の層で包み、厚紙輸送箱に梱包した。
【0143】
ついで、落下試験を、厚紙輸送箱を約１．５ｍの高さから５～１０回落下させることにより行った。厚紙輸送箱内に梱包された３Ｄ細胞培養基材を、落下試験の実行後に回収し、３Ｄ細胞培養基材を裸眼でならびに明視野顕微鏡および蛍光顕微鏡下で視覚的に検査して、重ねられたＰＧＡヒドロゲルおよび／またはスフェロイドの変位を決定した。
【0144】
結果。図７Ａ～図７Ｃおよび図８Ａ～図８Ｃを参照すると、重ねられたＰＧＡヒドロゲルを含む３Ｄ細胞培養基材のマイクロキャビティは、ＰＧＡヒドロゲルを含まない対照３Ｄ細胞培養基材のマイクロキャビティ（例えば、図７Ａ～図７Ｃを参照のこと）に比べ、落下試験後にＨｅｐＧ２スフェロイドのより高い保持を示した（例えば、図８Ａ～図８Ｃを参照のこと）。また、図７Ａ～図７Ｃにも示されているように、重ねられたＰＧＡヒドロゲルを含む３Ｄ細胞培養基材のウェルは、落下試験の後、ＨｅｐＧ２スフェロイドをその中に残存させた状態で、インタクトなままであった。このような保持を考慮して、理論に拘束されるものではないが、重ねられたＰＧＡヒドロゲルを含む３Ｄ細胞培養基材中に提供されたＨｅｐＧ２スフェロイドは、その輸送中にそこから変位せずかつ／または制御されない凝集体を形成しないであろうと考えられる。
【0145】
実施例３
２Ｄ細胞培養単層上で増殖させたＨｅｐＧ２細胞および重ねられたＰＧＡヒドロゲルを含む３Ｄ細胞培養基材上で増殖させたスフェロイドの回収
実験プロトコル。重ねられたＰＧＡヒドロゲルを含む３Ｄ細胞培養基材からのスフェロイドの回収を行った。重ねられたＰＧＡヒドロゲルを含む２Ｄ細胞培養単層上で増殖させたＨｅｐＧ２細胞を、実施例１の実験プロトコルに記載したように調製した。さらに、重ねられたＰＧＡヒドロゲルを含む３Ｄ細胞培養基材上で増殖させたＨｅｐＧ２スフェロイドを、実施例１の実験プロトコルに記載されたように調製した。ついで、ＰＧＡ消化溶液を調製した。重ねられたＰＧＡヒドロゲルを含む２Ｄ細胞培養単層上で増殖させたＨｅｐＧ２細胞の消化のために、ペクチナーゼ（Sigma Aldrich製）を２００Ｕ／ｍＬの最終濃度でかつＥＤＴＡを２０ｍＭの最終濃度でＤＰＢＳに添加することにより、ＰＧＡ消化溶液を調製した。重ねられたＰＧＡヒドロゲルを含む３Ｄ細胞培養基材上で増殖させたＨｅｐＧ２スフェロイドの消化のために、ペクチナーゼ（Sigma Aldrich）を１００Ｕ／ｍＬの最終濃度でかつＥＤＴＡを１０ｍＭの最終濃度でＤＰＢＳに添加することにより、ＰＧＡ消化溶液を調製した。
２Ｄ細胞培養単層上で増殖させたＨｅｐＧ２細胞および重ねられたＰＧＡヒドロゲルを含む３Ｄ細胞培養基材上で増殖させたスフェロイドの回収
実験プロトコル。重ねられたＰＧＡヒドロゲルを含む３Ｄ細胞培養基材からのスフェロイドの回収を行った。重ねられたＰＧＡヒドロゲルを含む２Ｄ細胞培養単層上で増殖させたＨｅｐＧ２細胞を、実施例１の実験プロトコルに記載したように調製した。さらに、重ねられたＰＧＡヒドロゲルを含む３Ｄ細胞培養基材上で増殖させたＨｅｐＧ２スフェロイドを、実施例１の実験プロトコルに記載されたように調製した。ついで、ＰＧＡ消化溶液を調製した。重ねられたＰＧＡヒドロゲルを含む２Ｄ細胞培養単層上で増殖させたＨｅｐＧ２細胞の消化のために、ペクチナーゼ（Sigma Aldrich製）を２００Ｕ／ｍＬの最終濃度でかつＥＤＴＡを２０ｍＭの最終濃度でＤＰＢＳに添加することにより、ＰＧＡ消化溶液を調製した。重ねられたＰＧＡヒドロゲルを含む３Ｄ細胞培養基材上で増殖させたＨｅｐＧ２スフェロイドの消化のために、ペクチナーゼ（Sigma Aldrich）を１００Ｕ／ｍＬの最終濃度でかつＥＤＴＡを１０ｍＭの最終濃度でＤＰＢＳに添加することにより、ＰＧＡ消化溶液を調製した。
【0146】
ついで、残存する何らかの液体を２Ｄ培養基材および３Ｄ細胞培養基材のウェルから除去した。ついで、ＰＧＡヒドロゲルの体積と等しい体積の２Ｄ細胞培養単層ＰＧＡ消化溶液を、２Ｄ細胞培養基材の各ウェルに添加した。例えば、２ｍＬの重ねられたＰＧＡヒドロゲルを含有するウェルについて、対応する２ｍＬの２Ｄ細胞培養単層ＰＧＡ消化溶液を、このようなウェルに添加した。このようにして、１００Ｕ／ｍＬのペクチナーゼおよび１０ｍＭのＥＤＴＡの最終濃度が、２Ｄ細胞培養基材の各ウェルにおいて達成された。ＰＧＡヒドロゲルの体積の２倍となる体積の３Ｄ細胞培養基材ＰＧＡ消化溶液を、３Ｄ細胞培養基材の各ウェルに添加した。例えば、２ｍＬの重ねられたＰＧＡヒドロゲルを含有するウェルについて、４ｍＬの３Ｄ細胞培養基材ＰＧＡ消化溶液を、このようなウェルに添加した。ついで、ＰＧＡ消化溶液を、ウェル中において、室温で３０分間インキュベートした。本開示の実施形態によれば、消化に必要とされる正確な時間は、容易な場合、試薬の特定の濃度により決まるであろうことが企図される。一部の実施形態では、この時間は、約１５分～約１時間の範囲であることができる。この期間中、ＰＧＡ消化溶液は、ＰＧＡマトリクスを消化しかつ可溶化して、ポリガラクツロン酸をモノガラクツロン酸に分解するように作用する。
【0147】
ついで、残存する何らかの液体をウェルから除去し、２ｍＬのＤＰＢＳを各ウェルに添加した。（例えば、スフェロイド収集を行うために）ＤＰＢＳを添加する代わりに、スフェロイド細胞培養を継続するために、細胞培養培地を添加することができる。
【0148】
当業者であれば、その広範な発明概念から逸脱することなく、上記された実施形態に変更を行うことができると理解するであろう。したがって、本開示は、開示された特定の実施形態に限定されず、添付の特許請求の範囲により定義される本開示の精神および範囲内にある修正をカバーすることが意図されると理解される。
【0149】
引用された全ての文献は、参照により本明細書に援用される。いずれの文献の引用も、それが本開示に関する先行技術であるとの容認として解釈されるべきではない。
【0150】
種々の実施形態の記載により「含む（comprising）」および／または「含んでいる（including）」なる用語が使用される場合、当業者であれば、一部の特定の事例において、実施形態により、「実質的に～からなる」または「～からなる」なる語を使用して代替的に説明できることが理解されるであろうことをさらに理解されたい。
【0151】
本明細書全体を通して与えられる全ての最大数値限定は、より低い数値限定が本明細書に明示的に記載されているのと同様に、全てのより低い数値限定を含むと理解されたい。本明細書全体を通して与えられる全ての最小数値限定は、より高い数値限定が本明細書に明示的に記載されているのと同様に、全てのより高い数値限定を含む。本明細書全体を通して与えられる全ての数値範囲は、このようなより狭い数値範囲が全て本明細書で明示的に記載されているのと同様に、このようなより広い数値範囲内に入る全てのより狭い数値範囲を含むであろう。
【0152】
特に断らない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、特許請求される主題が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書における説明で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためのみのものであり、限定を意図するものではない。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形“a”、“an”および“the”は、文脈から明示的に別段のことが示されない限り、複数形も含むことが意図される。
【0153】
コンポーネントの寸法および／もしくはその範囲ならびに／または組成物中の成分、例えば、消化性スフェロイド安定化ヒドロゲル等の量、濃度、体積、プロセス温度、プロセス時間、収率、流量、圧力、粘度および／またはそれらの値および範囲に関する「約」なる用語は、本開示の実施形態を記載する際に利用されるように、例えば、材料、組成物、組成物の成分等を調製するための典型的な測定および／もしくは取り扱い手法、手順における不注意な誤りならびに／または方法を実施するために使用される出発物質および／もしくは成分の製造、供給源および／もしくは純度における差異を介して生じる場合がある数量の変動を指す。また、「約」なる用語は、特定の初期濃度を有する組成物および／もしくは混合物の劣化に起因して異なる量ならびに特定の初期濃度を有する組成物および／もしくは混合物の混合および／もしくは処理に起因して異なる量も包含する。
【0154】
以下、本発明の好ましい実施形態を項分け記載する。
【0155】
実施形態１
カルシウムを含まないまたはカルシウムキレート化された細胞培養培地中でスフェロイド安定化ヒドロゲルを製造するためのキットであって、
（ａ）（ｉ）ペクチン酸もしくはその塩、または
（ｉｉ）約１～約４０モル％のエステル化度を有する部分的にエステル化されたペクチン酸もしくはその塩
のうちの少なくとも一方を含むポリガラクツロン酸（ＰＧＡ）化合物またはアルギン酸化合物を含むゲル化剤と、
（ｂ）二価イオンの塩を含む架橋剤と、
（ｃ）ラクトン、エステル、または水溶液中で加水分解して１０分～１時間の期間にわたって酸を形成する他の化合物を含む、プロトン供与体と
を含む、キット。
カルシウムを含まないまたはカルシウムキレート化された細胞培養培地中でスフェロイド安定化ヒドロゲルを製造するためのキットであって、
（ａ）（ｉ）ペクチン酸もしくはその塩、または
（ｉｉ）約１～約４０モル％のエステル化度を有する部分的にエステル化されたペクチン酸もしくはその塩
のうちの少なくとも一方を含むポリガラクツロン酸（ＰＧＡ）化合物またはアルギン酸化合物を含むゲル化剤と、
（ｂ）二価イオンの塩を含む架橋剤と、
（ｃ）ラクトン、エステル、または水溶液中で加水分解して１０分～１時間の期間にわたって酸を形成する他の化合物を含む、プロトン供与体と
を含む、キット。
【0156】
実施形態２
前記ＰＧＡ化合物が、前記カルシウムを含まないまたはカルシウムキレート化された細胞培養培地と混合されている、実施形態１記載のキット。
前記ＰＧＡ化合物が、前記カルシウムを含まないまたはカルシウムキレート化された細胞培養培地と混合されている、実施形態１記載のキット。
【0157】
実施形態３
前記ＰＧＡ化合物が、前記カルシウムを含まないまたはカルシウムキレート化された細胞培養培地とは別個の溶液である、実施形態１記載のキット。
前記ＰＧＡ化合物が、前記カルシウムを含まないまたはカルシウムキレート化された細胞培養培地とは別個の溶液である、実施形態１記載のキット。
【0158】
実施形態４
前記プロトン供与体が、グルコノラクトンである、実施形態１記載のキット。
前記プロトン供与体が、グルコノラクトンである、実施形態１記載のキット。
【0159】
実施形態５
前記架橋剤が、カルシウム塩である、実施形態１記載のキット。
前記架橋剤が、カルシウム塩である、実施形態１記載のキット。
【0160】
実施形態６
前記カルシウム塩が、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸カルシウム、またはこれらの組み合わせから選択される、実施形態５記載のキット。
前記カルシウム塩が、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸カルシウム、またはこれらの組み合わせから選択される、実施形態５記載のキット。
【0161】
実施形態７
前記カルシウム塩が、炭酸カルシウムを含む、実施形態５記載のキット。
前記カルシウム塩が、炭酸カルシウムを含む、実施形態５記載のキット。
【0162】
実施形態８
前記カルシウム塩が、２５℃で０ｍｇ／Ｌ超～約２０ｍｇ／Ｌの水溶性を有する、実施形態５記載のキット。
前記カルシウム塩が、２５℃で０ｍｇ／Ｌ超～約２０ｍｇ／Ｌの水溶性を有する、実施形態５記載のキット。
【0163】
実施形態９
前記キットが、三次元（３Ｄ）細胞培養基材をさらに含む、実施形態１記載のキット。
前記キットが、三次元（３Ｄ）細胞培養基材をさらに含む、実施形態１記載のキット。
【0164】
実施形態１０
前記３Ｄ細胞培養基材が、少なくとも１つの毛細管構造およびスフェロイド誘引幾何形状を含むマイクロウェルのアレイを有する、実施形態９記載のキット。
前記３Ｄ細胞培養基材が、少なくとも１つの毛細管構造およびスフェロイド誘引幾何形状を含むマイクロウェルのアレイを有する、実施形態９記載のキット。
【0165】
実施形態１１
前記３Ｄ細胞培養基材が、細胞培養容器の少なくとも一部を含む、実施形態９記載のキット。
前記３Ｄ細胞培養基材が、細胞培養容器の少なくとも一部を含む、実施形態９記載のキット。
【0166】
実施形態１２
前記キットが、スフェロイド容器をさらに含む、実施形態１記載のキット。
前記キットが、スフェロイド容器をさらに含む、実施形態１記載のキット。
【0167】
実施形態１３
前記キットが、スフェロイド安定化ヒドロゲルを分解するための消化剤をさらに含み、前記消化剤が、ペクチナーゼと、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＴＧＡ）、クエン酸、酒石酸、またはこれらの組み合わせから選択されるキレート剤とを含む、実施形態１記載のキット。
前記キットが、スフェロイド安定化ヒドロゲルを分解するための消化剤をさらに含み、前記消化剤が、ペクチナーゼと、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＴＧＡ）、クエン酸、酒石酸、またはこれらの組み合わせから選択されるキレート剤とを含む、実施形態１記載のキット。
【0168】
実施形態１４
消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを製造するための方法であって、前記方法が、
ポリガラクツロン酸（ＰＧＡ）化合物が架橋剤およびプロトン供与体を介して架橋されて、前記消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを形成する条件下で、
（ａ）カルシウム塩を含む架橋剤およびグルコノラクトンを含むプロトン供与体を、
（ｉ）ペクチン酸もしくはその塩、または
（ｉｉ）約１～約４０モル％のエステル化度を有する部分的にエステル化されたペクチン酸もしくはその塩
のうちの少なくとも一方を含むＰＧＡ化合物またはアルギン酸化合物を含むゲル化剤を含む水性媒体と共に提供するステップ
を含む、方法。
消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを製造するための方法であって、前記方法が、
ポリガラクツロン酸（ＰＧＡ）化合物が架橋剤およびプロトン供与体を介して架橋されて、前記消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルを形成する条件下で、
（ａ）カルシウム塩を含む架橋剤およびグルコノラクトンを含むプロトン供与体を、
（ｉ）ペクチン酸もしくはその塩、または
（ｉｉ）約１～約４０モル％のエステル化度を有する部分的にエステル化されたペクチン酸もしくはその塩
のうちの少なくとも一方を含むＰＧＡ化合物またはアルギン酸化合物を含むゲル化剤を含む水性媒体と共に提供するステップ
を含む、方法。
【0169】
実施形態１５
前記方法が、ペクチナーゼまたはアルギン酸リアーゼを添加して、前記ヒドロゲルを解離させ、前記ヒドロゲルからスフェロイドを放出させるステップをさらに含む、実施形態１４記載の方法。
前記方法が、ペクチナーゼまたはアルギン酸リアーゼを添加して、前記ヒドロゲルを解離させ、前記ヒドロゲルからスフェロイドを放出させるステップをさらに含む、実施形態１４記載の方法。
【0170】
実施形態１６
前記水性媒体が、細胞培養培地を含む、実施形態１４記載の方法。
前記水性媒体が、細胞培養培地を含む、実施形態１４記載の方法。
【0171】
実施形態１７
前記架橋剤および前記プロトン供与体を、前記ＰＧＡ化合物を含む前記ゲル化剤を含む前記水性媒体と共に提供するステップ（ａ）が、
（１）前記架橋剤を、前記ＰＧＡ化合物を含む前記水性媒体と混合して、水溶液を形成するステップと、
（２）前記グルコノラクトンに前記水溶液を提供することにより、前記ＰＧＡ化合物の架橋を開始するステップと
を含む、実施形態１４記載の方法。
前記架橋剤および前記プロトン供与体を、前記ＰＧＡ化合物を含む前記ゲル化剤を含む前記水性媒体と共に提供するステップ（ａ）が、
（１）前記架橋剤を、前記ＰＧＡ化合物を含む前記水性媒体と混合して、水溶液を形成するステップと、
（２）前記グルコノラクトンに前記水溶液を提供することにより、前記ＰＧＡ化合物の架橋を開始するステップと
を含む、実施形態１４記載の方法。
【0172】
実施形態１８
前記消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルが、
約１％重量／重量の、前記ペクチン酸である前記ＰＧＡ化合物と、
約２：１の前記プロトン供与体に対する前記架橋剤のモル比と
を含む、実施形態１４記載の方法。
前記消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルが、
約１％重量／重量の、前記ペクチン酸である前記ＰＧＡ化合物と、
約２：１の前記プロトン供与体に対する前記架橋剤のモル比と
を含む、実施形態１４記載の方法。
【0173】
実施形態１９
前記方法が、
（ｂ）前記消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルがｉｎ ｓｉｔｕで形成されるように、前記消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルのゲル化前に、前記架橋剤、前記プロトン供与体、および（ａ）の前記ポリガラクツロン酸（ＰＧＡ）化合物を含む前記ゲル化剤を含む前記水性媒体と、スフェロイドを含む三次元（３Ｄ）細胞培養基材とを提供するステップ
をさらに含む、実施形態１４記載の方法。
前記方法が、
（ｂ）前記消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルがｉｎ ｓｉｔｕで形成されるように、前記消化性スフェロイド安定化ヒドロゲルのゲル化前に、前記架橋剤、前記プロトン供与体、および（ａ）の前記ポリガラクツロン酸（ＰＧＡ）化合物を含む前記ゲル化剤を含む前記水性媒体と、スフェロイドを含む三次元（３Ｄ）細胞培養基材とを提供するステップ
をさらに含む、実施形態１４記載の方法。
【0174】
実施形態２０
前記３Ｄ細胞培養基材が、少なくとも１つの毛細管構造およびスフェロイド誘引幾何形状を含むマイクロウェルのアレイを有し、
前記スフェロイドが、前記マイクロウェルのアレイに配置されており、
前記提供するステップ（ｂ）が、前記架橋剤、前記プロトン供与体、および（ａ）の前記ポリガラクツロン酸（ＰＧＡ）化合物を含む前記ゲル化剤を含む前記水性媒体を、前記マイクロウェルのうちの少なくとも１つに適用するステップを含む、
実施形態１９記載の方法。
前記３Ｄ細胞培養基材が、少なくとも１つの毛細管構造およびスフェロイド誘引幾何形状を含むマイクロウェルのアレイを有し、
前記スフェロイドが、前記マイクロウェルのアレイに配置されており、
前記提供するステップ（ｂ）が、前記架橋剤、前記プロトン供与体、および（ａ）の前記ポリガラクツロン酸（ＰＧＡ）化合物を含む前記ゲル化剤を含む前記水性媒体を、前記マイクロウェルのうちの少なくとも１つに適用するステップを含む、
実施形態１９記載の方法。
【図1A-1C】
【図2A-2C】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図9A】
【図9B】
【図10】
【図11】
【国際調査報告】